CN106170494A - 结合血清白蛋白的纤连蛋白iii型结构域 - Google Patents

Abstract

本发明涉及包含具有南极环取代的纤连蛋白III型第十结构域(¹⁰Fn3)的多肽，所述多肽与血清白蛋白结合。本发明进一步涉及在诊断或治疗应用中使用的包含与异源蛋白连接的结合血清白蛋白的¹⁰Fn3的融合分子。

Description

结合血清白蛋白的纤连蛋白III型结构域

相关申请的引用

本申请要求2014年3月20日提交的名称为“新的结合血清白蛋白的纤连蛋白III型结构域”(Novel Serum Albumin-Binding Fibronectin Type III Domains)的美国临时申请号61/968,181的优先权，将该申请的内容通过提述完整并入本文。

背景

治疗剂的半衰期不足常常迫使人们以高频率和/或较高剂量进行给药、或使用持续释放制剂，以期维持疗效所必需的血清水平。然而，这常常伴随着消极的副作用。例如，频繁地全身注射给受试者带来相当程度的不适，且造成给药相关感染的高风险，并可能需要住院治疗或频繁地到医院就诊，尤其是在治疗剂需要静脉内给予时。而且，在长期治疗中，逐日静脉内注射还会导致由反复血管穿刺引起的组织疤痕形成及血管病变等相当大的副作用。已知所有频繁的全身性治疗剂给药均存在类似的问题，例如向糖尿病患者给予胰岛素、或向罹患多发性硬化的患者给予干扰素药物。所有这些因素均导致患者顺应性降低，并增加医疗体系的成本。

本申请提供了增加各种治疗剂的血清半衰期的化合物、具有增加的血清半衰期的化合物、和增加治疗剂的血清半衰期的方法。此类用于增加治疗剂的血清半衰期的化合物和方法可以成本高效的方式制造或实施，具有理想的生物物理学性质(例如，Tm，基本上为单体、或折叠良好)，并且大小足够小而允许组织穿透。

概述

本发明至少部分地基于新的Adnectin(PKE2Adnectin)的发现，这些新Adnectin基于南极(south pole)、结合血清白蛋白，含有纤连蛋白III型第十结构域(¹⁰Fn3)，相比于现有的基于北极的血清白蛋白结合性含¹⁰Fn3结构域的Adnectin的可提供强化的特性。

在一方面，本发明提供了包含¹⁰Fn3结构域的多肽，其中¹⁰Fn3结构域包含：a)AB、BC、CD、DE、EF、和FG环，b)具有相对于人¹⁰Fn3结构域的相应CD环序列改变的氨基酸序列的CD环，并且c)其中该多肽以小于500nM的K_D与人血清白蛋白结合。

在某些实施方案中，¹⁰Fn3结构域进一步与恒河猴血清白蛋白、食蟹猴血清白蛋白、小鼠血清白蛋白和大鼠血清白蛋白中的一者或多者结合。例如，¹⁰Fn3结构域可与HSA、恒河猴血清白蛋白、和食蟹猴血清白蛋白结合，或者，¹⁰Fn3结构域可与HSA、恒河猴血清白蛋白、食蟹猴血清白蛋白、小鼠血清白蛋白、和大鼠血清白蛋白结合。在一些实施方案中，¹⁰Fn3结构域以小于500nM的K_D，例如小于100nM的K_D、或甚至小于10nM的K_D与相应的血清白蛋白结合。在一些实施方案中，¹⁰Fn3结构域在5.5到7.4的pH范围与血清白蛋白结合。

在某些实施方案中，¹⁰Fn3结构域与HSA的结构域I-II结合。

在某些实施方案中，在人血清白蛋白存在下，所述包含¹⁰Fn3结构域的多肽的血清半衰期为至少10小时，比如至少20小时，或至少30小时。

在某些实施方案中，CD环包含根据式G-X₁-X₂-V-X₃-X₄-X₅-S-X₆-X₇-G-X₈-X₉-Y-X₁₀-X₁₁-X₁₂-E(SEQ ID NO：170)的氨基酸序列，其中，

(a)X₁选自R或W；

(b)X₂选自H、E、D、Y、或Q；

(c)X₃选自Q或H；

(d)X₄选自I、K、M、Q、L、或V；

(e)X₅选自Y、F、或N；

(f)X₆选自D、V、或E；

(g)X₇选自L、W、或F；

(h)X₈选自P或T；

(i)X₉选自L或M；

(j)X₁₀选自I或V；

(k)X₁₁选自Y或F；并且

(l)X₁₂选自T、S、Q、N、或A。

在一个优选实施方案中，(a)X₁是R；(b)X₂是E；(c)X₃是Q；(d)X₄是K；(e)X₅是Y；(f)X₆是D；(g)X₇是L或W；(h)X₈是P；(i)X₉是L；(j)X₁₀是I；(k)X₁₁是Y；并且(l)X₁₂是Q或N。

在又一个另外的优选实施方案中，(a)X₁是R；(b)X₂是E；(c)X₃是Q；(d)X₄是K；(e)X₅是Y；(f)X₆是D；(g)X₇是L；(h)X₈是P；(i)X₉是L；(j)X₁₀是I；(k)X₁₁是Y；并且(l)X₁₂是Q。

在又一个另外的优选实施方案中，(a)X₁是R；(b)X₂是E；(c)X₃是Q；(d)X₄是K；(e)X₅是Y；(f)X₆是D；(g)X₇是W；(h)X₈是P；(i)X₉是L；(j)X₁₀是I；(k)X₁₁是Y；并且(l)X₁₂是N。

在某些实施方案中，CD环包含选自SEQ ID NO：101-125的氨基酸序列。在一个优选的实施方案中，CD环包含在SEQ ID NO：106或113中示出的氨基酸序列。

在某些实施方案中，本发明提供了包含¹⁰Fn3结构域的多肽，所述¹⁰Fn3结构域包含：(i)包含具有共有序列SEQ ID NO：170的氨基酸序列、或SEQ ID NO：101-125的任一者的氨基酸序列的CD环；和(ii)与SEQ ID NO：23-100、184-209和235-260的非CD环区至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同，或者与SEQ ID NO：23-100、184-209和235-260之一至多有1、1-2、1-5、1-10或1-20个氨基酸差异的氨基酸序列。在某些实施方案中，该多肽包含与SEQ ID NO：23-100、184-209和235-260中的任一者至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％不同、或与SEQ ID NO：23-100、184-209和235-260中之一有至多1、1-2、1-5、1-10或1-20个氨基酸差异的氨基酸序列。氨基酸差异可以是取代、添加或缺失。

在某些方面，本发明提供了包含纤连蛋白III型第十(¹⁰Fn3)结构域和异源蛋白的融合多肽，其中¹⁰Fn3结构域包含：a)AB、BC、CD、DE、EF、和FG环，b)具有相对于人¹⁰Fn3结构域的相应CD环序列改变的氨基酸序列的CD环，并且c)其中该多肽以小于500nM的K_D与人血清白蛋白结合。

在某些实施方案中，该融合多肽包含结合白蛋白的Adnectin，所述结合白蛋白的Adnectin包含与SEQ ID NO：23-100、184-209和235-260的任一者至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同、或与SEQ ID NO：23-100、184-209和235-260中之一有至多1、1-2、1-5、1-10或1-20个氨基酸差异的氨基酸序列。在一个优选实施方案中，该融合多肽包含这样的结合白蛋白的Adnectin，该结合白蛋白的Adnectin包含SEQ ID NO：55、81、190或241的氨基酸序列。在又另一个优选实施方案中，该融合多肽包含这样的结合白蛋白的Adnectin，该结合白蛋白的Adnectin包含SEQ ID NO：62、88、197或248的氨基酸序列。

在某些实施方案中，该融合多肽包含结合白蛋白的Adnectin和异源部分，其中该异源部分为治疗部分。

在某些实施方案中，该异源蛋白为包含¹⁰Fn3结构域的多肽。在一些实施方案中，该¹⁰Fn3结构域与血清白蛋白之外的靶蛋白结合。在一个实施方案中，该¹⁰Fn3结构域与PCSK9(即，PCSK9 Adnectin)结合，并且包含与SEQ ID NO：167至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同、或与SEQ ID NO：167有至多1、1-2、1-5、1-10或1-20个氨基酸差异的氨基酸序列。

在某些实施方案中，该融合多肽为PCSK9-PKE2串联Adnectin，其包含与SEQ IDNO：168、169或261至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同，或与SEQ ID NO：168、169或261之一的氨基酸序列有至多1、1-2、1-5、1-10或1-20个氨基酸差异的氨基酸序列。

在某些实施方案中，在小鼠血清白蛋白的存在下，该融合多肽的血清半衰期为至少10小时。在一些实施方案中，在食蟹猴血清白蛋白的存在下，该融合多肽的血清半衰期为至少50小时。在某些实施方案中，在小鼠或食蟹猴血清白蛋白的存在下，该融合多肽的血清半衰期为10-100小时，如10-90小时、10-80小时、10-70小时、10-60小时、10-50小时、10-40小时、10-30小时、10-20小时、50-100小时、60-100小时、70-100小时、80-100小时、90-100小时、20-90小时、30-80小时、40-70小时、或50-60小时。

在某些方面，本发明提供了包含选自SEQ ID NO：23-100、168、169、184-209、235-260、和261的氨基酸序列的PKE2Adnectin或PCSK9-PKE2串联Adnectin。

在某些方面，本发明提供了组合物，包含：任一如本文中所述的结合白蛋白的Adnectin或含有如本文中描述的这种Adnectin的融合蛋白，和载体。

在某些方面，本发明提供了编码任一种如本文所述的结合白蛋白的Adnectin或含有所述Adnectin的融合蛋白的分离的核酸分子(例如在SEQ ID NO：126-151和172中所示出的那些)、编码这些核酸分子的载体、和包含这些核酸分子的细胞。还提供了包含与本文中描述的任何这些核苷酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同、或与其有至多1-5、1-10、1-50或1-100个核苷酸差异的核苷酸序列的核酸。

在某些方面，本发明提供了产生如本文中描述的结合白蛋白的Adnectin或含有此类Adnectin的融合蛋白的方法，该方法包括在适合于表达Adnectin或融合蛋白的条件下培养包含编码所述蛋白的核酸分子的细胞，并且纯化所述蛋白。

附图简述

图1显示了实施例6中描述的竞争性α筛选测定法的示意图。

图2是描绘不同Adnectin与人FcRn受体竞争结合人血清白蛋白(HSA)的线图。

图3是描绘2629_E06和2630_D02 PKE2Adnectin在WT小鼠中的血浆半衰期的线图。

图4是描绘关于2629_E06和2630_D02Adnectin、以及亲本2270_C01分子的抗原性百分比和增殖反应强度的T细胞增殖结果的图。

图5描绘了串联Adnectin的模块性的比较。Adnectin 1318_H04对应于基于北极的血清白蛋白结合性Adnectin。“X”是指非PKE靶特异性Adnectin(即，肌肉生长抑制素；“myo”、或PCSK9)的构型。下图描绘了在每个框中对应于正如通过直接结合ELISA所确定的结合HSA的EC₅₀串联：单Adnectin比率的灰色阴影图标(即，灰色阴影越深，与HSA的结合越强)。

图6显示了在HSA的存在或缺乏下PCSK9-PKE2串联Adnectin与hPCSK9的结合的生物层干涉测量法(Bio-Layer Interferometry)传感图。

图7是显示4472_C06 PCSK9-PKE2串联Adnectin首先与HSA，然后在注射相应的蛋白质之后与PCSK9结合的Biacore传感图。

图8为描绘串联PCSK9-PKE2Adnectin 4772_C06在野生型C57 Bl/6小鼠中的体内PK概貌的线图。

图9显示了在hPCSK9转基因小鼠中给予载体或0.5mg/kg或2mg/kg的PCSK9-PKE2Adnectin4472_C06之后的游离PCSK9水平。

图10是显示PKE2Adnectin 2629_E06、PCSK9-PKE2串联5190_E01Adnectin、和聚乙二醇化PCSK9在食蟹猴中的血浆PK概貌和半衰期的线图。

图11是显示PKE2Adnectin 2270_C01在食蟹猴中的血浆半衰期的线图。

图12是显示对食蟹猴给予PCSK9-PKE2串联Adnectin5190_E01之后在食蟹猴中的LDL-c和PCSK9的药效学概貌的线图。该概貌证明LDL-c的强烈降低、游离PCSK9的抑制和总PCSK9的增加，所有这些变化在研究结束时均返回到基线。

图13是显示PCSK9-PKE2串联Adnectin 5190_E01和聚乙二醇化PCSK9 Adnectin参比、连同2629_E06 PKE2对照在食蟹猴中的LDL-c降低效果的线图。

图14显示了在食蟹猴中两个不同浓度的串联PCSK9-PKE2Adnectin的靶接合，与聚乙二醇化PCSK9 Adnectin和PKE2Adnectin 2629_E06相比较。

图15显示了在食蟹猴中给予串联PCSK9-PKE2Adnectin、聚乙二醇化PCSK9Adnectin或PKE2Adnectin2629_E06之后随着时间推移的总PCSK9水平。

图16是描绘关于PCSK9-PKE2串联Adnectin4472_F08、4472_E06、和4472_C06，以及组分PKE2_Adnectin2629_E06和组分PCSK9 Adnectin 2382_D09的增殖反应百分比和强度的T细胞增殖结果的线图。该图最左边的条形对应于具有低、中、高抗原性的对照蛋白。

图17显示了在本文中描述的PKE2Adnectin的氨基酸序列。

图18A-18C显示了在本文中描述的PKE2Adnectin和PCSK9-PKE2串联Adnectin的核酸序列。

发明详述

定义

除非另有定义，本文中使用的所有的技术和科学术语具有与技术人员所通常理解的相同的含义。在下文中描述了优选的方法和组合物，但任何类似于或等同于本文中所描述的那些的方法和组合物均可以在本发明的实施或测试中使用。

如本文中使用的，“多肽”是指具有两个或更多个氨基酸的任何序列，而不论长度、翻译后修饰、或功能为何。“多肽”、“肽”、和“蛋白质”在本文中可互换使用。多肽可包括天然氨基酸和非天然氨基酸，如在美国专利No.6,559,126中描述的那些，通过提述将该专利并入本文。也可以用多种标准化学方法中的任一种修饰多肽(例如，可用保护基修饰氨基酸；羧基端氨基酸可被制成为末端酰胺基团；可用基团修饰氨基端残基，例如，以便增强亲油性；或者，可以化学方式将多肽糖基化或以别的方式修饰以便增加稳定性或体内半衰期)。多肽修饰可包括另一种结构如环状化合物或其他分子与多肽的附接，并且还可包括含有处于改变构型的一个或多个氨基酸(即，R或S；或者，L或D)的多肽。

如本文中使用的，“多肽链”是指其每一个结构域通过肽键，而不是非共价相互作用或二硫键，与其他结构域连接的多肽。

“分离的”多肽是已经被鉴定，并已被从其天然环境的组分中分离和/或回收的多肽。其天然环境的污染组分是将会干扰该多肽的诊断或治疗用途的物质，可包括酶类、激素类、和其他蛋白性或非蛋白性溶质。在优选实施方案中，该多肽将被纯化为：(1)正如通过洛瑞法(Lowry Method)确定的按多肽的重量计大于95％，并且最优选地按重量计大于99％，(2)到足以通过使用转杯测序仪获得至少N端残基或内部氨基酸序列的程度，或(3)达到在还原或非还原条件下进行的SDS-PAGE后，利用考马斯亮蓝，或优选地，银染色，呈现均一性的程度。分离的多肽包括重组细胞内的原位多肽，因为多肽的天然环境的至少一种组分将不存在。然而一般而言，分离的多肽将通过至少一个纯化步骤来制备。

如本文中使用的¹⁰Fn3结构域的“区域”是指人¹⁰Fn3结构域的环(AB、BC、CD、DE、EF和FG)、β链(A、B、C、D、E、F和G)、N端(对应于SEQ ID NO：1的氨基酸残基1-7)、或C端(对应于SEQ ID NO：1的氨基酸残基93-94)。

“北极环”是指人纤连蛋白3型第十(¹⁰Fn3)结构域的纤连蛋白BC、DE和FG环的任一者。

“南极环”是指人纤连蛋白3型第十(¹⁰Fn3)结构域的纤连蛋白AB、CD和EF环的任一者。

“支架区”是指人¹⁰Fn3结构域的任何非环区。支架区包括A、B、C、D、E、F和Gβ链以及N端区(对应于SEQ ID NO：1的残基1-8的氨基酸)和C端区(对应于SEQ ID NO：1的残基93-94的氨基酸并且任选地包含构成人纤连蛋白中的Fn3结构域的第10和第11重复之间的天然接头的7个氨基酸)。

本文中的“氨基酸序列同一性百分比(％)”定义为在候选序列中与选定序列进行序列比对，并且引入空位(如果需要的话)以达到最大序列同一性百分比之后，并且不将任何保守取代考虑作为序列同一性的一部分，此时候选序列中与选定序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。为了确定氨基酸序列同一性百分比，可以使用本领域技术人员熟知的各种方法来实施比对，例如，利用公众可获得的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定测量比对的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需要的任何算法。然而，出于本文的目的，通过使用序列比较计算机程序ALIGN-2，如下文所述获得氨基酸序列同一性％值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech，Inc.创作，其已在美国版权局(U.S.Copyright Office，Washington D.C.，20559)与用户文件一起备案，在美国版权局以美国版权登记号TXU510087登记，且公众可以通过Genentech，Inc.(South San Francisco，Calif)获得之。ALIGN-2程序应当编译为供在UNIX操作系统、优选数字UNIX V4.0D上使用。所有序列比较参数均由ALIGN-2程序设定且不变化。

为本文的目的，如下计算给定氨基酸序列A相对于(与、或针对)给定氨基酸序列B的氨基酸序列同一性％(或者可表述为给定氨基酸序列A相对于(与、或针对)给定氨基酸序列B具有或包含一定的氨基酸序列同一性％)：100乘以分数X/Y，其中X为在A与B的序列比对程序ALIGN-2比对中通过该程序评定为相同匹配的氨基酸残基的数目，且其中Y为B中的氨基酸残基的总数。应当理解的是，在氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度的情况下，A相对于B的氨基酸序列同一性％不会等于B相对于A的氨基酸序列同一性％。

如本文中可互换使用的术语“特异性地结合”、“特异性结合”、“选择性结合”、和“选择性地结合”是指Adnectin对血清白蛋白展现出亲和力、而与另一不同的多肽并不显著结合(例如，少于约10％结合)，正如通过本领域可得到的技术所测量的，所述技术例如但不限于，Scatchard分析和/或竞争性结合测定(例如，竞争ELISA、BIACORE测定)。例如，在本发明Adnectin的结合结构域对于血清白蛋白是特异的情况下，该术语同样适用。

多肽的“半衰期”通常可定义为该多肽的血清浓度在体内降低50％，例如，由于天然机制对该多肽的降解和/或该多肽的清除或螯合，所花费的时间。半衰期可以本身已知的任何方式，例如通过药代动力学分析来测定。适合的技术对于本领域人员来说是清楚的，例如，可通常涉及下列步骤：向灵长类动物给予适宜剂量的多肽；以规律间隔从所述灵长类动物采集血液样品或其他样品；确定所述血液样品中的多肽浓度水平；并且根据由此获得的数据(的绘图)计算到该多肽的水平或浓度相比于在给药时的初始水平降低50％为止所经过的时间。确定半衰期的方法例如可见于Kenneth等人，Chemical Stability ofPharmaceuticals：A Handbook for Pharmacists(1986)；Peters等人，Pharmacokineticanalysis：A Practical Approach(1996)；和″Pharmacokinetics″，M Gibaldi&D Perron，由Marcel Dekker出版，第2修订版(1982)。

半衰期可以使用诸如t_1/2-α、t_1/2-β和曲线下面积(AUC)之类的参数来表示。在本说明书中，“半衰期的增加”是指这些参数的任一者、这些参数的任何两者、或所有这三个参数的增加。在某些实施方案中，半衰期的增加是指t1/2-β的增加，有或没有t_1/2-α和/或AUC或这两者的增加。

如本文中使用的，术语“K_D”意指特定Adnectin-蛋白质相互作用的解离平衡常数或者Adnectin对于蛋白质(例如，血清白蛋白)的亲和力，如使用表面等离子体共振测定或细胞结合测定所测量的。如本文中使用的，“期望的K_D”是指对于预期目的足够的Adnectin的K_D。例如，期望的K_D可以指在例如基于细胞的萤光素酶测定的体外测定中引发功能效应所需要的Adnectin的K_D。

如本文中使用的，术语“k_ass”意指Adnectin结合成Adnectin/蛋白复合物的缔合速率常数。

如本文中使用的，术语“k_diss”意指Adnectin从Adnectin/蛋白复合物解离的解离速率常数。

如本文中使用的，术语“IC₅₀”是指Adnectin在体外或体内测定中将反应抑制到最大抑制反应的50％的水平(即，最大抑制反应和未经处理的反应之间的半程)的浓度。

术语“治疗有效量”指有效治疗哺乳动物中的疾病或失调和/或在一定程度上缓解与该失调相关的一种或多种症状的药物的量。

如本文中使用的，“预防”疾病或病症指相对于未经处理的对照样品降低统计样品中疾病状态的发生概率，或相对于未经处理的对照样品延迟该疾病或病症的一或多种症状的发作或降低其严重程度。可基于已知与普通群体相比增加罹患临床疾病状态的风险的因素选择患者进行预防性治疗。如本文中使用的，术语“治疗”包括(a)抑制疾病状态，即，阻止其发展；和/或(b)缓解疾病状态，即，一经确立，则使该疾病状态消退。

概览

本文中描述的新颖的基于纤连蛋白的支架多肽可与多种物种的血清白蛋白结合，并且可与另外的分子偶联，所述分子例如与不同靶标结合的其他¹⁰Fn3结构域、或对其而言增加半衰期是有益的多肽。

A.基于纤连蛋白的支架的一般结构

Fn3是指来自纤连蛋白的III型结构域。Fn3结构域是小的、单体的、可溶、且稳定的。其缺乏二硫键，因此在还原条件下是稳定的。Fn3的总体结构类似于免疫球蛋白折叠。Fn3结构域包含，按照从N端到C端的顺序：β或β样链A；环AB；β或β样链B；环BC；β或β样链C；环CD；β或β样链D；环DE；β或β样链E；环EF；β或β样链F；环FG；和β或β样链G。七个反平行β链排列成两个β片层，形成稳定的核心，同时产生两个由连接β或β样链的环构成的“面”。环AB、CD、和EF位于一个面上(“南极”)且环BC、DE、和FG位于相对的面上(“北极”)。环AB、BC、CD、DE、EF和FG均可参与配体结合。在人纤连蛋白中存在至少15个不同的Fn3模块，虽然在模块之间的序列同源性较低，但它们在三级结构上都有高度相似性。

在一些实施方案中，所述Fn3结构域是从人纤连蛋白III型结构域的野生型第十模块(¹⁰Fn3)衍生的Fn3结构域：

VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT(SEQ ID NO：1)(AB、CD、和EF环加下划线)。

在一些实施方案中，¹⁰Fn3的非配体结合序列，即“¹⁰Fn3支架”可被改变，前提是¹⁰Fn3保留配体结合功能和/或结构稳定性。已报道了多种突变体¹⁰Fn3支架。在一方面，Asp7、Glu 9、和Asp 23中的一者或多者被另一个氨基酸，例如非带负电的氨基酸残基(例如，Asn、Lys等)替换。已报道这些突变在中性PH值下与野生型形式相比具有促进突变体¹⁰Fn3的稳定性更强的作用(参见，例如PCT公开No.WO 02/04523)。已公开了多种其他的在¹⁰Fn3支架中有益的或中性的变化。参见，例如，Batori等人，Protein Eng.，15(12)：1015-1020(December 2002)；Koide等人，Biochemistry，40(34)：10326-10333(Aug.28，2001)。

变体和野生型¹⁰Fn3蛋白均以相同的结构为特征，即，命名为A到G的七个β链结构域序列、和连接这七个β链结构域序列的六个环区(AB环、BC环、CD环、DE环、EF环、和FG环)。位于最接近N端和C端处的β链在溶液中可采取β样构象。在SEQ ID NO：1中，AB环对应于残基14-17，BC环对应于残基23-31，CD环对应于残基37-47，DE环对应于残基51-56，EF环对应于残基63-67，且FG环对应于残基76-87。

因此，在一些实施方案中，本发明的血清白蛋白结合性Adnectin为与SEQ ID NO：1中所示的人¹⁰Fn3结构域至少40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、或90％相同的¹⁰Fn3多肽。变异性通常大多发生在一个或多个环中。¹⁰Fn3多肽的每一个β或β样链可实质上由与SEQ ID NO：1的相应β或β样链序列至少80％、85％、90％、95％或100％相同的氨基酸序列组成，前提是这样的变化不破坏该多肽在生理条件下的稳定性。

另外，还可在环区中形成插入和缺失，同时仍然产生高亲和力的结合血清的¹⁰Fn3结合结构域。因此，在一些实施方案中，选自AB、BC、CD、DE、EF和FG的一个或多个环相对于野生型人¹⁰Fn3中的相应环可以在长度上延长或缩短。在任何给定的多肽中，一个或多个环可以在长度上延长，一个或多个环可以在长度上缩短，或者其组合。在一些实施方案中，给定环的长度可以延长2-25、2-20、2-15、2-10、2-5、5-25、5-20、5-15、5-10、10-25、10-20、或10-15个氨基酸。在一些实施方案中，给定环的长度可以缩短1-15、1-11、1-10、1-5、1-3、1-2、2-10、或2-5个氨基酸。

如上所述，对应于SEQ ID NO：1的残基14-17、23-30、37-47、51-56、63-67和76-87的氨基酸残基分别定义了AB、BC、CD、DE、EF和FG环。然而，应当理解，为了实现对于期望靶标具有强亲和力的¹⁰Fn3结合结构域，并不是环区中的每个残基都需要修饰。在一些实施方案中，仅仅修饰一个环，例如CD环中的残基，产生高亲和力的结合靶标的¹⁰Fn3结构域。

在一些实施方案中，本发明提供包含¹⁰Fn3结构域的多肽，其中该¹⁰Fn3结构域包含AB、BC、CD、DE、和FG环，并且选自AB、CD、和EF环的至少一个环具有相对于SEQ ID NO：1的人¹⁰Fn3结构域的相应环序列改变的氨基酸序列。在一些实施方案中，AB、CD、和EF环被改变。在某些实施方案中，仅有AB环被改变。在某些实施方案中，仅有CD环被改变。在某些实施方案中，仅有EF环被改变。在某些实施方案中，AB环和CD环都被改变。在某些实施方案中，AB环和EF环都被改变。在某些实施方案中，CD环和EF环都被改变。在一些实施方案中，一个或多个特别的支架改变与一个或多个环改变相组合。关于“改变”意指相对于模板序列(即，相应的野生型人纤连蛋白结构域)的一个或多个氨基酸序列改变，包括氨基酸添加、缺失、和取代。

在一些实施方案中，基于纤连蛋白的支架蛋白包含具有北极与南极环的组合改变的¹⁰Fn3结构域。例如，环AB、CD、和EF中的一者或多者，与环BC、DE、和FG中的一者或多者形成组合，可相对于SEQ ID NO：1的人¹⁰Fn3结构域的相应环改变。

在一些实施方案中，所述多肽包含这样的¹⁰Fn3结构域：该¹⁰Fn3结构域包含与SEQID NO：1的非环区和/或非修饰环区至少80％、85％、90％、95％、98％、99％、或100％相同的氨基酸序列，其中选自AB、CD、和EF的至少一个环被改变。例如，在某些实施方案中，AB环可具有至多4个氨基酸取代，至多10个氨基酸插入，至多3个氨基酸插入，或上述组合；CD环可具有至多6个氨基酸取代，至多10个氨基酸插入，至多4个氨基酸缺失，或上述组合；并且EF环可具有至多5个氨基酸取代，至多10个氨基酸插入，至多3个氨基酸缺失，或上述组合；和/或FG环可具有至多12个氨基酸取代，至多11个氨基酸缺失，至多25个氨基酸插入，或上述组合。

在一些实施方案中，可取代整联蛋白结合基序“精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸”(RGD)(SEQ ID NO：1的氨基酸78-80)中的一个或多个残基，从而破坏整联蛋白结合。在一些实施方案中，本文中提供的所述多肽的FG环不含RGD整联蛋白结合位点。在一个实施方案中，该RGD序列被替换为极性氨基酸-中性氨基酸-酸性氨基酸序列(以N端到C端的方向)。在某些实施方案中，该RGD序列替换为SGE。在某些实施方案中，该RGD序列替换为RGE。

