ES2340662T3 - Factor de crecimiento de fibroblastos (fgf23) nuevo procedimiento para el uso. - Google Patents

Factor de crecimiento de fibroblastos (fgf23) nuevo procedimiento para el uso. Download PDF

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Ken White
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Abstract

Un ácido nucleico aislado que comprende ID. SEC. Nº 1, codificando dicho ácido nucleico un factor 23 de crecimiento de fibroblastos (FGF23).

Description

Factor de crecimiento de fibroblastos (FGF23) nuevo y procedimientos para el uso.
Antecedentes de la invención
Las afecciones en las que los niveles séricos de fosfato están reducidos o aumentados, denominadas hipofosfatemia e hiperfosfatemia, respectivamente, están asociadas con un grupo grande y diverso de enfermedades clínicamente significativas. La hipofosfatemia, que con frecuencia es el resultado de la pérdida renal de fosfato, es causada por una serie de trastornos genéticos que incluyen el raquitismo hipofosfatémico ligado al cromosoma X (XLH), el raquitismo hipofosfatémico hereditario con hipercalciuria (HHRH), la enfermedad hipofosfatémica de los huesos (HBD) y el raquitismo hipofosfatémico autosómico dominante (ADHR). La hiperfosfatemia, observada en pacientes con insuficiencia renal leve y calcinosis tumoral, puede estar asociada frecuentemente con la calcificación de tejidos blandos, el hiperparatiroidismo secundario, el hiperparatiroidismo terciario y otros trastornos metabólicos.
No se conocen bien los mecanismos moleculares por medio de los que se mantienen las concentraciones adecuadas de fosfato en el suero. La identificación de los genes responsables de los trastornos heredados que implican perturbaciones en la homeostasis del fosfato puede proporcionar conocimientos sobre las vías que regulan el equilibrio del fosfato. Actualmente, a pesar de las características clínicas evidentes en los pacientes con afecciones hipofosfatémicas e hiperfosfatémicas, no se dispone de marcadores moleculares útiles en el diagnóstico temprano, la clasificación y la estadificación de estos trastornos. Asimismo, la actual carencia de procedimientos eficaces de tratamiento para los pacientes con trastornos hipofosfatémicos e hiperfosfatémicos presenta una necesidad de terapias alternativas. La presente invención satisface estas necesidades.
El documento WO 01/66595 forma la técnica anterior a tenor del Artículo 54(3) del CPE y se refiere al factor de crecimiento de fibroblastos humano.
Econs M. J. y col., J. Clin. Invest., volumen 100, 1997, páginas 2653-2657 dan a conocer que el raquitismo hipofosfatémico autosómico dominante está ligado al cromosoma 12p13.
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Breve resumen de la invención
La invención incluye un ácido nucleico aislado que codifica FGF23 como se reivindica en las reivindicaciones 1 y 15.
En un aspecto, el ácido nucleico aislado que codifica FGF23 comparte al menos aproximadamente el 99% de similitud de secuencia con la secuencia del ácido nucleico de ID. SEC. Nº 1.
La invención también ilustra un ácido nucleico aislado que codifica FGF23, ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que comparte al menos el 40% de similitud de secuencia con una secuencia de aminoácidos de al menos una de ID. SEC. Nº 2 e ID. SEC. Nº 4.
En una forma de realización de preferencia, el ácido nucleico aislado de la invención está incluido en el depósito DSMZ con número de depósito DSM 13530.
En un aspecto de la invención, el ácido nucleico aislado que codifica FGF23 está unido de manera covalente a un ácido nucleico que codifica un polipéptido marcador. En una forma de realización de preferencia, el polipéptido marcador es un polipéptido marcador myc, un polipéptido marcador de glutatión S-transferasa, un polipéptido marcador de proteína fluorescente verde, un polipéptido marcador myc-piruvato cinasa, un polipéptido marcador His6, un polipéptido marcador de hemaglutinina del virus de la gripe, un polipéptido marcador "flag" o un polipéptido marcador de proteína de unión a la maltosa.
La invención también incluye un ácido nucleico que codifica FGF23, estando el ácido nucleico unido de manera operativa a un ácido nucleico que especifica una secuencia promotora/reguladora.
La invención incluye además un vector que comprende un ácido nucleico aislado que codifica FGF23. En una forma de realización de preferencia, el vector comprende un ácido nucleico aislado que codifica FGF23 unido de manera operativa a una secuencia promotora/reguladora.
La invención incluye además una célula recombinante como la de la reivindicación 8 ó 9 que comprende un ácido nucleico aislado que codifica FGF23 o un vector que lo comprende.
La invención incluye un ácido nucleico aislado complementario a un ácido nucleico que codifica FGF23 según se define en las reivindicaciones, estando el ácido nucleico complementario en una orientación antisentido. Se ilustran ácidos nucleicos complementarios que comparten al menos el 50% de similitud de secuencia con un ácido nucleico complementario con un ácido nucleico que tiene la secuencia de al menos una de ID. SEC. Nº 1 e ID. SEC. Nº 3. También está incluido en la invención un vector que comprende el ácido nucleico complementario reivindicado, así como un vector que comprende el ácido nucleico complementario unido de manera operativa a un ácido nucleico que especifica una secuencia promotora/reguladora.
La invención incluye además una célula recombinante que comprende el ácido nucleico complementario y los vectores que lo comprenden.
La invención incluye un mamífero no humano transgénico que comprende un ácido nucleico aislado que codifica FGF23 según se define en las reivindicaciones.
La invención incluye además un polipéptido aislado que comprende FGF23 según se define en la reivindicación 18. La invención ilustra un polipéptido aislado que comparte al menos aproximadamente el 40% de similitud de secuencia con una secuencia de aminoácidos de al menos una de ID. SEC. Nº 2 e ID. SEC. Nº 4. La invención incluye un anticuerpo que se une específicamente con un polipéptido FGF23 según se define en las reivindicaciones. En una forma de realización de preferencia, el anticuerpo es un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico o un anticuerpo sintético.
La invención incluye además un ácido nucleico aislado que codifica FGF23 según se define en las reivindicaciones, en el que el ácido nucleico comprende una mutación. En una forma de realización de preferencia, la mutación confiere mayor estabilidad a FGF23. De más preferencia, la mutación afecta al aminoácido 176 (arginina) con relación a ID. SEC. Nº 2 o el aminoácido 179 (arginina) con relación a ID. SEC. Nº 2. Aún de más preferencia, la mutación se selecciona del grupo constituido por 527G > A, 535C > T y 536G > A con relación a ID. SEC. Nº 1.
La invención también incluye un polipéptido FGF23 según se define en las reivindicaciones, que comprende una mutación. En una forma de realización de preferencia, el polipéptido FGF23 comprende una mutación que confiere mayor estabilidad. De más preferencia, la mutación está en el aminoácido 176 (arginina) con relación a ID. SEC. Nº 2 o es una mutación en el aminoácido 179 (arginina) con relación a ID. SEC. Nº 2.
La invención incluye un inhibidor de FGF23. El inhibidor puede ser una molécula que reduzca el nivel de ARNm que codifica el polipéptido FGF23, una molécula que reduzca el nivel del polipéptido FGF23 o una molécula que reduzca una actividad biológica de FGF23, según se define en la reivindicación 23. El inhibidor es un anticuerpo según se define en la reivindicación 23 o una molécula de ARN bicatenario que sirve para reducir el nivel de ARNm de FGF23 por interferencia de ARN. De más preferencia, el inhibidor es un anticuerpo que se une específicamente con FGF23 o un anticuerpo que se une específicamente con un receptor de FGF23.
La invención incluye una composición que comprende un ácido nucleico aislado que codifica FGF23 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
La invención también incluye una composición que comprende un ácido nucleico aislado complementario a un ácido nucleico que codifica FGF23 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
La invención también incluye una composición que comprende un polipéptido FGF23 aislado y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
La invención también incluye una composición que comprende un anticuerpo que se une específicamente con FGF23 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
La invención también incluye una composición que comprende un ácido nucleico aislado que codifica una forma mutante de FGF23 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
La invención también incluye una composición que comprende un ácido nucleico aislado que codifica una forma mutante de FGF23 con mayor estabilidad y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
La invención también incluye una composición que comprende un ácido nucleico aislado que codifica una forma mutante de FGF23 que comprende una mutación en el aminoácido 176 (arginina) con relación a ID. SEC. Nº 2 o una mutación en el aminoácido 179 (arginina) con relación a ID. SEC. Nº 2 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
La invención también incluye una composición que comprende un polipéptido FGF23 aislado que comprende una mutación y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
La invención también incluye una composición que comprende un polipéptido FGF23 aislado que comprende una mutación que confiere mayor estabilidad y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
La invención también incluye una composición que comprende un polipéptido FGF23 aislado que comprende una mutación en el aminoácido 176 (arginina) con relación a ID. SEC. Nº 2 o una mutación en el aminoácido 179 (arginina) con relación a ID. SEC. Nº 2 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
La invención también incluye una composición que comprende un inhibidor de FGF23 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
La invención incluye además un procedimiento in vitro para diagnosticar un trastorno hipofosfatémico en un mamífero según se define en las reivindicaciones. El procedimiento comprende (b) poner una muestra biológica definida de dicho mamífero en contacto con un reactivo que detecte la presencia o la ausencia de una mutación en un ácido nucleico que codifica FGF23, en el que la presencia de una mutación es una indicación de que el mamífero está afectado por el trastorno hipofosfatémico, diagnosticando de ese modo el trastorno hipofosfatémico en el mamífero.
En una forma de realización de preferencia, el trastorno hipofosfatémico es el raquitismo hipofosfatémico autosómico dominante (ADHR).
En otra forma de realización de preferencia, la muestra biológica es sangre u orina.
En aún otra forma de realización de preferencia, el reactivo es un ácido nucleico. De más preferencia, el reactivo está marcado de manera detectable. Los marcadores de preferencia incluyen un radioisótopo, un compuesto bioluminescente, un compuesto quimioluminiscente, un compuesto fluorescente, un quelato de metales y una enzima.
La invención incluye además un procedimiento in vitro para diagnosticar un trastorno hipofosfatémico en un mamífero según se define en las reivindicaciones. El procedimiento comprende poner una muestra biológica de dicho mamífero en contacto con un reactivo que detecte la presencia o la ausencia de una forma mutante del polipéptido FGF23, en el que la presencia de una forma mutante del polipéptido FGF23 es una indicación de que el mamífero está afectado por el trastorno hipofosfatémico, diagnosticando de ese modo el trastorno hipofosfatémico en el mamífero.
En una forma de realización de preferencia, el trastorno hipofosfatémico es el raquitismo hipofosfatémico autosómico dominante (ADHR).
En otra forma de realización de preferencia, la muestra biológica es sangre u orina.
En aún otra forma de realización de preferencia, el reactivo es un anticuerpo.
La invención incluye un procedimiento in vitro para diagnosticar un trastorno hipofosfatémico en un mamífero. El procedimiento comprende (b) poner una muestra biológica definida de dicho mamífero en contacto con el reactivo que detecte el nivel de polipéptido FGF23 en la muestra, en el que un nivel elevado de polipéptido FGF23 en la muestra, con relación al nivel de polipéptido FGF23 en un mamífero de control, es una indicación de que el mamífero está afectado por el trastorno hipofosfatémico, diagnosticando de ese modo el trastorno hipofosfatémico en el mamífero.
En una forma de realización de preferencia, el trastorno hipofosfatémico se selecciona del grupo constituido por el raquitismo hereditario ligado al cromosoma X (XLH), el raquitismo hipofosfatémico hereditario (HHRH), la enfermedad hipofosfatémica de los huesos (HBD), el raquitismo hipofosfatémico autosómico dominante (ADHR), la osteomalacia inducida por tumores, el síndrome del nevus epidérmico, la displasia fibrosa o la nefrolitiasis.
En otra forma de realización de preferencia, la muestra biológica es sangre u orina.
En aún otra forma de realización de preferencia, el reactivo es un anticuerpo para FGF23. De más preferencia, el reactivo está marcado de manera detectable. Los marcadores de preferencia incluyen un radioisótopo, un compuesto bioluminescente, un compuesto quimioluminiscente, un compuesto fluorescente, un quelato de metales y una enzima. La invención incluye además un procedimiento in vitro para diagnosticar en un paciente la osteomalacia inducida por tumores. El procedimiento comprende detectar la expresión o la falta de expresión de FGF23 en una muestra del tumor obtenida del paciente, en el que la expresión de FGF23 es indicativa de que el paciente tiene osteomalacia inducida por el tumor.
La invención también incluye el uso de la reivindicación 47 con respecto al trastorno hipofosfatémico en un mamífero.
El inhibidor capaz de dicho uso puede ser un inhibidor que reduzca el nivel de ARNm que codifica el polipéptido FGF23 en dicho mamífero, un inhibidor que reduzca el nivel del polipéptido FGF23 en dicho mamífero o un inhibidor de la actividad biológica de FGF23 en dicho mamífero, según se define en las reivindicaciones.
En una forma de realización de preferencia, el trastorno hipofosfatémico es el raquitismo hereditario ligado al cromosoma X (XLH), el raquitismo hipofosfatémico hereditario (HHRH), la enfermedad hipofosfatémica de los huesos (HBD), el raquitismo hipofosfatémico autosómico dominante (ADHR), la osteomalacia inducida por tumores, el síndrome del nevus epidérmico, la displasia fibrosa o la nefrolitiasis.
En otra forma de realización de preferencia, el inhibidor es un ácido nucleico complementario, una ribozima o un anticuerpo.
La invención ilustra además un procedimiento para tratar un trastorno hiperfosfatémico en un mamífero. El procedimiento comprende administrar a un mamífero afectado por el trastorno una cantidad terapéuticamente eficaz de un ácido nucleico aislado que codifica FGF23.
El ácido nucleico aislado puede comprender una mutación que confiere mayor estabilidad al polipéptido FGF23 codificado por el mismo.
El trastorno hiperfosfatémico puede ser la insuficiencia renal leve o la calcinosis tumoral.
La invención también ilustra un procedimiento para tratar un trastorno hiperfosfatémico en un mamífero. El procedimiento comprende administrar a un mamífero afectado por el trastorno una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido FGF23 aislado.
