BR112013033350B1 - Imunocitocina e composição farmacêutica - Google Patents

Abstract

imunocitocina, ácido nucleico, vetor, célula hospedeira e composição farmacêutica. a presente invenção se refere a compreendendo (a) um conjugado, e (b) um anticorpo ou fragmento do mesmo ligado diretamente ou ou indiretamente por covalência ao dito conjugado, sendo que o conjugado compreende (i) um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos da interleucina 15 ou derivados da mesma, e um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos do domínio sushi da il-15ra ou derivados da mesma; e usos dos mesmos.

Description

[0001] O presente Pedido de Patente Internacional reivindica a prioridade do Pedido de Patente Europeu 11358005.4 depositado em 24 de junho de 2011, que é aqui incorporado por referência.

Campo da Invenção

[0002] A presente invenção refere-se a novas imunocitocinas e à sua utilização como um medicamento, em particular para o tratamento de câncer.

Antecedentes

[0003] A imunoterapia, na medicina, refere-se a uma variedade de estratégias de tratamento baseadas no conceito de modular o sistema imunitário para atingir um objetivo profilático e/ou terapêutico.

[0004] Nos últimos anos, a imunoterapia tem sido utilizada para o tratamento ou a prevenção de várias patologias, em particular câncer. Desde o desenvolvimento da técnica de fusão de células para a produção de anticorpos monoclonais, um grande número de anticorpos monoclonais foi produzido por pesquisadores. Daí em diante, outras técnicas têm sido desenvolvidas para a geração de anticorpos monoclonais, incluindo a técnica de hibridoma de células B e a técnica hibridoma de EBV para produzir anticorpos monoclonais humanos.

[0005] Os anticorpos monoclonais (Mab) podem ser desenvolvidos para atingir quase todo o epítopo. A propriedade de um reconhecimento específico e ligação a células/moléculas particulares tem incentivado o desenvolvimento de Mabs como reagentes terapêuticos e de diagnóstico para uma variedade de estados de doença. Técnicas de DNA recombinante foram utilizadas para produzir anticorpos quiméricos ou humanizados para adaptar a sua administração a seres humanos. Atualmente, vários anticorpos monoclonais são comercializados e disponíveis para o tratamento de câncer, doenças infecciosas, doenças imunológicas, etc., tal como RITUXAN ®, HERCEPTIN ®, AVASTIN ®,...

[0006] Os anticorpos monoclonais são moléculas-alvo e capazes de localizar dentro de uma zona específica (células, tecidos...) tal como um tecido tumoral. Esta propriedade também levou ao desenvolvimento de Mabs conjugados com várias substâncias (cargas úteis), em um esforço para atingir as moléculas-alvo específicas nos locais tumorais chamados antígenos tumorais. Tais substâncias (cargas úteis) podem ser toxinas, drogas, radionuclídeos, compostos pró-droga... Muitas destas ligações envolvem a conjugação química do grupo reativo (carga útil), com uma dada preparação de anticorpo, um processo que pode ser complicado e sujeito a variação (EUA 4.671.958).

[0007] Entre essas novas moléculas, as imunocitocinas são de interesse particular. Ditas imunocitocinas correspondem a proteínas de fusão compreendendo um anticorpo e uma citocina. Estas proteínas retêm tanto a capacidade de ligação de antígeno como a atividade de citocina.

[0008] As citocinas são uma categoria de proteínas sinalizadoras e glicoproteínas que, como hormônios e neurotransmissores, são usadas extensivamente na comunicação celular. Enquanto os hormônios são secretados no sangue por órgãos específicos, e neurotransmissores estão relacionados com a atividade neural, as citocinas são uma classe de compostos mais diversa em termos de origem e finalidade. Elas são produzidas por uma grande variedade de tipos de células hematopoiéticas e não hematopoiéticas e podem ter efeitos tanto em células vizinhas ou por todo o organismo, por vezes dependendo fortemente da presença de outros produtos químicos. A família das citocinas consiste principalmente em pequenas proteínas e glicoproteínas solúveis em água com uma massa compreendida entre 8 e 30 kDa. Citocinas são críticas para o funcionamento de ambas as respostas imunes inatas e adaptativas. Elas são muitas vezes secretadas por células imunitárias, que encontraram um agente patogênico como um modo para ativar e recrutar mais células imunes e aumentar a resposta do sistema para o agente patogênico. No entanto, além do seu papel no desenvolvimento e funcionamento do sistema imune, as citocinas também estão envolvidas em vários processos de desenvolvimento durante a embriogênese.

[0009] Entre as citocinas, interleucina 15 (IL-15) é uma citocina com semelhança estrutural a IL-2 que é secretada por fagócitos mononucleares (e algumas outras células) após a infecção por vírus(es) ou a estimulação indireta de células reconhecidas como não-próprias ou debilitadas. Esta citocina induz a proliferação celular das células assassinas naturais; células do sistema imune inato, cujo papel principal é o de matar células infectadas por vírus. A proteína codificada por este gene é uma citocina que regula a ativação de células T e células assassinas naturais e a proliferação.

[0010] A construção de imunocitocinas na base de IL-15 seria, portanto, de particular interesse para a combinação dos ativos tumor-alvo de anticorpos específicos de tumor, com efeitos imunomoduladores da interleucina 15. Várias imunocitocinas utilizando notavelmente a interleucina-2 (IL-2) já foram obtidas e demonstraram resultados muito interessantes e encorajadores na fase 2 de ensaios clínicos oncológicos. Alguns exemplos destas proteínas de fusão encontram-se descritos em várias patentes norte-americanas (US 5.645.835, EP 0305967, WO 86/01533, EP 0.439.095 e WO 85/00974).

[0011] Deste modo, a imunocitocina baseada em interleucina-15 foi produzida em células HEK-293 e é descrita no pedido de patente PCT internacional WO 2007/128563 e em Kaspar et al. (Cancer Research, vol.67 (10), p:4940-4948, 2007).

[0012] No entanto, os inventores estabeleceram que tais imunocitocinas com base em interleucina-15 têm uma atividade de interleucina 15 muito limitada, e que a sua produção é muito difícil, notavelmente em células CHO com baixo rendimento e muitos contaminantes proteicos.

[0013] Deste modo, ainda existe uma necessidade por imunocitocinas baseadas em interleucina-15 que podem ser utilizadas em imunoterapia.

Sumário da Invenção

[0014] A invenção refere-se a uma imunocitocina que compreende: A) um conjugado, e B) um anticorpo ou um fragmento do mesmo ligado diretamente ou indiretamente por covalência ao dito conjugado, sendo que o dito conjugado compreende: (i) um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos da interleucina 15 ou seus derivados, e (ii) um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos do domínio sushi do IL-15Rα ou seus derivados.

[0015] Em um segundo aspecto, a invenção refere-se a um ácido nucleico que codifica para uma imunocitocina, como descrito acima.

[0016] Em um terceiro aspecto, a presente invenção fornece um vetor compreendendo um ácido nucleico como acima descrito.

[0017] Em um quarto aspecto, a presente invenção refere- se a uma célula hospedeira geneticamente manipulada com o polinucleotídeo ou com o vetor anteriormente descrito. A presente invenção também se refere a um método de produção de uma célula hospedeira geneticamente modificada expressando uma imunocitocina de acordo com a invenção, e o dito método compreende as etapas de: (i) introduzir in vitro ou ex vivo um ácido nucleico ou um vetor tal como descrito acima em uma célula hospedeira, (ii) cultivar in vitro ou ex vivo a célula hospedeira recombinante geneticamente modificada e (iii), opcionalmente, selecionar as células que expressam e/ou secretam a dita imunocitocina.

[0018] Em uma concretização preferida, a referida célula hospedeira geneticamente modificada é uma célula animal, de preferência uma célula CHO.

[0019] Em um quinto aspecto, a presente invenção proporciona uma composição farmacêutica compreendendo a imunocitocina como descrita acima, uma codificação de ácido nucleico desta, ou um vetor de ácido nucleico compreendendo o referido ácido nucleico, eventualmente associado a um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0020] Em uma concretização preferida, a referida composição compreende um agente terapêutico adicional, que é de preferência um agente anti-câncer.

[0021] Em um sexto aspecto, a presente invenção refere- se a uma composição farmacêutica tal como descrita anteriormente para o tratamento de câncer em um indivíduo.

[0022] Em um sétimo aspecto, a presente invenção relaciona-se com os produtos que contêm: (iii) uma imunocitocina como descrita acima, uma sequência de ácido nucleico codificando a mesma, ou um vetor compreendendo uma tal sequência de ácido nucleico, e (iv) um agente terapêutico, de preferência um agente anticancerígeno, como uma preparação combinada para utilização separada, simultânea ou sequencial para o tratamento de câncer em um indivíduo.

[0023] Em um oitavo aspecto, a presente invenção refere- se a um método para o tratamento de câncer em um indivíduo que compreende a etapa de administrar ao referido indivíduo uma composição farmacêutica tal como descrita anteriormente.

[0024] Em um aspecto final, a presente invenção refere- se a um método para o tratamento de câncer, compreendendo a etapa de, simultaneamente, separadamente ou sequencialmente, administrar a um indivíduo em necessidade uma quantidade terapeuticamente eficaz de: (i) uma imunocitocina como descrita acima, uma sequência de ácido nucleico codificando a mesma, ou um vetor compreendendo uma tal sequência de ácido nucleico, e (ii) um agente terapêutico, de preferência, um agente anti- câncer.

Breve Descrição dos Desenhos

[0025] A Figura 1 mostra a atividade de imunocitocinas anti-CD20 de IL15 em comparação com IL15.

[0026] A Figura 2 mostra a atividade de imunocitocina IL15 anti-GD2-O-acetilada em comparação com IL15.

[0027] A Figura 3 mostra atividade de ligação de CD20, GD2-O-acetilada e HER-2 de imunocitocinas IL15 anti-CD20, anti- GD2-O-acetilada e anti-HER2 IL-15 respectivamente.

[0028] A figura 4 mostra a atividade de ligação a IL- 15Rα de imunocitocina IL15 anti-CD20 em comparação com o anticorpo anti-CD20 (Rituximab).

[0029] A Figura 5 mostra a atividade de ligação de CD20, GD2-O-acetilada e HER-2 de imunocitocinas IL15 anti-CD20, anti- GD2-O-acetilada e anti-HER2 RLI respectivamente.

[0030] A Figura 6 mostra a atividade de ligação IL15Rα de imunocitocinas RLI anti-CD20 e IL15 anti-GD2-O-acetilada.

[0031] A Figura 7 mostra a atividade de imunocitocinas RLI anti-CD20 em comparação com IL15.

[0032] A Figura 8 mostra a atividade de imunocitocinas RLI anti-GD2-O-acetilado em comparação com IL15.

[0033] A Figura 9 mostra a atividade anti-metastática de imunocitocinas anti-GD2-O-acetilada em comparação com anticorpo anti-GD2-O-acetilada.

[0034] A Figura 10 mostra a atividade antitumoral de imunocitocinas anti-CD20 no modelo Raji.

[0035] A Figura 11 mostra a atividade de imunocitocinas IL-15 anti-HER2, em comparação com IL15.

[0036] A Figura 12 mostra a atividade de imunocitocinas RLI anti-HER2 em comparação com IL15.

Descrição Detalhada

[0037] A presente invenção é baseada na descoberta dos presentes inventores que, enquanto a produção de uma imunocitocina que compreende interleucina 15 conduz à perda de mais de 90% da atividade da interleucina 15, a produção de imunocitocinas com base em RLI leva a imunocitocinas IL15 inovadoras que apresentam uma poderosa atividade biológica em células imunitárias αβY e βY que é largamente superior a de imunocitocinas à base de IL-15.

[0038] Surpreendentemente, imunocitocinas à base de RLI com um anticorpo monoclonal IgG completo apresentam maior eficácia biológica em células imunitárias βY, em comparação com RLI sozinho ou com fragmento de anticorpo scFv. Este ganho surpreendente de atividade em células imunitárias βY pode ser crítico em termos de ativação/reativação das células NK e linfócitos T no ambiente imunossupressor.

[0039] Ainda surpreendentemente, e enquanto que uma imunocitocina interleucina 15 requer a presença de um agente de ligação entre a imunoglobulina e os grupos da interleucina 15 de modo a ser ativa, a imunocitocina da invenção apresenta uma atividade semelhante à interleucina 15, com ou sem qualquer ligante entre as suas respectivas partes de imunoglobulina e de citocina. Esta presença desnecessária de uma região de ligação pode representar argumentos poderosos em termos de imunogenicidade da proteína de fusão, limitando as regiões de charneira, gerando novos epítopos antigênicos e imunogenicidade e em termos de rendimento de produção com formas clivadas limitadas.

[0040] Ainda surpreendentemente, as imunocitocinas da invenção são a IL-15 superagonista mostrando um aumento da atividade (isto é, de 10 a 100 vezes) em comparação com RLI sozinho.

[0041] Além disso, os inventores obtiveram um bom rendimento de produção da imunocitocina da invenção em células CHO, e isto com um rendimento de mais de 90%. Isto é surpreendente, uma vez que a produção das mesmas células de imunocitocina interleucina 15 em células CHO foi muito difícil.

[0042] Como imunocitocinas possuem uma meia-vida sérica tradicionalmente limitada e como a velocidade de localização do tumor relacionada à imunocitocinas é uma questão crítica para gerar um efeito antitumoral robusto, a atividade biológica específica de imunocitocinas baseadas em RLI que permitem ativar as células imunitárias a concentração muito baixa representam um passo importante de inovação neste campo e poderia melhorar a eficácia de tais compostos biológicos em pacientes com câncer.

