CN102321768A - 一种用于鉴定油茶品种的方法及其专用引物和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于鉴定油茶品种的方法及其专用引物和试剂盒，该方法分别以待鉴定的油茶样品DNA和标准对照样的DNA为模板，在相同引物对引导下进行PCR扩增获得产物，对产物进行电泳，对电泳结果进行基因型比对，基因型不同为不同品种，否则进行相同概率计算，达不到检测要求，继续选择引物进行PCR鉴定，直至符合鉴定概率要求即可；与现有的油茶鉴定方法相比，本发明的突出优点包括：利用10对油茶专用微卫星引物，进行油茶品种的遗传真实性鉴定，鉴定方法操作简单、快捷，鉴定的准确率高。此外，根据本发明的方法开发出相应的检测试剂盒，用于油茶品种遗传真实性鉴定，具有使用方法简单、快速、灵敏的优点，检测结果可靠、稳定、准确，为油茶品种遗传真实性鉴定提供了可靠技术手段。本发明将为油茶良种使用的监督检验发挥重要作用，应用前景广阔，具有很好的实用性，能够产生较好的经济效益和社会效益。
Description
技术领域
本发明涉及油茶品种的鉴定方法，具体涉及一种用于鉴定油茶品种基于遗传基因的方法及其专用引物和方法。
背景技术
油茶是世界四大木本油料树种之一，也是我国最重要的木本油料经济作物，其寿命长，具有一次种植、多年受益的特点，稳定收获期可长达80年以上。然而，一旦误用不当或伪劣品种造林，影响也将是深远的。近年我国政府投入巨资，大力发展油茶产业。按国家发展规划，到2015年全国的油茶种植规模将要达到六千万亩左右。在油茶产业蓬勃发展过程中，造林种苗是否为真实的优良品种，如同优良品种的选育本身一样，也是油茶林优质高产的基础。为确保油茶产业健康发展，急需建立一套真实、简便、快速、可靠的油茶品种遗传真实性鉴定技术，以满足对油茶种苗生产的监督检查、对新品种进行认定，以及对育种工作者的知识产权进行保护的需要。
植物品种遗传真实性鉴定的关键是所依赖的技术手段。以往植物品种鉴别所采用的方法主要是依据植物的形态特征。但植物品种间在形态上的差异，特别是苗期的差异，往往并不十分显著。尤其对油茶这类世代周期长的物种，性状的差异一般到了成熟期才能表现出来，大多数品种根本无法从幼苗的形态上进行鉴别。自上世纪八十年代以来，现代分子标记技术的应用，为植物新品种的鉴定提供了准确可靠的技术手段。分子标记是以DNA为基础的标记技术，是指能反映生物个体或种群间基因组差异的特征DNA片段，也称DNA指纹图谱。随着分子标记技术的发展，通过DNA指纹技术鉴别生物个体已经成为一项成熟的技术，并在许多植物新品种鉴别中得到了广泛应用。分子标记技术直接以植物DNA为分析对象，从根本上克服了环境的影响，同时也不受基因表达的限制，在DNA水平上进行品种遗传真实性鉴定不仅可靠性高，而且大大提高了检测效率。常见的分子标记有RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism限制片段长度多态性)、ISSR(Inter-simple sequence repeat简单重复序列)、RAPD(Random amplifiedpolymorphic DNA)、AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism，扩增片段长度多态性)、SSR(Simple Sequence Repeat，简单重复序列)等。应用分子标记对植物品种进行遗传真实性鉴定需要考虑以下因素：1.简便、快速，易于在实际检验工作中推广使用；2.标记针对待检物种有高度特异性，使检测结果不受内源和外源微生物或病原菌影响；3.标记扩增基因位点多态性高，可以利用较少的引物组合达到较高的检测精度。考虑上述要求，微卫星标记是目前不同标记类型中，用于植物品种遗传真实性鉴定的最高效的分子标记。微卫星DNA也称简单重复序列，是由长度为1-6bp串联重复序列组成，微卫星是基因组中变异最为迅速的序列，其高度多态性主要来源于串联数目的不同。微卫星标记是基于PCR扩增为基础的标记，微卫星标记分析相对于基于分子杂交为基础的标记要简便、快速的多。同时微卫星引物是由待检物种的基因组序列开发而来，具有极高的种属特异性，这样既使样品中含有不同的内源和外源微生物或病原菌污染，检测结果也不会受到干扰。这一优点是RAPD或AFLP等这类随机标记所不具备的。
