ES2652318T3 - Variantes procedentes de ActRIIB y sus usos - Google Patents

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Abstract

Un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína ActRIIB variante que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos 29-109 de la SEQ ID NO: 2, en la que la proteína comprende un aminoácido ácido en la posición que corresponde a la posición 79 de la SEQ ID NO: 2 y en la que la proteína ActRIIB variante inhibe la señalización por miostatina y/o GDF11 en un ensayo basado en células.

Description

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esquelético en desarrollo y del adulto. La mutación anuladora de GDF8 en ratones transgénicos se caracteriza por una hipertrofia e hiperplasia marcadas del músculo esquelético (McPherron et al., Nature, 1997, 387:83-90). Aumentos similares en la masa muscular esquelética son evidentes en mutaciones de origen natural de GDF8 en el ganado vacuno (Ashmore et al., 1974, Growth, 38:501-507; Swatland y Kieffer, J. Anim. Sci., 1994, 38:752-757; McPherron y Lee, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 1997, 94:12457-12461; y Kambadur et al., Genome Res., 1997, 7:910-915) y, sorprendentemente, en seres humanos (Schuelke et al., N Engl J Med 2004;350:2682-8). Los estudios también han mostrado que la atrofia muscular progresiva asociada con la infección por VIH en seres humanos está acompañada de aumentos en la expresión de proteína GDF8 (Gonzalez-Cadavid et al., PNAS, 1998, 95:14938-43). Además, GDF8 puede modular la producción de enzimas específicas del músculo (p. ej., creatina-cinasa) y modular la proliferación celular de mioblastos (documento WO 00/43781). El polipéptido GDF8 puede unirse de forma no covalente al dímero del dominio GDF8 maduro, inactivando su actividad biológica (Miyazono et al. (1988) J. Biol. Chem., 263: 6407-6415; Wakefield et al. (1988) J. Biol. Chem., 263; 7646-7654; y Brown et al. (1990) Growth Factors, 3: 35-43). Otras proteínas que se unen a GDF8 o proteínas relacionadas estructuralmente con GDF8 y que inhiben su actividad biológica incluyen folistatina y potencialmente, proteínas relacionadas con folistatina (Gamer et al. (1999) Dev. Biol., 208: 222-232).
El factor de diferenciación y crecimiento 11 (GDF11), (también conocido como BMP11), es una proteína segregada (McPherron et al., 1999, Nat. Genet. 22: 260-264). GDF11 se expresa en el esbozo caudal, esbozo de las extremidades, arcos maxilares y mandibulares y ganglios de la raíz posterior durante el desarrollo del ratón (Nakashima et al., 1999, Mech. Dev. 80: 185-189). GDF11 juega un papel exclusivo en la formación de patrones en los tejidos tano mesodérmico como neural (Gamer et al., 1999, Dev Biol., 208:222-32). Se ha demostrado que GDF11 es un regulador negativo de la condrogénesis y la miogénesis en la extremidad del polluelo en desarrollo (Gamer et al., 2001, Dev Biol. 229:407-20). La expresión de GDF11 en músculo también sugiere su papel en la regulación del crecimiento muscular de una forma similar a GDF8. Además, la expresión de GDF11 en cerebro sugiere que GDF11 también puede poseer actividades que se relacionan con la función del sistema nervioso. De forma interesante, se ha encontrado que GDF11 inhibe la neurogénesis en el epitelio olfativo (Wu et al., 2003, Neuron. 37:197-207). Por tanto, GDF11 puede tener aplicaciones in vitro e in vivo en el tratamiento de enfermedades tales como enfermedades musculares y neurodegenerativas (p. ej., esclerosis lateral amiotrófica).
Es bien conocido que la proteína morfogenética ósea (BMP7, por sus siglas en inglés), también llamada proteína osteogénica 1 (OP-1) induce formación de hueso y cartílago. Además, BMP7 regula una amplia gama de procesos fisiológicos. Por ejemplo, BMP7 puede ser el factor osteoinductor responsable del fenómeno de la osteogénesis epitelial. También se ha encontrado que BMP7 juega un papel en la regulación del calcio y en la homeostasis ósea. Al igual que activina, BMP7 se une a los receptores de tipo II, ActRIIA y IIB. Sin embargo, BMP7 y activina reclutan receptores de tipo I distintos en los complejos de receptor heteroméricos. El principal receptor de tipo I de BM7 observado fue ALK2, mientras que activina se unió exclusivamente a ALK4 (ActRIIB). BMP7 y activina provocaron respuestas biológicas distintas y activaron diferentes vías de Smad (Macias-Silva et al., 1998, J Biol Chem. 273:25628-36).
Ciertos polipéptidos ActRIIB (p. ej., polipéptidos ActRIIB solubles) pueden usase para antagonizar la señalización de ligandos ActRIIB, generalmente en cualquier proceso asociado con actividad de ActRIIB. Opcionalmente, los polipéptidos ActRIIB de la invención pueden antagonizar uno o más ligandos de receptores ActRIIB, tales como activina, Nodal, GDF8, GDF11, y BMP7, y pueden ser, por lo tanto, útiles en el tratamiento de trastornos adicionales.
Por lo tanto, pueden usarse polipéptidos ActRIIB para tratar o prevenir enfermedades o afecciones que están asociadas con actividad anómala de un ActRIIB o un ligando ActRIIB. ActRIIB o los ligandos están implicados en la regulación de numerosos procesos biológicos críticos. Debido a sus funciones clave en estos procesos, pueden ser dianas deseables para la intervención terapéutica. Por ejemplo, Pueden usarse polipéptidos ActRIIB (p. ej., polipéptidos ActRIIB solubles) para tratar trastornos o afecciones humanas o animales. Los ejemplos de dichos trastornos o afecciones incluyen, pero no se limitan a, trastornos metabólicos tales como diabetes de tipo 2, alteración de la tolerancia a la glucosa, síndrome metabólico (p. ej., síndrome X) y resistencia a la insulina inducida por traumatismo (p. ej., quemaduras o desequilibrio del nitrógeno); trastornos del tejido adiposo (p. ej., obesidad); trastornos musculares y neuromusculares tales como distrofia muscular (incluyendo la distrofia muscular de Duchenne); esclerosis lateral amiotrófica (ELA); atrofia muscular; atrofia orgánica; debilidad; síndrome del túnel carpiano; enfermedad pulmonar obstructiva crónica; y sarcopenia, caquexia y otros síndromes de atrofia muscular progresiva; Otros ejemplos incluyen osteoporosis, especialmente en la tercera edad y/o en mujeres posmenopáusicas; osteoporosis inducida por glucocorticoides; osteopenia; artrosis; y fracturas relacionadas con osteoporosis. Otros ejemplos adicionales incluyen masa ósea baja debida a glucocorticoterapia crónica, insuficiencia gonadal precoz, supresión de andrógenos, deficiencia de vitamina D, hiperparatiroidismo secundario, deficiencias nutricionales y anorexia nerviosa. Estos trastornos y afecciones se discuten más adelante en "Usos terapéuticos de ejemplo".
Los términos que se usan en esta memoria descriptiva generalmente tienen sus significados ordinarios en la técnica, dentro del contexto de esta invención y en el contexto específico en el que se usa cada término. Ciertos términos se discuten a continuación o en cualquier otra parte en la memoria descriptiva, para proporcionar orientación adicional
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al facultativo para describir las composiciones y métodos de la invención y cómo hacerlos y usarlos. El alcance o significado de cualquier uso de un término será evidente a partir del contexto específico en el que se usa el término.
"Alrededor de" y "aproximadamente" significarán generalmente un grado de error aceptable para la cantidad determinada dada la naturaleza o precisión de las determinaciones. Típicamente, los grados de error de ejemplo están dentro del 20 por ciento (%), preferentemente dentro del 10%, y más preferentemente dentro del 5 % de un valor o intervalo de valores dado.
Como alternativa, y particularmente en los sistemas biológicos, las expresiones "alrededor de" y "aproximadamente" pueden significar valores que están dentro de un orden de magnitud, preferentemente dentro de 5 veces y más preferentemente dentro de 2 veces de un valor dado. Las cantidades numéricas que se dan en el presente documento son aproximadas, a menos que se manifieste otra cosa, significando que puede inferirse la expresión "alrededor de" o "aproximadamente" cuando no se manifieste expresamente.
Los métodos de la invención pueden incluir etapas de comparar secuencias entre sí, incluyendo la secuencia natural con uno o más mutantes (variantes de secuencia). Dichas comparaciones comprenden típicamente alineamientos de secuencias poliméricas, p. ej., usando programas y/o algoritmos de alineamiento que son bien conocidos en la técnica (por ejemplo, BLAST, FASTA y MEGALIGN, por nombrar unos pocos). El experto en la técnica puede apreciar fácilmente que, en dichos alineamientos, cuando una mutación contiene una inserción o eliminación de un resto, el alineamiento de secuencia introducirá un "hueco" (presentado típicamente por un guion, o "A") en la secuencia polimérica que no contiene el resto insertado o eliminado.
"Homólogo" en todas sus formas gramaticales y variantes ortográficas, se refiere a la relación entre dos proteínas que poseen un "origen evolutivo común", incluyendo proteínas de superfamilias de la misma especie de organismo, así como proteínas homólogas de diferentes especies de organismo. Dichas proteínas (y sus ácidos nucleicos codificantes) tienen homología de secuencia, tal como refleja su similitud de secuencia, bien en cuanto a porcentaje de identidad o bien mediante la presencia de restos o motivos específicos o posiciones conservadas.
La expresión "similitud de secuencia", en todas sus formas gramaticales, se refiere al grado de identidad o correspondencia entre secuencias de ácido nucleico o de aminoácidos que pueden o no compartir un origen evolutivo común.
Sin embargo, en el uso común y en la presente solicitud, el término "homólogo", cuando está modificado por un adverbio tal como "altamente" puede referirse a similitud de secuencia y puede o no relacionarse con un origen evolutivo común.
