RU2683277C1 - Способ использования хондральных клеток для скринирования веществ, обладающих противовоспалительной активностью - Google Patents
Способ использования хондральных клеток для скринирования веществ, обладающих противовоспалительной активностью Download PDFInfo
- Publication number
- RU2683277C1 RU2683277C1 RU2018107903A RU2018107903A RU2683277C1 RU 2683277 C1 RU2683277 C1 RU 2683277C1 RU 2018107903 A RU2018107903 A RU 2018107903A RU 2018107903 A RU2018107903 A RU 2018107903A RU 2683277 C1 RU2683277 C1 RU 2683277C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- tnf
- alpha
- chondroblasts
- expression
- culture
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 21
- 238000012216 screening Methods 0.000 title claims abstract description 13
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 title claims abstract description 12
- 239000000126 substance Substances 0.000 title claims abstract description 12
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 claims abstract description 50
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 claims abstract description 50
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 claims abstract description 46
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 39
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 23
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims abstract description 11
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims abstract description 10
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims abstract description 8
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 claims abstract description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 8
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims abstract description 6
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 claims abstract description 4
- 210000004276 hyalin Anatomy 0.000 claims abstract description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims abstract description 3
- 101000611183 Homo sapiens Tumor necrosis factor Proteins 0.000 claims abstract 2
- 102000057041 human TNF Human genes 0.000 claims abstract 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 25
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 7
- 239000002547 new drug Substances 0.000 abstract description 5
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 20
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 20
- 229940100601 interleukin-6 Drugs 0.000 description 19
- 229940046728 tumor necrosis factor alpha inhibitor Drugs 0.000 description 15
- 239000002452 tumor necrosis factor alpha inhibitor Substances 0.000 description 13
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 9
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 9
- 230000004044 response Effects 0.000 description 7
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 108010008165 Etanercept Proteins 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 210000003035 hyaline cartilage Anatomy 0.000 description 5
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 5
- 229940073621 enbrel Drugs 0.000 description 4
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 4
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 229940124790 IL-6 inhibitor Drugs 0.000 description 3
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 3
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 201000008482 osteoarthritis Diseases 0.000 description 3
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 101000979342 Homo sapiens Nuclear factor NF-kappa-B p105 subunit Proteins 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- 102000003812 Interleukin-15 Human genes 0.000 description 2
- 108090000172 Interleukin-15 Proteins 0.000 description 2
- 102000013691 Interleukin-17 Human genes 0.000 description 2
- 108050003558 Interleukin-17 Proteins 0.000 description 2
- 102000003810 Interleukin-18 Human genes 0.000 description 2
- 108090000171 Interleukin-18 Proteins 0.000 description 2
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 2
- 102000004890 Interleukin-8 Human genes 0.000 description 2
- 102100023050 Nuclear factor NF-kappa-B p105 subunit Human genes 0.000 description 2
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 2
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 2
- 239000000954 inflammatory inducer Substances 0.000 description 2
- 229950010006 olokizumab Drugs 0.000 description 2
- 238000002161 passivation Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 229950006348 sarilumab Drugs 0.000 description 2
- 206010002556 Ankylosing Spondylitis Diseases 0.000 description 1
- 101100022187 Caenorhabditis elegans mab-10 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100027995 Collagenase 3 Human genes 0.000 description 1
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 1
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 1
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 1
- 101000577887 Homo sapiens Collagenase 3 Proteins 0.000 description 1
- 101001013150 Homo sapiens Interstitial collagenase Proteins 0.000 description 1
- 101000645296 Homo sapiens Metalloproteinase inhibitor 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000990915 Homo sapiens Stromelysin-1 Proteins 0.000 description 1
- -1 IL- 20 Proteins 0.000 description 1
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 1