[0043] Finalmente, a forte atividade da imunocitocina da invenção permite prever um uso terapêutico realista para esta imunocitocina, que deve ser administrada por injeção em uma dose de 2,5-1 mg/kg do indivíduo ou menos, e mesmo com uma dose de 0,1 mg/kg ou menos. Na verdade, a baixa atividade de imunocitocinas interleucina 15 tais como as descritas no pedido de patente internacional WO 2007/128563 não permite qualquer utilização terapêutica realista (isto é, a obtenção de um efeito terapêutico precisou de uma dose de mais de 20 μg de imunocitocina com quatro injeções diárias em um modelo de tumor de rato, sugerindo a necessidade de uma dose de mais do que 5 mg/kg imunocitocina para obter algum efeito terapêutico).

[0044] Consequentemente, um aspecto da presente invenção

[0045] refere-se a uma imunocitocina que compreende: A) um conjugado, e B) um anticorpo ou um fragmento do mesmo, ligado diretamente ou indiretamente por covalência ao dito conjugado, sendo que o referido conjugado compreende: (i) um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de interleucina 15 ou seus derivados, e (ii) um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos do domínio sushi de IL-15Rα ou seus derivados.

[0046] O termo “imunocitocina” se refere a uma molécula que compreende um anticorpo, ou seus fragmentos, ligado diretamente ou indiretamente por covalência a uma citocina ou seus derivados. O referido anticorpo e a referida citocina podem ser ligados por um peptídeo ligante.

Conjugado da imunocitocina da invenção

[0047] O termo “interleucina 15” no seu significado geral na técnica se refere a uma citocina com semelhança estrutural com a IL-2 (GRABSTEIN et al., Science, vol.264 (5161), p:965-968, 1994). Esta citocina é também conhecida como IL-15, IL15 ou MGC9721. Esta citocina e IL-2 compartilham muitas atividades biológicas e foi descoberto que elas ligam as mesmas subunidades dos receptores de hematopoietina. Assim, eles podem competir para o mesmo receptor, que regula negativamente a atividade do outro. Tem sido demonstrado que a IL-15 regula a ativação e a proliferação das células T e assassinas naturais, e que o número de células CD8+ de memória mostrou-se ser controlado por um equilíbrio entre esta citocina e IL2. A atividade de IL-15 pode ser medida por determinação da sua indução da proliferação na linha celular Kit225 (HORI et al., Blood, vol.70 (4), p:1069-72, 1987), tal como descrito nos Exemplos.

[0048] A referida IL-15 ou os seus derivados possuem, pelo menos, 10% da atividade da interleucina-15 humana sobre a indução da proliferação de linha celular Kit225, preferencialmente pelo menos 25% e mais preferencialmente pelo menos 50%.

[0049] A referida interleucina 15 é uma interleucina 15 de mamífero, de preferência uma interleucina 15 de primata, e mais preferencialmente, uma interleucina 15 de humano.

[0050] A interleucina 15 de mamífero pode ser identificada facilmente pelo versado na técnica. Como exemplo, pode-se citar a Interleucina 15 de Sus scrofa (número de acesso ABF82250), a partir de Rattus norvegicus (número de acesso NP_037261), a partir de Mus musculus (número de acesso NP_032383), a partir de Bos Taurus (Número de acesso NP_776515), a partir de Oryctolagus cuniculus (número de acesso NP_001075685), a partir de Ovies aries (número de acesso NP_001009734), a partir de Felis catus (número de acesso NP_001009207), a partir de fascicularis Macaca (número de acesso BAA19149), do Homo sapiens (número de acesso NP_000576), a partir de Macaca mulatta (número de acesso NP_001038196), a partir de Cavia porcellus (número de acesso NP_001166300), ou de Chlorocebus sabaeus (número de acesso ACI289).

[0051] Tal como aqui utilizado, o termo “interleucina 15 de mamífero” refere-se à sequência de consenso SEQ ID n° 1.

[0052] A interleucina 15 de primata pode ser identificada facilmente pelo versado na técnica. Como exemplo, pode-se citar a Interleucina 15 de Sus scrofa (número de acesso ABF82250), a partir de Oryctolagus cuniculus (número de acesso NP_001075685), a partir de Macaca fascicularis (número de Acesso BAA19149), a partir de Homo sapiens (número de acesso NP_000576), a partir de Macaca mulatta (número de acesso NP_001038196), ou de Chlorocebus sabaeus (número de acesso ACI289).

[0053] Tal como aqui utilizado, o termo “interleucina 15 de primata” refere-se à sequência de consenso SEQ ID n° 2.

[0054] A interleucina 15 humana pode ser facilmente identificada pelo versado na técnica e refere-se à sequência de aminoácidos SEQ ID n° 3.

[0055] Tal como aqui utilizado, o termo “derivados de interleucina 15” refere-se a uma sequência de aminoácidos com uma percentagem de identidade de pelo menos 92,5% (isto é, correspondendo a cerca de 10 substituições de aminoácidos) com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID n°: 1, SEQ ID n° 2 e SEQ ID n° 3, de preferência de pelo menos 96% (isto é, correspondendo a cerca de 5 substituições de aminoácidos), e mais preferencialmente de pelo menos 98,5% (isto é, correspondente a cerca de duas substituições de aminoácidos) ou de, pelo menos, 99% (ou seja que corresponde a cerca de uma substituição de um aminoácido). Tais derivados podem ser identificados de forma simples pelo versado na técnica, tendo em conta o seu conhecimento pessoal e dos ensinamentos do presente pedido de patente. Como exemplo de tais derivados, pode- se citar os descritos no Pedido de Patente Internacional PCT WO 2009/135031. Também deve ser entendido que os aminoácidos naturais podem ser substituídos por aminoácidos quimicamente modificados. Tipicamente, esses aminoácidos quimicamente modificados aumentam a meia vida do polipeptídeo.

[0056] Conforme aqui utilizado, “percentagem de identidade” entre duas sequências de aminoácidos, significa que a percentagem de aminoácidos idênticos entre as duas sequências a serem comparadas, obtido com o melhor alinhamento das referidas sequências, esta percentagem sendo puramente estatística e as diferenças entre essas duas sequências sendo espalhadas aleatoriamente sobre as sequências de aminoácidos. Tal como aqui utilizado, “melhor alinhamento” ou “alinhamento ótimo”, significa o alinhamento para o qual é determinada a percentagem de identidade (veja abaixo) mais alta. A comparação de sequências entre duas sequências de aminoácidos é geralmente realizada por comparação destas sequências que tenham sido previamente alinhadas de acordo com o melhor alinhamento; esta comparação é realizada em segmentos de comparação, a fim de identificar e comparar regiões locais de similaridade. O melhor alinhamento de sequências para realizar uma comparação pode ser realizado, por um lado, de forma manual, utilizando o algoritmo de homologia global desenvolvida por Smith e Waterman (Ad. App. Math, vol.2, p:482, 1981), usando o algoritmo de homologia local desenvolvido por Neddleman e Wunsch (J. Mol Biol, vol.48, p:443, 1970), usando o método de semelhanças desenvolvidos por Pearson e Lipman (Proc. Natl. Acd. Sci. USA, vol.85, p:2444, 1988), usando softwares de computador que usam esses algoritmos (GAP, BESTFIT, BLAST p, N BLAST, FASTA, TFASTA no pacote de software Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI EUA), usando os algoritmos de alinhamento múltiplos MUSCLE (Edgar, Robert C., Nucleic Acids Research, vol. 32, p:1792, 2004). Para obter o melhor alinhamento local, pode-se utilizar preferencialmente o software BLAST com a matriz BLOSUM 62. A percentagem de identidade entre duas sequências de aminoácidos é determinada através da comparação destas duas sequências otimamente alinhadas, as sequências de aminoácidos sendo capazes de incluir adições ou deleções relativas à sequência de referência, a fim de se obter o alinhamento ótimo entre estas duas sequências. A percentagem de identidade é calculada determinando o número de posições idênticas entre estas duas sequências, e dividindo esse número pelo número total de posições comparadas, e multiplicando o resultado obtido por 100 para obter a percentagem de identidade entre estas duas sequências.

[0057] De preferência, os derivados de interleucina 15 são IL-15 agonista ou superagonista. Um versado na técnica pode simplesmente identificar uma IL-15 agonista ou superagonista. Como um exemplo de IL-15 agonista ou superagonista, pode-se citar aqueles descritos no pedido de patente internacional WO 2005/085282 ou em ZHU et al. (J. Immunol., Vol.183(6), p:3598- 607, 2009).

[0058] Ainda de preferência, o dito agonista ou superagonista IL-15 é selecionado do grupo que compreende/consiste em L45D, L45E, S51D, L52D, N72D, N72E, N72A, N72S, N72Y e N72P (em referência à sequência de IL-15 humana, SEQ ID n° 3).

[0059] Tal como aqui utilizado, o termo “domínio sushi de IL-15Rα” tem o seu significado geral na técnica e refere-se a um domínio começando no primeiro resíduo cisteína (C1) após o sinal de peptídeo de IL-15Rα, e terminando no quarto resíduo de cisteína (C4), após o que o referido sinal de peptídeo. O referido domínio sushi correspondente a uma parte da região extracelular do IL-15Rα é necessário para a sua ligação à tIL- 15 (WEI et al., J. Immunol., Vol.167(1), p:277-282, 2001).

[0060] O referido domínio sushi de IL-15Rα ou seus derivados possui pelo menos 10% da atividade de ligação do domínio de sushi de IL-15Rα humana para a interleucina-15 humana, de preferência pelo menos 25% e mais preferencialmente pelo menos 50%. A referida atividade de ligação pode ser simplesmente determinada pelo método descrito em WEI et al. (acima mencionado, 2001).

[0061] O referido domínio sushi do IL-15Rα é o domínio sushi de IL-15Rα de mamífero, de preferência, o domínio sushi de um IL-15Rα de primata e mais preferencialmente o domínio sushi do IL-15Rα humano.

[0062] O domínio sushi de IL-15Rα de mamífero pode ser simplesmente identificado pelo versado na técnica. Como exemplo, pode-se citar o domínio sushi de IL-15Rα a partir de Rattus norvegicus (número de Acesso XP_002728555), a partir de Mus musculus (número de Acesso EDL08026), a partir de Bos Taurus (número de Acesso XP_002692113), a partir de Oryctolagus cuniculus (número de Acesso XP_002723298), de Macaca fascicularis (número de acesso ACI42785), a partir de Macaca nemestrina (número de acesso ACI42783), do Homo sapiens (número de acesso CAI41081), a partir de Macaca mulatta (número de acesso NP_001166315), Pongo abelii (número de acesso XP_002820541), Cercocebus torquatus (número de acesso ACI42784), Callithrix jacchus (número de acesso XP_002750073), ou de Cavia porcellus (número de acesso NP001166314).

[0063] Tal como aqui utilizado, o termo “domínio sushi de uma IL-15Rα de mamífero” refere-se à sequência de consenso SEQ ID n°4.

[0064] De preferência, o polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos do domínio sushi de um mamífero de IL- 15Rα refere-se à sequência de consenso SEQ ID n° 5.

[0065] O domínio sushi de IL-15Rα de um primata pode ser facilmente identificado pelo versado na técnica. Como exemplo, pode-se citar os domínios sushi de IL-15Rα a partir de Oryctolagus cuniculus, Macaca fascicularis, Macaca nemestrina, Homo sapiens, Macaca mulatta, Pongo abelii, Cercocebus torquatus, ou Callithrix jacchus.

[0066] Tal como aqui utilizado, o termo “domínio sushi de IL-15Rα de um primata” refere-se à sequência de consenso SEQ ID n° 6.

[0067] De preferência, o polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos do domínio sushi de IL-15Rα de um primata refere-se à sequência de consenso SEQ ID n° 7.

[0068] O domínio sushi de IL-15Rα pode ser facilmente identificado pelo versado na técnica e refere-se à sequência de aminoácidos SEQ ID n° 8.

[0069] De preferência, o polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos do domínio sushi de IL-15Rα refere-se à SEQ ID N° 9.

[0070] Tal como aqui utilizado, o termo “derivados do domínio sushi de IL-15Rα” refere-se a uma sequência de aminoácidos com uma percentagem de identidade de pelo menos 92% (isto é, correspondendo a cerca de 5 substituições de aminoácidos) com uma sequência de aminoácidos selecionada no grupo que consiste em SEQ ID n°: 4, SEQ ID n° 5, SEQ ID n° 6, SEQ ID n°: 7, SEQ ID n° 8 e SEQ ID n° 9, preferencialmente de pelo menos 96% (isto é, correspondendo a cerca de 2 substituições de aminoácidos), e mais preferencialmente de pelo menos 98% (isto é, correspondendo a cerca de 1 substituição de aminoácidos). Tais derivados compreendem os quatro resíduos de cisteína do domínio sushi de L-15Rα e pode ser simplesmente identificado pelo versado na técnica, tendo em conta o seu conhecimento geral e os ensinamentos do presente pedido de patente. Também deve ser entendido que os aminoácidos naturais podem ser substituídos por aminoácidos quimicamente modificados. Tipicamente, esses aminoácidos quimicamente modificados permitem aumentar a meia- vida do polipeptídeo.

[0071] De acordo com uma concretização preferida, os conjugados de compreendem (ii) um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos dos domínios sushi e charneira de IL- 15Rα ou seus derivados.

