JP5583591B2 - Ｗｉｓｅ結合抗体及びエピトープ - Google Patents

Description

本出願は、２００７年１１月２１日に出願された、米国仮出願第６１／００４，０３７号の利益を請求し、これは参照することにより本明細書に組み込まれる。

線維症は、一般に、治癒過程の一部としての追加の結合組織の発達と定義され、多様な一連の症状を含む。過度の線維症は、治療法の選択肢がわずかしかない悲惨な問題である。

シスチンノット含有タンパク質は、典型的には、主要な機能の重要な制御因子であり、多様な細胞種に影響を及ぼす。Ｗｉｓｅ（ＵＳＡＧ−１、ＳＯＳＴＤＣ１）は、分泌されたシスチンノット含有タンパク質であり、腎臓、肺、及び上皮細胞で主に発現する。ＷＩＳＥ ＫＯマウスは妊娠可能であり、その腎臓は正常な機能を有する。しかしながら、片側尿管閉塞（ＵＵＯ）又は化学毒であるシスプラチンの注射のいずれかにより腎臓傷害を発現させようとするとき、ＷＩＳＥ ＫＯマウスは保護されている（Ｙａｎａｇｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２００６ Ｊａｎｕａｒｙ ４；１１６（１）：７０−７９）。ＵＵＯモデルでは、ＷＩＳＥ ＫＯマウスの罹患腎臓における線維症が非常に少なく、筋線維芽細胞活性化マーカーであるａＳＭＡの発現が非常に低く、上皮細胞マーカーＥ−カドヘリンの発現は保たれている。腎臓傷害のシスプラチンモデルでは、ＷＩＳＥの欠失により、動物が管傷害から保護され、死亡率が低下した（Ｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ａｄｖａｎｃｅ ｏｎｌｉｎｅ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ １７ Ｏｃｔｏｂｅｒ ２００７）。加えて、ＷＩＳＥ ＫＯマウス（すなわち、ＵＳＡＧ−１ ＫＯマウス）をＣｏｌ４ａ３ ＫＯマウスとともに飼育したとき、ダブルノックアウトマウスは、ＷＴ ＷＩＳＥ遺伝子を有するＣｏｌ４ａ３ ＫＯマウスに比べて、タンパク尿が著しく減少し、末期腎疾患の発現が減少した。４週齢で、ＵＳＡＧ−１＋／＋、３（ＩＶ）−／−マウスは既に糸球体基底膜（ＧＢＭ）の過剰な分裂を伴う重篤なタンパク尿を示したが、一方ダブルＫＯマウスは、正常な構造のＧＢＭを示した。１０週齢では、ＵＳＡＧ−１＋／＋、３（ＩＶ）−／−マウスは末期腎疾患が発現したが、一方ダブルＫＯマウスは腎臓の組織学的変化が少なく、腎機能が有意に保たれていた（Ａｂｓｔｒａｃｔ ＴＨ−ＦＣ０５９ ２００８ ＡＳＮ ｍｅｅｔｉｎｇ）。

これらのデータは、ＷＩＳＥが成体の腎臓機能の制御因子であり得ることを示唆する。しかしながら、これらの研究は、その発生周期全体にわたってＷＩＳＥを欠いているノックアウトマウスに限られており、したがって、抗体のような阻害剤を用いるＷＩＳＥ活性の急性阻害が、種々の線維性疾患に付随する病態下で腎臓機能を保つ療法的効果を提供できるかどうかは予測不可能であった。

Ｙａｎａｇｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２００６ Ｊａｎｕａｒｙ ４；１１６（１）：７０−７９ Ｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ａｄｖａｎｃｅ ｏｎｌｉｎｅ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ １７ Ｏｃｔｏｂｅｒ ２００７ Ａｂｓｔｒａｃｔ ＴＨ−ＦＣ０５９ ２００８ ＡＳＮ ｍｅｅｔｉｎｇ

本発明者らは、ＷＩＳＥを標的とする結合剤を用いて、線維症を含む損傷及び修復に付随する肺及び腎臓障害、並びに臓器不全の治療が可能であることを示す。

腎臓及び肺線維症を防止又は治療するために、並びに肺及び腎臓損傷、疾患及び／若しくは傷害を防止又は治療するために用いることができ、本明細書に記載する広範な疾患及び障害を治療するために用いることができる組成物及び方法を本明細書に開示する。

本発明は更に、本明細書に開示する結合剤により認識されるヒトＷＩＳＥの領域、これらの領域を用いる方法、及びこのような領域の作製方法に関する。

本発明はまた、シスチンノットドメインとして同定されたＷＩＳＥの領域に特異的なエピトープ、及びその領域に特異的に結合する結合剤に関する。

本発明は、ＷＩＳＥに特異的に結合する、抗体のような結合剤に関する。結合剤は、本明細書に開示する少なくとも１つの抗体のＷＩＳＥへの結合を交差ブロックする能力、及び／又は少なくとも１つの前記抗体によりＷＩＳＥ結合から交差ブロックされる能力によって特徴付けることができる。本発明の抗体及び他の結合剤はまた、本明細書に開示するようなヒトＷＩＳＥペプチドエピトープ競合結合アッセイにおける、ヒトＷＩＳＥペプチドへの結合パターンにより特徴付けることもできる。

特定の実施形態では、本発明は、ＷＩＳＥ活性を阻害し、腎臓、肺、皮膚、眼、肝臓、及び心臓のような組織における組織傷害及び付随する線維症を減少させることができる抗体のような結合剤に関する。加えて、本発明は、例えば糖尿病性腎症、糸球体腎炎（ｇｌｏｍｅｒｏｌｏｎｅｐｈｒｉｔｉｓ）、膜腎症、狼瘡、移植及びタンパク尿の増加徴候を伴う他の腎疾患患者における、種々の免疫及び非免疫介在腎疾患に付随する、タンパク尿を阻害する結合剤に関する。更に、本発明は、器官の機能を改善する、又は慢性腎臓疾患、慢性移植腎症、特発性肺線維症、心筋症、緑内障（水晶体細胞線維症）及び強皮症（皮膚線維症）のような疾患が挙げられるが、これらに限定されない線維症及び／若しくはタンパク尿のいずれかに起因して影響を受ける上述の器官の機能が失われるのを遅らせる結合剤に関する。加えて、腫瘍転移もまた組織線維症で用いられるのと類似の機序を用いるため、ＷＩＳＥ結合剤はまた、腫瘍転移及び／又は癌の進行を遅らせるのに有用である可能性もある。

他の実施形態では、本発明は、細胞ベースアッセイにおいてＷＩＳＥの阻害効果をブロックできる、抗体のような結合剤に関する。

本発明は更に、部分的に、ＷＩＳＥのシスチンノットのコア領域を表す、少なくとも１つのジスルフィド結合により連結された２、３、又は４つのポリペプチド断片を含むポリペプチド構造体、及びそれに特異的に結合できる抗体に関する。

１つの実施形態では、本発明は、ＷＩＳＥに特異的に結合できる抗体のような結合剤を哺乳類で作製するための免疫原として使用するのに好適なエピトープを得る方法に関し、ある実施形態では、作製した結合剤は、インビトロ及び／又はインビボでＷＩＳＥ活性を中和することができる。

別の実施形態では、本発明は、組成物を動物に投与したとき、ＷＩＳＥに特異的な抗体を誘発する組成物であって、配列番号２、４、６、及び８から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む組成物に関する。

他の実施形態では、本発明はまた、組成物を動物に投与したとき、ＷＩＳＥに特異的な抗体を誘発する組成物であって、ヒト、マウス、ラット、又はカニクイザルＷＩＳＥのアミノ酸配列（配列番号２、４、６、又は８）から本質的に成る少なくとも１つのポリペプチドを含む組成物に関する。

特定の実施形態では、本発明はまた、配列番号２の多重切断ヒトＷＩＳＥタンパク質から本質的に成るポリペプチドであって、配列番号２のアミノ酸１〜７０、１１３〜１２６、及び１７１〜２０６がポリペプチド中に存在しないポリペプチドに関し、このポリペプチドは、タンパク質の断片の組み換え発現、ヒトＷＩＳＥのトリプシン消化により得ることができ、このタンパク質はいくつかの方法の中でもＨＰＬＣ分画により単離できる。

別の特定の実施形態では、本発明は更に、配列番号２のアミノ酸７１〜１１２及び１２７〜１７０を含むヒトＷＩＳＥのシスチンノットの免疫原性部分であって、

（ａ）アミノ酸Ｃ１及びＣ５間のジスルフィド結合、

（ｂ）アミノ酸Ｃ２及びＣ６間のジスルフィド結合、及び

（ｃ）アミノ酸Ｃ３及びＣ７間のジスルフィド結合
のうち少なくとも１つを含む免疫原性部分に関し、

免疫原性部分はこれらのジスルフィド結合のうち少なくとも２つを有してもよく、３つ全てのジスルフィド結合を有してもよい。

１つの実施形態では、本発明は、（ａ）配列番号２のアミノ酸２４〜２０６を有するポリペプチド、配列番号４のアミノ酸２４〜２０６を有するポリペプチド、配列番号６のアミノ酸２４〜２０６を有するポリペプチド、及び配列番号８のアミノ酸２４〜２０６を有するポリペプチドを含む組成物で動物を免疫することと、（ｂ）動物から血清を採取することと、（ｃ）ＷＩＳＥに特異的に結合でき、ＷＩＳＥの生物活性を阻害することができる抗体を血清から単離することと、を含む、ＷＩＳＥに特異的に結合できる抗体を作製する方法に関する。

追加の実施形態では、本発明はまた、（ａ）ＷＩＳＥのシスチンノット含有断片又はその誘導体を含む組成物で動物を免疫することと、（ｂ）動物から血清を採取することと、（ｃ）ＷＩＳＥに特異的に結合でき、ＷＩＳＥの生物活性を阻害することができる抗体を血清から単離することと、を含む、ＷＩＳＥに特異的に結合できる抗体を作製する方法に関する。

更なる実施形態では、本発明は更に、（ａ）抗体とポリペプチドとの間に複合体を形成させることができる条件下で、配列番号２のアミノ酸２４〜２０６を有するポリペプチド、配列番号４のアミノ酸２４〜２０６を有するポリペプチド、配列番号６のアミノ酸２４〜２０６を有するポリペプチド、及び配列番号８のアミノ酸２４〜２０６を有するポリペプチドから本質的に成るポリペプチドと、生体サンプルとを接触させる工程と、（ｂ）複合体の存在又は非存在を検出する工程であって、複合体の存在が、生体サンプルが抗ＷＩＳＥ抗体を含有することを示す工程と、を含む、生体サンプル中の抗ＷＩＳＥ抗体を検出する方法に関する。

他の実施形態では、本発明は、（ａ）抗体とポリペプチドとの間に複合体を形成させることができる条件下で、ＷＩＳＥのシスチンノット含有断片を含む組成物と、生体サンプルとを接触させる工程と、（ｂ）複合体の存在又は非存在を検出する工程であって、複合体の存在が、生体サンプルが抗ＷＩＳＥ抗体を含有することを示す工程と、を含む、生体サンプル中の抗ＷＩＳＥ抗体を検出する方法に関する。

ある実施形態では、本発明は、抗体Ａｂ−Ａ、Ａｂ−Ｂ、Ａｂ−Ｃ、Ａｂ−Ｄ、Ａｂ−Ｅ、Ａｂ−Ｆ、Ａｂ−Ｇ、Ａｂ−Ｈ、Ａｂ−Ｉ、Ａｂ−Ｊ、Ａｂ−Ｋ、Ａｂ−Ｌ、Ａｂ−Ｍ、Ａｂ−Ｎ、Ａｂ−Ｏ、Ａｂ−Ｐ、Ａｂ−Ｑ、Ａｂ−Ｒ、Ａｂ−Ｓ、Ａｂ−Ｔ、Ａｂ−Ｕ、Ａｂ−Ｖ、Ａｂ−Ｗ、及びＡｂ−Ｘのうち少なくとも１種の、ＷＩＳＥタンパク質への結合を交差ブロックする、抗体のようなＷＩＳＥ結合剤に関する。他の実施形態では、本発明は、抗体Ａｂ−１、Ａｂ−１３、Ａｂ−１６、Ａｂ−１８、Ａｂ−２３、Ａｂ−２４、Ａｂ−２８、Ａｂ−２９、Ａｂ−４８、Ａｂ−６０、Ａｂ−６３、Ａｂ−６５、Ａｂ−６６、Ａｂ−６７、Ａｂ−６９、Ａｂ−７、Ａｂ−７０、Ａｂ−７２、Ａｂ−７４、Ａｂ−７５、Ａｂ−７６、及びＡｂ−９のうち少なくとも１種の、ＷＩＳＥタンパク質への結合を交差ブロックする、抗体のようなＷＩＳＥ結合剤に関する。

ＷＩＳＥ結合剤はまた、抗体Ａｂ−Ａ、Ａｂ−Ｂ、Ａｂ−Ｃ、Ａｂ−Ｄ、Ａｂ−Ｅ、Ａｂ−Ｆ、Ａｂ−Ｇ、Ａｂ−Ｈ、Ａｂ−Ｉ、Ａｂ−Ｊ、Ａｂ−Ｋ、Ａｂ−Ｌ、Ａｂ−Ｍ、Ａｂ−Ｎ、Ａｂ−Ｏ、Ａｂ−Ｐ、Ａｂ−Ｑ、Ａｂ−Ｒ、Ａｂ−Ｓ、Ａｂ−Ｔ、Ａｂ−Ｕ、Ａｂ−Ｖ、Ａｂ−Ｗ、及びＡｂ−Ｘのうち少なくとも１種によりＷＩＳＥへの結合から交差ブロックされ得る。ＷＩＳＥ結合剤はまた、抗体Ａｂ−１、Ａｂ−１３、Ａｂ−１６、Ａｂ−１８、Ａｂ−２３、Ａｂ−２４、Ａｂ−２８、Ａｂ−２９、Ａｂ−４８、Ａｂ−６０、Ａｂ−６３、Ａｂ−６５、Ａｂ−６６、Ａｂ−６７、Ａｂ−６９、Ａｂ−７、Ａｂ−７０、Ａｂ−７２、Ａｂ−７４、Ａｂ−７５、Ａｂ−７６、及びＡｂ−９のうち少なくとも１種によりＷＩＳＥへの結合から交差ブロックされ得る。

これらの実施形態では、本発明は更に、抗体Ａｂ−Ａ、Ａｂ−Ｂ、Ａｂ−Ｃ、Ａｂ−Ｄ、Ａｂ−Ｅ、Ａｂ−Ｆ、Ａｂ−Ｇ、Ａｂ−Ｈ、Ａｂ−Ｉ、Ａｂ−Ｊ、Ａｂ−Ｋ、Ａｂ−Ｌ、Ａｂ−Ｍ、Ａｂ−Ｎ、Ａｂ−Ｏ、Ａｂ−Ｐ、Ａｂ−Ｑ、Ａｂ−Ｒ、Ａｂ−Ｓ、Ａｂ−Ｔ、Ａｂ−Ｕ、Ａｂ−Ｖ、Ａｂ−Ｗ、及びＡｂ−Ｘのうち少なくとも１種によりＷＩＳＥへの結合から交差ブロックされる、抗体のようなＷＩＳＥ結合剤に関する。これらの実施形態では、本発明は更に、抗体Ａｂ−１、Ａｂ−１３、Ａｂ−１６、Ａｂ−１８、Ａｂ−２３、Ａｂ−２４、Ａｂ−２８、Ａｂ−２９、Ａｂ−４８、Ａｂ−６０、Ａｂ−６３、Ａｂ−６５、Ａｂ−６６、Ａｂ−６７、Ａｂ−６９、Ａｂ−７、Ａｂ−７０、Ａｂ−７２、Ａｂ−７４、Ａｂ−７５、Ａｂ−７６、及びＡｂ−９のうち少なくとも１種によりＷＩＳＥへの結合から交差ブロックされる、抗体のようなＷＩＳＥ結合剤に関する。

更に他の実施形態では、本発明は、抗体Ａｂ−Ａ、Ａｂ−Ｂ、Ａｂ−Ｃ、Ａｂ−Ｄ、Ａｂ−Ｅ、Ａｂ−Ｆ、Ａｂ−Ｇ、Ａｂ−Ｈ、Ａｂ−Ｉ、Ａｂ−Ｊ、Ａｂ−Ｋ、Ａｂ−Ｌ、Ａｂ−Ｍ、Ａｂ−Ｎ、Ａｂ−Ｏ、Ａｂ−Ｐ、Ａｂ−Ｑ、Ａｂ−Ｒ、Ａｂ−Ｓ、Ａｂ−Ｔ、Ａｂ−Ｕ、Ａｂ−Ｖ、Ａｂ−Ｗ、Ａｂ−Ｘ、Ａｂ−１、Ａｂ−１３、Ａｂ−１６、Ａｂ−１８、Ａｂ−２３、Ａｂ−２４、Ａｂ−２８、Ａｂ−２９、Ａｂ−４８、Ａｂ−６０、Ａｂ−６３、Ａｂ−６５、Ａｂ−６６、Ａｂ−６７、Ａｂ−６９、Ａｂ−７、Ａｂ−７０、Ａｂ−７２、Ａｂ−７４、Ａｂ−７５、Ａｂ−７６、及びＡｂ−９のうち少なくとも１種により示されるように、「ヒトＷＩＳＥペプチドエピトープ競合結合アッセイ」においてヒトＷＩＳＥペプチドに対して類似の結合パターンを示す単離抗体のような結合剤に関し、この単離抗体又はその抗原結合断片は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、又はキメラ抗体であってもよい。

本発明は更に、このような治療を必要とする被験体に、障害に付随する症状を減少させるのに十分な量の抗ＷＩＳＥ結合剤を提供することを含む、哺乳類の腎及び／若しくは肺線維性疾患又は障害を治療する方法であって、抗ＷＩＳＥ結合剤が抗体又はそのＷＩＳＥ結合断片を含む方法に関する。

ヒトＷＩＳＥに特異的に結合する抗体が本明細書で提供される。本発明の抗体は、本明細書に開示する少なくとも１種の抗体のヒトＷＩＳＥへの結合を交差ブロックする能力、及び／又は本明細書に開示する少なくとも１種の前記抗体によりヒトＷＩＳＥ結合から交差ブロックされる能力によって特徴付けられる。本発明はまた、細胞ベースアッセイにおいてＷＩＳＥの効果をブロックできる、単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。

ＷＩＳＥに特異的に結合し、配列番号１２３、１２４、１２５、１２７、１２８、１２９、１３１、１３２、１３３、１３５、１３６、１３７、１３９、１４０、１４１、１４３、１４４、１４５、１４７、１４８、１４９、１５１、１５２、１５３、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６４、１６７、１６８、１７０、１７１、１７３、１７４、１７５、１７７、１７８、１７９、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８９、１９０、１９１、１９３、１９４、１９５、１９７、１９８、１９９、２０１、２０２、２０３、２０５、２０６、２０７、２０９、２１０、２１１、２１３、２１４、２１５、２１７、２１８、２１９、２２１、２２２、２２３、２２５、２２６、２２７、２２９、２３０、２３１、２３３、２３４、２３５、２３７、２３８、２３９、２４１、２４２、２４３、２４５、２４６、２４７、２４９、２５０、２５１、２５３、２５４、２５５、２５７、２５８、２５９、２６１、２６２、２６３、２７３、２７４、２７５、２７７、２７８、及び２７９から選択される少なくとも１種のＣＤＲ配列、並びにその変異体を含む、抗体のような結合剤もまた提供される。

配列番号１２３、１２４、及び１２５のＣＤＲ配列；配列番号１２７、１２８、及び１２９のＣＤＲ配列；配列番号１３１、１３２、及び１３３のＣＤＲ配列；配列番号１３５、１３６、及び１３７のＣＤＲ配列；配列番号１３９、１４０、及び１４１のＣＤＲ配列；配列番号１４３、１４４、及び１４５のＣＤＲ配列；配列番号１４７、１４８、及び１４９のＣＤＲ配列；配列番号１５１、１５２、及び１５３のＣＤＲ配列；配列番号１５５、１５６、及び１５７のＣＤＲ配列；配列番号１５８、１５９、及び１６０のＣＤＲ配列；配列番号１６１、１６２、及び１６３のＣＤＲ配列；配列番号１６４、１６５、及び１６６のＣＤＲ配列；配列番号１６７、１６８、及び１６９のＣＤＲ配列；配列番号１７０、１７１、及び１７２のＣＤＲ配列；配列番号１７３、１７４、及び１７５のＣＤＲ配列；配列番号１７７、１７８、及び１７９のＣＤＲ配列；配列番号１８１、１８２、及び１８３のＣＤＲ配列；配列番号１８５、１８６、及び１８７のＣＤＲ配列；配列番号１８９、１９０、及び１９１のＣＤＲ配列；配列番号１９３、１９４、及び１９５のＣＤＲ配列；配列番号１９７、１９８、及び１９９のＣＤＲ配列；配列番号２０１、２０２、及び２０３のＣＤＲ配列；配列番号２０５、２０６、及び２０７のＣＤＲ配列；配列番号２０９、２１０、及び２１１のＣＤＲ配列；配列番号２１３、２１４、及び２１５のＣＤＲ配列；配列番号２１７、２１８、及び２１９のＣＤＲ配列；配列番号２２１、２２２、及び２２３のＣＤＲ配列；配列番号２２５、２２６、及び２２７のＣＤＲ配列；配列番号２２９、２３０、及び２３１のＣＤＲ配列；配列番号２３３、２３４、及び２３５のＣＤＲ配列；配列番号２３７、２３８、及び２３９のＣＤＲ配列；配列番号２４１、２４２、及び２４３のＣＤＲ配列；配列番号２４５、２４６、及び２４７のＣＤＲ配列；配列番号２４９、２５０、及び２５１のＣＤＲ配列；配列番号２５３、２５４、及び２５５のＣＤＲ配列；配列番号２５７、２５８、及び２５９のＣＤＲ配列；配列番号２６１、２６２、及び２６３のＣＤＲ配列；配列番号２７３、２７４、及び２７５のＣＤＲ配列；又は配列番号２７７、２７８、及び２７９のＣＤＲ配列から成る群から選択される３種のＣＤＲ配列を含む結合剤を意図する。

１つの実施形態では、本発明は、配列番号１２３、１２４、及び１２５、並びに配列番号１２７、１２８、及び１２９のＣＤＲ配列；配列番号１３１、１３２、及び１３３のＣＤＲ配列、並びに配列番号１３５、１３６、及び１３７のＣＤＲ配列；配列番号１３９、１４０、及び１４１のＣＤＲ配列、並びに配列番号１４３、１４４、及び１４５のＣＤＲ配列；配列番号１４７、１４８、及び１４９のＣＤＲ配列、並びに配列番号１５１、１５２、及び１５３のＣＤＲ配列；配列番号１５５、１５６、及び１５７のＣＤＲ配列、並びに配列番号１５８、１５９、及び１６０のＣＤＲ配列；配列番号１６１、１６２、及び１６３のＣＤＲ配列、並びに配列番号１６４、１６５、及び１６６のＣＤＲ配列；配列番号１６７、１６８、及び１６９のＣＤＲ配列、並びに配列番号１７０、１７１、及び１７２のＣＤＲ配列；配列番号１３５、１３６、及び１３７のＣＤＲ配列、並びに配列番号１７３、１７４、及び１７５のＣＤＲ配列；配列番号１３５、１３６、及び１３７のＣＤＲ配列、並びに配列番号１７７、１７８、及び１７９のＣＤＲ配列；配列番号１３５、１３６、及び１３７のＣＤＲ配列、並びに配列番号１８１、１８２、及び１８３のＣＤＲ配列；配列番号１３５、１３６、及び１３７のＣＤＲ配列、並びに配列番号１８５、１８６、及び１８７のＣＤＲ配列；配列番号１３５、１３６、及び１３７のＣＤＲ配列、並びに配列番号１８９、１９０、及び１９１のＣＤＲ配列；配列番号１３５、１３６、及び１３７のＣＤＲ配列、並びに配列番号１９３、１９４、及び１９５のＣＤＲ配列；配列番号１３５、１３６、及び１３７のＣＤＲ配列、並びに配列番号１９７、１９８、及び１９９のＣＤＲ配列；配列番号１３５、１３６、及び１３７のＣＤＲ配列、並びに配列番号２０１、２０２、及び２０３のＣＤＲ配列；配列番号１３５、１３６、及び１３７のＣＤＲ配列、並びに配列番号２０５、２０６、及び２０７のＣＤＲ配列；配列番号１３５、１３６、及び１３７のＣＤＲ配列、並びに配列番号２０９、２１０、及び２１１のＣＤＲ配列；配列番号１３５、１３６、及び１３７のＣＤＲ配列、並びに配列番号２１３、２１４、及び２１５のＣＤＲ配列；配列番号１３５、１３６、及び１３７のＣＤＲ配列、並びに配列番号２１７、２１８、及び２１９のＣＤＲ配列；配列番号１３５、１３６、及び１３７のＣＤＲ配列、並びに配列番号２２１、２２２、及び２２３のＣＤＲ配列；配列番号１３５、１３６、及び１３７のＣＤＲ配列、並びに配列番号２２５、２２６、及び２２７のＣＤＲ配列；配列番号１３５、１３６、及び１３７のＣＤＲ配列、並びに配列番号２２９、２３０、及び２３１のＣＤＲ配列；配列番号１３５、１３６、及び１３７のＣＤＲ配列、並びに配列番号２３３、２３４、及び２３５のＣＤＲ配列；配列番号１３５、１３６、及び１３７のＣＤＲ配列、並びに配列番号２３７、２３８、及び２３９のＣＤＲ配列；配列番号１３５、１３６、及び１３７のＣＤＲ配列、並びに配列番号２４１、２４２、及び２４３のＣＤＲ配列；配列番号１３５、１３６、及び１３７のＣＤＲ配列、並びに配列番号２４５、２４６、及び２４７のＣＤＲ配列；配列番号１３５、１３６、及び１３７のＣＤＲ配列、並びに配列番号２４９、２５０、及び２５１のＣＤＲ配列；配列番号１３５、１３６、及び１３７のＣＤＲ配列、並びに配列番号２５３、２５４、及び２５５のＣＤＲ配列；配列番号１３５、１３６、及び１３７のＣＤＲ配列、並びに配列番号２５７、２５８、及び２５９のＣＤＲ配列；配列番号１３５、１３６、及び１３７のＣＤＲ配列、並びに配列番号２６１、２６２、及び２６３のＣＤＲ配列；又は配列番号２７３、２７４、及び２７５のＣＤＲ配列、並びに配列番号２７７、２７８、及び２７９のＣＤＲ配列から成る群から選択される６種のＣＤＲ配列を含む結合剤を意図する。