- 102000003777 Interleukin-1 beta Human genes 0.000 description 1
- 108090000193 Interleukin-1 beta Proteins 0.000 description 1
- 102100030703 Interleukin-22 Human genes 0.000 description 1
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 102000043136 MAP kinase family Human genes 0.000 description 1
- 108091054455 MAP kinase family Proteins 0.000 description 1
- 102000000380 Matrix Metalloproteinase 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100026262 Metalloproteinase inhibitor 2 Human genes 0.000 description 1
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 102100030416 Stromelysin-1 Human genes 0.000 description 1
- 108010000134 Vascular Cell Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 description 1
- 102100023543 Vascular cell adhesion protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 229960002964 adalimumab Drugs 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002260 anti-inflammatory agent Substances 0.000 description 1
- 229940124599 anti-inflammatory drug Drugs 0.000 description 1
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 229960000106 biosimilars Drugs 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 229960003115 certolizumab pegol Drugs 0.000 description 1
- 229940090100 cimzia Drugs 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 229940088679 drug related substance Drugs 0.000 description 1
- 229960000403 etanercept Drugs 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 229960001743 golimumab Drugs 0.000 description 1
- 229940048921 humira Drugs 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 229960000598 infliximab Drugs 0.000 description 1
- 108010074108 interleukin-21 Proteins 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000000366 juvenile effect Effects 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 1
- 208000003580 polydactyly Diseases 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 150000003180 prostaglandins Chemical class 0.000 description 1
- 229940116176 remicade Drugs 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 229940068638 simponi Drugs 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 229960003989 tocilizumab Drugs 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0655—Chondrocytes; Cartilage
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/15—Medicinal preparations ; Physical properties thereof, e.g. dissolubility
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Hematology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии и медицине. Раскрыт способ скрининга веществ, обладающих противовоспалительной активностью, включающий смешивание исследуемого вещества с фиксированным количеством человеческого ФНО-альфа и добавление этой смеси к культуре клеток хондрального ряда с последующим измерением экспрессии биологического маркера. При этом в качестве культуры человеческих клеток используют хондробласты, полученные из гиалиновой хрящевой ткани пальцев шестипалых младенцев после множественного пассирования до 20-го пассажа, обладающие однородностью клеточного монослоя при отсутствии клеточного дебриса и способностью отвечать на ФНО-альфа индукцию и ФНО-альфа ингибирование после криоконсервации. Изобретение обеспечивает высокую эффективность скрининга новых лекарственных средств за счет использования однородной культуры хондробластов без клеточного дебриса. 4 ил., 1 табл., 1 пр.
Description
Изобретение относится к биотехнологии и медицине, а именно к созданию нового способа использования хондральных клеток для скринирования веществ, обладающих противовоспалительной активностью.
Остеоартрит (OA) и ревматоидный артрит (РА) - социально значимые заболевания, связанные с воспалительным процессом в суставах, которые приводят к разрушению и деформации суставной поверхности и, в конечном итоге, к инвалидности в 70% случаев. В настоящее время научные исследования сосредоточены на выявлении цитокинов и медиаторов, ответственных за развитие вышеупомянутых заболеваний [1, 2]. К провоспалительным цитокинам относятся ИЛ-1 бета, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-15, ИЛ-17, ИЛ-18, ФНО-альфа и другие. Противовоспалительным действием обладают цитокины ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-13 и другие. Особая роль в патогенезе данных заболеваний отводится таким цитокинам как Интерлейкин-6 (ИЛ-6) и ФНО-альфа [1-5].
В последние годы сделан огромный прогресс в лечении артрита с помощью ФНО-альфа ингибиторов. Показано, что ФНО-альфа играет ключевую роль в патогенезе таких заболеваниях как ревматоидный артрит, анкилозирующий спондилоартрит, болезнь Крона, псориаз, рефрактерная астма и другие. Эти заболевания, часто приводящие к инвалидности, успешно лечат моноклональными антителами против ФНО-альфа такими как инфликсимаб (Remicade), адалимумаб (Humira), этанерцепт (Enbrel), цертолизумаб пегол (Cimzia), голимумаб (Simponi) и др. В случае ревматоидного артрита, ФНО-альфа ингибиторы позволяют добиться ремиссии заболевания за счет ингибирования экспрессии провоспалительных медиаторов и цитокинов, что способствует уменьшению интенсивности деструктивных процессов в суставе и приводит к предотвращению инвалидности. IL-6 ингибиторы: тосилизумаб (Tocilizumab), сарилумаб (Sarilumab), олокизумаб (Olokizumab) и другие также представляют огромный интерес для лечения артритов.