在某些实施方案中，基于纤连蛋白的支架蛋白包含这样的¹⁰Fn3结构域，所述¹⁰Fn3结构域通常由以下序列限定：

在SEQ ID NO：2中，AB环以(X)_u表示，BC环以(X)_v表示，CD环以(X)_w表示，DE环以(X)_x表示，EF环以(X)_y表示，并且FG环以X_z表示。X表示任何氨基酸，在X下面的下标表示氨基酸的数目的整数。具体地说，u、v、w、x、y和z各自可独立地为选自2-20、2-15、2-10、2-8、5-20、5-15、5-10、5-8、6-20、6-15、6-10、6-8、2-7、5-7、或6-7个氨基酸的任一者。β链序列(加下划线)可以具有相对于SEQ ID NO：2中所示的相应氨基酸的在所有7个支架区上的从0到10、从0到8、从0到6、从0到5、从0到4、从0到3、从0到2、或从0到1个取代、缺失或添加的任一者。在一些实施方案中，β链序列可以具有相对于SEQ ID NO：2中所示的相应氨基酸的在所有7个支架区上的从0到10、从0到8、从0到6、从0到5、从0到4、从0到3、从0到2、或从0到1个保守性取代的任一者。在某些实施方案中，疏水性核心氨基酸残基(在以上SEQ ID NO：2中的粗体残基)是固定的，且任何取代、保守性取代、缺失或添加发生在除了所述疏水性核心氨基酸残基之外的残基处。在一些实施方案中，本文中提供的多肽的疏水性核心残基相对于野生型人¹⁰Fn3结构域(SEQ ID NO：1)未经修饰。

在一些实施方案中，本文中提供的多肽的N端和/或C端区的氨基酸序列可以通过相对于野生型人¹⁰Fn3结构域(SEQ ID NO：1)的相应区域的氨基酸序列的缺失、取代或插入而予以修饰。¹⁰Fn3结构域通常以SEQ ID NO：1的氨基酸编号1开始。然而，本发明也涵盖具有氨基酸缺失的结构域。还可将另外的序列添加至具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的¹⁰Fn3结构域的N端或C端。例如，在一些实施方案中，N端延伸由选自下组的氨基酸序列组成：M、MG、和G。

在示例性实施方案中，可将长度为1-20、1-15、1-10、1-8、1-5、1-4、1-3、1-2、或1个氨基酸的替代N端区添加至SEQ ID NO：1的N端区。示例性替代N端区包括(由单字母氨基酸代码表示)M、MG、G、MGVSDVPRDL(SEQ ID NO：3)和GVSDVPRDL(SEQ ID NO：4)。其他合适的替代N端区包括，例如，X_nSDVPRDL(SEQ ID NO：5)、X_nDVPRDL(SEQ ID NO：6)、X_nVPRDL(SEQ IDNO：7)、X_nPRDL(SEQ ID NO：8)X_nRDL(SEQ ID NO：9)、X_nDL(SEQ ID NO：10)、或X_nL，其中n＝0、1或2个氨基酸，其中当n＝1时，X是Met或Gly，并且当n＝2时，X是Met-Gly。当Met-Gly序列被添加至¹⁰Fn3结构域的N端时，M常会被切割掉，在N端留下G。在某些实施方案中，替代的N端区包含氨基酸序列MASTSG(SEQ ID NO：11)。

在示例性实施方案中，可将具有1-20、1-15、1-10、1-8、1-5、1-4、1-3、1-2、或1个氨基酸长度的替代C端区添加至SEQ ID NO：1的C端区。替代C端区序列的具体实例包括，例如，包含EIEK(SEQ ID NO：12)、EGSGC(SEQ ID NO：13)、EIEKPCQ(SEQ ID NO：14)、EIEKPSQ(SEQID NO：15)、EIEKP(SEQ ID NO：16)、EIEKPS(SEQ ID NO：17)、或EIEKPC(SEQ ID NO：18)，或基本上由上述序列组成，或由上述序列组成的多肽。在一些实施方案中，替代C端区包含EIDK(SEQ ID NO：19)，并且在特定的实施方案中，替代C端区是EIDKPCQ(SEQ ID NO：20)或EIDKPSQ(SEQ ID NO：21)。另外的适合的替代C端区包括在表20和SEQ ID NO：210-220中示出的那些。

在某些实施方案中，C端延伸序列包含E和D残基，并且长度可以在8和50、10和30、10和20、5和10、以及2和4个氨基酸之间。在一些实施方案中，尾部序列包括基于ED的接头，其中该序列包含ED的串联重复。在示例性实施方案中，尾部序列包含2-10、2-7、2-5、3-10、3-7、3-5、3、4或5个ED重复。在某些实施方案中，基于ED的尾部序列还可包含另外的氨基酸残基，比如，EI、EID、ES、EC、EGS、和EGC。这样的序列部分地基于已知的Adnectin尾部序列，如EIDKPSQ(SEQ ID NO：21)，其中残基D和K已去除。在示例性实施方案中，基于ED的尾部在ED重复之前包含E、I或EI残基。

在某些实施方案中，替代C端部分--其可与本文中提供的任何Adnectin的C端氨基酸RT(即，SEQ ID NO：1的氨基酸93-94)连接——包含氨基酸P_mX_n，其中P是脯氨酸，X是任何氨基酸，m是至少为1的整数，并且n是0或至少为1的整数。在某些实施方案中，替代C端部分包含氨基酸PC。在某些实施方案中，替代C端部分包含氨基酸PI、PC、PID、PIE、PIDK(SEQ IDNO：221)、PIEK(SEQ ID NO：222)、PIDKP(SEQ ID NO：223)、PIEKP(SEQ ID NO：224)、PIDKPS(SEQ ID NO：225)、PIEKPS(SEQ ID NO：226)、PIDKPC(SEQ ID NO：227)、PIEKPC(SEQ ID NO：228)、PIDKPSQ(SEQ ID NO：229)、PIEKPSQ(SEQ ID NO：230)、PIDKPCQ(SEQ ID NO：231)、PIEKPCQ(SEQ ID NO：232)、PHHHHHH(SEQ ID NO：233)、和PCHHHHHH(SEQ ID NO：234)。

在某些实施方案中，基于纤连蛋白的支架蛋白包含具有替代N端区序列和替代C端区序列二者的¹⁰Fn3结构域。

B.具有经过修饰的南极环的血清白蛋白结合物

由于¹⁰Fn3结构域的尺寸小，约为10kDa，它们经由肾脏过滤和降解从循环中迅速清除(在小鼠中t_1/2＝15-45分钟；在猴子中为3小时)。在某些方面，本申请提供了与血清白蛋白例如人血清白蛋白(HSA)特异性结合的¹⁰Fn3结构域，其具有南极修饰，从而延长¹⁰Fn3结构域的t_1/2。

在人体中HSA具有600μM的血清浓度，t_1/2为19天。延长的HSA t_1/2部分归因于其经由新生儿Fc受体(FcRn)的再循环。在HSA经过内体摄取到内皮细胞中之后，其以pH依赖性方式结合FcRn；这种相互作用使HSA再循环回到血流中，由此使其回避溶酶体降解。FcRn广泛表达并且该再循环途径被认为是组成性的。在大多数细胞类型中，大部分FcRn驻留在细胞内分选内体中。HSA易于通过非特异性液相胞饮机制而被内化，并被FcRn挽救免于在溶酶体中降解。在内体中的酸性pH下，HSA对于FcRn的亲和力增加(在pH 6.0下为5μM)。一旦与FcRn结合，HSA就回避了溶酶体降解，被转胞吞到细胞表面，并在细胞表面上释放。

基于北极的血清白蛋白结合性Adnectin，在本文中称为“第一代”血清白蛋白结合性Adnectin，已描述于例如WO2011140086中。第一代基于北极的血清白蛋白结合性Adnectin(SABA)中的一些不与小鼠或大鼠血清白蛋白结合，对于跨物种的血清白蛋白不具备高亲和力，并且在多价基于¹⁰Fn3的平台中并不总是相容，为了在其基础上进行改进，开发了具有修饰的南极环的第二代基于南极的血清白蛋白结合性Adnectin(PKE2Adnectin)，如实施例中所述。

因此，在一方面，本发明提供了这样的¹⁰Fn3结构域，其具有：(i)相对于野生型人¹⁰Fn3结构域(SEQ ID NO：1)的相应环在选自AB、CD、和EF环的至少一个南极环的氨基酸序列中的修饰，其中¹⁰Fn3结构域与血清白蛋白(例如，人血清白蛋白)结合。修饰的南极环贡献于与相同靶标的结合。设想了经修饰的南极环的各种组合。例如，¹⁰Fn3可包含一个经修饰的南极环、两个经修饰的南极环，或甚至全部三个南极环均被修饰。在某些实施方案中，可以使一个或多个经修饰的南极环与一个或多个经修饰的北极环(即，BC、DE、和FG环中的一者或多者)结合。经修饰的环可在整个环上具有序列修饰或仅仅在环的一部分中具有序列修饰。另外，一个或多个经修饰的环可具有插入或缺失，使得该环的长度相对于野生型序列(即，SEQ ID NO：1)的相应环的长度是变化的。在某些实施方案中，在¹⁰Fn3结构域中的其他区域(即，除了南极环之外)，如β链、N端和/或C端区，也可以经历相对于野生型¹⁰Fn3结构域的序列修饰，并且这样的额外修饰也可有助于与靶标的结合。在某些实施方案中，南极环是唯一经修饰的结构域。在具体的实施方案中，CD环是唯一经修饰的结构域。在某些实施方案中，结合血清的¹⁰Fn3结构域可被修饰为包含N端延伸序列和/或C端延伸序列，如上文所述。

在一个实施方案中，本发明提供了与血清白蛋白结合的Adnectin，其相对于野生型人¹⁰Fn3结构域(例如，在SEQ ID NO：23-100、184-209和235-260中示出的¹⁰Fn3结构域)的相应环具有改变的CD环。在一些实施方案中，结合白蛋白的Adnectin包含，或者缺乏，6X组氨酸尾。在一些实施方案中，结合白蛋白的Adnectin对应于缺乏N端前导序列和C端尾的核心Adnectin，如SEQ ID NO：75-100中所示出的。

在示例性实施方案中，本文中描述的结合血清白蛋白的¹⁰Fn3蛋白以小于3μM、2.5μM、2μM、1.5μM、1μM、500nM、100nM、50nM、10nM、1nM、500pM、100pM、100pM、50pM、或10pM的K_D与人血清白蛋白结合。Kd可以，例如，处于0.1nM到50nM、0.1nM到100nM、0.1nM到1μM、0.5nM到50nM、0.5nM到100nM、0.5nM到1μM、1nM到50nM、1nM到100nM或1nM到1μM的范围。

在某些实施方案中，本文中描述的结合白蛋白的Adnectin(或¹⁰Fn3蛋白)还可以结合食蟹猴、恒河猴、大鼠、或小鼠中一者或多者的血清白蛋白。

在某些实施方案中，本文中描述的结合血清白蛋白的¹⁰Fn3蛋白以小于3μM、2.5μM、2μM、1.5μM、1μM、500nM、100nM、50nM、10nM、1nM、500pM、100pM或100pM的K_D与恒河猴血清白蛋白(RhSA)或食蟹猴血清白蛋白(CySA)结合。K_D可以，例如，处于0.1nM到50nM、0.1nM到100nM、0.1nM到1μM、0.5nM到50nM、0.5nM到100nM、0.5nM到1μM、1nM到50nM、1nM到100nM或1nM到1μM的范围。

在某些实施方案中，本文中描述的结合血清白蛋白的¹⁰Fn3蛋白以小于3μM、2.5μM、2μM、1.5μM、1μM、500nM、100nM、50nM、10nM、1nM、500pM、100pM或100pM的K_D与恒河猴血清白蛋白(RhSA)、食蟹猴血清白蛋白(CySA)、和小鼠血清白蛋白(MSA)结合。K_D可以，例如，处于0.1nM到50nM、0.1nM到100nM、0.1nM到1μM、0.5nM到50nM、0.5nM到100nM、0.5nM到1μM、1nM到50nM、1nM到100nM或1nM到1μM的范围。

在某些实施方案中，本文中描述的结合血清白蛋白的¹⁰Fn3蛋白以小于3μM、2.5μM、2μM、1.5μM、1μM、500nM、100nM、50nM、10nM、1nM、500pM、100pM或100pM的K_D与恒河猴血清白蛋白(RhSA)、食蟹猴血清白蛋白(CySA)、小鼠血清白蛋白(MSA)、和大鼠血清白蛋白(RSA)结合。K_D可以，例如，处于0.1nM到50nM、0.1nM到100nM、0.1nM到1μM、0.5nM到50nM、0.5nM到100nM、0.5nM到1μM、1nM到50nM、1nM到100nM或1nM到1μM的范围。

在某些实施方案中，本文中描述的结合白蛋白的Adnectin在5.5到7.4的pH范围与血清白蛋白结合。

在某些实施方案中，本文中描述的结合白蛋白的Adnectin与人血清白蛋白的结构域I-II结合。

在某些实施方案中，本发明的结合白蛋白的Adnectin的血清半衰期、或与异源部分(例如，第二Adnectin)连接的结合白蛋白的Adnectin的血清半衰期，为至少2小时、2.5小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、15小时、20小时、25小时、30小时、35小时、40小时、50小时、60小时、70小时、80小时、90小时、100小时、110小时、120小时、130小时、135小时、140小时、150小时、160小时、或200小时。在某些实施方案中，结合白蛋白的Adnectin的血清半衰期、或与异源部分(例如，第二Adnectin)连接的结合白蛋白的Adnectin的血清半衰期，为2-200小时、5-200小时、10-200小时、25-200小时、50-200小时、100-200小时、150-200小时、2-150小时、2-100小时、2-50小时、2-25小时、2-10小时、2-5小时、5-150小时、10-100小时、或25-50小时。

在某些实施方案中，结合白蛋白的Adnectin包含与野生型¹⁰Fn3结构域(SEQ IDNO：1)具有至少40％、50％、60％、70％、75％、80％或85％同一性的序列。在一个实施方案中，AB、CD、或EF环中的至少一者相对于野生型¹⁰Fn3结构域是修饰的。在某些实施方案中，AB、CD、或EF环中的至少两者经历相对于野生型¹⁰Fn3结构域是修饰的。在某些实施方案中，AB、CD、或EF环全部三者相对于野生型¹⁰Fn3结构域都是修饰的。在某些实施方案中，结合血清白蛋白的¹⁰Fn3结构域包含与SEQ ID NO：23-100、184-209和235-260的任一者具有至少40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。

在某些实施方案中，结合血清白蛋白的¹⁰Fn3结构域(或Adnectin)可包含如SEQ IDNO：2中示出的序列，其中该CD环以(X)_w表示，并且被来自26个核心PKE2Adnectin序列(即，SEQ ID NO：75-100)的任一者的CD环所替换。这样的结合白蛋白的Adnectin的支架区相对于SEQ ID NO：1的支架氨基酸残基可具有0到20、0到15、0到10、0到8、0到6、0到5、0到4、0到3、0到2、或0到1个取代、保守性取代、缺失或添加。只要结合白蛋白的Adnectin能够以期望的K_D结合血清白蛋白，例如HSA，就可以产生这样的支架修饰。

在一些实施方案中，可以根据共有序列来描述本发明的结合白蛋白的Adnectin的CD环区。

因此，在一些实施方案中，CD环由共有序列G-X₁-X₂-V-X₃-X₄-X₅-S-X₆-X₇-G-X₈-X₉-Y-X₁₀-X₁₁-X₁₂-E(SEQ ID NO：170)限定，其中

(a)X₁选自R或W；

(b)X₂选自H、E、D、Y、或Q；

(c)X₃选自Q或H；

(d)X₄选自I、K、M、Q、L、或V；

(e)X₅选自Y、F、或N；

(f)X₆选自D、V、或E；

(g)X₇选自L、W、或F；

(h)X₈选自P或T；

(i)X₉选自L或M；

(j)X₁₀选自I或V；

(k)X₁₁选自Y或F；并且

(l)X₁₂选自T、S、Q、N、或A。

在某些优选实施方案中，

(a)X₁是R；

(b)X₂是E；

(c)X₃是Q；

(d)X₄是K；

(e)X₅是Y；

(f)X₆是D；

(g)X₇是L或W；

(h)X₈是P；

(i)X₉是L；

(j)X₁₀是I；

(k)X₁₁是Y；并且

(l)X₁₂是Q或N。

在一个优选实施方案中，X₇是L并且X₁₂是Q。

在另一个优选实施方案中，X₇是W并且X₁₂是N。

在一些实施方案中，本发明的结合白蛋白的Adnectin包含CD环，所述CD环具有与SEQ ID NO：101-125中示出的CD环序列至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同，或有至多1、1-2或1-3个氨基酸差异(即，取代，例如，缺失、添加或保守性取代)的序列。这样的结合白蛋白的Adnectin的支架区相对于SEQ ID NO：1的支架氨基酸残基可包含0到20、0到15、0到10、0到8、0到6、0到5、0到4、0到3、0到2、或0到1个取代、保守性取代、缺失或添加。只要Adnectin能够以期望的K_D结合血清白蛋白，就可以产生这样的支架修饰。

在一个优选实施方案中，本发明的结合白蛋白的Adnectin的CD环包含选自下组的氨基酸序列：

GRHVQIYSDLGPLYIYTE(SEQ ID NO：101)、

GRHVHIYSDWGPMYIYTE(SEQ ID NO：102)、

GREVQKYSVLGPLYIYTE(SEQ ID NO：103)、

GREVQMYSDLGPLYVYSE(SEQ ID NO：104)、

GREVQKFSDWGPLYIYTE(SEQ ID NO：105)、

GREVQKYSDLGPLYIYQE(SEQ ID NO：106)、

GREVHQYSDWGPMYIYNE(SEQ ID NO：107)、

GREVHKNSDWGTLYIYTE(SEQ ID NO：108)、

GREVQKYSDLGPLYIYAE(SEQ ID NO：109)、

GREVHLYSDWGPMYIYTE(SEQ ID NO：110)、

GRHVQMYSDLGPLYIFSE(SEQ ID NO：111)、

GREVHMYSDFGPMYIYTE(SEQ ID NO：112)、

GREVQKYSDWGPLYIYNE(SEQ ID NO：113)、

GREVQMYSDLGPLYIYNE(SEQ ID NO：114)、

GREVQMYSDLGPLYIYTE(SEQ ID NO：115)、

GRHVQIYSDLGPLYIYNE(SEQ ID NO：116)、

GREVQIYSDWGPLYIYNE(SEQ ID NO：117)、

GREVQKYSDWGPLYIYQE(SEQ ID NO：118)、

GRHVHLYSEFGPMYIYNE(SEQ ID NO：119)、

GRDVHMYSDWGPMYIYQE(SEQ ID NO：120)、

GRHVQIYSDWGPLYIYNE(SEQ ID NO：121)、

GRYVQLYSDWGPMYIYTE(SEQ ID NO：122)、

GRQVQVFSDLGPLYIYNE(SEQ ID NO：123)、

GRQVQIYSDWGPLYIYNE(SEQ ID NO：124)、和

GRQVQMYSDWGPLYIYAE(SEQ ID NO：125)。

在一些实施方案中，结合白蛋白的Adnectin包含与SEQ ID NO：23-100、184-209和235-260的任一者至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同，或有至多1、1-2、1-3、1-5、1-10或1-20个氨基酸差异(例如，氨基酸缺失、添加或取代(例如，保守性取代))的氨基酸序列。在某些实施方案中，结合白蛋白的分子包含与SEQ ID NO：23-100、184-209和235-260的非CD环区至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。

在一个优选实施方案中，结合白蛋白的Adnectin包含在SEQ ID NO：29、55、81、190和241的任一者中示出的氨基酸序列。在另一个优选实施方案中，结合白蛋白的Adnectin包含在SEQ ID NO：36、62、88、197和248的任一者中示出的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供了具有在特定位置导入半胱氨酸残基的突变的结合白蛋白的Adnectin分子。示例性的半胱氨酸突变有A12C、A26C、S55C、T56C和T58C(参见实施例中的表7)。在一个优选实施方案中，半胱氨酸突变不实质改变结合白蛋白的Adnectin与血清白蛋白的结合。

在某些实施方案中，¹⁰Fn3结构域的C端导入了脯氨酸残基，例如，如SEQ ID NO：184-209和235-260中所示。在某些实施方案中，串联的结合白蛋白的Adnectin的C端导入脯氨酸残基，例如，如SEQ ID NO：168和261中所示。脯氨酸残基的添加并不阻碍在结合白蛋白的Adnectin或串联的结合白蛋白的Adnectin的C端添加另外的氨基酸序列。

C.交叉竞争性Adnectin和/或与相同Adnectin结合位点结合的Adnectin

本文中提供了与本文中描述的特定PKE2Adnectin竞争(例如，交叉竞争)结合血清白蛋白(例如，HSA)的蛋白质，诸如Adnectin、抗体或其抗原结合片段、小分子、肽、等等之类。这样的竞争蛋白，例如Adnectin，可以基于其在标准血清白蛋白结合测定中竞争性抑制本文中描述的Adnectin与血清白蛋白(例如，HSA)结合的能力加以鉴定。例如，可以使用标准ELISA测定，其中重组血清白蛋白蛋白被固定在平板上，其中一种蛋白进行了荧光标记，并评估未标记蛋白竞争掉标记蛋白的结合的能力。

下述的示例性竞争测定是在Adnectin与本文描述的PKE2蛋白之一竞争结合血清白蛋白的背景下提供的。同样的测定在测试非Adnectin蛋白的竞争的情况下也可用。在一个实施方案中，可进行竞争形式的ELISA来确定两种血清白蛋白Adnectin是否结合血清白蛋白(例如，HSA)上的重叠的Adnectin结合位点(表位)。在一种形式中，Adnectin#1被包被在平板上，然后将其封闭和洗涤。向这个平板添加单独的血清白蛋白、或添加用饱和浓度的Adnectin#2预温育的血清白蛋白。在适当温育期之后，洗涤平板并用多克隆抗血清白蛋白抗体探测，然后用链霉亲和素-HRP偶联物和标准四甲基联苯胺显影程序进行检测。如果用或不用Adnectin#2预温育的OD信号相同，则这两种Adnectin的结合彼此独立，且它们的Adnectin结合位点不重叠。但是如果接受血清白蛋白/Adnectin#2混合物的孔的OD信号低于仅接受血清白蛋白的那些孔，则确认Adnectin#2的结合阻断了Adnectin#1与血清白蛋白的结合。

或者，通过表面等离子体共振(SPR，例如，BIAcore)进行类似的实验。将Adnectin#1固定在SPR芯片表面上，随后注射单独的血清白蛋白或用饱和浓度的Adnectin#2预温育的血清白蛋白。如果血清白蛋白/Adnectin#2混合物的结合信号与单独的血清白蛋白相同或更高，则这两种Adnectin的结合彼此独立，且它们的Adnectin结合位点不重叠。然而，如果对于血清白蛋白/Adnectin#2混合物的结合信号低于单独的血清白蛋白的结合信号，则Adnectin#2的结合被确认为阻断了Adnectin#1与血清白蛋白的结合。这些实验的一个特征是使用饱和浓度的Adnectin#2。如果血清白蛋白未用Adnectin#2饱和，则以上结论不成立。可以使用类似的实验来确定任何两种结合血清白蛋白的蛋白质是否与重叠的Adnectin结合位点结合。

上文例示的两种测定也可以相反的顺序进行，此时Adnectin#2被固定，而血清白蛋白-Adnectin#1被添加至平板。或者，可用单克隆抗体和/或可溶性受体-Fc融合蛋白替换Adnectin#1和/或#2。

在某些实施方案中，可使用HTRF夹心测定来确定竞争。

在某些实施方案中，竞争性Adnectin是这样的Adnectin，其与本文中描述的特定PKE2Adnectin结合血清白蛋白上的相同Adnectin结合位点。可以使用标准定位技术，如蛋白酶定位、突变分析、X射线结晶学和2维核磁共振来确定Adnectin是否与参考Adnectin结合相同的Adnectin结合位点(参见，例如，Epitope Mapping Protocols in Methods inMolecular Biology，Vol.66，G.E.Morris编辑(1996))。

竞争性的结合白蛋白的候选蛋白质，例如，Adnectin，可将本发明的PKE2Adnectin与血清白蛋白(例如，HSA)的结合抑制至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、或至少99％。可使用上文描述的方法确定竞争的％。

D.多价/串联Adnectin

本文中提供了包含两个或更多个与靶标特异性结合的¹⁰Fn3结构域(Adnectin)的多价蛋白。例如，多价蛋白可包含共价连接的2、3或更多个¹⁰Fn3结构域。在示例性实施方案中，多价蛋白是包含两个¹⁰Fn3结构域的双特异性或二聚体蛋白。在某些实施方案中，多价蛋白包含与血清白蛋白(例如，人血清白蛋白)结合的第一¹⁰Fn3结构域和与第二靶分子(例如，PCSK9)结合的第二¹⁰Fn3结构域。当第一和第二靶分子是血清白蛋白时，第一和第二¹⁰Fn3结构域可与相同或不同的表位结合。另外，当第一和第二靶分子相同时，在¹⁰Fn3结构域中的与靶结合相关的修饰区可以相同或不同。在示例性实施方案中，基于多价纤连蛋白的蛋白支架的每个¹⁰Fn3结构域以小于500nM、100nM、50nM、1nM、500pM、100pM或更小的K_D与期望靶标结合。在一些实施方案中，基于多价纤连蛋白的蛋白支架的每个¹⁰Fn3结构域以1pM和1μM之间、100pM和500nM之间、1nM和500nM之间、或1nM和100nM之间的K_D与期望靶标结合。在示例性实施方案中，基于多价纤连蛋白的蛋白支架的每个¹⁰Fn3结构域与不被野生型¹⁰Fn3结构域(特别是野生型人¹⁰Fn3结构域)结合的靶标特异性地结合。

基于多价纤连蛋白的支架蛋白中的¹⁰Fn3结构域可经由多肽接头连接。示例性的多肽接头包括具有1-20、1-15、1-10、1-8、1-5、1-4、1-3、或1-2个氨基酸的多肽。合适的用于连接¹⁰Fn3结构域的接头容许各个结构域彼此独立折叠，形成容许与靶分子高亲和力结合的三维结构。合适的接头的具体实例包括基于甘氨酸-丝氨酸的接头、基于甘氨酸-脯氨酸的接头、基于脯氨酸-丙氨酸的接头、以及具有氨基酸序列PSTPPTPSPSTPPTPSPS(SEQ ID NO：152)的接头。在一些实施方案中，所述接头是基于甘氨酸-丝氨酸的接头。在一些实施方案中，所述接头是基于甘氨酸-丝氨酸的接头。这些接头包含甘氨酸和丝氨酸残基并且长度可以在8和50、10和30、以及10和20个氨基酸之间。实例包括具有氨基酸序列(GS)₇(SEQ IDNO：153)、G(GS)₆(SEQ ID NO：154)、和G(GS)₇G(SEQ ID NO：155)的接头。其他接头含有谷氨酸并且包括例如(GSE)₅(SEQ ID NO：156)和GGSEGGSE(SEQ ID NO：157)。其他示例性甘氨酸-丝氨酸接头包括(GS)₄(SEQ ID NO：158)、(GGGGS)₇(SEQ ID NO：159)、(GGGGS)₅(SEQ IDNO：160)、和(GGGGS)₃G(SEQ ID NO：161)。在一些实施方案中，所述接头为基于甘氨酸-脯氨酸的接头。这些接头包含甘氨酸和脯氨酸残基，且长度可以在3和30、10和30、以及3和20个氨基酸之间。实例包括具有氨基酸序列(GP)₃G(SEQ ID NO：162)、(GP)₅G(SEQ ID NO：163)、和GPG的接头。在某些实施方案中，所述接头可以是具有3和30、10和30、以及3和20个氨基酸之间的长度的基于脯氨酸-丙氨酸的接头。基于脯氨酸丙氨酸的接头的实例包括例如(PA)₃(SEQ ID NO：164)、(PA)₆(SEQ ID NO：165)和(PA)₉(SEQ ID NO：166)。可以想见，最佳的接头长度和氨基酸组成可通过本领域熟知的方法经由常规实验来确定。在示例性实施方案中，接头不含任何Asp-Lys(DK)对。

在某些实施方案中，接头具有氨基酸序列PSPEPPTPEP(SEQ ID NO：173)、PSPEPPTPEPPSPEPPTPEP(SEQ ID NO：174)、PSPEPPTPEPPSPEPPTPEPPSPEPPTPEP(SEQ ID NO：175)、或PSPEPPTPEPPSPEPPTPEPPSPEPPTPEPPSPEPPTPEP(SEQ ID NO：176)。通常，接头可包含氨基酸序列(PSPEPPTPEP)_n(SEQ ID NO：262)，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、1-5或1-10。在某些实施方案中，接头具有氨基酸序列EEEEDE(SEQ ID NO：177)、EEEEDEEEEDE(SEQID NO：178)、EEEEDEEEEDEEEEDEEEEDE(SEQ ID NO：179)、EEEEDEEEEDEEEEDEEEEDEEEEDEEEEDE(SEQ ID NO：180)。通常，接头可包含序列(EEEEDE)_nE(SEQ ID NO：263)，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、1-5或1-10。在某些实施方案中，接头具有氨基酸序列RGGEEKKKEKEKEEQEERETKTP(SEQ ID NO：181)。这样的接头可用于将结合白蛋白的Adnectin与另一种多肽(例如，另一种Adnectin)连接。下文示出了PSPEPPTPEP(SEQ IDNO：173)接头的示例性用途。