2. Polipéptidos ActRIIB
En el presente documento se desvelan polipéptidos variantes ActRIIB (p. ej., polipéptidos ActRIIB solubles). Opcionalmente, los fragmentos, variantes funcionales y formas modificadas tienen similares o las mismas actividades biológicas que sus polipéptidos ActRIIB naturales correspondientes. Por ejemplo, un ActRIIB variante puede unirse a e inhibir la función de un ligando ActRIIB (p. ej., activina A, activina AB, activina B, Nodal, GDF8, GDF11 o BMP7). Opcionalmente, un polipéptido ActRIIB modula el crecimiento de tejidos tales como hueso, cartílago, músculo y grasa. Los ejemplos de polipéptidos ActRIIB incluyen polipéptido precursor ActRIIB humano (SEQ ID NO: 2), y polipéptidos ActRIIB humanos solubles (p. ej. las SEQ ID NO: 1, 5, 6 y 12).
La divulgación identifica porciones y variantes de ActRIIB funcionalmente activas. Los solicitantes han verificado que una proteína de fusión Fc que tiene la secuencia desvelada por Hilden et al. (Blood. 15 abril 1994;83(8):2163-70), la cual tiene una alanina en la posición correspondiente al aminoácido 64 de la SEQ ID NO: 2 (A64), tiene una afinidad relativamente baja por activina y GDF11. Por el contrario, la misma proteína de fusión Fc con una arginina en la posición 64 (R64) tiene una afinidad por activina y GDF11 en el intervalo nanomolar inferior a picomolar superior. Por lo tanto, una secuencia con una R64 se usa como la secuencia de referencia natural para ActRIIB en esta divulgación.
Attisano et al. (Cell. 10 de enero 1992;68(1):97-108) demostraron que una eliminación en el nudo de prolina en el extremo C del dominio extracelular de ActRIIB reducía la afinidad del receptor por activina. Los datos que se presentan aquí muestran que la proteína de fusión ActRIIB-Fc que contiene los aminoácidos 20-119 de la SEQ ID NO: 2, "ActRIIB(20-119)-Fc" tiene unión reducida a GDF-11 y activina en relación con una ActRIIB(20-134)-Fc, que incluye la región del nudo de prolina y el dominio yuxtamembrana completo. Sin embargo, una proteína ActRIIB(20129)-Fc conserva una actividad similar pero algo reducida en relación con la natural, aun cuando la región del nudo de prolina esté alterada. Por tanto, se espera que todos los dominios extracelulares ActRIIB que terminan en el aminoácido 134, 133, 132, 131, 130 y 129 sean activos, pero las construcciones que terminan en 134 o 133 pueden ser las más activas. De forma similar, no se espera que las mutaciones en cualquiera de los restos 129-134 alteren la afinidad de unión a ligando en grandes márgenes. En apoyo de esto, las mutaciones de P129 y P130 no reducen sustancialmente la unión a ligando. Por lo tanto, una proteína de fusión ActRIIB-Fc puede terminar ya en el
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La SEQ ID NO: 4 codifica un polipéptido precursor ActRIIB de origen natural, mientras que la SEQ ID NO: 3 codifica un polipéptido ActRIIB soluble. Los ácidos nucleicos objeto pueden ser monocatenarios o bicatenarios. Dichos ácidos nucleicos pueden ser moléculas de ADN o ARN. Estos ácidos nucleicos pueden usarse, por ejemplo, en métodos para hacer polipéptidos ActRIIB o como agentes terapéuticos directos (p. ej., en una estrategia de terapia génica).
Los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos ActRIIB incluyen ácidos nucleicos que son variantes de la SEQ ID NO: 3. Las secuencias de nucleótidos variantes incluyen secuencias que difieren en una o más sustituciones, adiciones o deleciones de nucleótidos, tales como las variantes alélicas; y, por tanto, incluirán secuencias codificantes que difieren de la secuencia de nucleótidos de la secuencia codificante designada en la SEQ ID NO: 4.
En el presente documento se desvelan secuencias de ácido nucleico aisladas o recombinantes que son al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idénticas a la SEQ ID NO: 3. Alguien con experiencia habitual en la técnica apreciará que también se desvelan las secuencias de ácido nucleico complementarias a la SEQ ID NO:3 y las variantes de la SEQ ID NO: 3. En realizaciones adicionales las secuencias de ácido nucleico de la invención pueden aislarse, recombinarse y/o fusionarse con una secuencia de nucleótidos heteróloga, o en una biblioteca de ADN.
En el presente documento se desvelan ácidos nucleicos que incluyen secuencias de nucleótidos que hibridan en condiciones de alta rigurosidad con la secuencia de nucleótidos designada en la SEQ ID NO: 3, la secuencia complementaria de la SEQ ID NO: 3, o fragmentos de las mismas. Tal como se ha discutido anteriormente, alguien con experiencia habitual en la técnica entenderá fácilmente que las condiciones de rigurosidad apropiadas que promueven la hibridación del ADN pueden variarse. Por ejemplo, se podría realizar la hibridación en cloruro sódico/citrato sódico (SSC, por sus siglas en inglés) 6,0 x a alrededor de 45 ºC seguida de un lavado de SSC 2,0 x a 50 ºC. Por ejemplo, la concentración de sal en la etapa de lavado se puede seleccionar desde una baja rigurosidad de aproximadamente SSC 2,0 x a 50 ºC hasta una alta rigurosidad de aproximadamente SSC 0,2 x a 50 ºC. Además, la temperatura en la etapa de lavado puede aumentarse desde condiciones de baja rigurosidad a temperatura ambiente, alrededor de 22 °C, hasta condiciones de alta rigurosidad a alrededor de 65 ºC. Tanto la temperatura como la sal pueden variarse, o puede mantenerse constante la temperatura o la concentración de sal mientras se cambia la otra variable. En el presente documento se desvelan ácidos nucleicos que hibridan en condiciones de baja rigurosidad de SSC 6 x a temperatura ambiente, seguido de un lavado a SSC 2 x a temperatura ambiente.
También se desvelan ácidos nucleicos que difieren de los ácidos nucleicos tal como se exponen en la SEQ ID NO: 3 debido a la degeneración del código genético. Por ejemplo, una serie de aminoácidos están designados por más de un triplete. Codones que especifican el mismo aminoácido, o sinónimos (por ejemplo, CAU y CAC son sinónimos para histidina) pueden resultar en mutaciones "silenciosas" que no afectan a la secuencia de aminoácidos de la proteína. Sin embargo, se espera que en las células de mamífero existan polimorfismos de secuencia de ADN que conducen a cambios en las secuencias de aminoácidos de las proteínas objeto. Un experto en la técnica apreciará que entre individuos de una especie dada pueden existir estas variaciones en uno o más nucleótidos (hasta alrededor del 3-5 % de los nucleótidos) de los ácidos nucleicos que codifican una proteína particular debido a variación alélica natural. Se desvelan cualquiera y todas las dichas variaciones de nucleótidos y polimorfismos de aminoácidos.
En determinadas realizaciones, los ácidos nucleicos recombinantes de la invención pueden estar unidos operativamente a una o más secuencias de nucleótidos reguladoras en una construcción de expresión. Las secuencias de nucleótidos reguladoras serán generalmente apropiadas para la célula anfitriona usada para la expresión. Se conocen en la técnica numerosos tipos de vectores de expresión apropiados y secuencias reguladoras adecuadas para una variedad de células anfitrionas. Típicamente, dichas una o más secuencias de nucleótidos reguladoras pueden incluir, pero no se limitan a, secuencias promotoras, secuencias líderes o señal, sitios de unión a ribosoma, secuencias de inicio y terminación de la transcripción, secuencias de inicio y terminación de la traducción y secuencias potenciadoras o activadoras. La invención contempla promotores constitutivos o inducibles tal y como se conocen en la técnica. Los promotores pueden ser, bien promotores de origen natural, o bien promotores híbridos que combinan elementos de más de un promotor. Una construcción de expresión puede estar presente en una célula o en un episoma, tal como un plásmido, o la construcción de expresión puede insertarse en un cromosoma. En una realización preferente, el vector de expresión contiene un gen marcador seleccionable para permitir la selección de células anfitrionas transformadas. Los genes marcadores seleccionables son bien conocidos en la técnica y variarán con la célula anfitriona usada.
En determinados aspectos de la invención, el ácido nucleico objeto se proporciona por un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido ActRIIB y unirse operativamente a al menos una secuencia reguladora. Las secuencias reguladoras están reconocidas en la técnica y se seleccionan para la expresión directa del polipéptido ActRIIB. Por consiguiente, la expresión secuencia reguladora incluye promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión. Se describen secuencias reguladoras de ejemplo en Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, CA (1990). Por ejemplo, pueden usarse en estos vectores cualquiera de una amplia variedad de secuencias de control de la
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expresión que controlan la expresión de una secuencia de ADN cuando se unen operativamente a ella para expresar secuencias de ADN que codifican un polipéptido ActRIIB. Dichas secuencias de control de la expresión útiles incluyen, por ejemplo, los promotores temprano y tardío de SV40, promotor tet, promotor temprano inmediato de adenovirus o citomegalovirus, promotores de VRS, el sistema lac, el sistema trp, el sistema TAC o TRC, el promotor de T7 cuya expresión está dirigida por la ARN-polimerasa de T7, las regiones operadora y promotora principales de fago lambda, las regiones de control para la proteína de cubierta fd, el promotor para 3-fosfoglicerato-cinasa u otras enzimas glucolíticas, los promotores de fosfatasa ácida, p. ej., Pho5, los promotores de los factores de apareamiento α de levaduras, el promotor del poliedro del sistema baculovirus y otras secuencias que se sabe que controlan la expresión de genes de células procariotas o eucariotas o sus virus y diversas combinaciones de los mismos. Debe entenderse que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula anfitriona que se va a transformar y/o el tipo de proteína deseada que se va a expresar. Además, también deberían considerarse el número de copias del vector, la capacidad para controlar ese número de copias y la expresión de cualquier otra proteína codificada por el vector, tal como marcadores de antibióticos.
Puede producirse un ácido nucleico recombinante de la invención ligando el gen clonado, o una porción del mismo, en un vector adecuado para la expresión en células procariotas, en células eucariotas (de levadura, ave, insecto o mamífero), o en ambas. Los vehículos de expresión para la producción de un polipéptido ActRIIB recombinante incluyen plásmidos y otros vectores. Por ejemplo, los vectores adecuados incluyen plásmidos de los tipos: plásmidos derivados de pBR322, plásmidos derivados de pEMBL, plásmidos derivados de pEX, plásmidos derivados de pBTac y plásmidos derivados de pUC para la expresión en células procariotas, tales como E. coli.