Успех ФНО-альфа и ИЛ-6 ингибирующих лекарств вызвал бум исследовательских работ в поиске новых препаратов [5-7]. С этой целью возникла необходимость создания оптимизированных клеточных тест-систем для поиска новых и сравнения биоэквивалентных ингибиторов провоспалительных цитокинов. Кроме этого, именно клеточные системы in vitro рекомендованы FDA и ЕМА для мониторинга антагонистов ФНО-альфа ингибиторов в крови пациентов [8, 9].
Известен клеточный метод iLite Bioassay (Biomonitor, Copenhagen, Denmark) для оценки антагонистов ФНО-альфа ингибиторов в сыворотке пациентов [10]. Для этого сыворотку пациента смешивают с фиксированным количеством рекомбинантного ФНО-альфа и после смесь добавляют к генноинженерно сконструированной бессмертной культуре человеческих лейкемических клеток К562, несущих репортерную конструкцию NFkappaB-люцифераза. ФНО-альфа, добавленный к клеткам, инициирует внутриклеточную NFkB-зависимую экспрессию каскада генов, включая встроенный репортер-ген, кодирующий фермент люциферазы светлячка. При этом активность ФНО-альфа ингибитора в сыворотке пациента напрямую коррелирует с клеточной люминисценцией.
Недостатком этой клеточной системы является ограниченный поиск только ФНО-альфа ингибиторов, действующих через сигнальную молекулу NFkB. В то время как известна активация трех сигнальных каскадов - NFkappaB, МАРК и ФНО-альфа индуцируемая клеточная гибель. Перекрестная активация этих сигналов в клетках различного происхождения затрудняет интерпретацию результатов при поиске новых лекарственных препаратов для лечения артритов и оценки их терапевтического эффекта.
ФНО-альфа ингибиторы остаются лидирующими препаратами в лечении воспалительных процессов в хрящевой ткани. Использование первичной культуры человеческих клеток, выделенных из хрящевой ткани неоспоримо эффективнее для поиска и оценки лекарственных препаратов, чем использование клеток животных или бессмертных (т.е. с измененным фенотипом онкогенных) культур клеток человека.
Известен клеточный метод определения ФНО-альфа ингибиторов с использованием первичной культуры человеческих хондроцитов, изолированных из суставной поверхности бедренного мыщелка взрослых доноров [11, 12]. ФНО-альфа ингибитор смешивают с фиксированным количеством рекомбинантного ФНО-альфа, затем смесь добавляют к первичной культуре человеческих хондроцитов прошедших 1-3 пассажа (Р1-3). Изменение в экспрессии цитокинов-мишеней оценивают с помощью РТ-ПЦР.
Недостатком является низкое качество и ограниченное количество хондроцитов, выращенных из тканей взрослых доноров. Хондроциты получают от больных перед аутологической имплантацией им хондроцитов или из тканей трупов [11]. Количество биоматериала для аутологической имплантации ограниченно, качество биоматериала от взрослых доноров опосредованно патолого-возрастными изменениями. Хондроциты взрослых доноров способны проходить только ограниченное количество пассажей (Р1-3). Низкое количество пассажей хондроцитов (Р1-3) приводит к наличию клеточного дебриса, и к невозможности создания мастер-банка однородной культуры клеток, необходимого для скрининга большого количеста новых ФНО-альфа ингибиторов. Такого рода ограничения приводят к необоснованной дороговизне и недостаточной эффективности клеточной тест-системы. Данный способ взят нами за прототип.
Целью нашего изобретения является создание нового способа использования хондральных клеток для скринирования веществ, обладающих противовоспалительной активностью. Эта цель достигается тем, что в качестве культуры человеческих клеток используют хондробласты, полученные из гиалиновой хрящевой ткани пальцев шестипалых младенцев, обладающие высоким индексом пассирования Р 1-20, однородностью клеточного монослоя при отсутствии клеточного дебриса, способностью отвечать на ФНО-альфа индукцию и ФНО-альфа ингибирование после криоконсервации.
В качестве источника хрящевой ткани мы используем суставную поверхность гиалиновой межфаланговой ткани пальцев шестипалых младенцев с врожденной полидактилией. Данная хрящевая ткань младенцев не обладает патолого-возрастными изменениями в отличие от биоматериала, используемого в патенте, взятом за прототип. Нами проведено сравнение характеристик клеток, выделенных из суставной поверхности гиалиновой межфаланговой хрящевой ткани пальцев шестипалых младенцев с хондроцитами, описанными в вышеупомянутом патенте, взятом за прототип (Таблица 1).
