CN109266778B - 基于杂交兰转录组开发的est-ssr标记引物及应用 - Google Patents

基于杂交兰转录组开发的est-ssr标记引物及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了杂交兰EST‑SSR引物，及其在杂交兰植物的种质资源遗传多样性分析、遗传图谱构建和标记辅助育种中的应用。本发明公开了9组引物对，以及杂交兰EST‑SSR引物的筛选方法，具体包括：获取目标杂交兰叶片的原始基因数据库、对原始基因数据库进行SSR位点搜索、Primer 5.0对目标序列进行PCR引物设计，并生成候选引物；对候选引物进行PCR扩增，选出初筛分PCR引物，最后筛选出杂交兰EST‑SSR引物。本发明提供的9对EST‑SSR标记引物来自于杂交兰叶片转录组序列，引物的多态性丰富、扩增稳定、扩增条带易于鉴定，是稳定存在的新标记，填补了杂交兰基于转录组开发SSR引物的空白。

Description

基于杂交兰转录组开发的EST-SSR标记引物及应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体的说是涉及基于杂交兰转录组开发的EST-SSR标记引物及应用。
背景技术
杂交兰(Cymbidium hybrid)是由国兰和大花蕙兰杂交培育而成的一类兰花的特称，不仅有国兰的植株小巧、幽香，还具有大花蕙兰的花大、色艳等优异特性，拥有较高的观赏、经济和文化价值，近年来深受消费者的喜爱，已成为兰花市场中新兴的、具发展潜力的兰花新种类，市场前景广阔。目前，有关杂交兰的研究主要集中在组织培养技术、栽培技术、花期调控等方面，对于杂交兰遗传多样性、遗传图谱构建、基因定位等方面的研究还很少。杂交兰中用于以上研究的分子标记仅为一些通用引物如RAPD，SRAP等，这大大限制了杂交兰分子育种的进程。
表达序列标签微卫星(EST-SSR)是一种基于表达序列标签的简单序列重复设计的新型分子标记，具多态性高、共显性遗传、重复性好、开发成本低等优点，且其来自基因组的编码区，与功能基因紧密连锁，更容易获得基因表达的信息。随着EST数据库不断丰富和高通量测序技术发展，EST-SSR在植物上被大量开发和应用，但有关EST-SSR在杂交兰中的应用研究还未见报道。
因此，建立一种基于杂交兰叶片转录组筛选EST-SSR引物方法，筛选出杂交兰EST-SSR引物，对杂交兰植物的种质资源遗传多样性进行分析、遗传图谱构建和标记辅助育种是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了杂交兰EST-SSR引物以及杂交兰EST-SSR引物在杂交兰植物的种质资源遗传多样性分析、遗传图谱构建和标记辅助育种中的应用。其中本发明的9对EST-SSR标记引物来自于杂交兰叶片转录组序列，引物的多态性丰富、扩增稳定、扩增条带易于鉴定，是稳定存在的新标记，填补了杂交兰基于转录组开发SSR引物的空白。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
杂交兰EST-SSR引物，包括以下9组引物对，其核苷酸序列如下：
F1：5'-TGGCACTAGTCAACCGTCAG-3'；SEQ ID NO.1；
R1：5'-GCCAGTTACTTTCCTTAGGCG-3'；SEQ ID NO.2；
F2：5'-CCGAGCACTGAAACATGAGA-3'；SEQ ID NO.3；
R2：5'-CACATGTGCTTGCTACCGAC-3'；SEQ ID NO.4；
F3：5'-GGAAACTAGTGAACCAGACGG-3'；SEQ ID NO.5；
R3：5'-CGCGATGCCATTTCTTATTC-3'；SEQ ID NO.6；
F4：5'-CCCAGTGTTCTCCTGGTCAT-3'；SEQ ID NO.7；
R4：5'-ATTCTCCGTACCGTCTGGTG-3'；SEQ ID NO.8；
F5：5'-AGGCACATAGGAGAGCCTGA-3'；SEQ ID NO.9；
R5：5'-CTGAGCAGGAACTTGAAGCC-3'；SEQ ID NO.10；
F6：5'-CATCAACGCGGTGTATGAAC-3'；SEQ ID NO.11；