また、ＷＩＳＥに特異的に結合し、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、２６６、及び２６８に由来する少なくとも１種のＣＤＲ配列、並びにその変異体を有する、抗体のような結合剤であって、抗体又はその抗原結合断片がインビトロ及び／又はインビボでＷＩＳＥを中和する結合剤が提供される。

また、重鎖がＡｂ−Ａ、Ａｂ−Ｂ、Ａｂ−Ｃ、Ａｂ−Ｄ、Ａｂ−Ｅ、Ａｂ−Ｆ、Ａｂ−Ｇ、Ａｂ−Ｈ、Ａｂ−Ｉ、Ａｂ−Ｊ、Ａｂ−Ｋ、Ａｂ−Ｌ、Ａｂ−Ｍ、Ａｂ−Ｎ、Ａｂ−Ｏ、Ａｂ−Ｐ、Ａｂ−Ｑ、Ａｂ−Ｒ、Ａｂ−Ｓ、Ａｂ−Ｔ、Ａｂ−Ｕ、Ａｂ−Ｖ、Ａｂ−Ｗ、及びＡｂ−Ｘから選択され、軽鎖がファージディスプレイの使用のようなスクリーニングを介して同定されている、ＷＩＳＥに特異的に結合する抗体が提供される。このような軽鎖配列の例を、配列番号７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、及び１２０に記す。

本発明のこれらの及び他の態様は、以下の詳細な説明及び添付図面を参照して明らかになろう。本明細書に開示する全ての参考文献は、それぞれが個々に組み込まれているかのように、その全文が参照することにより本明細書に組み込まれる。

ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１ ＳｕｐｅｒＴｏｐＦｌａｓｈ（ＳＴＦ）細胞においてＷＩＳＥ活性を中和する、抗体の生物活性。各一組の列について、最初の列は未処理を示し、２番目の列は抗体を含まないヒトＷＩＳＥであり、各４種の抗体について、０．３μｇ／ｍＬのヒトＷＩＳＥを、試験ウェルに添加する前に抗体と混合した。 ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１ ＳＴＦ細胞における、ＷＩＳＥ用量依存的に阻害されたＷｎｔ誘発性ルシフェラーゼ発現。 抗−ＷＩＳＥ Ａｂ（Ａｂ−Ｃ、Ａｂ−Ｅ、Ａｂ−Ａ）のヒトＷＩＳＥに対する直接結合。 抗−ＷＩＳＥ Ａｂ（Ａｂ−Ａ、Ａｂ−Ｂ、Ａｂ−Ｇ、Ａｂ−Ｉ）のヒトＷＩＳＥに対する直接結合。 抗−ＷＩＳＥ Ａｂ（Ａｂ−Ｃ、Ａｂ−Ｄ、Ａｂ−Ｊ）のヒトＷＩＳＥに対する直接結合。 抗−ＷＩＳＥ Ａｂ（Ａｂ−Ｃ、Ａｂ−Ｊ、Ａｂ−Ｎ、Ａｂ−Ｏ）のヒトＷＩＳＥに対する直接結合。 Ａｂ−Ｃの結合を示す競合アッセイは、Ａｂ−Ｃ、Ａｂ−Ｊ、Ａｂ−Ｎ、及びＡｂ−Ｏにより用量依存的に交差ブロックされ得る。 ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１ ＳｕｐｅｒＴｏｐＦｌａｓｈ（ＳＴＦ）細胞においてＷＩＳＥ活性を中和する、種々の抗体（Ａｂ−Ｃ、Ａｂ−Ｊ、Ａｂ−Ｎ、Ａｂ−Ｄ、Ａｂ−Ｐ、Ａｂ−Ｒ）の生物活性。各一組の列について、最初の列は未処理を示し、２番目の列は抗体を含まないヒトＷＩＳＥであり、各６種の抗体について、０．５μｇ／ｍＬのヒトＷＩＳＥを、試験ウェルに添加する前に抗体と混合した。 消化されたヒトＷＩＳＥペプチドの、成熟抗体Ａｂ−Ａ、Ａｂ−Ｃ、及びＡｂ−Ｅへの結合を示す競合アッセイ。 消化されたヒトＷＩＳＥペプチドの、成熟抗体Ａｂ−Ｐへの結合を示す競合アッセイ。 結合アッセイは、４種の抗ＷＩＳＥ Ａｂ（Ａｂ−Ａ、Ａｂ−Ｃ、Ａｂ−Ｅ、及びＡｂ−Ｐ）の野性型ヒトＷＩＳＥタンパク質への結合に対する、ヒトＷＩＳＥタンパク質における特異的突然変異の影響を示す。 細胞ベースアッセイは、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１ ＳｕｐｅｒＴｏｐＦｌａｓｈ（ＳＴＦ）細胞における変異体ＷＩＳＥタンパク質活性を中和する、Ａｂ−Ｒの能力に対する、各指定の位置における個々のアミノ酸のＡｌａへの変化の影響を示す。各一組の列について、最初の列は未処理を示し、２番目の列は抗体を含まない０．５μｇ／ｍＬのヒトＷＩＳＥ又はＷＩＳＥ変異体であり、３番目の列は試験ウェルに添加する前に抗体Ｒ（Ａｂ−Ｒ）と混合した０．５μｇ／ｍＬのヒトＷＩＳＥである。 細胞ベースアッセイは、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１ ＳｕｐｅｒＴｏｐＦｌａｓｈ（ＳＴＦ）細胞における変異体ＷＩＳＥタンパク質活性を中和する、Ａｂ−Ｃの能力に対する、各指定の位置における個々のアミノ酸のＡｌａへの変化の影響を示す。各一組の列について、最初の列は未処理を示し、２番目の列は抗体を含まない０．５μｇ／ｍＬのヒトＷＩＳＥ又はＷＩＳＥ変異体であり、３番目の列は試験ウェルに添加する前に抗体Ｃ（Ａｂ−Ｃ）と混合した０．５μｇ／ｍＬのヒトＷＩＳＥである。 細胞ベースアッセイは、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１ ＳｕｐｅｒＴｏｐＦｌａｓｈ（ＳＴＦ）細胞における変異体ＷＩＳＥタンパク質活性を中和する、Ａｂ−Ａの能力に対する、各指定の位置における個々のアミノ酸のＡｌａへの変化の影響を示す。各一組の列について、最初の列は未処理を示し、２番目の列は抗体を含まない０．５μｇ／ｍＬのヒトＷＩＳＥ又はＷＩＳＥ変異体であり、３番目の列は試験ウェルに添加する前に抗体Ａ（Ａｂ−Ａ）と混合した０．５μｇ／ｍＬのヒトＷＩＳＥである。 細胞ベースアッセイは、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１ ＳｕｐｅｒＴｏｐＦｌａｓｈ（ＳＴＦ）細胞における変異体ＷＩＳＥタンパク質活性を中和する、Ａｂ−Ｅの能力に対する、各指定の位置における個々のアミノ酸のＡｌａへの変化の影響を示す。各一組の列について、最初の列は未処理を示し、２番目の列は抗体を含まない０．５μｇ／ｍＬのヒトＷＩＳＥ又はＷＩＳＥ変異体であり、３番目の列は試験ウェルに添加する前に抗体Ｅ（Ａｂ−Ｅ）と混合した０．５μｇ／ｍＬのヒトＷＩＳＥである。 細胞ベースアッセイは、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１ ＳｕｐｅｒＴｏｐＦｌａｓｈ（ＳＴＦ）細胞における変異体ＷＩＳＥタンパク質活性を中和する、Ａｂ−Ｕの能力に対する、各指定の位置における個々のアミノ酸のＡｌａへの変化の影響を示す。各一組の列について、最初の列は未処理を示し、２番目の列は抗体を含まない０．５μｇ／ｍＬのヒトＷＩＳＥ又はＷＩＳＥ変異体であり、３番目の列は試験ウェルに添加する前に抗体Ｕ（Ａｂ−Ｕ）と混合した０．５μｇ／ｍＬのヒトＷＩＳＥである。 細胞ベースアッセイは、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１ ＳｕｐｅｒＴｏｐＦｌａｓｈ（ＳＴＦ）細胞における変異体ＷＩＳＥタンパク質活性を中和する、Ａｂ−Ｖの能力に対する、各指定の位置における個々のアミノ酸のＡｌａへの変化の影響を示す。各一組の列について、最初の列は未処理を示し、２番目の列は抗体を含まない０．５μｇ／ｍＬのヒトＷＩＳＥ又はＷＩＳＥ変異体であり、３番目の列は試験ウェルに添加する前に抗体Ｖ（Ａｂ−Ｖ）と混合した０．５μｇ／ｍＬのヒトＷＩＳＥである。 細胞ベースアッセイは、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１ ＳｕｐｅｒＴｏｐＦｌａｓｈ（ＳＴＦ）細胞における変異体ＷＩＳＥタンパク質活性を中和する、Ａｂ−Ｗの能力に対する、各指定の位置における個々のアミノ酸のＡｌａへの変化の影響を示す。各一組の列について、最初の列は未処理を示し、２番目の列は抗体を含まない０．５μｇ／ｍＬのヒトＷＩＳＥ又はＷＩＳＥ変異体であり、３番目の列は試験ウェルに添加する前に抗体Ｗ（Ａｂ−Ｗ）と混合した０．５μｇ／ｍＬのヒトＷＩＳＥである。 細胞ベースアッセイは、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１ ＳｕｐｅｒＴｏｐＦｌａｓｈ（ＳＴＦ）細胞における変異体ＷＩＳＥタンパク質活性を中和する、Ａｂ−Ｔの能力に対する、各指定の位置における個々のアミノ酸のＡｌａへの変化の影響を示す。各一組の列について、最初の列は未処理を示し、２番目の列は抗体を含まない０．５μｇ／ｍＬのヒトＷＩＳＥ又はＷＩＳＥ変異体であり、３番目の列は試験ウェルに添加する前に抗体Ｔ（Ａｂ−Ｔ）と混合した０．５μｇ／ｍＬのヒトＷＩＳＥである。 ヒトＷＩＳＥタンパク質のループ１又はループ３における各突然変異の位置を示す図。 競合ＥＬＩＳＡ結合アッセイは、抗体ＳのヒトＷＩＳＥへの結合が、それ自体又はＡｂ−Ｐにより交差ブロックされ得ることを示す。 競合ＥＬＩＳＡ結合アッセイは、抗体ＣのヒトＷＩＳＥへの結合が、それ自体、Ａｂ−Ａ、Ａｂ−Ｅにより完全に、Ａｂ−Ｐにより部分的に交差ブロックされ得ることを示す。 競合ＥＬＩＳＡ結合アッセイは、抗体ＥのヒトＷＩＳＥへの結合が、それ自体、Ａｂ−Ａ、Ａｂ−Ｃにより完全に、Ａｂ−Ｐにより部分的に交差ブロックされ得ることを示す。 競合ＥＬＩＳＡ結合アッセイは、抗体ＡのヒトＷＩＳＥへの結合が、それ自体、Ａｂ−Ｃ、Ａｂ−Ｅにより完全に、Ａｂ−Ｐにより部分的に交差ブロックされ得ることを示す。 競合ＥＬＩＳＡ結合アッセイは、抗体ＰのヒトＷＩＳＥへの結合が、それ自体によってのみ完全に、Ａｂ−Ｓにより部分的に交差ブロックされ得ることを示す。 競合ＥＬＩＳＡ結合アッセイは、抗体ＴのヒトＷＩＳＥへの結合が、それ自体、Ａｂ−Ａ、Ａｂ−Ｃ、Ａｂ−Ｐ、及びＡｂ−Ｓにより完全に交差ブロックされ得ることを示す。 競合ＥＬＩＳＡ結合アッセイは、抗体Ｐ及びＣのヒトＷＩＳＥへの結合が、それぞれＡｂ−Ｔにより完全に又は部分的に交差ブロックされ得ることを示す。 競合結合アッセイ及び細胞ベース中和アッセイに基づいて、様々な抗体により網羅される潜在的エピトープ領域を示す図。矢印は、トリプシン消化の際の切断部位を示す。 ブレオマイシン誘発性肺傷害モデルにおいて、予防的抗ＷＩＳＥ Ｍａｂ処理は肺傷害を減少させた。 ブレオマイシン誘発性肺傷害モデルにおいて、予防的抗ＷＩＳＥ Ｍａｂ処理はコラーゲン沈着を減少させた。 ブレオマイシン誘発性肺傷害モデルにおいて、予防的抗ＷＩＳＥ Ｍａｂ処理はａＳＭＡ発現を減少させた。 ブレオマイシン誘発性肺傷害モデルにおいて、予防的抗ＷＩＳＥ Ｍａｂ処理は血清ＯＰＮ濃度を減少させた。 ブレオマイシン誘発性肺傷害マウスモデルにおいて、抗ＷＩＳＥ Ｍａｂによる予防的処理はコラーゲン産生を減少させた。 ブレオマイシン誘発性肺傷害マウスモデルにおいて、抗ＷＩＳＥ Ｍａｂによる予防的処理はＢＡＬ ＯＰＮ発現を減少させた。 ＷＩＳＥ Ａｂにより肺傷害が中程度減少する組織学的分析の傾向。 ＷＩＳＥ Ａｂによりシリウスレッドスコアが中程度減少する組織学的分析の傾向。 ＷＩＳＥ Ａｂにより線維症マーカーであるＦＳＰ１の発現が中程度減少する組織学的分析の傾向。 ＷＩＳＥ Ａｂにより線維症マーカーであるａＳＭＡの発現が中程度減少する組織学的分析の傾向。 ＷＩＳＥ Ａｂ処理は血清ＯＰＮ濃度を中程度減少させる。 ＷＩＳＥ抗体処理は、Ｃｏｌ４ａ３ ＫＯマウスにおける２４時間尿中全タンパク質（ＵＴＰ）を減少させた。

本発明は、一つには、完全長ＷＩＳＥにも結合する抗体により認識されるエピトープを含むＷＩＳＥタンパク質領域、並びにこれらのエピトープを作製及び使用する方法に関する。本発明はまた、ＷＩＳＥ又はＷＩＳＥの一部に特異的に結合する（抗体のような）結合剤、及びこのような結合剤を使用する方法を提供する。結合剤は、ヒトＷＩＳＥの１つ以上のリガンド（複数可）への結合、及びその生物活性をブロックする又は損なわせるのに有効である。

本明細書で使用するとき、ヒトＷＩＳＥという用語は、配列番号２のタンパク質及びその対立遺伝子多型を含むことを意図する。ＷＩＳＥのオルソログについても記載され、マウス、ラット、及びカニクイザル（それぞれ、配列番号４、６、及び８）が挙げられる。ＷＩＳＥは、ＷＩＳＥをコードしている遺伝子がトランスフェクトされている宿主細胞から、宿主細胞培養液の濾過された上清を溶出することにより精製することができる。調製及び更なる精製については、実施例に記載されている。ヒトＷＩＳＥは、米国特許第５，７８０，２６３号に記載されている。

当業者は、ＷＩＳＥのオルソログ間の配列同一性の程度が非常に高いことを理解する。したがって、ヒトＷＩＳＥに対する結合剤は、結合剤の認識部位、例えばエピトープのような抗体結合部位が高度に保存されており、特にヒト配列にほぼ又は完全同一である場合、マウス、ラット、又はカニクイザルのＷＩＳＥに結合すると予測される。よって、用語「ＷＩＳＥに特異的に結合」という用語を使用するとき、種間で配列が保存されている場合、複数の種のＷＩＳＥに結合することを含むと理解される。

本発明による結合剤の例としては、以下の抗体が挙げられる：Ａｂ−Ａ、Ａｂ−Ｂ、Ａｂ−Ｃ、Ａｂ−Ｄ、Ａｂ−Ｅ、Ａｂ−Ｆ、Ａｂ−Ｇ、Ａｂ−Ｈ、Ａｂ−Ｉ、Ａｂ−Ｊ、Ａｂ−Ｋ、Ａｂ−Ｌ、Ａｂ−Ｍ、Ａｂ−Ｎ、Ａｂ−Ｏ、Ａｂ−Ｐ、Ａｂ−Ｑ、Ａｂ−Ｒ、Ａｂ−Ｓ、Ａｂ−Ｔ、Ａｂ−Ｕ、Ａｂ−Ｖ、Ａｂ−Ｗ、Ａｂ−Ｘ、Ａｂ−１、Ａｂ−１３、Ａｂ−１６、Ａｂ−１８、Ａｂ−２３、Ａｂ−２４、Ａｂ−２８、Ａｂ−２９、Ａｂ−４８、Ａｂ−６０、Ａｂ−６３、Ａｂ−６５、Ａｂ−６６、Ａｂ−６７、Ａｂ−６９、Ａｂ−７、Ａｂ−７０、Ａｂ−７２、Ａｂ−７４、Ａｂ−７５、Ａｂ−７６、及びＡｂ−９。

本明細書で使用するとき、Ａｂ−Ａは、配列番号９及び１１に示すヌクレオチドにより発現されるポリペプチドから構成される。Ａｂ−Ｂは、配列番号１３及び１５に示すヌクレオチドにより発現されるポリペプチドから構成される。Ａｂ−Ｃは、配列番号１７及び１９に示すヌクレオチドにより発現されるポリペプチドから構成される。Ａｂ−Ｄは、配列番号２１及び２３に示すヌクレオチドにより発現されるポリペプチドから構成される。Ａｂ−Ｅは、配列番号２５及び２７に示すヌクレオチドにより発現されるポリペプチドから構成される。Ａｂ−Ｆは、配列番号２９及び３１に示すヌクレオチドにより発現されるポリペプチドから構成される。Ａｂ−Ｇは、配列番号１３及び３３に示すヌクレオチドにより発現されるポリペプチドから構成される。Ａｂ−Ｈは、配列番号２１及び３５に示すヌクレオチドにより発現されるポリペプチドから構成される。Ａｂ−Ｉは、配列番号３７及び３９に示すヌクレオチドにより発現されるポリペプチドから構成される。Ａｂ−Ｊは、配列番号４１及び４３に示すヌクレオチドにより発現されるポリペプチドから構成される。Ａｂ−Ｋは、配列番号４５及び２３に示すヌクレオチドにより発現されるポリペプチドから構成される。Ａｂ−Ｌは、配列番号４５及び３５に示すヌクレオチドにより発現されるポリペプチドから構成される。Ａｂ−Ｍは、配列番号２７１及び２７２の成熟ポリペプチドから構成される。Ａｂ−Ｎは、配列番号１２１及び２３に示すヌクレオチドにより発現されるポリペプチドから構成される。Ａｂ−Ｏは、配列番号４１及び２３に示すヌクレオチドにより発現されるポリペプチドから構成される。Ａｂ−Ｐは、配列番号４９及び４７に示すヌクレオチドにより発現されるポリペプチドから構成される。Ａｂ−Ｑは、配列番号５５及び５７に示すヌクレオチドにより発現されるポリペプチドから構成される。Ａｂ−Ｒは、配列番号５３及び５１に示すヌクレオチドにより発現されるポリペプチドから構成される。Ａｂ−Ｓは、配列番号６１及び５９に示すヌクレオチドにより発現されるポリペプチドから構成される。Ａｂ−Ｔは、配列番号２６５及び２６７に示すヌクレオチドにより発現されるポリペプチドから構成される。Ａｂ−Ｕは、配列番号６５及び６３に示すヌクレオチドにより発現されるポリペプチドから構成される。Ａｂ−Ｖは、配列番号６９及び６７に示すヌクレオチドにより発現されるポリペプチドから構成される。Ａｂ−Ｗは、配列番号７３及び７１に示すヌクレオチドにより発現されるポリペプチドから構成される。Ａｂ−Ｘは、配列番号２６９及び２７０の成熟ポリペプチドから構成される。

Ａｂ−１は、配列番号７５及び２３に示すヌクレオチドにより発現されるポリペプチドから構成される。Ａｂ−１３は、配列番号７７及び２３に示すヌクレオチドにより発現されるポリペプチドから構成される。Ａｂ−１６は、配列番号７９及び２３に示すヌクレオチドにより発現されるポリペプチドから構成される。Ａｂ−１８は、配列番号８１及び２３に示すヌクレオチドにより発現されるポリペプチドから構成される。Ａｂ−２３は、配列番号８３及び２３に示すヌクレオチドにより発現されるポリペプチドから構成される。Ａｂ−２４は、配列番号８５及び２３に示すヌクレオチドにより発現されるポリペプチドから構成される。Ａｂ−２８は、配列番号８７及び２３に示すヌクレオチドにより発現されるポリペプチドから構成される。Ａｂ−２９は、配列番号８９及び２３に示すヌクレオチドにより発現されるポリペプチドから構成される。Ａｂ−４８は、配列番号９１及び２３に示すヌクレオチドにより発現されるポリペプチドから構成される。Ａｂ−６０は、配列番号９３及び２３に示すヌクレオチドにより発現されるポリペプチドから構成される。Ａｂ−６２は、配列番号９５及び２３に示すヌクレオチドにより発現されるポリペプチドから構成される。Ａｂ−６３は、配列番号９７及び２３に示すヌクレオチドにより発現されるポリペプチドから構成される。Ａｂ−６５は、配列番号９９及び２３に示すヌクレオチドにより発現されるポリペプチドから構成される。Ａｂ−６６は、配列番号１０１及び２３に示すヌクレオチドにより発現されるポリペプチドから構成される。Ａｂ−６７は、配列番号１０３及び２３に示すヌクレオチドにより発現されるポリペプチドから構成される。Ａｂ−６９は、配列番号１０５及び２３に示すヌクレオチドにより発現されるポリペプチドから構成される。Ａｂ−７は、配列番号１０７及び２３に示すヌクレオチドにより発現されるポリペプチドから構成される。Ａｂ−７０は、配列番号１０９及び２３に示すヌクレオチドにより発現されるポリペプチドから構成される。Ａｂ−７２は、配列番号１１１及び２３に示すヌクレオチドにより発現されるポリペプチドから構成される。Ａｂ−７４は、配列番号１１３及び２３に示すヌクレオチドにより発現されるポリペプチドから構成される。Ａｂ−７５は、配列番号１１５及び２３に示すヌクレオチドにより発現されるポリペプチドから構成される。Ａｂ−７６は、配列番号１１７及び２３に示すヌクレオチドにより発現されるポリペプチドから構成される。Ａｂ−９は、配列番号１１９及び２３に示すヌクレオチドにより発現されるポリペプチドから構成される。

本発明の結合剤は、典型的には、本明細書に定義するような抗体又はその断片である。用語「抗体」は、インタクトな抗体、又はその結合断片を指す。抗体は、完全な抗体分子（完全長重鎖及び／又は軽鎖を有する、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒト化、又はヒトバージョンを含む）を含んでもよく、又はその抗原結合断片を含んでもよい。抗体断片としては、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｖ、Ｆｃ、及びＦｄ断片が挙げられ、単一ドメイン抗体、単鎖抗体、マキシボディ（ｍａｘｉｂｏｄｙ）、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、細胞内抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体、ｖ−ＮＡＲ、及びｂｉｓ−ｓｃＦｖに組み込むことができる（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ，２００５，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２３，９，１１２６−１１３６参照）。抗体ポリペプチドはまた、米国特許第６，７０３，１９９号にも開示されており、これはフィブロネクチンポリペプチドモノボディ（ｍｏｎｏｂｏｄｙ）を含む。他の抗体ポリペプチドは、米国特許公開２００５／０２３８６４６に開示されており、これは単鎖ポリペプチドである。本明細書で使用するとき、単離抗体又はその抗原結合断片は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体等であってもよい。

抗体に由来する抗原結合断片は、例えば、従来の方法に従って、抗体のタンパク質分解性加水分解により、例えば抗体全体のペプシン又はパパイン消化により得ることができる。一例として、抗体断片は、ペプシンで抗体を酵素的に切断して、Ｆ（ａｂ’）２と名付けられた５Ｓ断片を得ることにより、生成され得る。この断片を、チオール還元剤を用いて更に切断して、３．５Ｓ Ｆａｂ’一価断片を生成することもできる。所望により、切断反応は、ジスルフィド結合の切断から生じるスルフヒドリル基について、ブロック基を用いて実施できる。代案として、パパインを用いる酵素的切断により直接２つの一価Ｆａｂ断片及びＦｃ断片を生成する。これらの方法は、例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇによる米国特許第４，３３１，６４７号、Ｎｉｓｏｎｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．８９：２３０，１９６０；Ｐｏｒｔｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．７３：１１９，１９５９；Ｅｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １：４２２（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９６７）；及びＡｎｄｒｅｗｓ，Ｓ．Ｍ．ａｎｄ Ｔｉｔｕｓ，Ｊ．Ａ．ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｃｏｌｉｇａｎ Ｊ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２００３）．ｐａｇｅｓ ２．８．１−２．８．１０ ａｎｄ ２．１０Ａ．１−２．１０Ａ．５に記載されている。断片がインタクトな抗体により認識される抗原に結合する限り、重鎖を分離して一価軽−重鎖断片（Ｆｄ）を形成する、断片を更に切断する、又は他の酵素的、化学的、若しくは遺伝子技術のような、抗体を切断する他の方法を用いてもよい。

抗体断片はまた、任意の合成タンパク質、又は遺伝子操作されたタンパク質であってもよい。例えば、抗体断片としては、軽鎖可変領域から成る単離断片、重鎖及び軽鎖の可変領域から成る「Ｆｖ」断片、軽鎖及び重鎖可変領域がペプチドリンカー（ｓｃＦｖタンパク質）により接続された組み換え単鎖ポリペプチド分子が挙げられる。

抗体断片の別の形態は、１つ以上の抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むペプチドである。ＣＤＲ（「最小認識単位」又は「超可変領域」とも呼ばれる）は、当該ＣＤＲをコードするポリヌクレオチドを構築することにより得ることができる。このようなポリヌクレオチドは、例えば、テンプレートとして抗体産生細胞のｍＲＮＡを用いて可変領域を合成するためにポリメラーゼ連鎖反応を用いることにより調製される（例えば、Ｌａｒｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２：１０６，１９９１；Ｃｏｕｒｔｅｎａｙ−Ｌｕｃｋ，“Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，”ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｒｉｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐａｇｅ １６６（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９５）；及びＷａｒｄ ｅｔ ａｌ．，“Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，”ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｂｉｒｃｈ ｅｔ ａｌ．，（ｅｄｓ．），ｐａｇｅ １３７（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９９５）を参照）。

