CN106676175A - 用于快速鉴定油茶良种岑软2号的特异性标记引物对及鉴定方法 - Google Patents
用于快速鉴定油茶良种岑软2号的特异性标记引物对及鉴定方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了用于快速鉴定油茶良种岑软2号的特异性标记引物对，它们包括具有序列表SEQ.ID.No.1和SEQ.ID.No.2碱基序列的上下游引物。同时，发明人还建立了相应的鉴定方法，即以前述特异性标记引物对油茶良种岑软系列品种进行PCR扩增，若电泳结果未出现756bp的DNA条带，则待测油茶品种为岑软2号，反之则否。试验表明，该法具有特异性，仅适用岑软系列油茶良种的鉴别，可对油茶良种岑软2号进行快速的早期鉴别，具有简单、快捷、准确等特点，是表观特征辨别油茶良种所不能替代的分子手段。
Description
技术领域
本发明属于油茶鉴定技术领域，尤其涉及用于快速鉴定油茶良种岑软2号的特异性标记引物对及鉴定方法。
背景技术
油茶(Camellia oleifera)是我国南方重要的木本油料树种，与油棕、油橄榄和椰子并称为世界四大木本食用油料植物。油茶籽油中富含油酸、亚油酸等不饱和脂肪酸，含量一般在90％以上，其营养价值和保健价值可与橄榄油相媲美，是名副其实的优质食用植物油。岑溪软枝油茶是我国第一个油茶良种，属普通油茶的一个农家品种，以枝条韧软、挂果下垂而得名，在此基础上先后育成并通过国家或省级良种审、认定的岑软系列高产优良无性系9个，如岑软2号、岑软3号等，这些无性系兼备早实、高产、稳产、优质等优良特性，适宜我国南方及东南亚地区推广应用。
传统的油茶品种鉴别多以形态特征、生物学特征、经济性状为主要依据，但这些指标的评价有时很细微，部分差异仅体现在特定发育阶段(如花期、果期)、特定经济性状(如出籽率、出油率、油品质)等，易受到生态环境、气候变化等因素的影响，且外观表现的数量有限，特别在苗期不具备多数识别特征，单纯依靠经验区分难度极大，导致目前市场上油茶岑软系列油茶优良无性系品种混乱，以劣充优、以实生苗充当无性系的现象常有发生，严重制约了油茶良种化的进程。究其原因，关键问题是缺乏一种快捷、准确适合于油茶品种早期鉴别的技术方法。
自本世纪以来，一些基于PCR的分子标记技术如RAPD(Random AmplifiedPolymorphic DNA，随机扩增多态性DNA)、ISSR(Inter-Simple Sequence Repeat，简单序列重复区间扩增多态性)和SRAP(sequence-related amplified polymorphism，相关序列扩增多态性)相继用于了油茶的种质资源遗传多样性、遗传距离研究，但对于分子标记与油茶性状的连锁、油茶品种间的分子鉴别研究很少。况且，这些分子标记技术所采用的均为通用引物，其PCR扩增图谱不仅复杂、重复性差，而且特异性不高，因此并不适合用于品种鉴别，只有开发出某个品种稳定、特异的DNA指纹标记才能真正用于该品种的准确快速鉴定。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供特异性高的用于快速鉴定油茶良种岑软2号的特异性标记引物对及鉴定方法，以实现对油茶良种岑软2号进行早期、快速鉴定。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
用于快速鉴定油茶良种岑软2号的特异性标记引物对，包括具有以下碱基序列的上下游引物：
上游引物：5’-ATCATGACTAGTCGTTCTT-3’(SEQ.ID.No.1)，
下游引物：5’-TAGCTACCAGTGTCTTGA-3’(SEQ.ID.No.2)。
油茶良种岑软2号的快速鉴定方法，使用具有以下碱基序列的特异性标记引物对进行PCR扩增：
上游引物：5’-ATCATGACTAGTCGTTCTT-3’，
下游引物：5’-TAGCTACCAGTGTCTTGA-3’。
上述油茶良种岑软2号的快速鉴定方法，提取油茶良种岑软系列品种叶片的基因组DNA作为模板，以特异性标记引物对作为扩增引物进行PCR扩增，再对扩增产物进行电泳检测。
PCR扩增的反应体系和反应程序分别为：
反应体系：2×Power Taq PCR Master Mix 10μL，10μM上下游引物各1μL，DNA模板2.0μL，加ddH2O至20μL；
反应程序：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸6min；4℃终止反应。