油茶不同品种间同一位点的SSR重复次数存在差异，造成了品种间等位位点的长度多态性。根据微卫星序列两端互补序列设计引物，通过PCR反应扩增微卫星片段，由于微卫星串联重复数目不同，通过扩增片段的电泳分离，可以获得不同微卫星位点的基因型频率信息。根据不同品种在不同微卫星位点的基因型频率，就可以估算出不同品种遗传真实性鉴定的准确概率。
发明内容
发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种真实、简便、快速、可靠的用于鉴定油茶品种的方法，为油茶新品种保护，保证油茶产业的健康和可持续发展，把好种苗质量关，提供关键技术支撑。本发明的另一目的是提供一种上述用于鉴定油茶品种的方法的专用引物。本发明还有一目的是提供上述用于鉴定油茶品种的方法的试剂盒。
技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种用于鉴定油茶品种的专用引物，所述引物至少为下表中的2个引物对：
| 序号 | 名称 | 上游引物(5’-3’) | 下游引物(5’-3’) |
| 1 | NJFUC-243 | TGTATGGTTTGGCTCG | GGTTGGCAAGATGAGA |
| 2 | NJFUC-251 | AATCAACCAAGCGTAC | AGATCCTCCAAACTCC |
| 3 | NJFUC-273 | ATCTGTAGCTTAATTCTAG | ATTTTCTGGAGCATCT |
| 4 | NJFUC-53 | TGCCCTAAGTGTCATTC | CAGGGATGATATTGTTTCT |
| 5 | NJFUC-57 | ATAGGTCTTTGTCTGGTT | ATGTAGAGGAAGACTGGA |
| 6 | NJFUC-600 | GTCTTGGCTATCATTTT | TTTCCTATTGACCTCC |
| 7 | NJFUC-601 | GTGGATTCTAGGGAGC | CAAAACCGACTTATGG |
| 8 | NJFUC-653 | ACTGGTCGCACGCACTT | GCTGACATCATCGGCTTAG |
| 9 | NJFUC-787 | GTGGCTCAATAAGGAT′ | CATTACACCGTCTTCAT |
| 10 | NJFUC-833 | GTGGGTTACGGGTTTA | CGGGACAAGTTCAGTT |
一种用于鉴定油茶品种的方法，分别以待鉴定的油茶样品DNA和标准对照样的DNA为模板，在任意选取的两个引物对引导下进行PCR扩增获得产物，对产物进行电泳，对电泳结果进行基因型比对，若检测到基因型不同为则为不同品种；若检测到基因型均相同，查表2相应引物基因型出现的频率，计算待检样品与标准样品基因型相同的概率；若相同概率达不到检测要求时，选取第三对引物进行检测，直至相同概率达到检测要求即可；其中，引物对为权力要求1所述的专用引物。
上述方法中，PCR反应体系为：模板DNA25ng，FAM标记的上、下游引物各20ng，200uM dNTP，0.5U Taq聚合酶，1.5uL含100uM pH 8.3的Tris-HCl、500mM KCl、20mM MgCl2和10.0g/L BSA的10×buffer，加灭菌去离子水补充反应积到15uL；PCR反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，进行30个循环；72℃延伸5min。
一种用于鉴定油茶品种的试剂盒，含有上述的用于鉴定油茶品种的10个引物对。还含有Taq DNA聚合酶，10×PCR缓冲液、dNTP和双蒸水等。
