CN116042519B - 一种修复型中性粒细胞的分类、诱导活化方法及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种修复型中性粒细胞的诱导、分类方法及其用途。其中修复型中性粒细胞为CD45+Ly6G+CD54+CD274+GLUT1+经物理电刺激诱导的细胞亚群，该修复型免疫细胞亚群经物理电刺激的诱导后能够发挥促进组织修复功能。此外，本发明的修复型中性粒细胞制备工艺简单，操作简便，可以实现批量生产及临床上的推广应用。

Description

一种修复型中性粒细胞的分类、诱导活化方法及其用途
技术领域
本发明涉及免疫学和再生医学领域，具体地涉及一种修复型中性粒细胞的分类、诱导活化方法及其用途。
背景技术
随着对免疫系统研究的深入，近几年通过免疫细胞调控组织再生修复已成为研究热点。有研究表明免疫反应是调控组织再生的重要因素。其中免疫细胞促进修复的作用被逐渐认识到。然而，目前对修复型免疫细胞的认识主要集中在巨噬细胞。而中性粒细胞被普遍认为是组织损伤发生时清除坏死组织，引发炎症反应的免疫细胞，对其促修复功能的研究较少，导致如何更好地利用免疫细胞的调控作用促进组织修复还不够清楚。修复型中性粒细胞对临床修复受损组织可能存在重要影响。
中国专利申请CN114891728A公开了一种聚电解质膜、巨噬细胞外泌体及其在促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化中的应用，其通过将M0巨噬细胞接种于涂覆聚电解质膜的培养器皿中，并收集含有巨噬细胞外泌体的培养液上清液；从培养液上清液中提取巨噬细胞外泌体，利用巨噬细胞外泌体可以促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化。不过，该方法利用巨噬细胞外泌体可以促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化未经过动物实验验证，临床效果的稳定性难以保证。
中国专利申请CN111529757A公开了一种人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)用于制备骨再生产品的用途，其利用人羊膜间充质干细胞的免疫调节作用优化骨缺损微环境，促血管化骨再生的M2巨噬细胞聚集，分泌促血管新生和成骨活性因子，刺激内源性骨再生。该申请所使用的人羊膜间充质干细胞来源是无传染性疾病剖宫产新鲜胎盘组织，其来源少，且涉及到剖宫产患者的知情同意及伦理要求，因此其临床推广和应用受到限制。
背景技术中的信息仅仅在于说明本发明的总体背景，不应视为承认或以任何形式暗示这些信息构成本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
为解决现有技术中的至少部分技术问题，本发明提供一种修复型中性粒细胞的分类、诱导活化方法及其用途。具体地，本发明包括以下内容。
本发明的第一方面，提供一种分离的修复型中性粒细胞，其中，所述分离的修复型中性粒细胞为CD45+Ly6G+CD54+CD274+GLUT1+细胞亚群。
在某些实施方案中，根据本发明所述的分离的修复型中性粒细胞，其中，所述修复型是指当使用物理电刺激所述细胞亚群时能够诱导该细胞亚群的促血管化功能。
在某些实施方案中，根据本发明所述的分离的修复型中性粒细胞，其中，所述物理电刺激包括压电材料、铁电材料，或者直流电、交流电、电磁场等提供的电刺激信号。
本发明的第二方面，提供一种修复型中性粒细胞的制备方法，其中，所述方法包括诱导中性粒细胞表达CD54、CD274和GLUT1的步骤，或者通过基因工程手段使中性粒细胞过表达CD54、CD274和GLUT1的步骤，或者分离修复型中性粒细胞的步骤。
本发明的第三方面，提供一种中性粒细胞的分类方法，其中，所述方法包括检测中性粒细胞表面或内部标志蛋白或其mRNA的步骤，其中，所述标志蛋白包括CD54、CD274和GLUT1；可选地，进一步包括鉴定中性粒细胞的步骤，优选地，通过CD45、Ly6G来鉴定所述中性粒细胞。
