JP6591437B2 - 血清アルブミン結合フィブロネクチンｉｉｉ型ドメイン - Google Patents

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Description

関連出願の参照
本出願は、２０１４年３月２０日に出願された、「Novel Serum Albumin-Binding Fibronectin Type III Domains」と題する米国仮特許出願第６１／９６８，１８１号の優先権を主張し、内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
治療薬の半減期が不十分であると、しばしば、治療効果に必要な血清中濃度を維持するために、高頻度および／またはより大用量での投与、あるいは徐放性の製剤の使用が必要となる。しかし、このことは、しばしば、負の副作用と関連している。例えば、特に治療薬が静脈内投与される場合、頻繁な全身注射は対象にかなりの不快感を与え、高い投与関連感染リスクをもたらし、また病院への入院あるいは頻繁な通院を必要とする可能性がある。さらに、長期治療において、毎日の静脈内注射はまた、繰り返される血管の穿刺により引き起こされる、組織の瘢痕および血管の病変といった無視できない副作用につながり得る。同様の問題が、例えばインスリンの糖尿病患者への投与、またはインターフェロン薬の多発性硬化症を患った患者への投与などの、治療薬の頻繁な全身投与全般において知られている。これらの全ての因子は、患者のコンプライアンスの低下および医療制度のコスト増加につながる。
本出願は、様々な治療薬の血清半減期を増加させる化合物、増加した血清半減期を持つ化合物、および治療薬の血清半減期を増加させる方法を提供する。治療薬の血清半減期を増加させるこのような化合物および方法は、費用対効果の高い方法で製造することができ、所望の生物物理学的特性（例えば、Ｔｍ、実質的に単量体である、または十分にフォールディングしている）を有し、組織浸透を可能にするのに十分小さいサイズである。
本発明は、新規のサウスポールベース血清アルブミン結合フィブロネクチンＩＩＩ型第１０ドメイン（１０Ｆｎ３）含有アドネクチン（ＰＫＥ２アドネクチン）の発見に、少なくとも部分的に基づいており、本アドネクチンは、従前のノースポールベース血清アルブミン結合１０Ｆｎ３ドメイン含有アドネクチンよりも強化された特性を提供する。
ある局面において、本発明は、１０Ｆｎ３ドメインを含むポリペプチドであって、１０Ｆｎ３ドメインが、ａ）ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、およびＦＧループ、ｂ）対応するヒト１０Ｆｎ３ドメインのＣＤループの配列と比較して変化したアミノ酸配列を持つＣＤループを含み、かつｃ）ポリペプチドが５００ｎＭより小さいＫＤでヒト血清アルブミンに結合する、ポリペプチドを提供する。
特定の実施形態において、１０Ｆｎ３ドメインはさらに、アカゲザル血清アルブミン、カニクイザル血清アルブミン、マウス血清アルブミン、およびラット血清アルブミンの一つ以上に結合する。例えば、１０Ｆｎ３ドメインは、ＨＳＡ、アカゲザル血清アルブミン、およびカニクイザル血清アルブミンに結合してもよく、あるいは１０Ｆｎ３ドメインはＨＳＡ、アカゲザル血清アルブミン、カニクイザル血清アルブミン、マウス血清アルブミン、およびラット血清アルブミンに結合してもよい。いくつかの実施形態において、１０Ｆｎ３ドメインは対応する血清アルブミンと、５００ｎＭより小さいＫＤで結合し、例えば１００ｎＭより小さいＫＤ、または１０ｎＭより小さいＫＤで結合する。いくつかの実施形態において、１０Ｆｎ３ドメインは５．５から７．４のｐＨ範囲で血清アルブミンに結合する。
特定の実施形態において、１０Ｆｎ３ドメインは、ＨＳＡのI−IIドメインに結合する。
特定の実施形態において、ヒト血清アルブミン存在下の１０Ｆｎ３ドメインを含むポリペプチドの血清半減期は、少なくとも１０時間であり、例えば少なくとも２０時間であり、または少なくとも３０時間である。
特定の実施形態において、ＣＤループが式Ｇ−Ｘ１−Ｘ２−Ｖ−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｓ−Ｘ６−Ｘ７−Ｇ−Ｘ８−Ｘ９−Ｙ−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｅ（配列番号１７０）のアミノ酸配列を含み、式中、
（ａ）Ｘ１がＲまたはＷからなる群から選択され；
（ｂ）Ｘ２がＨ、Ｅ、Ｄ、Ｙ、またはＱからなる群から選択され；
（ｃ）Ｘ３がＱまたはＨからなる群から選択され；
（ｄ）Ｘ４がＩ、Ｋ、Ｍ、Ｑ、Ｌ、またはＶからなる群から選択され；
（ｅ）Ｘ５がＹ、Ｆ、またはＮからなる群から選択され；
（ｆ）Ｘ６がＤ、Ｖ、またはＥからなる群から選択され；
（ｇ）Ｘ７がＬ、Ｗ、またはＦからなる群から選択され；
（ｈ）Ｘ８がＰまたはＴからなる群から選択され；
（ｉ）Ｘ９がＬまたはＭからなる群から選択され；
（ｊ）Ｘ１０がＩまたはＶからなる群から選択され；
（ｋ）Ｘ１１がＹまたはＦからなる群から選択され；および
（ｌ）Ｘ１２がＴ、Ｓ、Ｑ、Ｎ、またはＡからなる群から選択される。
好ましい実施形態において、（ａ）Ｘ１はＲ；（ｂ）Ｘ２はＥ；（ｃ）Ｘ３はＱ；（ｄ）Ｘ４はＫ；（ｅ）Ｘ５はＹ；（ｆ）Ｘ６はＤ；（ｇ）Ｘ７はＬまたはＷ；（ｈ）Ｘ８はＰ；（ｉ）Ｘ９はＬ；（ｊ）Ｘ１０はＩ；（ｋ）Ｘ１１はＹ；および（ｌ）Ｘ１２はＱまたはＮである。
よりさらに好ましい実施形態において、（ａ）Ｘ１はＲ；（ｂ）Ｘ２はＥ；（ｃ）Ｘ３はＱ；（ｄ）Ｘ４はＫ；（ｅ）Ｘ５はＹ；（ｆ）Ｘ６はＤ；（ｇ）Ｘ７はＬ；（ｈ）Ｘ８はＰ；（ｉ）Ｘ９はＬ；（ｊ）Ｘ１０はＩ；（ｋ）Ｘ１１はＹ；および（ｌ）Ｘ１２はＱである。
よりさらに好ましい実施形態において、（ａ）Ｘ１はＲ；（ｂ）Ｘ２はＥ；（ｃ）Ｘ３はＱ；（ｄ）Ｘ４はＫ；（ｅ）Ｘ５はＹ；（ｆ）Ｘ６はＤ；（ｇ）Ｘ７はＷ；（ｈ）Ｘ８はＰ；（ｉ）Ｘ９はＬ；（ｊ）Ｘ１０はＩ；（ｋ）Ｘ１１はＹ；および（ｌ）Ｘ１２はＮである。
特定の実施形態において、ＣＤループは配列番号１０１−１２５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。好ましい実施形態において、ＣＤループは配列番号１０６または１１３に記載されるアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態において、本発明は、(ｉ)配列番号１７０のコンセンサス配列を持つアミノ酸配列、または配列番号１０１−１２５のいずれか一つのアミノ酸配列を含むＣＤループ、および（ｉｉ）配列番号２３−１００、１８４−２０９および２３５−２６０の非ＣＤループ領域に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列、または配列番号２３−１００、１８４−２０９および２３５−２６０の一つと、最大で１、１−２、１−５、１−１０または１−２０個のアミノ酸が異なるアミノ酸配列を含む１０Ｆｎ３ドメインを含むポリペプチドを提供する。特定の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号２３−１００、１８４−２０９および２３５−２６０のいずれか一つに少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列、または配列番号２３−１００、１８４−２０９および２３５−２６０の一つと、最大で１、１−２、１−５、１−１０または１−２０個のアミノ酸が異なるアミノ酸配列を含む。アミノ酸の相違は、置換、付加、または欠失であってよい。
特定の局面において、本発明はフィブロネクチンＩＩＩ型第１０（１０Ｆｎ３）ドメインおよび異種タンパク質を含む融合ポリペプチドであって、１０Ｆｎ３ドメインが、ａ）ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、およびＦＧループ、ｂ）対応するヒト１０Ｆｎ３ドメインのＣＤループの配列と比較して変化したアミノ酸配列を持つＣＤループを含み、ｃ）ポリペプチドが５００ｎＭより小さいＫＤでヒト血清アルブミンに結合する、ポリペプチドを提供する。
特定の実施形態において、融合ポリペプチドは、配列番号２３−１００、１８４−２０９および２３５−２６０のいずれか一つに少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列、あるいは、配列番号２３−１００、１８４−２０９および２３５−２６０の一つから最大で１、１−２、１−５、１−１０または１−２０アミノ酸が異なるアミノ酸配列を含む、アルブミン結合アドネクチンを含む。好ましい実施形態において、融合ポリペプチドは、配列番号５５、８１、１９０または２４１のアミノ酸配列を含むアルブミン結合アドネクチンを含む。さらに別の好ましい実施形態において、配列番号６２、８８、１９７または２４８のアミノ酸配列を含むアルブミン結合アドネクチンを含む。
特定の実施形態において、融合ポリペプチドは、アルブミン結合アドネクチンおよび異種部分（heterologous moiety）を含み、ここで、異種部分は治療用部分（therapeutic moiety）である。
特定の実施形態において、異種タンパク質は、１０Ｆｎ３ドメインを含むポリペプチドである。いくつかの実施形態において、１０Ｆｎ３ドメインは、血清アルブミン以外の標的タンパク質に結合する。ある実施形態において、１０Ｆｎ３ドメインはＰＣＳＫ９に結合し（すなわちＰＣＳＫ９アドネクチン）、配列番号１６７に少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列、あるいは、配列番号１６７と最大で１、１−２、１−５、１−１０または１−２０アミノ酸が異なるアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態において、融合ポリペプチドは、配列番号１６８、１６９または２６１に少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列、あるいは、配列番号１６８、１６９または２６１の一つと最大で１、１−２、１−５、１−１０または１−２０アミノ酸が異なるアミノ酸配列（Ｎ末端メチオニンを含んでも含まなくてもよい）を含む、ＰＣＳＫ９−ＰＫＥ２タンデムアドネクチンである。
特定の実施形態において、マウス血清アルブミン存在下の融合ポリペプチドの血清半減期は、少なくとも１０時間である。いくつかの実施形態において、カニクイザル血清アルブミン存在下の融合ポリペプチドの血清半減期は、少なくとも５０時間である。特定の実施形態において、マウスあるいはカニクイザル血清アルブミン存在下の融合ポリペプチドの血清半減期は、１０−１００時間であり、例えば、１０−９０時間、１０−８０時間、１０−７０時間、１０−６０時間、１０−５０時間、１０−４０時間、１０−３０時間、１０−２０時間、５０−１００時間、６０−１００時間、７０−１００時間、８０−１００時間、９０−１００時間、２０−９０時間、３０−８０時間、４０−７０時間、または５０−６０時間である。
特定の局面において、本発明は、配列番号２３−１００、１６８、１６９、１８４−２０９、２３５−２６０および２６１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ＰＫＥ２アドネクチンまたはＰＣＳＫ９−ＰＫＥ２タンデムアドネクチンを提供する。
特定の局面において、本発明は、本明細書に記載されるアルブミン結合アドネクチンまたはこれを含む融合タンパク質のうちいずれか一つと、担体とを含む組成物を提供する。
特定の局面において、本発明は、例えば本明細書に記載されるアルブミン結合アドネクチンまたはこれを含む融合タンパク質のいずれか一つをコードする単離された核酸分子、例えば配列番号１２６−１５１および１７２に記載される核酸分子、当該核酸分子をコードする発現ベクター、および当該核酸分子を含む細胞を提供する。本明細書に記載のヌクレオチド配列のいずれかに、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるヌクレオチド配列、または明細書に記載のヌクレオチド配列のいずれかから、最大で１−５、１−１０、１−５０または１−１００個のヌクレオチドが異なるヌクレオチド配列を含む核酸もまた、提供される。
特定の局面において、本発明は、本明細書に記載のアルブミン結合アドネクチンまたはこれを含む融合タンパク質を生産する方法であって、アドネクチンまたは融合タンパク質の発現に適した条件下でこれをコードする核酸分子を含む細胞を培養すること、およびアドネクチンまたは融合タンパク質を精製することを含む方法を、提供する。
図１は、実施例６に記載の競合アルファスクリーンアッセイの模式図を表している。 図２は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合するヒトＦｃＲｎ受容体を持つ様々なアドネクチンの競合を表すグラフである。 図３は、ＷＴマウスの、２６２９＿Ｅ０６および２６３０＿Ｄ０２ ＰＫＥ２アドネクチンの血漿半減期を表すグラフである。 図４は、２６２９＿Ｅ０６並びに２６３０＿Ｄ０２アドネクチン、および２２７０＿Ｃ０１親分子のＴ細胞増殖結果を、抗原性パーセンテージおよび増殖応答強度で表したグラフである。 図５は、タンデムアドネクチンのモジュール性（modularity）の比較を表している。アドネクチン１３１８＿Ｈ０４は、ノースポールベース血清アルブミン結合アドネクチンに対応する。「Ｘ」は、非ＰＫＥ標的特異的アドネクチン（すなわち、ミオスタチン；「ｍｙｏ」、またはＰＣＳＫ９）の配置を指す。下図は、直接結合ＥＬＩＳＡによって決定される、ＨＳＡ結合ＥＣ５０タンデム：モノアドネクチン比に対応する、各ボックスのグレーの色合いの説明を表している（すなわち、グレーの色合いが暗いほど、ＨＳＡへの結合が強い）。 図６は、ＨＳＡの有無におけるｈＰＣＳＫ９へのＰＣＳＫ９−ＰＫＥ２タンデムアドネクチンの結合の、バイオレイヤー干渉センサグラム（Bio-Layer Interferometry sensogram）を示す。 図７は、４４７２＿Ｃ０６ ＰＣＳＫ９−ＰＫＥ２タンデムアドネクチンが、対応するタンパク質の注射後、初めはＨＳＡに、その後、ＰＣＳＫ９に結合することを示す、Biacoreセンサグラムである。 図８は、野生型Ｃ５７ Ｂｌ／６マウスにおけるタンデムＰＣＳＫ９−ＰＫＥ２アドネクチンの、インビボのＰＫプロファイルを表すグラフである。 図９は、賦形剤またはＰＣＳＫ９−ＰＫＥ２アドネクチン４４７２＿Ｃ０６を、ｈＰＣＳＫ９トランスジェニックマウスに０．５ｍｇ／ｋｇまたは２ｍｇ／ｋｇで投与後の、遊離のＰＣＳＫ９のレベルを示す。 図１０は、カニクイザルの、ＰＫＥ２アドネクチン２６２９＿Ｅ０６、ＰＣＳＫ９−ＰＫＥ２タンデム５１９０＿Ｅ０１アドネクチン、およびペグ化されたＰＣＳＫ９の血漿ＰＫプロファイルおよび半減期を示すグラフである。 図１１は、カニクイザルの、ＰＫＥ２アドネクチン２２７０＿Ｃ０１の血漿半減期を示すグラフである。 図１２は、カニクイザルにおいてＰＣＳＫ９−ＰＫＥ２タンデムアドネクチン５１９０＿Ｅ０１を投与後の、カニクイザル（cynos）におけるＬＤＬ−ｃおよびＰＣＳＫ９の薬力学的なプロファイルを示すグラフである。プロファイルは、ＬＤＬ−ｃの頑強な低下、遊離ＰＣＳＫ９の抑制、および総ＰＣＳＫ９の増加を示し、これらは全て研究の終わりまでに、ベースラインに戻ることを示している。 図１３は、カニクイザルにおける、２６２９＿Ｅ０６ ＰＫＥ２コントロール、ＰＣＳＫ９−ＰＫＥ２タンデムアドネクチン５１９０＿Ｅ０１および比較対象（comparator）のペグ化されたＰＣＳＫ９アドネクチンのＬＤＬ−ｃ低下効果を示すグラフである。 図１４は、カニクイザルにおける、ペグ化されたＰＣＳＫ９アドネクチンおよびＰＫＥ２アドネクチン２６２９＿Ｅ０６と比較した、異なる二つの濃度におけるタンデムＰＣＳＫ９−ＰＫＥ２アドネクチンの標的会合（target engagement）を示す。 図１５は、タンデムＰＣＳＫ９−ＰＫＥ２アドネクチン、ペグ化されたＰＣＳＫ９アドネクチンまたはＰＫＥ２アドネクチン２６２９＿Ｅ０６投与後の、カニクイザルの、経時のトータルＰＣＳＫ９レベルを示す。 図１６は、ＰＣＳＫ９−ＰＫＥ２タンデムアドネクチン４４７２＿Ｆ０８、４４７２＿Ｅ０６および４４７２＿Ｃ０６、並びにＰＫＥ２アドネクチン構成成分２６２９＿Ｅ０６およびＰＣＳＫ９アドネクチン構成成分２３８２＿Ｄ０９のＴ細胞増殖結果を、増殖応答のパーセントおよび強度で示すグラフである。グラフの左端の棒グラフは、低い、中程度の、および高い抗原性のコントロールタンパク質に対応する。 図１７は、本明細書に記載のＰＫＥ２アドネクチンのアミノ酸配列を示す。 図１８Ａ−１８Ｃは、本明細書に記載のＰＫＥ２アドネクチンおよびＰＣＳＫ９−ＰＫＥ２タンデムアドネクチンの核酸配列を示す。
詳細な説明
定義
他に定義されないかぎり、本明細書で用いられる全ての技術的および科学的用語は、当業者により一般的に理解される意味と同じ意味を持つ。本明細書に記載のものと類似または同等のいかなる方法および組成物も、本発明の実施または試験に使用可能であるが、好ましい方法および組成物は本明細書に記載されている。
「ポリペプチド」は、本明細書で用いられる場合、長さ、翻訳後修飾、または機能にかかわらず、二つ以上のアミノ酸からなる任意の配列を指す。「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書では互換的に用いられる。ポリペプチドは、例えば米国特許第６，５５９，１２６号に記載される、天然のアミノ酸および非天然のアミノ酸を含むことが可能であり、本特許は参照により本明細書に組み込まれる。ポリペプチドはまた、様々な標準的な化学的方法のうちのいずれかによって、修飾されることも可能である（例えば、アミノ酸は保護基によって修飾されることもまた可能である；カルボキシ末端アミノ酸は末端アミド基にさせることもまた可能である；アミノ末端残基は、例えば親油性を高める基によって修飾されることもまた可能である；あるいはポリペプチドは安定性を高めるため、またはインビボ半減期を増加させるために、化学的にグリコシル化する、または他の方法で修飾することが可能である）。ポリペプチド修飾は、ポリペプチドへの、環状化合物のような別の構造、または他の分子の付加を含み得、また立体配置が改変された一つ以上のアミノ酸（すなわち、ＲもしくはＳ；またはＬもしくはＤ）を含むポリペプチドもまた、含み得る。
「ポリペプチド鎖」は、本明細書で用いられる場合、各ドメインが他のドメインに、非共有性の相互作用またはジスルフィド結合ではなく、ペプチド結合で連結しているポリペプチドを指す。
「単離された」ポリペプチドは、天然の環境の構成成分から同定および分離され、および／または回収されたものである。天然の環境の構成成分の夾雑物は、ポリペプチドの診断または治療への利用を妨げる物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質様または非タンパク質様の溶質が含まれ得る。好ましい実施形態において、ポリペプチドは、（１）Ｌｏｗｒｙ法で測定されるポリペプチドの重量で９５％を超えるまで、また最も好ましくは重量で９９％を超えるまで、（２）スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくともＮ末端あるいは内部アミノ酸配列の残基を得るのに十分な程度まで、あるいは（３）クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた、還元あるいは非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均一性が得られるまで、精製される。ポリペプチドの天然の環境の少なくとも一つの構成成分は存在しないであろうために、単離されたポリペプチドには、組換え細胞内のインサイツのポリペプチドが含まれる。しかしながら、通常は、単離されたポリペプチドは少なくとも１つの精製工程により調製される。
１０Ｆｎ３ドメインの「領域」は、本明細書で用いられる場合、ヒト１０Ｆｎ３ドメインの、ループ（ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦおよびＦＧ）、βストランド（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧ）、Ｎ末端（配列番号１のアミノ酸残基１−７に対応する）またはＣ末端（配列番号１のアミノ酸残基９３−９４に対応する）のいずれかを指す。
「ノースポールループ」は、フィブロネクチンヒトフィブロネクチンＩＩＩ型第１０（１０Ｆｎ３）ドメインの、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループのいずれか一つを指す。
「サウスポールループ」は、フィブロネクチンヒトフィブロネクチンＩＩＩ型第１０（１０Ｆｎ３）ドメインの、ＡＢ、ＣＤおよびＥＦループのいずれか一つを指す。
「足場領域」は、ヒト１０Ｆｎ３ドメインの任意の非ループ領域を指す。足場領域にはＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧのβストランド、並びにＮ末端領域（配列番号１の残基１−８に対応するアミノ酸）およびＣ末端領域（配列番号１の残基９３−９４に対応し、場合によっては、ヒトフィブロネクチンのＦｎ３ドメインの１０番目と１１番目のリピートの間の天然のリンカーを構成する７アミノ酸を含む、アミノ酸）が含まれる。
本明細書において、「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」とは、配列同一性の一部分として保存的置換は全く考慮することなく、最大配列同一性パーセントを達成するために配列をアラインし、必要に応じてギャップを導入した後の、選択された配列中のアミノ酸残基と同一である、候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的上、アラインメントは、当技術分野における技術の範囲内にある様々な方法で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピューターソフトウェアを使用して達成できる。当業者であれば、比較されている配列の全長にわたって最大アラインメントを達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適当なパラメーターを決定できる。しかしながら、本明細書における目的上、アミノ酸配列同一性％の値は、配列比較コンピュータープログラムＡＬＩＧＮ−２を用いることによって、以下に記載されるように得られる。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータープログラムは、Genentech,Inc.によって著作され、ユーザー文書とともに米国著作権局、Washington D.C.,20559に提出されており、ここにおいて米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７として登録され、Genentech,Inc.,South San Francisco,Calif.を通じて公的に入手可能である。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、ＵＮＩＸオペレーティングシステム、好ましくは、デジタルＵＮＩＸ Ｖ４．０Ｄで使用するために作成されるべきである。すべての配列比較パラメーターは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定されており、変動しない。
本明細書における目的上、所与のアミノ酸配列Ｂに対する所与のアミノ酸配列Ａのアミノ酸配列同一性％（別法では、所与のアミノ酸配列Ｂに対する一定のアミノ酸配列同一性％を有するまたは含む所与のアミノ酸配列と表現することができる）は、以下のように計算される：１００×分数Ｘ／Ｙ、Ｘは、そのプログラムのＡとＢとのアラインメントにおいて、配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２により同一マッチとしてスコア化されたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂ中のアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さに等しくない場合、ＡのＢに対するアミノ酸配列同一性％は、ＢのＡに対するアミノ酸配列同一性％と等しくないことは、理解されるであろう。
本明細書で互換的に用いられる、「特異的に結合している」、「特異的結合」、「選択的結合」および「選択的に結合している」という用語は、血清アルブミンと親和性を示すが、他のペプチドにはほとんど結合しない（例えば約１０％未満の結合）アドネクチンを指す。これらの結合は、当技術分野において利用可能な技術、例えば、限定されないが、スキャッチャード解析および／または競合結合アッセイ(例えば、競合ＥＬＩＳＡ、ＢＩＡＣＯＲＥアッセイ)などによって測定される。本用語はまた、例えば本発明のアドネクチンの結合ドメインが血清アルブミンに特異的である場合にも、適用できる。
ポリペプチドの「半減期」は、例えば、ポリペプチドの分解が原因で、および／または天然のメカニズムによるポリペプチドのクリアランスまたは隔絶が原因で、ポリペプチドの血清濃度が５０％減少するのにかかる時間と、一般的に定義され得る。半減期は、それ自体が知られている任意の方法、例えば薬物動態学的な解析により決定され得る。好適な手法は、当業者には明らかであろうし、例えば、好適な用量のポリペプチドを霊長類に投与するステップ；前記霊長類から血液サンプルまたは他のサンプルを定期的に回収するステップ；前記血液サンプル中のポリペプチドのレベルまたは濃度を決定するステップ；およびこうして得られたデータ（のプロット）からポリペプチドのレベルまたは濃度が投与時の初期レベルと比較して５０％減少するまでの時間を計算するステップを、一般的に含み得る。半減期を決定する方法は、例えば、Kenneth et al., Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists (1986); Peters et al, Pharmacokinetic analysis: A Practical Approach (1996);およびMarcel Dekker出版の「Pharmacokinetics」, M Gibaldi & D Perron, 2nd Rev. edition (1982)において、見ることができる。
半減期は、ｔｌ／２−α、ｔｌ／２−βおよび曲線下面積（ＡＵＣ）などのパラメーターを用いて表すことができる。本明細書において、「半減期の増加」は、これらのパラメーターのうち任意の一つ、これらのパラメーターのうち任意の二つ、またはこれらの３つのパラメーター全てにおける増加を指す。特定の実施形態において、半減期の増加は、ｔｌ／２−αおよび／またはＡＵＣまたはその両方における増加を伴う、あるいは伴わない、ｔｌ／２−βにおける増加を指す。
「ＫＤ」という用語は、本明細書で用いられる場合、表面プラズモン共鳴アッセイまたは細胞結合アッセイを用いて測定される、特定のアドネクチン−タンパク質相互作用の解離平衡定数またはアドネクチンのタンパク質（例えば血清アルブミン）への親和性を指すことを意図している。「所望のＫＤ」は、本明細書で用いられる場合、企図された目的のために十分なアドネクチンのＫＤを指す。例えば、所望のＫＤは、インビトロアッセイ、例えば細胞をベースとするルシフェラーゼアッセイにおいて、機能的な効果を引き出す上で必要とされるアドネクチンのＫＤを指してもよい。
「ｋａｓｓ」という用語は、本明細書で用いられる場合、アドネクチンがアドネクチン／タンパク質複合体に結合する、結合速度定数のことを指すことを意図している。
「ｋｄｉｓｓ」という用語は、本明細書で用いられる場合、アドネクチンがアドネクチン／タンパク質複合体から解離する、解離速度定数のことを指すことを意図している。
「ＩＣ５０」という用語は、本明細書で用いられる場合、インビトロまたはインビボアッセイのいずれかにおいて、最大阻害反応の５０％のレベルまで、すなわち最大阻害反応と未処理の反応との中間のレベルまで、反応を阻害するアドネクチンの濃度を指す。
「治療的に有効な量」という用語は、哺乳動物において疾病または疾患を治療するのに有効な薬の量、および／または疾患に関連する一つ以上の症状をある程度緩和するのに有効な薬の量を指す。
本明細書で用いられる場合、疾病または疾患を「予防すること」は、未処理の対照サンプルと比較して統計サンプルにおいて、疾病状態の出現の確率を減らすことを指し、あるいは、未処理のサンプルと比較して疾病または疾患の一つ以上の症状の発症を遅らせるか、もしくは重症度を軽減させることを指す。患者は、予防治療のために、一般集団と比較して臨床疾病状態を患うリスクを増加させると知られている因子に基づいて、選択されてもよい。「治療する」という用語は、本明細書で用いられる場合、（ａ）疾病状態を抑制すること、すなわち進行を止めること；および／または（ｂ）疾病状態を緩和すること、すなわち一度確立された疾病状態の退行を引き起こすことを含む。
概説
本明細書に記載の新規のフィブロネクチンをベースとする足場ポリペプチドは、様々な種の血清アルブミンに結合し、さらなる分子、例えば、異なる標的に結合する他の１０Ｆｎ３ドメイン、あるいは半減期の増加が有益であるポリペプチドに、連結可能である。
Ａ．フィブロネクチンをベースとする足場の一般構造
Ｆｎ３は、フィブロネクチン由来のＩＩＩ型ドメインを指す。Ｆｎ３ドメインは、小分子であり、単量体であり、可溶性であり、また安定である。Ｆｎ３はジスルフィド結合を欠き、それゆえに、還元条件下で安定である。Ｆｎ３の全体構造は、免疫グロブリン群に似ている。Ｆｎ３ドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ順に、βまたはβ様ストランドＡ；ＡＢループ；βまたはβ様ストランドＢ；ＢＣループ；βまたはβ様ストランドＣ；ＣＤループ；βまたはβ様ストランドＤ；ＤＥループ；βまたはβ様ストランドＥ；ＥＦループ；βまたはβ様ストランドＦ；ＦＧループ；βまたはβ様ストランドＧを含む。７個の逆平行βストランドは、安定なコアを形成する二個のβシートとして配置されており、βまたはβ様ストランドを連結させるループから成る二つの「面（faces）」を作り出している。ＡＢ、ＣＤ、およびＥＦループは、一つの面（「サウスポール」）に位置し、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは、反対の面（「ノースポール」）に位置している。ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦおよびＦＧループのいずれかまたは全てが、リガンド結合に関与し得る。ヒトフィブロネクチンには、少なくとも１５個の異なるＦｎ３モジュールが存在し、モジュール間の配列相同性は低いが、全モジュールが三次構造において高い類似性を有する。
いくつかの実施形態において、Ｆｎ３ドメインは、ヒトフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインの野生型第１０モジュール（１０Ｆｎ３）由来の、Ｆｎ３ドメインである：
（配列番号１）（ＡＢ、ＣＤ、およびＥＦループは下線を付している）。
いくつかの実施形態において、１０Ｆｎ３の非リガンド結合配列、すなわち「１０Ｆｎ３足場」は、１０Ｆｎ３がリガンド結合機能および／または構造安定性を保持するならば、改変してもよい。様々な変異した１０Ｆｎ３足場が報告されている。ある局面において、Ａｓｐ７、Ｇｌｕ９、およびＡｓｐ２３のうちの一つ以上が別のアミノ酸で、例えば、負電荷のアミノ酸残基以外のアミノ酸残基など（例えば、Ａｓｎ、Ｌｙｓなど）で置換される。これらの変異は、野生型の形態と比較して、中性ｐＨにて、変異した１０Ｆｎ３の安定性の上昇を促進させる効果があると報告されている（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ ０２／０４５２３を参照されたい）。有益、あるいは中立のどちらかである１０Ｆｎ３足場の様々なさらなる改変が、開示されている。例えば、Batori et al., Protein Eng., 15(12):1015-1020 (December 2002); Koide et al., Biochemistry, 40(34):10326-10333 (Aug. 28, 2001)を参照されたい。
１０Ｆｎ３タンパク質の変異体および野生型は共に、同じ構造、つまりＡからＧと名付けられた七個のβストランドドメイン配列、および七個のβストランドドメイン配列を連結させる６個のループ領域（ＡＢループ、ＢＣループ、ＣＤループ、ＤＥループ、ＥＦループ、およびＦＧループ）を特徴としている。Ｎ末端およびＣ末端の最も近くに位置するβストランドは、溶液中でβ様立体構造をとり得る。配列番号１において、ＡＢループは残基１４−１７に対応し、ＢＣループは残基２３−３１に対応し、ＣＤループは残基３７−４７に対応し、ＤＥループは残基５１−５６に対応し、ＥＦループは残基６３−６７に対応し、ＦＧループは残基７６−８７に対応する。
従って、いくつかの実施形態において、本発明の血清アルブミン結合アドネクチンは、配列番号１に示した、ヒト１０Ｆｎ３ドメインに、少なくとも４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％同一である、１０Ｆｎ３ポリペプチドである。可変性の多くは、一般的に、一つ以上のループで生じる。１０Ｆｎ３ポリペプチドのβストランドまたはβ様ストランドはそれぞれ、配列番号１のβストランドまたはβ様ストランドに対応する配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または１００％同一であるアミノ酸配列から基本的になり得、これらの変化は生理的条件下でのポリペプチドの安定性を妨害しないという条件である。
さらに、ループ領域中の挿入および欠失はまた、高親和性血清結合１０Ｆｎ３結合ドメインを作成しながら、なされてもよい。従って、いくつかの実施形態において、ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦおよびＦＧから選択される一つ以上のループにおいて、野生型ヒト１０Ｆｎ３の対応するループと比較して、長さを伸長あるいは短縮させてもよい。任意の所与のポリペプチドにおいて、一つ以上のループの長さを伸長させてもよく、一つ以上のループの長さを減少させてもよく、あるいはそれらを組み合わせてもよい。いくつかの実施形態において、所与のループの長さを、２−２５、２−２０、２−１５、２−１０、２−５、５−２５、５−２０、５−１５、５−１０、１０−２５、１０−２０、または１０−１５アミノ酸まで伸長させてもよい。いくつかの実施形態において、所与のループの長さを、１−１５、１−１１、１−１０、１−５、１−３、１−２、２−１０、または２−５アミノ酸まで減少させてもよい。
配列番号１の残基１４−１７、２３−３０、３７−４７、５１−５６、６３−６７および７６−８７に対応するアミノ酸残基は、それぞれＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦおよびＦＧループを規定する。しかしながら、所望の標的に強い親和性をもつ１０Ｆｎ３結合ドメインを獲得するために、ループ領域内の全ての残基が修飾される必要はないことは、理解されるべきであろう。いくつかの実施形態において、あるループ、例えばＣＤループ内の残基のみの修飾により、高親和性標的結合１０Ｆｎ３ドメインが作られる。