[0072] O domínio charneira de IL-15Rα é definido como a sequência de aminoácidos que começa com o primeiro resíduo de aminoácidos após o domínio sushi e que termina no último resíduo de aminoácido, antes do primeiro local potencial de glicosilação. Em IL-15Rα humana, a sequência de aminoácidos da região de charneira consiste nos catorze aminoácidos que estão localizados após o domínio sushi de IL-15Ralfa, em uma posição C-terminal em relação ao referido domínio sushi, ou seja, dita região de charneira de IL-15Ralfa começa no primeiro aminoácido após o referido (C4) resíduo de cisteína, e termina no décimo quarto aminoácido (contando na orientação padrão “a partir de N- terminal para C-terminal”).

[0073] Os referidos domínios sushi e charneira de IL- 15Rα são os domínios sushi e charneira de IL-15Rα de mamífero, de preferência os domínios sushi e charneira de IL-15Rα de primata e mais preferencialmente os domínios sushi e dobradiça de IL-15Rα humana.

[0074] A sequência de aminoácidos dos domínios de charneira e sushi de IL-15Rα de mamífero pode ser facilmente identificada pelo versado na técnica. Tal como aqui utilizado, o termo “domínios sushi e charneira de IL-15Rα de mamífero” refere-se à sequência de consenso de SEQ ID n° 10.

[0075] A sequência de aminoácidos dos domínios charneira e sushi de IL-15Rα de primata pode ser facilmente identificada pelo versado na técnica. Tal como aqui utilizado, o termo “domínios sushi e charneira de IL-15Rα de primata” refere-se à sequência de consenso SEQ ID n° 11.

[0076] A sequência de aminoácidos dos domínios sushi e charneira de IL-15Rα pode ser facilmente identificada pelo versado na técnica. Tal como aqui utilizado, o termo “domínios sushi e charneira de IL-15Rα humana” refere-se à sequência de consenso de SEQ ID n° 12.

[0077] Tal como aqui utilizado, o termo “derivados dos domínios sushi e charneira de IL-15Rα” refere-se a uma sequência de aminoácidos com uma percentagem de identidade de pelo menos 93% (isto é, correspondendo a cerca de 5 substituições de aminoácidos) com uma sequência de aminoácido selecionado no grupo que consiste em SEQ ID n°: 10, SEQ ID n° 11 e SEQ ID n° 12, de preferência de pelo menos 97% (isto é, correspondendo a cerca de 2 substituições de aminoácidos), e mais preferencialmente pelo menos 98% (isto é, correspondendo a cerca de 1 substituição de aminoácidos). Tais derivados compreendem os quatro resíduos de cisteína do domínio sushi de L-15Rα e pode ser simplesmente identificado pelo versado na técnica, tendo em conta o seu conhecimento geral e os ensinamentos do presente pedido de patente. Também deve ser entendido que os aminoácidos naturais podem ser substituídos por aminoácidos quimicamente modificados. Tipicamente, esses aminoácidos quimicamente modificados permitem aumentar a meia-vida do polipeptídeo.

[0078] Ambos os polipeptídeos i) e ii) do conjugado podem ser ligados de forma não covalente, tal como no complexo revelado na Patente dos EUA 8.124.084 B2. O referido conjugado ou complexo pode ser simplesmente obtido ao fornecer uma quantidade adequada do polipeptídeo i), fornecer uma quantidade apropriada de polipeptídeo ii), misturar ambos os polipeptídeos sob pH e condições iônicas adequadas por uma duração suficiente para permitir a formação de complexos (por exemplo, conjugado) e opcionalmente concentrar ou purificar o referido complexo. Os polipeptídeos do complexo (ou seja, o conjugado) podem ser formados, por exemplo, utilizando um sintetizador de peptídeos de acordo com métodos padrão; expressando cada polipeptídeo separadamente em uma célula ou extrato de células, em seguida, isolando e purificando o polipeptídeo. Opcionalmente, o complexo terapêutico de polipeptídeo da invenção pode ser formado ao expressar ambos os polipeptídeos i) e ii) na mesma célula ou extrato celular, em seguida, isolar e purificar os complexos, por exemplo, usando técnicas cromatográficas, tais como cromatografia de afinidade com anticorpos para a porção de linfocinas, a porção de receptor de linfocina, ou para o complexo.

[0079] Os dois polipeptídeos i) e ii) do conjugado podem também ser ligados de forma covalente utilizando agentes de acoplamento de proteína bifuncionais, ou em uma proteína de fusão.

[0080] Os agentes de acoplamento de proteína bifuncionais são bem conhecidos do versado na técnica, bem como métodos que os utilizam, e incluem, a título de exemplo, N- succinimidil-(2-piridilditio)propionato (SPDP), succinimidil- (N-maleimidometil) ciclo-hexano-1-carboxilato, iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tais como adipimidato de dimetil HCL), ésteres ativos (tais como suberato de dissuccinimidil), aldeídos (tais como glutaraldeído), compostos bis-azido (tais como bis (p-azidobenzoil)- hexanodiamina), derivados bis-diazónio (tais como bis-(p- diazoniobenzoil)-etilenodiamina), diisocianatos (tais como tolieno 2,6-diisocianato), e compostos de flúor bis-ativos (tais como l,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno).

[0081] O termo “proteína de fusão” refere-se a uma proteína criada pela junção de dois ou mais genes que codificam para proteínas originalmente separadas. É também conhecido como uma proteína quimérica. A tradução do gene de fusão resulta em um único polipeptídeo com propriedades funcionais que derivam de cada uma das proteínas originais. As proteínas de fusão recombinantes são criadas artificialmente por tecnologia de DNA recombinante para utilização em pesquisas biológicas ou terapêuticas. Uma proteína de fusão recombinante é uma proteína criada através de engenharia genética de um gene de fusão. Isto tipicamente envolve a remoção do códon de terminação a partir de uma sequência de cDNA que codifica a primeira proteína, e depois adicionando a sequência de cDNA da segunda proteína na matriz por meio de ligação ou de extensão de sobreposição PCR. Essa sequência de DNA irá então ser expressa por uma célula, como uma única proteína. A proteína pode ser modificada para incluir a sequência completa de ambas as proteínas originais, ou apenas uma parte de qualquer uma.

[0082] Em uma concretização preferida, o conjugado é uma proteína de fusão.

[0083] A sequência de aminoácidos de interleucina 15 ou os seus derivados podem estar em uma posição C-terminal ou N- terminal em relação à sequência de aminoácidos do domínio sushi de IL-15Rα ou seus derivados. De preferência, a sequência de aminoácidos da interleucina 15 ou seus derivados está em uma posição C-terminal em relação à sequência de aminoácidos do domínio sushi de IL-15Rα ou seus derivados.

[0084] A sequência de aminoácidos de interleucina 15 ou seus derivados, e a sequência de aminoácidos do domínio sushi de IL-15Rα ou seus derivados podem ser separados por uma primeira sequência de aminoácidos “ligante”. A referida primeira sequência de aminoácidos “ligante” pode ser de um comprimento suficiente para assegurar que a proteína de fusão forme estruturas secundárias e terciárias apropriadas.

[0085] O comprimento da primeira sequência de aminoácidos ligante pode variar sem afetar significativamente a atividade biológica da proteína de fusão. Tipicamente, a primeira sequência de aminoácidos ligante compreende pelo menos um, mas menos do que 30 aminoácidos, por exemplo, um ligante de 2-30 aminoácidos, de preferência de 10-30 aminoácidos, mais de preferência de 15-30 aminoácidos, ainda mais preferencialmente de 15-25 aminoácidos, mais de preferência, de 18-22 aminoácidos.

[0086] Sequências de aminoácidos ligantes preferidas são aquelas que permitem que o conjugado adote uma conformação adequada (ou seja, uma conformação que permite a atividade de transdução de sinal apropriado através da via de sinalização IL- 15Rbeta/gama).

[0087] As primeiras sequências de aminoácidos ligantes mais apropriadas (1) adotarão uma conformação prolongada flexível, (2) não exibirão uma propensão para o desenvolvimento de estrutura secundária ordenada que possa interagir com os domínios funcionais das proteínas de fusão e (3) terão caráter hidrofóbico ou de carga mínimo que poderia promover a interação com os domínios de proteínas funcionais.

[0088] De preferência, a primeira sequência de aminoácidos ligante compreende aminoácidos quase neutros selecionados no grupo que compreende Gly (G), Asn (N), Ser (S), Thr(T), Ala (A), Leu (L), e Gln (Q), mais de preferência no grupo que compreende Gly (G), Asn (N), e Ser (S).

[0089] Exemplos de sequências de ligantes estão descritas na Patente dos EUA N°s 5.073.627 e 5.108.910.

[0090] Ligantes ilustrativos flexíveis que são mais particularmente adequados para a presente invenção incluem os codificados pelas sequências de SEQ ID NO: 13 (SGGSGGGGSGGGSGGGGSLQ), SEQ ID n ° 14 (SGGSGGGGSGGGSGGGGSGG) ou SEQ ID n° 15 (SGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQ).

Anticorpo da imunocitocina da invenção

[0091] O termo “anticorpo” refere-se a uma molécula de imunoglobulina correspondente a um tetrâmero composto por quatro cadeias de polipeptídeos, duas cadeias idênticas pesadas (H) (cerca de 50-70 kDa quando comprimento completo) e duas cadeias idênticas leves (L) (cerca de 25 kDa quando comprimento total) interligadas por pontes dissulfeto. As cadeias leves são classificadas como kapa e lambda. As cadeias pesadas são classificadas como gama, mu, alfa, delta, ou epsilon, e definem o isotipo do anticorpo como IgG, IgM, IgA, IgD, e IgE, respectivamente. Cada cadeia pesada é compreendida por uma região de cadeia pesada variável N-terminal (aqui abreviado como HCVR) e uma região constante de cadeia pesada. A cadeia pesada da região constante é constituída por três domínios (CH1, CH2, e CH3) para IgG, IgD e IgA; e quatro domínios (CH1, CH2, CH3, e CH4) para IgM e IgE. Cada cadeia leve é constituída por uma região variável de cadeia leve N-terminal (aqui abreviado como LCVR) e uma região constante de cadeia leve. A região constante de cadeia leve é constituída por um domínio CL. As regiões HCVR e LCVR podem ainda ser subdivididas em regiões de hipervariabilidade, designadas regiões determinantes de complementaridade (CDRs), intercaladas com regiões que são mais conservadas, denominadas as regiões estruturais (FR). Cada HCVR e LCVR é composto por três CDRs e quatro FRs, dispostas a partir do terminal amino para o terminal carboxila na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. A atribuição de aminoácidos para cada domínio está em conformidade com as convenções conhecidas. A capacidade funcional do anticorpo se ligar a um antígeno particular depende das regiões variáveis de cada par de cadeia leve/pesada, e é determinada em grande parte pelas CDRs.

[0092] O termo “anticorpo”, tal como aqui utilizado, refere-se a um anticorpo monoclonal per se. Um anticorpo monoclonal pode ser um anticorpo humano, anticorpo químico e/ou anticorpo humanizado.

[0093] Vantajosamente, o termo anticorpo refere-se a uma IgG, tal como IgG1, IgG2 (IgG2a ou IgG2b), IgG3 e IgG4. De preferência, o termo anticorpo refere-se a IgG1 ou IgG2, e mais preferivelmente para IgG2a.

[0094] “Anticorpo quimérico” significa um anticorpo que é composto por regiões variáveis a partir de uma imunoglobulina murina e de regiões constantes de uma imunoglobulina humana. Esta alteração consiste simplesmente em substituir a região constante de um anticorpo humano com a região constante murina, resultando assim em uma quimera humana/murina que pode ter imunogenicidade suficientemente baixa para ser aceitável para utilização farmacêutica. Diversos métodos para a produção de tais anticorpos quiméricos foram ainda relatados, formando-se assim parte do conhecimento geral do versado na técnica (Ver, por exemplo, Patente dos EUA No. 5.225.539).

[0095] “Anticorpo humanizado” significa um anticorpo que é constituído parcial ou totalmente de sequências de aminoácidos derivadas de uma linha germinal de anticorpo humano ao alterar a sequência de um anticorpo possuindo regiões determinantes de complementaridade (CDR) não humanas. Esta humanização da região variável do anticorpo e, eventualmente, o CDR é feita por meio de técnicas que são agora bem conhecidos na técnica. Como um exemplo, o Pedido de Patente Britânico GB 2188638A e Patente norte-americana No. 5.585.089 descrevem processos em que os anticorpos recombinantes são produzidos em que a única porção do anticorpo que é substituída é a região determinante da complementaridade, ou “CDR”. A técnica de enxertia de CDR foi utilizada para gerar anticorpos que consistem em CDR de murina, e a região variável de estrutura humana e regiões constantes (ver, por exemplo, Riechmann et al., Nature, vol.332, p:323-327, 1988). Estes anticorpos retêm as regiões constantes humanas necessárias para a função efetora dependente de Fc, mas são muito menos propensos a evocar uma resposta imunitária contra o anticorpo. Como um exemplo, as regiões estruturais das regiões variáveis são substituídas pelas regiões de estrutura humana correspondentes deixando as CDR não humanas substancialmente intactas ou mesmo substituindo as CDR com sequências derivadas de um genoma humano (ver, por exemplo, o pedido de patente norte- americana 2006/25885). Os anticorpos totalmente humanos são produzidos em ratinhos geneticamente modificados cujos sistemas imunitários foram alterados para corresponderem a sistemas imunitários humanos. Como mencionado acima, é suficiente para o uso nos métodos da presente invenção, empregar um fragmento imunologicamente específico do anticorpo, incluindo fragmentos que representam formas em cadeia simples.