在某些实施方案中，根据本发明所述的中性粒细胞的分类方法，其中，进一步包括将CD45+Ly6G+CD54+CD274+GLUT1+细胞分类为修复型中性粒细胞。
在某些实施方案中，根据本发明所述的中性粒细胞的分类方法，其中，进一步包括将CD45+Ly6G+CD54-CD274-GLUT1-细胞分类为非修复型中性粒细胞。
本发明的第四方面，提供一种用于活化修复型中性粒细胞的方法，其中，包括使用物理电刺激第一方面所述的修复型中性粒细胞的步骤。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用于活化修复型中性粒细胞的方法，其中，所述活化是指表达或增强表达VEGF、CXCL16、MMP9、Proliferin和Osteopontin中的至少一种。
本发明的技术效果包括但不限于：
(1) 本发明的具有修复功能的中性粒细胞亚群是首次被发现的能被电刺激诱导后发挥促修复功能的免疫细胞亚群，其在电学微环境的诱导下能够被激活细胞内的钙信号通路，进而发挥例如促进组织修复的功能。
(2) 本发明的具有修复功能的中性粒细胞亚群在动物体内具有良好的促进血管化、促进成骨的作用，可用于组织修复治疗，很好的解决了目前临床上骨缺损修复效果不佳的问题。
(3) 本发明的制备工艺简单，操作简便，可以实现批量生产及临床上的推广应用。
附图说明
图1-2示出了治疗性的电刺激敷贴（TESP）在早期骨再生过程中增加中性粒细胞浸润。
图3-4示出了TESP募集中性粒细胞。
图5-6示出了Neu1是独特的修复型中性粒细胞亚群。
图7-9示出了TESP显著升高了Neu1的胞内Ca2+浓度。
图10-15示出了TESP通过Ca2+/CaMKII信号通路激活Neu1促血管生成功能。
图16示出了修复型中性粒细胞用于骨修复效果的验证。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。除非另有说明，否则“%”为基于重量的百分数。
除非另有说明，否则本文所述的中性粒细胞亚群是指表达CD45+Ly6G+CD54+CD274+GLUT1+的细胞亚群(本文有时也简称为“Neu1”)，Neu2/3/4是指除表达CD45+Ly6G+CD54+CD274+GLUT1+外的细胞亚群，例如包括但不限于表达CD45+Ly6G+CD54-CD274-GLUT1-等细胞亚群。
修复型中性粒细胞
本发明的第一方面，提供一种分离的修复型中性粒细胞，术语“分离的”当用于描述一个或多个中性粒细胞时是指已经从它们的天然环境中分离出来的一个或多个细胞，包括从细胞起源的对象(例如受试者)中分离，和/或从天然环境中的一种或多种其它组分(例如碎片、组织、组织聚集体和其它细胞)中分离。受试者是指脊椎动物，优选为哺乳动物，哺乳动物包括但不限于鼠类、猿、家畜、人等，优选为人。在体外获得或在体外培养的生物实体的中性粒细胞及其后代也涵盖在本发明的保护范围之内。
本发明中，中性粒细胞的来源不特别限定，其来源包括但不限于例如骨髓、血液(如外周血)、组织(如结缔组织)等。
本发明中，修复型是指提取分离出Neu1后经过电刺激诱导后的Neu1的修复功能。本发明人发现仅分离出来的Neu1(naïve状态)不具备修复功能，而当使用物理电刺激，例如电学材料刺激中性粒细胞细胞亚群时能够激活细胞内的钙信号通路、诱导该细胞亚群的促血管化功能。优选地，中性粒细胞细胞亚群的细胞内的钙浓度相较于未刺激或未激活的中性粒细胞细胞亚群的细胞内的钙浓度显著升高。升高的钙进一步与CaMK II结合激活下游通路，使血管调控相关基因的表达量升高。
本发明中，物理电刺激的实例包括但不限于压电材料、铁电材料或直流电、交流电、电磁场等提供的电刺激信号。在某些实施方案中，使用基于压电材料的物理电刺激进行刺激活化细胞亚群，其包括以下步骤：
(1) 制备复合膜材料，其包含钛酸钡纳米颗粒或修饰的钛酸钡纳米颗粒和铁电高分子聚合物P(VDF-TrFE)；
(2) 筛选特定中性粒细胞亚群，在示例性的实施方案中，首先使小鼠骨髓细胞与特异性抗体低温孵育，其中所述特异性抗体携带荧光基团，然后通过流式细胞仪分选得到表达CD45+Ly6G+CD54+CD274+GLUT1+中性粒细胞亚群；
