ES2863564T3

ES2863564T3 - Heteromultímeros ALK7:ActRIIB y usos de los mismos

Info

Publication number: ES2863564T3
Application number: ES16777229T
Authority: ES
Inventors: John Knopf; Ravindra Kumar; Asya Grinberg; Dianne Sako; Robert Pearsall; Roselyne Castonguay; Gang Li; Yossi Dagon
Original assignee: Acceleron Pharma Inc
Current assignee: Acceleron Pharma Inc
Priority date: 2015-04-06
Filing date: 2016-04-06
Publication date: 2021-10-11
Anticipated expiration: 2036-04-06
Also published as: WO2016164089A2; CN107709358A; US11827689B2; AU2020281136A1; CN114736307A; US20220119491A1; AU2016244750A1; JP7246618B2; EP4599888A2; EP3280435A4; EP3828199A1; EP3828199B1; US11028145B2; JP7055636B2; EA202190016A1; US20190375820A1; US20160298093A1; EP3280728A1; US10227392B2; AU2016244750B2

Abstract

Un heteromultímero recombinante soluble que comprende un polipéptido de ALK7 y un polipéptido de ActRIIB, donde el polipéptido de ALK7 comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 85 % idéntica a los aminoácidos 28-92 de la SEQ ID NO: 9, y donde el polipéptido de ActRIIB comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 85 % idéntica a los aminoácidos 29-109 de la SEQ ID NO: 1, donde el polipéptido de ALK7 es una proteína de fusión que comprende además un dominio heterólogo, donde el polipéptido de ActRIIB es una proteína de fusión que comprende además un dominio heterólogo, y donde el heteromultímero se une a uno o más de activina A, activina B y GDF11.

Description

DESCRIPCIÓN

Heteromultímeros ALK7:ActRIIB y usos de los mismos

REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS

Esta solicitud reivindica el beneficio de prioridad de la solicitud provisional de Estados Unidos número de serie 62/143.579, depositada el lunes, 6 de abril de 2015.

ANTECEDENTES

La superfamilia del factor de crecimiento transformante beta (TGF-beta) contiene un abanico de factores de crecimiento que comparten elementos de secuencia y motivos estructurales comunes. Se sabe que estas proteínas ejercen efectos biológicos sobre un gran abanico de tipos celulares tanto en vertebrados como en invertebrados. Los miembros de la superfamilia realizan funciones importantes durante el desarrollo embrionario en la formación de patrones y la especificación tisular y pueden influir en un abanico de procesos de diferenciación, que incluyen adipogénesis, miogénesis, condrogénesis, cardiogénesis, hematopoyesis, neurogénesis y diferenciación de las células epiteliales. La familia se divide en dos clados filogenéticos generales: los miembros de la superfamilia que han evolucionado más recientemente, que incluye TGF-beta, activinas, y nodal y el clado de proteínas de la superfamilia relacionadas más lejanamente, que incluye una serie de BMP y ^gD^f[Hinck (2012) F^eB^sLetters 586: 1860-1870]. Los miembros de la familia de TGF-beta tienen diversos efectos biológicos, a menudo complementarios. Manipulando la actividad de un miembro de la familia de TGF-beta, a menudo es posible provocar cambios fisiológicos significativos en un organismo. Por ejemplo, las razas de ganado vacuno piamontesa y azul belga llevan una mutación de pérdida de función en el gen del GDF8 (también denominado miostatina) que provoca un aumento notable en la masa muscular [Grobet y col. (1997) Nat Genet. 17(1): 71-4]. Asimismo, en los seres humanos, los alelos inactivos del GDF8 están asociados a una masa muscular aumentada y, aparentemente, a una fuerza excepcional [Schuelke y col. (2004) N Engl J Med, 350: 2682-8].

Los cambios en la fibrosis, músculo, hueso, grasa, glóbulos rojos y otros tejidos se pueden lograr mejorando o inhibiendo la transducción de señales intracelular (p. ej., SMAD 1, 2, 3, 5, y/o 8) que está mediada por ligandos de la familia de TGF-beta. Por tanto, existe la necesidad de agentes que regulen la actividad de diversos ligandos de la superfamilia de TGF-beta.

RESUMEN DE LA PRESENTE DESCRIPCIÓN

En un primer aspecto, la presente invención proporciona un heteromultímero recombinante soluble que comprende un polipéptido de ALK7 y un polipéptido de ActRIIB, donde el polipéptido de ALK7 comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 85 % idéntica a los aminoácidos 28-92 de la SEQ ID NO: 9, y donde el polipéptido de ActRIIB comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 85 % idéntica a los aminoácidos 29-109 de la SEQ ID NO: 1, donde el polipéptido de ALK7 es una proteína de fusión que comprende además un dominio heterólogo, donde el polipéptido de ActRIIB es una proteína de fusión que comprende además un dominio heterólogo, y donde el heteromultímero se une a uno o más de activina A, activina B y GDF11. El polipéptido de ALK7 puede comprender una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a un polipéptido que: a. comienza en uno cualquiera de los aminoácidos 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 o 28 de la SEQ ID NO: 9, y b. termina en uno cualquiera de los aminoácidos 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112 o 113 de la SEQ ID NO: 9. El polipéptido de ActRIIB puede comprender una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a un polipéptido que: a. comienza en uno cualquiera de los aminoácidos 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 o 29 de la SEQ ID No : 1, y b. termina en uno cualquiera de los aminoácidos 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133 o 134 de la SEQ ID NO: 1. El dominio heterólogo puede comprender un dominio Fc de inmunoglobulina. El dominio Fc de inmunoglobulina puede comprender una o más modificaciones de aminoácidos que promueven la formación de heterodímeros y/o que inhiben la formación de homodímeros. El dominio heterólogo puede comprender un dominio Fc de inmunoglobulina de una inmunoglobulina IgG. La proteína de fusión puede comprender además un dominio de enlazador situado entre el dominio de ALK7 y el dominio heterólogo. En un aspecto, el polipéptido de ALK7 puede comprender comprende uno o más residuos de aminoácidos modificados seleccionados de entre el grupo que consiste en: un aminoácido glucosilado, un aminoácido PEGilado, un aminoácido farnesilado, un aminoácido acetilado, un aminoácido biotinilado, un aminoácido conjugado a un resto lipídico y un aminoácido conjugado a un agente de derivatización orgánico. El heteromultímero puede unirse a activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina AE, activina BC, activina BE, GDF8, GDF11, nodal, BMP5, BMP6, GDF3 y/o BMP10. El heteromultímero puede inhibir la transducción de señales de activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina AE, activina BC, activina BE, GDF8, GDF11, nodal, BMP5, BMP6, GDF3 y/o BMP10 en un ensayo basado en células. El heteromultímero puede ser un heterodímero ALK7:ActRIIB. El heteromultímero puede unirse a activina B.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una preparación farmacéutica que comprende el heteromultímero del primer aspecto. La preparación farmacéutica puede estar sustancialmente libre de pirógenos y/o comprende además un agente activo adicional. La preparación farmacéutica puede comprender menos de aproximadamente un 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, o menos de aproximadamente un 1 % de homomultímeros de ALK7 y/o menos de aproximadamente un 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, o menos de aproximadamente un 1 % de homomultímeros de ActRIIB.

Como se describe en este documento, se ha descubierto que un complejo proteico de heterodímero ALK7:ActRIIB es un antagonista único de ligandos de la superfamilia de TGF-beta, que presenta un perfil/selectividad de unión a ligando diferente en comparación con los correspondientes homodímeros de ActRIIB y ALK7. En particular, un heterodímero ALK7:ActRIIB ejemplar muestra una unión mejorada a activina AC, activina C y BMP5 en comparación con cualquiera de los homodímeros, conserva una unión fuerte a activina B como se observa con el homodímero de ActRIIB y presenta una unión reducida a GDF11, GDF8, activina A, BMP10, BMP6, GDF3 y BMP9. En particular, el heterodímero ALK7:ActRIIB muestra una afinidad baja a no observable por BMP9, mientras que este ligando se une fuertemente al homodímero de ActRIIB. Véase la figura 6. Por lo tanto, estos resultados demuestran que los heterodímeros ALK7:ActRIIB son antagonistas (inhibidores) más selectivos de ciertos ligandos de la superfamilia de TGF-beta en comparación con los homodímeros de ActRIIB. En consecuencia, un heterodímero ALK7:ActRIIB será más útil que un homodímero de ActRIIB en ciertas aplicaciones en las que dicho antagonismo selectivo es ventajoso. Los ejemplos incluyen aplicaciones terapéuticas en las que es deseable antagonizar uno o más de activina B, activina AC, activina C y Bm P5 con un antagonismo reducido de uno o más de activina A, BMP10, BMP6, GDF3 y BMP9. Además, se demostró que el heterodímero ALK7:ActRIIB tiene efectos terapéuticos en un modelo en ratón de enfermedad renal, así como efectos catabólicos beneficiosos sobre las células adiposas. Por lo tanto, aunque no se desee estar vinculado a un mecanismo de acción en particular, se espera que heteromultímeros ALK7:ActRIIB, así como variantes de los mismos, que se unen a/inhiben al menos uno o más de activina (p. ej., activina A, activina B, activina AB, activina C, activina E, activina AC, activina AE, activina BC y activina BE), g Df8, GDF11, BMP10, BMP6, BMP5, GDF3 y/o nodal serán agentes útiles para el tratamiento de la enfermedad renal, particularmente ciertos trastornos de la enfermedad renal, tales como inflamación y fibrosis, y/o promover efectos catabólicos beneficiosos sobre el tejido adiposo. Además, se espera que otros antagonistas (inhibidores), o combinaciones de antagonistas, que imitan las propiedades de unión/inhibidoras de los heterodímeros ALK7:ActRIIB, así como agentes que antagonizan directa o indirectamente los receptores ALK7 y/o ActRIIB, agentes que antagonizan directa o indirectamente ligandos de unión a ALK7 y/o a ActRIIB, agentes que antagonizan directa o indirectamente al mediador de transducción de señales aguas abajo (p. ej., Smad), y/o agentes que antagonizan directa o indirectamente los correceptores de la superfamilia de TGFp (por ejemplo, Cripto o Cryptic), tendrán efectos biológicos similares. Estos miméticos antagonistas se denominan colectivamente en este documento como "antagonistas de ALK7:ActRIIB"o "inhibidores de ALK7:ActRIIB".

Por lo tanto, la presente descripción proporciona, en parte, complejos heteromultiméricos (heteromultímeros) que comprenden al menos un polipéptido de a LK7 y al menos un polipéptido de ActRIIB. (heteromultímeros ALK7:ActRIIB). Preferiblemente, los polipéptidos de ALK7 comprenden un dominio de unión a ligando de un receptor ALK7, por ejemplo, una porción del dominio extracelular de ALK7. De manera similar, los polipéptidos de ActRIIB generalmente comprenden un dominio de unión a ligando de un receptor ActRIIB, por ejemplo, una porción del dominio extracelular de ActRIIB. Preferiblemente, tales polipéptidos de ALK7 y ActRIIB, así como los heteromultímeros resultantes de los mismos, son solubles.

En ciertos aspectos, un heteromultímero ALK7:ActRIIB comprende una secuencia de aminoácidos de ALK7 que es al menos un 70 % idéntica a un polipéptido que comienza en uno cualquiera de los aminoácidos 21-28 de la SEQ ID NO: 9 (p. ej., aminoácidos 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 o 28) y termina en uno cualquiera de los aminoácidos 92-113 de la SEQ ID NO: 9 (p. ej., aminoácidos 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112 o 113) de la SEQ ID NO: 9. Por ejemplo, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB pueden comprender una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a los aminoácidos 28-92 de la SEQ ID NO: 9. En otros aspectos, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB pueden comprender una secuencia de aminoácidos de ALK7 que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a los aminoácidos 21-113 de la SEQ ID NO: 9. En otros aspectos, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB pueden comprender una secuencia de aminoácidos de ALK7 que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 10. En otros aspectos más, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB pueden comprender una secuencia de aminoácidos de ALK7 que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %,

94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 20. En incluso otros aspectos, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB pueden comprender una secuencia de aminoácidos de ALK7 que es al menos un

70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o

100 % idéntica a la SEQ ID NO: 39. En aspectos adicionales, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB pueden comprender una secuencia de aminoácidos de ALK7 que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %,

91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 43. En aspectos adicionales, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB pueden comprender una secuencia de aminoácidos de ALK7 que es al menos un

100 % idéntica a la SEQ ID NO: 46.

En ciertos aspectos, un heteromultímero ALK7:ActRIIB comprende una secuencia de aminoácidos de ActRIIB que es al menos un 70 % idéntica a un polipéptido que comienza en uno cualquiera de los aminoácidos 20-29 de la SEQ ID

NO: 1 (p. ej., 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 o 29) y termina en uno cualquiera de los aminoácidos 109-134 de la

SEQ ID NO: 1 (109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128,

129, 130, 131, 132, 133 o 134) de la SEQ ID NO: 1. Por ejemplo, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB pueden comprender una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %,

90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a los aminoácidos 29-109 de la SEQ

ID NO: 1. En aspectos adicionales, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB pueden comprender una secuencia de aminoácidos de ActRIIB que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %,

93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a los aminoácidos 25-131. En otros aspectos, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB pueden comprender una secuencia de aminoácidos de ActRIIB que es al menos un

100 % idéntica a la SEQ ID NO: 2. En otros aspectos más, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB pueden comprender una secuencia de aminoácidos de ActRIIB que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %,

90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 3. En incluso otros aspectos, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB pueden comprender una secuencia de aminoácidos de ActRIIB que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %,

98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 5. En incluso otros aspectos más, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB pueden comprender una secuencia de aminoácidos de ActRIIB que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %,

87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 6. En ciertos aspectos preferidos, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB no comprenden un polipéptido de ActRIIB que comprende un aminoácido ácido (p. ej., los aminoácidos E o D naturales o un aminoácido ácido artificial) en la posición correspondiente a L79 de la SEQ ID N^o: 1.

También se contemplan diversas combinaciones de los polipéptidos de ALK7 y ActRIIB descritos en este documento con respecto a heteromultímeros ALK7:ActRIIB. Por ejemplo, en ciertos aspectos, un heteromultímero ALK7:ActRIIB puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en a) un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos de ALK7 que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %,

88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a los aminoácidos 28-92 de la SEQ ID NO: 9: y b) un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos de ActRIIB que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %,

93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a los aminoácidos 29-109 de la SEQ ID NO: 1. En aspectos adicionales, un heteromultímero ALK7:ActRIIB puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en a) un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos de ALK7 que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %,

97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a los aminoácidos 21-113 de la SEQ ID NO: 9: y b) un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos de ActRIIB que es al menos un 70 %, 75 %,

80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a los aminoácidos 25-131 de la SEQ ID NO: 1. En otros aspectos, un heteromultímero ALK7:ActRIIB puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en a) un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos de ALK7 que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %,

89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 10: y b) un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos de ActRIIB que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %,

98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 2. En otros aspectos, un heteromultímero ALK7:ActRIIB puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en a) un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos de ALK7 que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %,

89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 20: y b) un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos de ActRIIB que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 2. En otros aspectos, un heteromultímero ALK7:ActRIIB puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en a) un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos de ALK7 que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 39: y b) un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos de ActRIIB que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 2. En otros aspectos, un heteromultímero ALK7:ActRIIB puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en a) un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos de ALK7 que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 43: y b) un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos de ActRIIB que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 2. En otros aspectos, un heteromultímero ALK7:ActRIIB puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en a) un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos de ALK7 que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 46: y b) un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos de ActRIIB que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 2. En incluso otros aspectos, un heteromultímero ALK7:ActRIIB puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en a) un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos de ALK7 que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 10: y b) un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos de ActRIIB que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 3. En incluso otros aspectos, un heteromultímero ALK7:ActRIIB puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en a) un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos de ALK7 que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 20: y b) un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos de ActRIIB que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 3. En incluso otros aspectos, un heteromultímero ALK7:ActRIIB puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en a) un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos de ALK7 que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 39: y b) un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos de ActRIIB que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 3. En incluso otros aspectos, un heteromultímero ALK7:ActRIIB puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en a) un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos de ALK7 que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 43: y b) un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos de ActRIIB que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 3. En otros aspectos, un heteromultímero ALK7:ActRIIB puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en a) un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos de ALK7 que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 46: y b) un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos de ActRIIB que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 3. En otros aspectos más, un heteromultímero ALK7:ActRIIB puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en a) un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos de ALK7 que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 10: y b) un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos de ActRIIB que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 5. En incluso otros aspectos más, un heteromultímero ALK7:ActRIIB puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en a) un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos de ALK7 que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 10: y b) un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos de ActRIIB que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 6.

Como se describe en este documento, las estructuras de heteromultímeros ALK7:ActRIIB incluyen, por ejemplo, heterodímeros, heterotrímeros, heterotetrámeros, heteropentámeros y complejos de heteromultímeros de orden superior. Véanse, p. ej., las figuras 1,2 y 8-10. En ciertos aspectos preferidos, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB son heterodímeros.

En ciertos aspectos, los polipéptidos de ALK7 y/o ActRIIB pueden ser proteínas de fusión. Por ejemplo, en algunos aspectos, un polipéptido de ALK7 puede ser una proteína de fusión que comprende un dominio polipeptídico de ALK7 y uno o más dominios polipeptídicos heterólogos (no de ALK7). De manera similar, en algunos aspectos, un polipéptido de ActRIIB puede ser una proteína de fusión que comprende un dominio polipeptídico de ActRIIB y uno o más dominios polipeptídicos heterólogos (no de ActRIIB). Opcionalmente, los polipéptidos de ALK7 se conectan directamente (fusionan) a uno o más dominios heterólogos, o una secuencia intermedia, tal como un enlazador, puede situarse entre la secuencia de aminoácidos del polipéptido de ALK7 y uno o más dominios heterólogos. De manera similar, el polipéptido de ActRIIB puede conectarse directamente (fusionarse) a uno o más dominios heterólogos, o una secuencia intermedia, tal como un enlazador, puede situarse entre la secuencia de aminoácidos del polipéptido de ActRIIB y uno o más dominios heterólogos. Los enlazadores pueden corresponder a la región desestructurada de aproximadamente 15 aminoácidos del extremo carboxiterminal del dominio extracelular de ActRIIB o ALK7 (la “cola”), o puede ser una secuencia artificial de entre 5 y 15, 20, 30, 50, 100 o más aminoácidos que están relativamente libres de estructura secundaria. Un enlazador puede ser rico en residuos de glicina y prolina y puede, por ejemplo, contener secuencias repetitivas de treonina/serina y glicinas. Los ejemplos de enlazadores incluyen, pero no se limitan a, las secuencias TGGG (SEQ ID NO: 17), SGGG (SEQ ID NO: 18), TGGGG (SEQ ID NO: 15), SGGGG (SEQ ID NO: 16), GGGGS (SEQ ID NO: 58), GGGG (SEQ ID NO: 14) y GGG (SEQ ID NO: 13). En algunos aspectos, los uno o más dominios heterólogos que proporcionan una propiedad deseable a las proteínas de fusión de ALK7 y/o ActRIIB que incluyen, por ejemplo, farmacocinética mejorada, purificación más fácil, direccionamiento a tejidos particulares, etc. Por ejemplo, un dominio heterólogo de una proteína de fusión puede mejorar uno o más de entre estabilidad in vivo, semivida in vivo, captación/administración, localización o distribución de tejidos, formación de complejos de proteínas, multimerización de la proteína de fusión y/o purificación. Una proteína de fusión de ALK7 o ActRIIB puede incluir un dominio Fc de inmunoglobulina (tipo natural o mutante) o una seroalbúmina. En algunos aspectos, un polipéptido de ALK7 y/o ActRIIB puede comprender una subsecuencia de purificación, tal como un epítopo de identificación, un marcador FLAG, una secuencia de polihistidina y una fusión de GST.

En ciertos aspectos, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB descritos en este documento comprenden un polipéptido de ALK7 asociado covalentemente o no covalentemente con un polipéptido de ActRIIB donde el polipéptido de ALK7 comprende un dominio ALK7 y una secuencia de aminoácidos de un primer miembro (o segundo miembro) de un par de interacción y el polipéptido de ActRIIB comprende un polipéptido de ActRIIB y una secuencia de aminoácidos de un segundo miembro (o primer miembro) del par de interacción. Los pares de interacción descritos en este documento están diseñados para promover la dimerización o formar multímeros de orden superior. Véanse, p. ej., las figuras 1,2 y 8-10. En algunos aspectos, el par de interacción puede ser dos secuencias polipeptídicas cualesquiera que interaccionen para formar un complejo, particularmente un complejo heterodimérico, aunque los aspectos operativos también pueden emplear un par de interacción que forme una secuencia homodimérica. El primer y segundo miembros del par de interacción pueden ser un par asimétrico, lo que significa que los miembros del par se asocian preferentemente entre sí en lugar de autoasociarse (es decir, pares de interacción guiados). Por consiguiente, el primer y segundo miembros de un par de interacción asimétrico pueden asociarse para formar un complejo heterodimérico. Alternativamente, el par de interacción puede ser no guiado, lo que significa que los miembros del par pueden asociarse entre sí o autoasociarse sin una preferencia sustancial y, por tanto, pueden tener la misma o diferentes secuencias de aminoácidos. Por consiguiente, el primer y segundo miembros de un par de interacción no guiado pueden asociarse para formar un complejo homodímero o un complejo heterodimérico. Opcionalmente, el primer miembro del par de acción de interacción (p. ej., un par asimétrico o un par de interacción no guiado) se asocia covalentemente con el segundo miembro del par de interacción. Opcionalmente, el primer miembro del par de acción de interacción (p. ej., un par asimétrico o un par de interacción no guiado) se asocia no covalentemente con el segundo miembro del par de interacción. Opcionalmente, el primer miembro del par de acción de interacción (p. ej., un par asimétrico o un par de interacción no guiado) se asocia mediante mecanismos covalentes y no covalentes con el segundo miembro del par de interacción.

En algunos aspectos, los polipéptidos de ALK7 son proteínas de fusión que comprenden un dominio Fc de una inmunoglobulina. De manera similar, en algunos aspectos, los polipéptidos de ActRIIB son proteínas de fusión que comprenden un dominio Fc de una inmunoglobulina. Las proteínas de fusión y los anticuerpos de Fc tradicionales son ejemplos de pares de interacción no guiados, mientras que un abanico de dominios Fc genomanipulados se han diseñado como pares de interacción asimétricos [Spiess y col (2015) Molecular Immunology 67 (2A): 95-106]. Por tanto, un primer miembro y/o un segundo miembro de un par de interacción descrito en este documento puede comprender un dominio constante de una inmunoglobulina, que incluye, por ejemplo, la porción Fc de una inmunoglobulina. Por ejemplo, un primer miembro de un par de interacción puede comprender una secuencia de aminoácidos que se deriva de un dominio Fc de una inmunoglobulina IgG (IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4), IgA (IgA1 o IgA2), IgE o IgM. Tales dominios de inmunoglobulina pueden comprender una o más modificaciones de aminoácidos (p. ej., eliminaciones, adiciones y/o sustituciones) que promueven la formación de heteromultímeros ALK7:ActRIIB. Por ejemplo, el primer miembro de un par de interacción puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a cualquiera de las SEQ ID NO: 23-37. De manera similar, un segundo miembro de un par de interacción puede comprender una secuencia de aminoácidos que se deriva de un dominio Fc de una IgG (IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4), IgA (IgA1 o IgA2), IgE o IgM. Tales dominios de inmunoglobulina pueden comprender una o más modificaciones de aminoácidos (p. ej., eliminaciones, adiciones y/o sustituciones) que promueven la formación de heteromultímeros ALK7:ActRIIB. Por ejemplo, el segundo miembro de un par de interacción puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a cualquiera de las SEQ ID NO: 23-37. En algunos aspectos, un primer miembro y un segundo miembro de un par de interacción comprenden dominios Fc derivados de la misma clase y subtipo de inmunoglobulina. En otros aspectos, un primer miembro y un segundo miembro de un par de interacción comprenden dominios Fc derivados de diferentes clases o subtipos de inmunoglobulinas.

En algunos aspectos, un heterodímero ALK7:ActRIIB comprende i) un polipéptido de ALK7 que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 76, y ii) un polipéptido de ActRIIB que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 73. En otros aspectos, un heterodímero ALK7:ActRIIB comprende i) un polipéptido de ALK7 que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 80, y ii) un polipéptido de ActRIIB que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 78.

Opcionalmente, un primer miembro y/o un segundo miembro de un par de interacción (p. ej., un par asimétrico o un par de interacción no guiado) comprende un dominio constante modificado de una inmunoglobulina, que incluye, por ejemplo, una porción Fc modificada de una inmunoglobulina. Por ejemplo, los complejos de proteínas de la descripción pueden comprender una primera porción Fc modificada de una IgG que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo: SEQ ID NO: 23 37 y una segunda porción Fc modificada de una IgG, que puede ser igual o diferente de la secuencia de aminoácidos de la primera porción Fc modificada de la IgG, que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo: SEQ ID NO: 23-37. En algunos aspectos, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB comprenden, consisten esencialmente en o consisten en: a) una proteína de fusión ALK7 (o ActRIIB) que comprende un dominio de inmunoglobulina que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 23, opcionalmente donde el dominio de inmunoglobulina comprende un aminoácido cargado positivamente (por ejemplo, K, R o H) en las posiciones correspondientes a los residuos 134 y 177 de la SEQ ID NO: 23, y además opcionalmente donde el dominio de inmunoglobulina no comprende un aminoácido cargado positivamente (p. ej., K, R o H) en la posición correspondiente al residuo 225 de la SEQ ID NO: 23, y b) una proteína de fusión ActRIIB (o ALK7) que comprende una dominio de inmunoglobulina que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 24, opcionalmente donde el dominio de inmunoglobulina comprende un aminoácido cargado negativamente (por ejemplo, D o E) en las posiciones correspondientes a los residuos 170 y 187 de la SEQ ID NO: 24, y además opcionalmente donde el dominio de inmunoglobulina comprende un aminoácido cargado positivamente (por ejemplo, K, R o H) en la posición correspondiente al residuo 225 de la SEQ ID NO: 24. En otros aspectos, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB comprenden, consisten esencialmente en o consisten en: a) una proteína de fusión ALK7 (o ActRIIB) que comprende un dominio de inmunoglobulina que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 27, opcionalmente donde el dominio de inmunoglobulina comprende una C en la posición correspondiente al residuo 132 de la SEQ ID NO: 27 y un W en la posición correspondiente al residuo 144 de la SEQ ID NO: 27, y además opcionalmente donde el dominio de inmunoglobulina no comprende un aminoácido cargado positivamente (p. ej., K, R o H) en la posición correspondiente al residuo 225 de la SEQ ID NO: 27, y b) una proteína de fusión ActRIIB (o ALK7) que comprende un dominio de inmunoglobulina que comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 28, opcionalmente donde el dominio de inmunoglobulina comprende una S en la posición correspondiente al residuo 144 de la SEQ ID NO: 28, una A en la posición correspondiente al residuo 146 de la SEQ ID NO: 28, y una V en la posición correspondiente al residuo 185 de la SEQ ID NO: 28, y además opcionalmente donde el dominio de inmunoglobulina no comprende un aminoácido cargado positivamente (por ejemplo, K, R o H) en la posición correspondiente al residuo 225 de la SEQ ID NO: 28.

Opcionalmente, un polipéptido de ALK7 y/o ActRIIB incluye uno o más residuos de aminoácidos modificados seleccionados de entre: un aminoácido glucosilado, un aminoácido PEGilado, un aminoácido farnesilado, un aminoácido acetilado, un aminoácido biotinilado, un aminoácido conjugado con un resto lipídico y un aminoácido conjugado con un agente de derivatización orgánico. Los polipéptidos de ALK7 y/o ActRIIB pueden comprender al menos un azúcar unido a N y pueden incluir dos, tres o más azúcares unidos a N. Tales polipéptidos también pueden comprender azúcares unidos a O. Los polipéptidos deALK7 y/o ActRIIB se pueden producir en un abanico de estirpes celulares que glucosilan la proteína de una manera adecuada para el uso del paciente, incluidas células de insectos o levaduras genomanipuladas y células de mamíferos tales como células COS, células CHO, células HEK y células NSO. En algunos aspectos, un polipéptido de ALK7 y/o ActRIIB está glucosilado y tiene un patrón de glucosilación que puede obtenerse de una estirpe celular de ovario de hámster chino. Preferiblemente los complejos heteromultiméricos ALK7:ActRIIB de la descripción presentan una semivida en suero de al menos 4, 6, 12, 24, 36, 48 o 72 horas en un mamífero (p. ej., un ratón o un ser humano). Opcionalmente, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB pueden presentar una semivida en suero de al menos 6, 8, 10, 12, 14, 20, 25 o 30 días en un mamífero (p. ej., un ratón o un ser humano).

En ciertos aspectos, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB de la descripción se unen a uno o más ligandos de la superfamilia de TGF-beta. Opcionalmente, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB se unen a uno o más de estos ligandos con una K^dmenor o igual a 10-8,10-9, 10-1°, 10-11 o 10-12 M. Por ejemplo, en algunos aspectos, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB se unen a la activina. En algunos aspectos, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB se unen a la activina A.

En algunos aspectos, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB se unen a la activina B. En algunos aspectos, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB se unen a la activina C. En algunos aspectos, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB se unen a la activina AB. En algunos aspectos, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB se unen a la activina AC. En algunos aspectos, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB se unen a la activina BC. En algunos aspectos, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB se unen a la activina E. En algunos aspectos, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB se unen a la activina AE. En algunos aspectos, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB se unen a la activina BE. En algunos aspectos, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB se unen a GDF11. En algunos aspectos, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB se unen a GDF8. En algunos aspectos, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB se unen a BMP6. En algunos aspectos, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB se unen a BMP10. En algunos aspectos, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB se unen a BMP5. En algunos aspectos, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB se unen a GDF3. En algunos aspectos, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB se unen a la nodal. En algunos aspectos, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB no se unen o no se unen sustancialmente a BMP9. En algunos aspectos, el heteromultímero ALK7:ActRIIB se une a BMP10 con una afinidad más débil en comparación con un homomultímero de ActRIIB correspondiente. En algunos aspectos, el heteromultímero ALK7:ActRIIB se une a BMP9 con una afinidad más débil en comparación con un homomultímero de ActRIIB correspondiente. En algunos aspectos, el heteromultímero ALK7:ActRIIB se une a GDF3 con una afinidad más débil en comparación con un homomultímero de ActRIIB correspondiente. En algunos aspectos, el heteromultímero ALK7:ActRIIB se une a BMP6 con una afinidad más débil en comparación con un homomultímero de ActRIIB correspondiente. En algunos aspectos, el heteromultímero ALK7:ActRIIB se une a GDF8 con una afinidad más débil en comparación con un homomultímero de ActRIIB correspondiente. En algunos aspectos, el heteromultímero ALK7:ActRIIB se une a GDF11 con una afinidad más débil en comparación con un homomultímero de ActRIIB correspondiente. En algunos aspectos, el heteromultímero ALK7:ActRIIB se une a la activina C con una afinidad más fuerte en comparación con un homomultímero de ActRIIB correspondiente. En algunos aspectos, el heteromultímero ALK7:ActRIIB se une a la activina AC con una afinidad más fuerte en comparación con un homomultímero de ActRIIB correspondiente. En algunos aspectos, el heteromultímero ALK7:ActRIIB se une a BMP5 con una afinidad más fuerte en comparación con un homomultímero de ActRIIB correspondiente.

En general, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB de la descripción antagonizan (inhiben) una o más actividades de al menos un ligando de la superfamilia de TGF-beta, y tales alteraciones en la actividad pueden medirse usando diversos ensayos conocidos en la técnica, que incluyen, por ejemplo, un ensayo basado en células tal como los descritos en este documento. En ciertos aspectos, se pueden usar heteromultímeros ALK7:ActRIIB para inhibir la transducción de señales (p. ej., transducción de señales de Smad 2/3 y/o Smad 1/5/8 ) mediada por uno o más ligandos de la superfamilia de TGFp en, por ejemplo, un ensayo basado en células. Por ejemplo, en algunos aspectos, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB inhiben la transducción de señales de activina en un ensayo basado en células. En algunos aspectos, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB inhiben la transducción de señales de activina A en un ensayo basado en células. En algunos aspectos, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB inhiben la transducción de señales de activina B en un ensayo basado en células. En algunos aspectos, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB inhiben la transducción de señales de activina C en un ensayo basado en células. En algunos aspectos, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB inhiben la transducción de señales de activina AB en un ensayo basado en células. En algunos aspectos, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB inhiben la transducción de señales de activina AC en un ensayo basado en células. En algunos aspectos, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB inhiben la transducción de señales de activina BC en un ensayo basado en células. En algunos aspectos, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB inhiben la transducción de señales de activina E en un ensayo basado en células. En algunos aspectos, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB inhiben la transducción de señales de activina AE en un ensayo basado en células. En algunos aspectos, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB inhiben la transducción de señales de activina BE en un ensayo basado en células. En algunos aspectos, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB inhiben la transducción de señales de GDF11 en un ensayo basado en células. En algunos aspectos, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB inhiben la transducción de señales de GDF8 en un ensayo basado en células. En algunos aspectos, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB inhiben la transducción de señales de BMP6 en un ensayo basado en células. En algunos aspectos, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB inhiben la transducción de señales de BMP10 en un ensayo basado en células. En algunos aspectos, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB inhiben la transducción de señales de BMP5 en un ensayo basado en células. En algunos aspectos, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB pueden inhibir la transducción de señales de GDF3 en un ensayo basado en células. En algunos aspectos, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB pueden inhibir la transducción de señales de nodal en un ensayo basado en células. En algunos aspectos, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB no inhiben o no inhiben sustancialmente la transducción de señales de BMP9 en un ensayo basado en células. En algunos aspectos, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB son inhibidores más débiles de la transducción de señales de BMP9 en un ensayo basado en células en comparación con un homomultímero de ActRIIB correspondiente. En algunos aspectos, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB son inhibidores más débiles de la transducción de señales de BMP10 en un ensayo basado en células en comparación con un homomultímero de ActRIIB correspondiente. En algunos aspectos, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB son inhibidores más débiles de la transducción de señales de BMP6 en un ensayo basado en células en comparación con un homomultímero de ActRIIB correspondiente. En algunos aspectos, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB son inhibidores más débiles de la transducción de señales de GDF3 en un ensayo basado en células en comparación con un homomultímero de ActRIIB correspondiente. En algunos aspectos, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB son inhibidores más débiles de la transducción de señales de GDF11 en un ensayo basado en células en comparación con un homomultímero de ActRIIB correspondiente. En algunos aspectos, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB son inhibidores más débiles de la transducción de señales de GDF8 en un ensayo basado en células en comparación con un homomultímero de ActRIIB correspondiente. En algunos aspectos, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB son inhibidores más débiles de la transducción de señales de activina A en un ensayo basado en células en comparación con un homomultímero de ActRIIB correspondiente. En algunos aspectos, los heteromultímeros ALK7:ActRNB son inhibidores más fuertes de la transducción de señales de activina C en un ensayo basado en células en comparación con un homomultímero de ActRIIB correspondiente. En algunos aspectos, los heteromultímeros ALK7:ActRNB son inhibidores más fuertes de la transducción de señales de activina AC en un ensayo basado en células en comparación con un homomultímero de ActRIIB correspondiente. En algunos aspectos, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB son inhibidores más fuertes de la transducción de señales de BMP5 en un ensayo basado en células en comparación con un homomultímero de ActRIIB correspondiente.

Cualquiera de los heteromultímeros ALK7:ActRIIB así como los antagonistas de ALK7:ActRIIB descritos en este documento se pueden formular como una preparación (composición) farmacéutica. En algunos aspectos, las preparaciones farmacéuticas comprenden un vehículo farmacéuticamente aceptable. Una preparación farmacéutica estará preferiblemente libre de pirógenos (que significa libre de pirógenos en la medida requerida por las regulaciones que rigen la calidad de los productos para uso terapéutico). Una preparación farmacéutica puede incluir también uno o más compuestos adicionales, tales como un compuesto que se usa para tratar un trastorno/afección descrito en este documento. En general, las preparaciones farmacéuticas de heteromultímeros ALK7:ActRIIB están sustancialmente libres de homomultímeros de ^aLK7 y/o ActRIIB. Por ejemplo, en algunos aspectos, las preparaciones farmacéuticas de heteromultímeros ALK7:ActRIIB comprenden menos de aproximadamente un 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % o menos de aproximadamente un 1 % de homomultímeros de ALK7. En algunos aspectos, las preparaciones farmacéuticas de heteromultímeros ALK7:ActRIIB comprenden menos de aproximadamente un 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % o menos de aproximadamente un 1 % de homomultímeros de ActRIIB.

En ciertos aspectos, la descripción proporciona ácidos nucleicos que codifican un polipéptido de ALK7 o ActRIIB como se describe en este documento. Por ejemplo, un ácido nucleico de ActRIIB puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en un ácido nucleico que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntico a la secuencia de 73-396 de la SEQ ID NO: 7 o uno que hibrida en condiciones astringentes con el complemento de nucleótidos 73-396 de la SEQ ID NO: 7. Tal ácido nucleico puede ser uno que comprende la secuencia de las SEQ ID NO: 8 o 72. En algunos aspectos, un ácido nucleico de ActRIIB comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de nucleótidos que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a cualquiera de las SEQ ID NO: 7, 8 y 72. De manera similar, un ácido nucleico de ALK7 puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en un ácido nucleico que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntico a la secuencia de 61-339 de la SEQ ID NO: 11 o uno que hibrida en condiciones astringentes con el complemento de nucleótidos 61-339 de la SEQ ID NO: 11. Tal ácido nucleico de ALK7 puede ser uno que comprende la secuencia de las SEQ ID NO: 12, 22, 41, 45 o 75. En algunos aspectos, un ácido nucleico de ALK7 comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de nucleótidos que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a cualquiera de las SEQ ID NO: 11, 12, 22, 41, 45 o 75.

En ciertos aspectos, la presente descripción proporciona una secuencia de ácidos nucleicos que comprende una secuencia codificante para un polipéptido de AlK7 y una secuencia codificante para el polipéptido de ActRIIB. Por ejemplo, en algunos aspectos, los ácidos nucleicos de la descripción a) comprenden, consisten esencialmente en o consisten en una secuencia de nucleótidos que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a cualquiera de las SEQ ID NO: 11, 12, 21, 22, 40, 41,44, 45 o 75, y b) comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de nucleótidos que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a cualquiera de las SEQ ID NO: 7, 8 o 72. Preferiblemente, los ácidos nucleicos de ALK7 y/o ActRIIB son ácidos nucleicos aislados y/o recombinantes. Los ácidos nucleicos descritos en este documento pueden unirse operativamente a un promotor para la expresión. La presente descripción proporciona además vectores que comprenden tales polinucleótidos de ALK7 y/o ActRIIB así como células (p. ej., Células CHO), preferiblemente células aisladas de un ser humano u otra especie de vertebrado, que comprenden tales polinucleótidos de ALK7 y/o ActRIIB, así como vectores que comprenden tales polinucleótidos de ALK7 y/o ActRIIB.

En ciertos aspectos, los polipéptidos de ALK7 y/o los polipéptidos de ActRIIB pueden expresarse en una estirpe celular de mamífero, opcionalmente una estirpe celular que medie adecuadamente la glucosilación natural de la proteína ActRIIB o ALK7 para disminuir la probabilidad de una respuesta inmunitaria desfavorable en un paciente (incluida la posibilidad de pacientes veterinarios). Las estirpes celulares humanas y CHO se han usado satisfactoriamente y se espera que otros vectores de expresión de mamífero comunes sean útiles. Por tanto, la descripción proporciona células cultivadas que comprenden cualquiera de los ácidos nucleicos descritos en este documento. Tales células pueden ser células de mamífero, incluidas células CHO, células NSO, células HEK y células COS. Se pueden elegir otras células dependiendo de la especie del paciente previsto. En este documento se describen otras células. Se entiende que las células cultivadas significan células mantenidas en laboratorio u otras condiciones artificiales (p. ej., congeladas o en medio) y que no forman parte de un organismo vivo.

En ciertos aspectos, la descripción proporciona procedimientos para preparar cualquiera de los polipéptidos de ALK7 y ActRIIB descritos en este documento, así como complejos heteromultiméricos ALK7:ActRIIB que comprenden tales polipéptidos. Un procedimiento de este tipo puede incluir expresar cualquiera de los ácidos nucleicos descritos en este documento en una célula adecuada (p. ej.,, célula CHO o una célula COS). Por ejemplo, en algunos aspectos, un procedimiento para preparar un heteromultímero que comprende un polipéptido de ALK7 y un polipéptido de ActRIIB comprende: a) cultivar una célula en condiciones adecuadas para la expresión de un polipéptido de ALK7 y un polipéptido de ActRIIB, donde la célula comprende un polinucleótido de ALK7 y un polinucleótido de ActRIIB; y b) recuperar el heteromultímero así expresado. Alternativamente, un procedimiento para preparar un heteromultímero que comprende un polipéptido de ALK7 y un polipéptido de ActRIIB puede comprender: a) cultivar una primera célula en condiciones adecuadas para la expresión de un polipéptido de ALK7, donde la primera célula comprende un polinucleótido de ALK7; b) recuperar el polipéptido de a LK7 así expresado; c) cultivar una segunda célula en condiciones adecuadas para la expresión de un polipéptido de ActRIIB, donde la segunda célula comprende un polinucleótido de ActRIIB; d) recuperar el polipéptido de ActRIIB así expresado; e) combinar el polipéptido de ALK7 recuperado y el polipéptido de ActRIIB recuperado en condiciones adecuadas para la formación de heteromultímeros ALK7:ActRIIB; y f) recuperar el heteromultímero ALK7:ActRIIB. En ciertos aspectos, los polipéptidos de ALK7 y/o ActRIIB se expresan usando una secuencia líder de TPA (por ejemplo, SEQ ID NO: 70). En ciertos aspectos, los polipéptidos de ALK7 y/o ActRIIB se expresan en una célula CHO. Los polipéptidos de ALK7 y ActRIIB descritos en este documento, así como complejos de proteínas de los mismos, se pueden recuperar como fracciones brutas, parcialmente purificadas o muy purificadas usando cualquiera de las técnicas muy conocidas para obtener proteínas a partir de cultivos celulares. En general, tales procedimientos dan como resultado complejos de ALK7:ActRIIB que están sustancialmente libres de homomultímeros de ALK7 y/o ActRIIB. Por ejemplo, en algunos aspectos, los procedimientos para producir heteromultímeros ALK7:ActRIIB dan como resultado menos de aproximadamente un 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, o menos de aproximadamente un 1 % de homomultímeros de ALK7. En algunos aspectos, los procedimientos para producir heteromultímeros ALK7:ActRIIB dan como resultado menos de aproximadamente un 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, o menos de aproximadamente un 1 % de homomultímeros de ActRIIB. En algunos aspectos, los procedimientos para producir heteromultímeros ALK7:ActRIIB dan como resultado menos de aproximadamente un 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, o menos de aproximadamente un 1 % de homomultímeros de ALK7 y, en algunos aspectos, procedimientos para producir heteromultímeros ALK7:ActRIIB dan como resultado menos de aproximadamente un 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, o menos de aproximadamente un 1 % de homomultímeros de ActRIIB.

La descripción proporciona además procedimientos y heteromultímeros ALK7:ActRIIB para su uso en el tratamiento o la prevención de diversas enfermedades y afecciones asociadas con la activina C. Por ejemplo, en algunos aspectos, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB pueden usarse para aumentar la fertilidad, aumentar la producción de esperma, aumentar el volumen de los túbulos seminíferos, disminuir la inflamación de la próstata, disminuir la inflamación del hígado en un paciente que lo necesite. En algunos aspectos, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB pueden usarse para tratar o prevenir el cáncer de hígado, testicular o de próstata. En algunos aspectos, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB pueden usarse para disminuir los niveles (p. ej., niveles séricos) de activina C en un paciente que lo necesite.

La descripción proporciona además procedimientos y antagonistas de ALK7:ActRIIB (p. ej., heteromultímeros ALK7:ActRIIB) para su uso en el tratamiento o la prevención de diversas enfermedades y afecciones asociadas con ALK7:ActRIIB, asociadas con, por ejemplo, riñón, grasa, fibrosis y otros tejidos. Tales enfermedades o afecciones incluyen, por ejemplo, insuficiencia o enfermedad renal crónica, enfermedad o insuficiencia renal aguda, pacientes que tienen enfermedad renal en fase 1, pacientes que tienen enfermedad renal en fase 2, pacientes que tienen enfermedad renal en fase 3, pacientes que tienen enfermedad renal en fase 4, pacientes que tienen enfermedad renal en fase 5, enfermedades renales no diabéticas, glomerulonefritis, nefritis intersticial, enfermedades renales diabéticas, nefropatía diabética, glomeruloesclerosis, glomerulonefritis de progresión rápida, fibrosis renal, síndrome de Alport, nefritis DMID, glomerulonefritis proliferativa mesangial, glomerulonefritis membranoproliferativa, glomerulonefritis en media luna, fibrosis intersticial renal, glomeruloesclerosis segmentaria y focal, nefropatía membranosa, enfermedad de cambios mínimos, glomerulonefritis progresiva rápida pauci-inmune, nefropatía por IgA, poliquistosis renal, enfermedad de Dent, nefrocitinosis, nefritis de Heymann, poliquistosis renal (adulto) dominante autosómica, poliquistosis renal (infantil) recesiva autosómica, lesión renal aguda, síndrome nefrótico, isquemia renal, enfermedades o trastornos de los podocitos, proteinuria, enfermedades glomerulares, glomerulonefritis membranosa, glomerulonefritis segmentaria y focal, preeclampsia, eclampsia, lesiones renales, enfermedades vasculares del colágeno, proteinuria (postural) ortostática benigna, nefropatía por IgM, nefropatía membranosa, sarcoidosis, diabetes mellitus, daño renal debido a fármacos, enfermedad de Fabry, aminoaciduria, síndrome de Fanconi, nefroesclerosis hipertensiva, nefritis intersticial, enfermedad de células falciformes, hemoglobinuria, mioglobinuria, granulomatosis de Wegener, enfermedad por almacenamiento de glucógeno tipo 1, enfermedad renal crónica, insuficiencia renal crónica, baja tasa de filtración glomerular (TFG), nefroangioesclerosis, nefritis lúpica, glomerulonefritis de media luna pauciinmune positiva para ANCA, nefropatía crónica de aloinjerto, nefrotoxicidad, toxicidad renal, necrosis renal, daño renal, lesión glomerular y tubular, disfunción renal, síndrome nefrítico, insuficiencia renal aguda, insuficiencia renal crónica, disfunción tubárica proximal, rechazo de trasplante de riñón agudo, rechazo de trasplante de riñón crónico, glomerulonefritis mesangioproliferativa no por IgA, glomerulonefritis posinfecciosa, vasculitis con afectación renal de cualquier tipo, cualquier enfermedad renal hereditaria, cualquier nefritis intersticial, insuficiencia de trasplante de riñón, cáncer de riñón, enfermedad renal asociada con otras afecciones (p. ej., hipertensión, diabetes y enfermedad autoinmunitaria), enfermedad de Dent, nefrocitinosis, nefritis de Heymann, una enfermedad renal primaria, una glomerulopatía colapsante, una enfermedad de depósitos densos, una glomerulonefritis asociada a crioglobulinemia, una enfermedad de Henoch-Schonlein, una glomerulonefritis posinfecciosa, una endocarditis bacteriana, una poliangitis microscópica, un síndrome de Churg-Strauss, una glomerulonefritis mediada por anticuerpos anti-MBG, amiloidosis, una enfermedad por depósito de inmunoglobulina monoclonal, una glomerulonefritis fibrilar, una glomerulopatía inmunotactoide, lesión tubular isquémica, una nefritis tubulointersticial inducida por medicamentos, una nefritis tubulointersticial tóxica, una nefritis tubulointersticial infecciosa, una pielonefritis bacteriana, una nefritis tubulointersticial infecciosa vírica que resulta de una infección por poliomavirus o una infección por VIH, una enfermedad tubulointersticial inducida por el metabolismo, una enfermedad conectiva mixta, una nefropatía por cilindros, una nefropatía por cristales que puede resultar de urato u oxalato o depósito de cristales inducido por fármacos, un rechazo de aloinjerto tubulointersticial celular agudo, una enfermedad infiItrativa tumoral que resulta de un linfoma o una enfermedad linfoproliferativa postrasplante, una enfermedad obstructiva del riñón, enfermedad vascular, una microangiopatía trombótica, una nefroangioesclerosis, una enfermedad ateroembólica, una enfermedad de tejido conectivo mixta, una poliarteritis nudosa, una enfermedad vascular inducida por inhibidor de calcineurina, rechazo de aloinjerto vascular celular agudo, rechazo de aloinjerto humoral agudo, deterioro temprano de la función renal (DTFR), enfermedad renal en fase terminal (ERFT), trombosis de la vena renal, necrosis tubular aguda, oclusión renal, nefritis intersticial aguda, enfermedad renal crónica establecida, estenosis de la arteria renal, nefropatía isquémica, uremia, nefritis tubulointersticial crónica inducida por fármacos y toxinas, nefropatía por reflujo, cálculos renales, síndrome de Goodpasture, anemia normocítica normocrómica, anemia renal, enfermedad renal crónica diabética, enfermedad relacionada con IgG4, síndrome de von Hippel-Lindau, esclerosis tuberosa, nefronoptisis, enfermedad renal quística medular, carcinoma de células renales, adenocarcinoma, nefroblastoma, linfoma, leucemia, trastorno por hiposialilación, nefropatía crónica por ciclosporina, lesión por reperfusión renal, displasia renal, azotemia, oclusión arterial bilateral, nefropatía aguda por ácido úrico, hipovolemia, uropatía obstructiva bilateral aguda, nefropatía hipercalcémica, síndrome urémico hemolítico, retención urinaria aguda, nefroesclerosis maligna, glomeruloesclerosis posparto, esclerodermia, enfermedad anti-MBG no Goodpasture, poliarteritis nudosa microscópica, granulomatosis alérgica, nefritis aguda por radiación, glomerulonefritis posestreptocócica, macroglobulinemia de Waldenstrom, nefropatía analgésica, fístula arteriovenosa, injerto arteriovenoso, diálisis, riñón ectópico, riñón en esponja medular, osteodistrofia renal, riñón solitario, hidronefrosis, microalbuminuria, uremia, hematuria, hiperlipidemia, hipoalbuminemia, lipiduria, acidosis e hiperpotasemia. En algunos aspectos, la descripción proporciona además procedimientos y antagonistas de ALK7:ActRIIB (p. ej., heteromultímeros ALK7:ActRIIB) para retrasar o prevenir la progresión de: enfermedad renal en fase 1 a fase 2, enfermedad renal en fase 2 a fase 3, enfermedad renal en fase 3 a fase 4 o enfermedad renal en fase 4 a fase 5. En algunos aspectos, la descripción proporciona además procedimientos y antagonistas de ALK7:ActRIIB (p. ej., heteromultímeros ALK7:ActRIIB) para su uso en la prevención o reducción de la inflamación renal. En algunos aspectos, la descripción proporciona además procedimientos y antagonistas de ALK7:ActRIIB (p. ej., heteromultímeros ALK7:ActRIIB) para su uso en la prevención o reducción del daño renal. En algunos aspectos, la descripción proporciona además procedimientos y antagonistas de ALK7:ActRIIB (p. ej., heteromultímeros ALK7:ActRIIB) para su uso en la prevención o reducción de la fibrosis renal.

En algunos aspectos, la descripción proporciona además procedimientos y antagonistas de ALK7:ActRIIB (p. ej., heteromultímeros ALK7:ActRIIB) para su uso en la actividad de lipólisis en un sujeto que lo necesite. En algunos aspectos, la descripción proporciona además procedimientos y antagonistas de ALK7:ActRIIB (p. ej., heteromultímeros ALK7:ActRIIB) para su uso en la disminución del contenido de grasa corporal o en la reducción de la tasa de aumento del contenido de grasa corporal en un sujeto que lo necesite. En algunos aspectos, la descripción proporciona además procedimientos y antagonistas de ALK7:ActRIIB (p. ej., heteromultímeros ALK7:ActRIIB) para su uso en el tratamiento de un trastorno o afección asociada con una ganancia de peso corporal indeseable en un sujeto. Tales trastornos incluyen, por ejemplo, obesidad (p. ej., obesidad abdominal); sobrepeso; resistencia a la insulina; síndrome metabólico y otras enfermedades o afecciones metabólicas; un trastorno de lípidos tal como niveles bajos de HDL, niveles altos de LDL, hiperlipidemia, hipertrigliceridemia o dislipidemia; aberraciones de lipoproteínas; triglicéridos disminuidos; enfermedad del hígado graso; enfermedad del hígado graso no alcohólico; hiperglucemia; tolerancia alterada a la glucosa (IGT); hiperinsulinemia; colesterol alto (p. ej., niveles altos de LDL y/o hipercolesterolemia); enfermedad cardiovascular tal como cardiopatía que incluye cardiopatía coronaria, insuficiencia cardíaca congestiva, aterosclerosis; arteriosclerosis y/o hipertensión; Síndrome X; reestenosis vascular; neuropatía; y/u otros trastornos/afecciones asociados con una o más de las enfermedades o afecciones anteriores, y/o con sobrepeso (p. ej., IMC de >25 kg/m2), o con demasiada grasa corporal. En algunos aspectos, la descripción proporciona procedimientos para disminuir el contenido de grasa corporal o reducir la tasa de aumento del contenido de grasa corporal en un sujeto, que comprenden administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad efectiva de un antagonista de ALK7:ActRIIB o combinación de antagonistas de ALK7:ActRIIB. En algunos aspectos, la descripción proporciona procedimientos para tratar un trastorno asociado con un aumento de peso corporal indeseable en un sujeto, que comprenden administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad efectiva de un antagonista de ALK7:ActRIIB o combinación de antagonistas de ALK7:ActRIIB. En algunos aspectos, el trastorno asociado con un aumento de peso corporal indeseable en un sujeto se selecciona de entre el grupo que consiste en: obesidad, diabetes mellitus no insulinodependiente (DMNID), enfermedad cardiovascular, hipertensión, artrosis, accidente cerebrovascular, problemas respiratorios y colecistopatía. En algunos aspectos, la descripción proporciona procedimientos para reducir el colesterol y/o los triglicéridos en un paciente, que comprende administrar a un paciente sujeto que lo necesite una cantidad efectiva de un antagonista de ALK7:ActRIIB o combinación de antagonistas de ALK7:ActRIIB.

En algunos aspectos, la descripción proporciona además procedimientos y antagonistas de ALK7:ActRIIB (p. ej., heteromultímeros ALK7:ActRIIB) para su uso en el tratamiento y/o la mejora del cáncer o una afección asociada con el cáncer. En algunos aspectos, el sujeto tiene un cáncer seleccionado de entre el grupo que consiste en melanoma, cáncer de mama, colon y endometrio, páncreas, gástrico y útero. En algunos aspectos, el sujeto tiene mieloma (por ejemplo, mieloma múltiple, plasmocitoma, mieloma localizado y mieloma extramedular). En algunos aspectos, el antagonista de ALK7:ActRIIB se administra para tratar o prevenir metástasis linfática, metástasis del torrente sanguíneo, crecimiento tumoral o invasión tumoral.

En algunos aspectos, la descripción proporciona además procedimientos y antagonistas de ALK7:ActRIIB (p. ej., heteromultímeros ALK7:ActRIIB) para su uso en el tratamiento o la prevención de la fibrosis o un trastorno o afección asociada con la fibrosis en un paciente que lo necesite. Tales trastornos o afecciones incluyen, por ejemplo, fibrosis pulmonar, neumonitis por hipersensibilidad, fibrosis idiopática, tuberculosis, neumonía, fibrosis quística, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), enfisema, fibrosis renal (riñón), insuficiencia renal (riñón), enfermedad renal (riñón) crónica, fibrosis ósea, mielofibrosis, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, esclerodermia, sarcoidosis, granulomatosis con poliangeítis, enfermedad de Peyronie, fibrosis hepática, enfermedad de Wilson, enfermedades por almacenamiento de glucógeno (en particular, tipos III, IV, IX y X), sobrecarga de hierro, enfermedad de Gaucher, síndrome de Zellweger, esteatohepatitis no alcohólica y alcohólica, cirrosis biliar, colangitis esclerosante, síndrome de Budd-Chiari, fibrosis asociada a cirugía, enfermedad de Crohn, contractura de Duputren, fibrosis mediastínica, fibrosis nefrogénica, fibrosis retroperitoneal, fibrosis auricular, fibrosis endomiocárdica, fibrosis pancreática.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Las figuras 1A y 1B muestran dos ejemplos esquemáticos de complejos proteicos heteroméricos que comprenden polipéptidos de receptor de tipo I y de receptor de tipo II. La figura 1A representa un complejo proteico heterodimérico que comprende un polipéptido de fusión de receptor de tipo I y un polipéptido de fusión de receptor de tipo II, que pueden ensamblarse de forma covalente o no covalente mediante un dominio de multimerización contenido dentro de cada cadena polipeptídica. Dos dominios de multimerización ensamblados constituyen un par de interacción, que puede ser guiado o no guiado. La figura 1B representa un complejo proteico heterotetramérico que comprende dos complejos heterodiméricos como se representan en la figura 1A. Se pueden concebir complejos de orden superior.

La figura 2 muestra un ejemplo esquemático de un complejo proteico heteromérico que comprende un polipéptido receptor de tipo I (indicado como "I") (por ejemplo, un polipéptido que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntico a un dominio extracelular de una proteína ALK7 de seres humanos u otras especies tales como las descritas en este documento, por ejemplo, SEQ ID NO: 9, 10, 19, 20, 38, 39, 42, 43, 46, 74, 76, 79 y 80) y un polipéptido receptor de tipo II (indicado como "II") (por ejemplo, un polipéptido que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntico a un dominio extracelular de una proteína ActRIIB de seres humanos u otras especies tales como las descritas en este documento, por ejemplo, SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 71, 73, 77 y 78). En los aspectos ilustrados, el polipéptido receptor de tipo I es parte de un polipéptido de fusión que comprende un primer miembro de un par de interacción ("C1"), y el polipéptido receptor de tipo II es parte de un polipéptido de fusión que comprende un segundo miembro de un par de interacción ("C2"). En cada polipéptido de fusión, se puede colocar un enlazador entre el polipéptido receptor de tipo I o tipo II y el miembro correspondiente del par de interacción. El primer y segundo miembros del par de interacción pueden ser un par guiado (asimétrico), lo que significa que los miembros del par se asocian preferentemente entre sí en lugar de autoasociarse, o el par de interacción puede ser no guiado, lo que significa que los miembros del par pueden asociarse entre sí o autoasociarse sin preferencia sustancial y pueden tener secuencias de aminoácidos iguales o diferentes. Las proteínas de fusión y los anticuerpos de Fc tradicionales son ejemplos de pares de interacción no guiados, mientras que un abanico de dominios Fc genomanipulados se han diseñado como pares de interacción guiados (asimétricos) [p. ej., Spiess y col (2015) Molecular Immunology 67 (2A): 95-106].

La figura 3 muestra una alineación de dominios extracelulares de ActRIIA humano (SEQ ID NO: 49) y ActRIIB humano (SEQ ID NO: 2) con los residuos que se deducen en este documento, basado en el análisis de material compuesto de múltiples estructuras cristalinas de ActRIIB y ActRIIA, para entrar directamente en contacto con ligando indicado con recuadros.

La figura 4 muestra una alineación de secuencia múltiple de diversas proteínas precursoras de ActRIIB de vertebrados sin sus dominios intracelulares (SEQ ID NO: 50-55) proteína precursora de ActRIIA humana sin su dominio intracelular (SEQ ID NO: 56), y una proteína precursora de ActRII consenso (SEQ ID NO: 57).

La figura 5 muestra la alineación de múltiples secuencias de dominios Fc de isotipos de IgG humana usando Clustal 2.1. Las regiones bisagra se indican mediante un subrayado punteado. El subrayado doble indica ejemplos de posiciones genomanipuladas en Fc de IgG1 para promover el apareamiento de cadenas asimétricas y las posiciones correspondientes con respecto a otros isotipos IgG2, IgG3 e IgG4.

La figura 6 muestra datos de unión de ligandos comparativos para un complejo proteico heterodimérico ALK7-Fc:ActRIIB-Fc comparado con el homodímero de ActRIIB-Fc y el homodímero de ALK7-Fc. Para cada complejo proteico, los ligandos se clasifican por koff, una constante cinética que se correlaciona bien con la inhibición de la transducción de señales del ligando, y se enumeran en orden descendente de afinidad de unión (los ligandos unidos más estrechamente se enumeran en la parte superior). A la izquierda, las líneas amarillas, rojas, verdes y azules indican la magnitud de la constante de disociación. Las líneas negras continuas indican ligandos cuya unión al heterodímero está mejorada o no cambia en comparación con el homodímero, mientras que las líneas rojas discontinuas indican una unión sustancialmente reducida en comparación con el homodímero. Como se muestra, cuatro de los cinco ligandos con fuerte unión al homodímero de ActRIIB-Fc (activina A, BMP10, GDF8 y GDF11) presentan unión reducida al heterodímero ActRIIB-Fc:ALK7-Fc, siendo la excepción la activina B que conserva una unión estrecha al heterodímero. De manera similar, tres de los cuatro ligandos con unión intermedia al homodímero de ActRIIB-Fc (GDF3, BMP6 y particularmente BMP9) presentan una unión reducida al heterodímero ActRIIB-Fc:ALK7-Fc, mientras que la unión a activina AC aumenta para convertirse en la segunda interacción de ligando más fuerte con el heterodímero en general. Finalmente, la activina C y BMP5 se unen inesperadamente al heterodímero ActRIIB-Fc:ALK7 con fuerza intermedia a pesar de que no hay unión (activina C) o unión débil (BMP5) al homodímero de ActRIIB-Fc. Ningún ligando ensayado se une al homodímero de ALK7-Fc.

La figura 7 muestra un alineamiento de secuencia múltiple de dominios extracelulares de ALK7 derivados de diversas especies de vertebrados (SEQ ID NO: 59-64).

Las figuras 8A-8D muestran ejemplos esquemáticos de complejos proteicos heteroméricos que comprenden un polipéptido de ALK7 (por ejemplo, un polipéptido que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntico a un dominio extracelular de una proteína ALK7 de seres humanos u otras especies tales como las descritas en este documento, p. ej., SEQ ID NO: 9, 10, 19, 20, 38, 39, 42, 43, 46, 74, 76, 79 y 80) y un polipéptido ActRIIB (por ejemplo, un polipéptido que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntico a un dominio extracelular de una proteína ActRIIB de seres humanos u otras especies tales como las descritas en este documento, p. ej., SEQ ID NO: 1,2, 3, 4, 5, 6, 71, 73, 77 y 78). En los aspectos ilustrados, el polipéptido de ALK7 es parte de un polipéptido de fusión que comprende un primer miembro de un par de interacción ("C1"), y el polipéptido de ActRIIB es parte de un polipéptido de fusión que comprende un segundo miembro de un par de interacción ("C2"). Los pares de interacción adecuados incluyen, por ejemplo, pares de interacción de inmunoglobulina de cadena pesada y/o cadena ligera, truncamientos y variantes de los mismos, tales como los descritos en este documento [p. ej., Spiess y col (2015) Molecular Immunology 67 (2A): 95-106]. En cada polipéptido de fusión, se puede colocar un enlazador entre el polipéptido de ALK7 o ActRIIB y el miembro correspondiente del par de interacción. El primer y segundo miembros del par de interacción pueden ser no guiados, lo que significa que los miembros del par pueden asociarse entre sí o autoasociarse sin una preferencia sustancial y pueden tener la misma o diferentes secuencias de aminoácidos. Véase la figura 8A. Alternativamente, el par de interacción puede ser un par guiado (asimétrico), lo que significa que los miembros del par se asocian preferentemente entre sí en lugar de autoasociarse. Véase la Figura 8B. Se pueden concebir complejos de orden superior. Véanse las figuras 8C y 8D.

Las figuras 9A-9G muestran ejemplos esquemáticos de complejos proteicos heteroméricos que comprenden dos polipéptidos de ALK7 (por ejemplo, polipéptidos que son independientemente al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idénticos a un dominio extracelular de una proteína ALK7 de seres humanos u otras especies tales como las descritas en este documento, por ejemplo, SEQ ID NO: 9, 10, 19, 20, 38, 39, 42, 43, 46, 74, 76, 79 y 80) y dos polipéptidos de ActRIIB (p. ej., dos polipéptidos que son independientemente al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idénticos a un dominio extracelular de una proteína ActRIIB de seres humanos u otras especies tales como las descritas en este documento, p. ej., SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 71, 73, 77 y 78).

En el aspecto ilustrado 9A, el primer polipéptido de ALK7 (de izquierda a derecha) es parte de un polipéptido de fusión que comprende un primer miembro de un par de interacción ("C1") y comprende además un primer miembro adicional de un par de interacción ("A1"); y el segundo polipéptido de ALK7 es parte de un polipéptido de fusión que comprende un segundo miembro de un par de interacción ("C2") y comprende además un primer miembro de un par de interacción ("A2"). El primer polipéptido de ActRIIB (de izquierda a derecha) es parte de un polipéptido de fusión que comprende un segundo miembro de un par de interacción ("B1"); y el segundo polipéptido de ActRIIB es parte de un polipéptido de fusión que comprende un segundo miembro de un par de interacción ("B2"). A1 y A2 pueden ser iguales o diferentes; B1 y B2 pueden ser iguales o diferentes, y C1 y C2 pueden ser iguales o diferentes. En cada polipéptido de fusión, se puede colocar un enlazador entre el polipéptido de ALK7 o ActRIIB y el miembro correspondiente del par de interacción, así como entre pares de interacción. La figura 9A es un ejemplo de una asociación de pares de interacción no guiados, lo que significa que los miembros del par pueden asociarse entre sí o autoasociarse sin una preferencia sustancial y pueden tener la misma o diferentes secuencias de aminoácidos.

En el aspecto ilustrado 9B, el primer polipéptido de ActRIIB (de izquierda a derecha) es parte de un polipéptido de fusión que comprende un primer miembro de un par de interacción ("C1") y comprende además un primer miembro adicional de un par de interacción ("A1"); y el segundo polipéptido de ActRIIB es parte de un polipéptido de fusión que comprende un segundo miembro de un par de interacción ("B2"). El primer polipéptido de A^lK7 (de izquierda a derecha) es parte de un polipéptido de fusión que comprende un segundo miembro de un par de interacción ("B1"); y el segundo polipéptido de ALK7 es parte de un polipéptido de fusión que comprende un segundo miembro de un par de interacción ("C2") y comprende además un primer miembro de un par de interacción ("A2"). En cada polipéptido de fusión, se puede colocar un enlazador entre el polipéptido de ALK7 o ActRIIB y el miembro correspondiente del par de interacción, así como entre pares de interacción. La figura 9B es un ejemplo de una asociación de pares de interacción guiados (asimétricos), lo que significa que los miembros del par se asocian preferentemente entre sí en lugar de autoasociarse.