[0096] Um anticorpo humanizado refere-se novamente a um anticorpo compreendendo uma estrutura humana, pelo menos uma CDR de um anticorpo não humano, e na qual qualquer região constante presente é substancialmente idêntica a uma região constante de imunoglobulina humana, isto é, pelo menos cerca de 85 ou 90%, preferencialmente pelo menos 95% idêntica. Assim, todas as partes de um anticorpo humanizado, exceto possivelmente as CDR, são substancialmente idênticas às partes de uma ou mais sequências de imunoglobulinas humanas nativas correspondentes. Por exemplo, uma imunoglobulina humanizada não englobaria tipicamente um anticorpo de região variável de rato quimérico/região constante humana. Como um exemplo, a concepção de imunoglobulinas humanizadas pode ser realizada como se segue: quando um aminoácido cai sob a categoria seguinte, o aminoácido de estrutura de uma imunoglobulina humana a ser utilizado (imunoglobulina aceptora) é substituído por um aminoácido de estrutura de uma imunoglobulina não humana fornecedora de CDR (imunoglobulina doadora): (a) o aminoácido na região estrutural humana da imunoglobulina aceptora é não usual para a imunoglobulina humana nessa posição, enquanto que o aminoácido correspondente na imunoglobulina doadora é típico para a imunoglobulina humana nessa posição, (b) a posição do aminoácido é imediatamente adjacente a uma das CDR, ou (c) qualquer átomo de cadeia lateral de um aminoácido de estrutura está dentro de cerca de 5-6 angstroms (centro a centro) de qualquer átomo de um aminoácido de CDR em um modelo tridimensional de imunoglobulina (Queen et al., Proc Natl Acad Sci EUA , vol.88, p:2869, 1991). Quando cada um dos aminoácidos na região estrutural humana da imunoglobulina aceptora e um aminoácido correspondente na imunoglobulina doadora é não usual para a imunoglobulina humana nessa posição, tal aminoácido é substituído por um aminoácido típico para a imunoglobulina humana nessa posição.

[0097] O termo “fragmento de anticorpo”, tal como aqui utilizado refere-se a um fragmento de anticorpo capaz de reagir com o mesmo antígeno que o seu homólogo de anticorpo. Tais fragmentos podem ser simplesmente identificados pelo versado na técnica e incluem, por exemplo, fragmentos Fab (por exemplo, por digestão com papaína), fragmento Fab' (por exemplo, por digestão com pepsina e redução parcial), fragmentos F(ab')2 (por exemplo, por digestão com pepsina), Facb (por exemplo, por digestão com plasmina), Fd (por exemplo, por digestão da pepsina, redução parcial e reagregação), e também fragmento scFv (Fv de cadeia única, por exemplo, por técnicas de biologia molecular) estão englobados pela invenção.

[0098] Tais fragmentos podem ser produzidos por clivagem enzimática, técnicas sintéticas ou recombinantes como são conhecidas na técnica e/ou como aqui descritas. Os anticorpos também podem ser produzidos em uma variedade de formas truncadas, usando genes de anticorpos nos quais um ou mais códons de terminação foram introduzidos a montante do local de parada natural. Por exemplo, um gene de combinação que codifica uma porção de cadeia pesada F(ab')2 pode ser concebido para incluir sequências de DNA que codificam o domínio CH1 e/ou a região de charneira da cadeia pesada. As várias porções de anticorpos podem ser unidas quimicamente por técnicas convencionais, ou podem ser preparadas como uma proteína contígua utilizando técnicas de engenharia genética.

[0099] Preferencialmente, o referido fragmento de anticorpo é um fragmento scFv.

[0100] Em uma concretização preferida, o referido anticorpo ou fragmento deste é dirigido contra um antígeno relacionado com a neovascularização do tumor ou a matriz extracelular do tumor, ou contra um antígeno tumoral.

[0101] Tal como aqui utilizado, um “antígeno relacionado com a neovascularização do tumor” refere-se a um antígeno que é expresso pelos vasos sanguíneos neo-sintetizados presentes no tumor.

[0102] Como exemplo de tais antígenos, pode-se citar os domínios EDA e EDB de fibronectina, Endosalin/TEM1, Endoglin/105, PSMA ou B7-H4.

[0103] Tal como aqui utilizado, um “antígeno relacionado à matriz extracelular do tumor” refere-se a um antígeno que é expresso na matriz extracelular presentes no tumor.

[0104] Como exemplo de tais antígenos, pode-se citar o fragmento G45 de laminina-332 (ROUSSELLE et al. Cancer Research, vol.68 (8), p:2885-94, 2008).

[0105] Tal como aqui utilizado um “antígeno tumoral” refere-se a uma substância antigênica produzida em células tumorais. Muitos antígenos tumorais são bem conhecidos do versado na técnica e pode-se citar, como exemplos não limitantes, CD-20, CEA, EGFR, GD2, EPCAM, MUC1, PSMA, CD-19, GD3, GM1, CAIX, GD2-O-acetilado ou HER2.

[0106] CD-20 é uma fosfoproteína não glicosilada expressa durante o desenvolvimento das células pré-B e permanece até início da diferenciação de célula plasmática. Especificamente, a molécula de CD20 pode regular uma etapa no processo de ativação que é necessário para iniciação do ciclo celular e diferenciação e é geralmente expressa em níveis muito elevados nas células B neoplásicas (“tumor”). CD20, por definição, está presente tanto em células B “normais”, bem como em células B “malignas”. Assim, o antígeno de superfície CD20 tem o potencial de servir como candidato para o “direcionamento” de linfomas de células B.

[0107] No que diz respeito aos anticorpos dirigidos contra CD-20, pode-se citar o rituximab (“RITUXAN®”)(Patente dos EUA No. 5.736.137), o anticorpo murino 2B8 marcado com ítrio- [90] designado “Y2B8” ou “Ibritumomab Tiuxetano” ZEVALIN® (Patente dos EUA No. 5.736.137); murino IgG2a “BI”, também denominado “Tositumomab”, opcionalmente marcado com 131I para gerar o anticorpo “131I-BI” (iodo 131 tositumomab, BEXXAR®)(Patente norte-americana No. 5.595.721), e 2H7 humanizado; ofatumumab, uma IgG1 completamente humanizada contra um novo epítopo em CD20 huMax-CD20 (pedido de patente internacional PCT WO 2004/035607). Entre eles, o rituximab, ibritumomab, tiuxetano, e tositumomab receberam a aprovação do mercado para o tratamento de linfoma específico, e Ofatumumab recebeu a aprovação do mercado para o tratamento de leucemia específica.

[0108] A glicoproteína CEA (antígeno carcinoembrionário) é um marcador de tumores envolvidos na adesão celular.

[0109] Quanto aos anticorpos dirigidos contra CEA, pode- se citar arcitumomab (IMMUNOMEDICS).

[0110] Os receptores ErbB são expressos em vários tecidos epiteliais, células mesenquimais e de origem neuronal. Sob condições normais, a ativação dos receptores ErbB é controlada através da expressão espacial e temporal dos seus ligantes, que são membros da família EGF dos fatores de crescimento. A ligação dos ligantes aos receptores ErbB induz a formação de receptores de homo- e heterodímeros e ativação do domínio quinase intrínseca, resultando na fosforilação de resíduos de tirosina quinase específicos dentro da cauda citoplasmática. Estes resíduos fosforilados servem como locais de encaixe para várias proteínas, o recrutamento das quais leva à ativação de vias de sinalização intracelular. Entre os receptores de ErbB, EGFR e HER2 são conhecidos por desempenhar um papel essencial na regulação da proliferação e diferenciação celular. Eles têm uma forte tendência para a montagem com outros receptores HER em homo- e/ou heterodímeros sob o fator de crescimento extracelular de ligação, o que resulta em várias formas de ativação de vias de transdução de sinal, que conduzem a uma apoptose, sobrevivência ou proliferação das células.

[0111] No que diz respeito aos anticorpos dirigidos contra o EGFR, pode-se citar o anticorpo monoclonal humanizado 425, também designado como matuzumab (hMAb 425, Patente dos EUA No. 5.558.864; EP 0531 472), o anticorpo monoclonal quimérico 225 (cMAb 225), também designado como cetuximab (ERBITUX®; Patente dos EUA No. 7.060.808), e o anticorpo panitumumab anti- EGFR totalmente humano (VECTIBIX®; Patente dos EUA No. 6.235.883). Entre eles, cetuximab e panitumumab demonstraram inibir tumores coloretais humanos, in vivo e ambos receberam aprovação de mercado.

[0112] No que diz respeito aos anticorpos dirigidos contra Her2, pode-se citar a versão humanizada recombinante do anticorpo de rato 4D5 ((Patente dos EUA No. 5.677.171), designado como huMAb4D5-8, rhuMAb HER2, trastuzumab, ou HERCEPTIN® (Patente dos EUA No. 5.821.337). Este anticorpo recebeu aprovação de mercado em 1998 para o tratamento de pacientes com câncer de mama metastático cujos tumores superexpressam a proteína ErbB2.

[0113] GD2 é um disialogangliosídeo expresso em tumores de origem neuroectodérmico, incluindo neuroblastoma e melanoma.

[0114] No que diz respeito aos anticorpos dirigidos contra GD2, pode-se citar o anticorpo monoclonal 3F8 IgG3 murino, que tem sido utilizado no tratamento do neuroblastoma, ou o anticorpo monoclonal 8B6 IgG3 murino, que é específico da forma O-acetilada de GD2 (pedido de patente PCT internacional WO 2008/043777).

[0115] De preferência, o anticorpo é dirigido contra a CD-20 (por exemplo, rituximab divulgado na Patente dos EUA 5,736,137), GD2-O-acetilado (por exemplo, o descrito no pedido de patente PCT internacional WO 2008/043777) ou HER2 (por exemplo, trastuzumab ou HERCEPTIN® divulgado na Patente dos EUA No. 5821337).

[0116] Tanto o conjugado quanto o anticorpo ou seu fragmento podem ser ligados de forma covalente utilizando agentes de acoplamento de proteínas bifuncionais, ou em uma proteína de fusão.

[0117] Métodos de agentes de acoplamento de proteínas bifuncionais são bem conhecidos pelo versado na técnica e foram anteriormente divulgados. Como um exemplo, o versado na técnica pode usar o método divulgado em TILL et al. (Proc. Natl. Acad. EUA, vol.86 (6), p:1987-91, 1989).

[0118] Em uma concretização preferida, a imunocitocina uma proteína de fusão.

[0119] Em uma outra concretização preferida, a imunocitocina é um complexo, de preferência um complexo que compreende um conjugado entre os polipeptídeos i) e ii), em que o polipeptídeo i) ou ii) é fundido a um anticorpo ou fragmento do mesmo.

[0120] O polipeptídeo i), o polipeptídeo ii), ou o conjugado podem estar em uma posição C-terminal ou N-terminal em relação à sequência de aminoácidos do anticorpo ou seu fragmento.

[0121] De preferência, o conjugado é uma proteína de fusão e a sequência de aminoácidos do conjugado está em uma posição C-terminal em relação à sequência de aminoácidos do anticorpo ou fragmento do mesmo, mais preferencialmente na posição C-terminal em relação à sequência de aminoácidos de pelo menos uma da região constante da cadeia pesada do anticorpo ou seu fragmento.

[0122] A sequência de aminoácidos do conjugado e a sequência de aminoácidos do anticorpo ou seu fragmento podem ser separados ou não por uma segunda sequência de aminoácidos “ligante”.

[0123] Em uma concretização particular, a imunocitocina da invenção é uma proteína de fusão em que o conjugado e o anticorpo ou fragmento do mesmo não são separados por qualquer ligante.

[0124] De fato, os inventores surpreendentemente estabeleceram que a imunocitocina da invenção não necessita de qualquer ligante entre as partes de imunoglobulina e de citocina de modo a ser ativa.

[0125] Tal como para a primeira sequência de aminoácidos ligantes, a referida segunda sequência de aminoácidos “ligantes” pode ser de um comprimento suficiente para garantir que a proteína de fusão forme estruturas secundárias e terciárias adequadas.

[0126] O comprimento da primeira sequência de aminoácidos ligante pode variar sem afetar significativamente a atividade biológica da proteína de fusão. Tipicamente, a primeira sequência de aminoácidos ligante compreende pelo menos um, mas menos do que 30 aminoácidos, por exemplo, um ligante de 2-30 aminoácidos, de preferência de 10-30 aminoácidos, mais de preferência de 15-30 aminoácidos, mais preferencialmente de 15-25 aminoácidos.

[0127] Tal como para a primeira sequência de aminoácidos ligante, as segundas sequências de aminoácidos ligantes mais adequadas (1) adotarão uma conformação prolongada flexível, (2) não exibirão uma propensão para o desenvolvimento de estrutura secundária ordenada que poderia interagir com os domínios funcionais de proteínas de fusão, e (3) terão características hidrofóbicas ou de cargas mínimas que poderiam promover a interação com os domínios funcionais da proteína.

[0128] De preferência, a segunda sequência de aminoácidos ligante compreende aminoácido quase neutro selecionado no grupo constituído por Gly (G), Asn (N), Ser (S), Thr (T), Ala (A), Leu (L), e Gln (Q), mais preferencialmente no grupo que compreende Gly (G), Asn (N), e Ser (S).

[0129] Como um exemplo de uma segunda sequência de aminoácido ligante que é adequada para a presente invenção, pode- se citar a sequência SEQ ID n° 16 (SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSG) ou SEQ ID n° 28 (AAGGGSGGGSGGGGSGGGGSAA).