よって、１つの実施形態では、結合剤は、本明細書に記載するような少なくとも１つのＣＤＲを含む。結合剤は、本明細書に記載するような、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つのＣＤＲを含んでもよい。結合剤は更に、本明細書に記載する抗体の少なくとも１つの可変領域ドメインを含んでもよい。可変領域ドメインは、任意の大きさ又はアミノ酸組成であってもよく、一般にヒトＷＩＳＥへの結合に関与する少なくとも１つのＣＤＲ配列、例えば本明細書に具体的に記載されているＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３及び／又は軽鎖ＣＤＲを含み、これは１つ以上のフレームワーク配列に隣接する又は１つ以上のフレームワーク配列とインフレームである。一般用語では、可変（Ｖ）領域ドメインは、任意の好適な配置の免疫グロブリン重鎖（ＶＨ）及び／又は軽鎖（ＶＬ）可変ドメインであってもよい。よって、例えば、Ｖ領域ドメインは単量体であり、かつＶＨ又はＶＬドメインであってもよく、これは以下に記載のように、少なくとも１×１０^−７Ｍ以下の親和性でヒトＷＩＳＥに独立して結合することができる。あるいは、Ｖ領域ドメインは、二量体であり、かつＶＨ−ＶＨ、ＶＨ−ＶＬ、又はＶＬ−ＶＬ二量体を含有してもよい。Ｖ領域二量体は、非共有的に会合されてもよい、少なくとも１本のＶＨ鎖、及び少なくとも１本のＶＬ鎖を含む（以後ＦＶと呼ぶ）。必要に応じて、鎖は、直接的に、例えば２つの可変領域間のジスルフィド結合を介して、又はリンカー、例えばペプチドリンカーを通じて、共有的にカップリングして、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦＶ）を形成してもよい。

可変領域ドメインは、任意の天然可変ドメインであってもよく、その操作されたバージョンであってもよい。操作されたバージョンとは、組み換えＤＮＡ操作技術を用いて作製された可変領域ドメインを意味する。このような操作されたバージョンとしては、例えば、特定の抗体のアミノ酸配列の挿入、欠失、又は変化により、特定の抗体可変領域から作製されたものが挙げられる。具体例としては、少なくとも１つのＣＤＲ、並びに所望により第１の抗体由来の１つ以上のフレームワークアミノ酸、及び第２の抗体由来の残りの可変領域ドメインを含む、操作された可変領域ドメインが挙げられる。

可変領域ドメインは、Ｃ末端アミノ酸において、少なくとも１つの他の抗体ドメイン又はその断片に共有的に付着してもよい。よって、例えば、可変領域ドメインに存在するＶＨドメインは、免疫グロブリンＣＨ１ドメイン又はその断片に連結してもよい。同様に、ＶＬドメインは、ＣＫドメイン又はその断片に連結してもよい。このように、例えば、抗体は、抗原結合ドメインが、それぞれＣ末端においてＣＨＩ及びＣＫドメインに共有的に連結した、会合したＶＨ及びＶＬドメインを含む、Ｆａｂ断片であってもよい。ＣＨ１ドメインは、更にアミノ酸で延長して、例えばＦａｂ’断片に見られるようなヒンジ領域、若しくはヒンジ領域ドメインの一部を提供してもよく、又は抗体ＣＨ２及びＣＨ３ドメインのような更なるドメインを提供してもよい。

本明細書に記載のように、結合剤は、これらのＣＤＲの少なくとも１つを含む。例えば、１つ以上のＣＤＲを、既知の抗体フレームワーク領域（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２等）に組み込んでもよく、又は好適なビヒクルに抱合させて、その半減期を増してもよい。好適なビヒクルとしては、Ｆｃ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アルブミン、トランスフェリン等が挙げられるが、これらに限定されない。これらの及び他の好適なビヒクルは、当該技術分野において既知である。このような抱合ＣＤＲペプチドは、単量体、二量体、三量体、又は他の形態であってもよい。１つの実施形態では、１つ以上の水溶性ポリマーが、結合剤の１つ以上の特定の位置、例えばアミノ末端に結合する。

ある実施形態では、結合剤は、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレングリコール、又はポリプロピレングリコールが挙げられるが、これらに限定されない、１つ以上の水溶性ポリマーの付着を含む。例えば、米国特許第４，６４０，８３５号、同第４，４９６，６８９号、同第４，３０１，１４４号、同第４，６７０，４１７号、同第４，７９１，１９２号、及び同第４，１７９，３３７号を参照。ある実施形態では、誘導体結合剤は、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン、セルロース、又は他の炭水化物ベースポリマー、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）−ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、及びポリビニルアルコールの１つ以上、並びにこのようなポリマーの混合物を含む。ある実施形態では、１つ以上の水溶性ポリマーが、１つ以上の側鎖にランダムに付着する。ある実施形態では、ＰＥＧが作用して、抗体のような結合剤の療法的能力を改善することができる。あるこのような方法が、例えば、米国特許第６，１３３，４２６号で論じられており、これは任意の目的のために参照することにより本明細書に組み込まれる。

当業者であれば、本発明の結合剤は、少なくとも１つのアミノ酸置換を有してもよいが、ただし結合剤は結合特異性を保持することを理解する。それ故、結合剤構造の改変は、本発明の範囲内に包含される。これらはアミノ酸置換を含んでもよく、このアミノ酸置換は保存的であっても非保存的であってもよく、結合剤のＷＩＳＥ結合能を壊さない。保存的アミノ酸置換は、非天然アミノ酸残基を包含してもよく、この非天然アミノ酸残基は、典型的には、生物系における合成ではなく、化学的ペプチド合成により組み込まれる。これらとしては、ペプチド模倣体及びアミノ酸部分の他の反対又は逆位形が挙げられる。保存的アミノ酸置換はまた、その位置におけるアミノ酸残基の極性又は電荷にほとんど又は全く影響を及ぼさないように、天然アミノ酸残基を標準的な残基に置換することを含んでもよい。

非保存的置換は、あるクラスのメンバーであるアミノ酸又はアミノ酸模倣体を、異なる物理的特性（例えば、大きさ、極性、疎水性、電荷）を有する別のクラスのメンバーに交換することを含んでもよい。このような置換された残基を、非ヒト抗体と相同なヒト抗体の領域、又は分子の非相同性領域に導入してもよい。

更に、当業者は、それぞれの所望のアミノ酸残基に単一アミノ酸置換を含む試験用変異体を作製することができる。このような試験は、以下の実施例に記載するような結合剤の標的上、又は本発明の療法的結合剤上で行うことができる。次いで、当業者に既知である活性アッセイを用いて変異体をスクリーニングすることができる。このような変異体を用いて、好適な変異体についての情報を集めることができる。例えば、特定のアミノ酸残基への変化により活性が破壊された、不所望に低下した、又は不適当になったのが発見された場合、このような変化を有する変異体を避けることができる。換言すれば、このような日常的な実験から集めた情報に基づいて、当業者は、単独で又は他の突然変異と組み合わせて更に置換することを避けるべきであるアミノ酸を容易に決定することができる。

当業者は、周知の技術を用いて本明細書に記載のようなポリペプチドの好適な変異体を決定することができる。ある実施形態では、当業者は、活性にとって重要ではないと考えられる領域を標的とすることにより、活性を破壊することなく変化させることができる、分子の好適な領域を同定することができる。ある実施形態では、当業者は、類似のポリペプチド間で保存されている残基及び分子の一部を同定できる。ある実施形態では、生物活性、又は構造にとって重要である可能性がある領域でさえ、生物活性を破壊することなく、若しくはポリペプチドの構造に悪影響を与えることなく、保存的アミノ酸置換に供することができる。

更に、当業者は、活性又は構造にとって重要である類似のポリペプチド中の残基を同定する、構造−機能研究を再調査してもよい。このような比較の観点では、類似のタンパク質中の活性又は構造にとって重要なアミノ酸残基に対応する、タンパク質中のアミノ酸残基の重要性を予測することができる。当業者は、このように予測された重要なアミノ酸残基について、化学的に類似するアミノ酸置換を選ぶことができる。

多数の科学刊行物が、二次構造の予測に努めてきた。Ｍｏｕｌｔ Ｊ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，７（４）：４２２−４２７（１９９６）、Ｃｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３（２）：２２２−２４５（１９７４）；Ｃｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１１３（２）：２１１−２２２（１９７４）；Ｃｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｒｅｌａｔ．Ａｒｅａｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４７：４５−１４８（１９７８）；Ｃｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４７：２５１−２７６、及びＣｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，２６：３６７−３８４（１９７９）を参照。更に、二次構造の予測を補助するためにコンピュータプログラムが現在利用可能である。二次構造を予測する１つの方法は、相同性モデリングに基づいている。例えば、３０％を超える配列同一性、又は４０％を超える類似性を有する２つのポリペプチド又はタンパク質は、類似の構造トポロジーを有することが多い。タンパク質構造データベース（ＰＤＢ）の最近の発達により、二次構造の予測可能性が高まっており、これにはポリペプチド又はタンパク質の構造内の潜在的折り畳み数が含まれる。Ｈｏｌｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，２７（１）：２４４−２４７（１９９９）を参照。所与のポリペプチド又はタンパク質中の折り畳み数は制限されており、いったん決定的な構造数が決定されれば、構造予測は劇的に正確さを増すことが示唆されている（Ｂｒｅｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，７（３）：３６９−３７６（１９９７））。

二次構造を予測する更なる方法としては、「スレッディング（ｔｈｒｅａｄｉｎｇ）」（Ｊｏｎｅｓ，Ｄ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，７（３）：３７７−８７（１９９７）；Ｓｉｐｐｌ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，４（１）：１５−１９（１９９６））、「プロファイル分析」（Ｂｏｗｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５３：１６４−１７０（１９９１）；Ｇｒｉｂｓｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．，１８３：１４６−１５９（１９９０）；Ｇｒｉｂｓｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８４（１３）：４３５５−４３５８（１９８７））、及び「進化論的関連」（Ｈｏｌｍ，ｓｕｐｒａ（１９９９）、及びＢｒｅｎｎｅｒ，ｓｕｐｒａ（１９９７）を参照）が挙げられる。

ある実施形態では、結合剤の変異体としては、グリコシル化部位の数及び／又は種類が、親ポリペプチドのアミノ酸配列に比べて変化しているグリコシル化変異体が挙げられる。ある実施形態では、変異体は、ネイティブなタンパク質より多い又は少ない数のＮ−連結型グリコシル化部位を含む。Ｎ−連結型グリコシル化部位は、配列：Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ又はＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒを特徴とし、ここでＸと指定されたアミノ酸残基はプロリンを除く任意のアミノ酸残基であってもよい。この配列を生み出すためのアミノ酸残基の置換は、Ｎ−結合型炭水化物鎖を付加するための潜在的新規部位を提供する。あるいは、この配列をなくす置換は、既存のＮ−結合型炭水化物鎖を除去する。また、１つ以上のＮ−結合型グリコシル化部位（典型的には、天然であるもの）がなくなり、１つ以上の新規Ｎ−結合型部位が生み出される、Ｎ−結合型炭水化物鎖の再構成も提供される。更なる好ましい抗体変異体としては、親アミノ酸配列と比べて、１つ以上のシステイン残基が欠失している、又は別のアミノ酸（例えば、セリン）に置換されている、システイン変異体が挙げられる。システイン変異体は、抗体を、不溶性封入体の単離後のように、生物的に活性のある高次構造に再び折り畳まなくてはならないとき、有用であることがある。システイン変異体は、一般に、ネイティブなタンパク質より少ないシステイン残基を有し、典型的には、偶数個のシステイン残基を有して、不対システインから生じる相互作用を最低限に抑える。

所望のアミノ酸置換（保存的であろうと非保存的であろうと）は、このような置換が望ましい時点で、当業者が決定することができる。ある実施形態では、アミノ酸置換を用いて、抗体のＷＩＳＥに対して重要な残基を同定する、又は抗体の本明細書に記載のＷＩＳＥに対する親和性を上昇させる、若しくは低下させることができる。

ある実施形態によると、好ましいアミノ酸置換は、（１）タンパク質分解に対する敏感性を低下させる、（２）酸化に対する敏感性を低下させる、（３）タンパク質複合体を形成するための結合親和性を変化させる、（４）結合親和性を変化させる、及び／又は（４）このようなポリペプチドに対する他の生理化学的又は機能的特性を付与する、若しくは修正するものである。ある実施形態によると、単一又は複数のアミノ酸置換（ある実施形態では、保存的アミノ酸置換）を、天然配列中に（ある実施形態では、分子間接触を形成するドメイン（複数可）の外側のポリペプチド部分に）作製してもよい。ある実施形態では、保存的アミノ酸置換は、典型的には、親配列の構造的特徴を実質的に変化させない場合もある（例えば、アミノ酸交換は、親配列において生じるへリックスを破壊する、又は親配列を特徴付ける他の種類の二次構造を崩壊させる傾向を有するべきではない）。当該技術分野において認められているポリペプチドの二次構造及び三次構造の例は、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４））；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｃ．Ｂｒａｎｄｅｎ ａｎｄ Ｊ．Ｔｏｏｚｅ，ｅｄｓ．，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９１））；及びＴｈｏｒｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３５４：１０５（１９９１）に記載されており、これらはそれぞれ参照することにより本明細書に組み込まれる。

ある実施形態では、本発明の結合剤は、ポリマー、脂質、又は他の部分に化学的に結合することができる。

結合剤は、生体適合性フレームワーク構造に組み込まれた、本明細書に記載のＣＤＲの少なくとも１つを含んでもよい。１つの例では、生体適合性フレームワーク構造は、高次構造的に安定な構造支持体、又はフレームワーク、又は骨組を形成するのに十分な、ポリペプチド又はその一部を含み、これは局在した表面領域において抗原に結合する１つ以上のアミノ酸の配列（例えば、ＣＤＲ、可変領域等）を示すことができる。このような構造は、天然ポリペプチド又はポリペプチドの「折り畳み」（構造モチーフ）であってもよく、又は天然ポリペプチド若しくは折り畳みに対して、アミノ酸の付加、欠失、若しくは置換のような１つ以上の改変を有してもよい。これらの骨組は、ヒト、他の哺乳類、他の脊椎動物、無脊椎動物、植物、細菌、又はウイルスのような、任意の種（又は１種を超える種）のポリペプチドに由来してもよい。

典型的には、生体適合性フレームワーク構造は、免疫グロブリンドメイン以外のタンパク質の骨組又は骨格に基づく。例えば、フィブロネクチン、アンキリン、リポカリン、ネオカルチノスタチン（ｎｅｏｃａｒｚｉｎｏｓｔａｉｎ）、シトクロームｂ、ＣＰ１ジンクフィンガー、ＰＳＴ１、コイルドコイル、ＬＡＣ１−Ｄ１、Ｚドメイン及びテンドラミサト（ｔｅｎｄｒａｍｉｓａｔ）ドメインに基づくものを用いてもよい（例えば、Ｎｙｇｒｅｎ ａｎｄ Ｕｈｌｅｎ，１９９７，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，７，４６３−４６９を参照）。

好ましい実施形態では、本発明の結合剤は、本明細書に記載のヒト化抗体を含むと理解される。本明細書に記載されているもののようなヒト化抗体は、当業者に既知の技術を用いて産生することができる（Ｚｈａｎｇ，Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．４２（１２）：１４４５−１４５１，２００５；Ｈｗａｎｇ Ｗ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ．３６（１）：３５−４２，２００５；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ Ｗ Ｆ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６（１）：４３−６０，２００５；及びＣｌａｒｋ，Ｍ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ．２１（８）：３９７−４０２，２０００）。

更に、当業者は、好適な結合剤が、本明細書に具体的に記載されているような、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２及びＣＤＲ−Ｌ３のうち１種以上のような、これらの抗体の一部を含むことを認識する。ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２及びＣＤＲ−Ｌ３の領域の少なくとも１種は、少なくとも１つのアミノ酸置換を有してもよいが、ただし結合剤は非置換ＣＤＲの結合特異性を保持する。結合剤の非ＣＤＲ部分は、結合剤が本明細書に開示する抗体のＷＩＳＥへの結合を交差ブロックする、かつ／又はＷＩＳＥを中和する、非タンパク質分子であってもよい。結合剤の非ＣＤＲ部分は、結合剤が、「ヒトＷＩＳＥペプチドエピトープ競合結合アッセイ」において、抗体Ａｂ−Ａ、Ａｂ−Ｂ、Ａｂ−Ｃ、Ａｂ−Ｄ、Ａｂ−Ｅ、Ａｂ−Ｆ、Ａｂ−Ｇ、Ａｂ−Ｈ、Ａｂ−Ｉ、Ａｂ−Ｊ、Ａｂ−Ｋ、Ａｂ−Ｌ、Ａｂ−Ｍ、Ａｂ−Ｎ、Ａｂ−Ｏ、Ａｂ−Ｐ、Ａｂ−Ｑ、Ａｂ−Ｒ、Ａｂ−Ｓ、Ａｂ−Ｔ、Ａｂ−Ｕ、Ａｂ−Ｖ、Ａｂ−Ｗ、Ａｂ−Ｘ、Ａｂ−１、Ａｂ−１３、Ａｂ−１６、Ａｂ−１８、Ａｂ−２３、Ａｂ−２４、Ａｂ−２８、Ａｂ−２９、Ａｂ−４８、Ａｂ−６０、Ａｂ−６３、Ａｂ−６５、Ａｂ−６６、Ａｂ−６７、Ａｂ−６９、Ａｂ−７、Ａｂ−７０、Ａｂ−７２、Ａｂ−７４、Ａｂ−７５、Ａｂ−７６、及びＡｂ−９の少なくとも１種が示すものと類似の、ヒトＷＩＳＥペプチドへの結合パターンを示す、かつ／又はＷＩＳＥを中和する非タンパク質分子であってもよい。結合剤の非ＣＤＲ部分は、結合剤が組み換え結合タンパク質又は合成ペプチドであり、組み換え結合タンパク質が本明細書に開示する抗体のＷＩＳＥへの結合を交差ブロックする、かつ／又はＷＩＳＥを中和する、アミノ酸から構成されてもよい。結合剤の非ＣＤＲ部分は、結合剤が組み換え結合タンパク質であり、組み換え結合タンパク質が、ヒトＷＩＳＥペプチドエピトープ競合結合アッセイ（以下に記載）において、抗体Ａｂ−Ａ、Ａｂ−Ｂ、Ａｂ−Ｃ、Ａｂ−Ｄ、Ａｂ−Ｅ、Ａｂ−Ｆ、Ａｂ−Ｇ、Ａｂ−Ｈ、Ａｂ−Ｉ、Ａｂ−Ｊ、Ａｂ−Ｋ、Ａｂ−Ｌ、Ａｂ−Ｍ、Ａｂ−Ｎ、Ａｂ−Ｏ、Ａｂ−Ｐ、Ａｂ−Ｑ、Ａｂ−Ｒ、Ａｂ−Ｓ、Ａｂ−Ｔ、Ａｂ−Ｕ、Ａｂ−Ｖ、Ａｂ−Ｗ、Ａｂ−Ｘ、Ａｂ−１、Ａｂ−１３、Ａｂ−１６、Ａｂ−１８、Ａｂ−２３、Ａｂ−２４、Ａｂ−２８、Ａｂ−２９、Ａｂ−４８、Ａｂ−６０、Ａｂ−６３、Ａｂ−６５、Ａｂ−６６、Ａｂ−６７、Ａｂ−６９、Ａｂ−７、Ａｂ−７０、Ａｂ−７２、Ａｂ−７４、Ａｂ−７５、Ａｂ−７６、及びＡｂ−９の少なくとも１種が示すのと類似の、ヒトＷＩＳＥペプチドへの結合パターンを示す、かつ／又はＷＩＳＥを中和する、アミノ酸から構成されてもよい。

１つの実施形態では、再構成された抗体がＷＩＳＥに結合する場合、相補的ヒト軽鎖を同定するために、ライブラリがヒト抗体軽鎖から構成されるライブラリスクリーニングにおいて「餌（ｂａｉｔ）」として抗体の重鎖を用い得ることが意図される。この実施形態では、重鎖はＷＩＳＥ特異的抗体由来であり、マウス、キメラ、又はヒト化である。Ａｂ−Ｋ重鎖は、この種のスクリーニングに用いられ、いくつかのヒト軽鎖パートナーは、ＷＩＳＥに対する親和性が回復し、また重要なことに、親マウス抗体で見られた阻害活性も回復したことが確認された。このような軽鎖は、配列番号２４に示す重鎖を餌として用いた場合の以下の実施例に見られ、これらの軽鎖は配列番号７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、及び１２２に示される。

抗体が、上記のようなＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２及びＣＤＲ−Ｌ３の１種以上を含む場合、その抗体は、これらの配列をコードしているＤＮＡを含む宿主細胞における発現により得ることができる。各ＣＤＲ配列をコードしているＤＮＡは、ＣＤＲのアミノ酸配列に基づいて決定し、必要に応じてオリゴヌクレオチド合成技術、部位特異的突然変異誘発、及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を用いて、任意の所望の抗体可変領域フレームワーク及び定常領域ＤＮＡ配列とともに合成することができる。可変領域フレームワーク及び定常領域をコードしているＤＮＡは、ＧｅｎＢａｎｋ．ＲＴＭのような遺伝子配列データベースから当業者が広く入手可能である。上述のＣＤＲはそれぞれ、典型的には、Ｋａｂａｔ付番方式（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９８７ ｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ，ＵＳＡ）に従って、重鎖の位置３１〜３５（ＣＤＲ−Ｈ１）、５０〜６５（ＣＤＲ−Ｈ２）及び９５〜１０２（ＣＤＲ−Ｈ３）、並びに軽鎖の位置２４〜３４（ＣＤＲ−Ｌ１）、５０〜５６（ＣＤＲ−Ｌ２）及び８９〜９７（ＣＤＲ−Ｌ３）において、可変領域フレームワーク内に位置する。

ひとたび合成されると、本発明の抗体又はその断片をコードしているＤＮＡを、任意の数の既知の発現ベクターを用いて、核酸の切り出し、ライゲーション、形質転換、及びトランスフェクションのための種々の周知の手順のいずれかに従って増殖及び発現させることができる。よって、ある実施形態では、抗体断片の発現は、大腸菌のような原核生物宿主内であることが好ましい場合がある（例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１７８：４９７−５１５を参照）。ある他の実施形態では、抗体又はその断片の発現は、酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、及びＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、動物細胞（哺乳類細胞を含む）、又は植物細胞を含む、真核宿主細胞内であることが好ましい場合がある。好適な動物細胞の例としては、骨髄腫（マウスＮＳＯ系統のような）、ＣＯＳ、ＣＨＯ、又はハイブリドーマ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。植物細胞の例としては、タバコ、トウモロコシ、ダイズ、及びイネ細胞が挙げられる。

抗体可変領域及び／又は定常領域をコードしているＤＮＡを含む１つ以上の複製可能な発現ベクターを調製し、それを用いて適切な細胞株、例えばマウスＮＳＯ系統のような非産生型骨髄腫細胞株、又は大腸菌のような細菌に形質転換することができ、その中で抗体が産生される。効率よく転写及び翻訳させるために、各ベクター中のＤＮＡ配列は適切な制御配列、具体的には可変ドメイン配列に機能的に連結されたプロモータ及びリーダー配列を含むべきである。この方法で抗体を産生する具体的な方法は、一般に周知であり、日常的に用いられている。例えば、基本的な分子生物学的手順は、Ｍａｎｉａｔｉｓら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９；またＭａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ，３ｒｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（２００１）を参照）により記載されている。ＤＮＡの配列決定は、Ｓａｎｇｅｒら（ＰＮＡＳ ７４：５４６３，（１９７７））及びＡｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｐｌｃ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｈａｎｄｂｏｏｋに記載のように実施することができ、部位特異的突然変異誘発は当該技術分野において既知の方法に従って実行することができる（Ｋｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：９４４１，（１９８４）；Ｋｕｎｋｅｌ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４８８−９２（１９８５）；Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７−８２（１９８７）；ｔｈｅ Ａｎｇｌｉａｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｔｄ ｈａｎｄｂｏｏｋ）。更に、多くの刊行物が、ＤＮＡの操作による抗体の調製、発現ベクターの作製、並びに適切な細胞の形質転換及び培養に好適な技術について記載している（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ａ ａｎｄ Ａｄａｉｒ，Ｊ Ｒ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｒｅｖｉｅｗｓ（ｅｄ．Ｔｏｍｂｓ，Ｍ Ｐ，１０，Ｃｈａｐｔｅｒ １，１９９２，Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ，Ａｎｄｏｖｅｒ，ＵＫ）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”，１９９９，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（ｅｄ．），Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。

上述のＣＤＲの１つ以上を含む本発明による抗体の親和性を改善することが望ましい場合、ＣＤＲの維持（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５４，３９２−４０３，１９９５）、鎖シャフリング（Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，７７９−７８３，１９９２）、大腸菌の突然変異株の使用（Ｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５０，３５０−３６８，１９９６）、ＤＮＡシャフリング（Ｐａｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，８，７２４−７３３，１９９７）、ファージディスプレイ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５６，７−８８，１９９６）、及びセクシャルＰＣＲ（Ｃｒａｍｅｒｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３９１，２８８−２９１，１９９８）を含む、多くの親和性成熟プロトコルにより得ることができる。親和性成熟のこれらの方法は全て、Ｖａｕｇｈａｎ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１６，５３５−５３９，１９９８）で論じられている。

本発明による他の抗体は、本明細書に記載されており、当該技術分野において既知であるように、従来の免疫化及び細胞融合手順により得ることができる。本発明のモノクローナル抗体は、種々の既知の技術を用いて作製することができる。一般に、特定の抗原に結合するモノクローナル抗体は、当業者に既知の方法により得ることができる（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５，１９７５；Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１：２．５．１２．６．７（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ １９９１）；米国再発行特許第３２，０１１号、米国特許第４，９０２，６１４号、同第４，５４３，４３９号、及び同第４，４１１，９９３号；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｋｅｎｎｅｔｔ，ＭｃＫｅａｒｎ，ａｎｄ Ｂｅｃｈｔｏｌ（ｅｄｓ．）（１９８０）；並びにＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（ｅｄｓ．），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８８）；Ｐｉｃｋｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｅ．ｃｏｌｉ，”ｉｎ ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇｌｏｖｅｒ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐａｇｅ ９３（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９５）を参照）。抗体断片は、タンパク質消化、又は所望により、タンパク質消化（例えば、パパイン又はペプシンを用いる）に続くジスルフィド結合の穏やかな還元及びアルキル化による等のような、任意の好適な標準的な技術を用いて、それから由来するものであってもよい。あるいは、このような断片はまた、本明細書に記載のような、組み換え遺伝子操作技術により作製することもできる。