与C端多肽连接的N端Adnectin：

...NYRTPGPSPEPPTPEP-多肽(SEQ ID NO：182)

与C端Adnectin连接的N端多肽：

多肽-PSPEPPTPEPGVSDV...(SEQ ID NO：183)

在一些实施方案中，多价Adnectin为包含与血清白蛋白(例如，PKE2 Adnectin)结合的第一¹⁰Fn3结构域、和与特异性靶标结合的第二¹⁰Fn3结构域的串联Adnectin。串联Adnectin可具有结合白蛋白的Adnectin-X和结合X-白蛋白的Adnectin的构型，其中X为靶特异性¹⁰Fn3结构域。技术人员熟悉测试这样的串联Adnectin分子的功能活性和评估其生物物理学性质的方法。

在一方面，本发明提供了包含第一纤连蛋白III型第十(¹⁰Fn3)结构域和第二¹⁰Fn3结构域的融合多肽，其中第一¹⁰Fn3结构域包含：a)AB、BC、CD、DE、EF、和FG环，b)具有相对于人¹⁰Fn3结构域的相应CD环序列改变的氨基酸序列的CD环，并且c)其中该多肽以小于500nM的K_D与人血清白蛋白结合。“第一”结构域和第二“结构域”可处于N到C端或C到N端的取向。

在一些实施方案中，例如，在多价Adnectin的实施方案中，第一¹⁰Fn3结构域包含与SEQ ID NO：23-100、184-209和235-260的任一者至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同，或与之有至多1、1-2、1-5、1-10或1-20个氨基酸差异(例如，氨基酸缺失、添加或取代(例如，保守性氨基酸取代))的氨基酸序列。

在一些实施方案中，第一¹⁰Fn3结构域包含SEQ ID NO：23-100、184-209和235-260的任一者的氨基酸序列。

在一个优选实施方案中，第一¹⁰Fn3结构域包含SEQ ID NO：29、55、81、190或241的氨基酸序列。在另一个优选实施方案中，第一¹⁰Fn3结构域包含SEQ ID NO：36、62、88、197或248的氨基酸序列。

在一些实施方案中，多价Adnectin包含第二¹⁰Fn3结构域，其为特异性结合血清白蛋白之外的靶蛋白的¹⁰Fn3结构域。

在一个优选实施方案中，第二¹⁰Fn3结构域与PCSK9特异性地结合。

因此，在一个实施方案中，第二¹⁰Fn3结构域包含与SEQ ID NO：168或261至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同，或与之有至多1、1-2、1-5、1-10或1-20个氨基酸差异(例如，氨基酸缺失、添加或取代(例如，保守性氨基酸取代))的氨基酸序列。另外的与PCSK9结合的合适¹⁰Fn3结构域公开于例如WO2011/130354中，其内容通过提述并入本文。

在一个实施方案中，第二¹⁰Fn3结构域具有在SEQ ID NO：168或261中示出的氨基酸序列。

在某些实施方案中，本发明提供了包含在SEQ ID NO：168或261中示出的氨基酸序列的结合PCSK9-血清白蛋白的串联Adnectin、以及具有与SEQ ID NO：168或261至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同或与之至多有1、1-2、1-5、1-10或1-20个氨基酸差异(例如，氨基酸缺失、添加或取代(例如，保守性氨基酸取代))的氨基酸序列的PCSK9-血清白蛋白串联Adnectin，其中该串联Adnectin保留与PCSK9和血清白蛋白的结合。

在一个实施方案中，本发明提供了编码结合PCSK9-血清白蛋白的串联Adnectin的核酸，其具有SEQ ID NO：172中示出的核酸序列；以及与SEQ ID NO：172至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核酸序列，其中编码的结合PCSK9-血清白蛋白的串联Adnectin保留与PCSK9和血清白蛋白结合。在一些实施方案中，核苷酸取代不改变生成的翻译氨基酸序列(即，沉默突变)。

在一方面，本文中描述的基于结合血清白蛋白的串联Adnectin(例如，PCSK9-PKE2串联Adnectin)以小于3μM、2.5μM、2μM、1.5μM、1μM、500nM、100nM、50nM、10nM、1nM、500pM、100pM、100pM、50pM、或10pM的K_D与人血清白蛋白结合。K_D可以，例如，处于0.1nM到50nM、0.1nM到100nM、0.1nM到1μM、0.5nM到50nM、0.5nM到100nM、0.5nM到1μM、1nM到50nM、1nM到100nM或1nM到1μM的范围。

在某些实施方案中，本文中描述的基于结合血清白蛋白的串联Adnectin(例如，PCSK9-PKE2串联Adnectin)还可以结合食蟹猴、恒河猴、大鼠、或小鼠中一者或多者的血清白蛋白。

在某些实施方案中，本文中描述的基于结合血清白蛋白的串联Adnectin(例如，PCSK9-PKE2串联Adnectin)以小于3μM、2.5μM、2μM、1.5μM、1μM、500nM、100nM、50nM、10nM、1nM、500pM、100pM或100pM的K_D与恒河猴血清白蛋白(RhSA)或食蟹猴血清白蛋白(CySA)结合。K_D可以，例如，处于0.1nM到50nM、0.1nM到100nM、0.1nM到1μM、0.5nM到50nM、0.5nM到100nM、0.5nM到1μM、1nM到50nM、1nM到100nM或1nM到1μM的范围。

在某些实施方案中，本文中描述的基于结合血清白蛋白的串联Adnectin(例如，PCSK9-PKE2串联Adnectin)以小于3μM、2.5μM、2μM、1.5μM、1μM、500nM、100nM、50nM、10nM、1nM、500pM、100pM或100pM的K_D与恒河猴血清白蛋白(RhSA)、食蟹猴血清白蛋白(CySA)、和小鼠血清白蛋白(MSA)结合。K_D可以，例如，处于0.1nM到50nM、0.1nM到100nM、0.1nM到1μM、0.5nM到50nM、0.5nM到100nM、0.5nM到1μM、1nM到50nM、1nM到100nM或1nM到1μM的范围。

在某些实施方案中，本文中描述的基于结合血清白蛋白的串联Adnectin(例如，PCSK9-PKE2串联Adnectin)以小于3μM、2.5μM、2μM、1.5μM、1μM、500nM、100nM、50nM、10nM、1nM、500pM、100pM或100pM的K_D与恒河猴血清白蛋白(RhSA)、食蟹猴血清白蛋白(CySA)、小鼠血清白蛋白(MSA)、和大鼠血清白蛋白(RSA)结合。K_D可以，例如，处于0.1nM到50nM、0.1nM到100nM、0.1nM到1μM、0.5nM到50nM、0.5nM到100nM、0.5nM到1μM、1nM到50nM、1nM到100nM或1nM到1μM的范围。

在某些实施方案中，本文中描述的基于结合血清白蛋白的串联Adnectin(例如，PCSK9-PKE2串联Adnectin)与在5.5到7.4的pH范围与血清白蛋白结合。

在某些实施方案中，本文中描述的基于结合血清白蛋白的串联Adnectin(例如，PCSK9-PKE2串联Adnectin)与人血清白蛋白的结构域I-II结合。

在某些实施方案中，本文中描述的基于结合血清白蛋白的串联Adnectin(例如，PCSK9-PKE2串联Adnectin)在人血清白蛋白、食蟹猴血清白蛋白、恒河猴血清白蛋白、小鼠血清白蛋白、和/或大鼠血清白蛋白的存在下具有至少1小时、2小时、5小时、10小时、20小时、30小时、40小时、50小时、60小时、70小时、80小时、90小时、100小时、150小时、200小时、或至少约300小时的血清半衰期。在某些实施方案中，本文中描述的基于结合血清白蛋白的串联Adnectin(例如，PCSK9-PKE2串联Adnectin)在人血清白蛋白、食蟹猴血清白蛋白、恒河猴血清白蛋白、小鼠血清白蛋白、和/或大鼠血清白蛋白的存在下具有例如1-300小时，如1-250小时、1-200小时、1-150小时、1-100小时、1-90小时、1-80小时、1-70小时、1-60小时、1-50小时、1-40小时、1-30小时、1-20小时、1-10小时、1-5小时、5-300小时、10-300小时、20-300小时、30-300小时、40-300小时、50-300小时、60-300小时、70-300小时、80-300小时、90-300小时、100-300小时、150-300小时、200-300小时、250-300小时、5-250小时、10-200小时、50-150小时、或80-120小时的血清半衰期。

在某些实施方案中，基于血清白蛋白的串联Adnectin中的伴侣Adnectin(例如，在PCSK9-PKE2串联Adnectin情况下，为PCSK9 Adnectin)的血清半衰期相对于伴侣Adnectin在不与血清白蛋白结合性Adnectin偶联时的血清半衰期增加。在某些实施方案中，相对于伴侣Adnectin在不与血清白蛋白结合性Adnectin融合时的血清半衰期，基于血清白蛋白的串联Adnectin的血清半衰期至少长20％、40％、60％、80％、100％、120％、150％、180％、200％、400％、600％、800％、1000％、1200％、1500％、1800％、1900％、2000％、2500％、或3000％。在某些实施方案中，相对于伴侣Adnectin在不与血清白蛋白结合性Adnectin融合时的血清半衰期，基于血清白蛋白的串联Adnectin的血清半衰期长20-3000％，如40-3000％、60-3000％、80-3000％、100-3000％、120-3000％、150-3000％、180-3000％、200-3000％、400-3000％、600-3000％、800-3000％、1000-3000％、1200-3000％、1500-3000％、1800-3000％、1900-3000％、2000-3000％、2500-3000％、20-2500％、20-2000％、20-1900％、20-1800％、20-1500％、20-1200％、20-1000％、20-800％、20-600％、20-400％、20-200％、20-180％、20-150％、20-120％、20-100％、20-80％、20-60％、20-40％、50-2500％、100-2000％、150-1500％、200-1000％、400-800％、或500-700％。在某些实施方案中，相比于伴侣Adnectin在不与血清白蛋白结合性Adnectin融合时的血清半衰期，基于结合血清白蛋白的串联Adnectin的血清半衰期至少为1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、10倍、12倍、13倍、15倍、17倍、20倍、22倍、25倍、27倍、30倍、35倍、40倍、或50倍。在某些实施方案中，相比于伴侣Adnectin在不与血清白蛋白结合性Adnectin融合时的血清半衰期，基于结合血清白蛋白的串联Adnectin的血清半衰期为1.5-50倍，如1.5-40倍、1.5-35倍、1.5-30倍、1.5-27倍、1.5-25倍、1.5-22倍、1.5-20倍、1.5-17倍、1.5-15倍、1.5-13倍、1.5-12倍、1.5-10倍、1.5-9倍、1.5-8倍、1.5-7倍、1.5-6倍、1.5-5倍、1.5-4.5倍、1.5-4倍、1.5-3.5倍、1.5-3倍、1.5-2.5倍、1.5-2倍、2-50倍、2.5-50倍、3-50倍、3.5-50倍、4-50倍、4.5-50倍、5-50倍、6-50倍、7-50倍、8-50倍、10-50倍、12-50倍、13-50倍、15-50倍、17-50倍、20-50倍、22-50倍、25-50倍、27-50倍、30-50倍、40-50倍、2-40倍、5-35倍、10-20倍、或10-15倍。在某些实施方案中，基于结合血清白蛋白的串联Adnectin的血清半衰期为至少2小时、2.5小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、15小时、20小时、25小时、30小时、35小时、40小时、50小时、60小时、70小时、80小时、90小时、100小时、110小时、120小时、130小时、135小时、140小时、150小时、160小时、或200小时。在某些实施方案中，基于结合血清白蛋白的串联Adnectin的血清半衰期为2-200小时、2.5-200小时、3-200小时、4-200小时、5-200小时、6-200小时、7-200小时、8-200小时、9-200小时、10-200小时、15-200小时、20-200小时、25-200小时、30-200小时、35-200小时、40-200小时、50-200小时、60-200小时、70-200小时、80-200小时、90-200小时、100-200小时、125-200小时、150-200小时、175-200小时、190-200小时、2-190小时、2-175小时、2-150小时、2-125小时、2-100小时、2-90小时、2-80小时、2-70小时、2-60小时、2-50小时、2-40小时、2-35小时、2-30小时、2-25小时、2-20小时、2-15小时、2-10小时、2-9小时、2-8小时、2-7小时、2-6小时、2-5小时、2-4小时、2-3小时、5-175小时、10-150小时、15-125小时、20-100小时、25-75小时、或30-60小时。

E.血清白蛋白结合性Adnectin的偶联物

本发明的某些方面提供了偶联物，所述偶联物包含血清白蛋白结合性Adnectin和至少一个另外的部分(例如，治疗部分)。该另外的部分可以用于诊断、成像、或治疗目的。

在一些实施方案中，血清白蛋白结合性Adnectin与第二部分融合，所述第二部分是有机小分子、核酸、肽、或蛋白质。在一些实施方案中，血清白蛋白结合性Adnectin与靶向受体、受体配体、病毒外壳蛋白、免疫系统蛋白、激素、酶、抗原、或细胞信号蛋白的治疗部分融合。融合物可以通过使第二部分附接至血清白蛋白结合性Adnectin的任一端而形成，即如下的安排：血清白蛋白结合性Adnectin-治疗分子，或治疗分子-血清白蛋白结合性Adnectin。

在某些实施方案中，与血清白蛋白结合性Adnectin融合的部分的血清半衰期相对于该部分在不与血清白蛋白结合性Adnectin偶联时的血清半衰期增加。在某些实施方案中，血清白蛋白结合性Adnectin融合物的血清半衰期比该部分在不与血清白蛋白结合性Adnectin融合时的血清半衰期至少长20％、40％、60％、80％、100％、120％、150％、180％、200％、400％、600％、800％、1000％、1200％、1500％、1800％、1900％、2000％、2500％、或3000％。在某些实施方案中，基于结合血清白蛋白的串联Adnectin融合物的血清半衰期比该部分在不与血清白蛋白结合性Adnectin融合时的血清半衰期长20-3000％，如40-3000％、60-3000％、80-3000％、100-3000％、120-3000％、150-3000％、180-3000％、200-3000％、400-3000％、600-3000％、800-3000％、1000-3000％、1200-3000％、1500-3000％、1800-3000％、1900-3000％、2000-3000％、2500-3000％、20-2500％、20-2000％、20-1900％、20-1800％、20-1500％、20-1200％、20-1000％、20-800％、20-600％、20-400％、20-200％、20-180％、20-150％、20-120％、20-100％、20-80％、20-60％、20-40％、50-2500％、100-2000％、150-1500％、200-1000％、400-800％、或500-700％。在某些实施方案中，PKE2Adnectin融合物的血清半衰期至少是该部分在不与血清白蛋白结合性Adnectin融合时的血清半衰期的1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、10倍、12倍、13倍、15倍、17倍、20倍、22倍、25倍、27倍、30倍、35倍、40倍、或50倍。在某些实施方案中，PKE2Adnectin融合物的血清半衰期是该部分在不与血清白蛋白结合性Adnectin融合时的血清半衰期的1.5-50倍，如1.5-40倍、1.5-35倍、1.5-30倍、1.5-27倍、1.5-25倍、1.5-22倍、1.5-20倍、1.5-17倍、1.5-15倍、1.5-13倍、1.5-12倍、1.5-10倍、1.5-9倍、1.5-8倍、1.5-7倍、1.5-6倍、1.5-5倍、1.5-4.5倍、1.5-4倍、1.5-3.5倍、1.5-3倍、1.5-2.5倍、1.5-2倍、2-50倍、2.5-50倍、3-50倍、3.5-50倍、4-50倍、4.5-50倍、5-50倍、6-50倍、7-50倍、8-50倍、10-50倍、12-50倍、13-50倍、15-50倍、17-50倍、20-50倍、22-50倍、25-50倍、27-50倍、30-50倍、40-50倍、2-40倍、5-35倍、10-20倍、或10-15倍。在一些实施方案中，血清白蛋白结合性Adnectin融合物的血清半衰期为至少2小时、2.5小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、15小时、20小时、25小时、30小时、35小时、40小时、50小时、60小时、70小时、80小时、90小时、100小时、110小时、120小时、130小时、135小时、140小时、150小时、160小时、或200小时。在某些实施方案中，血清白蛋白结合性Adnectin融合物的血清半衰期为2-200小时、2.5-200小时、3-200小时、4-200小时、5-200小时、6-200小时、7-200小时、8-200小时、9-200小时、10-200小时、15-200小时、20-200小时、25-200小时、30-200小时、35-200小时、40-200小时、50-200小时、60-200小时、70-200小时、80-200小时、90-200小时、100-200小时、125-200小时、150-200小时、175-200小时、190-200小时、2-190小时、2-175小时、2-150小时、2-125小时、2-100小时、2-90小时、2-80小时、2-70小时、2-60小时、2-50小时、2-40小时、2-35小时、2-30小时、2-25小时、2-20小时、2-15小时、2-10小时、2-9小时、2-8小时、2-7小时、2-6小时、2-5小时、2-4小时、2-3小时、5-175小时、10-150小时、15-125小时、20-100小时、25-75小时、或30-60小时。

在某些实施方案中，血清白蛋白结合性Adnectin融合蛋白以小于3μM、2.5μM、2μM、1.5μM、1μM、500nM、100nM、50nM、10nM、1nM、500pM、100pM、100pM、50pM、或10pM的K_D与HSA结合。K_D可以，例如，处于0.1nM到50nM、0.1nM到100nM、0.1nM到1μM、0.5nM到50nM、0.5nM到100nM、0.5nM到1μM、1nM到50nM、1nM到100nM或1nM到1μM的范围。

在一些实施方案中，治疗部分可直接地或经由聚合接头间接地与血清白蛋白结合性Adnectin连接，如本文中所述。聚合接头可用于最佳地改变融合物各个组分之间的距离，以产生具有下列一个或多个特征的蛋白融合物：1)当与感兴趣蛋白结合时，的结合一个或多个蛋白质结构域的空间位阻减少或增加；2)增加的蛋白质稳定性或溶解度、3)减少的蛋白质聚集、和4)增加的蛋白质总亲合力或亲和力。

在一些实施方案中，本文中描述的融合物经由多肽接头与血清白蛋白结合性Adnectin连接，所述多肽接头具有可被血液或靶组织中的蛋白酶切割的蛋白酶位点。这样的实施方案可用于释放治疗性蛋白，以实现更好的递送或治疗特性或更高效的生产。

可在¹⁰Fn3结构域的C端导入另外的接头或间隔物，使其位于¹⁰Fn3结构域和多肽接头之间。

在一些实施方案中，治疗部分介由生物相容性聚合物(如聚合糖)与血清白蛋白结合性Adnectin连接。聚合糖可包括能被血液或靶组织中的酶切割的酶切割位点。这样的实施方案可用于释放治疗性蛋白，以实现更好的递送或治疗特性或更高效的生产。

本文中描述的血清白蛋白结合性Adnectin融合分子可用于通过在治疗部分和血清白蛋白结合性Adnectin之间形成融合来增加治疗部分的半衰期。这样的融合分子可用于治疗能响应融合物中包含的治疗部分的生物活性的病症。本发明设想了结合血清白蛋白的Fn3融合分子在由以下蛋白质或分子的任一者的失调引起的疾病中的用途。

在示例性实施方案中，与血清白蛋白结合性Adnectin连接(C端或N端)的治疗部分是VEGF、VEGF-R1、VEGF-R2、VEGF-R3、Her-1、Her-2、Her-3、EGF-I、EGF-2、EGF-3、A3、cMet、ICOS、CD40L、LFA-I、c-Met、ICOS、LFA-I、IL-6、B7.1、W1.2、OX40、IL-1b、TACI、IgE、BAFF或BLys、TPO-R、CD19、CD20、CD22、CD33、CD28、IL-I-R1、TNF-α、TRAIL-R1、补体受体1、FGFa、骨桥蛋白、玻连蛋白、肝配蛋白A1-A5、肝配蛋白B1-B3、α-2-巨球蛋白、CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CXCL16、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、PDGF、TGFb、GMCSF、SCF、p40(IL12/IL23)、IL1b、IL1a、IL1ra、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL8、IL10、IL12、IL15、IL23、Fas、FasL、Flt3配体、41BB、ACE、ACE-2、KGF、FGF-7、SCF、神经导向因子1，2、IFNa，b，g、半胱天冬酶-2，3，7，8，10、ADAM S1，S5，8，9，15，TS1，TS5；脂连素、ALCAM、ALK-I、APRIL、膜联蛋白V、血管生成素、双调蛋白、血管生成素-1，2，4、B7-1/CD80、B7-2/CD86、B7-H1、B7-H2、B7-H3、Bcl-2、BACE-I、BAK、BCAM、BDNF、bNGF、bECGF、BMP2，3，4，5，6，7，8；CRP、钙粘蛋白6、8、11；组织蛋白酶A，B，C，D，E，L，S，V，X；CD1 1a/LFA-1、LFA-3、GP2b3a、GH受体、RSV F蛋白、IL-23(p40、p19)、IL-12、CD80、CD86、CD28、CTLA-4、α4-β1、α4-β7、TNF/淋巴毒素、IgE、CD3、CD20、IL-6、IL-6R、BLYS/BAFF、IL-2R、HER2、EGFR、CD33、CD52、地高辛、Rho(D)、水痘(Varicella)、肝炎(Hepatitis)、CMV、破伤风(Tetanus)、牛痘(Vaccinia)、抗蛇毒血清、肉毒毒素、Trail-R1、Trail-R2、cMet、TNF-R家族，如LA NGF-R、CD27、CD30、CD40、CD95、淋巴毒素a/b受体、WsI-I、TL1A/TNFSF15、BAFF、BAFF-R/TNFRSF13C、TRAIL R2/TNFRSF10B、TRAIL R2/TNFRSF10B、Fas/TNFRSF6 CD27/TNFRSF7、DR3/TNFRSF25、HVEM/TNFRSF14、TROY/TNFRSF19、CD40配体/TNFSF5、BCMA/TNFRSF17、CD30/TNFRSF8、LIGHT/TNFSF14、4-1BB/TNFRSF9、CD40/TNFRSF5、GITR/[γ]NFRSF 18、骨保护素/TNFRSF1 IB、RANK/TNFRSF1 IA、TRAIL R3/TNFRSF10C、TRAIL/TNFSFIO、TRANCE/RANK L/TNFSF11、4-1BB配体/TNFSF9、TWEAK/TNFSF12、CD40配体/TNFSFS、Fas配体/TNFSF6、RELT/TNFRSF19L、APRIL/TNFSF13、DcR3/TNFRSF6B、TNF RI/TNFRSFIA、TRAIL R1/TNFRSFIOA、TRAIL R4/TNFRSF10D、CD30配体/TNFSF8、GITR配体/TNFSF18、TNFSF18、TACI/TNFRSF13B、NGF R/TNFRSF16、OX40配体/TNFSF4、TRAIL R2/TNFRSF10B、TRAIL R3/TNFRSF10C、TWEAK R/TNFRSF12、BAFF/BLyS/TNFSF13、DR6/TNFRSF21、TNF-α/TNFSF1 A、Pro-TNF-α/TNFSF1A、淋巴毒素βR/TNFRSF3、淋巴毒素βR(LTbR)/Fc嵌合体、TNF RI/TNFRSFIA、TNF-β/TNFSF1B、PGRP-S、TNF RI/TNFRSFIA、TNF RII/TNFRSFIB、EDA-A2、TNF-α/TNFSFIA、EDAR、XEDAR、TNF RI/TNFRSFIA。