Ácidos nucleicos, vetores e células hospedeiras recombinantes

[0130] Em um segundo aspecto, a presente invenção refere-se a um ácido nucleico que codifica para uma imunocitocina como descrita acima, preferencialmente uma imunocitocina que corresponde a uma proteína de fusão.

[0131] O referido ácido nucleico corresponde ao RNA ou DNA, de preferência o DNA.

[0132] De acordo com uma concretização preferida, o ácido nucleico que codifica a imunocitocina da invenção está operacionalmente ligado a uma sequência de expressão de gene, que dirige a expressão do ácido nucleico dentro de uma célula procariótica ou eucariótica, de preferência dentro de uma célula eucariota. A “sequência de expressão de gene” é qualquer sequência reguladora de nucleotídeos, tais como uma sequência promotora ou combinação promotora-melhoradora, que facilita a transcrição eficiente e tradução do ácido nucleico de imunocitocina para o qual está ligado operacionalmente. A sequência de expressão de gene pode, por exemplo, ser um promotor de mamífero ou viral, tal como um promotor constitutivo ou indutível.

[0133] Promotores mamíferos constitutivos incluem, mas não estão limitados a, os promotores para os seguintes genes: hipoxantina fosforribosil-transferase (HPTR), adenosina desaminase, piruvato quinase, promotor de p-actina, promotores de creatina-quinase de músculos, promotor do fator de alongamento humano e outros promotores constitutivos. Os promotores virais exemplificativos que funcionam de forma constitutiva em células eucarióticas incluem, por exemplo, promotores do vírus de símio (por exemplo, SV40), vírus do papiloma, adenovírus, vírus da imunodeficiência humana (HIV), o citomegalovírus (CMV), vírus do sarcoma de Rous (RSV), vírus da hepatite B (VHB), as repetições terminais longas (LTR) do vírus Moloney da leucemia e de outros retrovírus, e o promotor da timidina-quinase do vírus herpes simplex. Outros promotores constitutivos são conhecidos daqueles versados na técnica.

[0134] Os promotores úteis como sequências de expressão de gene da invenção também incluem os promotores indutíveis. Os promotores indutíveis são expressos na presença de um agente indutor. Por exemplo, a metalotiona no promotor é induzida para promover a transcrição e a tradução na presença de certos íons metálicos. Outros promotores indutíveis são conhecidos para os versados na técnica.

[0135] Em geral, a sequência de expressão do gene inclui, conforme necessário, sequências 5' não transcritas e sequências 5' não-traduzidas envolvidas com a iniciação da transcrição e tradução, respectivamente, tais como uma caixa TATA, sequência limite, sequência CAAT, e semelhantes. Especialmente, tais sequências 5' não transcritas incluirão uma região promotora que inclui uma sequência promotora para o controle da transcrição do ácido nucleico operacionalmente ligado. As sequências de expressão de gene, opcionalmente, incluem sequências potenciadoras ou sequências ativadoras a montante, como desejado. Tal como aqui utilizado, a sequência de ácido nucleico que codifica a imunocitocina da invenção e a sequência de expressão do gene são ditas serem “operacionalmente ligadas” quando elas são covalentemente ligadas de tal forma que se coloque a expressão ou transcrição e/ou tradução da imunocitocina da sequência codificadora da invenção sob a influência ou controle da sequência de expressão do gene.

[0136] Duas sequências de DNA são ditas serem operacionalmente ligadas se a indução de um promotor nas extremidades 5' da sequência de expressão de genes resulta na transcrição da imunocitocina da invenção e se a natureza da ligação entre as duas sequências de DNA não (1) resulta na introdução de uma mutação frameshift, (2) interfere com a capacidade da região promotora para dirigir a transcrição da imunocitocina da invenção, ou (3) interfere com a capacidade do transcrito de RNA correspondente para ser traduzido em uma proteína. Assim, uma sequência de expressão de gene seria operacionalmente ligada a uma sequência de ácido nucleico que codifica a imunocitocina da invenção, se a sequência de expressão do gene fosse capaz de efetuar a transcrição dessa sequência de ácido nucleico de tal forma que o transcrito resultante fosse traduzido para o polipeptídeo desejado.

[0137] Vantajosamente, a referida sequência de ácido nucleico compreende um íntron, uma vez que as moléculas de pré- mRNA tem demonstrado frequentemente melhorar o rendimento da produção de moléculas recombinantes. Quaisquer sequências de íntron podem ser usadas, e como um exemplo, pode-se citar aquelas descritas em ZAGO et al. (Biotechnol. Appl. Biochem., Vol.52(Pt 3), p:191-8, 2009) e em CAMPOS-DA-PAZ et al. (Mol. Biotechnol., Vol.39(2), p:155-8, 2008).

[0138] O ácido nucleico que codifica para a imunocitocina da invenção pode ser entregue in vivo sozinho ou em associação com um vetor.

[0139] Em um terceiro aspecto, a presente invenção refere-se a um vetor compreendendo um ácido nucleico como acima descrito.

[0140] No seu sentido mais amplo, um “vetor” é um veículo capaz de facilitar a transferência do ácido nucleico que codifica para a imunocitocina da invenção para as células. De preferência, o vetor transporta o ácido nucleico para as células com degradação reduzida em relação à extensão da degradação que resultaria na ausência do vetor. Em geral, os vetores úteis na invenção incluem, mas não estão limitados a, plasmídeos, cosmídeos, fagomídeos, epissomas, cromossomas artificiais, vírus, outros veículos derivados de fontes virais ou bacterianas que foram manipulados pela inserção ou incorporação das sequências de ácidos nucleicos da imunocitocina.

[0141] Vetores plasmídicos são um tipo preferido de vetor e têm sido extensivamente descritos na técnica e são bem conhecidos dos versados na técnica. Ver, por exemplo, SANBROOK et al, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, Segunda Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. Exemplos não limitantes de plasmídeos incluem pBR322, pUC18, pUCl9, pRC/CMV, SV40, e pBlueScript, e outros plasmídeos são bem conhecidos dos versados na técnica. Além disso, os plasmídeos podem ser personalizados usando enzimas de restrição e as reações de ligação para remover e adicionar fragmentos específicos de DNA.

[0142] De preferência, o vetor de ácido nucleico pode incluir marcadores selecionáveis que são ativos tanto em bactérias quanto em células de mamíferos.

[0143] Em um quarto aspecto, a presente invenção refere- se a uma célula hospedeira geneticamente modificada com o ácido nucleico ou com o vetor anteriormente descrito.

[0144] Tal como aqui utilizado, o termo “célula hospedeira geneticamente modificada” refere-se a células hospedeiras que tenham sido transduzidas, transformadas ou transfectadas com o ácido nucleico ou com o vetor anteriormente descrito.

[0145] Como exemplos representativos das células hospedeiras apropriadas, pode-se citar as células bacterianas, tais como E. coli, células fúngicas tais como leveduras, células de inseto, tais como Sf9, células animais tais como CHO ou COS, células de plantas, etc. A seleção de um hospedeiro apropriado é considerada estar no âmbito dos versados na técnica a partir dos ensinamentos aqui contidos.

[0146] De preferência, a célula hospedeira geneticamente modificada é uma célula animal e ainda mais preferencialmente, uma célula CHO-S (INVITROGEN, cat N° 11619-012).

[0147] Células do ovário de hamster chinês (CHO) são frequentemente usadas na indústria biofarmacêutica para a fabricação de produtos biológicos, tais como proteínas recombinantes, anticorpos, pepticorpos, e ligantes receptores. Uma das razões para que as células CHO sejam frequentemente utilizadas é que estas células têm um extenso histórico de segurança para a produção de produtos biológicos. Isto é considerado como uma linha de células bem caracterizadas e, como resultado, o teste de segurança exigido pode ser menos rigoroso em alguns aspectos (por exemplo, segurança retroviral) do que o requerido para outros tipos de células. No entanto, a produção de interleucina 15 é muito difícil, especialmente nesta célula.

[0148] Surpreendentemente, os inventores estabeleceram que as imunocitocinas da invenção são bem produzidas nesta célula, as imunocitocinas obtidas possuindo ainda uma pureza e uma atividade muito boas.

[0149] A introdução do ácido nucleico ou do vetor previamente descrito na célula hospedeira pode ser feita por métodos bem conhecidos de um versado na técnica, tal como transfecção com fosfato de cálcio, transfecção mediada por DEAE- dextrano ou eletroporação.

[0150] A presente invenção refere-se também a um método de produção de uma célula hospedeira geneticamente modificada expressando um imunocitocina de acordo com a invenção, dito método compreendendo as etapas de: (i) introduzir in vitro ou ex vivo um ácido nucleico ou um vetor tal como descrito acima em uma célula hospedeira, (ii) cultivar in vitro ou ex vivo a célula hospedeira recombinante geneticamente modificada e (iii), opcionalmente, selecionando as células que expressam e/ou secretam a dita imunocitocina. Tais células hospedeiras recombinantes podem ser utilizadas para a produção da imunocitocina da invenção.

Composição farmacêutica compreendendo a imunocitocina da invenção

[0151] Um outro objeto da invenção refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo a imunocitocina como descrita acima, uma codificação de ácido nucleico desta, ou um vetor compreendendo o referido ácido nucleico, eventualmente associado a um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0152] A expressão “farmaceuticamente aceitável” refere- se a entidades moleculares e composições que são fisiologicamente toleráveis e normalmente não produzem reações alérgicas indesejáveis ou semelhantes, tais como perturbações gástricas, tonturas e similares, quando administradas a um humano. De preferência, tal como aqui utilizado, a expressão “farmaceuticamente aceitável” significa aprovada por uma agência reguladora do governo federal ou do governo do estado ou listado na Farmacopeia dos EUA ou outra farmacopeia geralmente reconhecida para utilização em animais, e mais particularmente em seres humanos.

[0153] O termo “transportador” refere-se a um solvente, adjuvante, excipiente ou veículo com o qual o composto é administrado. Tais veículos farmacêuticos podem ser líquidos estéreis, tais como água e óleos, incluindo aqueles de origem oleosa, animal, vegetal ou de origem sintética, tais como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de sésamo e semelhantes.

[0154] A composição farmacêutica compreende uma “quantidade eficaz” da imunocitocina da invenção, cuja quantidade eficaz é suficiente para inibir o crescimento de células cancerosas, preferencialmente suficiente para induzir a regressão do crescimento do tumor. As doses utilizadas para a administração podem ser adaptadas em função de vários parâmetros, em particular como uma função do modo de administração utilizado, da patologia relevante, ou alternativamente da duração desejada do tratamento. Naturalmente, a forma da composição farmacêutica, a via de administração, a dosagem e o regime naturalmente dependem da condição a ser tratada, da gravidade da doença, da idade, do peso e do sexo do indivíduo, etc. As faixas de doses eficazes proporcionadas abaixo não se destinam a limitar a invenção e representam faixas de dose preferidas. No entanto, a dose preferida pode ser adaptada ao sujeito individual, como é compreendido e determinável por um versado na técnica, sem experimentação indevida.

[0155] Tendo em conta a eficiência acentuada da imunocitocina da invenção, o versado na técnica pode planejar o uso de doses muito pequenas para o tratamento de um sujeito. Como um exemplo não limitante, a imunocitocina da invenção pode ser administrada por injeção, em uma dose de 2,5 mg/kg ou 1 mg/kg do indivíduo ou menos, preferencialmente a uma dose de 0,5 mg/kg ou menos, ou de 0,25 mg/kg ou menos, e mais preferencialmente a uma dose de 0,1 mg/kg ou menos.

[0156] Como um exemplo, as composições farmacêuticas da invenção podem ser formuladas para administração tópica, oral, intranasal, intra-ocular, intravenosa, intramuscular ou administrações subcutâneas e semelhantes. De preferência, a composição farmacêutica contém veículos que são farmaceuticamente aceitáveis para uma formulação destinada a ser injetada. Estes podem ser, em particular, isotônicos, estéreis, soluções salinas (de fosfato monossódico ou dissódico, de sódio, de potássio, de cálcio ou de cloreto de magnésio e afins ou misturas de tais sais), ou secos, especialmente composições liofilizadas que a adição, dependendo do caso, de água esterilizada ou solução salina fisiológica permite a constituição de soluções injetáveis. Veículos farmaceuticamente aceitáveis são descritos em “Remington’s Pharmaceutical Sciences” por E.W. Martin.

[0157] A imunocitocina da invenção, os ácidos nucleicos que codificam para ela, ou os vetores de ácidos nucleicos podem ser solubilizados em um tampão ou água ou incorporados em emulsões, microemulsões, hidrogéis (por exemplo, hidrogéis à base de copolímeros de três blocos PLGA-PEG-PLGA), em microesferas, em nanosferas, em micropartículas, em nanopartículas (por exemplo, poli(ácido láctico-co-glicólico), micropartículas (por exemplo, poli ácido láctico (PLA); poli (ácido láctico-co-glicólico)(PLGA); microesferas de poliglutamato, nanoesferas, micropartículas ou nanopartículas), em lipossomas ou outras formulações galênicas. Em todos os casos, a formulação deve ser estéril e fluida até ao ponto de seringabilidade aceitável. Deve ser estável sob as condições de fabricação e armazenamento e deve ser preservada contra a ação contaminante de microrganismos, tais como bactérias e fungos.

[0158] As soluções dos compostos ativos como base livre ou sais farmacologicamente aceitáveis podem ser preparadas em água adequadamente misturada com um surfactante, tal como hidroxipropilcelulose.