El polipéptido aislado FGF23 puede comprender una mutación que confiere mayor estabilidad.
El trastorno hiperfosfatémico puede ser la insuficiencia renal leve o la calcinosis tumoral.
La invención ilustra además un procedimiento para tratar un trastorno hiperfosfatémico en un mamífero. El procedimiento comprende administrar al mamífero afectado por el trastorno una cantidad terapéuticamente eficaz de un reactivo que aumente el nivel del polipéptido FGF23 en el mamífero.
El reactivo puede inhibir la degradación del polipéptido FGF23.
El trastorno hiperfosfatémico puede ser la insuficiencia renal leve o la calcinosis tumoral.
La invención ilustra además un procedimiento para tratar un trastorno hiperfosfatémico en un mamífero. El procedimiento comprende administrar a un mamífero afectado por el trastorno una cantidad terapéuticamente eficaz de una población de células que comprenden un ácido nucleico aislado que codifica FGF23.
El ácido nucleico aislado puede comprender una mutación que confiere mayor estabilidad al FGF23 codificado por el mismo.
El trastorno hipofosfatémico puede ser la insuficiencia renal leve o la calcinosis tumoral.
La invención incluye un procedimiento para tratar la osteoporosis en un mamífero. El procedimiento comprende administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente eficaz de un FGF23 o de un reactivo que aumente el nivel del polipéptido FGF23 en el mamífero.
La invención ilustra además un procedimiento para tratar una afección que implica el depósito de calcio y de fosfato en las arterias o en los tejidos blandos de un mamífero. El procedimiento comprende administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente eficaz de FGF23 o de un reactivo que aumente el nivel del polipéptido FGF23. La afección puede ser la dermatomiositis.
La invención incluye un procedimiento para tratar la arteriopatía coronaria en un mamífero. El procedimiento comprende administrar a las células de la arteria coronaria de un mamífero afectado un ácido nucleico que codifica un FGF23.
La invención también incluye un kit para diagnosticar un trastorno hipofosfatémico en un mamífero. El kit comprende un reactivo que detecta la presencia o la ausencia de una mutación en la secuencia del ácido nucleico que codifica FGF23, siendo la presencia de la mutación una indicación de que el mamífero está afectado por el trastorno hipofosfatémico. El kit comprende además un aplicador y un material instructivo para el uso del mismo.
La invención también ilustra un kit para diagnosticar un trastorno hipofosfatémico en un mamífero. El kit comprende un reactivo que detecta el nivel del polipéptido FGF23, siendo un nivel elevado del polipéptido FGF23 una indicación de que el mamífero está afectado por el trastorno hipofosfatémico. El kit comprende además un aplicador y un material instructivo para el uso del mismo.
La invención también ilustra un kit para diagnosticar un trastorno hipofosfatémico en un mamífero. El kit comprende un reactivo que detecta la presencia o la ausencia de una forma mutante de un polipéptido FGF23, siendo la presencia de la forma mutante de FGF23 una indicación de que el mamífero está afectado por el trastorno hipofosfatémico. El kit comprende además un aplicador y un material instructivo para el uso del mismo.
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Breve descripción de las diversas vistas de los dibujos
El resumen anterior, así como la siguiente descripción detallada de las formas de realización de preferencia de la invención, se entenderán mejor cuando se lean conjuntamente con los dibujos adjuntos. Con el objeto de ilustrar la invención, en los dibujos se muestran las formas de realización actualmente preferidas. Debe entenderse, sin embargo, que la invención no está limitada a las disposiciones y a los instrumentos precisos que se muestran.
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En los dibujos:
La Figura 1A es un diagrama que representa el análisis de ligamiento dentro de los linajes de dos diferentes familias con ADHR (1406 y 1478).
La Figura 1B es una serie de diagramas de linajes y de imágenes de los geles de agarosa que representan el análisis de mutaciones en tres diferentes familias con ADHR (1406, 1478 y 2318).
La Figura 2 es un diagrama que representa un mapa físico de la región de ADHR. La posición de los marcadores de ADN y los cromosomas artificiales BACs/PACs se dibujan a escala según la estimación por los datos de secuencia inacabados (Baylor College of Medicine Human Genome Sequencing Center). Las flechas indican huecos en la secuencia genómica entre el clon RP11-303E5 y RP11-320N7, y el clon RP11-103A11 y RP11-935C2. Se indican las posiciones aproximadas de los genes entre D12S1624 y D12S1594 y de GPR46 y GDF2.
Las Figuras 3A a 3C son una alineación de las secuencias de aminoácidos de FGF23 y de otros miembros de la familia de FGF de mamíferos (ID. SEC. Nº 14-34 en el orden en que aparecen en la figura). La alineación está limitada a la secuencia central que está constituida por doce hebras beta antiparalelas. Las ubicaciones de los segmentos con la conformación de lámina beta en la estructura cristalina de FGF-2 están subrayadas. Las dos argininas que están mutadas en FGF23 (figura 3C; indicadas por los asteriscos) están conservadas dentro del homólogo de FGF23 del ratón. La alineación se generó con CLUSTAL y PRETTYBOX. El FGF23 humano y de ratón se identificó por el perfil de FGF de la base de datos PFAM (4,6e-14,1,9e-16). Comparten del 25% al 36% de similitud de aminoácidos con los otros miembros de la familia de FGF en la secuencia central común.
La Figura 4A es una imagen de un gel de agarosa que representa la expresión tisular de FGF23. El análisis de RT-PCR del ARN de los tejidos humanos usando cebadores que abarcan el intrón reveló un producto de 650 pares de bases en el corazón (Co), hígado (H), tiroides/paratiroides (TP), intestino delgado (ID), testículo (T) y en músculo esquelético (ME) humanos, mientras que el cerebro (Ce) y el riñón (R) resultaron negativos.
La Figura 4B es una imagen de una transferencia Northern que representa la expresión de FGF23 en múltiples líneas celulares de cáncer después de una exposición de 7 días. Se observaron transcripciones de 3 y 1,3 kb bajo condiciones rigurosas de lavado en la línea celular de la leucemia mieloide crónica K562 (carril 3). Otras líneas celulares produjeron la transcripción de 3 ó de 1,3 kb. (Carril 1 = HL-60; carril 2 = HeLaS3; carril 4 = MOLT-4; carril 5 = RAJI; carril 6 = SW480; carril 7 = A549; carril 8 = G-361.)
La Figura 5A es la secuencia de ADNc de FGF23 humano (ID. SEC. Nº 1).
La Figura 5B es la secuencia de aminoácidos de FGF23 humano (ID. SEC. Nº 2).
La Figura 6A es la secuencia de ADNc del FGF23 de ratón (ID. SEC. Nº 3).
La Figura 6B es la secuencia de aminoácidos del FGF23 de ratón (ID. SEC. Nº 4).
La Figura 7A es una imagen de una transferencia Western que representa la expresión in vitro de FGF23 producido por medio de bacterias. El anticuerpo anti-FGF23 reconoció una proteína de 27 kDa de las bacterias inducidas con IPTG (+) pero no de las no inducidas (-) transformadas con FGF23 marcado con histidina (FGF23-6xHis).
La Figura 7B es una imagen de una transferencia Northern que representa la expresión de FGF23 de células transfectadas. El análisis de transferencia Northern del ARN total de células HEK293 transfectadas con un vector de expresión de FGF23 (pFGF23; carril 3) usando una sonda de FGF23 reveló una única transcripción de 1,1 kb. (Carril 1 = células HEK293 no transfectadas; carril 2 = células HEK293 transfectadas con el vector de control, pcDNA3.1.)
La Figura 7C es una imagen de una transferencia Western que representa la secreción de FGF23 de las células transfectadas. El anticuerpo anti-FGF23 reconoció dos bandas de proteínas de 32 y 12 kDa en el medio acondicionado concentrado obtenido de las células transfectadas con pFGF23 (carriles 2, 4, 6), pero no de las células no transfectadas (carriles 1, 3, 5).
La Figura 8A es una imagen de una transferencia Northern que representa la expresión de FGF23 en tumores de osteomalacia hipofosfatémica oncogénica (OHO). Los análisis de transferencia Northern de ARN total de cinco tumores de OHO diferentes (carriles 3-7) mostraron transcripciones de FGF23 de fuerte hibridación de 1,3 y 3 kb y una banda débil de 2 kb después de una exposición de 30 minutos, mientras que los tejidos de control fueron negativos. (Carril 1 = hígado humano; carril 2 = paratiroides humana, carril 8 = cerebro de ratón; carril 9 = corazón de ratón; carril 10 = riñón de ratón.)
La Figura 8B es una imagen de una transferencia Western que representa la expresión de la proteína FGF23 en una muestra de tumor de OHO. El análisis de dos microgramos del extracto de un tumor de OHO demostró que se detectó una proteína de 32 kDa por el anticuerpo anti-FGF23 (+), pero no se detectó por medio del suero pre-inmune (-).
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La Figura 9 es la secuencia de aminoácidos de FGF23 humano (ID. SEC. Nº 2) donde se indican el péptido señal predicho y los sitios de escisión de proteasas RXXR/S.
La Figura 10A es una serie de imágenes de las transferencias Western que representan la expresión y la secreción de la proteína FGF23 de tipo natural y las formas mutantes de ADHR. La análisis de transferencia Western usando el anticuerpo anti-FGF23 y dos microgramos del medio acondicionado (M) o cincuenta microgramos del lisado celular (L) obtenidos de células HEK293 transfectadas con plásmidos que expresaban el tipo natural (FGF23) o las formas mutantes de ADHR (R176Q, R179W, R179Q) de FGF23. Se detectaron bandas de 32 y 12 kDa en el medio acondicionado en el caso de FGF23 de tipo natural, mientras que solamente se detectó la especie de 32 kDa en el caso de los mutantes de ADHR. Los lisados celulares fueron negativos para todas las transfecciones de FGF23, y todas las construcciones mostraron similar eficacia de transfección.
La Figura 10B es un listado de los aminoácidos 172 a 184 de FGF23 humana de tipo natural y de las formas mutantes de ADHR (R176Q, R179W, R179Q).
La Figura 11A es una imagen de una transferencia Western que representa la expresión de FGF23 marcado con FLAG. El análisis de transferencia Western con un anticuerpo monoclonal específico para FLAG (M2) se utilizó para detectar FGF23 de tipo natural marcado con FLAG en el extremo N-terminal (dos clones individuales, las dos bandas de la izquierda) o el mutante R176Q (dos clones individuales, las dos bandas de la derecha) en el medio acondicionado obtenido de las células HEK293 transfectadas con los plásmidos que expresaban FGF23 de tipo natural o las formas mutantes R176Q. El FLAG-FGF23 de tipo natural se detectó como una banda de 36 kDa y un fragmento pronunciado de 26 kDa, mientras que el mutante FLAG-R176Q se resolvió principalmente como la especie de 36 kDa, con una banda débil resolviendo en 26 kDa.
La Figura 11B es un diagrama que representa la proteína FGF23 donde se muestran las posiciones relativas del epítopo FLAG, el epítopo anti-FGF23 y el sitio SPC.
La Figura 12A es una imagen de una transferencia Western que representa la exposición extracelular de la proteína FGF23 a las células HEK293. El análisis de transferencia Western usando un anticuerpo específico para FGF23 se realizó en el medio acondicionado con FGF23 que se incubó durante 24 horas con 5 x 10^{6} células HEK293 (+) o en una placa de cultivo vacía (-). No hubo diferencia en la intensidad de las bandas de 32 y 12 kDa después del tratamiento.
La Figura 12B es una imagen de un gel teñido con azul de Coomassie. Las muestras que se presentan en la Figura 12A se sometieron a electroforesis en paralelo, y la tinción de Coomassie confirmó la carga igual del gel.
La Figura 13 es una imagen de una transferencia Western que representa la unión de FGF23 de tipo natural y mutante de ADHR a la heparina. Se incubó el medio acondicionado obtenido de células HEK293 transfectadas con FGF23 de tipo natural o con las formas mutantes y FGF23 de tipo natural o las formas mutantes marcados con FLAG con heparina-sepharose, y el material unido se sometió al análisis de transferencia Western con un anticuerpo anti-FGF23. Las especies de 32 kDa correspondientes a FGF23 de tipo natural o mutante se unen a la heparina. En el caso de los vectores de control, el medio resultó negativo. Se desconoce el origen de la banda débil aproximadamente en 28 kDa en algunas muestras. (Carril 1 = FGF23 natural; carril 2 = R176Q; carril 3 = R179W; carril 4 = R179Q; carril 5 = vector de CMV; carril 6 = FLAG-FGF23; carril 7 = FLAG-176Q; carril 8 = vector de FLAG.)
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Descripción detallada de la invención
La invención se refiere al descubrimiento de un ácido nucleico nuevo que codifica un factor 23 de crecimiento de fibroblastos de mamífero (FGF23) y las proteínas codificadas por el mismo. La invención da a conocer un nuevo miembro de la familia de factores de crecimiento de fibroblastos en el que el ácido nucleico y la proteína codificada por el mismo son útiles para el desarrollo de reactivos de diagnóstico y terapéuticos para el diagnóstico y el tratamiento de trastornos hipofosfatémicos e hiperfosfatémicos.
El riñón desempeña una función principal en el mantenimiento de las concentraciones séricas adecuadas de fosfato. La identificación de los genes que provocan los trastornos hereditarios raros de deterioro de la regulación del fosfato proporciona una oportunidad para descubrir las vías renales que controlan el equilibrio de los iones minerales.
En los experimentos iniciales que se dan a conocer en el presente documento, se ha descubierto el gen responsable del raquitismo hipofosfatémico autosómico dominante (ADHR) y se ha denominado FGF23. El ADHR está caracterizado por estatura corta, dolor óseo, fracturas y deformidad de las extremidades inferiores. También se ha descubierto en el presente documento que el FGF23 se sobreexpresa en los tumores que dan lugar a la osteomalacia hipofosfatémica oncogénica, un trastorno adquirido de pérdida renal de fosfato. Los pacientes con osteomalacia hipofosfatémica oncogénica comparten similitudes bioquímicas y clínicas con los pacientes que tienen ADHR. Estas son sólo dos de las diversas enfermedades hipofosfatémicas que pueden tratarse reduciendo el nivel y/o la actividad de FGF23 en un paciente. Otras enfermedades hipofosfatémicas susceptibles de tratamiento con los inhibidores de FGF23 incluyen, pero no se limitan a, XLH, HHRH, HBD, síndrome del nevus epidérmico, displasia fibrosa, nefrolitiasis, y similares.