Algunos vectores de expresión de mamífero contienen tanto secuencias procariotas para facilitar la propagación del vector en bacterias, como una o más unidades de transcripción eucariotas que se expresan en células eucariotas. Los vectores derivados de pcDNAI/amp, pcDNAI/neo, pRc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pSV2-dhfr, pTk2, pRSVneo, pMSG, pSVT7, pko-neo y pHyg son ejemplos de vectores de expresión de mamífero adecuados para la transfección de células eucariotas. Algunos de estos vectores están modificados con secuencias de plásmidos bacterianos, tales como pBR322, para facilitar la replicación y selección de resistencia farmacológica en células tanto procariotas como eucariotas. Como alternativa, pueden usarse derivados de virus tales como papilomavirus bovino (PVB-1) o el virus de Epstein-Barr (derivados de pHEBo, pREP y p205) para la expresión transitoria de proteínas en células eucariotas. Pueden encontrarse ejemplos de otros sistemas de expresión virales (incluyendo retrovirales) a continuación en la descripción de los sistemas de dispensación de terapia génica. Los diversos métodos empleados en la preparación de los plásmidos y en la transformación de los organismos anfitriones son bien conocidos en la técnica. Para otros sistemas de expresión adecuados para células tanto procariotas como eucariotas, así como para procedimientos recombinantes generales, véase Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Ed. ed. por Sambrook, Fritsch y Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) capítulos 16 y 17. En algunos casos, puede ser deseable expresar los polipéptidos recombinantes mediante el uso de un sistema de expresión de baculovirus. Los ejemplos de sistemas de expresión de baculovirus incluyen vectores derivados de pVL (tales como pVL1392, pVL1393 y pVL941), vectores derivados de pAcUW (tales como pAcUW1) y vectores derivados de pBlueBac (tales como el pBlueBac III que contiene β-gal).
En una realización preferente, un vector se diseñará para la producción de los polipéptidos ActRIIB objeto en células CHO, tal como un vector Pcmv-Script (Stratagene, La Jolla, Calif.), los vectores pcDNA4 (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) y los vectores pCI-neo (Promega, Madison, Wisc.). Tal como será evidente, las construcciones génicas objeto pueden usarse para causar la expresión de los polipéptidos ActRIIB objeto en células propagadas en cultivo, p. ej., para producir proteínas, incluyendo proteínas de fusión o proteínas variantes, para purificación.
La presente invención también está relacionada con una célula anfitriona transfectada con un gen recombinante que incluye un ácido nucleico de la invención que no está dentro de un ser humano. La célula anfitriona puede ser cualquier célula procariota o eucariota. Por ejemplo, un polipéptido ActRIIB de la invención puede expresarse en células bacterianas tales como E. coli, células de insecto (p. ej., usando un sistema de expresión de baculovirus), levadura, o células de mamíferos. Los expertos en la técnica conocen otras células anfitrionas adecuadas.
Por consiguiente, la presente invención también está relacionada con métodos para producir los polipéptidos ActRIIB objeto. Por ejemplo, una célula anfitriona transfectada con un vector de expresión que codifica un polipéptido ActRIIB puede cultivarse en condiciones apropiadas para permitir que se produzca la expresión del polipéptido ActRIIB. El polipéptido ActRIIB puede segregarse y aislarse a partir de una mezcla de células y medio que contiene el polipéptido ActRIIB. Como alternativa, el polipéptido ActRIIB puede retenerse en el citoplasma o en una fracción de membrana y las células recogerse, lisarse y aislarse la proteína. Un cultivo celular incluye células anfitrionas, medios y otros subproductos. Los medios de cultivo adecuados para el cultivo celular son bien conocidos en la técnica. Los polipéptido ActRIIB objeto pueden aislarse a partir de medio de cultivo celular, células anfitrionas, o ambos, usando técnicas conocidas en la técnica para purificar proteínas, incluyendo cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de filtración en gel, ultrafiltración, electroforesis y purificación por inmunoafinidad con anticuerpos específicos para epítopos particulares de los polipéptidos ActRIIB. En una realización preferente, el polipéptido ActRIIB es una proteína de fusión que contiene un dominio que facilita su purificación.
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En otra realización, un gen de fusión que codifica una secuencia líder de purificación, tal como una secuencia de sitio de escisión de poli-(His)/enterocinasa en el extremo N de la porción deseada del polipéptido ActRIIB recombinante, puede permitir la purificación de la proteína de fusión expresada mediante cromatografía de afinidad usando una resina metálica de Ni2+. La secuencia líder de purificación puede eliminarse posteriormente mediante tratamiento con enterocinasa para proporcionar el polipéptido ActRIIB purificado (p. ej., véase Hochuli, et al., (1987)
J. Chromatography 411:177; y Janknecht et al., PNAS EE.UU. 88:8972).
Las técnicas para hacer genes de fusión son bien conocidas. Esencialmente, la unión de diversos fragmentos de ADN que codifican diferentes secuencias de polipéptido se realiza de acuerdo con técnicas convencionales, empleando extremos romos o escalonados para el ligamiento, digestión con enzima de restricción para proporcionar los extremos apropiados, relleno de extremos cohesivos según sea apropiado, tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar unión indeseable y ligamiento enzimático. En otra realización, el gen de fusión puede sintetizarse mediante técnicas convencionales incluyendo sintetizadores de ADN automatizados. Como alternativa, puede llevarse a cabo amplificación por PCR de fragmentos de gen usando cebadores de anclaje que dan lugar a salientes complementarios entre dos fragmentos génicos consecutivos que pueden aparearse posteriormente para generar una secuencia génica quimérica (véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons: 1992).
4. Anticuerpos
También se desvelan en el presente documento anticuerpos. Un anticuerpo que es reactivo de forma específica con un polipéptido ActRIIB (p. ej., un polipéptido ActRIIB soluble) y que se une de forma competitiva con el polipéptido ActRIIB puede usarse como antagonista de actividades del polipéptido ActRIIB. Por ejemplo, usando inmunógenos procedentes de un polipéptido ActRIIB, pueden hacerse antisueros o anticuerpos monoclonales antiproteína/antipéptido mediante protocolos convencionales (véase, por ejemplo, Antibodies: A Laboratory Manual ed. por Harlow y Lane (Cold Spring Harbor Press: 1988)). Puede inmunizarse un mamífero, tal como un ratón, un hámster o un conejo con una forma inmunogénica del polipéptido ActRIIB, un fragmento antigénico que es capaz de provocar una respuesta de anticuerpos, o una proteína de fusión. Las técnicas para conferir inmunogenicidad en una proteína o péptido incluyen conjugación con vehículos u otras técnicas bien conocidas en la técnica. Puede administrarse una porción inmunogénica de un polipéptido ActRIIB en presencia de adyuvante. El progreso de la inmunización puede supervisarse mediante la detección de títulos de anticuerpo en plasma o suero. Pueden usarse ELISA u otros inmunoensayos convencionales con el inmunógeno como antígeno para valorar los niveles de anticuerpos.
Tras la inmunización de un animal con una preparación antigénica de un polipéptido ActRIIB, pueden obtenerse antisueros y, si se desea, pueden aislarse anticuerpos policlonales a partir del suero. Para producir anticuerpos monoclonales, pueden recogerse células productoras de anticuerpo (linfocitos) a partir de un animal inmunizado y fusionarse mediante procedimientos convencionales de fusión de células somáticas con células inmortalizadoras tales como células de mieloma para producir células de hibridoma. Dichas técnicas son bien conocidas en la técnica, e incluyen, por ejemplo, la técnica de hibridoma (desarrollada originalmente por Kohler y Milstein, (1975) Nature,
256: 495-497), la técnica de hibridoma de linfocito B humano (Kozbar et al., (1983) Immunology Today, 4: 72), y la técnica de hibridoma de VEB para producir anticuerpos monoclonales humanos (Cole et al., (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. págs. 77-96). Puede explorarse inmunoquímicamente la producción de anticuerpos reactivos de forma específica con un polipéptido ActRIIB en las células de hibridoma y pueden aislarse anticuerpos monoclonales a partir de un cultivo que comprende dichas células de hibridoma.
El término "anticuerpo" tal como se usa en el presente documento pretende incluir fragmentos del mismo que también reaccionan de forma específica con un polipéptido ActRIIB objeto. Los anticuerpos pueden fragmentarse usando técnicas convencionales y explorarse la utilidad en los fragmentos de la misma manera que se ha descrito anteriormente para anticuerpos completos. Por ejemplo, pueden generarse fragmentos F(ab)2 tratando anticuerpo con pepsina. El fragmento F(ab)2 resultante puede tratarse para reducir puentes disulfuro para producir fragmentos Fab. El anticuerpo puede incluir moléculas biespecíficas, monocatenarias, y quiméricas y humanizadas que tienen afinidad por un polipéptido ActRIIB conferida por al menos una región CDR del anticuerpo. El anticuerpo puede comprender además un marcador unido a éste y capaz de detectarse (p. ej., el marcador puede ser un radioisótopo, compuesto fluorescente, enzima o cofactor enzimático).
El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal. La presente divulgación hace métodos disponibles para generar anticuerpos novedosos. Por ejemplo, un método para generar un anticuerpo monoclonal que se une de forma específica a un polipéptido ActRIIB puede comprender administrar a un ratón una cantidad de una composición inmunogénica que comprende el polipéptido ActRIIB eficaz para estimular una respuesta inmunitaria detectable, obtener células productoras de anticuerpo (p. ej., células del bazo) a partir del ratón y fusionar las células productoras de anticuerpo con células de mieloma para obtener hibridomas productores de anticuerpo y ensayar los hibridomas productores de anticuerpo para identificar un hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal que se une de forma específica al polipéptido ActRIIB. Una vez obtenido, puede propagarse un hibridoma en un cultivo celular, opcionalmente en condiciones de cultivo en las que las células procedentes del hibridoma producen el
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anticuerpo monoclonal que se une de forma específica al polipéptido ActRIIB. El anticuerpo monoclonal puede purificarse a partir del cultivo celular.