モノクローナル抗体は、当該技術分野において既知であり、本明細書に記載されている方法に従って、当該技術分野において既知であるような、例えばトランスジェニック又はノックアウトを含む、動物、例えば、ラット、ハムスター、ウサギ、又は好ましくはマウスに、配列番号２のヒトＷＩＳＥ又はその断片を含む免疫原を注射することにより得ることができる。特定の抗体産生の存在は、血清サンプルを得、当該技術分野において既知であり、本明細書に記載されている、いくつかの免疫検出方法のうち任意の１つを用いてヒトＷＩＳＥ又はペプチドに結合する抗体の存在を検出することにより、最初の注射後及び／又は追加免疫注射後にモニタすることができる。所望の抗体を産生する動物から、リンパ球細胞、最も一般的には脾臓又はリンパ節由来の細胞を取り出して、Ｂリンパ球を得る。次いで、Ｂリンパ球を、薬剤感作した骨髄腫細胞融合パートナー、好ましくは免疫化動物と同系であり、所望により他の望ましい特性（例えば、内因性Ｉｇ遺伝子産物、例えばＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１５８０）；ＮＳＯ、ＳＰ２０を発現することができない）を有するものと融合させて、ハイブリドーマ（これは不死真核細胞株である）を産生する。リンパ球（例えば、脾臓）細胞及び骨髄腫細胞を、ポリエチレングリコール、又は非イオン性洗剤のような膜融合促進剤と数分間組み合わせ、次いでハイブリドーマ細胞の成長を支持するが、融合していない骨髄腫細胞の成長は支持しない選択培地上に低密度でプレーティングする。好ましい選択培地はＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）である。十分な時間の後、通常約１〜２週間後、細胞のコロニーを観察する。単一コロニーを単離し、細胞により産生された抗体を、当該技術分野において既知であり、本明細書に記載されている種々の免疫測定法のうち任意の１つを用いて、ヒトＷＩＳＥへの結合活性について試験してもよい。ハイブリドーマをクローニングし（例えば、限界希釈クローニングにより、又は軟寒天プラーク単離により）、ＷＩＳＥ特異的抗体を産生する陽性クローンを選択し、培養する。ハイブリドーマ培養から得られるモノクローナル抗体を、ハイブリドーマ培養物の上清から単離することができる。マウスのモノクローナル抗体を産生する別の方法は、ハイブリドーマ細胞を同系マウス、例えばモノクローナル抗体を含む腹水の形成を促進するために処理された（例えば、プリスタンで抗原刺激を受けた）マウスの腹腔内に注射することである。モノクローナル抗体は、種々の十分に確立された技術により単離及び精製することができる。このような単離技術としては、プロテインＡセファロースを用いる親和クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、及びイオン交換クロマトグラフィーが挙げられる（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ ａｔ ｐａｇｅｓ ２．７．１−２．７．１２ ａｎｄ ｐａｇｅｓ ２．９．１−２．９．３；Ｂａｉｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ（ＩｇＧ），”ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１０，ｐａｇｅｓ ７９−１０４（Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９２））を参照）。モノクローナル抗体は、抗体の具体的な特性（例えば、重鎖又は軽鎖のアイソタイプ、結合特異性等）に基づいて選択された適切なリガンドを用いて、親和クロマトグラフィーにより精製してもよい。固体の支持体上に固定化された、好適なリガンドの例としては、プロテインＡ、プロテインＧ、抗定常領域（軽鎖又は重鎖）抗体、抗イディオタイプ抗体、及びＴＧＦ−ベータ結合タンパク質、又はこれらの断片若しくは変異体が挙げられる。

本発明の抗体はまた、ヒトモノクローナル抗体であってもよい。ヒトモノクローナル抗体は、任意の数の当業者によく知られた技術を用いて作製することができる。このような方法としては、ヒト末梢血液細胞（例えば、Ｂリンパ球を含む）のエプスタイン・バー・ウイルス（ＥＢＶ）形質転換、ヒトＢ細胞のインビトロにおける免疫化、挿入されたヒト免疫グロブリン遺伝子を保有している免疫化トランスジェニックマウス由来の脾臓細胞の融合、ヒト免疫グロブリンＶ領域のファージライブラリからの単離、又は当該技術分野において既知であり、本明細書の開示に基づく他の手順が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、ヒトモノクローナル抗体は、抗原曝露（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）に応答して特異的ヒト抗体を産生するよう操作されているトランスジェニックマウスから得ることができる。トランスジェニックマウスからヒト抗体を得る方法は、例えば、Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．７：１３，１９９４；Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６，１９９４；Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎ．６：５７９，１９９４；米国特許第５，８７７，３９７号；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７ Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：４５５−５８；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，１９９５ Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６４：５２５−３５に記載されている。この技術では、ヒト重鎖及び軽鎖座のエレメントを、内因性重鎖及び軽鎖座の標的化崩壊を含む胚幹細胞株に由来するマウスの系統に導入する（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：４５５−５８（１９９７）も参照）。例えば、ヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、ミニ遺伝子コンストラクト、又は酵母人工染色体上の導入遺伝子座（ｔｒａｎｓｌｏｃｕｓ）であってもよく、これはマウスのリンパ組織においてＢ細胞特異的ＤＮＡ再構成及び過剰変異を受ける。ヒトモノクローナル抗体は、トランスジェニックマウスを免疫化することにより得ることができ、このマウスは次いで、ＷＩＳＥ特異的なヒト抗体を産生することができる。免疫化トランスジェニックマウスのリンパ球細胞を用いて、本明細書に記載されている方法に従ってヒト抗体を分泌するハイブリドーマを産生することができる。ヒト抗体を含むポリクローナル血清はまた、免疫化動物の血液からも得ることができる。

本発明のヒト抗体を作製する別の方法としては、ＥＢＶ形質転換によるヒト末梢血液細胞の不死化が挙げられる。例えば、米国特許第４，４６４，４５６号を参照。このようなＷＩＳＥに特異的に結合するモノクローナル抗体を産生する不死化Ｂ細胞株（又はリンパ芽球様細胞株）は、本明細書に提供するような免疫測定方法、例えばＥＬＩＳＡにより同定し、次いで標準的なクローニング技術により単離することができる。抗ＷＩＳＥ抗体を産生するリンパ芽球様細胞株の安定性は、当該技術分野において既知である方法に従って形質転換された細胞株をマウス骨髄腫と融合させて、マウス−ヒトハイブリッド細胞株を生成することにより、改善できる（例えば、Ｇｌａｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ８：３７７−８９（１９８９）を参照）。ヒトモノクローナル抗体を作製する更に別の方法は、インビトロにおける免疫化であり、これはヒト脾臓Ｂ細胞をヒトＷＩＳＥで初回抗原刺激し、続いて初回抗原刺激されたＢ細胞とヘテロハイブリッド融合パートナーと融合させることを含む。例えば、Ｂｏｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９１ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：８６−９５を参照。

ある実施形態では、抗ヒトＷＩＳＥ抗体を産生するＢ細胞を選択し、軽鎖及び重鎖可変領域を、当該技術分野において既知であり（ＷＯ９２／０２５５１、米国特許第５，６２７，０５２号、Ｂａｂｃｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：７８４３−４８（１９９６））、本明細書に記載されている分子生物学的技術に従ってＢ細胞からクローニングする。免疫化動物由来のＢ細胞を、ＷＩＳＥに特異的に結合する抗体を産生する細胞を選択することにより、脾臓、リンパ節、又は末梢血液サンプルから単離することができる。Ｂ細胞はまた、ヒト、例えば末梢血液サンプルから単離することができる。所望の特異性を有する抗体を産生する単一Ｂ細胞を検出する方法は、当該技術分野において周知であり、例えばプラーク形成、蛍光活性化細胞分取、インビトロにおける刺激後の特異的細胞の検出等による。特異的抗体を産生するＢ細胞の選択方法としては、例えば、ヒトＷＩＳＥを含む軟寒天中でＢ細胞の単一細胞懸濁液を調製することが挙げられる。Ｂ細胞により産生される特異的抗体の抗原への結合により、複合体が形成され、この複合体は免疫沈降物として目に見え得る。所望の抗体を産生するＢ細胞を選択した後、特定の抗体遺伝子を、当該技術分野において既知であり、本明細書に記載されている方法に従って、ＤＮＡ又はｍＲＮＡを単離及び増幅することにより、クローニングできる。

本発明の抗体を得るための追加の方法は、ファージディスプレイによるものである。例えば、Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９４ Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４３３−５５；Ｂｕｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４ Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５７：１９１−２８０を参照。ヒト又はマウス免疫グロブリン可変領域遺伝子コンビナトリアルライブラリは、ＴＧＦ−ベータ結合タンパク質又はその変異体若しくは断片に特異的に結合するＩｇ断片（Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖ、又はその多量体）を選択するためにスクリーニングすることができるファージベクター中に作製してもよい。例えば、米国特許第５，２２３，４０９号；Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，１９８９ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−８１；Ｓａｓｔｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：５７２８−３２（１９８９）；Ａｌｔｉｎｇ−Ｍｅｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３：１−９（１９９０）；Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９１ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：４３６３−６６；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１−３８８；Ｓｃｈｌｅｂｕｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９７ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １６：４７−５２、及び引用されている参考文献を参照。例えば、Ｉｇ可変領域断片をコードしている複数のポリヌクレオチド配列を含むライブラリを、ファージの外殻タンパク質をコードしている配列とともに、インフレームで、Ｍ１３又はその変異体のような糸状バクテリオファージのゲノムに挿入してもよい。融合タンパク質は、外殻タンパク質と、軽鎖可変領域ドメイン及び／又は重鎖可変領域ドメインとの融合であってもよい。ある実施形態によると、免疫グロブリンＦａｂ断片はまた、ファージ粒子上にディスプレイされてもよい（例えば、米国特許第５，６９８，４２６号を参照）。

重鎖及び軽鎖免疫グロブリンｃＤＮＡ発現ライブラリはまた、例えばラムダＩｍｍｕｎｏＺａｐ（商標）（Ｈ）及びラムダＩｍｍｕｎｏＺａｐ（商標）（Ｌ）ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）を用いて、ラムダファージ中で調製してもよい。簡潔に述べると、ｍＲＮＡをＢ細胞集団から単離し、ラムダＩｍｍｕｎｏＺａｐ（Ｈ）及びラムダＩｍｍｕｎｏＺａｐ（Ｌ）ベクター中に重鎖及び軽鎖免疫グロブリンｃＤＮＡ発現ライブラリを作製するために用いる。これらのベクターは、個々にスクリーニングしてもよく、又は共発現させて、Ｆａｂ断片若しくは抗体を形成してもよい（Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａを参照；またＳａｓｔｒｙ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａを参照）。その後、陽性プラークを、大腸菌由来のモノクローナル抗体断片を多量に発現できる非溶菌性プラスミドに変換してもよい。

１つの実施形態では、ハイブリドーマにおいて、対象となるモノクローナル抗体を発現している遺伝子の可変領域を、ヌクレオチドプライマーを用いて増幅する。これらのプライマーは、当業者が合成してもよく、又は市販の供給元（例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）を参照、この供給元はとりわけＶＨａ、ＶＨｂ、ＶＨｃ、ＶＨｄ、ＣＨＩ、ＶＬ及びＣＬ領域のプライマーを含む、マウス及びヒト可変領域のプライマーを販売している）から購入してもよい。これらのプライマーを用いて、重鎖又は軽鎖可変領域を増幅することができ、次いでこれらの領域を、それぞれＩｍｍｕｎｏＺＡＰ（商標）（Ｈ）又はＩｍｍｕｎｏＺＡＰ（商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のようなベクターに挿入してもよい。次いで、これらのベクターを、発現させるために、大腸菌、酵母、又は哺乳類ベースの系に導入してもよい。ＶＨ及びＶＬドメインの融合を含む大量の単鎖タンパク質を、これらの方法を用いて産生することができる（例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６，１９８８参照）。

ひとたび任意の上記免疫化及び他の技術を用いて、本発明による抗体を産生する細胞が得られると、特定の抗体遺伝子を、本明細書に記載されているような標準的な手順に従ってＤＮＡ又はそれに由来するｍＲＮＡを単離及び増幅することにより、クローニングすることができる。それから産生された抗体の配列を決定することができ、ＣＤＲを同定し、ＣＤＲをコードしているＤＮＡを既に記載のように操作して、本発明による他の抗体を作製することができる。

好ましくは、結合剤はＷＩＳＥに特異的に結合する。全ての結合剤及び結合アッセイと同様に、当業者は、療法的に有効かつ好適であるために、結合剤が検出可能な程度に結合すべきではない種々の部分が、包括的であり、一覧にするのは非現実的であることを認識する。それ故、本明細書に開示されている結合剤について、用語「特異的に結合」は、無関係な対照タンパク質に結合するよりも高い親和性で、ＷＩＳＥ、好ましくはヒトＷＩＳＥに結合する、結合剤の能力を指す。好ましくは、対照タンパク質は、ニワトリ卵白リゾチームである。好ましくは、結合剤は、対照タンパク質に対する親和性よりも、少なくとも５０、１００、２５０、５００、１０００、又は１０，０００倍高い親和性で、ＷＩＳＥに結合する。結合剤は、１×１０^−７Ｍ以下、１×１０^−８Ｍ以下、１×１０^−９Ｍ以下、１×１０^−１０Ｍ以下、１×１０^−１１Ｍ以下、又は１×１０^−１２Ｍ以下の、ヒトＷＩＳＥに対する結合親和性を有してもよい。

親和性は、親和ＥＬＩＳＡアッセイにより決定してもよい。ある実施形態では、親和性は、ビアコア（ＢＩＡｃｏｒｅ）アッセイにより決定してもよい。ある実施形態では、親和性は、運動論的方法により決定してもよい。ある実施形態では、親和性は、平衡／溶液方法により決定してもよい。このような方法は、本明細書に更に詳細に記載されている、又は当該技術分野において既知である。

本発明のＷＩＳＥ結合剤は、好ましくは、本明細書に記載されている細胞ベースアッセイにおいて及び／若しくは本明細書に記載されているインビボアッセイにおいて、ＷＩＳＥ機能を調節する、並びに／又は本明細書に記載されているエピトープの１つ以上に結合する、並びに／又は本出願に記載されている抗体の１つの結合を交差ブロックする、並びに／又は本出願に記載されている抗体の１つによりＷＩＳＥの結合から交差ブロックされる。したがって、このような結合剤は、本明細書に記載されているアッセイを用いて同定することができる。

ある実施形態では、結合剤は、最初に本明細書で提供されているエピトープの１つ以上に結合する、並びに／又は本明細書に記載されている細胞ベースアッセイ及び／若しくはインビボアッセイにおいて中和する、並びに／又は本出願に記載されている抗体を交差ブロックする、並びに／又は本出願に記載されている抗体の１種によりＷＩＳＥ結合から交差ブロックされる抗体を同定することにより作製される。次いで、これらの抗体由来のＣＤＲ領域を用いて、適切な生体適合性フレームワークに挿入し、ＷＩＳＥ結合剤を作製する。結合剤の非ＣＤＲ部は、アミノ酸から構成されてもよく、又は非タンパク質分子であってもよい。本明細書に記載されているアッセイにより、結合剤の特徴付けが可能になる。好ましくは、本発明の結合剤は、本明細書に定義されているような抗体である。

当業者は、抗体のような一部のタンパク質が、発現中及び宿主細胞から分泌中、種々の翻訳後修飾を受ける場合があることを理解する。これらの修飾の種類及び程度は、培養条件に加えて、タンパク質を発現させるために用いられる宿主細胞株にも依存することが多い。このような修飾は、グリコシル化における変異、メチオニン又はトリプトファン酸化、ジケトピぺリジン形成、アスパラギン酸塩異性化、及びアスパラギン脱アミドを挙げることができる。常習的な修飾は、カルボキシペプチダーゼの作用による、カルボキシ末端の塩基性残基（リジン又はアルギニンのような）の喪失である（Ｈａｒｒｉｓ，ＲＪ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ７０５：１２９−１３４，１９９５に記載されているように）。ひとたびタンパク質が発現し、プロセシングされると、それらは「成熟」型になる。よって、本発明は、本発明のＤＮＡの発現から生じる成熟抗体を含むと理解される。

本明細書に開示されている抗体は、タンパク質のインビボ活性にとって重要であるヒトＷＩＳＥの領域に結合し、それによりＷＩＳＥの活性を阻害する。ＷＩＳＥへの抗体の結合は、腎機能に関連するバイオマーカー、例えばアルブミンの尿中濃度、又は２４時間全尿タンパク質排出の変化に相関する場合がある。本発明のＣＤＲを含む抗体及びその断片を構築し、発現させる方法は、当業者に既知である。

オリゴペプチド又はポリペプチドは、それが表１に記すＣＤＲ；並びに／又は抗体Ａｂ−Ａ、Ａｂ−Ｂ、Ａｂ−Ｃ、Ａｂ−Ｄ、Ａｂ−Ｅ、Ａｂ−Ｆ、Ａｂ−Ｇ、Ａｂ−Ｈ、Ａｂ−Ｉ、Ａｂ−Ｊ、Ａｂ−Ｋ、Ａｂ−Ｌ、Ａｂ−Ｍ、Ａｂ−Ｎ、Ａｂ−Ｏ、Ａｂ−Ｐ、Ａｂ−Ｑ、Ａｂ−Ｒ、Ａｂ−Ｓ、Ａｂ−Ｔ、Ａｂ−Ｕ、Ａｂ−Ｖ、Ａｂ−Ｗ、Ａｂ−Ｘ、Ａｂ−１、Ａｂ−１３、Ａｂ−１６、Ａｂ−１８、Ａｂ−２３、Ａｂ−２４、Ａｂ−２８、Ａｂ−２９、Ａｂ−４８、Ａｂ−６０、Ａｂ−６３、Ａｂ−６５、Ａｂ−６６、Ａｂ−６７、Ａｂ−６９、Ａｂ−７、Ａｂ−７０、Ａｂ−７２、Ａｂ−７４、Ａｂ−７５、Ａｂ−７６、及びＡｂ−９の少なくとも１種の、ＷＩＳＥへの結合を交差ブロックする、並びに／又は抗体Ａｂ−Ａ、Ａｂ−Ｂ、Ａｂ−Ｃ、Ａｂ−Ｄ、Ａｂ−Ｅ、Ａｂ−Ｆ、Ａｂ−Ｇ、Ａｂ−Ｈ、Ａｂ−Ｉ、Ａｂ−Ｊ、Ａｂ−Ｋ、Ａｂ−Ｌ、Ａｂ−Ｍ、Ａｂ−Ｎ、Ａｂ−Ｏ、Ａｂ−Ｐ、Ａｂ−Ｑ、Ａｂ−Ｒ、Ａｂ−Ｓ、Ａｂ−Ｔ、Ａｂ−Ｕ、Ａｂ−Ｖ、Ａｂ−Ｗ、Ａｂ−Ｘ、Ａｂ−１、Ａｂ−１３、Ａｂ−１６、Ａｂ−１８、Ａｂ−２３、Ａｂ−２４、Ａｂ−２８、Ａｂ−２９、Ａｂ−４８、Ａｂ−６０、Ａｂ−６３、Ａｂ−６５、Ａｂ−６６、Ａｂ−６７、Ａｂ−６９、Ａｂ−７、Ａｂ−７０、Ａｂ−７２、Ａｂ−７４、Ａｂ−７５、Ａｂ−７６、及びＡｂ−９の少なくとも１種によりＷＩＳＥへの結合から交差ブロックされるＷＩＳＥ結合剤のＣＤＲ；並びに／又は結合剤が細胞ベースアッセイにおいてＷＩＳＥの阻害効果をブロックすることができるＷＩＳＥ結合剤のＣＤＲ（すなわち、ＷＩＳＥ中和結合剤）；並びに／又はシスチンノットドメインエピトープに結合するＷＩＳＥ結合剤のＣＤＲのうち少なくとも１種に対して、少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を有する場合、本発明の範囲内である。

ＷＩＳＥ結合剤ポリペプチド及び抗体は、それらが抗体Ａｂ−Ａ、Ａｂ−Ｂ、Ａｂ−Ｃ、Ａｂ−Ｄ、Ａｂ−Ｅ、Ａｂ−Ｆ、Ａｂ−Ｇ、Ａｂ−Ｈ、Ａｂ−Ｉ、Ａｂ−Ｊ、Ａｂ−Ｋ、Ａｂ−Ｌ、Ａｂ−Ｍ、Ａｂ−Ｎ、Ａｂ−Ｏ、Ａｂ−Ｐ、Ａｂ−Ｑ、Ａｂ−Ｒ、Ａｂ−Ｓ、Ａｂ−Ｔ、Ａｂ−Ｕ、Ａｂ−Ｖ、Ａｂ−Ｗ、Ａｂ−Ｘ、Ａｂ−１、Ａｂ−１３、Ａｂ−１６、Ａｂ−１８、Ａｂ−２３、Ａｂ−２４、Ａｂ−２８、Ａｂ−２９、Ａｂ−４８、Ａｂ−６０、Ａｂ−６３、Ａｂ−６５、Ａｂ−６６、Ａｂ−６７、Ａｂ−６９、Ａｂ−７、Ａｂ−７０、Ａｂ−７２、Ａｂ−７４、Ａｂ−７５、Ａｂ−７６、及びＡｂ−９の少なくとも１種の可変領域に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であり、抗体Ａｂ−Ａ、Ａｂ−Ｂ、Ａｂ−Ｃ、Ａｂ−Ｄ、Ａｂ−Ｅ、Ａｂ−Ｆ、Ａｂ−Ｇ、Ａｂ−Ｈ、Ａｂ−Ｉ、Ａｂ−Ｊ、Ａｂ−Ｋ、Ａｂ−Ｌ、Ａｂ−Ｍ、Ａｂ−Ｎ、Ａｂ−Ｏ、Ａｂ−Ｐ、Ａｂ−Ｑ、Ａｂ−Ｒ、Ａｂ−Ｓ、Ａｂ−Ｔ、Ａｂ−Ｕ、Ａｂ−Ｖ、Ａｂ−Ｗ、Ａｂ−Ｘ、Ａｂ−１、Ａｂ−１３、Ａｂ−１６、Ａｂ−１８、Ａｂ−２３、Ａｂ−２４、Ａｂ−２８、Ａｂ−２９、Ａｂ−４８、Ａｂ−６０、Ａｂ−６３、Ａｂ−６５、Ａｂ−６６、Ａｂ−６７、Ａｂ−６９、Ａｂ−７、Ａｂ−７０、Ａｂ−７２、Ａｂ−７４、Ａｂ−７５、Ａｂ−７６、及びＡｂ−９の少なくとも１種の、ＷＩＳＥへの結合を交差ブロックし、並びに／又は抗体Ａｂ−Ａ、Ａｂ−Ｂ、Ａｂ−Ｃ、Ａｂ−Ｄ、Ａｂ−Ｅ、Ａｂ−Ｆ、Ａｂ−Ｇ、Ａｂ−Ｈ、Ａｂ−Ｉ、Ａｂ−Ｊ、Ａｂ−Ｋ、Ａｂ−Ｌ、Ａｂ−Ｍ、Ａｂ−Ｎ、Ａｂ−Ｏ、Ａｂ−Ｐ、Ａｂ−Ｑ、Ａｂ−Ｒ、Ａｂ−Ｓ、Ａｂ−Ｔ、Ａｂ−Ｕ、Ａｂ−Ｖ、Ａｂ−Ｗ、Ａｂ−Ｘ、Ａｂ−１、Ａｂ−１３、Ａｂ−１６、Ａｂ−１８、Ａｂ−２３、Ａｂ−２４、Ａｂ−２８、Ａｂ−２９、Ａｂ−４８、Ａｂ−６０、Ａｂ−６３、Ａｂ−６５、Ａｂ−６６、Ａｂ−６７、Ａｂ−６９、Ａｂ−７、Ａｂ−７０、Ａｂ−７２、Ａｂ−７４、Ａｂ−７５、Ａｂ−７６、及びＡｂ−９の少なくとも１種によりるＷＩＳＥへの結合から交差ブロックされ；並びに／又は細胞ベースアッセイにおいてＷＩＳＥの阻害効果をブロックでき（すなわち、ＷＩＳＥ中和結合剤）；並びに／又はシスチンノットドメインエピトープに結合する場合、本発明の範囲内である。

ＷＩＳＥ結合剤をコードしているポリヌクレオチドは、それらが抗体Ａｂ−Ａ、Ａｂ−Ｂ、及びＡｂ−Ｃの少なくとも１種の可変領域をコードしているポリヌクレオチドに対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列を有し、ここでコードされているＷＩＳＥ結合剤が、抗体Ａｂ−Ａ、Ａｂ−Ｂ、Ａｂ−Ｃ、Ａｂ−Ｄ、Ａｂ−Ｅ、Ａｂ−Ｆ、Ａｂ−Ｇ、Ａｂ−Ｈ、Ａｂ−Ｉ、Ａｂ−Ｊ、Ａｂ−Ｋ、Ａｂ−Ｌ、Ａｂ−Ｍ、Ａｂ−Ｎ、Ａｂ−Ｏ、Ａｂ−Ｐ、Ａｂ−Ｑ、Ａｂ−Ｒ、Ａｂ−Ｓ、Ａｂ−Ｔ、Ａｂ−Ｕ、Ａｂ−Ｖ、Ａｂ−Ｗ、Ａｂ−Ｘ、Ａｂ−１、Ａｂ−１３、Ａｂ−１６、Ａｂ−１８、Ａｂ−２３、Ａｂ−２４、Ａｂ−２８、Ａｂ−２９、Ａｂ−４８、Ａｂ−６０、Ａｂ−６３、Ａｂ−６５、Ａｂ−６６、Ａｂ−６７、Ａｂ−６９、Ａｂ−７、Ａｂ−７０、Ａｂ−７２、Ａｂ−７４、Ａｂ−７５、Ａｂ−７６、及びＡｂ−９の少なくとも１種の、ＷＩＳＥへの結合を交差ブロックし、並びに／又は抗体Ａｂ−Ａ、Ａｂ−Ｂ、Ａｂ−Ｃ、Ａｂ−Ｄ、Ａｂ−Ｅ、Ａｂ−Ｆ、Ａｂ−Ｇ、Ａｂ−Ｈ、Ａｂ−Ｉ、Ａｂ−Ｊ、Ａｂ−Ｋ、Ａｂ−Ｌ、Ａｂ−Ｍ、Ａｂ−Ｎ、Ａｂ−Ｏ、Ａｂ−Ｐ、Ａｂ−Ｑ、Ａｂ−Ｒ、Ａｂ−Ｓ、Ａｂ−Ｔ、Ａｂ−Ｕ、Ａｂ−Ｖ、Ａｂ−Ｗ、Ａｂ−Ｘ、Ａｂ−１、Ａｂ−１３、Ａｂ−１６、Ａｂ−１８、Ａｂ−２３、Ａｂ−２４、Ａｂ−２８、Ａｂ−２９、Ａｂ−４８、Ａｂ−６０、Ａｂ−６３、Ａｂ−６５、Ａｂ−６６、Ａｂ−６７、Ａｂ−６９、Ａｂ−７、Ａｂ−７０、Ａｂ−７２、Ａｂ−７４、Ａｂ−７５、Ａｂ−７６、及びＡｂ−９の少なくとも１種によりＷＩＳＥへの結合から交差ブロックされ；並びに／又は細胞ベースアッセイにおいてＷＩＳＥの阻害効果をブロックでき（すなわち、ＷＩＳＥ中和結合剤）；並びに／又はシスチンノットドメインエピトープに結合する場合、本発明の範囲内である。

