EA018868B1 - Варианты, происходящие из actriib, и их применение - Google Patents

Варианты, происходящие из actriib, и их применение Download PDF

Info

Publication number
EA018868B1
EA018868B1 EA200970729A EA200970729A EA018868B1 EA 018868 B1 EA018868 B1 EA 018868B1 EA 200970729 A EA200970729 A EA 200970729A EA 200970729 A EA200970729 A EA 200970729A EA 018868 B1 EA018868 B1 EA 018868B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
protein
amino acid
variant
mice
muscle
Prior art date
Application number
EA200970729A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200970729A1 (ru
Inventor
Джон НОПФ
Равиндра КУМАР
Джасбир СИХРА
Original Assignee
Акселерон Фарма Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Акселерон Фарма Инк. filed Critical Акселерон Фарма Инк.
Publication of EA200970729A1 publication Critical patent/EA200970729A1/ru
Publication of EA018868B1 publication Critical patent/EA018868B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/08—Drugs for disorders of the urinary system of the prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/02—Muscle relaxants, e.g. for tetanus or cramps
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/72—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/01—Preparation of mutants without inserting foreign genetic material therein; Screening processes therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/64—General methods for preparing the vector, for introducing it into the cell or for selecting the vector-containing host
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)

Abstract

В некоторых своих аспектах настоящее изобретение относится к композициям и к способам, применяемым для модуляции (стимуляции или ингибирования) роста ткани, такой как костная ткань, хрящевая ткань, мышечная ткань, жировая ткань и/или нервная ткань. Настоящее изобретение также относится к способам скрининга соединений, модулирующих активность белка ActRIIB и/или лиганда ActRIIB. Описанные здесь композиции и способы могут быть применены для лечения заболеваний, ассоциированных с аномальной активностью белка ActRIIB и/или лиганда ActRIIB.