El adjetivo "reactivo de forma específica con" tal como se usa en referencia a un anticuerpo pretende significar, tal como se entiende generalmente en la técnica, que el anticuerpo es suficientemente selectivo entre el antígeno de interés (p. ej., un polipéptido ActRIIB) y otros antígenos que no son de interés, que el anticuerpo es útil para, como mínimo, detectar la presencia del antígeno de interés en un tipo particular de muestra biológica. En ciertos métodos que emplean el anticuerpo, tales como aplicaciones terapéuticas, puede ser deseable un mayor grado de especificidad en la unión. Los anticuerpos monoclonales tienen generalmente una mayor tendencia (en comparación con los anticuerpos policlonales) a discriminar de forma eficaz entre los antígenos deseados y polipéptidos que reaccionan de forma cruzada. Una característica que influye en la especificidad de una interacción antígeno: anticuerpo es la afinidad del anticuerpo por el antígeno. Aunque puede alcanzarse la especificidad deseada con un intervalo de afinidades diferentes, los anticuerpos preferidos generalmente tendrán una afinidad (una constante de disociación) de alrededor de 10-6, 10-7, 10-8, 10-9 o menos.
Además, las técnicas usadas para explorar anticuerpos con el fin de identificar un anticuerpo deseable pueden influir en las propiedades del anticuerpo obtenido. Por ejemplo, si un anticuerpo va a usarse para unirse a un antígeno en solución, puede ser deseable ensayar la unión a la solución. Hay disponible una variedad de técnicas diferentes para ensayar la interacción entre anticuerpos y antígenos para identificar anticuerpos particularmente deseables. Dichas técnicas incluyen ELISA, ensayos de unión por resonancia de plasmón superficial (p. ej. el ensayo de unión de Biacore, Biacore AB, Uppsala, Suecia), ensayos de sándwich (p. ej., el sistema de perlas paramagnéticas de IGEN International, Inc., Gaithersburg, Maryland), transferencias de Western, ensayos de inmunoprecipitación e inmunohistoquímica.
La divulgación proporciona anticuerpos que se unen a un polipéptido ActRIIB soluble. Dichos anticuerpos pueden generarse de la misma forma que se ha descrito anteriormente, usando un polipéptido ActRIIB soluble o fragmento del mismo como antígeno. Los anticuerpos de este tipo pueden usarse, p. ej., para detectar polipéptidos ActRIIB en muestras biológicas y/o supervisar niveles de polipéptido ActRIIB soluble en un individuo. En ciertos casos, un anticuerpo que se une de forma específica a un polipéptido ActRIIB soluble puede usarse para modular actividad de un polipéptido ActRIIB y/o un ligando ActRIIB, regulando así (promoviendo o inhibiendo) el crecimiento de tejidos, tales como hueso, cartílago, músculo, grasa y neuronas.
5. Ensayos de exploración
Los polipéptidos ActRIIB (p. ej., polipéptidos ActRIIB solubles) pueden usarse para identificar compuestos (agentes) que son agonistas o antagonistas de los polipéptidos ActRIIB. Los compuestos identificados a través de esta exploración pueden ensayarse en tejidos tales como hueso, cartílago, músculo, grasa y/o neuronas, para valorar su capacidad para modular crecimiento tisular in vitro. Opcionalmente, estos compuestos pueden ensayarse además en modelos animales para valorar su capacidad para modular crecimiento tisular in vivo.
Existen numerosas estrategias de exploración de agentes terapéuticos para modular crecimiento tisular dirigiéndose hacia polipéptidos ActRIIB. Puede llevarse a cabo exploración de alto rendimiento de compuestos para identificar agentes que perturban efectos mediados por ActRIIB sobre el crecimiento del hueso, cartílago, músculo, grasa y/o neuronas. El ensayo puede llevarse a cabo para explorar e identificar compuestos que inhiben o reducen de forma específica la unión de un polipéptido ActRIIB a su molécula asociada de unión, tal como un ligando ActRIIB (p. ej., activina, Nodal, GDF8, GDF11 o BMP7). Como alternativa, el ensayo puede usarse para identificar compuestos que potencian la unión de un polipéptido ActRIIB a su proteína de unión tal como un ligando ActRIIB. Los compuestos pueden identificarse mediante su capacidad para interaccionar con un polipéptido ActRIIB.
Serán suficientes una variedad de formatos de ensayo y, a la luz de la presente divulgación, alguien con experiencia habitual en la técnica comprenderá, no obstante, los que no se describen expresamente en el presente documento. Tal como se describe en el presente documento, los compuestos (agentes) de ensayo de la invención pueden crearse mediante cualquier método químico combinatorio. Como alternativa, los compuestos objeto pueden ser biomoléculas de origen natural sintetizadas in vivo o in vitro. Pueden producirse compuestos (agentes) para ensayar su capacidad de actuar como moduladores de crecimiento tisular, por ejemplo, mediante bacterias, levadura, vegetales u otros organismos (p. ej., productos naturales), producirse químicamente (p. ej., moléculas pequeñas, incluyendo peptidomiméticos), o producirse de forma recombinante. Los compuestos de ensayo que se contemplan en el presente documento incluyen moléculas orgánicas no peptidilo, péptidos, polipéptidos, peptidomiméticos, azúcares, hormonas y moléculas de ácido nucleico. El agente de ensayo puede ser una molécula orgánica pequeña que tiene un peso molecular de menos de alrededor de 2.000 daltons.
Los compuestos de ensayo pueden proporcionarse como entidades individuales discretas, o proporcionarse en bibliotecas de mayor complejidad, tales como las hechas mediante química combinatoria. Estas bibliotecas pueden comprender, por ejemplo, alcoholes, haluros de alquilo, aminas, amidas, ésteres, aldehídos, éteres y otras clases de compuestos orgánicos. La presentación de compuestos de ensayo al sistema de ensayo puede ser, bien en forma aislada o bien como mezclas de compuestos, especialmente en etapas de exploración iniciales. Opcionalmente, los
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En el presente documento se desvelan métodos y reactivos para estimular el crecimiento muscular y aumentar la masa muscular, por ejemplo, antagonizando funciones de un polipéptido ActRIIB y/o un ligando ActRIIB. Por lo tanto, cualquier compuesto identificado pueden ensayarse en células o tejidos completos, in vitro o in vivo, para confirmar su capacidad para modular crecimiento muscular. Pueden utilizarse diversos métodos conocidos en la técnica para este fin. Por ejemplo, se realizan métodos de modo que la transducción de señales a través de una proteína ActRIIB activada mediante la unión a un ligando ActRIIB (p. ej., GDF8) se ha reducido o inhibido. Se reconocerá que el crecimiento de tejido muscular en el organismo resultaría en una masa muscular aumentada en el organismo en comparación con la masa muscular de un organismo (o población de organismos) correspondiente en el cual no se había efectuado tampoco la transducción de señales a través de una proteína ActRIIB.
Por ejemplo, el efecto de los polipéptidos ActRIIB o los compuestos de ensayo sobre el crecimiento/proliferación de la célula muscular puede determinase midiendo la expresión génica de Pax-3 y Myf-5, que están asociados con proliferación de células miogénicas, y la expresión génica de MyoD, que está asociado con diferenciación muscular
(p. ej., Amthor et al., Dev Biol. 2002, 251:241-57). Se sabe que GDF8 regula negativamente la expresión génica de Pax-3 y Myf-5 y evita la expresión génica de MyoD. Se espera que los polipéptidos ActRIIB o los compuestos de ensayo antagonicen esta actividad de GDF8. Otro ejemplo de ensayos basados en células incluye medir la proliferación de mioblastos tales como mioblastos C(2)C(12) en presencia de los polipéptidos ActRIIB o los compuestos de ensayo (p. ej., Thomas et al., J Biol Chem. 2000, 275:40235-43).
En el presente documento se desvelan ensayos in vivo para medir masa y fuerza muscular. Por ejemplo, Whittemore et al. (Biochem Biophys Res Commun. 2003, 300:965-71) desvelan un método para medir masa muscular esquelética y fuerza de prensión aumentada en ratones. Opcionalmente, este método puede usarse para determinar efectos terapéuticos de los compuestos de ensayo (p. ej., polipéptidos ActRIIB) en enfermedades o afecciones musculares, por ejemplo aquellas enfermedades para las cuales la masa muscular es limitante.
Pueden proporcionarse métodos y agentes para modular (estimular o inhibir) formación de hueso e incrementar la masa ósea. Por lo tanto, cualquier compuesto identificado pueden ensayarse en células o tejidos completos, in vitro
o in vivo, para confirmar su capacidad para modular crecimiento de hueso o cartílago. Pueden utilizarse diversos métodos conocidos en la técnica para este fin.
Por ejemplo, el efecto de los polipéptidos ActRIIB o los compuestos de ensayo sobre el crecimiento de hueso o cartílago puede determinarse midiendo inducción de Msx2 o diferenciación de células osteoprogenitoras en osteoblastos en ensayos basados en células (véase, p. ej., Daluiski et al., Nat Genet. 2001,27(1):84-8; Hino et al., Front Biosci. 2004, 9:1520-9). Otro ejemplo de ensayos basados en células incluye analizar la actividad osteogénica de los polipéptidos ActRIIB y los compuestos de ensayo en células progenitoras mesenquimales y osteoblásticas. A modo de ilustración, se construyeron adenovirus recombinantes que expresaban un polipéptido ActRIIB para infectar células C3H10T1/2 progenitoras mesenquimales pluripotentes, células C2C12 preosteoblástsicas y células TE-85 osteoblásticas. La actividad osteogénica se determina después midiendo la inducción de fosfatasa alcalina, osteocalcina y matriz de mineralización (véase, p. ej., Cheng et al., J bone Joint Surg Am. 2003, 85-A (8):1544-52).
También se contemplan ensayos in vivo para medir crecimiento de hueso o cartílago. Por ejemplo, Namkung-Matthai et al., Bone, 28:80-86 (2001) desvela un modelo osteoporótico de rata en el cual se estudia reparación ósea durante el periodo temprano tras la fractura. Kubo et al., Steroid Biochemistry & Molecular Biology, 68:197-202 (1999) también desvela un modelo osteoporótico de rata en el cual se estudia reparación ósea durante el periodo tardío tras la fractura. Estas referencias desvelan un modelo de rata para el estudio sobre la fractura del hueso osteoporótico. Pueden utilizarse ensayos de consolidación de fractura que son conocidos en la técnica. Estos ensayos incluyen técnica de fractura, análisis histológicos y análisis biomecánicos, que se describen en, por ejemplo, la patente de EE.UU. n.º 6.521.750, que desvela protocolos experimentales para causar, así como para medir, el grado de fracturas y el proceso de reparación.