いくつかの実施形態において、本発明は１０Ｆｎ３ドメインを含むポリペプチドであって、１０Ｆｎ３ドメインがＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、およびＦＧループを含み、配列番号１のヒト１０Ｆｎ３ドメインの対応するループの配列と比較して、改変されたアミノ酸配列を有するＡＢ、ＣＤ、およびＥＦループから選択された少なくとも一つのループを有するポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態において、ＡＢ、ＣＤ、およびＥＦループが改変されている。特定の実施形態において、ＡＢループのみが改変されている。特定の実施形態において、ＣＤループのみが改変されている。特定の実施形態において、ＥＦループのみが改変されている。特定の実施形態において、ＡＢおよびＣＤループの両方が改変されている。特定の実施形態において、ＡＢおよびＥＦループの両方が改変されている。特定の実施形態において、ＣＤおよびＥＦループの両方が改変されている。いくつかの実施形態において、一つ以上の特異的な足場の改変は、一つ以上のループの改変と組み合わせられる。「改変されている」とは、鋳型配列（すなわち、対応する野生型ヒトフィブロネクチンドメイン）と比べて一つ以上のアミノ酸配列が改変されていることを意味し、アミノ酸の付加、欠失、および置換を含む。
いくつかの実施形態において、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、ノースポールループおよびサウスポールループの改変の組み合わせを有する１０Ｆｎ３ドメインを含む。例えば、ＡＢ、ＣＤ、およびＥＦループの一つ以上を、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループの一つ以上と組み合わせて、配列番号１のヒト１０Ｆｎ３ドメインの対応するループと比較して改変させることができる。
いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１の非ループ領域および／または非修飾ループ領域に、少なくとも８０、８５、９０、９５、９８、９９、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む１０Ｆｎ３ドメインを含み、ＡＢ、ＣＤ、およびＥＦから選択された少なくとも一つのループが改変されている。例えば、特定の実施形態において、ＡＢループは、最大４アミノ酸の置換、最大１０アミノ酸の挿入、最大３アミノ酸の欠失またはそれらの組み合わせを有してもよく；ＣＤループは、最大６アミノ酸の置換、最大１０アミノ酸の挿入、最大４アミノ酸の欠失またはそれらの組み合わせを有してもよく；ＥＦループは、最大５アミノ酸の置換、最大１０アミノ酸の挿入、最大３アミノ酸の欠失、またはそれらの組み合わせを有してもよく；および／またはＦＧループは、最大１２アミノ酸の置換、最大１１アミノ酸の欠失、最大２５アミノ酸の挿入、またはそれらの組み合わせを有してもよい。
いくつかの実施形態において、インテグリン結合モチーフ「アルギニン−グリシン−アスパラギン酸」（ＲＧＤ）（配列番号１のアミノ酸７８−８０）の一つ以上の残基を、インテグリン結合を妨害するように、置換してもよい。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるポリペプチドのＦＧループは、ＲＧＤインテグリン結合部位を含まない。ある実施形態において、ＲＧＤ配列は、極性アミノ酸−中性アミノ酸−酸性アミノ酸配列（Ｎ末端からＣ末端の方向）により置換される。特定の実施形態において、ＲＧＤ配列はＳＧＥにより置換される。さらに特定の実施形態において、ＲＧＤ配列はＲＧＥにより置換される。
特定の実施形態において、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、次の配列によって一般的に規定される１０Ｆｎ３ドメインを含む：
（配列番号２）
配列番号２において、ＡＢループは（Ｘ）ｕで表現され、ＢＣループは（Ｘ）ｖで表現され、ＣＤループは（Ｘ）ｗで表現され、ＤＥループは（Ｘ）ｘで表現され、ＥＦループは（Ｘ）ｙで表現され、ＦＧループはＸｚで表現されている。Ｘは任意のアミノ酸を表現し、Ｘに続く下付き文字はアミノ酸の数の整数値を表現している。特に、ｕ、ｖ、ｗ、ｘ、ｙおよびｚは、それぞれ独立して、２−２０、２−１５、２−１０、２−８、５−２０、５−１５、５−１０、５−８、６−２０、６−１５、６−１０、６−８、２−７、５−７、または６−７アミノ酸のいずれかであってよい。βストランドの配列（下線）は、配列番号２に示された対応するアミノ酸と比較して、全ての７個の足場領域に渡る、０から１０、０から８、０から６、０から５、０から４、０から３、０から２、または０から１のいずれかの、置換、欠失、または付加を有してもよい。いくつかの実施形態において、βストランドの配列は、配列番号２に示された対応するアミノ酸と比較して、全ての７個の足場領域に渡る、０から１０、０から８、０から６、０から５、０から４、０から３、０から２、０から１のいずれかの保存的置換を有してもよい。特定の実施形態において、疎水性コアアミノ酸残基（上記配列番号２の太字の残基）は固定され、いずれの置換、保存的置換、欠失、または付加も、疎水性コアアミノ酸残基以外の残基で生じる。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるポリペプチドの疎水性コア残基は、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１）と比較して、修飾されていない。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端領域のアミノ酸配列は、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１）の対応する領域のアミノ酸配列と比較して、欠失、置換、または挿入によって修飾されてもよい。１０Ｆｎ３ドメインは通常、配列番号１のアミノ酸番号１で始まる。しかしながら、アミノ酸を欠失したドメインもまた、本発明により包含される。さらなる配列がまた、配列番号１のアミノ酸配列を有する１０Ｆｎ３ドメインのＮ末端またはＣ末端に、付加されてもよい。例えば、いくつかの実施形態において、Ｎ末端の伸長は、Ｍ、ＭＧおよびＧからなる群から選択されるアミノ酸配列からなる。
例示的な実施形態において、１−２０、１−１５、１−１０、１−８、１−５、１−４、１−３、１−２、または１アミノ酸の長さを有する代替となるＮ末端領域を、配列番号１のＮ末端領域に付加することができる。例示的な代替となるＮ末端領域には、Ｍ、ＭＧ、Ｇ、ＭＧＶＳＤＶＰＲＤＬ（配列番号３）およびＧＶＳＤＶＰＲＤＬ（配列番号４）が含まれる（アミノ酸の一文字コードで表す）。他の好適な代表となるＮ末端領域には、例えば、ＸｎＳＤＶＰＲＤＬ（配列番号５）、ＸｎＤＶＰＲＤＬ（配列番号６）、ＸｎＶＰＲＤＬ（配列番号７）、ＸｎＰＲＤＬ（配列番号８）、ＸｎＲＤＬ（配列番号９）、ＸｎＤＬ（配列番号１０）、またはＸｎＬが含まれ、ここではｎ＝０、１または２アミノ酸であり、ここではｎ＝１のときＸはＭｅｔまたはＧｌｙであり、ｎ＝２のときＸはＭｅｔ−Ｇｌｙである。Ｍｅｔ−Ｇｌｙ配列が１０Ｆｎ３ドメインのＮ末端に付加されると、たいていＭは取り除かれ、ＧをＮ末端に残す。特定の実施形態において、代替となるＮ末端領域には、アミノ酸配列ＭＡＳＴＳＧ（配列番号１１）が含まれる。
例示的な実施形態において、１−２０、１−１５、１−１０、１−８、１−５、１−４、１−３、１−２、または１個の長さのアミノ酸を持つ、代替となるＣ末端領域を、配列番号１のＣ末端領域に加えることができる。代替となるＣ末端領域の配列の具体例には、例えば、ＥＩＥＫ（配列番号１２）、ＥＧＳＧＣ（配列番号１３）、ＥＩＥＫＰＣＱ（配列番号１４）、ＥＩＥＫＰＳＱ（配列番号１５）、ＥＩＥＫＰ（配列番号１６）、ＥＩＥＫＰＳ（配列番号１７）、またはＥＩＥＫＰＣ（配列番号１８）を含む、基本的にこれらからなる、あるいはこれらからなるポリペプチドが含まれる。いくつかの実施形態において、代替となるＣ末端領域は、ＥＩＤＫ（配列番号１９）を含み、特定の実施形態において、代替となるＣ末端領域は、ＥＩＤＫＰＣＱ（配列番号２０）またはＥＩＤＫＰＳＱ（配列番号２１）のいずれかである。さらなる好適な代替となるＣ末端領域には、表２０および配列番号２１０−２２０に記載される配列が含まれる。
特定の実施形態において、Ｃ末端伸長配列は、ＥおよびＤ残基を含み、８−５０、１０−３０、１０−２０、５−１０、および２−４個の長さのアミノ酸であってよい。いくつかの実施形態において、テール配列は、配列がＥＤのタンデムリピートを含むＥＤをベースとするリンカーを含む。例示的な実施形態において、テール配列は、２−１０、２−７、２−５、３−１０、３−７、３−５、３、４または５個のＥＤリピートを含む。特定の実施形態において、ＥＤをベースとするテール配列はまた、例えば：ＥＩ、ＥＩＤ、ＥＳ、ＥＣ、ＥＧＳ、およびＥＧＣのような、さらなるアミノ酸残基を含んでもよい。これらの配列は、部分的に、既知のアドネクチンテール配列、例えばＥＩＤＫＰＳＱ（配列番号２１）に基づいており、ここでは残基ＤおよびＫが除去されている。例示的な実施形態において、ＥＤをベースとするテールは、ＥＤリピートの前に、Ｅ、ＩまたはＥＩ残基を含む。
特定の実施形態において、本明細書で提供される任意のアドネクチンのＣ末端アミノ酸ＲＴ（すなわち、配列番号１のアミノ酸９３−９４）に連結可能な、代替となるＣ末端部分は、アミノ酸ＰｍＸｎを含み、ここではＰはプロリンであり、Ｘは任意のアミノ酸であり、ｍは少なくとも１である整数値であり、ｎは０または少なくとも１である整数値である。特定の実施形態において、代替となるＣ末端部分はアミノ酸ＰＣを含む。特定の実施形態において、代替となるＣ末端部分はアミノ酸ＰＩ、ＰＣ、ＰＩＤ、ＰＩＥ、ＰＩＤＫ（配列番号２２１）、ＰＩＥＫ（配列番号２２２）、ＰＩＤＫＰ（配列番号２２３）、ＰＩＥＫＰ（配列番号２２４）、ＰＩＤＫＰＳ（配列番号２２５）、ＰＩＥＫＰＳ（配列番号２２６）、ＰＩＤＫＰＣ（配列番号２２７）、ＰＩＥＫＰＣ（配列番号２２８）、ＰＩＤＫＰＳＱ（配列番号２２９）、ＰＩＥＫＰＳＱ（配列番号２３０）、ＰＩＤＫＰＣＱ（配列番号２３１）、ＰＩＥＫＰＣＱ（配列番号２３２）、ＰＨＨＨＨＨＨ（配列番号２３３）、およびＰＣＨＨＨＨＨＨ（配列番号２３４）を含む。
特定の実施形態において、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、代替となるＮ末端領域の配列および代替となるＣ末端領域の配列をいずれも有する１０Ｆｎ３ドメインを含む。
Ｂ．修飾されたサウスポールループを有する血清アルブミン結合物質
１０Ｆｎ３ドメインは、約１０ｋＤａというその小さなサイズゆえに、腎臓のろ過および分解を介して、血液循環から迅速に除去される（ｔ１／２が、マウスでは１５−４５分、サルでは３時間）。特定の局面において、本出願は、１０Ｆｎ３ドメインのｔ１／２を延長させるための、血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に特異的に結合するサウスポール修飾をもつ１０Ｆｎ３ドメインを提供する。
ＨＳＡは６００μＭの血清濃度を有し、ヒトにおいて１９日のｔ１／２を有する。ＨＳＡのｔ１／２の延長は、新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）を介した再利用に、部分的に起因すると考えられている。ＨＳＡは、内皮細胞へのエンドソームによる取り込み後に、ｐＨ依存的にＦｃＲｎに結合する；この相互作用がＨＳＡを血流に戻して再利用させ、それによりリソソーム分解を回避させる。ＦｃＲｎは、広く発現され、再利用経路は恒常的であると考えられる。大部分の細胞タイプにおいて、大半のＦｃＲｎは細胞内の選別エンドソーム（sorting endosome）に局在する。ＨＳＡは、非特異的な液相ピノサイト−シスメカニズムにより、容易に取り込まれ、ＦｃＲｎによりリソソームの分解から救出される。エンドソームで見られる酸性ｐＨにおいて、ＨＳＡのＦｃＲｎへの親和性は増加する（ｐＨ６．０において５μＭ）。いったんＦｃＲｎに結合すると、ＨＳＡはリソソームの分解経路を回避し、細胞表面へ経細胞輸送され、細胞表面で放出される。
本明細書で「第一世代」血清アルブミン結合アドネクチンと呼ばれる、ノースポールベース血清アルブミン結合アドネクチンは、例えばＷＯ２０１１１４００８６に記載されている。第一世代ノースポールベース血清アルブミン結合アドネクチン（ＳＡＢＡ）の一部は、マウスあるいはラット血清アルブミンに結合せず、種を越えて血清アルブミンに高い親和性を有することなく、多価の１０Ｆｎ３ベースプラットフォームに常に適合しておらず、これを改良するために、修飾されたサウスポールループを持つ第二世代サウスポールベース血清アルブミン結合アドネクチン（ＰＫＥ２アドネクチン）を、実施例に記載された通りに開発した。
従って、ある局面において、本発明は、（ｉ）ＡＢ、ＣＤ、およびＥＦループから選択される少なくとも一つのサウスポールループのアミノ酸配列において、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１）の対応するループと比較して修飾を有する１０Ｆｎ３ドメインであって、血清アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）に結合する１０Ｆｎ３ドメインを提供する。修飾されたサウスポールループは、同じ標的への結合に寄与する。修飾されたサウスポールループの様々な組み合わせが企図される。例えば、１０Ｆｎ３は、一つの修飾されたサウスポールループを含んでもよく、二つの修飾されたサウスポールループを含んでもよく、あるいはさらに三つ全ての修飾されたサウスポールループを含んでもよい。特定の実施形態において、一つ以上の修飾されたサウスポールループは、一つ以上の修飾されたノースポールループ（すなわち、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループのうち一つ以上）と組み合わせることができる。修飾されたループは、ループ全体にわたって配列の修飾を有してもよく、あるいはループの一部にのみ配列の修飾を有してもよい。さらに、一つ以上の修飾されたループは、ループの長さが野生型配列（すなわち配列番号１）の対応するループの長さと比較して変化するように、挿入または欠失を有してもよい。特定の実施形態において、βストランド、Ｎ末端領域および／またはＣ末端領域などの、１０Ｆｎ３ドメインのさらなる領域がまた（すなわちサウスポールループに加えて）、野生型１０Ｆｎ３ドメインと比較して配列において修飾されてもよく、これらのさらなる修飾はまた標的への結合に寄与してもよい。特定の実施形態において、サウスポールループは、修飾される唯一のドメインである。具体的な実施形態において、ＣＤループは修飾される唯一のドメインである。特定の実施形態において、血清結合１０Ｆｎ３ドメインは、上述のように、Ｎ末端伸長配列および／またはＣ末端伸長配列を含むように修飾されてもよい。
ある実施形態において、本発明は、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメインの対応するループと比較して改変されたＣＤループを持ち、血清アルブミンに結合するアドネクチン、例えば配列番号２３−１００、１８４−２０９および２３５−２６０に記載される１０Ｆｎ３ドメインを提供する。いくつかの実施形態において、アルブミン結合アドネクチンは、６×ヒスチジンテールを含むか、あるいは欠く。いくつかの実施形態において、アルブミン結合アドネクチンは、配列番号７５−１００に記載されるように、Ｎ末端リーダーおよびＣ末端テールを欠くコアアドネクチンに対応する。
例示的な実施形態において、本明細書に記載の血清アルブミン結合１０Ｆｎ３タンパク質は、ヒト血清アルブミンに、３μＭ、２．５μＭ、２μＭ、１．５μＭ、１μＭ、５００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、５００ｐＭ、１００ｐＭ、１００ｐＭ、５０ｐＭ、または１０ｐＭより小さいＫＤで結合する。ＫＤは、例えば、０．１ｎＭ−５０ｎＭ、０．１ｎＭ−１００ｎＭ、０．１ｎＭ−１μＭ、０．５ｎＭ−５０ｎＭ、０．５ｎＭ−１００ｎＭ、０．５ｎＭ−１μＭ、１ｎＭ−５０ｎＭ、１ｎＭ−１００ｎＭまたは１ｎＭ−１μＭの範囲であってよい。
特定の実施形態において、本明細書に記載のアルブミン結合アドネクチン（または１０Ｆｎ３タンパク質）はまた、カニクイザル、アカゲザル、ラット、またはマウスのうちの一つ以上に由来する血清アルブミンに結合してもよい。
特定の実施形態において、本明細書に記載の血清アルブミン結合１０Ｆｎ３タンパク質は、３μＭ、２．５μＭ、２μＭ、１．５μＭ、１μＭ、５００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、５００ｐＭまたは１００ｐＭ未満のＫＤで、アカゲザル血清アルブミン（ＲｈＳＡ）またはカニクイザル血清アルブミン（ＣｙＳＡ）に結合する。ＫＤは、例えば、０．１ｎＭ−５０ｎＭ、０．１ｎＭ−１００ｎＭ、０．１ｎＭ−１μＭ、０．５ｎＭ−５０ｎＭ、０．５ｎＭ−１００ｎＭ、０．５ｎＭ−１μＭ、１ｎＭ−５０ｎＭ、１ｎＭ−１００ｎＭまたは１ｎＭ−１μＭの範囲であってよい。
特定の実施形態において、本明細書に記載の血清アルブミン結合１０Ｆｎ３タンパク質は、３μＭ、２．５μＭ、２μＭ、１．５μＭ、１μＭ、５００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、５００ｐＭまたは１００ｐＭ未満のＫＤで、アカゲザル血清アルブミン（ＲｈＳＡ）、カニクイザル血清アルブミン（ＣｙＳＡ）、およびマウス血清アルブミン（ＭＳＡ）に結合する。ＫＤは、例えば、０．１ｎＭ−５０ｎＭ、０．１ｎＭ−１００ｎＭ、０．１ｎＭ−１μＭ、０．５ｎＭ−５０ｎＭ、０．５ｎＭ−１００ｎＭ、０．５ｎＭ−１μＭ、１ｎＭ−５０ｎＭ、１ｎＭ−１００ｎＭまたは１ｎＭ−１μＭの範囲であってよい。
特定の実施形態において、明細書に記載の血清アルブミン結合１０Ｆｎ３タンパク質は、３μＭ、２．５μＭ、２μＭ、１．５μＭ、１μＭ、５００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、５００ｐＭまたは１００ｐＭ未満のＫＤで、アカゲザル血清アルブミン（ＲｈＳＡ）、カニクイザル血清アルブミン（ＣｙＳＡ）、マウス血清アルブミン（ＭＳＡ）、およびラット血清アルブミン（ＲＳＡ）に結合する。ＫＤは、例えば、０．１ｎＭ−５０ｎＭ、０．１ｎＭ−１００ｎＭ、０．１ｎＭ−１μＭ、０．５ｎＭ−５０ｎＭ、０．５ｎＭ−１００ｎＭ、０．５ｎＭ−１μＭ、１ｎＭ−５０ｎＭ、１ｎＭ−１００ｎＭまたは１ｎＭ−１μＭの範囲であってよい。
特定の実施形態において、本明細書に記載のアルブミン結合アドネクチンは、血清アルブミンに５．５から７．４のｐＨ範囲で結合する。
特定の実施形態において、本明細書に記載のアルブミン結合アドネクチンは、ヒト血清アルブミンのＩ−ＩＩドメインに結合する。
特定の実施形態において、本発明のアルブミン結合アドネクチンの血清半減期、または、異種部分に結合するアルブミン結合アドネクチン、例えば第二のアドネクチンの血清半減期は、少なくとも２時間、２．５時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１５時間、２０時間、２５時間、３０時間、３５時間、４０時間、５０時間、６０時間、７０時間、８０時間、９０時間、１００時間、１１０時間、１２０時間、１３０時間、１３５時間、１４０時間、１５０時間、１６０時間、または２００時間である。特定の実施形態において、アルブミン結合アドネクチンの血清半減期、または、異種部分に結合するアルブミン結合アドネクチン、例えば第二のアドネクチンの血清半減期は、少なくとも２−２００時間、５−２００時間、１０−２００時間、２５−２００時間、５０−２００時間、１００−２００時間、１５０−２００時間、２−１５０時間、２−１００時間、２−５０時間、２−２５時間、２−１０時間、２−５時間、５−１５０時間、１０−１００時間、または２５−５０時間である。
特定の実施形態において、アルブミン結合アドネクチンは、野生型１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１）に少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％または８５％の同一性を有する配列を含む。ある実施形態において、ＡＢ、ＣＤ、またはＥＦループの少なくとも一つが、野生型１０Ｆｎ３ドメインと比較して修飾されている。特定の実施形態において、ＡＢ、ＣＤ、またはＥＦループの少なくとも二つが、野生型１０Ｆｎ３ドメインと比較して修飾されている。特定の実施形態において、ＡＢ、ＣＤ、またはＥＦループの三つ全てが、野生型１０Ｆｎ３ドメインと比較して修飾されている。特定の実施形態において、血清アルブミン結合１０Ｆｎ３ドメインは、配列番号２３−１００、１８４−２０９および２３５−２６０のいずれか一つと、少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する配列を含む。
特定の実施形態において、血清アルブミン結合１０Ｆｎ３ドメイン（またはアドネクチン）は、配列番号２に記載される配列を含んでよく、ここではＣＤループは（Ｘ）ｗで表され、２６個のコアＰＫＥ２アドネクチン配列（すなわち、配列番号７５−１００）のいずれか由来のＣＤループで置換される。これらのアルブミン結合アドネクチンの足場領域は、配列番号１の足場アミノ酸残基と比較して、０−２０、０−１５、０−１０、０−８、０−６、０−５、０−４、０−３、０−２、または０−１のいずれかの置換、保存的置換、欠失、または付加を有してもよい。これらの足場の修飾は、アルブミン結合アドネクチンが、所望のＫＤで血清アルブミン、例えばＨＳＡに結合できるように、なされてもよい。
いくつかの実施形態において、本発明のアルブミン結合アドネクチンのＣＤループ領域は、コンセンサス配列に従い記載され得る。
従って、いくつかの実施形態において、ＣＤループはコンセンサス配列
Ｇ−Ｘ１−Ｘ２−Ｖ−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｓ−Ｘ６−Ｘ７−Ｇ−Ｘ８−Ｘ９−Ｙ−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｅ（配列番号１７０）により規定され、ここでは、
（ａ）Ｘ１はＲまたはＷからなる群から選択され；
（ｂ）Ｘ２はＨ、Ｅ、Ｄ、ＹまたはＱからなる群から選択され；
（ｃ）Ｘ３はＱまたはＨからなる群から選択され；
（ｄ）Ｘ４はＩ、Ｋ、Ｍ、Ｑ、ＬまたはＶからなる群から選択され；
（ｅ）Ｘ５はＹ、ＦまたはＮからなる群から選択され；
（ｆ）Ｘ６はＤ、ＶまたはＥからなる群から選択され；
（ｇ）Ｘ７はＬ、ＷまたはＦからなる群から選択され；
（ｈ）Ｘ８はＰまたはＴからなる群から選択され；
（ｉ）Ｘ９はＬまたはＭからなる群から選択され；
（ｊ）Ｘ１０はＩまたはＶからなる群から選択され；
（ｋ）Ｘ１１はＹまたはＦからなる群から選択され：および
（ｌ）Ｘ１２はＴ、Ｓ、Ｑ、ＮまたはＡからなる群から選択される。
ある好ましい実施形態において、
（ａ）Ｘ１はＲであり；
（ｂ）Ｘ２はＥであり；
（ｃ）Ｘ３はＱであり；
（ｄ）Ｘ４はＫであり；
（ｅ）Ｘ５はＹであり；
（ｆ）Ｘ６はＤであり；
（ｇ）Ｘ７はＬまたはＷであり；
（ｈ）Ｘ８はＰであり；
（ｉ）Ｘ９はＬであり；
（ｊ）Ｘ１０はＩであり；
（ｋ）Ｘ１１はＹであり；および
（ｌ）Ｘ１２はＱまたはＮである。
好ましい実施形態において、Ｘ７はＬであり、Ｘ１２はＱである。
別の好ましい実施形態において、Ｘ７はＷであり、Ｘ１２はＮである。
いくつかの実施形態において、本発明のアルブミン結合アドネクチンは、配列番号１０１−１２５に記載されるＣＤループ配列に、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一の配列を有するＣＤループを含むか、あるいは最大１、１−２、または１−３アミノ酸の差異を含む（すなわち、置換、例えば、欠失、付加、または保存的置換）。これらのアルブミン結合アドネクチンの足場領域は、配列番号１の足場アミノ酸残基と比較して、０−２０、０−１５、０−１０、０−８、０−６、０−５、０−４、０−３、０−２、または０−１のいずれかの置換、保存的置換、欠失、または付加を含んでもよい。これらの足場の修飾は、アドネクチンが、所望のＫＤで血清アルブミンに結合できるように、なされてもよい。
好ましい実施形態において、本発明のアルブミン結合アドネクチンのＣＤループは、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む：
ＧＲＨＶＱＩＹＳＤＬＧＰＬＹＩＹＴＥ（配列番号１０１）、
ＧＲＨＶＨＩＹＳＤＷＧＰＭＹＩＹＴＥ（配列番号１０２）、
ＧＲＥＶＱＫＹＳＶＬＧＰＬＹＩＹＴＥ（配列番号１０３）、
ＧＲＥＶＱＭＹＳＤＬＧＰＬＹＶＹＳＥ（配列番号１０４）、
ＧＲＥＶＱＫＦＳＤＷＧＰＬＹＩＹＴＥ（配列番号１０５）、
ＧＲＥＶＱＫＹＳＤＬＧＰＬＹＩＹＱＥ（配列番号１０６）、
ＧＲＥＶＨＱＹＳＤＷＧＰＭＹＩＹＮＥ（配列番号１０７）、
ＧＲＥＶＨＫＮＳＤＷＧＴＬＹＩＹＴＥ（配列番号１０８）、
ＧＲＥＶＱＫＹＳＤＬＧＰＬＹＩＹＡＥ（配列番号１０９）、
ＧＲＥＶＨＬＹＳＤＷＧＰＭＹＩＹＴＥ（配列番号１１０）、
ＧＲＨＶＱＭＹＳＤＬＧＰＬＹＩＦＳＥ（配列番号１１１）、
ＧＲＥＶＨＭＹＳＤＦＧＰＭＹＩＹＴＥ（配列番号１１２）、
ＧＲＥＶＱＫＹＳＤＷＧＰＬＹＩＹＮＥ（配列番号１１３）、
ＧＲＥＶＱＭＹＳＤＬＧＰＬＹＩＹＮＥ（配列番号１１４）、
ＧＲＥＶＱＭＹＳＤＬＧＰＬＹＩＹＴＥ（配列番号１１５）、
ＧＲＨＶＱＩＹＳＤＬＧＰＬＹＩＹＮＥ（配列番号１１６）、
ＧＲＥＶＱＩＹＳＤＷＧＰＬＹＩＹＮＥ（配列番号１１７）、
ＧＲＥＶＱＫＹＳＤＷＧＰＬＹＩＹＱＥ（配列番号１１８）、
ＧＲＨＶＨＬＹＳＥＦＧＰＭＹＩＹＮＥ（配列番号１１９）、
ＧＲＤＶＨＭＹＳＤＷＧＰＭＹＩＹＱＥ（配列番号１２０）、
ＧＲＨＶＱＩＹＳＤＷＧＰＬＹＩＹＮＥ（配列番号１２１）、
ＧＲＹＶＱＬＹＳＤＷＧＰＭＹＩＹＴＥ（配列番号１２２）、
ＧＲＱＶＱＶＦＳＤＬＧＰＬＹＩＹＮＥ（配列番号１２３）、
ＧＲＱＶＱＩＹＳＤＷＧＰＬＹＩＹＮＥ（配列番号１２４）、および
ＧＲＱＶＱＭＹＳＤＷＧＰＬＹＩＹＡＥ（配列番号１２５）。
いくつかの実施形態において、アルブミン結合アドネクチンは配列番号２３−１００、１８４−２０９および２３５−２６０のいずれか一つと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、あるいは、最大１、１−２、１−３、１−５、１−１０または１−２０アミノ酸の差異、例えばアミノ酸の欠失、付加、または置換（例えば、保存的置換）で、これらの配列から異なる。特定の実施形態において、アルブミン結合分子は、配列番号２３−１００、１８４−２０９および２３５−２６０の非ループ領域に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
好ましい実施形態において、アルブミン結合アドネクチンは、配列番号２９、５５、８１、１９０および２４１のいずれか一つに記載されるアミノ酸配列を含む。別の好ましい実施形態において、アルブミン結合アドネクチンは、配列番号３６、６２、８８、１９７および２４８のいずれか一つに記載されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、本発明は、ある特定の位置に導入されたシステイン残基を有する、変異アルブミン結合アドネクチン分子を提供する。例示的なシステイン変異はＡ１２Ｃ、Ａ２６Ｃ、Ｓ５５Ｃ、Ｔ５６ＣおよびＴ５８Ｃである（実施例の表７参照）。好ましい実施形態において、システイン変異はアルブミン結合アドネクチンの、血清アルブミンへの結合を実質的には変化させない。
特定の実施形態において、プロリン残基は１０Ｆｎ３ドメインのＣ末端に、例えば、例として配列番号１８４−２０９および２３５−２６０に示されるように、導入される。特定の実施形態において、プロリン残基は、タンデムアルブミン結合アドネクチンのＣ末端に、例として配列番号１６８および２６１に示されるように、導入される。プロリン残基の付加は、アルブミン結合アドネクチンまたはタンデムアルブミン結合アドネクチンのＣ末端への、さらなるアミノ酸配列の付加を妨げない。
Ｃ．交差競合（Cross-Competing）するアドネクチンおよび／または同一のアドネクチン結合部位に結合するアドネクチン
本明細書では、本明細書に記載の特定のＰＫＥ２アドネクチンと、血清アルブミン（例えば、ＨＳＡ）への結合に対して競合（例えば、交差競合）する、アドネクチンなどのタンパク質、抗体またはその抗原結合フラグメント、小分子、ペプチドなどが提供される。これらの競合タンパク質、例えばアドネクチンは、標準的な血清アルブミン結合アッセイにおいて、本明細書に記載のアドネクチンの血清アルブミン（例えば、ＨＳＡ）への結合を競合的に阻害する能力に基づいて、同定され得る。例えば、標準的なＥＬＩＳＡアッセイが用いられ、本アッセイでは、組換え血清アルブミンタンパク質をプレート上に固定化し、タンパク質の一つを蛍光標識し、非標識タンパク質が標識タンパク質の結合に競合する能力を評価する。
次の例示的な競合アッセイは、本明細書に記載のＰＫＥ２タンパク質の一つと、血清アルブミンへの結合について競合するアドネクチンに関連して、提供される。同じアッセイが、非アドネクチンタンパク質について競合を試験する場合に、実行され得る。ある実施形態において、二つの血清アルブミンアドネクチンが、血清アルブミン（例えば、ＨＳＡ）の重複するアドネクチン結合部位（エピトープ）に結合するかどうかを決定するために、競合ＥＬＩＳＡ形式（competitive ELISA format）が実行され得る。ある形式では、アドネクチン＃１をプレート上にコーティングし、その後ブロックして洗浄する。このプレートに対し、血清アルブミン単独を、あるいは飽和濃度のアドネクチン＃２と事前に培養した血清アルブミンを加える。好ましい培養時間の後、プレートを洗浄してポリクローナル抗血清アルブミン抗体で標識し、続いてストレプトアビジン−ＨＲＰコンジュゲートにより検出し、標準的なテトラメチルベンジジン発色操作を行う。ＯＤシグナルが、アドネクチン＃２との事前培養の有無で同じであれば、二つのアドネクチンは互いに独立して結合し、アドネクチン結合部位は重複していない。しかしながら、血清アルブミン／アドネクチン＃２混合物を受け入れたウェルのＯＤシグナルが血清アルブミン単独を受け入れたウェルよりも低ければ、アドネクチン＃２の結合がアドネクチン＃１の血清アルブミンへの結合をブロックしていることが確認される。
あるいは、同様の実験が、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ、例えばBIAcore）により行われる。アドネクチン＃１をＳＰＲチップ表面に固定化し、その後血清アルブミン単独あるいは飽和濃度のアドネクチン＃２と事前培養した血清アルブミンのいずれかを注入する。血清アルブミン／アドネクチン＃２混合物の結合シグナルが血清アルブミン単独と同じか、より高ければ、二つのアドネクチンは互いに独立して結合し、アドネクチン結合部位は重複していない。しかしながら、血清アルブミン／アドネクチン＃２混合物の結合シグナルが血清アルブミン単独の結合シグナルよりも低ければ、アドネクチン＃２の結合がアドネクチン＃１の血清アルブミンへの結合をブロックしていることが確認される。これらの実験の特色は、飽和濃度のアドネクチン＃２の使用である。血清アルブミンがアドネクチン＃２で飽和していなければ、上記の結論は成立しない。同様の実験が、任意の二つの血清アルブミン結合タンパク質が、重複するアドネクチン結合部位に結合するかどうかを決定するために、用いられ得る。
また、上記に例示したアッセイはどちらも、アドネクチン＃２を固定化し、血清アルブミン−アドネクチン＃１をプレートに加えるという逆の順番で行われてもよい。あるいは、アドネクチン＃1および／または＃２を、モノクローナル抗体および／または可溶性Ｆｃ受容体融合タンパク質により置換することができる。
特定の実施形態において、競合はＨＴＲＦサンドイッチアッセイを用いて決定され得る。
特定の実施形態において、競合アドネクチンは、本明細書に記載の特定のＰＫＥ２アドネクチンと同じ血清アルブミン上のアドネクチン結合部位に結合する、アドネクチンである。標準的なマッピング技術、例えばプロテアーゼマッピング、変異解析、Ｘ線結晶解析および二次元核磁気共鳴が、アドネクチンが参照アドネクチンと同じアドネクチン結合部位に結合するかどうかを決定するために、用いられ得る（例えば、 Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996) を参照されたい）。
競合アルブミン結合タンパク質候補、例えばアドネクチンは、本発明のＰＫＥ２アドネクチンの血清アルブミン（例えば、ＨＳＡ）への結合を、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、あるいは少なくとも９９％、阻害することができる。競合％は、上述した方法を用いて決定できる。
Ｄ．多価／タンデムアドネクチン
ある標的に特異的に結合する１０Ｆｎ３ドメインを二つ以上含む多価タンパク質（アドネクチン）が、本明細書で提供される。例えば、多価タンパク質は共有結合する２つまたは３つ以上の１０Ｆｎ３ドメインを含んでもよい。例示的な実施形態において、多価タンパク質は、二つの１０Ｆｎ３ドメインを含む、二重特異性の、あるいは二量体のタンパク質である。特定の実施形態において、多価タンパク質は、血清アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）に結合する第一の１０Ｆｎ３ドメインと、第二の標的分子（例えば、ＰＣＳＫ９）に結合する第二の１０Ｆｎ３ドメインとを含む。第一および第二の標的分子がいずれも血清アルブミンの場合は、第一および第二の１０Ｆｎ３ドメインが、同じあるいは異なるエピトープに結合してもよい。さらに、第一および第二の標的分子が同じ場合は、標的結合に関連する１０Ｆｎ３ドメインの修飾領域が、同じあるいは異なってもよい。例示的な実施形態において、多価のフィブロネクチンをベースとするタンパク質足場の１０Ｆｎ３ドメインはそれぞれ、５００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、１ｎＭ、５００ｐＭ、１００ｐＭ、あるいはそれより低い値未満のＫＤで、所望の標的と結合する。いくつかの実施形態において、多価のフィブロネクチンをベースとするタンパク質足場の１０Ｆｎ３ドメインはそれぞれ、１ｐＭと１μΜの間、１００ｐＭと５００ｎＭの間、１ｎＭと５００ｎＭの間、あるいは１ｎＭと１００ｎＭの間のＫＤで、所望の標的と結合する。例示的な実施形態において、多価のフィブロネクチンをベースとするタンパク質足場の１０Ｆｎ３ドメインはそれぞれ、野生型１０Ｆｎ３ドメイン、特に野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメインが結合しない標的に特異的に結合する。
多価のフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質の１０Ｆｎ３ドメインは、ポリペプチドリンカーにより連結されてもよい。例示的なポリペプチドリンカーには、１−２０、１−１５、１−１０、１−８、１−５、１−４、１−３、または１−２アミノ酸を有するポリペプチドが含まれる。１０Ｆｎ３ドメインを連結する好適なリンカーは、それぞれのドメインが、互いに独立してフォールドし、標的分子へ高親和性で結合できる三次元構造を形成することを可能にするものである。好適なリンカーの具体例には、グリシン−セリンベースのリンカー、グリシン−プロリンベースのリンカー、プロリン−アラニンベースのリンカー、並びにアミノ酸配列ＰＳＴＰＰＴＰＳＰＳＴＰＰＴＰＳＰＳ（配列番号１５２）を有するリンカーが含まれる。いくつかの実施形態において、リンカーはグリシン−セリンベースのリンカーである。いくつかの実施形態において、リンカーはグリシン−セリンベースのリンカーである。これらのリンカーには、グリシンおよびセリン残基が含まれ、８から５０、１０から３０、および１０から２０の間のアミノ酸の長さであってよい。例には、アミノ酸配列（ＧＳ）７（配列番号１５３）、Ｇ（ＧＳ）６（配列番号１５４）、およびＧ（ＧＳ）７Ｇ（配列番号１５５）を有するリンカーが含まれる。他のリンカーには、グルタミン酸が含まれ、例えば、（ＧＳＥ）５（配列番号１５６）およびＧＧＳＥＧＧＳＥ（配列番号１５７）が含まれる。他の例示的なグリシン−セリンリンカーには、（ＧＳ）４（配列番号１５８）、（ＧＧＧＧＳ）７（配列番号１５９）、（ＧＧＧＧＳ）５（配列番号１６０）、および（ＧＧＧＧＳ）３Ｇ（配列番号１６１）が含まれる。いくつかの実施形態において、リンカーはグリシン−プロリンベースのリンカーである。これらのリンカーには、グリシンおよびプロリン残基が含まれ、３から３０、１０から３０、および３から２０の間のアミノ酸の長さであってよい。例には、アミノ酸配列（ＧＰ）３Ｇ（配列番号１６２）、（ＧＰ）５Ｇ（配列番号１６３）、およびＧＰＧを有するリンカーが含まれる。特定の実施形態において、リンカーは、３から３０、１０から３０、および３から２０のアミノ酸の長さを有するプロリン−アラニンをベースとするリンカーであり得る。プロリン、アラニンをベースとするリンカーの例には、例えば、（ＰＡ）３（配列番号１６４）、（ＰＡ）６（配列番号１６５）および（ＰＡ）９（配列番号１６６）が含まれる。最適なリンカーの長さおよびアミノ酸組成物は、当技術分野において周知の方法による通例の実験法によって決定し得ることが、企図される。例示的な実施形態において、リンカーはいずれのＡｓｐ−Ｌｙｓ（ＤＫ）の組み合わせも含まない。