在示例性实施方案中，与血清白蛋白结合性Adnectin连接(C端或N端)的治疗部分是任何下列蛋白质或与其结合的蛋白质：4EBP1、14-3-3ζ、53BP1、2B4/SLAMF4、CCL21/6Ckine、4-1BB/TNFRSF9、8D6A、4-1BB配体/TNFSF9、8-氧代-dG、4-氨基-1，8-萘二甲酰亚胺、A2B5、氨肽酶LRAP/ERAP2、A33、氨肽酶N/ANPEP、Aag、氨肽酶P2/XPNPEP2、ABCG2、氨肽酶P1/XPNPEP1、ACE、氨肽酶PILS/ARTS1、ACE-2、无羊膜蛋白、肌动蛋白、双调蛋白、β-肌动蛋白、AMPKα1/2、激活素A、AMPKα1、激活素AB、AMPKα2、激活素B、AMPKβ1、激活素C、AMPKβ2、激活素RIA/ALK-2、雄激素R/NR3C4、激活素RIB/ALK-4、血管生成素、激活素RIIA、血管生成素-1、激活素RIIB、血管生成素-2、ADAMS、血管生成素-3、ADAM9、血管生成素-4、ADAM1O、血管生成素样1、ADAM12、血管生成素样2、ADAM15、血管生成素样3、TACE/ADAM17、血管生成素样4、ADAM19、血管生成素样7/CDT6、ADAM33、血管抑素、ADAMTS4、膜联蛋白A1/膜联蛋白I、ADAMTS5、膜联蛋白A7、ADAMTS1、膜联蛋白A10、ADAMTSL-1/Punctin、膜联蛋白V、脂联素/Acrp30、ANP、AEBSF、AP位点、可聚蛋白聚糖、APAF-I、聚集蛋白、APC、AgRP、APE、AGTR-2、APJ、AIF、APLP-I、Akt、APLP-2、Akt1、载脂蛋白AI、Akt2、载脂蛋白B、Akt3、APP、血清白蛋白、APRIL/TNFSF13、ALCAM、ARC、ALK-I、Artemin、ALK-7、芳基硫酸酯酶AJARSA、碱性磷酸酶、ASAH2/N-酰基鞘氨醇门冬酰胺酶-2、α2u-球蛋白、ASC、α-1-酸性糖蛋白、ASGR1、α-甲胎蛋白、ASK1、ALS、ATM、成釉细胞ATRIP、AMICA/JAML、有丝分裂激酶A、AMIGO、有丝分裂激酶B、AMIG02、轴蛋白-1、AMIG03、AxI、氨基酰化酶/ACY1、天青杀素/CAP37/HBP、氨肽酶A/ENPEP、B4GALT1、BIM、B7-1/CD80、6-生物素-17-NAD、B7-2/CD86、BLAME/SLAMF8、B7-H1/PD-L1、CXCL13/BLC/BCA-1、B7-H2、BLIMP1、B7-H3、BIk、B7-H4、BMI-I、BACE-I、BMP-1/PCP、BACE-2、BMP-2、Bad、BMP-3、BAFF/TNFSF13B、BMP-3b/GDF-10、BAFF R/TNFRSF 13C、BMP-4、Bag-1、BMP-5、BAK、BMP-6、BAMBI/NMA、BMP-7、BARD 1、BMP-8、Bax、BMP-9、BCAM、BMP-10、Bcl-10、BMP-15/GDF-9B、Bcl-2、BMPR-IA/ALK-3、Bcl-2相关蛋白A1、BMPR-IB/ALK-6、Bcl-w、BMPR-II、Bcl-x、BNIP3L、Bcl-xL、BOC、BCMA/TNFRSF17、BOK、BDNF、BPDE、苯甲酰胺、鼠短尾突变体表型、普通β链、B-Raf、βIG-H3、CXCL14/BRAK、B细胞素、BRCA1、β-防御素2、BRCA2、BID、BTLA、双糖链蛋白聚糖、Bub-1、Bik样杀伤蛋白、c-jun、CD90/Thyl、c-Rel、CD94、CCL6/C10、CD97、CIq R1/CD93、CD151、CIqTNF1、CD160、ClqTNF4、CD163、ClqTNF5、CD164、补体成分CIr、CD200、补体成分CIs、CD200R1、补体成分C2、CD229/SLAMF3、补体成分C3a、CD23/FcεR11、补体成分C3d、CD2F-10/SLAMF9、补体成分C5a、CD5L、钙粘蛋白-4/R-钙粘蛋白、CD69、钙粘蛋白-6、CDC2、钙粘蛋白-8、CDC25A、钙粘蛋白-11、CDC25B、钙粘蛋白-12、CDCP1、钙粘蛋白-13、CDO、钙粘蛋白-17、CDX4、E-钙粘蛋白、CEACAM-1/CD66a、N-钙粘蛋白、CEACAM-6、P-钙粘蛋白、Cerberus 1、VE-钙粘蛋白、CFTR、钙结合蛋白D、cGMP、钙调磷酸酶A、Chem R23、钙调磷酸酶B、趋化蛋白、钙网蛋白-2、趋化因子采样包(chemokine sampler pack)、CaM激酶II、几丁质酶3样1、cAMP、壳三糖酶/CHIT1、大麻素R1、Chk1、大麻素R2/CB2/CNR2、Chk2、CAR/NR1I3、CHL-1/L1CAM-2、碳酸酐酶I、胆碱乙酰转移酶/CbAT、碳酸酐酶II、软骨凝集蛋白、碳酸酐酶III、脊索生成素、碳酸酐酶IV、脊索生成素样1、碳酸酐酶VA、脊索生成素样2、碳酸酐酶VB、CINC-I、碳酸酐酶VI、CINC-2、碳酸酐酶VII、CINC-3、碳酸酐酶VIII、卡拉斯宾(Claspin)、碳酸酐酶IX、紧密连接蛋白-6、碳酸酐酶X、CLC、碳酸酐酶XII、CLEC-I、碳酸酐酶XIII、CLEC-2、碳酸酐酶XIV、CLECSF13/CLEC4F、羧甲基赖氨酸、CLECSF8、羧肽酶A1/CPA1、CLF-I、羧肽酶A2、CL-P1/COLEC12、羧肽酶A4、簇集蛋白、羧肽酶B1、簇集蛋白样1、羧肽酶E/CPE、CMG-2、羧肽酶X1、CMV UL146、心脏营养素-1、CMV UL147、肌肽二肽酶1、CNP、卡隆特(Caronte)、CNTF、CART、CNTF Rα、半胱天冬酶、凝血因子II/凝血酶、半胱天冬酶-1、凝血因子I11/组织因子、半胱天冬酶-2、凝血因子VII、半胱天冬酶-3、凝血因子X、半胱天冬酶-4、凝血因子XI、半胱天冬酶-6、凝血因子XIV/蛋白C、半胱天冬酶-7、COCO、半胱天冬酶-8、粘连蛋白、半胱天冬酶-9、胶原蛋白I、半胱天冬酶-10、胶原蛋白II、半胱天冬酶-12、胶原蛋白IV、半胱天冬酶-13、普通γ链n/IL-2Rγ、半胱天冬酶肽抑制剂、COMP/凝血酶敏感蛋白-5、过氧化氢酶、补体成分CIrLP、β-连环蛋白、补体成分CIqA、组织蛋白酶1、补体成分CIqC、组织蛋白酶3、补体因子D、组织蛋白酶6、补体因子I、组织蛋白酶A、补体MASP3、组织蛋白酶B、连接蛋白43、组织蛋白酶C/DPPI、接触蛋白-1、组织蛋白酶D、接触蛋白-2/TAG1、组织蛋白酶E、接触蛋白-4、组织蛋白酶F、接触蛋白-5、组织蛋白酶H、心房利钠肽转化酶(Corin)、组织蛋白酶L、Cornulin、组织蛋白酶O、CORS26/ClqTNF，3、组织蛋白酶S、大鼠皮质干细胞、组织蛋白酶V、皮质醇、组织蛋白酶XITJ？、COUP-TF I/NR2F1、CBP、COUP-TF II/NR2F2、CCI、COX-I、CCK-A R、COX-2、CCL28、CRACC/SLAMF7、CCR1、C反应蛋白、CCR2、肌酸激酶、肌肉/CKMM、CCR3、肌酐、CCR4、CREB、CCR5、CREG、CCR6、CRELD1、CCR7、CRELD2、CCR8、CRHBP、CCR9、CRHR-I、CCR1O、CRIM1、CD155/PVR、Cripto、CD2、CRISP-2、CD3、CRISP-3、CD4、翅无横脉(Crossveinless)-2、CD4+/45RA-、CRTAM、CD4+/45RO、CRTH-2、CD4+/CD62L-/CD44、CRY1、CD4+/CD62L+/CD44、Cryptic、CD5、CSB/ERCC6、CD6、CCL27/CTACK、CD8、CTGF/CCN2、CD8+/45RA-、CTLA-4、CD8+/45RO-、Cubilin、CD9、CX3CR1、CD14、CXADR、CD27/TNFRSF7、CXCL16、CD27配体/TNFSF7、CXCR3、CD28、CXCR4、CD30/TNFRSF8、CXCR5、CD30配体/TNFSF8、CXCR6、CD31/PECAM-1、亲环蛋白A、CD34、Cyr61/CCN1、CD36/SR-B3、胱抑素A、CD38、胱抑素B、CD40/TNFRSF5、胱抑素C、CD40配体/TNFSF5、胱抑素D、CD43、胱抑素E/M、CD44、胱抑素F、CD45、胱抑素H、CD46、胱抑素H2、CD47、胱抑素S、CD48/SLAMF2、胱抑素SA、CD55/DAF、胱抑素SN、CD58/LFA-3、细胞色素c、CD59、脱血红素细胞色素c、CD68、全细胞色素c、CD72、细胞角蛋白8、CD74、细胞角蛋白14、CD83、细胞角蛋白19、CD84/SLAMF5、西托宁(Cytonin)、D6、DISP1、DAN、Dkk-1、DANCE、Dkk-2、DARPP-32、Dkk-3、DAX1/NR0B1、Dkk-4、DCC、DLEC、DCIR/CLEC4A、DLL1、DCAR、DLL4、DcR3/TNFRSF6B、d-萤光素、DC-SIGN、DNA连接酶IV、DC-SIGNR/CD299、DNA聚合酶β、DcTRAIL R1/TNFRSF23、DNAM-I、DcTRAIL R2/TNFRSF22、DNA-PKcs、DDR1、DNER、DDR2、多巴脱羧酶/DDC、DEC-205、DPCR-I、信号蛋白(Decapentaplegic)、DPP6、核心蛋白聚糖、DPP A4、树突细胞相关凝集素-1/CLEC7A、DPPA5/ESG1、树突细胞相关凝集素-2/CLEC6A、DPPII/QPP/DPP7、DEP-1/CD148、DPPIV/CD26、沙漠刺蝟因子、DR3/TNFRSF25、结蛋白、DR6/TNFRSF21、桥粒芯糖蛋白-1、DSCAM、桥粒芯糖蛋白-2、DSCAM-L1、桥粒芯糖蛋白-3、DSPG3、蓬乱蛋白-1、Dtk、蓬乱蛋白-3、发动蛋白、EAR2/NR2F6、EphA5、ECE-I、EphA6、ECE-2、EphA7、ECF-L/CHI3L3、EphA8、ECM-I、EphB1、Ecotin、EphB2、EDA、EphB3、EDA-A2、EphB4、EDAR、EphB6、EDG-I、肝配蛋白、EDG-5、肝配蛋白-A1、EDG-8、肝配蛋白-A2、eEF-2、肝配蛋白-A3、EGF、肝配蛋白-A4、EGF R、肝配蛋白-A5、EGR1、肝配蛋白-B、EG-VEGF/PK1、肝配蛋白-B1、eIF2α、肝配蛋白-B2、eIF4E、肝配蛋白-B3、EIk-I、表原(Epigen)、EMAP-II、表皮形态发生素/神经突触素2、EMMPRIN/CD147、表皮调节素、CXCL5/ENA、EPR-1/Xa受体、内皮细胞特异性分子-1(Endocan)、ErbB2、内皮糖蛋白/CD105、ErbB3、四聚糖(Endoglycan)、ErbB4、核酸内切酶III、ERCC1、核酸内切酶IV、ERCC3、核酸内切酶V、ERK1/ERK2、核酸内切酶VIII、ERK1、埃杜里培林(Endorepellin)/串珠素、ERK2、皮抑制素、ERK3、內皮素-1、ERK5/BMK1、齿状片段(Engrailed)-2、ERRα/NR3B1、EN-RAGE、ERRβ/NR3B2、肠肽酶/肠激酶、ERRγ/NR3B3、CCL1 1/嗜酸细胞活化趋化因子、促红细胞生成素、CCL24/嗜酸细胞活化趋化因子-2、促红细胞生成素R、CCL26/嗜酸细胞活化趋化因子-3、ESAM、EpCAM/TROP-1、ERα/NR3A1、EPCR、ERβ/NR3A2、Eph、核酸外切酶III、EphA1、外生骨疣样2/EXTL2、EphA2、外生骨疣样3/EXTL3、EphA3、FABP1、FGF-BP、FABP2、FGF R1-4、FABP3、FGF R1、FABP4、FGF R2、FABP5、FGF R3、FABP7、FGF R4、FABP9、FGF R5、补体因子B、Fgr、FADD、FHR5、FAM3A、纤连蛋白、FAM3B、纤维胶凝蛋白-2、FAM3C、纤维胶凝蛋白-3、FAM3D、FITC、成纤维细胞活化蛋白α/FAP、FKBP38、Fas/TNFRSF6、5-脂氧合酶活化蛋白(Flap)、Fas配体/TNFSF6、FLIP、FATP1、FLRG、FATP4、FLRT1、FATP5、FLRT2、FcγR1/CD64、FLRT3、FcγRIIB/CD32b、Flt-3、FcγRIIC/CD32c、Flt-3配体、FcγRIIA/CD32a、卵泡抑素、FcγRIII/CD16、卵泡抑素样1、FcRH1/IRTA5、FosB/G0S3、FcRH2/IRTA4、FoxD3、FcRH4/IRTA1、FoxJ1、FcRH5/IRTA2、FoxP3、Fc受体样3/CD16-2、Fpg、FEN-I、FPR1、胎球蛋白A、FPRL1、胎球蛋白B、FPRL2、酸性FGF、CX3CL1/分形素、碱性FGF、卷曲蛋白-1、FGF-3、卷曲蛋白-2、FGF-4、卷曲蛋白-3、FGF-5、卷曲蛋白-4、FGF-6、卷曲蛋白-5、FGF-8、卷曲蛋白-6、FGF-9、卷曲蛋白-7、FGF-IO、卷曲蛋白-8、FGF-11、卷曲蛋白-9、FGF-12、Frk、FGF-13、sFRP-1、FGF-16、sFRP-2、FGF-17、sFRP-3、FGF-19、sFRP-4、FGF-20、弗林蛋白酶、FGF-21、FXR/NR1H4、FGF-22、Fyn、FGF-23、G9a/EHMT2、GFRα-3/GDNF Rα-3、GABA-A-Rα1、GFRα-4/GDNFRα-4、GABA-A-Rα2、GITR/TNFRSF18、GABA-A-Rα4、GITR配体/TNFSF18、GABA-A-Rα5、GLI-I、GABA-A-Rα6、GLI-2、GABA-A-Rβ1、GLP/EHMT1、GABA-A-Rβ2、GLP-IR、GABA-A-Rβ3、胰高血糖素、GABA-A-Rγ2、葡糖胺(N-乙酰)-6-硫酸酯酶/GNS、GABA-B-R2、GIuR1、GAD1/GAD67、GluR2/3、GAD2/GAD65、GluR2、GADD45α、GluR3、GADD45B、Glut1、GADD45γ、Glut2、半乳糖凝集素-1、Glut3、半乳糖凝集素-2、Glut4、半乳糖凝集素-3、Glut5、半乳糖凝集素-3BP、谷氧还蛋白1、半乳糖凝集素-4、甘氨酸R、半乳糖凝集素-7、血型糖蛋白A、半乳糖凝集素-8、磷脂酰肌醇蛋白聚糖2、半乳糖凝集素-9、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3、GalNAc4S-6ST、磷脂酰肌醇蛋白聚糖5、GAP-43、磷脂酰肌醇蛋白聚糖6、GAPDH、GM-CSF、Gasl、GM-CSF Rα、Gas6、GMF-β、GASP-1/WFIKKNRP、gpl30、GASP-2/WFIKKN、糖原磷酸化酶BB/GPBB、GATA-I、GPR15、GATA-2、GPR39、GATA-3、GPVI、GATA-4、GR/NR3C1、GATA-5、Gr-1/Ly-6G、GATA-6、颗粒溶素、GBL、颗粒酶A、GCNF/NR6A1、颗粒酶B、CXCL6/GCP-2、颗粒酶D、G-CSF、颗粒酶G、G-CSF R、颗粒酶H、GDF-I、GRASP、GDF-3GRB2、GDF-5、格里莫林(Gremlin)、GDF-6、GRO、GDF-7、CXCL1/GROα、GDF-8、CXCL2/GROβ、GDF-9、CXCL3/GROγ、GDF-11、生长激素、GDF-15、生长激素R、GDNF、GRP75/HSPA9B、GFAP、GSK-3α/β、GFI-I、GSK-3α、GFRα-1/GDNF Rα-1、GSK-3β、GFRα-2/GDNF Rα-2、EZFIT、H2AX、组氨酸、H60、HM74A、HAI-I、HMGA2、HAI-2、HMGB1、HAI-2A、TCF-2/HNF-1β、HAI-2B、HNF-3β/FoxA2、HAND1、HNF-4α/NR2A1、HAPLN1、HNF-4γ/NR2A2、气道胰蛋白酶样蛋白酶/HAT、HO-1/HMOX1/HSP32、HB-EGF、HO-2/HMOX2、CCL 14a/HCC-1、HPRG、CCL 14b/HCC-3、Hrk、CCL16/HCC-4、HRP-I、αHCG、HS6ST2、Hck、HSD-I、HCR/CRAM-A/B、HSD-2、HDGF、HSP 10/EPF、血红蛋白、HSP27、肝活素、HSP60、HES-1、HSP70、HES-4、HSP90、HGF、HTRA/蛋白酶Do、HGF活化剂、HTRA1/PRSS11、HGF R、HTRA2/0ml、HIF-Iα、HVEM/TNFRSF14、HIF-2α、透明质酸、HIN-1/分泌球蛋白3A1、4-羟基壬烯醛、Hip、CCL1/I-309/TCA-3、IL-IO、cIAP(pan)、IL-IO Rα、cIAP-1/HIAP-2、IL-10Rβ、cIAP-2/HIAP-1、IL-11、IBSP/涎蛋白II、EL-11Rα、ICAM-1/CD54、IL-12、ICAM-2/CD102、IL-12/IL-23p40、ICAM-3/CD50、IL-12Rβ1、ICAM-5、IL-12Rβ2、ICAT、IL-13、ICOS、IL-13Rα1、艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶/EOS、IL-13Rα2、EFN、IL-15、IFN-α、IL-15Rα、IFN-α1、IL-16、IFN-α2、IL-17、IFN-α4b、IL-17R、IFN-αA、IL-17RC、IFN-αB2、IL-17RD、IFN-αC、IL-17B、IFN-αD、IL-17B R、IFN-αF、IL-17C、IFN-αG、IL-17D、IFN-αH2、IL-17E、IFN-αI、IL-17F、IFN-αJ1、IL-18/IL-1F4、IFN-αK、IL-18BPa、IFN-αWA、IL-18BPc、IFN-α/βR1、IL-18BPd、IFN-α/βR2、IL-18Rα/IL-1R5、IFN-β、IL-18Rβ/IL-1R7、IFN-γ、IL-19、IFN-γR1、IL-20、IFN-γR2、IL-20Rα、IFN-ω、IL-20Rβ、IgE、IL-21、IGFBP-I、IL-21R、IGFBP-2、IL-22、IGFBP-3、IL-22R、IGFBP-4、IL-22BP、IGFBP-5、IL-23、IGFBP-6、IL-23R、IGFBP-L1、IL-24、IGFBP-rp1/IGFBP-7、IL-26/AK155、IGFBP-rPIO、IL-27、IGF-I、EL-28A、IGF-I R、IL-28B、IGF-II、IL-29/EFN-λ1、IGF-II R、IL-31、IgG、EL-31RA、IgM、IL-32α、IGSF2、IL-33、IGSF4A/SynCAM、ILT2/CD85J、IGSF4B、ILT3/CD85k、IGSF8、ILT4/CD85d、IgY、ILT5/CD85a、IkB-β、ILT6/CD85e、IKKα、印度刺猬因子(Indian Hedgehog)、IKKε、INSRR、EKKγ、胰岛素、IL-1α/IL-IF1、胰岛素R/CD220、IL-1β/IL-1F2、胰岛素原、IL-1ra/IL-1F3、胰岛素溶酶/EDE、IL-1F5/FIL1δ、整联蛋白α2/CD49b、IL-1F6/FILlε、整联蛋白α3/CD49c、IL-1F7/FIL1ζ、整联蛋白α3β1/VLA-3、IL-1F8/FIL1ζ、整联蛋白α4/CD49d、IL-1F9/IL-1H1、整联蛋白α5/CD49e、IL-1F10/IL-1HY2、整联蛋白α5β1、IL-I RI、整联蛋白α6/CD49f、IL-I RII、整联蛋白α7、IL-I R3/IL-1R AcP、整联蛋白α9、IL-I R4/ST2、整联蛋白αE/CD103、IL-I R6/IL-1R rp2、整联蛋白αL/CD1Ia、IL-I R8、整联蛋白αLβ2、IL-I R9、整联蛋白αM/CD1Ib、IL-2、整联蛋白αMβ2、IL-2Rα、整联蛋白αV/CD51、IL-2Rβ、整联蛋白αVβ5、IL-3、整联蛋白αVβ3、IL-3Rα、整联蛋白αVβ6、IL-3Rβ、整联蛋白αXJCD1Ic、IL-4、整联蛋白β1/CD29、IL-4R、整联蛋白β2/CD18、IL-5、整联蛋白β3/CD61、IL-5Rα、整联蛋白β5、IL-6、整联蛋白β6、IL-6R、整联蛋白β7、IL-7、CXCL10/EP-10/CRG-2、IL-7Rα/CD127、IRAKI、CXCR1/IL-8RA、IRAK4、CXCR2/IL-8RB、ERS-I、CXCL8/IL-8、Islet-1、IL-9、CXCL1 1/I-TAC、IL-9R、锯齿状蛋白(Jagged)1、JAM-4/IGSF5、锯齿状蛋白(Jagged)2、JNK、JAM-A、JNK1/JNK2、JAM-B/VE-JAM、JNK1、JAM-C、JNK2、激肽原、激肽释放酶3/PSA、激肽抑制素、激肽释放酶4、KER/CD158、激肽释放酶5、KER2D1、激肽释放酶6/神经脉蛋白(Neurosin)、KIR2DL3、激肽释放酶7、KIR2DL4/CD158d、激肽释放酶8/神经视蛋白(Neuropsin)、KIR2DS4、激肽释放酶9、KIR3DL1、血浆激肽释放酶/KLKB1、KER3DL2、激肽释放酶10、不规则类视交叉蛋白2、激肽释放酶11、KLF4、激肽释放酶12、KLF5、激肽释放酶13、KLF6、激肽释放酶14、可罗索(Klotho)、激肽释放酶15、可罗索(Klotho)β、KC、KOR、Keleh样环氧氯丙烷相关蛋白(Keap)1、克曼蛋白(Kremen)-1、KeI1、克曼蛋白(Kremen)-2、KGF/FGF-7、LAG-3、LINGO-2、LAIR1、Lipin 2、LAIR2、脂质运载蛋白-1、层粘连蛋白α4、脂质运载蛋白-2/NGAL、层粘连蛋白γ1，5-脂加氧酶、层粘连蛋白I、LXRα/NR1H3、层粘连蛋白S、LXRβ/NR1H2、层粘连蛋白-1、凋亡抑制蛋白(Livin)、层粘连蛋白-5、LEX、LAMP、LMIR1/CD300A、朗格汉蛋白(Langerin)、LMIR2/CD300c、LAR、LMIR3/CD300LF、胶乳素、LMIR5/CD300LB、透明质酸受体(Layilin)、LMIR6/CD300LE、LBP、LMO2、LDL R、LOX-1/SR-E1、LECT2、LRH-1/NR5A2、LEDGF、LRIG1、莱夫替(Lefty)、LRIG3、莱夫替(Lefty)-1、LRP-I、莱夫替(Lefty)-A、LRP-6、豆荚蛋白、LSECtin/CLEC4G、瘦素、基膜聚糖、瘦素R、CXCL15/郎金(Lungkine)、白三烯B4、XCLl/淋巴细胞趋化因子、白三烯B4R1、淋巴毒素、LEF、淋巴毒素β/TNFSF3、LIF Rα、淋巴毒素βR/TNFRSF3、LIGHT/TNFSF14、Lyn、立米汀(Limitin)、Lyp、LIMPII/SR-B2、赖氨酰氧化酶同源物2、LIN-28、LYVE-I、LINGO-I、α2-巨球蛋白、CXCL9/MIG、MAD2L1、骨诱导因子(Mimecan)、MAdCAM-1、脊椎蛋白(Mindin)、MafB、盐皮质激素R/NR3C2、MafF、CCL3L1/MIP-1α同种型LD78β、MafG、CCL3/MIP-1α、MafK、CCL4L1/LAG-1、MAG/唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素(Siglec)-4-a、CCL4/MIP-1p、MANF、CCL15/MEP-1δ、MAP2、CCL9/10/MIP-1γ、MAPK、MIP-2、小皮伞菌素(Marapsin)/盘克里星(Pancreasin)、CCL19/MIP-3B、MARCKS、CCL20/MIP-3α、MARCO、MIP-I、Mash1、MIP-II、软骨基质蛋白-2、MIP-III、软骨基质蛋白-3、MIS/AMH、软骨基质蛋白-4、MIS RII、蛋白裂解酶/ST14、MIXL1、MBL、MKK3/MKK6、MBL-2、MKK3、黑素皮质素3R/MC3R、MKK4、MCAM/CD146、MKK6、MCK-2、MKK7、McI-I、MKP-3、MCP-6、MLH-I、CCL2/MCP-1、MLK4α、MCP-11、MMP、CCL8/MCP-2、MMP-1、CCL7/MCP-3/MARC、MMP-2、CCL13/MCP-4、MMP-3、CCL12/MCP-5、MMP-7、M-CSF、MMP-8、M-CSF R、MMP-9、MCV II型、MMP-IO、MD-I、MMP-I 1、MD-2、MMP-12、CCL22/MDC、MMP-13、MDL-1/CLEC5A、MMP-14、MDM2、MMP-15、MEA-I、MMP-16/MT3-MMP、MEK1/MEK2、MMP-24/MT5-MMP、MEK1、MMP-25/MT6-MMP、MEK2、MMP-26、整联蛋白β1结合蛋白(Melusin)、MMR、MEPE、MOG、安眠蛋白α、CCL23/MPIF-1、安眠蛋白β、M-Ras/R-Ras3、Mer、Mrel 1、间皮素(Mesothelin)、MRP1镍纹蛋白、MSK1/MSK2、甲硫氨酸氨肽酶1、MSK1、甲硫氨酸氨肽酶、MSK2、甲硫氨酸氨肽酶2、MSP、MFG-E8、MSP R/Ron、MFRP、Mug、MgcRacGAP、MULT-I、MGL2、武藏蛋白(Musashi)-1、MGMT、武藏蛋白(Musashi)-2、MIA、MuSK、MICA、MutY DNA糖基化酶、MICB、MyD88、MICL/CLEC12A、髓过氧化物酶、β2微球蛋白、心肌蛋白(Myocardin)、中期因子、肌纤蛋白、MIF、肌红蛋白、NAIP NGFI-Bγ/NR4A3、Nanog、NgR2/NgRH1、CXCL7/NAP-2、NgR3/NgRH2、Nbsl、巢蛋白-1/内动蛋白、NCAM-1/CD56、巢蛋白-2、NCAM-L1、一氧化氮、连接蛋白(Nectin)-1、硝基酪氨酸、连接蛋白-2/CD1 12、NKG2A、连接蛋白-3、NKG2C、连接蛋白-4、NKG2D、再生蛋白、NKp30、脑啡肽酶/CDIO、NKp44、脑啡肽酶-2/MMEL1/MMEL2、NKp46/NCR1、巢蛋白、NKp80/KLRF1、NETO2、NKX2.5、网蛋白(Netrin)-1、NMDAR、NR1亚基、网蛋白-2、NMDA R、NR2A亚基、网蛋白-4、NMDA R、NR2B亚基、网蛋白-Gla、NMDAR、NR2C亚基、网蛋白-G2a、N-Me-6，7-diOH-TIQ、神经调节蛋白-1/NRG1、Nodal、神经调节蛋白-3/NRG3、头蛋白(Noggin)、神经素(Neuritin)、勿动蛋白(Nogo)受体、NeuroD1、勿动蛋白-A、神经束蛋白、NOMO、神经原质蛋白-1、Nope、神经原质蛋白-2、诺里蛋白、神经原质蛋白-3、eNOS、溶神经蛋白、iNOS、后叶激素运载蛋白II、nNOS、神经纤毛蛋白-1、小凹蛋白(Notch)-1、神经纤毛蛋白-2、小凹蛋白(Notch)-2、神经生成素(Neuropoietin)、小凹蛋白(Notch)-3、神经营养因子(Neurotrimin)、小凹蛋白(Notch)-4、神经秩蛋白(Neurturin)、NOV/CCN3、NFAM1、NRAGE、NF-H、NrCAM、NFkB1、NRL、NFkB2、NT-3、NF-L、NT-4、NF-M、NTB-A/SLAMF6、NG2/MCSP、NTH1、NGF R/TNFRSF16、核干细胞因子、β-NGF、Nurr-1/NR4A2、NGFI-Bα/NR4A1、OAS2、食欲素B、OBCAM、OSCAR、OCAM、OSF-2/骨膜蛋白、OCIL/CLEC2d、抑瘤素M/OSM、OCILRP2/CLEC21、OSM Rβ、Oct-3/4、骨活素/GPNMB、OGG1、骨粘附蛋白聚糖、Olig 1、2、3、骨钙蛋白、Olig1、骨织素、Olig2、骨桥蛋白、Olig3、骨保护素/TNFRSF1 IB、少突胶质细胞标志物01、Otx2、少突胶质细胞标志物04、OV-6、OMgp、OX40/TNFRSF4、眼科新糖蛋白、OX40配体/TNFSF4、食欲素A、OAS2、食欲素B、OBCAM、OSCAR、OCAM、OSF-2/骨膜蛋白、0CIL/CLEC2d、抑瘤素M/OSM、OCILRP2/CLEC2i、OSM Rβ、Oct-3/4、骨活素/GPNMB、OGG1、骨粘附蛋白聚糖、Olig1、2、3、骨钙蛋白、Olig1、骨织素、Olig2、骨桥蛋白、Olig3、骨保护素/TNFRSF1 IB、少突胶质细胞标志物01、Otx2、少突胶质细胞标志物04、OV-6、OMgp、OX40/TNFRSF4、眼科新糖蛋白、OX40配体/TNFSF4、食欲素A、RACK1、Ret、Rad1、REV-ERBα/NR1D1、Rad17、REV-ERBβ/NR1D2、Rad51、Rex-1、Rae-1、RGM-A、Rae-1α、RGM-B、Rae-1β、RGM-C、Rae-1δ、Rheb、Rae-1ε、核糖体蛋白S6、Rae-1γ、RIP1、Raf-1、ROBO1、RAGE、ROBO2、Ra1A/Ra1B、ROB03、RaIA、ROBO4、RaIB、R0R/NR1F1-3(pan)、RANK/TNFRSF1 1A、RORα/NR1F1、CCL5/RANTES、RORγ/NR1F3、Rap1A/B、RTK样孤儿受体1/ROR1、RARα/NR1B1、RTK样孤儿受体2/ROR2、RARβ/NR1B2、RP105、RARγ/NR1B3、RPA2、Ras、RSK(pan)、RBP4、RSK1/RSK2、RECK、RSK1、Reg 2/PAP、RSK2、Reg I、RSK3、Reg II、RSK4、Reg III、R-脊椎蛋白1、Reg Ilia、R-脊椎蛋白2、Reg IV、R-脊椎蛋白3、松弛素-1、RUNX1/CBFA2、松弛素-2、RUNX2/CBFA1、松弛素-3、RUNX3/CBFA3、RELMα、RXRα/NR2B1、RELMβ、RXRβ/NR2B2、RELT/TNFRSF19L、RXRγ/NR2B3、抵抗素、S1OOAlO、SLITRK5、S100A8、SLPI、S100A9、SMAC/Diablo、S1OOB、Smad1、S1OOP、Smad2、SALL1、Smad3、δ-肌聚糖、Smad4、Sca-1/Ly6、Smad5、SCD-I、Smad7、SCF、Smad8、SCF R/c-kit、SMC1、SCGF、α-平滑肌肌动蛋白、SCL/Tall、SMUG1、SCP3/SYCP3、蜗牛蛋白(Snail)、CXCL12/SDF-1、钠钙交换蛋白1、SDNSF/MCFD2、索吉(Soggy)-1、α-分泌酶、音猬蛋白、γ-分泌酶、S或CS1、β-分泌酶、S或CS3、E-选择素、分拣蛋白、L-选择素、SOST、P-选择素、SOX1、臂板蛋白3A、SOX2、臂板蛋白3C、SOX3、臂板蛋白3E、SOX7、臂板蛋白3F、SOX9、臂板蛋白6A、SOX1O、臂板蛋白6B、SOX 17、臂板蛋白6C、SOX21臂板蛋白6D、SPARC、臂板蛋白7A、SPARC样1、分离酶、SP-D、丝氨酸/苏氨酸磷酸酶底物I、脊骨蛋白、丝氨酸蛋白酶抑制剂A1、F-脊椎蛋白、丝氨酸蛋白酶抑制剂A3、SR-AI/MSR、丝氨酸蛋白酶抑制剂A4/激肽释放酶结合蛋白(Kallistatin)、Src、丝氨酸蛋白酶抑制剂A5/蛋白C抑制剂、SREC-I/SR-F1、丝氨酸蛋白酶抑制剂A8/血管紧张素原、SREC-II、丝氨酸蛋白酶抑制剂B5、SSEA-I、丝氨酸蛋白酶抑制剂C1/Anti凝血酶-III、SSEA-3、丝氨酸蛋白酶抑制剂D1/肝素辅因子II、SSEA-4、丝氨酸蛋白酶抑制剂E1/PAI-1、ST7/LRP12、丝氨酸蛋白酶抑制剂E2、稳定素-1、丝氨酸蛋白酶抑制剂F1、稳定素-2、丝氨酸蛋白酶抑制剂F2、斯钙素1、丝氨酸蛋白酶抑制剂G1/C1抑制剂、斯钙素2、丝氨酸蛋白酶抑制剂12、STAT1、血清淀粉样蛋白A1、STAT2、SF-1/NR5A1、STAT3、SGK、STAT4、SHBG、STAT5a/b、SHIP、STAT5a、SHP/NR0B2、STAT5b、SHP-I、STATE、SHP-2、VE-抑制素、SIGIRR、斯特拉(Stella)/Dppa3、唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素-2/CD22、STRO-I、唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素-3/CD33、物质P、唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素-5、磺酰胺酶/SGSH、唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素-6、硫酸酯酶修饰因子1/SUMF1、唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素-7、硫酸酯酶修饰因子2/SUMF2、唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素-9、SUMO1、唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素-10、SUMO2/3/4、唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素-11、SUMO3、唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素-F、超氧化物歧化酶、SIGNR1/CD209、超氧化物歧化酶-1/Cu[0099]--Zn SOD、SIGNR4、超氧化物歧化酶-2/Mn-SOD、SIRPβ1、超氧化物歧化酶-3/EC-SOD、SKI、生存素、SLAM/CD150、突触蛋白I、睡美人转座酶(Sleeping BeautV Transposase)、多配体蛋白聚糖-I/CD 138、Slit3、多配体蛋白聚糖-2、SLITRK1、多配体蛋白聚糖-3、SLITRK2、多配体蛋白聚糖-4、SLITRK4、TACI/TNFRSF13B、TMEFF1/血栓调节蛋白-1、TAO2、TMEFF2、TAPP1、TNF-α/TNFSFIA、CCL17/TARC、TNF-β/TNFSF1B、Tau、TNF R1/TNFRSFIA、TC21/R-Ras2、TNF RII/TNFRSF1B、TCAM-I、TOR、TCCR/WSX-1、TP-I、TC-PTP、TP63/TP73L、TDG、TR、CCL25/TECK、TRα/NR1A1、腱糖蛋白C、TRβ1/NR1A2、腱糖蛋白R、TR2/NR2C1、TER-119、TR4/NR2C2、TERT、TRA-1-85、睾丸蛋白聚糖1/SPOCK1、TRADD、睾丸蛋白聚糖2/SPOCK2，TRAF-1、睾丸蛋白聚糖3/SPOCK3、TRAF-2、TFPI、TRAF-3、TFPI-2、TRAF-4、TGF-α、TRAF-6、TGF-β、TRAIL/TNFSF10、TGF-β1、TRAIL R1/TNFRSFIOA、LAP(TGF-β1)、TRAIL R2/TNFRSF10B、潜伏TGF-β1、TRAIL R3/TNFRSF10C、TGF-β1.2、TRAIL R4/TNFRSF10D、TGF-β2、TRANCE/TNFSF1 1、TGF-β3、TfR(转铁蛋白R)、TGF-β5、脱铁转铁蛋白、潜伏TGF-βby 1、全铁转铁蛋白、潜伏TGF-βbp2、捕获蛋白(Trappin)-2/内生多肽(Elafin)、潜伏TGF-βbp4、TREM-1、TGF-βR1/ALK-5、TREM-2、TGF-βR11、TREM-3、TGF-βRIIb、TREML1/TLT-1、TGF-βRIII、TRF-I、嗜热菌蛋白酶、TRF-2、硫氧还蛋白-1、TRH-降解胞外酶/TRHDE、硫氧还蛋白-2、TRIMS、硫氧还蛋白-80、三肽基-肽酶I、硫氧还蛋白样5/TRP14、TrkA、THOP1、TrkB、血栓调节蛋白/CD141、TrkC、血小板生成素、TROP-2、血小板生成素R、肌钙蛋白I肽3、凝血酶敏感蛋白-1、肌钙蛋白T、凝血酶敏感蛋白-2、TROY/TNFRSF 19、凝血酶敏感蛋白-4、胰蛋白酶1、胸腺生成素、胰蛋白酶2/PRSS2、胸腺趋化因子-1、胰蛋白酶3/PRSS3、Tie-1、类胰蛋白酶-5/Prss32、Tie-2、类胰蛋白酶α/TPS1、TIM-I/KIM-I/HAVCR、类胰蛋白酶β-1/MCPT-7、TIM-2、类胰蛋白酶β-2/TPSB2、TIM-3、类胰蛋白酶ε/BSSP-4、TIM-4、类胰蛋白酶γ-1/TPSG1、TIM-5、色胺酸羟化酶、TIM-6、TSC22、TIMP-I、TSG、TIMP-2、TSG-6、TIMP-3、TSK、TIMP-4、TSLP、TL1A/TNFSF15、TSLP R、TLR1、TSP50、TLR2、B-III微管蛋白、TLR3、TWEAK/TNFSF12、TLR4、TWEAK R/TNFRSF 12、TLR5、Tyk2、TLR6、磷酸酪氨酸、TLR9、酪氨酸羟化酶、TLX/NR2E1、酪氨酸磷酸酶底物I、泛素、UNC5H3、Ugi、UNC5H4、UGRP1、UNG、ULBP-I、uPA、ULBP-2、uPAR、ULBP-3、URB、UNC5H1、UVDE、UNC5H2、辣椒素R1、VEGF R、VASA、VEGF R1/Flt-1、血管抑制蛋白(Vasohibin)、VEGF R2/KDR/Flk-1、伐索林(Vasorin)、VEGF R3/FU-4、血管抑制因子、多功能蛋白聚糖、Vav-1、VG5Q、VCAM-1、VHR、VDR/NR1I1、波形蛋白、VEGF、玻连蛋白、VEGF-B、VLDLR、VEGF-C、vWF-A2、VEGF-D、突触核蛋白-α、Ku70、WASP、Wnt-7b、WIF-I、Wnt-8a WISP-1/CCN4、Wnt-8b、WNK1、Wnt-9a、Wnt-1、Wnt-9b、Wnt-3a、Wnt-10a、Wnt-4、Wnt-10b、Wnt-5a、Wnt-11、Wnt-5b、wnvNS3、Wnt7a、XCR1、XPE/DDB1、XEDAR、XPE/DDB2、Xg、XPF、XIAP、XPG、XPA、XPV、XPD、XRCC1、Yes、YY1、EphA4。