A diferencia de las enfermedades hipofosfatémicas que están caracterizadas por la pérdida renal de fosfato y fosfato sérico bajo, las enfermedades hiperfosfatémicas, incluidas la insuficiencia renal leve, la calcinosis tumoral y similares, están caracterizadas por un exceso de fosfato en el suero. La administración de FGF23 estimula la excreción del fosfato en la orina y de ese modo se reducen niveles de fosfato en el suero. Por consiguiente, las enfermedades hiperfosfatémicas pueden tratarse administrando FGF23 nativo o moléculas que aumenten el nivel del polipéptido FGF23 en un paciente. Además, también puede usarse FGF23 mutante para tratar la hiperfosfatemia, en particular en situaciones en las que el mutante tiene una semivida más prolongada que el FGF23 nativo. En el presente documento se dan a conocer mutantes específicos de FGF23 que tienen semivida más prolongada.
Por consiguiente, en la presente invención se ha descubierto que el FGF23 puede estar implicado tanto en afecciones hipofosfatémicas como hiperfosfatémicas en animales. Esencialmente, cuando el nivel de FGF23 en un animal está anormalmente elevado, por lo general cuando la proteína se sobreexpresa o tiene capacidad aumentada por mutación genética, el animal exhibe hipofosfatemia por la pérdida aumentada de fosfato. Aunque todavía no se ha determinado si los niveles anormales de FGF23 desempeñan un papel causal en la hiperfosfatemia, la capacidad del FGF23 para disminuir los niveles de fosfato del suero en un animal es una indicación clara de que el FGF23 desempeña un papel importante en la regulación de la homeostasis del fosfato.
La invención incluye un ácido nucleico aislado que codifica FGF23. Según se da a conocer en el presente documento, se ha aislado un ácido nucleico aislado que codifica FGF23 tanto de células humanas como de células murinas (véase por ejemplo, Figuras 5A y 6A; ID. SEC. Nº 1 e ID. SEC. Nº 3, respectivamente). El ácido nucleico que codifica FGF23 de preferencia es ADN. Además, aunque en el presente documento se dan como ejemplo el ácido nucleico y la proteína FGF23 humanos y murinos, no debe interpretarse que la invención esté limitada sólo al FGF23 obtenido de estas especies de mamífero. Más bien, debe interpretarse que la invención incluye cualquier ácido nucleico que codifique FGF23 o cualquier mutante, variante u homólogo del mismo, que tenga la actividad biológica de FGF23 según se define en las reivindicaciones. El ADN que codifica FGF23 de la invención puede compartir una homología de aproximadamente el 50% con ID. SEC. Nº 1 ó ID. SEC. Nº 3, una homología de aproximadamente el 60%, aproximadamente el 70%, aproximadamente el 80%, 90%, 95% ó 99-100% con ID. SEC. Nº 1 ó ID. SEC. Nº 3.
La invención incluye un ácido nucleico que codifica FGF23 en el que un ácido nucleico que codifica un polipéptido marcador está unido de manera covalente al mismo. Es decir, la invención abarca un ácido nucleico quimérico en el que las secuencias del ácido nucleico que codifica un polipéptido marcador están unidas de manera covalente al ácido nucleico que codifica el polipéptido FGF23. Tales polipéptidos marcadores son muy conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, la proteína fluorescente verde (GFP), myc, myc-piruvato cinasa (myc-PK), His6, proteína de unión a la maltosa (MBP), un polipéptido marcador de hemaglutinina del virus de la gripe, un polipéptido marcador flag (FLAG) y un polipéptido marcador de glutatión S-transferasa (GST). No obstante, la invención no debe interpretarse de ninguna manera como limitada a los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos marcadores presentados anteriormente. Más bien, debe interpretarse que cualquier secuencia de ácido nucleico que codifique un polipéptido que pueda fun-
cionar de una manera sustancialmente similar a estos polipéptidos marcadores está incluida en la presente invención.
El ácido nucleico que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido marcador puede utilizarse para localizar el FGF23 dentro de una célula, un tejido y/o un organismo completo (por ejemplo, un embrión de mamífero), para detectar el FGF23 secretado - excepto de una célula madre embrionaria humana - de una célula, y para estudiar el(los) papel(es) del FGF23 en una célula. Además, la adición de un polipéptido marcador facilita el aislamiento y la purificación de la proteína "marcada" de manera que las proteínas de la invención pueden producirse y purificarse fácilmente.
También está incluido en la invención un ácido nucleico que codifica FGF23 en el que un ácido nucleico que especifica una secuencia promotora/reguladora está unido de manera covalente al mismo. De preferencia, el ácido nucleico que especifica al promotor/regulador está situado en el extremo 5' de la secuencia codificadora de FGF23 tal que dirige la expresión de la proteína deseada en una célula.
En otros aspectos relacionados, la invención incluye un vector que comprende un ácido nucleico aislado que codifica FGF23. De preferencia, el vector es capaz de dirigir la expresión de FGF23 en una célula que contiene el vector. Los vectores adecuados para usar en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, vectores que facilitan la generación de múltiples copias del ácido nucleico que codifica FGF23 o que facilitan la expresión de la proteína FGF23 en células procariotas o eucariotas o ambas. Por consiguiente, la invención no debe interpretarse como limitada a ningún sistema de vectores conocido, sino más bien debe incluir todos los vectores adecuados conocidos hasta ahora o por conocer que faciliten la generación de múltiples copias del ácido nucleico que codifica FGF23, o que faciliten la expresión de FGF23 en una célula. Los ejemplos de vectores adecuados incluyen los vectores de expresión basados en el bacteriófago T7 para la replicación y la expresión en bacterias, el vector de expresión pMSXND para la replicación y la expresión en células de mamíferos y los vectores derivados de baculovirus para la replicación y la expresión en células de insecto. Los adenovirus, los retrovirus y otros vectores virales también están contemplados en la invención.
De preferencia, la molécula de ácido nucleico aislada de la invención está unida de manera operativa a elementos promotores/reguladores y a otros elementos reguladores, tales como señales de parada, señales de poliadenilación y similares, en el vector recombinante de la invención, cada uno de los cuales garantizan la replicación y la expresión eficaz de FGF23 en las células. La invención no debe estar limitada a ninguna secuencia promotora/reguladora específica que dirija la expresión de FGF23. Más bien, debe interpretarse que la invención incluye cualquiera y todas las secuencias promotoras/reguladoras adecuadas que puedan unirse de manera operativa al ácido nucleico que codifica FGF23 y que efectúen la expresión de FGF23 a partir de las mismas en cualquier célula eucariota o procariota deseada. Las técnicas para unir las secuencias promotoras adecuadas a un ácido nucleico son muy conocidas en la técnica y se describen, por ejemplo, en Sambrook y col. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York), en Ausubel y col. (1997, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York), y en Gerhardt y col. (eds., 1994, Methods for General and Molecular Bacteriology, American Society for Microbiology, Washington, DC).
La invención incluye además una célula que contiene el vector de la invención, en la que la célula es una célula procariota o eucariota, es decir, una célula de mamífero, bacteriana, de insecto o de levadura, por ejemplo. La proteína FGF23 puede producirse usando tales células que contienen el vector, como se describe en el presente documento. Una vez más la invención no debe interpretarse como limitada a los tipos particulares de célula utilizados para expresar FGF23.
La invención incluye además un ácido nucleico aislado que tiene una secuencia que está en la orientación antisentido (es decir, es complementaria) a todo o a una parte del ácido nucleico aislado que codifica FGF23. En un aspecto, la invención incluye una secuencia de ARN antisentido caracterizada por que puede unirse al ARNm que codifica FGF23 y de ese modo inhibe la síntesis de FGF23. Una vez más, los vectores, incluidos aquellos en los que el ácido nucleico está unido de manera operativa a los elementos promotores/reguladores, y las células que comprenden una secuencia de ácido nucleico aislada antisentido de FGF23 están contemplados en la invención.
En otro aspecto, la invención incluye una ribozima que comprende una secuencia de ARN complementaria al ARNm que codifica FGF23 en la que la ribozima es de tal modo capaz de unirse al ARNm y de escindirlo y de inhibir la síntesis de FGF23 codificado por el ARNm. Las ribozimas están compuestas por una cadena de ARN monocatenario que puede escindir intermolecularmente un ARN diana, por ejemplo, ARNm de FGF23. Es posible construir una ribozima que pueda escindir el ARN en un sitio específico de la diana siguiendo procedimientos descritos en la técnica (por ejemplo, Tanner y col., en: Antisense Research and Applications, CRC Press INC. 1993, páginas 415-426). Los dos requisitos principales para tales ribozimas son el dominio catalítico y las regiones que son complementarias al ARN diana y que las permiten unirse al sustrato (un requisito previo para la escisión). El ARN antisentido y las ribozimas son útiles como inhibidores de la expresión de FGF23. De preferencia, el ARN antisentido y la ribozima de la invención son complementarios al extremo 5' del ARNm que codifica FGF23. Un experto en la técnica de generar fragmentos antisentido y ribozimas conocerá, basándose en la secuencia proporcionada en el presente documento, exactamente qué secuencias del ARNm de FGF23 pueden resultar dianas de las moléculas antisentido o de las ribozimas para que tenga efecto la inhibición de la expresión de FGF23.
Hay dos tipos básicos de ribozimas, a saber, el tipo tetrahymena (Hasselhoff, 1988, Nature 334: 585) y el tipo cabeza de martillo. Las ribozimas del tipo tetrahymena reconocen secuencias que tienen una longitud de cuatro bases, mientras que las ribozimas del tipo cabeza de martillo reconocen secuencias de bases con una longitud de 11-18 bases. Cuanto más larga es la secuencia, mayor es la probabilidad de que la secuencia aparezca exclusivamente en la especie de ARNm diana. Por consiguiente, las ribozimas del tipo cabeza de martillo son preferibles a las ribozimas del tipo tetrahymena para inactivar especies específicas de ARNm, y las secuencias de reconocimiento de 18 bases son preferibles a las secuencias de reconocimiento más cortas que pueden aparecer aleatoriamente dentro de las diversas moléculas de ARNm no relacionadas.
Las ribozimas útiles para inhibir la expresión de FGF23 pueden diseñarse incorporando las secuencias diana en la estructura básica de la ribozima que son complementarias a la secuencia del ARNm del FGF23 codificado por FGF23 o que tienen al menos aproximadamente 50% de similitud de secuencia con al menos una de ID. SEC. Nº 1 e ID. SEC. Nº 3. Las ribozimas dirigidas a FGF23 pueden sintetizarse usando reactivos disponibles en el comercio (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) o pueden expresarse genéticamente a partir del ADN que las codifica.
La invención incluye además un mamífero transgénico no humano cuyo genoma carece de una forma funcional de FGF23, y de ese modo elimina la actividad biológica del FGF23. En un ejemplo, el mamífero transgénico no humano comprende un ácido nucleico exógeno insertado en un sitio deseado en el genoma del mismo suprimiendo de ese modo la región codificadora de FGF23, es decir, un mamífero transgénico knock-out. Tales animales proporcionan un modelo útil para estudiar estados de enfermedades humanas asociadas con mutaciones en FGF23. De preferencia, el mamífero transgénico es un ratón. Un ratón en el que se ha suprimido la función de FGF23 tendrá un fenotipo hiperfosfatémico o un fenotipo sin fosfato.
Además, la invención incluye un mamífero transgénico no humano en el que está insertado un ácido nucleico exógeno que codifica FGF23 en un sitio del genoma, es decir, un mamífero transgénico "knock-in". El transgén knock-in insertado puede comprender diversos ácidos nucleicos que codifiquen, por ejemplo, un polipéptido marcador, una región promotora/reguladora unida de manera operativa al ácido nucleico que codifica FGF23 que normalmente no está presente en la célula o que típicamente no está unida de manera operativa a FGF23. La expresión del transgén knock-in de FGF23 probablemente cause hipofosfatemia en el animal, dando como resultado un fenotipo que se asemeja a la osteomalacia hipofosfatémica oncogénica y al ADHR. Tanto el tipo natural como las formas mutantes de FGF23 pueden insertarse en el genoma del mamífero. En particular, la inserción de los mutantes dados a conocer en el presente documento producirá una forma de FGF23 más estable y por consiguiente puede dar como resultado una afección hipofosfatémica prolongada o aumentada en el animal.
La generación del mamífero transgénico no humano de la invención se lleva a cabo de preferencia usando el procedimiento que se describe a continuación. No obstante, la invención no debe interpretarse de ninguna manera como limitada solamente al uso de este procedimiento, ya que pueden usarse otros procedimientos para generar el mamífero knock-out deseado.
En el procedimiento de preferencia para generar un mamífero transgénico no humano, se generan las células ES que comprenden el transgén de la invención y a continuación se usan las células para generar el animal knock-out esencialmente como se describe en Nagy and Rossant (1993, en: Gene Targeting, A Practical Approach, páginas 146-179, Joyner ed., IRL Press). Las células ES se comportan como células embrionarias normales si se ponen nuevamente en el entorno embrionario por inyección en un blastocisto huésped o si se agregan con embriones en la etapa de blastómero. Cuando se las devuelve a ese entorno, las células tienen todo el potencial para desarrollarse a lo largo de todos los linajes del embrión. Por consiguiente, es posible obtener células ES, introducir un ADN deseado en las mismas, y a continuación devolver la célula al entorno embrionario para permitir el desarrollo en células maduras de mamíferos, en las que puede expresarse el ADN deseado. Las células ES son células ES no humanas.
Los protocolos precisos para la generación de ratones transgénicos se dan a conocer en Nagy and Rossant (1993, en: Gene Targeting, A Practical Approach, Joyner ed., IRL Press, páginas 146-179) y por lo tanto no se repiten en el presente documento. La transfección o la transducción de las células ES para introducir el ADN deseado en las mismas se realiza usando protocolos convencionales, tales como los descritos, por ejemplo, en Sambrook y col. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York) y en Ausubel y col. (1997, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York). De preferencia, el ADN deseado contenido dentro del transgén de la invención se electropora en las células ES no humanas, y las células se propagan como se describe en Soriano y col. (1991, Cell 64: 693-702).
