CN1753904A

CN1753904A - 骨形态发生蛋白－2的雌激素效应元件及其使用方法

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Publication number: CN1753904A
Application number: CNA038241234A
Authority: CN
Inventors: P·V·N·博丁; D·加茨特
Original assignee: Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem; Wyeth LLC
Current assignee: Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem; Wyeth LLC
Priority date: 2002-08-16
Filing date: 2003-08-18
Publication date: 2006-03-29
Also published as: AU2003261246A1; EP1534731A4; CO5721011A2; CA2497304A1; US20050271637A1; MXPA05001694A; KR20050083635A; NO20050935L; EP1534731A1; WO2004016639A1; JP2006500925A; BR0313729A; ZA200502131B; RU2005107330A

Abstract

本发明涉及一种相当于包含雌激素效应元件的BMP－2调节区或其片段的分离的核酸、包括所述核酸的载体以及包含所述载体的细胞。在另一个实施方案中，本发明提供鉴定雌激素激动剂、雌激素拮抗剂和治疗剂的方法；在另一个实施方案中，本发明提供治疗与雌激素不足或者对外来雌激素或其激动剂缺乏反应有关的疾病的方法。

Description

骨形态发生蛋白-2的雌激素效应元件及其使用方法

发明背景

在成年人的一生中，骨质通过骨形成和骨吸收的相互作用循环而不断地进行重建(骨质更新)。骨吸收一般是迅速的，并且是由破骨细胞(骨吸收细胞)介导的，破骨细胞通过单核吞噬细胞的前体细胞在骨质重建部位形成。这过程后面是出现成骨细胞(造骨细胞)，这些细胞慢慢地形成骨质而代替丢失的骨质。靠相互作用的全身性因子(例如激素、淋巴因子、生长因子、维生素)和局部因子(例如细胞因子、粘附分子、淋巴因子和生长因子)，来控制参加重建过程的各种细胞类型的活性。这过程的完成通常导致骨质的平衡替代和更新的事实表明，影响骨质重建的分子信号和事件是受到严格控制的。

已知许多在骨质重建循环过程中导致失调的骨生长障碍。其中主要的是骨代谢紊乱，例如骨质疏松、骨发育障碍(osteoplasia)(骨软化症)、慢性肾衰竭和甲状旁腺功能亢进，它们导致骨量的异常丢失或过度丢失(骨质减少)。佩吉特病(Paget′s disease)等其它骨病也会引起骨量在局限性部位的过度丢失。

骨质疏松是由起因于骨形成、骨吸收或这两者失调的骨量丢失所引起的骨骼结构变质；这样的状况，以致于骨吸收支配骨形成阶段，因此减小受影响骨质的承重能力。在健康成年人中，形成骨质和吸收骨质的比率是严格协调的，结果是维持骨骼骨质的更新。然而，在骨质疏松个体中，在这些个体的骨质重建循环过程中出现失调，该失调不但导致骨量的丢失，而且导致骨骼连续性方面微构筑缺陷的形成。在美国，在年龄超过50岁的人中，骨质疏松影响大约50％的女人和大约10％的男人。在患有骨质疏松的个体方面，骨量丢失加大导致脆性骨，结果是骨折危险性增大。佩吉特病和转移性骨癌等其它骨吸收疾病存在同样的症状。

骨形态发生蛋白(BMP)是转化生长因子β(TGF-β)超家族中的成员，并且最初由于它们在脱矿质骨的骨诱导提取物中的存在而被鉴定出来(Wozney等，1988；Rosen等，1996)。长期以来，人们一直认为BMP作用的主要靶细胞是早期成骨细胞的祖细胞或间充质干细胞(Oreffo等，1999)。重组人BMP-2，是BMP家族的一员，在体内诱导软骨和骨的形成(Wozney等1988，Wang等1990，Gazit等1999)，而在体外诱导几种间充质细胞类型的成骨分化(Katagiri等1990；Theis等1992；Wang等1993；Yamaguchi等1996；Hanada等1997；Gazit等1999；Moutsatsos等2001；Turgeman等2001)。

发明概述

在一个实施方案中，本发明提供其核酸序列相当于包含雌激素效应元件的BMP-2调节区或其片段的分离的核酸。

在另一个实施方案中，本发明提供包含其核酸序列相当于包含雌激素效应元件的BMP-2调节区或其片段且与第二核酸有效连接的分离的核酸的载体。

在另一个实施方案中，本发明提供包含其核酸序列相当于包含雌激素效应元件的BMP-2调节区或其片段的分离的核酸的宿主细胞。

在另一个实施方案中，本发明提供用于鉴定预防和/或治疗骨质疏松的潜在治疗剂的方法，所述方法包括：(a)将包含相当于BMP-2调节区或其片段的分离的核酸的载体导入细胞中，所述核酸包含雌激素效应元件且与报道基因有效连接；(b)使所述细胞与候选剂接触；和(c)监测由报道基因编码的蛋白的表达，其中所诱导的蛋白表达表明所述候选剂是潜在的治疗剂。

在另一个实施方案中，本发明提供调节受治疗者体内BMP-2表达的方法，所述方法包括下述步骤：给予包含相当于BMP-2调节区或其片段的分离的核酸的载体，所述核酸包含雌激素效应元件且与第二核酸有效连接；并且给予所述受治疗者有效量的雌激素或雌激素激动剂；从而调节所述受治疗者体内BMP-2的表达。

在另一个实施方案中，本发明提供调节受治疗者体内BMP-2表达的方法，所述方法包括下述步骤：将有效量的包含相当于BMP-2调节区或其片段的分离的核酸的细胞给予受治疗者，所述核酸包含雌激素效应元件且与编码BMP-2的核酸有效连接；并且给予所述有需要的受治疗者有效量的雌激素或雌激素激动剂；从而调节所述受治疗者体内BMP-2的表达。

在另一个实施方案中，本发明提供增强细胞对雌激素或雌激素激动剂的反应性的方法，所述方法包括下述步骤：给予包含相当于包含雌激素效应元件的BMP-2调节区或其片段且与第二核酸有效连接的分离的核酸的载体；从而增强所述细胞对雌激素的反应性。

在另一个实施方案中，本发明提供增强有需要的受治疗者体内骨修复的方法，所述方法包括下述步骤：给予包含相当于包含雌激素效应元件的BMP-2调节区或其片段且与目标第二核酸有效连接的分离的核酸；并且给予所述有需要的受治疗者有效量的雌激素或雌激素激动剂；从而增强所述有需要的受治疗者体内的骨修复。

在另一个实施方案中，本发明提供增强骨修复的方法，所述方法包括下述步骤：给予受治疗者有效量的包含分离的核酸的细胞即宿主细胞，所述核酸相当于包含雌激素效应元件的BMP-2调节区或其片段且与第二核酸有效连接；并且给予所述有需要的受治疗者有效量的雌激素或雌激素激动剂；从而增强所述受治疗者的骨修复。

在另一个实施方案中，本发明提供维持或增加有需要的受治疗者的骨体积、骨质量或骨强度的方法，所述受治疗者罹患由雌激素减少引起的骨质疏松或者伴有雌激素减少的骨质疏松，所述方法包括下述步骤：给予包含分离的核酸的载体，所述核酸相当于包含雌激素效应元件BMP-2调节区或其片段且与第二核酸有效连接；并且给予所述有需要的受治疗者有效量的雌激素或雌激素激动剂；从而维持或增加所述有需要的受治疗者的骨体积、骨质量或骨强度。

在另一个实施方案中，本发明提供维持或增加有需要的受治疗者的骨体积、骨质量或骨强度的方法，所述受治疗者罹患由雌激素减少引起的骨质疏松或者伴有雌激素减少的骨质疏松，所述方法包括下述步骤：给予受治疗者有效量的包含分离的核酸的细胞即宿主细胞，所述核酸相当于包含雌激素效应元件的BMP-2调节区或其片段且与第二核酸有效连接；并且给予所述有需要的受治疗者有效量的雌激素或雌激素激动剂；从而维持或增加所述有需要的受治疗者的骨体积、骨质量或骨强度。

在另一个实施方案中，本发明提供增强有需要的受治疗者体内骨修复的方法，所述方法包括下述步骤：获得所述受治疗者的细胞；用包含分离的核酸的载体转染所述细胞，所述核酸相当于包含雌激素效应元件的BMP-2调节区或其片段且与第二核酸有效连接；将所述工程细胞给予所述受治疗者；并且给予所述有需要的受治疗者有效量的雌激素或雌激素激动剂；从而增强所述有需要的受治疗者体内的骨修复。

在另一个实施方案中，本发明提供维持或增加有需要的受治疗者的骨体积、骨质量或骨强度的方法，所述受治疗者罹患由雌激素减少引起的骨质疏松或者伴有雌激素减少的骨质疏松，所述方法包括下述步骤：获得所述受治疗者的细胞；用包含分离的核酸的载体转染所述细胞，所述核酸相当于包含雌激素效应元件的BMP-2调节区或其片段且与第二核酸有效连接；将所述工程细胞给予所述受治疗者；并且给予所述有需要的受治疗者有效量的雌激素或雌激素激动剂；从而维持或增加所述有需要的受治疗者的骨体积、骨质量或骨强度。