Description

Перекрестная ссылка на родственные заявки
В настоящей заявке испрашивается преимущество предварительной заявки рег. № 60/899304, поданной 2 февраля 2007 г.; предварительной заявки рег. № 60/927088, поданной 1 мая 2007 г.; и предварительной заявки рег. № 60/931880, поданной 25 мая 2007 г. Все описания вышеуказанных заявок вводятся в настоящее описание посредством ссылки.
Предшествующий уровень техники
Суперсемейство трансформирующего фактора роста-бета (ТСР-бета) содержит ряд факторов роста, которые имеют общие элементы и структурные мотивы последовательностей. Известно, что эти белки оказывают биологическое действие на клетки широкого ряда позвоночных и беспозвоночных различных типов. Члены этого суперсемейства белков играют важную роль в образовании структуры и формировании ткани в процессе эмбрионального развития и могут оказывать влияние на различные процессы дифференцировки, включая адипогенез, миогенез, хондрогенез, кардиогенез, гемопоэз, нейрогенез и дифференцировку эпителиальных клеток. Это семейство подразделяется на две основных ветви: ВМР/СЭР и ТСР-бета/активин/ВМР10, члены которых обладают различными, а часто дополнительными функциями. При изменении активности члена семейства ТСР-бета в организме часто могут происходить значительные физиологические изменения. Так, например, у крупного рогатого скота пьемонтской породы и породы бельгийская голубая имеется мутация в гене СИР8 (также называемом миостатином), приводящая к потере его функции, что вызывает значительное увеличение мышечной массы. СгоЬе! с1 а1., №11 Сепе!. 1997, 17(1):71-4. Кроме того, у человека неактивные аллели СИР8 ассоциируются с увеличением мышечной массы, и, как сообщалось, с исключительно высокой мышечной силой. 8с1ше1ке е! а1., N. Епд1. 1. Мей. 2004, 350:2682-8.
Изменения в мышцах, костях, хрящах и в других тканях могут быть достигнуты путем активации или подавления передачи сигнала, опосредуемого соответствующим членом семейства ТСР-бета. А поэтому в настоящее время необходимо разработать средства, которые будут служить сильными регуляторами передачи сигнала ТСР-бета.
Описание сущности изобретения
В некоторых своих аспектах настоящее изобретение относится к полипептидам ЛсЖИВ, в частности к вариантам Ас®ЛВ, включая амино- и карбоксиконцевые усечения и альтерации последовательностей. Такие полипептиды Ас®ЛВ могут быть использованы для лечения различных расстройств или состояний, в частности мышечных и нейромышечных расстройств (например, мышечной дистрофии, амиотрофического бокового склероза (АБС) и атрофии мышц); расстройств, ассоциированных с отложением жира в ткани (например, ожирения); метаболических расстройств (например, диабета типа 2); нейродегенеративных расстройств и гипотрофии мышц, ассоциированной со старением (саркопении); рака предстательной железы и кахексии при раке. В конкретных вариантах изобретения полипептиды Ас®ЛВ (например, растворимые полипептиды Ас®ПВ) могут служить антагонистами рецептора АсШПВ в любом процессе, ассоциированном с активностью Ас®ПВ. Могут быть сконструированы, но необязательно, полипептиды Ас®ЛВ согласно изобретению, которые будут преимущественно антагонистами одного или нескольких лигандов рецепторов Ас®ЛВ, таких как СИР8 (также называемый миостатином), СЭР11. активин А, активин В, активин АВ, №йа1 и ВМР7 (также называемый ОР-1), а поэтому могут быть использованы для лечения других расстройств. Примерами полипептидов АсЖПВ являются природные полипептиды АсЖЛВ, а также их функциональные варианты. Настоящее изобретение также относится к ряду вариантов, происходящих от Ас®ЛВ, которые вызывают значительное снижение аффинности к активину, но при этом сохраняют способность связываться с СЭР11. Такие варианты оказывают желаемое воздействие на мышцы, но оказывают более слабое воздействие на другие ткани.
В некоторых своих аспектах настоящее изобретение относится к фармацевтическим препаратам, включающим растворимый полипептид Ас®ЛВ, который связывается с лигандом АсЖПВ, таким как СЭР8, СЭР11, активин, ВМР7 или №йа1, и фармацевтически приемлемый носитель. Растворимый полипептид Ас®ЛВ связывается, но необязательно, с лигандом Ас®ПВ с Кй, составляющим менее чем 10 мкмоль или менее чем 1 мкмоль, 100, 10 или 1 нмоль. Растворимый полипептид Ас®ЛВ ингибирует, но необязательно, передачу сигнала Ас®ЛВ, такую как передача внутриклеточного сигнала, запускаемая лигандом Ас®ЛВ. Растворимый полипептид Ас®ПВ, который может быть использован в таком препарате, может представлять собой любой из полипептидов, описанных в настоящей заявке, такой как полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из 8ЕС ГО №: 1, 2, 5, 6 и 12, или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 97 или 99% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из 8ЕС ГО №: 1, 2, 5, 6 и 12. Растворимый полипептид Ас®ЛВ может включать функциональный фрагмент природного полипептида Ас®ПВ, например, фрагмент, содержащий по меньшей мере 10, 20 или 30 аминокислот последовательности, выбранной из 8ЕС ГО №: 1, 2, 5, 6 и 12 или последовательности 8ЕС ГО N0:1, в которой отсутствуют 1, 2, 3, 4, 5 или 10-15 С-концевых аминокислот и 1, 2, 3, 4 или 5 Ν-концевых аминокислот. Предпочтительный полипептид, в отличие из 8Е0 ГО N0:1, может иметь усечение в 2-5 аминокислот у Ν-конца и не более, чем в 3 аминокислоты у С-конца. Другим предпочтительным полипептидом является полипептид, представленный в 8ЕС ГО N0:12. Растворимый полипептид АсЖПВ, в отличие от природного полипептида Ас®ЛВ, может
- 1 018868 включать одну или несколько модификаций в аминокислотной последовательности (например, в лигандсвязывающем домене). Модификация в аминокислотной последовательности, в отличие от природного полипептида АсШПВ. может вызывать, например, изменение характера гликозилирования полипептида, продуцируемого у млекопитающих, насекомых или в других эукариотических клетках, или изменение уровня протеолитического расщепления полипептида. Растворимым полипептидом Ас1КИВ может быть слитый белок, который в качестве одного домена имеет полипептид Ас1КЛВ (например, лигандсвязывающий домен АсШПВ или его вариант) и один или несколько дополнительных доменов, которые сообщают нужные свойства, такие как улучшенные фармакокинетические свойства, способность к более легкой очистке, способность к нацеливанию на конкретные ткани и т.п. Так, например, домен слитого белка может усиливать одно или несколько свойств, таких как ίη νίνο стабильность, время полужизни ίη νίνο, способность к поглощению/внедрению, локализация или распределение в ткани, образование белковых комплексов, мультимеризация слитого белка, и/или очистка. Растворимый слитый белок АсШПВ может включать Ес-домен иммуноглобулина (дикого типа или мутантный) или сывороточный альбумин. В некоторых вариантах изобретения гибрид Ас1КИВ-Ес включает относительно неструктурированный линкер, расположенный между Ес-доменом и внеклеточным доменом Ас1КЛВ. Этот неструктурированный линкер может соответствовать неструктурированной области, состоящей приблизительно из 15 аминокислот и находящейся у С-конца внеклеточного домена АсЖПВ (хвоста), либо он может представлять собой искусственную последовательность, состоящую из 5-15, 20, 30, 50 или более аминокислот и, в основном, не содержащую вторичной структуры. Линкер может быть обогащен глициновыми и пролиновыми остатками и может, например, содержать повторяющиеся последовательности треонина/серина и глицинов (например, повторы ТО4 или 8С4). Слитый белок может включать подпоследовательность для очистки, такую как эпитопная метка, метка ЕЬАО, полигистидиновая последовательность и О8Т-гибрид. Растворимый полипептид АсЖИВ включает, но необязательно, один или несколько модифицированных аминокислотных остатков, выбранных из гликозилированной аминокислоты, ПЭГилированной аминокислоты, фарнезилированной аминокислоты, ацетилированной аминокислоты, биотинилированной аминокислоты, аминокислоты, конъюгированной с липидной молекулой, и аминокислоты, конъюгированной с органическим дериватизирующим агентом. Фармацевтический препарат может также включать одно или несколько дополнительных соединений, таких как соединение, которое может быть использовано для лечения АсЖНВ-ассоциированного расстройства. Предпочтительно фармацевтический препарат является, по существу, апирогенным. Вообще говоря, предпочтительно, чтобы белок Ас1КНВ экспрессировался в клеточной линии млекопитающих, которая опосредует соответствующее природное гликозилирование белка АсЖИВ, что позволило бы снизить вероятность возникновения нежелательного иммунного ответа у пациента. В настоящее время с успехом используются человеческие клеточные линии и клеточные линии СНО, но при этом предполагается, что могут быть использованы и другие стандартные экспрессионные векторы млекопитающих.
В некоторых своих аспектах настоящее изобретение относится к фармацевтическим средствам в упаковках, содержащих описанный здесь фармацевтический препарат и этикетку, в которой указывается на возможность применения этого препарата для стимуляции роста ткани, либо снижения или предотвращения потери ткани у человека. Репрезентативными тканями являются ткани костей, хряща, мышц, жировые ткани и нервные ткани.
В некоторых своих аспектах настоящее изобретение относится к растворимым полипептидам Ас1КИВ, содержащим модифицированный лигандсвязывающий (например, ОЭЕ8-связывающий) домен. Такие модифицированные лигандсвязывающие домены рецептора АсЖПВ имеют одну или несколько мутаций в аминокислотных остатках, таких как Е37, Е39, К40, К55, К56, Υ60, А64, К74, ^78, Ь79, Ό80, Е82 и Е101 человеческого Ас1КПВ. (Нумерация сделана по отношению к 8ΕΟ ΕΌ N0:2). Модифицированный лигандсвязывающий домен, в отличие от лигандсвязывающего домена рецептора Ас1КЛВ дикого типа, может иметь, но необязательно, повышенную селективность по отношению к лиганду, такому как СЭЕ8/СЭЕ11. Для иллюстрации, мутациями, представленными в настоящей заявке, являются мутации: Κ74Υ, К74Е, К741 и Ό80Ι, повышающие селективность модифицированного лигандсвязывающего домена к СЭЕ11 (а следовательно, предположительно, к ОЭЕ8), но не к активину (данные приводятся для Ас1Ш1В). Нижеследующие мутации, а именно Ό54Α, К55А, Ь79А и Е82А, дают обратный эффект, то есть приводят к увеличению отношения связывания активина по отношению к СЭЕ11. Общая активность связывания (с СЭЕ11 и активином) может быть повышена путем включения области хвоста, или предположительно неструктурированной линкерной области, а также путем введения мутации К74А. Другими мутациями, которые приводят к общему снижению аффинности связывания с лигандом, являются: К40А, Е37А, К56А, №78А, Э80К, Ό80Κ, Ό80Α, Ό80Ο, Э80Е, Ό80Μ и Ό80Ν. Мутации могут быть объединены для достижения желаемых эффектов. Так, например, многие мутации, которые влияют на отношение связывания ОПЕ11:активин, в целом, оказывают негативное влияние на связывание с лигандом, а поэтому они могут быть объединены с мутациями, которые, в основном, повышают уровень связывания с лигандом, что будет приводить к повышению селективности связывания белка с лигандом.
Модифицированный лигандсвязывающий домен имеет, но необязательно, отношение К, для связывания с активином к К, для связывания с СЭЕ8, которое по меньшей мере в 2, 5, 10 или даже в 100 раз
- 2 018868 превышает отношение для лигандсвязывающего домена дикого типа. Модифицированный лигандсвязывающий домен имеет, но необязательно, отношение 1С50 Для ингибирования активина к 1С50 для ингибирования ΟΌΕ8/ΟΌΕ11, которое по меньшей мере в 2, 5, 10 или даже в 100 раз превышает отношение для лигандсвязывающего домена дикого типа. Указанный модифицированный лигандсвязывающий домен ингибирует, но необязательно, 6ΌΕ8/6ΌΕ11 с 1С50 которая по меньшей мере в 2, 5, 10 или даже в 100 раз ниже, чем 1С50 для ингибирования активина. Такими растворимыми полипептидами Ас®ЛВ могут быть слитые белки, включающие Рс-домен иммуноглобулина (дикого типа или мутантный). В некоторых случаях рассматриваемыми растворимыми полипептидами Ас®ЛВ являются антагонисты (ингибиторы) ΟΌΡ8/ΟΌΡ11.
Рассматриваются и другие варианты Ас®ЛВ, например варианты, описанные ниже. Вариант слитого белка АсЖЛВ содержит часть, происходящую из последовательности АсЖЛВ 8ЕЦ ГО N0:2, и вторую полипептидную часть, где часть, происходящая от Ас1К11В. соответствует последовательности, начинающейся в положениях любой из аминокислот 21-29 последовательности 8ЕЦ ГО N0:2 (необязательно начинающейся в положениях 22-25 последовательности 8ЕЦ ГО N0:2) и заканчивающейся в положениях любой из аминокислот 109-134 последовательности 8ЕЦ ГО N0:2, и где слитый белок Ас®ЛВ ингибирует передачу сигнала под действием активина, миостатина и/или 0ΌΡ11, как показал клеточный анализ. Описанный выше вариант слитого белка Ас®ЛВ имеет часть, происходящую от АсЖИВ, которая соответствует последовательности, начинающейся в любом из положений аминокислот 20-29 последовательности 8Е0 ГО N0:2 (начинающейся, но необязательно, в положениях 22-25 последовательности 8ЕЦ ГО N0:2) и заканчивающейся в любом из положений аминокислот 109-133 последовательности 8ЕЦ ГО N0:2. Описанный выше вариант слитого белка АсЖИВ имеет часть, происходящую от Ас®ЛВ, которая соответствует последовательности, начинающейся в любом из положений аминокислот 20-24 последовательности 8Е0 ГО N0:2 (начинающейся, но необязательно, в положениях 22-25 последовательности 8ЕЦ ГО N0:2) и заканчивающейся в любом из положений аминокислот 109-133 8ЕЦ ГО N0:2. Вышеописанный вариант слитого белка Ас®ЛВ имеет часть, происходящую от Ас®ЛВ, которая соответствует последовательности, начинающейся в любом из положений аминокислот 21-24 8ЕЦ ГО N0:2 и заканчивающейся в любом из положений аминокислот 109-134 8ЕЦ ГО N0:2. Вышеописанный вариант слитого белка Ас®ЛВ имеет часть, происходящую от Ас®ЛВ, которая соответствует последовательности, начинающейся в любом из положений аминокислот 20-24 8ЕЦ ГО N0:2, и заканчивающейся в любом из положений аминокислот 118-133 8ЕЦ ГО N0:2. Вышеописанный вариант слитого белка АсШПВ имеет часть, происходящую от Ас®ЛВ, которая соответствует последовательности, начинающейся в любом из положений аминокислот 21-24 8ЕЦ ГО N0:2 и заканчивающейся в любом из положений аминокислот 118-134 8Е0 ГО N0:2. Вышеописанный вариант слитого белка Ас1Р11В имеет часть, происходящая от АсЖПВ, которая соответствует последовательности, начинающейся в любом из положений аминокислот
20- 24 8Е0 ГО N0:2 и заканчивающейся в любом из положений аминокислот 128-133 8ЕЦ ГО N0:2. Вышеописанный вариант слитого белка Ас®ИВ имеет часть, происходящую от Ас®ИВ, которая соответствует последовательности, начинающейся в любом из положений аминокислот 20-24 8ЕЦ ГО N0:2 и заканчивающейся в любом из положений аминокислот 128-133 8ЕЦ ГО N0:2. Вышеописанный вариант слитого белка Ас®ИВ имеет часть, происходящую от Ас®ЛВ, которая соответствует последовательности, начинающейся в любом из положений аминокислот 21-29 8ЕЦ ГО N0:2 и заканчивающейся в любом из положений аминокислот 118-134 8ЕЦ ГО N0:2. Вышеописанный вариант слитого белка АсШПВ имеет часть, происходящую от Ас®ЛВ, которая соответствует последовательности, начинающейся в любом из положений аминокислот 20-29 8ЕЦ ГО N0:2 и заканчивающейся в любом из положений аминокислот 118-133 8Е0 ГО N0:2. Вышеописанный вариант слитого белка Ас®ИВ имеет часть, происходящую от АсЖПВ, которая соответствует последовательности, начинающейся в любом из положений аминокислот
21- 29 8Е0 ГО N0:2 и заканчивающейся в любом из положений аминокислот 128-134 8ЕЦ ГО N0:2. Вышеописанный вариант слитого белка Ас®ИВ имеет часть, происходящую от Ас®ИВ, которая соответствует последовательности, начинающейся в любом из положений аминокислот 20-29 8ЕЦ ВО N0:2 и заканчивающейся в любом из положений аминокислот 128-133 8ЕЦ ГО N0:2. Неожиданно было обнаружено, что конструкции, начинающиеся в положениях 22-25 8ЕЦ ГО N0:2, обладают активностью, уровень которой превышает уровень активности белков, имеющих полноразмерный внеклеточный домен человеческого Ас®ЛВ. Любой из вышеописанных вариантов слитого белка Ас®ЛВ может быть продуцирован в виде гомодимера. Любой из вышеуказанных слитых белков Ас®ИВ может иметь гетерологичную часть, которая содержит константную область тяжелой цепи 1дО, такую как Рс-домен.
Рассматриваются и другие варианты белков Ас®ЛВ, например, варианты, описанные ниже. Вариант белка Ас®ИВ содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислот 29-109 8ЕЦ ГО N0:2, где в положении, соответствующем аминокислоте 64 8ЕЦ ГО N0:2, присутствует В или К, и где вариант белка АсЖПВ ингибирует передачу сигнала под действием активина, миостатина и/или 0ΌΡ11 в клеточном анализе. Описанный выше вариант белка Ас®ИВ по отношению к последовательности 8ЕЦ ГО N0:2 имеет по меньшей мере одну модификацию, которая находится за пределами лигандсвязывающего кармана. Описанный выше вариант белка Ас®ЛВ по отношению к последовательности 8ЕЦ ГО N0:2 имеет
- 3 018868 по меньшей мере одну консервативную модификацию, расположенную в лигандсвязывающем кармане. Описанный выше вариант белка Ас1ЯПВ по отношению к последовательности ЗЕО ГО N0:2 имеет по меньшей мере одну модификацию в одном или более положениях, выбранных из группы, состоящей из К74, Я40, 053. К55, Е82 и Ь79. Описанный выше вариант белка АсЖПВ содержит по меньшей мере одну последовательность Ν-Χ-8/Τ в положении, отличающемся от положения эндогенной последовательности Ν-Χ-8/Τ Ас1ЯПВ, и в положении, находящемся за пределами лигандсвязывающего кармана.
Рассматриваются и другие варианты белков Ас1КНВ, например, варианты, описанные ниже. Вариант белка Ас1КПВ содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислот 29-109 ЗЕО ГО N0:2, где указанный белок содержит по меньшей мере одну последовательность Ν-Χ-3/Τ в положении, отличающемся от положения эндогенной последовательности Ν-Χ-3/Τ Ас1КНВ, и в положении, находящемся за пределами лигандсвязывающего кармана. Описанный выше вариант белка Ас1КНВ содержит N в положении, соответствующем положению 24 ЗЕО ГО N0:2, и З или Т в положении, соответствующем положению 26 ЗЕО ГО N0:2, где указанный вариант белка Ас1ЯПВ ингибирует передачу сигнала под действием активина, миостатина и/или 0ΌΡ11 в клеточном анализе. Описанный выше вариант белка Ас1ЯПВ содержит Я или К в положении, соответствующем положению 64 ЗЕО ГО N0:2. Описанный выше вариант белка Ас1ЯПВ по отношению к последовательности ЗЕО ГО N0:2 имеет по меньшей мере одну консервативную модификацию, расположенную в лигандсвязывающем кармане. Описанный выше вариант белка Ас1ЯПВ по отношению к последовательности ЗЕО ГО N0:2 имеет по меньшей мере одну модификацию в одном или более положениях, выбранных из группы, состоящей из К74, Я40, 053, К55, Е82 и Ь79. Описанный выше вариант белка Ас1ЯПВ представляет собой слитый белок, который дополнительно содержит гетерологичную часть. Любой из вышеописанных вариантов слитого белка Ас1ЯПВ может быть продуцирован в виде гомодимера. Любой из вышеуказанных слитых белков Ас1ЯНВ может иметь гетерологичную часть, которая содержит константную область тяжелой цепи 1дО, такую как Ес-домен.
В некоторых своих аспектах настоящее изобретение относится к нуклеиновым кислотам, которые кодируют растворимый полипептид Ас1ЯНВ, но не кодируют полноразмерный полипептид Ас1ЯПВ. Выделенный полинуклеотид может содержать последовательность, кодирующую растворимый полипептид Ас1ЯНВ, такой как полипептид, описанный выше. Так, например, выделенная нуклеиновая кислота может включать последовательность, кодирующую внеклеточный домен (например, лигандсвязывающий домен) Ас1ЯНВ, и последовательность, кодирующую полноразмерный трансмембранный домен Ас1ЯПВ или его часть и/или полноразмерный цитоплазматический домен Ас1ЯНВ или его часть, а также стопкодон, расположенный в трансмембранном домене или в цитоплазматическом домене, или расположенный между внеклеточным доменом и трансмембранным доменом или цитоплазматическим доменом. Так, например, выделенный полинуклеотид может содержать полноразмерную полинуклеотидную последовательность Ас1ЯНВ, такую как последовательность ЗЕО ГО N0:4, или ее частично усеченный вариант, где указанный выделенный полинуклеотид также содержит кодоны терминации транскрипции, состоящие по меньшей мере из 600 нуклеотидов, расположенных перед З'-концом или в каком-либо другом участке таким образом, чтобы трансляция полинуклеотида приводила к образованию внеклеточного домена, присоединенного, но необязательно, к усеченной части полноразмерного Ас1ЯНВ. Нуклеиновые кислоты, описанные в настоящей заявке, могут быть функционально присоединены к промотору, регулирующему экспрессию, и настоящее изобретение также относится к клеткам, трансформированным такими рекомбинантными полинуклеотидами. Предпочтительными клетками являются клетки млекопитающих, такие как клетки СНО.
В некоторых своих аспектах настоящее изобретение относится к способам получения растворимого полипептида Ас1ЯНВ. Этот способ может включать экспрессию любой из нуклеиновых кислот (например, ЗЕО ГО N0:3), описанных в настоящей заявке, в подходящей клетке, такой как клетки яичника китайского хомячка (СНО). Указанный способ может включать а) культивирование клеток в условиях, подходящих для экспрессии растворимого полипептида Ас1ЯПВ, где указанные клетки трансформируются конструкцией для экспрессии растворимого Ас1ЯПВ; и Ь) выделение экспрессируемого таким образом растворимого полипептида Ас1ЯПВ. Растворимые полипептиды Ас1ЯПВ могут быть выделены в виде неочищенных, частично очищенных или в высокой степени очищенных фракций с применением хорошо известных методов получения белка из клеточных культур.
В некоторых аспектах изобретения описанный здесь растворимый полипептид Ас1ЯПВ может быть использован в способе лечения индивидуума, страдающего расстройством, ассоциированным с потерей мышечной массы или с недостаточным ростом мышечной массы. Такими расстройствами являются атрофия мышц, мышечная дистрофия, амиотрофический боковой склероз (АБС) и гипотрофия мышц (например, кахексия, анорексия, синдром мышечной дистрофии Дюшенна (МДД), синдром мышечной дистрофии Беккера, истощение при СПИДе, мышечная дистрофия, нейромышечные заболевания, заболевание двигательных нейронов, заболевания нервно-мышечных соединений и воспалительные миопатии). Такой способ может включать введение индивидууму, нуждающемуся в этом, эффективного количества растворимого полипептида Ас1ЯПВ.
В некоторых аспектах изобретения описанный здесь растворимый полипептид Ас1ЯПВ может быть
- 4 018868 использован в способе снижения содержания жира в организме или снижения скорости увеличения содержания жира в организме, а также для лечения расстройства, ассоциированного с нежелательным увеличением массы тела, такого как ожирение, инсулиннезависимый сахарный диабет (ИНЗСД), сердечнососудистое заболевание, рак, гипертензия, остеоартрит, инсульт, заболевания дыхательных путей и заболевание желчного пузыря. Такие способы могут включать введение индивидууму, нуждающемуся в этом, эффективного количества растворимого полипептида ЛеЖИВ.
В некоторых конкретных аспектах изобретения описанный здесь растворимый полипептид Ас!КЛВ может быть использован в способе лечения расстройства, ассоциированного с аномальной активность. ΟΌΡ8. Такими расстройствами являются метаболические расстройства, такие как диабет типа 2, непереносимость глюкозы, метаболический синдром (например, синдром X), и инсулинорезистентность, вызываемая травмами (например, ожогами или нарушением баланса азота); расстройства, ассоциированные с отложением жира в ткани (например, ожирение), мышечная дистрофия (включая мышечную дистрофию Дюшенна); амиотрофический боковой склероз (АБС); атрофия мышц; атрофия органов; общее недомогание; синдром канала запястья, хроническая обструктивная болезнь легких, саркопения, кахексия и другие синдромы гипотрофии мышц; остеопороз; остеопороз, индуцированный глюкокортикоидами; остеопения; остеоартрит; переломы, ассоциированные с остеопорозом; разрежение кости, вызываемое длительной терапией глюкокортикоидами; преждевременное угасание половой функции; подавление функции андрогенов; дефицит витамина Ό; вторичный гиперпаратиреоидит; дефицит питательных веществ и нервная анорексия. Такой способ может включать введение индивидууму, нуждающемуся в этом, эффективного количества растворимого полипептида Ас®ИВ.
В некоторых своих аспектах настоящее изобретение относится к способу идентификации агента, стимулирующего рост ткани, такой как костная, хрящевая, мышечная и жировая ткань. Указанный способ включает а) идентификацию тестируемого агента, который конкурирует с растворимым полипептидом Ас!КЛВ за связывание с лигандсвязывающим доменом полипептида Ас!КЛВ; и Ь) оценку влияния данного агента на рост массы ткани.
В некоторых своих аспектах настоящее изобретение относится к способам подавления активности полипептида Ас!КПВ или лиганда АсЖИВ (например, ΟΌΡ8, ΟΌΡ11, активина, ВМР7 и Νοάαΐ) в клетке. Эти способы включают контактирование клеток с растворимым полипептидом Ас®ИВ. Мониторинг активности полипептида или лиганда Ас!КПВ проводят, но необязательно, путем оценки передачи сигнала, опосредуемой комплексом Ас!КЛВ/лиганд Ас!КЛВ, например, путем оценки пролиферации клеток. Клетками, используемыми в данных способах, являются остеобласты, хондроциты, миоциты, адипоциты и мышечные клетки.
В некоторых своих аспектах настоящее изобретение относится к применению растворимого полипептида Ас®ИВ для производства лекарственного препарата для лечения описанного здесь расстройства или состояния.
Краткое описание графического материала
На фиг. 1 представлена последовательность человеческого растворимого полипептида Ас®ИВ (внеклеточного) (БЕО ГО N0:1). С-концевой хвост подчеркнут.
На фиг. 2 представлена последовательность человеческого белка-предшественника Ас!КЛВ (БЕО ГО N0:2). Сигнальный пептид подчеркнут; внеклеточный домен (также называемый БЕО ГО N0:1), показан жирным шрифтом, а предполагаемые сайты Ν-связанного гликозилирования показаны в рамке.
На фиг. 3 представлена последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая человеческий растворимый полипептид Ас®ИВ (внеклеточный), представленный как БЕО ГО N0:3.
На фиг. 4 представлена последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая человеческий белок-предшественник Ас!КПВ, представленный как БЕО ГО N0:4.
На фиг. 5 проиллюстрировано увеличение массы тела у мышей, обработанных носителем (ромбы), полипептидом Ас!К11В(К64 20-134)-тРс (квадраты) или его формой с длительным временем полужизни, Ас!К11В(К64 А24N 20-134) (треугольники).
На фиг. 6 представлены массы мышц, иссеченных в конце исследования. Носитель: левый столбец (слабое затенение) для каждой группы; Ас!К11В(К64 20-134)-тРс: средний столбец (умеренное затенение) для каждой группы; Ас!КПВ(К64 А24N 20-134): правый столбец (сильное затенение) для каждой группы.
На фиг. 7 проиллюстрировано измерение силы спазмов у мышей Б0Э. обработанных РВБ и мышиным АсЖЛВ (К64 К74А 20-134)-тРс (или хвост К74А+15) (белые и черные столбцы, соответственно). На этой фигуре проиллюстрировано увеличение мышечной силы у мышей Ас!К11В (К64 К74А 20-134)тРс-группы по сравнению с мышами РВБ-группы на ранней стадии (на день 117) и на поздней стадии (на день 149) развития заболевания. *Р<0,05, двухсторонний т-критерий Стьюдента.
На фиг. 8 проиллюстрировано сравнение выживаемости мышей Б0Э, обработанных РВБ и Ас®ИВ (К.64 К74А 20-134)-тРс (белые и черные линии, соответственно) в соответствии с критерием КапланаМейера. У Ас!КПВ (К64 К74А 20-134)-тРс-обработанной группы, по сравнению с РВБ-обработанной группой, выживаемость была, в среднем, на несколько дней выше.
На фиг. 9 проиллюстрировано процентное изменение состава веществ в организме у мышей, кото
- 5 018868 рым давали корм с высоким содержанием жира, включающий РВ8 и АсЖПВ (К64 20-134)-шРс (белые и черные столбцы, соответственно). Обработка мышей мышиным белком Ас®11В(К.64 20-134)-Рс приводит к значительному снижению массы жира и увеличению безжировой ткани.
На фиг. 10 показано поперечное сечение мышц бедра (с 4-кратным увеличением) у старых мышей (А) или у старых мышей, обработанных белком АсЖИВ(К,64 20-134)-шРс (В).
На фиг. 11 представлены средние массы тела мышей в эксперименте на мышах с раковой кахексией, проводимом с использованием клеток рака толстой кишки СТ26. Ромбы: животные, не имеющие опухолей и обработанные физиологическим раствором; квадраты: АсЖПВ (П64 20-134)-шРсобработанные мыши, не имеющие опухолей; треугольники: мыши с опухолями, обработанные физиологическим раствором; х: Ас!К11В(В64 20-134)-шРс-обработанные мыши с опухолями (10 мг/кг); *: Ас!К11В(В64 20-134)-шРс-обработанные мыши с опухолями (30 мг/кг); кружки: Ас!К11В(В64 20-134)шРс-обработанные мыши с опухолями, (10 мг/кг), для проведения профилактического лечения обработку начинали во время имплантации опухоли.
На фиг. 12 проиллюстрировано сопоставление путем выравнивания остатков человеческих Ас!КЛА и АсЖПВ с остатками, выведенными здесь исходя из анализа состава множества кристаллических структур АсЖПВ и АсЖПА, и непосредственно контактирующих с лигандом (лигандсвязывающего кармана), показанных в рамках.
На фиг. 13 проиллюстрировано сопоставление путем выравнивания множества последовательностей различных белков АсЖПВ позвоночных и человеческого АсЖПА.
Подробное описание изобретения
1. Общий обзор.
В некоторых своих аспектах настоящее изобретение относится к полипептидам АсЖПВ. Используемый здесь термин АсШПВ означает семейство белков-рецепторов активина типа 11В (АсЖПВ) и АсШПВ-родственных белков, происходящих от любых видов. Членами семейства АсЖПВ, в основном, являются все трансмембранные белки, состоящие из лигандсвязывающего внеклеточного домена с богатой цистеином областью, трансмембранного домена и цитоплазматического домена с предсказанной серин/треонин-киназной специфичностью. Аминокислотные последовательности белка-предшественника человеческого Ас®ЛА (показаны для сравнения) и белка-предшественника АсЖПВ проиллюстрированы на фиг. 1 (8ΕΟ ΙΌ N0:1) и фиг. 2 (8Εβ ΙΌ N0:2), соответственно.
Используемый здесь термин полипептид АсШПВ означает полипептиды, содержащие любой природный полипептид, являющийся членом семейства АсЖПВ, а также любые их варианты (включая мутанты, фрагменты, гибриды и пептидомиметики), которые сохраняют нужную активность. Так, например, полипептидами АсЖПВ являются полипептиды, происходящие от последовательности любого известного АсЖПВ и имеющие последовательность, которая, по меньшей мере, примерно на 80%, а предпочтительно по меньшей мере на 85, 90, 95, 97, 99% или более идентична последовательности полипептида АсЖПВ.
В своем конкретном варианте настоящее изобретение относится к растворимым полипептидам АсЖИВ. Используемый здесь термин растворимый полипептид Ас!К11В, в общих чертах, означает полипептиды, содержащие внеклеточный домен белка АсЖПВ. Используемый здесь термин растворимый полипептид АсЖПВ включает любой природный внеклеточный домен белка АсЖПВ, а также любые его варианты (включая мутанты, фрагменты и пептидомиметики), которые сохраняют нужную активность. Так, например, внеклеточный домен белка АсЖПВ связывается с лигандом и по существу является растворимым. Примерами растворимых полипептидов АсЖПВ являются растворимые полипептиды АсЖПВ, проиллюстрированные на фиг. 1 (8Ε0 ΕΌ N0:1). Другие примеры растворимых полипептидов АсЖПВ, помимо внеклеточного домена белка АсЖПВ, содержат сигнальную последовательность, см. пример 1. Сигнальной последовательностью может быть нативная сигнальная последовательность АсЖИВ или сигнальная последовательность другого белка, такая как сигнальная последовательность тканевого активатора плазминогена (ТРА) или сигнальная последовательность мелатина пчелиного меда (НВМ).
ΤΟΕ-β-сигналы опосредуются гетеромерными комплексами серин/треонин-киназных рецепторов типа I и типа II, которые фосфорилируют и активируют расположенные ниже белки 8шаб после стимуляции лиганда (Маккадие, 2000, Ναι. Псу. Мо1. Се11 Бю1. 1:169-178). Все эти рецепторы типа I и типа II представляют собой трансмембранные белки, состоящие из лигандсвязывающего внеклеточного домена с богатой цистеином областью, трансмембранного домена и цитоплазматического домена с предсказанной специфичностью к серину/треонину. Рецепторы типа I играют важную роль в передаче сигнала, а рецепторы типа II необходимы для связывания с лигандами и для экспрессии рецепторов типа I. Рецепторы активина типа I и II, после связывания с лигандом, образуют стабильный комплекс, что приводит к фосфорилированию рецепторов типа I под действие рецепторов типа II.
Два родственных рецептора типа II, АсЖПА и ЛсЖПВ были идентифицированы как рецепторы активинов типа II (Ма111е\ук и Уа1е, 1991, Се11 65:973-982; АЖкаио е! а1., 1992, Се11 68: 97-108). Помимо активинов АсЖПА и АсЖПВ могут биохимически взаимодействовать с несколькими другими белками
- 6 018868 семейства ТСР-β, включая ВМР7, Ыоба1, СЭР8 и СЭР11 (УатакЬ11а е! а1., 1995, 1. Се11 ΒίοΙ. 130:217-226; Ьее и МсРйетгоп, 2001, Ргос. Ыа!1. Асаб. 8с1. 98:9306-9311; Уео и \У1Шшап. 2001, Мо1. Се11 7: 949-957; Ой е! а1., 2002, Сепек Эех. 16:2749-54). Заявителями было обнаружено, что растворимые слитые белки Ас®ИА-Рс и слитые белки АсЖИВ-Рс оказывают, в основном, различное действие ίη у1уо, причем Ас®ИА-Рс влияет, главным образом, на кости, а Ас1Я11В-Рс влияет, главным образом, на скелетную мышцу.
В некоторых своих вариантах настоящее изобретение относится к подавлению функции лиганда для рецепторов Ас®ЛВ (также называемого лигандом Ас!ВПВ) под действием рассматриваемого полипептида Ас!ВПВ (например, растворимого полипептида Ас!ВПВ). Таким образом, композиции и способы согласно изобретению могут быть применены для лечения расстройств, ассоциированных с аномальной активностью одного или нескольких лигандов для рецепторов Ас®ИВ.
Репрезентативными лигандами для рецепторов Ас®ЛВ являются некоторые члены семейства ТСРβ, такие как активин, Ыоба1, СЭР8, СЭР11 и ВМР7.
Активины представляют собой димерные полипептидные факторы роста и принадлежат к суперсемейству ТОР-бета. Существует три активина (А, В и АВ), которые представляют собой гомо/гетеродимеры, состоящие из двух близкородственных β-субъединиц (вАвА, вВвВ и β..··,β В). В суперсемействе ТОРбета активины являются уникальными и многофункциональными факторами, которые могут стимулировать продуцирование гормонов в клетках яичника и плаценты, поддерживать выживаемость нервных клеток, положительно или отрицательно влиять на прохождение клеточного цикла в зависимости от типа клетки, и индуцировать дифференцировку мезодермы, по меньшей мере, в эмбрионах амфибий (ЭеРао1о е! а1., 1991, Ргос 8осЕр Вю1 Меб. 198:500-512; Эукоп е! а1., 1997, Сигг Вю1. 7:81-84; ХУообгиГГ, 1998, Вюсйет Р1агтасо1. 55:953-963). Кроме того, было обнаружено, что эритроидный фактор дифференцировки (ΕΌΡ), выделенный из стимулированных человеческих клеток моноцитарного лейкоза, идентичен активину А (Мига!а е! а1., 1988, РЫА8, 85:2434). Было высказано предположение, что активин А действует как природный регулятор эритропоэза в костном мозге. В некоторых тканях передача активинового сигнала подавляется под действием родственного ему гетеродимера, ингибина. Так, например, в процессе высвобождения фолликулостимулирующего гормона (Р8Н) из гипофиза активин стимулирует секрецию и синтез Р8Н, а ингибин способствует предупреждению секреции и синтеза Р8Н. Другими белками, которые могут регулировать биологическую активность активина и/или связываться с активином, являются фоллистатин (Р8), белок, родственный фоллистатину (Р8ВР), а2-макроглобулин, белок СегЬегик и эндоглин, описанные ниже.
Белки Ыоба1 функционируют в мезодерме и участвуют в индуцировании и образовании эндодермы, а также в последующей организации аксиальных структур, например, на ранней стадии эмбриогенеза в сердце и в желудке. Было продемонстрировано, что дорсальная ткань, на стадии развития эмбрионов позвоночных, преимущественно участвует в образовании аксиальных структур спинной хорды и прехордальной пластины, но в то же время она участвует в рекрутинге окружающих клеток с образованием неаксиальных эмбрионных структур. Белок Ыоба1 очевидно передает сигнал посредством рецепторов типа I и типа II и внутриклеточных эффекторов, известных как белки 8таб. Недавно проведенные исследования лишь подтвердили идею о том, что Ас®ЛА и Ас1ВЛВ служат в качестве рецепторов типа II для Ыоба1 (8акита е! а1., Сенек Се11к. 2002, 7:401-12). Было высказано предположение, что лиганды Ыоба1 взаимодействуют со своими кофакторами (например, крипто-белок), что приводит к активации рецепторов активина типа I и типа II, которые фосфорилируют 8таб2. Белки Ыоба1 участвуют во многих событиях, играющих важную роль в развитии эмбриона позвоночного на ранней стадии, включая образование мезодермы, образование структуры передней пластины и формирование левой-правой оси. Экспериментальные исследования показали, что передача сигнала Ыоба1 активирует рАВ3-Еих, то есть репортерную молекулу люциферазы, которая, как сообщалось ранее, является специфической по отношению к активину и ТСР-бета. Однако Ыоба1 не обладает способностью индуцировать рТ1х2-Ьих, то есть репортер, который, является специфическим по отношению к белкам морфогенеза кости. Недавно полученные результаты биохимического анализа со всей очевидностью показали, что передача сигнала Ыоба1 опосредуется путями активина-ТСР-бета, 8табк, 8таб2 и 8таб3. Последующие результаты показали, что внеклеточный крипто-белок необходим для передачи сигнала Ыоба1, а не активина или ТСР-бета.
Фактор роста и дифференцировки-8 (СЭР8) также известен как миостатин. СЭР8 является негативным регулятором массы скелетной мышцы. СЭР8 в высокой степени экспрессируется в скелетной мышце развивающегося организма и в скелетной мышце взрослого индивидуума. Нуль-мутация СЭР8 у трансгенных мышей характеризуется заметной гипертрофией и гиперплазией скелетной мышцы (МсРйетгоп е! а1., №!ите, 1997, 387:83-90). Аналогичное увеличение массы скелетной мышцы наблюдается в случае природных мутаций СЭР8 у крупного рогатого скота (Акйтоге е! а1., 1974, ΟΐΌλνίΚ 38:501507; 8\ха11апб и КлеГГет, 1. Агат. 8сЬ, 1994, 38:752-757; МсРйетгоп и Ьее, Ргос. Ыа!1. Асаб. 8сР И8А, 1997, 94:12457-12461; и КатЬабиг е! а1., Сепоте Век., 1997, 7:910-915), и что удивительно, у человека (8с1ше1ке е! а1., N Епд1 1 Меб 2004; 350:2682-8). Исследования также показали, что гипотрофия мышц, ассоциированная с ВИЧ-инфекцией у человека, сопровождается повышением уровня экспрессии белка
- 7 018868
СИЕ8 (Сопха1сх-Са6ау|6 с! а1., ΡΝΆ8, 1998, 95:14938-43). Кроме того, СИЕ8 может модулировать продуцирование мышцеспецифических ферментов (например, креатинкиназы) и пролиферацию миобластов (\νϋ 00/43781). Пропептид СИЕ8 может нековалентно связываться со зрелым димером домена СИЕ8, что приводит к инактивации его биологической активности (Μίναχοηο с! а1. (1988) 1. Бю1. СНет., 263: 6407-6415; №акейе16 е! а1. (1988) 1. Бю1. СНет., 263; 7646-7654; и Вгомп е! а1. (1990) СгоМН ЕасФге, 3: 35-43). Другими белками, которые связываются с СИЕ8 или со структурно родственными белками и ингибируют их биологическую активность, являются фоллистатин, а возможно и белки, родственные фоллистатину (Сатег е! а1. (1999) Эем. Βίο1., 208: 222-232).
Фактор роста и дифференцировки-11 (СИЕ11), также известный как ВМР11, представляет собой секретируемый белок (МсРНетюи е! а1., 1999, ΝηΙ. Сепе!. 22: 260-264). СИЕ11 экспрессируется в хвостовой почке, в почке конечностей, в верхнечелюстной и в челюстной дуге, и в спинномозговых узлах в процессе развития организма у мышей (Ν;·ι1<;·ΐ51ιίιη;·ι е! а1., 1999, МесН. Эем. 80: 185-189). СЭЕ11 играет уникальную роль в образовании структуры тканей мезодермы и нервных тканей (Сатег е! а1., 1999, Эем Βίο1., 208:222-32). Было показано, что СЭЕ11 является негативным регулятором хондрогенеза и миогенеза на стадии развития конечностей кур (Сатег е! а1., 2001, Эем Βίο1. 229:407-20). Экспрессия СИЕ11 в мышце также указывает на то, что СИЕ11, также как и СИЕ8, играет определенную роль в регуляции роста мышц. Кроме того, экспрессия СИЕ11 в головном мозге указывает на то, что СИЕ11 может также обладать активностями, ассоциированными с функцией нервной системы. Интересно отметить, что СИЕ11, как было обнаружено, ингибирует нейрогенез обонятельного эпителия (νυ е! а1., 2003, №игоп. 37:197-207). Следовательно, СИЕ11 может быть использован ш νί!το и ш νίνο для лечения таких заболеваний, как заболевания мышц и нейродегенеративные заболевания (например, амиотрофический боковой склероз).
Хорошо известно, что белок морфогенеза кости (ВМР7), также называемый остеогенным белком-1 (ОР-1), индуцирует образование хряща и костей. Кроме того, ВМР7 регулирует широкий ряд физиологических процессов. Так, например, ВМР7 может представлять собой остеоиндуцирующий фактор, ответственный за остеогенез эпителия. Было также обнаружено, что ВМР7 играет определенную роль в регуляции уровня кальция и в гомеостазе кости. ВМР7, подобно активину, связывается с рецепторами типа II, ЛсЖНЛ и 11В. Однако ВМР7 и активин осуществляют рекрутинг различных рецепторов типа I с образованием гетеромерных рецепторных комплексов. Как показали наблюдения, основной рецептор ВМР7 типа I, представляет собой АЬК2, а активин связывается исключительно с ЛЬК4 (ЛсГКНВ). ВМР7 и активин вырабатывают определенные биологические ответы и активируют различные пути 8та6 (Мааак81Ка е! а1., 1998, 1 Вю1 СНет. 273:25628-36).
В некоторых своих аспектах настоящее изобретение относится к использованию некоторых полипептидов Ас1ВЛВ (например, растворимых полипептидов Ас!КНВ) для подавления сигнала, передаваемого лигандами Ас1ВНВ, по существу, в любом процессе, ассоциированном с активностью Ас1ВЛВ. Полипептиды Ас!КНВ согласно изобретению могут, но необязательно, подавлять активность одного или нескольких лигандов рецепторов АсЖНВ, таких как активин, №6а1, СИЕ8, СИЕ11 и ВМР7, а поэтому они могут быть использованы для лечения других расстройств.
Поэтому в настоящем изобретении рассматривается использование полипептидов Ас1ВЛВ для лечения или предупреждения заболеваний или состояний, ассоциированных с аномальной активностью Ас1ВЛВ или лиганда Ас1ВНВ. АсЖНВ или лиганды Ас1ВНВ участвуют в регуляции многих важных биологических процессов. Благодаря ключевым функциям, которые они играют в этих процессах, они могут быть желательными мишенями для терапевтического лечения. Так, например, полипептиды Ас!КНВ (например, растворимые полипептиды Ас1ВЛВ) могут быть использованы для лечения расстройств или состояний у человека или животного. Примерами таких расстройств или состояний являются, но не ограничиваются ими, метаболические расстройства, такие как диабет типа 2, непереносимость глюкозы, метаболический синдром (например, синдром X), и инсулинорезистентность, вызываемая травмами (например, ожогами или нарушением баланса азота); расстройства, ассоциированные с отложением жира в ткани (например, ожирение), мышечные и нейромышечные заболевания, такие как мышечная дистрофия (включая мышечную дистрофию Дюшенна); амиотрофический боковой склероз (АБС); атрофия мышц; атрофия органов; общее недомогание; синдром канала запястья, хроническая обструктивная болезнь легких, саркопения, кахексия и другие синдромы гипотрофии мышц. Другими примерами является остеопороз, в частности, у пожилых женщин и/или у женщин после менопаузы; остеопороз, индуцированный глюкокортикоидами; остеопения; остеоартрит и переломы, ассоциированные с остеопорозом. Другими примерами являются разрежение кости, вызываемое длительной терапией глюкокортикоидами; преждевременное угасание половой функции; подавление функции андрогенов; дефицит витамина Ό; вторичный гиперпаратиреоидит; дефицит питательных веществ и нервная анорексия. Такие расстройства и состояния обсуждаются ниже в разделе Репрезентативное терапевтическое применение.
Термины, используемые в описании настоящей заявки, обычно употребляются в своем общепринятом смысле в соответствии с контекстом настоящего изобретения и в соответствии с контекстом, в котором употребляется каждый из этих терминов. Для представления специалисту дополнительной информации о композициях и способах согласно изобретению и информации об осуществлении и применении
- 8 018868 таких способов, некоторые термины обсуждаются ниже или в каком-либо разделе описания настоящей заявки. Объем употребления или значение любого используемого здесь термина будут очевидны специалистам из конкретного контекста, в котором используется данный термин.
Термины примерно и приблизительно, в общих чертах, означают допустимую степень ошибки при определении количественной величины, вычисленной с учетом способа или точности измерений. Обычно допустимые степени ошибок составляют в пределах 20 процентов (%), предпочтительно 10%, а более предпочтительно 5% от данной величины или интервала величин.
Альтернативно, в частности, в биологических системах, термины примерно и приблизительно могут означать величины, которые входят в пределы величин, предпочтительно порядка величин, которые в 5 раз, а более предпочтительно в 2 раза превышают данную величину. Если это не оговорено особо, то представленные здесь численные значения являются приблизительными, а это означает, что, если эти значения не указаны точно, то могут быть использованы термины примерно или приблизительно.
Способы согласно изобретению могут включать стадии сравнения последовательностей друг с другом, включая сравнение последовательности дикого типа с последовательностями одного или нескольких мутантов (вариантов последовательностей). Такие сравнения обычно включают выравнивание полимерных последовательностей, например, с использованием программ и/или алгоритмов выравнивания последовательностей, хорошо известных специалистам (например, ВЬАБТ, ЕА8ТА и ΜΕΟΑΕΙΟΝ и т.п.). Специалисту в данной области хорошо известно, что при осуществлении таких выравниваний, в том случае, если мутация представляет собой инсерцию или делецию остатка, в сравниваемую полимерную последовательность, не содержащую введенного или делетированного остатка, будет вводиться пробел (обычно обозначаемый штрихом, или А).
Термин гомологичный, во всех его грамматических формах и орфографических вариантах, относится к взаимосвязи между двумя белками, которые имеют общее эволюционное происхождение, включая белки, происходящие от суперсемейств белков организмов одного и того же вида, а также гомологичные белки, происходящие от организмов других видов. Такие белки (и кодирующие их нуклеиновые кислоты) имеют гомологичные последовательности, на что указывает их сходство, независимо от процента идентичности, или присутствия конкретных остатков или мотивов и наличия консервативных положений.
Термин сходство последовательностей, во всех его грамматических формах, означает степень идентичности или соответствия между последовательностями нуклеиновых кислот или между аминокислотными последовательностями, которые могут иметь, а могут и не иметь общее эволюционное происхождение.
Однако термин гомологичный, употребляемый в своем общепринятом смысле и в контексте описания настоящей заявки, в том случае, если он употребляется вместе с наречием в высокой степени, может относиться к сходству последовательностей, которые могут иметь, а могут и не иметь общее эволюционное происхождение.
2. Полипептиды ΑείΚΙΙΒ.
В некоторых своих аспектах настоящее изобретение относится к вариантам полипептидов ΑείΚΙΙΒ (например, к растворимым полипептидам ΑείΚΙΙΒ). Их фрагменты, функциональные варианты и модифицированные формы могут, но необязательно, обладать биологическими активностями, которые сходны с биологическими активностями их соответствующих полипептидов ΑείΚΙΙΒ дикого типа, или являются такими же, как биологические активности данных полипептидов дикого типа. Так, например, вариант ΑείΚΙΙΒ согласно изобретению может связываться с лигандом ΑείΚΙΙΒ (например, с активином А, активином АВ, активином В, Νοάαΐ. ΟΌΕ8, ΟΌΕ11 или ВМР7) и ингибировать функцию этого лиганда. Полипептид ΑείΚΙΙΒ модулирует, но необязательно, рост тканей, таких как ткани костей, хряща, мышц или жировых тканей. Примерами полипептидов ΑείΚΙΙΒ являются человеческий полипептидпредшественник ΑείΚΙΙΒ (3ΕΟ ΙΌ N0:2) и растворимые человеческие полипептиды ΑείΚΙΙΒ (например, <ΕΟ ΙΌ №№: 1, 5, 6 и 12).
В настоящем изобретении идентифицированы функционально активные части и варианты ΑείΚΙΙΒ. Заявителями было установлено, что Ее-слитый белок, имеющий последовательность, описанную в публикации Ηίΐάεη εί а1. (Βίοοά. 1994 Αρτ 15; 83(8):2163-70), где аланин присутствует в положении, соответствующем аминокислоте 64 3Ε0 ΙΌ N0:2 (А64), обладает относительно низкой аффинностью по отношению к активину и ΟΌΡ-11. В противоположность этому, тот же самый Ес-слитый белок с аргинином в положении 64 (Κ64) обладает аффинностью по отношению к активину и 0ΌΕ-11 в интервалах от низких наномолярных значений до высоких пикомолярных значений. Поэтому в описании настоящей заявки последовательность с Κ64 используется как эталонная последовательность человеческого ΑсίΚIIΒ дикого типа.
ЛИйапо и др. (Се11. 1992 1ап 10; 68 (1): 97-108) показали, что делеция пролинового узла у С-конца внеклеточного домена ΑсίΚIIΒ приводит к снижению аффинности рецептора по отношению к активину. Представленные здесь данные показали, что слитый белок ΑсίΚIIΒ-Ес, содержащий аминокислоты 20119 3Ε0 ΙΌ N0:2, ΑΛΚΙΙΒ(20-119)-Εε, обладает пониженной способностью связываться с ΟΌΕ-11 и с активином по сравнению с ΑсίΚIIΒ(20-134)-Ес, который включает область пролинового узла и полно
- 9 018868 размерный пограничный мембранный домен. Однако белок Ас!В11В(20-129)-Ес сохраняет аналогичную, но несколько меньшую активность по сравнению с активностью белка дикого типа, даже если область пролинового узла отсутствует в результате дизрупции. Таким образом, предполагается, что все внеклеточные домены Ас!ВЛВ, которые заканчиваются в положениях аминокислот 134, 133, 132, 131, 130 и 129, являются активными, однако конструкции, заканчивающиеся в положении 134 или 133, могут быть наиболее активными. Аналогичным образом, предполагается, что мутации в любом из остатков 129-134 не будут оказывать влияние на аффинность связывания с лигандом в крупных концевых областях. В подтверждение этому следует отметить, что мутации Р129 и Р130 не приводят к значительному снижению уровня связывания с лигандом. Поэтому слитый белок АсЖЛВ-Рс может заканчиваться уже в положении аминокислоты 109 (конечный цистеин), однако при этом предполагается, что формы полипептидов, заканчивающиеся в положениях 109 и 119 или между этими положениями, обладают пониженной способностью связываться с лигандом. Аминокислота 119 является слабоконсервативной, а поэтому она может быть легко модифицирована или удалена. Формы, заканчивающиеся в положении 128 или далее, сохраняют активность связывания с лигандом. Формы, заканчивающиеся в положениях 119 и 127, или между этими положениями, обладают умеренной способностью к связыванию. Любая из этих форм может оказаться желательной для применения в зависимости от клинических или экспериментальных условий.
Предполагается, что у Ν-конца Ас!ВЛВ, белок, начинающийся в положении аминокислоты 29 или ранее, будет сохранять активность связывания с лигандом. Аминокислотой 29 является исходный цистеин. Замена аланина на аспарагин, вводимая в положение 24 последовательности Ν-связанного гликозилирования, не оказывает какого-либо значительного влияния на связывание с лигандом. Это подтверждает тот факт, что мутации в области, расположенной между сигнальным отщепляемым пептидом и перекрестно-связанной цистеиновой областью, соответствующей аминокислотам 20-29, являются в достаточной степени толерантными. В частности, конструкции, начинающиеся в положениях 20, 21, 22, 23 и 24, сохраняют свою активность, а также предполагается, что такую активность также сохраняют конструкции, начинающиеся в положениях 25, 26, 27, 28 и 29. Данные, представленные в примерах, указывают на то, что, как было неожиданно обнаружено, конструкция, начинающаяся в положениях 22, 23, 24 или 25, обладает наибольшей активностью.
В целом активная часть Ас!ВПВ содержит аминокислоты 29-109 ЗЕО ΙΌ N0:2, и конструкции могут, например, начинаться в положении остатка, соответствующего аминокислотам 20-29, и заканчиваться в положении, соответствующем аминокислотам 109-134. Другими примерами могут служить конструкции, которые начинаются в положениях 20-29 или 21-29 и заканчиваются в положениях 119-134, 119133 или 129-134, 129-133. Другими примерами являются конструкции, которые начинаются в положениях 20-24 (или 21-24, или 22-25) и заканчиваются в положениях 109-134 (или 109-133), 119-134 (или 119133) или 129-134 (или 129-133). Также рассматриваются варианты с этими интервалами, в частности, варианты, которые по меньшей мере на 80, 85, 90, 95 или 99% идентичны соответствующей части ЗЕО ΙΌ N0:4.