La introducción de un ácido nucleico aislado en el huevo fertilizado del mamífero se lleva a cabo por cualquier serie de técnicas convencionales en la tecnología transgénica (Hogan y col., 1986, Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY). Más comúnmente, el ácido nucleico se introduce en el embrión por medio de microinyección.
Una vez que el ácido nucleico está introducido en el huevo, el huevo se incuba durante un período de tiempo corto y a continuación se transfiere a un mamífero pseudopreñado de la misma especie de la que se ha obtenido el huevo según se describe, por ejemplo, en Hogan y col. (1986, Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY). Típicamente, se inyectan muchos huevos por experimento, y aproximadamente dos tercios de los huevos sobreviven al procedimiento. Posteriormente se transfieren aproximadamente veinte huevos viables a los animales pseudopreñados y, por lo general, de cuatro a diez de los huevos viables transferidos de ese modo se convertirán en crías vivas.
Puede usarse cualquier gen FGF23 de mamífero en los procedimientos descritos en el presente documento para producir un mamífero transgénico o una célula transgénica que lleve un transgén que comprenda una deleción de todo o una parte de ese gen FGF23. De preferencia, se utiliza un gen FGF23 tal como, por ejemplo, FGF23 de ratón (ID. SEC. Nº 3), y también se usa un gen FGF23 humano (ID. SEC. Nº 1).
El mamífero transgénico de la invención puede ser cualquier especie de mamífero. Por consiguiente, debe interpretarse que la invención incluye la generación de mamíferos transgénicos que codifican el ácido nucleico quimérico, mamíferos que incluyen ratones, cobayas, ratas, conejos, cerdos, ovejas y ganado bovino. Los procedimientos descritos en el presente documento para la generación de ratones transgénicos pueden aplicarse de manera análoga usando cualquier especie de mamífero. De preferencia, el mamífero transgénico de la invención es un roedor y aún de más preferencia, el mamífero transgénico de la invención es un ratón. A modo de ejemplo, Lukkarinen y col. (1997, Stroke 28: 639-645), enseñan que las construcciones de genes que posibilitan la generación de ratones transgénicos también permiten la generación de otros roedores transgénicos, incluidas ratas. De manera similar, las mutaciones nulas en un locus genético de un animal de una especie pueden replicarse en un animal de otra especie que tenga un locus genético altamente homólogo a la primera especie.
Para identificar a los mamíferos transgénicos de la invención, se examina la presencia del ácido nucleico aislado en las crías usando tecnología convencional tal como la hibridación por transferencia Southern, PCR y/o RT-PCR. La expresión del ácido nucleico en las células y en los tejidos del mamífero se evalúa también usando la tecnología usual que se describe en el presente documento. Además, puede determinarse la presencia o la ausencia de FGF23 en la sangre circulante del animal transgénico, por ejemplo, como se da a conocer en el presente documento (por ejemplo, análisis de transferencia Western), o usando los procedimientos convencionales para la detección de proteínas queda son muy conocidos en la técnica.
Las células obtenidas del mamífero transgénico de la invención, que se consideran también "células transgénicas" según se utiliza el término en el presente documento, abarcan células tales como las obtenidas del mamífero transgénico no humano FGF23 (+/-) y (-/-) descrito en otra parte en el presente documento, son sistemas útiles para modelar enfermedades y síntomas de los mamíferos que se cree que están asociados con niveles alterados de expresión de FGF23.
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Son particularmente adecuadas las células que proceden de un tejido del mamífero transgénico no humano knock-out o knock-in descrito en el presente documento, en las que el transgén que comprende el gen FGF23 está expresado o inhibe la expresión de FGF23 en diversos tejidos. A modo de ejemplo, los tipos de células de los que proceden tales células incluyen los fibroblastos y las células endoteliales (1) del mamífero vivo transgénico no humano FGF23 (+/+), (+/-) y (-/-), (2) del animal fetal FGF23 (+/+), (-/-) o (+/-), y (3) de las líneas celulares placentarias obtenidas del mamífero vivo y del feto FGF23 (+/+), (-/-) y (+/-).
La invención incluye además un polipéptido aislado codificado por el ácido nucleico FGF23 según se define en las reivindicaciones. La secuencia de aminoácidos codificada por el ADN de FGF23 humano y de ratón se proporciona en el presente documento en las Figuras 5B y 6B como ID. SEC. Nº 2 e ID. SEC. Nº 4, respectivamente. Como se indicó anteriormente, la invención no debe interpretarse de ninguna manera como limitada al FGF23 aislado de especie humana y murina. Más bien, debe interpretarse que la invención incluye cualquier polipéptido FGF23 aislado o cualquier mutante, variante u homólogo del mismo, que tenga la actividad biológica de FGF23 según se define en las reivindicaciones.
La secuencia de aminoácidos de la proteína FGF23 humana es ID. SEC. Nº 2 y la proteína FGF23 de ratón es ID. SEC. Nº 4.
La secuencia de aminoácidos de FGF23 humana y de ratón puede ser cualquier mutante, variante u homólogo de la misma, que tenga la actividad biológica de FGF23 según se define en las reivindicaciones. Las secuencias de aminoácidos de FGF23 pueden compartir aproximadamente el 40% de similitud de secuencia con ID. SEC. Nº 2 ó ID. SEC. Nº 4, aproximadamente el 50%, aproximadamente el 70%, 80%, 90%, 95% o aproximadamente 99-100% de homología con ID. SEC. Nº 2 ó ID. SEC. Nº 4.
La presente invención también proporciona análogos de las proteínas o péptidos codificados por un gen FGF23 según se define en las reivindicaciones. Los análogos, según se definen en el presente documento, pueden diferir de la proteína o los péptidos naturales por diferencias conservadoras de la secuencia de aminoácidos o por modificaciones que no afectan a la secuencia, o por ambas.
Además de los péptidos de longitud completa, la invención proporciona los péptidos que tienen la actividad biológica de FGF23, según se define en el presente documento. Un experto en la técnica apreciará, basándose en las secuencias que se dan a conocer en el presente documento, que pueden generarse fragmentos de superposición de FGF23 usando técnicas recombinantes convencionales, por ejemplo, las descritas en Sambrook y col. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York) y Ausubel y col. (1997, Current Protocols in Molecular Biology, Green & Wiley, Nueva York). Un experto en la técnica apreciaría, basándose en la descripción presentada en el presente documento, que la actividad biológica de los fragmentos de FGF23 podría probarse inyectando el material en ratones y evaluando si los ratones inyectados exhiben pérdida de fosfato. La inducción de la pérdida de fosfato serviría como indicación de que el fragmento de FGF23 retuvo la actividad biológica. Además, pueden usarse ensayos in vitro para probar la actividad biológica de FGF23. Por ejemplo, pueden perfundirse túbulos renales aislados con fragmentos de FGF23 y pueden evaluarse las alteraciones en el transporte de fosfato, en comparación con el tipo de FGF23 natural. De manera similar, pueden transfectarse modelos de cultivo celular que posean la maquinaria necesaria de transducción de la señal de FGF23 (es decir, el receptor de FGF y el transportador del sodio) con fragmentos de FGF23 y posteriormente puede probarse la presencia de alteraciones en el transporte de fosfato, en comparación con el tipo de FGF23 natural.
Como se indicó anteriormente, la presente invención también proporciona análogos de las proteínas o péptidos codificados por FGF23. Los análogos pueden diferir de las proteínas o los péptidos naturales por diferencias conservadoras de la secuencia de aminoácidos o por modificaciones que no afecten la secuencia, o por ambas. Puede usarse cualquier serie de procedimientos para la generación de formas mutantes, derivadas o variantes de FGF23 usando los procedimientos de ADN recombinante conocidos en la técnica tales como, por ejemplo, los descritos en Sambrook y col. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York) y Ausubel y col. (1997, Current Protocols in Molecular Biology, Green & Wiley, Nueva York).
Por ejemplo, pueden realizarse cambios conservadores de aminoácidos, que aunque alteren la secuencia primaria de la proteína o del péptido, no alteren normalmente su función. Las sustituciones conservadoras de aminoácidos incluyen típicamente sustituciones dentro de los siguientes grupos:
glicina, alanina;
valina, isoleucina, leucina;
ácido aspártico, ácido glutámico;
asparagina, glutamina;
serina, treonina;
lisina, arginina (en posiciones diferentes de los sitios de reconocimiento de enzimas proteolíticas);
fenilalanina, tirosina.
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Las modificaciones (que no alteran normalmente la secuencia primaria) incluyen la derivatización química in vivo o in vitro de polipéptidos, por ejemplo, acetilación o carboxilación. También están incluidas las modificaciones de glicosilación, por ejemplo, las realizadas por modificación de los patrones de glicosilación de un polipéptido durante su síntesis y procesamiento o en otras etapas de procesamiento; por ejemplo, exponiendo el polipéptido a enzimas que afectan la glicosilación, por ejemplo, enzimas de glicosilación o desglicosilación de mamíferos. También están abarcadas
las secuencias que tienen residuos aminoácidos fosforilados, por ejemplo, fosfotirosina, fosfoserina o fosfotreonina.
También están incluidos los polipéptidos que se han modificado usando las técnicas usuales de biología molecular para mejorar su resistencia a la degradación proteolítica o para optimizar las propiedades de solubilidad o para hacerlos más adecuados como agentes terapéuticos. Los análogos de tales polipéptidos incluyen los que contienen residuos diferentes de los L-aminoácidos que se presentan naturalmente, por ejemplo, D-aminoácidos o aminoácidos sintéticos que no se presentan en la naturaleza. Los péptidos de la invención no están limitados a los productos de los procedimientos de ejemplo específicos presentados en el presente documento.
Por la expresión "actividad biológica de FGF23" según se utiliza en el presente documento se entiende la capacidad de una molécula para unirse a un receptor de FGF y alterar el transporte de fosfato in vivo o in vitro. El técnico experto apreciaría además, basándose en la presente descripción, que la invención no está limitada a ningún procedimiento particular para evaluar la actividad de FGF23 y que la invención abarca cualquier ensayo para evaluar la actividad de FGF23 conocido en la técnica o que se desarrolle en el futuro.
La presente invención no sólo proporciona proteínas, péptidos y análogos de FGF23 aislados y sus fragmentos, sino también proporciona los procedimientos para su producción. En un aspecto de la invención, las proteínas, péptidos y análogos de FGF23 y sus fragmentos, se producen cultivando una célula que contiene el vector, en el que el vector comprende el ácido nucleico de FGF23, bajo condiciones que permiten la síntesis de la proteína. El aislamiento y la purificación de proteínas, polipéptidos, fragmentos, etc. de FGF23 producidos de manera recombinante puede realizarse por medios convencionales, incluidos la cromatografía, las separaciones por afinidad y basadas en la inmunología, por ejemplo usando un anticuerpo anti-FGF23. Cada uno de estos procedimientos está descrito en libros del texto convencionales, tales como, por ejemplo, en Sambrook y col. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York), en Ausubel y col. (1997, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York) y en Gerhardt y col. (eds., 1994, Methods for General and Molecular Bacteriology, American Society for Microbiology, Washington; DC).
La invención incluye además un anticuerpo que se une específicamente con FGF23 según se define en las reivindicaciones. En una forma de realización de preferencia, la invención incluye un anticuerpo que inhibe la actividad biológica de FGF23. El anticuerpo es útil para la identificación para FGF23 en un ensayo de diagnóstico para la determinación de los niveles de FGF23 en un mamífero que tiene una enfermedad asociada con los niveles de FGF23. Además, un anticuerpo que se une específicamente a FGF23 es útil para bloquear la interacción entre FGF23 y su receptor afín y, por consiguiente, es tanto útil en un escenario terapéutico para el tratamiento de la enfermedad relacionada con FGF23, según se describe en el presente documento.
Se han identificado dos receptores para FGF23 e incluyen FGFR2 y FGFR4; no obstante, no hay razones para creer que estos son los únicos dos receptores de FGF23. Para identificar otros receptores de FGF, pueden utilizarse los siguientes ensayos. La unión de FGF23 a su receptor puede detectarse usando ensayos convencionales de unión de proteínas, incluido el uso de la proteína A inmovilizada para precipitar quimeras receptor de FDF-Fc disponibles en el comercio. Además, pueden cribarse bibliotecas de expresión por procedimientos convencionales conocidos en la técnica para detectar la unión de FGF23 a receptores diferentes de los que se sabe que unen los FGF. Por consiguiente, siguiendo a los experimentos proporcionados en el presente documento, pueden identificarse otros receptores de FGF23.
La administración de FGFR2 y FGFR4 u otros receptores de FGF23 a un paciente, por medios genéticos o no genéticos descritos en el presente documento, puede inhibir la interacción y la posterior activación del FGF23, y de tal modo tratar la hipofosfatemia. Asimismo, los anticuerpos y otras moléculas pequeñas que bloquean la interacción de FGF23 y su receptor pueden también funcionar inhibiendo la actividad de FGF23, ya sea uniéndose al FGF23 o a su receptor. Un experto en la técnica apreciará, basándose en la descripción presentada en el presente documento, que los bloqueadores del receptor de FGF23 pueden identificarse seleccionando los compuestos por su capacidad para bloquear la interacción de FGF23 y el receptor usando uno de los numerosos ensayos de unión de proteínas bien caracterizados.
La generación de anticuerpos que se unen específicamente a FGF23 está descrita en la sección de detalles experimentales en el presente documento. Sin embargo, la invención no debe interpretarse como limitada solamente a los anticuerpos dados a conocer específicamente en el presente documento, sino que debe incluir cualquiera y todos los anticuerpos que puedan producirse que se unan específicamente a FGF23. Por ejemplo, la generación de anticuerpos policlonales se lleva a cabo inoculando el animal deseado con el antígeno y aislando los anticuerpos que se unen específicamente al antígeno del mismo.