在另一个实施方案中，本发明提供用于生产可移植骨基质的方法，所述方法包括下述步骤：获得细胞；用包含相当于BMP-2调节区或其片段的分离的核酸的载体转染所述细胞，所述核酸包含雌激素效应元件且与第二核酸有效连接；以及将所述细胞与所述细胞相关基质一起培养一段有效时间，即允许形成可移植骨基质的时间。

在另一个实施方案中，本发明提供刺激成骨细胞分化的方法，所述方法包括下述步骤：给予包含相当于BMP-2调节区或其片段的分离的核酸的载体，所述核酸包含雌激素效应元件且与第二核酸有效连接；并且给予有效量的雌激素或雌激素激动剂；从而刺激成骨细胞的分化。

在另一个实施方案中，本发明提供治疗受治疗者的骨病的方法，所述方法包括下述步骤：给予包含相当于BMP-2调节区或其片段的分离的核酸的载体，所述核酸包含雌激素效应元件且与第二核酸有效连接；并且给予所述受治疗者有效量的雌激素或雌激素激动剂；从而治疗所述受治疗者的骨病。

在另一个实施方案中，本发明提供治疗受治疗者的骨病的方法，所述方法包括下述步骤：给予受治疗者有效量的包含分离的核酸的细胞即宿主细胞，所述核酸相当于包含雌激素效应元件的BMP-2调节区或其片段且与基因有效连接；并且给予所述有需要的受治疗者有效量的雌激素或雌激素激动剂；从而治疗所述受治疗者的骨病。

在另一个实施方案中，本发明提供鉴定样品中作为雌激素激动剂的化合物的方法，所述方法包括：(a)提供表达人雌激素受体的细胞系，所述细胞系已用与包含分离的核酸有效连接的报道基因的载体稳定转染，所述核酸相当于包含雌激素效应元件的BMP-2调节区或其片段，所述雌激素效应元件能够响应雌激素而控制报道基因的表达；(b)在人雌激素会导致报道基因表达增加的条件下，使转染细胞系与怀疑含有人雌激素激动剂的样品接触；和(c)测定报道基因的表达水平；由此与缓冲液对照产生的表达水平相比，根据测量到报道基因表达水平的增加可鉴定出样品中的人雌激素激动剂。

在另一个实施方案中，本发明提供鉴定样品中作为雌激素拮抗剂的化合物的方法，所述方法包括：(a)提供表达人雌激素受体的细胞系，所述细胞系已用包含与分离的核酸有效连接的报道基因的载体稳定转染，所述核酸相当于包含雌激素效应元件的BMP-2调节区或其片段，所述雌激素效应元件能够响应雌激素而控制报道基因的表达；(b)使转染细胞系与怀疑含有人雌激素拮抗剂的样品接触；已向所述样品中添加了适量的人雌激素，并且所述样品中不存在这样的拮抗剂，将会导致报道基因表达的可测量的增加，和(c)测定报道基因的表达水平；由此与在没有这种拮抗剂的情况下由人雌激素产生的表达水平相比，根据测量到报道基因表达水平的减少可鉴定出样品中的人雌激素拮抗剂。

附图简述

图1：通过实时RT-PCR证明，E2(雌二醇)调节得自OVX小鼠间充质干细胞(MSC)中的小鼠BMP-2 mRNA表达。在用100nM E2处理24小时后，在2μg的总RNA中，小鼠BMP-2mRNA的水平从570±81拷贝显著增加到1337±177拷贝(p＜0.05，ANOVA)。

图2：E2直接调节得自卵巢切除小鼠的MSC中的BMP-2mRNA表达。通过用雌二醇(E2)处理4小时，5μM放线菌酮没有阻断BMP-2的正调节(A)，尽管同样浓度的放线菌酮会导致c-myc的超诱导(B)。

图3：E2而不是选择性雌激素受体调节剂经由雌激素受体(ER)调节得自卵巢切除小鼠的MSC中的BMP-2mRNA表达。(A)通过用E2(10^-7M)处理24小时，ICI(10μM)阻断MSC中的BMP-2mRNA表达的正调节；正如由半定量RT-PCR所显示的。(B)通过用E2(10^-7M)处理24小时，而不是用他莫昔芬(10^-6M)或雷洛昔芬(10^-7M)处理，可正调节MSC中的BMP-2mRNA表达。

图4：野生型小鼠C3H10T1/2细胞不表达功能性ER并且需要ERα或者ERβ的转染。(A)从过量表达人ERα或人ERβ的野生型(WT)或稳定C3H10T1/2细胞系中，分离出RNA，并对ER或GADPDH进行RT-PCR。泳道：M，1kb分子量梯；1，供ERα分析的WT细胞；2，供ERβ分析的ERβ细胞；3，ERβ的cDNA对照；4，供GAPDH分析的WT细胞；5，供GAPDH分析的ERβ细胞；6，供ERα分析的WT细胞；7，供ERα分析的ERα细胞；8，ERα的cDNA对照；9，供GAPDH分析的WT细胞；10，供GAPDH分析的ERα细胞。(B)用ERE-tk-萤光素酶质粒瞬时转染过量表达人ERα或人ERβ的野生型(WT)或稳定C3H10T1/2细胞系，用10nM E2处理24小时，并且用发光计测定萤光素酶活性。

图5：E2经由ERα和ERβ而刺激小鼠BMP-2启动子活性。E2经由ER以剂量依赖性方式调节小鼠全长BMP-2启动子(-2712)(B)和经典雌激素效应元件(ERE)(C)的活性。将5μg BMP-2启动子-萤光素酶质粒(在pGL3载体中连接萤光素酶(基因)的BMP-2全长启动子)或ERE-tk-萤光素酶质粒与人ERα表达载体或人ERβ表达载体各2μg一起瞬时共转染到小鼠C3H10T1/2细胞中。然后，所述细胞用不同剂量的E2处理24小时，然后用发光计测定萤光素酶活性。

图6：ICI-182，780以剂量依赖性方式抑制E2经由ERα和ERβ对小鼠BMP-2启动子活性的刺激。如图5所描述的，用小鼠BMP-2启动子-萤光素酶载体(-2712)和ERα表达载体(A)或ERβ表达载体(B)转染小鼠C3H10T1/2细胞。

图7：小鼠BMP-2启动子的ER调节部位的位置。通过用限制性酶消化，从全长启动子(-2712)获得小鼠BMP-2启动子的特异性缺失(-838和-150)。然后，把作为PCR产物的启动子片段亚克隆到pGL3-基础载体(-448至+23和-400至+23)中。如同在材料与方法一节中所描述的，完成全长启动子-萤光素酶质粒中野生型BMP-2启动子的变体ERE(Δ变体ERE：5′-GAACCActcTACCTC-3′)的突变。

图8：E2、选择性雌激素受体调节剂(SERM)和染料木黄酮经由ERα和/或ERβ对小鼠BMP-2启动子活性的影响。如同图5所描述的，把BMP-2启动子-萤光素酶载体(-2712)和hERα表达载体或hERβ表达载体一起瞬时转染到C3H10T1/2细胞中。用10nM E2、10μM他莫昔芬、100nM雷洛昔芬、100nM ICI-182，780或100nM染料木黄酮处理所述细胞。

图9：在小鼠BMP-2启动子的变异型雌激素效应元件方面，ER作用的模型。

本发明详细的实施方案

本发明涉及其核酸序列相当于包含雌激素效应元件的BMP-2调节区的分离的核酸、包括所述核酸的载体和包含所述载体的细胞。在另一个实施方案中，本发明提供鉴定雌激素激动剂、雌激素拮抗剂和治疗剂的方法；在另一个实施方案中，本发明提供治疗与雌激素不足或者对外来雌激素或其激动剂缺乏反应有关的疾病的方法。

在一个实施方案中，本发明提供相当于包含雌激素效应元件的BMP-2调节区或其片段的分离的核酸。

在一个实施方案中，“雌激素效应元件”是这样的核酸序列：当雌激素效应元件与启动子有效连接时，它们使该启动子变得是可被雌激素诱导的。作为这样连接的结果，在有雌激素或雌激素激动剂的情况下，在用包含报道基因的载体稳定转化的细胞中，产生增加的报道基因产物浓度，所述报道基因与相当于包含雌激素效应元件的BMP-2调节区或其片段的核酸有效连接。

