CN105462984B - 与靶蛋白质结合的核酸片段 - Google Patents
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Abstract
本发明的目的是开发并提供用于有效制备核酸适体、特别是DNA适体的方法,所述核酸适体相比通过常规方法获得的核酸适体具有对靶物质的更高的特异性和结合活性。本发明提供了包含天然核苷酸和具有人工碱基可配对的人工碱基的非天然核苷酸的可转录或可复制的核酸适体。本发明还提供了用于对选自单链核酸文库的含有非天然核苷酸的单链核酸分子进行测序的方法。
Description
本申请是申请日为2012年11月15日,申请号为201280067396.0,发明名称为“与靶蛋白质结合的核酸片段”的申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及用于使用包含人工碱基(artificial base)的核酸文库有效制备功能性核酸、特别是核酸适体(尤其是,DNA适体)的方法。
背景技术
近年来,核酸适体,如与其它功能性核酸诸如siRNA一样,作为代替低分子量化合物用于制药药物或诊断药物的新的活性成分已受到关注,并且在世界各地以多种方式被研究和开发,旨在在医学上应用适体。
这些核酸适体是能够通过其自身的构象牢固地并且特异地与靶物质诸如蛋白质结合以抑制或压制靶物质的功能的功能性核酸。在2004年被FDA批准的用于治疗年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration)的靶向血管内皮生长因子(VEGF)的修饰的RNA适体(Macugen)已知为药学上使用的核酸适体的典型实例。
相比作为包括20种氨基酸的蛋白质的抗体,此类核酸适体仅由4种碱基构成。此外,这4种碱基在化学或物理性质方面十分类似。由于这些原因,核酸适体被变化形式(variation)和性能不利地限制。
为了解决这个问题,以前报道的方法在核酸文库中使用一种或两种类型的修饰的天然碱基用于核酸适体分离,所述修饰的天然碱基包括通过接头(linker)与取代基结合的天然碱基(专利文献1和2以及非专利文献1至3)。预期用于应用至能够检测蛋白质的核酸芯片并且可被用于诊断领域的DNA适体也被已知为包括此类修饰的天然碱基的修饰的核酸适体(非专利文献3)。然而,被引入修饰的核酸适体的一种或两种类型的修饰的天然碱基导致具有修饰的天然碱基的整个核酸适体中约25%或更多的碱基的替换。虽然提高了适体的生产效率,但这提出了适体的减少的选择性或细胞毒性的另一个问题。因此,使用具有修饰的天然碱基的修饰的核酸适体目前限于诊断,且没有这样的适体被批准用作治疗药物(非专利文献3)。
引用列表
专利文献
专利文献1:日本专利公布(Kohyo)号09-502354 A(1997)
专利文献2:WO1992014842
非专利文献
非专利文献1:Shoji A.,等人,J.Am.Chem.Soc.,129,1456-1464(2007)
非专利文献2:Vaught J.D.,等人,J.Am.Chem.Soc.,132,4141-4151(2010)
非专利文献3:Gold L.,等人,PLoS One,5,e15004(2010)
发明内容
技术问题
本发明的一个目的是开发并提供用于有效制备核酸适体、特别是DNA适体的方法,所述核酸适体相比通过常规方法获得的核酸适体具有针对靶物质的更高的特异性和结合活性。
本发明的另一个目的是提供包括核酸分子作为活性成分的药物组合物。
问题的解决方案
本发明人进行了勤勉的研究以实现目的,并因此发现了可通过将具有人工碱基的非天然核苷酸引入由天然核苷酸组成的单链核酸分子,获得相比仅由天然核苷酸构成的核酸适体具有更高的靶物质结合能力的核酸适体。该人工碱基与另一个人工碱基通过互补是可配对的,并因此也可以在核酸复制或转录方面行使功能。这允许通过常规核酸扩增方法例如PCR扩增核酸文库。虽然能够在核酸复制或转录方面行使功能的此人工碱基已经是已知的(Hirao I.,等人,Nature Methods,3,729-735(2006);Hirao I.,等人,J.Am.Chem.Soc.,129,15549-15555(2007);Kimoto M.,等人,Nucleic Acids Res.,37,e14(2009);Kimoto M.,等人,J.Am.Chem.Soc.,132,15418-15426(2010);Kimoto M.,等人,Expert Rev.Mol.Diagn.,11,321-331(2011);Malyshev D.A.,等人,J.Am.Chem.Soc.,131,14620-14621(2009);Malyshev D.A.,等人,Chemistry,16,12650-12659(2010);Yang Z.,等人,Nucleic Acids Res.,35,4238-4249,(2007);和Yang Z.,等人,J.Am.Chem.Soc.,133,15105-15112(2011)),到目前为止,包括具有人工碱基的非天然核苷酸的核酸适体是完全未知的。这部分地是因为没有已经建立的用于对核酸文库中包括非天然核苷酸的核酸适体进行测序的方法。因此,本发明人还开发了用于确定包括包含非天然核苷酸的核酸分子的文库中单个核苷酸序列的新的方法。
本发明基于开发结果,并特别地提供了以下方面:
(1)一种可转录或可复制的核酸适体,其包括天然核苷酸以及具有人工碱基可配对的人工碱基(artificial base-pairable artificial base)的非天然核苷酸。
(2)根据(1)的核酸适体,其中人工碱基选自由Ds、Pn、和Pa构成的组。
(3)根据(2)的核酸适体,其中人工碱基包括人工碱基的人工碱基可配对衍生物(artificial base-pairable derivative of artificial base)。
(4)根据(1)至(3)中任一项的核酸适体,其中非天然核苷酸的含量为核苷酸总数的20%或更少。
(5)根据(1)至(4)中任一项的核酸适体,其中核酸是DNA或RNA。
(6)根据(1)的核酸适体,其中核酸适体针对血管内皮生长因子作为靶物质。
(7)根据(6)的核酸适体,其中核酸适体包括选自由以下构成的组的任何一个核苷酸序列:SEQ ID NO:25至73、80至104、106至109、111、和155至166(只要序列中的“n”表示Ds)、175、177、179、181、183、198、201、202、205至209、211、212、和229至278。
(8)根据(7)的核酸适体,其中核酸适体由5′侧翼为SEQ ID NO:1表示的核苷酸序列且3′侧翼为SEQ ID NO:2表示的核苷酸序列的根据(7)的任何一个核苷酸序列组成。
(9)根据(1)的核酸适体,其中核酸适体针对干扰素γ作为靶物质。
(10)根据(9)的核酸适体,其中核酸适体包括选自由以下构成的组的任何一个核苷酸序列:SEQ ID NO:167至174(只要序列中的“n”表示Ds)、186、188、190、192、194、214至222、和279至328。
(11)根据(10)的核酸适体,其中核酸适体由5′侧翼为SEQ ID NO:1表示的核苷酸序列且3′侧翼为SEQ ID NO:2表示的核苷酸序列的根据(10)的任何一个核苷酸序列组成。
(12)一种单链核酸文库,所述单链核酸文库包括可转录或可复制的、含有非天然核苷酸的单链核酸分子,所述含有非天然核苷酸的单链核酸分子包括天然核苷酸和具有人工碱基可配对的人工碱基的非天然核苷酸。
(13)根据(12)的单链核酸文库,其中非天然核苷酸在含有非天然核苷酸的单链核酸分子中的含量为核苷酸总数的20%或更少。
(14)根据(12)或(13)的单链核酸文库,其中单链核酸分子包括5′-末端和3′-末端的引物结合区,以及位于引物结合区之间的中心区(central region),所述引物结合区各自由文库中共有的已知核苷酸序列组成。
(15)根据(14)的单链核酸文库,其中文库包括含有非天然核苷酸的单链核酸分子,所述含有非天然核苷酸的单链核酸分子还包括与设置在所述中心区的核苷酸序列的特定位置处的一个或多个人工碱基的位置信息相关的识别位点,所述识别位点设置在中心区的至少一端以便在引物结合区的侧翼并且由天然核苷酸构成。
(16)一种用于制备核酸适体的方法,所述方法包括:将根据(12)至(15)中的任一项的单链核酸文库与靶物质在溶液中混合以形成单链核酸分子与靶物质的复合物的复合物形成步骤;回收复合物的复合物回收步骤;从回收的复合物中回收单链核酸分子的单链核酸分子回收步骤;通过核酸扩增方法扩增回收的单链核酸分子的扩增步骤;以及从通过扩增步骤获得的核酸分子制备核酸适体的核酸适体制备步骤。
(17)根据(16)的方法,还包括使用核酸适体制备步骤中制备的核酸适体的新的单链核酸文库,将从复合物形成步骤至核酸适体制备步骤的新的轮重复一次或多次的重复步骤。
(18)根据(17)的方法,其中重复的次数为15或更少。
(19)根据(16)至(18)中任一项的方法,其中核酸适体是DNA适体或RNA适体。
(20)根据(19)的方法,其中当核酸适体是RNA适体时,扩增步骤包括逆转录子步骤(substep)、DNA扩增子步骤、以及转录子步骤。
(21)根据(16)至(20)中任一项的方法,其中人工碱基选自Ds、Pn、和Pa。
(22)根据(21)的方法,其中人工碱基包括人工碱基的人工碱基可配对衍生物。
(23)一种用于对选自根据(14)的单链核酸文库的含有非天然核苷酸的单链核酸分子进行测序的方法,所述方法包括:使用结合至引物结合区的引物组,以天然核苷酸作为底物,通过核酸扩增方法扩增选择的单链核酸分子的第一扩增步骤;从通过第一扩增步骤获得的仅由天然核苷酸构成的扩增产物获得单克隆的克隆步骤;使用结合至引物结合区的引物组,以天然核苷酸和非天然核苷酸作为底物,通过核酸扩增方法扩增选择的单链核酸分子的第二扩增步骤;使用克隆步骤中获得的单克隆作为探针从通过第二扩增步骤获得的扩增产物分离源自单克隆的单链核酸分子的单链核酸分子分离步骤;以及对单链核酸分子分离步骤中分离的源自单克隆的单链核酸分子进行测序的测序步骤。
(24)根据(23)的方法,其中用于单链核酸分子分离步骤的探针被固定在固相载体(solid-phase carrier)上。
(25)根据(23)或(24)的方法,其中单链核酸分子分离步骤中分离的源自单克隆的单链核酸分子包括非天然核苷酸。
(26)一种用于对选自根据(15)的单链核酸文库的含有非天然核苷酸的单链核酸分子进行测序的方法,所述方法包括:使用结合至引物结合区的引物组,以天然核苷酸作为底物,通过核酸扩增方法扩增选择的单链核酸分子的第三扩增步骤;从通过扩增步骤获得的仅由天然核苷酸构成的扩增产物获得单克隆的克隆步骤;对通过克隆步骤获得的单克隆进行测序的测序步骤;以及基于单克隆的核苷酸序列中的识别位点的核苷酸序列,确定人工碱基在作为单克隆的模板的单链核酸分子的核苷酸序列上的位置的人工碱基位置确定步骤。
(27)根据(23)至(26)中任一项的方法,其中人工碱基选自由Ds、Pn、和Pa构成的组。
(28)根据(27)的方法,其中人工碱基包括人工碱基的人工碱基可配对衍生物。
(29)根据(23)至(28)中任一项的方法,其中构成单链核酸文库的单链核酸分子是DNA或RNA。
(30)根据(26)至(29)中任一项的方法,其中当单链核酸分子是RNA时,扩增步骤或第一至第三扩增步骤包括逆转录子步骤、DNA扩增子步骤、以及转录子步骤。
(31)一种药物组合物,其包括根据(1)至(5)中任一项的核酸适体和/或通过根据(16)至(22)中任一项的方法获得的核酸适体作为活性成分,并且在功能上抑制核酸适体的靶物质。
(32)一种用于血管内皮生长因子的功能性抑制的药物组合物,所述药物组合物包括根据(6)至(8)中任一项的核酸适体作为活性成分。
(33)一种用于干扰素γ的功能性抑制的药物组合物,所述药物组合物包括根据(9)至(11)中任一项的核酸适体作为活性成分。
(34)一种方法,包括使用根据(1)至(5)中任一项的核酸适体和/或通过根据(16)至(22)中任一项的方法获得的核酸适体以检测样品中核酸适体结合的靶物质。
(35)一种可复制的脱氧核酶或一种可转录的核酶,所述可复制的脱氧核酶或可转录的核酶包括未修饰的天然核糖核苷酸和具有人工碱基可配对的人工碱基的非天然核糖核苷酸。
(36)根据(35)的核酶,其中人工碱基选自由Ds、Pn、和Pa构成的组。
(37)根据(35)的核酶,其中人工碱基包括人工碱基的人工碱基可配对衍生物。
(38)一种用于核酸适体、脱氧核酶、或核酶制备的试剂盒,所述试剂盒包括根据(12)至(15)中任一项的单链核酸文库以及结合至引物结合区的引物组。
本说明书涵盖本申请的优先权所基于的日本专利申请号2011-253357和2012-148962的说明书和/或附图中描述的内容。
发明的有益效果
根据本发明的用于制备核酸适体的方法可有效地制备针对靶物质具有高特异性和结合活性的核酸适体、特别是DNA适体。
本发明的测序方法可以对选自单链核酸文库的可包括非天然核苷酸的单链核酸分子进行测序,尽管这种测序迄今尚未实现。
附图说明
图1是显示人工碱基的具体实例的图。
图2是显示构成单链核酸文库的单链核酸分子的结构的示意图。
图3显示了用于制备核酸适体的方法的工序流程。
图4显示了随机文库方法的工序流程。
图5显示了预测定方法(predetermination method)的工序流程。
图6-1显示了通过离子激流PGM(Ion Torrent PGM)分析的克隆及其编号的明细。在图中,带下划线的粗体表示识别位点。从识别位点预测的Ds的位置以小写字母“n”表示。
图6-2显示了通过离子激流PGM分析的克隆及其编号的明细。在图中,带下划线的粗体表示识别位点。从识别位点预测的Ds的位置以小写字母“n”表示。
图7显示了通过离子激流PGM获得的克隆中的基序比对(motif alignment)。“样品”列中括号内的数值表示读段(read)数(克隆数)。将识别位点加下划线。从识别位点预测的Ds的位置以粗体Ds表示。9条序列中与GGGDsTTGGNGGGGDsGTCGG(N表示任意的天然碱基)同源的序列以斜体表示。
图8显示了用于实施例2的SPR分析的全长DNA适体和对照序列(结合VEGF的DNA64)。带下划线的粗体表示识别序列。小写字母表示引物结合区。粗体表示Ds或替换为天然碱基的Ds的位点。T*=生物素-dT。结合VEGF的DNA64对应于对照序列。以粗斜体表示的序列区对应于用作选择中的竞争剂(Competitor)的序列。
图9显示了全长DNA适体的传感图。
图10显示了5轮后通过掺杂选择(doped selection)获得的28个克隆的核苷酸序列,其中核苷酸序列通过使用大肠杆菌(E.coli)的克隆方法被确定。在每一条核苷酸序列中,“D”表示“Ds”。
图11显示了5轮后通过掺杂选择获得的DNA的离子激流PGM分析结果。在横坐标中所示的核苷酸序列中,“D”表示“Ds”。
图12显示了全长和截短的DNA适体的传感图。
图13显示了与VEGF-165和其它蛋白质的相互作用的分析。
图14显示了8轮后通过随机选择获得的59个克隆的核苷酸序列,其中核苷酸序列通过使用大肠杆菌的克隆方法被确定。括号内的数值表示相同克隆的数目。在每一条克隆序列的随机区中,以粗体表示的碱基代表发现具有同源碱基中的单核苷酸突变的位点。该图还显示了用于人工碱基Ds的位置识别的5种类型的生物素化的探针(3′-探针序列-5′)。
图15显示了SPR传感图,显示了实施例8中所述的通过针对VEGF-165的第一轮SELEX获得的各个克隆的VEGF-165结合。图15A至15C显示了SPR传感图,其中注射了2.5nM、5nM、或10nM的VEGF-165。图15D显示了VG20Ds-57与多种蛋白质的结合的分析。每个传感图都针对与SPR结合的DNA片段的分子量、注射的蛋白质的分子量、以及SPR结合的固定的DNA片段的量(RU)被标准化。注射时间为480秒。解离时间为480秒。注射后930秒获得的值(时隔作为解离时间的450秒之后)示于表9。
图16A显示了通过针对VEGF-165的第二轮掺杂的SELEX获得的序列。45个碱基的部分被掺杂在通过4轮掺杂的SELEX获得的序列中前50条序列的选择中,并显示在图中。粗体表示从VG20的序列突变的碱基部分。
图16B显示了VGd1-2Ds-47的序列和预测的二级结构。在通过4轮掺杂选择获得的序列中,除了人工碱基之外的掺杂序列部分中表现出99%或更多和96%或更多的保持率(rate of retention)的碱基,分别以圆形和八角形表示。小写字母表示在选择期间源自引物区序列的碱基。
图17A显示了VGd1-2Ds-47和现有的抗-VEGF-165适体与各蛋白质结合的SPR分析结果。
图17B显示了多种VGd1-2Ds-47变体的预测的二级结构中的Ds的位置,及其针对VEGF-165的结合能力(KD)。
图18显示了SPR传感图,显示多种VGd1-2Ds-47变体的VEGF-165结合,其中注射了2.5nM(A)、5nM(B)、10nM(C)、或20nM(D)的VEGF-165。
图19显示了SPR传感图,显示了实施例11描述的通过针对IFN-γ的第一轮SELEX获得的各克隆的IFN-γ结合。图19A至19C显示了SPR传感图,其中注射了50nM、100nM、或150nM的IFN-γ。图19D显示了IF07bDs-57与多种蛋白质的结合的分析。每个传感图都针对与SPR结合的DNA片段的分子量、注射的蛋白质的分子量、及SPR结合的固定的DNA片段量(RU)被标准化。注射时间为480秒。解离时间为480秒。注射后930秒获得的值(时隔作为解离时间的450秒之后)示于表9。
图20A显示了通过针对IFN-γ的第二轮掺杂的SELEX获得的序列。45个碱基的部分被掺杂在通过4轮掺杂的SELEX获得的序列中前50条序列的选择中,并显示在图中。粗体表示从IF07b的序列突变的碱基部分。
图20B显示了IFd1-3Ds-49的序列和预测的二级结构。在通过4轮掺杂选择获得的序列中,除了人工碱基之外的掺杂序列部分中表现出99%或更多和96%或更多的保持率的碱基,分别以圆形和八角形表示。小写字母表示在选择期间源自引物区序列的碱基。
图21A显示了IFd1-3Ds-49和现有的抗-IFN-γ适体与各蛋白质结合的SPR分析结果。
图21B显示了多种IFd1-3Ds-49变体的预测的二级结构中的Ds的位置,及其针对IFN-γ的结合能力(KD)。
图22显示了SPR传感图,显示多种IFd1-3Ds-49变体的IFN-γ结合,其中注射了50nM(A)、100nM(B)、或150nM(C)的IFN-γ。
具体实施方式
1.核酸适体
1-1.概述
本发明的第一实施方案涉及核酸适体。本发明的核酸适体包括天然核苷酸和非天然核苷酸,并且可典型地相比通过常规方法获得的核酸适体可具有针对靶物质的更高的特异性和结合活性。
1-2.定义
在本说明书中使用的一般术语定义如下:
在本说明书中,通常,“核酸”或“核酸分子”是指由通过磷酸二酯键连接的核苷酸单元构成的生物聚合物。
在本说明书中,“天然核苷酸”是指天然存在的核苷酸。其实例包括包含具有天然碱基腺嘌呤、乌嘌呤、胞嘧啶、和胸腺嘧啶的任何一种的脱氧核糖核苷酸的DNA,包含具有天然碱基腺嘌呤、乌嘌呤、胞嘧啶、和尿嘧啶的任何一种的核糖核苷酸的RNA,及其组合。仅由天然核苷酸构成的核酸(分子)在本说明书中被称为天然核酸(分子)。
在本说明书中,“非天然核苷酸”是指由人工碱基构成的非天然存在的核苷酸。根据本发明,构成非天然核苷酸的磷酸基团和糖在结构上与天然核苷酸的那些相同。
在本说明书中,“人工碱基”是指具有类似于构成天然核苷酸的天然碱基的性质的人工构建的碱基类似物,并且可与其配偶碱基类似物形成如在天然碱基中的人工碱基配对(在本说明书中的下文中被称为“互补的人工碱基”)。在本说明书中,“人工碱基配对”是指在一对互补的人工碱基之间形成的碱基配对,如在一对互补的天然碱基腺嘌呤和胸腺嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶、或乌嘌呤和胞嘧啶之间形成的碱基配对。人工碱基配对包括在天然碱基之间的碱基配对中发现的经由氢键的化学键、人工碱基之间经由基于分子结构缔合的物理键、及经由疏水性相互作用的堆垛效应(stacking effect)。
人工碱基具有的“类似于天然碱基的性质”包括允许通过人工碱基配对的互补的核酸复制或转录(包括逆转录)的性质。人工碱基具有如在天然碱基中的人工碱基配对方面的专一选择性。因此,如果底物核苷酸中存在分别具有一对互补的人工碱基的非天然核苷酸,即使是包括非天然核苷酸的核酸分子,也与天然核苷酸一样,可通过人工碱基之间的互补被精确地复制或转录。尽管分子包括非天然核苷酸,但是这允许DNA分子通过核酸扩增方法诸如PCR被扩增,或允许RNA分子通过体外转录方法被扩增。
人工碱基的具体实例示于图1。图1a显示了Ds(7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基;在本说明书中称为“Ds”)。图1b显示了Pn(2-硝基吡咯-1-基;在本说明书中称作“Pn”)。图1c显示了Pa(2-甲酰基-1H-吡咯-1-基;在本说明书中称为“Pa”)。图1d显示了P(2-氨基-咪唑并[1,2-a]-1,3,5-三嗪-4(8H)-酮;在本说明书中称为“P”)。图1e显示了Z(6-氨基-5-硝基-2(1H)-吡啶酮;在本说明书中称为“Z”)。图1f显示了5SICS(6-甲基异喹啉-1(2H)-硫酮;在本说明书中称为“5SICS”)。图1g显示了NaM(3-甲氧基萘-2-基;在本说明书中称为“NaM”)。图1h显示了MMO2(2-甲氧基-4-甲基苯基;在本说明书中称为“MMO2”)。人工碱基Ds的互补人工碱基是Pn和Pa。P的互补人工碱基是Z。5SICS的互补人工碱基是NaM和MMO2。
在复制或转录过程中,在底物中不存在具有互补的人工碱基的非天然核苷酸的情况下,人工碱基可以转而与在结构和/或性质方面类似于互补的人工碱基的天然碱基配对。在这种情况下,复制或转录后,模板核酸分子中的非天然核苷酸被替换为天然核苷酸。例如,Ds已知被替换为A或T。
在本说明书中,“核酸适体”是指由核酸构成的适体,并且是指能够通过经由氢键等的单链核酸分子的二级结构以及另外的基于三级结构形成的构象牢固地并特异性地与靶物质结合,从而特异性地抑制或压制靶物质的功能(例如,生物活性)的配体分子。因此,核酸适体可作为靶物质功能的抑制剂。在本说明书中,“靶物质的功能性抑制”是指催化功能或基因表达控制功能(包括控制转录、翻译、转运、等)和/或生物功能诸如靶物质的细胞凋亡控制功能的抑制或压制。
核酸适体通常已知为仅由RNA构成的RNA适体和仅由DNA构成的DNA适体。在本说明书中,构成核酸适体的核酸并未被特别限制。核酸适体包括,例如,DNA适体、RNA适体、以及由DNA和RNA组合构成的适体。考虑到稳定性、化学合成所需的生产成本、及适体制备步骤的数目,DNA适体是更优选的。
在本说明书中,“靶物质”是指可以作为核酸适体、脱氧核酶、或核酶结合的靶的物质。靶物质未被其类型特别限制,只要靶物质是核酸分子可以结合的物质。其实例包括肽(寡肽和多肽)、核酸、脂质、糖类(包括糖链)、和低分子量化合物。靶物质优选地是肽,更优选地是多肽,即,蛋白质。可选地,靶物质可以是任何天然来源的物质、化学合成的物质、重组物质、等。
1-3.构成
本发明的核酸适体包括天然核苷酸和非天然核苷酸,并且由可转录或可复制的多核苷酸构成。
包含在本发明的核酸适体中的非天然核苷酸由人工碱基构成。人工碱基并未被其类型特别限制,只要人工碱基具有上述性质。其实例包括作为以上人工碱基的特定实例列出的人工碱基和稍后描述的人工碱基的衍生物。
本发明的核酸适体中的非天然核苷酸的含量可以是构成核酸适体的核苷酸总数的20%或更少、优选15%或更少、更优选10%或更少。通常,如果每个核酸适体具有1至20个非天然核苷酸,那么全长为100个或更少碱基的核酸适体可产生本发明的效果。
当每个核酸适体包含多个非天然核苷酸时,这些非天然核苷酸的人工碱基可以是相同的和/或不同的。当这些人工碱基不同时,应当注意的是,具有相同的互补人工碱基的两种或多种人工碱基彼此不共存于一个核酸适体中。这是因为原始人工碱基可在复制或转录过程中经由互补人工碱基替换为另一个人工碱基。例如,在包含分别具有Pn和Pa的非特异性核苷酸的核酸适体中,Pn和Pa的位置可在复制过程中经由它们的互补人工碱基Ds被另一个替换。
构成本发明的核酸适体的非天然核苷酸的碱基可以是以上示例的人工碱基的衍生物。“人工碱基的衍生物”是指源自人工碱基的由不同的原子团或不同的官能团部分取代的碱基类似物,并保留了人工碱基与互补的人工碱基的互补性。
人工碱基Ds的衍生物的实例包括由下式(1)表示的Ds衍生物:
[式1]
其中R和R′各自独立地表示由下式(2)表示的任何部分:
[式2]
其中,n1=2至10;n2=1或3;n3=1、6、或9;n4=1或3;n5=3或6;R1=Phe(苯丙氨酸)、Tyr(酪氨酸)、Trp(色氨酸)、His(组氨酸)、Ser(丝氨酸)、或Lys(赖氨酸);且R2、R3、和R4分别=Leu(亮氨酸)、Leu、和Leu,或分别为Trp、Phe、和Pro(脯氨酸)。
Pn的衍生物的实例包括由下式(3)表示的人工碱基衍生物:
[式3]
其中R代表由下式(4)表示的任何部分:
[式4]
其中n1=1或3;n2=2至10;n3=1、6、或9;n4=1或3;n5=3或6;R1=Phe、Tyr、Trp、His、Ser、或Lys;且R2、R3、和R4分别=Leu、Leu、和Leu,或分别为Trp、Phe、和Pro。
Pa的衍生物的实例包括由下式(5)表示的人工碱基衍生物:
[式5]
其中R代表由下式(6)表示的任何部分:
[式6]
其中n1=1或3;n2=2至10;n3=1、6、或9;n4=1或3;n5=3或6;R1=Phe、Tyr、Trp、His、Ser、或Lys;且R2、R3、和R4分别=Leu、Leu、和Leu,或分别为Trp、Phe、和Pro。
衍生物是与互补人工碱基可配对以实现核酸复制或转录(包括逆转录)的人工碱基。
一些构成本发明的核酸适体的天然核苷酸可被修饰。在此上下文中,“修饰”是指构成核酸或其组分核苷的一些或全部核苷酸单元被不同的原子团或不同的官能团取代。其具体实例包括糖修饰、碱基修饰、和磷酸修饰。
糖修饰是指构成核苷的核糖部分的修饰。其实例包括构成核糖核苷的核糖部分的修饰,其是2′-羟基基团的取代。具体地,此类修饰对应于例如,通过甲氧基基团取代羟基基团形成2′-O-甲基核糖、通过乙氧基基团取代羟基基团形成2′-O-乙基核糖、通过丙氧基基团取代羟基基团形成2′-O-丙基核糖、通过丁氧基基团取代羟基基团形成2′-O-丁基核糖、通过氟代基团取代羟基基团形成2′-脱氧-2′-氟核糖、或通过2′-O-甲氧基-乙基基团取代羟基基团形成2′-O-甲氧基乙基核糖。其替代实例包括核苷的(脱氧)核糖部分被不同的糖取代。具体地,此类取代对应于例如,通过阿拉伯糖、2′-氟-β-D-阿拉伯糖取代核糖部分,其中核糖的2′-羟基基团和4′-碳原子通过亚甲基交联的核糖衍生物,或其中核糖环中的4′-氧被硫取代的核糖衍生物。可选地,此类取代包括呋喃核糖环上的氧原子(核糖的4′-氧原子)被硫取代。
“碱基修饰”是指构成核苷的碱基部分的修饰。其实例包括通过官能团取代碱基部分、将官能团添加至碱基部分、和通过碱基类似物取代碱基部分。具体地,此修饰的碱基对应于例如,修饰的嘧啶诸如通过甲基基团取代胞嘧啶的位置5形成的5-甲基胞嘧啶、通过羟基基团取代胞嘧啶的位置5形成的5-羟基胞嘧啶、通过氟代基团取代尿嘧啶的位置5形成的5-氟尿嘧啶、通过硫代基团取代尿嘧啶的4-氧原子形成的4-硫尿嘧啶、通过甲基基团取代尿嘧啶的位置5形成的5-甲基尿嘧啶、以及通过硫代基团取代尿嘧啶的2-氧原子形成的2-硫尿嘧啶,修饰的嘌呤诸如通过甲基基团取代腺嘌呤的位置6形成的6-甲基腺嘌呤、以及通过硫代基团取代乌嘌呤的位置6形成的6-硫乌嘌呤,或其它杂环碱基。
本发明的适体的碱基长度没有限制,且优选在10至100个碱基的范围内、更优选在15至80个碱基的范围内。
本发明的核酸适体由天然和非天然核苷酸构成,且如仅由天然核苷酸构成的多核苷酸,可被复制或转录(或逆转录)。这是因为,如上所述,由非天然核苷酸携带的人工碱基可通过其与互补的人工碱基的配对的人工碱基的互补性,在核酸适体的复制或转录中发挥类似于天然碱基的功能。因此,核酸适体可通过常规的核酸扩增方法或体外转录方法被克隆。
1-4.制备方法
包括非天然核苷酸的本发明的核酸适体,因为由非天然核苷酸携带的人工碱基具有上述性质,可通过在核酸扩增步骤中将分别具有一对互补的人工碱基的非天然核苷酸添加至底物核苷酸,通过预定的制备步骤从单链核酸文库中制备。在下文中,将描述用于制备根据本发明的核酸适体的方法。
1-4-1.单链核酸文库
在本说明书中,“单链核酸文库”是指由包括核酸适体的候选分子的多个相同和/或不同的单链核酸分子构成的库(pool)。然而,单链核酸文库,可包括单链核酸分子中的全部或一些碱基与另一个单链核酸分子中的全部或一些碱基配对形成的双链分子。
本发明的单链核酸文库全部或部分地由含有非天然核苷酸的单链核酸分子构成。
在本说明书中,“含有非天然核苷酸的单链核酸分子”是指包括天然核苷酸和非天然核苷酸的单链核酸分子。非天然核苷酸可以是上述提及的保留了人工碱基与互补的人工碱基的互补性的人工碱基的衍生物。
含有非天然核苷酸的单链核酸分子中的非天然核苷酸的含量为构成核酸分子的核苷酸总数的20%或更少、优选15%或更少、更优选10%或更少。当含有非天然核苷酸的单链核酸分子包括多种非天然核苷酸时,这些非天然核苷酸的人工碱基可以是相同的和/或不同的。含有非天然核苷酸的单链核酸分子可以含有,例如,分别具有与彼此互补的一对不同的人工碱基例如Ds和Pn、Ds衍生物和Pn、Ds衍生物和Pn衍生物、Ds和Pa、Ds衍生物和Pa、或DS衍生物和Pa衍生物的非天然核苷酸。当这些人工碱基不同时,应当注意的是,具有相同的互补人工碱基的两种或多种人工碱基彼此不共存于一个核酸分子中。这是因为原始人工碱基可在复制或转录过程中经由互补人工碱基替换为另一个人工碱基。例如,在包含分别具有Pa和Pn的非特异性核苷酸的含有非天然核苷酸的单链核酸分子中,Pa和Pn的位置可在复制过程中经由它们的互补人工碱基Ds被另一个替换。
构成单链核酸文库的单链核酸分子可以是单链DNA分子或单链RNA分子。由单链DNA分子构成的单链核酸文库被用于通过根据本发明的用于制备核酸适体的方法制备DNA适体,而由单链RNA分子构成的单链核酸文库被用于通过根据本发明的方法制备RNA适体。
构成单链核酸文库的单链核酸分子可以具有图2中所示的一级结构(primarystructure)。如图2A和2B中所示,所有单链核酸分子各自都包括引物结合的5′-末端和3′-末端引物结合区(201和203),以及位于这两个引物结合区之间的中心区(202)。
引物结合区由天然核苷酸、非天然核苷酸、或其组合构成。
引物结合区各自长度都为15至40个碱基。中心区长度为20至80个碱基。因此,构成单链核酸文库的单链核酸分子具有从50至160个碱基范围的碱基长度。
5′-末端和3′-末端引物结合区各自由构成单链核酸文库的单链核酸分子中共有的已知核苷酸序列组成。5′-末端引物结合区(201)包括与正向引物(204)匹配的核苷酸序列,而3′-末端引物结合区(203)包括与反向引物(205)互补的核苷酸序列。优选的是:每个引物的核苷酸序列应为在引物分子中几乎不会形成二级结构的序列,和/或在正向引物和反向引物之间不会通过碱基配对形成连续的双链区的序列;每个引物应具有40℃至80℃、45℃至75℃、或50℃至65℃范围内的Tm值;两个引物不应在Tm值中差异较大;且每个引物应具有40%至60%或45%至55%的GC含量。
中心区(202)完全或部分地由随机核苷酸序列或特定核苷酸序列构成。
通常,中心区的全部核苷酸序列是随机核苷酸序列(以斜线表示的202)。特别地,为了在根据本发明的用于制备核酸适体的方法中的第一轮中使用单链核酸文库,随机核苷酸序列还被优选用于扩大核酸适体的选择。在这种情况下,单链核酸文库可包括在中心区不具有非天然核苷酸的单链核酸分子。这是因为包括含有非天然核苷酸的单链核酸分子并且还包括不含非天然核苷酸的单链核酸分子的此类单链核酸文库,对用于制备核酸适体的方法的目标作出更大的贡献,因为在根据本发明的制备核酸适体的方法中使用该文库可产生仅由天然核苷酸构成的核酸适体,其比本发明的包括非天然核苷酸的核酸适体更牢固地与靶物质结合。
中心区可由“特定核苷酸序列”组成。特定核苷酸序列是指,例如,置于预定的选择压力下的单链核酸分子的核苷酸序列。在此上下文中,“置于预定的选择压力下的单链核酸分子”对应于,例如,构成本发明的包括重复步骤的制备方法中的重复步骤(其将在后面描述)之后的单链核酸文库的单链核酸分子。
单链核酸文库的一种形式可包括具有部分地由随机核苷酸序列构成的中心区的单链核酸分子。具有“部分地由随机核苷酸序列构成的中心区”的单链核酸分子的实例包括其中特定的核苷酸序列被定位在中心区的核苷酸序列的预定位点处且其它碱基是随机的单链核酸分子,和/或其中在预定位点处的碱基由人工碱基构成且其它碱基是随机的单链核酸分子。其具体实例包括含有非天然核苷酸的单链核酸分子,其包括如图2B中所示的在中心区的至少一端的识别位点(206)。“识别位点”(206)是指被设置在中心区以便在引物结合区的侧翼并具有预定的核苷酸序列的位点。该识别位点由1至10个、优选1至8个、更优选1至5个具有天然碱基的天然核苷酸构成。识别位点的核苷酸序列与关于预先设置在中心区的核苷酸序列上的特定位置处的一个或多个人工碱基(207)的位置信息相关。短语“与关于人工碱基的位置信息相关”是指行使指示引入中心区的预定位置处的人工碱基的位置的标签序列的功能。例如,当设置在中心区的5’端的识别位点具有核苷酸序列AG时,该识别位点可指示从中心区的5’端起计数的第10个碱基是Ds。由于识别位点由天然核苷酸构成并包括如上所述的在引物结合区侧翼的已知核苷酸序列,其核苷酸序列即使在扩增步骤后也被保持,并可行使标签序列的功能。关于人工碱基的位置信息可根据识别位点中碱基的数目、其核苷酸序列、设置在5′端和/或3′端的识别位点的位置、或其组合被无限地设置(set)。因此,1个或2个或多个人工碱基可被设置在中心区。包括此类含有非天然核苷酸的单链核酸分子的单链核酸文库在随后描述的用于对单链核酸分子进行测序的方法的一种形式中是有用的。
单链核酸文库可根据本领域已知的方法适当地制备。其实例包括用于使用例如核酸合成仪通过化学合成制备单链核酸文库的方法。具体地,单链DNA文库可使用DNA合成仪制备。在这种情况下,设计的核苷酸序列可被输入到合成程序中,以根据该程序获得目的单链核酸文库。例如,预定的核苷酸序列可被输入其中用于引物结合区,而随机核苷酸序列可被编程用于中心区。在这方面,可将一种或多种非天然核苷酸添加至4种天然核苷酸作为核酸合成的底物,以获得包含含有非天然核苷酸(引入的非天然核苷酸)的单链核酸分子的单链核酸文库。
