MD3280727T2

MD3280727T2 - Proteine de fuziune ale receptorului de tip I și de tip II cu un singur braț și utilizările acestora

Info

Publication number: MD3280727T2
Application number: MDE20180158T
Authority: MD
Inventors: Ravindra Kumar; Asya Grinberg; Dianne S Sako
Original assignee: Acceleron Pharma Inc
Priority date: 2015-04-06
Filing date: 2016-04-06
Publication date: 2021-06-30
Also published as: US20220315642A1; CN107849114B; LT3280727T; CN107849114A; US20160289298A1; EP3865505A1; US10358476B2; EP3280727B1; US12338273B2; CN113683709A; US11208460B2; JP6810702B2; WO2016164501A1; PL3280727T3; SMT202100246T1; KR20170141215A; ES2864850T3; CA2981793A1; AU2021200906A1; HUE054180T2

Abstract

În anumite aspecte, dezvăluirea redă complecşi polipeptidici heteromerici cu un singur braţ solubili care cuprind un domeniu extracelular al unui receptor de serină/treonină kinază tip I al familiei TGF-beta sau un domeniu extracelular al unui receptor de serină/treonină kinază tip II al familiei TGF-beta. În unele modalităţi de realizare, dezvăluirea redă complecşi polipeptidici cu un singur braţ solubili care cuprind un domeniu extracelular al unui receptor tip II selectat dintre: ActRIIA, ActRIIB, TGFBRII, BMPRII, şi MISRII. În unele modalităţi de realizare, dezvăluirea redă complecşi polipeptidici cu un singur braţ solubili care cuprind un domeniu extracelular al unui receptor tip I selectat dintre : ALK1, ALK2, ALK3, ALK4, ALK5, ALK6, şi ALK7. Opţional complexul solubil este un heterodimer. În anumite aspecte, astfel de complecşi polipeptidici solubili se pot utiliza pentru tratamentul sau prevenirea a diferite afecţiuni asociate cu TGF-beta, incluzând fără limitare boli sau tulburări asociate cu, de exemplu, cancer, muşchi, os, grăsime, celule roşii din sânge, metabolism, fibroză şi alte ţesuturi care sunt afectate de unul sau mai mulţi liganzi ai superfamiliei TGF-beta.

Description

BAZELE INVENŢIEI

Superfamilia factorului de creştere transformator-beta (TGF-beta) conţine o varietate de factori de creştere care împărtăşesc elemente de secvenţă şi motive structurale comune Se cunoaşte că aceste proteine exercită efecte biologice asupra unei mari varietăţi de tipuri de celule atât la vertebrate, cât şi la nevertebrate. Membrii superfamiliei îndeplinesc funcţii importante în timpul dezvoltării embrionare în formarea tiparului şi specificarea ţesuturilor şi pot influenţa o varietate de procese de diferenţiere, inclusiv adipogeneza, miogeneza, condrogeneza, cardiogeneza, hematopoieza, neurogeneza şi diferenţierea celulelor epiteliale. Superfamilia este împărţită în două clade filogenetice generale: membrii evoluaţi mai recent ai superfamiliei, care includ TGF-beta, activine şi nodale şi clada proteinelor mai îndepărtate ale superfamiliei, care include un număr de BMP-uri şi GDF-uri. Hinck (2012) FEBS Letters 586:1860-1870. Membrii superfamiliei TGF-beta au efecte biologice diverse, adesea complementare. Prin manipularea activităţii unui membru al superfamiliei TGF-beta, este adesea posibil să se producă modificări fiziologice semnificative ale unui organism. De exemplu, rasele de bovine Piemontese şi Belgian Blue poartă o mutaţie de pierdere a funcţiei în gena GDF8 (numită de asemenea şi miostatină) care determină o creştere semnificativă a masei musculare. Grobet şi colab. (1997) Nat Genet, 17(1):71-4. Mai mult, la oameni, alelele inactive ale GDF8 sunt asociate cu o masă musculară crescută şi, se pare, cu o forţă excepţională. Schuelke şi colab. (2004) N Engl J Med, 350:2682-8.

Modificări ale muşchiului, osului, grăsimii, celulelor roşii din sânge şi ale altor ţesuturi pot fi realizate prin îmbunătăţirea sau inhibarea semnalizării (de exemplu, SMAD 1, 2, 3, 5 şi/sau 8) care este mediată de liganzii superfamilie TGF-beta. Astfel, este nevoie de agenţi care să regleze activitatea diferiţilor liganzi ai superfamiliei TGF-beta.

REZUMATUL INVENŢIEI

În parte, dezvăluirea redă complecşi heteromultimerici care cuprind o singură polipeptidă a receptorului de serin/treonin kinază de tip I sau tip II a superfamiliei de TGF-beta (de exemplu, o polipeptidă ALK1, ALK2, ALK3, ALK4, ALK5, ALK6, ALK7, ActRIIA, ActRIIB, TGFBRII, BMPRII, sau MISRII), inclusiv fragmente şi variante ale acestora. Aceşti construcţi pot fi denumiţi aici drept complecşi polipeptidici "cu un singur braţ". Opţional, complecşii polipeptidici cu un singur braţ dezvăluiţi aici (de exemplu, un complex polipeptidic ActRIIB cu un singur braţ, cum ar fi un heterodimer ActRIIB-Fc:Fc) au specificităţi/profiluri diferite de legare a ligandului comparativ cu un complex homodimeric corespunzător (de exemplu, un homodimer ActRIIB, cum ar fi un ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc). Complecşii polipeptidici heteromultimerici care cuprind un singur domeniu al unei polipeptide a receptorului de serină/treonin kinază tip I sau tip II a superfamiliei de TGF-beta, prezintă noi proprietăţi, aşa cum este arătat în Exemplele de aici.

Structurile heteromultimerice includ, de exemplu, heterodimeri, heterotrimeri şi complecşi de ordin superior. De preferinţă, polipeptidele receptorului de tip I şi de tip II al superfamiliei de TGF-beta, aşa cum este descris aici, cuprind un domeniu de legare a ligandului al receptorului, de exemplu, un domeniu extracelular al unui receptor de tip I sau de tip II al superfamiliei de TGF-beta. În consecinţă, în anumite aspecte, complecşii proteici descrişi aici cuprind un domeniu extracelular al unui receptor de tip II al superfamiliei de TGF-beta selectat dintre: ActRIIA, ActRIIB, TGFBRII, BMPRII, şi MISRII, precum şi trunchieri şi variante ale acestora, sau un domeniu extracelular al unui receptor tip I al superfamiliei TGF-beta de selectat dintre: ALK1, ALK2, ALK3, ALK4, ALK5, ALK6, şi ALK7, precum şi trunchieri şi variante ale acestora. De preferinţă, polipeptidele de tip I şi de tip II ale superfamiliei de TGF-beta aşa cum este descris aici, precum şi complecşii de proteine care le cuprind, sunt solubili. În anumite aspecte, complecşii heteromultimeri conform dezvăluirii se leagă de unul sau mai mulţi liganzi ai superfamiliei de TGF-beta (de exemplu, BMP2, BMP2/7, BMP3, BMP4, BMP4/7, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8a, BMP8b, BMP9, BMP10, GDF3, GDF5, GDF6/BMP13, GDF7, GDF8, GDF9b/BMP15, GDF11/BMP11, GDF15/MIC1, TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, activină A, activină B, activină C, activină E, activină AB, activină AC, activină AE, activină BC, activină BE, nodal, factor neurotrofic derivat de celule gliale (GDNF), neurturina, artemina, persefina, substanţă inhibitoare de Mullerian (MIS), şi Lefty). Opţional, complecşii proteici din dezvăluire se leagă la unul sau mai mulţi dintre aceşti liganzi cu un KD mai mic sau egal cu 10-8, 10-9, 10-10, 10-11, sau 10-12. În general, complecşii heteromultimeri conform dezvăluirii antagonizează (inhibă) una sau mai multe activităţi ale cel puţin unui ligand al superfamiliei de TGF-beta şi astfel de modificări ale activităţii pot fi măsurate folosind diferite analize cunoscute în domeniu, inclusiv, de exemplu, analiză pe bază de celule aşa cum este descris aici. De preferinţă, complecşii proteici conform dezvăluirii prezintă un timp de înjumătăţire în ser de cel puţin 4, 6, 12, 24, 36, 48 sau 72 de ore la un mamifer (de exemplu, un şoarece sau un om). Opţional, complecşii proteici din dezvăluire pot prezenta un timp de înjumătăţire în ser de cel puţin 6, 8, 10, 12, 14, 20, 25 sau 30 de zile la un mamifer (de exemplu, un şoarece sau un om).

În anumite aspecte, complecşii proteici descrişi aici cuprind o primă polipeptidă asociată covalent sau necovalent cu o a doua polipeptidă în care prima polipeptidă cuprinde secvenţa de aminoacizi a unei polipeptide a receptorului de tip I sau tip II a superfamiliei TGF-beta şi secvenţa de aminoacizi a unui prim membru al unei perechi de interacţiune şi a doua polipeptidă cuprinde un al doilea membru al perechii de interacţiune şi nu conţine o secvenţă de aminoacizi a unei polipeptide a receptorului de tip I sau de tip II a superfamiliei TGF-beta. Opţional, a doua polipeptidă cuprinde, pe lângă cel de-al doilea membru al perechii de interacţiune, o altă secvenţă de polipeptidă care nu este o polipeptidă a receptorului de tip I sau de tip II a superfamiliei TGF-beta şi care poate cuprinde opţional nu mai mult de 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 sau 500 aminoacizi. Opţional, polipeptida receptorului de tip I sau tip II a superfamiliei TGF-beta este conectată direct la primul membru al perechii de interacţiune, sau o secvenţă care intervine, cum ar fi un linker, poate fi poziţionată între secvenţa de aminoacizi a polipeptidei receptorului tip I sau tip II superfamiliei TGF-beta şi secvenţa de aminoacizi a primului membru al perechii de interacţiune. Exemple de linkeri includ, dar nu se limitează la, secvenţele TGGG, TGGGG, SGGGG, GGGGS, şi GGG.

Perechile de interacţiune descrise aici sunt concepute pentru a promova dimerizarea sau a forma multimeri de ordin superior. În unele modalităţi de realizare, perechea de interacţiune poate fi oricare dintre două secvenţe polipeptidice care interacţionează pentru a forma un complex, în special un complex heterodimeric, deşi modalităţile de realizare operative pot utiliza şi o pereche de interacţiune care formează un complex homodimeric. Primul şi al doilea membru al perechii de interacţiune pot fi o pereche asimetrică, ceea ce înseamnă că membrii perechii se asociază preferenţial unul cu celălalt, mai degrabă decât să se auto-asocieze. În consecinţă, primul şi al doilea membru al unei perechi de interacţiune asimetrică se pot asocia pentru a forma un complex heterodimeric. Alternativ, perechea de interacţiune poate fi neghidată, ceea ce înseamnă că membrii perechii se pot asocia unul cu celălalt sau se pot auto-asocia substanţial fără preferinţă şi, prin urmare, pot avea aceleaşi sau diferite secvenţe de aminoacizi. În consecinţă, primul şi al doilea membru al unei perechi de interacţiune neghidate se pot asocia pentru a forma un complex homodimeric sau un complex heterodimeric. Opţional, primul membru al perechii de interacţiune (de exemplu, o pereche asimetrică sau o pereche de interacţiune neghidată) se asociază covalent cu al doilea membru al perechii de interacţiune. Opţional, primul membru al perechii de interacţiune (de exemplu, o pereche asimetrică sau o pereche de interacţiune neghidată) se asociază necovalent cu al doilea membru al perechii de interacţiune.

Proteinele de fuziune Fc şi anticorpii tradiţional sunt exemple de perechi de interacţiune neghidate, în timp ce o varietate de domenii Fc modificate au fost concepute ca perechi de interacţiune asimetrice. Prin urmare, un prim membru şi/sau un al doilea membru al unei perechi de interacţiune descrise aici poate cuprinde un domeniu constant al unei imunoglobuline, incluzând, de exemplu, porţiunea Fc a unei imunoglobuline. Opţional, un prim membru al unei perechi de interacţiune poate cuprinde o secvenţă de aminoacizi care este derivată dintr-un domeniu Fc al unei imunoglobuline IgG1, IgG2, IgG3, sau IgG4. De exemplu, primul membru al unei perechi de interacţiune poate cuprinde, consta în esenţă sau consta dintr-o secvenţă de aminoacizi care este cel puţin 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% sau 100% identică cu oricare dintre SEQ ID NO: 200-214. Opţional, un al doilea membru al unei perechi de interacţiune poate cuprinde o secvenţă de aminoacizi care este derivată dintr-un domeniu Fc al unei IgG1, IgG2, IgG3, sau IgG4. De exemplu, al doilea membru al unei perechi de interacţiune poate cuprinde, consta în esenţă sau consta dintr-o secvenţă de aminoacizi care este cel puţin 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% sau 100% identică cu oricare dintre SEQ ID NO: 200-214. În unele modalităţi de realizare, un prim membru şi un al doilea membru al unei perechi de interacţiune cuprind domenii Fc derivate din aceeaşi clasă şi subtip de imunoglobulină. În alte modalităţi de realizare, un prim membru şi un al doilea membru al unei perechi de interacţiune cuprind domenii Fc derivate din clase sau subtipuri de imunoglobulină diferite. Opţional, un prim membru şi/sau un al doilea membru al unei perechi de interacţiune (de exemplu, o pereche asimetrică sau o pereche de interacţiune neghidată) cuprind un domeniu constant modificat al unei imunoglobuline, incluzând, de exemplu, o porţiune Fc modificată a unei imunoglobuline. De exemplu, complecşii proteici conform dezvăluirii pot cuprinde o primă porţiune Fc a unei IgG cuprinzând o secvenţă de aminoacizi care este de cel puţin 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, sau 99% identică cu o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul: SEQ ID NO: 200-214 şi o a doua porţiune Fc a unei IgG, care poate fi identică sau diferită de secvenţa de aminoacizi a primei porţiuni Fc modificate a IgG, cuprinzând o secvenţă de aminoacizi care este de cel puţin 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% sau 99% identică cu o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul: SEQ ID NO: 200-214.

În unele modalităţi de realizare, dezvăluirea redă complecşi polipeptidici heteromerici care cuprind o singură polipeptidă a receptorului de tip I sau tip II a superfamiliei TGF-beta, în care polipeptida receptorului superfamiliei TGF-beta este derivată dintr-un receptor ActRIIA. De exemplu, polipeptidele ActRIIA pot cuprinde, consta în esenţă sau consta dintr-o secvenţă de aminoacizi care este cel puţin 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% sau 100% identică cu o secvenţă de ActRIIA dezvăluită aici (de exemplu, SEQ ID NO: 9, 10, 11, 101, 103, 401, şi 402). Opţional, polipeptidele ActRIIA pot cuprinde, consta în esenţă sau consta dintr-o secvenţă de aminoacizi care este cel puţin 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% sau 100% identică cu o polipeptidă care a) începe de la oricare dintre aminoacizii 21-30 (de exemplu, resturile de aminoacizi 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 sau 30) SEQ ID NO: 9 şi b) se termină la oricare dintre aminoacizii 110-135 (de exemplu, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134 sau 135) din SEQ ID NO: 9. Opţional, polipeptidele ActRIIA din dezvăluire pot fi proteine de fuziune care cuprind în plus una sau mai multe porţiuni (domenii) care sunt heterologe cu ActRIIA. De exemplu, o polipeptidă ActRIIA poate fi fuzionată cu o polipeptidă heterologă care cuprinde un domeniu de multimerizare, opţional cu un domeniu linker poziţionat între polipeptida ActRIIA şi polipeptida heterologă (de exemplu, SEQ ID NO: 101, 103, 401, şi 402). În unele modalităţi de realizare, domeniile de multimerizare descrise aici cuprind o componentă a unei perechi de interacţiune. Complecşii heteromerici care cuprind o polipeptidă ActRIIA nu cuprind o altă polipeptidă a receptorului de tip I sau de tip II a superfamiliei de TGF-beta, dar pot conţine polipeptide suplimentare care nu sunt polipeptide ale receptorului de tip I sau de tip II a superfamiliei TGF-beta.

În unele modalităţi de realizare, dezvăluirea redă complecşi polipeptidici heteromerici care cuprind o polipeptidă a receptorului de tip I sau tip II a superfamiliei TGF-beta, în care polipeptida receptorului superfamiliei TGF-beta este derivată dintr-un receptor de ActRIIB. De exemplu, polipeptidele ActRIIB pot cuprinde, consta în esenţă sau consta dintr-o secvenţă de aminoacizi care este cel puţin 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% sau 100% identică cu o secvenţă ActRIIB dezvăluită aici (de exemplu, SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 104, 106, 403, şi 404). Opţional, polipeptidele ActRIIB pot cuprinde, consta în esenţă sau consta dintr-o secvenţă de aminoacizi care este cel puţin 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% sau 100% identică cu o polipeptidă care a) începe la oricare dintre aminoacizii 20-29 (de exemplu, resturile de aminoacizi 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 sau 29) SEQ ID NO: 1 şi b) se termină la oricare dintre aminoacizii 109-134 (de exemplu, resturile de aminoacizi 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133 sau 134 ai SEQ ID NO. 1. Opţional, polipeptidele ActRIIB din dezvăluire pot fi proteine de fuziune care cuprind în plus una sau mai multe porţiuni (domenii) care sunt heterologe cu ActRIIB. De exemplu, o polipeptidă ActRIIB poate fi fuzionată cu o polipeptidă heterologă care cuprinde un domeniu de multimerizare, opţional cu un domeniu linker poziţionat între polipeptida ActRIIB şi polipeptida heterologă (de exemplu, SEQ ID NO: 104, 106, 403, şi 404).

În unele modalităţi de realizare, domeniile de multimerizare descrise aici cuprind o componentă a unei perechi de interacţiune. Complecşii heteromerici care cuprind o polipeptidă ActRIIB nu cuprind o altă polipeptidă a receptorului de tip I sau de tip II a superfamiliei de TGF-beta, dar pot conţine polipeptide suplimentare care nu sunt polipeptide ale receptorului de tip I sau de tip II a superfamiliei de TGF-beta.

În unele modalităţi de realizare, dezvăluirea redă complecşi polipeptidici heteromerici care cuprind o polipeptidă a receptorului de tip I sau tip II a superfamiliei TGF-beta, în care polipeptida receptorului superfamiliei TGF-beta este derivată dintr-un receptor TGFBRII. De exemplu, polipeptidele TGFBRII pot cuprinde, consta în esenţă sau consta dintr-o secvenţă de aminoacizi care este cel puţin 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% sau 100% identică cu o secvenţă TGFBRII dezvăluită aici (de exemplu, SEQ ID NO: 42, 43, 67, 68, 113, 115, 409, şi 410). Opţional, polipeptidele TGFBRII pot cuprinde, consta în esenţă sau consta dintr-o secvenţă de aminoacizi care este cel puţin 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% sau 100% identică cu o polipeptidă care a) începe la oricare dintre aminoacizii 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 sau 51 ai SEQ ID NO: 42, şi b) se termină la oricare dintre aminoacizii 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165 sau 166 ai SEQ ID NO: 42. Opţional, polipeptidele TGFBRII pot cuprinde, consta în esenţă din sau consta dintr-o secvenţă de aminoacizi care este cel puţin 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% sau 100% identică cu o polipeptidă care a) începe la oricare de aminoacizii 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 sau 44 ai SEQ ID NO: 67, şi b) se termină la oricare dintre aminoacizii 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190 sau 191 ai SEQ ID NO: 67. Opţional, polipeptidele TGFBRII din dezvăluire pot să fie proteine de fuziune care cuprind în plus una sau mai multe porţiuni (domenii) care sunt heterologe cu TGFBRII. De exemplu, o polipeptidă TGFBRII poate fi fuzionată cu o polipeptidă heterologă care cuprinde un domeniu de multimerizare, opţional cu un domeniu linker poziţionat între polipeptida TGFBRII şi polipeptida heterologă (de exemplu, SEQ ID NO: 113, 115, 409, şi 410). În unele modalităţi de realizare, domeniile de multimerizare descrise aici cuprind o componentă a unei perechi de interacţiune. Complecşii heteromerici care cuprind o polipeptidă TGFBRII nu cuprind o altă polipeptidă a receptorului de tip I sau de tip II a superfamiliei TGF-beta, dar pot conţine polipeptide suplimentare care nu sunt polipeptide ale receptorului de tip I sau de tip II a superfamiliei TGF-beta.

În unele modalităţi de realizare, dezvăluirea redă complecşi polipeptidici heteromerici care cuprind o polipeptidă a receptorului de tip I sau tip II a superfamiliei TGF-beta, în care polipeptida receptorului superfamiliei TGF-beta este derivată de la un receptor de BMPRII. De exemplu, polipeptidele BMPRII pot cuprinde, consta în esenţă sau consta dintr-o secvenţă de aminoacizi care este cel puţin 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% sau 100% identică cu o secvenţă BMPRII dezvăluită aici (de exemplu, SEQ ID NO: 46, 47, 71, 72, 107, 109, 405, şi 406). Opţional, polipeptidele BMPRII pot cuprinde, consta în esenţă sau consta dintr-o secvenţă de aminoacizi care este cel puţin 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% sau 100% identică cu o polipeptidă care a) începe de la oricare dintre aminoacizii 27-34 (de exemplu, resturile de aminoacizi 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 şi 34) SEQ ID NO: 46 sau 71 şi b) se termină la oricare dintre aminoacizii 123-150 (de exemplu, resturile de aminoacizi 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, şi 150) ai SEQ ID NO: 46 sau 71. Opţional, polipeptidele BMPRII din dezvăluire pot fi proteine de fuziune care cuprind în plus una sau mai multe porţiuni (domenii) care sunt heterologe cu BMPRII. De exemplu, o polipeptidă BMPRII poate fi fuzionată cu o polipeptidă heterologă care cuprinde un domeniu de multimerizare, opţional cu un domeniu linker poziţionat între polipeptida BMPRII şi polipeptida heterologă (de exemplu, SEQ ID NO: 107, 109, 405 şi 406). Complecşii heteromerici care cuprind o polipeptidă BMPRII nu cuprind o altă polipeptidă a receptorului de tip I sau tip II a superfamiliei TGF-beta, dar pot conţine polipeptide suplimentare care nu sunt polipeptide ale receptorului de tip I sau de tip II a superfamiliei TGF-beta.

În unele modalităţi de realizare, dezvăluirea redă complecşi polipeptidici heteromerici care cuprind o polipeptidă a receptorului tip I sau tip II, a superfamiliei TGF-beta în care polipeptida receptorului superfamiliei TGF-beta este derivată dintr-un receptor MISRII. De exemplu, polipeptidele MISRII pot cuprinde, consta în esenţă sau consta dintr-o secvenţă de aminoacizi care este cel puţin 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% sau 100% identică la o secvenţă MISRII dezvăluită aici (de exemplu, SEQ ID NO: 50, 51, 75, 76, 79, 80, 110, 112, 407, şi 408). Opţional, polipeptidele MISRII pot cuprinde, consta în esenţă sau consta dintr-o secvenţă de aminoacizi care este cel puţin 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% sau 100% identică cu o polipeptidă care a) începe la oricare dintre aminoacizii 17-24 (de exemplu, resturile de aminoacizi 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 şi 24) SEQ ID NO: 50, 75 sau 79, şi b) se termină la oricare dintre aminoacizii 116-149 (de exemplu, resturile de aminoacizi 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148 şi 149) ai SEQ ID NO. 50, 75 sau 79. Opţional, Polipeptidele MISRII din dezvăluire pot fi proteine de fuziune care cuprind în plus una sau mai multe porţiuni (domenii) care sunt heterologe cu MISRII. De exemplu, o polipeptidă MISRII poate fi fuzionată cu o polipeptidă heterologă care cuprinde un domeniu de multimerizare, opţional cu un domeniu linker poziţionat între polipeptida MISRII şi polipeptida heterologă (de exemplu, SEQ ID NO: 110, 112, 407, şi 408). În unele modalităţi de realizare, domeniile de multimerizare descrise aici cuprind o componentă a unei perechi de interacţiune. Complecşii heteromerici care cuprind o polipeptidă MISRII nu cuprind o altă polipeptidă a receptorului de tip I sau de tip II a superfamiliei TGF-beta, dar pot conţine polipeptide suplimentare care nu sunt polipeptide ale receptorului de tip I sau de tip II a superfamiliei TGF-beta.

În unele modalităţi de realizare, dezvăluirea redă complecşi polipeptidici heteromerici care cuprind o polipeptidă a receptorului tip I sau tip II a superfamiliei TGF-beta, în care polipeptida receptorului superfamiliei TGF-beta este derivată dintr-un receptor ALK1. De exemplu, polipeptidele ALK1 pot cuprinde, consta în esenţă sau consta dintr-o secvenţă de aminoacizi care este cel puţin 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% sau 100% identică la o secvenţă ALK1 dezvăluită aici (de exemplu, SEQ ID NO: 14, 15, 116, 118, 411, şi 412). Opţional, polipeptidele ALK1 pot cuprinde, consta în esenţă sau consta dintr-o secvenţă de aminoacizi care este cel puţin 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% sau 100% identică cu o polipeptidă care a) începe la oricare dintre aminoacizii de 22-34 (de exemplu, resturile de aminoacizi 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 şi 34) SEQ ID NO: 14 şi b) se termină la oricare dintre aminoacizii 95-118 (de exemplu, resturile de aminoacizi 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117 şi 118) ai SEQ ID NO: 14. Opţional, polipeptidele ALK1 din dezvăluire pot fi proteine de fuziune care cuprind în plus una sau mai multe porţiuni (domenii) care sunt heterologe cu ALK1. De exemplu, o polipeptidă ALK1 poate fi fuzionată cu o polipeptidă heterologă care cuprinde un domeniu de multimerizare, opţional cu un domeniu linker poziţionat între polipeptida ALK1 şi polipeptida heterologă (de exemplu, SEQ ID NO: 116, 118, 411 şi 412). Complecşii heteromerici care cuprind o polipeptidă ALK1 nu cuprind o altă polipeptidă a receptorului de tip I sau de tip II a superfamiliei TGF-beta, dar pot conţine polipeptide suplimentare care nu sunt polipeptide ale receptorului de tip I sau de tip II a superfamiliei TGF-beta.

În unele modalităţi de realizare, dezvăluirea redă complecşi polipeptidici heteromerici care cuprind o polipeptidă a receptorului de tip I sau tip II a superfamiliei TGF-beta, în care polipeptida receptorului superfamiliei TGF-beta este derivată dintr-un receptor ALK2. De exemplu, polipeptidele ALK2 pot cuprinde, consta în esenţă sau consta dintr-o secvenţă de aminoacizi care este cel puţin 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% sau 100% identică la o secvenţă ALK2 dezvăluită aici (de exemplu, SEQ ID NO: 18, 19, 119, 121, 413, şi 414). Opţional, polipeptidele ALK2 pot cuprinde, consta în esenţă din, sau consta dintr-o secvenţă de aminoacizi care este cel puţin 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% sau 100% identică cu o polipeptidă care a) începe la oricare dintre aminoacizii 21-35 (de exemplu, resturile de aminoacizi 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, şi 35) SEQ ID NO: 18, şi b) se termină la oricare dintre aminoacizii 99-123 (de exemplu, resturile de aminoacizi 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, şi 123) ai SEQ ID NO: 18. Opţional, polipeptidele ALK2 din dezvăluire pot fi proteine de fuziune care cuprind în plus una sau mai multe porţiuni (domenii) care sunt heterologe cu ALK2. De exemplu, o polipeptidă ALK2 poate fi fuzionată la o polipeptidă heterologă care cuprinde un domeniu de multimerizare, opţional cu un domeniu linker poziţionat între polipeptida ALK2 şi polipeptida heterologă (de exemplu, SEQ ID NO: 119, 121, 413, şi 414). Complecşii heteromerici care cuprind o polipeptidă ALK2 nu cuprind o altă polipeptidă a receptorului tip I sau tip II a superfamiliei TGF-beta dar pot conţine polipeptide suplimentare care nu sunt polipeptide ale receptorului tip I sau tip II a superfamiliei TGF-beta.

În unele modalităţi de realizare, dezvăluirea redă complecşi polipeptidici heteromerici care cuprind o polipeptidă a receptorului tip I sau tip II a superfamiliei TGF-beta, în care polipeptida receptorului superfamiliei TGF-beta este derivată de la un receptor de ALK3. De exemplu, polipeptidele ALK3 pot cuprinde, consta în esenţă din, sau consta dintr-o secvenţă de aminoacizi care este cel puţin 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% sau 100% identică cu o secvenţă de ALK3 dezvăluită aici (de exemplu, SEQ ID NO: 22, 23, 122, 124, 415, şi 416). Opţional, polipeptidele ALK3 pot cuprinde, consta în esenţă din, sau consta dintr-o secvenţă de aminoacizi care este cel puţin 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% sau 100% identică cu o polipeptidă care a) începe la oricare dintre aminoacizii 24-61 (de exemplu, resturile de aminoacizi 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, şi 61) SEQ ID NO: 22, şi b) se termină la oricare dintre aminoacizii 130-152 (de exemplu, resturile de aminoacizi 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, şi 152) ai SEQ ID NO: 22. Opţional, polipeptidele ALK3 din dezvăluire pot fi proteine de fuziune care cuprind în plus una sau mai multe porţiuni (domenii) care sunt heterologe cu ALK3. De exemplu, o polipeptidă ALK3 poate fi fuzionată la o polipeptidă heterologă care cuprinde un domeniu de multimerizare, opţional cu un domeniu linker poziţionat între polipeptida ALK3 şi polipeptida heterologă (de exemplu, SEQ ID NO: 122, 124, 415, şi 416). Complecşii heteromerici care cuprind o polipeptidă ALK3 nu cuprind o altă polipeptidă a receptorului tip I sau tip II a superfamiliei TGF-beta dar pot conţine polipeptide suplimentare care nu sunt polipeptide ale a receptorului tip I sau tip II a superfamiliei TGF-beta.

În unele modalităţi de realizare, dezvăluirea redă complecşi polipeptidici heteromerici care cuprind o polipeptidă a receptorului tip I sau tip II a superfamiliei TGF-beta, în care polipeptida receptorului superfamiliei TGF-beta este derivată de la un receptor de ALK4. De exemplu, ALK4 polipeptidele pot cuprinde, consta în esenţă din, sau consta dintr-o secvenţă de aminoacizi care este cel puţin 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% sau 100% identică cu o secvenţă de ALK4 dezvăluită aici (de exemplu, SEQ ID NO: 26, 27, 83, 84, 125, 127, 417, şi 418). Opţional, polipeptidele ALK4 pot cuprinde, consta în esenţă din, sau consta dintr-o secvenţă de aminoacizi care este cel puţin 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% sau 100% identică cu o polipeptidă care a) începe la oricare dintre aminoacizii 23-34 (de exemplu, resturile de aminoacizi 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34) SEQ ID NO: 26 sau 83, şi b) se termină la oricare dintre aminoacizii 101-126 (de exemplu, resturile de aminoacizi 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, şi 126) ai SEQ ID NO: 26 sau 83. Opţional, polipeptidele ALK4 din dezvăluire pot fi proteine de fuziune care cuprind în plus una sau mai multe porţiuni (domenii) care sunt heterologe cu ALK4. De exemplu, o polipeptidă ALK4 poate fi fuzionată la o polipeptidă heterologă care cuprinde un domeniu de multimerizare, opţional cu un domeniu linker poziţionat între polipeptida ALK4 şi polipeptida heterologă (de exemplu, SEQ ID NO: 125, 127, 417, şi 418). Complecşii heteromerici care cuprind o polipeptidă ALK4 nu cuprind o altă polipeptidă a receptorului tip I sau tip II a superfamiliei TGF-beta dar pot conţine polipeptide suplimentare care nu sunt polipeptide ale receptorului tip I sau tip II a superfamiliei TGF-beta.

În unele modalităţi de realizare, dezvăluirea redă complecşi polipeptidici heteromerici care cuprind o polipeptidă a receptorului tip I sau tip II a superfamiliei TGF-beta, în care polipeptida receptorului superfamiliei TGF-beta este derivată de la un receptor de ALK5. De exemplu, polipeptidele ALK5 pot cuprinde, consta în esenţă din, sau consta dintr-o secvenţă de aminoacizi care este cel puţin 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% sau 100% identică cu o secvenţă ALK5 dezvăluită aici (de exemplu, SEQ ID NO: 30, 31, 87, 88, 128, 130, 419, şi 420). Opţional, polipeptidele ALK5 pot cuprinde, consta în esenţă din, sau consta dintr-o secvenţă de aminoacizi care este cel puţin 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% sau 100% identică cu o polipeptidă care a) începe la oricare dintre aminoacizii 25-36 (de exemplu, resturile de aminoacizi 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, şi 36) SEQ ID NO: 30 sau 87, şi b) se termină la oricare dintre aminoacizii 106-126 (de exemplu, resturile de aminoacizi 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, şi 126) ai SEQ ID NO: 30 sau 87. Opţional, polipeptidele ALK5 din dezvăluire pot fi proteine de fuziune care cuprind în plus una sau mai multe porţiuni (domenii) care sunt heterologe cu ALK5. De exemplu, o polipeptidă ALK5 poate fi fuzionată la o polipeptidă heterologă care cuprinde un domeniu de multimerizare, opţional cu un domeniu linker poziţionat între polipeptida ALK5 şi polipeptida heterologă (de exemplu, SEQ ID NO: 128, 130, 419, şi 420). Complecşii heteromerici care cuprind o polipeptidă ALK5 nu cuprind o altă polipeptidă a receptorului tip I sau tip II a superfamiliei TGF-beta dar pot conţine polipeptide suplimentare care nu sunt polipeptide ale receptorului tip I sau tip II a superfamiliei TGF-beta.

În unele modalităţi de realizare, dezvăluirea redă complecşi polipeptidici heteromerici care cuprind o polipeptidă a receptorului tip I sau tip II a superfamiliei TGF-beta, în care polipeptida receptorului superfamiliei TGF-beta este derivată de la un receptor de ALK6. De exemplu, polipeptidele ALK6 pot cuprinde, consta în esenţă din, sau consta dintr-o secvenţă de aminoacizi care este cel puţin 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% sau 100% identică cu o secvenţă ALK6 dezvăluită aici (de exemplu, SEQ ID NO: 34, 35, 91, 92, 131, 133, 421, şi 422). Opţional, polipeptidele ALK6 pot cuprinde, consta în esenţă din, sau consta dintr-o secvenţă de aminoacizi care este cel puţin 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% sau 100% identică cu o polipeptidă care a) începe la oricare dintre aminoacizii 14-32 (de exemplu, resturile de aminoacizi 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, şi 32) SEQ ID NO: 34, şi b) se termină la oricare dintre aminoacizii 102-126 (de exemplu, resturile de aminoacizi 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, şi 126) ai SEQ ID NO: 34. Opţional, polipeptidele ALK6 pot cuprinde, consta în esenţă din, sau consta dintr-o secvenţă de aminoacizi care este cel puţin 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% sau 100% identică cu o polipeptidă care a) începe la oricare dintre aminoacizii 26-62 (de exemplu, resturile de aminoacizi 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, şi 62) SEQ ID NO: 91, şi b) se termină la oricare dintre aminoacizii 132-156 (de exemplu, resturile de aminoacizi 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, şi 156) ai SEQ ID NO: 91. Opţional, polipeptidele ALK6 din dezvăluire pot fi proteine de fuziune care cuprind în plus una sau mai multe porţiuni (domenii) care sunt heterologe cu ALK6. De exemplu, o polipeptidă ALK6 poate fi fuzionată la o polipeptidă heterologă care cuprinde un domeniu de multimerizare, opţional cu un domeniu linker poziţionat între polipeptida ALK6 şi polipeptida heterologă (de exemplu, SEQ ID NO: 131, 133, 421, şi 422). Complecşii heteromerici care cuprind o polipeptidă ALK6 nu cuprind o altă polipeptidă a receptorului tip I sau tip II a superfamiliei TGF-beta dar pot conţine polipeptide suplimentare care nu sunt polipeptide ale receptorului tip I sau tip II a superfamiliei TGF-beta.

În unele modalităţi de realizare, dezvăluirea redă complecşi polipeptidici heteromerici care cuprind o polipeptidă a receptorului tip I sau tip II a superfamiliei TGF-beta, în care polipeptida receptorului superfamiliei TGF-beta este derivată de la un receptor de ALK7. De exemplu, polipeptidele ALK7 pot cuprinde, consta în esenţă din, sau consta dintr-o secvenţă de aminoacizi care este cel puţin 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% sau 100% identică cu o secvenţă ALK7 dezvăluită aici (de exemplu, SEQ ID NO: 38, 39, 134, 136, 301, 302, 305, 306, 309, 310, 313, 423, şi 424). Opţional, polipeptidele ALK7 pot cuprinde, consta în esenţă din, sau consta dintr-o secvenţă de aminoacizi care este cel puţin 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% sau 100% identică cu o polipeptidă care începe la oricare dintre aminoacizii 21-28 ai SEQ ID NO: 38 (de exemplu, aminoacizii 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, sau 28) şi se termină la oricare dintre aminoacizii 92-113 ai SEQ ID NO: 38 (de exemplu, aminoacizii 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, sau 113 ai SEQ ID NO: 38). Opţional, polipeptidele ALK7 din dezvăluire pot fi proteine de fuziune care cuprind în plus una sau mai multe porţiuni (domenii) care sunt heterologe cu ALK7. De exemplu, o polipeptidă ALK7 poate fi fuzionată la o polipeptidă heterologă care cuprinde un domeniu de multimerizare, opţional cu un domeniu linker poziţionat între polipeptida ALK7 şi polipeptida heterologă (de exemplu, SEQ ID NO: 134, 136, 423, şi 424). Complecşii heteromerici care cuprind o polipeptidă ALK7 nu cuprind o altă polipeptidă a receptorului tip I sau tip II a superfamiliei TGF-beta dar pot conţine polipeptide suplimentare care nu sunt polipeptide ale receptorului tip I sau tip II a superfamiliei TGF-beta.

În unele modalităţi de realizare, polipeptidele receptorului de tip I şi/sau tip II ai superfamiliei TGF-beta dezvăluite aici cuprind unul sau mai multe resturi de aminoacizi modificaţi selectaţi dintre: un aminoacid glicozilat, un aminoacid PEGilat, un aminoacid farnesilat, un aminoacid acetilat, un aminoacid biotinilat, un aminoacid conjugat la o porţiune lipidică şi un aminoacid conjugat la un agent organic de derivatizare. În unele modalităţi de realizare, polipeptidele tip I şi/sau tip II ale superfamiliei TGF-beta descrise aici a sunt glicozilate şi au un model de glicozilare susceptibil de a fi obţinut din exprimarea polipeptidelor într-o celulă de mamifer, incluzând, de exemplu, o celulă CHO.

În anumite aspecte, dezvăluirea redă acizi nucleici care codifică oricare dintre polipeptidele de tip I şi/sau de tip II ale superfamiliei TGF-beta descrise aici, incluzând orice proteine de fuziune care cuprind membri ai unei perechi de interacţiune. Acizii nucleici dezvăluiţi aici pot fi legaţi operaţional de un promotor pentru exprimare, şi dezvăluirea redă în plus celule transformate cu astfel de polinucleotide recombinante. De preferinţă, celula este o celulă de mamifer, cum ar fi o celulă COS sau o celulă CHO.

În anumite aspecte, dezvăluirea redă metode pentru obţinerea oricăreia dintre polipeptidele tip I şi/sau tip II ale superfamiliei TGF-beta descrise aici precum şi complecşi proteici care cuprind o astfel de polipeptidă. O astfel de metodă poate include exprimarea oricăruia dintre acizii nucleici dezvăluiţi aici într-o celulă adecvată (de exemplu, o celulă CHO sau o celulă COS). O astfel de metodă poate cuprinde: a) cultivarea unei celule în condiţii adecvate pentru exprimarea unor polipeptide de tip I sau tip II ale superfamiliei TGF-beta descrise aici, în care respectiva celulă menţionată este transformată cu un construct de exprimare a unei polipeptide de tip I sau de tip II; şi b) recuperarea polipeptidelor de tip I sau de tip II exprimate astfel. Polipeptidele tip I şi/sau tip II ale superfamiliei TGF-beta descrise aici, precum şi complecşii proteici ai acestora, pot fi recuperate ca fracţii brute, parţial purificate sau cu o purificare ridicată utilizând oricare dintre tehnicile bine cunoscute pentru obţinerea proteinelor din culturi de celule

Oricare dintre complecşii proteici descrişi aici pot fi încorporaţi într-un preparat farmaceutic. Opţional, astfel de preparate farmaceutice sunt cel puţin 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% sau 99% pure faţă de alte componente polipeptidice. Opţional, preparatele farmaceutice dezvăluite aici pot cuprinde unul sau mai mulţi agenţi activi suplimentari.

Dezvăluirea redă în plus metode de utilizare a complecşilor proteici şi a preparatelor farmaceutice descrise aici pentru tratamentul sau prevenirea diferitelor afecţiuni asociate TGF-beta, incluzând fără limitare boli şi tulburări asociate, de exemplu, cu cancer, muşchi, os, grăsimi, celulele roşii din sânge, metabolism, fibroza şi alte ţesuturi care sunt afectate de unul sau mai mulţi liganzi ai superfamiliei TGF-beta.

SCURTĂ DESCRIERE A DESENELOR

Figura 1 prezintă exemple schematice de complecşi proteici heteromerici cu un singur braţ care cuprind fie o polipeptidă de receptor de tip I, fie o polipeptidă de receptor de tip II. Astfel de complecşi pot fi asamblaţi covalent sau necovalent printr-un domeniu de multimerizare conţinut în fiecare lanţ polipeptidic. Două domenii de multimerizare asamblate constituie o pereche de interacţiune, care poate fi fie ghidată, fie neghidată.

Figura 2 prezintă un exemplu schematic al unui complex proteic heteromeric cu un singur braţ care cuprinde o polipeptidă a receptorului de tip I (indicată ca "I") (de exemplu, o polipeptidă care este de cel puţin 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% sau 100% identică cu un domeniu extracelular al unei proteine ALK1, ALK2, ALK3, ALK4, ALK5, ALK6 sau ALK7 de la oameni sau alte specii) sau o polipeptidă a receptorului de tip II (indicată ca "II") (de exemplu o polipeptidă care este cel puţin 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% sau 100% identică cu un domeniu extracelular al unei proteine ActRIIA, ActRIIB, MISRII, BMPRII sau TGFBRII de la oameni sau alte specii). Modalitatea de realizare ilustrată, polipeptida receptorului de tip I sau tip II face parte dintr-o polipeptidă de fuziune care cuprinde un prim membru al unei perechi de interacţiune ("B"), care se asociază cu un al doilea membru al unei perechi de interacţiune ("C"). În polipeptida de fuziune, între polipeptida receptorului de tip I sau tip II şi membrul corespunzător al perechii de interacţiune poate fi poziţionat un linker. Primul şi al doilea membru al perechii de interacţiune (B, C) pot fi o pereche ghidată (asimetrică), ceea ce înseamnă că membrii perechii se asociază preferenţial între ei, mai degrabă decât să se auto-asocieze, sau perechea de interacţiune poate fi neghidată, adică că membrii perechii se pot asocia unul cu celălalt sau se pot auto-asocia fără preferinţă substanţială şi pot avea aceleaşi sau diferite secvenţe de aminoacizi. Proteinele de fuziune Fc şi anticorpii tradiţionali sunt exemple de perechi de interacţiune neghidate, în timp ce o varietate de domenii Fc modificate au fost concepute ca perechi de interacţiune ghidate (asimetrice).

Figura 3 prezintă o aliniere a domeniilor extracelulare ale ActRIIA uman (SEQ ID NO: 500) şi ActRIIB uman (SEQ ID NO: 2) cu resturile care sunt deduse aici, pe baza analizei compozite a mai multor structuri cristaline ActRIIB şi ActRIIA, la ligandul de contact indicat cu cutii.

Figura 4 prezintă o aliniere de secvenţă multiplă a diferitelor proteine precursoare de ActRIIB ale vertebratelor fără domeniile lor intracelulare (SEQ ID NO: 501, 502, 503, 504, 505 şi respectiv 506) proteina precursoare a ActRIIA umană fără domeniul său intracelular (SEQ ID NO. 507) şi o proteină precursoare de ActRII consens (SEQ ID NO: 508).

Figura 5 prezintă alinierea secvenţei multiple a domeniilor Fc din izotipurile de IgG umane utilizând Clustal 2.1. Regiunile de balama sunt indicate prin subliniere punctată. Sublinierea dublă indică exemple de poziţii modificate în Fc IgG1 pentru a promova împerecherea lanţului asimetric şi poziţiile corespunzătoare faţă de alte izotipuri de IgG2, IgG3 şi IgG4.

Figura 6 prezintă date de legare a liganzilor pentru un complex proteic ActRIIB-Fc cu un singur braţ: Fc heterodimeric comparativ cu homodimerul ActRIIB-Fc. Pentru fiecare complex proteic, liganzii sunt clasificaţi în afara ratei (koff sau kd), o constantă cinetică care se corelează bine cu inhibarea semnalizării ligandului şi listată în ordinea descrescătoare a afinităţii de legare (liganzii legaţi cel mai strâns sunt enumeraţi în partea de sus). În stânga, liniile galbene, roşii, verzi şi albastre indică magnitudinea constantei off-rate. Liganzii de interes deosebit sunt evidenţiaţi cu caractere aldine, în timp ce alţii sunt reprezentaţi cu gri, iar liniile negre pline indică liganzi a căror legare la heterodimer este îmbunătăţită sau nemodificată în comparaţie cu homodimerul, în timp ce liniile punctate indică legarea substanţial redusă în comparaţie cu homodimerul. Aşa cum este arătat, homodimerul ActRIIB-Fc se leagă la fiecare dintre cinci liganzi cu afinitate ridicată cu afinitate similară, în timp ce ActRIIB-Fc cu un singur braţ discriminează mai uşor între aceşti liganzi. Astfel, ActRIIB-Fc cu un singur braţ se leagă puternic de activina B şi GDF11 şi cu o tărie intermediară la GDF8 şi activina A. Spre deosebire de homodimerul ActRIIB-Fc, ActRIIB-Fc cu un singur braţ afişează doar o legare slabă la BMP10 şi nu se leagă la BMP9. Aceste date indică faptul că ActRIIB-Fc cu un singur braţ are o selectivitate mai mare pentru ligand decât ActRIIB-Fc homodimeric.

Figura 7 prezintă date de legare a ligandului pentru un complex proteic heterodimeric ALK3-Fc:Fc cu un singur braţ comparativ cu homodimerul ALK3-Fc. Formatul este acelaşi ca şi pentru Figura 6. După cum este arătat, heterodimerul ALK3-Fc cu un singur braţ păstrează legarea excepţional de strânsă la BMP4 observată cu homodimerul ALK3-Fc, în timp ce prezintă rezistenţă redusă de legare la BMP2 şi, prin urmare, discriminează mai bine între BMP4 şi BMP2 decât homodimerul ALK3-Fc. ALK3-Fc cu un singur braţ discriminează, de asemenea, mai bine între BMP5 (legare intermediară), GDF7 (legare slabă) şi GDF6 (fără legare) comparativ cu homodimerul ALK3-Fc, care leagă aceşti trei liganzi cu o tărie deosebit de similară (toate intermediare). Aceste date indică faptul că ALK3-Fc cu un singur braţ are o selectivitate mai mare de ligand decât ALK3-Fc homodimeric.

Figura 8 prezintă date de legare a ligandului pentru un complex proteic heterodimeric ActRIIA-Fc:Fc cu un singur braţ comparativ cu homodimerul ActRIIA-Fc. Formatul este acelaşi ca şi în Figura 6. După cum se arată, homodimerul ActRIIA-Fc prezintă o legare preferenţială la activina B combinată cu legare puternică la activina A şi GDF11, în timp ce ActRIIA-Fc cu un singur braţ are o preferinţă inversă pentru activina A faţă de activina B combinată cu o selectivitate mult îmbunătăţită pentru activina A peste GDF11 (liant slab). Aceste date indică faptul că ActRIIA-Fc cu un singur braţ are o selectivitate pentru ligand substanţial diferită decât ActRIIA-Fc homodimeric.

DESCRIEREA DETALIATĂ A INVENŢIEI

1. Privire de ansamblu

În parte, prezenta dezvăluire se referă la complecşi heteromultimerici cu un singur braţ cuprinzând un domeniu extracelular al unei polipeptide a receptorului de tip I a superfamiliei TGFβ sau un domeniu extracelular al unei polipeptide a receptorului de tip II al superfamiliei de TGFβ, metode de obţinere a unor astfel de complecşi heteromultimeri cu un singur braţ şi utilizări ale acestora. Aşa cum este descris aici, complecşii heteromultimerici cu un singur braţ pot cuprinde un domeniu extracelular al unei polipeptide a receptorului de tip I a superfamiliei TGFβ selectat dintre: ALK1, ALK2, ALK3, ALK4, ALK5, ALK6 şi ALK7, sau un domeniu extracelular al polipeptidei receptorului de tip II al unei superfamilii de TGFβ selectat dintre: ActRIIA, ActRIIB, TGFBRII, BMPRII şi MISRII. În anumite modalităţi de realizare preferate, complecşii heteromultimerici conform dezvăluirii au un profil de legare modificat la liganzii superfamiliei TGFβ în raport cu un complex homomultimer corespunzător (de exemplu, un heterodimer ActRIIB-Fc:Fc comparativ cu un complex homodimer ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc).

Superfamilia TGF-β este alcătuită din peste treizeci de factori secretaţi, inclusiv TGF-beta, activine, nodali, proteine morfogenetice osoase (BMP-uri), factori de creştere şi diferenţiere (GDF-uri) şi hormon anti-mulerian (AMH). Vezi, de exemplu, Weiss şi colab. (2013) Developmental Biology, 2(1): 47-63. Membrii superfamiliei, care se găsesc atât la vertebrate, cât şi la nevertebrate, sunt exprimaţi omniprezent în diverse ţesuturi şi funcţionează în primele etape de dezvoltare de pe parcursul vieţii unui animal. Într-adevăr, proteinele superfamiliei TGF-β sunt mediatori cheie pentru autoînnoirea celulelor stem, gastrulaţia, diferenţierea, morfogeneza organelor şi homeostazia ţesutului adult. În concordanţă cu această activitate omniprezentă, semnalizarea aberantă a superfamiliei TGF-beta este asociată cu o gamă largă de patologii umane, inclusiv, de exemplu, boli autoimune, boli cardiovasculare, boli fibrotice şi cancer.

Liganzii superfamiliei TGF-beta împărtăşesc aceeaşi structură dimerică în care helixul central 3-1/2 al unui monomer se împachetează pe suprafaţa concavă formată din catene beta ale celuilalt monomer. Majoritatea membrilor familiei TGF-beta sunt stabilizaţi în plus printr-o legătură intermoleculară de disulfură. Aceste legături disulfidice traversează printr-un inel format din alte două legături disulfidice care generează ceea ce a fost numit motiv de ʺnod de cisteinăʺ. Vezi, de exemplu, Lin şi colab., (2006) Reproduction 132: 179-190 şi Hinck (2012) FEBS Letters 586: 1860-1870.

Semnalizarea superfamiliei TGF-beta este mediată de complecşi heteromerici de receptori serină/treonină kinază tip I şi tip II, care fosforilează şi activează proteinele SMAD din aval (de exemplu, proteinele SMAD 1, 2, 3, 5, şi 8) la stimularea ligandului. Vezi, de exemplu, Massagué (2000) Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1:169-178. Aceşti receptori de tip I şi de tip II sunt proteine transmembranare, compuse dintr-un domeniu extracelular care leagă ligandul cu o regiune bogată în cisteină, un domeniu transmembranar şi un domeniu citoplasmatic cu specificitatea prezisă pentru serin/treonin kinază. În general, receptorii de tip I mediază semnalizarea intracelulară în timp ce receptorii de tip II sunt necesari pentru legarea liganzilor superfamiliei TGF-beta. Receptorii de tip I şi II formează un complex stabil după legarea ligandului, având ca rezultat fosforilarea receptorilor de tip I de către receptorii de tip II.

Familia TGF-beta poate fi împărţită în două ramuri filogenetice pe baza receptorilor de tip I pe care îi leagă şi a proteinelor Smad pe care le activează. Una este ramura dezvoltată mai recent, care include, de exemplu, TGF-beta-urile, activinele, GDF8, GDF9, GDF11, BMP3 şi nodalul. Cealaltă ramură cuprinde proteinele înrudite mai îndepărtat ale superfamiliei şi include, de exemplu, BMP2, BMP4, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8a, BMP8b, BMP9, BMP10, GDF1, GDF5, GDF6, şi GDF7. Vezi, de exemplu Hinck (2012) FEBS Letters 586:1860-1870.

Izoformele TGF-beta sunt membrii fondatori ai superfamiliei TGF-beta, dintre care există 3 izoforme cunoscute la mamifere desemnate ca TGF-beta1, TGF-beta2 şi TGF-beta3. Liganzii bioactivi TGF-beta maturi funcţionează ca homodimeri şi semnalizează predominant prin receptorul de tip I ALK5, dar s-a descoperit că semnalizează prin ALK1 în celulele endoteliale. Vezi, de exemplu, Goumans şi colab. (2003) Mol Cell 12(4): 817-828. TGF-beta1 este cea mai abundentă şi omniprezent exprimată izoformă. Se ştie că TGF-beta1 are un rol important în vindecarea rănilor, iar şoarecii care exprimă o transgenă constitutivă activă de TGF-beta1 dezvoltă fibroză. Vezi de exemplu, Clouthier şi colab., (1997) J Clin. Invest. 100(11): 2697-2713. TGF-beta1 este, de asemenea, implicat în activarea celulelor T şi întreţinerea celulelor T reglatoare. Vezi, de exemplu, Li şi colab., (2006) Immunity 25(3): 455-471. Exprimarea TGF-beta2 a fost descrisă mai întâi în celulele glioblastomului uman şi apare în neuroni şi celule astrogliale ale sistemului nervos embrionar. TGF-beta2 este, de asemenea, cunoscut pentru faptul că suprimă creşterea dependentă de interleukina-2 a limfocitelor T. TGF-beta3 a fost izolat iniţial dintr-o linie de celule de rabdomiosarcom uman şi de atunci a fost găsit în liniile de celule de adenocarcinom pulmonar şi carcinom renal. TGF-beta3 este cunoscut ca fiind important pentru morfogeneza palatului şi a plămânilor. Vezi, de exemplu., Kubiczkova şi colab., (2012) Journal of Translational Medicine 10:183.

Activinele sunt membre ale superfamiliei TGF-beta care au fost descoperite iniţial ca reglatori ai secreţiei de hormoni stimulatori ai foliculului, dar ulterior au fost caracterizate diverse roluri reproducătoare şi nereproducătoare. Principalele forme de activină A, B şi AB sunt homo/heterodimeri ai două subunităţi β strâns înrudite (βAβA, βBβB, şi respectiv βAβB,). Genomul uman codifică, de asemenea, o activină C şi o activină E, care sunt exprimate în principal în ficat, şi sunt, de asemenea, cunoscute forme heterodimere care conţin βC sau βE. În superfamilia TGF-beta, activinele sunt factori unici şi multifuncţionali care pot stimula producţia de hormoni în celulele ovariene şi placentare, susţine supravieţuirea celulelor neuronale, influenţa progresul ciclului celular pozitiv sau negativ în funcţie de tipul celulei şi induce diferenţierea mezodermică cel puţin la embrioni amfibieni. Vezi, de exemplu, DePaolo şi colab. (1991) Proc Soc Ep Biol Med. 198:500-512; Dyson şi colab. (1997) Curr Biol. 7:81-84; şi Woodruff (1998) Biochem Pharmacol. 55:953-963. În mai multe ţesuturi, semnalizarea activinei este antagonizată de heterodimerul său înrudit, inhibina. De exemplu, în reglarea secreţiei de hormon de stimulare a foliculului (FSH) din hipofiză, activina promovează sinteza şi secreţia FSH, în timp ce inhibina reduce sinteza şi secreţia FSH. Alte proteine care pot regla bioactivitatea activinei şi/sau se pot lega la activină includ folistatina (FS), proteina asociată folistatinei (FSRP, cunoscută şi sub numele de FLRG sau FSTL3) şi α2-macroglobulin.