多种人类离子通道是特别关注的靶标。非限制性实例包括5-羟色胺3受体B亚基、5-羟色胺3受体前体、5-羟色胺受体3亚基C、AAD 14蛋白、乙酰胆碱受体蛋白、α亚基前体、乙酰胆碱受体蛋白、β亚基前体、乙酰胆碱受体蛋白、δ亚基前体、乙酰胆碱受体蛋白、ε亚基前体、乙酰胆碱受体蛋白、γ亚基前体、酸感应离子通道3剪接变体b、酸感应离子通道3剪接变体c、酸感应离子通道4、ADP核糖焦磷酸酶、线粒体前体、A1A电压依赖性钙通道、阿米洛利敏感性阳离子通道1、神经元阿米洛利敏感性阳离子通道2、神经元阿米洛利敏感性阳离子通道4同种型2、阿米洛利敏感性钠通道、阿米洛利敏感性钠通道α亚基、阿米洛利敏感性钠通道β亚基、阿米洛利敏感性钠通道6亚基、阿米洛利敏感性钠通道γ亚基、膜联蛋白A7、顶端样蛋白(Apical-like protein)、ATP敏感性内向整流钾通道1、ATP敏感性内向整流钾通道10、ATP敏感性内向整流钾通道11、ATP敏感性内向整流钾通道14、ATP敏感性内向整流钾通道15、ATP敏感性内向整流钾通道8、钙通道α12.2亚基、钙通道α12.2亚基、钙通道α1E亚基、δ19δ40δ46剪接变体、钙激活钾通道α亚基1、钙激活钾通道β亚基1、钙激活钾通道β亚基2、钙激活钾通道β亚基3、钙依赖性氯通道1、阳离子通道TRPM4B、CDNA FLJ90453fis、克隆NT2RP3001542(高度类似于含钾通道四聚化结构域6)、CDNA FLJ90663fis、克隆PLACE1005031(高度类似于氯化物细胞内通道蛋白5)、CGMP门控阳离子通道β亚基、氯通道蛋白、氯通道蛋白2、氯通道蛋白3、氯通道蛋白4、氯通道蛋白5、氯通道蛋白6、氯通道蛋白C1C-Ka、氯通道蛋白C1C-Kb、氯通道蛋白、骨骼肌氯化物细胞内通道6、氯化物细胞内通道蛋白3、氯化物细胞内通道蛋白4、氯化物细胞内通道蛋白5、CHRNA3蛋白、Clcn3e蛋白、CLCNKB蛋白、CNGA4蛋白、滞蛋白-5、环GMP门控钾通道、环核苷酸门控阳离子通道4、环核苷酸门控阳离子通道α3、环核苷酸门控阳离子通道β3、环核苷酸门控嗅觉通道、囊性纤维化跨膜传导调节因子、细胞色素B-245重链、二氢吡啶敏感性L型钙通道α-2/δ亚基前体、含FXYD结构域离子转运调节因子3前体、含FXYD结构域离子转运调节因子5前体、含FXYD结构域离子转运调节因子6前体、含FXYD结构域离子转运调节因子7、含FXYD结构域离子转运调节因子8前体、G蛋白激活内向整流钾通道1、G蛋白激活内向整流钾通道2、G蛋白激活内向整流钾通道3、G蛋白激活内向整流钾通道4、γ-氨基丁酸受体α-1亚基前体、γ-氨基丁酸受体α-2亚基前体、γ-氨基丁酸受体α-3亚基前体、γ-氨基丁酸受体α-4亚基前体、γ-氨基丁酸受体α-5亚基前体、γ-氨基丁酸受体α-6亚基前体、γ-氨基丁酸受体β-1亚基前体、γ-氨基丁酸受体β-2亚基前体、γ-氨基丁酸受体β-3亚基前体、γ-氨基丁酸受体δ亚基前体、γ-氨基丁酸受体ε亚基前体、γ-氨基丁酸受体γ-1亚基前体、γ-氨基丁酸受体γ-3亚基前体、γ-氨基丁酸受体π亚基前体、γ-氨基丁酸受体r-1亚基前体、γ-氨基丁酸受体r-2亚基前体、γ-氨基丁酸受体θ亚基前体、GluR6红藻氨酸受体、谷氨酸受体1前体、谷氨酸受体2前体、谷氨酸受体3前体、谷氨酸受体4前体、谷氨酸受体7、谷氨酸受体B、谷氨酸受体δ-1亚基前体、谷氨酸受体、离子移变红藻氨酸1前体、谷氨酸受体、离子移变红藻氨酸2前体、谷氨酸受体、离子移变红藻氨酸3前体、谷氨酸受体、离子移变红藻氨酸4前体、谷氨酸受体、离子移变红藻氨酸5前体、谷氨酸[NMDA]受体亚基3A前体、谷氨酸[NMDA]受体亚基3B前体、谷氨酸[NMDA]受体亚基ε1前体、谷氨酸[NMDA]受体亚基ε2前体、谷氨酸[NMDA]受体亚基ε4前体、谷氨酸[NMDA]受体亚基ζ1前体、甘氨酸受体α-1链前体、甘氨酸受体α-2链前体、甘氨酸受体α-3链前体、甘氨酸受体β链前体、H/ACA核糖核蛋白复合体亚基1、高亲和力免疫球蛋白ε受体β亚基、假定蛋白DKFZp31310334、假定蛋白DKFZp761M1724、假定蛋白FLJ12242、假定蛋白FLJ14389、假定蛋白FLJ14798、假定蛋白FLJ14995、假定蛋白FLJ16180、假定蛋白FLJ16802、假定蛋白FLJ32069、假定蛋白FLJ37401、假定蛋白FLJ38750、假定蛋白FLJ40162、假定蛋白FLJ41415、假定蛋白FLJ90576、假定蛋白FLJ90590、假定蛋白FLJ90622、假定蛋白KCTD15、假定蛋白MGC15619、肌醇1，4，5-三磷酸受体1型、肌醇1，4，5-三磷酸受体2型、肌醇1，4，5-三磷酸受体3型、中电导钙激活钾通道蛋白4、内向整流钾通道13、内向整流钾通道16、内向整流钾通道4、内向整流K(+)通道阴性调节因子Kir2.2v、红藻氨酸受体亚基KA2a、KCNH5蛋白、KCTD 17蛋白、KCTD2蛋白、角质形成细胞相关跨膜蛋白1、Kv通道相互作用蛋白4、黑素抑素1、膜蛋白MLC1、MGC 15619蛋白、粘脂蛋白-1、粘脂蛋白-2、粘脂蛋白-3、多药抗药性相关蛋白4、N-甲基-D-天冬氨酸受体2C亚基前体、NADPH氧化酶同源物1Nav1.5、神经元乙酰胆碱受体蛋白、α-10亚基前体、神经元乙酰胆碱受体蛋白、α-2亚基前体、神经元乙酰胆碱受体蛋白、α-3亚基前体、神经元乙酰胆碱受体蛋白、α-4亚基前体、神经元乙酰胆碱受体蛋白、α-5亚基前体、神经元乙酰胆碱受体蛋白、α-6亚基前体、神经元乙酰胆碱受体蛋白、α-7亚基前体、神经元乙酰胆碱受体蛋白、α-9亚基前体、神经元乙酰胆碱受体蛋白、β-2亚基前体、神经元乙酰胆碱受体蛋白、β-3亚基前体、神经元乙酰胆碱受体蛋白、β-4亚基前体、神经元电压依赖性钙通道α2D亚基、P2X嘌呤受体1、P2X嘌呤受体2、P2X嘌呤受体3、P2X嘌呤受体4、P2X嘌呤受体5、P2X嘌呤受体6、P2X嘌呤受体7、胰钾通道TALK-Ib、胰钾通道TALK-Ic、胰钾通道TALK-Id、磷酸神经膜蛋白前体、浆脂蛋白、多囊性肾病2相关蛋白、多囊性肾病2样1蛋白、多囊性肾病2样2蛋白、多囊性肾病及卵胶相关蛋白前体的受体、多囊肾蛋白(Polycystin)-2、钾通道调节因子、钾通道亚家族K成员1、钾通道亚家族K成员10、钾通道亚家族K成员12、钾通道亚家族K成员13、钾通道亚家族K成员15、钾通道亚家族K成员16、钾通道亚家族K成员17、钾通道亚家族K成员2、钾通道亚家族K成员3、钾通道亚家族K成员4、钾通道亚家族K成员5、钾通道亚家族K成员6、钾通道亚家族K成员7、钾通道亚家族K成员9、含钾通道四聚化结构域3、含钾通道四聚化结构域蛋白12、含钾通道四聚化结构域蛋白14、含钾通道四聚化结构域蛋白2、含钾通道四聚化结构域蛋白4、含钾通道四聚化结构域蛋白5、含钾通道四聚化结构域10、含钾通道四聚化结构域蛋白13、含钾通道四聚化结构域1、钾电压门控通道亚家族A成员1、钾电压门控通道亚家族A成员2、钾电压门控通道亚家族A成员4、钾电压门控通道亚家族A成员5、钾电压门控通道亚家族A成员6、钾电压门控通道亚家族B成员1、钾电压门控通道亚家族B成员2、钾电压门控通道亚家族C成员1、钾电压门控通道亚家族C成员3、钾电压门控通道亚家族C成员4、钾电压门控通道亚家族D成员1、钾电压门控通道亚家族D成员2、钾电压门控通道亚家族D成员3、钾电压门控通道亚家族E成员1、钾电压门控通道亚家族E成员2、钾电压门控通道亚家族E成员3、钾电压门控通道亚家族E成员4、钾电压门控通道亚家族F成员1、钾电压门控通道亚家族G成员1、钾电压门控通道亚家族G成员2、钾电压门控通道亚家族G成员3、钾电压门控通道亚家族G成员4、钾电压门控通道亚家族H成员1、钾电压门控通道亚家族H成员2、钾电压门控通道亚家族H成员3、钾电压门控通道亚家族H成员4、钾电压门控通道亚家族H成员5、钾电压门控通道亚家族H成员6、钾电压门控通道亚家族H成员7、钾电压门控通道亚家族H成员8、钾电压门控通道亚家族KQT成员1、钾电压门控通道亚家族KQT成员2、钾电压门控通道亚家族KQT成员3、钾电压门控通道亚家族KQT成员4、钾电压门控通道亚家族KQT成员5、钾电压门控通道亚家族S成员1、钾电压门控通道亚家族S成员2、钾电压门控通道亚家族S成员3、钾电压门控通道亚家族V成员2、钾电压门控通道亚家族H成员7同种型2、钾/钠超极化激活环核苷酸门控通道1、钾/钠超极化激活环核苷酸门控通道2、钾/钠超极化激活环核苷酸门控通道3、钾/钠超极化激活环核苷酸门控通道4、可能的线粒体输入受体亚基TOM40同源物、嘌呤受体P2X5同种型A、假定的4重复电压门控离子通道、假定的氯通道蛋白7、假定的GluR6红藻氨酸受体、假定的离子通道蛋白CATSPER2变体1、假定的离子通道蛋白CATSPER2变体2、假定的离子通道蛋白CATSPER2变体3、钾通道蛋白变体1的假定调节因子、假定的酪氨酸-蛋白磷酸酶TPTE、雷诺定受体1、雷诺定受体2、雷诺定受体3、SH3KBP1结合蛋白1、短的瞬时受体潜在通道1、短的瞬时受体潜在通道4、短的瞬时受体潜在通道5、短的瞬时受体潜在通道6、短的瞬时受体潜在通道7、小电导钙激活钾通道蛋白1、小电导钙激活钾通道蛋白2同种型b、小电导钙激活钾通道蛋白3同种型b、小电导钙激活钾通道SK2、小电导钙激活钾通道SK3、钠通道、钠通道β-1亚基前体、II型钠通道蛋白α亚基、III型钠通道蛋白α亚基、IV型钠通道蛋白α亚基、IX型钠通道蛋白α亚基、V型钠通道蛋白α亚基、VII型钠通道蛋白α亚基、VIII型钠通道蛋白α亚基、X型钠通道蛋白α亚基、XI型钠通道蛋白α亚基、钠及氯化物激活ATP敏感性钾通道、转运钠/钾的ATP酶γ链、精子相关阳离子通道1、精子相关阳离子通道2同种型4、突触融合蛋白-1B1、瞬时受体潜在阳离子通道亚家族A成员1、瞬时受体潜在阳离子通道亚家族M成员2、瞬时受体潜在阳离子通道亚家族M成员3、瞬时受体潜在阳离子通道亚家族M成员6、瞬时受体潜在阳离子通道亚家族M成员7、瞬时受体潜在阳离子通道亚家族V成员1、瞬时受体潜在阳离子通道亚家族V成员2、瞬时受体潜在阳离子通道亚家族V成员3、瞬时受体潜在阳离子通道亚家族V成员4、瞬时受体潜在阳离子通道亚家族V成员5、瞬时受体潜在阳离子通道亚家族V成员6、瞬时受体潜在通道4ε剪接变体、瞬时受体潜在通道4ζ剪接变体、瞬时受体潜在通道7γ剪接变体、肿瘤坏死因子、α-诱导性蛋白1、内皮细胞双孔钙通道蛋白2、VDAC4蛋白、电压门控钾通道Kv3.2b、电压门控钠通道β1B亚基、电压依赖性阴离子通道、电压依赖性阴离子通道2、电压依赖性阴离子选择性通道蛋白1、电压依赖性阴离子选择性通道蛋白2、电压依赖性阴离子选择性通道蛋白3、电压依赖性钙通道γ-1亚基、电压依赖性钙通道γ-2亚基、电压依赖性钙通道γ-3亚基、电压依赖性钙通道γ-4亚基、电压依赖性钙通道γ-5亚基、电压依赖性钙通道γ-6亚基、电压依赖性钙通道γ-7亚基、电压依赖性钙通道γ-8亚基、电压依赖性L型钙通道α-1C亚基、电压依赖性L型钙通道α-1D亚基、电压依赖性L型钙通道α-IS亚基、电压依赖性L型钙通道β-1亚基、电压依赖性L型钙通道β-2亚基、电压依赖L型钙通道β-3亚基、电压依赖性L型钙通道β-4亚基、电压依赖性N型钙通道α-1B亚基、电压依赖性P/Q型钙通道α-1A亚基、电压依赖性R型钙通道α-1E亚基、电压依赖性T型钙通道α-1G亚基、电压依赖性T型钙通道α-1H亚基、电压依赖性T型钙通道α-1I亚基、电压门控L型钙通道α-1亚基、电压门控钾通道B-1亚基、电压门控钾通道β-2亚基、电压门控钾通道β-3亚基、电压门控钾通道KCNA7。人电压门控钠通道的Nav1.x家族亦为特别有前途的靶标。这个家族包括例如通道Nav1.6和Nav1.8。

在某些实施方案中，治疗性蛋白可以是G蛋白偶联受体(GPCR)。示例性GPCR包括但不限于，A类视紫质样受体，如脊椎动物1型毒蕈碱乙酰胆碱、脊椎动物2型毒蕈碱乙酰胆碱、脊椎动物3型毒蕈碱乙酰胆碱、脊椎动物4型毒蕈碱乙酰胆碱；肾上腺素受体(1型α肾上腺素受体、2型α肾上腺素受体、1型β肾上腺素受体、2型β肾上腺素受体、3型β肾上腺素受体、脊椎动物1型多巴胺、脊椎动物2型多巴胺、脊椎动物3型多巴胺、脊椎动物4型多巴胺、1型组胺、2型组胺、3型组胺、4型组胺、1型血清素、2型血清素、3型血清素、4型血清素、5型血清素、6型血清素、7型血清素、8型血清素、其他血清素类型、痕量胺、1型血管紧张素、2型血管紧张素、铃蟾肽、缓激肽、C5a过敏毒素、Fmet-leu-phe、APJ样、A型白细胞介素-8、B型白细胞介素-8、其他类型白细胞介素-8、C--C趋化因子1型至11型及其他类型、C--X--C趋化因子(2至6型及其他类型)、C--X3-C趋化因子、胆囊收缩素CCK、A型CCK、B型CCK、其他CCK、内皮素、黑皮质素(黑素细胞刺激激素、促肾上腺皮质激素、黑皮质素激素)、达菲抗原(Duffy antigen)、催乳素释放肽(GPR10)、神经肽Y(1至7型)、神经肽Y、其他神经肽Y、神经降压素、类鸦片(D、K、M、X型)、生长抑素(1至5型)、速激肽(物质P(NK1)、物质K(NK2)、神经调节肽K(NK3)、速激肽样1、速激肽样2、血管加压素/加压催产素(1至2型)、加压催产素、催产素/中催产素、芋螺加压素(Conopressin)、甘丙肽(Galanin)样、蛋白酶活化样、食欲素及神经肽FF.QRFP、趋化因子受体样、神经调节肽U样(神经调节肽U、PRXamide)、激素蛋白(卵泡刺激素、促黄体-绒毛膜促性腺激素、促甲状腺素、I型促性腺激素、II型促性腺激素)、(视紫质)视蛋白、脊椎动物视紫质(1-5型)、脊椎动物5型视紫质、节肢动物视紫质、节肢动物1型视紫质、节肢动物2型视紫质、节肢动物3型视紫质、软体动物视紫质、视紫质、嗅觉(嗅觉II家族1至13)、前列腺素(前列腺素E2亚型EP1、前列腺素E2/D2亚型EP2、前列腺素E2亚型EP3、前列腺素E2亚型EP4、前列腺素F2-α、前列环素)、血栓烷、1至3型腺苷、嘌呤受体、嘌呤受体P2RY1-4，6，1 1GPR91、嘌呤受体P2RY5，8，9，10GPR35，92，174、嘌呤受体P2RY12-14GPR87(UDP-葡萄糖)、大麻素、血小板激活因子、促性腺激素释放激素、I型促性腺激素释放激素、II型促性腺激素释放激素、脂肪动用激素样、黑化诱导激素、促甲状腺素释放激素及促泌素、促甲状腺素释放激素、生长激素促泌素、生长激素促泌素样、蜕皮引发激素(ETHR)、褪黑素、溶血鞘脂及LPA(EDG)、鞘氨醇1-磷酸酯Edg-1、溶血磷脂酸Edg-2、鞘氨醇1-磷酸酯Edg-3、溶血磷脂酸Edg-4、鞘氨醇1-磷酸酯Edg-5、鞘氨醇1-磷酸酯Edg-6、溶血磷脂酸Edg-7、鞘氨醇1-磷酸酯Edg-8、其他Edg白三烯B4受体、白三烯B4受体BLT1、白三烯B4受体BLT2、A类孤儿/其他、假定的神经递质、SREB、Mas原癌基因及Mas相关(MRGs)、GPR45样、半胱氨酰白三烯、G蛋白偶联胆汁酸受体、游离脂肪酸受体(GP40、GP41、GP43)、B类分泌素样、降钙素、促肾上腺皮质激素释放因子、抑胃肽、胰高血糖素、生长激素释放激素、甲状旁腺激素、PACAP、分泌素、血管活性肠肽、蛛毒素受体(Latrophilin)、1型蛛毒素受体、2型蛛毒素受体、3型蛛毒素受体、ETL受体、脑特异性血管生成抑制剂(BAI)、玛士撒拉样蛋白(Methuselah-like protein，MTH)、钙粘蛋白EGF LAG(CELSR)、极大G蛋白偶联受体、C类促代谢型谷氨酸/信息素、I至III组促代谢型谷氨酸、钙感应样、细胞外钙感应、信息素、其他钙感应样、假定的信息素受体、GABA-B、GABA-B亚型1、GABA-B亚型2、GABA-B样、孤儿GPRC5、孤儿GPCR6、无七蛋白桥(Bride ofsevenlessprotein，BOSS)、味觉受体(T1R)、D类真菌信息素、真菌信息素A-因子样(STE2.STE3)、真菌信息素B样(BAR、BBR、RCB、PRA)、E类cAMP受体、眼白化病蛋白、卷曲蛋白/润滑蛋白(Smoothened)家族、A组卷曲蛋白(Fz 1及2及4及5及7-9)、B组卷曲蛋白(Fz 3及6)、C组卷曲蛋白(其他)、犁鼻器受体、线虫化学感受器、昆虫气味感受器、和Z类古细菌/细菌/真菌视蛋白。