同样,包括具有部分地由随机核苷酸序列构成的中心区的单链核酸分子的单链核酸文库,可以以与上述相同的方式,通过将引物结合区和中心区的预定位置(例如,识别位点和其相关的人工碱基引入位置)处的预定碱基输入程序,并将中心区的其它位点处的随机核苷酸序列输入合成程序来制备。
构成单链核酸文库的每个核酸分子的合成可外包给每个生命科学的制造商(lifescience manufacturer)。
在包括随后描述的重复步骤的用于制备核酸适体的方法中,用于第2轮或以后的单链核酸文库可基于紧邻重复步骤之前的一轮中获得的单链核酸分子来制备。
由于单链核酸文库是包括核酸适体候选物的文库,通常,构成单链核酸文库的每个单链核酸分子都具有通过自我折叠形成的构象。
1-4-2.制备步骤
图3显示了根据本发明的用于制备核酸适体的方法的工序流程。如该图所示,根据本发明用于制备核酸适体的方法包括作为必要步骤的复合物形成步骤(301)、复合物回收步骤(302)、单链核酸分子回收步骤(303)、扩增步骤(304)、以及核酸适体制备步骤(305)。根据本发明用于制备核酸适体的方法还可包括作为任选步骤的重复步骤(306)。在制备DNA适体作为核酸适体的情况下,复合物回收步骤(302)包括固定子步骤(307)。在制备RNA适体作为核酸适体的情况下,扩增步骤(304)包括逆转录子步骤(308)、DNA扩增子步骤(309)、以及转录子步骤(310)。
原则上,用于制备核酸适体的方法基于常规的体外选择方法,称为SELEX(指数富集的配体系统进化)(WO1991019813;WO1994008050;Lauhon C.T.和Szostak J.W.,1995,J.Am.Chem.Soc.,117:1246-1257;Zhao X.,等人,2006,Nucleic Acids Res.,34:3755-3761;Fan X.,等人,2004,J.T.Lis,101:6934-6939;和Jeong S.,等人,2010,Oligonucleotides,20:155-161)。特别地,RNA适体可根据常规的SELEX方法制备。然而,常规的SELEX方法,采用以下作为用于在复合物回收步骤中回收复合物的方法:(1)涉及通过使用疏水性相互作用将蛋白质诱捕至硝酸纤维素膜作为靶物质,从而回收复合物的方法、(2)涉及基于在凝胶电泳期间凝胶上的迁移率变动回收复合物的方法、或(3)涉及将靶物质预先固定在载体或类似物上并将所得载体与DNA文库混合的方法。因此,在DNA适体的制备中,方法(1)的问题是比RNA更具疏水性的DNA,其自身被非特异性地吸附至硝酸纤维素膜;方法(2)的问题是由多种类型的不同序列构成的DNA文库倾向于产生干扰的条带;以及方法(3)的问题是甚至获得仅与固相载体结合的DNA。
因此,由本发明人开发的改良版的SELEX被用于根据本发明制备核酸适体的方法。这使得归因于非特异性吸附的背景的最小化以及制备非常牢固并且特异性地与靶物质结合的核酸适体特别是DNA适体成为可能。
在下文中,以上步骤和子步骤的每一个都将被具体描述。
(1)复合物形成步骤
“复合物形成步骤”(301)是指将单链核酸文库与靶物质在溶液中混合以形成单链核酸分子与靶物质的复合物的步骤。
在该步骤中,“复合物”是指通过构成单链核酸文库的每个单链核酸分子,特别地,作为核酸适体候选物的单链核酸分子和靶物质之间的结合形成的核酸-靶物质复合物。
在该步骤中使用的溶液未被其类型或性质特别限制,只要溶液允许核酸和靶物质之间的复合物的形成。水或水溶液是优选的。水溶液可具有5.0至9.0、优选6.0至8.0、更优选6.5至7.6范围的pH。其盐浓度可在依据终浓度的20mM至500mM、优选50mM至300mM、更优选90mM至180mM的范围内。水溶液优选是缓冲液。缓冲液是例如适于以上的pH范围(例如,磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液、tris-HCl缓冲液、或HEPES缓冲液),并含有以以上范围内的最终盐浓度添加的适当的盐(例如,NaCl或CH3COOK)的pH缓冲溶液。其具体实例包括PBS缓冲液(1.1mM KH2PO4、155mM NaCl、以及3mM Na2HPO4,pH 7.4)。pH缓冲液的组成可基于例如,Sambrook,J.等人,(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual第三版,ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York中描述的本领域已知的构成,根据需要进行细微调整。
如果需要,溶液还可包含还原剂或表面活性剂。
还原剂的实例包括二硫苏糖醇(DTT)和2-巯基乙醇。溶液中的还原剂可具有从0.5mM至10mM、优选1mM至5mM范围的终浓度。
表面活性剂优选是非离子表面活性剂。其实例包括Nonidet P40(NO-40)、TritonX-100、Triton X-114、Brij-35、Brij-58、吐温-20、吐温-40、吐温-60、吐温-80、正-辛基-β-葡萄糖苷、MEGA-8、MEGA-9、和MEGA-10。溶液中的表面活性剂可具有依据体积/体积(V/V)的从0.005%至0.1%、优选0.01%至0.08%范围的终浓度。
在该步骤中使用的溶液还可包含竞争性物质。在本说明书中,“竞争性物质”是指与作为核酸适体候选物的单链核酸分子竞争结合靶物质的物质。含有竞争性物质的溶液允许制备更牢固地与靶物质结合的核酸适体。竞争性物质未被其类型特别限制,只要物质可与单链核酸分子竞争结合靶物质。其实例包括核酸、肽、脂质、糖、和低分子量化合物。竞争性物质优选为在性质方面类似于用作目的核酸适体的单链核酸分子的物质,例如,与单链核酸酸分子结合的相同的靶物质上位点结合的物质。此类物质对应于具有类似于目的单链核酸分子的核苷酸序列的核酸分子(单链核酸分子和/或双链核酸分子)。具体地,当靶物质是例如转录调节因子,竞争性物质对应于例如,该转录调节因子原始结合的基因组序列上的核苷酸序列。用作竞争性物质的该核酸分子被设计为以便不具有构成单链核酸文库的单链核酸分子共有的引物结合区(201和203),并因此制备的核酸分子不能在随后描述的扩增步骤(304)中被扩增并因此即使竞争性物质与靶物质形成复合物,其也可以从样品中被去除。
为了形成复合物,单链核酸文库与靶物质可以以9∶1至1∶9、优选1∶1(体积∶体积)的比被混合,并在4℃至40℃、优选15℃至37℃范围的温度下温育5分钟至30分钟或更长时间,例如,约10分钟至约1小时、优选约20分钟至约40分钟。
形成的复合物可在随后的复合物回收步骤(302)之前被洗涤。这是因为溶液中未与靶物质复合的处于游离状态的单链核酸分子,可通过洗涤被去除或减少,从而进一步减少归因于游离的单链核酸分子的非特异性结合的背景。可基于靶物质的类型和复合物的分子大小或特征,使用本领域已知的方法进行复合物的洗涤。当靶物质是例如蛋白质时,可使用根据分子大小仅允许核酸通过的超滤膜将复合物与游离的单链核酸分开。用于洗涤的缓冲液可具有与用于复合物形成的缓冲液相同的组成。用于洗涤的缓冲液,与用于复合物形成的缓冲液一样,也可包含还原剂或表面活性剂。还原剂或表面活性剂的浓度或组成,可以与用于复合物形成的缓冲液的浓度或组成相同。当然,即使在这个阶段游离的单链核酸未被去除或不能被完全去除,剩余的游离单链核酸,还可通过在随后的复合物回收步骤(302)或在单链核酸分子回收步骤(303)中的洗涤操作被去除。因此,如果需要,可进行洗涤。
(2)复合物回收步骤
“复合物回收步骤”(302)是指前述步骤之后从溶液中回收复合物的步骤。
关于RNA适体的制备,在该步骤中的回收,可根据常规的SELEX方法(WO1991019813;WO1994008050;Lauhon C.T.和Szostak J.W.,同上;Zhao X.,等人,同上;Fan X.等人,同上;和Jeong S.,等人,同上)执行。然而,常规的SELEX方法,存在以上的与制备DNA适体中的该步骤相关的问题。因此,在根据本发明用于制备核酸适体的方法中,复合物优选地通过基于由本发明人开发的改良版本的SELEX的复合物回收步骤回收。
基于改良版本的SELEX的复合物回收步骤包括将复合物形成步骤之后的溶液与固相载体混合以将复合物固定在固相载体上的固定子步骤(307)。
(2-1)固定子步骤
“固定子步骤”(307)是指将复合物形成步骤之后的溶液与固相载体混合以将复合物固定在固相载体上的子步骤。
在本发明中,“固相载体”是指呈固体状态的载体,并包括例如,磁珠、高分子量多糖支持体(support)、二氧化硅、玻璃、金属、塑料、陶瓷、天然或合成树脂、以及其组合。固相载体优选具有亲水性表面。在这种情况下,固相载体本身可以是亲水的,或可以是其表面通过亲水性包被处理的疏水性载体。载体未被其形状特别限制。具有球形或近球形形状的颗粒诸如珠子,具有大的结合表面面积并且还具有高的可操作性,并如此,被特别优选作为该子步骤中的固相载体的形状。
在该子步骤中,“固定”是指复合物与固相载体的偶合。复合物经由吸附至靶物质和/或固相载体的连接子(connector)被固定至固相载体。
在本说明书中,“连接子”是指介导靶物质与固相载体偶合的分子。连接子可包括单个分子以及彼此连接的两个或多个不同的分子,只要作为结果连接子可介导靶物质与固相载体之间的偶合。连接子的具体实例包括生物素和亲和素或链霉亲和素连接子、凝集素-生物素(与生物素结合的凝集素)和亲和素、链霉亲和素、或NeutrAvidin连接子,由至少一种单独的抗体组成的连接子、以及由抗体和蛋白质A、G、或L组成的连接子。
连接子被吸附至靶物质或固相载体、或两者。在此上下文中,“吸附”是指通过化学吸附、物理吸附、和/或亲和力将连接子固定在靶物质或固相载体上。在此上下文中,化学吸附包括化学键诸如共价键、离子键、和氢键。物理吸附包括电荷相互作用、范德华相互作用、疏水相互作用、或CH-π相互作用。
当连接子仅被吸附在靶物质或固相载体上时,该连接子能够特异性识别并结合到连接子未吸附的另一侧的物质上。例如,吸附在固相载体上的连接子特异性识别并与靶物质结合。更具体地,例如,当抗体或抗体结合蛋白质A(antibody-bound protein A)被吸附在固相载体上作为连接子时,抗体特异性识别并与靶物质结合。因此,靶物质和固相载体在溶液中混合,从而经由连接子将靶物质偶合至固相载体。复合物形成步骤之后,部分或全部靶物质已与作为核酸适体候选物的单链核酸分子复合。因此,该步骤可将复合物固定在固相载体上。
当连接子被吸附在靶物质和固相载体的每一个上时,它们的连接子(在下文中,为方便起见,吸附在靶物质上的连接子被称为“第一连接子”,而吸附在固相载体上的连接子被称为“第二连接子”)能够彼此特异性结合。例如,生物素可被吸附在靶物质上作为第一连接子,而亲和素、链霉亲和素、或NeutrAvidin可被吸附在固相载体上作为第二连接子。在这种情况下,靶物质和固相载体在溶液中混合,从而允许生物素与亲和素、链霉亲和素、或NeutrAvidin的彼此特异性结合。结果,靶物质经由生物素和亲和素、链霉亲和素、或NeutrAvidin之间的结合偶合到固相载体上。
连接子可通过取决于靶物质、固相载体、和/或连接子的类型的不同方法被吸附在靶物质或固相载体上。连接子可根据其类型或目的通过本领域已知的方法被适当地吸附。将连接子吸附至任何靶物质和固相载体,优选通过防止复合物由于在该子步骤和随后的回收步骤中的操作被轻易解离的方法进行。
当靶物质或固相载体具有官能团时,示例性的吸附方法可包括,例如,使用具有能够与该官能团共价结合的活性官能团(例如,醛基、羧基、磺基、氨基、硫醇基、氰基、或硝基)的连接子,或具有引入其中的以经由通过两个官能团之间的化学反应诸如亲核加成反应、亲核取代反应、或亲电取代反应形成的共价键将连接子吸附在靶物质或固相载体上的此活性官能团的连接子。用于允许官能团通过化学反应彼此共价结合的方法是本领域熟知的技术。在例如将靶蛋白质吸附至生物素连接子的情况下,使用N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)等将活性酯基引入生物素。然后,可在蛋白质中的氨基和酯基之间形成酰胺键,从而将蛋白质吸附至生物素上。多种生物素酰化试剂从各制造商是商购可得的,且可被用于将生物素吸附在靶物质上。
当靶物质是抗原且第一连接子是特异性识别并与该抗原中的表位结合的抗体时,可在适当的溶液中将抗原和抗体彼此接触,从而通过亲和结合将第一连接子吸附在靶物质上。
在复合物形成步骤之后和该子步骤之前的适当时间将连接子吸附至靶物质,且可通过以上描述的任何吸附方法,使用例如复合物形成步骤之后获得的含有复合物的溶液将连接子吸附至靶物质。可选地,可至少在该子步骤中将含有复合物的溶液与固相载体混合之前通过任何吸附方法将连接子吸附至固相载体。具体地,在将例如作为第一连接子的生物素吸附至作为靶物质的蛋白质并将作为第二连接子的链霉亲和素吸附至作为固相载体的磁珠的情况下,可根据例如随附的操作说明使用商购可得的生物素酰化试剂,并且同样使用复合物形成步骤之后获得的含有复合物的溶液,将生物素吸附至蛋白质。同样,可独立于复合物形成步骤,使用本领域已知的方法将链霉亲和素预先吸附至磁珠。例如,可将具有甲苯磺酰基或环氧基的磁珠仅与链霉亲和素混合,从而经由基团和链霉亲和素中的伯氨基(primary amino group)之间的共价键,将链霉亲和素直接吸附于其上。可选地,具有羧基的磁珠可通过碳二亚胺被活化,从而经由活化的羧基和链霉亲和素中的伯氨基之间的共价键,将链霉亲和素吸附于其上。这些方法是本领域熟知的。
固定子步骤之后,形成的复合物可使用基于固相载体的特征的方法以固定复合物的固相载体的形式从溶液中回收。固相载体的特征是指固相载体特有的性质,诸如磁力、比重、荧光、发光,或亲和力。当固相载体例如为磁珠时,固定复合物的固相载体使用磁体从溶液中回收,且然后使用具有与用于复合物形成步骤的缓冲液相同组成的缓冲液洗涤,以洗去非特异性吸附至固相载体的靶物质或单链核酸。以这种方式,固定复合物的固相载体可被回收。可选地,当固相载体是高分子量多糖支持体、二氧化硅、金属、或玻璃时,固定复合物的固相载体通过离心被沉淀。去除上清液之后,还可以用缓冲液洗涤沉淀物,从而回收固定复合物的固相载体。当固相载体为例如携带荧光材料的高分子量多糖支持体时,固定复合物的固相载体可使用荧光检测器诸如FACS被回收。
呈游离状态的未复合的靶物质在该子步骤中可被固定在固相载体上。然而,此类未复合的靶物质也可在随后描述的扩增步骤中被去除,该扩增步骤包括从复合物中去除靶物质以回收单链核酸,并因此,不是特别重要。
(3)单链核酸分子回收步骤
“单链核酸分子回收步骤”(303)是指从回收的复合物中回收单链核酸分子的步骤。
单链核酸分子可根据本领域已知的用于从复合物中回收核酸的方法回收。这种方法通常取决于与其复合的靶物质的类型而不同。当靶物质例如是肽诸如蛋白质时,目的单链核酸分子可根据蛋白质变性方法诸如碱法或苯酚/氯仿法通过蛋白质的凝结和去除被回收。可选地,当靶物质例如是脂质或低分子量化合物时,将洗脱缓冲液添加至复合物,其随后被热处理以破坏核酸的结构、或热处理并以螯合剂补充洗脱缓冲液或将洗脱缓冲液转变为结合缓冲液的pH以破坏核酸的结构。因此,由靶物质与核酸之间的结合的解离获得的单链核酸分子可通过醇沉淀法等被回收。
当复合物回收步骤(302)包括固定子步骤时,如果需要,复合物以固定复合物的固相载体的形式被回收,并因此被洗脱。洗脱方法取决于连接子的类型而不同。当连接子例如是抗体时,固定复合物的固相载体可通过酸处理等被解离,并且然后如果需要通过加入碱被中和,从而从固定复合物的固相载体洗脱复合物。可选地,当连接子是生物素和亲和素、链霉亲和素、或NeutrAvidin时,固定复合物的固相载体可在含有7M或更高浓度的尿素和/或2M或更高浓度的β-巯基乙醇的溶液中经热处理以解离生物素和亲和素、链霉亲和素、或NeutrAvidin之间的结合,并从而从其中洗脱复合物。当靶物质是糖基化的物质且连接子是凝集素时,复合物可通过添加糖诸如葡萄糖被洗脱。这些方法可根据本领域已知的方法适当地进行。随后从洗脱的复合物中回收单链核酸分子通过如上所述的方法进行。
用于该步骤中的洗涤的缓冲液可具有与用于复合物形成步骤中的缓冲液相同的组成。如果需要,缓冲液还可以包含还原剂诸如DTT或2-巯基乙醇或非离子表面活性剂诸如Nonidet P40(NO-40)、Triton X-100、或吐温-20。溶液中的表面活性剂可具有依据体积/体积(V/V)从0.005%至0.1%或0.01%至0.08%范围的终浓度。洗涤可使用缓冲液进行1至数次,且优选进行2至3次。洗涤温度和洗涤时间未被特别限制,且可以为15℃至50℃或20℃至40℃持续10分钟至1小时。
(4)扩增步骤
“扩增步骤”(304)是指通过核酸扩增方法扩增在单链核酸分子回收步骤中回收的单链核酸分子的步骤。
“核酸扩增方法”是指使用引物和酶诸如聚合酶,模板核酸借以被扩增的方法。
该步骤在待被制备为核酸适体的DNA适体和RNA适体之间某种程度上不同。具体地,仅DNA扩增子步骤(309)满足DNA适体的需要,而DNA扩增子步骤(309)及逆转录子步骤(308)和转录子步骤(310)是RNA适体所需要的。
(4-1)DNA扩增子步骤
“DNA扩增子步骤”(309)是指用于制备DNA适体的方法和制备RNA适体的方法的扩增步骤之间共有的子步骤。该子步骤使用引物和酶诸如DNA聚合酶复制并扩增模板DNA(包括cDNA)中的特定区域。在该子步骤中使用的DNA扩增方法可以是本领域已知的任何方法。其实例包括聚合酶链式反应(PCR)和等温的和嵌合引物起始的核酸扩增(ICAN)。PCR是优选的。
反应中使用的DNA聚合酶取决于使用的核酸扩增方法被适当地确定。通常,使用热稳定DNA聚合酶。此类热稳定核酸聚合酶从各制造商诸如Takara Bio Inc.、New EnglandBiolabs Inc.、Life Technologies Corp.、F.Hoffmann-La Roche Ltd.、或Promega Corp.作为多种类型是商购可得的,并且可被用于本发明。
DNA扩增方法的反应条件可考虑待被扩增的多核苷酸长度、用于模板的DNA的量、引物的Tm值、使用的DNA聚合酶的最适反应温度和最适pH等被确定。例如,对于PCR,与构成单链核酸分子的5′-末端引物结合区(201)匹配的序列可被用作正向引物(204),而与3′-末端引物结合区(203)互补的序列可被用作反向引物(205)。在这种情况下,标记有标记物的反向引物是方便的,因为在扩增反应之后可基于标记物从反应溶液中选择性分离并纯化双链核酸作为各种扩增产物,并且然后双链核酸中与目的单链核酸互补的另一个单链核酸可基于标记物被分离并去除。
对于该子步骤,要注意的点是用于DNA扩增,即DNA复制的底物的组成。在普通DNA扩增方法中,4种天然脱氧核糖核苷酸(dATP、dGTP、dCTP、和dTTP;下文中,这些被统称为“dNTP”)被用作底物。然而,在该子步骤中,这些dNTP以及非天然脱氧核糖核苷酸和具有由核苷酸携带的人工碱基的互补人工碱基的非天然脱氧核糖核苷酸被用作底物。使用的非天然脱氧核糖核苷酸取决于在该制备方法中使用的单链核酸文库中包含的含有非天然核苷酸的单链核酸分子中包含的非天然核苷酸。当单链核酸文库包括例如具有Ds的含有非天然核苷酸的单链DNA分子时,在该子步骤中使用的底物为除了dNTP之外,分别具有Ds和其互补人工碱基Pn或Pa的非天然脱氧核糖核苷酸。如上文提到的,本文所用的人工碱基具有类似于天然碱基的性质,并从而允许通过人工碱基配对的互补的核酸复制或转录(包括逆转录)。因此,将分别具有一对互补的人工碱基的非天然核苷酸添加至底物核苷酸,允许即使是包括非天然核苷酸的DNA分子通过DNA扩增方法被扩增。
对于涉及3个步骤(变性、退火、和延伸)的PCR,每个步骤的温度和反应时间可以是,例如,对于热变性步骤的90℃至98℃持续约30秒至约1分钟、对于退火步骤的50℃至60℃持续约30秒至约1分钟、以及对于延伸步骤的70℃至75℃持续约40秒至约2分钟。循环数通常可以是10个循环至40个循环。15个循环至20个循环是优选的。
如果需要,通过该子步骤获得的扩增的DNA可以被纯化。纯化方法可以是本领域已知的任何方法。其实例包括乙醇沉淀法和使用旋转型凝胶过滤柱(spin-type gelfiltration column)的纯化方法。
(4-2)逆转录子步骤
“逆转录子步骤”(308)是不同于用于制备RNA适体的方法的扩增步骤的子步骤。该子步骤使用引物和酶诸如逆转录聚合酶,以RNA作为模板形成cDNA。在用于制备RNA适体的方法中,该子步骤在DNA扩增子步骤(309)之前进行。
在该子步骤中使用的逆转录方法可以是本领域已知的任何方法。该逆转录可以根据例如,Sambrook,J.等人,1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual第二版,ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York中描述的逆转录方法进行。
在该子步骤中,要注意的点是在逆转录反应中使用的底物的组成。在普通逆转录反应中,如在DNA扩增子步骤,dNTP被用作底物。然而,在该子步骤中,这些dNTP以及具有由在模板RNA分子中包含的非天然核糖核苷酸携带的人工碱基的非天然脱氧核糖核苷酸,和具有其互补人工碱基的非天然脱氧核糖核苷酸被用作底物。使用的非天然脱氧核糖核苷酸取决于该制备方法中使用的单链核酸文库中包含的含有非天然核苷酸的单链核酸分子中包含的非天然核苷酸。当单链核酸文库包括例如具有Ds的含有非天然核苷酸的单链RNA分子时,在该子步骤中使用的底物是除了dNTP之外,分别具有Ds和其互补人工碱基Pn或Pa的非天然脱氧核糖核苷酸。如上文提到的,本文所用的人工碱基允许通过人工碱基配对的互补的核酸逆转录。因此,将分别具有一对互补的人工碱基的非天然核苷酸添加至底物核苷酸,允许cDNA分子从即使是包含非天然核苷酸的RNA分子的形成。
通过该子步骤获得的cDNA经受DNA扩增子步骤(309)。
(4-3)转录子步骤
“转录子步骤”(310)是不同于用于制备RNA适体的方法的扩增步骤的子步骤。该子步骤使用引物和酶诸如RNA聚合酶,从DNA转录RNA。在用于制备RNA适体的方法中,该子步骤在DNA扩增子步骤之后进行。
在该子步骤中使用的转录方法可以是本领域已知的任何方法。其实例包括体外RNA转录方法。可选地,表达诱导处理可使用转化有DNA的大肠杆菌或类似物的转化子通过本领域已知的技术来进行,并且目的RNA可从转化子中回收。这些转录方法可以根据,例如,Sambrook,J.等人,1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual第二版,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York中描述的转录方法具体地进行。
对于该子步骤,要注意的点是转录反应中使用的底物的组成。在普通转录反应中,4种天然核糖核苷酸(ATP、GTP、CTP、和UTP;下文中,这些被统称为“NTP”)被用作底物。然而,在该子步骤中,这些NTP以及具有由DNA分子中包含的非天然脱氧核糖核苷酸携带的人工碱基的非天然核糖核苷酸,和具有其互补人工碱基的非天然核糖核苷酸被用作底物。使用的非天然核糖核苷酸取决于在该制备方法中使用的单链核酸文库中包含的含有非天然核苷酸的单链核酸分子中包含的非天然核苷酸。当单链核酸文库包括例如具有Ds的含有非天然核苷酸的单链DNA分子时,在该子步骤中使用的底物是除了NTP之外,分别具有Pn或Pa(Ds的互补人工碱基)的非天然核糖核苷酸。如上文提到的,本文所用的人工碱基允许通过人工碱基配对的互补的核酸逆转录。因此,将分别具有一对互补的人工碱基的非天然核苷酸添加至底物核苷酸,允许RNA分子从即使是包含非天然核苷酸的DNA分子转录。
(5)核酸适体制备步骤
“核酸适体制备步骤”(305)是指从通过扩增步骤获得的核酸分子制备核酸适体的步骤。
当在扩增步骤之后的核酸分子是DNA时,由于与靶物质特异性结合的单链核酸分子(核酸适体)与具有与其互补的核苷酸序列的另一个单链核酸分子的碱基配对,该核酸分子通常被发现呈双链核酸的形式。当核酸分子是RNA时,该核酸分子作为单链核酸分子被获得,但并不总是形成本发明的核酸适体的结构。因此,在该步骤中,从双链核酸(当核酸分子是DNA时)制备的单链,或获得的单链核酸分子(当核酸分子是RNA时)自我折叠以制备本发明的具有针对靶物质的结合活性的核酸适体。
当核酸分子是DNA时,双链核酸通常通过热变性被制备为单链。热变性可以在从60℃至90℃范围的温度下进行。该变性中使用的溶液可包含1M至7M尿素。然后,使用变性凝胶进行电泳。具有目的大小的条带从凝胶中被洗脱以纯化单链。本领域已知的此方法或与其等效的方法可实现从双链制备单链及其纯化。
因此,从双链核酸制备的单链核酸是能够形成目的核酸适体的单链核酸分子和具有与其互补的核苷酸序列的其配偶单链核酸分子的混合物。因此,在该步骤中,具有互补核苷酸序列的非必要的单链核酸分子可以在形成目的核酸适体的单链核酸分子的自我折叠之前被分离并去除。目的单链核酸分子的选择性分离可通过使用,例如上文提到的标记有标记物的反向引物实现。具体地,在使用例如生物素标记的反向引物的PCR之后,反应溶液中的每个扩增的双链核酸通过乙醇沉淀法等被回收。然后,将链霉亲和素添加至悬浮液,以形成生物素-链霉亲和素复合物,随后双链核酸借以被分离并纯化。然后,纯化的双链核酸被变性成单链,其继而取决于链之间的迁移率差异通过变性凝胶电泳被分级。目的单链核酸分子可从凝胶中被分离并纯化。
例如,为了自我折叠单链核酸分子,单链核酸分子可经受加热-冷却处理。作为具体实例,单链核酸分子可被溶解在复合物形成步骤中使用的缓冲液中(例如,PBS缓冲液),然后在80℃至98℃、优选在85℃至95℃,持续30秒至5分钟、优选30秒至3分钟热变性,并且然后置于例如室温下以缓慢冷却或阶段(in stages)冷却以形成分子内构象。可进行阶段冷却,例如,热变性后在50℃至70℃暂时冷却约1分钟至约20分钟,并且然后在降低到15℃至35℃的温度下进一步冷却。
该步骤可制备与靶物质特异性结合的本发明的核酸适体。
(6)重复步骤
“重复步骤”(306)是指使用核酸适体制备步骤中制备的核酸适体或作为其候选物的单链核酸分子的新的单链核酸文库,将从复合物形成步骤至核酸适体制备步骤的过程(在下文中,该系列步骤在本说明书中被称为“轮”)新重复一次或多次的步骤。
该步骤是可选的步骤。然而,优选进行一轮或多轮该步骤,用于缩小核酸适体制备步骤之后具有针对靶物质的较高特异性的核酸适体的范围。具体地,例如,进行一轮或多轮、优选1至15轮、1至8轮、或1至5轮。
在该步骤的每一轮中,通常,紧临前一轮的核酸适体制备步骤中获得的单链核酸分子库被用作在复合物形成步骤中使用的新的单链核酸文库。根据需要,用于每轮中使用的单链核酸文库可被置于与初始条件相同或不同的单独步骤,即,复合物形成步骤至核酸适体制备步骤的条件下。轮之间不同条件的实例包括每一轮中使用的溶液或缓冲液组成的变化。具体地,在前期的轮中,在温和洗涤条件下使用缓冲液获得较大量的核酸适体候选物。在后期的轮中,更牢固地与靶物质结合的单链核酸分子可在严格洗涤条件下使用与约3M尿素混合的缓冲液分离。可选地,复合物形成步骤中的靶物质以及单链核酸文库的浓度可在轮之间变化。例如,靶物质与单链核酸文库的浓度可随着每轮被降低以使得复合物形成条件更为严格。结果,更牢固地与靶物质结合的核酸适体可被分离。
2.测序方法
本发明的第二个实施方案涉及用于对选自单链核酸文库的单链核酸分子进行测序的方法。
通过根据第一实施方案的用于制备核酸适体的方法获得的核酸适体需要进行测序,以用于通过化学合成的大规模制备。具有相同核苷酸序列的单克隆是测序所必需的。然而,通过制备步骤获得的核酸适体可包括多个不同的核酸适体克隆。因此,必须从制备的核酸适体中制备此类单克隆。由天然核苷酸构成的常规核酸适体可通过本领域已知的普通核酸克隆技术制备成单克隆,并随后测序,即使获得的核酸适体为多个不同的克隆。具体地,示例性方法包括将获得的核酸适体的各个克隆插入到合适的克隆载体,其然后被转移至大肠杆菌或类似物中,分离单克隆作为转化子,且然后通过循环测序反应等对单克隆进行测序。
本发明的核酸适体包括具有人工碱基的非天然核苷酸。用于对包含非天然核苷酸的核酸分子进行测序的方法本身在本领域中是技术上已知的(Hirao I.,等人,NatureMethods,3,729-735(2006);和Kimoto M.,等人,Nucleic Acids Res.,37,e14(2009))。然而,如同仅由天然核苷酸构成的常规核酸分子,该方法需要制备包含非天然核苷酸的核酸分子的单克隆。然而,本发明的包含非天然核苷酸的核酸适体,不能通过常规克隆技术被制备成单克隆,因为此类非天然核苷酸并非体内存在于大肠杆菌或类似物中。因此,用于对可包含非天然核苷酸的、选自由单克隆或多个不同的克隆构成的单链核酸文库的单链核酸分子进行测序的方法尚未建立。
此时,本发明人已经开发了两种新的方法,即,随机文库方法和预测定方法,作为用于对可包含非天然核苷酸的、选自单链核酸文库的单链核酸分子进行测序的方法。使用这些方法可对通过用于制备核酸适体的方法获得的核酸适体进行测序。在下文中,将描述每一种方法。
2-1.随机文库方法
“随机文库方法”是用于对选自本发明的单链核酸文库的单链核酸分子进行测序的方法。由该方法针对的单链核酸分子具有由可包含非天然核苷酸的随机核苷酸序列构成的中心区(202)(示于图2A)。
图4显示了随机文库方法的工序流程。如该图所示,随机文库方法包括:第一扩增步骤(401)、克隆步骤(402)、第二扩增步骤(403)、单链核酸分子分离步骤(404)、和测序步骤(405)作为必要步骤。在这些步骤中,第二扩增步骤(403)独立于第一扩增步骤(401)和克隆步骤(402)。因此,第二扩增步骤(403),可在第一次扩增步骤(401)之前、克隆步骤(402)之后进行,或与第一扩增步骤(401)和克隆步骤(402)平行进行。在下文中,将具体描述每一个步骤。
(1)第一扩增步骤
“第一扩增步骤”(401)是指以天然核苷酸作为底物,通过核酸扩增方法扩增选自单链核酸文库的单链核酸分子的步骤。
该步骤的基本程序遵循第一实施方案的“1-4.制备方法”中的“1-4-2.制备步骤(4)扩增步骤”中描述的程序。具体地,在该步骤中,选自单链核酸文库的单链核酸分子通过本领域已知的核酸扩增方法被扩增。当待被测序的单链核酸分子是DNA时,该步骤仅包括DNA扩增子步骤,且在RNA待被测序的情况下,该步骤包括逆转录子步骤、DNA扩增子步骤、和转录子步骤。
此处,关于与上文提到的第一实施方案的“1-4-2.制备步骤(4)扩增步骤”中相同方法的描述将被省略,且将仅具体描述不同点。
如上所述,选自本发明的单链核酸文库的单链核酸分子具有图2中显示的结构。由于5′-末端和3′-末端引物结合区(201和203)各自由已知的核苷酸序列组成,单链核酸分子可使用包括正向引物(204)和反向引物(205)的引物组通过核酸扩增方法被扩增。
该步骤的特征在于,在核酸扩增方法中仅天然核苷酸被用作底物,即使待被测序的单链核酸分子包括非天然核苷酸。这意味着:在DNA扩增子步骤中,仅dNTP被用作DNA复制的底物;在逆转录子步骤中,仅dNTP被用作用于从RNA逆转录的底物;且在转录子步骤中,仅NTP被用作用于从DNA的RNA转录的底物。如上所述,在底物中不存在具有互补人工碱基的非天然核苷酸的情况下,在复制或转录过程中,人工碱基可转而与在结构和/或性质方面与互补人工碱基类似的天然碱基配对,使得非天然核苷酸被替换为天然核苷酸。因此,该步骤产生仅由天然核苷酸构成的单链核酸分子作为扩增产物,即使待被测序的单链核酸分子是含有非天然核苷酸的单链核酸分子。
(2)克隆步骤
“克隆步骤”(402)是指由第一扩增步骤获得的扩增产物获得单克隆的步骤。
如上所述,由第一扩增步骤获得的每个扩增产物仅由天然核苷酸构成。因此,即使是选自单链核酸文库的单链核酸分子的多个不同的克隆,也可通过本领域已知的普通核酸克隆技术被制备成单克隆。示例性方法包括将获得的核酸适体的各个克隆插入合适的克隆载体,其然后被转移至大肠杆菌或类似物中,并分离单克隆作为转化子。此克隆方法可以根据,例如,Sambrook,J.等人,1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual第二版,ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York中描述的方法进行。可选地,各种克隆试剂盒等从各制造商是商购可得的,并可被用于本发明。
(3)第二扩增步骤
“第二扩增步骤”(403)是指以天然核苷酸和非天然核苷酸作为底物,使用结合至引物结合区的引物组,通过核酸扩增方法扩增选择的单链核酸分子的步骤。
与第一扩增步骤一样,该步骤的基本程序也遵循第一实施方案中“1-4.制备方法”中的“1-4-2.制备步骤(4)扩增步骤”中描述的程序。具体地,在该步骤中,选自单链核酸文库的单链核酸分子通过本领域已知的核酸扩增方法被扩增。当待被测序的单链核酸分子是DNA时,该步骤仅包括DNA扩增子步骤,且在RNA待被测序的情况下,该步骤包括逆转录子步骤、DNA扩增子步骤、和转录子步骤。
第二扩增步骤与第一扩增步骤的不同点在于,第一扩增步骤的核酸扩增方法中仅使用天然核苷酸作为底物,而在该步骤中,天然核苷酸和非天然核苷酸被用作底物以扩增选择的单链核酸分子。因此,该步骤可被视为更接近于在第一实施方案的“1-4-2.制备步骤(4)扩增步骤”中描述的程序的方法。
根据本发明的单链核酸文库中包含的含有非天然核苷酸的单链核酸分子中包含的非天然核苷酸,该非天然核苷酸和其配偶非天然核苷酸与天然核苷酸一起被用作底物。因此,当单链核酸分子是含有非天然核苷酸的单链核酸分子时,该步骤产生含有非天然核苷酸的单链核酸分子作为扩增产物。
(4)单链核酸分子分离步骤
“单链核酸分子分离步骤”(404)是指使用克隆步骤中获得的单克隆作为探针,从通过第二扩增步骤获得的扩增产物分离单个单链核酸分子的步骤。
该步骤首先包括将克隆步骤中获得的单克隆制备为探针。
当单链核酸文库是DNA文库时,单克隆通常作为双链DNA被获得。因此,将该双链DNA制备成单链。将双链DNA制备成单链通常通过热变性进行。热变性可以在从60℃至90℃范围的温度下进行。在该变性中使用的溶液可包含1M至7M尿素。然后,使用变性凝胶进行电泳。具有目的大小的条带从凝胶中被洗脱以纯化单链。本领域已知的此方法或与其等效的方法可以实现单链从双链DNA的制备及其纯化。
随后,两条DNA链中的一条被分离作为探针。可使用编码核酸适体的正义链或具有与其互补的核苷酸序列的反义链。反义链是优选的。上述方法可被用于分离两条DNA链中的一条。其具体实例包括涉及以标记物标记正向引物和反向引物中的任一个,并基于标记物分离并纯化一条DNA链作为探针的方法。具体地,例如,为了分离反义链,使用生物素标记的反向引物在PCR之后的反应溶液中的每一个扩增的双链DNA,通过乙醇沉淀法等被回收。然后,将链霉亲和素添加至悬浮液中,以形成双链核酸随后借以被分离并纯化的生物素-链霉亲和素复合物。然后,将纯化的双链核酸变性成单链,其继而取决于链之间迁移率的差异通过变性凝胶电泳被分级。目的反义链可从凝胶中被分离并纯化。