[0159] As dispersões também podem ser preparadas em glicerol, glicóis líquidos de polietileno, suas misturas e em óleos. Sob condições normais de armazenamento e utilização, estas preparações contêm um conservante para evitar o crescimento de microrganismos.

[0160] As imunocitocinas de acordo com a invenção podem ser formuladas em uma composição em uma forma neutra ou de sal. Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os sais de adição de ácido (formados com os grupos amino livres da proteína) que são formados com ácidos inorgânicos tais como, por exemplo, ácido clorídrico ou fosfórico, ou ácidos orgânicos tais como acético, oxálico, tartárico, mandélico, e semelhantes. Os sais formados com os grupos carboxila livres também podem ser derivados de bases inorgânicas tais como, por exemplo, hidróxido de sódio, potássio, amônio, cálcio, ou férricos e bases orgânicas tais como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína e semelhantes.

[0161] O veículo também pode ser um solvente ou um meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol, e polietilenoglicol líquido, e semelhantes), suas misturas adequadas, e óleos vegetais. As imunocitocinas da invenção também podem ser modificadas, por PEGilação, por exemplo, de modo a aumentar a sua biodisponibilidade. Quando a imunocitocina da invenção tem uma forma de ácido nucleico, o veículo também pode ser um vetor, tal como um vírus (por exemplo, MVA, rAAV, lentivirus, etc.)

[0162] A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento, tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersão e pela utilização de surfactantes. A prevenção da ação de microrganismos pode ser provocada por vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal, e semelhantes. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares ou cloreto de sódio.

[0163] A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser provocada pelo uso nas composições de agentes que atrasam a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio, gelatina, polióis, formulações covalentes e não covalentes melhoradoras de meia-vida.

[0164] Há inúmeras causas de instabilidade ou de degradação do peptídeo, incluindo hidrólise e desnaturação. A interação hidrofóbica pode causar aglomeração de moléculas em conjunto (isto é, agregação). Estabilizadores poderão ser adicionados para reduzir ou impedir esses problemas.

[0165] Estabilizadores incluem ciclodextrina e seus derivados (ver Patente dos EUA No. 5,730,969). Os conservantes adequados, tais como sacarose, manitol, sorbitol, trealose, dextrano e glicerina também podem ser adicionados para estabilizar a formulação final. Um estabilizador selecionado a partir de surfactantes iônicos e não iônicos, a D-glucose, D- galactose, D-xilose, ácido D-galacturônico, trealose, dextrano, amidos hidroxietil, e misturas dos mesmos podem ser adicionados à formulação. A adição de sal de metal alcalino ou de cloreto de magnésio pode estabilizar um peptídeo. O peptídeo pode também ser estabilizado por contato com um sacarídeo selecionado a partir do grupo que consiste em dextrano, ácido sulfúrico de condroitina, amido, glicogênio, dextrina, e o sal do ácido algínico. Outros açúcares que podem ser adicionados incluem monossacarídeos, dissacarídeos, álcoois de açúcar, e suas misturas (por exemplo, glicose, manose, galactose, frutose, sacarose, maltose, lactose, manitol, xilitol). Os polióis podem estabilizar um peptídeo, e são miscíveis em água ou solúveis em água. Os polióis adequados podem ser poli-hidroxi álcoois, monossacarídeos e dissacarídeos, incluindo manitol, glicerol, etileno glicol, propileno glicol, trimetil-glicol, vinilpirrolidona, glicose, frutose, arabinose, manose, maltose, sacarose, e os seus polímeros. Vários excipientes também podem estabilizar os peptídeos, incluindo a albumina do soro, os aminoácidos, a heparina, os ácidos graxos e os fosfolipídeos, agentes tensoativos, os metais, os polióis, agentes redutores, agentes quelantes de metais, a polivinilpirrolidona, a gelatina hidrolisada, e o sulfato de amônio.

[0166] A promessa da terapia de citocinas, de fato, deriva da identificação dessas novas citocinas, mas ainda mais importante, a área está se beneficiando muito da quantidade cada vez maior de dados pré-clínicos que demonstram de maneira convincente efeitos biológicos sinérgicos e/ou novos, o que pode ser conseguido através do uso de várias combinações de citocinas com capacidades imuno-estimulantes complementares. Combinações de agentes ativos terapêuticos potenciais com imunocitocinas baseados em RLI inclui, por exemplo, os agentes quimioterápicos, agentes antiangiogênicos, ou agentes imunomoduladores.

[0167] Em uma concretização preferida, a composição da invenção pode compreender ainda um agente terapêutico ativo, tal como agentes quimioterapêuticos, agentes antiangiogênicos ou agentes imunomoduladores.

[0168] Para os agentes quimioterapêuticos, tem sido demonstrado que os seus efeitos terapêuticos poderiam ser mediados em parte por um efeito indireto sobre as respostas imunes, tanto por induzir uma morte celular imunogênica, equilibrando os ambientes imunossupressores, pré-compactando o grande tumor primário e em seguida, facilitando o ataque do sistema imunológico ou induzindo uma linfopenia transitória seguida por linfoproliferação homeostática. Muitos deles são bem conhecidos do versado na técnica e, e como um exemplo de um agente quimioterapêutico que pode ser combinado com a imunocitocina da invenção, pode-se citar fludarabina, gencitabina, capecitabina, metotrexato, taxol, taxotere, mercaptopurina, tioguanina, hidroxiureia, citarabina, ciclofosfamida, ifosfamida, nitrosoureias, complexos de platina, tais como cisplatina, carboplatina e oxaliplatina, mitomicina, dacarbazina, procarbizina, etoposido, teniposido, campatecins, bleomicina, doxorrubicina, idarrubicina, daunorrubicina, dactinomicina, plicamicina, mitoxantrona, L-asparaginase, doxorrubicina, epimbicm, 5-fluorouracilo, taxanos como o docetaxel e o paclitaxel, leucovorina, levamisole, irinotecano, estramustina, etoposido, mostardas de nitrogênio, BCNU, nitrosoureias tais como carmustme e lomustina, alcalóides de vinca tais como vinblastina, vincristina e vinorelbina, imatimb mesilato, hexametinelamina, topotecano, inibidores da quinase, inibidores de fosfatase, inibidores de ATPase, tirfostinas, inibidores de protease, inibidores de herbimicm A, genisteína, erbstatina, e lavendustina A.

[0169] Para os agentes anti-angiogênicos, demonstrou-se que eles têm efeitos de desvio no sistema imunitário e assim, poderiam facilitar as respostas imunes de tumor. Como um exemplo de agente anti-angiogênico que pode ser combinado com a imunocitocina da invenção, pode-se citar drogas que visam o receptor do fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR), através da sua tirosina quinase, tais como o sorafenib, sunitinib e pazopanib, ou o alvo de mamífero rapamicina (mTOR), tal como temsirolímus e everolimus.

[0170] Para agentes imunomoduladores que podem ser combinados com a imunocitocina da invenção, pode-se citar as citocinas (IL-2, IL-7, IL-15, IL-12, IL18, IL-21, GM-CSF, G-CSF, IFNα,...), quimiocinas/citocinas anti-angiogênicos (IP10, Mig, SDF-1, RANTES,...), agonistas de TLR e anticorpos imuno- reguladores (anti-CTLA4, anti-PD1, anti-TGFb, agonista anti- CD40,...).

Métodos terapêuticos e usos

[0171] Em um outro aspecto, a presente invenção refere- se a uma composição farmacêutica tal como descrita anteriormente para o tratamento de câncer em um sujeito, de preferência, de uma composição farmacêutica compreendendo uma imunocitocina como descrita anteriormente.

[0172] Tal como aqui utilizado, o termo “sujeito” significa um mamífero, tal como um roedor, um felino, um canino ou um primata, e mais preferencialmente um humano.

[0173] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a produtos que contêm: (i) uma imunocitocina como descrita acima, uma sequência de ácido nucleico codificando a mesma, ou um vetor compreendendo uma tal sequência de ácido nucleico, e (ii) um agente terapêutico, de preferência, um agente anticancerígeno, como uma preparação combinada para utilização separada, simultânea ou sequencial para o tratamento de câncer em um sujeito.

[0174] Ainda em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método para o tratamento de câncer em um sujeito compreendendo a etapa de administrar ao referido sujeito uma composição farmacêutica tal como descrita anteriormente.

[0175] Em um aspecto final, a presente invenção refere- se a um método para o tratamento de câncer compreendendo a etapa de administrar simultaneamente, separadamente ou sequencialmente a um sujeito com necessidade de uma quantidade terapeuticamente eficaz de: (i) uma imunocitocina como descrita acima, uma sequência de ácido nucleico codificando a mesma, ou um vetor compreendendo tal sequência de ácido nucleico, e (ii) um agente terapêutico, de preferência, um agente anti- câncer.

[0176] No contexto da invenção, o termo “tratar” ou “tratamento”, tal como aqui utilizado, significa reverter, aliviar, inibir o progresso, ou prevenir a perturbação ou estado ao qual tal termo se aplica, ou um ou mais sintomas de tal desordem ou condição. O termo “tratar o câncer”, tal como aqui utilizado, significa a inibição do crescimento de células cancerosas. Preferivelmente, tal tratamento conduz também à regressão do crescimento do tumor, isto é, a diminuição do tamanho de um tumor mensurável. Mais preferencialmente, tal tratamento conduz a uma regressão completa do tumor.

[0177] No que se segue, a invenção é descrita em mais detalhes com referência às sequências de aminoácidos, sequências de ácidos nucleicos e exemplos. No entanto, nenhuma limitação da invenção é desejada pelos detalhes dos exemplos. Em vez disso, a invenção refere-se a qualquer concretização que compreenda detalhes que não são explicitamente mencionados nos exemplos aqui apresentados, mas que o versado na técnica descobre sem esforço indevido.

EXEMPLOS 1) Construção de imunocitocinas baseadas em interleucina 15

[0178] Construção de imunocitocinas anti-CD20 (rituximab) e anti-GD2-O-acetiladas

[0179] Os plasmídeos de expressão que codificam para as cadeias leves de IgG quimérico anti-CD20 e cadeias leves de IgG quimérico anti-GD2-O-acetilado foram gentilmente cedidos pelo Dr. Watier (Université François Rabelais de Tours, França) e Dr. Birkle (INSERM, Université de Nantes, U892, França), respectivamente. As sequências de cadeia pesada de IgG quimérico de cada anticorpo foram concebidas para serem fundidos no 3'term com ou sem um ligante de 22 aminoácidos (SEQ ID n° 16) para IL15 (SEQ ID n° 3, em que o aminoácido na posição 93 é K). Estas sequências de nucleotídeos foram sintetizadas e clonadas em plasmídeos de pcDNA3.1 por GENEART. A sequência completa de cadeias leves e pesadas do anticorpo anti-GD2-O-acetilado (8B6) é revelada no pedido de patente EP 2.076.542 A1 e em CERATO et al. (Hybridoma, vol.16(4), p:307-16, 1997). A sequência completa de cadeias leves e pesadas do anticorpo anti-CD20 (2B8) é descrita na patente dos EUA 5.736.137 (Anderson et al. como o anticorpo denominado “C2B8”) e em REFF et al. (Blood, vol.83(2), p:435-45, 1994).

Preparação de plasmídeo de DNA e Reagente de Transfecção

[0180] Uma PEI de 40 kDa linear foi obtida a partir de POLYSCIENCE. Uma solução mãe a 1 mg/ml foi preparada por dissolução do PEI em água com aquecimento, neutralização com NaOH, e esterilização por filtração através de um filtro de 0,22 μm. A solução mãe foi aliquotada e armazenada a -20° C.

[0181] Os plasmídeos de DNA para transfecções foram purificados utilizando kits de purificação de plasmídeo seguindo o protocolo do fabricante (MachereyNagel) e esterilização por filtração através de um filtro de 0,22 μm.

Produção e purificação das imunocitocinas 1- Transfecção transiente em suspensão:

[0182] Células CHO-S (Invitrogen) mantidas rotineiramente foram inoculadas a uma densidade de 1x106 células/mL em meio PowerCHO2 (LONZA) e cultivadas durante a noite a 37° C em uma incubadora com agitação (100 rpm) com 5% de CO2. Para a transfecção, as células foram então diluídas para 2x106 células/mL em meio CD-CHO (Invitrogen). Os complexos de transfecção foram preparadas em 10% do volume de cultura utilizando NaCl 150 mM. Constructos de expressão de DNA (2,5mg/L de volume de cultura, usando uma razão de 1:2 de plasmídeo codificando para cadeia pesada para plasmídeo codificando para cadeia leve) foram misturados com PEI diluídos em NaCl (10 mg/L de volume de cultura final) e incubados durante 10 min à temperatura ambiente antes da adição à cultura. As células foram cultivadas em um incubador com agitação (130 rpm) a 37° C durante 5h antes de se dobrar o volume de cultura com meio PowerCHO2. O sobrenadante foi coletado cinco dias após a transfecção.

2- Transfecção estável em células aderentes

[0183] As células CHO-K1 (ATCC n° CCL-61) foram cultivadas em DMEM suplementado com L-glutamina, 10% FCS e penicilina (100 unidades/ml)/estreptomicina (100 μg/ml) e transfectadas com cada vetor usando reagente lipofectamina 2000 (Invitrogen), tal como recomendado pelo fabricante. Os clones foram selecionados por diluição limite com meio contendo geneticina e higromicina (0,5 mg/ml) ou blasticina e higromicina (5μg/mL e 100 μg/mL) para o ICK anti-GD2O—acetilado e ICK anti- CD20, respectivamente. O sobrenadante da cultura de cada clone foi analisado para a produção de proteínas bifuncionais por ELISA. Para a produção de ICK, os clones selecionados foram amplificados em meio 25% DMEM e meio 75% AIM (INVITROGEN). As células foram então mantidas em 100% de AIM, e o sobrenadante foi recolhido e substituído a cada dois dias, durante 10 dias.