Как видно из Таблицы 1 в нашем способе и прототипе используются разные фенотипы клеток за счет выделения из разных источников хрящевой ткани: ювенильные хондробласты в нашей тест ситеме и хондроциты взрослых в патенте US. Индекс пассирования у хондробластов, используемых в нашем способе, на порядок выше по сравнению с хондроцитами прототипа - их возможно пересаживать до 20-го пассажа. На ранних пассажах (Р 1-2) любая первичная клеточная культура неоднородна и загрязнена клеточным дебрисом, что снижает ее качества для скрининга. При множественном пассировании клеточная культура ходробластов в нашем способе становится однородной, без клеточного дебриса (Фиг. 1), что обеспечивает высокую эффективность скринирования новых лекарственных веществ.
Возможность длительного пассирования хондробластов приводит к возможности криоконсервации клеточного материала и созданию мастер-банка, что делает данные клетки сопоставимыми с бессмертной культурой клеток и позволяет скринировать большие библиотеки новых веществ с противовоспалительной активностью.
Недостатком метода, взятого за прототип, является ограниченное количество пассажей хондроцитов, присутствие возрастных деструктивных процессов в хрящах взрослых доноров и наличие дебриса в монослое клеток на ранних пассажах, что не позволяет создать мастер банк однородных клеток необходимый для скринирования больших библиотек лекарственных веществ. Кроме этого, в патенте, взятом за прототип, права ограничены методом оценки только ФНО-альфа ингибиторов.
Способ использования хондральных клеток для скринирования веществ, обладающих противовоспалительной активностью, включает смешивание исследуемого противовоспалительного вещества с фиксированным количеством индуктора воспаления, в частности, рекомбинантного ФНО-альфа, и добавления этой смеси к культуре человеческих клеток хондральной этиологии с последующим измерением экспрессии биологического маркера, отличающийся тем, что в качестве культуры человеческих клеток используют хондробласты, полученные из гиалиновой хрящевой ткани пальцев шестипалых младенцев, обладающие высоким индексом пассирования Р1-20, однородностью клеточного монослоя при отсутствии клеточного дебриса, способностью изменять экспрессию цитокинов на ФНО-альфа индукцию и ФНО-альфа ингибирование после криоконсервации.
Способ иллюстрируется лабораторными примерами.
Мы первыми показали, что хондробласты поздних пассажей, полученные из гиалиновой хрящевой ткани пальцев шестипалых младенцев, после криоконсервации не теряют способности изменять экспрессию провоспалительного цитокина-мишени ИЛ-6 в ответ на ФНО-альфа индукцию и ФНО-альфа ингибирование. На Фигуре 2 показано изменение ИЛ-6 экспрессии в ответ на ФНО-альфа индукцию и ФНО-альфа ингибирование в хондробластах 6-го пассажа. Хондробласты были выделены из гиалинового хряща донора №3 и пассированы в культуральных флаконах до 6-го пассажа. Как видно из Фиг. 2, контрольные хондробласты, растущие без добавления ФНО-альфа, имеют минимальную экспрессию ИЛ-6 (контроль). Хондробласты, инкубированные 18 часов с ФНО-альфа (10 нг/мл), показывают значительное увеличение экспрессии ИЛ-6 (ФНОα). Смесь ФНО-альфа (10 нг/мл) с ФНО-альфа ингибитором МАВ (моноклональные антитела к ФНО-альфа в концентрации 10 нг/мл), добавленная к хондробластам на 18 часов, значительно ингибирует экспрессию ИЛ-6 (ФНО + МАВ 10 нг/мл).