当单链核酸文库是RNA文库时,单克隆作为单链RNA被获得。尽管如此,该单链RNA不能被用作探针,因为通过第二扩增步骤获得的扩增产物也是未与其形成互补关系的单链RNA。此外,出现的另一个问题是RNA自身是不稳定的并且容易降解。因此,在克隆步骤中作为单克隆获得的RNA可临时逆转录成双链DNA,其继而以如上述相同的方式被制备成单链并被纯化。逆转录反应可按照逆转录子步骤中描述的方法进行。
随后,由此制得的源自单克隆的单链核酸被用作探针,以从通过第二扩增步骤获得的扩增产物分离单一的单链核酸分子。使用相同单链核酸文库作为模板,通过第一扩增步骤和第二扩增步骤获得的扩增产物,可包括源自相同单链核酸分子的扩增产物。通常,源自相同分子的这些扩增产物具有相同的核苷酸序列。然而,在含有非天然核苷酸的单链核酸分子的情况下,第一扩增步骤的扩增产物具有代替非天然核苷酸的天然核苷酸。因此,尽管源自相同的单链核酸分子,扩增产物的核苷酸序列不同。然而,扩增产物作为整体在其核苷酸序列中是非常高度同源的。因此,即使单链核酸文库包括多个不同的单链核酸分子,该单链核酸分子是含有非天然核苷酸的单链核酸分子,单克隆可通过使用通过从第一扩增步骤的扩增产物的克隆步骤获得的单克隆作为探针,以足够的量被分离作为测序样品。该步骤基于此类原理。
单一的单链核酸分子可通过本领域已知的方法使用制备的探针从第二扩增步骤的扩增产物中被分离。该分离可根据,例如,Sambrook,J.等人,1989,Molecular Cloning:ALaboratory Manual第二版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,New York中描述的方法进行。为了更有效的分离,可将探针固定在固相载体上,并与第二扩增步骤的扩增产物中的目的单链核酸分子杂交,随后为分离。可使用第一实施方案的“1-4.制备方法”中的“1-4-2.制备步骤(2)复合物回收步骤”中描述的方法进行将探针固定至固相载体和目的单链核酸分子的分离。
无论是仅由天然核苷酸构成的单链核酸分子,或是由含有非天然核苷酸的单链核苷酸构成的单链核酸分子,该步骤可分离待被测序的单链核酸分子作为单克隆。
(5)测序步骤
“测序步骤”(405)是指对通过单链核酸分子分离步骤分离的源自单克隆的单链核酸分子进行测序的步骤。
本领域已知的测序方法可被用于该步骤。用于对包括具有人工碱基的非天然核苷酸的DNA进行测序的方法是本领域技术上已知的。该测序可根据,例如,Hirao I.,等人,Nature Methods,3,729-735(2006);和Kimoto M.,等人,Nucleic Acids Res.,37,e14(2009)中描述的方法进行。该测序方法也可确定仅由天然核苷酸构成的常规DNA分子的核苷酸序列,并且如此,无论是含有非天然核苷酸的单链核酸分子或是仅由天然核苷酸组成的核酸适体,可确定通过单链核酸分子分离步骤分离的源自单克隆的单链核酸分子的序列。
可包含非天然核苷酸的、选自单链核酸文库的单链核酸分子,可通过这些步骤被测序,虽然此类测序手段迄今还未实现。
2-2.预测定方法
“预测定方法”是指用于对选自由含有非天然核苷酸的单链核酸分子构成的单链核酸文库的单链核酸分子进行测序的方法,所述每个含有非天然核苷酸的单链核酸分子都具有识别位点并仅在预定的特定位置处包括非天然核苷酸。构成该单链核酸文库的每个含有非天然核苷酸的单链核酸分子中的识别位点由天然核苷酸构成。识别位点的核苷酸序列与关于单链核酸分子中中心区的核苷酸序列上预定的人工碱基的位置信息相关。该方法包括用仅由天然核苷酸构成的单链核酸分子替换含有非天然核苷酸的单链核酸分子、通过常规技术制备单克隆、对单克隆进行测序、且然后基于识别位点的核苷酸序列确定天然核苷酸替换的具有人工碱基的非天然核苷酸的位置以对目的含有非天然核苷酸的单链核酸分子进行测序。
图5显示了预测定方法的工序流程。如该图所示,预测定方法包括第三扩增步骤(501)、克隆步骤(502)、测序步骤(503)、以及人工碱基位置确定步骤(504)作为必要步骤。在下文中,将具体描述每一个步骤。
(1)第三扩增步骤
“第三扩增步骤”(501)是指以天然核苷酸作为底物,使用结合至引物结合区的引物组,通过核酸扩增方法扩增选择的含有非天然核苷酸的单链核酸分子的步骤。
该步骤的基本程序遵循第一实施方案的“1-4.制备方法”中的“1-4-2.制备步骤(4)扩增步骤”中描述的程序。具体地,在该步骤中,选自单链核酸文库的含有非天然核苷酸的单链核酸分子,通过本领域已知的核酸扩增方法被扩增。当待被测序的单链核酸分子是DNA时,该步骤仅包括DNA扩增子步骤,且在RNA待被测序的情况下,该步骤可包括逆转录子步骤、DNA扩增子步骤、和转录子步骤。
该方法中待被测序的所有单链核酸分子是含有非天然核苷酸的单链核酸分子。然而,如随机文库方法的第一扩增步骤,在该步骤中,只有天然核苷酸被用作核酸扩增方法中的底物。这意味着,在DNA扩增子步骤中,仅dNTP被用作DNA复制的底物;在逆转录子步骤中,仅dNTP被用作从RNA逆转录的底物;及在转录子步骤中,仅NTP被用作用于从DNA的RNA转录的底物。结果,在扩增反应过程期间,非天然核苷酸被替换为天然核苷酸,使得仅由天然核苷酸构成的单链核酸分子被获得作为扩增产物,即使待被测序的单链核酸分子是含有非天然核苷酸的单链核酸分子。
(2)克隆步骤
“克隆步骤”(502)是指获得来自通过扩增步骤获得的仅由天然核苷酸构成的扩增产物的单克隆的步骤。
如上所述,通过第三扩增步骤获得的每个扩增产物仅由天然核苷酸构成。因此,由于替换为天然核苷酸,即使是选自单链核酸文库的含有非天然核苷酸的单链核酸分子的多个不同克隆,也可通过本领域已知的普通核酸克隆技术被制备成单克隆。示例性方法包括将获得的核酸适体的各个克隆插入合适的克隆载体,其然后被转移至大肠杆菌或类似物中,并分离单克隆作为转化子。此克隆方法可根据,例如,Sambrook,J.等人,1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual第二版,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,New York中描述的方法进行。可选地,各种克隆试剂盒等从各制造商是商购可得的,并可被用于本发明。
(3)测序步骤
“测序步骤”(503)是指对通过克隆步骤获得的单克隆进行测序的步骤。该步骤可根据本领域已知的技术进行。例如,从单克隆的转化子制备的单克隆可通过本领域已知的技术经由循环测序反应等进行测序。具体地,示例性的方法可包括通过本领域已知的技术例如小量制备方法(mini-preparation method)从单克隆的转化子制备DNA,随后使用商购可得的试剂盒诸如Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit(Applied BiosystemsInc.)和测序仪测序。
(4)人工碱基位置确定步骤
“人工碱基位置确定步骤”(504)是指基于单克隆的核苷酸序列中的识别位点的核苷酸序列,确定人工碱基在用于单克隆的模板的单链核酸分子的核苷酸序列上的位置的步骤。
通过测序步骤确定的单链核酸分子的核苷酸序列是仅由4种天然碱基(A、T、G、和C)构成的核苷酸序列。由于在该方法的第三扩增步骤中测序的所有单链核酸分子是含有非天然核苷酸的单链核酸分子,人工碱基被设置在实际核苷酸序列中中心区的特定位置处。在该步骤中,基于测序步骤之后单链核酸分子的核苷酸序列中的识别位点的核苷酸序列,在第三扩增步骤中核苷酸序列上被替换为天然碱基的碱基被修改为原始的人工碱基,以确定测序的含有非天然核苷酸的单链核酸分子的实际核苷酸序列。
识别位点被设置在中心区的末端位点处,以便在含有非天然核苷酸的单链核酸分子的5′-末端和/或3′-末端引物结合区的侧翼,并具有预定的核苷酸序列。同样,由天然核苷酸构成的其核苷酸序列,从第三扩增步骤至测序步骤被保持没有改变。此外,识别位点的核苷酸序列与关于中心区的核苷酸序列上预定的人工碱基的位置信息相关。因此,识别位点的核苷酸序列的确定可必然地揭示人工碱基被设置或已被设置在单链核酸分子的中心区的什么位置。
3.抗血管内皮生长因子核酸适体
本发明的第三实施方案涉及抗血管内皮生长因子(下文简称为“VEGF”)核酸适体。
VEGF行使血管生成因子的功能。这种生长因子已知为年龄相关性黄斑变性(AMD)的致病物(causative agent)。年龄相关性黄斑变性是引起严重症状诸如成人中下降的视觉功能(visual performance)或后天性失明(acquired blindness)的进行性视网膜疾病(progressive retinal disease)。该病已被发现由于其临床病症随着视网膜中血管生成的进展而恶化而变得严重(Martin A.等人,2003,Medicinal Research Reviews,第23卷,第2期:117-145;和Ferris III,F.L.等人,1984,Archives of Ophthalmology,第102卷,第11期:1640-1642)。
本发明的抗-VEGF核酸适体是与作为靶物质的VEGF牢固地并特异性地结合以压制VEGF的血管生成功能的包含含有非天然核苷酸的单链DNA分子的DNA适体(在下文中,该DNA适体被称为“抗-VEGF DNA适体”)。本发明的抗-VEGF DNA适体通过根据第一实施方案用于制备核酸适体的方法制备,并通过根据第二实施方案的随机文库方法或预测定方法测序。
本发明的抗-VEGF DNA适体包括选自由以下构成的组的任何一个核苷酸序列:SEQID NO:25至73、80至104、106至109、111、和155至166(只要序列中的“n”表示Ds)、175、177、179、181、183、198、201、202、205至209、211、212、和229至278。由SEQ ID NO:25至73、80至104、106至109、111、和155至166(只要序列中的“n”表示Ds)、198、201、202、205至209、211、和212中任一条表示的区主要对应于图2所示的本发明的核酸适体中的中心区(202)。因此,包括5′侧翼为SEQ ID NO:1表示的核苷酸序列且3′侧翼为SEQ ID NO:2表示的核苷酸序列的这些核苷酸序列的每一个的核酸适体,还优选作为本发明的抗-VEGF DNA适体。
4.抗干扰素-γ核酸适体
本发明的第四实施方案涉及抗干扰素-γ(在下文简称为“IFN-γ”)核酸适体。
本发明的抗-IFN-γ核酸适体是牢固地并特异性地结合作为靶物质的IFN-γ以压制IFN-γ的诱导细胞毒性T细胞活性的包含含有非天然核苷酸的单链DNA分子的DNA适体(在下文中,该DNA适体被称为“抗-IFN-γDNA适体”)。本发明的抗-IFN-γDNA适体通过根据第一实施方案用于制备核酸适体的方法制备,并通过根据第二实施方案的预测定方法测序。
本发明的抗-IFN-γDNA适体包括选自由以下构成的组的任何一个核苷酸序列:SEQ ID NO:167至174(只要序列中的“n”表示Ds)、186、188、190、192、194、214至222、和279至328。
5.药物组合物
本发明的第五实施方案涉及药物组合物。
5-1.构成
本发明的药物组合物包括第三实施方案中描述的靶物质功能的至少一种抑制剂。本发明的药物组合物还可包含药学上可接受的载体。“药学上可接受的载体”是指通常用于药物配制领域中并且被添加而不会抑制或压制药物组合物的作用的物质,以便于药物组合物的配制或其向生物体的应用并维持靶物质功能的抑制剂的作用。载体的实例包括赋形剂、粘合剂、崩解剂、填充剂、乳化剂、流控制添加剂(flow control additive)、润滑剂、和表面活性剂。
“赋形剂”的实例包括糖类诸如单糖、二糖、环糊精、和多糖(具体包括,但不限于,葡萄糖、蔗糖、乳糖、棉子糖、甘露醇、山梨醇、肌醇、糊精、麦芽糊精、淀粉、和纤维素),金属盐类(例如,磷酸钠或磷酸钙、硫酸钙、和硫酸镁),柠檬酸,酒石酸,甘氨酸,低分子量聚乙二醇(PEG)、中分子量聚乙二醇(PEG)、或高分子量聚乙二醇(PEG),普朗尼克,以及其组合。
“粘合剂”的实例包括包含玉米、小麦、大米、或马铃薯淀粉的淀粉胶、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷酮、及其组合。
“崩解剂”的实例包括上述的淀粉、羧甲基淀粉、交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、海藻酸(alginic acid)或海藻酸钠(sodium alginate)、及其盐。
“填充剂”的实例包括上述的糖、磷酸钙(例如,磷酸三钙或磷酸氢钙)、及其组合。
“乳化剂”的实例包括山梨糖醇酐脂肪酸酯、甘油脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯、和丙二醇脂肪酸酯。
“流控制添加剂”和“润滑剂”的实例包括硅酸盐、滑石、硬脂酸盐、和聚乙二醇。
这些载体可根据需要适当使用。除了以上描述的添加剂,本发明的药物组合物还可包含任选的添加剂诸如矫正剂(corrigent)、增溶剂、悬浮剂、稀释剂、表面活性剂、稳定剂,吸收促进剂(例如,季铵盐和月桂基硫酸钠)、膨胀剂、润湿剂、保湿剂(例如,甘油和淀粉)、吸附剂(例如,淀粉、乳糖、高岭土、膨润土、和胶体硅酸)、崩解抑制剂(例如,蔗糖(saccharose)、硬脂精、可可脂、以及氢化油)、被膜剂(coating agent)、着色剂、防腐剂、抗氧化剂、香料、调味剂、甜味剂、和缓冲剂。
“表面活性剂”对应于,例如,碱金属盐、碱土金属盐、以及木素磺酸、萘磺酸、苯酚磺酸、或二丁基萘磺酸的铵盐、烷基芳基磺酸盐、烷基硫酸盐、烷基磺酸盐、脂肪醇硫酸盐/酯、脂肪酸及硫酸化脂肪醇乙二醇醚、磺化萘或萘衍生物与甲醛的缩合物、萘或萘磺酸、苯酚与甲醛的缩合物、聚氧乙烯辛基酚醚、乙氧基化异辛基酚、辛基酚、壬基酚、烷基苯基聚乙二醇醚、三丁基苯基聚乙二醇醚、三硬脂酰苯基聚乙二醇醚、烷基芳基聚醚醇、醇和脂肪醇/环氧乙烷缩合物、乙氧基化蓖麻油、聚氧乙烯烷基醚、乙氧基化聚氧丙烯、月桂醇聚乙二醇醚缩醛、山梨醇酯、木素亚硫酸盐废液(lignosulfite waste liquor)、和甲基纤维素。
该实施方案的药物组合物可包含每药物组合物一种或多种这些载体。
本发明的药物组合物还可包含另外的药物,而不消除本发明的核酸的药理作用。本发明的药物组合物可包含例如,预定量的抗生素。
本发明的药物组合物未被其剂型特别限制,只要该形式不会使活性成分失活且体内施用后可发挥药理作用。剂型通常取决于施用方法和/或处方条件而不同。
适于口服施用的剂型的实例可包括固体制品(preparation)(包括片剂、丸剂、舌下制品、胶囊、滴剂、和锭剂)、颗粒剂、粉剂、散剂、和液体制品。如果需要,固体制品可以以本领域已知的包衣剂型被制备,例如,制备为糖衣片剂、明胶包衣片剂、肠溶包衣片剂、薄膜包衣片剂、双层片剂、或多层片剂。
胃肠外施用细分为全身施用和局部施用。局部施用被进一步细分为间质施用、经表皮施用、经粘膜施用、和经直肠施用。药物组合物还可以以适于每种施用方法的剂型被制备。适于全身或间质施用的剂型的实例包括为液体制品的注射剂。适于经表皮施用或经粘膜施用的剂型的实例可包括液体制品(包括搽剂、滴眼剂、滴鼻剂、和吸入剂)、混悬剂(包括乳剂和乳膏)、粉剂(dust)(包括滴鼻剂和吸入剂)、糊剂、凝胶剂、软膏剂(ointment)、和硬膏剂(plaster)。适于经直肠施用的剂型的实例可包括栓剂。
在将药物施用至植物的情况下,药物组合物的剂型的实例包括液体、固体(包括半固体)、及其组合。在这种情况下,药物组合物可被制备为溶液、油分散体、乳剂、混悬剂、粉剂、散剂、糊剂、凝胶剂、丸剂、片剂、和颗粒剂。
这些剂型未被其特定形状或尺寸特别限制,并可具有落在关于本领域已知的各种剂型接受的范围内的任何形状或尺寸。
5-2.制备方法
通常,本发明的药物组合物可通过应用本领域已知的配制方法来制备。参见例如,Remington′s Pharmaceutical Sciences(Merck Publishing Co.,Easton,Pa.)中描述的方法。
例如,注射剂可通过本领域常规使用的方法制备,该方法包括将第二实施方案的核酸分子溶解在药学上可接受的溶剂中,并且如果需要,将药学上可接受的载体添加至所得溶液。
“药学上可接受的溶剂”的实例包括水、乙醇、丙二醇、乙氧基化异硬脂醇、多氧化异硬脂醇(polyoxygenated isostearyl alcohol)、和聚乙二醇山梨醇酐脂肪酸酯。期望地,此溶剂被灭菌,并且如果需要,优选被调节至与血液等渗。
5-3.施用方法
该实施方案的药物组合物可以以治疗或预防目的疾病等药学上有效量被使用至生物体。受体(recipient)生物体是脊椎动物、优选哺乳动物、更优选人。
本发明的药物组合物可被全身性或局部施用。可根据例如,疾病的类型、发作部位、或进展的程度选择合适的途径。对于其发作定位在部位(localized to a site)的疾病,优选为局部施用,其中本发明的药物组合物通过注射或类似方法被直接施用至发作部位及其邻近部位。这是因为本发明的核酸分子可以以足够的量被递送到待被治疗的部位(组织或器官),对其它组织几乎没有影响。对于其待被治疗的部位未能被鉴定的疾病或发作是全身性的疾病,优选为通过静脉注射等的全身性施用,然而施用途径不限于其。这是因为本发明的核酸分子可经由血流遍及身体分布,并从而被递送至甚至通过诊断未能发现的病变部位(lesion)。
本发明的药物组合物可通过任何适合的方法被施用,而不会使活性成分失活。例如,可进行任何肠胃外(例如,注射剂、气雾剂、敷用剂(application)、滴眼剂、和滴鼻剂)和口服施用。优选为注射。
在通过注射施用的情况下,注射部位没有特别限制。注射部位可以是其中作为活性成分的核酸分子可与靶物质结合从而压制其功能的任何部位。其实例包括静脉内注射、动脉内注射、肝内注射、肌内注射、关节内注射、髓内注射、椎管内注射、心室内注射、经肺注射、经皮注射、皮下注射、皮内注射、腹腔内注射、鼻内注射、肠内注射、和舌下注射。优选为血管内注射诸如静脉内注射或动脉内注射。这是因为,如上所述,本发明的药物组合物可经由血流遍及身体分布,并且还因为该注射是相对低侵入性的。
6.用于检测靶物质的方法
本发明的第六实施方案涉及用于使用根据第一实施方案的核酸适体检测靶物质的方法。
6-1.构成
根据第一实施方案的核酸适体能够非常牢固地并特异性地与核酸分子的靶物质结合。存在于样品中的靶物质因此可通过使用核酸分子的该性质被检测。
检测方法自身可以是本领域已知的任何检测方法,只要该方法是基于根据第一实施方案的核酸适体与靶物质之间的结合。例如,可使用SPR法、石英晶体微天平法、比浊法、比色法、或荧光法。
SPR(表面等离子体共振)是指其中薄金属膜被激光束照射,反射光的强度在特定入射角(共振角)时显着减弱的现象。SPR方法是基于该现象的测定方法,并且能够高度灵敏地测定吸附在作为传感器部分的薄金属膜表面的物质。例如,在本发明中,第一实施方案的核酸适体被预先固定在薄金属膜的表面。将样品流经薄金属膜表面,以允许靶物质与核酸分子结合。可检测样品流经之前和之后吸附在金属表面的物质中所产生的差异,从而检测样品中的靶物质。SPR方法诸如位移法和间接竞争法是已知的,其任何一个都可被用于本发明。
石英晶体微天平(QCM)法是指使用其中石英晶体的共振频率根据附着至石英晶体的电极表面吸附的物质的质量降低的现象的方法。基于该方法的QCM传感器可根据石英晶体的共振频率中的变化的量,定量地捕获痕量的吸附的物质。在本发明中,如同SPR方法,核酸分子被预先固定在电极表面。将样品与电极表面接触。样品中的靶物质可从由核酸分子与靶物质之间的结合导致的石英晶体的共振频率中的变化的量被定量检测出。该技术是本领域熟知的。参见例如,Christopher J.,等人(2005),Self-Assembled Monolayers of aForm of Nanotechnology,Chemical Review,105:1103-1169。
比浊法是指包括以下的方法:以光照射溶液、并使用色度仪等光学测量通过浮动在溶液中的物质的光散射或透过溶液的光的减弱,以确定溶液中的物质的量。在本发明中,可在将第一实施方案的核酸适体添加至样品之前和之后测量吸光度,从而定量检测样品中的靶物质。
可选地,靶物质可通过联合使用针对靶物质的抗体来检测。例如,可使用基于夹心ELISA(Sandwich ELISA)的方法。该方法包括首先将第一实施方案的核酸适体固定在固相载体上,并其次将样品添加至其中,以允许核酸分子与存在于样品中的靶物质结合。随后,将样品洗脱。然后,抗靶物质抗体被加入其中,并允许与靶物质的结合。洗涤后,可使用适当标记的二抗检测抗靶物质抗体,从而检测样品中的靶物质。呈例如,由例如聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚乙烯基甲苯、聚丙烯、聚乙烯、聚氯乙烯、尼龙、聚甲基丙烯酸酯、乳胶、明胶、琼脂糖、纤维素、琼脂糖凝胶、玻璃、金属、陶瓷、或磁性材料的材料制成的珠、微板、试管、棒、或试验片形式的不溶性载体,可被用作固相载体。
7.催化酶(脱氧核酶或核酶)
本发明的第七实施方案涉及催化酶。
7-1.构成
“脱氧核酶”是指具有催化活性的DNA分子,且还被称为DNA催化剂。“核酶”是指具有催化活性的RNA分子,且还被称为核糖核酸酶。这些酶与作为底物的靶物质例如RNA分子或低分子量化合物特异性结合以裂解或连接靶RNA分子或行使功能以催化化学反应诸如氧化或还原。
本发明的脱氧核酶包括天然脱氧核糖核苷酸和非天然脱氧核糖核苷酸,且由可复制的多核苷酸构成。
本发明的核酶包括天然核糖核苷酸和非天然核糖核苷酸,且由可转录或可复制的多核苷酸构成。
包含在本发明的脱氧核酶或核酶(在本说明书的下文中,还被称为“(脱氧)核酶”)中的非天然核苷酸由人工碱基构成。人工碱基未被其类型特别限制,只要人工碱基具有第一实施方案中描述的人工碱基的性质。其实例包括作为以上人工碱基的特定实施例列出的人工碱基和随后描述的人工碱基的衍生物。
本发明的(脱氧)核酶中非天然核苷酸的含量可以是构成(脱氧)核酶的核苷酸总数的20%或更少、优选15%或更少、更优选10%或更少。通常,如果具有每(脱氧)核酶1至4个非天然核苷酸,则全长为100个或更少碱基的(脱氧)核酶可产生本发明的效果。
当每(脱氧)核酶包含多个非天然核苷酸时,这些非天然核苷酸的人工碱基可以是相同和/或不同。当这些人工碱基不同时,应当注意的是,具有相同的互补人工碱基的两种或多种人工碱基彼此不共存于一个(脱氧)核酶中。这是因为原始人工碱基可在复制或转录过程中经由互补人工碱基替换为另一个人工碱基。例如,在包含分别具有Pn和Pa的非特异性核苷酸的(脱氧)核酶中,Pn和Pa的位置可在复制过程中经由它们的互补人工碱基Ds替换为另一个。
构成本发明的(脱氧)核酶的非天然核苷酸的碱基可以是示例于第一实施方案中的人工碱基的衍生物。
7-2.制备(脱氧)核酶的方法
用于制备本发明的脱氧核酶的方法包括复合物形成步骤、复合物回收步骤、单链核酸分子回收步骤、DNA扩增步骤、脱氧核酶制备步骤、和催化活性确认步骤作为必要步骤。用于制备本发明的脱氧核酶的方法可包括重复步骤作为任选步骤。
用于制备本发明的核酶的方法包括复合物形成步骤、复合物回收步骤、单链核酸分子回收步骤、逆转录步骤、DNA扩增步骤、转录步骤、核酶制备步骤、和催化活性确认步骤作为必要步骤。用于制备本发明的核酶的方法可包括重复步骤作为任选步骤。
这些步骤中,复合物形成步骤、复合物回收步骤、单链核酸分子回收步骤、及重复步骤可分别根据用于制备核酸适体的方法中的复合物形成步骤、复合物回收步骤、单链核酸分子回收步骤、及重复步骤进行。同样,逆转录步骤、DNA扩增步骤、及转录步骤可分别根据用于制备核酸适体的方法的扩增步骤中的逆转录子步骤、DNA扩增子步骤、及转录子步骤进行。(脱氧)核酶制备步骤,与在用于制备核酸适体的方法中的核酸适体制备步骤一样,可包括自我折叠获得的单链核酸分子以制备本发明的具有针对靶物质的结合活性与酶促活性的(脱氧)核酶。催化活性确认步骤是指确认(脱氧)核酶的催化活性的步骤,且可以包括通过本领域已知的技术,基于作为反应产物的底物的状态确认(脱氧)核酶是否催化作为其靶物质的底物。
8.用于核酸适体、脱氧核酶、或核酶制备的试剂盒
本发明的第八实施方案涉及用于制备根据第一实施方案的核酸适体或根据第七实施方案的核酶的试剂盒。
本发明的试剂盒包括包含根据第一实施方案的含有非天然核苷酸的单链核酸分子的单链核酸文库,以及具有与构成单链核酸文库的单链核酸分子的引物结合区互补的序列的引物组。试剂盒还可以包括试剂盒的说明手册。
实施例
实施例1:与VEGF-165结合的DNA适体的制备-(1)
(1)制备各自都在中心区的特定位点处包含人工碱基Ds的单链DNA的文库
关于各自都在中心区的特定位点处包含人工碱基Ds的单链DNA(全长97个碱基或98个碱基)的文库,首先,各自都具有被指定到中心区的1至3个任意的特定位置处的人工碱基Ds的22种DNA文库序列(见下文),各自被化学合成并被凝胶纯化。然后,这些不同的DNA文库被等量混合并用作根据本发明制备核酸适体的方法的第一文库。为了鉴定Ds被设置在即使是处于混合状态的这些不同的单链DNA的中心区的什么位置,2-碱基或3-碱基标签序列被掺入中心区紧邻5′-末端PCR引物结合区的下游作为识别位点。结果,即使通过PCR将DNA片段中的人工碱基替换为天然碱基之后,DNA片段所源自的文库及人工碱基被掺入的位置也可通过序列分析被确定。
化学合成的22种DNA文库序列将在下面示出。
N43Ds-01:
5′-CTGTCAATCGATCGTATCAGTCCAC(AA)NNNNNNNNNNNNNDsNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGCATGACTCGAACGGATTAGTGACTAC-3′;SEQ ID NO:3
N43Ds-02:
5′-CTGTCAATCGATCGTATCAGTCCAC(AT)NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNDsNNNNNNNNNNNNNNGCATGACTCGAACGGATTAGTGACTAC-3′;SEQ ID NO:4
N43Ds-03:
5′-CTGTCAATCGATCGTATCAGTCCAC(AG)NNNNNNNNNNNNNNNNDsNNNNNNNNNNNNNNNDsNNNNNNNNNNGCATGACTCGAACGGATTAGTGACTAC-3′;SEQ ID NO:5
N43Ds-04:
5′-CTGTCAATCGATCGTATCAGTCCAC(TA)NNNNNNNNNNDsNNNNNNNNNNNNNNNDsNNNNNNNNNNNNNNNNGCATGACTCGAACGGATTAGTGACTAC-3′;SEQ ID NO:6
N43Ds-05:
5′-CTGTCAATCGATCGTATCAGTCCAC(TT)NNNNNNNNNNDsNNNNNNNDsNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGCATGACTCGAACGGATTAGTGACTAC-3′;SEQ ID NO:7
N43Ds-06:
5′-CTGTCAATCGATCGTATCAGTCCAC(TG)NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNDsNNNNNNNDsNNNNNNNNNNGCATGACTCGAACGGATTAGTGACTAC-3′;SEQ ID NO:8
N43Ds-07:
5′-CTGTCAATCGATCGTATCAGTCCAC(TC)NNNNNNNNNNDsNNNNNNNNNNDsNNNNNNNNNNDsNNNNNNNNNNGCATGACTCGAACGGATTAGTGACTAC-3′;SEQ ID NO:9
N43Ds-08:
5′-CTGTCAATCGATCGTATCAGTCCAC(GA)NNNNNNNNNNNNNNNNNNDsNNNNNNNNNDsNNNNNNDsNNNNNNNGCATGACTCGAACGGATTAGTGACTAC-3′;SEQ ID NO:10
N43Ds-09:
5′-CTGTCAATCGATCGTATCAGTCCAC(GT)NNNNNNNDsNNNNNNDsNNNNNNNNNDsNNNNNNNNNNNNNNNNNNGCATGACTCGAACGGATTAGTGACTAC-3′;SEQ ID NO:11
N43Ds-10:
5′-CTGTCAATCGATCGTATCAGTCCAC(CA)NNNNNNNNNNNDsNNNNNNNNNDsNNNNNNNNNNNNNDsNNNNNNNGCATGACTCGAACGGATTAGTGACTAC-3′;SEQ ID NO:12
N43Ds-11:
5′-CTGTCAATCGATCGTATCAGTCCAC(CT)NNNNNNNNNNNDsNNNNNNNNNNNNNDsNNNNNNNNNDsNNNNNNNGCATGACTCGAACGGATTAGTGACTAC-3′;SEQ ID NO:13
N43Ds-12:
5′-CTGTCAATCGATCGTATCAGTCCAC(CAG)NNNNNNNNNDsNNNNNNNNNNNNNNNNDsNNNNNNDsNNNNNNNNNGCATGACTCGAACGGATTAGTGACTAC-3′;SEQ ID NO:14
N43Ds-13:
5′-CTGTCAATCGATCGTATCAGTCCAC(CAT)NNNNNNNNNDsNNNNNNDsNNNNNNDsNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGCATGACTCGAACGGATTAGTGACTAC-3′;SEQ ID NO:15
N43Ds-14:
5′-CTGTCAATCGATCGTATCAGTCCAC(TAT)NNNNNNNNNNNNNNNNDsNNNNNNDsNNNNNNDsNNNNNNNNNNNNGCATGACTCGAACGGATTAGTGACTAC-3′;SEQ ID NO:16
N43Ds-15:
5′-CTGTCAATCGATCGTATCAGTCCAC(TTA)NNNNNNNNNNNNNNNNDsNNNNNNDsNNNNNNNNNDsNNNNNNNNNGCATGACTCGAACGGATTAGTGACTAC-3′;SEQ ID NO:17
N43Ds-16:
5′-CTGTCAATCGATCGTATCAGTCCAC(GCT)NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNDsNNNNDsNNNNNNNNNNNNNNGCATGACTCGAACGGATTAGTGACTAC-3′;SEQ ID NO:18
N43Ds-17:
5′-CTGTCAATCGATCGTATCAGTCCAC(CCA)NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNDsNNNNNDsNNNNNNNNNNNNNNGCATGACTCGAACGGATTAGTGACTAC-3′;SEQ ID NO:19
N43Ds-18:
5′-CTGTCAATCGATCGTATCAGTCCAC(CCT)NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNDsNNNNNNDsNNNNNNNNNNNNNNGCATGACTCGAACGGATTAGTGACTAC-3′;SEQ ID NO:20
N43Ds-19:
5′-TGTCAATCGATCGTATCAGTCCAC(GGA)NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNDsNNNNNNNDsNNNNNNNNNNNNNNGCATGACTCGAACGGATTAGTGACTAC-3′;SEQ ID NO:21
N43Ds-20:
5′-CTGTCAATCGATCGTATCAGTCCAC(GGT)NNNNNNNNNNNNNNNNNNNDsNNNNNNNNDsNNNNNNNNNNNNNNGCATGACTCGAACGGATTAGTGACTAC-3′;SEQ ID NO:22
N43Ds-21:
5′-CTGTCAATCGATCGTATCAGTCCAC(CGA)NNNNNNNNNNNNNNNNNNDsNNNNNNNNNDsNNNNNNNNNNNNNNGCATGACTCGAACGGATTAGTGACTAC-3′;SEQ ID NO:23
N43Ds-22:
5′-CTGTCAATCGATCGTATCAGTCCAC(CGT)NNNNNNNNNNNNNNNNNNDsNNNNNNNNNNDsNNNNNNNNNNNNNGCATGACTCGAACGGATTAGTGACTAC-3′;SEQ ID NO:24
在这些序列中,N=A、G、C、或T;5′固定序列(对应于5′-PCR引物序列)表示CTGTCAATCGATCGTATCAGTCCAC(SEQ ID NO:1);3′固定序列(对应于与由SEQ ID NO:149表示的3′PCR引物序列互补的序列)表示GCATGACTCGAACGGATTAGTGACTAC(SEQ ID NO:2);且括号内的序列表示识别位点。
(2)结合VEGF-165的包含Ds的单链DNA适体的制备
使用前段(1)中制备的每个单链DNA文库、靶蛋白质人VEGF-165(Pepro Tech,Inc.)、和磁珠,根据核酸-蛋白质复合物固定方法,通过下述程序分离结合VEGF-165的DNA适体。
A.1选择轮的操作
(i)靶蛋白质与DNA文库之间的结合
将每个单链DNA文库溶解于PBS溶液(1.1mM KH2PO4、155mM NaCl、和3mM Na2HPO4,pH 7.4)中,并经受折叠处理(90℃持续3min→60℃持续3min→25℃)用于形成DNA分子中的构象。然后,将文库溶液与含Nonidet P-40的PBS溶液混合,以调节Nonidet P-40的终浓度为0.05%。为了从文库中排除非特异性吸附至磁珠的核酸片段,将所得核酸溶液与0.2mg链霉亲和素偶联的磁珠(Hydrophilic Streptavidin Magnetic Beads,New EnglandBiolabs Inc.)混合,并将混合物在室温下颠倒并混合30分钟。使用磁架(magnetic stand)和离心操作去除磁珠后,将上清液与靶蛋白质VEGF-165混合,并在25℃温育30分钟,以形成DNA-蛋白质复合物。
(ii)筛选与靶蛋白质结合的DNA序列