一种用于鉴定油茶品种的方法，分别以待鉴定的油茶样品DNA和标准对照样的DNA为模板，用鉴定油茶品种的试剂盒进行PCR扩增获得产物，对产物进行电泳，对电泳结果进行基因型比对，若检测到基因型不同为则为不同品种；若检测到基因型均相同，查表2相应引物基因型出现的频率，计算待检样品与标准样品基因型相同的概率；若相同概率达不到检测要求时，选取第三对引物进行检测，直至相同概率达到检测要求即可；其中，试剂盒为权利要求2或3所述的用于鉴定油茶品种的试剂盒。其中，试剂盒为上述的用于鉴定油茶品种的试剂盒。
上述方法中，PCR反应体系为：模板DNA25ng，FAM标记的上、下游引物各20ng，200uM dNTP，0.5U Taq聚合酶，1.5uL含100uM pH 8.3的Tris-HCl、500mM KCl、20mM MgCl2和10.0g/L BSA的10×buffer，加灭菌去离子水补充反应积到15uL；PCR反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，进行30个循环；72℃延伸5min。
上述方法中，是以大群体抽样的方法，用128个油茶品种的DNA模板，在权利要求1的引物对引导下进行PCR扩增，采用ABI-3130和GeneMapper分析软件进行基因型分析，获得不同品种在不同引物位点的基因型频率信息，然后利用获得的基因型频率，选择引物。对待测样本进行检验时可利用低成本的聚丙烯酰胺凝胶电泳，通过基因型比对，若待检样品和对照标准品种基因型在任何一个微卫星引物位点上表现不同，即否定待检品种和标准对照是同一品种，若所有选用引物在待检样品和对照标准品种中产生的基因型均一致，可查表2的基因型频率，计算出待检样品和对照标准品种是同一品种的鉴定准确概率。
有益效果：与现有的油茶鉴定方法相比，本发明的突出优点包括：利用10对油茶专用微卫星引物，进行油茶品种的遗传真实性鉴定，鉴定方法操作简单、快捷，鉴定的准确率高。此外，根据本发明的方法开发出相应的检测试剂盒，用于油茶品种遗传真实性鉴定，具有使用方法简单、快速、灵敏的优点，检测结果可靠、稳定、准确，为油茶品种遗传真实性鉴定提供了可靠技术手段。本发明将为油茶良种使用的监督检验发挥重要作用，应用前景广阔，具有很好的实用性，能够产生较好的经济效益和社会效益。
附图说明
图1是用于测序的浙江红花油茶基因组DNA的1％的琼脂糖凝胶电泳图；
图2是Agilent-2100生物分析仪显示的油茶DNA文库电泳图；
图3是NJFUC-243(上)及NJFUC-57(下)在对照及送检样品中产生的指纹图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。
下述实例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所用微卫星引物合成工作由上海捷瑞生物技术有限公司完成。微卫星引物具体如表1所示。
表1 微卫星引物序列详情表
| 序号 | 名称 | 上游引物(5’-3’) | 下游引物(5’-3’) |
| 1 | NJFUC-243 | TGTATGGTTTGGCTCG | GGTTGGCAAGATGAGA |
| 2 | NJFUC-251 | AATCAACCAAGCGTAC | AGATCCTCCAAACTCC |
| 3 | NJFUC-273 | ATCTGTAGCTTAATTCTAG | ATTTTCTGGAGCATCT |
| 4 | NJFUC-53 | TGCCCTAAGTGTCATTC | CAGGGATGATATTGTTTCT |
| 5 | NJFUC-57 | ATAGGTCTTTGTCTGGTT | ATGTAGAGGAAGACTGGA |
| 6 | NJFUC-600 | GTCTTGGCTATCATTTT | TTTCCTATTGACCTCC |
| 7 | NJFUC-601 | GTGGATTCTAGGGAGC | CAAAACCGACTTATGG |
| 8 | NJFUC-653 | ACTGGTCGCACGCACTT | GCTGACATCATCGGCTTAG |