在一个实施方案中，本发明提供与包含雌激素效应元件的BMP-2调节区或其片段有至少95％同源性的核酸。在另一个实施方案中，本发明提供与包含雌激素效应元件的BMP-2调节区或其片段有至少90％同源性的核酸。在另一个实施方案中，本发明提供与包含雌激素效应元件的BMP-2调节区或其片段有至少85％同源性的核酸。在另一个实施方案中，本发明提供与包含雌激素效应元件的BMP-2调节区或其片段有至少80％同源性的核酸。在另一个实施方案中，本发明提供与包含雌激素效应元件的BMP-2调节区或其片段有至少77％同源性的核酸。在另一个实施方案中，本发明提供与包含雌激素效应元件的BMP-2调节区或其片段有至少70％同源性的核酸序列。在另一个实施方案中，本发明提供与包含雌激素效应元件的BMP-2调节区或其片段有介于70％和90％之间同源性的核酸。

在一个实施方案中，“包含雌激素效应元件的BMP-2调节区或其片段”是可用雌激素或雌激素激动剂诱导的BMP-2基因。作为这种诱导的结果，在有人雌激素的情况下，用包含报道基因的载体稳定转化的细胞会产生增加的报道基因产物(例如但不限于BMP-2)浓度，所述报道基因与相当于包含雌激素效应元件的BMP-2调节区或其片段的核酸有效连接。

在另一个实施方案中，相当于包含雌激素效应元件的BMP-2调节区或其片段的分离的核酸的核酸序列为SEQ ID No.1。在小鼠BMP-2启动子序列中，申请人发现位于-415至-402的变体非回文ERE(5′- GGG CCAnnnTGACC C-3′)(SEQ ID NO：1)。所述小鼠BMP-2变体ERE与经典卵黄生成素A2ERE(5′- AGG TCAnnnTGACC T-3′)(SEQ IDNO：2)在15bp序列范围内有3bp变化。然而，在核心13bp的ERE共有序列(5′GG CCAnnnTGACC-3′)(SEQ ID NO：3)的范围内，仅有一个碱基对被改变。正如本文中所提供的，通过比较小鼠BMP-2启动子的不同缺失和BMP-2变体ERE突变两者的活性，证明ERα和ERβ对启动子的调节是经由该变体ERE的结合部位而不是经由AP-1部位或Spl部位。

根据本发明的公开内容，通过化学合成、体外扩增[包括但不限于聚合酶链式反应(PCR)]或者这些方法的组合，可以从天然存在的材料例如哺乳动物细胞培养物、来自这样细胞的基因组DNA或者这样DNA的文库，获得编码包含本发明雌激素效应元件的BMP-2调节区或其片段的DNA。

可以通过使用合适的载体、构建体和本领域众所周知的DNA介导的基因转移等方法，包括但不限于转染、电穿孔和病毒介导的感染，可以把相当于包含本发明雌激素效应元件的BMP-2调节区或其片段的分离的核酸与报道基因有效连接，并且用来瞬时转化或者稳定转化合适的宿主细胞。如果使用病毒，在一个实施方案中，所用的病毒可以是腺病毒。

在另一个实施方案中，所述载体是包含宿主细胞中基因转录所必需的调节元件的DNA分子。通常，使所述基因处于在某些调节元件的控制之下，所述调节元件包括组成型启动子或诱导型启动子、组织特异性调节元件和增强子元件。如果调节元件控制基因的表达，则说这样的基因是与该调节元件“有效连接”。表达载体一般包括便于挑选包含表达载体的细胞的真核选择标记和/或细菌选择标记。

在另一个实施方案中，本发明提供包含相当于BMP-2调节区或其片段的分离的核酸的载体，所述核酸包含雌激素效应元件且与第二核酸有效连接。

如果包含启动子和报道基因的DNA末端和载体末端都包含匹配的限制位点，则使这样的元件插入到载体中是容易完成的。

另一方面，可以通过使核苷酸序列(接头)连接在末端上，来产生所需要的任何位点。这样的接头可以包含确定所需限制位点的特异性寡聚核苷酸序列。如果需要，也可以通过同聚物加尾反应，来修饰切割的载体和DNA片段。

可以把所述效应元件插入到许多包含哺乳动物报道基因的载体中，所述载体包括但不限于质粒pSV2Apap、质粒pMAMneo-CAT、质粒pMAMneo-LUC、质粒pSVOCAT、质粒pBCO、质粒pBLCAT2、质粒pBLCAT3、质粒pON1、质粒pCH110、质粒p.O slashed.GH、质粒pIL-4RE-SV40-LacZ、质粒pSP72以及由De Wet等描述的种种质粒；在所需要的载体包含不同的启动子的情况下，可以用标准方法，切除这样的启动子，而用包含雌激素效应元件的BMP-2调节区或其片段代替它。另一方面，可以使雌激素效应元件处于与另一启动子相结合，从而使其变得可被雌激素所诱导。

可以用上述重组载体稳定地转化任何能够响应雌激素或其激动剂的哺乳动物细胞，也就是说，所述哺乳动物细胞包括响应雌激素或雌激素激动剂的受体。迄今为止，有两种已知类型的雌激素受体，它们是雌激素受体α和雌激素受体β。

在另一个实施方案中，本发明提供包含相当于BMP-2调节区或其片段的分离的核酸的宿主细胞，所述核酸包含雌激素效应元件且与第二核酸有效连接。

在另一个实施方案中，按照Berry等，E.M.B.O.J.，9：2811-2818(1990)中所描述的方法，可以对本发明的细胞进行修饰，以提供截短或嵌合的雌激素受体，或者提供天然雌激素受体。这些修饰可导致雌激素亲和性增加和灵敏度提高，并且将会提高治疗功效。

在另一个实施方案中，本发明的细胞可以是成骨细胞、间充质干细胞、祖细胞或可以分化成成骨细胞的细胞。

在一个实施方案中，“第二核酸”是与雌激素不足疾病有关的任何核酸(基因)，或是与由于受治疗者缺乏对雌激素的反应性有关的任何核酸(基因)。为治疗遗传病或后天疾病而会在受治疗者细胞中表达的具体目标核酸包括：编码成骨因子的那些核酸；或与雌激素的其它作用有关的基因，例如与认知功能、神经保护、神经再生的增强和轴突生长的刺激有关的那些基因。在另一个实施方案中，所述基因与癌症、血管生成、中风和心血管疾病有关。

在另一个实施方案中，可以用本发明的雌激素效应元件来治疗各种各样的骨病，所述骨病与雌激素缺乏有关，或者与缺乏对雌激素的反应有关。所述治疗会导致由第二核酸编码的产物的表达更高。

在另一个实施方案中，所述第二核酸可以是编码成骨因子的基因，例如OP-1、OP-2、BMP-5、BMP-6、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-9、DPP、Vg-1、60A、Vgr-1。

在另一个实施方案中，将使目标基因产物的表达增加至少1.5倍。在另一个实施方案中，将使BMP-2产物的表达增加1.5倍至30倍。

虽然用于本发明的细胞原则上可以是瞬时转化的，但优选稳定转化的细胞。采用标准方法，用上述重组载体之一以及赋予对抗生素等选择试剂的抗性的第二载体(例如pSV2neo或pRSVneo)共转染所述细胞，可完成人细胞系的稳定转化。另一方面，可以用既包含启动子/报道基因构建体又包含选择标记基因的一种载体，来进行转化。

定量实时RT-PCR的结果表明，在(E2)处理24小时后，E2增加起源于小鼠骨髓的MSC中的BMP-2基因表达。用蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺共同处理没有阻断BMP-2mRNA由于E2处理所致的正调节。然而，同样浓度的该抑制剂导致c-myc mRNA水平的超诱导，暗示它阻断蛋白质合成(Hauguel-de Mouzon和Kahn，1991)。因此，这些结果表明，E2直接调节BMP-2mRNA水平。另外，他莫昔芬、雷洛昔芬和ICI等SERM不能激活小鼠BMP-2基因表达，而ICI抑制E2对基因表达的刺激。这些结果表明，由于E2的BMP-2mRNA的增加是依赖ER的。

为了确定E2转录激活小鼠BMP-2启动子的机制，开发出一种通过将启动子-萤光素酶报道基因构建体瞬时转染到小鼠多潜能间充质细胞C3H10T1/2中的模型系统。因为C3H10T1/2细胞不表达ER，所以，将其用编码人ERα和/或ERβ中任一种的表达载体进行共转染(An等，1999)。在用ERα或ERβ共转染的细胞中，E2以剂量依赖性方式诱导小鼠BMP-2启动子活性。在E2的剂量为10nM时，ERα诱导出9.0倍小鼠BMP-2启动子萤光素酶活性，而在用ERβ共转染的细胞中，观察到3.3倍增加。ICI阻断由E2经由ERα和ERβ来激活小鼠BMP-2启动子活性，表明启动子的激活是依赖ER的。这一结果证实，有关BMP-2mRNA在小鼠骨髓MSC中表达的RT-PCR结果。