Настоящее изобретение включает результаты анализа состава структур Ас!ВЛВ, представленные на фиг. 22, где указанные результаты указывают на то, что лигандсвязывающий карман определяется остатками Υ31, N33, N35, Б38-Т41, Е47, Е50, Р53-К55, Ь57, Н58, Υ60, З62, К74, №78-Ν83, Υ85, В87, А92 и Е94-Е101. Предполагается, что в этих положениях консервативные мутации являются толерантными, хотя мутация К74А также является достаточно толерантной, как и мутации В40А, К55А, Е82А, и мутации в положении Ь79. У Хепорик В40 представляет собой К, что указывает на то, что основные аминокислоты в этом положении являются толерантными. В Ас!ВПВ коров 053 представляет собой В, а в АсЖНВ Хепорик 053 представляет собой К, а поэтому аминокислоты, включая В, К, О. N и Н, являются толерантными в этом положении. Таким образом, активный вариант белка Ас!ВНВ имеет общую структурную формулу, которая содержит аминокислоты 29-109, но необязательно, начинается в положениях 20-24 или 22-25 и заканчивается в положениях 129-134, и которая также содержит не более, чем 1, 2, 5, 10 или 15 консервативных аминокислотных замен в лигандсвязывающем кармане, и 0, 1 или более неконсервативных модификаций в положениях 40, 53, 55, 74, 79 и/или 82 в лигандсвязывающем кармане. Такой белок может сохранять последовательность, которая более чем на 80, 90, 95 или 99% идентична последовательности аминокислот 29-109 ЗЕО ΙΌ N0:4. Сайты, находящиеся за пределами связывающего кармана, вариабельность которых может быть, в частности, достаточно толерантной, включают амино- и карбокси-концы внеклеточного домена (указанного выше) и положения 42-46 и 65-73. Замена аспарагина аланином в положении 65 (Ж>5А) фактически может приводить к повышению уровня связывания с лигандом в эталонном А64, и, таким образом, предполагается, что такая замена не будет оказывать негативного влияния на уровень связывания с лигандом в эталонном В64. Такая замена, вероятно, будет приводить к элиминации сайта гликозилирования в положении N65 в эталонном А64, что указывает на то, что значительные изменения, сделанные в этой области, являются, очевидно, толерантными. Замена В64 является слабо толерантной, В64К является достаточно толерантной, и, таким образом, другой основный остаток, такой как Н, может быть толерантным в положении 64.
Ас!ВНВ является в высокой степени консервативным почти у всех позвоночных, при этом крупные фрагменты внеклеточного домена такого белка являются полностью консервативными. Многие из этих
- 10 018868 лигандов, которые связываются с ΆεΐΚΙΙΒ, также являются в высокой степени консервативными. В соответствии с этим, сравнение последовательностей ΆεΐΚΙΙΒ различных позвоночных позволяет идентифицировать остатки, которые могут быть модифицированными. Следовательно, активный человеческий вариант ΆεΐΚΙΙΒ может включать одну или несколько аминокислот в соответствующих положениях последовательности ΆεΐΚΙΙΒ другого позвоночного, либо он может включать остаток, аналогичный остатку, присутствующему в последовательности человека или другого позвоночного. Такой способ определения активного варианта ΑεΐΚΙΙΒ проиллюстрирован в нижеследующих примерах. В ΑεΐΚΙΙΒ Хепорик Ь46 представляет собой валин, и в этом положении такой остаток может быть модифицирован, и он может быть заменен, но необязательно, другим гидрофобным остатком, таким как V, Ι или Р, или неполярным остатком, таким как А. У Хеиорик Е52 представляет собой К, что указывает на то, что этот сайт может быть толерантным к модификациям широкого ряда, включая замены полярными остатками, такими как Е, Ό, К, Κ, Н, 8, Т, Р, С, Υ, и вероятно, А. У Хеиорик, Т93 представляет собой К, что указывает на то, что в этом положении широкие структурные изменения могут оставаться толерантными, при этом предпочтение следует отдать полярным остаткам, таким как 8, К, Κ, Е, Ό, Н, С, Р, С и Υ. У Хеиорик, Р108 представляет собой Υ, а поэтому Υ или другая гидрофобная группа, такая как Ι, V или Ь, должны быть толерантными. У Хеиорик, Е111 представляет собой К, что указывает на то, что в этом положении заряженные остатки, включая Ό, Κ, К и Н, а также О и Ν, могут быть толерантными. У Хеиорик, Κ112 представляет собой К, что указывает на то, что в этом положении, включая Κ и Н, основные остатки являются толерантными. В положении 119 остаток А и, очевидно, Р у грызунов и V у Хеиорик являются относительно слабоконсервативными, а поэтому, по существу, любая аминокислота в этом положении должна быть толерантной.
В описании настоящей заявки продемонстрировано, что присоединение дополнительного сайта Νсвязанного гликозилирования (№Х-8/Т) приводит к увеличению времени полужизни слитого белка АсΐΚΙΙΒ-Рс в сыворотке по сравнению со временем полужизни ΑсΐΚIIΒ(Κ64)-Рс-формы. При введении аспарагина в положение 24 (А24№конструкции) образуется последовательность NXТ, которая сообщает более длительное время полужизни. Другие последовательности NX(Т/8) присутствуют в положениях 42-44 (N08) и 65-67 (N88), хотя последняя последовательность не может быть эффективно гликозилирована остатком Κ в положении 64. Последовательности №Х-8/Т могут быть, в основном, введены в положениях, находящихся за пределами лигандсвязывающего кармана, определенного на фиг. 12. Особенно подходящими сайтами для введения неэндогенных последовательностей №Х-8/Т являются аминокислоты 20-29, 20-24, 22-25, 109-134, 120-134 или 129-134. Последовательности №Х-8/Т могут быть также введены в линкер между последовательностью Α^ΚΙΕΒ и Рс или другим компонентом гибрида. Такой сайт может быть легко встроен путем введения N в правильное положение по отношению к уже существующему 8 или Т, или путем введения 8 или Т в положение, соответствующее уже существующему Ν. Таким образом, желательными модификациями, которые могут приводить к образованию сайта Νсвязанного гликозилирования, являются Α24Ν, Κ64Ν, 867Ν (возможно объединенные с модификациями Ν65Α), Ε106Ν, Κ112Ν, Ο120Ν, Ε123Ν, Ρ129Ν, Α132Ν, Κ1128 и Κ112Έ Благодаря защите, сообщаемой гликозилированием, любой 8, который, как было предсказано, является гликозилированным, может быть заменен на Т без создания иммуногенного сайта. Аналогичным образом, любой Т, который, как было предсказано, является гликозилированным, может быть заменен на 8. Рассматриваются также модификации 867Т и 844Т. Аналогичным образом, в вариант Α24Ν может быть введена модификация 826Т. В соответствии с этим, вариант ΑΛΚΙΙΒ может включать одну или несколько дополнительных неэндогенных консенсусных последовательностей Ν-связанного гликозилирования.
Положение Ь79 может быть модифицировано в целях изменения связывающих свойств активинамиостатина (СОР-11). Ε79Α или Ь79Р снижают уровень связывания СОР-11 в гораздо большей степени, чем уровень связывания активина. Ь79Е или Ь79О сохраняют способность связываться с СОР-11. Интересно отметить, что варианты Ь79Е и Ь79О обладают значительно меньшей способностью связываться с активином. Ιη νί\Ό эксперименты показали, что такие неактивиновые рецепторы в значительной степени сохраняют способность увеличивать мышечную массу, но обладают значительно меньшим действием на другие ткани. Полученные данные продемонстрировали необходимость и целесообразность получения полипептидов, обладающих более слабым действием на активин.
Описанные модификации могут быть объединены различными методами. Кроме того, описанные здесь результаты применения программы мутагенеза показали, что в ΑсΐΚIIΒ имеются положения аминокислот, которые часто и предпочтительно являются консервативными. Такими положениями являются положение 64 (основная аминокислота), положение 80 (кислотная или гидрофобная аминокислота), положение 78 (гидрофобная аминокислота, в частности, триптофан), положение 37 (кислотная аминокислота, в частности, аспарагиновая или глутаминовая аминокислота), положение 56 (основная аминокислота), положение 60 (гидрофобная аминокислота, в частности, фенилаланин или тирозин). Таким образом, в каждом из описанных здесь вариантов настоящее изобретение относится к каркасной области аминокислот, которые могут быть консервативными. Другими положениями, которые могут быть, что предпочтительно, консервативными, являются следующие положения: положение 52 (кислотная аминокислота), положение 55 (основная аминокислота), положение 81 (кислотная аминокислота), положение 98 (поляр
- 11 018868 ная или заряженная аминокислота, в частности Е, Ό, К или К).
В некоторых вариантах изобретения выделенные фрагменты полипептидов АсЖПВ могут быть получены путем скрининга полипептидов, рекомбинантно продуцированных из соответствующего фрагмента нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид Лс®ЛВ (например, ЗЕО Ш №№: 3 и 4). Кроме того, фрагменты могут быть химически синтезированы методами, известными специалистам, такими как стандартный метод химического твердофазного синтеза Меррифилда с использованием Г-Мос или ΐ-Вос. Такие фрагменты могут быть получены (рекомбинантными методами или методами химического синтеза) и протестированы для идентификации тех пептидильных фрагментов, которые могут действовать, например, как антагонисты (ингибиторы) или агонисты (активаторы) белка АсЖПВ или лиганда АсЖПВ.
В некоторых вариантах изобретения функциональный вариант полипептида Ас®ИВ имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 75% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из ЗЕО Ш N0: 3, 4 и 10. В некоторых случаях функциональный вариант имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99 или 100% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из ЗЕО Ш N0: 3, 4 и 10.
В некоторых вариантах изобретения рассматривается получение функциональных вариантов путем модификации структуры полипептида Ас1КПВ для таких целей, как повышение терапевтической эффективности или стабильности (например, срока хранения ех νίνο и резистентности к протеолитическому расщеплению ίη νίνο). Модифицированные полипептиды Ас®ПВ могут быть также получены, например, путем замены, делеции или добавления аминокислот. Так, например, имеются основания предположить, что отдельная замена лейцина на изолейцин или валин, аспартата на глутамат, треонина на серин или аналогичная замена аминокислоты структурно родственной аминокислотой (например, консервативные мутации) не будет оказывать значительного влияния на биологическую активность полученной молекулы. Консервативными заменами являются замены, осуществляемые в пределах семейства аминокислот, которые являются родственными по их боковым цепям. Для того чтобы определить, может ли замена в аминокислотной последовательности полипептида Лс1В11В приводить к образованию функционального гомолога, вариант полипептида АсЖПВ может быть легко оценен на его способность вырабатывать клеточный ответ методом, аналогичным методу определения такой способности полипептида Ас®ПВ дикого типа, либо он может быть оценен на его способность связываться с одним или несколькими лигандами, такими как активин, ΟΌΕ-11 или миостатин, методом, аналогичным методу определения такой способности полипептида дикого типа.
В некоторых конкретных вариантах изобретения рассматривается введение мутаций во внеклеточный домен (также называемый лигандсвязывающим доменом) полипептида Ас®11В так, чтобы такой вариант (или мутант) полипептида АсЖ11В обладал измененной активностью связывания с лигандом (например, аффинностью связывания или специфичностью связывания). В некоторых случаях такие варианты полипептидов АсЖПВ обладают измененной (повышенной или пониженной) аффинностью связывания с конкретным лигандом. В других случаях варианты полипептидов АсЖ11В обладают измененной специфичностью связывания с их лигандами.
Так, например, настоящее изобретение относится к вариантам полипептидов Ас®ПВ, которые преимущественно связываются с ΟΌΕ8/ΟΌΕ11, а не с активинами. В настоящем изобретении преимущественными также являются такие полипептиды, которые обеспечивают уменьшение побочных эффектов, хотя такие селективные варианты могут оказаться менее желательными для лечения тяжелых заболеваний, при которых для достижения терапевтического эффекта может оказаться необходимым очень высокий прирост мышечной массы, и где некоторый определенный уровень побочных эффектов является допустимым. Так, например, аминокислотные остатки белка АсЖПВ, такие как Е39, К55, Υ60, К74, \У78. Ό80 и Г101, присутствуют в лигандсвязывающем кармане и опосредуют связывание с его лигандами, такими как активин и ΟΌΕ8. Таким образом, настоящее изобретение относится к модифицированному лигандсвязывающему домену (например, ООЕ8-связывающему домену) рецептора АсЖПВ, который содержит одну или несколько мутаций в этих аминокислотных остатках. Модифицированный лигандсвязывающий домен, по сравнению с лигандсвязывающим доменом рецептора АсЖ11В дикого типа, может, но необязательно, обладать повышенной селективностью к лиганду, такому как ΟΌΕ8. Для иллюстрации можно сказать, что эти мутации повышают селективность модифицированного лигандсвязывающего домена по отношению к ΟΌΕ8, а не к активину. Модифицированный лигандсвязывающий домен имеет, но необязательно, отношение К,| для связывания с активином к К,| для связывания с ΟΌΕ8, которое по меньшей мере в 2, 5, 10 или даже в 100 раз превышает отношение для лигандсвязывающего домена дикого типа. Модифицированный лигандсвязывающий домен имеет, но необязательно, отношение 1С50 для ингибирования активина к 1С50 для ингибирования ΟΌΕ8, которое по меньшей мере в 2, 5, 10 или даже в 100 раз превышает отношение для лигандсвязывающего домена дикого типа. Такой модифицированный лигандсвязывающий домен ингибирует ΟΌΕ8, но необязательно, с ингибирующей концентрацией 1С50, которая по меньшей мере в 2, 5, 10 или даже в 100 раз ниже ингибирующей концентрации 1С50 для ингибирования активина.
В конкретном примере положительно заряженный аминокислотный остаток Акр (Ό80) лигандсвя
- 12 018868 зывающего домена ΑεΐΚΙΙΒ может быть заменен другим аминокислотным остатком так, чтобы вариант полипептида ΑεΐΚΙΙΒ предпочтительно связывался с ΟΌΕ8, а не с активином. Предпочтительно остаток Ό80 заменяют аминокислотным остатком, выбранным из группы, состоящей из незаряженного аминокислотного остатка, отрицательно заряженного аминокислотного остатка и гидрофобного аминокислотного остатка. В другом конкретном примере для значительного снижения уровня связывания с активином, но сохранения способности связываться с ΟΌΕ11, гидрофобный остаток Ь79 может быть заменен кислотными аминокислотами, такими как аспарагиновая кислота или глутаминовая кислота. Для специалистов в данной области очевидно, что большинство описанных мутаций, вариантов или модификаций может быть сделано на уровне нуклеиновых кислот или, в некоторых случаях с помощью посттрансляционной модификации или химического синтеза. Такие методы хорошо известны специалистам.
В некоторых вариантах изобретения рассматриваются специфические мутации, вводимые в полипептиды ΆεΐΚΙΙΒ в целях изменения характера гликозилирования данного полипептида. Репрезентативные сайты гликозилирования в полипептидах ΆεΐΚΙΙΒ проиллюстрированы на фиг. 2. Такие мутации могут быть выбраны для введения или элиминации одного или нескольких сайтов гликозилиролвания, таких как сайты О-связанного или Ν-связанного гликозилирования. Сайты распознавания аспарагинсвязанного гликозилирования обычно содержат последовательность из трех пептидов, аспарагин-Хтреонин (где X представляет собой любую аминокислоту), которая специфически распознается соответствующими клеточными гликозилирующими ферментами. Такая модификация может быть также введена путем добавления одного или нескольких сериновых или треониновых остатков в последовательность полипептида ΑεΐΚΙΙΒ дикого типа, либо замены на эти остатки в данной последовательности (для сайтов О-связанного гликозилирования). Различные аминокислотные замены или делеции в первом или третьем положениях или в обоих этих положениях аминокислот распознаваемого сайта гликозилирования (и/или аминокислотная делеция во втором положении) приводят к предотвращению гликозилирования в модифицированной последовательности из трех пептидов. Другим методом увеличения числа углеводных молекул в полипептиде ΑεΐΚΙΙΒ является химическое или ферментативное присоединение гликозидов к полипептиду ΑεΐΚΙΙΒ. В зависимости от применяемого метода присоединения, сахар (сахара) может (могут) быть присоединен(ы) к (а) аргинину и гистидину; (Ь) свободным карбоксильным группам; (с) свободным сульфгидрильным группами, таким как сульфгидрильные группы цистеина; (б) свободным гидроксильным группам, таким как группы серина, треонина или гидроксипролина; (е) ароматическим остаткам, таким как остатки фенилаланина, тирозина или триптофана; или (ί) к амидной группе глутамина. Эти методы описаны в \УО 87/05330, опубликованной 11 сентября 1987, и в публикации Арби & νήβΐοη (1981) ΟΚΟ Οήΐ. Κεν. Β^οс11ст.. рр. 259-306, которая вводится в настоящее описание посредством ссылки. Удаление одной или нескольких углеводных групп, присутствующих на полипептиде ΑεΐΚΙΙΒ, может быть осуществлено химически и/или ферментативно. Химическое дегликозилирование может включать, например, обработку полипептида ΑεΐΚΙΙΒ соединением трифторметансульфоновой кислоты или эквивалентным соединением. Такая обработка приводит к отщеплению большинства или всех сахаров, за исключением линкерного сахара (Ν-ацетилглюкозамина или Ν-ацетилгалактозамина), при этом аминокислотная последовательность остается интактной. Химическое дегликозилирование более подробно описано в публикации Нактшиббш εΐ а1. (1987) ΑγοΙι. Βίοοίιειη. Βίορίινβ. 259:52 и Ебде εΐ а1. (1981) Αηαΐ. Βίοοίιειη. 118:131. Ферментативное расщепление углеводных групп на полипептидах ΑεΐΚΙΙΒ может быть достигнуто с использованием различных эндо- и экзо-гликозидаз как описано Т1ю1акига εΐ а1. (1987) Μεΐ1. Еηζутο1. 138:350. Последовательность полипептида ΑεΐΚΙΙΒ может быть скорректирована, если это необходимо, в зависимости от типа используемой экспрессионной системы, поскольку все клетки млекопитающих, дрожжей, насекомых и растений могут иметь различные типы гликозилирования, на которые может влиять аминокислотная последовательность пептида. В общих чертах, белки ΑεΐΚΙΙΒ, которые присутствуют у человека, могут быть экспрессированы в клеточных линиях млекопитающих, таких как клеточные линии НЕК293 или СНО, которые имеют свой собственный тип гликозилирования, хотя предполагается, что могут быть также использованы и другие экспрессионные клеточные линии млекопитающих.
Настоящее изобретение также относится к способу получения вариантов, в частности, серий комбинаторных вариантов полипептидов ΑεΐΚΙΙΒ, включая, но необязательно, усеченные варианты; и пулов комбинаторных мутантов, которые являются особенно подходящими для идентификации функциональных вариантов последовательности. Целью скрининга таких комбинаторых библиотек может быть, например, получение вариантов полипептида ΑεΐΚΙΙΒ, обладающих измененными свойствами, такими как измененные фармакокинетические свойства или измененный характер связывания с лигандом. Ниже описаны различные скрининг-анализы, и такие анализы могут быть проведены для оценки вариантов. Так, например, вариант полипептида ΑεΐΚΙΙΒ может быть скринирован на его способность связываться с полипептидом ΑεΐΚΙΙΒ и на предотвращение связывания лиганда ΑεΐΚΙΙΒ с полипептидом ΑεΐΚΙΙΒ.
Активность полипептида ΑεΐΚΙΙΒ или его вариантов может быть также протестирована в клеточном анализе или в анализе ίη νίνο. Так, например, может быть оценено влияние варианта полипептида ΑεΐΚΙΙΒ на экспрессию генов, участвующих в формировании кости, и в образовании остеобластов или их предшественников. При необходимости это может быть осуществлено в присутствии одного или не
- 13 018868 скольких рекомбинантных белков-лигандов Ас1КНВ (например, ВМР7), а клетки могут быть трансфицированы так, чтобы они продуцировали полипептид АсЖНВ и/или его варианты, и, необязательно, лиганд АсЖПВ. Аналогичным образом, полипептид Ас1КНВ может быть введен мышам или другим животным, а затем могут быть оценены одно или несколько свойств кости, таких как плотность или объем. Может быть также оценена скорость срастания костей после их перелома. Аналогичным образом, активность полипептида Ас®ИВ или его вариантов может быть протестирована в клетках мышц, в адипоцитах и в нервных клетках на любое ее влияние на рост этих клеток, например, с помощью анализов, описанных ниже. Такие анализы являются хорошо известными и могут быть осуществлены рутинными методами. Для мониторинга влияния на последующую передачу сигнала в таких клеточных линиях может быть использован 8МАЭ-чувствительный ген-репортер.
Могут быть получены комбинаторные варианты, которые, по сравнению с природным полипептидом Ас1КНВ, обладают селективной способностью. Такие варианты белков при их экспрессии из рекомбинантных ДНК-конструкций, могут быть использованы в протоколах генотерапии. Аналогичным образом, путем мутагенеза могут быть получены варианты, которые имеют внутриклеточное время полужизни, значительно отличающееся от времени полужизни соответствующего полипептида АсЖНВ дикого типа. Так, например, модифицированный белок может сообщать нативному полипептиду Ас1КНВ большую или меньшую стабильность к протеолитическому расщеплению или к другим процессам, которые приводят к деструкции или к какой-либо другой инактивации нативного полипептида Ас1КНВ. Такие варианты и кодирующие их гены могут быть использованы в целях изменения уровней полипептида Ас1КНВ посредством модуляции времени полужизни полипептидов Ас®ПВ. Так, например, короткое время полужизни может давать более кратковременные биологические эффекты, а в случае использования части индуцибельно экспрессионной системы, оно может более жестко регулировать уровни рекомбинантных полипептидов Ас®ПВ в клетках.
В некоторых вариантах изобретения полипептиды АсГКЛВ согласно изобретению могут также содержать пострансляционные модификации, помимо любых модификаций, которые обычно присутствуют в полипептидах Ас1КНВ. Такими модификациями являются, но не ограничиваются ими, ацетилирование, карбоксилирование, гликозилирование, фосфорилирование, липидизация и ацилирование. В результате этого модифицированные полипептиды Ас1КНВ могут содержать неаминокислотные элементы, такие как полиэтиленгликоли, липиды, поли- или моносахариды и фосфаты. Влияние таких неаминокислотных элементов на функциональные свойства полипептида Ас1КНВ может быть протестировано как описано в настоящей заявке для других вариантов полипептидов Ас®ПВ. Если полипептид АсГКЛВ продуцируется в клетках путем отщепления растущей формы полипептида Ас1КНВ, то для регулирования укладки и/или функции белка важную роль может также играть посттрансляционный процессинг. Различные клетки (такие как СНО, НеЬа, МОСК, 293, ^138, ΝΙΗ-3Τ3 или НЕК293) имеют конкретные клеточные механизмы и характерные механизмы такой посттрансляционной активности, и могут быть выбраны для гарантии соответствующей модификации и процессинга полипептидов Ас®ПВ.
В некоторых аспектах изобретения функциональными вариантами или модифицированными формами полипептидов Ас®ПВ являются слитые белки, имеющие по меньшей мере часть полипептидов АсЖНВ и один или несколько слитых доменов. Хорошо известными примерами таких слитых доменов являются, но не ограничиваются ими, полигистидин, С1и-С1и, глутатион-8-трансфераза (С8Т), тиоредоксин, белок А, С-белок, константная область тяжелой цепи иммуноглобулина (например, Ес), белок, связывающийся с мальтозой (МВР), или альбумин человеческой сыворотки. Слитый домен может быть выбран так, чтобы он сообщал нужные свойства. Так, например, некоторые слитые домены являются особенно подходящими для выделения слитых белков с помощью аффинной хроматографии. Для проведения аффинной очистки используются соответствующие матрицы для аффинной хроматографии, такие как смолы, конъюгированные с глутатионом, амилазой и никелем или кобальтом. Многие такие матрицы поставляются в виде набора, такого как система очистки Рйатташа С8Т и система р1Аехртезз™ (01адеп). в которой используются партнеры по связыванию (ΗΙ86). В другом примере, слитый домен может быть выбран так, чтобы он облегчал детектирование полипептидов АсЖНВ. Примерами таких доменов для детектирования являются различные флуоресцентные белки (например, СЕР), а также эпитопные метки, обычно представляющие собой короткие пептидные последовательности, для которых имеются специфические антитела. Хорошо известными эпитопными метками, которые легко доступны для специфических моноклональных антител, являются метки ЕЬАС, гемаглютинин вируса гриппа (НА), и с-тус. В некоторых случаях слитые домены имеют сайт расщепления протеазой, такой как фактор Ха или тромбин, что позволяет релевантной протеазе частично расщеплять слитые белки и тем самым высвобождать из них рекомбинантные белки. Высвобождаемые белки могут быть затем выделены из слитого домена путем проведения хроматографического разделения. В некоторых предпочтительных вариантах изобретения полипептид Ас®ПВ присоединяют к домену, который стабилизирует полипептид Ас1Р11В ίη νίνο (домен-стабилизатор). Термин стабилизация означает увеличение времени полужизни в сыворотке, независимо от того, происходит ли это вследствие снижения уровня деструкции, снижения уровня выведения из почек или других фармакокинетических эффектов. Известно, что гибриды Ес-части иммуноглобулина сообщают белкам широкого ряда желательные фармакокинетические свойства. Аналогичным
- 14 018868 образом, желательные свойства могут также сообщать гибриды с альбумином человеческой сыворотки. Слитыми доменами других типов, которые могут быть отобраны, являются мультимеризующие (например, димеризующие, тетрамеризующие) домены и функциональные домены (которые сообщают дополнительную биологическую функцию, такую как дополнительная стимуляция роста мышечной массы).
В своем конкретном примере настоящее изобретение относится к слитому белку, который используется в качестве антагониста ΟΌΡ8 и содержит внеклеточный (например, ООР8-связывающий) домен, присоединенный к Рс-домену (например, 8ЕО Ш N0:13).
ТНТСРРСРАРЕЬЬССРЗУГЬЕ’РРКРКОТЬШЗКТРЕУТСЛЩУр(А) νΞΗΕΟΡΕνΚΓΝΜΥνΟΘνΕνΗΝΑΚΤΚΡΚΕΕΟΥΝΕΤΥΚννΒνΤΤνΤΗΏΟΗΕΝσΚΕΥΚΟΚ(А)
УЗЦКАЬРУР1ЕКТ15КАК60РКЕР0УУТЬРРЗРЕЕМТКНОУЗЬТСЕУКСГУРЗО1АУЕИЕЗМС
ОРЕЫЫУКТТРРУЪОЗОСРГЕЬУЗКЪТУРКЗКНООСЫУГЗСЗУМНЕАЪНЫ(А)
НУТ<2КЗЬ5Ъ5РСК*
Рс-домен, предпочтительно, имеет одну или несколько мутаций в таких остатках, как Акр-265, Ьук322 и Акп-434. В некоторых случаях мутантный Рс-домен, имеющий одну или несколько таких мутаций (например, мутацию в Акр-265), обладает пониженной способностью связываться с Рсу-рецептором по сравнению с Рс-доменом дикого типа. В других случаях мутантный Рс-домен, имеющий одну или несколько таких мутаций (например, мутацию в Акп-434), по сравнению с Рс-доменом дикого типа, обладает повышенной способностью связываться с Рс-рецептором, родственным МНС класса I (РсКХ).
Следует отметить, что различные элементы слитых белков могут быть расположены в любом порядке, который позволяет сохранять их желательные функции. Так, например, полипептид АсГКПВ может быть расположен у С-конца по отношению к гетерологичному домену, либо, альтернативно, гетерологичный домен может быть расположен у С-конца по отношению к полипептиду АсГКПВ. Домен полипептида АсГКПВ и гетерологичный домен необязательно должны находиться рядом друг с другом в слитом белке, а дополнительные домены или аминокислотные последовательности могут быть включены со стороны С- или Ν-концов по отношению к любому домену или между этими доменами.
В некоторых вариантах изобретения полипептиды АсГКПВ согласно изобретению содержат одну или несколько модификаций, обладающих способностью стабилизировать полипептиды АсГКПВ. Так, например, такие модификации увеличивают время полужизни полипептидов АсГКПВ ίη уйго, увеличивают время полужизни полипептидов АсГКПВ в кровотоке или снижают уровень протеолитического расщепления полипептидов АсГКПВ. Такими стабилизирующими модификациями являются, но не ограничиваются ими, слитые белки (включая, например, слитые белки, содержащие полипептид АсГКПВ и домен-стабилизатор), модификации сайта гликозилирования (включая, например, присоединение сайта гликозилирования к полипептиду АсГКПВ) и модификации углеводной молекулы (включая, например, удаление углеводных групп из полипептида АсГКПВ). В случае слитых белков полипептид АсГКПВ присоединяют к домену-стабилизатору, такому как молекула 1дО (например, Рс-домену). Используемый здесь термин домен-стабилизатор означает не только слитый домен (например, Рс), как в случае слитых белков, но также включает небелковые модификации, такие как углеводная молекула или небелковый полимер, такой как полиэтиленгликоль.
В некоторых своих вариантах настоящее изобретение относится к получению подходящих выделенных и/или очищенных форм полипептидов АсГКПВ, которые были отделены или как-либо иначе очищены от других белков.
В некоторых вариантах изобретения полипептиды АсГКПВ (немодифицированные или модифицированные) согласно изобретению могут быть получены различными методами, известными специалистам. Так, например, такие полипептиды АсГКПВ могут быть синтезированы стандартными методами химического синтеза белков, такими как методы, описанные в публикациях Войапкку, М. Рппс1р1ек οί Рерййе 8упГйе818, 8ргшдег Уег1ад, Вег1ш (1993) и ОгапГ О. А. (ей.), ЗупГйейс Рср(1йез: А Икег'к Ошйе, Н. Ргеетап & Сотрапу, №\ν Уогк (1992). Кроме того, автоматические синтезаторы пептидов являются коммерчески доступными (например, Айуапсей СйетТесй Мойе1 396; Мййдеп/Вюкеагсй 9600). Альтернативно, полипептиды АсГКПВ, их фрагменты или варианты могут быть рекомбинантно продуцированы с использованием различных экспрессионных систем (например, Е.сой, клеток яичника китайского хомячка, клеток С08, бакуловируса), хорошо известных специалистам (также см. ниже). В другом варианте изобретения модифицированные или немодифицированные полипептиды АсГКПВ могут быть получены путем гидролиза природных или рекомбинантно продуцированных полноразмерных полипептидов Ас1К11В с использованием, например, протеазы, например, трипсина, термолизина, химотрипсина, пепсина или комплексного фермента, конвертирующего основную аминокислоту (РАСЕ). Для идентификации сайтов протеолитического расщепления может быть проведен компьютерный анализ (с использованием коммерчески доступной программы, например, МасУесГог, Отеда, РСОепе, Мо1еси1аг 81ти1аГюп, 1пс.). Альтернативно, такие полипептиды АсГКПВ могут быть получены из природных или рекомбинантно продуцированных полноразмерных полипептидов АсГКПВ известными стандартными методами, такими как метод химического расщепления (например, бромцианом, гидроксиламином).
3. Нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды АсГКПВ.
- 15 018868
В некоторых своих аспектах настоящее изобретение относится к выделенным и/или рекомбинантным нуклеиновым кислотам, кодирующим любой из полипептидов Ас®ПВ (например, растворимые полипептиды Ас!ЯПВ), включая любые описанные здесь варианты. Так, например, ЗЕО ΙΌ N0:4 кодирует природный полипептид-предшественник Ас®ПВ, а ЗЕО ΙΌ N0:3 кодирует растворимый полипептид АсЖЛВ. Рассматриваемые нуклеиновые кислоты могут быть одноцепочечными или двухцепочечными. Такими нуклеиновыми кислотами могут быть молекулы ДНК или РНК. Указанные нуклеиновые кислоты могут быть использованы, например, в методах получения полипептидов Ас®ПВ или в качестве самих терапевтических средств (например, в методе генотерапии).
Из некоторых аспектов изобретения также очевидно, что рассматриваемые нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды Ас®ПВ, включают нуклеиновые кислоты, которые являются вариантами ЗЕО ΙΌ N0:3. Вариантами нуклеотидных последовательностей являются последовательности, которые отличаются одной или несколькими нуклеотидными заменами, добавлениями или делециями, такие как аллельные варианты, а поэтому такими последовательностями являются кодирующие последовательности, которые отличаются от нуклеотидной кодирующей последовательности, представленной в ЗЕО ΙΌ N0:4.
В некоторых своих вариантах настоящее изобретение относится к выделенным или рекомбинантным последовательностям нуклеиновой кислоты, которые по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99 или 100% идентичны ЗЕО ΙΌ N0:3. Для среднего специалиста в данной области совершенно очевидно, что последовательности нуклеиновой кислоты, комплементарные ЗЕО ΙΌ N0:3, и варианты ЗЕО ΙΌ N0:3 также входят в объем настоящего изобретения. В других вариантах изобретения последовательности нуклеиновой кислоты согласно изобретению могут быть выделенными, рекомбинантными и/или присоединенными к гетерологичной нуклеотидной последовательности, либо они могут присутствовать в библиотеке ДНК.
В других вариантах изобретения нуклеиновыми кислотами согласно изобретению также являются нуклеотидные последовательности, которые гибридизуются в условиях высокой жесткости с нуклеотидной последовательностью, представленной в ЗЕО ΙΌ N0:3, с комплементарной последовательностью ЗЕО ΙΌ N0:3, или с их фрагментами. Как обсуждалось выше, для среднего специалиста в данной области совершенно очевидно, что соответствующие условия жесткости, которые стимулируют гибридизацию ДНК, могут варьироваться. Для среднего специалиста в данной области совершенно очевидно, что соответствующие условия жесткости, которые стимулируют гибридизацию ДНК, могут варьироваться. Так, например, может быть осуществлена гибридизация в присутствии 6,0 х хлорида натрия/цитрата натрия (ЗЗС) примерно при 45°С, с последующей промывкой 2,0х ЗЗС при 50°С. Так, например, концентрация соли на стадии промывки может быть выбрана из интервала концентраций, соответствующих условиям низкой жесткости примерно при 2,0х ЗЗС при 50°С, и концентраций, соответствующих условиям высокой жесткости примерно при 0,2х ЗЗС при 50°С. Кроме того, температура в стадии промывки может быть увеличена, начиная от комнатной температуры, соответствующей условиям низкой жесткости примерно 22°С, до температуры, соответствующей условиям высокой жесткости примерно 65°С. Температура и концентрация соли могут варьироваться, при этом один из параметров может оставаться постоянным, например, температура или концентрация соли, а другой параметр может изменяться. В одном из своих вариантов настоящее изобретение относится к нуклеиновым кислотам, которые гибридизуются в условиях низкой жесткости при 6х ЗЗС и при комнатной температуре с последующей промывкой 2х ЗЗС при комнатной температуре.
Выделенные нуклеиновые кислоты, которые отличаются от нуклеиновых кислот, представленных в ЗЕО ΙΌ N0:3, вырожденностью генетического кода, также входят в объем настоящего изобретения. Так, например, ряд аминокислот кодируется более чем одним триплетом. Кодоны, которые соответствуют одной и той же аминокислоте, или синонимичные кодоны (например, САИ и САС являются синонимичными кодонами для гистидина) могут давать молчащие мутации, которые не влияют на аминокислотную последовательность белка. Однако предполагается, что в клетках млекопитающих имеется полиморфизм последовательностей ДНК, который приводит к изменениям в аминокислотных последовательностях рассматриваемых белков. Для специалистов в данной области очевидно, что такие изменения в одном или нескольких нуклеотидах (примерно до 3-5% нуклеотидов) нуклеиновых кислот, кодирующих конкретный белок, могут присутствовать у индивидуумов данного вида вследствие природной аллельной вариабельности. Любые и все указанные нуклеотидные модификации и полиморфизмы аминокислот входят в объем настоящего изобретения.
В некоторых вариантах изобретения рекомбинантные нуклеиновые кислоты согласно изобретению могут быть функционально присоединены к одной или нескольким регуляторным нуклеотидным последовательностям в экспрессионной конструкции. Регуляторные нуклеотидные последовательности обычно присутствуют в клетке-хозяине, используемой для экспрессии. Специалистам известно много типов соответствующих экспрессионных векторов и подходящих регуляторных последовательностей для различных клеток-хозяев. Обычно указанными одной или несколькими регуляторными нуклеотидными последовательностями могут быть, но не ограничиваются ими, промоторные последовательности, лидер
- 16 018868 ные или сигнальные последовательности, сайты связывания с рибосомой, последовательности инициации и терминации транскрипции, последовательности инициации и терминации трансляции и последовательности энхансеров или активаторов. В настоящем изобретении рассматриваются конститутивные или индуцибельные промоторы, известные специалистам. Промоторами могут быть природные промоторы или слитые промоторы, которые объединяют элементы, содержащие более чем один промотор. Экспрессионная конструкция может присутствовать в клетке на эписоме, такой как плазмида, либо такая экспрессионная конструкция может быть встроена в хромосому. В предпочтительном варианте изобретения экспрессионный вектор содержит селективный маркерный ген, что позволяет осуществлять отбор трансформированных клеток-хозяев. Селективные маркерные гены хорошо известны специалистам и могут варьироваться в зависимости от используемой клетки-хозяина.
В некоторых своих аспектах настоящее изобретение относится к рассматриваемой нуклеиновой кислоте, присутствующей в экспрессионном векторе, включающем нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид ΑΛΚΙΙΒ и функционально присоединенную по меньшей мере к одной регуляторной последовательности. Регуляторные последовательности известны специалистам и могут быть выбраны так, чтобы они позволяли осуществлять прямую экспрессию полипептида ΑсίΚΠΒ. В соответствии с этим, термин регуляторная последовательность включает промоторы, энхансеры и другие элементы регуляции экспрессии. Репрезентативные регуляторные последовательности описаны в публикации Соеббе1; Оепе Ехргеккюп Тесйпо1оду: МеШобз ίη Еп/уто1оду, Αсабет^с Ргезз, 8ап П1едо, СΑ (1990). Так, например, любая из последовательностей регуляции экспрессии широкого ряда, регулирующих экспрессию последовательности ДНК, при ее функциональном присоединении к данной последовательности, может быть использована в данных векторах для экспрессии последовательностей ДНК, кодирующих полипептид ΑсίΚIIΒ. Такими подходящими последовательностями регуляции экспрессии являются, например, ранний и поздний промотор 8У40, промотор 1еЕ предранний промотор аденовируса или цитомегаловируса, промоторы Κδν, система 1ас, система 1гр, система ТАС или ТЕС, промотор Т7, экспрессия которого регулируется РНК-полимеразой Т7, главные операторные и промоторные области фага лямбда, регуляторные области оболочечного белка £б, промотор 3-фосфоглицераткиназы или других гликолитических ферментов, промоторы кислотной фосфатазы, например, Р1ю5, промоторы дрожжевых факторов скрещивания α, полиэдроновый промотор бакуловирусной системы и другие последовательности, которые, как известно, регулируют экспрессию генов прокариотических или эукариотических клеток или их вирусов и различные их комбинации. Следует отметить, что конструирование экспрессионного вектора может зависеть от таких факторов, как выбор трансформируемой клетки-хозяина и/или типа белка, предназначенного для экспрессии. Кроме того, необходимо также учитывать число копий векторов, способность регулировать число таких копий и уровень экспрессии любого другого белка, кодируемого вектором, такого как антибиотики-маркеры.
Рекомбинантная нуклеиновая кислота согласно изобретению может быть продуцирована путем лигирования клонируемого гена или его части в вектор, подходящий для экспрессии в любых прокариотических клетках, эукариотических клетках (дрожжей, птиц, насекомых или млекопитающих) или в обеих этих клетках. Экспрессионными носителями для продуцирования рекомбинантного полипептида ЛсίΚΙΙΒ являются плазмиды и другие векторы. Так, например, подходящими векторами являются плазмиды следующих типов: плазмиды, происходящие от ρΒΚ322; плазмиды, происходящие от ρΕΜΒΕ; плазмиды, происходящие от рЕХ; плазмиды, происходящие от рВТас; и плазмиды, происходящие от рИС, которые могут быть использованы для экспрессии в прокариотических клетках, таких как Е.со11.
Некоторые экспрессионные векторы млекопитающих содержат прокариотические последовательности, облегчающие размножение векторов в бактериях, и одну или несколько эукариотических транскрипционных единиц, которые экспрессируются в эукариотических клетках. Примерами экспрессионных векторов млекопитающих, подходящих для трансфекции эукариотических клеток, являются векторы, происходящие от ρс^NΑI/атρ, ρс^NΑI/ηеο, ρΚΥΜν, ρδν2§ρΐ, ρδV2ηеο, ρδν2-61ιίϊ, рТк2, рВ^пео, рМ8С, ρδνΊ7, ]эко-пео и ]эНуд. Для облегчения репликации и отбора на резистентность к лекарственному средству в прокариотических и эукариотических клетках некоторые из этих векторов модифицируют последовательностями, происходящими от бактериальных плазмид, таких как ρΒΚ322. Альтернативно, для временной экспрессии белков в эукариотических клетках могут быть использованы производные вирусов, таких как вирус бычьей папилломы (ΒΡν-1) или вирус Эпштейна-Барра (ρΗΕΒο, ρΚΕΡпроизводное и р205). Примеры других вирусных экспрессионных систем (включая ретровирусные системы) можно найти ниже в разделе Системы доставки методами генотерапии. Различные методы, применяемые для получения плазмид и трансформации организмов-хозяев, хорошо известны специалистам. Описание других подходящих экспрессионных систем для прокариотических и эукариотических клеток, а также описание общих процедур рекомбинации можно найти в руководстве Мо1еси1аг С1ошпд Α ЬаЬогаЮгу Мапиа1, 2пб Еб., еб. 8атЬгоок, Ег1(ксН & Машабз (Со1б δρππβ НагЬог БаЬогаЮгу Ргезз, 1989) Οιηρ1ег8 16 апб 17. В некоторых случаях может оказаться желательным экспрессировать рекомбинантные полипептиды с использованием бакуловирусной экспрессионной системы. Примерами таких бакуловирусных экспрессионных систем являются векторы, происходящие от ρΥΕ (такие как ρΥΕ1392, ρΥΕ1393 и ρνΕ941), векторы, происходящие от ρΑ^ν (такие как ρΑ^ν1) и векторы, происходящие от ρΒ1иеΒас
- 17 018868 (такие как β-даКсодержащий вектор рВ1иеВас III).
В предпочтительном варианте изобретения для продуцирования рассматриваемых полипептидов АсЖПВ в клетках СНО могут быть сконструированы такие векторы, как вектор Рсшу-8спр1 (81га!адепе, Ьа 1о11а, СаИГ.), векторы рс^NА4 ПпуЦгодеп, СагкЬай, Са11£.) и векторы рС1-пео (Рготеда, Майкоп, \У1ке). Следует отметить, что рассматриваемые генные конструкции могут быть использованы для индуцирования экспрессии рассматриваемых полипептидов Ас£КИВ в клетках, размножаемых в культуре, например, для продуцирования белков, включая слитые белки или варианты белков, и для их очистки.
Настоящее изобретение также относится к клетке-хозяину, трансфицированной рекомбинантным геном, включая последовательность (например, 8Ε0 ΙΌ N0:4), кодирующую один или несколько рассматриваемых полипептидов Ас®ЛВ. Клеткой-хозяином может быть любая прокариотическая или эукариотическая клетка. Так, например, полипептид АсЖНВ согласно изобретению может быть экспрессирован в бактериальных клетках, таких как Е.соН, клетки насекомых (например, с использованием бакуловирусной экспрессионной системы), клетки дрожжей или клетки млекопитающих. Специалистам известны и другие подходящие клетки-хозяева.
В соответствии с этим, настоящее изобретение также относится к способам продуцирования рассматриваемых полипептидов Ас®ЛВ. Так, например, клетки-хозяева, трансфицированные экспрессионным вектором, кодирующим полипептид Ас®ЛВ, могут быть культивированы в условиях, подходящих для экспрессии полипептида Ас£КИВ. Полипептид Ас®ИВ может быть секретирован и выделен из смеси клеток и среды, содержащей полипептид Ас£КИВ. Альтернативно, полипептид Ас®ЛВ может сохраняться в цитоплазме или в мембранной фракции, после чего клетки собирают, подвергают лизису и выделяют белок. Клеточная культура включает клетки-хозяева, среду и другие побочные продукты. Подходящие среды для культивирования клеток хорошо известны специалистам. Рассматриваемые полипептиды АсЙПВ могут быть выделены из среды для культивирования клеток, клеток-хозяев или того и другого известными методами, применяемыми для очистки белков, включая ионообменную хроматографию, гель-фильтрацию, ультрафильтрацию, электрофорез и иммуноаффинную очистку с использованием антител, специфичных к конкретным эпитопам полипептидов Ас®ИВ. В предпочтительном варианте изобретения полипептидом Ас£КИВ является слитый белок, содержащий домен, который облегчает его очистку.
В другом варианте изобретения слитый ген, кодирующий лидерную последовательность для очистки, такую как последовательность сайта расщепления поли-(Н1к)/энтерокиназой, расположенную у Νконца нужной части рекомбинантного полипептида Ас®ИВ, может обеспечивать очистку экспрессируемого слитого белка с помощью аффинной хроматографии, проводимой с использованием смолы, связанной с металлом Νί2+. Для очистки лидерная последовательность может быть затем удалена путем обработки энтерокиназой с получением очищенного полипептида АсЖИВ (например, см. НосНнИ е! а1., (1987) 1. СНготаЮщарНу 411:177; и 1апкпесН1 е! а1., ΡΝΑ8 И8А 88:8972).
Методы получения слитых генов хорошо известны специалистам. По существу, присоединение различных ДНК-фрагментов, кодирующих различные полипептидные последовательности, осуществляют в соответствии со стандартными методами с применением затупленных концов или липких концов со ступенчатыми разрывами для лигирования; гидролиза рестриктирующими ферментами для образования соответствующих концов; достраивания липких концов, если это необходимо; обработки щелочной фосфатазой во избежание нежелательного присоединения, и ферментативного лигирования. В другом варианте изобретения слитый ген может быть синтезирован стандартными методами, включая использование автоматизированных синтезаторов ДНК. Альтернативно, ПЦР-амплификация генных фрагментов может быть осуществлена с использованием заякоривающих праймеров, которые образуют комплементарные выступающие концы между двумя расположенными друг за другом генными фрагментами, которые затем могут быть подвергнуты отжигу с получением химерной генной последовательности (см., например, Сштеп! Рго!осо1к ίη Мо1еси1аг Вю1оду, е,к. АнкнЬе1 е! а1., 1оНп \УПеу & 8опк: 1992).
4. Антитела.
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к антителам. Антитело, которое специфически реагирует с полипептидом Ас®ЛВ (например, с растворимым полипептидом Ас(К11В) и которое конкурентно связывается с полипептидом АсЖИВ, может быть использовано в качестве антагониста активности полипептида Ас®ЛВ. Так, например, с использованием иммуногенов, происходящих от полипептида Ас®ИВ, могут быть получены антисыворотка или моноклональные антитела против белков/пептидов в соответствии со стандартными протоколами (см., например, АпйЬойек: А ЬаЬогайгу Мапиа1 е,. Наг1о\у & Ьапе (Со1, 8ргтд НагЬог Ргекк: 1988)). Млекопитающее, такое как мышь, хомячок или кролик, может быть иммунизировано иммуногенной формой полипептида Ас®ИВ, антигенным фрагментом, обладающим способностью вырабатывать ответ типа продуцирования антител, или слитым белком. Методы сообщения иммуногенности белку или пептиду включают конъюгирование с носителями или другие способы, хорошо известные специалистам. Иммуногенная часть полипептида Ас®ЛВ может быть введена в присутствии адъюванта. Мониторинг процесса иммунизации может быть проведен путем детектирования титров антител в плазме или сыворотке. Для оценки уровней антител могут быть проведены стандартный ЕЬ18А или другие иммуноанализы с использованием иммуногена в качестве
- 18 018868 антигена.
После иммунизации животного антигенным препаратом полипептида АсЖПВ может быть получена антисыворотка, и, если это необходимо, из такой сыворотки могут быть выделены поликлональные антитела. Для продуцирования моноклональных антител у иммунизованного животного могут быть собраны антитело-продуцирующие клетки (лимфоциты), а затем, в соответствии со стандартными процедурами слияния соматических клеток, эти клетки могут быть подвергнуты слиянию с иммортализованными клетками, такими как клетки миеломы, в результате чего могут быть получены гибридомные клетки. Такие методы хорошо известны специалистам и включают, например, гибридомный метод (впервые разработанный КоЫег и М115(е1п, (1975) Шипе, 256: 495-497), гибридомный метод с использованием человеческих В-клеток (КохЬаг е! а1., (1983) 1ттипо1оду Тойау, 4: 72), и ЕВУ-гибридомный метод для продуцирования человеческих моноклональных антител (Со1е е! а1., (1985) Мопос1опа1 АпйЬоФек апй Сапсег ТНегару, А1ап В. Ь188, 1пс. рр. 77-96). Гибридомные клетки могут быть скринированы иммунохимическим методом на продуцирование антител, специфически реагирующих с полипептидом АсГВПВ, и моноклональных антител, выделенных из культуры, содержащей такие гибридомные клетки.
Используемый здесь термин антитело включает фрагменты антитела, которые также специфически реагируют с рассматриваемым полипептидом АсГВНВ. Антитела могут быть фрагментированы стандартными методами, и полученные фрагменты могут быть скринированы на возможность их использования в описанных выше способах, применяемых для целых антител. Так, например, Р(аЬ')2-фрагменты могут быть получены путем обработки антитела пепсином. Так, например, Р(аЬ')2-фрагмент может быть обработан для восстановления дисульфидных мостиков в целях продуцирования РаЬ-фрагментов. Термин антитело согласно изобретению также включает биспецифические, одноцепочечные, химерные и гуманизированные молекулы, обладающие аффинностью по отношению к полипептиду АсГВНВ, сообщаемой по меньшей мере одной областью СОВ данного антитела. В предпочтительных вариантах изобретения указанное антитело также содержит присоединенную к нему метку, которая может быть детектирована (например, такой меткой может быть радиоизотоп, флуоресцентное соединение, фермент и кофактор фермента).
В некоторых предпочтительных вариантах изобретения антителом согласно изобретению является моноклональное антитело, а в некоторых своих вариантах настоящее изобретение относится к способу разработки подходящих методов получения новых антител. Так, например, метод получения моноклонального антитела, которое специфически связывается с полипептидом Ас1ВПВ, может включать введение мышам иммуногенной композиции, содержащей полипептид Ас1ВЛВ, в количестве, эффективном для стимуляции детектируемого иммунного ответа; получение антитело-продуцирующих клеток (например, клеток селезенки) у этих мышей; слияние указанных антитело-продуцирующих клеток с миеломными клетками для получения антитело-продуцирующих гибридом и тестирование антителопродуцирующих гибридом для идентификации гибридомы, продуцирующей моноклональное антитело, которое специфически связывается с полипептидом Ас1ВПВ. Гибридома, после ее получения, может быть размножена в клеточной культуре, необязательно в условиях культивирования, при которых гибридомные клетки продуцируют моноклональное антитело, которое специфически связывается с полипептидом Ас1ВПВ. Моноклональное антитело может быть выделено из клеточной культуры.
Используемое здесь определение специфически реагирующий с..., если оно относится к антителу, означает, как в общих чертах известно специалистам, что данное антитело является достаточно селективным по отношению к представляющему интерес антигену (например, к полипептиду Ас1ВПВ), но не к другим не представляющим интерес антигенам, и что данное антитело может быть использовано, как минимум, для детектирования присутствия представляющего интерес антигена в биологическом образце конкретного типа. В некоторых способах, в которых используется данное антитело, таких как терапевтические методы, может оказаться желательной более высокая степень специфичности связывания. Моноклональные антитела обычно имеют более высокую тенденцию (по сравнению с поликлональными антителами) к эффективному распознаванию нужных антигенов, но не перекрестно реагирующих полипептидов. Одним из факторов, который влияет на специфичность взаимодействия антитело:антиген, является аффинность антитела к антигену. Хотя нужная специфичность может достигаться в интервале различных аффинностей, однако, в основном, предпочтительные антитела должны обладать аффинностью (должны иметь константу диссоциации), составляющей примерно 10-6, 10-7, 10-8, 10-9 или менее.
Кроме того, выбор методов, используемых для скрининга антител в целях идентификации нужного антитела, может зависеть от свойств полученного антитела. Так, например, если антитело используется для связывания с антигеном в растворе, то может оказаться желательным проведение теста на связывание в растворе. Для тестирования взаимодействия между антителами и антигенами в целях идентификации особенно подходящих антител применяется ряд различных методов. Такими методами являются ЕЬ18А, анализы на связывание методом поверхностного плазмонного резонанса (например, анализ на связывание В1асоге, В1а-соге АВ, Ирр8а1а, 8^ейеп), сэндвич-анализы (например, система парамагнитных сфер IСЕN 1п!егпа!1опа1, 1пс., СайЬегаЬигд, Магу1апй), вестерн-блот-анализы, анализы методом иммунопреципитации и иммуногистохимический анализ.