(3) 使步骤(1)中的所述复合膜材料与步骤(2)中的中性粒细胞接触并培养，从而激活细胞内的钙信号通路。
在另外的示例性实施方案中，可以先对来源小鼠骨髓的中粒细胞进行刺激或活化，再通过流式分选得到表达CD45+Ly6G+CD54+CD274+GLUT1+中性粒细胞亚群，其中，所述中性粒细胞能够激活细胞内的钙信号通路，并进一步促进血管生成。
本发明的步骤(1)中，将钛酸钡纳米颗粒或修饰的钛酸钡纳米颗粒与铁电压电高分子聚合物P(VDF-TrFE)分散于有机溶液后进行浇铸成膜，在室温下电晕极化处理，得到本发明的复合膜材料。有机溶剂不特别限定，优选非质子极性溶剂，其实例包括但不限于N,N-二甲基甲酰胺、甲苯、三氯甲烷、二氯甲烷、甲醇和乙酸乙酯中的一种或多种，特别优选N,N-二甲基甲酰胺。
可以理解的是，制备的复合膜材料可以作为专用于培养和/或筛选中性粒细胞的培养基材和/或筛选基材，并且所述基材还可以包括用于培养或筛选中性粒细胞所需的必要成分(例如抗体、缓冲液、抗生素等)和培养装置，例如培养皿。
本发明的步骤(2)中，使骨髓细胞与筛选抗体低温孵育，筛选抗体均为市售产品，所述抗体能够结合中性粒细胞表面或内部的下述蛋白：CD45、Ly6G、CD54、CD274和GLUT1。上述抗体产品的实例包括但不限于：FITC-CD54、PE-CD274、APC/Cy7-CD45、PE/Cy7-Ly-6G、GLUT1。孵育之后进一步包括与二抗的低温孵育。低温是指0-10℃的温度，优选为4℃。随后通过流式细胞术分选得到表达CD45+Ly6G+CD54+CD274+GLUT1+中性粒细胞亚群。
本发明的步骤(3)中，将复合膜材料与中性粒细胞亚群接触并培养6-24h，优选6-20h，还优选6-15h，进一步优选6-12h。培养条件为在含有5-15%胎牛血清、0.5-1.2%的青链霉素的RPMI-1640培养基中，在5% CO2，30-40℃下进行培养，温度优选为35-37℃。
修复型中性粒细胞的制备方法
本发明的第二方面，提供修复型中性粒细胞的制备方法，包括下述中的至少一种：
(1)诱导中性粒细胞表达CD54、CD274和GLUT1的步骤，如何诱导中性粒细胞表达CD54、CD274和GLUT1是本领域已知的，例如使用诱导剂或诱导物直接进行诱导；或者
(2)使中性粒细胞过表达CD54、CD274和GLUT1的步骤，例如将携带上述蛋白的编码基因的核酸构建体导入载体，经转化后过表达CD54、CD274和GLUT1；或者
(3)从例如外周血或骨髓细胞分离修复型中性粒细胞的步骤，例如使用本文所述的特异性结合CD54、CD274和GLUT1的抗体，然后使用本领域已知的分离技术进行分离，例如使用流式细胞仪进行分选。
分类方法
本发明还提供一种中性粒细胞的分类方法，包括使用试剂检测中性粒细胞表面或内部标志蛋白或其mRNA的步骤，试剂包括生物大分子和/或小分子试剂，大分子试剂包括但不限于能够特异性结合CD54、CD274和GLUT1的抗体，小分子试剂包括但不限于能够特异性结合CD54、CD274和GLUT1基因的探针，和/或能够扩增其的引物。
进一步可以通过鉴定标志物CD45、Ly6G来鉴定所述中性粒细胞。
活化修复型中性粒细胞的方法
本发明还提供一种活化修复型中性粒细胞的方法，包括使用电学材料刺激本文所述的修复型中性粒细胞的步骤。电学材料的类型不特别限定，只要其具有电学性能或压电活性即可，上述材料可参见例如CN115252872A、CN114904054A、CN104208754A、CN115286883A和CN115282345A，它们通过引用整体并入本文。
在示例性实施方案中，本发明的电学材料包括铁电高分子聚合物和无机铁电材料。本发明中，无机铁电材料的实例包括但不限于钛酸钡、钛酸锶钡、钛酸锶、铁酸铋、铌酸钾钠和铌酸锂中的一种或多种。
本发明中，铁电高分子聚合物不特别限定，包括聚偏氟乙烯或其共聚物，其实例包括但不限于聚偏二氟乙烯、聚偏氟乙烯-六氟丙烯和聚偏氟乙烯-三氟乙烯和聚乳酸。
实施例
一、实验方法
1、电学材料
实施例中使用治疗性的电刺激敷贴(本文简称为“TESP”)，不具有电刺激信号的对照材料为CON。