在另一个实施方案中，按照Berry等，E.M.B.O.J.，9：2811-2818(1990)中描述的方法，可以对本发明的细胞进行修饰，以提供截短或嵌合的雌激素受体。这些修饰可导致雌激素亲和性增加和分析灵敏度提高，并且当为治疗目的而使用该细胞时，它将会提高治疗功效。

在另一个实施方案中，本发明提供用于鉴定预防和/或治疗骨质疏松的潜在治疗剂的方法，所述方法包括：(a)将包含分离的核酸的载体导入细胞中，所述核酸相当于包含雌激素效应元件的BMP-2调节区或其片段且与报道基因有效连接；(b)使所述细胞与候选剂接触；和(c)监测由报道基因编码的蛋白的表达，其中所诱导的蛋白表达表明所述候选剂是潜在的治疗剂。

在另一个实施方案中，本发明提供鉴定样品中作为雌激素激动剂的化合物的方法，所述方法包括：(a)提供表达人雌激素受体的细胞系，所述细胞系已用包含与分离的核酸有效连接的报道基因的载体稳定转染，所述核酸相当于包含雌激素效应元件的BMP-2调节区或其片段，所述雌激素效应元件能够响应雌激素而控制所述报道基因的表达；(b)在人雌激素会导致报道基因表达增加的条件下，使转染细胞系与怀疑含有人雌激素激动剂的样品接触；和(c)测定报道基因的表达水平；由此与缓冲液对照产生的表达水平相比，根据测量到报道基因表达水平的增加可鉴定出样品中的人雌激素激动剂。

在另一个实施方案中，本发明提供鉴定样品中作为人雌激素拮抗剂的化合物的方法，所述方法包括：(a)提供表达人雌激素受体的细胞系，所述细胞系已用包含与分离的核酸有效连接的报道基因的载体稳定转染，所述分离的核酸相当于包含雌激素效应元件的BMP-2调节区或其片段，所述雌激素效应元件能够响应雌激素而控制报道基因的表达；(b)使转染细胞系与怀疑含有人雌激素拮抗剂的样品接触；已向所述样品中添加了适量的人雌激素，并且所述样品中不存在这样的拮抗剂，将会导致报道基因表达的可测量的增加；和(c)测定报道基因的表达水平；由此与在没有这种拮抗剂的情况下由人雌激素产生的表达水平相比，根据测量到报道基因表达水平的减少可鉴定出样品中的人雌激素拮抗剂。

在一个实施方案中，“报道基因”是容易分析其产物的编码单位(例如但不限于萤光素酶或氯霉素乙酰转移酶)。报道基因或者可以是从基因组DNA中分离的DNA分子(这些DNA分子可以含有或者不含内含子)，或者可以是用信使RNA为模板制备的互补DNA(cDNA)。在任一种情况下，所述DNA编码可容易地例如通过生物学活性分析、酶联免疫吸附测定(ELISA)或放射免疫测定(RIA)而测量的表达产物。可以用标准方法测定所述报道基因的表达产物。可以使用各种类型的免疫测定，例如竞争性免疫测定、直接免疫测定和间接免疫测定。

这样的免疫测定涉及包含所述报道基因产物和可测量标记的免疫复合物的形成。在一个实施方案中，“标记”包括：能够被直接检测出的部分，例如荧光染料和放射性标记；以及为了检测而必须起作用或者衍生化的部分，例如酶。

所用的特定标记将取决于所使用的免疫测定类型。可使用的标记实例包括例如放射性标记，例如³²P、¹²⁵I、³H和¹⁴C；荧光标记，例如荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹磺酰和伞形酮；化学发光标记，例如各种萤光素化合物；以及酶，例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、溶菌酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。

可以用已知的方法，视情况而定地用这样的标记来标记抗体或报道基因产物。例如，可以使用醛、碳二亚胺、二马来酰亚胺、亚氨酸酯、琥珀酰亚胺、双重氮化benzadine等偶联剂标记带有荧光标记、化学发光标记或酶标记的抗体。

在竞争性免疫测定中，将来自所诱导培养物(如果不分泌报道基因产物，则在细胞破裂后)的样品与针对报道基因产物的抗体和已知量的标记的报道基因产物一起温育。由所述细胞产生的任何未标记产物与标记材料竞争结合所述抗体。分离所产生的免疫复合物，并测定标记复合物的量。通过把所观察的测量结果与得自标准曲线的结果进行比较，可确定由所述细胞产生的报道基因产物量。直接免疫测定必须包括：将有针对报道基因产物的标记抗体的培养物样品温育，以及分离形成的任何免疫复合物。测定所述复合物中的标记量，并且同标准曲线相比较，可用对所述标记进行定量。

也可以用众所周知的方法来进行酶联免疫吸附测定(ELISA)，例如在美国专利4,665,018号中描述的。

在筛选骨质疏松用治疗剂中，提供用本发明重组载体之一来转化的细胞。在许多培养皿中或者在多孔培养板中，把所述细胞在适合于所用种类细胞的培养基中进行培养，然后使所述细胞与怀疑含有骨质疏松用治疗剂的样品接触。这些样品例如可以是溶液中已溶解了分离的化合物的水溶液或水可混溶溶液，或者例如可以是来自纯化步骤(例如层析或制备电泳)的单独或混合的级分。平行操作阴性对照(仅样品缓冲液)和阳性对照(已知量的雌激素或雌激素激动剂)。

对于具有治疗或预防由雌激素介导的各种各样癌症(例如乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌)及其他疾病(例如子宫内膜异位)的合乎要求性质的那些化合物，本发明提供筛选大量的试验化合物的有效方法。因此，本发明提供筛选新型抗雌激素化合物的方法，所述抗雌激素化合物在经典雌激素效应元件方面阻断雌激素间接响应和/或阻断雌激素作用的抗雌激素化合物。本文所用的抗雌激素是显著抑制雌激素活性的化合物；所述雌激素活性即正如在雌激素活性的标准分析中测定的雌激素活性，所述标准分析例如在Webb等Mol.Endocrinol.，6：157-167(1993)中描述的细胞分析。在温育所述细胞达诱导期之后，通过适合于所用基因的分析，测定由各样品导致的报道基因的表达水平。用常规实验法确定进行所述测定的最佳时间，但一般是在大约24小时至72小时的范围内。通过测定高于未刺激的(缓冲液对照)表达水平的报道基因表达水平，将鉴定出样品中适合于骨质疏松的治疗剂。

当为雌激素活性而测试环境化合物时，所述方法一般包括所培养的产生高水平的人雌激素受体的细胞。这样的细胞包括：MCF-7细胞(ATCC号HTB 22)，MDA453细胞(ATCC号HTB 131)，ZR-75-1细胞(ATCC号CRL 1500)，或Kushner等描述的ERC1细胞(Mol.Endocrinol，4：1465-1473(1990))、Webb等描述的ERC2细胞和ERC3细胞(Mol.Endocrinol.，6：157-167(1993))。

为测试环境化合物，多半采用表达突变型雌激素受体的细胞，所述突变型雌激素受体即对雌激素化合物具有降低的灵敏度的突变型雌激素受体。也可以使用表达野生型受体的细胞(例如MCF7细胞)。在另一个实施方案中，用于筛选分析的细胞可包括过量表达突变型雌激素受体的细胞，例如在上面提到的ERC细胞。

另外，可以用报道基因转染这些细胞，在所述报道基因中，其他的效应元件(例如AP1)调节报道基因的表达。一般使用两种不同的报道基因。一种基因报道由本发明的雌激素响应系统诱导的转录；而另一种基因报道由雌激素的间接响应诱导的转录。一般将两种报道基因和效应元件安置在不同的细胞中，但也可以使用在同一细胞中用两种构建体的方法。

如果DNA区域是功能上彼此有关的，则它们有效连接。例如，如果启动子控制所述序列的转录，则所述启动子与编码序列有效连接；如果使核糖体结合位点定位得以致允许翻译，则所述核糖体结合位点与编码序列有效连接。通常，有效连接意味着邻近的。

来源于多细胞生物的细胞培养物是表达本发明雌激素效应元件的所需要的宿主。原则上，天然表达所述雌激素受体或者已遗传上修饰得表达雌激素受体(或那受体的一部分)的任何高等真核细胞培养物是可用的。正如在实施例中所阐明的，优选哺乳动物细胞。在细胞培养中增殖这样的细胞已成为常规的步骤。参见Tissue Culture，Academic Press，Kruse和Patterson编著(1973)。有用宿主细胞系的实例是MCF-7、MG63、HeLa、RL95.2、HepG2和CHO细胞(全都得自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)，Rockville，Md)。对于本发明的目的，使用MCF-7细胞系是特别优选的，因为所述细胞系组成型表达雌激素受体。

总之，本发明的实施例证明E2调节小鼠BMP-2基因的转录需要BMP-2启动子中变体ERE结合位点，而且证明ERα是基因表达的主要激活剂。对于雌激素在骨质疏松的病理生理学方面的作用和高剂量雌激素的合成作用对骨骼的影响，这些发现构成一种机械的解释。