Los anticuerpos monoclonales dirigidos contra una proteína de longitud total o contra fragmentos peptídicos de una proteína o de un péptido pueden prepararse usando cualquier procedimiento conocido de preparación de anticuerpos monoclonales, tales como los descritos, por ejemplo, en Harlow y col. (1988, en: Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY) y en Tuszynski y col. (1988, Blood, 72: 109-115). También pueden sintetizarse cantidades del péptido deseado usando tecnología de síntesis química. Como alternativa, el ADN que codifica el péptido deseado puede clonarse y expresarse a partir de una secuencia promotora apropiada en células adecuadas para la generación de grandes cantidades de péptido. Los anticuerpos monoclonales dirigidos contra el péptido se generan a partir de ratones inmunizados con el péptido usando procedimientos convencionales como aquellos a los que se hace referencia en el presente documento.
El ácido nucleico que codifica el anticuerpo monoclonal obtenido usando los procedimientos descritos en el presente documento puede clonarse y secuenciarse usando la tecnología que está disponible en la técnica, y que se describe, por ejemplo, en Wright y col. (1992, Critical Rev. en Immunol. 12 (3,4): 125-168) y en las referencias citadas en el mismo. Además, el anticuerpo de la invención puede "humanizarse" usando la tecnología descrita en Wright y col., (supra) y en las referencias citadas en el mismo, y en Gu y col. (1997, Thrombosis and Hematocyst 77 (4): 755-759).
Para generar una biblioteca de anticuerpos de fagos, primero se obtiene una biblioteca de ADNc a partir del ARNm que se aísla de las células, por ejemplo, el hibridoma, que expresa la proteína deseada en la superficie del fago, por ejemplo, el anticuerpo deseado. Las copias del ADNc del ARNm se producen usando la transcriptasa inversa. El ADNc que especifica los fragmentos de la inmunoglobulina se obtiene por PCR y el ADN resultante se clona en un vector de bacteriófago adecuado para generar una biblioteca de ADN del bacteriófago que comprende el ADN que especifica los genes de la inmunoglobulina. Los procedimientos para producir una biblioteca de bacteriófagos que comprende ADN heterólogo son muy conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Sambrook y col. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY).
El bacteriófago que codifica el anticuerpo deseado, puede construirse para que la proteína se presente en la superficie de los mismos de manera que esté disponible para unirse a su proteína de unión correspondiente, por ejemplo, el antígeno contra el que está dirigido el anticuerpo. Por consiguiente, cuando el bacteriófago que expresa un anticuerpo específico se incuba en presencia de una célula que expresa el antígeno correspondiente, el bacteriófago se unirá a la célula. El bacteriófago que no exprese el anticuerpo no se unirá a la célula. Tales técnicas de selección son muy conocidas en la técnica y se describen por ejemplo, en Wright y col., (supra).
Los procedimientos tales como los descritos anteriormente, se han desarrollado para la producción de anticuerpos humanos usando la presentación del bacteriófago M13 (Burton y col., 1994, Adv. Immunol. 57: 191-280). Esencialmente, se genera una biblioteca de ADNc a partir del ARNm obtenido de una población de células productoras de anticuerpo. El ARNm codifica los genes reorganizados de la inmunoglobulina y por consiguiente, el ADNc codifica lo mismo. El ADNc amplificado se clona en los vectores de expresión M13 creando una biblioteca del fagos que expresan los fragmentos Fab humanos en sus superficies. Los fagos que presentan el anticuerpo de interés se seleccionan por la unión al antígeno y se propagan en bacterias para producir la inmunoglobulina Fab humana soluble. Por consiguiente, en contraste con la síntesis convencional de anticuerpos monoclonales, este procedimiento inmortaliza el ADN que codifica la inmunoglobulina humana más que las células que expresan la inmunoglobulina humana.
Los procedimientos presentados recientemente describen la generación de fagos que codifican la porción Fab de una molécula de anticuerpo. Sin embargo, la invención no debe interpretarse como limitada solamente a la generación de fagos que codifican anticuerpos Fab. Más bien, los fagos que codifican anticuerpos de cadena única (bibliotecas de anticuerpos scFv/fago) también están incluidos en la invención. Las moléculas Fab comprenden la cadena ligera completa de Ig, es decir, comprenden la región variable y la región constante de la cadena ligera, pero incluyen solamente la región variable y el primer dominio de la región constante (CH1) de la cadena pesada. Las moléculas de anticuerpos de cadena única comprenden una única cadena de proteína que comprende el fragmento Fv de la Ig. Un fragmento Fv de Ig incluye solamente las regiones variables de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo, y no contiene ninguna región constante en el mismo. Las bibliotecas de fagos que comprenden el DNA de scFv pueden generarse siguiendo los procedimientos descritos en Marks y col., 1991, J. Mol. Biol. 222: 581-597. La selección de fagos generados de ese modo para el aislamiento de un anticuerpo deseado se lleva a cabo de manera similar a la descrita para las bibliotecas de fagos que comprenden el ADN de Fab.
Debe interpretarse que la invención incluye también las bibliotecas sintéticas de presentación de fagos en las que las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras pueden sintetizarse para que incluyan casi todas las especificidades posibles (Barbas, 1995, Nature Medicine 1: 837-839; de Kruif y col. 1995, J. Mol. Biol. 248: 97-105).
La invención incluye además las formas mutantes de FGF23. Es decir, la invención abarca los ácidos nucleicos aislados que codifican las formas mutantes de FGF23, así como las proteínas codificadas por los mismos. Debe interpretarse que la invención significa todas las mutaciones que afecten la actividad biológica o la estabilidad de la proteína FGF23. De preferencia, las mutaciones están asociadas con afecciones hipofosfatémicas o hiperfosfatémicas, de las cuales algunas son hereditarias, tales como, por ejemplo, ADHR, como se demuestra por medio de los datos presentados el en presente documento. Como se documenta en la sección detalles experimentales en el presente documento, varias formas mutantes de FGF23 dan FGF23 más estable que la forma de tipo salvaje de esta proteína que se presenta en la naturaleza. Tales formas estables de FGF23 son por consiguiente útiles como compuestos terapéuticos para el tratamiento de la enfermedad asociada con FGF23 que es el resultado de los elevados niveles de fosfato en el suero. Los vectores, incluidos aquellos en los que el ácido nucleico está unido de manera operativa a los elementos promotores/reguladores, y las células que comprenden el ácido nucleico que codifica las formas más estables de FGF23 también están contemplados en la invención.
Según se da a conocer en el presente documento, se han identificado mutaciones en FGF23 que dan como resultado mayor estabilidad de la proteína FGF23. Se ha demostrado que tales mutaciones, que incluyen pero no se limitan a R176Q, R179W y R179Q, aumentan la estabilidad de la proteína al eliminar un sitio de escisión de proteasa de consenso, inhibiendo de ese modo la degradación de la proteína. La semivida prolongada de estas formas mutantes de FGF23 es una ventaja clara con respecto al tratamiento de afecciones hiperfosfatémicas, ya que la frecuencia de administración de FGF23 mutante necesaria para el tratamiento eficaz ser significativamente menor que la del FGF23 nativo. Mutaciones de sustitución en cualquiera de las argininas en las posiciones 176 y 179 con cualquier aminoácido aumentarán también la estabilidad de la proteína. La invención no debe interpretarse como limitada solamente a las mutaciones de ejemplo del presente documento. En la sección detalles experimentales del presente documento, se proporciona la enseñanza adecuada para que un experto en la técnica pueda identificar otras mutaciones en el gen FGF23, en las que el FGF23 mutante pueda tener mayor estabilidad, etc. en comparación con el FGF23 de tipo natural.
La invención ilustra moléculas que son capaces de modular la expresión y/o la actividad de FGF23 en una célula o en un fluido corporal de un mamífero.
El mamífero es de preferencia un ser humano.
Por el término "modulador" de la actividad de FGF23, según se utiliza en el presente documento, se entiende un compuesto que afecta la actividad biológica de FGF23, según se define en el presente documento, en el que la actividad es mayor o menor en presencia del modulador comparada con la actividad de FGF23 en la ausencia del modulador.
Por consiguiente, un modulador puede ser un inhibidor o un potenciador de la expresión o de la actividad de FGF23. Los moduladores que inhiben la expresión de FGF23 incluyen, pero no se limitan a, moléculas antisentido y ribozimas que se unen al ácido nucleico que codifica FGF23 y/o lo escinden.
La invención proporciona inhibidores de FGF23 que sirven para reducir o para eliminar las moléculas de proteína FGF23. Tales inhibidores se definen en las reivindicaciones y puede ser ácidos nucleicos antisentido o ribozimas, como se describió anteriormente. Los inhibidores también pueden ser moléculas de ARN bicatenario que sirven para reducir el nivel de ARNm de FGF23 por interferencia de ARN como está descrito (Elbashir y col., 2001, Nature, 411: 428-429; Carthew, 2001, Curr. Opin. Cell Biol., 13: 244-248).
La invención proporciona además inhibidores de FGF23 que sirven para inhibir la actividad biológica de FGF23 que incluyen, pero no se limitan a, moléculas que bloquean la interacción del FGF23 con su receptor o las que inhiben la activación del receptor de FGF23. Ejemplos específicos incluyen, pero no se limitan a, FGFR2, FGFR4 y otros receptores de FGF23, y anticuerpos, péptidos y peptidomiméticos que se unen a FGF23 o a su receptor, inhibiendo de ese modo la actividad biológica de FGF23. Por consiguiente, en la invención está contemplado cualquier tipo de inhibidor de FGF23, en el que el inhibidor inhibe la expresión o la actividad biológica del FGF23.
Basándose en la secuencia de FGF23 que se da a conocer en el presente documento, un experto en la técnica puede generar peptidomiméticos y otras moléculas pequeñas útiles como inhibidores de FGF23. Específicamente, pueden generarse peptidomiméticos usando las técnicas descritas en el documento PCT/US93/01201.
Es una cuestión relativamente simple, una vez armados con la presente descripción, identificar un modulador de la expresión de FGF23 o de su actividad biológica. Por ejemplo, las células que naturalmente expresan FGF23, o que expresan FGF23 después de la transfección con el ácido nucleico que codifica FGF23 pueden ponerse en contacto con un compuesto de prueba. A continuación se mide el nivel de expresión de FGF23 en presencia o en ausencia del compuesto de prueba, en el que un nivel más alto o más bajo de expresión de FGF23 en presencia del compuesto de prueba comparado con el nivel de expresión FGF23 en ausencia del compuesto de prueba, es una indicación que el compuesto de prueba es un modulador de la expresión de FGF23. Cuando el nivel de FGF23 se eleva en presencia del compuesto de prueba comparado con el nivel de expresión de FGF23 en ausencia del compuesto de prueba, se considera que el compuesto de prueba es un potenciador de la expresión de FGF23. A la inversa, cuando el nivel de expresión de FGF23 se reduce en presencia del compuesto de prueba comparado con el nivel de expresión de FGF23 en ausencia del compuesto de prueba, se considera que el compuesto de prueba es un inhibidor de la expresión de FGF23.
De manera similar, la actividad biológica de FGF23 puede medirse en células, suero u orina de un mamífero. En este caso, se mide el nivel de la actividad biológica de FGF23 producida por las células en presencia o en ausencia de un compuesto de prueba, siendo un nivel superior o inferior de actividad de FGF23 en presencia del compuesto de prueba comparado con el nivel de actividad de FGF23 en ausencia del compuesto de prueba, una indicación de que el compuesto de prueba es un modulador de la actividad biológica de FGF23. Cuando el nivel de actividad de FGF23 se eleva en presencia del compuesto de prueba comparado con el nivel de actividad de FGF23 en ausencia del compuesto de prueba, se considera que el compuesto de prueba es un potenciador de la actividad biológica de FGF23. A la inversa, cuando el nivel de actividad de FGF23 se reduce en presencia del compuesto de prueba comparado con el nivel de actividad de FGF23 en ausencia del compuesto de prueba, se considera que el compuesto de prueba es un inhibidor de la actividad biológica de FGF23.
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La expresión de FGF23 puede medirse usando cualquier tecnología usual de biología molecular, tal como usando la tecnología de RT-PCR, la protección de RNAsa, la transferencia Northern y similares. Como alternativa, los efectos sobre la expresión pueden medirse uniendo de manera operativa la secuencia del promotor de FGF23 a un gen informador adecuado y transfectando células con la construcción de ADN resultante. La actividad del promotor sensible al compuesto de prueba puede medirse midiendo el nivel de expresión del gen informador en las células puestas en contacto con el compuesto de prueba y comparando el nivel de expresión del gen informador en esas células con las células que no estuvieron en contacto con el compuesto de prueba. Los genes informadores adecuados incluyen, pero no se limitan a, beta-galactosidasa, acetil transferasa de cloranfenicol, proteína fluorescente verde y similares.
La invención proporciona un procedimiento para producir un polipéptido aislado que tiene la actividad biológica de FGF23, según se describe en el presente documento, por el que una célula huésped que comprende un vector que codifica FGF23 se cultiva bajo condiciones que permitan la síntesis de la proteína. La proteína se aísla a continuación de las células cultivadas y/o del medio cultivado. El aislamiento y la purificación de las proteínas producidas de manera recombinante pueden realizarse por medios convencionales que incluyen la cromatografía preparativa y las separaciones por afinidad e inmunológicas que implican la cromatografía de afinidad con anticuerpos que se unen específicamente con FGF23.
La invención proporciona un procedimiento para diagnosticar in vitro trastornos hipofosfatémicos e hiperfosfatémicos en un sujeto. En un ejemplo proporcionado en el presente documento, los datos establecen que los pacientes con ADHR tienen mutaciones en FGF23, y el FGF23 es útil como herramienta de diagnóstico para la detección del ADHR. El procedimiento de ejemplo del presente documento comprende poner una muestra biológica obtenida del paciente en contacto con un reactivo que detecta el FGF23 (o una mutación en FGF23), ya sea un ácido nucleico que codifica la proteína o la proteína misma. La detección de FGF23 en la muestra o la ausencia de detección de FGF23 es el diagnóstico de afecciones hipofosfatémicas e hiperfosfatémicas relacionadas con el FGF23.
La muestra biológica obtenida del sujeto puede ser cualquier fluido o tejido en el que pueda detectarse el ácido nucleico de FGF23 o la proteína. De preferencia, la muestra es sangre u orina. No obstante, la invención no debe interpretarse como limitada a ninguna muestra biológica particular obtenida del sujeto.