2、流式细胞术和中性粒细胞亚群的分选
收集C57BL/6小鼠的骨髓细胞并与以下初级抗体孵育：FITC-CD54 (BioLegend，YN1/1.7.4)、PE-CD274 (BioLegend，MIH7)、APC/Cy7-CD45 (BioLegend，30-F11)、PE/Cy7-Ly-6G (BioLegend，1A8)、Glut1 (HUABIO，SA0377)。然后洗涤细胞并与第二抗体AlexaFluor 647 (Abcam)在孵育。通过流式细胞仪分选和分析细胞。
3、动物实验
本发明使用7周龄的雄性SD大鼠和C57BL/6小鼠。实验方案经北京大学动物保护与使用委员会批准(LA2020290)。为了研究Neu1在体内的促血管生成功能，建立了小鼠颅骨缺损模型。创建两个直径为3 mm的临界尺寸全层骨缺损以研究促血管生成功能，并创建一个直径为2 mm的全层骨缺损以研究促成骨功能。为了评估新血管形成，在术后2周用Microfil进行血管形成微血管灌注。
4、细胞培养和条件培养基样品的收集
HUVECs购自ScienCell Research Laboratories，并在内皮细胞培养基(ECM；1001；ScienCell Research Laboratories)中培养。
通过ATRA(sigma，R2625，1 μmol/L)处理HL-60细胞分化成粒细胞样细胞(命名为HL-60衍生的中性粒细胞，简称为H-中性粒细胞)。在RPMI-1640(proce cell)中培养H-中性粒细胞或流式分选的中性粒细胞。所有细胞都在37℃含5% CO2的湿化培养箱中培养。
H-中性粒细胞或分选的中性粒细胞亚群在TESP或CON膜上培养，收集细胞培养物上清液用于随后的实验。
5、单细胞(10X) RNA测序和预处理数据
单细胞RNA-seq文库是在Chromium平台(10X Genomics)上制备和进行。使用cellranger count(2.0版)将原始数据与大鼠参考基因组进行比对。使用Seurat 3 in R进行单细胞数据分析(包括质量控制、数据标准化、降维、聚类检测)。
6、Smart-seq2 RNA测序和预处理数据
将Neu1(即本发明的表达CD45+Ly6G+CD54+CD274+GLUT1+的中性粒细胞细胞亚群)和Neu2/3/4分别分选并汇集在一起，进一步与裂解组分和核糖核酸酶抑制剂一起孵育。然后使用Smart-Seq2方法进行文库制备。然后，使用Illumina Hiseq平台上加载的合格文库进行PE150测序。
获得clean reads后从UCSC(http://Hg download . SOE . ucsc . edu/goldenpath/gal gal 4)下载参考基因和基因组注释文件，构建参考基因组库，将clean reads据映射到参考基因组上，识别外显子-外显子剪接位点。
7、差异表达基因分析以及表面蛋白表达分析
差异表达基因通过使用“Wilcox检验”进行识别，表面标记列表从细胞表面蛋白图谱(http://wlab.ethz.ch/cspa/)下载。
8、功能富集分析(GO)分析
为了阐明每个聚类的特征基因的生物学意义，使用R中的ClusterProfiler软件包对每个聚类的差异基因进行GO分析。
9、酶联免疫吸附法(ELISA)
如前所述收集细胞培养上清液。使用CXCL1 (Solarbio，SEKH-0065)、CXCL3(FineTest，EH3179)、CCL3 (Solarbio，SEKH-0246)、VEGF (Solarbio，SEKH-0052，SEKM-0039) ELISA试剂盒，以及小鼠血管生成阵列试剂盒(R&D系统公司，ARY015)，并根据各自制造商的说明进行ELISA测定。
10、体外成管试验
用每孔250 μL Matrigel包被。然后，将平板置于培养箱使基质凝胶固化。接下来，将HUVECs铺在基质胶上。最后，24孔板在培养箱中孵育，在共聚焦显微镜下观察到管状结构。对相对总小管长度、连接数目和每个视野的小管数目进行量化，以评估小管形成。
11、体外发芽血管生成试验