На Фигуре. 3 показано изменение ИЛ-6 экспрессии в ответ на ФНО-альфа индукцию и ФНО-альфа ингибирование в хондробластах того же донора №3 на более позднем 9-ом пассаже после криоконсервации. Хондробласты 6-го пассажа были криоконсервированы в виде мастер-банка при -80 С. Перед использованием в эксперименте клетки были разморожены и пассированы во флаконах до 9-го пассажа. Как следует из Фиг. 3, способность хондробластов изменять экспрессию маркера ИЛ-6 в ответ на ФНО-альфа индукцию и ФНО-альфа ингибирование сохраняется после множественного пассирования и криоконсервации. Размороженные контрольные хондробласты позднего пассажа (пассаж 9), растущие без добавления ФНО-альфа, имеют минимальную экспрессию ИЛ-6 (контроль). Хондробласты, инкубированные 18 часов с ФНО-альфа (10 нг/мл) показывают значительное увеличение экспрессии ИЛ-6 (ФНОα). Смесь ФНО-альфа (10 нг/мл) с ФНО-альфа ингибитором МАВ (моноклональные антитела к ФНО-альфа в концентрации 2,5 мкг/мл, добавленная к хондробластам на 18 часов, полностью ингибирует экспрессию ИЛ-6 до контрольного уровня (ФНО + МАВ 2,5 мкг/мл). Экспериментальные данные подтверждают возможность использования хондробластов из мастер-банка для скринирования веществ с противовоспалительной активностью.
Для подтверждения того, что хондробласты разных доноров имеют способность изменять экспрессию ИЛ-6 в ответ на ФНО-альфа индукцию и ФНО-альфа ингибирование, были протестированы хондробласты от 5 доноров, полученные из гиалиновой хрящевой ткани пальцев шестипалых младенцев (Фиг. 4). В качестве ФНО-альфа ингибитора использовали коммерчески доступный лекарственный препарат (ЛП) Энбрел (Файзер). ФНО-альфа ингибитор Энбрел в двух концентрациях ([С1] 2.5 мкг/мл и [С2] 25 нг/мл) смешивали с фиксированным количеством рекомбинантного ФНО-альфа (10 нг/мл) и затем смесь добавляли к первичной культуре человеческих хондробластов от разных доноров. Изменение экспрессии ИЛ-6 (пг/мл) оценивали с помощью ИФА ИЛ-6 (Вектор-Бест). Как видно на фиг.4, экспрессия ИЛ-6 в хондробластах от всех 5 доноров напрямую коррелирует с присутствием ФНО-альфа в культуральной среде хондробластов. Метод позволяет тестировать ингибирующий эффект лекарственного препарата Энбрел (ЛП) в концентрации от 25 нг/мл до 2.5 мкг/мл. Таким образом, на примере хондробластов от 5 доноров показана воспроизводимая и титруемая экспрессия цитокина-мишени ИЛ-6 в ответ на ФНО-альфа индукцию и ФНО-альфа ингибирование (Фиг. 4).
Наш метод разработан на основе ФНО-альфа индуцируемого измерения ИЛ-6 в культуральной среде с применением коммерчески доступного ИФА-ИЛ-6 (Вектор-Бест). При этом мы оставляем право предполагать, что индукция воспаления может быть достигнута с помощью любого провоспалительного индуктора: биологической или механической природы. Также с учетом литературных данных, демонстрирующих, что человеческие клетки хондральной этиологии в ответ на воспаление способны изменять экспрессию многих генов (например IL-1, IL-8, IL-10, IL-15, IL-17, IL-18, IL-20, IL-21, IFN-gamma, VCAM-1, TIMP2, ММР1, ММР3, ММР13, и др.), мы оставляем за собой право утверждать, что наш способ может быть использован для оценки изменения экспрессии любых других биологических маркеров с помощью различных молекулярно-биологических методов (ИФА, ПЦР, гибридизация и др.) с использованием данных первичных хондробластов.
Способ может быть применен для скрининга новых лекарственных препаратов с противовоспалительной активностью, включая ФНО-альфа и ИЛ-6 ингибиторы; для доклинического тестирования веществ с противовоспалительной активностью, для сравнения биоэквивалентных ФНО-альфа и ИЛ-6 ингибиторов (биосимиляров); для контроля качества противовоспалительных препаратов в процессе их производства и для оценки нейтрализующих ФНО-альфа антител в сыворотке пациентов.
ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ
1. Wojdasiewicz Р, Poniatowski 
Szukiewicz D. The role of inflammatory and antiinflammatory cytokines in the pathogenesis of osteoarthritis. Mediators Inflamm. 2014; 2014:561459.
2. Burska A, Boissinot M, Ponchel F. Cytokines as Biomarkers in Rheumatoid Arthritis. Mediators of Inflammation. 2014; 2014:545493.