В некоторых своих аспектах настоящее изобретение относится к антителам, которые связываются с
- 19 018868 растворимым полипептидом ΑсΐΚIIΒ. Такие антитела могут быть получены, в основном, как описано выше, с использованием растворимого полипептида ΑсΐΚIIΒ или его фрагмента в качестве антигена. Антитела этого типа могут быть использованы, например, для детектирования полипептидов ΑсΐΚIIΒ в биологических образцах и/или для мониторинга уровней растворимых полипептидов ΑсΐΚIIΒ у индивидуума. В некоторых случаях антитело, которое специфически связывается с растворимым полипептидом ΑΛΚΙΙΒ, может быть использовано для модуляции активности полипептида ΑΛΚΙΙΒ и/или лиганда Α^ ΐΚΙΙΒ, и, тем самым, регуляции (стимуляции или ингибирования) роста тканей, таких как ткани костей, хрящей и мышц; жировые ткани и нервные ткани.
5. Скрининг-анализы.
В некоторых своих аспектах настоящее изобретение относится к применению рассматриваемых полипептидов ΑΛΚΙΙΒ (например, растворимых полипептидов ΑсΐΚIIΒ) для идентификации соединений (агентов), которые являются агонистами или антагонистами полипептидов ΑΛΚΙΙΒ. Соединения, идентифицированные с помощью такого скрининга, могут быть протестированы в таких тканях, как ткани костей, хрящей и мышц; жировые ткани и/или нервные ткани, для оценки способности этих соединений модулировать рост ткани ίη уйго. Данные соединения могут быть также, но необязательно, протестированы на животных-моделях для оценки способности этих соединений модулировать рост ткани ίη у1уо.
Существует множество методов скрининга терапевтических средств, модулирующих рост ткани, путем нацеливания на полипептиды ΑсΐΚIIΒ. В некоторых вариантах изобретения может быть осуществлен крупномасштабный скрининг соединений для идентификации агентов, которые устраняют влияние ΑсΐΚIIΒ-опосредуемых эффектов на рост кости, хряща, мышц, жировой ткани и/или нейронов. В некоторых вариантах изобретения осуществляют анализ для скрининга и идентификации соединений, которые специфически ингибируют или подавляют связывание полипептида ΑсΐΚIIΒ с его партнером по связыванию, таким как лиганд ΑсΐΚIIΒ (например, активин, №ба1, СОР8, СЭЕ11 или ВМР7). Альтернативно, может быть осуществлен анализ для идентификации соединений, которые повышают уровень связывания полипептида ΑсΐΚIIΒ с белком-партнером по связыванию, таким как лиганд ΑсΐΚIIΒ. В другом варианте изобретения такие соединения могут быть идентифицированы на их способность взаимодействовать с полипептидом ΑсΐΚIIΒ.
Существует достаточное число форматов анализов, которые точно не описаны в настоящем изобретении, но тем не менее они известны среднему специалисту в данной области. Как описано в настоящей заявке, тестируемые соединения (агенты) согласно изобретению могут быть получены любым комбинаторным химическим методам. Альтернативно, рассматриваемые соединения могут быть ίη у1уо или ίη уйго синтезированы естественным образом как биомолекулы. Такие соединения (агенты), тестируемые на их способность действовать как модуляторы роста ткани, могут быть продуцированы, например, бактериями, дрожжами, растениями или другими организмами (например, природные продукты), химическими методами (например, в виде небольших молекул, включая пептидомиметики) или рекомбинантными методами. Тестируемыми соединениями, рассматриваемыми в настоящей заявке, являются непептидильные органические молекулы, пептиды, полипептиды, пептидомиметики, сахара, гормоны и молекулы нуклеиновой кислоты. В конкретном варианте изобретения тестируемым агентом является небольшая органическая молекула, молекулярная масса которой составляет примерно менее чем 2000 Да.
Тестируемые соединения согласно изобретению могут быть получены в виде одной дискретной молекулы или в виде более сложных библиотек, таких как библиотеки, полученные химическим комбинаторным методом. Такие библиотеки могут включать, например, спирты, алкилгалогениды, амины, амиды, сложные эфиры, альдегиды, простые эфиры и органические соединения других классов. Тестируемые соединения могут быть презентированы тест-системе в выделенной форме или в виде смеси соединений, в частности, в начальных стадиях скрининга. Такие соединения могут быть, но необязательно, дериватизированы другими соединениями и могут иметь дериватизирующие группы, облегчающие выделение данных соединений. Неограничивающими примерами дериватизирующих групп являются биотин, флуоресцеин, дигоксигенин, белок, флуоресцирующий в зеленом диапазоне спектра, изотопы, полигистидин, магнитные сферы, глутатион-8-трансфераза (С8Т), фотоактивируемые сшивающие агенты или любые их комбинации.
Во многих программах скрининга лекарственных средств, в которых тестируют библиотеки соединений и природных экстрактов, для максимизации числа соединений, наблюдаемых в данный период времени, может оказаться желательным проведение анализов в крупномасштабном формате. Анализы, осуществляемые в бесклеточных системах, например системах, которые могут быть модифицированы очищенными или наполовину очищенными белками, часто и предпочтительно используются в качестве предварительного скрининга, то есть такие анализы могут быть разработаны для быстрого выявления и относительно легкого детектирования модификации в молекулярной мишени, опосредуемой тестируемым соединением. Кроме того, токсическое воздействие на клетку или биологическая доступность тестируемого соединения, могут, вообще говоря, не учитываться в ίη уйго системе, а вместо этого все внимание в этом анализе может быть сфокусировано, главным образом, на влиянии лекарственного средства на молекулярную мишень, которое может проявляться в модификации аффинности связывания полипептида ΑсΐΚIIΒ со связывающимся с ним белком (например, лигандом ΑсΐΚIIΒ).
- 20 018868
В репрезентативном скрининг-анализе согласно изобретению, который описан здесь лишь для иллюстрации, представляющее интерес соединение подвергают контактированию с выделенным и очищенным полипептидом АсДКПВ, обычно способным связываться с лигандом АсДКЛВ, если это необходимо для проведения данного анализа. Затем к смеси соединения и полипептида АсДКДДВ добавляют композицию, содержащую лиганд АсДКДДВ. Детектирование и количественная оценка комплексов Ас®ИВ/лиганд АсДКДДВ представляют собой методы определения эффективности соединений в ингибировании (или потенцировании) образования комплексов между полипептидом АсДКДДВ и связывающимся с ним белком. Эффективность данного соединения может быть оценена путем построения кривой дозаответ на основании данных, полученных с использованием различных концентраций тестируемого соединения. Кроме того, может быть также осуществлен анализ с контролем, в котором для сравнения используется фоновый уровень. Так, например, в анализе с контролем, выделенный и очищенный лиганд АсЖПВ добавляют к композиции, содержащей полипептид АсДКПВ, и образование комплекса АсЖЛВ/лиганд АсДКДДВ количественно оценивают в отсутствие тестируемого соединения. При этом следует отметить, что, по существу, порядок смешивания реагентов может варьироваться, и такие реагенты могут быть смешаны одновременно. Кроме того, для разработки подходящей бесклеточной аналитической системы вместо очищенных белков могут быть использованы клеточные экстракты и лизаты.
Образование комплексов между полипептидом АсДКДДВ и связывающимся с ним белком может быть детектировано различными методами. Так, например, модуляция образования комплексов может быть количественно оценена с использованием, например, детектируемо меченных белков, таких как О'О ОГ 1 Я О радиоактивно меченные (например, Р, Б, С или Н), флуоресцентно меченные (например, ФИТЦ) или ферментативно меченные полипептид АсДКДДВ или связывающийся с ним белок, с помощью иммуноанализа или хроматографического детектирования.
В некоторых вариантах настоящего изобретения рассматривается применение анализов с поляризацией флуоресценции и анализов с переносом флуоресцентной резонансной энергии (РКЕТ) для прямого или непосредственного измерения степени взаимодействия между полипептидом АсДКДДВ и связывающимся с ним белком. Кроме того, во многих вариантах изобретения могут применяться и другие способы детектирования, например, с использованием оптических волноводов (публикация РСТ \У0 96/26432 и патент США N0. 5677196), поверхностного плазмонного резонанса (БРК), датчиков поверхностных зарядов и датчиков поверхностного натяжения.
Кроме того, в настоящем изобретении рассматривается применение анализа, проводимого посредством взаимодействия по типу захвата, также известного как анализ с использованием двухкомпонентного гибрида, который осуществляют в целях идентификации агентов, ингибирующих или потенцирующих взаимодействие между полипептидом АсДКДДВ и связывающимся с ним белком. См., например, патент США N0. 5283317; Ζβτνοκ е! а1. (1993) Се11 72:223-232; Макита е! а1. (1993) Д. Бю1. Сйет 268:12046-12054; ВайеД е! а1. (1993) ВДоДесйиДдиек 14:920-924; и ДтаЬисйД е! а1. (1993) 0псодепе 8:16931696). В конкретном варианте изобретения рассматривается использование обратимых двухкомпонентных слитых систем для идентификации соединений (например, небольших молекул или пептидов), которые нарушают взаимодействие между полипептидом АсДКДДВ и связывающимся с ним белком. См., например, νίώ·ι1 & ЬедтаДп, (1999) №.1с1ею АсДбк Кек 27:919-29; νίώ·ι1 & ЬедтаДп, (1999) Ттепбк Вю!есйпо1 17:374-81; и патенты США №№ 5525490, 5955280 и 5965368.
В некоторых вариантах изобретения рассматриваемые соединения идентифицируют по их способности взаимодействовать с полипептидом АсДКДДВ согласно изобретению. Взаимодействие между указанным соединением и полипептидом АсДКДДВ может быть ковалентным или нековалентным. Так, например, такое взаимодействие может быть идентифицировано на уровне белка с применением биохимических методов ш νίΐτο, включая перекрестное сшивание под действием оптически активных агентов, связывание с радиоактивно меченным лигандом и аффинную хроматографию (ДакоЬу У.В. е! а1., 1974, Ме!йой§ 1п Епхуто1оду 46: 1). В некоторых случаях соединения могут быть скринированы в анализе на основе механизма их действия, таком как анализ на соединения, которые связываются с полипептидом АсДКДДВ. Таким анализом может быть твердофазный анализ на связывание или анализ на связывание в растворе. Альтернативно, ген, кодирующий полипептид АсДКДДВ, вместе с репортерной системой (например, β-галактозидазой, люциферазой или белком, флуоресцирующим в зеленом диапазоне спектра), может быть трансфицирован в клетку, а затем библиотеку скринируют, предпочтительно, путем высокопроизводительного скрининга или с использованием отдельных членов библиотеки. Могут быть использованы и другие анализы на связывание, проводимые на основе определенного механизма, например, анализы на связывание, которые позволяют детектировать изменение свободной энергии. Анализы на связывание могут быть проведены с использованием мишени, фиксированной на лунке, на сферах или на чипах, или захваченной иммобилизованным антителом, или выделенной путем капиллярного электрофореза. Связанные соединения могут быть, в основном, детектированы с помощью колориметрического или флуоресцентного анализа, или методом поверхностного плазмонного резонанса.
В некоторых своих аспектах настоящее изобретение относится к способам и агентам для стимуляции роста мышц и увеличения мышечной массы, например, путем подавления функций полипептида АсДКДДВ и/или лиганда АсДКДДВ. Поэтому любое идентифицированное соединение может быть протести
- 21 018868 ровано в целых клетках или тканях, ίη νίίτο или ίη νίνο, для подтверждения его способности модулировать рост мышечной массы. Для осуществления этих целей могут быть применены различные методы, известные специалистам. Так, например, могут быть осуществлены такие способы согласно изобретению, которые позволяют подавлять или ингибировать передачу сигнала посредством белка Ас!В11В, активированного путем связывания с лигандом Ас!ВНВ (например, СИР8). Следует отметить, что рост мышечной ткани в организме приводит к увеличению мышечной массы в организме по сравнению с мышечной массой соответствующего организма (или популяции организмов), в котором не происходит передачи сигнала посредством белка Ас!ВПВ.
Так, например, влияние полипептидов Ас!ВПВ или тестируемых соединений на рост/пролиферацию мышечных клеток может быть определено путем измерения уровней экспрессии генов Рах-3 и Му£-5, которые ассоциированы с пролиферацией миогенных клеток, и уровней экспрессии гена МуоЭ, которая ассоциируется с дифференциацией мышц (например, Ат11юг е1 а1., Оеу В1о1. 2002, 251:241-57). Известно, что СИР8 ингибирует экспрессию генов Рах-3 и Му£-5 и предупреждает экспрессию генов МуоИ. Предполагается, что полипептиды Ас!ВНВ или тестируемые соединения подавляют такую активность СИР8. Другой пример клеточных анализов включает измерение уровня пролиферации миобластов, таких как миобласты С(2)С(12) в присутствии полипептидов Ас!ВПВ или тестируемых соединений (например, ТЬотак е1 а1., ί Бю1 СЬет. 2000, 275:40235-43).
В настоящем изобретении также рассматриваются анализы ίη νί\Ό, проводимые для измерения мышечной массы и силы. Так, например, в публикации \У1Ш1етоге е1 а1. (ВюсЬет ВюрЬук Век Соттип. 2003, 300:965-71) описан метод измерения уровня увеличения массы скелетной мышцы и силы сокращения мышцы у мышей. Этот метод может быть использован, но необязательно, для определения терапевтического влияния тестируемых соединений (например, полипептидов Ас!ВПВ) на мышечные заболевания и патологии, например, на такие состояния, которые ассоциируются с ограничением мышечной массы.
В некоторых своих аспектах настоящее изобретение относится к способам и агентам для модуляции (стимуляции или ингибирования) образования кости и увеличения массы кости. Поэтому любое идентифицированное соединение может быть протестировано в целых клетках или тканях ίη νίΙΐΌ или ίη νί\Ό для подтверждения его способности модулировать рост костей или хрящей. Для этой цели могут быть применены различные методы, известные специалистам.
Так, например, влияние полипептидов Ас!ВПВ или тестируемых соединений на рост костей или хряща может быть определено путем измерения уровня индуцирования Мкх2 или дифференцировки преостеобластов (мезенхимных клеток) в остеобласты в клеточных анализах (см., например, Иа1шкк1 е1 а1., №к СеиеТ 2001, 27(1):84-8; Нто е1 а1., Ргой Вюксг 2004, 9:1520-9). Другим примером клеточных анализов является анализ остеогенной активности рассматриваемых полипептидов Ас!ВПВ и тестируемых соединений в преостеобластах и остеобластах. Для иллюстрации следует отметить, что для инфицирования плюрипотентных мезенхимных преостеобластов С3Н10Т1/2, преостеобластов С2С12 и остеобластов ТЕ-85 были сконструированы рекомбинантные аденовирусы, экспрессирующие Ас!ВПВ. Затем определяют остеогенную активность путем измерения уровня индуцирования щелочной фосфатазы, остеокальцина и минерализации матрикса (см., например, СТеид е1 а1., Р Ьоме Ло1и( Зигд. Ат. 2003, 85-А(8): 154452).
В настоящем изобретении также рассматривается анализы ίη νί\Ό, проводимые для измерения уровня роста костей или хряща. Так, например, в публикации №ткипд-МаЦ11а1 е1 а1., Воне, 28:80-86 (2001) описаны крысы с моделью остеопороза, на которых проводили исследования по репарации кости через короткий период времени после перелома. В публикации КиЬо е1 а1., З1егснб В1осЬет1к1гу & Мо1еси1аг Вю1оду, 68:197-202 (1999) также описаны крысы с моделью остеопороза, на которых проводили исследования по репарации кости через более длительный период времени после перелома. Работы, в которых приводится описание крысиной модели для исследования перелома костей при остеопорозе, во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки. В некоторых своих аспектах настоящее изобретение относится к анализам на срастание костей при переломах, известным специалистам. Такими анализами являются анализ, в котором провоцируют переломы, и гистологический и биохимический анализы, описанные, например, в патенте США Ж. 6521750, который во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки и в котором описаны экспериментальные протоколы провоцирования переломов, а также измерения степени переломов и процессов их репарации.
В некоторых своих аспектах настоящее изобретение относится к способам и агентам для регуляции увеличения массы тела и ожирения. На клеточном уровне в развитии ожирения важную роль играет пролиферация и дифференцировка адипоцитов, что приводит к образованию дополнительных жировых клеток (адипоцитов). Поэтому любое идентифицированное соединение может быть протестировано в целых клетках или тканях ίη νίΙΐΌ или ίη νί\Ό для подтверждения способности этих соединений модулировать адипогенез путем измерения уровня пролиферации или дифференцировки адипоцитов. Для этой цели могут быть применены различные методы, известные специалистам. Так, например, влияние полипептида Ас!В11В (например, растворимого полипептида АсЖНВ) или тестируемых соединений на адипогенез может быть определено путем измерения уровня дифференцировки преадипоцитов 3Т3-Ь1 в зрелые ади
- 22 018868 поциты в клеточных анализах, например, путем наблюдения аккумуляции триацилглицерина в везикулах, окрашенных масляным красным О, и выявления некоторых маркеров адипоцитов, таких как РАВР (аР2/422) и РРАКу 2. См., например, Кеиксй е! а1., 2000, Мо1 Се11 В1о1. 20:1008-20; Эепд е! а1., 2000, Епбосг1по1оду. 141:2370-6; Вс11 е! а1., 2000, 0Ьек Кек. 8:249-54. Другим примером клеточных анализов является анализ роли полипептидов АйКПВ и тестируемых соединений в пролиферации адипоцитов или клеток-предшественников адипоцитов (например, клеток 3Т3-Ы), например, путем монитринга бромдезоксиуридин (ВЖ^-позитивных клеток. См., например, Р1со е! а1., 1998, Мо1. Се11. ВшсНет. 189:1-7; Макипо е! а1., 2003, Тох1со1 8ск 75:314-20.
Следует отметить, что скрининг-анализы согласно изобретению применяются не только для рассматриваемых полипептидов АсЖПВ и вариантов полипептидов АсЖПВ, но также и для любых тестируемых соединений, включая агонисты и антагонисты полипептидов ЛсΐКIIБ. Кроме того, эти скрининганализы могут быть проведены для подтверждения эффективности нужных лекарственных средств и для контроля их качества, 6.
Репрезентативное терапевтическое применение
В некоторых вариантах изобретения композиции (например, полипептидов ЛсΐКIIБ) согласно изобретению могут быть использованы для лечения или предупреждения заболевания или состояния, которые ассоциируются с аномальной активностью полипептида АсЖПВ и/или лиганда АсЖПВ (например, ΟΌΡ8). Такие заболевания, расстройства или состояния называются здесь общим термином ЛсЖIIБассоциированные состояния. В некоторых своих вариантах настоящее изобретение относится к способам лечения или предупреждения заболевания у индивидуума, нуждающегося в этом, путем введения указанному индивидууму терапевтически эффективного количества полипептида ЛсΐКIIБ, описанного выше. Такие способы являются особенно подходящими для терапевтического или профилактического лечения животных, а более предпочтительно, человека.
Используемый здесь термин терапевтическое соединение, которое предупреждает развитие расстройства или состояния, означает соединение, которое, в статистическом образце, подавляет развитие расстройства или состояния в обработанном образце, по сравнению с необработанным контрольным образцом, или замедляет начало развития или ослабляет тяжесть одного или нескольких симптомов такого расстройства или состояния по сравнению с необработанным контрольным образцом. Используемый здесь термин лечение включает профилактику указанного состояния, ослабление или предотвращение его развития после диагностики такого состояния.
Комплексы Ас^КПВ/лиганд АсЖПВ играют важную роль в росте ткани, а также на ранних процессах развития, таких как регуляция образования различных структур, или в одной или нескольких постэволюционных функциях, включая развитие половой функции, продуцирование гормонов гипофиза и образование костей и хряща. Таким образом, ЛсЖIIБ-ассоциированными состояниями являются аномальный рост ткани и дефекты развития. Кроме того, ЛсЖIIБ-ассоциированными состояниями являются, но не ограничиваются ими, состояния, ассоциированные с нарушением роста и дифференцировки клеток, такие как воспаление, аллергия, аутоиммунные заболевания, инфекционные заболевания и опухоли.
Репрезентативными Ас^КИВ-ассоциированными состояниями являются нейромышечные расстройства (например, мышечная дистрофия и атрофия мышц), хроническая обструктивная болезнь легких (и гипотрофия мышц, ассоциированная с ХОБЛ), синдром гипотрофии мышц, саркопения, кахексия, расстройства, ассоциированные с отложением жира в ткани (например, ожирение), диабет типа 2 и дегенеративное заболевание кости (например, остеопороз). Другими репрезентативными АсЖПВассоциированными состояниями являются мышечно-дегенеративные и нейромышечные расстройства, репарация ткани (например, при заживлении ран), нейродегенеративные заболевания (например, амиотрофический боковой склероз), иммунные расстройства (например, расстройства, ассоциированные с аномальной пролиферацией или функцией лимфоцитов), и ожирение или расстройства, ассоциированные с аномальной пролиферацией адипоцитов.
В некоторых вариантах изобретения композиции (например, растворимых полипептидов АйКИВ) согласно изобретению используются для лечения мышечной дистрофии. Термин мышечная дистрофия означает группу дегенеративных мышечных заболеваний, характеризующихся постепенным ослаблением и разрушением скелетных мышц, а иногда мышц сердца и дыхательных путей. Мышечные дистрофии представляют собой генетические заболевания, характеризующиеся прогрессирующей гипотрофией мышц и слабостью мышц, которые начинаются с микроскопических изменений в мышцах. По мере ослабления мышц в течение определенного периода времени мышечная сила у человека снижается. Репрезентативными мышечными дистрофиями, которые могут быть подвергнуты лечению по схеме, предусматривающей использование рассматриваемых полипептидов АсЖПВ, являются мышечная дистрофия Дюшенна (МДД), мышечная дистрофия Беккера (МДБ), мышечная дистрофия Эмери-Дрейфуса (МДЭД), мышечная дистрофия тазового и плечевого поясов (МДТПП), плече-лопаточно-лицевая мышечная дистрофия (ППЛ или ППЛД) (также известная как болезнь Ландузи-Дежерина), миотоническая дистрофия (МТД) (также известная как болезнь Штейнерта), мышечная дистрофия глаза и носоглотки (МДГН), дистальная мышечная дистрофия (ДМД), и наследственная мышечная дистрофия (НМД).
Мышечная дистрофия Дюшенна (МДД) впервые была описана французским неврологом Гийомом
- 23 018868
Бенджамин Аманд Дюшенном в 1860-х годах. Мышечная дистрофия Беккера (МДБ) была названа по имени немецкого врача Петера Эмиля Беккера, который впервые описал этот тип МДД в 1950-х годах. МДД является одной из наиболее часто встречающихся наследственных заболеваний у мужчин, которой страдает один из 3500 мужчин. МДД развивается в случае разрушения гена дистрофина, локализованного на коротком плече хромасомы X. Поскольку у мужчин имеется только одна копия хромосомы X, то у них присутствует только одна копия гена дистрофина. В отсутствие белка дистрофина, мышца легко разрушается при прохождении циклов сокращения и релаксации. Хотя на ранней стадии заболевания мышца компенсируется посредством регенерации, однако на более поздних стадиях, мышечные клеткипредшественники больше не могут претерпевать имеющееся повреждение, в результате чего здоровая мышца заменяется нефункциональной фибро-жировой тканью.
МДБ возникает в результате различных мутаций в гене дистрофина. У пациентов с МДБ присутствует некоторое количество дистрофина, но либо это количество является недостаточным, либо этот дистрофин имеет недостаточную функцию. При этом следует принять во внимание тот факт, что определенное количество дистрофина так же сильно или быстро защищает мышцы пациентов с МДБ от дегенерации, как и мышцы людей с МДД.
Так, например, недавно проведенные исследования продемонстрировали, что блокирование или элиминация функции ΟΌΕ8 (лиганда ΑεΐΚΙΙΒ) ίη νίνο может способствовать эффективному лечению, по меньшей мере, некоторых симптомов у пациентов с МДД и МДБ. Таким образом, рассматриваемые полипептиды ΑεΐΚΙΙΒ могут действовать как ингибиторы ΟΌΕ8 (антагонисты) и являются альтернативными средствами, блокирующими функции ΟΌΕ8 и/или ΑεΐΚΙΙΒ ίη νίνο у пациентов с МДД и с МДБ. Этот результат подтверждается и подкрепляется представленными здесь данными, при этом было показано, что белок ΑεΐΚΙΙΒ-Εε способствует увеличению мышечной массы у мышей с моделью мышечной дистрофии.
Аналогичным образом, рассматриваемые полипептиды ΑεΐΚΙΙΒ представляют собой эффективные средства, увеличивающие мышечную массу при других патологических состояниях, при которых необходимо такое увеличение. Так, например, АБС, также называемый болезнью Луи Герига (заболевание двигательных нейронов), представляет собой хроническое неизлечимое и прогрессирующее расстройство ЦНС, которое поражает двигательные нейроны, то есть компоненты ЦНС, которые соединяют головной мозг со скелетными мышцами. При АБС двигательные нейроны повреждаются и в конечном счете погибают, и хотя головной мозг человека обычно полностью сохраняет свои функции и находится в возбужденном состоянии, однако сигнал, подаваемый мышцам на сокращение, никогда не достигает цели. Большинство людей страдает АБС в возрасте от 40 до 70 лет. Сначала ослабляются те двигательные нейроны, которые воздействуют на руки или ноги. У пациентов с АБС может наблюдаться затрудненная походка, они могут ронять вещи, падать, иметь запинающуюся речь и могут предаваться неконтролируемому смеху или плачу. В конечном счете мышцы конечностей начинают атрофироваться от бездействия. Такая мышечная слабость подрывает силы человека, и он может нуждаться в инвалидной коляске, либо он становится вообще неспособным вставать с постели. Большинство пациентов с АБС умирает через 3-5 лет после начала заболевания от недостаточности дыхательных путей или от осложнений, возникающих в результате искусственной вентиляции легких, подобно той, которую обычно проводят при пневмонии. Эти результаты подтверждаются и подкрепляются представленными здесь данными, при этом было показано, что белок ΑεΐΚΙΙΒ-Εε вызывает заметное увеличение мышечной массы и повышает продолжительность жизни у мышей с моделью АБС.
Увеличение мышечной массы, индуцированное полипептидом ΑεΐΚΙΒΒ, может также давать положительный эффект при лечении пациентов, страдающих заболеваниями, ассоциированными с гипотрофией мышц. В публикации Οοηζ;·ι1εζ-ί’;·ι6;·ινί6 εΐ а1. (см. выше) сообщалось, что экспрессия 6ΌΕ8 обратно пропорционально коррелирует с безжировой массой у человека, и что повышенная экспрессия гена ΟΌΕ8 ассоциируется с потерей массы у мужчин, страдающих СПИДом с синдромом истощения. В результате ингибирования функции ΟΌΕ8 у пациентов со СПИДом, по меньшей мере, некоторые симптомы СПИДа могут ослабляться, а могут и вообще исчезнуть, что позволяет значительно повысить качество жизни пациентов со СПИДом.
Поскольку потеря функции ΟΌΕ8 (лиганда ΑεΐΚΙΙΒ) также ассоциируется с потерей жира без снижения уровня поглощения питательных веществ (ΖίιηιηεΐΈ εΐ а1., см. выше; МсРНеггог! и Бее, см. выше), то рассматриваемые полипептиды ΑεΐΚΙΙΒ могут быть также использованы в качестве терапевтических средств для замедления или предупреждения развития ожирения и диабета типа ΙΙ. Эти результаты подтверждаются и подкрепляются представленными здесь данными, при этом было показано, что белок ΑεΐΚΙΙΒ-Εε улучшает метаблический статус у мышей с ожирением.
Синдром анорексии-кахексии при раке является одним из наиболее неблагоприятных и опасных для жизни факторов при раке. Прогрессирующее снижение массы тела в случае синдрома анорексиикахексии при раке является основным отличительным признаком рака многих типов, и приводит не только к ухудшению качества жизни и к неэффективному ответу на химиотерапию, но также и к уменьшению продолжительности жизни по сравнению с пациентами, у которых имеются такие же опухоли, но не наблюдается потеря массы тела. Кахексия, ассоциированная с анорексией, потерей жировой и мы
- 24 018868 шечной ткани, психическим расстройством и снижением качества жизни, является результатом сложного взаимодействия раковой опухоли с организмом хозяина. Это заболевание является одной из наиболее распространенных причин смертности пациентов, страдающих раком, которая составляет 80%. Данное заболевание представляет собой комплексное нарушение метаболизма белков, углеводов и жиров. Опухоли непосредственно и косвенно приводят к развитию патологий, которые, в свою очередь, вызывают анорексию и потерю массы. В настоящее время не существует какого-либо способа регуляции или предотвращения процессов развития опухолей. Синдром анорексии-кахексии при раке влияет на продуцирование цитокинов и на высвобождение липид-мобилизующих и протеолиз-индуцирующих факторов, и приводит к изменению промежуточного метаболизма. Хотя анорексия является широко распространенным расстройством, однако лишь одно снижение потребления пищи не способно изменить состав веществ в организме, наблюдаемый у пациентов, страдающих раком, а увеличение потребления пищи может привести к реверсии синдрома истощения. Если у пациентов, страдающих раком, в течение шести месяцев наблюдается беспричинная потеря массы, составляющая более, чем 5% от преклинической массы, то таких пациентов следует отнести к индивидуумам с подозрением на рак.
Поскольку было обнаружено, что у взрослых мышей системная сверхэкспрессия СЭЕ8 индуцирует значительную потерю мышечной и жировой ткани, аналогичную потери, наблюдаемой у человека с синдромами кахексии (21штегк е1 а1., см. выше), то рассматриваемые полипептиды Ас®ЛВ, полученные в виде фармацевтических композиций, могут быть с успехом использованы для предупреждения, лечения или ослабления симптомов, наблюдаемых при синдроме кахексии, в том случае, где желательным является рост мышечной ткани.
В других своих вариантах настоящее изобретение относится к способам индуцирования образования костей и/или хряща, предупреждения потери костной ткани, повышения уровня минерализации кости или предупреждения деминерализации кости. Так, например, рассматриваемые полипептиды Ас®ЛВ и соединения, идентифицированные в настоящем изобретении, могут быть применены для лечения остеопороза и сращения костей при переломах и устранения дефектов хряща у человека и других животных. Полипептиды Ас®ЛВ могут быть использованы для лечения пациентов, у которых субклинически была диагностирована низкая плотность кости, в качестве профилактической меры против развития остеопороза.
В одном из конкретных вариантов изобретения способы и композиции согласно изобретению могут быть применены в терапии для сращивания костей при переломах и для устранения дефектов хряща у человека и животных. Рассматриваемые способы и композиции могут также иметь профилактическое применение для сращивания костей при закрытых и открытых переломах, а также для улучшения фиксации искусственных суставов. Образование костей йе ηονο, индуцированное остеогенным агентом, способствует заживлению врожденных, вызванных травмами или онкологическими операциями черепнолицевых дефектов, а также может оказаться эффективным для применения в косметической пластической хирургии. Кроме того, способы и композиции согласно изобретению могут быть использованы для лечения периодонтоза, а также в других стоматологических операциях. В некоторых случаях рассматриваемые полипептиды Ас®ПВ могут обеспечивать условия для миграции остеогенных клеток в данных участок, для стимуляции роста остеогенных клеток или для индуцирования дифференцировки предшественников остеогенных клеток. Полипептиды Ас®ЛВ согласно изобретению могут быть также использованы для лечения остеопороза. Кроме того, полипептиды Ас®ЛВ могут быть использованы для устранения дефектов хряща и предупреждения/лечения остеоартрита.
В другом своем конкретном варианте настоящее изобретение относится к терапевтическому способу и к композиции для сращивания переломов и для лечения других состояний, ассоциированных с дефектами хряща и/или костей, или периодонтоза. Настоящее изобретение также относится к терапевтическим способам и композициям для заживления ран и репарации ткани. Типами ран являются, но не ограничиваются ими, ожоги, порезы и язвы. См., например, публикацию РСТ Νο. \УО84/01106. Такие композиции включают терапевтически эффективное количество по меньшей мере одного из полипептидов АсЖНВ согласно изобретению в смеси с фармацевтически приемлемыми наполнителями, носителями или матрицами.
В другом конкретном варианте изобретения указанные способы и композиции согласно изобретению могут быть применены для лечения состояний, вызывающих потерю костной ткани, таких как остеопороз; гиперпаратиреоидит; болезнь Кушинга; тиротоксикоз; хроническая диарея; или малабсорбция; ацидоз почечных канальцев; или нервная анорексия. Многим людям известно, что женщин, которые имеют низкий вес и ведут сидячий образ жизни, можно отнести к группе с фактором риска развития остеопороза (потери минеральной плотности кости, которая увеличивает риск перелома). Однако остеопороз может быть также результатом длительного употребления некоторых лекарственных препаратов. Остеопороз, возникающий в результате употребления лекарственных средств или индуцированный другими патологическими состояниями, известен как вторичный остеопороз. При состоянии, известном как болезнь Кушинга, избыточное количество кортизола, продуцируемое организмом, приводит к развитию остеопороза и к переломам. Наиболее распространенными лекарственными препаратами, ассоциированными с развитием вторичного остеопороза, являются кортикостероиды, то есть класс лекарственных
- 25 018868 средств, которые действуют как кортизол, то есть гормон, обычно продуцируемый надпочечниками. Хотя для развития скелета необходимы адекватные уровни тиреотропных гормонов (которые продуцируются щитовидной железой), однако избыток тиреотропных гормонов может приводить к снижению костной массы в течение определенного периода времени. Антациды, содержащие алюминий, при их употреблении в высоких дозах пациентами с почечными заболеваниями, в частности, пациентами, подвергаемыми диализу, могут вызывать потерю костной ткани. Другими лекарственными препаратами, которые могут вызывать вторичный остеопороз, являются фенитоин (дилантин) и барбитураты, которые используются для предупреждения эпилептических припадков; метотрексат (ВкеитаГгех, Iттиηеx, Ро1ех РР8), то есть лекарственное средство, применяемое для лечения некоторых форм артрита, рака и иммунных расстройств; циклоспорин (8апб1ттипе, №ога1), то есть лекарственное средство, применяемое для лечения некоторых аутоиммунных заболеваний и для подавления иммунной системы у пациентов с трансплантированными органами; агонисты лютеинизирующего рилизинг-фактора (Ьиргоп, 2о1абех), применяемые для лечения рака предстательной железы и эндометриоза; гепарин (кальципарин, Ыциаетш), то есть препарат, препятствующий свертыванию крови; и холестирамин (ЦиекГгап) и колестипол (Со1ек!1б), применяемые для снижения высокого уровня холестерина. Потеря костной ткани вызывается также заболеваниями десен, поскольку болезнетворные бактерии, присутствующие в ротовой полости, провоцируют организм на вырабатывание защиты против таких бактерий. Эти бактерии продуцируют токсины и ферменты под линией десны, что приводит к развитию хронических инфекций.
В другом своем варианте настоящее изобретение относится к способам и терапевтическим средствам, применяемым для лечения заболеваний или расстройств, ассоциированных с аномальным или нежелательным ростом кости. Так, например, у пациентов, страдающих заболеванием, известным как прогрессирующая оссифицирующая фибродисплазия (ПОФ), наблюдается аномальный рост второго скелета, который затрудняет любое движение. Кроме того, аномальный рост костей может наблюдаться после заместительной хирургии на бедрах, что приводит к ухудшению результата хирургической операции. Этот факт является наиболее типичным примером патологического роста костей и ситуации, при которой рассматриваемые способы и композиции могут давать терапевтический эффект. Те же самые способы и композиции могут быть также применены для лечения других форм аномального роста кости (например, патологического роста кости после травм, ожогов или поражения спинного мозга) и для лечения или предупреждения нежелательных состояний, ассоциированных с аномальным ростом кости, наблюдаемым в комбинации с метастазирующим раком предстательной железы или остеосаркомой. Примерами таких терапевтических средств являются, но не ограничиваются ими, полипептиды Ас!КЛВ, которые ингибируют функцию лиганда Ас!КЛВ (например, ВМР7), соединения, которые нарушают взаимодействие между Ас!КЛВ и его лигандом (например, ВМР7), и антитела, которые специфически связываются с рецептором Ас!КПВ, в результате чего лиганд Ас!КПВ (например, ВМР7) не может связываться с рецептором Ас!КПВ.
В других своих вариантах настоящее изобретение относится к композициям и к способам регуляции содержания жира в организме у животного и для лечения или предупреждения состояний, в частности, опасных для жизни состояний, ассоциированных с содержанием жира в организме. В соответствии с настоящим изобретением, термин регуляция (контролирование) массы тела может означать снижение или увеличение массы тела, либо снижение или увеличение скорости набора веса, либо увеличение или снижение скорости потери веса, и этот термин также включает активное поддержание массы тела или предотвращение значительного ее изменения (например, предотвращение внешних или внутренних воздействий, которые могут каким-либо образом повышать или снижать массу тела). В одном из своих вариантов настоящее изобретение относится к регуляции массы тела путем введения животному (например, человеку), нуждающемуся в этом, полипептида АсЖПВ.
В одном из своих конкретных вариантов настоящее изобретение относится к способам и соединениям, применяемым для снижения массы тела и/или уменьшения прироста массы тела у животного, а более конкретно, для лечения или уменьшения степени ожирения у пациентов с риском развития ожирения или у пациентов, страдающих ожирением. В другом своем конкретном варианте настоящее изобретение относится к способам и соединениям для лечения животного, у которого отсутствует способность к набору или сохранению веса (например, у животного с синдромом истощения). Такие способы являются эффективными для увеличения веса и/или массы тела, или для снижения потери веса и/или массы, или для улучшения состояний, ассоциированных с нежелательно низким весом и/или массой тела или вызываемых таким нежелательно низким весом и/или массой тела (например, у больных).
Другие расстройства, включая высокий уровень холестерина, которые могут быть подвергнуты лечению с использованием белков Ас!КЛВ, описаны в примерах.
7. Фармацевтические композиции.
В некоторых вариантах изобретения соединения (например, полипептиды Ас!КЛВ) согласно изобретению приготавливают вместе с фармацевтически приемлемым носителем. Так, например, полипептид Ас®ПВ может быть введен отдельно или как компонент фармацевтической композиции (терапевтической композиции). Рассматриваемые композиции могут быть приготовлены для введения в любой форме, подходящей для ее применения в медицине или ветеринарии.
- 26 018868
В некоторых вариантах изобретения терапевтический способ согласно изобретению включает введение композиции местно, системно или в определенный участок в виде имплантата или медицинского приспособления. Терапевтическую композицию, вводимую в соответствии с настоящим изобретением, обычно приготавливают в апирогенной физиологически приемлемой форме. Кроме того, указанная композиция может быть, если это необходимо, инкапсулирована или инъецирована в вязкой форме для доставки в нужный участок ткани (например, в кость, хрящ, мышцу, жировую ткань или в нервную ткань), например, в участок поражения ткани. Местное введение может быть подходящим для заживления ран и репарации ткани. Терапевтически эффективные средства, которые не являются полипептидами Ас®НВ и которые могут быть также, но необязательно, включены в композицию, описанную выше, альтернативно или дополнительно могут быть введены одновременно или последовательно с рассматриваемыми соединениями (например, с полипептидами Ас£КЛВ) в способах согласно изобретению.
В некоторых вариантах изобретения композиции согласно изобретению могут включать матрицу, способную доставлять одно или несколько терапевтических соединений (например, полипептидов Ас®НВ) в нужный участок ткани, и образовывать структуру, подходящую для развития ткани и обладающую оптимальной способностью ресорбироваться в организм. Так, например, такая матрица может обеспечивать пролонгированное высвобождение полипептидов АсЖНВ. Такие матрицы могут быть изготовлены из материалов, которые в настоящее время используются в целях приготовления других имплантируемых медицинских препаратов.
Материал для изготовления матрицы выбирают с учетом биологической совместимости, биологической разлагаемости, механических свойств, внешнего вида и межфазных свойств. Соответствующий состав препарата определяется конкретной целью применения рассматриваемых композиций. Потенциальные матрицы для данных композиций могут быть биологически разлагаемыми, и такими матрицами могут быть химические вещества, такие как сульфат кальция, трифосфат кальция, гидроксиапатит, полимолочная кислота и полиангидриды. Другие потенциальные материалы являются биологически разлагаемыми и имеют хорошо определенные биологические свойства, и такими материалами являются костный или кожный коллаген. Другие матрицы состоят из чистых белков или компонентов внеклеточного матрикса. Другие потенциальные матрицы не являются биологически разлагаемыми и имеют определенные химические свойства, и такими матрицами являются спеченный гидроксиапатит, биостекло, алюминаты или другие керамические изделия. Матрицы могут состоять из комбинаций материалов любого из вышеупомянутых типов, таких как полимолочная кислота и гидроксиапатит, или коллаген и трифосфат кальция. Биокерамические изделия в композиции, такой как алюминат-фосфат кальция, могут быть модифицированы и обработаны так, чтобы они имели измененные размер пор, размер частиц, форму частиц и биологическую разлагаемость.
В некоторых вариантах изобретения композиции согласно изобретению могут быть введены перорально, например, в форме капсул, каше, драже, таблеток, лекарственных лепешек (приготовленных с использованием ароматизированной основы, обычно сахарозы и аравийской или трагакантовой камеди), порошков, гранул, или в виде раствора или суспензии в водной или безводной жидкости, или в виде жидкой эмульсии масло в воде или вода в масле, или в виде эликсира или сиропа, или пастилок (приготовленных с использованием инертной основы, такой как желатин и глицерин, или сахароза и аравийская камедь), и/или в виде растворов для полоскания рта и т.п., содержащих предварительно определенное количество агента, используемого в качестве активного ингредиента. Агент может быть также введен в виде болюса, лекарственной кашки или пасты.
В твердых лекарственных формах для перорального введения (капсулах, таблетках, пилюлях, драже, порошках, гранулах и т.п.) одно или несколько терапевтических соединений согласно изобретению могут быть смешаны с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями, такими как цитрат натрия или дифосфат кальция, и/или с любым из нижеследующих компонентов, таких как (1) наполнители или агенты, придающие объем, такие как крахмалы, лактоза, сахароза, глюкоза, маннит и/или кремниевая кислота; (2) связующие вещества, такие как, например, карбоксиметилцеллюлоза, альгинаты, желатин, поливинилпирролидон, сахароза и/или аравийская камедь; (3) увлажнители, такие как глицерин; (4) дезинтегрирующие агенты, такие как агар-агар, карбонат кальция, картофельный крахмал или крахмал тапиоки, альгиновая кислота, некоторые силикаты и карбонат натрия; (5) агенты, замедляющие растворение, такие как парафин; (6) ускорители абсорбции, такие как соединения четвертичного аммония; (7) смачивающие агенты, такие как, например, цетиловый спирт и моностеарат глицерина; (8) абсорбенты, такие как каолин и бентонитовая глина; (9) замасливатели, такие как тальк, стеарат кальция, стеарат магния, твердые полиэтиленгликоли, лаурилсульфат натрия и их смеси, и (10) красители. В случае капсул, таблеток и драже фармацевтические композиции могут также содержать забуферивающие агенты. Твердые композиции аналогичного типа могут быть также использованы в качестве наполнителей в мягких и твердых желатиновых капсулах, приготовленных с использованием таких наполнителей, как лактоза или молочные сахара, а также высокомолекулярные полиэтиленгликоли и т.п.
Жидкими лекарственными формами для перорального введения являются фармацевтически приемлемые эмульсии, микроэмульсии, растворы, суспензии, сиропы и эликсиры. Жидкие лекарственные формы, помимо активного ингредиента, могут содержать инертные разбавители, обычно используемые
- 27 018868 специалистами, такие как вода или другие растворители, солюбилизирующие агенты и эмульгаторы, такие как этиловый спирт, изопропиловый спирт, этилкарбонат, этилацетат, бензиловый спирт, бензилбензоат, пропиленгликоль, 1,3-бутиленгликоль, масла (в частности, масло из семян хлопчатника, арахисовое масло, кукурузное масло, масло из зародышевых семян, оливковое масло, касторовое масло и кунжутное масло), глицерин, тетрагидрофуриловый спирт, полиэтиленгликоли и сложные эфиры жирной кислоты и сорбитана, и их смеси. Композиции для перорального введения, помимо инертных разбавителей, могут также включать адъюванты, такие как смачивающие агенты, эмульгирующие и суспендирующие агенты, подсластители, ароматизаторы, красители, отдушки и консерванты.
Суспензии, помимо активных соединений, могут содержать суспендирующие агенты, такие как этоксилированные изостеариловые спирты, полиоксиэтиленсорбит и сложные эфиры сорбитана, микрокристаллическая целлюлоза, метагидроксид алюминия, бентонит, агар-агар и трагакантовая камедь, и их смеси.
Некоторые описанные здесь композиции могут быть введены местно, либо нанесены на кожу, либо на слизистую оболочку. Композиции для местного применения могут также включать один или несколько агентов широкого ряда, которые, как известно, являются эффективными при их использовании в качестве усилителей пенетрации через кожу или роговой слой. Примерами таких агентов являются 2пирролидон, №метил-2-пирролидон, диметилацетамид, диметилформамид, пропиленгликоль, метиловый или изопропиловый спирт, диметилсульфоксид и азон. Для приготовления приятного на вид препарата, в него могут быть также включены и другие агенты. Примерами таких агентов являются жиры, воски, масла, красители, ароматизаторы, консерванты, стабилизаторы и поверхностно-активные вещества. В данную композицию могут быть также включены кератолитические агенты, известные специалистам. Примерами являются салициловая кислота и сера.
Лекарственными формами для местного или чрескожного введения являются порошки, спреи, мази, пасты, кремы, лосьоны, гели, растворы, пластыри и ингаляторы. Активное соединение может быть смешано в стерильных условиях с фармацевтически приемлемым носителем и, при необходимости, с консервантами, буферами или пропеллентами. Мази, пасты, кремы и гели, помимо рассматриваемого соединения согласно изобретению (например, полипептида АсГКЛВ), могут содержать наполнители, такие как животные и растительные жиры, масла, воски, парафины, крахмал, трагакантовая камедь, производные целлюлозы, полиэтиленгликоли, силиконы, бентониты, кремниевая кислота, тальк и оксид цинка, или их смеси.
Порошки и спреи, помимо рассматриваемого соединения, могут содержать наполнители, такие как лактоза, тальк, кремниевая кислота, гидроксид алюминия, силикаты кальция и полиамидный порошок, или смеси этих веществ. Спреи могут также содержать специально приготовленные пропелленты, такие как хлорфторуглеводороды и летучие незамещенные углеводороды, такие как бутан и пропан.
В некоторых вариантах изобретения фармацевтические композиции, подходящие для парентерального введения, могут содержать один или несколько полипептидов АсГКЛВ в комбинации с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми стерильными изотоническими водными или безводными растворами, дисперсиями, суспензиями или эмульсиями, или стерильными порошками, которые, непосредственно перед их применением, могут быть разведены с получением стерильных растворов или дисперсий для инъекций, и которые могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостаты, растворенные вещества, которые сообщают данному препарату изотоничность с кровью данного реципиента, или суспендирующие агенты или загустители. Примерами подходящих водных и безводных носителей, которые могут быть использованы в фармацевтических композициях согласно изобретению, являются вода, этанол, полиолы (такие как глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и т.п.), и их подходящие смеси; растительные масла, такие как оливковое масло, и органические сложные эфиры для инъекций, такие как этилолеат. Соответствующая текучесть может поддерживаться, например, с использованием материалов для покрытий, таких как лецитин, путем сохранения нужного размера частиц в случае дисперсий, и с использованием поверхностно-активных веществ.
Композиции согласно изобретению могут также содержать адъюванты, такие как консерванты, смачивающие агенты, эмульгаторы и диспергирующие агенты. Предотвращение действия микроорганизмов может быть достигнуто путем включения различных антибактериальных и противогрибковых средств, например, парабена, хлорбутанола, фенолсорбиновой кислоты и т.п. В данные композиции могут быть также включены изотонические агенты, такие как сахара, хлорид натрия и т.п. Кроме того, пролонгированная абсорбция фармацевтической формы для инъекции может быть достигнута путем включения агентов, замедляющих абсорбцию, таких как моностеарат алюминия и желатин.
Следует отметить, что схема введения доз может быть определена лечащим врачом с учетом различных факторов, которые изменяют действие рассматриваемых соединений согласно изобретению (например, полипептидов АсГКПВ). Различные факторы зависят от типа заболевания, подвергаемого лечению. В случае мышечных заболеваний такими факторами могут быть, но не ограничиваются ими, желаемое количество образуемой мышечной массы, мышцы, наиболее подверженные действию данного заболевания, условия, приводящие к ослаблению мышц, возраст, пол и режим питания пациента, время введения и другие клинические факторы. Доза может также определена с учетом добавления в конечную
- 28 018868 композицию других известных факторов роста. Мониторинг благоприятного эффекта лечения может быть проведен путем периодической оценки роста и/или репарации мышц, например, путем измерения мышечной силы, оценки размера мышц с помощью МРИ и анализа мышц с помощью биопсии.
В некоторых вариантах изобретения один или несколько полипептидов Ас®ИВ могут быть введены вместе (одновременно) или через различные периоды времени (последовательно или с перекрыванием). Кроме того, полипептиды АсЖЛВ могут быть введены вместе с терапевтическими средствами других типов, например, с агентом, индуцирующим рост хряща, с агентом, индуцирующим рост кости, с агентом, индуцирующим рост мышц, с агентом, снижающим уровень жира, или с агентом, индуцирующим рост нейронов. Соединения двух типов могут быть введены одновременно или через различные периоды времени. Предполагается, что полипептиды Ас®ЛВ согласно изобретению могут действовать в сочетании с другим терапевтическим средством, либо, вероятно, они могут действовать синергически.
В конкретном примере изобретения описаны различные остеогенные факторы, факторы, индуцирующие рост хряща, и факторы, индуцирующие рост кости, в частности, бисфосфонаты. См., например, европейские патентные заявки №№ 148155 и 169016. Так, например, другими факторами, которые могут быть объединены с рассматриваемыми полипептидами Ас®ЛВ, являются различные факторы роста, такие как эпидермальный фактор роста (ЕСР), тромбоцитарный фактор роста (РИСР), трансформирующие факторы роста (ТСР-α и ТСР-β ) и инсулиноподобный фактор роста (1СР).
В некоторых своих вариантах настоящее изобретение также относится к генотерапии для продуцирования полипептидов Ас®ИВ ίη νίνο. Такая терапия дает терапевтический эффект в результате введения полинуклеотидных последовательностей Ас®ЛВ в клетки или ткани, пораженные заболеваниями, перечисленными выше. Доставка полинуклеотидных последовательностей Ас®ЛВ может быть достигнута с использованием рекомбинантного экспрессионного вектора, такого как химерный вирус или коллоидальная дисперсионная система. Для терапевтической доставки полинуклеотидных последовательностей Ас®ЛВ предпочтительно используются липосомы, доставляемые в нужный участок.