明胶甲基丙烯酰凝胶用于包埋过夜产生的HUVEC球状体。随后进行光固化并加入条件培养基。球状体已经充分发芽后对细胞侵袭距离和延伸数量进行数字定量。分析了每个实验组大约10个球状体。
12、钙内流检测
研究Neu1细胞内的钙内流是否由TESP引起。使用荧光钙探针对细胞进行染色，并监测细胞内钙信号。简言之，将分选的Neu1细胞培养在TESP膜上，用Fluo-4避光染色，悬浮在RPMI1640培养基中。然后测量荧光强度并进行定量分析。
13、材料共培养和移植试验
为了研究Neu1群体的电响应潜力和促血管生成能力，使用CD45.2小鼠作为Neu1细胞和Neu2/3/4细胞的供体(CD45.2背景)。将FACS分选的Neu1细胞或Neu2/3/4细胞铺在RPMI1640培养基中的TESP或CON膜上。共培养12小时后，收集细胞，然后通过尾静脉注射入8周龄雄性受体小鼠(CD45.2背景)，每个受体1×104个供体细胞。受体预处理两个临界大小的全层骨缺损(2mm直径)，缺损区用CON膜覆盖。如前所述，分别在移植后2周和12周检测血管形成和骨再生。
14、统计分析
结果以平均值±标准差表示。不配对t检验用于两个样本，ANOVA方差分析用于两个以上的样本组。p < 0.05有统计学意义，(*p< 0.05，** p< 0.01，*** p< 0.001，*** p<0.0001)。
二、结果
图1-2示出了TESP在早期骨再生过程中增加中性粒细胞浸润。其中图1上半部分的图为t-SNE图展示CON组(左)以及TESP组(右)的免疫细胞群体。图1下半部分的图为每个细胞亚群在不同时间点的相对分布比例。图2上半部分的图为不同时间点髓系细胞和淋系细胞的相对分布比例。图2下半部分的图为髓系细胞中每个细胞亚群的百分比，提示TESP在早期(day 3)骨再生过程中增加中性粒细胞的比例。
图3-4示出了TESP募集中性粒细胞。其中图3的左图为骨缺损第3天中性粒细胞top20差异基因表达热图。图3的中间的图为骨缺损第3天TESP组中性粒细胞高表达趋化相关基因的小提琴图。图3的右图GSEA图显示骨缺损第3天TESP组的嗜中性粒细胞中富集的趋化相关信号通路。图4的ELISA实验展示TESP组的嗜中性粒细胞的培养上清液中CXCL3、CCL3和CXCL1水平显著高于对照组，n=3。
图5-6示出了Neu1是独特的电响应中性粒细胞亚群。其中(a) t-SNE图展示了四种嗜中性粒细胞亚群(Neu1，Neu2，Neu3，Neu4)。(b)血管生成(GO:BP)通路富集的直方图，显示TESP组的Neu1中血管生成通路的富集程度高于其他亚组。(c)每个亚群的血管生成分数的箱线图，显示TESP组中Neu1的血管生成分数高于其他亚群。(d)小提琴图显示，与对照组相比，TESP组中Neu1的血管生成得分更高。(e)手术后第3天，TESP增加了Neu1亚群的比例。图6的(a)气泡图显示每个中性粒亚群中高表达的细胞表面标志基因。(b) t-SNE显示CD274、Icam1(CD54)和Slc2a1(Glut1)在Neu1亚群中富集。(c) ELISA实验证明TESP显著上调Neu1中的VEGF表达。
图7-9示出了TESP显著升高了Neu1的胞内Ca2+浓度。其中图7为naive Neu1和Neu2/3/4之间的差异表达基因热图，提示naive Neu1高表达电压相关离子通道的基因。图8为每个亚群中Fluo-4(钙探针)的代表性免疫荧光图像。虚线表示细胞。图9左图为中Fluo-4荧光强度的定量分析，提示电诱导后的Neu1细胞内钙浓度显著升高，n=50。图9中间的图为每个亚群中Fluo-4(钙探针)的代表性流式分析图。图9右图为Fluo-4荧光强度的定量分析，提示电诱导后的Neu1细胞内钙浓度显著升高，n=3。
图10-15示出了TESP通过Ca2+/CaMKII信号通路激活Neu1促血管生成功能。其中图10为血管化相关蛋白的ELISA检测，对分别使用或者不使用钙信号通路抑制剂KN93处理的TESP-neu1细胞的培养上清液进行检测。图11为所示蛋白表达水平的定量分析，提示钙信号通路抑制剂显著抑制了TESP诱导后的neu1的CXCL16、MMP9、Proliferin和Osteopontin表达，n=4。图12为体外管腔和3D细胞球出芽血管生成(图13)实验示意图。图14对总管腔长度、连接点数目和小管数目进行定量分析，提示钙信号通路抑制剂显著抑制了TESP诱导后的neu1的促血管再生能力。图15定量分析图13中的侵入距离和新芽数量，提示钙信号通路抑制剂显著抑制了TESP诱导后的neu1的促血管再生能力。