针对现有岑软系列油茶识别鉴定存在的问题，在大量引物对的基础上，发明人利用基于PCR的分子标记技术对油茶良种岑软系列进行引物对筛选试验，意外的发现其它岑软系列油茶品种均获得756bp大小的特异性片段而岑软2号没有获得。据此，发明人设计并制备了用于快速鉴定油茶良种岑软2号的特异性标记引物对，它们包括具有序列表SEQ.ID.No.1和SEQ.ID.No.2碱基序列的上下游引物。同时，发明人还建立了相应的鉴定方法，即以前述特异性标记引物对油茶良种岑软系列品种进行PCR扩增，若电泳结果未出现756bp(SEQ.ID.No.3)的DNA条带，则待测油茶品种为岑软2号，反之则否。试验表明，该法具有特异性，仅适用岑软系列油茶良种的鉴别，可对油茶良种岑软2号进行快速的早期鉴别，具有简单、快捷、准确等特点，是表观特征辨别油茶良种所不能替代的分子手段。
附图说明
图1是应用本发明对油茶良种岑软系列品种进行PCR扩增的结果之一，图中：M为DNA分子量标准(型号：DL200DNA Mark)，1油茶良种岑软2号，2岑软3号，3岑软4号，4岑软11号，5岑软14号，6岑软22号，7岑软23号，8岑软24号，9岑软25号，10岑软26号。
图2是应用本发明对油茶良种岑软系列品种进行PCR扩增的结果之二，图中：M为DNA分子量标准(型号：DL200DNA Mark)，1油茶良种岑软2号，2岑软3号，3岑软4号，4岑软11号，5岑软14号，6岑软22号，7岑软23号，8岑软24号，9岑软25号，10岑软26号。
具体实施方式
以下通过具体实例结合附图，对本发明的如何实施进一步具体说明。需要注意的是，本发明关键在于特异性扩增引物的选择，其它操作步骤如DNA提取、PCR反应体系及反应条件确定、电泳检测均可按照本领域常规操作进行。若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。
实施例1
(1)油茶良种岑软2号及对照组叶片基因组DNA的提取
取待测油茶良种幼嫩叶片0.3g，加液氮彻底磨碎，基因组DNA的提取利用新型快速植物基因组DNA提取盒(DP320，TIANGEN，天根生化科技北京有限公司)，以提取获得油茶良种的基因组DNA粗提物。DNA粗提物通过1.5％的琼脂糖凝胶电泳和DNA/RNA紫外分光光度计(Nanodrop Teehnologies，USA)来检测完整性、纯度及浓度，OD260/OD280＞1.8的DNA样品用于后续PCR扩增。DNA提取物于-20℃冰箱贮藏备用。
(2)油茶良种岑软2号的分子特异性标记引物对的序列(上海生物工程技术有限公司合成)
上游引物：5’-ATCATGACTAGTCGTTCTT-3’，
下游引物：5’-TAGCTACCAGTGTCTTGA-3’。
(3)PCR扩增反应体系及扩增条件
PCR扩增反应体系(20μL)，如表1。
表1实施例1反应体系
PCR扩增反应条件：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸6min；4℃终止反应。扩增反应在美国伯乐T100型扩增仪上进行。(4)电泳检测：取步骤(3)PCR扩增产物5μL，与1μL0.25％嗅酚兰缓冲液混匀，点样于1.5％的琼脂糖凝胶上，于1×TAE缓冲液中，100V电压下电泳，电泳结束后，然后在美国伯乐自动凝胶图像分析仪(chemiDocxRSimagingSystem，BIO-Rad，HerCules，CA，USA)上照相。
按照上述方法，分别对多个油茶良种的特异引物PCR扩增图谱进行电泳检测(油茶良种均来岑溪国家油茶良种繁育基地种子园)，结果见图1。结果显示，油茶良种岑软2号中未扩增出756bp大小的特异DNA条带，而其余编号的岑软油茶良种均可见清晰稳定756bp大小的特殊DNA条带产生。
实施例2
(1)油茶良种岑软2号及对照组叶片基因组DNA的提取
取待测油茶良种幼嫩叶片0.3g，加液氮彻底磨碎，基因组DNA的提取利用新型快速植物基因组DNA提取盒(DP320，TIANGEN，天根生化科技北京有限公司)，以提取获得油茶良种的基因组DNA粗提物。DNA粗提物通过1.5％的琼脂糖凝胶电泳和DNA/RNA紫外分光光度计(Nanodrop Teehnologies，USA)来检测完整性、纯度及浓度，OD260/OD280＞1.8的DNA样品用于后续PCR扩增。DNA提取物于-20℃冰箱贮藏备用。
(2)油茶良种岑软2号的分子特异性标记引物对的序列(上海生物工程技术有限公司合成)
上游引物：5’-ATCATGACTAGTCGTTCTT-3’，
下游引物：5’-TAGCTACCAGTGTCTTGA-3’。
(3)PCR扩增反应体系及扩增条件
PCR扩增反应体系(20μL)，表2。
表2实施例2反应体系
PCR扩增反应条件：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸6min；4℃终止反应。扩增反应在美国伯乐T100型扩增仪上进行。(4)电泳检测：取步骤(3)PCR扩增产物5μL，与1μL0.25％嗅酚兰缓冲液混匀，点样于1.5％的琼脂糖凝胶上，于1×TAE缓冲液中，100V电压下电泳，电泳结束后，然后在美国伯乐自动凝胶图像分析仪(chemiDocxRSimagingSystem，BIO-Rad，HerCules，CA，USA)上照相。