特定の実施形態において、リンカーはアミノ酸配列ＰＳＰＥＰＰＴＰＥＰ（配列番号１７３）、ＰＳＰＥＰＰＴＰＥＰＰＳＰＥＰＰＴＰＥＰ（配列番号１７４）、ＰＳＰＥＰＰＴＰＥＰＰＳＰＥＰＰＴＰＥＰＰＳＰＥＰＰＴＰＥＰ（配列番号１７５）、またはＰＳＰＥＰＰＴＰＥＰＰＳＰＥＰＰＴＰＥＰＰＳＰＥＰＰＴＰＥＰＰＳＰＥＰＰＴＰＥＰ（配列番号１７６）を有する。通常、リンカーはアミノ酸配列（ＰＳＰＥＰＰＴＰＥＰ）ｎ（配列番号２６２）を含んでもよく、ここでは、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１−５または１−１０である。特定の実施形態において、リンカーはアミノ酸配列ＥＥＥＥＤＥ（配列番号１７７）、ＥＥＥＥＤＥＥＥＥＤＥ（配列番号１７８）、ＥＥＥＥＤＥＥＥＥＤＥＥＥＥＤＥＥＥＥＤＥ（配列番号１７９）、ＥＥＥＥＤＥＥＥＥＤＥＥＥＥＤＥＥＥＥＤＥＥＥＥＤＥＥＥＥＤＥ（配列番号１８０）を有する。通常、リンカーは配列（ＥＥＥＥＤＥ）ｎＥ（配列番号２６３）を含んでもよく、ここでは、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１−５または１−１０である。特定の実施形態において、リンカーはアミノ酸配列ＲＧＧＥＥＫＫＫＥＫＥＫＥＥＱＥＥＲＥＴＫＴＰ（配列番号１８１）を有する。これらのリンカーは、アルブミン結合アドネクチンを、別のポリペプチド（例えば、別のアドネクチン）に連結させるために用いられてもよい。ＰＳＰＥＰＰＴＰＥＰ（配列番号１７３）リンカーの例示的な使用を、以下に示す。
Ｃ末端ポリペプチドに連結したＮ末端アドネクチン：
…ＮＹＲＴＰＧＰＳＰＥＰＰＴＰＥＰ−ポリペプチド（配列番号１８２）
Ｃ末端アドネクチンに連結したＮ末端ポリペプチド：
ポリペプチド−ＰＳＰＥＰＰＴＰＥＰＧＶＳＤＶ…（配列番号１８３）
いくつかの実施形態において、多価アドネクチンは、血清アルブミンに結合する第一の１０Ｆｎ３ドメイン（例えば、ＰＫＥ２アドネクチン）と、特異的標的に結合する第二の１０Ｆｎ３ドメインとを含む、タンデムアドネクチンである。タンデムアドネクチンは、アルブミン結合アドネクチン−ＸおよびＸ−アルブミン結合アドネクチンの立体配置を有してもよく、ここではＸは標的特異的１０Ｆｎ３ドメインである。当業者であれば、これらのタンデムアドネクチンの機能的活性を試験する方法および生物物理学的特性を評価する方法に精通しているであろう。
ある局面において、本発明は第一のフィブロネクチンＩＩＩ型第１０（１０Ｆｎ３）ドメインおよび第二の１０Ｆｎ３ドメインを含む融合ポリペプチドであって、第一の１０Ｆｎ３ドメインは、ａ）ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、およびＦＧループ、ｂ）対応するヒト１０Ｆｎ３ドメインのＣＤループの配列と比較して変化したアミノ酸配列を持つＣＤループを含み、かつｃ）ポリペプチドが５００ｎＭより小さいＫＤでヒト血清アルブミンに結合する融合ポリペプチドを提供する。「第一」のドメインおよび「第二」のドメインは、Ｎ末端からＣ末端の方向、あるいはＣ末端からＮ末端の方向で存在し得る。
例えば多価アドネクチンの、いくつかの実施形態において、第一の１０Ｆｎ３ドメインは、配列番号２３−１００、１８４−２０９および２３５−２６０のいずれか一つと、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含むか、あるいは、例えばアミノ酸の欠失、付加、または置換（例えば保存的アミノ酸置換）により、これらの配列から最大で１、１−２、１−５、１−１０または１−２０アミノ酸が異なる。
いくつかの実施形態において、第一の１０Ｆｎ３ドメインは、配列番号２３−１００、１８４−２０９および２３５−２６０のいずれか一つのアミノ酸配列を含む。
好ましい実施形態において、第一の１０Ｆｎ３ドメインは、配列番号２９、５５、８１、１９０または２４１のアミノ酸配列を含む。別の好ましい実施形態において、第一の１０Ｆｎ３ドメインは、配列番号３６、６２、８８、１９７または２４８のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、多価アドネクチンは、血清アルブミン以外の標的タンパク質に特異的に結合する１０Ｆｎ３ドメインである、第二の１０Ｆｎ３ドメインを含む。
好ましい実施形態において、第二の１０Ｆｎ３ドメインは特異的にＰＣＳＫ９に結合する。
従って、ある実施形態において、第二の１０Ｆｎ３ドメインは、配列番号１６８または２６１に少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含むか、あるいは、例えばアミノ酸の欠失、付加、または置換（例えば保存的アミノ酸置換）により、これらの配列から最大で１、１−２、１−５、１−１０または１−２０アミノ酸が異なる。ＰＣＳＫ９に結合する、さらなる好適な１０Ｆｎ３ドメインは、例えばＷＯ２０１１／１３０３５４において開示され、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
ある実施形態において、第二の１０Ｆｎ３ドメインは配列番号１６８または２６１に記載されるアミノ酸配列を有する。
特定の実施形態において、本発明は、配列番号１６８または２６１に記載されるアミノ酸配列を含むＰＣＳＫ９−血清アルブミン結合タンデムアドネクチン、並びにこれらの配列に少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を持つＰＣＳＫ９−血清アルブミンタンデムアドネクチン、あるいは、例えばアミノ酸の欠失、付加または置換（例えば、保存的アミノ酸置換）により、これらの配列から最大で１、１−２、１−５、１−１０または１−２０アミノ酸が異なるアミノ酸配列を持つＰＣＳＫ９−血清アルブミンタンデムアドネクチンであって、ＰＣＳＫ９および血清アルブミンへの結合を保持しているタンデムアドネクチンを提供する。
ある実施形態において、本発明は、配列番号１７２に記載される核酸配列、並びに本配列に少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一の核酸配列を含む、ＰＣＳＫ９−血清アルブミン結合タンデムアドネクチンをコードする核酸であって、コードされたＰＣＳＫ９−血清アルブミン結合タンデムアドネクチンが、ＰＣＳＫ９および血清アルブミンへの結合を保持している核酸を提供する。いくつかの実施形態において、ヌクレオチドの置換は、結果として生じるアミノ酸配列を変化させない（すなわち、サイレント変異）。
ある局面において、本明細書に記載の血清アルブミン結合ベースタンデムアドネクチン（例えば、ＰＣＳＫ９−ＰＫＥ２タンデムアドネクチン）は、３μＭ、２．５μＭ、２μＭ、１．５μＭ、１μＭ、５００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、５００ｐＭ、１００ｐＭ、１００ｐＭ、５０ｐＭ、または１０ｐＭ未満のＫＤで、ヒト血清アルブミンに結合する。ＫＤは、例えば、０．１ｎＭ−５０ｎＭ、０．１ｎＭ−１００ｎＭ、０．１ｎＭ−１μＭ、０．５ｎＭ−５０ｎＭ、０．５ｎＭ−１００ｎＭ、０．５ｎＭ−１μＭ、１ｎＭ−５０ｎＭ、１ｎＭ−１００ｎＭまたは１ｎＭ−１μＭの範囲であってよい。
特定の実施形態において、本明細書に記載の血清アルブミン結合ベースタンデムアドネクチン（例えば、ＰＣＳＫ９−ＰＫＥ２タンデムアドネクチン）はまた、カニクイザル、アカゲザル、ラットまたはマウスのうちの一つ以上に由来する血清アルブミンに結合し得る。
特定の実施形態において、本明細書に記載の血清アルブミン結合ベースタンデムアドネクチン（例えば、ＰＣＳＫ９−ＰＫＥ２タンデムアドネクチン）はまた、３μＭ、２．５μＭ、２μＭ、１．５μＭ、１μＭ、５００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、５００ｐＭまたは１００ｐＭ未満のＫＤで、アカゲザル血清アルブミン（ＲｈＳＡ）またはカニクイザル血清アルブミン（ＣｙＳＡ）に結合する。ＫＤは、例えば、０．１ｎＭ−５０ｎＭ、０．１ｎＭ−１００ｎＭ、０．１ｎＭ−１μＭ、０．５ｎＭ−５０ｎＭ、０．５ｎＭ−１００ｎＭ、０．５ｎＭ−１μＭ、１ｎＭ−５０ｎＭ、１ｎＭ−１００ｎＭまたは１ｎＭ−１μＭの範囲であってよい。
特定の実施形態において、本明細書に記載の血清アルブミン結合ベースタンデムアドネクチン（例えば、ＰＣＳＫ９−ＰＫＥ２タンデムアドネクチン）は、３μＭ、２．５μＭ、２μＭ、１．５μＭ、１μＭ、５００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、５００ｐＭまたは１００ｐＭ未満のＫＤで、アカゲザル血清アルブミン（ＲｈＳＡ）、カニクイザル血清アルブミン（ＣｙＳＡ）、およびマウス血清アルブミン（ＭＳＡ）に結合する。ＫＤは、例えば、０．１ｎＭ−５０ｎＭ、０．１ｎＭ−１００ｎＭ、０．１ｎＭ−１μＭ、０．５ｎＭ−５０ｎＭ、０．５ｎＭ−１００ｎＭ、０．５ｎＭ−１μＭ、１ｎＭ−５０ｎＭ、１ｎＭ−１００ｎＭまたは１ｎＭ−１μＭの範囲であってよい。
特定の実施形態において、本明細書に記載の血清アルブミン結合ベースタンデムアドネクチン(例えば、ＰＣＳＫ９−ＰＫＥ２タンデムアドネクチン)は、３μＭ、２．５μＭ、２μＭ、１．５μＭ、１μＭ、５００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、５００ｐＭまたは１００ｐＭ未満のＫＤで、アカゲザル血清アルブミン（ＲｈＳＡ）、カニクイザル血清アルブミン（ＣｙＳＡ）、マウス血清アルブミン（ＭＳＡ）、およびラット血清アルブミン（ＲＳＡ）に結合する。ＫＤは、例えば、０．１ｎＭ−５０ｎＭ、０．１ｎＭ−１００ｎＭ、０．１ｎＭ−１μＭ、０．５ｎＭ−５０ｎＭ、０．５ｎＭ−１００ｎＭ、０．５ｎＭ−１μＭ、１ｎＭ−５０ｎＭ、１ｎＭ−１００ｎＭまたは１ｎＭ−１μＭの範囲であってよい。
特定の実施形態において、本明細書に記載の血清アルブミン結合ベースタンデムアドネクチン（例えば、ＰＣＳＫ９−ＰＫＥ２タンデムアドネクチン）は、５．５から７．４のｐＨ範囲で、血清アルブミンに結合する。
特定の実施形態において、本明細書に記載のタンデム血清アルブミン結合ベースアドネクチン（例えば、ＰＣＳＫ９−ＰＫＥ２タンデムアドネクチン）は、ヒト血清アルブミンのドメインＩ−ＩＩに結合する。
特定の実施形態において、本明細書に記載のタンデム血清アルブミン結合ベースアドネクチン（例えば、ＰＣＳＫ９−ＰＫＥ２タンデムアドネクチン）は、ヒト血清アルブミン、カニクイザル血清アルブミン、アカゲザル血清アルブミン、マウス血清アルブミン、および／またはラット血清アルブミンの存在下で、少なくとも１時間、２時間、５時間、１０時間、２０時間、３０時間、４０時間、５０時間、６０時間、７０時間、８０時間、９０時間、１００時間、１５０時間、２００時間、または少なくとも約３００時間の血清半減期を有する。特定の実施形態において、本明細書に記載のタンデム血清アルブミン結合ベースアドネクチン（例えば、ＰＣＳＫ９−ＰＫＥ２タンデムアドネクチン）は、ヒト血清アルブミン、カニクイザル血清アルブミン、アカゲザル血清アルブミン、マウス血清アルブミン、および／またはラット血清アルブミンの存在下で、１−３００時間、例えば１−２５０時間、１−２００時間、１−１５０時間、１−１００時間、１−９０時間、１−８０時間、１−７０時間、１−６０時間、１−５０時間、１−４０時間、１−３０時間、１−２０時間、１−１０時間、１−５時間、５−３００時間、１０−３００時間、２０−３００時間、３０−３００時間、４０−３００時間、５０−３００時間、６０−３００時間、７０−３００時間、８０−３００時間、９０−３００時間、１００−３００時間、１５０−３００時間、２００−３００時間、２５０−３００時間、５−２５０時間、１０−２００時間、５０−１５０時間、または８０−１２０時間の血清半減期を有する。
特定の実施形態において、血清アルブミンベースタンデムアドネクチンのパートナーアドネクチン（例えば、ＰＣＳＫ９−ＰＫＥ２タンデムアドネクチンの場合はＰＣＳＫ９アドネクチン）の血清半減期は、血清アルブミン結合アドネクチンに結合していない場合のパートナーアドネクチンの血清半減期と比較して増加する。特定の実施形態において、血清アルブミンベースタンデムアドネクチンの血清半減期は、血清アルブミン結合アドネクチンに融合していない場合のパートナーアドネクチンの血清半減期と比較して、少なくとも２０、４０、６０、８０、１００、１２０、１５０、１８０、２００、４００、６００、８００、１０００、１２００、１５００、１８００、１９００、２０００、２５００、または３０００％長い。特定の実施形態において、血清アルブミンベースタンデムアドネクチンの血清半減期は、血清アルブミン結合アドネクチンに融合していない場合のパートナーアドネクチンの血清半減期と比較して、２０−３０００％、例えば４０−３０００％、６０−３０００％、８０−３０００％、１００−３０００％、１２０−３０００％、１５０−３０００％、１８０−３０００％、２００−３０００％、４００−３０００％、６００−３０００％、８００−３０００％、１０００−３０００％、１２００−３０００％、１５００−３０００％、１８００−３０００％、１９００−３０００％、２０００−３０００％、２５００−３０００％、２０−２５００％、２０−２０００％、２０−１９００％、２０−１８００％、２０−１５００％、２０−１２００％、２０−１０００％、２０−８００％、２０−６００％、２０−４００％、２０−２００％、２０−１８０％、２０−１５０％、２０−１２０％、２０−１００％、２０−８０％、２０−６０％、２０−４０％、５０−２５００％、１００−２０００％、１５０−１５００％、２００−１０００％、４００−８００％、または５００−７００％長い。特定の実施形態において、血清アルブミン結合ベースタンデムアドネクチンの血清半減期は、血清アルブミン結合アドネクチンに融合していない場合のパートナーアドネクチンの血清半減期より、少なくとも１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５−倍、５倍、６倍、７倍、８倍、１０倍、１２倍、１３倍、１５倍、１７倍、２０倍、２２倍、２５倍、２７倍、３０倍、３５倍、４０倍、または５０倍長い。特定の実施形態において、血清アルブミン結合ベースタンデムアドネクチンの血清半減期は、血清アルブミン結合アドネクチンに融合していない場合のパートナーアドネクチンの血清半減期より、１．５−５０倍、例えば１．５−４０倍、１．５−３５倍、１．５−３０倍、１．５−２７倍、１．５−２５倍、１．５−２２倍、１．５−２０倍、１．５−１７倍、１．５−１５倍、１．５−１３倍、１．５−１２倍、１．５−１０倍、１．５−９倍、１．５−８倍、１．５−７倍、１．５−６倍、１．５−５倍、１．５−４．５倍、１．５−４倍、１．５−３．５倍、１．５−３倍、１．５−２．５倍、１．５−２倍、２−５０倍、２．５−５０倍、３−５０倍、３．５−５０倍、４−５０倍、４．５−５０倍、５−５０倍、６−５０倍、７−５０倍、８−５０倍、１０−５０倍、１２−５０倍、１３−５０倍、１５−５０倍、１７−５０倍、２０−５０倍、２２−５０倍、２５−５０倍、２７−５０倍、３０−５０倍、４０−５０倍、２−４０倍、５−３５倍、１０−２０倍、または１０−１５倍長い。特定の実施形態において、血清アルブミン結合ベースタンデムアドネクチンの血清半減期は、少なくとも２時間、２．５時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１５時間、２０時間、２５時間、３０時間、３５時間、４０時間、５０時間、６０時間、７０時間、８０時間、９０時間、１００時間、１１０時間、１２０時間、１３０時間、１３５時間、１４０時間、１５０時間、１６０時間、または２００時間である。特定の実施形態において、血清アルブミン結合ベースタンデムアドネクチンの血清半減期は、２−２００時間、２．５−２００時間、３−２００時間、４−２００時間、５−２００時間、６−２００時間、７−２００時間、８−２００時間、９−２００時間、１０−２００時間、１５−２００時間、２０−２００時間、２５−２００時間、３０−２００時間、３５−２００時間、４０−２００時間、５０−２００時間、６０−２００時間、７０−２００時間、８０−２００時間、９０−２００時間、１００−２００時間、１２５−２００時間、１５０−２００時間、１７５−２００時間、１９０−２００時間、２−１９０時間、２−１７５時間、２−１５０時間、２−１２５時間、２−１００時間、２−９０時間、２−８０時間、２−７０時間、２−６０時間、２−５０時間、２−４０時間、２−３５時間、２−３０時間、２−２５時間、２−２０時間、２−１５時間、２−１０時間、２−９時間、２−８時間、２−７時間、２−６時間、２−５時間、２−４時間、２−３時間、５−１７５時間、１０−１５０時間、１５−１２５時間、２０−１００時間、２５−７５時間、または３０−６０時間である。
Ｅ．血清アルブミン結合アドネクチンの複合物
本発明の特定の局面は、血清アルブミン結合アドネクチンと、少なくとも一つの付加部分（例えば、治療用部分）とを含む複合物を提供する。付加部分は、診断、イメージング、または治療のいずれかの目的のために、有用であり得る。
いくつかの実施形態において、血清アルブミン結合アドネクチンは、有機小分子、核酸、ペプチド、またはタンパク質である第二の部分に融合している。いくつかの実施形態において、血清アルブミン結合アドネクチンは、受容体、受容体リガンド、ウイルスコートタンパク質、免疫系タンパク質、ホルモン、酵素、抗原、または細胞シグナルタンパク質を標的とする治療用部分に融合している。本融合は、血清アルブミン結合アドネクチンのどちらかの末端に第二の部分を結合させることにより、形成され得る。すなわち、血清アルブミン結合アドネクチン−治療用分子あるいは治療用分子−血清アルブミン結合アドネクチンの並びである。
特定の実施形態において、血清アルブミン結合アドネクチンに融合した部分の血清半減期は、血清アルブミン結合アドネクチンに結合しない場合の当該部分の血清半減期と比較して、増加する。特定の実施形態において、血清アルブミン結合アドネクチン融合物の血清半減期は、血清アルブミン結合アドネクチンに融合していない場合の当該部分の血清半減期と比較して、少なくとも２０、４０、６０、８０、１００、１２０、１５０、１８０、２００、４００、６００、８００、１０００、１２００、１５００、１８００、１９００、２０００、２５００、または３０００％長い。特定の実施形態において、血清アルブミン結合アドネクチン融合物の血清半減期は、血清アルブミン結合アドネクチンに融合しない場合の当該部分の血清半減期と比較して、２０−３０００％、例えば４０−３０００％、６０−３０００％、８０−３０００％、１００−３０００％、１２０−３０００％、１５０−３０００％、１８０−３０００％、２００−３０００％、４００−３０００％、６００−３０００％、８００−３０００％、１０００−３０００％、１２００−３０００％、１５００−３０００％、１８００−３０００％、１９００−３０００％、２０００−３０００％、２５００−３０００％、２０−２５００％、２０−２０００％、２０−１９００％、２０−１８００％、２０−１５００％、２０−１２００％、２０−１０００％、２０−８００％、２０−６００％、２０−４００％、２０−２００％、２０−１８０％、２０−１５０％、２０−１２０％、２０−１００％、２０−８０％、２０−６０％、２０−４０％、５０−２５００％、１００−２０００％、１５０−１５００％、２００−１０００％、４００−８００％、または５００−７００％長い。特定の実施形態において、ＰＫＥ２アドネクチン融合物の血清半減期は、血清アルブミン結合アドネクチンに融合していない場合の当該部分の血清半減期よりも、少なくとも１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、１０倍、１２倍、１３倍、１５倍、１７倍、２０倍、２２倍、２５倍、２７倍、３０倍、３５倍、４０倍、または５０倍長い。特定の実施形態において、ＰＫＥ２アドネクチン融合物の血清半減期は、血清アルブミン結合アドネクチンに融合していない場合の当該部分の血清半減期よりも、１．５−５０倍、例えば１．５−４０倍、１．５−３５倍、１．５−３０倍、１．５−２７倍、１．５−２５倍、１．５−２２倍、１．５−２０倍、１．５−１７倍、１．５−１５倍、１．５−１３倍、１．５−１２倍、１．５−１０倍、１．５−９倍、１．５−８倍、１．５−７倍、１．５−６倍、１．５−５倍、１．５−４．５倍、１．５−４倍、１．５−３．５倍、１．５−３倍、１．５−２．５倍、１．５−２倍、２−５０倍、２．５−５０倍、３−５０倍、３．５−５０倍、４−５０倍、４．５−５０倍、５−５０倍、６−５０倍、７−５０倍、８−５０倍、１０−５０倍、１２−５０倍、１３−５０倍、１５−５０倍、１７−５０倍、２０−５０倍、２２−５０倍、２５−５０倍、２７−５０倍、３０−５０倍、４０−５０倍、２−４０倍、５−３５倍、１０−２０倍、または１０−１５倍大きい。いくつかの実施形態において、血清アルブミン結合アドネクチン融合物の血清半減期は、少なくとも２時間、２．５時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１５時間、２０時間、２５時間、３０時間、３５時間、４０時間、５０時間、６０時間、７０時間、８０時間、９０時間、１００時間、１１０時間、１２０時間、１３０時間、１３５時間、１４０時間、１５０時間、１６０時間、または２００時間である。特定の実施形態において、血清アルブミン結合アドネクチン融合物の血清半減期は、２−２００時間、２．５−２００時間、３−２００時間、４−２００時間、５−２００時間、６−２００時間、７−２００時間、８−２００時間、９−２００時間、１０−２００時間、１５−２００時間、２０−２００時間、２５−２００時間、３０−２００時間、３５−２００時間、４０−２００時間、５０−２００時間、６０−２００時間、７０−２００時間、８０−２００時間、９０−２００時間、１００−２００時間、１２５−２００時間、１５０−２００時間、１７５−２００時間、１９０−２００時間、２−１９０時間、２−１７５時間、２−１５０時間、２−１２５時間、２−１００時間、２−９０時間、２−８０時間、２−７０時間、２−６０時間、２−５０時間、２−４０時間、２−３５時間、２−３０時間、２−２５時間、２−２０時間、２−１５時間、２−１０時間、２−９時間、２−８時間、２−７時間、２−６時間、２−５時間、２−４時間、２−３時間、５−１７５時間、１０−１５０時間、１５−１２５時間、２０−１００時間、２５−７５時間、または３０−６０時間である。
特定の実施形態において、血清アルブミン結合アドネクチン融合タンパク質は、３μＭ、２．５μＭ、２μＭ、１．５μＭ、１μＭ、５００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、５００ｐＭ、１００ｐＭ、１００ｐＭ、５０ｐＭまたは１０ｐＭよりも小さいＫＤで、ＨＳＡに結合する。ＫＤは、例えば、０．１ｎＭ−５０ｎＭ、０．１ｎＭ−１００ｎＭ、０．１ｎＭ−１μＭ、０．５ｎＭ−５０ｎＭ、０．５ｎＭ−１００ｎＭ、０．５ｎＭ−１μＭ、１ｎＭ−５０ｎＭ、１ｎＭ−１００ｎＭまたは１ｎＭ−１μＭの範囲であってよい。
いくつかの実施形態において、治療用部分は、本明細書に記載の通り、重合体のリンカーを介して血清アルブミン結合アドネクチンに、直接あるいは間接的に、連結させてもよい。重合体のリンカーは、一つ以上の、次の特徴をもつタンパク質融合物を作成するために、融合物の各構成成分間の距離を至適に変化させる上で使用することができる。：１）目的のタンパク質に結合させる場合の、一つ以上のタンパク質ドメインの結合の立体障害の減少または増加、２）タンパク質の安定性または溶解性の増加、３）タンパク質凝集の減少、４）タンパク質の全体的な結合力または親和性の増加。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の融合物は、血液または標的組織中のプロテアーゼにより切断可能なプロテアーゼ部位をもつポリペプチドリンカーを介して、血清アルブミン結合アドネクチンに連結している。これらの実施形態は、より優れた送達または治療特性のため、あるいはより効率的な生産のための、治療用タンパク質の放出に用いることができる。
さらなるリンカーまたはスペーサーが、１０Ｆｎ３ドメインとポリペプチドリンカーとの間の、１０Ｆｎ３ドメインのＣ末端に導入されてもよい。
いくつかの実施形態において、治療用部分は、ポリマー糖などの生体適合性ポリマーを介して、血清アルブミン結合アドネクチンに連結される。ポリマー糖は、血液または標的組織中において酵素により切断可能な切断部位を含み得る。これらの実施形態は、より優れた送達または治療特性のため、あるいはより効率的な生産のための、治療用タンパク質の放出に用いることができる。
本明細書に記載の血清アルブミン結合アドネクチン融合分子は、治療用部分と血清アルブミン結合アドネクチンの間に融合を生み出すことにより治療用部分の半減期を増加させる上で有用である。これらの融合分子は、融合物に含まれる治療用部分の生物活性に応答する症状を治療する上で、使用することができる。本発明は、以下のタンパク質または分子のいずれかの調節異常により引き起こされる疾病において、血清アルブミン結合Ｆｎ３融合分子の利用を企図するものである。
例示的な実施形態において、血清アルブミン結合アドネクチンに（Ｃ末端あるいはＮ末端のいずれかで）連結する治療用部分は、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ｒ１、ＶＥＧＦ−Ｒ２、ＶＥＧＦ−Ｒ３、Ｈｅｒ−１、Ｈｅｒ−２、Ｈｅｒ−３、ＥＧＦ−Ｉ、ＥＧＦ−２、ＥＧＦ−３、α３、ｃＭｅｔ、ＩＣＯＳ、ＣＤ４０Ｌ、ＬＦＡ−Ｉ、ｃ−Ｍｅｔ、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ−Ｉ、ＩＬ−６、Ｂ７．１、Ｗ１．２、ＯＸ４０、ＩＬ−１ｂ、ＴＡＣＩ、ＩｇＥ、ＢＡＦＦまたはＢＬｙｓ、ＴＰＯ−Ｒ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ２８、ＩＬ−Ｉ−Ｒ１、ＴＮＦ−α、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、補体受容体１、ＦＧＦａ、オステオポンチン、ビトロネクチン、エフリンＡ１−Ａ５、エフリンＢ１−Ｂ３、α−２−マクログロブリン、ＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ６、ＣＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５、ＣＸＣＬ１６、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＰＤＧＦ、ＴＧＦｂ、ＧＭＣＳＦ、ＳＣＦ、ｐ４０（ＩＬ１２／ＩＬ２３）、ＩＬ１ｂ、ＩＬ１ａ、ＩＬ１ｒａ、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＬ１Ｏ、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ２３、Ｆａｓ、ＦａｓＬ、Ｆｌｔ３リガンド、４１ＢＢ、ＡＣＥ、ＡＣＥ−２、ＫＧＦ、ＦＧＦ−７、ＳＣＦ、ネトリン１，２、ＩＦＮａ，ｂ，ｇ、カスパーゼ２，３，７，８，１０、ＡＤＡＭ Ｓ１，Ｓ５，８，９，１５，ＴＳ１，ＴＳ５；アディポネクチン、ＡＬＣＡＭ、ＡＬＫ−Ｉ、ＡＰＲＩＬ、アネキシンＶ、アンギオゲニン、アンフィレギュリン、アンジオポエチン１，２，４、Ｂ７−１／ＣＤ８０、Ｂ７−２／ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ１、Ｂ７−Ｈ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂｃｌ−２、ＢＡＣＥ−Ｉ、ＢＡＫ、ＢＣＡＭ、ＢＤＮＦ、ｂＮＧＦ、ｂＥＣＧＦ、ＢＭＰ２，３，４，５，６，７，８；ＣＲＰ、カドヘリン６，８，１１；カテプシンＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｌ，Ｓ，Ｖ，Ｘ；ＣＤ１１ａ／ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−３、ＧＰ２ｂ３ａ、ＧＨ受容体、ＲＳＶ Ｆタンパク質、ＩＬ−２３（ｐ４０、ｐ１９）、ＩＬ−１２、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、α４−β１、α４−β７、ＴＮＦ／リンフォトキシン、ＩｇＥ、ＣＤ３、ＣＤ２０、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、ＢＬＹＳ／ＢＡＦＦ、ＩＬ−２Ｒ、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ジゴキシン、Ｒｈｏ（Ｄ）、水痘（Varicella）、肝炎（Hepatitis）、ＣＭＶ、破傷風（Tetanus）、ワクシニア（Vaccinia）、抗毒素（Antivenom）、ボツリヌス（Botulinum）、Ｔｒａｉｌ−Ｒ１、Ｔｒａｉｌ−Ｒ２、ｃＭｅｔ、ＴＮＦ−Ｒファミリー、例えばＬＡ ＮＧＦ−Ｒ、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ９５、リンフォトキシンａ／ｂ受容体、ＷｓＩ−Ｉ、ＴＬ１Ａ／ＴＮＦＳＦ１５、ＢＡＦＦ、ＢＡＦＦ−Ｒ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ、ＴＲＡＩＬ Ｒ２／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＴＲＡＩＬ Ｒ２／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、Ｆａｓ／ＴＮＦＲＳＦ６ＣＤ２７／ＴＮＦＲＳＦ７、ＤＲ３／ＴＮＦＲＳＦ２５、ＨＶＥＭ／ＴＮＦＲＳＦ１４、ＴＲＯＹ／ＴＮＦＲＳＦ１９、ＣＤ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ５、ＢＣＭＡ／ＴＮＦＲＳＦ１７、ＣＤ３０／ＴＮＦＲＳＦ８、ＬＩＧＨＴ／ＴＮＦＳＦ１４、４−１ＢＢ／ＴＮＦＲＳＦ９、ＣＤ４０／ＴＮＦＲＳＦ５、ＧＩＴＲ／［γ］ＮＦＲＳＦ１８、オステオプロテゲリン／ＴＮＦＲＳＦ１ ＩＢ、ＲＡＮＫ／ＴＮＦＲＳＦ１ＩＡ、ＴＲＡＩＬ Ｒ３／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ、ＴＲＡＩＬ／ＴＮＦＳＦＩＯ、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫ Ｌ／ＴＮＦＳＦ１１、４−１ＢＢリガンド／ＴＮＦＳＦ９、ＴＷＥＡＫ／ＴＮＦＳＦ１２、ＣＤ４０リガンド／ＴＮＦＳＦＳ、Ｆａｓリガンド／ＴＮＦＳＦ６、ＲＥＬＴ／ＴＮＦＲＳＦ１９Ｌ、ＡＰＲＩＬ／ＴＮＦＳＦ１３、ＤｃＲ３／ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ、ＴＮＦ ＲＩ／ＴＮＦＲＳＦＩＡ、ＴＲＡＩＬ Ｒ１／ＴＮＦＲＳＦＩＯＡ、ＴＲＡＩＬ Ｒ４／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ、ＣＤ３０リガンド／ＴＮＦＳＦ８、ＧＩＴＲリガンド／ＴＮＦＳＦ１８、ＴＮＦＳＦ１８、ＴＡＣＩ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ、ＮＧＦ Ｒ／ＴＮＦＲＳＦ１６、ＯＸ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ４、ＴＲＡＩＬ Ｒ２／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＴＲＡＩＬ Ｒ３／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ、ＴＷＥＡＫ Ｒ／ＴＮＦＲＳＦ１２、ＢＡＦＦ／ＢＬｙＳ／ＴＮＦＳＦ１３、ＤＲ６／ＴＮＦＲＳＦ２１、ＴＮＦ−α／ＴＮＦＳＦ１ Ａ、Ｐｒｏ−ＴＮＦ−α／ＴＮＦＳＦ１Ａ、リンフォトキシンβ Ｒ／ＴＮＦＲＳＦ３、リンフォトキシンβ Ｒ （ＬＴｂＲ）／Ｆｃキメラ、ＴＮＦ ＲＩ／ＴＮＦＲＳＦＩＡ、ＴＮＦ−β／ＴＮＦＳＦ１Ｂ、ＰＧＲＰ−Ｓ、ＴＮＦ ＲＩ／ＴＮＦＲＳＦＩＡ、ＴＮＦ ＲＩＩ／ＴＮＦＲＳＦＩＢ、ＥＤＡ−Ａ２、ＴＮＦ−α／ＴＮＦＳＦＩＡ、ＥＤＡＲ、ＸＥＤＡＲ、ＴＮＦ ＲＩ／ＴＮＦＲＳＦＩＡである。