| 9 | NJFUC-787 | GTGGCTCAATAAGGAT′ | CATTACACCGTCTTCAT |
| 10 | NJFUC-833 | GTGGGTTACGGGTTTA | CGGGACAAGTTCAGTT |
实施例1
微卫星引物是基于二代高通量测序获得的大量油茶基因组序列开发而来，首先利用高通量测序完成了油茶基因组3.48亿碱基“Shotgun”序列测定。油茶二倍体基因组染色体数目为2n＝30，基因组大小约为3800Mb。而栽培品种中油茶多倍体比较普遍，为提高测序和组装效率，优选采用二倍体油茶进行DNA测序。浙江红花油茶为二倍体，本专利选用的测序个体为一株采自福建泰宁的浙江红花油茶。
为满足DNA测序的质量要求，测序DNA模板采用Qiagen DNeasy Plant MiniKit提取，通过微量核酸蛋白检测仪检测浓度，1％的琼脂糖凝胶电泳检测质量如图1所示。提出的15份DNA材料A260/280的比值在1.75≤OD≤1.85，根据琼脂糖的检测结果，确定了11-15号为最理想建库的DNA样品。
利用Roche GS Rapid Library Preparation Kit进行了文库构建。取2ug基因组DNA用Roche Nebulizer Kit中的试剂，在0.2Mpa的氮气压力下将DNA打断成随机片段，将片段补平加A后连接接头，再用AMPure beads处理去除小片段，用TBS-380荧光分光光度计对文库进行定量，根据定量结果用TE将文库稀释成1×107molecules/uL，-80℃保存。用Agilent-2100生物分析仪测定文库的质量，片段电泳结果见图2。从图2中可以看出文库片段的长度范围符合DNA测序最适片段平均大小在600-900bp适合区间内，同时图形积分的结果显示长度小于350bp的片段总数约占文库片段总数的1％，建成文库质量高于350bp的片段的含量要小于10％的标准，建成的文库质量较高。
利用ROCHE-454GLX测序仪对建成的文库进行序列测定。首先利用RocheemPCR标准试剂盒确定样品回收率为8％的最佳文库上样量，根据emPCR SV实验确定了最佳上样量为4.5cpb(copies per bead)。然后再用emPCR LV的试剂盒对样品进行扩增，最后回收扩增后一个珠子连接一个DNA序列的珠子上机测序。根据颗粒计数仪的结果取400万个珠子上样，测序时将PTP板分成两个区，每区分别有200万珠子。测序统计结果显示，总共得到109183个序列，共测得油茶基因组348.9Mb的DNA序列，片段平均读长为320bp。利用GS Assembler软件对测定序列进行了序列组装和拼接。共获得了8.51万个长度大于300bp的Contigs。由于微卫星扩增片段一般在100-300bp之间，这些Contigs适合用于微卫星标记开发。利用Sputnick程序搜寻SSR，搜索SSR的参数设定为：单核苷酸在10bp以上，其它SSR的核苷酸重复序列在12bp以上。对搜索出的SSR的分布和频率进行统计和分析。通过分析开发了包含1万多个油茶微卫星序列的数据库。
采用Primer 5.0软件设计引物，引物的长度一般在16-22bp，GC含量在40％-60％之间，理论退火温度在50-65℃之间，产物预测长度在150-300bp之间，引物内不出现二级结构。
以往的生物信息学分析发现微卫星可分为两大类：长度≥20bp的SSR为第一类，长度大于12bp但小于＜20bp的为第二类(Temnykh et al，2001)。与第二类SSR相比，第一类SSR具有更高的多态性。这一规律是Weber(1990)最早于人类的微卫星实验数据中发现，并已在很多生物体中得到证实。针对油茶的微卫星分析还发现，油茶基因组微卫星长度的变异速率与重复单元长度呈负相关。根据以上生物信息学结果，选取1000对油茶微卫星引物由上海捷瑞生物技术有限公司进行了合成。利用合成的引物对浙江红花油茶和湘林1号DNA进行PCR扩增，用1.5％的琼脂糖凝胶电泳对这1000对SSR引物进行了初步筛选，筛选出能扩增出产物且条带清晰的引物612对。