Los reactivos de preferencia para la detección del ácido nucleico de FGF23 incluyen, pero nos se limitan a, un ácido nucleico complementario al ácido nucleico que codifica FGF23. Los reactivos de preferencia para la detección de la proteína FGF23 incluyen, pero no se limitan a, un anticuerpo. Resulta además de preferencia que estos reactivos estén marcados para facilitar la detección del ácido nucleico de FGF23 o la proteína. Un experto en la técnica apreciará, basándose en la descripción del presente documento, que los reactivos para la detección de FGF23 pueden marcarse usando una diversidad de marcadores adecuados que incluyen un radioisótopo, un compuesto bioluminescente, un compuesto quimioluminiscente, un compuesto fluorescente, un quelato metálico o una enzima.
También está incluido en la invención un ensayo en suero, plasma u otro ensayo en sangre para las afecciones hipofosfatémicas así como ensayos de orina u otros fluidos corporales. Los ensayos pueden utilizarse para diagnosticar pacientes que tienen las enfermedades hipofosfatémicas presentadas anteriormente. El ensayo de FGF23 es un ensayo competitivo diseñado para medir un péptido específico correspondiente a una porción del FGF23 así como el FGF23. El ensayo está basado en la competición del péptido marcado ^{125}I-FGF23 y el péptido sin marcar (ya sea un patrón o una cantidad desconocida de fluido corporal que contiene FGF23) que se unen a la cantidad limitada de anticuerpos específicos para el péptido FGF23 en cada mezcla de reacción. A medida que la cantidad de patrón o desconocido aumenta en la reacción, la cantidad del péptido ^{125}I-FGF23 capaz de unirse al anticuerpo disminuye. Midiendo la cantidad del péptido ^{125}I-FGF23 en función de la concentración del péptido FGF23 sin marcar en las mezclas de reacción del patrón, se construye una curva patrón a partir de la cual puede determinarse la concentración de FGF23 en el fluido corporal.
El ensayo de competición descrito anteriormente está diseñado para cuantificar el nivel de FGF23 presente en la muestra biológica de un paciente. Comparando el nivel del polipéptido FGF23 en una muestra dada de un paciente con el de un paciente que se sabe que no está afectado por un trastorno del fosfato, los niveles elevados de FGF23 pueden utilizarse como una indicación de que un paciente dado está afectado con un trastorno hipofosfatémico. Este ensayo puede ser útil para numerosos trastornos hipofosfatémicos, incluidos aquellos para los que no está disponible un medio de diagnóstico genético. Las enfermedades hipofosfatémicas para las que este ensayo puede ser útil incluyen XLH, HHRH, HBD, ADHR, osteomalacia inducida por tumores, síndrome del nevus epidérmico, displasia fibrosa y nefrolitiasis. Por ejemplo, según se da a conocer en el presente documento, los pacientes con ADHR tendrán niveles elevados de FGF23 debido a las mutaciones en la proteína que inhiben su degradación.
La invención también incluye un procedimiento para diagnosticar in vitro la osteomalacia inducida por tumores en un paciente, en el que la presencia de FGF23 en la muestra del tumor de un paciente es un indicador de esta enfermedad, según se da a conocer en el presente documento. Una muestra de tumor escindida de un paciente puede someterse a una diversidad de procedimientos diseñados para detectar FGF23, incluidos, pero no limitados a, RT-PCR, análisis de transferencia Northern y ensayo de protección de RNasa. Por consiguiente, los pacientes que muestran síntomas clínicos de osteomalacia inducida por tumores pueden diagnosticarse más definitivamente usando este procedimiento basado en FGF23.
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La invención proporciona un procedimiento para tratar una enfermedad hipofosfatémica en un animal afectado, en el que se administra una cantidad terapéuticamente eficaz de un reactivo que disminuye la expresión y/o la actividad biológica de FGF23 al mamífero. Las enfermedades hipofosfatémicas que pueden tratarse incluyen, pero no se limitan al raquitismo hipofosfatémico ligado al cromosoma X (XLH), raquitismo hipofosfatémico hereditario con hipercalciuria (HHRH), enfermedad hipofosfatémica de los huesos (HBD), raquitismo hipofosfatémico autosómico dominante (ADHR), osteomalacia inducida por tumores (TIO) u osteomalacia hipofosfatémica oncogénica (OHO), síndrome del nevus epidérmico, displasia fibrosa, nefrolitiasis y similares. Según se da a conocer en el presente documento, la enfermedad hipofosfatémica puede caracterizarse por la sobreexpresión de FGF23, la mutación u otra inhibición de una enzima que degrada el FGF23, o por mutaciones en FGF23 que aumenten la estabilidad de la proteína, que dan como resultado todos ellos un aumento en la pérdida de fosfato acompañada por una disminución en los niveles de fosfato en el suero. Por consiguiente, los reactivos que disminuyen la expresión y/o la actividad biológica del FGF23 restaurarán la homeostasis normal del fosfato en pacientes hipofosfatémicos. Los ejemplos de reactivos que disminuyen la expresión de FGF23 incluyen, pero no se limitan a, ácidos nucleicos antisentido y ribozimas. Los ejemplos de reactivos que disminuyen la actividad biológica de FGF23 incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos y otras moléculas pequeñas que bloquean la interacción entre FGF23 y su receptor.
La invención también ilustra el uso con respecto al tratamiento de una enfermedad hiperfosfatémica en un mamífero, en el que se administra una cantidad terapéuticamente eficaz de FGF23, ya sea el ácido nucleico o el polipéptido codificado por el mismo, o un reactivo que aumente el nivel del polipéptido FGF23 al mamífero. Un ejemplo de un reactivo que aumenta el nivel del polipéptido FGF23 es un inhibidor de proteasas. Como se describe en los ejemplos presentados en el presente documento, el FGF23 es degradado por una proteasa SPC, y la inhibición de la escisión del sitio SPC de FGF23 prolonga su semivida, dando como resultado niveles más altos de FGF23. Las enfermedades hiperfosfatémicas que pueden tratarse incluyen, pero no se limitan a los pacientes con insuficiencia renal leve, calcinosis tumoral y similares. Los niveles elevados de fosfato sérico en los pacientes hiperfosfatémicos pueden solucionarse por medio de la administración de FGF23 o un reactivo que aumente el nivel de FGF23, que estimulan ambos la pérdida de fosfato y reducen de ese modo los niveles de fosfato del suero. El FGF23 puede administrarse por procedimientos convencionales de terapia génica, así como por inyección directa del polipéptido FGF23 por procedimientos que incluyen, pero no se limitan a, inyecciones intravenosas, subcutáneas e intramusculares. Debe interpretarse que la invención incluye la administración de FGF23 nativo así como las formas mutantes de FGF23, incluidos, pero no limitados a, los mutantes dados a conocer en el presente documento que sirven para aumentar la estabilidad de la proteína FGF23.
La invención también ilustra un procedimiento para tratar un trastorno hiperfosfatémico usando una cantidad terapéuticamente eficaz de una población de células que expresan FGF23. Este procedimiento puede ser un procedimiento para administrar FGF23 puesto que, como se muestra en el presente documento, el FGF23 es una proteína secretada. También está incluida en la invención la administración de células que expresan formas mutantes del polipéptido FGF2, para este fin. Las mutaciones de preferencia incluyen las que confieren mayor estabilidad sobre el polipéptido FGF23, tales como las mutaciones dadas a conocer en el presente documento.
La invención ilustra además un procedimiento para tratar la osteoporosis en un mamífero, en el que se administra una cantidad terapéuticamente eficaz de FGF23 o un reactivo que aumente la expresión de FGF23 al mamífero. Los pacientes con la enfermedad hipofosfatémica XLH sufren fracturas óseas con menos frecuencia que los pacientes sin la enfermedad (Econs y col., 1994, Bone and Min., 24: 17-24). La administración de FGF23 o de un reactivo que aumente el nivel de FGF23 producirá hipofosfatemia transitoria con el efecto asociado en la densidad y fortaleza de los huesos. Por consiguiente, además de su función en la regulación de la homeostasis del fosfato, el FGF23 puede tener una función osteosclerótica in vivo. Sin la intención de estar ligados a este, el mecanismo por el que la hipofosfatemia da lugar al aumento de la masa ósea probablemente implica la 1,25 dihidroxi vitamina D. Específicamente, la administración intermitente de FGF23 (o FGF23 mutante) o de un reactivo que aumenta la expresión de FGF23 puede disminuir de manera transitoria la reabsorción de fosfato, una reacción que estimula la reabsorción aumentada de fosfato y la producción aumentada de 1,25 dihidroxi vitamina D, un agente terapéutico eficaz para una diversidad de enfermedades de los huesos.
La invención ilustra además un procedimiento para tratar las afecciones que incluyen el depósito de calcio y fosfato en las arterias o en los tejidos blandos de un mamífero, en el que se administra una cantidad terapéuticamente eficaz de FGF23 (o mutante de FGF23) o un reactivo que aumente la expresión de FGF23 al mamífero, como se describe a continuación. Debido a los niveles aumentados de fosfato en el suero, los pacientes con insuficiencia renal leve muestran comúnmente depósito de calcio y fósforo en sus arterias coronarias, así como en otras arterias. El depósito de calcio y fosfato en la pared arterial, denominado arteriopatía coronaria, provoca una reducción en el flujo de sangre a través de estas arterias y puede dar lugar a infarto de miocardio. Por consiguiente, el tratamiento de la arteriopatía coronaria disminuirá el riesgo de desarrollar infarto de miocardio.
El FGF23 o un reactivo que aumente el nivel de FGF23 reducirán los niveles de fosfato del suero y protegerá de ese modo a los pacientes hiperfosfatémicos de la enfermedad cardiovascular y arteriopatía coronaria acelerada. El ácido nucleico que codifica FGF23 puede administrarse a las células de la arteria coronaria por procedimientos que incluyen, pero no se limitan a, terapia génica. Además, el uso de un promotor específico de tejido facilita la expresión selectiva de FGF23 en células de músculo liso vascular o en células endoteliales.
De manera similar, el FGF23 o un reactivo que aumente el nivel de FGF23 pueden ser útiles para tratar otras afecciones que incluyan depósitos de calcio y fosfato en tejidos blandos, incluidas, pero no limitadas a, dermatomiositis y calcinosis tumoral. La calcinosis tumoral es un trastorno caracterizado por la reabsorción renal aumentada de fosfato y concentraciones aumentadas de 1,25 dihidroxi vitamina D. Como resultado, los pacientes desarrollan calcificaciones de los tejidos blandos, que son depósitos de calcio y fosfato. La administración de FGF23, nativo o mutante, a los tejidos blandos usando cualquiera de los medios descritos en el presente documento revertirá los defectos bioquímicos.
La invención ilustra diversos kits que comprenden un compuesto, tal como un ácido nucleico que codifica FGF23, un anticuerpo que se une específicamente a FGF23, un ácido nucleico complementario a un ácido nucleico que codifica FGF23 pero en una orientación antisentido con respecto a la transcripción, y/o composiciones de la invención, un aplicador y materiales instructivos que describen el uso del compuesto para llevar a cabo los procedimientos de la invención. Aunque a continuación se describen kits de ejemplo, el contenido de otros kits útiles resultará evidente para el experto en la técnica a la luz de la presente descripción. Cada uno de estos kits está incluido dentro de la invención.
La invención ilustra un kit para aliviar una enfermedad mediada por la expresión defectuosa de FGF23. El kit se utiliza conforme a los procedimientos dados a conocer en la invención. En resumen, el kit puede utilizarse para poner una célula en contacto con un ácido nucleico complementario a un ácido nucleico que codifica FGF23 donde el ácido nucleico está en una orientación antisentido con respecto a la transcripción para reducir la expresión de FGF23, o con un anticuerpo que se une específicamente con FGF23, en el que la expresión, la cantidad o la actividad disminuida de FGF23 media un efecto ventajoso. Por otra parte, el kit comprende un aplicador y un material instructivo para el uso del kit. Estas instrucciones incorporan simplemente los ejemplos proporcionados en el presente documento.
El kit puede incluir un vehículo farmacéuticamente aceptable. La composición se proporciona en una cantidad apropiada según lo establecido en otra parte en el presente documento. Además, la vía de administración y la frecuencia de administración son como se estableció previamente en otra parte en el presente documento.
El experto en la técnica apreciará, basándose en la descripción proporcionada en el presente documento, que la invención abarca kits donde se incluyen ribozimas, composiciones antisentido, anticuerpos que se unen específicamente con FGF23 y similares, para reducir el nivel de FGF23.
Además, la invención ilustra un kit que comprende un ácido nucleico que codifica un FGF23 de mamífero. Tal kit puede utilizarse según los procedimientos de la invención dondequiera que se desee aumentar el FGF23. Es decir, donde una enfermedad, un trastorno o una afección esté asociado o mediado por el nivel disminuido de FGF23 comparado con el nivel normal de FGF23 sin la enfermedad, el kit puede utilizarse conforme a las enseñanzas dadas a conocer en otra parte en el presente documento, para proporcionar FGF23 a una célula en la que nivel de FGF23 en la célula es más bajo que el nivel de FGF23 en otra célula de otra manera idéntica pero normal (es decir, sin la enfermedad) y/o a un animal que comprende tal célula. Las formas mutantes de FGF23 según se dan a conocer en el presente documento, que son más estables que las formas no mutantes, son particularmente útiles en tales kits.
Composiciones farmacéuticas
La invención también abarca el uso de las composiciones farmacéuticas de un modulador de FGF23 adecuado para llevar a la práctica los procedimientos de la invención, las composiciones que comprenden un modulador de FGF23 adecuado y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Según se usa en el presente documento, la expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" significa una composición química con la que un modulador de FGF23 adecuado puede combinarse y que, tras la combinación, puede usarse para administrar el modulador de FGF23 adecuado a un mamífero.
Las composiciones farmacéuticas útiles para llevar a la práctica la invención pueden administrarse para suministrar una dosis de entre 1 ng/kg/día y 100 mg/kg/día.
Las composiciones farmacéuticas que son útiles en los procedimientos de la invención pueden administrarse sistémicamente en formulaciones orales sólidas, de aerosol, tópicas u otras formulaciones similares. Además del modulador de FGF23 adecuado, tales composiciones farmacéuticas pueden contener vehículos farmacéuticamentes aceptables y otros ingredientes conocidos para potenciar y para facilitar la administración del fármaco. Otras formulaciones posibles, tales como nanopartículas, liposomas, eritrocitos resellados y sistemas con base inmunológica también pueden utilizarse para administrar un modulador de FGF23 adecuado según los procedimientos de la invención.