3- Purificação do sobrenadante:

[0184] O sobrenadante recolhido foi centrifugado a 3000 rpm durante 20 minutos a 4° C, equilibrado a pH 7,8 com NaOH e filtrado através de um filtro de 0,22 μm. Os meios condicionados foram purificados por cromatografia de afinidade utilizando uma coluna A de proteína (GE) de acordo com as instruções do fabricante. As proteínas purificadas foram concentradas com unidades de AMICON de 50 kDa (Millipore). Durante esta etapa, o tampão de eluição foi substituído por PBS. As proteínas purificadas foram, finalmente, analisadas por ELISA e medição de absorvância a 280 nm. A pureza foi avaliada por eletroforese.

4- Detecção da porção de imunoglobulina por meio de ELISA.

[0185] A placa de microtitulação de fundo plano Maxisorp (NUNC) foi revestida com 100 μL de anticorpo de cabra anti- humano (UP892370, Interchim) diluído em PBS a 1,5 μg/mL por h a 4° C. A placa foi, em seguida, bloqueada com 200 μL de tampão de bloqueio (BSA a 1% + 0,1% de Tween 20 em PBS) durante 1 hora a 37° C. A placa foi então lavada três vezes com tampão de lavagem (0,1% Tween 20 em PBS) e amostras diluídas em tampão de bloqueio foram adicionadas e incubadas por 30 min a 37° C (100 μL). Depois de 3 lavagens, IgG1 anti-humano de cabra (109-036-003, Jackson) conjugado com peroxidase diluído a 1:10000 foi adicionada e incubada durante 30 min a 37° C. O substrato TMB (Interchim) foi utilizado para determinar os níveis de proteína e as placas foram lidas a 450 nm. Rituximab purificado (ROCHE) foi usado para gerar uma curva padrão na placa.

5- Detecção da porção de citocina por ELISA.

[0186] Uma placa de microtitulação de fundo plano Maxisorp (NUNC) foi revestida com 100 μL do B-E29 anti-IL15 (Diaclone) diluído em tampão de carbonato a 2 μg/mL durante 16 h a 4° C. A placa foi, em seguida, bloqueada com 200 μL de tampão de bloqueio (1% BSA em PBS) durante 1 hora a 37° C. A placa foi então lavada três vezes com tampão de lavagem (0,05% Tween 20 em PBS). A amostra diluída em TBS+0,05% de BSA foi adicionada e incubada a 1h30min a 37° C (100 μL). Depois de três lavagens, anticorpo BAM 247 anti-IL15 biotinilado (R&D System) diluído a 200 ng/ml foi adicionado e incubado por 1h30 min a 37° C. A placa foi lavada 3 vezes e estreptavidina conjugada com peroxidase foi adicionada a diluição de 1:1000. O substrato TMB (Interchim) foi utilizado para determinar os níveis de proteína e as placas foram lidas a 450 nm. IL-15 (Peprotech) foi usada para gerar uma curva padrão na placa.

[0187] Os resultados mostraram que a preparação obtida de imunocitocinas compreende muitos contaminantes proteicos (isto é, igual ou superior a 25%). De modo a reduzir estes contaminantes de proteína, os dois anti-GD2-O-acetilado/ imunocitocinas de interleucina 15 foram submetidos a um outro ciclo de purificação de proteína A-Sepharose.

[0188] Depois deste segundo ciclo de purificação de proteína A-Sepharose, a pureza do ICK c8B6-l22-IL15 e c8B6-IL15 foi respectivamente de 70 e 90%.

Atividade de proliferação das imunocitocinas

[0189] A atividade de proliferação de interleucina-15 das imunocitocinas obtidas foi testada. As respostas proliferativas de Kit 225 e células 32Dβ para ICK foram medidas por incorporação de timidina [3H]. As células foram mantidas em meio de cultura durante 3 dias, lavadas por duas vezes, e atrofiadas em um meio sem citocinas durante 24h ou 4h para Kit 225 e 32Dβ, respectivamente. Elas foram então inoculadas em placas de poços múltiplos a 104 células/poço em 100 μl e cultivadas durante 48 horas em meio suplementado com concentrações aumentadas de amostra. rIL-15 humana e RLI foram utilizados como calibradores. As células foram pulsadas durante 16 h com 0,5 pCi/poço de timidina [3H], colhidas em filtros de fibra de vidro e a radioatividade associada às células foi medida.

[0190] A figura 1 mostra a incorporação de timidina [3H] por Kit 225 e células 32Dβ cultivadas com concentrações crescentes de rIL-15 (■), c8B6-IL15 (Δ), e c8B6-122-IL15 (O).

[0191] A figura 2 mostra a timidina [3H] por Kit 225 e células 32Dβ cultivadas com concentrações crescentes de rIL-15 e c2B8- l22-IL15 (O).

[0192] Os resultados mostram que a atividade biológica da IL-15 é drasticamente reduzida no contexto de imunocitocinas, o que significa que a conjugação de IL-15 com o anticorpo monoclonal induz uma perda de atividade. Além disso, esta perda é mais importante na ausência de ligante entre as duas porções.

[0193] Deve-se notar que esta perda de atividade é mais pronunciada no contexto βy.

A atividade de ligação das imunocitocinas

[0194] A ligação específica do anticorpo ICK anti-CD20 e anti-GD2 O-acetilado foi avaliada por citometria de fluxo em tumores de células Raji e IMR32 respectivamente. A capacidade de ICK de se ligar a receptor de IL-15 sobre células efetoras foi testada em Kit225. ICK revestido em células-alvo foi revelado com um IgG mAb (PN IM0550, BECKMAN COULTER) de cabra anti-humano conjugado com PE, ou com um anticorpo de rato biotinilado anti- IL15 (BAM247, R&D SYSTEM) acoplado a PE-estreptavidina (Sigma- Aldrich). As células-alvo (1x105) foram incubadas com cada ICK durante 1 h a 4° C, lavadas e depois incubadas com um conjugado de PE durante 1 hora a 4° C. As células lavadas foram finalmente analisadas em um FACScalibur (Becton Dickinson).

[0195] A Figura 3 mostra a avaliação de citometria de fluxo de ICK anti-CD20 (C2B8-l22-IL15) e anti-GD2O-acetilado (c8B6- IL15 e c8B6-l22-IL15) em células CD20 expressando células Raji e GD2O-acetilado expressando células IMR32. As células foram incubadas primeiro com ICK, em seguida, com uma IgG mAb de cabra anti-humano conjugado com PE para anti-CD20 ou com anticorpo anti-IL15 biotinilado + estreptavidina conjugado com PE para anti-CD20 e anti-GD2, respectivamente. Finalmente, as amostras foram analisadas em um FACSCalibur. ICK foram comparadas com células Raji para o anti-CD20 Mab Rituximab (MabThera, Roche).

[0196] A Figura 4 mostra a avaliação de citometria de fluxo do ICK anti-CD20 (C2B8-l22-IL15 e anti-GD2O-acetilado (c8B6-IL15 e c8B6-l22-IL15) em IL15R expressando células Kit 225. As células foram primeiramente incubadas com ICK, em seguida, com um IgG mAb de cabra anti-humano conjugado com PE. Finalmente, as amostras foram analisadas em um FACSCalibur. ICK foram comparados com o Rituximab mAb anti-CD20 (MABTHERA, ROCHE).

[0197] Os resultados mostram que as diferentes imunocitocinas se ligam ao receptor de IL-15 e também ao seu respectivo antígeno tumoral alvo.

[0198] Assim, a perda de atividade de interleucina 15 nestas imunocitocinas não é o resultado de uma perda de ligação da interleucina 15 no seu receptor específico. No entanto, verifica-se que esta ligação existente não permite induzir a proliferação de células normais.

Construção de imunocitocinas com base em RLI Construção de imunocitocinas anti-CD20 e anti-GD2-Oacetilado RLI

[0199] As imunocitocinas anti-CD20 e anti-GD2-O- acetilada foram construídas como anteriormente, exceto que a sequência de IL15 de Homo sapiens foi substituída pela sequência de RLI2 (SEQ ID n° 17).

Produção e purificação das imunocitocinas

[0200] A produção e purificação das imunocitocinas foram realizadas como anteriormente descrito, exceto que estas imunocitocinas foram obtidas com bons rendimentos e uma boa pureza (ou seja, maior do que 90%) depois de apenas um ciclo de purificação de proteína A Sepharose.

Atividade de ligação das imunocitocinas

[0201] A ligação específica do ICK anti-CD20 e anti-GD2- O-acetilado RLI foi avaliada por citometria de fluxo em células tumorais de Raji, WM266.4 e IMR32. A capacidade de ICK RLI para ligar ao receptor de IL-15 sobre as células efetoras foi testada em Kit225. ICK RLI revestido em células-alvo foram células reveladas com um IgG mAb de cabra anti-humano conjugado com PE (PN IM0550 BECKMAN COULTER), ou com um anticorpo anti-IL15 de rato biotinilado (BAM247, R&D SYSTEM) acoplado a PE- estreptavidina (SIGMA-Aldrich). As células-alvo (1x105) foram incubadas com cada ICK durante 1h a 4° C, lavadas e depois incubadas com um conjugado com PE durante 1 hora a 4° C. As células lavadas foram, finalmente, analisadas em um FACScalibur (Becton Dickinson).

[0202] A Figura 5 mostra a avaliação de citometria de fluxo do ICK C2B8-RLI, c8B6-RLI e c8B6-l22-RLI em CD20 expressando células Raji e GD2O-acetilado expressando células WM266.4 e IMR32. As células foram primeiramente incubadas com ICK RLI, em seguida, com IgG mAb de cabra anti-humano conjugado com PE para anti-CD20 ou com anti-IL15 biotinilado + estreptavidina conjugada com PE com para anti-CD20 e anti-GD2O- acetilado, respectivamente. Finalmente, as amostras foram analisadas em um FACSCalibur. ICK RLI foram comparadas com células Raji para o Rituximab Mab anti-CD20 (MabThera, Roche).

[0203] A Figura 6 mostra a avaliação de citometria de fluxo do ICK RLI anti-CD20 (C2B8-RLI) e anti-GD2O-acetilado (c8B6-RLI e c8B6-122-RLI) em IL15Rα expressando células Kit 225. As células foram primeiramente incubadas com ICK RLI, em seguida, com IgG mAb de cabra anti-humano conjugado com PE. Finalmente, a amostra foi analisada num FACSCalibur.

[0204] Os resultados mostram que as imunocitocinas da invenção ligam-se ao receptor de IL-15 e também ao seu respectivo antígeno tumoral alvo.

Atividade de proliferação das imunocitocinas

[0205] A atividade de proliferação de interleucina-15 das imunocitocinas recém-obtidas foi testada.

[0206] A figura 7 mostra a incorporação de timidina [3H] por Kit 225 e células 32Dβ cultivadas com concentrações crescentes de RLI (■), rIL-15 (♦)c8B6 - RLI (Δ), e c8B6-l22-RLI (O).

[0207] A figura 8 mostra a incorporação de timidina [3H] por células 32Dβ cultivadas com concentrações crescentes de RLI (■), rIL-15 (♦) e C2B8-RLI (Δ).

[0208] Os resultados mostram que a atividade biológica da IL-15 se conserva no contexto de imunocitocinas derivadas de RLI, apesar das imunocitocinas IL15, o que significa que a conjugação de RLI com anticorpos monoclonais permite surpreendentemente a conservação desta atividade da IL-15. Além disso, este efeito intrigante não requer qualquer segundo ligante entre RLI e o anticorpo monoclonal. Surpreendentemente, é de se notar que as imunocitocinas derivadas de RLI apresentam um ganho significativo de atividade biológica, em comparação com a IL-15 livre no contexto βy (cerca de 10 a 100 vezes de aumento).

Capacidade antitumoral da imunocitocina anti-GD2-O- acetilada

[0209] A linha celular neuroblatomas NXS2 murino foi propagada em DMEM (FCS a 10%), sob condições de cultura de tecidos padrões (37° C, 5% de CO2). A linha celular NXS2 NB que expressa GD2-O-Ac foi desenvolvida e caracterizada por LODE et al. (J. Natl., Cancer Inst., Vol.89(21), p:1586-94, 1997).

[0210] Camundongos A/JOlaHsd, com idades de 8 semanas, foram comprados dos laboratórios HARLAN. Ratos foram alojados no biotério do Inserm U892, que é aprovado pela Associação Francesa de Credenciamento de Laboratórios de Cuidados ao Animal e é mantido em conformidade com os regulamentos e normas de Instituto Inserm e do Departamento de Agricultura francês.

[0211] Metástases hepáticas experimentais foram induzidas por injeção na veia da cauda de 1x105 células tumorais NXS2 NB em 200 μl de DMEM (pH 7,4). O tratamento foi iniciado um dia após a inoculação de células tumorais e consistiu em 4 injeções ip de 80 pmol de c8B6-RLI2 ou c8B6 no dia 1, 4, 7 e 11. Os camundongos foram sacrificados 25 dias após o enxerto e o peso do tumor hepático foi avaliado pelo peso úmido do fígado.