然后再随机挑选了8个不同产地的油茶DNA，用8％的聚丙烯酰胺凝胶电泳对这612对引物进行多态性的筛选。对引物扩增位点的变异频率用多态信息含量(polymorphism information content，PIC)指数进行估算(Keim et al，1992)。
式中n为某一SSR引物扩增的等位基因数，Pi为该位点第i个等位基因的频率。一般认为PIC＞0.5为高度多态微卫星位点。
根据聚丙烯凝胶电泳谱带和引物扩增位点的PIC指数，选取了10对电泳指纹清晰、基因型容易判定、多态性信息含量高的引物组合：NJFUC-601，NJFUC-53，NJFUC-57，NJFUC-251，NJFUC-833，NJFUC-600，NJFUC-787，NFJUCID-273，NJFUC-243，NJFUC-653，用于油茶品种的遗传真实性鉴定。对应引物的PIC指数分别为：0.70，0.85，0.94，0.98，0.94，0.88，0.94，0.94，0.96，0.95。具体序列见序列表或表1所示。
实施例2
利用实施例1筛选得到的10对引物对采自广西、湖北、湖南、江西、安徽、福建等地的128个油茶品种进行了基因型检测。具体方法如下：
DNA提取参照Murry和Thomson(1990)的方法，从油茶叶片中提取。然后以此为模板，利用筛选得到的10对引物在ABI-9700热循环仪上进行PCR扩增。PCR的总反应体系为15uL，反应体系包括：模板DNA25ng，上、下游引物各20ng(FAM标记)，200uM dNTP，0.5U Taq聚合酶，1.5uL 10×buffer(含100uMTris-HCl，pH 8.3，500mM KCl，20mM MgCl2和10.0g/L BSA)，加灭菌去离子水补充反应积到15uL。PCR反应条件为：94℃预变性2min；然后94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，进行30个循环；循环结束后，72℃延伸5min。
基因型分析在ABI3130测序仪上按如下步骤进行：反应产物用灭菌去离子水1∶20稀释；取1uL稀释后的反应产物，加9uL上样缓冲液(含91％去离子甲酰胺，9％450ROX内标)；配制好的上样产物95℃变性5min后置于冰上迅速冷却，然后上机运行。
利用GeneMapper基因型分析软件对获得的电泳谱带进行基因型分析，对每一引物具有相同扩增谱带的品种进行基因型合并，用每一基因型所含的品种数除以检测品种的总数，就可以得到每一基因型在某一微卫星位点的基因型频率。如采用引物i，某一品种基因型在检测品种中的出现频率为Gfi，则采用10对引物，待检品种与该品种用所有10个微卫星位点都扩增出相同指纹图的概率为：式中Gfi为某一品种用第i引物所揭示的基因型频率。本专利检测的所有品种用相应引物扩增的基因型频率，以及待检样品和对应品种在10对引物位点均具有相同基因型的概率见表2。表中每一品种与对应引物单元格内的数字为该品种利用相应引物扩增得到的基因型在128个测试品种中出现的频率。表中概率为用所有10对引物进行检测时，待检样品与对应品种基因型相同的概率。从表中概率值可以看出，待检样品和表中品种在10个微卫星位点上都出现相同基因型的概率是极低的。在实际检验过程中选用不同品种基因型频率较低的引物，可以减少所需引物组合的数量，对大多数品种而言，选用2对引物即可使鉴定准确概率达到99.5％以上。
表2 128个品种对应引物基因型出现频率表
表中，“-”代表数据缺失。
实施例3
利用实施例1筛选的引物，对国家林业局南方种子检验中心送检的一批可能为岑软3号，也可能是假冒岑软3号的样品进行了检测，送检样品共有9个样。在实验过程中采用标准的岑软3号为对照，为验证PCR的重复性，对照设置了两个重复。任选用引物NJFUC-243和NJFUC-57对包括对照在内的11份样品进行了PCR扩增。这两个引物在岑软3号中扩增出的基因型在表2的128个品种中出现频率均较低。