按照上述方法，分别对多个油茶良种的特异引物PCR扩增图谱进行电泳检测(油茶良种均来岑溪国家油茶良种繁育基地种子园)，结果见图2。结果显示，油茶良种岑软2号中未扩增出756bp大小的特异DNA条带，而其余编号的岑软油茶良种均可见清晰稳定756bp大小的特殊DNA条带产生。
SEQUENCE LISTING
<110> 广西壮族自治区林业科学研究院
<120> 用于快速鉴定油茶良种岑软2号的特异性标记引物对及鉴定方法
<130> 用于快速鉴定油茶良种岑软2号的特异性标记引物对及鉴定方法
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<400> 1
atcatgacta gtcgttctt 19
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(18)
<400> 2
tagctaccag tgtcttga 18
<210> 3
<211> 756
<212> DNA
<213> Camellia oleifera
<400> 3
atcatgacta gtcgttcttg gatcccggca ccaatgttcg gcggagaccg agcgccgccg 60
cgggaggagg aggaggagaa gaggccattt ctgattcgct ctcgaagacg agctcgttgg 120
aaactgatag tttggttttt ggttcggaaa acaatcagag tcagatcgta gacggtgacg 180
gcggcgataa ggttgcgaat ggagaggaca gggagaagga caatttggcg aaattctcgt 240
accggccgtc tgctccggcc caccggagaa tcagggagag tcctctcagc tctgacgcta 300
tattcaaaca gagtcatgct ggtctcttca acctctgtat agtagttctt gaattggtaa 360
acagccggct tatcattgaa aatctgatga agtatggctg gttgattagg tctggtttct 420
ggtttagttc gaaatcattg agggattggc caggactaat gtgctgtatt actctcctgc 480
ttttcccact tgctgctttt gtagtcgaga agttggtgcg acaaaagaat atatctttag 540
gagtggttgt cagccttcac atattaataa cgattgctac agttttgatt ccagtttttg 600
tgatcctcag gtatgattct gctgttctat ctggcgtcac attaatgctc tttgcatgcg 660
ttgtgtggct gaagttggta tcctatgcac atacaaatta tgacatgaga gcgcttgcta 720
aatcacttga taaggggaag tgatggtcac agaact 756
Claims (4)
1.用于快速鉴定油茶良种岑软2号的特异性标记引物对，其特征在于包括具有以下碱基序列的上下游引物：
上游引物：5’-ATCATGACTAGTCGTTCTT-3’，
下游引物：5’-TAGCTACCAGTGTCTTGA-3’。
2.油茶良种岑软2号的快速鉴定方法，其特征在于使用具有以下碱基序列的特异性标记引物对进行PCR扩增：
上游引物：5’-ATCATGACTAGTCGTTCTT-3’，
下游引物：5’-TAGCTACCAGTGTCTTGA-3’。
3.根据权利要求2所述的油茶良种岑软2号的快速鉴定方法，其特征在于提取油茶良种岑软系列品种叶片的基因组DNA作为模板，以所述特异性标记引物对作为扩增引物进行PCR扩增，再对扩增产物进行电泳检测。
4.根据权利要求3所述的用于快速鉴定油茶良种岑软2号的特异性标记引物对及鉴定方法，其特征在于所述PCR扩增的反应体系和反应程序分别为：
反应体系：2×Power Taq PCR Master Mix 10μL，10μM上下游引物各1μL，DNA模板2.0μL，加ddH2O至20μL；
反应程序：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸6min；4℃终止反应。
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