Los pares de interacción adecuados incluyen, por ejemplo, pares de interacción de inmunoglobulina de cadena pesada y/o cadena ligera, truncamientos y variantes de los mismos tales como se describen en este documento [p. ej., Spiess y col (2015) Molecular Immunology 67 (2A): 95-106]. Se pueden concebir complejos de orden superior. Véanse las figuras 9C-9F. Usando procedimientos similares, particularmente aquellos que emplean inmunoglobulinas de cadena ligera y/o pesada, truncamientos o variantes de las mismas, se pueden usar pares de interacción para producir heterodímeros ALK7:ActRIIB que se asemejan a los complejos de anticuerpos Fab y F(ab')2 [p. ej., Spiess y col (2015) Molecular Immunology 67 (2A): 95-106]. Véase la figura 9G.

Las figuras 10A y 10B muestran ejemplos esquemáticos de un complejo proteico heteromérico que comprende un polipéptido de ALK7 (por ejemplo, un polipéptido que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntico a un dominio extracelular de una proteína ALK7 de seres humanos u otras especies tales como las descritas en este documento, p. ej., SEQ ID NO: 9, 10, 19, 20, 38, 39, 42, 43, 46, 74, 76, 79 y 80), un polipéptido de ActRIIB (por ejemplo, un polipéptido que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntico a un dominio extracelular de una proteína ActRIIB de seres humanos u otras especies tales como las descritas en este documento, por ejemplo, SEQ ID NO: 1,2, 3, 4, 5, 6, 71, 73, 77, y 78), y un dominio de unión a ligando de un anticuerpo (por ejemplo, un dominio de unión a ligando derivado de un anticuerpo que se une a uno o más ligandos de unión a ALK7:ActRIIB). En los aspectos ilustrados, el polipéptido de ALK7 es parte de un polipéptido de fusión que comprende un primer miembro de un par de interacción ("C1") y comprende además un primer miembro adicional de un par de interacción ("A1"). El polipéptido de ActRIIB es parte de un polipéptido de fusión que comprende un segundo miembro de un par de interacción ("B1"). El polipéptido de cadena pesada variable (Vh) es parte de un polipéptido de fusión que comprende un segundo miembro de un par de interacción ("C2") y comprende además un primer miembro de un par de interacción ("A2"). El polipéptido de cadena pesada variable (Vl) es parte de un polipéptido de fusión que comprende un segundo miembro de un par de interacción ("B2"). En cada polipéptido de fusión, se puede colocar un enlazador entre el polipéptido de ALK7 o ActRIIB y el miembro correspondiente del par de interacción, entre los pares de interacción y entre los polipéptidos V^hy V^ly un miembro del par de interacción. A1 y A2 pueden ser iguales o diferentes; B1 y B2 pueden ser iguales o diferentes, y C1 y C2 pueden ser iguales o diferentes. Los pares de interacción adecuados incluyen, por ejemplo, pares de interacción de inmunoglobulina de cadena pesada y/o cadena ligera constante, truncamientos y variantes de los mismos tales como se describen en este documento [p. ej., Spiess y col (2015) Molecular Immunology 67 (2A): 95-106]. La figura 10A es un ejemplo de una asociación de pares de interacción guiados (asimétricos), lo que significa que los miembros del par se asocian preferentemente entre sí en lugar de autoasociarse. La figura 10B es un ejemplo de una asociación de pares de interacción no guiados, lo que significa que los miembros del par pueden asociarse entre sí o autoasociarse sin una preferencia sustancial y pueden tener la misma o diferentes secuencias de aminoácidos.

Tales complejos anticuerpo-ALK7:ActRIIB pueden ser útiles en situaciones en las que es deseable unirse a/antagonizar adicionalmente un agente que no es un ligando de ALK7:ActRIIB. Alternativamente, tales complejos anticuerpo-ALK7:ActRIIB pueden ser útiles en situaciones en las que es deseable mejorar aún más la unión/el antagonismo a un ligando de ALK7:ActRIIB. Por ejemplo, como se demuestra en los ejemplos en este documento, un heterodímero ALK7:ActRIIB tiene una alta afinidad por varios ligandos que incluyen, p. ej., activina B y activina AC. Adicionalmente, los heterodímeros ALK7:ActRIIB se unen a GDF3 pero con una afinidad más débil. En ciertas situaciones en las que es deseable antagonizar la actividad de GDF3 además de uno o más de los ligandos de unión de alta afinidad (por ejemplo, activina B y activina AC), el GDF3 puede verse superado por la unión a un heterodímero ALK7:ActRIIB. En estas situaciones, la adición de un dominio de unión de un anticuerpo anti-GDF3 al complejo heteromultimérico ALK7:ActRIIB mejoraría la capacidad del complejo proteico para antagonizar GDF3 además de uno o más de los ligandos de unión a ALK7:ActRIIB de mayor afinidad (por ejemplo, activina B y activina AC).

La figura 11 muestra ejemplos esquemáticos de polipéptidos de trampa única de ALK7:ActRIIB. Los polipéptidos de trampa única de ALK7:ActRIIB pueden contener múltiples dominios ALK7 (p. ej., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más dominios), que tienen secuencias iguales o diferentes y múltiples dominios ActRIIB (p. ej., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más dominios), que tienen secuencias iguales o diferentes. Estos dominios ALK7 y ActRIIB pueden disponerse en cualquier orden y pueden comprender una o más posiciones de dominios de enlazador entre uno o más de los dominios ALK7 y ActRIIB. Tales trampas de ligando pueden ser útiles como agentes terapéuticos para tratar o prevenir enfermedades o trastornos descritos en este documento.

Las figuras 12A-12D muestran ejemplos esquemáticos de complejos proteicos multiméricos que comprenden al menos un polipéptido de trampa monocatenario de ALK7:ActRIIB. En los aspectos ilustrados 12A y 12B, un primer polipéptido de trampa monocatenario de ALK7:ActRIIB (de izquierda a derecha) es parte de un polipéptido de fusión que comprende un primer miembro de un par de interacción ("C1"); y un segundo polipéptido de trampa monocatenario de ALK7:ActRIIB es parte de un polipéptido de fusión que comprende un segundo miembro de un par de interacción ("C2"). C1 y C2 pueden ser iguales o diferentes. El primer y segundo polipéptidos de trampa monocatenarios de ALK7:ActRIIB pueden ser iguales o diferentes. En cada polipéptido de fusión, se puede colocar un enlazador entre el polipéptido de trampa monocatenario ALK7:ActRIIB y el miembro correspondiente del par de interacción. Los pares de interacción adecuados incluyen, por ejemplo, pares de interacción de inmunoglobulina de cadena pesada y/o cadena ligera, truncamientos y variantes de los mismos tales como se describen en este documento [p. ej., Spiess y col (2015) Molecular Immunology 67 (2A): 95-106]. La figura 12A es un ejemplo de una asociación de pares de interacción no guiados, lo que significa que los miembros del par pueden asociarse entre sí o autoasociarse sin una preferencia sustancial y pueden tener la misma o diferentes secuencias de aminoácidos. La figura 12B es un ejemplo de una asociación de pares de interacción guiados (asimétricos), lo que significa que los miembros del par se asocian preferentemente entre sí en lugar de autoasociarse. Se pueden concebir complejos de orden superior. Además, tales polipéptidos de trampa monocatenarios de ALK7:ActRIIB pueden estar asociados de manera similar, covalente o no covalentemente, con uno o más polipéptidos de ALK7 y/o uno o más polipéptidos de ActRIIB. Véase la figura 12C. Además, tales polipéptidos de trampa monocatenarios de ALK7:ActRIIB pueden asociarse de forma similar, covalente o no covalentemente, con uno o más dominios de unión a ligando de un anticuerpo (p. ej., un dominio de unión a ligando de un anticuerpo que se une a uno o más ligandos de unión a ALK7:ActRIIB). Véase la figura 12D.

Las figuras 13A-13C muestran perfiles de expresión génica de genes fibróticos (Colla1, Col3a1, Fibronectina, PAI-1, CTGF y a-SMA), genes inflamatorios (Tnfa y MCP1), genes de citocinas (Tgfb1, Tgfb2, Tgfb3 y activina A), gen de daño renal (NGAL), factor 1 -alfa inducible por hipoxia (HIF1a) y receptor de activina A (Acvr2A) de riñones de ratón sometidos a obstrucción ureteral unilateral (OUU). Se usaron muestras del riñón contralateral no quirúrgico como control (Ctrl). Los perfiles de expresión génica se obtuvieron a los 3 días y 17 días después de la cirugía. A los ratones se les administró PBS o un homodímero ALK7-Fc:ActRIIB-Fc en los días 3, 7, 10 y 14 después de la cirugía. Las estadísticas se realizaron usando una ANOVA de una vía seguida de un análisis de Tukey. (*) indica una diferencia estadística entre i) muestras de control en comparación con los riñones con OUU a los 3 días o ii) muestras de control en comparación con los riñones con OUU a los 17 días en ratones a los que se les administró el homodímero ALK7-Fc:ActRIIB-Fc. ($) denota una diferencia estadística entre los riñones OUU a los 17 días en ratones a los que se les administró solo PBS en comparación con los riñones con UUO a los 17 días en ratones a los que se les administró el homodímero ALK7-Fc:ActRIIB-Fc. (@) indica que no se detectó ningún transcrito.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA DESCRIPCIÓN

1. Análisis general

En parte, la presente descripción se refiere a heteromultímeros que comprenden un polipéptido receptor de tipo I de la superfamilia de TGFp y un polipéptido receptor de tipo II de la superfamilia de TGFp, usos de los mismos y procedimientos para preparar tales heteromultímeros. Véanse, por ejemplo, las figuras 1 y 2. En ciertos aspectos preferidos, los heteromultímeros comprenden un dominio extracelular de un polipéptido receptor de tipo I de la superfamilia de TGFp y un dominio extracelular de un polipéptido receptor de tipo II de la superfamilia de TGFp. En particular, la descripción proporciona heteromultímeros que comprenden un polipéptido de a LK7 y un polipéptido de ActRIIB. Preferiblemente, los polipéptidos de ALK7 comprenden un dominio de unión a ligando de un receptor ALK7, y los polipéptidos de ActRIIB comprenden un dominio de unión a ligando de un receptor ActRIIB. En ciertos aspectos preferidos, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB tienen un perfil/una especificidad de unión al ligando de la superfamilia de TGFp alterada en comparación con una muestra correspondiente de un homomultímero (por ejemplo, un heterodímero ALK7:ActRIIB en comparación con un homodímero ActRIIB:ActRIIB o un homodímero ALK7:ALK7).

La superfamilia de TGF-p está compuesta por más de 30 factores secretados que incluyen TGF-beta, activinas, nodales, proteínas morfogenéticas óseas (BMP), factores de crecimiento y diferenciación (GDF) y hormona anti-Mulleriana (AMH) [ Weiss y col. (2013) Developmental Biology, 2(1): 47-63]. Los miembros de la superfamilia, que se encuentran tanto en vertebrados como en invertebrados, se expresan de manera ubicua en diversos tejidos y funcionan durante las primeras fases de desarrollo a lo largo de la vida de un animal. De hecho, las proteínas de la superfamilia de TGF-p son mediadores clave de la autorrenovación, gastrulación, diferenciación de células madre, la morfogénesis de órganos y la homeostasis del tejido adulto. De acuerdo con esta actividad ubicua, la transducción de señales aberrante de la superfamilia de TGF-beta se asocia con una amplia gama de patologías humanas que incluyen, por ejemplo, enfermedades autoinmunitarias, enfermedades cardiovasculares, enfermedades fibróticas y cáncer.

Los ligandos de la superfamilia de TGF-beta comparten la misma estructura dimérica en la que la hélice de giro 3-1/2 central de los paquetes de un monómero contra la superficie cóncava formada por las cadenas beta del otro monómero. La mayoría de los miembros de la familia de TGF-beta se estabilizan aún más mediante un enlace disulfuro intermolecular. Estos enlaces disulfuro atraviesan un anillo formado por otros dos enlaces disulfuro que generan lo que se ha denominado un motivo de 'nudo de cisterna' [Lin y col. (2006) Reproduction 132: 179-190; y Hinck y col. (2012) FEBS Letters 586: 1860-1870].

La transducción de señales de la superfamilia de TGF-beta está mediada por complejos heteroméricos de receptores de la serina/treonina cinasa de tipo I y tipo II, que fosforilan y activan aguas abajo las proteínas SMAD (p. ej., las proteínas SMAD 1, 2, 3, 5 y 8) tras la estimulación del ligando [Massagué (2000) Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1: 169-178]. Estos receptores de tipo I y tipo II son proteínas transmembranarias, compuestas por un dominio extracelular de unión a ligando con una región rica en cisteína, un dominio transmembranario y un dominio citoplásmico con especificidad por la serina/treonina cinasa prevista. En general, los receptores de tipo I median la transducción de señales intracelular, mientras que los receptores de tipo II son necesarios para unirse a ligandos de la superfamilia de TGF-beta. Los receptores de tipo I y II forman un complejo estable después de la unión a ligando, lo que da como resultado la fosforilación de los receptores de tipo I por los receptores de tipo II.

La familia de TGF-beta se puede dividir en dos ramas filogenéticas según los receptores de tipo I a los que se unen y las proteínas Smad que activan. Una es la rama de evolución más reciente, que incluye, p. ej., TGF-beta, activinas, GDF8, GDF9, GDF11, BMP3 y nodal, que señalizan a través de receptores de tipo I que activan las Smad 2 y 3. [Hinck (2012) FEBS Letters 586: 1860-1870]. La otra rama comprende las proteínas relacionadas de forma más distante de la superfamilia e incluye, p. ej., BMP2, BMP4, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8a, BMP8b, BMP9, BMP10, GDF1, GDF5, GDF6 y GDF7, que señalizan mediante las Smad 1, 5 y 8.

Las isoformas de TGF-beta son los miembros fundadores de la superfamilia de TGF-beta, de las cuales hay 3 isoformas conocidas en mamíferos designadas como TGF-beta1, TGF-beta2 y TGF-beta3. Los ligandos de TGF-beta bioactivos maduros funcionan como homodímeros y señalizan predominantemente a través del receptor ALK5 de tipo I, pero también se ha encontrado que señalizan adicionalmente a través de ALK1 en las células endoteliales.

[Goumans y col. (2003) Mol Cell 12 (4): 817-828]. TGF-beta1 es la isoforma más abundante y de expresión ubicua. Se sabe que TGF-beta1 tiene un papel importante en la cicatrización de heridas, y los ratones que expresan un transgén de TGF-beta1 constitutivamente activo desarrollan fibrosis [Clouthier y col. (1997) J. Clin. Invertir. 100 (11): 2697-2713]. TGF-beta1 también participa en la activación de las células T y el mantenimiento de las células T reguladoras [Li y col. (2006) Immunity 25 (3): 455-471]. La expresión de TGF-beta2 se describió por primera vez en células de glioblastoma humano y se produce en neuronas y células astrogliales del sistema nervioso embrionario. Se sabe que TGF-beta2 suprime el crecimiento de linfocitos T dependiente de interleucina-2. El TGF-beta3 se aisló inicialmente de una estirpe celular de rabdomiosarcoma humano y desde entonces se ha encontrado en estirpes celulares de adenocarcinoma de pulmón y carcinoma de riñón. Se sabe que TGF-beta3 es importante para la morfogénesis del paladar y el pulmón [Kubiczkova y col. (2012) Journal of Translational Medicine 10: 183].

Las activinas son miembros de la superfamilia de TGF-beta y se descubrieron inicialmente como reguladores de la secreción de la hormona foliculoestimulante, pero posteriormente se han caracterizado diversas funciones reproductivas y no reproductivas. Hay tres formas principales de activina (A, B y AB) que son homo/heterodímeros de dos subunidades p relacionadas estrechamente (pApA, pBpB y pApB, respectivamente). El genoma humano codifica también una activina C y una activina E, que se expresan principalmente en el hígado, y también se conocen formas heterodiméricas que contienen pC o pE. En la superfamilia de TGF-beta, las activinas son factores únicos y multifuncionales que pueden estimular la producción de hormonas en células ováricas y placentarias, respaldar la supervivencia de las células neuronales, influir en el desarrollo del ciclo celular de forma positiva o negativa en función del tipo celular e inducir la diferenciación mesodérmica al menos en embriones de anfibios [DePaolo y col., (1991) Proc Soc Ep Biol Med. 198:500-512; Dyson y col., (1997) Curr Biol. 7:81-84; y Woodruff, 1998, Biochem Pharmacol.

55:953-963]. En varios tejidos, la transducción de señales de la activina es antagonizada por su heterodímero relacionado, la inhibina. Por ejemplo, en la regulación de la secreción de hormona foliculoestimulante (FSH) desde la pituitaria, la activina favorece la síntesis y secreción de FSH, mientras que la inhibina reduce la síntesis y secreción de FSH. Otras proteínas que pueden regular la bioactividad de la activina y/o unirse a la activina incluyen la folistatina (FS), la proteína relacionada con la folistatina (FSRP, también conocida como FLRG o FSTL3) y la a2-macroglobulina.

Como se describe en este documento, los agentes que se unen a “activina A” son agentes que se unen específicamente a la subunidad pA, ya sea en el contexto de una subunidad pA aislada o como un complejo dimérico (p. ej., un homodímero pApA o un heterodímero pApB). En el caso de un complejo de heterodímero (p. ej., un heterodímero pApB), los agentes que se unen a “activina A” son específicos para epítopos presentes dentro de la subunidad pA, pero no se unen a epítopos presentes dentro de la subunidad que no es pA del complejo (p. ej., la subunidad pB del complejo). De manera similar, los agentes descritos en este documento que antagonizan (inhiben) la “activina A” son agentes que inhiben una o más actividades mediadas por una subunidad pA, ya sea en el contexto de una subunidad pA aislada o como un complejo dimérico (p. ej., un homodímero pApA o un heterodímero pApB). En el caso de los heterodímeros pApB, los agentes que inhiben la “activina A” son agentes que inhiben específicamente una o más actividades de la subunidad pA, pero no inhiben la actividad de la subunidad que no es pA del complejo (p. ej., la subunidad pB del complejo). Este principio se aplica también a los agentes que se unen a, y/o inhiben, la “activina B”, “activina C” y “activina E”. Los agentes descritos en este documento que antagonizan la “activina AB” son agentes que inhiben una o más actividades mediadas por la subunidad pA y una o más actividades mediadas por la subunidad pB. El mismo principio se aplica también a los agentes que se unen a, y/o inhiben, la “activina AC”, “activina AE”, "activina BC" o “activina BE”.

Las proteínas Nodal tienen funciones en la inducción y formación del mesodermo y endodermo, así como en la organización posterior de estructuras axiales tales como el corazón y el estómago en la embriogénesis temprana. Se ha demostrado que el tejido dorsal de un embrión de vertebrado en desarrollo contribuye predominantemente a las estructuras axiales de la placa notocordal y precordal, a la vez que recluta células circundantes para formar estructuras embrionarias no axiales. Nodal parece señalizar tanto a través de los receptores de tipo I y tipo II como de efectores intracelulares conocidos como proteínas SMAD. Los estudios respaldan la idea de que ActRIIA y ActRIIB sirven como receptores de tipo II para nodal [Sakuma y col. (2002) Genes Cells. 2002, 7: 401-12]. Se apunta a que los ligandos de Nodal interactúan con sus cofactores (por ejemplo, Crypto o Cryptic) para activar los receptores de la activina de tipo I y tipo II, que fosforilan SMAD2. Las proteínas Nodal están implicadas en muchos acontecimientos cruciales para el embrión de vertebrado incipiente, que incluyen la formación del mesodermo, la formación del patrón anterior y la especificación del eje izquierda-derecha. Los datos experimentales han demostrado que la transducción de señales de nodal activa pAR3-Lux, un indicador de luciferasa que se demostró anteriormente que responde específicamente a activina y TGF-beta. Sin embargo, nodal es incapaz de inducir pTlx2-Lux, un indicador sensible específicamente a las proteínas morfogenéticas óseas. Los resultados recientes proporcionan pruebas bioquímicas directas de que la transducción de señales de nodal está mediada por SMAD2 y SMAD3 que también median en la transducción de señales por TGF-beta y activinas. Las pruebas adicionales han demostrado que la proteína Cripto o Cryptic extracelular es necesaria para la transducción de señales de nodal, lo que la diferencia de la transducción de señales por activina o TGF-beta.

Las BMP y GDF juntas forman una familia de citocinas de nudos de cisteína que comparten el pliegue característico de la superfamilia de TGF-beta [Rider y col. (2010) Biochem J., 429 (1): 1-12 ]. Esta familia incluye, por ejemplo, BMP2, BMP4, BMP6, BMP7, BMP2a, BMP3, BMP3b (también conocida como GDF10), BMP4, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8, BMP8a, BMP8b, BMP9 (también conocida como GDF2), BMP10, BMP11 (también conocida como GDF11), BMP12 (también conocida como GDF7), BMP13 (también conocida como GDF6), BMP14 (también conocida como GDF5), BMP15, GDF1, GDF3 (también conocida como VGR2), GDF8 (también conocida como miostatina), GDF9, GDF15 y decapentapléjico. Además de la capacidad de inducir la formación ósea, que dio a las BMP su nombre, las BMP/GDF presentan actividades morfogenéticas en el desarrollo de una amplia gama de tejidos. Los homo y heterodímeros de BMP/GDF interactúan con combinaciones de dímeros de receptores de tipo I y tipo II para producir múltiples complejos de transducción de señales posibles, lo que lleva a la activación de uno de los dos conjuntos de factores de transcripción de SMAD en competencia. Los BMP/GDF tienen funciones muy específicas y localizadas. Estas están reguladas de varias formas, incluida la restricción en el desarrollo de la expresión de BMP/GDF y a través de la secreción de varias proteínas antagonistas específicas de BMP que se unen con alta afinidad a las citocinas. Curiosamente, varios de estos antagonistas se parecen a los ligandos de la superfamilia de TGF-beta.

El factor 8 de crecimiento y diferenciación (GDF8) también se conoce como miostatina. GDF8 es un regulador negativo de la masa del músculo esquelético y está altamente expresado en el músculo esquelético adulto y en desarrollo. La mutación anuladora del GDF8 en ratones transgénicos está caracterizada por una hipertrofia e hiperplasia notables del músculo esquelético [McPherron y col., Nature, 1997, 387: 83-90]. Los aumentos similares en la masa del músculo esquelético son evidentes en mutaciones de origen natural de GDF8 en el ganado y, sorprendentemente, en seres humanos [Ashmore y col., 1974, Growth, 38: 501-507; Swatland y Kieffer, J. Anim. Sci., (1994) 38: 752-757; McPherron y Lee, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1997) 94: 12457-12461; y Kambadur y col., Genome Res., (1997) 7: 910-915; y Schuelke y col., (2004) N Engl J Med;350: 2682-8]. Los estudios también han demostrado que la atrofia muscular asociada con infección por VIH en los seres humanos está acompañada de aumentos en la expresión de proteínas GDF8 [Gonzalez-Cadavid y col., PNAS, 1998, 95: 14938-43]. Además, el GDF8 puede modular la producción de enzimas específicas del músculo (p. ej., creatina cinasa) y modular la proliferación celular de mioblastos [solicitud de patente internacional con n.° de publicación WO 00/43781]. El propéptido de GDF8 se puede unir de forma no covalente al dímero del dominio de GDF8 maduro, al inactivar su actividad biológica [Miyazono y col. (1988) J. Biol. Chem., 263: 6407-6415; Wakefield y col. (1988) J. Biol. Chem., 263; 7646-7654; y Brown y col. (1990) Growth Factors, 3: 35-43]. Otras proteínas que se unen a GDF8 o relacionadas estructuralmente con las proteínas y que inhiben su actividad biológica incluyen folistatina y, potencialmente, proteínas relacionadas con folistatina [Gamer y col. (1999) Dev. Biol., 208: 222-232].

El GDF11, también conocido como BMP11, es una proteína secretada que se expresa en el brote caudal, el brote de las extremidades, los arcos maxilar y mandibular y los ganglios de la raíz dorsal durante el desarrollo del ratón [McPherron y col. (1999) Nat. Genet., 22: 260-264 y Nakashima y col. (1999) Mech. Dev., 80: 185-189]. El GDF11 desempeña un papel único en la formación del patrón tanto del tejido mesodérmico como del neural [Gamer y col., 1999, Dev Biol., 208: 222-32]. El GDF11 demostró ser un regulador negativo de la condrogénesis y la miogénesis en el desarrollo de las extremidades de polluelos [Gamer y col., 2001, Dev Biol. 229: 407-20]. La expresión de GDF11 en el músculo también sugiere su papel en la regulación del crecimiento muscular de una manera similar al GDF8. Además, la expresión de GDF11 en el cerebro sugiere que el GDF11 también puede poseer actividades que se relacionan con la función del sistema nervioso. Curiosamente, se encontró que el GDF11 inhibe la neurogénesis en el epitelio olfativo [Wu y col., 2003, Neuron. 37: 197-207]. Por lo tanto, los inhibidores de GDF11 pueden tener aplicaciones in vitro e in vivo en el tratamiento de enfermedades tales como enfermedades musculares y enfermedades neurodegenerativas (p. ej., esclerosis lateral amiotrófica).

La BMP7, también denominada proteína osteogénica 1 (OP-1), se sabe que induce la formación de cartílagos y huesos. Además, la BMP7 regula un amplio abanico de procesos fisiológicos. Por ejemplo, la BMP-7 puede ser el factor osteoinductor responsable del fenómeno de la osteogénesis epitelial. También se encontró que la BMP7 desempeña una función en la regulación del calcio y la homeostasis ósea. Al igual que la activina, la BMP7 se une a receptores de tipo II, ActRIIA y ActRIIB. Sin embargo, la BMP7 y la activina reclutan distintos receptores de tipo I en los complejos de receptores heteroméricos. El receptor de tipo I principal de la BMP7 observado fue ALK2, mientras que la activina se unía exclusivamente a ALK4 (ActRIIB). La b MP7 y la activina provocaron respuestas biológicas distintas y activaron diferentes vías de SMAD [Macias-Silva y col., 1998, J Biol Chem. 273: 25628-36].

Como se describe en este documento, los datos de unión comparativos demostraron que un heterodímero ALK7:ActRIIB tiene un perfil de unión alterado (selectividad de ligando) en comparación con los homodímeros de ActRIIB o ALK7 correspondientes. En particular, el heterodímero ALK7:ActRIIB muestra una unión mejorada a activina C, activina AC y BMP5 en comparación con cualquiera de los homodímeros, y conserva una fuerte unión a activina B como se observa con el homodímero de ActRIIB. Sin embargo, el heterodímero ALK7:ActRIIB presenta una unión reducida a GDF11, GDF8, activina A, BMP10, BMP6, GDF3 y BMP9 en comparación con el homodímero de ActRIIB. En particular, la BMP9 muestra una afinidad baja o nula por el heterodímero ALK7:ActRIIB, mientras que este ligando se une estrechamente al homodímero de ActRIIB.

Estos resultados demuestran, por tanto, que los heterodímeros ALK7:ActRIIB son antagonistas más selectivos de activina B, activina C, activina AC y BMP5 en comparación con los homodímeros de ActRIIB. Adicionalmente, se espera que dichos heterodímeros se unan estrechamente a la activina BC, dada la unión a las activinas B y C. Adicionalmente, se espera que dichos heterodímeros se unan a la activina E, la activina AE y la activina BE dada la similitud estructural entre la activina C y E. por consiguiente, un heterodímero ALK7:ActRIIB puede ser más útil que un homodímero de ActRIIB en ciertas aplicaciones en las que tal antagonismo selectivo es ventajoso. Los ejemplos incluyen aplicaciones terapéuticas donde es deseable retener el antagonismo de una o más de activina B, activina C, activina AC, activina BC, activina E, activina AE, activina BE y BMP5 pero minimizar el antagonismo de una o más de activina A, BMP9, BMP10, GDF3 y BMP6.

Además, los heterodímeros ALK7:ActRIIB, como se describe en este documento, ejercen efectos catabólicos beneficiosos sobre el tejido adiposo. Además, se ha demostrado que los heterodímeros ALK7:ActRIIB descritos en este documento tienen potentes efectos protectores en un modelo de enfermedad renal crónica, con efectos que incluyen la inhibición de la fibrosis y la inflamación. Sin embargo, a diferencia del homodímero de ActRIIB, un heterodímero de ActRIIB:ALK7 presenta sólo unión transitoria o de baja afinidad a BMP9 y, por lo tanto, tendrá poca o ninguna inhibición concurrente en procesos mediados por BMP9, tales como la angiogénesis. Esta nueva selectividad será útil, por ejemplo, en el tratamiento de pacientes que necesiten efectos inhibidores sobre la grasa o efectos protectores sobre el riñón, pero que no necesiten angiogénesis alterada.

Los términos usados en esta memoria descriptiva generalmente tienen sus significados habituales en la técnica, dentro del contexto de esta descripción y en el contexto específico en el que se usa cada término. Ciertos términos se describen a continuación o en otra parte de la memoria descriptiva para proporcionar una orientación adicional al facultativo a la hora de describir las composiciones y los procedimientos de la descripción y cómo prepararlos y usarlos. El alcance o significado de cualquier uso de un término resultará evidente a partir del contexto específico en el que se usa.

Los términos "heterómero" o "heteromultímero" es un complejo que comprende al menos una primera cadena polipeptídica y una segunda cadena polipeptídica, donde la segunda cadena polipeptídica difiere en la secuencia de aminoácidos de la primera cadena polipeptídica en al menos una residuo de aminoácido. El heterómero puede comprender un "heterodímero" formado por la primera y segunda cadenas polipeptídicas o puede formar estructuras de orden superior donde están presentes una o más cadenas polipeptídicas además de la primera y segunda cadenas polipeptídicas. Las estructuras ejemplares para el heteromultímero incluyen heterodímeros, heterotrímeros, heterotetrámeros y otras estructuras oligoméricas. Los heterodímeros se designan en este documento como X:Y o de forma equivalente como X-Y, donde X representa una primera cadena polipeptídica e Y representa una segunda cadena polipeptídica. Los heterómeros y las estructuras oligoméricas de orden superior se designan en este documento de la manera correspondiente. En ciertos aspectos, un heteromultímero es recombinante (por ejemplo, uno o más componentes polipeptídicos pueden ser una proteína recombinante), aislado y/o purificado.

“Homóloga”, en todas sus formas gramaticales y variaciones ortográficas, se refiere a la relación entre dos proteínas que poseen un “origen evolutivo común”, lo que incluye proteínas de superfamilias de la misma especie de organismo, así como proteínas homólogas de diferentes especies de organismos. Tales proteínas (y sus ácidos nucleicos codificantes) tienen homología de secuencia, como refleja su similitud de secuencia, ya sea en términos de porcentaje de identidad o por la presencia de residuos o motivos específicos y posiciones conservadas. Sin embargo, en el uso habitual y en la presente solicitud, el término “homóloga”, cuando está modificado con un adverbio tal como “muy”, se puede referir a similitud de secuencia y puede o no estar relacionado con un origen evolutivo común.

El término “similitud de secuencia”, en todas sus formas gramaticales, se refiere al grado de identidad o correspondencia entre las secuencias de ácidos nucleicos o aminoácidos que pueden compartir o no un origen evolutivo común.

“Porcentaje (%) de identidad de secuencia” con respecto a una secuencia de polipéptido (o nucleótidos) de referencia se define como el porcentaje de residuos de aminoácido (o ácidos nucleicos) de una secuencia candidata que son idénticos a los residuos de aminoácido (o ácidos nucleicos) de la secuencia de polipéptido (o nucleótidos) de referencia, después de alinear las secuencias e introducir espacios, si es necesario, para conseguir el porcentaje de identidad de secuencia máximo y sin considerar ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. La alineación a efectos de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos se puede conseguir de diversas maneras que se encuentran dentro de los conocimientos de los expertos en la técnica, por ejemplo, usando software informático disponible públicamente tal como el software BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la técnica pueden determinar los parámetros apropiados para alinear secuencias, lo que incluye cualquier algoritmo necesario para conseguir el alineamiento máximo a lo largo de la longitud completa de las secuencias que se están comparando. Sin embargo, a efectos de esta solicitud, los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos (ácidos nucleicos) se generan usando el programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2. El programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2 fue creado por Genentech, Inc. y el código fuente se ha depositado con la documentación del usuario en la Oficina de Derechos de Autor de los EE. UU., Washington D.C., 20559, en la que está registrado con el n.° de registro de derechos de autor de los EE. UU. TXU510087. El programa ALIGN-2 está disponible públicamente en Genentech, Inc., South San Francisco, Calif., o se puede compilar a partir del código fuente. El programa ALIGN-2 se debe compilar para uso en un sistema operativo UNIX, lo que incluye UNIX V4.0D digital. Todos los parámetros de comparación de secuencias son establecidos por el programa ALIGN-2 y no varían.

"Agonizar", en todas sus formas gramaticales, se refiere al proceso de activación de una proteína y/o gen (p. ej., activando o amplificando la expresión génica de esa proteína o induciendo a una proteína inactiva a entrar en un estado activo) o aumentando la actividad de una proteína y/o un gen.

"Antagonizar", en todas sus formas gramaticales, se refiere al proceso de inhibición de una proteína.y/o gen (p. ej., inhibiendo o disminuyendo la expresión génica de esa proteína o induciendo a una proteína activa a entrar en un estado inactivo) o disminuyendo la actividad de una proteína y/o un gen.

Como se emplea en este documento, la expresión "no se une sustancialmente a X ' está destinada a significar que un agente tiene una K^dque es superior a aproximadamente 10-7, 10-6, 10-5, 10-4 o superior (p, ej., ausencia de unión detectable mediante el ensayo usado para determinar la K^d) para "X', donde "X' es un agente especificado tal como proteína o ácido nucleico.

El término "aproximadamente" como se usa en relación con un valor numérico en toda la memoria descriptiva y las reivindicaciones denota un intervalo de precisión, familiar y aceptable para un experto en la técnica. En general, dicho intervalo de precisión es ± 10 %. De forma alternativa y en sistemas biológicos en particular, el término "aproximadamente" puede significar valores que se encuentran dentro de un orden de magnitud, preferiblemente, < 5 veces y, más preferiblemente, < 2 veces un valor dado.

Los intervalos numéricos descritos en este documento incluyen los números que definen el intervalo.

Los términos "un" y "una" incluyen los referentes plurales a menos que el contexto en el que se usa el término dicte claramente otra cosa. Los términos "un" (o "una"), así como los términos "uno o más" y "al menos uno" se pueden usar de manera intercambiable en este documento. Además, "y/o" donde se usa en este documento debe tomarse como una descripción específica de cada una de las dos o más características o componentes especificados con o sin el otro. Por consiguiente, se pretende que el término "y/o", tal como se usa en una expresión tal como "A y/o B" en este documento, incluya "A y B", "A o B", "A" (sola) y "B" (sola). De manera similar, se pretende que el término "y/o", tal como se usa en una expresión tal como "A, B y/o C" abarque cada uno de los siguientes aspectos: A, B, y C; A, B, o C; A o C; A o B; B o C; A y C; A y B; B y C; A (sola); B (sola); y C (sola).

A lo largo de esta memoria descriptiva, la palabra "comprender", o variaciones de la misma tales como "comprende" o "que comprende", se entenderá que implicará la inclusión de un entero o grupo de enteros indicado, pero no la exclusión de cualquier otro entero o grupo de enteros.

2. Antagonistas de ActRIIB:ALK7

Como se describe en este documento, se ha descubierto que los heterodímeros ALK7:ActRIIB tienen un perfil/selectividad unión a ligando única en comparación con los correspondientes homodímeros de ActRIIB y ALK7. Curiosamente, cuatro de los cinco ligandos con la unión más fuerte al homodímero de ActRIIB (activina A, BMP10, GDF8 y GDF11) presentan unión reducida al heterodímero ALK7:ActRIIB, siendo la excepción la activina B que conserva una unión estrecha al heterodímero. De manera similar, tres de los cuatro ligandos con unión intermedia al homodímero de ActRIIB (GDF3, BMP6 y particularmente BMP9) presentan una unión reducida al heterodímero ALK7:ActRIIB, mientras que la unión a activina AC aumenta para convertirse en la segunda interacción de ligando más fuerte con el heterodímero en general. Finalmente, la activina C y BMP5 se unen inesperadamente al heterodímero ALK7:ActRIIB con fuerza intermedia a pesar de que no hay unión (activina C) o unión débil (BMP5) al homodímero de ActRIIB. Dada la unión a activina B y activina C, se espera que el heterodímero ALK7:ActRIIB se una estrechamente a la activina BC. El resultado neto es que el heterodímero ALK7:ActRIIB posee un perfil de unión a ligando claramente diferente del del homodímero de ActRIIB o del homodímero de ALK7, que no se une a ninguno de los ligandos anteriores.

Estos resultados indican, por tanto, que los heteromultímeros ALK7:ActRIIB son antagonistas más selectivos de activina B, activina AC y activina BC en comparación con los homomultímeros de ActRIIB. Además, el heterodímero ALK7:ActRIIB presenta la propiedad inusual de unión robusta a activina C. En consecuencia, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB serán más útiles que los homomultímeros de ActRIIB en ciertas aplicaciones donde tal antagonismo selectivo es ventajoso.

Además, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB son sorprendentemente eficaces para mejorar diversas complicaciones de la enfermedad renal (por ejemplo, tratar o prevenir la lesión, inflamación y daño renal), así como para ejercer células adiposas anabólicas beneficiosas. A pesar de que los heteromultímeros ALK7:ActRIIB pueden ejercer efectos biológicos a través de un mecanismo diferente a la inhibición del ligando. [p. ej., la inhibición de uno o más de activina B, activina AC, activina C, GDF11, GDF8, activina A, BMP10, BMP6, B^mP5, nodal y GDF3 puede ser un indicador de la tendencia de un agente a inhibir las actividades de un espectro de agentes adicionales, incluidos, quizás, otros miembros de la superfamilia de TGF-beta, y tal inhibición colectiva puede conducir a un efecto deseado en, por ejemplo, enfermedad renal o un trastorno metabólico], otros tipos de antagonistas de ligandos de la superfamilia de TGF-beta, así como antagonistas de receptores de tipo I y tipo II (p. ej., trampas de ligandos naturales tales como folistatina y Lefty, anticuerpos, ácidos nucleicos inhibidores y moléculas pequeñas inhibidoras), o combinaciones de dichos antagonistas, se espera que sean útiles de acuerdo con los procedimientos descritos en este documento, en particular aquellos que imitan las propiedades de unión/inhibidoras de los heterodímeros ALK7:ActRIIB, así como agentes que antagonizan directa o indirectamente a los receptores ALK7 y/o ActRIIB, agentes que antagonizan directa o indirectamente a ligandos de unión a ALK7 y/o ActRIIB, agentes que antagonizan directa o indirectamente a los mediadores de transducción de señales aguas abajo (p. ej., Smad), y/o agentes que antagonizan directa o indirectamente los correceptores de la superfamilia de TGFp (p. ej., Cripto o Cryptic) tendrán efectos biológicos similares. Colectivamente los heteromultímeros ALK7:ActRIIB y estos antagonistas alternativos se denominan en este documento "antagonistas de ALK7:ActRIIB" o "inhibidores de ALK7:ActRIIB".

A. Heteromultímeros ALK7:ActRIIB

En ciertos aspectos, la presente descripción se refiere a heteromultímeros que comprenden uno o más polipéptidos del receptor A^lK7 (p. ej., SEQ ID NO: 9, 10, 19, 20, 38, 39, 42, 43, 46, 74, 76, 79 y 80 ) y uno o más polipéptidos del receptor ActRIIB (p. ej., SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 71, 73, 77 y 78), que generalmente se denominan en este documento "complejos heteromultiméricos ALK7:ActRIIB" o "heteromultímeros ALK7:ActRIIB". Preferiblemente, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB de la descripción son solubles, por ejemplo, un heteromultímero puede comprender una porción (dominio) soluble de un receptor ALK7 y una porción (dominio) soluble de un receptor ActRIIB. En general, los dominios extracelulares de ALK7 y ActRIIB corresponden a una porción soluble de estos receptores. Por lo tanto, en algunos aspectos, los heteromultímeros de la descripción comprenden un dominio extracelular de un receptor ALK7 y un dominio extracelular de un receptor ActRIIB. En este documento se describen ejemplos de dominios extracelulares de receptores ALK7 y ActRIIB y estas secuencias, así como fragmentos, variantes funcionales y formas modificadas de las mismas, pueden usarse de acuerdo con la descripción (p. ej., heteromultímeros ALK7:ActRIIB y usos de los mismos). Los heteromultímeros ALK7:ActRIIB de la descripción incluyen, p. ej., heterodímeros, heterotrímeros, heterotetrámeros y estructuras oligoméricas de orden superior. Véanse, p. ej., las figuras 1, 2 y 8-10. En ciertos aspectos preferidos, los heteromultímeros de la descripción son heterodímeros ALK7:ActRIIB.

Preferiblemente, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB de la descripción se unen a uno o más ligandos de la superfamilia de TGF-beta. En algunos aspectos, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB se unen a uno o más de activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina AE, activina BC y activina B^e), G^dF8 y GDF11. Opcionalmente, en algunos aspectos, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB se unen además a BMP6. Opcionalmente, en algunos aspectos, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB se unen además a BMP10. Opcionalmente, en algunos aspectos, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB se unen además a BMP5. Opcionalmente, en algunos aspectos, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB se unen además a GDF3. Opcionalmente, en algunos aspectos, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB se unen además a nodal. Opcionalmente, en algunos aspectos, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB se unen además a BMP10. Opcionalmente, en algunos aspectos, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB no se unen o no se unen sustancialmente a BMP9. En ciertos aspectos preferidos, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB se unen a uno o más de GDF11, GDF8, activina A, BMP10, B^mP6, G^dF3 y BMP9 con una afinidad más débil en comparación con un homomultímero de ActRIIB correspondiente. En otros aspectos preferidos, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB se unen a uno o más de activina C, activina AC, activina BC y BMP5 con una afinidad más fuerte en comparación con un homomultímero de ActRIIB correspondiente. Opcionalmente, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB se unen además a uno o más de BMP2, BMP2/7, BMP3, BMP4, BMP4/7, BMP7, BMP8a, BMP8b, GDF5, GDF6/BMP13, GDF7, GDF9b/BMP15, GDF15/MIC1, TGF-pi, TGF-p2, TGF-p3, factor neurotrófico derivado de células gliales (GDNF), neurturina, artemina, persefina, MIS y Lefty.

Los heteromultímeros ALK7:ActRIIB de unión a ligandos de la superfamilia de TGF-beta pueden usarse para inhibir (antagonizar) la transducción de señales (p. ej., transducción de señales de Smad 2/3 y/o Smad 1/5/8 ) mediada por uno o más ligandos de la superfamilia de TGFp. En particular, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB de la descripción se pueden usar para inhibir la transducción de señales por uno o más ligandos de la superfamilia de TGFp en, por ejemplo, un ensayo basado en células tal como los descritos en este documento. Por ejemplo, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB inhiben la transducción de señales mediada por uno o más de, p. ej., activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE y activina ^bE), GDF11, GDF8, BMP10, BMP6 , BMP5, nodal y GDF3 en un ensayo basado en células. Opcionalmente, en algunos aspectos, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB pueden inhibir además la transducción de señales de BMP6 en un ensayo basado en células. Opcionalmente, en algunos aspectos, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB pueden inhibir además la transducción de señales de GDF3 en un ensayo basado en células. Opcionalmente, en algunos aspectos, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB pueden inhibir además la transducción de señales de nodal en un ensayo basado en células. Opcionalmente, en algunos aspectos, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB pueden inhibir además la transducción de señales de BMP5 en un ensayo basado en células. Opcionalmente, en algunos aspectos, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB pueden inhibir además la transducción de señales de BMP10 en un ensayo basado en células. Opcionalmente, en algunos aspectos, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB no inhiben o no inhiben sustancialmente la transducción de señales mediada por BMP9 en un ensayo basado en células. En ciertos aspectos preferidos, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB tienen un efecto inhibidor más débil sobre la transducción de señales mediada por uno o más de GDF11, GDF8, activina A, BMP10, BMP6 , GDF3 y BMP9 en comparación con un homomultímero de ActRIIB correspondiente en un ensayo basado en células. En otros aspectos preferidos, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB tienen un efecto inhibidor más fuerte sobre la transducción de señales mediada por una o más de entre activina AC, activina BC, activina C y BMP5 en comparación con un homomultímero de ActRIIB correspondiente en un ensayo basado en células. Opcionalmente, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB pueden inhibir además la transducción de señales por uno o más de BMP2, BMP2/7, BMP3, BMP4, BMP4/7, BMP7, BMP8a, BMP8b, GDF5, GDF6/BMP13, GDF7, GDF9b/BMP15, GDF15/MIC1, TGF-|31, TGF-32, TGF-33, factor neurotrófico derivado de células gliales (GDNF), neurturina, artemina, persefina, MIS y Lefty en un ensayo basado en células.

Como se emplea en este documento, el término “ActRIIB” se refiere a una familia de proteínas de receptor de activina de tipo IIB (ActRIIB) de cualquier especie y a variantes derivadas de tales proteínas ActRIIB mediante mutagénesis u otra modificación. La referencia a ActRIIB en este documento se entiende que es una referencia a cualquiera de las formas identificadas actualmente. Los miembros de la familia ActRIIB generalmente son proteínas transmembranarias, compuestas por un dominio extracelular de unión a ligando que comprende una región rica en cisteína, un dominio transmembranario y un dominio citoplásmico con actividad serina/treonina cinasa prevista.

El término “polipéptido de ActRIIB” incluye polipéptidos que comprenden cualquier polipéptido de origen natural de un miembro de la familia de ActRIIB, así como cualquier variante de los mismos (lo que incluye mutantes, fragmentos, fusiones y formas peptidomiméticas), que conserva una actividad útil. Los ejemplos de tales variantes de polipéptidos de ActRIIB se proporcionan a lo largo de la presente descripción, así como en las solicitudes de patente internacional con n.° de publicación WO 2006/012627, WO 2008/097541 y WO 2010/151426. La numeración de los aminoácidos para todos lo polipéptidos relacionados con ActRIIB descritos en este documento se basa en la numeración de la secuencia de proteína precursora de ActRIIB humano proporcionada más adelante (SEQ ID NO: 1), a menos que se designe específicamente de otro modo.

La secuencia de proteína precursora de ActRIIB humano es la siguiente:

1 MTAPWVALAL LWGSLCAGSG RGEAETRECI YYNANWELER TgQSGLERCE

51 GEQDKRLHCYASWR^SSGTI ELVKKGCWLD DFNCYDRQEC VATEENPQVY

101 FCCCEGNFCN ERFTHLPEAG GPEVTYEPPP TAPTLLTVLA YSLLPIGGLS

151 LIVLLAFWMY RHRKPPYGHV D1HEDPGPPP PSPLVGLKPL QLLEIKARGR

201 FGCVWKAQLM NDFVAVKIFP LQDKQSWQSE REIFSTPGMK HENLLQFIAA

251 EKRGSNLEVE LWLITAFHDK GSLTDYLKGN IITWNELCHV AETMSRGLSY

301 LHEDVPWCRG EGHKPSIAHR DFKSKNVLLK SDLTAVLADF GLAVRFEPGK

351 PPGDTHGQVG TRRYMAPEVL EGAINFQRDA FLRIDMYAMG LVLWELVSRC

401 KAADGPVDEY MLPFEEEIGQ HPSLEELQEV WHKKMRPTI KDHWLKHPGL

451 AQLCVTIEEC WDHDAEARLS AGCVEERVSL IRRSVNGTTS DCLVSLVTSV

501 TNVDLPPKES SI (SEQ ID NO: 1)

El péptido señal está indicado con un subrayado único; el dominio extracelular está indicado en negrita y los puntos de N-glucosilación endógenos potenciales están indicados con un subrayado doble.

La secuencia de polipéptiods de ActRIIB extracelular procesada (madura) es la siguiente:

GRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDD

FNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT (SEQ ID

NO: 2)

En algunos aspectos, la proteína se puede producir con una secuencia “SGR...” en el extremo amínico. La “cola” del extremo carboxiterminal del dominio extracelular está indicada mediante un subrayado único. La secuencia con la "cola" eliminada (una secuencia A15) es la siguiente:

GRGEAETKECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDD

FNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEA(SEQ ID NO: 3)

También se describe en la bibliografía una forma de ActRIIB con una alanina en la posición 64 de la SEQ ID NO: 1 (A64). Véase, p. ej., Hilden y col. (1994) Blood, 83(8): 2163-2170. Los solicitantes han determinado que una proteína de fusión ActRIIB-Fc que comprende un dominio extracelular de ActRIIB con la sustitución A64 tiene una afinidad relativamente baja por la activina y el GDF11. Por el contrario, la misma proteína de fusión ActRIIB-Fc con una arginina en la posición 64 (R64) tiene una afinidad para la activina y el GDF11 en el intervalo de nanomolar bajo a picomolar alto. Por lo tanto, las secuencias con una R64 se usan como la secuencia de referencia de “tipo natural” para ActRIIB humano en esta descripción.

La forma de ActRIIB con una alanina en la posición 64 es la siguiente:

1 MTAPWVALAL LWGSLCAGSG RGEAETRECI YYNANWELER TNQSGLERCE

51 GEQDKRLHCYASWANSSGTI ELVKKGCWLD DFNCYDRQEC VATEENPQVY

101 FCCCEGNFCN ERFTHLPEAG GPEVTYEPPP TAPTLLTVLA YSLLPIGGLS

151 LIVLLAFWMY RHRKPPYGHV D1HEDPGPPP PSPLVGLKPL QLLEIKARGR

201 FGCVWKAQLM NDFVAVKIFP LQDKQSWQSE REIFSTPGMK HENLLQFIAA

251 EKRGSNLEVE LWLITAFHDK GSLTDYLKGN IITWNELCHV AETMSRGLSY

301 LHEDVPWCRG EGHKPSIAHR DFKSKNVLLK SDLTAVLADF GLAVRFEPGK

351 PPGDTHGQVG TRRYMAPEVL EGAINFQRDA FLRIDMYAMG LVLWELVSRC

401 KAADGPVDEY MLPFEEEIGQ HPSLEELQEV WHKKMRPTI KDHWLKHPGL

451 AQLCVTIEEC WDHDAEARLS AGCVEERVSL IRRSVNGTTS DCLVSLVTSV

501 TNVDLPPKES SI (SEQ ID NO: 4)

El péptido señal está indicado mediante subrayado único y el dominio extracelular está indicado en negrita.

La secuencia del polipéptido de ActRIIB extracelular (maduro) procesado de la forma A64 alternativa es la siguiente:

En algunos aspectos, la proteína se puede producir con una secuencia “SGR...” en el extremo amínico. La “cola” del extremo carboxiterminal del dominio extracelular está indicada mediante subrayado único. La secuencia con la "cola" eliminada (una secuencia A15) es la siguiente:

GRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWANSSGTIELVKKGCWLDD

FNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEA (SEQ ID NO: 6)

Una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína precursora de ActRIIB humano se muestra a continuación (SEQ ID NO: 7), que representa los nucleótidos 25-1560 de la secuencia de referencia de Genbank NM_001106.3, que codifica los aminoácidos 1-513 del precursor de ActRIIB. La secuencia mostrada proporciona una arginina en la posición 64 y se puede modificar para proporcionar una alanina en su lugar. La secuencia señal está subrayada.

1 ATGACGGCGC CCTGGGTGGC CCTCGCCCTC CTCTGGGGAT CGCTGTGCGC

51 CGGCTCTGGG CGTGGGGAGG CTGAGACACG GGAGTGCATC TACTACAACG

101 CCAACTGGGA GCTGGAGCGC ACCAACCAGA GCGGCCTGGA GCGCTGCGAA

151 GGCGAGCAGG ACAAGCGGCT GCACTGCTAC GCCTCCTGGC GCAACAGCTC

201 TGGCACCATC GAGCTCGTGA AGAAGGGCTG CTGGCTAGAT GACTTCAACT

251 GCTACGATAG GCAGGAGTGT GTGGCCACTG AGGAGAACCC CCAGGTGTAC

301 TTCTGCTGCT GTGAAGGCAA CTTCTGCAAC GAACGCTTCA CTCATTTGCC

351 AGAGGCTGGG GGCCCGGAAG TCACGTACGA GCCACCCCCG ACAGCCCCCA

401 CCCTGCTCAC GGTGCTGGCC TACTCACTGC TGCCCATCGG GGGCCTTTCC

451 CTCATCGTCC TGCTGGCCTT TTGGATGTAC CGGCATCGCA AGCCCCCCTA

501 CGGTCATGTG GACATCCATG AGGACCCTGG GCCTCCACCA CCATCCCCTC

551 TGGTGGGCCT GAAGCCACTG CAGCTGCTGG AGATCAAGGC TCGGGGGCGC

601 TTTGGCTGTG TCTGGAAGGC CCAGCTCATG AATGACTTTG TAGCTGTCAA

651 GATCTTCCCA CTCCAGGACA AGCAGTCGTG GCAGAGTGAA CGGGAGATCT

701 TCAGCACACC TGGCATGAAG CACGAGAACC TGCTACAGTT CATTGCTGCC

751 GAGAAGCGAG GCTCCAACCT CGAAGTAGAG CTGTGGCTCA TCACGGCCTT

801 CCATGACAAG GGCTCCCTCA CGGATTACCT CAAGGGGAAC ATCATCACAT

851 GGAACGAACT GTGTCATGTA GCAGAGACGA TGTCACGAGG CCTCTCATAC

901 CTGCATGAGG ATGTGCCCTG GTGCCGTGGC GAGGGCCACA AGCCGTCTAT

951 TGCCCACAGG GACTTTAAAA GTAAGAATGT ATTGCTGAAG AGCGACCTCA

1001 CAGCCGTGCT GGCTGACTTT GGCTTGGCTG TTCGATTTGA GCCAGGGAAA

1051 CCTCCAGGGG ACACCCACGG ACAGGTAGGC ACGAGACGGT ACATGGCTCC

1101 TGAGGTGCTC GAGGGAGCCA TCAACTTCCA GAGAGATGCC TTCCTGCGCA

1151 TTGACATGTA TGCCATGGGG TTGGTGCTGT GGGAGCTTGT GTCTCGCTGC

1201 AAGGCTGCAG ACGGACCCGT GGATGAGTAC ATGCTGCCCT TTGAGGAAGA

1251 GATTGGCCAG CACCCTTCGT TGGAGGAGCT GCAGGAGGTG GTGGTGCACA

1301 AGAAGATGAG GCCCACCATT AAAGATCACT GGTTGAAACA CCCGGGCCTG

1351 GCCCAGCTTT GTGTGACCAT CGAGGAGTGC TGGGACCATG ATGCAGAGGC

1401 TCGCTTGTCC GCGGGCTGTG TGGAGGAGCG GGTGTCCCTG ATTCGGAGGT

1451 CGGTCAACGG CACTACCTCG GACTGTCTCG TTTCCCTGGT GACCTCTGTC

1501 ACCAATGTGG ACCTGCCCCC TAAAGAGTCA AGCATC (SEQ ID NO: 7)

Una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de ActRIIB humano extracelular procesado se muestra más adelante (SEQ ID NO: 8). La secuencia mostrada proporciona una arginina en la posición 64 y se puede modificar para proporcionar una alanina en su lugar.

1 GGGCGTGGGG AGGCTGAGAC ACGGGAGTGC ATCTACTACA ACGCCAACTG

51 GGAGCTGGAG CGCACCAACC AGAGCGGCCT GGAGCGCTGC GAAGGCGAGC

101 AGGACAAGCG GCTGCACTGC TACGCCTCCT GGCGCAACAG CTCTGGCACC

151 ATCGAGCTCG TGAAGAAGGG CTGCTGGCTA GATGACTTCA ACTGCTACGA

201 TAGGCAGGAG TGTGTGGCCA CTGAGGAGAA CCCCCAGGTG TACTTCTGCT

251 GCTGTGAAGG CAACTTCTGC AACGAACGCT TCACTCATTT GCCAGAGGCT

301 GGGGGCCCGG AAGTCACGTA CGAGCCACCC CCGACAGCCC CCACC

(SEQ ID NO: 8)

Una alineación de las secuencias de aminoácidos del dominio extracelular de ActRIIB humano y el dominio extracelular de ActRIIA humano se ilustra en la figura 3. Esta alineación indica residuos de aminoácidos dentro de ambos receptores que se cree que entran en contacto directamente con ligandos de ActRII. Por ejemplo, las estructuras compuestas de ActRII indicaron que la cavidad de unión a ligando ActRIIB está definida, en parte, por los residuos Y31, N33, N35, L38 a T41, E47, E50, Q53 a K55, L57, H58, Y60, S62, K74, W78 a N83, Y85, R87, A92 y E94 a F101. En estas posiciones, se espera que se toleren mutaciones conservadoras.

Además, ActRIIB se conserva bien entre los vertebrados, con grandes extensiones de dominio extracelular conservadas completamente. Por ejemplo, la figura 4 representa una alineación de múltiples secuencias de un dominio extracelular de ActRIIB humano en comparación con diversos ortólogos de ActRIIB. Muchos de los ligandos que se unen a ActRIIB también están muy conservados. Por consiguiente, a partir de estas alineaciones, es posible predecir las posiciones de aminoácidos clave dentro del dominio de unión a ligando que son importantes para las actividades de unión ActRIIB-ligando normales, así como predecir las posiciones de los aminoácidos que es probable que sean tolerantes a sufrir sustitución sin alterar significativamente las actividades de unión ActRIIB-ligando normales. Por lo tanto, una variante de polipéptido de ActRIIB humano activa útil según los procedimientos descritos actualmente pueden incluir uno o más aminoácidos en las posiciones correspondientes de la secuencia de otro ActRIIB de vertebrado, o pueden incluir un residuo que es similar al de las secuencias humanas o de otro vertebrado. Sin pretender ser limitantes, los ejemplos siguientes ilustran esta estrategia para definir una variante de ActRIIB activa. L46 en el dominio extracelular humano (SEQ ID NO: 53) es una valina en ActRIIB de Xenopus (SEQ ID NO: 55) y, por tanto, esta posición se puede alterar y, opcionalmente se puede alterar a otro residuo hidrófobo, tal como V, I o F, o un residuo apolar tal como A. E52 en el dominio extracelular humano es una K en Xenopus, lo que indica que este punto puede tolerar un amplio abanico de cambios, que incluyen residuos polares, tales como E, D, K, R, H, S, T, P, G, Y y probablemente A. ^t93 en el dominio extracelular humano es una K en Xenopus, lo que indica que se tolera una amplia variación estructural en esta posición, con los residuos polares favorecidos, tales como S, K, R, E, D, H, G, P, G e y. F108 en el dominio extracelular humano es una Y en Xenopus y, por lo tanto, se debería tolerar Y u otro grupo hidrófobo, tal como I, V o L. E111 en el dominio extracelular humano es K en Xenopus, lo que indica que se tolerarán residuos cargados en esta posición, lo que incluye D, R, K y H, así como Q y N. R112 en el dominio extracelular humano es K en Xenopus, lo que indica que se toleran residuos básicos en esta posición, lo que incluye R y H. A en la posición 119 en el dominio extracelular humano está relativamente mal conservada y se presenta como P en roedores y V en Xenopus, por tanto, se debería tolerar esencialmente cualquier aminoácido en esta posición.

Además, las proteínas ActRII se han caracterizado en la técnica en términos de características estructurales y funcionales, particularmente en lo que respecta a la unión a ligando [Attisano y col. (1992) Cell 68(1): 97-108; Greenwald y col. (1999) Nature Structural Biology 6(1): 18-22; Allendorph y col. (2006) PNAS 103(20: 7643-7648; Thompson y col. (2003) The EMBO Journal 22(7): 1555-1566 así como las patentes de los EE. UU. n.°: 7709605, 7 612041 y 7842663]. Además de las enseñanzas de este documento, estas referencias proporcionan una amplia guía sobre cómo generar variantes de ActRIIB que conservan una o más actividades normales (por ejemplo, actividad de unión a ligando).

Por ejemplo, un motivo estructural definitorio conocido como pliegue de toxina de tres dedos es importante para la unión al ligando por los receptores tipo I y tipo II y está formado por residuos de cisteína conservados ubicados en diferentes posiciones dentro del dominio extracelular de cada receptor monomérico. [ Greenwald y col. (1999) Nat Struct Biol 6 : 18-22; y Hinck (2012) FEBS Lett 586: 1860-1870]. Por consiguiente, los dominios de unión al ligando central de ActRIIB humano, según lo demarcado por la más externa de estas cisteínas conservadas, corresponden a las posiciones 29-109 de la SEQ ID NO: 1 (precursor de ActRIIB). Por tanto, los aminoácidos estructuralmente menos ordenados que flanquean estas secuencias centrales demarcadas por cisteína se pueden truncar por aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15., 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27 o 28 residuos en el extremo amínico y/o por aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, o 25 residuos en el extremo carboxiterminal sin alterar necesariamente la unión al ligando. Dominios extracelulares de ActRIIB ejemplares para truncamiento N-terminal y/o C-terminal incluyen las SEQ ID NO: 2, 3, 5 y 6.

Attisano y col. demostraron que una eliminación del nudo de prolina en el extremo carboxiterminal del dominio extracelular de ActRIIB reducía la afinidad del receptor por la activina. Una proteína de fusión ActRIIB-Fc que contiene los aminoácidos 20-119 de la presente SEQ ID NO: 1, “ActRNB(20-119)-Fc” tiene unión reducida a GDF11 y activina con respecto a una ActRIIB(20-134)-Fc, que incluye la región de nudo de prolina y el dominio yuxtamembranario completo (véase, p. ej., la patente de los EE. UU. n.° 7842 663). Sin embargo, una proteína ActRIIB(20-129)-Fc conserva una actividad similar, aunque algo reducida, con respecto al tipo natural, incluso aunque la región de nudo de prolina esté alterada.

Por tanto, los dominios extracelulares de ActRIIB que terminan en el aminoácido 134, 133, 132, 131, 130 y 129 (con respecto a la SEQ ID NO: 1) se espera que sean todos activos, pero las construcciones que terminan en el 134 o 133 pueden ser más activas. Similarmente, las mutaciones en cualquiera de los residuos 129-134 (con respecto a la SEQ ID NO: 1) no se espera que alteren la afinidad de unión a ligando por márgenes grandes. Para respaldar esto, en la técnica se conoce que las mutaciones de P129 y P130 (con respecto a la SEQ ID NO: 1) no reducen sustancialmente la unión a ligando. Por lo tanto, un polipéptido de ActRIIB de la presente descripción puede terminar tan pronto como en el aminoácido 109 (la cisteína final), sin embargo, las formas que terminan en, o entre, el 109 y 119 (p. ej., 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118 o 119) se espera que tengan unión a ligando reducida. El aminoácido 119 (con respecto a la presente SEQ ID NO: 1) está mal conservado y, por tanto, se altera o trunca fácilmente. Los polipéptidos de ActRIIB que terminan en el 128 (con respecto a la ^sE^qID NO: 1) o posterior deberían conservar actividad de unión a ligando. Los polipéptidos de ActRIIB que terminan en, o entre, el 119 y 127 (p. ej., 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126 o 127), con respecto a la SEQ ID NO: 1, tendrán una capacidad de unión intermedia. Puede ser deseable usar cualquiera de estas formas, en función del entorno clínico o experimental.

En el extremo amínico de ActRIIB, se espera que una proteína que comienza en el aminoácido 29 o antes (con respecto a la SEQ ID NO: 1) conservará actividad de unión a ligando. El aminoácido 29 representa la cisteína inicial. Una mutación de alanina a asparagina en la posición 24 (con respecto a la SEQ ID NO: 1) introduce una secuencia de N-glucosilación sin afectar sustancialmente a la unión a ligando [patente de los EE. UU. n.° 7 842 663]. Esto confirma que las mutaciones en la región situada entre el péptido señal de escisión y la región reticulada de cisteína, que corresponde a los aminoácidos 20-29, se toleran bien. En particular, los polipéptidos de ActRIIB que comienzan en la posición 20, 21, 22, 23 y 24 (con respecto a la SEQ ID NO: 1) deberían conservar actividad general de unión a ligando, y los polipéptidos de ActRIIB que comienzan en las posiciones 25, 26, 27, 28 y 29 (con respecto a la SEQ ID NO: 1) también se espera que conserven actividad de unión a ligando. Se ha demostrado, p. ej., patente de los EE. UU. n.° 7842663 que, sorprendentemente, una construcción de ActRIIB que comienza en el 22, 23, 24 o 25 tendrá la actividad máxima.

En conjunto, una fórmula general para una porción activa (p. ej., porción de unión a ligando) de ActRIIB comprende los aminoácidos 29-109 de la SEQ ID NO: 1. Por lo tanto, los polipéptidos de ActRIIB pueden, por ejemplo, comprender, consistir esencialmente en o consistir en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a una porción de ActRIIB que comienza en un residuo que corresponde a uno cualquiera de los aminoácidos 20-29 (p. ej., que comienza en uno cualquiera de los aminoácidos 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 o 29) de la SEQ ID NO: 1 y que termina en una posición que corresponde a uno cualquiera de los aminoácidos 109-134 (p. ej., que termina en uno cualquiera de los aminoácidos 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133 o 134) de la SEQ ID NO: 1.. Otros ejemplos incluyen polipéptidos que comienzan en una posición de 20-29 (p. ej., cualquiera de las posiciones 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 o 29) o 21 29 (p. ej., cualquiera de las posiciones 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 o 29) de la SEQ ID NO: 1 y terminan en una posición de 119-134 (p. ej., cualquiera de las posiciones 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133 o 134), 119-133 (p. ej., cualquiera de las posiciones 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132 o 133), 129-134 (p. ej., cualquiera de las posiciones 129, 130, 131, 132, 133 o 134) o 129-133 (p. ej., cualquiera de las posiciones 129, 130, 131, 132 o 133) de la SEQ ID NO: 1. Otros ejemplos incluyen construcciones que comienzan en una posición de 20-24 (p. ej., cualquiera de las posiciones 20, 21, 22, 23 o 24), 21-24 (p. ej., cualquiera de las posiciones 21, 22, 23 o 24) o 22-25 (p. ej., cualquiera de las posiciones 22, 22, 23 o 25) de la SEQ ID NO: 1 y terminan en una posición de 109-134 (p. ej., cualquiera de las posiciones 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133 o 134), 119-134 (p. ej., cualquiera de las posiciones 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133 o 134) o 129 134 (p. ej., cualquiera de las posiciones 129, 130, 131, 132, 133 o 134) de la SEQ ID NO: 1. También se contemplan variantes dentro de estos intervalos, particularmente las que tienen al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad con la porción correspondiente de la SEQ ID NO: 1.