R6：5'-CCGAGATTTGAGTGTCGGAT-3'；SEQ ID NO.12；
F7：5'-CTTCATTCCCGGCTAAATCA-3'；SEQ ID NO.13；
R7：5'-GAAACTTCGCTCAAAAACGC-3'；SEQ ID NO.14；
F8：5'-GAATTGGAACAATGAACGCA-3'；SEQ ID NO.15；
R8：5'-AAGCAGGTGTTTCCAGCACT-3'；SEQ ID NO.16；
F9：5'-CGCGTTCATACTCCGATACA-3'；SEQ ID NO.17；
R9：5'-TAATTTAGAAGGAGGCGGGG-3'；SEQ ID NO.18。
本发明公开的9对引物能够扩增出145个条带，多态性条带数在8～26个之间，平均每对引物扩增到16.1个多态性条带，各引物的多态性比率均为100.00％。其多态性信息含量分别范围为0.769～0.938，充分证明了EST-SSR标记在杂交兰种质中具有较丰富的遗传多态性。
进一步的，杂交兰EST-SSR引物在杂交兰植物的种质资源遗传多样性分析、遗传图谱构建和标记辅助育种中的应用。
杂交兰EST-SSR引物的筛选方法，包括以下步骤：
1)获取目标杂交兰的原始基因数据库；
2)对步骤1)中所述原始基因数据库进行SSR位点搜索，其中一、二、三、四、五、六核苷酸的重复数目分别至少为10，6，5，5，5，5次；
3)Primer 5.0对目标序列进行PCR引物设计，并生成候选引物；
4)对所述候选引物进行PCR扩增，初步筛选出能扩增出目标片段的初筛分PCR引物，最后以不同与所述目标杂交兰叶片的杂交兰DNA为模版，再次对所述初筛分PCR引物进行验证，筛选出所述杂交兰EST-SSR引物。
优选的，步骤4)中不同与所述目标杂交兰，包括金龙爪、立叶大凤、樱花、韩国小姐、凤凰于飞、芭蕾舞、黄金小神童、红钻石、宽叶绿翡翠、西施、醉美人、红贵妃、爪艺韩国小姐、红美人、东方快车、韩国桃花、黄金美人、金玉满堂、中国龙、小快车、华韵玉凤、叶艺紫妍氏、爪艺黄金龙、金边小神童、紫妍氏、华韵红霞、双艺金龙、台北快车、十八格格、黄金龙、青龙冠、立叶神童、汉成公主、爪艺夏日香水、大果、香兰、华韵丹霞、台北小姐、金凤冠、夏日彩虹等品种。
进一步的，步骤1)中所述目标杂交兰为‘紫妍氏’的生根组培苗、一年生植株或两年生植株叶片。
进一步的，步骤3)中所述引物设计的主要参数为：引物长度为18bp～22bp；退火温度为48℃～54℃；上下游引物之间的退火温度差不高于3℃；GC含量为35％～60％；杂交兰EST-SSR的PCR扩增产物预期片段为150bp～500bp。
进一步的，步骤3)中所述PCR扩增反应体系的总体积为20μL，其中含有20ng μL-1的模板DNA 2.5μL，10μmolL-1的上、下游引物各1μL，含Mg2+的10×Buffer 2μL，2.5mmolL-1的dNTPs 2μL，5UμL-1的Taq聚合酶0.2μL，ddH2O 11.3μL。
进一步的，步骤3)中所述PCR扩增程序为：94℃预变性4min，其次于94℃变性30s，48℃～54℃的退火温度退火30s，72℃延伸45s，共30个循环；72℃延伸10min。
本发明公开提供了杂交兰EST-SSR引物及其应用，至少有以下优点：本发明提供了杂交兰EST-SSR引物以及杂交兰EST-SSR引物在杂交兰植物的种质资源遗传多样性分析、遗传图谱构建和标记辅助育种中的应用。其中本发明的9对EST-SSR标记引物来自于杂交兰叶片转录组序列，引物的多态性丰富、扩增稳定、扩增条带易于鉴定，是稳定存在的新标记，填补了杂交兰基于转录组开发SSR引物的空白。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明提供的第9组引物对的EST-SSR扩增结果；
图2附图为本发明提供的40个杂交兰聚类分析图。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1目标杂交兰样本为福建省农业科学院作物研究所花卉圃内‘紫妍氏’生根组培苗、一年生植株或两年生植株叶片，液氮速冻后送百迈克基因公司(北京)进行全转录组的Illumina高通量深度测序，共包含88734条Unigenes，作为分析背景数据。
实施例2目标杂交兰转录组SSR位点的鉴别及SSR引物设计