将9%(体积)10mM的EZ-连接磺基-NHS-LC-生物素(EZ-link Sulfo-NHS-LC-Biotin)(Thermo Fischer Scientific Inc.)的水溶液加入(终浓度:0.83mM)由此获得的混合溶液中,并将混合物在25℃温育15分钟用于蛋白质的生物素化。使用Microcon 50(Millipore Corp.)通过超滤法去除未反应的生物素化试剂。然后,将所得溶液与链霉亲和素偶联的磁珠混合,并在室温下温育10分钟以将DNA-蛋白质复合物固定至磁珠。为了洗去非特异性吸附至磁珠的未结合的蛋白质或核酸,随后重复以下的操作2至3次:将磁珠悬浮于40ml含0.05%Nonidet P-40的PBS溶液(缓冲溶液A)中,并在37℃温育悬浮液30分钟。向由此被洗涤的磁珠中加入400μl的洗脱溶液(100mM柠檬酸钠(pH5.0)、7M尿素、和3mMEDTA),并将混合物在90℃加热5分钟以解离蛋白质-DNA复合物。然后,通过苯酚-氯仿抽提和异丙醇沉淀操作,将由此从蛋白质解离的DNA从洗脱液中回收,并被用作用于随后的选择轮的文库制备中的PCR模板。
(iii)单链DNA文库的制备(扩增)
在随后的轮中使用的各单链DNA文库通过以下被制备:使用通过之前的选择轮获得的模板DNA和生物素修饰的引物进行PCR扩增;然后使用与链霉亲和素的结合,基于凝胶迁移(gel shift)分离包含Ds的单链DNA片段;并从凝胶中洗脱和回收DNA片段。使用AccuPrime Pfx DNA聚合酶(Invitrogen Corp.)进行PCR(体积:400μl)。反应组分为1xAccuPrime Pfx反应混合物(含有0.3mM dNTP和1mM MgSO4)、1μM 5′-引物(序列:见下文)、1μM 3′-引物(序列:见下文)、0.1mM dNTP(N=A、G、C、和T)(终浓度:0.4mM)、0.5mM MgSO4(终浓度:1.5mM)、50μM dDsTP、50μM Dioll-dPxTP、和0.05U/μl AccuPrime Pfx DNA聚合酶。PCR循环条件包括(94℃持续30秒→50℃持续30秒→65℃持续2min)x 13至19个循环。
5′-引物:5′-CTGTCAATCGATCGTATCAGTCCAC-3′(SEQ ID NO:1)
3′-引物:5′-BGTAGTCACTAATCCGTTCGAGTCATGC-3′(SEQ ID NO:148;B=生物素修饰的T)
通过乙醇沉淀从PCR溶液中回收DNA,且然后通过添加每0.1ml PCR溶液5μl SA缓冲溶液(10mM Tris-HCl(pH 7.6)、50mM NaCl、和1mM EDTA)被溶解。将溶液在75℃加热3分钟以将DNA变性为单链。向该溶液添加每0.1ml PCR溶液12.5μg链霉亲和素(5mg/ml SA缓冲溶液,2.5μl),并将混合物在25℃温育30分钟以形成生物素-亲和素复合物。向该含有复合物的溶液中加入相同体积的10M尿素-1xTBE溶液,且然后使用含有7M尿素的6%聚芳酰胺变性凝胶(polyaramide denaturing gel)分离扩增的单链DNA文库,从凝胶洗脱并回收扩增的单链DNA文库,并用作用于随后轮的文库。
B.重复步骤中选择轮的条件
每一轮的选择条件示于表1。
[表1]
在制备与VEGF-165结合的DNA适体中通过预测定方法选择的条件
对于第一轮,直接使用通过化学合成制备的22种DNA文库序列的等量的混合物。分子种类(molecular species)的总数为300pmol,即,约2x 1014个分子。为了使蛋白质-DNA复合物的形成条件更为严格,蛋白质和DNA的浓度逐渐降低,同时在第8轮的蛋白质-DNA文库混合期间,加入过量的先前被报道作为VEGF-结合DNA适体的DNA片段(5′-TGTGGGGGTGGACGGGCCGGGTAGA-3′)(SEQ ID NO:147),作为竞争性DNA分子(竞争剂)。第7轮中,用40ml缓冲溶液A进行两次洗涤,随后为使用含有3M尿素的缓冲溶液A(1ml,在室温下持续15min)颠倒并混合的另外操作以使得洗涤条件进一步更加严格。第8轮中,在尿素的存在下,重复两次洗涤操作。
(3)对通过选择获得的DNA适体进行测序
通过选择获得的DNA适体使用下述两种方法进行测序。
(i)通过使用大肠杆菌的克隆方法对DNA适体进行测序
在最后一轮(第8轮)后的选择中回收的单链DNA的等分试样用作PCR中的模板,以将人工碱基Ds替换为天然碱基。通过常规方法克隆PCR产物。具体地,在1μM各引物(5′-引物:5′-CTGTCAATCGATCGTATCAGTCCAC-3′(SEQ ID NO:1)和3′-引物:5′-GTAGTCACTAATCCGTTCGAGTCATGC-3′(SEQ ID NO:149))和20nM模板单链DNA以及0.3mM dNTP(N=A、G、C、和T)、50μM dPa′TP、和1×Titanium Taq PCR缓冲液中的1×Titanium Taq(Clontech Laboratories,Inc.)的反应组分的存在下进行5个循环的PCR(体积:20μl)。在该PCR中,有意添加dPa′TP。这是因为人工碱基Ds,取决于其侧翼序列,仅使用天然碱基底物可能难以扩增,并且在PCR的第一个循环中,易被替换为天然碱基的Pa′在与Ds互补的位置处被掺入代替Ds,以减少替换为天然碱基的效率中的变化。PCR循环条件包括94℃持续1min→(94℃持续30秒→68℃持续2min)x 5个循环→75℃持续10min。使用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen Crop.)将部分(4μl)PCR产物克隆到大肠杆菌(Top 10)中。回收源自每个克隆的质粒,并对每个克隆进行测序。在测定的克隆的序列中,各自在引物序列之间具有45个或46个碱基、并具有标签序列的35个克隆的核苷酸序列(14种)示于表2。
[表2]
8轮后通过选择获得的35个克隆的核苷酸序列
(通过使用大肠杆菌的克隆方法测定)
5′-CTGTCAATCGATCGTATCAGTCCAC-(标签序列)2-3-(N)43-GCATGACTCGAACGGATTAGTGACTAC-3′
克隆 | (<u>标签序列</u>)<sub>2-3</sub>-(N)<sub>43</sub> | SEQ ID NO. | |
cN43Ds-01-44 | (1) | <u>AA</u>GTGTTCTGGAGACnCTTAGGATGTCGCGGAGGGGTGCGGCCTT | 25 |
cN43Ds-01-46 | (1) | <u>AA</u>AAATGCGAGGGTCnGTGGCGTAGGTTCGGAAATTTTGTTATGT | 26 |
cN43Ds-01-43 | (1) | <u>AA</u>AAATGCGGGGGTCnGTGGCGTAGGTTCGGAAATTTTGTTATGT | 27 |
cN43Ds-02-01 | (2) | <u>AT</u>GGAATTGTGGGGCCGGAATCTGTTATGTnTGCCAGGAAGGAGC | 28 |
cN43Ds-02-18 | (2) | <u>AT</u>GGAAATGTGGGGCCGGAATCTGTTATGTnTGCCAGGAAGGAGC | 29 |
cN43Ds-02-26 | (1) | <u>AT</u>CTTGCACGCGGGGGGTTCTGGTGTAGGAnCGGAGGGAAAGTGC | 30 |
cN43Ds-08-07 | (2) | <u>GA</u>GGAATGTCCAGCGCTGGGnTTGGAGGGGnGTCGGAnTGGGCTC | 31 |
cN43Ds-08-37 | (1) | <u>GA</u>GGGCGGCTTAAACAAGGGnTTGGGGGGGtGTCGGTnGTAAGGC | 32 |
cN43Ds-08-24 | (1) | <u>GA</u>TGAAGAGGGTGGCGTCCGnACGGGGGGGaAGGTATnCACGTAG | 33 |
cN43Ds-09-11 | (3) | <u>GT</u>CTAAGTAnGGTGGGnTTGGCGGGGnTGTCGGATATACTTTGAC | 34 |
cN43Ds-10-13 | (4) | <u>CA</u>CAATATTCGGGnTTGGAGGGGnGTCGGGTGGATAGnTGGTGCT | 35 |
cN43Ds-20-21 | (4) | <u>GGT</u>AGGGTAAGTAGGTATTGCCnGTCGTAGCnTGGATGGCGTGCCG | 36 |
cN43Ds-21-04 | (11) | <u>CGA</u>TTCCTTATCCTAGGACTTnTTTCCGCGCnCACGTGCTCAGATT | 37 |
cN43Ds-21-33 | (1) | <u>CGA</u>TTCCTTTTCCTAGGACTTnTTTCCGCGCnCACGTGCTCAGATT | 38 |
基于根据标签序列分类的DNA文库的序列确定人工碱基Ds的位置。数目最多的克隆是cN43Ds-21-04序列,而与cN43Ds-08-07中包含的序列GGGDsTTGGAGGGGDsGTCGG类似的基序显示被保守地包含在其它克隆中。同样,在从标签序列预测的人工碱基Ds的位置处的核苷酸序列显示在大多数克隆中被替换为A或T。在对应于人工碱基Ds的位置处的序列的A或T突变强烈地表明甚至在PCR直至选择的过程中,人工碱基被保留。
(ii)使用下一代测序仪(Life Technologies Corp.;Ion Torrent The PersonalGenome Machine(TM)(PGM(TM)))对DNA适体进行测序
示于前段(i)的用于以天然碱基替换人工碱基的PCR在100μl的体积中进行。使用Wizard(R)SV Gel and PCR Clean-Up System(Promega Corp.)纯化获得的PCR产物。按照其附带的手册中描述的方法,使用Ion Fragment Library Kit(Life TechnologiesCorp.)从由此纯化的DNA制备文库。使用Ion Library Quantification Kit(LifeTechnologies Corp.)定量获得的DNA文库、稀释至预定浓度且然后用Ion Xpress(TM)Template Kit v2.0(Life Technologies Corp.)处理,以制备用于以来自LifeTechnologies Corp.的The Personal Genome Machine(TM)(PGM(TM))分析的模板DNA。然后,使用Ion Sequencing Kit(Life Technologies Corp.)进行离子激流PGM(TM)测序。使用来自CLC bio Japan,Inc.的CLC Genomics Workbench(4.7.2版)分析由此获得的读段总数。具体地,针对连续包含25-碱基5′-引物-标签序列(变化)-43-碱基序列-3′-引物的6-碱基部分序列(GCATGA)的分析物序列筛选包含Ds的文库序列,对于相同序列的读段数为2个或多个,而针对连续包含27-碱基3′-引物-43-碱基序列-标签序列(变化)-5′-引物的6-碱基部分序列(GTGGAC)的分析物序列筛选包含Ds的文库序列的互补序列,对于相同序列的读段数为2个或多个。进一步分析了总计14094个读段序列。图6-1和图6-2显示每个文库满足上述条件的分析的读段数,以及其中除了对应于人工碱基Ds的位点之外相同序列的读段数为3个或更多个的选择的序列。
结果,以离子激流PGM(TM)分析的克隆序列和通过克隆分析的克隆序列都显示了展示出类似的趋势。通过克隆方法证实的大多数序列也能够从克隆的离子激流PGM(TM)分析结果被证实。在以离子激流PGM(TM)分析的序列中,克隆的最大数目是N43Ds-21-1,其具有与通过克隆方法以最大数目获得的克隆cN43Ds-21-04相同的序列。还证实了包含基序GGGDsTTGGNGGGGDsGTCGG(N=任意的天然碱基)的许多序列。其中,13种序列能够被证实具有50个或更多个的读段数(图7)。
实施例2:与VEGF-165结合的DNA适体的结合分析-(1)
在该实施例中,N43Ds-08-1、N43Ds-09-1、N43Ds-20-1、和N43Ds-21-1从实施例1中获得的克隆中被选择作为代表性的克隆,并使用BIACORE3000(GE Healthcare JapanCorp.)通过表面等离子体共振(SPR)测定分析其作为全长DNA片段(DNA适体)结合VEGF-165的能力。
首先,基于通过根据本发明用于制备核酸适体的方法获得的各克隆序列,通过化学合成和凝胶纯化制备了各自具有添加至5′端(全长中的98-mer或99-mer)的生物素化的T的含有Ds的单链DNA片段,以及具有以天然碱基A、T、或G替换Ds的DNA片段。其序列示于图8,使用的SPR传感器芯片是链霉亲和素包被的(SA)芯片(GE Healthcare Japan Corp.)。每个DNA片段被不可逆地固定至芯片,且然后分析其与VEGF的结合。报道的作为结合VEGF的DNA适体的DNA片段(结合VEGF的DNA 64,64mer)也被制备作为对照并类似地分析其结合。SPR测定条件包括:运行缓冲液:缓冲溶液A和设定温度:25℃。
为了将各DNA片段固定至传感器芯片,以PBS溶液稀释至50nM的DNA溶液经受折叠处理(90℃持续3min→60℃持续3min→25℃),且然后向其中加入终浓度为0.05%的Nonidet P-40。所得DNA溶液(10μl;对应2min)以5μl/min的流速注射至SA芯片以将DNA片段固定至芯片。固定后,非特异性吸附至SA芯片的DNA片段通过以20μl/min的流速注射(5μl x5)50mM NaOH溶液被洗去。固定的DNA片段和VEGF-165之间的相互作用在以动力学注射模式通过注射100nM、150nM、及200nM的VEGF-165溶液(用缓冲溶液A稀释;对于二聚体)的监测下被检测。测定条件包括20μl/min的流速和持续3分钟的蛋白质注射。通过注射5μl(对应15秒)的50mM NaOH溶液、随后为芯片的引发处理(priming treatment of the chip)并注射大量缓冲溶液A进行芯片再生(结合蛋白质的解离和DNA再折叠)。为了消除传感器芯片上的体效应(bulk effect)或归因于非特异性吸附的响应值,将用作参考细胞的DNA-未固定的细胞的响应值从每个DNA片段的传感图中减去。结果示于图9。
作为该测定的结果,除了DNA片段和VEGF-165之间的特异性结合之外,传感图的波形显示了弱的非特异性结合。在这种情况下,基于结合速率(ka)和解离速率(kd)的解离常数(Kd=kd/ka)被判断为难以通过曲线拟合计算。因此,每个DNA片段的结合强度通过使用在蛋白质注射完成后的蛋白质解离阶段的非可解离性程度的比较作为指标被评价。具体地,在注射完成后23秒获得的响应值(RU)被定义为100%,且结合保持的程度从时隔另外的200秒后获得的响应值(RU)被确定。获得的100nM、150nM、和200nM蛋白质的程度被平均以计算结合保持率(保持%)。计算结果示于表3。
[表3]
VEGF-165结合后结合保持率(非可解离性)的比较
在所有克隆中,相比具有以天然碱基替换人工碱基Ds的DNA片段,包含人工碱基Ds的DNA片段显示具有较高的VEGF-165结合保持率。特别地,N43Ds-09-1不仅表现出相比其它DNA片段更较牢固的结合,而且相比其它的DNA片段,由于以G或A/T替换Ds,N43Ds-09-1还表现出结合保持率中更大的降低。这些结果证明,N43Ds-09-1与VEGF-165的结合依赖于Ds的存在或不存在,并且由于以天然碱基替换Ds,具有较大的解离速率(kd)。
实施例3:基于N43Ds-09-1序列的掺杂选择-(1)
在该实施例中,关于以依赖于人工碱基Ds的方式与VEGF-165牢固结合的98-mer(全长)DNA片段N43Ds-09-1(在实施例1和2中获得),进行了掺杂选择,以检查参与与靶蛋白质结合的位点。
(1)用于掺杂选择的DNA文库的制备
用于掺杂选择的每个DNA文库通过化学合成和凝胶纯化来制备,以使得N43Ds-09-1序列中的3个Ds碱基和引物区被固定,而由天然核苷酸序列构成的包括标签序列的其它部分含有62.5%的原始碱基和37.5%的不同于原始碱基的碱基(3种碱基各12.5%)。序列如下:
N43Ds-09-1-Dope
5′-ctgtcaatcgatcgtatcagtccacgtctaagta(Ds)ggtggg(Ds)ttggcgggg(Ds)tgtcggatatactttgacgcatgactcgaacggattagtgactac-3′
(大写字母:固定的序列,小写字母:掺杂序列)
a=A:62.5%;G:12.5%;C:12.5%,T:12.5%
g=A:12.5%;G:62.5%;C:12.5%,T:12.5%
c=A:12.5%;G:12.5%;C:62.5%,T:12.5%
t=A:12.5%;G:12.5%;C:12.5%,T:62.5%
(2)结合VEGF-165的包含Ds的ssDNA适体的掺杂选择
使用段(1)中制备的各DNA文库、靶蛋白质人VEGF-165(PeproTech,Inc.)、和磁珠,根据核酸-蛋白质复合物固定方法,通过与实施例1中显示的“A.1选择轮的操作”中相同的程序分离结合VEGF-165的DNA适体。
A.掺杂选择轮的条件
每一轮的选择条件示于表4。
[表4]
在制备与VEGF-165结合的DNA适体中掺杂选择的条件
使用300pmol通过化学合成制备的DNA文库N43Ds-09-1-Dope直接进行第一轮。如实施例1,为了使蛋白质-DNA复合物形成条件随着每一个选择轮更为严格,蛋白质和DNA的浓度逐渐降低,同时在第3、4、和5轮中蛋白质-DNA文库混合期间,添加过量的先前报道的作为结合VEGF的DNA适体的DNA片段(5′-TGTGGGGGTGGACGGGCCGGGTAGA-3′;SEQ ID NO:147)作为竞争性DNA分子(竞争剂)。第4轮中,用40ml缓冲溶液A进行两次洗涤,随后为使用含有3M尿素的缓冲溶液A(1ml,在室温下持续15min)颠倒并混合的另外操作以使得洗涤条件进一步更加严格。第5轮中,重复两次该操作。
(3)通过掺杂选择获得的DNA适体的测序
通过掺杂选择获得的DNA适体,以与实施例1中的相同方式,使用最后一轮(第5轮)之后的选择中回收的DNA通过下述两种方法被测序。
(i)通过使用大肠杆菌的克隆方法鉴定DNA适体序列
在以与实施例1中相同的方式确定的克隆的序列中,各自在引物序列之间具有45个碱基的28个克隆的核苷酸序列(25种)示于图10。
(ii)使用下一代测序仪(Life Technologies Corp.;Ion Torrent The PersonalGenome Machine(TM)(PGM(TM)))鉴定DNA适体序列
以与实施例1中相同的方式进行PGM测序。使用CLC Genomics Workbench(4.7.2版)分析由此获得的读段总数。针对包含Ds的文库序列选择连续包含25-碱基5′-引物-45-碱基序列-3′-引物的6-碱基部分序列(GCATGAC)的读段(总数:2474),而针对包含Ds的文库序列的互补序列选择连续包含27个碱基3′-引物-45-碱基序列-5′引物的6-碱基部分序列(GTGGAC)的读段(总数:2365)。进一步分析了总计4839个克隆序列。图11显示了计算45个碱基中的每个位置处的碱基构成的结果。
作为通过(i)和(ii)两种方法分析的结果,N43Ds-09-1的原始序列中由基序GGGDsTTGGNGGGGDsTGTCGG(N=A、G、C、或T)组成的共有序列(SEQ ID NO:105)显示是非常高度保守的。包含与该基序类似的序列的许多克隆也在实施例1的选择中获得(图7),表明该基序对与VEGF-165结合是重要的。
实施例4:通过掺杂选择获得的包含基序的DNA片段的结合分析-(1)
在该实施例中,使用BIACORE 3000(GE Healthcare Japan Corp.)通过表面等离子体共振(SPR)测定分析了N43Ds-09-1的包含实施例3中鉴定的基序GGGDsTTGGNGGGGDsTGTCGG(SEQ ID NO:105)的截短的DNA片段Ds-09-1-DsDsDs(35-mer)及其变体DNA片段以确认它们结合VEGF-165的能力。
A.关于多种DNA片段的VEGF-165结合的SPR分析
如实施例2,SPR测定条件包括:运行缓冲液:缓冲溶液A和设定温度:25℃。用于该实施例的分析的六种DNA片段示于表5。
[表5]
用于SPR分析的DNA片段(35-mer)
T*=生物素-dT
由于Ds-09-1-DsDsDs中的一个或全部人工碱基Ds替换为天然碱基A,产生了Ds-09-1-ADsDs、Ds-09-1-DsADs、Ds-09-1-DsDsA、和Ds-09-1-AAA。变体DNA片段DS-09-1-mDsDsDs由于在掺杂选择中以具有高出现频率的碱基替换处于低频率的DS-09-1-DsDsDs中保守的两个碱基部分而产生。为了比较,98-mer(全长)N43Ds-09-1、具有以天然碱基替换人工碱基Ds的全长DNA片段N43Ds-09-1(AT)和N43Ds-09-1(G)、以及报道作为结合VEGF的DNA适体的对照DNA片段(结合VEGF的DNA 35,35mer),也在相同条件下被测定。如实施例2的全长结合分析,具有添加在末端的生物素化的T的用于将DNA片段直接固定至SA芯片(GEHealthcare Japan Corp.)的每个DNA片段,通过化学合成和凝胶纯化制备。为了将每个DNA片段固定至传感器芯片,以PBS溶液稀释至25nM的DNA溶液经受折叠处理(90℃持续3min→60℃持续3min→25℃),且然后向其中加入终浓度为0.05%的Nonidet P-40。所得DNA溶液(5μl;对应1min)以5μl/min的流速注射至SA芯片以将DNA片段固定至芯片。固定后,非特异性吸附至SA芯片的DNA片段通过以20μl/min的流速注射(5μl x 5)50mM NaOH溶液被洗去。
固定的DNA片段和VEGF-165之间的相互作用在以动力学注射模式通过注射12.5nM、25nM、37.5nM、50nM、62.5nM、及75nM的VEGF-165溶液(以缓冲溶液A稀释;对于二聚体)的监测下被检测。测定条件包括20μl/min的流速和持续6分钟的蛋白质注射。通过注射5μl(对应15秒)50mM NaOH溶液、随后为芯片的引发处理并注射大量缓冲溶液A实现芯片再生(结合蛋白质的解离和DNA再折叠)。为了消除传感器芯片上的体效应或归因于非特异性吸附的响应值,将用作参考细胞的DNA-未固定的细胞的响应值从每个DNA片段的传感图中减去。结果示于图12。35-mer截短形式Ds-09-1-DsDsDs,与全长N43Ds-09-1(Ds)一样,显示与VEGF-165的牢固结合。由于以天然碱基A替换Ds-09-1-DsDsDs中包含的三个Ds碱基的5-末端Ds产生的DNA片段Ds-09-11-ADsDs也显示与VEGF-165的牢固结合。相比之下,由于将从5′端数第2个或第3个Ds替换为A产生的DNA片段Ds-09-1-DsADs或Ds-09-1-DsDsA、及由于以A替换所有人工碱基Ds产生的DNA片段Ds-09-1-AAA,相比Ds-09-1-DsDsDs和Ds-09-1-ADsDs,证明在VEGF注射后展示较快的解离和针对VEGF的较弱的结合。VEGF注射后,DNA片段Ds-09-1-mDsDsDs具有比其它DNA片段低的响应(RU),但证明VEGF注射后展示如在Ds-09-1-DsDsDs或Ds-09-1-ADsDs中的从VEGF较慢的解离。
与使用全长DNA片段的SPR测定相比,使用短片段的SPR测定只产生可忽略水平的弱的非特异性结合。因此,Ds-09-1-DsDsDs、Ds-09-1-ADsDs、和DS-09-1-mDsDsDs的解离常数(Kd),使用连接到Biacore 3000的BiaEvaluation软件以及1∶1结合反应模型,通过曲线拟合被成功地计算出。Ds-09-1-DsDsDs的Kd值为4nM,DS-09-1-ADsDs的Kd值为1nM,以及Ds-09-1-mDsDsDs的Kd值为50nM。具有弱结合的Ds-09-1-DsADs、Ds-09-1-DsDsA、和Ds-09-1-AAA的Kd值由于难以拟合是不可准确计算的,但显示大于100nM(表5)。
各DNA片段的结合强度也以与实施例2中相同的方式,使用蛋白质注射完成后的蛋白质解离阶段的非可解离性程度作为指标被比较。具体地,在完成注射后16秒获得的响应值(RU)被定义为100%,且结合保持的程度从时隔另外的300秒后获得的响应值(RU)被确定。获得的37.5nM、50nM、62.5nM、以及75nM蛋白质的程度被平均以计算结合保持率(保持%)(图10和表5)。结果,短的截短DNA片段Ds-09-1-DsDsDs、Ds-09-1-ADsDs、和Ds-09-1-mDsDsDs具有90%或更高的结合保持率,其几乎等同于98-mer(全长)Ds-09-1的结合保持率。
这些结果证明,包含GGGDsTTGGNGGGGDsTGTCGG(SEQ ID NO:105)的短的截短DNA片段(35-mer)变为从VEGF较少可解离的,并以依赖于基序中的Ds碱基的方式与VEGF牢固结合。
B.截短的DNA片段对VEGF-165的结合选择性的分析
为了检查由该选择获得的35-mer适体以确认其VEGF-165结合选择性,检查了Ds-09-11-DsDsDs和Ds-09-11-ADsDs以确认其对VEGF-165亚型VEGF-121(PeproTech,Inc.)、人EGF(PeproTech,Inc.)、和人α-凝血酶(Enzyme Research Laboratories Ltd.)的结合能力。以如VEGF-165结合分析中相同的方式,将Ds-09-11-DsDsDs和Ds-09-11-ADsDs各自固定至SA芯片,将每一种蛋白质(75nM)注射至其。所得传感图示于图13。Ds-09-11-DsDsDs和Ds-09-11-ADsDs都几乎不与除了VEGF-165的蛋白质结合,证明了通过在该实验中的选择获得的含人工碱基的适体与VEGF-165选择性结合。
实施例5:使用各自在中心区随机包含人工碱基Ds的单链DNA的文库(随机文库方法)的选择
在该实施例中,使用各自具有随机掺入的人工碱基Ds的单链DNA的随机文库,作为各自含人工碱基Ds的单链DNA文库以选择与VEGF结合的DNA适体。
(1)具有随机掺入的人工碱基Ds的单链DNA文库的制备
各自具有随机掺入的人工碱基Ds的单链DNA文库(N45.26mixDs-3),使用制备的包括6%的人工碱基Ds的亚酰胺(amidite)和94%的用于中心区的45-碱基序列的等量的4种天然碱基的亚酰胺的亚酰胺混合物化学合成。作为该条件下合成的文库的理论组成,假定:由天然碱基构成的不含Ds的DNA片段的文库构成总数的6.2%;各自在任意位置处包含1个Ds碱基的DNA片段的文库构成总数的17.7%;各自包含2个Ds碱基的DNA片段的文库构成总数的24.9%;各自包含3个Ds碱基的DNA片段的文库构成总数的22.8%;各自包含4个Ds碱基的DNA片段的文库构成总数的15.3%;各自包含5个Ds碱基的DNA片段的文库构成总数的8.0%;及各自包含6个或更多个Ds碱基的DNA片段的文库构成剩余的约2%。N45.26mixDs-3的序列(全长:89-mer;括号内的区域表示PCR引物的固定序列)将在下面示出。
5′-(ACGCATGAACAAACTTGCTTG)NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN(GGAGTACGCAGAAGTTTCATTGT)-3′(SEQ ID NO:114)
(N=A、G、C、或T(94%)或Ds(6%))
(2)结合VEGF-165的包含Ds的ssDNA适体的选择
使用前段(1)中制备的各个DNA文库、靶蛋白质人VEGF-165(PeproTech,Inc.)、和磁珠,根据核酸-蛋白质复合物固定方法,通过与实施例1中显示的<1选择轮的操作>中相同的程序,分离结合VEGF-165的DNA适体。用于(iii)的文库制备的PCR循环条件包括(94℃持续30秒→50℃持续30秒→65℃持续2min)×15至25个循环。以下序列用作5′-引物和3′-引物:
5′-引物:5′-ACGCATGAACAAACTTGCTTG-3′(SEQ ID NO:112)
3′-引物:5′-BACAATGAAACTTCTGCGTACTCC-3′(B=生物素修饰的T)(SEQ ID NO:150)
<选择轮的条件>
每一轮的选择条件示于表6。
[表6]
与VEGF-165结合的DNA适体的选择条件
(在其中Ds被掺入随机位置的情况下的选择)
对于第一轮,直接使用通过化学合成制备的各DNA文库。分子种类的总数为300pmol,即,约2×1014个分子。为了使蛋白质-DNA复合物形成条件更为严格,将蛋白质和DNA的浓度逐渐降低,而复合物洗涤步骤的数目增加。
(3)每个选择轮的文库的序列分析
在包含人工碱基Ds的DNA的序列分析中,测序图型(sequencing pattern)根据在普通染料终止物测序反应期间加入ddPa′TP或dPa′TP作为与人工碱基Ds互补的底物而不同。在测序中作为模板的每个DNA片段中人工碱基Ds的存在或不存在因此可被预测。因此,在ddPa′TP或dPa′TP的存在下,将每个选择轮之后制备的各单链DNA文库用作序列分析中的模板,以通过选择过程来分析人工碱基Ds的保持程度。
具体地,对于以总规模为10μl的DNA测序反应,将1μl用于商购可得的BigDyeTerminator v1.1Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems Inc.)附带的v1.1的测序缓冲液(×5)、测序引物(2pmol,5′-ACAATGAAACTTCTGCGTACTCC-3′;SEQ ID NO:113)、通过每轮后的PCR扩增制备的单链DNA片段(约0.15pmol)、和ddPa′TP或dPa′TP(500pmol)添加至2μl的试剂盒的Cycle Sequencing Mix中,随后为25个循环的PCR(96℃持续10秒→50℃持续5秒→60℃持续4min)。使用CentriSep离心柱(Applied Biosystems Inc.)从反应溶液中去除未反应的染料终止物。剩余的溶液在减压下干燥。向残余物中加入3μlBlue-Dextran的甲酰胺稀释液,并以ABI377DNA测序仪分析部分混合物。在分析中使用的凝胶的组成为6%聚丙烯酰胺-6M尿素凝胶。使用Applied Biosystems PRISM测序分析v3.2软件分析每个序列的峰型(peak pattern)。分析测序图型的结果显示,特定序列组在第4轮或随后轮中被集中。由于仅由天然核苷酸序列构成的适体也被包括在文库中,没有图型表明,在ddPa′TP的存在下测序反应在与人工碱基互补的位置处终止。然而,在ddPa′TP存在下的测序图型和在dPa′TP存在下的测序图型被证实在所有轮中都不同。在仅由天然碱基构成的序列的情况下,在ddPa′TP的存在下和在dPa′TP的存在下的测序图型之间通常被证实没有显著差异。因此,通过该选择获得的文库被推定为具有保留至少人工碱基Ds的序列。
(4)通过选择获得的DNA适体序列的鉴定
段(3)中测序的结果表明仅由天然核苷酸序列构成的适体也被包括在8轮后的文库中。因此,在实施例1(3)(i)的方法之前,进行了浓缩包含人工碱基Ds的DNA片段的操作。产生的包含Ds的DNA适体被测序。
除了使用生物素-dPxTP代替该文献中的FAM-hx-dPxTP之外,以与Nucleic AcidResearch(2009),Kimoto等人中记载的方法相同的方式进行浓缩包含人工碱基Ds的DNA片段的操作。具体地,1pmol的8轮后扩增的各单链DNA文库作为模板,在50μM dDsTP和50μM生物素-dPxTP存在下,使用AccuPrime Pfx DNA聚合酶通过5个循环的PCR被扩增,以制备含有Ds的单链DNA片段为包含Ds-(生物素-dPx)碱基对的双链DNA。PCR的组成和条件除了以下的之外与实施例1(2)(iii)中的相同:Dioll-dPxTP替换为生物素-dPxTP;且未生物素化的引物(5′-ACAATGAAACTTCTGCGTACTCC-3′(SEQ ID NO:113)和5′-ACGCATGAACAAACTTGCTTG-3′(SEQ ID NO:112)被用作PCR引物。然后,使用Microcon 10(Millipore Corp.)通过超滤,将PCR溶液以1×结合溶液(20mM Tris-HCl(pH 7.6)、0.5M NaCl、和10mM MgCl2)进行缓冲液替换,以从PCR溶液中去除未掺入PCR产物的未反应的生物素-dPxTP。将所得溶液(约45μl)在25℃下与用于选择的链霉亲和素偶联的磁珠(40μl)温育15分钟,以将包含Ds-(生物素-dPx)碱基对的双链DNA固定至磁珠。用1×结合溶液洗涤珠子以去除不包含Ds-(生物素-dPx)碱基对的DNA片段。然后,将12μl 20mM NaOH溶液加入回收的磁珠中,并将混合物置于室温约5分钟,从而使双链DNA成为单链DNA并释放含有Ds的DNA片段至溶液中。通过加入3μl80mM HCl溶液中和溶液。然后,使用磁架回收含有DNA片段的溶液以制备用于实施例1(3)(i)的方法的模板DNA。
(5)通过克隆方法鉴定DNA适体序列
由此获得的部分DNA溶液被用作PCR中的模板以将人工碱基Ds替换为天然碱基。PCR产物通过常规方法克隆。具体地,在1μM各引物(5′-ACAATGAAACTTCTGCGTACTCC-3′(SEQID NO:113)和5′-ACGCATGAACAAACTTGCTTG-3′(SEQ ID NO:112))的存在下,使用4μl DNA溶液作为模板,和补充了终浓度为50μM的dPa′TP的1×ExTaq Premix(Takara Bio Inc.)进行PCR(体积:20μl)。PCR循环条件包括(94℃持续30秒→50℃持续30秒→65℃持续2min)×10个循环→75℃持续5min。使用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen Corp.)将部分(4μl)PCR产物克隆到大肠杆菌(TOPl0)中。回收源自每个克隆的质粒,并对每个克隆进行测序。在克隆的确定的序列中,比对了各自在引物序列之间具有45个碱基的59个克隆的核苷酸序列(27种)。结果示于图14。