Las variaciones descritas en este documento se pueden combinar de diversas maneras. En algunos aspectos, las variantes de ActRIIB comprenden no más de 1, 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o 15 cambios de aminoácidos conservadores en la cavidad de unión a ligando, y cero, una o más alteraciones no conservadoras en las posiciones 40, 53, 55, 74, 79 y/o 82 en la cavidad de unión a ligando. Los puntos fuera de la cavidad de unión en los que la variabilidad se puede tolerar particularmente bien, incluyen los extremos amino y carboxi del dominio extracelular (como se señaló anteriormente) y las posiciones 42-46 y 65-73 (con respecto a la SEQ ID NO: 1). Una alteración de asparagina a alanina en la posición 65 (N65A) mejora realmente la unión a ligando en fondo de A64 y, por tanto, se espera que no tenga un efecto perjudicial sobre la unión a ligando en el fondo de R64 [patente de los EE. UU. n.°. 7 842 663]. Este cambio probablemente elimina la glucosilación en N65 del fondo de A64, lo que demuestra, por tanto, que es probable que se tolere un cambio significativo en esta región. Mientras que un cambio R64A se tolera mal, R64K se tolera bien y, por tanto, se puede tolerar otro residuo básico, tal como H, en la posición 64 [patente de los EE. UU. n.° 7842663]. Adicionalmente, los resultados del programa de mutagénesis descrito en este documento indican que hay posiciones de aminoácidos en ActRIIB que a menudo es beneficioso conservar. Con respecto a la SEQ ID NO: 1, estas incluyen la posición 80 (aminoácido ácido o hidrófobo), posición 78 (hidrófobo, y particularmente triptófano), posición 37 (ácido, y particularmente ácido aspártico o glutámico), posición 56 (aminoácido básico), posición 60 (aminoácido hidrófobo, particularmente fenilalanina o tirosina). Por tanto, la descripción proporciona una estructura de aminoácidos que se puede conservar en polipéptidos de ActRIIB. Otras posiciones que puede ser deseable conservar son las siguientes: la posición 52 (aminoácido ácido), posición 55 (aminoácido básico), posición 81 (ácido), 98 (polar o cargado, particularmente E, D, R o K), todas con respecto a la SEQ ID NO: 1.

En ciertos aspectos, la descripción se refiere a heteromultímeros que comprenden al menos un polipéptido de ActRIIB, que incluye fragmentos, variantes funcionales y formas modificadas de los mismos. Preferiblemente, los polipéptidos de ActRIIB para su uso de acuerdo con la descripción son solubles (porejemplo, un dominio extracelular de ActRIIB). En otros aspectos preferidos, los polipéptidos de ActRIIB para su uso de acuerdo con la descripción se unen a uno o más ligandos de la superfamilia de TGF-beta. Por lo tanto, en algunos aspectos, los polipéptidos de ActRIIB para su uso de acuerdo con la descripción inhiben (antagonizan) la actividad (p. ej., inhibición de la transducción de señales de Smad) de uno o más ligandos de la superfamilia de TGF-beta. En algunos aspectos, los heteromultímeros de la descripción comprenden al menos un polipéptido de ActRIIB que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a una porción de ActRIIB que comienza en un residuo correspondiente a los aminoácidos 20-29 (p. ej., que comienza en uno cualquiera de los aminoácidos 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 o 29 ) de la SEQ ID NO: 1 y que termina en una posición correspondiente a los aminoácidos 109-134 (p. ej., que termina en uno cualquiera de los aminoácidos 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133 o 134) de la SEQ ID NO: 1. En ciertos aspectos preferidos, los heteromultímeros de la descripción comprenden al menos un polipéptido de ActRIIB que comprende, consiste o consiste esencialmente en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a los aminoácidos 29-109 de la SEQ ID NO: 1. En otros aspectos preferidos, los heteromultímeros de la descripción comprenden al menos un polipéptido de ActRIIB que comprende, consiste o consiste esencialmente en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a los aminoácidos 25-131 de la SEQ ID NO: 1. En algunos aspectos, los heteromultímeros de la descripción comprenden al menos un polipéptido de ActRIIB que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntico a la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 71, 73, 77 y 78. En ciertos aspectos, los heteromultímeros de la descripción comprenden al menos un polipéptido de ActRIIB donde la posición de aminoácido correspondiente a L79 de la SEQ ID NO: 1 no es un aminoácido ácido (es decir, no es un residuo de aminoácido D o E de origen natural o aminoácido ácido artificial).

En ciertos aspectos, la presente descripción se refiere a complejos proteicos que comprenden un polipéptido de ALK7. Como se emplea en este documento, el término “ALK7” se refiere a una familia de proteínas de cinasa-7 de tipo receptores de activina de cualquier especie y a variantes derivadas de tales proteínas ALK7 mediante mutagénesis u otra modificación. La referencia a ALK7 en este documento se entiende que es una referencia a cualquiera de las formas identificadas actualmente. Los miembros de la familia de proteínas ALK7 son en general proteínas transmembranarias, compuestas por un dominio extracelular de unión a ligando con una región rica en cisteína, un dominio transmembranario y un dominio citoplásmico con actividad serina/treonina cinasa prevista.

El término “polipéptido de ALK7” incluye polipéptidos que comprenden cualquier polipéptido de origen natural de un miembro de la familia de ALK7, así como cualquier variante de los mismos (lo que incluye mutantes, fragmentos, fusiones y formas peptidomiméticas), que conserva una actividad útil. La numeración de los aminoácidos para todos lo polipéptidos relacionados con ALK7 descritos en este documento se basa en la numeración de la secuencia de proteína precursora de ALK7 humano proporcionada a continuación (SEQ ID NO: 9), a menos que se designe específicamente de otro modo.

Hay diversas isoformas naturales de ALK7 humana. La secuencia de la proteína precursora de la isoforma 1 humana canónica de ALK7 (Sec de Ref de NCBI NP_660302.2) es la siguiente:

1 MTRALCSALRQALLLLAAAAELSPGLKCVCLLCDSSNFTCQTEGACWASV

MLTNGKEQVI

61 KSCVSLPELN AQVFCHSSNNVTKTECCFTD FCNNITLHLP TASPNAPKLG

PMELAIIITV

121 PVCLLSIAAM LTVWACQGRQ CSYRKKKRPN VEEPLSECNL VNAGKTLKDL

IYDVTASGSG

181 SGLPLLVQRT IARTIVLQEI VGKGRFGEVW HGRWCGEDVAVKIFSSRDER

SWFREAEIYQ

241 TVMLRHENIL GFIAADNKDN GTWTQLWLVS EYHEQGSLYD YLNRNIVTVA

GMIKLALSIA

301 SGLAHLHMEI VGTQGKPAIA HRDIKSKNIL VKKCETCAIA DLGLAVKHDS

ILNTIDIPQN

361 PKVGTKRYMA PEMLDDTMNV NIFESFKRAD IYSVGLVYWE IARRCSVGGI

VEEYQLPYYD

421 MVPSDPSIEE MRKVVCDQKF RPSIPNQWQS CEALRVMGRI MRECWYANGA

ARLTALRIKK

481 TISQLCVKED CKA (SEQ ID NO: 9)

El péptido señal está indicado mediante un subrayado único y el dominio extracelular está indicado en negrita. La secuencia del polipéptido de la isoforma 1 de ALK7 extracelular procesada es la siguiente:

ELSPGLKCVCLLCDSSNFTCQTEGACWASVMLTNGKEQVIKSCVSLPELNAQVFCHSSNNVT

KTECCFTDFCNNITLHLPTASPNAPKLGPME (SEQ ID NO: 10)

Una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína precursora de la isoforma 1 de ALK7 humana se muestra a continuación (SEQ ID NO: 11), que corresponde a los nucleótidos 244-1722 de la secuencia de referencia de Genbank NM_145259.2. La secuencia señal está subrayada y el dominio extracelular se indica en negrita.

ATGACCCGGGCGCTCTGCTCAGCGCTCCGCCAGGCTCTCCTGCTGCTCGCAGCGGCCGCCGA

GCTCTCGCCAGGACTGAAGTGTGTATGTCTTTTGTGTGATTCTTCAAACTTTACCTGCCAAA

CAGAAGGAGCATGTTGGGCATCAGTCATGCTAACCAATGGAAAAGAGCAGGTGATCAAATCC

TGTGTCTCCCTTCCAGAACTGAATGCTCAAGTCTTCTGTCATAGTTCCAACAATGTTACCAA

AACCGAATGCTGCTTCACAGATTTTTGCAACAACATAACACTGCACCTTCCAACAGCATCAC

CAAATGCCCCAAAACTTGGACCCATGGAGCTGGCCATCATTATTACTGTGCCTGTTTGCCTC

CTGTCCATAGCTGCGATGCTGACAGTATGGGCATGCCAGGGTCGACAGTGCTCCTACAGGAA

GAAAAAGAGACCAAATGTGGAGGAACCACTCTCTGAGTGCAATCTGGTAAATGCTGGAAAAA

CTCTGAAAGATCTGATTTATGATGTGACCGCCTCTGGATCTGGCTCTGGTCTACCTCTGTTG

GTTCAAAGGACAATTGCAAGGACGATTGTGCTTCAGGAAATAGTAGGAAAAGGTAGATTTGG

TGAGGTGTGGCATGGAAGATGGTGTGGGGAAGATGTGGCTGTGAAAATATTCTCCTCCAGAG

ATGAAAGATCTTGGTTTCGTGAGGCAGAAATTTACCAGACGGTCATGCTGCGACATGAAAAC

ATCCTTGGTTTCATTGCTGCTGACAACAAAGATAATGGAACTTGGACTCAACTTTGGCTGGT

ATCTGAATATCATGAACAGGGCTCCTTATATGACTATTTGAATAGAAATATAGTGACCGTGG

CTGGAATGATCAAGCTGGCGCTCTCAATTGCTAGTGGTCTGGCACACCTTCATATGGAGATT

GTTGGTACACAAGGTAAACCTGCTATTGCTCATCGAGACATAAAATCAAAGAATATCTTAGT

GAAAAAGTGTGAAACTTGTGCCATAGCGGACTTAGGGTTGGCTGTGAAGCATGATTCAATAC

TGAACACTATCGACATACCTCAGAATCCTAAAGTGGGAACCAAGAGGTATATGGCTCCTGAA

ATGCTTGATGATACAATGAATGTGAATATCTTTGAGTCCTTCAAACGAGCTGACATCTATTC

TGTTGGTCTGGTTTACTGGGAAATAGCCCGGAGGTGTTCAGTCGGAGGAATTGTTGAGGAGT

ACCAATTGCCTTATTATGACATGGTGCCTTCAGATCCCTCGATAGAGGAAATGAGAAAGGTT

GTTTGTGACCAGAAGTTTCGACCAAGTATCCCAAACCAGTGGCAAAGTTGTGAAGCACTCCG

AGTCATGGGGAGAATAATGCGTGAGTGTTGGTATGCCAACGGAGCGGCCCGCCTAACTGCTC

TTCGTATTAAGAAGACTATATCTCAACTTTGTGTCAAAGAAGACTGCAAAGCC (SEQ ID

NO: 11)

Una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de ALK7 extracelular procesado (isoforma 1) es la siguiente:

GAGCTCTCGCCAGGACTGAAGTGTGTATGTCTTTTGTGTGATTCTTCAAACTTTACCTGCCA

AACAGAAGGAGCATGTTGGGCATCAGTCATGCTAACCAATGGAAAAGAGCAGGTGATCAAAT

CCTGTGTCTCCCTTCCAGAACTGAATGCTCAAGTCTTCTGTCATAGTTCCAACAATGTTACC

AAAACCGAATGCTGCTTCACAGATTTTTGCAACAACATAACACTGCACCTTCCAACAGCATC

ACCAAATGCCCCAAAACTTGGACCCATGGAG (SEQ ID NO: 12)

La secuencia de aminoácidos de una isoforma alternativa de ALK7 humana, isoforma 2 (Sec de Ref de NCBINP_001104501.1), se muestra en su forma procesada como sigue (SEQ ID NO: 19), donde el dominio extracelular se indica en negrita.

1 MLTNGKEQVI KSCVSLPELN AQVFCHSSNN VTKTECCFTD FCNNITLHLP

TASPNAPKLG

61 PMELAIIITV PVCLLSIAAM LTVWACQGRQ CSYRKKKRPN VEEPLSECNL

VNAGKTLKDL

121 IYDVTASGSG SGLPLLVQRT IARTIVLQEI VGKGRFGEVW HGRWCGEDVA

VKIFSSRDER

181 SWFREAEIYQ TVMLRHENIL GFIAADNKDN GTWTQLWLVS EYHEQGSLYD

YLNRNIVTVA

241 GMIKLALSIA SGLAHLHMEI VGTQGKPAIA HRDIKSKNIL VKKCETCAIA

DLGLAVKHDS

301 ILNTIDIPQN PKVGTKRYMA PEMLDDTMNV NIFESFKRAD IYSVGLVYWE

IARRCSVGGI

361 VEEYQLPYYD MVPSDPSIEE MRKVVCDQKF RPSIPNQWQS CEALRVMGRI

MRECWYANGA

421 ARLTALRIKK TISQLCVKED CKA (SEQ ID NO: 19)

La secuencia de aminoácidos del polipéptido de ALK7 extracelular (isoforma 2) es la siguiente:

MLTNGKEQVIKSCVSLPELNAQVFCHSSNNVTKTECCFTDFCNNITLHLPTASPNAPK

LGPME (SEQ ID NO: 20).

A continuación se muestra una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de ALK7 procesado (isoforma 2) (SEQ ID NO: 21), correspondiente a los nucleótidos 279-1607 de la secuencia de referencia de NCBI NM_001111031.1. El dominio extracelular se indica en negrita.

ATGCTAACCAATGGAAAAGAGCAGGTGATCAAATCCTGTGTCTCCCTTCCAGAACTGAATGC

TCAAGTCTTCTGTCATAGTTCCAACAATGTTACCAAAACCGAATGCTGCTTCACAGATTTTT

GCAACAACATAACACTGCACCTTCCAACAGCATCACCAAATGCCCCAAAACTTGGACCCATG

GAGCTGGCCATCATTATTACTGTGCCTGTTTGCCTCCTGTCCATAGCTGCGATGCTGACAGT

ATGGGCATGCCAGGGTCGACAGTGCTCCTACAGGAAGAAAAAGAGACCAAATGTGGAGGAAC

CACTCTCTGAGTGCAATCTGGTAAATGCTGGAAAAACTCTGAAAGATCTGATTTATGATGTG

ACCGCCTCTGGATCTGGCTCTGGTCTACCTCTGTTGGTTCAAAGGACAATTGCAAGGACGAT

TGTGCTTCAGGAAATAGTAGGAAAAGGTAGATTTGGTGAGGTGTGGCATGGAAGATGGTGTG

GGGAAGATGTGGCTGTGAAAATATTCTCCTCCAGAGATGAAAGATCTTGGTTTCGTGAGGCA

GAAATTTACCAGACGGTCATGCTGCGACATGAAAACATCCTTGGTTTCATTGCTGCTGACAA

CAAAGATAATGGAACTTGGACTCAACTTTGGCTGGTATCTGAATATCATGAACAGGGCTCCT

TATATGACTATTTGAATAGAAATATAGTGACCGTGGCTGGAATGATCAAGCTGGCGCTCTCA

ATTGCTAGTGGTCTGGCACACCTTCATATGGAGATTGTTGGTACACAAGGTAAACCTGCTAT

TGCTCATCGAGACATAAAATCAAAGAATATCTTAGTGAAAAAGTGTGAAACTTGTGCCATAG

CGGACTTAGGGTTGGCTGTGAAGCATGATTCAATACTGAACACTATCGACATACCTCAGAAT

CCTAAAGTGGGAACCAAGAGGTATATGGCTCCTGAAATGCTTGATGATACAATGAATGTGAA

TATCTTTGAGTCCTTCAAACGAGCTGACATCTATTCTGTTGGTCTGGTTTACTGGGAAATAG

CCCGGAGGTGTTCAGTCGGAGGAATTGTTGAGGAGTACCAATTGCCTTATTATGACATGGTG

CCTTCAGATCCCTCGATAGAGGAAATGAGAAAGGTTGTTTGTGACCAGAAGTTTCGACCAAG

TATCCCAAACCAGTGGCAAAGTTGTGAAGCACTCCGAGTCATGGGGAGAATAATGCGTGAGT

GTTGGTATGCCAACGGAGCGGCCCGCCTAACTGCTCTTCGTATTAAGAAGACTATATCTCAA

CTTTGTGTCAAAGAAGACTGCAAAGCC (SEQ ID NO: 21)

Una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de ALK7 extracelular (isoforma 2) es la siguiente (SEQ ID NO: 22):

ATGCTAACCAATGGAAAAGAGCAGGTGATCAAATCCTGTGTCTCCCTTCCAGAACTGAATGC

TCAAGTCTTCTGTCATAGTTCCAACAATGTTACCAAAACCGAATGCTGCTTCACAGATTTTT

GCAACAACATAACACTGCACCTTCCAACAGCATCACCAAATGCCCCAAAACTTGGACCCATG

GAG (SEQ ID NO: 22)

La secuencia de aminoácidos de una proteína precursora de ALK7 humana alternativa, isoforma 3 (Sec de Ref de NCBI NP_001104502.1), se muestra como sigue (SEQ ID NO: 38), donde el péptido señal se indica mediante un subrayado único.

1 MTRALCSALR QALLLLAAAA ELSPGLKCVC LLCDSSNFTC QTEGACWASV

MLTNGKEQVI

61 KSCVSLPELN AQVFCHSSNN VTKTECCFTD FCNNITLHLP TGLPLLVQRT

IARTIVLQEI

121 VGKGRFGEVW HGRWCGEDVA VKIFSSRDER SWFREAEIYQ TVMLRHENIL

GFIAADNKDN

181 GTWTQLWLVS EYHEQGSLYD YLNRNIVTVA GMIKLALSIA SGLAHLHMEI

VGTQGKPAIA

241 HRDIKSKNIL VKKCETCAIA DLGLAVKHDS ILNTIDIPQN PKVGTKRYMA

PEMLDDTMNV

301 NIFESFKRAD IYSVGLVYWE IARRCSVGGI VEEYQLPYYD MVPSDPSIEE

MRKWCDQKF

361 RPSIPNQWQS CEALRVMGRI MRECWYANGA ARLTALRIKK TISQLCVKED

CKA

(SEQ ID NO: 38)

La secuencia de aminoácidos del polipéptido de ALK7 procesado (isoforma 3) es la siguiente (SEQ ID NO: 39). Esta isoforma carece de dominio transmembranario y, por lo tanto, se propone que sea soluble en su totalidad (Roberts y col., 2003, Biol Reprod 68: 1719-1726). Las variantes N-terminales de la SEQ ID NO: 39 se predicen como se describe a continuación.

1 ELSPGLKCVC LLCDSSNFTC QTEGACWASV MLTNGKEQVI KSCVSLPELN

AQVFCHSSNN

61 VTKTECCFTD FCNNITLHLP TGLPLLVQRT IARTIVLQEI VGKGRFGEVW

HGRWCGEDVA

121 VKIFSSRDER SWFREAEIYQ TVMLRHENIL GFIAADNKDN GTWTQLWLVS

EYHEQGSLYD

181 YLNRNIVTVA GMIKLALSIA SGLAHLHMEI VGTQGKPAIA HRDIKSKNIL

VKKCETCAIA

241 DLGLAVKHDS ILNTIDIPQN PKVGTKRYMA PEMLDDTMNV NIFESFKRAD

IYSVGLVYWE

301 IARRCSVGGI VEEYQLPYYD MVPSDPSIEE MRKVVCDQKF RPSIPNQWQS

CEALRVMGRI

361 MRECWYANGA ARLTALRIKK TISQLCVKED CKA (SEQ ID NO: 39)

A continuación se muestra una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína precursora del polipéptido de ALK7 sin procesar (isoforma 3) (SEQ ID NO: 40), correspondiente a los nucleótidos 244-1482 de la secuencia de referencia de NCBI NM_001111032.1. La secuencia señal se indica con un subrayado continuo.

ATGACCCGGGCGCTCTGCTCAGCGCTCCGCCAGGCTCTCCTGCTGCTCGCAGCGGCCGCCGA

GCTCTCGCCAGGACTGAAGTGTGTATGTCTTTTGTGTGATTCTTCAAACTTTACCTGCCAAA

CAGAAGGAGCATGTTGGGCATCAGTCATGCTAACCAATGGAAAAGAGCAGGTGATCAAATCC

TGTGTCTCCCTTCCAGAACTGAATGCTCAAGTCTTCTGTCATAGTTCCAACAATGTTACCAA

AACCGAATGCTGCTTCACAGATTTTTGCAACAACATAACACTGCACCTTCCAACAGGTCTAC

CTCTGTTGGTTCAAAGGACAATTGCAAGGACGATTGTGCTTCAGGAAATAGTAGGAAAAGGT

AGATTTGGTGAGGTGTGGCATGGAAGATGGTGTGGGGAAGATGTGGCTGTGAAAATATTCTC

CTCCAGAGATGAAAGATCTTGGTTTCGTGAGGCAGAAATTTACCAGACGGTCATGCTGCGAC

ATGAAAACATCCTTGGTTTCATTGCTGCTGACAACAAAGATAATGGAACTTGGACTCAACTT

TGGCTGGTATCTGAATATCATGAACAGGGCTCCTTATATGACTATTTGAATAGAAATATAGT

GACCGTGGCTGGAATGATCAAGCTGGCGCTCTCAATTGCTAGTGGTCTGGCACACCTTCATA

TGGAGATTGTTGGTACACAAGGTAAACCTGCTATTGCTCATCGAGACATAAAATCAAAGAAT

ATCTTAGTGAAAAAGTGTGAAACTTGTGCCATAGCGGACTTAGGGTTGGCTGTGAAGCATGA

TTCAATACTGAACACTATCGACATACCTCAGAATCCTAAAGTGGGAACCAAGAGGTATATGG

CTCCTGAAATGCTTGATGATACAATGAATGTGAATATCTTTGAGTCCTTCAAACGAGCTGAC

ATCTATTCTGTTGGTCTGGTTTACTGGGAAATAGCCCGGAGGTGTTCAGTCGGAGGAATTGT

TGAGGAGTACCAATTGCCTTATTATGACATGGTGCCTTCAGATCCCTCGATAGAGGAAATGA

GAAAGGTTGTTTGTGACCAGAAGTTTCGACCAAGTATCCCAAACCAGTGGCAAAGTTGTGAA

GCACTCCGAGTCATGGGGAGAATAATGCGTGAGTGTTGGTATGCCAACGGAGCGGCCCGCCT

AACTGCTCTTCGTATTAAGAAGACTATATCTCAACTTTGTGTCAAAGAAGACTGCAAAGCC

(SEQ ID NO: 40)

Una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de ALK7 procesado (isoforma 3) es la siguiente (SEQ ID NO: 41):

GAGCTCTCGCCAGGACTGAAGTGTGTATGTCTTTTGTGTGATTCTTCAAACTTTACCTGCCA

AACAGAAGGAGCATGTTGGGCATCAGTCATGCTAACCAATGGAAAAGAGCAGGTGATCAAAT

CCTGTGTCTCCCTTCCAGAACTGAATGCTCAAGTCTTCTGTCATAGTTCCAACAATGTTACC

AAAACCGAATGCTGCTTCACAGATTTTTGCAACAACATAACACTGCACCTTCCAACAGGTCT

ACCTCTGTTGGTTCAAAGGACAATTGCAAGGACGATTGTGCTTCAGGAAATAGTAGGAAAAG

GTAGATTTGGTGAGGTGTGGCATGGAAGATGGTGTGGGGAAGATGTGGCTGTGAAAATATTC

TCCTCCAGAGATGAAAGATCTTGGTTTCGTGAGGCAGAAATTTACCAGACGGTCATGCTGCG

ACATGAAAACATCCTTGGTTTCATTGCTGCTGACAACAAAGATAATGGAACTTGGACTCAAC

TTTGGCTGGTATCTGAATATCATGAACAGGGCTCCTTATATGACTATTTGAATAGAAATATA

GTGACCGTGGCTGGAATGATCAAGCTGGCGCTCTCAATTGCTAGTGGTCTGGCACACCTTCA

TATGGAGATTGTTGGTACACAAGGTAAACCTGCTATTGCTCATCGAGACATAAAATCAAAGA

ATATCTTAGTGAAAAAGTGTGAAACTTGTGCCATAGCGGACTTAGGGTTGGCTGTGAAGCAT

GATTCAATACTGAACACTATCGACATACCTCAGAATCCTAAAGTGGGAACCAAGAGGTATAT

GGCTCCTGAAATGCTTGATGATACAATGAATGTGAATATCTTTGAGTCCTTCAAACGAGCTG

ACATCTATTCTGTTGGTCTGGTTTACTGGGAAATAGCCCGGAGGTGTTCAGTCGGAGGAATT

GTTGAGGAGTACCAATTGCCTTATTATGACATGGTGCCTTCAGATCCCTCGATAGAGGAAAT

GAGAAAGGTTGTTTGTGACCAGAAGTTTCGACCAAGTATCCCAAACCAGTGGCAAAGTTGTG

AAGCACTCCGAGTCATGGGGAGAATAATGCGTGAGTGTTGGTATGCCAACGGAGCGGCCCGC

CTAACTGCTCTTCGTATTAAGAAGACTATATCTCAACTTTGTGTCAAAGAAGACTGCAAAGC

C (SEQ ID NO: 308)

La secuencia de aminoácidos de una proteína precursora de ALK7 humana alternativa, isoforma 4 (Sec de Ref de NCBI NP_001104503.1), se muestra como sigue (SEQ ID NO: 42), donde el péptido señal se indica mediante un subrayado único.

1 MTRALCSALR QALLLLAAAA ELSPGLKCVC LLCDSSNFTC QTEGACWASV

MLTNGKEQVI

61 KSCVSLPELN AQVFCHSSNN VTKTECCFTD FCNNITLHLP TDNGTWTQLW

LVSEYHEQGS

121 LYDYLNRNIV TVAGMIKLAL SIASGLAHLH MEIVGTQGKP AIAHRDIKSK

NILVKKCETC

181 AIADLGLAVK HDSILNTIDI PQNPKVGTKR YMAPEMLDDT MNVNIFESFK

RADIYSVGLV

241 YWEIARRCSV GGTVEEYQLP YYDMVPSDPS IEEMRKWCD QKFRPSIPNQ

WQSCEALRVM

301 GRIMRECWYA NGAARLTALR IKKTISQLCV KEDCKA (SEQ ID NO: 42)

La secuencia de aminoácidos del polipéptido de ALK7 procesado (isoforma 4) es la siguiente (SEQ ID NO: 43). Al igual que la isoforma 3 de ALK7, la isoforma 4 carece de dominio transmembranario y, por lo tanto, se propone que sea soluble en su totalidad (Roberts y col., 2003, Biol Reprod 68: 1719-1726). Las variantes N-terminales de la SEQ ID NO: 43 se predicen como se describe a continuación.

1 ELSPGLKCVC LLCDSSNFTC QTEGACWASV MLTNGKEQVI KSCVSLPELN

AQVFCHSSNN

61 VTKTECCFTD FCNNITLHLP TDNGTWTQLW LVSEYHEQGS LYDYLNRNIV

TVAGMIKLAL

121 SIASGLAHLH MEIVGTQGKP AIAHRDIKSK NILVKKCETC AIADLGLAVK

HDSILNTIDI

181 PQNPKVGTKR YMAPEMLDDT MNVNIFESFK RADIYSVGLV YWEIARRCSV

GGIVEEYQLP

240 YYDMVPSDPS IEEMRKWCD QKFRPSIPNQ WQSCEALRVM GRIMRECWYA

NGAARLTALR

301 IKKTISQLCV KEDCKA (SEQ ID NO: 43)

A continuación se muestra una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína precursora del polipéptido de ALK7 sin procesar (isoforma 4) (SEQ ID NO: 44), correspondiente a los nucleótidos 244-1244 de la secuencia de referencia de NCBI NM_001111033.1. La secuencia señal se indica conun subrayado continuo.

ATGACCCGGGCGCTCTGCTCAGCGCTCCGCCAGGCTCTCCTGCTGCTCGCAGCGGCCGCCGA

GCTCTCGCCAGGACTGAAGTGTGTATGTCTTTTGTGTGATTCTTCAAACTTTACCTGCCAAA

CAGAAGGAGCATGTTGGGCATCAGTCATGCTAACCAATGGAAAAGAGCAGGTGATCAAATCC

TGTGTCTCCCTTCCAGAACTGAATGCTCAAGTCTTCTGTCATAGTTCCAACAATGTTACCAA

AACCGAATGCTGCTTCACAGATTTTTGCAACAACATAACACTGCACCTTCCAACAGATAATG

GAACTTGGACTCAACTTTGGCTGGTATCTGAATATCATGAACAGGGCTCCTTATATGACTAT

TTGAATAGAAATATAGTGACCGTGGCTGGAATGATCAAGCTGGCGCTCTCAATTGCTAGTGG

TCTGGCACACCTTCATATGGAGATTGTTGGTACACAAGGTAAACCTGCTATTGCTCATCGAG

ACATAAAATCAAAGAATATCTTAGTGAAAAAGTGTGAAACTTGTGCCATAGCGGACTTAGGG

TTGGCTGTGAAGCATGATTCAATACTGAACACTATCGACATACCTCAGAATCCTAAAGTGGG

AACCAAGAGGTATATGGCTCCTGAAATGCTTGATGATACAATGAATGTGAATATCTTTGAGT

CCTTCAAACGAGCTGACATCTATTCTGTTGGTCTGGTTTACTGGGAAATAGCCCGGAGGTGT

TCAGTCGGAGGAATTGTTGAGGAGTACCAATTGCCTTATTATGACATGGTGCCTTCAGATCC

CTCGATAGAGGAAATGAGAAAGGTTGTTTGTGACCAGAAGTTTCGACCAAGTATCCCAAACC

AGTGGCAAAGTTGTGAAGCACTCCGAGTCATGGGGAGAATAATGCGTGAGTGTTGGTATGCC

AACGGAGCGGCCCGCCTAACTGCTCTTCGTATTAAGAAGACTATATCTCAACTTTGTGTCAA

AGAAGACTGCAAAGCCTAA (SEQ ID NO: 44)

Una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de ALK7 procesado (isoforma 4) es la siguiente (SEQ ID NO: 45):

GAGCTCTCGCCAGGACTGAAGTGTGTATGTCTTTTGTGTGATTCTTCAAACTTTACCTGCCA

AACAGAAGGAGCATGTTGGGCATCAGTCATGCTAACCAATGGAAAAGAGCAGGTGATCAAAT

CCTGTGTCTCCCTTCCAGAACTGAATGCTCAAGTCTTCTGTCATAGTTCCAACAATGTTACC

AAAACCGAATGCTGCTTCACAGATTTTTGCAACAACATAACACTGCACCTTCCAACAGATAA

TGGAACTTGGACTCAACTTTGGCTGGTATCTGAATATCATGAACAGGGCTCCTTATATGACT

ATTTGAATAGAAATATAGTGACCGTGGCTGGAATGATCAAGCTGGCGCTCTCAATTGCTAGT

GGTCTGGCACACCTTCATATGGAGATTGTTGGTACACAAGGTAAACCTGCTATTGCTCATCG

AGACATAAAATCAAAGAATATCTTAGTGAAAAAGTGTGAAACTTGTGCCATAGCGGACTTAG

GGTTGGCTGTGAAGCATGATTCAATACTGAACACTATCGACATACCTCAGAATCCTAAAGTG

GGAACCAAGAGGTATATGGCTCCTGAAATGCTTGATGATACAATGAATGTGAATATCTTTGA

GTCCTTCAAACGAGCTGACATCTATTCTGTTGGTCTGGTTTACTGGGAAATAGCCCGGAGGT

GTTCAGTCGGAGGAATTGTTGAGGAGTACCAATTGCCTTATTATGACATGGTGCCTTCAGAT

CCCTCGATAGAGGAAATGAGAAAGGTTGTTTGTGACCAGAAGTTTCGACCAAGTATCCCAAA

CCAGTGGCAAAGTTGTGAAGCACTCCGAGTCATGGGGAGAATAATGCGTGAGTGTTGGTATG

CCAACGGAGCGGCCCGCCTAACTGCTCTTCGTATTAAGAAGACTATATCTCAACTTTGTGTC

AAAGAAGACTGCAAAGCCTAA (SEQ IDNO: 45)

Basándose en la secuencia señal de ALK7 de longitud completa (isoforma 1) en la rata (véase la secuencia de referencia de NCBI NP_620790.1) y en el alto grado de identidad de secuencia entre ALK7 humana y de rata, se predice que una forma procesada de la isoforma 1 de ALK7 humana es la siguiente (SEQ ID NO: 46).

1 LKCVCLLCDS SNFTCQTEGA CWASVMLTNG KEQVIKSCVS LPELNAQVFC

HSSNNVTKTE

61 CCFTDFCNNI TLHLPTASPN APKLGPME (SEQ IDNO: 46)

Se predicen variantes activas de la isoforma 1 de ALK7 procesada en las que la SEQ ID NO: 10 está truncada por 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 aminoácidos en el extremo amínico y la SEQ ID NO: 46 está truncada por 1 o 2 aminoácidos en el extremo amínico. De acuerdo con la SEQ ID NO: 46, se espera además que la leucina sea el aminoácido N-terminal en las formas procesadas de la isoforma 3 de ALK7 humana (SEQ ID NO: 39) y la isoforma 4 de ALK7 humana (SEQ ID NO: 43).

En ciertos aspectos, la descripción se refiere a heteromultímeros que comprenden al menos un polipéptido de ALK7, lo que incluye fragmentos, variantes funcionales y formas modificadas de los mismos. Preferiblemente, los polipéptidos de ALK7 para su uso de acuerdo con la descripción (por ejemplo, heteromultímeros que comprenden un polipéptido de ALK7 y usos de los mismos) son solubles (por ejemplo, un dominio extracelular de ALK7). En otros aspectos preferidos, los polipéptidos de ALK7 para su uso de acuerdo con la descripción se unen a uno o más ligandos de la superfamilia de TGF-beta. Por lo tanto, en algunos aspectos preferidos, los polipéptidos de ALK7 para su uso de acuerdo con la descripción inhiben (antagonizan) la actividad (p. ej., Inducción de la transducción de señales de Smad 2/3 y/o Smad 1/5/8 ) de uno o más ligandos de la superfamilia de TGF-beta. En algunos aspectos, los heteromultímeros de la descripción comprenden al menos un polipéptido de ALK7 que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico a la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 9, 10, 19, 20, 38, 39, 42, 43, 46, 74, 75, 79 u 80. En algunos aspectos, el heteromultímero de la descripción consiste o consiste esencialmente en al menos un polipéptido de ALK7 que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico a la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 9, 10, 19, 20, 38, 39, 42, 43, 46, 74, 75, 79 y 80.

ALK7 se conserva bien entre los vertebrados, con grandes extensiones de dominio extracelular conservadas completamente. Por ejemplo, la figura 7 representa una alineación de múltiples secuencias de un dominio extracelular de ALK7 humano en comparación con diversos ortólogos de ALK7. A partir de estas alineaciones, es posible predecir las posiciones de aminoácidos clave dentro del dominio de unión a ligando que son importantes para las actividades de unión ALK7-ligando normales, así como predecir las posiciones de los aminoácidos que es probable que sean tolerantes a sufrir sustitución sin alterar significativamente las actividades de unión ALK7-ligando normales. Por lo tanto, una variante de polipéptido de ALK7 humano activa útil según los procedimientos descritos actualmente pueden incluir uno o más aminoácidos en las posiciones correspondientes de la secuencia de otro ALK7 de vertebrado, o pueden incluir un residuo que es similar al de la secuencia humana o de otro vertebrado. Sin pretender ser limitantes, los ejemplos siguientes ilustran esta estrategia para definir una variante de ALK7 activa. V61 en el dominio extracelular de ALK7 humano (SEQ ID NO: 59) es isoleucina en ALK7 de Callithrix jacchus (SEQ ID NO: 62), por lo que la posición se puede alterar, y opcionalmente se puede alterar a otro residuo hidrófobo tal como L, I o F, o un residuo apolar tal como A. L32 en el dominio extracelular humano es R en ALK7 de Tarsius syrichta (SEQ ID NO: 63), lo que indica que este sitio puede tolerar un amplio abanico de cambios, incluidos residuos polares, tales como E, D, K, R, H, S, T, P, G, Y, y probablemente un residuo apolar tal como A. K37 en el dominio extracelular humano es R en ALK7 de Pan troglodytes (SEQ ID NO: 60), lo que indica que se toleran residuos básicos en esta posición, incluidos R, K y H. P4 en el dominio extracelular humano está relativamente mal conservado, apareciendo como A en ALK7 de Pan troglodytes, lo que indica que un amplio abanico de aminoácidos debe ser tolerado en esta posición.

Además, las proteínas ALK7 se han caracterizado en la técnica en términos de características estructurales y funcionales. [p. ej., Romano y col (2012) Journal of Molecular Modeling 18 (8): 3617-3625]. Por ejemplo, un motivo estructural definitorio conocido como pliegue de toxina de tres dedos es importante para la unión al ligando por los receptores tipo I y tipo II y está formado por residuos de cisteína conservados ubicados en diferentes posiciones dentro del dominio extracelular de cada receptor monomérico. [Greenwald y col. (1999) Nat Struct Biol 6: 18-22; y Hinck (2012) FEBS Lett 586: 1860-1870]. Por consiguiente, los dominios de unión al ligando del núcleo de ALK7 humana, según lo demarcado por la más externa de estas cisteínas conservadas, corresponden a las posiciones 28-92 de la SEQ ID NO: 9. Los aminoácidos estructuralmente menos ordenados que flanquean estas secuencias centrales demarcadas por cisteína se pueden truncar por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 o 27 residuos en el extremo amínico y por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o 21 residuos en el extremo carboxiterminal sin alterar necesariamente la unión al ligando. Dominios extracelulares de ALK7 ejemplares para truncamiento N-terminal y/o C-terminal incluyen las SEQ ID NO: 10, 20, 39 y 43.

Por consiguiente, una fórmula general para una porción activa (p. ej., una porción de unión a ligando) de ALK7 comprende los aminoácidos 28-92. Por lo tanto, los polipéptidos de ALK7 pueden, por ejemplo, comprender, consistir esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a una porción de ALK7 que comienza en un residuo correspondiente a uno cualquiera de los aminoácidos 20-28 (p. ej., que comienza en uno cualquiera de los aminoácidos 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 o 28) de la SEQ ID NO: 9 y que termina en una posición correspondiente a uno cualquiera de los aminoácidos 92-113 (p. ej., que termina en uno cualquiera de los aminoácidos 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112 o 113) de la SEQ ID NO: 9.

Otros ejemplos incluyen construcciones que comienzan en una posición de 21-28 (p. ej., cualquiera de las posiciones 21,22, 23, 24, 25, 26, 27 o 28), 24-28 (p. ej., cualquiera de las posiciones 24, 25, 26, 27 o 28), o 25-28 (p. ej., cualquiera de las posiciones 25, 26, 27 o 28) de la SEQ ID NO: 9 y terminan en una posición de 93-112 (p. ej., cualquiera de las posiciones 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111 o 112), 93-110 (p. ej., cualquiera de las posiciones 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109 o 110), 93-100 (p. ej., cualquiera de las posiciones 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100) o 93-95 (p. ej., cualquiera de las posiciones 93, 94 o 95) de la SEQ ID NO: 9. Las variantes dentro de estos intervalos son también contemplados, particularmente aquellos que tienen al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad con la porción correspondiente de la SEQ ID NO: 9.

Las variaciones descritas en este documento se pueden combinar de diversas maneras. En algunos aspectos, las variantes de ALK7 comprenden no más de 1, 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o 15 cambios conservadores de aminoácidos en la cavidad de unión al ligando. Los puntos fuera de la cavidad de unión, en los que se puede tolerar particularmente bien la variabilidad, incluyen los extremos amino y carboxi del dominio extracelular (como se indicó anteriormente).

En ciertos aspectos, la presente descripción se refiere a heteromultímeros que comprenden uno o más polipéptidos del receptor A^lK7 (p. ej., SEQ ID NO: 9, 10, 19, 20, 38, 39, 42, 43, 46, 74, 76, 79 y 80) y uno o más polipéptidos del receptor ActRIIB (p. ej., SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 71, 73, 77 y 78), que generalmente se denominan en este documento "complejos heteromultiméricos ALK7:ActRIIB" o "heteromultímeros ALK7:ActRIIB". Preferiblemente, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB son solubles, p.ej., un heteromultímero comprende una porción (dominio) soluble de un receptor ALK7 y una porción (dominio) soluble de un receptor ActRIIB. En general, los dominios extracelulares de ALK7 y ActRIIB corresponden a una porción soluble de estos receptores. Por lo tanto, en algunos aspectos, los heteromultímeros comprenden un dominio extracelular de un receptor ALK7 y un dominio extracelular de un receptor ActRIIB. En este documento se describen ejemplos de dominios extracelulares de receptores ALK7 y ActRIIB y tales secuencias, así como fragmentos, variantes funcionales y formas modificadas de las mismas, pueden usarse de acuerdo con la descripción (p. ej., composiciones heteromultiméricas ALK7:ActRIIB y usos de las mismas). En algunos aspectos, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB comprenden al menos un polipéptido de ALK7 que comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 % 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 9, 10, 19, 20, 38, 39, 42, 43, 46, 74, 76, 79 y 80. En algunos aspectos, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB comprenden al menos un polipéptido de ALK7 que comprende, consiste esencialmente en, consiste en una secuencia que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 % 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a una porción de ALK7 que comienza en un residuo correspondiente a uno cualquiera de los aminoácidos 21-28, 22-28, 23-28, 24-28, 25-28, 26-28 o 27-28 de la SEQ ID NO: 9 y que termina en una posición de 93-112, 93, 110, 93-100, 93-95 de la SEQ ID NO: 9. En algunos aspectos, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB comprenden al menos un polipéptido de ALK7 que comprende, consiste esencialmente en, consiste en una secuencia que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 % 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a los aminoácidos 28-92 de la SEQ ID NO: 9. En algunos aspectos, los heteromultímeros ALK7-ActRIIB comprenden al menos un polipéptido de ActRIIB que comprende, consiste esencialmente en, consiste en una secuencia que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 % 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 71, 73, 77 y 78. En algunos aspectos, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB comprenden al menos un polipéptido de ActRIIB que comprende, consiste esencialmente en, consiste en una secuencia que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 % 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a una porción de ActRIIB que comienza en un residuo correspondiente a uno cualquiera de los aminoácidos 20-29, 20-24, 21-24, 22-25 o 21-29 y termina en una posición de 109-134, 119-134, 119-133, 129-134 o 129-133 de la SEQ ID NO: 1. En algunos aspectos, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB comprenden al menos un polipéptido de ActRIIB que comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia que es al menos un 70 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 % 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a los aminoácidos 29-109 de la SEQ ID NO: 1. En algunos aspectos, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB comprenden al menos un polipéptido de ActRIIB que comprende, consiste esencialmente en, consiste en una secuencia que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 % 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a los aminoácidos 25-125 de la SEQ ID NO: 1. En ciertos aspectos preferidos, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB comprenden al menos un polipéptido de ActRIIB donde la posición correspondiente a L79 de la SEQ ID NO: 1 no es un aminoácido ácido (es decir, no aminoácidos D o E de origen natural o un residuo ácido artificial). Los heteromultímeros ALK7:ActRIIB incluyen, p. ej., heterodímeros, heterotrímeros, heterotetrámeros y estructuras oligoméricas de orden superior adicionales. Véanse, p. ej., las figuras 1, 2 y 8-10. En ciertos aspectos preferidos, los heteromultímeros de la descripción son heterodímeros ALK7:ActRIIB.

En algunos aspectos, la presente descripción contempla fabricar variantes funcionales modificando la estructura de un polipéptido de ALK7 y/o un polipéptido de ActRIIB. Las variantes se pueden producir mediante sustitución, eliminación o adición de aminoácidos o combinaciones de las mismas Por ejemplo, es razonable esperar que un reemplazo aislado de una leucina con una isoleucina o valina, un aspartato con un glutamato, una treonina con una serina, o un reemplazo similar de un aminoácido con un aminoácido relacionado estructuralmente (por ejemplo, mutaciones conservadoras) no tendrá un efecto importante sobre la actividad biológica de la molécula resultante. Las sustituciones conservadoras son aquellas que tienen lugar dentro de una familia de aminoácidos que están relacionados en cuanto a sus cadenas laterales. Si un cambio en la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de la descripción da como resultado un homólogo funcional, se puede determinar fácilmente evaluando la capacidad del polipéptido variante para producir una respuesta en las células de una manera similar al polipéptido de tipo natural, o para se unen a uno o más ligandos de la superfamilia de TGF-beta que incluyen, por ejemplo, BMP2, BMP2/7, BMP3, BMP4, BMP4/7, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8a, BMP8b, BMP9, BMP10, GDF3, GDF5, GDF6/BMP13, GDF7, GDF8, GDF9b/BMP15, GDF11/BMP11, GDF15/MIC1, TGF-pi, TGF-p2, TGF-p3, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina AE, activina BC, activina BE, nodal, factor neurotrófico derivado de células gliales (GDNF), neurturina, artemina, persefina, MIS y Lefty.

En algunos aspectos, la presente descripción contempla fabricar variantes funcionales modificando la estructura de un polipéptido de ALK7 y/o polipéptido de ActRIIB para fines tales como mejorar la eficacia terapéutica o la estabilidad (p. ej., semivida ex vivo o resistencia a la degradación proteolítica in vivo).

En algunos aspectos, la presente descripción contempla mutaciones específicas en un polipéptido de ALK7 y/o ActRIIB para alterar la glucosilación del polipéptido. Tales mutaciones se pueden seleccionar para introducir o eliminar uno o más puntos de glucosilación, tales como puntos de O-glucosilación o N-glucosilación. Los puntos de reconocimiento de la glucosilación en asparagina generalmente comprenden una secuencia tripeptídica, asparagina-X-treonina o asparagina-X-serina (en la que “X” es cualquier aminoácido) que es reconocida específicamente por las enzimas de glucosilación celular apropiadas. La alteración también se puede hacer mediante la adición de, o sustitución por, uno o más residuos de serina o treonina en la secuencia del polipéptido (para puntos de O-glucosilación). Un abanico de sustituciones o eliminaciones de aminoácidos en una o ambas de la primera o tercera posiciones de aminoácido de un punto de reconocimiento de la glucosilación (y/o eliminación de aminoácidos en la segunda posición) dan como resultado la ausencia de glucosilación en la secuencia tripeptídica modificada. Otro medio para aumentar el número de restos carbohidrato en un polipéptido es mediante acoplamiento químico o enzimático de glucósidos al polipéptido. En función del modo de acoplamiento usado, el uno o más glúcidos se pueden fijar a (a) arginina e histidina; (b) grupos carboxilo libres; (c) grupos sulfhidrilo libres tales como los de cisteína; (d) grupos hidroxilo libres tales como los de serina, treonina o hidroxiprolina; (e) residuos aromáticos tales como los de fenilalanina, tirosina o triptófano; o (f) el grupo amida de la glutamina. La retirada de uno o más restos carbohidrato presentes en un polipéptido se puede lograr química y/o enzimáticamente. La desglucosilación química puede implicar, por ejemplo, la exposición de un polipéptido al compuesto ácido trifluorometanosulfónico o a un compuesto equivalente. Este tratamiento da como resultado la escisión de la mayor parte o la totalidad de los glúcidos a excepción del glúcido enlazador (N-acetilglucosamina o N-acetilgalactosamina) a la vez que deja la secuencia de aminoácidos intacta. La escisión enzimática de restos carbohidrato en polipéptidos se puede lograr mediante el uso de un abanico de endo- y exoglucosidasas como describen Thotakura y col. [Meth. Enzymol. (1987) 138: 350]. La secuencia de un polipéptido se puede ajustar, según proceda, en función del tipo de sistema de expresión usado, ya que las células de mamífero, levadura, insecto o vegetales pueden introducir patrones de glucosilación diferentes que se pueden ver afectados por la secuencia de aminoácidos del péptido. En general, los complejos heteroméricos de la presente descripción para su uso en seres humanos se pueden expresar en una estirpe celular de mamífero que proporciona la glucosilación correcta, tal como las estirpes celulares HEK293 o CHO, aunque se espera que otras estirpes celulares de expresión de mamífero también sean útiles.

La presente descripción contempla además un procedimiento para generar mutantes, particularmente conjuntos de mutantes combinatorios de un polipéptido de ALK7 y/o ActRIIB, así como mutantes de truncamiento. Los grupos de mutantes combinatorios son especialmente útiles para identificar secuencias de ALK7 y/o ActRIIB funcionalmente activas (p. ej., unión a ligando de la superfamilia TGF-beta). El fin de cribar tales colecciones combinatorias puede ser el de generar, por ejemplo, variantes de polipéptido que tienen propiedades alteradas, tales como farmacocinética alterada o unión a ligando alterada. A continuación, se proporciona un abanico de ensayos de cribado, y tales ensayos se pueden usar para evaluar variantes. Por ejemplo, las variantes complejas de ALK7:ActRIIB se pueden seleccionar para determinar la capacidad de unirse a uno o más ligandos de la superfamilia de TGF-beta, para evitar la unión de un ligando de la superfamilia de TGF-beta a un receptor de la superfamilia de TGF-beta, y/o para interferir en la transducción de señales causada por un ligando de la superfamilia de TGF-beta.

La actividad de un heteromultímero ALK7:ActRIIB puede ensayarse, por ejemplo, en un ensayo in vivo o basado en células. Por ejemplo, se puede evaluar el efecto de un heteromultímero ALK7:ActRIIB sobre la expresión de genes o la actividad de proteínas implicadas en el metabolismo de las grasas, daño renal, inflamación renal, y/o fibrosis renal. Esto se puede realizar, según sea necesario, en presencia de una o más proteínas ligando de la superfamilia de TGF-beta recombinantes, y las células se pueden transfectar para producir un heteromultímero ALK7:ActRIIB y, opcionalmente, un ligando de la superfamilia de TGF-beta. Asimismo, un heteromultímero ALK7:ActRIIB se puede administrar a un ratón u otro animal, y una o más mediciones, tales como el metabolismo de las grasas o daño, inflamación, fibrosis y/o función renal puede evaluarse usando procedimientos reconocidos en la técnica. Del mismo modo, la actividad de un heteromultímero ALK7:ActRIIB, o variantes del mismo, se pueden probar en, por ejemplo, adipocitos y/o células glomerulares para cualquier efecto sobre el crecimiento de estas células, por ejemplo, mediante los ensayos descritos en este documento y los de conocimiento común en la técnica. Puede usarse un gen informador sensible a SMAD en tales estirpes celulares para controlar los efectos sobre la transducción de señales aguas abajo.

Se pueden generar variantes derivadas de forma combinatoria que tienen una selectividad aumentada o potencia generalmente aumentada con respecto a un heteromultímero ALK7:ActRIIB de referencia. Tales variantes, cuando se expresan a partir de construcciones de ADN recombinante, se pueden usar en protocolos de genoterapia. Del mismo modo, la mutagénesis puede dar lugar a variantes que tienen semividas intracelulares drásticamente diferentes al heteromultímero ALK7:ActRIIB correspondiente. Por ejemplo, la proteína alterada se puede hacer más estable o menos estable a la degradación proteolítica u otros procesos celulares que dan como resultado la destrucción, o inactivación de otro modo, de un polipéptido no modificado. Tales variantes, y los genes que las codifican, se pueden utilizar para alterar los niveles de complejo polipeptídico modulando la semivida del polipéptido. Por ejemplo, una semivida corta puede dar lugar a efectos biológicos más transitorios y, cuando forma parte de un sistema de expresión inducible, puede permitir un control más estricto de los niveles del complejo polipeptídico recombinante dentro de la célula. En una proteína de fusión Fc, se pueden realizar mutaciones en el enlazador (si corresponde) y/o la porción Fc para alterar una o más actividades del heteromultímero ALK7:ActRIIB que incluyen, por ejemplo, inmunogenicidad, semivida y solubilidad.

Se puede producir una colección combinatoria por medio de una genoteca degenerada que codifica una colección de polipéptidos que incluyen cada uno al menos una porción de secuencias de ALK7 y/o ActRIIB potenciales. Por ejemplo, una mezcla de oligonucleótidos sintéticos se puede ligar enzimáticamente a secuencias genéticas de tal manera que el conjunto degenerado de secuencias de nucleótidos codificantes de ALK7 y/o ActRIIB potenciales sean expresables como polipéptidos individuales, o alternativamente, como un conjunto de proteínas de fusión más grandes (p. ej., para presentación en fagos).

Hay muchas maneras mediante las que se puede generar la colección de homólogos potenciales a partir de una secuencia de oligonucleótido degenerada. La síntesis química de una secuencia genética degenerada se puede llevar a cabo en un sintetizador de ADN automático, y los genes sintéticos se pueden ligar a continuación en un vector apropiado para la expresión. La síntesis de oligonucleótidos degenerados es muy conocida en la técnica [Narang, SA (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura y col. (1981) Recombinant DNA, Proc. 3rd Cleveland Sympos. Macromolecules, ed. Ag Walton, Amsterdam: Elsevier páginas 273-289; Itakura y col. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura y col. (1984) Science 198:1056; y Ike y col. (1983) Nucleic Acid Res. 11:477]. Tales técnicas se han empleado en la evolución dirigida de otras proteínas [Scott y col., (1990) Science 249:386-390; Roberts y col. (1992) PNAS USA 89:2429-2433; Devlin y col. (1990) Science 249: 404-406; Cwirla y col., (1990) PNAS USA 87: 6378-6382; así como las patentes de los EE. UU. n.°: 5223409, 5198346 y 5096815].

Alternativamente, se pueden utilizar otras formas de mutagénesis para generar una colección combinatoria. Por ejemplo, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB se pueden generar a partir de una colección cribando mediante, por ejemplo, mutagénesis dirigida por barrido de alanina [Ruf y col. (1994) Biochemistry 33: 1565-1572; Wang y col. (1994) J. Biol. Chem. 269:3095-3099; Balint y col. (1993) Gene 137: 109-118; Grodberg y col. (1993) Eur. J. Biochem. 218: 597-601; Nagashima y col. (1993) J. Biol. Chem. 268: 2888-2892; Lowman y col. (1991) Biochemistry 30:10832-10838 y Cunningham y col. (1989) Science 244:1081-1085], mediante mutagénesis dirigida barrido de enlazador [Gustin y col. (1993) Virology 193: 653-660; y Brown y col. (1992) Mol. Cell Biol. 12: 2644-2652; McKnight y col. (1982) Science 232:316], mediante mutagénesis por saturación [Meyers y col., (1986) Science 232:613]; mediante mutagénesis dirigida por PCR [Leung y col. (1989) Method Cell Mol Biol 1: 11-19]; o mediante mutagénesis aleatoria, lo que incluye mutagénesis química [Miller y col. (1992) A Short Course in Bacterial Genetics, CSHL Press, Cold Spring Harbor, Ny y Greener y col. (1994) Strategies in Mol Biol 7: 32-34]. La mutagénesis dirigida por barrido de enlazador, particularmente en un entorno combinatorio, es un procedimiento atractivo para identificar formas truncadas (bioactivas) de polipéptidos de ALK7 y/o ActRIIB.

Se conoce un abanico de técnicas en la técnica para cribar productos genéticos de colecciones combinatorias fabricadas mediante mutaciones y truncamientos puntuales y, por ende, para cribar genotecas de ADNc para seleccionar productos genéticos que tienen una cierta propiedad. Tales técnicas serán generalmente adaptables para el cribado rápido de las genotecas generadas mediante la mutagénesis combinatoria de heteromultímeros ALK7:ActRIIB. Las técnicas usadas más ampliamente para cribar genotecas grandes comprenden típicamente clonar la genoteca en vectores de expresión replicables, transformar células apropiadas con la colección de vectores resultante y expresar los genes combinatorios en condiciones en las que la detección de una actividad deseada facilita el aislamiento relativamente fácil del vector que codifica el gen cuyo producto se detectó. Los ensayos preferidos incluyen ensayos de unión a un ligando de la superfamilia de TGF-beta (p. ej., BMP2, BMP2/7, BMP3, BMP4, BMP4/7, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8a, BMP8b, BMP9, BMP10, GDF3, GDF5, GDF6/BMP13, GDF7, GDF8, GDF9b/BMP15, GDF11/BMP11, GDF15/MIC1, TGF-p1, TGF-p2, TGF-p3, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE, activina BE, nodal, factor neurotrófico derivado de células gliales (GDNF), neurturina, artemina, persefina, MIS y Lefty) y/o ensayos de transducción de señales celular mediada por ligando de la superfamilia de TGF-beta.

En ciertos aspectos, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB pueden comprender además modificaciones postraduccionales además de cualquiera que esté presente de forma natural en el polipéptido ALK7 y/o ActRIIB. Tales modificaciones incluyen, pero no se limitan a, acetilación, carboxilación, glucosilación, fosforilación, lipidación y acilación. Como resultado, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB pueden comprender elementos no aminoacídicos, tales como polietilenglicoles, lípidos, polisacáridos o monosacáridos, y fosfatos. Los efectos de tales elementos que no son aminoácidos en la funcionalidad de un complejo heteromultimérico se pueden someter a prueba como se describe en este documento para otras variantes del heteromultímero. Cuando se produce un polipéptido de la descripción en células escindiendo una forma incipiente del polipéptido, el procesamiento postraduccional también puede ser importante para el plegamiento y/o la función correctos de la proteína. Diferentes células (p. ej., CHO, HeLa, MDCK, 293, WI38, NIH-3T3 o HEK293) tienen maquinaria celular específica y mecanismos característicos para tales actividades postraduccionales y se pueden elegir para garantizar la modificación y el procesamiento correctos del polipéptido de ALK7 y/o ActRIIB, así como heteromultímeros que lo comprenden.

En ciertos aspectos preferidos, los heteromultímeros descritos en este documento comprenden al menos un polipéptido de ALK7 asociado, covalente o no covalentemente, con al menos un polipéptido de ActRIIB. Preferiblemente, los polipéptidos descritos en este documento forman complejos heterodiméricos, aunque también se incluyen complejos heteromultiméricos de orden superior tales como, pero sin limitarse a, heterotrímeros, heterotetrámeros y estructuras oligoméricas adicionales (véase, p. ej., figuras 1, 2 y 8-10). En algunos aspectos, los polipéptidos de ^aLK7 y/o ActRIIB comprenden al menos un dominio de multimerización. Como se describe en este documento, el término "dominio de multimerización" se refiere a un aminoácido o secuencia de aminoácidos que promueven la interacción covalente o no covalente entre al menos un primer polipéptido y al menos un segundo polipéptido. Los polipéptidos descritos en este documento pueden unirse de forma covalente o no covalente a un dominio de multimerización. Preferiblemente, un dominio de multimerización promueve la interacción entre un primer polipéptido (p. ej., un polipéptido de ALK7) y un segundo polipéptido (p. ej., un polipéptido de ActRIIB) para promover la formación de heteromultímeros (p. ej., formación de heterodímeros) y opcionalmente dificulta o desfavorece la formación de homomultímeros (p. ej., formación de homodímeros), aumentando así el rendimiento del heteromultímero deseado (véase, p. ej., la figura 2).

Se pueden usar muchos procedimientos conocidos en la técnica para generar heteromultímeros ALK7:ActRIIB. Por ejemplo, los enlaces disulfuro de origen no natural se pueden construir reemplazando en un primer polipéptido (p. ej., un polipéptido de ALK7) un aminoácido de origen natural con un residuo que contiene tiol libre, tal como cisteína, de modo que el tiol libre interactúe con otro residuo que contiene tiol libre en un segundo polipéptido (p. ej., un polipéptido de ActRIIB) de manera que se forma un enlace disulfuro entre el primer y el segundo polipéptidos. Ejemplos adicionales de interacciones para promover la formación de heteromultímeros incluyen, pero no se limitan a, interacciones iónicas tales como las descritas en Kjaergaard y col., WO2007147901; efectos de direccionamiento electrostático tales como los descritos en Kannan y col., US 8592562; interacciones de super hélice tales como las descritas en Christensen y col., US 20120302737; cremalleras de leucina tales como las descritas en Pack & Plueckthun, (1992) Biochemistry 31: 1579-1584; y motivos de hélice-giro-hélice tales como los descritos en Pack y col., (1993) Bio/Technology 11: 1271-1277. La unión de los diversos segmentos se puede obtener mediante, por ejemplo, unión covalente tal como mediante reticulación química, enlazadores peptídicos, puentes disulfuro, etc., o interacciones de afinidad tales como mediante tecnología de cremallera avidina-biotina o leucina.

En ciertos aspectos, un dominio de multimerización puede comprender un componente de un par de interacción. En algunos aspectos, los polipéptidos descritos en este documento pueden formar complejos de proteínas que comprenden un primer polipéptido asociado covalente o no covalentemente con un segundo polipéptido, donde el primer polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de ALK7 y la secuencia de aminoácidos de un primer miembro de un par de interacción; y el segundo polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de ActRIIB y la secuencia de aminoácidos de un segundo miembro de un par de interacción. El par de interacción puede ser dos secuencias polipeptídicas cualesquiera que interaccionen para formar un complejo, particularmente un complejo heterodimérico, aunque los aspectos operativos también pueden emplear un par de interacción que puede formar un complejo homodimérico. Un miembro del par de interacción puede fusionarse con un polipéptido de ALK7 o ActRIIB como se describe en este documento, que incluye, por ejemplo, una secuencia polipeptídica que comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de cualquiera de las SEQ ID NO: 2, 3, 5, 6, 10, 20, 39, 43 y 46. Puede seleccionarse un par de interacción para conferir una propiedad/actividad mejorada tal como un aumento de la semivida en suero, o para actuar como un adaptador al que se une otro resto para proporcionar una propiedad/actividad mejorada. Por ejemplo, un resto de polietilenglicol puede unirse a uno o ambos componentes de un par de interacción para proporcionar una propiedad/actividad mejorada tal como una semivida en suero mejorada.

El primer y segundo miembros del par de interacción pueden ser un par asimétrico, lo que significa que los miembros del par se asocian preferentemente entre sí en lugar de autoasociarse. Por consiguiente, el primer y segundo miembros de un par de interacción asimétrico pueden asociarse para formar un complejo heterodimérico (véase, p. ej., la figura 2). Alternativamente, el par de interacción puede ser no guiado, lo que significa que los miembros del par pueden asociarse entre sí o autoasociarse sin una preferencia sustancial y, por tanto, pueden tener la misma o diferentes secuencias de aminoácidos. Por consiguiente, el primer y segundo miembros de un par de interacción no guiado pueden asociarse para formar un complejo homodímero o un complejo heterodimérico. Opcionalmente, el primer miembro del par de interacción (p. ej., un par asimétrico o un par de interacción no guiado) se asocia covalentemente con el segundo miembro del par de interacción. Opcionalmente, el primer miembro del par de interacción (p. ej., un par asimétrico o un par de interacción no guiado) se asocia no covalentemente con el segundo miembro del par de interacción.

Como ejemplos específicos, la presente descripción proporciona proteínas de fusión que comprenden ALK7 o ActRIIB fusionadas a un polipéptido que comprende un dominio constante de una inmunoglobulina, tal como un dominio CH1, CH2 o CH3 de una inmunoglobulina o un dominio Fc. Los dominios Fc derivados de IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 humanas se proporcionan en este documento. Se conocen otras mutaciones que disminuyen la actividad de CDC o ADCC y, colectivamente, cualquiera de estas variantes se incluyen en la descripción y pueden usarse como componentes ventajosos de un complejo heteromultimérico de la descripción. Opcionalmente, el dominio Fc de IgG1 de la SEQ ID NO: 31 tiene una o más mutaciones en residuos tales como Asp-265, Lys-322 y Asn-434 (numerados de acuerdo con la correspondiente IgG1 de longitud completa). En ciertos casos, el dominio Fc mutante que tiene una o más de esas mutaciones (por ejemplo, mutación Asp-265) tiene una capacidad reducida para unirse a los receptores F^cycon respecto a un dominio Fc de tipo natural. En otros casos, el dominio Fc mutante que tiene una o más de esas mutaciones (por ejemplo, mutación Asn-434) tiene una capacidad aumentada para unirse al receptor Fc relacionado a la clase I de MHC (FcRN) en respecto a un dominio Fc de tipo natural.

A continuación se muestra un ejemplo de una secuencia de aminoácidos nativa que puede usarse para la porción Fc de IgG1 humana (G1Fc) (SEQ ID NO: 31). El subrayado punteado indica la región bisagra y el subrayado continuo indica posiciones con variantes naturales. En parte, la descripción proporciona polipéptidos que comprenden, consisten esencialmente en o consisten en secuencias de aminoácidos con un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad con la SEQ ID NO: 31. Las variantes de origen natural en G1Fc incluirían E134D y M136L de acuerdo con el sistema de numeración usado en la SEQ ID NO: 31 (véase Uniprot P01857).

1 THTCPPCPAP ELLGGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV WDVSHEDPE

51 VKFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQYNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK

101 VSNKALPAPI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSREEMTKNQ VSLTCLVKGF

151 YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSKLTV DKSRWQQGNV

201 FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSPGK (SEQ ID NO: 31)

A continuación se muestra un ejemplo de una secuencia de aminoácidos nativa que puede usarse para la porción Fc de IgG2 humana (G2Fc) (SEQ ID NO: 32). El subrayado punteado indica la región bisagra y el subrayado doble indica posiciones donde hay conflictos de base de datos en la secuencia (de acuerdo con UniProt P01859). En parte, la descripción proporciona polipéptidos que comprenden, consisten esencialmente en o consisten en secuencias de aminoácidos con un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad con la SEQ ID NO: 32.

¹VECPPCPAPP VAGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCWV DVSHEDPEVQ

51 FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QFNSTFRWS VLTWHQDWL NGKEYKCKVS

¹⁰¹NKGLPAPIEK TISKTKGQPR EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LTCLVKGFYP

151 SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPMLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS

²⁰¹CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PGK (SEQ ID NO::32)

A continuación se muestran dos ejemplos de secuencias de aminoácidos que pueden usarse para la porción Fc de IgG3 humana (G3Fc). La región bisagra en G3Fc puede ser hasta cuatro veces más larga que en otras cadenas de Fc y contiene tres segmentos idénticos de 15 residuos precedidos por un segmento similar de 17 residuos. La primera secuencia de G3Fc que se muestra a continuación (SEQ ID NO: 33) contiene una región bisagra corta que consiste en un solo segmento de 15 residuos, mientras que la segunda secuencia de G3Fc (SEQ ID NO: 34) contiene una región bisagra de longitud completa. En cada caso, el subrayado punteado indica la región bisagra y el subrayado continuo indica posiciones con variantes de origen natural de acuerdo con UniProt P01859. En parte, la descripción proporciona polipéptidos que comprenden, consisten esencialmente en o consisten en secuencias de aminoácidos con un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad con las S^eQ ID NO: 33 y 34.