En el presente documento se desvelan métodos y agentes para controlar la ganancia de peso y la obesidad. A nivel celular, la proliferación y diferenciación adipocítica es crítica en el desarrollo de la obesidad, lo cual conduce a la generación de células de grasa (adipocitos). Por lo tanto, cualquier compuesto identificado pueden ensayarse en células o tejidos completos, in vitro o in vivo, para confirmar su capacidad para modular adipogénesis midiendo proliferación o diferenciación adipocítica. Pueden utilizarse diversos métodos conocidos en la técnica para este fin. Por ejemplo, el efecto de un polipéptido ActRIIB (p. ej., un polipéptido ActRIIB soluble) o compuestos de ensayo sobre la adipogénesis puede determinarse midiendo diferenciación de preadipocitos 3T3-L1 a adipocitos maduros en ensayos basados en células, tales como, observando la acumulación de triacilglicerol en tinción de vesículas con rojo oleoso O y mediante la aparición de ciertos marcadores adipocíticos tales como (aP2/422) y PPARγ2. Véase, por ejemplo, Reusch et al., 2000, Mol Cell Biol. 20:1008-20; Deng et al., 2000, Endocrinology. 141:2370-6; Bell et al., 2000, Obes Res. 8:249-54. Otro ejemplo de ensayos basados en células incluye analizar el papel de polipéptidos ActRIIB y compuestos de ensayo en la proliferación de adipocitos o células precursoras de adipocitos (p. ej., células 3T3-L1), tales como, supervisando células positivas a bromodesoxiuridina (BrdU). Véase, por ejemplo, Pico et al., 1998, Mol Cell Biochem. 189:1-7; Masuno et al., 2003, Toxicol Sci. 75:314-20.
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polipéptidos ActRIIB de ejemplo pueden actuar como inhibidores (antagonistas) de GDF8 y constituyen un medio alternativo de bloquear las funciones de GDF8 y/o ActRIIB in vivo en pacientes con DMD o DMB. Esta estrategia está confirmada y respaldada por los datos que se muestran en el presente documento, por medio de los cuales se demostró que una proteína ActRIIB-Fc aumenta la masa muscular en un modelo de ratón de distrofia muscular.
De forma similar, los polipéptidos ActRIIB objeto proporcionan un medio eficaz de aumentar la masa muscular en otras afecciones patológicas que necesitan crecimiento muscular. Por ejemplo, ELA, también llamada enfermedad de Lou Gehrig (enfermedad de las motoneuronas) es un trastorno crónico, incurable e imparable del SNC que ataca a las motoneuronas, componentes del SNC que conectan el cerebro con los músculos esqueléticos. En la ELA, las motoneuronas se deterioran y terminan muriendo y aunque el cerebro de una persona permanece normalmente funcionando y alerta completamente, la orden para moverse jamás alcanza los músculos. La mayoría de las personas que tienen ELA tiene entre 40 y 70 años de edad. Las primeras motoneuronas que se debilitan son las que se dirigen a los brazos o piernas. Los que tienen ELA pueden tener problemas para caminar, y se les pueden caer cosas, caerse, hablar de forma ininteligible y reír o llorar de forma incontrolable. Finalmente, los músculos de las extremidades empiezan a atrofiarse debido al desuso. Esta debilidad muscular se volverá debilitante y la persona necesitará una silla de ruedas o se volverá incapaz de funcionar fuera de la cama. La mayoría de los pacientes con ELA mueren de insuficiencia respiratoria o de complicaciones de la ventilación asistida como la neumonía, a los 3-5 años del comienzo de la enfermedad. Esta estrategia está confirmada y respaldada por los datos que se muestran en el presente documento, por medio de los cuales se demostró que una proteína ActRIIB-Fc mejora la aparición, masa muscular y esperanza de vida en un modelo de ratón de ELA.
La masa muscular aumentada inducida por polipéptido ActRIIB podría beneficiar también a los que padecen enfermedades de atrofia muscular progresiva. Gonzalez-Cadavid et al. (citado anteriormente) publicaron que la expresión de GDF8 se correlaciona de forma inversa con la masa libre de grasa en seres humanos y que la expresión aumentada del gen GDF8 está asociada con la pérdida de peso en hombres son síndrome de emaciación por SIDA. Inhibiendo la función de GDF8 en los pacientes de SIDA, al menos ciertos síntomas de SIDA pueden aliviarse, si no eliminarse completamente, mejorando significativamente, por tanto, la calidad de vida en los pacientes de SIDA.
Como la pérdida de función de GDF8 (un ligando de ActRIIB) también está asociada con pérdida de grasa sin disminución de la ingesta de nutrientes (Zimmers et al., citado anteriormente; McPherron and Lee, citado anteriormente), los polipéptidos ActRIIB objeto pueden usarse además como agente terapéutica para retrasar o prevenir el desarrollo de obesidad y diabetes de tipo II. Esta estrategia está confirmada y respaldada por los datos que se muestran en el presente documento, por medio de los cuales se demostró que una proteína ActRIIB-Fc mejora el estado metabólico en ratones obesos.
El síndrome de anorexia-caquexia por cáncer está entre los aspectos del cáncer más debilitantes y potencialmente mortales. La pérdida progresiva de peso en el síndrome de anorexia-caquexia por cáncer es un aspecto común de muchos tipos de cáncer y es responsable, no solo de una mala calidad de vida y mala respuesta a la quimioterapia, sino también de un periodo de supervivencia más corto del que se encuentra en pacientes con tumores comparables pero sin pérdida de peso. Asociada con anorexia, consunción de grasa y tejido muscular, sufrimiento psicológico y una menor calidad de vida, la caquexia surge a partir de una interacción compleja entre el cáncer y el anfitrión. Es una de las causas de muerte más comunes entre los pacientes de cáncer y está presente en el 80 % en el momento de la muerte. Es un ejemplo complejo de caos metabólico que afecta al metabolismo de proteínas, carbohidratos, y grasas. Los tumores producen anomalías tanto directas como indirectas, resultando en anorexia y pérdida de peso. Actualmente, no existe tratamiento para controlar o invertir el proceso. El síndrome de anorexia-caquexia afecta a la producción de citocinas, liberación de factores movilizadores de lípidos e inductores de proteolisis y alteraciones en el metabolismo intermedio. Aunque la anorexia es común, una ingesta de alimento reducida sola es incapaz de justificar los cambios en la composición corporal que se observan en los pacientes de cáncer y el aumento de la ingesta de nutrientes es incapaz de invertir el síndrome de emaciación. Debe sospecharse caquexia en pacientes con cáncer si se produce una pérdida de peso involuntaria de más del cinco por ciento del peso premórbido dentro de un periodo de seis meses.
Como se encontró que la sobreexpresión sistémica de GDF8 induce una profunda pérdida de músculo y grasa análoga a la que se observa en los síndromes de caquexia humanos (Zimmers et al., citado anteriormente), pueden usarse beneficiosamente los polipéptidos ACTRIIB objeto como composiciones farmacéuticas para prevenir, tratar, o aliviar los síntomas del síndrome de caquexia, en el que se desea crecimiento muscular.
En el presente documento se desvelan métodos para inducir formación de hueso y/o cartílago, prevenir la pérdida ósea, aumentar la mineralización ósea o prevenir la desmineralización del hueso. Por ejemplo, los polipéptidos ActRIIB objeto y los compuestos tienen aplicación en el tratamiento de la osteoporosis y en la consolidación de fracturas óseas y defectos del cartílago en seres humanos y otros animales. Los polipéptidos ActRIIB pueden ser útiles en pacientes que están diagnosticados de densidad ósea baja subclínica, como una medida protectora contra el desarrollo de osteoporosis.
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cápsulas rellenas de gelatina dura o blanda usando excipientes tales como lactosa o azúcares lácteos, así como polietilenglicoles de alto peso molecular y similares.
Las formas de dosificación líquidas para administración oral incluyen emulsiones, microemulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y elixires farmacéuticamente aceptables. Además del principio activo, las formas de dosificación líquidas pueden contener diluyentes usados de manera común en la técnica, tales como agua u otros disolventes, agentes solubilizantes y emulsionantes, tales como alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, aceites (en particular, aceites de semilla de algodón, de cacahuete, de maíz, de germen, de oliva, de ricino, y de sésamo), glicerol, alcohol tetrahidrofurfurílico, polietilenglicoles y ésteres de ácidos grasos de sorbitán y mezclas de los mismos. Además de diluyentes inertes, las composiciones orales también pueden incluir adyuvantes, tales como agentes humectantes, agentes emulsionantes y de suspensión, agentes edulcorantes, saborizantes, colorantes, perfumantes y conservantes.
Además de los principios activos, las suspensiones pueden contener agentes de suspensión tales como alcoholes etoxilados isoestearílicos, polioxietilensorbitol y ésteres de sorbitán, celulosa microcristalina, metahidróxido de aluminio, bentonita, agar y tragacanto y mezclas de los mismos.
Ciertas composiciones que se desvelan en el presente documento pueden administrarse por vía tópica, bien en la piel o bien en las mucosas. Las formulaciones tópicas pueden incluir además una o más de la amplia variedad de agentes que se sabe que son eficaces como potenciadores de la penetración en la piel o el estrato córneo. Ejemplos de estos son 2-pirrolidona, N-metilpirrolidona, dimetilacetamida, dimetilformamida, propilenglicol, alcohol metílico o isopropílico, dimetilsulfóxido, y azona. Pueden incluirse además agentes adicionales para hacer la formulación cosméticamente aceptable. Ejemplos de estos son grasas, ceras, aceites, colorantes, fragancias, conservantes, estabilizantes, y agentes tensioactivos. También pueden incluirse agentes queratolíticos tales como los conocidos en la técnica. Son ejemplos el ácido salicílico y el azufre.