在某些实施方案中，本文中描述的结合血清白蛋白的Fn3融合物可包含下列活性多肽的任一者：BOTOX、Myobloc、Neurobloc、Dysport(或其他血清型的肉毒杆菌神经毒素)、阿葡糖苷酶α、达托霉素、YH-16、绒毛膜促性腺激素α、非格司亭、西曲瑞克、白细胞介素-2、阿地白介素、替西白介素、地尼白介素-白喉毒素连接物(denileukin diftitox)、干扰素α-n3(注射剂)、干扰素α-n1、DL-8234、干扰素、桑托里(Suntory)(γ-Ia)、干扰素γ、胸腺素α1、他索那敏、DigiFab、ViperaTAb、EchiTAb、CroFab、奈西立肽、阿巴他塞、阿法赛特、利比(Rebif)、依托特明α(eptotermin alfa)、特立帕肽(teriparatide)(骨质疏松症)、可注射降钙素(骨病)、降钙素(鼻部、骨质疏松症)、依那西普、谷他血红蛋白(glutamer)250(牛)、屈曲可净(drotrecogin)α、胶原酶、卡培立肽(carperitide)、重组人表皮生长因子(局部用凝胶，伤口愈合)、DWP-401、达依泊汀α(darbepoetin alfa)、依泊汀ω(epoetin omega)、依泊汀β、依泊汀α、地西卢定、来匹卢定、比伐卢定、诺那凝血素α(nonacog alpha)、凝血因子IX粉针剂(Mononine)、依他凝血素α(eptacog alfa)(活化)、重组因子VIII+VWF、浓缩的重组抗血友病因子(Recombinate)、重组因子VIII、因子VIII(重组)、血源性凝血因子(Alphanate)、辛凝血素α(octocog alfa)、因子VIII、帕利夫明、印地激酶(Indikinase)、替奈普酶、阿替普酶、帕米普酶、瑞替普酶、那替普酶、孟替普酶、促卵泡素α(follitropinalfa)、rFSH、hpFSH、米卡芬净、聚乙二醇化非格司亭(pegfilgrastim)、来格司亭、那托司亭、舍莫瑞林、胰高血糖素、艾塞那肽、普兰林肽、伊米苷酶、加硫酶(galsulfase)、留可曲平(Leucotropin)、莫拉司亭、乙酸曲普瑞林、组胺瑞林(皮下植入，Hydron)、地洛瑞林、组胺瑞林、那法瑞林、亮丙瑞林缓释储库(ATRIGEL)、亮丙瑞林植入物(DUROS)、戈舍瑞林、生长激素(somatropin)、尤得盼(Eutropin)、KP-102程序、生长激素、生长激素、美卡舍明(生长失败)、恩夫韦肽、0rg-33408、甘精胰岛素(insulin glargine)、谷赖胰岛素、胰岛素(吸入型)、赖脯胰岛素、地特胰岛素、胰岛素(经颊，RapidMist)、美卡舍明-林菲培(mecaserminrinfabate)、阿那白滞素、西莫白介素、99mTc-阿西肽锝(99mTc-apcitide)注射剂、麦罗匹德(myelopid)、倍泰龙(Betaseron)、乙酸格拉默(glatiramer acetate)、格旁(Gepon)、沙格司亭、奥普瑞白介素、人白细胞衍生α干扰素、Bilive、胰岛素(重组)、重组人胰岛素、门冬胰岛素、美卡舍明、罗扰素-A、干扰素-α2、α干扰素(Alfaferone)、复合干扰素alfacon-1、干扰素α、阿沃纳斯(Avonex)重组人黄体化激素、链道酶α(dornase alfa)、曲弗明、齐考诺肽、他替瑞林、地波特明α(diboterminalfa)、阿托西班、贝卡普勒明、依替巴肽、泽美拉(Zemaira)、CTC-111、夏伐克(Shanvac)-B、HPV疫苗(四价)、N0V-002、奥曲肽、兰瑞肽、安西司亭、无半乳糖甘酶(agalsidase)β、无半乳糖甘酶α、拉罗尼酶、醋肽铜(prezatide copperacetate)(局部用凝胶)、拉布立酶、兰尼单抗、阿克替姆(Actimmune)、佩乐能(PEG-1ntron)、曲可明(Tricomin)、重组屋尘螨过敏脱敏注射剂、重组人甲状旁腺激素(PTH)1-84(sc，骨质疏松症)、依泊汀δ、转基因抗凝血酶III、格兰蒂曲平(Granditropin)、透明质酸酶(Vitrase)、重组胰岛素、干扰素-α(口服锭剂)、GEM-2IS、伐普肽、艾杜硫酶(idursulfase)、奥马曲拉、重组血清白蛋白、聚乙二醇结合赛妥珠单抗(certolizumab peg0l)、谷卡匹酶、人重组Cl酯酶抑制剂(血管性水肿)、拉诺替普酶(Ianoteplase)、重组人生长激素、恩夫韦肽(无针注射，Biojector2000)、VGV-I、干扰素(α)、芦西纳坦、阿肽地尔(吸入型，肺病)、艾替班特、艾卡拉肽(ecallantide)、奥米加南(omiganan)、奥罗格雷(Aurograb)、乙酸培西加南(pexiganan acetate)、ADI-PEG-20、LDI-200、地加瑞克(degarelix)、贝辛白介素(cintredekin besudotox)、FavId、MDX-1379、ISAtx-247、利拉鲁肽(liraglutide)、特立帕肽(骨质疏松症)、替法可近、AA-4500、T4N5脂质体洗液、卡妥索单抗(catumaxomab)、DWP-413、ART-123、蛾蛹素(Chrysalin)、去氨普酶、安地普酶、绒促卵泡素α(corifollitropinalpha)、TH-9507、替度鲁肽(teduglutide)、戴麦德(Diamyd)、DWP-412、生长激素(缓释注射剂)、重组G-CSF、胰岛素(吸入型，AIR)、胰岛素(吸入型，Technosphere)、胰岛素(吸入型，AERx)、RGN-303、DiaPep277、干扰素β(丙型肝炎病毒感染(HCV))、干扰素α-n3(口服)、贝拉西普(belatacept)、经皮胰岛素贴片、AMG-531、MBP-8298、西雷西普(Xerecept)、奥培巴坎、AIDSVAX、GV-1001、LymphoScan、豹娃酶、利普散(Lipoxysan)、卢舒普肽、MP52(β-磷酸三钙载体，骨再生)、黑色素瘤疫苗、西普鲁塞(sipuleucel)-T、CTP-37、印瑟吉(Insegia)、维特斯朋(vitespen)、人凝血酶(冷冻，手术抽血)、凝血酶、TransMID、蛇毒纤溶酶(alfimeprase)、聚乙二醇-尿酸酶(Puricase)、特利加压素(静脉内，肝肾综合征)、EUR-1008M、重组FGF-I(可注射，血管疾病)、BDM-E、罗替加肽(rotigaptide)、ETC-216、P-113、MBI-594AN、耐久霉素(吸入型，囊性纤维化)、SCV-07、OPI-45、内皮抑素、血管抑素、ABT-510、鲍曼-伯克(Bowman Birk)抑制剂浓缩物、XMP-629、99mTc_联肼尼克酰胺-膜联蛋白V、卡哈拉德(kahalalide)F、CTCE-9908、替维瑞克(延长释放)、奥扎瑞克(ozarelix)、罗米地辛(romidepsin)、BAY-50-4798、白细胞介素-4、PRX-321、佩斯坎(Pepscan)、埃布他德金(iboctadekin)、rh乳铁传递蛋白(rh lactoferrin)、TRU-015、IL-21、ATN-161、西仑吉肽、白蛋白干扰素(Albuferon)、比费西克斯(Biphasix)、IRX-2、ω干扰素、PCK-3145、CAP-232、帕瑞肽(pasireotide)、huN901-DM1、卵巢癌免疫治疗疫苗、SB-249553、Oncovax-CL、OncoVax-P、BLP-25、CerVax-16、多表位肽黑色素瘤疫苗(MART-I、gp100、酪氨酸酶)、奈米非肽(nemifitide)、rAAT(吸入型)、rAAT(皮肤病)、CGRP(吸入型，哮喘)、培那西普(pegsunercept)、胸腺素β-4、普利提环肽(plitidepsin)、GTP-200、雷莫拉宁、GRASPA、OBI-I、AC-100、鲑鱼降钙素(口服，eligen)、降钙素(口服，骨质疏松症)、艾沙瑞林、卡普瑞林、卡德瓦(Cardeva)、维拉弗明(velafermin)、131I-TM-601、KK-220、TP-10、乌拉立肽、地来司他(depelestat)、赫马肽(hematide)、克里萨林(局部)、rNAPc2、重组因子VIII(聚乙二醇化脂质体)、bFGF、聚乙二醇化重组葡激酶变体、V-10153、SonoLysis Prolyse、NeuroVax、CZEN-002、胰岛细胞再生疗法、rGLP-1、BIM-51077、LY-548806、艾塞那肽(exenatide)(控制释放，Medisorb)、AVE-0010、GA-GCB、阿伏瑞林、AOD-9604、乙酸利那洛肽(linaclotideacetate)、CETi-I、赫莫斯盘(Hemospan)、VAL(可注射)、速效胰岛素(可注射，Viadel)、鼻内胰岛素、胰岛素(吸入型)、胰岛素(口服，eligen)、重组甲硫氨酰基人瘦素、皮崔金拉(pitrakinra)(皮下注射，eczema)、匹曲白滞素(吸入型干粉，哮喘)、木替金(Multikine)、RG-1068、MM-093、NBI-6024、AT-001、PI-0824、Org-39141、CpnlO(自身免疫病/炎症)、塔乳铁蛋白(talactoferrin)(局部)、rEV-131(眼用)、rEV-131(呼吸疾病)、口服重组人胰岛素(糖尿病)、RPI-78M、奥普瑞白介素(口服)、CYT-99007CTLA4-Ig、DTY-001、伐拉格特(valategrast)、干扰素α-n3(局部)、IRX-3、RDP-58、涛弗隆(Tauferon)、胆盐刺激性脂肪酶、梅里斯普酶(Merispase)、碱性磷酸酶、EP-2104R、美拉诺坦(Melanotan)-II、布美诺肽(bremelanotide)、ATL-104、重组人微纤维蛋白溶酶(recombinant人microplasmin)、AX-200、SEMAX、ACV-I、Xen-2174、CJC-1008、强啡肽A、SI-6603、LAB GHRH、AER-002、BGC-728、疟疾疫苗(病毒体，PeviPRO)、ALTU-135、细小病毒B 19疫苗、流感疫苗(重组神经氨酸酶)、疟疾/HBV疫苗、炭疽疫苗、Vacc-5q、Vacc-4x、HIV疫苗(口服)、HPV疫苗、Tat类毒素、YSPSL、CHS-13340、PTH(1-34)脂质体乳膏(Novasome)、奥斯布尔(Ostabolin)-C、PTH类似物(局部，银屑病)、MBRI-93.02、MTB72F疫苗(肺结核)、MVA-Ag85A疫苗(结核病)、FAR-404、BA-210、重组鼠疫F1V疫苗、AG-702、OxSODro1、rBetV1、Der-p1/Der-p2/Der-p7变应原靶向疫苗(尘螨过敏)、PRl肽抗原(白血病)、突变ras疫苗、HPV-16E7脂肽疫苗、迷路蛋白疫苗(腺癌)、CML疫苗、WT1-肽疫苗(癌症)、IDD-5、CDX-110、朋曲斯(Pentrys)、诺雷林(Norelin)、CytoFab、P-9808、VT-111、艾罗卡肽(icrocaptide)、替柏明(telbermin)(皮肤病，糖尿病足溃疡)、芦平曲韦(rupintrivir)、雷替库罗(reticulose)、rGRF、P1A、α-半乳糖苷酶A、ACE-011、ALTU-140、CGX-1160、血管紧张素治疗疫苗、D-4F、ETC-642、APP-018、rhMBL、SCV-07(口服，结核病)、DRF-7295、ABT-828、ErbB2特异性免疫毒素(抗癌剂)、DT388IL-3、TST-10088、PRO-1762、库姆波托克斯(Combotox)、胆囊收缩素-B/胃泌素受体结合肽、1 1 1ln-hEGF、AE-37、曲妥珠单抗-DM1、拮抗剂G、IL-12(重组)、PM-02734、IMP-321、rhIGF-BP3、BLX-883、CUV-1647(局部)、基于L-19的放射免疫治疗剂(癌症)、Re-188-P-2045、AMG-386、DC/I540/KLH疫苗(癌症)、VX-001、AVE-9633、AC-9301、NY-ESO-I疫苗(肽)、NA17.A2肽、黑色素瘤疫苗(脉冲抗原治疗剂)、前列腺癌疫苗、CBP-501、重组人乳铁蛋白(干眼病)、FX-06、AP-214、WAP-8294A2(可注射)、ACP-HIP，SUN-11031、肽YY[3-36](肥胖症，鼻内)、FGLL、阿塞西普(atacicept)、BR3-Fc、BN-003、BA-058、人甲状旁腺激素1-34(鼻内，骨质疏松症)、F-18-CCR1、AT-1001(乳糜泻/糖尿病)、JPD-003、PTH(7-34)脂质体乳膏(Novasome)、耐久霉素(眼用，干眼病)、CAB-2、CTCE-0214、糖聚乙二醇化(Glycopegylation)红细胞生成素、EPO-Fc、CNTO-528、AMG-114、JR-013、因子XIII、氨基康定(aminocandin)、PN-951、716155、SUN-E7001、TH-0318、BAY-73-7977、替维瑞克(立即释放)、EP-51216、hGH(控制释放，Biosphere)、OGP-I、西夫韦肽(sifuvirtide)、TV-4710、ALG-889、0rg-41259、rhCCI0、F-991、胸腺喷丁(thymopentin)(肺病)、r(m)CRP、肝选择性胰岛素、苏巴林(subalin)、L 19-IL-2融合肽、内生多肽(elafin)、NMK-150、ALTU-139、EN-122004、rhTP0、血小板生成素受体激动剂(血小板减少症)、AL-108、AL-208、神经生长因子拮抗剂(疼痛)、SLV-317、CGX-1007、INNO-105、口服特立帕肽(eligen)、GEM-OS1、AC-162352、PRX-302、LFn-p24融合疫苗(Therapore)、EP-1043、肺炎链球菌(S.pneumoniae)儿科疫苗、疟疾疫苗、B群脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)疫苗、新生儿B群链球菌疫苗)、炭疽疫苗、HCV疫苗(gpE1+gpE2+MF-59)、中耳炎疗法、HCV疫苗(核心抗原+ISCOMATRIX)、hPTH(1-34)(经皮，ViaDerm)、768974、SYN-101、PGN-0052、阿维库明(aviscumine)、BIM-23190、结核疫苗、多表位酪氨酸酶肽、癌症疫苗、恩卡斯替母(enkastim)、APC-8024、G1-5005、ACC-001、TTS_CD3、血管靶向TNF(实体瘤)、去氨加压素(经颊控制释放)、奥那西普、TP-9201。

其他修饰

在某些实施方案中，血清白蛋白结合物及其融合物可进一步包含翻译后修饰。示例性的翻译后蛋白质修饰包括磷酸化、乙酰化、甲基化、ADP核糖基化、泛素化、糖基化、羰基化、SUMO化(sumoylation)、生物素化、或多肽侧链或疏水基团的添加。结果，经修饰的血清白蛋白结合物和它们的融合物可含有非氨基酸成分，如脂质、多糖或单糖、和磷酸。优选的糖基化形式是唾液酸化，其使一个或多个唾液酸部分与多肽偶联。唾液酸部分可提高溶解度和血清半衰期，同时还降低蛋白质的可能免疫原性。参见，例如，Raju等人，Biochemistry.2001Jul.31；40(30)：8868-76。可以测试血清白蛋白结合物结合特定血清白蛋白(例如，HSA或RhSA)的能力，和/或在融合物环境中由具体的非¹⁰Fn3部分赋予的功能角色，以测试这样的非氨基酸成分对血清白蛋白结合物或它们的融合物的功能性的影响。

F.核酸-蛋白质融合技术

在一方面，本发明提供了基于纤连蛋白的支架蛋白，此类蛋白包含与HSA结合的纤连蛋白III型结构域。一种迅速制造并测试具有特定结合特性的Fn3结构域的方式是Adnexus(Bristol-Myers Squibb旗下公司)的核酸-蛋白质融合技术。利用核酸-蛋白质融合(RNA-和DNA-蛋白质融合)的这种体外表达和标签技术(称作PROfusion)可鉴定对于与蛋白质结合而言重要的新的多肽和氨基酸基序。核酸-蛋白质融合技术是使蛋白质与其编码遗传信息共价偶联的技术。关于RNA-蛋白质融合技术和基于纤连蛋白的支架蛋白文库筛选方法的详细描述，可参见Szostak等人，美国专利6,258,558；6,261,804；6,214,553；6,281,344；6,207,446；6,518,018；PCT公开文本WO00/34784；WO01/64942；WO02/032925；以及Roberts和Szostak，Proc Natl.Acad.Sci.94：12297-12302，1997，通过提述将其并入本文。

G.载体及多核苷酸实施方案

本公开还包括编码任何本文中描述的蛋白质的核酸序列。如本领域技术人员理解的，由于第三碱基的简并性，几乎每个氨基酸在编码核苷酸序列中均可由一个以上的三联体密码子表示。另外，微小的碱基对变化可导致所编码的氨基酸序列中的保守性取代，但预期不会实质性改变基因产物的生物活性。因此，编码本文中描述的蛋白质的核酸序列可以在序列上轻微被修饰，而仍然编码其相应的基因产物。编码本文中描述的血清白蛋白结合物及其融合物的某些示例性核酸包括具有在SEQ ID NO：126-151中示出的序列的核酸。本发明还涵盖与SEQ ID NO：126-151至少50％，如至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％相同，并且优选地编码与血清白蛋白结合的蛋白质的核酸序列，以及编码串联PCSK9-PKE2Adnectin的核酸，其优选地与血清白蛋白和PCSK9结合。在一些实施方案中，导入核苷酸取代，以不改变被翻译出来的氨基酸序列。

编码本文中公开的任何蛋白质或多肽的核酸均可以化学合成。可以选择密码子用法，以提高细胞中的表达。这样的密码子用法将取决于所选择的细胞类型。已经开发了专门针对大肠杆菌和其他细菌、以及哺乳动物细胞、植物细胞、酵母细胞和昆虫细胞的密码子使用模式。参见，例如，Mayfield等人，Proc Natl Acad Sci USA.2003 100(2)：438-42；Sinclair等人，Protein Expr Purif.2002(1)：96-105；Connell ND.Curr OpinBiotechnol.2001(5)：446-9；Makrides等人，Microbiol.Rev.199660(3)：512-38；和Sharp等人，Yeast.1991 7(7)：657-78。

核酸操作的一般技术在本领域技术人员的能力范围之内，在例如Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Vols.1-3，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，第2版，1989，或F.Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology(GreenPublishing and Wiley-Interscience：New York，1987)及定期的更新中有描述，将这些文献通过提述并入本文。编码蛋白质的DNA与适合的来源于哺乳动物、病毒、或昆虫基因的转录或翻译调节元件可操作连接。这样的调节元件包括转录启动子、任选的控制转录的操作序列、编码适合的mRNA核糖体结合位点的序列、和控制转录和翻译的终止的序列。另外，组入了常常由复制起点赋予的在宿主中复制的能力、以及便于识别转化体的选择基因。合适的调节元件是本领域中熟知的。

本文中描述的蛋白质和融合蛋白可以以具有异源多肽的融合蛋白的形式产生，所述异源多肽优选是信号序列、或其他在成熟蛋白或多肽的N端具有特异性切割位点的多肽。优选选择的异源信号序列是可被宿主细胞识别和加工(即，被信号肽酶切割)的信号序列。对于不识别和加工天然信号序列的原核宿主细胞，信号序列用例如选自下组的原核信号序列取代：碱性磷酸酶、青霉素酶、Ipp、或热稳定肠毒素II前导序列。为了酵母分泌，可将天然信号序列取代为例如酵母转化酶前导序列、a因子前导序列(包括酵母属和克鲁维酵母属α-因子前导序列)、或酸性磷酸酶前导序列、白色念珠菌葡糖淀粉酶前导序列、或PCT公开文本No.WO 90/13646中描述的信号。在哺乳动物细胞表达中，可使用哺乳动物信号序列以及病毒分泌性前导序列，例如单纯疱疹gD信号。这样的前体区域的DNA可以阅读框的方式连接于编码蛋白质的DNA。

在真核宿主细胞(例如，酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人类、或来自其他多细胞生物的有核细胞)中使用的表达载体还将含有对于终止转录和稳定化mRNA必需的序列。这样的序列通常可从真核生物或病毒DNA的5′、有时从3′非翻译区或cDNA得到。这些区域含有转录为编码多价抗体的mRNA的非翻译部分中的多腺苷酸化片段的核苷酸区段。一种有用的转录终止组分是牛生长激素多腺苷酸化区。参见PCT公开文本WO 94/11026及其中所公开的表达载体。

重组DNA也可包括任何类型的可用于纯化蛋白质的蛋白质标签序列。蛋白质标签的实例包括，但不限于，组氨酸标签、FLAG标签、myc标签、HA标签、或GST标签。适合用于细菌、真菌、酵母及哺乳动物细胞宿主的克隆与表达载体可见于：Cloning Vectors：ALaboratory Manual，(Elsevier，New York，1985)，该文献的相关公开内容通过提述并入本文。

使用适合于宿主细胞的方法将表达构建体导入宿主细胞中，这是本领域技术人员容易想到的。将核酸导入宿主细胞中的各种方法是本领域中已知的，包括，但不限于，电穿孔；使用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、DEAE-葡聚糖或其他物质转染；微粒轰击；脂质体转染；及感染(其中载体为感染剂)。

适合的宿主细胞包括原核生物、酵母、哺乳动物细胞、或细菌细胞。适合的细菌包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物，例如，大肠杆菌或芽孢杆菌属物种。酵母，优选来自酵母属物种的酵母如酿酒酵母，也可用于产生多肽。还可使用各种哺乳动物或昆虫细胞培养系统来表达重组蛋白质。用于在昆虫细胞中产生异源蛋白质的杆状病毒系统由Luckow和Summers(Bio/Technology，6：47，1988)综述。在一些情况下，比如为了糖基化，希望在脊椎动物细胞中产生蛋白质，在培养(组织培养)中繁殖脊椎动物细胞已成为常规程序。适合的哺乳动物宿主细胞系的实例包括内皮细胞、COS-7猴肾细胞、CV-1、L细胞、C127、3T3、中国仓鼠卵巢(CHO)、人胚肾细胞、HeLa、293、293T、和BHK细胞系。对于许多应用而言，由于本文中描述的蛋白多聚体大小较大，使得大肠杆菌成为优选的表达方法。

H.蛋白质产生

用本文中描述的用于产生蛋白质的表达或克隆载体转化宿主细胞，并在视需要改良为适于诱导启动子、选择转化体、或扩增编码期望序列的基因的常规营养培养基中培养宿主细胞。

可在各种培养基中培养用于产生基于纤连蛋白的支架蛋白或其融合物的宿主细胞。可商购的培养基，如Ham′s F10(Sigma)、最低必需培养基((MEM)、(Sigma))、RPMI-1640(Sigma)、和Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium((DMEM)、(Sigma))适合于培养宿主细胞。另外，在Ham等人，Meth.Enz.58：44(1979)、Barnes等人，Anal.Biochem.102：255(1980)、美国专利4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO90/03430；WO87/00195；或美国专利Re.30,985中描述的任何培养基均可用作宿主细胞的培养基。在需要时，可对任何这些培养基补充激素及/或其他生长因子(如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(如氯化钠、钙、镁、和磷酸盐)、缓冲液(如HEPES)、核苷酸(如腺苷和胸苷)、抗生素(如GENTAMYCIN^TM药物)、微量元素(定义为无机化合物，通常以在微摩尔范围内的终浓度存在)、以及葡萄糖或等效能源。还可包括适当浓度的本领域技术人员已知的任何其他必要的补充剂。诸如温度、PH值等培养条件为先前用于经选择用于表达的宿主细胞的那些条件，且对于普通技术人员而言是显而易见的。

还可使用无细胞翻译系统产生本文中公开的基于纤连蛋白的支架蛋白或其融合物。为了这样的目的，必须修饰编码基于纤连蛋白的支架蛋白的核酸，以允许体外转录而产生mRNA并允许mRNA在所用的特定无细胞系统(真核无细胞翻译系统例如哺乳动物或酵母无细胞翻译系统，原核无细胞翻译系统例如细菌无细胞翻译系统)中进行无细胞翻译。

基于纤连蛋白的支架蛋白或其融合物也可通过化学合成产生(例如，通过在SolidPhase Peptide Synthesis，第2版，1984，The Pierce Chemical Co.，Rockford，IL中描述的方法)。基于纤连蛋白的支架蛋白的修饰也可通过化学合成产生。

本文中公开的基于纤连蛋白的支架蛋白或其融合物可通过蛋白质化学领域中通常已知的用于蛋白质的分离/纯化方法来纯化。非限制性实例包括萃取、重结晶、盐析(例如，使用硫酸铵或硫酸钠)、离心、透析、超滤、吸附色谱法、离子交换色谱法、疏水色谱法、正相色谱法、反相色谱法、凝胶过滤、凝胶渗透色谱法、亲和色谱法、电泳、逆流分布法或这些方法的任何组合。纯化后，可通过本领域已知的多种方法中的任何方法，包括但不限于，过滤和透析，将基于纤连蛋白的支架蛋白交换到不同的缓冲液中和/或浓缩。

经纯化的基于纤连蛋白的支架蛋白优选为至少85％纯，更优选为至少95％纯，且最优选为至少98％纯。不论纯度的精确数值如何，基于纤连蛋白的支架蛋白的纯度足以用作医药产品。

I.成像、诊断、和其他应用

基于与结合血清白蛋白的¹⁰Fn3结构域融合的异源分子的身份，本文中提供的结合血清白蛋白的¹⁰Fn3融合物可用于治疗多种疾病和病症。结合血清白蛋白的¹⁰Fn3融合物的应用可由技术人员基于本领域的知识和本文中提供的信息来确定。在本文中详细描述了各种结合血清白蛋白的¹⁰Fn3融合蛋白的用途。结合血清白蛋白的¹⁰Fn3融合物可以给予任何哺乳动物受试者或患者(包括人和非人类生物)。

本文中描述的血清白蛋白结合物和融合分子可进行可检测地标记，并使之接触例如表达被融合分子结合的蛋白质的细胞，以用于成像或诊断应用。可采用本领域中已知的用于使蛋白质与可检测部分偶联的任何方法，包括由Hunter等人，Nature 144：945(1962)；David等人，Biochemistry 13：1014(1974)；Pain等人，J.Immunol.Meth.40：219(1981)；和Nygren，J.Histochem.和Cytochem.30：407(1982)所描述的那些方法。

在某些实施方案中，本文中描述的血清白蛋白结合物和融合分子进一步被附接于能够被检测的标记物(例如，该标记物可为放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子)。标记物可为放射性物质，如放射性重金属，如铁螯合物，钆或锰的放射性螯合物，氧、氮、铁、碳或镓的正电子发射体、⁴³K、⁵²Fe、⁵⁷Co、⁶⁷Cu、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、¹²³I、¹²⁵I、¹³¹I、¹³²I、或⁹⁹Tc。在某些实施方案中，标记物可以是荧光或化学发光化合物，如异硫氰酸荧光素、罗丹明、或萤光素；或酶，如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或辣根过氧化物酶。附着在这样的部分上的血清白蛋白结合物或融合分子可用作成像剂并且以有效用于哺乳动物(如人类)中的诊断用途的量施用，然后检测该成像剂的定位和累积。可通过放射性闪烁照相法、核磁共振成像、计算机断层摄影术或正电子发射断层摄影术来检测成像剂的定位和累积。对于技术人员清楚的是，放射性同位素的施用量视放射性同位素而定。基于用作活性部分的给定放射性核素的比活性和能量，本领域普通技术人员易于调配成像剂的施用量。

血清白蛋白结合物和融合分子也可用作亲和纯化剂。在这种方法中，使用本领域中熟知的方法将蛋白质固定在适合的载体(如Sephadex树脂或滤纸)上。蛋白质可用于任何已知测定方法中，如竞争性结合测定、直接和间接夹心测定、以及免疫沉淀测定(Zola，Monoclonal Antibodies：A Manual of Techniques，第147-158页(CRC Press，Inc.，1987))。

J.生物物理学和生物化学表征

可以用平衡常数(例如，解离，K_D)和动力学常数(例如，缔合速率常数k_on和解离速率常数k_off)为单位来评估本文中描述的血清白蛋白结合性Adnectin与血清白蛋白(例如，HSA)的结合。血清白蛋白结合性Adnectin(例如，PKE2-单体或串联-Adnectin)通常会以小于500nM、100nM、10nM、1nM、500pM、200pM、或100pM的KD与靶分子结合，不过在k_off足够低或k_on足够高的场合，更高的K_D值也是可以容许的。

结合亲和力的体外测定

可以使用各种体外测定来鉴定与血清白蛋白(例如，HSA)结合的PKE2-Adnectin。在某些实施方案中，所述测定是允许同时筛选多种候选Adnectin的高通量测定。

用于确定Adnectin与其靶标的结合亲和力的示例性测定包括但不限于溶液相法，如动力学排阻测定(KinExA)(Blake等人，JBC 1996；271：27677-85；Drake等人，AnalBiochem 2004；328：35-43)、采用Biacore系统(Uppsala，Sweden)的表面等离子体共振(SPR)(Welford等人，Opt.Quant.Elect 1991；23：1；Morton和Myszka，Methods inEnzymology 1998；295：268)和均相时间分辨荧光(HTRF)测定(Newton等人，J BiomolScreen 2008；13：674-82；Patel等人，Assay Drug Dev Technol 2008；6：55-68)。

在某些实施方案中，可在Biacore系统中实时监测生物分子的相互作用，Biacore系统利用SPR来检测光从玻璃支持物上的薄金膜的表面到300nm开外的由于折射率变化所致的共振角变化。Biacore分析(例如，如实施例2中描述)生成缔合速率常数、解离速率常数、平衡解离常数、和亲和常数。通过使用Biacore表面等离子体共振系统(Biacore，Inc.)评估缔合速率常数和解离速率常数而求得结合亲和力。活化生物传感器芯片以便共价偶联靶标。然后将靶标稀释并注射到芯片上方，获得以固定材料的反应单位表示的信号。由于以共振单位(RU)表示的信号与固定材料的质量成比例，这代表在基质上的固定靶标的密度的范围。在全局分析中同时拟合结合数据和解离数据，以解出1∶1双分子相互作用的净速率表达，从而产生k_on、k_off和R_max(饱和时的最大反应)的最佳拟合值。从SPR测量值计算关于结合的平衡解离常数K_D，表示为k_off/k_on。