Aşa cum este descris aici, agenţii care se leagă la "activina A" sunt agenţi care se leagă în mod specific la subunitatea βA, fie în contextul unei subunităţi βA izolate fie ca un complex dimeric (de exemplu, un homodimer βAβA sau un heterodimer βAβB). În cazul unui complex heterodimer (de exemplu, un heterodimer βAβB), agenţii care se leagă la "activina A" sunt specifici pentru epitopii prezenţi în subunitatea βA, dar nu se leagă la epitopii prezenţi în subunitatea non-βA a complexului (de exemplu, subunitatea βB a complexului). Similar, agenţii dezvăluiţi aici care antagonizează (inhibă) ʺactivina Aʺ sunt agenţi care inhibă una sau mai multe activităţi mediate de o subunitate βA, fie în contextul unei subunităţi βA izolate fie ca un complex dimeric (de exemplu, un homodimer βAβA sau un heterodimer βAβB). În cazul heterodimerilor βAβB, agenţii care inhibă ʺactivina Aʺ sunt agenţi care inhibă specific una sau mai multe activităţi ale subunităţii βA dar nu inhibă activitatea subunităţii non-βA a complexului (de exemplu, subunitatea βB a complexului). Acest principiu se aplică şi agenţilor care se leagă la şi/sau inhibă "activina B", "activina C", şi "activina E". Agenţii dezvăluiţi aici care antagonizează ʺactivina ABʺ sunt agenţi care inhibă una sau mai multe activităţi mediate de subunitatea βA şi una sau mai multe activităţi mediate de subunitatea βB.

BMP-urile şi GDF-urile formează împreună o familie de citokine cu nod de cisteină care împărtăşesc pliul caracteristic al superfamiliei TGF-beta. Vezi, de exemplu, Rider şi colab. (2010) Biochem J, 429(1):1-12. Această familie include, de exemplu, BMP2, BMP4, BMP6, BMP7, BMP2a, BMP3, BMP3b (cunoscut de asemenea şi ca GDF10), BMP4, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8, BMP8a, BMP8b, BMP9 (cunoscut de asemenea şi ca GDF2), BMP10, BMP11 (cunoscut de asemenea şi ca GDF11), BMP12 (cunoscut de asemenea şi ca GDF7), BMP13 (cunoscut de asemenea şi ca GDF6), BMP14 (cunoscut de asemenea şi ca GDF5), BMP15, GDF1, GDF3 (cunoscut de asemenea şi ca VGR2), GDF8 (cunoscut de asemenea şi ca miostatină), GDF9, GDF15, şi decapentaplegic. Pe lângă capacitatea de a induce formarea osoasă, care le-a dat BMP-urilor numele, BMP/GDF prezintă activităţi morfogenetice în dezvoltarea unei game largi de ţesuturi. Homo-şi hetero-dimerii BMP/GDF interacţionează cu combinaţii de dimeri ai receptorilor de tip I şi tip II pentru a produce multipli complecşi de semnalizare posibili, conducând la activarea unuia dintre cele două seturi concurente de factori de transcripţie SMAD. BMP/GDF-urile au funcţii deosebit de specifice şi localizate. Acestea sunt reglate în mai multe moduri, inclusiv restricţia dezvoltării exprimării BMP/GDF şi prin secreţia mai multor proteine care leagă anumiţi liganzi ai superfamiliei TGF-beta cu afinitate ridicată şi astfel inhibă activitatea ligandului. Curios, unii dintre aceşti antagonişti endogeni seamănă cu liganzii superfamiliei TGF-beta în sine.

Factorul de creştere şi diferenţiere-8 (GDF8) este, de asemenea, cunoscut sub numele de miostatină. GDF8 este un agent de reglare negativ al masei muşchilor scheletici şi este puternic exprimat în muşchii scheletici în curs de dezvoltare şi adulţi. Mutaţia nulă GDF8 la şoarecii transgenici se caracterizează printr-o hipertrofie marcată şi o hiperplazie a muşchilor scheletici. Vezi, de exemplu, McPherron şi colab., Nature (1997) 387:83-90. Creşteri similare ale masei musculare scheletice sunt evidente în mutaţiile naturale ale GDF8 la bovine şi, în mod izbitor, la oameni. Vezi, de exemplu, Ashmore şi colab. (1974) Growth, 38:501-507; Swatland şi Kieffer, J. Anim. Sci. (1994) 38:752-757; McPherron şi Lee, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997) 94:12457-12461; Kambadur şi colab, Genome Res. (1997) 7:910-915; şi Schuelke şi colab. (2004) N Engl J Med, 350:2682-8. Studiile au arătat, de asemenea, că pierderea musculară asociată cu infecţia cu HIV la om este însoţită de creşteri ale exprimării proteinei GDF8. Vezi, de exemplu, Gonzalez-Cadavid şi colab., PNAS (1998) 95:14938-43. În plus, GDF8 poate modula producţia de enzime specifice muşchilor (de exemplu, creatin kinaza) şi modulează proliferarea celulelor mioblaste. Vezi, de exemplu, International Patent Application Publication No. WO 00/43781). Propeptida GDF8 se poate lega necovalent la dimerul matur al domeniului GDF8, inactivând activitatea sa biologică. Vezi, de exemplu, Miyazono şi colab. (1988) J. Biol. Chem, 263: 6407-6415; Wakefield şi colab. (1988) J. Biol. Chem, 263; 7646-7654; şi Brown şi colab. (1990) Growth Factors, 3: 35-43. Alte proteine care se leagă la GDF8 sau proteine înrudite structural şi care inhibă activitatea lor biologică includ folistatina şi, potenţial, proteinele asociate cu folistatina. Vezi, de exemplu, Gamer şi colab. (1999) Dev. Biol, 208: 222-232.

GDF11, cunoscut de asemenea şi sub numele de BMP11, este o proteină secretată care este exprimată în mugurul cozii, mugurul membrelor, arcadele maxilare şi mandibulare şi ganglionii rădăcinii dorsale în timpul dezvoltării şoarecelui. Vezi, de exemplu, McPherron şi colab. (1999) Nat. Genet, 22: 260-264; şi Nakashima şi colab. (1999) Mech. Dev, 80: 185-189. GDF11 joacă un rol unic în modelarea atât a ţesuturilor mezodermice cât şi neuronale. Vezi, de exemplu, Gamer şi colab. (1999) Dev Biol, 208:222-32. GDF11 s-a dovedit a fi un agent de reglare negativ al condrogenezei şi miogenezei în dezvoltarea membrului la pui de găină. Vezi, de exemplu, Gamer şi colab. (2001) Dev Biol, 229:407-20. Exprimarea GDF11 în muşchi sugerează, de asemenea, rolul său în reglarea creşterii musculare într-un mod similar cu GDF8. În plus, exprimarea GDF11 în creier sugerează că GDF11 poate avea de asemenea şi activităţi care au legătură cu funcţia sistemului nervos. Interesant, s-a constatat că GDF11 inhibă neurogeneza în epiteliul olfactiv. Vezi, de exemplu, Wu şi colab. (2003) Neuron, 37:197-207. Prin urmare, GDF11 poate avea aplicaţii in vitro şi in vivo în tratamentul unor boli cum ar fi bolile musculare şi bolile neurodegenerative (de exemplu, scleroza laterală amiotrofică).

BMP7, denumită de asemenea şi proteină osteogenică-1 (OP-1), este bine cunoscută pentru faptul că induce formarea de cartilaj şi os. În plus, BMP7 reglează o gamă largă de procese fiziologice. De exemplu, BMP7 poate fi factorul osteoinductiv responsabil de fenomenul osteogenezei epiteliale. De asemenea, se constată că BMP7 joacă un rol în reglarea calciului şi în homeostazia osoasă. La fel ca activina, BMP7 se leagă la receptorii de tip II, ActRIIA şi ActRIIB. Cu toate acestea, BMP7 şi activina recrutează receptori distincţi de tip I în complecşi de receptori heteromerici. Principalul receptor BMP7 de tip I observat a fost ALK2, în timp ce activina s-a legat exclusiv de ALK4 (ActRIIB). BMP7 şi activina au provocat răspunsuri biologice distincte şi au activat diferite căi SMAD. Vezi, de exemplu, Macias-Silva şi colab. (1998) J Biol Chem. 273:25628-36.

Hormonul anti-mulerian (AMH), cunoscut şi sub numele de substanţă inhibitoare a Mullerianului (MIS), este o glicoproteină a familiei TGF-beta. Un receptor de tip II asociat cu AMH a fost identificat şi este desemnat ca AMHRII, sau alternativ MISRII. AMH induce regresia canalelor Mulleriene la embrionul masculin uman. AMH este exprimat la femeile de vârstă reproducătoare şi nu fluctuează odată cu ciclul sau sarcina, dar s-a constatat că scade treptat pe măsură ce atât cantitatea cât şi calitatea de ovocite scad, sugerând că AMH ar putea servi drept biomarker pentru fiziologia ovariană. Vezi de exemplu. Zec şi colab., (2011) Biochemia Medica 21(3): 219-30.

Kinaza-1 asemănătoare receptorului de activină (ALK1), produsul genei ACVRL1 cunoscută alternativ ca ACVRLK1, este un receptor de tip I a cărui exprimare este predominant limitată la celulele endoteliale. Vezi, de exemplu, OMIM intrarea 601284. ALK1 este activat prin legarea liganzilor familiei TGF-beta, cum ar fi BMP9 şi BMP10, şi semnalizarea ALK1 este esenţială în reglarea formării vaselor de sânge atât de dezvoltare cât şi patologice. Exprimarea ALK1 se suprapune cu situsurile de vasculogeneză şi angiogeneză în dezvoltarea timpurie a şoarecelui, iar şoarecii knock-out ALK1 mor în jurul zilei embrionare 11.5 din cauza anomaliilor vasculare severe (vezi de exemplu, Cunha şi Pietras (2011) Blood 117(26):6999-7006.) Exprimarea ALK1 a fost descrisă şi în alte tipuri de celule, cum ar fi celulele stelate hepatice şi condrocitele. În plus, ALK1 împreună cu kinaza-2 (ALK2) asemănătoare receptorului de activină s-au dovedit a fi importante pentru semnalizarea osteogenică indusă de BMP9 în celulele stem mezenchimale. Vezi de exemplu, Cunha şi Pietras (2011) Blood 117(26):6999-7006.

ALK2, produsul genei ACVR1 cunoscută alternativ ca ActRIA sau ACVRLK2, este un receptor de tip I care s-a dovedit că leagă activinele şi BMP-urile. ALK2 este esenţial pentru embriogeneză, deoarece şoarecii knockout ALK2 mor la scurt timp după gastrulare. Vezi, de exemplu, Mishina şi colab. (1999) Dev Biol. 213: 314-326 şi OMIM intrarea 102576. Mutaţiile active din punct de vedere constitutiv în ALK2 sunt asociate cu fibrodisplazia ossificans progressiva (FOP), o tulburare genetică rară care determină osificarea spontană sau când este afectat a ţesutului fibros, incluzând muşchiul, tendonul şi ligamentul. O mutaţie arginină-la-histidină în poziţia 206 a ALK2 este o mutaţie naturală asociată cu FOP la oameni. Această mutaţie induce semnalizarea specifică BMP prin ALK2 fără legarea ligandului. Vezi, de exemplu, Fukuda şi colab., (2009) J Biol Chem. 284(11):7149-7156 şi Kaplan şi colab., (2011) Ann N.Y. Acad Sci. 1237: 5-10.

Kinaza-3 (ALK3), asemănătoare receptorului activinei, produsul genei BMPR1A cunoscută alternativ ca ACVRLK3, este un receptor de tip I care mediază efectele mai multor liganzi din familia BMP. Spre deosebire de mai mulţi receptori de tip I cu exprimare omniprezentă în ţesuturi, ALK3 prezintă un model limitat de exprimare în concordanţă cu funcţionalitatea mai specializată. Vezi, de exemplu, ten Dijke (1993) Oncogene, 8: 2879-2887 şi OMIM intrarea 601299. ALK3 este în general recunoscut ca un receptor cu afinitate ridicată pentru BMP2, BMP4, BMP7 şi alţi membri ai familiei BMP. BMP2 şi BMP7 sunt stimulatori puternici ai diferenţierii osteoblastice şi acum sunt utilizaţi clinic pentru a induce formarea osoasă în fuziunile coloanei vertebrale şi anumite fracturi neunionale. ALK3 este considerat un receptor cheie în medierea semnalizării BMP2 şi BMP4 în osteoblaste. Vezi, de exemplu, Lavery şi colab. (2008) J. Biol. Chem. 283: 20948-20958. Un şoarece homozigot knockout ALK3 moare devreme în embriogeneză (∼ziua 9,5), cu toate acestea, a fost raportat recent că şoarecii adulţi care poartă o întrerupere condiţionată a ALK3 în osteoblaste prezintă o masă osoasă crescută, deşi osul nou format a prezentat dovezi de dezorganizare. Vezi, de exemplu, Kamiya (2008) J. Bone Miner. Res, 23:2007-2017; şi Kamiya (2008) Development 135: 3801-3811. Această constatare este în contrast uimitor cu eficacitatea BMP2 şi BMP7 (liganzi pentru ALK3) ca agenţi de construcţie osoasă în utilizare clinică.

Kinaza-4 asemănătoare receptorului activinei (ALK4), produsul genei ACVR1B cunoscută alternativ sub numele de ACVRLK4, este un receptor de tip I care transduce semnalizarea pentru un număr de liganzi din familia TGF-beta, inclusiv activine, nodale şi GDF-uri. Mutaţiile ALK4 sunt asociate cu cancerul pancreatic, şi exprimarea izoformelor ALK4 trunchiate negative dominante sunt puternic exprimate în tumorile hipofizare umane. Vezi, de exemplu, Tsuchida şi colab., (2008) Endocrine Journal 55(1): 11-21 şi OMIM intrarea 601300.

Kinaza-5 (ALK5) asemănătoare receptorului activinei, produsul genei TGFBR1, este exprimată pe scară largă în majoritatea tipurilor de celule. Mai mulţi liganzi din superfamilia TGF-beta, inclusiv TGF-beta-urile, activina şi GDF-8, semnalizează prin ALK5 şi activează în aval Smad 2 şi Smad 3. Şoarecii deficienţi de ALK5 prezintă defecte severe în dezvoltarea vasculară a sacului de gălbenuş şi a placentei, sunt lipsiţi de celulele roşii din sânge circulante şi mor la mijlocul gestaţiei. S-a constatat că aceşti embrioni au avut potenţial hematopoietic normal, dar proliferare sporită şi migraţie necorespunzătoare a celulelor endoteliale. Astfel, semnalizarea dependentă de ALK5 este importantă pentru angiogeneză, dar nu şi pentru dezvoltarea celulelor progenitoare hematopoietice şi a hematopoiezei funcţionale. Vezi, de exemplu Larsson şi colab., (2001) The EMBO Journal, 20(7): 1663-1673 şi OMIM intrarea 190181. În celulele endoteliale, ALK5 acţionează cooperativ şi opus semnalizării ALK1. ALK5 inhibă migraţia şi proliferarea celulară, în special efectul opus al ALK1. Vezi, de exemplu, Goumans şi colab. (2003) Mol Cell 12(4): 817-828. În plus, se crede că ALK5 reglează negativ creşterea musculară. S-a constatat că, knockdown-ul ALK5 în muşchi la un model de distrofie musculară la şoarece scade fibroza şi creşte exprimarea genelor asociate cu creşterea musculară. Vezi, de exemplu Kemaladewi şi colab., (2014) Mol Ther Nucleic Acids 3, e156.

Kinaza-6 asemănătoare receptorului activinei (ALK6) este produsul genei BMPR1B, a cărei deficienţă este asociată cu crondodisplazia şi defecte ale membrelor atât la oameni, cât şi la şoareci. Vezi, de exemplu, Demirhan şi colab., (2005) J Med Genet. 42:314-317. ALK6 este exprimat pe scară largă în întregul schelet în curs de dezvoltare şi este necesar pentru condrogeneza la şoareci. Vezi, de exemplu, Yi şi colab., (2000) Development 127:621-630 şi OMIM intrarea 603248.

Kinaza-7 asemănătoare receptorului activinei (ALK7) este produsul genei ACVR1C. Şoarecii ALK7 nul sunt viabili, fertili şi nu prezintă malformaţii ale scheletului sau ale membrelor. Semnalizarea GDF3 prin ALK7 pare să joace un rol în sensibilitatea la insulină şi obezitate. Acest lucru este susţinut de rezultatele conform cărora şoarecii ALK7 nuli prezintă o acumulare redusă de grăsime şi rezistenţă la obezitate indusă de dietă. Vezi, de exemplu, Andersson şi colab., (2008) PNAS 105(20): 7252-7256. Semnalizarea nodală mediată de ALK7 a fost implicată ca având atât efecte de promovare a tumorii, cât şi efecte de suprimare a tumorii într-o varietate de linii de celule de cancer diferite. Vezi, de exemplu, De Silva şi colab., (2012) Frontiers in Endocrinology 3:59 şi OMIM intrarea 608981.

Aşa cum se utilizează aici, termenul "ActRII" se referă la familia receptorilor de activină de tip II. Această familie include atât receptorul de activină de tip IIA (ActRIIA), codificat de gena ACVR2A, cât şi receptorul de activină de tip IIB (ActRIIB), codificat de gena ACVR2B. Receptorii de ActRII sunt receptori de tip II ai superfamiliei TGF-beta care leagă o varietate de liganzi ai superfamiliei TGF-beta, inclusiv activine, GDF8 (miostatină), GDF11 şi un subset de BMP, în special BMP6 şi BMP7. Receptorii ActRII sunt implicaţi într-o varietate de tulburări biologice, inclusiv tulburări musculare şi neuromusculare (de exemplu, distrofie musculară, scleroză laterală amiotrofică (ALS) şi atrofie musculară), creştere nedorită a osului/cartilajului, tulburări ale ţesutului adipos (de exemplu, obezitate), tulburări metabolice (de exemplu, diabet de tip 2) şi tulburările neurodegenerative. Vezi, de exemplu, Tsuchida şi colab., (2008) Endocrine Journal 55(1): 11-21, Knopf şi colab, U.S.8.252.900, şi OMIM intrările 102581 şi 602730.

Receptorul beta II al factorului de creştere transformator (TGFBRII), codificat de gena TGFBR2, este un receptor de tip II despre care se ştie că leagă liganzii TGF-beta şi activează efectorii Smad 2 şi Smad 3 din aval. Vezi, de exemplu, Hinck (2012) FEBS Letters 586: 1860-1870 şi OMIM intrarea 190182. Semnalizarea TGF-beta prin TGFBRII este critică în proliferarea celulelor T, menţinerea celulelor T reglatoare şi proliferarea celulelor stem precartilaginoase. Vezi, de exemplu, Li şi colab., (2006) Immunity 25(3): 455-471 şi Cheng şi colab., Int. J. Mol. Sci. 2014, 15, 12665-12676.

Receptorul proteinei morfogenetice osoase II (BMPRII), codificat de gena BMPR2, este un receptor de tip II despre care se ştie că leagă liganzi BMP, inclusiv BMP7 şi BMP4. Legarea eficientă a ligandului la BMPRII depinde de prezenţa receptorilor TGFBR de tip I. Vezi, de exemplu, Rosenzweig şi colab., (1995) PNAS 92:7632-7636. Mutaţiile din BMPRII sunt asociate cu hipertensiunea pulmonară la oameni. Vezi OMIM intrarea 600799.

Receptorul II al substanţei care inhibă Müllerianul (MISRII), produsul genei AMHR2 cunoscut alternativ ca receptor hormonal anti-Müllerian de tip II, este un receptor al superfamiliei TGF-beta tip II. MISRII leagă ligandul MIS, dar necesită prezenţa unui receptor adecvat de tip I, cum ar fi ALK3 sau ALK6, pentru transducţia semnalului. Vezi, de exemplu, Hinck (2012) FEBS Letters 586:1860-1870 şi OMIM intrarea 600956. MISRII este implicat în diferenţierea sexuală la om şi este necesar pentru regresia Mülleriană la masculul uman. AMH este exprimată la femeile aflate la vârsta de reproducere şi nu fluctuează odată cu ciclul sau sarcina, dar s-a constatat că scade treptat pe măsură ce atât cantitatea cât şi calitatea de ovocite scad, sugerând că AMH ar putea servi drept biomarker al fiziologiei ovariene. Vezi, de exemplu, Zec şi colab., (2011) Biochemia Medica 21(3): 219-30 şi OMIM intrarea 600956.

În anumite aspecte, prezenta dezvăluire se referă la utilizarea complecşilor heteromultimerici cu un singur braţ cuprinzând un domeniu extracelular al unei polipeptide de receptor de tip I al superfamiliei TGFβ (de exemplu, ALK1, ALK2, ALK3, ALK4, ALK5, ALK6 şi ALK7) sau un domeniu extracelular al unei polipeptide a receptorului de tip II a superfamiliei TGFβ (de exemplu, ActRIIA, ActRIIB, TGFBRII, BMPRII, şi MISRII), de preferinţă complecşi heteromultimerici solubili, pentru a antagoniza transducţia de semnalizare intracelulară (de exemplu, semnalizarea Smad 2/3 şi/sau Smad 1/5/8) iniţiată de unul sau mai mulţi liganzi ai superfamiliei TGFβ (de exemplu, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina AE, activina BC, activina BE, Nodal, GDF8, GDF11, BMP6 şi/sau BMP7). Aşa cum este descris aici, astfel de complecşi heteromultimerici antagonişti cu un singur braţ pot fi utili pentru tratamentul sau prevenirea diferitelor afecţiuni asociate cu TGF-beta, incluzând fără limitare boli şi tulburări asociate cu, de exemplu, cancer, muşchi, os, grăsime, celule roşii din sânge, metabolism, fibroză şi alte ţesuturi care sunt afectate de unul sau mai mulţi liganzi ai superfamiliei TGF-beta.

În special, datele din prezenta dezvăluire demonstrează că, complecşii heteromultimeri cu un singur braţ care cuprind un domeniu extracelular al unei polipeptide a receptorului de tip I a superfamiliei TGFβ sau un domeniu extracelular al unei polipeptide a receptorului de tip II al superfamiliei TGFβ au profiluri diferite de selectivitate a ligandului în comparaţie cu complecşii lor homomultimeri corespunzători.

Termenii utilizaţi în această specificaţie au în general semnificaţiile lor obişnuite în domeniu, în contextul acestei dezvăluiri şi în contextul specific în care se utilizează fiecare termen. Anumiţi termeni sunt discutaţi mai jos sau în altă parte în specificaţie pentru a furniza o ghidare suplimentară practicianului, în ceea ce priveşte descrierea compoziţiilor şi metodelor conform dezvăluirii şi a modului în care acestea se pot face şi utiliza. Scopul sau semnificaţia oricărei utilizări a unui termen va fi evidentă din contextul specific în care este utilizat.

Termenii "heteromer" sau "heteromultimer" se referă la un complex care cuprinde cel puţin o primă polipeptidă şi o a doua polipeptidă, în care a doua polipeptidă diferă ca secvenţă de aminoacizi de prima polipeptidă prin cel puţin un rest de aminoacid. Heteromerul poate cuprinde un "heterodimer" format din prima şi a doua polipeptidă sau poate forma structuri de ordin superior în care sunt prezente polipeptide în plus faţă de prima şi a doua polipeptidă. Structurile exemplare pentru heteromultimer includ heterodimeri, heterotrimeri, heterotetrameri şi alte structuri oligomerice. Heterodimerii sunt desemnaţi aici ca X:Y sau echivalent ca X-Y, în care X reprezintă un prim lanţ polipeptidic şi Y reprezintă un al doilea lanţ polipeptidic. Heteromerii de ordin superior şi structurile oligomerice sunt desemnate aici într-o manieră corespunzătoare. În anumite modalităţi de realizare, un heteromultimer este recombinant (de exemplu, una sau mai multe componente polipeptidice pot fi o proteină recombinantă), izolat şi/sau purificat.

ʺOmologʺ, în toate formele sale gramaticale şi variaţiile de ortografie, se referă la relaţia dintre două proteine care posedă o ʺorigine evolutivă comunăʺ, inclusiv proteine din superfamilii din aceeaşi specie de organism, precum şi proteine omoloage din diferite specii de organism. Astfel de proteine (şi acizii lor nucleici de codificare) au omologie de secvenţă, reflectată de similaritatea lor de secvenţă, fie în termeni de identitate procentuală, fie prin prezenţa unor resturi sau motive specifice şi poziţii conservate. Cu toate acestea, în utilizarea obişnuită şi în aplicaţia de faţă, termenul "omolog", atunci când este modificat cu un adverb precum "ridicat", se poate referi la similitudinea secvenţei şi poate sau nu să se raporteze la o origine evolutivă comună.

Termenul ʺsimilitudine de secvenţăʺ, în toate formele sale gramaticale, se referă la gradul de identitate sau corespondenţă dintre secvenţele de acid nucleic sau aminoacizi care pot avea sau nu o origine evolutivă comună.

ʺProcent (%) de identitate a secvenţeiʺ în raport cu o secvenţă de polipeptidă (sau nucleotidă) de referinţă este definită ca procentul de resturi de aminoacizi (sau acizi nucleici) dintr-o secvenţă candidată care sunt identice cu resturile de aminoacizi (sau acizi nucleici) în secvenţa de polipeptidă de referinţă (nucleotidă), după alinierea secvenţelor şi introducerea lacunelor, dacă este necesar, pentru a atinge procentul maxim de identitate a secvenţei şi fără a lua în considerare nicio substituţie conservativă ca parte a identităţii secvenţei. Alinierea în scopul determinării procentului de identitate a secvenţei de aminoacizi poate fi realizată în diferite moduri care fac parte din competenţele în domeniu, de exemplu, utilizând un software de calculator disponibil public, cum ar fi software-ul BLAST, BLAST-2, ALIGN sau Megalign (DNASTAR). Specialiştii în domeniu pot determina parametrii adecvaţi pentru alinierea secvenţelor, incluzând orice algoritmi necesari pentru a realiza alinierea maximă pe toată lungimea secvenţelor care sunt comparate. În scopurile de aici, totuşi, valorile % a identităţii secvenţei de aminoacizi (acid nucleic) sunt generate utilizând programul de calculator ALIGN-2 de comparare a secvenţei. Programul de calculator de comparare a secvenţelor ALIGN-2 a fost creat de Genentech, Inc., iar codul sursă a fost depus cu documentaţia utilizatorului la U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, unde este înregistrat sub numărul de înregistrare al drepturilor de autor din SUA TXU510087. Programul ALIGN-2 este disponibil public de la Genentech, Inc., South San Francisco, California sau poate fi compilat din codul sursă. Programul ALIGN-2 trebuie compilat pentru a fi utilizat pe un sistem de operare UNIX, inclusiv UNIX V4.0D digital. Toţi parametrii de comparaţie a secvenţei sunt setaţi de programul ALIGN-2 şi nu variază.

Aşa cum se utilizează aici "nu se leagă în mod substanţial la X" este destinat să însemne că un agent are un KD care este mai mare decât aproximativ 10-7, 10-6, 10-5, 10-4 sau mai mare (de exemplu, nicio legare detectabilă prin analiza utilizată pentru determinarea KD) pentru "X".

2. Complecşi heteromultimeri cuprinzând polipeptide ale receptorului superfamiliei TGFβ cu un singur braţ

În anumite aspecte, dezvăluirea se referă la complecşi proteici heteromultimeri care cuprind una sau mai multe polipeptide ale receptorului tip I sau tip II a superfamiliei TGF-beta cu un singur braţ. În anumite modalităţi de realizare, polipeptidele dezvăluite aici pot forma complecşi proteici care cuprind o primă polipeptidă asociată covalent sau necovalent cu o a doua polipeptidă, în care prima polipeptidă cuprinde secvenţa de aminoacizi a unei polipeptide a receptorului de tip I sau tip II şi secvenţa de aminoacizi a unui prim membru al unei perechi de interacţiune; şi a doua polipeptidă cuprinde secvenţa de aminoacizi a unui al doilea membru al perechii de interacţiune şi în care a doua polipeptidă nu cuprinde un polipeptidă a receptorului de tip I sau tip II. Perechea de interacţiune poate fi oricare dintre două secvenţe de polipeptide care interacţionează pentru a forma un complex, în special un complex heterodimeric, deşi modalităţi de realizare operative pot utiliza, de asemenea, o pereche de interacţiune care formează o secvenţă homodimeră. Aşa cum este descris aici, un membru al perechii de interacţiune poate fi fuzionat cu o polipeptidă a receptorului de tip I sau tip II, cum ar fi o polipeptidă care cuprinde o secvenţă de aminoacizi care este cel puţin 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% sau 100% identică cu secvenţa a oricăreia dintre SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 9, 10, 11, 14, 15, 18, 19, 22, 23, 26, 27, 30, 31, 34, 35, 38, 39, 42, 43, 46, 47, 50, 51, 67, 68, 71, 72, 75, 76, 79, 80, 83, 84, 87, 88, 91, 92, 301, 302, 305, 306, 309, 310, şi 313. De preferinţă, perechea de interacţiune este selectată pentru a conferi un timp de înjumătăţire seric îmbunătăţit sau pentru a acţiona ca un adaptor pe care un alt fragment, cum ar fi un fragment de polietilenglicol, este ataşat pentru a oferi un timp de înjumătăţire serică îmbunătăţit în raport cu forma monomerică a polipeptidei receptorului de tip I sau tip II.

Aşa cum se arată aici, formele monomere (cu un singur braţ) ale receptorilor de tip I sau de tip II ai superfamiliei TGF-beta pot prezenta o selectivitate modificată substanţial de legare a ligandului în comparaţie cu formele lor homodimere corespunzătoare, dar formele monomere tind să aibă un timp de şedere seric scurt (timp de înjumătăţire), ceea ce este nedorit în mediul terapeutic. Un mecanism comun pentru îmbunătăţirea timpului de înjumătăţire seric constă în exprimarea unei polipeptide ca o proteină de fuziune homodimerică cu o porţiune de domeniu constant (de exemplu, o porţiune Fc) a unei IgG. Cu toate acestea, polipeptidele receptorului superfamiliei TGF-beta exprimate ca proteine homodimere (de exemplu, într-un construct de fuziune Fc) pot să nu prezinte acelaşi profil de activitate ca forma monomeră. Aşa cum s-a demonstrat aici, problema poate fi rezolvată prin fuzionarea formei monomere cu un fragment care extinde timpul de înjumătăţire şi, în mod surprinzător, acest lucru poate fi uşor realizat prin exprimarea unor astfel de proteine ca o proteină de fuziune heterodimerică asimetrică în care este fuzionat un membru al unei perechi de interacţiune la o polipeptidă a receptorului superfamiliei TGF-beta şi un alt membru al perechii de interacţiune este fuzionat fie cu nici o porţiune, fie cu o porţiune heterologă, rezultând un nou profil de legare a ligandului cuplat cu o îmbunătăţire a timpului de înjumătăţire seric conferit de perechea de interacţiune.

În anumite aspecte, prezenta dezvăluire se referă la complecşi heteromultimeri cu un singur braţ care conţin cel puţin o polipeptidă a receptorului de tip I a superfamiliei TGF-beta (de exemplu, ALK1, ALK2, ALK3, ALK4, ALK5, ALK6, şi ALK7 precum şi SEQ ID NO: 14, 15, 18, 19, 22, 23, 26, 27, 30, 31, 34, 35, 38, 39, 83, 84, 87, 88, 91, 92, 301, 302, 305, 306, 309, 310, 313) sau cel puţin o polipeptidă a receptorului de tip II a superfamiliei TGF-beta (de exemplu, ActRIIA, ActRIIB, TGFBRII, BMPRII, şi MISRII precum şi SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 9, 10, 11, 42, 43, 46, 47, 50, 51, 67, 68, 71, 72, 75, 76, 79, şi 80), care sunt denumiţi în general aici ʺcomplecşi heteromultimeri cu un singur braţ conform dezvăluiriiʺ sau ʺcomplecşi heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului de superfamilie TGF-betaʺ. De preferinţă, complecşii heteromultimeri cu un singur braţ conform dezvăluirii sunt solubili, de exemplu, un complex heteromultimer cu un singur braţ cuprinde o porţiune solubilă din cel puţin o polipeptidă a receptorului de tip I a superfamiliei TGFβ sau o porţiune solubilă din cel puţin o polipeptidă a receptorului de tip II a superfamiliei TGFβ. În general, domeniile extracelulare ale receptorilor de tip I şi de tip II ai superfamiliei TGFβ corespund unei porţiuni solubile a receptorului de tip I sau tip II. Prin urmare, în unele modalităţi de realizare, complecşii heteromultimeri cu un singur braţ conform dezvăluirii cuprind un domeniu extracelular al unei polipeptide a receptorului de tip I a superfamiliei TGFβ (de exemplu, unul sau mai multe domenii extracelulare ale receptorului ALK1, ALK2, ALK3, ALK4, ALK5, ALK6 şi/sau ALK7 domenii) sau un domeniu extracelular al unei polipeptide a receptorului de tip II a superfamiliei TGFβ (de exemplu, unul sau mai multe domenii extracelulare ale receptorilor ActRIIA, ActRIIB, TGFBRII, BMPRII şi/sau MISRII). Domenii extracelulare exemplare ale ALK1, ALK2, ALK3, ALK4, ALK5, ALK6, ALK7, ActRIIA, ActRIIB, TGFBRII, BMPRII şi MISRII sunt dezvăluite aici şi astfel de secvenţe, precum şi fragmente, variante funcţionale şi forme modificate ale acestora, pot fi utilizate în conformitate cu invenţiile din prezenta dezvăluire (de exemplu, compoziţii de complecşi heteromultimeri cu un singur braţ şi utilizări ale acestora).

Un motiv structural definitoriu, cunoscut sub numele de pliu de toxină cu trei degete, este important pentru legarea ligandului de către receptorii de tip I şi tip II şi este format din 10, 12 sau 14 resturi de cisteină conservate localizate în poziţii diferite în cadrul domeniului extracelular al fiecărui receptor monomeric Vezi, de exemplu, Greenwald şi colab. (1999) Nat Struct Biol 6:18-22; Hinck (2012) FEBS Lett 586:1860-1870. Oricare dintre complecşii heteromerici descrişi aici poate cuprinde un astfel de domeniu al unui receptor de tip I sau de tip II al superfamiliei TGF-beta. Domeniile centrale de legare a ligandului ale receptorilor superfamiliei TGFβ, aşa cum sunt delimitate de cele mai exterioare dintre aceste cisteine conservate, corespund poziţiilor 29-109 ale SEQ ID NO: 1 (ActRIIB precursor); poziţiilor 30-110 ale SEQ ID NO: 9 (precursor ActRIIA); poziţiilor 34-95 ale SEQ ID NO: 14 (precursor ALK1); poziţiilor 35-99 ale SEQ ID NO: 18 (precursor ALK2); poziţiilor 61-130 ale SEQ ID NO: 22 (precursor ALK3); poziţiilor 34-101 ale SEQ ID NO: 26 şi 83 (precursori ALK4); poziţiilor 36-106 ale SEQ ID NO: 30 şi 87 (precursori ALK 5); poziţiilor 32-102 ale SEQ ID NO: 34 (izoforma ALK6 precursor B); poziţiilor 28-92 ale SEQ ID NO: 38, 305, şi 309 (precursori ALK7); poziţiilor 51-143 ale SEQ ID NO: 42 (izoforma TGFBRII precursor B); poziţiilor 34-123 ale SEQ ID NO: 46 şi 71 (precursori BMPRII); poziţiilor 24-116 ale SEQ ID NO: 50, 75, şi 79 (precursori MISRII); poziţiilor 44-168 ale SEQ ID NO: 67 (izoforma TGFBRII precursor A); şi poziţiilor 62-132 ale SEQ ID NO: 91 (izoforma ALK6 precursor A). Aminoacizii structuraţi mai puţin ordonaţi care înconjoară aceste secvenţe centrale delimitate de cisteină pot fi trunchiate de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, sau 37 resturi de pe oricare dintre capete, fără a modifica în mod necesar ligandul legare. Domenii extracelulare exemplare pentru trunchierea N-terminală şi/sau C-terminală includ SEQ ID NO: 2, 3, 5, 6, 10, 11 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 47, 51, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 302, 306, 310, şi 313.

În alte modalităţi de realizare preferate, complecşii heteromultimeri cu un singur braţ conform dezvăluirii se leagă şi inhibă (antagonizează) activitatea unuia sau mai multor liganzi ai superfamiliei TGF-beta incluzând, dar fără a se limita la, BMP2, BMP2/7, BMP3, BMP4, BMP4/7, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8a, BMP8b, BMP9, BMP10, GDF3, GDF5, GDF6/BMP13, GDF7, GDF8, GDF9b/BMP15, GDF11/BMP11, GDF15/MIC1, TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina AE, activina BC, activina BE, nodal, factor neurotrofic derivat din celule gliale (GDNF), neurturina, artemina, persefina, MIS şi Lefty. În special, complecşii heteromultimeri cu un singur braţ conform dezvăluirii pot fi utilizaţi pentru a antagoniza transducţia de semnalizare intracelulară (de exemplu, semnalizarea Smad 2/3 şi/sau Smad 1/5/8) iniţiată de unul sau mai mulţi liganzi ai superfamiliei TGFβ. Aşa cum este descris aici, astfel de complecşi heteromultimeri antagonişti pot fi, pentru tratamentul sau prevenirea diferitelor afecţiuni asociate cu TGF-beta, incluzând fără limitare boli şi tulburări asociate, de exemplu, cu cancer, muşchi, os, grăsimi, celule roşii din sânge, metabolism, fibroză şi alte ţesuturi care sunt afectate de unul sau mai mulţi liganzi ai superfamiliei TGF-beta. În unele modalităţi de realizare, complecşii heteromultimeri cu un singur braţ conform dezvăluirii au profiluri diferite de legare a liganzilor în comparaţie cu complexul lor homomultimer corespunzător (de exemplu, un ActRIIB-Fc:Fc heterodimer vs. un ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc corespunzător sau Fc:Fc homodimer). Aşa cum este descris aici, complecşii heteromultimeri cu un singur braţ conform dezvăluirii includ, de exemplu, heterodimeri, heterotrimeri, heterotetrameri şi alte structuri oligomerice bazate pe un complex unitar cu un singur braţ În anumite modalităţi de realizare preferate, complecşii heteromultimeri cu un singur braţ conform dezvăluirii sunt heterodimeri.

Aşa cum se utilizează aici, termenul "ActRIIB" se referă la o familie de proteine de receptor de activină tip IIB (ActRIIB) din orice specie şi variante derivate din astfel de proteine ActRIIB prin mutageneză sau altă modificare. Referirea aici la ActRIIB este înţeleasă a fi o referire la oricare dintre formele identificate curent. Membrii familiei ActRIIB sunt în general proteine transmembranare, compuse dintr-un domeniu extracelular care leagă ligandul cuprinzând o regiune bogată în cisteină, un domeniu transmembranar şi un domeniu citoplasmatic cu activitate de serină/treonină kinază predictibilă.

Termenul "polipeptidă ActRIIB" include polipeptide care cuprind orice polipeptidă naturală a unui membru al familiei ActRIIB precum şi orice variante ale acestuia (incluzând mutanţi, fragmente, fuziuni şi forme peptidomimetice) care păstrează o activitate utilă. Exemple de astfel de variante de polipeptide ActRIIB sunt furnizate pe parcursul prezentei dezvăluiri, precum şi în publicaţia internaţională a cererii de brevet nr. WO 2006/012627. Numerotarea aminoacizilor pentru toate polipeptidele înrudite cu ActRIIB descrise aici se bazează pe numerotarea secvenţei de proteine precursoare a ActRIIB umane redate mai jos (SEQ ID NO: 1), cu excepţia cazului în care este specificat altfel.

Secvenţa de proteine precursoare ActRIIB umană este după cum urmează:

Peptida semnal este indicată prin sublinierea cu o singură linie; domeniul extracelular este indicat cu litere aldine; şi potenţialele situsuri de glicozilare N-legate endogene sunt indicate prin sublinierea cu o linie dublă.

Secvenţa de polipeptide ActRIIB extracelulară prelucrată este după cum urmează:

În unele modalităţi de realizare, proteina poate fi produsă cu o secvenţă "SGR..." la capătul N-terminal. ʺCoadaʺ C-terminală a domeniului extracelular este indicată prin sublinierea cu o singură linie. Secvenţa cu ʺcoadaʺ deletată (o secvenţă Δ15) este următoarea:

O formă de ActRIIB cu o alanină la poziţia 64 a SEQ ID NO: 1 (A64) este, de asemenea, raportată în literatura de specialitate Vezi, de exemplu, Hilden şi colab. (1994) Blood, 83(8): 2163-2170. Solicitanţii au constatat că o proteină de fuziune ActRIIB-Fc cuprinzând un domeniu extracelular al ActRIIB cu substituţie A64 are o afinitate relativ scăzută pentru activină şi GDF11. Prin contrast, aceeaşi proteină de fuziune ActRIIB-Fc cu o arginină în poziţia 64 (R64) are o afinitate pentru activină şi GDF11 în intervalul nanomolar scăzut la picomolar ridicat. Prin urmare, secvenţele cu un R64 sunt utilizate ca secvenţa de referinţă "de tip sălbatic" pentru ActRIIB uman în această dezvăluire.

Forma ActRIIB cu o alanină în poziţia 64 este după cum urmează:

Peptida semnal este indicată prin sublinierea cu o singură linie şi domeniul extracelular este indicat prin litere aldine.

Secvenţa polipeptidică extracelulară ActRIIB prelucrată a formei alternative A64 este după cum urmează:

În unele modalităţi de realizare, proteina poate fi produsă cu o secvenţă "SGR..." la capătul N-terminal. ʺCoadaʺ cu C-terminal a domeniului extracelular este indicată prin sublinierea cu o singură linie. Secvenţa cu ʺcoadaʺ deletată (o secvenţă Δ15) este după cum urmează:

O secvenţă de acid nucleic care codifică proteina precursorului ActRIIB umană este prezentată mai jos (SEQ ID NO: 7), constând din nucleotidele 25-1560 din secvenţa de referinţă Genbank NM_001106.3, care codifică aminoacizii 1-513 ai precursorului ActRIIB. Secvenţa aşa cum este prezentată furnizează o arginină în poziţia 64 şi poate fi modificată pentru a furniza în schimb o alanină. Secvenţa semnal este subliniată.

O secvenţă de acid nucleic care codifică polipeptida ActRIIB umană extracelulară prelucrată este după cum urmează (SEQ ID NO: 8). Secvenţa aşa cum este prezentată furnizează o arginină în poziţia 64 şi poate fi modificată pentru a furniza în schimb o alanină.

O aliniere a secvenţelor de aminoacizi a domeniului extracelular solubil ActRIIB uman şi a domeniului extracelular solubil ActRIIA uman este ilustrată în Figura 3. Această aliniere indică resturile de aminoacizi din ambii receptori despre care se crede că intră în contact direct cu liganzii ActRII. Figura 4 prezintă o aliniere cu mai multe secvenţe a diferitelor proteine ActRIIB pentru vertebrate şi ActRIIA umane. Din aceste alinieri este posibil să se prezică poziţiile cheie ale aminoacizilor din domeniul de legare a ligandului, care sunt importante pentru activităţile normale de legare a ligandului ActRII, precum şi pentru a prezice poziţiile aminoacizilor care sunt susceptibile de a fi tolerante la substituţie, fără a modifica semnificativ activităţi de legare a ligandului ale ActRII normal. Proteinele ActRII au fost caracterizate în domeniu în ceea ce priveşte caracteristicile structurale şi funcţionale, în special în ceea ce priveşte legarea ligandului. Vezi, de exemplu, Attisano şi colab. (1992) Cell 68(1):97-108; Greenwald şi colab. (1999) Nature Structural Biology 6(1): 18-22; Allendorph şi colab. (2006) PNAS 103(20: 7643-7648; Thompson şi colab. (2003) The EMBO Journal 22(7): 1555-1566; precum şi Brevetele U.S. Nr: 7.709.605, 7.612.041, şi 7.842.663.

De exemplu, Attisano şi colab. a arătat că o deleţie a nodului prolinei la capătul C-terminal al domeniului extracelular al ActRIIB a redus afinitatea receptorului pentru activină. O proteină de fuziune ActRIIB-Fc conţinând aminoacizi 20-119 din prezenta SEQ ID NO. 1, "ActRIIB(20-119)-Fc", are o legare redusă la GDF11 şi activină în raport cu un ActRIIB(20-134)-Fc, care include regiunea nodului prolinei şi domeniul juxtamembranar complet (vezi, de exemplu, Brevet U.S. nr. 7.842.663). Cu toate acestea, o proteină ActRIIB (20-129)-Fc păstrează o activitate similară, dar oarecum redusă în raport cu tipul sălbatic, chiar dacă regiunea nodului prolinei este întreruptă. Astfel, domeniile extracelulare ActRIIB care se opresc la aminoacizii 134, 133, 132, 131, 130 şi 129 (cu privire la SEQ ID NO: 1) sunt toate de aşteptat să fie active, dar construcţii care se opresc la 134 sau 133 pot fi cei mai activi. Similar, mutaţiile la oricare dintre resturile 129-134 (cu privire la SEQ ID NO: 1) nu sunt de aşteptat să modifice afinitatea de legare a ligandului în limite mari. În susţinerea acestui fapt, se ştie în domeniu că mutaţiile la P129 şi P130 (cu privire la SEQ ID NO: 1) nu scad substanţial legarea ligandului. Prin urmare, o polipeptidă ActRIIB din prezenta dezvăluire se poate termina încă de la aminoacidul 109 (cisteina finală), totuşi, formele care se termină la sau între 109 şi 119 (de exemplu, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, sau 119) sunt de aşteptat să aibă o legare redusă a ligandului. Aminoacidul 119 (în ceea ce priveşte prezenta SEQ ID NO: 1) este slab conservat şi astfel este uşor de modificat sau trunchiat. Polipeptidele ActRIIB şi capcanele GDF pe bază de ActRIIB care se termină la 128 (în raport cu SEQ ID NO: 1) sau mai târziu ar trebui să păstreze activitatea de legare a ligandului. Polipeptide ActRIIB şi capcanele GDF pe bază de ActRIIB care se termină la sau între 119 şi 127 (de exemplu, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, sau 127), în ceea ce priveşte SEQ ID NO: 1, vor avea o capacitate de legare intermediară. Oricare dintre aceste forme poate fi de dorit să fie utilizată, în funcţie de contextul clinic sau experimental.

La capătul N-terminal al ActRIIB, este de aşteptat ca o proteină care începe la aminoacidul 29 sau înainte (în raport cu SEQ ID NO: 1) să păstreze activitatea de legare a ligandului. Aminoacidul 29 reprezintă cisteina iniţială. O mutaţie alanină-asparagină în poziţia 24 (în raport cu SEQ ID NO: 1) introduce o secvenţă de glicozilare N-legată fără a afecta substanţial legarea ligandului. Vezi, de exemplu, Brevetul U.S. nr. 7.842.663. Acest lucru confirmă că mutaţiile din regiunea dintre peptida de clivaj a semnalului şi regiunea reticulată prin cisteină, corespunzătoare aminoacizilor 20-29, sunt bine tolerate. În special, polipeptidele ActRIIB şi capcanele GDF pe bază de ActRIIB începând cu poziţiile 20, 21, 22, 23 şi 24 (în ceea ce priveşte SEQ ID NO: 1) ar trebui să păstreze activitatea generală de legare a ligandului, şi polipeptidele ActRIIB şi capcanele GDF bazate pe ActRIIB care încep la poziţiile 25, 26, 27, 28 şi 29 (în ceea ce priveşte SEQ ID NO: 1) sunt, de asemenea, de aşteptat să păstreze activitatea de legare a ligandului. Datele prezentate în, de exemplu, Brevetul U.S. Nr. 7.842.663 demonstrează că, surprinzător, un construct ActRIIB începând la 22, 23, 24 sau 25 va avea cea mai mare activitate.

Luată împreună, o porţiune activă (de exemplu, porţiune de legare a ligandului) din ActRIIB cuprinde aminoacizii 29-109 din SEQ ID NO: 1. Prin urmare, polipeptidele ActRIIB din prezenta dezvăluire pot cuprinde, de exemplu, o secvenţă de aminoacizi care este cel puţin 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% sau 100% identică cu o porţiune din ActRIIB începând cu un rest corespunzător aminoacizilor 20-29 (de exemplu, începând la amino acidul 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 sau 29) din SEQ ID NO: 1 şi se termină într-o poziţie corespunzătoare aminoacizilor 109-134 (de exemplu, care se termină la aminoacidul 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, sau 134) din SEQ ID NO: 1. Alte exemple includ polipeptide care încep într-o poziţie de la 20 la 29 (de exemplu, poziţia 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, sau 29) sau 21-29 (de exemplu, poziţia 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, sau 29) şi se termină la o poziţie de la 119-134 (de exemplu, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, sau 134), 119-133 (de exemplu, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, sau 133), 129-134 (de exemplu, 129, 130, 131, 132, 133, sau 134), sau 129-133 (de exemplu, 129, 130, 131, 132, sau 133) a SEQ ID NO: 1. Alte exemple includ construcţi care încep la poziţia de la 20-24 (de exemplu, 20, 21, 22, 23, sau 24), 21-24 (de exemplu, 21, 22, 23, sau 24), sau 22-25 (de exemplu, 22, 22, 23, sau 25) şi se termină la o poziţie de la 109-134 (de exemplu, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, sau 134), 119-134 (de exemplu, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, sau 134) sau 129-134 (de exemplu, 129, 130, 131, 132, 133, sau 134) din SEQ ID NO: 1. Sunt, de asemenea, avute în vedere variantele din aceste intervale, în special cele care au cel puţin 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, sau 100% identitate cu porţiunea corespunzătoare din SEQ ID NO: 1.

Dezvăluirea include rezultatele unei analize a structurilor compozite de ActRIIB, prezentate în Figura 3, demonstrând că buzunarul de legare a ligandului este definit, în parte, de resturile Y31, N33, N35, L38 până la T41, E47, E50, Q53 până la K55, L57, H58, Y60, S62, K74, W78 până la N83, Y85, R87, A92, şi E94 până la F101. În aceste poziţii, este de aşteptat ca mutaţiile conservative să fie tolerate. R40 este un K în Xenopus, indicând faptul că aminoacizii bazici de la această poziţie vor fi toleraţi. Q53 este R în ActRIIB bovin şi K în ActRIIB Xenopus şi, prin urmare, aminoacizii incluzând R, K, Q, N şi H vor fi toleraţi în această poziţie. Astfel, o formulă generală pentru o polipeptidă ActRIIB conform dezvăluirii este una care cuprinde o secvenţă de aminoacizi care este de cel puţin 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, sau 100% identică cu aminoacizii 29-109 din SEQ ID NO. 1, opţional începând dintr-o poziţie cuprinsă între 20-24 (de exemplu, 20, 21, 22, 23, sau 24) sau 22-25 (de exemplu, 22, 23, 24, sau 25) şi se termină într-o poziţie cuprinsă între 129-134 (de exemplu, 129, 130, 131, 132, 133, sau 134), şi care cuprind nu mai mult de 1, 2, 5, 10 sau 15 modificări conservative de aminoacizi în buzunarul de legare a ligandului şi zero, una sau mai multe modificări neconservative în poziţiile 40, 53, 55, 74, 79 şi/sau 82 în buzunarul de legare a ligandului. Situsurile din afara buzunarului de legare, la care variabilitatea poate fi deosebit de bine tolerată, includ amino şi carboxi terminale ale domeniului extracelular (aşa cum s-a menţionat mai sus) şi poziţiile 42-46 şi 65-73 (în raport cu SEQ ID NO:1.) O modificare asparagină-la-alanină la poziţia 65 (N65A) îmbunătăţeşte de fapt legarea ligandului în fundalul A64 şi, prin urmare, se aşteaptă să nu aibă niciun efect negativ asupra legării ligandului în fundalul R64. Vezi, de exemplu, Brevetul U.S. Nr. 7.842.663. Această modificare elimină probabil glicozilarea la N65 în fundalul A64, demonstrând astfel că este probabil ca o schimbare semnificativă în această regiune să fie tolerată. În timp ce o schimbare R64A este slab tolerată, R64K este bine tolerată şi, prin urmare, un alt rest bazic, cum ar fi H, poate fi tolerat la poziţia 64. Vezi, de exemplu, Brevetul U.S nr. 7.842.663.

ActRIIB este bine conservat la aproape toate vertebratele, cu întinderi mari ale domeniului extracelular conservate complet. Mulţi dintre liganzii care se leagă de ActRIIB sunt, de asemenea, deosebit de conservaţi. În consecinţă, comparaţiile secvenţelor ActRIIB de la diferite organisme vertebrate oferă informaţii despre resturile care pot fi modificate. Prin urmare, o variantă activă de polipeptidă ActRIIB umană utilă în conformitate cu metodele dezvăluite în prezent poate include unul sau mai mulţi aminoacizi la poziţiile corespunzătoare din secvenţa unui alt ActRIIB de vertebrat sau poate include un rest similar cu cel de la om sau altă secvenţă de vertebrate. Următoarele exemple ilustrează această abordare a definirii unei variante de ActRIIB active. L46 este o valină în ActRIIB de Xenopus şi, prin urmare, această poziţie poate fi modificată şi, opţional, poate fi modificată cu un alt rest hidrofob, cum ar fi V, I sau F, sau un rest nepolar, cum ar fi A. E52 este un K în Xenopus, indicând faptul că acest situs poate fi tolerant la o mare varietate de modificări, inclusiv resturi polare, cum ar fi E, D, K, R, H, S, T, P, G, Y şi probabil A. T93 este un K în Xenopus, indicând faptul că o variaţie structurală largă este tolerată în această poziţie, cu resturi polare favorizate, cum ar fi S, K, R, E, D, H, G, P, G şi Y. F108 este Y în Xenopus şi, prin urmare, Y sau alte grupări hidrofobe, cum ar fi I, V sau L, ar trebui să fie tolerate. E111 este K în Xenopus, indicând că resturile cu sarcină vor fi tolerate în această poziţie, incluzând D, R, K şi H, precum şi Q şi N. R112 este K în Xenopus, indicând faptul că resturile bazice sunt tolerate în această poziţie, incluzând R şi H. A în poziţia 119 este relativ slab conservat şi apare ca P la rozătoare şi V la Xenopus, astfel, în esenţă, orice aminoacid ar trebui să fie tolerat în această poziţie.

Variaţiile descrise aici pot fi combinate în diferite moduri. În plus, rezultatele programului de mutageneză descris în domeniu indică faptul că există poziţii de aminoacizi în ActRIIB care sunt adesea benefic să fie conservate. În ceea ce priveşte SEQ ID NO: 1, aceasta include poziţia 64 (aminoacid bazic), poziţia 80 (aminoacid acid sau hidrofob), poziţia 78 (hidrofob şi, în special, triptofan), poziţia 37 (acid, în special acid aspartic sau glutamic), poziţia 56 (aminoacid bazic), poziţia 60 (aminoacid hidrofob, în special fenilalanină sau tirozină). Astfel, în polipeptidele de ActRIIB dezvăluite aici, dezvăluirea redă un cadru de aminoacizi care pot fi conservaţi. Alte poziţii care ar putea fi de dorit să fie conservate sunt următoarele: poziţia 52 (aminoacid acid), poziţia 55 (aminoacid bazic), poziţia 81 (acid), 98 (polar sau cu sarcină, în special E, D, R sau K), totul cu privire la SEQ ID NO: 1.