¹EPKSCDTPPP CPRCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVWD

51 VSHEDPEVQF KWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTFRVVSV LTVLHQDWLN

¹⁰¹GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKTKGQPRE PQVYTLPPSR EEMTKNQVSL

151 TCLVKGFYPS DIAVEWESSG QPENNYNTTP PMLDSDGSFF LYSKLTVDKS

²⁰¹RWQQGNIFSC SVMHEALHNR FTQKSLSLSP GK (SEQ IDNO: 33)

¹ELKTPLGDTT HTCPRCPEPK SCDTPPPCPR CPEPKSCDTP PPCPRCPEPK

51 SCDTPPPCPR CPAPELLGGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCWVDVSH

¹⁰¹EDPEVQFKWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS TFRWSVLTV LHQDWLNGKE

151 YKCKVSNKAL PAPIEKTISK TKGQPREPQV YTLPPSREEM TKNQVSLTCL

201 VKGFYPSDIA VEWESSGQPE NNYNTTPPML DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ

251 QGNIFSCSVM HEALHNRFTQ KSLSLSPGK (SEQ ID NO:

34)

Las variantes de origen natural en G3Fc (por ejemplo, véase Uniprot P01860) incluyen E68Q, P76L, E79Q, Y81F, D97N, N100D, T124A, S169N, S169del, ^f221Y cuando se convierten al sistema de numeración usado en la S^eQ ID NO: 33, y la presente descripción proporciona proteínas de fusión que comprenden dominios G3Fc que contienen una o más de estas variaciones. Además, el gen IgG3 de inmunoglobulina humana (IGHG3) muestra un polimorfismo estructural caracterizado por diferentes longitudes de bisagra [véase Uniprot P01859]. Específicamente, la variante WIS carece de la mayor parte de la región V y de toda la región CH1. Tiene un enlace disulfuro adicional entre cadenas en la posición 7 además del 11 normalmente presente en la región bisagra. La variante ZUC carece de la mayor parte de la región V, toda la región CH1 y parte de la bisagra. La variante OMM puede representar una forma alélica u otra subclase de cadena gamma. La presente descripción proporciona proteínas de fusión adicionales que comprenden dominios G3Fc que contienen una o más de estas variantes.

A continuación se muestra un ejemplo de una secuencia de aminoácidos nativa que puede usarse para la porción Fc de IgG4 humana (G4Fc) (SEQ ID NO: 35). El subrayado punteado indica la región bisagra. En parte, la descripción proporciona polipéptidos que comprenden, consisten esencialmente en o consisten en secuencias de aminoácidos con un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad con la SEQ ID NO: 35.

1 ESKYGPPCPS CPAPEFLGGPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCWVDVSQ

51 EDPEVQFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQFNS TYRWSVLTVLHQDWLNGKE

101 YKCKVSNKGL PSSIEKTISKAKGQPREPQV YTLPPSQEEMTKNQVSLTCL

151 VKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSRLTVDKSRWQ

201 EGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSLGK (SEQ ID NO: 35)

Se presentan en este documento un abanico de mutaciones diseñadas en el dominio Fc con respecto a la secuencia de G1Fc (SEQ ID NO: 31), y mutaciones análogas en G2Fc, G3Fc y G4Fc pueden derivarse de su alineación con G1Fc en la figura 5. Debido a longitudes de bisagra desiguales, posiciones de Fc análogas basadas en la alineación de isotipo (figura 5) poseen diferentes números de aminoácidos en las SEQ ID NO: 31, 32, 33, 34 y 35. También se puede apreciar que una posición de aminoácido dada en una secuencia de inmunoglobulina que consiste en regiones bisagra,CH2 yCi-i3 (por ejemplo, SEQ ID NO: 31, 32, 33, 34 y 35) se identificará mediante un número diferente a la misma posición cuando la numeración abarca todo el dominio constante de la cadena pesada de IgG1 (que consiste en las regionesC-1, bisagra,C-2 yC-3) como en la base de datos Uniprot. Por ejemplo, la correspondencia entre posiciones C^h3 seleccionadas en una secuencia G1Fc humana (SEQ ID NO: 31), el dominio constante de cadena pesada de IgG1 humana (Uniprot P01857), y la cadena pesada de IgG1 humana es como sigue.

Un problema que surge en la producción a gran escala de proteínas asimétricas basadas en inmunoglobulinas a partir de una única estirpe celular se conoce como "problema de asociación de cadenas". Como se enfrenta de manera prominente en la producción de anticuerpos biespecíficos, el problema de la asociación de cadenas se refiere al desafío de producir de manera eficiente una proteína de cadena múltiple deseada entre las múltiples combinaciones que resultan inherentemente cuando diferentes cadenas pesadas y/o cadenas ligeras se producen en una sola estirpe celular [Klein y col (2012) mAbs 4:653-663]. Este problema es más agudo cuando se producen dos cadenas pesadas diferentes y dos cadenas ligeras diferentes en la misma célula, en cuyo caso hay un total de 16 combinaciones de cadenas posibles (aunque algunas de ellas son idénticas) cuando típicamente solo se desea una. Sin embargo, el mismo principio explica la disminución del rendimiento de una proteína de fusión de múltiples cadenas deseada que incorpora solo dos cadenas pesadas diferentes (asimétricas).

Se conocen diversos procedimientos en la técnica que aumentan el apareamiento deseado de cadenas polipeptídicas de fusión que contienen Fc en una única estirpe celular para producir una proteína de fusión asimétrica preferida con rendimientos aceptables [ Klein y col (2012) mAbs 4: 653-663; y Spiess y col (2015) Molecular Immunology 67(2A): 95-106 ]. Los procedimientos para obtener el apareamiento deseado de cadenas que contienen Fc incluyen, pero no se limitan a, apareamiento basado en carga (direccionamiento electrostático), apareamiento estérico "botones en ojales", apareamiento de SEEDbody y apareamiento basado en cremallera de leucina [Ridgway y col (1996) Protein Eng 9: 617-621; Merchant y col (1998) Nat Biotech 16: 677-681; Davis y col (2010) Protein Eng Des Sel 23: 195-202; Gunasekaran y col (2010); 285: 19637-19646; Wranik y col (2012) J Biol Chem 287: 43331-43339; US5932448; WO 1993/011162; WO 2009/089004 y WO 2011/034605]. Como se describe en este documento, estos procedimientos pueden usarse para generar complejos heteromultiméricos ALK7-Fc:ActRIIB-Fc. Véanse las figuras 8-10.

Por ejemplo, un medio por el cual se puede promover la interacción entre polipéptidos específicos es mediante la genomanipulación de regiones complementarias de protuberancia en la cavidad (protuberancia en los orificios), como se describe en Arathoon y col., US 7 183076 y Carter y col., US 5731 168. Las "protuberancias" se construyen reemplazando pequeñas cadenas laterales de aminoácidos de la interfase del primer polipéptido (p. ej., un primer par de interacción) con cadenas laterales más grandes (p.ej., tirosina o triptófano). Se crean opcionalmente "cavidades" complementarios de tamaño idéntico o similar a las protuberancias en la interfase del segundo polipéptido (p. ej., un segundo par de interacción) remplazando las cadenas laterales grandes de aminoácidos con unas más pequeñas (p. ej., alanina o treonina). Cuando exista una protuberancia o cavidad adecuadamente posicionada y dimensionada en la interfase del primer o segundo polipéptido, sólo es necesario diseñar una cavidad o protuberancia correspondiente, respectivamente, en la interfase adyacente.

A pH neutro (7,0), el ácido aspártico y el ácido glutámico tienen carga negativa y la lisina, arginina e histidina tienen carga positiva. Estos residuos cargados se pueden usar para promover la formación de heterodímeros y, al mismo tiempo, impedir la formación de homodímeros. Se producen interacciones atractivas entre cargas opuestas y se producen interacciones repulsivas entre cargas similares. En parte, los complejos de proteínas descritos en este documento hacen uso de interacciones atractivas para promover la formación de heteromultímeros (por ejemplo, formación de heterodímeros) y, opcionalmente, interacciones repulsivas para dificultar la formación de homodímeros (por ejemplo, formación de homodímeros) al llevar a cabo mutagénesis dirigida de residuos de interfase cargados.

Por ejemplo, la interfase del dominio CH3 de IgG1 comprende cuatro pares de residuos de carga única involucrados en interacciones dominio-dominio: Asp356-Lys439 ', Glu357-Lys370', Lys392-Asp399 'y Asp399-Lys409' [la numeración del residuo en la segunda cadena se indica mediante (')]. Cabe señalar que el esquema de numeración usado aquí para designar residuos en el dominio CH3 de IgG1 se ajusta al esquema de numeración de la UE de Kabat. Debido a la simetría doble presente en las interacciones del dominio CH3-CH3, cada interacción única se representará dos veces en la estructura (p. ej., Asp-399-Lys409' y Lys409-Asp399'). En la secuencia de tipo natural, K409-D399' favorece tanto la formación de heterodímeros como de homodímeros. Una sola mutación que cambia la polaridad de la carga (p. ej., K409E; carga positiva a negativa) en la primera cadena conduce a interacciones desfavorables para la formación del homodímero de la primera cadena. Las interacciones desfavorables surgen debido a las interacciones repulsivas que ocurren entre las mismas cargas (negativo-negativo; K409E-D399' y D399-K409E'). Una mutación similar que cambia la polaridad de carga (D399K'; negativa a positiva) en la segunda cadena conduce a interacciones desfavorables (K409'-D399K' y D399K-K409') para la formación del homodímero de la segunda cadena. Pero, al mismo tiempo, estas dos mutaciones (K409E y D399K') conducen a interacciones favorables (K409E-D399K' y D399-K409') para la formación de heterodímeros.

El efecto de direccionamiento electrostático sobre la formación de heterodímeros y la disuasión de los homodímeros se puede mejorar aún más mediante la mutación de residuos de carga adicionales que pueden estar emparejados o no con un residuo de carga opuesta en la segunda cadena, incluidos, por ejemplo, Arg355 y Lys360. La siguiente tabla enumera posibles mutaciones de cambio de carga que se pueden usar, solas o en combinación, para mejorar la formación de heteromultímeros ALK7:ActRIIB.

En algunos aspectos, uno o más residuos que forman la interfase CH3-CH3 en una proteína de fusión de la presente solicitud se reemplazan con un aminoácido cargado, de manera que la interacción se vuelve electrostáticamente desfavorable. Por ejemplo, un aminoácido cargado positivamente en la interfase (p. ej., una lisina, arginina o histidina) se reemplaza con un aminoácido cargado negativamente (p. ej., ácido aspártico o ácido glutámico). Alternativamente, o en combinación con la sustitución anterior, un aminoácido con carga negativa en la interfase se reemplaza por un aminoácido con carga positiva. En ciertos aspectos, el aminoácido se reemplaza con un aminoácido de origen no natural que tiene la característica de carga deseada. Cabe señalar que la mutación de residuos cargados negativamente (Asp o Glu) a His conducirá a un aumento en el volumen de la cadena lateral, lo que puede causar problemas estéricos. Además, su forma de donante y aceptor de protones depende del entorno localizado. Estos problemas deben tenerse en cuenta con la estrategia de diseño. Debido a que los residuos de la interfase están altamente conservados en las subclases de IgG de ratón y humana, los efectos de direccionamiento electrostático descritos en este documento pueden aplicarse a IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 de ratón y humana. Esta estrategia también puede extenderse para modificar residuos no cargados a residuos cargados en la interfase del dominio CH3.

En parte, la descripción proporciona el apareamiento deseado de cadenas polipeptídicas asimétricas que contienen Fc usando secuencias de Fc diseñadas para ser complementarias sobre la base del apareamiento de cargas (direccionamiento electrostático). Una de un par de secuencias de Fc con complementariedad electrostática se puede fusionar arbitrariamente al polipéptido de ALK7 o ActRIIB de la construcción, con o sin un enlazador opcional, para generar un heteromultímero ALK7:ActRIIB. Esta cadena sencilla se puede coexpresar en una célula de elección junto con la secuencia de Fc complementaria a la primera Fc para favorecer la generación de la construcción de cadenas múltiples deseada (p. ej., heteromultímero ALK7:ActRIIB). En este ejemplo basado en direccionamiento electrostático, la SEQ ID NO: 23 G1Fc(E134K/D177K) humano] y la SEQ ID NO: 24 [G1Fc(K170D/K187D) humano] son ejemplos de secuencias de Fc complementarias en las que las sustituciones de aminoácidos genomanipulados están subrayadas dos veces, y el polipéptido receptor de tipo I o tipo II de la superfamilia de TGF-beta de la construcción puede fusionarse con la SEQ ID No : 23 o la SEQ ID NO: 24, pero no ambas. Dado el alto grado de identidad de secuencia de aminoácidos entre hG1Fc nativo, hG2Fc nativo, hG3Fc nativo y hG4Fc nativo, se puede apreciar que las sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes en hG2Fc, hG3Fc o hG4Fc (véase la figura 5) generarán pares de Fc complementarios que pueden usarse en lugar del par de hG1 Fc complementario a continuación (SEQ ID NO: 23 y 24).

1 THTCPPCPAP ELLGGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VVDVSHEDPE

51 VKFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQYNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK

101VSNKALPAPI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSREEMTKNQ VSLTCLVKGF

151YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLKSDG SFFLYSKLTV DKSRWQQGNV

201 FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSPGK (SEQ ID NO: 23)

1 THTCPPCPAP ELLGGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VVDVSHEDPE

51 VKFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQYNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK

101VSNKALPAPI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSREEMTKNQ VSLTCLVKGF

151YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSKLTV DKSRWQQGNV

201 FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSPGK (SEQ ID NO: 24)

En parte, la descripción proporciona el apareamiento deseado de cadenas polipeptídicas asimétricas que contienen Fc usando secuencias de Fc diseñadas para la complementariedad estérica. En parte, la descripción proporciona apareamiento de botones en ojales como ejemplo de complementariedad estérica. Una de un par de secuencias de Fc con complementariedad estérica se puede fusionar arbitrariamente al polipéptido de ALK7 o ActRIIB de la construcción, con o sin un enlazador opcional, para generar un heteromultímero ALK7:ActRIIB. Esta cadena sencilla se puede coexpresar en una célula de elección junto con la secuencia de Fc complementaria a la primera Fc para favorecer la generación de la construcción multicadena deseada. En este ejemplo basado en el apareamiento de botones en ojales, la SEQ ID NO: 25 [G1Fc (T144Y) humano] y la SEQ ID NO: 26 [G1Fc (Y185T) humano] son ejemplos de secuencias de Fc complementarias en las que las sustituciones de aminoácidos genomanipulados están subrayadas dos veces, y el polipéptido de ALK7 o ActRIIB de la construcción se puede fusionar con la SEQ ID NO: 25 o la SEQ ID NO: 26, pero no ambas. Dado el alto grado de identidad de secuencia de aminoácidos entre hG1Fc nativo, hG2Fc nativo, hG3Fc nativo y hG4Fc nativo, se puede apreciar que las sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes en hG2Fc, hG3Fc o hG4Fc (véase la figura 5) generarán pares de Fc complementarios que pueden usarse en lugar del par de hG1 Fc complementario a continuación (SEQ ID NO: 25 y 26).

1 THTCPPCPAP ELLGGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VVDVSHEDPE

51 VKFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQYNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK

101 VSNKALPAPI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSREEMTKNQ VSLTCLVKGF

151 YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSKLTV DKSRWQQGNV

201 FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSPGK (SEQ ID NO: 25)

1 THTCPPCPAP ELLGGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VVDVSHEDPE

51 VKFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQYNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK

101VSNKALPAPI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSREEMTKNQ VSLTCLVKGF

151YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLTSKLTV DKSRWQQGNV

201 FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSPGK (SEQ ID NO: 26)

Un ejemplo de complementariedad de Fc basado en el apareamiento de botones en ojales combinado con un enlace disulfuro genomanipulado se describe en la SEQ ID NO: 27 [hG1Fc(S132C/T144W)] y la SEQ ID NO: 28 [hG1Fc(Y127C/T144S/L146A/Y185V)]. Las sustituciones de aminoácidos genomanipulados en estas secuencias están doblemente subrayadas, y el polipéptido de tipo I o tipo II de la superfamilia de TGF-beta de la construcción puede fusionarse con la SEQ ID NO: 27 o la SEQ ID NO: 28, pero no con ambas. Dado el alto grado de identidad de secuencia de aminoácidos entre hG1Fc nativo, hG2Fc nativo, hG3Fc nativo y hG4Fc nativo, se puede apreciar que las sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes en hG2Fc, hG3Fc o hG4Fc (véase la figura 5) generarán pares de Fc complementarios que pueden usarse en lugar del par de hG1 Fc complementario a continuación (SEQ ID NO: 27 y 28).

1 THTCPPCPAP ELLGGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VVDVSHEDPE

51 VKFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQYNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK

101VSNKALPAPI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSREEMTKNQ VSLWCLVKGF

151YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSKLTV DKSRWQQGNV

201 FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSPGK (SEQ ID NO: 27)

1 THTCPPCPAP ELLGGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VVDVSHEDPE

51 VKFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQYNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK

101VSNKALPAPI EKTISKAKGQ PREPQVQTLP PSREEMTKNQ VSL£CAVKGF

151YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLVSKLTV DKSRWQQGNV

201 FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSPGK (SEQ ID NO: 28)

En parte, la descripción proporciona el apareamiento deseado de cadenas polipeptídicas asimétricas que contienen Fc usando secuencias de Fc genomanipuladas para generar segmentos de cadena p interdigitantes de dominios C^h3 de IgG e IgA humanas. Tales procedimientos incluyen el uso de heterodímeros C^h3 de dominio de intercambio de cadenas (SEED) que permiten la formación de proteínas de fusión de SEEDbody [Davis y col. (2010) Protein Eng Design Sel 23: 195-202]. Una de un par de secuencias de Fc con complementariedad de SEEDbody puede fusionarse arbitrariamente al ALK7 o ActIIB de la construcción, con o sin un enlazador opcional, para generar un polipéptido de fusión de ALK7 o ActRIIB. Esta cadena sencilla se puede coexpresar en una célula de elección junto con la secuencia de Fc complementaria a la primera Fc para favorecer la generación de la construcción multicadena deseada. En este ejemplo basado en el apareamiento de SEEDbody (Sb), la SEQ ID NO: 29 [hG1Fc(SbA9)] y la SEQ ID NO: 30 [hG1 Fc(Sb9A)] son ejemplos de secuencias de Fc de IgG complementarias en las que las sustituciones de aminoácidos de Fc de IgA modificadas genéticamente están subrayadas dos veces, y el polipéptido de ALK7 o ActRIIB de la construcción se puede fusionar con la SEQ ID NO: 29 o la SEQ ID NO: 30, pero no con ambas. Dado el alto grado de identidad de secuencia de aminoácidos entre hG1Fc nativo, hG2Fc nativo, hG3Fc nativo y hG4Fc nativo, se puede apreciar que las sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes en hG1Fc, hG2Fc, hG3Fc o hG4Fc (véase la figura 5) generarán un monómero de Fc que se puede usar en el par IgG-IgA complementario a continuación (SEQ ID NO: 29 y 30).

1 THTCPPCPAP ELLGGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VVDVSHEDPE

51 VKFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQYNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK

101 VSNKALPAPI EKTISKAKGQ PFRPEVHLLP PSREEMTKNQ VSLTCLARGF

151 YPKDIAVEWE SNGQPENNYK TTPSRQEPSO GTTTFAVTSK LTVDKSRWQQ

201 GNVFSCSVMH EALHNHYTQK TISLSPGK (SEQ ID NO: 29)

1 THTCPPCPAP ELLGGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCVVVDVSHEDPE

51 VKFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQYNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK

101VSNKALPAPI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PPSEELALNE LVTLTCLVKG

151FYPSDIAVEW ESNGQELPRE KYLTWAPVLD SDGSFFLYSI LRVAAEDWKK

201 GDTFSCSVMH EALHNHYTQK SLDRSPGK (SEQ ID NO: 30)

En parte, la descripción proporciona apareamiento de cadenas de polipéptidos que contienen Fc asimétrica deseada con un dominio de cremallera de leucina escindible unido en el extremo carboxiterminal de los dominios C^h3 de Fc. La unión de una cremallera de leucina es suficiente para provocar un ensamblaje preferencial de cadenas pesadas de anticuerpos heterodiméricos [Wranik y col (2012) J Biol Chem 287: 43331-43339]. Como se describe en este documento, una de un par de secuencias de Fc unidas a una cadena formadora de cremalleras de leucina se puede fusionar arbitrariamente al polipéptido de ALK7 o ActRIIB de la construcción, con o sin un enlazador opcional, para generar un polipéptido de fusión de ALK7 o ActRIIB. Esta cadena sencilla se puede coexpresar en una célula de elección junto con la secuencia de Fc unida a una cadena complementaria formadora de cremallera de leucina para favorecer la generación de la construcción multicadena deseada. La digestión proteolítica de la construcción con la endoproteinasa bacteriana Lys-C después de la purificación puede liberar el dominio de cremallera de leucina, dando como resultado una construcción Fc cuya estructura es idéntica a la de la Fc nativa. En este ejemplo basado en el apareamiento de cremalleras de leucina, la SEQ ID NO: 36 [hG1Fc-Ap1 (ácido)] y la SEQ ID NO: 37 [hG1Fc-Bp1 (básico)] son ejemplos de secuencias de Fc de IgG complementarias en las que las secuencias de cremallera de leucina complementarias genomanipuladas están subrayadas, y el polipéptido de ALK7 o ActRIIB de la construcción se puede fusionar con la SEQ ID NO: 36 o la SEQ ID NO: 37, pero no ambas. Dado el alto grado de identidad de secuencia de aminoácidos entre hG1Fc nativo, hG2Fc nativo, hG3Fc nativo y hG4Fc nativo, se puede apreciar que las secuencias formadoras de cremalleras de leucina unidas, con o sin un enlazador opcional, a hG1Fc, hG2Fc, hG3Fc, o hG4Fc (véase la figura 5) generará un monómero de Fc que puede usarse en el par complementario formador de cremalleras de leucina a continuación (SEQ ID NO: 36 y 37).

1 THTCPPCPAP ELLGGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV WDVSHEDPE

51 VKFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQYNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK

101 VSNKALPAPI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSREEMIKNQ VSLTCLVKGF

151 YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSKLTV DKSRWQQGNV

201 FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSPGKGGSAQ LEKELQALEK ENAQLEWELQ

251 ALEKELAQGA T (SEQ ID NO: 36)

1 THTCPPCPAP ELLGGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV WDVSHEDPE

51 VKFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQYNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK

101 VSNKALPAPI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSREEMTKNQ VSLTCLVKGF

151 YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSKLTV DKSRWQQGNV

201 FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSPGKGGSAQ LKKKLQALKK KNAQLKWKLQ

251 ALKKKLAQGA T (SEQ ID NO: 37)

Como se describió anteriormente, se conocen diversos procedimientos en la técnica que aumentan el apareamiento deseado de cadenas polipeptídicas de fusión que contienen Fc en una única estirpe celular para producir una proteína de fusión asimétrica preferida con rendimientos aceptables. [ Klein y col (2012) mAbs 4: 653-663; y Spiess y col (2015) Molecular Immunology 67 (2A): 95-106 ]. Además, se pueden generar heteromultímeros ALK7:ActRIIB usando una combinación de proteínas de fusión de cadena pesada y ligera que comprenden un polipéptido de ALK7 o ActRIIB. Por ejemplo, en algunos aspectos, un polipéptido de ALK7 puede fusionarse, con o sin un dominio de enlazador, a una cadena pesada de inmunoglobulina (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1 o IgA2) que comprende al menos una porción del dominio Ch1. De manera similar, un polipéptido de ActRIIB puede fusionarse, con o sin un dominio de enlazador, a una cadena ligera de inmunoglobulina (kappa o lambda) que comprende al menos una porción del dominio constante de cadena ligera (C^l). En aspectos alternativos, un polipéptido de ActRIIB puede fusionarse, con o sin un dominio de enlazador, a una cadena pesada de inmunoglobulina (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1 o IgA2) que comprende al menos una porción del dominio C^h1, y un polipéptido de ALK7 puede fusionarse, con o sin un dominio de enlazador, a una cadena ligera de inmunoglobulina (kappa o lambda) que comprende al menos una porción del dominio constante de cadena ligera (Cl). Este diseño aprovecha la capacidad natural de las cadenas pesadas para heterodimerizar con cadenas ligeras. En particular, se produce la heterodimerización de una cadena ligera y pesada entre el Ch1 con el Cl, que generalmente se estabiliza mediante la unión covalente de los dos dominios mediante un puente disulfuro. Las construcciones que emplean la cadena pesada de longitud completa, o al menos una porción de la cadena pesada que comprende la región bisagra, podrían dar lugar a moléculas de tipo anticuerpo que comprenden dos "cadenas ligeras" y dos "cadenas pesadas". Véase la figura 9. Una ventaja potencial de este diseño es que puede imitar más de cerca el complejo ALK7-ligando-ActRIIB de origen natural y puede mostrar una mayor afinidad por el ligando que los heterodímeros individuales comparables. En algunos aspectos, este diseño puede modificarse incorporando diversos truncamientos de cadena pesada que incluyen, por ejemplo, truncamientos que comprenden el dominio C^h1 y parte o todo el dominio bisagra (dando lugar a moléculas similares a F(ab')2) así como truncamientos que solo comprenden el dominio Ch1 o un fragmento del mismo (dando lugar a moléculas tipo Fab). Véase la figura 9G. Diversos procedimientos para diseñar tales construcciones de heteromultímeros se describen en US 2009/0010879, Klein y col. [(2012) mAbs 4: 653-663], y Spiess y col [(2015) Molecular Immunology 67(2A): 95-106].

En algunos aspectos, es deseable generar anticuerpos similares a heterodímeros ALK7:ActRIIB que comprenden al menos una rama del complejo que comprende un par de heterodímeros ALK7-Ci_:ActRNB-CHl y al menos una segunda rama que comprende un par de heterodímeros ActRNB-Ci_:ALK7-CHl. Véase, p. ej., la figura 9B. Tales complejos de heterodímeros se pueden generar, por ejemplo, usando combinaciones de tecnologías de apareamiento asimétrico de cadena pesada y cadena ligera [Spiess y col (2015) Molecular Immunology 67 (2A): 95-106]. Por ejemplo, en la tecnología CrossMab, [Schaefer y col (2011). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108: 11187-11ⁱ92] El apareamiento incorrecto de cadenas ligeras se supera usando cruces de dominios y cadenas pesadas heterodimerizadas utilizando botones en ojales [Merchant y col (1998) Nat. Biotechnol. 16: 677-681]. Para los cruces de dominios, los dominios variables o los dominios constantes se intercambian entre cadenas ligeras y pesadas para crear dos brazos Fab asimétricos que impulsan el apareamiento de cadenas ligeras análogas mientras se preserva la integridad estructural y funcional del dominio variable. [Fenn y col (2013) PLoS ONE 8: e61953]. Una estrategia alternativa para superar el apareamiento incorrecto de cadenas ligeras es diseñar cadenas ligeras y pesadas con interfases Fab ortogonales [Lewis (2014) Nat. Biotechnol. 32: 191 -198]. Esto se ha logrado mediante modelización computacional [Das y col (2008) Annu. Rev. Biochem.77: 363-382] en combinación con cristalografía de rayos X para identificar mutaciones en las interfases Vh/Vl y Ch1/Cl. Para los heterodímeros generados con esta metodología, puede ser necesario genomanipular mutaciones en ambas interfases V^h/V^ly C^h1/C^lpara minimizar apareamiento de cadena pesada/ligera. La interfase de Fab ortogonal diseñada puede usarse junto con una estrategia de heterodimerización de cadena pesada para facilitar la producción eficiente de IgG en una única célula hospedadora. El direccionamiento electrostático también se puede usar para generar interfases de Fab ortogonales para facilitar la construcción de tales heterodímeros. Se pueden usar enlazadores peptídicos para asegurar el apareamiento análogo de cadenas ligeras y pesadas en un formato conocido como "LUZ-Y". [Wranik y col. (2012) J. Biol. Chem. 287: 43331-43339], donde la heterodimerización de la cadena pesada se logra usando cremalleras de leucina que pueden eliminarse posteriormente mediante proteólisis in vitro.

Alternativamente, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB pueden comprender una o más trampas de ligando de monocatenarias como se describe en este documento, que opcionalmente pueden estar asociadas covalentemente o no covalentemente con uno o más polipéptidos de ALK7 o ActRIIB, así como con trampas de ligando monocatenarias ALK7:ActRIIB adicionales [ US 2011/0236309 y US2009/0010879]. Véase la figura 12. Como se describe en este documento, las trampas de ligando monocatenarias no requieren la fusión con ningún dominio de multimerización, tales como los dominios Fc de super hélice, para ser multivalentes. En general, las trampas de ligando monocatenarias de la presente descripción comprenden al menos un dominio polipeptídico de ALK7 y un dominio polipeptídico de ActRIIB. Los dominios polipeptídicos de ALK7 y ActRIIB, generalmente denominados en este documento dominios de unión (BD), pueden unirse opcionalmente mediante una región enlazadora.

Por ejemplo, en un aspecto, la presente descripción proporciona heteromultímeros que comprenden un polipéptido que tiene la siguiente estructura:

(<BD1>-enlazador1 )k-[< BD2>-enlazador2-{<BD3>-enlazador3}f]n-(<BD4>)m-(enlazador4-BD5>d)h

donde: n y h son independientemente mayores o iguales a uno; d, f, m y k son independientemente iguales o mayores que cero; BD1, BD2, BD3, BD4 y BD5 son independientemente dominios polipeptídicos de ALK7 o ActRIIB, donde al menos uno de BD1, BD2, BD3 y BD4 es un dominio polipeptídico de ALK7, y donde al menos uno de BD1, BD2, BD3 y BD4 es un dominio polipeptídico de ActRIIB, y enlazadorl, enlazador2, enlazador3 y enlazador4 son independientemente mayores o iguales a cero. En algún aspecto, las trampas monocatenarias de ALK7:ActRIIB comprenden al menos dos polipéptidos de ALK7 diferentes. En algunos aspectos, las trampas monocatenarias de ALK7:ActRIIB comprenden al menos dos polipéptidos de ActRIIB diferentes. En algún aspecto, las trampas monocatenarias de ALK7:ActRIIB comprenden al menos dos enlazadores diferentes. Dependiendo de los valores seleccionados para d, f, h, k, m y n, la estructura heteromultimérica puede comprender un gran número de unidades repetidas en diversas combinaciones o puede ser una estructura relativamente simple.

En otro aspecto, la presente descripción proporciona heteromultímeros que comprenden un polipéptido que tiene la siguiente estructura:

< BD1>-enlazador1-< BD2>

En otro aspecto más, la presente descripción proporciona heteromultímeros que comprenden un polipéptido que tiene la siguiente estructura:

< BD1>-(enlazador2-< BD2>)n

donde n es mayor o igual que uno.

Otro aspecto de la descripción proporciona heteromultímeros que comprenden un polipéptido que tiene la siguiente estructura:

(<BD1>-enlazador1 -< BD1>)f-enlazador2-(<BD2>-enlazador3-<BD3>)9

donde f y g son mayores o iguales a uno.

En un aspecto donde BD2 y BD3 son iguales, y f y g son el mismo número, esto puede dar como resultado una estructura sustancialmente simétrica especular alrededor del enlazador 2, sujeta a diferencias en los enlazadores. En aspectos donde BD2 es diferente de BD3 y/o donde f y g son números diferentes, se producirán diferentes estructuras. Está dentro de la capacidad de un experto en la técnica seleccionar dominios de unión, enlazadores y frecuencias de repetición adecuados a la luz de la descripción en este documento y el conocimiento en la técnica. En la figura 11 se representan esquemáticamente ejemplos no limitantes específicos de tales trampas de ligando monocatenarias de acuerdo con la presente descripción.

Los enlazadores (1,2, 3 y 4) pueden ser iguales o diferentes. La región enlazadora proporciona un segmento que es distinto de los dominios de unión a ligando estructurados de ALK7 y ActRIIB y, por lo tanto, se puede usar para la conjugación con moléculas accesorias (p. ej., moléculas útiles para aumentar la estabilidad, tales como restos de PEGilación) sin tener que modificar químicamente los dominios de unión. El enlazador puede incluir una secuencia de aminoácidos no estructurada que puede ser la misma o derivada de modificaciones conservadoras a la secuencia de una región natural no estructurada en la porción extracelular del receptor para el ligando de interés u otro receptor en la superfamilia de TGF-p. En otros aspectos, tales enlazadores pueden ser completamente artificiales en composición y origen, pero contendrán aminoácidos seleccionados para proporcionar un enlazador flexible no estructurado con una baja probabilidad de encontrar complicaciones de impedimento electrostático o estérico cuando se acerquen al ligando de interés. La longitud del enlazador se considerará aceptable cuando permita que los dominios de unión ubicados en cada uno de los extremos amínico y carboxiterminal del enlazador se unan a sus puntos de unión naturales en su ligando natural de manera que, con ambos dominios de unión así unidos, el ligando se une con una afinidad más alta de la que estaría unido por la unión de solo uno de los dominios de unión. En algunos aspectos, el número de residuos de aminoácidos en el enlazador de origen natural o artificial se selecciona para que sea igual o mayor que la distancia mínima requerida para la unión simultánea (mediante enlace) a dos sitios de unión en el ligando de ALK7 y/o ActRIIB. Por ejemplo, y sin desear ser limitante de ninguna manera, la longitud del enlazador puede estar entre aproximadamente 1-10 aminoácidos, 10-20 aminoácidos, 18-80 aminoácidos, 25-60 aminoácidos, 35-45 aminoácidos o cualquier otra longitud adecuada.

Se pueden diseñar enlazadores para facilitar la purificación del polipéptido. El esquema de purificación exacto elegido determinará qué modificaciones se necesitan, por ejemplo y sin desear ser limitantes, se contemplan adiciones de "marcadores" de purificación tales como marcadores de His; en otros ejemplos, el enlazador puede incluir regiones para facilitar la adición de moléculas carga o accesorias. Cuando tales adiciones afectan la naturaleza no estructurada del enlazador o introducen posibles problemas electrostáticos o estéricos, se harán aumentos apropiados en la longitud del enlazador para asegurar que los dos dominios de unión sean capaces de unirse a sus respectivos sitios en el ligando. A la luz de los procedimientos y enseñanzas de este documento, un experto en la técnica podría realizar tales determinaciones de forma rutinaria.

Además, el presente diseño permite el enlace de otras moléculas de carga (por ejemplo, agentes de formación de imágenes como moléculas fluorescentes), toxinas, etc. Por ejemplo, y sin desear ser limitantes de ninguna manera, los polipéptidos monocatenarios se pueden modificar para añadir uno o más carga y/o moléculas accesorias (denominadas colectivamente en este documento R1, R2, R3, R4, etc.):

R2

Sin limitar la generalidad de los sustituyentes R disponibles, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9 pueden estar presentes o no; cuando están presentes, pueden ser iguales o diferentes, y pueden ser independientemente uno o más de: una proteína de fusión para direccionamiento, por ejemplo, pero sin limitarse a, tal como un fragmento de anticuerpo (por ejemplo, Fv monocatenario) y/o un anticuerpo de dominio único (sdAb); una radioterapia y/o agente de formación de imágenes, por ejemplo, pero sin limitarse a, un radionuceótido (por ejemplo, 123I, 111In, 18F, 64C, 68Y, 124I, 131ⁱ, 9°^y, 177Lu, 57Cu, 213Bi, 211At), un tinte fluorescente (por ejemplo, Alexa Fluor, Cy dye) y/o un marcador de proteína fluorescente (por ejemplo, GFP, DsRed); un agente citotóxico para quimioterapia, por ejemplo, pero sin limitarse a, doxorrubicina, caliqueamicina, derivados de maitansinoide (p, ej., DM1, DM4), una toxina (por ejemplo, endotoxina A de Pseudomonas truncada, toxina de difteria); un vehículo basado en nanopartículas, por ejemplo, pero sin limitarse a, polietilenglicol (PEG), un polímero conjugado con fármaco, nanovehículo o agente de formación de imágenes (por ejemplo, de un polímero N-(2-hidroxilpropil)metacrilamida (HPMA), ácido glutámico, PEG, dextrano); un fármaco (por ejemplo, pero sin limitarse a, doxorrubicina, camptotecina, paclitaxel, palatinado); un nanovehículo, por ejemplo, pero sin limitarse a, una nanocubierta o liposoma; un agente de formación de imágenes, por ejemplo, pero sin limitarse a, óxido de hierro supermagnético (SPIO); un dendrímero; y/o un soporte sólido para su uso en la purificación, concentración o secuestro de ligandos (p. ej., nanopartículas, resinas inertes, soportes de sílice adecuados).

En general, no será preferible tener moléculas de carga o accesorias en todas las posiciones posibles, ya que esto puede ocasionar complicaciones estéricas o electrostáticas. Sin embargo, los efectos de añadir una molécula de carga o accesoria a cualquier posición o posiciones dadas en la estructura se pueden determinar de manera rutinaria a la luz de la descripción en este documento modelando el enlazador entre los dominios de unión y realizando simulaciones de dinámica molecular para minimizar sustancialmente la energía de la mecánica molecular y reducir la incompatibilidad estérica y electrostática entre el enlazador y los polipéptidos de ALK7 y ActRIIB como se enseña en este documento.

Puede ser preferible añadir la molécula de carga o accesoria a la porción enlazadora del agente, en lugar del dominio de unión, para reducir la probabilidad de interferencia en la función de unión. Sin embargo, la adición al dominio de unión es posible y podría ser deseable en algunos aspectos y el efecto de dicha adición se puede determinar de forma rutinaria por adelantado modelizando el agente de unión y el enlazador con la adición propuesta como se describe en este documento.

Las metodologías de conjugación se pueden realizar usando kits comerciales que permiten la conjugación a través de grupos reactivos comunes tales como aminas primarias, ésteres de succinimidilo (NHS) y grupos reactivos con sulfhidral. Algunos ejemplos no limitantes son: el kit de etiquetado de proteínas Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, tecnologías de detección de Invitrogen) y los kits de PEGilación (Pierce Biotechnology Inc.).

En determinados aspectos, las trampas monocatenarias de ALK7:ActRIIB pueden estar asociadas covalentemente o no covalentemente con uno o más polipéptidos de ALK7 o ActRIIB, así como con otras trampas de ligando monocatenarias de ALK7:ActRIIB para formar heteromultímeros de orden superior, que pueden usarse de acuerdo con los procedimientos descritos en este documento. Véase, p. ej., el ejemplo 12. Por ejemplo, una trampa de ligando monocatenaria de ALK7:ActRIIB puede comprender además un dominio de multimerización como se describe en este documento. En algunos aspectos, las trampas de ligando monocatenarias de ALK7:ActRIIB comprenden un dominio constante de una inmunoglobulina Ig. Dichos dominios constantes de inmunoglobulinas pueden seleccionarse para promover complejos simétricos o asimétricos que comprenden al menos una trampa de ALK7:ActRIIB monocatenaria. En ciertos aspectos, una trampa monocatenaria de ALK7:ActRIIB, o combinaciones de tales trampas, pueden usarse como antagonistas de ALK7:ActRIIB para tratar o prevenir un trastorno o enfermedad relacionada con ALK7:ActRIIB como se describe en este documento (por ejemplo, enfermedad renal y/o un trastorno o afección metabólica).

Se entiende que diferentes elementos de las proteínas de fusión (p. ej., proteínas de fusión Fc de inmunoglobulina) se pueden disponer de cualquier manera que sea compatible con la funcionalidad deseada. Por ejemplo, un dominio de polipéptido de ALK7 y/o ActRIIB se puede colocar en el extremo carboxiterminal a un dominio heterólogo o, alternativamente, un dominio heterólogo se puede colocar en el extremo carboxiterminal a un dominio de polipéptido de ALK7 y/o ActRIIB. El dominio de polipéptido de ALK7 y/o ActRIIB y el dominio heterólogo no necesitan estar adyacentes en una proteína de fusión, y se pueden incluir dominios o secuencias de aminoácidos adicionales carboxio aminoterminales a cualquier dominio o entre los dominios.

Por ejemplo, una proteína de fusión de receptor ALK7 y/o ActRIIB puede comprender una secuencia de aminoácidos como se expone en la fórmula A-B-C. La porción B corresponde a un dominio de polipéptido de ALK7 o ActRIIB. Las porciones A y C pueden ser independientemente cero, uno o más de un aminoácido, y las porciones tanto A como C, cuando están presentes, son heterólogas a B. Las porciones A y/o C se pueden fijar a la porción B a través de una secuencia de enlazador. Un enlazador puede ser rico en glicina (p. ej., 2-10, 2-5, 2-4, 2-3 residuos de glicina) o residuos de glicina y prolina y puede, por ejemplo, contener una única secuencia de treonina/serina y glicinas o secuencias repetidas de treonina/serina y/o glicinas, p. ej., singletes o repeticiones de GGG (SEQ ID NO: 13), GGGG (SEQ ID NO: 14), TGGGG (SEQ ID NO: 15), SGGGG (SEQ ID NO: 16), TGGG (SEQ ID NO: 17), SGGG (SEQ ID NO: 18) o GGGGS (SEQ ID NO: 58). En ciertos aspectos, una proteína de fusión de ALK7 y/o ActRIIB comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en la fórmula A-B-C, donde A es una secuencia líder (señal), B consiste en un dominio de polipéptido de ALK7 y/o ActRIIB y C es una porción de polipéptido que mejora una o más de estabilidad in vivo, semivida in vivo, absorción/administración, ubicación o distribución tisular, formación de complejos proteicos y/o purificación. En ciertos aspectos, una proteína de fusión de ALK7 y/o ActRIIB comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en la fórmula A-B-C, donde A es una secuencia líder de TPA, B es un dominio de polipéptido de receptor ALK7 y/o ActRIIB y C es un dominio Fc de inmunoglobulina. Las proteínas de fusión preferidas comprenden la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 71, 73, 74, 76, 77, 78, 79 y 80.

En algunos aspectos, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB comprenden además una o más porciones heterólogas (dominios) para conferir una propiedad deseada. Por ejemplo, algunos dominios de fusión son particularmente útiles para el aislamiento de proteínas de fusión mediante cromatografía de afinidad. Los ejemplos muy conocidos de tales dominios de fusión incluyen, pero no se limitan a, polihistidina, Glu-Glu, glutatión S-transferasa (GST), tiorredoxina, proteína A, proteína G, una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina (Fc), proteína de unión a maltosa (MBP) o albúmina sérica humana. Con fines de purificación por afinidad, se usan matrices relevantes para cromatografía de afinidad, tales como resinas conjugadas a glutatión, amilasa y níquel o cobalto. Muchas de tales matrices están disponibles en forma de “kit”, tal como el sistema de purificación de GST de Pharmacia y el sistema QIAexpress™ (Qiagen) útiles con parejas de fusión (HIS6). Como otro ejemplo, se puede seleccionar un dominio de fusión para facilitar la detección de los polipéptidos de trampa de ligando. Los ejemplos de los dominios de detección de este tipo incluyen las diversas proteínas fluorescentes (por ejemplo, GFP), así como los "epítopos de identificación", que son normalmente secuencias peptídicas cortas para las que está disponible un anticuerpo específico. Los epítopos de identificación muy conocidos para los que se dispone fácilmente de anticuerpos monoclonales específicos incluyen epítopos FLAG, hemaglutinina (H^a) del virus de la gripe y c-myc. En algunos casos, los dominios de fusión tienen un punto de escisión de proteasas, tal como para el factor Xa o la trombina, que permite que la proteasa relevante digiera parcialmente las proteínas de fusión y libere de ese modo las proteínas recombinantes de las mismas. Las proteínas liberadas se pueden aislar a continuación del dominio de fusión mediante separación cromatográfica posterior.

En ciertos aspectos, los polipéptidos de ALK7 y/o ActRIIB pueden contener una o más modificaciones que son capaces de estabilizar los polipéptidos. Por ejemplo, tales modificaciones mejoran la semivida in vitro de los polipéptidos, mejoran la semivida circulatoria de los polipéptidos y/o reducen la degradación proteolítica de los polipéptidos. Tales modificaciones estabilizadoras incluyen, pero no se limitan a, proteínas de fusión (que incluyen, por ejemplo, proteínas de fusión que comprenden un dominio de polipéptido de ALK7 y/o ActRIIB y un dominio estabilizador), modificaciones de un punto de glucosilación (que incluyen, por ejemplo, la adición de un punto de glucosilación a un polipéptido de la descripción) y modificaciones de restos carbohidrato (que incluyen, por ejemplo, la retirada de restos carbohidrato de un polipéptido de la descripción). Como se emplea en este documento, el término “dominio estabilizador” no solo se refiere a un dominio de fusión (p. ej., un dominio Fc de inmunoglobulina) como en el caso de las proteínas de fusión, sino que también incluye modificaciones no proteicas tales como un resto carbohidrato, o resto no proteico, tal como polietilenglicol.

En aspectos preferidos, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB que se van a usar según los procedimientos descritos en este documento son complejos aislados. Como se emplea en este documento, una proteína (o complejo proteico) o un polipéptido (o complejo polipeptídico) aislado es uno que ha sido separado de un componente de su entorno natural. En algunos aspectos, un heteromultímero de la descripción se purifica hasta más de 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de pureza como se determina mediante, por ejemplo, electroforesis (p. ej., SDS-PAGE, isoelectroenfoque (IEF), electroforesis capilar) o cromatografía (p. ej., HPLc de intercambio iónico o de fase inversa). Los procedimientos para la evaluación de la pureza de los anticuerpos son muy conocidos en la técnica [Flatman y col., (2007) J. Chromatogr. B 848: 79-87]. En algunos aspectos, las preparaciones de heteromultímeros ALK7:ActRIIB están sustancialmente libres de homomultímeros de ALK7 y/o ActRIIB. Por ejemplo, en algunos aspectos, las preparaciones de heteromultímeros ALK7:ActRIIB comprenden menos de aproximadamente un 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % o menos de aproximadamente un 1 % de homomultímeros de ALK7. En algunos aspectos, las preparaciones de heteromultímeros ALK7:ActRIIB comprenden menos de aproximadamente un 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % o menos de aproximadamente un 1 % de homomultímeros de ActRIIB. En algunos aspectos, las preparaciones de heteromultímeros ALK7:ActRIIB comprenden menos de aproximadamente un 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % o menos de aproximadamente un 1 % de homomultímeros de ALK7 y menos de aproximadamente un 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % o menos de aproximadamente un 1 % de homomultímeros de ActRIIB.

En ciertos aspectos, los polipéptidos de ALK7 y/o ActRIIB, así como los heteromultímeros que los comprenden, pueden producirse mediante un abanico de técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo, los polipéptidos se pueden sintetizar usando técnicas de química proteica estándar, tales como las descritas en Bodansky, M. Principles of Peptide Synthesis, Springer Verlag, Berlín (1993) y Grant G. A. (ed.), Synthetic Peptides: A User's Guide, W. H. Freeman and Company, Nueva York (1992). Además, los sintetizadores de péptidos automatizados se encuentran disponibles comercialmente (Advanced Chemtech Modelo 396; Milligen/Biosearch 9600). Alternativamente, los polipéptidos y complejos, lo que incluye fragmentos o variantes de los mismos, se pueden producir recombinantemente usando diversos sistemas de expresión [E. coli, células de ovario de hámster chino (CHO), células COS, baculovirus], como se sabe bien en la técnica. En un aspecto adicional, los polipéptidos modificados o no modificados de la descripción se pueden producir mediante digestión de polipéptidos de ALK7 y/o ActRIIB de longitud completa producidos recombinantemente usando, por ejemplo, una proteasa, p, ej., tripsina, termolisina, quimotripsina, pepsina o enzima convertidora de aminoácidos básicos emparejados (PACE). Se puede usar análisis por ordenador (usando software disponible comercialmente, por ejemplo, MacVector, Omega, PCGene, Molecular Simulation, Inc.) para identificar los puntos de escisión proteolítica.

B. Ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de ALK7 y/o ActRIIB

En ciertos aspectos, la presente descripción proporciona ácidos nucleicos aislados y/o recombinantes que codifican los receptores ALK7 y/o ActRIIB (lo que incluye fragmentos, variantes funcionales y proteínas de fusión de los mismos) descritos en este documento. Por ejemplo, la SEQ ID NO: 11 codifica el polipéptido precursor de ALK7 humano de origen natural, mientras que la SEQ ID NO: 12 codifica un dominio extracelular maduro de ALK7. Los ácidos nucleicos objetivo pueden ser monocatenarios o bicatenarios. Tales ácidos nucleicos pueden ser moléculas de ADN o ARN. Estos ácidos nucleicos se pueden usar, por ejemplo, en procedimientos para preparar heteromultímeros ALK7:ActRIIB como se describe en este documento.

Como se emplea en este documento, ácido nucleico aislado se refiere a una molécula de ácido nucleico que ha sido separada de un componente de su entorno natural. Un ácido nucleico aislado incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que normalmente contienen la molécula de ácido nucleico, pero la molécula de ácido nucleico está presente extracromosómicamente o en una ubicación cromosómica que es diferente de su ubicación cromosómica natural.

En ciertos aspectos, la expresión ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de ALK7 y/o ActRIIB de la presente descripción se entiende que incluye cualquiera de las SEQ ID NO: 7, 8, 11, 12, 21, 22, 40, 41, 44, 45, 72 o 75, así como variantes de las mismas. Las variantes de secuencias de nucleótidos incluyen secuencias que difieren en una o más sustituciones, adiciones o eliminaciones de nucleótidos, lo que incluye variantes alélicas, y, por lo tanto, incluirán secuencias codificantes que difieren de la secuencia de nucleótidos designada en cualquiera de las SEQ ID NO: 7, 8, 11, 12, 21, 22, 40, 41, 44, 45, 72 o 75.

En ciertos aspectos, los polipéptidos de ALK7 y/o ActRIIB de la superfamilia de TGFp de la presente descripción están codificados por secuencias de ácido nucleico aisladas o recombinantes que comprenden, consisten esencialmente en o consisten en una secuencia que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a las SEQ ID NO: 7, 8, 11, 12, 21, 22, 40, 41, 44, 45, 72 o 75. Un experto en la técnica apreciará que las secuencias de ácido nucleico que comprenden, consisten esencialmente en o consisten en una secuencia complementaria a una secuencia que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a las SEQ ID NO: 7, 8, 11, 12, 21, 22, 40, 41, 44, 45, 72 o 75 también dentro del alcance de la presente descripción. En aspectos adicionales, las secuencias de ácidos nucleicos de la descripción se pueden aislar, recombinar y/o fusionar con una secuencia de nucleótidos heteróloga, o en una genoteca.

En otros aspectos, los ácidos nucleicos de la presente descripción también incluyen secuencias de nucleótidos que se hibridan en condiciones rigurosas a la secuencia de nucleótidos designada en las SEQ ID NO: 7, 8, 11, 12, 21,22, 40, 41, 44, 45, 72 o 75, las secuencias complementarias de SEQ ID NO: 7, 8, 11, 12, 21, 22, 40, 41, 44, 45, 72 o 75, o fragmentos de las mismas. Un experto en la técnica entenderá fácilmente que las condiciones de rigurosidad apropiadas que favorecen la hibridación de ADN se pueden variar. Por ejemplo, se podría realizar la hibridación a 6,0 x cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45 °C, seguido de un lavado de 2,0 x SSC a 50 °C. Por ejemplo, la concentración salina en la etapa de lavado se puede seleccionar desde una rigurosidad baja de aproximadamente 2,0 x SSC a 50 °C hasta una rigurosidad alta de aproximadamente 0,2 x SSC a 50 °C. Además, la temperatura de la etapa de lavado se puede aumentar de condiciones de rigurosidad baja a temperatura ambiente, aproximadamente 22 °C, a condiciones de rigurosidad alta a aproximadamente 65 °C. Tanto la temperatura como la sal se pueden variar, o la temperatura o la concentración salina se pueden mantener constantes mientras se cambia la otra variable. En un aspecto, la descripción proporciona ácidos nucleicos que se hibridan en condiciones de rigurosidad baja de 6 x SSC a temperatura ambiente, seguido de un lavado en 2 x SSC a temperatura ambiente.

Los ácidos nucleicos aislados que difieren de los ácidos nucleicos como se exponen en las SEQ ID NO: 7, 8, 11, 12, 21, 22, 40, 41, 44, 45, 72 o 75, por la degeneración en el código genético, también se encuentran dentro del alcance de la descripción. Por ejemplo, varios aminoácidos se designan mediante más de un triplete. Los codones que especifican el mismo aminoácido, o sinónimos (por ejemplo, CAU y CAC son sinónimos para histidina), pueden dar como resultado mutaciones “imperceptibles” que no afectan a la secuencia de aminoácidos de la proteína. Sin embargo, se espera que los polimorfismos de la secuencia de ADN que conducen a cambios en las secuencias de aminoácidos de las proteínas objetivo existan entre las células de mamíferos. Un experto en la técnica apreciará que estas variaciones en uno o más nucleótidos (hasta aproximadamente 3-5 % de los nucleótidos) de los ácidos nucleicos que codifican una proteína particular pueden existir entre individuos de una especie dada debido a la variación alélica natural. Cualquiera y todas tales variaciones de nucleótidos y los polimorfismos de aminoácidos resultantes se encuentran dentro del alcance de esta descripción.

En ciertos aspectos, los ácidos nucleicos recombinantes de la descripción se pueden unir operativamente a una o más secuencias de nucleótidos reguladoras en una construcción de expresión. Las secuencias de nucleótidos reguladoras generalmente serán apropiadas para la célula hospedadora usada para la expresión. Se conocen en la técnica numerosos tipos de vectores de expresión apropiados y secuencias reguladoras adecuadas para un abanico de células hospedadoras. Típicamente, dicha una o más secuencias de nucleótidos reguladoras pueden incluir, pero no se limitan a, secuencias promotoras, secuencias líder o señal, puntos de unión al ribosoma, secuencias de inicio y terminación de la transcripción, secuencias de inicio y terminación de la traducción y secuencias potenciadoras o activadoras. La descripción contempla los promotores constitutivos o inducibles como se conocen en la técnica. Los promotores pueden ser promotores de origen natural o promotores híbridos que combinan elementos de más de un promotor. Una construcción de expresión puede estar presente en una célula en un episoma, tal como un plásmido, o la construcción de expresión se puede insertar en un cromosoma. En algunos aspectos, el vector de expresión contiene un gen marcador seleccionable para permitir la selección de células hospedadoras transformadas. Los genes marcadores seleccionables son muy conocidos en la técnica y variarán con la célula hospedadora usada.

En ciertos aspectos, el ácido nucleico objetivo se proporciona en un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de ALK7 y/o ActRIIB y unido operativamente a al menos una secuencia reguladora. Las secuencias reguladoras están reconocidas en la técnica y se seleccionan para dirigir la expresión del polipéptido de ALK7 y/o ActRIIB. Por consiguiente, el término secuencia reguladora incluye promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión. Las secuencias reguladoras ejemplares se describen en Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, Ca (1990). Por ejemplo, se puede usar cualquiera de un amplio abanico de secuencias de control de la expresión que controlan la expresión de una secuencia de ADN cuando están enlazadas operativamente a ella en estos vectores para expresar secuencias de ADN que codifican un polipéptido de ALK7 y/o ActRIIB. Tales secuencias de control de la expresión útiles incluyen, por ejemplo, los promotores temprano y tardío de SV40, el promotor tet, el promotor temprano inmediato de adenovirus o citomegalovirus, los promotores de RSV, el sistema lac, el sistema trp, el sistema TAC o TRC, el promotor T7 cuya expresión es dirigida por la T7 ARN polimerasa, las principales regiones operadoras y promotoras del fago lambda, las regiones de control para la proteína de la envoltura de fd, el promotor para la 3-fosfoglicerato cinasa u otras enzimas glucolíticas, los promotores de la fosfatasa ácida, p. ej., Pho5, los promotores de los factores de apareamiento a de la levaduras, el promotor de poliedros del sistema de baculovirus y otras secuencias que se sabe que controlan la expresión de genes de células procariotas o eucariotas o sus virus y diversas combinaciones de los mismos. Se debe entender que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula hospedadora que se va a transformar y/o el tipo de proteína que se desea expresar. Asimismo, también se debe considerar el número de copias del vector, la capacidad para controlar ese número de copias y la expresión de cualquier otra proteína codificada por el vector, tal como los marcadores de antibióticos.

Un ácido nucleico recombinante de la presente descripción se puede producir ligando el gen clonado, o una porción del mismo, a un vector adecuado para la expresión en células procariotas, células eucariotas (levadura, ave, insecto o mamífero) o ambas. Los vehículos de expresión para la producción de un polipéptido de ALK7 y/o ActRIIB recombinante incluyen plásmidos y otros vectores. Por ejemplo, los vectores adecuados incluyen plásmidos de los tipos siguientes: plásmidos derivados de pBR322, plásmidos derivados de pEMBL, plásmidos derivados de pEX, plásmidos derivados de pBTac y plásmidos derivados de pUC para la expresión en células procariotas, tales como E.

coli..

Algunos vectores de expresión de mamífero contienen tanto secuencias procariotas para facilitar la propagación del vector en bacterias, como una o más unidades de transcripción eucariotas que se expresan en células eucariotas. Los vectores derivados de pcDNAI/amp, pcDNAI/neo, pRc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pSV2-dhfr, pTk2, pRSVneo, pMSG, pSVT7, pko-neo y pHyg son ejemplos de vectores de expresión de mamífero adecuados para la transfección de células eucariotas. Algunos de estos vectores se modifican con secuencias de plásmidos bacterianos, tales como pBR322, para facilitar la replicación y la selección por resistencia a fármacos tanto en células procariotas como en eucariotas. Alternativamente, los derivados de virus tales como el virus del papiloma bovino (VPB-1) o el virus de Epstein-Barr (pHEBo, derivado de pREP y p205) se pueden usar para la expresión transitoria de proteínas en células eucariotas. Los ejemplos de otros sistemas de expresión víricos (lo que incluye los retrovíricos) se pueden encontrar más adelante en la descripción de sistemas de administración de genoterapia. Los diversos procedimientos empleados en la preparación de los plásmidos y en la transformación de organismos hospedadores son muy conocidos en la técnica. Para consultar otros sistemas de expresión adecuados tanto para células procariotas como eucariotas, así como procedimientos recombinantes generales [Molecular Cloning A Laboratory Manual, 3a ed., ed. por Sambrook, Fritsch y Maniatis Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001]. En algunos aspectos, puede ser deseable expresar los polipéptidos recombinantes mediante el uso de un sistema de expresión de baculovirus. Los ejemplos de tales sistemas de expresión de baculovirus incluyen vectores derivados de pVL (tales como pVL1392, pVLl393 y pVL941), vectores derivados de pAcUW (como pAcUWI) y vectores derivados de pBlueBac (tal como el pBlueBac III que contiene p-gal).

En un aspecto preferido, se diseñará un vector para la producción de los polipéptidos de ALK7 y/o ActRIIB objetivo en células CHO, tal como un vector Pcmv-Script (Stratagene, La Jolla, Calif.), vectores pcDNA4 (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) y vectores pCI-neo (Promega, Madison, Wisc.). Como resultará evidente, las construcciones genéticas objetivo se pueden usar para provocar la expresión del polipéptido de ALK7 y/o ActRIIB objetivo en células propagadas en cultivo, p. ej., para producir proteínas, lo que incluye proteínas de fusión o variantes de proteínas, para purificación.

Esta descripción se refiere también a una célula hospedadora transfectada con un gen recombinante que incluye una secuencia codificante para uno o más de los polipéptidos de ALK7 y/o ActRIIB objetivo. La célula hospedadora puede ser cualquier célula procariota o eucariota. Por ejemplo, un polipéptido de ALK7 y/o ActRIIB se puede expresar en células bacterianas tales como E. coli, células de insecto (p. ej., usando un sistema de expresión de baculovirus), células de levadura o de mamífero [p. ej., una estirpe de células de ovario de hámster chino (CHO)]. Los expertos en la técnica conocen otras células hospedadoras adecuadas.

Por consiguiente, la presente descripción se refiere además a procedimientos para producir los polipéptidos de ALK7 y/o ActRIIB objetivo. Por ejemplo, una célula hospedadora transfectada con un vector de expresión que codifica un polipéptido de ALK7 y/o ActRIIB se puede cultivar en condiciones apropiadas para permitir que se produzca la expresión del polipéptido de ALK7 y/o ActRIIB. El polipéptido puede ser secretado y aislado de una mezcla de células y medio que contiene el polipéptido. Alternativamente, el polipéptido de ALK7 y/o ActRIIB se puede aislar a partir de una fracción de membrana o citoplásmica obtenida de las células recogidas y lisadas. Un cultivo celular incluye células hospedadoras, medios y otros subproductos. Los medios adecuados para el cultivo celular son muy conocidos en la técnica. Los polipéptidos objetivo se pueden aislar del medio de cultivo celular, las células hospedadoras, o ambos, usando técnicas conocidas en la técnica para purificar proteínas, que incluyen cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de filtración en gel, ultrafiltración, electroforesis, purificación por inmunoafinidad con anticuerpos específicos para epítopos particulares de los polipéptidos de ALK7 y/o ActRIIB, y purificación por afinidad con un agente que se une a un dominio fusionado al polipéptido de ALK7 y/o ActRIIB (p. ej., se puede usar una columna de proteína A para purificar proteínas de fusión ALK7-Fc y/o ActRIIB-Fc). En algunos aspectos, el polipéptido de ALK7 y/o ActRIIB es una proteína de fusión que contiene un dominio que facilita su purificación.

En algunos aspectos, la purificación se consigue mediante una serie de etapas de cromatografía en columna, que incluyen, por ejemplo, tres o más de las siguientes, en cualquier orden: cromatografía en columna de proteína A, cromatografía en columna de Q Sepharose, cromatografía en columna de fenilsefarosa, cromatografía de exclusión molecular y cromatografía de intercambio catiónico. La purificación se podría completar con filtración vírica e intercambio de tampón. Un polipéptido de ALK7 y/o ActRIIB, así como proteínas de fusión y complejos heteroméricos de las mismas, se pueden purificar hasta una pureza de >90 %, >95 %, >96 %, >98 % o >99 % como se determina mediante cromatografía de exclusión molecular y >90 %, >95 %, >96 %, >98 % o >99 % como se determina mediante SDS PAGE. El nivel objetivo de pureza debe ser uno que sea suficiente para conseguir resultados deseables en sistemas de mamífero, particularmente de primates no humanos, roedores (ratones) y seres humanos.

En otro aspecto, un gen de fusión que codifica una secuencia líder de purificación, tal como una secuencia de un punto de escisión de poli-(His)/enterocinasa en el extremo amínico de la porción deseada del polipéptido de ALK7 y/o ActRIIB recombinante, puede permitir la purificación de la proteína de fusión expresada mediante cromatografía de afinidad usando una resina metálica de Ni2+. La secuencia líder de purificación se puede eliminar posteriormente mediante tratamiento con enterocinasa para proporcionar el polipéptido de ALK7 y/o ActRIIB purificado, así como heteromultímeros del mismo [Hochuli y col., (1987) J. Chromatography 411: 177 y Janknecht y col., (1991) PNAS EE. UU. 88: 8972].

Las técnicas para fabricar genes de fusión son muy conocidas. Esencialmente, la unión de diversos fragmentos de ADN que codifican diferentes secuencias de polipéptidos se realiza según técnicas convencionales, empleando extremos romos o irregulares para la ligadura, digestión con enzimas de restricción para proporcionar extremos apropiados, relleno de extremos cohesivos según proceda, tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar uniones no deseables y ligadura enzimática. En otro aspecto, el gen de fusión se puede sintetizar mediante técnicas convencionales que incluyen sintetizadores de ADN automatizados. Alternativamente, la amplificación por PCR de fragmentos genéticos se puede llevar a cabo usando cebadores de anclaje que dan lugar a salientes complementarios entre dos fragmentos genéticos consecutivos que posteriormente se pueden hibridar para generar una secuencia genética quimérica. Véase, p. ej., Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel y col., John Wiley & Sons: 1992.

C. Antagonistas de anticuerpos

En ciertos aspectos, un antagonista de ALK7:ActRIIB es un anticuerpo (anticuerpo antagonista de ALK7:ActRIIB) o una combinación de anticuerpos. Un anticuerpo antagonista de ALK7:ActRIIB, o combinación de anticuerpos, puede unirse, por ejemplo, a uno o más ligandos de ALK7, ligandos de ActRIIB, ligandos de unión a ALK7:ActRIIB, un receptor ALK7, un receptor ActRIIB, y/o un correceptor de la superfamilia de TGF-beta (p. ej., Crypto o Cryptic). Como se describe en este documento, se pueden usar anticuerpos antagonistas de ALK7:ActRIIB, solos o en combinación con una o más terapias de apoyo o agentes activos, para tratar a un paciente que lo necesite (p. ej., pacientes que tienen enfermedad renal y/o un trastorno o afección metabólica).

En ciertos aspectos, un anticuerpo antagonista de ALK7:ActRIIB, o combinación de anticuerpos, es un anticuerpo que inhibe uno o más de los ligandos unidos o probablemente unidos por un heteromultímero ALK7:ActRIIB, tales como activina B, GDF11, activina A, BMP10, B^mP6, BMP5, GDF3, activina C, activina E, activina AC, activina BC, activina AE, nodal o activina BE. Por lo tanto, en algunos aspectos, un anticuerpo antagonista de ALK7:ActRIIB, o combinación de anticuerpos, se une a al menos uno de dichos ligandos. Como ejemplo, como se emplea en este documento, un anticuerpo de activina C (o anticuerpo anti-activina C) generalmente se refiere a un anticuerpo que puede unirse a activina C con suficiente afinidad de modo que el anticuerpo sea útil como agente de diagnóstico y/o terapéutico en el direccionamiento de la activina C. En ciertos aspectos, el grado de unión de un anticuerpo de activina C a una proteína no relacionada con la activina C es menos de aproximadamente un 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % o menos de aproximadamente un 1 % de la unión del anticuerpo a la activina C medida, por ejemplo, mediante un radioinmunoanálisis (RIA), Biacore u otra interacción de proteínas o ensayo de afinidad de unión. En ciertos aspectos, un anticuerpo anti-activina C se une a un epítopo de activina C que se conserva entre activina C de diferentes especies. En ciertos aspectos preferidos, un anticuerpo anti-activina C se une a la activina C humana. En algunos aspectos, un anticuerpo de activina C puede inhibir que la activina C se una a un receptor de tipo I y/o tipo II (p. ej., ActRIIB y/o ALK7) y por tanto inhiben la transducción de señales mediada por activina C (p. ej., transducción de señales de Smad). En algunos aspectos, un anticuerpo de activina C puede inhibir la unión de activina C a un correceptor y, por tanto, inhibir la transducción de señales mediada por activina C (p. ej., transducción de señales de Smad). Cabe señalar que la activina C comparte alguna homología de secuencia con la activina A, B y E y, por lo tanto, los anticuerpos que se unen a la activina C, en algunos aspectos, también pueden unirse a y/o inhibir otra activina. En algunos aspectos, la descripción se refiere a un anticuerpo multiespecífico (p. ej., anticuerpo biespecífico) y usos del mismo, que se une, por ejemplo, a activina C y se une además, por ejemplo, a uno o más ligandos de la superfamilia de TGF-p adicionales. que se unen al heteromultímero ALK7:ActRIIB [p. ej., activina (p. ej., activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE o activina BE), G^dF11, GDF8, BMP10, BMP6, BMP5, nodal y GDF3], uno o más receptores de tipo I y/o receptores de tipo II (p. ej., ActRIIB y/o ALK7), y/o uno o más correceptores. En algunos aspectos, un anticuerpo multiespecífico que se une a activina C no se une o no se une sustancialmente a BMP9 (p. ej., se une a BMP9 con una K^dsuperior a 1 x 10'7 M o tiene una unión relativamente modesta, p. ej., aproximadamente 1 x 10-8 M o aproximadamente 1 x 10-9 M). En algunos aspectos, la descripción se refiere a combinaciones de anticuerpos y usos de los mismos, donde la combinación de anticuerpos comprende una combinación de anticuerpos que se unen, por ejemplo, a dos o más ligandos de la superfamilia de TGF-p que se unen al heteromultímero ALK7:ActRIIB [p. ej., activina ( p. ej., activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina A^eo activina BE), GDF11, GDF8, BMP10, BMP6, BMP5, nodal y GDF] uno o más receptores de tipo I y/o receptores de tipo II (p. ej., ActRIIB y/o ALK7), y/o uno o más correceptores. En algunos aspectos, una combinación de anticuerpos no comprende un anticuerpo de BMP9.