本实验中，扩增反应体系及扩增条件同实施例1。扩增结束后，对扩增产物用8％聚丙烯酰胺凝胶进行电泳检测。具体操作步骤如下：制备8％聚丙烯酰胺凝胶；室温下聚合2h后，将凝胶板固定于电泳槽上，用1x TBE冲洗胶孔，并在55℃保温箱中低压预电泳30min；取1uL PCR产物，按1∶9与上样缓冲液(9uL去离子甲酰胺加1uL 10mg/mL溴酚兰)混合；94℃变性10min，结束后迅速置冰上冷却；点样，200V恒压在55℃保温箱中电泳1h。电泳结束后，进行凝胶硝酸银染色，具体过程如下：将凝胶放入脱色盘中，用去离子水在脱色摇床上缓慢洗涤2min；将凝胶转入盛1％硝酸银溶液的脱色盘中，在脱色摇床上缓慢摇动，染色30min；用去离子水快速清洗凝胶2次后，转入盛显色液的脱色盘中，在脱色摇床上缓慢摇动，显色约10min，当凝胶上显出清晰的DNA条带时，取出凝胶用去离子水漂洗2次后，置灯箱上拍照。两个引物对送检样品获得的基因型指纹图如图3所示。
图3中，靠左边的两个箭头所指为对照岑软3号(1、2)的聚丙烯酰胺凝胶电泳指纹图，其他箭头所指为待检样品(3、4、5、6、7、8、9、10、11)中和对照基因型相同的样品(6、9、10、11)。从结果可以看出，当利用NJFUC-243引物进行检测时，共有4份样品和和对照基因型一致。当利用第二个引物NJFUC-57进一步检测时，只剩其中的一个样品(6)和对照基因型一致。所以只有样品6可能为岑软3号，其它样品均排除为岑软3号的可能。在表2的128个品种中，NJFUC-243在岑软3号中扩增出的基因型出现频率约为0.01，NJFUC-57在岑软3号中扩增出的基因型出现频率约为0.02。从图3中看出，对应引物在岑软3号扩增出的基因型在本例实验待检样品中出现频率明显偏高，说时待检样品可能存在一定的亲缘关系。在基因型频率估算时，群体应采用样品间没有亲缘关系的大样本，所以基因型频率应以表2中对应的数值为准。同时用这两个引物检测，样品6与岑软3号是同一基因型的概率约为99.98％。在实验检验过程中如要确定待检样品是否为某一品种，只需利用相应品种作对照，然后在表2中选择在对照中扩增出的基因型出现频率较低的引物，进行基因型分析，只要待检样品在任何一个引物中出现的基因型和对照不匹配，就可以否定待检样品和对照为同一基因型。若所有选用的引物在待检样品和对照中扩增出相同的基因型，可根据表2中对应引物在对照中扩增出的基因型的出现频率，利用实施例2中的公式，计算待检样品和对照基因型相同的准确概率，若准确概率达不到要求，可增加选用其它引物，直到准确概率达到要求为止。
对表2没有包括的新品种，可用表2中的引物获得该品种的标准指纹图，若新品种在某一引物位点的基因型是表2中品种已出现的基因型，其频率可用表2中对应的基因型频率作为估计值。若基因型为新品种中出现的新的基因型，其频率可按0.01作保守估计。根据上述信息就可以对待检样品和新品种进行检验了。
实施例4
用于鉴定油茶品种的试剂盒，包括以下试剂：5U/μl Taq聚合酶，10×PCR扩增反应缓冲液(含100μM Tris-HCl，pH 8.3，500mM KCl，20mM MgCl2和10.0g/L BSA)，25mmol/L 10×dNTPs，实施例1中筛选出的10对用于油茶品种遗传真实性鉴定的引物25ng/uL，dd H2O。
试剂盒规格可以为100次反应/盒。试剂盒各组分的数量和体积可以为：Taq聚合酶1管(30uL每管)；10×PCR扩增反应缓冲液1管(500uL每管)；25mmol/L10X dNTPs 1管(150uL每管)；每对引物上、下游引物25ng/uL各1管(150uL每管)；dd H2O 1管(1000uL每管)。按上述试剂量对试剂盒中的各个组分进行包装既得。
采用上述试剂盒进行鉴定油茶品种鉴定的方法，与采用专用引物进行鉴定油茶品种鉴定的方法相同，效果相当。
SEQUENCE LISTING
<110> 南京林业大学
<120> 一种用于鉴定油茶品种的方法及其专用引物和试剂盒
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<170> PatentIn version 3.5