例示的な実施形態において、血清アルブミン結合アドネクチンに（Ｃ末端あるいはＮ末端のいずれかで）連結する治療用部分は、以下のタンパク質またはこれらのタンパク質に結合するタンパク質のいずれかである：４ＥＢＰ１、１４−３−３ζ、５３ＢＰ１、２Ｂ４／ＳＬＡＭＦ４、ＣＣＬ２１／６Ｃｋｉｎｅ、４−１ＢＢ／ＴＮＦＲＳＦ９、８Ｄ６Ａ、４−１ＢＢ リガンド／ＴＮＦＳＦ９、８−オキソ−ｄＧ、４−アミノ−１，８−ナフタルイミド、Ａ２Ｂ５、アミノペプチダーゼＬＲＡＰ／ＥＲＡＰ２、Ａ３３、アミノペプチダーゼ Ｎ／ＡＮＰＥＰ、Ａａｇ、アミノペプチダーゼ Ｐ２／ＸＰＮＰＥＰ２、ＡＢＣＧ２、アミノペプチダーゼ Ｐ１／ＸＰＮＰＥＰ１、ＡＣＥ、アミノペプチダーゼ ＰＩＬＳ／ＡＲＴＳ１、ＡＣＥ−２、アムニオンレス（Amnionless）、アクチン、アンフィレギュリン、β−アクチン、ＡＭＰＫα１／２，アクチビンＡ、ＡＭＰＫα１、アクチビン ＡＢ、ＡＭＰＫ α ２，アクチビン Ｂ、ＡＭＰＫβ１，アクチビン Ｃ、ＡＭＰＫβ２，アクチビン ＲＩＡ／ＡＬＫ−２、アンドロゲンＲ／ＮＲ３Ｃ４，アクチビン ＲＩＢ／ＡＬＫ−４、アンギオゲニン、アクチビン ＲＩＩＡ、アンジオポエチン−１，アクチビン ＲＩＩＢ、アンジオポエチン−２、ＡＤＡＭＳ、アンジオポエチン−３、ＡＤＡＭ９、アンジオポエチン−４、ＡＤＡＭ１Ｏ、アンジオポエチン様 １、ＡＤＡＭ１２、アンジオポエチン様 ２、ＡＤＡＭ１５、アンジオポエチン様 ３、ＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７、アンジオポエチン様 ４、ＡＤＡＭ１９、アンジオポエチン様 ７／ＣＤＴ６、ＡＤＡＭ３３、アンジオスタチン、ＡＤＡＭＴＳ４、アネキシン Ａ１／アネキシン Ｉ、ＡＤＡＭＴＳ５、アネキシン Ａ７、ＡＤＡＭＴＳ１、アネキシン Ａ１０、ＡＤＡＭＴＳＬ−１／パンクチン（Punctin）、アネキシン Ｖ、アディポネクチン／Ａｃｒｐ３０、ＡＮＰ、ＡＥＢＳＦ、ＡＰサイト（AP Site）、アグリカン、ＡＰＡＦ−Ｉ、アグリン、ＡＰＣ、ＡｇＲＰ、ＡＰＥ、ＡＧＴＲ−２、ＡＰＪ、ＡＩＦ、ＡＰＬＰ−Ｉ、Ａｋｔ、ＡＰＬＰ−２、Ａｋｔ１、アポリポタンパク質ＡＩ、Ａｋｔ２、アポリポタンパク質Ｂ、Ａｋｔ３、ＡＰＰ，血清アルブミン、ＡＰＲＩＬ／ＴＮＦＳＦ１３、ＡＬＣＡＭ、ＡＲＣ、ＡＬＫ−Ｉ、アルテミン、ＡＬＫ−７、アリールスルファターゼＡＪＡＲＳＡ、アルカリホスファターゼ、ＡＳＡＨ２／Ｎ−アシルスフィンゴシンアミドヒドロラーゼ−２、α２ｕ−グロブリン、ＡＳＣ、α−１−酸性糖タンパク質、ＡＳＧＲ１、α−フェトプロテイン、ＡＳＫ１、ＡＬＳ、ＡＴＭ、エナメル芽細胞ＡＴＲＩＰ、ＡＭＩＣＡ／ＪＡＭＬ、オーロラ（Aurora）Ａ、ＡＭＩＧＯ、オーロラＢ、ＡＭＩＧ０２、アキシン（Axin）−１、ＡＭＩＧ０３、ＡｘＩ、アミノアシラーゼ／ＡＣＹ１、アズロシジン／ＣＡＰ３７／ＨＢＰ、アミノペプチダーゼ Ａ／ＥＮＰＥＰ、Ｂ４ＧＡＬＴ１、ＢＩＭ、Ｂ７−１／ＣＤ８０、６−ビオチン−１７−ＮＡＤ、Ｂ７−２／ＣＤ８６、ＢＬＡＭＥ／ＳＬＡＭＦ８、Ｂ７−Ｈ１／ＰＤ−Ｌ１、ＣＸＣＬ１３／ＢＬＣ／ＢＣＡ−１、Ｂ７−Ｈ２、ＢＬＩＭＰ１、Ｂ７−Ｈ３、ＢＩｋ、Ｂ７−Ｈ４、ＢＭＩ−Ｉ、ＢＡＣＥ−Ｉ、ＢＭＰ−１／ＰＣＰ、ＢＡＣＥ−２、ＢＭＰ−２、Ｂａｄ、ＢＭＰ−３、ＢＡＦＦ／ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＢＭＰ−３ｂ／ＧＤＦ−１０、ＢＡＦＦ Ｒ／ＴＮＦＲＳＦ １３Ｃ、ＢＭＰ−４、Ｂａｇ−１、ＢＭＰ−５、ＢＡＫ、ＢＭＰ−６、ＢＡＭＢＩ／ＮＭＡ、ＢＭＰ−７、ＢＡＲＤ １、ＢＭＰ−８、Ｂａｘ、ＢＭＰ−９、ＢＣＡＭ、ＢＭＰ−１０、Ｂｃｌ−１０、ＢＭＰ−１５／ＧＤＦ−９Ｂ、Ｂｃｌ−２、ＢＭＰＲ−ＩＡ／ＡＬＫ−３、Ｂｃｌ−２ 関連タンパク質 Ａ１、ＢＭＰＲ−ＩＢ／ＡＬＫ−６、Ｂｃｌ−ｗ、ＢＭＰＲ−ＩＩ、Ｂｃｌ−ｘ、ＢＮＩＰ３Ｌ、Ｂｃｌ−ｘＬ、ＢＯＣ、ＢＣＭＡ／ＴＮＦＲＳＦ１７、ＢＯＫ、ＢＤＮＦ、ＢＰＤＥ、ベンズアミド、ブラキュリ（Brachyury）、共通β鎖、Ｂ−Ｒａｆ、βＩＧ−Ｈ３、ＣＸＣＬ１４／ＢＲＡＫ、ベータセルリン、ＢＲＣＡ１、β−ディフェンシン２、ＢＲＣＡ２、ＢＩＤ、ＢＴＬＡ、バイグリカン、Ｂｕｂ−１、Ｂｉｋ様キラータンパク質、ｃ−ｊｕｎ、ＣＤ９０／Ｔｈｙｌ、ｃ−Ｒｅｌ、ＣＤ９４、ＣＣＬ６／Ｃ１０、ＣＤ９７、ＣＩｑ Ｒ１／ＣＤ９３、ＣＤ１５１、ＣＩｑＴＮＦ１、ＣＤ１６０、ＣｌｑＴＮＦ４、ＣＤ１６３、ＣｌｑＴＮＦ５、ＣＤ１６４、補体成分 ＣＩｒ、ＣＤ２００、補体成分 ＣＩｓ、ＣＤ２００ Ｒ１、補体成分 Ｃ２、ＣＤ２２９／ＳＬＡＭＦ３、補体成分 Ｃ３ａ、ＣＤ２３／ＦｃεＲ１１、補体成分 Ｃ３ｄ、ＣＤ２Ｆ−１０／ＳＬＡＭＦ９、補体成分 Ｃ５ａ、ＣＤ５Ｌ，カドヘリン−４／Ｒ−カドヘリン、ＣＤ６９，カドヘリン−６、ＣＤＣ２，カドヘリン−８、ＣＤＣ２５Ａ，カドヘリン−１１、ＣＤＣ２５Ｂ，カドヘリン−１２、ＣＤＣＰ１，カドヘリン−１３、ＣＤＯ，カドヘリン−１７、ＣＤＸ４、Ｅ−カドヘリン、ＣＥＡＣＡＭ−１／ＣＤ６６ａ、Ｎ−カドヘリン、ＣＥＡＣＡＭ−６、Ｐ−カドヘリン、サーベラス（Cerberus）１、ＶＥ−カドヘリン、ＣＦＴＲ，カルビンディン Ｄ、ｃＧＭＰ、カルシニューリンＡ、Ｃｈｅｍ Ｒ２３、カルシニューリンＢ、ケマリン、カルレティキュリン−２、ケモカインサンプラーパック、ＣａＭキナーゼＩＩ、キチナーゼ３様１、ｃＡＭＰ、キトトリオシダーゼ／ＣＨＩＴ１、カンナビノイドＲ１、Ｃｈｋ１、カンナビノイドＲ２／ＣＢ２／ＣＮＲ２、Ｃｈｋ２、ＣＡＲ／ＮＲ１Ｉ３、ＣＨＬ−１／Ｌ１ＣＡＭ−２、炭酸脱水酵素Ｉ、コリンアセチルトランスフェラーゼ／ＣｂＡＴ、炭酸脱水酵素ＩＩ、コンドロレクチン、炭酸脱水酵素ＩＩＩ、コーディン、炭酸脱水酵素ＩＶ、コーディン様１、炭酸脱水素ＶＡ、コーディン様２、炭酸脱水酵素ＶＢ、ＣＩＮＣ−Ｉ、炭酸脱水酵素ＶＩ、ＣＩＮＣ−２、炭酸脱水酵素ＶＩＩ、ＣＩＮＣ−３、炭酸脱水酵素ＶＩＩＩ、クラスピン、炭酸脱水酵素ＩＸ、クローディン−６、炭酸脱水酵素Ｘ、ＣＬＣ、炭酸脱水酵素ＸＩＩ、ＣＬＥＣ−Ｉ、炭酸脱水酵素ＸＩＩＩ、ＣＬＥＣ−２、炭酸脱水酵素ＸＩＶ、ＣＬＥＣＳＦ１３／ＣＬＥＣ４Ｆ、カルボキシメチルリジン、ＣＬＥＣＳＦ８、カルボキシペプチダーゼＡ１／ＣＰＡ１、ＣＬＦ−Ｉ、カルボキシペプチダーゼＡ２、ＣＬ−Ｐ１／ＣＯＬＥＣ１２、カルボキシペプチダーゼＡ４、クラスタリン、カルボキシペプチダーゼＢ１、クラスタリン様１、カルボキシペプチダーゼＥ／ＣＰＥ、ＣＭＧ−２、カルボキシペプチダーゼＸ１、ＣＭＶ ＵＬ１４６、カルジオトロフィン−１、ＣＭＶ ＵＬ１４７、カルノシンジペプチダーゼ１、ＣＮＰ、カロンテ（Caronte）、ＣＮＴＦ、ＣＡＲＴ、ＣＮＴＦ Ｒα、カスパーゼ、凝固第ＩＩ因子／トロンビン、カスパーゼ−１、凝固第ＩＩＩ因子／組織因子、カスパーゼ−２、凝固第ＶＩＩ因子、カスパーゼ−３、凝固第Ｘ因子、カスパーゼ−４、凝固第ＸＩ因子、カスパーゼ−６、凝固第ＸＩＶ因子／プロテインＣ、カスパーゼ−７、ＣＯＣＯ、カスパーゼ−８、コヒーシン、カスパーゼ−９、コラーゲンＩ、カスパーゼ−１０、コラーゲンＩＩ、カスパーゼ−１２、コラーゲンＩＶ、カスパーゼ−１３、共通γ鎖／ＩＬ−２ Ｒγ、カスパーゼペプチドインヒビター、ＣＯＭＰ／トロンボスポンジン−５、カタラーゼ、補体成分ＣＩｒＬＰ、β−カテニン、補体成分ＣＩｑＡ、カテプシン１、補体成分ＣＩｑＣ、カテプシン３、補体因子Ｄ、カテプシン６、補体因子Ｉ、カテプシンＡ、補体ＭＡＳＰ３、カテプシンＢ、コネキシン４３、カテプシンＣ／ＤＰＰＩ、コンタクチン−１、カテプシンＤ、コンタクチン−２／ＴＡＧ１、カテプシンＥ、コンタクチン−４、カテプシンＦ、コンタクチン−５、カテプシンＨ、コリン（Corin）、カテプシンＬ、コルヌリン（Cornulin）、カテプシンＯ、ＣＯＲＳ２６／Ｃ１ｑＴＮＦ，３、カテプシンＳ、ラット皮質幹細胞、カテプシンＶ、コルチゾール、カテプシンＸＩＴＪ？、ＣＯＵＰ−ＴＦ Ｉ／ＮＲ２Ｆ１、ＣＢＰ、ＣＯＵＰ−ＴＦ ＩＩ／ＮＲ２Ｆ２、ＣＣＩ、ＣＯＸ−Ｉ、ＣＣＫ−Ａ Ｒ、ＣＯＸ−２、ＣＣＬ２８、ＣＲＡＣＣ／ＳＬＡＭＦ７、ＣＣＲ１、Ｃ反応性タンパク質、ＣＣＲ２、クレアチンキナーゼ筋型／ＣＫＭＭ、ＣＣＲ３、クレアチニン、ＣＣＲ４、ＣＲＥＢ、ＣＣＲ５、ＣＲＥＧ、ＣＣＲ６、ＣＲＥＬＤ１、ＣＣＲ７、ＣＲＥＬＤ２、ＣＣＲ８、ＣＲＨＢＰ、ＣＣＲ９、ＣＲＨＲ−Ｉ、ＣＣＲ１０、ＣＲＩＭ１、ＣＤ１５５／ＰＶＲ、クリプト（Cripto）、ＣＤ２、ＣＲＩＳＰ−２、ＣＤ３、ＣＲＩＳＰ−３、ＣＤ４、クロスベインレス（Crossveinless）−２、ＣＤ４＋／４５ＲＡ−、ＣＲＴＡＭ、ＣＤ４＋／４５ＲＯ−、ＣＲＴＨ−２、ＣＤ４＋／ＣＤ６２Ｌ−／ＣＤ４４、ＣＲＹ１、ＣＤ４＋／ＣＤ６２Ｌ＋／ＣＤ４４、クリプティック（Cryptic）、ＣＤ５、ＣＳＢ／ＥＲＣＣ６、ＣＤ６、ＣＣＬ２７／ＣＴＡＣＫ、ＣＤ８、ＣＴＧＦ／ＣＣＮ２、ＣＤ８＋／４５ＲＡ−、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ８＋／４５ＲＯ−、キュビリン、ＣＤ９、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＤ１４、ＣＸＡＤＲ、ＣＤ２７／ＴＮＦＲＳＦ７、ＣＸＣＬ１６、ＣＤ２７リガンド／ＴＮＦＳＦ７、ＣＸＣＲ３、ＣＤ２８、ＣＸＣＲ４、ＣＤ３０／ＴＮＦＲＳＦ８、ＣＸＣＲ５、ＣＤ３０リガンド／ＴＮＦＳＦ８、ＣＸＣＲ６、ＣＤ３１／ＰＥＣＡＭ−１、シクロフィリンＡ、ＣＤ３４、Ｃｙｒ６１／ＣＣＮ１、ＣＤ３６／ＳＲ−Ｂ３、シスタチンＡ、ＣＤ３８、シスタチンＢ、ＣＤ４０／ＴＮＦＲＳＦ５、シスタチンＣ、ＣＤ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ５、シスタチンＤ、ＣＤ４３、シスタチンＥ／Ｍ、ＣＤ４４、シスタチンＦ、ＣＤ４５、シスタチンＨ、ＣＤ４６、シスタチンＨ２、ＣＤ４７、シスタチンＳ、ＣＤ４８／ＳＬＡＭＦ２、シスタチンＳＡ、ＣＤ５５／ＤＡＦ、シスタチンＳＮ、ＣＤ５８／ＬＦＡ−３、シトクロムｃ、ＣＤ５９、アポシトクロムｃ、ＣＤ６８、ホロシトクロムｃ、ＣＤ２、サイトケラチン８、ＣＤ７４、サイトケラチン１４、ＣＤ８３、サイトケラチン１９、ＣＤ８４／ＳＬＡＭＦ５、サイトニン、Ｄ６、ＤＩＳＰ１、ＤＡＮ、Ｄｋｋ−１、ＤＡＮＣＥ、Ｄｋｋ−２、ＤＡＲＰＰ−３２、Ｄｋｋ−３、ＤＡＸ１／ＮＲ０Ｂ１、Ｄｋｋ−４、ＤＣＣ、ＤＬＥＣ、ＤＣＩＲ／ＣＬＥＣ４Ａ、ＤＬＬ１、ＤＣＡＲ、ＤＬＬ４、ＤｃＲ３／ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ、ｄ−ルシフェリン、ＤＣ−ＳＩＧＮ、ＤＮＡリガーゼＩＶ、ＤＣ−ＳＩＧＮＲ／ＣＤ２９９、ＤＮＡポリメラーゼβ、ＤｃＴＲＡＩＬ Ｒ１／ＴＮＦＲＳＦ２３、ＤＮＡＭ−Ｉ、ＤｃＴＲＡＩＬ Ｒ２／ＴＮＦＲＳＦ２２、ＤＮＡ−ＰＫｃｓ、ＤＤＲ１、ＤＮＥＲ、ＤＤＲ２、ドーパデカルボキシラーゼ／ＤＤＣ、ＤＥＣ−２０５、ＤＰＣＲ−Ｉ、デカペンタプレジック、ＤＰＰ６、デコリン、ＤＰＰ Ａ４、デクチン−１／ＣＬＥＣ７Ａ、ＤＰＰＡ５／ＥＳＧ１、デクチン−２／ＣＬＥＣ６Ａ、ＤＰＰＩＩ／ＱＰＰ／ＤＰＰ７、ＤＥＰ−１／ＣＤ１４８、ＤＰＰＩＶ／ＣＤ２６、デザートヘッジホッグ、ＤＲ３／ＴＮＦＲＳＦ２５、デスミン、ＤＲ６／ＴＮＦＲＳＦ２１、デスモグレイン−１、ＤＳＣＡＭ、デスモグレイン−２、ＤＳＣＡＭ−Ｌ１、デスモグレイン−３、ＤＳＰＧ３、ディシェベルド−１、Ｄｔｋ、ディシェベルド−３、ダイナミン、ＥＡＲ２／ＮＲ２Ｆ６、ＥｐｈＡ５、ＥＣＥ−Ｉ、ＥｐｈＡ６、ＥＣＥ−２、ＥｐｈＡ７、ＥＣＦ−Ｌ／ＣＨＩ３Ｌ３、ＥｐｈＡ８、ＥＣＭ−Ｉ、ＥｐｈＢ１、エコチン、ＥｐｈＢ２、ＥＤＡ、ＥｐｈＢ３、ＥＤＡ−Ａ２、ＥｐｈＢ４、ＥＤＡＲ、ＥｐｈＢ６、ＥＤＧ−Ｉ、エフリン、ＥＤＧ−５、エフリン−Ａ１、ＥＤＧ−８、エフリン−Ａ２、ｅＥＦ−２、エフリン−Ａ３、ＥＧＦ、エフリン−Ａ４、ＥＧＦ Ｒ、エフリン−Ａ５、ＥＧＲ１、エフリン−Ｂ、ＥＧ−ＶＥＧＦ／ＰＫ１、エフリン−Ｂ１、ｅＩＦ２α、エフリン−Ｂ２、ｅＩＦ４Ｅ、エフリン−Ｂ３、ＥＩｋ−Ｉ、エピジェン（Epigen）、ＥＭＡＰ−ＩＩ、エピモルフィン／シンタキシン２、ＥＭＭＰＲＩＮ／ＣＤ１４７、エピレギュリン、ＣＸＣＬ５／ＥＮＡ、ＥＰＲ−１／Ｘａ受容体、エンドカン（Endocan）、ＥｒｂＢ２、エンドグリン／ＣＤ１０５、ＥｒｂＢ３、エンドグリカン（Endoglycan）、ＥｒｂＢ４、エンドヌクレアーゼＩＩＩ、ＥＲＣＣ１、エンドヌクレアーゼＩ
Ｖ、ＥＲＣＣ３、エンドヌクレアーゼＶ、ＥＲＫ１／ＥＲＫ２、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ、ＥＲＫ１、エンドレペリン（Endorepellin）／パーレカン、ＥＲＫ２、エンドスタチン、ＥＲＫ３、エンドセリン−１、ＥＲＫ５／ＢＭＫ１、エングレイルド（Engrailed）−２、ＥＲＲα／ＮＲ３Ｂ１、ＥＮ−ＲＡＧＥ、ＥＲＲβ／ＮＲ３Ｂ２、エンテロペプチダーゼ／エンテロキナーゼ、ＥＲＲγ／ＮＲ３Ｂ３、ＣＣＬ１１／エオタキシン、エリスロポエチン、ＣＣＬ２４／エオタキシン−２、エリスロポエチンＲ、ＣＣＬ２６／エオタキシン−３、ＥＳＡＭ、ＥｐＣＡＭ／ＴＲＯＰ−１、ＥＲα／ＮＲ３Ａ１、ＥＰＣＲ、ＥＲβ／ＮＲ３Ａ２、Ｅｐｈ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、ＥｐｈＡ１、エキソストシン（Exostosin）様２／ＥＸＴＬ２、ＥｐｈＡ２、エキソストシン様３／ＥＸＴＬ３、ＥｐｈＡ３、ＦＡＢＰ１、ＦＧＦ−ＢＰ、ＦＡＢＰ２、ＦＧＦ Ｒ１−４、ＦＡＢＰ３、ＦＧＦ Ｒ１、ＦＡＢＰ４、ＦＧＦ Ｒ２、ＦＡＢＰ５、ＦＧＦ Ｒ３、ＦＡＢＰ７、ＦＧＦ Ｒ４、ＦＡＢＰ９、ＦＧＦ Ｒ５、補体因子Ｂ、Ｆｇｒ、ＦＡＤＤ、ＦＨＲ５、ＦＡＭ３Ａ、フィブロネクチン、ＦＡＭ３Ｂ、フィコリン−２、ＦＡＭ３Ｃ、フィコリン−３、ＦＡＭ３Ｄ、ＦＩＴＣ、線維芽細胞活性化タンパク質α／ＦＡＰ、ＦＫＢＰ３８、Ｆａｓ／ＴＮＦＲＳＦ６、Ｆｌａｐ、Ｆａｓリガンド／ＴＮＦＳＦ６、ＦＬＩＰ、ＦＡＴＰ１、ＦＬＲＧ、ＦＡＴＰ４、ＦＬＲＴ１、ＦＡＴＰ５、ＦＬＲＴ２、ＦｃγＲＩ／ＣＤ６４、ＦＬＲＴ３、ＦｃγＲＩＩＢ／ＣＤ３２ｂ、Ｆｌｔ−３、ＦｃγＲＩＩＣ／ＣＤ３２ｃ、Ｆｌｔ−３リガンド、ＦｃγＲＩＩＡ／ＣＤ３２ａ、フォリスタチン、ＦｃγＲＩＩＩ／ＣＤ１６、フォリスタチン様１、ＦｃＲＨ１／ＩＲＴＡ５、ＦｏｓＢ／Ｇ０Ｓ３、ＦｃＲＨ２／ＩＲＴＡ４、ＦｏｘＤ３、ＦｃＲＨ４／ＩＲＴＡ１、ＦｏｘＪ１、ＦｃＲＨ５／ＩＲＴＡ２、ＦｏｘＰ３、Ｆｃ受容体様３／ＣＤ１６−２、Ｆｐｇ、ＦＥＮ−Ｉ、ＦＰＲ１、フェチュインＡ、ＦＰＲＬ１、フェチュインＢ、ＦＰＲＬ２、酸性ＦＧＦ、ＣＸ３ＣＬ１／フラクタルカイン、塩基性ＦＧＦ、フリズルド（Frizzled）−１、ＦＧＦ−３、フリズルド−２、ＦＧＦ−４、フリズルド−３、ＦＧＦ−５、フリズルド−４、ＦＧＦ−６、フリズルド−５、ＦＧＦ−８、フリズルド−６、ＦＧＦ−９、フリズルド−７、ＦＧＦ−１０、フリズルド−８、ＦＧＦ−１１、フリズルド−９、ＦＧＦ−１２、Ｆｒｋ、ＦＧＦ−１３、ｓＦＲＰ−１、ＦＧＦ−１６、ｓＦＲＰ−２、ＦＧＦ−１７、ｓＦＲＰ−３、ＦＧＦ−１９、ｓＦＲＰ−４、ＦＧＦ−２０、フューリン、ＦＧＦ−２１、ＦＸＲ／ＮＲ１Ｈ４、ＦＧＦ−２２、Ｆｙｎ、ＦＧＦ−２３、Ｇ９ａ／ＥＨＭＴ２、ＧＦＲα−３／ＧＤＮＦ Ｒα−３、ＧＡＢＡ−Ａ−Ｒα１、ＧＦＲα−４／ＧＤＮＦ Ｒα−４、ＧＡＢＡ−Ａ−Ｒα２、ＧＩＴＲ／ＴＮＦＲＳＦ１８、ＧＡＢＡ−Ａ−Ｒα４、ＧＩＴＲリガンド／ＴＮＦＳＦ１８、ＧＡＢＡ−Ａ−Ｒα５、ＧＬＩＩ、ＧＡＢＡ−Ａ−Ｒα６、ＧＬＩ−２、ＧＡＢＡ−Ａ−Ｒβ１、ＧＬＰ／ＥＨＭＴ１、ＧＡＢＡ−Ａ−Ｒβ２、ＧＬＰ−Ｉ Ｒ、ＧＡＢＡ−Ａ−Ｒβ３、グルカゴン、ＧＡＢＡ−Ａ−Ｒγ２、グルコサミン（Ｎ−アセチル）−６−スルファターゼ／ＧＮＳ、ＧＡＢＡＢ−Ｒ２、ＧｌｕＲ１、ＧＡＤ１／ＧＡＤ６７、ＧｌｕＲ２／３、ＧＡＤ２／ＧＡＤ６５、ＧｌｕＲ２、ＧＡＤＤ４５α、ＧｌｕＲ３、ＧＡＤＤ４５β、Ｇｌｕｔ１、ＧＡＤＤ４５γ、Ｇｌｕｔ２、ガレクチン−１、Ｇｌｕｔ３、ガレクチン−２、Ｇｌｕｔ４、ガレクチン−３、Ｇｌｕｔ５、ガレクチン−３ＢＰ、グルタレドキシン１、ガレクチン−４、グリシンＲ、ガレクチン−７、グリコホリンＡ、ガレクチン−８、グリピカン２、ガレクチン−９、グリピカン３、ＧａｌＮＡｃ４Ｓ−６ＳＴ、グリピカン５、ＧＡＰ−４３、グリピカン６、ＧＡＰＤＨ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇａｓ１、ＧＭ−ＣＳＦ Ｒα、Ｇａｓ６、ＧＭＦ−β、ＧＡＳＰ−１／ＷＦＩＫＫＮＲＰ、ｇｐ１３０、ＧＡＳＰ−２／ＷＦＩＫＫＮ、グリコーゲンホスホリラーゼＢＢ／ＧＰＢＢ、ＧＡＴＡ−Ｉ、ＧＰＲ１５、ＧＡＴＡ−２、ＧＰＲ３９、ＧＡＴＡ−３、ＧＰＶＩ、ＧＡＴＡ−４、ＧＲ／ＮＲ３Ｃ１、ＧＡＴＡ−５、Ｇｒ−１／Ｌｙ−６Ｇ、ＧＡＴＡ−６、グラニュライシン、ＧＢＬ、グランザイムＡ、ＧＣＮＦ／ＮＲ６Ａ１、グランザイムＢ、ＣＸＣＬ６／ＧＣＰ−２、グランザイムＤ、Ｇ−ＣＳＦ、グランザイムＧ、Ｇ−ＣＳＦ Ｒ、グランザイムＨ、ＧＤＦ−Ｉ、ＧＲＡＳＰ、ＧＤＦ−３ ＧＲＢ２、ＧＤＦ−５、グレムリン（Gremlin）、ＧＤＦ−６、ＧＲＯ、ＧＤＦ−７、ＣＸＣＬ１／ＧＲＯα、ＧＤＦ−８、ＣＸＣＬ２／ＧＲＯβ、ＧＤＦ−９、ＣＸＣＬ３／ＧＲＯγ、ＧＤＦ−１１、成長ホルモン、ＧＤＦ−１５、成長ホルモンＲ、ＧＤＮＦ、ＧＲＰ７５／ＨＳＰＡ９Ｂ、ＧＦＡＰ、ＧＳＫ−３α／β、ＧＦＩ−Ｉ、ＧＳＫ−３α、ＧＦＲα−１／ＧＤＮＦ Ｒα−１、ＧＳＫ−３β、ＧＦＲα−２／ＧＤＮＦ Ｒα−２、ＥＺＦＩＴ、Ｈ２ＡＸ、ヒスチジン、Ｈ６０、ＨＭ７４Ａ、ＨＡＩ−Ｉ、ＨＭＧＡ２、ＨＡＩ−２、ＨＭＧＢ１、ＨＡＩ−２Ａ、ＴＣＦ−２／ＨＮＦ−１β、ＨＡＩ−２Ｂ、ＨＮＦ−３β／ＦｏｘＡ２、ＨＡＮＤ１、ＨＮＦ−４α／ＮＲ２ Ａ１、ＨＡＰＬＮ１、ＨＮＦ−４γ／ＮＲ２Ａ２、気道トリプシン様プロテアーゼ／ＨＡＴ、ＨＯ−１／ＨＭＯＸ１／ＨＳＰ３２、ＨＢ−ＥＧＦ、ＨＯ−２／ＨＭＯＸ２、ＣＣＬ１４ａ／ＨＣＣ−１、ＨＰＲＧ、ＣＣＬ１４ｂ／ＨＣＣ−３、Ｈｒｋ、ＣＣＬ１６／ＨＣＣ−４、ＨＲＰ−Ｉ、αＨＣＧ、ＨＳ６ＳＴ２、Ｈｃｋ、ＨＳＤ−Ｉ、ＨＣＲ／ＣＲＡＭ−Ａ／Ｂ、ＨＳＤ−２、ＨＤＧＦ、ＨＳＰ１０／ＥＰＦ、ヘモグロビン、ＨＳＰ２７、ヘパソシン（Hepassocin）、ＨＳＰ６０、ＨＥＳ−１、ＨＳＰ７０、ＨＥＳ−４、ＨＳＰ９０、ＨＧＦ、ＨＴＲＡ／プロテアーゼＤｏ、ＨＧＦ活性化因子、ＨＴＲＡ１／ＰＲＳＳ１１、ＨＧＦ Ｒ、ＨＴＲＡ２／Ｏｍｌ、ＨＩＦ−Ｉα、ＨＶＥＭ／ＴＮＦＲＳＦ１４、ＨＩＦ−２α、ヒアルロナン、ＨＩＮ−１／セクレトグロブリン（Secretoglobulin）３Ａ１、４−ヒドロキシノネナール、Ｈｉｐ、ＣＣＬ１／Ｉ−３０９／ＴＣＡ−３、ＩＬ−１０、ｃＩＡＰ（pan）、ＩＬ−１０ Ｒα、ｃＩＡＰ−１／ＨＩＡＰ−２、ＩＬ−１０ Ｒβ、ｃＩＡＰ−２／ＨＩＡＰ−１、ＩＬ−１１、ＩＢＳＰ／シアロタンパク質ＩＩ、ＥＬ−１１ Ｒα、ＩＣＡＭ−１／ＣＤ５４、ＩＬ−１２、ＩＣＡＭ−２／ＣＤ１０２、ＩＬ−１２／ＩＬ−２３ ｐ４０、ＩＣＡＭ−３／ＣＤ５０、ＩＬ−１２ Ｒβ１、ＩＣＡＭ−５、ＩＬ−１２ Ｒβ２、ＩＣＡＴ、ＩＬ−１３、ＩＣＯＳ、ＩＬ−１３ Ｒα１、イズロン酸２−スルファターゼ／ＥＯＳ、ＩＬ−１３ Ｒα２、ＥＦＮ、ＩＬ−１５、ＩＦＮ−α、ＩＬ−１５ Ｒα、ＩＦＮ−α１、ＩＬ−１６、ＩＦＮ−α２、ＩＬ−１７、ＩＦＮ−α４ｂ、ＩＬ−１７ Ｒ、ＩＦＮ−αＡ、ＩＬ−１７ ＲＣ、ＩＦＮ−α Ｂ２、ＩＬ−１７ ＲＤ、ＩＦＮ−α Ｃ、ＩＬ−１７Ｂ、ＩＦＮ−α Ｄ、ＩＬ−１７Ｂ Ｒ、ＩＦＮ−α Ｆ、ＩＬ−１７Ｃ、ＩＦＮ−αＧ、ＩＬ−１７Ｄ、ＩＦＮ−α Ｈ２、ＩＬ−１７Ｅ、ＩＦＮ−α Ｉ、ＩＬ−１７Ｆ、ＩＦＮ−α Ｊ１、ＩＬ−１８／ＩＬ−１Ｆ４、ＩＦＮ−αＫ、ＩＬ−１８ ＢＰａ、ＩＦＮ−α ＷＡ、ＩＬ−１８ ＢＰｃ、ＩＦＮ−α／β Ｒ１、ＩＬ−１８ ＢＰｄ、ＩＦＮ−α／β Ｒ２、ＩＬ−１８ Ｒ α／ＩＬ−１ Ｒ５、ＩＦＮ−β、ＩＬ−１８ Ｒ β／ＩＬ−１ Ｒ７、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１９、ＩＦＮ−γ Ｒ１、ＩＬ−２０、ＩＦＮ−γ Ｒ２、ＩＬ−２０ Ｒα、ＩＦＮ−ω、ＩＬ−２０ Ｒβ、ＩｇＥ、ＩＬ−２１、ＩＧＦＢＰ−Ｉ、ＩＬ−２１ Ｒ、ＩＧＦＢＰ−２、ＩＬ−２２、ＩＧＦＢＰ−３、ＩＬ−２２ Ｒ、ＩＧＦＢＰ−４、ＩＬ−２２ＢＰ、ＩＧＦＢＰ−５、ＩＬ−２３、ＩＧＦＢＰ−６、ＩＬ−２３ Ｒ、Ｉ（２１） ＪＰ ５８７６８７２ Ｂ２ ２０１６．３．２１０２０３０４０５０ＧＦＢＰ−Ｌ１、ＩＬ−２４、ＩＧＦＢＰ−ｒｐ１／ＩＧＦＢＰ−７、ＩＬ−２６／ＡＫ１５５、ＩＧＦＢＰ−ｒＰ１０、ＩＬ−２７、ＩＧＦ−Ｉ、ＥＬ−２８Ａ、ＩＧＦ−Ｉ Ｒ、ＩＬ−２８Ｂ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＬ−２９／ＥＦＮ−λ１、ＩＧＦ−ＩＩ Ｒ、ＩＬ−３１、ＩｇＧ、ＥＬ−３１ ＲＡ、ＩｇＭ、ＩＬ−３２α、ＩＧＳＦ２、ＩＬ−３３、ＩＧＳＦ４Ａ／ＳｙｎＣＡＭ、ＩＬＴ２／ＣＤ８５Ｊ、ＩＧＳＦ４Ｂ、ＩＬＴ３／ＣＤ８５ｋ、ＩＧＳＦ８、ＩＬＴ４／ＣＤ８５ｄ、ＩｇＹ、ＩＬＴ５／ＣＤ８５ａ、ＩｋＢ−β、ＩＬＴ６／ＣＤ８５ｅ、ＩＫＫα、インディアンヘッジホッグ、ＩＫＫε、ＩＮＳＲＲ、ＥＫＫγ、インスリン、ＩＬ−Ｉα／ＩＬ−１Ｆ１、インスリンＲ／ＣＤ２２０、ＩＬ−Ｉβ／ＩＬ−１Ｆ２、プロインスリン、ＩＬ−１ｒａ／ＩＬ−１Ｆ３、インスリジン／ＥＤＥ、ＩＬ−１Ｆ５／ＦＩＬ１δ、インテグリンα２／ＣＤ４９ｂ、ＩＬ−１Ｆ６／ＦＩＬ１ε、インテグリンα３／ＣＤ４９ｃ、ＩＬ−１Ｆ７／ＦＩＬ１ζ、インテグリンα３β１／ＶＬＡ−３、ＩＬ−１Ｆ８／ＦＩＬ１η、インテグリンα４／ＣＤ４９ｄ、ＩＬ−１Ｆ９／ＩＬ−１ Ｈ１、インテグリンα５／ＣＤ４９ｅ、ＩＬ−１Ｆ１０／ＩＬ−１ＨＹ２、インテグリンα５β１、ＩＬ−Ｉ ＲＩ、インテグリンα６／ＣＤ４９ｆ、ＩＬ−Ｉ ＲＩＩ、インテグリンα７、ＩＬ−Ｉ Ｒ３／ＩＬ−１ Ｒ ＡｃＰ、インテグリンα９、ＩＬ−Ｉ Ｒ４／ＳＴ２、インテグリンαＥ／ＣＤ１０３、ＩＬ−Ｉ Ｒ６／ＩＬ−１ Ｒ ｒｐ２、インテグリンαＬ／ＣＤ１１ａ、ＩＬ−Ｉ Ｒ８、インテグリンαＬβ２、ＩＬ−Ｉ Ｒ９、インテグリンαＭ／ＣＤ１Ｉｂ、ＩＬ−２、インテグリンαＭβ２、ＩＬ−２ Ｒα、インテグリンαＶ／ＣＤ５１、ＩＬ−２ Ｒβ、インテグリンαＶβ５、ＩＬ−３、インテグリンαＶβ３、ＩＬ−３ Ｒα、インテグリンαＶβ６、ＩＬ−３ Ｒβ、インテグリンαＸ／ＣＤ１１ｃ、ＩＬ−４、インテグリンβ１／ＣＤ２９、ＩＬ−４ Ｒ、インテグリンβ２／ＣＤ１８、ＩＬ−５、インテグリンβ３／ＣＤ６１、ＩＬ−５ Ｒα、インテグリンβ５、ＩＬ−６、インテグリンβ６、ＩＬ−６ Ｒ、インテグリンβ７、ＩＬ−７、ＣＸＣＬ１０／ＥＰ−１０／ＣＲＧ−２、ＩＬ−７ Ｒα／ＣＤ１２７、ＩＲＡＫＩ、ＣＸＣＲ１／ＩＬ−８ ＲＡ、ＩＲＡＫ４、ＣＸＣＲ２／ＩＬ−８ ＲＢ、ＥＲＳ−Ｉ、ＣＸＣＬ８／ＩＬ−８、Ｉｓｌｅｔ−１、ＩＬ−９、ＣＸＣＬ１１／Ｉ−ＴＡＣ、ＩＬ−９ Ｒ、ジャギド（Jagged）１、ＪＡＭ−４／ＩＧＳＦ５、ジャギド２、ＪＮＫ、ＪＡＭ−Ａ、ＪＮＫ１／ＪＮＫ２、ＪＡＭ−Ｂ／ＶＥ−ＪＡＭ、ＪＮＫ１、ＪＡＭ−Ｃ、ＪＮＫ２、キニノーゲン、カリクレイン３／ＰＳＡ、キニノスタチン（Kininostatin）、カリクレイン４、ＫＥＲ／ＣＤ１５８、カリクレイン５、ＫＥＲ２Ｄ１、カリクレイン６／ニューロシン、ＫＩＲ２ＤＬ３、カリクレイン７、ＫＩＲ２ＤＬ４／ＣＤ１５８ｄ、カリクレイン８／ニューロプシン、ＫＩＲ２ＤＳ４、カリクレイン９、ＫＩＲ３ＤＬ１、血漿カリクレイン／ＫＬＫＢ１、ＫＥＲ３ＤＬ２、カリクレイン１０、Ｋｉｒｒｅｌ２、カリクレイン１１、ＫＬＦ４、カリクレイン１２、ＫＬＦ５、カリクレイン１３、ＫＬＦ６、カリクレイン１４、クロトー（クロトー）、カリクレイン１５、クロトーβ、ＫＣ、ＫＯＲ、Ｋｅａｐ１、クレメン（Kremen）−１、ＫｅＩ１、クレメン−２、ＫＧＦ／ＦＧＦ−７、ＬＡＧ−３、ＬＩＮＧＯ−２、ＬＡＩＲ１、リピン２、ＬＡＩＲ２、リポカリン−１、ラミニンα４、リポカリン−２／ＮＧＡＬ、ラミニンγ１、５−リポキシゲナーゼ、ラミニンＩ、ＬＸＲα／ＮＲ１Ｈ３、ラミニンＳ、ＬＸＲβ／ＮＲ１Ｈ２、ラミニン−１、リビン（Livin）、ラミニン−５、ＬＥＸ、ＬＡＭＰ、ＬＭＩＲ１／ＣＤ３００Ａ、ランゲリン、ＬＭＩＲ２／ＣＤ３００ｃ、ＬＡＲ、ＬＭＩＲ３／ＣＤ３００ＬＦ、ラテキシン（Latexin）、ＬＭＩＲ５／ＣＤ３００ＬＢ、レーイリン（Layilin）、ＬＭＩＲ６／ＣＤ３００ＬＥ、ＬＢＰ、ＬＭＯ２、ＬＤＬ Ｒ、ＬＯＸ−１／ＳＲ−ＥＩ、ＬＥＣＴ２、ＬＲＨ−１／ＮＲ５Ａ２、ＬＥＤＧＦ、ＬＲＩＧ１、レフティー（Lefty）、ＬＲＩＧ３、レフティー−１、ＬＲＰ−Ｉ、レフティー−Ａ、ＬＲＰ
−６、レグマイン（Legumain）、ＬＳＥＣｔｉｎ／ＣＬＥＣ４Ｇ、レプチン、ルミカン、レプチンＲ、ＣＸＣＬ１５／ラングカイン（Lungkine）、ロイコトリエンＢ４、ＸＣＬｌ／リンフォタクチン、ロイコトリエンＢ４ Ｒ１、リンフォトキシン、ＬＥＦ、リンフォトキシンβ／ＴＮＦＳＦ３、ＬＩＦ Ｒα、リンフォトキシンβＲ／ＴＮＦＲＳＦ３、ＬＩＧＨＴ／ＴＮＦＳＦ１４、Ｌｙｎ、リミチン（Limitin）、Ｌｙｐ、ＬＩＭＰＩＩ／ＳＲ−Ｂ２、リジルオキシダーゼホモログ２、ＬＩＮ−２８、ＬＹＶＥ−Ｉ、ＬＩＮＧＯ−Ｉ、α２−マクログロブリン、ＣＸＣＬ９／ＭＩＧ、ＭＡＤ２Ｌ１、ミメカン（Mimecan）、ＭＡｄＣＡＭ−１、ミンディン、ＭａｆＢ、鉱質コルチコイドＲ／ＮＲ３Ｃ２、ＭａｆＦ、ＣＣＬ３Ｌ１／ＭＩＰ−１αアイソフォームＬＤ７８β、ＭａｆＧ、ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１α、ＭａｆＫ、ＣＣＬ４Ｌ１／ＬＡＧ−１、ＭＡＧ／シグレック−４ａ、ＣＣＬ４／ＭＩＰ−１β、ＭＡＮＦ、ＣＣＬ１５／ＭＥＰ−１δ、ＭＡＰ２、ＣＣＬ９／１０／ＭＩＰ−１γ、ＭＡＰＫ、ＭＩＰ−２、マラプシン（Marapsin）／パンクレアシン（Pancreasin）、ＣＣＬ１９／ＭＩＰ−３β、ＭＡＲＣＫＳ、ＣＣＬ２０／ＭＩＰ−３α、ＭＡＲＣＯ、ＭＩＰ−Ｉ、Ｍａｓｈ１、ＭＩＰ−ＩＩ、マトリリン−２、ＭＩＰ−ＩＩＩ、マトリリン−３、ＭＩＳ／ＡＭＨ、マトリリン−４、ＭＩＳ ＲＩＩ、マトリプターゼ／ＳＴ１４、ＭＩＸＬ１、ＭＢＬ、ＭＫＫ３／ＭＫＫ６、ＭＢＬ−２、ＭＫＫ３、メラノコルチン３Ｒ／ＭＣ３Ｒ、ＭＫＫ４、ＭＣＡＭ／ＣＤ１４６、ＭＫＫ６、ＭＣＫ−２、ＭＫＫ７、ＭｃＩ−Ｉ、ＭＫＰ−３、ＭＣＰ−６、ＭＬＨ−Ｉ、ＣＣＬ２／ＭＣＰ−１、ＭＬＫ４α、ＭＣＰ−１１、ＭＭＰ、ＣＣＬ８／ＭＣＰ−２、ＭＭＰ−１、ＣＣＬ７／ＭＣＰ−３／ＭＡＲＣ、ＭＭＰ−２、ＣＣＬ１３／ＭＣＰ−４、ＭＭＰ−３、ＣＣＬ１２／ＭＣＰ−５、ＭＭＰ−７、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＭＰ−８、Ｍ−ＣＳＦ Ｒ、ＭＭＰ−９、ＭＣＶＩＩ型、ＭＭＰ−１０、ＭＤ−Ｉ、ＭＭＰ−１１、ＭＤ−２、ＭＭＰ−１２、ＣＣＬ２２／ＭＤＣ、ＭＭＰ−１３、ＭＤＬ−１／ＣＬＥＣ５Ａ、ＭＭＰ−１４、ＭＤＭ２、ＭＭＰ−１５、ＭＥＡ−Ｉ、ＭＭＰ−１６／ＭＴ３−ＭＭＰ、ＭＥＫ１／ＭＥＫ２、ＭＭＰ−２４／ＭＴ５−ＭＭＰ、ＭＥＫ１、ＭＭＰ−２５／ＭＴ６−ＭＭＰ、ＭＥＫ２、ＭＭＰ−２６、メルシン（Melusin）、ＭＭＲ、ＭＥＰＥ、ＭＯＧ、メプリンα、ＣＣＬ２３／ＭＰＩＦ−１、メプリンβ、Ｍ−Ｒａｓ／Ｒ−Ｒａｓ３、Ｍｅｒ、Ｍｒｅ１１、メソテリン、ＭＲＰ１ メテオリン（Meteorin）、ＭＳＫ１／ＭＳＫ２、メチオニンアミノペプチダーゼ１、ＭＳＫ１、メチオニンアミノペプチダーゼ、ＭＳＫ２、メチオニンアミノペプチダーゼ２、ＭＳＰ、ＭＦＧ−Ｅ８、ＭＳＰ Ｒ／Ｒｏｎ、ＭＦＲＰ、Ｍｕｇ、ＭｇｃＲａｃＧＡＰ、ＭＵＬＴ−Ｉ、ＭＧＬ２、ムサシ（Musashi）−１、ＭＧＭＴ、ムサシ−２、ＭＩＡ、ＭｕＳＫ、ＭＩＣＡ、ＭｕｔＹＤＮＡグリコシラーゼ、ＭＩＣＢ、ＭｙＤ８８、ＭＩＣＬ／ＣＬＥＣ１２Ａ、ミエロペルオキシダーゼ、β２ミクログロブリン、ミオカルディン、ミッドカイン、ミオシリン、ＭＩＦ、ミオグロビン、ＮＡＩＰ ＮＧＦＩ−Ｂγ／ＮＲ４Ａ３、ナノグ（Nanog）、ＮｇＲ２／ＮｇＲＨ１、ＣＸＣＬ７／ＮＡＰ−２、ＮｇＲ３／ＮｇＲＨ２、Ｎｂｓ１、ナイドジェン−１／エンタクチン、ＮＣＡＭ−１／ＣＤ５６、ナイドジェン−２、ＮＣＡＭ−Ｌ１、一酸化窒素、ネクチン−１、ニトロチロシン、ネクチン−２／ＣＤ１１２、ＮＫＧ２Ａ、ネクチン−３、ＮＫＧ２Ｃ、ネクチン−４、ＮＫＧ２Ｄ、ネオゲニン、ＮＫｐ３０、ネプリライシン／ＣＤ１０、ＮＫｐ４４、ネプリライシン−２／ＭＭＥＬ１／ＭＭＥＬ２、ＮＫｐ４６／ＮＣＲ１、ネスチン、ＮＫｐ８０／ＫＬＲＦ１、ＮＥＴＯ２、ＮＫＸ２．５、ネトリン−１、ＮＭＤＡ Ｒ、ＮＲ１サブユニット、ネトリン−２、ＮＭＤＡ Ｒ、ＮＲ２Ａサブユニット、ネトリン−４、ＮＭＤＡ Ｒ、ＮＲ２Ｂサブユニット、ネトリン−Ｇ１ａ、ＮＭＤＡ Ｒ、ＮＲ２Ｃサブユニット、ネトリン−Ｇ２ａ、Ｎ−Ｍｅ−６，７−ｄｉＯＨ−ＴＩＱ、ニューレグリン−１／ＮＲＧ１、ノーダル（Nodal）、ニューレグリン−３／ＮＲＧ３、ノギン、ニューリチン（Neuritin）、Ｎｏｇｏ受容体、ＮｅｕｒｏＤ１、Ｎｏｇｏ−Ａ、ニューロファシン、ＮＯＭＯ、ニューロゲニン−１、ノープ（Nope）、ニューロゲニン−２、ノリン（Norrin）、ニューロゲニン−３、ｅＮＯＳ、ニューロリシン、ｉＮＯＳ、ニューロフィジンＩＩ、ｎＮＯＳ、ニューロピリン−１、ノッチ−１、ニューロピリン−２、ノッチ−２、ニューロポエチン（Neuropoietin）、ノッチ−３、ニューロトリミン（Neurotrimin）、ノッチ−４、ニュールツリン、ＮＯＶ／ＣＣＮ３、ＮＦＡＭ１、ＮＲＡＧＥ、ＮＦ−Ｈ、ＮｒＣＡＭ、ＮＦｋＢ１、ＮＲＬ、ＮＦｋＢ２、ＮＴ−３、ＮＦ−Ｌ、ＮＴ−４、ＮＦ−Ｍ、ＮＴＢ−Ａ／ＳＬＡＭＦ６、ＮＧ２／ＭＣＳＰ、ＮＴＨ１、ＮＧＦ Ｒ／ＴＮＦＲＳＦ１６、ヌクレオステミン（Nucleostemin）、β−ＮＧＦ、Ｎｕｒｒ−１／ＮＲ４Ａ２、ＮＧＦＩ−Ｂα／ＮＲ４Ａ１、ＯＡＳ２、オレキシンＢ、ＯＢＣＡＭ、ＯＳＣＡＲ、ＯＣＡＭ、ＯＳＦ−２／ペリオスチン、ＯＣＩＬ／ＣＬＥＣ２ｄ、オンコスタチンＭ／ＯＳＭ、ＯＣＩＬＲＰ２／ＣＬＥＣ２ｉ、ＯＳＭ Ｒβ、Ｏｃｔ−３／４、オステオアクチビン／ＧＰＮＭＢ、ＯＧＧ１、オステオアドヘリン（Osteoadherin）、Ｏｌｉｇ１，２，３、オステオカルシン、Ｏｌｉｇ１、オステオクリン（Osteocrin）、Ｏｌｉｇ２、オステオポンチン、Ｏｌｉｇ３、オステオプロテゲリン／ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ、乏突起膠細胞マーカーＯ１、Ｏｔｘ２、乏突起膠細胞マーカーＯ４、ＯＶ−６、ＯＭｇｐ、ＯＸ４０／ＴＮＦＲＳＦ４、オプチシン（Opticin）、ＯＸ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ４、オレキシンＡ、ＯＡＳ２、オレキシンＢ、ＯＢＣＡＭ、ＯＳＣＡＲ、ＯＣＡＭ、ＯＳＦ−２／ペリオスチン、ＯＣＩＬ／ＣＬＥＣ２ｄ、オンコスタチンＭ／ＯＳＭ、ＯＣＩＬＲＰ２／ＣＬＥＣ２ｉ、ＯＳＭ Ｒβ、Ｏｃｔ−３／４、オステオアクチビン／ＧＰＮＭＢ、ＯＧＧ１、オステオアドヘリン、Ｏｌｉｇ１，２，３、オステオカルシン、Ｏｌｉｇ１、オステオクリン、Ｏｌｉｇ２、オステオポンチン、Ｏｌｉｇ３、オステオプロテゲリン／ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ、乏突起膠細胞マーカーＯ１、Ｏｔｘ２、乏突起膠細胞マーカー０４、ＯＶ−６、ＯＭｇｐ、ＯＸ４０／ＴＮＦＲＳＦ４、オプチシン、ＯＸ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ４、オレキシンＡ、ＲＡＣＫ１、Ｒｅｔ、Ｒａｄ１、ＲＥＶ−ＥＲＢα／ＮＲ１Ｄ１、Ｒａｄ１７、ＲＥＶ−ＥＲＢβ／ＮＲ１Ｄ２、Ｒａｄ５１、Ｒｅｘ−１、Ｒａｅ−１、ＲＧＭ−Ａ、Ｒａｅ−１α、ＲＧＭ−Ｂ、Ｒａｅ−１β、ＲＧＭ−Ｃ、Ｒａｅ−１δ、Ｒｈｅｂ、Ｒａｅ−１ε、リボソームタンパク質Ｓ６、Ｒａｅ−１γ、ＲＩＰ１、Ｒａｆ−１、ＲＯＢＯ１、ＲＡＧＥ、ＲＯＢＯ２、ＲａｌＡ／ＲａｌＢ、Ｒ０Ｂ０３、ＲａＩＡ、ＲＯＢＯ４、ＲａＩＢ、ＲＯＲ／ＮＲ１Ｆ１−３（pan）、ＲＡＮＫ／ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ、ＲＯＲα／ＮＲ１Ｆ１、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ、ＲＯＲγ／ＮＲ１Ｆ３、Ｒａｐ１Ａ／Ｂ、ＲＴＫ様オーファン受容体１／ＲＯＲ１、ＲＡＲα／ＮＲ１Ｂ１、ＲＴＫ様オーファン受容体２／ＲＯＲ２、ＲＡＲβ／ＮＲ１Ｂ２、ＲＰ１０５、ＲＡＲγ／ＮＲ１Ｂ３、ＲＰ Ａ２、Ｒａｓ、ＲＳＫ（pan）、ＲＢＰ４、ＲＳＫ１／ＲＳＫ２、ＲＥＣＫ、ＲＳＫ１、Ｒｅｇ２／ＰＡＰ、ＲＳＫ２、Ｒｅｇ Ｉ、ＲＳＫ３、Ｒｅｇ ＩＩ、ＲＳＫ４、Ｒｅｇ ＩＩＩ、Ｒ−スポンジン１、Ｒｅｇ ＩＩＩａ、Ｒ−スポンジン２、Ｒｅｇ ＩＶ、Ｒ−スポンジン３、リラキシン−１、ＲＵＮＸ１／ＣＢＦＡ２、リラキシン−２、ＲＵＮＸ２／ＣＢＦＡ１、リラキシン−３、ＲＵＮＸ３／ＣＢＦＡ３、ＲＥＬＭα、ＲＸＲα／ＮＲ２Ｂ１、ＲＥＬＭβ、ＲＸＲβ／ＮＲ２Ｂ２、ＲＥＬＴ／ＴＮＦＲＳＦ１９Ｌ、ＲＸＲγ／ＮＲ２Ｂ３、レジスチン、Ｓ１ＯＯＡ１Ｏ、ＳＬＩＴＲＫ５、Ｓ１００Ａ８、ＳＬＰＩ、Ｓ１００Ａ９、ＳＭＡＣ／ディアブロ（Diablo）、Ｓ１ＯＯＢ、Ｓｍａｄ１、Ｓ１ＯＯＰ、Ｓｍａｄ２、ＳＡＬＬ１、Ｓｍａｄ３、δ−サルコグリカン、Ｓｍａｄ４、Ｓｃａ−１／Ｌｙ６、Ｓｍａｄ５、ＳＣＤ−Ｉ、Ｓｍａｄ７、ＳＣＦ、Ｓｍａｄ８、ＳＣＦ Ｒ／ｃ−ｋｉｔ、ＳＭＣ１、ＳＣＧＦ、α−平滑筋アクチン、ＳＣＬ／Ｔａｌｌ、ＳＭＵＧ１、ＳＣＰ３／ＳＹＣＰ３、Ｓｎａｉｌ、ＣＸＣＬ１２／ＳＤＦ−１、ナトリウム・カルシウム交換輸送体１、ＳＤＮＳＦ／ＭＣＦＤ２、Ｓｏｇｇｙ−１、α−セクレターゼ、ソニックヘッジホッグ、γ−セクレターゼ、ＳｏｒＣＳ１、β−セクレターゼ、ＳｏｒＣＳ３、Ｅ−セレクチン、ソルチリン、Ｌ−セレクチン、ＳＯＳＴ、Ｐ−セレクチン、ＳＯＸ１、セマフォリン３Ａ、ＳＯＸ２、セマフォリン３Ｃ、ＳＯＸ３、セマフォリン３Ｅ、ＳＯＸ７、セマフォリン３Ｆ、ＳＯＸ９、セマフォリン６Ａ、ＳＯＸ１Ｏ、セマフォリン６Ｂ、ＳＯＸ１７、セマフォリン６Ｃ、ＳＯＸ２１ セマフォリン６Ｄ、ＳＰＡＲＣ、セマフォリン７Ａ、ＳＰＡＲＣ様１、セパラーゼ、ＳＰ−Ｄ、セリン／スレオニンホスファターゼ基質Ｉ、スピネシン（Spinesin）、セルピンＡ１、Ｆ−スポンジン、セルピンＡ３、ＳＲ−ＡＩ／ＭＳＲ、セルピンＡ４／カリスタチン、Ｓｒｃ、セルピンＡ５／プロテインＣインヒビター、ＳＲＥＣ−Ｉ／ＳＲ−Ｆ１、セルピンＡ８／アンジオテンシノゲン、ＳＲＥＣ−ＩＩ、セルピンＢ５、ＳＳＥＡ−Ｉ、セルピンＣ１／アンチトロンビン−ＩＩＩ、ＳＳＥＡ−３、セルピンＤ１／ヘパリン補因子ＩＩ、ＳＳＥＡ−４、セルピンＥ１／ＰＡＩ−１、ＳＴ７／ＬＲＰ１２、セルピンＥ２、スタビリン（Stabilin）−１、セルピンＦ１、スタビリン−２、セルピンＦ２、スタニオカルシン１、セルピンＧ１／Ｃ１インヒビター、スタニオカルシン２、セルピン１２、ＳＴＡＴ１、血清アミロイドＡ１、ＳＴＡＴ２、ＳＦ−１／ＮＲ５Ａ１、ＳＴＡＴ３、ＳＧＫ、ＳＴＡＴ４、ＳＨＢＧ、ＳＴＡＴ５ａ／ｂ、ＳＨＩＰ、ＳＴＡＴ５ａ、ＳＨＰ／ＮＲ０Ｂ２、ＳＴＡＴ５ｂ、ＳＨＰ−Ｉ、ＳＴＡＴＥ、ＳＨＰ−２、ＶＥ−スタチン、ＳＩＧＩＲＲ、ステラ（Stella）／Ｄｐｐａ３、シグレック（Siglec）−２／ＣＤ２２、ＳＴＲＯ−Ｉ、シグレック−３／ＣＤ３３、サブスタンスＰ、シグレック−５、スルファミダーゼ／ＳＧＳＨ、シグレック−６、スルファターゼ修飾因子１／ＳＵＭＦ１、シグレック−７、スルファターゼ修飾因子２／ＳＵＭＦ２、シグレック−９、ＳＵＭＯ１、シグレック−１０、ＳＵＭＯ２／３／４、シグレック−１１、ＳＵＭＯ３、シグレック−Ｆ、スーパーオキシドジスムターゼ、ＳＩＧＮＲ１／ＣＤ２０９、スーパーオキシドジスムターゼ−１／Ｃｕ［００９９］−Ｚｎ ＳＯＤ、ＳＩＧＮＲ４、スーパーオキシドジスムターゼ−２／Ｍｎ−ＳＯＤ、ＳＩＲＰβ１、スーパーオキシドジスムターゼ−３／ＥＣ−ＳＯＤ、ＳＫＩ、サバイビン、ＳＬＡＭ／ＣＤ１５０、シナプシンＩ、スリーピング・ビューティ（Sleeping Beauty）トランスポザーゼ、シンデカン−Ｉ／ＣＤ１３８、Ｓｌｉｔ３、シンデカン−２、ＳＬＩＴＲＫ１、シンデカン−３、ＳＬＩＴＲＫ２、シンデカン−４、ＳＬＩＴＲＫ４、ＴＡＣＩ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ、ＴＭＥＦＦ１／トモレギュリン（Tomoregulin）−１、ＴＡＯ２、ＴＭＥＦＦ２、ＴＡＰＰ１、ＴＮＦ−α／ＴＮＦＳＦ ＩＡ、ＣＣＬ１７／ＴＡＲＣ、ＴＮＦ−β／ＴＮＦＳＦ１Ｂ、タウ、ＴＮＦ ＲＩ／ＴＮＦＲＳＦＩＡ、ＴＣ２１／Ｒ−Ｒａｓ２、ＴＮＦ ＲＩＩ／ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＴＣＡＭ−Ｉ、ＴＯＲ、ＴＣＣＲ／ＷＳＸ−１、ＴＰ−Ｉ、ＴＣ−ＰＴＰ、ＴＰ６３／ＴＰ７３Ｌ、ＴＤＧ、ＴＲ、ＣＣＬ２５／ＴＥＣＫ、ＴＲα／ＮＲ１Ａ１、テネイシンＣ、ＴＲβ１／ＮＲ１Ａ２、テネイシンＲ、ＴＲ２／ＮＲ２Ｃ１、ＴＥＲ−１１９、ＴＲ４／ＮＲ２Ｃ２、ＴＥＲＴ、ＴＲＡ−１−８５、テスティカン（Testican）１／ＳＰＯＣＫ１、ＴＲＡＤＤ、テスティカン２／ＳＰＯＣＫ２、ＴＲＡＦ−１、テスティカン３／ＳＰＯＣＫ３、ＴＲＡＦ−２、ＴＦＰＩ、ＴＲＡＦ−３、ＴＦＰＩ−２、ＴＲＡＦ−４、ＴＧＦ−α、ＴＲＡＦ−６、ＴＧＦ