在另一个实施方案中，本发明提供调节受治疗者体内BMP-2表达的方法，所述方法包括下述步骤：给予包含相当于BMP-2调节区或其片段的分离的核酸的载体，所述核酸包含雌激素效应元件且与编码BMP-2蛋白的核酸有效连接；并且给予所述受治疗者有效量的雌激素或雌激素激动剂；从而调节所述受治疗者体内BMP-2的表达。

在另一个实施方案中，本发明涉及妇科学和生育领域。所述雌激素效应元件可以用来调节基因表达，诸如激素，例如但不限于黄体生成素(LH)或促卵泡激素(FSH)。

在另一个实施方案中，本发明提供调节受治疗者体内BMP-2表达的方法，所述方法包括下述步骤：给予受治疗者有效量的包括含雌激素效应元件的BMP-2调节区或其片段的细胞；并且给予所述有需要的受治疗者有效量的雌激素或雌激素激动剂；从而调节所述受治疗者体内BMP-2的表达。

在另一个实施方案中，本发明提供增强细胞对雌激素或雌激素激动剂的反应性的方法，所述方法包括下述步骤：给予包含相当于BMP-2调节区或其片段的分离的核酸的载体，所述核酸包含雌激素效应元件且与第二核酸有效连接；从而增强所述细胞对雌激素的反应性。

所述细胞可以是受治疗者体内的细胞、来自受治疗者的细胞或在另一个实施方案中的这样的任何细胞，所述细胞包括但不限于：酵母细胞，植物细胞，真菌细胞，昆虫细胞例如Schneider细胞和sF9细胞，哺乳动物细胞例如HeLa细胞(人)、NIH3T3(鼠)、RK13(兔)细胞，胚胎干细胞系例如D3和J1，以及细胞类型例如造血干细胞、成肌细胞、肝细胞、淋巴细胞、气道上皮细胞和皮肤上皮细胞或重组真核宿主细胞。

然后，可以将所修饰的细胞植入到需要这细胞的受治疗者体内，以致于在需要诱导反应性的受治疗者体内诱导某些基因对雌激素或其激动剂的反应性。

在另一个实施方案中，本发明提供通过抑制本发明的雌激素效应元件而抑制某些基因对雌激素或其激动剂的响应或过度敏感响应的方法。通过利用作为引诱物的本发明雌激素效应元件的结合雌激素受体的亲和性，从而通过将大量的引诱物导入细胞中而抑制ER结合基因组的功能性ERE，则可完成这。

在另一个实施方案中，本发明提供增强有需要的受治疗者体内骨修复的方法，所述方法包括下述步骤：给予包含相当于BMP-2调节区或其片段的分离的核酸的载体，所述核酸包含雌激素效应元件且与第二核酸有效连接；并且给予所述有需要的受治疗者有效量的雌激素或雌激素激动剂；从而增强所述有需要的受治疗者体内的骨修复。

在另一个实施方案中，本发明提供增强骨修复的方法，所述方法包括下述步骤：给予受治疗者有效量的包含相当于BMP-2调节区或其片段的分离的核酸的细胞，所述核酸包含雌激素效应元件且与第二核酸有效连接；并且给予所述有需要的受治疗者有效量的雌激素或雌激素激动剂；从而增强所述受治疗者的骨修复。

在另一个实施方案中，本发明提供维持或增加有需要的受治疗者的骨体积、骨质量或骨强度的方法，所述受治疗者罹患由雌激素减少引起的骨质疏松或者伴有雌激素减少的骨质疏松，所述方法包括下述步骤：给予包含相当于BMP-2调节区或其片段的分离的核酸的载体，所述核酸包含雌激素效应元件且与第二核酸有效连接；并且给予所述有需要的受治疗者有效量的雌激素或雌激素激动剂；从而维持或增加所述有需要的受治疗者的骨体积、骨质量或骨强度。

在另一个实施方案中，本发明提供维持或增加有需要的受治疗者的骨体积、骨质量或骨强度的方法，所述受治疗者罹患由雌激素减少引起的骨质疏松或者伴有雌激素减少的骨质疏松，所述方法包括下述步骤：给予受治疗者有效量的包含相当于BMP-2调节区或其片段的分离的核酸的细胞，所述核酸包含雌激素效应元件且与第二核酸有效连接；并且给予所述有需要的受治疗者有效量的雌激素或雌激素激动剂；从而维持或增加所述有需要的受治疗者的骨体积、骨质量或骨强度。

在另一个实施方案中，本发明提供增强有需要的受治疗者体内骨修复的方法，所述方法包括下述步骤：获得所述受治疗者的细胞；用包含相当于BMP-2调节区或其片段的分离的核酸的载体转染所述细胞，所述核酸包含雌激素效应元件且与第二核酸有效连接；将所述工程细胞给予所述受治疗者；并且给予所述有需要的受治疗者有效量的雌激素或雌激素激动剂；从而增强所述有需要的受治疗者体内的骨修复。

在另一个实施方案中，本发明提供维持或增加有需要的受治疗者的骨体积、骨质量或骨强度的方法；所述受治疗者罹患由雌激素减少引起的骨质疏松或者伴有雌激素减少的骨质疏松，所述方法包括下述步骤：获得所述受治疗者的细胞；用包含相当于BMP-2调节区或其片段的分离的核酸的载体转染所述细胞，所述核酸包含雌激素效应元件且与第二核酸有效连接；将所述工程细胞给予所述受治疗者；并且给予所述有需要的受治疗者有效量的雌激素或雌激素激动剂；从而维持或增加所述有需要的受治疗者的骨体积、骨质量或骨强度。

在另一个实施方案中，本发明提供刺激成骨细胞分化的方法，所述方法包括下述步骤：给予包含相当于BMP-2调节区或其片段的分离的核酸的载体，所述核酸包含雌激素效应元件且与第二核酸有效连接；并且给予有效量的雌激素或雌激素激动剂；从而调节刺激成骨细胞分化的表达。

在另一个实施方案中，本发明提供治疗受治疗者的骨病的方法，所述方法包括下述步骤：给予受治疗者有效量的包含相当于BMP-2调节区或其片段的分离的核酸细胞，所述核酸包含雌激素效应元件且与第二核酸有效连接；并且给予所述有需要的受治疗者有效量的雌激素或雌激素激动剂；从而治疗所述受治疗者的骨病。

他莫昔芬和雷洛昔芬等选择性雌激素受体调节剂(SERM)是一些适应症的治疗剂，包括治疗和/或预防乳腺癌和骨质疏松，并且它们对心血管系统也有雌激素样的潜在有益作用(Paech等，1997；Black等，1994；Sato等，1996；Yang等，1996a；Yang等，1996b)。近来，已批准雷洛昔芬用于预防和治疗骨质疏松(Clemett和Spencer2000)。在维持骨矿物质密度方面，这种SERM比许多甾族雌激素的效力小(Sato等，1996)，并且并不改善认知功能(Nickelsen等，1999)或防止髋骨骨折(Ettinger等，1999)。因此，寻找优良的、用于激素替代疗法(HRT)的SERM继续是一个热烈的研究方面(An等，2001)。正如本文中所表明的，结果显示他莫昔芬和雷洛昔芬等SERM是小鼠BMP-2启动子经由ERα而不是ERβ的弱激活剂。这些SERM对刺激人BMP-4启动子活性具有类似的作用。与ERα相比较，植物雌激素例如染料木黄酮对ERβ显示出某些偏爱(An等，2001)。与其适中的结合选择性一致，在本发明中证明染料木黄酮用ERβ而不是用ERα来引发小鼠BMP-2基因转录激活途径。本发明广泛地适用于各种各样的情况，以快速的、有效率的和控制的方式而不导致多向性效应或细胞毒性，在所需要的能够“打开”和“关闭”基因表达或者调节基因表达的水平之处。可应用到或者治疗遗传病、或者治疗后天病的人的基因治疗用途，本发明是有用的。基因治疗的一般方法涉及把一种或多种核酸分子导入细胞中，这样，以致于在所述细胞中产生一种或多种由所引入遗传物质编码的基因产物，从而恢复或增强功能性活性。然而，当前的基因治疗载体一般利用对内源转录因子敏感的组成型调节元件。这些载体系统不便于具有在受治疗者体内调节基因表达水平的能力。相比之下，本发明的调节系统提供这种能力。

在一个实施方案中，本发明系统的细胞或载体可以包含组织或器官特异性的启动子(例如头、心脏或血管)，这样，使所述基因能够在特定的器官或组织中表达。在另一个实施方案中，通过用本领域众所周知的递送方法，可将其用于特定的组织或器官。因此，本发明的调节系统呈现出超过组成型调节系统的、便于随治疗情况要求而定地调节基因表达水平的优点。