对目标杂交兰叶片的88734条Unigenes，使用位点挖掘工具MISA软件进行SSR位点搜索，搜索标准为：单、二、三、四、五、六核苷酸的重复数目至少为10，6，5，5，5，5次。从杂交兰转录组的88734条Unigene序列中发现了19728个SSR位点，分布在14469个Unigene中，发生频率为16.31％。其中，只含有1个SSR位点的Unigene序列有10350条，含有2个及2个以上SSR位点的Unigene序列有4119条，平均每4.79kb出现1个SSR位点。在杂交兰转录组中检测到的SSR位点种类包括一、二、三、四、五、六核苷酸重复单元类型以及混合SSR，其中，一、二、三核苷酸重复单元的位点较多，分别有12111个、4382个、2002个，出现的频率分别为61.39％、22.21％、10.15％。
利用Primer 5.0软件共设计了565对候选引物，引物设计的主要参数为：引物长度为18bp～22bp；退火温度为48℃～54℃；上下游引物之间的退火温度差不高于3℃；GC含量为35％～60％；杂交兰EST-SSR的PCR扩增产物预期片段大小为150bp～500bp。PCR反应体系的总体积为20μL，其中含有20ngμL-1的模板DNA 2.5μL，10μmolL-1的上、下游引物各1μL，含Mg2+的10×Buffer 2μL，2.5mmolL-1的dNTPs 2μL，5UμL-1的Taq聚合酶0.2μL，ddH2O 11.3μL。PCR扩增程序为：首先于94℃预变性4min，其次于94℃变性30s，48℃～54℃的退火温度退火30s，72℃延伸45s，共30个循环；最后在72℃延伸10min，而后保存于4℃条件下。PCR扩增产物先通过2.5％琼脂糖凝胶电泳检测，有目标片段的产物再利用全自动核酸分析仪检测并进行数据分析。
EST-SSR扩增所用的40份杂交兰材料，如表1，均取自福建省农业科学院作物研究所花卉圃。采集新鲜叶片，低温下带回实验室于-70℃条件下保存备用。
表1 40份杂交兰供试材料
Figure BDA0001873049190000051
采用改良的CTAB法分别对40个杂交兰品种叶片进行总DNA的提取，提取得到的总DNA经1％琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，结果表明样品DNA的质量可用于PCR扩增，经分光光度计检测其纯度,将检测合格的基因组DNA原液(OD260/OD280的比值在1.80-2.00)稀释至20ng/L，产物置于-20℃条件下保存备用。
从表1中随机选取3个杂交兰品种的DNA为模板对设计的引物进行扩增。筛选出22对能扩增出明显条带的初筛分引物。为明确所设计引物对其它杂交兰品种的可用性，利用筛选出来的杂交兰EST-SSR引物对40个杂交兰品种进行扩增，发现9对杂交兰EST-SSR引物在这40个杂交兰品种中均扩增出条带，其中第9组杂交兰EST-SSR引物对在40个杂交兰品种中扩增出的条带结果如图1。其中，9组杂交兰EST-SSR引物对，其核苷酸序列如下：
F1：5'-TGGCACTAGTCAACCGTCAG-3'；SEQ ID NO.1；
R1：5'-GCCAGTTACTTTCCTTAGGCG-3'；SEQ ID NO.2；
F2：5'-CCGAGCACTGAAACATGAGA-3'；SEQ ID NO.3；
R2：5'-CACATGTGCTTGCTACCGAC-3'；SEQ ID NO.4；
F3：5'-GGAAACTAGTGAACCAGACGG-3'；SEQ ID NO.5；
R3：5'-CGCGATGCCATTTCTTATTC-3'；SEQ ID NO.6；
F4：5'-CCCAGTGTTCTCCTGGTCAT-3'；SEQ ID NO.7；
R4：5'-ATTCTCCGTACCGTCTGGTG-3'；SEQ ID NO.8；
F5：5'-AGGCACATAGGAGAGCCTGA-3'；SEQ ID NO.9；
R5：5'-CTGAGCAGGAACTTGAAGCC-3'；SEQ ID NO.10；
F6：5'-CATCAACGCGGTGTATGAAC-3'；SEQ ID NO.11；
R6：5'-CCGAGATTTGAGTGTCGGAT-3'；SEQ ID NO.12；
F7：5'-CTTCATTCCCGGCTAAATCA-3'；SEQ ID NO.13；