（抗体のような）結合剤が結合を阻害する程度に加えて、抗体のような結合剤又は結合パートナーの親和性は、従来の技術、例えばＳｃａｔｃｈａｒｄら（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１：６６０−６７２（１９４９））により記載されているものを用いて、又は表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ；ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）により、当業者が決定することができる。表面プラズモン共鳴では、標的分子を固体相上に固定化し、フローセルに沿って移動する移動相中のリガンドに曝露する。リガンドが固定化された標的に結合した場合、局所的屈折率が変化し、それがＳＰＲ角の変化を導き、その変化を反射光の強度変化を検出することによりリアルタイムでモニタすることができる。ＳＰＲシグナルの変化速度を分析して、結合反応の会合及び解離相の見かけの速度定数を得ることができる。これらの値の比により、見かけの平衡定数（親和性）が得られる（例えば、Ｗｏｌｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：２５６０−６５（１９９３）を参照）。

本発明による抗体は、いずれの免疫グロブリンクラス、例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、又はＩｇＡに属してもよい。それは、動物、例えば鳥類（例えば、ニワトリ）及びマウス、ラット、ハムスター、ウサギ、若しくは他のげっ歯類、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、ヒト、若しくは他の霊長類が挙げられるが、これらに限定されない哺乳類から得られる、又はそれらに由来する。抗体は、内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｉｎｇ）抗体であってもよい。抗体の産生は、一般に米国特許公開第２００４／０１４６８８８Ａ１号に開示されている。

特徴付けアッセイ
特定のＡｂ−Ａ、Ａｂ−Ｂ、Ａｂ−Ｃ、Ａｂ−Ｄ、Ａｂ−Ｅ、Ａｂ−Ｆ、Ａｂ−Ｇ、Ａｂ−Ｈ、Ａｂ−Ｉ、Ａｂ−Ｊ、Ａｂ−Ｋ、Ａｂ−Ｌ、Ａｂ−Ｍ、Ａｂ−Ｎ、Ａｂ−Ｏ、Ａｂ−Ｐ、Ａｂ−Ｑ、Ａｂ−Ｒ、Ａｂ−Ｓ、Ａｂ−Ｔ、Ａｂ−Ｕ、Ａｂ−Ｖ、Ａｂ−Ｗ、Ａｂ−Ｘ、Ａｂ−１、Ａｂ−１３、Ａｂ−１６、Ａｂ−１８、Ａｂ−２３、Ａｂ−２４、Ａｂ−２８、Ａｂ−２９、Ａｂ−４８、Ａｂ−６０、Ａｂ−６３、Ａｂ−６５、Ａｂ−６６、Ａｂ−６７、Ａｂ−６９、Ａｂ−７、Ａｂ−７０、Ａｂ−７２、Ａｂ−７４、Ａｂ−７５、Ａｂ−７６、及びＡｂ−９ＣＤＲの、新規フレームワーク及び／又は定常領域への操作を含む、本発明に従って抗体を作製するために本明細書に記載されている方法では、所望の抗体又は結合剤を選択するための適切なアッセイが利用可能である（すなわち、ＷＩＳＥへの結合親和性を決定するアッセイ；クロスブロッキングアッセイ；ビアコアベース「ヒトＷＩＳＥペプチドエピトープ競合結合アッセイ」、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１ベースアッセイ；インビボアッセイ）。

エピトープ結合アッセイ
プロセシングされていないヒトＷＩＳＥは、シグナルペプチドを含む２０６アミノ酸であり、ヒトＷＩＳＥの成熟型は、シスチンノットモチーフを含む１８３アミノ酸の糖タンパク質である。重要なアミノ酸残基、具体的にはシステインが保存されているため、ＷＩＳＥは既に記載したシステインノットタンパク質に類似の構造を有すると考えられる。この構造としては、シスチンノットモチーフに加えて、ループ１、ループ２、及びループ３と指定される３つのループが挙げられる。本明細書で使用するとき、ループの位置は、ループ１に関しては配列番号２のおおよそアミノ酸７５〜１０４；ループ２はおおよそアミノ酸１０５〜１３２；ループ３は配列番号２のおおよそアミノ酸１３４〜１７０であると定義される。おおよその位置は、相対位置が、規定の位置のプラス又はマイナス２アミノ酸分カルボキシ末端又はアミノ末端側であってもよいことを意味する。

ヒトＷＩＳＥをタンパク質消化して、断片を生成した。簡潔に述べると、トリプシン、ａｓｐＮ、及びｌｙｓＣを含む様々なプロテアーゼを用いて、種々の切断部位及び大きさを有する断片を作製した。種々のヒトＷＩＳＥペプチドの配列及び質量を決定した。抗体保護を評価して、切り取られた部位のマスキング、ペプチド転移（ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｈｉｆｔｉｎｇ）を含む、タンパク質分解の到達性に対する効果を決定した。最後に、ビアコアベース「ヒトＷＩＳＥペプチドエピトープ競合アッセイ」を実施した。

Ｔ４９と呼ばれるこのような断片は、配列番号２の多重切断ヒトＷＩＳＥタンパク質であって、配列番号２のアミノ酸１〜７０、１１３〜１２６、及び１７１〜２０６がポリペプチドに存在しないタンパク質から本質的に成り；このポリペプチドはヒトＷＩＳＥのトリプシン消化により得ることができ、タンパク質はＨＰＬＣ分画により単離することができる。この断片は、配列番号２のアミノ酸７１〜１１２及び１２７〜１７０を含むヒトＷＩＳＥのシスチンノットの免疫原性部分であり、ここでこの免疫原性部分は、（ａ）アミノ酸Ｃ１及びＣ５間のジスルフィド結合、（ｂ）アミノ酸Ｃ２及びＣ６間のジスルフィド結合、及び（ｃ）アミノ酸Ｃ３及びＣ７間のジスルフィド結合のうち少なくとも１つを含み；これらのジスルフィド結合のうち少なくとも２つを有してもよく；これらのジスルフィド結合３つ全てを有してもよい。

Ｔ５６．１と呼ばれる別の断片は、配列番号２の多重切断ヒトＷＩＳＥタンパク質であって、配列番号２のアミノ酸１〜７０、１２２〜１２６、及び１７１〜２０６がポリペプチドに存在しないタンパク質から本質的に成り；このポリペプチドはヒトＷＩＳＥのトリプシン消化により得ることができ、タンパク質はＨＰＬＣ分画により単離することができる。この断片は、配列番号２のアミノ酸７１〜１２１及び１２７〜１７０を含むヒトＷＩＳＥのシスチンノットの免疫原性部分であり、ここでこの免疫原性部分は、（ａ）アミノ酸Ｃ１及びＣ５間のジスルフィド結合、（ｂ）アミノ酸Ｃ２及びＣ６間のジスルフィド結合、及び（ｃ）アミノ酸Ｃ３及びＣ７間のジスルフィド結合のうち少なくとも１つを含み；これらのジスルフィド結合のうち少なくとも２つを有してもよく；これらのジスルフィド結合３つ全てを有してもよい。

抗体の１群は、ビアコアベース「ヒトＷＩＳＥペプチドエピトープ競合結合アッセイ」により証明されているように、あるエピトープに対して特異的な結合パターンを示す。簡潔に述べると、抗体上のエピトープ結合部位を飽和させる濃度で、試験すべきエピトープとともに抗体を温置前保温前保温する。次いで、抗体を、チップ表面に結合したＷＩＳＥに曝露する。適切な温置温置及び洗浄手順後、競合結合のパターンを確立する。

クロスブロッキングアッセイ

用語「交差ブロックする」、「交差ブロックされた」、及び「クロスブロッキング」は、本明細書では互換的に用いられ、抗体又は他の結合剤が、他の抗体又は他の結合剤のＷＩＳＥへの結合を干渉する能力を意味する。

抗体又は他の結合剤が、別の抗体又は他の結合剤のＷＩＳＥへの結合を干渉できる程度、及びその結果、その干渉の程度が本発明による交差ブロックと言えるかどうかは、競合結合アッセイを用いて決定することができる。特に好適な定量的アッセイは、表面プラズモン共鳴技術を用いて相互作用の程度を測定することができるビアコアの機械を用いる。別の好適な定量的クロスブロッキングアッセイは、ＥＬＩＳＡベースのアプローチを用いて、ＷＩＳＥへの結合の観点で、抗体又は他の結合剤間の競合を測定する。

ビアコアクロスブロッキングアッセイ
以下に、抗体又は他の結合剤が交差ブロックするかどうか、又は本発明によるクロスブロッキングできるかどうかを決定するために好適なビアコアアッセイについて一般に記載する。便宜上２種の抗体について言及するが、このアッセイは本明細書に記載されているＷＩＳＥ結合剤のいずれに対しても使用できることが理解される。ビアコアの機械（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００）は、製造業者の奨めによりインライン式で操作する。

よって、あるクロスブロッキングアッセイでは、標準的なアミンカップリング化学を用いてＣＭ５ビアコアチップにＷＩＳＥをカップリングさせて、ＷＩＳＥでコーティングされた表面を作製する。典型的には、２００〜８００共鳴単位のＷＩＳＥをチップにカップリングする（容易に測定可能なレベルの結合であるが、用いている試験試薬の濃度により容易に飽和可能な量）。

互いに交差ブロックする能力を評価するための２種の抗体（Ａ^＊及びＢ^＊と呼ぶ）を、好適な緩衝液中にて、１：１の結合部位のモル比で混合し、試験混合物を作製する。結合部位ベースの濃度を計算するとき、抗体の分子量は、抗体の総分子量を、その抗体のＷＩＳＥ結合部位の数で割ったものであるとみなす。

試験混合物中の各抗体の濃度は、ビアコアチップ上に捕捉されたＷＩＳＥ分子に対して、その抗体の結合部位が容易に飽和するのに十分な程度高くあるべきである。混合物中の抗体は、同じモル濃度（結合ベースで）であり、その濃度は典型的には１．００〜１．５マイクロモル（結合部位ベースで）である。

また、抗体Ａ^＊のみ及びＢ^＊のみを含有する別個の溶液を調製する。これらの溶液中の抗体Ａ^＊及び抗体Ｂ^＊は、同じ種類の緩衝液中にあり、試験混合物中のように同じ濃度であるべきである。

試験混合物を、ＷＩＳＥでコーティングされたビアコアチップ上を通過させ、結合の合計量を記録する。次いで、チップに結合したＷＩＳＥに損傷を与えることなく結合した抗体を取り除くようにチップを処理する。典型的には、これは、３０ｎＭのＨＣｌで６０秒間チップを処理することにより行われる。

次いで、抗体Ａ^＊のみの溶液を、ＷＩＳＥでコーティングされた表面上を通過させ、結合の量を記録する。チップを再び処理して、チップに結合したＷＩＳＥに損傷を与えることなく結合した抗体を全て取り除く。

次いで、抗体Ｂ^＊のみの溶液を、ＷＩＳＥでコーティングされた表面上を通過させ、結合の量を記録する。

次に、抗体Ａ^＊及びＢ^＊の混合物の理論上の最大結合を計算し、それは単独でＷＩＳＥ表面を通過させたときの各抗体の結合の合計である。実際に記録された混合物の結合がこの理論上の最大より少ない場合、２種の抗体は互いに交差ブロックしている。

よって、一般に、本発明による交差ブロックしている抗体又は他の結合剤は、アッセイ中かつ本発明の第２の抗体又は他の結合剤の存在下で、記録された結合が、２種の抗体又は結合剤を組み合わせた、理論上の最大結合の８０％〜０．１％（例えば、８０〜４％）、詳細には理論上の最大結合の７５％〜０．１％（例えば、７５％〜４％）、より詳細には理論上の最大結合（上記定義のような）の７０％〜０．１％（例えば、７０％〜４％）であるように、上記ビアコアクロスブロッキングアッセイにおいてＷＩＳＥに結合するものである。

上記ビアコアアッセイは、抗体又は他の結合剤が本発明に従って互いに交差ブロックするかどうかを決定するために用いられるアッセイである。稀に、特定の抗体又は他の結合剤が、アミン化学を介してＣＭ５ビアコアチップにカップリングしたＷＩＳＥに結合しない場合もある（これは通常、ＷＩＳＥ上の関連結合部位がマスクされている、又はチップへのカップリングにより破壊されているときに生じる）。このような場合には、クロスブロッキングは、ＷＩＳＥのタグ付きバージョン、例えばＮ−末端Ｈｉｓ−タグ付ＷＩＳＥを用いて決定することができる。この特定の形式では、抗Ｈｉｓ抗体をビアコアチップにカップリングさせ、次いでＨｉｓタグ付ＷＩＳＥを、チップ表面を通過させ、抗Ｈｉｓ抗体により捕捉させる。クロスブロッキング分析は、各チップ再生周期後、新規Ｈｉｓタグ付ＷＩＳＥを抗Ｈｉｓ抗体でコーティングされた表面上にロードし戻すことを除き、本質的に上記のように実行する。Ｎ−末端Ｈｉｓ−タグ付ＷＩＳＥを用いる所与の例に加えて、Ｃ−末端Ｈｉｓ−タグ付ＷＩＳＥを代替として用いてもよい。更に、当該技術分野において既知である、種々の他のタグ及びタグ結合タンパク質の組み合わせを、このようなクロスブロッキング分析に用いてもよい（例えば、ＨＡタグと抗ＨＡ抗体；ＦＬＡＧタグと抗ＦＬＡＧ抗体；ビオチンタグとストレプトアビジン）。

Ｅｌｉｓａベースクロスブロッキングアッセイ
以下に、抗ＷＩＳＥ抗体又は他のＷＩＳＥ結合剤が交差ブロックするかどうか、又は本発明によるクロスブロッキングできるかどうかを決定するためのＥＬＩＳＡアッセイについて一般に記載する。便宜上２種の抗体について言及するが、このアッセイは本明細書に記載されているＷＩＳＥ結合剤のいずれに対しても使用できることが理解される。

このアッセイの一般原理は、抗ＷＩＳＥ抗体でＥＬＩＳＡプレートのウェル上をコーティングすることである。過剰な量の第２の、潜在的にクロスブロッキングする、抗ＷＩＳＥ抗体を、溶液中に添加する（すなわち、ＥＬＩＳＡプレートには結合していない）。次いで、限られた量のＷＩＳＥをウェルに添加する。コーティングされた抗体と溶液中の抗体は、限られた数のＷＩＳＥ分子との結合について競合する。プレートを洗浄して、コーティングされた抗体に結合していないＷＩＳＥを除去し、また第２の溶液相抗体とＷＩＳＥとの間に形成される任意の複合体に加えて、第２の溶液相抗体も除去する。次いで、結合したＷＩＳＥの量を、適切なＷＩＳＥ検出試薬を用いて測定する。コーティングされた抗体を交差ブロックすることができる溶液中の抗体は、コーティングされた抗体が第２の溶液相抗体の非存在下で結合できるＷＩＳＥ分子の数に比べて、コーティングされた抗体が結合できるＷＩＳＥ分子の数を減少させることができる。

このアッセイは、Ａｂ−Ａ、Ａｂ−Ｃ及びＡｂ−Ｅについて、以下でより詳細に記載される。Ａｂ−Ａを固定化抗体として選択する場合には、それをＥＬＩＳＡプレートのウェル上にコーティングし、その後プレートを好適なブロッキング溶液でブロックして、その後添加される試薬の非特異的な結合を最低限に抑える。次いで、ＥＬＩＳＡプレートのコーティング中、ウェルあたりのＡｂ−ＣのＷＩＳＥ結合部位のモル数が、ウェルあたりの用いたＡｂ−ＡのＷＩＳＥ結合部位のモル数より少なくとも１０倍多いように、過剰な量のＡｂ−ＣをＥＬＩＳＡプレートに添加する。

次いで、ウェルあたりの添加されたＷＩＳＥのモル数が、各ウェルをコーティングするために用いたＡｂ−ＡのＷＩＳＥ結合部位のモル数より少なくとも２５倍少ないように、ＷＩＳＥを添加する。好適な温置温置期間に続いて、ＥＬＩＳＡプレートを洗浄し、ＷＩＳＥ検出試薬を添加して、コーティングされた抗ＷＩＳＥ抗体（この場合Ａｂ−Ａ）に特異的に結合したＷＩＳＥの量を測定する。このアッセイでは、バックグラウンドシグナルを、コーティングされた抗体（この場合Ａｂ−Ａ）、第２の溶液相抗体（この場合Ａｂ−Ｂ）、ＷＩＳＥ緩衝液のみ（すなわち、ＷＩＳＥなし）、及びＷＩＳＥ検出試薬を含むウェルにおいて得られるシグナルとして定義する。このアッセイでは、陽性対照シグナルは、コーティングされた抗体（この場合Ａｂ−Ａ）、第２の溶液相抗体緩衝液のみ（すなわち、第２の溶液相抗体なし）、ＷＩＳＥ、及びＷＩＳＥ検出試薬を含むウェルにおいて得られるシグナルとして定義する。ＥＬＩＳＡアッセイは、陽性対照シグナルがバックグラウンドシグナルの少なくとも３倍であるような方法で実行する必要がある。

コーティング抗体として使用する抗体及び第２の（競合相手の）抗体として使用する抗体の選択から生じる任意のアーチファクト（例えば、Ａｂ−ＡとＡｂ−Ｂとの間でＷＩＳＥに対する親和性が著しく異なる）を避けるために、クロスブロッキングアッセイは、２種の方式：１）形式１は、第１の抗体がＥＬＩＳＡプレート上にコーティングされる抗体であり、第２の抗体が溶液中にある競合相手の抗体である場合、及び２）第１の抗体及び第２の抗体がコーティング及び溶液において逆である場合、で実行する必要がある。

細胞ベース中和アッセイ
ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１ ＳｕｐｅｒＴｏｐＦｌａｓｈ（ＳＴＦ）レポーター細胞を用いて、ＷＩＳＥタンパク質がＷｎｔのシグナル伝達を調節できるかどうかを決定する。培養培地を分化培地に切り換えることにより、又はＷｎｔ３ａのような外因性Ｗｎｔを添加することにより誘発される、内因性Ｗｎｔシグナル伝達を用いて、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１ ＳＴＦ細胞におけるＴＣＦ依存性シグナル伝達の活性化を引き起こすことができる。大腸菌又は哺乳類細胞に由来する組み換えＷＩＳＥタンパク質は、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１ ＳＴＦ細胞におけるＷｎｔシグナル伝達を用量依存的に阻害することができる。

ルシフェラーゼアッセイ：バイアル１本分のＭＣ３Ｔ３−Ｅ１／ＳＴＦ細胞を、培養瓶の増殖培地中にプレーティングする。細胞がコンフルエントになったとき、トリプシン処理し、増殖培地中の細胞を、９６ウェルプレートの各ウェルにプレーティングする。次の日、増殖培地を全て除去し、１００μＬの新たに調製した分化培地に置き換える。

次の４日間、毎日分化培地の半分（５０μＬ）を新たに調製した分化培地に置き換えた。分化の５日後、全ての培地を、体積１００μＬの新たな分化培地中の試験サンプルに置き換える。次いで、プレートを２４時間温置し、その後ルシフェラーゼシグナルを測定する。ルシフェラーゼシグナルは、試験プレートから培地を除去し、室温に平衡化されている２０μＬの１×ｌｙｓｉｓ緩衝液を添加するときに測定する。プレートを密封し、室温で３０分間振動させ、１００μＬのルシフェラーゼアッセイ試薬を各ウェルに添加し、製造業者の指示書に従って照度計（ＬＭＡＸ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）を用いてシグナルを捕捉した。

インビボ中和アッセイ
腎保護又は肺保護に付随する、又はそれらから生じる種々のパラメータの増加は、ＷＩＳＥを中和し、療法的効果をもたらすことができる結合剤を同定するために、ＷＩＳＥ結合剤のインビボ試験結果として測定できる。このようなパラメータとしては、種々の腎／肺マーカー、及び腎／肺の健康の組織形態計測的マーカーが挙げられる。ＷＩＳＥ中和結合剤は、腎／肺保護の刺激に付随する、又はそれらから生じる任意のパラメータにおいて、ビヒクル処理動物と比較したとき、統計的に有意な増加を引き起こすことができるものとして定義される。このようなインビボ試験は、任意の好適な哺乳類（例えば、マウス、ラット、サル）で実施することができる。

治療の処方及び送達
薬剤的に又は生理学的に許容可能な担体、賦形剤、又は希釈剤とともに、ヒトＷＩＳＥに対する抗体Ａｂ−Ａ、Ａｂ−Ｂ、Ａｂ−Ｃ、Ａｂ−Ｄ、Ａｂ−Ｅ、Ａｂ−Ｆ、Ａｂ−Ｇ、Ａｂ−Ｈ、Ａｂ−Ｉ、Ａｂ−Ｊ、Ａｂ−Ｋ、Ａｂ−Ｌ、Ａｂ−Ｍ、Ａｂ−Ｎ、Ａｂ−Ｏ、Ａｂ−Ｐ、Ａｂ−Ｑ、Ａｂ−Ｒ、Ａｂ−Ｓ、Ａｂ−Ｔ、Ａｂ−Ｕ、Ａｂ−Ｖ、Ａｂ−Ｗ、Ａｂ−Ｘ、Ａｂ−１、Ａｂ−１３、Ａｂ−１６、Ａｂ−１８、Ａｂ−２３、Ａｂ−２４、Ａｂ−２８、Ａｂ−２９、Ａｂ−４８、Ａｂ−６０、Ａｂ−６３、Ａｂ−６５、Ａｂ−６６、Ａｂ−６７、Ａｂ−６９、Ａｂ−７、Ａｂ−７０、Ａｂ−７２、Ａｂ−７４、Ａｂ−７５、Ａｂ−７６、及びＡｂ−９の少なくとも１種のような上記結合剤の１種を含む医薬組成物を提供する。

例えば、皮下、経口、非経口、静脈内、鼻腔内、及び筋肉内投与及び処方を含む、種々の治療レジメンにおいて、本明細書に記載されている具体的な組成物を用いるための、好適な投薬及び治療レジメンの開発は、当該技術分野において周知であり、このうちいくつかは一般的な説明の目的のために以下で簡潔に論じる。

ある用途では、本明細書に開示されている医薬組成物は、動物への経口投与を介して送達してもよい。このように、これらの組成物は、不活性希釈剤、若しくは同化可能な可食性担体とともに処方してもよく、又は硬質若しくは軟質殻ゼラチンカプセルに封入してもよく、又は錠剤に圧縮してもよく、又は食事の食品に直接組み込んでもよい。

ある状況では、本明細書に開示されている医薬組成物を、皮下、非経口、静脈内、筋肉内、又は更には腹腔内に送達することが望ましい。このようなアプローチは、当業者に周知であり、これらのうちいくつかは、更に、例えば米国特許第５，５４３，１５８号；同第５，６４１，５１５号；及び同第５，３９９，３６３号に記載されている。ある実施形態では、遊離塩基としての活性化合物又は薬理学的に許容可能な塩類の溶液を、ヒドロキシプロピルセルロースのような界面活性剤と好適に混合した水中で調製してもよい。分散液はまた、グリセロール、脂質ポリエチレングリコール、及びこれらの混合物、並びに油中で調製してもよい。通常の保存及び使用条件下で、これらの調合品は一般に微生物の増殖を防ぐための防腐剤を含有する。

注射可能な使用に好適な実例となる医薬品形態としては、滅菌水溶液又は分散液、及び滅菌注射溶液又は分散液を即時に調製するための滅菌粉末が挙げられる（例えば、米国特許第５，４６６，４６８号を参照）。全ての場合において、形態は滅菌されていなくてはならず、容易に注射可能な程度に流体でなければならない。形態は、製造及び保存条件下で安定でなくてはならず、細菌及び真菌のような微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール等）、これらの好適な混合物、及び／又は植物油を含有する溶媒又は分散媒であってもよい。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用により、分散液の場合必要な粒径を維持することにより、及び／又は界面活性剤の使用により維持することができる。微生物の作用の阻止は、種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等により促進することができる。多くの場合、等張剤、例えば砂糖又は塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射可能な組成物の持続的吸収は、吸収遅延剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物中で使用することによりもたらされ得る。

１つの実施形態では、水溶液中の非経口投与の場合、溶液は必要に応じて好適に緩衝されるべきであり、液体希釈剤が十分な生理食塩水又はグルコースを用いて最初に等張化される。これらの具体的な水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下、及び腹腔内投与に特に好適である。これに関連して、使用できる滅菌水性培地は本開示の観点で当業者に周知である。例えば、単回投薬量を１ｍＬの等張ＮａＣｌ溶液に溶解させて、１０００ｍＬの皮下注入用流体に添加してもよく、又は注入の提案部位に注射してもよい（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１５ｔｈ ｅｄ．，ｐｐ．１０３５−１０３８ ａｎｄ １５７０−１５８０を参照）。治療される被験体の状態に応じて、投薬量を一部変更する必要がある。更に、ヒトへの投与では、調合品は、無論、ＦＤＡの生物学的規格に定められている不妊、発熱性、並びに一般的な安全性及び純度の規格を満たすことが好ましい。

本発明の別の実施形態では、本明細書に開示されている組成物は、中性型又は塩型で配合してもよい。例示的な薬剤的に許容可能な塩類としては、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基とともに形成される）が挙げられ、これは例えば塩酸若しくはリン酸のような無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸のような有機酸等とともに形成される。遊離カルボキシル基とともに形成される塩類はまた、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、又は第二鉄の水酸化物のような無機塩基、及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカイン等のような有機塩基から誘導してもよい。配合すると、溶液は、投薬量の製剤に適合する方式で、療法的に有効な量投与される。

担体は、溶媒、分散媒、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張及び吸収遅延剤、緩衝剤、担体溶液、懸濁液、コロイド等のいずれか並びに全てを更に含んでもよい。薬剤的に活性のある物質のためのこのような媒質及び剤の使用は、当該技術分野において周知である。いずれかの従来の媒質及び剤が活性成分に不適合である場合を除いて、療法的組成物におけるその使用が意図される。また、補充の活性成分を組成物に組み込んでもよい。語句「薬剤的に許容可能」とは、ヒトに投与したとき、アレルギー又は類似の有害反応を発生させない分子実体及び組成物を指す。