Различными вирусными векторами, которые могут быть использованы в генотерапии, описанной в настоящей заявке, являются векторы на основе аденовируса, вируса герпеса, вируса коровьей оспы, или, предпочтительно, РНК-вируса, такого как ретровирус. Предпочтительным ретровирусным вектором является производное мышиного или птичьего ретровируса. Примерами ретровирусных векторов, в которые может быть встроен один чужеродный ген, являются, но не ограничиваются ими, векторы на основе вируса мышиного лейкоза Молони (МоМиЬУ), вируса мышиной саркомы Харви (НаМи8У), вируса мышиной опухоли молочной железы (МиМТУ) и вируса саркомы Рауса (В8У). Ряд других ретровирусных векторов может включать множество генов. Все эти векторы могут переносить или включать ген селективного маркера так, что в результате этого могут быть идентифицированы и получены трансдуцированные клетки. Ретровирусные векторы могут быть сделаны мишень-специфическим путем присоединения, например, сахара, гликолипида или белка. Такую доставку предпочтительно осуществляют с использованием антитела. Специалистам в данной области очевидно, что специфические полинуклеотидные последовательности могут быть встроены в геном ретровируса или присоединены к вирусной оболочке так, чтобы обеспечивалась специфическая доставка ретровирусного вектора, содержащего полинуклеотид АсЖЛВ, в нужную мишень. В одном из предпочтительных вариантов изобретения вектор доставляют в клетки/ткани кости, хряща, мышц или нейронов.
Альтернативно, клетки тканевой культуры могут быть непосредственно трансфицированы плазмидами, кодирующими ретровирусные структурные гены дад, ро1 и спу, стандартными методами трансфекции фосфатом кальция. Затем эти клетки трансфицируют плазмидным вектором, содержащим представляющие интерес гены. Полученные клетки высвобождают ретровирусный вектор в культуральную среду.
Другой системой целевой доставки полинуклеотидов Ас®ЛВ является коллоидальная дисперсионная система. Коллоидальными дисперсионными системами являются макромолекулярные комплексы, нанокапсулы, микросферы, сферы и липидные системы, включая эмульсии типа масло в воде, мицеллы, смешанные мицеллы и липосомы. Предпочтительной коллоидальной системой согласно изобретению является липосома. Липосомы представляют собой искусственные мембранные везикулы, которые могут быть использованы в качестве носителей для доставки ίη νίίτο и ίη νίνο. РНК, ДНК и интактные вирионы могут быть инкапсулированы во внутреннюю водную среду и доставлены в клетки в биологически активной форме (см., например, Рга1еу, с1 а1., Тгепбз Вюсбет. 8сб, 6:77, 1981). Методы эффективного переноса генов с использованием липосомы в качестве носителя известны специалистам, см., например, Маптпо, е1 а1., ВюЧесбтдиез, 6:682, 1988. В состав липосом обычно входит комбинация фосфолипидов, в основном, вместе со стероидами, в частности, с холестерином. Могут быть также использованы и другие фосфолипиды или липиды. Физические свойства липосом зависят от рН, ионной силы и присутствия двухвалентных катионов.
Примерами липидов, которые могут быть использованы для получения липосом, являются фосфатидильные соединения, такие как фосфатидилглицерин, фосфатидилхолин, фосфатидилсерин, фосфатидилэтаноламин, сфинголипиды, цереброзиды и ганглиозиды. Репрезентативными фосфолипидами являются яичный фосфатидилхолин, дипальмитоилфосфатидилхолин и дистеароилфосфатидилхолин. Доставка липосом может быть также осуществлена на основе, например, специфичности к органу, к клетке и
- 29 018868 органелле, и такая доставка известна специалистам в данной области.
Примеры
В общих чертах, настоящее изобретение будет более очевидным исходя из описанных ниже примеров, которые приводятся лишь в целях иллюстрации некоторых вариантов и аспектов настоящего изобретения, и не должны рассматриваться как ограничение объема изобретения.
Пример 1. Получение слитого белка Ас®ПЬ-Ес.
Заявителями был сконструирован растворимый слитый белок Ас®ПЬ, который имеет внеклеточный домен человеческого Ас!ЯПЬ, присоединенный к человеческому или мышиному Ес-домену посредством расположенного между ними линкера минимального размера (из трех аминокислот глицинов). Полученные конструкции обозначены Ас(КИЬ-НЕс и Ас!ЯПЬ-тЕс, соответственно.
Ас®ПЬ-№с представлен ниже как белок, выделенный из клеточных линий СНО (ЗЕО ΙΌ N0:5):
СВОЕАЕТВЕС1УУ№МШЕ1.ЕКТМ(23СЬЕКСЕСЕ12РККЬНСУАЗНКК38СТ1ЕЕУККСС
НЬРРГЫСУРКОЕСУАТЕЕЫРОУУГСССЕСЙГСЫЕВГТНЬРЕАССРЕУТУЕРРРТАРТС
ССТНТСРРСРАРЕЬЬССРЗУЕЬГРРКРКРТЬМ!ЗКТРЕУТСУУУРУЗНЕРРЕУКЕИНУУ
РСУЕУНЦЙКТКРКЕЕ0УИЗТУКУУ5УЕТУЪН0РИШСКЕ¥КСКУ5МКАЬРУР1ЕКТ15
ΚΑΚ30ΡΚΕΡ0νΥΤΕΡΡ5ΒΕΕΜΤΚΝ0ν5ΙΛΌΙ,νΚΟΕΥΡ5ΡΙΑνΕΜΕ3Ν30ΡΕΝΝΥΚΤΤΡΡ
УЬРЗРСЗГЕЬУЗКЬТУРКЗНИООСНУГЗСЗУМНЕАЬНИНУТОКЗЬЗЬЗРСК
Белки Ас®ПЬ-№с и Ас!КПЬ-тЕс были экспрессированы в клеточных линиях СНО.
Рассматривались три различных лидерных последовательности:
(ί) последовательность меллитина пчелиного меда (НВМЬ):
МКЕ^VNVА^VЕМVVΥIЗΥIΥА (ЗЕО ΙΌ N0:7);
(ίί) последовательность тканевого активатора плазминогена (ТРА):
МПЛМККбЬССУЪЬЬСбАУЕУЗР (ЗЕО ΙΌ N0:8);
(ш) нативная последовательность:
М6ААЛК^ЛЕАVЕ^IЗСЗЗ6А (ЗЕО ΙΌ N0:9).
Выбранная форма имеет лидерную последовательность ТРА и нижеследующую непроцессирован ную аминокислотную последовательность:
МРАМКВСЬССУЫЛССАУГУЗ РСАЗСВСЕАЕ Т ЕЕ СIΥ Υ NАМИЕЬЕ ΒΤΝ Ώ 3 С ЬЕ В С ЕС
ЕОРКВЬНСУАЗКВНЗЗСТРЕЬУККССИЬОРГЫСУРКОЕСУАТЕЕМР^УУГСССЕСЫГ
ΟΝΕК ЕТ Н Ь Ρ Е АСС РЕ УТ ΥΕ Ρ РРТАРТСССТНТСРРСРАРЕЬЬССРЗУГЬГРРКРКРТЬМТЗ
ВТРЕУТСУУУРУЗНЕРРЕУКГЫИУУРСУЕУНИАКТКРВЕЕСУМЗТУВУУЗУЬТУЬНО
Р!УЬПСКЕУКСКУ5МКАЬРУР1ЕКТ18КАКС<^РВЕРСУ¥ТЬРРЗВЕЕМТКЫСУ5ЬТСЬУК
СГУРЗРХАУЕИЕЗЫСОРЕМИУКТТРРУЬРЗРСЗЕЕЬУЗКЬТУРКЗВИООСМУГЗСЗУМ
НЕАЬНИНУТОКЗЬЗЬЗРСК
Указанный полипептид кодируется нижеследующей последовательностью нуклеиновой кислоты (ЗЕО ΙΌ N0:10):
А ТСЗАТССААТ ЗААЗАСАСЗЗ СТСТОСТЗТЗ ТЗСТОСТЗСТ СТСТЗСАССА СТСТТСОТТТ сзсссзсссс АСТОЗСАССТ АЗСЗЗСТЗСА АЗЗССТССТС АЗААСССССА АТТТОССАОА ЗТСЗТЗСААС тсттсстстт САТЗСЗТСЗТ АСЗЗСЗТЗЗА АСССТСТССТ АСТЗСААССТ ААЗЗЗСАОСС АЗААССАССТ АСТСССАСАС ССЗАСЗССТС
СТСТСССССТ ССАСС6САСС СТССТАСОСС ССТАЗАТЗАС ССТСТАСТТС езстзззвзс ТСАСАСАТЗС ССССССАААА сстзсдсстз ЗСТССАТААТ САССЗТССТС СТССААСААА ССЗАЗААССА САСССТЗАСС СААТССССАС СТТСТТССТС
ССССАСССТС ААССАЗАССЗ ТССТЗЗСЗСА ТТСААСТССТ ТЗСТССТЗТО ССЗЗААЗТСА ССАСССТССС СССААССАСА АЗССАССДАЗ ЗССААЗАСАА АСС6ТССТСС ССССТСССАЗ САЗЗТЗТАСА ТСССТССТСА ССССДСДАСА ТАТАЗСААЗС
АСАСАСеООА зсстсмзассс АСАССТСТЗЗ АСЗАТАЗЗСА ААЗССААСТТ СЗТАСЗАЗСС САССАССТСА СССТСАТОАТ АСССТСАЗЗТ АОССОСООСА АССАССАСТЗ ТССССАТСОА СССТСССССС ААООСТТСТА АСТАСААЗАС ТСАСССТССА
ЗТЗСАТСТАС СТЗССААСОС САССАТССАС ССАСТСТСТС СТЗСДАСЗАЗ АССССССАСА АСТССТСССС СТССССОАСС СААСТТСААС ЗОАОСАОТАС ЗСТСААТСЗС ЗААААССАТС АТСССЗСЗАЗ ТСССАЗСЗАС САСЗССТССС СААЗАССАЗЗ
ТАСААСЗССА САССА60АСА СТСЗТЗААЗА СССАСТСАЗС СЗСТТСАСТС ЗСССССАССС ЗСАСССТСАС ССТЗАЗЗТСА ТСОТАССТЗС ААСАЗСАСЗТ ААЗСАСТАСА ТССАААСССА ЗАЗАТСАССА АТСЗССЗЮЗ СТССТЗСАСТ ТСССАССАСС
ССААССТСТТ СТСАТОСТСС ссстстссст зтстссзззт
ОТЗАТЗСАТЗ АААТЗА
АСЗСТСТ8СА
СААССАСТАС
АСЗСАЗААЗА ^концевое секвенирование вещества, продуцируемого клетками СНО, выявило основную последовательность -СЯСЕАБ (ЗЕО ΙΌ N0:11). Примечательно то, что другие конструкции, описанные в литературе, начинаются с последовательности -ЗОЯ...
Очистка может быть проведена с помощью колоночной хроматографии в несколько стадий, включая, например, три или более стадий, осуществляемых в любом порядке, например, с помощью хроматографии на белке А, хроматографии на β-сефарозе, хроматографии на фенилсефарозе, эксклюзионной
- 30 018868 хроматографии и катионообменной хроматографии. Очистка может быть завершена с помощью вирусной фильтрации и буферного обмена.
Слитые белки ΑсΐΚIIЬ-Рс экспрессировали также в клетках НЕК293 и в клетках СО8. Хотя материал, выделенный из всех клеточных линий, культивированных в подходящих условиях, обеспечивал присутствие белка, обладающего активностью, направленной на формирование структуры мышц ίη у1уо, однако при этом в его активности наблюдалась некоторая вариабельность, вероятно обусловленная условиями отбора и/или культивирования клеточных линий.
Пример 2. Генерирование мутантов ΑсΐΚIIЬ-Рс.
Заявителями была генерирована серия мутаций внеклеточного домена ΑсΐΚIIΒ, и указанные мутантные белки были продуцированы в виде растворимых слитых белков, образованных между внеклеточным ΑΛΚΙΙΒ и Рс-доменом. Контрольный гибрид ΑΛΚΙΙΒ-Το имеет нижеследующую последовательность (Рс-область подчеркнута) (8Е0 ГО ΝΟ:12):
ЗбВСЕАЕТКЕС1УУКАЫИЕЬЕК.ТЦ256ЬЕКСЕ6Е(2ОККЬНС¥й5ИК№ЗСТ1ЕЬ7ККС
СКЬРРГЫСУРКОЕСУАТЕЕКРаУУЕСССЕСКГСНЕВГТНЪРЕАССРЕУТУЕРРРТАРТ
С0СТНТСРРСРАРЕЬЬССР£УЕЬГРРКРКРТЪМ13ПТРЕУТСУУУРУ5НЕРРЕУКГМИУ
УРСУЕУНМАКТКРКЕЕОУНЗТУВУУЗУЬТУЬНОРИЬЦОКЕУКСКУЗЫКАЬРУРГЕКТ!
3ΚΑΚΟ0ΡΚΕΡ0νΥΤΡΡΡ5ΒΕΕΜΤΚΝ0ν3ΡΤΕΡνΚ6ΕΥΡ5ΡΙΑνΕΜΕ5Ν60ΡΕΝΝΥΚΤΤΡ
РУЬРЗРСЗЕГЬУЗКЕТУРКЗКНО^СНУЕЗСЗУМНЕАЬНМНУТ^КЗЕЗЬЗРСК
В исходный ΑсΐΚIIΒ-Рс-белок были введены различные мутации, включая Ν- и С-концевые усечения. На основании данных, представленных в примере 1, было высказано предположение, что эти конструкции, если они экспрессируются с лидерной последовательностью ТРА, не содержат Ν-концевого серина. Мутации были введены во внеклеточный домен ΑΛΚΙΙΒ с помощью ПЦР-мутагенеза. После проведения ПЦР фрагменты очищали на колонке Οία^η, гидролизовали ферментами 8ГЫ и Α^Ι, и подвергали гель-очистке. Полученные фрагменты лигировали в экспрессионный вектор ]1ΑΙΟ4 (см. \УО 2006/012627) так, чтобы после лигирования образовывался химерный гибрид с человеческим ΙβΟ1. После трансформации в Е.сой ЭН5-альфа колонии собирали и выделяли ДНК. В мышиных конструкциях (тРс), человеческий ΙβΟ1 заменяли мышиным Ι§62;·ι. Затем подтверждали последовательности всех мутантов.
Все мутанты продуцировали в клетках НЕК293Т путем временной трансфекции. Вкратце, во вращающийся 500-мл сосуд высевали клетки НЕК293Т при плотности 6х105 клеток/мл в среде Егеек1у1е (Ιηуйтоден) в объеме 250 мл, и культивировали в течение ночи. На следующий день эти клетки обрабатывали комплексом ДНК:ПЭИ (1:1) при конечной концентрации ДНК, составляющей 0,5 мкг/мл. Через 4 ч добавляли 250 мл среды и клетки культивировали в течение 7 дней. Кондиционированную среду собирали путем центрифугирования клеток, а затем эту среду концентрировали.
Мутанты очищали различными методами, включая, например, очистку на колонке с белком А, которую элюировали глициновым буфером с низким рН (3,0). После нейтрализации мутанты диализовали против ΡΒ8.
Мутанты были также продуцированы в клетках СНО аналогичным методом.
Мутанты тестировали в анализах и/или в биоанализах на связывание, описанных ниже. В некоторых случаях анализы проводили с использованием кондиционированной среды, а не очищенных белков.
Пример 2. Биоанализ на передачу сигнала, опосредуемую СОР-11 и активином.
Анализ с использованием репортерного гена А-204 проводили для оценки влияния белков ΑсΐΚIIΒРс на передачу сигнала СОР-11 и активином А. Клеточная линия: человеческая рабдомиосаркома (образованная из мышечной ткани). Репортерный вектор: рС^3(СΑСΑ)12 (описанный Оешйег е1 а1, 1998, ΕΜΒΟ 17: 3091-3100.) См. фиг. 5. Мотив СΑСΑ12 присутствует на ТСР-бета-чувствительных генах (гене ΡΑΙ-1), а поэтому такой вектор обычно применяется для передачи сигнала факторов под действием 8шаб2 и 3.
День 1. Клетки А-204 распределяли по лункам 48-луночного планшета.
День 2. Клетки А-204 трансфицировали 10 мкг рС^3(СΑСΑ)12 или рС^3(СΑСΑ)12(10 мкг)+рΚ^СΜV (1 мкг) и реагентом Еи/еие.
День 3. Добавляли факторы (разведенные в среде + 0,1% Β8Α). Ингибиторы, перед их добавлением в клетки, должны быть предварительно инкубированы с факторами в течение 1 ч. Через 6 ч клетки промывали ΡΒ8 и подвергали лизису.
После этого проводили анализ с использованием люциферазы. В отсутствие любых ингибиторов, активин А способствует 10-кратной стимуляции экспрессии репортерного гена с ЕО50 ~2 нг/мл. СОР-11: 16-кратная стимуляция, ЕО50 ~1,5 нг/мл.
В этом анализе ΑсΐΚIIΒ(Κ64, 20-134) представляет собой сильный ингибитор активности активина, СОР-8 и СОР-11. В этом анализе также были протестированы варианты.
Пример 3. Ингибирование СОР-11 с Ν-концевыми и С-концевыми усечениями.
- 31 018868
Был получен белок ΑсίΚIIΒ-Ес (Κ64, 20-134), в котором ΑсίΚIIΒ-часть имела Ν- и С-концевые усечения, и этот белок тестировали на активность в качестве ингибиторов СЭЕ-11 и активина. Активности представлены ниже (измеренные в кондиционированных средах):
С-концевые усечения ΑΛΚ1Λ-1Εο
Следует отметить, что усечения в три аминокислоты (заканчивающиеся ...РРТ), шесть аминокислот (заканчивающихся ...ΥΕΡ) или более аминокислот у С-конца приводят к трехкратному или к еще более значительному снижению активности данной молекулы. Усечение 15 конечных аминокислот в ΑΛΚΙΙΒчасти приводит к значительной потере активности (см. ν0 2006/012627).
Аминоконцевые усечения были сделаны в контрольном белке ΑсίΚIIЬ-ЬЕс (Κ64 20-131). Полученные активности представлены ниже (измеренные в кондиционированных средах).
Ν-концевые усечения ΑсίΚIIЬ-ЬЕс
1С50 (нг/мл)
СОЕ-11 Активин
АсЪКЫЬ-пГс (К64, 20-131) (СКС...) 183 201
АсбВЫЬ-КГс (В64, 21-131) (ВСЕ-) 121 325
АсЬКЫЬ-пГс (К64, 22-131) (СЕД...) 71 100
АсРКИЬ-ЬЕс (В64, 23-131) (ЕАЕ...) 60 43
Ас^ЕНЬ-^Гс (К64, 24-131) (АКТ...) 69 105
В соответствии с этим, усечения в две, три или четыре аминокислоты у Ν-конца приводят к образованию более активного белка, чем варианты, содержащие полноразмерный внеклеточный домен. Дополнительные эксперименты показали, что ΑсίΚIIЬ-ЬЕс (Κ64, 25-131) с усечениями в пять аминокислот обладает активностью, эквивалентной активности неусеченной формы, а дополнительные делеции у Νконца способствуют дальнейшему снижению активности белка. Поэтому оптимальные конструкции имеют у С-конца последовательность, заканчивающуюся в положениях аминокислот 133-134 8ЕС Ш Ν0:4, а у Ν-конца - начинающуюся в положениях аминокислот 22-24 8ЕО ΙΌ Ν0:4. Конструкция, в которой Ν-конец, соответствующий аминокислотам 21 или 25, обладает активностью, аналогичной активности конструкции ΑΛΚ!^-№ο (Κ64, 20-134).
Пример 4. Варианты ΑсίΚIIЬ-Ес и их активность в клетках Активность белков ΑсίΚIIΒ-Ес тестировали в клеточном анализе, описанном выше. Результаты систематизированы ниже в табл. 1. Некоторые варианты тестировали в различных конструкциях с С-концевыми усечениями. Как обсуждалось выше, усечения в пять или пятнадцать аминокислот приводили к снижению активности. Интересно отметить, что варианты Б79Э и Ь79Е, по существу, не обладали способностью связываться с активином, но почти полностью сохраняли способность ингибировать СЭЕ-11 дикого типа.
Связывание растворимого ΑсίΚIIΒ-Ес с СЭЕ11 и активином А
Варианты АсЪКНВ-Ес Часть АсЬВНВ (соответствует аминокислотам ЗЕО Ю N0:4) Активность ингибирования СОЕ-11 Активность ингибирования активина
64В 20Ί34 +++ (лрибл. 10-8 М Кт) 4 + 4 (лрибл. 10*3 И Кг)
64А 20-134 + (лрибл. 10’& М Кт) + (лрибл. 10'& М Кт)
64В 20-129 +++ + + +
64В К74А 20-134 4 + 44 + + + +
64В Α24Ν 20-134 4+4 444
64В Α24Ν 20-119 + 4 + +
64В Α24Ν К74А 20-119 + 4
В64 Ь79Р 20-134 + +
В64 Ь79₽ К74А 20-134 + +
В64 Ь79О 20-134 4+4 4
В64 Ъ79Е 20-134 4+4 4
В64К 20-134 4 + 4 444
В64К 20-129 4+4 444
В64 Р1293 Р130А 20-134 + + + + + +
Β64Ν 20-134 + 4
- 32 018868 + Низкая активность (приблизительно 1х 10 -6 К1).
++ Умеренная активность (приблизительно 1х 10-7 К1).
+++ Высокая активность (дикого типа) (приблизительно 1х 10-8 К1).
++++ Активность, превышающая активность дикого типа.
Несколько вариантов оценивали на время их полужизни в крысиной сыворотке. Время полужизни АсГК11В(К64 20-134)-Рс в сыворотке составляло примерно 70 ч. Время полужизни АсГК11В(К64 Ά24Ν 20134)-Рс в сыворотке составляло примерно 100-150 ч. В клеточном анализе (описанном выше) и в анализах ш νίνο (описанных ниже) вариант Ά24N обладал активностью, эквивалентной активности молекулы дикого типа. Если учесть более длительное время полужизни этого варианта, то это означает, что в течение всего этого времени вариант Ά24N будет давать лучший эффект на единицу активности белка, чем молекула дикого типа.
Интересно отметить, что введение кислотных аминокислот (аспарагиновой или глутаминовой кислоты) в положение 79 приводит к селективному снижению способности связываться с активином, но сохраняет способность связываться с СЭР11/СЭР8. Как обсуждается ниже, белки АсГК11В-Рс дикого типа, очевидно, действуют на ткани, но не на мышцы, причем некоторые из этих эффектов могут быть нежелательными. Как описано в настоящей заявке, предполагается, что такие эффекты заключаются в том, что различные лиганды связываются с АсГК11В-Рс и ингибируются под действием АсГК11В-Рс, включая, вероятно, связывание с активином и ингибирование активином. Предварительные данные показали, что у мышей варианты Ь79Е и Ь79Э оказывают меньшее влияние на ткани, чем на мышцы, но при этом они сохраняют свое воздействие на мышцы. Хотя варианты такого типа могут рассматриваться как варианты АсГКПВ, однако следует отметить, что эти белки больше не обладают истинной функцией как рецепторы активина, а поэтому присвоенное обозначение АсГКПВ служит только указанием на происхождение этих полипептидов. Хотя кислотные остатки в положении 79 вызывают снижение способности связывания с активином, сохраняя при этом способность связывания с СЭР11, однако другие модификации в этом положении не дают такого эффекта. Замена Ь79А приводит к повышению способности связываться с активином, но не с СЭР11. Замена Ь79Р приводит к снижению способности связываться с активином и с СЭР11.
Пример 5. Связывание с СЭР-11 и с активином А.
Связывание некоторых белков АсГКЛВ-Рс с лигандами тестировали в анализе В1аСоге™.
Варианты АсГКЛВ-Рс или белок дикого типа иммобилизовали на системе с использованием анти11Рс антитела. Лиганды инжектировали и пропускали через колонку с иммобилизованными белками рецептора. Результаты систематизированы в нижеследующей таблице.
Специфичность связывания лигандов с вариантами 11В
СОРИ
Белок Коп (1/М5) ΚΟίί{1/5) КО(М)
АсИНИВ-ЬГс (В64 20-134) 1,34е-6 1,13е-4 8,42е-11
Ас£Е1ΙΒ-ЬЕс (Я64, Α24Ν 20-134) 1,21е-б 6,35е-5 5,19е-11
АсЪЕИВ-кГс (Еб4, Σ79ϋ 20-134) 6,7е-5 4,39е-4 6,55е-10
АсЪЕИВ-ЬГс (Еб4, Ь79Е 20-134) 3,8е-5 2,74е-4 7,16е-10
АсгКИВ-ЬГс (Β64Κ 20-134 ) 6,77е-5 2,41е-5 3,56е-11
С0Г8
Белок коп (1/мз) Ко££(1/з) КО(М)
АсСКИВ-ЬГс (К64 20-134) 3,69е-5 3,45е-5 9,35е-11
АсОЕНВ-НГс (К64, Α24Ν 20-134)
Ас^ЕИВ-ЬГс (Е64, Ъ79Б 20-134) 3,85е-5 8,Зе-4 2,15е-9
АсЪКИВ-ИГс (Е64, Ъ79Е 20-134) 3,74е-5 9е-4 2,41е-9
Ас£Е1ΙΒ-ПГс (Е64К 20-134) 2,25е-5 4,71е-5 2,1е-10
АсЪЙНВ-кГс (Е64К 20-129) 9,74е-4 2,О9е-4 2,15е-9
АсЪЕЫВ-ЬГс (Е64, Р1293, Р13ОЕ 20-134} 1,08е-5 1,8е-4 1,67е-9
ΑθΐΕΙΙΒ-ИЕС (В64, К74А 20-134) 2,8е-5 2,03е-5 7,18е-11
Активин А
Белок Коп (1/Мз) Κοίί(1/з) КБ(М)
Ас£ЕИВ-ПГс (К64 20-134) 5,94е6 1,59е-4 2,68е-11
АсЪКИВ-КГс (Е64, Α24Ν 20-134) 3,34еб 3,46е-4 1,04&-1О
- 33 018868
АсСКИВ-ЬГс (К64, Σ79ϋ 20-134) Низкий уровень связывания
АсбЯНВ-ЬГс {Я64, Ь79Е 20-134) Низкий уровень связывания
АсГЯНВ-ЬЕс (В64К 20-134) 6,82еб 3,25е-4 4,76е-11
АсГНИВ-ЬГс (В64К 20-129) 7,46еб 6,28е-4 8,41е-11
АсСЯНВ-ЬГс (Я64, Р1293, Р130Я 20-134) 5, 02еб 4,17е-4 6,31е-11
Полученные данные подтверждают данные клеточного анализа, и указывают на то, что вариант А24N сохраняет лигандсвязывающую активность, аналогичную активности молекулы АсВИЬ-ЬРс (В64 20-134), и что молекулы Ь79Э или Ь79Е сохраняют способность связываться с миостатином и СЭР11, но вызывают значительное снижение уровня (не поддающееся количественной оценке) связывания с активином А.
Другие варианты получали и тестировали, как сообщалось в А0 2006/012627, с использованием иммобилизованных на данном устройстве лигандов и с последующим пропусканием рецепторов над указанными иммобилизованными лигандами. Ниже приводится таблица данных, относящихся к этим вариантам.
Связывание растворимых вариантов Ас!В11В-Рс с СЭР11 и с активином А (В1аСоге-анализ)
* связывания не наблюдалось;
--<1/5 от связывания дикого типа (^Т);
- ~1/2 от связывания АТ;
+ АТ;
++ < 2-кратное увеличение уровня связывания;
+++ ~5-кратное увеличение уровня связывания;
++++ ~10-кратное увеличение уровня связывания;
+++++ ~40-кратное увеличение уровня связывания.
Пример 6. Влияние белков Ас1ВПВ-Рс на мышечную массу у мышей дикого типа.
Заявителями была определена способность белка Ас1ВПВ-Рс увеличивать мышечную массу у мышей дикого типа.
Мышам С57В110 два раза в неделю вводили дозу (10 мг/кг; внутрибрюшинно (1.р.)) человеческого
- 34 018868 белка ΑεΐΚΙΙΒ (Κ64 20-134) или человеческого ΑεΐΚΙΙΒ (Κ74Α 20-134). Мышей подвергали ЯМРсканированию на день 0 и на день 28 для определения процента изменения безжировой массы ткани всего организма. У мышей, обработанных ΑεΐΚΙΙΒ (Κ64 20-134)-Ес, наблюдалось значимое 31,1% увеличение массы безжировой ткани по сравнению с массой мышей в контрольной группе, обработанной носителем. У мышей, обработанных человеческим белком ΑсΐΚIIΒ (Κ74Α 20-134)-Ес, наблюдалось значимое увеличение массы безжировой ткани по сравнению с массой, наблюдаемой у контрольной группы, хотя и в меньшей степени, чем у группы, обработанной человеческим ΑΛΚΙΙΒ (Κ64 20-134). В аналогичном исследовании мышей внутрибрюшинно два раза в неделю обрабатывали ΡΒ8, 1 мг/кг, 3 мг/кг или 10 мг/кг мышиного ΑсΐΚIIΒ (ντ, 20-134)-Ес. По окончании исследований мышцы бедра, икроножные мышцы, мышцы грудной клетки и мышцы диафрагмы иссекали и взвешивали. Результаты систематизированы ниже в табл. 3.
Таблица 3. Массы ткани у мышей дикого типа, обработанных носителем и мышиным
ΑΛΚΙΙΒ (ντ, 20-134)-Ес
Обработанные носителем Икроножная мышца (Ь+Н) Бедро (Ь+Н) Грудная клетка (Ь+К) Диафрагма
Среднее (граммы) ± ст.кв.откл. 0,ЗО6±0,020 0,187±0,040 0,257+0,020 0,07б±0,020
тиАсбКИВ (КТ, 20-134)-Гс (10 мг/кг) Икроножная мышца (Ь+й) Бедро (Ь+й) Грудная клетка {Ь+К) Диафрагма
Среднее (граммы) + ст.кв.откл. С,387+0,010 0,241+0,014 0,360+0,070 0, 124+0,040
Величина ρ Ткритерия 0,0001 0, 009 0, 02 0, 04
Как показано в табл. 3, мышиный слитый белок ΑсΐΚIIΒ (ντ, 20-134)-Ес способствовал значительному увеличению мышечной массы у мышей дикого типа. У мышей, обработанных мышиным ΑΛΚΙΙΒ (ντ, 20-134)-Ес, масса икроножных мышц увеличивалась на 26,5%, масса мышц бедра увеличивалась на 28,9%, а масса мышц грудной клетки увеличивалась на 40,0%. Авторами настоящего изобретения были также обнаружены изменения массы мышц диафрагмы, которая на 63% превышала массу мышц диафрагмы у контрольных мышей, обработанных носителем. Уменьшение массы мышц диафрагмы ассоциируется с осложнениями, которые обычно наблюдаются при различных мышечных дистрофиях. Поэтому увеличение массы диафрагмы, наблюдаемое после обработки мышиным ΑΛΚΙΙΒ (ντ, 20-134)-Ес, может иметь клинически важное значение.
Пример 7. Влияние длительного времени полужизни белков ΑΛΚΙΙΒ^ на мышечную массу мышей дикого типа.
Заявителями было определено влияние длительного времени полужизни варианта белка ΑсΐΚIIΒтЕс (Κ64, Α24Ν 20-134) на увеличение мышечной массы у мышей дикого типа.
Мышам С57В110 два раза в неделю вводили дозу (10 мг/кг; внутрибрюшинно (1.р.)) человеческого белка ΑсΐΚIIΒ-тΕс (Κ64 20-134) или человеческого ΑсΐΚIIΒ-тΕс (Κ64, Α24Ν 20-134). Мышей подвергали ЯМР-сканированию в различные периоды времени вплоть до 25-го дня для определения процента изменения массы безжировой ткани всего организма. Обе молекулы способствовали эквивалентному увеличению массы всего организма и мышечной массы, при этом масса икроножных мышц, бедра и грудной клетки увеличивалась на 40-70%. См. фиг. 5 и 6.
Полученные данные показали, что более длительное время полужизни данной молекулы стимулирует рост мышц за короткий период исследований с эффективностью, эквивалентной эффективности молекулы дикого типа.
Пример 8. Влияние белков ΑсΐΚIIΒ-Εс с пониженной способностью связываться с активином на мышечную массу мышей дикого типа.
Заявителями была определена способность варианта белка ΑсΐΚIIΒ-тΕс (Κ64, Б79Э 20-134) с длительным временем полужизни увеличивать мышечную массу у мышей дикого типа.
Мышам С57В110 два раза в неделю вводили дозу (10 мг/кг; внутрибрюшинно (1.р.)) человеческого белка ΑсΐΚIIΒ-тΕс (Κ64 20-134) или человеческого ΑсΐΚIIΒ-тΕс (Κ64, Б79Э 20-134). Мышей подвергали ЯМР-сканированию в различные периоды времени вплоть до 24-го дня исследований для определения процента изменения массы безжировой ткани всего организма. Данные представлены ниже в табл.
Масса тела День 0 (г) Масса тела День 24 (г) Икроножная мышца (Ь+й) Бедро (Ь+К) Грудная клетка (Ь+Ю
Мод. ТВЗ (масс./об.) 24,4+1,51 26,8±1,43 0,29+0,02 0,17±0,02 0,24±0,05
К64, 20-134 (10 мг/кг) 25,0+1,36 31,2*±1,53 0,40*±0,02 0,24*±0,02 0,37*±0,07
Н64, Ъ79б 20-134 (10 мг/кг) 25,3±1,22 28,1+1,64 0,32*±0,02 0,20*+0,02 0,27±0,05
*р<0< 05
- 35 018868
Эти данные продемонстрировали, что вариант Ь79О Ас^КПВ (с пониженной способностью связываться с активином А) обладает активностью ίη νίνο, направленной на стимуляцию роста мышц, однако этот вариант дает меньшее количество прироста мышц, чем ЛсίКIIБ дикого типа. Такое снижение эффекта может быть отчасти вызвано небольшим снижением уровня связывания миостатина или потерей способности связываться с другим еще неизвестным негативным регулятором роста мышц. Способность стимулировать рост мышц в отсутствие влияния на передачу сигнала активина А является особенной желательной, поскольку активин представляет собой широко экспрессируемую регуляторную молекулу, которая, как известно, оказывает влияние на репродуктивную систему, кости, печень и многие другие ткани. У мышей ЛсίКIIБ-тРс (К64 20-134) оказывает значительное влияние на репродуктивную систему, а в некоторых случаях способствует увеличению размера селезенки. Молекула ЛсίК1IБ-тРс (К64, Ь79О 20-134) оказывает значительно более слабое влияние на репродуктивные ткани и селезенку, что указывает на то, что эта молекула является особенно подходящей для стимуляции роста мышц у пациентов с хорошей репродуктивной способностью или у пациентов, у которых желательно минимизировать влияние на репродуктивную систему.
Пример 9. Влияние белка ЛсίКIIБ-Рс на мышечную массу и силу мышц у мышей Мбх.
Для определения способности мышиного белка ЛсίКIIБ (^Т, 20-134)-Рс увеличивать мышечную массу при патологических состояниях, заявителями была определена способность белка АйКПВ-Рс увеличивать мышечную массу у мышей тбх с моделью мышечной дистрофии.
Взрослых мышей Мбх два раза в неделю обрабатывали мышиным белком АсГКПВ (^Т, 20-134)-Рс (1, 3 или 10 мг/кг; внутрибрюшинно) или РВЗ-носителем, используемым в качестве контроля. Для определения сокращения мышц передних конечностей определяли силу, которую мышь прилагает при нажатии датчика мышечной силы. Для сравнения силы сокращения мышц у различных групп мышей была использована средняя сила из 5 испытаний с нажатием датчика. В конце исследований мышцы бедра, икроножные мышцы, мышцы грудной клетки и диафрагмы иссекали и взвешивали.
Измерения силы мышечных сокращений также указывали на значимое увеличение этой силы. Результаты измерения мышечной массы систематизированы ниже в таблице.
Массы ткани у мышей тбх, обработанных носителем и мышиным АсГКПВ (^Т, 20-134)-Рс
Обработанные носителем Икроножная мышца (Ь+К) Бедро (Ь+К) Грудная клетка (Ь+К) Диафрагма
Среднее (граммы)+ст. кв.откл. 0,413±0,040 0,296±0,019 0,437+0,060 0,111±0,030
тиАс1;К1 ΙΒ (ИТ, 20134)-Ес (10 мг/кг) Икроножная мышца (Ь+В) Бедро (Ъ+К) Грудная клетка (Ъ+К) Диафрагма
Среднее (граммы)±ст. кв.откл. 0,52+0,050 0,39±0,05 0,807+0,21 0,149+0,020
Величина р т-критерия 0,0006 0,0006 0,002 0,05
Как показано в табл., у групп мышей тбх, обработанных мышиным АсГКПВ (^Т, 20-134)-Рс, наблюдается увеличение массы безжировой ткани по сравнению с массой у мышей, обработанных РВ8. Лс!КIIБ-Рс-обработка, по сравнению с контрольной группой, обработанной носителем, приводила к увеличению размера икроножных мышц на 25,9%, мышц бедра - на 31,8%, а грудной клетки - на 85,4%. Возможный клинический интерес состоит в том, что авторами настоящего изобретения было также обнаружено, что массы диафрагмы мышей, обработанных мышиным Ас^КПВ (^Т, 20-134)-Рс, по сравнению с контрольной группой, увеличивались на 34,2%. Полученные данные показали, что белок ЛсίКIIБРс является эффективным для лечения такого патологического состояния, как мышечная дистрофия.
Кроме того, у мышей тбх, обработанных белком Ас^КЕВ-Рс, по сравнению с контролем, обработанным носителем, наблюдались более сильные мышечные сокращения. Через 16 недель у групп мышей, которым вводили 1, 3 и 10 мг/кг ЛсίКIIБ, по сравнению с контрольными группами, которым вводили носитель, наблюдалось 31,4%-ное, 32,3%-ное и 64,4%-ное увеличение силы мышечных сокращений, соответственно. Увеличение силы мышечных сокращений у групп, обработанных мышиным ЛсίКIIБ (^Т, 20-134)-Рс, подтвердило предположение о том, что увеличение мышечной силы, обнаруженное у групп обработки, является физиологически релевантным. Мыши тбх были восприимчивыми к поражениям, индуцированным мышечными сокращениями, и претерпевали значительно большее число циклов дегенерации и регенерации, чем мыши дикого типа. Несмотря на присутствие таких мышечных фенотипов, у мышей тбх, обработанных мышиным ЛсίКIIБ (^Т, 20-134)-Рс, наблюдались более сильные мышечные сокращения.
Мышечная дистрофия Дюшенна начинает развиваться в раннем детстве, чаще всего в возрасте до пяти лет. В соответствии с этим, представленные выше данные, полученные для взрослых мышей, необя
- 36 018868 зательно отражают эффекты, которые дает молекула Ас®НВ у детей с МДД. Для подтверждения этих данных исследования проводили на молодых мышах тбх.
У молодых мышей (4-недельных) С57ВБ/10 и у мышей тбх обработка белком АсЖНВ-тЕс (В64, 20-134) приводила к значительному увеличению массы тела. Анализ состава веществ в организме, проводимый с помощью ЯМР-спектроскопии ίπ νίνο, указывал на увеличение массы безжировой ткани, сопровождающееся увеличением массы тела. У мышей С57ВБ/10, обработанных АсЖНВ-тЕс (В64, 20134), наблюдался 35,2% прирост массы безжировой ткани, а у обработанных групп тбх такой прирост массы безжировой ткани составлял 48,3% по сравнению с соответствующими контрольными группами. Кроме того, было оценено влияние АсЖИВ-тЕс (В64, 20-134)-обработки на мышечную силу. У обработанных носителем мышей тбх показатели силы мышечных сокращений были на 15,7% ниже, чем у групп С57ВБ/10, обработанных носителем, что указывает на то, что мышечная слабость ассоциируется с дефицитом дистрофина. В противоположность этому, у мышей тбх, обработанных Ас®ПВ-тЕс (В64, 20-134), сила мышечных сокращений превышала силу, наблюдаемую у группы мышей тбх, обработанных носителем, и величины измерений достигаемой силы мышечных сокращений превышали величины, полученные для мышей С57ВБ/10, обработанных носителем, и достигали уровня величин силы мышечных сокращений у обработанных мышей С57ВБ/10 (мыши тбх, обработанные носителем: 0,140±0,01 кгС; обработанные мыши тбх: 0,199±0,02 кгС; мыши С57ВБ/10, обработанные носителем: 0,166±0,03; 0,205±0,02 кгС). Интересно отметить, что такая обработка приводила к восстановлению силы мышечных сокращений у молодых мышей тбх до уровней, наблюдаемых у мышей дикого типа. Поэтому молекула Ас£КЛВ-тЕс (В64, 20-134), вероятно, играет важную роль в клинической практике лечения мышечной дистрофии Дюшенна, в частности, у молодых пациентов в возрасте, близком к возрасту, при котором начинается развитие данного заболевания.
Пример 7. Влияние белка Ас£КЛВ-Ес на мышечную силу и выживаемость у мышей 8ΘΌ1.
Для определения способности полипептидов Ас®НВ увеличивать мышечную силу и выживаемость мышей с моделью АБС, заявителями был протестирован белок Ас£КЛВ-Ес на мышах 8ΘΌ1.
Мыши В6.Сд-Τд(8Ο^1-С93А)IСи^/^, или 8ΘΌ1, имели большое число копий мутантного аллеля человеческого трансгена супероксид-дисмутазы. Высокие уровни этого белка сообщают мышам фенотип, сравнимый с фенотипом, наблюдаемым у человека с АБС. У мышей 8ΘΌ1 развивался прогрессирующий паралич, а первые признаки заболевания проявлялись на 91-й день. Такое заболевание приводило к преждевременной гибели мышей в возрасте 19-23 недель.
Мышам 8ΘΌ1, начиная с возраста 10 недель, вводили дозу носителя в качестве контроля или АсЖНВ-тЕс (К74А 20-134) (ί.ρ., 5 мг/кг, два раза в неделю). Для определения силы сокращения мышц передних конечностей измеряли силу, которую мышь прилагает при нажатии датчика мышечной силы. Для сравнения силы сокращения мышц у различных групп мышей была использована средняя сила из 5 испытаний с нажатием датчика. Выживаемость определяли как число дней, начиная с рождения мыши и до дня, когда мышь, положенная на один бок, не могла сама встать за 30 с. На фиг. 7 представлены результаты измерения силы сокращения мышц, а на фиг. 8 проиллюстрированы данные по выживаемости.
Мышам на последней стадии заболевания трудно поддерживать чистоту тела, что преимущественно обусловлено прогрессированием паралича, и они становятся неопрятными на вид. Поверхностное наблюдение этих мышей показало, что мыши в группе обработки мышиным Ас®НВ (К74А 20-134)-Ес являются опрятными на вид даже в конечной стадии заболевания по сравнению с РВ8-группой. Это наблюдение дает основание предположить, что обработанные мыши имеют лучшее здоровье и более высокое качество жизни, чем контрольные животные.
Как видно на фиг. 7, у мышей 8ΘΌ1, которых обрабатывали мышиным Ас£КНВ (К74А 20-134)-Ес, по сравнению с контрольной группой, которой вводили РВ8, наблюдались значительно более сильные мышечные сокращения. Это наблюдение отмечалось на день 117, то есть на ранней стадии заболевания, а также после прогрессирования заболевания на день 149. На фиг. 8 показано, что Ас£КНВ (К74А 20134)-Ес-обработанные мыши имели большую продолжительность жизни, чем контрольные животные, обработанные носителем. Такое исследование продемонстрировало возможность применения мышиного Ас!КПВ(К74А 20-134) у мышей с моделью АБС в целях увеличения мышечной силы и повышения выживаемости.
Аналогичный эксперимент проводили на мышах 8ΘΌ1, однако, для более точной имитации лечения человеческого АБС после появления значимых симптомов заболевания, обработку осуществляли более медленно до тех пор, пока не наблюдались едва заметные признаки заболевания (день 130). На день 130 мышей 8ΘΌ1 распределяли на группы, которые обрабатывали либо носителем (модифицированным ТВ8), либо АсЖНВ (В64 20-134)-тЕс (10 мг/кг). Мышам подкожно вводили дозу один раз в неделю. Затем этих мышей подвергали ЯМР-сканированию на дни исследования -1 и 27 (в возрасте 129 и 157 дней, соответственно). Измерения силы мышечных сокращений проводили на дни исследования 0 и 20. По окончании исследования у самцов контрольной группы потеря массы тела со дня исследования 0 составляла 4,3%, а у группы обработки прирост массы тела со дня исследования 0 составлял 7,8%. Потеря массы тела у самок контрольной группы по сравнению с их массой на день исследования 0 составляла
- 37 018868
1,5%, тогда как у самок группы обработки наблюдался 15%-ный прирост массы тела.
Измерение силы мышечных сокращений у мышей ЗОИ 1
День 0 День 20
Самцы, контроль 0,149±0,02 0, 0Э7±0,02а
Самцы, обработка АсЪКИВ (К64 20-134)-тГс 0,147±0,02 0, 128+0, 02а'ь
Самки, контроль 0,130+0,02 0,091+0,02а
Самки, обработка АсЕКИВ (К64 20-134)-тГс 0,128+0,01 0,11+0,02ь
У самцов и самок мышей ЗОИ1, силу мышечных сокращений измеряли на дни 0 и 20. Верхний индекс а означает значимое различие по сравнению с соответствующим измерением на день 0 (р<0,05). Верхний индекс Ь означает значимое различие между величинами измерений для групп, которым вводили РВЗ (группа 1) и Ас1КНВ (К64 20-134)-тРс (группа 2) на день 20 (р<0,05).
Мышей подвергали ЯМР-сканированию для определения изменений состава веществ в организме после обработки. На протяжении всего исследования у самок контрольных мышей потеря массы безжировой ткани составляла 6,0% (день -1: 18,2 г ± 1,28; день 27: 17,1 г ± 1,10), у самцов обработанных мышей со дня исследования 0 прирост массы безжировой ткани составлял 9,1% (день -1: 19,17 г ± 0,77; день 27: 20,92 г ± 0,74). У самок контрольных мышей снижение безжировой массы с начала исследования составляло 0,83% (день -1: 13,18 г ± 0,84; день 27: 13,08 г ± 0,71), а у самок обработанных мышей прирост массы тела со дня исследования 0 составлял 10,7% (день -1: 13,66 г ± 0,83; день 27: 15,12 г ± 1,21). У самцов и самок групп обработки наблюдался значимый прирост массы безжировой ткани по сравнению с массой, наблюдаемой у соответствующих контрольных групп, обработанных РВЗ (р<0,001).
Влияние Ас®ИВ (К64 20-134)-тРс на мышечную массу мышей ЗОИ1
Икроножная мышца (Ь+Ю Бедро (Ь+К) Грудная клетка (Ь+К)
Самцы, контроль 0,18+0,03 0,12+0,03 0,20+0,04
Самцы, обработка АсбКИВ (К64 20-134)тГс 0,22±0,04 0,15+0,02 0,30±0,04
Самки, контроль 0,13+0, 02 0,089+0,016 0,11±0,01
Самки, обработка АсЪЕИВ (В64 20-134)гпГс 0, 17±0,03 0,01+0,02 0,15+0,05
Полученные данные показали, что Ас1КЛВ-Рс-обработка может оказывать благоприятный эффект при лечении пациентов с активной формой АБС, как в отношении улучшения мышечной функции, так и в отношении повышения качества жизни.
Пример 8. Влияние белка Ас1КЛВ-Рс на развитие ожирения и диабета у мышей с ожирением.
Для определения способности Ас1КЛВ-Рс снижать степень ожирения у мышей с моделью ожирения заявителями были протестированы белки АсЖПВ-тРс на мышах, которым давали корм с высоким содержанием жира (НРИ).
Диабет типа II является серьезным осложнением при ожирении и характеризуется инсулинорезистентностью. Характерными признаками инсулинорезистентности являются повышенные уровни инсулина натощак, и по этим признакам можно определить наличие у животного инсулинорезистентности. Заявителями было определено влияние обработки мышиным АсЖПВ (К64 К74А 20-134)-Рс на нормализацию уровней инсулина натощак у мышей с моделью ожирения.
Мышам С57ВБ/6 давали корм НРИ, который состоял из 35% жира, при этом считалось, что мыши имеют ожирение, если их масса тела приблизительно на 50% выше массы тела мышей этого же возраста, которым давали стандартный корм (с 4,5% жира). Мышам с ожирением два раза в неделю вводили дозу носителя в качестве контроля или человеческого АсЖПВ (К64 К74А 20-134)-Рс (10 мг/кг; 1.р.). Мышей с ожирением подвергали ЯМР-сканированию для определения состава веществ в организме сразу после введения дозы и через 3 недели после введения дозы. Изменения состава веществ в организме по сравнению со стандартом систематизированы на фиг. 9.
Мышам давали корм с высоким содержанием жира, при этом считалось, что мыши имеют ожирение, если их масса тела на 50% выше, чем масса тела мышей, которым давали стандартный корм. Мышам, которым давали корм НРИ, в течение 35 недель вводили либо носитель в качестве контроля, либо мышиный Ас1КПВ (К64 К74А 20-134)-Рс (5 мг/кг, два раза в неделю; 1.р.). По окончании исследования мышей поддерживали в условиях голодания в течение ночи. По окончании периода голодания брали кровь и выделяли сыворотку. Затем сыворотку использовали для определения уровней инсулина натощак у мышей обеих групп. Результаты влияния мышиного Ас1КПВ (К74А 20-134)-Рс на уровни инсулина натощак у мышей с ожирением систематизированы ниже в табл.
Уровни инсулина натощак у мышей, обработанных носителем и мышиным Ас1КЛВ (К74А 20-134)-Рс
- 38 018868
Η?Ό, РВ8 ΗΕϋ, мышиный АсСКИВ (К74А 20- 134)-тГс
Среднее (нг/мл) ± ст.кв.откл. 2,27±1,64 0,78+0,40
т-критерий Ν/Α 0, 012
На фиг. 9 проиллюстрировано снижение степени ожирения у группы мышей, которым вводили мышиный АсГКНВ (В64 К74А 20-134)-Ес, по сравнению с контрольной группой, обработанной носителем. Было обнаружено, что жировая масса у обработанных мышей на 25,9% ниже, чем их исходная жировая масса. Кроме того, у мышей этой обработанной группы безжировая масса на 10,1% превышала исходную безжировую массу. Процентное изменение массы жировой ткани и безжировой ткани у мышей, обработанных Ас1КПВ (В64 К74А 20-134)-тЕс, было значительно выше, чем процентное изменение такой массы у группы, обработанной РВ8.
Мышам этой модели давали корм с высоким содержанием жира до тех пор, пока их масса более, чем на 50% не превышала массу таких же мышей, которым давали стандартный корм. Исходя из заметного увеличения массы тела и степени ожирения, можно сделать вывод, что эта модель будет соответствовать человеческой модели, которая характеризуется как явно выраженная степень ожирения. Поэтому установление того факта, что обработка мышей с ожирением человеческим белком АсЖПВ (К.64 К74А 20-134)-Ес приводит к снижению степени ожирения, может оказаться клинически релевантным для лечения человека с явно выраженной степенью ожирения.
Полученные результаты, систематизированные в табл. 5, дают основание предполагать, что обработка мышиным белком АсГКЛВ (К74А 20-134)-Ес будет значительно снижать повышенные уровни инсулина в сыворотке натощак, ассоциированные с ожирением. Полученные данные подтверждают возможную клиническую релевантность применения полипептидов АсГКПВ для лечения диабета типа II.
Последующие эксперименты проводили на ΗΕΌ-мышах с моделью ожирения и диабета, которым вводили АсГКНВ-тРс (К64 20-134). 30-недельных мышей С57ВБ/6, которым давали корм ΗΕΌ, распределяли на две группы (РВ8 и 10 мг/кг АсЖПВ-тРс (К64 20-134)). Затем мышей взвешивали, и два раза в неделю в течение 12 недель внутрибрюшинно вводили нужную дозу. Мышей оценивали с помощью ЯМР на дни исследования 0 и 94.
У обработанных мышей потеря массы тела составляла 1,9% от их массы на день исследования 0, а у РВ8-обработанных мышей прирост массы тела во время исследования составлял 6,7% от их массы на день исследования 0. Во время исследования у обработанных мышей также наблюдалось значительное увеличение массы безжировой ткани по сравнению с массой, наблюдаемой у РВ8-группы (21,1%± 6,28 и 3,7%± 4,08, соответственно). У обработанных мышей также наблюдалась значительная потеря жировой ткани (-34%± 10,95) по сравнению с РВ8-группой (+10,2± 10,18).
Увеличение мышечной массы также наблюдалось у отдельных мышей в группе, обработанной АсЖПВ-тЕс (К64 20-134)
Икроножная мышца (Ь+К) Бедро (Ъ+К) Грудная клетка (Ь+К)
РВЗ 0,33±0,05 0,18+0,03 0,31+0,05
Ас£Н1ΙΒ-тГс (К64 20-134) 0,44+0,08* 0,25±0,02* 0,44+0,13*
*р<0,05
Помимо позитивных эффектов, наблюдаемых в отношении массы жира и мышечной массы, которые ассоциировались с АсГКПВ-Ес-обработкой этих мышей, наблюдались также позитивные эффекты в отношении изменения уровней липидов в сыворотке. Уровни холестерина и триглицеридов в сыворотке заметно снижались, что дает основание предположить, что слитые белки АсГКЛВ-Ес могут быть использованы для снижения уровней этих липидов у пациентов.
Пример 9. Влияние белка АсГКЛВ-Ес на мышечную массу у мышей с кахексией.
Заявителями была протестирована способность АсГКЛВ (К64 20-134)-тЕс снижать потерю мышечной массы у мышей с моделью гипотрофии мышц, индуцированной глюкокортикоидами.
Мышам ежедневно в течение 13 дней подкожно вводили дозу РВ8 или дексаметазона (2 мг/кг) для индуцирования гипотрофии мышц. В течение этих же 13 дней группам, обработанным РВ8 или дексаметазоном, вводили носитель или АсЖНВ (К64 20-134)-тЕс (10 мг/кг; 1.р.; два раза в неделю) так, чтобы были представлены все комбинации обработки. Мышей подвергали ЯМР-сканированию на дни 0 и 13 для определения изменений массы безжировой ткани для всех групп. Результаты ЯМР-анализа представлены ниже в табл. 6.
Таблица 6. Масса безжировой ткани у мышей, обработанных носителем и мышиным АсГКЛВ (К64 20-134)-Ес.
- 39 018868
Группа (Обработка, 5ο:ίρ) Средняя безжировая масса на день 13 - Средняя безжировая масса на день 0 (г) ± ст.кв.откл.
РВЗ:РВЗ 0,83+0,94
Дексаметазон:РВЗ 0, 47±0, 34*
Дексаметазон: АсЕНИ В 2,56±0, 37*'*=
РВ5: Ас£Е.ПВ 3, 63+0,62*
Значимое различие по сравнению с РВ8:РВ8-группой при р<0,05;
Значимое различие по сравнению с дексаметазон:РВ8-группой при р<0,05.
ЯМР-сканирование выявило значимое 2,5%-ное снижение массы безжировой ткани у животных группы дексаметазон:РВ8 по сравнению с животными РВ8:РВ8-группы. В противоположность этому, у животных группы дексаметазон:Ас!КПВ (В64 20-134)-тРс наблюдалось 13,5%-ное увеличение массы безжировой ткани, и такое увеличение было значимо более высоким по сравнению с группой РВ8:РВ8 и дексаметазон:РВ8. Кахексия представляет собой нежелательный побочный эффект, возникающий при проведении различных терапевтических процедур, включая длительную терапию глюкокортикоидами. Поэтому тот факт, что лечение с использованием человеческого белка Ас!КЛВ (В64 20-134)-тРс может снижать уровень гипотрофии мышц, ассоциированной с кахексией, должен иметь клинически важное значение.
Пример 10. Влияние Ас!КЛВ-Рс на мышечную массу и ожирение у старых мышей или у мышей, подвергнутых овариэктомии.
Саркопения представляет собой одну из форм потери мышечной массы, ассоциированных со старением относительно здоровых людей. Это расстройство ассоциируется с прогрессирующей потерей массы скелетных мышц и снижением мышечной силы и подвижности. Этиология саркопении почти неизвестна. У женщин в период менопаузы потеря мышечной массы ускоряется так же, как и потеря кости. В соответствии с этим, Ас!КЛВ (В64, 20-134)-тРс тестировали у очень старых (двухлетних) мышей и у мышей с овариэктомией (модели климактерического состояния).
8-недельных самок мышей С57ВЬ/6 подвергали операции овариэктомии (ОУХ) или ложной операции, а затем оставляли в покое на 16 недель до начала исследования. В начале исследования каждую группу мышей, подвергнутых ложной операции, и мышей, подвергнутых овариэктории, разделяли на группу обработки и группу, которой вводили носитель. Мышей всех групп взвешивали, и еженедельно в течение 11 недель вводили дозу либо АсЖПВ (В64, 20-134)-тРс, либо буфера в качестве контроля. Всех исследуемых мышей на дни 0 и 83 подвергали ЯМР-сканированию для определения состава веществ в организме.
По окончании исследования у ложнооперированных РВ8-мышей наблюдалась 4,7%-ная потеря безжировой массы от исходной массы, а у ложнообработанных мышей в течение всего исследования безжировая масса увеличивалась на 21%. По окончании исследования у контрольных ОУХ-мышей наблюдалась 12,1% потеря безжировой массы (значительно большая, чем у ложноопрерированных мышей, которым вводили носитель), тогда как у обработанных ОУХ-мышей прирост массы составлял 12,9%.
Полученные данные показали, что слитые белки Ас®ПВ-Рс могут быть использованы для предотвращения потери мышечной массы, которая обычно наблюдается у женщин в климактерическом периоде.
Для оценки эффектов Ас®ПВ-Рс у естественно стареющих животных, самцов мышей С57ВЬ/6 оставляли на 70 недель до начала обработки. Мышей распределяли на 2 группы (РВ8 и 10 мг/кг Ас®ЛВ (В64, 20-134)-тРс). Мышей каждой группы взвешивали и 2 раза в неделю в течение 10 недель вводили нужную дозу. В течение всего исследования прирост массы безжировой ткани у обработанной группы был значительно выше, чем у РВ8-группы.
% изменения безжировой массы РВЗ 10 мг/кг
Среднее (% от фонового уровня) 101,76 117,27
Ср.кв.откл. 3, 83 3, 91
Р-величина для РВЗ <0,001
У животных группы обработки масса отдельных мышц была значительно выше, чем у мышей РВ8группы.
Масса мышц Икроножная мышца (Ь+Р) Бедро (Ь+Р) Грудная клетка (Ь+Р.)
РВЗ 0,283+0,07 0,156+0,01 0,241+0,07
АсОКИВ (К64 го- 134 ) -тГс 0,371±0,03* 0, 192+0,021* 0,330±0,05*
* р<0,05
- 40 018868
Было также обнаружено, что целостность мышц у животных группы обработки выше, чем у животных РВЗ-группы, на что указывает явное снижение уровня внутримышечного жира и улучшение структуры цитоскелета (см. фиг. 10).
Полученные данные показали, что слитые белки Ас!В11В-Рс могут быть использованы для лечения гипотрофии мышц, ассоциированной со старением мужчин и женщин.
Пример 11. Влияние АйВПВ-Рс на потерю мышечной массы, ассоциированную с кастрацией.
Рак предстательной железы обычно подвергают лечению методом антиандрогенной терапии. Побочными эффектами такого лечения являются потеря мышечной массы и увеличение степени ожирения. У кастрированных мышей наблюдаются аналогичные изменения, а поэтому такие мыши представляют собой хорошую модель для проведения исследования на возможность применения АсЕВНВ-Рс в медицине.
8-недельных самцов мышей С57ВБ/6 кастрировали или подвергали ложной кастрации, а затем оставляли на 3 недели до начала исследований. Затем ложнокастрированных и кастрированных мышей подразделяли на группы, которым вводили РВЗ и АсЖПВ (В64, 20-134)-тРс (10 мг/кг). Мышей взвешивали и один раз в неделю в течение 12 недель подкожно вводили нужную дозу. Мышей подвергали ЯМРсканированию на дни исследования 0 и 83.
Во время исследования у ложнокастрированных РВЗ-мышей прирост массы безжировой ткани со дня исследования 0 в среднем составлял 9,72%±3,67, а у ложнокастрированных мышей, которым вводили Ас!ВНВ (В64, 20-134)-тРс, прирост составлял 35,79%±3,1. У кастрированных РВЗ-обработанных мышей потеря массы безжировой ткани со дня 0 составляла 8,1%±4,22, а у обработанных кастрированных мышей наблюдался прирост массы, составляющий 17,77%±3,86. Кроме того, кастрация приводила к увеличению степени ожирения, а Ас!ВНВ (В64, 20-134)-тРс-обработка способствовала уменьшению прироста жировой массы.
Масса икроножных мышц и мышц грудной клетки у кастрированных мышей, обработанных носителем, была меньше, чем масса ложнокастрированных мышей РВЗ-группы (масса икроножных мышц у кастрированных мышей: 0,275± 0,03 г, масса мышц грудной клетки у кастрированных мышей: 0,196± 0,06 г; масса икроножных мышц у ложнокастрированных мышей: 0,313±0,02 г, масса мышц грудной клетки у ложнокастрированных мышей: 0,254± 0,03 г). Ас!ВНВ (В64, 20-134)-тРс-обработка приводила к значительному ослаблению скорости снижения мышечной массы, индуцированного кастрацией (масса икроножных мышц у кастрированных мышей: 0,421±0,03 г, масса мышц грудной клетки у кастрированных мышей: 0,296±0,06 г).
Пример 12. Влияние АсЖПВ-Рс на кахексию при раке.
Многие опухоли ассоциируются с потерей аппетита и со значительной потерей мышечной массы. У пациентов с кахексией прогноз хуже, чем у пациентов, не страдающих кахексией. Клеточная линия рака толстой кишки СТ26 индуцирует развитие тяжелой кахексии у мышей. У этой модели Ас!В11В(В64 20134) тестировали на его воздействие на кахексию, индуцированную ксенотрансплантацией.
В эксперименте участвовало шесть групп мышей:
Группа Опухоль Обработка Доза Парадигма лечения
1 N νΕΗ Об./об. Терапевтическое
2 N Ас&НИВ-Ес 10 мг/кг Терапевтическое
3 Υ УЕН Об./об. Терапевтическое
4 Υ АсбКИВ-Гс 10 мг/кг Терапевтическое
5 Υ АсЬВИВ-Гс 30 мг/кг Терапевтическое
6 Υ АсОВИВ-Ес 10 ыг/кг Превентивное
Животным групп 3-6 подкожно вводили 5х106 опухолевых клеток. Группу 6 сразу обрабатывали АсЕВПВ-Рс два раза в неделю. Группам 1-5 начинали вводить дозу на 28-й день исследования, когда опухоли достигали размера 300-500 мм3. Как показано на фиг. 11, АйВИВ-Рс вызывал значительное снижение потери мышечной массы, ассоциированной с опухолями СТ26, как у мышей с диагностированными опухолями, так и у мышей, используемых в качестве превентивной модели до введения им опухолевых клеток.
Пример 13. Влияние вариантов Ас!В11В-Рс на мышечную массу у мышей дикого типа.
Это исследование продемонстрировало влияние нижеследующих АсЕК-ПВ-конструкций, конъюгированных с Рс, на мышечную массу и другие ткани у 6-недельных самцов мышей С57ВБ/6. Мышей взвешивали и этим мышам два раза в неделю внутрибрюшинно инъецировали либо РВЗ, либо Ас!ВПВконструкции, конъюгированные с Рс (10 мг/кг):
ΑοίΒΙΙΒ (К64 : 20-134)-Ес
АсбКИВ (1/790 20-134)-Ес
АсбВИВ (Ь7 9Е 20-134)-Ес
АсТНИВ (Α24Ν 20-134)-Ес
АсбКИВ (К64К 20-134)-Ес
- 41 018868
Мышей подвергали ЯМР-сканированию в начале, в середине и в конце исследования. Мышцы бедра, мышцы грудной клетки и икроножные мышцы, а также печень, почки и селезенку взвешивали и хранили в формалине.
Первый анализ данных показал, что Ас®ЛВ (В64 20-134)-Бс вызывал значительное увеличение мышечной массы и безжировой массы тела, а также оказывал более эффективное действие на другие ткани. Варианты Б79Э и Ь79Е способствовали увеличению мышечной массы в меньшей степени, и при этом оказывали незначительное влияние на другие ткани. Конструкции Α24Ν и В64К оказывали промежуточное действие на мышцы и другие ткани. Полученные данные подтвердили, что варианты АсЖЛВ, обладающие пониженной способностью связываться с активином, имеют желательные свойства, в частности, оказывают селективное действие на мышечную ткань.
Введение путем ссылки
Все упомянутые здесь публикации и патенты во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки так, как если бы каждая отдельная публикация или патент были конкретно и отдельно введены в настоящее описание посредством ссылки.
Хотя в настоящей заявке обсуждаются конкретные варианты рассматриваемых объектов изобретения, однако вышеуказанное описание имеет лишь иллюстративный, а не ограничительный характер. Многие варианты будут очевидны специалистам в данной области исходя из описания изобретения и прилагаемой ниже формулы изобретения. Полный объем изобретения, вместе с полным объемом эквивалентов и вместе с указанными вариантами в описании изобретения, должен быть определен формулой изобретения.