În anumite modalităţi de realizare, dezvăluirea se referă la complecşi heteromultimeri cu un singur braţ care cuprind cel puţin o polipeptidă ActRIIB, care include fragmente, variante funcţionale şi forme modificate ale acestora. De preferinţă, polipeptidele ActRIIB pentru utilizarea în conformitate cu invenţiile dezvăluirii (de exemplu, complecşi heteromultimeri cu un singur braţ care cuprind o polipeptidă ActRIIB şi utilizări ale acestora) sunt solubile (de exemplu, un domeniu extracelular al ActRIIB). În alte modalităţi de realizare preferate, polipeptidele ActRIIB pentru utilizare în conformitate cu invenţiile din dezvăluire se leagă şi/sau inhibă (antagonizează) activitatea (de exemplu, inducerea semnalizării Smad 2/3 şi/sau Smad 1/5/8) a unuia sau mai multor liganzi ai superfamiliei TGF-beta. În unele modalităţi de realizare, complecşii heteromultimeri cu un singur braţ conform descrierii cuprind cel puţin o polipeptidă ActRIIB care cuprinde, constă sau constă în esenţă dintr-o secvenţă de aminoacizi care este de cel puţin 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, sau 100% identică cu o porţiune a ActRIIB începând de la un rest care corespunde aminoacizilor 20-29 (de exemplu, începând la aminoacidul 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, sau 29) al SEQ ID NO: 1 şi care se termină la poziţia corespunzătoare aminoacizilor 109-134 (de exemplu, se termină la aminoacidul 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, sau 134) al SEQ ID NO: 1. În unele modalităţi de realizare, complecşii heteromultimeri cu un singur braţ conform dezvăluirii cuprind cel puţin o polipeptidă ActRIIB care cuprinde, constă sau constă în esenţă dintr-o secvenţă de aminoacizi care este cel puţin 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, sau 100% identică cu o porţiune a ActRIIB începând de la un rest care corespunde aminoacizilor 20-29 (de exemplu, începând la aminoacidul 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, sau 29) al SEQ ID NO: 1 şi care se termină la poziţia corespunzătoare aminoacizilor 109-134 (de exemplu, se termină la aminoacidul 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, sau 134) al SEQ ID NO: 1, în care poziţia care corespunde la L79 din SEQ ID NO: 1 este un aminoacid acid (adică, un rest de aminoacid D sau E). În anumite modalităţi de realizare preferate, complecşii heteromultimeri cu un singur braţ conform dezvăluirii cuprind cel puţin o polipeptidă ActRIIB care cuprinde, constă sau constă în esenţă dintr-o secvenţă de aminoacizi care este cel puţin 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, sau 100% identică cu aminoacizii 29-109 ai SEQ ID NO: 1. În alte modalităţi de realizare preferate, complecşii heteromultimeri cu un singur braţ conform dezvăluirii cuprind cel puţin o polipeptidă ActRIIB care cuprinde, constă sau constă în esenţă dintr-o secvenţă de aminoacizi care este cel puţin 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, sau 100% identică cu aminoacizii 29-109 ai SEQ ID NO: 1, în care poziţia care corespunde la L79 al SEQ ID NO: 1 este un aminoacid acid (adică, un rest de aminoacid D sau E). În unele modalităţi de realizare, complecşii heteromultimeri cu un singur braţ conform dezvăluirii cuprind cel puţin o polipeptidă ActRIIB care este cel puţin 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, sau 99% identică cu secvenţa de aminoacizi a oricăreia dintre SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 104, 106, 403, sau 404. În unele modalităţi de realizare, complecşii heteromultimeri cu un singur braţ conform dezvăluirii cuprind cel puţin o polipeptidă ActRIIB care este cel puţin 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, sau 99% identică cu secvenţa de aminoacizi a oricăreia dintre SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 104, 106, 403, sau 404, în care poziţia care corespunde la L79 al SEQ ID NO: 1 este un aminoacid acid (adică, un rest de aminoacid D sau E). În unele modalităţi de realizare, complecşii heteromultimeri cu un singur braţ conform dezvăluirii cuprind, constau, sau constau în esenţă din cel puţin o polipeptidă ActRIIB care este cel puţin 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, sau 99% identică cu secvenţa de aminoacizi a oricăreia dintre SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 104, 106, 403, sau 404. În unele modalităţi de realizare, complecşii heteromultimeri cu un singur braţ conform dezvăluirii cuprind, constau sau constau în esenţă din cel puţin o polipeptidă ActRIIB care este cel puţin 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, sau 99% identică cu secvenţa de aminoacizi a oricăreia dintre SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 104, 106, 403, sau 404, în care poziţia care corespunde la L79 a SEQ ID NO: 1 este un aminoacid acid (adică, un rest de aminoacid D sau E).

În anumite modalităţi de realizare, prezenta dezvăluire se referă la un complex proteic care cuprinde o polipeptidă ActRIIA. Aşa cum se utilizează aici, termenul "ActRIIA" se referă la o familie de proteine ale receptorului de activină tip IIA (ActRIIA) de la orice specie şi variante derivate din astfel de proteine ActRIIA prin mutageneză sau altă modificare. Referirea la ActRIIA de aici este înţeleasă a fi o referire la oricare dintre formele identificate curent. Membrii familiei de ActRIIA sunt în general proteine transmembranare, compuse dintr-un domeniu extracelular care leagă ligandul cuprinzând o regiune bogată în cisteină, un domeniu transmembranar şi un domeniu citoplasmatic cu activitate previzibilă de serină/treonină kinază.

Termenul "polipeptidă ActRIIA" include polipeptide care cuprind orice polipeptidă naturală a unui membru al familiei de ActRIIA precum şi orice variante ale acestuia (inclusiv mutanţi, fragmente, fuziuni şi forme peptidomimetice) care păstrează o activitate utilă. Exemple de astfel de variante de polipeptide ActRIIA sunt furnizate pe parcursul prezentei dezvăluiri, precum şi în publicaţia internaţională a cererii de brevet nr. WO 2006/012627. Numerotarea aminoacizilor pentru toate polipeptidele în legătură cu ActRIIA descrise aici se bazează pe numerotarea secvenţei de proteine precursoare de ActRIIA umană redată mai jos (SEQ ID NO: 9), cu excepţia cazului în care este specificat altfel.

Secvenţa de proteine precursoare ActRIIA umană este după cum urmează:

Secvenţa polipeptidică ActRIIA umană extracelulară prelucrată este după cum urmează:

ʺCoadaʺ C-terminală a domeniului extracelular este indicată prin sublinierea cu o singură linie. Secvenţa cu ʺcoadaʺ deletată (o secvenţă Δ15) este după cum urmează:

O secvenţă de acid nucleic care codifică proteina precursoare a ActRIIA umană este prezentată mai jos (SEQ ID NO: 12), corespunzătoare nucleotidelor 159-1700 din secvenţa de referinţă Genbank NM_001616.4. Secvenţa semnalului este subliniată.

Secvenţa de acizi nucleici care codifică polipeptida ActRIIA extracelulară prelucrată este după cum urmează:

O formulă generală pentru o polipeptidă ActRIIA activă (de exemplu, legarea ligandului) este una care cuprinde o polipeptidă care începe de la aminoacidul 30 şi se termină la aminoacidul 110 din SEQ ID NO: 9. În consecinţă, polipeptidele ActRIIA din prezenta dezvăluire pot cuprinde o polipeptidă care este cel puţin 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% sau 100% identică cu aminoacizii 30-110 din SEQ ID NO: 9. Opţional, polipeptide ActRIIA din prezenta dezvăluire cuprind o polipeptidă care este cel puţin 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% sau 100% identică cu aminoacizii aminoacizi 12-82 din SEQ ID NO: 9. opţional începând cu o poziţie cuprinsă între 1-5 (de exemplu, 1, 2, 3, 4, sau 5) sau 3-5 (de exemplu, 3, 4, sau 5) şi se termină într-o poziţie cuprinsă între 110-116 (de exemplu, 110, 111, 112, 113, 114, 115, sau 116) sau 110-115 (de exemplu, 110, 111, 112, 113, 114, sau 115), respectiv, şi care cuprinde nu mai mult de 1, 2, 5, 10 sau 15 modificări conservative de aminoacizi în buzunarul de legare a ligandului şi zero, una sau mai multe modificări neconservative la poziţiile 40, 53, 55, 74, 79 şi/sau 82 în buzunarul de legare a ligandului în raport cu SEQ ID NO: 9.

În anumite modalităţi de realizare, dezvăluirea se referă la complecşii heteromultimeri cu un singur braţ care cuprind cel puţin o polipeptidă ActRIIA, care include fragmente, variante funcţionale şi forme modificate ale acestora. Preferabil, ActRIIA polipeptidele pentru utilizarea în conformitate cu invenţiile din dezvăluire (de exemplu, complecşii heteromultimeri cu un singur braţ care cuprind o polipeptidă ActRIIA şi utilizări ale acestora) sunt solubile (de exemplu, un domeniu extracelular al ActRIIA). În alte modalităţi de realizare preferate, Polipeptidele ActRIIA pentru utilizarea în conformitate cu invenţiile din dezvăluire se leagă şi/sau inhibă (antagonizează) activitatea (de exemplu, inducerea semnalizării Smad 2/3 şi/sau Smad 1/5/8) a unuia sau mai multora dintre liganzii superfamiliei TGF-beta. În unele modalităţi de realizare, complecşii heteromultimeri cu un singur braţ conform dezvăluirii cuprind cel puţin o polipeptidă ActRIIA care este cel puţin 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, sau 99% identică cu secvenţa de aminoacizi a oricăreia dintre SEQ ID NO: 9, 10, 11, 101, 103, 401, sau 402. În unele modalităţi de realizare, complecşii heteromultimeri cu un singur braţ conform dezvăluirii cuprind, constau sau constau în esenţă din cel puţin o polipeptidă ActRIIA care este cel puţin 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, sau 99% identică cu secvenţa de aminoacizi a oricăreia dintre SEQ ID NO: 9, 10, 11, 101, 103, 401, sau 402.

În anumite aspecte, prezenta dezvăluire se referă la complecşi proteici care cuprind o polipeptidă TGFBRII. Aşa cum se utilizează aici, termenul "TGFBRII" se referă la o familie de proteine ale receptorului II a factorului de creştere beta transformator (TGFBRII) din orice specie şi variante derivate din astfel de proteine prin mutageneză sau altă modificare. Referirea de aici la TGFBRII este înţeleasă a fi o referire la oricare dintre formele identificate în prezent. Membrii familiei TGFBRII sunt, în general, proteine transmembranare, compuse dintr-un domeniu extracelular care leagă ligandul cu o regiune bogată în cisteină, un domeniu transmembranar şi un domeniu citoplasmatic cu activitate prezisă de serină/treonină kinază.

Termenul "polipeptidă TGFBRII" include polipeptide care cuprind orice polipeptidă naturală a unui membru al familiei TGFBRII precum şi orice variante ale acestuia (incluzând mutanţi, fragmente, fuziuni şi forme peptidomimetice) care păstrează o activitate utilă. Numerotarea aminoacizilor pentru toate polipeptidele în legătură cu TGFBRII descrise aici se bazează pe numerotarea secvenţei de proteine precursoare umane TGFBRII de mai jos (SEQ ID NO: 42), cu excepţia cazului în care este specificat altfel.

Secvenţa de proteine precursoare de TGFBRII umană canonică (NCBI Ref Seq NP_003233.4) este după cum urmează:

Peptida semnal este indicată prin sublinierea cu o singură linie şi domeniul extracelular este indicat cu litere aldine.

Secvenţa polipeptidică extracelulară TGFBRII prelucrată este după cum urmează:

Secvenţa de acid nucleic care codifică proteina precursoare TGFBRII este prezentată mai jos (SEQ ID NO: 44), corespunzătoare nucleotidelor 383-2083 din secvenţa de referinţă Genbank NM_003242.5. Secvenţa semnalului este subliniată.

Secvenţa de acid nucleic care codifică polipeptida TGFBRII extracelulară prelucrată este după cum urmează:

O izoformă alternativă a TGFBRII, izoforma A (NP_001020018.1), este după cum urmează:

Secvenţa de polipeptidă TGFBRII extracelulară prelucrată (izoforma A) este după cum urmează:

O secvenţă de acid nucleic care codifică proteina precursoare TGFBRII (izoforma A) este prezentată mai jos (SEQ ID NO: 69), fiind corespunzătoare nucleotidelor 383-2158 ale secvenţei de referinţă Genbank NM_001024847.2. Secvenţa semnalului este subliniată.

O secvenţă de acid nucleic care codifică polipeptida TGFBRII prelucrată extracelulară (izoforma A) este după cum urmează:

Oricare dintre următoarele TGFβRII izoforme (SEQ ID NO: 42, 43, 67, şi 68) ar putea încorpora o inserţie de 36 aminoacizii (SEQ ID NO: 95) între perechea resturilor de glutamat (poziţiile 151 şi 152 ale SEQ ID NO: 42; poziţiile 129 şi 130 ale SEQ ID NO: 43; poziţiile 176 şi 177 ale SEQ ID NO: 67; sau poziţiile 154 şi 155 ale SEQ ID NO: 68) localizate aproape de C-terminalul ECD TGFβRII, aşa cum apare natural în izoforma C a TGFβRII (Konrad şi colab., BMC Genomics 8:318, 2007).

GRCKIRHIGS NNRLQRSTCQ NTGWESAHVM KTPGFR (SEQ ID NO: 95)

În anumite modalităţi de realizare, dezvăluirea se referă la complecşii heteromultimeri cu un singur braţ care cuprind cel puţin o polipeptidă TGFBRII, care include fragmente, variante funcţionale şi forme modificate ale acestora. Preferabil, polipeptidele TGFBRII pentru utilizarea în conformitate cu invenţiile din dezvăluire (de exemplu, complecşii heteromultimeri cu un singur braţ care cuprind o polipeptidă TGFBRII şi utilizări ale acestora) sunt solubile (de exemplu, un domeniu extracelular al TGFBRII). În alte modalităţi de realizare preferate, TGFBRII polipeptidele pentru utilizarea în conformitate cu invenţiile din dezvăluire se leagă şi/sau inhibă (antagonizează) activitatea (de exemplu, inducerea semnalizării Smad 2/3 şi/sau Smad 1/5/8) a unuia sau mai multora dintre liganzii superfamiliei TGF-beta. În unele modalităţi de realizare, complecşii heteromultimeri cu un singur braţ conform dezvăluirii cuprind cel puţin o polipeptidă TGFBRII care este cel puţin 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, sau 99% identică cu secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO: 42, 43, 67, 68, 113, 115, 409, sau 410. În unele modalităţi de realizare, complecşii heteromultimeri cu un singur braţ conform dezvăluirii cuprind cel puţin o polipeptidă TGFBRII care este cel puţin 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, sau 99% identică cu oricare dintre secvenţele de aminoacizi ale SEQ ID NO: 42, 43, 67, 68, 113, 115, 409, sau 410, în care este introdusă SEQ ID NO: 95 dintre resturile de glutamat împerecheate aşa cum a fost descris mai sus. În unele modalităţi de realizare, complecşii heteromultimeri cu un singur braţ conform dezvăluirii constau sau constau în esenţă din cel puţin o polipeptidă TGFBRII care este cel puţin 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, sau 99% identică cu secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO: 42, 43, 67, 68, 113, 115, 409, sau 410.

În anumite aspecte, prezenta dezvăluire se referă la complecşi proteici care cuprind o polipeptidă BMPRII. Aşa cum se utilizează aici, termenul "BMPRII" se referă la o familie a receptorului proteinei morfogenetice de tip II din ţesut osos (BMPRII) din orice specie şi variante derivate din astfel de proteine BMPRII prin mutageneză sau altă modificare. Referirea la BMPRII de aici este înţeleasă a fi o referire la oricare dintre formele identificate în prezent. Membrii familiei BMPRII sunt, în general, proteine transmembranare, compuse dintr-un domeniu extracelular care leagă ligandul cu o regiune bogată în cisteină, un domeniu transmembranar şi un domeniu citoplasmatic cu activitate prezisă de serină/treonină kinază.

Termenul "polipeptidă BMPRII" include polipeptide care cuprind orice polipeptidă naturală a unui membru al familiei BMPRII precum şi orice variante ale acestuia (incluzând mutanţi, fragmente, fuziuni şi forme peptidomimetice) care păstrează o activitate utilă. Numerotarea aminoacizilor pentru toate polipeptidele legate de BMPRII descrise aici se bazează pe numerotarea secvenţei proteinei precursoare de BMPRII umană de mai jos (SEQ ID NO: 46), cu excepţia cazului în care este specificat altfel.

Secvenţa canonică a proteinei precursoare de BMPRII uman (NCBI Ref Seq NP_001195.2) este după cum urmează:

Secvenţa de polipeptidă extracelulară BMPRII prelucrată este după cum urmează:

O secvenţă de acid nucleic care codifică proteina precursoare BMPRII este prezentată mai jos (SEQ ID NO: 48), după cum urmează nucleotidele 1149-4262 ale secvenţei de referinţă Genbank NM_001204.6. Secvenţa semnal este subliniată.

Secvenţa de acid nucleic care codifică polipeptida BMPRII extracelulară este după cum urmează:

O izoformă alternativă a BMPRII, izoforma 2 (GenBank: AAA86519.1) este după cum urmează:

Secvenţa polipeptidică a BMPRII extracelulară prelucrată (izoforma 2) este după cum urmează:

O secvenţă de acid nucleic care codifică proteina precursoare BMPRII umană (izoforma 2) este prezentată mai jos (SEQ ID NO: 73), fiind corespunzătoare nucleotidelor 163-1752 ale secvenţei de referinţă Genbank U25110.1. Secvenţa semnal este subliniată.

O secvenţă de acid nucleic care codifică o polipeptidă BMPRII extracelulară (izoforma 2) este după cum urmează:

În anumite modalităţi de realizare, dezvăluirea se referă la complecşii heteromultimeri cu un singur braţ care cuprind cel puţin o polipeptidă BMPRII, care include fragmente, variante funcţionale şi forme modificate ale acestora. Preferabil, BMPRII polipeptidele pentru utilizarea în conformitate cu invenţiile din dezvăluire (de exemplu, complecşii heteromultimeri cu un singur braţ care cuprind o polipeptidă BMPRII şi utilizări ale acestora) sunt solubile (de exemplu, un domeniu extracelular al BMPRII). În alte modalităţi de realizare preferate, polipeptidele BMPRII pentru utilizarea în conformitate cu invenţiile din dezvăluire se leagă şi/sau inhibă (antagonizează) activitatea (de exemplu, inducerea semnalizării Smad 2/3 şi/sau Smad 1/5/8) a unuia sau mai multora dintre liganzii superfamiliei TGF-beta. În unele modalităţi de realizare, complecşii heteromultimeri cu un singur braţ conform dezvăluirii cuprind cel puţin o polipeptidă BMPRII care este cel puţin 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, sau 99% identică cu secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO: 46, 47, 71, 72, 107, 109, 405, sau 406. În unele modalităţi de realizare, complecşii heteromultimeri cu un singur braţ conform dezvăluirii constau sau constau în esenţă din cel puţin o polipeptidă BMPRII care este cel puţin 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, sau 99% identică cu secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO: 46, 47, 71, 72, 107, 109, 405, sau 406.

În anumite aspecte, prezenta dezvăluire se referă la complecşi proteici care cuprind o polipeptidă MISRII. Aşa cum se utilizează aici, termenul "MISRII" se referă la o familie de proteine ale receptorului tip II care inhibă substanţa Mullerian (MISRII) de la orice specii şi variante derivate din astfel de proteine MISRII prin mutageneză sau altă modificare. Referirea aici la MISRII este înţeleasă a fi o referire la oricare dintre formele identificate curent. Membrii familiei MISRII sunt în general proteine transmembranare, compuse dintr-un domeniu extracelular care leagă ligandul cu o regiune bogată în cisteină, un domeniu transmembranar, şi un domeniu citoplasmic cu activitate de serină/treonină kinază prezisă.

Termenul "polipeptidă MISRII" include polipeptidele care cuprind orice polipeptidă care apare natural a unui membru al familiei MISRII precum şi variante ale acestora (incluzând mutanţi, fragmente, fuziuni şi forme peptidomimetice) care păstrează o activitate utilă. Numerotarea aminoacizilor pentru toate polipeptidele MISRII în legătură cu cele descrise aici se bazează pe numerotarea secvenţei proteinei precursoare MISRII umane de mai jos (SEQ ID NO: 50), cu excepţia cazului în care este specificat altfel.

Secvenţa proteinei precursoare MISRII umane canonice (NCBI Ref Seq NP_065434.1) este după cum urmează:

Secvenţa de polipeptidă MISRII prelucrată extracelulară este după cum urmează:

O secvenţă de acid nucleic care codifică proteina precursoare MISRII este prezentată mai jos (SEQ ID NO: 52), fiind corespunzătoare nucleotidelor 81-1799 ale secvenţei de referinţă Genbank NM_020547.2. Secvenţa semnal este subliniată.

O secvenţă de acid nucleic care codifică polipeptida MISRII extracelulară umană este după cum urmează:

O izoformă alternativă a secvenţei proteinei precursoare MISRII umane, izoforma 2 (NCBI Ref Seq NP_001158162.1), este după cum urmează:

Secvenţa de polipeptidă MISRII prelucrată extracelulară (izoforma 2) este după cum urmează:

O secvenţă de acid nucleic care codifică proteina precursoare MISRII (izoforma 2) este prezentată mai jos (SEQ ID NO: 77), fiind corespunzătoare nucleotidelor 81-1514 ale secvenţei de referinţă Genbank NM_001164690.1. Secvenţa semnal este subliniată.

Secvenţa de acid nucleic care codifică polipeptida MISRII umană (extracelulară) solubilă prelucrată (izoforma 2) este după cum urmează:

O izoformă alternativă a secvenţei proteinei precursoare MISRII umane, izoforma 3 (NCBI Ref Seq NP_001158163.1), este după cum urmează:

Secvenţa de polipeptidă MISRII prelucrată extracelulară (izoforma 3) este după cum urmează:

O secvenţă de acid nucleic care codifică proteina precursoare MISRII umană (izoforma 3) este prezentată mai jos (SEQ ID NO: 81), fiind corespunzătoare nucleotidelor 81-1514 ale secvenţei de referinţă Genbank NM_001164691.1. Secvenţa semnal este subliniată.

O secvenţă de acid nucleic care codifică polipeptida MISRII umană (extracelulară) solubilă prelucrată (izoforma 3) este după cum urmează:

În anumite modalităţi de realizare, dezvăluirea se referă la complecşii heteromultimeri cu un singur braţ care cuprind cel puţin o polipeptidă MISRII, care include fragmente, variante funcţionale şi forme modificate ale acestora. Preferabil, polipeptidele MISRII pentru utilizarea în conformitate cu invenţiile din dezvăluire (de exemplu, complecşii heteromultimeri cu un singur braţ care cuprind o polipeptidă MISRII şi utilizări ale acestora) sunt solubile (de exemplu, un domeniu extracelular al MISRII). În alte modalităţi de realizare preferate, polipeptidele MISRII pentru utilizarea în conformitate cu invenţiile din dezvăluire se leagă şi/sau inhibă (antagonizează) activitatea (de exemplu, inducerea semnalizării Smad 2/3 şi/sau Smad 1/5/8) a unuia sau mai multora dintre liganzii superfamiliei TGF-beta. În unele modalităţi de realizare, complecşii heteromultimeri cu un singur braţ conform dezvăluirii cuprind cel puţin o polipeptidă MISRII care este cel puţin 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, sau 99% identică cu secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO: 50, 51, 75, 76, 79, 80, 110, 112, 407, sau 408. În unele modalităţi de realizare, complecşii heteromultimeri cu un singur braţ conform dezvăluirii constau sau constau în esenţă din cel puţin o polipeptidă MISRII care este cel puţin 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, sau 99% identică cu secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO: 50, 51, 75, 76, 79, 80, 110, 112, 407, sau 408.

În anumite aspecte, prezenta dezvăluire se referă la complecşi proteici care cuprind o polipeptidă ALK1. Aşa cum se utilizează aici, termenul "ALK1" se referă la o familie proteine kinază-1 similare receptorului de activină de la orice specii şi variante derivate din astfel de proteine ALK1 prin mutageneză sau altă modificare. Referirea la ALK1 aici este înţeleasă a fi o referire la oricare una dintre formele identificate curent. Membrii familiei ALK1 sunt în general proteine transmembranare, compuse dintr-un domeniu extracelular care leagă ligandul cu o regiune bogată în cisteină, un domeniu transmembranar, şi un domeniu citoplasmic cu activitate de serină/treonină kinază prezisă.

Termenul "polipeptidă ALK1" include polipeptide care cuprind orice polipeptidă care apare natural al unui membru al familiei ALK1 precum şi variante ale acestora (incluzând mutanţi, fragmente, fuziuni şi forme peptidomimetice) care păstrează o activitate utilă. Numerotarea aminoacizilor pentru toate polipeptidele ALK1 în legătură cu descrise aici se bazează pe numerotarea secvenţei ALK1 umane de mai jos a proteinei precursoare (SEQ ID NO: 14), cu excepţia cazului în care este specificat altfel.

Secvenţa proteinei precursoare ALK1 umane (NCBI Ref Seq NP_000011.2) este după cum urmează:

Secvenţa de polipeptidă ALK1 extracelulară prelucrată este după cum urmează:

O secvenţă de acid nucleic care codifică proteina precursoare ALK1 umană este prezentată mai jos (SEQ ID NO: 16), fiind corespunzătoare nucleotidelor 284-1792 ale secvenţei de referinţă Genbank NM_000020.2. Secvenţa semnal este subliniată.

O secvenţă de acid nucleic care codifică polipeptida ALK1 extracelulară prelucrată este după cum urmează:

În anumite modalităţi de realizare, dezvăluirea se referă la complecşii heteromultimeri cu un singur braţ care cuprind cel puţin o polipeptidă ALK1, care include fragmente, variante funcţionale şi forme modificate ale acestora. Preferabil, polipeptidele ALK1 pentru utilizarea în conformitate cu invenţiile din dezvăluire (de exemplu, complecşii heteromultimeri cu un singur braţ care cuprind o polipeptidă ALK1 şi utilizări ale acestora) sunt solubile (de exemplu, un domeniu extracelular al ALK1). În alte modalităţi de realizare preferate, polipeptidele ALK1 pentru utilizarea în conformitate cu invenţiile din dezvăluire se leagă şi/sau inhibă (antagonizează) activitatea (de exemplu, inducerea semnalizării Smad 2/3 şi/sau Smad 1/5/8) a unuia sau mai multora dintre liganzii superfamiliei TGF-beta. În unele modalităţi de realizare, complecşii heteromultimeri cu un singur braţ conform dezvăluirii cuprind cel puţin o polipeptidă ALK1 care este cel puţin 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, sau 99% identică cu secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO: 14, 15, 116, 118, 411, sau 412. În unele modalităţi de realizare, complecşii heteromultimeri cu un singur braţ conform dezvăluirii constau sau constau în esenţă din cel puţin o polipeptidă ALK1 care este cel puţin 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, sau 99% identică cu secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO: 14, 15, 116, 118, 411, sau 412.

În anumite aspecte, prezenta dezvăluire se referă la complecşi proteici care cuprind o polipeptidă ALK2. Aşa cum se utilizează aici, termenul "ALK2" se referă la o familie de proteine kinaze-2 similare receptorului de activină de la orice specii şi variante derivate din astfel de proteine ALK2 prin mutageneză sau altă modificare. Referirea de aici la ALK2 este înţeleasă a fi o referire la oricare dintre formele identificate curent. Membrii familiei ALK2 sunt în general proteine transmembranare, compuse dintr-un domeniu extracelular care leagă ligandul cu o regiune bogată în cisteină, un domeniu transmembranar, şi un domeniu citoplasmic cu activitate de serină/treonină kinază prezisă.

Termenul "polipeptidă ALK2" include polipeptidele care cuprind orice polipeptidă care apare natural a unui membru al familiei ALK2 precum şi variante ale acestora (incluzând mutanţi, fragmente, fuziuni şi forme peptidomimetice) care păstrează o activitate utilă. Numerotarea aminoacizilor pentru toate polipeptidele în legătură cu ALK2 descrise aici se bazează pe numerotarea secvenţei de mai jos a proteinei precursoare ALK2 umane (SEQ ID NO: 18), cu excepţia cazului în care este specificat altfel.

Secvenţa proteinei precursoare ALK2 umane (NCBI Ref Seq NP_001096.1) este după cum urmează:

Secvenţa de polipeptidă ALK2 prelucrată extracelulară este după cum urmează:

O secvenţă de acid nucleic care codifică proteina precursoare ALK2 umană este prezentată mai jos (SEQ ID NO: 20), fiind corespunzătoare nucleotidelor 431-1957 ale secvenţei de referinţă Genbank NM_001105.4. Secvenţa semnal este subliniată.

O secvenţă de acid nucleic care codifică polipeptidă ALK2 extracelulară este după cum urmează:

În anumite modalităţi de realizare, dezvăluirea se referă la complecşii heteromultimeri cu un singur braţ care cuprind cel puţin o polipeptidă ALK2, care include fragmente, variante funcţionale şi forme modificate ale acestora. Preferabil, polipeptidele ALK2 pentru utilizarea în conformitate cu invenţiile din dezvăluire (de exemplu, complecşii heteromultimeri cu un singur braţ care cuprind o polipeptidă ALK2 şi utilizări ale acestora) sunt solubile (de exemplu, un domeniu extracelular al ALK2). În alte modalităţi de realizare preferate, polipeptidele ALK2 pentru utilizarea în conformitate cu invenţiile din dezvăluire se leagă şi/sau inhibă (antagonizează) activitatea (de exemplu, inducerea semnalizării Smad 2/3 şi/sau Smad 1/5/8) a unuia sau mai multora dintre liganzii superfamiliei TGF-beta. În unele modalităţi de realizare, complecşii heteromultimeri cu un singur braţ conform dezvăluirii cuprind cel puţin o polipeptidă ALK2 care este cel puţin 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, sau 99% identică cu secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO: 18, 19, 119, 121, 413, sau 414. În unele modalităţi de realizare, complecşii heteromultimeri cu un singur braţ conform dezvăluirii constau sau constau în esenţă din cel puţin o polipeptidă ALK2 care este cel puţin 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, sau 99% identică cu secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO: 18, 19, 119, 121, 413, sau 414.

În anumite aspecte, prezenta dezvăluire se referă la complecşi proteici care cuprind o polipeptidă ALK3. Aşa cum se utilizează aici, termenul "ALK3" se referă la o familie de proteine kinaze-3 similare receptorului de activină de la orice specii şi variante derivate din astfel proteine ALK3 prin mutageneză sau altă modificare. Referirea la ALK3 de aici este înţeleasă a fi o referire la oricare dintre formele identificate curent. Membrii familiei ALK3 sunt în general proteine transmembranare, compuse dintr-un domeniu extracelular care leagă ligandul cu o regiune bogată în cisteină, un domeniu transmembranar, şi un domeniu citoplasmic cu activitate de serină/treonină kinază prezisă.

Termenul "polipeptidă ALK3" include polipeptidele care cuprind orice polipeptidă care apare natural a unui membru al familiei ALK3 precum şi variante ale acestora (incluzând mutanţi, fragmente, fuziuni şi forme peptidomimetice) care păstrează o activitate utilă. Numerotarea aminoacizilor pentru toate polipeptidele în legătură cu ALK3 descrise aici se bazează pe numerotarea secvenţei de mai jos a proteinei precursoare ALK3 umane (SEQ ID NO: 22), cu excepţia cazului în care este specificat altfel.

Secvenţa proteinei precursoare umane ALK3 (NCBI Ref Seq NP_004320.2) este după cum urmează:

Secvenţa de polipeptidă ALK3 prelucrată extracelulară este după cum urmează:

O secvenţă de acid nucleic care codifică proteina precursoare ALK3 umană este prezentată mai jos (SEQ ID NO: 24), fiind corespunzătoare nucleotidelor 549-2144 ale secvenţei de referinţă Genbank NM_004329.2. Secvenţa semnal este subliniată şi domeniul extracelular este indicat cu litere aldine.

O secvenţă de acid nucleic care codifică polipeptida ALK3 umană extracelulară este după cum urmează:

O formulă generală pentru o polipeptidă ALK3 activă (de exemplu, care leagă un ligand) este una care cuprinde o polipeptidă care începe la orice poziţie a unui aminoacid 25-31 (adică, poziţia 25, 26, 27, 28, 29, 30, sau 31) a SEQ ID NO: 22 şi se termină la orice poziţie a unui aminoacid 140-152 a SEQ ID NO: 22 (adică, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, sau 152). Vezi Brevetul U.S. 8.338.377.

În anumite modalităţi de realizare, dezvăluirea se referă la complecşii heteromultimeri cu un singur braţ care cuprind cel puţin o polipeptidă ALK3, care include fragmente, variante funcţionale şi forme modificate ale acestora. Preferabil, polipeptidele ALK3 pentru utilizarea în conformitate cu invenţiile din dezvăluire (de exemplu, complecşii heteromultimeri cu un singur braţ care cuprind o polipeptidă ALK3 şi utilizări ale acestora) sunt solubile (de exemplu, un domeniu extracelular al ALK3). În alte modalităţi de realizare preferate, polipeptidele ALK3 pentru utilizarea în conformitate cu invenţiile din dezvăluire se leagă şi/sau inhibă (antagonizează) activitatea (de exemplu, inducerea semnalizării Smad 2/3 şi/sau Smad 1/5/8) a unuia sau mai multora dintre liganzii superfamiliei TGF-beta. În unele modalităţi de realizare, complecşii heteromultimeri cu un singur braţ conform dezvăluirii cuprind cel puţin o polipeptidă ALK3 care cuprinde, constă sau constă în esenţă dintr-un aminoacid care începe la orice poziţie a unui aminoacid 25-31 (adică, poziţia 25, 26, 27, 28, 29, 30, sau 31) a SEQ ID NO: 22 şi se termină la orice poziţie a unui aminoacid 140-153 of SEQ ID NO: 22 (adică, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, sau 152) a SEQ ID NO: 22. În unele modalităţi de realizare, complecşii heteromultimeri cu un singur braţ conform dezvăluirii cuprind cel puţin o polipeptidă ALK3 care este cel puţin 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, sau 99% identică cu secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO: 22, 23, 122, 124, 415, sau 416. În unele modalităţi de realizare, complecşii heteromultimeri cu un singur braţ conform dezvăluirii constau sau constau în esenţă din cel puţin o polipeptidă ALK3 care este cel puţin 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, sau 99% identică cu secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO: 22, 23, 122, 124, 415, sau 416.

În anumite aspecte, prezenta dezvăluire se referă la complecşi proteici care cuprind o polipeptidă ALK4. Aşa cum se utilizează aici, termenul "ALK4" se referă la o familie de proteine kinaze-4 similare receptorului de activină de la orice specii şi variante derivate din astfel de proteine ALK4 prin mutageneză sau altă modificare. Referirea la ALK4 este înţeleasă aici a fi o referire la oricare dintre formele identificate curent. Membrii familiei ALK4 sunt în general proteine transmembranare, compuse dintr-un domeniu extracelular care leagă ligandul cu o regiune bogată în cisteină, un domeniu transmembranar, şi un domeniu citoplasmic cu activitate de serină/treonină kinază prezisă.

Termenul "polipeptidă ALK4" include polipeptide care cuprind orice polipeptidă care apare natural a unui membru al familiei ALK4 precum şi variante ale acestora (incluzând mutanţi, fragmente, fuziuni şi forme peptidomimetice) care păstrează o activitate utilă. Numerotarea aminoacizilor pentru toate polipeptidele în legătură cu ALK4 descrise aici se bazează pe numerotarea secvenţei de mai jos a proteinei precursoare ALK4 umane (SEQ ID NO: 26), cu excepţia cazului în care este specificat altfel.

Secvenţa de proteină a precursorului ALK4 canonic uman (izoforma A, NCBI Ref Seq NP_004293) este după cum urmează:

Secvenţa de polipeptidă ALK4 umană prelucrată extracelulară este după cum urmează:

O secvenţă de acid nucleic care codifică proteina precursoare ALK4 este prezentată mai jos (SEQ ID NO: 28), fiind corespunzătoare nucleotidelor 78-1592 ale secvenţei de referinţă Genbank NM_004302.4. Secvenţa semnal este subliniată şi domeniul extracelular este indicat prin litere aldine.

O secvenţă de acid nucleic care codifică polipeptida ALK4 extracelulară este după cum urmează:

O izoformă alternativă a precursorului ALK4 uman, izoforma B (NCBI Ref Seq NP_064732.3), este după cum urmează:

Domeniul extracelular este indicat prin litere aldine.

Secvenţa de polipeptidă ALK4 extracelulară (izoforma B) este după cum urmează:

O secvenţă de acid nucleic care codifică izoforma B a proteinei precursoare ALK4 este prezentată mai jos (SEQ ID NO: 85), fiind corespunzătoare nucleotidelor 186-1547 ale secvenţei de referinţă Genbank NM_020327.3. Domeniul extracelular este indicat prin litere aldine.

O secvenţă de acid nucleic care codifică domeniul extracelular al polipeptidei ALK4 (izoforma B) este după cum urmează:

În anumite modalităţi de realizare, dezvăluirea se referă la complecşii heteromultimeri cu un singur braţ care cuprind cel puţin o polipeptidă ALK4, care include fragmente, variante funcţionale şi forme modificate ale acestora. Preferabil, polipeptidele ALK4 pentru utilizarea în conformitate cu invenţiile din dezvăluire (de exemplu, complecşii heteromultimeri cu un singur braţ care cuprind o polipeptidă ALK4 şi utilizări ale acestora) sunt solubile (de exemplu, un domeniu extracelular al ALK4). În alte modalităţi de realizare preferate, polipeptidele ALK4 pentru utilizarea în conformitate cu invenţiile din dezvăluire se leagă şi/sau inhibă (antagonizează) activitatea (de exemplu, inducerea semnalizării Smad 2/3 şi/sau Smad 1/5/8) a unuia sau mai multora dintre liganzii superfamiliei TGF-beta. În unele modalităţi de realizare, complecşii heteromultimeri cu un singur braţ conform dezvăluirii cuprind cel puţin o polipeptidă ALK4 care este cel puţin 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, sau 99% identică cu secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO: 26, 27, 83, 84, 125, 127, 417, sau 418. În unele modalităţi de realizare, complecşii heteromultimeri cu un singur braţ conform dezvăluirii constau sau constau în esenţă din cel puţin o polipeptidă ALK4 care este cel puţin 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, sau 99% identică cu secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO: 26, 27, 83, 84, 125, 127, 417, sau 418.

În anumite aspecte, prezenta dezvăluire se referă la complecşi proteici care cuprind o polipeptidă ALK5. Aşa cum se utilizează aici, termenul "ALK5" se referă la o familie de proteine kinaze-5 similare receptorului de activină de la orice specii şi variante derivate din astfel de proteine ALK4 prin mutageneză sau altă modificare. Referirea la ALK5 este înţeleasă aici a fi o referire la oricare dintre formele identificate curent. Membrii familiei ALK5 sunt în general proteine transmembranare, compuse dintr-un domeniu extracelular care leagă ligandul cu o regiune bogată în cisteină, un domeniu transmembranar, şi un domeniu citoplasmic cu activitate de serină/treonină kinază prezisă.

Termenul "polipeptidă ALK5" include polipeptidele care cuprind orice polipeptidă care apare natural a unui membru al familiei ALK5 precum şi variante ale acestora (incluzând mutanţi, fragmente, fuziuni şi forme peptidomimetice) care păstrează o activitate utilă. Numerotarea aminoacizilor pentru toate polipeptidele în legătură cu ALK5 descrise aici se bazează pe numerotarea secvenţei proteinei precursoare ALK5 umane de mai jos a (SEQ ID NO: 30), cu excepţia cazului în care este specificat altfel.

Secvenţa proteinei precursoare ALK5 umane canonice (NCBI Ref Seq NP_004603.1) este după cum urmează:

Secvenţa de polipeptidă ALK5 extracelulară prelucrată este după cum urmează:

O secvenţă de acid nucleic care codifică proteina precursoare ALK5 este prezentată mai jos (SEQ ID NO: 32), fiind corespunzătoare nucleotidelor 77-1585 ale secvenţei de referinţă Genbank NM_004612.2. Secvenţa semnal este subliniată şi domeniul extracelular este indicat prin litere aldine.

O secvenţă de acid nucleic care codifică polipeptida ALK5 umană extracelulară este după cum urmează:

O izoformă alternativă secvenţei proteinei precursoare ALK5 umane, izoforma 2 (NCBI Ref Seq XP_005252207.1), este după cum urmează:

Secvenţa de polipeptidă ALK5 extracelulară prelucrată (izoforma 2) este după cum urmează:

O secvenţă de acid nucleic care codifică proteina precursoare ALK5 umană (izoforma 2) este prezentată mai jos (SEQ ID NO: 89), fiind corespunzătoare nucleotidelor 77-1597 ale secvenţei de referinţă Genbank XM_005252150.1. Secvenţa semnal este subliniată şi domeniul extracelular este indicat prin litere aldine.

O secvenţă de acid nucleic care codifică polipeptida ALK5 extracelulară prelucrată este după cum urmează:

În anumite modalităţi de realizare, dezvăluirea se referă la complecşii heteromultimeri cu un singur braţ care cuprind cel puţin o polipeptidă ALK5, care include fragmente, variante funcţionale şi forme modificate ale acestora. Preferabil, polipeptidele ALK5 pentru utilizarea în conformitate cu invenţiile din dezvăluire (de exemplu, complecşii heteromultimeri cu un singur braţ care cuprind o polipeptidă ALK5 şi utilizări ale acestora) sunt solubile (de exemplu, un domeniu extracelular al ALK5). În alte modalităţi de realizare preferate, polipeptidele ALK5 pentru utilizarea în conformitate cu invenţiile din dezvăluire se leagă şi/sau inhibă (antagonizează) activitatea (de exemplu, inducerea semnalizării Smad 2/3 şi/sau Smad 1/5/8) a unuia sau mai multora dintre liganzii superfamiliei TGF-beta. În unele modalităţi de realizare, complecşii heteromultimeri cu un singur braţ conform dezvăluirii cuprind cel puţin o polipeptidă ALK5 care este cel puţin 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, sau 99% identică cu secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO: 30, 31, 87, 88, 128, 130, 419, sau 420. În unele modalităţi de realizare, complecşii heteromultimeri cu un singur braţ conform dezvăluirii constau sau constau în esenţă din cel puţin o polipeptidă ALK5 care este cel puţin 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, sau 99% identică cu secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO: 30, 31, 87, 88, 128, 130, 419, sau 420.

În anumite aspecte, prezenta dezvăluire se referă la complecşi proteici care cuprind o polipeptidă ALK6. Aşa cum se utilizează aici, termenul "ALK6" se referă la o familie de proteine kinaze-6 similare receptorului de activină de la orice specii şi variante derivate din astfel de proteine ALK6 prin mutageneză sau altă modificare. Referirea la ALK6 este înţeleasă aici a fi o referire la oricare dintre formele identificate curent. Membrii familiei ALK6 sunt în general proteine transmembranare, compuse dintr-un domeniu extracelular care leagă ligandul cu o regiune bogată în cisteină, un domeniu transmembranar, şi un domeniu citoplasmic cu activitate de serină/treonină kinază prezisă.

Termenul "polipeptidă ALK6" include polipeptidele care cuprind orice polipeptidă care apare natural a unui membru al familiei ALK6 precum şi variante ale acestora (incluzând mutanţi, fragmente, fuziuni şi forme peptidomimetice) care păstrează o activitate utilă. Numerotarea aminoacizilor pentru toate polipeptidele în legătură cu ALK6 descrise aici se bazează pe numerotarea secvenţei proteinei precursoare de ALK6 umane de mai jos (SEQ ID NO: 34), cu excepţia cazului în care este specificat altfel.

Secvenţa proteinei precursoare ALK6 umane canonice (NCBI Ref Seq NP_001194.1) este după cum urmează:

Secvenţa de polipeptidă ALK6 extracelulară prelucrată este după cum urmează:

O secvenţă de acid nucleic care codifică proteina precursoare ALK6 este prezentată mai jos (SEQ ID NO: 36), fiind corespunzătoare nucleotidelor 275-1780 ale secvenţei de referinţă Genbank NM_001203.2. Secvenţa semnal este subliniată şi domeniul extracelular este indicat prin litere aldine.

O secvenţă de acid nucleic care codifică prelucrată extracelulară ALK6 polipeptidă este după cum urmează:

O izoformă alternativă a secvenţei proteinei precursoare ALK6 umane, izoforma 2 (NCBI Ref Seq NP_001243722.1) este după cum urmează:

Secvenţa de polipeptidă ALK6 extracelulară prelucrată (izoforma 2) este după cum urmează:

O secvenţă de acid nucleic care codifică proteina precursoare ALK6 umană (izoforma 2) este prezentată mai jos, fiind corespunzătoare nucleotidelor 22-1617 ale secvenţei de referinţă Genbank NM_001256793.1. Secvenţa semnal este subliniată şi domeniul extracelular este indicat cu litere aldine.

O secvenţă de acid nucleic care codifică polipeptidă ALK6 extracelulară prelucrată este după cum urmează:

În anumite modalităţi de realizare, dezvăluirea se referă la complecşii heteromultimeri cu un singur braţ care cuprind cel puţin o polipeptidă ALK6, care include fragmente, variante funcţionale şi forme modificate ale acestora. Preferabil, polipeptidele ALK6 pentru utilizarea în conformitate cu invenţiile din dezvăluire (de exemplu, complecşii heteromultimeri cu un singur braţ care cuprind o polipeptidă ALK6 şi utilizări ale acestora) sunt solubile (de exemplu, un domeniu extracelular al ALK6). În alte modalităţi de realizare preferate, polipeptidele ALK6 pentru utilizarea în conformitate cu invenţiile din dezvăluire se leagă şi/sau inhibă (antagonizează) activitatea (de exemplu, inducerea semnalizării Smad 2/3 şi/sau Smad 1/5/8) a unuia sau mai multora dintre liganzii superfamiliei TGF-beta. În unele modalităţi de realizare, complecşii heteromultimeri cu un singur braţ conform dezvăluirii cuprind cel puţin o polipeptidă ALK6 care este cel puţin 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, sau 99% identică cu secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO: 34, 35, 91, 92, 131, 133, 421, sau 422. În unele modalităţi de realizare, complecşii heteromultimeri cu un singur braţ conform dezvăluirii constau sau constau în esenţă din cel puţin o polipeptidă ALK6 care este cel puţin 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, sau 99% identică cu secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO: 34, 35, 91, 92, 131, 133, 421, sau 422.

În anumite aspecte, prezenta dezvăluire se referă la complecşi proteici care cuprind o polipeptidă ALK7. Aşa cum se utilizează aici, termenul "ALK7" se referă la o familie proteine kinaze-7 similare receptorului de activină de la orice specii şi variante derivate din astfel proteine ALK7 prin mutageneză sau altă modificare. Referirea la ALK7 este înţeleasă aici a fi o referire la oricare una dintre formele identificate curent. Membrii familiei ALK7 sunt în general proteine transmembranare, compuse dintr-un domeniu extracelular care leagă ligandul cu o regiune bogată în cisteină, un domeniu transmembranar, şi un domeniu citoplasmic cu activitate de serină/treonină kinază prezisă.

Termenul "polipeptidă ALK7" include polipeptidele care cuprind orice polipeptidă care apare natural a unui membru al familiei ALK7 precum şi orice variante ale acestora (incluzând mutanţi, fragmente, fuziuni şi forme peptidomimetice) care păstrează o activitate utilă. Numerotarea aminoacizilor pentru toate polipeptidele în legătură cu ALK7 descrise aici se bazează pe numerotarea secvenţei de mai jos a proteinei precursoare ALK7 umane (SEQ ID NO: 38), cu excepţia cazului în care este specificat altfel.

Unele izoforme care apar natural ale ALK7 umane au fost descrise. Secvenţa proteinei precursoare a izoformei 1 a ALK7 umane canonice (NCBI Ref Seq NP_660302.2) este după cum urmează:

Secvenţa de polipeptidă a izoformei 1 a ALK7 extracelulară prelucrată este după cum urmează:

O secvenţă de acid nucleic care codifică proteina precursoare a izoformei 1 a ALK7 umane este prezentată mai jos (SEQ ID NO: 40), fiind corespunzătoare nucleotidelor 244-1722 ale secvenţei de referinţă Genbank NM_145259.2. Secvenţa semnal este subliniată şi domeniul extracelular este indicat prin litere aldine.

O secvenţă de acid nucleic care codifică polipeptida ALK7 (izoforma 1) extracelulară prelucrată este după cum urmează:

Secvenţa de aminoacizi a unei izoforme alternative a ALK7 umane, izoforma 2 (NCBI Ref Seq NP_001 104501.1), este prezentată în forma sa prelucrată după cum urmează (SEQ ID NO: 301), în care domeniul extracelular este indicat prin litere aldine.

1 MLTNGKEQVI KSCVSLPELN AQVFCHSSNN VTKTECCFTD FCNNITLHLP TASPNAPKLG

Secvenţa de aminoacizi a polipeptidei ALK7 extracelulare (izoforma 2) este după cum urmează:

MLTNGKEQVIKSCVSLPELNAQVFCHSSNNVTKTECCFTDFCNNITLHLPTASPNAPKLGPME (SEQ ID NO: 302).

O secvenţă de acid nucleic care codifică polipeptida ALK7 prelucrată (izoforma 2) este prezentată mai jos (SEQ ID NO: 303), fiind corespunzătoare nucleotidelor 279-1607 ale secvenţei de referinţă NCBI NM_001111031.1. Domeniul extracelular este indicat prin litere aldine.

O secvenţă de acid nucleic care codifică polipeptida ALK7 extracelulară (izoforma 2) este după cum urmează (SEQ ID NO: 304):

Secvenţa de aminoacizi a unei proteine precursoare ALK7 alternative umane, izoforma 3 (NCBI Ref Seq NP_001104502.1), este prezentată după cum urmează (SEQ ID NO: 305), în care peptida semnal este indicată prin sublinierea cu o singură linie.

Secvenţa de aminoacizi a polipeptidei ALK7 prelucrate (izoforma 3) este după cum urmează (SEQ ID NO: 306). Această izoformă este lipsită de un domeniu transmembranar şi este ca urmare propusă a fi solubilă în întregimea sa (Roberts şi colab., 2003, Biol Reprod 68:1719-1726). Variantele N-terminale ale SEQ ID NO: 306 sunt prezise aşa cum este explicat mai jos.

O secvenţă de acid nucleic care codifică proteina precursoare a polipeptidei ALK7 neprelucrate (izoforma 3) este prezentată mai jos (SEQ ID NO: 307), fiind corespunzătoare nucleotidelor 244-1482 ale secvenţei de referinţă NCBI NM_001111032.1. Secvenţa semnal este indicată prin sublinierea cu linie plină.

O secvenţă de acid nucleic care codifică polipeptida ALK7 prelucrată (izoforma 3) este după cum urmează (SEQ ID NO: 308):

Secvenţa de aminoacizi a unei proteine precursoare ALK7 alternative umane, izoforma 4 (NCBI Ref Seq NP_001104503.1), este prezentată după cum urmează (SEQ ID NO: 309), în care peptida semnal este indicată prin sublinierea cu o singură linie.

Secvenţa de aminoacizi a polipeptidei ALK7 prelucrate (izoforma 4) este după cum urmează (SEQ ID NO: 310). La fel ca ALK7 izoforma 3, izoforma 4 este lipsită de un domeniu transmembranar şi este ca atare propusă a fi solubilă în întregimea sa (Roberts şi colab., 2003, Biol Reprod 68:1719-1726). Variantele N-terminale ale SEQ ID NO: 310 sunt prezise aşa cum este explicat mai jos.

O secvenţă de acid nucleic care codifică proteina precursoare a polipeptidei ALK7 neprelucrate (izoforma 4) este prezentată mai jos (SEQ ID NO: 311), fiind corespunzătoare nucleotidelor 244-1244 ale secvenţei de referinţă NCBI NM_001111033.1. Secvenţa semnal este indicată prin sublinierea cu linie plină.

O secvenţă de acid nucleic care codifică polipeptida ALK7 prelucrată (izoforma 4) este după cum urmează (SEQ ID NO: 312):

Pe baza secvenţei semnal a ALK7 cu lungime întreagă (izoforma 1) la şobolan (vezi Secvenţei de referinţă NCBI NP_620790.1) şi a gradului ridicat de identitate a secvenţei dintre ALK7 uman şi de şobolan, se prezice că o formă prelucrată de ALK7 umană izoforma 1 este după cum urmează (SEQ ID NO: 313).

Sunt prezise variantele active ale izoformei 1 prelucrate a ALK7 în care SEQ ID NO: 39 este trunchiată cu 1, 2, 3, 4, 5, 6 sau 7 aminoacizi la capătul N-terminal şi SEQ ID NO: 313 este trunchiată cu 1 sau 2 aminoacizi la capătul N-terminal. În concordanţă cu SEQ ID NO. 313, este de aşteptat ca leucina să fie aminoacidul N-terminal în formele prelucrate ale izoformei 3 a ALK7 umane (SEQ ID NO: 306) şi izoformei 4 a ALK7 umane (SEQ ID NO: 310).

În anumite modalităţi de realizare, dezvăluirea se referă la complecşii heteromultimeri cu un singur braţ care cuprind cel puţin o polipeptidă ALK7, care include fragmente, variante funcţionale şi forme modificate ale acestora. Preferabil, polipeptidele ALK7 pentru utilizarea în conformitate cu invenţiile din dezvăluire (deexemplu, complecşii heteromultimeri cu un singur braţ care cuprind o polipeptidă ALK7 şi utilizări ale acestora) sunt solubile (de exemplu, un domeniu extracelular al ALK7). În alte modalităţi de realizare preferate, polipeptidele ALK7 pentru utilizarea în conformitate cu invenţiile din dezvăluire se leagă şi/sau inhibă (antagonizează) activitatea (de exemplu, inducerea semnalizării Smad 2/3 şi/sau Smad 1/5/8) a unuia sau mai multora dintre liganzii superfamiliei TGF-beta. În unele modalităţi de realizare, complecşii heteromultimeri cu un singur braţ conform dezvăluirii cuprind cel puţin o polipeptidă ALK7 care este cel puţin 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, sau 99% identică cu secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO: 38, 39, 134, 136, 301, 302, 305, 306, 309, 310, 313, 423, sau 424. În unele modalităţi de realizare, complecşii heteromultimeri cu un singur braţ conform dezvăluirii constau sau constau în esenţă din cel puţin o polipeptidă ALK7 care este cel puţin 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, sau 99% identică cu secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO: 38, 39, 134, 136, 301, 302, 305, 306, 309, 310, 313, 423, sau 424.

În unele modalităţi de realizare, prezenta dezvăluire are în vedere realizarea unor variante funcţionale prin modificarea structurii unei polipeptide a receptorului de tip I a superfamiliei TGF-beta (de exemplu, ALK1, ALK2, ALK3, ALK4, ALK5, ALK6, şi ALK7) sau o polipeptidă a receptorului tip II a superfamiliei TGF-beta (de exemplu, ActRIIA, ActRIIB, TGFBRII, BMPRII, şi MISRII) în scopuri precum îmbunătăţirea eficacităţii terapeutice sau a stabilităţii (de exemplu, termen de valabilitate şi rezistenţă la degradarea proteolitică in vivo). Variantele pot fi produse prin substituţie, deleţie, adiţie de aminoacizi sau combinaţii ale acestora. De exemplu, este rezonabil de aşteptat ca o înlocuire izolată a unei leucine cu o izoleucină sau valină, a unui aspartat cu un glutamat, a unei treonine cu o serină sau o înlocuire similară al unui aminoacid cu un aminoacid înrudit structural (de exemplu, mutaţii conservative) să nu aibă un efect major asupra activităţii biologice a moleculei rezultate. Înlocuirile conservative sunt cele care au loc într-o familie de aminoacizi care sunt înrudiţi în lanţurile lor laterale. Dacă o schimbare în secvenţa de aminoacizi a unei polipeptide din dezvăluire are ca rezultat într-un omolog funcţional poate fi uşor de determinat prin evaluarea capacităţii polipeptidei variante de a produce un răspuns în celule într-un mod similar cu polipeptida de tip sălbatic sau să se lege la unul sau mai mulţi liganzi TGF-beta, incluzând, de exemplu, BMP2, BMP2/7, BMP3, BMP4, BMP4/7, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8a, BMP8b, BMP9, BMP10, GDF3, GDF5, GDF6/BMP13, GDF7, GDF8, GDF9b/BMP15, GDF11/BMP11, GDF15/MIC1, TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, nodal, GDNF, neurturina, artemina, persefina, MIS, şi Lefty.

În anumite modalităţi de realizare, prezenta dezvăluire are în vedere mutaţiile specifice a unei polipeptide a receptorului de tip I a superfamiliei TGF-beta (de exemplu, ALK1, ALK2, ALK3, ALK4, ALK5, ALK6, şi ALK7) sau a unei polipeptide a receptorului de tip II a superfamiliei TGF-beta (de exemplu, ActRIIA, ActRIIB, TGFBRII, BMPRII, şi MISRII) conform dezvăluirii astfel încât să se modifice glicozilarea polipeptidei. Astfel de mutaţii pot fi selectate astfel încât să introducă sau să elimine unul sau mai multe situsuri de glicozilare, cum ar fi situsurile de glicozilare O-legate sau N-legate. Situsurile de recunoaştere a glicozilării legate de asparagină cuprind în general o secvenţă tripeptidică, asparagină-X-treonină sau asparagină-X-serină (unde ʺXʺ este orice aminoacid) care este recunoscut specific de enzime de glicozilare celulare adecvate. Modificarea poate fi făcută, de asemenea, prin adăugarea substituirea cu unul sau mai multe resturi de serină sau treonină în secvenţa polipeptidei (pentru situsurile de glicozilare legate de O). O varietate de substituţii sau deleţii de aminoacizi la una sau ambele din prima sau a treia poziţie de aminoacid a unui situs de recunoaştere a glicozilării (şi/sau deleţia aminoacizilor din a doua poziţie) are ca rezultat neglicozilarea la secvenţa de tripeptidă modificată. Un alt mijloc de creştere a numărului de fragmente de carbohidraţi pe o polipeptidă este prin cuplarea chimică sau enzimatică a glicozidelor la polipeptidă. În funcţie de modul de cuplare utilizat, zahărul(zaharurile) poate fi ataşat la (a) arginină şi histidină; (b) grupări carboxil libere; (c) grupări sulfhidril libere, cum ar fi cele ale cisteinei; (d) grupări hidroxil libere, cum ar fi cele ale serinei, treoninei sau hidroxiprolinei; (e) resturi aromatice cum ar fi cele de fenilalanină, tirozină sau triptofan; sau (f) gruparea amidică a glutaminei. Îndepărtarea unuia sau mai multor fragmente de carbohidraţi prezente pe o polipeptidă poate fi realizată chimic şi/sau enzimatic. Deglicozilarea chimică poate implica, de exemplu, expunerea unei polipeptide la compusul acid trifluorometansulfonic sau la un compus echivalent. Acest tratament are ca rezultat clivarea majorităţii sau a tuturor zaharurilor, cu excepţia zahărului de legătură (N-acetilglucozamina sau N-acetilgalactozamina), lăsând în acelaşi timp intactă secvenţa de aminoacizi. Clivarea enzimatică a fragmentelor de carbohidraţi de pe polipeptide poate fi realizată prin utilizarea unei varietăţi de endo- şi exo-glicozidaze, aşa cum este descris de Thotakura şi colab. [Meth. Enzymol. (1987) 138:350]. Secvenţa unei polipeptide poate fi ajustată, după caz, în funcţie de tipul de sistem de exprimare utilizat, deoarece celulele de mamifere, drojdie, insecte şi plante pot introduce modele diferite de glicozilare care pot fi afectate de secvenţa de aminoacizi a peptidei. În general, complecşii cu un singur braţ receptorilor de tip I şi II ai superfamiliei TGF-beta conform prezentei dezvăluiri pentru utilizarea la om pot fi exprimaţi într-o linie celulară de mamifer care asigură glicozilarea adecvată, cum ar fi liniile celulare HEK293 sau CHO, deşi alte celule de exprimare ale mamiferelor sunt de aşteptat să fie de asemenea utile.