ある実施形態では、リポソーム、ナノカプセル、マイクロ粒子、脂質粒子、ベシクル等を、本発明の組成物を好適な宿主細胞／生物に導入するために用いる。具体的には、本発明の組成物は、脂質粒子、リポソーム、ベシクル、ナノ球体、又はナノ粒子等のいずれかにカプセル化して送達するために配合してもよい。あるいは、本発明の組成物は、このような担体ビヒクルの表面に、共有的に又は非共有的に結合してもよい。

潜在的な薬剤担体としてリポソーム及びリポソーム様調合品を配合及び使用することは、当業者に周知である（例えば、Ｌａｓｉｃ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（７）：３０７−２１，１９９８；Ｔａｋａｋｕｒａ，Ｎｉｐｐｏｎ Ｒｉｎｓｈｏ ５６（３）：６９１−９５，１９９８；Ｃｈａｎｄｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｄｉａｎ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．３５（８）：８０１−０９，１９９７；Ｍａｒｇａｌｉｔ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ．１２（２−３）：２３３−６１，１９９５；米国特許第５，５６７，４３４号；同第５，５５２，１５７号；同第５，５６５，２１３号；同第５，７３８，８６８号、及び同第５，７９５，５８７号を参照、それぞれその全文が参照することにより詳細に本明細書に組み込まれる）。リポソームの使用は、全身への送達後の自己免疫反応又は許容できない毒性とは関連のないように思われる。ある実施形態では、リポソームは、水性媒質に分散したリン脂質から形成され、同時に多重膜同心二重膜ベシクル（多重膜ベシクル（ＭＬＶ）とも呼ばれる）を形成する。

あるいは、他の実施形態では、本発明は、本発明の組成物の薬剤的に許容可能なナノカプセル製剤を提供する。ナノカプセルは、一般に、安定かつ再現可能な方法で化合物を捕捉することができる（例えば、Ｑｕｉｎｔａｎａｒ−Ｇｕｅｒｒｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．Ｉｎｄ．Ｐｈａｒｍ．２４（１２）：１１１３−２８，１９９８を参照）。細胞内のポリマー過負荷による副作用を避けるために、このような超微粒子（約０．１μｍの大きさ）は、インビボで分解可能なポリマーを用いて設計してもよい。このような粒子は、例えば、Ｃｏｕｖｒｅｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ．５（１）：１−２０，１９８８；ｚｕｒ Ｍｕｈｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ．４５（２）：１４９−５５，１９９８；Ｚａｍｂａｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ５０（１−３）：３１−４０，１９９８；及び米国特許第５，１４５，６８４号により記載されているように作製することができる。

加えて、本発明の医薬組成物は、このような医薬組成物の使用に関する説明書を提供する包装材料とともに、容器に入れてもよい。一般に、このような説明書は、ある実施形態では、医薬組成物を再構成するのに必要な場合がある賦形剤成分又は希釈剤（例えば、水、生理食塩水、又はＰＢＳ）の相対量に加えて、試薬の濃度を記載する明確な表現を含む。

投与される用量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜２００ｍｇ／ｋｇ（体重）の範囲であってもよい。典型的な投薬量は、３０ｍｇ／ｋｇ〜７５ｍｇ／ｋｇである。しかしながら、当業者に明らかであるように、投与量及び頻度は、無論、治療される適応症の性質及び重篤度、望ましい反応、患者の状態等のような要因に応じて決定される。典型的には、組成物は、上述のような種々の技術により投与してもよい。

ＷＩＳＥ結合剤を使用した治療方法
「治療」は、障害の病態の発達を防ぐ又は変化させる意図を持って実施される。したがって、「治療」は、療法的治療及び予防又は防止的処置の両方を指す。治療の必要のあるものとしては、障害を防止すべきものに加えて、既に障害を有するものが挙げられる。

治療目的のための「哺乳類」は、ヒト、イヌ、ウマ、ネコ、ウシ等のような、家畜、及び動物園の動物、スポーツ用動物、又はペット動物を含む、哺乳類に分類される任意の動物を指す。好ましくは、哺乳類はヒトである。

腎障害又は疾患の治療の文脈で使用するとき、語句「療法的に有効な量」は、腎損傷又は変質を減少させる、又は線維症及びタンパク尿のような腎疾患に付随する症状の重篤度若しくは進行を減少させる（すなわち、「療法的効果」を提供する）、療法的又は予防的ＷＩＳＥ抗体の量を指す。線維症の治療の文脈で使用するとき、語句「療法的に有効な量」は、線維性エレメント若しくはその前駆体を減少させる、及び／又は線維性疾患、例えばタンパク尿糸球体疾患に付随する症状の重篤度若しくは進行を減少させる（すなわち、「療法的効果」を提供する）、療法的又は予防的ＷＩＳＥ抗体の量を指す。

１つの実施形態では、本発明の組成物は、タンパク尿糸球体疾患、末期腎疾患、慢性腎疾患、ＩｇＡ腎症、バーター症候群、ギテルマン症候群、腎石症、腎アミロイドーシス、高血圧、原発性アルドステロン症、アジソン病；腎不全；糸球体腎炎及び慢性糸球体腎炎；尿細管間質性腎炎；多嚢性疾患、腎形成異常、及び皮質又は髄質嚢胞のような、腎臓の嚢胞性障害及び異形成（ｄｙｓｐｌａｓｔｉｃ ｍａｌｆｏｒｍａｔｉｏｎ）；劣性及び常染色体優性ＰＲＤのような遺伝性多嚢性腎疾患（ＰＲＤ）；髄質嚢胞性疾患；髄質海綿腎及び尿細管異形成；アルポート症候群；肺の気管支腫瘍又は脳の基底部の腫瘍のような、腎臓の生理に影響を及ぼす腎臓以外の癌；多発性骨髄腫；腎臓の腺癌；転移性腎癌；更に、摂取、注射、吸入、又は吸収された任意の医薬品、化学剤、又は生物剤により生じる、腎臓の任意の機能的又は形態的変化を含む腎毒性障害から成る群から選択されるものを含む、腎機能障害を治療、減少、及び／又は防止するために有用であることが意図される。一般的な腎毒性剤のいくつかの広分類としては、カルシニューリン阻害剤のような免疫抑制剤、重金属、全ての部類の抗生物質、鎮痛剤、溶媒、シュウ酸症誘発剤、抗癌剤、除草剤及び農薬、植物及び生物、並びに抗てんかん剤が挙げられるが、これらに限定されない。

語句「線維症減少活性」は、類繊維形成を完全に若しくは部分的に阻害する能力、又は既存の線維症を除去する若しくは減少させる能力を指す。よって、１つの実施形態では、本発明の組成物は、病的線維症又は瘢痕（心内膜硬化症を含む）、特発性間質性肺炎線維症、間質性肺線維症、筋周囲線維化、シンマーズ線維症、中心静脈周囲線維化、肝炎、皮膚線維腫、胆汁性硬変、アルコール性肝硬変、急性肺線維症、特発性肺線維症、急性呼吸促迫症候群、腎線維症／糸球体腎炎、腎線維症／糖尿病性腎症、強皮症／全身性、強皮症／局所性、ケロイド、肥厚性瘢痕、重篤な関節癒着／関節炎、骨髄線維症、角膜瘢痕、嚢胞性線維症、筋ジストロフィー（デュシェンヌ型）、心線維症、筋線維症／網膜剥離、食道狭窄、及びペイロニー病（ｐａｙｒｏｎｌｅｓ ｄｉｓｅａｓｅ）を含む、線維性疾患を治療するために有用であることが意図される。瘢痕修正／整形手術、緑内障、白内障性線維症、角膜瘢痕、関節癒着、移植片対宿主病（例えば、移植患者における）、腱手術、神経絞扼、デュピュイトラン拘縮、ＯＢ／ＧＹＮでの癒着／線維症、骨盤内癒着、硬膜外線維症、再狭窄症を含む、更なる線維性障害が、手術により誘発または開始されることがある。フィブロネクチンの沈着が原因因子である線維性状態を本発明により治療できることも意図される。特発性肺線維症、ブレオマイシン肺、嚢胞性線維症、及び腎臓におけるフィブロネクチン沈着を特徴とし、最終的には腎不全をもたらす疾患を含む糸球体腎症も、本発明に従って治療し得る状態の例である。

本発明はまた、線維症に付随する病状を治療する方法で用いるために、ＷＩＳＥに対して１×１０^−７Ｍ未満の親和性を有し、ＷＩＳＥ活性を阻害する抗体も意図し、ここで線維症は肺疾患又は腎臓疾患を含む上述の疾患に付随することがある。更に、タンパク尿に付随する病状を治療する方法で用いるのに好適な、ＷＩＳＥに対して１×１０^−７Ｍ未満の親和性を有し、ＷＩＳＥ活性を阻害する抗体も意図される。

本発明はまた、本発明の組成物を、根底にある疾患を治療する、又は治療されている疾患に付随する症状を減少させる追加療法剤とともに、それを必要とする患者に投与する、併用療法を提供する。これらの追加療法は、本発明の組成物の投与と同時に、投与前に、又は投与後に投与することができる。本発明の組成物と併用する追加療法としては、ＡＣＥ阻害剤、アンギオテンシン受容体遮断剤（ＡＲＢ）、エリスロポエチン（例えば、Ａｒａｎｅｓｐ（登録商標）（ダーベポエチン）、Ｅｐｏｇｅｎ（登録商標）（エリスロポエチンα）、カルシニューリン阻害剤、ステロイド、ベータ遮断剤等が挙げられる。

本発明はまた、本発明による少なくとも１つの抗ＷＩＳＥ結合剤を含む診断キットを提供する。結合剤は抗体であってもよい。加えて、このようなキットは、所望により、以下のうち１つ以上を含む：（１）スクリーニング、診断、予後、療法的モニタリング、又はこれらの用途の任意の組み合わせ用に１つ以上の結合剤（複数可）を使用するための説明書；（２）抗ＷＩＳＥ結合剤（複数可）に対する標識された結合パートナー；（３）その上に抗ＷＩＳＥ結合剤（複数可）を固定化する固相（試薬ストリップのような）；及び（４）スクリーニング、診断、予後、療法的使用、又はこれらの任意の組み合わせのための規制認可を示すラベル又は挿入物。結合剤（複数可）に対する標識された結合パートナーが提供されない場合、結合剤（複数可）自体を１つ以上の検出可能なマーカー（複数可）、例えば、化学発光、酵素、蛍光、又は放射性部分で標識してもよい。

以下の実施例は、例示のために提供されるものであり、限定のためではない。

ヒトＷＩＳＥクローンをＰＣＲのテンプレートとして用いて、ＰＣＲによりｈｕＷｉｓｅ−ＭＹＣ発現カセットを作製した。配列を確認した後、得られた産物をベクターに構築し、次いでクローンから断片をｐＣＤＮＡ３．１ベクターにクローニングした。ｈｕＷｉｓｅ−ＭＹＣ／ｐＣＤＮＡ３．１をテンプレートとして用いて、ＰＣＲを用いてｈｕＷｉｓｅ発現カセットを作製した。ＰＣＲ産物の配列を確認し、その後切断し、次いで発現ベクターにサブクローニングした。ｈｕＷｉｓｅのＤＮＡ配列を配列番号１に記す。ヒトＷＩＳＥのポリペプチド配列を配列番号２に記す。

マウス、ラット、及びカニクイザルＷｉｓｅのクローニング
マウスのＷＩＳＥをＰＣＲのテンプレートとして用いて、プライマーを用いることにより、ＮＳＰ−ｍＷｉｓｅ発現コンストラクト（ＮＳＰ−ネイティブシグナルペプチド）を作製した。配列を確認するために、ＰＣＲ産物をベクターにクローニングし、次いで正しい配列を有するＤＮＡ断片を遺伝子発現ベクターにクローニングした。ｍＷＩＳＥのＤＮＡ配列を配列番号３に記す。マウスＷＩＳＥ／ｐＴＴ５のポリペプチド配列を配列番号４に記す。ラットＷｉｓｅをＰＣＲを用いてクローニングし、ベクターに直接クローニングした。ラットＷｉｓｅのＤＮＡ配列を配列番号５に記す。ラットＷＩＳＥのポリペプチド配列を配列番号６に記す。またカニクイザルＷｉｓｅもクローニングし、発現ベクターに挿入した。ｃｙｎｏＷｉｓｅのＤＮＡ配列を配列番号７に記す。ＣｙｎｏＷＩＳＥのポリペプチド配列を配列番号８に記す。

大腸菌におけるマウス及びヒトＷＩＳＥタンパク質の発現及び精製
ＷＩＳＥ発現ベクターで形質転換されている細胞を、６００ｎｍにおいて８〜１１の光学密度まで増殖させ、次いで誘導し、６時間後遠心分離により収集した。凍結細胞ペーストを解凍し、スラリーが均質になるまで、ホモジナイザーを用いて緩衝液に再懸濁させた。次いで、細胞のスラリーを均質化して、細胞を壊して開き、封入体を放出させた。次いで、得られたホモジネートを５，０００×ｇで１時間５℃にて遠心分離して、ペレットとして封入体を収集し、廃棄した上清中に細胞質混入物を残した。ペレットを、冷水を及び高速ホモジナイザーを用いて元のホモジネートの体積に均質に再懸濁し、続いて既に述べたように遠心分離することにより、残留細胞質を封入体から洗い流した。次いで、得られたペレット、洗浄した封入体（ＷＩＢＳ）を−８０℃で冷凍した。

十分な量のＷＩＢＳ及び塩酸グアニジン（ＧｎＨＣｌ）を還元可溶化で用いて、およそ１ｍｇ／ｍＬの還元産物及び０．１８Ｍの最終濃度を得た。次いで、攪拌しながら可溶化物を再折り畳み溶液に添加した。再折り畳み溶液を穏やかに攪拌し、７２時間６℃にて空気酸化させた。０．４５μｍ濾過により沈殿を取り除き、濾液（ＡＰ）を残した。次いでＡＰを、１ＭのＴｒｉｓＨＣｌを用いて２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．５に調節して、５Ｋ×ｇで１時間５℃にて遠心分離することにより第２のごくわずかな沈殿を得た。

マウスＷＩＳＥを精製するために、逆相ＨＰＬＣカラムを平衡化し、酸−塩基沈殿工程からの上清をロードし、続いてベースラインの紫外線（ＵＶ）トレースが達成されるまで平衡緩衝液で洗浄した。生成物を溶出し、画分を集め、その後のプーリング（ｐｏｏｌｉｎｇ）を画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド電気泳動）により決定した。

タンパク質折り畳みの後に、ヒトＷＩＳＥをカラムクロマトグラフィーを用いて精製した。精製プロセスは室温で実行した。精製スキームは陽イオン交換クロマトグラフィー、続いて逆相クロマトグラフィーを用いた。次いで、画分をクマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥによりアッセイして、ＷＩＳＥの予測された大きさで移動するポリペプチドを含む画分を同定した。カラムからの適切な画分を組み合わせて、ＳＰＨＰプールを作製した。精製した後、ＷＩＳＥを透析によりＰＢＳ中で配合した。配合後、調合品を、滅菌０．２μｍフィルタを通して濾過し、４℃で保存又は冷凍した。

哺乳類細胞におけるマウス及びヒトＷＩＳＥの発現及び精製
バイアル１本の保存培養物を、振盪フラスコ（１２５ｍＬ、プラスチック）内の１０ｍＬの培養培地に接種し、２〜３日培養を続け、次いで培養を１０ｍＬから１００ｍＬの振盪フラスコに拡大し、再び１００ｍＬから５００ｍＬの体積の培養に拡大した。トランスフェクションのために、１リットルの培養培地に播種し、適切な細胞密度まで増殖させた。

トランスフェクションミックスを調製し、標準的な技術を用いて細胞をトランスフェクトし、トランスフェクションの２４時間後細胞に飼料（ｆｅｅｄ）を添加した。次いで培養を更に４８時間続け、４０００ｒｐｍで３０分間回転させ、次いで０．２μＭフィルタを通して濾過することによりならし培地を収集した。次いで、少量のサンプル（１ｍＬ）をウエスタンのためにとっておき、残りを精製のために冷凍した。宿主細胞培養液（ＣＣＦ）を遠心分離して、細胞片を取り除いた。次いでＣＣＦ上清を濾過した。

ヘパリンカラムにタンパク質をロードし、次いで通過画分の２８０ｎｍにおける吸光度がベースラインに戻るまでＰＢＳで洗浄した。次いで、ＷＩＳＥタンパク質を、直線勾配の１５０ｍＭ〜２Ｍの塩化ナトリウムＰＢＳ溶液を用いてカラムから溶出させ、画分を集めた。次いでクマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥにより画分をアッセイして、ＷＩＳＥの予測された大きさで移動するポリペプチドを含む画分を同定した。カラムからの適切な画分を組み合わせてヘパリンプールを作製した。

ヘパリンカラムから溶出したＷＩＳＥタンパク質を、逆相クロマトグラフィーにより更に精製した。ヘパリンプールを２２％エタノールで作製し、酢酸でｐＨ５．０に調節した。プールを濾過した。次いで、濾過したヘパリンプールを平衡化カラムにロードした。ロード後、通過画分の２８０ｎｍにおける吸光度がベースラインに戻るまでカラムを洗浄した。次いでＷＩＳＥタンパク質をカラムから溶出させた。

精製後、透析によりＷＩＳＥをＰＢＳ中で配合した。配合後、ＷＩＳＥを滅菌０．２μｍフィルタを通して濾過し、４℃で保存した又は冷凍した。

組み換えＷＩＳＥタンパク質のインビトロにおける生物活性
ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１ ＳＴＦレポーター細胞を用いて、ＷＩＳＥタンパク質がＷｎｔシグナル伝達を調節できるかどうかを決定した。培養培地を分化培地に切り換えることにより、又はＷｎｔ３ａのような外因性Ｗｎｔを添加することにより誘発される、内因性Ｗｎｔシグナル伝達を用いて、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１ ＳＴＦ細胞におけるＴＣＦ依存性シグナル伝達の活性化を引き起こすことができる。大腸菌又は哺乳類細胞に由来する組み換えＷＩＳＥタンパク質は、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１ ＳＴＦ細胞におけるＷｎｔシグナル伝達を用量依存的に阻害することができる（図２）。

ルシフェラーゼアッセイ：バイアル１本のＭＣ３Ｔ３−Ｅ１／ＳＴＦ細胞を、培養瓶の増殖培地中にプレーティングした。細胞がコンフルエントになったとき、トリプシン処理し、１００μＬの増殖培地中の細胞を、９６ウェルプレートの各ウェルにプレーティングした。次の日、増殖培地を全て除去し、１００μＬの新たに調製した分化培地に置き換えた。

次の４日間、毎日分化培地の半分（５０μＬ）を新たに調製した分化培地に置き換えた。分化の５日後、全ての培地を、総体積１００μＬの新たな分化培地中の試験サンプルに置き換えた。次いで、プレートを２４時間温置し、その後ルシフェラーゼシグナルを測定した。ルシフェラーゼシグナルは、試験プレートから培地を除去し、室温に平衡化されている２０μＬの１×ｌｙｓｉｓ緩衝液を添加するときに測定した。プレートを密封し、室温で３０分間振動させ、１００μＬのルシフェラーゼアッセイ試薬を各ウェルに添加し、製造業者の指示書に従って照度計（ＬＭＡＸ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）を用いてシグナルを捕捉した。

モノクローナル抗体の作製及び特徴付け
哺乳類源に加えて、細菌からマウス及びヒトＷＩＳＥタンパク質を、ＰＡＤＲＥペプチドに抱合させた。未反応の架橋剤を透析を介して取り除き、続いて添加された架橋剤の量に等しいモル量のＰＡＤＲＥペプチドを添加した。このＷＩＳＥ−ＰＡＤＲＥ誘導体化抗原を、種々のアジュバントの組み合わせを用いて乳化し、次いで正常Ｃ５７ＢＬ／６、ＢＤＦ１、及び１２９ｘ ＢＬ／６ Ｆ１マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）に皮下及び腹腔内免疫化した。加えて、茶色のドブネズミも、ＰＡＤＲＥ−ＷＩＳＥ抱合体又はネイティブなマウスＷＩＳＥタンパク質のいずれかにより免疫化するために用いた。免疫化は少なくとも２週間毎に行った。

融合の４日前、各マウスをＰＢＳ中のＷＩＳＥ−ＰＡＤＲＥ抗原で腹腔内追加免疫した。融合の日、脾臓を無菌的に取り出し、器官を単一細胞懸濁液に加工した。洗浄後、細胞を融合緩衝液に懸濁させ、この混合物を融合チャンバに充填し、次いで電気融合条件に供した。

細胞懸濁液をチャンバから取り除き、細胞増殖培地に懸濁させた。各ウェルあたり２０μＬのこの細胞懸濁液を、３８４ウェルの細胞培養プレートにプレーティングし、インキュベータ中で一晩温置した。次の日、２×ＨＡＴ（Ｓｉｇｍａ）を含有する２０μＬの上述の増殖培地を、プレートの各ウェルに添加した。培地を７日間温置し、次いで増殖培地をウェルの外に吸い出し、新たな増殖培地に交換した。ハイブリドーマ上清のスクリーニングを、培地交換の２〜３日後に始めた。

高結合透明ポリスチレン３８４ウェルプレートを、２５μＬ／ウェルの、ヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃ特異的ｐＡｂ（Ｐｉｅｒｃｅ）から成る１μｇ／ｍＬのＰＢＳ溶液でコーティングした。プレートをコーティング溶液とともに４℃で一晩温置し、次いでＰＢＳ＋０．５％のＴｗｅｅｎ２０（Ｓｉｇｍａ）を用いて自動プレート洗浄機で１回洗浄した。ブロック溶液を各ウェルに添加し、４℃で一晩温置した。５μＬのハイブリドーマ上清をＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに移し、室温で６０分間温置した。次いでプレートを、上述の方法を用いて２回洗浄した。次いで、２０μＬ／ウェルの、Ｎｕｅｔｒａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ（Ｐｉｅｒｃｅ）の１：１０，０００希釈液とプレミックスされていたブロッキング溶液で希釈したビオチン化ＷＩＳＥタンパク質の２０ｎｇ／ｍＬ溶液を、プレートの各ウェルに添加した。

ＷＩＳＥ抗原の添加後、ＥＬＩＳＡプレートを室温で６０分間温置した。次いでそれらを洗浄した。最後に、２０μＬ／ウェルのＴＭＢ（Ｐｉｅｒｃｅ）を各ウェルに添加し、プレートを吸光度プレートリーダーで読み取った。その後、ＥＬＩＳＡで陽性であるハイブリドーマウェルの細胞を、更に特徴付け試験を行うために、細胞培養で増殖させた。

ＥＬＩＳＡで陽性であるハイブリドーマウェルの単一細胞を、ＦＡＣＳ選別を用いて単離し、３８４ウェルプレートに入れた（１ウェルあたり１細胞）。これらの細胞を３日間増殖させた。ひとたび十分な細胞量に達すると、各ウェルから上清を集め、抗原結合活性について再スクリーニングした（スクリーニングを参照）。

各３８４ウェルプレートから、最も高い抗原結合活性を有する２つのクローンを同定し、ウェルあたり１５０μＬのハイブリドーマ増殖培地を含む９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ）で更に増殖させた。３日後、９６ウェルプレートから培地を含む２４ウェルプレートに細胞を移し、更に３日間増殖させた。ひとたび２４ウェルプレートがコンフルエントになると、細胞を６ウェルプレートに移した。温置の５日後、細胞の一部を冷凍した。残りの細胞をフラスコに移し、増殖させた。ひとたびフラスコがコンフルエントになると、更なるバックアップのために細胞の半分を冷凍した（クローンあたりバイアル３本）。抗体産生のために、もう半分を培地を含むフラスコ内で更に増殖させた。

標準的な方法論を用いてアイソタイプを決定した。ＷＩＳＥモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を、以下のようにハイブリドーマ細胞培養物から精製した。全ての精製プロセスを４℃で実行した。１つの精製スキームを用いて、種々のｍＡｂを精製し、親和クロマトグラフィーに用いた。

宿主細胞培養液（ＣＣＦ）を遠心分離して、細胞片を取り除いた。次いでＣＣＦ上清を濾過し、希釈し、次いでカラム、プロテインＧ高性能（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の形態のプロテインＧクロマトグラフィー媒質上にロードし、平衡化した。

ロード後、プロテインＧカラムを、通過画分の２８０ｎｍにおける吸光度がベースラインに戻るまで洗浄した。次いで、グリシン、ｐＨ２．５を用いてＷＩＳＥ ｍＡｂをカラムから溶出させ、すぐに溶出体積１ｍＬあたり５０μＬの１Ｍ Ｔｒｉｓ塩基の原液を添加することにより中和した。溶出物の２８０ｎｍにおける吸光度をモニタし、タンパク質を含む画分を集めてプロテインＧプールを作製した。

精製後、ＷＩＳＥのｍＡｂを、１０，０００ＭＷＣＯ膜（Ｐｉｅｒｃｅ Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ又は透析管）を用いて、透析によりＰＢＳ中で配合した。配合後、ＷＩＳＥのｍＡｂを濾過した。

試験した上位１４０個のハイブリドーマＣＭの中で、４０個が組み換えｍｕＷＩＳＥタンパク質に対して良好な結合を示した。増殖及び精製のためにこれらのハイブリドーマクローンを選択した。マウスＷＩＳＥに対する中和抗体を産生するハイブリドーマクローンをスクリーニングするために、ハイブリドーマＣＭの、３００ｎｇ／ｍＬの組み換えＷＩＳＥタンパク質によるＴＣＦ−ルシフェラーゼシグナル伝達の阻害を逆行させる能力を試験した。

マウス、ラット、カニクイザル、及びヒトＷＩＳＥタンパク質は両方、同様の効力（ＩＣ５０〜２００ｎｇ／ｍＬ）で、Ｗｎｔ誘発性ＴＣＦ−ルシフェラーゼシグナルを阻害した。３００ｎｇ／ｍＬのｍｕＷＩＳＥは一貫して分化により誘発されるシグナルのおよそ６０％を阻害した。ＷＩＳＥタンパク質のみ、又はｍＷＩＳＥタンパク質とハイブリドーマＣＭ（１：１希釈）との温置前保温された混合物を、５日間分化させた培養物に添加し、次いで処理２４時間後にルシフェラーゼシグナルを測定した。細胞ベースアッセイにおいて試験した４０個の上位結合抗体の中で、成熟抗体Ａｂ−Ａ、Ａｂ−Ｃ、及びＡｂ−ＥはマウスＷＩＳＥに対して強力な中和活性を示した。

また、上位ハイブリドーマクローンのＣＭから精製された抗体を用いて結果を確認した。この場合、Ｗｉｓｅタンパク質を、様々な量の精製抗体又はＰＢＳと１時間３７℃にて混合し、その後５日間分化させた培養物に添加し、２４時間後ルシフェラーゼシグナルを測定した。これらの抗体はまた、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１ ＳＴＦ−ルシフェラーゼアッセイにおいてヒト、ラット、及びカニクイザルＷＩＳＥの活性を中和し、ヒト活性についての結果を図１に示す。ラット及びカニクイザルアッセイでも同様の結果が見られた。