Las formas de dosificación para la administración tópica o transdérmica incluyen polvos, pulverizaciones, pomadas, pastas, cremas, lociones, geles, soluciones, parches, e inhalantes. El principio activo puede mezclarse en condiciones estériles con un vehículo farmacéuticamente aceptable y con cualesquiera conservantes, tampones o propulsores que puedan ser necesarios. Las pomadas, pastas, cremas y geles pueden contener, además de un compuesto objeto (p. ej., un polipéptido ActRIIB), excipientes, tales como grasas animales o vegetales, aceites, ceras, parafinas, almidón, tragacanto, derivados de celulosa, polietilenglicoles, siliconas, bentonitas, ácido silícico, talco y óxido de cinc, o mezclas de los mismos.
Los polvos y las pulverizaciones pueden contener, además de un compuesto objeto, excipientes tales como lactosa, talco, ácido silícico, hidróxido de aluminio, silicatos de calcio y polvo de poliamida, o mezclas de estas sustancias. Las pulverizaciones pueden contener además propulsores habituales, tales como clorofluorohidrocarburos e hidrocarburos volátiles sin sustituir, tales como butano y propano.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración parenteral pueden comprender uno o más polipéptidos ActRIIB en combinación con una o más soluciones, dispersiones, suspensiones o emulsiones acuosas o no acuosas isotónicas estériles farmacéuticamente aceptables, o polvos estériles que pueden reconstituirse en soluciones o dispersiones inyectables estériles inmediatamente antes de su uso, las cuales pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos, solutos que hacen a la formulación isotónica con la sangre del receptor previsto o agentes de suspensión o espesantes. Los ejemplos de vehículos acuosos y no acuosos adecuados que pueden emplearse en las composiciones farmacéuticas incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol, y similares), mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, tal como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo. La fluidez adecuada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de materiales de recubrimiento, tales como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula necesario en el caso de dispersiones y mediante el uso de tensioactivos.
Las composiciones también pueden contener adyuvantes, tales como conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes de dispersión. La prevención de la acción de microorganismos puede garantizarse mediante la inclusión de diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, ácido fenol sórbico y similares. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos, tales como azúcares, cloruro sódico, y similares en las composiciones. Además, puede provocarse la absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable mediante la inclusión de agentes que retrasan la absorción, tales como monoestearato de aluminio y gelatina.
Se entiende que el médico a cargo determinará la pauta de dosificación considerando diversos factores que modifican la acción de los compuestos objeto de la invención (p. ej., polipéptidos ActRIIB). Los diversos factores dependerán de la enfermedad que se va a tratar. En el caso de trastornos musculares, los factores pueden incluir, pero no se limitan a, cantidad de masa muscular que se desea formar, los músculos más afectados por la enfermedad, la afección del músculo deteriorado, la edad sexo y dieta del paciente, el momento de administración y otros factores clínicos. La adición de otros factores de crecimiento conocidos a la composición final también puede
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Ejemplos
La invención que se está describiendo ahora de forma general, se entenderá más fácilmente con referencia a los siguientes ejemplos, que se incluyen meramente con fines de ilustración de ciertas realizaciones de la presente 5 invención y no se pretende que limiten la invención.
Ejemplo 1. Generación de una proteína de fusión ActRIIb-Fc
Los solicitantes construyeron una proteína de fusión ActRIIB soluble que tiene el dominio extracelular de ActRIIb
10 humano fusionado con un dominio Fc humano o de ratón con un enlazador mínimo (tres aminoácidos de glicina) en medio. Las construcciones se denominan como ActRIIb-hFc y ActRIIb-mFc, respectivamente. ActRIIb-hFc se muestra más adelante como purificada a partir de líneas celulares de CHO (SEQ ID NO: 5).
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15 Las proteínas ActRIIb-hFc y ActRIIb-mFc se expresaron en líneas celulares de CHO. Se consideraron tres secuencias líder diferentes:
(i) Melitina de abeja melífera (HBML): MKFLVNVALVFMVVYISYIYA (SEQ ID NO: 7). 20
(ii) Activador tisular del plasminógeno (TPA): MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSP (SEQ ID NO: 8).
(iii) Nativa: MGAAAKLAFAVFLISCSSGA (SEQ ID NO: 9). 25 La forma seleccionada emplea la líder de TPA y tiene la siguiente secuencia de aminoácidos no procesada:
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Este polipéptido está codificado por la siguiente secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 10):
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5 La secuenciación N-terminal del material producido por la célula CHO reveló una secuencia principal de -GRGEAE (SEQ ID NO: 11). De manera notable, otras construcciones publicadas en la bibliografía empiezan con una secuencia -SGR...
La purificación pudo lograrse mediante una serie de etapas de cromatografía en columna, incluyendo, por ejemplo,
10 tres o más de las siguientes, en cualquier orden: cromatografía de proteína A, cromatografía en sefarosa Q, cromatografía en fenilsefarosa, cromatografía de exclusión por tamaño y cromatografía de intercambio catiónico. La purificación pudo completarse con filtración viral e intercambio de tampón.
Las proteínas de fusión ActRIIb-Fc también se expresaron en células HEK293 y células COS. Aunque el material de
15 todas las líneas celulares y condiciones de cultivo razonables proporcionó proteína con actividad de construcción muscular in vivo, se observó variabilidad de la potencia, relacionada quizá con la selección de la línea celular y/o las condiciones de cultivo.
Ejemplo 2: Generación de mutantes ActRIIb-Fc
20 Los solicitantes generaron una serie de mutaciones en el dominio extracelular de ActRIIB y produjeron estas proteínas mutantes como proteínas de fusión solubles entre el ActRIIB extracelular y el dominio Fc. La proteína de fusión ActRIIB-Fc original tiene la secuencia (porción Fc subrayada) de SEQ ID NO: 12:
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Se introdujeron diversas mutaciones, incluyendo truncamientos N y C terminales, en la proteína ActRIIB-Fc original. Basándose en los datos que se presentan en el ejemplo 1, se espera que estas construcciones, si se expresan con 30 una líder de TPA, carecerán de la serina N-terminal. Las mutaciones se generaron en el dominio extracelular de ActRIIB mediante mutagénesis por PCR. Después de la PCR, los fragmentos se purificaron a través de una columna Qiagen, se digirieron con SfoI y AgeI y se purificaron en gel. Estos fragmentos se ligaron en el vector de expresión pAID4 (véase el documento WO2006/012627) de modo que tras el ligamiento creó una quimera de fusión con IgG1 humana. Tras la transformación en E. coli DH5 alfa, se recogieron las colonias y se aislaron los ADN. Para las
construcciones murinas (mFc), se sustituyó una IgG2a murina por la IgG1 humana. Se verificó la secuencia de todos los mutantes.
Todos los mutantes se produjeron en células HEK293T mediante transfección transitoria. En resumen, las células 5 HEK293T se ajustaron en un agitador orbital de 500 ml a 6x105 células/ml en medio Freestyle (Invitrogen), en 250 ml de volumen, y se cultivaron durante toda la noche. Al día siguiente, estas células se trataron con complejo ADN:PEI
(1:1) a 0,5 μg/ml de concentración final de ADN. Después de 4 h, se añadieron 250 ml de medio y las células se cultivaron durante 7 días. El medio acondicionado se recogió precipitando las células y se concentró.
10 Los mutantes se purificaron usando una variedad de técnicas, incluyendo, por ejemplo, columna de proteína A y se eluyeron con tampón glicina a pH bajo (3,0). Después de la neutralización, éstas se dializaron contra PBS.
También se produjeron mutantes en células CHO mediante metodología similar.
15 Los mutantes se analizaron en ensayos y/o bioensayos de unión descritos a continuación. En algunos casos, los ensayos se realizaron con medio acondicionado en lugar de proteínas purificadas.
Ejemplo 3. Bioensayo para la señalización mediada por GDF-11 y activina.
20 Se usó un ensayo de gen indicador A-204 para evaluar los efectos de las proteínas ActRIIB-Fc sobre la señalización por GDF-11 y activina A. Línea celular: Rabdomiosarcoma humano (procedente de músculo). Vector indicador: pGL3(CAGA)12 (descrito en Dennler et al, 1998, EMBO 17: 3091-3100.). Véase la figura 5. El motivo CANA12 está presente en los genes con respuesta a TGF-Beta (gen PAI-1), de modo que este vector es de uso general para factores de señalización a través de Smad2 y 3.
25 Día 1: División de las células A-204 en placa de 48 pocillos.
Día 2: Las células A-204 se transfectan con 10 μg pGL3(CAGA)12 o pGL3(CAGA)12 (10 μg)+ pRLCMV (1 μg) y Fugene.
30 Día 3: Adición de factores (diluidos en medio + BSA al 0,1 %). Es necesario preincubar los inhibidores con factores durante 1 h antes de añadirlos a las células. 6 horas después, las células se aclaran con PBS y las células se lisan.
Esto se sigue de un ensayo de luciferasa. En ausencia de cualquier inhibidor, activina A mostró 10 veces la 35 estimulación de la expresión del gen indicador y una DE50∼ 2 ng/ml. GDF-11:estimulación de 16 veces, DE50: ∼ 1,5 ng/ml.
ActRIIB(R64,20-134) es un potente inhibidor de la actividad de activina, GDF-8 y GDF-11 en este ensayo. También se analizaron variantes en este ensayo. 40 Ejemplo 4. Inhibición de GDF-11 de truncamientos N-terminales y C-terminales
Se generaron truncamientos en el extremo N y el extremo C de la porción ActRIIB-Fc (R64, 20-134) de ActRIIB y se analizó su actividad como inhibidores de GDF-11 y activina. Las actividades se muestran a continuación 45 (determinadas en medios acondicionados):
Truncamientos C-terminales de ActRIIb-hFc:
CI50 (ng/ml)
GDF-11
Activina
ActRIIb-hFc (R64, 20-134)
45 22
ActRIIb-hFc (R64, 20-132)
87 32
ActRIIb-hFc (R64, 20-131)
120 44
ActRIIb-hFc (R64, 20-128)
130 158
Como puede observarse, los truncamientos de tres (que terminan en...PPT), seis (que terminan en...YEP) o más
50 aminoácidos en el extremo C causan un descenso de tres veces o más de la actividad de la molécula. El truncamiento de los 15 aminoácidos finales de la porción ActRIIB causa una pérdida de actividad mayor (véase el documento WO2006/012627).