Claims (37)

1. Вариант белка Ас®ЛВ, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности аминокислот 29-109 ЗЕО ΙΌ Ν0:2, где указанный белок содержит кислотную аминокислоту в положении, соответствующем положению 79 ЗЕО ΙΌ Ν0:2, и где указанный вариант белка Ас®ЛВ ингибирует передачу сигнала под действием миостатина и/или ΟΌΡ11 в клеточном анализе.
2. Вариант белка Ас®ЛВ по п.1, где белок содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности аминокислот 29-109 ЗЕО ΙΌ Ν0:2.
3. Вариант белка Ас®ЛВ по п.1, где белок содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична последовательности аминокислот 29-109 ЗЕО ΙΌ Ν0:2.
4. Вариант белка Ас®ЛВ по п.1, где белок содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 96% идентична последовательности аминокислот 29-109 ЗЕО ΙΌ Ν0:2.
5. Вариант белка Ас®ЛВ по п.1, где белок содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 97% идентична последовательности аминокислот 29-109 ЗЕО ΙΌ Ν0:2.
6. Вариант белка Ас®ЛВ по п.1, где белок содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 98% идентична последовательности аминокислот 29-109 ЗЕО ΙΌ Ν0:2.
7. Вариант белка Ас®ЛВ по любому из пп.1-6, где белок содержит аспарагиновую кислоту (Ό) в положении, соответствующем положению 79 ЗЕО ΙΌ Ν0:2.
8. Вариант белка Ас®ЛВ по любому из пп.1-6, где белок содержит глутаминовую кислоту (Е) в положении, соответствующем положению 79 ЗЕО ΙΌ Ν0:2.
9. Вариант белка Ас®ЛВ по любому из пп.1-8, где указанный белок содержит по меньшей мере одну последовательность Ν-Χ-З/Т в положении, отличающемся от положения эндогенной последовательности Ν-Χ-З/Т АсЖЛВ, и где указанная неэндогенная последовательность Ν-Χ-З/Т находится в положении, находящемся за пределами лигандсвязывающего кармана.
10. Вариант белка АсЖЛВ по любому из пп.1-9, где указанный белок содержит аспарагин (Ν) в положении, соответствующем положению 24 ЗЕО ΙΌ Ν0:2, и серин (З) или треонин (Т) в положении, соответствующем положению 26 ЗЕО ΙΌ Ν0:2.
11. Вариант белка Ас®ЛВ по любому из пп.1-10, где указанный белок содержит В или К в положении, соответствующем положению 64 ЗЕО ΙΌ Ν0:2.
12. Вариант белка Ас®ЛВ по любому из пп.1-11, где по меньшей мере одной модификацией по отношению к последовательности ЗЕО ΙΌ Ν0:2 является консервативная модификация, расположенная в лигандсвязывающем кармане.
13. Вариант белка Ас®ЛВ по любому из пп.1-12, где по меньшей мере одной модификацией по отношению к последовательности ЗЕО ΙΌ Ν0:2 является модификация в одном или более положениях, выбранных из группы, состоящей из К74, В40, 053, К55, Б82 и Ь79.
14. Вариант белка Ас®ЛВ по любому из пп.1-13, где указанный белок содержит аминокислотную последовательность, начинающуюся в положении аминокислоты, соответствующем любой из аминокислот 22, 23, 24 или 25 ЗЕО ΙΌ Ν0:2, и заканчивающуюся в положении аминокислоты, соответствующем любой из аминокислот 131, 133 и 134 ЗЕО ΙΌ Ν0:2.
15. Вариант белка Ас®ЛВ по п.14, который содержит аминокислотную последовательность, начи
- 42 018868 нающуюся с аминокислоты 25 БЕЦ ΙΌ N0:2 и заканчивающуюся аминокислотой 133 БЕЦ ΙΌ N0:2.
16. Вариант белка АсДКПВ по любому из пп.1-15, где указанный белок является слитым белком, дополнительно содержащим гетерологичную часть.
17. Вариант слитого белка АсДКПВ по п.16, где указанный белок является гомодимером.
18. Вариант слитого белка АсДКЛВ по п.16, где указанная гетерологичная часть содержит константную область тяжелой цепи 1§С.
19. Вариант слитого белка АсДКПВ по п.18, где гетерологичной частью является Рс-домен.
20. Вариант белка АсДКЛВ по п.16, где слитый белок дополнительно содержит линкерный домен, расположенный между полипептидом АсДКЛВ и гетерологичным полипептидом.
21. Вариант белка АсДКПВ по любому из пп.1-20, где белок один или более модифицированных аминокислотных остатков, выбранных из гликозилированной аминокислоты, ПЭГилированной аминокислоты, фарнезилированной аминокислоты, ацетилированной аминокислоты, биотинилированной аминокислоты и аминокислоты, конъюгированной с липидной молекулой.
22. Вариант белка АсДКЛВ по любому из пп.1-20, где белок дополнительно содержит последовательность для очистки, выбранную из эпитопной метки, метки РЬАС, полигистидиновой последовательности и СБТ-гибрида.
23. Фармацевтический препарат, содержащий белок по любому из пп.1-22.
24. Применение фармацевтического препарата по п.23 для производства лекарственного средства для:
(a) лечения индивидуума, страдающего расстройством, ассоциированным с потерей мышечной массы или с недостаточным мышечным ростом;
(b) лечения индивидуума, страдающего расстройством, ассоциированным с нейродегенерацией;
(c) понижения содержания жира в организме или снижения скорости увеличения содержания жира в организме у индивидуума;
(ά) лечения расстройства, ассоциированного с нежелательным увеличением массы тела у индивидуума;
(е) снижения уровней холестерина и/или триглицеридов; или (ί) лечения саркопении.
25. Применение по п.24(а), где указанный индивидуум страдает атрофией мышц.
26. Применение по п.24(а), где указанный индивидуум страдает мышечной дистрофией.
27. Применение по п.26, где указанной мышечной дистрофией является мышечная дистрофия Дюшенна.
28. Применение по п.27, где указанным индивидуумом является молодой человек и где его лечение начинают в период от одного до пяти лет со времени диагностики у него мышечной дистрофии Дюшенна.
29. Применение по п.26, где указанной мышечной дистрофией является плече-лопаточно-лицевая (РБН) мышечная дистрофия.
30. Применение по п.24(а), где указанный индивидуум страдает амиотрофическим боковым склерозом (АБС).
31. Применение по п.30, где указанный индивидуум получает лечение после диагностики у него амиотрофического бокового склероза (АБС).
32. Применение по п.24(а), где указанным расстройством является кахексия, ассоциированная с раком или противораковой терапией.
33. Применение по п.32, где указанным расстройством является потеря мышечной массы, ассоциированная с терапией рака предстательной железы.
34. Применение по п.32, где указанным расстройством является потеря мышечной массы, ассоциированная с опухолью.
35. Применение по п.34, где указанной опухолью является раковая опухоль толстой кишки.
36. Применение по п.24(Ь), где указанным расстройством является амиотрофический боковой склероз.
37. Применение по п.24(ф, где указанное расстройство выбрано из группы, состоящей из ожирения, патологического или явно выраженного ожирения, инсулиннезависимого сахарного диабета (ИНЗСД), сердечно-сосудистого заболевания, рака, гипертензии, остеоартрита, инсульта, заболеваний дыхательных путей и заболевания желчного пузыря.
EA200970729A 2007-02-02 2008-02-04 Варианты, происходящие из actriib, и их применение EA018868B1 (ru)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US89930407P 2007-02-02 2007-02-02
US92708807P 2007-05-01 2007-05-01
US93188007P 2007-05-25 2007-05-25
PCT/US2008/001506 WO2008097541A2 (en) 2007-02-02 2008-02-04 Variants derived from actriib and uses therefor