Prezenta dezvăluire are în vedere în plus o metodă de generare a mutanţilor, în special seturi de mutanţi combinatori ai unei polipeptide a receptorului de tip I a superfamiliei TGF-beta (de exemplu, ALK1, ALK2, ALK3, ALK4, ALK5, ALK6, şi ALK7) a polipeptidei receptorului de tip II a superfamiliei TGF-beta (de exemplu, ActRIIA, ActRIIB, TGFBRII, BMPRII, şi MISRII) ai prezentei dezvăluiri, precum şi mutanţi de trunchiere. Grupurile de mutanţi combinatori sunt utile în special pentru identificarea secvenţelor receptorilor de tip I ai superfamiliei TGF-beta sau de tip II ai superfamiliei TGF-beta. Scopul screeningului acestor biblioteci combinatorii poate fi acela de a genera, de exemplu, variante de polipeptide care au proprietăţi modificate, cum ar fi modificarea farmacocineticii sau legarea modificată a unui ligand. O varietate de analize de screening sunt redate mai jos şi astfel de analize pot fi utilizate pentru a evalua variantele. De exemplu, variantele polipeptidei receptorului de tip I sau tip II a superfamiliei TGF-beta pot fi supuse unui screening în ceea ce priveşte capacitatea lor de a lega un ligand al superfamiliei TGF-beta (de exemplu, BMP2, BMP2/7, BMP3, BMP4, BMP4/7, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8a, BMP8b, BMP9, BMP10, GDF3, GDF5, GDF6/BMP13, GDF7, GDF8, GDF9b/BMP15, GDF11/BMP11, GDF15/MIC1, TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina AE, activina BC, activina BE, nodal, GDNF, neurturina, artemina, persefina, MIS, şi Lefty), de a preveni legarea unui ligand al superfamiliei TGF-beta la un receptor al superfamiliei TGF-beta, şi/sau de a interfera cu semnalizarea cauzată de un ligand al superfamiliei TGF-beta.

Activitatea unui complex heteromultimeric cu un singur braţ al receptorului superfamiliei TGF-beta conform dezvăluirii poate fi, de asemenea, testat într-o analiză pe bază celulară sau in vivo. De exemplu, poate fi evaluat efectul unui complex heteromultimer cu un singur braţ asupra exprimării genelor implicate în producţia musculară într-o celulă musculară. Acest lucru poate fi efectuat, după cum este necesar, în prezenţa uneia sau mai multor proteine ligand a superfamilie TGF-beta recombinante (de exemplu, BMP2, BMP2/7, BMP3, BMP4, BMP4/7, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8a, BMP8b, BMP9, BMP10, GDF3, GDF5, GDF6/BMP13, GDF7, GDF8, GDF9b/BMP15, GDF11/BMP11, GDF15/MIC1, TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina AE, activina BC, activina BE, nodal, GDNF, neurturina, artemina, persefina, MIS, şi Lefty), şi celulele pot fi transfectate astfel încât să producă un complex cu un singur braţ al receptorului de tip I sau tip II al superfamiliei TGF-beta şi, opţional, un ligand al superfamiliei TGF-beta. La fel, un complex heteromultimer cu un singur braţ conform dezvăluirii poate fi administrat la un şoarece sau alt animal şi una sau mai multe măsurători, cum ar fi formarea şi rezistenţa musculară, pot fi evaluate utilizând metode recunoscute în domeniu. Similar, activitatea unei polipeptide a receptorului superfamiliei TGF-beta sau a variantelor sale poate fi testată în osteoblaste, adipocite şi/sau celule neuronale în ceea ce priveşte orice efect asupra creşterii acestor celule, de exemplu, prin analizele descrise aici şi cele care fac parte din cunoştinţele comune în domeniu. O genă raportor sensibilă la SMAD poate fi utilizată în astfel de linii celulare pentru a monitoriza efectele asupra semnalizării din aval.

Pot fi generate variante derivate combinator care au o selectivitate crescută sau, în general, o creştere a puterii faţă de un complex heteromultimer cu un singur braţ al receptorului superfamiliei TGF-beta de referinţă. Astfel de variante, atunci când sunt exprimate din construcţi de ADN recombinant, pot fi utilizate în protocoalele de terapie genetică. Similar, mutageneza poate da naştere la variante care au perioade de înjumătăţire extracelulară dramatic diferite de complexul heteromultimer cu un singur braţ al receptorului superfamiliei TGF-beta nemodificat corespunzător. De exemplu, proteina modificată poate fi făcută să fie mai stabilă sau mai puţin stabilă la degradarea proteolitică sau la alte proces celulare care au ca rezultat distrugerea sau inactivarea altfel a unei polipeptide nemodificate. Astfel de variante şi genele care le codifică pot fi utilizate pentru a modifica nivelurile complecşilor polipeptidici prin modularea timpului de înjumătăţire al polipeptidei. De exemplu, un timp de înjumătăţire scurt poate da naştere la efecte biologice mai tranzitorii şi, atunci când face parte dintr-un sistem de exprimare inductibil, poate permite un control mai strâns al nivelurilor complecşilor polipeptidici recombinaţi în afara celulei. Într-o proteină de fuziune Fc, pot fi făcute mutaţii în linker (dacă există) şi/sau în porţiunea Fc pentru a modifica timpul de înjumătăţire al complexului heteromultimer cu un singur braţ al receptorului superfamiliei TGF-beta.

O bibliotecă combinatorie poate fi produsă printr-o bibliotecă degenerată de gene care codifică o bibliotecă de polipeptide care include fiecare cel puţin o porţiune din potenţialele secvenţe de receptor de tip I sau tip II ai superfamiliei TGF-beta. De exemplu, un amestec de oligonucleotide sintetice poate fi ligat enzimatic în secvenţe genetice astfel încât setul degenerat potenţialului receptor de tip I sau de tip II al superfamilie TGF-beta care codifică secvenţe de nucleotide să fie exprimabile ca polipeptide individuale sau, alternativ, ca un set de proteine de fuziune mai mari (de exemplu, pentru afişarea fagilor).

Există multe căi prin care poate fi generată o biblioteca de potenţiali omologi dintr-o secvenţă degenerată de oligonucleotide. Sinteza chimică a unei secvenţe genetice degenerate poate fi efectuată într-un sintetizator automat de ADN, şi genele sintetice pot fi apoi ligate într-un vector adecvat pentru exprimare. Sinteza oligonucleotidelor degenerate este bine cunoscută în domeniu. Vezi, de exemplu, Narang, SA (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura şi colab. (1981) Recombinant DNA, Proc. 3rd Cleveland Sympos. Macromolecules, ed. AG Walton, Amsterdam: Elsevier pp273-289; Itakura şi colab. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura şi colab. (1984) Science 198:1056; Ike şi colab. (1983) Nucleic Acid Res. 11:477. Astfel de tehnici au fost folosite în evoluţia dirijată a altor proteine. Vezi, de exemplu, Scott şi colab., (1990) Science 249:386-390; Roberts şi colab. (1992) PNAS USA 89:2429-2433; Devlin şi colab. (1990) Science 249: 404-406; Cwirla şi colab., (1990) PNAS USA 87: 6378-6382; precum şi Brevetele U.S. Nr: 5.223.409, 5.198.346, şi 5.096.815.

Alternativ, alte forme de mutageneză pot fi utilizate pentru a genera o bibliotecă combinatorie. De exemplu, complecşii heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului superfamiliei TGF-beta conform dezvăluirii pot fi generaţi şi izolaţi dintr-o bibliotecă prin screening folosind, de exemplu, mutageneza de scanare cu alanină [vezi, de exemplu, Ruf şi colab. (1994) Biochemistry 33:1565-1572; Wang şi colab. (1994) J. Biol. Chem. 269:3095-3099; Balint şi colab. (1993) Gene 137:109-118; Grodberg şi colab. (1993) Eur. J. Biochem. 218:597-601; Nagashima şi colab. (1993) J. Biol. Chem. 268:2888-2892; Lowman şi colab. (1991) Biochemistry 30:10832-10838; şi Cunningham şi colab. (1989) Science 244:1081-1085], prin mutageneză de scanare a linkerului [vezi, de exemplu, Gustin şi colab. (1993) Virology 193:653-660; şi Brown şi colab. (1992) Mol. Cell Biol. 12:2644-2652; McKnight şi colab. (1982) Science 232:316], prin mutageneză de saturaţie [vezi, de exemplu, Meyers şi colab, (1986) Science 232:613]; prin mutageneză PCR [vezi, de exemplu, Leung şi colab. (1989) Method Cell Mol Biol 1:11-19]; sau prin mutageneză aleatorie, incluzând mutageneza chimică [vezi, de exemplu, Miller şi colab. (1992) A Short Course in Bacterial Genetics, CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY; şi Greener şi colab. (1994) Strategies in Mol Biol 7:32-34]. Mutageneza de scanare a linkerului, în special într-un cadru combinatoriu, este o metodă atractivă pentru identificarea formelor trunchiate (bioactive) ale polipeptidelor receptorului de tip I sau de tip II ai superfamiliei TGF-beta.

O gamă largă de tehnici sunt cunoscute în domeniu pentru screening-ul produselor genetice ale bibliotecilor combinatorii obţinute prin mutaţii punctuale şi trunchieri şi, de altfel, pentru screening-ul bibliotecilor de ADNc pentru produsele genetice care au o anumită proprietate. Astfel de tehnici vor fi în general adaptabile pentru screening-ul rapid al bibliotecilor genetice generate de mutageneza combinatorie a complecşilor heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului superfamiliei TGF-beta din dezvăluire. Cele mai utilizate tehnici pentru screening-ul bibliotecilor genetice mari cuprind tipic clonarea bibliotecii genetice în vectori de exprimare replicabili, transformarea celulelor adecvate cu biblioteca de vectori rezultată şi exprimarea genelor combinatorii în condiţii în care detectarea unei activităţi dorite facilitează izolarea relativ uşoară a vectorul care codifică gena al cărui produs a fost detectat. Analizele preferate includ analize de legare şi/sau analize de semnalizare celulară pentru liganzii superfamiliei TGF-beta (de exemplu, BMP2, BMP2/7, BMP3, BMP4, BMP4/7, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8a, BMP8b, BMP9, BMP10, GDF3, GDF5, GDF6/BMP13, GDF7, GDF8, GDF9b/BMP15, GDF11/BMP11, GDF15/MIC1, TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina AE, activina BC, activina BE, nodal, GDNF, neurturina, artemina, persefina, MIS, şi Lefty).

În anumite modalităţi de realizare, complecşii heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului de tip I şi de tip II a superfamiliei TGF-beta conform dezvăluirii pot cuprinde alte modificări post-translaţionale în plus faţă de oricare dintre cele care sunt prezente natural în polipeptida receptorului de tip I sau tip II a superfamiliei TGF-beta. Astfel de modificări includ, dar nu se limitează la, acetilare, carboxilare, glicozilare, fosforilare, lipidare şi acilare. Ca rezultat, complexul heteromultimer cu un singur braţ al receptorului de tip I sau de tip II al superfamiliei TGF-beta poate cuprinde elemente non-aminoacidice, cum ar fi polietilenglicoli, lipide, polizaharide sau monozaharide şi fosfaţi. Efectele unor astfel de elemente non-aminoacid asupra funcţionalităţii unui complex heteromultimer cu un singur braţ pot fi testate aşa cum este descris aici pentru alte variante de complecşi heteromultimeri cu un singur braţ. Când o polipeptidă conform dezvăluirii este produsă în celule prin clivarea unei forme native a polipeptidei, prelucrarea post-translaţională poate fi, de asemenea, importantă pentru plierea şi/sau funcţionarea corectă a proteinei. Diferite celule (de exemplu, CHO, HeLa, MDCK, 293, WI38, NIH-3T3 sau HEK293) au maşinării celulare specifice şi mecanisme caracteristice pentru astfel de activităţi post-translaţionale şi pot fi alese pentru a asigura modificarea şi prelucrarea corectă a polipeptidei receptorului de tip I sau tip II a superfamiliei TGF-beta.

În anumite aspecte, polipeptidele dezvăluite aici pot forma complecşi proteici care cuprind cel puţin o polipeptidă a receptorului de tip I sau tip II a superfamiliei TGF-beta asociată, covalent sau necovalent, cu cel puţin o polipeptidă cuprinzând un membru complementar al unei perechi de interacţiune. De preferinţă, polipeptidele dezvăluite aici formează complecşi heterodimerici cu un singur braţ, deşi sunt incluşi şi complecşi heteromultimerici de ordin superior (heteromultimeri), cum ar fi, dar fără a se limita la, heterotrimeri, heterotetrameri şi alte structuri oligomerice (vezi, de exemplu, Figura 1). În unele modalităţi de realizare, polipeptidele receptorului de tip I sau tip II a superfamiliei TGF-beta din prezenta dezvăluire cuprind cel puţin un domeniu de multimerizare. Aşa cum este dezvăluit aici, termenul "domeniu de multimerizare" se referă la un aminoacid sau o secvenţă de aminoacizi care promovează interacţiunea covalentă sau necovalentă între cel puţin o primă polipeptidă şi cel puţin o a doua polipeptidă. Polipeptidele dezvăluite aici pot fi unite covalent sau necovalent la un domeniu de multimerizare. De preferinţă, un domeniu de multimerizare promovează interacţiunea dintre o polipeptidă cu un singur braţ (de exemplu, o polipeptidă de fuziune care cuprinde o polipeptidă a receptorului de tip I a superfamiliei TGF-beta sau o polipeptidă a receptorului de tip II a superfamiliei TGF-beta) şi un membru complementar al unei perechi de interacţiune pentru a promova formarea de heteromultimeri (de exemplu, formarea unui heterodimer), şi opţional împiedică sau defavorizează în alt fel formarea unui homomultimer (de exemplu, formarea homodimerului), crescând astfel randamentul heteromultimerului dorit (vezi, de exemplu, Figura 2).

Multe metode cunoscute în domeniu pot fi utilizate pentru a genera complecşi cu un singur braţ ai receptorului superfamiliei TGF-beta. De exemplu, legăturile disulfurice care nu apar în mod natural pot fi construite prin înlocuirea pe o primă polipeptidă (de exemplu, o polipeptidă de fuziune care cuprind o polipeptidă a receptorului de tip I sau tip II a superfamiliei TGF-beta) un aminoacid natural cu un rest conţinând tiol liber, cum ar fi cisteina, astfel încât tiolul liber interacţionează cu un alt rest conţinând tiol liber dintr-o a doua polipeptidă (de exemplu, un membru complementar al unei perechi de interacţiune) astfel încât se formează o legătură disulfură între prima şi a doua polipeptidă. Exemple suplimentare de interacţiuni pentru a promova formarea unui heteromultimer includ, dar nu se limitează la, interacţiuni ionice, cum ar fi cele descrise în Kjaergaard şi colab., WO2007147901; efecte de direcţionare electrostatice, aşa cum sunt descrise în Kannan şi colab., U.S.8.592.562; interacţiuni spiralare-spirală, aşa cum este descris în Christensen şi colab., U.S.20120302737; fermoare de leucină, aşa cum este descris în Pack & Plueckthun,(1992) Biochemistry 31: 1579-1584; şi motive elice-întoarcere-elice aşa cum sunt cele descrise în Pack şi colab., (1993) Bio/Technology 11: 1271-1277. Legătura diferitelor segmente poate fi obţinută prin, de exemplu, legare covalentă, cum ar fi prin reticulare chimică, linkeri peptidici, punţi disulfură, etc., sau interacţiuni de afinitate, cum ar fi tehnologia avidină-biotină sau cu fermoar de leucină.

În anumite aspecte, un domeniu de multimerizare poate cuprinde o componentă a unei perechi de interacţiune. În unele modalităţi de realizare, polipeptidele dezvăluite aici pot forma complecşi proteici cuprinzând o primă polipeptidă asociată covalent sau necovalent cu o a doua polipeptidă, în care prima polipeptidă cuprinde secvenţa de aminoacizi a polipeptidei receptorului de tip I sau tip II a superfamiliei TGF-beta şi secvenţa de aminoacizi unui prim membru al unei perechi de interacţiune; iar a doua polipeptidă cuprinde secvenţa de aminoacizi a unui al doilea membru al unei perechi de interacţiune. Perechea de interacţiune poate fi oricare două secvenţe polipeptidice care interacţionează pentru a forma un complex, în special un complex heterodimeric, deşi modalităţi de realizare operative pot utiliza, de asemenea, o pereche de interacţiune care poate forma un complex homodimeric. Un membru al perechii de interacţiune poate fi fuzionat cu o polipeptidă a receptorului de tip I sau tip II a superfamiliei TGF-beta aşa cum este descris aici, incluzând de exemplu, o secvenţă de polipeptidă cuprinzând, constând în esenţă din sau constând dintr-o secvenţă de aminoacizi care este cel puţin 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, sau 100% identică cu secvenţa oricăreia dintre SEQ ID NO: 2, 3, 5, 6, 10, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 47, 51, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 302, 306, 310, şi 313. O pereche de interacţiune poate fi selectată o pentru a conferi o proprietate/activitate îmbunătăţită, cum ar fi creşterea timpului de înjumătăţire serică, sau pentru a acţiona ca un adaptor pe care este ataşat un alt fragment pentru a oferi o proprietate/activitate îmbunătăţită. De exemplu, un fragment de polietilenglicol poate fi ataşat la unul sau la ambele componente ale unei perechi de interacţiune pentru a oferi o proprietate/activitate îmbunătăţită, cum ar fi un timp de înjumătăţire serică îmbunătăţit.

Primul şi al doilea membru al perechii de interacţiune pot fi o pereche asimetrică, ceea ce înseamnă că membrii perechii se asociază preferenţial între ei, mai degrabă decât să se auto-asocieze. În consecinţă, primul şi al doilea membru al unei perechi de interacţiune asimetrică se pot asocia pentru a forma un complex pereche de interacţiune heterodimeric (vezi, de exemplu, Figura 2). Alternativ, perechea de interacţiune poate fi neghidată, ceea ce înseamnă că membrii perechii se pot asocia între ei sau se pot auto-asocia fără preferinţă substanţială şi, prin urmare, pot avea aceleaşi sau diferite secvenţe de aminoacizi. În consecinţă, primul şi al doilea membru al unei perechi de interacţiune neghidate se pot asocia pentru a forma un complex de pereche de interacţiune homodimeric sau un complex de pereche de acţiune heterodimeric. Opţional, primul membru al perechii de interacţiune (de exemplu, o pereche asimetrică sau o pereche de interacţiune neghidată) se asociază covalent cu al doilea membru al perechii de interacţiune. Opţional, primul membru al perechii de interacţiune (de exemplu, o pereche asimetrică sau o pereche de interacţiune neghidată) se asociază necovalent cu al doilea membru al perechii de interacţiune.

Ca exemple specifice, prezenta dezvăluire redă complecşi proteici de fuziune cuprinzând cel puţin o polipeptidă a receptorului de tip I sau tip II a superfamiliei TGF-beta fuzionată cu o polipeptidă cuprinzând un domeniu constant al unei imunoglobuline, cum ar fi un domeniu CH1, CH2 sau CH3 al unei imunoglobuline sau un domeniu Fc. Sunt redate aici domenii Fc derivate de la IgG1, IgG2, IgG3 şi IgG4 umană. Se cunosc alte mutaţii care scad fie activitatea CDC, fie ADCC şi, colectiv, oricare dintre aceste variante sunt incluse în dezvăluire şi pot fi utilizate drept componente avantajoase ale unui complex heteromultimeric cu un singur braţ conform dezvăluirii. Opţional, domeniul Fc IgG1 al SEQ ID NO: 208 are una sau mai multe mutaţii la resturi cum ar fi Asp-265, Lys-322 şi Asn-434 (numerotate în conformitate cu IgG1 de lungime completă corespunzătoare). În anumite cazuri, domeniul Fc mutant având una sau mai multe dintre aceste mutaţii (de exemplu, mutaţia Asp-265) are capacitatea redusă de legare la receptorul Fcγ în raport cu un domeniu Fc de tip sălbatic. În alte cazuri, domeniul Fc mutant având una sau mai multe dintre aceste mutaţii (de exemplu, mutaţia Asn-434) are o capacitate crescută de legare la receptorul Fc (FcRN) în legătură cu MHC clasa I în raport cu un domeniu Fc de tip sălbatic.

Un exemplu de secvenţă de aminoacizi nativă care poate fi utilizată pentru porţiunea Fc a IgG1 umană (G1Fc) este prezentat mai jos (SEQ ID NO: 208). Sublinierea cu linie punctată indică regiunea de balama, şi sublinierea cu linie plină indică poziţiile cu variante care apar natural. În parte, dezvăluirea redă polipeptide care cuprind secvenţe de aminoacizi cu 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, sau 99% identitate cu SEQ ID NO: 208. Variante naturale în G1Fc ar putea include E134D şi M136L conform sistemului de numerotare utilizat în SEQ ID NO: 208 (vezi Uniprot P01857).

Un exemplu de secvenţă de aminoacizi nativă care poate fi utilizată pentru porţiunea Fc a IgG2 umană (G2Fc) este prezentat mai jos (SEQ ID NO: 209). Sublinierea cu linie punctată indică regiunea de balama şi sublinierea cu linie dublu indică poziţiile în care există conflicte de baze de date în secvenţă (conform UniProt P01859). În parte, dezvăluirea redă polipeptide care cuprind secvenţe de aminoacizi cu 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% sau 99% identitate la SEQ ID NO: 209.

Două exemple de secvenţe de aminoacizi care pot fi utilizate pentru porţiunea Fc a IgG3 umană (G3Fc) sunt prezentate mai jos. Regiunea de balama din G3Fc poate fi de până la patru ori mai lungă decât în alte lanţuri Fc şi conţine trei segmente identice de 15 resturi precedate de un segment similar de 17 resturi. Prima secvenţă G3Fc prezentată mai jos (SEQ ID NO: 210) conţine o regiune scurtă de balama constând dintr-un singur segment de 15 resturi, în timp ce a doua secvenţă G3Fc (SEQ ID NO: 211) conţine o regiune de balama cu lungime întreagă. În fiecare caz, sublinierea cu linie punctată indică regiunea balamalei, iar sublinierea cu linie plină indică poziţii cu variante naturale în conformitate cu UniProt P01859. În parte, dezvăluirea redă polipeptide care cuprind secvenţe de aminoacizi cu 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% sau 99% identitate la SEQ ID NO: 210 şi 211.

Variantele naturale din G3Fc (de exemplu, vezi Uniprot P01860) includ E68Q, P76L, E79Q, Y81F, D97N, N100D, T124A, S169N, S169del, F221Y atunci când sunt convertite la sistemul de numerotare utilizat în SEQ ID NO: 210 şi prezenta dezvăluire redă proteine de fuziune care cuprind domenii G3Fc care conţin una sau mai multe dintre aceste variaţii. În plus, gena IgG3 a imunoglobulinei umane (IGHG3) prezintă un polimorfism structural caracterizat prin diferite lungimi ale balamalelor [vezi Uniprot P01859]. Specific, variantei WIS îi lipseşte cea mai mare parte a regiunii V şi toată regiunea CH1. Aceasta are o legătură de disulfură inter-catenară suplimentară la poziţia 7 în plus faţă de cele 11 prezente în mod normal în regiunea balamalei. Variantei ZUC îi lipseşte cea mai mare parte a regiunii V, toată regiunea CH1 şi o parte a balamalei. Varianta OMM poate reprezenta o formă alelică sau o altă subclasă a lanţului gamma. Prezenta dezvăluire oferă proteine de fuziune suplimentare care cuprind domenii G3Fc care conţin una sau mai multe dintre aceste variante.

Un exemplu de secvenţă de aminoacizi nativi care poate fi utilizată pentru porţiunea Fc a IgG4 umană (G4Fc) este prezentat mai jos (SEQ ID NO: 212). Sublinierea cu linie punctată indică regiunea de balama. În parte, dezvăluirea redă polipeptide care cuprind secvenţe de aminoacizi cu 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% sau 99% identitate la SEQ ID NO: 212.

Sunt prezentate aici o varietate de mutaţii proiectate în domeniul Fc în legătură cu secvenţa G1Fc (SEQ ID NO: 208), şi mutaţiile analoge în G2Fc, G3Fc şi G4Fc pot fi derivate din alinierea lor cu G1Fc în Figura 5. Datorită lungimilor inegale ale balamalei, poziţiile Fc analoge bazate pe alinierea izotipului (Figura 5) posedă diferite numere de aminoacizi în SEQ ID NO: 208, 209, 210, şi 212. Se poate de asemenea aprecia că o poziţie dată a unui aminoacid într-o secvenţă de imunoglobulină care constă din regiunile de balama, CH2, şi CH3 (de exemplu, SEQ ID NO: 208, 209, 210, 211, sau 212) va fi identificată cu un număr diferit de aceeaşi poziţie atunci când numerotarea cuprinde întregul domeniu constant al lanţului greu al IgG1 (care constă din regiunile CH1, balama, CH2, şi CH3) ca în baza de date Uniprot. De exemplu, corespondenţa dintre poziţiile CH3 selectate într-o secvenţă G1Fc uman (SEQ ID NO: 208), domeniul constant al lanţului greu al IgG1 uman (Uniprot P01857) şi lanţul greu al IgG1 uman este după cum urmează.

Corespondenţa poziţiilor CH3 în diferite sisteme de numerotare G1Fc (Numerotarea începe la prima treonină în regiunea de balama) Domeniul constant al lanţului greu al IgG1 (numerotarea începe la CH1) Lanţul greu al IgG1 (schema de numerotare EU a lui Kabat şi colab., 1991 *) Y127 Y232 Y349 S132 S237 S354 E134 E239 E356 T144 T249 T366 L146 L251 L368 K170 K275 K392 D177 D282 D399 Y185 Y290 Y407 K187 K292 K409 * Kabat şi colab. (editori) 1991; pag. 688-696 in Sequences of Proteine of Immunological Interest, ed. a 5-a, Vol. 1, NIH, Bethesda, MD.

O problemă care apare în producţia pe scară largă de proteine asimetrice pe bază de imunoglobulină dintr-o singură linie celulară este cunoscută sub numele de ʺproblema asocierii lanţuluiʺ. Aşa cum se confruntă preponderent producţia de anticorpi bispecifici, problema asocierii lanţului se referă la provocarea de a produce eficient o proteină multicatenară dorită din combinaţiile multiple care rezultă inerent atunci când diferite lanţuri grele şi/sau lanţuri uşoare sunt produse într-o singură linie de celule [vezi, de exemplu, Klein şi colab (2012) mAbs 4:653-663]. Această problemă este cea mai acută atunci când două lanţuri grele diferite şi două lanţuri uşoare diferite sunt produse în aceeaşi celulă, caz în care există un total de 16 combinaţii posibile de lanţuri (deşi unele dintre acestea sunt identice) atunci când se doreşte tipic numai una. Cu toate acestea, acelaşi principiu explică randamentul scăzut al unei proteine de fuziune multicatenare dorite care încorporează numai două lanţuri grele diferite (asimetrice).

Sunt cunoscute în domeniu diverse metode care măresc împerecherea dorită a lanţurilor polipeptidice de fuziune care conţin Fc într-o singură linie de celule pentru a produce o proteină de fuziune asimetrică preferată, cu randamente acceptabile [vezi, de exemplu, Klein şi colab (2012) mAbs 4:653-663]. Metodele pentru obţinerea împerecherii dorite a lanţurilor care conţin Fc includ, dar nu se limitează la, împerecherea pe bază de sarcină (direcţionare electrostatică), asocierea sterică ʺnasturi-în-butoniereʺ, împerecherea SEEDbody şi împerecherea pe bază de fermoar de leucină. Vezi, de exemplu, Ridgway şi colab (1996) Protein Eng 9:617-621; Merchant şi colab (1998) Nat Biotech 16:677-681; Davis şi colab (2010) Protein Eng Des Sel 23:195-202; Gunasekaran şi colab (2010); 285:19637-19646; Wranik şi colab (2012) J Biol Chem 287:43331-43339; US5932448; WO 1993/011162; WO 2009/089004, şi WO 2011/034605.

De exemplu, un mijloc prin care poate fi promovată interacţiunea dintre polipeptide specifice este prin proiectarea regiunilor complementare protuberanţă-în-cavitate (nasture-în-butonieră), aşa cum este descris în Arathoon şi colab., U.S.7,183,076 şi Carter şi colab., U.S.5.731.168. ʺProtuberanţeleʺ sunt construite prin înlocuirea lanţurilor laterale mici de aminoacizi din interfaţa primei polipeptide (de exemplu, o primă pereche de interacţiune) cu lanţuri laterale mai mari (de exemplu, tirozină sau triptofan). ʺCavităţiʺ complementare cu dimensiuni identice sau similare protuberanţelor sunt create opţional pe interfaţa celei de-a doua polipeptide (de exemplu, a doua pereche de interacţiune) prin înlocuirea lanţurilor laterale mari de aminoacizi cu cele mai mici (de exemplu, alanină sau treonină). Atunci când există o protuberanţă sau o cavitate poziţionată şi dimensionată corespunzător la interfaţa fie a primei, fie a celei de-a doua polipeptide, este necesar numai să se proiecteze o cavitate sau o protuberanţă corespunzătoare, respectiv, la interfaţa adiacentă.

La pH neutru (7,0), acidul aspartic şi acidul glutamic au sarcină negativă, iar lizina, arginina şi histidina au sarcină pozitivă. Aceste resturi cu sarcină pot fi utilizate pentru a promova formarea heterodimerului şi în acelaşi timp împiedica formarea homodimerului. Interacţiuni de atragere au loc între sarcini opuse şi interacţiuni de respingere între sarcini similare. În parte, complecşii proteici dezvăluiţi aici fac uz de interacţiunile de atracţie pentru promovarea formării heteromultimerilor (de exemplu, formarea heterodimerului) şi opţionale interacţiuni de respingere pentru împiedicarea formării homodimerului (de exemplu, formarea homodimerului) prin efectuarea mutagenezei direcţionate la situs a resturilor de interfaţă cu sarcină.

De exemplu, interfaţa domeniului CH3 a IgG1 cuprinde patru perechi de resturi cu sarcină unică implicate în interacţiuni domeniu-domeniu: Asp356-Lys439', Glu357-Lys370', Lys392-Asp399', şi Asp399-Lys409' [numerotarea resturilor în al doilea lanţ este indicată prin (')]. Ar trebui remarcat faptul că schema de numerotare utilizată aici pentru a desemna resturile din domeniul CH3 al IgG1 este conformă cu schema de numerotare a EU a lui Kabat. Datorită simetriei de 2 ori prezente în interacţiunile domeniului CH3-CH3, fiecare interacţiune unică va fi reprezentată de două ori în structură (de exemplu, Asp-399-Lys409' şi Lys409-Asp399'). În secvenţa de tip sălbatic, K409-D399' favorizează atât formarea heterodimerului, cât şi formarea homodimerului. O singură mutaţie care comută polaritatea sarcinii (de exemplu, K409E; sarcină pozitivă la negativă) în primul lanţ conduce la interacţiuni defavorabile pentru formarea primului lanţ homodimer. Interacţiunile defavorabile apar din cauza interacţiunilor de respingere care apar între aceleaşi sarcini (negativ-negativ; K409E-D399' şi D399-K409E'). O mutaţie similară care comută polaritatea sarcinii (D399K'; negativ la pozitiv) în al doilea lanţ conduce la interacţiuni defavorabile (K409'-D399K' şi D399K-K409') pentru formarea homodimerului celui de-al doilea lanţ. Dar, în acelaşi timp, aceste două mutaţii (K409E şi D399K') conduc la interacţiuni favorabile (K409E-D399K' şi D399-K409') pentru formarea heterodimerului.

Efectul de direcţionare electrostatică asupra formării heterodimerului şi descurajării homodimerului poate fi îmbunătăţit în continuare prin mutaţia suplimentară a resturilor cu sarcină pot fi sau nu împerecheate cu un rest cu sarcină opusă din al doilea lanţ, incluzând, de exemplu, Arg355 şi Lys360. Tabelul de mai jos listează posibile mutaţii de schimbare a sarcinii care pot fi utilizate, singure sau în combinaţie, pentru a spori formarea heteromultimerului complecşilor polipeptidici dezvăluiţi aici.

Exemple de mutaţii ale resturilor cu sarcină în perechi pentru a îmbunătăţi formarea heterodimerului Poziţia în primul lanţ Mutaţia în primul lanţ Poziţia de interacţiune în al doilea lanţ Mutaţia corespunzătoare în al doilea lanţ Lys409 Asp sau Glu Asp399' Lys, Arg, sau His Lys392 Asp sau Glu Asp399' Lys, Arg, sau His Lys439 Asp sau Glu Asp356' Lys, Arg, sau His Lys370 Asp sau Glu Glu357' Lys, Arg, sau His Asp399 Lys, Arg, sau His Lys409' Asp sau Glu Asp399 Lys, Arg, sau His Lys392' Asp sau Glu Asp356 Lys, Arg, sau His Lys439' Asp sau Glu Glu357 Lys, Arg, sau His Lys370' Asp sau Glu

În unele modalităţi de realizare, unul sau mai multe resturi care alcătuiesc interfaţa CH3-CH3 într-o proteină de fuziune conform prezentei cereri sunt înlocuite cu un aminoacid cu sarcină astfel încât interacţiunea să devină defavorabilă electrostatic. De exemplu, un aminoacid cu sarcină pozitivă în interfaţă (de exemplu, o lizină, arginină sau histidină) se înlocuieşte cu un aminoacid cu sarcină negativă (de exemplu, acid aspartic sau acid glutamic). Alternativ, sau în combinaţie cu substituţia de evitare, un aminoacid cu sarcină negativă din interfaţă este înlocuit cu un aminoacid cu sarcină pozitivă. În anumite modalităţi de realizare, aminoacidul este înlocuit cu un aminoacid care nu apare în mod natural, având caracteristica de sarcină dorită. Trebuie remarcat faptul că mutarea resturilor cu sarcină negativă (Asp sau Glu) la His va conduce la creşterea volumului lanţului lateral, care poate provoca probleme sterice. Mai mult, forma de donor şi acceptor de protoni a His depinde de mediul în care este localizat. Aceste probleme ar trebui luate în considerare în cadrul strategiei de proiectare. Deoarece resturile de interfaţă sunt puternic conservate în subclasele de IgG umane şi de şoarece, efectele de direcţionare electrostatică descrise aici pot fi aplicate la IgG1, IgG2, IgG3 şi IgG4 umane şi de şoarece. Această strategie poate fi extinsă şi la modificarea resturilor lipsite de sarcină în resturi cu sarcină la interfaţa domeniului CH3.

În parte, dezvăluirea furnizează împerecherea dorită de lanţuri polipeptidice care conţin Fc asimetrice utilizând secvenţe Fc proiectate pentru a fi complementare pe baza împerecherii de sarcină (direcţionare electrostatică). Una dintr-o pereche de secvenţe Fc cu complementaritate electrostatică poate fi fuzionată arbitrar la polipeptida receptorului de tip I sau tip II a superfamiliei TGF-beta constructului, cu sau fără un linker opţional, pentru a genera o polipeptidă de fuziune a receptorului de tip I sau tip II a superfamiliei TGF-beta. Acest lanţ unic poate fi coexprimat într-o celulă la alegere împreună cu secvenţa Fc complementară primului Fc pentru a favoriza generarea constructului multicatenar dorit (de exemplu, un complex heteromeric cu un singur braţ al receptorului superfamiliei TGF-beta). În acest exemplu bazat pe direcţionarea electrostatică, SEQ ID NO: 200 [G1Fc uman (E134K/D177K)] şi SEQ ID NO: 201 [G1Fc uman (K170D/K187D)] sunt exemple de secvenţe Fc complementare în care substituţiile de aminoacizi proiectate sunt subliniate cu linie dublă, şi polipeptida receptorului de tip I sau tip II a superfamiliei TGF-beta a constructului poate fi fuzionată fie cu SEQ ID NO: 200, fie cu SEQ ID NO: 201, dar nu ambele. Având în vedere gradul ridicat de identitate a secvenţei de aminoacizi între hG1Fc nativ, hG2Fc nativ, hG3Fc nativ şi hG4Fc nativ, se poate aprecia că substituţiile de aminoacizi la poziţiile corespunzătoare din hG2Fc, hG3Fc sau hG4Fc (vezi Figura 5) vor genera perechi de Fc complementare care pot fi utilizate în locul perechii hG1Fc complementare de mai jos (SEQ ID NO: 200 şi 201).

În parte, dezvăluirea redă împerecherea dorită a unor lanţuri polipeptidice care conţin Fc asimetrice utilizând secvenţe Fc proiectate pentru complementaritate sterică În parte, dezvăluirea redă împerecherea tip nasturi-în-butoniere ca un exemplu de complementaritate sterică. Una dintr-o pereche de secvenţe Fc cu complementaritate sterică poate fi fuzionată arbitrar la polipeptida receptorului de tip I sau tip II a superfamiliei TGF-beta a constructului, cu sau fără un linker opţional, pentru a genera o polipeptidă de fuziune a receptorului de tip I sau tip II a superfamiliei TGF-beta. Acest lanţ unic poate fi coexprimat într-o celulă la alegere împreună cu secvenţa Fc complementară primului Fc pentru a favoriza generarea constructului multicatenar dorit (de exemplu, complex heteromeric cu un singur braţ al receptorului superfamiliei TGF-beta). În acest exemplu bazat pe împerecherea tip narturi-în-butoniere, SEQ ID NO: 202 [G1Fc uman (T144Y)] şi SEQ ID NO: 203 [G1Fc uman (Y185T)] sunt exemple de secvenţe Fc complementare în care substituţiile de aminoacizi proiectate sunt subliniate cu linie dublă şi polipeptidă tip I sau tip II a superfamiliei TGF-beta a constructului poate fi fuzionată la oricare dintre SEQ ID NO: 202 sau SEQ ID NO: 203, dar nu ambele. Dat fiind gradul ridicat de identitate a secvenţei de aminoacizi între hG1Fc nativ, hG2Fc nativ, hG3Fc nativ şi hG4Fc nativ, se poate aprecia că substituţiile de aminoacizi în poziţiile corespunzătoare din hG2Fc, hG3Fc sau hG4Fc (vezi Figura 5) vor genera perechi Fc complementare care pot fi utilizate în locul perechii hG1Fc complementare de mai jos (SEQ ID NO: 202 şi 203).

Un exemplu de complementaritate Fc bazat pe împerecherea tip nasturi-în-butoniere combinate cu o legătură de disulfură proiectată este dezvăluit în SEQ ID NO: 204 [hG1Fc(S132C/T144W)] şi SEQ ID NO: 205 [hG1Fc(Y127C/T144S/L146A/Y185V)]. Substituţiile de aminoacizi proiectate în aceste secvenţe sunt subliniate cu linie dublă, şi polipeptida de tip I sau tip II a superfamiliei TGF-beta a constructului poate fi fuzionată fie la SEQ ID NO: 204 fie la SEQ ID NO: 205, dar nu ambele. Dat fiind gradul ridicat de identitate a secvenţei de aminoacizi între hG1Fc nativ, hG2Fc nativ, hG3Fc nativ şi hG4Fc nativ, se poate aprecia că substituţiile de aminoacizi la poziţiile corespunzătoare din hG2Fc, hG3Fc sau hG4Fc (vezi Figura 5) vor genera perechi Fc complementare care pot fi utilizate în locul perechii hG1Fc complementare de mai jos (SEQ ID NO: 204 şi 205).

În parte, dezvăluirea redă împerecherea dorită de lanţuri polipeptidice care conţin Fc-uri asimetrice folosind secvenţe Fc proiectate pentru a genera segmente de catene β interdigitante de domenii CH3 de IgG şi IgA umane. Astfel de metode includ utilizarea unui domeniu proiectat prin schimb de catene (SEED) de CH3 heterodimerii permiţând formarea proteinelor de fuziune SEEDbody [vezi, de exemplu, Davis şi colab (2010) Protein Eng Design Sel 23:195-202]. Una dintr-o pereche de secvenţe Fc cu complementaritate SEEDbody poate fi fuzionată în mod arbitrar la polipeptida receptorului de tip I sau tip II a superfamiliei TGF-beta a constructului, cu sau fără un linker opţional, pentru a genera o polipeptidă de fuziune a receptorului de tip I sau tip II a superfamiliei TGF-beta. Acest lanţ unic poate fi coexprimat într-o celulă la alegere împreună cu secvenţa Fc complementară primului Fc pentru a favoriza generarea constructului multicatenar dorit. În acest exemplu bazat pe împerecherea SEEDbody (Sb), SEQ ID NO: 206 [hG1Fc(SbAG)] şi SEQ ID NO: 207 [hG1Fc(SbGA)] sunt exemple de secvenţe Fc de IgC complementare în care substituţiile de aminoacizi proiectate din Fc de IgA sunt subliniate cu linie dublă, şi polipeptida receptorului de tip I sau tip II a superfamiliei TGF-beta a constructului poate fi fuzionată fie cu SEQ ID NO: 206, fie ID SECV NR: 207, dar nu ambele. Dat fiind gradul ridicat de identitate a secvenţei de aminoacizi între hG1Fc nativ, hG2Fc nativ, hG3Fc nativ şi hG4Fc nativ, se poate aprecia că substituţiile de aminoacizi în poziţiile corespunzătoare din hG1Fc, hG2Fc, hG3Fc sau hG4Fc (vezi Figura 5) vor genera un monomer Fc care poate fi utilizat în perechea IgG-IgA complementară de mai jos (SEQ ID NO: 206 şi 207).

În parte, dezvăluirea redă împerecherea dorită a lanţurilor polipeptidice asimetrice care conţin Fc cu un domeniu cu fermoar de leucină clivabil ataşat la C-terminalul domeniilor CH3 Fc. Ataşarea unui fermoar de leucină este suficientă pentru a provoca asamblarea preferenţială a lanţurilor grele de anticorpi heterodimerici. Vezi, de exemplu, Wranik şi colab (2012) J Biol Chem 287:43331-43339. Aşa cum este dezvăluit aici, una dintr-o pereche de secvenţe Fc ataşate la o catenă de formare a fermoarului de leucină poate fi fuzionată arbitrar la polipeptida receptorului de tip I sau tip II a superfamiliei TGF-beta a constructului, cu sau fără un linker opţional, pentru a genera o polipeptidă de fuziune a receptorului de tip I sau tip II a superfamiliei TGF-beta. Acest lanţ unic poate fi coexprimat într-o celulă la alegere împreună cu secvenţa Fc ataşată la o catenă complementar de formare a fermoarului de leucină pentru a favoriza generarea constructului multicatenar dorit. Digestia proteolitică a constructului cu endoproteinaza Lys-C bacteriană după purificare poate elibera domeniul fermoarului de leucină, rezultând un construct Fc a cărui structură este identică cu cea a Fc nativ. În acest exemplu bazat pe împerecherea fermoarului de leucină, SEQ ID NO: 213 [hG1Fc-Ap1 (acid)] şi SEQ ID NO: 214 [hG1Fc-Bp1 (bazic)] sunt exemple de secvenţe complementare Fc IgG în care secvenţele fermoarului de leucină complementar proiectat sunt subliniate, şi polipeptida receptorului de tip I sau tip II a superfamiliei TGF-beta a constructului poate fi fuzionată fie cu SEQ ID NO: 213 fie SEQ ID NO: 214, dar nu ambele. Dat fiind gradul ridicat de identitate a secvenţei de aminoacizi între hG1Fc nativ, hG2Fc nativ, hG3Fc nativ şi hG4Fc nativ, se poate aprecia că secvenţele de formare a fermoarului de leucină ataşate, cu sau fără un linker opţional, la hG1Fc, hG2Fc, hG3Fc sau hG4Fc (vezi Figura 5) vor genera un monomer Fc care poate fi utilizat în perechea complementară de formare a fermoarului de leucină de mai jos (SEQ ID NO: 213 şi 214).

Se înţelege că diferite elemente ale proteinelor de fuziune (de exemplu, proteinele de fuziune ale Fc a imunoglobulinei) pot fi aranjate în orice mod care este în concordanţă cu funcţionalitatea dorită. De exemplu, domeniul unei polipeptide a receptorului de tip I sau tip II a superfamiliei TGF-beta poate fi plasat C-terminal într-un domeniu heterolog sau, alternativ, un domeniu heterolog poate fi plasat C-terminal la domeniul unei polipeptide a receptorului de tip I sau tip II a superfamiliei TGF-beta. Domeniul polipeptidei receptorului de tip I sau tip II a superfamiliei TGF-beta şi domeniul heterolog nu trebuie să fie adiacente într-o proteină de fuziune şi domenii sau secvenţe de aminoacizi suplimentare pot fi incluse C- sau N-terminal fie la domeniu, fie între domenii.

De exemplu, o polipeptidă de fuziune a receptorului de tip I sau tip II a superfamiliei TGF-beta poate cuprinde o secvenţă de aminoacizi aşa cum este stabilit în formula A-B-C. Porţiunea B corespunde unui domeniu al polipeptidei receptorului de tip I sau tip II a superfamiliei TGF-beta. Porţiunile A şi C pot fi independent zero, unul sau mai mulţi aminoacizi şi atât porţiunea A cât şi C atunci când sunt prezente sunt heterologe la B. Porţiunile A şi/sau C pot fi ataşate la porţiunea B printr-o secvenţă linker. Un linker poate fi bogat în glicină (de exemplu, 2-10, 2-5, 2-4, 2-3 resturi de glicină) sau resturi de glicină şi prolină şi poate conţine, de exemplu, o singură secvenţă de treonină/serină şi glicine sau secvenţe repetate de treonină/serină şi/sau glicine, de exemplu, GGG (SEQ ID NO: 58), GGGG (SEQ ID NO: 59), TG4 (SEQ ID NO: 60), SG4 (SEQ ID NO: 61), TG3 (SEQ ID NO: 62), sau SG3 (SEQ ID NO: 63) singlete, sau repetări. În anumite modalităţi de realizare, o polipeptidă de fuziune a receptorului de tip I sau tip II a superfamiliei TGF-beta cuprinde o secvenţă de aminoacizi aşa cum este stabilită în formula A-B-C, în care în care A este o secvenţă lider (semnal), B constă dintr-un domeniu al polipeptidei receptorului de tip I sau tip II a superfamiliei TGF-beta, şi C este o porţiune polipeptidică care îmbunătăţeşte unul sau mai multe dintre stabilitatea in vivo, timpul de înjumătăţire in vivo, absorbţia/administrarea, localizarea sau distribuţia ţesuturilor, formarea de complecşi proteici şi/sau purificarea. În anumite modalităţi de realizare, o polipeptidă de fuziune a receptorului de tip I sau tip II a superfamiliei TGF-beta cuprinde o secvenţă de aminoacizi aşa cum este stabilită în formula A-B-C, în care în care A este o secvenţă lider TPA, B constă dintr-un domeniul al polipeptidei receptorului de tip I sau tip II a superfamiliei TGF-beta, şi C este un domeniu Fc al imunoglobulinei. Polipeptidele de fuziune preferate cuprind secvenţa de aminoacizi specificată în oricare dintre SEQ ID NO: 101, 103, 104, 106, 107, 109, 110, 112, 113, 115, 116, 118, 119, 121, 122, 124, 125, 127, 128, 130, 131, 133, 134, 136, şi 401-424.

În unele modalităţi de realizare, complecşii heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului superfamiliei TGF-beta din prezenta dezvăluire conţin în plus una sau mai multe porţiuni heterologe (domenii) astfel încât să confere o proprietate dorită. De exemplu, unele domenii de fuziune sunt deosebit de utile pentru izolarea proteinelor de fuziune prin cromatografie de afinitate. Exemple bine cunoscute de astfel de domenii de fuziune includ, dar nu se limitează la, polihistidină, Glu-Glu, glutation S-transferază (GST), tioredoxină, proteină A, proteină G, o regiune constantă a lanţului greu al imunoglobulinei (Fc), proteina de legare a maltozei (MBP) sau albumina serică umană. În scopul purificării de afinitate, se utilizează matrice relevante pentru cromatografia de afinitate, cum ar fi răşini conjugate cu glutationă, amilază şi nichel sau cobalt. Multe dintre astfel de matrice sunt disponibile sub formă de "kit", cum ar fi sistemul de purificare Pharmacia GST şi sistemul QIAexpress™ (Qiagen) util cu parteneri de fuziune (HIS6). Ca un alt exemplu, un domeniu de fuziune poate fi selectat astfel încât să faciliteze detectarea polipeptidelor capcană de ligand. Exemple de astfel de domenii de detectare includ diferitele proteine fluorescente (de exemplu, GFP) precum şi ʺetichete epitopʺ, care sunt uzual secvenţe peptidice scurte pentru care este disponibil un anticorp specific. Etichetele epitop bine-cunoscute pentru care anticorpii monoclonali specifici sunt uşor disponibili includ FLAG, hemaglutinina (HA) a virusului gripal şi etichetele c-myc. În unele cazuri, domeniile de fuziune au un situs de scindare a proteazei, cum ar fi factorul Xa sau trombina, care îi permite proteazei relevante să digere parţial proteinele de fuziune şi astfel să elibereze proteinele recombinante din acestea. Proteinele eliberate pot fi apoi izolate din domeniul de fuziune prin separarea cromatografică ulterioară.

În anumite modalităţi de realizare, polipeptidele receptorului de tip I şi/sau tip II ai superfamiliei TGF-beta din prezenta dezvăluire conţin una sau mai multe modificări care sunt capabile să stabilizeze polipeptidele. De exemplu, astfel de modificări îmbunătăţesc timpul de înjumătăţire in vitro al polipeptidelor, îmbunătăţesc timpul de înjumătăţire circulator al polipeptidelor şi/sau reduc degradarea proteolitică a polipeptidelor. Astfel de modificări stabilizatoare includ, dar nu se limitează la, polipeptide de fuziune (incluzând, de exemplu, polipeptide de fuziune cuprinzând un domeniu al polipeptidei receptorului de tip I sau tip II a superfamiliei TGF-beta şi şi un domeniu stabilizator), modificări ale unui situs de glicozilare (incluzând, pentru de exemplu, adăugarea unui situs de glicozilare la o polipeptidă din dezvăluire) şi modificări ale fragmentului de carbohidrat (incluzând, de exemplu, îndepărtarea fragmentelor de carbohidrat dintr-o polipeptidă din dezvăluire). Aşa cum se utilizează aici, termenul "domeniu stabilizator" nu se referă numai la un domeniu de fuziune (de exemplu, un domeniu Fc al imunoglobulinei) ca în cazul polipeptidelor de fuziune, ci include de asemenea şi modificări neproteinice, cum ar fi un fragment de carbohidrat sau un fragment neproteinic, cum ar fi polietilenglicol.

În modalităţi de realizare preferate, complecşii heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului superfamiliei TGF-beta care trebuie utilizaţi în conformitate cu metodele descrise aici sunt complecşi polipeptidici izolaţi. Aşa cum se utilizează aici, o proteină izolată (sau complex proteic) sau polipeptidă (sau complex polipeptidic) este una care a fost separată de o componentă a mediului său natural. În unele modalităţi de realizare, un complex heteromultimer cu un singur braţ conform dezvăluirii este purificat la o puritate mai mare de 95%, 96%, 97%, 98%, sau 99% aşa cum este determinate electroforetic (de exemplu, SDS-PAGE, concentrare izoelectrică (IEF), electroforeză capilară) sau cromatografic (de exemplu, HPLC cu schimb de ioni sau cu fază inversă). Metodele de evaluare a purităţii anticorpilor sunt bine cunoscute în domeniu [Vezi, de exemplu, Flatman şi colab., (2007) J. Chromatogr. B 848:79-87].

În anumite modalităţi de realizare, polipeptida receptorului de tip I sau tip II a superfamiliei TGF-beta, precum şi complecşii heteromultimeri cu un singur braţ ai acesteia, conform dezvăluirii pot fi produşi printr-o varietate de tehnici cunoscute în domeniu. De exemplu, polipeptidele din dezvăluire pot fi sintetizate folosind tehnici standard de chimie a proteinelor, cum ar fi cele descrise în Bodansky, M. Principles of Peptide Synthesis, Springer Verlag, Berlin (1993) şi Grant G. A. (ed.), Synthetic Peptides: A User's Guide, W. H. Freeman şi Company, New York (1992). În plus, sunt disponibile comercial sintetizatoare automate de peptide (vezi, de exemplu, Advanced ChemTech Model 396; Milligen/Biosearch 9600). Alternativ, polipeptidele şi complecşii din dezvăluire, incluzând fragmente sau variante ale acestora, pot fi produse recombinant folosind diverse sisteme de exprimare [de exemplu, E. coli, celule ovariene de hamster chinezesc (CHO), celule COS, baculovirus] aşa cum este bine cunoscut în domeniu. Într-o altă modalitate de realizare, polipeptidele modificate sau nemodificate conform dezvăluirii pot fi produse prin digestia polipeptidelor receptorului tip I sau tip II a superfamiliei TGFβ cu lungime completă produse recombinant prin utilizarea, de exemplu, a unei proteaze, de exemplu, tripsină, termolizină, chimotripsină, pepsină sau enzimă de conversie a aminoacizilor bazici împerecheaţi (PACE). Analiza computerizată (folosind un software disponibil comercial, de exemplu, MacVector, Omega, PCGene, Molecular Simulation, Inc.) poate fi utilizată pentru a identifica situsurile de scindare proteolitică.

3. Acizi nucleici care codifică polipeptidele receptorului superfamiliei TGFβ

În anumite modalităţi de realizare, prezenta dezvăluire redă acizi nucleici izolaţi şi/sau recombinanţi care codifică receptorii de tip I sau de tip II ai superfamiliei TGFβ (incluzând fragmente, variante funcţionale şi proteine de fuziune ale acestora) dezvăluite aici. De exemplu, SEQ ID NO: 12 codifică polipeptida precursoare a ActRIIA uman care apare natural, în timp ce SEQ ID NO: 13 codifică domeniul extracelular prelucrat al ActRIIA. Acizii nucleici în cauză pot fi monocatenari sau bicatenari. Astfel de acizi nucleici pot fi molecule de ADN sau ARN. Aceşti acizi nucleici pot fi utilizaţi, de exemplu, în metode pentru fabricarea complecşilor heteromultimeri cu un singur braţ ai superfamiliei TGF-beta din prezenta dezvăluire.

Aşa cum se utilizează aici, acid(zi) nucleic(i) izolat(i) se referă la o moleculă de acid nucleic care a fost separată de o componentă a mediului său natural. Un acid nucleic izolat include o moleculă de acid nucleic conţinută în celule care conţin de obicei molecula de acid nucleic, dar molecula de acid nucleic este prezentă extracromozomial sau într-o locaţie cromozomială diferită de locaţia sa cromozomială naturală.