R7：5'-GAAACTTCGCTCAAAAACGC-3'；SEQ ID NO.14；
F8：5'-GAATTGGAACAATGAACGCA-3'；SEQ ID NO.15；
R8：5'-AAGCAGGTGTTTCCAGCACT-3'；SEQ ID NO.16；
F9：5'-CGCGTTCATACTCCGATACA-3'；SEQ ID NO.17；
R9：5'-TAATTTAGAAGGAGGCGGGG-3'；SEQ ID NO.18。
实施例3杂交兰EST-SSR标记的多态性分析
将实施例2筛选出来的9对杂交兰EST-SSR引物进行多态性分析，结果见表2。
表2杂交兰EST-SSR标记多态性分析表
Figure BDA0001873049190000061
Figure BDA0001873049190000071
由表2可知，9对引物共扩增出145个条带，多态性条带数在8～26个之间，平均每对引物扩增到16.1个多态性条带，平均每对引物扩增到16.1个多态性条带，各引物的多态性比率均为100.00％。对各引物的多态性信息含量分析显示，多态性信息含量分别范围为0.769～0.938，表明EST-SSR标记在杂交兰种质中具有较丰富的遗传多态性。
实施例4杂交兰EST-SSR标记引物在杂交兰遗传多样性分析中的应用
根据EST-SSR标记建立的0,1型数据，利用NTSYS-pc2.10e软件，构建杂交兰40个品种的聚类图，如图2。从图2可以看出，40个杂交兰品种间的遗传距离变化在0.26～0.40。其中，‘华韵丹霞’品种和‘红美人’品种的亲缘关系最近。在遗传距离为0.385处，40个杂交兰品种分为5大聚类群：第Ⅰ类包括3个品种，有‘金龙爪’、‘小快车’和‘黄金美人’，均为黄色花；第Ⅱ类包括32个品种，又可将其分为5个亚类，第1亚类包括‘立叶大凤’、‘黄金龙’、‘华韵玉凤’、‘宽叶绿翡翠’等4个黄色素花有微香的品种及‘华韵丹霞’、‘红美人’和‘华韵红霞’等3个红色花有微香的品种；第2亚类有‘十八格格’、‘樱花’、‘双艺金龙’、‘青龙冠’、‘金边小神童’和‘大果’；第3亚类为品种‘汉成公主’、‘中国龙’、‘叶艺紫妍氏’、‘韩国小姐’和‘爪艺黄金龙’；第4亚类为品种‘红钻石’、‘香兰’、‘立叶神童’、‘黄金小神童’、‘夏日彩虹’和‘韩国桃花’；第5亚类为品种‘爪艺韩国小姐’、‘芭蕾舞’、‘红贵妃’、‘紫妍氏’、‘西施’、‘台北小姐’、‘东方快车’和‘台北快车’；第Ⅲ类中有2个品种，分别为‘金玉满堂’和‘醉美人’，橘红或橙红花瓣带胭脂红斑纹；第Ⅳ类为品种‘瓜艺夏日香水’，花瓣青黄色，唇瓣带深红斑块，浓香；第Ⅴ类包括2个品种，有‘金凤冠’和‘凤凰于飞’。
综上所述，本发明提供了杂交兰EST-SSR引物以及杂交兰EST-SSR引物在杂交兰植物的种质资源遗传多样性分析、遗传图谱构建和标记辅助育种中的应用。其中本发明的9对EST-SSR标记引物来自于杂交兰叶片转录组序列，引物的多态性丰富、扩增稳定、扩增条带易于鉴定，是稳定存在的新标记，填补了杂交兰基于转录组开发SSR引物的空白。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 福建省农业科学院作物研究所
<120> 基于杂交兰转录组开发的EST-SSR标记引物及应用
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tggcactagt caaccgtcag 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gccagttact ttccttaggc g 21
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccgagcactg aaacatgaga 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cacatgtgct tgctaccgac 20
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggaaactagt gaaccagacg g 21