−β、ＴＲＡＩＬ／ＴＮＦＳＦ１０、ＴＧＦ−β１、ＴＲＡＩＬ Ｒ１／ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＬＡＰ（ＴＧＦ−β１）、ＴＲＡＩＬ Ｒ２／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、潜在型ＴＧＦ−β１、ＴＲＡＩＬ Ｒ３／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ、ＴＧＦ−β１．２、ＴＲＡＩＬ Ｒ４／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ、ＴＧＦ−β２、ＴＲＡＮＣＥ／ＴＮＦＳＦ１１、ＴＧＦ−β３、ＴｆＲ（トランスフェリンＲ）、ＴＧＦ−β５、アポ−トランスフェリン、潜在型ＴＧＦ−β by１、ホロ−トランスフェリン、潜在型ＴＧＦ−β ｂｐ２、トラッピン（Trappin）−２／エラフィン、潜在型ＴＧＦ−β ｂｐ４、ＴＲＥＭ−１、ＴＧＦ−βＲ１／ＡＬＫ−５、ＴＲＥＭ−２、ＴＧＦ−βＲ１１、ＴＲＥＭ−３、ＴＧＦ−βＲＩＩｂ、ＴＲＥＭＬ１／ＴＬＴ−１、ＴＧＦ−βＲＩＩＩ、ＴＲＦ−Ｉ、サーモライシン、ＴＲＦ−２、チオレドキシン−１、ＴＲＨ分解エクトエンザイム／ＴＲＨＤＥ、チオレドキシン−２、ＴＲＩＭＳ、チオレドキシン−８０、トリペプチジル−ペプチダーゼＩ、チオレドキシン様５／ＴＲＰ１４、ＴｒｋＡ、ＴＨＯＰ１、ＴｒｋＢ、トロンボモジュリン／ＣＤ１４１、ＴｒｋＣ、トロンボポエチン、ＴＲＯＰ−２、トロンボポエチンＲ、トロポニンＩペプチド３、トロンボスポンジン−１、トロポニンＴ、トロンボスポンジン−２、ＴＲＯＹ／ＴＮＦＲＳＦ１９、トロンボスポンジン−４、トリプシン１、サイモポエチン、トリプシン２／ＰＲＳＳ２、胸腺ケモカイン−１、トリプシン３／ＰＲＳＳ３、Ｔｉｅ−１、トリプターゼ−５／Ｐｒｓｓ３２、Ｔｉｅ−２、トリプターゼα／ＴＰＳ１、ＴＩＭ−Ｉ／ＫＩＭ−Ｉ／ＨＡＶＣＲ、トリプターゼβ−１／ＭＣＰＴ−７、ＴＩＭ−２、トリプターゼβ−２／ＴＰＳＢ２、ＴＩＭ−３、トリプターゼε／ＢＳＳＰ−４、ＴＩＭ−４、トリプターゼγ−１／ＴＰＳＧ１、ＴＩＭ−５、トリプトファンヒドロキシラーゼ、ＴＩＭ−６、ＴＳＣ２２、ＴＩＭＰ−Ｉ、ＴＳＧ、ＴＩＭＰ−２、ＴＳＧ−６、ＴＩＭＰ−３、ＴＳＫ、ＴＩＭＰ−４、ＴＳＬＰ、ＴＬ１Ａ／ＴＮＦＳＦ１５、ＴＳＬＰＲ、ＴＬＲ１、ＴＳＰ５０、ＴＬＲ２、β−ＩＩＩチューブリン、ＴＬＲ３、ＴＷＥＡＫ／ＴＮＦＳＦ１２、ＴＬＲ４、ＴＷＥＡＫ Ｒ／ＴＮＦＲＳＦ１２、ＴＬＲ５、Ｔｙｋ２、ＴＬＲ６、ホスホ−チロシン、ＴＬＲ９、チロシンヒドロキシラーゼ、ＴＬＸ／ＮＲ２Ｅ１、チロシンホスファターゼ基質Ｉ、ユビキチン、ＵＮＣ５Ｈ３、Ｕｇｉ、ＵＮＣ５Ｈ４、ＵＧＲＰ１、ＵＮＧ、ＵＬＢＰ−Ｉ、ｕＰＡ、ＵＬＢＰ−２、ｕＰＡＲ、ＵＬＢＰ−３、ＵＲＢ、ＵＮＣ５Ｈ１、ＵＶＤＥ、ＵＮＣ５Ｈ２、バニロイドＲ１、ＶＥＧＦＲ、ＶＡＳＡ、ＶＥＧＦ Ｒ１／Ｆｌｔ−１、バソヒビン、ＶＥＧＦ Ｒ２／ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１、バソリン（Vasorin）、ＶＥＧＦＲ３／ＦＵ−４、バソスタチン、バーシカン、Ｖａｖ−１、ＶＧ５Ｑ、ＶＣＡＭ−１、ＶＨＲ、ＶＤＲ／ＮＲ１Ｉ１、ビメンチン、ＶＥＧＦ、ビトロネクチン、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＬＤＬＲ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ｖＷＦ−Ａ２、ＶＥＧＦ−Ｄ、シヌクレイン−α、Ｋｕ７０、ＷＡＳＰ、Ｗｎｔ−７ｂ、ＷＩＦ−Ｉ、Ｗｎｔ−８ａ ＷＩＳＰ−１／ＣＣＮ４、Ｗｎｔ−８ｂ、ＷＮＫ１、Ｗｎｔ−９ａ、Ｗｎｔ−１、Ｗｎｔ−９ｂ、Ｗｎｔ−３ａ、Ｗｎｔ−１０ａ、Ｗｎｔ−４、Ｗｎｔ−１０ｂ、Ｗｎｔ−５ａ、Ｗｎｔ−１１、Ｗｎｔ−５ｂ、ｗｎｖＮＳ３、Ｗｎｔ７ａ、ＸＣＲ１、ＸＰＥ／ＤＤＢ１、ＸＥＤＡＲ、ＸＰＥ／ＤＤＢ２、Ｘｇ、ＸＰＦ、ＸＩＡＰ、ＸＰＧ、ＸＰＡ、ＸＰＶ、ＸＰＤ、ＸＲＣＣ１、Ｙｅｓ、ＹＹ１、ＥｐｈＡ４。
数多くのヒトイオンチャネルはとりわけ興味深いターゲットである。非限定的な例には、次に挙げるものが包含される：５−ヒドロキシトリプタミン３受容体Ｂサブユニット、５−ヒドロキシトリプタミン３受容体前駆体、５−ヒドロキシトリプタミン受容体３サブユニットＣ、ＡＡＤ１４タンパク質、アセチルコリン受容体タンパク質、αサブユニット前駆体、アセチルコリン受容体タンパク質、βサブユニット前駆体、アセチルコリン受容体タンパク質、δサブユニット前駆体、アセチルコリン受容体タンパク質、εサブユニット前駆体、アセチルコリン受容体タンパク質、γサブユニット前駆体、酸感受性イオンチャネル３スプライス変異体ｂ、酸感受性イオンチャネル３スプライス変異体ｃ、酸感受性イオンチャネル４、ＡＤＰ−リボースピロホスファターゼ，ミトコンドリア前駆体、α１Ａ電位依存性カルシウムチャネル、アミロライド感受性カチオンチャネル１，神経性、アミロライド感受性カチオンチャネル２、神経性アミロライド感受性カチオンチャネル４アイソフォーム２、アミロライド感受性ナトリウムチャネル、アミロライド感受性ナトリウムチャネルαサブユニット、アミロライド感受性ナトリウムチャネルβサブユニット、アミロライド感受性ナトリウムチャネルδサブユニット、アミロライド感受性ナトリウムチャネルγ−サブユニット、アネキシンＡ７、アピカル（Apical）様タンパク質、ＡＴＰ感受性内向き整流カリウムチャネル１、ＡＴＰ感受性内向き整流カリウムチャネル１０、ＡＴＰ感受性内向き整流カリウムチャネル１１、ＡＴＰ感受性内向き整流カリウムチャネル１４、ＡＴＰ感受性内向き整流カリウムチャネル１５、ＡＴＰ感受性内向き整流カリウムチャネル８、カルシウムチャネルα１２．２サブユニット、カルシウムチャネルα１２．２サブユニット、カルシウムチャネルα１Ｅサブユニット・デルタ１９デルタ４０デルタ４６スプライス変異体、カルシウム活性化カリウムチャネルαサブユニット１、カルシウム活性化カリウムチャネルβサブユニット１、カルシウム活性化カリウムチャネルβサブユニット２、カルシウム活性化カリウムチャネルβサブユニット３、カルシウム依存性クロライドチャネル−１、カチオンチャネルＴＲＰＭ４Ｂ、ＣＤＮＡ ＦＬＪ９０４５３ ｆｉｓ，クローンＮＴ２ＲＰ３００１５４２，カリウムチャネル四量体化ドメイン含有６に高度に類似、ＣＤＮＡ ＦＬＪ９０６６３ ｆｉｓ，クローンＰＬＡＣＥ１００５０３１，細胞内クロライドチャネルタンパク質５に高度に類似、ＣＧＭＰ作動性カチオンチャネルβサブユニット、クロライドチャネルタンパク質、クロライドチャネルタンパク質２、クロライドチャネルタンパク質３、クロライドチャネルタンパク質４、クロライドチャネルタンパク質５、クロライドチャネルタンパク質６、クロライドチャネルタンパク質Ｃ１Ｃ−Ｋａ、クロライドチャネルタンパク質Ｃ１Ｃ−Ｋｂ、クロライドチャネルタンパク質、骨格筋、細胞内クロライドチャネル６、細胞内クロライドチャネルタンパク質３、細胞内クロライドチャネルタンパク質４、細胞内クロライドチャネルタンパク質５、ＣＨＲＮＡ３タンパク質、Ｃｌｃｎ３ｅタンパク質、ＣＬＣＮＫＢタンパク質、ＣＮＧＡ４タンパク質、カリン−５、サイクリックＧＭＰ作動性カリウムチャネル、環状ヌクレオチド作動性カチオンチャネル４、環状ヌクレオチド作動性カチオンチャネルα３、環状ヌクレオチド作動性カチオンチャネルβ３、環状ヌクレオチド作動性嗅覚チャネル、嚢胞性線維症膜コンダクタンス調節因子、シトクロムＢ−２４５重鎖、ジヒドロピリジン感受性Ｌ型、カルシウムチャネルα−２／δサブユニット前駆体、ＦＸＹＤドメイン含有イオン輸送調節因子３前駆体、ＦＸＹＤドメイン含有イオン輸送調節因子５前駆体、ＦＸＹＤドメイン含有イオン輸送調節因子６前駆体、ＦＸＹＤドメイン含有イオン輸送調節因子７、ＦＸＹＤドメイン含有イオン輸送調節因子８前駆体、Ｇタンパク質活性化内向き整流カリウムチャネル１、Ｇタンパク質活性化内向き整流カリウムチャネル２、Ｇタンパク質活性化内向き整流カリウムチャネル３、Ｇタンパク質活性化内向き整流カリウムチャネル４、γ−アミノ酪酸受容体α−１サブユニット前駆体、γ−アミノ酪酸受容体α２サブユニット前駆体、γ−アミノ酪酸受容体α３サブユニット前駆体、γ−アミノ酪酸受容体α４サブユニット前駆体、γ−アミノ酪酸受容体α５サブユニット前駆体、γ−アミノ酪酸受容体α６サブユニット前駆体、γ−アミノ酪酸受容体β１サブユニット前駆体、γ−アミノ酪酸受容体β２サブユニット前駆体、γ−アミノ酪酸受容体β３サブユニット前駆体、γ−アミノ酪酸受容体δサブユニット前駆体、γ−アミノ酪酸受容体εサブユニット前駆体、γ−アミノ酪酸受容体γ−１サブユニット前駆体、γ−アミノ酪酸受容体γ−３サブユニット前駆体、γ−アミノ酪酸受容体πサブユニット前駆体、γ−アミノ酪酸受容体ρ１サブユニット前駆体、γ−アミノ酪酸受容体ρ２サブユニット前駆体、γ−アミノ酪酸受容体θサブユニット前駆体、ＧｌｕＲ６カイニン酸受容体、グルタミン酸受容体１前駆体、グルタミン酸受容体２前駆体、グルタミン酸受容体３前駆体、グルタミン酸受容体４前駆体、グルタミン酸受容体７、グルタミン酸受容体Ｂ、グルタミン酸受容体δ１サブユニット前駆体、グルタミン酸受容体イオンチャネル型カイニン酸型１前駆体、グルタミン酸受容体イオンチャネル型カイニン酸型２前駆体、グルタミン酸受容体イオンチャネル型カイニン酸型３前駆体、グルタミン酸受容体イオンチャネル型カイニン酸型４前駆体、グルタミン酸受容体イオンチャネル型カイニン酸型５前駆体、グルタミン酸［ＮＭＤＡ］受容体サブユニット３Ａ前駆体、グルタミン酸［ＮＭＤＡ］受容体サブユニット３Ｂ前駆体、グルタミン酸［ＮＭＤＡ］受容体サブユニットε１前駆体、グルタミン酸［ＮＭＤＡ］受容体サブユニットε２前駆体、グルタミン酸［ＮＭＤＡ］受容体サブユニットε４前駆体、グルタミン酸［ＮＭＤＡ］受容体サブユニットζ１前駆体、グリシン受容体α１鎖前駆体、グリシン受容体α２鎖前駆体、グリシン受容体α３鎖前駆体、グリシン受容体β鎖前駆体、Ｈ／ＡＣＡリボ核タンパク質複合体サブユニット１、高親和性免疫グロブリンε受容体βサブユニット、仮想（Hypothetical）タンパク質ＤＫＦＺｐ３１３１０３３４、仮想タンパク質ＤＫＦＺｐ７６１Ｍ１７２４、仮想タンパク質ＦＬＪ１２２４２、仮想タンパク質ＦＬＪ１４３８９、仮想タンパク質ＦＬＪ１４７９８、仮想タンパク質ＦＬＪ１４９９５、仮想タンパク質ＦＬＪ１６１８０、仮想タンパク質ＦＬＪ１６８０２、仮想タンパク質ＦＬＪ３２０６９、仮想タンパク質ＦＬＪ３７４０１、仮想タンパク質ＦＬＪ３８７５０、仮想タンパク質ＦＬＪ４０１６２、仮想タンパク質ＦＬＪ４１４１５、仮想タンパク質ＦＬＪ９０５７６、仮想タンパク質ＦＬＪ９０５９０、仮想タンパク質ＦＬＪ９０６２２、仮想タンパク質ＫＣＴＤ１５、仮想タンパク質ＭＧＣ１５６１９、イノシトール１，４，５−三リン酸受容体１型、イノシトール１，４，５−三リン酸受容体２型、イノシトール１，４，５−三リン酸受容体３型、中間コンダクタンスカルシウム活性化カリウムチャネルタンパク質４、内向き整流カリウムチャネル１３、内向き整流カリウムチャネル１６、内向き整流カリウムチャネル４、内向き整流Ｋ（＋）チャネル負調節因子Ｋｉｒ２．２ｖ、カイニン酸受容体サブユニットＫＡ２ａ、ＫＣＮＨ５タンパク質、ＫＣＴＤ１７タンパク質、ＫＣＴＤ２タンパク質、ケラチノサイト関連膜貫通タンパク質１、Ｋｖチャネル相互作用タンパク質４、メラスタチン１、膜タンパク質ＭＬＣ１、ＭＧＣ１５６１９タンパク質、ムコリピン（Ｍｕｃｏｌｉｐｉｎ）−１、ムコリピン−２、ムコリピン−３、多剤耐性関連タンパク質４、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体２Ｃサブユニット前駆体、ＮＡＤＰＨオキシダーゼホモログ１、Ｎａｖ１．５、神経性アセチルコリン受容体タンパク質α１０サブユニット前駆体、神経性アセチルコリン受容体タンパク質α２サブユニット前駆体、神経性アセチルコリン受容体タンパク質α３サブユニット前駆体、神経性アセチルコリン受容体タンパク質α４サブユニット前駆体、神経性アセチルコリン受容体タンパク質α５サブユニット前駆体、神経性アセチルコリン受容体タンパク質α６サブユニット前駆体、神経性アセチルコリン受容体タンパク質α７サブユニット前駆体、神経性アセチルコリン受容体タンパク質α９サブユニット前駆体、神経性アセチルコリン受容体タンパク質β２サブユニット前駆体、神経性アセチルコリン受容体タンパク質β３サブユニット前駆体、神経性アセチルコリン受容体タンパク質β４サブユニット前駆体、神経性電位依存性カルシウムチャネルα２Ｄサブユニット、Ｐ２Ｘプリン受容体１、Ｐ２Ｘプリン受容体２、Ｐ２Ｘプリン受容体３、Ｐ２Ｘプリン受容体４、Ｐ２Ｘプリン受容体５、Ｐ２Ｘプリン受容体６、Ｐ２Ｘプリン受容体７、膵カリウムチャネルＴＡＬＫ−Ｉｂ、膵カリウムチャネルＴＡＬＫ−Ｉｃ、膵カリウムチャネルＴＡＬＫ−Ｉｄ、ホスホレマン前駆体、プラスモリピン（Plasmolipin）、多発性嚢胞腎２関連タンパク質、多発性嚢胞腎２様１タンパク質、多発性嚢胞腎２様２タンパク質、ＰＫＤＲＥＪ（Polycystic kidney and receptor for egg jelly related protein）前駆体、ポリシスチン−２、カリウムチャネル調節因子、カリウムチャネルサブファミリーＫメンバー１、カリウムチャネルサブファミリーＫメンバー１０、カリウムチャネルサブファミリーＫメンバー１２、カリウムチャネルサブファミリーＫメンバー１３、カリウムチャネルサブファミリーＫメンバー１５、カリウムチャネルサブファミリーＫメンバー１６、カリウムチャネルサブファミリーＫメンバー１７、カリウムチャネルサブファミリーＫメンバー２、カリウムチャネルサブファミリーＫメンバー３、カリウムチャネルサブファミリーＫメンバー４、カリウムチャネルサブファミリーＫメンバー５、カリウムチャネルサブファミリーＫメンバー６、カリウムチャネルサブファミリーＫメンバー７、カリウムチャネルサブファミリーＫメンバー９、カリウムチャネル四量体化ドメイン含有３、カリウムチャネル四量体化ドメイン含有タンパク質１２、カリウムチャネル四量体化ドメイン含有タンパク質１４、カリウムチャネル四量体化ドメイン含有タンパク質２、カリウムチャネル四量体化ドメイン含有タンパク質４、カリウムチャネル四量体化ドメイン含有タンパク質５、カリウムチャネル四量体化ドメイン含有１０、カリウムチャネル四量体化ドメイン含有タンパク質１３、カリウムチャネル四量体化ドメイン含有１、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーＡメンバー１、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーＡメンバー２、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーＡメンバー４、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーＡメンバー５、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーＡメンバー６、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーＢメンバー１、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーＢメンバー２、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーＣメンバー１、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーＣメンバー３、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーＣメンバー４、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーＤメンバー１、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーＤメンバー２、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーＤメンバー３、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーＥメンバー１、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーＥメンバー２、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーＥメンバー３、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーＥメンバー４、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーＦメンバー１、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーＧメンバー１、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーＧメンバー２、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーＧメンバー３、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーＧメンバー４、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーＨメンバー１、電位作動性カリ
ウムチャネルサブファミリーＨメンバー２、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーＨメンバー３、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーＨメンバー４、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーＨメンバー５、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーＨメンバー６、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーＨメンバー７、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーＨメンバー８、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーＫＱＴメンバー１、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーＫＱＴメンバー２、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーＫＱＴメンバー３、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーＫＱＴメンバー４、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーＫＱＴメンバー５、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーＳメンバー１、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーＳメンバー２、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーＳメンバー３、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーＶメンバー２、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーＨメンバー７アイソフォーム２、カリウム／ナトリウム過分極活性化環状ヌクレオチド作動性チャネル１、カリウム／ナトリウム過分極活性化環状ヌクレオチド作動性チャネル２、カリウム／ナトリウム過分極活性化環状ヌクレオチド作動性チャネル３、カリウム／ナトリウム過分極活性化環状ヌクレオチド作動性チャネル４、予想（Probable）ミトコンドリア搬入受容体サブユニットＴＯＭ４０ホモログ、プリン作動性受容体Ｐ２Ｘ５アイソフォームＡ、推定（Putative）４リピート電位作動性イオンチャネル、推定クロライドチャネルタンパク質７、推定ＧｌｕＲ６カイニン酸受容体、推定イオンチャネルタンパク質ＣＡＴＳＰＥＲ２変異体１、推定イオンチャネルタンパク質ＣＡＴＳＰＥＲ２変異体２、推定イオンチャネルタンパク質ＣＡＴＳＰＥＲ２変異体３、推定カリウムチャネル調節因子タンパク質変異体１、推定チロシン−プロテインホスファターゼＴＰＴＥ、リアノジン受容体１、リアノジン受容体２、リアノジン受容体３、ＳＨ３ＫＢＰ１結合タンパク質１、短型（Short）一過性受容体電位チャネル１、短型一過性受容体電位チャネル４、短型一過性受容体電位チャネル５、短型一過性受容体電位チャネル６、短型一過性受容体電位チャネル７、小コンダクタンスカルシウム活性化カリウムチャネルタンパク質１、小コンダクタンスカルシウム活性化カリウムチャネルタンパク質２アイソフォームｂ、小コンダクタンスカルシウム活性化カリウムチャネルタンパク質３アイソフォームｂ、小コンダクタンスカルシウム活性化カリウムチャネルＳＫ２、小コンダクタンスカルシウム活性化カリウムチャネルＳＫ３、ナトリウムチャネル、ナトリウムチャネルβ−１サブユニット前駆体、ナトリウムチャネルタンパク質ＩＩ型αサブユニット、ナトリウムチャネルタンパク質ＩＩＩ型αサブユニット、ナトリウムチャネルタンパク質ＩＶ型αサブユニット、ナトリウムチャネルタンパク質ＩＸ型αサブユニット、ナトリウムチャネルタンパク質Ｖ型αサブユニット、ナトリウムチャネルタンパク質ＶＩＩ型αサブユニット、ナトリウムチャネルタンパク質ＶＩＩＩ型αサブユニット、ナトリウムチャネルタンパク質Ｘ型αサブユニット、ナトリウムチャネルタンパク質ＸＩ型αサブユニット、ナトリウム・クロライド活性化ＡＴＰ感受性カリウムチャネル、ナトリウム／カリウム輸送ＡＴＰアーゼγ鎖、精子関連カチオンチャネル１、精子関連カチオンチャネル２アイソフォーム４、シンタキシン−１Ｂ１、一過性受容体電位カチオンチャネルサブファミリーＡメンバー１、一過性受容体電位カチオンチャネルサブファミリーＭメンバー２、一過性受容体電位カチオンチャネルサブファミリーＭメンバー３、一過性受容体電位カチオンチャネルサブファミリーＭメンバー６、一過性受容体電位カチオンチャネルサブファミリーＭメンバー７、一過性受容体電位カチオンチャネルサブファミリーＶメンバー１、一過性受容体電位カチオンチャネルサブファミリーＶメンバー２、一過性受容体電位カチオンチャネルサブファミリーＶメンバー３、一過性受容体電位カチオンチャネルサブファミリーＶメンバー４、一過性受容体電位カチオンチャネルサブファミリーＶメンバー５、一過性受容体電位カチオンチャネルサブファミリーＶメンバー６、一過性受容体電位チャネル４εスプライス変異体、一過性受容体電位チャネル４ζスプライス変異体、一過性受容体電位チャネル７γスプライス変異体、腫瘍壊死因子α誘導タンパク質１内皮性、２ポアカルシウムチャネルタンパク質２、ＶＤＡＣ４タンパク質、電位作動性カリウムチャネルＫｖ３．２ｂ、電位作動性ナトリウムチャネルβ１Ｂサブユニット、電位依存性アニオンチャネル、電位依存性アニオンチャネル２、電位依存性アニオン選択的チャネルタンパク質１、電位依存性アニオン選択的チャネルタンパク質２、電位依存性アニオン選択的チャネルタンパク質３、電位依存性カルシウムチャネルγ１サブユニット、電位依存性カルシウムチャネルγ２サブユニット、電位依存性カルシウムチャネルγ３サブユニット、電位依存性カルシウムチャネルγ４サブユニット、電位依存性カルシウムチャネルγ５サブユニット、電位依存性カルシウムチャネルγ６サブユニット、電位依存性カルシウムチャネルγ７サブユニット、電位依存性カルシウムチャネルγ８サブユニット、電位依存性Ｌ型カルシウムチャネルα１Ｃサブユニット、電位依存性Ｌ型カルシウムチャネルα１Ｄサブユニット、電位依存性Ｌ型カルシウムチャネルαＩＳサブユニット、電位依存性Ｌ型カルシウムチャネルβ１サブユニット、電位依存性Ｌ型カルシウムチャネルβ２サブユニット、電位依存性Ｌ型カルシウムチャネルβ３サブユニット、電位依存性Ｌ型カルシウムチャネルβ４サブユニット、電位依存性Ｎ型カルシウムチャネルα１Ｂサブユニット、電位依存性Ｐ／Ｑ型カルシウムチャネルα１Ａサブユニット、電位依存性Ｒ型カルシウムチャネルα１Ｅサブユニット、電位依存性Ｔ型カルシウムチャネルα１Ｇサブユニット、電位依存性Ｔ型カルシウムチャネルα１Ｈサブユニット、電位依存性Ｔ型カルシウムチャネルα１Ｉサブユニット、電位作動性Ｌ型カルシウムチャネルα１サブユニット、電位作動性カリウムチャネルβ１サブユニット、電位作動性カリウムチャネルβ２サブユニット、電位作動性カリウムチャネルβ３サブユニット、電位作動性カリウムチャネルＫＣＮＡ７。ヒト電位作動性ナトリウムチャネルのＮａｖｌ．ｘファミリーも特に有望なターゲットである。このファミリーには、例えばチャネルＮａｖｌ．６およびＮａｖｌ．８が包含される。
特定の実施形態において、治療タンパク質がＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）であってもよい。例示的ＧＰＣＲには、次に挙げるものが包含されるが、これらに限定されるわけではない：クラスＡロドプシン様受容体、例えばムスカリン性（Muse.）アセチルコリン脊椎動物１型、ムスカリン性アセチルコリン脊椎動物２型、ムスカリン性アセチルコリン脊椎動物３型、ムスカリン性アセチルコリン脊椎動物４型；アドレノセプター（αアドレノセプター１型、αアドレノセプター２型、βアドレノセプター１型、βアドレノセプター２型、βアドレノセプター３型、ドーパミン脊椎動物１型、ドーパミン脊椎動物２型、ドーパミン脊椎動物３型、ドーパミン脊椎動物４型、ヒスタミン１型、ヒスタミン２型、ヒスタミン３型、ヒスタミン４型、セロトニン１型、セロトニン２型、セロトニン３型、セロトニン４型、セロトニン５型、セロトニン６型、セロトニン７型、セロトニン８型、セロトニンの他のタイプ、微量アミン、アンジオテンシン１型、アンジオテンシン２型、ボンベシン、ブラジキニン、Ｃ５ａアナフィラトキシン、Ｆｍｅｔ−ｌｅｕ−ｐｈｅ、ＡＰＪ様、インターロイキン８タイプＡ、インターロイキン８タイプＢ、インターロイキン８の他のタイプ、Ｃ−−Ｃケモカイン１型〜１１型および他のタイプ、Ｃ−−Ｘ−−Ｃケモカイン（２型〜６型および他のタイプ）、Ｃ−−Ｘ３−−Ｃケモカイン、コレシストキニンＣＣＫ、ＣＣＫタイプＡ、ＣＣＫタイプＢ、他のＣＣＫ、エンドセリン、メラノコルチン（メラニン細胞刺激ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン、メラノコルチンホルモン）、ダッフィ抗原、プロラクチン放出ペプチド（ＧＰＲ１０）、神経ペプチドＹ（１型〜７型）、神経ペプチドＹ、他の神経ペプチドＹ、ニューロテンシン、オピオイド（Ｄ、Ｋ、Ｍ、Ｘ型）、ソマトスタチン（１型〜５型）、タキキニン（サブスタンスＰ（ＮＫ１）、サブスタンスＫ（ＮＫ２）、ニューロメジンＫ（ＮＫ３）、タキキニン様１、タキキニン様２、バソプレシン／バソトシン（１型〜２型）、バソトシン、オキシトシン／メソトシン、コノプレッシン、ガラニン様、プロテイナーゼ活性化様、オレキシンおよび神経ペプチドＦＦ、ＱＲＦＰ、ケモカイン受容体様、ニューロメジンＵ様（ニューロメジンＵ、ＰＲＸアミド）、ホルモンタンパク質（卵胞刺激ホルモン、ルトロピン−絨毛性性腺刺激ホルモン、サイロトロピン、ゴナドトロピンＩ型、ゴナドトロピンＩＩ型）、オプシン（ロドプシン）、ロドプシン脊椎動物（１〜５型）、ロドプシン脊椎動物５型、ロドプシン節足動物、ロドプシン節足動物１型、ロドプシン節足動物２型、ロドプシン節足動物３型、ロドプシン軟体動物、ロドプシン，嗅覚（嗅覚ＩＩファミリー１〜１３）、プロスタグランジン（プロスタグランジンＥ２サブタイプＥＰ１、プロスタグランジンＥ２／Ｄ２サブタイプＥＰ２、プロスタグランジンＥ２サブタイプＥＰ３、プロスタグランジンＥ２サブタイプＥＰ４、プロスタグランジンＦ２−α、プロスタサイクリン、トロンボキサン、アデノシン１型〜３型、プリン受容体、プリン受容体Ｐ２ＲＹ１−４，６，１１ ＧＰＲ９１、プリン受容体Ｐ２ＲＹ５，８，９，１０ ＧＰＲ３５，９２，１７４、プリン受容体Ｐ２ＲＹ１２−１４ ＧＰＲ８７（ＵＤＰ−グルコース）、カンナビノイド、血小板活性化因子、性腺刺激ホルモン放出ホルモン、性腺刺激ホルモン放出ホルモンＩ型、性腺刺激ホルモン放出ホルモンＩＩ型、脂質動員ホルモン様、コラゾニン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモンおよび分泌促進物質、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン分泌促進物質、成長ホルモン分泌促進物質様、脱皮トリガリングホルモン（ＥＴＨＲ）、メラトニン、リゾスフィンゴリピドおよびＬＰＡ（ＥＤＧ）、スフィンゴシン１−リン酸Ｅｄｇ−１、リゾホスファチジン酸Ｅｄｇ−２、スフィンゴシン１−リン酸Ｅｄｇ−３、リゾホスファチジン酸Ｅｄｇ−４、スフィンゴシン１−リン酸Ｅｄｇ−５、スフィンゴシン１−リン酸Ｅｄｇ−６、リゾホスファチジン酸Ｅｄｇ−７、スフィンゴシン１−リン酸Ｅｄｇ−８、他のＥｄｇ、ロイコトリエンＢ４受容体、ロイコトリエンＢ４受容体ＢＬＴ１、ロイコトリエンＢ４受容体ＢＬＴ２、クラスＡオーファン／その他、推定神経伝達物質、ＳＲＥＢ、Ｍａｓがん原遺伝子およびＭａｓ関連（ＭＲＧ）、ＧＰＲ４５様、システイニルロイコトリエン、Ｇタンパク質共役胆汁酸受容体、遊離脂肪酸受容体（ＧＰ４０、ＧＰ４１、ＧＰ４３）、クラスＢセクレチン様、カルシトニン、副腎皮質刺激ホルモン放出因子、胃抑制ペプチド、グルカゴン、成長ホルモン放出ホルモン、副甲状腺ホルモン、ＰＡＣＡＰ、セクレチン、血管作用性腸管ポリペプチド、ラトロフィリン、ラトロフィリン１型、ラトロフィリン２型、ラトロフィリン３型、ＥＴＬ受容体、脳特異的血管新生インヒビター（ＢＡＩ）、メトセラ（Methuselah）様タンパク質（ＭＴＨ）、カドヘリンＥＧＦ ＬＡＧ（ＣＥＬＳＲ）、超高分子（Very large）Ｇタンパク質共役受容体、クラスＣ代謝型グルタミン酸／フェロモン、代謝型グルタミン酸グループＩ〜ＩＩＩ、カルシウム感知様、細胞外カルシウム感知、フェロモン、他のカルシウム感知様、推定フェロモン受容体、ＧＡＢＡ−Ｂ、ＧＡＢＡ−Ｂサブタイプ１、ＧＡＢＡ−Ｂサブタイプ２、ＧＡＢＡ−Ｂ様、オーファンＧＰＲＣ５、オーファンＧＰＣＲ６、ブライド・オブ・セブンレス（Bride of sevenless）タンパク質（ＢＯＳＳ）、味覚受容体（ＴｌＲ）、クラスＤ真菌フェロモン、真菌フェロモンＡ因子様（ＳＴＥ２、ＳＴＥ３）、真菌フェロモンＢ様（ＢＡＲ、ＢＢＲ、ＲＣＢ、ＰＲＡ）、クラスＥ ｃＡＭＰ受容体、眼白子症タンパク質、フリズルド／スムースンド（Smoothened）ファミリー、フリズルドグループＡ（Ｆｚ１および２および４および５および７〜９）、フリズルドグループＢ（Ｆｚ３および６）、フリズルドグループＣ（その他）、鋤鼻受容体、線虫化学受容体、昆虫匂い受容体、およびクラスＺ古細菌／細菌／真菌オプシン。
特定の実施形態において、本明細書に記載の血清アルブミン結合Ｆｎ３融合物は、次に挙げる活性ポリペプチドをどれでも含むことができる：ボトックス（ＢＯＴＯＸ）、マイオブロック（Myobloc）、ニューロブロック（Neurobloc）、ディスポート（Dysport）（または他の血清型のボツリヌス神経毒）、アルグルコシダーゼアルファ、ダプトマイシン、ＹＨ−１６、絨毛性ゴナドトロピンアルファ、フィルグラスチム、セトロレリクス、インターロイキン−２、アルデスロイキン、テセロイキン、デニロイキンジフチトクス、インターフェロンアルファ−ｎ３（注射剤）、インターフェロンアルファ−ｎ１、ＤＬ−８２３４、インターフェロン、サントリー（Suntory）（ガンマ−Ｉａ）、インターフェロンガンマ、チモシンアルファ１、タソネルミン、ＤｉｇｉＦａｂ、ＶｉｐｅｒａＴＡｂ、ＥｃｈｉＴＡｂ、ＣｒｏＦａｂ、ネシリチド、アバタセプト、アレファセプト、レビフ（Ｒｅｂｉｆ）、エプトテルミンアルファ、テリパラチド（骨粗鬆症）、カルシトニン注射用（骨疾患）、カルシトニン（点鼻用、骨粗鬆症）、エタネルセプト、ヘモグロビングルタマー（hemoglobin glutamer）２５０（ウシ）、ドロトレコギンアルファ、コラゲナーゼ、カルペリチド、組換えヒト上皮成長因子（局所外用ゲル、創傷治癒）、ＤＷＰ−４０１、ダルベポエチンアルファ、エポエチンオメガ、エポエチンベータ、エポエチンアルファ、デシルジン、レピルジン、ビバリルジン、ノナコグアルファ、モノニン（Mononine）、エプタコグアルファ（活性型）、組換え第ＶＩＩＩ因子＋ＶＷＦ、リコネイト（Recombinate）、組換え第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子（組換え）、アルファネート（Alphanate）、オクトコグアルファ、第ＶＩＩＩ因子、パリフェルミン、インディキナーゼ（Indikinase）、テネクテプラーゼ、アルテプラーゼ、パミテプラーゼ、レテプラーゼ、ナテプラーゼ（nateplase）、モンテプラーゼ、フォリトロピンアルファ、ｒＦＳＨ、ｈｐＦＳＨ、ミカファンギン、ペグフィルグラスチム、レノグラスチム、ナルトグラスチム、セルモレリン、グルカゴン、エクセナチド、プラムリンチド、イミグルセラーゼ、ガルスルファーゼ、ロイコトロピン（Leucotropin）、モルグラモスチム、酢酸トリプトレリン、ヒストレリン（皮下インプラント、ハイドロン（Hydron））、デスロレリン、ヒストレリン、ナファレリン、ロイプロリド徐放性デポー（アトリゲル（ＡＴＲＩＧＥＬ））、ロイプロリドインプラント（デュロス（ＤＵＲＯＳ））、ゴセレリン、ソマトロピン、ユートロピン（Eutropin）、ＫＰ−１０２プログラム（program）、ソマトロピン、ソマトロピン、メカセルミン（成長不全）、エンフビルチド、Ｏｒｇ−３３４０８、インスリングラルギン、インスリングルリジン、インスリン（吸入薬）、インスリンリスプロ、インスリンデテミル、インスリン（バッカル剤、ＲａｐｉｄＭｉｓｔ）、メカセルミンリンファベート（mecasermin rinfabate）、アナキンラ、セルモロイキン、９９ｍＴｃ−アプシタイド（apcitide）注射剤、ミエロピド（myelopid）、ベータセロン（Betaseron）、酢酸グラチラマー、ゲポン（Gepon）、サルグラモスチム、オプレルベキン、ヒト白血球由来アルファインターフェロン、ビリブ（Bilive）、インスリン（組換え）、組換えヒトインスリン、インスリンアスパルト、メカセルミン、ロフェロン（Roferon）−Ａ、インターフェロン−アルファ２、アルファフェロン（Alfaferone）、インターフェロンアルファコン−１、インターフェロンアルファ、アボネックス（Avonex）組換えヒト黄体形成ホルモン、ドルナーゼアルファ、トラフェルミン、ジコノチド、タルチレリン、ジボテルミンアルファ、アトシバン、ベカプレルミン、エプチフィバチド、ゼマイラ（Zemaira）、ＣＴＣ−１１１、シャンバック（Shanvac）−Ｂ、ＨＰＶワクチン（四価）、ＮＯＶ−００２、オクトレオチド、ランレオチド、アンセスチム、アガルシダーゼベータ、アガルシダーゼアルファ、ラロニダーゼ、酢酸プレザチド銅（局所外用ゲル）、ラスブリカーゼ、ラニビズマブ、アクティミューン、ＰＥＧ−イントロン、トリコミン（Tricomin）、組換えヒョウヒダニアレルギー脱感作注射剤、組換えヒト副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）１−８４（皮下、骨粗鬆症）、エポエチンデルタ、トランスジェニックアンチトロンビンＩＩＩ、グランジトロピン（Granditropin）、ビトラーゼ（Vitrase）、組換えインスリン、インターフェロン−アルファ（経口口中錠）、ＧＥＭ−２ＩＳ、バプレオチド、イデュルスルファーゼ、オマパトリラート、組換え血清アルブミン、セルトリズマブペゴール、グルカルピダーゼ、ヒト組換えＣ１エステラーゼインヒビター（血管性浮腫）、ラノテプラーゼ、組換えヒト成長ホルモン、エンフビルチド（無針注射剤、Biojector 2000）、ＶＧＶ−Ｉ、インターフェロン（アルファ）、ルシナクタント、アビプタジル（吸入型、肺疾患）、イカチバント、エカランチド、オミガナン（omiganan）、オーログラブ（Aurograb）、酢酸ペキシガナン、ＡＤＩ−ＰＥＧ−２０、ＬＤＩ−２００、デガレリクス、シントレデキン・ベスドトクス（cintredekin besudotox）、ＦａｖＩｄ、ＭＤＸ−１３７９、ＩＳＡｔｘ−２４７、リラグルチド、テリパラチド（骨粗鬆症）、チファコギン（tifacogin）、ＡＡ−４５００、Ｔ４Ｎ５リポソームローション、カツマキソマブ、ＤＷＰ−４１３、ＡＲＴ−１２３、クリサリン（Chrysalin）、デスモテプラーゼ、アメジプラーゼ、コリフォリトロピンアルファ、ＴＨ−９５０７、テデュグルチド（ｔｅｄｕｇｌｕｔｉｄｅ）、ディアミド（Diamyd）、ＤＷＰ−４１２、成長ホルモン（徐放性注射剤）、組換えＧ−ＣＳＦ、インスリン（吸入型、ＡＩＲ）、インスリン（吸入型、テクノスフェア（Technosphere））、インスリン（吸入型、ＡＥＲｘ）、ＲＧＮ−３０３、ＤｉａＰｅｐ２７７、インターフェロンベータ（Ｃ型肝炎ウイルス感染（ＨＣＶ））、インターフェロンアルファ−ｎ３（経口）、ベラタセプト、経皮インスリン貼付薬、ＡＭＧ−５３１、ＭＢＰ−８２９８、キセレセプト（Xerecept）、オペバカン、エイズバックス（ＡＩＤＳＶＡＸ）、ＧＶ−１００１、リンフォスキャン（LymphoScan）、ランピルナーゼ、リポキシサン（Lipoxysan）、ルスプルチド、ＭＰ５２（β−リン酸三カルシウム運搬体、骨再生）、黒色腫ワクチン、シプロイセルＴ、ＣＴＰ−３７、インセジア（Insegia）、ビテスペン、ヒトトロンビン（凍結物、手術による出血）、トロンビン、ＴｒａｎｓＭＩＤ、アルフィメプラーゼ、プリカーゼ（Puricase）、テルリプレシン（静脈内、肝腎症候群）、ＥＵＲ−１００８Ｍ、組換えＦＧＦ−Ｉ（注射用、血管疾患）、ＢＤＭ−Ｅ、ロチガプチド、ＥＴＣ−２１６、Ｐ−１１３、ＭＢＩ−５９４ＡＮ、デュラマイシン（duramycin）（吸入型、嚢胞性線維症）、ＳＣＶ−０７、ＯＰＩ−４５、エンドスタチン、アンジオスタチン、ＡＢＴ−５１０、ボウマン・バーク・インヒビター・コンセントレート、ＸＭＰ−６２９、９９ｍＴｃ−Ｈｙｎｉｃ−アネキシンＶ、カハラライドＦ、ＣＴＣＥ−９９０８、テベレリクス（teverelix）（持続放出）、オザレリクス（ozarelix）、ロミデプシン、ＢＡＹ−５０−４７９８、インターロイキン−４、ＰＲＸ−３２１、ペプスキャン（Pepscan）、イボクタデキン（iboctadekin）、ｒｈラクトフェリン、ＴＲＵ−０１５、ＩＬ−２１、ＡＴＮ−１６１、シレンジチド（cilengitide）、アルブフェロン（Albuferon）、Biphasix、ＩＲＸ−２、オメガインターフェロン、ＰＣＫ−３１４５、ＣＡＰ−２３２、パシレオチド（pasireotide）、ｈｕＮ９０１−ＤＭ１、卵巣がん免疫療法ワクチン、ＳＢ−２４９５５３、Ｏｎｃｏｖａｘ−ＣＬ、ＯｎｃｏＶａｘ−Ｐ、ＢＬＰ−２５、ＣｅｒＶａｘ−１６、マルチエピトープペプチド黒色腫ワクチン（ＭＡＲＴ−Ｉ、ｇｐ１００、チロシナーゼ）、ネミフィチド、ｒＡＡＴ（吸入型）、ｒＡＡＴ（皮膚科用）、ＣＧＲＰ（吸入型、喘息）、ペグスネルセプト、チモシンβ−４、プリチデプシン、ＧＴＰ−２００、ラモプラニン、ＧＲＡＳＰＡ、ＯＢＩ−Ｉ、ＡＣ−１００、サケカルシトニン（経口、エリジェン（eligen））、カルシトニン（経口、骨粗鬆症）、エクサモレリン（examorelin）、カプロモレリン、Cardeva、ベラフェルミン、１３１Ｉ−ＴＭ−６０１、ＫＫ−２２０、ＴＰ−１０、ウラリチド、デペレスタット、ヘマチド（hematide）、クリサリン（Chrysalin）（局所外用）、ｒＮＡＰｃ２、組換え第ＶＩＩＩ因子（ＰＥＧ化リポソーム）、ｂＦＧＦ、ＰＥＧ化組換えスタフィロキナーゼ変異体、Ｖ−１０１５３、SonoLysis Prolyse、NeuroVax、ＣＺＥＮ−００２、島細胞新生療法、ｒＧＬＰ−１、ＢＩＭ−５１０７７、ＬＹ−５４８８０６、エクセナチド（放出制御剤、Ｍｅｄｉｓｏｒｂ）、ＡＶＥ−００１０、ＧＡ−ＧＣＢ、アボレリン（avorelin）、ＡＯＤ−９６０４、酢酸リナクロチオド、ＣＥＴｉ−Ｉ、ヘモスパン（Hemospan）、ＶＡＬ（注射用）、速効性インスリン（注射用、Viadel）、鼻腔内インスリン、インスリン（吸入型）、インスリン（経口、エリジェン（eligen））、組換えメチオニルヒトレプチン、ピトラキンラ（皮下注射剤、湿疹）、ピトラキンラ（吸入用乾燥粉末、喘息）、マルチカイン（Multikine）、ＲＧ−１０６８、ＭＭ−０９３、ＮＢＩ−６０２４、ＡＴ−００１、ＰＩ−０８２４、Ｏｒｇ−３９１４１、Ｃｐｎ１Ｏ（自己免疫疾患／炎症）、タラクトフェリン（talactoferrin）（局所外用）、ｒＥＶ−１３１（眼科用）、ｒＥＶ−１３１（呼吸器疾患）、経口組換えヒトインスリン（糖尿病）、ＲＰＩ−７８Ｍ、オプレルベキン（経口）、ＣＹＴ−９９００７ ＣＴＬＡ４−Ｉｇ、ＤＴＹ−００１、バラテグラスト、インターフェロンアルファ−ｎ３（局所外用）、ＩＲＸ−３、ＲＤＰ−５８、タウフェロン（Tauferon）、胆汁酸塩刺激リパーゼ、メリスパーゼ（Merispase）、アルカリホスファターゼ、ＥＰ−２１０４Ｒ、メラノタン−ＩＩ、ブレメラノチド、ＡＴＬ−１０４、組換えヒトマイクロプラスミン、ＡＸ−２００、ＳＥＭＡＸ、ＡＣＶ−Ｉ、Ｘｅｎ−２１７４、ＣＪＣ−１００８、ダイノルフィンＡ、ＳＩ−６６０３、ＬＡＢ ＧＨＲＨ、ＡＥＲ−００２、ＢＧＣ−７２８、マラリアワクチン（ビロゾーム、ＰｅｖｉＰＲＯ）、ＡＬＴＵ−１３５、パルボウイルスＢ１９ワクチン、インフルエンザワクチン（組換えノイラミニダーゼ）、マラリア／ＨＢＶワクチン、炭疽ワクチン、Ｖａｃｃ−５ｑ、Ｖａｃｃ−４ｘ、ＨＩＶワクチン（経口）、ＨＰＶワクチン、Ｔａｔトキソイド、ＹＳＰＳＬ、ＣＨＳ−１３３４０、ＰＴＨ（１−３４）リポソームクリーム（Novasome）、オスタボリン（Ostabolin）−Ｃ、ＰＴＨアナログ（局所外用、乾癬）、ＭＢＲＩ−９３．