在特定的治疗后，也可以用本发明的调节系统在细胞中以便于破坏所述细胞(例如在体内)的条件方式表达自杀基因(例如蓖麻毒蛋白基因或HSV tk基因)。例如，可以把自杀基因导入待用于抗癌免疫的肿瘤细胞中或导入待用作疫苗的减毒活病毒的病毒基因组中。在有锝(Tc)(或其类似物)的情况下，将携带自杀基因的肿瘤细胞或病毒疫苗给予受治疗者。在免疫后，取消用所述药物(例如停止给药)，从而诱导自杀基因的表达，从而破坏所述肿瘤细胞或携带活病毒的细胞。

为了基因治疗目的而可以修饰的细胞类型包括：造血干细胞、成肌细胞、肝细胞、淋巴细胞、气道上皮细胞和皮肤上皮细胞。对于基因治疗的细胞类型、基因和方法的进一步描述，参见例如Wilson，J.M等，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：3014-3018；Armentano，D.等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：6141-6145；Wolff，J.A.等，(1990)Science 247：1465-1468；Chowdhury，J.R.等，(1991)Science 254：1802-1805；Ferry，N.等，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：8377-8381；Wilson，J.M.等，(1992)J.Biol.Chem.267：963-967；Quantin，B.等，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：2581-2584；Dai，Y.等，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10892-10895；van Beusechem，V.W.等，(1992)Proc.Natl.Acad Sci.USA 89：7640-7644；Rosenfeld，M.A.等，(1992)Cell68：143-155；Kay，M.A.等，(1992)Human Gene Therapy 3：641-647；Cristiano，R.J.等，(1993)Proc.Natl.Acad Sci.USA 90：2122-2126；Hwu，P.等，(1993)J.Immunol.150：4104-4115；以及Herz，J.和Gerard，R.D.(1993)Proc.Natl.Acad Sci.USA 90：2812-2816。

也可用本发明的调节系统来生产和分离目标基因产物(例如蛋白)。利用体外培养的已修饰得包含1)编码本发明雌激素效应元件的核酸以及2)第二核酸的细胞，可完成目标蛋白的大规模生产；所述第二核酸即与包含本发明雌激素效应元件的BMP-2启动子或其片段上的第二核酸(例如编码目标蛋白)有效连接。例如，可以将哺乳动物细胞、酵母细胞或真菌细胞修饰得包含本文中描述的这些核酸组分。另一方面，可以使用昆虫细胞/杆状病毒表达系统。为了生产和分离目标基因产物，首先在没有雌激素的情况下，将包括含本发明雌激素效应元件的BMP-2启动子或其片段以及第二核酸的宿主细胞(例如哺乳动物细胞、酵母细胞或真菌细胞)在培养基中进行培养，所述第二核酸与编码目标基因产物的核酸连接。在这些条件下，第二核酸的表达被抑制。其次，增大所述培养基中雌激素或雌激素类似物的浓度，以促进第二核酸的转录。然后，可按标准技术，从所收获的细胞中或者从培养基中分离出基因产物。

本发明也保证在动物中例如在转基因家畜中大规模生产目标蛋白。转基因技术方面的进展已使产生转基因牲畜例如牛、山羊、猪和绵羊成为可能(有关综述参见Wall，R.J.等，(1992)J.Cell.Biochem.49：113-120和Clark，A.J.等，(1987)Trends in Biotechnology 5：20-24)。因此，可以构建在牲畜基因组中携带本发明调节系统组分的转基因牲畜。

例如，通过把连接本发明雌激素调节元件的、编码目标蛋白的核酸导入受精卵母细胞的雄性原核中(例如通过显微注射)，并且让所述卵母细胞在假孕的雌性代孕动物体内发育，则可产生转基因动物。在转基因中也可包括内含子序列和聚腺苷酸化信号，以提高转基因的表达效率。在本领域中，产生转基因动物的方法，特别是产生小鼠等转基因动物的方法，已成为常规的；参见例如美国专利第4,736,866号和第4,870,009号以及Hogan，B.等，(1986)A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor，N.Y.，Cold Spring Harbor Laboratory。可以用创始(founder)转基因动物来繁殖另外的携带转基因的动物。可以进一步使携带一种转基因的转基因动物与另一种携带第二转基因的转基因动物配种，产生携带两种转基因的即所谓的“双转基因”动物。

实施例

材料与方法

化学试剂

除非另有说明，所有材料全都购自Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO)。DMEM、青霉素-链霉素、L-谷氨酰胺购自BiologicalIndustries(Beit Haemek，以色列)。ICI-182，780购自英国ZenecaPharmaceuticals。

质粒构建

先前描述了适合于人ERα和人ERβ(485)的表达载体(Webb等，1998)。如同先前描述的(Harris等，2000)，将全长(-2712至+165)的小鼠BMP-2启动子和5′-端缺失的小鼠BMP-2启动子(-838至+165，-150至+165)克隆在pGL3载体(Promega)萤光素酶cDNA的上游。按照生产商的方案，用QuikChange定点诱变试剂盒(Stratagene，美国)，来完成全长启动子质粒中的小鼠BMP-2变体ERE(Δ变体ERE：5′-GAACCActcTACCTC-3′)的突变。把作为PCR产物的启动子片段亚克隆到pGL3-基础载体(-448至+23和-400至+23)中。如同先前所描述的(An等，1999)，构建ERE-tk-萤光素酶载体(来自蛙卵黄生成素A2基因的一拷贝ERE)。

动物和细胞培养

两个月大Swiss-Webster雌性小鼠(ICR)是按照人道照管的托管标准OVX的，并且按照NIH的照管指南和实验室动物的使用来饲养该动物。在外科手术后5个月后，从股骨和胫骨分离出骨髓，并且如同先前描述的(Gazit等，1999以及Zhou等，2001)，培养MSC。用含有15％FBS(活性炭吸收，热灭活)、100单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素和2mM谷氨酰胺的DMEM(无酚红，1.0克/升葡萄糖，Biological Industries，以色列)，保存所述骨髓细胞。在第4天，给所述培养物补充50μg/ml抗坏血酸、10mMβ-甘油磷酸和10nM地塞米松。从第10天起，所述细胞用有2％经活性炭吸收的去固醇血清(CS)-FBS而没有成骨添加物的DMEM进行培养。在第11天，所述培养物用E2(Sigma)、ICI-182，780(AstraZeneca Pharmaceuticals，英国)、他莫昔芬(Sigma)或雷洛昔芬处理24小时。然后在第12天，分离出RNA。为了确定E2在小鼠MSC中是否直接调节BMP-2mRNA表达，在用100nM E2处理前，向有新鲜DMEM加上2％CS-FBS的培养物中，加入5.0□M的环己酰亚胺达45分钟；并在E2处理后4小时，分离出RNA。用含有10％FBS、100单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素和2mM谷氨酰胺的DMEM(Sigma和Biological Industries)，培养小鼠C3H10T1/2细胞。

细胞转染和萤光素酶的分析

如同先前描述的，进行瞬时转染(An等，1999)。简短地说，在100mm的皿中培养C3H10T1/2细胞直到汇合。通过胰蛋白酶消化而收获所述细胞，将其再悬浮于培养基中，计数，以800rpm离心5分钟而使其沉淀；且用0.5ml包含0.1％葡萄糖的PBS，再次再悬浮1.5×10⁷个细胞。将所述细胞悬液与5μg萤光素酶报道质粒和2μg hERα表达载体或hERβ表达载体混合。把所述细胞转移到小池中，并用Bio-Rad基因脉冲发生器进行电穿孔。在电穿孔后，使所述细胞悬浮在含有2％CS-FBS的DMEM(无酚红)中，并且将其按每孔1ml接种到12孔的多孔板中。所述细胞用E2(10^-8M)或乙醇(溶媒)处理24小时，并用来自Promega的试剂盒与光度计(Turner Designs TD-20/20，CA)，测定萤光素酶活性。通过0.5μg pNGVLl-nt-βGal质粒(由美国安阿伯市(Ann Arbor)密西根大学国家基因载体实验室构建)的共转染，来监测转染效率；且用Galacto-Light化学发光报道分析系统试剂盒(Tropix of PE Biosystems，美国)，测定β-半乳糖苷酶的活性。在把β-半乳糖苷酶的表达标准化后，以RLU(相对光单位)的诱导倍数形式，记录E2处理的细胞比起载体对照处理细胞来的转染结果。误差线表示在5个实验中的标准误差，各实验重复三次。

RNA分离、半定量RT-PCR和实时RT-PCR

按照生产商的方案，用TRIzol Reagent(Life Technologies，美国)分离RNA。如同先前描述的，进行半定量RT-PCR(Zhou等，2001)。小鼠BMP-2(505bp)(Zhou等，2001)、内部对照RPL19(190bp)(Orly等，1994)和c-myc(550bp)(Goswami等，1997)的引物是先前所描述的。对于小鼠BMP-2RT-PCR，所用的PCR条件是，用MJ MiniCycler(MJ Research，美国)，进行94℃1分钟、55℃1分钟和72℃2分钟的循环30个。把小鼠BMP-2的RT-PCR产物克隆到pGEM-T Easy载体(A1360，Promega)中，并且按照该生产商的方案，用T7序列的测序试剂盒(US70770，USB，Cleveland，美国)，测定pGEM-T-小鼠BMP-2载体的序列。DNA序列分析证实已扩增了小鼠BMP-2。