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cgcgatgcca tttcttattc 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cccagtgttc tcctggtcat 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
attctccgta ccgtctggtg 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aggcacatag gagagcctga 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ctgagcagga acttgaagcc 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
catcaacgcg gtgtatgaac 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ccgagatttg agtgtcggat 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cttcattccc ggctaaatca 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gaaacttcgc tcaaaaacgc 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gaattggaac aatgaacgca 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
aagcaggtgt ttccagcact 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
cgcgttcata ctccgataca 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
taatttagaa ggaggcgggg 20

Claims (2)

1.杂交兰EST-SSR引物组，其特征在于，包括以下9组引物对，其核苷酸序列如下：
F1：5'-TGGCACTAGTCAACCGTCAG-3'；SEQ ID NO.1；
R1：5'-GCCAGTTACTTTCCTTAGGCG-3'；SEQ ID NO.2；
F2：5'-CCGAGCACTGAAACATGAGA-3'；SEQ ID NO.3；
R2：5'-CACATGTGCTTGCTACCGAC-3'；SEQ ID NO.4；
F3：5'-GGAAACTAGTGAACCAGACGG-3'；SEQ ID NO.5；
R3：5'-CGCGATGCCATTTCTTATTC-3'；SEQ ID NO.6；
F4：5'-CCCAGTGTTCTCCTGGTCAT-3'；SEQ ID NO.7；
R4：5'-ATTCTCCGTACCGTCTGGTG-3'；SEQ ID NO.8；
F5：5'-AGGCACATAGGAGAGCCTGA-3'；SEQ ID NO.9；
R5：5'-CTGAGCAGGAACTTGAAGCC-3'；SEQ ID NO.10；
F6：5'-CATCAACGCGGTGTATGAAC-3'；SEQ ID NO.11；
R6：5'-CCGAGATTTGAGTGTCGGAT-3'；SEQ ID NO.12；
F7：5'-CTTCATTCCCGGCTAAATCA-3'；SEQ ID NO.13；
R7：5'-GAAACTTCGCTCAAAAACGC-3'；SEQ ID NO.14；
F8：5'-GAATTGGAACAATGAACGCA-3'；SEQ ID NO.15；
R8：5'-AAGCAGGTGTTTCCAGCACT-3'；SEQ ID NO.16；
F9：5'-CGCGTTCATACTCCGATACA-3'；SEQ ID NO.17；
R9：5'-TAATTTAGAAGGAGGCGGGG-3'；SEQ ID NO.18。
2.根据权利要求1所述的杂交兰EST-SSR引物组在杂交兰植物的种质资源遗传多样性分析、遗传图谱构建和标记辅助育种中的应用。
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