０２、ＭＴＢ７２Ｆワクチン（結核）、ＭＶＡ−Ａｇ８５ Ａワクチン（結核）、ＦＡＲ−４０４、ＢＡ−２１０、組換えペストＦ１Ｖワクチン、ＡＧ−７０２、ＯｘＳＯＤｒｏｌ、ｒＢｅｔＶｌ、Ｄｅｒ−ｐｌ／Ｄｅｒ−ｐ２／Ｄｅｒ−ｐ７アレルゲンターゲティングワクチン（チリダニアレルギー）、ＰＲ１ペプチド抗原（白血病）、変異型ｒａｓワクチン、ＨＰＶ−１６ Ｅ７リポペプチドワクチン、ラビリンシン（labyrinthin）ワクチン（腺癌）、ＣＭＬワクチン、ＷＴ１−ペプチドワクチン（がん）、ＩＤＤ−５、ＣＤＸ−１１０、ペントリス（Pentrys）、ノレリン（Norelin）、ＣｙｔｏＦａｂ、Ｐ−９８０８、ＶＴ−１１１、イクロカプチド、テルベルミン（皮膚科、糖尿病性足病変潰瘍）、ルピントリビル、レティキュロース（reticulose）、ｒＧＲＦ、Ｐ１Ａ、α−ガラクトシダーゼＡ、ＡＣＥ−０１１、ＡＬＴＵ−１４０、ＣＧＸ−１１６０、アンジオテンシン治療用ワクチン、Ｄ−４Ｆ、ＥＴＣ−６４２、ＡＰＰ−０１８、ｒｈＭＢＬ、ＳＣＶ−０７（経口、結核）、ＤＲＦ−７２９５、ＡＢＴ−８２８、ＥｒｂＢ２特異的イムノトキシン（抗がん）、ＤＴ３８８ＩＬ−３、ＴＳＴ−１００８８、ＰＲＯ−１７６２、コンボトックス（Combotox）、コレシストキニン−Ｂ／ガストリン受容体結合ペプチド、１１１Ｉｎ−ｈＥＧＦ、ＡＥ−３７、トラスツズマブ−ＤＭ１、アンタゴニストＧ、ＩＬ−１２（組換
え）、ＰＭ−０２７３４、ＩＭＰ−３２１、ｒｈＩＧＦ−ＢＰ３、ＢＬＸ−８８３、ＣＵＶ−１６４７（局所外用）、Ｌ−１９に基づく放射免疫治療薬（がん）、Ｒｅ−１８８−Ｐ−２０４５、ＡＭＧ−３８６、ＤＣ／Ｉ５４０／ＫＬＨワクチン（がん）、ＶＸ−００１、ＡＶＥ−９６３３、ＡＣ−９３０１、ＮＹ−ＥＳＯ−Ｉワクチン（ペプチド）、ＮＡ１７．Ａ２ペプチド、黒色腫ワクチン（パルス抗原治療薬）、前立腺がんワクチン、ＣＢＰ−５０１、組換えヒトラクトフェリン（ドライアイ）、ＦＸ−０６、ＡＰ−２１４、ＷＡＰ−８２９４Ａ２（注射用）、ＡＣＰ−ＨＩＰ、ＳＵＮ−１１０３１、ペプチドＹＹ［３−３６］（肥満、鼻腔内）、ＦＧＬＬ、アタシセプト、ＢＲ３−Ｆｃ、ＢＮ−００３、ＢＡ−０５８、ヒト副甲状腺ホルモン１−３４（点鼻用、骨粗鬆症）、Ｆ−１８−ＣＣＲ１、ＡＴ−１００１（セリアック病／糖尿病）、ＪＰＤ−００３、ＰＴＨ（７−３４）リポソームクリーム（Novasome）、デュラマイシン（眼科用、ドライアイ）、ＣＡＢ−２、ＣＴＣＥ−０２１４、グリコＰＥＧ化（GlycoPEGylated）エリスロポエチン、ＥＰＯ−Ｆｃ、ＣＮＴＯ−５２８、ＡＭＧ−１１４、ＪＲ−０１３、第ＸＩＩＩ因子、アミノキャンディン（Aminocandin）、ＰＮ−９５１、７１６１５５、ＳＵＮ−Ｅ７００１、ＴＨ−０３１８、ＢＡＹ−７３−７９７７、テベレリクス（即放性）、ＥＰ−５１２１６、ｈＧＨ（放出制御剤、バイオスフェア（Biosphere））、ＯＧＰ−Ｉ、シフビルチド（sifuvirtide）、ＴＶ−４７１０、ＡＬＧ−８８９、Ｏｒｇ−４１２５９、ｒｈＣＣＩＯ、Ｆ−９９１、チモペンチン（肺疾患）、ｒ（ｍ）ＣＲＰ、肝選択的インスリン、スバリン（subalin）、Ｌ１９−ＩＬ−２融合タンパク質、エラフィン、ＮＭＫ−１５０、ＡＬＴＵ−１３９、ＥＮ−１２２００４、ｒｈＴＰＯ、トロンボポエチン受容体アゴニスト（血小板減少性障害）、ＡＬ−１０８、ＡＬ−２０８、神経成長因子アンタゴニスト（疼痛）、ＳＬＶ−３１７、ＣＧＸ−１００７、ＩＮＮＯ−１０５、経口テリパラチド（エリジェン（eligen））、ＧＥＭ−ＯＳ１、ＡＣ−１６２３５２、ＰＲＸ−３０２、ＬＦｎ−ｐ２４融合ワクチン（セラポア（Therapore））、ＥＰ−１０４３、肺炎レンサ球菌小児用ワクチン、マラリアワクチン、Ｂ群髄膜炎菌ワクチン、新生児Ｂ群連鎖球菌ワクチン、炭疽ワクチン、ＨＣＶワクチン（ｇｐＥｌ＋ｇｐＥ２＋ＭＦ−５９）、中耳炎治療、ＨＣＶワクチン（コア抗原＋ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ）、ｈＰＴＨ（１−３４）（経皮、ViaDerm）、７６８９７４、ＳＹＮ−１０１、ＰＧＮ−００５２、アビスクミン（aviscumine）、ＢＩＭ−２３１９０、結核ワクチン、マルチエピトープチロシナーゼペプチド、がんワクチン、エンカスチム（enkastim）、ＡＰＣ−８０２４、Ｇ１−５００５、ＡＣＣ−００１、ＴＴＳ−ＣＤ３、血管標的ＴＮＦ（固形腫瘍）、デスモプレシン（口腔粘膜放出制御剤）、オネルセプト、ＴＰ−９２０１。
さらなる修飾
特定の実施形態において、血清アルブミン結合物質およびそれらの融合物は、さらに翻訳後修飾を含みうる。例示的翻訳後タンパク質修飾には、リン酸化、アセチル化、メチル化、ＡＤＰ−リボシル化、ユビキチン化、グリコシル化、カルボニル化、ＳＵＭＯ化、ビオチン化、またはポリペプチド側鎖もしくは疎水性基の付加が含まれる。結果として、修飾された血清アルブミン結合物質およびそれらの融合物は、脂質、多糖または単糖、およびリン酸基などの非アミノ酸要素を含有しうる。好ましい形態のグリコシル化は、１つ以上のシアル酸部分がポリペプチドに結合するシアリル化である。シアル酸部分は溶解性および血清半減期を改善すると同時に、タンパク質の見込まれる免疫原性も減少させる。例えばRaju et al. Biochemistry. 2001 Jul 31;40(30):8868-76を参照されたい。そのような非アミノ酸要素が血清アルブミン結合物質またはそれらの融合物の機能性に及ぼす効果を、特定の血清アルブミン（例えばＨＳＡまたはＲｈＳＡ）に結合するそれらの能力に関して、および/または融合物の場合には具体的な非１０Ｆｎ３部分によって付与される機能的役割に関して、調べることができる。
Ｆ．核酸−タンパク質融合技術
ある局面において、本出願は、ＨＳＡに結合するフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインを含む、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質を提供する。特異的結合特性をもつＦｎ３ドメインを迅速に作成して試験する一つの方法は、Adnexus, a Bristol-Myers Squibb Companyの、核酸−タンパク質融合技術である。このような、核酸−タンパク質融合物（ＲＮＡ−およびＤＮＡ−タンパク質融合物）を開発するインビトロの発現および標識技術は、ＰＲＯｆｕｓｉｏｎと呼ばれ、タンパク質への結合に重要な、新規のポリペプチドおよびアミノ酸のモチーフの同定に、用いることができる。核酸−タンパク質融合技術は、タンパク質を、それをコードする遺伝子情報に、共有結合させる技術である。ＲＮＡ−タンパク質融合技術およびフィブロネクチンベース足場タンパク質ライブラリーの選別方法についての詳細な記述は、Szostak et al., 米国特許第６，２５８，５５８号；同第６，２６１，８０４号；同第６，２１４，５５３号；同第６，２８１，３４４号；同第６，２０７，４４６号；同第６，５１８，０１８号；ＰＣＴ公開番号ＷＯ００／３４７８４；ＷＯ ０１／６４９４２；ＷＯ ０２／０３２９２５; および Roberts and Szostak, Proc Natl. Acad. Sci. 94: 12297-12302, 1997を参照されたい。これらは本明細書に参照により組み込まれる。
Ｇ.ベクターおよびポリヌクレオチドの実施形態
本開示には、本明細書に記載されるタンパク質のいずれかをコードする核酸配列も含まれる。当業者には理解されるように、第３塩基の縮重ゆえに、ほとんどすべてのアミノ酸は、コードしているヌクレオチド配列中で、２つ以上のトリプレットコドンによって表されうる。加えて、軽微な塩基対変化は、コードされるアミノ酸配列における保存的置換をもたらす場合もあるが、遺伝子産物の生物学的活性は実質的に改変させないと予想される。それゆえに、本明細書に記載のタンパク質をコードする核酸配列は、配列をわずかに修飾してもなお、それぞれの遺伝子産物をコードすることができる。本明細書に記載の血清アルブミン結合物質およびそれらの融合物をコードする特定の例示的核酸には、配列番号１２６−１５１に記載される配列を有する核酸が含まれる。配列番号１２６−１５１に、少なくとも５０％、例えば少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一の核酸配列がまた、本発明により包含され、好ましくは血清アルブミンに結合するタンパク質をコードする核酸配列、タンデムＰＣＳＫ９−ＰＫＥ２アドネクチンをコードする核酸においては、好ましくは血清アルブミンおよびＰＣＳＫ９に結合するタンパク質をコードする核酸配列が、包含される。いくつかの実施形態において、結果として生じる翻訳されたアミノ酸配列を改変しないように、ヌクレオチド置換が導入される。
本明細書に開示するさまざまなタンパク質またはポリペプチドのいずれかをコードする核酸は、化学的に合成することができる。細胞内での発現が改善されるようにコドン使用頻度を選択することができる。そのようなコドン使用頻度は選択した細胞タイプに依存するであろう。大腸菌および他の細菌、ならびに哺乳動物細胞、植物細胞、酵母細胞および昆虫細胞に、それぞれ特化したコドン使用頻度パターンが開発されている。例えばMayfieldら, Proc Natl Acad Sci USA. 2003 100(2):438-42；Sinclair et al. Protein Expr Purif. 2002 (1):96-105；Connell ND. Curr Opin Biotechnol. 2001 (5):446-9；Makridesら,Microbiol Rev. 1996 60(3):512-38；およびSharp et al. Yeast. 1991 7(7):657-78を参照されたい。
核酸操作のための一般技法は当業者の知るところであり、例えばSambrookら「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」第１〜３巻（Cold Spring Harbor Laboratory Press,第2版, 1989）またはF. Ausubelら「Current Protocols in Molecular Biology」（GreenPublishing and Wiley-Interscience: New York、1987）とその定期改訂版にも記載されており、これらは参照により本明細書に組み込まれる。タンパク質をコードするＤＮＡは、哺乳動物遺伝子、ウイルス遺伝子または昆虫遺伝子に由来する適切な転写または翻訳調節要素に作動的に連結される。そのような調節要素には、転写プロモーター、転写を制御するための随意のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写および翻訳の終結を制御する配列が包含される。宿主中で複製する能力（通常は複製起点によって付与される）および形質転換体の認識を容易にするための選択遺伝子が、さらに組み込まれる。適切な調節要素は当技術分野ではよく知られている。
本明細書に記載のタンパク質および融合タンパク質は、異種ポリペプチド（好ましくはシグナル配列であるか、成熟タンパク質またはポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドであるもの）との融合タンパク質として作製することができる。好ましく選択される異種シグナル配列は、宿主細胞によって認識されプロセシングされる（すなわちシグナルペプチダーゼによって切断される）ものである。ネイティブシグナル配列を認識せずプロセシングしない原核宿主細胞の場合は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐ、または耐熱性エンテロトキシンＩＩリーダーの群などから選択される原核生物シグナル配列で、シグナル配列を置換する。酵母分泌のためには、ネイティブシグナル配列を、例えば酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダー（サッカロミセス（Saccharomyces）およびクリベロミセス（Kluyveromyces）のα因子リーダーを包含する）、または酸性ホスファターゼリーダー、カンジダ・アルビカンス（C. albicans）グルコアミラーゼリーダー、またはＰＣＴ公開番号ＷＯ９０／１３６４６に記載のシグナルで置換することができる。哺乳動物細胞発現においては、哺乳動物シグナル配列ならびにウイルス分泌リーダー、例えば単純ヘルペスｇＤシグナルを利用することができる。そのような前駆体領域のＤＮＡは、タンパク質をコードするＤＮＡに読み枠を合わせてライゲートすることができる。
真核宿主細胞（例えば酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、または他の多細胞生物由来の有核細胞）において使用される発現ベクターは、転写の終結およびｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含有するであろう。そのような配列は、一般に、真核生物またはウイルスのＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’非翻訳領域、また時には３’非翻訳領域から、入手することができる。これらの領域は、多価抗体をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化フラグメントとして転写されるヌクレオチドセグメントを含有する。有用な転写終結構成要素の一つは、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。ＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／１１０２６とそこに開示されている発現ベクターを参照されたい。
組換えＤＮＡは、タンパク質の精製に役立ちうる任意のタイプのタンパク質タグ配列も包含することができる。タンパク質タグの例には、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、またはＧＳＴタグが含まれるが、これらに限定されるわけではない。細菌、真菌、酵母、および哺乳動物細胞宿主と共に使用するための適当なクローニングベクターおよび発現ベクターは、Cloning Vectors: A Laboratory Manual（Elsevier, New York, 1985）に見いだすことができ、この文献の関連する開示は参照により本明細書に組み込まれる。
発現コンストラクトは、当業者には明白であるだろうように、その宿主細胞に適した方法を使って、宿主細胞に導入される。エレクトロポレーション；塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン、または他の物質を使用するトランスフェクション；マイクロプロジェクタイルボンバードメント；リポフェクション；および感染（この場合、ベクターは感染性因子である）などを含む（ただしこれらに限定されるわけではない）、宿主細胞中に核酸を導入するためのさまざまな方法が、当技術分野では知られている。
適切な宿主細胞には、原核生物、酵母、哺乳動物細胞、または細菌細胞が含まれる。適切な細菌には、グラム陰性生物またはグラム陽性生物、例えば大腸菌またはバチルス属（Bacillus spp.）が含まれる。酵母、好ましくは、サッカロミセス属の酵母、例えばサッカロミセス・セレビシア（S. cerevisiae）なども、ポリペプチドの生産に使用することができる。さまざまな哺乳動物細胞培養系または昆虫細胞培養系も、組換えタンパク質を発現させるために使用することができる。昆虫細胞中で異種タンパク質を生産するためのバキュロウイルス系については、Luckow and Summersによる総説（Bio/Technology,6:47, 1988）がある。いくつかの例では、例えばグリコシル化のために、脊椎動物細胞においてタンパク質を生産することが望ましいであろうが、培養（組織培養）における脊椎動物細胞の増殖は、既に日常的な手法になっている。適切な哺乳動物宿主細胞株の例には、内皮細胞、ＣＯＳ−７サル腎臓細胞、ＣＶ−１、Ｌ細胞、Ｃ１２７、３Ｔ３、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ヒト胎児腎臓細胞、ＨｅＬａ、２９３、２９３Ｔ、およびＢＨＫ細胞株が含まれる。多くの応用では、本明細書に記載のタンパク質多量体のサイズが小さいことから、大腸菌が好ましい発現方法になるであろう。
Ｈ．タンパク質生産
宿主細胞は、タンパク質生産のために本明細書に記載の発現ベクターまたはクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために、適宜、変更が加えられた従来の栄養培地において培養される。
フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質またはその融合物を生産するために使用される宿主細胞は、さまざまな培地中で培養することができる。ハムＦ１０（Sigma）、最小必須培地（（ＭＥＭ），Sigma）、ＲＰＭＩ−１６４０（Sigma）、およびダルベッコ変法イーグル培地（（ＤＭＥＭ），Sigma）などの市販培地は、宿主細胞を培養するのに適している。加えて、Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979)、 Barnes et al., Anal. Biochem.102:255 (1980)、米国特許第４，７６７，７０４号；同第４，６５７，８６６号；同第４，９２７，７６２号；同第４，５６０，６５５号；または同第５，１２２，４６９号；ＷＯ９０／０３４３０；ＷＯ８７／００１９５；または米国再発行特許発明第３０，９８５号に記載された培地はどれでも、宿主細胞用の培養培地として使用することができる。これらの培地のいずれにも、必要に応じて、ホルモンおよび／または他の成長因子（インスリン、トランスフェリン、または上皮成長因子など）、塩類（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸塩など）、バッファー（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（アデノシンおよびチミジンなど）、抗生物質（ゲンタマイシン（商標）薬など）、微量元素（通常はマイクロモル濃度域の最終濃度で存在する無機化合物と定義される）、およびグルコースまたは等価なエネルギー源を補足することができる。他の必要な補足物も、当業者には知られているであろう適当な濃度で含めることができる。例えば温度、ｐＨその他の培養条件は、発現用に選択した宿主細胞で以前使用されたものであり、当業者には明白であるだろう。
本明細書に開示されるフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質またはその融合物は、無細胞翻訳系を使って生産することもできる。そのような目的には、インビトロ転写によるｍＲＮＡの生産が可能になるように、そしてまた、利用する特定の無細胞系（哺乳動物または酵母無細胞翻訳系などの真核生物無細胞翻訳系、細菌無細胞翻訳系などの原核生物無細胞翻訳系）におけるｍＲＮＡの無細胞翻訳が可能になるように、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質をコードする核酸を修飾しなければならない。
フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質またはその融合物は、化学合成によって（例えば「Solid Phase Peptide Synthesis」（2nd ed.，1984，The Pierce Chemical Co.，Rockford, IL）に記載の方法によって）生産することもできる。フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質への修飾も化学合成によって加えることができる。
本明細書に開示されるフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質またはその融合物は、タンパク質化学の分野において広く知られているタンパク質の単離／精製法によって精製することができる。非限定的な例には、抽出、再結晶、塩析（例えば硫酸アンモニウムまたは硫酸ナトリウム）、遠心分離、透析、限外濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲル濾過、ゲル浸透クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動、向流分配法またはこれらの任意の組合せが含まれる。精製後に、濾過および透析などといった（ただしこれらに限定されるわけではない）当技術分野において知られているさまざまな方法のいずれかによって、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質を異なるバッファーへと交換し、および／または濃縮することができる。
精製されたフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質またはその融合物は、好ましくは、少なくとも８５％の純度、より好ましくは少なくとも９５％の純度、最も好ましくは少なくとも９８％の純度を有する。純度の正確な数値がどうであれ、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、医薬製品としての使用にとっては、十分に純粋である。
Ｉ．イメージング、診断および他の応用
本明細書で提供される血清アルブミン結合１０Ｆｎ３融合物は、血清アルブミン結合１０Ｆｎ３ドメインに融合された異種分子の実体に基づいて、さまざまな疾病および疾患を処置するために使用することができる。当業者は、当技術分野における知識および本明細書に記載される情報に基づいて、血清アルブミン結合１０Ｆｎ３融合物の応用を決定することができる。さまざまな血清アルブミン結合１０Ｆｎ３融合タンパク質の使用を本明細書において詳述する。血清アルブミン結合１０Ｆｎ３融合物は、ヒトと非ヒト生物の両方を含む任意の哺乳動物対象または患者に投与することができる。
本明細書に記載の血清アルブミン結合物質および融合分子は、検出可能に標識することができ、イメージング応用または診断応用のために、例えばその融合分子が結合するタンパク質を発現する細胞と接触させる目的で使用することができる。タンパク質を検出可能部分に結合させるための当技術分野において知られる方法は、Hunter, et al., Nature 144:945 (1962)；David, et al., Biochemistry 13:1014 (1974)；Pain, et al., J. Immunol. Meth. 40:219 (1981)；およびNygren, J. Histochem. and Cytochem. 30:407 (1982)に記載されている方法を含めて、どれでも使用することができる。
特定の実施形態において、本明細書に記載する血清アルブミン結合物質および融合分子を、さらに、検出することができるラベルに取り付ける（例えば、ラベルは、放射性同位体、蛍光化合物、酵素または酵素補因子であることができる）。ラベルは、放射性物質、例えば鉄キレート化合物などの放射性重金属、ガドリニウムまたはマンガンの放射性キレート化合物、酸素、窒素、鉄、炭素、またはガリウムの陽電子放出体、４３Ｋ、５２Ｆｅ、５７Ｃｏ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１３２Ｉ、または９９Ｔｃであることができる。特定の実施形態において、ラベルは、蛍光化合物あるいは化学発光化合物、例えばフルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、またはルシフェリンであることができ；あるいは酵素、例えばアルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼであることができる。そのような部分に付加された血清アルブミン結合物質または融合分子は、イメージング剤として使用することができ、ヒトなどの哺乳動物における診断的使用のために有効量で投与された後、イメージング剤の局在化および蓄積が検出される。イメージング剤の局在化および蓄積は、ラジオシンチグラフィ、核磁気共鳴イメージング、コンピュータ断層撮影法または陽電子放射断層撮影法によって検出することができる。当業者には明らかであるだろうように、投与すべき放射性同位体の量は放射性同位体に依存する。当業者であれば、投与すべきイメージング剤の量を、放射能部分として使用される所与の放射性核種の比放射能およびエネルギーに基づいて、容易に処方することができる。
血清アルブミン結合物質および融合分子は、アフィニティ精製剤としても有用である。
このプロセスでは、当技術分野において周知の方法を使って、Sephadex樹脂または濾紙な
どの適切な支持体上にタンパク質が固定化される。タンパク質は、競合結合アッセイ、直
接および間接サンドイッチアッセイ、ならびに免疫沈降アッセイなどといった、任意の既
知アッセイ法で使用することができる（Zola「Monoclonal Antibodies: A Manual of Tec
hniques」pp.147-158（CRC Press, Inc., 1987））。
Ｊ．生物物理学的および生化学的特徴解析
本明細書に記載の血清アルブミン結合アドネクチンの、血清アルブミン（例えば、ＨＳＡ）への結合は、平衡定数（例えば、解離、ＫＤ）という用語、および速度定数（例えば、結合速度定数（on-rate constant）、ｋｏｎおよび解離速度定数（off-rate constant）、ｋｏｆｆ）という用語で、評価することができる。ｋｏｆｆが十分に低い、あるいはｋｏｎが十分に高い場合、より高いＫＤ値が許容され得るが、血清アルブミン結合アドネクチン（例えば、ＰＫＥ２モノまたはタンデムアドネクチン）は、５００ｎＭ、１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、５００ｐＭ、２００ｐＭ、または１００ｐＭ未満のＫＤで、一般的に標的分子に結合するであろう。
結合親和性のインビトロアッセイ
血清アルブミン（例えば、ＨＳＡ）に結合するＰＫＥ２−アドネクチンは、様々なインビトロアッセイを用いて、同定することができる。特定の実施形態において、本アッセイは、複数の候補アドネクチンを同時に選別することを可能にする、ハイスループットのアッセイである。
アドネクチンの、標的への結合親和性を決定するための例示的なアッセイには、結合平衡除外法（kinetic exclusion assay）（ＫｉｎＥｘＡ）などの液相法(Blake et al., JBC 1996; 271:27677-85; Drake et al., Anal Biochem 2004; 328:35-43)、Biacoreシステムによる表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）(Uppsala, Sweden) (Welford et al., Opt. Quant. Elect 1991; 23:1; Morton and Myszka, Methods in Enzymology 1998; 295:268)およびホモジニアス時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）アッセイ (Newton et al., J Biomol Screen 2008; 13:674-82; Patel et al., Assay Drug Dev Technol 2008; 6:55-68)が含まれるが、これらに限定されない。
特定の実施形態において、生体分子の相互作用は、ガラス支持体上の金薄膜表面での、最大３００ｎｍ離れた表面の屈折率の変化による光の共鳴角の変化を検出するためにＳＰＲを用いる、Biacoreシステムによりリアルタイムでモニターできる。Biacore解析により（例えば、実施例２に記載されているように）、結合速度定数、解離速度定数、平衡解離定数、および親和定数が生じる。結合親和性はBiacore表面プラズモン共鳴法システム（Biacore, Inc.）を用いて結合速度定数及び解離速度定数を評価することにより得られる。バイオセンサーチップは、標的の共有結合により活性化される。固定化された物質の反応単位（response unit）のシグナルを獲得するために、標的を希釈してチップ上に注入する。共鳴単位（ＲＵ）のシグナルは、固定化された物質の質量に比例するため、マトリックス上の固定化された標的の密度の範囲を表現している。結合および解離のデータを、１：１の生体分子相互作用の正味の速度式を解くために、網羅的解析に同時に適合させると、ｋｏｎ、ｋｏｆｆおよびＲｍａｘ（飽和時の最大応答）の最適値が得られる。結合のための平衡解離定数ＫＤは、ｋｏｆｆ／ｋｏｎとしてＳＰＲ測定から計算する。
本明細書で上述したアッセイは例示的であり、当技術分野で知られるタンパク質間の結合親和性を決定するいずれの方法も（例えば、蛍光ベース転移（ＦＲＥＴ）、酵素結合免疫吸着アッセイ、および競合結合アッセイ（例えば、ラジオイムノアッセイ））、本明細書に記載のＰＫＥ２−アドネクチンの結合親和性を評価するために使用できることは、理解されるであろう。
特定の実施形態において、本明細書に記載の血清アルブミン結合アドネクチン、またはこれを含む融合タンパク質の変性温度（Ｔｍ）は、例えば実施例に記載したように、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）または熱走査型蛍光（ＴＳＦ）を用いて測定した場合、少なくとも５０℃、例えば少なくとも５１°Ｃ、少なくとも５２°Ｃ、少なくとも５３°Ｃ、少なくとも５４°Ｃ、少なくとも５５°Ｃ、少なくとも５６°Ｃ、少なくとも５７°Ｃ、少なくとも５８°Ｃ、少なくとも５９°Ｃ、少なくとも６０°Ｃ、少なくとも６１°Ｃ、少なくとも６２°Ｃ、少なくとも６３°Ｃ、少なくとも６４°Ｃ、少なくとも６５°Ｃ、少なくとも６６°Ｃ、少なくとも６７°Ｃ、少なくとも６８°Ｃ、少なくとも６９°Ｃ、少なくとも７０°Ｃ、少なくとも７１°Ｃ、少なくとも７２°Ｃ、少なくとも７３°Ｃ、少なくとも７４°Ｃまたは少なくとも７５°Ｃである。特定の実施形態において、本明細書に記載の血清アルブミン結合アドネクチン、またはこれを含む融合タンパク質の変性温度（Ｔｍ）は、例えば実施例に記載したように、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）または熱走査型蛍光（ＴＳＦ）を用いて測定した場合、５０−７５°Ｃ、例えば５１−７５°Ｃ、５２−７５°Ｃ、５３−７５°Ｃ、５４−７５°Ｃ、５５−７５°Ｃ、５６−７５°Ｃ、５７−７５°Ｃ、５８−７５°Ｃ、５９−７５°Ｃ、６０−７５°Ｃ、６１−７５°Ｃ、６２−７５°Ｃ、６３−７５°Ｃ、６４−７５°Ｃ、６５−７５°Ｃ、６６−７５°Ｃ、６７−７５°Ｃ、６８−７５°Ｃ、６９−７５°Ｃ、７０−７５°Ｃ、５０−７４°Ｃ、５０−７３°Ｃ、５０−７２°Ｃ、５０−７１°Ｃ、５０−７０°Ｃ、５０−６９°Ｃ、５０−６８°Ｃ、５０−６７°Ｃ、５０−６６°Ｃ、５０−６５°Ｃ、５０−６４°Ｃ、５０−６３°Ｃ、５０−６２°Ｃ、５０−６１°Ｃ、５０−６０°Ｃ、５０−５９°Ｃ、５０−５８°Ｃ、５０−５７°Ｃ、５０−５６°Ｃ、５０−５５°Ｃ、５１−７４°Ｃ、５２−７３°Ｃ、５３−７１°Ｃ、５４−７０°Ｃ、または５５−６５°Ｃである。
Ｋ．治療用インビボ用途