3. B.J. de Lange-Brokaar, A. Ioan-Facsinay, G.J. van Osch et al., "Synovial inflammation, immune cells and their cytokines in osteoarthritis: a review," Osteoarthritis Cartilage, 2012; 20(12):1484-1499.
4. Kim GW, Lee NR, Pi RH, Lim YS, Lee YM, Lee JM, Jeong HS, Chung SH. IL-6 inhibitors for treatment of rheumatoid arthritis: past, present, and future. Arch Pharm Res. 2015; 38(5):575-84.
5. Wang P, Zhu F, Konstantopoulo K. Interleukin-6 Synthesis in Human Chondrocytes Is Regulated via the Antagonistic Actions of Prostaglandin (PG)E2 and 15-deoxy-D12,14-PGJ2.PLoSOne. 2011; 6(11): e27630
6. Willrich MA, Murray DL, Snyder MR. Tumor necrosis factor inhibitors: clinical utility in autoimmune diseases. Transl Res. 2015; 165(2):270-82.
7. Melagraki G, Ntougkos E, Rinotas V, Papaneophytou C, Leonis G, Mavromoustakos T, Kontopidis G, Douni E, Afantitis A, Kollias G. Cheminformatics-aided discovery of small-molecule Protein-Protein Interaction(PPI) dual inhibitors of Tumor Necrosis Factor (TNF) and Receptor Activator of NF-κВ Ligand (RANKL). PLoS Comput Biol. 2017 Apr 20; 13(4).
8. https://www.fda.gov/downloads/drugs/guidances/ucm3 38856.pdf
9. http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/2012/06/WC500128688.pdf
10. Lallemand C, Kavrochorianou N, Steenholdt C, Bendtzen K, Ainsworth MA, Meritet JF, Blanchard B, Lebon P, Taylor P, Charles P, Alzabin S, Tovey MG. Reporter gene assay for the quantification of the activity and neutralizing antibody response to TNFα antagonists. J Immunol Methods. 2011 Oct 28; 373(1-2):229-39.
11. US 20140140994 A1 Cell-based assay for assessing tnf alpha inhibitors
12. 
Blejec A(3), Kregar Velikonja N. Gene expression of cultured human chondrocytes as a model for assessing neutralization efficacy of soluble TNFα by TNFα antagonists. Biologicals. 2015 May; 43(3):171-80.
Приложение 1
Claims (1)
- Способ скрининга веществ, обладающих противовоспалительной активностью, включающий смешивание исследуемого вещества с фиксированным количеством человеческого ФНО-альфа и добавление этой смеси к культуре клеток хондрального ряда с последующим измерением экспрессии биологического маркера, отличающийся тем, что в качестве культуры человеческих клеток используют хондробласты, полученные из гиалиновой хрящевой ткани пальцев шестипалых младенцев после множественного пассирования до 20-го пассажа, обладающие однородностью клеточного монослоя при отсутствии клеточного дебриса и способностью отвечать на ФНО-альфа индукцию и ФНО-альфа ингибирование после криоконсервации.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018107903A RU2683277C1 (ru) | 2018-03-02 | 2018-03-02 | Способ использования хондральных клеток для скринирования веществ, обладающих противовоспалительной активностью |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018107903A RU2683277C1 (ru) | 2018-03-02 | 2018-03-02 | Способ использования хондральных клеток для скринирования веществ, обладающих противовоспалительной активностью |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2683277C1 true RU2683277C1 (ru) | 2019-03-27 |
Family
ID=65858776
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2018107903A RU2683277C1 (ru) | 2018-03-02 | 2018-03-02 | Способ использования хондральных клеток для скринирования веществ, обладающих противовоспалительной активностью |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2683277C1 (ru) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1994009118A1 (en) * | 1992-10-13 | 1994-04-28 | The General Hospital Corporation | Immortalized human chondrocytes |
| JP2001089390A (ja) * | 1999-09-16 | 2001-04-03 | Sumitomo Pharmaceut Co Ltd | 軟骨障害治療剤の新規なスクリーニング方法 |