图16示出了修复型中性粒细胞用于骨修复效果的验证。图16的(a)：小鼠颅骨缺损术后移植不同材料刺激后的不同中性粒细胞亚群，手术后2周实施血管造影术后的小鼠颅骨的代表性CT图像。虚线表示缺陷边界。(b)定量分析a中的新生血管体积，提示TESP诱导的Neu1促进体内血管再生的能力显著高于其他对照组，n=9。(c) 小鼠颅骨缺损术后移植不同材料刺激后的不同中性粒细胞亚群，手术后12周小鼠颅骨的代表性CT图像。虚线表示缺陷边界。(d)定量分析c中的新骨体积(BV) (n ≥ 6)和骨矿物质密度(BMD)(n≥6)。提示，TESP诱导的Neu1中性粒细胞促进体内骨再生的能力显著高于其他对照组。
尽管本发明已经参考示例性实施方案进行了描述，但应理解本发明不限于公开的示例性实施方案。在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的示例性实施方案做多种调整或变化。权利要求的范围应基于最宽的解释以涵盖所有修改和等同结构与功能。

Claims (9)

1.一种分离的修复型中性粒细胞，其特征在于，其为CD45+Ly6G+CD54+CD274+GLUT1+细胞亚群，其中，当使用基于压电材料的物理电刺激进行刺激活化细胞亚群后，在所述细胞亚群具有CD54、CD274和GLUT1富集，其中包括制备复合膜材料的步骤，所述复合膜材料包含钛酸钡纳米颗粒或修饰的钛酸钡纳米颗粒和铁电高分子聚合物P(VDF-TrFE)。
2.根据权利要求1所述的分离的修复型中性粒细胞，其特征在于，所述修复型是指当使用基于压电材料的物理电刺激进行刺激活化细胞亚群后能够引发细胞内的钙离子流。
3.根据权利要求2所述的分离的修复型中性粒细胞，其特征在于，由所述细胞内的钙离子流进一步引发组织修复。
4.根据权利要求1-3任一项所述的修复型中性粒细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括诱导中性粒细胞表达CD54、CD274和GLUT1的步骤，或者通过基因工程手段使中性粒细胞过表达CD54、CD274和GLUT1的步骤，或者从细胞群中鉴定并分离所述修复型中性粒细胞的步骤。
5.一种中性粒细胞的分类方法，其特征在于，包括检测中性粒细胞表面或内部标志蛋白或其mRNA的步骤，其中，所述标志蛋白包括CD54、CD274和GLUT1中的至少之一；进一步包括鉴定中性粒细胞的步骤，通过CD45、Ly6G来鉴定所述中性粒细胞，进一步包括将CD45+Ly6G+CD54+CD274+GLUT1+细胞分类为修复型中性粒细胞，其中，当使用基于压电材料的物理电刺激进行刺激活化细胞亚群后，在所述细胞亚群具有CD54、CD274和GLUT1富集，其中包括制备复合膜材料的步骤，所述复合膜材料包含钛酸钡纳米颗粒或修饰的钛酸钡纳米颗粒和铁电高分子聚合物P(VDF-TrFE)。
6.根据权利要求5所述的中性粒细胞的分类方法，其特征在于，进一步包括将CD45+Ly6G+CD54-CD274-GLUT1-细胞分类为非修复型中性粒细胞。
7.根据权利要求5所述的中性粒细胞的分类方法，其特征在于，使用试剂检测所述标志蛋白或其mRNA，所述试剂包括抗体或引物、探针。
8.一种用于体外活化修复型中性粒细胞的方法，其特征在于，包括使用基于压电材料的物理电刺激进行刺激活化根据权利要求1-3任一项所述的修复型中性粒细胞的步骤。
9.根据权利要求8所述的用于体外活化修复型中性粒细胞的方法，其特征在于，所述活化是指表达或增强表达VEGF、CXCL16、MMP9、Proliferin和Osteopontin中的至少之一。
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