按照生产商的方案，用Roche LightCycler(Roche MolecularBiochemicals，美国)进行实时PCR。在用2μg总RNA进行反转录反应后，用LightCycler-FastStart DNA Master SYBR Green I试剂盒(Roche)，在20μl的终体积中进行实时PCR。该反应混合物包含lxLightCycler-FastStart Master SYBR Green I、每种引物各0.5μM、4mMMgCl₂以及2μl来自RT反应的cDNA。实时PCR的条件如下：95℃10分钟的一个循环以激活修饰的FastStart Taq DNA聚合酶，继之以95℃15秒、以0.5℃的间隔从60℃降至55℃达10秒、以及72℃25秒的循环45个。于82℃测量荧光达5秒。为了确定MSC中的小鼠BMP-2mRNA的拷贝数的数量，按标准曲线使用pGEM-T-小鼠BMP-2质粒(102-108拷贝)。

统计分析

所有实验独立进行三次至五次。数据表示为平均值±平均标准误差。在三次独立实验中，用从每次均来源于3-6只动物的MSC中分离的总RNA进行半定量RT-PCR和实时RT-PCR。或者用Mann-Whitney非参数检验，或者用ANOVA检验，对定量数据进行分析。

实验结果

实施例1

E2在小鼠MSC中直接调节BMP-2mRNA表达

通过实时RT-PCR证明，得自卵巢切除小鼠(手术后5个月)的骨髓MSC表达BMP-2mRNA(图1A)。在用100nM E2处理24小时后，小鼠BMP-2mRNA水平显著增加2.4倍，在2μg的总RNA中，小鼠BMP-2mRNA从570±81拷贝增加到1337±177拷贝(p＜0.05，ANOVA)(图1D)。核糖体蛋白L19(RPL19)用作内部对照，而通过E2处理，没有改变其表达(图1B)。

为了排除小鼠BMP-2的PCR引物扩增预定目标除外的mRNA序列的可能性，纯化扩增产物，克隆并进行测序。随后的BLAST分析(数据未显示)鉴定出正如在GeneBank数据库中列出的、相当于小鼠BMP-2的序列(Feng等，1994；登记号NM 007553)。然后，将所克隆的小鼠BMP-2 cDNA产物(pGEM-T-小鼠BMP-2载体)用于实时RT-PCR，以绘制小鼠BMP-2基因的标准曲线(图1C)。

如图2A所示，在用100nM E2处理小鼠MSC 24小时后，根据半定量RT-PCR测定，有BMP-2 mRNA水平的正调节。用5μM放线菌酮(蛋白质合成抑制剂)的共处理不阻断BMP-2mRNA的这种增加；尽管同样浓度的放线菌酮会导致c-myc mRNA的超诱导，暗示它在抑制蛋白质合成方面仍是有效的(Hauguel-de Mouzon和Kahn1991)(图2B)。这一结果表明，在MSC中，E2调节小鼠BMP-2mRNA是直接的，而与正在进行的蛋白质合成无关。

实施例2

E2在小鼠MSC中调节BMP-2mRNA表达是依赖ER的

根据半定量RT-PCR测定，在24小时处理期后，单独的ER拮抗剂ICI(10μM)对小鼠组成型BMP-2mRNA水平无影响(图3A)。然而，它阻断在小鼠MSC中由E2(100nM)正调节BMP-2mRNA表达，表明E2在MSC中经由ER调节小鼠BMP-2基因表达。另外，通过E2(100nM)处理MSC，来正调节小鼠BMP-2mRNA表达；而不是用选择性雌激素受体调节剂例如他莫昔芬(1.0μM)或雷洛昔芬(100nM)(图3B)。

实施例3

E2在C3H10T1/2细胞中经由ERα和ERβ以剂量依赖性方式调节

小鼠BMP-2启动子活性

为了检验雌激素经由变体雌激素效应元件结合部位转录激活小鼠BMP-2基因表达的假说，研究了E2在间充质干细胞系C3H10T1/2中对小鼠BMP-2启动子活性的影响。因为小鼠C3H10T1/2细胞不表达可检测水平的ER，并且因此需要ER的转染以引起E2对转录的作用；所以使用所述细胞系(图4)。将小鼠全长BMP-2启动子(-2712)-萤光素酶质粒或经典ERE-tk-萤光素酶(An等，1999)质粒与人ERα表达载体或人ERβ表达载体一起瞬时共转染到小鼠C3H10T1/2细胞中。然后，所述细胞用不同浓度的E2处理24小时，然后用光度计测定萤光素酶活性。结果(图5A)显示，E2经由ERα或ERβ以剂量依赖性方式正调节BMP-2启动子(-2712)的活性，尽管ERα不但是小鼠BMP-2启动子的更有效激活剂，而且是小鼠经典ERE的更有效激活剂(图5B)。

实施例4

E2激发小鼠BMP-2启动子活性是依赖ER的

如图6所示，ER拮抗剂ICI以剂量依赖性方式抑制由10nM E2通过ERα或ERβ对小鼠BMP-2启动子(-2712)活性的激发。这些萤光素酶测定结果与用小鼠骨髓MSC(用E2和ICI共处理)而获得的BMP-2mRNA表达的数据一致(图3)。

实施例5

小鼠BMP-2启动子中ER调节部位的位置

Harris等(2000)已克隆了小鼠BMP-2启动子(-2712至+165)，并测定了所述小鼠BMP-2启动子的序列；且报道它包含一些顺式作用的DNA控制元件，包括Spl和AP-1。另外，在本发明中，鉴定出一种非回文序列的、位于所述启动子-415至-402的、先前未被认出的变体ERE(5′-GGGCCActcTGACCC-3′)(SEQ ID NO：4)。Heller等(1999)也克隆了小鼠BMP-2启动子(-3365至-1658)，并且像Harris等(2000)一样，这些作者没报道雌激素效应元件样序列的存在。

为了找到所述小鼠BMP-2启动子中的ER调节部位，我们把全长启动子(-2712)的活性与启动子的不同缺失以及被公认的变体ERE的突变相比较(图7)。全长启动子(-2712)包含两个AP-1效应元件、一个富含GC的Spl部位和一个可允许的变体ERE，ER可以通过它们全体而起作用(Paech等，1997)。-838片段包含Spl部位和被公认的变体ERE，但缺少两个AP-1效应元件；而-150片段没有这些部位中的任何一种。-448片段仍然包含Spl部位和变体ERE的部位；而-400片段没有变体ERE，但保留Spl部位。最后，所述全长启动子(-2712)中的被公认的变体ERE也发生过突变(Δ变体ERE：5′-G AACCActcT ACC TC-3′)(SEQ ID NO：5)，而剩下另一个完整的调节部位。或者用人ERα表达载体、或者用人ERβ表达载体，把小鼠的这些不同的BMP-2启动子-萤光素酶构建体瞬时共转染到C3H10T1/2细胞中，而在用10nM E2处理24小时后，测定萤光素酶活性。

如图7所示，通过ERα或者ERβ而起作用的E2，正调节小鼠全长(-2712)BMP-2启动子活性以及小鼠BMP-2启动子的-838片段和-448片段的活性，但不增加没有这些调节部位的全部的-150片段的表达。因为在全长(-2712)启动子片段的活性和-838片段及-448片段的活性之间没有差异，所以对于E2的诱导，不需要AP-1效应元件。从另一方面来说，被公认的变体ERE的缺失(-400)或突变(Δ变体ERE)，除去了E2经由ERα或ERβ增强小鼠BMP-2启动子活性的能力。因此，关于ER对所述启动子的作用，Spl部位似乎是不重要的；而被公认的变体ERE对所述激素的作用似乎是决定性的。

实施例6

选择性雌激素受体调节剂和染料木黄酮对

小鼠BMP-2启动子的刺激

为了测试选择性雌激素受体调节剂和染料木黄酮以及E2是否调节小鼠BMP-2启动子活性，将全长启动子(-2712)-萤光素酶质粒与人ERα或ERβ一起瞬时共转染到C3H10T1/2细胞中。在转染后，所述细胞用溶媒(乙醇对照)、10nM E2、100nM雷洛昔芬、1.0μM他莫昔芬、100nM染料木黄酮或100nM ICI处理24小时，然后用发光计测定萤光素酶活性。如图8所示，经由ERα而不经由ERβ的他莫昔芬和雷洛昔芬是BMP-2启动子的部分激动剂。

如图8所示，染料木黄酮也激发小鼠BMP-2启动子活性，但这作用是经由ERα介导的而不是经由ERβ介导的。最后，如同E2的作用一样，全长(-2712)启动子中变体ERE的突变消除SERM和染料木黄酮的激发，表明所述变体ERE决定着这些作用。上述结果的总结示于图9。

序列表

<110>Gazit，D.