鉴定的序列的同源性分析结果显示了5种在中心区含有2个或3个碱基突变的同源序列组,且还证明了这些碱基突变包括推定为作为该克隆方法的结果以天然碱基T或A替换人工碱基Ds的碱基突变。
实施例6:通过制备方法获得的适体中人工碱基Ds的位置的鉴定
在该实施例中,鉴定了实施例5中获得的5种适体组的序列中人工碱基Ds的存在或不存在以及其在这些序列中的位置。
A.从DNA文库分离与探针互补的DNA片段
图14显示了设计为分别是5种组的序列特异性的24-碱基DNA片段的探针序列。已被化学合成(同样在5′-末端生物素化)并简单纯化的这些探针,购自Invitrogen Corp并用于该实验。通过8轮后获得的DNA片段的PCR扩增(使用dDsTP和Dioll-dPxTP)制备的各单链DNA文库被调节至100nM/1×结合溶液。将所得溶液(130μl)在室温下与链霉亲和素偶联的磁珠(50μl)温育10分钟,以去除链霉亲和素结合的DNA片段。然后,将20μl回收的DNA溶液与各生物素化的探针(5μM,1μl)混合,随后为退火操作(90℃持续3min→以0.1℃/秒的速率缓慢冷却→55℃持续15min)。然后,将反应溶液与链霉亲和素偶联的磁珠(5μl)混合,以1×结合溶液进行缓冲液替换,并将混合物在55℃温育5分钟,以将生物素化的探针及与各探针互补地杂交的DNA片段固定至磁珠。使用磁架去除溶液,以去除未与探针杂交的冗余DNA片段。然后,将磁珠以150μl 1×结合溶液洗涤5次。然后,将10μl无菌水添加至由此洗涤的磁珠,并将混合物在75℃加热5分钟。然后,回收所得溶液以回收与各探针杂交的DNA片段。
B.使用探针回收的DNA片段的DNA测序
回收的DNA片段被用于以下描述的(i)至(iii)3种DNA测序方法。除了指定的改变,这些测序方法以与实施例5(3)中所示方法相同的方式进行。
(i)在0.05mM dPa′TP的存在下直接对4μl回收的DNA溶液进行测序。
(ii)在dDsTP和Dioll-dPxTP的存在下,使用2μl回收的DNA溶液和AccuPrime PfxDNA聚合酶进行15个循环的PCR扩增。然后,通过凝胶纯化回收片段并溶解在10μl水中。在0.05mM dPa′TP的存在下或在0.05mM ddPa′TP的存在下,将溶液(1μl至2μl)用于测序(如果回收的DNA携带Ds,则人工碱基Ds在PCR过程中被保留)。
(iii)在0.05mM dPa′TP的存在下,使用2μl回收的DNA溶液和Ex Taq DNA聚合酶进行15个循环的PCR扩增。然后,通过凝胶纯化回收片段并溶解在10μl水中。在0.05mM dPa′TP的存在下或在0.05mM ddPa′TP的存在下,将溶液(1μl至2μl)用于测序(如果回收的DNA携带Ds,则PCR后人工碱基Ds被替换为A或T)。
在方法(ii)和(iii)中,在Pa′底物不存在的情况下,使用测序引物(测序引物2:5′-ACAATGAAACTTCTGCGTACTCC-3′(SEQ ID NO:113))对含有人工碱基Ds的链进行测序,并且还使用测序引物(测序引物1:5′-ACGCATGAACAAACTTGCTTG-3′)(SEQ ID NO:112)对含有人工碱基Dioll-Px的链进行测序。(i)至(iii)的测序图型证明,在8轮后从每个文库回收的DNA的适体序列中通过克隆方法发现具有A/T碱基突变的位置处,(A)Ds是完全保守的或(B)一些Ds碱基被替换为天然碱基A或T,而Ds以恒定的比例被保留。因此,该实施例中所示的方法能够鉴定随机引入的Ds的位置。如涉及使用预定的Ds引入位置的选择的实施例1和3中所示,在使用下一代测序仪的序列分析中,大多数Ds引入位点也被替换为A/T。因此,该实施例的结果表明:被掺入中心区并在选择过程中保守的Ds的位置,可在选择后通过使用下一代测序仪分析大量序列组被鉴定;且即使在使用各自具有被掺入随机位置处的Ds的DNA文库的情况下,选择也是可行的。
实施例7:多种dPnTP衍生物的制备
在实施例1、3、和5中,Ds作为第5碱基在选择文库中使用。由于Pn碱基与Ds互补并在PCR中行使功能,Pn可作为第5碱基用于文库制备和选择。此外,人工碱基Pn的丙炔基基团可被多种取代基取代。在该实施例中,将描述本说明书中所示的多种dPnTP衍生物的制备。
(1)试剂和溶剂
试剂和溶剂购自标准的供应商且未经进一步纯化而使用。1H-NMR(300MHz)、31p-NMR(121MHz)、和13C-NMR(75MHz)光谱被记录在BRUKER AV300核磁共振波谱仪上。使用Gilson HPLC系统纯化合成的核苷衍生物及5′-三磷酸核苷。高分辨率质谱(HR-MS,FAB)被记录在JEOL JM 700或JEOL GC mate光谱仪上。电喷雾电离质谱(MS,ESI)被记录在配备有Waters 2690LC系统的Waters ZMD 4000质量系统或Waters UPLC-MS(H class)系统上。
(2)dPnTP的合成
(2-1)1-(2-脱氧-3-O-乙酰基-β-D-呋喃核糖基)-4-丙炔基-2-硝基吡咯的合成
在1-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-4-丙炔基-2-硝基吡咯(200mg,0.75mmol)与吡啶共沸后,将吡啶(7.5ml)加入残余物中,然后向其中加入4,4′-二甲氧基三苯甲基氯(280mg,0.83mmol),并将混合物在室温下搅拌1小时。通过加入乙酸乙酯和5%碳酸氢钠水溶液将反应溶液分为水层和有机层。将有机层用饱和盐水洗涤。将有机层经无水硫酸钠干燥,且然后在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(二氯甲烷∶甲醇,200∶1,v/v)纯化以获得365mg(86%)的1-(2-脱氧-5-O-二甲氧基三苯甲基-β-D-呋喃核糖基)-4-丙炔基-2-硝基吡咯。在1-(2-脱氧-5-O-二甲氧基三苯甲基-β-D-呋喃核糖基)-4-丙炔基-2-硝基吡咯(160mg,0.28mmol)与吡啶共沸后,将吡啶(2.8ml)加入残余物中,然后向其中加入乙酸酐(53μl,0.56mmol),并将反应溶液在室温下搅拌12小时。通过加入乙酸乙酯和5%碳酸氢钠水溶液将反应溶液分为水层和有机层。将有机层经无水硫酸钠干燥,且然后浓缩。在残余物与甲苯共沸后,将残余物溶于28ml二氯甲烷中。在0℃向该反应溶液中加入二氯乙酸(280μl),并在冰冷却下搅拌混合物15分钟。通过加入5%的碳酸氢钠水溶液将反应溶液分为水层和有机层。将有机层用5%的碳酸氢钠水溶液洗涤。将有机层经无水硫酸钠干燥并在减压下浓缩。然后,将残余物通过硅胶柱色谱法纯化以获得78mg(89%)的1-(2-脱氧-3-O-乙酰基-β-D-呋喃核糖基)-4-丙炔基-2-硝基吡咯。
(2-2)1-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-4-丙炔基-2-硝基吡咯5′-三磷酸的合成
在1-(2-脱氧-3-O-乙酰基-β-D-呋喃核糖基)-4-丙炔基-2-硝基吡咯(31mg,0.1mmol)与吡啶共沸后,将吡啶(100μl)和二恶烷(300μl)加入残余物中,然后向其中加入2-氯-4H-1,3,2-苯并二氧磷-4-酮(2-chloro-4H-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one)(110μl,1M二恶烷溶液),并将混合物在室温下搅拌10分钟。向反应溶液中加入三正丁基胺(100μl)和双(三丁基铵)焦磷酸盐(bis(tributylammonium)pyrophosphate)(300μl,0.5MDMF溶液),并将混合物搅拌10分钟。向其中加入碘/吡啶(2.0ml,1%碘的吡啶-水(98:2v/v)溶液),并将混合物搅拌15分钟。然后,向其中加入5%NaHSO3(150μl),并将反应溶液浓缩。向其中加入水(5.0ml),并将混合物在室温下搅拌30分钟。然后,向其中加入20ml 28%氨水,并将混合物在室温下搅拌2小时。浓缩反应溶液并冷冻干燥。然后,通过DEAE SephadexA-25离子交换柱色谱法(以50mM至1.0M的TEAB线性梯度洗脱)和RP-HPLC纯化残余物,以获得目的1-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-4-丙炔基-2-硝基吡咯5′-三磷酸(31μmol,31%)。
(2-3)化合物的物理性质
(2-3-1)1-(2-脱氧-3-O-乙酰基-β-D-呋喃核糖基)-4-丙炔基-2-硝基吡咯
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ7.90(d,1H,J=2.1Hz),7.30(d,1H,J=2.1Hz),6.60(t,1H,J=6.4Hz),5.22(m,2H),4.13(m,1H),3.65(m,2H),2.62(ddd,1H,J=3.1,6.1,14.3Hz),2.43(m,1H),2.08(s,3H),2.00(s,3H)。C14H17N2O6(M+H)+的HR-MS(FAB,3-NBA基质)计算值309.1087,实测值309.1066。
(2-3-2)1-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-4-丙炔基-2-硝基吡咯5′-三磷酸
1H NMR(300MHz,D2O)δ7.74(d,1H,J=2.1Hz),7.35(d,1H,J=2.1Hz),6.76(t,1H,J=6.1Hz),4.63(m,1H),4.24(m,3H),3.21(q,20H,J=7.3Hz),2.64(ddt,1H,J=5.2,13.9Hz),2.49(ddt,1H,J=6.2,14.0Hz),1.99(s,3H),1.28(t,29H,J=7.3Hz)。31P NMR(121MHz,D2O)δ-10.16(d,1P,J=19.8Hz),-10.66(d,1P,J=20.0Hz),-22.58(t,1P,J=20.0Hz)。C12H17O14N2P3(M-H)-的MS(ESI)计算值504.97,实测值504.82(M-H)-。UV(10mM磷酸钠缓冲液,pH 7.0)λ最大值=373nm(ε9500)。
(3)NH2-Cl-dPnTP的合成
(3-1)1-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-4-(3-(三氟乙酰氨基)-1-丙炔基)-2-硝基吡咯(TFA-NH-Cl-dPn)的合成
在0℃下,将二氯甲烷中乙酸酐(4.6ml,33mmol)的溶液(30ml)加入二氯甲烷中炔丙胺(1.0ml,15mmol)及吡啶(3.7ml)的溶液(30ml)中。将反应溶液在室温下搅拌12小时。通过加入二氯甲烷和5%碳酸氢钠水溶液将产物分为水层和有机层。将有机层用5%碳酸氢钠洗涤,且然后经无水硫酸钠干燥。将有机层在减压下浓缩,以获得TFA-NH接头(925mg)。将TFA-NH接头(227mg,1.5mmol)加入DMF中1-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-4-碘-2-硝基吡咯(354mg,1.0mmol)、CuI(30mg,0.16mmol)、Pd(PPh3)4(58mg,0.05mmol)、和TEA(209μl,1.5mmol)的溶液(5.0ml)中。将反应溶液在室温下搅拌12小时,且然后在减压下浓缩。通过硅胶柱色谱法纯化(以10%甲醇/二氯甲烷溶液洗脱)和RP-HPLC(H2O中35%至50%的CH3CN,12min)获得TFA-NH-Cl-dPn(330mg,88%)。
(3-2)1-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基吡咯5′-三磷酸(NH2-Cl-dPnTP)的合成
在TFA-NH-Cl-dPn核苷(75mg,0.2mmol)与吡啶和甲苯共沸干燥后,将质子海绵(66mg,0.3mmol)添加至残余物,并将混合物溶解于(CH3O)3PO(1.0ml)中。向溶液中加入POCl3(26μl,0.26mmol),并将混合物在0℃下搅拌1小时。将三正丁基胺(240μl)和双(三正丁基铵)焦磷酸盐(2.0ml,0.5M DMF溶液)加入反应溶液中,并将混合物搅拌30分钟。然后,向其中加入0.5M三乙铵碳酸盐缓冲溶液(TEAB)(1ml)和水(10ml)。将反应溶液在室温下搅拌1小时,且然后冷冻干燥。向残余物中加入H2O(10ml),然后向其中加入28%NH4OH(40ml),并将混合物在室温下搅拌1小时。将反应溶液在减压下浓缩。然后,通过DEAE Sephadex A-25离子交换柱色谱法(以50mM至1.0M的TEAB线性梯度洗脱)和RP-HPLC(100mM TEAA中28%CH3CN,15min)纯化获得NH2-Cl-dPnTP(54μmol,27%)。
(3-3)化合物的物理性质
(3-3-1)1-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-4-[3-(三氟乙酰氨基)-1-丙炔基]-2-硝基吡咯(TFA-NH-Cl-dPn)
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ10.04(s,1H),7.98(s,1H),7.34(s,1H),6.54(t,1H,J=5.5Hz),5.27(d,1H,J=4.4Hz),5.10(t,1H,J=4.9Hz),4.22(bs,3H),3.84(m,1H),3.67-3.54(m,2H),2.44(m,1H),2.26(m,1H)。C14H15F3N3O6(M+H)+的HRMS(FAB,3-NBA基质)计算值378.0913,实测值378.0882。
(3-3-2)1-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基吡咯5′-三磷酸(NH2-Cl-dPnTP)
1H NMR(300MHz,D2O)δ7.96(d,1H,J=2.1Hz),7.32(d,1H,J=2.2Hz),6.67(t,1H,J=6.4Hz),4.55(m,1H),4.24-4.12(m,3H),3.91(s,2H),3.11(q,16H,J=7.3Hz),2.58(dt,1H,J=6.3和13.8Hz),2.41(ddd,1H,J=1.6,4.8,和14.0Hz),1.19(t,24H,J=7.3Hz)。31PNMR(121MHz,D2O)δ-8.51(bs,1P),-10.70(d,1P,J=19.4Hz),-22.19(t,1P,J=19.9Hz)。C12H18O14N3P3(M-H)-的MS(ESI)计算值520.20,实测值,520.24。UV(10mM磷酸钠缓冲液,pH7.0)λ最大值=364nm(ε10,600)。
(4)NH2-C3-dPnTP的合成
(4-1)1-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-4-[5-三氟乙酰氨基-1-戊炔基]-2-硝基吡咯的合成
向1-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-4-碘-2-硝基吡咯(373mg,1.05mmol)的DMF溶液(5.3ml)中加入碘化亚铜(I)(32mg,168μmol)和四(三苯膦)钯(0)(61mg,53μmol),向其中进一步加入三乙胺(220μl,1.6mmol),并将混合物于室温下在氩气气氛中搅拌。向该溶液中逐滴加入5-三氟乙酰氨基-1-戊炔(283mg,1.6mmol)的DMF溶液(3.0ml),并将混合物在室温下搅拌19小时。在减压下浓缩后,通过硅胶柱色谱法(展开剂:二氯甲烷∶甲醇=100∶0→90∶10)和C18-HPLC纯化粗产物以获得目的化合物(355mg,收率:83%)。
(4-2)1-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-4-[5-氨基-1-戊炔基]-2-硝基吡咯5′-三磷酸(NH2-C3-dPnTP)的合成
1-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-4-[5-三氟乙酰氨基-1-戊炔基]-2-硝基吡咯(101mg,250μmol)经受与无水吡啶共沸两次,并经受与无水甲苯共沸两次。将残余物和质子海绵(80mg,375μmol)溶解于磷酸三甲酯(1.25ml)中。向溶液中加入三氯氧磷(30μl,325μmol),并将混合物在0℃下搅拌1小时。然后,向其中加入三正丁基胺(300μl,1.25mmol)和双(三正丁基铵)焦磷酸盐的0.5M DMF溶液(2.5ml),并将混合物搅拌30分钟。通过向其中加入0.5M的三乙铵碳酸盐缓冲溶液(TEAB)(1.25ml)终止反应。向其中加入水(12.5ml),并将混合物在室温下搅拌1小时。向该溶液中加入浓氨水(50ml),并将混合物在室温下搅拌1小时。在减压下浓缩溶液。然后,通过聚苯乙烯柱色谱法(1.5×20em,0%至15%乙腈的50mM TEAB溶液)和DEAE Sephadex A-25柱色谱法(1.5×30em,线性浓度梯度;50mM至0.8M的TEAB溶液)纯化残余物。由DEAE纯化获得的部分(3/5的合成量)NH2-C3-dPnTP通过C8-HPLC(SenshuPak,浓度梯度;2.5%至50%乙腈的100mM三乙铵乙酸盐缓冲溶液(pH 7.0))纯化(37.8μmol)。
(4-3)化合物的物理性质
(4-3-1)1-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-4-[5-三氟乙酰氨基-1-戊炔基]-2-硝基吡咯
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ9.47(brs,1H),7.91(d,1H,J=2.2Hz),7.27(d,1H,J=2.2Hz),6.55(t,1H,J=5.7Hz),5.29(d,1H,J=4.5Hz),5.10(t,1H,J=5.2Hz),4.24(m,1H),3.85(dt,1H,J=4.1,3.9Hz),3.66(ddd,1H,J=12.1,5.2,3.7Hz),3.57(ddd,1H,J=12.1,4.9,4.8Hz),3.29(m,2H),2.48-2.39(m,1H),2.42(t,2H,J=7.0Hz),2.23(ddd,1H,J=13.4,5.8,5.7Hz),1.73(m,2H)。C16H19F3N3O6(M+H)+的HRMS(FAB,3-NBA基质)计算值406.1226,实测值406.1225。
(4-3-2)1-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-4-[5-氨基-1-戊炔基]-2-硝基吡咯5′-三磷酸(NH2-C3-dPnTP)。1H NMR(300MHz,D2O)δ7.87(d,1H,J=1.6Hz),7.25(d,1H,J=2.0Hz),6.68(t,1H,J=5.8Hz),4.56(m,1H),4.24-4.13(m,3H),3.11(q,J=7.3Hz,NH2CH2-的信号是叠加的),2.65-2.36(m,4H),1.85(m,2H),1.19(t,22H,J=7.4Hz)。31P NMR(121MHz,D2O)δ-9.15(1P),-11.13(d,1P,J=19.4Hz),-22.61(t,1P,J=20.0Hz)。C14H21N3O14P3(M-H)-的MS(ESI)计算值548.02,实测值548.09。UV(10mM磷酸钠缓冲液,pH 7.0)λ最大值=374nm(ε10,600)。
(5)Diol3o3-dPnTP的合成
(5-1)5-(4-戊炔氧基)戊烷-1,2-二乙酸酯(Di(OAc)3o3接头)的合成
将苯中4-戊炔-1-醇(4.65ml,50mmol)、5-溴-1-戊烯(17.8ml,150mmol)、和KOH(12.6g,225mmol)的溶液(50ml)加热回流12小时。过滤后,通过加入乙酸乙酯和10%氯化铵水溶液将反应溶液分为水层和有机层。将有机层用10%氯化铵水溶液和饱和氯化钠水溶液洗涤,经无水硫酸钠干燥,且然后在减压下浓缩。5-(4-戊炔氧基)-1-戊烯(6.5g)通过硅胶柱色谱法(以10%EtOAc的己烷溶液洗脱)被部分纯化。向丙酮/H2O/tBuOH(4∶1∶1,214ml)中5-(4-戊炔氧基)-1-戊烯(6.5g)和N-甲基吗啉-N-氧化物(10.0g,85.4mmol)的溶液中加入OsO4(543mg,2.0mmol),并将混合物在室温下搅拌1小时。添加NaHSO3(1.5g)后,将所得沉淀物滤出。残余物用甲醇洗涤,并将滤液在减压下浓缩。将产物通过硅胶柱色谱法(以3%甲醇的二氯甲烷溶液洗脱)部分纯化,以获得5-(4-戊炔氧基)戊烷-1,2-二醇(2.9g)。5-(4-戊炔氧基)戊烷-1,2-二醇(2.9g)与吡啶共沸干燥后,向残余物中加入吡啶(78ml),并向其中加入乙酸酐(5.9ml,62.4mmol)。将反应溶液在室温下搅拌9小时。将产物用乙酸乙酯和5%碳酸氢钠水溶液萃取。将有机层经无水硫酸钠干燥并在减压下浓缩。通过硅胶柱色谱法纯化(以20%己烷的二氯甲烷溶液洗脱)获得5-(4-戊炔氧基)戊烷-1,2-二乙酸酯(Di(OAc)3o3接头)(3.27g,24%,3个步骤)。
(5-2)1-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-4-[5-(4-戊炔氧基)戊烷-1,2-二乙酸酯基)-1-丙炔基]-2-硝基吡咯(Di(OAc)3o3-dPn)的合成
将Di(OAc)3o3接头(180mg,0.7mmol)加入DMF(2.5ml)中1-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-4-碘-2-硝基吡咯(177mg,0.5mmol)、CuI(19mg,0.1mmol)、Pd(PPh3)4(29mg,0.025mmol)、和TEA(104μl,0.75mmol)的溶液中。将反应溶液在室温下搅拌13小时,并在减压下浓缩。将产物通过硅胶柱色谱法(以5%甲醇的二氯甲烷溶液洗脱)和RP-HPLC(以50%至55%乙腈水溶液的线性梯度经过10分钟洗脱)纯化,以获得Di(OAc)3o3-dPn)(60mg,24%)。
(5-3)1-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-4-[5-(4-戊炔氧基)戊烷-1,2-二醇)-1-丙炔基]-2-硝基吡咯5′-三磷酸(Diol3o3-dPnTP)的合成
将Di(OAc)3o3-dPn核苷(50mg,0.1mmol)与吡啶和甲苯共沸干燥。向残余物中加入质子海绵(33mg,0.15mmol),并将混合物溶解于(CH3O)3PO(500μl)。在0℃下向该溶液中加入POCl3(13μl,0.13mmol),并将混合物搅拌1.5小时。向反应溶液中加入三正丁基胺(120μl)和双三正丁基铵焦磷酸盐(1.0ml,0.5M DMF溶液),并将混合物搅拌30分钟。向反应溶液中加入0.5M的三乙铵碳酸盐缓冲溶液(TEAB)(500μl)和水(5ml),并将混合物在0℃下搅拌30分钟。冷冻干燥后,向残余物中加入H2O(2.0ml),然后向其中加入28%NH4OH(20ml),并将混合物在室温下搅拌1小时。将反应溶液在减压下浓缩。然后,通过DEAE Sephadex A-25离子交换色谱法(以50mM至1.0M的TEAB线性梯度洗脱)和RP-HPLC(以5%至50%乙腈的100mMTEAA溶液经过12分钟洗脱)纯化产物,以获得Diol3o3-dPnTP(18μmol,18%)。
(5-4)化合物的物理性质
(5-4-1)5-(4-戊炔氧基)戊烷-1,2-二乙酸酯(Di(OAc)3o3接头)
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ4.96(m,1H),4.16(dd,1H,J=3.3,12.0Hz),4.01(dd,1H,J=6.4,11.9Hz),3.39(t,2H,J=6.4Hz),3.33(t,2H,J=6.2Hz),2.74(t,1H,J=2.7Hz),2.18(dt,2H,J=2.6,7.2Hz),1.66-1.45(m,6H)。C14H23O5(M+H)+的HR-MS(FAB,NBA基质)计算值271.1545,实测值271.1592。
(5-4-2)1-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-4-[5-(4-戊炔氧基)戊烷-1,2-二乙酸酯基)-1-丙炔基]-2-硝基吡咯(Di(OAc)3o3-dPn)
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ7.91(d,1H,J=2.2Hz),7.28(d,1H,J=2.2Hz),6.55(t,1H,J=5.7Hz),5.29(d,1H,J=4.5Hz),5.10(t,1H,J=5.2Hz),4.97(m,1H),4.24(m,1H),4.16(dd,1H,J=3.3,12.0Hz),4.01(dd,1H,J=6.5,11.9Hz),3.85(m,1H),3.70-3.53(m,2H),3.44(t,2H,J=6.2Hz),3.36(t,2H,J=6.1Hz),2.45-2.39(m,3H),2.28-2.19(m,2H),2.01,2.00(s,s,3H,3H),1.76-1.47(m,6H)。C23H33N2O10(M+H)+的HR-MS(FAB,NBA基质)计算值497.2135,实测值497.2110。
(5-4-3)1-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-4-[5-(4-戊炔氧基)戊烷-1,2-二醇)-1-丙炔基]-2-硝基吡咯5′-三磷酸(Diol3o3-dPnTP)
1H NMR(300MHz,D2O)δ7.73(d,1H,J=2.1Hz),7.37(d,1H,J=2.1Hz),6.76(t,1H,J=6.1Hz),4.62(m,1H),4.26-4.20(m,3H),3.72-3.42(m,7H),3.20(q,22H,J=7.3Hz),2.64(m,1H),2.53-2.44(m,3H),1.89-1.41(m,6H),1.28(t,32H,J=7.3Hz)。31P NMR(121MHz,D2O)δ-10.07(d,1P,J=19.7Hz),-10.63(d,1P,J=20.1Hz),-22.55(t,1P,J=20.0Hz)。C19H30N2O17P3(M-H)-的MS(ESI)计算值651.37,实测值651.39。UV(10mM磷酸钠缓冲液,pH7.0)λ最大值=374nm(ε9,200)。
(6)Diox6-dPnTP的合成
(6-1)2-(7-辛炔基)-1,3-二氧戊环(Diox6接头)的合成
向DMSO中乙炔锂乙二胺复合物(563mg,5.5mmol)的溶液(25ml)中加入8-溴-1-辛烯(839μl,5.0mmol)。将反应溶液在10℃下搅拌2小时。通过加入乙醚和水将产物分为水层和有机层。然后,将有机层用水洗涤,经无水硫酸钠干燥,且然后在减压下浓缩。产物通过硅胶柱色谱法(以25%己烷的二氯甲烷溶液洗脱)部分纯化,以获得癸-1-烯-9-炔(457mg,67%)。向丙酮/H2O/tBuOH(4∶1∶1,16.5ml)中癸-1-烯-9-炔(450mg)和N-甲基吗啉-N-氧化物(775mg,6.6mmol)的溶液中加入OsO4(42mg,0.17mmol),并将混合物在室温下搅拌30分钟。向反应溶液加入NaHSO3(115mg)后,将所得沉淀物滤出。将沉淀物用甲醇洗涤,并合并滤液并在减压下浓缩。将产物通过硅胶柱色谱法(以3%甲醇的二氯甲烷溶液洗脱)部分纯化,以获得癸-9-炔-1,2-二醇。向丙酮/H2O(7∶3,33ml)中癸-9-炔-1,2-二醇的溶液中加入NaIO4(10mg,4.8mmol),并将混合物在室温下搅拌12小时。通过加入乙酸乙酯和水将反应溶液分为水层和有机层。将有机层经无水硫酸钠干燥,且然后在减压下浓缩,以获得310mg的壬-8-炔醛(2个步骤,收率:68%)。将苯(11ml)中壬-8-炔醛(310mg)、对-甲苯磺酸一水合物(42mg,0.22mmol)和乙二醇(279mg,4.5mmol)的溶液加热回流2小时。将反应溶液在减压下浓缩。产物通过硅胶柱色谱法(以二氯甲烷洗脱)纯化,以获得2-(7-辛炔基)-1,3-二氧戊环(310mg,76%)。
(6-2)4-(2-(7-辛炔基)-1,3-二氧戊环)-1-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-2-硝基吡咯(Diox-C6CC-dPn)的合成
向DMF中1-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-4-碘-2-硝基吡咯(177mg,0.5mmol)、CuI(15mg,0.08mmol)、Pd(PPh3)4(29mg,0.025mmol)、和TEA(105μl,0.75mmol)的溶液(2.5ml)中加入2-(7-辛炔基)-1,3-二氧戊环(137mg,0.37mmol),并将混合物在室温下搅拌12小时。将反应溶液在减压下浓缩。然后,将产物通过硅胶柱色谱法(以2%甲醇的二氯甲烷溶液洗脱)和C18RP-HPLC(54%至55%乙腈水溶液)纯化,以获得180mg(收率:88%)的4-(2-(7-辛炔基)-1,3-二氧戊环)-1-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-2-硝基吡咯(Dio-C6CC-dPn)。
(6-3)4-(2-(7-辛炔基)-1,3-二氧戊环)-1-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-2-硝基吡咯5′-三磷酸(Diox6-dPnTP)的合成
在4-(2-(7-辛炔基)-1,3-二氧戊环)-1-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-2-硝基吡咯(82mg,0.2mmol)与吡啶和甲苯共沸干燥后,向残余物中加入质子海绵(66mg,0.3mmol)和(CH3O)3PO(1.0ml)。向该溶液中加入POCl3(26μl,0.26mmol),并将混合物在℃下搅拌1.5小时。向该反应溶液中加入三正丁基胺(240μl)和双三正丁基铵焦磷酸盐(2.0ml,0.5M DMF溶液),并将混合物搅拌30分钟。向反应溶液中加入0.5M三乙铵碳酸盐缓冲溶液(TEAB)(1ml)和水(10ml),并将混合物在0℃下搅拌30分钟。产物通过DEAE Sephadex A-25离子交换柱色谱(以50mM至1.0M的TEAB线性梯度洗脱)和RP-HPLC纯化,获得4-(2-(7-辛炔基)-1,3-二氧戊环)-1-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-2-硝基吡咯5′-三磷酸(Diox6-dPnTP)(收率:29μmol)。
(6-4)化合物的物理性质
(6-4-1)2-(7-辛炔基)-1,3-二氧戊环(Diox6接头)
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ4.86(t,1H,J=4.8Hz),3.99-3.86(m,4H),2.20(dt,2H,J=2.6,7.1Hz),1.95(t,1H,J=2.7Hz),1.66(m,2H),1.58-1.39(m,8H)。C11H19O2(M+H)+的HR-MS(FAB,NBA基质)计算值183.1385,实测值183.1579。
(6-4-2)4-(2-(7-辛炔基)-1,3-二氧戊环)-1-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-2-硝基吡咯(Diox6-dPn)
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ7.90(d,1H,J=2.2Hz),6.27(d,1H,J=5.8Hz),5.28(d,1H,J=4.5Hz),5.10(t,1H,J=5.2Hz),4.75(t,1H,J=4.8Hz),4.24(m,1H),3.88-3.53(m,7H),2.43(m,1H),2.36(t,2H,J=7.1Hz),2.23(m,1H),1.56-1.34(m,10H)。C20H29O7N2(M+H)+的HR-MS(FAB,NBA基质)计算值409.1975,实测值409.1979。
(6-4-3)4-(2-(7-辛炔基)-1,3-二氧戊环)-1-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-2-硝基吡咯5′-三磷酸(Diox6-dPnTP)
1H NMR(300MHz,D2O)δ7.72(d,1H,J=2.1Hz),7.37(d,1H,J=2.1Hz),6.77(t,1H,J=6.1Hz),4.93(t,1H,J=5.0Hz),4.63(m,1H),4.27-4.18(m,3H),4.08-3.87(m,4H),3.21(q,19H,J=7.3Hz),2.65(dt,1H,J=6.1Hz),2.48(dt,1H,J=6.2Hz),2.40(t,2H,J=7.0Hz),1.69(m,2H),1.59(m,2H),1.50-1.42(m,6H),1.29(t,28H,J=7.3Hz)。31P NMR(121MHz,D2O)δ-10.23(d,1P,J=19.6Hz),-10.63(d,1P,J=19.7Hz),-22.59(t,1P,J=19.8Hz)。C20H31N2O16P3(M-H)-的MS(ESI)计算值647.09,实测值647.14。UV(10mM磷酸钠缓冲液,pH 7.0)λ最大值=373nm(ε9900)。
(7)Diol6-dPnTP的合成
(7-1)9-癸炔-1,2-二基二乙酸酯的合成