En ciertos aspectos, un anticuerpo antagonista de ALK7:ActRIIB, o una combinación de anticuerpos, es un anticuerpo que inhibe al menos GDF8. Por lo tanto, en algunos aspectos, un anticuerpo antagonista de ALK7:ActRIIB, o una combinación de anticuerpos, se une al menos a GDF8. Como se emplea en este documento, anticuerpo de GDF8 (o anticuerpo anti-GDF8) generalmente se refiere a un anticuerpo que se une a GDF8 con afinidad suficiente, de tal manera que el anticuerpo es útil como agente de diagnóstico y/o agente terapéutico en el direccionamiento a GDF8. En ciertos aspectos, el grado de unión de un anticuerpo de ^gDF8 a una proteína distinta de GDF8 no relacionada es inferior a aproximadamente un 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % o inferior a aproximadamente un 1 % de la unión del anticuerpo a GDF8 como se mide, por ejemplo, mediante un radioinmunoanálisis (RIA), Biacore, u otro ensayo de interacción con o afinidad de unión a proteínas. En ciertos aspectos, un anticuerpo de GDF8 se une a un epítopo de GDF8 que se conserva entre GDF8 de diferentes especies. En ciertos aspectos preferidos, un anticuerpo anti-GDF8 se une a GDF8 humana. En algunos aspectos, un anticuerpo de GDF8 puede inhibir que GDF8 se una a un receptor de tipo I y/o tipo II (p. ej., ActRIIB y/o ALK7) y por tanto inhibir la transducción de señales mediada por GDF8 (p. ej., transducción de señales de Smad). En algunos aspectos, un anticuerpo de GDF8 puede inhibir que GDF8 se una a un correceptor y así inhibir la transducción de señales mediada por GDF8 (p. ej., transducción de señales de Smad). Cabe señalar que GDF8 tiene una alta homología de secuencia con GDF11 y, por lo tanto, los anticuerpos que se unen a GDF8, en algunos aspectos, también pueden unirse a y/o inhibir GDF11. En algunos aspectos, la descripción se refiere a un anticuerpo multiespecífico (p. ej., anticuerpo biespecífico) y usos del mismo, que se une a GDF8 y se une además a, por ejemplo, uno o más ligandos de la superfamilia de TGF-p adicionales. [p. ej., activina (p. ej., activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina a E, activina BE), GDF11, BMP10, BMP6, BMP5, nodal y GDF3], uno o más receptores de tipo I y/o receptores de tipo II (p. ej., ActRIIB y/o ALK7), y/o uno o más correceptores. En algunos aspectos, un anticuerpo multiespecífico que se une a GDF8 no se une o no se une sustancialmente a BMP9 (p. ej., se une a BMP9 con una K^dsuperior a 1 x 10-7 M o tiene una unión relativamente modesta, p. ej., aproximadamente 1 x 10-8 M o aproximadamente 1 x 10-9 M). En algunos aspectos, la descripción se refiere a combinaciones de anticuerpos y usos de los mismos, donde la combinación de anticuerpos comprende un anticuerpo de GDF8 y uno o más anticuerpos adicionales que se unen, por ejemplo, a uno o más ligandos de la superfamilia de TGF-p adicionales. [p. ej., activina (p. ej., activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE, activina BE), GDF11, GDF3, BMP6, BMP10, nodal y BMP5], uno o más receptores de tipo I y/o receptores de tipo II (p. ej., ActRIIB y/o ALK7), y/o uno o más correceptores. En algunos aspectos, una combinación de anticuerpos que comprende un anticuerpo de GDF8 no comprende un anticuerpo de BMP9.

En ciertos aspectos, un anticuerpo antagonista de ALK7:ActRIIB, o una combinación de anticuerpos, es un anticuerpo que inhibe al menos GDF11. Por lo tanto, en algunos aspectos, un anticuerpo antagonista de ALK7:ActRIIB, o una combinación de anticuerpos, se une al menos a GDF11. Como se emplea en este documento, anticuerpo de GDF11 (o anticuerpo anti-GDF11) generalmente se refiere a un anticuerpo que se une a GDF11 con afinidad suficiente, de tal manera que el anticuerpo es útil como agente de diagnóstico y/o agente terapéutico en el direccionamiento a GDF11. En ciertos aspectos, el grado de unión de un anticuerpo de GDF11 a una proteína distinta de GDF11 no relacionada es inferior a aproximadamente un 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % o inferior a aproximadamente un 1 % de la unión del anticuerpo a GDF11 como se mide, por ejemplo, mediante un radioinmunoanálisis (RIA), Biacore, u otro ensayo de interacción con o afinidad de unión a proteínas. En ciertos aspectos, un anticuerpo de GDF11 se une a un epítopo de GDF11 que se conserva entre GDF11 de diferentes especies. En ciertos aspectos preferidos, un anticuerpo anti-GDF11 se une a GDF11 humana. En algunos aspectos, un anticuerpo de GDF11 puede inhibir que GDF11 se una a un receptor de tipo I y/o tipo II (p. ej., ActRIIB y/o ALK7) y por tanto inhibir la transducción de señales mediada por GDF11 (p. ej., transducción de señales de Smad). En algunos aspectos, un anticuerpo de GDF11 puede inhibir que GDF11 se una a un correceptor y así inhibir la transducción de señales mediada por GDF11 (p. ej., transducción de señales de Smad). Cabe señalar que GDF11 tiene una alta homología de secuencia con GDF8 y, por lo tanto, los anticuerpos que se unen a GDF11, en algunos aspectos, también pueden unirse a y/o inhibir GDF8. En algunos aspectos, la descripción se refiere a un anticuerpo multiespecífico (p. ej., anticuerpo biespecífico) y usos del mismo, que se une a GDF11 y se une además a, por ejemplo, uno o más ligandos de la superfamilia de TGF-p adicionales. [p. ej., activina (p. ej., activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE, activina BE), ^gD^f11, BMP10, BMP6, BMP5, nodal y GDF3], uno o más receptores de tipo I y/o receptores de tipo II (p. ej., ActRIIB y/o ALK7), y/o uno o más correceptores. En algunos aspectos, un anticuerpo multiespecífico que se une a GDF11 no se une o no se une sustancialmente a BMP9 (p. ej., se une a BMP9 con una K^dsuperior a 1 x 10-7 M o tiene una unión relativamente modesta, p. ej., aproximadamente 1 x 10-8 M o aproximadamente 1 x 10-9 M). En algunos aspectos, la descripción se refiere a combinaciones de anticuerpos y usos de los mismos, donde la combinación de anticuerpos comprende un anticuerpo de GDF11 y uno o más anticuerpos adicionales que se unen, por ejemplo, a uno o más ligandos de la superfamilia de TGF-p adicionales. [p. ej., activina (p. ej., activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE, activina BE), GDF8, GDF3, BMP6, BMP10, nodal y BMP5], uno o más receptores de tipo I y/o receptores de tipo II (p. ej., ActRIIB y/o ALK7), y/o uno o más correceptores. En algunos aspectos, una combinación de anticuerpos que comprende un anticuerpo de GDF11 no comprende un anticuerpo de BMP9.

En ciertos aspectos, un anticuerpo antagonista de ALK7:ActRIIB, o combinación de anticuerpos, es un anticuerpo que inhibe al menos la activina (activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina AE, activina BC y/o activina BE). Por lo tanto, en algunos aspectos, un anticuerpo antagonista de ALK7:ActRIIB, o combinación de anticuerpos, se une a al menos activina (activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina AE, activina BC y/o activina BE). Como se emplea en este documento, anticuerpo de activina (o anticuerpo antiactivina) generalmente se refiere a un anticuerpo que se puede unir a una forma de activina con afinidad suficiente, de tal manera que el anticuerpo es útil como agente de diagnóstico y/o agente terapéutico en el direccionamiento a esa forma de activina. En ciertos aspectos, el grado de unión de un anticuerpo de activina a una proteína distinta de activina no relacionada es inferior a aproximadamente un 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % o inferior a aproximadamente un 1 % de la unión del anticuerpo a activina como se mide, por ejemplo, mediante un radioinmunoanálisis (RIA), Biacore, u otro ensayo de interacción con o afinidad de unión a proteínas. En ciertos aspectos, un anticuerpo anti-activina se une a un epítopo de activina que se conserva entre activina de diferentes especies. En ciertos aspectos preferidos, un anticuerpo anti-activina se une a activina humana. En otros aspectos preferidos, un anticuerpo de activina puede inhibir que activina se una a un receptor de tipo I y/o tipo II (p. ej., ActRIIB y/o ALK7) y por tanto inhibir la transducción de señales mediada por activina (p. ej., transducción de señales de Smad). En algunos aspectos, un anticuerpo de activina se une a activina B. En algunos aspectos, un anticuerpo de activina se une a activina A. En algunos aspectos, un anticuerpo de activina se une a activina A y activina B. En algunos aspectos, un anticuerpo de activina se une a activina AB. En algunos aspectos, un anticuerpo de activina se une a activina C. En algunos aspectos, un anticuerpo de activina se une a activina E. En algunos aspectos, un anticuerpo de activina se une a activina A y activina C. En algunos aspectos, un anticuerpo de activina se une a activina AC. En algunos aspectos, un anticuerpo de activina se une a activina A y activina E. En algunos aspectos, un anticuerpo de activina se une a activina AE. En algunos aspectos, un anticuerpo de activina se une a activina B y activina C. En algunos aspectos, un anticuerpo de activina se une a activina BC. En algunos aspectos, un anticuerpo de activina se une a activina B y activina E. En algunos aspectos, un anticuerpo de activina se une a activina BE. En algunos aspectos, un anticuerpo de activina se une a activina A, activina B y activina C. En algunos aspectos, un anticuerpo de activina se une a activina A, activina B y activina E. Opcionalmente, un anticuerpo de activina que se une a una o más de activina A, activina B y activina C pueden unirse además a activina E. En algunos aspectos, la descripción se refiere a un anticuerpo multiespecífico (p. ej., anticuerpo biespecífico), y usos del mismo, que se une a activina y se une además a, por ejemplo, uno o más ligandos de la superfamilia de TGF-p adicionales [p. ej., GDF11, GDF8, BMP10, BMP6, BMP5, nodal y GDF3], uno o más receptores de tipo I y/o receptores de tipo II (p. ej., ActRIIB y/o ALK7), y/o uno o más correceptores. En algunos aspectos, un anticuerpo multiespecífico que se une a activina no se une o no se une sustancialmente a BMP9 (p. ej., Se une a BMP9 con una K^dsuperior a 1 x 10'7 M o tiene una unión relativamente modesta, p. ej., Aproximadamente 1 x 10'6 M o aproximadamente 1 x 10'9 M. En algunos aspectos, la descripción se refiere a combinaciones de anticuerpos y usos de los mismos, donde la combinación de anticuerpos comprende un anticuerpo de activina y uno o más anticuerpos adicionales que se unen a, por ejemplo, uno o más ligandos de la superfamilia de TGF-p adicionales [p. ej., GDF11, GDF8 GDF3, BMP6, BMP10, nodal y BMP5], uno o más receptores de tipo I y/o receptores de tipo II (p. ej., ActRIIB y/o ALK7), y/o uno o más correceptores. En algunos aspectos, una combinación de anticuerpos que comprende un anticuerpo de activina no comprende un anticuerpo de BMP9.

En ciertos aspectos, un anticuerpo antagonista de ALK7:ActRIIB, o una combinación de anticuerpos, es un anticuerpo que inhibe al menos BMP6. Por lo tanto, en algunos aspectos, un anticuerpo antagonista de ALK7:ActRIIB, o una combinación de anticuerpos, se une al menos a BMP6. Como se emplea en este documento, anticuerpo de BMP6 (o anticuerpo anti-BMP6) generalmente se refiere a un anticuerpo que se puede unir a BMP6 con afinidad suficiente, de tal manera que el anticuerpo es útil como agente de diagnóstico y/o agente terapéutico en el direccionamiento a BMP6. En ciertos aspectos, el grado de unión de un anticuerpo de BMP6 a una proteína distinta de BMP6 no relacionada es inferior a aproximadamente un 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % o inferior a aproximadamente un 1 % de la unión del anticuerpo a BMP6 como se mide, por ejemplo, mediante un radioinmunoanálisis (RIA), Biacore, u otro ensayo de interacción con o afinidad de unión a proteínas. En ciertos aspectos, un anticuerpo de BMP6 se une a un epítopo de BMP6 que se conserva entre BMP6 de diferentes especies. En ciertos aspectos preferidos, un anticuerpo anti-BMP6 se une a BMP6 humana. En algunos aspectos, un anticuerpo de BMP6 puede inhibir que BMP6 se una a un receptor de tipo I y/o tipo II (p. ej., ActRIIB y/o ALK7) y por tanto inhibir la transducción de señales mediada por BMP6 (p. ej., transducción de señales de Smad). En algunos aspectos, un anticuerpo de BMP6 puede inhibir que BMP6 se una a un correceptor y así inhibir la transducción de señales mediada por BMP6 (p. ej., transducción de señales de Smad). En algunos aspectos, la descripción se refiere a un anticuerpo multiespecífico (p. ej., anticuerpo biespecífico) y usos del mismo, que se une a BMP6 y se une además a, por ejemplo, uno o más ligandos de la superfamilia de TGF-p adicionales. [p. ej., activina (p. ej., activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE, activina BE), GDF8, BMP10, GDF11, BMP5, nodal y GDF3], uno o más receptores de tipo I y/o receptores de tipo II (p. ej., ActRIIB y/o ALK7), y/o uno o más correceptores. En algunos aspectos, un anticuerpo multiespecífico que se une a BMP6 no se une o no se une sustancialmente a BMP9 (p. ej., se une a BMP9 con una K^dsuperior a 1 x 10-7 M o tiene una unión relativamente modesta, p. ej., aproximadamente 1 x 10-8 M o aproximadamente 1 x 10-9 M). En algunos aspectos, la descripción se refiere a combinaciones de anticuerpos y usos de los mismos, donde la combinación de anticuerpos comprende un anticuerpo de BMP6 y uno o más anticuerpos adicionales que se unen, por ejemplo, a uno o más ligandos de la superfamilia de TGF-p adicionales.

[p. ej., activina (p. ej., activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE, activina BE), ^gD^f8, GDF3, GDF11, BMP10, nodal y BMP5], uno o más receptores de tipo I y/o receptores de tipo II (p. ej., ActRIIB y/o ALK7), y/o uno o más correceptores. En algunos aspectos, una combinación de anticuerpos que comprende un anticuerpo de BMP6 no comprende un anticuerpo de BMP9.

En ciertos aspectos, un anticuerpo antagonista de ALK7:ActRIIB, o una combinación de anticuerpos, es un anticuerpo que inhibe al menos GDF3. Por lo tanto, en algunos aspectos, un anticuerpo antagonista de ALK7:ActRIIB, o una combinación de anticuerpos, se une al menos a GDF3. Como se emplea en este documento, anticuerpo de GDF3 (o anticuerpo anti-GDF3) generalmente se refiere a un anticuerpo que se une a GDF3 con afinidad suficiente, de tal manera que el anticuerpo es útil como agente de diagnóstico y/o agente terapéutico en el direccionamiento a GDF3. En ciertos aspectos, el grado de unión de un anticuerpo de GDF3 a una proteína distinta de GDF3 no relacionada es inferior a aproximadamente un 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % o inferior a aproximadamente un 1 % de la unión del anticuerpo a GDF3 como se mide, por ejemplo, mediante un radioinmunoanálisis (RIA), Biacore, u otro ensayo de interacción con o afinidad de unión a proteínas. En ciertos aspectos, un anticuerpo de GDF3 se une a un epítopo de GDF3 que se conserva entre GDF3 de diferentes especies. En ciertos aspectos preferidos, un anticuerpo de GDF3 se une a GDF3 humana. En algunos aspectos, un anticuerpo de GDF3 puede inhibir que GDF3 se una a un receptor de tipo I y/o tipo II (p. ej., ActRIIB y/o ALK7) y por tanto inhibir la transducción de señales mediada por GDF3 (p. ej., transducción de señales de Smad). En algunos aspectos, un anticuerpo de GDF3 puede inhibir que GDF3 se una a un correceptor y así inhibir la transducción de señales mediada por GDF3 (p. ej., transducción de señales de Smad). En algunos aspectos, la descripción se refiere a un anticuerpo multiespecífico (p. ej., anticuerpo biespecífico) y usos del mismo, que se une a GDF3 y se une además a, por ejemplo, uno o más ligandos de la superfamilia de TGF-p adicionales. [p. ej., activina (p. ej., activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE, activina BE), GDF11, BMP10, BMP6, BMP5 y nodal, uno o más receptores de tipo I y/o receptores de tipo II (p. ej., ActRIIB y/o ALK7), y/o uno o más correceptores. En algunos aspectos, un anticuerpo multiespecífico que se une a GDF3 no se une o no se une sustancialmente a BMP9 (p. ej., se une a BMP9 con una K^dsuperior a 1 x 10-7 M o tiene una unión relativamente modesta, p. ej., aproximadamente 1 x 10-8 M o aproximadamente 1 x 10-9 M). En algunos aspectos, la descripción se refiere a combinaciones de anticuerpos y usos de los mismos, donde la combinación de anticuerpos comprende un anticuerpo de GDF3 y uno o más anticuerpos adicionales que se unen, por ejemplo, a uno o más ligandos de la superfamilia de TGF-p adicionales. [p. ej., activina (p. ej., activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE, activina BE), GDF11, B^mP10, BMP6, BMP5 y nodal, uno o más receptores de tipo I y/o receptores de tipo II (p. ej., ActRIIB y/o ALK7), y/o uno o más correceptores. En algunos aspectos, una combinación de anticuerpos que comprende un anticuerpo de GDF3 no comprende un anticuerpo de Bm P9.

En ciertos aspectos, un anticuerpo antagonista de ALK7:ActRIIB, o una combinación de anticuerpos, es un anticuerpo que inhibe al menos BMP5. Por lo tanto, en algunos aspectos, un anticuerpo antagonista de ALK7:ActRIIB, o una combinación de anticuerpos, se une al menos a BMP5. Como se emplea en este documento, anticuerpo de BMP5 (o anticuerpo anti-BMP5) generalmente se refiere a un anticuerpo que se une a BMP5 con afinidad suficiente, de tal manera que el anticuerpo es útil como agente de diagnóstico y/o agente terapéutico en el direccionamiento a BMP5. En ciertos aspectos, el grado de unión de un anticuerpo de ^bMP5 a una proteína distinta de BMP5 no relacionada es inferior a aproximadamente un 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % o inferior a aproximadamente un 1 % de la unión del anticuerpo a BMP5 como se mide, por ejemplo, mediante un radioinmunoanálisis (RIA), Biacore, u otro ensayo de interacción con o afinidad de unión a proteínas. En ciertos aspectos, un anticuerpo de BMP5 se une a un epítopo de BMP5 que se conserva entre BMP5 de diferentes especies. En ciertos aspectos preferidos, un anticuerpo anti-BMP5 se une a BMP5 humana. En algunos aspectos, un anticuerpo de BMP5 puede inhibir que BMP5 se una a un receptor de tipo I y/o tipo II (p. ej., ActRIIB y/o ALK7) y por tanto inhibir la transducción de señales mediada por BMP5 (p. ej., transducción de señales de Smad). En algunos aspectos, un anticuerpo de BMP5 puede inhibir que BMP5 se una a un correceptor y así inhibir la transducción de señales mediada por BMP5 (p. ej., transducción de señales de Smad). En algunos aspectos, la descripción se refiere a un anticuerpo multiespecífico (p. ej., anticuerpo biespecífico) y usos del mismo, que se une a BMP5 y se une además a, por ejemplo, uno o más ligandos de la superfamilia de TGF-p adicionales. [p. ej., activina (p. ej., activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE y activina ^bE), G^dF8, BMP10, BMP6, GDF11, nodal y GDF3], uno o más receptores de tipo I y/o receptores de tipo II (p. ej., ActRIIB y/o ALK7), y uno o más correceptores. En algunos aspectos, un anticuerpo multiespecífico que se une a BMP5 no se une o no se une sustancialmente a BMP9 (p. ej., se une a BMP9 con una K^dsuperior a 1 x 10-7 M o tiene una unión relativamente modesta, p. ej., aproximadamente 1 x 10-8 M o aproximadamente 1 x 10-9 M). En algunos aspectos, la descripción se refiere a combinaciones de anticuerpos y usos de los mismos, donde la combinación de anticuerpos comprende un anticuerpo de BMP5 y uno o más anticuerpos adicionales que se unen, por ejemplo, a uno o más ligandos de la superfamilia de TGF-p adicionales. [p. ej., activina (p. ej., activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina bC, activina AE y activina BE), G^dF8, GDF3, BMP6, BMP10, nodal y GDF11], receptor de tipo I y/o receptores de tipo II (p. ej., ActRIIB y/o ALK7), y/o correceptor. En algunos aspectos, una combinación de anticuerpos que comprende un anticuerpo de BMP5 no comprende un anticuerpo de b MP9.

En ciertos aspectos, un anticuerpo antagonista de ALK7:ActRIIB, o combinación de anticuerpos, es un anticuerpo que inhibe al menos BMP10. Por lo tanto, en algunos aspectos, un anticuerpo antagonista de ALK7:ActRIIB, o combinación de anticuerpos, se une al menos a BMP10. Como se emplea en este documento, un anticuerpo de BMP10 (o anticuerpo anti-BMP10) generalmente se refiere a un anticuerpo que puede unirse a BMP10 con suficiente afinidad de manera que el anticuerpo sea útil como agente de diagnóstico y/o terapéutico en el direccionamiento a BMP10, En ciertos aspectos, el grado de unión de un anticuerpo de BMP10 a una proteína no relacionada con BMP10 es menos de aproximadamente un 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, o menos de aproximadamente un 1 % de la unión del anticuerpo a BMP10 medida, por ejemplo, mediante un radioinmunoanálisis (RIA), Biacore u otro ensayo de interacción con o afinidad de unión a proteínas. En ciertos aspectos, un anticuerpo de BMP10 se une a un epítopo de BMP10 que se conserva entre BMP10 de diferentes especies. En ciertos aspectos preferidos, un anticuerpo anti-BMPIO se une a BMP10 humana. En algunos aspectos, un anticuerpo de BMP10 puede inhibir que BMP10 se una a un receptor de tipo I y/o tipo II (p. ej., ActRIIB y/o ALK7) y por tanto inhibir la transducción de señales mediada por BMP10 (p. ej., transducción de señales de Smad). En algunos aspectos, un anticuerpo de BMP10 puede inhibir que BMP10 se una a un correceptor y así inhibir la transducción de señales mediada por BMP10 (p. ej., transducción de señales de Smad). En algunos aspectos, la descripción se refiere a un anticuerpo multiespecífico (p. ej., anticuerpo biespecífico) y usos del mismo, que se une a BMP10 y se une además a, por ejemplo, uno o más ligandos de la superfamilia de TGF-p adicionales. [p. ej., activina (p. ej., activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina Ae y activina b E), Gd F8, GDF11, BMP6, BMP5, nodal y GDF3], uno o más receptores de tipo I y/o receptores de tipo II (p. ej., ActRIIB y/o ALK7), y uno o más correceptores. En algunos aspectos, un anticuerpo multiespecífico que se une a BMP10 no se une o no se une sustancialmente a BMP9 (p. ej., se une a BMP9 con una K^dsuperior a 1 x 10-7 M o tiene una unión relativamente modesta, p. ej., aproximadamente 1 x 10-8 M o aproximadamente 1 x 10-9 M). En algunos aspectos, la descripción se refiere a combinaciones de anticuerpos y usos de los mismos, donde la combinación de anticuerpos comprende un anticuerpo de BMP10 y uno o más anticuerpos adicionales que se unen, por ejemplo, a uno o más ligandos de la superfamilia de TGF-p adicionales. [p. ej., activina (p. ej., activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina bC, activina AE y activina BE), G^dF8, GDF3, BMP6, GDF11, nodal y BMP5], uno o más receptores de tipo I y/o receptores de tipo II (p. ej., ActRIIB y/o ALK7), y/o uno o más correceptores. En algunos aspectos, una combinación de anticuerpos que comprende un anticuerpo de BMP10 no comprende un anticuerpo de BMP9.

En ciertos aspectos, un anticuerpo antagonista de ALK7:ActRIIB, o combinación de anticuerpos, es un anticuerpo que inhibe al menos nodal. Por lo tanto, en algunos aspectos, un anticuerpo antagonista de ALK7:ActRIIB, o una combinación de anticuerpos, se une al menos a nodal. Como se emplea en este documento, un anticuerpo de nodal (o anticuerpo anti-nodal) generalmente se refiere a un anticuerpo que puede unirse a nodal con suficiente afinidad de manera que el anticuerpo sea útil como agente de diagnóstico y/o terapéutico en el direccionamiento a nodal, En ciertos aspectos, el grado de unión de un anticuerpo de nodal a una proteína no relacionada con nodal es menos de aproximadamente un 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, o menos de aproximadamente un 1 % de la unión del anticuerpo a nodal medida, por ejemplo, mediante un radioinmunoanálisis (RIA), Biacore, u otro ensayo de interacción con o afinidad de unión a proteínas. En ciertos aspectos, un anticuerpo de nodal se une a un epítopo de nodal que se conserva entre nodal de diferentes especies. En ciertos aspectos preferidos, un anticuerpo anti-nodal se une a nodal humana. En algunos aspectos, un anticuerpo de nodal puede inhibir la unión de nodal a un receptor de tipo I y/o tipo II (p. ej., ActRIIB y/o ALK7) y por tanto inhibir la transducción de señales mediada por nodal (p. ej., transducción de señales de Smad). En algunos aspectos, un anticuerpo de nodal puede inhibir que nodal se una a un correceptor y así inhibir la transducción de señales mediada por nodal (p. ej., transducción de señales de Smad). En algunos aspectos, la descripción se refiere a un anticuerpo multiespecífico (p. ej., anticuerpo biespecífico) y usos del mismo, que se une a nodal y se une además a, por ejemplo, uno o más ligandos de la superfamilia de TGF-p adicionales. [p. ej., activina (p. ej., activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE y activina BE), GDF8, GDF11, BMP6, BMP5, BMP10 y GDF3], uno o más receptores de tipo I y/o receptores de tipo II (p. ej., ActRIIB y/o ALK7), y/o uno o más correceptores. En algunos aspectos, un anticuerpo multiespecífico que se une a nodal no se une o no se une sustancialmente a BMP9 (p. ej., se une a BMP9 con una K^dsuperior a 1 x 10-7 M o tiene una unión relativamente modesta, p. ej., aproximadamente 1 x 10-8 M o aproximadamente 1 x 10'9 M). En algunos aspectos, la descripción se refiere a combinaciones de anticuerpos y usos de los mismos, donde la combinación de anticuerpos comprende un anticuerpo de nodal y uno o más anticuerpos adicionales que se unen, por ejemplo, a uno o más ligandos de la superfamilia de TGF-p adicionales. [p. ej., activina (p. ej., activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE y activina BE), GDF8, GDF3, BMP6, GDF11, BMP10 y BMP5], uno o más receptores de tipo I y/o receptores de tipo II (p. ej., ActRIIB y/o ALK7), y/o uno o más correceptores. En algunos aspectos, una combinación de anticuerpos que comprende un anticuerpo de nodal no comprende un anticuerpo de BMP9.

Con respecto a los anticuerpos que se unen y antagonizan a los ligandos que se unen a ALK7:ActRIIB, [p. ej., activina (p. ej., activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina Ac , activina BC, activina AE y activina BE), GDF8 GDF3, BMP6, GDF11, BMP10 y BMP5], se contempla que un anticuerpo puede diseñarse como un anticuerpo biespecífico que comprende una primera porción que se une a un epítopo de dicho ligando, de modo que la primera porción del anticuerpo compite por unirse con un receptor de tipo I, y que comprende una segunda porción que se une a un epítopo de dicho ligando, de modo que la segunda porción del anticuerpo compita por unirse con un receptor de tipo II. De esta manera, se puede diseñar un anticuerpo biespecífico que se dirija a un único ligando para imitar el bloqueo de unión al receptor dual de tipo I-tipo II que puede conferir un heteromultímero ALK7:ActRIIB. De manera similar, se contempla que se podría lograr el mismo efecto usando una combinación de dos o más anticuerpos donde al menos un primer anticuerpo se une a un epítopo de dicho ligando, de modo que el primer anticuerpo compite por unirse con un receptor de tipo I y al menos un segundo anticuerpo se une a un epítopo de dicho ligando, de modo que el segundo anticuerpo compite por unirse con un receptor de tipo II.

En ciertos aspectos, un anticuerpo antagonista de ALK7:ActRIIB, o una combinación de anticuerpos, es un anticuerpo que inhibe al menos ActRIIB. Por lo tanto, en algunos aspectos, un anticuerpo antagonista de ALK7:ActRIIB, o una combinación de anticuerpos, se une al menos a ActRIIB. Como se emplea en este documento, anticuerpo de ActRIIB (anticuerpo anti-ActRIIB) generalmente se refiere a un anticuerpo que se une a ActRIIB con afinidad suficiente, de tal manera que el anticuerpo es útil como agente de diagnóstico y/o agente terapéutico en el direccionamiento a ActRIIB. En ciertos aspectos, el grado de unión de un anticuerpo anti-ActRIIB a una proteína distinta de ActRIIB no relacionada es inferior a aproximadamente un 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % o inferior a aproximadamente un 1 % de la unión del anticuerpo a ActRIIB como se mide, por ejemplo, mediante un radioinmunoanálisis (RIA), Biacore, u otro ensayo de interacción con o afinidad de unión a proteínas. En ciertos aspectos, un anticuerpo anti-ActRIIB se une a un epítopo de ActRIIB que se conserva entre ActRIIB de diferentes especies. En ciertos aspectos preferidos, un anticuerpo anti-ActRIIB se une a ActRIIB humana. En algunos aspectos, un anticuerpo anti-ActRIIB puede inhibir que uno o más ligandos de la superfamilia de TGF-p [p. ej., GDF8, activina (p. ej., activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE y activina BE) ^gD^f3, BMP6, BMP10, nodal y BMP9] se unan a ActRIIB y/o ALK7. En algunos aspectos, un anticuerpo anti-ActRIIB es un anticuerpo multiespecífico (p. ej., anticuerpo biespecífico) que se une a ActRIIB y a uno o más ligandos de la superfamilia de TGF-p [p. ej., GDF11, GDF8, activina (p. ej., activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC) GDF3, b Mp6, BMP10, nodal y BMP9], receptor de tipo I (p. ej., ALK7), correceptor, y/o un receptor de tipo II adicional. En algunos aspectos, la descripción se refiere a combinaciones de anticuerpos y usos de los mismos, donde la combinación de anticuerpos comprende un anticuerpo anti-ActRIIB y uno o más anticuerpos adicionales que se unen, por ejemplo, a uno o más ligandos de la superfamilia de TGF-p. [p.ej., GDF11, GDF8, activina (p. ej., activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE y activina BE) ^gD^f3, BMP6, BMP10, nodal y BMP9], correceptores, receptores de tipo I (p. ej., ALK7), y/o receptores de tipo II adicionales. Cabe señalar que ActRIIB tiene una similitud de secuencia a ActRIIA y, por lo tanto, los anticuerpos que se unen a ActRIIB, en algunos aspectos, también pueden unirse a y/o inhibir ActRIIA.

En ciertos aspectos, un anticuerpo antagonista de ALK7:ActRIIB, o una combinación de anticuerpos, es un anticuerpo que inhibe al menos ALK7. Por lo tanto, en algunos aspectos, un anticuerpo antagonista de ALK7:ActRIIB, o una combinación de anticuerpos, se une al menos a ALK7. Como se emplea en este documento, un anticuerpo de ALK7 (o anticuerpo anti-ALK7) generalmente se refiere a un anticuerpo que se une a ALK7 con afinidad suficiente, de tal manera que el anticuerpo es útil como agente de diagnóstico y/o agente terapéutico en el direccionamiento a ALK7. En ciertos aspectos, el grado de unión de un anticuerpo anti-ALK7 a una proteína distinta de ALK7 no relacionada es inferior a aproximadamente un 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % o inferior a aproximadamente un 1 % de la unión del anticuerpo a ALK7 como se mide, por ejemplo, mediante un radioinmunoanálisis (RIA), Biacore, u otro ensayo de interacción o afinidad de unión proteína-proteína. En ciertos aspectos, un anticuerpo anti-ALK7 se une a un epítopo de ALK7 que se conserva entre ALK7 de diferentes especies. En ciertos aspectos preferidos, un anticuerpo anti-ALK7 se une a ^aLK7 humana. En algunos aspectos, un anticuerpo anti-ALK7 puede inhibir que uno o más ligandos de la superfamilia de TGF-p [p. ej., GDF11, GDF8, activina (p. ej., activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE y activina BE) G^dF3, BMP5, BMP6 y BMP10] se unan a un receptor de tipo I (p. ej., ALK7), receptor de tipo II (p. ej., ActRIIB) o correceptor. En algunos aspectos, un anticuerpo anti-ALK7 es un anticuerpo multiespecífico (p. ej., anticuerpo biespecífico) que se une a ALK7 y uno o más ligandos de la superfamilia de TGF-p [p.ej., activina (p. ej., activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina A^ey activina BE), GDF11, GDF8, BMP10, BMP6, BMP5, nodal y GDF3, receptores de tipo II (p. ej., ActRIIB), correceptores, y/o un receptor de tipo I adicional. En algunos aspectos, la descripción se refiere a combinaciones de anticuerpos y usos de los mismos, donde la combinación de anticuerpos comprende un anticuerpo anti-ALK7 y uno o más anticuerpos adicionales que se unen, por ejemplo, a uno o más ligandos de la superfamilia de TGF-p. [p. ej., activina (p. ej., activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE y activina BE), GDF11, GDF8, BMP10, BMP6, BMP5, nodal y GDF3], correceptores, un receptor de tipo I adicional, y/o receptores de tipo II (p. ej., ActRIIB).

En ciertos aspectos, un anticuerpo antagonista de ALK7:ActRIIB, o una combinación de anticuerpos, es un anticuerpo que inhibe al menos Cripto o Cryptic. Por lo tanto, en algunos aspectos, un anticuerpo antagonista de ALK7:ActRIIB, 0 una combinación de anticuerpos, se une al menos a Cripto o Cryptic. Como se emplea en este documento, un anticuerpo de Cripto (o anticuerpo anti-Cripto) generalmente se refiere a un anticuerpo que se une a Cripto con afinidad suficiente, de tal manera que el anticuerpo es útil como agente de diagnóstico y/o agente terapéutico en el direccionamiento a Cripto. En ciertos aspectos, el grado de unión de un anticuerpo anti-Cripto a una proteína distinta de Cripto no relacionada es inferior a aproximadamente un 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % o inferior a aproximadamente un 1 % de la unión del anticuerpo a Cripto como se mide, por ejemplo, mediante un radioinmunoanálisis (RIA), Biacore, u otro ensayo de interacción o afinidad de unión proteína-proteína. En ciertos aspectos, un anticuerpo anti-Cripto se une a un epítopo de Cripto que se conserva entre Cripto de diferentes especies. En ciertos aspectos preferidos, un anticuerpo anti-Cripto se une a Cripto humana. Como se emplea en este documento, un anticuerpo de Cryptic (o anticuerpo anti-Cryptic) generalmente se refiere a un anticuerpo que se une a Cryptic con afinidad suficiente, de tal manera que el anticuerpo es útil como agente de diagnóstico y/o agente terapéutico en el direccionamiento a Cryptic. En ciertos aspectos, el grado de unión de un anticuerpo anti-Cripto a una proteína distinta de Cryptic no relacionada es inferior a aproximadamente un 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % o inferior a aproximadamente un 1 % de la unión del anticuerpo a Cryptic como se mide, por ejemplo, mediante un radioinmunoanálisis (RIA), Biacore, u otro ensayo de interacción o afinidad de unión proteína-proteína. En ciertos aspectos, un anticuerpo anti-Cryptic se une a un epítopo de Cryptic que se conserva entre Cryptic de diferentes especies. En ciertos aspectos preferidos, un anticuerpo anti-Cryptic se une a Cryptic humana. En algunos aspectos, un anticuerpo anti-Cripto o Cryptic puede inhibir que uno o más ligandos de la superfamilia de TGF-p [p. ej., activina (p. ej., activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE y activina BE) GDF11, GDF8, BMP10, BMP6, BMP5, nodal y GDF3] se unan a Cripto o Cryptic, respectivamente, o a ActRIIB y/o ALK7. En algunos aspectos, un anticuerpo anti-Cripto o Cryptic puede inhibir la unión del ganglio a un receptor de tipo 1 y/o tipo II. En algunos aspectos, un anticuerpo anti-Cripto o Cryptic es un anticuerpo multiespecífico (p. ej., anticuerpo biespecífico) que se une a Cripto o Cryptic y a uno o más de la superfamilia de TGF-p [p. ej., activina (p. ej., activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE y activina BE), GDF11, GDF8, BMP10, BMP6, BMP5, nodal y GDF3], receptor de tipo I (p. ej., ALK7), correceptor adicional, y/o receptor de tipo II. En algunos aspectos, un anticuerpo puede unirse tanto a Cripto como a Cryptic. En algunos aspectos, la descripción se refiere a combinaciones de anticuerpos y usos de los mismos, donde la combinación de anticuerpos comprende un anticuerpo anti-Cripto o Cryptic y uno o más anticuerpos adicionales que se unen, por ejemplo, a uno o más ligandos de la superfamilia de TGF-p. [p.ej., activina (p. ej., activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina A^ey activina BE) GCF11, GDF8, BMP10, BMP6, BMP5, nodal y GDF3], correceptores adicionales, receptores de tipo I (p. ej., ALK7), y/o receptores de tipo II.

Como se describe en este documento, existe un abanico de procedimientos para generar complejos heteromultiméricos. Tales procedimientos pueden usarse para generar complejos heteromultiméricos que comprenden un dominio de unión a anticuerpos (por ejemplo, un complejo de cadenas VL y VH) y uno o más polipéptidos seleccionados de entre un polipéptido de ALK7, un polipéptido de ActRIIB, un heterómero ALK7:ActRIIB, o un polipéptido de trampa única ALK7:ActRIIB. Véanse la figura 10A, 10B y 12D. Por ejemplo, en algunos aspectos, la descripción proporciona complejos de proteínas que comprenden un dominio de unión a ligando de un anticuerpo que se une a un ligando de unión a ALK7:ActRIIB [p. ej., activina (p. ej., activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE y activina BE), g Df 11, GDF8, BMP10, BMP6, BMP5, nodal y GDF3] que está asociado covalente o no covalentemente con un polipéptido de ALK7. En algunos aspectos, la descripción proporciona complejos de proteínas que comprenden un dominio de unión a ligando de un anticuerpo que se une a un ligando de unión a ALK7:ActRIIB [p. ej., activina (p. ej., activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE y activina BE), G^dF11, GDF8, BMP10, BMP6, BMP5, nodal y GDF3] que está asociado covalente o no covalentemente con un polipéptido de ActRIIB. En algunos aspectos, la descripción proporciona complejos de proteínas que comprenden un dominio de unión a ligando de un anticuerpo que se une a un ligando de unión a ALK7:ActRIIB [p. ej., activina (p. ej., activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE y activina BE), G^dF11, GDF8, BMP10, BMP6, BMP5, nodal y GDF3] que está asociado covalente o no covalentemente con una trampa de ligando monocatenaria ALK7:ActRIIB. En algunos aspectos, la descripción proporciona complejos de proteínas que comprenden un dominio de unión a ligando de un anticuerpo que se une a un ligando de unión a ALK7:ActRIIB [p. ej., activina (p. ej., activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE y activina BE), Gd F11, GDF8, BMP10, BMP6, BMP5, nodal y GDF3] que está asociado covalente o no covalentemente con un multímero ALK7:ActRIIB.

El término anticuerpo se emplea en este documento en el sentido más amplio y abarca diversas estructuras de anticuerpo, que incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (p. ej., anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpo, siempre que presenten la actividad de unión a antígeno deseada. Un fragmento de anticuerpo se refiere a una molécula que no es un anticuerpo intacto que comprende una porción de un anticuerpo intacto y que se une a antígeno al que se une el anticuerpo intacto. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo monocatenarias (p. ej., scFv); y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo [véase, p. ej., Hudson y col. (2003) Nat. Med. 9: 129-134; Plückthun, en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, Nueva York), págs. 269-315 (1994); WO 93/16185; y las patentes de los EE. UU. Nos. 5571894; 5587458; y 5869046]. Los diacuerpos son fragmentos de anticuerpos con dos puntos de unión al antígeno que pueden ser bivalentes o biespecíficos [Véanse, p. ej., los documentos EP 404097; WO 1993/01161; Hudson y col. (2003) Nat. Med. 9: 129-134 (2003) y Hollinger y col. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448.] Los triacuerpos y tetracuerpos también se describen en Hudson y col.(2003) Nat. Med. 9: 129-134. Los anticuerpos de dominio único son fragmentos de anticuerpo que comprenden toda o una porción del dominio variable de cadena pesada o toda o una porción del dominio variable de cadena ligera de un anticuerpo. En ciertos aspectos, un anticuerpo de dominio único es un anticuerpo de dominio único humano [véase, p. ej., la patente de los EE. UU. No. 6248516]. Los anticuerpos descritos en este documento pueden ser anticuerpos policlonales o anticuerpos monoclonales. En ciertos aspectos, los anticuerpos de la presente descripción comprenden un marcador fijado a los mismos y capaz de ser detectado (p. ej., el marcador puede ser un radioisótopo, un compuesto fluorescente, una enzima o un cofactor enzimático). En ciertos aspectos preferidos, los anticuerpos de la presente descripción son anticuerpos aislados. En ciertos aspectos preferidos, los anticuerpos de la presente descripción son anticuerpos recombinantes.

Los anticuerpos en este documento pueden ser de cualquier clase. La clase de un anticuerpo se refiere al tipo de dominio constante o región constante que posee su cadena pesada. Hay cinco clases principales de anticuerpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM y varias de estas se pueden dividir además en subclases (isotipos), por ejemplo, IgGi, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 y IgA2. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan alfa, delta, épsilon, gamma y mu.

En general, un anticuerpo para uso en los procedimientos descritos en este documento se une específicamente a su antígeno diana, preferiblemente con afinidad de unión alta. La afinidad se puede expresar como un valor de K^dy refleja la afinidad de unión intrínseca (p. ej., con efectos de avidez minimizados). Típicamente, la afinidad de unión se mide in vitro, ya sea en un entorno exento de células o asociado a células. Se puede usar cualquiera de varios ensayos conocidos en la técnica, lo que incluye los descritos en este documento, para obtener mediciones de afinidad de unión que incluyen, por ejemplo, Biacore, ensayo de unión a antígeno radiomarcado (RIA) y ELISA. En algunos aspectos, los anticuerpos de la presente descripción se unen a sus antígenos diana (p. ej. ^aLK7, ActRIIB, activina, GDF11, GDF8, BMP10, BMP6, GDF3, nodal, y/o BMP5) con al menos una K^dde 1 x 10'7 o más fuerte, 1 x 10'8 o más fuerte, 1 x 10'9 o más fuerte, 1 x 10_1° o más fuerte, 1 x 10'11 o más fuerte, 1 x 10'12 o más fuerte, 1 x 10'13 o más fuerte o 1 x 10'14 o más fuerte.

En ciertos aspectos, la Kd se mide mediante RIA realizado con la versión Fab de un anticuerpo de interés y su antígeno diana como describe el ensayo siguiente. La afinidad de unión en solución de Fab por el antígeno se mide equilibrando los Fab con una concentración mínima de antígeno radiomarcado (p. ej., marcado con 125I) en presencia de una serie de titulación de antígeno no marcado, capturando a continuación el antígeno unido con una placa revestida con anticuerpos anti-Fab [véase, p. ej., Chen y col. (1999) J. Mol. Biol. 293:865-881]. Para establecer las condiciones para el ensayo, se revisten placas de múltiples pocillos (p. ej., MICROTITER® de Thermo Scientific) (p. ej., durante la noche) con un anticuerpo anti-Fab de captura (p. ej., de Cappel Labs) y posteriormente se bloquean con albúmina sérica bovina, preferiblemente a temperatura ambiente (aproximadamente 23 °C). En una placa no adsorbente, se mezcla antígeno radiomarcado con diluciones en serie de un Fab de interés [p. ej., compatible con la evaluación del anticuerpo anti-VEGF, Fab-12, en Presta y col., (1997) Cancer Res. 57:4593-4599]. El Fab de interés se incuba a continuación, preferiblemente durante la noche, pero la incubación puede continuar durante un periodo más largo (p. ej., aproximadamente 65 horas) para garantizar que se alcanza el equilibrio. Posteriormente, las mezclas se transfieren a la placa de captura para la incubación, preferiblemente a temperatura ambiente durante aproximadamente una hora. A continuación, se retira la solución y la placa se lava varias veces, preferiblemente con mezcla de polisorbato 20 y PBS. Cuando las placas han secado, se añade centelleador (p. ej., MICROSCINT® de Packard) y se cuentan las placas en un contador gamma (p. ej., TOPCOUNT® de Packard).

Según otro aspecto, la Kd se mide usando ensayos de resonancia de plasmones superficiales con, por ejemplo, un BIACORE® 2000 o BIACORE ® 3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, N.J.) con chips CM5 de antígeno inmovilizado a aproximadamente 10 unidades de respuesta (UR). Brevemente, se activan chips biosensores de dextrano carboximetilado (CM5, BIACORE, Inc.) con clorhidrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) según las instrucciones del proveedor. Por ejemplo, el antígeno se puede diluir con acetato de sodio 10 mM, pH 4,8, a 5 pg/ml (aproximadamente 0,2 pM) antes de la inyección a un caudal de 5 pl/minuto para conseguir aproximadamente 10 unidades de respuesta (UR) de proteína acoplada. Después de la inyección de antígeno, se inyecta etanolamina 1 M para bloquear los grupos que no han reaccionado. Para las mediciones de cinética, se inyectan diluciones en serie a la mitad de Fab (0,78 nM a 500 nM) en PBS con 0,05 % de tensioactivo de polisorbato 20 (TWEEN-20®) (PBST) a un caudal de aproximadamente 25 pl/min. Las velocidades de asociación (kas) y las velocidades de disociación (kdis) se calculan usando, por ejemplo, un modelo de unión de Langmuir individual sencillo (software de evaluación BIACORE® versión 3.2) ajustando simultáneamente los sensorgramas de asociación y disociación. La constante de equilibrio de disociación (K^d) se calcula como la relación kdis/kas [véase, p. ej., Chen y col., (1999) J. Mol. Biol. 293: 865-881]. Si la velocidad de asociación supera, por ejemplo, 106 M-1s-1 mediante el ensayo de resonancia de plasmones superficiales anterior, entonces la velocidad de asociación se puede determinar usando una técnica de extinción fluorescente que mide el aumento o la reducción de la intensidad de emisión de fluorescencia (p. ej., excitación = 295 nm; emisión = 340 nm, paso de banda 16 nm) de un anticuerpo antiantígeno 20 nM (forma Fab) en PBS en presencia de concentraciones crecientes de antígeno como se miden en un espectrómetro, tal como un espectrofotómetro equipado con detención de flujo (Aviv Instruments) o un espectrofotómetro SLM-AMINCO® serie 8000 (ThermoSpectronic) con una cubeta agitada.

Los fragmentos de anticuerpo se pueden fabricar mediante diversas técnicas, que incluyen, pero no se limitan a, digestión proteolítica de un anticuerpo intacto, así como producción mediante células hospedadoras recombinantes (p. ej., E. coli o fagos), como se describe en este documento. Las secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos de ActRIIB humana, activina (activina A, activina B, activina C y activina E), GDF11, GDF8, BMP10, BMP6, GDF3, nodal, y/o BMP5 son conocidas en la técnica. Además, numerosos procedimientos para generar anticuerpos son bien conocidos en la técnica, algunos de los cuales se describen en este documento. Por lo tanto, el experto en la técnica puede fabricar de forma rutinaria antagonistas de anticuerpos para su uso de acuerdo con esta descripción basándose en el conocimiento de la técnica y las enseñanzas proporcionadas en este documento.

En ciertos aspectos, un anticuerpo que se proporciona en este documento es un anticuerpo quimérico. El término anticuerpo quimérico se refiere a un anticuerpo en el que una porción de la cadena pesada y/o ligera se deriva de una fuente o especie particular, mientras que el resto de la cadena pesada y/o ligera se deriva de una fuente o especie diferente. Ciertos anticuerpos quiméricos se describen, por ejemplo, en la patente de los EE. UU. n.° 4816 567 y Morrison y col., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855. En algunos aspectos, un anticuerpo quimérico comprende una región variable no humana (p. ej., una región variable derivada de un ratón, una rata, un hámster, un conejo o un primate no humano, tal como un mono) y una región constante humana. En algunos aspectos, un anticuerpo quimérico es un anticuerpo con “cambio de clase” en el que la clase o subclase ha sido cambiada con respecto a la del anticuerpo precursor. En general, los anticuerpos quiméricos incluyen fragmentos de unión a antígeno de los mismos.

En ciertos aspectos, un anticuerpo quimérico que se proporciona en este documento es un anticuerpo humanizado. Un anticuerpo humanizado se refiere a un anticuerpo quimérico que comprende residuos de aminoácido de regiones hipervariables (HVR) no humanas y residuos de aminoácido de regiones de estructura (FR) humanas. En ciertos aspectos, un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las HVR (p. ej., CDR) corresponden a las de un anticuerpo no humano y todas o sustancialmente todas las FR corresponden a las de un anticuerpo humano. Un anticuerpo humanizado puede comprender opcionalmente al menos una porción de una región constante de anticuerpo derivada de un anticuerpo humano. Una “forma humanizada” de un anticuerpo, p. ej., un anticuerpo no humano, se refiere a un anticuerpo que se ha sometido a humanización. Los anticuerpos humanizados y los procedimientos para fabricarlos se analizan, por ejemplo, en Almagro y Fransson (2008) Front. Biosci. 13: 1619-1633 y se describen además, por ejemplo, en Riechmann y col., (1988) Nature 332:323-329; Queen y col. (1989) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86: 10029-10033; las patentes de los EE. UU. n.° 5821 337, 7527 791, 6982 321 y 7087409; Kashmiri y col., (2005) Methods 36: 25-34 [que describen el injerto de SDR (a-CDR)]; Padlan, Mol. Immunol. (1991) 28: 489-498 (que describen la “remodelación de la superficie”); Dall'Acqua y col. (2005) Methods 36: 43-60 (que describen la “transposición de FR”); Osbourn y col. (2005) Methods 36: 6 l -68 y Klimka y col. Br. J. Cancer (2000) 83:252-260 (que describen la estrategia de “selección guiada” para transposición de FR). Las regiones de estructura humanas que se pueden usar para humanización incluyen, pero no se limitan a: regiones de estructura seleccionadas usando el procedimiento de “ajuste óptimo” [véase, p. ej., Sims y col. (1993) J. Immunol. 151:2296]; regiones de estructura derivadas de la secuencia consenso de anticuerpos humanos de un subgrupo particular de regiones variables de cadena ligera o pesada [véase, p. ej., Carter y col. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. uSa , 89:4285 y Presta y col. (1993) J. Immunol., 151:2623]; regiones de estructura (mutadas somáticamente) maduras humanas o regiones de estructura de la estirpe germinal humana [véase, p. ej., Almagro y Fransson (2008) Front. Biosci. 13: 1619-1633]; y regiones de estructura derivadas del cribado de colecciones de FR [véase, p. ej., Baca y col., (1997) J. Biol. Chem.

272: 10678-10684 y Rosok y col., (1996) J. Biol. Chem. 271: 22611-22618].

En ciertos aspectos, un anticuerpo que se proporciona en este documento es un anticuerpo humano. Los anticuerpos humanos se pueden producir usando diversas técnicas conocidas en la técnica. Los anticuerpos humanos se describen en general en van Dijk y van de Winkel (2008) Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) y Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459. Por ejemplo, los anticuerpos humanos se pueden preparar administrando un inmunógeno (p. ej., un polipéptido de GDF11, un polipéptido de activina B, un polipéptido de ActRIIA o un polipéptido de ActRIIB) a un animal transgénico que ha sido modificado para producir anticuerpos humanos intactos o anticuerpos intactos con regiones variables humanas en respuesta a una exposición antigénica. Tales animales contienen típicamente todos o una porción de los locus de inmunoglobulina humana, que sustituyen a los locus de inmunoglobulina endógena, o que están presentes extracromosómicamente o integrados aleatoriamente en los cromosomas del animal. En tales animales transgénicos, los locus de inmunoglobulina endógena generalmente han sido generalmente. Para consultar un análisis de los procedimientos para obtener anticuerpos humanos a partir de animales transgénicos, véase, p. ej., Lonberg (2005) Nat. Biotech. 23: 1117-1125; las patentes de los EE. ^uU. n.° 6075181 y 6150584 (que describen la tecnología XENOMOUSE™); la patente de los EE. UU. n.° 5 770 429 (que describe la tecnología HuMab®); la patente de los EE. UU. n.° 7041870 (que describe la tecnología K-M MOUSE®) y la solicitud de patente de los EE. UU. con n.° de publicación 2007/0061900 (que describe la tecnología VelociMouse®). Las regiones variables humanas de anticuerpos intactos generados por tales animales se pueden modificar adicionalmente, por ejemplo, combinando con una región constante humana diferente.

Los anticuerpos humanos proporcionados en este documento también se pueden fabricar mediante procedimientos a base de hibridomas. Se han descrito estirpes de células de mieloma humano y heteromieloma de ratón-humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos [véase, p. ej., Kozbor J. Immunol., (1984) 133: 3001; Brodeur y col. (1987) Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, páginas. 51-63, Marcel Dekker, Inc., New York y Boemer y col. (1991) J. Immunol., 147: 86]. También se describen anticuerpos humanos generados mediante tecnología de hibridomas de linfocitos B humanos en Li y col., (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562. Los procedimientos adicionales incluyen los descritos, por ejemplo, en la patente de los EE. UU. n.° 7 189 826 (que describe la producción de anticuerpos de IgM humana monoclonales a partir de estirpes celulares de hibridoma) y Ni, Xiandai Mianyixue (2006) 26(4):265-268 (2006) (que describen hibridomas humano-humano). La tecnología de hibridomas humanos (tecnología Trioma) también se describe en Vollmers y Brandlein (2005) Histol. Histopathol., 20(3): 927-937 (2005) y Vollmers y Brandlein (2005) Methods Find Exp. Clin. Pharmacol., 27(3): 185-91. Los anticuerpos humanos pueden generarse también mediante el aislamiento de las secuencias de dominio variable del clon de Fv que se seleccionan de colecciones de presentación en fagos derivadas de seres humanos. Tales secuencias de dominio variable se pueden combinar a continuación con un dominio constante humano deseado. En la técnica se conocen y en este documento se describen técnicas para seleccionar anticuerpos humanos de colecciones de anticuerpos.

Por ejemplo, se pueden aislar anticuerpos de la presente descripción cribando colecciones combinatorias para seleccionar anticuerpos con la actividad o actividades deseadas. Se conocen en la técnica un abanico de procedimientos para generar colecciones de presentación en fagos y cribar tales colecciones para seleccionar anticuerpos que posean las características de unión deseadas. Tales procedimientos se analizan, por ejemplo, en Hoogenboom y col. (2001) en Methods in Molecular Biology 178:1-37, O'Brien y col., Ed., Human Press, Totowa, NJ y se describen adicionalmente, por ejemplo, en McCafferty y col. (1991) Nature 348:552-554; Clackson y col., (1991) Nature 352: 624-628; Marks y col. (1992) J. Mol. Biol. 222:581-597; Marks y Bradbury (2003) en Methods in Molecular Biology 248:161-175, Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ.; Sidhu y col. (2004) J. Mol. Biol. 338(2):299-310; Lee y col. (2004) J. Mol. Biol. 340(5):1073-1093; Fellouse (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472 y Lee y col. (2004) J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132.

En ciertos procedimientos de presentación en fagos, se clonan independientemente repertorios de genes de VH y VL mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y se recombinan aleatoriamente en colecciones de fagos, que a continuación se pueden cribar para seleccionar fagos de unión a antígeno como se describe en Winter y col. (1994) Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455. Los fagos presentan típicamente fragmentos de anticuerpo, como fragmentos Fv monocatenarios (scFv) o como fragmentos Fab. Las colecciones de fuentes inmunizadas proporcionan anticuerpos de afinidad alta al inmunógeno (p. ej., ALK7, ActRIIB, activina, GDF11, GDF8, BMP10, BMP6, GDF3 y/o BMP5) sin necesidad de construir hibridomas. Alternativamente, se puede clonar el repertorio de fuentes no inmunizadas (p. ej., seres humanos) para proporcionar una única fuente de anticuerpos para un amplio abanico de autoantígenos y no autoantígenos sin ninguna inmunización, como describen Griffiths y col. (1993) EMBO J, 12: 725-734. Por último, las colecciones de fuentes no inmunizadas también se pueden fabricar sintéticamente clonando segmentos de genes V no reordenados de células madre y usando cebadores de PCR que contienen secuencias aleatorias para codificar las regiones CDR3 muy variables y lograr el reordenamiento in vitro, como describen Hoogenboom y Winter (1992) J. Mol. Biol., 227: 381-388. Las publicaciones de patentes que describen colecciones de fagos de anticuerpos humanos incluyen, por ejemplo: la patente de los EE. UU. n.° 5750373 y las patentes de los EE. UU. con n.° de publicación 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 y 2009/0002360.

En ciertos aspectos, un anticuerpo proporcionado en este documento es un anticuerpo multiespecífico, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos multiespecíficos (típicamente anticuerpos monoclonales) tienen especificidades de unión por al menos dos epítopos diferentes (p. ej., dos, tres, cuatro, cinco o seis o más) sobre uno o más (p. ej., dos, tres, cuatro, cinco, seis o más) antígenos.

Las técnicas para generar anticuerpos multiespecíficos incluyen, pero sin limitarse a, la coexpresión recombinante de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina que tienen diferentes especificidades (véase, p. ej., Milstein y Cuello (1983) Nature 305:537; publicación de patente internacional no. WO 93/08829; y Traunecker et al. (1991) EMBO J. 10: 3655, y patente de los EE. UU. No. 5731 168 (genomanipulación "botón en ojal")]. También se pueden producir anticuerpos multiespecíficos modificando los efectos de direccionamiento electrostático para producir moléculas heterodiméricas de Fc de anticuerpos (véase, p. ej., WO 2009/089004A1); reticulando dos o más fragmentos o anticuerpos [véase, p. ej., patente de los EE. u U. No. 4676980; y Brennan y col. (1985) Science, 229: 81]; usando cremalleras de leucina para producir anticuerpos biespecíficos [véase, p. ej., Kostelny y col. (1992) J. Immunol., 148(5): 1547-1553]; usando tecnología de "diacuerpo" para fabricar fragmentos de anticuerpo biespecíficos [véase, p. ej., Hollinger y col. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448]; usando dímeros de Fv monotatenarios (sFv) [véase, p. ej., Gruber y col. (1994) J. Immunol., 152: 5368]; y preparando anticuerpos triespecíficos (véase, p. ej., Tutt y col. (1991) J. Immunol. 147: 60. Los anticuerpos multiespecíficos se pueden preparar como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpos. También se incluyen en este documento anticuerpos genomanipulados con tres o más puntos de unión a antígeno funcionales, que incluyen “anticuerpos pulpo”, (véase, p. ej., el documento US 2006/0025576A1).

En ciertos aspectos, un anticuerpo que se describe en este documento es un anticuerpo monoclonal. Anticuerpo monoclonal se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos y/o unen el mismo epítopo, a excepción de posibles variantes de anticuerpo, p. ej., que contienen mutaciones de origen natural o que se producen durante la producción de un preparado de anticuerpos monoclonales, estando presentes generalmente tales variantes en cantidades pequeñas. Al contrario que los preparados de anticuerpos policlonales, que típicamente incluyen anticuerpos diferentes dirigidos contra epítopos diferentes, cada anticuerpo monoclonal de un preparado de anticuerpos monoclonales está dirigido contra un único epítopo sobre un antígeno. Por tanto, el modificador “monoclonal” indica el carácter del anticuerpo como obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea y no se debe interpretar como que requiere la producción del anticuerpo mediante cualquier procedimiento particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se van a usar según los presentes procedimientos se pueden fabricar mediante un abanico de técnicas que incluyen, pero no se limitan a, el procedimiento del hibridoma, procedimientos de ADN recombinante, procedimientos de presentación en fagos y procedimientos que utilizan animales transgénicos que contienen todos o parte de los locus de inmunoglobulina humana, tales procedimientos y otros procedimientos ejemplares para fabricar anticuerpos monoclonales se describen en este documento.

Por ejemplo, usando inmunógenos derivados de activina, se pueden fabricar antisueros o anticuerpos monoclonales antiproteína/antipéptido mediante protocolos estándar [véase, p. ej., Antibodies: A Laboratory Manual ed. por Harlow y Lane (1988) Cold Spring Harbor Press: 1988]. Un mamífero, tal como un ratón, hámster o conejo, se puede inmunizar con una forma inmunogénica del polipéptido de activina, un fragmento antigénico que es capaz de provocar una respuesta de anticuerpos, o una proteína de fusión. Las técnicas para conferir inmunogenicidad a una proteína o un péptido incluyen la conjugación a vehículos u otras técnicas muy conocidas en la técnica. Se puede administrar una porción inmunogénica de un polipéptido de activina en presencia de adyuvante. El progreso de la inmunización se puede supervisar mediante la detección de títulos de anticuerpos en plasma o suero. Se pueden usar ELISA estándar u otros inmunoanálisis con el inmunógeno como antígeno para evaluar los niveles de producción de anticuerpos y/o el nivel de afinidad de unión.

Después de la inmunización de un animal con un preparado antigénico de activina, se pueden obtener antisueros y, si se desea, se pueden aislar anticuerpos policlonales del suero. Para producir anticuerpos monoclonales, las células productoras de anticuerpos (linfocitos) se pueden recoger de un animal inmunizado y fusionar mediante procedimientos estándar de fusión de células somáticas con células inmortalizantes, tales como células de mieloma, para producir células de hibridoma. Tales técnicas son muy conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, la técnica del hibridoma [véase, p. ej., Kohler y Milstein (1975) Nature, 256: 495-497], la técnica del hibridoma de linfocitos B humanos [véase, p. ej., Kozbar y col. (1983) Immunology Today, 4: 72] y la técnica de hibridoma de EBV para producir anticuerpos monoclonales humanos [Cole y col. (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. páginas 77-96]. Las células de hibridoma se pueden cribar inmunoquímicamente para detectar la producción de anticuerpos reactivos específicamente con un polipéptido de activina y aislar los anticuerpos monoclonales de un cultivo que comprende tales células de hibridoma.

En ciertos aspectos, se pueden introducir una o más modificaciones de aminoácidos en la región Fc de un anticuerpo proporcionado en este documento, lo que genera de este modo una variante de la región Fc. La variante de la región Fc puede comprender una secuencia de la región Fc humana (p. ej., una región Fc de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humana) que comprende una modificación de aminoácidos (p. ej., una sustitución, eliminación y/o adición) en una o más posiciones de aminoácidos.

Por ejemplo, la presente descripción contempla una variante de anticuerpo que posee algunas funciones efectoras, pero no todas, que la convierten en una candidata deseable para aplicaciones en las que la semivida del anticuerpo in vivo es importante y para ciertas funciones efectoras [p. ej., la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) y la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC)] son innecesarias o perjudiciales. Se pueden realizar ensayos de citotoxicidad in vitro y/o in vivo para confirmar la reducción/disminución de las actividades CDC y/o ADCC. Por ejemplo, se pueden realizar ensayos de unión a receptor de Fc (FcR) para garantizar que el anticuerpo carece de unión a F^cyR (que probablemente, por tanto, carece de actividad ADCC), pero conserva la capacidad de unión a FcRn. Las células principales para mediar la ADCC, los linfocitos citolíticos naturales, solo expresan FcyRIII, mientras que los monocitos expresan FcyRI, FcyRII y FcyRIII. La expresión de FcR en células hematopoyéticas se resume en, por ejemplo, Ravetch y Kinet (1991) Annu. Rev. Immunol. 9:457-492. Los ejemplos no limitantes de ensayos in vitro para evaluar la actividad ADCC de una molécula de interés se describen en la patente de los EE. UU. n.° 5500 362; Hellstrom, I. y col. (1986) Proc. Natl Acad. Sci. USA 83:7059-7063; Hellstrom, I y col. (1985) Proc. Natl Acad. Sci. USA 82: 1499-1502; la patente de los EE. UU. n.° 5821 337 y Bruggemann, M. y col. (1987) J. Exp. Med. 166:1351-1361. Alternativamente, se pueden emplear procedimientos de ensayo no radioactivos (p. ej., ACTF™, ensayo de citotoxicidad no radioactivo para citometría de flujo; CellTechnology, Inc. Mountain View, Calif.; y el ensayo de citotoxicidad no radioactivo CytoTox 96® (Promega, Madison, WI). Las células efectoras útiles para tales ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y linfocitos citolíticos naturales (NK). Alternativamente, o adicionalmente, la actividad ADCC del anticuerpo de interés se puede evaluar in vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como el descrito en Clynes y col. (1998) Proc. Natl Acad. Sci. USA 95: 652-656. También se pueden llevar a cabo ensayos de unión a C1q para confirmar que el anticuerpo es incapaz de unir C1q y, por tanto, carece de actividad CdC [véanse, p. ej., ELiSa de unión a C1q y C3c en los documentos WO 2006/029879 y WO 2005/100402]. Para evaluar la activación del complemento, se puede realizar un ensayo de CDC [véase, p. ej., Gazzano-Santoro y col. (1996) J. Immunol. Methods 202:163; Cragg, MS y col. (2003) Blood 101:1045-1052 y Cragg, M. S y MJ Glennie (2004) Blood 103:2738-2743]. También se pueden realizar determinaciones de unión a FcRn y depuración/semivida in vivo usando procedimientos conocidos en la técnica (véase, p. ej., Petkova, S. B. y col. (2006) Int. Immunol.

18(12):1759-1769]. Los anticuerpos de la presente descripción con función efectora reducida incluyen los que tienen sustitución de uno o más residuos de la región Fc 238, 265, 269, 270, 297, 327 y 329 (patente de los EE. UU. n.° 6 737 056). Tales mutantes de Fc incluyen mutantes de Fc con sustituciones en dos o más de las posiciones de aminoácido 265, 269, 270, 297 y 327, lo que incluye el mutante de Fc denominado “DANA” con sustitución de los residuos 265 y 297 a alanina (patente de los EE. ^uU. n.° 7332581).