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200970729A1 EA200970729A1 (ru) 2010-02-26
EA018868B1 true EA018868B1 (ru) 2013-11-29

Family

ID=39682306

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201300713A EA025891B1 (ru) 2007-02-02 2008-02-04 ВАРИАНТЫ, ПРОИСХОДЯЩИЕ ИЗ ActRIIB, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
EA201691260A EA033623B1 (ru) 2007-02-02 2008-02-04 ВАРИАНТЫ, ПРОИСХОДЯЩИЕ ИЗ ActRIIB, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
EA200970729A EA018868B1 (ru) 2007-02-02 2008-02-04 Варианты, происходящие из actriib, и их применение

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201300713A EA025891B1 (ru) 2007-02-02 2008-02-04 ВАРИАНТЫ, ПРОИСХОДЯЩИЕ ИЗ ActRIIB, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
EA201691260A EA033623B1 (ru) 2007-02-02 2008-02-04 ВАРИАНТЫ, ПРОИСХОДЯЩИЕ ИЗ ActRIIB, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ

Country Status (25)

Country Link
US (6) US7842663B2 (ru)
EP (6) EP3293198B1 (ru)
JP (7) JP5554067B2 (ru)
KR (5) KR101801506B1 (ru)
CN (5) CN105906708A (ru)
AR (1) AR065169A1 (ru)
AU (5) AU2008214375B2 (ru)
BR (1) BRPI0808164B8 (ru)
CA (2) CA3038197A1 (ru)
CY (1) CY1115489T1 (ru)
DK (1) DK2607379T3 (ru)
EA (3) EA025891B1 (ru)
ES (4) ES2587934T3 (ru)
HK (2) HK1186477A1 (ru)
HR (1) HRP20140731T1 (ru)
IL (6) IL200171A (ru)
ME (1) ME02234B (ru)
MX (5) MX363943B (ru)
NO (1) NO3053933T3 (ru)
PL (2) PL3053933T3 (ru)
PT (1) PT2607379E (ru)
RS (1) RS53455B (ru)
SI (1) SI2607379T1 (ru)
TW (9) TW201907946A (ru)
WO (1) WO2008097541A2 (ru)

Families Citing this family (93)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6891082B2 (en) * 1997-08-01 2005-05-10 The Johns Hopkins University School Of Medicine Transgenic non-human animals expressing a truncated activintype II receptor
DK2332977T3 (en) 2004-07-23 2016-02-29 Acceleron Pharma Inc ActRII receptor polypeptides
ES2852549T3 (es) 2005-02-09 2021-09-13 Sarepta Therapeutics Inc Composición antisentido para tratamiento de la atrofia muscular
US8067562B2 (en) 2005-11-01 2011-11-29 Amgen Inc. Isolated nucleic acid molecule comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:1
CA3045808C (en) 2005-11-23 2022-08-16 Acceleron Pharma, Inc. Activin-actriia antagonists and uses for promoting bone growth
US8128933B2 (en) 2005-11-23 2012-03-06 Acceleron Pharma, Inc. Method of promoting bone growth by an anti-activin B antibody
CN104524548A (zh) 2006-12-18 2015-04-22 阿塞勒隆制药公司 活化素-actrii拮抗剂及在提高红细胞水平中的用途
US8895016B2 (en) 2006-12-18 2014-11-25 Acceleron Pharma, Inc. Antagonists of activin-actriia and uses for increasing red blood cell levels
US20100028332A1 (en) * 2006-12-18 2010-02-04 Acceleron Pharma Inc. Antagonists of actriib and uses for increasing red blood cell levels
ES2415666T3 (es) 2007-02-01 2013-07-26 Acceleron Pharma, Inc. Composiciones farmacéuticas que comprenden antagonistas de Activina-ActRIIa para uso en la prevención o el tratamiento de metástasis de cáncer de mama o pérdida ósea relacionada con el cáncer de mama
TW201907946A (zh) 2007-02-02 2019-03-01 美商艾瑟勒朗法瑪公司 衍生自ＡｃｔＲＩＩＢ的變體與其用途
EP2484372A1 (en) * 2007-02-09 2012-08-08 Acceleron Pharma, Inc. Activin-ActRIIa Antagonists and Uses for Promoting Bone Growth in Cancer Patients
TWI573802B (zh) * 2007-03-06 2017-03-11 安美基公司 變異之活動素受體多肽及其用途
US8501678B2 (en) 2007-03-06 2013-08-06 Atara Biotherapeutics, Inc. Variant activin receptor polypeptides and uses thereof
CA2699936A1 (en) 2007-09-18 2009-03-26 Acceleron Pharma Inc. Activin-actriia antagonists and uses for decreasing or inhibiting fsh secretion
KR20110031951A (ko) 2008-06-26 2011-03-29 악셀레론 파마 인코포레이티드 액티빈-ａｃｔｒｉｉａ의 길항물질 및 적혈구 수준을 증가시키기 위한 이들의 용도
WO2009158025A2 (en) * 2008-06-26 2009-12-30 Acceleron Pharma Inc. Methods for dosing an actriib antagonist and monitoring of treated patients
HRP20230761T1 (hr) * 2008-08-14 2023-10-13 Acceleron Pharma Inc. Gdf zamke
AU2015202035B2 (en) * 2008-08-14 2017-03-23 Acceleron Pharma Inc. Use of GDF traps to increase red blood cell levels
US8216997B2 (en) 2008-08-14 2012-07-10 Acceleron Pharma, Inc. Methods for increasing red blood cell levels and treating anemia using a combination of GDF traps and erythropoietin receptor activators
EA201791940A3 (ru) 2008-11-26 2018-04-30 Амген Инк. Варианты полипептидов рецептора iib активина и их использование
US8138142B2 (en) * 2009-01-13 2012-03-20 Acceleron Pharma Inc. Methods for increasing adiponectin in a patient in need thereof
SI2424895T1 (en) * 2009-04-27 2018-01-31 Novartis Ag Ingredients and procedures for increasing muscle growth
AU2010258931B2 (en) * 2009-06-08 2015-04-23 Acceleron Pharma Inc. Methods for increasing thermogenic adipocytes
US8293881B2 (en) * 2009-06-12 2012-10-23 Acceleron Pharma Inc. Isolated nucleic acid encoding a truncated ActRIIB fusion protein
AU2015203400A1 (en) * 2009-08-13 2015-07-16 Acceleron Pharma Inc. Combined use of GDF traps and erythropoietin receptor activators to increase red blood cell levels
IL287990B (en) * 2009-08-13 2022-07-01 Acceleron Pharma Inc Combined use of gdf traps and erythropoietin receptor activators to increase red blood cell levels
CN102781518A (zh) 2009-09-09 2012-11-14 阿塞勒隆制药公司 Actriib拮抗剂及其给药和用途
WO2011056896A1 (en) * 2009-11-03 2011-05-12 Acceleron Pharma Inc. Methods for treating fatty liver disease
ES2658292T3 (es) * 2009-11-17 2018-03-09 Acceleron Pharma, Inc. Proteínas ActRIIB y variantes y usos de las mismas con respecto a la inducción de la utrofina para el tratamiento de la distrofia muscular
US20150359850A1 (en) 2009-11-25 2015-12-17 Santa Maria Biotherapeutics, Inc. Administration of an anti-activin-a compound to a subject
EP2600901B1 (en) 2010-08-06 2019-03-27 ModernaTX, Inc. A pharmaceutical formulation comprising engineered nucleic acids and medical use thereof
ES2737960T3 (es) 2010-10-01 2020-01-17 Modernatx Inc Nucleósidos, nucleótidos y ácidos nucleicos modificados y sus usos
EP2638065A4 (en) 2010-11-08 2014-04-09 Acceleron Pharma Inc ACTRIIA BINDING AGENTS AND USES THEREOF
AU2012236099A1 (en) 2011-03-31 2013-10-03 Moderna Therapeutics, Inc. Delivery and formulation of engineered nucleic acids
HUE040276T2 (hu) 2011-07-01 2019-02-28 Novartis Ag Eljárás metabolikus rendellenességek kezelésére
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
EP3682905B1 (en) 2011-10-03 2021-12-01 ModernaTX, Inc. Modified nucleosides, nucleotides, and nucleic acids, and uses thereof
US20130085139A1 (en) 2011-10-04 2013-04-04 Royal Holloway And Bedford New College Oligomers
CA2852683A1 (en) 2011-10-17 2013-04-25 Acceleron Pharma, Inc. Methods and compositions for treating ineffective erythropoiesis
US8765385B2 (en) 2011-10-27 2014-07-01 Ravindra Kumar Method of detection of neutralizing anti-actriib antibodies
EP2791160B1 (en) 2011-12-16 2022-03-02 ModernaTX, Inc. Modified mrna compositions
SG10201605027XA (en) * 2011-12-19 2016-08-30 Amgen Inc Variant activin receptor polypeptides, alone or in combination with chemotherapy, and uses thereof
US9572897B2 (en) 2012-04-02 2017-02-21 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
AU2013243948A1 (en) 2012-04-02 2014-10-30 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of proteins associated with human disease
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
US9303079B2 (en) 2012-04-02 2016-04-05 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
US9809636B2 (en) 2012-04-06 2017-11-07 Acceleron Pharma Inc. Methods for increasing red blood cell levels comprising administering BMP9
GB201206559D0 (en) * 2012-04-13 2012-05-30 Ucl Business Plc Polypeptide
ES2753811T3 (es) * 2012-10-24 2020-04-14 Celgene Corp Biomarcador para uso en el tratamiento de anemia
CN112957462A (zh) 2012-10-24 2021-06-15 细胞基因公司 用于治疗贫血的方法
WO2014071158A1 (en) * 2012-11-02 2014-05-08 Celgene Corporation Activin-actrii antagonists and uses for treating bone and other disorders
EP4074834A1 (en) 2012-11-26 2022-10-19 ModernaTX, Inc. Terminally modified rna
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
US9872906B2 (en) 2013-03-15 2018-01-23 Merck Sharp & Dohme Corp. Ceftolozane antibiotic compositions
EP3037524B8 (en) 2013-08-23 2020-03-04 Sumitomo Chemical Company, Limited Method for producing retinal tissue and retina-related cells
CA2926218A1 (en) 2013-10-03 2015-04-09 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding low density lipoprotein receptor
EP3808778A1 (en) 2014-04-18 2021-04-21 Acceleron Pharma Inc. Methods for increasing red blood cell levels and treating sickle-cell disease
CA2951926C (en) 2014-06-13 2023-01-10 Acceleron Pharma, Inc. Methods and compositions for treating ulcers
US20160075772A1 (en) * 2014-09-12 2016-03-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Treatment of Fibrodysplasia Ossificans Progressiva
MA41052A (fr) 2014-10-09 2017-08-15 Celgene Corp Traitement d'une maladie cardiovasculaire à l'aide de pièges de ligands d'actrii
MA41119A (fr) 2014-12-03 2017-10-10 Acceleron Pharma Inc Méthodes de traitement de syndromes myélodysplasiques et d'anémie sidéroblastique
ES2946160T3 (es) 2014-12-03 2023-07-13 Celgene Corp Antagonistas de activina-ActRII y usos para tratar síndrome mielodisplásico
MX2017007519A (es) * 2014-12-08 2017-08-22 Novartis Ag Antagonistas de miostatina o activina para el tratamiento de sarcopenia.
EP3256148A1 (en) 2015-02-12 2017-12-20 INSERM - Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods for predicting the responsiveness of a patient affected with malignant hematological disease to chemotherapy treatment and methods of treatment of such disease
MA41795A (fr) 2015-03-18 2018-01-23 Sarepta Therapeutics Inc Exclusion d'un exon induite par des composés antisens dans la myostatine
EA039118B1 (ru) * 2015-04-01 2021-12-07 Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. Способ лечения прогрессирующей оссифицирующей фибродисплазии
ES2863564T3 (es) 2015-04-06 2021-10-11 Acceleron Pharma Inc Heteromultímeros ALK7:ActRIIB y usos de los mismos
CN107849114B (zh) * 2015-04-06 2021-08-20 阿塞勒隆制药公司 单臂i型和ii型受体融合蛋白和其用途
MA41919A (fr) 2015-04-06 2018-02-13 Acceleron Pharma Inc Hétéromultimères alk4:actriib et leurs utilisations
SG11201708351XA (en) 2015-04-22 2017-11-29 Alivegen Usa Inc Novel hybrid actriib ligand trap proteins for treating muscle wasting diseases
CA2986432A1 (en) 2015-05-20 2016-11-24 Celgene Corporation In vitro cell culture methods for beta-thalassemia using activin type ii receptor ligand traps
BR112018007066A2 (pt) 2015-10-09 2018-10-23 Sarepta Therapeutics Inc composições e métodos para tratamento da distrofia muscular de duchene e distúrbios relacionados
US11123430B2 (en) 2015-11-04 2021-09-21 Acceleron Pharma Inc. Methods for increasing red blood cell levels and treating ineffective erythropoiesis
EP3380121B1 (en) 2015-11-23 2023-12-20 Acceleron Pharma Inc. Actrii antagonist for use in treating eye disorders
WO2017145166A1 (en) 2016-02-25 2017-08-31 B. G. Negev Technologies And Applications Ltd., At Ben-Gurion University Composition and method for treating amyotrophic lateral sclerosis
JP6987072B2 (ja) 2016-03-10 2021-12-22 アクセレロン ファーマ インコーポレーテッド アクチビン２型受容体結合タンパク質及びその使用
RS62011B1 (sr) 2016-07-15 2021-07-30 Acceleron Pharma Inc Kompozicije koje sadrže polipeptide actriia za upotrebu u lečenju plućne hipertenzije
KR20190040972A (ko) 2016-07-27 2019-04-19 악셀레론 파마 인코포레이티드 골섬유증 치료 방법 및 조성물
WO2018067879A1 (en) * 2016-10-05 2018-04-12 Acceleron Pharma Inc. Alk4:actriib heteromultimers and uses thereof
JP7280182B2 (ja) 2016-10-05 2023-05-23 アクセルロン ファーマ インコーポレイテッド バリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質およびその使用
AU2017340504A1 (en) 2016-10-05 2019-04-11 Acceleron Pharma, Inc. Compositions and method for treating kidney disease
US11013785B2 (en) 2016-11-10 2021-05-25 Keros Therapeutics, Inc. Activin receptor type IIA variants and methods of use thereof
WO2018144542A1 (en) * 2017-02-01 2018-08-09 Acceleron Pharma Inc. TGFβ AND ACTRII ANTAGONISTS FOR USE IN INCREASING IMMUNE ACTIVITY
CN107011430B (zh) * 2017-04-07 2020-09-01 哈尔滨医科大学 一种具有生物学活性的截短的生长分化因子11及其制备方法
WO2019094751A1 (en) 2017-11-09 2019-05-16 Keros Therapeutics, Inc. Activin receptor type iia variants and methods of use thereof
JP2021518745A (ja) 2018-01-12 2021-08-05 ケロス セラピューティクス インコーポレイテッドＫｅｒｏｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． アクチビンｉｉｂ型受容体変異体およびそれらの使用方法
RU2683277C1 (ru) * 2018-03-02 2019-03-27 Наталья Константиновна Осина Способ использования хондральных клеток для скринирования веществ, обладающих противовоспалительной активностью
BR112022013589A2 (pt) 2020-01-08 2022-09-13 Regeneron Pharma Tratamento da fibrodisplasia ossificante progressiva
EP4121088A1 (en) * 2020-03-20 2023-01-25 Keros Therapeutics, Inc. Methods of using activin receptor type iib variants
WO2021189006A1 (en) * 2020-03-20 2021-09-23 Keros Therapeutics, Inc. Methods of using activin receptor type iia variants
WO2023108137A1 (en) 2021-12-10 2023-06-15 Biogen Ma Inc. Modified actriib proteins and methods of use thereof
US11945856B2 (en) 2022-01-28 2024-04-02 35Pharma Inc. Activin receptor type IIB variants and uses thereof

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2004126254A (ru) * 2002-02-28 2005-04-10 Пфайзер Продактс Инк. (Us) Анализ активности киназы actriib
WO2006012627A2 (en) * 2004-07-23 2006-02-02 Acceleron Pharma Inc. Actrii receptor polypeptides, methods and compositions
WO2006020884A2 (en) * 2004-08-12 2006-02-23 Wyeth Combination therapy for diabetes, obesity, and cardiovascular diseases using gdf-8 inhibitors