向DMSO中乙炔锂乙二胺复合物(563mg,5.5mmol)的溶液(5ml)中加入8-溴-1-辛烯(839μl,5.0mmol),并将混合物在10℃搅拌2小时。通过加入乙醚和水将反应溶液分为水层和有机层。将有机层用水洗涤,经无水硫酸钠干燥,且然后在减压下浓缩。产物通过硅胶柱色谱法(以己烷洗脱)纯化,以获得癸-1-烯-9-炔(633mg,93%)。向丙酮/H2O/tBuOH(4∶1∶1,23ml)中癸-1-烯-9-炔(633mg)和N-甲基吗啉-N-氧化物(1.08g,9.2mmol)的溶液中加入OsO4(58mg,0.23mmol),并将混合物在室温下搅拌1小时。加入NaHSO3(160mg)后,将所得沉淀物滤出。将沉淀物用甲醇洗涤,且然后将滤液合并并在减压下浓缩。产物通过硅胶柱色谱法(以3%甲醇的二氯甲烷溶液洗脱)纯化,以获得癸-9-炔-1,2-二醇(494mg)。癸-9-炔-1,2-二醇(494mg)与吡啶共沸后,向残余物中加入吡啶(10ml)。向其中加入乙酸酐(2.17ml,23mmol),并将混合物在室温下搅拌13小时。通过加入乙酸乙酯和5%碳酸氢钠将反应溶液分为水层和有机层。将有机层用5%碳酸氢钠水溶液洗涤,经无水硫酸钠干燥,且然后在减压下浓缩。产物通过硅胶柱色谱法(以1%甲醇的二氯甲烷溶液洗脱)纯化,以获得9-癸炔-1,2-二基二乙酸酯(414mg,2个步骤,收率:35%)。
(7-2)4-(9-癸炔-1,2-二基二乙酸酯基)-1-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-2-硝基吡咯(Di-OAc-6-dPn)的合成
向DMF中1-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-4-碘-2-硝基吡咯(354mg,1.0mmol)、CuI(38mg,0.2mmol)、Pd(PPh3)4(58mg,0.05mmol)、和TEA(208μl,1.5mmol)的溶液(5ml)中加入9-癸炔-1,2-二基二乙酸酯(381mg,1.5mmol),并将混合物在室温下搅拌20小时。通过加入乙酸乙酯和水将反应溶液分成水层和有机层。将有机层用水洗涤,经无水硫酸钠干燥,且然后在减压下浓缩。产物通过硅胶柱色谱法(以3%甲醇的二氯甲烷溶液洗脱)和RP-HPLC(55%乙腈水溶液)纯化,以获得500mg(收率:99%)的4-(9-癸炔-1,2-二基二乙酸酯基)-1-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-2-硝基吡咯(Di-OAc-6-dPn)。
(7-3)4-(9-癸炔-1,2-二醇)-1-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-2-硝基吡咯5′-三磷酸(Diol6-dPnTP)的合成
4-(9-癸炔-1,2-二基二乙酸酯基)-1-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-2-硝基吡咯(48mg,0.1mmol)与吡啶和甲苯共沸干燥后,向残余物中加入质子海绵(33mg,0.15mmol)和(CH3O)3PO(500μl)。在0℃下向该溶液中加入POCl3(13μl,0.13μmol),并将混合物搅拌1.5小时。向其中加入三正丁基胺(120μl)和双三正丁基铵焦磷酸盐(1.0ml,0.5M DMF溶液),并将混合物搅拌30分钟。然后,向其中加入0.5M三乙铵碳酸盐缓冲溶液(TEAB)(500μl)和水(5.0ml),并将混合物在0℃下搅拌30分钟。冷冻干燥后,向残余物中加入H2O(2.0ml)和28%NH4OH(20ml),并将混合物在室温下搅拌1小时。在减压下浓缩后,产物通过DEAESephadexA-25离子交换柱色谱法(以50mM至1.0M的TEAB线性梯度洗脱)和RP-HPLC(5%至50%乙腈的100mM TEAA溶液,12min)纯化,以获得18μmol(收率:18%)的4-(9-癸炔-1,2-二醇)-1-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-2-硝基吡咯5′-三磷酸(Diol6-dPnTP)。
(7-4)化合物的物理性质
(7-4-1)9-癸炔-1,2-二基二乙酸酯1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ4.94(m,1H),4.07(ddd,2H,J=3.2,6.5,48.3Hz),2.72(t,1H,J=2.7Hz),2.13(dt,2H,J=2.6,6.8Hz),2.00(s,3H9,1.99(s,3H),1.52-1.25(m,10H)。C14H23O4(M+H)+的HR-MS(FAB,NBA基质)计算值255.1596,实测值255.1605。
(7-4-2)4-(9-癸炔-1,2-二基二乙酸酯基)-1-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-2-硝基吡咯(Di-OAc-6-dPn)1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ7.89(d,1H,J=2.2Hz),7.26(d,1H,J=2.2Hz),6.54(t,1H,J=5.8Hz),5.27(d,1H,J=4.5Hz),5.09(t,1H,J=5.2Hz),4.94(m,1H),4.23(m,1H),4.07(ddd,2H,J=3.2,6.5,48.8Hz),3.83(m,1H),3.68-3.52(m,2H),2.42(m,1H),2.35(t,2H,J=7.1Hz),2.22(m,1H),2.00(s,3H),1.99(s,3H),1.52-1.28(m,10H)。C23H33O9N2(M+H)+的HR-MS(FAB,NBA基质)计算值481.2186,实测值481.2206。
(7-4-3)4-(9-癸炔-1,2-二醇)-1-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-2-硝基吡咯5′-三磷酸(Diol6-dPnTP)1H NMR(300MHz,D2O)δ7.72(d,1H,J=2.1Hz),7.35(d,1H,J=2.1Hz),6.76(t,1H,J=6.1Hz),4.62(m,1H),4.26-4.20(m,3H),3.70(m,1H),3.59(dd,1H,J=3.8,11.6Hz),3.46(dd,1H,J=6.9,11.6Hz),3.20(q,20H,J=7.3Hz),2.64(dt,1H,J=6.2,13.0Hz),2.47(dt,1H,J=6.2,14.0Hz),2.40(t,2H,J=7.0Hz),1.60-1.25(m,10H),1.28(t,30H,J=7.3Hz)。31P NMR(121MHz,D2O)δ-10.20(d,1P,J=19.9Hz),-10.64(d,1P,J=20.1Hz),-22.59(t,1P,J=20.0Hz)。C19H31N2O16P3(M-H)-的MS(ESI)计算值635.08,实测值635.08。UV(10mM磷酸钠缓冲液,pH 7.0)λ最大值=374nm(ε9400)。
(8)COOH-Cl-dPnTP的合成
(8-1)1-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-4-(3-羧基丙酰氨基-1-丙炔基)-2-硝基吡咯5′-三磷酸(COOH-Cl-dPnTP)的合成
向TEAA(pH 7.0,500μL)中NH2-Cl-dPnTP的200mM溶液中加入DMSO中琥珀酸酐(4mg,40μmol)的溶液(500μL),并将混合物在室温下静置1小时。冷冻干燥后,残余物通过HPLC(以100mM三乙铵乙酸盐溶液中0%至30%乙腈线性梯度经过10分钟洗脱)纯化,以获得8.4μmol(收率:84%)的1-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-4-(3-羧基丙酰氨基-1-丙炔基)-2-硝基吡咯5′-三磷酸(COOH-Cl-dPnTP)。
(8-2)化合物的物理性质
(COOH-Cl-dPnTP)1H-NMR(300MHz,D2O)δ(ppm)7.73(1H,d,J=2.0Hz),7.36(d,1H,J=2.0Hz),6.70(t,1H,J=5.9和6.3Hz),4.59-4.54(m,1H),4.21-4.15(m,3H),4.10(s,2H),3.15(q,24H,J=7.3Hz),2.64-2.55(m,1H),2.48-2.39(m,5H),1.23(t,36H,J=7.3Hz)。31P-NMR(121MHz,D2O)δ(ppm)-10.66(d,1P,J=19.6Hz),-11.27(d,1P,J=19.9Hz),-23.16(t,1P,J=19.8和20.1Hz)。C16H21O17N3P3(M-H)-的MS(ESI)计算值620.01,实测值619.91。UV(10mM磷酸钠缓冲液,pH 7.0)λ最大值365nm(ε9800)。
(9)1-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-4-(3-(2-吡啶基二硫代)丙酰氨基-1-丙炔基)-2-硝基吡咯5′-三磷酸(PDP-Cl-dPnTP)的合成
(9-1)PDP-Cl-dPnTP的合成
向NH2-Cl-dPnTP(20μmol)的0.1M NaHCO3-Na2CO3缓冲溶液(pH8.5,600μl)中加入DMF中琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)-丙酸酯(PDP-SE,Invitrogen Corp.)(12.5mg,40μmol)溶液(300μl),并将混合物在室温下搅拌3小时。通过向反应溶液中加入28%氨水(1ml)终止反应,然后为冷冻干燥。产物通过DEAE Sephadex A-25离子交换柱色谱法(1.5cm×30cm,以50mM至1.0M的TEAB线性梯度洗脱)和C18HPLC纯化,以获得3.8μmol的PDP-dPnTP(19%)。
(9-2)化合物的物理性质
PDP-Cl-dPnTP:1H NMR(300MHz,D2O)δ8.38(m,1H),7.89-7.83(m,2H),7.80(d,1H,J=2.1Hz),7.38(d,1H,J=2.1Hz),7.29(m,1H),6.75(t,1H,J=6.0Hz),4.62(m,1H),4.23(m,3H),4.08(s,2H),3.21(q,19H,J=7.3Hz),3.12(t,2H,J=6.7Hz),2.69(t,2H,J=6.6Hz),2.62(m,1H),2.49(m,1H),1.29(t,30H,J=7.3Hz)。31PNMR(121MHz,D2O)δ-10.02(d,1P,J=19.9Hz),-10.68(d,1P,J=20.0Hz),-22.48(t,1P,J=19.9Hz)。C20H24N4O15P3S2(M-H)-的MS(ESI)计算值717.00,实测值717.08。UV(10mM磷酸钠缓冲液,pH 7.0)λ最大值285nm(ε7600),365nm(ε10700)。
(10)氨基酸结合的Cl-dPnTP(a.a.-Cl-dPnTP)的合成
(10-1)Fmoc-氨基酸琥珀酰亚胺酯(Fmoc-a.a.-SE)的合成
将DMF中Fmoc-L-氨基酸(0.5mmol)、1-羟基琥珀酰亚胺(0.6mmol)、和N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐(0.6mmol)的溶液(1ml)在室温下搅拌1小时。将反应溶液加入30ml水中。将所得沉淀物过滤,用水洗涤,并在减压下干燥。通过加入乙酸乙酯和水分别将Fmoc-His(Fmoc)-SE、Fmoc-Ser(OTBDMS)-SE、和Fmoc-Lys(Fmoc)-SE的反应溶液各自分成水层和有机层。将有机相用水洗涤两次,且然后经硫酸钠干燥。将有机相在减压下浓缩。残余物通过硅胶柱色谱法(以1%甲醇的二氯甲烷溶液洗脱)纯化,以获得Fmoc-Phe-SE(195mg,81%)、Fmoc-Tyr-SE(216mg,86%)、Fmoc-Trp-SE(219mg,84%)、Fmoc-His(Fmoc)-SE(200mg,57%)、Fmoc-Ser(TBDMS)-SE(222mg,82%)、和Fmoc-Lys(Fmoc)-SE(278mg,81%)。
(10-2)氨基酸结合的Cl-dPnTP(a.a.-Cl-dPnTP)的合成
(10-2-1)Phe-Cl-dPnTP、Tyr-Cl-dPnTP、和Trp-Cl-dPnTP:
向DMF中1-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-4-(3-氨基-丙炔基)-2-硝基吡咯5′-三磷酸(19μmol)的溶液(1ml)中加入DMF中Fmoc-氨基酸琥珀酰亚胺酯(Fmoc-a.a.-SE)(29μmol)的溶液(1ml),并将混合物在室温下静置12小时。向反应溶液中加入哌啶(100μl),并将混合物在室温下搅拌3分钟。向反应溶液中加入水(2ml),随后以乙酸乙酯(4ml)洗涤3次。向水相中加入水(10ml)和2M TEAB(100μl),并将混合物冷冻干燥。将残余物在DEAE Sephadex A-25柱(以50mM至1M TEAB线性梯度洗脱)上纯化且然后通过HPLC纯化,以获得1-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-4-(3-(L-酪氨酸酰胺基)-1-丙炔基)-2-硝基吡咯5′-三磷酸(Tyr-Cl-dPnTP,11.3μmol,收率:59%,HPLC:以100mM三乙胺乙酸盐缓冲液中0%至40%乙腈线性梯度经过15分钟洗脱)、1-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-4-(3-(L-色氨酸酰胺基)-1-丙炔基)-2-硝基吡咯5′-三磷酸(Trp-Cl-dPnTP,12.1μmol,收率:64%,HPLC:以100mM三乙胺乙酸盐缓冲液中10%至50%乙腈线性梯度经过10分钟洗脱)、和1-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-4-(3-(L-苯丙氨酸酰胺基)-1-丙炔基)-2-硝基吡咯5′-三磷酸(Phe-Cl-dPnTP,11.4μmol,收率:60%,HPLC:以100mM三乙胺乙酸盐缓冲液中0%至50%乙腈线性梯度经过10分钟洗脱)。
(10-2-2)His-Cl-dPnTP和Ser-Cl-dPnTP:
向DMF中1-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-4-(3-氨基-丙炔基)-2-硝基吡咯5′-三磷酸(19μmol)的溶液(1ml)中加入DMF中Fmoc氨基酸琥珀酰亚胺酯(Fmoc-a.a.-SE)(29μmol)的溶液(1ml),并将混合物在室温下搅拌24小时。向反应溶液中加入水(8ml),随后以乙酸乙酯(4ml)洗涤1次。包含在水相中的含有Fmoc基团的三磷酸通过HPLC(组氨酸:以100mM三乙胺乙酸盐缓冲液中20%至50%乙腈线性梯度经过10分钟洗脱,丝氨酸:以100mM三乙胺乙酸盐缓冲液中30%乙腈经过10分钟洗脱)纯化,且然后冷冻干燥。将残余物溶解在DMF(2.0ml)中,并将溶液在室温下用哌啶(100μl)处理5分钟。向反应溶液中加入H2O(4.0ml),随后以乙酸乙酯(4ml)洗涤3次。向水相中加入H2O(4ml)和2M TEAB(100μl),并将混合物冷冻干燥。将残余物在DEAE Sephadex A-25柱(以50mM至1M TEAB线性梯度洗脱)上纯化且然后通过HPLC纯化,以获得1-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-4-(3-(L-组氨酸酰胺基)-1-丙炔基)-2-硝基吡咯5′-三磷酸(His-Cl-dPnTP,8.8μmol,收率:46%,HPLC:以100mM三乙胺乙酸盐缓冲液中0%至40%乙腈线性梯度经过15分钟洗脱)和1-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-4-(3-(L-丝氨酸酰胺基)-1-丙炔基)-2-硝基吡咯5′-三磷酸(Ser-Cl-dPnTP,10.3μmol,收率:54%,HPLC:以100mM三乙胺乙酸盐缓冲液中0%至30%乙腈线性梯度经过13分钟洗脱)。
(10-3)化合物的物理性质
(10-3-1)Fmoc-氨基酸琥珀酰亚胺酯(Fmoc-a.a.-SE)
Fmoc-Phe-SE:1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ8.24(d,1H,J=8.5Hz),7.88(d,2H,J=7.5Hz),7.62(dd,2H,J=2.9和7.4Hz),7.43-7.21(m,9H),4.73-4.65(m,1H),7.29-4.14(m,3H),3.25(dd,1H,J=4.3和13.8Hz),3.05(dd,1H,J=11.0和13.8Hz),2.84(s,4H)。Fmoc-Tyr-SE:1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ9.23(s,1H),8.19(d,1H,J=8.5Hz),7.89(d,2H,J=7.5Hz),7.65-7.60(m,2H),7.44-7.39(m,2H),7.34-7.27(m,2H),7.14(d,2H,J=8.4Hz),7.68(d,2H,J=8.5Hz),4.61-4.53(m,1H),4.26-4.15(m,3H),3.12(dd,1H,J=4.3和13.8Hz),2.92(dd,1H,J=10.7和13.8Hz),2.83(s,4H)。Fmoc-Trp-SE:1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ10.95(s,1H),8.24(d,1H,J=8.2Hz),7.88(d,2H,J=7.6Hz),7.65-7.57(m,3H),7.44-7.24(m,6H),7.10(t,1H,J=7.9Hz),7.01(t,1H,J=7.5Hz),4.70-4.63(m,1H),4.29-4.18(m,3H),3.39(m,1H),3.21(m,1H),2.84(s,4H)。Fmoc-Ser(OTBDMS)-SE:1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ8.11(d,1H,J=8.5Hz),7.90(d,2H,J=7.5Hz),7.72(t,2H,J=6.6Hz),7.42(t,2H,J=7.4Hz),7.32(dt,2H,J=1.0和7.4Hz),4.63-4.56(m,1H),4.35-4.22(m,3H),4.00-3.88(m,2H),2.81(s,4H),0.86(s,9H),0.07(s,3H),0.06(s,3H)。Fmoc-His(Fmoc)-SE:1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ8.14(m,2H),7.95-7.86(m,4H),7.7(dd,2H,J=3.0,7.3Hz),7.62(d,2H,J=7.4Hz),7.46-7.25(m,9H),4.84-4.76(m,1H),4.69(d,2H,J=6.7Hz),4.43(t,1H,J=6.7Hz),4.30(d,2H,J=7.0Hz),4.20(t,1H,J=7.3Hz),3.15-3.00(m,2H),2.81(s,4H)。Fmoc-Lys(Fmoc)-SE:1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ8.10(d,1H,J=7.8Hz),7.89(d,4H,J=7.5Hz),7.70(m,4H),7.41(t,4H,J=7.4Hz),7.35-7.26(m,5H),4.44-4.18(m,7H),2.98(m,2H),2.80(s,4H),1.81(m,2H),1.42(m,4H)。
(10-3-2)氨基酸结合的Cl-dPnTP(a.a.-Cl-dPnTP)
(10-3-2-1)Phe-Cl-dPnTP:1H-NMR(300MHz,D2O)δ7.83(d,1H,J=2.1Hz),7.32-7.20(m,6H),7.66(dd,1H,J=4.7,6.3Hz),4.54(m,1H),4.22-4.11(m,4H),4.07(d,1H,J=17.7Hz),3.78(d,1H,J=17.7Hz),3.11(q和m,15H,2H,J=7.3Hz),2.56(m,1H),2.40(m,1H),1.19(t,23H,J=7.3Hz)。31P-NMR(121MHz,D2O)δ-8.37(bs,1P),-10.67(d,1P,J=20.1Hz),-22.01(t,1P,J=20.1Hz)。C21H27O15N4P3(M-H)-的MS(ESI)计算值667.06,实测值666.66。UV(10mM磷酸钠缓冲液,pH 7.0)λ最大值368nm(ε9540)。
(10-3-2-2)Tyr-Cl-dPnTP:1H-NMR(300MHz,D2O)δ7.81(d,1H,J=2.1Hz),7.27(d,1H,J=2.1Hz),7.08(d,2H,J=8.5Hz),6.75(d,2H,J=8.6Hz),6.67(dd,1H,J=4.8,6.2Hz),4.53(m,1H),4.21-4.09(m,4H),4.04(d,1H,J=17.6Hz),3.85(d,1H,J=17.7Hz),3.11(q和m,13H,1H,J=7.3Hz),2.94(m,1H),2.56(m,1H),2.40(m,1H),1.19(t,20H,J=7.3Hz)。31P-NMR(121MHz,D2O)δ-9.11(bs,1P),-10.71(d,1P,J=19.8Hz),-22.22(t,1P,J=19.9Hz)。C21H27O16N4P3(M-H)-的MS(ESI)计算值683.06,实测值682.80。UV(10mM磷酸钠缓冲液,pH 7.0)λ最大值282nm(ε3400),368nm(ε9760)。
(10-3-2-3)Trp-Cl-dPnTP:1H-NMR(300MHz,D2O)δ7.79(d,1H,J=2.1Hz),7.53(d,1H,J=7.6Hz),7.38(d,1H,J=7.9Hz),7.27(s,1H),7.21(d,1H,J=2.1Hz),7.16-7.04(m,2H),6.66(dd,1H,J=4.5,6.3Hz),3.54(m,1H),4.23-4.10(m,4H),3.95(d,1H,J=17.7Hz),3.68(d,1H,J=17.6Hz),3.39-3.19(m,2H),3.11(q,23H,J=7.3Hz),2.55(m,1H),2.41(m,1H),1.19(t,35H,J=7.3Hz)。31P-NMR(121MHz,D2O)δ-7.36(bs,1P),-10.61(d,1P,J=19.8Hz),-21.79(t,1P,J=19.9Hz,20.1Hz)。C23H28O15N5P3(M-H)-的MS(ESI)计算值706.07,实测值705.84。UV(10mM磷酸钠缓冲液,pH 7.0)λ最大值280nm(ε7270),287nm(ε6950),369nm(ε9650)。
(10-3-2-4)His-Cl-dPnTP:1H-NMR(300MHz,D2O)δ8.38(d,1H,J=1.2Hz),7.90(d,1H,J=2.1Hz),7.22(s,1H),6.67(dd,1H,J=4.5,6.4Hz),4.54(m,1H),4.33-4.12(m,4H),4.08(d,1H,J=17.7Hz),3.94(d,1H,J=17.8Hz),3.23(m,2H),3.11(q,10H,J=7.3Hz),2.57(m,1H),2.41(m,1H),1.19(t,16H,J=7.3Hz)。31P-NMR(121MHz,D2O)δ-8.29(d,1P,J=19.2Hz),-10.69(d,1P,J=19.2Hz),-21.86(t,1P,J=19.4,19.3Hz)。C18H25O15N6P3(M-H)-的MS(ESI)计算值657.05,实测值656.93。UV(10mM磷酸钠缓冲液,pH 7.0)λ最大值367nm(ε9890)。
(10-3-2-5)Ser-Cl-dPnTP:1H-NMR(300MHz,D2O)δ7.87(d,1H,J=2.0Hz),7.27(d,1H,J=2.1Hz),6.66(dd,1H,J=4.5,6.3Hz),4.54(m,1H),4.24-4.09(m,5H),4.0-3.81(m,3H),3.11(q,18H,J=7.3Hz),2.56(m,1H),2.40(m,1H),1.19(t,27H,J=7.3Hz)。31P-NMR(121MHz,D2O)δ-7.57(bs,1P),-10.62(d,1P,J=19.6Hz),-21.88(t,1P,J=20.2,20.0Hz)。C15H23O16N4P3(M-H)-的MS(ESI)计算值607.02,实测值606.81。UV(10mM磷酸钠缓冲液,pH7.0)λ最大值367nm(ε9630)。
(11)氨基酸结合的C3-dPnTP的合成
(11-1)1-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-4-[5-(L-苯丙氨酸酰胺基)-1-戊炔基]-2-硝基吡咯5′-三磷酸(Phe-C3-dPnTP)的合成
向NH2-C3-dPnTP(18μmol)的DMF溶液(4ml)中加入Fmoc-Phe-SE(13.1mg,27μmol),并将混合物在室温下反应20小时。然后,向其中加入三乙胺,并将混合物进一步搅拌5小时。向该反应溶液中加入哌啶(100μl),并将混合物在室温下反应30分钟。向该反应溶液中加入水(5ml),且将水层以乙酸乙酯洗涤3次且然后冷冻干燥。将残余物通过DEAE Sephadex A-25柱色谱法(1.5x 30cm,线性浓度梯度;50mM至1M TEAB溶液)和C8-HPLC(Senshu Pak,浓度梯度;10%至50%乙腈的100mM三乙铵乙酸盐缓冲溶液(pH 7.0))纯化,以获得目的化合物(7.4μmol,41%)。
(11-2)1-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-4-[5-(L-色氨酸酰胺基)-1-戊炔基]-2-硝基吡咯5′-三磷酸(Trp-C3-dPnTP)的合成
向NH2-C3-dPnTP(18μmol)的DMF溶液(4ml)中加入Fmoc-Trp-SE(14.1mg,27μmol),并将混合物在室温下反应20小时。然后,向其中加入三乙胺,并将混合物进一步搅拌5小时。向该反应溶液中加入哌啶(100μl),并将混合物在室温下反应30分钟。向该反应溶液中加入水(5ml),且将水层以乙酸乙酯洗涤3次且然后冷冻干燥。将残余物通过DEAE Sephadex A-25柱色谱法(1.5x 30cm,线性浓度梯度;50mM至1M TEAB溶液)和C8-HPLC(Senshu Pak,浓度梯度;15%至50%乙腈的100mM三乙铵乙酸盐缓冲溶液(pH 7.0))纯化,以获得目的化合物(6.6μmol,36%)。
(11-3)1-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-4-[5-(L-酪氨酸酰胺基)-1-戊炔基]-2-硝基吡咯5′-三磷酸(Tyr-C3-dPnTP)的合成
向NH2-C3-dPnTP(21μmol)的DMF溶液(1ml)中加入Fmoc-Tyr-SE(15.8mg,31.5μmol),并将混合物在室温下反应60小时。向该反应溶液中加入H2O(8ml),且将水层以乙酸乙酯洗涤3次且然后通过C8HPLC(Senshu Pak,浓度梯度;35%乙腈的100mM三乙铵乙酸盐缓冲溶液(pH7.0))纯化。向Fmoc-Tyr-C3-dPnTP的DMF溶液(2ml)中加入哌啶(100μl),并将混合物在室温下反应10分钟。向该反应溶液中加入H2O(8ml),且将水层以乙酸乙酯洗涤3次且然后冷冻干燥。将残余物通过DEAE Sephadex A-25柱色谱法(1.5x 30cm,线性浓度梯度;50mM至1M TEAB溶液)和C8-HPLC(Senshu Pak,浓度梯度;10%至50%乙腈的100mM三乙铵乙酸盐缓冲溶液(pH 7.0))纯化,以获得目的化合物(9.7μmol,46%)。
(11-4)1-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-4-[5-(L-丝氨酸酰胺基)-1-戊炔基]-2-硝基吡咯5′-三磷酸(Ser-C3-dPnTP)的合成
向NH2-C3-dPnTP(19μmol)的DMF溶液(1ml)中加入Fmoc-(OTBDMS)-Ser-SE(13.0mg,28μmol),并将混合物在室温下反应60小时。向该反应溶液中加入H2O(8ml),且将水层以乙酸乙酯洗涤3次且然后通过C8HPLC(Senshu Pak,浓度梯度;32%乙腈的100mM三乙铵乙酸盐缓冲溶液(pH 7.0))纯化。向Fmoc-Ser-C3-dPnTP的DMF溶液(2ml)中加入哌啶(100μl),并将混合物在室温下反应10分钟。向该反应溶液中加入H2O(8ml),且将水层以乙酸乙酯洗涤3次且然后冷冻干燥。将残余物通过DEAE Sephadex A-25柱色谱法(1.5x 30cm,线性浓度梯度;50mM至1M TEAB溶液)和C8-HPLC(Senshu Pak,浓度梯度;10%至50%乙腈的100mM三乙铵乙酸盐缓冲溶液(pH 7.0))纯化,以获得目的化合物(5.4μmol,29%)。
(11-5)1-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-4-[5-(L-赖氨酸酰胺基)-1-戊炔基]-2-硝基吡咯5′-三磷酸(Lys-C3-dPnTP)的合成
向NH2-C3-dPnTP(20μmol)的DMF溶液(1mL)中加入Fmoc-Lys(Fmoc)-SE(27.5mg,40μmol),并将混合物在室温下反应58小时。向反应溶液中加入哌啶(100μL),并将混合物反应3分钟。然后,向其中加入H2O(2ml)。将水层以乙酸乙酯(4mL)洗涤3次且然后冷冻干燥。粗产物通过DEAE Sephadex A-25柱色谱法(1.5x 30cm,线性浓度梯度;50mM至0.8M TEAB溶液)和C8-HPLC(浓度梯度;5%至50%乙腈的100mM三乙铵乙酸盐缓冲溶液(pH 7.0))纯化,以获得目的化合物(4.6μmol,23%)。
(11-6)化合物的物理性质
(11-6-1)Phe-C3-dPnTP:1H NMR(300MHz,D2O)δ7.71(d,1H,J=1.9Hz),7.32-7.14(m,5H),7.19(d,1H,J=2.0Hz)6.61(t,1H,J=5.8Hz),4.51(m,1H),4.16-4.10(m,4H),3.36(m,1H),3.11(q,J=7.4Hz,Phe-CH2-和-CONHCH2-的一个质子的信号是叠加的),2.51(m,1H),2.31(m,1H),2.19(m,1H),2.05(m,1H),1.55(m,2H),1.19(t,18H,J=7.3Hz)。31PNMR(121MHz,D2O)δ-10.34(d,1P,J=18.0Hz),-11.32(d,1P,J=19.7Hz),-22.99(t,1P,J=20.0Hz)。C23H30N4O15P3(M-H)-的MS(ESI)计算值,695.09,实测值694.53。UV(10mM磷酸钠缓冲液,pH 7.0)λ最大值=374nm(ε10,000)。
(11-6-2)Trp-C3-dPnTP:1H NMR(300MHz,D2O)δ7.57(d,1H,J=2.0Hz),7.38(d,2H,J=8.5Hz),7.24(s,1H),7.15(d,1H,J=2.0Hz),7.11(t,1H,J=7.8Hz),6.99(t,1H,J=7.9Hz),6.40(t,1H,J=5.8Hz),4.29(m,1H),4.14-4.07(m,4H),3.39(m,1H),3.24(t,2H,J=6.9Hz),3.11(q,J=7.3Hz,-CONHCH2-的一个质子的信号是叠加的),3.17-3.01(m,1H),2.32(m,1H),2.14(m,1H),2.01(m,1H),1.84(m,1H),1.49(m,2H),1.19(t,18H,J=7.3Hz)。31P NMR(121MHz,D2O)δ-10.45(d,1P,J=19.6Hz),-11.29(d,1P,J=19.4Hz),-23.01(t,1P,J=20.0Hz)。C25H31N5O15P3(M-H)-的MS(ESI)计算值,734.10,实测值733.64。UV(10mM磷酸钠缓冲液,pH 7.0)λ最大值=280nm(ε8,000),287nm(ε7,600),375nm(ε9,600)。
(11-6-3)Tyr-C3-dPnTP:1H NMR(300MHz,D2O)δ7.70(d,1H,J=2.1Hz),7.19(d,1H,J=2.1Hz),7.02(d,2H,J=8.5Hz),6.75(d,2H,J=8.5Hz),6.62(t,1H,J=5.9Hz),4.51(m,1H),4.16(m,3H),4.06(m,1H),3.39(m,1H),3.11(q,13H,J=7.4Hz),3.06-2.90(m,3H),2.52(m,1H),2.30(m,1H),2.17(m,1H),2.01(m,1H),1.53(m,2H),1.19(t,20H,J=7.3Hz)。31P NMR(121MHz,D2O)δ-9.86(1P),-11.30(d,1P,J=19.8Hz),-22.89(t,1P,J=19.9Hz)。C23H30N4O16P3(M-H)-的MS(ESI)计算值,711.09,实测值711.07。UV(10mM磷酸钠缓冲液,pH7.0)λ最大值=282nm(ε3,800),373nm(ε10,400)。
(11-6-4)Ser-C3-dPnTP:1H NMR(300MHz,D2O)δ7.77(d,1H,J=2.0Hz),7.26(d,1H,J=2.0Hz),6.68(t,1H,J=5.9Hz),4.56(m,1H),4.16(m,3H),4.07(dd,1H,J=5.4,4.6Hz),3.92(dd,1H,J=12.3,4.2Hz),3.82(dd,1H,J=12.4,6.0Hz),3.34(m,2H),3.11(q,13H,J=7.3Hz),2.57(m,1H),2.45-2.36(m,3H),1.72(m,2H),1.19(t,20H,J=7.3Hz)。31P NMR(121MHz,D2O)δ-9.83(1P),-11.29(d,1P,J=19.6Hz),-22.85(t,1P,J=19.9Hz)。C17H26N4O16P3(M-H)-的MS(ESI)计算值635.06,实测值634.68。UV(10mM磷酸钠缓冲液,pH7.0)λ最大值=373nm(ε9,900)。