En ciertos aspectos, puede ser deseable crear anticuerpos genomanipulados con cisteína, p. ej., “thioMAb”, en los que uno o más residuos de un anticuerpo están sustituidos por residuos de cisteína. En aspectos particulares, los residuos sustituidos se encuentran en puntos accesibles del anticuerpo Sustituyendo esos residuos por cisteína, los grupos tiol reactivos se sitúan de ese modo en puntos accesibles del anticuerpo y se pueden usar para conjugar el anticuerpo a otros restos, tales como restos de fármaco o restos de enlazador-fármaco, para crear un inmunoconjugado, tal como se describe adicionalmente en este documento. En ciertos aspectos, uno cualquiera o más de los residuos siguientes se pueden sustituir por cisteína: V205 (numeración de Kabat) de la cadena ligera; A118 (numeración de la UE) de la cadena pesada y S400 (numeración de la UE) de la región Fc de cadena pesada. Los anticuerpos genomanipulados con cisteína se pueden generar como se describe, por ejemplo, en la patente de los EE. UU. n.° 7521541.

Además, las técnicas usadas para cribar anticuerpos con el fin de identificar un anticuerpo deseable pueden influir en las propiedades del anticuerpo obtenido. Por ejemplo, si se va a usar un anticuerpo para unir un antígeno en solución, puede ser deseable ensayar la unión en solución. Se dispone de un abanico de técnicas diferentes para ensayar las interacciones entre anticuerpos y antígenos para identificar anticuerpos particularmente deseables. Tales técnicas incluyen ELISA, ensayos de unión por resonancia de plasmones superficiales (p. ej., el ensayo de unión Biacore, Biacore AB, Uppsala, Suecia), ensayos de tipo sándwich (p. ej., el sistema de perlas paramagnéticas de IGEN International, Inc., Gaithersburg, Maryland), inmunoelectrotransferencias, ensayos de inmunoprecipitación e inmunohistoquímica.

En ciertos aspectos, se contemplan variantes de secuencias de aminoácidos de los anticuerpos y/o los polipéptidos de unión proporcionados en este documento. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo y/o el polipéptido de unión. Las variantes de secuencias de aminoácidos de un anticuerpo y/o polipéptidos de unión se pueden preparar introduciendo modificaciones apropiadas en la secuencia de nucleótidos que codifica al anticuerpo y/o polipéptido de unión o mediante síntesis peptídica. Tales modificaciones incluyen, por ejemplo, eliminaciones de y/o inserciones en y/o sustituciones de residuos en las secuencias de aminoácidos del anticuerpo y/o el polipéptido de unión. Se puede realizar cualquier combinación de eliminación, inserción y sustitución para llegar a la construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas, p. ej., unión a la diana (p. ej, unión a activina tal como activina E y/o activina C).

Se pueden hacer alteraciones (p. ej., sustituciones) en las HVR, por ejemplo, para mejorar la afinidad de los anticuerpos. Tales alteraciones se pueden hacer en “puntos críticos” de las HVR, es decir, en residuos codificados por codones que experimentan mutación a frecuencia alta durante el procedimiento de maduración somática (véase, p. ej., Chowdhury (2008) Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)) y/o en las SDR (a-CDR), ensayando la variante de VH o VL resultante para determinar la afinidad de unión. La maduración de la afinidad construyendo y reseleccionado a partir de colecciones secundarias se ha descrito en la técnica, [véase, p. ej., Hoogenboom y col., en Methods in Molecular Biology 178:1-37, O'Brien y col., ed., Human Press, Totowa, N.J., (2001). En algunos aspectos de la maduración de la afinidad, se introduce diversidad en los genes variables elegidos para la maduración mediante cualquiera de un abanico de procedimientos (p. ej., PCR propensa a error, transposición de cadena o mutagénesis dirigida por oligonucleótidos). A continuación, se crea una segunda colección. La colección se criba a continuación para identificar cualquier variante de anticuerpo con la afinidad deseada. Otro procedimiento para introducir diversidad implica estrategias dirigidas a HVR, en las que se aleatorizan varios residuos de HVR (p. ej., 4-6 residuos a la vez). Los residuos de HVR implicados en la unión a antígeno se pueden identificar específicamente, p. ej., usando modelado o mutagénesis dirigida por barrido de alanina. En particular, a menudo se eligen como diana CDR-H3 y CDR-L3.

En ciertos aspectos, se pueden producir sustituciones, inserciones o eliminaciones en una o más HVR, siempre que tales alteraciones no reduzcan sustancialmente la capacidad del anticuerpo para unirse al antígeno. Por ejemplo, se pueden hacer alteraciones conservadoras (p. ej., sustituciones conservadoras como se proporcionan en este documento) en las HVR que no reducen sustancialmente la afinidad de unión. Tales alteraciones pueden estar fuera de los “puntos críticos” de las HVR o SDR. En ciertos aspectos de las variantes de secuencias de VH y VL proporcionadas anteriormente, cada HVR está inalterada o no contiene más de una, dos o tres sustituciones de aminoácidos.

Un procedimiento útil para la identificación de residuos o regiones de un anticuerpo y/o el polipéptido de unión que se pueden elegir como dianas para la mutagénesis se denomina “mutagénesis dirigida por barrido de alanina”, como describen Cunningham y Wells (1989) Science, 244:1081-1085 En este procedimiento, un residuo o grupo de residuos diana (p. ej., residuos con carga como Arg, Asp, His, Lys y Glu) se identifican y sustituyen por un aminoácido neutro o cargado negativamente (p. ej., alanina o polialanina) para determinar si la interacción del anticuerpo-antígeno se ve afectada. Se pueden introducir sustituciones adicionales en las posiciones de aminoácido que presentan sensibilidad funcional a las sustituciones iniciales. Alternativamente, o adicionalmente, se determina una estructura cristalina de un complejo antígeno-anticuerpo para identificar puntos de contacto entre el anticuerpo y el antígeno. Tales residuos de contacto y residuos adyacentes se pueden elegir como diana o eliminar como candidatos para la sustitución. Las variantes se pueden cribar para determinar si contienen las propiedades deseadas.

Las inserciones de secuencias de aminoácidos incluyen fusiones en los extremos amino- y/o carboxiterminal que varían en cuanto a longitud de un residuo a polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como inserciones intrasecuencia de un único o múltiples residuos de aminoácido. Los ejemplos de inserciones en los extremos incluyen un anticuerpo con un residuo de metionilo aminoterminal. Otras variantes de inserción de la molécula de anticuerpo incluyen la fusión de los extremos amino- o carboxiterminal del anticuerpo a una enzima (p. ej., para ADEPT) o un polipéptido que aumenta la semivida en suero del anticuerpo.

En ciertos aspectos, un anticuerpo y/o polipéptido de unión proporcionados en este documento se pueden modificar adicionalmente para que contengan restos no proteicos adicionales que son conocidos en la técnica y fácilmente asequibles. Los restos adecuados para la derivatización del anticuerpo y/o el polipéptido de unión incluyen, pero no se limitan a, polímeros hidrosolubles. Los ejemplos no limitantes de polímeros hidrosolubles incluyen, pero no se limitan a, polietilenglicol (PEG), copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anhídrido maleico, poliaminoácidos (homopolímeros o copolímeros aleatorios) y dextrano o poli(n-vinilpirrolidona)polietilenglicol, homopolímeros de propropilenglicol, copolímeros de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados (p. ej., glicerol), alcohol polivinílico y mezclas de los mismos. El polietilenglicol propionaldehído puede tener ventajas en la fabricación debido a su estabilidad en agua. El polímero puede ser de cualquier peso molecular y puede ser ramificado o no ramificado. El número de polímeros fijados al anticuerpo y/o al polipéptido de unión puede variar y, si hay fijado más de un polímero, estos pueden ser la misma molécula o diferentes moléculas. En general, el número y/o tipo de polímeros usados para la derivatización se puede determinar en base a consideraciones que incluyen, pero no se limitan a, las propiedades o funciones particulares del anticuerpo y/o el polipéptido de unión que se va a mejorar, si el derivado de anticuerpo y/o el derivado de polipéptido de unión se usará en una terapia en condiciones definidas, etc.

D. Antagonistas de molécula pequeña

En otros aspectos, un antagonista de ALK7:ActRIIB es una molécula pequeña (antagonista de molécula pequeña de ALK7:ActRIIB), o combinación de antagonistas de molécula pequeña. Un antagonista de molécula pequeña de ALK7:ActRIIB, o combinación de antagonistas de molécula pequeña, puede inhibir, por ejemplo, uno o más ligandos de unión a ALK7:ActRIIB, un receptor de tipo I (p. ej., ALK7), un receptor de tipo II (p. ej., ActRIIB), y/o correceptor (por ejemplo, Cripto o Cryptic). En algunos aspectos, antagonista de molécula pequeña de ALK7:ActRIIB, o combinación de antagonistas de molécula pequeña, inhibe la transducción de señales mediada por uno o más ligandos de unión a ALK7:ActRIIB, por ejemplo, según se determina en un ensayo basado en células tal como los descritos en este documento. Como se describe en este documento, se pueden usar antagonistas de molécula pequeña de ALK7:ActRIIB, solos o en combinación con una o más terapias de apoyo o agentes activos, para tratar a un paciente que lo necesite (p. ej., pacientes que tienen enfermedad renal y/o un trastorno metabólico).

En algunos aspectos, un antagonista de molécula pequeña de ALK7:ActRIIB, o combinación de antagonistas de molécula pequeña, inhibe al menos GDF11. En algunos aspectos, un antagonista de molécula pequeña de ALK7:ActRIIB, o combinación de antagonistas de molécula pequeña, inhibe al menos GDF8. En algunos aspectos, un antagonista de molécula pequeña de ALK7:ActRIIB, o combinación de antagonistas de molécula pequeña, inhibe al menos activina (activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE y/o activina BE). En algunos aspectos, un antagonista de molécula pequeña de ALK7:ActRIIB, o combinación de antagonistas de molécula pequeña, inhibe al menos GDF11, GDF8 y activina. En algunos aspectos, un antagonista de molécula pequeña de ALK7:ActRIIB, o combinación de antagonistas de molécula pequeña, inhibe al menos ALK7. En algunos aspectos, un antagonista de molécula pequeña de ALK7:ActRIIB, o combinación de antagonistas de molécula pequeña, inhibe al menos ActRIIB. En algunos aspectos, un antagonista de molécula pequeña de ALK7:ActRIIB, o combinación de antagonistas de molécula pequeña, inhibe al menos Cripto o Cryptic. En algunos aspectos, un antagonista de molécula pequeña de ALK7:ActRIIB, o combinación de antagonistas de molécula pequeña, inhibe al menos BMP6. En algunos aspectos, un antagonista de molécula pequeña de ALK7:ActRIIB, o combinación de antagonistas de molécula pequeña, inhibe al menos GDF3. En algunos aspectos, un antagonista de molécula pequeña de ALK7:ActRIIB, o combinación de antagonistas de molécula pequeña, inhibe al menos BMP5. En algunos aspectos, un antagonista de molécula pequeña de ALK7:ActRIIB, o combinación de antagonistas de molécula pequeña, inhibe al menos BMP10. En algunos aspectos, un antagonista de molécula pequeña de ALK7:ActRIIB, o combinación de antagonistas de molécula pequeña, inhibe al menos nodal. En algunos aspectos, un antagonista de molécula pequeña de ALK7:ActRIIB, o combinación de antagonistas de molécula pequeña, como se describe en este documento, no inhibe o no inhibe sustancialmente BMP9.

Los antagonistas de molécula pequeña de ALK7:ActRIIB pueden ser inhibidores directos o indirectos. Por ejemplo, un antagonista indirecto de molécula pequeña, o una combinación de antagonistas de molécula pequeña, puede inhibir la expresión (p. ej., transcripción, traducción, secreción celular o combinaciones de las mismas) de al menos uno o más ligandos de la superfamilia de TGF-p. [p ej., activina ( p. ej., activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina B, activina BC, activina AE o activina BE), GDF11, BMP10, BMP9, BMP6, BMP5, GDF3, activina C, activina E, activina AC, GDF8, BMP10, BMP6, BMP5, nodal y GDF3, receptor de tipo I (p. ej., ALK7), receptores de tipo II (p. ej., ActRIIB), correceptor (p. ej., Cripto o Cryptic ), y/o uno o más componentes de transducción de señales aguas abajo (por ejemplo, Smad). Alternativamente, un antagonista directo de molécula pequeña, o una combinación de antagonistas de molécula pequeña, puede unirse directamente e inhibir, por ejemplo, uno o más ligandos de la superfamilia de TGF-p. [p. ej., activina (p. ej., activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina B, activina BC, activina AE o activina BE), GDF11, BMP10, BMP9, BMP6, BMP5, GDF3, activina C, activina E, activina AC, GDF8, BMP10. BMP6, BMP5, nodal y GDF3, receptores de tipo I (p. ej., ALK7), receptores de tipo II (p. ej., ActRIIB), correceptores (p. ej., Cripto o Cryptic), y/o componentes de transducción de señales aguas abajo (por ejemplo, Simad). Se pueden usar combinaciones de uno o más antagonistas de molécula pequeña ALK7:ActRIIB indirectos y uno o más directos de acuerdo con los procedimientos descritos en este documento.

Los antagonistas de molécula pequeña de unión de la presente descripción se pueden identificar y sintetizar químicamente usando metodología conocida (véanse, p. ej., las publicaciones PCT n.° WO 00/00823 y WO 00/39585). En general, los antagonistas de molécula pequeña de la descripción son normalmente de tamaño inferior a aproximadamente 2000 daltons, alternativamente de tamaño inferior a aproximadamente 1500, 750, 500, 250 o 200 daltons, donde tales moléculas pequeñas orgánicas son capaces de unirse, preferiblemente específicamente, a un polipéptido como se describe en este documento. Estos antagonistas de molécula pequeña se pueden identificar sin experimentación excesiva usando técnicas muy conocidas. A este respecto, cabe señalar que las técnicas para cribar colecciones de moléculas pequeñas orgánicas para seleccionar moléculas que son capaces de unirse a una diana polipeptídica son muy conocidas en la técnica (véanse, p. ej., las publicaciones de patentes internacionales n.° WO00/00823 y WO00/39585).

Las moléculas pequeñas orgánicas de unión de la presente descripción pueden ser, por ejemplo, aldehídos, cetonas, oximas, hidrazonas, semicarbazonas, carbazidas, aminas primarias, aminas secundarias, aminas terciarias, hidrazinas sustituidas en N, hidrazidas, alcoholes, éteres, tioles, tioéteres, disulfuros, ácidos carboxílicos, ésteres, amidas, ureas, carbamatos, carbonatos, cetales, tiocetales, acetales, tioacetales, haluros de arilo, sulfonatos de arilo, haluros de alquilo, sulfonatos de alquilo, compuestos aromáticos, compuestos heterocíclicos, anilinas, alquenos, alquinos, dioles, aminoalcoholes, oxazolidinas, oxazolinas, tiazolidinas, tiazolinas, enaminas, sulfonamidas, epóxidos, aziridinas, isocianatos, cloruros de sulfonilo, compuestos diazo y cloruros de ácido.

E. Antagonistas polinucleotídicos

En otros aspectos, un antagonista de ALK7:ActRIIB es un polinucleótido (antagonista polinucleotídico de ALK7:ActRIIB), o combinación de polinucleótidos. Un antagonista polinucleotídico de ALK7:ActRIIB, o una combinación de antagonistas polinucleotídicos, puede inhibir, por ejemplo, uno o más ligandos de unión a ALK7:ActRIIB, receptores de tipo I (p. ej., ALK7), receptores de tipo II (p. ej., ActRIIB), correceptor (p. ej., Cripto o Cryptic), y/o componente de transducción de señales aguas abajo (por ejemplo, Smad). En algunos aspectos, antagonista polinucleotídico de ALK7:ActRIIB, o combinación de antagonistas polinucleotídicos, inhibe la transducción de señales mediada por uno o más ligandos de unión a ALK7:ActRIIB, por ejemplo, según se determina en un ensayo basado en células tal como los descritos en este documento. Como se describe en este documento, se pueden usar antagonistas polinucleotídicos de ALK7:ActRIIB, solos o en combinación con una o más terapias de apoyo o agentes activos, para tratar a un paciente que lo necesite (p. ej., pacientes que tienen enfermedad renal y/o un trastorno metabólico).

En algunos aspectos, un antagonista polinucleotídico de ALK7:ActRIIB, o combinación de antagonistas polinucleotídicos, inhibe al menos GDF11. En algunos aspectos, un antagonista polinucleotídico de ALK7:ActRIIB, o combinación de antagonistas polinucleotídicos, inhibe al menos GDF8. En algunos aspectos, un antagonista polinucleotídico de ALK7:ActRIIB, o combinación de antagonistas polinucleotídicos, inhibe al menos activina (activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina AE, activina BC y/o activina BE). En algunos aspectos, un antagonista polinucleotídico de ALK7:ActRIIB, o combinación de antagonistas polinucleotídicos, inhibe al menos GDF11, GDF8 y activina. En algunos aspectos, un antagonista polinucleotídico de ALK7:ActRIIB, o combinación de antagonistas polinucleotídicos, inhibe al menos ALK7. En algunos aspectos, un antagonista polinucleotídico de ALK7:ActRIIB, o combinación de antagonistas polinucleotídicos, inhibe al menos ActRIIB. En algunos aspectos, un antagonista polinucleotídico de ALK7:ActRIIB, o combinación de antagonistas polinucleotídicos, inhibe al menos Crypto o Cryptic. En algunos aspectos, un antagonista polinucleotídico de ALK7:ActRIIB, o combinación de antagonistas polinucleotídicos, inhibe al menos ActRIIB. En algunos aspectos, un antagonista polinucleotídico de ALK7:ActIIB, o combinación de antagonistas polinucleotídicos, inhibe al menos BMP6. En algunos aspectos, un antagonista polinucleotídico de ALK7:ActRIIB, o combinación de antagonistas polinucleotídicos, inhibe al menos GDF3. En algunos aspectos, un antagonista polinucleotídico de ALK7:ActRIIB, o combinación de antagonistas polinucleotídicos, inhibe al menos BMP10, en algunos aspectos, un antagonista polinucleotídico de ALK7:ActRIIB, o combinación de antagonistas polinucleotídicos, inhibe al menos BMP5. En algunos aspectos, un antagonista polinucleotídico de ALK7:ActRIIB, o combinación de antagonistas polinucleotídicos, inhibe al menos nodal. En algunos aspectos, un antagonista polinucleotídico de ALK7:ActRIIB, o combinación de antagonistas polinucleotídicos, como se describe en este documento, no inhibe o no inhibe sustancialmente BMP9.

Los antagonistas polinucleotídicos de la descripción pueden ser un ácido nucleico no codificante, una molécula de ARNi [por ejemplo, ARN de interferencia pequeño (siRNA), ARN de horquilla corta (shRNA), microARN (miARN)], un aptámero y/o una ribozima. Las secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos de GDF11, GDF8, activina (activina A, activina B, activina C, activina E), BMP6, GDF3, BMP5, ALK7, ActRIIB, Cripto, Cryptic, Nodal, y BMP10 se conocen en la técnica además, en la técnica se conocen muchos procedimientos diferentes de generación de antagonistas polinucleotídicos. Por lo tanto, los antagonistas polinucleotídicos para su uso según los procedimientos de la presente descripción pueden ser fabricados rutinariamente por un experto en la técnica en base a los conocimientos de la técnica y las enseñanzas proporcionadas en este documento.

Se puede usar tecnología no codificante para controlar la expresión genética mediante ADN o ARN no codificante o mediante la formación de triple hélice. Las técnicas no codificantes se describen, por ejemplo, en Okano (1991) J. Neurochem. 56:560; Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, Fla. (1988). La formación de triple hélice se describe en, por ejemplo, Cooney y col. (1988) Science 241:456; y Dervan y col., (1991) Science 251:1300. Los procedimientos se basan en la unión de un polinucleótido a un ^aDⁿo ARN complementario. En algunos aspectos, los ácidos nucleicos no codificantes comprenden una secuencia de ADN o ARN monocatenarios que es complementaria a al menos una porción de una transcripción de ARN de un gen descrito en este documento. Sin embargo, no se requiere complementariedad absoluta, aunque se prefiere.

Una secuencia “complementaria a al menos una porción de un ARN” a la que se hace referencia en este documento significa una secuencia que tiene complementariedad suficiente para ser capaz de hibridarse con el ARN, lo que forma un dúplex estable; en el caso de ácidos nucleicos no codificantes bicatenarios de un gen descrito en este documento se puede ensayar, por tanto, una única cadena del dúplex de ADN o se puede ensayar la formación de tríplex. La capacidad para hibridar dependerá tanto del grado de complementariedad como de la longitud del ácido nucleico no codificante. Generalmente, cuanto mayor es el ácido nucleico de hibridación, más apareamientos incorrectos de bases con un ARN puede contener y seguir formando un dúplex estable (o tríplex, según sea el caso). Un experto en la técnica puede determinar un grado tolerable de apareamientos incorrectos mediante el uso de procedimientos estándar para determinar el punto de fusión del complejo hibridado.

Los polinucleótidos que son complementarios al extremo 5' del mensaje, por ejemplo, la secuencia 5' no traducida hasta, e incluyendo, el codón de iniciación AUG, deberían funcionar con más efectividad para inhibir la traducción. Sin embargo, se ha demostrado que las secuencias complementarias a las secuencias 3' no traducidas de ARNm también son efectivas para inhibir la traducción de ARNm [véase, p. ej., Wagner, R., (1994) Nature 372:333-335]. Por tanto, los oligonucleótidos complementarios a las regiones no codificantes 5 'o 3' no traducidas de un gen de la descripción se podrían usar en una estrategia no codificante para inhibir la traducción de un ARNm endógeno. Los polinucleótidos complementarios a la región 5' no traducida del ARNm deben incluir el complemento del codón de iniciación AUG. Los polinucleótidos no codificantes complementarios a regiones codificantes de ARNm son inhibidores menos eficaces de la traducción, pero se podrían usar según los procedimientos de la presente descripción. Independientemente de si están diseñados para hibridarse a las regiones 5', 3' o codificante de un ARNm de la descripción, los ácidos nucleicos no codificantes deben tener al menos seis nucleótidos de longitud, y son preferiblemente oligonucleótidos que varían de 6 a aproximadamente 50 nucleótidos de longitud. En aspectos específicos, el oligonucleótido tiene al menos 10 nucleótidos, al menos 17 nucleótidos, al menos 25 nucleótidos o al menos 50 nucleótidos.

En un aspecto, el ácido nucleico no codificante de la presente descripción se produce intracelularmente por transcripción a partir de una secuencia exógena. Por ejemplo, se transcribe un vector o una porción del mismo, lo que produce un ácido nucleico no codificante (ARN) de un gen de la descripción. Tal vector contendría una secuencia que codifica el ácido nucleico no codificante deseado. Tal vector puede permanecer episómico o integrarse cromosómicamente, siempre que pueda transcribirse para producir el ARN no codificante deseado. Tales vectores se pueden construir mediante procedimientos de tecnología de ADN recombinante estándar de la técnica. Los vectores pueden ser plásmidos, víricos u otros conocidos en la técnica, usados para la replicación y expresión en células de vertebrados. La expresión de la secuencia que codifica genes deseados de la presente descripción, o fragmentos de los mismos, se puede realizarse mediante cualquier promotor que se sabe en la técnica que actúa en células de vertebrados, preferiblemente de seres humanos. Tales promotores pueden ser inducibles o constitutivos. Tales promotores incluyen, pero no se limitan a, la región de promotor temprano de SV40 [véase, p. ej., Benoist y Chambon (1981) Nature 290:304-310], el promotor contenido en la repetición terminal larga 3' del virus del sarcoma de Rous [véase, p. ej., Yamamoto y col. (1980) Cell 22:787-797], el promotor de timidina del herpes [véase, p. ej., Wagner y col. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445] y las secuencias reguladoras del gen de la metalotioneína [véase, p. ej., Brinster y col. (1982) Nature 296:39-42].

En algunos aspectos, los antagonistas de polinucleótidos son moléculas de ARN de interferencia (ARNi) que se dirigen a la expresión de uno o más de: GDF11, GDF8, activina (activina A, activina B, activina C y activina E), BMP6, GDF3, BMP5, ALK7, ActRIIB, Cripto, Cryptic, nodal y BMP 10. ARNi se refiere a la expresión de un ARN que interfiere con la expresión del ARNm objetivo. Específicamente, el ARNi silencia un gen objetivo al interactuar con el ARNm específico mediante un siRNA (a Rn de interferencia pequeño). El complejo de ARN bicatenario se convierte a continuación en objetivo para la degradación por la célula. Una molécula de siRNA es un dúplex de ARN bicatenario de 10 a 50 nucleótidos de longitud, que interfiere con la expresión de un gen objetivo que es lo suficientemente complementario (p. ej., al menos 80 % de identidad con el gen). En algunos aspectos, la molécula de siRNA comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % idéntica a la secuencia de nucleótidos del gen objetivo.

Las moléculas de ARNi adicionales incluyen ARN de horquilla corta (shRNA); así como horquilla de interferencia corta y microARN (miARN). La molécula de shRNA contiene secuencias codificantes y no codificantes de un gen objetivo conectadas por un bucle. El shRNA es transportado del núcleo al citoplasma y es degradado junto con el ARNm. Los promotores Pol III o U6 se pueden usar para expresar ARN para ARNi. Paddison y col. [Genes & Dev. (2002) 16:948-958, 2002] han usado moléculas de ARN pequeñas plegadas en horquillas como un medio para afectar al ARNi. Por consiguiente, tales moléculas de ARN de horquilla corta (shRNA) también se usan ventajosamente en los procedimientos descritos en este documento. La longitud del tallo y el bucle de los shRNA funcionales varía; las longitudes de los tallos pueden variar de aproximadamente 25 a aproximadamente 30 nt y el tamaño del bucle puede variar de 4 a aproximadamente 25 nt sin que esto afecte a la actividad de silenciamiento. Sin desear ceñirnos a ninguna teoría particular, se cree que estos shRNA se asemejan a los productos de ARN bicatenario (dsARN) de la RNasa DICER y, en cualquier caso, tienen la misma capacidad para inhibir la expresión de un gen específico. El shRNA se puede expresar a partir de un vector lentivírico. Un miARN es un ARN monocatenario de aproximadamente 10 a 70 nucleótidos de longitud que se transcribe inicialmente como pre-miARN caracterizado por una estructura de “tallobucle”, que posteriormente se procesa para producir miARN maduro después del procesamiento adicional mediante el RISC.

Las moléculas que median ARNi, lo que incluye, sin limitación, siRNA, se pueden producir in vitro mediante síntesis química (Hohjoh, FEBS Lett 521:195-199, 2002), hidrólisis de dsARN (Yang y col., Proc Natl Acad Sci USA 99:9942-9947, 2002), mediante transcripción in vitro con T7 ARN polimerasa (Donzeet y col., Nucleic Acids Res 30:e46, 2002; Yu y col., Proc Natl Acad Sci USA 99:6047-6052, 2002) y mediante hidrólisis de ARN bicatenario utilizando una nucleasa tal como RNasa III de E. coli (Yang y col., Proc Natl Acad Sci USA 99:9942-9947, 2002).

Según otro aspecto, la descripción proporciona antagonistas de polinucleótidos que incluyen, pero no se limitan a, un ADN señuelo, un ADN bicatenario, un ADN monocatenario, un ADN complejado, un ADN encapsulado, un ADN vírico, un ADN de plásmido, un ARN desnudo, un ARN encapsulado, un ARN vírico, un ARN bicatenario, una molécula capaz de generar interferencia de ARN o combinaciones de los mismos.

En algunos aspectos, los antagonistas de polinucleótidos de la descripción son aptámeros. Los aptámeros son moléculas de ácido nucleico, que incluyen moléculas de ADN bicatenario y ARN monocatenario, que se unen a y forman estructuras terciarias que se unen específicamente a una molécula diana. La generación y el uso terapéutico de aptámeros están muy consolidados en la técnica. (véase, p. ej., la patente de los EE. UU. n.° 5475096). Se puede encontrar información adicional sobre aptámeros en la solicitud de patente de los EE. UU. con n.° de publicación 20060148748. Los aptámeros de ácidos nucleicos se seleccionan usando procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante el procedimiento de evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial (SELEX). SELEx es un procedimiento para la evolución in vitro de moléculas de ácido nucleico con unión muy específica a moléculas diana como se describe en, p. ej., las patentes de los EE. UU. n.° 5475096, 5580737, 5567588, 5707 796, 5763 177, 6011 577 y 6699843. Otro procedimiento de cribado para identificar aptámeros se describe en la patente de los EE. UU. n.° 5270163. El procedimiento SELEX se basa en la capacidad de los ácidos nucleicos para formar un abanico de estructuras bi- y tridimensionales, así como en la versatilidad química disponible en los monómeros de nucleótido para actuar como ligandos (formar pares de unión específica) con virtualmente cualquier compuesto químico, ya sea monomérico o polimérico, lo que incluye otras moléculas de ácido nucleico y polipéptidos. Las moléculas de cualquier tamaño o composición pueden servir como dianas. El procedimiento SELEX implica la selección de una mezcla de oligonucleótidos candidatos e iteraciones graduales de unión, separación y amplificación, usando el mismo esquema de selección general, para conseguir la afinidad y selectividad de unión deseadas. A partir de una mezcla de ácidos nucleicos, que puede comprender un segmento de secuencia aleatorizada, el procedimiento SELEX incluye etapas de poner en contacto la mezcla con la diana en condiciones favorables para la unión; separar los ácidos nucleicos no unidos de los ácidos nucleicos que se han unido específicamente a las moléculas diana; disociar los complejos ácido nucleico-diana; amplificar los ácidos nucleicos disociados de los complejos ácido nucleicodiana para producir una mezcla de ácidos nucleicos enriquecida con ligando. Las etapas de unión, separación, disociación y amplificación se repiten tantos ciclos como se desee para producir ligandos de ácido nucleico que se unen con alta afinidad y especificidad a la molécula diana.

Típicamente, tales moléculas de unión se administran independientemente al animal [véase, p. ej., O'Connor (1991) J. Neurochem. 56:560], pero tales moléculas de unión también se pueden expresar in vivo a partir de polinucleótidos absorbidos por una célula hospedadora y expresados in vivo [véase, p. ej., Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, Fla. (1988)].

F. Antagonistas de folistatina y FLRG

Se sabe que los miembros del grupo de proteínas folistatina y FLRG antagonizan los ligandos que envían señales a través de la vía de ALK7:ActRIIB. Por consiguiente, en otros aspectos, un antagonista de ALK7:ActRIIB es un polipéptido de folistatina o FLRG, que puede usarse solo o en combinación con una o más terapias y/o agentes activos de apoyo adicionales como se describe en este documento para lograr un efecto deseado (p. ej., tratar a pacientes que tienen enfermedad renal y/o un trastorno metabólico).

El término “polipéptido de folistatina” incluye polipéptidos que comprenden cualquier polipéptido de folistatina de origen natural, así como cualquier variante de los mismos (lo que incluye mutantes, fragmentos, fusiones y formas peptidomiméticas) que conserva una actividad útil, e incluye además cualquier monómero o multímero funcionales de folistatina. En ciertos aspectos preferidos, los polipéptidos de folistatina de la descripción se unen a y/o inhiben la actividad de activina y/o GDF8. Las variantes de polipéptidos de folistatina que conservan las propiedades de unión a activina se pueden identificar en base a estudios anteriores que implican interacciones entre folistatina y activina. Por ejemplo, el documento WO2008/030367 describe dominios de folistatina específicos (“FSD”) que se ha demostrado que son importantes para la unión a activina. Como se muestra más adelante en las SEQ ID NO: 90-94, el dominio aminoterminal de la folistatina (“FSND” SEQ ID NO: 92), FSD2 (SEQ ID NO: 94) y, en menor medida, Fs D1 (SEQ ID NO: 93) representan dominios ejemplares de la folistatina que son importantes para la unión a activina. Además, los procedimientos para fabricar y ensayar colecciones de polipéptidos se describieron anteriormente en el contexto de los polipéptidos de ActRII, y tales procedimientos también se refieren a la fabricación y el ensayo de variantes de folistatina. Los polipéptidos de folistatina incluyen polipéptidos derivados de la secuencia de cualquier folistatina conocida que tiene una secuencia al menos aproximadamente 80 % idéntica a la secuencia de un polipéptido de folistatina, y opcionalmente al menos 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o identidad superior. Los ejemplos de polipéptidos de folistatina incluyen el polipéptido de folistatina maduro o isoformas más cortas u otras variantes del polipéptido precursor de la folistatina humana (SEQ ID NO: 90) como se describe, por ejemplo, en el documento WO2005/025601.

La isoforma FST344 del polipéptido precursor de la folistatina humana es la siguiente:

1 MVRARHQPGG LCLLLLLLCQ FMEDRSAQAG NCWLRQAKNG RCQVLYKTEL

51 SKEECCSTGR LSTSWTEEDV NDNTLFKWMI FNGGAPNCIP CKETCENVDC

101 GPGKKCRMNK KNKPRCVCAP DCSNITWKGP VCGLDGKTYR NECALLEARC

151 KEQPELEVQY QGRCKKTCRD VFCPGSSTCV VDQTNNAYCV TCNRICPEPA

201 SSEQYLCGND GVTYSSACHL RKATCLLGRS IGLAYEGKCI KAKSCEDIQC

251 TGGKKCLWDF KVGRGRCSLC DELCPDSKSD EPVCASDNAT YASECAMKEA

301 ACSSGVLLEV KHSGSCNSIS EDTEEEEEDE DQDYSFPISS ILEW

(SEQ ID NO: 90; NCBI N.° de referencia NP_037541.1)

El péptido señal está subrayado; también están subrayados los últimos 27 residuos que representan la extensión carboxiterminal que distingue esta isoforma de la folistatina de la isoforma de la folistatina más corta FST317 mostrada a continuación.

La isoforma FST317 del polipéptido precursor de la folistatina humana es la siguiente:

1 MVRARHOPGG LCLLLLLLCO FMEDRSAOAG NCWLRQAKNG

RCQVLYKTEL

51 SKEECCSTGR LSTSWTEEDV NDNTLFKWMI FNGGAPNCIP CKETCENVDC

101 GPGKKCRMNK KNKPRCVCAP DCSNITWKGP VCGLDGKTYR

NECALLKARC

151 KEQPELEVQY QGRCKKTCRD VFCPGSSTCV VDQTNNAYCV TCNRICPEPA

201 SSEQYLCGND GVTYSSACML RKATCLLGRS 1GLAYEGKCI KAKSCED1QC

251 TGGKKCLWDF KVGRGRCSLC DELCPDSKSD EPVCASDNAT

YASECAMKEA

30! ACSSGVLLEV KHSGSCN (SEQIDNO: 91;NCBIN.° de referencia NP 006341.1)

El péptido señal está subrayado.

La secuencia del dominio aminoterminal de la folistatina (FSND) es la siguiente:

GN CWLRQ AKNGRC Q VLYKTELSKEEC C S TGRLSTSWTEED VNDN

TLFKWMIFNGGAPNCIPCK (SEQ ID NO: 92; FSND)

Las secuencias FSD1 y FSD2 son las siguientes:

ETCENVDCGPGKKCRMNKKNKPRCV (SEQ ID NO: 93; FSD1)

KTCRDVFCPGSSTCVVDQTNNAYCVT (SEQ ID NO: 94; FSD2)

En otros aspectos, un antagonista de ALK7:ActRIIB es un gen relacionado con folistatina (FLRG), también conocido como proteína 3 relacionada con folistatina (FSTL3). El término “polipéptido de FLRG” incluye polipéptidos que comprenden cualquier polipéptido de origen natural de FLRG, así como cualquier variante de los mismos (lo que incluye mutantes, fragmentos, fusiones y formas peptidomiméticas) que conserva una actividad útil. En ciertos aspectos, los polipéptidos de FLRG de la descripción se unen a y/o inhiben la actividad de activina, particularmente activina A. Las variantes de polipéptidos de FLRG que conservan las propiedades de unión a activina se pueden identificar usando procedimientos rutinarios para ensayar las interacciones entre FLRG y activina (véase, p. ej., el documento US 6 537 966). Además, los procedimientos para fabricar y ensayar colecciones de polipéptidos se describieron anteriormente en el contexto de los polipéptidos de ActRII y ALK7, y tales procedimientos también se refieren a la fabricación y el ensayo de variantes de FLRG. Por ejemplo, los polipéptidos de FLRG incluyen polipéptidos derivados de la secuencia de cualquier FLRG conocida que tiene una secuencia al menos aproximadamente 80 % idéntica a la secuencia de un polipéptido de FLRG, y opcionalmente al menos un 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 99 % o identidad superior.

El polipéptido precursor de FLRG humana (precursor de la proteína 3 relacionada con la folistatina) es el siguiente:

1 MRPGAPGPLW PLPWGALAWA VGFVSSMGSG NPAPGGVCWL QQGQEATCSL

51 VLQTDVTRAE CCASGNIDTA WSNLTHPGNK INLLGFLGLV HCLPCKDSCD

10 L GVECGPGKAC RMLGGRPRCE CAPDCSGLPA RLQVCGSDGA TYRDECELRA

151 ARCRGHPDLS VMYRGRCRKS CEHVVC'PRPQ SCVVDQTGSA HCVVCRAAPC

201 PVPSSPGQEL CGNNNVTYIS SCHMRQATCF LGRSIGVRHA GSCAGTPEEP

251 PGGESAEEEE NFV (SEQ ID NO: 95;NCBIN.° de referenciaNPJ)05S51.1)

El péptido señal está subrayado.

En ciertos aspectos, las variantes funcionales o formas modificadas de los polipéptidos de folistatina y los polipéptidos de FLRG incluyen proteínas de fusión que tienen al menos una porción del polipéptido de folistatina o polipéptido de FLRG y uno o más dominios de fusión, tales como, por ejemplo, dominios que facilitan el aislamiento, la detección, la estabilización o la multimerización del polipéptido. Los dominios de fusión adecuados se comentaron pormenorizadamente anteriormente con referencia a los polipéptidos de ActRII. En algún aspecto, un agente antagonista de la descripción es una proteína de fusión que comprende una porción de unión a activina de un polipéptido de folistatina fusionado a un dominio Fc. En otro aspecto, un agente antagonista de la descripción es una proteína de fusión que comprende una porción de unión a activina de un polipéptido de FLRG fusionado a un dominio Fc.

G. Lefty A y B

Se sabe que las proteínas Lefty A y B regulan Nodal y otras que envían señales a través de la vía de ALK7:ActRIIB. Por consiguiente, en otros aspectos, un antagonista de ALK7:ActRIIB es un polipéptido de Lefty A o Lefty B, que puede usarse solo o en combinación con una o más terapias y/o agentes activos de apoyo adicionales como se describe en este documento para lograr un efecto deseado (p. ej., tratar enfermedad renal y/o una afección o trastorno metabólico).

El término “polipéptido de Lefty A” incluye polipéptidos que comprenden cualquier polipéptido de Lefty A de origen natural, así como cualquier variante de los mismos (lo que incluye mutantes, fragmentos, fusiones y formas peptidomiméticas) que conserva una actividad útil, e incluye además cualquier monómero o multímero funcionales de Lefty A. En ciertos aspectos preferidos, los polipéptidos de Lefty A de la descripción se unen a y/o inhiben la actividad de nodal. Además, los procedimientos para crear y probar colecciones de polipéptidos se describen anteriormente en el contexto de los polipéptidos de ActRII y ALK7, y dichos procedimientos también se refieren a la fabricación y prueba de variantes de Lefty A. Los polipéptidos de Lefty A incluyen polipéptidos derivados de la secuencia de cualquier Lefty A conocida que tiene una secuencia al menos aproximadamente un 80 % idéntica a la secuencia de un polipéptido de Lefty A, y opcionalmente al menos un 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más de identidad. Los ejemplos de polipéptidos Lefty A incluyen el polipéptido Lefty A maduro o isoformas más cortas u otras variantes del polipéptido precursor de Lefty A humana (SEQ ID NO: 96).

El polipéptido precursor de Lefty A humana es el siguiente:

1 MWPLWLCWALWVLPLAGPGAALTEEQLLGSLLRQLQLSEVPVLDRADMEKLVIPAHVRAQ

61YWLLRRSHGDRSRGKRFSQSFREVAGRFLASEASTHLLVFGMEQRLPPNSELVQAVLRL

121FQEPVPKAALHRHGRLSPRSAQARVTVEWLRVRDDGSNRTSLIDSRLVSVHESGWKAFDV

181TEAVNFWQQLSRPRQPLLLQVSVQREHLGPLASGAHKLVRFASQGAPAGLGEPQLELHTL

241DLRDYGAQGDCDPEAPMTEGTRCCRQEMYIDLQGMKWAKNWVLEPPGFLAYECVGTCQQP

301PEALAFNWPFLGPRQCIASETASLPMIVSIKEGGRTRPQVVSLPNMRVQKCSCASDGALV

361PRRLQP

(SEQ ID NO: 96; GenBank Id: AAD48145.1)

El péptido señal está subrayado.

El término “polipéptido de Lefty B” incluye polipéptidos que comprenden cualquier polipéptido de Lefty B de origen natural, así como cualquier variante de los mismos (lo que incluye mutantes, fragmentos, fusiones y formas peptidomiméticas) que conserva una actividad útil, e incluye además cualquier monómero o multímero funcionales de Lefty B. En ciertos aspectos preferidos, los polipéptidos de Lefty B de la descripción inhiben la actividad de nodal. Además, los procedimientos para crear y probar colecciones de polipéptidos se describen anteriormente en el contexto de los polipéptidos de ActRII y ALK7, y dichos procedimientos también se refieren a la fabricación y prueba de variantes de Lefty B. Los polipéptidos de Lefty B incluyen polipéptidos derivados de la secuencia de cualquier Lefty B conocida que tiene una secuencia al menos aproximadamente un 80 % idéntica a la secuencia de un polipéptido de Lefty B, y opcionalmente al menos un 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más de identidad. Los ejemplos de polipéptidos Lefty B incluyen el polipéptido Lefty B maduro o isoformas más cortas u otras variantes del polipéptido precursor de Lefty B humana (^sE^qID NO: 97).

El polipéptido precursor de Lefty B humana es el siguiente:

1 MQPLWLCWALWVLPLASPGAALTGEQLLGSLLRQLQLKEVPTLDRADMEELVIPTHVRAQ

61YVALLQRSHGDRSRGKRFSQSFREVAGRFLALEASTHLLVFGMEQRLPPNSELVQAVLRL

121FQEPVPKAALHRHGRLSPRSARARVTVEWLRVRDDGSNRTSLIDSRLVSVHESGWKAFDV

181TEAVNFWQQLSRPRQPLLLQVSVQREHLGPLASGAHKLVRFASQGAPAGLGEPQLELHTL

241DLGDYGAQGDCDPEAPMTEGTRCCRQEMYIDLQGMKWAENWVLEPPGFLAYECVGTCRQP

301PEALAFKWPFLGPRQCIASETDSLPMIVSIKEGGRTRPQVVSLPNMRVQKCSCASDGALV

361PRRLQP

(SEQ ID NO: 97; GenBank Id: AAD48144.1)

El péptido señal está subrayado.

En ciertos aspectos, las variantes funcionales o formas modificadas de los polipéptidos de Lefty A y los polipéptidos de Lefty B incluyen proteínas de fusión que tienen al menos una porción del polipéptido de Lefty A o polipéptido de Lefty y uno o más dominios de fusión, tales como, por ejemplo, dominios que facilitan el aislamiento, la detección, la estabilización o la multimerización del polipéptido. Los dominios de fusión adecuados se comentaron pormenorizadamente anteriormente con referencia a los polipéptidos de ActRII y ALK7. En algún aspecto, un agente antagonista de la descripción es una proteína de fusión que comprende una porción de unión a nodal de un polipéptido de Lefty A y/o Lefty B fusionado a un dominio Fc.

H. Proteínas relacionadas con DAN

Se sabe que los miembros de la familia de proteínas DAN regulan los ligandos que envían señales a través de la ruta ALK7:ActRIIB. Por consiguiente, en otros aspectos, un antagonista de ALK7:ActRIIB es una proteína relacionada con DAN (p. ej., Cerberus y Coco), que puede usarse sola o en combinación con una o más terapias y/o agentes activos de apoyo adicionales como se describe en este documento para lograr un efecto deseado (p. ej., tratar a pacientes que tienen enfermedad renal y/o un trastorno metabólico).

El término “polipéptido de Cerberus” incluye polipéptidos que comprenden cualquier polipéptido de Cerberus de origen natural, así como cualquier variante de los mismos (lo que incluye mutantes, fragmentos, fusiones y formas peptidomiméticas) que conserva una actividad útil, e incluye además cualquier monómero o multímero funcionales de Cerberus. En ciertos aspectos preferidos, los polipéptidos de Cerberus de la descripción se unen a y/o inhiben la actividad de nodal. Además, los procedimientos para fabricar y ensayar colecciones de polipéptidos se describieron anteriormente en el contexto de los polipéptidos de ActRII y ALK7, y tales procedimientos también se refieren a la fabricación y el ensayo de variantes de Cerberus. Los polipéptidos de Cerberus incluyen polipéptidos derivados de la secuencia de cualquier Cerberus conocida que tiene una secuencia al menos aproximadamente 80 % idéntica a la secuencia de un polipéptido de Cerberus, y opcionalmente al menos 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o identidad superior. Los ejemplos de polipéptidos de Cerberus incluyen el polipéptido de Cerberus maduro o isoformas más cortas u otras variantes del polipéptido precursor de la Cerberus humana (SEQ ID NO: 98).

El polipéptido precursor de Cerberus humana es el siguiente:

1 MHLLLFQLLVLLPLGKTTRHQDGRQNQSSLSPVLLPRNQRELPTGNHEEAEEKPDLFVAV

61PHLVATSPAGEGQRQREKMLSRFGRFWKKPEREMHPSRDSDSEPFPPGTQSLIQPIDGMK

121MEKSPLREEAKKFWHHFMFRKTPASQGVILPIKSHEVHWETCRTVPFSQTITHEGCEKW

181VQNNLCFGKCGSVHFPGAAQHSHTSCSHCLPAKFTTMHLPLNCTELSSVIKVVMLVEECQ

241CKVKTEHEDGHILHAGSQDSFIPGVSA

(SEQ ID NO:98; NCBI Referencia: NP_005445.1)

El péptido señal está subrayado.

El término “polipéptido de Coco” incluye polipéptidos que comprenden cualquier polipéptido de Coco de origen natural, así como cualquier variante de los mismos (lo que incluye mutantes, fragmentos, fusiones y formas peptidomiméticas) que conserva una actividad útil, e incluye además cualquier monómero o multímero funcionales de Coco. En ciertos aspectos preferidos, los polipéptidos de Coco de la descripción se unen a y/o inhiben la actividad de nodal. Además, los procedimientos para fabricar y ensayar colecciones de polipéptidos se describieron anteriormente en el contexto de los polipéptidos de ActRII y ALK7, y tales procedimientos también se refieren a la fabricación y el ensayo de variantes de Coco. Los polipéptidos de Coco incluyen polipéptidos derivados de la secuencia de cualquier Coco conocida que tiene una secuencia al menos aproximadamente 80 % idéntica a la secuencia de un polipéptido de Coco, y opcionalmente al menos 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o identidad superior. Los ejemplos de polipéptidos de Coco incluyen el polipéptido de Coco maduro o isoformas más cortas u otras variantes del polipéptido precursor de la Coco humana (^sE^qID NO: 99).

El polipéptido precursor de Coco humana es el siguiente:

i MLLGQLSTLLCLLSGALPTGSGRPEPQSPRPQSWAAANQTWALGPGALPPLVPASALGSW

61KAFLGLQKARQLGMGRLQRGQDEVAAVTLPLNPQEVIQGMCKAVPFVQVFSRPGCSAIRL

121RNHLCFGHCSSLYIPGSDPTPLVLCNSCMPARKRWAPWLWCLTGSSASRRRVKISTMLI

181EGCHCSPKA

(SEQ ID NO: 99; GenBank Id:)

El péptido señal está subrayado.

En ciertos aspectos, las variantes funcionales o formas modificadas de los polipéptidos de Cerberus y los polipéptidos de Coco incluyen proteínas de fusión que tienen al menos una porción del polipéptido de Cerberus y/o polipéptido de Coco y uno o más dominios de fusión, tales como, por ejemplo, dominios que facilitan el aislamiento, la detección, la estabilización o la multimerización del polipéptido. Los dominios de fusión adecuados se comentaron pormenorizadamente anteriormente con referencia a los polipéptidos de ActRII y ALK7. En algún aspecto, un agente antagonista de la descripción es una proteína de fusión que comprende una porción de unión a nodal de un polipéptido de Cerberus y/o Coco fusionado a un dominio Fc.

3. Ensayos de cribado

En ciertos aspectos,se pueden usar heteromultímeros de receptores ALK7:ActRIIB (p. ej., heterodímeros ALK7:ActRIIB) para generar y/o cribar inhibidores de ALK7:ActRIIB, en particular inhibidores que interfieren en la interacción del ligando de ALK7 y/o el receptor ALK7-Tipo II (por ejemplo, ActRIIB) (por ejemplo, anticuerpos anti-ALK7).

Como se describe en este documento, las señales de ligandos de la superfamilia TGF-p están mediadas por complejos de receptores de cinasa de tipo I y tipo II, que fosforilan y activan aguas abajo las proteínas Smad tras la estimulación del ligando [véase, p. ej., Massagué (2000) Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1: 169-178]. Aunque son esenciales para la transducción de señales, los receptores de tipo I generalmente tienen una afinidad muy débil por los ligandos de la superfamilia de TGF-beta. En cambio, los receptores de tipo II generalmente se unen a ligandos con alta afinidad. Esta unión al ligando da como resultado la formación de un complejo estable entre los receptores de activina de tipo I y II, lo que da como resultado la fosforilación de los receptores de tipo I por los receptores de tipo II y, por tanto, la activación de proteínas Smad. En vista de la afinidad más débil, generalmente es difícil observar la actividad de unión al ligando de los receptores de tipo I de forma aislada.

De hecho, los ejemplos de este documento demuestran que un homodímero de ActRIIB se une a muchos ligandos diferentes, muchos de ellos con alta afinidad. Por el contrario, un homodímero de ALK7 no mostró afinidad por ninguno de los ligandos examinados. Como los ligandos no se unen de forma detectable a ALK7, es difícil cribar/identificar agentes que pueden inhibir la actividad de ALK7. Sin embargo, como se demuestra en los ejemplos en este documento, la actividad de unión al ligando de ALK7 se vuelve medible cuando se empareja con un receptor de tipo II. Así, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB (p. ej., heterodímeros) son una herramienta útil para identificar inhibidores de ALK7 usando diversos ensayos de cribado tales como los descritos en este documento así como los conocidos en la técnica. Por lo tanto, en algunos aspectos, la presente descripción se refiere al uso Heteromultímeros ALK7:receptor de tipo II (p. ej., heteromultímeros ALK7:ActRIIB) para identificar (cribar) inhibidores de ALK7.

Por ejemplo, los heteromultímeros ALK7:receptor de tipo II (p. ej., heteromultímeros ALK7:ActRIIB) pueden ser particularmente útiles para generar/identificar anticuerpos que se unen a ALK7, en particular anticuerpos que se unen a e inhiben ALK7. Aunque los polipéptidos de ALK7, incluidos los homodímeros de ALK7 como se describen en este documento, pueden usarse para generar/identificar anticuerpos que se unen a ALK7, la unión simple no es suficiente para demostrar que un anticuerpo de ALK7 dado puede inhibir una actividad de ALK7 (p. ej., interferir en las interacciones ALK7-ligando o ALK7-receptor de tipo II). Como se demuestra en este documento, los polipéptidos de ALK7 no muestran actividad de unión a ligando en ausencia de un receptor de tipo II, lo que dificulta la identificación de anticuerpos que puedan inhibir ALK7. Los heteromultímeros ALK7:receptor de tipo II (p. ej., heteromultímeros ALK7:ActRIIB) resuelven este problema proporcionando una lectura funcional para la actividad de ALK7. Además, sin desear estar ligado a ningún mecanismo de acción particular, la asociación con un receptor de tipo II (por ejemplo, ActRIIB) puede mejorar la capacidad para generar anticuerpos que inhiben la actividad de ALK7. Por ejemplo, la asociación con un receptor de tipo II puede ayudar a estabilizar ALK7 de tal manera que optimice el procesamiento y la presentación de importantes epítopos de ALK7 que median las actividades de unión al ligando y así mejorar el desarrollo de anticuerpos inhibidores de ALK7. Por lo tanto, en algunos aspectos, la presente descripción se refiere al uso de heteromultímeros ALK7:tipo II (p. ej., heteromultímeros ALK7:ActRIIB) para generar anticuerpos que se unen a e inhiben ALK7. Los procedimientos para generar y cribar anticuerpos son bien conocidos en la técnica y se describen en este documento, y se pueden usar heteromultímeros ALK7-Tipo II (por ejemplo, heteromultímeros ALK7:ActRIIB) de acuerdo con uno o más de estos procedimientos para generar/identificar anticuerpos que se unen a e inhiben la actividad de ALK7.

En ciertos aspectos, se pueden usar heterodímeros ALK7:receptor de tipo II (p. ej., heteromultímeros ALK7:ActRIIB, tales como heterodímeros) para identificar inhibidores de activina C, particularmente inhibidores que se unen a activina C e interfieren en la interacción activina de tipo C I/receptor II.

Sorprendentemente, los datos presentados en este documento demuestran que los heterodímeros ALK7:ActRIIB se unen a la activina C. La comprensión de esta nueva interacción brinda la oportunidad de desarrollar/identificar inhibidores de la activina C. Además, dada la similitud estructural entre la activina C y la activina E, se espera que la activina E también se una a ALK7:ActRIIB, y, por tanto, esta nueva interacción puede usarse para identificar también antagonistas de activina E. Los ligandos heterodiméricos, tales como activina A^c, AE, BC y B^etambién se incluyen en la referencia a activina C o E, respectivamente, en esta sección de la descripción. También se contemplan los agentes que afectan tanto a la activina C como a la E. Se espera que diversos tipos de antagonistas de activina C o E sean útiles de acuerdo con los procedimientos descritos en este documento que incluyen, por ejemplo, moléculas pequeñas, anticuerpos e inhibidores de ácidos nucleicos, particularmente aquellos que alteran la interacción activina C (o E)-ALK7:ActRIIB. Un agente (p. ej., un anticuerpo o molécula pequeña) que es específicamente reactivo con activina C o E y que se une a activina C o E para competir con su unión a ALK7 y/o ActRIIB o inhibe de otro modo la transducción de señales mediada por activina C o E puede usarse como un antagonista de activina C o E. Asimismo, un agente que es específicamente reactivo con ALK7 y/o ActRIIB y que altera la unión a activina C o E puede usarse como antagonista. Con respecto a los anticuerpos, los inmunógenos pueden derivarse de un polipéptido de activina C o E, polipéptido de ALK7 o polipéptido de ActRIIB y usarse para generar anticuerpos usando procedimientos estándar conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Antibodies: A Laboratory Maneal ed. por Harlow y Lane, Cold Spring Harbor Press, 1988. Usando diversos ensayos de cribado conocidos en la técnica, tales como los descritos en este documento, se pueden usar heterodímeros ALK7:receptor de tipo II (p. ej., heteromultímeros ALK7:ActRIIB tales como heterodímeros) para identificar inhibidores de activina C o E.

En ciertos aspectos, la presente descripción se refiere al uso de complejos heteromultiméricos ALK7:ActRIIB para identificar compuestos (agentes) que son agonistas o antagonistas de los receptores de la superfamilia de TGFp. Los compuestos identificados mediante este cribado se pueden ensayar para evaluar su capacidad para modular el crecimiento tisular, tal como crecimiento de hueso, cartílago, músculo, grasa y/o neuronas in vivo o in vitro. Estos compuestos se pueden ensayar, por ejemplo, en modelos animales.

Existen numerosas estrategias para el cribado de agentes terapéuticos para modular el crecimiento tisular dirigiéndose a la transducción de señales del ligando de la superfamilia de TGFp (p. ej., transducción de señales de SMAD). En ciertos aspectos, el cribado de alto rendimiento de compuestos se puede llevar a cabo para identificar agentes que perturban los efectos mediados por receptor de la superfamilia de TGF-p sobre una estirpe celular seleccionada. En ciertos aspectos, el ensayo se lleva a cabo para cribar e identificar compuestos que inhiben específicamente o reducen la unión de un heteromultímero ALK7:ActRIIB a su compañero de unión (p. ej., activina, GDF11, GDF8, BMP6, GDF3, BMP5, nodal y BMP10). De forma alternativa, el ensayo se puede usar para identificar compuestos que mejoran la unión de un heteromultímero ALK7:ActRIIB a un ligando. En un aspecto adicional, los compuestos se pueden identificar por su capacidad de interactuar con un heteromultímero ALK7:ActRIIB.

En algunos aspectos, la presente descripción se refiere al uso de un heteromultímero ALK7:ActRIIB y polipéptidos de activina C o E para identificar compuestos que son agonistas o antagonistas de la vía de transducción de señales de activina C (o E)-ALK7:ActRIIB. Los compuestos identificados a través de este ensayo de cribado se pueden probar para evaluar su capacidad para modular la actividad de transducción de señales de activina C o E in vitro. Opcionalmente, estos compuestos se pueden probar adicionalmente en modelos animales para evaluar su capacidad para modular el crecimiento tisular in vivo. Existen numerosas estrategias para el cribado de agentes terapéuticos para modular el crecimiento tisular dirigiéndose a la activina C o E y heteromultímeros ALK7:ActRIIB. En ciertos aspectos, el cribado de alto rendimiento de compuestos se puede llevar a cabo para identificar agentes que perturban la transducción de señales celular mediada por activina C o E o ALK7:ActRIIB. En ciertos aspectos, el ensayo se lleva a cabo para cribar e identificar compuestos que inhiben o reducen específicamente la unión de un heteromultímero ALK7:ActRIIB a activina C o E. Alternativamente, el ensayo puede usarse para identificar compuestos que mejoran la unión de un heteromultímero ALK7:ActRIIB a activina C o E. En un aspecto adicional, los compuestos pueden identificarse por su capacidad para interactuar con activina C o E o un heteromultímero ALK7:ActRIIB.

Bastará un abanico de formatos de ensayo y, a la vista de la presente descripción, aquellos no descritos expresamente en este documento serán comprendidos, no obstante, por un experto en la técnica. Como se describe en este documento, los compuestos de ensayo (agentes) de la descripción se pueden crear mediante cualquier procedimiento químico combinatorio. Alternativamente, los compuestos objetivo pueden ser biomoléculas de origen natural sintetizadas in vivo o in vitro. Los compuestos (agentes) que se van a ensayar para determinar su capacidad para actuar como moduladores del crecimiento tisular pueden ser producidos, por ejemplo, por bacterias, levaduras, plantas u otros organismos (p. ej., productos naturales), producidos químicamente (p. ej., moléculas pequeñas, lo que incluye peptidomiméticos) o producidos recombinantemente. Los compuestos de ensayo contemplados por la presente descripción incluyen moléculas orgánicas no peptidílicas, péptidos, polipéptidos, peptidomiméticos, glúcidos, hormonas y moléculas de ácido nucleico. En ciertos aspectos, el agente de ensayo es una molécula orgánica pequeña que tiene un peso molecular inferior a aproximadamente 2000 Daltons.

Los compuestos de ensayo de la descripción se pueden proporcionar como entidades únicas y discretas o como colecciones de mayor complejidad, tal como fabricadas mediante química combinatorio. Estas colecciones pueden comprender, por ejemplo, glúcidos, haluros de alquilo, aminas, amidas, ésteres, aldehídos, éteres y otras clases de compuestos orgánicos. La presentación de los compuestos de ensayo al sistema de ensayo puede ser de forma aislada o como mezclas de compuestos, especialmente en las etapas iniciales de cribado. Opcionalmente, los compuestos se pueden derivatizar opcionalmente con otros compuestos y tienen grupos de derivatización que facilitan el aislamiento de los compuestos. Los ejemplos no limitativos de grupos de derivatización incluyen biotina, fluoresceína, digoxigenina, proteína fluorescente verde, isótopos, polihistidina, microesferas magnéticas, glutatión S transferasa (GST), agentes de reticulación fotoactivable o cualquier combinación de los mismos.

En muchos programas de cribado de fármacos con colecciones de compuestos y extractos naturales de ensayo, son deseables ensayos de alto rendimiento con el fin de maximizar el número de compuestos estudiados en un periodo de tiempo determinado. Los ensayos que se realizan en sistemas exentos de células, tales como los que se pueden derivar con proteínas purificadas o semipurificadas, a menudo se prefieren como cribados "principales", ya que se pueden generar para permitir el desarrollo rápido y la detección relativamente fácil de una alteración en una diana molecular que está mediada por un compuesto de ensayo. Además, los efectos de la toxicidad celular o biodisponibilidad del compuesto de prueba se pueden ignorar en general en el sistema in vitro, en su lugar, el ensayo se centra principalmente en el efecto del fármaco sobre la diana molecular como se puede manifestar en una alteración de la afinidad de unión entre un complejo heteromultimérico ALK7:ActRIIB y un compañero de unión (por ejemplo, activina C o E).

Simplemente para ilustrar, en un ensayo de cribado ejemplar de la presente descripción, el compuesto objetivo se pone en contacto con un heteromultímero ALK7:ActRIIB aislado y purificado que habitualmente es capaz de unirse a activina C, según sea apropiado para la intención del ensayo. A la mezcla del compuesto y el complejo heteromultimérico ALK7:ActRIIB a continuación, se añade una composición que contiene activina C o E. La detección y cuantificación de complejos de heteromultímero ALK7:ActRIIB-activina C o E proporcionan un medio para determinar la eficacia del compuesto para inhibir (o potenciar) la formación de complejos entre el heteromultímero ALK7:ActRIIB y activina C o E. La eficacia del compuesto se puede evaluar generando curvas de respuesta a la dosis a partir de los datos obtenidos usando diversas concentraciones del compuesto de ensayo. Asimismo, también se puede realizar un ensayo de control para proporcionar un valor de referencia para la comparación. Por ejemplo, en un ensayo de control, se añade activina C o E aislada y purificada a una composición que contiene el heteromultímero ALK7:ActRIIB y se cuantifica la formación de complejo de heteromultímero ALK7:ActRIIB/activina C o E en ausencia del compuesto de ensayo. Se entenderá que, en general, el orden en el que se pueden mezclar los reactivos se puede variar, y se pueden mezclar simultáneamente. Además, en lugar de proteínas purificadas, se pueden usar extractos celulares y lisados para conseguir un sistema de ensayo extracelular adecuado.

La unión de un complejo heteromultímero ALK7:ActRIIB con otra proteína (p. ej., activina C o E) puede detectarse mediante un abanico de técnicas. Por ejemplo, la modulación de la formación de complejos se puede cuantificar usando, por ejemplo, proteínas marcadas de forma detectable tales como radiomarcado (p. ej., 32P, 35S, 14C o 3H), marcado con fluorescencia (por ejemplo, FITC), o complejo heteromérico ALK7:ActRIIB marcado enzimáticamente y/o un compañero de unión (p. ej., activina C o E), mediante inmunoensayo o mediante detección cromatográfica.

En ciertos aspectos, la presente descripción contempla el uso de ensayos de polarización de fluorescencia y ensayos de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) en la medición, ya sea directa o indirectamente, del grado de interacción entre un heteromultímero ALK7:ActRIIB y una proteína de unión (p. ej., activina C o E).

Además, otros modos de detección, tales como los basados en guías de onda ópticas (la publicación PCT WO 96/26432 y la patente estadounidense n.° 5.677.196), la resonancia de plasmón superficial (SPR), sensores de carga de superficie y sensores de fuerza de superficie, son compatibles con muchos aspectos de la descripción.

Además, la presente descripción contempla el uso de un ensayo de trampa de interacción, también conocido como el "ensayo de dos híbridos", para identificar agentes que interrumpen o potencian la interacción entre un heteromultímero ALK7:ActRIIB y un compañero de unión (p. ej., activina C o E). Véase, p. ej., la patente de los EE. UU. n.° 5283317; Zervos y col. (1993) Cell 72:223-232; Madura y col. (1993) J Biol Chem 268:12046-12054; Bartel y col. (1993) Biotechniques 14:920-924 y Iwabuchi y col. (1993) Oncogene 8:1693-1696). En un aspecto específico, la presente descripción contempla el uso de sistemas de dos híbridos inversos para identificar compuestos (p. ej., moléculas pequeñas o péptidos) que disocian las interacciones entre un heteromultímero ALK7:ActRIIB y una proteína de unión (p. ej., activina C o E) [Vidal y Legrain, (1999) Nucleic Acids Res 27:919-29; Vidal y Legrain, (1999) Trends Biotechnol 17:374-81 y las patentes de los EE. UU. n.° 5525490; 5955280 y 5965368].

En ciertos aspectos, los compuestos objetivo se identifican mediante su capacidad para interactuar con un heteromultímero ALK7:ActRIIB o activina C o E de la descripción. La interacción entre el compuesto y el heteromultímero ALK7:ActRIIB o activa C o E puede ser covalente o no covalente. Por ejemplo, tal interacción se puede identificar a nivel proteico usando procedimientos bioquímicos in vitro, que incluyen fotorreticulación, unión a ligando radiomarcado y cromatografía de afinidad [Jakoby WB y col. (1974) Methods in Enzymology 46:1]. En ciertos casos, los compuestos se pueden cribar en un ensayo basado en mecanismos, tal como un ensayo para detectar compuestos que se unen a un heteromultímero ALK7:ActRIIB o activina C o E. Esto puede incluir un evento de unión en fase sólida o en fase fluida. Alternativamente, el gen que codifica un heteromultímero ALK7:ActRIIB o activina C o E se puede transfectar con un sistema indicador (p. ej., p-galactosidasa, luciferasa o proteína fluorescente verde) en una célula y se puede cribar contra la colección, preferiblemente mediante cribado de alto rendimiento o con miembros individuales de la colección. Se pueden usar ensayos de unión a base de otros mecanismos, por ejemplo, ensayos de unión que detectan cambios en la energía libre. Los ensayos de unión se pueden realizar con la diana fijada a un pocillo, una perla o un chip o capturada por un anticuerpo inmovilizado o resuelta mediante electroforesis capilar. Los compuestos unidos se pueden detectar normalmente usando criterios de valoración colorimétricos, fluorescencia, o resonancia de plasmones superficiales.

4. Usos terapéuticos ejemplares

En ciertos aspectos, un antagonista de ALK7:ActRIIB, o combinaciones de tales antagonistas, de la presente descripción pueden usarse para tratar o prevenir una enfermedad o afección que está asociada con la actividad anormal de un ligando de unión a ALK7:ActRIIB. Estas enfermedades, trastornos o afecciones se denominan generalmente en este documento "afecciones asociadas a ALK7:ActRIIB" o "trastornos asociados a ALK7:ActRIIB". En ciertos aspectos, la presente descripción proporciona procedimientos para tratar o prevenir una afección asociada a ALK7:ActRIIB en un individuo mediante la administración a un individuo que lo necesita de una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista de ALK7:ActRIIB (p. ej., un heteromultímero ALK7:ActRIIB tal como un heterodímero ALK7:ActRIIB), o combinaciones de dichos antagonistas, como se describe en este documento. Los términos "sujeto", "individuo" o "paciente" son intercambiables en toda la memoria descriptiva. Cualquiera de los antagonistas de ALK7:ActRIIB de la descripción se pueden emplear potencialmente individualmente o en combinación para usos terapéuticos descritos en este documento. Estos procedimientos se pueden usar para tratamientos terapéuticos y profilácticos de mamíferos que incluyen, por ejemplo, roedores, primates y seres humanos.