应当理解，本文中上述测定是示例性的，并且可以使用本领域任何已知的用于确定蛋白质之间的结合亲和力的方法(例如，荧光共振能量转移(FRET)、酶联免疫吸附测定、和竞争性结合测定(例如，放射免疫测定))来评估在本文中描述的PKE2-Adnectin之间的结合亲和力。

在某些实施方案中，当使用例如差示扫描量热法(DSC)或热扫描荧光(TSF)测量时，例如按照实施例中所描述地那样进行时，本文描述的血清白蛋白结合性Adnectin，或包含此类Adnectin的融合蛋白，的熔融温度(T_m)为至少50℃，如至少51℃、至少52℃、至少53℃、至少54℃、至少55℃、至少56℃、至少57℃、至少58℃、至少59℃、至少60℃、至少61℃、至少62℃、至少63℃、至少64℃、至少65℃、至少66℃、至少67℃、至少68℃、至少69℃、至少70℃、至少71℃、至少72℃、至少73℃、至少74℃、或至少75℃。在某些实施方案中，当使用例如差示扫描量热法(DSC)或热扫描荧光(TSF)测量时，例如像实施例中所描述的那样进行时，本文中描述的血清白蛋白结合性Adnectin、或包含所述Adnectin的融合蛋白，的熔融温度(T_m)为50-75℃，如51-75℃、52-75℃、53-75℃、54-75℃、55-75℃、56-75℃、57-75℃、58-75℃、59-75℃、60-75℃、61-75℃、62-75℃、63-75℃、64-75℃、65-75℃、66-75℃、67-75℃、68-75℃、69-75℃、70-75℃、50-74℃、50-73℃、50-72℃、50-71℃、50-70℃、50-69℃、50-68℃、50-67℃、50-66℃、50-65℃、50-64℃、50-63℃、50-62℃、50-61℃、50-60℃、50-59℃、50-58℃、50-57℃、50-56℃、50-55℃、51-74℃、52-73℃、53-71℃、54-70℃、或55-65℃。

K.体内治疗用途

本文中提供了在治疗病症中有用的基于纤连蛋白的支架蛋白。在包含血清白蛋白结合性Adnectin的融合蛋白的情况下，可被治疗的疾病或病症将由与Adnectin连接的部分(例如，第二Adnectin)的结合特异性所决定。如本文中描述的，基于纤连蛋白的支架蛋白可被设计为与任何感兴趣靶标结合。在一个实施方案中，该靶标为PCSK9。与PSCK9结合的基于纤连蛋白的支架蛋白、以及包含所述支架蛋白的融合蛋白，可用于治疗动脉粥样硬化、高胆固醇血症和其他胆固醇相关疾病。

本申请还提供了向受试者施用基于纤连蛋白的支架蛋白的方法。在一些实施方案中，受试者是人。在一些实施方案中，基于纤连蛋白的支架蛋白对于哺乳动物，尤其是人类是药学上可接受的。“药学上可接受的”组合物是指被施用动物而无显著不良医疗后果的组合物。药学上可接受的组合物的实例包括：包含缺乏整联蛋白结合结构域(RGD)的¹⁰Fn3结构域的组合物，以及基本上不含内毒素或热原或具有极低内毒素或热原水平的组合物。

L.制剂和给药

本申请提供了施用与结合血清白蛋白的¹⁰Fn3结构域融合的治疗部分的方法，其中该治疗部分的半衰期在与结合血清白蛋白的¹⁰Fn3结构域融合时延长。施用融合构建体的技术和剂量将依赖于与结合血清白蛋白的¹⁰Fn3结构域融合的治疗部分的类型以及被治疗的具体病症而变化，但可容易地由技术人员确定。一般而言，监管机构要求，要用作治疗剂的蛋白质试剂的配制应以热原的水平低到可以接受为目标。因此，治疗制剂与其他制剂通常的区别在于它们基本上无热原，或含有至少不超过可接受水平的热原，如由适宜的监管机构(例如，FDA)确定的。在某些实施方案中，结合血清白蛋白的¹⁰Fn3结构域和它们的融合分子的药物制剂包含，例如，1-20mM琥珀酸、2-10％山梨醇、和1-10％甘氨酸(pH 4.0-7.0)。在示例性实施方案中，结合血清白蛋白的¹⁰Fn3结构域和它们的融合分子的药物制剂包含，例如，10mM琥珀酸、8％山梨醇、和5％甘氨酸(pH 6.0)。

在一些实施方案中，结合血清白蛋白的¹⁰Fn3结构域及其融合物对于哺乳动物，尤其是人类，是药学上可接受的。“药学上可接受”的多肽是指施用给动物而无显著不良医疗后果的多肽。药学上可接受的结合血清白蛋白的¹⁰Fn3结构域及其融合物的实例包括：缺乏整联蛋白结合结构域(RGD)的¹⁰Fn3结构域；以及结合血清白蛋白的¹⁰Fn3结构域或结合血清白蛋白的¹⁰Fn3结构域融合物，其基本上不含内毒素或具有极低内毒素水平。

治疗组合物可以单位剂型的形式与药学上可接受的稀释剂、载体、或赋形剂一起给予。作为非限制性实例，可肠胃外(例如，静脉内、皮下)、口服、或局部给予。组合物可呈以下形式：用于口服给药的丸剂、片剂、胶囊、液体或缓释片剂；用于静脉内、皮下或肠胃外给药的液体；或用于局部给药的凝胶、洗剂、软膏、乳膏、或聚合物或其他缓释溶媒。

本领域中熟知的用于制造制剂的方法见于例如″Remington：The Science andPractice of Pharmacy″′(20th ed.，ed.A.R.Gennaro A R.，2000、Lippincott Williams&Wilkins，Philadelphia，Pa.)中。用于肠胃外给药的制剂可例如含有赋形剂、无菌水、盐水、聚亚烷基二醇(如聚乙二醇)、植物来源的油类、或氢化萘。生物相容性、生物可降解丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物、或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物可用于控制化合物的释放。纳米粒子制剂(例如生物可降解纳米颗粒、固体脂质纳米颗粒、脂质体)可用于控制化合物的生物分布。其他潜在有用的肠胃外递送系统包括乙烯-乙酸乙烯共聚物颗粒、渗透泵、可植入输注系统、和脂质体。制剂中化合物的浓度依赖于许多因素而变化，包括要给予的药物的剂量和给药途径。

任选地以药学上可接受的盐形式给予多肽，在制药工业中常用的无毒酸加成盐或金属络合物。酸加成盐的实例包括有机酸，如乙酸、乳酸、扑酸、马来酸、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、琥珀酸、苯甲酸、棕榈酸、辛二酸、水杨酸、酒石酸、甲磺酸、甲苯磺酸、或三氟乙酸等；聚合酸，如鞣酸、羧甲基纤维素等；以及无机酸，如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸等。金属复合物包括锌、铁等。在一个实例中，在乙酸钠存在下配制多肽以增加热稳定性。

适于口服使用的制剂包括含有活性成分与无毒的在药学上可接受的赋形剂的混合物的片剂。这些赋形剂可例如为惰性稀释剂或填充剂(例如，蔗糖和山梨醇)、润滑剂、助流剂及抗粘合剂(例如，硬脂酸镁、硬脂酸锌、硬脂酸、二氧化硅、氢化植物油、或滑石)。

供口服使用的制剂还可以提供为咀嚼片，或提供为硬明胶胶囊，其中活性成分与惰性固体稀释剂混合；或为软明胶胶囊，其中活性成分与水或油介质混合。

治疗有效剂量指产生给药所追求的治疗效果的剂量。确切的剂量将取决于待治疗的病症，且可由本领域技术人员使用已知技术来确定。一般而言，以约0.01μg/kg到约50mg/kg每天、优选0.01mg/kg到约30mg/kg每天、最优选0.1mg/kg到约20mg/kg每天给予结合血清白蛋白的¹⁰Fn3结构域或结合血清白蛋白的¹⁰Fn3结构域融合物。可每天(例如，每天一次、两次、三次、或四次)或以更低频率(例如，每隔天一次、每周一次或两次、或每月一次)给予多肽。另外，如本领域中已知，可能需要针对年龄以及体重、一般健康状况、性别、饮食、给药时间、药物相互作用、和疾病严重程度进行调整，且可由本领域技术人员使用常规实验来确定。

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所有附图和所有参考文献的内容、Genbank序列，在本申请各处引证的专利和公开的专利申请都清楚地通过提述并入本文。具体地说，将美国临时专利申请No.61/968,181(2014年3月20日提交)的公开内容明确地通过提述并入本文。

以上公开内容总体上描述了本发明公开，其进一步通过下列实施例进行例示。描述这些具体的实施例仅仅是为了说明的目的，而不旨在限制本公开的范围。尽管在本文中采用了具体的靶标、术语、和数值，但这样的靶标、术语、和数值同样应当理解为对于本公开的范围是示例性的和非限制性的。

实施例

高通量蛋白质产生(HTPP)

将选定的结合物克隆到PET9d载体中HIS₆标签的上游，并转化到大肠杆菌BL21DE3plysS细胞中，在5ml含50μg/mL卡那霉素的LB培养基中以24孔格式进行温育，在37℃培养过夜。从过夜培养物中吸出200μl并将其分配到适当的孔中，制备新鲜的5ml LB培养基(50μg/mL卡那霉素)培养物用于诱导表达。使培养物在37℃生长直到A₆₀₀为0.6-0.9。在用1mM异丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后，使培养物在30℃表达6小时，在2750g下在4℃离心10分钟收获培养物。

通过在450μl的裂解缓冲液(50mM NaH₂PO₄、0.5M NaCl、1x Complete ^TM无EDTA的全蛋白酶抑制剂混合物(Roche)、1mM PMSF、10mM CHAPS、40mM咪唑、1mg/ml溶菌酶、30μg/mlDNA酶、2μg/ml抑肽酶，pH 8.0)中重悬将细胞沉淀物(24孔形式)溶解，并在室温下振摇1-3小时。澄清裂解物并通过转移到配备有96孔1.2ml捕捉板(catch plate)的96孔WhatmanGF/D Unifilter中而重排(re-rack)为96孔形式，并正压过滤。将澄清的裂解物转移到已用平衡缓冲液(50mM NaH₂PO₄、0.5M NaCl、40mM咪唑，pH8.0)平衡的96孔镍-钴螯合板中并温育5分钟。借助于正压去除未结合的材料。用洗涤缓冲液#1(50mM NaH₂PO₄、0.5M NaCl、5mMCHAPS、40mM咪唑，pH 8.0)以0.3ml/孔洗涤树脂两次。借助正压去除每次的洗涤物。在洗脱之前，用50μl洗脱缓冲液(PBS+20mM EDTA)洗涤每个孔，温育5分钟，借助正压弃去此次洗涤物。向每个孔施用另外的100μl洗脱缓冲液来洗脱蛋白质。在室温下温育30分钟后，将板在200g下离心5分钟并将洗脱的蛋白质收集在96孔捕捉板中，洗脱捕捉板底部在洗脱前已添加了5μl 0.5M MgCl₂。使用总蛋白质测定，利用野生型¹⁰Fn3结构域作为蛋白质标准品来定量洗脱的蛋白质。

基于纤连蛋白的支架蛋白的不溶性结合物的中等规摆表达和纯化

对于不溶性克隆的表达，将克隆连同后随的HIS₆标签克隆到pET9d(EMDBioscience，San Diego，CA)载体中并在大肠杆菌HMS174细胞中表达。使用20ml的一个接种培养物(从铺板的单个菌落产生)接种1升含有50μg/ml羧苄青霉素和34μg/ml氯霉素的LB培养基。使培养物在37℃生长直到A₆₀₀为0.6-1.0。在用1mM异丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导之后，使培养物在30℃生长4小时，通过在＞10,000g下在4℃离心30分钟收获培养物。细胞离心沉淀在-80℃下冷冻。在冰上使用均质器(IKA works)将细胞沉淀再悬浮于25ml裂解缓冲液(20mM NaH₂PO₄、0.5M NaCl、1x Complete^TM无EDTA蛋白酶抑制剂混合物(Roche)、1mM PMSF，pH 7.4)中。通过使用M-l 10S型(Microfluidics)进行高压均质化(＞18,000psi)实现细胞裂解。通过在4℃下以23,300g离心30分钟来分离不溶部分。从裂解物离心回收的不溶性离心沉淀用20mM磷酸钠/500mMNaCl(pH 7.4)洗涤。用超声处理将该沉淀再溶解于在20mM磷酸钠/500mM NaCl(pH 7.4)中的6.0M盐酸胍中，随后在37度下温育1-2小时。将再溶解的沉淀过滤至0.45μm并上样到用20mM磷酸钠/500M NaCl/6.0M胍(pH7.4)缓冲液平衡的Histrap柱上。在上样之后，用另外25CV的相同缓冲液洗涤柱。用溶于20mM磷酸钠/500mM NaCl/6.0M胍-HCl(pH 7.4)的50mM咪唑洗脱结合的蛋白质。对50mM乙酸钠/150mM NaCl(pH 4.5)透析以使纯化的蛋白质再折叠。

基于纤连蛋白的支架蛋白的可溶性结合物的中等规模表达和纯化

对于可溶性克隆的表达，将克隆连同后随的HIS₆标签克隆到pET9d(EMDBioscience，San Diego，CA)载体中，并在大肠杆菌HMS174细胞中表达。使用20ml的一个接种培养物(从铺板的单个菌落产生)接种1升含有50μg/ml羧苄青霉素和34μg/ml氯霉素的LB培养基。使培养物在37℃生长直到A₆₀₀为0.6-1.0。在用1mM异丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导之后，使培养物在30℃生长4小时，通过在＞10,000g下在4℃离心30分钟收获培养物。在-80℃下冷冻细胞沉淀。使用均质器(IKA works)将细胞沉淀再悬浮于在冰上的25ml裂解缓冲液(20mM NaH₂PO₂、0.5M NaCl、1x Complete^TM无EDTA蛋白酶抑制剂混合物(Roche)(Roche)、1mM PMSF，pH 7.4)中。通过使用M-1 10S型(Microfluidics)进行高压均质化(＞18,000psi)实现细胞裂解。通过在4℃下以23,300g离心30分钟来分离可溶部分。经由0.45μm过滤器使上清液澄清。将澄清的裂解物上样到用20mM磷酸钠/500M NaCl(pH 7.4)预平衡的Histrap柱(GE)上。然后用25柱体积的相同缓冲液、之后20柱体积的20mM磷酸钠/500mM NaCl/25mM咪唑(pH 7.4)、随后35柱体积的20mM磷酸钠/500M NaCl/40mM咪唑(pH 7.4)洗涤柱。用15柱体积的20mM磷酸钠/500mM NaCl/500mM咪唑(pH 7.4)洗脱蛋白质，根据A280下的吸光度合并各部分并针对lx PBS、50mM Tris、150mM NaCl(pH 8.5)或50mM NaOAc、150mM NaCl(pH 4.5)进行透析。通过在0.22μm过滤去除任何沉淀。

实施例1：基于结合血清白蛋白的亲本南环(CD环)的结合物的筛选

第一代基于北极的血清白蛋白结合性Adnectin(SABA)不与小鼠和大鼠血清白蛋白结合，对于跨物种的血清白蛋白不具备高亲和力，并且在多价基于¹⁰Fn3的平台中并不总是相容，为了在其基础上进行改进，使用如下文所述的mRNA展示法筛选了具有修饰的CD环序列的第二代基于南极的血清白蛋白结合性Adnectin (PKE2Adnectin)。

利用mRNA展示法(Xu等人，Chem Biol 2002；9：933-42)筛选出包含修饰的¹⁰Fn3结构域的基于CD环的结合物多肽的文库与人血清白蛋白(HSA)结合的能力。CD环结合物被设计为具有不同CD环长度，至多达+7个氨基酸，而¹⁰Fn3序列的其余部分仍然是野生型。通过qPCR检测靶结合，并且当观察到特异性结合信号时克隆群体并在大肠杆菌中表达。

实施例2：与Rh-SA和MSA交叉反应的能够结合HSA的CD环结合物的鉴定

使用直接结合ELISA格式来鉴定在实施例1中生成的并且结合HSA并与恒河猴血清白蛋白(Rh-SA)和/或小鼠血清白蛋白(MSA)交叉反应的CD环结合物。用10μg/mL的HSA、Rh-SA、或MSA的任一者包被MaxiSorp^rM ELISA平板，在1μM测试纯化的CD环结合物。经由HRP偶联的抗组氨酸mAb(R&D Systems)和TMB检测试剂(BD Biosciences)检测结合的Adnectin。如下文所述利用Biacore证实ELISA结果。对于在ELISA实验中鉴定为与Rh-SA和/或MSA交叉反应(＞2X背景)的CD环结合物，通过SEC分析其聚集，以证明该结合是由于单体所致——正如稳定的、良好折叠的蛋白质所预期的那样。如下文所述通过差示扫描量热法(DSC)证实该蛋白质的稳定性。

鉴定的一个克隆在本文中称为2270_C01，具有如下氨基酸序列：

MASTSGVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGWQVQMYSDWGPLYIYKEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGSGESPASSKPISINYRTEGDKPSQHHHHHH(2270_C01；SEQ ID NO：23)

CD环加下划线。AB、BC、DE、EF、和FG环具有与野生型人¹⁰Fn3结构域(SEQ ID NO：1)相同的序列。在中等规模2270_C01上进行大小排阻色谱法和DSC分析，以证实单体性，并确定热稳定性。

在从中等规模过程生成的2270_C01上进行标准大小排阻色谱(SEC)。使用Superdex 200 10/30或在Agilent 1100或1200HPLC系统上的Superdex 75 10/30柱(GEHealthcare)上进行中等规模材料的SEC，在A214nm和A280nm进行UV检测，并进行荧光检测(激发＝280nM，发射＝350nm)。SEC柱采用适当流速的pH 6.8的100mM硫酸钠、100mM磷酸钠、150mM氯化钠的缓冲液。分子量校准使用凝胶过滤标准品(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)。如表2中所示，2270_C01主要为单体(98％单体)。

进行中等规模的Adnectin的差示扫描量热法(DSC)分析来确定其对应的T_m。在VP-毛细管差示扫描量热仪(GE Microcal)中在70p.s.i压力下扫描0.5mg/ml溶液，温度以每分钟1度的速率从15℃逐渐上升到110℃。数据使用Origin Software(OriginLab Corp)利用最佳拟合进行分析，用适当缓冲液对照运行作为比照。如表2中所示，2270_C01的Tm为64℃。

为了确定与人、恒河猴、和小鼠血清白蛋白的结合动力学，并且确定结合是否在生理pH和内体pH保持，利用NHS/EDC偶联将对应的血清白蛋白固定在Biacore CM5芯片上，至约1200RU的表面密度。将一定浓度范围(0.25nM-5μM)的2270_C01施加到固定的白蛋白，其中2270_C01处于HBS-P+(0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、0.05％v/v表面活性剂P-20)或乙酸盐(0.02mM乙酸钠pH 5.5、0.15M NaCl、0.05％v/v表面活性剂P-20)运行缓冲液中。动力学测量使用3分钟缔合相与6-10分钟解离相。使用Biaevaluation软件将减去了参比的传感图的动力学轨迹拟合为1∶1结合模型。如表1中所示，2270_C01在中性pH和低pH时以等同的亲和力与每个种类的白蛋白结合，然而对于小鼠白蛋白的亲和力为与人或恒河猴白蛋白的结合亲和力的大约1/10。

表1：相比于HuSA和RhSA，2270_C01在pH 7.4和5.5与MuSA结合的结合速率略微更快、且解离速率显著更快

为了改进2270_C01的特性，即计算机预测的免疫原性，通过mRNA展示进行2270_C01序列优化。从这种优化产生的Adnectin在本文中称为PKE2Adnectin。

实施例3：具有进一步修饰的CD环的2270_C01后代Adnectin：PKE2Adnectin的生成

利用定制设计的文库，通过mRNA展示对2270_C01序列进行优化以降低潜在的免疫原性，筛选所述序列在mRNA展示过程中与人和小鼠血清白蛋白两者的结合，以获得保留跨物种白蛋白结合，且免疫原性更低的后代分子。评价生成序列的计算机预测的免疫原性，仅将计算机免疫原性评分低于预定截止值的克隆进一步通过HTPP产生蛋白质。通过HTPP纯化生成的Adnectin，并通过如上文所述的直接结合ELISA和SEC-HPLC进行筛选

在2270_C01后代的筛选中获得并经过测试的308种PKE2Adnectin中，就计算机预测的免疫原性、通过SEC确定的单体性、以及通过直接结合ELISA确定的与来自各个物种的血清白蛋白的结合而言，下列25种是表现最佳的分子。通过如上文所述的SPR分析最佳候选者的亲和力测定结果。

实施例4：PKE2Adnectin的生物物理学性质

两种PKE2Adnectin——2629_E06和2630_D02，在实施例3中筛选中鉴定为表现良好，如上文所述对它们进行大小排阻色谱法(SEC)。如表2中所示，两种PKE2分子都大多是单体。

如上文所述对两种PKE2Adnectin进行差示扫描量热法(DSC)分析来确定其对应的T_m。如表2中所示，2629_E06和2630_D02的T_M分别为56℃和57℃。

表2

实施例5：PKE2Adnectin与各个物种的血清白蛋白的结合的表征

如上所述确定2629_E06和2630_D02、以及第一代基于北极的血清白蛋白结合性Adnectin——1318_H04与血清白蛋白的结合动力学。另外，在pH 5.5到pH 7.4范围的不同pH条件下进行了与白蛋白的结合。2629_E06和2630_D02均未显示出与人、恒河猴、或小鼠血清白蛋白的pH依赖性结合，提示它们在内体中会保持结合。如表3中所示，相对于2629_E06和2630_D02，1318_H04与人、食蟹猴、和恒河猴血清白蛋白的亲和力较低，并且不与小鼠或大鼠血清白蛋白结合。而且，相对于人血清白蛋白，1318_H04对于恒河猴血清白蛋白展现的亲和力为十分之一，而PKE2Adnectin对于不同白蛋白种类的亲和力是相对等同的。

相对于1318_H04，2629_E06和2630_D02这两种PKE2Adnectin对于所有测试血清白蛋白都显示出显著更高的亲和力，正如上文论述，其中对人、食蟹猴、恒河猴、和小鼠血清白蛋白的K_D都处于低纳摩尔范围。2629_E06对于大鼠血清白蛋白也展现出低纳摩尔范围的K_D，并且2630_D02对于大鼠血清白蛋白展现出200nM的K_D。

表3.

实施例6：PKE2Adnectin与hFcRn竞争结合HSA

考虑到抑制HSA与hFcRn受体结合会阻止HSA经由hFcRn的再循环，并缩短HSA的长半衰期，由此可能降低药代动力学增强的幅度，使用竞争性α筛选测试了PKE2Adnectin与hFcRn竞争结合HSA的水平，描绘在图1中。将Adnectin连续稀释在测定缓冲液(50mM乙酸盐/150mM NaCl/0.1％吐温-20，pH 5.5，+0.005％止泡剂-204)中，获得期望的最终测定浓度范围。制备在测定缓冲液中的蛋白质和AlphaScreen珠子的主预混物，获得下述最终测定浓度：hFcRn-GST(BMS)6.5nM、生物素化的人血清白蛋白(Abcam)30nM、AlphaScreen链霉亲和素供体珠和AlphaLISA谷胱甘肽受体珠(Perkin Elmer)各5μg/ml。将10μl/孔的连续稀释的Adnectin，随后10μl/孔的蛋白质+珠子溶液，添加到384孔小容量测定板(Greiner Bio-one)中。AlphaScreen珠，以及所有向测定板上的转移都避免环境光。用粘性密封箔密封测定板，并在室温振摇下温育2-2.5小时。在Synergy 4酶标仪(Biotek)中读取所述板，其中激发波长为570nm，发射波长为680nm。来自没有Adnectin的对照孔的平均信号设置为0％抑制，相对于该信号计算出FcRn-HSA相互作用的抑制百分比；从所有数据点减除来自没有生物素化HSA的对照孔的平均背景信号。

表4和图2显示了筛选的结果。值得注意的是，1318_H04比第二代亲本2270_C01Adnectin以及PKE2 2629_E06和2630_D02Adnectin更强地与hFcRn竞争结合HSA，表明PKE2Adnectin相对于1318_H04可提供改进的PK增强。

而且，通过SPR确定了HSA上被1318_H04、2629_E06、和2630_D02结合的结构域。如表4中所示，1318_H04Adnectin与HSA的结构域I结合，而2270_C01、2629_E06、和2630_D02与HSA的结构域I-II而不仅仅与结构域I结合，表明1318_H04和PKE2Adnectin与HSA上的不同表位结合。表4中的Adnectin都不与HSA的结构域III结合，HSA的结构域III是HSA与FcRn的重要相互作用位点。

表4.

*剂量反应到2μM亦未饱和，尽管抑制百分比(即，对hFcRn与HSA结合的抑制)为约80％

实施例7：候选PKE2Adnectin的体内半衰期

制备、纯化了PKE2Adnectin 2629_E06和2630_D02，并去除内毒素。2629_E06或2630_D02以1mg/kg注射到野生型小鼠(n＝3/组)的尾静脉中，使用一种基于定量ELISA的测定法(为检测血浆样品中的Adnectin而建立的)来确定在注射后以一定时间间隔取得的血液样品中的浓度。具体地说，使用Meso Scale技术平台或标准比色ELISA测量了小鼠血浆中的Adnectin药物水平。经由抗His mAb(BMS)捕获2629_E06和2630_D02，并且使用针对Adnectin支架的兔抗血清联合山羊抗兔HRP偶联pAb进行检测。或者，经由与Adnectin结合的物种特异性白蛋白和具有磺酸标签的物种特异性抗白蛋白二级pAb来检测它们。利用Phoenix WinNonlin软件，使用非房室模型确定每种Adnectin的药代动力学参数。

如图3和表5中所示比较2629_E06和2630_D02的药代动力学概貌。2629_E06在小鼠血浆中的半衰期为33-41小时，而2630_D02的半衰期为35-39小时。

表5.

实施例8：PKE2Adnectin的免疫原性

使用Epimatrix软件(Epivax)评估HLA结合的计算机预测。评分比较显示在表6中。PKE2Adnectin 2629_E06和2630_D09相对于2270_C01显示出降低的计算机评分。另外，评价了响应于1318_H04、2270_C01和PKE2Adnectin的CD4+T细胞的体外增殖，作为潜在人免疫原性的离体评估。利用Ficoll密度梯度法从获自40位与一般群体的MHC II类匹配的独立供体的全血中分离外周血单核细胞(PBMC)。分离来自每个供体的细胞之后，将其储存在液体N2中，并在使用之前解冻。用荧光染料羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记来自每个供体的细胞，并用感兴趣的Adnectin在37℃温育7天。用抗CD4抗体标记T细胞，并使用BD FACSCanto和FlowJo分析软件通过流式细胞术评估增殖。计算显示CD4+增殖显著增加的供体的百分比来表示蛋白质的抗原性。

亲本2270_C01及其两个后代2629_E06或2630_D02的比较揭示亲本分子具有更高的抗原性(图4和表6)，表明两个后代PKE2Adnectin相对于亲本分子显示出降低的免疫原性潜能。

表6.

实施例9：PKE2Adnectin的单半胱氨酸突变体对结合白蛋白的影响

在PKE-2Adnectin的不同于HSA结合残基的位点处组入单个半胱氨酸残基，以便于通过标准马来酰亚胺化学作用来化学偶联感兴趣的治疗分子。在半胱氨酸突变的背景下保留与血清白蛋白的结合(由此增强PK)是重要的，因此使用2629_E06作为突变基础测试了这些突变对与各个物种的血清白蛋白结合的影响。通过基于SPR的测定在250nM分析每个突变体的解离速率(k_off)，其中白蛋白被固定，并以Adnectin用作分析物。如表7中所示，在不同物种中，在2629_E06中导入单个半胱氨酸突变后显示的血清白蛋白解离的速率均与亲本2629_E06分子相似，表明在这些具体突变的背景下与血清白蛋白的结合被保留。因此，这些半胱氨酸突变体的任一者均可用作感兴趣治疗分子的化学偶联伴侣，并提供PK增强。

表7.

实施例10：2629_E06的单半胱氨酸突变体的生物物理学特性

评估了在实施例9中描述的单半胱氨酸突变体的生物物理学特性，显示在表8中。每个突变体都产生了热稳定的、单体性的蛋白。

表8.