| US20140140994A1 (en) * | 2012-10-04 | 2014-05-22 | IN.Medica, d.o.o. | Cell-based assay for assessing tnf alpha inhibitors |
| EA201691260A1 (ru) * | 2007-02-02 | 2017-02-28 | Акселерон Фарма Инк. | ВАРИАНТЫ, ПРОИСХОДЯЩИЕ ИЗ ActRIIB, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ |
-
2018
- 2018-03-02 RU RU2018107903A patent/RU2683277C1/ru active IP Right Revival
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1994009118A1 (en) * | 1992-10-13 | 1994-04-28 | The General Hospital Corporation | Immortalized human chondrocytes |
| JP2001089390A (ja) * | 1999-09-16 | 2001-04-03 | Sumitomo Pharmaceut Co Ltd | 軟骨障害治療剤の新規なスクリーニング方法 |
| EA201691260A1 (ru) * | 2007-02-02 | 2017-02-28 | Акселерон Фарма Инк. | ВАРИАНТЫ, ПРОИСХОДЯЩИЕ ИЗ ActRIIB, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ |
| US20140140994A1 (en) * | 2012-10-04 | 2014-05-22 | IN.Medica, d.o.o. | Cell-based assay for assessing tnf alpha inhibitors |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Carmona-Rivera et al. | Synovial fibroblast-neutrophil interactions promote pathogenic adaptive immunity in rheumatoid arthritis | |
| SenGupta et al. | Triple-negative breast cancer cells recruit neutrophils by secreting TGF-β and CXCR2 ligands | |
| Calderón-Gómez et al. | Commensal-specific CD4+ cells from patients with Crohn’s disease have a T-helper 17 inflammatory profile | |
| Mitra et al. | Functional role of IL-22 in psoriatic arthritis | |
| CN109777872A (zh) | 肺癌中的t细胞亚群及其特征基因 | |
| Chen et al. | Selective targeting of PI3Kδ suppresses human IL-17-producing T cells and innate-like lymphocytes and may be therapeutic for IL-17-mediated diseases | |
| Yao et al. | Mechanism of neuroinflammation: enhanced cytotoxicity and IL-17 production via CD46 binding | |
| CN116042519B (zh) | 一种修复型中性粒细胞的分类、诱导活化方法及其用途 | |
| Yamato et al. | Adipose tissue‐derived stem cells prevent fibrosis in murine steatohepatitis by suppressing IL‐17‐mediated inflammation | |
| RU2683277C1 (ru) | Способ использования хондральных клеток для скринирования веществ, обладающих противовоспалительной активностью | |
| Shen et al. | Elevated expansion of follicular helper T cells in peripheral blood from children with acute measles infection | |
| WO2024026384A1 (en) | Assays for detection and quantitation of human endotrophin | |
| JP4486497B2 (ja) | 複合混合物中の個々の活性成分を同定する方法 | |
| Svala et al. | Effects of interleukin-6 and interleukin-1β on expression of growth differentiation factor-5 and Wnt signaling pathway genes in equine chondrocytes | |
| Sayo et al. | Fabrication of bone marrow-like tissue in vitro from dispersed-state bone marrow cells | |
| Seo et al. | Long-term treatment of allogeneic adipose-derived stem cells in a dog with rheumatoid arthritis | |
| Iborra et al. | In vitro differentiation of naïve CD4+ T cells: a tool for understanding the development of atherosclerosis | |
| JP6628178B2 (ja) | ＩｇＥ非依存性アレルギー疾患検査方法 | |
| CN109503712B (zh) | 一种单克隆抗体ZKns2E11及其应用 | |
| Maarouf et al. | IL-36/IL-36R Signaling Promotes CD4+ T Cell-Dependent Colitis via Pro-Inflammatory Cytokine Production | |
| Barlič et al. | Gene expression of cultured human chondrocytes as a model for assessing neutralization efficacy of soluble TNFα by TNFα antagonists | |
| KR20080053323A (ko) | 효현제로서의 아프타머 | |
| Vitales-Noyola et al. | Levels of Pathogenic Th17 and Th22 Cells in Patients with Rheumatoid Arthritis | |
| CN113337571B (zh) | 一种快速、超高灵敏度的TNFα生物活性检测方法 | |
| Žigon-Branc et al. | In vitro Cell-Based Assays for Potency Testing of Anti-TNF-α Biological Drugs |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20210303 |
|
| NF4A | Reinstatement of patent |
Effective date: 20211206 |