Se hicieron truncamientos amino terminales en el entorno de una proteína ActRIIb-hFc (R64 20-131). Las 55 actividades se muestran a continuación (determinadas en medios acondicionados):
Truncamientos N-terminales de ActRIIb-hFc:
CI50 (ng/ml)
GDF-11
Activina
ActRIIb-hFc (R64, 20-131)
183 201
(GRG...)
ActRIIb-hFc (R64, 21-131) (RGE...)
121 325
ActRIIb-hFc (R64,22-131) (GEA...)
71 100
ActRIIb-hFc (R64,23-131) (EAE...)
60 43
ActRIIb-hFc (R64, 24-131) (AET...)
69 105
Por consiguiente, los truncamientos de dos, tres o cuatro aminoácidos del extremo N condujeron a la producción de una proteína más activa que las versiones con el dominio extracelular completo. Los experimentos adicionales 5 muestran que un truncamiento de cinco aminoácidos, ActRIIb-hFc (R64, 25-131) tiene una actividad equivalente a la de la forma no truncada y eliminaciones adicionales en el extremo N continúan degradando la actividad de la proteína Por lo tanto, las construcciones óptimas tendrán un extremo C que termina entre los aminoácidos 133134 de la SEQ ID NO: 4 y un extremo N que empieza en los aminoácidos 22-24 de la SEQ ID NO: 4. Un extremo N correspondiente a los aminoácidos 21 o 25 dará una actividad que es similar a la de la construcción ActRIIb
10 hFc (R64,20-134).
Ejemplo 5. Variantes ActRIIB-Fc, actividad basada en células
La actividad de las proteínas ActRIIB-Fc se analizó en un ensayo basado en células, tal como se ha descrito
15 anteriormente. Los resultados se muestran en la Tabla 1, a continuación. Algunas variantes se analizaron en diferentes construcciones de truncamiento C-terminal. Tal como se ha discutido anteriormente, los truncamientos de cinco o quince aminoácidos causaron reducción de la actividad. De manera destacable, las variantes L79D y L79E mostraron una pérdida sustancial de unión a activina mientras que conservan casi toda la inhibición natural de GDF
11.
20 Unión de ActRIIB-Fc soluble a GDF-11 y activina A:
Variaciones de ActRIIb-Fc
Porción de ActRIIB (corresponde a los aminoácidos de la SEQ ID NO: 4) Actividad de inhibición de GDF11 Actividad de inhibición de activina
64R
20-134 +++ (KI aprox. 10-8 M) +++ (KI aprox. 10-8 M )
64A
20-134 + (KI aprox. 10-6 M) + (KI aprox. 10-6 MI)
64R
20-129 +++ +++
64RK74A
20-134 ++++ ++++
64R A24N
20-134 +++ +++
64R A24N
20-119 ++ ++
64R A24N K74A
20-119 + +
R64 L79P
20-134 + +
R64 L79P K74A
20-134 + +
R64 L79D
20-134 +++ +
R64 L79E
20-134 +++ +
R64K
20-134 +++ +++
R64K
20-129 +++ +++
R64 P129S P130A
20-134 +++ +++
R64N
20-134 + +
+ Actividad deficiente (KI de aproximadamente 1x10-6) ++ Actividad moderada (KI de aproximadamente 1x10-7) +++ Actividad buena (natural) (KI de aproximadamente1x10-8) ++++ Actividad mayor que la natural
Se ha valorado la semivida sérica en ratas de algunas variantes. ActRIIB(R64 20-134)-Fc tiene una semivida sérica de aproximadamente 70 horas. ActRIIB(R64 A24N 20-134)-Fc tiene una semivida sérica de aproximadamente 100
25 150 horas. La variante A24N tiene actividades en el ensayo basado en células (anterior) y en ensayos in vivo (a continuación) que son equivalentes a la molécula natural. Sumado a la semivida más larga, esto significa que, a lo largo del tiempo, una variante A24N dará mayor efecto por unidad de proteína que la molécula natural.
De manera destacable, la introducción de aminoácidos ácidos (ácido aspártico o glutámico) en la posición 79 disminuyó selectivamente la unión a activina mientras que se conservó la unión a GDF11/GDF8. Tal como se discute a continuación, las proteínas ActRIIB-Fc naturales parecen tener efectos sobre tejidos distintos al músculo, algunos de los cuales pueden ser indeseables. Tal como se desvela en el presente documento, se espera que estos efectos 5 estén relacionados con los diversos ligandos diferentes que se unen y son inhibidos por ActRIIB-Fc, incluyendo, quizá, activina. Los datos iniciales indican que, en ratones, las variantes L79E y L79D tienen efectos reducidos sobre tejidos distintos del músculo mientras que conservan sus efectos sobre el músculo. Aunque las variaciones de este tipo pueden verse como variantes de ActRIIB, cabe destacar que estas proteínas ya no funcionan realmente como receptores de activina y, por tanto, el nombre "ActRIIB" es apropiado solo como indicador de la procedencia de estos
10 polipéptidos. Aunque los restos ácidos en la posición 79 disminuyen la unión a activina mientras que conservan la unión a GDF11, otras alteraciones en esta posición no tienen este efecto. Un cambio L79A aumenta la unión en relación con la unión a GDF11. Un cambio L79P disminuye la unión tanto a activina como a GDF11.
Ejemplo 6. Unión a GDF-11 y activina A 15 La unión de ciertas proteínas ActRIIB-Fc a ligandos se analizó en un ensayo BiaCore™.
Las variantes ActRIIB-Fc o la proteína natural se capturaron sobre el sistema usando un anticuerpo anti-hFc. Los ligandos se inyectaron y se hicieron fluir sobre las proteínas receptoras capturadas. Los resultados se resumen en 20 las tablas, a continuación.
Variantes IIB de especificidad de unión a ligando.
GDF11
Proteína
Kon (1/Ms) Koff (1/s) KD (M)
ActRIIB-hFc (R64 20-134)
1,34 e-6 1,13 e-4 8,42 e-11
ActRIIB-hFc (R64, A24N 20-134)
1,21 e-6 6,35e-5 5,19 e-11
ActRIIB-hFc (R64, L79D 20-134)
6,7 e-5 4,39 e-4 6,55 e-10
ActRIIB-hFc (R64, L79E 20-134)
3,8 e-5 2,74 e-4 7,16 e-10
ActRIIB-hFc (R64K 20-134)
6,77 e-5 2,41 e-5 3,56 e-11
GDF8
Proteína
Kon (1/Ms) Koff (1/s) KD (M)
ActRIIB-hFc (R64 20-134)
3,69 e-5 3,45 e-5 9,35 e-11
ActRIIB-hFc (R64, A24N 20-134)
ActRlIB-hFc (R64, L79D 20-134)
3,85 e-5 8,3 e-4 2,15 e-9
ActRIIB-hFc (R64, L79E 20-134)
3,74 e-5 9 e-4 2,41 e-9
ActRIIB-hFc (R64K 20-134)
2,25 e-5 4,71 e-5 2,1 e-10
ActRIIB-hFc (R64K 20-129)
9,74 e-4 2,09 e-4 2,15 e-9
ActRIIB-hFc (R64, P129S, P130R 20-134)
1,08 e-5 1,8 e-4 1,67 e-9
ActRIIB-hFc (R64, K74A 20-134)
2,8 e-5 2,03 e-5 7,18 e-11
Activina A
Proteína
Kon (1/Ms) Koff (1/s) KD (M)
ActRIIB-hFc (R64 20-134)
5,94 e6 1,59 e-4 2,68 e-11
ActRIIB-hFc (R64, A24N 20-134)
3,34 e6 3,46 e-4 1,04 e-10
ActRIIB-hFc (R64, L79D 20-134)
Unión baja
ActRIIB-hFc (R64, L79E 20-134)
Unión baja
ActRIIB-hFc (R64K 20-134)
6,82e6 3,25 e-4 4,76 e-11
ActRIIB-hFc (R64K 20-129)
7,46 e6 6,28 e-4 8,41 e-11
ActRIIB-hFc (R64, P129S, P130R 20-134)
5,02 e6 4,17 e-4 8,31 e-11
Estos datos confirman los datos de los ensayos basados en células, demostrando que la variante A24N conserva
25 una actividad de unión a ligando que es similar a la de la molécula ActRIIb-hFc (R64 20-134) y que las moléculas L79D o L79E conserva la unión a miostatina y GDF11 pero muestra una unión marcadamente disminuida (no cuantificable) a activina A.
Se han generado y analizado otras variantes, tal como se publica en el documento WO2006/012627, usando
30 ligandos acoplados al dispositivo y haciendo fluir el receptor sobre los ligandos acoplado. A continuación se reproduce una tabla de datos con respecto a estas variantes:
Unión de variantes ActRIIB-Fc solubles a GDF-11 y activina A (ensayo BiaCore)
ActRIIB
ActA GDF11
WT (64A)
KD= 1,8 e-7M (+) KD= 2,6 e-7M (+)
WT (64R)
na KD= 8,6 e-8M (+++)
+ cola 15
KD ∼2,6 e-8M (+++) KD=1,9 e-8M (++++)
E37A
* *
R40A
- -
D54A
- *
K55A
++ *
R56A
* *
K74A
KD= 4,35 e-9 M ++++ KD= 5,3 e-9M +++++
K74Y
* --
K74F
* --
K74I
* --
W78A
* *
L79A
+ *
D80K
* *
D80R
* *
D80A
* *
D80F
* *
D80G
* *
D80M
* *
D80N
* *
D80I
* --
F82A
++ -
* Unión no observada --Unión < 1/5 WT (natural; siglas en inglés) -Unión ∼1/2 WT + WT ++ Aumento de la unión < 2x +++ Aumento de la unión∼5x ++++ Aumento de la unión ∼10x +++++ Aumento de la unión ∼40x
Ejemplo 7. Efecto de las proteínas ActRIIB-Fc sobre la masa muscular en ratones naturales
5 Los solicitantes determinaron la capacidad de la proteína ActRIIB-Fc de aumentar la masa muscular en ratones naturales.