În anumite modalităţi de realizare, acizii nucleici care codifică polipeptide ale receptorului tip I sau tip II a superfamiliei TGFβ din prezenta dezvăluire sunt înţeleşi ca incluzând acizi nucleici care sunt variante ale oricăreia dintre SEQ ID NO: 7, 8, 12, 13, 16, 17, 20, 21, 24, 25, 28, 29, 32, 33, 36, 37, 40, 41, 44, 45, 48, 49, 52, 53, 69, 70, 73, 74, 77, 78, 81, 82, 85, 86, 89, 90, 93, 94, 102, 105, 108, 114, 117, 120, 123, 126, 129, 132, 135, 303, 304, 307, 308, 311, şi 312. Diferite secvenţe de nucleotide includ secvenţe care diferă prin una sau mai multe substituţii, adiţii sau deleţii de nucleotide incluzând variante alelice şi, prin urmare, vor include secvenţe de codificare care diferă de secvenţa de nucleotide desemnată în oricare dintre SEQ ID NO: 7, 8, 12, 13, 16, 17, 20, 21, 24, 25, 28, 29, 32, 33, 36, 37, 40, 41, 44, 45, 48, 49, 52, 53, 69, 70, 73, 74, 77, 78, 81, 82, 85, 86, 89, 90, 93, 94, 102, 105, 108, 114, 117, 120, 123, 126, 129, 132, 135, 303, 304, 307, 308, 311, şi 312.

În anumite modalităţi de realizare, polipeptidele receptorului tip I sau tip II a superfamiliei TGFβ din prezenta dezvăluire sunt codificate de secvenţe de acid nucleic izolate sau recombinante care sunt cel puţin 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, sau 99% identice cu SEQ ID NO: 7, 8, 12, 13, 16, 17, 20, 21, 24, 25, 28, 29, 32, 33, 36, 37, 40, 41, 44, 45, 48, 49, 52, 53, 69, 70, 73, 74, 77, 78, 81, 82, 85, 86, 89, 90, 93, 94, 102, 105, 108, 114, 117, 120, 123, 126, 129, 132, 135, 303, 304, 307, 308, 311, şi 312. Un specialist în domeniu va aprecia că secvenţele de acid nucleic care sunt cel puţin 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, sau 99% identice cu secvenţele complementare SEQ ID NO: 7, 8, 12, 13, 16, 17, 20, 21, 24, 25, 28, 29, 32, 33, 36, 37, 40, 41, 44, 45, 48, 49, 52, 53, 69, 70, 73, 74, 77, 78, 81, 82, 85, 86, 89, 90, 93, 94, 102, 105, 108, 114, 117, 120, 123, 126, 129, 132, 135, 303, 304, 307, 308, 311, şi 312 se încadrează de asemenea în scopul prezentei dezvăluiri. În alte modalităţi de realizare, secvenţele de acid nucleic conform dezvăluirii pot fi izolate, recombinante şi/sau fuzionate cu o secvenţă de nucleotide heterologe sau într-o bibliotecă de ADN.

În alte modalităţi de realizare, acizii nucleici conform prezentei dezvăluiri includ, de asemenea, secvenţe de nucleotide care hibridizează în condiţii stringente cu secvenţa de nucleotide desemnată în SEQ ID NO: 7, 8, 12, 13, 16, 17, 20, 21, 24, 25, 28, 29, 32, 33, 36, 37, 40, 41, 44, 45, 48, 49, 52, 53, 69, 70, 73, 74, 77, 78, 81, 82, 85, 86, 89, 90, 93, 94, 102, 105, 108, 114, 117, 120, 123, 126, 129, 132, 135, 303, 304, 307, 308, 311, şi 312, secvenţa complementară a SEQ ID NO: 7, 8, 12, 13, 16, 17, 20, 21, 24, 25, 28, 29, 32, 33, 36, 37, 40, 41, 44, 45, 48, 49, 52, 53, 69, 70, 73, 74, 77, 78, 81, 82, 85, 86, 89, 90, 93, 94, 102, 105, 108, 114, 117, 120, 123, 126, 129, 132, 135, 303, 304, 307, 308, 311, şi 312, sau fragmente ale acestora. O persoană cu calificare obişnuită în domeniu va înţelege cu uşurinţă că, condiţiile adecvate de stringenţă care promovează hibridizarea ADN-ului pot fi variate. De exemplu, s-ar putea efectua hibridizarea la 6,0 x clorură de sodiu/citrat de sodiu (SSC) la aproximativ 45 °C, urmată de o spălare de 2,0 x SSC la 50 °C. De exemplu, concentraţia de sare în etapa de spălare poate fi selectată dintre o stringenţă scăzută de aproximativ 2,0 x SSC la 50 °C până la o stringenţă ridicată de aproximativ 0,2 x SSC la 50 °C. În plus, temperatura în etapa de spălare poate fi crescută de la condiţii de stringenţă scăzută la temperatura camerei, aproximativ 22 °C, la condiţii de stringenţă ridicată la aproximativ 65 °C. Atât temperatura, cât şi sarea pot fi variate, sau temperatura sau concentraţia de sare pot fi menţinute constante în timp ce cealaltă variabilă este schimbată. Într-un modalitate de realizare, dezvăluirea redă acizi nucleici care hibridizează în condiţii de stringenţă scăzută de 6 x SSC la temperatura camerei, urmată de o spălare la 2 x SSC la temperatura camerei.

Acizi nucleici izolaţi care diferă de acizii nucleici aşa cum este specificat în SEQ ID NO: 7, 8, 12, 13, 16, 17, 20, 21, 24, 25, 28, 29, 32, 33, 36, 37, 40, 41, 44, 45, 48, 49, 52, 53, 69, 70, 73, 74, 77, 78, 81, 82, 85, 86, 89, 90, 93, 94, 102, 105, 108, 114, 117, 120, 123, 126, 129, 132, 135, 303, 304, 307, 308, 311, şi 312 din cauza degenerării în codul genetic fac parte, de asemenea, din scopul dezvăluirii. De exemplu, un număr de aminoacizi sunt desemnaţi de mai mult de un triplet. Codonii care specifică acelaşi aminoacid sau sinonime (de exemplu, CAU şi CAC sunt sinonime pentru histidină) pot avea ca rezultat mutaţii ʺsilenţioaseʺ care nu afectează secvenţa de aminoacizi a proteinei. Cu toate acestea, este de aşteptat ca printre celulele de mamifere să existe polimorfisme ale secvenţei de ADN care să conducă la modificări ale secvenţelor de aminoacizi ale proteinelor în cauză. Un specialist în domeniu va aprecia că aceste variaţii într-una sau mai multe nucleotide (până la aproximativ 3-5% din nucleotide) ale acizilor nucleici care codifică o anumită proteină pot exista la indivizii unei specii date datorită variaţiei alelice naturale. Oricare şi toate astfel de variaţii de nucleotide şi polimorfisme ale aminoacizilor rezultate se încadrează în scopul acestei dezvăluiri.

În anumite modalităţi de realizare, acizii nucleici recombinanţi ai prezentei dezvăluiri pot fi legaţi operaţional la una sau mai multe secvenţe de nucleotide reglatoare într-un construct de exprimare. Secvenţele de nucleotide reglatoare vor fi în general adecvate celulei gazdă utilizate pentru exprimare. Numeroase tipuri de vectori de exprimare corespunzători şi secvenţe de reglare adecvate sunt cunoscute în domeniu pentru o varietate de celule gazdă. Tipic, una sau mai multe secvenţe de nucleotide reglatoare pot include, dar nu se limitează la, secvenţe promotor, secvenţe lider sau de semnal, situsuri de legare ribozomală, secvenţe de pornire şi terminare transcripţionale, secvenţe de pornire şi terminare translaţionale şi secvenţe de amplificator sau activator. Promotorii constitutivi sau inductibili, cunoscuţi în domeniu, sunt luaţi în considerare în dezvăluire. Promotorii pot fi fie promotori naturali, fie promotori hibrizi care combină elemente ale mai multor promotori. Un construct de exprimare poate fi prezent într-o celulă pe un episom, cum ar fi o plasmidă, sau constructul de exprimare poate fi inserat într-un cromozom. În unele modalităţi de realizare, vectorul de exprimare conţine o genă marker selectabilă pentru a permite selectarea celulelor gazdă transformate. Genele marker selectabile sunt bine cunoscute în domeniu şi vor varia în funcţie de celula gazdă utilizată.

În anumite aspecte ale prezentei dezvăluiri, acidul nucleic în cauză este furnizat într-un vector de exprimare cuprinzând o secvenţă de nucleotidă care codifică o polipeptidă a receptorului de tip I sau tip II a superfamiliei TGFβ şi este legată operaţional de cel puţin o secvenţă reglatoare. Secvenţele reglatoare sunt recunoscute în domeniu şi sunt selectate pentru exprimarea directă a polipeptidei receptorului de tip I sau tip II a superfamiliei TGFβ. În consecinţă, termenul secvenţă reglatoare include promotori, amplificatori şi alte elemente de control a exprimării. Secvenţe reglatoare exemplare sunt descrise în Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, CA (1990). De exemplu, oricare dintr-o mare varietate de secvenţe de control a exprimării care controlează exprimarea unei secvenţe de ADN atunci când este legată operativ de aceasta poate fi utilizată în aceşti vectori pentru a exprima secvenţe de ADN care codifică o polipeptidă a receptorului de tip I sau tip II a superfamiliei TGFβ. Astfel de secvenţe de control a exprimării utile includ, de exemplu, promotorii timpurii şi tardivi ai SV40, promotor tet, promotor timpuriu imediat de adenovirus sau citomegalovirus, promotori RSV, sistemul lac, sistemul trp, sistemul TAC sau TRC, promotorul T7 a cărui exprimare este direcţionată de ARN polimeraza T7, principalele regiuni operator şi promotor ale fagului lambda, regiunile de control pentru proteina de acoperire fd, promotorul pentru 3-fosfoglicerat kinaza sau alte enzime glicolitice, promotori ai fosfatazei acide, de exemplu, Pho5, promotorii factorilor de cuplare α de drojdie, promotorul poliedrului sistemului baculovirusului şi alte secvenţe cunoscute pentru controlul exprimării genelor celulelor procariote sau eucariote sau a virusurilor acestora şi a diverselor combinaţii ale acestora. Ar trebui înţeles că proiectarea vectorului de exprimare poate depinde de factori precum alegerea celulei gazdă care urmează să fie transformată şi/sau tipul de proteină care se doreşte a fi exprimată. Mai mult, ar trebui luate în considerare şi numărul copiei vectorului, capacitatea de a controla numărul respectivei copii şi exprimarea oricărei alte proteine codate de vector, cum ar fi markerii antibiotici.

Un acid nucleic recombinant conform prezentei dezvăluiri poate fi produs prin ligarea genei clonate, sau a unei porţiuni a acesteia, într-un vector adecvat pentru exprimarea fie în celule procariote, celule eucariote (drojdie, aviare, insecte sau mamifere), fie ambele. Vehiculele de exprimare pentru producerea unei polipeptide recombinante a receptorului de tip I sau tip II a superfamiliei TGFβ include plasmide şi alţi vectori. De exemplu, vectorii adecvaţi includ plasmide de următoarele tipuri: plasmide derivate din pBR322, plasmide derivate din pEMBL, plasmide derivate din pEX, plasmide derivate din pBTac şi plasmide derivate din pUC pentru exprimare în celule procariote, cum ar fi E. coli.

Unii vectori de exprimare a mamiferelor conţin atât secvenţe procariote pentru a facilita propagarea vectorului în bacterii, cât şi una sau mai multe unităţi de transcripţie eucariote care sunt exprimate în celule eucariote. Vectorii derivaţi de pcDNAI/amp, pcDNAI/neo, pRc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pSV2-dhfr, pTk2, pRSVneo, pMSG, pSVT7, pko-neo şi pHyg sunt exemple de vectori de exprimare de mamifere adecvaţi pentru transfecţia celulelor eucariote. Unii dintre aceşti vectori sunt modificaţi cu secvenţe din plasmide bacteriene, cum ar fi pBR322, pentru a facilita replicarea şi selectarea rezistenţei la medicamente atât în celulele procariote, cât şi în celulele eucariote. Alternativ, derivaţii de viruşi precum virusul papilomului bovin (BPV-1) sau virusul Epstein-Barr (pHEBo, derivat din pREP şi p205) pot fi utilizaţi pentru exprimarea tranzitorie a proteinelor în celulele eucariote. Exemple de alte sisteme de exprimare virale (incluzând retrovirale) pot fi găsite mai jos în descrierea sistemelor de administrare a terapiei genice. Diferitele metode utilizate în prepararea plasmidelor şi în transformarea organismelor gazdă sunt bine cunoscute în domeniu. Pentru alte sisteme de exprimare adecvate atât pentru celulele procariote, cât şi pentru celulele eucariote, precum şi pentru proceduri recombinante generale, vezi, de exemplu, Molecular Cloning A Laboratory Manual, ed a 3-a, ed. de Sambrook, Fritsch şi Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001). În unele cazuri, poate fi de dorit să se exprime polipeptidele recombinante prin utilizarea unui sistem de exprimare a baculovirusului. Exemple de astfel de sisteme de exprimare a baculovirusului includ vectori derivaţi de pVL (cum ar fi pVL1392, pVL1393 şi pVL941), vectori derivaţi de pAcUW (cum ar fi pAcUW1), şi vectori derivaţi de pBlueBac (cum ar fi β-gal conţinând pBlueBac III).

Într-o modalitate de realizare preferată, un vector va fi proiectat pentru producerea polipeptidei în cauză a receptorului de tip I sau tip II a superfamiliei TGFβ în celule CHO, cum ar fi un vector Pcmv-Script (Stratagene, La Jolla, California), vectori pcDNA4 (Invitrogen, Carlsbad, California) şi vectorii pCI-neo (Promega, Madison, Wise.). După cum va fi evident, construcţii genei în cauză pot fi utilizaţi pentru a provoca exprimarea polipeptidei în cauză a receptorului de tip I sau tip II a superfamiliei TGFβ în celule propagate în cultură, de exemplu, pentru a produce proteine, incluzând proteine de fuziune sau variante de proteine, pentru purificare

Această dezvăluire se referă, de asemenea, la o celulă gazdă transfectată cu o genă recombinantă, incluzând o secvenţă de codificare pentru una sau mai multe din polipeptidele în cauză a receptorului de tip I sau tip II a superfamiliei TGFβ. Celula gazdă poate fi orice celulă procariotă sau eucariotă. De exemplu, o polipeptidă a receptorului de tip I sau tip II a superfamiliei TGFβ conform dezvăluirii poate fi exprimată în celule bacteriene cum ar fi E. coli, celule de insecte (de exemplu, utilizând un sistem de exprimare a baculovirusului), drojdie sau celule de mamifere [de exemplu. o linie celulară de ovar de hamster chinezesc (CHO)]. Alte celule gazdă adecvate sunt cunoscute specialiştilor în domeniu

În consecinţă, prezenta dezvăluire se referă în plus la metode de producere a polipeptidelor în cauză a receptorului de tip I sau tip II a superfamiliei TGFβ. De exemplu, o celulă gazdă transfectată cu un vector de exprimare care codifică polipeptidă a receptorului de tip I sau tip II a superfamiliei TGFβ poate fi cultivată în condiţii adecvate pentru a permite exprimarea unei polipeptide a receptorului de tip I sau tip II a superfamiliei TGFβ. Polipeptida poate fi secretată şi izolată dintr-un amestec de celule şi mediu care conţine polipeptida. Alternativ, polipeptida receptorului de tip I sau tip II a superfamiliei TGFβ poate fi izolată dintr-o fracţie citoplasmatică sau membranară obţinută din celule recoltate şi lizate. O cultură celulară include celule gazdă, medii şi alte produse secundare. Mediile adecvate pentru cultura celulelor sunt bine cunoscute în domeniu. Polipeptidele în cauză pot fi izolate din mediul de cultură celulară, celulele gazdă sau ambele, utilizând tehnici cunoscute în domeniu pentru purificarea proteinelor, incluzând cromatografia cu schimb de ioni, cromatografia de filtrare pe gel, ultrafiltrarea, electroforeza, purificarea de imunoafinitate cu anticorpi specifici pentru epitopii specifici ai polipeptidelor receptorului tip I sau tip II a superfamiliei TGFβ şi purificarea de afinitate cu un agent care se leagă la un domeniu fuzionat cu o polipeptidă a receptorului de tip I sau tip II a superfamiliei TGFβ (de exemplu, o coloană de proteină A poate fi utilizată pentru a purifica o polipeptidă de fuziune sau complex proteic a receptorului tip I -Fc sau a receptorului tip II-Fc a superfamiliei TGFβ). În unele modalităţi de realizare, o polipeptidă a receptorului de tip I sau tip II a superfamiliei TGFβ este o polipeptidă de fuziune sau complex proteic care conţine un domeniu care facilitează purificarea acesteia.

În unele modalităţi de realizare, purificarea se realizează printr-o serie de etape de cromatografie pe coloană, incluzând, de exemplu, trei sau mai multe dintre următoarele, în orice ordine: cromatografia cu proteină A, cromatografia cu sefaroză Q, cromatografia cu fenilsefaroză, cromatografia cu excludere a dimensiunii şi cromatografia cu schimb de cationi. Purificarea ar putea fi completată cu filtrare virală şi schimb de tampon. O polipeptidă de fuziune sau complex proteic a receptorului tip I -Fc sau a receptorului tip II-Fc a superfamiliei TGFβ se pot purifica la >90%, >95%, >96%, >98%, sau >99% aşa cum este determinat prin cromatografie de excludere a dimensiunii şi >90%, >95%, >96%, >98%, sau >99% aşa cum este determinat prin SDS PAGE. Nivelul ţintă de puritate ar trebui să fie unul suficient pentru a obţine rezultatele dorite în sistemele de mamifere, în special primatele neumane, rozătoarele (şoarecii) şi oamenii.

Într-o altă modalitate de realizare, o genă de fuziune care codifică o secvenţă lider de purificare, cum ar fi o secvenţă a situsului de clivare poli-(His)/enterokinază la capătul N-terminal al porţiunii dorite a polipeptidei recombinante a receptorului de tip I sau tip II a superfamiliei TGFβ, poate permite purificarea proteinei de fuziune exprimate prin cromatografie de afinitate folosind o răşină metalică Ni2+. Secvenţa lider de purificare poate fi apoi îndepărtată ulterior prin tratament cu enterokinază pentru a furniza polipeptida purificată sau complexul proteic a receptorului de tip I sau tip II a superfamiliei TGFβ. Vezi, de exemplu, Hochuli şi colab. (1987) J. Chromatography 411:177; şi Janknecht şi colab. (1991) PNAS USA 88:8972.

Tehnicile pentru obţinerea genelor de fuziune sunt bine cunoscute. În esenţă, îmbinarea diferitelor fragmente de ADN care codifică diferite secvenţe de polipeptide se efectuează în conformitate cu tehnicile convenţionale, utilizând capete terminale teşite sau cu capete eşalonate pentru ligare, digestie a enzimei de restricţionare pentru a asigura capete adecvate, completarea capetelor coezive după caz, tratament cu fosfatază alcalină pentru evitarea îmbinării nedorite şi ligatură enzimatică. Într-o altă modalitate de realizare, gena de fuziune poate fi sintetizată prin tehnici convenţionale, incluzând sintetizatoare automate de ADN. Alternativ, amplificarea PCR a fragmentelor de gene poate fi efectuată folosind grunduri de ancorare care dau naştere unor console complementare între două fragmente de gene consecutive care pot fi ulterior recoapte pentru a genera o secvenţă genică himerică. Vezi, de exemplu, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel şi colab., John Wiley & Sons: 1992.

4. Analize de Screening

În anumite aspecte, prezenta dezvăluire se referă la utilizarea complecşii heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului tip I şi tip II ai superfamiliei TGFβ pentru identificarea compuşilor(agenţilor) care sunt agonişti sau antagonişti ai receptorilor superfamiliei TGFβ. Compuşii identificaţi prin acest screening pot fi testaţi pentru a se evalua capacitatea lor de a modula ţesuturi cum ar fi os, cartilaj, muşchi, grăsime şi/sau neuroni, pentru a evalua capacitatea lor de a modula creşterea ţesutului in vivo sau in vitro. Aceşti compuşi pot fi testaţi, de exemplu, pe modele de animale.

Există numeroase abordări ale screening-ului agenţilor terapeutici pentru modularea creşterii ţesuturilor prin ţintirea semnalizării ligandului superfamiliei TGFβ (de exemplu, semnalizarea SMAD 2/3 şi/sau SMAD 1/5/8). În anumite modalităţi de realizare, screeningul de mare viteză al compuşilor poate fi efectuat pentru identificarea unor agenţi care perturbă efectele mediate de receptorii superfamiliei TGFβ pe o linie celulară selectată. În anumite modalităţi de realizare, analiza este efectuată pentru a selecta şi identifica compuşii care inhibă sau reduc specific legarea unui complex heteromultimer cu un singur braţ al unui receptor al superfamiliei TGF-beta la partenerul său de legare, cum ar fi un ligand al superfamiliei TGFβ (de exemplu, BMP2, BMP2/7, BMP3, BMP4, BMP4/7, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8a, BMP8b, BMP9, BMP10, GDF3, GDF5, GDF6/BMP13, GDF7, GDF8, GDF9b/BMP15, GDF11/BMP11, GDF15/MIC1, TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina AE, activina BC, activina BE, nodal, GDNF, neurturina, artemina, persefina, MIS, şi Lefty). Alternativ, analiza poate fi utilizată pentru a se identifica compuşii care îmbunătăţesc legarea unui complex heteromultimer cu un singur braţ al unui receptor al superfamiliei TGF-beta la partenerul său de legare, cum ar fi un ligand al superfamiliei TGFβ. Într-o altă modalitate de realizare, compuşii pot fi identificaţi prin capacitatea lor de a interacţiona cu un complex heteromultimer cu un singur braţ al unui receptor al superfamiliei TGF-beta conform dezvăluirii.

O varietate de formate de analize va fi suficientă şi, în lumina prezentei dezvăluiri, cele care nu sunt descrise în mod expres aici vor fi totuşi înţelese de către un specialist în domeniu. Aşa cum este descris aici, compuşii de (agenţi) testare conform invenţiei pot fi creaţi prin orice metodă combinatorie chimică. Alternativ, compuşii în cauză pot fi sintetizaţi biomolecule naturale in vivo sau in vitro. Compuşii (agenţi) care trebuie testaţi în ceea ce priveşte capacitatea lor de a acţiona ca modulatori ai creşterii ţesuturilor pot fi produşi, de exemplu, de bacterii, drojdie, plante sau alte organisme (de exemplu, produse naturale), produşi chimic (de exemplu, molecule mici, incluzând peptidomimetice), sau produşi recombinant. Compuşii de testat luaţi în considerare de prezenta invenţie includ molecule organice non-peptidil, peptide, polipeptide, peptidomimetice, zaharuri, hormoni şi molecule de acid nucleic. În anumite modalităţi de realizare, agentul de testare este o moleculă organică mică având o greutate moleculară mai mică de aproximativ 2.000 Daltoni.

Compuşii de testare conform dezvăluirii pot fi furnizaţi ca entităţi unice, discrete, sau furnizaţi în biblioteci de complexitate mai mare, cum ar fi unele realizate prin chimie combinatorie. Aceste biblioteci pot cuprinde, de exemplu, alcooli, halogenuri de alchil, amine, amide, esteri, aldehide, eteri şi alte clase de compuşi organici. Prezentarea compuşilor de testat la sistemul de testare poate fi, fie într-o formă izolată, fie ca amestecuri de compuşi, în special în etapele iniţiale de screening. Opţional, compuşii pot fi opţional derivatizaţi cu alţi compuşi şi au grupe de derivatizare care facilitează izolarea compuşilor. Exemple nelimitative de grupări derivatizante includ biotină, fluoresceină, digoxigenină, proteină fluorescentă verde, izotopi, polistidină, perle magnetice, glutation S-transferază (GST), agenţi de reticulare fotoactivabili sau orice combinaţii ale acestora.

În multe programe de screening pentru medicamente care testează biblioteci de compuşi şi extracte naturale, sunt de dorit analize cu randament ridicat pentru a maximiza numărul de compuşi studiaţi într-o perioadă de timp dată. Analizele care sunt efectuate în sisteme fără celule, cum ar fi derivate de proteine purificate sau semipurificate, sunt deseori preferate ca screeninguri ʺprimareʺ prin faptul că pot fi generate pentru a permite dezvoltarea rapidă şi detectarea relativ uşoară a unei modificări într-o ţintă moleculară care este mediată de un compus de testat. Mai mult, efectele toxicităţii celulare sau a biodisponibilităţii compusului testat pot fi ignorate în general în sistemul in vitro, analiza fiind în schimb axată în primul rând pe efectul medicamentului asupra ţintei moleculare, aşa cum se poate manifesta într-o modificare a afinităţii de legare între un complex heteromultimer cu un singur braţ al unui receptor al superfamiliei TGF-beta şi partenerul său de legare (de exemplu, BMP2, BMP2/7, BMP3, BMP4, BMP4/7, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8a, BMP8b, BMP9, BMP10, GDF3, GDF5, GDF6/BMP13, GDF7, GDF8, GDF9b/BMP15, GDF11/BMP11, GDF15/MIC1, TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina AE, activina BC, activina BE, nodal, GDNF, neurturina, artemina, persefina, MIS, şi Lefty).

Numai pentru a ilustra, într-o analiză de screening exemplară conform prezentei dezvăluiri, compusul de interes este contactat cu un complex heteromultimer cu un singur braţ al unui receptor al superfamiliei TGF-beta izolat şi purificat, care este în mod obişnuit capabil să se lege la un ligand al superfamiliei TGF-beta, aşa cum este adecvat pentru intenţia analizei. La amestecul compusului şi complexului heteromultimer cu un singur braţ al unui receptor al superfamiliei TGF-beta se adaugă apoi ligandul adecvat al superfamiliei TGF-beta (de exemplu, BMP2, BMP2/7, BMP3, BMP4, BMP4/7, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8a, BMP8b, BMP9, BMP10, GDF3, GDF5, GDF6/BMP13, GDF7, GDF8, GDF9b/BMP15, GDF11/BMP11, GDF15/MIC1, TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina AE, activina BC, activina BE, nodal, GDNF, neurturina, artemina, persefina, MIS, şi Lefty). Detectarea şi cuantificarea complecşilor dintre heteromultimerii cu un singur braţ şi liganzii superfamiliei oferă un mijloc pentru determinarea eficacităţii compusului la inhibarea (sau potenţarea) formării complexului între un complex heteromultimer cu un singur braţ al unui receptor al superfamiliei TGF-beta şi proteina sa de legare. Eficacitatea compusului poate fi evaluată prin generarea curbelor doză-răspuns din datele obţinute folosind diferite concentraţii ale compusului testat. Mai mult, o analiză de control poate fi de asemenea efectuată şi pentru a oferi o valoare iniţială pentru comparaţie. De exemplu, într-o analiză de control, un ligand al superfamiliei TGF-beta, izolat şi purificat este adăugat la o compoziţie care conţine complexul heteromultimer cu un singur braţ al receptorului superfamiliei TGF-beta, şi formarea complexului heteromultimer-ligand este cuantificată în absenţa compusului de testat. Se va înţelege că, în general, ordinea în care reactanţii pot fi amestecaţi poate fi variată şi pot fi amestecaţi simultan. Mai mult, în locul proteinelor purificate, pot fi utilizate extracte şi lizate celulare pentru a se obţine un sistem adecvat de analiză liber de celule.

Legarea unui complex heteromultimer cu un singur braţ al unui receptor al superfamiliei TGF-beta la o altă proteină poate fi detectată printr-o varietate de tehnici. De exemplu, modularea formării complecşilor poate fi cuantificată utilizând, de exemplu, proteine etichetate detectabil, cum ar fi etichetate radioactiv (de exemplu, 32P, 35S, 14C sau 3H), etichetate fluorescent (de exemplu, FITC), sau un complex heteromultimer cu un singur braţ al unui receptor al superfamiliei TGF-beta etichetat enzimatic şi proteina sa de legare prin imunoanaliză sau prin detectare cromatografică.

În anumite modalităţi de realizare, prezenta dezvăluire are în vedere utilizarea analizelor de polarizare a fluorescenţei şi a analizelor de transfer de energie prin rezonanţă de fluorescenţă (FRET) în măsurarea, directă sau indirectă, a gradului de interacţiune dintre un complex heteromultimer cu un singur braţ al unui receptor al superfamiliei TGF-beta şi proteina sa de legare. Mai mult, alte moduri de detectare, cum ar fi cele bazate pe ghidări de unde optice (vezi, de exemplu, Publicaţia PCT WO 96/26432 şi Brev. U.S. nr. 5.677.196), rezonanţă plasmonică de suprafaţă (SPR), senzori de încărcare de suprafaţă şi senzori de forţă de suprafaţă, sunt compatibile cu multe modalităţi de realizare a dezvăluirii.

Mai mult, prezenta dezvăluire are în vedere utilizarea unui analize de interacţiune tip capcană, cunoscut şi sub denumirea de "analiză cu doi hibrizi", pentru identificarea agenţilor care întrerup sau potenţează interacţiunea dintre un complex heteromultimer cu un singur braţ al unui receptor al superfamiliei TGF-beta şi partenerul său de legare. Vezi, de exemplu, Brev. U.S. nr. 5.283.317; Zervos şi colab. (1993) Cell 72:223-232; Madura şi colab. (1993) J Biol Chem 268:12046-12054; Bartel şi colab. (1993) Biotechniques 14:920-924; şi Iwabuchi şi colab. (1993) Oncogene 8:1693-1696). Într-o modalitate de realizare specifică, prezenta dezvăluire are în vedere utilizarea sistemelor inversate cu doi hibrizi pentru identificarea compuşilor (de exemplu, molecule mici sau peptide) care disociază interacţiunile dintre un complex heteromultimer cu un singur braţ al unui receptor al superfamiliei TGF-beta şi proteina sa de legare [vezi, de exemplu, Vidal şi Legrain, (1999) Nucleic Acids Res 27:919-29; Vidal şi Legrain, (1999) Trends Biotechnol 17:374-81; şi Brev. U.S. nr. 5.525.490; 5.955.280; şi 5.965.368].

În anumite modalităţi de realizare, compuşii în cauză sunt identificaţi prin capacitatea lor de a interacţiona cu un complex heteromultimer cu un singur braţ al unui receptor al superfamiliei TGF-beta din dezvăluire. Interacţiunea dintre compus şi complexul heteromultimer cu un singur braţ al unui receptor al superfamiliei TGF-beta poate fi covalentă sau necovalentă. De exemplu, o astfel de interacţiune poate fi identificată la nivel de proteină folosind metode biochimice in vitro, incluzând foto-reticularea, legarea ligandului etichetat radioactiv şi cromatografia de afinitate. Vezi, de exemplu, Jakoby WB şi colab. (1974) Methods in Enzymology 46:1. În anumite cazuri, compuşii pot fi selectaţi printr-o analiză bazată pe mecanism, cum ar fi o analiză pentru detectarea compuşilor care se leagă la un complex heteromultimer cu un singur braţ al receptorului superfamiliei TGF-beta. Aceasta poate include un eveniment de legare în fază solidă sau în fază fluidă. Alternativ, gena care codifică un complex heteromultimer cu un singur braţ al unui receptor al superfamiliei TGF-beta poate fi transfectată cu un sistem reporter (de exemplu, β-galactozidază, luciferază sau proteină fluorescentă verde) într-o celulă şi supusă unui screening faţă de bibliotecă, de preferinţă prin screening cu randament ridicat sau cu membri individuali ai bibliotecii. Pot fi utilizate alte analize de legare bazate pe mecanisme; de exemplu, analize de legare care detectează modificări ale energiei libere. Analizele de legare pot fi efectuate cu ţinta fixată pe un godeu, perlă sau cip sau captată de un anticorp imobilizat sau separată prin electroforeză capilară. Compuşii legaţi pot fi detectaţi de obicei folosind puncte finale colorimetrice sau de fluorescenţă sau rezonanţă plasmonică de suprafaţă.

5. Utilizări terapeutice exemplare

În anumite modalităţi de realizare, un complex heteromultimer cu un singur braţ al receptorului superfamiliei TGF-beta, sau combinaţii de complecşi heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului superfamiliei TGF-beta, din prezenta dezvăluire se pot utiliza pentru a trata sau preveni o boală sau o afecţiune care este asociată cu activitatea anormală a unui receptor al superfamiliei TGFβ (de exemplu, ALK1, ALK2, ALK3, ALK4, ALK5, ALK6, ALK7, ActRIIA, ActRIIB, BMPRII, TGFBRII, şi MISRII) şi/sau un ligand al superfamiliei TGFβ (de exemplu, BMP2, BMP2/7, BMP3, BMP4, BMP4/7, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8a, BMP8b, BMP9, BMP10, GDF3, GDF5, GDF6/BMP13, GDF7, GDF8, GDF9b/BMP15, GDF11/BMP11, GDF15/MIC1, TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina AE, activina BC, activina BE, nodal, GDNF, neurturina, artemina, persefina, MIS, şi Lefty). Aceste boli, tulburări sau afecţiuni sunt denumite în general aici ʺafecţiuni asociate superfamiliei TGFβʺ. În anumite modalităţi de realizare, prezenta invenţie redă metode de tratare sau prevenire a unei persoane care are nevoie de aceasta prin administrarea la individ a unei cantităţi eficiente terapeutic dintr-un complex heteromultimer cu un singur braţ al receptorului superfamiliei TGF-beta, sau combinaţii ale unor complecşi heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului superfamiliei TGF-beta, aşa cum este descris aici. Termenii ʺsubiectʺ, ʺindividʺ sau ʺpacientʺ sunt interschimbabili în toată specificaţia. Oricare dintre complecşii heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului superfamiliei TGF-beta din prezenta dezvăluire ar fi, potenţial, utilizat individual sau în combinaţie pentru utilizări terapeutice descrise aici. Aceste metode vizează în special tratamentele terapeutice şi profilactice ale mamiferelor, incluzând, de exemplu, rozătoare, primate şi oameni.

Aşa cum se utilizează aici, un terapeutic care ʺprevineʺ o tulburare sau afecţiune se referă la un compus care, într-un eşantion statistic, reduce apariţia tulburării sau afecţiunii în eşantionul tratat faţă de un eşantion martor netratat, sau întârzie debutul sau reduce severitatea unuia sau mai multor simptome ale tulburării sau stării în raport cu eşantionul martor netratat. Termenul "tratare", aşa cum se utilizează aici, include ameliorarea sau eliminarea afecţiunii odată ce a fost stabilită. În oricare dintre cazuri, prevenirea sau tratamentul pot fi discernute în diagnosticul dat de un medic sau alt furnizor de asistenţă medicală şi rezultatul intenţionat al administrării agentului terapeutic.

Complecşii receptori-ligand ai superfamiliei TGFβ nativi au roluri esenţiale în creşterea ţesuturilor, precum şi în procesele de dezvoltare timpurie, cum ar fi formarea corectă a diferitelor structuri sau în una sau mai multe capacităţi post-dezvoltare, incluzând dezvoltarea sexuală, producţia de hormoni hipofizari şi crearea de os şi cartilaj. Astfel, afecţiunile/tulburările asociate cu superfamilia TGFβ includ creşterea anormală a ţesuturilor şi defecte de dezvoltare. În plus, afecţiunile asociate cu superfamilia TGFβ includ, dar nu se limitează la acestea, tulburări de creştere şi diferenţiere celulară, cum ar fi inflamaţia, alergia, bolile autoimune, bolile infecţioase şi tumorile.

Afecţiuni exemplare asociate cu superfamilia TGFβ includ tulburări neuromusculare (de exemplu, distrofie musculară şi atrofie musculară), boală pulmonară obstructivă congestivă (şi pierderea musculară asociată cu COPD), sindrom de pierdere musculară, sarcopenie, caşexie, tulburări ale ţesutului adipos (de exemplu, obezitate), diabet de tip 2 (NIDDM, diabet cu debut la adult) şi boală degenerativă osoasă (de exemplu, osteoporoză). Alte afecţiuni exemplare asociate cu superfamilia TGFβ includ tulburări musculodegenerative şi neuromusculare, de reparare a ţesuturilor (de exemplu, vindecare a rănilor), boli neurodegenerative (de exemplu, scleroză laterală amiotrofică) şi tulburări imunologice (de exemplu, tulburări legate de proliferarea sau funcţia anormală a limfocitelor).

În anumite modalităţi de realizare, un complex heteromultimer cu un singur braţ al receptorului superfamiliei TGF-beta, sau combinaţii ale complecşilor heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului superfamiliei TGF-beta, conform dezvăluirii sunt utilizate ca parte a unui tratament pentru distrofia musculară. Termenul "distrofie musculară" se referă la un grup de boli degenerative musculare caracterizate prin slăbirea şi deteriorarea treptată a muşchilor scheletici şi uneori a muşchilor inimii şi a celor respiratori. Distrofiile musculare sunt tulburări genetice caracterizate prin pierderea musculară progresivă şi slăbiciune care încep cu modificări microscopice ale muşchiului. Pe măsură ce muşchii degenerează în timp, forţa musculară a persoanei scade. Distrofii musculare exemplare care pot fi tratate cu un regim care include complecşii heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului superfamiliei TGF-beta includ: distrofia musculară Duchenne (DMD), distrofia musculară Becker (BMD), distrofia musculară Emery-Dreifuss (EDMD), distrofia musculară a centurii membrelor (LGMD), distrofia musculară facioscapulohumerală (FSH sau FSHD) (cunoscută şi sub numele de Landouzy-Dejerine), distrofia miotonică (MMD; cunoscută şi sub numele de Boala Steinert), distrofia musculară oculofaringiană (OPMD), distrofia musculară distală (DD), distrofia musculară congenitală (CMD).

Distrofia musculară Duchenne (DMD) a fost descrisă pentru prima dată de neurologul francez Guillaume Benjamin Amand Duchenne în anii 1860. Distrofia musculară Becker (BMD) este numită după medicul german Peter Emil Becker, care a descris prima dată această variantă a DMD în anii 1950. DMD este una dintre cele mai frecvente boli moştenite la bărbaţi, afectând unul din 3.500 de băieţi. DMD apare atunci când gena distrofinei, situată pe braţul scurt al cromozomului X, este defectivă. Deoarece bărbaţii poartă numai o copie a cromozomului X, ei au numai o copie a genei distrofinei. Fără proteina distrofină, muşchii sunt uşor deterioraţi în timpul ciclurilor de contracţie şi relaxare. În timp ce la începutul bolii muşchiul compensează prin regenerare, ulterior celulele progenitoare ale muşchilor nu pot ţine pasul cu distrugerile care au loc şi muşchiul sănătos este înlocuit cu ţesut fibro-gras non-funcţional.

BMD rezultă din diferite mutaţii ale genei distrofinei. Pacienţii cu BMD au o anumită distrofină, dar este fie în cantitate insuficientă, fie de calitate slabă. Prezenţa unei anumite distrofine protejează muşchii pacienţilor cu BMD împotriva degenerării la fel de severă sau la fel de rapidă ca şi a pacienţilor cu DMD.

Studiile efectuate pe animale indică faptul că inhibarea căii de semnalizare GDF8 poate trata eficient diferite aspecte ale bolii la pacienţii cu DMD şi BMD (Bogdanovich şi colab., 2002, Nature 420:418-421; Pistilli şi colab., 2011, Am J Pathol 178:1287-1297). Astfel, Complecşii heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului superfamiliei TGF-beta conform dezvăluirii pot acţiona ca inhibitori GDF8 (antagonişti) şi pot constitui un mijloc alternativ de blocare a semnalizării prin GDF8 şi/sau liganzi ai superfamiliei TGFβ in vivo la pacienţi cu DMD şi BMD.

Similar, complecşii heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului superfamiliei TGF-beta conform dezvăluirii pot oferi un mijloc eficient de creştere a masei musculare în alte condiţii de boală unde este necesară o creştere musculară. De exemplu, scleroza laterală amiotrofică (ALS), numită şi boala Lou Gehrig sau boala neuronului motor, este o tulburare cronică, progresivă şi incurabilă a CNS care atacă neuronii motori, care sunt componente ale sistemului nervos central necesare pentru iniţierea contracţiei muşchilor scheletici. În ALS, neuronii motori se deteriorează şi mor în cele din urmă şi, deşi creierul unei persoane rămâne în mod normal pe deplin funcţional şi alert, iniţierea contracţiei musculare este blocată la nivelul coloanei vertebrale. Persoanele care dezvoltă ALS au de obicei între 40 şi 70 de ani, iar primii neuroni motori care degenerează sunt cei care inervează braţele sau picioarele. Pacienţii cu ALS pot avea probleme cu mersul pe jos, pot lăsa să cadă lucruri, să cadă, să-şi încurce vorbirea şi să râdă sau să plângă necontrolabil. Pe măsură ce boala progresează, muşchii de la nivelul membrelor încep să se atrofieze din neutilizare. Slăbiciunea musculară devine debilitantă, şi pacienţii au nevoie eventual de un scaun cu rotile sau sunt ţinuţi la pat. Majoritatea pacienţilor ALS mor din cauza insuficienţei respiratorii sau din cauza complicaţiilor asistenţei ventilatoare, cum ar fi pneumonia, la 3-5 ani de la debutul bolii.

De promovarea creşterii masei musculare de către complecşii heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului superfamiliei TGF-beta ar putea, de asemenea, să beneficieze cei care suferă de boli de pierdere musculară. Gonzalez-Cadavid şi colab. (supra) a raportat că exprimarea GDF8 se corelează invers cu masa lipsită de grăsime la om şi că exprimarea crescută a genei GDF8 este asociată cu scăderea în greutate la bărbaţii cu sindrom de epuizare SIDA. Prin inhibarea funcţiei GDF8 la pacienţii cu SIDA, cel puţin anumite simptome ale SIDA pot fi ameliorate, dacă nu sunt eliminate complet, îmbunătăţind astfel semnificativ calitatea vieţii la pacienţii cu SIDA.

Deoarece pierderea funcţiei GDF8 este, de asemenea, asociată cu pierderea de grăsime fără diminuarea aportului de nutrienţi (Zimmers şi colab., Supra; McPherron şi Lee, supra), complecşii heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului superfamiliei TGF-beta în cauză pot fi utilizaţi în continuare ca agent terapeutic pentru încetinirea sau prevenirea dezvoltării obezităţii şi a diabetului de tip 2.

Sindromul de anorexie-caşexie al cancerului se numără printre aspectele cele mai debilitante şi care pun viaţa în pericol ale cancerului. Acest sindrom este o caracteristică comună a multor tipuri de cancer - prezent la aproximativ 80% dintre pacienţii cu cancer la moarte - şi este responsabil nu numai pentru o calitate slabă a vieţii şi un răspuns slab la chimioterapie, ci şi un timp de supravieţuire mai scurt decât se întâlneşte la pacienţi cu tumori comparabile dar fără pierdere în greutate. Caşexia este de obicei suspectată la pacienţii cu cancer dacă într-o perioadă de şase luni are loc o pierdere involuntară în greutate mai mare de cinci la sută din greutatea premorbidă. Asociată cu anorexia, irosirea ţesutului adipos şi muscular şi cu suferinţa psihologică, caşexia provine dintr-o interacţiune complexă între cancer şi gazdă. Caşexia canceroasă afectează producţia de citokine, eliberarea factorilor care mobilizează lipidele şi care induc proteoliza şi modificări ale metabolismului intermediar. Deşi anorexia este comună, un aport alimentar scăzut singur nu este în măsură să ţină seama de modificările compoziţiei corpului observate la pacienţii cu cancer, iar creşterea aportului de nutrienţi nu este capabilă să inverseze sindromul de pierdere. În prezent, nu există niciun tratament care să controleze sau să inverseze procesul caşexic. Dat fiind că s-a constatat că supraexprimarea sistemică a GDF8 la şoareci adulţi induce pierderi musculare şi de grăsime profunde analoage cu cele observate în sindroamele de caşexie umană (Zimmers şi colab., supra), compoziţiile farmaceutice ale unui complex heteromultimer cu un singur braţ al unui receptor al superfamiliei TGF-beta în cauză pot fi utilizate benefic pentru prevenirea, tratarea sau ameliorarea simptomelor sindromului caşexiei, unde se doreşte creşterea musculară.

În anumite modalităţi de realizare, un complex heteromultimer cu un singur braţ al receptorului superfamiliei TGF-beta, sau combinaţii de complecşi heteromultimeri cu un singur braţ al receptorului superfamiliei TGF-beta, din prezenta dezvăluire se pot utiliza în metode de inducere a formării osoase şi/sau a cartilajului, prevenind pierderea de os, creşterea mineralizării osoase, prevenirea demineralizării osului şi/sau creşterea densităţii osoase. Complecşii heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului superfamiliei TGF-beta pot fi utili la pacienţii care sunt diagnosticaţi cu densitate osoasă subclinică scăzută, ca măsură de protecţie împotriva dezvoltării osteoporozei.

În unele modalităţi de realizare, un Complex heteromultimer cu un singur braţ al receptorului superfamiliei TGF-beta, sau combinaţii de complecşi heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului superfamiliei TGF-beta, din prezenta dezvăluire îşi pot găsi utilitate medicală în vindecarea fracturilor osoase şi a defectelor cartilajului la om şi alte animale. Metodele şi compoziţiile în cauză pot avea, de asemenea, utilizare profilactică în reducerea fracturilor închise şi deschise şi, de asemenea, în fixarea îmbunătăţită a articulaţiilor artificiale. Formarea osoasă de novo indusă de un agent osteogenic este utilă pentru repararea defectelor craniofaciale care sunt congenitale, induse de traume sau cauzate de rezecţia oncologică şi este utilă şi în chirurgia plastică cosmetică. Mai mult, metodele şi compoziţiile conform invenţiei pot fi utilizate în tratamentul bolii parodontale şi în alte procese de reparare a dinţilor. În anumite cazuri, un complex heteromultimer cu un singur braţ al receptorului superfamiliei TGF-beta, sau combinaţii de complecşi heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului superfamiliei TGF-beta, pot oferi un mediu care să atragă celulele formatoare de os, să stimuleze creşterea celulelor formatoare de os sau pot induce diferenţierea progenitorilor celulelor formatoare de os. Complecşii heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului superfamiliei TGF-beta conform dezvăluirii pot fi de asemenea utili în tratamentul osteoporozei. Mai mult, complecşii heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului superfamiliei TGF-beta pot fi utilizaţi pentru repararea defectelor cartilajului şi prevenirea/inversarea osteoartritei.

Rosen şi colab. (ed) Primer on the Metabolic Bone Diseases şi Disorders of Mineral Metabolism, ed. a 7-a American Society for Bone şi Mineral Research, Washington D.C. oferă o discuţie extinsă asupra tulburărilor osoase care pot fi supuse tratamentului cu un complex heteromultimer cu un singur braţ al unui receptor al superfamiliei TGF-beta sau cu unele combinaţii de complecşi heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului superfamiliei TGF-beta. O listă parţială este redată aici. Metodele şi compoziţiile conform invenţiei pot fi aplicate în afecţiuni caracterizate sau care cauzează pierderea osoasă, cum ar fi osteoporoza (incluzând osteoporoza secundară), hiperparatiroidismul, afecţiuni cronice ale rinichilor tulburări osoase minerale, privarea sau ablaţia hormonilor sexuali (de exemplu, androgen şi/sau estrogen), tratament cu glucocorticoizi, poliartrită reumatoidă, arsuri severe, hiperparatiroidism, hipercalcemie, hipocalcemie, hipofosfatemie, osteomalacie (incluzând osteomalacie indusă de tumori), hiperfosfatemie, deficit de vitamina D, hiperparatiroidism (incluzând hiperparatiroidism familial) şi pseudohipoparatiroidism, metastaze tumorale la os, pierdere de os drept consecinţă a unei tumori sau chimioterapie, tumori osoase şi ale măduvei osoase (de exemplu, mielom multiplu), tulburări osoase ischemice, boală parodontală şi pierderea osoasă orală, boala Cushing, boala Paget, tirotoxicoza, stare diareică cronică sau malabsorbţie, acidoză tubulară renală, sau anorexie nervoasă. Metodele şi compoziţiile conform invenţiei pot fi, de asemenea, aplicate la afecţiuni caracterizate printr-un eşec al formării sau vindecării osoase, incluzând fracturi care nu se unesc, fracturi care din alte motive se vindecă lent, displazii osoase fetale şi neonatale (de exemplu, hipocalcemie, hipercalcemie, defecte de receptor de calciu şi deficit de vitamina D), osteonecroză (incluzând osteonecroza maxilarului) şi osteogeneză imperfectă. În plus, efectele anabolizante vor determina astfel de antagonişti să diminueze durerea osoasă asociată cu deteriorarea sau eroziunea osoasă. Ca o consecinţă a efectelor anti-resorptive, astfel de antagonişti pot fi utili pentru tratarea tulburărilor de formare osoasă anormală, cum ar fi metastazele tumorale osteoblastice (de exemplu, asociate cu cancerul de prostată sau de sân primar), osteosarcomul osteogen, osteopetroza, displazia diafizară progresivă, hiperostoza endosteală, osteopoikiloză şi melorheostoza. Alte tulburări care pot fi tratate includ displazia fibroasă şi condrodisplaziile.

Într-o altă modalitate de realizare specifică, dezvăluirea redă o metodă terapeutică şi o compoziţie pentru repararea fracturilor şi a altor afecţiuni legate de defecte cartilaj şi/sau osoase sau boli parodontale. Invenţia redă în plus metode terapeutice şi compoziţii pentru vindecarea rănilor şi repararea ţesuturilor. Tipurile de răni includ, dar nu se limitează la, arsuri, incizii şi ulcere. Vezi, de exemplu, Publicaţia PCT Nr. WO 84/01106. Astfel de compoziţii cuprind o cantitate eficientă terapeutic din cel puţin unul dintre complecşii heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului superfamiliei TGF-beta conform dezvăluirii în amestec cu un vehicul, purtător sau matrice acceptabile farmaceutic.

În unele modalităţi de realizare, un complex heteromultimer cu un singur braţ al receptorului superfamiliei TGF-beta, sau combinaţii de complecşi heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului superfamiliei TGF-beta, conform dezvăluirii se pot aplica unor afecţiuni care cauzează pierderea osoasă, cum ar fi osteoporoza, hiperparatiroidismul, boala Cushing, tirotoxicoza, starea diareică cronică sau malabsorbţia, acidoza tubulară renală sau anorexia nervoasă. Este de regulă apreciat faptul că a fi femeie, a avea o greutate corporală redusă şi a conduce un stil de viaţă sedentar sunt factori de risc pentru osteoporoză (pierderea densităţii minerale osoase, ceea ce duce la riscul de fractură). Cu toate acestea, osteoporoza poate rezulta şi din utilizarea pe termen lung a anumitor medicaţii. Osteoporoza care rezultă din medicamente sau altă afecţiune este cunoscută sub numele de osteoporoză secundară. În boala Cushing, cantitatea în exces de cortizol produsă de organism are ca rezultat osteoporoză şi fracturi. Cele mai frecvente medicaţii asociate osteoporozei secundare sunt corticosteroizii, o clasă de medicamente care acţionează similar cortizolului, un hormon produs în mod natural de glandele suprarenale. Deşi sunt necesare niveluri adecvate de hormoni tiroidieni pentru dezvoltarea scheletului, excesul de hormon tiroidian poate scădea în timp masa osoasă. Antiacidele care conţin aluminiu pot conduce la pierderea osoasă atunci când sunt luate în doze mari de persoanele cu probleme renale, în special cele care fac dializă. Alte medicaţii care pot provoca osteoporoză secundară includ fenitoina (Dilantin) şi barbituricele care sunt utilizate pentru a preveni convulsiile; metotrexat (Rheumatrex, Immunex, Folex PFS), un medicament pentru unele forme de artrită, cancer şi tulburări imune; ciclosporină (Sandimmune, Neoral), un medicament utilizat pentru tratarea unor boli autoimune şi pentru suprimarea sistemului imunitar la pacienţii cu transplant de organe; agonişti hormonali care eliberează hormon de luteinizare (Lupron, Zoladex), utilizaţi pentru tratarea cancerului de prostată şi a endometriozei; heparină (Calciparine, Liquaemin), o medicaţie anticoagulantă; şi colestiramină (Questran) şi colestipol (Colestid), utilizate pentru tratamentul colesterolului ridicat. Pierderea osoasă rezultată din terapia cancerului este larg recunoscută şi denumită pierderea osoasă indusă de terapia cancerului (CTIBL). Metastazele osoase pot crea cavităţi în os care pot fi corectate prin tratamentul cu un complex heteromultimer al superfamiliei TGF-beta. Pierderea osoasă poate fi cauzată şi de boala gingiilor, o infecţie cronică în care bacteriile localizate în adânciturile gingivale produc toxine şi enzime dăunătoare.

Într-o altă modalitate de realizare, prezenta dezvăluire redă metode şi agenţi terapeutici pentru tratarea bolilor sau tulburărilor asociate cu creşterea osoasă anormală sau nedorită. De exemplu, pacienţii cu tulburare congenitală fibrodisplazie ossificans progressiva (FOP) sunt afectaţi de creşterea osoasă ectopică progresivă în ţesuturile moi spontan sau ca răspuns la un traumatism tisular, cu un impact major asupra calităţii vieţii. În plus, creşterea osoasă anormală poate apărea după intervenţia chirurgicală de înlocuire a şoldului şi astfel distruge rezultatul chirurgical. Acesta este un exemplu mai comun de creştere osoasă patologică şi o situaţie în care metodele şi compoziţiile în cauză pot fi utile terapeutic. Aceleaşi metode şi compoziţii pot fi utile şi pentru tratarea altor forme de creştere osoasă anormală (de exemplu, creşterea patologică a osului după traume, arsuri sau leziuni ale măduvei spinării) şi pentru tratarea sau prevenirea afecţiunilor nedorite asociate cu creşterea osoasă anormală observată în legătură cu cancer de prostată metastatic sau osteosarcom.

În anumite modalităţi de realizare, un complex heteromultimer cu un singur braţ al receptorului superfamiliei TGF-beta, sau combinaţii de complecşi heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului superfamiliei TGF-beta, conform dezvăluirii se pot utiliza pentru a promova formarea osoasă la pacienţii cu cancer. Pacienţii care au anumite tumori (de exemplu, prostată, sân, mielom multiplu sau orice tumoare care provoacă hiperparatiroidism) prezintă un risc ridicat de pierdere osoasă datorită pierderii osoase induse de tumori, metastaze osoase şi agenţi terapeutici. Aceşti pacienţi pot fi trataţi cu un complex heteromultimer cu un singur braţ al receptorului superfamiliei TGF-beta, sau o combinaţie de complecşi, chiar şi în absenţa dovezilor de pierdere osoasă sau metastaze osoase. Pacienţii pot fi, de asemenea, monitorizaţi pentru evidenţa pierderii osoase sau a metastazelor osoase şi pot fi trataţi cu un complex heteromultimer cu un singur braţ al unui receptor al superfamiliei TGF-beta în cazul în care indicatorii sugerează un risc crescut. În general, scanările DEXA sunt utilizate pentru a evalua modificările densităţii osoase, în timp ce indicatorii de remodelare osoasă pot fi utilizaţi pentru a evalua probabilitatea metastazelor osoase. Markerii serici pot fi monitorizaţi. Fosfataza alcalină specifică oaselor (BSAP) este o enzimă care este prezentă în osteoblaste. Nivelurile sanguine de BSAP sunt crescute la pacienţii cu metastaze osoase şi alte afecţiuni care duc la creşterea remodelării osoase. Osteocalcina şi peptidele procolagene sunt, de asemenea, asociate cu formarea osoasă şi metastaze osoase. Creşteri ale BSAP au fost detectate la pacienţii cu metastaze osoase cauzate de cancerul de prostată şi, într-un grad mai mic, în metastazele osoase din cancerul de sân. Nivelurile BMP7 sunt ridicate în cancerul de prostată care s-a metastazat până la os, dar nu şi în metastazele osoase datorate cancerului de vezică, piele, ficat sau pulmonar. Telopeptida carboxi-terminală de tip I (ICTP) este o reticulare găsită în colagen care se formează în timpul resorbţiei osoase. Deoarece osul este în mod constant descompus şi reformat, ICTP va fi găsit în tot corpul. Cu toate acestea, la locul metastazei osoase, nivelul va fi semnificativ mai ridicat decât într-o zonă a osului normal. ICTP a fost găsit la niveluri ridicate în metastaze osoase datorate cancerului de prostată, plămâni şi sân. O altă reticulare de colagen, telopeptida N-terminală de tip I (NTx), este produsă împreună cu ICTP în timpul reînnoirii osoase. Cantitatea de NTx este crescută în metastazele osoase cauzate de multe tipuri diferite de cancer, incluzând cancerul pulmonar, de prostată şi de sân. De asemenea, nivelurile de NTx cresc odată cu progresarea metastazei osoase. Prin urmare, acest marker poate fi utilizat atât pentru detectarea metastazelor, cât şi pentru măsurarea extinderii bolii. Alţi markeri de resorbţie includ piridinolina şi deoxipiridinolina. Orice creştere a markerilor de resorbţie sau a markerilor metastazelor osoase indică necesitatea terapiei cu un complex heteromultimer cu un singur braţ al receptorului superfamiliei TGF-beta, sau combinaţii de complecşi heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului superfamiliei TGF-beta, la un pacient.