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<213> Artificial Sequence
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<223> NJFUC-600上游引物序列
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<213> Artificial Sequence
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<400> 15
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<213> Artificial Sequence
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<211> 17
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NJFUC-833下游引物序列
<400> 20
cgggacaagttcagtt 16
Claims (7)
1.一种用于鉴定油茶品种的专用引物，其特征在于：所述引物至少为下表中的2个引物对：
。
2.一种用于鉴定油茶品种的试剂盒，其特征在于：含有权利要求1所述的10个用于鉴定油茶品种的引物对。
3.根据权利要求2所述的用于鉴定油茶品种的试剂盒，其特征在于：还包括10×PCR缓冲液、dNTP、双蒸水、以及Taq DNA聚合酶。
4.一种用于鉴定油茶品种的方法，其特征在于：分别以待鉴定的油茶样品DNA和标准对照样的DNA为模板，在任意选取的两个引物对引导下进行PCR扩增获得产物，对产物进行电泳，对电泳结果进行基因型比对，若检测到基因型不同为则为不同品种；若检测到基因型均相同，查表2相应引物基因型出现的频率，计算待检样品与标准样品基因型相同的概率；若相同概率达不到检测要求时，选取第三对引物进行检测，直至相同概率达到检测要求即可；其中，引物对为权力要求1所述的专用引物，表2为说明书中的表2。
5.根据权利要求4所述的用于鉴定油茶品种的方法，其特征在于：PCR反应体系为：模板DNA 25ng，FAM标记的上、下游引物各20ng，200uM dNTP，0.5 U Taq聚合酶，1.5uL含100 uM pH 8.3的Tris-HCl、500 mM KCl、20 mM MgCl2和10.0 g /L BSA 的10× buffer，加灭菌去离子水补充反应积到15uL；PCR反应条件为：94℃预变性2min； 94℃变性30s，50℃退火30 s，72℃延伸1min，进行30个循环；72℃延伸5min。
6.一种用于鉴定油茶品种的方法，其特征在于：分别以待鉴定的油茶样品DNA和标准对照样的DNA为模板，用鉴定油茶品种的试剂盒进行PCR扩增获得产物，对产物进行电泳，对电泳结果进行基因型比对，若检测到基因型不同为则为不同品种；若检测到基因型均相同，查表2相应引物基因型出现的频率，计算待检样品与标准样品基因型相同的概率；若相同概率达不到检测要求时，选取第三对引物进行检测，直至相同概率达到检测要求即可；其中，试剂盒为权利要求2或3所述的用于鉴定油茶品种的试剂盒，表2为说明书中的表2。
7.根据权利要求6所述的用于鉴定油茶品种的方法，其特征在于：PCR反应体系为：模板DNA 25ng，FAM标记的上、下游引物各20ng，200uM dNTP，0.5 U Taq聚合酶，1.5uL含100 uM pH 8.3的Tris-HCl、500 mM KCl、20 mM MgCl2和10.0 g /L BSA 的10× buffer，加灭菌去离子水补充反应积到15uL；PCR反应条件为：94℃预变性2min； 94℃变性30s，50℃退火30 s，72℃延伸1min，进行30个循环；72℃延伸5min。
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