(11-6-5)Lys-C3-dPnTP:1H NMR(300MHz,D2O)δ7.80(d,1H,J=2.1Hz),7.26(d,1H,J=2.1Hz),6.69(t,1H,J=6.0Hz),4.55(m,1H),4.23-4.14(m,3H),3.96(t,1H,J=6.8Hz),3.44(m,1H),3.25(m,1H),3.12(q,7H,J=7.3Hz),2.90(t,2H,J=7.4Hz),2.57(m,1H),2.45-2.36(m,3H),1.83(m,2H),1.73(m,2H),1.61(m,2H),1.40(m,2H),1.19(t,11H,J=7.3Hz)。31P NMR(121MHz,D2O)δ-9.92(d,1P,J=19.3Hz),-11.34(d,1P,J=19.9Hz),-22.79(t,1P,J=19.8Hz)。C20H33N5O15P3(M-H)-的MS(ESI)计算值676.12,实测值675.67。
(12)Dioll-dPnTP的合成
(12-1)4-戊炔-1,2-二乙酸酯的合成
4-戊炔-1,2-二醇(13.5mmol)[参考:J.Org.Chem.2008,73,5965-5976]与吡啶共沸后,将残余物溶解于吡啶(27ml)中。然后,向溶液中加入乙酸酐(4.8ml,50.8mmol),并将混合物在室温下反应14小时。通过加入乙酸乙酯和5%碳酸氢钠水溶液将反应溶液分为水层和有机层。将有机层经硫酸钠干燥,过滤,且然后浓缩。该残余物通过硅胶柱色谱法纯化,以获得4-戊炔-1,2-二乙酸酯(800mg,4.34mmol,32%)。
(12-2)1-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-4-(4-戊烯-1,2-二乙酸酯基)-1-丙炔基-2-硝基吡咯的合成
向1-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-4-碘-2-硝基吡咯(354mg,1mmol)、碘化亚铜(31mg,0.16mmol)、和Pd(PPh3)4(58mg,0.05mmol)中加入DMF(5ml)。1-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-4-碘-2-硝基吡咯溶解后,向其中加入三乙胺(208μl,1.5mmol)和4-戊炔-1,2-二乙酸酯(276mg,1.5mmol),且将混合物在室温下反应14小时。将反应溶液浓缩。然后,将残余物通过硅胶柱色谱法和HPLC纯化,以获得1-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-4-(4-戊烯-1,2-二乙酸酯基)-1-丙炔基-2-硝基吡咯(400mg,0.97mmol,97%)。
(12-3)1-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-4-(4-戊烯-1,2-二乙酸酯基)-1-丙炔基-2-硝基吡咯5′-三磷酸的合成
1-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-4-(4-戊烯-1,2-二醇)-1-丙炔基-2-硝基吡咯(41mg,0.1mmol)与吡啶共沸两次以及与甲苯共沸一次后,向残余物中加入质子海绵(33mg,0.15mmol),并将混合物溶解于磷酸三甲酯(500μl)中。然后,将溶液冷却至0℃。向其中加入三氯氧磷(13μl,0.13mmol),并将混合物在0℃下搅拌1小时。向其中加入三正丁基胺(120μl)和双三正丁基铵焦磷酸盐(1.0ml,0.5M DMF溶液),并将混合物在0℃下搅拌30分钟。此外,向其中加入0.5M TBAF(0.5ml)和水(5.0ml),并将混合物在0℃下搅拌30分钟。然后,将反应溶液冷冻干燥。将残余物溶解于H2O(4.0ml)中。向溶液中加入28%氨水(20ml),并将混合物在室温下搅拌90分钟。该产物通过DEAE SephadexA-25离子交换柱色谱法和HPLC纯化,以获得1-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-4-(4-戊烯-1,2-二乙酸酯基)-1-丙炔基-2-硝基吡咯5′-三磷酸(24μmol,24%)。
(12-4)化合物的物理性质
(12-4-1)4-戊炔-1,2-二乙酸酯
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ5.05-4.98(m,1H),4.24-4.07(m,2H),2.91(t,1H,J=2.7Hz),2.53(dd,1H,J=2.6,6.4Hz),2.01(s,6H)。
(12-4-2)1-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-4-(4-戊烯-1,2-二醇)-1-丙炔基-2-硝基吡咯
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ7.92(d,1H,J=2.2Hz),7.28(d,1H,J=2.2Hz),6.54(t,1H,J=5.6Hz),5.27(d,1H,J=4.5Hz),5.11-5.04(m,2H),4.29-4.12(m,3H),3.86-3.82(m,1H),3.69-3.52(m,2H),2.74(d,2H,J=6.3Hz),2.47-2.38(m,1H),2.27-2.19(m,1H),2.04,2.02(s,s,3H,3H)。C18H23N2O9(M+H)+的HR-MS(FAB,NBA基质)计算值411.1409,实测值411.1403。
(12-4-3)1-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-4-(4-戊烯基-1,2-二乙酸酯基)-1-丙炔基-2-硝基吡咯5′-三磷酸
1H NMR(300MHz,D2O)δ7.79(d,1H,J=2.1Hz),7.39(d,1H,J=2.1Hz),6.77(t,1H,J=6.0Hz),4.66-4.61(m,1H),4.27-4.22(m,3H),3.98-3.91(m,1H),3.74-3.60(m,2H),3.20(q,22H,J=7.3Hz),2.72-2.46(m,4H),1.28(t,32H,J=7.3Hz)。31P NMR(121MHz,D2O)δ-9.83(d,1P,J=19.8Hz),-10.66(d,1P,J=20.0Hz),-22.53(t,1P,J=20.1Hz)。C14H21N2O16P3(M-H)-的MS(ESI)计算值566.24,实测值565.04。UV(10mM磷酸钠缓冲液,pH 7.0)λ最大值=374nm(ε9,400)。
(13)Diol9-dPnTP的合成
(13-1)Diol9接头的合成
将乙炔锂乙二胺复合物(1.69g,16.5mmol)溶解于DMSO(75ml)中。然后,将溶液冷却至0℃至10℃。向其中加入11-溴-1-十一碳烯(3.24ml,15mmol),并将混合物在室温下搅拌2小时。通过加入水和乙醚将反应溶液分为水层和有机层。将有机层经硫酸钠干燥,过滤,且然后浓缩。该残余物通过硅胶柱色谱法纯化(粗产物(crude),16.5mmol)。向该粗产物(8.40mmol)中加入OsO4(108mg,0.42mmol)、N-甲基吗啉-N-氧化物(1.97g,20mmol)、及丙酮/H2O/tBuOH(4∶1∶1,42ml),并将混合物在室温下搅拌1小时。向反应溶液中加入NaHSO3(295mg),然后进行过滤。将沉淀物用甲醇洗涤,并将滤液浓缩。该残余物通过硅胶柱色谱法纯化(粗产物)。该粗产物(8.40mmol)与吡啶共沸后,将残余物溶解于吡啶(15ml)中。然后,向溶液中加入乙酸酐(3ml,32mmol),并将混合物在室温下反应14小时。通过加入乙酸乙酯和5%碳酸氢钠水溶液将反应溶液分为水层和有机层。将有机层经硫酸钠干燥,过滤,且然后浓缩。该残余物通过硅胶柱色谱法纯化,以获得Diol9接头(877mg,2.96mmol,35%)。
(13-2)Diol9-dPn的合成
向1-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-4-碘-2-硝基吡咯(354mg,1mmol)、碘化亚铜(31mg,0.16mmol)、和Pd(PPh3)4(58mg,0.05mmol)中加入DMF(5ml)。1-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-4-碘-2-硝基吡咯溶解后,向其中加入三乙胺(208μl,1.5mmol)和Diol9接头(445mg,1.5mmol),且将混合物在室温下反应14小时。将反应溶液浓缩。然后,将残余物通过硅胶柱色谱法和HPLC纯化,以获得Diol9-dPn(450mg,0.86mmol,86%)。
(13-3)Diol9-dPnTP的合成
Diol9-dPn(45mg,0.1mmol)与吡啶共沸两次以及与甲苯共沸一次后,向残余物中加入质子海绵(33mg,0.15mmol),并将混合物溶解于磷酸三甲酯(500μl)中。然后,将溶液冷却至0℃。向其中加入三氯氧磷(13μl,0.13mmol),并将混合物在0℃下搅拌1小时。向其中加入三正丁基胺(120μl)和双三正丁基铵焦磷酸盐(1.0ml,0.5M DMF溶液),并将混合物在0℃下搅拌30分钟。此外,向其中加入0.5M TBAF(0.5ml)和水(5.0ml),并将混合物在0℃下搅拌30分钟。然后,将反应溶液冷冻干燥。将残余物溶解于H2O(4.0ml)中。向溶液中加入28%氨水(20ml),并将混合物在室温下搅拌90分钟。将该产物通过DEAE Sephadex A-25离子交换柱色谱法和HPLC纯化,以获得Diol9-dPnTP(26μmol,26%)。
(13-4)化合物的物理性质
(13-4-1)Diol9接头
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ4.98-4.90(m,1H),4.15(dd,1H,J=3.2,8.7),3.99(dd,1H,J=6.5,5.4),2.71(t,1H,J=2.7),2.15-2.10(m,8H),1.99,1.98(s,s,3H,3H),1.51-1.23(m,16H)。
(13-4-2)Diol9-dPn
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ7.88(d,1H,J=2.2Hz),7.25(d,1H,J=2.2Hz),6.54(t,1H,J=5.6Hz),5.28(d,1H,J=4.4Hz),5.09(t,1H,J=5.1Hz),4.97-4.90(m,1H),4.26-3.95(m,3H),3.85-3.81(m,1H),3.68-3.52(m,2H),2.46-2.18(m,4H),1.99,1.98(s,s,3H,3H),1.51-1.24(m,16H)。
(13-4-3)Diol9-dPnTP
1H NMR(300MHz,D2O)δ7.71(d,1H,J=2.1Hz),7.35(d,1H,J=2.1Hz),6.76(t,1H,J=6.1Hz),4.65-4.60(m,1H),4.26-4.20(m,3H),3.70-3.41(m,3H),3.20(q,22H,J=7.3Hz),2.68-2.37(m,4H),1.60-1.25(m,50H)。31P NMR(121MHz,D2O)δ-10.07(d,1P,J=19.7Hz),-10.63(d,1P,J=20.0Hz),-22.6(t,1P,J=20.0Hz)。C22H37N2O16P3·N(C2H5)3(M)+的MS(ESI-Tof)计算值779.26,实测值780.26。UV(10mM磷酸钠缓冲液,pH 7.0)λ最大值=374nm(ε9,400)。
(14)Bza3-dPnTP的合成
(14-1)Bza3接头的合成
向4-戊炔基-1-醇(2.8ml,30mmol)和三苯基膦(11.8g,45mmol)中加入二氯甲烷(40ml),并将该混合物冷却至0℃。然后,向其中加入溶解于二氯甲烷的四溴化碳(14.9g,45mmol)(20ml)。使溶液回到室温,且然后通过加入二氯甲烷和5%碳酸氢钠水溶液将溶液分为水层和有机层。将有机层经硫酸钠干燥,过滤,且然后浓缩。将该残余物通过硅胶柱色谱法纯化(粗产物,30mmol)。将该粗产物(2.2g,15mmol)加入到溶解于DMF的4-羟基苯甲醛(1.83g,15mmol)、碳酸钾(2.07g,15mmol)、和碘化钾(250mg,1.5mmol)(7.5ml)中,并将混合物在70℃搅拌过夜。通过加入乙酸乙酯、水、和几滴盐酸将反应溶液分为水层和有机层。将有机层经硫酸钠干燥,过滤,且然后浓缩。将该残余物通过硅胶柱色谱法纯化,以获得Bza3接头(453mg,2.41mmol,16%)。
(14-2)Bza3-dPn的合成
向1-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-4-碘-2-硝基吡咯(354mg,1mmol)、碘化亚铜(31mg,0.16mmol)、和Pd(PPh3)4(58mg,0.05mmol)中加入DMF(5ml)。1-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-4-碘-2-硝基吡咯溶解后,向其中加入三乙胺(208μl,1.5mmol)和Bza3接头(282mg,1.5mmol),且将混合物在室温下反应14小时。将反应溶液浓缩。然后,将残余物通过硅胶柱色谱法和HPLC纯化,以获得Bza3-dPn(236mg,0.57mmol,57%)。
(14-3)Bza3-dPnTP的合成
Bza3-dPn(41mg,0.1mmol)与吡啶共沸两次以及与甲苯共沸一次后,向残余物中加入质子海绵(33mg,0.15mmol),并将混合物溶解于磷酸三甲酯(500μl)中。然后,将溶液冷却至0℃。向其中加入三氯氧磷(13μl,0.13mmol),并将混合物在0℃下搅拌1小时。向其中加入三正丁基胺(120μl)和双三正丁基铵焦磷酸盐(1.0ml,0.5M DMF溶液),并将混合物在0℃下搅拌30分钟。此外,向其中加入0.5M TBAF(0.5ml)和水(5.0ml),并将混合物在0℃下搅拌30分钟。然后,将反应溶液冷冻干燥。将该残余物通过DEAE Sephadex A-25离子交换柱色谱法和HPLC纯化,以获得Bza3-dPnTP(30.5μmol,30%)。
(14-4)化合物的物理性质
(14-4-1)Bza3接头
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ9.86(s,1H),7.87-7.84(m,2H),7.14-7.10(m,2H),4.15(t,2H,J=6.2Hz),2.82(t,2H,J=2.6Hz),2.36-2.31(m,2H),1.96-1.87(m,2H)。
(14-4-2)Bza3-dPn
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ9.87(s,1H),7.92(d,1H,J=2.1Hz),7.90-7.84(m,2H),7.28(d,1H,J=2.2Hz),7.17-7.13(m,2H),6.55(t,1H,J=5.6Hz),5.29(d,1H,J=4.4Hz),5.10(t,1H,J=5.1Hz),4.27-4.18(m,3H),3.87-3.83(m,1H),3.69-3.53(m,2H),2.57(t,2H,J=7.1Hz),2.47-2.39(m,1H),2.27-2.19(m,1H),2.04-1.95(m,2H)。
(14-4-3)Bza3-dPnTP
1H NMR(300MHz,D2O)δ9.77(s,1H),7.95-7.90(m,2H),7.69(d,1H,J=2.1Hz),7.25(d,1H,J=2.1Hz),7.21-7.16(m,2H),6.74(t,1H,J=6.0Hz),4.64-4.59(m,1H),4.36-4.20(m,5H),3.19(q,19H,J=7.3Hz),2.67-2.42(m,4H),2.14-2.05(m,2H),1.28(t,28H,J=7.3Hz)。31P NMR(121MHz,D2O)δ-9.98(d,1P,J=19.9Hz),-10.65(d,1P,J=20.1Hz),-22.55(t,1P,J=20.0Hz)。C21H25N2O16P3.N(C2H5)3(M)+的MS(ESI-Tof)计算值755.16,实测值756.22。UV(10mM磷酸钠缓冲液,pH 7.0)λ最大值=288nm(ε21,300),373nm(ε9,600)。
(15)Bza6-dPnTP的合成
(15-1)Bza6接头的合成
向7-辛炔基-1-醇(2.60g,20mmol)和三苯基膦(7.87g,30mmol)中加入二氯甲烷(30ml),并将该混合物冷却至0℃。然后,向其中加入溶解于二氯甲烷(10ml)的四溴化碳(9.95g,30mmol)。使溶液回到室温,且然后通过加入二氯甲烷和5%碳酸氢钠水溶液将溶液分为水层和有机层。将有机层经硫酸钠干燥,过滤,且然后浓缩。将该残余物通过硅胶柱色谱法纯化(粗产物,20mmol)。将该粗产物(20mmol)加入溶解于DMF的4-羟基苯甲醛(2.44g,20mmol)、碳酸钾(2.76g,20mmol)、和碘化钾(332mg,2mmol)(10ml)中,并将混合物在70℃搅拌过夜。通过加入乙酸乙酯、水、和几滴盐酸将反应溶液分为水层和有机层。将有机层经硫酸钠干燥,过滤,且然后浓缩。将该残余物通过硅胶柱色谱法纯化,以获得Bza6接头(729mg,3.17mmol,16%)。
(15-2)Bza6-dPn的合成
向1-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-4-碘-2-硝基吡咯(354mg,1mmol)、碘化亚铜(31mg,0.16mmol)、和Pd(PPh3)4(58mg,0.05mmol)中加入DMF(5ml)。1-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-4-碘-2-硝基吡咯溶解后,向其中加入三乙胺(208μl,1.5mmol)和Bza6接头(276mg,1.2mmol),且将混合物在室温下反应14小时。将反应溶液浓缩。然后,将残余物通过硅胶柱色谱法和HPLC纯化,以获得Bza6-dPn(138mg,0.30mmol,30%)。
(15-3)Bza6-dPnTP的合成
Bza6-dPn(46mg,0.1mmol)与吡啶共沸两次以及与甲苯共沸一次后,向残余物中加入质子海绵(33mg,0.15mmol),并将混合物溶解于磷酸三甲酯(500μl)中。然后,将溶液冷却至0℃。向其中加入三氯氧磷(13μl,0.13mmol),并将混合物在0℃下搅拌1小时。向其中加入三正丁基胺(120μl)和双三正丁基铵焦磷酸盐(1.0ml,0.5M DMF溶液),并将混合物在0℃下搅拌30分钟。此外,向其中加入0.5M TBAF(0.5ml)和水(5.0ml),并将混合物在0℃下搅拌30分钟。然后,将反应溶液冷冻干燥。将该残余物通过DEAE Sephadex A-25离子交换柱色谱法和HPLC纯化,以获得Bza6-dPnTP(27μmol,27%)。
(15-4)化合物的物理性质
(15-4-1)Bza6接头
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ9.85(s,1H),7.86-7.83(m,2H),7.12-7.09(m,2H),4.07(t,2H,J=6.4Hz),2.73(t,2H,J=2.6Hz),2.17-2.12(m,2H),1.48-1.42(m,8H)。
(15-4-2)Bza6-dPn
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ9.84(s,1H),7.89(d,1H,J=2.1Hz),7.86-7.81(m,2H),7.24(d,1H,J=2.2Hz),7.12-7.08(m,2H),6.53(t,1H,J=5.6Hz),5.28(d,1H,J=3.8Hz),5.10(t,1H,J=5.3Hz),4.22(m,1H),4.08(t,2H,J=6.4Hz),3.85-3.81(m,1H),3.66-3.53(m,2H),2.46-2.17(m,4H),1.77-1.73(m,2H),1.55-1.44(m,6H)。
(15-4-3)Bza6-dPnTP
1H NMR(300MHz,D2O)δ9.71(s,1H),7.85-7.82(m,2H),7.63(d,1H,J=2.1Hz),7.14(d,1H,J=2.1Hz),7.11-7.07(m,2H),6.65(t,1H,J=6.0Hz),4.60-4.58(m,1H),4.25-4.17(m,5H),3.20(q,18H,J=7.3Hz),2.63-2.57(m,1H),2.44-2.38(m,3H),1.88-1.84(m,2H),1.63-1.54(m,6H),1.28(t,27H,J=7.3Hz)。31P NMR(121MHz,D2O)δ-10.25(d,1P,J=19.4Hz),-10.68(d,1P,J=19.8Hz),-22.62(t,1P,J=19.8Hz)。C24H31N2O16P3·N(C2H5)3(M)+的MS(ESI-Tof)计算值797.21,实测值798.24。UV(10mM磷酸钠缓冲液,pH 7.0)λ最大值=289nm(ε20,500),374nm(ε8,900)。
(16)三肽结合的dPnTP的合成
(16-1)三肽的合成
在配备有过滤器的5-mL柱管(由PP制成)中进行Fmoc固相合成。称取2-氯三苯甲基氯树脂(1.58mmol/mg,250mg,0.4mmol)至管中,然后向其中加入2mL二氯甲烷(DCM)。将管在摇床上摇动20分钟,以使树脂溶胀(×2)。为了将第一氨基酸残基偶联至树脂,将Fmoc-氨基酸(1.5当量)和DIPEA(2.5当量)溶解于DCM(1.5mL)中,并将溶液加入含有树脂的柱管中,并在室温下搅拌2小时,以将氨基酸偶联至树脂。反应后,向其中加入1mL MeOH,并将混合物搅拌15分钟。然后,将反应溶液去除,并将树脂以DCM(2mL)×4、DMF(2mL)×4、DCM(2mL)×2、DMF∶MeOH=1∶1(v/v)×2、DCM∶MeOH=1∶1(v/v)×2、和MeOH×2洗涤。在真空管路(vacuumline)中充分干燥后,树脂的质量被称重,且从反应前和反应后树脂的质量检查引入的第一残基的量。根据该值,用于偶联第二或之后的残基的材料的当量被用于反应。将树脂在上述条件下再次溶胀。然后,向其中加入1.5mL的DMF中20%哌啶溶液,并将混合物搅拌20分钟,以去除Fmoc基团。将树脂以DMF充分洗涤,直到哌啶的气味消失(2mL×约8至10次)(该Fmoc去除操作重复两次)。将Fmoc-氨基酸(2.5当量)、HOBt(2.5当量)、和N,N′-二异丙基碳二亚胺(2.5当量)溶解于DMF(1.5mL)。将溶液加入柱中,并在室温下搅拌1小时用于反应。将反应溶液去除,且然后将树脂以DMF(2mL)×5、DCM(2mL)×5、和DMF(2mL)×5洗涤。重复这些反应以将链延伸至三肽。关于后续的从树脂上切离三肽,向其中加入2mL 20%六氟异丙醇/DCM(或1%TFA/DCM),并将混合物在室温下搅拌10分钟,并过滤,以回收含有肽的滤液(该操作重复3次)。将滤液通过蒸发浓缩至干燥,以获得三肽。
(16-2)Fmoc-Leu-Leu-Leu N-琥珀酰亚胺酯的合成
将Fmoc-Leu-Leu-Leu(292.5mg,0.5mmol)溶解于DMF(5mL)中。向溶液中加入N-羟基琥珀酰亚胺(89.3mg,0.75mmol)和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(143.7mg,0.75mmol),并将混合物在室温下反应1小时。将反应溶液逐滴加入冷水中以形成白色沉淀物,其然后被抽滤。将结晶用水洗涤,且然后在真空管路中干燥,以获得目的化合物的白色粉末(255.8mg,76%)。
(16-3)Fmoc-Pro-Phe-Trp N-琥珀酰亚胺酯的合成
将Fmoc-Pro-Phe-Trp(202mg,0.3mmol)溶解于DMF(3mL)中。向溶液中加入N-羟基琥珀酰亚胺(53mg,0.45mmol)和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(86mg,0.45mmol),并将混合物在室温下反应1小时。将反应溶液逐滴加入冷水中以形成白色沉淀物,其然后被抽滤。将结晶用水洗涤,且然后在真空管路中干燥,以获得目的化合物的白色粉末(163mg,95%)。
(16-4)Leu-Leu-Leu-hx-dPnTP的合成
将NH2-hx-dPnTP(196μmol)溶解于DMF(4mL)中。向反应溶液中加入溶解于DMF(4mL)的Fmoc-Leu-Leu-Leu N-琥珀酰亚胺酯,并将混合物在室温下反应。22小时后,向反应溶液中加入哌啶(500μl),并将混合物搅拌10分钟以去除Fmoc基团。使反应溶液经受乙酸乙酯和水的萃取。将水相以乙酸乙酯洗涤两次,且然后冷冻干燥。粗产物结晶溶解于50mMTEAB,并将溶液装入以50mM TEAB溶胀的DEAE树脂中,并DEAE-纯化(树脂:DEAE SephadexA-25柱,梯度:50mM至1M的TEAB等梯度线)。将含有目的化合物的级分冷冻干燥,并通过HPLC(0至10min:100mM TEAA中10%至100%线性梯度的CH3CN,pH 7.0)纯化,以获得目的化合物(34.7μmol,18%)。
(16-5)Pro-Phe-Trp-hx-dPnTP的合成
将NH2-hx-dPnTP(30μmol)溶解于DMF(800μL)中。向反应溶液中加入溶解于DMF(800μL)的Fmoc-Pro-Phe-Trp N-琥珀酰亚胺酯(56.3mg,73μmol),并将混合物在室温下反应。20小时后,向反应溶液中加入哌啶(100μl),并将混合物搅拌10分钟以去除Fmoc基团。使反应溶液经受乙酸乙酯和水的萃取。将水相以乙酸乙酯洗涤两次,且然后冷冻干燥。将粗产物结晶溶解于50mM TEAB,并将溶液装入以50mM TEAB溶胀的DEAE树脂中,并DEAE-纯化(树脂:DEAE Sephadex A-25柱,梯度:50mM至1M的TEAB等梯度线)。将含有目的化合物的级分冷冻干燥,并通过HPLC(0至10min:100mM TEAA中10%至100%线性梯度的CH3CN,pH 7.0)纯化,以获得目的化合物(8.5μmol,28%)。
(16-6)化合物的物理性质
(16-6-1)Fmoc-Leu-Leu-Leu N-琥珀酰亚胺酯:1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ8.56(d,1H,J=7.6Hz),7.94(d,1H,J=8.1Hz),7.88(d,2H,J=7.4Hz),7.70(d,2H,J=7.1Hz),7.48-7.28(m,5H),4.61(m,1H),4.38-4.17(m,4H),4.04(m,1H),2.79(s,4H),1.76-1.37(m,9H),0.92-0.79(m,18H)13C NMR(75MHz,DMSO-d6)δ172.71,172.33,172.05,169.88,168.43,155.79,143.88,143.69,140.67,127.01,125.25,120.06,65.49,52.94,50.46,48.31,46.66,25.42,25.19,24.11,23.99,23.03,22.87,22.59,21.43,20.97。
(16-6-2)Fmoc-Pro-Phe-Trp N-琥珀酰亚胺酯:1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ10.94(s,1H),8.23(d,1H,J=8.7Hz),8.04-7.85(m,5H),7.64-7.43(m,4H),7.40-6.79(m,24H),4.67(m,1H),4.52(m,1H),4.33-4.05(m,5H),3.84(m,2H),3.31-3.14(m,2H,被H2O信号叠加),2.26-2.08(m,1H),3.00(m,2H),2.88-2.72(m,9H),2.17(m,1H),1.92(m,1H),1.67(m,5H)。
(16-6-3)Leu-Leu-Leu-hx-dPnTP:1H NMR(300MHz,D2O)δ7.81(d,1H,J=2.1Hz),7.39(d,1H,J=2.1Hz),6.75(t,1H,J=6.0Hz),4.61(m,1H),4.42(t,1H,J=7.5Hz),4.26(m,4H),4.14(s,2H),4.01(t,1H,J=7.4Hz),3.20(q,17H,J=7.3Hz),2.69-2.60(m,1H),2.51-2.43(m,1H),2.28(t,1H,J=7.3Hz),1.74-1.46(m,13H),1.28(t,24H,J=7.3Hz),1.06-0.85(m,18H)。13C NMR(75MHz,DMSO-d6)δ176.66,173.83,173.31,170.28,136.03,129.83,118.60,104.72,88.14,85.73,85.59,75.16,69.71,64.95,52.53,52.36,51.71,46.64,40.48,39.99,39.76,39.70,38.98,35.45,29.47,27.89,25.30,24.79,24.30,24.27,23.88,22.05,21.82,21.56,21.50,21.35,20.89,8.21。31P NMR(121MHz,D2O)δ-9.14(d,1P,J=20.0Hz),-10.72(d,1P,J=20.0Hz),-22.35(t,1P,J=20.1Hz)。C36H62N7O18P3(M-H)-的MS(ESI)计算值972.34,实测值972.12。UV(10mM磷酸钠缓冲液,pH 7.0)λ最大值=365nm(ε10700。
(16-6-4)Pro-Phe-Trp-hx-dPnTP:1H NMR(300MHz,D2O)δ7.67(s,1H),7.46-7.40(m,2H),7.33-7.06(m,9H),6.55(t,1H,J=5.9Hz),4.54-4.22(m,3H),4.37-4.31(m,1H),4.21-4.07(m,5H),3.38-3.25(m,3H),3.20(q,19H,J=7.3Hz),3.02-2.80(m,6H),2.57-2.48(m,1H),2.28-2.15(m,4H),1.99-1.93(m,1H),1.91-1.75(m,1H),1.58-1.46(m,3H),1.28(t,29H,J=7.3Hz),1.22-1.19(m,2H),1.09-1.00(m,3H)。31PNMR(121MHz,D2O)δ-9.21(d,1P,J=19.6Hz),-10.68(d,1P,J=19.6Hz),-22.27(t,1P,J=20.0Hz)。C43H55N8O18P3(M-H)-的MS(ESI)计算值1064.28,实测值1063.82。UV(10mM磷酸钠缓冲液,pH 7.0)λ最大值=281nm(ε8,600),287nm(ε8,200),366nm(ε=10,500)。
(17)琥珀酰亚胺酯的合成
[式7]
条件:(a)(b)(c)N-羟基琥珀酰亚胺、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、CH2Cl2、rt。(d)N-羟基琥珀酰亚胺、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、THF、DMF、rt。
(17-1)二苯基乙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯的合成
将二苯基乙酸(216mg,1.02mmol)、N-羟基琥珀酰亚胺(177mg,1.53mmol)、和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(290mg,1.51mmol)溶解于脱水的二氯甲烷(5ml)中,并将溶液在室温下搅拌7小时。将反应溶液以二氯甲烷(20ml)稀释,且然后以饱和碳酸氢钠水溶液(10ml)洗涤,且随后以饱和盐水(10ml)洗涤。将有机层经硫酸钠干燥并在减压下浓缩。将残余物通过制备中压液相色谱法(使用AI-580仪器和Hi-Flash Column(硅胶)(均来自Yamazen Corp.),以二氯甲烷-甲醇梯度洗脱)纯化,以获得作为白色固体的目的化合物(156mg,0.50mmol,49%)。
《已知的化合物》参考J.Med.Chem.2000,51,8168。
(17-2)二苯基乙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯的物理性质
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ7.38-7.29(m,10H),5.35(s,1H),2.82(s,4H)。
(18)1-萘甲酸N-羟基琥珀酰亚胺酯的合成
(18-1)
将1-萘甲酸(176mg,1.02mmol)、N-羟基琥珀酰亚胺(174mg,1.51mmol)、和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(288mg,1.50mmol)溶解于脱水的二氯甲烷(5ml)中,并将溶液在室温下搅拌18小时。将反应溶液以二氯甲烷(10ml)稀释,且然后以饱和碳酸氢钠水溶液(10ml)洗涤,且随后以饱和盐水(10ml)洗涤。将有机层经硫酸钠干燥并在减压下浓缩。将残余物通过制备中压液相色谱法(使用AI-580仪器和Hi-Flash Column(硅胶)(均来自Yamazen Corp.),以二氯甲烷-甲醇梯度洗脱)纯化,以获得作为白色固体的目的化合物(131mg,0.48mmol,48%)。
《已知的化合物》参考Tetrahedron Letters 2003,44(12)2477-2480(合成方法与本文所述的不同)。
(18-2)1-萘甲酸N-羟基琥珀酰亚胺酯的物理性质
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ8.62(dd,1H,J=7.7,1.0Hz),8.40-8.35(m,4H),8.13(dd,1H,J=7.9,0.7Hz),7.79-7.66(m,3H),2.94(s,4H)。