[0212] A figura 9 mostra a eficácia de c8B6-RLI2 em metástase do fígado de NXS2. c8B6 (12 μg) ou c8B6-RLI (16 μg) foi administrado ip nos dias 1, 4, 7 e 11. Esquerda: Gráfico representa a média de cada grupo (n=5); barras, SEM. Direita: fotos representativas de fígado, setas indicam algumas metástases.

[0213] Os resultados mostram que os ratos que receberam ICK permanecem livres de metástase do fígado. Assim, e ao contrário do c8B6, ICK pode erradicar o desenvolvimento de metástases do fígado de NXS2, o que significa que a conjugação com RLI a um anticorpo monoclonal aumenta dramaticamente as suas capacidades anti-tumorais.

Capacidade antitumoral do anti-CD20-RLI2 em Modelo Raji:

[0214] As células B de Raji humanas foram cultivadas em meio RPMI1640 suplementado com 10% de soro fetal de vitela, 2 mM de L-glutamina.

[0215] Camundongos SCID CB-17, com 8 semanas de idade, foram comprados do Charles River Breeding Laboratories. Os camundongos foram mantidos em condições livres de patógenos específicos em uma instalação separada usando gaiolas autoclavadas de unidades de micro-isolantes e alimentados com comida sólida irradiada e água esterilizada.

[0216] Para a inoculação, as células Raji foram colhidas na fase log, lavadas e re-suspensas em 2,5x106 células/0,1 ml em solução salina tamponada com fosfato (PBS), antes de serem injetadas por via intravenosa em camundongos, seguida por tratamento ip com imunocitocinas 3 vezes por semana (começando no dia 5) por 3 semanas após a implantação. Os camundongos receberam tratamento em quantidade equimolar, exceto para os grupos “imunocitocina” e “rituximab + RLI”, que receberam metade da dose. Os camundongos foram monitorados diariamente quanto à presença de paralisia de perna traseira e, nesse caso, sacrificados e marcados como mortos.

[0217] A figura 10 mostra a análise de sobrevivência de Kaplan- Meier de camundongos CB17 SCID iv injetados com células Raji (n=5) e tratados em J5-J7-J9; J12-J14-J16; J19-J21-J23 com PBS O; RLI (; 2 μg); Rituximab (+; 12 μg); Rituximab + RLI (•, 6 μg + 1 μg), antiCD20-RLI (▼ ; 8 μg).

[0218] Os resultados mostram que a percentagem de sobrevivência obtida nos camundongos Raji tratados com RLI ou com rituximab foi semelhante e prolonga a sobrevivência de 50% dos camundongos portadores de tumor de 20-27 dias e 28 dias, respectivamente, em relação ao controle PBS.

[0219] Os resultados mostram um aumento de mais da metade da percentagem de sobrevivência de camundongos portadores de tumor para o grupo “Rituximab + RLI”, cujo aumento é significativamente diferente do obtido no grupo RLI (P<0,01 ou menos).

[0220] Finalmente e surpreendentemente, os resultados mostram que o tratamento com imunocitocina anti-CD20 anula totalmente o desenvolvimento do tumor sem a morte do rato no final do experimento (dia 50).

3) Construção de imunocitocinas adicionais Construção de imunocitocinas RLI anti-Her2neu (completa IgG e ScFv) e IL15

[0221] Sequência de codificação para as cadeias leves de IgG 4D5 anti-HER2 murino, cadeias pesadas de IgG 4D5 anti-HER2 murino e scFv anti-HER2 foram gentilmente cedidas pelo Dr. DONDA (Instituto de Bioquímica de Lausanne, Suíça). As imunocitocinas anti-Her2neu IL15 e RLI foram construídas como anteriormente na base das cadeias leves (SEQ ID n° 18) e pesadas (SEQ ID n° 19) de anti HER2Neu do anticorpo anti- Her2neu. Para estas construções, a sequência que codifica a sequência líder de microglobulina beta2 na estrutura com a sequência que codifica as sequências quiméricas de cadeia pesada de IgG foi concebida para ser fundida no 3'term com ou sem um ligante de 22 aminoácidos (SEQ ID n° 16) a IL15 (SEQ ID n° 20 e 21, respectivamente) e a RLI (SEQ ID n° 22 e 23 respectivamente).

[0222] Construções correspondentes à sequência que codifica a sequência líder de beta2 microglobulina na estrutura com a sequência que codifica para fragmento scFv anti-Her2neu fundido no 3'term com ou sem um ligante de 22 aminoácidos a IL15 (SEQ ID n° 24 e 25, respectivamente) e a RLI (SEQ ID n° 26 e 27, respectivamente) foram também concebidas e produzidas. Estas sequências de nucleotídeos foram sintetizadas pela GeneArt e sub-clonadas em plasmídeos pCR3 (Invitrogen).

[0223] As atividades biológicas e de ligação destes compostos são testadas.

Construção de imunocitocinas baseadas em interleucina 15 Preparação do plasmídeo de DNA e Reagente de Transfecção

[0224] Uma PEI de 40 kDa linear foi obtida a partir de Polyscience. Uma solução mãe a 1 mg/mL foi preparada por dissolução do PEI em água com aquecimento, neutralização com NaOH, e esterilização por filtração através de um filtro de 0,22 μm. A solução mãe foi aliquotada e armazenada a -20° C.

[0225] Os plasmídeos de DNA para as transfecções foram purificados utilizando kits de purificação de plasmídeo seguindo o protocolo do fabricante (Macherey-Nagel) e esterilização por filtração através de um filtro de 0,22 μm.

Produção e purificação das imunocitocinas 1- transfecção transiente:

[0226] Células HEK293T gentilmente fornecidas pelo Dr. SCHNEIDER (Instituto de Bioquímica de Lausanne, Suíça) foram inoculadas em um frasco T175 cm2 em meio DMEM-Glutamax 10% SVF a 37° C e 5% de CO2. No dia da transfecção, um complexo de plasmídeo de DNA e PEI foi preparado em NaCl 150 mM estéril. O plasmídeo de DNA diluído em NaCl (1,25 mg/L de volume de cultura) foi misturado com PEI diluído em NaCl (12,5 mg/L de volume de cultura) e incubado durante 10 minutos à temperatura ambiente antes da adição à cultura de células. Para imunocitocina anti- HER2 IgG-RLI ou IL15 uma proporção de 1:2 de plasmídeo de DNA (cadeia pesada:leve) foi usada. As células foram então cultivadas a 37° C durante 4 h. Após este tempo, o meio foi raemovido e DMEN fresco sem SVF foi adicionado. O sobrenadante foi coletado 5 dias após a transfecção.

2- Purificação do sobrenadante:

[0227] Os sobrenadantes recolhidos foram centrifugados a 1000 rpm, primeiramente durante 5 minutos e, posteriormente, a 3000 rpm durante 15 minutos a 4° C, ajustados para 20 mM de fosfato de sódio a pH 8-9, tal como recomendado pelo fabricante, e filtrados através de um filtro de 0,22 μm. O meio condicionado foi purificado por cromatografia de afinidade utilizando uma coluna de proteína A (GE) de acordo com as instruções do fabricante. As proteínas purificadas foram concentradas com unidades de 50 kDa da Amicon (Millipore) para IgG-ICK ou 10 kDa para scFv-ICK. Durante esta etapa, o tampão de eluição foi substituído por PBS. As proteínas foram finalmente analisadas por ELISA e por medição da absorvância a 280 nm. A pureza foi avaliada por electroforese.

Atividade de ligação das imunocitocinas

[0228] A ligação específica do IgG-ICK ou scFv-ICK anti- HER2 foi avaliada por citometria de fluxo em células HER2 positivas para SK-BR-3 utilizando o anticorpo anti-IL15. A capacidade de ICK de se ligar ao receptor da IL-15 sobre as células efetoras foram testadas em Kit225. ICK revestido em células-alvo foram reveladas com um conjugado de IgG mAb de cabra anti-murino (SIGMA-andrich) com FITC ou com um anticorpo de rato anti- IL15 conjugado com FITC (R&D System). As células-alvo (1x105) foram incubadas com cada ICK durante 1h a 4° C, lavadas e depois incubadas com um conjugado de FITC durante 1 hora a 4° C. As células lavadas foram finalmente analisadas em um FACScalibur (Becton Dickinson).

[0229] A Figura 3 mostra a avaliação de citometria de fluxo de anti-HER2 (trastuzumab-IL15 e trastuzumab-l22-IL15) em HER2 expressando células SKBR3.

[0230] A Figura 5 mostra a avaliação de citometria de fluxo do ICK Trastuzumab-RLI em HER2 expressando células SKBR3. ICK anti-HER2 foi comparado em células SKBR3 para o Trastuzumab (Herceptin®, Genentech)

[0231] Os resultados demonstraram a capacidade do RLI- trastuzumab de ICK de revestir as linhas celulares tumorais que expressam a TAA relevante.

Atividade de proliferação das imunocitocinas

[0232] A atividade de proliferação de interleucina-15 de fusão de IL-15 e Trastuzumab ou fragmentos scFv anti-HER2 foi testada em células Kit 225 e 32Dβ medindo a incorporação de timidina [3H] de acordo com o método descrito anteriormente.

[0233] A figura 11 mostra a incorporação de timidina [3H] por células Kit 225 e 32Dβ cultivadas com concentrações crescentes de Trastuzumab-l22-IL-15 (O), Trastuzumab-IL-15 (Δ) e rIL-15 (■).

[0234] A figura 12 mostra a incorporação de timidina [3H] por células Kit 225 e 32Dβ cultivadas com concentrações crescentes de Trastuzumab-RLI (Δ), RLI (■) e rIL-15 (♦).

[0235] Os resultados mostram que a atividade biológica da IL-15 é diminuída drasticamente em células αβY no contexto de imunocitocinas, o que significa que a conjugação de IL-15 com o anticorpo monoclonal induz uma perda de atividade. Além disso, esta perda é mais importante na ausência de ligante entre as duas porções. Em células βy, a conjugação anula completamente a atividade biológica de IL-15 com ou sem ligante.

[0236] No contexto de imunocitocinas derivadas de RLI, apesar de imunocitocinas IL15, os resultados mostram que a atividade biológica da IL-15 é conservada, o que significa que a conjugação de RLI com anticorpos monoclonais permite, surpreendentemente, a conservação desta atividade da IL-15. Além disso, este efeito intrigante não requer qualquer segundo ligante entre RLI e o anticorpo monoclonal.

[0237] Ainda surpreendentemente, os resultados mostram que as imunocitocinas trastuzumab derivadas de RLI apresentam um ganho significativo de atividade biológica, em comparação com a IL-15 livre no contexto βy (cerca de 10 a 100 vezes de aumento).

[0238] Os resultados demonstraram ainda que, no contexto de imunocitocinas scFv derivadas de RLI, apesar das imunocitocinas IL15, a atividade biológica da IL-15 também é conservada, significando que a conjugação de RLI com um fragmento scFv permite surpreendentemente a conservação desta atividade de IL-15 (dados não mostrados). Mais uma vez, este efeito intrigante não requer qualquer segundo ligante entre RLI e o fragmento de scFv (dados não mostrados).

Claims (9)

1. Imunocitocina caracterizada por compreender: a) um conjugado, e b) um anticorpo ligado diretamente ou indiretamente por covalência ao dito conjugado, sendo que o dito conjugado compreende: (i) um polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácidos da interleucina 15 de acordo com a SEQ ID NO: 3, e (ii) um polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácidos do domínio sushi da IL-15Rα de acordo com a SEQ ID NO: 12.

2. Imunocitocina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por: a) os polipeptídeos (i) e (ii) do conjugado serem covalentemente ligados em uma proteína de fusão; e b) o dito conjugado e o anticorpo serem covalentemente ligados em uma proteína de fusão.

3. Imunocitocina, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada por a sequência de aminoácidos do conjugado e a sequência de aminoácidos do anticorpo não serem separadas por qualquer sequência de aminoácidos ligante.

4. Imunocitocina, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada por a sequência de aminoácidos do conjugado e a sequência de aminoácidos do anticorpo serem separadas por uma segunda sequência de aminoácidos ligante, em que a segunda sequência de aminoácidos ligante é selecionada dentre SEQ ID NO: 16 (SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSG) e SEQ ID NO: 28 (AAGGGSGGGSGGGGSGGGGSAA).

5. Imunocitocina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 4, caracterizada por o dito conjugado compreender a sequência de aminoácidos da interleucina 15 (SEQ ID NO: 3) em uma posição C-terminal em relação à sequência de aminoácidos do domínio sushi da IL-15Rα (SEQ ID NO: 12).

6. Imunocitocina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 5, caracterizada por a sequência de aminoácidos da interleucina 15 e a sequência de aminoácidos do domínio sushi da IL-15Rα serem separados por uma primeira sequência de aminoácidos ligante, em que a primeira sequência de aminoácidos ligante é selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 13 (SGGSGGGGSGGGSGGGGSLQ), SEQ ID NO: 14 (SGGSGGGGSGGGSGGGGSGG) e SEQ ID NO: 15 (SGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQ).

7. Imunocitocina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 6, caracterizada por o anticorpo ser direcionado contra um antígeno selecionado do grupo relacionados à neovascularização tumoral ou a matriz extracelular tumoral e antígenos tumorais.

8. Imunocitocina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 7, caracterizada por a sequência de aminoácidos do conjugado estar em uma posição C-terminal em relação à sequência de aminoácidos do anticorpo ou fragmento do mesmo.

9. Composição farmacêutica caracterizada por compreender a imunocitocina conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, eventualmente associada a um veículo farmaceuticamente aceitável.