交差競合ＥＬＩＳＡ
透明なポリスチレンプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ＃３７０８）を、２５μＬ／ウェルの、４０個のマウス抗ＷＩＳＥ抗体のうち１個から成る２μｇ／ｍＬのＭａｂのＰＢＳ溶液でコーティングした。プレートをコーティング溶液とともに一晩４℃で温置し、次いでＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ２０（Ｓｉｇｍａ）を用いて自動プレート洗浄機で１回洗浄した。ＰＢＳ＋１％ ＢＳＡ＋１％ 正常ヤギ血清＋０．５％のＴｗｅｅｎ２０（Ｓｉｇｍａ）から成る５０μＬのブロック溶液を各ウェルに添加し、４℃で一晩温置した。次いで、３０μｇ／ｍＬから始めて３倍に段階希釈したブロッキング溶液中の２５μＬの競合抗体をプレートの各ウェルに添加し、続いて２５μＬ／ウェルの、ブロッキング溶液中のＮｕｅｔｒａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ（Ｐｉｅｒｃｅ）とプレミックスしたビオチン化ＷＩＳＥタンパク質の１ｎｇ／ｍＬ溶液を添加した。

抗原−抗体ミックスの添加後、ＥＬＩＳＡプレートを、平衡に達するよう、４℃で一晩温置した。次いで、それをＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ２０で４回洗浄した。最後に、２５μＬ／ウェルの発光基質（Ｐｉｅｒｃｅ）を各ウェルに添加し、プレートを発光プレートリーダーで読み取った。データの完全なセットに基づいて、複数の抗体ｂｉｎが存在する。データの例を図２０〜２６に示す。

エピトープのマッピング
ＷＩＳＥ抗体が直線状エピトープに結合するのか、立体構造エピトープに結合するのかを決定するために、ウエスタンブロットを用いて、選択した抗体が還元又は非還元抗体に結合する能力を試験した。抗体が直線状エピトープに結合する場合、それは還元されていようといまいとＷＩＳＥタンパク質に結合する。そうでなければ、それは立体構造エピトープに結合する。簡潔に述べると、哺乳類細胞において作製されたヒト（１μｇ／μＬ）及びマウス（０．２５μｇ／μＬ）ＷＩＳＥタンパク質は両方、還元又は非還元条件下のいずれかで変性する（それぞれｂ−ＭＥの有り無しで６５℃にて１０分間）。

各レーンにつき、Ｌａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液中の１００ｎｇの変性タンパク質を、ＮｕＰＡＧＥ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ４〜１２％ゲルにロードし、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、及びニトロセルロース膜を用いたウエスタンブロットに供した。ブロッキング時、１２０ｎｇ／ｍＬの各試験抗体を、穏やかに攪拌しながら、室温で１時間、膜とともにＰＢＳ及び０．０５％のＴｗｅｅｎ中で温置した。

結合した抗体を、室温で１時間、１：１００００希釈して用いたマウスＩｇＧ−Ｆｃ（カタログ番号３１４３９、ＰＩＥＲＣＥ）に対するＨＲＰ標識された二次抗体を用いて検出した。シグナルをＥＣＬ基質を用いて検出し、フィルムに焼き付けた。試験した抗体の中で、全ての抗体が立体構造エピトープに結合している。

様々な抗体のエピトープを決定するために、個々の抗体の存在下又は非存在下のいずれかにおけるＷＩＳＥタンパク質のトリプシン消化に由来するトリプシンペプチドのＨＰＬＣプロファイルを比較した。哺乳類細胞に由来するヒト組み換えＷｉｓｅタンパク質（１０μｇ）を、２００μＬの０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）中において、およそ１：１のモル比で個々の抗体（３２μｇ）と混合した。混合物を室温で３０分間温置した。トリプシン（Ｒｏｃｈｅ）（２μｇ）を添加し、３７℃で２４時間消化を進行させた。これらの条件下で、ヒトＷｉｓｅに対する抗体は、タンパク質消化、特にトリプシン消化に対して比較的安定である。トリプシン処理されたサンプルを、ＴＦＡ−アセトニトリル系を用いて直接逆相ＨＰＬＣに供した。逆相ＨＰＬＣカラムをペプチドの分離に用いた。ペプチドを、２％の溶媒Ｂ〜３５％の溶媒Ｂの直線勾配により、０．２５ｍＬ／分の流速で３０分間溶出させ、２１５ｎｍの吸光度をモニタした。このアプローチを用いて、いくつかの群の抗体は、Ａｂ−Ａ、Ａｂ−Ｃ、及びＡｂ−Ｅの成熟型を含む類似のトリプシンペプチドプロファイルを生じさせることが見出された。

トリプシン消化に由来する個々のペプチドの配列同一性を得るために、ＷＩＳＥタンパク質（１００μｇ）を３７℃で２４時間トリプシン（Ｒｏｃｈｅ）（２μｇ）で消化し、タンパク質を完全に分解するために、２μｇのトリプシンを添加した後更に２４時間消化を進行させた。ペプチドを逆相ＨＰＬＣにより精製した。以下のような直線勾配条件を用いた：カラムを２％の溶媒Ｂで平衡化させた。サンプル注入後、２％の溶媒Ｂ〜３５％の溶媒Ｂの直線勾配を６０分間、０．２５ｍＬ／分の流速で実施した。ＨＰＬＣペプチドピークを手動で集め、乾燥させた。上記のように再構成した後、サンプル（０．７〜１μＬ）をＭＡＬＤＩ質量分析（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ，Ｗａｔｅｒｓ）に供し、残りのサンプルを配列分析のために保持した。サンプルの１アリコートを、マトリックスとして、アルファ−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（４−ＨＣＣＡ）を用いる、ステンレス鋼ＭＡＬＤＩプレート上にロードした。ペプチド配列も決定した。

どのペプチドが、本発明の抗体への結合についてＷＩＳＥと競合するのかを同定するために、ｒｈｕＷｉｓｅを高密度でＣＭ５表面上に固定化した。３ｎＭの成熟抗体Ａｂ−Ａ、Ａｂ−Ｃ、及びＡｂ−Ｅを、３０ｎＭのペプチド及びｈｕＷｉｓｅ（対照として）の有り無しで温置前保温し、次いでｈｕＷｉｓｅ表面上に注入した。図９Ａ及び９Ｂの両方に示すように、Ｔ４９及びＴ５６．１ペプチドはｈｕＷＩＳＥへの抗体の結合をブロックした。これらの抗体はウエスタンブロットにより示されるように立体構造エピトープに結合するため、これらの抗体の結合部位は、シスチンノット由来の残基に加えて、ループ１及び／又はループ３により形成されるドメインを含むと推論される。

選択された抗体の親和性測定
ｍｕＡｂとｒｈｕＷｉｓｅ及びｒｍｕＷｉｓｅの結合を、ＫｉｎＥｘＡで試験した。アズラクトンビーズ（Ｐｉｅｒｃｅ）をｐＨ９．０にてｒｈｕＷｉｓｅ／ｒｍｕＷｉｓｅでプレコーティングし、エタノールアミンでブロックし、更にサンプル緩衝液（０．１ｍｇ／ｍＬのヘパリンのＢＳＡ／Ｐ２０／ＰＢＳ溶液）で洗浄した。１０ｐＭ及び１００ｐＭのＡｂ−Ａ、Ａｂ−Ｃ、及びＡｂ−Ｅを、室温で少なくとも１０時間、種々の濃度（０．１ｐＭ〜３ｎＭ）のｒｈｕＷｉｓｅ／ｒｍｕＷｉｓｅとともに温置し、その後ｒｈｕＷｉｓｅ／ｒｍｕＷｉｓｅでコーティングしたビーズを通過させた。

ビーズに結合したｍｕＡｂの量を、蛍光（Ｃｙ５）標識されたヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）により定量した。結合シグナルは、結合平衡において遊離ｍｕＡｂの濃度に比例する。平衡解離定数（Ｋｄ）を、二曲線一部位相同結合モデル（ｔｗｏ−ｃｕｒｖｅ ｏｎｅ−ｓｉｔｅ ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｅｌ）（ＫｉｎＥｘＡ（商標）Ｐｒｏ ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて競合曲線の非線形回帰から得た。成熟抗体Ａｂ−Ａ、Ａｂ−Ｃ、及びＡｂ−Ｅは、マウス及びヒトＷＩＳＥについて類似の親和性を有し、ヒトＷＩＳＥのＫｄ測定値は、Ａｂ−Ａではおよそ２ｐＭ、Ａｂ−Ｃではおよそ４ｐＭ、及びＡｂ−Ｅではおよそ１８ｐＭである。

上述のように、本発明の特定の実施形態を例示のために本明細書に記載したが、種々の修正を本発明の趣旨及び範囲を逸脱することなく行い得る。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲を除いては限定されない。本明細書に開示した全ての刊行物、公開されている特許出願、及び特許文書は、参照することにより本明細書に組み込まれる。

Ａｂ−Ａ、Ａｂ−Ｃ、Ａｂ−Ｅ、Ａｂ−Ｐ及びＡｂ−Ｔのヒト化

Ａｂ−Ａ及びＡｂ−Ｃの可変ドメインのそれぞれをヒトＩｇＧ２定常ドメインにクローニングして、キメラ抗体（Ａｂ−Ｉ及びＡｂ−Ｊ）を作製し、配列番号１０、１２、１８、及び２０の適切なＣＤＲ領域を、ヒトカッパ軽鎖（配列番号１０及び１８のＣＤＲ）又はヒトＩｇＧ２フレームワーク（配列番号１２及び２０のＣＤＲ）のいずれかに移植して、抗体Ａｂ−Ｂ、Ａｂ−Ｄ、及びＡｂ−Ｇ、Ａｂ−Ｈ、Ａｂ−Ｋ、Ａｂ−Ｌ、Ａｂ−Ｎ及びＡｂ−Ｏを得た。

Ａｂ−Ｐ及びＡｂ−Ｔの可変ドメインのそれぞれを、ヒトＩｇＧ２定常ドメインにクローニングして、キメラ抗体（Ａｂ−Ｑ及びＡｂ−Ｘ）を作製し、配列番号４８、５０、２６６、２６８の適切なＣＤＲ領域を、それぞれヒトカッパ軽鎖（配列番号５０のＣＤＲ）若しくはラムダ鎖（配列番号２６６のＣＤＲ）、又はヒトＩｇＧ２フレームワーク（配列番号４８、２６８のＣＤＲ）のいずれかに移植して、ヒト化抗体Ａｂ−Ｒ及びＡｂ−Ｍを生じさせた。

抗体がヒトＷＩＳＥに結合する能力を、以下の結合アッセイを用いて決定した。９６ウェルプレートを、５０μＬ／ウェルの、２μｇ／ｍＬの各試験抗体のコーティング緩衝剤溶液で、室温にて２時間コーティングした。次いでプレートをＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ２０（Ｓｉｇｍａ）を用いて１回洗浄した。ブロック溶液を各ウェルに添加し、４℃で一晩温置した。Ｎｕｅｔｒａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ（Ｐｉｅｒｃｅ）の１：１０，０００希釈液とプレミックスされていたブロッキング溶液中の、３０ｎｇ／ｍＬ又は１００ｎｇ／ｍＬで始めるビオチン化ヒトＷＩＳＥタンパク質の段階希釈溶液をプレートの各ウェルに添加し、４℃で一晩温置した。温置の後、プレートを洗浄した。最後に、５０μＬ／ウェルのＴＭＢ（Ｐｉｅｒｃｅ）を各ウェルに添加し、プレートを吸光度プレートリーダーで読み取った。データをＰＲＩＳＭソフトウェアでプロット化した。データを図３、４、及び５、６に示す。

ヒト化抗体の、Ａｂ−ＣのヒトＷＩＳＥへの結合を交差ブロックする能力を、競合結合アッセイを用いて決定した。９６ウェルプレートを、室温にて２時間、５０μＬ／ウェルの、１μｇ／ｍＬの抗体Ｃ（Ａｂ−Ｃ）のコーティング緩衝剤溶液でコーティングした。次いで、プレートをＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ２０（Ｓｉｇｍａ）を用いて１回洗浄した。ブロック溶液を各ウェルに添加し、４℃で一晩温置した。試験抗体Ａｂ−Ｃ、Ａｂ−Ｊ、Ａｂ−Ｎ及びＡｂ−Ｏの２倍段階希釈液を、Ｎｕｅｔｒａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ（Ｐｉｅｒｃｅ）の１：１０，０００希釈液とプレミックスされていたブロッキング溶液中の１ｎｇ／ｍＬのビオチン化ヒトＷＩＳＥタンパク質とともに、プレートの各ウェルに添加し、４℃で一晩温置した。温置の後、プレートを洗浄した。最後に、５０μＬ／ウェルのＴＭＢ（Ｐｉｅｒｃｅ）を各ウェルに添加し、プレートを吸光度プレートリーダーで読み取った。データをＰＲＩＳＭソフトウェアでプロット化した。データを図７に示す。

元のげっ歯類抗体と比べた、キメラ抗体又はヒト化抗体のＷＩＳＥ活性を中和する能力を、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１ ＳｕｐｅｒＴｏｐＦｌａｓｈ（ＳＴＦ）細胞を用いた細胞ベースアッセイを用いて決定した。本発明に記載の詳細な手順に従ってまず５日間細胞を分化させ、次いでそれらをＰＢＳのみ、０．５μｇ／ｍＬのヒトＷＩＳＥタンパク質のみ、又は５μｇ／ｍＬで始めた試験抗体の２倍段階希釈液とプレミックスされていた０．５μｇ／ｍＬのヒトＷＩＳＥタンパク質のいずれかで処理した。２４時間後、製造業者の指示書に従って、照度計（ＬＭＡＸ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）を用いてルシフェラーゼシグナルを決定した。データをＰＲＩＳＭソフトウェアでプロット化した。データを図８に示す。

抗ＷＩＳＥヒト化抗体のクローニング

これらの抗ＷＩＳＥ抗体は、マウス又はラットのＣＤＲの相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒト生殖系アクセプタフレームワーク配列に移植することにより作製したヒト化抗体である。

抗体の軽鎖及び重鎖の両方をコードしている完全長げっ歯類ｃＤＮＡを、ＲＡＣＥ、続いてＰＣＲを用いて単一細胞をクローニングしたハイブリドーマ細胞から単離した。選択したリード候補である、マウス抗体Ａｂ−Ｃ、Ａｂ−Ａ、並びにラット抗体Ａｂ−Ｐ及びＡｂ−Ｔの可変領域のｃＤＮＡを、ＣＤＲ移植の設計テンプレートとして用いた。

抗体ＣをＣＤＲ移植及び突然変異誘発によりヒト化して、いくつかの軽鎖及び重鎖変異体を作製した。配列番号２２に記した軽鎖、変異体１は、Ａｂ−Ｃの軽鎖ＣＤＲをヒト生殖系アクセプタフレームワークＶＫ１ Ｏ２及びＪＫ２に移植することにより作製した。残基２２（カバット付番）を、マウスのセリン残基として維持した。

配列番号４６に記した軽鎖、軽鎖変異体２は、Ａｂ−Ｃの軽鎖ＣＤＲをヒト生殖系アクセプタフレームワークＶＫ４ Ｂ３及びＪＫ２に移植することにより作製した。残基２２（カバット付番）を、マウスのセリン残基として維持した。

配列番号１２２に記した軽鎖、軽鎖変異体３は、配列番号２２にＹ３６Ｆ、Ｙ８７Ｆ突然変異を生じさせることにより作製した。

配列番号２４に記した重鎖、重鎖変異体１は、マウス重鎖ＣＤＲを、ヒト生殖系アクセプタフレームワークＶＨ１ １−６９及びＪＨ４に移植することにより作製した。配列番号３６に記した重鎖、重鎖変異体２は、マウス重鎖ＣＤＲを、ヒト生殖系アクセプタフレームワークＶＨ１ １−６９及びＪＨ４に移植し、以下のように選択したＣＤＲ２残基をその元のマウス残基に復帰突然変異させることにより作製した：Ｍ４８Ｉ、Ｇ４９Ａ、Ｒ６６Ｋ、Ｖ６７Ａ、Ｔ６８Ｑ及びＩ６９Ｌ。

抗体Ａ（配列番号１０及び１２）をＣＤＲ移植及び突然変異誘発によりヒト化して、ヒト化軽鎖及びいくつかのヒト化重鎖変異体を作製した。

配列番号１４に記したヒト化軽鎖変異体１は、軽鎖マウスＣＤＲを、フレームワーク１についてはヒト生殖系アクセプタフレームワークＶＫ２ Ａ１７に、フレームワーク２、３、及び４についてはヒト生殖系アクセプタフレームワークＶＫ２ Ａ１９及びＪＫ４に移植して、マウスとヒト化バージョンとの相同性をできる限り高く維持することにより作製した。カバット位置８７のアミノ酸は、そのＣＤＲ３に対する近接性並びにループ構造及び抗原結合（配列番号１４）における潜在的関与のためにマウスのフェニルアラニンとして維持した。

配列番号１６に記したヒト化重鎖変異体１は、マウス重鎖ＣＤＲを、フレームワーク１及び２についてはヒト生殖系アクセプタフレームワークＶＨ１ １−０２に、フレームワーク３及び４についてはヒト生殖系アクセプタ配列ＶＨ７ ７−４．１及びＪＨ４に移植することにより作製した。位置８２ａにおける天然システイン残基を、セリンに置換して、不均一なジスルフィド結合の形成を避けた（配列番号１６）。

配列番号３４に記したヒト化重鎖変異体２は、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３近接残基の逆転：Ｒ３８Ｋ、Ｙ９１Ｆ及びＡ９３Ｖにより作製した（配列番号３４）。

抗体Ｐは、ＣＤＲ移植によりヒト化した。配列番号５４に記した軽鎖は、ラット軽鎖ＣＤＲをヒト生殖系アクセプタフレームワークＶＫ３ Ｌ２及びＪＫ４に移植することにより作製した（配列番号５４）。

配列番号５２に記した重鎖は、ラット重鎖ＣＤＲを、ヒト生殖系アクセプタフレームワークＶＨ３ ３−３３及びＪＨ４に移植することにより作製した。ＣＤＲ１及びＣＤＲ３への近接性のために所定の位置に保持されたマウス残基としては、プロリン２８（Ｐ２８）、スレオニン９３（Ｔ９３）、及びセリン９４（Ｓ９４）が挙げられた（配列番号５２）。

抗体Ｔは、ＣＤＲ移植によりヒト化した。配列番号２７１に記した軽鎖は、ラット軽鎖ＣＤＲをヒト生殖系アクセプタフレームワークＶＬ６ ６ａ及びＪＬ２に移植することにより設計した。基準（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）又は界面残基としての重要性のために所定の位置に保持されたラット残基としては、グルタミン１（Ｑ１）、バリン２（Ｖ２）、グルタミン酸４０（Ｅ４０）、アルギニン４２（Ｒ４２）、及びフェニルアラニン８７（Ｆ８７）が挙げられた。

配列番号２７２に記した重鎖は、ラット重鎖ＣＤＲを、ヒト生殖系アクセプタフレームワークＶＨ４ ４−５９及びＪＨ３に移植することにより設計した。ＣＤＲ１及びＣＤＲ３への近接性、又は界面及び基準残基としての重要性のために所定の位置に保持されたラット残基としては、フェニルアラニン２７（Ｆ２７）、ロイシン２９（Ｌ２９）、スレオニン３０（Ｔ３０）、バリン３７（Ｖ３７）、アルギニン７１（Ｒ７１）、及びバリン９３（Ｖ９３）が挙げられた。

ファージ由来の抗Ｗｉｓｅ Ａｂ−Ｃ軽鎖

パート１：ＬＣ−シャフリングライブラリの構築

３．５×１０^１１ｐｆｕ（ライブラリサイズの１０倍）の３１０Ｆａｂライブラリ（Ｄｙａｘ）及び４×１０^１１ｐｆｕのＴＱライブラリ（Ｔａｒｇｅｔ Ｑｕｅｓｔ）を用いて、３７℃で３０分間、対数期のＴＧ１培養物２Ｌを感染させた（ＯＤ６００は０．６）。感染した細胞を遠心沈殿させ、再懸濁させ、１０枚の２ＸＹＴ−ＣＧ ２４５平方ｍｍのプレート上にプレーティングした。３７℃で一晩温置した後、細胞をこすり取り、遠心沈殿させた。細胞ペレットを、ライブラリのファージミドプラスミドのメガプレップに用いた。

３１０Ｆａｂライブラリ及びＴＱライブラリのファージミドプラスミドを、ＳｆｉＩ及びＮｏｔＩで消化した。消化したサンプルを、調製用０．５％アガロースゲルに流して、ＶＨ−ＣＨ１断片プール及びｐＣＥＳ１−ＬＣ断片プールを分離した。大きなベクター−ＬＣ断片のバンド（ＴＱライブラリでは５２４２ｂｐ、３１０Ｆａｂライブラリでは４５１７ｂｐ）を切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＤＮＡを溶出させた。

ヒト化抗ＷＩＳＥ Ａｂ−Ｃ ＶＨ−ＣＨ１断片を、テンプレートとしてヒト化抗ＷＩＳＥ Ａｂ−Ｃ ＩｇＧ２ガンマ鎖（配列番号２４）を用いて、プライマー５１０４−９１（ＣＣＧ ＴＴＣ ＧＴＧ ＧＣＣ ＣＡＧ ＣＣＧ ＧＣＣ ＴＣＴ ＧＣＴ ＣＡＧ ＧＴＴ ＣＡＧ ＣＴＧ ＧＴＧ ＣＡＧ ＴＣＴ Ｇ；配列番号２８１）及び５１０４−９３（ＧＴＧ ＡＴＧ ＧＴＧ ＡＴＧ ＡＴＧ ＡＴＧ ＴＧＣ ＧＧＣ ＣＧＣ ＡＣＡ ＴＴＴ ＧＣＧ ＣＴＣ ＡＡＣ ＴＧＴ ＣＴＴ ＧＴＣ；配列番号２８２）により増幅させた。増幅したヒト化Ａｂ−Ｃ重鎖ＶＨ−ＣＨ１断片（６７６ｂｐ）をＳｆｉＩ及びＮｏｔＩで消化し、Ｑｉａｇｅｎ製のＰＣＲ精製キットを用いて精製した。

ヒト化Ａｂ−Ｃ ＶＨ−ＣＨ１ ＳｆｉＩ／ＮｏｔＩ断片を、それぞれ４：１及び３：１の比で、ｐＣＥＳ１−ＬＣ ＳｆｉＩ／ＮｏｔＩ断片プールにライゲーションした。ライゲーションしたＤＮＡを、フェノールクロロホルム抽出及びエタノール沈殿により清浄化した。ＴＱライブラリから２０μｇのライゲーションしたＤＮＡ及び３１０Ｆａｂライブラリから９３μｇのライゲーションしたＤＮＡを用いて、２５μＦ、２００ｏｈｍ、２５００Ｖで０．２２ＣＭキュベット（ＢｉｏＲａｄ、カタログ番号１６５２０８６）を用いて、ＢｉｏＲａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ内で電気穿孔により、１００μＬの細胞あたり５００ｎｍのＤＮＡ及び３００μＬ／キュベットで、エレクトロコンピーテントＴＧ１細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、＃２００１２３）を形質転換した。電気穿孔した細胞をＳＯＣで３倍に希釈し、３７℃で１時間温置した。形質転換した細胞の力価を調べ、２ＸＹ−ＣＧ ２４５平方ｍｍのプレート上にプレーティングし、３７℃で一晩温置した。形質転換細胞のコロニーをこすり取り、ファージレスキューに用いた。構築したＴＱ−ＬＣシャフリングライブラリのライブラリサイズは６．６×１０６であり、構築した３１０ Ｆａｂ−ＬＣシャフリングライブラリのライブラリサイズは２．１×１０９であった。

ファージミドファージをＬＣシャフリングライブラリから別々にレスキューした。２ＸＹＴ−ＣＧ培地に、それぞれＯＤ６００が０．１になるように、ＬＣシャフリングライブラリからの１０×ライブラリサイズの接種材料を接種した。培養物をＯＤ６００が０．５になるまで増殖させ、ＭＯＩ２０でＫＯ７ヘルパーファージ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に感染させた。３７℃で接種の３０分後、細胞を遠心沈殿させ、２ＸＹ−ＣＫに再懸濁し、３０℃で一晩温置した。細胞を遠心分離により遠心沈殿させた。ファージ上清を新たな試験管に移した。２０％ＰＥＧ／１．５Ｍ ＮａＣｌの体積の１／５をファージ上清に添加して、ファージを沈殿させた。混合物を氷上で１〜３時間温置した。沈殿したファージを１４Ｋで３０分間遠心分離により遠心沈殿させた。ファージのペレットを１ｍＬのＰＢＳに再懸濁し、１４Ｋで１０分間遠心分離して、細胞片を除去した。ファージ沈殿を上記のように繰り返した。最終的なファージのペレットを、１ｍＬのＰＢＳ／１％ ＢＳＡに再懸濁させた。

パート２：ＬＣシャフリングライブラリのパニング

１×１０１１ｐｆｕのＴＱ−ＬＣシャフリングライブラリからレスキューされたファージ及び１×１０１２ｐｆｕの３１０Ｆａｂ−ＬＣシャフリングライブラリからレスキューされたファージを、ストレプトアビジンＭ−２８０Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｄｙｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ，＃１１２．０６）上にコーティングされたビオチン化ｈｕＷＩＳＥに対してパニングするために用いた。パニング手順は、ビオチン化ＦＧＦ２３でコーティングされたストレプトアビジンＤｙｎａｂｅａｄｓを用いて３０分の陰性選択を３回を行い、続いて６０分の陽性選択を行い、次いで３％ＢＳＡ／３％ＭＰＢＴ（０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０）で６回、ＰＢＳＴで６回、及びＰＢＳで２回ビーズを洗浄し、最後に結合したファージを１ｍＬの０．１Ｍ ＴＥＡで溶出し、続いて０．５ｍＬの１Ｍ ＴｒｉｓＨＣｌで中和する。各ラウンドについて、パニングは２種の抗原コーティング濃度で行い、以下に示すようなＲＤ４を除いてその後のラウンドでは１０倍又は２０倍低いコーティング濃度で行った：ＲＤ１Ａ（３．３ｕｇ／ｍｌ）；ＲＤ２Ｂ（０．３３ｕｇ／ｍｌ）；ＲＤ３Ｄ（０．０１５ｕｇ／ｍｌ）；ＲＤ４Ｄ（０．０１５ｕｇ／ｍｌ）及びＲＤ１Ｂ（０．３３ｕｇ／ｍｌ）；ＲＤ２Ｃ（０．０３３ｕｇ／ｍｌ）；ＲＤ３Ｅ（０．００３３ｕｇ／ｍｌ）；ＲＤ４Ｅ（０．００３３ ｕｇ／ｍｌ）。ＲＤ３パニングでは、２つの洗浄プロトコルを実行した。通常の洗浄に加えて、別のセットのＲＤ３パニングのために更に一晩洗浄工程を行った。