疾患の治療に有用なフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質が本明細書で提供される。血清アルブミン結合アドネクチンを含む融合タンパク質の場合、治療できる疾病あるいは疾患は、アドネクチンに連結する部分、例えば第二のアドネクチンの結合特異性により、決定されるであろう。本明細書に記載されるように、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、目的のいずれの標的にも結合するように、設計され得る。ある実施形態において、標的はＰＣＳＫ９である。ＰＳＣＫ９に結合するフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質およびこれを含む融合タンパク質は、アテローム動脈硬化症、高コレステロール血症、および他のコレステロール関連疾病を治療するために用いることができる。
本出願はまた、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質を対象に投与するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、対象はヒトである。いくつかの実施形態において、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、哺乳動物、特にヒトにとって医薬上許容される。「医薬上許容される」組成物とは、動物に投与しても際立った有害な医学的結果を伴わない組成物を指す。医薬上許容される組成物の例には、インテグリン結合ドメイン（ＲＧＤ）を欠いた１０Ｆｎ３ドメインを含む組成物、および本質的にエンドトキシンまたは発熱性物質を有さない、あるいは非常に低い濃度のエンドトキシンまたは発熱性物質を有する組成物が含まれる。
Ｌ．製剤および投与
本出願は、血清アルブミン結合１０Ｆｎ３ドメインに融合された治療用部分を投与するための方法であって、血清アルブミン結合１０Ｆｎ３ドメインに融合されると治療用部分の半減期が延長される方法を提供する。融合コンストラクトを投与するための技法および投薬量は、血清アルブミン結合１０Ｆｎ３ドメインに融合される治療用部分のタイプおよび治療される具体的症状に依存して変動するであろうが、当業者であれば容易に決定することができる。一般に、規制当局は、治療薬として使用されるタンパク質試薬については、発熱性物質のレベルが許容される程度に低くなるように製剤化されることを要求する。したがって、治療用製剤は一般に、それらが実質的に発熱性物質を含まないという点で、または少なくとも、適当な規制当局（例えばＦＤＡ）によって決定される許容されるレベルを超える発熱性物質を含有しないという点で、他の製剤とは区別されるであろう。特定の実施形態において、血清アルブミン結合１０Ｆｎ３ドメインおよびその融合分子の医薬製剤が、例えばｐＨ４．０−７．０で、１−２０ｍＭコハク酸、２−１０％ソルビトール、および１−１０％グリシンを含む。例示的な実施形態において、血清アルブミン結合１０Ｆｎ３ドメインおよびその融合分子の医薬製剤が、例えばｐＨ６．０で、１０ｍＭコハク酸、８％ソルビトール、および５％グリシンを含む。
いくつかの実施形態において、血清アルブミン結合１０Ｆｎ３ドメインおよびその融合物が、哺乳動物、特にヒトにとって、医薬上許容される。「医薬上許容される」ポリペプチドとは、動物に投与しても際立った有害な医学的結果を伴わないポリペプチドを指す。医薬上許容される血清アルブミン結合１０Ｆｎ３ドメインおよびその融合物の例には、インテグリン結合ドメイン（ＲＧＤ）を欠く１０Ｆｎ３ドメイン、および本質的にエンドトキシンを有さないか、非常に低い濃度のエンドトキシンを有する、血清アルブミン結合１０Ｆｎ３ドメインまたは血清アルブミン結合１０Ｆｎ３ドメイン融合物の組成物が含まれる。
治療用組成物は、医薬上許容される希釈剤、担体、または賦形剤と共に、単位剤形で投
与することができる。組成物は、経口投与用の丸剤、錠剤、カプセル剤、液剤、または徐放性錠剤；静脈内、皮下または非経口投与用の液剤；または局所外用投与のためのゲル剤、ローション剤、軟膏、クリーム剤、またはポリマーもしくは他の徐放性媒体の形態をとることができる。
製剤を製造するための当技術分野において周知の方法は、例えば「Remington: The Science and Practice of Pharmacy」（20th ed., ed. A. R. Gennaro A R., 2000, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa.）に見いだされる。非経口投与用の製剤は、例えば賦形剤、滅菌水、食塩水、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール、植物由来の油、または水素化ナフタレン（hydrogenated napthalenes）を含有しうる。化合物の放出を制御するために、生体適合性生分解性ラクチドポリマー、ラクチド／グリコリドコポリマー、またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマーを使用することができる。化合物の体内分布を制御するためにナノ粒子状製剤（例えば生分解性ナノ粒子、固形脂質ナノ粒子、リポソーム）を使用することができる。他の潜在的に有用な非経口送達システムには、エチレン−酢酸ビニルコポリマー粒子、浸透圧ポンプ、植え込み型注入システム、およびリポソームが包含される。製剤中の化合物の濃度は、投与すべき薬物の投薬量や投与経路などといった、いくつかの要因に依存して変動する
ポリペプチドは、場合により、医薬上許容される塩、例えば無毒性酸付加塩として、または医薬品業界においてよく使用される金属錯体として投与することができる。酸付加塩の例には、酢酸、乳酸、パモ酸、マレイン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、コハク酸、安息香酸、パルミチン酸、スベリン酸、サリチル酸、酒石酸、メタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、またはトリフルオロ酢酸などの有機酸；タンニン酸、カルボキシメチルセルロースなどのポリマー酸；および塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸などの無機酸が含まれる。金属錯体には、亜鉛、鉄などが含まれる。ある例では、ポリペプチドが、熱安定性を増加させるために酢酸ナトリウムの存在下で製剤化される。
経口使用のための製剤には、無毒性の医薬上許容される賦形剤と混合された活性成分を含有する錠剤が含まれる。これらの賦形剤は、例えば不活性希釈剤または充填剤（例えばスクロースおよびソルビトール）、潤滑剤、流動促進剤、および粘着防止剤（例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸、シリカ、硬化植物油、またはタルク）であることができる。
経口使用のための製剤は、咀嚼錠として、または活性成分が不活性固形希釈剤と混合されている硬ゼラチンカプセル剤として、または活性成分が水または油性媒質と混合されている軟ゼラチンカプセル剤として提供することもできる。
治療有効量とは、その投与の目的である治療効果をもたらす用量を指す。正確な用量は治療される疾患に依存するであろうが、当業者であれば、既知の技法を使って確かめることができる。一般に、血清アルブミン結合１０Ｆｎ３ドメインまたは血清アルブミン結合１０Ｆｎ３ドメイン融合物は、１日あたり約０．０１μｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１日あたり０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは１日あたり０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。ポリペプチドは、毎日（例えば毎日１回、２回、３回、または４回）与えてもよいし、それより低い頻度で（例えば２日に１回、週に１回または２回、２週間に１回、または毎月）与えてもよい。加えて、当技術分野では知られているとおり、年齢ならびに体重、全身の健康状態、性別、食餌、投与の時間、薬物相互作用、および疾病の重症度に合わせた調節が必要になりうるが、当業者は、それらを日常的な実験で確かめることができるであろう。
本出願を通して引用される、全ての図面、全ての参考文献、Genbank配列、特許および公開特許出願の内容は、本明細書に参照により明確に組み込まれる。特に、米国仮特許出願 No.61/968,181 （March 20, 2014に出願）の開示は、本明細書に参照により明確に組み込まれる。
上記開示は、広く本開示について記述し、本開示はさらに以下の例により例示される。これらの具体例は、単に例示を目的として記述され、本開示の範囲を限定することを意図してはいない。本明細書において、特定の標的、用語、および値が用いられているが、このような標的、用語、および値は、同様に、例示的であり、本開示の範囲を限定するものではないことは、理解されるであろう。
ハイスループットタンパク質生産（ＨＴＰＰ）
選択した結合物質をＰＥＴ９ｄベクターのＨＩＳ６ｔａｇ上流にクローニングして、E.coli BL21 DE3 plysS 細胞に形質転換し、２４ウェルのフォーマット中の５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含む５ｍｌ ＬＢ培地に播種して、３７℃で一晩増殖させた。一晩培養液から２００μｌ吸引し、適切なウェルに分注することにより、新鮮な５ｍｌ ＬＢ培地（５０μｇ／ｍＬカナマイシン）培養液を、誘導発現のために調製した。培養液は３７℃でＡ６０００．６−０．９まで増殖させた。１ｍＭのイソプロピル−β−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）で誘導後、培養液を３０℃で６時間発現させ、４℃、２７５０ｇで１０分遠心分離することにより回収した。
細胞ペレット（２４ウェルのフォーマット中）は、４５０μｌのLysis buffer（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１ｘComplete（商標） Protease Inhibitor Cocktail-EDTA free （Roche）、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１０ｍＭ ＣＨＡＰＳ、４０ｍＭイミダゾール、１ｍｇ／ｍｌリゾチーム、３０μｇ／ｍｌ ＤＮＡｓｅ、２μｇ／ｍｌ aprotonin、ｐＨ８．０）に溶解し、室温で１−３時間振とうした。可溶化液を除去し、９６ウェル、１．２ｍｌのキャッチプレートを備え、陽圧でフィルター処理した９６ウェル Whatman GF/D Unifilterに移すことにより、９６ウェルフォーマットに再度負荷した（re-racked）。除去した可溶化液は、平衡化バッファー（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、０．５Ｍ ＮａＣｌ、４０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）で平衡化した９６ウェルのNickel Chelating PlateまたはCobalt Chelating Plateに移し、５分間培養した。非結合物質は、陽圧で取り除いた。樹脂はWash buffer＃１（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、０．５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣＨＡＰＳ、４０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）により０．３ｍｌ／ウェルで二回洗浄した。各洗浄液は陽圧で取り除いた。溶出に先立ち、各ウェルを５０μｌ Elution buffer（ＰＢＳ＋２０ｍＭ ＥＤＴＡ）で洗浄し、５分間培養して、本洗浄液は陽圧で廃棄した。さらに１００μｌのElution bufferを各ウェルへアプライすることにより、タンパク質を溶出した。室温で３０分培養後、プレートを２００ｇで５分間遠心分離して、溶出前に溶出キャッチプレートの下部に添加した５μｌの０．５Ｍ ＭｇＣｌ２を含む９６ウェルキャッチプレート中で、溶出タンパク質を回収した。溶出したタンパク質は、タンパク質のスタンダードとして野生型１０Ｆｎ３ドメインを使用する総タンパク質アッセイを用いて定量した。
不溶性のフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質結合物質の、中規模の発現および精製
不溶性クローンの発現のために、ＨＩＳ６ｔａｇが続くクローンを、ｐＥＴ９ｄ（EMD Bioscience, San Diego, CA）ベクターにクローニングし、E.coli ＨＭＳ１７４細胞で発現させる。２０ｍｌの播種培養液（プレート上の単一のコロニーから作成した）を使用して、５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンおよび３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含む１リットルのＬＢ培地に播種する。培養液は３７℃でＡ６０００．６−１．０まで増殖させる。１ｍＭのイソプロピル−β−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）で誘導後、培養液を３０℃で４時間増殖させ、４℃、＞１０，０００ｇで３０分遠心分離して回収する。細胞ペレットは−８０℃で凍結させる。細胞ペレットは、ＵＬＴＲＡ−ＴＵＲＲＡＸ（登録商標）ホモジナイザー（IKA works）を用いて、氷上で２５ｍｌの溶解バッファー（２０ｍＭ ＮａＨ２Ｐ０４、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｌｘComplete Protease Inhibitor Cocktail-EDTA free （Roche）、ＩｍＭ ＰＭＳＦ、ｐＨ７．４）に再懸濁させる。細胞溶解は、Model M-l 10S ＭＩＣＲＯＦＬＵＩＤＩＺＥＲ（登録商標）を用いた高圧均質化（＞１８，０００ｐｓｉ）（マイクロフルイディクス）により達成する。不溶性画分は、４℃、２３，３００ｇで３０分遠心分離することにより、分離させる。可溶化液の遠心分離から回収された不溶性ペレットは、２０ｍＭリン酸ナトリウム／５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４で洗浄する。ペレットは、２０ｍＭリン酸ナトリウム／５００Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ７．４中の６．０Ｍ塩酸グアニジンで、超音波処理後に３７℃で１−２時間培養して、再度可溶化させる。再度可溶化したペレットは０．４５μｍで濾過し、２０ｍＭリン酸ナトリウム／５００Ｍ ＮａＣｌ／６．０ＭグアニジンｐＨ７．４バッファーで平衡化したＨｉｓｔｒａｐカラムに負荷する。負荷後、カラムはさらに２５カラムボリューム（ＣＶ）の同じバッファーで洗浄する。結合タンパク質は、２０ｍＭリン酸ナトリウム／５００ｍＭ ＮａＣｌ／６．０Ｍ塩酸グアニジンｐＨ７．４中の５０ｍＭイミダゾールで溶出する。精製したタンパク質は、５０ｍＭ酢酸ナトリウム／１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ４．５で透析することにより、リフォールディングさせる。
可溶性のフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質結合物質の、中規模の発現および精製
可溶性クローンの発現のために、ＨＩＳ６ｔａｇが続くクローンを、ｐＥＴ９ｄ（EMD Bioscience, San Diego, CA）ベクターにクローニングし、E.coli ＨＭＳ１７４細胞で発現させた。２０ｍｌの播種培養液（単一のプレート上のコロニーから生成した）を使用して、５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンおよび３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含む１リットルのＬＢ培地に播種した。培養液は３７℃でＡ６０００．６−１．０まで増殖させた。１ｍＭのイソプロピル−β−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）で誘導後、培養液を３０℃で４時間増殖させ、４℃、＞１０，０００ｇで３０分遠心分離して回収した。細胞ペレットは−８０℃で凍結させた。細胞ペレットは、ＵＬＴＲＡ−ＴＵＲＲＡＸ（登録商標）ホモジナイザー（IKA works）を用いて、氷上で、２５ｍｌの溶解バッファー（２０ｍＭ ＮａＨ２Ｐ０４、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｌｘ Complete Protease Inhibitor Cocktail-EDTA free （Roche）、ＩｍＭ ＰＭＳＦ、ｐＨ７．４）に再懸濁させた。細胞溶解は、Ｍｏｄｅｌ Ｍ−ｌ １０Ｓ ＭＩＣＲＯＦＬＵＩＤＩＺＥＲ（登録商標）を用いた高圧均質化（＞１８，０００ｐｓｉ）（マイクロフルイディクス）により達成した。可溶性画分は、４℃、２３，３００ｇで３０分遠心分離することにより、分離させた。上清を０．４５μｌフィルターによって清澄化した。清澄化した可溶化液を２０ｍＭリン酸ナトリウム／５００Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ７．４で予め平衡化したＨｉｓｔｒａｐカラム（ＧＥ）に負荷した。カラムは、その後２５カラムボリュームの同じバッファーで洗浄後、２０カラムボリュームの２０ｍＭリン酸ナトリウム／５００Ｍ ＮａＣｌ／２５ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４で洗浄し、その後３５カラムボリュームの２０ｍＭリン酸ナトリウム／５００Ｍ ＮａＣｌ／４０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４で洗浄した。タンパク質は、１５カラムボリュームの２０ｍＭリン酸ナトリウム／５００Ｍ ＮａＣｌ／５００ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４で溶出し、画分は、Ａ２ｓｏの吸光度に基づいてプールし、ｌｘＰＢＳ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ８．５または５０ｍＭ ＮａＯＡｃ；１５０ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ４．５で透析した。沈殿物はいずれも、０．２２μｍで濾過して取り除いた。
実施例１：血清アルブミン結合親サウスループ（ＣＤループ）ベース結合物質の選別
マウスおよびラット血清アルブミンに結合せず、種を越えた血清アルブミンへの高い親和性を持たず、多価の１０Ｆｎ３ベースプラットフォームに常に適合するわけではない、第一世代ノースポールベース血清アルブミン結合アドネクチン（ＳＡＢＡ）を改良するために、修飾されたＣＤループ配列を持つ第二世代サウスポールベース血清アルブミン結合アドネクチン（ＰＫＥ２アドネクチン）を、下記に記載のｍＲＮＡディスプレイを用いて選別した。
修飾された１０Ｆｎ３ドメインを含む、ＣＤループベース結合物質ポリペプチドのライブラリーに対して、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）へ結合する能力についてｍＲＮＡディスプレイを用いて選別した（Xu et al., Chem Biol 2002;9:933-42）。ＣＤループ結合物質は、最大プラス７アミノ酸の、様々な長さのＣＤループで設計され、残りの１０Ｆｎ３配列は野生型のままであった。標的結合はｑＰＣＲでモニターし、特定の結合シグナルが観察された場合に、個体群をクローニングし、大腸菌（E.Coli）で発現させた。
実施例２：ＨＳＡに結合可能かつ、Ｒｈ−ＳＡおよびＭＳＡと交差反応する、ＣＤループ結合物質の同定
実施例１で作成され、ＨＳＡに結合してアカゲザル血清アルブミン（Ｒｈ−ＳＡ）および／またはマウスの血清アルブミン（ＭＳＡ）と交差反応するＣＤループ結合物質を同定するために、直接結合ＥＬＩＳＡ形式を用いた。MaxiSorp（商標）ＥＬＩＳＡプレートを１０μｇ／ｍＬのＨＳＡ、Ｒｈ−ＳＡ、またはＭＳＡのいずれかでコーティングし、精製されたＣＤループ結合物質を１μＭで試験した。結合したアドネクチンはＨＲＰ−結合抗ヒスチジンｍＡｂ（R&D Systems）およびＴＭＢ検出試薬（BD Biosciences）によって検出した。ＥＬＩＳＡの結果は、以下に記載の通り、Biacoreを用いて確認した。ＥＬＩＳＡ実験においてＲｈ−ＳＡおよび／またはＭＳＡと交差反応するとして同定されたＣＤループ結合物質（＞２×バックグラウンド）は、その後、その結合が安定で十分にフォールディングされたタンパク質と予想される単量体によるものであることを証明するために、ＳＥＣにより凝集を解析した。タンパク質の安定性は、以下に記載の通り、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）により確認した。
本明細書で２２７０＿Ｃ０１と呼ばれる、同定されたクローンの一つは、次のアミノ酸配列を持つ：
（２２７０＿Ｃ０１；配列番号２３）
ＣＤループには下線を付している。ＡＢ、ＢＣ、ＤＥ、ＥＦおよびＦＧループは、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１）に同一の配列を持つ。中規模の２２７０＿Ｃ０１に対し、単量体性を確認し、熱安定性を測定するために、サイズ排除クロマトグラフィーおよびＤＳＣ分析を行った。
標準的なサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を、中規模プロセスの結果得られた２２７０＿Ｃ０１に対して行った。中規模プロセスで得られた物質に対するＳＥＣは、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３０または Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ １０／３０カラム(GE Healthcare)を用いて、Ａｇｉｌｅｎｔ １１００または１２００ＨＰＬＣ ｓｙｓｔｅｍのＡ２１４ｎｍおよびＡ２８０ｎｍのＵＶ検出および蛍光検出(励起光＝２８０ｎｍ、蛍光＝３５０ｎｍ)で行った。１００ｍＭ硫酸ナトリウム、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ６．８のバッファーを、ＳＥＣカラムに対する適切な流速で使用した。ゲルろ過スタンダード（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA）を、分子量のキャリブレーションのために使用した。表２に示したように、２２７０＿Ｃ０１は主に単量体であった（９８％単量体）。
中規模のアドネクチンの示差走査熱量測定（ＤＳＣ）分析を、各々のＴｍを決定するために行った。０．５ｍｇ／ｍｌの溶液を、７０ｐ．ｓ．ｉの圧力下で、一分間に一度の割合で１５℃から１１０℃まで温度を傾斜させて上昇させることで、VP-Capillary Differential Scanning calorimeter （GE Microcal）により走査した。データを、Origin Software （OriginLab Corp）を用いて、最適なバッファーでの対照ランと比較して解析した。表２に示したように、２２７０＿Ｃ０１は６４℃のＴｍを有した。
ヒト、アカゲザル、およびマウス血清アルブミンへの結合動態、並びに、結合が生理的ｐＨ並びにエンドソームのｐＨで共に保持されるかどうかを決定するために、各血清アルブミンを、表面密度が１２００ＲＵまでになるように、標準的なＮＨＳ／ＥＤＣの共役を用いて、Biacore ＣＭ５チップ上に固定化した。ある濃度域（０．２５ｎＭ−５μＭ）の２２７０＿Ｃ０１を、ＨＢＳ−Ｐ＋（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％ｖ／ｖ界面活性剤Ｐ−２０）またはＡｃｅｔａｔｅ（０．０２ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％ｖ／ｖ界面活性剤Ｐ−２０）ランニングバッファー中で、固定化されたアルブミンに流した。３分間の結合および６−１０分間の解離フェーズを用いて、動態の決定を行った。参照を減算したセンサグラムの動態トレースは、Biaevaluationソフトウェアを用いた１：１の結合モデルと一致していた。表１に示したように、２２７０＿Ｃ０１は各種アルブミンに、中性ｐＨおよび低ｐＨにおいて等しい親和性で結合したが、マウスアルブミンに対する親和性はヒトあるいはアカゲザルアルブミンへの結合親和性よりも、約１０倍弱かった。
２２７０＿Ｃ０１の特性、すなわちインシリコの予測免疫原性を改良するために、ｍＲＮＡディスプレイにより２２７０＿Ｃ０１配列を最適化した。本最適化の結果得られたアドネクチンは、本明細書においてＰＫＥ２アドネクチンと呼ばれる。
実施例３：さらに修飾されたＣＤループをもつ、２２７０＿Ｃ０１子孫アドネクチン：ＰＫＥ２アドネクチンの産生
２２７０＿Ｃ０１配列に対して、免疫原性の潜在力を減らすために、特注のライブラリーを利用してｍＲＮＡディスプレイによる最適化を行い、並びに異種間のアルブミン結合を維持するより低い免疫原性の子孫分子を獲得するために、ｍＲＮＡディスプレイプロセスの間、ヒト血清アルブミンおよびマウス血清アルブミンの両方に対する結合についてスクリーニングした。その結果得られた配列について、インシリコの予測免疫原性を評価し、あらかじめ決定したカットオフ値よりも低いインシリコの免疫原性を有するクローンのみを、ＨＴＰＰによるタンパク質製造に進行させた。結果として得られたアドネクチンは、ＨＴＰＰにより精製し、上述したように直接結合ＥＬＩＳＡおよびＥＣ−ＨＰＬＣによりスクリーニングした。
２２７０＿Ｃ０１子孫のスクリーニングで獲得し、試験した３０８個のＰＫＥ２アドネクチンの中で、以下の２５個が、インシリコの予測免疫原性、ＳＥＣにより決定される単量体性、および直接結合ＥＬＩＳＡにより決定される様々な種由来の血清アルブミンへの結合に関して、最高の性能の分子であった。上位候補の親和性の決定は、上述したようにＳＰＲにより解析した。
実施例４：ＰＫＥ２アドネクチンの生物物理学的特性
実施例３で良好な挙動を示したとして、スクリーニングで同定された二つのＰＫＥ２アドネクチン、２６２９＿Ｅ０６および２６３０＿Ｄ０２に対して、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を上述したように行った。表２に示したように、ＰＫＥ２分子はどちらもほとんど単量体であった。
二つのＰＫＥ２アドネクチンの示差走査熱量測定（ＤＳＣ）分析を、それぞれのＴｍを測定するために、上述したように行った。表２に示したように、２６２９＿Ｅ０６および２６３０＿Ｄ０２はそれぞれ５６℃および５７℃のＴＭを示した。
実施例５：ＰＫＥ２アドネクチンの、様々な種の血清アルブミンへの結合についての特徴解析
２６２９＿Ｅ０６および２６３０＿Ｄ０２による血清アルブミンへの結合動態、並びに第一世代ノースポールベース血清アルブミン結合アドネクチン、１３１８＿Ｈ０４の結合動態を、上述したように決定した。加えて、アルブミンへの結合は、ｐＨ５．５からｐＨ７．４の範囲の、様々なｐＨ条件下で行われた。２６２９＿Ｅ０６、２６３０＿Ｄ０２のいずれも、ヒト、アカゲザル、またはマウス血清アルブミンへのｐＨ依存的結合を示さず、このことはそれらがエンドソーム内で結合を維持していることを示唆している。表３に示したように、１３１８＿Ｈ０４は、２６２９＿Ｅ０６および２６３０＿Ｄ０２と比較してヒト、カニクイザル、およびアカゲザル血清アルブミンに低い親和性を示し、さらにマウスまたはラット血清アルブミンに結合しなかった。さらに、ＰＫＥ２アドネクチンの様々なアルブミン種に対する親和性が比較的等しかった一方、１３１８＿Ｈ０４はアカゲザル血清アルブミンに対し、ヒト血清アルブミンと比較して１０倍弱い親和性を示した。
ＰＫＥ２アドネクチン、２６２９＿Ｅ０６および２６３０＿Ｄ０２は両方とも、上述したように、１３１８＿Ｈ０４と比較して、試験した全ての血清アルブミンに対して実質的に高い親和性を示し、ヒト、カニクイザル、アカゲザルおよびマウス血清アルブミンのＫＤは、低いナノモル範囲であった。２６２９＿Ｅ０６はまた、ラット血清アルブミンに対して低いナノモル範囲のＫＤを示し、２６３０＿Ｄ０２はラット血清アルブミンに対して２００ｎＭのＫＤを示した。
実施例６：ＰＫＥ２アドネクチンの、ＨＳＡへの結合に対する、ｈＦｃＲｎとの競合
ＨＳＡのｈＦｃＲｎ受容体への結合の阻害が、ｈＦｃＲｎを介したＨＳＡの再利用を妨げ、ＨＳＡの長い半減期を減少させ、従って薬物動態の増強の程度を潜在的に減少させると考え、ＨＳＡへの結合に対するｈＦｃＲｎとの競合レベルを、ＰＫＥ２アドネクチンに対して、図１に示した競合アルファスクリーニングを用いて試験した。所望の最終アッセイ濃度範囲を得るために、アドネクチンをアッセイバッファー（５０ｍＭ Ａｃｅｔａｔｅ／１５０ｍＭ ＮａＣｌ／０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ５．５＋０．００５％ ａｎｔｉｆｏａｍ−２０４）に連続的に希釈した。最終アッセイ濃度である６．５ｎＭ ｈＦｃＲｎ−ＧＳＴ（ＢＭＳ）、３０ｎＭビオチン化ヒト血清アルブミン（Ａｂｃａｍ）、並びに各５μｇ／ｍｌのAlphascreenストレプトアビジンドナービーズおよびAlphaLISAグルタチオンアクセプタービーズ（Perkin Elmer）を得るために、アッセイバッファー中で、タンパク質とアルファスクリーンビーズの基本的なミックス（master mix）を調製した。３８４ウェルの小容量アッセイプレート（Greiner Bio-one）に対し、連続的に希釈したアドネクチンをウェル当たり１０μｌ、その後タンパク質＋ビーズをウェル当たり１０μｌ加えた。アルファスクリーンビーズおよびアッセイプレートに移されたものは全て、外部の光から保護した。アッセイプレートを粘着性のホイルシールで封滅し、室温で振とうしながら２−２．５時間培養した。プレートをSynergy 4 reader （Biotek）にて、５７０ｎｍ（エキサイテーション）および６８０ｎｍ（エミッション）で読み取った。アドネクチンなしのコントロールウェルからの平均シグナルを、０％阻害として設定し、ＦｃＲｎ−ＨＡＳ相互作用の阻害パーセントをそのシグナルと比較して計算した；ビオチン化ＨＳＡなしのコントロールウェルからの平均バックグラウンドシグナルを、全てのデータポイントから減算した。
表４および図２は、スクリーニングの結果を示している。特に、１３１８＿Ｈ０４は、第二世代親２２７０＿Ｃ０１アドネクチンおよびＰＫＥ２ ２６２９＿Ｅ０６および２６３０＿Ｄ０２アドネクチンよりも強く、ＨＳＡへの結合に対してｈＦｃＲｎと競合し、このことはＰＫＥ２アドネクチンが、１３１８＿Ｈ０４と比較して改良された薬物動態（ＰＫ）の増強を提供し得ることを示唆している。
さらに、１３１８＿Ｈ０４、２６２９＿Ｅ０６、および２６３０＿Ｄ０２が結合したＨＳＡ上のドメインを、ＳＰＲを用いて決定した。表４に示したように、１３１８＿Ｈ０４アドネクチンは、ＨＳＡのドメインＩに結合し、２２７０＿Ｃ０１、２６２９＿Ｅ０６、および２６３０＿Ｄ０２は、ＨＳＡのドメインＩ−ＩＩに結合したがドメインＩ単独には結合せず、このことは、１３１８＿Ｈ０４およびＰＫＥ２アドネクチンがＨＳＡ上の異なるエピトープに結合していることを示唆している。表４中のアドネクチンはいずれも、ＨＳＡのＦｃＲｎとの重要な相互作用部位である、ＨＳＡのドメインＩＩＩには結合しなかった。
実施例７：候補ＰＫＥ２アドネクチンのインビボでの半減期
ＰＫＥ２アドネクチン２６２９＿Ｅ０６および２６３０＿Ｄ０２を調製して精製し、エンドトキシンを除去した。野生型マウス（１グループ当たりｎ＝３）に対し、２６２９＿Ｅ０６または２６３０＿Ｄ０２のいずれかにより１ｍｇ／ｋｇで尾静脈に注射し、注射後間隔を開けて採取した血液サンプル中の濃度を、血漿サンプル中のアドネクチンを検出するように開発された、定量ＥＬＩＳＡベースアッセイを用いて決定した。具体的には、アドネクチン薬のレベルを、Mesoscale technology platformまたは標準比色ＥＬＩＳＡを用いて、マウス血漿中で測定した。２６２９＿Ｅ０６および２６３０＿Ｄ０２は、抗Ｈｉｓ ｍＡｂ（ＢＭＳ）を介して捕捉し、ヤギ抗ウサギＨＲＰ結合ｐＡｂと組み合わせて、アドネクチン足場に対するウサギ抗血清を用いて検出した。あるいは、それらは、アドネクチンに結合する種特異的アルブミンおよび種特異的抗アルブミンスルホタグ付二次ｐＡｂを介して検出した。各アドネクチンの薬物動態パラメーターは、Phoenix WinNonlinソフトウェアによるノンコンパートメントモデリングを用いて決定した。
２６２９＿Ｅ０６および２６３０＿Ｄ０２の薬物動態のプロファイルを、図３および表５に示したように比較した。マウス血漿における２６２９＿Ｅ０６の半減期は３３−４１時間であり、一方、２６３０＿Ｄ０２の半減期は３５−３９時間であった。
実施例８：ＰＫＥ２アドネクチンの免疫原性
ＨＬＡ結合のインシリコの予測は、Epimatrix software (Epivax)を用いて評価した。スコアの比較は表６に示している。ＰＫＥ２アドネクチン２６２９＿Ｅ０６および２６３０＿Ｄ０９は、２２７０＿Ｃ０１と比較してインシリコのスコアの減少を示した。さらに、１３１８＿Ｈ０４、２２７０＿Ｃ０１およびＰＫＥ２アドネクチンに応答するＣＤ４＋Ｔ細胞のインビトロでの増殖を、潜在的なヒト免疫原性のエクスビボでの評価として、評価した。ＭＨＣクラスＩＩが一般集団に適合している独立した４０のドナーから取得した全血から、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を単離するために、フィコール密度勾配法を使用した。各ドナー由来の細胞を、単離した後に液体窒素で保管し、使用前に解凍した。各ドナー由来の細胞は、蛍光色素カルボキシフルオセインサクシニミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識し、目的のアドネクチンと３７℃で７日間培養した。Ｔ細胞は抗ＣＤ４抗体で標識し、増殖はBD FACS CantoおよびFlowJo 解析ソフトを用いて、フローサイトメトリーで評価した。タンパク質の抗原性は、ＣＤ４＋の増殖において顕著な増加を示したドナーの割合として計算した。
親２２７０＿Ｃ０１およびその二つの子孫２６２９＿Ｅ０６または２６３０＿Ｄ０２の比較により、親分子がより高い抗原性を有することが明らかになり（図４および表６）、このことは二つの子孫ＰＫＥ２アドネクチンにおいて、親分子と比較して免疫原性の潜在性が減少していることを暗示している。
実施例９：ＰＫＥ２アドネクチンの単一システイン変異体の、アルブミンへの結合における影響
単一システイン残基は、標準的なマレイミド化学を介して目的の治療用分子への化学的結合を可能にするために、ＰＫＥ−２アドネクチンのＨＳＡ結合残基とは異なる部位に組み込まれた。システイン変異に関連して血清アルブミンへの結合（ひいては薬物動態（ＰＫ）の増強）を保持することは重要であり、それゆえ、様々な種の血清アルブミンへの結合におけるこれらの変異の影響を、変異のための基準として２６２９＿Ｅ０６分子を用いて、試験した。各変異体の解離速度（ｋｏｆｆ）は、固定化されたアルブミンと分析物として使用した２５０ｎＭのアドネクチンを用いて、ＳＰＲベースアッセイにより解析した。表７に示したように、２６２９＿Ｅ０６における単一システイン変異の導入は、親分子２６２９＿Ｅ０６と比較して、様々な種に渡る血清アルブミンとの同様の解離速度を示し、このことは、血清アルブミンへの結合が特異的変異に関して保持されることを示す。それゆえ、これらのシステイン変異体のいずれも、目的の治療用分子の化学的結合パートナーとして役立ち得、薬物動態（ＰＫ）の増強を提供し得る。
実施例１０：２６２９＿Ｅ０６の単一システイン変異体の生物物理学的特性