Ahora se describen los compuestos que están identificados usando cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento que pueden formularse y administrarse a un mamífero para el tratamiento de las enfermedades dadas a conocer en el presente documento.
La invención abarca la preparación y el uso de las composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto útil para el tratamiento de las enfermedades dadas a conocer en el presente documento como un ingrediente activo. Tal composición farmacéutica puede estar constituida por un ingrediente activo solo, en una forma adecuada para la administración a un sujeto, o la composición farmacéutica puede comprender el ingrediente activo y uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables, uno o más ingredientes adicionales o alguna combinación de estos. El ingrediente activo puede estar presente en la composición farmacéutica en la forma de un éster o sal fisiológicamente aceptable, tal como en combinación con un catión o un anión fisiológicamente aceptable, como se conoce bien en la técnica.
Según se usa en el presente documento, la expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" significa una composición química con la que el ingrediente activo puede combinarse y que, tras la combinación, puede usarse para administrar el ingrediente activo a un sujeto.
Según se usa en el presente documento, la expresión éster o sal "fisiológicamente aceptable" significa una forma de éster o sal del ingrediente activo que es compatible con cualquier otro ingrediente de la composición farmacéutica, que no es perjudicial para el sujeto al que se le va a administrar la composición.
Las formulaciones de las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento pueden prepararse por cualquier procedimiento conocido o que se desarrolle en el futuro en la técnica de la farmacología. En general, tales procedimientos preparatorios incluyen la etapa de poner el ingrediente activo en asociación con un vehículo o uno o más ingredientes accesorios, y a continuación, de ser necesario o deseable, dar forma o envasar el producto en una unidad de monodosis o de dosis múltiples deseada.
Aunque las descripciones de las composiciones farmacéuticas proporcionadas en el presente documento están dirigidas principalmente a las composiciones farmacéuticas que son adecuadas para la administración ética a los seres humanos, los expertos en la técnica entenderán que tales composiciones son por lo general adecuadas para la administración a animales de todos los tipos. Se conoce bien la modificación de las composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración a seres humanos para hacer las composiciones adecuadas para la administración a diversos animales, y el farmacólogo veterinario experto en la técnica puede diseñar y realizar tal modificación simplemente, si acaso, con experimentación normal. Los sujetos en quienes está contemplada la administración de las composiciones farmacéuticas de la invención incluyen, pero no se limitan a, seres humanos y otros primates, y otros mamíferos.
Las composiciones farmacéuticas que son útiles en los procedimientos de la invención pueden prepararse, envasarse o venderse en formulaciones adecuadas para la administración oral, parenteral, pulmonar, intranasal, bucal u otra vía de administración. Otras formulaciones contempladas incluyen nanopartículas proyectadas, preparaciones de liposomas, eritrocitos resellados que contienen el ingrediente activo, y formulaciones con base inmunológica.
Una composición farmacéutica de la invención puede prepararse, envasarse o venderse a granel, como una única monodosis, o como una pluralidad de monodosis. Como se usa en el presente documento, una "monodosis" es una cantidad discreta de la composición farmacéutica que comprende una cantidad predeterminada del ingrediente activo. La cantidad del ingrediente activo es por lo general igual a la dosificación del ingrediente activo que se administrará a un sujeto o una fracción conveniente de tal dosificación tal como, por ejemplo, la mitad o un tercio de tal dosificación.
Las cantidades relativas del ingrediente activo, el vehículo farmacéuticamente aceptable y cualquier otro ingrediente en una composición farmacéutica de la invención variarán, según la identidad, del tamaño y de la afección del sujeto tratado y además según la vía por la que se administrará la composición. A modo de ejemplo, la composición puede comprender entre el 0,1% y el 100% de ingrediente activo (p/p).
Además del ingrediente activo, una composición farmacéutica de la invención puede comprender además uno o más agentes farmacéuticamente activos. Los agentes adicionales particularmente contemplados incluyen los antieméticos y los secuestrantes tales como secuestrantes de cianuro y de cianato.
Las formulaciones de liberación controlada o sostenida de una composición farmacéutica de la invención pueden producirse usando la tecnología convencional.
Una formulación de una composición farmacéutica de la invención adecuada para la administración oral puede prepararse, envasarse o venderse bajo la forma de monodosis sólida discreta que incluye, pero no se limita a, un comprimido, una cápsula dura o blanda, un sello, una pastilla o un caramelo, conteniendo cada uno una cantidad predeterminada del ingrediente activo. Otras formulaciones adecuadas para la administración oral incluyen, pero no se limitan a, una formulación en polvo o en gránulos, una suspensión acuosa u oleosa, una disolución acuosa u oleosa, o una emulsión.
Según se usa en el presente documento, un líquido "oleoso" es uno que comprende una molécula líquida que contiene carbono y que exhibe un carácter polar menor que el agua.
Un comprimido que comprende el ingrediente activo puede, por ejemplo, producirse comprimiendo o moldeando el ingrediente activo, opcionalmente con uno o más ingredientes adicionales. Los comprimidos comprimidos pueden prepararse comprimiendo, en un dispositivo adecuado, el ingrediente activo en una forma de flujo libre tal como una preparación en polvo o en gránulos, opcionalmente mezclada con uno o más de, un aglutinante, un lubricante, un excipiente, un agente tensioactivo y un agente de dispersión. Los comprimidos moldeados pueden producirse moldeando, en un dispositivo adecuado, una mezcla del ingrediente activo, un vehículo farmacéuticamente aceptable y al menos líquido suficiente para humedecer la mezcla. Los excipientes farmacéuticamente aceptables utilizados en la fabricación de comprimidos incluyen, pero no se limitan a, diluyentes inertes, agentes de granulación y agentes disgregantes, agentes ligantes y agentes lubricantes. Los agentes de dispersión conocidos incluyen, pero no se limitan a, almidón de patata y almidón glicolato de sodio. Los agentes tensioactivos conocidos incluyen, pero no se limitan a, laurilsulfato de sodio. Los diluyentes conocidos incluyen, pero no se limitan a, carbonato de calcio, carbonato de sodio, lactosa, celulosa microcristalina, fosfato de calcio, hidrógeno fosfato de calcio y fosfato de sodio. Los agentes de granulación y los agentes disgregantes conocidos incluyen, pero no se limitan a, almidón de maíz y ácido algínico. Los agentes ligantes conocidos incluyen, pero no se limitan a, gelatina, acacia, almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona e hidroxipropilmetilcelulosa. Los agentes lubricantes conocidos incluyen, pero no se limitan a, estearato de magnesio, ácido esteárico, sílice y talco.
Los comprimidos pueden ser no recubiertos o pueden recubrirse usando procedimientos conocidos para conseguir la disgregación retardada en el tracto gastrointestinal de un sujeto, proporcionando de ese modo liberación y absorción sostenida del ingrediente activo. A modo de ejemplo, puede usarse un elemento tal como el monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo para recubrir los comprimidos. A modo de otro ejemplo, los comprimidos pueden recubrirse usando los procedimientos descritos en las Patentes de EEUU números 4.256.108; 4.160.452; y 4.265.874 para formar comprimidos de liberación controlada osmóticamente. Los comprimidos pueden comprender además un agente edulcorante, un agente aromatizante, un agente colorante, un conservante o alguna combinación de estos para proporcionar la preparación farmacéuticamente elegante y agradable.
Las cápsulas duras que comprenden el ingrediente activo pueden fabricarse usando una composición fisiológicamente degradable, tal como gelatina. Tales cápsulas duras comprenden el ingrediente activo, y pueden comprender además otros ingredientes que incluyen, por ejemplo, un diluyente sólido inerte tal como carbonato de calcio, fosfato de calcio o caolín.
Las cápsulas de gelatina blanda que comprenden el ingrediente activo pueden fabricarse usando una composición fisiológicamente degradable, tal como gelatina. Tales cápsulas blandas comprenden el ingrediente activo, que puede mezclarse con agua o con un medio oleoso tal como aceite de cacahuete, parafina líquida o aceite de oliva.
Las formulaciones líquidas de una composición farmacéutica de la invención que son adecuadas para la administración oral pueden prepararse, envasarse y venderse en forma líquida o en la forma de un producto seco destinado a la reconstitución con agua u otro vehículo adecuado antes del uso.
Las suspensiones líquidas pueden prepararse usando procedimientos convencionales para conseguir la suspensión del ingrediente activo en un vehículo acuoso u oleoso. Los vehículos acuosos incluyen, por ejemplo, el agua y la disolución salina isotónica. Los vehículos oleosos incluyen, por ejemplo, aceite de almendras, ésteres oleosos, alcohol etílico, aceites vegetales tales como aceite de cacahuete, aceite de oliva, aceite de sésamo o aceite de coco, aceites vegetales fraccionados y aceites minerales tales como la parafina líquida. Las suspensiones líquidas pueden comprender además uno o más ingredientes adicionales que incluyen, pero no se limitan a, agentes de suspensión, agentes de dispersión o humectantes, agentes emulsivos, demulcentes, conservantes, tampones, sales, aromatizantes, colorantes y edulcorantes. Las suspensiones oleosas pueden comprender además un agente espesante. Los agentes de suspensión conocidos incluyen, pero no se limitan a, jarabe de sorbitol, grasas comestibles hidrogenadas, alginato de sodio, polivinilpirrolidona, goma tragacanto, goma acacia y derivados de celulosa tales como carboximetilcelulosa sódica, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa. Los agentes de dispersión o agentes humectantes conocidos incluyen, pero no se limitan a, fosfátidos que se presentan naturalmente tal como lecitina, productos de condensación de un óxido de alquileno con un ácido graso, con un alcohol alifático de cadena larga, con un éster parcial derivado de un ácido graso y un hexitol, o con un éster parcial derivado de un ácido graso y de un anhídrido de hexitol (por ejemplo, estearato de polioxietileno, heptadecaetilenoxicetanol, monooleato de polioxietilensorbitol y monooleato de polietilensorbitano, respectivamente). Los agentes emulsivos conocidos incluyen, pero no se limitan a, lecitina y acacia. Los agentes conservantes conocidos incluyen, pero no se limitan a, metil-, etil- o n-propil-para-hidroxibenzoato, ácido ascórbico y ácido sórbico. Los agentes edulcorantes conocidos incluyen, por ejemplo, glicerol, propilenglicol, sorbitol, sacarosa y sacarina. Los agentes espesantes conocidos para las suspensiones oleosas incluyen, por ejemplo, cera de abejas, parafina dura y alcohol cetílico.
Las disoluciones líquidas del ingrediente activo en los disolventes acuosos u oleosos pueden prepararse sustancialmente de la misma manera que las suspensiones líquidas, siendo la diferencia principal que el ingrediente activo se disuelve, en lugar de suspenderse en el disolvente. Las disoluciones líquidas de la composición farmacéutica de la invención pueden comprender cada uno de los componentes descritos con respecto a las suspensiones líquidas, entendiéndose que los agentes de suspensión no necesariamente ayudan a la disolución del ingrediente activo en el disolvente. Los disolventes acuosos incluyen, por ejemplo, el agua y la disolución salina isotónica. Los disolventes oleosos incluyen, por ejemplo, aceite de almendras, ésteres oleosos, alcohol etílico, aceites vegetales tales como aceite de cacahuete, aceite de oliva, aceite de sésamo o aceite de coco, aceites vegetales fraccionados y aceites minerales tales como la parafina líquida.
Las formulaciones en polvo y en gránulos de una preparación farmacéutica de la invención pueden prepararse usando procedimientos conocidos. Tales formulaciones pueden administrarse directamente a un sujeto, utilizándose, por ejemplo, para formar comprimidos, para llenar cápsulas o para preparar una suspensión acuosa u oleosa o una disolución añadiendo un vehículo acuoso u oleoso a las mismas. Cada una de estas formulaciones puede comprender además uno o más agentes de dispersión o humectantes, un agente de suspensión y un conservante. También pueden incluirse en estas formulaciones otros excipientes, tales como agentes de carga y agentes edulcorantes, aromatizantes o colorantes.
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Una composición farmacéutica de la invención también puede prepararse, envasarse o venderse bajo la forma de una emulsión de aceite en agua o una emulsión de agua en aceite. La fase oleosa puede ser un aceite vegetal tal como aceite de oliva o aceite de cacahuete, un aceite mineral tal como parafina líquida o una combinación de estos. Tales composiciones pueden comprender además uno o más agentes emulsivos tales como goma acacia o goma tragacanto, fosfátidos que se presentan naturalmente tales como fosfátidos de semilla de soja o lecitina, ésteres o ésteres parciales derivados de combinaciones de ácidos grasos y anhídridos de hexitol tales como, monooleato de sorbitán y productos de condensación de tales ésteres parciales con óxido de etileno tal como el monooleato de polioxietilensorbitán. Estas emulsiones pueden contener también otros ingredientes que incluyen, por ejemplo, agentes edulcorantes y aromatizantes.
Según se usa en el presente documento, "administración parenteral" de una composición farmacéutica incluye cualquier vía de administración caracterizada por practicar una abertura física de un tejido de un sujeto y la administración de la composición farmacéutica a través de la abertura del tejido. La administración parenteral incluye por consiguiente, pero no se limita a, la administración de una composición farmacéutica por inyección de la composición, por aplicación de la composición a través de una incisión quirúrgica, por aplicación de la composición a través de una herida no quirúrgica que penetra en el tejido, y similares. En particular, está contemplado que la administración parenteral incluya, pero está limitada a, inyección subcutánea, intraperitoneal, intramuscular, intraesternal y las técnicas de infusión renal por diálisis.