Como se usa en este documento, un agente terapéutico que "previene" un trastorno o afección se refiere a un compuesto que, en una muestra estadística, reduce la aparición del trastorno o afección en la muestra tratada con respecto a una muestra de control no tratada, o retrasa la aparición o reduce la gravedad de uno o más síntomas del trastorno o afección con respecto a la muestra de control no tratada. El término “tratar”, como se empela en este documento, incluye la mejora o eliminación de la afección una vez que se ha consolidado. En cualquier caso, la prevención o el tratamiento se pueden discernir del diagnóstico proporcionado por un médico u otro profesional sanitario y del resultado previsto de la administración del agente terapéutico.

En general, el tratamiento o la prevención de una enfermedad o afección como se describe en la presente descripción se consigue administrando antagonista de ALK7:ActRIIB, o combinaciones de tales antagonistas, de la presente descripción en una "cantidad efectiva". Una cantidad efectiva de un agente se refiere a una cantidad efectiva, en dosis y durante períodos de tiempo necesarios, para conseguir el resultado terapéutico o profiláctico deseado. Una “cantidad terapéuticamente efectiva” de un agente de la presente descripción puede variar en función de factores tales como el estado patológico, la edad, el sexo y peso del individuo y la capacidad del agente para provocar una respuesta deseada en el individuo. Una “cantidad profilácticamente efectiva” se refiere a una cantidad efectiva, en dosis y durante períodos de tiempo necesarios, para conseguir el resultado profiláctico deseado.

Los riñones mantienen muchas características de la sangre, incluido el volumen, el equilibrio del pH, las concentraciones de electrolitos y la presión arterial, además de ser responsables de la filtración de toxinas y desechos. Estas funciones dependen de la intrincada estructura de las nefronas del riñón, el flujo constante de sangre a través de los diversos capilares del riñón y la regulación del riñón por señales del resto del cuerpo, incluidas las hormonas endocrinas. Los problemas con la función renal se manifiestan por mecanismos directos (p. ej. defectos genéticos, infección o exposición a toxinas) y por mecanismos indirectos que proceden progresivamente de factores estresantes a largo plazo como la hipertrofia y la hiperfiltración (que a menudo son el resultado de agresiones más directas a la función renal). Debido al papel central del riñón en el mantenimiento de la sangre y la secreción de desechos, las manifestaciones de la enfermedad renal asociada son muchas y variadas; pueden revisarse en Harrison's Principles of Internal Medicine, 18a edición, McGraw Hill, NY, Parte 13, Cap 277-289.

Como se describe en este documento, un antagonista de ALK7:ActRIIB tuvo diversos efectos beneficiosos en un modelo de enfermedad renal. En particular, el tratamiento con un heteromultímero ALK7:ActRIIB redujo el daño, la inflamación y la fibrosis del tejido renal en sujetos que tenían obstrucción ureteral unilateral. Estos datos indican que el antagonista de ALK7:ActRIIB se puede usar para tratar o prevenir enfermedades renales, particularmente para tratar o prevenir diversas complicaciones (manifestaciones) de la enfermedad renal, incluyendo, por ejemplo, daño al tejido renal, inflamación y/o fibrosis.

Por lo tanto, los procedimientos de esta descripción pueden aplicarse a diversas enfermedades o afecciones asociadas al riñón. Como se emplea en este documento, "enfermedad o afección asociada al riñón" puede referirse a cualquier enfermedad, trastorno o afección que afecte a los riñones o al sistema renal. Los ejemplos de enfermedades o afecciones asociadas al riñón incluyen, pero sin limitarse a, enfermedades (o insuficiencia) renales crónicas, enfermedades (o insuficiencia) renales agudas, enfermedades renales primarias, enfermedades renales no diabéticas, glomerulonefritis, nefritis intersticial, enfermedades renales diabéticas, nefropatía diabética, glomeruloesclerosis, glomerulonefritis de progresión rápida, fibrosis renal, síndrome de Alport, nefritis DMID, glomerulonefritis proliferativa mesangial, glomerulonefritis membranoproliferativa, glomerulonefritis en media luna, fibrosis intersticial renal, glomeruloesclerosis segmentaria y focal, nefropatía membranosa, enfermedad de cambios mínimos, glomerulonefritis progresiva rápida pauci-inmune, nefropatía por IgA, poliquistosis renal, enfermedad de Dent, nefrocitinosis, nefritis de Heymann, poliquistosis renal (adulto) dominante autosómica, poliquistosis renal (infantil) recesiva autosómica, lesión renal aguda, síndrome nefrótico, isquemia renal, enfermedades o trastornos de los podocitos, proteinuria, enfermedades glomerulares, glomerulonefritis membranosa, glomerulonefritis segmentaria y focal, preeclampsia, eclampsia, lesiones renales, enfermedades vasculares del colágeno, proteinuria (postural) ortostática benigna, nefropatía por IgM, nefropatía membranosa, sarcoidosis, diabetes mellitus, daño renal debido a fármacos, enfermedad de Fabry, aminoaciduria, síndrome de Fanconi, nefroesclerosis hipertensiva, nefritis intersticial, enfermedad de células falciformes, hemoglobinuria, mioglobinuria, granulomatosis de Wegener, enfermedad por almacenamiento de glucógeno tipo 1, enfermedad renal crónica, insuficiencia renal crónica, baja tasa de filtración glomerular (TFG), nefroangioesclerosis, nefritis lúpica, glomerulonefritis de media luna pauci-inmune positiva para ANCA, nefropatía crónica de aloinjerto, nefrotoxicidad, toxicidad renal, necrosis renal, daño renal, lesión glomerular y tubular, disfunción renal, síndrome nefrítico, insuficiencia renal aguda, insuficiencia renal crónica, disfunción tubárica proximal, rechazo de trasplante de riñón agudo, rechazo de trasplante de riñón crónico, glomerulonefritis mesangioproliferativa no por IgA, glomerulonefritis posinfecciosa, vasculitis con afectación renal de cualquier tipo, cualquier enfermedad renal hereditaria, cualquier nefritis intersticial, insuficiencia de trasplante de riñón, cáncer de riñón, enfermedad renal asociada con otras afecciones (p. ej., hipertensión, diabetes y enfermedad autoinmunitaria), enfermedad de Dent, nefrocitinosis, nefritis de Heymann, una enfermedad renal primaria, una glomerulopatía colapsante, una enfermedad de depósitos densos, una glomerulonefritis asociada a crioglobulinemia, una enfermedad de Henoch-Schonlein, una glomerulonefritis posinfecciosa, una endocarditis bacteriana, una poliangitis microscópica, un síndrome de Churg-Strauss, una glomerulonefritis mediada por anticuerpos anti-MBG, amiloidosis, una enfermedad por depósito de inmunoglobulina monoclonal, una glomerulonefritis fibrilar, una glomerulopatía inmunotactoide, lesión tubular isquémica, una nefritis tubulointersticial inducida por medicamentos, una nefritis tubulointersticial tóxica, una nefritis tubulointersticial infecciosa, una pielonefritis bacteriana, una nefritis tubulointersticial infecciosa vírica que resulta de una infección por poliomavirus o una infección por VIH, una enfermedad tubulointersticial inducida por el metabolismo, una enfermedad conectiva mixta, una nefropatía por cilindros, una nefropatía por cristales que puede resultar de urato u oxalato o depósito de cristales inducido por fármacos, un rechazo de aloinjerto tubulointersticial celular agudo, una enfermedad infiltrativa tumoral que resulta de un linfoma o una enfermedad linfoproliferativa postrasplante, una enfermedad obstructiva del riñón, enfermedad vascular, una microangiopatía trombótica, una nefroangioesclerosis, una enfermedad ateroembólica, una enfermedad de tejido conectivo mixta, una poliarteritis nudosa, una enfermedad vascular inducida por inhibidor de calcineurina, rechazo de aloinjerto vascular celular agudo, rechazo de aloinjerto humoral agudo, deterioro temprano de la función renal (DTFR), enfermedad renal en fase terminal (ERFT), trombosis de la vena renal, necrosis tubular aguda, nefritis intersticial aguda, enfermedad renal crónica establecida, estenosis de la arteria renal, nefropatía isquémica, uremia, nefritis tubulointersticial crónica inducida por fármacos y toxinas, nefropatía por reflujo, cálculos renales, síndrome de Goodpasture, anemia normocítica normocrómica, anemia renal, enfermedad renal crónica diabética, enfermedad relacionada con IgG4, síndrome de von Hippel-Lindau, esclerosis tuberosa, nefronoptisis, enfermedad renal quística medular, carcinoma de células renales, adenocarcinoma, nefroblastoma, linfoma, leucemia, trastorno por hiposialilación, nefropatía crónica por ciclosporina, lesión por reperfusión renal, displasia renal, azotemia, oclusión arterial bilateral, nefropatía aguda por ácido úrico, hipovolemia, uropatía obstructiva bilateral aguda, nefropatía hipercalcémica, síndrome urémico hemolítico, retención urinaria aguda, nefroesclerosis maligna, glomeruloesclerosis posparto, esclerodermia, enfermedad anti-MBG no Goodpasture, poliarteritis nudosa microscópica, granulomatosis alérgica, nefritis aguda por radiación, glomerulonefritis posestreptocócica, macroglobulinemia de Waldenstrom, nefropatía analgésica, fístula arteriovenosa, injerto arteriovenoso, diálisis, riñón ectópico, riñón en esponja medular, osteodistrofia renal, riñón solitario, hidronefrosis, microalbuminuria, uremia, hematuria, hiperlipidemia, hipoalbuminemia, lipiduria, acidosis, hiperpotasemia y edema.

En algunos aspectos, un antagonista de ALK7:ActRIIB, o combinaciones de tales antagonistas, de la presente descripción (p. ej., heteromultímeros ALK7:ActRIIB tales como un heterodímero ALK7:ActRIIB) puede usarse para tratar o prevenir la enfermedad renal crónica, opcionalmente en combinación con una o más terapias de apoyo para tratar la enfermedad renal crónica. En algunos aspectos, un antagonista de ALK7:ActRIIB, o combinaciones de tales antagonistas, de la presente descripción (p. ej., heteromultímeros ALK7:ActRIIB tales como un heterodímero ALK7:ActRIIB ) puede usarse para tratar o prevenir una o más complicaciones (síntomas o manifestaciones) de la enfermedad renal crónica (p. ej., daño tisular, inflamación y/o fibrosis), opcionalmente en combinación con una o más terapias de apoyo para tratar la enfermedad renal crónica. En algunos aspectos, un antagonista de ALK7:ActRIIB, o combinaciones de tales antagonistas, de la presente descripción (p. ej., heteromultímeros ALK7:ActRIIB tales como un heterodímero ALK7:ActRIIB) se puede usar para tratar o prevenir la insuficiencia renal en fase terminal, opcionalmente en combinación con una o más terapias de apoyo para tratar la enfermedad renal en fase terminal. La enfermedad renal crónica (ERC), también conocida como nefropatía crónica, es una pérdida progresiva de la función renal durante un período de meses o años. Los síntomas del empeoramiento de la función renal pueden incluir malestar general y disminución del apetito. A menudo, la enfermedad renal crónica se diagnostica como resultado de la detección de personas que se sabe que tienen riesgo de problemas renales, tales como las que tienen presión arterial alta o diabetes y las que tienen un pariente consanguíneo con ERC. Esta enfermedad también puede identificarse cuando conduce a alguna de sus complicaciones reconocidas, tales como enfermedad cardiovascular, anemia o pericarditis. Las pautas profesionales recientes clasifican la gravedad de la ERC en cinco fase, siendo la fase 1 la más leve y generalmente causa pocos síntomas y la fase 5 es una enfermedad grave con baja esperanza de vida si no se trata. La ERC en fase 5 a menudo se denomina nefropatía en fase terminal, enfermedad renal en fase terminal o insuficiencia renal en fase terminal, y es en gran parte sinónimo de los términos ahora obsoletos insuficiencia crónica de riñón o insuficiencia renal crónica; y generalmente significa que el paciente requiere terapia de reemplazo renal, que puede implicar una forma de diálisis, pero idealmente constituye un trasplante de riñón. La ERC inicialmente no presenta síntomas específicos y generalmente solo se detecta como un aumento de la creatinina sérica o de las proteínas en la orina. A medida que disminuye la función renal, pueden manifestarse diversos síntomas como se describe a continuación. La presión arterial puede aumentar debido a la sobrecarga de líquidos y la producción de hormonas vasoactivas creadas por el riñón a través del sistema renina-angiotensina, lo que aumenta el riesgo de desarrollar hipertensión. y/o padecer insuficiencia cardíaca congestiva. La urea puede acumularse, dando lugar a azoemia y finalmente a uremia (síntomas que van desde letargo a pericarditis y encefalopatía). Debido a su alta circulación sistémica, la urea se excreta en el sudor ecrino en concentraciones elevadas y cristaliza en la piel a medida que el sudor se evapora ("escarcha urémica"). El potasio puede acumularse en la sangre (hiperpotasemia con una gama de síntomas que incluyen malestar y arritmias cardíacas potencialmente mortales). La hiperpotasemia generalmente no se desarrolla hasta que la tasa de filtración glomerular cae a menos de 20-25 ml/min/1,73 m2, momento en el que los riñones tienen una capacidad disminuida para excretar potasio. La hiperpotasemia en la ERC puede exacerbarse por la acidemia (que conduce a un desplazamiento extracelular de potasio) y por la falta de insulina. La síntesis de eritropoyetina puede disminuir y causar anemia. Pueden aparecer síntomas de sobrecarga de volumen de líquidos, que van desde un edema leve hasta un edema pulmonar potencialmente mortal. La hiperfosfatemia, debido a la excreción reducida de fosfato, puede ocurrir generalmente después de la disminución de la filtración glomerular. La hiperfosfatemia se asocia a un mayor riesgo cardiovascular, siendo un estímulo directo para la calcificación vascular. Puede manifestarse hipocalcemia, que generalmente es causada por la estimulación del factor de crecimiento de fibroblastos 23. Los osteocitos son responsables del aumento de la producción de FGF23, que es un potente inhibidor de la enzima 1-alfa-hidroxilasa (responsable de la conversión de 25-hidroxicolecalciferol en 1,25 dihidroxivitamina D3). Más tarde, esto progresa a hiperparatiroidismo secundario, osteodistrofia renal y calcificación vascular que deteriora aún más la función cardíaca. Puede producirse acidosis metabólica (debido a la acumulación de sulfatos, fosfatos, ácido úrico, etc.) y causar una actividad enzimática alterada por un exceso de ácido que actúa sobre las enzimas; y también aumento de la excitabilidad de las membranas cardíacas y neuronales mediante la promoción de hiperpotasemia debido al exceso de ácido (acidemia). La acidosis también se debe a la disminución de la capacidad de generar suficiente amoníaco a partir de las células del túbulo proximal. La anemia por deficiencia de hierro, cuya prevalencia aumenta a medida que disminuye la función renal, es especialmente prevalente en aquellos que requieren hemodiálisis. Es de causa multifactorial, pero incluye aumento de la inflamación, reducción de la eritropoyetina e hiperuricemia que conduce a la supresión de la médula ósea. Las personas con ERC padecen aterosclerosis acelerada y tienen más probabilidades de desarrollar enfermedades cardiovasculares que la población en general. Los pacientes que padecen ERC y enfermedades cardiovasculares tienden a tener pronósticos significativamente peores que aquellos que solo padecen esta última.

En otro aspecto, un antagonista de ALK7:ActRIIB (p. ej., un heterodímero ALK7:ActRIIB), o combinaciones de tales antagonistas, pueden usarse en pacientes con trastorno óseo mineral asociado a enfermedad renal crónica (ERC-TOM), un síndrome amplio de trastornos esqueléticos, cardiovasculares y metabólicos minerales interrelacionados que surgen de la enfermedad renal. ERC-TOM abarca diversas patologías esqueléticas a menudo denominadas osteodistrofia renal (ODR), que es un aspecto preferido para el tratamiento con, un antagonista de ALK7:ActRIIB (p. ej., un heterodímero ALK7:ActRIIB), o combinaciones de tales antagonistas. Dependiendo de la contribución relativa de diferentes factores patógenos, la ODR se manifiesta como diversos patrones patológicos de remodelación ósea (Hruska y col., 2008, Chronic kidney disease mineral bone disorder (ERC-TOM); en Rosen y col. (ed) Primer on the Metabolic Bone Diseases and Disorders of Mineral Metabolism, 7a ed. American Society for Bone and Mineral Research, Washington DC, págs. 343-349). En un extremo del espectro se encuentra la ODR con osteodistrofia urémica y bajo recambio óseo, que se caracteriza por un bajo número de puntos de remodelación activa, formación ósea profundamente suprimida y baja resorción ósea. En el otro extremo está la ODR con hiperparatiroidismo, alto recambio óseo y osteítis fibrosa. Dado que un antagonista de ALK7:ActRIIB (p. ej., un heterodímero ALK7:ActRIIB), o combinaciones de tales antagonistas, pueden ejercer efectos tanto anabólicos como antirresortivos, estos agentes pueden ser útiles en pacientes de todo el espectro patológico de la ODR.

En otros aspectos, un antagonista de ALK7:ActRIIB (p. ej., un heterodímero ALK7:ActRIIB), o combinaciones de tales antagonistas, se pueden usar para regular el contenido de grasa corporal en un animal y para tratar o prevenir afecciones relacionadas con el mismo, y particularmente, afecciones que comprometen la salud relacionadas con el mismo. De acuerdo con la presente divulgación, regular (controlar) el peso corporal puede referirse a reducir o aumentar el peso corporal, reducir o aumentar la tasa de aumento de peso, o aumentar o reducir la tasa de pérdida de peso, y también incluye mantener activamente, o no significativamente cambio de peso corporal (p. ej., contra influencias externas o internas que de otro modo pueden aumentar o disminuir el peso corporal). Un ejemplo de la presente descripción se refiere a la regulación del peso corporal administrando a un animal (p. ej., un ser humano) que lo necesite un antagonista de ALK7:ActRIIB (p. ej., un heterodímero ALK7:ActRIIB), o combinaciones de tales antagonistas. Por ejemplo, en algunos aspectos, un antagonista de ALK7:ActRIIB (p. ej., un heterodímero ALK7:ActRIIB), o combinaciones de dichos antagonistas, pueden usarse para tratar o prevenir un trastorno o afección derivada de la obesidad (p. ej., obesidad abdominal); sobrepeso; resistencia a la insulina; síndrome metabólico y otras enfermedades o afecciones metabólicas; un trastorno de lípidos tal como niveles bajos de HDL, niveles altos de LDL, hiperlipidemia, hipertrigliceridemia o dislipidemia; aberraciones de lipoproteínas; triglicéridos disminuidos; inflamación (p. ej., inflamación del hígado y/o inflamación del tejido adiposo), enfermedad del hígado graso; enfermedad del hígado graso no alcohólico; hiperglucemia; tolerancia alterada a la glucosa (IGT); hiperinsulinemia; colesterol alto (p. ej., niveles altos de LDL e hipercolesterolemia); enfermedad cardiovascular tal como cardiopatía que incluye cardiopatía coronaria, insuficiencia cardíaca congestiva, accidente cerebrovascular, vasculopatía periférica, aterosclerosis; arteriosclerosis e hipertensión; Síndrome X; reestenosis vascular; neuropatía; retinopatía; enfermedad neurodegenerativa; disfunción endotelial, disfunción respiratoria; pancreatitis; síndrome de ovario poliquístico; niveles elevados de ácido úrico; hemocromatosis (sobrecarga de hierro); acantosis nigricans (manchas oscuras en la piel); o cáncer (p. ej., cáncer de ovario, mama, endometrio y colon); u otros trastornos/afecciones asociados con una o más de las enfermedades o afecciones anteriores. En algunos aspectos, la enfermedad o afección tratada con un antagonista de ALK7:ActRIIB (p. ej., un heterodímero ALK7:ActRIIB), o combinaciones de tales antagonistas, se asocia con sobrepeso (p. ej., IMC de >25 kg/m2), o con demasiada grasa corporal.

En un aspecto, la descripción proporciona un procedimiento para reducir el peso corporal que comprende administrar a un sujeto que desee reducir el peso corporal, o que lo necesite, una cantidad efectiva de un antagonista de ALK7:ActRIIB (p. ej., un heterodímero ALK7:ActRIIB), o combinaciones de tales antagonistas. En algunos aspectos, el sujeto tiene sobrepeso (p. ej., es pre-obeso). En algunos aspectos, el sujeto tiene un índice de masa corporal (IMC) de 25 kg/m2 o más. En aspectos adicionales, el sujeto tiene un IMC de 25 kg/m2 a 29,9 kg/m2, 30 kg/m2 a 39,9 kg/m2, 25 kg/m2 a 39,9 kg/m2, o 25 kg/m2 a 50 kg/m2. En algunos aspectos, el sujeto es obeso. En algunos aspectos, el sujeto tiene un IMC de 30 kg/m2 o más (p. ej., de 30 a 39,9 kg/m2 o 30 kg/m2 a 50 kg/m2). En algunos aspectos, el sujeto es obeso mórbido. En algunos aspectos, el sujeto tiene un IMC de 40 kg/m2 o más. En otros aspectos, el sujeto tiene un IMC de 40 kg/m2 a 45 kg/m2o 40 kg/m2 a 50 kg/m2. En algunos aspectos, el sujeto tiene obesidad central (p. ej., exceso de adiposidad en la región abdominal, incluida la grasa abdominal y/o la grasa visceral). En algunos aspectos, el sujeto tiene una relación de circunferencia de cintura/cadera(WHR) de 0,85 o más. En algunos aspectos, el sujeto tiene obesidad periférica (p. ej., exceso de adiposidad en las caderas). En algunos aspectos, el sujeto tiene diabetes mellitus de tipo 2. El antagonista de ALK7:ActRIIB, o una combinación de antagonistas, puede administrarse solo o como terapia combinada con otro tipo de terapia de apoyo. Por ejemplo, en algunos aspectos, la terapia de apoyo es la dieta. y/o ejercicio.

En un aspecto, la descripción proporciona un procedimiento para reducir el aumento de peso que comprende administrar a un sujeto que desee reducir el aumento de peso, o que lo necesite, una cantidad efectiva de un antagonista de ALK7:ActRIIB (p. ej., un heterodímero ALK7:ActRIIB), o una combinación de tales antagonistas. En algunos aspectos, el sujeto tiene sobrepeso (p. ej., es pre-obeso). En algunos aspectos, el sujeto tiene un IMC de 25 kg/m2 o más. En aspectos adicionales, el sujeto tiene un IMC de 25 kg/m2 a 29,9 kg/m2, 30 kg/m2 a 39,9 kg/m2, 25 kg/m2 a 39,9 kg/m2, o 25 kg/m2 a 50 kg/m2. En algunos aspectos, el sujeto es obeso. En algunos aspectos, el sujeto tiene un IMC de 30 kg/m2 o más (p. ej., de 30 a 39,9 kg/m2 o 30 kg/m2 a 50 kg/m2). En algunos aspectos, el sujeto es obeso mórbido. En algunos aspectos, el sujeto tiene un IMC de 40 kg/m2 o más. En otros aspectos, el sujeto tiene un IMC de 40 kg/m2 a 45 kg/m2o 40 kg/m2 a 50 kg/m2. En algunos aspectos, el sujeto tiene diabetes mellitus de tipo 2.

También se proporciona un procedimiento para tratar o prevenir una enfermedad o afección asociada con el exceso de peso corporal, que comprende administrar a un sujeto que necesita tratamiento o prevención, una cantidad efectiva de un antagonista de ALK7:ActRIIB (p. ej., un heterodímero ALK7:ActRIIB), o una combinación de tales antagonistas. En un aspecto, la enfermedad o afección tratada o prevenida es la obesidad. En un aspecto, la enfermedad o afección tratada o prevenida es la resistencia a la insulina. En un aspecto, la enfermedad o afección tratada o prevenida es un miembro seleccionado de entre el grupo que consiste en: dislipidemia, hiperlipidemia (nivel de colesterol total >240 mg/dl), hipercolesterolemia (p. ej., nivel de colesterol total de >200 mg/dl, >220 mg/dl, >240 mg/dl, >250 mg/dl o >275 mg/dl), nivel sérico bajo de HDL (p. ej., < 40mg/dl, < 45 mg/dl, o < 50 mg/dl), nivel sérico alto de LDL (p. ej., > 100 mg/dl, > 130 mg/dl, > 160 mg/dl o > 190 mg/dl), e hipertrigliceridemia (p. ej., un nivel de TG en ayunas de > 150 mg/dl, > 175 mg/dl, > 200 mg/dl, > 300 mg/dl, > 400 mg/dl o > 499 mg/dl). En ciertos aspectos, el tratamiento con antagonistas de ALK7:ActRIIB es un complemento de la dieta y/o el ejercicio.

En otro aspecto, la descripción proporciona un procedimiento para reducir el peso corporal en un sujeto que tiene sobrepeso. El procedimiento incluye administrar a un sujeto con sobrepeso una cantidad efectiva de un antagonista de ALK7:ActRIIB (p. ej., un heterodímero ALK7:ActRIIB), o una combinación de tales antagonistas. En algunos aspectos, el sujeto tiene un índice de masa corporal (IMC) de 25 kg/m2 o más. En aspectos adicionales, el sujeto tiene un IMC de 25 kg/m2 a 29,9 kg/m2, 30 kg/m2 a 39,9 kg/m2, 25 kg/m2 a 39,9 kg/m2, o 25 kg/m2 a 50 kg/m2. o 27 a 40 kg/m2. En algunos aspectos, el sujeto es obeso. En algunos aspectos, el sujeto tiene un IMC de 30 kg/m2 o más (p. ej., de 30 a 39,9 kg/m2 o 30 kg/m2 a 50 kg/m2). La proteína de unión a ALK7 se administra sola o como terapia combinada. En algunos aspectos, el tratamiento con antagonista de ALK7:ActRIIB es un complemento de la dieta y/o el ejercicio.

En un aspecto, la descripción proporciona un procedimiento para reducir el peso corporal en un sujeto obeso. El procedimiento incluye administrar al sujeto una cantidad efectiva de un antagonista de ALK7:ActRIIB (p. ej., un heterodímero ALK7:ActRIIB), o una combinación de tales antagonistas. En algunos aspectos, el sujeto tiene un IMC de 30 kg/m2 o más (p. ej., de 30 a 39,9 kg/m2 o 30 kg/m2 a 50 kg/m2. En algunos aspectos, el sujeto tiene un IMC de 40 kg/m2 o más. En algunos aspectos, el sujeto tiene obesidad central (p. ej., exceso de adiposidad en la región abdominal, incluida la grasa abdominal y/o la grasa visceral). En algunos aspectos, el sujeto tiene una relación de circunferencia de cintura/cadera(WHR) de 0,85 o más. En algunos aspectos, el sujeto tiene obesidad periférica (p. ej., exceso de adiposidad en las caderas). En algunos aspectos, el tratamiento con antagonista de ALK7:ActRIIB es un complemento de la dieta y/o el ejercicio.

En otro aspecto, la descripción proporciona un procedimiento para tratar y/o mejorar la obesidad o una enfermedad o afección asociada con la obesidad, que comprende administrar a un sujeto obeso una cantidad efectiva de un antagonista de ALK7:ActRIIB (p. ej., un heterodímero ALK7:ActRIIB), o una combinación de tales antagonistas. En algunos aspectos, el sujeto tiene un IMC de 30 kg/m2 o más. En aspectos adicionales, el sujeto tiene un IMC de 30 a 39,9 kg/m2 o 30 kg/m2 a 50 kg/m2. En algunos aspectos, el sujeto es obeso mórbido. En algunos aspectos, el sujeto tiene un IMC corporal de 40 kg/m2 o más. En otros aspectos, el sujeto tiene un IMC de 40 kg/m2 a 45 kg/m2 o 40 kg/m2 a 50 kg/m2En algunos aspectos, el sujeto tiene diabetes mellitus tipo 2. En algunos aspectos, el sujeto tiene un IMC de 30 kg/m2 o más (p. ej., de 30 a 39,9 kg/m2). En algunos aspectos, el sujeto tiene un IMC de al menos 40 kg/m2. En algunos aspectos, el sujeto tiene obesidad central (p. ej., exceso de adiposidad en la región abdominal, incluida la grasa abdominal y/o la grasa visceral). En algunos aspectos, el sujeto tiene una relación de circunferencia de cintura/cadera(WHR) de 0,85 o más. En algunos aspectos, el sujeto tiene obesidad periférica (p. ej., exceso de adiposidad en las caderas). En algunos aspectos, el tratamiento con antagonista de ALK7:ActRIIB es un complemento de la dieta y/o el ejercicio.

También se proporciona un procedimiento para tratar o prevenir una enfermedad o afección asociada con la obesidad, que comprende administrar a un sujeto que necesita tratamiento o prevención, una cantidad efectiva de un antagonista de ALK7:ActRIIB (p. ej., un heterodímero ALK7:ActRIIB), o una combinación de tales antagonistas. En un aspecto, la enfermedad o afección tratada o prevenida es un miembro seleccionado de entre el grupo que consiste en: dislipidemia, hiperlipidemia (nivel de colesterol total >240 mg/dl), hipercolesterolemia (p. ej., nivel de colesterol total de >200 mg/dl, >220 mg/dl, >240 mg/dl, >250 mg/dl o >275 mg/dl), nivel sérico bajo de ^hD^l(p. ej., < 40mg/dl, < 45 mg/dl, o < 50 mg/dl), nivel sérico alto de LDL (p. ej., > 100 mg/dl, > 130 mg/dl, > 160 mg/dl o > 190 mg/dl), e hipertrigliceridemia (p. ej., un nivel de TG en ayunas de > 150 mg/dl, > 175 mg/dl, > 200 mg/dl, > 300 mg/dl, > 400 mg/dl o > 499 mg/dl). En un aspecto, la enfermedad o afección tratada o prevenida es la enfermedad cardiovascular. En un aspecto adicional, la enfermedad o afección tratada o prevenida es hipertensión (presión arterial alta), infarto de miocardio, enfermedad arterial periférica, disfunción vasorregulatoína, arteriosclerosis, insuficiencia cardíaca congestiva, aterosclerosis, cardiopatía coronaria o enfermedad microvascular. En un aspecto, la enfermedad o afección tratada o prevenida es una enfermedad hepática. En un aspecto, la enfermedad o afección hepática tratada o prevenida es EHGNA. En un aspecto, la enfermedad hepática es el hígado graso. En un aspecto, la enfermedad hepática es EHNA. En otro aspecto, la enfermedad o afección tratada o prevenida es un miembro seleccionado de entre el grupo: esteatohepatitis, esteatosis, fibrosis, y/o cirrosis. En ciertos aspectos, el tratamiento con antagonista de ALK7:ActRIIB es un complemento de la dieta y/o el ejercicio.

En otro aspecto, la descripción proporciona un procedimiento para tratar, mejorar y/o prevenir la diabetes mellitus tipo 2 o una enfermedad o afección asociada con la diabetes que comprende administrar a un sujeto que tiene diabetes mellitus tipo 2, o en riesgo de desarrollar diabetes tipo 2, una cantidad efectiva de un antagonista de ALK7:ActRIIB (p. ej., un heterodímero ALK7:ActRIIB), o una combinación de tales antagonistas. En algunos aspectos, el sujeto tiene un índice de masa corporal IMC de 30 kg/m2 o más (p. ej., 30 a 39,9 kg/m2). En algunos aspectos, el sujeto tiene un IMC de al menos 40 kg/m2. En algunos aspectos, el sujeto tiene obesidad central (p. ej., exceso de adiposidad en la región abdominal, incluida la grasa abdominal y/o la grasa visceral). En algunos aspectos, el sujeto tiene una WHR de 0,85 o más. En algunos aspectos, el sujeto tiene obesidad periférica (p. ej., exceso de adiposidad en las caderas). En algunos aspectos, el tratamiento con antagonista de ALK7:ActRIIB es un complemento de la dieta y/o el ejercicio.

También se proporciona un procedimiento para tratar, mejorar o prevenir una enfermedad o afección asociada con la diabetes, que comprende administrar a un sujeto que tiene diabetes, una cantidad efectiva de un antagonista de ALK7:ActRIIB (p. ej., un heterodímero ALK7:ActRIIB), o una combinación de tales antagonistas. En un aspecto, la enfermedad o afección tratada o prevenida es un miembro seleccionado de entre el grupo que consiste en: dislipidemia, hiperlipidemia (nivel de colesterol total >240 mg/dl), hipercolesterolemia (p. ej., nivel de colesterol total de >200 mg/dl, >220 mg/dl, >240 mg/dl, >250 mg/dl o >275 mg/dl), nivel sérico bajo de ^hD^l(p. ej., < 40mg/dl, < 45 mg/dl, o < 50 mg/dl), nivel sérico alto de LDL (p. ej., > 100 mg/dl, > 130 mg/dl, > 160 mg/dl o > 190 mg/dl), e hipertrigliceridemia (p. ej., un nivel de TG en ayunas de > 150 mg/dl, > 175 mg/dl, > 200 mg/dl, > 300 mg/dl, > 400 mg/dl o > 499 mg/dl). En un aspecto, la enfermedad o afección tratada o prevenida es la enfermedad cardiovascular. En un aspecto adicional, la enfermedad o afección tratada o prevenida es hipertensión (presión arterial alta), infarto de miocardio, enfermedad arterial periférica, disfunción vasorregulatoína o arteriosclerosis. En un aspecto, la enfermedad o afección tratada o prevenida es una enfermedad hepática. En otro aspecto, la enfermedad o afección tratada o prevenida es un miembro seleccionado de entre el grupo: enfermedad del hígado graso, esteatohepatitis, esteatosis y/o cirrosis. En un aspecto, la enfermedad o afección tratada o prevenida es un miembro seleccionado de entre el grupo que consiste en: cataratas, apnea obstructiva del sueño, flebitis, gota, artrosis, colecistopatía y colesterol alto. En ciertos aspectos, el tratamiento con antagonista de ALK7:ActRIIB es un complemento de la dieta y/o el ejercicio.

La descripción también proporciona un procedimiento para mejorar el perfil de lípidos en sangre en un sujeto, que comprende administrar a un sujeto que necesite dicho tratamiento una cantidad efectiva de un antagonista de ALK7:ActRIIB (p. ej., un heterodímero ALK7:ActRIIB), o una combinación de tales antagonistas. En algunos aspectos, la descripción proporciona un procedimiento para reducir los niveles de colesterol LDL o aumentar los niveles de colesterol HDL. En un aspecto, el sujeto humano tiene dislipidemia. En otro aspecto, el sujeto tiene lípidos séricos elevados (p. ej., colesterol (hipercolesterolemia) y/o triglicéridos (p. ej., hipertrigliceridemia). En un aspecto, el sujeto tiene un LDL-C > 100 mg/dl, > 130 mg/dl, o > 160 mg/dl). En un aspecto, el sujeto tiene un TG > 150 mg/dl, > 160 mg/dl, > 170 mg/dl). En un aspecto, el sujeto tiene niveles elevados de insulina en plasma (hiperinsulinemia; por ejemplo, nivel de insulina en ayunas de >20 ug/ml puede superar los 100). En algunos aspectos, el sujeto tiene diabetes de tipo II.

Según un aspecto, la descripción proporciona un procedimiento para tratar o prevenir una enfermedad o trastorno metabólico o una afección asociada con una enfermedad o trastorno metabólico, que comprende administrar un antagonista de ALK7:ActRIIB (p. ej., un heterodímero ALK7:ActRIIB), o una combinación de tales antagonistas, a un sujeto que lo necesite. En un aspecto, la enfermedad, trastorno o afección metabólica tratada es la hiperglucemia (p. ej., > 130 mg/dl en ayunas o después de la administración de glucosa durante una prueba oral de tolerancia a la glucosa). En un aspecto, la enfermedad, trastorno o afección metabólica tratada es una enfermedad, trastorno o afección del metabolismo de los lípidos. En un aspecto, la enfermedad, trastorno o afección metabólica tratada es la dislipidemia. En un aspecto adicional, la enfermedad, trastorno o afección del metabolismo de los lípidos es un miembro seleccionado de entre: niveles bajos de HDL, niveles altos de LDL, niveles altos de triglicéridos, hiperlipidemia y una aberración de lipoproteínas. En un aspecto, el sujeto tiene un nivel de colesterol total de >200 mg/dl, >220 mg/dl, >240 mg/dl, >250 mg/dl o >275 mg/dl. En un aspecto, el sujeto tiene un nivel sérico de HDL de < 40 mg/dl, < 45 mg/dl o < 50 mg/dl). En un aspecto, el sujeto tiene un nivel sérico de LDL > 100 mg/dl, > 130 mg/dl, > 160 mg/dl o > 190 mg/dl. En un aspecto, el sujeto tiene un nivel de TG en ayunas de > 150 mg/dl, > 175 mg/dl, > 200 mg/dl, > 300 mg/dl, > 400 mg/dl o > 499 mg/dl. En un aspecto, la enfermedad, trastorno o afección metabólica tratada es una enfermedad, trastorno o afección del metabolismo de la glucosa. En un aspecto adicional, la enfermedad, trastorno o afección del metabolismo de la glucosa es un miembro seleccionado de entre: intolerancia a la glucosa, resistencia a la insulina, tolerancia a la glucosa alterada (IGT), glucosa en ayunas alterada (IFG). En un aspecto, la enfermedad, trastorno o afección metabólica tratada es un miembro seleccionado de entre el grupo que consiste en: niveles elevados de ácido úrico, EHGNA, hígado graso, EHNA y síndrome de ovario poliquístico. En un aspecto, el sujeto tratado tiene hiperinsulinemia. En un aspecto, el sujeto tratado es obeso (p. ej., el sujeto tiene obesidad abdominal). En otro aspecto, el sujeto tratado tiene diabetes de tipo II.

El síndrome metabólico es una afección que involucra un conjunto de trastornos que aumenta el riesgo de cardiopatía. Los principales componentes del síndrome metabólico son el exceso de peso, los parámetros cardiovasculares (presión arterial alta, dislipidemia, niveles altos de triglicéridos y/o niveles bajos de HDL en sangre), aterosclerosis, diabetes y/o resistencia a la insulina. Un sujeto que tiene varios de estos componentes, es decir, síndrome metabólico, es muy propenso a sufrir cardiopatías, aunque cada componente es un factor de riesgo. La descripción también proporciona un procedimiento para tratar o prevenir 1, 2, 3 o más de los componentes anteriores del síndrome metabólico, que comprende administrar a un sujeto que necesita tratamiento una cantidad efectiva de un antagonista de ALK7:ActRIIB (p. ej., un heterodímero ALK7:ActRIIB), o una combinación de tales antagonistas.

Adicionalmente, se proporciona un procedimiento para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad o afección cardiovascular, que comprende administrar un antagonista de ALK7:ActRIIB (p. ej., un heterodímero ALK7:ActRIIB), o una combinación de tales antagonistas, a un sujeto que lo necesite. En un aspecto, la enfermedad o afección cardiovascular tratada, prevenida o mejorada es la aterosclerosis. En un aspecto, la enfermedad o afección cardiovascular tratada, prevenida o mejorada es hipertensión (p. ej., presión arterial >130/80 mmHg o >140/90 mmHg, en estado de reposo. En un aspecto, la enfermedad cardiovascular es la aterosclerosis (enfermedad coronaria).

En un aspecto, la descripción proporciona un procedimiento para tratar y/o mejorar una enfermedad o afección inflamatoria del hígado que comprende la administración de un antagonista de ALK7:ActRIIB (p. ej., un heterodímero ALK7:ActRIIB), o una combinación de tales antagonistas, a un sujeto que lo necesite. En un aspecto, la enfermedad o afección es EHGNA. En otro aspecto, la enfermedad o afección es el hígado graso. En un aspecto adicional, la enfermedad o afección es la esteatosis (p. ej., esteatohepatitis no alcohólica (EHNA)). En un aspecto adicional, la enfermedad o afección es enfermedad de hígado graso alcohólico.

Esta descripción también proporciona un procedimiento para mejorar el control glucémico, que comprende administrar a un sujeto que necesita tratamiento una cantidad efectiva de un antagonista de ALK7:ActRIIB (p. ej., un heterodímero ALK7:ActRIIB). En un aspecto, al sujeto se le administra un nivel de azúcar en sangre en ayunas de >130, >135, >140, >145, o >150 mg/dl. En un aspecto, al sujeto se le administra un nivel de azúcar en sangre posprandial de >180, >185, >190, >195, o >200 mg/dl 2 horas después de comer. En ciertos aspectos, el tratamiento con antagonista de ALK7:ActRIIB es un complemento de la dieta y/o el ejercicio. La administración también puede reducir el peso corporal o tratar la obesidad. En ciertos aspectos, el sujeto tiene diabetes mellitus de tipo 2. En ciertos aspectos, el sujeto tiene un IMC de 27 a 40 kg/m2. En ciertos aspectos, el sujeto tiene un IMC de 30 a 39,9 kg/m2. En ciertos aspectos, el sujeto tiene un IMC de al menos 40. En ciertos aspectos, el anticuerpo tiene sobrepeso. En algunos aspectos, el sujeto es obeso. Se puede evaluar una mejora en el control glucémico usando técnicas conocidas en la técnica, tales como una prueba de comidas mixtas.

La descripción también proporciona composiciones y procedimientos para tratar, prevenir o mejorar la hiperglucemia o una afección asociada con la hiperglucemia en un sujeto, que comprenden administrar a un sujeto que necesita tal tratamiento una cantidad efectiva de un antagonista de ALK7:ActRIIB (p. ej., un heterodímero ALK7:ActRIIB). En un aspecto, al sujeto se le administra un nivel de azúcar en sangre en ayunas de >130, >135, >140, >145, o >150 mg/dl.

En un aspecto, al sujeto se le administra un nivel de azúcar en sangre posprandial de >180, >185, >190, >195, o >200 mg/dl 2 horas después de comer. En un aspecto, el resultado del tratamiento, prevención o mejora es un miembro seleccionado de entre el grupo que consiste en: una disminución de los niveles séricos de glucosa, una disminución de los niveles séricos de triglicéridos, una disminución de los niveles séricos de insulina y/o una disminución de los niveles séricos de ácidos grasos no esterificados, en comparación con los niveles séricos en el sujeto antes del tratamiento. En un aspecto, el resultado del tratamiento, prevención o mejora es un aumento de la temperatura corporal de aproximadamente 0,4°C a 1°C en comparación con la temperatura corporal del sujeto antes del tratamiento. En algunos aspectos, el tratamiento con ALK7:ActRIIB también reduce el peso corporal del sujeto.

En otro aspecto, la descripción proporciona un procedimiento para disminuir los niveles de insulina en plasma en un sujeto, que comprende administrar una cantidad efectiva de un antagonista de ALK7:ActRIIB (p. ej., un heterodímero ALK7:ActRIIB), a un sujeto que necesite tal tratamiento. En un aspecto, el sujeto tiene un nivel de azúcar en sangre en ayunas de >130, >135, >140, >145, o >150 mg/dl. En un aspecto, el sujeto tiene un nivel de azúcar en sangre posprandial de >180, >185, >190, >195, o >200 mg/dl 2 horas después de comer. En un aspecto, el sujeto tiene sobrepeso. En un aspecto, el sujeto es obeso. En otro aspecto, el sujeto tiene diabetes tipo 2.

La descripción también proporciona composiciones y procedimientos para tratar, prevenir o mejorar la hiperglucemia o una afección asociada con la hiperglucemia en un sujeto, que comprenden administrar a un sujeto que necesita tal tratamiento una cantidad efectiva de un antagonista de ALK7:ActRIIB (p. ej., un heterodímero ALK7:ActRIIB). En un aspecto, el sujeto tiene un nivel de azúcar en sangre en ayunas de >130, >135, >140, >145, o >150 mg/dl. En un aspecto, el sujeto tiene un nivel de azúcar en sangre posprandial de >180, >185, >190, >195, o >200 mg/dl 2 horas después de comer. En un aspecto, el resultado del tratamiento, prevención o mejora es un miembro seleccionado de entre el grupo que consiste en: una disminución de los niveles séricos de glucosa, una disminución de los niveles séricos de triglicéridos, una disminución de los niveles séricos de insulina y/o una disminución de los niveles séricos de ácidos grasos no esterificados, en comparación con los niveles séricos en el sujeto antes del tratamiento. En un aspecto, el resultado del tratamiento, prevención o mejora es un aumento de la temperatura corporal de aproximadamente 0,4°C a 1°C en comparación con la temperatura corporal del sujeto antes del tratamiento. En algunos aspectos, el tratamiento con antagonista de ALK7:ActRIIB también reduce el peso corporal del sujeto.

En otro aspecto, la descripción proporciona un procedimiento para disminuir los niveles de insulina en plasma en un sujeto, que comprende administrar una cantidad efectiva de un antagonista de ALK7:ActRIIB (p. ej., un heterodímero ALK7:ActRIIB), o una combinación de tales antagonistas, a un sujeto que necesite tal tratamiento. En un aspecto, el sujeto tiene un nivel de azúcar en sangre en ayunas de >130, >135, >140, >145, o >150 mg/dl. En un aspecto, tiene un nivel de azúcar en sangre posprandial de >180, >185, >190, >195, o >200 mg/dl 2 horas después de comer. En un aspecto, el sujeto tiene sobrepeso. En un aspecto, el sujeto es obeso. En otro aspecto, el sujeto tiene diabetes tipo 2.

En otro aspecto, la descripción proporciona un procedimiento para tratar, prevenir o mejorar la enfermedad hepática en un sujeto, que comprende administrar una cantidad efectiva de un antagonista de ALK7:ActRIIB (p. ej., un heterodímero ALK7:ActRIIB), o una combinación de tales antagonistas, a un sujeto que tiene una enfermedad hepática. En un aspecto, el sujeto tiene inflamación del hígado. En un aspecto, el sujeto tiene EHGNA. En un aspecto, el sujeto tiene hígado graso. En otro aspecto, el sujeto tiene EHNA. En un aspecto, el sujeto tiene hígado graso. En otro aspecto, el sujeto tiene enfermedad del hígado graso alcohólico. En un aspecto, la enfermedad hepática tratada, prevenida o mejorada es fibrosis, cicatrización fibrosa, cirrosis o insuficiencia hepática. En otro aspecto, la enfermedad hepática tratada, prevenida o mejorada es cáncer de hígado. En un aspecto, el sujeto tiene sobrepeso. En otro aspecto, el sujeto es obeso. En otro aspecto, el sujeto tiene diabetes tipo 2.

Por ejemplo, la descripción proporciona un procedimiento para aumentar la lipólisis en una célula (p. ej., células o tejido adiposo blanco o marrón) que comprende la administración de una cantidad efectiva de un antagonista de ALK7:ActRIIB (p. ej., un heterodímero ALK7:ActRIIB), o una combinación de tales antagonistas. En algunos aspectos, la célula se pone en contacto in vitro. En algunos aspectos, la célula se pone en contacto in vivo. En un aspecto, el procedimiento se lleva a cabo in vivo, por ejemplo, en un sujeto mamífero (p. ej., un modelo animal). En un aspecto adicional, el sujeto es un ser humano. En algunos aspectos, el procedimiento conduce a una mayor producción de glicerol. En otros aspectos, el procedimiento conduce a un aumento de glicerol y/o ácido graso libre en un cultivo de adipocitos. En algunos aspectos, el procedimiento conduce a una disminución del contenido de triglicéridos (TG) en la célula o tejido. En algunos aspectos, el procedimiento conduce a una disminución del nivel de TG plasmáticos en un sujeto.

En otro aspecto, la descripción proporciona un procedimiento para aumentar la transducción de señales del receptor adrenérgico p (ADRB) en una célula o tejido (p. ej., células o tejido adiposo blanco o marrón). El procedimiento comprende poner en contacto una célula o tejido con un antagonista de ALK7:ActRIIB (p. ej., un heterodímero ALK7:ActRIIB), o una combinación de tales antagonistas, en una cantidad suficiente para aumentar la transducción de señales de ADRB. En algunos aspectos, la célula o tejido se pone en contacto in vitro. En algunos aspectos, la célula o tejido se pone en contacto in vitro. En un aspecto, el procedimiento se lleva a cabo in vivo, por ejemplo, en un sujeto mamífero (p. ej., un modelo animal). En un aspecto adicional, el sujeto es un ser humano. En algunos aspectos, el procedimiento conduce a una mayor producción de glicerol. En otros aspectos, el procedimiento conduce a un aumento de glicerol y/o ácido graso libre en un cultivo de adipocitos. En algunos aspectos, el procedimiento conduce a una disminución del contenido de TG en la célula o tejido. En algunos aspectos, el procedimiento conduce a una disminución del nivel de TG plasmáticos en un sujeto. En algunos aspectos, el procedimiento conduce a un aumento de la transducción de señales de ADRB en un adipocito o tejido adiposo durante la sobrecarga de nutrientes.

En otro aspecto, la descripción proporciona un procedimiento para disminuir la transducción de señales del receptor gamma activado por proliferador de peroxisoma (PPAR gamma) en una célula o tejido (por ejemplo, célula o tejido adiposo blanco y/o marrón). El procedimiento incluye poner en contacto una célula o tejido con un antagonista de ALK7:ActRIIB (p. ej., un heterodímero ALK7:ActRIIB), o una combinación de tales antagonistas, en una cantidad efectiva para disminuir la actividad de PPAR gamma. En algunos aspectos, las células o el tejido se ponen en contacto in vitro. En algunos aspectos, las células diferenciadas o el tejido se ponen en contacto in vitro. En un aspecto, el procedimiento se lleva a cabo in vivo, por ejemplo, en un sujeto mamífero (p. ej., un modelo animal). En un aspecto adicional, el sujeto es un ser humano. En algunos aspectos, el procedimiento conduce a una mayor producción de glicerol. En otros aspectos, el procedimiento conduce a un aumento de glicerol y/o ácido graso libre en un cultivo de adipocitos. En algunos aspectos, el procedimiento conduce a una disminución del contenido de TG en las células o el tejido. En algunos aspectos, el procedimiento conduce a una disminución del nivel de TG plasmáticos en un sujeto.

En otro aspecto, la descripción proporciona un procedimiento para disminuir la resistencia a la insulina en una célula o tejido (por ejemplo, célula o tejido adiposo blanco y/o marrón). El procedimiento incluye poner en contacto una célula o tejido con un antagonista de ALK7:ActRIIB (p. ej., un heterodímero ALK7:ActRIIB), o una combinación de tales antagonistas, en una cantidad efectiva para reducir la resistencia a la insulina. En algunos aspectos, la célula o tejido se pone en contacto in vitro. En algunos aspectos, la célula o tejido se pone en contacto in vitro. En un aspecto, el procedimiento se lleva a cabo in vivo, por ejemplo, en un sujeto mamífero (p. ej., un modelo animal). En un aspecto adicional, el sujeto es un ser humano.

En otro aspecto, la descripción proporciona un procedimiento para aumentar la tasa metabólica de una célula o tejido (p. ej., célula o tejido adiposo blanco y/o marrón). El procedimiento incluye poner en contacto una célula o tejido con un antagonista de ALK7:ActRIIB (p. ej., un heterodímero ALK7:ActRIIB), o una combinación de tales antagonistas, en una cantidad efectiva para aumentar el metabolismo de la célula o tejido. En algunos aspectos, la célula o tejido se pone en contacto in vitro. En algunos aspectos, la célula o tejido se pone en contacto in vitro. En un aspecto, el procedimiento se lleva a cabo in vivo, por ejemplo, en un sujeto mamífero (p. ej., un modelo animal). En un aspecto adicional, el sujeto es un ser humano.

La descripción proporciona procedimientos que comprenden administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista de ALK7:ActRIIB (p. ej., un heterodímero ALK7:ActRIIB), o una combinación de tales antagonistas, solos o en combinación con una o más terapias adicionales (p. ej., uno o más agentes terapéuticos y/o de apoyo) a un sujeto que tiene, o está en riesgo de desarrollar, una enfermedad y/o afección mediada por ALK7 tal como obesidad (p. ej., obesidad abdominal); sobrepeso; resistencia a la insulina; síndrome metabólico y otras enfermedades o afecciones metabólicas; un trastorno de lípidos tal como niveles bajos de HDL, niveles altos de LDL, hiperlipidemia, hipertrigliceridemia o dislipidemia; aberraciones de lipoproteínas; triglicéridos disminuidos; enfermedad del hígado graso; enfermedad del hígado graso no alcohólico; hiperglucemia; tolerancia alterada a la glucosa (TGA); hiperinsulinemia; colesterol alto (p. ej., niveles altos de LDL y/o hipercolesterolemia); enfermedad cardiovascular tal como cardiopatía que incluye cardiopatía coronaria, insuficiencia cardíaca congestiva, aterosclerosis; arteriosclerosis y/o hipertensión; Síndrome X; reestenosis vascular; neuropatía; y/u otros trastornos/afecciones asociados con una o más de las enfermedades o afecciones anteriores, y/o con sobrepeso (p. ej., IMC de >25 kg/m 2), o con demasiada grasa corporal.

En aspectos adicionales, la descripción proporciona procedimientos para tratar y/o mejorar el cáncer o una afección asociada con el cáncer, que comprende la administración de un antagonista de ALK7:ActRIIB (p. ej., un heterodímero ALK7:ActRIIB), o una combinación de tales antagonistas. En algunos aspectos, el sujeto tiene un cáncer seleccionado de entre el grupo que consiste en melanoma, cáncer de mama, colon y endometrio, páncreas, gástrico y útero. En algunos aspectos, el sujeto tiene mieloma (por ejemplo, mieloma múltiple, plasmocitoma, mieloma localizado y mieloma extramedular). En algunos aspectos, el antagonista de ALK7:ActRIIB se administra para tratar o prevenir metástasis linfática, metástasis del torrente sanguíneo, crecimiento tumoral o invasión tumoral.

La fibrosis generalmente se refiere a un depósito excesivo tanto de fibras de colágeno como de matriz extracelular, combinado con una disminución relativa del número de células en un órgano o tejido. Si bien este proceso es una característica importante de la cicatrización natural de heridas después de una lesión, la fibrosis puede provocar daños patológicos en diversos tejidos y órganos, incluidos, por ejemplo, los pulmones, los riñones, el hígado, los huesos, los músculos y la piel. El papel del TGF-beta en la fibrosis se ha estudiado ampliamente. Sin embargo, otros ligandos de la superfamilia de TGF-beta también han estado implicados en la fibrosis, incluyendo, por ejemplo, activinas (p. ej., activina A y activina B) y GDF8. [Hedger y col (2013) Cytokine and Growth Factor Reviews 24:285-295; Hardy y col. (2015) 93: 567-574; y Cantini y col. (2008) J Sex Med 5:1607-1622]. Por lo tanto, en algunos aspectos, un antagonista de ALK7:ActRIIB (p. ej., un heterodímero ALK7:ActRIIB), o combinaciones de tales antagonistas, de la presente descripción se pueden usar para tratar la fibrosis, particularmente los trastornos y afecciones asociados a la fibrosis. Por ejemplo, un ALK7:ActRIIB antagonista (p. ej., un ALK7:ActRIIB heterodímero), o combinaciones de dichos antagonistas, pueden usarse para tratar o prevenir uno o más de: fibrosis pulmonar, neumonitis por hipersensibilidad, fibrosis idiopática, tuberculosis, neumonía, fibrosis quística, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), enfisema, fibrosis renal (riñón), insuficiencia renal (riñón), enfermedad renal (riñón) crónica, fibrosis ósea, mielofibrosis, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, esclerodermia, sarcoidosis, granulomatosis con poliangeítis, enfermedad de Peyronie, fibrosis hepática, enfermedad de Wilson, enfermedades por almacenamiento de glucógeno (en particular, tipos III, IV, IX y X), sobrecarga de hierro, enfermedad de Gaucher, síndrome de Zellweger, esteatohepatitis no alcohólica y alcohólica, cirrosis biliar, colangitis esclerosante, síndrome de Budd-Chiari, fibrosis asociada a cirugía, enfermedad de Crohn, contractura de Duputren, fibrosis mediastínica, fibrosis nefrogénica, fibrosis retroperitoneal, fibrosis auricular, fibrosis endomiocárdica, fibrosis pancreática.

En parte, la presente descripción se refiere al sorprendente descubrimiento de que los heteromultímeros ALK7:ActRIIB pueden unirse a la activina C. Por lo tanto, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB representan una nueva clase de inhibidores de la activina C que pueden usarse para tratar o prevenir trastornos o afecciones relacionados con la activina C. En algunos aspectos, se pueden usar heteromultímeros ALK7:ActRIIB para inhibir la actividad de activina C en un paciente que lo necesite. La sobreexpresión de activina C se ha relacionado con enfermedades y trastornos asociados con el hígado, los testículos y la próstata, en particular con el cáncer en tales tejidos. Véase, por ejemplo, Gold y col. Am J Pathol (2009) 174(1): 184-195. En algunos aspectos, se pueden usar los heteromultímeros ALK7:ActRIIB para aumentar la fertilidad masculina, aumentar la producción de esperma, aumentar el volumen de los túbulos seminíferos, disminuir la inflamación del hígado, tratar el cáncer de hígado (hepático), tratar el cáncer de testículo, tratar el cáncer de próstata, disminuir la inflamación de la próstata y/o tratar la hipertrofia de próstata.

En algunos aspectos, las afecciones asociadas con ALK7:ActRIIB incluyen trastornos neuromusculares (p. ej., distrofia muscular y atrofia muscular), enfermedad pulmonar obstructiva congestiva (y atrofia muscular asociada con la EPOC), síndrome de atrofia muscular, sarcopenia, caquexia, trastornos del tejido adiposo (p. ej., obesidad), diabetes tipo 2 (DMNID, diabetes de aparición en adulto) y enfermedad degenerativa ósea (p. ej., osteoporosis). Otras afecciones asociadas con ALK7:ActRIIB incluyen trastornos musculodegenerativos y neuromusculares, reparación de tejidos (p. ej., cicatrización de heridas), enfermedades neurodegenerativas (p. ej., esclerosis lateral amiotrófica) y trastornos inmunológicos (p. ej., trastornos relacionados con la proliferación o función anormal de linfocitos).

En ciertos aspectos, un antagonista de ALK7:ActRIIB (p. ej., un heterodímero ALK7:ActRIIB), o combinaciones de tales antagonistas, de la descripción pueden usarse como parte de un tratamiento para una distrofia muscular. El término "distrofia muscular" se refiere a un grupo de enfermedades musculares degenerativas caracterizadas por debilitamiento gradual y deterioro de los músculos esqueléticos y, algunas veces, del corazón y los músculos respiratorios. Las distrofias musculares son trastornos genéticos caracterizados por un desgaste muscular progresivo y debilidad que comienzan con cambios microscópicos en el músculo. A medida que los músculos se degeneran con el tiempo, la fuerza muscular de la persona disminuye. Las distrofias musculares ejemplares que se pueden tratar con una pauta que incluye los complejos heteromultiméricos de la superfamilia de de TGF-beta incluyen: distrofia muscular de Duchenne (DMD), distrofia muscular de Becker (DMB), distrofia muscular de Emery-Dreifuss (DMED), distrofia muscular de Limb-Girdle (DMLG), distrofia muscular facioescapulohumeral (FSH o FSHD) (también conocida como de Landouzy-Dejerine), distrofia miotónica (DMM: también conocida como enfermedad de Steinert), distrofia muscular oculofaríngea (DMOF), distrofia muscular distal (DD), distrofia muscular congénita (DMC).

La distrofia muscular de Duchenne (DMD) fue descrita por primera vez por el neurólogo francés Guillaume Benjamin Amand Duchenne en la década de 1860. La distrofia muscular de Becker (DMB) lleva el nombre del médico alemán Peter Emil Becker, quien describió por primera vez esta variante de la DMD en la década de 1950. La DMD es una de las enfermedades hereditarias más frecuentes en los hombres, afectando a uno de cada 3.500 niños. La DMD se produce cuando el gen de la distrofina, ubicado en el brazo corto del cromosoma X, es defectuoso. Dado que los hombres solo tienen una copia del cromosoma X, solo tienen una copia del gen de la distrofina. Sin la proteína distrofina, el músculo se daña fácilmente durante los ciclos de contracción y relajación. Mientras que al principio de la enfermedad, el músculo se compensa mediante la regeneración, más adelante las células progenitoras del músculo no pueden seguir el ritmo del daño continuo y el músculo sano es remplazado por tejido fibro-graso no funcional.

La DMB resulta de diferentes mutaciones en el gen de la distrofina. Los pacientes con DMB tienen algo de distrofina, pero es insuficiente en cantidad o de mala calidad. Tener algo de distrofina protege los músculos de las personas con DMB de degenerar tan mal o tan rápidamente como los de las personas con DMD.

Los estudios en animales indican que la inhibición de la vía de transducción de señales de GDF8 puede tratar eficazmente diversos aspectos de la enfermedad en pacientes con DMD y DMB ( Bogdanovich y col., 2002, Nature 420:418-421; Pistilli y col., 2011, Am J Pathol 178:1287-1297). Así, los antagonistas de ALK7:ActRIIB de la descripción pueden actuar como inhibidores (antagonistas) de GDF8 y constituir un medio alternativo para bloquear la transducción de señales de GDF8. y/o ligandos de la superfamilia de TGFp relacionados in vivo en pacientes con DMD y DMB.

De manera similar, los antagonistas de ALK7:ActRIIB de la descripción proporcionan un medio eficaz para aumentar la masa muscular en otras enfermedades que necesitan crecimiento muscular. Por ejemplo, la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), también denominada enfermedad de Lou Gehrig o enfermedad de la motoneurona, es un trastorno del SNC crónico, progresivo e incurable que ataca a las motoneuronas, que son componentes del sistema nervioso central necesarios para el inicio de la contracción del músculo esquelético. En la ELA, las neuronas motoras se deterioran y finalmente mueren, y aunque el cerebro de una persona normalmente permanece en pleno funcionamiento y alerta, la orden de moverse nunca llega a los músculos. Los individuos que desarrollan ELA tienen típicamente entre 40 y 70 años, y las primeras neuronas motoras en degenerar son las que inervan los brazos o las piernas. Los pacientes con ELA pueden tener problemas para caminar, pueden dejar caer cosas, caerse, arrastrar las palabras y reír o llorar incontrolablemente. Finalmente, los músculos de las extremidades comienzan a atrofiarse por falta de uso. La debilidad muscular se vuelve debilitante y los pacientes eventualmente requieren una silla de ruedas o quedan confinados en la cama. La mayoría de los pacientes con ELA mueren por insuficiencia respiratoria o por complicaciones de la asistencia del respirador, como neumonía, entre 3 y 5 años desde el inicio de la enfermedad.

La promoción del aumento de masa muscular por antagonistas de ALK7:ActRIIB también podría beneficiar a aquellos que sufren de enfermedades de atrofia muscular progresiva. González-Cadavid y col. (supra) informaron que la expresión de GDF8 se correlaciona inversamente con la masa libre de grasa en seres humanos y que la expresión aumentada del gen GDF8 está asociada con la pérdida de peso en hombres con síndrome consuntivo por SIDA. Al inhibir la función de GDF8 en pacientes con SIDA, al menos ciertos síntomas de SIDA se pueden aliviar, si no eliminar por completo, mejorando así significativamente la calidad de vida en pacientes con SIDA.

Dado que la pérdida de función de GDF8 también se asocia con la pérdida de grasa sin disminución de la ingesta de nutrientes (Zimmers y col., supra; McPherron y Lee, supra), los antagonistas de ALK7:ActRIIB objeto se pueden usar además como un agente terapéutico para ralentizar o prevenir el desarrollo de obesidad y diabetes tipo 2.

El síndrome de anorexia-caquexia por cáncer se encuentra entre los aspectos más debilitantes y potencialmente mortales del cáncer. Este síndrome es una característica común de muchos tipos de cáncer, presente en aproximadamente el 80 % de pacientes con cáncer al morir, y es responsable no solo de una mala calidad de vida y una mala respuesta a la quimioterapia, sino también de un tiempo de supervivencia más corto que el que se encuentra en pacientes con tumores comparables pero sin pérdida de peso. Se sospecha típicamente de caquexia en pacientes con cáncer si ocurre una pérdida de peso involuntaria de más del cinco por ciento del peso premórbido dentro de un período de seis meses. Asociada con anorexia, pérdida de tejido graso y muscular, malestar psicológico y una menor calidad de vida, la caquexia surge de una interacción compleja entre el cáncer y el hospedador. La caquexia por cáncer afecta la producción de citocinas, la liberación de factores movilizadores de lípidos e inductores de proteólisis y alteraciones en el metabolismo intermedio. Aunque la anorexia es común, una disminución de la ingesta de alimentos por sí sola no puede explicar los cambios en la composición corporal observados en los pacientes con cáncer, y el aumento de la ingesta de nutrientes no puede revertir el síndrome consuntivo. Actualmente, no existe un tratamiento para controlar o revertir el proceso caquéxico. Dado que se encontró que la sobreexpresión sistémica de GDF8 en ratones adultos induce una pérdida profunda de músculo y grasa análoga a la observada en los síndromes de caquexia humana (Zimmers y col., supra), los antagonistas de ALK7:ActRIIB objeto se pueden usar de manera beneficiosa para prevenir, tratar o aliviar los síntomas del síndrome de caquexia, donde se desea el crecimiento muscular. Un ejemplo de un complejo heteromérico útil para prevenir, tratar o aliviar la pérdida de músculo como se describe anteriormente es un heterodímero ALK7:ActRIIB.

En ciertos aspectos, un antagonista de ALK7:ActRIIB (p. ej., un heterodímero ALK7:ActRIIB), o combinaciones de tales antagonistas, de la presente descripción pueden usarse en procedimientos para inducir formación de hueso y/o cartílago, prevenir la pérdida ósea, aumentar la mineralización ósea, prevenir la desmineralización del hueso y/o aumentar la densidad ósea. Los antagonistas de ALK7:ActRIIB pueden ser útiles en pacientes a los que se les diagnostica baja densidad ósea subclínica, como medida protectora contra el desarrollo de osteoporosis.