Se dieron a ratones C57B110 dosis (10 mg/kg; vía intraperitoneal (i.p.)) dos veces/semana, bien de la proteína ActRIIB (R64 20-134) humana, o bien de ActRIIB (K74A 20-134) humana. Los ratones se escanearon mediante 10 RMN el día 0 y el día 28 para determinar el cambio porcentual de la masa tisular magra corporal completa. Los ratones tratados con ActRIIB (R64 20-134)-Fc humana mostraron un aumento significativo del 31,1 % del tejido magro al compararlos con el grupo de control con vehículo. Los ratones tratados con la proteína ActRIIB (K74A 20134)-Fc humana mostraron un aumento significativo de la masa tisular magra en comparación con la cohorte de control, si bien en menor grado que el grupo tratado con ActRIIB (R64 20-134) humana. En un estudio similar, los
15 ratones se trataron dos veces/semana con PBS, 1 mg/kg, 3 mg/kg, o 10 mg/kg de ActRIIB (WT, 20-134)-Fc murina, por vía intraperitoneal. Al final del estudio se diseccionaron y se pesaron los músculos bíceps crural, gemelos, pectorales y diafragma. Los resultados se muestran en la tabla 3, a continuación.
Tabla 3: Pesos tisulares de ratones naturales tratados con vehículo y ActRIIB (WT, 20-134)-Fc murina
Tratados con vehículo
Gemelos (I+D) Bíceps crural (I+D) Pectorales (I+D) Diafragma
Media (gramos) Desviación típica
0,306  0,020 0,187  0,040 0,257  0,020 0,076  0,020
muActRIIB (WT, 20-134)-Fc (10 mg/kg)
Gemelos (I+D) Bíceps crural (I+D) Pectorales (I+D) Diafragma
Media (gramos)  Desviación típica
0,387  0,010 0,241  0,014 0,360  0,070 0,124  0,040
Valor de p de la prueba de la t
0,0001 0,009 0,02 0,04
Tal como se muestra en la tabla 3, la proteína de fusión ActRIIB (WT, 20-134)-Fc murina aumenta significativamente la masa muscular en ratones naturales. En los ratones tratados con ActRIIB (WT, 20-134)-Fc murina, los músculos
5 gemelos aumentaron un 26,5 %, los músculos bíceps crurales aumentaron un 28,9 %, los músculos pectorales aumentaron un 40,0%. También observamos cambios en el músculo diafragma, que aumentó en un 63 % en comparación con los ratones de control tratados con vehículo. La disminución del músculo diafragma es una complicación común en una variedad de distrofias musculares. Por lo tanto, el aumento del peso del diafragma que se observa después del tratamiento con ActRIIB (WT, 20-134)-Fc murina podría ser de importancia clínica.
10 Ejemplo 8. Efecto de proteínas ActRIIB-Fc de semivida larga sobre la masa muscular en ratones naturales
Los solicitantes determinaron la capacidad de la variante de semivida larga de la proteína ActRIIB-mFc (R64, A24N 20-134) de aumentar la masa muscular en ratones naturales.
15 Se dieron a ratones C57B110 dosis (10 mg/kg; vía intraperitoneal (i.p.)) dos veces/semana, bien de la proteína ActRIIB-mFc (R64 20-134) humana, o bien de ActRIIB-mFc (R64, A24N 20-134) humana. Los ratones se escanearon mediante RMN en distintos puntos hasta el día 25 para determinar el cambio porcentual de la masa tisular magra corporal completo. Ambas moléculas causaron aumentos equivalentes del peso corporal y masas
20 musculares totales, oscilando los efectos sobre los músculos gemelos, bíceps crural y pectoral de un 40-70 % de aumento. Véanse las figuras 5 y 6.
Estos datos demuestran que la forma de semivida aumentada de la molécula promueve crecimiento muscular en un estudio a corto plazo con una potencia equivalente a la molécula natural.
25 Ejemplo 9. Efecto de proteínas ActRIIB-Fc con unión a activina reducida sobre la masa muscular en ratones naturales
Los solicitantes determinaron la capacidad de la variante de semivida larga de la proteína ActRIIB-mFc (R64, L79D 30 20-134) de aumentar la masa muscular en ratones naturales.
Se dieron a ratones C57B110 dosis (10 mg/kg; vía intraperitoneal (i.p.)) dos veces/semana, bien de la proteína ActRIIB-mFc (R64 20-134) humana, o bien de ActRIIB-mFc (R64, L79D 20-134) humana. Los ratones se escanearon mediante RMN en distintos puntos hasta el día 24 para determinar el cambio porcentual de la masa tisular magra
35 corporal completo. Los datos se muestran en la tabla a continuación.
Peso corporal, día 0 (g)
Peso corporal, día 24 (g) Gemelos (I+D) Bíceps crural (I+D) Pectorales (I+D)
TBS mod. (p/v)
24,4  1,51 26,8  1,43 0,29  0,02 0,17  0,02 0,24  0,05
R64,20-134 (0 mg/kg)
25,0  1,36 31,2*  1,53 0,40*  0,02 0,24*  0,02 0,37*  0,07
R64, L79D, 20-134 (10 mg/kg)
25,3  1,22 28,1  1,64 0,32*  0,02 0,20*  0,02 0,27  0,05
*p < 0,05
Estos datos demuestran que la variante L79D (unión a activina A reducida) de ActRIIB es activa in vivo para promover crecimiento muscular, sin embargo, la cantidad de crecimiento muscular es menor que la de ActRIIB 40 natural. Este efecto disminuido puede estar causado en parte por la ligera reducción de la unión a miostatina o por la pérdida de unión a un regulador negativo adicional, hasta ahora desconocido, del crecimiento muscular. La capacidad de estimular crecimiento muscular sin afectar a la señalización de activina A es altamente deseable porque activina es una molécula reguladora expresada ampliamente que se sabe que tiene efectos sobre el sistema reproductor, hueso, hígado y muchos otros tejidos. En ratones, ActRIIB-mFc (R64 20-134) causa efectos 45 sustanciales sobre el sistema reproductor y, en algunos casos, causa un aumento del tamaño del bazo. La molécula
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crónica. Por lo tanto, podría ser de importancia clínica que el tratamiento con una proteína ActRIIB (R64 20-134)mFc humana pudiera atenuar la atrofia muscular asociada con la caquexia.
Ejemplo 14. Efecto de ActRIIB-Fc sobre la masa muscular y la obesidad en ratones ancianos u ovariectomizados.
5 La sarcopenia es una forma de pérdida muscular asociada con el envejecimiento en seres humanos por otra parte sanos. El trastorno está asociado con una pérdida progresiva de masa muscular esquelética y fuerza y movilidad alteradas. Las causas de la sarcopenia se comprenden mal. En las mujeres, la menopausia acelera la pérdida muscular, de la misma forma que lo hace con respecto a la pérdida ósea. Por consiguiente, se analizó ActRIIB (R64,
10 20-134)-mFc en ratones extremadamente viejos (de dos años de vida) y en ratonas ovariectomizadas (un modelo de estado menopáusico).
Se ovariectomizó (OVX), o bien se operó de forma simulada a ratones hembra C57BL/6 de 8 semanas; después se las dejó llegar a las 16 semanas de edad antes del inicio del estudio. Al principio del estudio, las ratonas simuladas y
15 OVX se dividieron en cada caso en grupos de tratamiento y de vehículo. Todos los grupos se pesaron y se les dieron dosis semanales, bien de ActRIIB (R64, 20-134)-mFc o de control de tampón durante 11 semanas. Todas las ratonas tuvieron escaneados mediante RMN los días del estudio 0 y 83 para determinar la composición corporal.
Al final del estudio, las ratonas simuladas con PBS habían perdido un 4,7 5 de su masa magra original mientras que
20 el grupo tratado de forma simulada aumentó su masa magra en un 21 % a lo largo del transcurso del estudio. Las OVX de control perdieron un 12,1 % (significativamente más que las simuladas con vehículo) de su masa magra mientras que las ratonas OVX tratadas ganaron un 12,9 % hacia el final del estudio.
Estos datos indican que las proteínas de fusión ActRIIB-Fc pueden usarse para contrarrestar la pérdida muscular 25 que es común en las mujeres posmenopáusicas.
Para valorar los efectos de ActRIIB-Fc en una población senescente de forma natural, se dejó llegar a ratones C57BL/6 macho hasta 70 semanas de edad antes del inicio del tratamiento. Los ratones se dividieron en 2 grupos (PBS y 10 mg/kg de ActRIIB (R64, 20-134)-mFc). Cada grupo se pesó y se les dieron dosis 2X/semana durante 10
30 semanas. A lo largo del transcurso del estudio, los grupos tratados ganaron significativamente más masa tisular magra que el grupo con PBS.
% cambio de masa magra
PBS 10 mg/kg
Promedio (% desde el inicio)
101,76 117,27
DT
3,83 3,91
Valor de p con respecto a PBS
< 0,001
El grupo tratado también tuvo pesos musculares significativamente mayores en comparación con los ratones con 35 PBS.
Pesos musculares
Gemelos (I+D) Bíceps crural (I+D) Pectorales (I+D)
PBS
0,283  0,07 0,156  60,01 0,241  0,07
ActRIIB (R64,20134)-mFc
0,371  0,03* 0,192  0,021* 0,330  0,05*
*p < 0,05
La integridad muscular en la cohorte tratada también pareció ser mayor que la del grupo con PBS, ya que, aparentemente, se redujo la grasa intramuscular y se mejoró la citoarquitectura. (Véase la figura 10).
40 Estos datos demuestran que las proteínas de fusión ActRIIB-Fc pueden usarse para tratar atrofia muscular asociada con edad avanzada en hombres y mujeres.
Ejemplo 15. Efecto de ActRIIB-Fc sobre la pérdida muscular asociada con la castración
45 El cáncer de próstata se trata comúnmente con terapia antiandrogénica. Los efectos secundarios del tratamiento incluyen pérdida muscular y obesidad aumentada. Los ratones castrados sufren cambios similares, haciendo de éste un buen modelo para el estudio del potencial de ActRTTB-Fc para su uso en esta situación clínica.
50 Se castró o se operó de forma simulada a ratones C57BL/6 macho de 8 semanas, después se les dejó recuperarse durante 3 semanas antes del comienzo del estudio. Los grupos simulados y castrados se subdividieron
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