<120>骨形态发生蛋白-2的雌激素效应元件及其使用方法

<130>p-4921-PC

<160>5

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>15

<212>DNA

<213>小家鼠(Mus musculus)

<220>

<221>其他特征

<222>(7)..(9)

<223>n＝任何核苷酸

<400>1

gggccannnt gacct

<210>2

<211>14

<212>DNA

<213>小家鼠(Mus musculus)

<220>

<221>其他特征

<222>(6)..(8)

<223>n＝任何核苷酸

<400>2

ggtcannntg acct

<210>3

<211>13

<212>DNA

<213>小家鼠(Mus musculus)

<220>

<221>其他特征

<222>(6)..(8)

<223>n＝任何核苷酸

<220>

<221>其他特征

<222>(6)..(8)

<223>n＝任何核苷酸

<400>3

ggccannntg acc

<210>4

<211>15

<212>DNA

<400>4

gggccactct gaccc

<210>5

<211>15

<212>DNA

<213>小家鼠(Mus musculus)

<400>5

gaaccactct acctc

Claims

1.一种分离的核酸分子，所述核酸分子包含相当于包含雌激素效应元件的BMP-2调节区的核酸。

2.一种包含权利要求1的核酸的载体，其中所述核酸与第二核酸有效连接。

3.一种宿主细胞，所述细胞包含权利要求2的载体。

4.权利要求3的宿主细胞，其中所述细胞还包含雌激素受体。

5.权利要求4的宿主细胞，其中所述雌激素受体为α雌激素受体。

6.权利要求4的宿主细胞，其中所述雌激素受体为β雌激素受体。

7.一种鉴定用于预防和/或治疗骨质疏松的治疗剂的方法，所述方法包括：

(a)将权利要求2的载体导入细胞中；

(b)使所述细胞与候选剂接触；和

(c)监测由报道核酸编码的蛋白的表达，其中所诱导的蛋白表达表明所述候选剂是潜在的治疗剂。

8.权利要求7的方法，其中在步骤(a)中，将包含编码雌激素受体的核酸分子的第二表达载体导入所述细胞中。

9.权利要求8的方法，其中所述雌激素受体为α雌激素受体。

10.权利要求8的方法，其中所述雌激素受体为β雌激素受体。

11.一种调节受治疗者体内BMP-2表达的方法，所述方法包括下述步骤：给予权利要求2的载体，其中所述第二核酸编码BMP-2；并且给予所述受治疗者有效量的雌激素或雌激素激动剂；从而调节所述受治疗者体内BMP-2的表达。

12.一种调节受治疗者体内BMP-2表达的方法，所述方法包括下述步骤：给予所述受治疗者有效量的权利要求3的细胞，其中所述第二核酸编码BMP-2；并且给予所述有需要的受治疗者有效量的雌激素或雌激素激动剂；从而调节所述受治疗者体内BMP-2的表达。

13.权利要求12的方法，其中所述细胞是间充质干细胞、祖细胞或能够分化成成骨细胞的细胞。

14.一种增强细胞对雌激素或雌激素激动剂的反应性的方法，所述方法包括下述步骤：给予权利要求2的载体；从而增强所述细胞对雌激素的反应性。

15.权利要求14的方法，其中所述细胞包含雌激素受体。

16.权利要求14的方法，其中所述细胞是间充质干细胞、祖细胞或能够分化成成骨细胞的细胞。

17.一种增强有需要的受治疗者体内骨修复的方法，所述方法包括下述步骤：给予权利要求2的载体；并且给予所述有需要的受治疗者有效量的雌激素或雌激素激动剂；从而增强所述有需要的受治疗者体内的骨修复。

18.一种增强骨修复的方法，所述方法包括下述步骤：给予受治疗者有效量的权利要求3的细胞；并且给予所述有需要的受治疗者有效量的雌激素或雌激素激动剂；从而增强所述受治疗者的骨修复。

19.权利要求18的方法，其中所述细胞是间充质干细胞、祖细胞或能够分化成成骨细胞的细胞。

20.一种维持或增加有需要的受治疗者的骨体积、骨质量或骨强度的方法，所述受治疗者罹患由雌激素减少引起的骨质疏松或者伴有雌激素减少的骨质疏松，所述方法包括下述步骤：给予所述受治疗者权利要求2的载体；并且给予所述有需要的受治疗者有效量的雌激素或雌激素激动剂；从而维持或增加所述有需要的受治疗者的骨体积、骨质量或骨强度。

21.一种维持或增加有需要的受治疗者的骨体积、骨质量或骨强度的方法，所述受治疗者罹患由雌激素减少引起的骨质疏松或者伴有雌激素减少的骨质疏松，所述方法包括下述步骤：给予受治疗者有效量的权利要求3的细胞；并且给予所述有需要的受治疗者有效量的雌激素或雌激素激动剂；从而维持或增加所述有需要的受治疗者的骨体积、骨质量或骨强度。

22.权利要求21的方法，其中所述细胞是间充质干细胞、祖细胞或能够分化成成骨细胞的细胞。

23.一种增强有需要的受治疗者体内骨修复的方法，所述方法包括下述步骤：获得所述受治疗者的细胞；用权利要求2的载体转染所述细胞；将所述工程细胞给予所述受治疗者；并且给予所述有需要的受治疗者有效量的雌激素或雌激素激动剂；从而增强所述有需要的受治疗者体内的骨修复。

24.一种维持或增加有需要的受治疗者的骨体积、骨质量或骨强度的方法，所述受治疗者罹患由雌激素减少引起的骨质疏松或者伴有雌激素减少的骨质疏松，所述方法包括下述步骤：获得所述受治疗者的细胞；用权利要求2的载体转染所述细胞；将所述工程细胞给予所述受治疗者；并且给予所述有需要的受治疗者有效量的雌激素或雌激素激动剂；从而维持或增加所述有需要的受治疗者的骨体积、骨质量或骨强度。

25.权利要求24的方法，其中所述给予所述有需要的受治疗者有效量的雌激素或雌激素激动剂的步骤，还使BMP-2的表达水平增加1.5-30倍。

26.权利要求24的方法，其中所述细胞是间充质干细胞、祖细胞或能够分化成成骨细胞的细胞。

27.一种用于生产可移植骨基质的方法，所述方法包括下述步骤：获得细胞；用权利要求2的载体转染所述细胞；以及将所述细胞与所述细胞相关基质一起培养一段有效时间，即允许形成可移植骨基质的时间。

28.权利要求27的方法，其中所述细胞是间充质干细胞、祖细胞或能够分化成成骨细胞的细胞。

29.一种刺激成骨细胞分化的方法，所述方法包括下述步骤：给予权利要求2的载体；并且给予有效量的雌激素或雌激素激动剂；从而调节刺激成骨细胞分化的表达。

30.一种治疗受治疗者的骨病的方法，所述方法包括下述步骤：给予权利要求2的载体；并且给予所述受治疗者有效量的雌激素或雌激素激动剂；从而治疗所述受治疗者的骨病。

31.一种治疗受治疗者的骨病的方法，所述方法包括下述步骤：给予所述受治疗者有效量的权利要求3的细胞；并且给予所述有需要的受治疗者有效量的雌激素或雌激素激动剂；从而治疗所述受治疗者的骨病。

32.权利要求31的方法，其中所述细胞是间充质干细胞、祖细胞或能够分化成成骨细胞的细胞。

33.一种用于鉴定样品中作为雌激素激动剂的化合物的方法，所述方法包括：

(a)提供表达人雌激素受体的细胞系，所述细胞系已用包含报道核酸的载体稳定转染，所述报道核酸与相当于包含雌激素效应元件的BMP-2调节区或其片段的分离的核酸有效连接，其中所述雌激素效应元件能够响应雌激素而控制所述报道核酸的表达；

(b)在人雌激素会导致所述报道核酸表达增加的条件下，使转染细胞系与怀疑含有人雌激素激动剂的样品接触；和

(c)测定所述报道核酸的表达水平；

由此与缓冲液对照产生的表达水平相比，根据测量到所述报道核酸表达水平的增加可鉴定出样品中的人雌激素激动剂。

34.一种用于鉴定样品中作为人雌激素拮抗剂的化合物的方法，所述方法包括：

(b)使转染细胞系与怀疑含有人雌激素拮抗剂的样品接触；已向所述样品中添加了适量的人雌激素，并且所述样品中不存在这样的拮抗剂，将会导致报道核酸表达的可测量的增加；和

(c)测定报道核酸的表达水平；

由此与在没有这种拮抗剂的情况下由人雌激素产生的表达水平相比，根据测量到报道核酸表达水平的减少可鉴定出样品中的人雌激素拮抗剂。