Într-o altă modalitate de realizare, un complex heteromultimer cu un singur braţ al receptorului superfamiliei TGF-beta, sau combinaţii de complecşi heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului superfamiliei TGF-beta, se pot utiliza la pacienţii cu afecţiuni cronice ale rinichilor tulburări osoase minerale (CKD-MBD), sindromul larg al tulburărilor scheletice, cardiovasculare şi mineral-metabolice intercorelate care apar de la afecţiuni renale. CKD-MBD cuprinde diverse patologii scheletice adesea denumite osteodistrofie renală (ROD), care este o modalitate de realizare preferată pentru tratamentul cu un complex heteromultimer cu un singur braţ al receptorului superfamiliei TGF-beta, sau combinaţii de complecşi heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului superfamiliei TGF-beta. În funcţie de contribuţia relativă a diferiţilor factori patogeni, ROD se manifestă ca diverse modele patologice de remodelare osoasă (Hruska şi colab., 2008, Chronic kidney disease mineral bone disorder (CKD-MBD); în Rosen şi colab. (ed) Primer on the Metabolic Bone Diseases şi Disorders of Mineral Metabolism, ed. a 7-a American Society for Bone şi Mineral Research, Washington D.C, pag. 343-349). La un capăt al spectrului se află ROD cu osteodistrofie uremică şi o reînnoire redusă a oaselor, caracterizată printr-un număr redus de locuri de remodelare activă, formarea osoasă profund suprimată şi resorbţie osoasă scăzută. La cealaltă extremă se află ROD cu hiperparatiroidism, reînnoire osoasă ridicată şi osteită fibroasă. Dat fiind că un complex heteromultimer cu un singur braţ al receptorului superfamiliei TGF-beta, sau combinaţii de complecşi heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului superfamiliei TGF-beta, pot exercita atât efecte anabolizante, cât şi antiresorptive, aceşti agenţi pot fi utili la pacienţii din spectrul patologiei ROD.

Un complex heteromultimer cu un singur braţ al receptorului superfamiliei TGF-beta, sau combinaţii de complecşi heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului superfamiliei TGF-beta, conform dezvăluirii se pot administra în comun cu alţi agenţi farmaceutici activi pentru os. Administrarea în comun poate fi realizată prin administrarea unei singure co-formulări, prin administrarea simultană sau prin administrarea la momente de timp separate. Complecşii heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului superfamiliei TGF-beta pot fi deosebit de avantajoşi dacă sunt administraţi împreună cu alţi agenţi activi pentru os. Un pacient poate beneficia de primirea împreună a unui complex heteromultimer cu un singur braţ al unui receptor al superfamiliei TGF-beta şi administrarea de suplimente pe bază de calciu, vitamina D, exerciţii fizice adecvate şi/sau, în unele cazuri, de altă medicaţie. Exemple de alte medicaţii includ, bifosfonaţi (alendronat, ibandronat şi risedronat), calcitonină, estrogeni, hormon paratiroidian şi raloxifen. Bifosfonaţii (alendronat, ibandronat şi risedronat), calcitonina, estrogenii şi raloxifenul afectează ciclul de remodelare osoasă şi sunt clasificaţi ca medicaţii anti-resorptive. Remodelarea osoasă constă din două etape distincte: resorbţia osoasă şi formarea osoasă. Medicaţiile anti-resorptive încetinesc sau opresc porţiunea de resorbţie osoasă a ciclului de remodelare osoasă, dar nu încetinesc porţiunea de formare osoasă a ciclului. Drept rezultat, noua formare continuă cu o rată mai mare decât resorbţia osoasă, iar densitatea osoasă poate creşte în timp. Teriparatida, o formă de hormon paratiroidian, creşte rata formării osoase în ciclul de remodelare osoasă. Alendronatul este aprobat atât pentru prevenirea (5 mg pe zi sau 35 mg o dată pe săptămână), cât şi pentru tratamentul (10 mg pe zi sau 70 mg o dată pe săptămână) osteoporozei postmenopauzale. Alendronatul reduce pierderea osoasă, creşte densitatea osoasă şi reduce riscul fracturilor coloanei vertebrale, ale încheieturii mâinii şi ale şoldului. Alendronatul este, de asemenea, aprobat pentru tratamentul osteoporozei induse de glucocorticoizi la bărbaţi şi femei ca urmare a utilizării pe termen lung a acestor medicaţii (de exemplu, prednison şi cortizon) şi pentru tratamentul osteoporozei la bărbaţi. Alendronatul plus vitamina D este aprobat pentru tratamentul osteoporozei la femeile aflate în postmenopauză (70 mg o dată pe săptămână plus vitamina D) şi pentru tratamentul de îmbunătăţire a masei osoase la bărbaţii cu osteoporoză. Ibandronatul este aprobat pentru prevenirea şi tratamentul osteoporozei postmenopauzale. Luat ca o pastilă o dată pe lună (150 mg), ibandronatul trebuie luat în aceeaşi zi în fiecare lună. Ibandronatul reduce pierderea osoasă, creşte densitatea osoasă şi reduce riscul fracturilor coloanei vertebrale. Risedronatul este aprobat pentru prevenirea şi tratamentul osteoporozei postmenopauzale. Luat zilnic (doză de 5 mg) sau săptămânal (doză de 35 mg sau doză de 35 mg cu calciu), risedronatul încetineşte pierderea osoasă, creşte densitatea osoasă şi reduce riscul fracturilor coloanei vertebrale şi a celor care nu sunt ale coloanei vertebrale. Risedronatul este, de asemenea, aprobat pentru utilizare de către bărbaţi şi femei pentru a preveni şi/sau trata osteoporoza indusă de glucocorticoizi care rezultă din utilizarea pe termen lung a acestor medicaţii (de exemplu, prednison sau cortizon). Calcitonina este un hormon natural implicat în reglarea calciului şi în metabolismul osos. La femeile cu peste 5 ani peste menopauză, calcitonina încetineşte pierderea osoasă, creşte densitatea osoasă a coloanei vertebrale şi poate ameliora durerea asociată cu fracturile osoase. Calcitonina reduce riscul de fracturi ale coloanei vertebrale. Calcitonina este disponibilă sub formă de injecţie (50-100 IU zilnic) sau spray nazal (200 IU zilnic).

Un pacient poate beneficia, de asemenea, de primirea în comun a unui complex heteromultimer cu un singur braţ al receptorului superfamiliei TGF-beta, sau combinaţii de complecşi heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului superfamiliei TGF-beta, şi a unor medicaţii suplimentare active pentru os. Terapia cu estrogen (ET)/terapia hormonală (HT) este aprobată pentru prevenirea osteoporozei. S-a demonstrat că ET reduce pierderea osoasă, creşte densitatea osoasă atât la nivelul coloanei vertebrale, cât şi la şold şi reduce riscul fracturilor de şold şi de coloană la femeile aflate în postmenopauză. ET este administrat cel mai frecvent sub formă de pastilă sau plasture pentru piele care oferă o doză mică de aproximativ 0,3 mg pe zi sau o doză standard de aproximativ 0,625 mg pe zi şi este eficient chiar şi atunci când se începe după vârsta de 70 de ani. Când estrogenul este luat singur, poate creşte riscul unei femei de a dezvolta cancer al mucoasei uterine (cancer endometrial). Pentru a elimina acest risc, furnizorii de asistenţă medicală prescriu hormonul progestin în combinaţie cu estrogen (terapia de substituţie hormonală sau HT) pentru acele femei care au un uter intact. ET/HT ameliorează simptomele menopauzei şi s-a dovedit că are un efect benefic asupra sănătăţii osoase. Efectele secundare pot include sângerări vaginale, sensibilitate a sânilor, tulburări de dispoziţie şi boli ale vezicii biliare. Raloxifenul, 60 mg pe zi, este aprobat pentru prevenirea şi tratamentul osteoporozei postmenopauzale. Provine dintr-o clasă de medicamente numite modulatori selectivi ai receptorilor de estrogen (SERM-uri) care au fost dezvoltate pentru a oferi efectele benefice ale estrogenilor fără potenţialele lor dezavantaje. Raloxifenul creşte masa osoasă şi reduce riscul fracturilor coloanei vertebrale. Încă nu sunt disponibile date pentru a demonstra că raloxifenul poate reduce riscul de fracturi de şold şi alte fracturi care nu sunt ale coloanei vertebrale. Teriparatida, o formă de hormon paratiroidian, este aprobată pentru tratamentul osteoporozei la femeile postmenopauză şi bărbaţii cu risc crescut de fractură. Această medicaţie stimulează formarea osoasă nouă şi creşte semnificativ densitatea minerală osoasă. La femeile aflate în postmenopauză, a fost observată reducerea fracturilor la nivelul coloanei vertebrale, şoldului, piciorului, coastelor şi încheieturii mâinii. La bărbaţi, a fost observată reducerea fracturii la nivelul coloanei vertebrale, dar nu au existat suficiente date pentru a se evalua reducerea fracturii la alte locuri. Teriparatida se autoadministrează ca injecţie zilnică timp de până la 24 de luni.

În alte modalităţi de realizare, un complex heteromultimer cu un singur braţ al receptorului superfamiliei TGF-beta, sau combinaţii de complecşii heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului superfamiliei TGF-beta se pot utiliza pentru reglarea conţinutului de grăsime corporală la un animal şi pentru tratarea sau prevenirea afecţiunilor legate de acesta şi în special, afecţiunilor care compromit sănătatea legate de acestea. Conform prezentei invenţii, reglarea (controlul) greutăţii corporale se poate referi la reducerea sau creşterea greutăţii corporale, reducerea sau creşterea ratei de creştere în greutate sau creşterea sau reducerea ratei de pierdere în greutate şi include, de asemenea, menţinerea activă sau nu schimbarea semnificativă a greutăţii corporale (de exemplu, împotriva influenţelor externe sau interne care altfel pot creşte sau scădea greutatea corporală). O modalitate de realizare a prezentei dezvăluiri se referă la reglarea greutăţii corporale prin administrarea la un animal (de exemplu, un om) care necesită aceasta a unui complex heteromultimer cu un singur braţ al receptorului superfamiliei TGF-beta, sau combinaţii de complecşi heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului superfamiliei TGF-beta, din dezvăluire.

În unele modalităţi de realizare, un complex heteromultimer cu un singur braţ al receptorului superfamiliei TGF-beta, sau combinaţii de complecşi heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului superfamiliei TGF-beta, din prezenta dezvăluire se pot utiliza pentru reducerea greutăţii corporale şi/sau reducerea creşterii în greutate la un animal şi, mai specific, pentru tratarea sau ameliorarea obezităţii la pacienţii cu risc sau care suferă de obezitate. Într-o altă modalitate de realizare specifică, prezenta invenţie este direcţionată către metode şi compuşi pentru tratarea unui animal care nu este capabil să câştige sau să reţină în greutate (de exemplu, un animal cu un sindrom de irosire). Astfel de metode sunt eficiente pentru a creşte greutatea şi/sau masa corporală, sau pentru a reduce greutatea şi/sau pierderea masei sau pentru a îmbunătăţi condiţiile asociate sau cauzate de greutatea şi/sau masa corporală nedorit de scăzută (de exemplu, nesănătoasă). În plus, tulburările de colesterol ridicat (de exemplu, hipercolesterolemie sau dislipidemie) pot fi tratate cu un complex heteromultimer cu un singur braţ al receptorului superfamiliei TGF-beta, sau combinaţii de complecşi heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului superfamiliei TGF-beta, din dezvăluire.

În anumite aspecte, un complex heteromultimer cu un singur braţ al receptorului superfamiliei TGF-beta, sau o combinaţie de complecşi heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului superfamiliei TGF-beta, din prezenta dezvăluire se pot utiliza pentru a creşte nivelul celulelor roşii din sânge, pentru a trata sau preveni o anemie şi/sau tratarea sau prevenirea eritropoiezei ineficiente la un subiect care are nevoie de aceasta. În anumite aspecte, un complex heteromultimer cu un singur braţ al receptorului superfamiliei TGF-beta, sau o combinaţie de complecşi heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului superfamiliei TGF-beta, din prezenta dezvăluire se pot utiliza se pot utiliza în combinaţie cu abordări terapeutice convenţionale pentru creşterea nivelului de celule roşii din sânge, în special cele utilizate pentru tratarea anemiilor de origine multifactorială Abordările terapeutice convenţionale pentru creşterea nivelului de celule roşii din sânge includ, de exemplu, transfuzia de celule roşii din sânge, administrarea unuia sau mai multor activatori ai receptorilor EPO, transplantul de celule stem hematopoietice, substanţe biologice imunosupresoare şi medicamente (de exemplu, corticosteroizi). În anumite modalităţi de realizare, un complex heteromultimer cu un singur braţ al receptorului superfamiliei TGF-beta, sau o combinaţie de complecşi heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului superfamiliei TGF-beta, din prezenta dezvăluire se pot utiliza pentru a trata sau preveni eritropoieza ineficientă şi/sau tulburările asociate cu eritropoieză ineficientă la un subiect care are nevoie de aceasta. În anumite aspecte, un complex heteromultimer cu un singur braţ al receptorului superfamiliei TGF-beta, sau o combinaţie de complecşi heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului superfamiliei TGF-beta, din prezenta dezvăluire se pot utiliza în combinaţie cu abordări terapeutice convenţionale pentru tratarea sau prevenirea unei anemii sau unei tulburări de eritropoieză ineficientă, în special a celor utilizate pentru tratarea anemiilor de origine multifactorială.

În general, tratamentul sau prevenirea unei boli sau afecţiuni, aşa cum este descris în prezenta dezvăluire, se realizează prin administrarea unui complex heteromultimer cu un singur braţ al receptorului superfamiliei TGF-beta, sau o combinaţie de complecşi heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului superfamiliei TGF-beta, din prezenta dezvăluire într-o "cantitate eficientăʺ. O cantitate eficientă dintr-un agent se referă la o cantitate eficientă, la dozaje şi pentru perioade de timp necesare, pentru a obţine rezultatul terapeutic sau profilactic dorit. O ʺcantitate eficientă terapeuticʺ dintr-un agent din prezenta dezvăluire poate varia în funcţie de factori precum starea de boală, vârsta, genul şi greutatea individului şi capacitatea agentului de a da un răspuns dorit la individ. O "cantitate eficientă profilactic" se referă la o cantitate eficientă, la doze şi pentru perioade de timp necesare, pentru a obţine rezultatul profilactic dorit.

În anumite modalităţi de realizare, un complex heteromultimer cu un singur braţ al receptorului superfamiliei TGF-beta, sau o combinaţie de complecşi heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului superfamiliei TGF-beta, opţional combinat cu un activator al receptorului de EPO, poate fi utilizat pentru creşterea celulelor roşii din sânge, hemoglobinei, sau a nivelurilor de reticulocite la indivizi sănătoşi şi la populaţii de pacienţi selectaţi. Exemple de populaţii de pacienţi adecvate îi includ cei cu un nivel nedorit de scăzut de celule roşii din sânge sau hemoglobină, cum ar fi pacienţii cu anemie, şi cei care sunt expuşi riscului de a dezvolta niveluri nedorite de celule roşii în sânge sau hemoglobină, cum ar fi acei pacienţi care urmează să fie supuşi unei intervenţii chirurgicale majore sau altor proceduri care pot duce la pierderi substanţiale de sânge. Într-o modalitate de realizare, un pacient cu niveluri adecvate de celule roşii din sânge este tratat cu un complex heteromultimer cu un singur braţ al receptorului superfamiliei TGF-beta, sau o combinaţie de complecşi heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului superfamiliei TGF-beta, pentru a-i creşte nivelul celulelor roşii din sânge şi apoi sângele este extras şi depozitat pentru utilizare ulterioară în transfuzii.

Unul sau mai mulţi complecşi heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului superfamiliei TGF-beta din dezvăluire, opţional combinat cu un activator al receptorului EPO, se pot utiliza pentru creşterea nivelurilor de celule roşii din sânge, a nivelurilor de hemoglobină şi/sau a nivelurilor de hematocrit la un pacient cu anemie. La observarea nivelurilor de hemoglobină şi/sau hematocrit la om, un nivel mai mic decât cel normal pentru vârsta şi categoria de gen adecvate poate fi indicativ pentru anemie, deşi sunt luate în considerare variaţiile individuale. De exemplu, un nivel de hemoglobină cuprins între 10-12,5 g/dl şi tipic de aproximativ 11,0 g/dl este considerat a fi în intervalul normal la adulţii sănătoşi, deşi, în ceea termeni de terapie, un nivel ţintă mai scăzut poate provoca mai puţine efecte secundare cardiovasculare [vezi, de exemplu, Jacobs şi colab. (2000) Nephrol Dial Transplant 15, 15-19]. Alternativ, nivelurile de hematocrit (procentul din volumul unei probe de sânge ocupat de celule) pot fi utilizate ca măsură pentru anemie. Nivelurile de hematocrit pentru persoanele sănătoase variază de la aproximativ 41-51% pentru bărbaţii adulţi şi de la 35-45% pentru femeile adulte. În anumite modalităţi de realizare, un pacient poate fi tratat cu un regim de dozare destinat să readucă pacientul la un nivel ţintă de celule roşii din sânge, hemoglobină şi/sau hematocrit. Deoarece nivelurile de hemoglobină şi hematocrit variază de la o persoană la alta, optim, nivelul ţintei de hemoglobină şi/sau hematocrit poate fi individualizat pentru fiecare pacient.

Anemia este observată frecvent la pacienţii cu leziuni tisulare, infecţie şi/sau boli cronice, în special cancer. La unii subiecţi, anemia se distinge prin niveluri scăzute de eritropoietină şi/sau un răspuns inadecvat la eritropoietină în măduva osoasă [vezi, de exemplu, Adamson (2008) Harrison's Principles of Internal Medicine, ed. a 17-a; McGraw Hill, New York, pag. 628-634]. Cauzele potenţiale ale anemiei includ, de exemplu, pierderea de sânge, deficitele nutriţionale (de exemplu. aport alimentar redus de proteine), reacţie la medicaţie, diverse probleme asociate cu măduva osoasă şi multe boli. Mai specific, anemia a fost asociată cu o varietate de tulburări şi afecţiuni care includ, de exemplu, transplantul de măduvă osoasă; tumori solide (de exemplu, cancer de sân, cancer pulmonar şi cancer de colon); tumori ale sistemului limfatic (de exemplu, leucemie limfocitară cronică, limfom non-Hodgkins şi limfom Hodgkins); tumori ale sistemului hematopoietic (de exemplu, leucemie, sindrom mielodisplazic şi mielom multiplu); terapie cu radiaţii; chimioterapie (de exemplu, regimuri care conţin platină); boli inflamatorii şi autoimune, incluzând, dar fără a se limita la acestea, artrita reumatoidă, alte artrite inflamatorii, lupus eritematos sistemic (SLE), boli acute sau cronice ale pielii (de exemplu, psoriazis), boală inflamatorie intestinală (de exemplu, boala Crohn şi colita ulcerativă); boală sau insuficienţă renală acută sau cronică, incluzând afecţiuni idiopatice sau congenitale; boală hepatică acută sau cronică; sângerări acute sau cronice; situaţii în care transfuzia de celule roşii din sânge nu este posibilă din cauza alo- sau auto-anticorpilor pacientului şi/sau din motive religioase (de exemplu, unii dintre Martorii lui Jehovah); infecţii (de exemplu, malarie şi osteomielită); hemoglobinopatii incluzând, de exemplu, boala cu celule falciforme (anemie), talasemiile; consumul sau abuzul de droguri (de exemplu, abuz de alcool); copii şi adolescenţi cu anemie din orice cauză pentru a evita transfuzia; şi pacienţi vârstnici sau pacienţi cu boală cardiopulmonară subiacentă cu anemie care nu pot primi transfuzii din cauza preocupărilor legate de supraîncărcarea circulatorie [vezi, de exemplu, Adamson (2008) Harrison's Principles of Internal Medicine, ed. a 17-a; McGraw Hill, New York, pag. 628-634].

Mulţi factori pot contribui la anemia legată de cancer. Unii sunt asociaţi cu procesul bolii în sine şi cu generarea de citokine inflamatorii, cum ar fi interleukina-1, interferonul-gamma şi factorul de necroză tumorală [Bron şi colab. (2001) Semin Oncol 28(Suppl 8):1-6]. Printre efectele sale, inflamaţia induce hepcidina peptida reglatoare cheie a fierului, inhibând astfel exportul de fier din macrofage şi limitând în general disponibilitatea fierului pentru eritropoieză [vezi, de exemplu, Ganz (2007) J Am Soc Nephrol 18:394-400]. Pierderea de sânge prin diferite căi poate contribui, de asemenea, la anemia legată de cancer. Prevalenţa anemiei datorată progresării cancerului variază în funcţie de tipul de cancer, variind de la 5% în cancerul de prostată până la 90% în mielomul multiplu. Anemia legată de cancer are consecinţe profunde pentru pacienţi, incluzând oboseala şi calitatea redusă a vieţii, eficacitatea redusă a tratamentului şi mortalitatea crescută. În unele modalităţi de realizare, unul sau mai mulţi dintre complecşii heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului superfamiliei TGF-beta din dezvăluire, opţional în combinaţie cu un activator al receptorului EPO, ar putea fi utilizaţi pentru a trata o anemie legată de cancer.

O anemie hipoproliferativă poate rezulta din disfuncţia primară sau insuficienţa măduvei osoase. Anemiile hipoproliferative includ: anemia bolilor cronice, anemia bolilor renale, anemia asociată cu stări hipometabolice şi anemia asociată cu cancerul. În fiecare dintre aceste tipuri, nivelurile de eritropoietină endogenă sunt inadecvat de scăzute pentru gradul de anemie observat. Alte anemii hipoproliferative includ: anemie cu deficit de fier în stadiu incipient şi anemie cauzată de deteriorarea măduvei osoase. In În aceste tipuri, nivelurile de eritropoietină endogenă sunt crescute corespunzător pentru gradul de anemie observat. Exemple proeminente ar fi mielosupresia cauzată de cancer şi/sau medicamente chimioterapeutice sau radioterapia cancerului. O trecere în revistă amplă a studiilor clinice a constatat că anemia uşoară poate apărea la 100% dintre pacienţi după chimioterapie, în timp ce anemia mai severă poate apărea la până la 80% dintre aceşti pacienţi [vezi, de exemplu, Groopman şi colab. (1999) J Natl Cancer Inst 91:1616-1634]. Medicamentele mielosupresive includ, de exemplu: 1) agenţi alchilanţi, cum ar fi muştarurile de azot (de exemplu, melfalan) şi nitrozureas (de exemplu, streptozocin); 2) antimetaboliţi cum ar fi antagonişti ai acidului folic (de exemplu, metotrexat), analogi de purină (de exemplu, tioguanină), şi analogi de pirimidină (de exemplu, gemcitabină); 3) antibiotice citotoxice cum ar fi antraciclinele (de exemplu, doxorubicina); 4) inhibitori de kinază (de exemplu, gefitinib); 5) inhibitori mitotici cum ar fi taxani (de exemplu, paclitaxel) şi alcaloizi vinca (de exemplu, vinorelbină); 6) anticorpi monoclonali (de exemplu, rituximab); şi 7) inhibitori de topoizomerază (de exemplu, topotecan şi etopozidă). În plus, afecţiunile care au ca rezultat o rată hipometabolică pot produce o anemie hipoproliferativă uşoară până la moderată. Printre astfel de afecţiuni se numără stările de deficit endocrin. De exemplu, anemia poate apărea în boala Addison, hipotiroidism, hiperparatiroidism sau la bărbaţii care sunt castraţi sau trataţi cu estrogen. În unele modalităţi de realizare, unul sau mai mulţi dintre complecşii heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului superfamiliei TGF-beta din dezvăluire, opţional combinaţi cu un activator al receptorului EPO, ar putea fi utilizaţi pentru a trata o anemie hiperproliferativă.

Boala renală cronică este uneori asociată cu anemie hipoproliferativă, iar gradul de anemie variază ca severitate cu nivelul insuficienţei renale. O astfel de anemie se datorează în primul rând producerii inadecvate de eritropoietină şi reducerii supravieţuirii celulelor roşii. Boala renală cronică se desfăşoară, de obicei, treptat pe o perioadă de ani sau decenii până la stadiul final (stadiul 5) de boală, moment în care dializa sau transplantul de rinichi sunt necesare pentru supravieţuirea pacientului. Anemia se dezvoltă adesea la începutul acestui proces şi se agravează pe măsură ce boala progresează. Consecinţele clinice ale anemiei datorate bolilor renale sunt bine documentate şi includ dezvoltarea hipertrofiei ventriculare stângi, afectarea funcţiei cognitive, calitatea redusă a vieţii şi modificarea funcţiei imune [vezi, de exemplu, Levin şi colab. (1999) Am J Kidney Dis 27:347-354; Nissenson (1992) Am J Kidney Dis 20(Suppl 1):21-24; Revicki şi colab. (1995) Am J Kidney Dis 25:548-554; Gafter şi colab., (1994) Kidney Int 45:224-231]. În unele modalităţi de realizare, unul sau mai mulţi dintre complecşii heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului superfamiliei TGF-beta din dezvăluire, opţional combinaţi cu un activator al receptorului de EPO, s-ar putea utiliza pentru tratarea anemiei asociate cu boală sau insuficienţa renală acută sau cronică.

Anemia rezultată din pierderea acută de sânge cu un volum suficient, cum ar fi din cauza traumei sau hemoragiei postpartum, este cunoscută sub numele de anemie acută post-hemoragică. Pierderea acută de sânge cauzează iniţial hipovolemie fără anemie, deoarece există o epuizare proporţională a RBC-urilor, împreună cu alţi constituenţi ai sângelui. Cu toate acestea, hipovolemia va declanşa rapid mecanisme fiziologice care schimbă lichidul din compartimentul extravascular în cel vascular, ceea ce duce la hemodiluţie şi anemie. Dacă este cronică, pierderea de sânge epuizează treptat depozitele de fier din corp şi duce în cele din urmă la deficit de fier. În unele modalităţi de realizare, unul sau mai mulţi dintre complecşii heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului superfamiliei TGF-beta din dezvăluire, opţional combinaţi cu un activator al receptorului de EPO, s-ar putea utiliza pentru tratarea anemiei rezultate din pierderea acută de sânge.

Anemia cu deficit de fier este etapa finală într-o progresare treptată a creşterii deficitului de fier, care include echilibrul negativ al fierului şi eritropoieza cu deficit de fier ca stadii intermediare. Deficienţa de fier poate rezulta din creşterea cererii de fier, scăderea aportului de fier sau pierderea crescută a fierului, după cum este exemplificat în stări precum sarcina, dieta inadecvată, malabsorbţia intestinală, inflamaţia acută sau cronică şi pierderea de sânge acută sau cronică. Cu anemie uşoară până la moderată de acest tip, măduva osoasă rămâne hipoproliferativă, iar morfologia RBC este în mare măsură normală; cu toate acestea, chiar şi anemia uşoară poate duce la unele RBC-uri hipocromice microcitice, şi tranziţia la anemie severă cu deficit de fier este însoţită de hiperproliferare a măduvei osoase şi de RBC-uri microcitice şi hipocromice din ce în ce mai răspândite [vezi, de exemplu, Adamson (2008) Harrison's Principles of Internal Medicine, ed. a 17-a; McGraw Hill, New York, pag. 628-634]. Terapia adecvată pentru anemia cu deficit de fier depinde de cauza şi severitatea acesteia, cu preparate orale de fier, formulări parenterale de fier şi transfuzie RBC ca opţiuni convenţionale majore. În unele modalităţi de realizare, unul sau mai mulţi dintre complecşii heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului superfamiliei TGF-beta din dezvăluire, opţional combinaţi cu un activator al receptorului de EPO, s-ar putea utiliza pentru a trata o deficienţă cronică de fier.

Sindromul mielodisplazic (MDS) este o colecţie diversă de afecţiuni hematologice caracterizate prin producţia ineficientă de celule mieloide din sânge şi riscul de transformare în leucemie mielogenoasă acută. La pacienţii cu MDS, celulele stem din sânge nu se maturizează în celule roşii sanguine, celule albe sanguine sau trombocite. Tulburările MDS includ, de exemplu, anemie refractară, anemie refractară cu sideroblaste inelare, anemie refractară cu exces de blaste, anemie refractară cu exces de blaste în transformare, citopenie refractară cu displazie multiliniară şi sindrom mielodisplazic asociat cu o anomalie izolată a cromozomului 5q. Deoarece aceste tulburări se manifestă ca defecte ireversibile atât în cantitatea, cât şi în calitatea celulelor hematopoietice, majoritatea pacienţilor cu MDS sunt afectaţi de anemie cronică. Prin urmare, pacienţii cu MDS necesită eventual transfuzii de sânge şi/sau tratament cu factori de creştere (de exemplu, eritropoietină sau G-CSF) pentru a creşte nivelul celulelor roşii din sânge. Cu toate acestea, mulţi pacienţi cu MDS dezvoltă efecte secundare datorită frecvenţei unor astfel de terapii. De exemplu, pacienţii care primesc transfuzii frecvente de celule roşii din sânge pot prezenta leziuni ale ţesuturilor şi organelor din cauza acumulării de fier în exces. În consecinţă, unul sau mai mulţi dintre complecşii heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului superfamiliei TGF-beta din dezvăluire, se pot utiliza pentru a trata pacienţii cu MDS. În anumite modalităţi de realizare, pacienţii care suferă de MDS pot fi trataţi utilizând unul sau mai mulţi dintre complecşii heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului superfamiliei TGF-beta din dezvăluire, opţional în combinaţie cu un activator al receptorului de EPO. În alte modalităţi de realizare, pacienţii care suferă de MDS pot fi trataţi utilizând o combinaţie de unul sau mai mulţi dintre complecşii heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului superfamiliei TGF-beta conform dezvăluirii şi unul sau mai mulţi agenţi terapeutici suplimentari pentru tratarea MDS incluzând, de exemplu, talidomida, lenalidomida, azacitadina, decitabina, eritropoietine, deferoxamina, globulina antitimocitară şi filgrastrimul (G-CSF).

Diferenţiată iniţial de anemie aplastică, hemoragie sau hemoliză periferică pe baza studiilor ferocinetice [vezi, de exemplu, Ricketts şi colab. (1978) Clin Nucl Med 3:159-164], eritropoieza ineficientă descrie un grup de diverse anemii în care producţia de RBC-uri mature este mai mică decât s-ar fi aşteptat dat fiind numărul de precursori eritroizi (eritroblaste) prezenţi în măduva osoasă [Tanno şi colab. (2010) Adv Hematol 2010:358283]. În astfel de anemii, hipoxia tisulară persistă în pofida nivelurilor ridicate de eritropoietină din cauza producţiei ineficiente de RBC-uri mature. În cele din urmă se dezvoltă un ciclu vicios în care nivelurile ridicate de eritropoietină determină expansiunea masivă a eritroblastelor, conducând potenţial la splenomegalie (mărire a splinei) din cauza eritropoiezei extramedulare [vezi, de exemplu, Aizawa şi colab. (2003) Am J Hematol 74:68-72], patologiei osoase induse de eritroblaste [vezi, de exemplu, Di Matteo şi colab. (2008) J Biol Regul Homeost Agents 22:211-216], şi supraîncărcării ţesutului cu fier, chiar şi în absenţa transfuziilor terapeutice de RBC-uri [vezi, de exemplu, Pippard şi colab. (1979) Lancet 2:819-821]. Astfel, prin creşterea eficacităţii eritropoietice, unul sau mai mulţi dintre complecşii heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului superfamiliei TGF-beta din prezenta dezvăluire pot rupe ciclul menţionat anterior şi astfel pot atenua nu numai anemia de bază, ci şi complicaţiile asociate ale nivelurilor crescute de eritropoietină, splenomegalie, patologie osoasă şi supraîncărcare a ţesutului cu fier. În unele modalităţi de realizare, unul sau mai mulţi dintre complecşii heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului superfamiliei TGF-beta din prezenta dezvăluire se pot utiliza pentru a trata sau preveni eritropoieza ineficientă, incluzând anemie şi niveluri crescute de EPO, precum şi complicaţii cum ar fi splenomegalie, patologia osoasă indusă de eritroblaste, supraîncărcare de fier şi patologiile asociate acestora. Cu splenomegalie, astfel de patologii includ dureri toracice sau abdominale şi hiperplazie reticuloendotelială. Hematopoieza extramedulară poate apărea nu numai în splină, ci potenţial şi în alte ţesuturi sub formă de pseudotumori hematopoietici extramedulari [vezi, de exemplu, Musallam şi colab. (2012) Cold Spring Harb Perspect Med 2:a013482]. Cu patologia osoasă indusă de eritroblaste, patologiile asociate includ densitate minerală osoasă scăzută, osteoporoză şi durere osoasă [vezi, de exemplu, Haidar şi colab. (2011) Bone 48:425-432]. Cu supraîncărcarea cu fier, patologiile asociate includ supresia hepcidinei şi hiperabsorbţia fierului din dietă [vezi, de exemplu, Musallam şi colab. (2012) Blood Rev 26(Suppl 1):S16-S19], endocrinopatii multiple şi fibroză hepatică/ciroză [vezi, de exemplu, Galanello şi colab. (2010) Orphanet J Rare Dis 5:11], şi cardiomiopatie cu supraîncărcare a fierului [Lekawanvijit şi colab., 2009, Can J Cardiol 25:213-218].

Cele mai frecvente cauze ale eritropoiezei ineficiente sunt sindroamele de talasemie, hemoglobinopatii ereditare în care dezechilibrele în producţia lanţurilor intacte de alfa şi beta-hemoglobină conduc la creşterea apoptozei în timpul maturării eritroblastelor [vezi, de exemplu, Schrier (2002) Curr Opin Hematol 9:123-126]. Talasemiile se numără în colectiv printre cele mai frecvente tulburări genetice din întreaga lume, cu modele epidemiologice în schimbare preconizate să contribuie la o problemă de sănătate publică în creştere atât în SUA, cât şi la nivel global [Vichinsky (2005) Ann NY Acad Sci 1054:18-24]. Sindroamele de talasemie sunt denumite în funcţie de severitatea lor. Astfel, α-talasemia include α-talasemia minoră (cunoscută şi sub denumirea de α-talasemie caracteristică; două gene de α-globină afectate), boala hemoglobinei H (trei gene de α-globină afectate) şi α-talasemia majoră (cunoscută şi sub numele de hidrops fetalis ; patru gene de α-globină afectate). β-Talasemia include β-talasemia minoră (cunoscută şi sub numele de β-talasemie caracteristică; o genă de β-globină afectată), β-talasemia intermediară (două gene de β-globină afectate), talasemia hemoglobină E (două gene de β-globină afectate), şi β-talasemia majoră (cunoscută şi sub numele de anemia lui Cooley; două gene de β-globină afectate rezultând o absenţă completă a proteinei β-globină). β-Talasemia are un impact asupra mai multor organe, este asociată cu morbiditate şi mortalitate considerabile şi necesită actualmente îngrijiri pe tot parcursul vieţii. Deşi speranţa de viaţă la pacienţii cu β-talasemie a crescut în ultimii ani datorită utilizării transfuziilor periodice de sânge în combinaţie cu chelatarea fierului, supraîncărcarea cu fier rezultată atât din transfuzii, cât şi din absorbţia excesivă gastro-intestinală a fierului poate provoca complicaţii grave, cum ar fi boli de inimă, tromboză, hipogonadism, hipotiroidism, diabet, osteoporoză şi osteopenie [vezi, de exemplu, Rund şi colab. (2005) N Engl J Med 353:1135-1146]. În anumite modalităţi de realizare, unul sau mai mulţi dintre complecşii heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului superfamiliei TGF-beta din dezvăluire, opţional combinaţi cu un activator al receptorului de EPO, se pot utiliza pentru a trata sau preveni un sindrom de talasemie.

În unele modalităţi de realizare, unul sau mai mulţi dintre complecşii heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului superfamiliei TGF-beta din dezvăluire, opţional combinaţi cu un activator al receptorului de EPO, se pot utiliza pentru tratarea tulburărilor eritropoiezei ineficiente pe lângă sindroamele de talasemie. Astfel de tulburări includ anemie siderblastică (moştenită sau dobândită); anemie diseritropoietică (tipurile I şi II); anemie cu celule seceră; sferocitoză ereditară; deficit de piruvat kinază; anemii megaloblastice, potenţial cauzate de afecţiuni precum deficitul de folat (din cauza bolilor congenitale, aportul scăzut sau necesităţi crescute), deficitul de cobalamină (din cauza bolilor congenitale, anemia pernicioasă, absorbţia defectuoasă, insuficienţa pancreatică sau aportul scăzut), anumite medicamente, sau cauze inexplicabile (anemie diseritropoietică congenitală, anemie megaloblastică refractară sau eritroleucemie); anemii mieloftizice incluzând, de exemplu, mielofibroză (metaplazie mieloidă) şi mieloftizie; porfirie eritropoietică congenitală; şi otrăvirea cu plumb.

În anumite modalităţi de realizare, unul sau mai mulţi dintre complecşii heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului superfamiliei TGF-beta conform dezvăluirii se pot utiliza în combinaţie cu terapii de susţinere pentru eritropoieza ineficientă. Astfel de terapii includ transfuzia fie cu celule roşii, fie cu sânge integral pentru tratarea anemiei. În anemiile cronice sau ereditare, mecanismele normale pentru homeostazia fierului sunt copleşite de transfuzii repetate, conducând în cele din urmă la acumularea toxică şi potenţial fatală de fier în ţesuturile vitale precum inima, ficatul şi glandele endocrine. Astfel, terapiile de susţinere pentru pacienţii afectaţi cronic de eritropoieză ineficientă includ, de asemenea, tratamentul cu una sau mai multe molecule de chelatare a fierului pentru a promova excreţia de fier în urină şi/sau scaun şi astfel pentru a preveni sau inversa supraîncărcarea cu fier a ţesutului [vezi, de exemplu, Hershko (2006) Haematologica 91:1307-1312; Cao şi colab. (2011), Pediatr Rep 3(2):e17]. Agenţii eficienţi de chelatare a fierului ar trebui să poată lega şi neutraliza selectiv fierul feric, forma oxidată a fierului legat fără transferină, care este probabil responsabilă de cea mai parte a toxicităţii fierului prin producţia catalitică a radicalilor hidroxil şi a produselor de oxidare [vezi, de exemplu, Esposito şi colab. (2003) Blood 102:2670-2677]. Aceşti agenţi sunt diferiţi din punct de vedere structural, dar posedă toţi atomi donori de oxigen sau azot capabili să formeze complecşi de coordinare octaedrică neutralizanţi cu atomii de fier individuali în stoichiometriile de 1:1 (agenţi hexadentaţi), 2:1 (tridentat) sau 3:1 (bidentat) [Kalinowski şi colab. (2005) Pharmacol Rev 57:547-583]. În general, agenţii eficienţi de chelatare a fierului au, de asemenea, o greutate moleculară relativ mică (de exemplu, mai puţin de 700 daltoni), cu solubilitate atât în apă, cât şi în lipide, pentru a permite accesul la ţesuturile afectate. Exemple specifice de molecule de chelatare a fierului includ deferoxamina, un agent hexadentat de origine bacteriană care necesită administrare parenterală zilnică şi agenţii sintetici activi oral, deferipronă (bidentat) şi deferasirox (tridentat). Terapia combinată constând în administrarea în aceeaşi zi a doi agenţi de chelatare a fierului se arată promiţătoare la pacienţii care nu răspund la monoterapia de chelatare şi, de asemenea, la depăşirea problemelor legate de complianţa slabă a pacientului cu dereroxamină individuală [Cao şi colab. (2011) Pediatr Rep 3(2):e17; Galanello şi colab. (2010) Ann NY Acad Sci 1202:79-86].

Aşa cum se utilizează aici, ʺîn combinaţie cuʺ sau ʺadministrare conjugatăʺ se referă la orice formă de administrare astfel încât a doua terapie mai este încă eficientă în organism (de exemplu, cei doi compuşi sunt simultan eficienţi la pacient, care poate include efecte sinergice ale cei doi compuşi). Eficacitatea poate să nu se coreleze cu o concentraţie măsurabilă a agentului în sânge, ser sau plasmă. De exemplu, diferiţii compuşi terapeutici pot fi administraţi fie în aceeaşi formulare, fie în formulări separate, fie concomitent, fie secvenţial, şi în scheme diferite. Astfel, un individ care primeşte un astfel de tratament poate beneficia de un efect combinat al diferitelor terapii. Unul sau mai mulţi dintre complecşii heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului superfamiliei TGF-beta conform dezvăluirii pot fi administraţi concomitent cu, înainte sau ulterior unuia sau mai multor alţi agenţi suplimentari sau terapii de susţinere. În general, fiecare agent terapeutic va fi administrat la o doză şi/sau într-un interval de timp determinat pentru acel agent particular. Combinaţia particulară de utilizat într-un regim va lua în considerare compatibilitatea antagonistului prezentei dezvăluiri cu terapia şi/sau efectul terapeutic dorit care trebuie realizat.

În anumite modalităţi de realizare, unul sau mai mulţi dintre complecşii heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului superfamiliei TGF-beta conform dezvăluirii se pot utiliza în combinaţie cu hepcidină sau un agonist al hepcidinei pentru eritropoieza ineficientă. O polipeptidă circulantă produsă în principal în ficat, hepcidina este considerată un agent reglator principal al metabolismului fierului în virtutea capacităţii sale de a induce degradarea feroportinei, o proteină exportatoare de fier localizată pe enterocite, hepatocite şi macrofage absorbante. În linii mari, hepcidina reduce disponibilitatea fierului extracelular, astfel încât agoniştii hepcidinei pot fi benefici în tratamentul eritropoiezei ineficiente [vezi, de exemplu, Nemeth (2010) Adv Hematol 2010:750643]. Acest punct de vedere este susţinut de efectele benefice ale creşterii exprimării hepcidinei la un model de β-talasemie la şoarece [Gardenghi şi colab. (2010) J Clin Invest 120:4466-4477].

Unul sau mai mulţi dintre complecşii heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului superfamiliei TGF-beta din dezvăluire, opţional combinaţi cu un activator al receptorului de EPO, ar fi, de asemenea, adecvat pentru tratarea anemiilor de maturare dezordonată a RBC, care se caracterizează parţial prin subdimensionare (microcitară), supradimensionare (macrocitară), deformare sau RBC-uri colorate anormal (hipocromice).

În anumite modalităţi de realizare, prezenta dezvăluire redă metode de tratare sau prevenire a anemiei la un individ care are nevoie de aceasta, prin administrarea individului a unei cantităţi eficiente terapeutic din unul sau mai mulţi dintre complecşii heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului superfamiliei TGF-beta conform dezvăluirii şi a unui activator al receptorului de EPO. În anumite modalităţi de realizare, unul sau mai mulţi dintre complecşii heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului superfamiliei TGF-beta conform dezvăluirii se pot utiliza în combinaţie cu activatori ai receptorilor EPO pentru a reduce doza necesară a acestor activatori la pacienţii care sunt sensibili la efectele adverse ale EPO. Aceste metode pot fi utilizate pentru tratamentele terapeutice şi profilactice ale unui pacient.

Unul sau mai mulţi dintre complecşii heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului superfamiliei TGF-beta conform dezvăluirii se pot utiliza în combinaţie cu activatori ai receptorilor EPO pentru a obţine o creştere a celulelor roşii, în special la doze mai mici de activatori ai receptorilor EPO. Acest lucru poate fi benefic în reducerea efectelor cunoscute în afara obiectivelor şi a riscurilor asociate cu doze mari de activatori ai receptorilor EPO. Efectele adverse primare ale EPO includ, de exemplu, o creştere excesivă a nivelului de hematocrit sau de hemoglobină şi policitemie. Nivelurile crescute de hematocrit pot conduce la hipertensiune (mai ales agravarea hipertensiunii) şi tromboză vasculară. Alte efecte adverse ale EPO care au fost raportate, dintre care unele se referă la hipertensiune, sunt durerile de cap, sindromul similar gripal, obstrucţia şunturilor, infarctele miocardice şi convulsiile cerebrale datorate trombozei, encefalopatiei hipertensive şi aplaziei celulelor roşii din sânge. Vezi, de exemplu, Singibarti (1994) J. Clin Investig 72(suppl 6), S36-S43; Horl şi colab. (2000) Nephrol Dial Transplant 15(suppl 4), 51-56; Delanty şi colab. (1997) Neurology 49, 686-689; şi Bunn (2002) N Engl J Med 346(7), 522-523).

Cu condiţia ca, complecşii heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului superfamiliei TGF-beta din prezenta dezvăluire să acţioneze printr-un mecanism diferit de EPO, aceşti antagonişti pot fi utili pentru creşterea nivelului de celule roşii din sânge şi a hemoglobinei la pacienţii care nu răspund bine la EPO. De exemplu, un complex heteromultimer cu un singur braţ al unui receptor al superfamiliei TGF-beta din prezenta dezvăluire poate fi benefic pentru un pacient la care administrarea unei doze de EPO de la normală la crescută (>300 IU/kg/săptămână) nu are ca rezultat creşterea nivelului de hemoglobină până la nivelul ţintă. Pacienţii cu un răspuns EPO inadecvat se găsesc în toate tipurile de anemie, dar au fost observat frecvent un număr mai mare de persoane care nu răspund la pacienţii cu cancer şi pacienţii cu boală renală în stadiu final. Un răspuns inadecvat la EPO poate fi fie constitutiv (observat la primul tratament cu EPO), fie dobândit (observat la tratamentul repetat cu EPO).

În anumite modalităţi de realizare, prezenta dezvăluire redă metode de gestionare a unui pacient care a fost tratat cu, sau este un candidat care urmează să fie tratat cu, unul sau mai mulţi dintre complecşii heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului superfamiliei TGF-beta conform dezvăluirii prin măsurarea unuia sau mai multor parametrii hematologici la pacient. Parametrii hematologici pot fi utilizaţi pentru a evalua dozarea adecvată pentru un pacient care este candidat pentru a fi tratat cu antagonistul conform prezentei dezvăluiri, pentru a monitoriza parametrii hematologici în timpul tratamentului, pentru a evalua dacă să se ajusteze doza în timpul tratamentului cu unul sau mai mulţi antagonişti din dezvăluire şi/sau pentru a evalua o doză adecvată de întreţinere a unuia sau mai multor antagonişti conform dezvăluirii. Dacă unul sau mai mulţi dintre parametrii hematologici sunt în afara nivelului normal, dozarea cu unul sau mai mulţi dintre complecşii heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului superfamiliei TGF-beta conform dezvăluirii poate fi redusă, întârziată sau terminată.

Parametrii hematologici care pot fi măsuraţi în conformitate cu metodele redate aici includ, de exemplu, nivelurile de celule roşii, tensiunea arterială, depozitele de fier şi alţi agenţi găsiţi în fluidele corporale care se corelează cu niveluri crescute de celule roşii din sânge, utilizând metode recunoscute în domeniu. Astfel de parametri pot fi determinaţi folosind o probă de sânge de la un pacient. Creşterile nivelurilor de celule roşii, hemoglobină şi/sau niveluri de hematocrit pot determina creşterea tensiunii arteriale.

Într-o modalitate de realizare, dacă unul sau mai mulţi parametri hematologici sunt în afara intervalului normal sau pe partea înaltă a normalului la un pacient care este candidat pentru a fi tratat cu unul sau mai mulţi dintre complecşii heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului superfamiliei TGF-beta din dezvăluire, atunci, debutul administrării unuia sau mai multora dintre complecşii heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului superfamiliei TGF-beta conform dezvăluirii poate fi întârziat până când parametrii hematologici au revenit la un nivel normal sau acceptabil fie în mod natural, fie prin intervenţie terapeutică. De exemplu, dacă un pacient candidat este hipertensiv sau pre-hipertensiv, atunci pacientul poate fi tratat cu un agent de scădere a tensiunii arteriale pentru a reduce tensiunea arterială a pacientului. Se poate utiliza orice agent de scădere a tensiunii arteriale adecvat pentru starea pacientului, incluzând, de exemplu, diuretice, inhibitori adrenergici (incluzând alfa blocanţi şi beta-blocanţi), vasodilatatori, blocanţi ai canalelor de calciu, inhibitori ai enzimei de conversie a angiotensinei (ACE) sau blocante ale receptorilor de angiotensină II. Tensiunea arterială poate fi tratată alternativ folosind o dietă şi un regim de exerciţii fizice. Similar, dacă un pacient candidat are depozite de fier mai mici decât în mod normal sau pe partea inferioară a normalului, atunci pacientul poate fi tratat cu un regim adecvat de dietă şi/sau suplimente de fier până când depozitele de fier ale pacientului au revenit la un nivel normal sau un nivel acceptabil. Pentru pacienţii cu niveluri mai ridicate decât normal ale celulelor roşii din sânge şi/sau ale nivelurilor de hemoglobină administrarea unuia sau mai multora dintre complecşii heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului superfamiliei TGF-beta conform dezvăluirii poate fi întârziată până când nivelurile au revenit la un nivel normal sau acceptabil.

În anumite modalităţi de realizare, dacă unul sau mai mulţi parametri hematologici sunt în afara intervalului normal sau pe partea superioară a normalului la un pacient care este candidat pentru a fi tratat cu unul sau mai mulţi dintre complecşii heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului superfamiliei TGF-beta din dezvăluire, atunci debutul administrării nu poate fi întârziat. Cu toate acestea, cantitatea de dozare sau frecvenţa de dozare a respectivului unul sau mai mulţi dintre complecşii heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului superfamiliei TGF-beta conform dezvăluirii pot fi stabilite la o cantitate care ar reduce riscul unei creşteri inacceptabile a parametrilor hematologici care apar la administrarea unuia sau mai multora dintre complecşii heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului superfamiliei TGF-beta din dezvăluire. Alternativ, poate fi dezvoltat un regim terapeutic pentru pacient care combină unul sau mai mulţi dintre complecşii heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului superfamiliei TGF-beta conform dezvăluirii cu un agent terapeutic care se adresează nivelului nedorit al parametrului hematologic. De exemplu, dacă pacientul are tensiune arterială crescută, atunci poate fi conceput un regim terapeutic care implică administrarea unuia sau mai multora dintre complecşii heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului superfamiliei TGF-beta conform dezvăluirii şi şi a unui agent de scădere a tensiunii arteriale. Pentru un pacient care are depozite de fier mai mici decât cele dorite, poate fi dezvoltat un regim terapeutic cu unul sau mai mulţi dintre complecşii heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului superfamiliei TGF-beta conform dezvăluirii şi suplimentarea cu fier.

Într-o modalitate de realizare, parametrii iniţiali pentru unul sau mai mulţi parametri hematologici pot fi stabiliţi pentru un pacient care este candidat pentru a fi tratat cu unul sau mai mulţi dintre complecşii heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului superfamiliei TGF-beta conform dezvăluirii şi un regim de dozare adecvat stabilit pentru pacientul respectiv pe baza valorii(lor) iniţiale. Alternativ, parametrii iniţiali stabiliţi pe baza istoricului medical al unui pacient ar putea fi utilizaţi pentru informarea pentru un regim de dozare adecvat pentru un pacient. De exemplu, dacă un pacient sănătos are stabilită o tensiune iniţială care depăşeşte intervalul normal definit, este posibil să nu fie necesar să se aducă tensiunea arterială a pacientului în intervalul considerat normal pentru populaţia generală înainte de tratamentul cu respectivul unul sau mai mulţi complecşi ai superfamiliei TGF-beta din dezvăluire. Valorile iniţiale ale unui pacient pentru unul sau mai mulţi parametri hematologici înainte de tratamentul cu unul sau mai mulţi dintre complecşii heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului superfamiliei TGF-beta conform dezvăluirii pot fi, de asemenea, utilizate ca valori comparative relevante pentru monitorizarea oricăror modificări ale parametrilor hematologici în timpul tratamentului respectivul unul sau mai mulţi dintre complecşii heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului superfamiliei TGF-beta din dezvăluire.

În anumite modalităţi de realizare, unul sau mai mulţi parametri hematologici sunt măsuraţi la pacienţii care sunt trataţi cu unul sau mai mulţi dintre complecşii heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului superfamiliei TGF-beta din dezvăluire. Parametrii hematologici pot fi utilizaţi pentru a monitoriza pacientul în timpul tratamentului şi pentru a permite ajustarea sau încetarea dozării respectivul unul sau mai mulţi dintre complecşii heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului superfamiliei TGF-beta conform dezvăluirii sau dozării suplimentare cu un alt agent terapeutic. De exemplu, dacă administrarea unuia sau mai multora dintre complecşii heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului superfamiliei TGF-beta conform dezvăluirii conform dezvăluirii rezultă într-o creştere a tensiunii arteriale, a nivelului de celule roşii din sânge sau a nivelului de hemoglobină sau o reducere a depozitelor de fier, atunci doza respectivului unul sau mai mulţi dintre complecşii heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului superfamiliei TGF-beta conform dezvăluirii poate fi redusă din punct de vedere a cantităţii sau frecvenţei pentru a reduce efectele unuia sau mai multora dintre complecşii heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului superfamiliei TGF-beta conform dezvăluirii asupra respectivului unul sau mai mulţi parametri hematologici. Dacă administrarea unuia sau mai multora dintre complecşii heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului superfamiliei TGF-beta conform dezvăluirii rezultă într-o modificare a unuia sau mai multor parametri hematologici care este adversă pentru pacient, atunci dozarea respectivului unul sau mai mulţi dintre complecşii heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului superfamiliei TGF-beta conform dezvăluirii pot fi terminate fie temporar, până când parametrii hematologici revin la un nivel acceptabil, sau permanent. Similar, dacă unul sau mai mulţi parametri hematologici nu sunt aduşi într-un interval acceptabil după reducerea dozei sau a frecvenţei de administrare a unuia sau mai multora dintre complecşii heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului superfamiliei TGF-beta din dezvăluire, atunci dozarea poate fi terminată. Ca o alternativă sau, în plus faţă de reducerea sau terminarea dozării cu respectivul unul sau mai mulţi dintre complecşii heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului superfamiliei TGF-beta din dezvăluire, pacientul poate fi dozat cu un agent terapeutic suplimentar care se adresează nivelului nedorit al parametrului(lor) hematologic(i), cum ar fi, de exemplu, un agent de scădere a tensiunii arteriale sau un supliment de fier. De exemplu, dacă un pacient tratat cu unul sau mai mulţi dintre complecşii heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului superfamiliei TGF-beta conform dezvăluirii are tensiune arterială crescută, atunci dozarea cu respectivul unul sau mai mulţi dintre complecşii heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului superfamiliei TGF-beta conform dezvăluirii poate continua la acelaşi nivel şi la regimul de tratament se adaugă un agent de scădere a tensiunii arteriale, dozarea cu respectivul unul sau mai mulţi dintre complecşii heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului superfamiliei TGF-beta conform dezvăluirii poate fi redusă (de exemplu, în cantitate şi/sau frecvenţă) şi un agent de scădere a tensiunii arteriale este adăugat la regimul de tratament, sau dozarea cu respectivul unul sau mai mulţi dintre complecşii heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului superfamiliei TGF-beta conform dezvăluirii poate fi terminată şi pacientul poate fi tratat cu un agent de scădere a tensiunii arteriale.

6. Compoziţii farmaceutice

În anumite aspecte, complecşii heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului superfamiliei TGF-beta din prezenta dezvăluire pot fi administraţi singuri sau ca o componentă a unei formulări farmaceutice (denumită şi compoziţie terapeutică sau compoziţie farmaceutică). O formulare farmaceutică se referă la un preparat care este într-o astfel de formă încât să permită activitatea biologică a unui ingredient activ (de exemplu, un agent al prezentei dezvăluiri) conţinut în aceasta pentru a fi eficient şi care nu conţine componente suplimentare care sunt inacceptabil de toxice pentru un subiect căruia i s-ar administra formularea. Compuşii în cauză pot fi formulaţi pentru administrare în orice mod convenabil pentru utilizare în medicina umană sau veterinară. De exemplu, unul sau mai mulţi agenţi din prezenta descriere pot fi formulaţi cu un purtător acceptabil farmaceutic. Un purtător acceptabil farmaceutic se referă la un ingredient dintr-o formulare farmaceutică, altul decât un ingredient activ, care este, în general, netoxic pentru un subiect. Un purtător acceptabil farmaceutic include, dar nu se limitează la, un tampon, excipient, stabilizator şi/sau conservant. În general, formulările farmaceutice pentru utilizarea în prezenta dezvăluire sunt într-o formă liberă de pirogeni, acceptabilă fiziologic, atunci când sunt administrate unui subiect. Agenţii terapeutic utili, alţii decât cei descrişi aici, care pot fi incluşi opţional în formulare aşa cum a fost descris mai sus, pot fi administraţi în combinaţie cu agenţii în cauză în metodele conform prezentei dezvăluiri.