実施例９に記載の単一システイン変異体の生物物理学的特性を評価して、表８に示している。全ての変異体が、熱安定性であり単量体のタンパク質を産生した。
実施例１１：ＰＫＥ２アドネクチンタンデム分子のモジュール性
ノースポール血清アルブミン結合アドネクチンの制限の一つは、タンデムでの使用における他の１０Ｆｎ３タンパク質との適合性の欠如であった。それゆえ、ＰＫＥ２アドネクチンの他の１０Ｆｎ３タンパク質との適合性を調べた。ＰＫＥ２アドネクチンの生物物理学的な挙動を、別の標的に特異的なアドネクチンとタンデムに融合した場合において、試験した。ＰＫＥ２アドネクチンは可能な立体配置の両方：Ｎ末端位置（ＰＫＥ２−Ｘ）およびＣ末端位置（Ｘ−ＰＫＥ２）において、試験した。サイズ排除クロマトグラフィーの挙動は、ＨＴＰＰ法を用いて得られた分子を用いて試験した。第一世代ノースポールベース１３１８＿Ｈ０４アドネクチンとの融合物を、ＰＫＥ２アドネクチン２６２９＿Ｅ０６および２６３０＿Ｄ０２との融合物と直接比較した。試験した融合パートナーには、ミオスタチン結合１０Ｆｎ３ドメイン（２９８７＿Ｈ０７；ＷＯ２０１４／０４３３４４参照）、二つのＰＣＳＫ９結合１０Ｆｎ３ドメイン（２０１３＿Ｅ０１および２３８２＿Ｄ０９）、およびＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３ドメイン（１３１２＿Ｅ０１）が含まれた。ＰＣＳＫ９アドネクチン２３８２＿Ｄ０９および２０１３＿Ｅ０１の配列は、ＷＯ２０１１／１３０３５４において見いだすことができ、これは参照により本明細書に組み込まれる。表９に示したように、ＰＫＥ２アドネクチン分子は両方とも、ノースポールベース１３１８＿Ｈ０４ ＳＡＢＡ分子と比較して、タンデムアドネクチンに関して、ＳＥＣグレードがＡの分子の割合に反映されるように、一貫して良好な生物物理学的挙動を保持した（すなわち、単量体アドネクチンの９０％以上に相当）。表中のＰＫＥは、血清アルブミン結合１０Ｆｎ３ドメイン（すなわち、薬物動態（ＰＫ）増強１０Ｆｎ３ドメイン）を指す。比率は、ＳＥＣ＝Ａのクローンの＃／試験したクローン全体の＃を表している。生成されなかったタンデムは、「−」と表記している。
図５のデータは、様々なグレーの色合いが、上述の直接結合ＥＬＩＳＡアッセイで測定される、タンデム分子がＨＳＡに依然として結合する能力を反映している事を除いては、２９８７＿Ｈ０７ミオスタチン結合１０Ｆｎ３ドメインおよび２０１３＿Ｅ０１ ＰＣＳＫ９結合１０Ｆｎ３ドメインについての表９のデータを複製している。図５における異なるグレーの色合いは、ＨＳＡに結合する、ＥＣ５０＿タンデムアドネクチン／ＥＣ５０＿モノアドネクチンの、様々な割合に相当し、より暗い色合いはタンデム分子がＨＳＡにより強く結合することを表す。図５のデータは、ＰＫＥ２ベースタンデム分子が、１３１８＿Ｈ０４アドネクチンと比較して、単量体性がよく（すなわち、二量体化や凝集がしにくい）、ＨＳＡ結合性がよい（すなわち、ＨＳＡおよびＲｈＳＡとの結合をほとんど欠いていない）ことを示している。同様のパターンが４つのさらなる標的結合アドネクチンで観察された。これらのデータは、ＰＫＥ２アドネクチンが、ノースポール血清アルブミン結合アドネクチンよりも、より安定で活性化した他の１０Ｆｎ３タンパク質への結合パートナーを提供することを示している。
実施例１２：ＰＣＳＫ９−ＰＫＥ２タンデム分子は、ＰＣＳＫ９の生化学的なアッセイにおける良好な能力、低いＥｐｉＭａｔｒｉｘスコア、良好な生物物理学的特性および良好な異種間のアルブミン結合を示す。
表１０に示したように、様々なＰＣＳＫ９−ＰＫＥ２タンデムアドネクチンを、ＰＫＥ２アドネクチン２６２９＿Ｅ０６およびＰＣＳＫ９アドネクチン２３８２＿Ｄ０９をベースとして作成した。各タンデム分子は、リンカーのみが異なり、アルブミン結合ＰＫＥ２およびＰＣＳＫ９結合アドネクチンの両方の活性の保持を確かめるために、全ての分子の、生物物理学的および機能的特性を試験した。異種間のアルブミン結合は、上述したＥＬＩＳＡ法を用いて決定した。相対熱安定性は熱走査型蛍光（ＴＳＦ）により評価した。ＨＴＰＰサンプルは、ＰＢＳ中で０．２ｍｇ／ｍｌに正規化した。ＰＢＳで１：４０に希釈した１μｌのＳｙｐｒｏオレンジ色素を、２５μｌの各サンプルに添加し、プレートは、透明な９６ウェルマイクロプレート粘着シールでシールした。サンプルを、２５−９５℃にかけて１分当たり２℃の割合で温度勾配をかけることによりBioRad RT-PCR machineを用いてスキャンした。データは、BioRad CFX manager 2.0 softwareを用いて解析した。ＴＳＦにより得られた値は、変性の範囲である４０℃〜７０℃にわたって、ＤＳＣにより得られたＴｍ値とよく相関することが示された。この範囲は、本技術にとっての許容可能な機能範囲と考えられる。ＮＤ（「No data」）という結果は、微分したピーク（時間に伴う蛍光の変化率）をノイズから区別することを可能にするには、遷移曲線（transition curve）の傾きが小さすぎる際に、得られる。
ＰＣＳＫ９：ＥＧＦＡ ＦＲＥＴアッセイにより、バキュロウイルスで発現された組換えヒトＰＣＳＫ９と、（ビオチン化した）合成４０アミノ酸長ＥＧＦＡペプチドとを用いて、ＰＣＳＫ９の、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）の上皮増殖因子前駆体ホモロジードメイン（ＥＧＦＡドメイン）への結合の阻害を測定した。ＥＧＦＡは、ＬＤＬＲ中の、ＰＣＳＫ９との重要な相互作用ドメインを表すことが、示されている（Kwon, H.J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 105(6): 1820-1825 (2008)）。本アッセイは、ストレプトアビシン／アロフィコシアニン フルオロフォア複合体を通して、ビオチン化ＥＧＦＡとＦＲＥＴ相互作用を提供するために、Ｅｕキレートで標識されたＰＣＳＫ９のＣ末端ドメイン結合ｍＡｂ（ｍＡｂ ４Ｈ５）を用いた。ＰＣＳＫ９−ＬＤＬＲ ＦＲＥＴアッセイは、ＥＧＦＡペプチドの代わりにＬＤＬＲの細胞外ドメインを用いて、同様の方法で実行した。
全てのタンデム分子は低い免疫原性（負のＥｐｉｍａｔｒｉｘスコア）、高い単量体性（ＳＥＣによって評価される）、許容可能な相対熱安定性（ＴＳＦ）およびＥＬＩＳＡアッセイによる好ましい異種間のアルブミン結合を示した。さらに、ＰＣＳＫ９−ＰＫＥ２タンデムアドネクチンは、フォーマットされていない（unformatted）２３８２＿Ｄ０９アドネクチンと同様に、ＩＣ５０によるＰＣＳＫ９の生化学的アッセイにおいて、良好な能力を保持した。
実施例１３：ＰＣＳＫ９−ＰＫＥ２タンデム分子のヒトＰＣＳＫ９への結合動態
固定化されたヒトＰＣＳＫ９に結合するＰＣＳＫ９−ＰＫＥ２タンデムアドネクチンを、バイオレイヤーインターフェロメトリー（Octet Red 96, using Superstreptavidin sensor tips, ForteBio, Menlo Park CA）によりＨＳＡの有無において測定した。結合および解離の現象は、センサーチップ上で捕捉したビオチン化全長ＰＣＳＫ９を用いて一連のアドネクチン濃度についてリアルタイムで捕らえた。結合曲線は、ＫＤ、ｋｏｎ、ｋｏｆｆの値を生み出す上で、全体的に適合していた。タンデムアドネクチン−ＨＳＡ複合体は、タンデムを過剰に培養し、結合解析を過剰のＨＳＡの存在下で行うことにより、事前に形成した。タンデムアドネクチン−ＨＳＡ複合体とヒトＰＣＳＫ９との複合体は、同じ濃度のＨＳＡ存在下のタンデムアドネクチンの見かけの質量が増加した際に、形成されたと考えられた（例えば、図６参照）。表１１に示したように、試験したタンデムＰＣＳＫ９−ＰＫＥ２分子は全て、ＰＣＳＫ９に対する同様の結合動態および結合能力を有した。ｈｕＰＣＳＫ９に結合したＨＳＡ−アドネクチン複合体について、結合のわずかな減少と、やや速い解離が見られた。
実施例１４：ＰＣＳＫ９−ＰＫＥ２タンデム分子の、様々な種の血清アルブミンへの結合の特徴決定
様々な種の血清アルブミンに対するＰＣＳＫ９−ＰＫＥ２タンデム分子の親和性並びにＰＫＥ２アドネクチン２６２９＿Ｅ０６の親和性を、実施例２に記載したように、Biacorｅ解析により評価した。
表１２に示したように、タンデムの親和性は２６２９＿Ｅ０６ ＰＫＥ２アドネクチンと比較して５−７倍弱かったが（解離速度は同様）、三つのＰＣＳＫ９−ＰＫＥ２タンデム分子は全て、種を超えた血清アルブミンに同等の親和性を示した。
同様の実験を（実施例２に記載の条件下で）、６×ヒスチジンテールなしで４４７２＿Ｃ０６タンデムアドネクチン（５１９０＿Ｅ０１と呼ばれる）において行った。表１３に示したように、５１９０＿Ｅ０１はマウス血清アルブミンに、ヒト、カニクイザル、およびアカゲザル血清アルブミンと同様のＫＤで結合し、ラット血清アルブミンに、２００ｎＭのＫＤで結合した。
ＰＫＥ２アドネクチン２６２９＿Ｅ０６並びにＰＣＳＫ９−ＰＫＥ２タンデムアドネクチン４４７２＿Ｃ０６、４４２７＿Ｅ０６、および４４７２＿Ｆ０８の結合に対するｐＨの影響もまた、試験した。表１４または１５に示したように、試験した全てのアドネクチンは、様々な種の血清アルブミンに対し、ｐＨ非感受性の結合を示した。
実施例１５：アルブミンおよびＰＣＳＫ９に対する、タンデムＰＣＳＫ９−ＰＫＥ２アドネクチンの二重の結合
タンデムＰＣＳＫ９−ＰＫＥ２アドネクチンが血清アルブミンおよびＰＣＳＫ９に同時に結合する能力を、ＳＰＲを用いて評価した。おそらくタンデムはインビボでほとんどの時間アルブミンに結合しているため、ＰＣＳＫ９アドネクチンの活性がアルブミンに結合している際に保持されていることが不可欠であろう。タンデムＰＣＳＫ９−ＰＫＥ２アドネクチンが両方の標的に同時に結合することは、チップ表面の固定化されたアルブミンへのタンデムの一回目の注射と、それに続くヒトＰＣＳＫ９の二回目の注射による二重注射で試験し、各注射に対し、３分間の結合フェーズ後の結合レベルを記録した。バッファーと対比して、ＰＣＳＫ９の注射によるＳＰＲ結合シグナルの増加は、図７に示したように、タンデムのＨＳＡとＰＣＳＫ９への同時の結合を示唆する。ＰＣＳＫ９は、事前にＨＳＡに結合した５００ｎＭまたは１μＭのタンデムアドネクチンへの予測結合レベルの、４０％以下を示す。さらなるコントロールとして、ＰＣＳＫ９はＰＫＥ−２単独への結合は示さない（データは示さず）。
実施例１６：ＷＴ Ｃ５７ ＢＬ／６マウスにおける、ＰＣＳＫ９−ＰＫＥ２アドネクチンのインビボでのクリアランス
タンデムＰＣＳＫ９−ＰＫＥ２アドネクチン４７７２＿Ｃ０６のインビボでの半減期を、野生型Ｃ５７ Ｂｌ／６マウスにおける２週間の単回２ｍｇ／ｋｇ静脈内（ＩＶ）投与試験において、決定した。タンデムアドネクチンの血漿レベルを、MesoScale Discoveryプラットフォームを用いて決定した。ビオチン化ヒトＰＣＳＫ９を、アドネクチンの捕捉のために用い、検出は、タンデムに結合したマウス血清アルブミンおよび抗マウス血清アルブミンスルホタグ付き二次ｐＡｂを介して行った。血漿モデルおよびlinear up/log down計算法を用いたPhoenix WinNonlin 6.3 （Pharsight Corporation, Mountain View, CA）を利用して、ノンコンパートメント解析を実施した。表１６および図８に示したように、４７７２＿Ｃ０６タンデムアドネクチンの平均の半減期は１６．７時間であった。
実施例１７：ＰＣＳＫ９−ＰＫＥ２タンデムアドネクチンは、インビボにおいて頑強なＰＣＳＫ９標的会合を示す。
ＰＣＳＫ９−ＰＫＥ２タンデムアドネクチン４４７２＿Ｃ０６の薬力学的な活性を、正常なヒトＰＣＳＫ９のレベルを示すヒトＰＣＳＫ９トランスジェニックマウスモデルにおいて、評価した。このモデルは、肝臓において、マウスＰＣＳＫ９と同様に制御され、血漿中のヒトの正常レベルに近いｈＰＣＳＫ９を発現する、ゲノムｈＰＣＳＫ９トランスジェニック（ＢＡＣ−トランスジェニック）である。非結合ｈＰＣＳＫ９について、グループ当たり８匹の動物に対し、ＰＢＳ賦形剤または０．５もしくは２ｍｇ／ｋｇのタンデムの単回ＩＰ投与後に評価した。マウスＰＣＳＫ９を検出しない、遊離（非結合）ヒトＰＣＳＫ９に特異的な酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を開発した。本アッセイは、捕捉試薬として２μｇ／ｍＬのビオチン化ＰＣＳＫ９−アドネクチン２０１３＿Ｅ０１で覆った、ストレプトアビジンで前処理した９６ウェルプレートを使用した。一度だけ凍結した血漿サンプルは、ＥＬＩＳＡバッファー（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０および０．１％ＢＳＡを伴う、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）で適切に希釈し、ウェルに添加し、２０℃で１時間培養した。その後ウェルを洗浄し、５ｕｇ／ｍＬのウサギポリクローナル抗ヒトＰＣＳＫ９ ＩｇＧ（Lampire Biological Labs、 Pipersville PA により製造されたＢＭＳカスタム抗体）と１時間培養し、その後標準的なＥＬＩＳＡ方法によりＴＭＢとともにＨＲＰで標識した抗ウサギＩｇＧで処理した。精製した組換えヒトＰＣＳＫ９を使って、検量線を作成した。
図９に示したように、遊離のｈＰＣＳＫ９レベルの解析によると、試験した両方の用量において、ＰＣＳＫ９−ＰＫＥ２タンデムアドネクチンによる強力な標的会合を示す。０．５ｍｇ／ｋｇの用量と比較して２ｍｇ／ｋｇの用量においてより長い反応持続時間を示したことによって示されるように、遊離のｈＰＣＳＫ９は、用量依存的に阻害された。これらのデータは、ＰＣＳＫ９−ＰＫＥ２タンデムアドネクチンのインビボ活性を証明している。
実施例１８：カニクイザルにおける、ＰＫＥ２モノアドネクチンおよびタンデムＰＣＳＫ９−ＰＫＥ２アドネクチンのインビボでの半減期
単回投与の薬物動態・薬力学（ＰＫ／ＰＤ）試験を、正常な痩せた雌のカニクイザルにおいて、ＰＣＳＫ９−ＰＫＥ２と、比較対象のモル当量投与量のＰＫＥ２モノアドネクチンあるいはペグ化されたＰＣＳＫ９アドネクチンとを比較して行い、以下の表１７において、陰影によって示した。ＰＫＥ２アドネクチン２６２９＿Ｅ０６またはＰＣＳＫ９−ＰＫＥ２タンデム５１９０＿Ｅ０１アドネクチン、または比較対象としてペグ化されたＰＣＳＫ９アドネクチン（ＡＴＩ−１４７６と呼ばれる）を、示された濃度および経路（表１７および図１０参照）で、カニクイザルに投与し、薬物動態の評価および薬力学的な評価のために血漿（Ｋ２ＥＤＴＡ）および血清サンプルを、時間間隔を空けて回収した。アドネクチンの薬物レベルをMesoscale technology platformを用いてカニクイザルの血漿中で決定した。２６２９＿Ｅ０６を、抗Ｈｉｓ ｍＡｂ（ＢＭＳ）を介して捕捉し、アドネクチンに結合したカニクイザル血清アルブミンおよび抗カニクイザル血清アルブミンスルホタグ付き二次ｐＡｂを用いて検出した。タンデム解析のために、ビオチン化ヒトＰＣＳＫ９を、アドネクチンを捕捉するために使用し、検出は上述したようにカニクイザルのアルブミンを介して行った。ペグ化されたアドネクチンＡＴＩ−１４７６は、ビオチン化ｈＰＣＳＫ９を介して捕捉し、ヤギ抗ウサギスルホタグ付きｐＡｂと共に抗ＰＥＧｍＡｂ（Epitomics）を介して検出した。血漿モデルおよびlinear up/log down計算法を用いたPhoenix WinNonlin 6.3 (Pharsight Corporation, Mountain View, CA)を利用して、ノンコンパートメント解析を実施した。
表１７に示したように、２６２９＿Ｅ０６およびＡＴＩ−１４７６の血漿半減期は１１２時間と同等であった。５１９０−Ｅ０１の半減期は、ＰＫＥ２モノアドネクチンの半減期よりも短く、静脈内投与後６０−８２時間の範囲であった。５１９０＿Ｅ０１は、３および１０ｍｇ／ｋｇの静脈内投与量の間で用量比例的な出現を示した（ＡＵＣＡＬＬの比率は１．０２）。試験した全てのタンパク質において、分布容積は血漿容積よりも小さかったが、このことは、ＰＣＳＫ９−ＰＫＥ２タンデムアドネクチンおよびペグ化されたアドネクチンの分布が、主に脈管性間隙に限られていることを示唆している。クリアランスは概して低く、様々な用量およびフォーマットに渡って同等であった。５１９０＿Ｅ０１タンデムアドネクチンの皮下生体利用能は４１−４９％であった。
親２２７０＿Ｃ０１アドネクチンの薬物動態もまた、別の研究で、カニクイザルにおいて試験した。アドネクチン薬物レベルを、マウス薬物動態（ＰＫ）試験で上述したように、定量した。表１８および図１１に示したように、２２７０＿Ｃ０１アドネクチンは、１ｍｇ／ｋｇの単回ＩＶ急速投与の後に、８３．５時間の半減期を有した。
実施例１９：タンデムＰＣＳＫ９−ＰＫＥ２アドネクチンは、カニクイザルで、ＰＣＳＫ９インヒビターとして働く
ＰＣＳＫ９を阻害する薬力学的な効果について、上述したカニクイザルのＰＫ／ＰＤ試験を評価した。カニクイザルＰＣＳＫ９に特異的な酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を開発した。遊離（非結合）ＰＣＳＫ９アッセイは、 MesoScale Discovery platformを使用し、捕捉試薬として２μｇ／ｍｌのビオチン化ＰＣＳＫ９−アドネクチン２０１３＿Ｅ０１で覆い、ストレプトアビシンで前処理した９６ウェルＭＳＤプレートを組み入れた。サンプルは、スルホタグ付きウサギポリクローナル抗ヒトＰＣＳＫ９ ＩｇＧの遮断抗体（Lampire Biological Labs、 Pipersville PA により製造されたＢＭＳカスタム抗体）で１：４に希釈し、ウェルに添加し、室温で１０分間培養した。その後ウェルを洗浄し、ＭＳＤ ２×読み込みバッファーを用いて読んだ。総ＰＣＳＫ９ ＥＬＩＳＡアッセイは、ｍＡｂ−４Ｈ５（Lampire Biological Labs、 Pipersville PA により製造されたＢＭＳカスタム抗体）を捕捉抗体として組み込み、検出ステップを捕捉ステップと分離して実施したことを除いて、上述したアッセイと同様に行った。ｍＡｂ−４Ｈ５はＰＣＳＫ９のＣ末端ドメインに結合し、９６ウェルプレートに結合した場合に効率的に総ＰＣＳＫ９を捕捉する（遊離ＰＣＳＫ９に加えてアドネクチン−ＰＣＳＫ９複合体の両方）。総ＰＣＳＫ９の捕捉および検出ステップでは、１時間培養した。検量線は、精製された組換えヒトＰＣＳＫ９または組換えカニクイザルＰＣＳＫ９を用いて作成した。
血清検体は、標準化された酵素的手法を用いて、Siemens Advia 1800 Clinical Chemistry Systemにより評価した。ＬＤＬコレステロールを、直接ＬＤＬ法 (Roche Diagnostics)により評価した。他の試験した検査項目は：アスパラギン酸アミノ基転移酵素；アラニンアミノ基転移酵素；アルカリホスファターゼ；γグルタミン酸転移酵素；総ビリルビン；血中尿素窒素；クレアチニン；総コレステロール；トリグリセリド；高密度リポタンパク質；低密度リポタンパク質；グルコース；総タンパク質；アルブミン；グロブリン；アルブミン／グロブリン比；カルシウム；無機リン；ナトリウム；カリウム；クロライドであった。
図１２に示したように、５１９０＿Ｅ０１は、以前に他のＰＣＳＫ９アドネクチン阻害剤で観察された、非結合／遊離ＰＣＳＫ９、総ＰＣＳＫ９およびＬＤＬ−ｃに対する薬力学的な効果を誘発した。具体的には、遊離ＰＣＳＫ９が、投与１時間以内に検出不可能なレベルまで急落する、迅速な標的会合が観察された。ＬＤＬ−ｃは、ＰＣＳＫ９阻害の結果、５０％ベースライン以下まで低下し、最大阻害が２〜５日の期間に観察された。さらに、ＰＣＳＫ９−ＰＫＥ２アドネクチン：ＰＣＳＫ９複合体が蓄積するにつれて、総ＰＣＳＫ９が上昇する。複合体の解離と薬物クリアランスにより、ＰＣＳＫ９およびＬＤＬ−ｃのレベルは、本研究の１５日以内に、ベースラインに戻る。同様の傾向が、ペグ化されたＰＣＳＫ９アドネクチンの比較対象において、観察された。図１３に示したように、５１９０＿Ｅ０１は１０ｍｇ／ｋｇにおいて、モル当量投与量の比較対象のペグ化されたＰＣＳＫ９アドネクチンと同様の、頑強なＬＤＬ−ｃの低下を示した。
実施例２０：ＰＣＳＫ９標的会合の用量依存性
図１４に示したように、遊離ＰＣＳＫ９阻害の用量依存的反応が、５１９０＿Ｅ０１の３ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇ用量において観察された。１０ｍｇ／ｋｇ用量は、３ｍｇ／ｋｇ用量よりも、ＰＣＳＫ９標的会合においてより長い持続時間を示す。図１４はまた、タンデムアドネクチンおよびペグ化されたアドネクチンのモル当量投与量について、同等のＰＣＳＫ９標的会合を図示している。予想通り、２６２９＿Ｅ０６は遊離ＰＣＳＫ９を調節せず；遊離ＰＣＳＫ９で観察されたいずれの差異も、概日リズムおよびベースラインの変化によるものであろう。
図１５は、総ＰＣＳＫ９に対する、タンデムアドネクチンおよびペグ化されたＰＣＳＫ９アドネクチンの影響の違いを図示している。全体的な傾向は同じであるが、比較対象のペグ化されたＰＣＳＫ９アドネクチンと比較して、５１９０＿Ｅ０１を投与したカニクイザルでは、総ＰＣＳＫ９が、より急速にピークに達し、ベースラインに戻っており、このことは、使用される薬物動態（ＰＫ）増強法によってＰＣＳＫ９：アドネクチン薬複合体のクリアランスメカニズムが異なることを示唆している（タンデムでは腎クリアランスであるのに対し、ペグ化されたアドネクチンではマクロファージの取り込み）。この場合も、２６２９＿Ｅ０６は予想通り、本アッセイにおいて、薬力学的な効果を示さない。
実施例２１：タンデムフォーマットは、構成成分と比較して、同等のインビトロ免疫原性応答を示す。
実施例８に記載したように、潜在的な免疫原性のインビトロでの評価を、Ｔ細胞増殖アッセイを用いて、いくつかのタンデムＰＣＳＫ９−ＰＫＥ２アドネクチンに対して行った。
図１６に示したように、タンデムアドネクチンへの免疫原性応答のパーセンテージと大きさは、モノアドネクチン構成成分（すなわち、ＰＣＳＫ９またはＰＫＥ２；図１６の中央）と同様である。これらの結果は、モノアドネクチンと比較して、タンデムアドネクチンにおいてさらなる免疫原性のリスクが、最小である、または無いことを示唆している。さらに、タンデムに対する増殖応答の違いは、ＰＣＳＫ９およびＰＫＥ２アドネクチンを連結するリンカー配列の関数として、観察される。４４７２＿Ｆ０８および４４７２＿Ｅ０６タンデムＰＣＳＫ９−ＰＫＥ２アドネクチンと比較して、４４７２＿Ｃ０６タンデムアドネクチンは最も低い免疫原性を示した。これらの観察された違いの潜在的なメカニズムの一つは、リンカー配列に応答する、Ｔ細胞によるタンパク質プロセシングの違いであろう。
４４７２＿Ｃ０６の特性の概要は、以下の表１９に提示している。
例示的な実施形態
１．フィブロネクチンＩＩＩ型第１０ドメイン（１０Ｆｎ３）を含むポリペプチドであって、１０Ｆｎ３ドメインがａ）ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、およびＦＧループ、ｂ）対応するヒト１０Ｆｎ３ドメインのＣＤループの配列と比較して変化したアミノ酸配列を持つＣＤループを含み、かつｃ）ポリペプチドが５００ｎＭより小さいＫＤでヒト血清アルブミンに結合する、ポリペプチド。
２．１０Ｆｎ３ドメインがさらに、アカゲザル血清アルブミン、カニクイザル血清アルブミン、マウス血清アルブミン、およびラット血清アルブミンの一つ以上と結合する、実施形態１に記載のポリペプチド。
３．１０Ｆｎ３ドメインが、アカゲザル血清アルブミンおよびカニクイザル血清アルブミンと結合する、実施形態２に記載のポリペプチド。
４．１０Ｆｎ３ドメインが、５００ｎＭより小さいＫＤで、アカゲザル血清アルブミンおよびカニクイザル血清アルブミンと結合する、実施形態３に記載のポリペプチド。
５．１０Ｆｎ３ドメインが、１００ｎＭより小さいＫＤで、アカゲザル血清アルブミンおよびカニクイザル血清アルブミンと結合する、実施形態４に記載のポリペプチド。
６．１０Ｆｎ３ドメインが、１０ｎＭより小さいＫＤで、アカゲザル血清アルブミンおよびカニクイザル血清アルブミンと結合する、実施形態５に記載のポリペプチド。
７．１０Ｆｎ３ドメインが、マウスおよびラット血清アルブミンと結合する、実施形態１−６のいずれかに記載のポリペプチド。
８．１０Ｆｎ３ドメインが、５００ｎＭより小さいＫＤで、アカゲザル血清アルブミンおよびカニクイザル血清アルブミンと結合する、実施形態７に記載のポリペプチド。
９．１０Ｆｎ３ドメインが、１００ｎＭより小さいＫＤで、アカゲザル血清アルブミンおよびカニクイザル血清アルブミンと結合する、実施形態８に記載のポリペプチド。
１０．１０Ｆｎ３ドメインが、１０ｎＭより小さいＫＤで、アカゲザル血清アルブミンおよびカニクイザル血清アルブミンと結合する、実施形態９に記載のポリペプチド。
１１．１０Ｆｎ３ドメインが、５．５から７．４のｐＨ範囲で血清アルブミンと結合する、実施形態１−１１のいずれか一つに記載のポリペプチド。
１２．１０Ｆｎ３ドメインが、ＨＳＡのＩ−ＩＩドメインと結合する、実施形態１−１１のいずれか一つに記載のポリペプチド。
１３．ヒト血清アルブミン存在下のポリペプチドの血清半減期が、少なくとも３０時間である、実施形態１−１２のいずれか一つに記載のポリペプチド。
１４．ＣＤループが式Ｇ−Ｘ１−Ｘ２−Ｖ−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｓ−Ｘ６−Ｘ７−Ｇ−Ｘ８−Ｘ９−Ｙ−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｅのアミノ酸配列を含み、式中、
（ａ）Ｘ１がＲまたはＷからなる群から選択され；
（ｂ）Ｘ２がＨ、Ｅ、Ｄ、Ｙ、またはＱからなる群から選択され；
（ｃ）Ｘ３がＱまたはＨからなる群から選択され；
（ｄ）Ｘ４がＩ、Ｋ、Ｍ、Ｑ、Ｌ、またはＶからなる群から選択され；
（ｅ）Ｘ５がＹ、Ｆ、またはＮからなる群から選択され；
（ｆ）Ｘ６がＤ、Ｖ、またはＥからなる群から選択され；
（ｇ）Ｘ７がＬ、Ｗ、またはＦからなる群から選択され；
（ｈ）Ｘ８がＰまたはＴからなる群から選択され；
（ｉ）Ｘ９がＬまたはＭからなる群から選択され；
（ｊ）Ｘ１０がＩまたはＶからなる群から選択され；
（ｋ）Ｘ１１がＹまたはＦからなる群から選択され；および
（ｌ）Ｘ１２がＴ、Ｓ、Ｑ、Ｎ、またはＡからなる群から選択される、
実施形態１−１３のいずれか一つに記載のポリペプチド。
１５．
（ａ）Ｘ１がＲ；
（ｂ）Ｘ２がＥ；
（ｃ）Ｘ３がＱ；
（ｄ）Ｘ４がＫ；
（ｅ）Ｘ５がＹ；
（ｆ）Ｘ６がＤ；
（ｇ）Ｘ７がＬまたはＷ；
（ｈ）Ｘ８がＰ；
（ｉ）Ｘ９がＬ；
（ｊ）Ｘ１０がＩ；
（ｋ）Ｘ１１がＹ；および
（ｌ）Ｘ１２がＱまたはＮである、
実施形態１４に記載のポリペプチド。
１６．Ｘ１０がＬ、かつＸ１２がＱである、実施形態１５に記載のポリペプチド。
１７．Ｘ１０がＷ、かつＸ１２がＮである、実施形態１５に記載のポリペプチド。
１８．ＣＤループが、配列番号１０１−１２５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態１４に記載のポリペプチド。
１９．ＣＤループが、配列番号１０６に記載されるアミノ酸配列を含む、実施形態１−１８のいずれか一つに記載のポリペプチド。
２０．ＣＤループが、配列番号１１３に記載されるアミノ酸配列を含む、実施形態１−１９のいずれか一つに記載のポリペプチド。
２１．ポリペプチドが、配列番号２３−１００、１８４−２０９および２３５−２６０の非ＣＤループ領域に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態１−２０のいずれか一つに記載のポリペプチド。
２２．ポリペプチドが、配列番号２３−１００、１８４−２０９および２３５−２６０のいずれか一つに、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態１−２１のいずれか一つに記載のポリペプチド。
２３．フィブロネクチンＩＩＩ型第１０（１０Ｆｎ３）ドメインおよび異種タンパク質を含む融合ポリペプチドであって、１０Ｆｎ３メインが、ａ）ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、およびＦＧループ、ｂ）対応するヒト１０Ｆｎ３ドメインのＣＤループの配列と比較して変化したアミノ酸配列を持つＣＤループを含み、かつｃ）ポリペプチドが５００ｎＭより小さいＫＤでヒト血清アルブミンに結合する、ポリペプチド。
２４．１０Ｆｎ３ドメインが、配列番号２３−１００、１８４−２０９および２３５−２６０に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態２３に記載の融合ポリペプチド。
２５．１０Ｆｎ３ドメインが、配列番号５５、８１、１９０または２４１に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態２４に記載の融合ポリペプチド。
２６．１０Ｆｎ３ドメインが、配列番号５５、８１、１９０または２４１のアミノ酸配列を含む、実施形態２５に記載の融合ポリペプチド。
２７．１０Ｆｎ３ドメインが、配列番号６２、８８、１９７または２４８に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態２４に記載の融合ポリペプチド。
２８．１０Ｆｎ３ドメインが、配列番号６２、８８、１９７または２４８のアミノ酸配列を含む、実施形態２７に記載の融合ポリペプチド。
２９．異種タンパク質が治療用部分である、実施形態２３に記載の融合ポリペプチド。
３０．異種タンパク質が１０Ｆｎ３ドメインを含むポリペプチドである、実施形態２３に記載の融合ポリペプチド。
３１．１０Ｆｎ３ドメインが、血清アルブミン以外の標的タンパク質に結合する、実施形態３０に記載の融合ポリペプチド。
３２．１０Ｆｎ３ドメインが、ＰＣＳＫ９に結合する、実施形態３１に記載の融合ポリペプチド。
３３．１０Ｆｎ３ドメインが、配列番号１６７に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態３２に記載の融合ポリペプチド。
３４．１０Ｆｎ３ドメインが、配列番号１６７のアミノ酸配列を含む、実施形態３３に記載の融合ポリペプチド。
３５．融合ポリペプチドが、配列番号１６８、１６９または２６１に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態２３に記載の融合ポリペプチド。
３６．融合ポリペプチドが、配列番号１６８、１６９または２６１に記載されるアミノ酸配列を含む、実施形態３５に記載の融合ポリペプチド。
３７．マウス血清アルブミン存在下のポリペプチドの血清半減期が、少なくとも１０時間である、実施形態２３−３６のいずれか一つに記載の融合ポリペプチド。
３８．カニクイザル血清アルブミン存在下のポリペプチドの血清半減期が、少なくとも５０時間である、実施形態２３−３６のいずれか一つの融合ポリペプチド。
３９．配列番号２３−１２５、１８４−２０９および２３５−２６０、１６８、および１６９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
４０．実施形態１−３９のいずれか一つに記載のポリペプチドおよび担体を含む、組成物。
４１．実施形態１−３９のいずれか一つに記載のポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。
４２．核酸分子が、配列番号１２６−１５１および１７２からなる群から選択される配列、またはこれに少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるヌクレオチド配列を持つ、実施形態４１に記載の単離された核酸分子。
４３．実施形態４１または４２に記載のヌクレオチド配列を含む、発現ベクター。
４４．実施形態４１もしくは４２に記載の核酸分子、または実施形態４３に記載の発現ベクターを含む、細胞。
４５．実施形態１−３９のいずれか一項に記載のポリペプチドを生産する方法であって、該ポリペプチドの発現に適した条件下で実施形態４４の細胞を培養すること、および該ポリペプチドを精製することを含む、方法。























等価物
当業者は、通例の実験のみを用いて、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態の多くの等価物を認識するであろう、あるいは、確認することができるであろう。これらの等価物は、以下の請求項に包含されることを意図している。

Claims (15)

  1. フィブロネクチンＩＩＩ型第１０ドメイン（１０Ｆｎ３）を含むポリペプチドであって、１０Ｆｎ３ドメインが、ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、およびＦＧループを含み、 １０ Ｆｎ３ドメインのＣＤループが、配列番号１０１−１２５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ポリペプチドが５００ｎＭより小さいＫＤでヒト血清アルブミンに結合し、かつ、５００ｎＭよりも小さいＫＤで、アカゲザル血清アルブミン、カニクイザル血清アルブミン、マウス血清アルブミン、およびラット血清アルブミンの一つ以上と結合する、ポリペプチド。
  2. １０Ｆｎ３ドメインが、５．５から７．４のｐＨ範囲で血清アルブミンに結合する、請求項１に記載のポリペプチド。
  3. １０Ｆｎ３ドメインが、ＨＳＡのＩ−ＩＩドメインに結合する、請求項１−２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  4. ポリペプチドが、異種タンパク質を含む融合ポリペプチドである、請求項１−３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  5. 異種タンパク質が治療用部分である、請求項４に記載のポリペプチド。
  6. 異種タンパク質が、１０Ｆｎ３ドメインを含むポリペプチドである、請求項４に記載のポリペプチド。
  7. １０Ｆｎ３ドメインが、血清アルブミン以外の標的タンパク質と結合する、請求項６に記載のポリペプチド。
  8. １０ Ｆｎ３ドメインが、配列番号８１、８８、２３−８０、８２−８７、８９−１００、１６８−１６９、１８４−２０９および２３５−２６１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１−７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  9. 請求項１−８のいずれか一項に記載のポリペプチドおよび担体を含む、組成物。
  10. 請求項１−８のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。
  11. 核酸分子が、配列番号１２６−１５１および１７２からなる群から選択される配列を含む、請求項１０に記載の単離された核酸分子。
  12. 請求項１−８のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、発現ベクター。
  13. 請求項１０もしくは１１に記載の核酸分子、または請求項１２に記載の発現ベクターを含む、細胞。
  14. 請求項１−８のいずれか一項に記載のポリペプチドを生産する方法であって、該ポリペプチドの発現に適した条件下で請求項１３に記載の細胞を培養すること、および該ポリペプチドを精製することを含む、方法。
  15. １０ Ｆｎドメインが、配列番号８１に記載のアミノ酸配列においてアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換が、
    （ｉ）配列番号１の位置５５に対応するセリン残基のシステインでの置換；
    （ｉｉ）配列番号１の位置１２に対応するアラニン残基のシステインでの置換；
    （ｉｉｉ）配列番号１の位置５８に対応するスレオニン残基のシステインでの置換；
    （ｉｖ）配列番号１の位置５６に対応するスレオニン残基のシステインでの置換；および
    （ｖ）配列番号１の位置２６に対応するアラニン残基のシステインでの置換
    からなる群から選択される、請求項１に記載のポリペプチド。
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