(19)4-联苯羧酸N-羟基琥珀酰亚胺酯的合成
(19-1)
将4-联苯羧酸(200mg,1.00mmol)、N-羟基琥珀酰亚胺(178mg,1.55mmol)、和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(287mg,1.50mmol)溶解于脱水的二氯甲烷(5ml)中,并将溶液在室温下搅拌21小时。将反应溶液以二氯甲烷(20ml)稀释,且然后以饱和碳酸氢钠水溶液(10ml)洗涤,且随后以饱和盐水(10ml)洗涤。将有机层经硫酸钠干燥并在减压下浓缩。将残余物通过制备中压液相色谱法(使用AI-580仪器和Hi-Flash Column(硅胶)(均来自Yamazen Corp.),以二氯甲烷-甲醇梯度洗脱)纯化并溶解于DMF(2.5ml)。将该溶液加入水(50ml)中用于再沉淀以获得作为白色固体的目的化合物(139mg,0.47mmol,47%)。
《已知的化合物》参考Russ.J.Bioorg.Chem.2009,35,342(合成方法与本文所述的不同)。
(19-2)4-联苯羧酸N-羟基琥珀酰亚胺酯的物理性质
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ8.18(d,2H,J=8.6Hz),7.97(d,2H,J=8.6Hz),7.82-7.78(m,2H),7.57-7.44(m,3H),2.91(s,4H)。
(20)4′-羟基-4-联苯羧酸N-羟基琥珀酰亚胺酯的合成
(20-1)
将4′-羟基-4-联苯羧酸(214mg,1.00mmol)、N-羟基琥珀酰亚胺(174mg,1.50mmol)、和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(288mg,1.50mmol)溶解于脱水的THF(10ml)和脱水的DMF(4ml)中,并将溶液在室温下搅拌5小时。将反应溶液倒入水(50ml)中。所得沉淀物通过过滤收集,用己烷洗涤,且然后在真空中干燥,以获得作为白色固体的目的化合物(207mg,0.67mmol,67%)。
《已知的化合物》参考J.Med.Chem.2008,51,6665-6681(合成方法在其中未被描述或引用)。
(20-2)4′-羟基-4-联苯羧酸N-羟基琥珀酰亚胺酯的物理性质
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ9.84(s,1H),8.11(dd,2H,J=6.8,1.8Hz),7.88(dd,2H,J=6.8,1.8Hz),7.68-7.64(m,2H),6.93-6.88(m,2H),2.90(s,4H)。
(21)9-蒽羧酸N-羟基琥珀酰亚胺酯的合成
(21-1)
将9-蒽羧酸(220mg,0.99mmol)、二(N-琥珀酰亚胺基)碳酸酯(357mg,1.39mmol)、和三乙胺(220μl,1.60mmol)溶解于脱水的二氯甲烷(10ml)中,并将溶液在室温下搅拌24小时。将反应溶液以二氯甲烷(10ml)稀释,且然后以饱和碳酸氢钠水溶液(20ml)洗涤,且随后以饱和盐水(20ml)洗涤。将有机层经硫酸钠干燥并在减压下浓缩。将残余物通过制备中压液相色谱(使用AI-580仪器和Hi-Flash Column(硅胶)(均来自Yamazen Corp.),以二氯甲烷-甲醇梯度洗脱)纯化,以获得作为白色固体的目的化合物(66mg,0.20mmol,20%)。
(21-2)9-蒽羧酸N-羟基琥珀酰亚胺酯的物理性质
1H NMR(300MHz,DMSO-d6,40℃)δ8.97(s,1H),8.32-8.24(m,4H),7.78-7.63(m,4H),3.02(s,4H)。
(22)修饰的dPnTP(R-hx-dPnTP)的合成
[式8]
条件:N-羟基琥珀酰亚胺酯、三乙胺、70%DMF-H2O,rt。
[式9]
(22-1)二苯甲烷修饰的dPnTP(DPM-hx-dPnTP)的合成
向3-(β-D-呋喃核糖基)-4-[3-(6-氨基己酰氨基)-1-丙炔基]-2-硝基吡咯5′-三磷酸(30μmol)的40%DMF水溶液(3.0ml)中加入二苯基乙酸琥珀酰亚胺酯(120μmol)的DMF溶液(3.0ml)和三乙胺(6.2μl),并将混合物在室温下静置24小时。向反应溶液中加入水(18ml),并将所得白色沉淀物通过Steriflip(Millipore Corp.)滤出。将滤液冷冻干燥,且然后溶解于100mM三乙胺乙酸盐缓冲溶液(2.0ml)中。将溶液通过Ultrafree(0.22μm,Millipore Corp.)过滤。滤液通过C18柱(Nacalai Tesque,Inc.,COSMOSIL140C19-OPN;以100mM三乙胺乙酸盐缓冲溶液中0%至30%乙腈线性梯度洗脱)纯化,并通过C8HPLC(Shiseido CAPCELL PAK C8;以100mM三乙胺乙酸盐缓冲溶液中25%至50%乙腈线性梯度经过13分钟洗脱)纯化,以获得DPM-hx-dPnTP(收率:15.4μmol(51%))。
(22-2)萘修饰的dPnTP(NAP-hx-dPnTP)的合成
向3-(β-D-呋喃核糖基)-4-[3-(6-氨基己酰氨基)-1-丙炔基]-2-硝基吡咯5′-三磷酸(30μmol)的40%DMF水溶液(3.0ml)中加入1-萘甲酸琥珀酰亚胺酯(120μmol)的DMF溶液(3.0ml)和三乙胺(6.2μl),并将混合物在室温下静置66小时。向反应溶液中加入水(18ml),并将所得白色沉淀物通过Steriflip(Millipore Corp.)滤出。将滤液冷冻干燥,且然后溶解于100mM三乙胺乙酸盐缓冲溶液(3.0ml)中。将溶液通过Ultrafree(0.22μm,Millipore Corp.)过滤。将滤液通过C18柱(Nacalai Tesque,Inc.,COSMOSIL140C19-OPN;以100mM三乙胺乙酸盐缓冲溶液中0%至30%乙腈线性梯度洗脱)纯化,并通过C8HPLC(Shiseido CAPCELL PAK C8;以100mM三乙胺乙酸盐缓冲溶液中15%至50%乙腈线性梯度经过13分钟洗脱)纯化,以获得NAP-hx-dPnTP(收率:16.4μmol(55%))。
(22-3)联苯修饰的dPnTP(BPH-hx-dPnTP)的合成
向3-(β-D-呋喃核糖基)-4-[3-(6-氨基己酰氨基)-1-丙炔基]-2-硝基吡咯5′-三磷酸(30μmol)的40%DMF水溶液(3.0ml)中加入4-联苯羧酸琥珀酰亚胺酯(120μmol)的DMF溶液(3.0ml)和三乙胺(6.2μl),并将混合物在室温下静置51小时。向反应溶液中加入水(18ml),并将所得白色沉淀物通过Steriflip(Millipore Corp.)滤出。将滤液冷冻干燥,且然后溶解于100mM三乙胺乙酸盐缓冲溶液(2.0ml)中。将溶液通过Ultrafree(0.22μm,Millipore Corp.)过滤。将滤液通过C18柱(Nacalai Tesque,Inc.,COSMOSIL140C19-OPN;以100mM三乙胺乙酸盐缓冲溶液中0%至30%乙腈线性梯度洗脱)纯化,并通过C1HPLC(Shiseido CAPCELL PAK C1;以100mM三乙胺乙酸盐缓冲溶液中20%至50%乙腈线性梯度经过13分钟洗脱)纯化,以获得BPH-hx-dPnTP(收率:10.0μmol(33%))。
(22-4)4-羟基联苯修饰的dPnTP(HBP-hx-dPnTP)的合成
向3-(β-D-呋喃核糖基)-4-[3-(6-氨基己酰氨基)-1-丙炔基]-2-硝基吡咯5′-三磷酸(30μmol)的40%DMF水溶液(3.0ml)中加入4′-羟基-4-联苯羧酸琥珀酰亚胺酯(120μmol)的DMF溶液(3.0ml)和三乙胺(6.2μl),并将混合物在室温下静置45小时。向反应溶液中加入水(18ml),并将所得白色沉淀物通过Steriflip(Millipore Corp.)滤出。将滤液冷冻干燥,且然后溶解于100mM三乙胺乙酸盐缓冲溶液(2.0ml)中。将溶液通过Ultrafree(0.22μm,Millipore Corp.)过滤。将滤液通过C18柱(Nacalai Tesque,Inc.,COSMOSIL140C19-OPN;以100mM三乙胺乙酸盐缓冲溶液中0%至30%乙腈线性梯度洗脱)纯化,并通过C8HPLC(Shiseido CAPCELL PAK C8;以100mM三乙胺乙酸盐缓冲溶液中15%至50%乙腈线性梯度经过13分钟洗脱)纯化,以获得HBP-hx-dPnTP(收率:13.9μmol(46%))。
(22-5)修饰的dPnTP(R-hx-dPnTP)的物理性质
(22-5-1)DPM-hx-dPnTP的物理性质
1H NMR(300MHz,D2O)δ7.72(d,1H,J=2.1Hz),7.43-7.33(m,6H),7.26-7.21(m,5H),6.64(t,1H,J=5.9Hz),5.01(s,1H),4.53(m,1H),4.20(m,3H),4.14(m,2H),2.23-3.16(m,1H和(CH3CH2)3N),2.54(m,1H),2.36(m,1H),2.26(t,1H,J=7.0Hz),1.63-1.58(m,2H),1.53-1.49(m,2H),1.30-1.35(m,1H和(CH3CH2)3N)。
31P NMR(121MHz,D2O),δ-9.47(d,1P,J=15.5Hz),-10.70(d,1P,J=19.8Hz),-22.47(t,1P,J=20.0Hz)。
[M-H]-(C32H38N4O16P3)的ESI-MS:计算值827.16,实测值:827.02。
l最大值=369nm,e260=2.40×103,e369=1.07×104。
(22-5-2)NAP-hx-dPnTP的物理性质
1H NMR(300MHz,D2O)δ8.02-7.93(m,3H),7.65-7.48(m,5H),6.98(d,1H,J=2.1Hz),6.50(t,1H,J=5.9Hz),4.53(m,1H),4.18(m,3H),4.10(s,2H),3.49(t,1H,J=6.4Hz),2.58-2.49(m,1H),2.37-2.26(m,3H),1.79-1.67(m,4H),1.54-1.46(m,2H)。
31P NMR(121MHz,D2O),δ9.91(d,1P,J=19.4Hz),-10.77(d,1P,J=20.0Hz),-22.56(t,1P,J=20.0Hz)。
l最大值=369nm,e260=4.90×103,e369=9.35×103。
(22-5-3)BPH-hx-dPnTP的物理性质
1H NMR(300MHz,D2O)δ7.76-7.68(m,7H),7.61(d,1H,J=2.1Hz),7.55-7.7.45(m,3H),7.04(d,1H,J=2.1Hz),6.38(t,1H,J=5.9Hz),4.45(m,1H),4.16-4.10(m,5H),3.39(t,2H,J=6.6Hz),2.42(m,1H),2.32(t,1H,J=6.5Hz),2.19(m,1H),1.74-1.62(m,4H),1.45(m,1H)。
31P NMR(121MHz,D2O),δ-10.33(d,1P,J=19.7Hz),-10.84(d,1P,J=19.7Hz),-22.75(t,1P,J=19.8Hz)。
l最大值=368nm,e260=2.46×104,e368=1.04×104。
(22-5-4)HBP-hx-dPnTP的物理性质
1H NMR(300MHz,D2O)δ7.71(d,2H,J=8.4Hz),7.62-7.56(m,5H),6.99(d,2H,J=7.5Hz),6.97(s,1H),6.36(t,1H,J=5.9Hz),4.44(m,1H),4.15-4.09(m,5H),3.39(t,2H,J=6.5Hz),2.46-2.38(m,1H),2.32(t,2H,J=6.3Hz),2.18-2.12(m,1H),1.73-1.61(m,4H),1.29-1.24(m,2H)。
31P NMR(121MHz,D2O),δ-9.86(d,1P,J=19.6Hz),-10.75(d,1P,J=19.8Hz),-22.55(t,1P,J=19.9Hz)。
l最大值=368nm,e260=1.41×104,e368=1.02×104。
实施例8:与VEGF-165结合的DNA适体的制备-(2)
使用基于实施例1中描述的方法的修改的方法制备与VEGF-165更牢固地结合的DNA适体。
(1)各自在中心区的特定位点处包含人工碱基Ds的单链DNA的文库的制备
使用在实施例1中制备的各单链DNA文库。
(2)结合VEGF-165的包含Ds的单链DNA适体的制备
基本方法遵循实施例1中描述的方法。在下文中,通常,与实施例1不同的点将被具体描述,以使得关于重叠部分的描述将被省略。
A.1选择轮的操作
(i)靶蛋白质和DNA文库之间的结合
为了在DNA分子中形成构象,进行折叠处理(95℃持续3min→室温持续10min→冰上持续5min→室温)。然后,将文库溶液与含有Nonidet P-40的PBS溶液混合以调节NonidetP-40的终浓度为0.005%。将所得核酸溶液与链霉亲和素偶联的磁珠混合,并将混合物在25℃下颠倒并混合30分钟。将使用离心操作获得的上清液和磁架与VEGF-165混合,以形成DNA-蛋白质复合物。
(ii)筛选与靶蛋白质结合的DNA序列
将N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)-生物素化试剂加入由此获得的混合溶液中,用于蛋白质生物素化。然后,通过超滤去除未反应的生物素化试剂。在室温下将所得溶液与链霉亲和素偶联的磁珠混合以将DNA-蛋白质复合物固定至磁珠。然后,重复以下操作5次:将磁珠悬浮于1.0ml含有0.005%Nonidet P-40的PBS溶液(缓冲溶液A)中,并将悬浮液在25℃下温育5分钟。
在最后一轮(第7轮)中,进行3次使用含有3M尿素的缓冲溶液A的颠倒和混合(1.0ml,25℃持续5min)的操作,随后为使用缓冲溶液A的颠倒和混合的(1.0ml,25℃持续5min)的2次另外的操作以使得洗涤条件进一步更加严格。向由此经洗涤的磁珠中加入200μl洗脱溶液(50mM NaOH),并将混合物在25℃下温育5分钟。然后,回收所得溶液,并使用离子交换树脂中和。回收的溶液中的DNA被用作随后的选择轮的文库制备中的PCR模板。
(iii)单链DNA文库的制备(扩增)
使用通过在前选择轮获得的模板DNA制备在随后轮中使用的各单链DNA文库。具体地,基于Bartel等人(Nucleic Acids Res.1995,23:4220-1)的方法进行PCR扩增。由此扩增的包含Ds的单链DNA文库使用含有7M尿素的10%聚芳酰胺变性凝胶分离,然后从凝胶中洗脱并回收,并用作随后轮的文库。以下引物组用作单链DNA文库制备的引物:
5′-引物:5′-TTCTGTCAATCGATCGTATCAGTCCAC-3′(SEQ ID NO:151)
3′-引物:5′-TTTTTTTTTTTTTTT-(CH2)12-AAGTAGTCACTAATCCGTTCGAGTCATGC-3′(SEQ ID NO:152)
使用AccuPrime Pfx DNA聚合酶(Invitrogen Corp.)进行PCR(体积:400μl至600μl)。使用的反应组成为进一步补充有0.1mM dNTP(N=A、G、C、和T,终浓度:每种dNTP 0.4mM)和0.5mM MgSO4(终浓度:1.5mM)的1×AccuPrime Pfx反应混合物(含有0.3mM dNTP和1mMMgSO4)、1μM 5′-引物、1μM 3′-引物、50μM dDsTP、50μM Dioll-dPxTP、和0.05U/μlAccuPrime Pfx DNA聚合酶。PCR循环条件包括(94℃持续30秒→65℃持续2.5min)×12至26个循环。
B.重复步骤中选择轮的条件
进行七轮选择。每一轮的选择条件列于表7。
[表7]
为了使蛋白质-DNA复合物的形成条件更为严格,将蛋白质和DNA的浓度逐渐降低,同时在第5至7轮中蛋白质-DNA文库混合期间,添加过量的以前报道作为与靶蛋白质结合的DNA适体的DNA片段作为竞争性抑制DNA分子(竞争剂)。使用的DNA片段的核苷酸序列如下:
ContVG(28-mer):5′-GCCCGTCTTCCAGACAAGAGTGCAGGGC-3′(SEQ ID NO:153)
(3)通过选择获得的DNA适体序列的鉴定
使用下述方法鉴定DNA适体序列。首先,7轮体外选择完成后的回收的单链DNA的等分试样被用作PCR中的模板,以将人工碱基位点替换为天然碱基而不添加人工碱基底物。使用第三代测序仪(Life Technologies Corp.;Ion Torrent The Personal GenomeMachine(TM)(PGM(TM)))而无需使用大肠杆菌的常规克隆操作,对获得的双链DNA文库进行测序。通过使用在大多数克隆中Ds被替换为A或T的特性,Ds的位置被鉴定,并提取目的序列组。测序获得的DNA适体。具体地,使用1μM的5′-引物(5′-TTCTGTCAATCGATCGTATCAGTCCAC-3′;以上的SEQ ID NO:151)和3′-引物(5′-AAGTAGTCACTAATCCGTTCGAGTCATGC-3′;SEQ IDNO:154)的每一种,以0.3mM dNTP(N=A、G、C、和T)、50μM dPa′TP、和1×Titanium Taq PCR缓冲液中的1×Titanium Taq(Clontech Laboratories,Inc.)的反应组成进行PCR(体积:100μl)。PCR循环条件包括(94℃持续30秒→68℃持续2min)×20至25个循环。
将获得的PCR产物通过硅胶膜柱纯化。然后,按照其附带的手册中描述的方法,使用Ion Fragment Library Kit(Life Technologies Corp.)从其中制备文库。使用IonLibrary Quantification Kit(Life Technologies Corp.)定量获得的DNA文库,稀释至预定浓度,且然后以Ion OneTouch(Tm)Template Kit(Life Technologies Corp.)处理,以制备用于以来自Life Technologies Corp.的The Personal Genome Machine(TM)(PGM(TM))分析的模板DNA。使用Ion Sequencing Kit v2.0(Life Technologies Corp.)进行离子激流The Personal Genome Machine(TM)测序。使用来自CLC bio Japan,Inc.的CLCGenomics Workbench(4.7.2版)分析由此获得的读段总数。具体地,针对连续包含27-碱基5′-引物-标签序列(变化)-43-碱基序列-3′-引物的6-碱基部分序列(GCATGA)的分析物序列筛选包含Ds的文库序列,同时针对连续包含除了接头和poly-T区外3′-引物的29-碱基序列-43-碱基序列-标签序列(变化)-5′-引物的6-碱基部分序列(GTGGAC)的分析物序列筛选包含Ds的文库序列的互补序列。然后,根据每个标签序列的Ds的位置筛选序列。最后,分析了总计92613个读段序列。其中,具有大量克隆(=大量读段)的DNA适体是具有对靶物质的特别高结合能力的DNA适体。表8显示了具有100个或更多个克隆数的序列。
[表8]
*:总的计数:使用下一代测序仪通过序列分析获得的读段的总数
提取的计数:从读段的总数中提取的分析物序列。
实施例9:与VEGF-165结合的DNA适体的结合分析-(2)
五种序列选自表8中所示的序列,并使用BIACORE 3000(GE Healthcare JapanCorp.)和在引物区截短的57-mer DNA片段(表9),通过表面等离子体共振(SPR)测定,分析了其结合VEGF-165的能力。还制备了先前报道的包含VEGF-165的DNA序列的57-mer DNA片段并作为对照被分析。
[表9]
*:结合=[自蛋白质注射开始930秒后的共振单位]/[固定的DNA的共振单位]×[固定的DNA的分子量]/[蛋白质的分子量]。
SPR测定条件:流速:20μl/min,测定温度:25℃,VEGF-165(10nM)的注射时间:480秒,及解离的监测时间:480秒。
基本方法遵循实施例2中描述的方法。在下文中,通常,与实施例2不同的条件将被具体地描述,以使得关于重叠部分的描述将被省略。
为了将各DNA片段固定至SA芯片(GE Healthcare Japan Corp.),以PBS溶液稀释至25nM的DNA溶液经受折叠处理(95℃持续3min→室温持续10min→冰上持续5min→室温),且然后向其中加入终浓度为0.005%的Nonidet P-40。以5μl/min的流速将所得DNA溶液(5μl;对应1min)注射到SA芯片,以实现固定。固定后,非特异性吸附在SA芯片上的DNA片段被洗去。在通过以动力学注射模式注射2.5nM、5nM、及10nM的VEGF-165溶液的监测下检测固定的DNA片段和VEGF-165之间的相互作用。测定条件包括20μl/min的流速和持续8分钟的蛋白质注射。通过检查与VEGF-165的结合获得的传感图示于图15。
该测定的结果表明,在用于测定中的DNA片段中,VG20Ds-57与VEGF-165特别牢固地结合。这些DNA片段中以天然碱基A替换Ds也被发现减弱了所得DNA片段与靶蛋白质的结合。
使用连接到Biacore 3000的BiaEvaluation软件和具有质量传递的Langmuir的反应模型,用于测定的DNA片段经受曲线拟合。结果,VG20Ds-57显示具有5.9pM的解离常数(Kd),其低于现有适体(contVG-57)的解离常数(46pM)。源自VG20Ds-57的通过将Ds碱基替换为天然碱基A的序列VG20A-57具有0.22nM的解离常数,表明了VG20Ds-57与VEGF-165的结合依赖于Ds碱基。
实施例10:基于VG20Ds-57的序列的掺杂选择
发现与靶蛋白质牢固地结合的VG20Ds-57的标签和随机区序列被突变。通过选择进行适体的优化和二级结构的预测。
基于VG20Ds-57的序列,用于掺杂选择的每个DNA文库以如实施例3中相同的方法制备。用于掺杂选择的每个DNA文库通过化学合成和凝胶纯化来制备,以使得引物区、Ds碱基、和3-碱基标签序列的一个碱基被固定,而由天然核苷酸序列构成的包含标签序列的剩余部分的其它部分包含55%的原始碱基和45%的不同于原始碱基的碱基(3种碱基各15%)。该序列如下:
5′-CTGTCAATCGATCGTATCAGTCCACGgtaaactgagtccgaaggggcDstgcagtgaDscccgaatgggtccgGCATGACTCGAACGGATTAGTGACT-3′(SEQ ID NO:330)
(大写字母:固定的序列,小写字母:掺杂序列)
a=A:55%;G:15%;C:15%,T:15%
g=A:15%;G:55%;C:15%,T:15%
c=A:15%;G:15%;C:55%,T:15%
t=A:15%;G:15%;C:15%,T:55%
与靶蛋白质结合的DNA适体使用该文库通过如实施例1(2)中的程序选择。选择条件示于表10。
[表10]
4轮后通过选择获得的适体以与实施例8(3)中描述的方法相同的方式测序,以分析总计43719个读段序列。从测序结果鉴定具有高保持率的区和具有共变的区。从所获得的信息预测其二级结构(图16A和16B)。结果,在VG20Ds-57中证实了稳定预测的结构的单碱基突变,例如,A11突变为C11。包含该单碱基突变的47-mer截短的VEGF-165结合DNA片段(VGd1-2Ds-47;SEQ ID NO:198)(图17A),被用于通过如实施例9中相同的SPR程序的结合分析(图17B和18)。结果,VGd1-2Ds-47具有4.6pM的Kd,其比仅由天然碱基构成的现有DNA适体(contVG-47;SEQ ID NO:200)的Kd 44pM小一个数量级。这表明VGd1-2Ds-47可以以现有DNA适体的约10倍的强度与靶蛋白质结合。作为检查VGd1-2Ds-47与非靶蛋白质(VEGF-121(PeproTech,Inc.)、EGF(PeproTech,Inc.)、凝血酶(Enzyme Research laboratoriesLtd.)、和BSA(Sigma-Aldrich Corp.))结合的结果,VGd1-2Ds-47显示与靶蛋白质的选择性结合(图17B)。
还制备了适体的多种截短的变体或具有将Ds碱基替换为A的取代变体的每一种,如表11所示。
[表11]
抗-VEGF-165适体(VGd1-2Ds-47)和其变体的序列及通过SPR测定的各DNA片段的VEGF-165结合能力的分析结果
a)contVG的序列以加下划线的斜体表示。
b)结合=[自蛋白质注射开始930秒后的共振单位]/[固定的DNA的共振单位]×[固定的DNA的分子量]/[VEGF-165的分子量]。
SPR测定条件:流速:20μl/min,测定温度:25℃,VEGF-165(10nM)的注射时间:480秒,及解离的监测时间:480秒。
传感图示于图18。解离常数通过全局拟合计算。
作为检查与靶蛋白质结合的结果,在5′-末端引物区处截短的45-mer变体(VGd1-2Ds-45;SEQ ID NO:202)具有16pM的Kd值(图17B和表11)。关于源自该45-mer DNA片段的通过将Ds碱基取代为A的变体(VGd1-2A-45;SEQ ID NO:203)的结合分析结果表明,在VGd1-2Ds-45中,两个Ds碱基,即Ds22和Ds33,强烈参与结合。在VGd1-2Ds-47中,进一步发现侧翼为两个Ds碱基的茎-2特别大程度地参与结合。同样,36-mer变体(VGd1-2Ds-36B;SEQ IDNO:212)具有17pM的Kd值(图17B和表11)。这些结果表明,在具有与VGd1-2Ds-47相关的核苷酸序列的抗-VEGF-165适体中,包含由SEQ ID NO:212代表的核苷酸序列的DNA适体具有VEGF-165结合活性。
通常,在本发明的核酸适体中,非天然核苷酸不会与天然核苷酸碱基配对。因此,核酸适体的核苷酸序列中一个或多个、优选两个或多个非天然核苷酸(例如,Ds)的存在导致一些预测的二级结构的候选物的排除。具体地,相比传统的核酸适体,根据本发明的核酸适体,预测的二级结构范围可被缩小,以获得更准确的二级结构。因此,根据本发明的核酸适体,其允许二级结构的更准确的预测,具有任意核苷酸序列的其它核酸适体衍生物可基于核酸适体的二级结构被构建。
实施例11:与IFN-γ结合的DNA适体的制备
与IFN-γ牢固地结合的DNA适体以如实施例8中相同的方式制备。该实施例的方法基本上与实施例8中的方法相同,并根据其进行。
(1)各自在中心区的特定位点处包含人工碱基Ds的单链DNA的文库的制备
使用实施例1中制备的各单链DNA文库。
(2)结合IFN-γ的包含Ds的单链DNA适体的制备
基本程序等遵循实施例8中描述的方法。在下文中,通常,与实施例8不同的点将被具体描述,以使得关于重叠部分的描述将被省略。
A.1选择轮的操作
(i)靶蛋白质与DNA文库之间的结合
为了在DNA分子中形成构象,进行折叠处理。然后,将文库溶液与含有Nonidet P-40的PBS溶液混合以调节Nonidet P-40的终浓度为0.005%。将所得核酸溶液与链霉亲和素偶联的磁珠混合。将上清液与IFN-γ(PeproTech,Inc.)混合以形成DNA-蛋白质复合物。
(ii)筛选与靶蛋白质结合的DNA序列
程序按照实施例8中描述的方法进行。
(iii)单链DNA文库的制备(扩增)
程序按照实施例8中描述的方法进行。选择轮数设定为7。每个选择轮的条件示于以上表7。为了使蛋白质-DNA复合物的形成条件更为严格,加入过量的具有以下核苷酸序列的DNA片段作为竞争性抑制分子(竞争剂):
ContIF(26-mer):5′-GGGGTTGGTTGTGTTGGGTGTTGTGT-3′(SEQ ID NO:228)
(3)通过选择获得的DNA适体序列的鉴定
DNA适体序列根据实施例8中描述的方法被鉴定。最终,分析了总计21242个读段序列。其中,具有大量克隆(=大量读段)的DNA适体是具有对靶物质的特别高结合能力的DNA适体。表12显示了具有100个或更多个克隆数的序列。
[表12]
*:总的计数:使用下一代测序仪通过序列分析获得的读段的总数
提取的计数:从读段总数中提取的分析物序列。
实施例12:与IFN-γ结合的DNA适体的结合分析
五种序列选自表12中所示的序列,并通过表面等离子体共振测定和在引物区截短的57-mer DNA片段(表13)分析了其结合IFN-γ的能力。还制备了先前报道的包含IFN-γ的DNA序列的57-mer DNA片段并作为对照被分析。
[表13]
*:结合=[自蛋白质注射开始930秒后的共振单位]/[固定的DNA的共振单位]×[固定的DNA的分子量]/[蛋白质的分子量]。
SPR测定条件:流速:20μl/min,测定温度:25℃,IFN-γ(150nM)的注射时间:480秒,及解离的监测时间:480秒。
基本方法遵循实施例9中描述的方法。在下文中,通常,与实施例9不同的条件将被具体地描述,以使得关于重叠部分的描述将被省略。通过与IFN-γ结合的检查获得的传感图示于图19。
该测定的结果表明,在用于测定的DNA片段中,IF07b-57与IFN-γ最牢固地结合。这些DNA片段中以天然碱基A替换Ds也被发现削弱所得DNA片段与靶蛋白质的结合。
使用于测定的DNA片段以与实施例9中相同的方式经受曲线拟合。结果,IF07b-57显示具有2nM的解离常数(Kd),其低于仅由天然碱基构成的现有适体(contIF-57)的解离常数(67nM),证明了该适体与靶蛋白质的牢固结合。
实施例13:基于IF07b-57的序列的掺杂选择
如实施例10,被发现与靶蛋白质牢固地结合的IF07b-57的标签和随机区序列被突变。通过选择进行适体的优化和二级结构的预测。基本操作按照实施例10中描述的方法进行。在以上表10所示的条件下进行每轮中的DNA适体选择。
4轮后通过选择获得的适体被测序,以分析73918个读段序列。从测序结果鉴定了具有高保持率的区和具有共变的区。从所获得的信息预测了其二级结构(图20A和20B)。
结果,在IF07b-57中证实了稳定预测的结构的单碱基突变,例如,G13突变为A13。包含该单碱基突变的47-mer截短的IFN-γ结合DNA片段(IFd1-3Ds-49;SEQ ID NO:214)(图21A),被用于通过SPR的结合分析。结果,IFd1-3Ds-49具有1.6nM的Kd,其高于仅由天然碱基构成的现有DNA适体(contIF-49;SEQ ID NO:224)的Kd 76nM(图21B和22)。这表明IFd1-3Ds-49可以以现有DNA适体的约40倍或更多倍强度与靶蛋白质结合。作为检查IFd1-3Ds-49与非靶蛋白质(VEGF-121(PeproTech,Inc.)、EGF(PeproTech,Inc.)、凝血酶(EnzymeResearch laboratories Ltd.)、和BSA(Sigma-Aldrich Corp.))结合的结果,IFd1-3Ds-49显示与靶蛋白质IFN-γ的选择性结合(图21A)。还制备了适体的多种截短的变体或将Ds碱基替换为A的取代变体的每一种,如表14所示。
[表14]
抗-IFN-γ适体(IFd1-3Ds-49)和其变体的序列及通过SPR测定的各DNA片段的IFN-γ结合能力的分析结果
a)contIF的序列以加下划线的斜体表示。
b)结合=[自蛋白质注射开始930秒后的共振单位]/[固定的DNA的共振单位]×[固定的DNA的分子量]/[IFN-γ的分子量]。
SPR测定条件:流速:20μl/min,测定温度:25℃,IFN-γ(150nM)的注射时间:480秒,及解离的监测时间:480秒。测定缓冲液:1mM KH2PO4、3mM Na2HPO4、和205mM NaCl,pH7.4。
传感图示于图22。解离常数通过全局拟合计算。
c)非特异性吸附从这些解离常数中被证实。因此,R最大值通过局部拟合确定,且其它值通过全局拟合来计算。
作为检查与靶蛋白质结合的结果,在5′-末端引物区截短的45-mer变体(IFd1-3Ds-45;SEQ ID NO:215)具有15nM的Kd值(图21B和22)。该结果表明,茎-1不是如图20B所示的IFd1-3Ds-49的IFN-γ结合活性所必需的。关于源自该45-mer DNA片段的通过以A替换Ds碱基的变体(IFd1-A2Ds-45;SEQ ID NO:219,IFd1-2DsA-45;SEQ ID NO:220,IFd1-DsADs-45;SEQ ID NO:221,IFd1-2ADs-45;SEQ ID NO:222,和IFd1-3A-45;SEQ ID NO:223)的结合分析结果表明,在IFd1-3Ds-45中,两个Ds碱基,即Ds29和Ds40,强烈参与结合。然而,这些结果还表明,这些Ds碱基Ds29或Ds40的任何一个足够用于结合。另一方面,Ds18被发现不是结合必需的。虽然除了茎-1和茎-2之外关于IFd1-3Ds-49的结构信息是未知的,四个G-段(G-tracts)出现在高度保守区,表明G-四联体(G-quartet)结构的可能形成。G-四联体结构是多种现有DNA适体或蛋白质相互作用的重要基序。这表明,Ds碱基的引入还可以增强特定基序诸如G-四联体结构的多样性。
本文引用的所有出版物、专利和专利申请都通过引用以其整体并入本文。
Claims (2)
1.一种可转录或可复制的核酸适体,所述核酸适体包含
天然核苷酸和
具有人工碱基可配对的人工碱基的非天然核苷酸,其中所述核酸适体针对干扰素γ作为靶物质;
其中所述核酸适体包括选自由以下构成的组的任何一个核苷酸序列:SEQ ID NO:167至174,条件是序列SEQ ID NO:167至174中的“n”表示7-(2-噻吩基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-3-基;SEQ ID NO:186;SEQ ID NO:188;SEQ ID NO:190;SEQ ID NO:192;SEQ ID NO:194;SEQ ID NO:214至222和SEQ ID NO:279至328。
2.根据权利要求1所述的核酸适体,其中所述核酸适体由5'侧翼为SEQ ID NO:1表示的核苷酸序列且3'侧翼为SEQ ID NO:2表示的核苷酸序列的根据权利要求1所述的任何一个核苷酸序列组成。
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