În anumite modalităţi de realizare, compoziţiile vor fi administrate parenteral [de exemplu, prin injecţie intravenoasă (I.V.), injecţie intraarterială, injecţie intraosoasă, injecţie intramusculară, injecţie intratecală, injecţie subcutanată sau injecţie intradermică]. Compoziţiile farmaceutice adecvate pentru administrarea parenterală pot cuprinde unul sau mai mulţi agenţi conform dezvăluirii în combinaţie cu una sau mai multe soluţii, dispersii, suspensii sau emulsii, sau pulberi sterile care pot fi reconstituite în soluţii sterile injectabile sau dispersii exact înainte de utilizare, apoase sau neapoase izotonice sterile acceptabile farmaceutic. Soluţiile sau dispersiile injectabile pot conţine antioxidanţi, tampoane, bacteriostatice, agenţi de suspendare, agenţi de îngroşare sau soluţi care fac formularea izotonică cu sângele destinatarului intenţionat. Exemple de purtători apoşi şi neapoşi care pot fi folosiţi în formulările farmaceutice din prezenta descriere includ apă, etanol, polioli (de exemplu, glicerol, propilenglicol, polietilenglicol, etc.), uleiuri vegetale (de exemplu, ulei de măsline), esteri organici injectabili (de exemplu, oleat de etil) şi amestecuri adecvate ale acestora. Fluiditatea adecvată poate fi menţinută, de exemplu, prin utilizarea materialelor de acoperire (de exemplu, lecitină), prin menţinerea dimensiunii necesare a particulelor în cazul dispersiilor şi prin utilizarea agenţilor tensioactivi.

În unele modalităţi de realizare, o metodă terapeutică conform prezentei dezvăluiri include administrarea compoziţiei farmaceutice sistemic sau local, de la un implant sau dispozitiv. Mai mult, compoziţia farmaceutică poate fi încapsulată sau injectată într-o formă pentru livrarea la un situs ţesut ţintă (de exemplu, măduvă osoasă sau muşchi). În anumite modalităţi de realizare, compoziţiilor din prezenta dezvăluire pot include o matrice capabilă să livreze unul sau mai mulţi dintre agenţii conform prezentei descrieri într-un situs de ţesut ţintă (de exemplu, măduvă osoasă sau muşchi), oferind o structură pentru ţesutul în curs de dezvoltare şi capabil să fie resorbit optim în corp. De exemplu, matricea poate furniza eliberarea lentă a unuia sau mai multor agenţi conform prezentei dezvăluiri. Astfel de matrice pot fi formate din materiale utilizate în prezent pentru alte aplicaţii medicale implantate.

Alegerea materialului matricei se poate baza pe una sau mai multe dintre: biocompatibilitate, biodegradabilitate, proprietăţi mecanice, aspect cosmetic şi proprietăţi de interfaţă. Aplicarea particulară a compoziţiilor în cauză va defini formularea adecvată. Matricele potenţiale pentru compoziţii pot fi sulfat de calciu, fosfat tricalcic, hidroxiapatită, acid polilactic şi polianhidride, biodegradabile şi definite chimic. Alte materiale potenţiale sunt biodegradabile şi biologic bine definite, incluzând, de exemplu, colagenul osos sau dermic. Alte matrice sunt alcătuite din proteine pure sau componente ale matricei extracelulare. Alte matrice potenţiale sunt non-biodegradabile şi definite chimic incluzând, de exemplu, hidroxiapatita sinterizată, biosticlă, aluminaţi sau alte ceramice. Matricele pot fi compuse din combinaţii ale oricăruia dintre tipurile de materiale menţionate mai sus, incluzând, de exemplu, acid polilactic şi hidroxiapatit sau colagen şi fosfat tricalcic. Bioceramicele pot fi modificate ca şi compoziţie (de exemplu, fosfat aluminat de calciu) şi prelucrate pentru a modifica una sau mai multe dintre dimensiunea porilor, dimensiunea particulelor, forma particulelor şi biodegradabilitatea.

În anumite modalităţi de realizare, compoziţiile farmaceutice din prezenta dezvăluire se pentru administra topic. "Aplicare topică" sau "topic" înseamnă contactul compoziţiei farmaceutice cu suprafeţele corpului, incluzând, de exemplu, pielea, locurile plăgii şi membranele mucoase. Compoziţiile farmaceutice topice pot avea diverse forme de aplicare şi cuprind tipic un strat care conţine medicament, care este adaptat pentru a fi plasat aproape sau în contact direct cu ţesutul la administrarea topică a compoziţiei. Compoziţiile farmaceutice adecvate pentru administrare topică pot cuprinde unul sau mai mulţi complecşii heteromultimeri cu un singur braţ ai receptorului superfamiliei TGFβ conform dezvăluirii într-o combinaţie formulată sub formă de lichid, gel, cremă, loţiune, unguent, spumă, pastă, chit, un semi-solid sau un solid. Compoziţiile în formă de lichid, gel, cremă, loţiune, unguent, spumă, pastă sau chit pot fi aplicate prin împrăştiere, pulverizare, ungere, tamponare sau rulare a compoziţiei pe ţesutul ţintă. Compoziţiile pot fi, de asemenea, impregnate în pansamente sterile, plasturi transdermici, plasturi şi bandaje. Compoziţiile sub formă de chit, semi-solide sau solide pot fi deformabile. Ele pot fi elastice sau neelastice (de exemplu, flexibile sau rigide). În anumite aspecte, compoziţia face parte dintr-un compozit şi poate include fibre, granulate sau mai multe straturi având compoziţii identice sau diferite.

Compoziţiile topice sub formă lichidă pot include soluţii, emulsii, microemulsii şi suspensii acceptabile farmaceutic. În plus faţă de ingredientul(ele) activ(e), forma de dozare lichidă poate conţine un diluant inert utilizat în mod obişnuit în domeniu, incluzând, de exemplu, apă sau alt solvent, un agent de solubilizare şi/sau emulgator [de exemplu, alcool etilic, alcool izopropilic, carbonat de etil, acetat de etil, alcool benzilic, benzoat de benzil, propilenglicol sau 1,3-butilenglicol, un ulei (de exemplu, ulei de seminţe de bumbac, arahide, porumb, germeni, măsline, ricin şi susan), glicerol, alcool tetrahidrofurilic, polietilenglicol, un ester de acid gras al sorbitanului şi amestecuri ale acestora].

Compoziţiile topice de gel, cremă, loţiune, unguent, semi-solide sau solide pot include unul sau mai mulţi agenţi de îngroşare, cum ar fi o polizaharidă, un polimer sintetic sau un polimer pe bază de proteină. Într-o modalitate de realizare a invenţiei, agentul de gelificare din prezenta este unul care este în mod adecvat netoxic şi conferă vâscozitatea dorită. Agenţii de îngroşare pot include polimeri, copolimeri, şi monomeri de: vinilpirolidone, metacrilamide, N-vinilimidazole acrilamide, carboxi vinili, esteri vinilici, eteri vinilici, siliconi, polietilenoxizi, polietilenglicoli, alcooli vinilici, acrilaţi de sodiu, acrilaţi, acizi maleici, NN-dimetilacrilamide, diacetonacrilamide, acrilamide, acriloil morfolină, pluronic, colageni, poliacrilamide, poliacrilaţi, alcooli polivinilici, polivinilene, silicaţi polivinilici, poliacrilaţi substituiţi cu un zahar (de exemplu, zaharoză, glucoză, glucozamine, galactoză, trehaloză, manoză, sau lactoză), acizi acilamidopropansulfonici, tetrametoxiortosilicaţi, metiltrimetoxiortosilicaţi, tetraalcoxiortosilicaţi, trialcoxiortosilicaţi, glicoli, propilenglicol, glicerină, polizaharide, alginaţi, dextrani, ciclodextrină, celuloze, celuloze modificate, celuloze oxidate, chitozani, chitine, guari, caragenani, acizi hialuronici, inulină, amidonuri, amidonuri modificate, agaroză, metilceluloză, gume vegetale, hilaronani, hidrogeluri, gelatine, glicosaminoglicani, carboximetil celuloze, hidroxietil celuloze, hidroxi propil metil celuloze, pectine, metoxi-pectine inferioare, dextrani reticulaţi, copolimeri amidon-acrilonitril grefaţi, poliacrilat de amidon sodiu, hidroxietil metacrilaţi, hidroxil etil acrilaţi, polivinilenă, eteri polietilvinilici, metacrilaţi de polimetil, polistireni, poliuretani, polialcanoaţi, acizi polilactici, polilactaţi, poli(3-hidroxibutirat), hidrogeluri sulfonate, AMPS (acid 2-acrilamido-2-metil-1-propansulfonic), SEM (metacrilat de sulfoetil), SPM (metacrilat de sulfopropil), SPA (acrilat de sulfopropil), N,N-dimetil-N-metacriloxietil-N-(3-sulfopropil)amoniu betaină, acid metacrilic amidopropil-dimetil amoniu sulfobetaină, SPI (ester itaconic al acidului -bis(1-propil sulfonizacid-3) sare dipotasică), acizi itaconici, AMBC (acid 3-acrilamido-3-metilbutanoic), acrilat de beta-carboxietil (dimeri de acid acrilic), şi polimeri eter maleic anhidridă-metilvinil, derivaţi ai acestora, săruri ale acestora, acizi ai acestora şi combinaţii ale acestora. În anumite modalităţi de realizare, compoziţiile farmaceutice ale prezentei dezvăluiri pot fi administrate pe cale orală, de exemplu, sub formă de capsule, caşete, pastile, tablete, pastile rombice (folosind o bază aromată precum zaharoză şi acacia sau tragacant), pulberi, granule, o soluţie sau o suspensie într-un lichid apos sau neapos, o emulsie lichidă ulei-în-apă sau apă-în-ulei, sau un elixir sau sirop sau pastilă (folosind o bază inertă, cum ar fi gelatina şi glicerina, sau zaharoza şi acacia) şi/sau o apă de gură, fiecare conţinând o cantitate predeterminată dintr-un compus din prezenta descriere şi opţional unul sau mai multe alte ingrediente active. Un compus din prezenta dezvăluire şi opţional unul sau mai multe alte ingrediente active pot fi, de asemenea, administrate sub formă de bolus, electuar sau pastă.

În forme de dozare solide pentru administrare orală (de exemplu, capsule, tablete, pilule, drajeuri, pulberi şi granule), unul sau mai mulţi compuşi din prezenta descriere pot fi amestecaţi cu unul sau mai mulţi purtători acceptabili farmaceutic incluzând, de exemplu, citrat de sodiu, fosfat dicalcic, un material de umplutură sau diluant (de exemplu, un amidon, lactoză, zaharoză, glucoză, manitol şi acid silicic), un liant (de exemplu carboximetilceluloză, un alginat, gelatină, polivinilpirolidonă, zaharoză şi salcâm), un umectant (de exemplu, glicerol), un agent de dezintegrare (de exemplu, agar-agar, carbonat de calciu, amidon de cartof sau tapioca, acid alginic, un silicat, şi carbonat de sodiu), un agent de întârziere a soluţiei (de exemplu parafină), un accelerator de absorbţie (de exemplu un compus cuaternar de amoniu), un agent de umectare (de exemplu, alcool cetilic şi monostearat de glicerol), un absorbant (de exemplu, caolin şi argilă bentonitică), un lubrifiant (de exemplu, un talc, stearat de calciu, stearat de magneziu, polietilen glicoli solizi, laurilsulfat de sodiu), un agent de colorare şi amestecuri ale acestora. În cazul capsulelor, tabletelor şi pilulelor, formularea farmaceutică (compoziţia) poate cuprinde, de asemenea, un agent de tamponare. Compoziţii solide de un tip similar pot fi de asemenea utilizate ca umpluturi în capsule gelatinoase moi şi tari utilizând unul sau mai mulţi excipienţi incluzând, de exemplu, lactoză sau un zahăr din lapte, precum şi un polietilenglicol cu greutate moleculară ridicată.

Formele de dozare lichide pentru administrarea orală a compoziţiei farmaceutice pot include emulsii acceptabile farmaceutic, microemulsii, soluţii, suspensii, siropuri şi elixire. În plus faţă de ingredientul(ele) activ(e), forma de dozare lichidă poate conţine un diluant inert utilizat în mod obişnuit în domeniu, incluzând, de exemplu, apă sau alt solvent, un agent de solubilizare şi/sau emulgator [de exemplu, alcool etilic, alcool izopropilic, carbonat de etil, acetat de etil, alcool benzilic, benzoat de benzil, propilenglicol sau 1,3-butilenglicol, un ulei (de exemplu, ulei de seminţe de bumbac, arahide, porumb, germeni, măsline, ricin şi de susan), glicerol, alcool tetrahidrofurilic, un polietilenglicol, un ester de acid gras al sorbitanului şi amestecuri ale acestora]. Pe lângă diluanţii inerţi, formularea orală poate include, de asemenea, un adjuvant care include, de exemplu, un agent de umectare, un agent de emulsionare şi suspendare, un agent de îndulcire, un agent de aromatizare, un agent de colorare, un agent de parfumare, un agent de conservare şi combinaţii ale acestora.

Suspensiile, pe lângă compuşii activi, pot conţine agenţi de suspendare incluzând, de exemplu, un alcool izostearilic etoxilat, polioxietilensorbitol, un ester sorbitan, celuloză microcristalină, metahidroxid de aluminiu, bentonită, agar-agar, tragacant şi combinaţii ale acestora.

Prevenirea acţiunii şi/sau creşterii microorganismelor poate fi asigurată prin includerea a diferiţi agenţi antibacterieni şi antifungici incluzând, de exemplu, paraben, clorobutanol şi acid fenol sorbic.

În anumite modalităţi de realizare, poate fi de dorit să se includă în compoziţii un agent izotonic incluzând, de exemplu, un zahăr sau clorură de sodiu. În plus, absorbţia prelungită a unei forme farmaceutice injectabile poate fi realizată prin includerea unui agent de întârziere a absorbţiei incluzând, de exemplu, monostearat de aluminiu şi gelatină.

Se înţelege că regimul de dozare va fi determinat de medicul curant, luând în considerare diferiţi factori care modifică acţiunea unuia sau mai multor agenţi din prezenta dezvăluire. În cazul unui complex heteromultimer cu un singur braţ al unui receptor al superfamiliei TGF-beta care promovează formarea celulelor roşii, diferiţi factori pot include, dar nu se limitează la, numărul de celule roşii al pacientului, nivelul de hemoglobină, numărul ţintă dorit de celule roşii, vârsta pacientului, genul pacientului, dieta pacientului, severitatea oricărei boli care ar putea contribui la un nivel de celule roşii din sânge deprimat, momentul administrării şi alţi factori clinici. Adăugarea altor agenţi activi cunoscuţi la compoziţia finală poate afecta, de asemenea, dozarea. Progresul poate fi monitorizat prin evaluarea periodică a unuia sau mai multor niveluri de celule roşii din sânge, niveluri de hemoglobină, niveluri de reticulocite şi alţi indicatori ai procesului hematopoietic.

În anumite modalităţi de realizare, prezenta dezvăluire redă, de asemenea, terapie genetică pentru producerea in vivo a unuia sau mai multor agenţi conform prezentei dezvăluiri. O astfel de terapie îşi va atinge efectul terapeutic prin introducerea secvenţelor de agenţi în celule sau ţesuturi care au una sau mai multe dintre tulburările enumerate mai sus. Eliberarea secvenţelor de agent poate fi realizată, de exemplu, prin utilizarea unui vector de exprimare recombinant, cum ar fi un virus himeric sau un sistem de dispersie coloidală. Eliberarea terapeutică preferată a uneia sau mai multor secvenţe de agenţi din dezvăluire este utilizarea lipozomilor vizaţi.

Diverşi vectori virali care pot fi utilizaţi pentru terapia genică aşa cum sunt învăţămintele de aici includ adenovirus, virusul herpes, vaccinia sau un virus ARN (de exemplu, un retrovirus). Vectorul retroviral poate fi un derivat al unui retrovirus murin sau aviar. Exemple de vectori retrovirali în care poate fi inserată o singură genă străină includ, dar nu se limitează la: virusul leucemiei murine Moloney (MoMuLV), virusul sarcomului murin Harvey (HaMuSV), virusul tumorii mamare murine (MuMTV) şi virusul sarcomului Rous (RSV). Un număr de vectori retrovirali suplimentari pot încorpora gene multiple. Toţi aceşti vectori pot transfera sau încorpora o genă pentru un marker selectabil, astfel încât celulele transduse să poată fi identificate şi generate. Vectorii retrovirali pot fi produşi specific ţintei prin ataşarea, de exemplu, a unui zahăr, a unei glicolipide sau a unei proteine. Ţintirea preferată se realizează prin utilizarea unui anticorp. Cei de specialitate în domeniu vor recunoaşte că în genomul retroviral pot fi inserate secvenţe de polinucleotide specifice sau ataşate la un înveliş viral pentru a permite livrarea specifică ţintă a vectorului retroviral care conţine unul sau mai mulţi agenţi ai prezentei dezvăluiri.

Alternativ, celulele de cultură tisulară pot fi transfectate direct cu plasmide care codifică genele structurale retrovirale (gag, pol şi env), prin transfecţie convenţională cu fosfat de calciu. Aceste celule sunt apoi transfectate cu vectorul plasmidic care conţine genele de interes. Celulele rezultate eliberează vectorul retroviral în mediul de cultură.

Un alt sistem de livrare ţintită pentru unul sau mai mulţi agenţi din prezenta dezvăluire este un sistem de dispersie coloidală. Sistemele de dispersie coloidală includ, de exemplu, complecşi macromoleculari, nanocapsule, microsfere, perle şi sisteme pe bază de lipide, incluzând emulsii ulei-în-apă, micele, micele mixte şi lipozomi. În anumite modalităţi de realizare, sistemul coloidal preferat al acestei dezvăluiri este un lipozom. Lipozomii sunt vezicule cu membrană artificială care sunt utili ca vehicule de livrare in vitro şi in vivo. ARN, ADN şi virioni intacţi pot fi încapsulaţi în interiorul apos şi pot fi eliberaţi la celule într-o formă activă biologic. Vezi, de exemplu, Fraley, şi colab. (1981) Trends Biochem. Sci, 6:77. Metode pentru transferul eficient de gene folosind un vehicul lipozomic sunt cunoscute în domeniu. Vezi, de exemplu, Mannino, şi colab. (1988) Biotechniques, 6:682, 1988.

Compoziţia lipozomului este de obicei o combinaţie de fosfolipide, care poate include un steroid (de exemplu colesterol). Caracteristicile fizice ale lipozomilor depind de pH, tăria ionică şi prezenţa cationilor divalenţi. Se pot utiliza şi alte fosfolipide sau alte lipide, incluzând, de exemplu, un compus fosfatidilic (de exemplu, fosfatidilglicerol, fosfatidilcolină, fosfatidilserină, fosfatidiletanolamină, un sfingolipid, un cerebrozid şi un gangliozid), fosfatidilcolină din ouă, dipalmitoilfosfatidilcolină şi distearilfosfatidilcolină. Ţintirea lipozomilor este, de asemenea, posibilă pe baza, de exemplu, a specificităţii organelor, a specificităţii celulei şi a specificităţii organelelor şi este cunoscută în domeniu.

EXEMPLIFICARE

Invenţia fiind acum descrisă în general, va fi mai uşor înţeleasă prin referire la următoarele exemple, care sunt incluse numai în scopul ilustrării anumitor modalităţi de realizare ale prezentei invenţii şi nu sunt destinate limitării invenţiei.

Exemplul 1. Generarea şi caracterizarea unui heterodimer ActRIIB-Fc cu un singur braţ

Solicitanţii au construit un complex heterodimeric ActRIIB-Fc cu un singur braţ solubil cuprinzând o polipeptidă Fc monomerică cu o extensie N-terminală scurtă şi o a doua polipeptidă în care domeniul extracelular al ActRIIB uman a fost fuzionat cu un domeniu Fc separat printr-un linker poziţionat între domeniul extracelular şi acest al doilea domeniu Fc. Construcţii individuali sunt denumiţi polipeptidă Fc monomerică şi respectiv polipeptidă de fuziune ActRIIB-Fc, iar secvenţele fiecăruia sunt prezentate mai jos.

O metodologie pentru promovarea formării complecşilor heteromerici ActRIIB-Fc:Fc, mai degrabă decât a complecşilor homodimerici ActRIIB-Fc: ActRIIB-Fc sau Fc:Fc este aceea de a introduce modificări în secvenţa de aminoacizi a domeniilor Fc pentru a ghida formarea complecşilor heteromerici asimetrici. În această dezvăluire sunt descrise multe abordări diferite pentru obţinerea unor perechi de interacţiune asimetrice utilizând domenii Fc.

Într-o abordare, ilustrată în secvenţele polipeptidice ActRIIB-Fc şi Fc monomerice ale SEQ ID NO: 104-106 şi respectiv 137-139, un domeniu Fc este modificat pentru a introduce aminoacizi cationici la faţa de interacţiune, în timp ce celălalt domeniu Fc este modificat pentru a introduce aminoacizi anionici pe faţa de interacţiune. Polipeptida de fuziune ActRIIB-Fc şi polipeptida Fc monomerică utilizează fiecare activatorul plasminogen tisular (TPA) lider: MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSP (SEQ ID NO: 100).

Secvenţa de polipeptidă ActRIIB-Fc (SEQ ID NO: 104) este prezentată mai jos:

Secvenţa lider (semnal) şi linkerul sunt subliniate. Pentru a promova formarea heterodimerului ActRIIB-Fc:Fc, mai degrabă decât a oricăruia dintre posibilii complecşi homodimeri (ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc sau Fc:Fc), pot fi introduse două substituţii de aminoacizi (înlocuirea aminoacizilor acizi cu lizină) în domeniul Fc al proteinei de fuziune ActRIIB aşa cum este indicat prin sublinierea cu o linie dublă de mai sus. Secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO: 104 poate fi furnizată opţional cu eliminarea lizinei C-terminale (K).

Această polipeptidă de fuziune ActRIIB-Fc este codificată de următoarea secvenţă de acid nucleic (SEQ ID NO: 105):

Polipeptida de fuziune ActRIIB-Fc matură (SEQ ID NO: 106) este după cum urmează şi poate fi furnizată opţional cu lizina C-terminală îndepărtată.

Polipeptida G1Fc umană complementară (SEQ ID NO: 137) foloseşte TPA-ul lider şi este după cum urmează:

Secvenţa lider este subliniată, şi o extensie N-terminală opţională a polipeptidei Fc este indicată prin sublinierea cu o linie dublă. Pentru a promova formarea heterodimerului ActRIIB-Fc:Fc mai degrabă decât a oricăruia dintre complecşii homodimerici posibili, două substituţii de aminoacizi (înlocuind lizinele cu resturi anionice) se pot introduce în polipeptida monomerică Fc aşa cum este indicat prin sublinierea cu o linie dublă de mai sus. Secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO: 137 poate fi furnizată opţional cu lizina C-terminală îndepărtată.

Această polipeptidă Fc complementară este codificată de următoarea secvenţă de acizi nucleici (SEQ ID NO: 138).

Secvenţa polipeptidei Fc monomerice mature este după cum urmează (SEQ ID NO: 139) şi poate fi furnizată opţional cu lizina C-terminală îndepărtată.

Polipeptida de fuziune ActRIIB-Fc şi polipeptida Fc monomerică ale SEQ ID NO: 106 şi, respectiv, SEQ ID NO: 139, pot fi co-exprimate şi purificate dintr-o linie de celule CHO pentru a da naştere la un complex proteic heteromeric cu un singur braţ care cuprinde ActRIIB-Fc:Fc.

Într-o altă abordare pentru promovarea formării de complecşi heteromultimerici utilizând polipeptide de fuziune Fc asimetrice, domeniile Fc sunt modificate pentru a introduce interacţiuni hidrofobe complementare şi o legătură de disulfură intramoleculară suplimentară, aşa cum este ilustrat în secvenţele de ActRIIB-Fc şi polipeptidă Fc monomerică ale SEQ ID NO: 403-404 şi 425-426, respectiv.

Secvenţa de polipeptidă ActRIIB-Fc (SEQ ID NO: 403) foloseşte TPA-ul lider şi este prezentată mai jos:

Secvenţa lider şi linkerul sunt subliniate. Pentru a promova formarea heterodimerului ActRIIB-Fc:Fc mai degrabă decât a oricăruia dintre complecşii homodimerici posibili, două substituţii de aminoacizi (înlocuind o serină cu o cisteină şi o treonină cu un triptofan) se pot introduce în domeniul Fc al proteinei de fuziune aşa cum este indicat prin sublinierea cu o linie dublă de mai sus. Secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO: 403 poate fi furnizată opţional cu lizina C-terminală îndepărtată.

Polipeptida de fuziune matură ActRIIB-Fc este după cum urmează:

Forma complementară polipeptidei Fc monomerice (SEQ ID NO: 425) utilizează TPA-ul lider şi este după cum urmează.

Secvenţa lider este este subliniată, şi o extensie N-terminală opţională a polipeptidei Fc este indicată prin sublinierea cu o linie dublă. Pentru a promova formarea heterodimerului ActRIIB-Fc:Fc mai degrabă decât a oricăruia dintre complecşii homodimerici posibili, patru substituţii de aminoacid se pot introduce în polipeptida monomerică Fc aşa cum este indicat prin sublinierea cu o linie dublă de mai sus. Secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO: 425 poate fi furnizată opţional cu lizina C-terminală îndepărtată.

Secvenţa de polipeptidă Fc monomerică matură (SEQ ID NO: 426) este după cum urmează şi poate fi furnizată opţional cu lizina C-terminală îndepărtată.

Polipeptida de fuziune ActRIIB-Fc şi polipeptida Fc monomerică a SEQ ID NO: 404 şi SEQ ID NO: 426, respectiv, pot fi co-exprimate şi purificate dintr-o linie de celule CHO pentru a da naştere la un complex proteic heteromeric cu un singur braţ care cuprinde ActRIIB-Fc:Fc.

Purificarea diferiţilor complecşi ActRIIB-Fc:Fc ar putea fi realizată printr-o serie de etape de cromatografie pe coloană, incluzând, de exemplu, trei sau mai multe dintre următoarele, în orice ordine: cromatografia pe proteină A, cromatografia pe sefaroză Q, cromatografia pe fenilsefaroză, cromatografia de excludere dimensională, şi cromatografia cu schimb de cationi. Purificarea ar putea fi terminată cu filtrare virală şi schimb de tampon.

O analiză de legare bazată pe Biacore™ s-a utilizat pentru a compara selectivitatea legării ligandului a complexului heterodimeric ActRIIB-Fc cu un singur braţ descris mai sus cu aceea a complexului homodimeric ActRIIB-Fc. ActRIIB-Fc cu un singur braţ şi ActRIIB-Fc homodimeric au fost capturaţi independent pe sistem utilizând un anticorp anti-Fc. Liganzii au fost injectaţi şi lăsaţi să curgă peste proteina receptoare capturată. Rezultatele sunt rezumate în tabelul de mai jos, în care ratele de scădere a ligandului (kd) asociate tipic cu cele mai eficiente capcane de ligand sunt notate prin umbrire cu gri.

Aceste date de legare comparative demonstrează că ActRIIB-Fc cu un singur braţ are o selectivitate mai mare pentru ligand decât ActRIIB-Fc homodimeric. În timp ce ActRIIB-Fc homodimer se leagă puternic la cinci liganzi importanţi (vezi grupul de activină A, activină B, BMP 10, GDF8, şi GDF11 din Fig. 6), ActRIIB-Fc cu un singur braţ face o discriminare mai uşoară între aceşti liganzi. Astfel, ActRIIB-Fc cu un singur braţ se leagă puternic la activina B şi GDF11 şi cu tărie intermediară la GDF8 şi activina A. Spre deosebire de ActRIIB-Fc homodimer, ActRIIB-Fc cu un singur braţ prezintă numai o legare slabă la BMP10 şi nicio legare la BMP9. Vezi Figura 6.

Aceste rezultate indică faptul că ActRIIB-Fc cu un singur braţ este un antagonist mai selectiv decât ActRIIB-Fc homodimer. În consecinţă, ActRIIB-Fc cu un singur braţ va fi mai util decât ActRIIB-Fc homodimer în anumite aplicaţii în care astfel de antagonism selectiv este avantajos. Exemplele includ aplicaţii terapeutice în care este de dorit să se păstreze antagonismul uneia sau mai multora dintre activina A, activina B, GDF8, şi GDF11 dar să se minimizeze antagonismul uneia sau mai multora dintre BMP9, BMP10, BMP6, şi GDF3. Inhibarea selectivă a liganzilor din grupul anterior ar putea fi deosebit de avantajoasă din punct de vedere terapeutic, deoarece aceştia constituie o subfamilie care tinde să difere funcţional de ultimul grup şi de setul său asociat de condiţii clinice.

Exemplul 2. Generarea şi caracterizarea unui heterodimer ALK3-Fc cu un singur braţ

Solicitanţii au construit un complex heterodimeric ALK3-Fc solubil cu un singur braţ care cuprinde o polipeptida Fc monomerică cu o extindere N-terminală scurtă şi o a doua polipeptidă în care domeniul extracelular al ALK3 uman a fost fuzionat la un domeniu Fc separat printr-un linker poziţionat între domeniul extracelular şi acest al doilea domeniu Fc. Construcţii individuali sunt denumiţi ca polipeptidă Fc monomerică şi respectiv polipeptidă de fuziune ALK3-Fc, şi secvenţele pentru fiecare sunt redate mai jos.

Formarea unui heterodimer ALK3-Fc cu un singur braţ poate fi ghidată prin abordări similare celor descrise pentru un heterodimer ActRIIB-Fc cu un singur braţ în Exemplul 1. Într-o primă abordare, ilustrată în secvenţele de ALK3-Fc şi polipeptida Fc monomerică din SEQ ID NO: 122-124 şi respectiv 140-142, un domeniu Fc este modificat pentru a se introduce aminoacizi cationici la faţa de interacţiune, în timp ce celălalt domeniu Fc este modificat pentru a se introduce aminoacizi anionici la faţa de interacţiune.

Polipeptida de fuziune ALK3-Fc foloseşte TPA-ul lider şi este după cum urmează:

Secvenţele lider şi linker sunt subliniate. Pentru a promova formarea heterodimerului ALK3-Fc:Fc mai degrabă decât a oricăruia dintre complecşii homodimerici posibili (ALK3-Fc:ALK3-Fc sau Fc:Fc, două substituţii de aminoacizi (înlocuirea lizinei cu aminoacizi anionici) se pot introduce în domeniul Fc al proteinei de fuziune aşa cum este indicat prin sublinierea cu o linie dublă de mai sus. Secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO: 122 poate fi furnizată opţional cu o lizină adăugată la C-terminal.

Această polipeptida de fuziune ALK3-Fc este codificată de următorul acid nucleic (SEQ ID NO: 123).

Secvenţa polipeptidei de fuziune ALK3-Fc mature este după cum urmează (SEQ ID NO: 124) şi poate fi furnizată opţional cu o lizină adăugată la C-terminal.

Polipeptida G1Fc umană complementară (SEQ ID NO: 140) foloseşte TPA-ul lider şi este după cum urmează:

Secvenţa lider este subliniată, şi o extensie N-terminală opţională a polipeptidei Fc este indicată prin sublinierea cu o linie dublă. Pentru a promova formarea heterodimerului ALK3-Fc:Fc mai degrabă decât a oricăruia dintre complecşii homodimerici posibili, două substituţii de aminoacizi (înlocuirea resturilor anionice cu lizine) se pot introduce în polipeptida monomerică Fc aşa cum este indicat prin sublinierea cu o linie dublă de mai sus. Secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO: 140 poate fi furnizată opţional cu lizina C-terminală îndepărtată.

Această polipeptidă Fc complementară este codificată de următorul acid nucleic (SEQ ID NO: 141).

Secvenţa polipeptidei Fc monomerice mature este după cum urmează (SEQ ID NO: 142) şi poate fi furnizată opţional cu lizina C-terminală îndepărtată.

Polipeptida de fuziune ALK3-Fc şi polipeptida Fc monomerică a SEQ ID NO: 124 şi respectiv SEQ ID NO: 142, pot fi co-exprimate şi purificate dintr-o linie de celule CHO pentru a da naştere la un complex proteic heteromeric cu un singur braţ care cuprind ALK3-Fc:Fc.

Într-o altă abordare pentru promovarea formării complecşilor heteromultimerici utilizând polipeptide de fuziune Fc asimetrice, domeniile Fc sunt modificate pentru a introduce interacţiuni hidrofobe complementare şi o legătură de disulfură intramoleculară suplimentară aşa cum este ilustrat în secvenţele polipeptidei ALK3-Fc şi Fc din SEQ ID NO: 415-416 şi respectiv 427-428.

Polipeptida de fuziune ALK3-Fc (SEQ ID NO: 415) utilizează TPA-ul lider şi este după cum urmează:

Secvenţa lider şi linkerul sunt subliniate. Pentru a promova formarea heterodimerului ALK3-Fc:Fc mai degrabă decât a oricăruia dintre complecşii homodimerici posibili, patru substituţii de aminoacid se pot introduce în domeniul Fc al polipeptidei de fuziune ALK3 aşa cum este indicat prin sublinierea cu o linie dublă de mai sus. Secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO: 415 poate fi furnizată opţional cu lizina C-terminală îndepărtată.

Polipeptida de fuziune ALK3-Fc mature (SEQ ID NO: 416) este după cum urmează şi poate fi furnizată opţional cu lizina C-terminală îndepărtată.

Forma complementară polipeptidei G1Fc monomerice (SEQ ID NO: 427) foloseşte TPA-ul lider şi este după cum urmează:

Secvenţa lider este subliniată, şi o extensie N-terminală opţională a polipeptidei Fc este indicată prin sublinierea cu o linie dublă. Pentru a promova formarea heterodimerului ALK3-Fc:Fc mai degrabă decât a oricăruia dintre complecşii homodimerici posibili, două substituţii de aminoacizi (înlocuind o serină cu o cisteină şi o treonină cu un triptofan) se pot introduce în polipeptida monomerică Fc aşa cum este indicat prin sublinierea cu o linie dublă de mai sus. Secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO: 427 poate fi furnizată opţional cu lizina C-terminală îndepărtată.

Secvenţa polipeptidei Fc monomerice mature este după cum urmează (SEQ ID NO: 428) şi poate fi furnizată opţional cu lizina C-terminală îndepărtată.

Polipeptida de fuziune ALK3-Fc şi polipeptida Fc monomerică a SEQ ID NO: 416 şi respectiv SEQ ID NO: 428, pot fi co-exprimate şi purificate dintr-o linie de celule CHO pentru a da naştere la un complex heteromeric cu un singur braţ care cuprind ALK3-Fc:Fc.

Purificarea diferiţilor complecşi ALK3-Fc:Fc ar putea fi realizată printr-o serie de etape de cromatografie pe coloană, incluzând, de exemplu, trei sau mai multe dintre următoarele, în orice ordine: cromatografia pe proteină A, cromatografia pe sefaroză Q, cromatografia pe fenilsefaroză, cromatografia de excludere dimensională, şi cromatografia cu schimb de cationi. Purificarea ar putea fi terminată cu o filtrare virală şi schimb de tampon.

O analiză de legare bazată pe Biacore™ s-a utilizat pentru a compara selectivitatea legării ligandului a complexului heterodimeric ALK3-Fc cu un singur braţ descris mai sus cu aceea a unui complex homodimeric ALK3-Fc. ALK3-Fc cu un singur braţ şi ALK3-Fc homodimeric au fost capturaţi independent pe sistem utilizând un anticorp anti-Fc. Liganzii au fost injectaţi şi lăsaţi să curgă peste proteina receptoare capturată. Rezultatele sunt rezumate în tabelul de mai jos, în care ratele de scădere a ligandului (kd) asociate tipic cu cele mai eficiente capcane de ligand sunt notate prin umbrire cu gri.

Aceste date comparative indică faptul că ALK3-Fc cu un singur braţ are o selectivitate mai mare pentru ligand decât ALK3-Fc homodimeric. În timp ce heterodimerul ALK3-Fc cu un singur braţ păstrează legarea excepţional de strânsă la BMP4 observată cu homodimer ALK3-Fc, acesta prezintă o tărie redusă a legării la BMP2 şi şi prin urmare discriminează mai bine între BMP4 şi BMP2 (tot un ligand puternic) decât o face homodimerul ALK3-Fc. ALK3-Fc cu un singur braţ discriminează de asemenea mai bine între BMP5 (legare intermediară), GDF7 (legare slabă), şi GDF6 (fără legare) comparativ cu homodimerul ALK3-Fc, care leagă aceşti trei liganzi cu o putere deosebit de similară (toate intermediare). Vezi Figura 7. Spre deosebire de construcţii dezvăluiţi în Exemplul 1, nici ALK3-Fc cu un singur braţ nici ALK3-Fc homodimeric nu leagă activinele, GDF8, GDF11, sau BMP10.

Aceste rezultate indică prin urmare că ALK3-Fc cu un singur braţ este un antagonist mai selectiv al BMP4 decât este ALK3-Fc homodimer. ALK3-Fc cu un singur braţ poate fi de aşteptat să antagonizeze BMP4 într-o manieră mai ţintită - cu efecte reduse de la antagonizarea concurentă a BMP2 sau BMP5 şi în special GDF6 sau GDF7 - comparativ cu ALK3-Fc homodimer. În consecinţă, ALK3-Fc cu un singur braţ va fi mai util decât ALK3-Fc homodimer în anumite aplicaţii în care astfel de antagonism selectiv este avantajos. Exemplele includ aplicaţii terapeutice în care este de dorit să se păstreze antagonismul uneia sau mai multora dintre BMP4, BMP2, şi potenţial al BMP5 dar să se minimizeze antagonismul uneia sau mai multora dintre BMP6, GDF6, şi GDF7.

Exemplul 3. Generarea şi caracterizarea unui heterodimer ActRIIA-Fc cu un singur braţ

Solicitanţii au construit un complex heterodimeric ActRIIA-Fc cu un singur braţ solubil care cuprinde o polipeptida Fc monomerică cu o extindere N-terminală scurtă şi o a doua polipeptidă în care domeniul extracelular al ActRIIA uman a fost fuzionat la un domeniu Fc separat printr-un linker poziţionat între domeniul extracelular şi acest al doilea domeniu Fc. Construcţii individuali sunt denumiţi polipeptida Fc monomerică şi respectiv polipeptida de fuziune ActRIIA-Fc, şi secvenţele pentru fiecare sunt redate mai jos.

Formarea unui heterodimer ActRIIA-Fc cu un singur braţ poate fi ghidată prin abordări similare celor descrise pentru heterodimerul ActRIIB-Fc cu un singur braţ în Exemplul 1. Într-o primă abordare, ilustrată în secvenţele de ActRIIA-Fc şi polipeptidă Fc monomerică din SEQ ID NO: 101-103 şi respectiv 137-139, un domeniu Fc este modificat pentru a se introduce aminoacizi cationici la faţa de interacţiune, în timp ce celălalt domeniu Fc este modificat pentru a se introduce aminoacizi anionici la faţa de interacţiune.

Polipeptida de fuziune ActRIIA-Fc foloseşte TPA-ul lider şi este după cum urmează:

Secvenţele lider şi linker sunt subliniate. Pentru a promova formarea heterodimerului ActRIIA-Fc:Fc mai degrabă decât a oricăruia dintre complecşii homodimerici posibili (ActRIIA-Fc:ActRIIA-Fc sau Fc-Fc), două substituţii de aminoacizi (înlocuirea resturilor anionice cu lizine) se pot introduce în domeniul Fc al polipeptidei de fuziune aşa cum este indicat prin sublinierea cu o linie dublă de mai sus. Secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO: 101 poate fi furnizată opţional cu lizina C-terminală îndepărtată.

Această polipeptidă de fuziune ActRIIA-Fc este codificată de următorul acid nucleic (SEQ ID NO: 102).

Secvenţa polipeptidei de fuziune ActRIIA-Fc mature este după cum urmează (SEQ ID NO: 103) şi poate fi furnizată opţional cu lizina C-terminală îndepărtată.

Aşa cum este descris în Exemplul 1, forma complementară a polipeptidei G1Fc umane monomerice (SEQ ID NO: 137) foloseşte TPA-ul lider şi încorporează o extensie N-terminală opţională. Pentru a promova formarea heterodimerului ActRIIA-Fc:Fc mai degrabă decât a oricăruia dintre complecşii homodimerici posibili, două substituţii de aminoacizi (înlocuind lizinele cu resturi anionice) se pot introduce în polipeptida Fc monomerică. Secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO: 137 poate fi furnizată opţional fără lizina C-terminală. Această polipeptidă Fc complementară este codificată de acidul nucleic cu SEQ ID NO: 138, şi polipeptida Fc monomerică matură (SEQ ID NO: 139) poate fi furnizată opţional cu lizina C-terminală îndepărtată.

Polipeptida de fuziune ActRIIA-Fc şi polipeptida Fc monomerică cu SEQ ID NO: 103 şi respectiv SEQ ID NO: 139, pot fi co-exprimate şi purificate dintr-o linie de celule CHO pentru a da naştere la un complex proteic heteromeric cu un singur braţ care cuprind ActRIIA-Fc:Fc.

Într-o altă abordare pentru promovarea formării complecşilor heteromultimerici utilizând polipeptide de fuziune Fc asimetrice, domeniile Fc sunt modificate pentru a se introduce interacţiuni hidrofobe complementare şi o legătură de disulfură intramoleculară suplimentară aşa cum este ilustrat în secvenţele polipeptidice ale ActRIIA-Fc şi Fc cu SEQ ID NO: 401-402 şi respectiv 425-426.

Polipeptida de fuziune ActRIIA-Fc (SEQ ID NO: 401) utilizează TPA-ul lider şi este după cum urmează:

Secvenţa lider şi linkerul sunt subliniate. Pentru a promova formarea heterodimerului ActRIIA-Fc:Fc mai degrabă decât a oricăruia dintre complecşii homodimerici posibili, două substituţii de aminoacizi (înlocuind o serină cu o cisteină şi o treonină cu un triptofan) se pot introduce în domeniul Fc al polipeptidei de fuziune ActRIIA aşa cum este indicat prin sublinierea cu o linie dublă de mai sus. Secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO: 401 poate fi furnizată opţional cu lizina C-terminală îndepărtată.

Polipeptida de fuziune ActRIIA-Fc matură (SEQ ID NO: 402) este după cum urmează şi poate fi furnizată opţional cu lizina C-terminală îndepărtată.

Aşa cum este descris în Exemplul 1, forma complementară of polipeptidei G1Fc umane monomerice (SEQ ID NO: 425) foloseşte TPA-ul lider şi încorporează o extensie N-terminală opţională. Pentru a promova formarea heterodimerului ActRIIA-Fc:Fc mai degrabă decât a oricăruia dintre complecşii homodimerici posibili, patru substituţii de aminoacid se pot introduce în polipeptida monomerică Fc aşa cum a fost indicat. Secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO: 425 şi polipeptida G1Fc matură (SEQ ID NO: 426) poate fi furnizată opţional cu lizina C-terminală îndepărtată.

Polipeptida de fuziune ActRIIA-Fc şi polipeptida Fc monomerică cu SEQ ID NO: 402 şi respectiv SEQ ID NO: 426, pot fi co-exprimate şi purificate dintr-o linie de celule CHO pentru a da naştere la un complex proteic heteromeric cu un singur braţ care cuprind ActRIIA-Fc:Fc.

Purificarea diferiţilor complecşi ActRIIA-Fc:Fc ar putea fi realizată printr-o serie de etape de cromatografie pe coloană, incluzând, de exemplu, trei sau mai multe dintre următoarele, în orice ordine: cromatografia pe proteină A, Cromatografia pe sefaroză Q, cromatografia pe fenilsefaroză, cromatografia de excludere dimensională, şi cromatografia cu schimb de cationi. Purificarea ar putea fi terminată cu o filtrare virală şi schimb de tampon.

O analiză de legare bazată pe Biacore™ s-a utilizat pentru a compara selectivitatea legării ligandului a complexului heterodimeric ActRIIA-Fc cu un singur braţ descris mai sus cu aceea unui complex homodimeric ActRIIA-Fc. ActRIIA-Fc cu un singur braţ şi ActRIIA-Fc homodimeric au fost capturaţi independent pe un sistem utilizând un anticorp anti-Fc. Liganzii au fost injectaţi şi lăsaţi să curgă peste proteina receptoare capturată. Rezultatele sunt rezumate în tabelul de mai jos, în care ratele de scădere a ligandului (kd) asociate tipic cu cele mai eficiente capcane de ligand sunt notate prin umbrire cu gri.

Aceste date de legare comparative indică faptul că ActRIIA-Fc cu un singur braţ are o selectivitate diferită pentru ligand decât ActRIIA-Fc homodimeric (şi de asemenea diferită de aceea a ActRIIB-Fc cu un singur braţ sau ActRIIB-Fc homomeric - vezi Exemplul 1). În timp ce homodimerul ActRIIA-Fc prezintă o legare preferenţială la activina B combinată cu o legare puternică la activina A şi GDF11, ActRIIA-Fc cu un singur braţ are o preferinţă inversă pentru activina A faţă de activina B combinată cu o selectivitate mult îmbunătăţită pentru activina A faţă de GDF11 (ligand slab). Vezi Figura 8. În plus, ActRIIA-Fc cu un singur braţ păstrează în mare măsură legarea intermediară la GDF8 şi BMP10 observată cu homodimerul ActRIIA-Fc.

Aceste rezultate indică faptul că heterodimerul ActRIIA-Fc cu un singur braţ este un antagonist cu selectivitate pentru ligand modificată substanţial comparativ cu ActRIIA-Fc homodimer. În consecinţă, ActRIIA-Fc cu un singur braţ va fi mai util decât ActRIIA-Fc homodimer în anumite aplicaţii în care un astfel de antagonism este avantajos. Exemplele includ aplicaţii terapeutice în care este de dorit să se antagonizează activina A preferenţial faţă de activina B minimizând în acelaşi timp antagonismul GDF11.

Împreună exemplele de mai sus demonstrează că polipeptidele receptorului de tip I sau tip II, când sunt plasate în contextul unui complex proteic heteromeric cu un singur braţ, formează noi buzunare de legare care prezintă selectivitate modificată în raport cu oricare tip de complex proteic homomeric, permiţând formarea de noi agenţi proteici pentru o posibilă utilizare ca agenţi terapeutici.

Exemplul 4. Generarea şi caracterizarea unui heterodimer BMPRII-Fc cu un singur braţ

Solicitanţii au construit un complex heterodimeric BMPRII-Fc solubil cu un singur braţ care cuprinde o polipeptidă Fc monomerică cu o extindere N-terminală scurtă şi o a doua polipeptidă în care domeniul extracelular al BMPRII uman a fost fuzionat la un domeniu Fc separat printr-un linker poziţionat între domeniul extracelular şi acest al doilea domeniu Fc. Construcţii individuali sunt denumiţi polipeptida Fc monomerică şi respectiv polipeptida de fuziune BMPRII-Fc, şi secvenţele pentru fiecare sunt redate mai jos. Solicitanţii preconizează de asemenea complecşi heterodimeric BMPRII-Fc cu un singur braţ suplimentari, care cuprind domeniul extracelular al izoformei A a BMPRII (SEQ ID NO: 72).

Formarea heterodimerului BMPRII-Fc cu un singur braţ poate fi ghidată prin abordări similare celor descrise pentru heterodimerul ActRIIB-Fc cu un singur braţ în Exemplul 1. Într-o primă abordare, ilustrată în secvenţele polipeptidelor BMPRII-Fc şi Fc monomerică cu SEQ ID NO: 107-109 şi respectiv 137-139, un domeniu Fc este modificat pentru a se introduce aminoacizi cationici la faţa de interacţiune, în timp ce celălalt domeniu Fc este modificat pentru a se introduce aminoacizi anionici la faţa de interacţiune.

Polipeptida de fuziune BMPRII-Fc foloseşte TPA-ul lider şi este după cum urmează:

Secvenţele lider şi linker sunt subliniate. Pentru a promova formarea heterodimerului BMPRII-Fc:Fc mai degrabă decât a oricăruia dintre complecşii homodimerici posibili (BMPRII-Fc:BMPRII-Fc sau Fc:Fc), două substituţii de aminoacizi (înlocuirea resturilor anionice cu lizine) se pot introduce în domeniul Fc al polipeptidei de fuziune aşa cum este indicat prin sublinierea cu o linie dublă de mai sus. Secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO: 107 poate fi furnizată opţional cu lizina C-terminală îndepărtată.

Această polipeptidă de fuziune BMPRII-Fc este codificată de următorul acid nucleic (SEQ ID NO: 108).

Secvenţa polipeptidei de fuziune BMPRII-Fc mature este după cum urmează (SEQ ID NO: 109) şi poate fi furnizată opţional cu lizina C-terminală îndepărtată.

Aşa cum este descris în Exemplul 1, forma complementară a polipeptidei G1Fc umane monomerice (SEQ ID NO: 137) utilizează TPA-ul lider şi încorporează o extensie N-terminală opţională. Pentru a promova formarea heterodimerului BMPRII-Fc:Fc mai degrabă decât a oricăruia dintre complecşii homodimerici posibili, două substituţii de aminoacizi (înlocuind lizinele cu resturi anionice) se pot introduce în polipeptida Fc monomerică. Secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO: 137 poate fi furnizată opţional cu lizina C-terminală îndepărtată. Această polipeptidă Fc complementară este codificată de acidul nucleic cu SEQ ID NO: 138), şi polipeptida Fc monomerică matură (SEQ ID NO: 139) poate fi furnizată opţional cu lizina C-terminală îndepărtată.

Polipeptida de fuziune BMPRII-Fc şi polipeptida Fc monomerică cu SEQ ID NO: 103 şi respectiv SEQ ID NO: 139, pot fi co-exprimate şi purificate dintr-o linie de celule CHO pentru a da naştere la un complex proteic heteromeric cu un singur braţ care cuprind BMPRII-Fc:Fc.

Într-o altă abordare pentru promovarea formării complecşilor heteromultimerici utilizând polipeptide de fuziune Fc asimetrice, domeniile Fc sunt modificate pentru a introduce interacţiuni hidrofobe complementare şi o legătură de disulfură intramoleculară suplimentară aşa cum este ilustrat în secvenţele polipeptidice ale BMPRII-Fc şi Fc cu SEQ ID NO: 405-406 şi respectiv 425-426.

Polipeptida de fuziune BMPRII-Fc (SEQ ID NO: 405) utilizează TPA-ul lider şi este după cum urmează:

Secvenţa lider şi linkerul sunt subliniate. Pentru a promova formarea heterodimerului BMPRII-Fc:Fc mai degrabă decât a oricăruia dintre complecşii homodimerici posibili, două substituţii de aminoacizi (înlocuind o serină cu o cisteină şi o treonină cu un triptofan) se pot introduce în domeniul Fc al polipeptidei de fuziune BMPRII aşa cum este indicat prin sublinierea cu o linie dublă de mai sus. Secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO: 405 poate fi furnizată opţional cu lizina C-terminală îndepărtată.

Polipeptida de fuziune BMPRII-Fc matură (SEQ ID NO: 406) este după cum urmează şi poate fi furnizată opţional cu lizina C-terminală îndepărtată.

Aşa cum este descris în Exemplul 1, forma complementară a polipeptidei G1Fc monomerice (SEQ ID NO: 425) foloseşte TPA-ul lider şi încorporează o extensie N-terminală opţională. Pentru a promova formarea heterodimerului BMPRII-Fc:Fc mai degrabă decât a oricăruia dintre complecşii homodimerici posibili, patru substituţii de aminoacid se pot introduce în polipeptida monomerică Fc aşa cum a fost indicat. Secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO: 425 şi polipeptida Fc matură (SEQ ID NO: 426) pot fi furnizate opţional cu lizina C-terminală îndepărtată.

Polipeptida de fuziune BMPRII-Fc şi polipeptida Fc monomerică cu SEQ ID NO: 406 şi respectiv SEQ ID NO: 426, pot fi co-exprimate şi purificate dintr-o linie de celule CHO pentru a da naştere la un complex proteic heteromeric cu un singur braţ care cuprind BMPRII-Fc:Fc.

Purificarea diferiţilor complecşi BMPRII-Fc:Fc ar putea fi realizată printr-o serie de etape de cromatografie pe coloană, incluzând, de exemplu, trei sau mai multe dintre următoarele, în orice ordine: cromatografia pe proteină A, Cromatografia pe sefaroză Q, cromatografia pe fenilsefaroză, cromatografia de excludere dimensională, şi cromatografia cu schimb de cationi. Purificarea ar putea fi terminată cu o filtrare virală şi schimb de tampon.

O analiză de legare bazată pe Biacore™ s-a utilizat pentru a compara selectivitatea legării ligandului complexului heterodimeric BMPRII-Fc cu un singur braţ descris mai sus cu aceea a unui complex homodimeric BMPRII-Fc. BMPRII-Fc cu un singur braţ şi BMPRII-Fc homodimeric au fost capturaţi independent pe un sistem utilizând un anticorp anti-Fc. Liganzii au fost injectaţi şi lăsaţi să curgă peste proteina receptoare capturată. Rezultatele sunt rezumate în tabelul de mai jos.

Legarea ligandului de BMPRII-Fc cu un singur braţ comparativ cu homodimerul BMPRII-Fc Ligand homodimer BMPRII-Fc BMPRII-Fc cu un singur braţ ka (1/Ms) kd (1/s) KD (pM) ka (1/Ms) kd (1/s) KD (pM) Activina B 2,0 x 107 7,5 x 10-2 3800 Legare minimă BMP2 Tranzitoriu * >2 x 106 Fără legare BMP4 --- Fără legare BMP5 --- 4,1 x 105 1,5 x 10-2 36000 BMP6 Tranzitoriu * >8900 Fără legare BMP7 Tranzitoriu * >38000 Fără legare BMP9 1,2 x 107 2,6 x 10-2 2100 Legare minimă BMP10 2,6 x 107 2,5 x 10-3 98 2,1 x 107 9,1 x 10-3 430 BMP15 9,9 x 106 2,8 x 10-3 280 7,1 x 107 6,7 x 10-2 940 GDF6 Tranzitoriu * >88000 Legare minimă GDF7 --- Tranzitoriu * > 190000 * Nedeterminat din cauza naturii tranzitorii a interacţiunii Netestat

Aceste date de legare comparative indică faptul că, BMPRII-Fc heterodimer cu un singur braţ păstrează legarea numai la un subset de liganzi legaţi de homodimerul BMPRII-Fc. In particular, în timp ce heterodimerul BMPRII-Fc cu un singur braţ păstrează legarea la BMP10 şi BMP15, legarea la BMP9 este esenţial eliminată.

Exemplul 5. Generarea unui heterodimer MISRII-Fc cu un singur braţ

Solicitanţii preconizează construcţia unui complex heterodimeric MISRII-Fc cu un singur braţ solubil care cuprinde o polipeptidă Fc monomerică cu o extindere N-terminală scurtă şi o a doua polipeptidă în care domeniul extracelular al MISRII uman este fuzionat la un domeniu Fc separat printr-un linker poziţionat între domeniul extracelular şi acest al doilea domeniu Fc. Construcţii individuali sunt denumiţi polipeptida Fc monomerică şi respectiv polipeptida de fuziune MISRII-Fc, şi secvenţele pentru fiecare sunt redate mai jos. Solicitanţii preconizează de asemenea în plus, complecşi heterodimerici MISRII-Fc cu un singur braţ care cuprind domeniul extracelular a izoformei 2 sau 3 a MISRII (SEQ ID NO: 76, 80).

Formarea heterodimerului MISRII-Fc cu un singur braţ poate fi ghidată prin abordări similare celor descrise pentru heterodimer ActRIIB-Fc cu un singur braţ în Exemplul 1. Într-o primă abordare, ilustrată în secvenţele polipeptidelor MISRII-Fc şi Fc monomerică cu SEQ ID NO: 110-112 şi respectiv 137-139, un domeniu Fc este modificat pentru a se introduce aminoacizi cationici la faţa de interacţiune, în timp ce celălalt domeniu Fc este modificat pentru a se introduce aminoacizi anionici la faţa de interacţiune.

Polipeptida de fuziune MISRII-Fc foloseşte TPA-ul lider şi este după cum urmează:

Secvenţele lider şi linker sunt subliniate. Pentru a promova formarea heterodimerului MISRII-Fc:Fc mai degrabă decât a oricăruia dintre complecşii homodimerici posibili (MISRII-Fc:MISRII-Fc sau Fc:Fc), două substituţii de aminoacizi (înlocuirea resturilor anionice cu lizine) se pot introduce în domeniul Fc al polipeptidei de fuziune aşa cum este indicat prin sublinierea cu o linie dublă de mai sus. Secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO: 110 poate fi furnizată opţional cu lizina C-terminală îndepărtată.

Secvenţa polipeptidei de fuziune MISRII-Fc matură este după cum urmează (SEQ ID NO: 112) şi poate fi furnizată opţional cu lizina C-terminală îndepărtată.