Family Cites Families (221)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0105014B1 (en) 1982-09-24 1992-05-20 THE UNITED STATES OF AMERICA as represented by the Secretary United States Department of Commerce Repair of tissue in animals
NZ210699A (en) 1984-01-04 1989-06-28 Int Genetic Eng Isolation of an osteogenic protein of the p3 immunologically related family
ATE128715T1 (de) 1984-07-16 1995-10-15 Celtrix Pharma Polypeptide induzierende faktoren in knochen und knorpel.
JPH0637520B2 (ja) * 1985-07-03 1994-05-18 味の素株式会社 ポリペプチド
EP0272253A4 (en) 1986-03-07 1990-02-05 Massachusetts Inst Technology METHOD FOR IMPROVING GLYCOPROTE INSTABILITY.
US4973577A (en) * 1986-04-04 1990-11-27 The Salk Institute For Biological Studies FSH-releasing peptides
US5080891A (en) 1987-08-03 1992-01-14 Ddi Pharmaceuticals, Inc. Conjugates of superoxide dismutase coupled to high molecular weight polyalkylene glycols
US5182375A (en) 1987-08-28 1993-01-26 The Salk Institute For Biological Studies DNA encoding follistatin
EP0548276A4 (en) 1990-09-13 1993-12-29 Children's Hospital Medical Center Of Northern California Method for increasing red blood cell production by treatment with activin or activin-related peptides
US5118667A (en) * 1991-05-03 1992-06-02 Celtrix Pharmaceuticals, Inc. Bone growth factors and inhibitors of bone resorption for promoting bone formation
US5885794A (en) * 1991-05-10 1999-03-23 The Salk Institute For Biological Studies Recombinant production of vertebrate activin receptor polypeptides and identification of receptor DNAs in the activin/TGF-β superfamily
US6162896A (en) * 1991-05-10 2000-12-19 The Salk Institute For Biological Studies Recombinant vertebrate activin receptors
JPH06500574A (ja) 1991-05-10 1994-01-20 ザ　ソーク　インスティテュート　フォア　バイオロジカル　スタディーズ アクチビン／ＴＧＦ―βスーパーファミリーのレセプターのクローニングおよび組換えによる産生
US20050186593A1 (en) 1991-05-10 2005-08-25 The Salk Institute For Biological Studies Cloning and recombinant production of CRF receptor(s)
US6287816B1 (en) 1991-06-25 2001-09-11 Genetics Institute, Inc. BMP-9 compositions
DK0592562T3 (da) 1991-06-25 1999-08-30 Genetics Inst BMP-9-præparater
US5288931A (en) * 1991-12-06 1994-02-22 Genentech, Inc. Method for refolding insoluble, misfolded insulin-like growth factor-I into an active conformation
CA2144081C (en) 1992-09-16 2004-11-30 Filip Roos Protection against liver damage by hgf
US6692925B1 (en) * 1992-11-17 2004-02-17 Ludwig Institute For Cancer Research Proteins having serine/threonine kinase domains, corresponding nucleic acid molecules, and their use
EP0679163A4 (en) 1993-01-12 1997-07-16 Univ Johns Hopkins Med FACTOR-3 OF GROWTH AND DIFFERENTIATION.
CA2161807A1 (en) 1993-05-12 1994-11-24 Anthony J. Celeste Bmp-10 compositions
US5637480A (en) 1993-05-12 1997-06-10 Genetics Institute, Inc. DNA molecules encoding bone morphogenetic protein-10
US5677196A (en) 1993-05-18 1997-10-14 University Of Utah Research Foundation Apparatus and methods for multi-analyte homogeneous fluoro-immunoassays
US5831050A (en) * 1993-06-07 1998-11-03 Creative Biomolecules, Inc. Morphogen cell surface receptor
AU701623B2 (en) 1993-10-14 1999-02-04 President And Fellows Of Harvard College Method of inducing and maintaining neuronal cells
US6686198B1 (en) 1993-10-14 2004-02-03 President And Fellows Of Harvard College Method of inducing and maintaining neuronal cells
US5525490A (en) 1994-03-29 1996-06-11 Onyx Pharmaceuticals, Inc. Reverse two-hybrid method
US5658876A (en) * 1994-04-28 1997-08-19 The General Hospital Corporation Activin antagonists as novel contraceptives
US5545616A (en) 1994-09-22 1996-08-13 Genentech, Inc. Method for predicting and/or preventing preterm labor
US5760010A (en) 1995-01-01 1998-06-02 Klein; Ira Method of treating liver disorders with a macrolide antibiotic
US5814565A (en) 1995-02-23 1998-09-29 University Of Utah Research Foundation Integrated optic waveguide immunosensor
DE69636866D1 (en) 1995-04-11 2007-03-15 Gen Hospital Corp Reverse "two-hybrid"-systeme
GB2306481A (en) 1995-10-21 1997-05-07 Univ Manchester Pharmaceutical comprising a stimulator of activin and/or inhibin
EP0771873A3 (en) * 1995-10-27 1998-03-04 Takeda Chemical Industries, Ltd. Neuronal cell-specific receptor protein
GB9526131D0 (en) 1995-12-21 1996-02-21 Celltech Therapeutics Ltd Recombinant chimeric receptors
US6004780A (en) * 1996-03-26 1999-12-21 Human Genome Sciences, Inc. Growth factor HTTER36
US20050244867A1 (en) * 1996-03-26 2005-11-03 Human Genome Sciences, Inc. Growth factor HTTER36
CZ130199A3 (cs) 1996-10-25 1999-07-14 G. D. Searle & Co. Cirkulárně permutovaní agonisté receptoru erythropoietinu
US6605699B1 (en) * 1997-01-21 2003-08-12 Human Genome Sciences, Inc. Galectin-11 polypeptides
US6034062A (en) 1997-03-13 2000-03-07 Genetics Institute, Inc. Bone morphogenetic protein (BMP)-9 compositions and their uses
US6231880B1 (en) * 1997-05-30 2001-05-15 Susan P. Perrine Compositions and administration of compositions for the treatment of blood disorders
CA2297489A1 (en) 1997-07-30 1999-02-11 Emory University Novel bone mineralization proteins, dna, vectors, expression systems
US6891082B2 (en) * 1997-08-01 2005-05-10 The Johns Hopkins University School Of Medicine Transgenic non-human animals expressing a truncated activintype II receptor
US6656475B1 (en) 1997-08-01 2003-12-02 The Johns Hopkins University School Of Medicine Growth differentiation factor receptors, agonists and antagonists thereof, and methods of using same
US6696260B1 (en) * 1997-08-01 2004-02-24 The Johns Hopkins University School Of Medicine Methods to identify growth differentiation factor (GDF) binding proteins
AU8666398A (en) 1997-08-01 1999-02-22 Johns Hopkins University School Of Medicine, The Methods to identify growth differentiation factor (gdf) receptors
US6953662B2 (en) * 1997-08-29 2005-10-11 Human Genome Sciences, Inc. Follistatin-3
AU8921698A (en) * 1997-08-29 1999-03-16 Human Genome Sciences, Inc. Follistatin-3
CN1277632A (zh) 1997-10-03 2000-12-20 中外制药株式会社 天然人源化抗体
US6004937A (en) 1998-03-09 1999-12-21 Genetics Institute, Inc. Use of follistatin to modulate growth and differentiation factor 8 [GDF-8] and bone morphogenic protein 11 [BMP-11]
US6696411B1 (en) * 1998-04-22 2004-02-24 Cornell Research Foundation, Inc. Canine erythropoietin gene and recombinant protein
CN1317967A (zh) 1998-09-17 2001-10-17 伊莱利利公司 蛋白质制剂
JP2002526073A (ja) * 1998-09-22 2002-08-20 龍 余 新規のヒト生長分化因子のコード配列、そのｄｎａ配列によりコードされるポリペプチド、およびこれらの製造方法。
US6472179B2 (en) 1998-09-25 2002-10-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Receptor based antagonists and methods of making and using
US6548634B1 (en) 1998-09-30 2003-04-15 Chiron Corporation Synthetic peptides having FGF receptor affinity
US6238860B1 (en) 1998-11-05 2001-05-29 Dyax Corp. Binding moieties for human parvovirus B19
US6777205B1 (en) * 1998-11-06 2004-08-17 Sterrenbeld Biotechnologie North America, Inc. Host cells expressing recombinant human erythropoietin
US20040009535A1 (en) 1998-11-27 2004-01-15 Celltech R&D, Inc. Compositions and methods for increasing bone mineralization
NZ513642A (en) 1999-01-21 2004-02-27 Metamorphix Inc Growth differentiation factor inhibitors and uses therefor
US6914128B1 (en) 1999-03-25 2005-07-05 Abbott Gmbh & Co. Kg Human antibodies that bind human IL-12 and methods for producing
EP1174149A1 (en) 1999-04-19 2002-01-23 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Proliferation inhibitor for androgen-independent tumor
US6468543B1 (en) * 1999-05-03 2002-10-22 Zymogenetics, Inc. Methods for promoting growth of bone using ZVEGF4
GB9912350D0 (en) * 1999-05-26 1999-07-28 European Molecular Biology Lab Embl Modified cytokine
WO2001009368A1 (en) 1999-07-30 2001-02-08 The General Hospital Corporation Follistatin antagonists
CA2390292A1 (en) 1999-11-12 2001-05-25 Maxygen Holdings Ltd. Interferon gamma conjugates
CA2394576A1 (en) 1999-12-15 2001-06-21 Research Development Foundation Betaglycan as an inhibin receptor and uses thereof
US20030224501A1 (en) 2000-03-17 2003-12-04 Young Paul E. Bone morphogenic protein polynucleotides, polypeptides, and antibodies
JP4487376B2 (ja) * 2000-03-31 2010-06-23 味の素株式会社 腎疾患治療剤
WO2001087329A1 (en) 2000-05-15 2001-11-22 F. Hoffmann-La Roche Ag Liquid pharmaceutical composition containing an erythropoietin derivate
US6627424B1 (en) 2000-05-26 2003-09-30 Mj Bioworks, Inc. Nucleic acid modifying enzymes
US20030162291A1 (en) 2000-06-22 2003-08-28 Seigfried Hekimi Clk-2, cex-7 and coq-4 genes, and uses thereof
US20030215913A1 (en) 2000-07-19 2003-11-20 Enrique Alvarez Nucleic acids, vectors, host cells, polypeptides, and uses thereof
US6632180B1 (en) 2000-09-07 2003-10-14 John H. Laragh Method for evaluating and treating hypertension
DE10045591A1 (de) 2000-09-15 2002-04-04 Klaus Pfizenmaier Ortsspezifische, antikörpervermittelte Aktivierung proapoptotischer Zytokine - AMAIZe (Antibody-Mediated Apoptosis Inducing Zytokine)
US7087224B2 (en) 2000-10-31 2006-08-08 Amgen Inc. Method of treating anemia by administering IL-1ra
BR0115475A (pt) 2000-11-20 2004-02-10 Univ Illinois Proteìnas de estruturação de membranas
WO2002043759A2 (en) 2000-12-01 2002-06-06 Wyeth Method and composition for modulating bone growth
US20030082233A1 (en) 2000-12-01 2003-05-01 Lyons Karen M. Method and composition for modulating bone growth
MXPA03005406A (es) * 2000-12-20 2003-09-25 Hoffmann La Roche Conjugados de eritropoyetina.
TWI329129B (en) * 2001-02-08 2010-08-21 Wyeth Corp Modified and stabilized gdf propeptides and uses thereof
US20040132675A1 (en) * 2002-02-08 2004-07-08 Calvin Kuo Method for treating cancer and increasing hematocrit levels
US7294472B2 (en) 2001-03-14 2007-11-13 Caden Biosciences Method for identifying modulators of G protein coupled receptor signaling
EP1369130A1 (en) 2001-03-16 2003-12-10 Takeda Chemical Industries, Ltd. Process for producing sustained release preparation
RS20120253A1 (en) 2001-05-24 2013-02-28 Zymogenetics Inc. TACI-IMUNOGLOBULINSKI PROTEIN FUNCTIONS
IL159015A0 (en) * 2001-05-25 2004-05-12 Genset Sa Polypeptides, their preparation and use
AUPR638101A0 (en) 2001-07-13 2001-08-09 Bioa Pty Limited Composition and method for treatment of disease
US6855344B2 (en) * 2001-07-17 2005-02-15 Integrated Chinese Medicine Holdings, Ltd. Compositions and methods for prostate and kidney health and disorders, an herbal preparation
JP3888998B2 (ja) 2001-07-17 2007-03-07 帝人株式会社 ＰＰＡＲδ活性化作用を測定することを特徴とする物質の選択方法及び薬剤
KR100453877B1 (ko) 2001-07-26 2004-10-20 메덱스젠 주식회사 연쇄체화에 의한 면역 글로블린 융합 단백질의 제조 방법 및 이 방법에 의해 제조된 ＴＮＦＲ/Ｆｃ 융합 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 ＤＮＡ, 상기 ＤＮＡ를 포함하는벡터, 및 상기 벡터에 의한 형질전환체
US7320789B2 (en) 2001-09-26 2008-01-22 Wyeth Antibody inhibitors of GDF-8 and uses thereof
US6784154B2 (en) * 2001-11-01 2004-08-31 University Of Utah Research Foundation Method of use of erythropoietin to treat ischemic acute renal failure
EP2324834B1 (en) 2001-12-06 2019-05-08 Fibrogen, Inc. Methods of Increasing Endogenous Erythropoietin (EPO)
US20060234918A1 (en) 2001-12-19 2006-10-19 Voyager Pharmaceutical Corporation Methods for treating and preventing cancers that express the hypothalamic-pituitary-gonadal axis of hormones and receptors
US20030144203A1 (en) * 2001-12-19 2003-07-31 Voyager Pharmaceutical Corporation Methods for slowing senescence and treating and preventing diseases associated with senescence
US6998118B2 (en) * 2001-12-21 2006-02-14 The Salk Institute For Biological Studies Targeted retrograde gene delivery for neuronal protection
US20030224397A1 (en) 2002-02-11 2003-12-04 Genentech, Inc. Antibody variants with faster antigen association rates
JP4429729B2 (ja) 2002-02-21 2010-03-10 ワイス エルエルシー Ｇａｓｐ１；フォリスタチンドメイン含有タンパク質
WO2003072714A2 (en) 2002-02-21 2003-09-04 Wyeth Follistatin domain containing proteins
AU2003232485A1 (en) 2002-04-18 2003-10-27 Mtm Laboratories Ag Neopeptides and methods useful for detection and treatment of cancer
DE10234192B4 (de) 2002-07-26 2009-11-26 Epoplus Gmbh Co.Kg Verwendung von Erythropoetin
CN1753904A (zh) 2002-08-16 2006-03-29 惠氏公司 骨形态发生蛋白－2的雌激素效应元件及其使用方法
US7261893B2 (en) 2002-10-22 2007-08-28 Wyeth Neutralizing antibodies against GDF-8 and uses therefor
US20040223966A1 (en) 2002-10-25 2004-11-11 Wolfman Neil M. ActRIIB fusion polypeptides and uses therefor
AU2002953327A0 (en) 2002-12-12 2003-01-09 Monash University Methods of diagnosing prognosing and treating activin associated diseases and conditions
ZA200506246B (en) 2003-02-07 2006-12-27 Prometic Biosciences Inc Medium-chain length fatty acids, glycerides and analogues as stimulators of erythropoiesis
WO2004073633A2 (en) * 2003-02-14 2004-09-02 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and compositions for modulating the development of stem cells
ATE474593T1 (de) 2003-03-21 2010-08-15 Celldex Therapeutics Ltd Behandlung von allergischen erkrankungen unter verwendung eines modulators des notch signaling pathway
US20040197828A1 (en) * 2003-03-26 2004-10-07 Gaddy Dana P. Method for diagnosis and treatment of bone turnover
WO2005028517A2 (en) 2003-05-09 2005-03-31 The General Hospital Corporation SOLUBLE TGF-β TYPE III RECEPTOR FUSION PROTEINS
EP1635870A2 (en) 2003-06-02 2006-03-22 Wyeth Use of myostatin (gdf8) inhibitors in conjunction with corticosteroids for treating neuromuscular disorders
CA2529623A1 (en) 2003-06-16 2005-02-17 Celltech R & D, Inc. Antibodies specific for sclerostin and methods for increasing bone mineralization
WO2005009460A2 (en) 2003-07-25 2005-02-03 Medexis, S.A. Pharmaceutical composition comprising activin a, alk-4 or derivatives thereof for the treatment of ophthalmic disorders or cancer
US20070135336A1 (en) 2003-09-15 2007-06-14 De Kretser David Follistatin isoforms and uses thereof
WO2005033134A2 (en) 2003-09-30 2005-04-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Secreted protein therapeutics and uses thereof
JP2007507429A (ja) 2003-10-06 2007-03-29 モナシュ ユニバーシティー 治療方法
US8895540B2 (en) 2003-11-26 2014-11-25 DePuy Synthes Products, LLC Local intraosseous administration of bone forming agents and anti-resorptive agents, and devices therefor
PL1706428T3 (pl) 2004-01-22 2010-02-26 Merck Patent Gmbh Przeciwciała przeciwnowotworowe o zredukowanym wiązaniu dopełniacza
US20050197292A1 (en) * 2004-01-30 2005-09-08 Glennda Smithson Compositions and methods for treating T-cell mediated pathological conditions
AU2005229072A1 (en) 2004-03-26 2005-10-13 Acceleron Pharma Inc. BMP-3 propeptides and related methods
EP1730186A2 (en) 2004-03-31 2006-12-13 Xencor, Inc. Bmp-7 variants with improved properties
JP4688483B2 (ja) 2004-04-15 2011-05-25 株式会社テクノネットワーク四国 フォリスタチン変異体ポリペプチド
WO2005113590A2 (en) 2004-05-12 2005-12-01 Acceleron Pharma Inc. Bmp10 propeptides and related methods
AU2005258286A1 (en) 2004-06-24 2006-01-05 Acceleron Pharma Inc. GDF3 propeptides and related methods
JP5149620B2 (ja) * 2004-07-23 2013-02-20 エンドサイト，インコーポレイテッド ２価リンカーおよびその結合体
EP1794191B1 (en) 2004-08-05 2016-05-18 The Regents of The University of California Molecules with effects on cellular development and function
EP1804824B1 (en) 2004-09-29 2017-01-04 Icahn School of Medicine at Mount Sinai Fsh and fsh receptor modulator compositions and methods for inhibiting osteoclastic bone resorption and bone loss in osteoporosis
NZ538097A (en) 2005-02-07 2006-07-28 Ovita Ltd Method and compositions for improving wound healing
ES2547866T3 (es) 2005-02-16 2015-10-09 The General Hospital Corporation Uso de proteínas de fusión de hemojuvelina para regular el metabolismo del hierro mediado por hepcidina
JPWO2006115274A1 (ja) 2005-04-26 2008-12-18 味の素株式会社 骨髄赤血球前駆細胞分化促進剤
CN103450359B (zh) 2005-08-19 2018-07-24 惠氏有限责任公司 抗gdf-8的拮抗剂抗体以及在als和其他gdf-8-相关病症治疗中的用途
JP2007099764A (ja) 2005-09-09 2007-04-19 Ajinomoto Co Inc 血糖低下剤
AU2006294511B2 (en) 2005-09-28 2011-11-17 Zymogenetics, Inc IL-17A and IL-17F antagonists and methods of using the same
US8067562B2 (en) 2005-11-01 2011-11-29 Amgen Inc. Isolated nucleic acid molecule comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:1
US8128933B2 (en) 2005-11-23 2012-03-06 Acceleron Pharma, Inc. Method of promoting bone growth by an anti-activin B antibody
CA3045808C (en) 2005-11-23 2022-08-16 Acceleron Pharma, Inc. Activin-actriia antagonists and uses for promoting bone growth
EP1968621A2 (en) 2005-12-06 2008-09-17 Amgen Inc. Uses of myostatin antagonists
AU2006326815A1 (en) 2005-12-20 2007-06-28 Merck Frosst Canada Ltd. Heteroaromatic compounds as inhibitors of stearoyl-coenzyme A delta-9 desaturase
CA2634940A1 (en) 2005-12-21 2007-07-05 Schering Corporation Treatment of nonalcoholic fatty liver disease using cholesterol lowering agents and h3 receptor antagonist/inverse agonist
WO2007076127A2 (en) 2005-12-22 2007-07-05 Biogen Idec Ma Inc Condensed imidazoles or pyrazoles and their use as transforming growth factor modulators
WO2007084977A2 (en) * 2006-01-20 2007-07-26 Beckman Coulter, Inc. Low hemoglobin concentration cell percentage and method of use in detection of iron deficiency
CA2637375A1 (en) 2006-01-25 2007-08-02 Wellstat Therapeutics Corporation Compounds for the treatment of metabolic disorders
JP2009528375A (ja) 2006-02-28 2009-08-06 ウェルスタット セラピューティクス コーポレイション 代謝障害を処置するための化合物
US20080102065A1 (en) * 2006-04-14 2008-05-01 Borges Luis G Erythropoietin receptor extended duration limited agonists
WO2007123391A1 (en) 2006-04-20 2007-11-01 Academisch Ziekenhuis Leiden Therapeutic intervention in a genetic disease in an individual by modifying expression of an aberrantly expressed gene.
CN101489544A (zh) * 2006-05-09 2009-07-22 海玛奎斯特医药公司 治疗血液病的方法
MX2009000722A (es) * 2006-07-21 2009-06-11 Lyne Lab Composiciones liquidas de acetato de calcio.
GB0615129D0 (en) 2006-07-29 2006-09-06 Univ Cardiff Anti-cancer activity of BMP-9 and BMP-10 and their use in cancer therapies
WO2008030367A2 (en) 2006-09-01 2008-03-13 The General Hospital Corporation Selective myostatin inhibitors
CL2007002567A1 (es) 2006-09-08 2008-02-01 Amgen Inc Proteinas aisladas de enlace a activina a humana.
US7547781B2 (en) * 2006-09-11 2009-06-16 Curis, Inc. Quinazoline based EGFR inhibitors containing a zinc binding moiety
WO2008060139A1 (en) 2006-11-17 2008-05-22 Erasmus University Medical Center Rotterdam Methods for controlling mineralization of extracellular matrix, therapeutic methods based thereon and medicaments for use therein
WO2008073292A2 (en) 2006-12-08 2008-06-19 Caritas St. Elizabeth's Medical Center Of Boston, Inc. Method for protecting renal tubular epithelial cells from radiocontrast nephro parhy (rcn)
AU2007332473B2 (en) 2006-12-14 2012-09-27 Forerunner Pharma Research Co., Ltd. Anti-Claudin-3 monoclonal antibody, and treatment and diagnosis of cancer using the same
CN104524548A (zh) 2006-12-18 2015-04-22 阿塞勒隆制药公司 活化素-actrii拮抗剂及在提高红细胞水平中的用途
US8895016B2 (en) 2006-12-18 2014-11-25 Acceleron Pharma, Inc. Antagonists of activin-actriia and uses for increasing red blood cell levels
US20100028332A1 (en) 2006-12-18 2010-02-04 Acceleron Pharma Inc. Antagonists of actriib and uses for increasing red blood cell levels
ES2415666T3 (es) * 2007-02-01 2013-07-26 Acceleron Pharma, Inc. Composiciones farmacéuticas que comprenden antagonistas de Activina-ActRIIa para uso en la prevención o el tratamiento de metástasis de cáncer de mama o pérdida ósea relacionada con el cáncer de mama
TW201907946A (zh) 2007-02-02 2019-03-01 美商艾瑟勒朗法瑪公司 衍生自ＡｃｔＲＩＩＢ的變體與其用途
EP2484372A1 (en) * 2007-02-09 2012-08-08 Acceleron Pharma, Inc. Activin-ActRIIa Antagonists and Uses for Promoting Bone Growth in Cancer Patients
TWI573802B (zh) 2007-03-06 2017-03-11 安美基公司 變異之活動素受體多肽及其用途
US8501678B2 (en) 2007-03-06 2013-08-06 Atara Biotherapeutics, Inc. Variant activin receptor polypeptides and uses thereof
JP2010529041A (ja) * 2007-06-01 2010-08-26 ワイス・エルエルシー Ｂｍｐ−１０活性を調整する方法および組成物
WO2009009059A1 (en) 2007-07-09 2009-01-15 Biogen Idec Ma Inc. Spiro compounds as antagonists of tgf-beta
LT2170396T (lt) 2007-08-03 2017-03-10 Summit (Oxford) Limited Vaistų deriniai, skirti diušeno raumenų distrofijos gydymui
GB0715087D0 (en) 2007-08-03 2007-09-12 Summit Corp Plc Drug combinations for the treatment of duchenne muscular dystrophy
GB0715938D0 (en) 2007-08-15 2007-09-26 Vastox Plc Method of treatment of duchenne muscular dystrophy
WO2009025651A1 (en) 2007-08-17 2009-02-26 University Of Maine System Board Of Trustees Biologically active peptide and method of using the same
WO2009035629A1 (en) 2007-09-13 2009-03-19 Ludwig Institute Of Cancer Research Method for modifying cellular immune response by modulating activin activity
CA2699936A1 (en) * 2007-09-18 2009-03-26 Acceleron Pharma Inc. Activin-actriia antagonists and uses for decreasing or inhibiting fsh secretion
PE20091163A1 (es) * 2007-11-01 2009-08-09 Wyeth Corp Anticuerpos para gdf8
JP5583591B2 (ja) 2007-11-21 2014-09-03 アムジエン・インコーポレーテツド Ｗｉｓｅ結合抗体及びエピトープ
EP2265603B1 (en) 2008-03-13 2014-05-07 The General Hospital Corporation Inhibitors of the bmp signaling pathway
WO2009137075A1 (en) 2008-05-06 2009-11-12 Acceleron Pharma Inc. Anti-activin antibodies and uses for promoting bone growth
CA2725208A1 (en) 2008-05-06 2009-11-12 Joslin Diabetes Center, Inc. Methods and compositions for inducing brown adipogenesis
KR20110031951A (ko) 2008-06-26 2011-03-29 악셀레론 파마 인코포레이티드 액티빈-ａｃｔｒｉｉａ의 길항물질 및 적혈구 수준을 증가시키기 위한 이들의 용도
WO2009158025A2 (en) 2008-06-26 2009-12-30 Acceleron Pharma Inc. Methods for dosing an actriib antagonist and monitoring of treated patients
HRP20230761T1 (hr) * 2008-08-14 2023-10-13 Acceleron Pharma Inc. Gdf zamke
US8216997B2 (en) 2008-08-14 2012-07-10 Acceleron Pharma, Inc. Methods for increasing red blood cell levels and treating anemia using a combination of GDF traps and erythropoietin receptor activators
US20110293526A1 (en) 2008-11-20 2011-12-01 University Of Southern California Compositions and methods to modulate hair growth
EA201791940A3 (ru) 2008-11-26 2018-04-30 Амген Инк. Варианты полипептидов рецептора iib активина и их использование
US8138142B2 (en) * 2009-01-13 2012-03-20 Acceleron Pharma Inc. Methods for increasing adiponectin in a patient in need thereof
US8110355B2 (en) 2009-02-20 2012-02-07 GenRemedy, LLC Methods for identifying agents that inhibit cell migration, promote cell adhesion and prevent metastasis
SI2424895T1 (en) 2009-04-27 2018-01-31 Novartis Ag Ingredients and procedures for increasing muscle growth
AU2010258931B2 (en) 2009-06-08 2015-04-23 Acceleron Pharma Inc. Methods for increasing thermogenic adipocytes
US8293881B2 (en) 2009-06-12 2012-10-23 Acceleron Pharma Inc. Isolated nucleic acid encoding a truncated ActRIIB fusion protein
IL287990B (en) 2009-08-13 2022-07-01 Acceleron Pharma Inc Combined use of gdf traps and erythropoietin receptor activators to increase red blood cell levels
CN102781518A (zh) 2009-09-09 2012-11-14 阿塞勒隆制药公司 Actriib拮抗剂及其给药和用途
WO2011056896A1 (en) 2009-11-03 2011-05-12 Acceleron Pharma Inc. Methods for treating fatty liver disease
ES2658292T3 (es) 2009-11-17 2018-03-09 Acceleron Pharma, Inc. Proteínas ActRIIB y variantes y usos de las mismas con respecto a la inducción de la utrofina para el tratamiento de la distrofia muscular
WO2012027065A2 (en) 2010-08-27 2012-03-01 Celgene Corporation Combination therapy for treatment of disease
CN103492562B (zh) * 2011-02-03 2017-04-05 佐马技术有限公司 用于增强细菌中功能蛋白表达的方法和材料
US8580922B2 (en) 2011-03-04 2013-11-12 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Peptide linkers for polypeptide compositions and methods for using same
HUE040276T2 (hu) 2011-07-01 2019-02-28 Novartis Ag Eljárás metabolikus rendellenességek kezelésére
CA2852683A1 (en) 2011-10-17 2013-04-25 Acceleron Pharma, Inc. Methods and compositions for treating ineffective erythropoiesis
US8765385B2 (en) 2011-10-27 2014-07-01 Ravindra Kumar Method of detection of neutralizing anti-actriib antibodies
WO2013063536A1 (en) 2011-10-27 2013-05-02 Acceleron Pharma, Inc. Actriib binding agents and uses thereof
US20140303068A1 (en) 2011-10-28 2014-10-09 Paranta Biosciences Limited Method of treating mucus hypersecretion
SG10201605027XA (en) 2011-12-19 2016-08-30 Amgen Inc Variant activin receptor polypeptides, alone or in combination with chemotherapy, and uses thereof
US9303079B2 (en) 2012-04-02 2016-04-05 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
US10034920B2 (en) 2012-05-17 2018-07-31 Paranta Biosciences Limited Method of treatment and agents useful for same
US9663569B2 (en) 2012-06-14 2017-05-30 The Medical Research, Infrastructure, And Health Services Fund Of The Tel Aviv Medical Center Use of blocking agents of bone morphogenic protein (BMP) signalling for the treatment of neuroinflammatory and neurodegenerative diseases
CA2874117C (en) 2012-07-02 2021-10-12 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Pharmaceutical agent comprising anti-bmp9 antibody as active ingredient for treatment of anemia such as renal anemia and cancer anemia
CN112957462A (zh) 2012-10-24 2021-06-15 细胞基因公司 用于治疗贫血的方法
ES2753811T3 (es) 2012-10-24 2020-04-14 Celgene Corp Biomarcador para uso en el tratamiento de anemia
WO2014064292A1 (en) 2012-10-26 2014-05-01 Universite Pierre Et Marie Curie (Paris 6) A method for preventing or treating atrial fibrillation
WO2014071158A1 (en) 2012-11-02 2014-05-08 Celgene Corporation Activin-actrii antagonists and uses for treating bone and other disorders
BR112015010566A2 (pt) 2012-11-08 2017-07-11 Clearside Biomedical Inc métodos e dispositivos para o tratamento de doenças oculares em indivíduos humanos
WO2014093531A1 (en) 2012-12-11 2014-06-19 Los Angeles Biomedical Research Institute At Harbor-Ucla Medical Center Modulation of myofiber repair by anti-myostatin in strategies with stem cells
ES2715710T3 (es) 2013-01-25 2019-06-05 Shire Human Genetic Therapies Folistatina en el tratamiento de la distrofía muscular de Duchenne
US20140220033A1 (en) 2013-02-01 2014-08-07 Santa Maria Biotherapeutics, Inc. Administration of an Anti-Activin-A Compound to a Subject
WO2014152940A1 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Mrna therapeutic compositions and use to treat diseases and disorders
WO2014187807A1 (en) 2013-05-21 2014-11-27 Arcarios B.V. Follistatin derivatives
TW201920262A (zh) 2013-07-30 2019-06-01 美商再生元醫藥公司 抗活化素ａ之抗體及其用途
RU2016108652A (ru) 2013-08-14 2017-09-14 Новартис Аг Способы лечения спорадического миозита с тельцами включений
EP3084000A4 (en) 2013-12-16 2017-09-20 Paranta Biosciences Limited Method of diagnosis and treatment
WO2015108972A1 (en) 2014-01-14 2015-07-23 Santa Maria Biotherapeutics, Inc. Activin inhibitor response prediction and uses for treatment
JP2017510622A (ja) 2014-01-27 2017-04-13 ノバルティス アーゲー 筋萎縮を予測するバイオマーカー、方法および使用
JP6601687B2 (ja) 2014-03-31 2019-11-06 大日本住友製薬株式会社 進行性骨化性線維異形成症の予防剤及び治療剤
EP3808778A1 (en) 2014-04-18 2021-04-21 Acceleron Pharma Inc. Methods for increasing red blood cell levels and treating sickle-cell disease
TW201622746A (zh) 2014-04-24 2016-07-01 諾華公司 改善或加速髖部骨折術後身體復原之方法
TW201625675A (zh) 2014-06-13 2016-07-16 聖塔瑪麗亞生物治療公司 經調配之受體多肽及相關方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2004126254A (ru) * 2002-02-28 2005-04-10 Пфайзер Продактс Инк. (Us) Анализ активности киназы actriib
WO2006012627A2 (en) * 2004-07-23 2006-02-02 Acceleron Pharma Inc. Actrii receptor polypeptides, methods and compositions
WO2006020884A2 (en) * 2004-08-12 2006-02-23 Wyeth Combination therapy for diabetes, obesity, and cardiovascular diseases using gdf-8 inhibitors

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GRAY С. Peter et al., "Identification of a Binding Site on the Type II Activin Receptor for Activin and Inhibin", Journal of Biological Chemistry, 2000, v. 275, n. 5, p. 3206-3212 *
THOMPSON B. Thomas et al., "Structures of an ActRIIB: activin A complex reveal a novel binding mode for TGF-beta ligand: receptor interactions", EMBO Journal, 2003, v. 22, n. 7, p. 1555-1566 *

Also Published As

Publication number Publication date
AU2016208313A1 (en) 2016-08-11
KR101801506B1 (ko) 2017-11-24
US7842663B2 (en) 2010-11-30
EP2607379B1 (en) 2014-05-28
IL275608B (en) 2021-10-31
ES2796347T3 (es) 2020-11-26
KR20160125526A (ko) 2016-10-31
KR102382781B1 (ko) 2022-04-04
PT2607379E (pt) 2014-08-25
WO2008097541A3 (en) 2009-03-05
KR20090114393A (ko) 2009-11-03
IL286494A (en) 2021-10-31
MX2019004066A (es) 2019-08-26
US10259861B2 (en) 2019-04-16
KR20170130620A (ko) 2017-11-28
CA3038197A1 (en) 2008-08-14
TW201940502A (zh) 2019-10-16
EP3293198B1 (en) 2020-04-08
JP2013155180A (ja) 2013-08-15
PL3053933T3 (pl) 2018-03-30
MX2020014234A (es) 2022-06-08
TWI548647B (zh) 2016-09-11
MX363943B (es) 2019-04-08
TW201803890A (zh) 2018-02-01
ES2488854T3 (es) 2014-08-29
TW202021980A (zh) 2020-06-16
KR102317987B1 (ko) 2021-10-28
TWI782836B (zh) 2022-11-01
AR065169A1 (es) 2009-05-20
US20220281951A1 (en) 2022-09-08
TW202104248A (zh) 2021-02-01
CN105906707B (zh) 2021-03-12
IL225045A (en) 2016-04-21
AU2008214375B2 (en) 2013-05-09
IL200171A0 (en) 2010-04-15
ME02234B (me) 2014-12-31
TW201907946A (zh) 2019-03-01
TW200846357A (en) 2008-12-01
BRPI0808164B8 (pt) 2021-05-25
HRP20140731T1 (hr) 2014-08-29
CA2677160C (en) 2019-05-21
KR20190108196A (ko) 2019-09-23
JP2020072750A (ja) 2020-05-14
KR20210132727A (ko) 2021-11-04
US20090005308A1 (en) 2009-01-01
IL240521A0 (en) 2015-10-29
TW201420597A (zh) 2014-06-01
US9399669B2 (en) 2016-07-26
NO3053933T3 (ru) 2018-02-17
MX2009008154A (es) 2009-08-12
EP3053933A1 (en) 2016-08-10
CN101679505B (zh) 2016-05-25
CN105884880A (zh) 2016-08-24
TW201627320A (zh) 2016-08-01
JP5876847B2 (ja) 2016-03-02
EP2805967B1 (en) 2016-04-20
MX350324B (es) 2017-09-04
KR101669278B1 (ko) 2016-10-25
KR102072897B1 (ko) 2020-02-03
US8343933B2 (en) 2013-01-01
AU2016208313B2 (en) 2018-03-01
CA2677160A1 (en) 2008-08-14
EP3293198A1 (en) 2018-03-14
BRPI0808164A2 (pt) 2014-07-08
EA025891B1 (ru) 2017-02-28
CN105884880B (zh) 2019-12-10
JP2018108112A (ja) 2018-07-12
CN105906708A (zh) 2016-08-31
HK1203530A1 (zh) 2015-10-30
US20110092670A1 (en) 2011-04-21
HK1186477A1 (en) 2014-03-14
CN105924517A (zh) 2016-09-07
EA200970729A1 (ru) 2010-02-26
EP2125884B1 (en) 2014-07-09
JP6662939B2 (ja) 2020-03-11
JP2022044589A (ja) 2022-03-17
EA201691260A1 (ru) 2017-02-28
ES2652318T3 (es) 2018-02-01
EP3053933B1 (en) 2017-09-20
AU2008214375A1 (en) 2008-08-14
CN105906707A (zh) 2016-08-31
WO2008097541A2 (en) 2008-08-14
BRPI0808164B1 (pt) 2020-05-05
AU2021245102A1 (en) 2021-10-28
IL275608A (en) 2020-08-31
JP6317779B2 (ja) 2018-04-25
SI2607379T1 (sl) 2014-08-29
DK2607379T3 (da) 2014-09-01
TW202214680A (zh) 2022-04-16
EP2125884A2 (en) 2009-12-02
CN101679505A (zh) 2010-03-24
US20170058016A1 (en) 2017-03-02
TWI432449B (zh) 2014-04-01
PL2607379T3 (pl) 2014-11-28
EP3708578A1 (en) 2020-09-16
RS53455B (en) 2014-12-31
AU2019240707A1 (en) 2019-10-24
EA201300713A1 (ru) 2014-03-31
JP2014098028A (ja) 2014-05-29
JP5554067B2 (ja) 2014-07-23
ES2587934T3 (es) 2016-10-27
IL200171A (en) 2015-08-31
EP2607379A1 (en) 2013-06-26
CY1115489T1 (el) 2017-01-04
JP2010518009A (ja) 2010-05-27
AU2018201131A1 (en) 2018-03-08
JP2016135141A (ja) 2016-07-28
IL240522B (en) 2020-07-30
EP2805967A1 (en) 2014-11-26
US20130184210A1 (en) 2013-07-18
US20200071381A1 (en) 2020-03-05
EA033623B1 (ru) 2019-11-11
CN105924517B (zh) 2022-03-01
IL240522A0 (en) 2015-10-29
WO2008097541A4 (en) 2009-05-28
IL240521A (en) 2017-10-31
AU2019240707B2 (en) 2021-07-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA018868B1 (ru) Варианты, происходящие из actriib, и их применение
JP2021143207A (ja) 熱発生性脂肪細胞を増加させるための方法
JP2020158546A (ja) 筋ジストロフィー治療のためのユートロフィン誘導に関するａｃｔｒｉｉｂタンパク質およびその改変体およびその使用
JP5785129B2 (ja) アクチビン−ＡｃｔＲＩＩａアンタゴニストおよび骨成長を促進するための使用
CN102548617B (zh) Bmp‑alk3拮抗剂和促进骨生长的用途
EA018221B1 (ru) АНТАГОНИСТЫ АКТИВИНА-ActRIIa И ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ СТИМУЛЯЦИИ РОСТА КОСТИ У БОЛЬНЫХ РАКОМ