En algunos aspectos, un antagonista de ALK7:ActRIIB (p. ej., un heterodímero ALK7:ActRIIB), o combinaciones de tales antagonistas, de la presente descripción pueden encontrar utilidad médica en la consolidación de fracturas óseas y defectos del cartílago en seres humanos y otros animales. Los procedimientos y composiciones objeto también pueden tener uso profiláctico en la reducción de fracturas cerradas así como abiertas y también en la fijación mejorada de articulaciones artificiales. La formación de hueso de novo inducida por un agente osteógeno contribuye a la reparación de defectos craneofaciales congénitos, inducidos por traumatismos u provocados por resección oncológica, y también es útil en cirugía plástica cosmética. Además, los procedimientos y composiciones de la descripción pueden usarse en el tratamiento de la enfermedad periodontal y en otros procesos de reparación de dientes. En ciertos aspectos, un antagonista de ALK7:ActRIIB (p. ej., un heterodímero ALK7:ActRIIB), o combinaciones de tales antagonistas, pueden proporcionar un entorno para atraer células formadoras de hueso, estimular el crecimiento de células formadoras de hueso o inducir la diferenciación de progenitores de células formadoras de hueso. Un antagonista de ALK7:ActRIIB (p. ej., un heterodímero ALK7:ActrIIB), o combinaciones de tales antagonistas, de la descripción también pueden ser útiles en el tratamiento de la osteoporosis. Además, los antagonistas de ALK7:ActRIIB se pueden usar en la reparación de defectos del cartílago y la prevención/reversión de la artrosis. Ejemplos de complejos heteroméricos útiles para inducir la formación ósea, prevenir la pérdida ósea, aumentar la mineralización ósea, prevenir la desmineralización del hueso y/o aumentar la densidad ósea como se describe en este documento son heterodímeros ALK7:ActRIIB.

Rosen y col. (ed) Primer on the Metabolic Bone Diseases and Disorders of Mineral Metabolism, 7a ed. American Society for Bone and Mineral Research, Washington D.C. proporciona una amplia discusión de los trastornos óseos que pueden estar sujetos a tratamiento con un antagonista de ALK7:ActRIIB, o con combinaciones de tales antagonistas. En este documento se proporciona una lista parcial. Los procedimientos y composiciones de la descripción se pueden aplicar a afecciones caracterizadas por o que causan pérdida ósea, tales como osteoporosis (incluida la osteoporosis secundaria), hiperparatiroidismo, enfermedad renal crónica, trastorno mineral óseo, privación o ablación de hormonas sexuales (p. ej. andrógeno y/o estrógeno), tratamiento con glucocorticoides, artritis reumatoide, quemaduras graves, hiperparatiroidismo, hipercalcemia, hipocalcemia, hipofosfatemia, osteomalacia (incluida la osteomalacia inducida por tumores), hiperfosfatemia, deficiencia de vitamina D, hiperparatiroidismo (incluido el hiperparatiroidismo familiar) y pseudohipoparatiroidismo, metástasis tumoral hasta el hueso, pérdida ósea como consecuencia de un tumor o quimioterapia, tumores de hueso y médula ósea (p. ej., mieloma múltiple), trastornos óseos isquémicos, enfermedad periodontal y pérdida de hueso bucal, enfermedad de Cushing, enfermedad de Paget, tirotoxicosis, estado diarreico crónico o malabsorción, acidosis tubular renal o anorexia nerviosa. Los procedimientos y composiciones de la descripción también se pueden aplicar a afecciones caracterizadas por un fallo en la formación o consolidación ósea, incluidas fracturas sin consolidación, fracturas que de otra manera son lentas en consolidarse, displasias óseas fetales y neonatales (por ejemplo, hipocalcemia, hipercalcemia, defectos del receptor de calcio y deficiencia de vitamina D), osteonecrosis (incluida la osteonecrosis de la mandíbula) y osteogénesis imperfecta. Adicionalmente, los efectos anabólicos harán que dichos antagonistas disminuyan el dolor óseo asociado con el daño o la erosión ósea. Como consecuencia de los efectos antirresortivos, tales antagonistas pueden ser útiles para tratar trastornos de formación ósea anormal, tales como metástasis tumorales osteoblásticas (p. ej., asociadas con cáncer primario de próstata o de mama), osteosarcoma osteógeno, osteopetrosis, displasia diafisaria progresiva, hiperostosis endosteal, osteopoiquilosis y melorreostosis. Otros trastornos que pueden tratarse incluyen displasia fibrosa y condrodisplasias.

En otro aspecto específico, la descripción proporciona un procedimiento y composición terapéuticos para reparar fracturas y otras afecciones relacionadas con defectos del cartílago y/o huesos o enfermedades periodontales. La descripción proporciona además procedimientos y composiciones terapéuticos para la cicatrización de heridas y la reparación de tejidos. Los tipos de heridas incluyen, pero no se limitan a, quemaduras, incisiones y úlceras. Véase, p. ej., Publicación PCT No. WO 84/01106. Tales composiciones comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de al menos uno de los antagonistas de ALK7:ActRIIB de la descripción en mezcla con un vehículo, portador o matriz farmacéuticamente aceptable.

En algunos aspectos, un antagonista de ALK7:ActRIIB (p. ej., un heterodímero ALK7:ActRIIB), o combinaciones de tales antagonistas, de la descripción se pueden aplicar a afecciones que causan pérdida ósea tales como osteoporosis, hiperparatiroidismo, enfermedad de Cushing, tirotoxicosis, estado de diarrea crónica o malabsorción, acidosis tubular renal o anorexia nerviosa. Mucha gente sabe que ser mujer, tener un peso corporal bajo y llevar un estilo de vida sedentario son factores de riesgo de osteoporosis (pérdida de densidad mineral ósea, que conduce al riesgo de fracturas). Sin embargo, la osteoporosis también puede resultar del uso prolongado de ciertos medicamentos. La osteoporosis resultante de fármacos u otra afección médica se conoce como osteoporosis secundaria. En la enfermedad de Cushing, el exceso de cortisol producido por el cuerpo provoca osteoporosis y fracturas. Los medicamentos más comunes asociados con la osteoporosis secundaria son los corticosteroides, una clase de fármacos que actúan como el cortisol, una hormona producida naturalmente por las glándulas suprarrenales. Aunque se necesitan niveles adecuados de hormonas tiroideas para el desarrollo del esqueleto, el exceso de hormona tiroidea puede disminuir la masa ósea con el tiempo. Los antiácidos que contienen aluminio pueden provocar la pérdida de masa ósea cuando las personas con problemas renales los toman en dosis altas, en particular las que se someten a diálisis. Otros medicamentos que pueden causar osteoporosis secundaria incluyen fenitoína (Dilantin) y barbitúricos que se usan para prevenir convulsiones; metotrexato (Rheumatrex, Immunex, Folex PFS), un fármaco para algunas formas de artritis, cáncer y trastornos inmunitarios; ciclosporina (Sandimmune, Neoral), un fármaco que se usa para tratar algunas enfermedades autoinmunitarias y para inhibir el sistema inmunológico en pacientes con trasplante de órganos; agonistas de la hormona liberadora de hormona luteinizante (Lupron, Zoladex), usados para tratar el cáncer de próstata y la endometriosis; heparina (Calciparine, Liquaemin), un medicamento anticoagulante; y colestiramina (Questran) y colestipol (Colestid), usados para tratar el colesterol alto. La pérdida ósea resultante de la terapia del cáncer es ampliamente reconocida y se denomina pérdida ósea inducida por la terapia del cáncer (CTIBL). Las metástasis óseas pueden crear cavidades en el hueso que pueden corregirse mediante el tratamiento con un antagonista de ALK7:ActRIIB (p. ej., un heterodímero ALK7:ActRIIB). La pérdida ósea también puede ser causada por la enfermedad de las encías, una infección crónica en la que las bacterias ubicadas en los huecos de las encías producen toxinas y enzimas dañinas.

En un aspecto adicional, la presente descripción proporciona procedimientos y agentes terapéuticos para tratar enfermedades o trastornos asociados con el crecimiento óseo anormal o no deseado. Por ejemplo, los pacientes con el trastorno congénito fibrodisplasia osificante progresiva (FOP) se ven afectados por un crecimiento óseo ectópico progresivo en los tejidos blandos de forma espontánea o en respuesta a un traumatismo tisular, con un impacto importante en la calidad de vida. Además, puede producirse un crecimiento óseo anormal después de la cirugía de reemplazo de cadera y, por tanto, arruinar el resultado quirúrgico. Este es un ejemplo más común de crecimiento óseo patológico y una situación en la que los procedimientos y composiciones en cuestión pueden ser terapéuticamente útiles. Los mismos procedimientos y composiciones también pueden ser útiles para tratar otras formas de crecimiento óseo anormal (p. ej., crecimiento patológico del hueso después de un traumatismo, quemaduras o lesión de la médula espinal), y para tratar o prevenir las condiciones indeseables asociadas con el crecimiento óseo anormal observado en relación con cáncer de próstata metastásico u osteosarcoma.

En ciertos aspectos, un antagonista de ALK7:ActRIIB (p. ej., un heterodímero ALK7:ActRIIB), o combinaciones de tales antagonistas, de la descripción pueden usarse para promover la formación de hueso en pacientes con cáncer. Los pacientes que tienen ciertos tumores (por ejemplo, de próstata, mama, mieloma múltiple o cualquier tumor que cause hiperparatiroidismo) tienen un alto riesgo de pérdida ósea debido a la pérdida ósea inducida por el tumor, metástasis óseas y agentes terapéuticos. Dichos pacientes pueden tratarse con un complejo heteromultimérico de la superfamilia de TGF-beta, o una combinación de complejos, incluso en ausencia de evidencia de pérdida ósea o metástasis óseas. Los pacientes también se pueden supervisar para detectar evidencia de pérdida ósea o metástasis óseas, y pueden ser tratados con un antagonista de ALK7:ActRIIB en el caso de que los indicadores sugieran un mayor riesgo. Generalmente, las exploraciones DEXA se emplean para evaluar los cambios en la densidad ósea, mientras que los indicadores de remodelación ósea pueden usarse para evaluar la probabilidad de metástasis óseas. Se pueden supervisar los marcadores séricos. La fosfatasa alcalina específica de hueso (BSAP) es una enzima que está presente en los osteoblastos. Los niveles sanguíneos de BSAP aumentan en pacientes con metástasis ósea y otras afecciones que provocan un aumento de la remodelación ósea. Los péptidos de osteocalcina y procolágeno también están asociados con la formación ósea y las metástasis óseas. Se han detectado aumentos de BSAP en pacientes con metástasis óseas por cáncer de próstata y, en menor grado, en metástasis óseas por cáncer de mama. Los niveles de BMP7 son altos en el cáncer de próstata que ha hecho metástasis en los huesos, pero no en las metástasis óseas debidas a cáncer de vejiga, piel, hígado o pulmón. El telopéptido carboxi-terminal de tipo I (ICTP) es un entrecruzamiento que se encuentra en el colágeno y que se forma durante la reabsorción del hueso. Dado que el hueso se descompone y reforma constantemente, el ICTP se encontrará en todo el cuerpo. Sin embargo, en el punto de la metástasis ósea, el nivel será significativamente más alto que en un área de hueso normal. Se ha encontrado ICTP en niveles altos en metástasis óseas debido a cáncer de próstata, pulmón y mama. Otro entrecruzamiento de colágeno, el telopéptido N-terminal de tipo I (NTx), se produce junto con ICTP durante el recambio óseo. La cantidad de NTx aumenta en la metástasis ósea causada por muchos tipos diferentes de cáncer, incluidos los de pulmón, próstata y mama. Además, los niveles de NTx aumentan con la progresión de la metástasis ósea. Por lo tanto, este marcador puede usarse tanto para detectar metástasis como para medir la extensión de la enfermedad. Otros marcadores de reabsorción incluyen piridinolina y desoxipiridinolina. Cualquier aumento en los marcadores de reabsorción o marcadores de metástasis óseas indica la necesidad de terapia con un antagonista de ALK7:ActRIIB en un paciente.

Un antagonista de ALK7:ActRIIB (p. ej., un heterodímero ALK7:ActRIIB), o combinaciones de tales antagonistas, de la descripción se pueden administrar conjuntamente con otros agentes farmacéuticos activos para los huesos. La administración conjunta se puede realizar mediante la administración de una única co-formulación, mediante administración simultánea o mediante administración en momentos separados. Los antagonistas de ALK7:ActRIIB pueden ser particularmente ventajosos si se administran con otros agentes activos para los huesos. Un paciente puede beneficiarse de recibir conjuntamente un complejo de antagonista de ALK7:ActRIIB y tomar suplementos de calcio, vitamina D, ejercicio adecuado y/o, en algunos casos, otros medicamentos. Entre los ejemplos de otros medicamentos se incluyen los bisfosfonatos (alendronato, ibandronato y risedronato), calcitonina, estrógenos, hormona paratiroidea y raloxifeno. Los bisfosfonatos (alendronato, ibandronato y risedronato), calcitonina, estrógenos y raloxifeno afectan el ciclo de remodelación ósea y se clasifican como medicamentos antirresortivos. La remodelación ósea consta de dos fases distintas: reabsorción ósea y formación ósea. Los medicamentos antirresortivos retrasan o detienen la parte de reabsorción ósea del ciclo de remodelación ósea, pero no retrasan la parte del ciclo de formación de hueso. Como resultado, la nueva formación continúa a una tasa mayor que la resorción ósea y la densidad ósea puede aumentar con el tiempo. La teriparatida, una forma de hormona paratiroidea, aumenta la tasa de formación ósea en el ciclo de remodelación ósea. El alendronato está aprobado tanto para la prevención (5 mg al día o 35 mg una vez a la semana) como para el tratamiento (10 mg al día o 70 mg una vez a la semana) de la osteoporosis posmenopáusica. El alendronato reduce la pérdida ósea, aumenta la densidad ósea y reduce el riesgo de fracturas de columna, muñeca y cadera. El alendronato también está aprobado para el tratamiento de la osteoporosis inducida por glucocorticoides en hombres y mujeres como resultado del uso prolongado de estos medicamentos (es decir, prednisona y cortisona) y para el tratamiento de la osteoporosis en hombres. El alendronato más vitamina D está aprobado para el tratamiento de la osteoporosis en mujeres posmenopáusicas (70 mg una vez a la semana más vitamina D) y para el tratamiento para mejorar la masa ósea en hombres con osteoporosis. El ibandronato está aprobado para la prevención y el tratamiento de la osteoporosis posmenopáusica. Tomado como una pastilla de una vez al mes (150 mg), el ibandronato debe tomarse el mismo día cada mes. El ibandronato reduce la pérdida ósea, aumenta la densidad ósea y reduce el riesgo de fracturas de columna. El risedronato está aprobado para la prevención y el tratamiento de la osteoporosis posmenopáusica. Tomado diariamente (dosis de 5 mg) o semanalmente (dosis de 35 mg o dosis de 35 mg con calcio), el risedronato ralentiza la pérdida ósea, aumenta la densidad ósea y reduce el riesgo de fracturas de columna y otras fracturas. El risedronato también está aprobado para su uso por hombres y mujeres para prevenir y/o tratar la osteoporosis inducida por glucocorticoides que resulta del uso prolongado de estos medicamentos (es decir, prednisona o cortisona). La calcitonina es una hormona natural involucrada en la regulación del calcio y el metabolismo óseo. En mujeres que han pasado más de 5 años después de la menopausia, la calcitonina retarda la pérdida ósea, aumenta la densidad ósea espinal y puede aliviar el dolor asociado con las fracturas óseas. La calcitonina reduce el riesgo de fracturas de columna. La calcitonina está disponible en forma de inyección (50-100 UI al día) o aerosol nasal (200 UI al día).

Un paciente también puede beneficiarse de recibir conjuntamente un antagonista de ALK7:ActRIIB, o combinaciones de tales antagonistas, y medicamentos activos óseos adicionales. La terapia de estrógenos (TE)/terapia hormonal (TH) está aprobada para la prevención de la osteoporosis. Se ha demostrado que la TE reduce la pérdida ósea, aumenta la densidad ósea tanto en la columna como en la cadera y reduce el riesgo de fracturas de cadera y columna en mujeres posmenopáusicas. La TE se administra con mayor frecuencia en forma de píldora o parche cutáneo que administra una dosis baja de aproximadamente 0,3 mg al día o una dosis estándar de aproximadamente 0,625 mg al día y es eficaz incluso cuando se inicia después de los 70 años. Cuando el estrógeno se toma solo, puede aumentar el riesgo de que una mujer desarrolle cáncer del revestimiento del útero (cáncer de endometrio). Para eliminar este riesgo, los médicos recetan la hormona progestina en combinación con estrógeno (terapia de reemplazo hormonal o TH) para aquellas mujeres que tienen el útero intacto. La TE/TH alivia los síntomas de la menopausia y se ha demostrado que tiene un efecto beneficioso sobre la salud ósea. Los efectos secundarios pueden incluir sangrado vaginal, sensibilidad en los senos, alteraciones del estado de ánimo y colecistopatía. El raloxifeno, 60 mg al día, está aprobado para la prevención y el tratamiento de la osteoporosis posmenopáusica. Es de una clase de medicamentos llamados Moduladores Selectivos del Receptor de Estrógenos (MSRE) que se han desarrollado para proporcionar los efectos beneficiosos de los estrógenos sin sus posibles desventajas. El raloxifeno aumenta la masa ósea y reduce el riesgo de fracturas de columna. Aún no se dispone de datos que demuestren que el raloxifeno puede reducir el riesgo de fracturas de cadera y otras fracturas no de columna. La teriparatida, una forma de hormona paratiroidea, está aprobada para el tratamiento de la osteoporosis en mujeres posmenopáusicas y hombres con alto riesgo de fractura. Este medicamento estimula la formación de hueso nuevo y aumenta significativamente la densidad mineral ósea. En mujeres posmenopáusicas, se observó una reducción de las fracturas en la columna, la cadera, el pie, las costillas y la muñeca. En hombres, se observó una reducción de las fracturas en la columna, pero no hubo datos suficientes para evaluar la reducción de las fracturas en otros puntos. La teriparatida se autoadministra en forma de inyección diaria durante un máximo de 24 meses.

Como se emplea en este documento, “en combinación con”, "combinaciones de" o “administración conjunta” se refiere a cualquier forma de administración de tal manera que las terapias adicionales (p. ej., segunda, tercera, cuarta, etc.) siguen siendo efectivas en el cuerpo (p. ej., múltiples compuestos son efectivos simultáneamente en el paciente, lo que puede incluir efectos sinérgicos de esos compuestos). La eficacia puede no correlacionarse con la concentración mensurable del agente en sangre, suero o plasma. Por ejemplo, los diferentes compuestos terapéuticos se pueden administrar en la misma formulación o en formulaciones independientes, concomitante o secuencialmente, y en diferentes programas. Por tanto, un individuo que recibe tal tratamiento se puede beneficiar de un efecto combinado de diferentes terapias. Se pueden administrar uno o más antagonistas de ALK7:ActRIIB de la descripción simultáneamente con, antes o después de, uno o más de otros agentes adicionales o tratamientos complementarios distintos. En general, cada agente se administrará en una dosis y/o con una programación determinados para ese agente particular. La combinación particular que se va a emplear en una pauta tendrá en cuenta la compatibilidad del antagonista de la presente descripción con la terapia y/o el deseado.

5 Composiciones farmacéuticas

En ciertos aspectos, se pueden administrar antagonistas de ALK7:ActRIIB (p. ej., heteromultímeros ALK7:ActRIIB), o combinaciones de tales antagonistas, de la presente descripción solos o como un componente de una formulación farmacéutica (también denominada composición terapéutica o composición farmacéutica). El término formación farmacéutica se refiere a un preparado que es de tal forma que permite que la actividad biológica de un principio activo (p. ej., un agente de la presente descripción) contenido en el mismo sea efectiva y que no contiene componentes adicionales que sean inaceptablemente tóxico para un sujeto al que se le administraría la formulación. Los compuestos objetivo se pueden formular para administración de cualquier manera conveniente para uso en medicina humana o veterinaria. Por ejemplo, uno o más agentes de la presente descripción se pueden formular con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Un vehículo farmacéuticamente aceptable se refiere a un ingrediente de una formulación farmacéutica, distinto de un principio activo, que generalmente no es tóxico para un sujeto. Un vehículo farmacéuticamente aceptable incluye, pero no se limita a, un tampón, excipiente, estabilizante y/o conservante. En general, las formulaciones farmacéuticas para uso en la presente descripción están en una forma exenta de pirógenos fisiológicamente aceptable cuando se administran a un sujeto. Los agentes terapéuticamente útiles distintos de los descritos en este documento, que se pueden incluir opcionalmente en la formulación como se describió anteriormente, se pueden administrar en combinación con los agentes objetivo en los procedimientos de la presente descripción.

En ciertos aspectos, las composiciones se administrarán por vía parenteral [p. ej., mediante inyección intravenosa (i.v.), inyección intraarterial, inyección intraósea, inyección intramuscular, inyección intratecal, inyección subcutánea o inyección intradérmica]. Las composiciones farmacéuticas adecuadas para administración parenteral pueden comprender uno o más agentes de la descripción en combinación con una o más soluciones, dispersiones, suspensiones o emulsiones acuosas o no acuosas isotónicas y farmacéuticamente aceptables, o con polvos estériles que se pueden reconstituir para proporcionar soluciones o dispersiones inyectables estériles justo antes del uso. Las soluciones o dispersiones inyectables pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos, agentes de suspensión, agentes espesantes o solutos que hacen la formulación isotónica con la sangre del receptor previsto. Los ejemplos de vehículos acuosos y no acuosos adecuados que se pueden emplear en las composiciones farmacéuticas de la descripción incluyen agua, etanol, polioles (p. ej., glicerol, propilenglicol, polietilenglicol, etc.), aceites vegetales (p. ej., aceite de oliva), ésteres orgánicos inyectables (p. ej., oleato de etilo) y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez correcta se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de materiales de revestimiento (p. ej. lecitina), mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de las dispersiones y mediante el uso de tensioactivos.

En ciertos aspectos, un procedimiento terapéutico de la presente descripción incluye la administración de la composición farmacéutica sistémica o localmente a partir de un implante o dispositivo. Además, la composición farmacéutica se puede encapsular o inyectar en una forma para administración a un punto de tejido objetivo (p. ej. médula ósea o músculo). En ciertos aspectos, las composiciones de la presente descripción pueden incluir una matriz capaz de administrar uno o más de los agentes de la presente descripción a un punto de tejido objetivo (p. ej., médula ósea o músculo), proporcionando una estructura para el tejido en desarrollo y óptimamente capaz de ser reabsorbida en el cuerpo. Por ejemplo, la matriz puede proporcionar la liberación lenta de uno o más agentes de la presente descripción. Tales matrices pueden estar formadas por materiales actualmente en uso para otras aplicaciones médicas implantadas.

En algunos aspectos, las composiciones farmacéuticas se administrarán al ojo incluyendo, p. ej., mediante administración tópica, inyección intraocular (p. ej., intravítrea) o mediante implante o dispositivo. Se puede inyectar una inyección intravítrea, por ejemplo, a través de la pars plana, 3 mm a 4 mm por detrás del limbo. Las composiciones farmacéuticas para administración al ojo se pueden formular de diversas formas que incluyen, por ejemplo, colirios, soluciones oftálmicas, suspensiones oftálmicas, emulsiones oftálmicas, inyecciones intravítreas, inyecciones subTenon, implantes oftálmicos bioerosionables e insertos o depósitos oftálmicos no bioerosionables.

La elección del material de la matriz puede estar basada en uno o más de: biocompatibilidad, biodegradabilidad, propiedades mecánicas, aspecto cosmético y propiedades de la interfase. La aplicación particular de las composiciones objetivo definirá la formulación apropiada. Las matrices potenciales para las composiciones pueden ser sulfato de calcio, fosfato tricálcico, hidroxiapatita, ácido poliláctico y polianhídridos biodegradables y químicamente definidos. Otros materiales potenciales son biodegradables y están biológicamente bien definidos, lo que incluye, por ejemplo, el hueso o el colágeno dérmico. Las matrices adicionales están compuestas por proteínas puras o componentes de la matriz extracelular. Otras matrices potenciales no son biodegradables ni están químicamente definidas, lo que incluye, por ejemplo, hidroxiapatita sinterizada, biovidrio, aluminatos u otros materiales cerámicos. Las matrices pueden estar compuestas por combinaciones de cualquiera de los tipos de material mencionados anteriormente, lo que incluye, por ejemplo, ácido poliláctico e hidroxiapatita o colágeno y fosfato tricálcico. Las biocerámicas pueden estar alteradas en cuanto a la composición (p. ej., aluminato-fosfato de calcio) y procesarse para alterar uno o más de tamaño de poro, tamaño de partícula, forma de la partícula y biodegradabilidad.

En ciertos aspectos, las composiciones farmacéuticas de la presente descripción se pueden administrar por vía tópica. "Aplicación tópica" o "por vía tópica" significa el contacto de la composición farmacéutica con superficies corporales que incluyen, por ejemplo, la piel, puntos de heridas y membranas mucosas. Las composiciones farmacéuticas tópicas pueden tener diversas formas de aplicación y típicamente comprenden una capa que contiene fármaco, que está adaptada para colocarse cerca o en contacto directo con el tejido tras la administración por vía tópica de la composición. Las composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración tópica pueden comprender una o más complejos polipeptídicos de receptores de tipo I y/o tipo II de la superfamilia de TGFp de la descripción en combinación formulados como un líquido, un gel, una crema, una loción, una pomada, una espuma, una pasta, una masilla, un semisólido o un sólido. Las composiciones en forma de líquido, gel, crema, loción, pomada, espuma, pasta o masilla se pueden aplicar extendiendo, rociando, untando, frotando o enrollando la composición sobre el tejido diana. Las composiciones también se pueden impregnar en apósitos, parches transdérmicos, tiritas y vendas estériles. Las composiciones de las formas de masilla, semisólidas o sólidas pueden ser deformables. Pueden ser elásticas o no elásticas (p. ej., flexibles o rígidas). En ciertos aspectos, la composición forma parte de un material compuesto y puede incluir fibras, partículas o múltiples capas con la misma o diferentes composiciones.

Las composiciones tópicas en forma líquida pueden incluir soluciones, emulsiones, microemulsiones y suspensiones farmacéuticamente aceptables. Además del uno o más principios activos, las formas farmacéuticas líquidas pueden contener un diluyente inerte usado habitualmente en la técnica, lo que incluye, por ejemplo, agua u otro disolvente, un agente solubilizante y/o emulsionante [p. ej., alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol o 1,3-butilenglicol, un aceite (p. ej., aceite de semilla de algodón, cacahuete, maíz, germen, oliva, ricino y sésamo), glicerol, alcohol tetrahidrofurílico, un polietilenglicol, un éster de ácido graso de sorbitano y mezclas de los mismos].

Las composiciones tópicas de gel, crema, loción, pomada, semisólidas o sólidas pueden incluir uno o más agentes espesantes, tales como un polisacárido, polímero sintético o polímero a base de proteínas. En un aspecto de la descripción, el agente gelificante en este documento es uno que es adecuadamente no tóxico y proporciona la viscosidad deseada. Los agentes espesantes pueden incluir polímeros, copolímeros y monómeros de: vinilpirrolidonas, metacrilamidas, acrilamidas N-vinilimidazoles, carboxivinilos, ésteres vinílicos, éteres vinílicos, siliconas, óxidos de polietileno, polietilenglicoles, alcoholes vinílicos, acrilatos sódicos, acrilacrilatos, ácidos maleicos, NN-dimetilacrilamidas, diacetona acrilamidas, acrilamidas, acriloil morfolina, pluronic, colágenos, poliacrilamidas, poliacrilatos, alcoholes polivinílicos, polivinilenos, silicatos de polivinilo, poliacrilatos sustituidos con un azúcar (p. ej., sacarosa, glucosa, glucosaminas, galactosa, trehalosa, manosa o lactosa), ácidos acilamidopropanosulfónicos, tetrametoxiosilicatos, metiltrimetoxiortosilicatos, tetraalcoxiorosilicatos, trialcoxiorosilicatos, glicoles, propilenglicol, glicerina, polisacáridos, alginatos, dextranos, ciclodextrina, celulosas, celulosas modificadas, celulosas oxidadas,, quitosanos, gomas guar, carragenanos, ácidos hialurónicos, inulina, almidones, almidones modificados, agarosa, metilcelulosas, gomas vegetales, hilaronanos, hidrogeles, gelatinas, glucosaminoglucanos, carboximetilcelulosas, hidroxietilcelulosas, hidroxipropilmetilcelulosas, pectinas, pectinas bajas en metoxi, dextranos reticulados, copolímeros de injerto de almidón-acrilonitrilo, almidón poliacrilato de sodio, hidroxietil metacrilatos, hidroxil etil acrilatos, polivinileno, polietilviniléteres, polimetilmetacrilatos, poliestirenos, poliuretanos, polialcanoatos, ácidos polilácticos, polilactatos, poli(3-hidroxibutirato), hidrogeles sulfonados, AMPS (ácido 2-acrilamido-2-metil--1-propanosulfónico), SEM (metacrilato de sulfoetil), SPM (metacrilato de sulfopropilo), SPA (acrilato de sulfopropilo), N,N-dimetil-N-metacriloxietil-N-(3-sulfopropil)amonio betaína, ácido metacrílico amidopropil-dimetilamonio sulfobetaína, SPI (sal di potásica del éster del ácido itacónico bis(1 -propil ácido sulfónico-3)), ácidos itacónicos, AMBC (ácido 3-acrilamido-3-metilbutanoico), acrilato de beta-carboxietilo (dímeros de ácido acrílico) y polímeros de anhídrido maleicometilviniléter, derivados de los mismos, sales de los mismos, ácidos de los mismos y combinaciones de los mismos.

En ciertos aspectos, las composiciones farmacéuticas de la presente descripción se pueden administrar por vía oral, por ejemplo, en forma de cápsulas, obleas, píldoras, comprimidos, grageas (usando una base saborizada, tal como sucrosa y acacia o tragacanto), polvos, gránulos, una solución o una suspensión en un líquido acuoso o no acuoso, una emulsión líquida de aceite en agua o agua en aceite, un elixir o jarabe, o pastillas (usando una base inerte, tal como gelatina y glicerina o sucrosa y acacia) y/o un enjuague bucal, conteniendo, cada una, una cantidad predeterminada de un compuesto de la presente descripción y opcionalmente uno o más principios activos distintos. Un compuesto de la presente descripción y opcionalmente uno o más principios activos distintos también se pueden administrar como un bolo, un electuario o una pasta.

En las formas farmacéuticas sólidas para administración oral (p. ej., cápsulas, comprimidos, píldoras, grageas, polvos y gránulos), se pueden mezclar uno o más compuestos de la presente descripción con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables que incluyen, por ejemplo, citrato de sodio o fosfato dicálcico, una carga o un extensor (p. ej., un almidón, lactosa, sucrosa, glucosa, manitol y ácido silícico), un aglutinante (p. ej., carboximetilcelulosa, un alginato, gelatina, polivinilpirrolidona, sucrosa y acacia), un humectante (p. ej., glicerol), un agente desintegrante (p. ej., agar-agar, carbonato de calcio, almidón de patata o tapioca, ácido algínico, un silicato y carbonato de sodio), un agente retardante de la solución (p. ej., parafina), un acelerante de la absorción (p. ej., un compuesto de amonio cuaternario) un agente humectante (p. ej., alcohol cetílico y monoestearato de glicerol), un absorbente (p. ej., arcilla de caolín y bentonita), un lubricante (p. ej., un talco, estearato de calcio, estearato de magnesio, polietilenglicoles sólidos, laurilsulfato de sodio), un agente colorante y mezclas de los mismos. En el caso de cápsulas, comprimidos y pastillas, la formulación (composición) farmacéutica (composición) también puede comprender un agente tamponador. Las composiciones sólidas de tipo similar también se pueden emplear como cargas en cápsulas de gelatina duras y blandas usando uno o más excipientes que incluyen, p. ej., lactosa o un glúcido de la leche, así como un polietilenglicol de peso molecular alto.

Las formas farmacéuticas líquidas para administración oral de la composición farmacéutica incluyen emulsiones, microemulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y elixires farmacéuticamente aceptables. Además del uno o más principios activos, las formas farmacéuticas líquidas pueden contener un diluyente inerte usado habitualmente en la técnica, lo que incluye, por ejemplo, agua u otro disolvente, un agente solubilizante y/o emulsionante [p. ej., alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol o 1,3-butilenglicol, un aceite (p. ej., aceite de semilla de algodón, cacahuete, maíz, germen, oliva, ricino y sésamo), glicerol, alcohol tetrahidrofurílico, un polietilenglicol, un éster de ácido graso de sorbitano y mezclas de los mismos]. Además de los diluyentes inertes, la formulación oral también puede incluir un adyuvante, lo que incluye, por ejemplo, un agente humectante, un agente emulsionante y de suspensión, un agente edulcorante, un agente saborizante, un agente colorante, un perfume, un agente conservante y combinaciones de los mismos.

Las suspensiones, además de los compuestos activos, pueden contener agentes de suspensión que incluyen, por ejemplo, alcoholes isoestearílicos etoxilados, polioxietileno sorbitol, un éster de sorbitano, celulosa microcristalina, metahidróxido de aluminio, bentonita, agar-agar, tragacanto y mezclas de los mismos.

La prevención de la acción y/o el crecimiento de microorganismos se puede garantizar mediante la inclusión de diversos agentes antibacterianos y antifúngicos que incluyen, por ejemplo, parabeno, clorobutanol y ácido fenol sórbico.

En ciertos aspectos, puede ser deseable incluir un agente isotónico, lo que incluye, por ejemplo, un glúcido o cloruro de sodio, en las composiciones. Además, la absorción prolongada de una forma farmacéutica inyectable se puede lograr mediante la inclusión de un agente que retarda la absorción, lo que incluye, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Se entiende que la pauta posológica será determinada por el médico responsable del tratamiento considerando diversos factores que modifican la acción del uno o más agentes de la presente descripción. En el caso de antagonistas de ALK7:ActRIIB que favorecen la formación de glóbulos rojos, diversos factores pueden incluir, pero no se limitan a, el recuento de glóbulos rojos del paciente, el nivel de hemoglobina, el recuento de glóbulos rojos objetivo deseado, la edad del paciente, el sexo del paciente, la dieta del paciente, la gravedad de cualquier enfermedad que puede estar contribuyendo a un nivel de glóbulos rojos deprimido, el momento de administración y otros factores clínicos. La adición de otros agentes activos conocidos a la composición final también puede afectar a la dosis. El progreso se puede supervisar mediante la evaluación periódica de uno o más de los niveles de glóbulos rojos, los niveles de hemoglobina, los niveles de reticulocitos y otros indicadores del proceso hematopoyético.

En ciertos aspectos, la presente descripción también proporciona genoterapia para la producción in vivo de uno o más de los agentes de la presente descripción. Tal terapia conseguiría su efecto terapéutico mediante la introducción de las secuencias de agentes en células o tejidos que tienen los trastornos enumerados anteriormente. La administración de las secuencias de agentes se puede conseguir, por ejemplo, usando un vector de expresión recombinante tal como un virus quimérico o un sistema de dispersión coloidal. La administración terapéutica preferida de una o más de las secuencias de agentes de la descripción es el uso de liposomas dirigidos.

Diversos vectores víricos que se pueden utilizar para genoterapia como se enseña en este documento incluyen adenovirus, virus del herpes, vacunas o un virus de ARN (p. ej., un retrovirus). El vector retrovírico puede ser un derivado de un retrovirus murino o aviar. Los ejemplos de vectores retrovíricos en los que se puede insertar un único gen extraño incluyen, pero no se limitan a: virus de la leucemia murina de Moloney (MoMuLV), virus del sarcoma murino de Harvey (HaMuSV), virus del tumor mamario murino (MuMTV) y virus del sarcoma de Rous (RSV). Diversos vectores retrovíricos adicionales pueden incorporar múltiples genes. Todos estos vectores pueden transferir o incorporar un gen para un marcador seleccionable de manera que las células transducidas se puedan identificar y generar. Los vectores retrovíricos se pueden hacer específicos de la diana fijando, por ejemplo, un glúcido, un glucolípido o una proteína. El direccionamiento preferido se logra usando un anticuerpo. Los expertos en la técnica reconocerán que se pueden insertar secuencias de polinucleótidos específicas en el genoma retrovírico o fijar a una envoltura vírica para permitir la administración específica a la diana del vector retrovírico que contiene uno o más de los agentes de la presente descripción.

Alternativamente, se pueden transfectar directamente células de cultivo tisular con plásmidos que codifican genes estructurales retrovíricos (gaga, pol y env) mediante transfección con fosfato de calcio convencional. Estas células se transfectan a continuación con el plásmido vector que contiene los genes de interés. Las células resultantes liberan el vector retrovírico en el medio de cultivo.

Otro sistema de administración dirigida para uno o más de los agentes de la presente descripción es un sistema de dispersión coloidal. Los sistemas de dispersión coloidal incluyen, por ejemplo, complejos de macromoléculas, nanocápsulas, microesferas, esferas y sistemas a base de lípidos que incluyen emulsiones de aceite en agua, micelas, micelas mixtas y liposomas. En ciertos aspectos, el sistema coloidal preferido de esta descripción es un liposoma. Los liposomas son vesículas de membrana artificiales que son útiles como vehículos de administración in vitro e in vivo. El ARN, el ADN y los viriones intactos se pueden encapsular en el interior acuoso y administrar a las células en una forma biológicamente activa [Fraley, y col. (1981) Trends Biochem. Sci., 6:77]. Los procedimientos para la transferencia genética eficiente usando un vehículo liposómico se conocen en la técnica, [Mannino y col. (1988) Biotechniques, 6:682, 1988].

La composición del liposoma normalmente es una combinación de fosfolípidos, que puede incluir un esteroide (p. ej., colesterol). Las características físicas de los liposomas dependen del pH, la fuerza iónica y la presencia de cationes divalentes. También se pueden usar otros fosfolípidos u otros lípidos, que incluyen, por ejemplo, un compuesto de fosfatidilo (p. ej., fosfatidilglicerol, fosfatidilcolina, fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina, esfingolípido, cerebrósido y un gangliósido), fosfatidilcolina de huevo, dipalmitoilfosfatidilcolina y diestearoilfosfatidilcolina. El direccionamiento de liposomas también es posible en base a, por ejemplo, la especificidad por órganos, especificidad por células y especificidad por orgánulos, y se conoce en la técnica.

Aunque se han analizado aspectos específicos de la materia, la memoria descriptiva anterior es ilustrativa y no restrictiva. Muchas variaciones resultarán evidentes para los expertos en la técnica tras la visión general de esta memoria descriptiva y las siguientes reivindicaciones. El alcance total de la descripción deberá determinarse en relación a las reivindicaciones, junto a su alcance completo de equivalentes, y la memoria descriptiva, junto a tales variaciones.

Ejemplificación

La descripción que ahora se describe en general, se entenderá más fácilmente por referencia a los ejemplos siguientes, que se incluyen simplemente con fines ilustrativos de ciertas realizaciones y realizaciones de la presente descripción y no están destinados a limitar la descripción.

Ejemplo 1. Generación de un heterodímero ActRIIB-Fc:ALK7-Fc

Los solicitantes construyeron un complejo heteromérico ActRIIB-Fc:ALK7-Fc que comprende los dominios extracelulares de ActRIIB humana y ALK7 humana, cada uno de los cuales está fusionado a un dominio Fc con un enlazador situado entre el dominio extracelular y el dominio Fc. Las construcciones individuales se denominan ActRIIB-Fc y ALK7-Fc, respectivamente.

Una metodología para promover la formación de complejos heteroméricos ActRIIB-Fc:ALK7-Fc, a diferencia de los complejos homodiméricos ActRIIB-Fc o ALK7-Fc, es introducir alteraciones en la secuencia de aminoácidos de los dominios Fc para guiar la formación de complejos heteroméricos asimétricos. En esta descripción se describen muchas estrategias diferentes para fabricar pares de interacción asimétricos usando dominios Fc.

En una estrategia, ilustrada en las secuencias de polipéptidos de ActRIIB-Fc y ALK7-Fc descritas a continuación, respectivamente, se altera un dominio Fc para introducir aminoácidos catiónicos en la cara de interacción, mientras que el otro dominio Fc se modifica para introducir aminoácidos aniónicos en la cara de interacción. El polipéptido de fusión ActRIIB-Fc y el polipéptido de fusión ALK7-Fc emplean, cada uno, el activador del plasminógeno tisular (TPA) líder:

MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSP (SEQ ID NO: 70).

La secuencia del polipéptido ActRIIB-Fc (SEQ ID NO: 71) se muestra a continuación:

1 MDAMKRGLCC VLLLCGAVFV SPGASGRGEA ETRECIYYNA NWELERTNQS

51 GLERCEGEQD KRLHCYASWR NSSGTIELVK KGCWLDDFNC YDRQECVATE

101 ENPQVYFCCC EGNFCNERFT HLPEAGGPEV TYEPPPTAPT GGGTHTCPPC

151 PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVWDVSHE DPEVKFNWYV

201 DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRWSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP

251 APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRKEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV

301 EWESNGQPEN NYKTTPPVLK SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH

351 EALHNHYTQK SLSLSPGK (SEQ ID NO: 71)

La secuencia líder (señal) y el enlazador están subrayados. Para promover la formación del heterodímero ActRIIB-Fc:ALK7-Fc en lugar de cualquiera de los posibles complejos homodiméricos, se pueden introducir dos sustituciones de aminoácidos (reemplazando los aminoácidos ácidos con lisina) en el dominio Fc de la proteína de fusión ActRIIB como se indica por el doble subrayado anterior. La secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 71 se puede proporcionar opcionalmente con lisina (K) eliminada del extremo carboxiterminal.

Esta proteína de fusión ActRIIB-Fc se codifica por la siguiente secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 72):

1 ATGGATGCAA TGAAGAGAGG GCTCTGCTGT GTGCTGCTGC TGTGTGGAGC

51 AGTCTTCGTT TCGCCCGGCG CCTCTGGGCG TGGGGAGGCT GAGACACGGG

101 AGTGCATCTA CTACAACGCC AACTGGGAGC TGGAGCGCAC CAACCAGAGC

151 GGCCTGGAGC GCTGCGAAGG CGAGCAGGAC AAGCGGCTGC ACTGCTACGC

201 CTCCTGGCGC AACAGCTCTG GCACCATCGA GCTCGTGAAG AAGGGCTGCT

251 GGCTAGATGA CTTCAACTGC TACGATAGGC AGGAGTGTGT GGCCACTGAG

301 GAGAACCCCC AGGTGTACTT CTGCTGCTGT GAAGGCAACT TCTGCAACGA

351 GCGCTTCACT CATTTGCCAG AGGCTGGGGG CCCGGAAGTC ACGTACGAGC

401 CACCCCCGAC AGCCCCCACC GGTGGTGGAA CTCACACATG CCCACCGTGC

451 CCAGCACCTG AACTCCTGGG GGGACCGTCA GTCTTCCTCT TCCCCCCAAA

501 ACCCAAGGAC ACCCTCATGA TCTCCCGGAC CCCTGAGGTC ACATGCGTGG

551 TGGTGGACGT GAGCCACGAA GACCCTGAGG TCAAGTTCAA CTGGTACGTG

601 GACGGCGTGG AGGTGCATAA TGCCAAGACA AAGCCGCGGG AGGAGCAGTA

651 CAACAGCACG TACCGTGTGG TCAGCGTCCT CACCGTCCTG CACCAGGACT

701 GGCTGAATGG CAAGGAGTAC AAGTGCAAGG TCTCCAACAA AGCCCTCCCA

751 GCCCCCATCG AGAAAACCAT CTCCAAAGCC AAAGGGCAGC CCCGAGAACC

801 ACAGGTGTAC ACCCTGCCCC CATCCCGGAA GGAGATGACC AAGAACCAGG

851 TCAGCCTGAC CTGCCTGGTC AAAGGCTTCT ATCCCAGCGA CATCGCCGTG

901 GAGTGGGAGA GCAATGGGCA GCCGGAGAAC AACTACAAGA CCACGCCTCC

951 CGTGCTGAAG TCCGACGGCT CCTTCTTCCT CTATAGCAAG CTCACCGTGG

1001 ACAAGAGCAG GTGGCAGCAG GGGAACGTCT TCTCATGCTC CGTGATGCAT

1051 GAGGCTCTGC ACAACCACTA CACGCAGAAG AGCCTCTCCC TGTCTCCGGG

1101 TAAA (SEQ ID NO: 72)

El polipéptido de fusión ActRIIB-Fc maduro (SEQ ID NO: 73) es el siguiente, y opcionalmente se puede proporcionar con lisina eliminada del extremo carboxiterminal.

1 GRGEAETREC IYYNANWELE RTNQSGLERC EGEQDKRLHC YASWRNSSGT

51 IELVKKGCWL DDFNCYDRQE CVATEENPQV YFCCCEGNFC NERFTHLPEA

101 GGPEVTYEPP PTAPTGGGTH TCPPCPAPEL LGGPSVFLFP PKPKDTLMIS

151 RTPEVTCWV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRWS

201 VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPS

251 RKEMTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLKSDGSF

301 FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PGK

(SEQ ID NO: 73)

La forma complementaria de la proteína de fusión ALK7-Fc (SEQ ID NO: 74) es la siguiente:

1 MDAMKRGLCC VLLLCGAVFVSPGAGLKCVC LLCDSSNFTC QTEGACWASV 51 MLTNGKEQVI KSCVSLPELN AQVFCHSSNN VTKTECCFTD FCNNITLHLP 101 TASPNAPKLG PMETGGGTHTCPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR 151 TPEVTCWVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRVVSV

201 LTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKT

ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR 251 EEMTKNQVSL TCLVKGFYPSDIAVEWESNG

QPENNYDTTP PVLDSDGSFF

301 LYSgLTVDKS RWQQGNVFSCSVMHEALHNH

YTQKSLSLSP G

(SEQ IDNO: 74)

La secuencia señal y la secuencia del enlazador están subrayadas. Para promover la formación del heterodímero ActRIIB-Fc:ALK7-Fc en lugar de cualquiera de los posibles complejos homodiméricos, se pueden introducir dos sustituciones de aminoácidos (reemplazando las lisinas con ácidos aspárticos) en el dominio Fc de la proteína de fusión como se indica por el doble subrayado anterior. La secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 74 se puede proporcionar opcionalmente con una lisina añadida en el extremo carboxiterminal.

Esta proteína de fusión ALK7-Fc se codifica por la siguiente secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 75):

1 ATGGATGCAA TGAAGAGAGG GCTCTGCTGT GTGCTGCTGC TGTGTGGAGC

51 AGTCTTCGTT TCGCCCGGCG CCGGACTGAA GTGTGTATGT CTTTTGTGTG

101 ATTCTTCAAA CTTTACCTGC CAAACAGAAG GAGCATGTTG GGCATCAGTC

151 ATGCTAACCA ATGGAAAAGA GCAGGTGATC AAATCCTGTG TCTCCCTTCC

201 AGAACTGAAT GCTCAAGTCT TCTGTCATAG TTCCAACAAT GTTACCAAAA

251 CCGAATGCTG CTTCACAGAT TTTTGCAACA ACATAACACT GCACCTTCCA

301 ACAGCATCAC CAAATGCCCC AAAACTTGGA CCCATGGAGA CCGGTGGTGG

351 AACTCACACA TGCCCACCGT GCCCAGCACC TGAACTCCTG GGGGGACCGT

401 CAGTCTTCCT CTTCCCCCCA AAACCCAAGG ACACCCTCAT GATCTCCCGG

451 ACCCCTGAGG TCACATGCGT GGTGGTGGAC GTGAGCCACG AAGACCCTGA

501 GGTCAAGTTC AACTGGTACG TGGACGGCGT GGAGGTGCAT AATGCCAAGA

551 CAAAGCCGCG GGAGGAGCAG TACAACAGCA CGTACCGTGT GGTCAGCGTC

601 CTCACCGTCC TGCACCAGGA CTGGCTGAAT GGCAAGGAGT ACAAGTGCAA

651 GGTCTCCAAC AAAGCCCTCC CAGCCCCCAT CGAGAAAACC ATCTCCAAAG

701 CCAAAGGGCA GCCCCGAGAA CCACAGGTGT ACACCCTGCC CCCATCCCGG

751 GAGGAGATGA CCAAGAACCA GGTCAGCCTG ACCTGCCTGG TCAAAGGCTT

801 CTATCCCAGC GACATCGCCG TGGAGTGGGA GAGCAATGGG CAGCCGGAGA

851 ACAACTACGA CACCACGCCT CCCGTGCTGG ACTCCGACGG CTCCTTCTTC

901 CTCTATAGCG ACCTCACCGT GGACAAGAGC AGGTGGCAGC AGGGGAACGT

951 CTTCTCATGC TCCGTGATGC ATGAGGCTCT GCACAACCAC TACACGCAGA

1001 AGAGCCTCTC CCTGTCTCCG GGT (SEQ ID NO: 75)

Se espera que la secuencia de la proteína de fusión ALK7-Fc madura (SEQ ID NO: 76) sea la siguiente y se puede proporcionar opcionalmente con una lisina añadida en el extremo carboxiterminal.

1 GLKCVCLLCD SSNFTCQTEG ACWASVMLTN GKEQVIKSCV SLPELNAQVF

51 CHSSNNVTKT ECCFTDFCNN ITLHLPTASP NAPKLGPMET GGGTHTCPPC

101 PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVWDVSHE DPEVKFNWYV

151 DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP

201 APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSREEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV

251 EWESNGQPEN NYDTTPPVLD SDGSFFLYSD LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH

301 EALHNHYTQK SLSLSPG (SEQ ID NO: 76)

Las proteínas de fusión ActRIIB-Fc y ALK7-Fc de SEQ ID NO: 71 y SEQ ID NO: 74, respectivamente, pueden coexpresarse y purificarse a partir de una estirpe celular de CHO para dar lugar a un complejo heteromérico que comprendeActRIIB-Fc:ALK7-Fc.

En otra estrategia para promover la formación de complejos de heteromultímeros usando proteínas de fusión Fc asimétricas, los dominios Fc se alteran para introducir interacciones hidrófobas complementarias y un enlace disulfuro intermolecular adicional como se ilustra en las secuencias de polipéptidos ActRIIB-Fc y ALK7-Fc que se describen a continuación.

La secuencia del polipéptido ActRIIB-Fc (SEQ ID NO: 77) se muestra a continuación:

1 MDAMKRGLCC VLLLCGAVFV SPGASGRGEA ETRECIYYNA NWELERTNQS

51 GLERCEGEQD KRLHCYASWR NSSGTIELVK KGCWLDDFNC YDRQECVATE

101 ENPQVYFCCC EGNFCNERFT HLPEAGGPEV TYEPPPTAPT GGGTHTCPPC

151 PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVWDVSHE DPEVKFNWYV

201 DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRWSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP

251 APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSREEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV

301 EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH

351 EALHNHYTQK SLSLSPGK (SEQ ID NO:77)

La secuencia líder y el enlazador están subrayados. Para promover la formación del heterodímero ActRIIB-Fc:ALK7-Fc en lugar de cualquiera de los posibles complejos homodiméricos, se pueden introducir dos sustituciones de aminoácidos (reemplazando una serina con una cisteína y una treonina con un triptófano) en el dominio Fc de la proteína de fusión como se indica por el doble subrayado anterior. La secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 77 se puede proporcionar opcionalmente con lisina eliminada del extremo carboxiterminal.

El polipéptido de fusión ActRIIB-Fc maduro (SEQ ID NO: 78) es el siguiente, y opcionalmente se puede proporcionar con lisina eliminada del extremo carboxiterminal.

1 GRGEAETREC IYYNANWELE RTNQSGLERC EGEQDKRLHC YASWRNSSGT

51 IELVKKGCWL DDFNCYDRQE CVATEENPQV YFCCCEGNFC NERFTHLPEA

101 GGPEVTYEPP PTAPTGGGTH TCPPCPAPEL LGGPSVFLFP PKPKDTLMIS

151 RTPEVTCVW DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRWS

201 VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPC

251 REEMTKNQVS LWCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF

301 FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PGK

(SEQ ID NO: 78)

La forma complementaria del polipéptido de fusión ALK7-Fc (SEQ ID NO: 79) es la siguiente:

1 MDAMKRGLCC VLLLCGAVFV SPGAGLKCVC LLCDSSNFTC QTEGACWASV

51 MLTNGKEQVI KSCVSLPELN AQVFCHSSNN VTKTECCFTD FCNNITLHLP

101 TASPNAPKLG PMETGGGTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR

151 TPEVTCWVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRVVSV

201 LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVQTLPPSR

251 EEMTKNQVSL SCAVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF

301 LVSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK

(SEQ ID NO: 79)

La secuencia líder y la secuencia del enlazador están subrayadas. Para guiar la formación de heterodímeros con el polipéptido de fusión ActRIIB-Fc de las SEQ ID NO 76 y 78 anteriores, se pueden introducir cuatro sustituciones de aminoácidos en el dominio Fc del polipéptido de fusión ALK7 como se indica mediante doble subrayado anterior. La secuencia de aminoácidos de la SEQ iD NO: 79 se puede proporcionar opcionalmente con la lisina eliminada del extremo carboxiterminal.

Se espera que la secuencia de la proteína de fusión ALK7-Fc madura (SEQ ID NO: 80) sea la siguiente y se puede proporcionar opcionalmente con la lisina eliminada del extremo carboxiterminal.

1 GLKCVCLLCD SSNFTCQTEG ACWASVMLTN GKEQVIKSCV SLPELNAQVF

51 CHSSNNVTKT ECCFTDFCNN ITLHLPTASP NAPKLGPMET GGGTHTCPPC

101 PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVWDVSHE DPEVKFNWYV

151 DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRWSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP

201 APIEKTISKA KGQPREPQVC TLPPSREEMT KNQVSLSCAV KGFYPSDIAV

251 EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLVSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH

301 EALHNHYTQK SLSLSPGK (SEQ ID NO: 80)

Las proteínas ActRIIB-Fc y ALK7-Fc de SEQ ID NO: 77 y SEQ ID NO: 79, respectivamente, pueden coexpresarse y purificarse a partir de una estirpe celular de CHO, para dar lugar a un complejo heteromérico que comprende ActRIIB-Fc:ALK7-Fc.

La purificación diversos complejos ActRIIB-Fc:ALK7-Fc se podría conseguir mediante una serie de etapas de cromatografía en columna, que incluyen, por ejemplo, tres o más de las siguientes, en cualquier orden: cromatografía en columna de proteína A, cromatografía en columna de Q Sepharose, cromatografía en columna de fenilsefarosa, cromatografía de exclusión molecular y cromatografía de intercambio catiónico. La purificación se podría completar con filtración vírica e intercambio de tampón.

Ejemplo 2. Perfil de unión al ligando de heterodímero ActRIIB-Fc:ALK7-Fc en comparación con el homodímero de ActRIIB-Fc y el homodímero de ALK7-Fc

Se usó un ensayo de unión basado en Biacore™ para comparar la selectividad de unión al ligando del complejo heterodimérico ActRIIB-Fc:ALK7-Fc descrito anteriormente con la de los complejos homodiméricos ActRIIB-Fc y ALK7-Fc. El El heterodímero ActRIIB-Fc:ALK7-Fc, el homodímero de ActRIIB-Fc y el homodímero de ALK7-Fc se capturaron independientemente en el sistema usando un anticuerpo anti-Fc. Los ligandos se inyectaron y se dejaron fluir sobre la proteína de receptor capturada. Los resultados se resumen en la tabla siguiente, en la que las constantes de disociación de ligandos (kd) más indicativas de trampas de ligandos eficaces se indican mediante sombreado gris.

Estos datos de unión comparativos demuestran que el heterodímero ActRIIB-Fc:ALK7-Fc tiene un perfil/selectividad de unión alterada con respecto al homodímero de ActRIIB-Fc o al homodímero de ALK7-Fc. Curiosamente, cuatro de los cinco ligandos con la unión más fuerte al homodímero de ActRIIB-Fc (activina A, BMP10, GDF8 y GDF11) presentan unión reducida al heterodímero ActRIIB-Fc:ALK7-Fc, siendo la excepción la activina B que conserva una unión estrecha al heterodímero. De manera similar, tres de los cuatro ligandos con unión intermedia al homodímero de ActRIIB-Fc (GDF3, BMP6 y particularmente BMP9) presentan una unión reducida al heterodímero ActRIIB-Fc:ALK7-Fc, mientras que la unión a activina AC aumenta para convertirse en la segunda interacción de ligando más fuerte con el heterodímero en general. Finalmente, la activina C y BMP5 se unen inesperadamente al heterodímero ActRIIB-Fc:ALK7 con fuerza intermedia a pesar de que no hay unión (activina C) o unión débil (BMP5) al homodímero de ActRIIB-Fc. El resultado neto es que el heterodímero ActRIIB-Fc:ALK7-Fc posee un perfil de unión a ligando claramente diferente del del homodímero de ActRIIB-Fc o del homodímero de ALK7-Fc, que no se une a ninguno de los ligandos anteriores. Véase la figura 6.

Estos resultados demuestran, por lo tanto, que el heterodímero ActRIIB-Fc:ALK7-Fc es un antagonista más selectivo de la activina B y la activina AC en comparación con el homodímero de ActRIIB-Fc. Además, el heterodímero ActRIIB-Fc:ALK7-Fc presenta la propiedad inusual de unión robusta a activina C. En consecuencia, un heterodímero ActRIIB-Fc:ALK7-Fc será más útil que un homodímero de ActRIIB-Fc en ciertas aplicaciones en las que tal antagonismo selectivo es ventajoso. Los ejemplos incluyen aplicaciones terapéuticas en las que es deseable conservar el antagonismo de activina B o activina AC pero disminuir el antagonismo de uno o más de activina A, GDF3, GDF8, GDF11, BMP9 o BMP10. También se incluyen aplicaciones terapéuticas, de diagnóstico o analíticas en las que es deseable antagonizar la activina C o, basándose en la similitud entre la activina C y la activina E, la activina E.

Ejemplo 3. El tratamiento con el heteromultímero ALK7:ActRIIB suprime la fibrosis e inflamación renal y reduce la lesión renal.

Los efectos del heterodímero ALK7-Fc:ActRIIB-Fc descrito en el ejemplo 2 sobre la enfermedad renal se evaluaron en un modelo de obstrucción ureteral unilateral en ratón. Véase, por ejemplo, Klahr y Morrissey (2002) Am J Physiol Renal Physiol 283: F861-F875.

Veinticuatro ratones C57BL/6 machos de 12 semanas de edad se sometieron a ligadura ureteral unilateral izquierda dos veces al nivel del polo inferior del riñón. Después de 3 días, se sacrificaron ocho ratones y se recogieron riñones de animales individuales para evaluar la lesión renal. Los ratones restantes se asignaron al azar en dos grupos: i) ocho ratones fueron inyectados por vía subcutánea con el heterodímero ALK7-Fc:ActRIIB-Fc a una dosis de 10mg/kg el día 3, el día 7, el día 10 y el día 14 después de la cirugía y ii) ocho ratones fueron inyectados por vía subcutánea con control de vehículo, solución salina tamponada con fosfato (PBS), el día 3, el día 7, el día 10 y el día 14 después de la cirugía. Ambos grupos se sacrificaron el día 17 de acuerdo con las Pautas de Cuidado Animal relevantes. Se recogieron la mitad de riñones de animales individuales para análisis histológico (H&E y tinción tricrómica de Masson), tanto del riñón con OUU como del riñón contralateral, y se usaron 1/4 de riñón para la extracción de ARN (RNeasy Midi Kit, Qiagen, IL).

análisis de expresión génica en muestras de riñón con OUU para evaluar los niveles de diversos genes. Se realizó QRT-PCR en un sistema de detección por PCR en tiempo real CFX Connect™ (Bio-Rad, CA) para evaluar la expresión de diversos genes fibróticos (Colla1, Col3a1, Fibronectina, PAI-1, CTGF y a-SMA), genes inflamatorios (Tnfa y MCP1), citocinas (TGFpl, TGFp2, TGFp3 y activina A), genes de lesión renal (NGAL), factor 1 -alfa inducible por hipoxia (HIF1a) y receptor de activina A (ActRIIA). Véase la figura 13. El tratamiento de ratones con el heterodímero ALK7-Fc:ActRIIB-Fc suprimió significativamente la expresión de genes fibróticos e inflamatorios, inhibió la regulación positiva de TGFp 1/2/3, activina A y ActRIIa y redujo la lesión renal. Los datos histológicos confirmaron que el tratamiento con el heterodímero ALK7-Fc:ActRIIB-Fc inhibió significativamente la fibrosis renal y redujo la lesión renal en el modelo de OUU.

Juntos, estos datos demuestran que el tratamiento con el heteromultímero ALK7:ActRIIB suprime la fibrosis e inflamación renal y reduce la lesión renal. Además, estos datos indican que otros antagonistas de ALK7:ActRIIB pueden ser útiles en el tratamiento o prevención de la enfermedad renal, incluidos, por ejemplo, antagonistas de ALK7. y/o ligandos de unión a ActRIIB (p. ej., anticuerpos de ligando y otras trampas de ligando tales como folistatina, Cerberus y Lefty), antagonistas de receptores ALK7 y/o ActRIIB, antagonistas de mediadores de transducción de señales aguas abajo de ALK7 y/o ActRIIB (p. ej., Smad) y antagonistas de los correceptores de la superfamilia de TGFp (p. ej., antagonistas de Crypto o Cryptic).

Ejemplo 4. El heteromultímero ALK7:ActRIIB aumenta la lipólisis en los adipocitos.

La lipólisis es la hidrólisis de los triglicéridos dentro de la célula en glicerol y ácidos grasos libres. El glicerol y los ácidos grasos libres se liberan luego al torrente sanguíneo o al medio de cultivo. Si bien la lipólisis ocurre esencialmente en todas las células, es más abundante en los adipocitos blancos y marrones. Se cree que la transducción de señales de ALK7 suprime la lipólisis y, en consecuencia, conduce a la acumulación de grasa en los adipocitos y el tejido adiposo. En consecuencia, se evaluaron los efectos del heterodímero ALK7-Fc:ActRIIB-Fc descrito en el ejemplo 2 sobre lipólisis en adipocitos.

Específicamente, las células 3T3-L1 (suministradas por ATCC; ATCC® CL-173™) se cultivaron en Medio Eagle modificado de Dulbecco (ATCC; ATc C® 30-2002™) que contenía suero bovino al 10 % (Life Technologies; 16170 060) hasta llegar a la confluencia. Para inducir la diferenciación, a los 2 días después de la confluencia, el medio se reemplazó por medio Eagle modificado de Dulbecco fresco (ATCC; ATCC® 30-2002™) que contenía suero fetal bovino al 10 % (Life Technologies; 10082147), dexametasona (Sigma, D8893), IBMX (Sigma, 17018) e insulina (Sigma, 10516) durante 2 semanas. Se usó la acumulación de gotitas de lípidos en las células, determinada por microscopía, para confirmar una diferenciación completa en células adipocitarias maduras. Los adipocitos se trataron durante la noche con vehículo (PBS), activina B (50 ng/ml) o se trataron conjuntamente con activina B (50 ng/ml) y heterodímero ALK7-Fc:ActRIIB-Fc (5 pg/ml). Las células se lavaron dos veces con PBS y se incubaron con tampón de ensayo de lipólisis (suministrado por Abcam; ab185433). Se recogió el tampón de ensayo de lipólisis después de 3 horas y se midieron los niveles de glicerol de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Abcam; ab185433). Se determinó que el heterodímero ALK7-Fc:ActRIIB-Fc aumentó significativamente la actividad de lipólisis en un 44,36 % en este ensayo basado en células.

Por consiguiente, estos datos demuestran que el heterodímero ALK7-Fc:ActRIIB-Fc se puede usar para antagonizar la supresión de la lipólisis mediada por ALK7 y, por tanto, aumentar la descomposición de los ácidos grasos en los adipocitos. Además, estos datos indican que los heterodímeros ALK7-Fc:ActRIIB-Fc, así como otros antagonistas de ALK7:ActRIIB, tales como los descritos en este documento, pueden usarse para tratar un abanico de trastornos o afecciones asociadas con una baja actividad de lipólisis y/o acumulación excesiva de ácidos grasos en las células, particularmente adipocitos, que incluyen, por ejemplo, obesidad, diabetes, resistencia a la insulina; síndrome metabólico, enfermedad del hígado graso y otras enfermedades o afecciones metabólicas, particularmente las asociadas con niveles excesivos de grasa.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un heteromultímero recombinante soluble que comprende un polipéptido de ALK7 y un polipéptido de ActRIIB, donde el polipéptido de ALK7 comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 85 % idéntica a los aminoácidos 28-92 de la SEQ ID NO: 9, y donde el polipéptido de ActRIIB comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 85 % idéntica a los aminoácidos 29-109 de la SEQ ID NO: 1, donde el polipéptido de ALK7 es una proteína de fusión que comprende además un dominio heterólogo, donde el polipéptido de ActRIIB es una proteína de fusión que comprende además un dominio heterólogo, y donde el heteromultímero se une a uno o más de activina A, activina B y GDF11.

2. El heteromultímero de la reivindicación 1, donde el polipéptido de ALK7 comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 100 % idéntica a un polipéptido que:

a. comienza en uno cualquiera de los aminoácidos 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 o 28 de la SEQ ID NO: 9, y b. termina en uno cualquiera de los aminoácidos 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112 o 113 de la SEQ ID NO: 9.

3. El heteromultímero de la reivindicación 1 o 2, donde el polipéptido de ActRIIB comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a un polipéptido que:

a. comienza en uno cualquiera de los aminoácidos 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 o 29 de la SEQ ID NO: 1, y b. termina en uno cualquiera de los aminoácidos 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133 o 134 de la SEQ ID NO: 1.

4. El heteromultímero de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde el dominio heterólogo comprende un dominio Fc de inmunoglobulina.

5. El heteromultímero de la reivindicación 4, donde el dominio Fc de inmunoglobulina comprende una o más modificaciones de aminoácidos que promueven la formación de heterodímeros y/o que inhiben la formación de homodímeros.

6. El heteromultímero de la reivindicación 4 o 5, donde el dominio heterólogo comprende un dominio Fc de inmunoglobulina de una inmunoglobulina IgG.

7. El heteromultímero de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde la proteína de fusión comprende además un dominio de enlazador situado entre el dominio de ALK7 y el dominio heterólogo.

8. El heteromultímero de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, donde el polipéptido de ALK7 comprende uno o más residuos de aminoácidos modificados seleccionados de entre el grupo que consiste en: un aminoácido glucosilado, un aminoácido PEGilado, un aminoácido farnesilado, un aminoácido acetilado, un aminoácido biotinilado, un aminoácido conjugado a un resto lipídico y un aminoácido conjugado a un agente de derivatización orgánico.

9. El heteromultímero de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, donde el heteromultímero se une a activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina AE, activina BC, activina BE, GDF8, GDF11, nodal, BMP5, BMP6, GDF3 y/o BMP10.

10. El heteromultímero de cualquiera de las reivindicaciones 1 -9, donde el heteromultímero inhibe la transducción de señales de activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina AE, activina BC, activina BE, GDF8, GDF11, nodal, BMP5, BMP6, GDF3 y/o BMP10 en un ensayo basado en células.

11. El heteromultímero de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, donde el heteromultímero es un heterodímero ALK7:ActRIIB.

12. El heteromultímero de cualquiera de las reivindicaciones 1-11, donde el heteromultímero se une a activina B.

13. Una preparación farmacéutica que comprende el heteromultímero de cualquiera de las reivindicaciones 1-12.

14. La preparación farmacéutica de la reivindicación 13, donde la preparación farmacéutica está sustancialmente libre de pirógenos y/o comprende además un agente activo adicional.

15. La preparación farmacéutica de la reivindicación 13 o la reivindicación 14, donde la preparación farmacéutica comprende menos de aproximadamente un 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, o menos de aproximadamente un 1 % de homomultímeros de ALK7 y/o menos de aproximadamente un 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, o menos de aproximadamente un 1 % de homomultímeros de ActRIIB.