实施例11：PKE2Adnectin串联分子的模块性

北极血清白蛋白结合性Adnectin的局限性之一是缺乏与其他¹⁰Fn3蛋白串联使用的相容性。因此，探索了PKE2Adnectin与其他¹⁰Fn3蛋白的相容性。测试了PKE2Adnectin在与特异性针对不同靶标的Adnectin串联融合时的生物物理学行为。测试了PKE2Adnectin的两种可能构型：在N端位置(PKE2-X)、和在C端位置(X-PKE2)。使用通过HTPP方法获得的分子测试了大小排阻色谱行为。将第一代基于北极的1318_H04Adnectin的融合物与PKE2Adnectin——2629_E06和2630_D02的融合物直接比较。测试的融合伴侣包括：结合肌肉生长抑制素的¹⁰Fn3结构域(2987_H07；参见WO2014/043344)、两种结合PCSK9的¹⁰Fn3结构域(2013_E01和2382_D09)、和结合EGFR的¹⁰Fn3结构域(1312_E01)。2382_D09和2013_E01这两种PCSK9Adnectin的序列可在WO2011/130354中找到，将该专利通过提述并入本文。图表9中所示，两种PKE2Adnectin分子都一致地保留了良好的生物物理学行为，反映在串联Adnectin的背景下相对于基于北极的1318H04SABA分子SEC评级为A(即，相应于≥90％单体Adnectin)的分子的比例。在该表中的PKE是指血清白蛋白结合性¹⁰Fn3结构域(即，增强PK的¹⁰Fn3结构域)。比值代表了具有SEC＝A的克隆数/测试的总克隆数。未生成的串联表示为“-”。

表9.

图5中的数据再现了表9中结合2987_H07肌肉生长抑制素的¹⁰Fn3结构域和结合2013_E01PCSK9的¹⁰Fn3结构域的数据，只是灰色的不同深浅反映了串联分子仍然与HSA结合的能力，如在上述直接结合ELISA测定中所确定的。在图5中的不同深浅的灰色对应于与HSA结合的不同EC₅₀_串联Adnectin/EC₅₀_单Adnectin的比率，其中深浅越深代表串联分子与HSA的结合越强。图5中的数据显示，基于PKE2的串联分子相对于1318_H04Adnectin具有更好的单体性(即，更不易二聚化和聚集)和HSA结合(即，丧失较少的HSA和RhSA结合)。对于四种另外的结合靶标的Adnectin观察到相似的模式。这些数据指示，相比于北极血清白蛋白结合性Adnectin，PKE2Adnectin对其他¹⁰Fn3蛋白提供了更稳定和更具活性的结合伴侣。

实施例12：PCSK9-PKE2串联分子在PCSK9生物化学测定中展现出良好的效能、低EpiMatrix评分、良好的生物物理学特性和跨物种白蛋白结合

基于PKE2Adnectin 2629_E06和PCSK9Adnectin2382_D09，产生了各种PCSK9-PKE2串联Adnectin，如表10中所示。每个串联分子仅有接头不同，并且均经过生物物理学和功能特性的测试，以确保它们保留结合白蛋白的PKE2、亦结合PCSK9的Adnectin的活性。利用上述ELISA法确定了跨物种白蛋白结合。通过热扫描荧光(TSF)评估了相对热稳定性。HTPP样品对PBS中0.2mg/ml标准化。1μl的Sypro橙色染料用PBS以1∶40稀释，添加至25μl的各样品，用透明的96孔微孔板密封胶密封所述板。使用BioRad RT-PCR机扫描样品，使温度从25℃以每分钟2度的速率逐渐上升到95℃。使用BioRad CFX manager 2.0软件分析数据。通过TSF获得的值已经证实与通过DSC在40℃到70℃的熔融范围获得的Tm值良好关联。这被认为是本项技术可接受的工作范围。当过渡曲线的斜率太小而不允许将其导数峰(随着时间的荧光的变化速率)与噪音区分时，获得ND(“无数据”)结果。

使用在杆状病毒中表达的重组人PCSK9和合成的40-mer EGFA肽(生物素化)，PCSK9：EGFA FRET测定测量了PCSK9与低密度脂蛋白受体(LDLR)表皮生长因子前体同源结构域(EGFA结构域)的结合的抑制。已经证明EGFA是LDLR与PCSK9相互作用的关键结构域(Kwon，H.J.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，105(6)：1820-1825(2008))。这种测定利用标记有Eu螯合物的结合PCSK9C端结构域的mAb(mAb 4H5)，以通过链霉亲和素/别藻蓝蛋白荧光团复合物提供与生物素化EGFA的FRET相互作用。利用LDLR的细胞外结构域代替EGFA肽以相似的方式运行PCSK9-LDLR FRET测定。

所有串联分子均具有低免疫原性(负的Epimatrix评分)、高单体性(如通过SEC评估的)、可接受的相对热稳定性(TSF)、和通过ELISA测定有利的跨物种白蛋白结合。而且，PCSK9-PKE2串联Adnectin在PCSK9生物化学测定中保留了良好的效能，其IC₅₀类似于未格式化的2382_D09Adnectin。

表10.

实施例13：PCSK9-PKE2串联分子与人PCSK9的结合动力学

通过生物层干涉测量法(Octet Red 96，利用超级链霉亲和素传感器尖端(Superstreptavidin sensor tip)，ForteBio，Menlo Park CA)，测量了PCSK9-PKE2串联Adnectin与固定的人PCSK9在有或无HSA存在下的结合。利用捕获在传感器尖端上的生物素化的全长PCSK9，针对一系列Adnectin浓度，实时捕获了缔合和解离事件。对结合曲线进行全局拟合以产生K_D、k_on、和k_off的值。

通过温育过量的串联物，并在过量HSA的存在下运行结合分析，预先形成了串联Adnectin-HSA复合物。当在相同的浓度HSA的存在下，串联Adnectin的表观质量增加时，认为串联Adnectin-HSA复合物与人PSCK9之间已经形成了复合物(参见，例如，图6)。如表11中所示，所有测试的串联PCSK9-PKE2分子均具有相似的对PCSK9的结合动力学和效能。对于与huPCSK9结合的HSA-Adnectin复合物，可见轻微的缔合降低和略微更快的解离。

表11.

实施例14：PCSK9-PKE2串联分子与多个物种血清白蛋白的结合的表征

通过Biacore分析评估PCSK9-PKE2串联分子对于多个物种的血清白蛋白的亲和力、连同PKE2Adnectin 2629_E06的亲和力，如实施例2中描述。

如表12中所示，所有三种PCSK9-PKE2串联分子显示出相当的与跨物种血清白蛋白的亲和力，尽管串联物的亲和力比2629_E06PKE2Adnectin弱5-7倍(具有相似的解离速率)。

表12.

用没有6X组氨酸尾的4472_C06串联Adnectin(称为5190_E01)进行了相似的实验(在实施例2中描述的条件下)。如表13中所示，5190_E01以类似于与人、食蟹猴、和恒河猴血清白蛋白结合的K_D与小鼠血清白蛋白结合，并以200nM的K_D与大鼠血清白蛋白结合。

表13.

测试了pH对结合PKE2Adnectin 2629_E06以及PCSK9-PKE2串联Adnectin 4472_C06、4427_E06、和4472_F08的影响。如表14和15中所示，所有测试的Adnectin都显示出与各个物种血清白蛋白的pH不敏感结合。

表14.

表15.

实施例15：串联PCSK9-PKE2Adnectin与白蛋白和PCSK9的双重结合

使用SPR评估了串联PCSK9-PKE2Adnectin同时结合血清白蛋白和PCSK9的能力。很可能的是，串联物在体内大部分时间会与白蛋白结合，因此，PCSK9Adnectin与白蛋白结合时保留活性是必需的。以双注入模式测试串联PCSK9-PKE2Adnectin与两种靶标的同时结合，其中第一次将串联物注入到芯片表面上固定的白蛋白上，随后第二次注入人PCSK9，并记录在每次注入3分钟缔合相之后的结合水平。PCSK9相对于缓冲液在注入之后SPR结合信号增加指示串联物与HSA和PCSK9的同时结合，如图7中所示。PCSK9与预先结合HSA的500nM或1μM串联Adnectin显示出预期结合水平的约40％。作为另外的对照，PCSK9与单独的PKE-2未显示出结合(数据未显示)。

实施例16：PCSK9-PKE2Adnectin在WTC57BL/6小鼠中的体内清除

在野生型C57B1/6小鼠的2周单次2mg/kg IV给药研究中，确定了串联PCSK9-PKE2Adnectin4772_C06的体内半衰期。利用MesoScale Discovery平台确定串联Adnectin血浆水平。使用生物素化人PCSK9来捕获Adnectin，并通过与串联物结合的小鼠血清白蛋白和具有磺酸标签的(sulfo-tagged)抗小鼠血清白蛋白二级pAb进行检测。使用血浆模型和线性上调/对数下调计算方法，利用Phoenix WinNonlin 6.3(Pharsight Corporation，Mountain View，CA)进行非房室分析。如表16和图8中所示，4772_C06串联Adnectin的平均半衰期为16.7小时。

表16.

实施例17：PCSK9-PKE2串联Adnectin展现出强的PCSK9体内靶接合

在展现出正常的人PCSK9水平的人PCSK9转基因小鼠模型中评估了PCSK9-PKE2串联Adnectin 4472_C06的药效学活性。这个模型是基因组hPCSK9转基因(BAC-转基因)的，其在肝脏中的调节与小鼠PCSK9相似，并且在血浆中以接近于人的正常水平表达hPCSK9。在PBS载体或0.5或2mg/kg串联物(每组8只动物)单次IP给药之后，评估未结合的hPCSK9。开发了一种酶联免疫吸附测定(ELISA)，其对游离(未结合)人PCSK9特异，而不检测小鼠PCSK9。该测定采用的链霉亲和素预处理96孔板用作为捕获剂的2μg/mL生物素化PCSK9-Adnectin2013_E01进行包被。仅冷冻一次的血浆样品视需要在ELISA缓冲液(25mM Tris、150mM NaCl，pH 7.2，具有0.05％Tween-20和0.1％BSA)中稀释一次，加入孔中并在20℃温育1小时。然后洗涤所述孔，并与5μg/mL的兔多克隆抗人PCSK9IgG(由Lampire BiologicalLabs生产的BMS定制抗体，Pipersville PA)温育1小时，随后通过标准ELISA方法用TMB加工HRP标记的抗兔IgG。使用纯化的重组人PCSK9生成标准曲线。

如图9中所示，游离hPCSK9水平的分析指示在两个测试剂量下PCSK9-PKE2串联Adnectin的强有力的靶接合。游离hPCSK9以剂量依赖性的方式被抑制，表现在2mg/kg剂量的反应比0.5mg/kg剂量更持久。这些数据证实了PCSK9-PKE2串联Adnectin的体内活性。

实施例18：PKE2单Adnectin和串联PCSK9-PKE2Adnectin在食蟹猴中的体内半衰期

在正常的瘦雌性食蟹猴中进行单剂量PK/PD研究，比较摩尔剂量等价的PKE2单Adnectin与聚乙二醇化PCSK9Adnectin参比物的PCSK9-PKE2串联物，如下列表17中的阴影部分指示。向食蟹猴以指示的浓度和途径(参见表17和图10)施用PKE2Adnectin 2629_E06或PCSK9-PKE2串联5190_E01Adnectin、或聚乙二醇化PCSK9Adnectin(称为ATI-1476)作为参比物，以一定的时间间隔采集血浆(K2EDTA)和血清样品用于药代动力学和药效学评估。使用Meso Scale技术平台测量食蟹猴血浆中的Adnectin药物水平。通过抗His mAb(BMS)捕获2629_E06，并使用与Adnectin结合的食蟹猴血清白蛋白和具有磺酸标签的(sulfo-tagged)抗食蟹猴血清白蛋白二级pAb进行检测。对于串联分析，使用生物素化人PCSK9来捕获Adnectin，并如上所述通过食蟹猴白蛋白进行检测。经由生物素化hPCSK9捕获聚乙二醇化Adnectin ATI-1476，并经由与具有硫标签的(sulfo-tagged)羊抗兔pAb结合的抗PEGmAb(Epitomics)进行检测。使用血浆模型和线性上调/对数下调计算方法，利用PhoenixWinNonlin 6.3(Pharsight Corporation，Mountain View,CA)进行非房室分析。

如表17中所示，2629_E06和ATI-1476的血浆半衰期同为112小时。5190-E01的半衰期比PKE2单Adnectin的半衰期短，并且在静脉给药之后60-82小时的范围内。5190_E01在3到10mg/kg的静脉剂量之间展现出与剂量成正比的暴露(AUC_全比率为1.02)。对于测试的所有蛋白质，分布容积小于血浆容量，表明PCSK9-PKE2串联Adnectin和聚乙二醇化Adnectin的分布别主要限于血管空间。清除率总的来说是低的，且在不同的剂量和形式之间是相当的。5190_E01串联Adnectin的皮下生物利用度为41-49％。

表17.

在另一独立研究中，还测试了亲本2270_C01Adnectin在食蟹猴中的药代动力学。如上文对于小鼠PK研究的描述对Adnectin药物水平定量。如表18和图11中所示，在以1mg/kg单次IV推注给药之后，2270_C01Adnectin具有83.5小时的半衰期。

表18.

实施例19：串联PCSK9-PKE2Adnectin作为食蟹猴中的PCSK9抑制剂起作用

评价了上述食蟹猴PK/PD研究的抑制性PCSK9的药效学作用。建立了对食蟹猴PCSK9特异的酶联免疫吸附测定(ELISA)。该游离(未结合)PCSK9测定采用了Meso ScaleDiscovery平台，并纳入用2μg/mL的生物素化PCSK9-Adnectin 2013_E01作为捕获剂进行包被的链霉亲和素预处理的96孔MSD板。将样品用封闭性和具有磺酸标签的(sulfo-tagged)兔多克隆抗人PCSK9IgG(由Lampire Biological Labs生产的BMS定制抗体，PipersvillePA)以1∶4稀释，加入孔中，并在室温下温育10分钟。然后使用MSD 2X读取缓冲液(readbuffer)洗涤所述孔并进行读取。总PCSK9ELISA测定类似于如上所述进行，不同之处在于使用mAb-4H5(由Lampire Biological Labs生产的BMS定制抗体，Pipersville PA)作为捕获抗体，且检测步骤与捕获步骤分开进行。mAb-4H5结合PCSK9的C端结构域，并且当结合到96孔板上时，高效地捕获总PCSK9(Adnectin-PCSK9复合物加上游离PCSK9)。PCSK9的捕获和检测步骤温育1小时。使用纯化的重组人或食蟹猴PCSK9生成标准曲线。

在Siemens Advia 1800Clinical Chemistry System上利用标准化酶促程序测定血清分析物。通过直接LDL法(Roche Diagnostics)测定LDL-胆固醇。其他测试的分析物为：天冬氨酸转氨酶；丙氨酸转氨酶；碱性磷酸酶；γ谷氨酰转移酶；总胆红素；血尿素氮；肌酐；总胆固醇；甘油三酯(trigylceride)；高密度脂蛋白；低密度脂蛋白；葡萄糖；总蛋白；白蛋白；球蛋白；白蛋白/球蛋白比；钙；无机磷；钠；钾；氯化物。

如图12中所示，5190_E01引发了对未结合/游离PCSK9、总PCSK9和LDL-c的药效学作用，这种药效学作用先前已经用其他PCSK9Adnectin抑制剂观察到。具体地说，观察到迅速的靶接合，其中游离PCSK9在给药1小时之内急速跌至不可检测的水平。作为PCSK9抑制的结果，LDL-c下降到约50％基线，其中在2-5天的时间框内观察到最大抑制。另外，总PCSK9随着PCSK9-PKE2Adnectin：PCSK9复合物的累积而上升。一旦复合物解离且药物被清除，PCSK9和LDL-c水平在研究进行约第15天后返回到基线。用聚乙二醇化PCSK9Adnectin参比物观察到相似的趋势。如图13中所示，5190_E01在聚乙二醇化PCSK9Adnectin参比物的等效摩尔剂量10mg/kg下展示出相似的强LDL-c降低作用。

实施例20：PCSK9靶接合的剂量依赖性

以3和10mg/kg剂量的5190_E01观察到游离PCSK9抑制作用的剂量依赖性应答，如图14中所示。10mg/kg剂量比3mg/kg剂量展现出更长的PCSK9靶接合持续时间。该图还展示，等效摩尔剂量的串联Adnectin和聚乙二醇化Adnectin有等效的PCSK9靶接合。正如预期的那样，2629_E06并不调节游离PCSK9；在游离PCSK9中观察到的任何变化很可能是由于昼夜节律和基线变异性所致。

图15展示了串联和聚乙二醇化PCSK9Adnectin对总PCSK9的影响的差异。尽管一般趋势相同，但相对于聚乙二醇化PCSK9Adnectin参比物，在5190_E01给药的食蟹猴中总PCSK9达到峰值和返回到基线更加迅速，表明根据所采用的PK增强方法不同(串联物为肾脏清除；聚乙二醇化Adnectin为巨噬细胞摄取)，PCSK9：Adnectin药物复合物的清除机制不同。同样，在这个测定中，2629_E06如所预期的那样没有显示出药效学作用。

实施例21：串联形式相对于各组分展现等效的体外免疫原性反应

使用T细胞增殖测定体外评估了几种串联PCSK9-PKE2Adnectin的潜在免疫原性，如实施例8中所述。

如图16中所示，对串联Adnectin的免疫原性反应的百分比和幅度类似于单Adnectin组分(即，PCSK9或PKE2；图16的中间)。这些结果表明串联Adnectin相对于单Adnectin极少/没有额外的免疫原性风险。另外，观察了对串联物的增殖反应的差异因连接PCSK9和PKE2Adnectin的接头序列而变化。相对于4472_F08和4472_E06串联PCSK9-PKE2Adnectin，4472_C06串联Adnectin显示出最低的免疫原性。观察到的这些差异的一个可能机制是，T细胞响应于接头序列对蛋白质加工的差异。

4472_C06性质的总结示于下文表19中。

表19.

示例性实施方案

1.一种包含纤连蛋白III型第十结构域(¹⁰Fn3)的多肽，其中¹⁰Fn3结构域包含：a)AB、BC、CD、DE、EF、和FG环，b)具有相对于人¹⁰Fn3结构域的相应CD环的序列改变的氨基酸序列的CD环，并且c)其中该多肽以小于500nM的K_D与人血清白蛋白结合。

2.实施方案1的多肽，其中所述¹⁰Fn3结构域进一步与恒河猴血清白蛋白、食蟹猴血清白蛋白、小鼠血清白蛋白、和大鼠血清白蛋白中的一者或多者结合。

3.实施方案2的多肽，其中所述¹⁰Fn3结构域与恒河猴血清白蛋白和食蟹猴血清白蛋白结合。

4.实施方案3的多肽，其中所述¹⁰Fn3结构域以小于500nM的K_D与恒河猴血清白蛋白和食蟹猴血清白蛋白结合。

5.实施方案4的多肽，其中所述¹⁰Fn3结构域以小于100nM的K_D与恒河猴血清白蛋白和食蟹猴血清白蛋白结合。

6.实施方案5的多肽，其中所述¹⁰Fn3结构域以小于10nM的K_D与恒河猴血清白蛋白和食蟹猴血清白蛋白结合。

7.以上实施方案中任一项的多肽，其中¹⁰Fn3结构域与小鼠和大鼠血清白蛋白结合。

8.实施方案7的多肽，其中所述¹⁰Fn3结构域以小于500nM的K_D与恒河猴血清白蛋白和食蟹猴血清白蛋白结合。

9.实施方案8的多肽，其中所述¹⁰Fn3结构域以小于100nM的K_D与恒河猴血清白蛋白和食蟹猴血清白蛋白结合。

10.实施方案9的多肽，其中所述¹⁰Fn3结构域以小于10nM的K_D与恒河猴血清白蛋白和食蟹猴血清白蛋白结合。

11.以上实施方案中任一项的多肽，其中所述¹⁰Fn3结构域在5.5到7.4的pH范围与血清白蛋白结合。

12.以上实施方案中任一项的多肽，其中所述¹⁰Fn3结构域与HSA的结构域I-II结合。

13.以上实施方案中任一项的多肽，其中该多肽在人血清白蛋白的存在下的血清半衰期为至少30小时。

14.以上实施方案中任一项的多肽，其中该CD环包含根据式G-X₁-X₂-V-X₃-X₄-X₅-S-X₆-X₇-G-X₈-X₉-Y-X₁₀-X₁₁-X₁₂-E的氨基酸序列，其中，

(a)X₁选自R或W；

(b)X₂选自H、E、D、Y、或Q；

(c)X₃选自Q或H；

(d)X₄选自I、K、M、Q、L、或V；

(e)X₅选自Y、F、或N；

(f)X₆选自D、V、或E；

(g)X₇选自L、W、或F；

(h)X₈选自P或T；

(i)X₉选自L或M；

(j)X₁₀选自I或V；

(k)X₁₁选自Y或F；并且

(l)X₁₂选自T、S、Q、N、或A。

15.实施方案14的多肽，其中：

(a)X₁是R；

(b)X₂是E；

(c)X₃是Q；

(d)X₄是K；

(e)X₅是Y；

(f)X₆是D；

(g)X₇是L或W；

(h)X₈是P；

(i)X₉是L；

(j)X₁₀是I；

(k)X₁₁是Y；并且

(l)X₁₂是Q或N。

16.实施方案15的多肽，其中X₁₀为L并且X₁₂为Q。

17.实施方案15的多肽，其中X₁₀为W并且X₁₂为N。

18.实施方案14的多肽，其中所述CD环包含选自SEQ ID NO：101-125的氨基酸序列。

19.以上实施方案中任一项的多肽，其中所述CD环包含在SEQ ID NO：106中示出的氨基酸序列。

20.以上实施方案中任一项的多肽，其中该CD环包含在SEQ ID NO：113中示出的氨基酸序列。

21.以上实施方案中任一项的多肽，其中该多肽包含与SEQ ID NO：23-100、184-209和235-260的非CD环区至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。

22.以上实施方案中任一项的多肽，其中该多肽包含与SEQ ID NO：23-100、184-209和235-260中任一项至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。

23.一种包含纤连蛋白III型第十(¹⁰Fn3)结构域和异源蛋白的融合多肽，其中所述¹⁰Fn3结构域包含：a)AB、BC、CD、DE、EF、和FG环，b)具有相对于人¹⁰Fn3结构域的相应CD环的序列改变的氨基酸序列的CD环，并且c)其中该多肽以小于500nM的K_D与人血清白蛋白结合。

24.实施方案23的融合多肽，其中所述¹⁰Fn3结构域包含与SEQ ID NO：23-100、184-209和235-260中任一项至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。

25.实施方案24的融合多肽，其中所述¹⁰Fn3结构域包含与SEQ ID NO：55、81、190或241至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。

26.实施方案25的融合多肽，其中所述¹⁰Fn3结构域包含SEQ ID NO：55、81、190或241的氨基酸序列。

27.实施方案24的融合多肽，其中所述¹⁰Fn3结构域包含与SEQ ID NO：62、88、197或248至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。

28.实施方案27的融合多肽，其中所述¹⁰Fn3结构域包含SEQ ID NO：62、88、197或248的氨基酸序列。

29.实施方案23的融合多肽，其中所述异源蛋白为治疗部分。

30.实施方案23的融合多肽，其中所述异源蛋白为包含¹⁰Fn3结构域的多肽。

31.实施方案30的融合多肽，其中所述¹⁰Fn3结构域与血清白蛋白之外的靶蛋白结合。

32.实施方案31的融合多肽，其中所述¹⁰Fn3结构域与PCSK9结合。

33.实施方案32的融合多肽，其中所述¹⁰Fn3结构域包含与SEQ ID NO：167至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。

34.实施方案33的融合多肽，其中¹⁰Fn3结构域包含SEQ ID NO：167的氨基酸序列。

35.实施方案23的融合多肽，其中该融合多肽包含与SEQ ID NO：168、169或261至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。

36.实施方案35的融合多肽，其中该融合多肽包含在SEQ ID NO：168、169或261中示出的氨基酸序列。

37.实施方案23-36中任一项的融合多肽，其中该多肽在小鼠血清白蛋白存在下的血清半衰期为至少10小时。

38.实施方案23-36中任一项的融合多肽，其中该多肽在食蟹猴血清白蛋白存在下的血清半衰期为至少50小时。

39.一种包含选自下组的氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO：23-125、184-209以及235-260、168、和169。

40.一种组合物，其包含以上实施方案中任一项的多肽和载体。

41.一种分离的核酸分子，其编码实施方案1-39中任一项的多肽。

42.实施方案41的分离的核酸分子，其中该核酸分子具有选自SEQ ID NO：126-151和172的序列，或与SEQ ID NO：126-151和172至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的核苷酸序列。

43.一种表达载体，其包含实施方案41或42的核苷酸序列。

44.一种细胞，其包含实施方案41或42的核酸分子或实施方案43的表达载体的。

45.一种产生实施方案1-39中任一项的多肽的方法，该方法包括在适合于表达所述多肽的条件下培养实施方案44的细胞，并纯化所述多肽。

表20：序列汇总

等效形式

本领域技术人员将认识到、或能够使用不超出常规的实验来确定，本文中描述了本发明的具体实施方案的许多等效形式。这样的等效形式预期被下列权利要求所涵盖。

Claims (20)

1.一种包含纤连蛋白III型第十结构域(¹⁰Fn3)的多肽，其中所述¹⁰Fn3结构域包含：a)AB、BC、CD、DE、EF、和FG环，b)具有相对于人¹⁰Fn3结构域的相应CD环的序列改变的氨基酸序列的CD环，c)其中该多肽以小于500nM的K_D与人血清白蛋白结合，并且d)其中所述¹⁰Fn3结构域进一步以小于500nM、例如小于100nM、或小于10nM的K_D与恒河猴血清白蛋白、食蟹猴血清白蛋白、小鼠血清白蛋白、和大鼠血清白蛋白中的一者或多者结合。

2.权利要求1的多肽，其中所述¹⁰Fn3结构域结合：

a)恒河猴血清白蛋白和食蟹猴血清白蛋白，

b)小鼠血清白蛋白和大鼠血清白蛋白，或

c)恒河猴血清白蛋白、食蟹猴血清白蛋白、小鼠血清白蛋白、和大鼠血清白蛋白。

3.前述权利要求中任一项的多肽，其中所述¹⁰Fn3结构域在5.5到7.4的pH范围与血清白蛋白结合。

4.前述权利要求中任一项的多肽，其中所述¹⁰Fn3结构域与HSA的结构域I-II结合。

5.前述权利要求中任一项的多肽，其中该CD环包含根据式G-X₁-X₂-V-X₃-X₄-X₅-S-X₆-X₇-G-X₈-X₉-Y-X₁₀-X₁₁-X₁₂-E的氨基酸序列，其中，

(a)X₁选自R或W；

(b)X₂选自H、E、D、Y、或Q；

(c)X₃选自Q或H；

(d)X₄选自I、K、M、Q、L、或V；

(e)X₅选自Y、F、或N；

(f)X₆选自D、V、或E；

(g)X₇选自L、W、或F；

(h)X₈选自P或T；

(i)X₉选自L或M；

(j)X₁₀选自I或V；

(k)X₁₁选自Y或F；并且

(l)X₁₂选自T、S、Q、N、或A。

6.权利要求5的多肽，其中所述CD环包含选自SEQ ID NO:106、113、101-105、107-112、和114-125的氨基酸序列。

7.前述权利要求中任一项的多肽，其中该多肽包含与SEQ ID NO:81、88、23-80、82-87、89-100、184-209和235-260的非CD环区至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。

8.前述权利要求中任一项的多肽，其中该多肽包含与SEQ ID NO:81、88、23-80、82-87、89-100、184-209和235-260中任一项至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。

9.一种包含纤连蛋白III型第十结构域(¹⁰Fn3)和异源蛋白的融合多肽，其中所述¹⁰Fn3结构域包含：a)AB、BC、CD、DE、EF、和FG环，b)具有相对于人¹⁰Fn3结构域的相应环的序列改变的氨基酸序列的CD环，c)其中该多肽以小于500nM的K_D与人血清白蛋白结合，并且其中¹⁰Fn3结构域进一步以小于500nM，例如小于100nM、或小于10nM的K_D与恒河猴血清白蛋白、食蟹猴血清白蛋白、小鼠血清白蛋白、和大鼠血清白蛋白中的一者或多者结合。

10.权利要求9的融合多肽，其中该异源蛋白为治疗部分。

11.权利要求9的融合多肽，其中该异源蛋白为包含¹⁰Fn3结构域的多肽。

12.权利要求11的融合多肽，其中所述¹⁰Fn3结构域与血清白蛋白之外的靶蛋白，比如PCSK9结合。

13.权利要求9的融合多肽，其中所述¹⁰Fn3结构域包含与SEQ ID NO:81、88、23-80、82-87、89-100、184-209和235-260至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。

14.一种多肽，其包含选自SEQ ID NO:81、88、23-80、82-87、89-100、168-169、184-209和235-261的氨基酸序列。

15.一种组合物，其包含前述权利要求中任一项的多肽和载体。

16.一种分离的核酸分子，其编码权利要求1-14中任一项的多肽。

17.权利要求16的分离的核酸分子，其中该核酸分子具有选自SEQ ID NO:126-151和172的序列，或与SEQ ID NO:126-151和172至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。

18.一种表达载体，其包含编码权利要求1-14中任一项的多肽的核苷酸序列。

19.一种细胞，其包含权利要求16或17的核酸分子或权利要求18的表达载体。

20.一种产生权利要求1-14中任一项的多肽的方法，该方法包括在适合于表达所述多肽的条件下培养权利要求19的细胞，并纯化所述多肽。