Aşa cum este descris în Exemplul 1, forma complementară a polipeptidei G1Fc umane monomerice (SEQ ID NO: 137) foloseşte TPA-ul lider şi încorporează o extensie N-terminală opţională. Pentru a promova formarea heterodimerului MISRII-Fc:Fc mai degrabă decât a oricăruia dintre complecşii homodimerici posibili, două substituţii de aminoacizi (înlocuind lizinele cu resturi anionice) se pot introduce în polipeptida monomerică Fc aşa cum a fost indicat. Secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO: 137 poate fi furnizată opţional cu lizina C-terminală îndepărtată. Această polipeptidă Fc complementară este codificată de acidul nucleic cu SEQ ID NO: 138, şi polipeptida Fc monomerică matură (SEQ ID NO: 139) poate fi furnizată opţional cu lizina C-terminală îndepărtată.

Polipeptida de fuziune MISRII-Fc şi polipeptida Fc monomerică cu SEQ ID NO: 112 şi respectiv SEQ ID NO: 139, pot fi co-exprimate şi purificate dintr-o linie de celule CHO pentru a da naştere la un complex proteic heteromeric cu un singur braţ care cuprinde MISRII-Fc:Fc.

Într-o altă abordare pentru promovarea formării complecşilor heteromultimerici utilizând polipeptide de fuziune Fc asimetrice, domeniile Fc sunt modificate pentru a introduce interacţiuni hidrofobe complementare şi o legătură de disulfură intramoleculară suplimentară aşa cum este ilustrat în secvenţele polipeptidelor MISRII-Fc şi Fc cu SEQ ID NO: 407-408 şi respectiv 425-426.

Polipeptida de fuziune MISRII-Fc (SEQ ID NO: 407) utilizează TPA-ul lider şi este după cum urmează:

Secvenţa lider şi linkerul sunt subliniate. Pentru a promova formarea heterodimerului MISRII-Fc:Fc mai degrabă decât a oricăruia dintre complecşii homodimerici posibili, două substituţii de aminoacizi (înlocuind o serină cu o cisteină şi o treonină cu un triptofan) se pot introduce în domeniul Fc al polipeptidei de fuziune MISRII aşa cum este indicat prin sublinierea cu o linie dublă de mai sus. Secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO: 407 poate fi furnizată opţional cu lizina C-terminală îndepărtată.

Polipeptida de fuziune MISRII-Fc matură (SEQ ID NO: 408) este după cum urmează şi poate fi furnizată opţional cu lizina C-terminală îndepărtată.

Aşa cum este descris în Exemplul 1, forma complementară a polipeptidei G1Fc monomerice (SEQ ID NO: 425) foloseşte TPA-ul lider şi încorporează o extensie N-terminală opţională. Pentru a promova formarea heterodimerului MISRII-Fc:Fc mai degrabă decât a oricăruia dintre complecşii homodimerici posibili, patru substituţii de aminoacid se pot introduce în polipeptida monomerică Fc aşa cum a fost indicat. Secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO: 425 şi polipeptida Fc matură (SEQ ID NO: 426) pot fi furnizate opţional cu lizina C-terminală îndepărtată.

Polipeptida de fuziune MISRII-Fc şi polipeptida Fc monomerică cu SEQ ID NO: 408 şi respectiv SEQ ID NO: 426, pot fi co-exprimate şi purificate dintr-o linie de celule CHO pentru a da naştere la un complex proteic heteromeric cu un singur braţ care cuprinde MISRII-Fc:Fc.

Purificarea diferiţilor complecşi MISRII-Fc:Fc ar putea fi realizată printr-o serie de etape de cromatografie pe coloană, incluzând, de exemplu, trei sau mai multe dintre următoarele, în orice ordine: cromatografia pe proteină A, cromatografia pe sefaroză Q, cromatografia pe fenilsefaroză, cromatografia de excludere dimensională, şi cromatografia cu schimb de cationi. Purificarea ar putea fi terminată cu filtrare virală şi schimb de tampon.

Exemplul 6. Generarea şi caracterizarea unui heterodimer TGFβRII-Fc cu un singur braţ

Solicitanţii au construit un complex heterodimeric TGFβRII-Fc cu un singur braţ solubil care cuprinde o polipeptidă Fc monomerică cu o extindere N-terminală scurtă şi o a doua polipeptidă în care domeniul extracelular al TGFβRII uman (izoforma scurtă, SEQ ID NO: 43) a fost fuzionat la un domeniu Fc separat printr-un linker poziţionat între domeniul extracelular şi acest al doilea domeniu Fc. Construcţii individuali sunt denumiţi polipeptida Fc monomerică şi respectiv polipeptida de fuziune TGFβRII-Fc, şi secvenţele pentru fiecare sunt redate mai jos. Solicitanţii preconizează de asemenea în plus, complecşi TGFβRII-Fc cu un singur braţ care cuprind domeniul extracelular al izoformei A a TGFβRII (SEQ ID NO: 68) precum şi complecşi TGFβRII-Fc cu un singur braţ în care domeniul extracelular al TGFβRII canonic (izoforma scurtă, SEQ ID NO: 43) sau cel al izoformei A a TGFβRII (SEQ ID NO: 68) conţin un insert de 36-aminoacizi (SEQ ID NO: 95) derivat de la izoforma C a TGFβRII aşa cum este descris aici.

Formarea heterodimerului TGFβRII-Fc cu un singur braţ poate fi ghidată prin abordări similare celor descrise pentru heterodimerul ActRIIB-Fc cu un singur braţ în Exemplul 1. Într-o primă abordare, ilustrată în secvenţele polipeptidelor TGFβRII-Fc şi Fc monomerică cu SEQ ID NO: 113-115 şi respectiv 137-139, un domeniu Fc este modificat pentru a se introduce aminoacizi cationici la faţa de interacţiune, în timp ce celălalt domeniu Fc este modificat pentru a se introduce aminoacizi anionici la faţa de interacţiune.

Polipeptida de fuziune TGFβRII-Fc foloseşte TPA-ul lider şi este după cum urmează:

Secvenţele lider şi linker sunt subliniate. Pentru a promova formarea heterodimerului TGFβRII-Fc:Fc mai degrabă decât a oricăruia dintre complecşii homodimerici posibili (TGFβRII-Fc: TGFβRII-Fc sau Fc:Fc), două substituţii de aminoacizi (înlocuirea resturilor anionice cu lizine) se pot introduce în domeniul Fc al polipeptidei de fuziune aşa cum este indicat prin sublinierea cu o linie dublă de mai sus. Secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO: 113 poate fi furnizată opţional cu lizina C-terminală îndepărtată.

Această polipeptidă de fuziune TGFβRII-Fc este codificată de următorul acid nucleic (SEQ ID NO: 114).

Secvenţa polipeptidei de fuziune TGFβRII-Fc mature este după cum urmează (SEQ ID NO: 115) şi poate fi furnizată opţional cu lizina C-terminală îndepărtată.

Aşa cum este descris în Exemplul 1, forma complementară a polipeptidei G1Fc umane monomerice (SEQ ID NO: 137) foloseşte TPA-ul lider şi încorporează o extensie N-terminală opţională. Pentru a promova formarea heterodimerului TGFβRII-Fc:Fc mai degrabă decât a oricăruia dintre complecşii homodimerici posibili, două substituţii de aminoacizi (înlocuind lizinele cu resturi anionice) se pot introduce în polipeptida monomerică Fc aşa cum a fost indicat. Secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO: 137 poate fi furnizată opţional cu lizina C-terminală îndepărtată. Această polipeptidă Fc complementară este codificată de acidul nucleic cu SEQ ID NO: 138, şi polipeptida Fc monomerică matură (SEQ ID NO: 139) poate fi furnizată opţional cu lizina C-terminală îndepărtată.

Polipeptida de fuziune TGFβRII-Fc şi polipeptida Fc monomerică cu SEQ ID NO: 115 şi respectiv SEQ ID NO: 139, pot fi co-exprimate şi purificate dintr-o linie de celule CHO pentru a da naştere la un complex proteic heteromeric cu un singur braţ care cuprinde TGFβRII-Fc:Fc.

Într-o altă abordare pentru promovarea formării complecşilor heteromultimerici utilizând polipeptide de fuziune Fc asimetrice, domeniile Fc sunt modificate pentru a introduce interacţiuni hidrofobe complementare şi o legătură de disulfură intramoleculară suplimentară aşa cum este ilustrat în secvenţele polipeptidelor TGFβRII-Fc şi Fc cu SEQ ID NO: 409-410 şi respectiv 425-426.

Polipeptida de fuziune TGFβRII-Fc (SEQ ID NO: 409) utilizează TPA-ul lider şi este după cum urmează:

Secvenţa lider şi linkerul sunt subliniate. Pentru a promova formarea heterodimerului TGFβRII-Fc:Fc mai degrabă decât a oricăruia dintre complecşii homodimerici posibili, două substituţii de aminoacizi (înlocuind o serină cu o cisteină şi o treonină cu un triptofan) se pot introduce în domeniul Fc al polipeptidei de fuziune TGFβRII aşa cum este indicat prin sublinierea cu o linie dublă de mai sus. Secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO: 409 poate fi furnizată opţional cu lizina C-terminală îndepărtată.

Polipeptida de fuziune TGFβRII-Fc matură (SEQ ID NO: 410) este după cum urmează şi poate fi furnizată opţional cu lizina C-terminală îndepărtată.

Aşa cum este descris în Exemplul 1, forma complementară a polipeptidei G1Fc monomerice (SEQ ID NO: 425) foloseşte TPA-ul lider şi încorporează o extensie N-terminală opţională. Pentru a promova formarea heterodimerului TGFβRII-Fc:Fc mai degrabă decât a oricăruia dintre complecşii homodimerici posibili, patru substituţii de aminoacid se pot introduce în polipeptida monomerică Fc aşa cum a fost indicat. Secvenţa de aminoacizi cu SEQ ID NO: 425 şi polipeptida Fc monomerică matură (SEQ ID NO: 426) pot fi furnizate opţional cu lizina C-terminală îndepărtată.

Polipeptida de fuziune TGFβRII-Fc şi polipeptida Fc monomerică cu SEQ ID NO: 410 şi respectiv SEQ ID NO: 426, pot fi co-exprimate şi purificate dintr-o linie de celule CHO pentru a da naştere la un complex proteic heteromeric cu un singur braţ care cuprinde TGFβRII-Fc:Fc.

Purificarea diferiţilor complecşi TGFβRII-Fc:Fc ar putea fi realizată printr-o serie de etape de cromatografie pe coloană, incluzând, de exemplu, trei sau mai multe dintre următoarele, în orice ordine: cromatografia pe proteină A, cromatografia pe sefaroză Q, cromatografia pe fenilsefaroză, cromatografia de excludere dimensională, şi cromatografia cu schimb de cationi. Purificarea ar putea fi terminată cu o filtrare virală şi schimb de tampon.

O analiză de legare bazată pe Biacore™ s-a utilizat pentru a compara selectivitatea legării ligandului complexului heterodimeric TGFβRII-Fc cu un singur braţ descris mai sus cu aceea a unui complex homodimeric TGFβRII-Fc. TGFβRII-Fc cu un singur braţ şi TGFβRII-Fc homodimeric au fost capturaţi independent pe un sistem utilizând un anticorp anti-Fc. Liganzii au fost injectaţi şi lăsaţi să curgă peste proteina receptoare capturată. Rezultatele sunt rezumate în tabelul de mai jos.

Legarea unui ligand de TGFβRII-Fc cu un singur braţ comparativ cu homodimerul TGFβRII-Fc Ligand Homodimer TGFβRII-Fc TGFβRII-Fc cu un singur braţ ka (1/Ms) kd (1/s) KD (pM) ka (1/Ms) kd (1/s) KD (pM) TGFβ1 4,2 x 107 1,1 x 10-3 25 1,5 x 108 4,7 x 10-3 31 TGFβ2 Tranzitoriu * > 44000 Tranzitoriu * > 61000 TGFβ3 5,9 x 107 5,9 x 10-3 99 1,4 x 108 9,9 x 10-3 73 * Nedeterminat din cauza naturii tranzitorii a interacţiunii

Exemplul 7. Generarea şi caracterizarea unui heterodimer ALK1-Fc cu un singur braţ

Solicitanţii au construit un complex heterodimeric ALK1-Fc cu un singur braţ solubil care cuprinde o polipeptidă Fc monomerică cu o extindere N-terminală scurtă şi o a doua polipeptidă în care domeniul extracelular al ALK1 uman a fost fuzionat la un domeniu Fc separat printr-un linker poziţionat între domeniul extracelular şi acest al doilea domeniu Fc. Construcţii individuali sunt denumiţi polipeptida Fc monomerică şi respectiv polipeptida de fuziune ALK1-Fc, şi secvenţele pentru fiecare sunt redate mai jos.

Formarea heterodimerului ALK1-Fc cu un singur braţ poate fi ghidată prin abordări similare celor descrise pentru heterodimerul ActRIIB-Fc cu un singur braţ în Exemplul 1. Într-o primă abordare, ilustrată în secvenţele polipeptidelor ALK1-Fc şi Fc monomerică cu SEQ ID NO: 116-118 şi respectiv 140-142, un domeniu Fc este modificat pentru a se introduce aminoacizi cationici la faţa de interacţiune, în timp ce celălalt domeniu Fc este modificat pentru a se introduce aminoacizi anionici la faţa de interacţiune.

Polipeptida de fuziune ALK1-Fc foloseşte TPA-ul lider şi este după cum urmează:

Secvenţele lider şi linker sunt subliniate. Pentru a promova formarea heterodimerului ALK1-Fc:Fc mai degrabă decât a oricăruia dintre complecşii homodimerici posibili (ALK1-Fc:ALK1-Fc sau Fc:Fc), două substituţii de aminoacizi (înlocuirea lizinei cu aminoacizi anionici) se pot introduce în domeniul Fc al polipeptidei de fuziune aşa cum este indicat prin sublinierea cu o linie dublă de mai sus. Secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO: 116 poate fi furnizată opţional cu o lizină adăugată la C-terminal.

Această polipeptidă de fuziune ALK1-Fc este codificată de următorul acid nucleic (SEQ ID NO: 117).

Secvenţa polipeptidei de fuziune ALK1-Fc mature este după cum urmează (SEQ ID NO: 118) şi poate fi furnizată opţional cu o lizină adăugată la C-terminal.

Aşa cum este descris în Exemplul 2, forma complementară a polipeptidei G1Fc umane monomerice (SEQ ID NO: 140) foloseşte TPA-ul lider şi încorporează o extensie N-terminală opţională. Pentru a promova formarea heterodimerului ALK1-Fc:Fc mai degrabă decât a oricăruia dintre complecşii homodimerici posibili, două substituţii de aminoacizi (înlocuirea resturilor anionice cu lizine) se pot introduce în polipeptida monomerică Fc aşa cum a fost indicat. Secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO: 140 poate fi furnizată opţional cu lizina C-terminală îndepărtată. Această polipeptidă Fc complementară este codificată de acidul nucleic cu SEQ ID NO: 141, şi polipeptida Fc monomerică matură (SEQ ID NO: 142) poate fi furnizată opţional cu lizina C-terminală îndepărtată.

Polipeptida de fuziune ALK1-Fc şi polipeptida Fc monomerică cu SEQ ID NO: 118 şi respectiv SEQ ID NO: 142, pot fi co-exprimate şi purificate dintr-o linie de celule CHO pentru a da naştere la un complex proteic heteromeric cu un singur braţ care cuprinde ALK1-Fc:Fc.

Într-o altă abordare pentru promovarea formării complecşilor heteromultimerici utilizând proteine de fuziune asimetrice, domeniile Fc sunt modificate pentru a introduce interacţiuni hidrofobe complementare şi o legătură de disulfură intramoleculară suplimentară aşa cum este ilustrat în secvenţele polipeptidelor ALK1-Fc şi Fc cu SEQ ID NO: 411-412 şi respectiv 427-428.

Polipeptida de fuziune ALK1-Fc (SEQ ID NO: 411) utilizează TPA-ul lider şi este după cum urmează:

Secvenţa lider şi linkerul sunt subliniate. Pentru a promova formarea heterodimerului ALK1-Fc:Fc mai degrabă decât a oricăruia dintre complecşii homodimerici posibili, patru substituţii de aminoacid se pot introduce în domeniul Fc al polipeptidei de fuziune ALK1 aşa cum este indicat prin sublinierea cu o linie dublă de mai sus. Secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO: 411 poate fi furnizată opţional cu lizina C-terminală îndepărtată.

Polipeptida de fuziune ALK1-Fc matură (SEQ ID NO: 412) este după cum urmează şi poate fi furnizată opţional cu lizina C-terminală îndepărtată.

Aşa cum este descris în Exemplul 2, forma complementară a polipeptidei G1Fc monomerice (SEQ ID NO: 427) foloseşte TPA-ul lider şi încorporează o extensie N-terminală opţională. Pentru a promova formarea heterodimerului ALK1-Fc:Fc mai degrabă decât a oricăruia dintre complecşii homodimerici posibili, două substituţii de aminoacizi (înlocuind o serină cu o cisteină şi o treonină cu un triptofan) se pot introduce în polipeptida monomerică Fc aşa cum a fost indicat. Secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO: 427 şi polipeptida matură Fc (SEQ ID NO: 428) poate fi furnizată opţional cu lizina C-terminală îndepărtată.

Polipeptida de fuziune ALK1-Fc şi polipeptida Fc monomerică cu SEQ ID NO: 412 şi respectiv SEQ ID NO: 428, pot fi co-exprimate şi purificate dintr-o linie de celule CHO pentru a da naştere la un complex proteic heteromeric cu un singur braţ care cuprinde ALK1-Fc:Fc.

Purificarea diferiţilor complecşi ALK1-Fc:Fc ar putea fi realizată printr-o serie de etape de cromatografie pe coloană, incluzând, de exemplu, trei sau mai multe dintre următoarele, în orice ordine: cromatografia pe proteină A, cromatografia pe sefaroză Q, cromatografia pe fenilsefaroză, cromatografia de excludere dimensională, şi cromatografia cu schimb de cationi. Purificarea ar putea fi terminată cu o filtrare virală şi schimb de tampon.

O analiză de legare bazată pe Biacore™ s-a utilizat pentru a compara selectivitatea legării ligandului de un complex heterodimeric ALK1-Fc cu singur braţ descris mai sus cu aceea a unui complex homodimeric ALK1-Fc. ALK1-Fc cu un singur braţ şi ALK1-Fc homodimeric au fost capturaţi independent pe un sistem utilizând un anticorp anti-Fc. Liganzii au fost injectaţi şi lăsaţi să curgă peste proteina receptoare capturată. Rezultatele sunt rezumate în tabelul de mai jos, în care ratele de scădere a ligandului (kd) asociate tipic cu cele mai eficiente capcane de ligand sunt notate prin umbrire cu gri.

Aceste date de legare comparative indică faptul că ALK1-Fc cu un singur braţ are o selectivitate pentru ligand modificată comparativ cu ALK1-Fc homodimeric. ALK1-FRc cu un singur braţ păstrează legarea puternică la BMP10 observată cu ALK1-Fc homodimeric în timp ce leagă BMP9 mai puţin strâns ca homodimerul ALK1-Fc, astfel încât rata de scădere a legării BMP9 la ALK1-Fc cu un singur braţ este de aproximativ 10-ori mai rapidă decât este pentru legarea la AK1-Fc homodimeric. Aceste rezultate indică faptul că ALK1-Fc cu un singur braţ este un antagonist mai selectiv decât ActRIIB-Fc homodimeric. În consecinţă, ALK1-Fc cu un singur braţ va fi mai util decât ALK1-Fc homodimeric în anumite aplicaţii în care astfel de antagonism selectiv este avantajos. Exemplele includ aplicaţii terapeutice în care este de dorit să se păstreze antagonismul BMP10 dar să se reducă antagonismul BMP9.

Exemplul 8. Generarea unui heterodimer ALK2-Fc cu un singur braţ

Solicitanţii preconizează construcţia unui complex heterodimeric ALK2-Fc cu un singur braţ solubil care cuprinde o polipeptidă Fc monomerică cu o extindere N-terminală scurtă şi o a doua polipeptidă în care domeniul extracelular al ALK2 uman este fuzionat la un domeniu Fc separat printr-un linker poziţionat între domeniul extracelular şi acest al doilea domeniu Fc. Construcţii individuali sunt denumiţi polipeptida Fc monomerică şi respectiv polipeptida de fuziune ALK2-Fc, şi secvenţele pentru fiecare sunt redate mai jos.

Formarea heterodimerului ALK2-Fc cu un singur braţ poate fi ghidată prin abordări similare celor descrise pentru heterodimerul ActRIIB-Fc cu un singur braţ în Exemplul 1. Într-o primă abordare, ilustrată în secvenţele polipeptidelor ALK2-Fc şi Fc monomerică cu SEQ ID NO: 119-121 şi respectiv 140-142, un domeniu Fc este modificat pentru a se introduce aminoacizi cationici la faţa de interacţiune, în timp ce celălalt domeniu Fc este modificat pentru a se introduce aminoacizi anionici la faţa de interacţiune.

Polipeptida de fuziune ALK2-Fc foloseşte TPA-ul lider şi este după cum urmează:

Secvenţele lider şi linker sunt subliniate. Pentru a promova formarea heterodimerului ALK2-Fc:Fc mai degrabă decât a oricăruia dintre complecşii homodimerici posibili (ALK2-Fc:ALK2-Fc sau Fc:Fc), două substituţii de aminoacizi (înlocuirea lizinei cu aminoacizi anionici) se pot introduce în domeniul Fc al polipeptidei de fuziune aşa cum este indicat prin sublinierea cu o linie dublă de mai sus. Secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO: 119 poate fi furnizată opţional cu o lizină adăugată la C-terminal.

Această polipeptidă de fuziune ALK2-Fc este codificată de următorul acid nucleic (SEQ ID NO: 120).

Secvenţa polipeptidei de fuziune ALK2-Fc mature este după cum urmează (SEQ ID NO: 121) şi poate fi furnizată opţional cu o lizină adăugată la C-terminal.

Aşa cum este descris în Exemplul 2, forma complementară a polipeptidei G1Fc umane monomerice (SEQ ID NO: 140) foloseşte TPA-ul lider şi încorporează o extensie N-terminală opţională. Pentru a promova formarea heterodimerului ALK2-Fc:Fc mai degrabă decât a oricăruia dintre complecşii homodimerici posibili, două substituţii de aminoacizi (înlocuirea resturilor anionice cu lizine) se pot introduce în polipeptida monomerică Fc aşa cum a fost indicat. Secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO: 140 poate fi furnizată opţional cu lizina C-terminală îndepărtată. Această polipeptidă Fc complementară este codificată de acidul nucleic cu SEQ ID NO: 141, şi polipeptida Fc monomerică matură (SEQ ID NO: 142) poate fi furnizată opţional cu lizina C-terminală îndepărtată.

polipeptida de fuziune ALK2-Fc şi polipeptida Fc monomerică of SEQ ID NO: 121 şi SEQ ID NO: 142, respectiv, pot fi co-exprimate şi purificate dintr-o linie de celule CHO pentru a da naştere la un complex proteic heteromeric cu un singur braţ care cuprinde ALK2-Fc:Fc.

Într-o altă abordare pentru promovarea formării complecşilor heteromultimerici utilizând polipeptide de fuziune Fc asimetrice, domeniile Fc sunt modificate pentru a introduce interacţiuni hidrofobe complementare şi o legătură de disulfură intramoleculară suplimentară aşa cum este ilustrat în secvenţele polipeptidelor ALK2-Fc şi Fc cu SEQ ID NO: 413-414 şi respectiv 427-428.

Polipeptida de fuziune ALK2-Fc (SEQ ID NO: 413) utilizează TPA-ul lider şi este după cum urmează:

Secvenţa lider şi linkerul sunt subliniate. Pentru a promova formarea heterodimerului ALK2-Fc:Fc mai degrabă decât a oricăruia dintre complecşii homodimerici posibili, patru substituţii de aminoacid se pot introduce în domeniul Fc al polipeptidei de fuziune ALK2 aşa cum este indicat prin sublinierea cu o linie dublă de mai sus. Secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO: 413 poate fi furnizată opţional cu lizina C-terminală îndepărtată.

Polipeptida de fuziune ALK2-Fc matură (SEQ ID NO: 414) este după cum urmează şi poate fi furnizată opţional cu lizina C-terminală îndepărtată.

Aşa cum este descris în Exemplul 2, forma complementară a polipeptidei G1Fc monomerice (SEQ ID NO: 427) foloseşte TPA-ul lider şi încorporează o extensie N-terminală opţională. Pentru a promova formarea heterodimerului ALK2-Fc:Fc mai degrabă decât a oricăruia dintre complecşii homodimerici posibili, două substituţii de aminoacizi (înlocuind o serină cu o cisteină şi o treonină cu un triptofan) se pot introduce în polipeptida monomerică Fc aşa cum a fost indicat. Secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO: 427 şi polipeptida matură Fc (SEQ ID NO: 428) poate fi furnizată opţional cu lizina C-terminală îndepărtată.

Polipeptida de fuziune ALK2-Fc şi polipeptida Fc monomerică cu SEQ ID NO: 414 şi respectiv SEQ ID NO: 428, pot fi co-exprimate şi purificate dintr-o linie de celule CHO pentru a da naştere la un complex proteic heteromeric cu un singur braţ care cuprinde ALK2-Fc:Fc.

Purificarea diferiţilor complecşi ALK2-Fc:Fc ar putea fi realizată printr-o serie de etape de cromatografie pe coloană, incluzând, de exemplu, trei sau mai multe dintre următoarele, în orice ordine: cromatografia pe proteină A, cromatografia pe sefaroză Q, cromatografia pe fenilsefaroză, cromatografia de excludere dimensională, şi cromatografia cu schimb de cationi. Purificarea ar putea fi terminată cu o filtrare virală şi schimb de tampon.

Exemplul 9. Generarea unui heterodimer ALK4-Fc cu un singur braţ

Solicitanţii preconizează construirea unui complex heterodimeric ALK4-Fc cu un singur braţ solubil care cuprinde o polipeptidă Fc monomerică cu o extindere N-terminală scurtă şi o a doua polipeptidă în care domeniul extracelular al ALK4 uman este fuzionat la un domeniu Fc separat printr-un linker poziţionat între domeniul extracelular şi acest al doilea domeniu Fc. Construcţii individuali sunt denumiţi polipeptida Fc monomerică şi respectiv polipeptida de fuziune ALK4-Fc, şi secvenţele pentru fiecare sunt redate mai jos. Solicitanţii preconizează de asemenea în plus, complecşi heterodimerici ALK4-Fc cu un singur braţ care cuprind domeniul extracelular al izoformei B a ALK4 (SEQ ID NO: 84).

Formarea heterodimerului ALK4-Fc cu un singur braţ poate fi ghidată prin abordări similare celor descrise pentru heterodimerul ActRIIB-Fc cu un singur braţ în Exemplul 1. Într-o primă abordare, ilustrată în secvenţele ALK4-Fc şi a polipeptidei Fc monomerice cu SEQ ID NO: 125-127 şi respectiv 140-142, un domeniu Fc este modificat pentru a se introduce aminoacizi cationici la faţa de interacţiune, în timp ce celălalt domeniu Fc este modificat pentru a se introduce aminoacizi anionici la faţa de interacţiune.

Polipeptida de fuziune ALK4-Fc foloseşte TPA-ul lider şi este după cum urmează:

Secvenţele lider şi linker sunt subliniate. Pentru a promova formarea heterodimerului ALK4-Fc:Fc mai degrabă decât a oricăruia dintre complecşii homodimerici posibili (ALK4-Fc:ALK4-Fc sau Fc:Fc), două substituţii de aminoacizi (înlocuirea lizinei cu aminoacizi anionici) se pot introduce în domeniul Fc al polipeptidei de fuziune aşa cum este indicat prin sublinierea cu o linie dublă de mai sus. Secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO: 125 poate fi furnizată opţional cu o lizină adăugată la C-terminal.

Această polipeptidă de fuziune ALK4-Fc este codificată de următorul acid nucleic (SEQ ID NO: 126).

Secvenţa polipeptidei de fuziune ALK4-Fc mature este după cum urmează (SEQ ID NO: 127) şi poate fi furnizată opţional cu o lizină adăugată la C-terminal.

Aşa cum este descris în Exemplul 2, forma complementară a polipeptidei G1Fc umane monomerice (SEQ ID NO: 140) foloseşte TPA-ul lider şi încorporează o extensie N-terminală opţională. Pentru a promova formarea heterodimerului ALK4-Fc:Fc mai degrabă decât a oricăruia dintre complecşii homodimerici posibili, două substituţii de aminoacizi (înlocuirea resturilor anionice cu lizine) se pot introduce în polipeptida monomerică Fc aşa cum a fost indicat. Secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO: 140 poate fi furnizată opţional cu lizina C-terminală îndepărtată. Această polipeptidă Fc complementară este codificată de acidul nucleic cu SEQ ID NO: 141, şi polipeptida Fc monomerică matură (SEQ ID NO: 142) poate fi furnizată opţional cu lizina C-terminală îndepărtată.

Polipeptida de fuziune ALK4-Fc şi polipeptida Fc monomerică cu SEQ ID NO: 127 şi respectiv SEQ ID NO: 142, pot fi co-exprimate şi purificate dintr-o linie de celule CHO pentru a da naştere la un complex proteic heteromeric cu un singur braţ care cuprinde ALK4-Fc:Fc.

Într-o altă abordare pentru promovarea formării complecşilor heteromultimerici utilizând polipeptide de fuziune Fc asimetrice, domeniile Fc sunt modificate pentru a introduce interacţiuni hidrofobe complementare şi o legătură de disulfură intramoleculară suplimentară aşa cum este ilustrat în secvenţele de polipeptide ALK4-Fc şi Fc cu SEQ ID NO: 417-418 şi respectiv 427-428.

Polipeptida de fuziune ALK4-Fc (SEQ ID NO: 417) utilizează TPA-ul lider şi este după cum urmează:

Secvenţa lider şi linkerul sunt subliniate. Pentru a promova formarea heterodimerului ALK4-Fc:Fc mai degrabă decât a oricăruia dintre complecşii homodimerici posibili, patru substituţii de aminoacid se pot introduce în domeniul Fc al polipeptidei ALK4 de fuziune aşa cum este indicat prin sublinierea cu o linie dublă de mai sus. Secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO: 417 poate fi furnizată opţional cu lizina C-terminală îndepărtată.

Polipeptida de fuziune ALK4-Fc matură (SEQ ID NO: 418) este după cum urmează şi poate fi furnizată opţional cu lizina C-terminală îndepărtată.

Aşa cum este descris în Exemplul 2, forma complementară a polipeptidei G1Fc monomerice (SEQ ID NO: 427) foloseşte TPA-ul lider şi încorporează o extensie N-terminală opţională. Pentru a promova formarea heterodimerului ALK4-Fc:Fc mai degrabă decât a oricăruia dintre complecşii homodimerici posibili, două substituţii de aminoacizi (înlocuind o serină cu o cisteină şi o treonină cu un triptofan) se pot introduce în polipeptida monomerică Fc aşa cum a fost indicat. Secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO: 427 şi polipeptida Fc matură (SEQ ID NO: 428) pot fi furnizate opţional cu lizina C-terminală îndepărtată.

Polipeptida de fuziune ALK4-Fc şi polipeptida Fc monomerică cu SEQ ID NO: 418 şi respectiv SEQ ID NO: 428, pot fi co-exprimate şi purificate dintr-o linie de celule CHO pentru a da naştere la un complex proteic heteromeric cu un singur braţ care cuprinde ALK4-Fc:Fc.

Purificarea diferiţilor complecşi ALK4-Fc:Fc ar putea fi realizată printr-o serie de etape de cromatografie pe coloană, incluzând, de exemplu, trei sau mai multe dintre următoarele, în orice ordine: cromatografia pe proteină A, cromatografia pe sefaroză Q, cromatografia pe fenilsefaroză, cromatografia de excludere dimensională, şi cromatografia cu schimb de cationi. Purificarea ar putea fi terminată cu o filtrare virală şi schimb de tampon.

Exemplul 10. Generarea unui heterodimer ALK5-Fc cu un singur braţ

Solicitanţii preconizează construirea unui complex heterodimeric ALK5-Fc cu un singur braţ solubil care cuprinde o polipeptidă Fc monomerică cu o extindere N-terminală scurtă şi o a doua polipeptidă în care domeniul extracelular al ALK5 uman este fuzionat la un domeniu Fc separat printr-un linker poziţionat între domeniul extracelular şi acest al doilea domeniu Fc. Construcţii individuali sunt denumiţi polipeptida Fc monomerică şi respectiv polipeptida de fuziune ALK5-Fc, şi secvenţele pentru fiecare sunt redate mai jos. Solicitanţii preconizează de asemenea în plus, complecşi heterodimerici ALK5-Fc cu un singur braţ care cuprind domeniul extracelular al izoformei 2 a ALK5 (SEQ ID NO: 88).

Formarea heterodimerului cu un singur braţ ALK5-Fc poate fi ghidată prin abordări similare celor descrise pentru heterodimerul ActRIIB-Fc cu un singur braţ în Exemplul 1. Într-o primă abordare, ilustrată în secvenţele polipeptidelor ALK5-Fc şi Fc monomerică cu SEQ ID NO: 128-130 şi respectiv 140-142, un domeniu Fc este modificat pentru a se introduce aminoacizi cationici la faţa de interacţiune, în timp ce celălalt domeniu Fc este modificat pentru a se introduce aminoacizi anionici la faţa de interacţiune.

Polipeptida de fuziune ALK5-Fc foloseşte TPA-ul lider şi este după cum urmează:

Secvenţele lider şi linker sunt subliniate. Pentru a promova formarea heterodimerului ALK5-Fc:Fc mai degrabă decât a oricăruia dintre complecşii homodimerici posibili (ALK5-Fc:ALK5-Fc sau Fc:Fc), două substituţii de aminoacizi (înlocuirea lizinei cu aminoacizi anionici) se pot introduce în domeniul Fc al polipeptidei de fuziune aşa cum a fost indicat. Secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO: 128 poate fi furnizată opţional cu o lizină adăugată la C-terminal.

Această polipeptidă de fuziune ALK5-Fc este codificată de următorul acid nucleic (SEQ ID NO: 129).

Secvenţa polipeptidei de fuziune ALK5-Fc mature este după cum urmează (SEQ ID NO: 130) şi poate fi furnizată opţional cu o lizină adăugată la C-terminal.

Aşa cum este descris în Exemplul 2, forma complementară a polipeptidei G1Fc umane monomerice (SEQ ID NO: 140) foloseşte TPA-ul lider şi încorporează o extensie N-terminală opţională. Pentru a promova formarea heterodimerului ALK5-Fc:Fc mai degrabă decât a oricăruia dintre complecşii homodimerici posibili, două substituţii de aminoacizi (înlocuirea resturilor anionice cu lizine) se pot introduce în polipeptida monomerică Fc aşa cum a fost indicat. Secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO: 140 poate fi furnizată opţional cu lizina C-terminală îndepărtată. Această polipeptidă Fc complementară este codificată de acidul nucleic cu SEQ ID NO: 141, şi polipeptida Fc monomerică matură (SEQ ID NO: 142) poate fi furnizată opţional cu lizina C-terminală îndepărtată.

Polipeptida de fuziune ALK5-Fc şi polipeptida Fc monomerică cu SEQ ID NO: 130 şi respectiv SEQ ID NO: 142, pot fi co-exprimate şi purificate dintr-o linie de celule CHO pentru a da naştere la un complex proteic heteromeric cu un singur braţ care cuprinde ALK5-Fc:Fc.

Într-o altă abordare pentru promovarea formării complecşilor heteromultimerici utilizând polipeptide de fuziune Fc asimetrice, domeniile Fc sunt modificate pentru a introduce interacţiuni hidrofobe complementare şi o legătură de disulfură intramoleculară suplimentară aşa cum este ilustrat în secvenţele polipeptidelor ALK5-Fc şi Fc cu SEQ ID NO: 419-420 şi respectiv 427-428.

Polipeptida de fuziune ALK5-Fc (SEQ ID NO: 419) utilizează TPA-ul lider şi este după cum urmează:

Secvenţa lider şi linkerul sunt subliniate. Pentru a promova formarea heterodimerului ALK5-Fc:Fc mai degrabă decât a oricăruia dintre complecşii homodimerici posibili, patru substituţii de aminoacid se pot introduce în domeniul Fc al polipeptidei de fuziune ALK5 aşa cum este indicat prin sublinierea cu o linie dublă de mai sus. Secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO: 419 poate fi furnizată opţional cu lizina C-terminală îndepărtată.

Polipeptida de fuziune ALK5-Fc matură (SEQ ID NO: 420) este după cum urmează şi poate fi furnizată opţional cu lizina C-terminală îndepărtată.

Aşa cum este descris în Exemplul 2, forma complementară a polipeptidei G1Fc monomerice (SEQ ID NO: 427) foloseşte TPA-ul lider şi încorporează o extensie N-terminală opţională. Pentru a promova formarea heterodimerului ALK5-Fc:Fc mai degrabă decât a oricăruia dintre complecşii homodimerici posibili, două substituţii de aminoacizi (înlocuind o serină cu o cisteină şi o treonină cu un triptofan) se pot introduce în polipeptida monomerică Fc aşa cum a fost indicat. Secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO: 427 şi polipeptida G1Fc monomerică matură (SEQ ID NO: 428) poate fi furnizată opţional cu lizina C-terminală îndepărtată.

Polipeptida de fuziune ALK5-Fc şi polipeptida Fc monomerică cu SEQ ID NO: 420 şi respectiv SEQ ID NO: 428, pot fi co-exprimate şi purificate dintr-o linie de celule CHO pentru a da naştere la un complex proteic heteromeric cu un singur braţ care cuprinde ALK5-Fc:Fc.

Purificarea diferiţilor complecşi ALK5-Fc:Fc ar putea fi realizată printr-o serie de etape de cromatografie pe coloană, incluzând, de exemplu, trei sau mai multe dintre următoarele, în orice ordine: cromatografia pe proteină A, cromatografia pe sefaroză Q, cromatografia pe fenilsefaroză, cromatografia de excludere dimensională, şi cromatografia cu schimb de cationi. Purificarea ar putea fi terminată cu o filtrare virală şi schimb de tampon.

Exemplul 11. Generarea unui heterodimer ALK6-Fc cu un singur braţ

Solicitanţii preconizează construirea unui complex heterodimeric ALK6-Fc cu un singur braţ solubil care cuprinde o polipeptidă Fc monomerică cu o extindere N-terminală scurtă şi o a doua polipeptidă în care domeniul extracelular al ALK6 uman este fuzionat la un domeniu Fc separat printr-un linker poziţionat între domeniul extracelular şi acest al doilea domeniu Fc. Construcţii individuali sunt denumiţi polipeptida Fc monomerică şi respectiv polipeptida de fuziune ALK6-Fc, şi secvenţele pentru fiecare sunt redate mai jos. Solicitanţii preconizează de asemenea, în plus, complecşi heterodimerici ALK6-Fc cu un singur braţ care cuprind domeniul extracelular al izoformei 2 a ALK6 (SEQ ID NO: 92).

Formarea heterodimerului ALK6-Fc cu un singur braţ poate fi ghidată prin abordări similare celor descrise pentru heterodimerul ActRIIB-Fc cu un singur braţ în Exemplul 1. Într-o primă abordare, ilustrată în secvenţele polipeptidelor ALK6-Fc şi Fc monomerică cu SEQ ID NO: 131-133 şi respectiv 140-142, un domeniu Fc este modificat pentru a se introduce aminoacizi cationici la faţa de interacţiune, în timp ce celălalt domeniu Fc este modificat pentru a se introduce aminoacizi anionici la faţa de interacţiune.

Polipeptida de fuziune ALK6-Fc foloseşte TPA-ul lider şi este după cum urmează:

Secvenţele lider şi linker sunt subliniate. Pentru a promova formarea heterodimerului ALK6-Fc:Fc mai degrabă decât a oricăruia dintre complecşii homodimerici posibili (ALK6-Fc:ALK6-Fc sau Fc:Fc), două substituţii de aminoacizi (înlocuirea lizinei cu aminoacizi anionici) se pot introduce în domeniul Fc al polipeptidei de fuziune aşa cum este indicat prin sublinierea cu o linie dublă de mai sus. Secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO: 131 poate fi furnizată opţional cu o lizină adăugată la C-terminal.

Această polipeptidă de fuziune ALK6-Fc este codificată de următorul acid nucleic (SEQ ID NO: 132).

Secvenţa polipeptidei de fuziune ALK6-Fc mature este după cum urmează (SEQ ID NO: 133) şi poate fi furnizată opţional cu o lizină adăugată la C-terminal.

Aşa cum este descris în Exemplul 2, forma complementară a polipeptidei G1Fc umane monomerice (SEQ ID NO: 140) foloseşte TPA-ul lider şi încorporează o extensie N-terminală opţională. Pentru a promova formarea heterodimerului ALK6-Fc:Fc mai degrabă decât a oricăruia dintre complecşii homodimerici posibili, două substituţii de aminoacizi (înlocuirea resturilor anionice cu lizine) se pot introduce în polipeptida monomerică Fc aşa cum a fost indicat. Secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO: 140 poate fi furnizată opţional cu lizina C-terminală îndepărtată. Această polipeptidă Fc complementară este codificată de acidul nucleic cu SEQ ID NO: 141, şi proteina Fc monomerică matură (SEQ ID NO: 142) poate fi furnizată opţional cu lizina C-terminală îndepărtată.

Polipeptida de fuziune ALK6-Fc şi polipeptida Fc monomerică cu SEQ ID NO: 133 şi respectiv SEQ ID NO: 142, pot fi co-exprimate şi purificate dintr-o linie de celule CHO pentru a da naştere la un complex proteic heteromeric cu un singur braţ care cuprind ALK6-Fc:Fc.

Într-o altă abordare pentru promovarea formării complecşilor heteromultimerici utilizând polipeptide de fuziune Fc asimetrice, domeniile Fc sunt modificate pentru a introduce interacţiuni hidrofobe complementare şi o legătură de disulfură intramoleculară suplimentară aşa cum este ilustrat în secvenţele polipeptidice ALK6-Fc şi Fc cu SEQ ID NO: 421-422 şi respectiv 427-428.

Polipeptida de fuziune ALK6-Fc (SEQ ID NO: 421) utilizează TPA-ul lider şi este după cum urmează:

Secvenţa lider şi linkerul sunt subliniate. Pentru a promova formarea heterodimerului ALK6-Fc:Fc mai degrabă decât a oricăruia dintre complecşii homodimerici posibili, patru substituţii de aminoacid se pot introduce în domeniul Fc al polipeptidei de fuziune ALK6 aşa cum este indicat prin sublinierea cu o linie dublă de mai sus. Secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO: 421 poate fi furnizată opţional cu lizina C-terminală îndepărtată.

Polipeptida de fuziune ALK6-Fc matură (SEQ ID NO: 422) este după cum urmează şi poate fi furnizată opţional cu lizina C-terminală îndepărtată.

Aşa cum este descris în Exemplul 2, forma complementară a polipeptidei G1Fc monomerice (SEQ ID NO: 427) foloseşte TPA-ul lider şi încorporează o extensie N-terminală opţională. Pentru a promova formarea heterodimerului ALK6-Fc:Fc mai degrabă decât a oricăruia dintre complecşii homodimerici posibili, două substituţii de aminoacizi (înlocuind o serină cu o cisteină şi o treonină cu un triptofan) se pot introduce în polipeptida monomerică Fc aşa cum a fost indicat. Secvenţa de aminoacizi cu SEQ ID NO: 427 şi polipeptida G1Fc monomerică matură (SEQ ID NO: 428) poate fi furnizată opţional cu lizina C-terminală îndepărtată.

Polipeptida de fuziune ALK6-Fc şi polipeptida Fc monomerică cu SEQ ID NO: 422 şi respectiv SEQ ID NO: 428, pot fi co-exprimate şi purificate dintr-o linie de celule CHO pentru a da naştere la un complex proteic heteromeric cu un singur braţ care cuprinde ALK6-Fc:Fc.

Purificarea diferiţilor complecşi ALK6-Fc:Fc ar putea fi realizată printr-o serie de etape de cromatografie pe coloană, incluzând, de exemplu, trei sau mai multe dintre următoarele, în orice ordine: cromatografia pe proteină A, cromatografia pe sefaroză Q, cromatografia pe fenilsefaroză, cromatografia de excludere dimensională, şi cromatografia cu schimb de cationi. Purificarea ar putea fi terminată cu o filtrare virală şi schimb de tampon.

Exemplul 12. Generarea unui heterodimer ALK7-Fc cu un singur braţ

Solicitanţii preconizează construirea unui complex heterodimeric ALK7-Fc cu un singur braţ solubil care cuprinde o polipeptidă Fc monomerică cu o extindere N-terminală scurtă şi o a doua polipeptidă în care domeniul extracelular (NΔ4) trunchiat N-terminal al ALK7 uman este fuzionat la un domeniu Fc separat printr-un linker poziţionat între domeniul extracelular şi acest al doilea domeniu Fc. Construcţii individuali sunt denumiţi polipeptida Fc monomerică şi respectiv polipeptida de fuziune ALK7-Fc, şi secvenţele pentru fiecare sunt redate mai jos. Solicitanţii preconizează de asemenea în plus, complecşi heterodimerici ALK7-Fc cu un singur braţ care cuprind alte variante trunchiate N-terminal (de exemplu, varianta NΔ5) a izoformei 1 a ALK7 (SEQ ID NO: 313), domeniul extracelular al izoformei 2 a ALK7 (SEQ ID NO: 302), sau secvenţele native prelucrate ale izoformelor 3 şi 4 ale ALK7 (SEQ ID NO: 306, 310).

Formarea heterodimerului ALK7-Fc cu un singur braţ poate fi ghidată prin abordări similare celor descrise pentru heterodimerul ActRIIB-Fc cu un singur braţ în Exemplul 1. Într-o primă abordare, ilustrată în secvenţele polipeptidelor ALK7-Fc şi Fc monomerică cu SEQ ID NO: 134-136 şi respectiv 140-142, un domeniu Fc este modificat pentru a se introduce aminoacizi cationici la faţa de interacţiune, în timp ce celălalt domeniu Fc este modificat pentru a se introduce aminoacizi anionici la faţa de interacţiune.

Polipeptida de fuziune ALK7-Fc foloseşte TPA-ul lider şi este după cum urmează:

Secvenţele lider şi linker sunt subliniate. Pentru a promova formarea heterodimerului ALK7-Fc:Fc mai degrabă decât a oricăruia dintre complecşii homodimerici posibili (ALK7-Fc:ALK7-Fc sau Fc:Fc), două substituţii de aminoacizi (înlocuirea lizinei cu aminoacizi anionici) se pot introduce în domeniul Fc al polipeptidei de fuziune aşa cum este indicat prin sublinierea cu o linie dublă de mai sus. Secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO: 134 poate fi furnizată opţional cu o lizină adăugată la C-terminal.

Această polipeptida de fuziune ALK7-Fc este codificată de următorul acid nucleic (SEQ ID NO: 135).

Secvenţa polipeptidei de fuziune ALK7-Fc mature este de aşteptat a fi după cum urmează (SEQ ID NO: 136) şi poate fi furnizată opţional cu o lizină adăugată la C-terminal.

Aşa cum este descris în Exemplul 2, forma complementară a polipeptidei G1Fc umane monomerice (SEQ ID NO: 140) foloseşte TPA-ul lider şi încorporează o extensie N-terminală opţională. Pentru a promova formarea heterodimerului ALK7-Fc:Fc mai degrabă decât a oricăruia dintre complecşii homodimerici posibili, două substituţii de aminoacizi (înlocuirea resturilor anionice cu lizine) se pot introduce în polipeptida monomerică Fc aşa cum a fost indicat. Secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO: 140 poate fi furnizată opţional cu lizina C-terminală îndepărtată. Această polipeptidă Fc complementară este codificată de acidul nucleic cu SEQ ID NO: 141, şi polipeptida Fc monomerică matură (SEQ ID NO: 142) poate fi furnizată opţional cu lizina C-terminală îndepărtată.

Polipeptida de fuziune ALK7-Fc şi polipeptida Fc monomerică cu SEQ ID NO: 136 şi respectiv SEQ ID NO: 142, pot fi co-exprimate şi purificate dintr-o linie de celule CHO pentru a da naştere la un complex proteic heteromeric cu un singur braţ care cuprind ALK7-Fc:Fc.

Într-o altă abordare pentru promovarea formării complecşilor heteromultimerici utilizând polipeptide de fuziune Fc asimetrice, domeniile Fc sunt modificate pentru a introduce interacţiuni hidrofobe complementare şi o legătură de disulfură intramoleculară suplimentară aşa cum este ilustrat în secvenţele polipeptidice ALK7-Fc şi Fc cu SEQ ID NO: 423-424 şi respectiv 427-428.

Polipeptida de fuziune ALK7-Fc (SEQ ID NO: 423) utilizează TPA-ul lider şi este după cum urmează:

Secvenţa lider şi linkerul sunt subliniate. Pentru a promova formarea heterodimerului ALK7-Fc:Fc mai degrabă decât a oricăruia dintre complecşii homodimerici posibili, patru substituţii de aminoacid se pot introduce în domeniul Fc al polipeptidei de fuziune ALK7 aşa cum este indicat prin sublinierea cu o linie dublă de mai sus. Secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO: 423 poate fi furnizată opţional cu lizina C-terminală îndepărtată.

Polipeptida de fuziune ALK7-Fc matură (SEQ ID NO: 424) este de aşteptat a fi după cum urmează şi poate fi furnizată opţional cu lizina C-terminală îndepărtată.

Aşa cum este descris în Exemplul 2, forma complementară a polipeptidei G1Fc monomerice (SEQ ID NO: 427) foloseşte TPA-ul lider şi încorporează o extensie N-terminală opţională. Pentru a promova formarea heterodimerului ALK7-Fc:Fc mai degrabă decât a oricăruia dintre complecşii homodimerici posibili, două substituţii de aminoacizi (înlocuind o serină cu o cisteină şi o treonină cu un triptofan) se pot introduce în polipeptida monomerică Fc aşa cum a fost indicat. Secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO: 427 şi polipeptida G1Fc monomerică matură (SEQ ID NO: 428) poate fi furnizată opţional cu lizina C-terminală îndepărtată.

Polipeptida de fuziune ALK7-Fc şi polipeptida Fc monomerică cu SEQ ID NO: 424 şi respectiv SEQ ID NO: 428, pot fi co-exprimate şi purificate dintr-o linie de celule CHO pentru a da naştere la un complex proteic heteromeric cu un singur braţ care cuprinde ALK7-Fc:Fc.

Purificarea diferiţilor complecşi ALK7-Fc:Fc ar putea fi realizată printr-o serie de etape de cromatografie pe coloană, incluzând, de exemplu, trei sau mai multe dintre următoarele, în orice ordine: cromatografia pe proteină A, cromatografia pe sefaroză Q, cromatografia pe fenilsefaroză, cromatografia de excludere dimensională, şi cromatografia cu schimb de cationi. Purificarea ar putea fi terminată cu o filtrare virală şi schimb de tampon.

Împreună, aceste exemple demonstrează că polipeptidele receptorului de tip I sau tip II, atunci când sunt plasate în contextul unui complex proteic heteromeric cu un singur braţ, formează noi buzunare de legare care prezintă selectivitate modificată în raport cu un complex homodimeric al aceluiaşi receptor polipeptidic, permiţând formarea unor agenţi proteici noi pentru posibila utilizare ca agenţi terapeutici.

Claims

1. Complex proteic care cuprinde o primă polipeptidă asociată covalent sau necovalent cu o a doua polipeptidă, în care:

a. prima polipeptidă cuprinde secvenţa de aminoacizi a unui prim membru al unei perechi de interacţiune şi secvenţa de aminoacizi a unei polipeptide a receptorului tip II a superfamiliei TGFβ, în care polipeptida receptorului tip II a superfamiliei TGFβ este o polipeptidă ActRIIB, în care polipeptida ActRIIB cuprinde o secvenţă de aminoacizi care este cel puţin 85% identică cu aminoacizii 29-109 cu SEQ ID NO: 1, şi în care prima polipeptidă cuprinde o leucină la poziţia aminoacidului care corespunde poziţiei 79 a SEQ ID NO: 1; şi

b. a doua polipeptidă cuprinde secvenţa de aminoacizi a unui al doilea membru al perechii de interacţiune, şi în care a doua polipeptidă nu cuprinde o polipeptidă a receptorului tip II a superfamiliei TGFβ;

în care primul membru al perechii de interacţiune este un Fc care cuprinde un domeniu de multimerizare, şi în care al doilea membru al perechii de interacţiune este un Fc care cuprinde un domeniu de multimerizare şi în care polipeptida ActRIIB este capabilă să lege GDF8 şi/sau GDF11.

2. Complex proteic conform revendicării 1, în care polipeptida receptorului tip II a superfamiliei TGFβ este o polipeptidă ActRIIB care cuprinde, constă sau constă în esenţă dintr-o secvenţă de aminoacizi care este:

a. cel puţin 90%, 95%, 97%, 98%, 99% sau 100% identică cu secvenţa oricăreia dintre SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, şi 6; sau

b. cel puţin 90%, 95%, 97%, 98%, 99% sau 100% identică cu o polipeptidă care începe la oricare dintre aminoacizii 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, sau 29 ai SEQ ID NO: 1, şi se termină la oricare dintre aminoacizii 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, sau 134 ai SEQ ID NO: 1.

3. Complex proteic conform oricăreia dintre revendicările 1-2, în care complexul proteic este un heterodimer recombinant.

4. Complex proteic conform oricăreia dintre revendicările 1-3, în care primul membru al perechii de interacţiune cuprinde o primă regiune constantă din lanţul greu al unei IgG, şi/sau în care al doilea membru al perechii de interacţiune cuprinde o a doua regiune constantă din lanţul greu al unei IgG.

5. Complex proteic conform revendicării 4, în care regiunea constantă este un domeniu Fc de imunoglobulină.

6. Complex proteic conform oricăreia dintre revendicările 1-5, în care prima polipeptidă şi/sau a doua polipeptidă cuprind unul sau mai multe resturi de aminoacizi modificate selectate dintre: un aminoacid glicozilat, un aminoacid PEGilat, un aminoacid farnesilat, un aminoacid acetilat, un aminoacid biotinilat, un aminoacid conjugat la un fragment lipidic, şi un aminoacid conjugat la un agent de derivatizare organic.

7. Complex proteic conform oricăreia dintre revendicările 1-6, în care complexul proteic are una sau mai multe dintre următoarele caracteristici: i) se leagă la un ligand al superfamiliei TGF-beta cu un KD mai mic sau egal cu 10-7, 10-8, 10-9, sau 10-10 M; şi ii) inhibă transducţia de semnal mediată de un receptor tip I şi/sau tip II al superfamiliei TGF-beta într-o celulă.

8. Complex proteic conform oricăreia dintre revendicările 1-7, în care complexul proteic se leagă la una sau mai multe dintre: BMP10, GDF8, GDF11/BMP11, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina AE, activina BC, sau activina BE.

9. Complex proteic conform oricăreia dintre revendicările 1-8, în care complexul proteic inhibă activitatea unuia sau mai multora dintre liganzii superfamiliei TGF-beta într-o analiză pe bază de celule; în care ligandul superfamiliei TGF-beta este selectat dintre: BMP10, GDF8, GDF11/BMP11, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina AE, activina BC, sau activina BE.

10. Complex proteic conform oricăreia dintre revendicările 1-9, în care polipeptida ActRIIB cuprinde o secvenţă de aminoacizi care este cel puţin 95% identică cu aminoacizii 29-109 ai SEQ ID NO: 1.

11. Complex proteic conform oricăreia dintre revendicările 1-10, în care polipeptida ActRIIB cuprinde aminoacizii 29-109 ai SEQ ID NO: 1.

12. Complex proteic conform oricăreia dintre revendicările 1-11, în care prima polipeptidă cuprinde o secvenţă de aminoacizi care este cel puţin 95% identică cu SEQ ID NO: 404, şi în care a doua polipeptidă cuprinde o secvenţă de aminoacizi care este cel puţin 95% identică cu SEQ ID NO: 426.

13. Complex proteic conform oricăreia dintre revendicările 1-11, în care prima polipeptidă cuprinde secvenţa de aminoacizi cu SEQ ID NO: 404, şi în care a doua polipeptidă cuprinde secvenţa de aminoacizi cu SEQ ID NO: 426.

14. Complex proteic conform revendicării 5, în care domeniul Fc de imunoglobulină este un domeniu Fc de imunoglobulină al IgG1.

15. Preparat farmaceutic care cuprinde un complex proteic conform oricăreia dintre revendicările 1-14 şi un purtător acceptabil farmaceutic.