パート３：ファージミドクローン分析及びクローン選択

溶出されたＲＤ２、ＲＤ３、及びＲＤ４ファージミドクローンを、３．３ｕｇ／ｍＬ及び０．３３ｕｇ／ｍＬのビオチン化ヒトＷＩＳＥでコーティングされたＮｅｕｔｒａｖｉｄｉｎプレート上におけるファージＥＬＩＳＡでスクリーニングした。各ＲＤ２、ＲＤ３、及びＲＤ４溶出プールからの個々のクローンの１枚の９６ウェルプレートをスクリーニングした。両方の抗原濃度において類似の結合シグナルを示すクローンだけを選び、配列を決定した。合計７７個の独特のファージミドクローンを同定した。そのうち２個は、フレームワーク中に終止コドンが存在していたため、脱落した。残りの全ては、ＢｓｓＨＩＩ／ＢｓＭＢＩ断片としてＨＣ及びラムダＬＣの可変領域、並びにＢｓｓＨＩＩ／ＢｗｉＩとしてカッパＬＣの可変領域を挿入することにより、Ｖκ１｜Ｏ１２−Ｏ２シグナルペプチド配列（ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣ；配列番号５８のアミノ酸１〜２２）を含む、対応するｐＴＴ５ベクターに変換された。

パート４：ＬＣ変異体ＩｇＧ２の一過性トランスフェクション

最終濃度０．５μｇ／ｍＬの、等量のヒト化抗ＷＩＳＥ Ａｂ−Ｃ ＩｇＧ２ガンマ鎖ベクターと、軽鎖ベクターとを用いて、トランスフェクタントとしてＰＥＩを用い、１×１０^６細胞／ｍＬで５０ｍＬの２９３ ６Ｅ細胞をトランスフェクトした。トランスフェクション２日目にトリプトンを添加した。ならし培地を７日目に集めた。この実施例で同定された軽鎖のポリペプチドは、Ｌ１（配列番号：７６）、Ｌ１３（配列番号：７８）、Ｌ１６（配列番号：８０）、Ｌ１８（配列番号：８２）、Ｌ２３（配列番号：８４）、Ｌ２４（配列番号：８６）、Ｌ２８（配列番号：８８）、Ｌ２９、（配列番号：９０）、Ｌ４８（配列番号：９２）、Ｌ６０（配列番号：９４）、Ｌ６２（配列番号：９６）、Ｌ６３（配列番号：９８）、Ｌ６５（配列番号：１００）、Ｌ６６（配列番号：１０２）、Ｌ６６（配列番号：１０４）、Ｌ６７（配列番号：１０６）、Ｌ６９（配列番号：１０８）、Ｌ７（配列番号：１１０）、Ｌ７０（配列番号：１１２）、Ｌ７２（配列番号：１１４）、Ｌ７４（配列番号：１１６）、Ｌ７５（配列番号：１１８）、Ｌ７６（配列番号：１２０）、及びＬ９（配列番号：１２２）であり、配列番号２４に記した重鎖と対になるとき、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１ ＳｕｐｅｒＴｏｐＦｌａｓｈ（ＳＴＦ）アッセイを含む種々のアッセイで、ＷＩＳＥタンパク質との結合、及びＷＩＳＥ活性の阻害において活性を有する。

部位特異的突然変異誘発による微細エピトープマッピング

アラニンスキャニングを利用して、抗体とＷＩＳＥタンパク質との接触点を決定した。ＷＩＳＥタンパク質の第１及び第３のループにおける部位特異的単一アミノ酸突然変異を、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘発キットによりＰＣＲを用いて導入した。ＤＮＡコンストラクトの配列を確認し、突然変異したタンパク質を一過的に産生するために２９３細胞にトランスフェクトした。単一アミノ酸突然変異の効果は、タンパク質発現に影響を及ぼさないことが見出された。上清及び精製タンパク質を試験し、全ての突然変異体がＭＣ３Ｔ３−Ｅ１ ＳＴＦレポーター細胞株において野性型タンパク質のようにＷｎｔシグナル伝達を阻害する能力を保持していた。

Ａｂ−Ｃ、Ａｂ−Ｅ、Ａｂ−Ａ、又はＡｂ−Ｐのような中和抗体、又は非中和抗体Ａｂ−Ｓのいずれかによる、個々のＷＩＳＥ突然変異タンパク質又は野性型タンパク質の相対的捕獲を比較して、これらの突然変異のいずれかが、抗体のＷＩＳＥタンパク質への結合に影響を及ぼすかどうかを評価した。次いで、結合したＷＩＳＥタンパク質を、ＷＩＳＥに対するＨＲＰ抱合親和性精製ポリクローナル抗体を用いて検出した。

個々の突然変異タンパク質を、機能的活性について試験して、結合に必要な残基のいずれかがＷＩＳＥタンパク質活性にも重要であるかどうかを評価した。単一突然変異体は、上記細胞ベースアッセイにおいてＴＣＦ−Ｌｕｃ発現を阻害する活性を保持していた。

個々の抗体の相対中和活性を、試験抗体の、野性型ヒトＷＩＳＥ又は突然変異体ＷＩＳＥタンパク質のいずれかによるＴＣＦ−Ｌｕｃの阻害を逆行させる能力を比較することにより得た。Ａｂ−Ｒ、Ａｂ−Ｃ、Ａｂ−Ａ、Ａｂ−Ｅ、Ａｂ−Ｕ、Ａｂ−Ｖ、Ａｂ−Ｗ、及びＡｂ−Ｔについてのデータを図１１〜１８に示す。

ブレオマイシン誘発製肺線維症のマウスモデルにおける抗ＷＩＳＥ Ｍａｂのインビボ活性

ＷＩＳＥ阻害の、疾患進行及び線維症に対する効果を、ブレオマイシン誘発製肺線維症のマウスモデルを用いて評価した。８〜１０週齢の雌Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂ）を、腹腔内経路によるＷＩＳＥ Ａｂ、ｓＴＧＦ−ベータ受容体−ｍｕＦｃ、及びｍＩｇＧ２ｂ対照アイソタイプの注射で２回（−５日目及び−３日目）前処理した。０日目に、各マウスに気管内ブレオマイシン（３．７５ｕ／ｋｇ又は生理食塩水対照）を単回投与し、続いて２週間各処理の投与レジメンＭ、Ｗ、Ｆを行った。ブレオマイシン処理の２週間（１４日）後、アベルチンを用いてマウスを麻酔し、血液／組織を以下のように採取した：右肺はＳｉｒｃｏｌコラーゲンアッセイのためにスナップ凍結（ｓｎａｐ ｆｒｏｚｅｎ）し、各マウスの左肺は膨張させ、次いで光学顕微鏡用のプレパラートにおいて１０％の中性緩衝化ホルマリン中に置いた。肺の切片をヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）並びにシリウスレッド（コラーゲンの実証）染料で染色し、免疫組織化学的方法によりアルファ平滑筋アクチン（αＳＭＡ）及び線維芽細胞特異的タンパク質１（ＦＳＰ−１又はＡ１００Ｓ４）を実証し、通例の光学顕微鏡により評価した。血清に加えて、各マウスから気管支肺胞洗浄液を、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ）を用いてオステオポンチン濃度を測定するために採取した。

Ｈ＆Ｅ染色した組織切片を、半定量的尺度（０＝存在しない、１＝≦１０％の肺が罹患、２＝１１％〜３３％の肺が罹患、３＝３４％〜６７％の肺が罹患、及び４＝＞６７％の肺が罹患）で、肺胞虚脱／硬化により特徴付けた肺組織の量について点数化した。したがって、肺胞虚脱／硬化により影響を受けていない肺の領域の肺胞及び間質性変化の重篤度を、半定量的尺度（０＝存在しない、１＝最低限、２＝軽度、３＝中程度、及び４＝重篤）により重篤度について点数化した。合計Ｈ＆Ｅスコアは、これらの２種のスコアの合計を表した。全てのスライドを、少なくとも２日に分けられた２回の別々の機会において、処理群を知ることなく評価した。最終Ｈ＆Ｅスコアを、これらの２日間に決定したスコアの平均として取った。

肺切片はシリウスレッドにより染色され、免疫組織化学的方法によりαＳＭＡ又はＦＳＰ−１を実証するために特異的染色の程度を評価し、半定量的尺度（０＝存在しない、１＝最低限、２＝軽度、３＝中程度、及び４＝重篤）によりスコアを割り当てた。全てのスライドを少なくとも２日に分けられた２回の別々の機会において、処理群を知ることなく評価した。各パラメータについての最終スコアを、これらの２日間に決定したスコアの平均として取った。

最初の研究では、２種の抗ＷＩＳＥ抗体Ａｂ−Ｃ（２０ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝１０）及びＡｂ−Ｅ（２０ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝１０）を用い、ｍＩｇＧ１（ｎ＝１０）、及びＩｇＧ２ｂ（ｎ＝１０）対照ＩｇＧの両方を用いた。Ａｂ−Ｃ及びＡｂ−Ｅについての結果は類似しており、よってデータを抗ＷＩＳＥ Ｍａｂとしてプールし；２種のＩｇＧ対照についての結果は類似しており、よってデータをＩｇＧ対照としてプールした。結果を図２８、２９、３０、３１に示す。抗ＷＩＳＥ抗体によるマウスの予防的処理は、Ｈ＆Ｅスコア（図２８）、Ｓｉｒｃｏｌコラーゲンアッセイにより測定されたコラーゲン沈着（図２９）、筋線維芽細胞マーカーアルファ平滑筋アクチンの発現（免疫組織化学によるａＳＭＡ、図３０）、及び最後にＥＬＩＳＡにより測定された血清中オステオポンチン濃度（図３１）に基づいて肺損傷を著しく減少させた。同様に、シリウスレッド染色及びＦＳＰ１の発現もまた、ＷＩＳＥ抗体処理により著しく減少した。これらのパラメータはまた、５ｍｇ／ｋｇのｓＴＧＦｂＲ＿ｍＦｃによっても減少したが、その効果は、抗ＷＩＳＥ抗体で観察されたものより少なかった。

２番目の研究では、抗ＷＩＳＥ抗体Ａｂ−Ｃ（２日毎に２０ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝２０）及びｍＩｇＧ２ｂ（２日毎に２０ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝２０）対照ＩｇＧを用いた。可溶性ＴＧＦベータ受容体マウスＦｃタンパク質（２日毎に３ｍｇ／ｋｇ）を陽性対照として用いた。結果を図３２〜３３に示す。目的は、最初の研究中に観察されたコラーゲン沈着の差異の観点で、多数の動物を用いてコラーゲン沈着に対する影響を評価することである。抗ＷＩＳＥ抗体Ｃによるマウスの予防的処理は、Ｓｉｒｃｏｌコラーゲンアッセイにより測定されたコラーゲン沈着を著しく減少させた（ＩｇＧ２ｂ対照に対して約５０％）（図３２）。マウスの部分集合からの気管支肺胞洗浄液（Ｂｒｏｃｈｏａｌｖｅｏｌａｒ ｌａｖａｒｇｅ ｆｌｕｉｄ）も採取し、図３３に示すように、抗ＷＩＳＥ Ａｂ−ＣはＢＡＬ ＯＰＮ濃度を著しく減少させた。加えて、組織傷害又は線維症のいくつかの可溶性マーカーは、ブレオマイシン（ｂｅｌｏｍｙｃｉｎ）注射時に増加したが、ＩｇＧ２ｂで処理したものに対してＡｂ−Ｃ処理マウスのＢＡＬ液では著しく減少し、例えばＭＭＰ９、ＶＥＧＦ、ＩＰ１０、ＭＩＰ−２、ＭＩＰ−１ガンマ、及びＩｇＡが挙げられる。ＢＡＬ液を回収したマウスは形態が良好に保存されないため、全ての肺サンプルを組織学的研究のために採取した訳ではなく、よって３番目の研究を実施してそれを評価した。

３番目の研究では、抗ＷＩＳＥ Ａｂ−Ｃ（２０ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝２０）及びｍＩｇＧ２ｂ（ｎ＝２０）対照ＩｇＧを用いた。ａＳＭＡ、ＦＳＰ１のＨ＆Ｅ、シリウスレッド染色、及びＩＨＣを用いた評価を実施した。抗ＷＩＳＥ抗体Ｃによるマウスの予防的処理は、Ｈ＆Ｅスコア（図３４）、シリウスレッドにより測定されたコラーゲン沈着（図３５）、筋線維芽細胞マーカーＦＳＰ１の発現（図３６）、及びアルファ平滑筋アクチン（免疫組織化学によるａＳＭＡ、図３７）の発現、並びにＥＬＩＳＡにより測定された血清中オステオポンチン濃度低下（図３８）に基づいて肺損傷を減少させた。ｓｉｒｃｏｌコラーゲンアッセイにより測定されたＩｇＧ対照群におけるコラーゲン沈着は、最初の研究及び２番目の研究で報告されたものの２倍であり、よってこれらのマウスは前の２つの研究よりも重篤な疾患を有することに留意すべきである（新しいバッチのブレオマイシンを用いた）。

これらのデータは、抗ＷＩＳＥ抗体処理が、予防的に、肺傷害、コラーゲン沈着、及び筋線維芽細胞マーカー、並びにブレオマイシン誘発性肺線維症モデルにおけるＢＡＬ液及び血清中のオステオポンチン濃度を減少させ得ることを示した。ＯＰＮはヒトＩＰＦサンプルで大きく上方調節され（Ｐａｒｄｏ ｅｔ ａｌ ＰＬＯＳ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２００５ Ｖｏｌｕｍｅ ２，Ｐａｇｅ ０８９１−０９０３；Ｋａｄｏｔａ ｅｔ ａｌ．Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｖｏｌｕｍｅ ９９，Ｉｓｓｕｅ １，Ｊａｎｕａｒｙ ２００５，Ｐａｇｅｓ １１１−１１７）、ＯＰＮ自体のノックアウトによりブレオマイシンモデル及び片側尿管閉塞（ＵＵＯ）誘発性腎線維症モデル、シクロスポリン誘発性腎毒性モデルを含むいくつかの線維症モデルにおいて線維症が減少したことに留意することは興味深い。加えて、ＯｐｎノックアウトマウスはＬＰＳ注射に応答してタンパク尿を発症させず、Ｏｐｎノックアウトマウスは糖尿病誘発性タンパク尿及び糸球体間質膨張から保護された（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌｕｍｅ ２４，Ｎｕｍｂｅｒ ３，Ｍａｒｃｈ，２００１ ２６４−２７１；Ｂｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｌｕｎｇ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２８６：Ｌ１３１１−Ｌ１３１８，２００４；Ｍａｚｚａｌｉ ｅｔ ａｌ Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（２００２） ６２，７８−８５；Ｙｏｏ ｅｔ ａｌ．Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（２００６） ７０，１７３５−１７４１；Ｌｏｒｅｎｚｅｎ ＪＡＳＮ，Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．５．（Ｍａｙ ２００８），ｐｐ．８８４−８９０）。よってＷＩＳＥ Ａｂ処理は、腎臓及び肺傷害、並びに関連線維症を含む種々の障害の治療に利用できる可能性がある。

加えて、オステオポンチン（ＯＰＮ）血漿濃度の上昇は、進行した非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）において高度に予後的であり（２００６ ＡＳＣＯ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ａｂｓｔｒａｃｔ ７１９８）、ＯＰＮはインテグリンの活性化及び癌細胞の生存を促進し得ることが示されている（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００７ Ｍａｒ １；６７（５）：２０８９−９７）。ＯＰＮはまた、腫瘍転移を促進する可能性があり、種々の種類の癌におけるオステオポンチン濃度の上昇は、不良予後に関連する（Ｅｌ−Ｔａｎａｎｉ ＭＫ Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ．２００８ Ｍａｙ １；１３：４２７６−８４；Ｊｏｈｎｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ．２００８ Ｍａｙ １：１３：４３６１−４３７２により概説）。よって、ＷＩＳＥ結合剤はまた、腫瘍におけるオステオポンチン発現を低下させる能力を通して癌細胞の生存及び転移を減少させる可能性がある。

Ｃｏｌ４ａ３ ＫＯマウスにおけるタンパク尿に対する抗ＷＩＳＥ抗体処理の効果

Ｃｏｌ４ａ３ ＫＯマウス（１２９−Ｃｏｌ４ａ３＜ｔｍ１Ｄｅｃ＞／Ｊ）をＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手した。Ｃｏｌ４ａ３マウスは５週齢で始まる重篤なタンパク尿を発症し、１０週又はそれ以上で、徐々に末期腎疾患を発症する。タンパク尿が発症した後の抗ＷＩＳＥ抗体処理の影響を評価するために、４３日齢（６週）で、１日おきに２０ｍｇ／ｋｇの抗ＷＩＳＥ抗体Ａｂ−Ｃ若しくはＡｂ−Ｅ又はビヒクルを用いて（ＩＰ）処理を開始した。処理を１４日間続けた。各群（ｎ＝１２）は、研究期間中６回注射を受けた。４２日（処理１日前）、４８日、５２日、及び５７日目に、代謝ケージ内で尿のサンプルを集めた。２４時間全尿タンパク質（ＵＴＰ）の排出を、製造業者の指示書に従って、Ａｌｂｕｗｅｌｌ Ｍ（Ｅｘｏｃｅｌｌ Ｉｎｃ．）を用いて測定し、尿の体積について調節した。図３９は、２４時間全尿タンパク質（ＵＴＰ）が、ビヒクル処理群に比べて、抗ＷＩＳＥ処理群で統計的に有意に減少したことを示す。ＷＩＳＥ ＫＯマウスで報告された観察とともに、このデータは、糸球体腎炎、膜性腎症、糖尿病性腎症、及び移植関連腎症のような種々の腎臓疾患における一般的な徴候であるタンパク尿の減少における抗ＷＩＳＥ剤の潜在的利用性を示唆する。

Claims (18)

1. 第一の可変領域及び第二の可変領域を含む単離抗体又はその抗原結合断片であって、各可変領域は、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、前記ＣＤＲは
   （ａ）Ａｂ−Ａに由来する、配列番号９に示されるヌクレオチドによりコードされる軽鎖に由来するＣＤＲ、及び、配列番号１１に示されるヌクレオチドによりコードされる重鎖に由来するＣＤＲ；
   （ｂ）Ａｂ−Ｃに由来する、配列番号１７に示されるヌクレオチドによりコードされる軽鎖に由来するＣＤＲ、及び、配列番号１９に示されるヌクレオチドによりコードされる重鎖に由来するＣＤＲ；
   （ｃ）Ａｂ−Ｅに由来する、配列番号２５に示されるヌクレオチドによりコードされる軽鎖に由来するＣＤＲ、及び、配列番号２７に示されるヌクレオチドによりコードされる重鎖に由来するＣＤＲ；
   （ｄ）Ａｂ−Ｊに由来する、配列番号４１に示されるヌクレオチドによりコードされる軽鎖に由来するＣＤＲ、及び、配列番号４３に示されるヌクレオチドによりコードされる重鎖に由来するＣＤＲ；
   （ｅ）Ａｂ−Ｎに由来する、配列番号１２１に示されるヌクレオチドによりコードされる軽鎖に由来するＣＤＲ、及び、配列番号２３に示されるヌクレオチドによりコードされる重鎖に由来するＣＤＲ；
   （ｆ）Ａｂ−Ｒに由来する、配列番号５３に示されるヌクレオチドによりコードされる軽鎖に由来するＣＤＲ、及び、配列番号５１に示されるヌクレオチドによりコードされる重鎖に由来するＣＤＲ；及び
   （ｇ）Ａｂ−Ｐに由来する、配列番号４９に示されるヌクレオチドによりコードされる軽鎖に由来するＣＤＲ、及び、配列番号４７に示されるヌクレオチドによりコードされる重鎖に由来するＣＤＲ
   からなる群から選択され、前記抗体又はその抗原結合断片は、ヒトＷＩＳＥに結合する、抗体又はその抗原結合断片。
2. 以下のパラメータ：組織傷害、シリウスレッド染色又はコラーゲン産生、ａＳＭＡ又はＦＳＰ−１から選択される筋線維芽細胞マーカーの発現、オステオポンチンの発現、及びタンパク尿のうち少なくとも１つを減少させることができ、並びに／又は細胞ベースアッセイにおいてＷＩＳＥの阻害作用をブロックできる、請求項１に記載の単離抗体又はその抗原結合断片。
3. 配列番号２のおおよそアミノ酸７５〜１０４に位置するＷＩＳＥのループ１エピトープに結合する、請求項１に記載の単離抗体又はその抗原結合断片。
4. 配列番号２のおおよそアミノ酸１３４〜１７０に位置するＷＩＳＥのループ３エピトープに結合する、請求項１に記載の単離抗体又はその抗原結合断片。
5. 配列番号２の多重切断ヒトＷＩＳＥタンパク質から本質的になるエピトープであって、配列番号２のアミノ酸１〜７０、１１３〜１２６、及び１７１〜２０６をＷＩＳＥタンパク質から欠くエピトープであるＷＩＳＥのＴ４９エピトープ、又は配列番号２の多重切断ヒトＷＩＳＥタンパク質から本質的になるエピトープであって、配列番号２のアミノ酸１〜７０、１２２〜１２６、及び１７１〜２０６をＷＩＳＥタンパク質から欠くエピトープであるＷＩＳＥのＴ５６．１エピトープに結合する、請求項１に記載の単離抗体又はその抗原結合断片。
6. ＷＩＳＥに結合する前記抗体が、配列番号２のアミノ酸残基８１のスレオニン、配列番号２のアミノ酸残基８３のチロシン、配列番号２のアミノ酸残基８４のイソロイシン、及び配列番号２のアミノ酸残基９７のグルタミン酸から成る群から選択される１個以上のアミノ酸を必要とする、請求項３に記載の単離抗体又はその抗原結合断片。
7. ＷＩＳＥに結合する前記抗体が、配列番号２のアミノ酸残基１５４のスレオニン、配列番号２のアミノ酸残基１５５のチロシン、及び配列番号２のアミノ酸残基１５７のイソロイシンから成るリストから選択される１個以上のアミノ酸を必要とする、請求項４に記載の単離抗体又はその抗原結合断片。
8. 重鎖を含む請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片であって、前記重鎖が、配列番号２４又は配列番号５２に示す配列を有するポリペプチドを含む、単離抗体又はその抗原結合断片。
9. 軽鎖を含む請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片であって、前記軽鎖が、配列番号２２又は配列番号５４に示す配列を有するポリペプチドを含む、単離抗体又はその抗原結合断片。
10. 重鎖及び軽鎖の両方を含む請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片であって、前記重鎖が配列番号２４に示す配列を有するポリペプチドを含み、並びに前記軽鎖が配列番号１２２の配列から選択される配列を有するポリペプチドを含む、単離抗体又はその抗原結合断片。
11. 重鎖及び軽鎖の両方を含む請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片であって、前記重鎖が配列番号５２に示す配列を有するポリペプチドを含み、前記軽鎖が配列番号５４に示す配列を有するポリペプチドを含む、単離抗体又はその抗原結合断片。
12. 線維症に付随する病状を治療する方法で使用するための、ＷＩＳＥに対して１×１０^−７Ｍ未満の親和性を有し、並びにＷＩＳＥ活性を阻害する請求項１〜１１のいずれか１項に記載の単離抗体又はその抗原結合断片。
13. 線維症が肺疾患に付随する、請求項１２に記載の抗体又はその抗原結合断片。
14. 線維症が腎臓疾患に付随する、請求項１２に記載の抗体又はその抗原結合断片。
15. タンパク尿に付随する病状を治療する方法で使用するために好適である、ＷＩＳＥに対して１×１０^−７Ｍ未満の親和性を有し、並びにＷＩＳＥ活性を阻害する請求項１〜１２のいずれか１項に記載の単離抗体又はその抗原結合断片。
16. ヒトＷＩＳＥに結合する抗体又は抗原結合断片と、薬剤的に許容可能な担体、賦形剤、又は希釈剤とを含む医薬組成物であって、前記抗体又は抗原結合断片は、それぞれ３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、第一の可変領域及び第二の可変領域を含み、前記ＣＤＲは、
    Ａｂ−Ｃに由来する、配列番号１７に示されるヌクレオチドによりコードされる軽鎖に由来するＣＤＲ、及び、配列番号１９に示されるヌクレオチドによりコードされる重鎖に由来するＣＤＲ；及び
    Ａｂ−Ｅに由来する、配列番号２５に示されるヌクレオチドによりコードされる軽鎖に由来するＣＤＲ、及び、配列番号２７に示されるヌクレオチドによりコードされる重鎖に由来するＣＤＲ
    から選択される、腎臓及び肺傷害、並びに関連線維症を含む疾患又は腫瘍の治療のための医薬組成物。
17. Ｆｃ、ＰＥＧ、アルブミン、及びトランスフェリンの少なくとも１種に抱合された、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の単離抗体又はその抗原結合断片。
18. 阻害抗体の産生に用いるために好適であるＷＩＳＥの免疫原性ポリペプチドであって、前記抗体が１×１０^−７未満の親和性で完全長ヒトＷＩＳＥに結合し、以下のパラメータ：組織傷害、シリウスレッド染色又はコラーゲン産生、ａＳＭＡ又はＦＳＰ−１から選択される筋線維芽細胞マーカーの発現、オステオポンチンの発現、及びタンパク尿のうち少なくとも１つを減少させることができ、並びに／又は細胞ベースアッセイにおいてＷＩＳＥの阻害作用をブロックでき、前記免疫原性ペプチドは、配列番号２のおおよそアミノ酸７５〜１０４に位置するＷＩＳＥのループ１エピトープ、配列番号２のおおよそアミノ酸１３４〜１７０に位置するＷＩＳＥのループ３エピトープ、配列番号２の多重切断ヒトＷＩＳＥタンパク質から本質的になるエピトープであって、配列番号２のアミノ酸１〜７０、１１３〜１２６、及び１７１〜２０６をＷＩＳＥタンパク質から欠くエピトープであるＷＩＳＥのＴ４９エピトープ、及び配列番号２の多重切断ヒトＷＩＳＥタンパク質から本質的になるエピトープであって、配列番号２のアミノ酸１〜７０、１２２〜１２６、及び１７１〜２０６をＷＩＳＥタンパク質から欠くエピトープであるＷＩＳＥのＴ５６．１エピトープからなる群から選択される、免疫原性ポリペプチド。

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