Las formulaciones de una composición farmacéutica adecuada para la administración parenteral comprenden el ingrediente activo combinado con un vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como agua estéril o disolución salina isotónica estéril. Tales formulaciones pueden prepararse, envasarse o venderse en una forma adecuada para la administración en embolada o para la administración continua. Las formulaciones inyectables pueden prepararse, envasarse o venderse en forma de monodosis, por ejemplo en ampollas o en recipientes de dosis múltiples que contienen un conservante. Las formulaciones para administración parenteral incluyen, pero no se limitan a, suspensiones, disoluciones, emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, pastas y formulaciones implantables de liberación prolongada o biodegradables. Tales formulaciones pueden comprender además uno o más ingredientes adicionales que incluyen, pero no se limitan a, agentes de suspensión, estabilizantes o agentes de dispersión. En una forma de realización de una formulación para administración parenteral, el ingrediente activo se proporciona en forma seca (es decir en polvo o gránulos) para la reconstitución con un vehículo adecuado (por ejemplo, agua estéril sin pirógenos) previa a la administración parenteral de la composición reconstituida.
Las composiciones farmacéuticas pueden prepararse, envasarse o venderse en la forma de suspensión o disolución inyectable estéril acuosa u oleosa. Esta suspensión o disolución puede formularse según la técnica conocida, y puede comprender, además del ingrediente activo, otros ingredientes tales como agentes de dispersión, agentes humectantes o agentes de suspensión que se describen en el presente documento. Tales formulaciones inyectables estériles pueden prepararse usando un diluyente o disolvente no tóxico parenteralmente aceptable, tal como, por ejemplo, agua o 1,3-butanodiol. Otros diluyentes y disolventes aceptables incluyen, pero no se limitan a, disolución de Ringer, disolución isotónica de cloruro de sodio y aceites fijos tales como mono o diglicéridos sintéticos. Otras formulaciones que pueden administrarse por vía parenteral que son útiles incluyen las que comprenden el ingrediente activo en forma microcristalina, en una preparación de liposomas, o como un componente de un sistema polimérico biodegradable. Las composiciones para liberación sostenida o implantación pueden comprender materiales poliméricos o hidrófobos farmacéuticamentes aceptables tales como una emulsión, una resina de intercambio iónico, un polímero escasamente soluble o una sal escasamente soluble.
Una composición farmacéutica de la invención puede prepararse, envasarse o venderse en una formulación adecuada para administración pulmonar a través de la cavidad bucal. Tal formulación puede comprender partículas secas que comprenden el ingrediente activo y que tienen un diámetro en el intervalo desde aproximadamente 0,5 hasta aproximadamente 7 nanómetros, y de preferencia desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 6 nanómetros. Tales composiciones están convenientemente en la forma de polvo seco para administración usando un dispositivo que comprende un depósito de polvo seco al que puede dirigirse un chorro de propulsor para dispersar el polvo o usando un disolvente autopropulsado/recipiente de administración de polvo tal como un dispositivo que comprende el ingrediente activo disuelto o suspendido en un propulsor de bajo punto de ebullición en un recipiente sellado. De preferencia, tales polvos comprenden partículas en las que al menos el 98% en peso de las partículas tienen un diámetro mayor que 0,5 nanómetros y al menos el 95% de las partículas tienen un diámetro menor que 7 nanómetros. De más preferencia, al menos el 95% en peso de las partículas tienen un diámetro mayor que 1 nanómetro y al menos el 90% en número de las partículas tienen un diámetro menor que 6 nanómetros. Las composiciones de polvo seco incluyen de preferencia un diluyente sólido de polvo fino tal como azúcar y se proporcionan convenientemente en una forma de
monodosis.
Los propulsores de bajo punto de ebullición incluyen por lo general propulsores líquidos que tienen una temperatura de ebullición inferior a 18,3ºC (65 grados F) a presión atmosférica. El propulsor puede constituir por lo general del 50 al 99,9% (p/p) de la composición, y el ingrediente activo puede constituir del 0,1 al 20% (p/p) de la composición. El propulsor puede comprender además otros ingredientes tales como un tensioactivo no iónico líquido o un tensioactivo aniónico sólido o un diluyente sólido (que tiene de preferencia un tamaño de partícula del mismo orden que las partículas que comprenden el ingrediente activo).
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Las composiciones farmacéuticas de la invención formuladas para administración pulmonar pueden también proporcionar el ingrediente activo en la forma de gotículas de una disolución o de una suspensión. Tales formulaciones pueden prepararse, envasarse o venderse como disoluciones o suspensiones acuosas o alcohólicas diluidas, opcionalmente estériles, que comprenden el ingrediente activo, y pueden administrarse convenientemente usando cualquier dispositivo de nebulización o de atomización. Tales formulaciones pueden comprender además uno o más ingredientes que incluyen, pero no se limitan a, un agente saborizante tal como sacarina sódica, un aceite volátil, un agente tamponador, un agente tensioactivo o un conservante tal como metilhidroxibenzoato. Las gotículas proporcionadas por esta vía de administración tienen de preferencia un diámetro promedio en el intervalo desde aproximadamente 0,1 hasta aproximadamente 200 nanómetros.
Las formulaciones descritas en el presente documento como útiles para la administración pulmonar también son útiles para la administración intranasal de una composición farmacéutica de la invención.
Otra formulación adecuada para administración intranasal es un polvo grueso que comprende el ingrediente activo y que tiene una partícula promedio de aproximadamente 0,2 hasta 500 micrómetros. Tal formulación se administra de la manera en que se realiza una aspiración, es decir mediante una inhalación rápida a través del conducto nasal desde un recipiente del polvo que se mantiene cerca de las narinas.
Las formulaciones adecuadas para administración nasal pueden comprender, por ejemplo, desde aproximadamente tan poco como 0,1% (p/p) y tanto como 100% (p/p) del ingrediente activo, y pueden comprender además uno o más de los ingredientes adicionales que se describen en el presente documento.
Una composición farmacéutica de la invención puede prepararse, envasarse o venderse en una formulación adecuada para administración bucal. Tales formulaciones pueden estar, por ejemplo, en forma de comprimidos o pastillas preparados usando procedimientos convencionales, y pueden tener, por ejemplo, del 0,1 al 20% (p/p) del ingrediente activo, comprendiendo el equilibrio una composición que puede disolverse o degradarse por vía oral y, opcionalmente, uno o más de los ingredientes adicionales que se describen en el presente documento. Como alternativa, las formulaciones adecuadas para la administración bucal pueden comprender un polvo o una disolución o suspensión de aerosol o atomizada que comprende el ingrediente activo. Tales formulaciones en polvo o en aerosol, cuando se dispersan, tienen de preferencia un tamaño promedio de partícula o de gotícula en el intervalo desde aproximadamente 0,1 hasta aproximadamente 200 nanómetros, y además pueden comprender uno o más de los ingredientes adicionales que se describen en el presente documento.
Según se usa en el presente documento, "ingredientes adicionales" incluyen, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: excipientes; agentes tensioactivos; agentes de dispersión; diluyentes inertes; agentes de granulación y de disgregación; agentes ligantes; agentes lubricantes; agentes edulcorantes; agentes aromatizantes; agentes colorantes; conservantes; composiciones fisiológicamente degradables tales como gelatina; vehículos y disolventes acuosos; vehículos y disolventes oleosos; agentes de suspensión; agentes dispersantes o humectantes; agentes emulsivos, demulcentes; tampones; sales; agentes espesantes; cargas; agentes emulsivos; antioxidantes; antibióticos; agentes antifúngicos; agentes estabilizantes; y materiales poliméricos o hidrófobos farmacéuticamente aceptables. Otros "ingredientes adicionales" que pueden incluirse en las composiciones farmacéuticas de la invención son conocidos en la técnica y están descritos, por ejemplo en Genaro, ed., 1985, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA.
Típicamente las dosificaciones del compuesto de la invención que pueden administrarse a un animal, de preferencia un ser humano, varían en cantidad desde 1 microgramo hasta aproximadamente 100 gramos por kilogramo de peso corporal del animal. Aunque la dosis precisa administrada variará según una serie de factores, incluidos, pero no limitados al tipo de animal y tipo de estado de enfermedad que se trata, la edad del animal y la vía de administración. De preferencia, la dosis del compuesto variará desde aproximadamente 1 mg hasta aproximadamente 10 g por kilogramo de peso corporal del animal. De preferencia, la dosis variará desde aproximadamente 10 mg hasta aproximadamente 1 g por kilogramo de peso corporal del animal.
El compuesto puede administrarse a un animal tan frecuentemente como varias veces al día, o puede administrarse con menos frecuencia, por ejemplo una vez al día, una vez por semana, una vez cada dos semanas, una vez al mes, o aún menos frecuentemente, tal como una vez cada varios meses o incluso una vez al año o menos. La frecuencia de la dosis será fácilmente evidente para el experto en la técnica y dependerá de una serie de factores, tales como, pero no limitados a, el tipo y gravedad de la enfermedad que se está tratando, el tipo y la edad del animal, etc.
Depósito. Bajo los términos del tratado de Budapest en el International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the purpose of Patent Procedure, el depósito del ácido nucleico que incluye ADN de FGF23 se realizó en la colección alemana de cultivos celulares y microorganismos (DSMZ) el 14 de junio de 2000, como número de depósito DSM 13530.
La secuencia de nucleótidos del clon depositado puede determinarse fácilmente por secuenciación del clon depositado según los procedimientos conocidos. La secuencia de aminoácidos puede verificarse a continuación a partir de tal depósito. Por otra parte, la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada por el clon depositado también puede determinarse directamente mediante la secuenciación del péptido o la expresión de la proteína en una célula huésped adecuada que contiene el ADN depositado que codifica FGF23, recogiendo la proteína y determinando su secuencia.
Los cesionarios de la solicitud, Advanced Research and Technology Institute and LMU Munchen, describen que el DSMZ es un almacén que garantiza permanencia del depósito y fácil accesibilidad al mismo por el público si se concede una patente. Todas las restricciones en la disponibilidad del material depositado para el público quedan irrevocablemente eliminadas tras la concesión de una patente. El material estará fácilmente disponible mientras esté pendiente la solicitud de una patente determinada por la Comisión a tenor de 37 C.F.R. \NAK 1.14 y de 35 U.S.C. \NAK 122. El material depositado se mantendrá con todo el cuidado necesario para mantenerlo viable y sin contaminación durante un período de al menos de cinco años después de la petición más reciente para la producción de una muestra del material depositado, y en cualquier caso, durante un período de al menos treinta (30) años después de la fecha del depósito o durante la vida ejecutable de la patente, el período que sea más prolongado. El titular de la solicitud reconoce su responsabilidad de reemplazar el depósito si el almacén es incapaz de ofrecer una muestra cuando se solicita por la condición del depósito.
Definiciones
Según se utiliza en el presente documento, cada uno de los siguientes términos tiene el significado asociado con el mismo en esta sección.
Los artículos "un" y "una" se usan en el presente documento para referirse a uno o más de uno (es decir, al menos a uno) de los objetos gramaticales del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" significa un elemento o más de un elemento.
Según se utiliza en el presente documento, la frase "variante alélica" se refiere a una secuencia de nucleótidos que aparece en un locus dado o a un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos.
Según se utiliza en el presente documento, los aminoácidos se representan por el nombre completo de los mismos, por el código de tres letras correspondiente a los mismos, o por el código de la una letra correspondiente a los mismos, según se indica en la siguiente tabla:
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Según se utiliza en el presente documento, "aliviar" una enfermedad, trastorno o afección mediada o asociada a FGF23.
El término "anticuerpo", según se utiliza en el presente documento, se refiere a una molécula de inmunoglobulina que es capaz de unirse específicamente a un epítopo específico en un antígeno. Los anticuerpos pueden ser inmunoglobulinas intactas procedentes de fuentes naturales o de fuentes recombinantes y pueden ser porciones inmunorreactivas de inmunoglobulinas intactas. Los anticuerpos son típicamente tetrámeros de moléculas de inmunoglobulinas. Los anticuerpos en la presente invención pueden existir en una diversidad de formas que incluyen, por ejemplo, anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, Fv, Fab y F(ab)_{2}, así como anticuerpos monocatenarios y anticuerpos humanizados (Harlow y col., 1999, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow y col., 1989, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Nueva York; Houston y col., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883; Bird y col., 1988, Science 242: 423-426).
Por el término "anticuerpo sintético" según se utiliza en el presente documento, se entiende un anticuerpo que se genera usando tecnología de ADN recombinante, tal como, por ejemplo, un anticuerpo expresado por un bacteriófago como se describe en el presente documento. Debe también interpretarse que el término significa un anticuerpo que se ha generado por la síntesis de una molécula de ADN que codifica el anticuerpo y cuya molécula de ADN expresa una proteína de anticuerpo, o una secuencia de aminoácidos que especifica un anticuerpo, en el que el ADN o la secuencia de aminoácidos se han obtenido usando tecnología de ADN o de secuencia de aminoácidos sintéticos que está disponible y se conoce muy bien en la técnica.
"Antisentido" se refiere en particular a la secuencia del ácido nucleico de la hebra no codificadora de una molécula de ADN bicatenaria que codifica una proteína, o a una secuencia que es substancialmente homóloga a la hebra no codificadora. Según se define en el presente documento, una secuencia antisentido es complementaria a la secuencia de una molécula de ADN bicatenaria que codifica una proteína. No es necesario que la secuencia antisentido sea complementaria solamente a la porción codificadora de la hebra codificadora de la molécula de ADN. La secuencia antisentido puede ser complementaria a secuencias reguladoras especificadas en la hebra codificadora de una molécula de ADN que codifica una proteína, cuyas secuencias reguladoras controlan la expresión de las secuencias codificadoras.
Por el término "aplicador" según se utiliza el término en el presente documento, se entiende cualquier dispositivo que incluye, pero no se limita a, una jeringa hipodérmica, una pipeta, un nebulizador, y similares, para administrar el ácido nucleico, la proteína, y/o una composición de la invención a un mamífero.
Una "región codificadora" de un gen está constituida por los residuos de nucleótidos de la hebra codificadora del gen y los nucleótidos de la hebra no codificadora del gen que son homólogos con o complementarios a, respectivamente, los de la región codificadora de una molécula de ARNm que se produce por la transcripción del gen.
Una "región codificadora" de una molécula de ARNm también está constituida por los residuos de nucleótidos de la molécula de ARNm que coinciden con una región del anticodón de una molécula de ARN de transferencia durante la traducción de la molécula de ARNm o que codifican un codón de parada. La región codificadora puede por consiguiente incluir residuos de nucleótidos correspondientes a residuos aminoácidos que no están presentes en la proteína madura codificada por la molécula de ARNm (por ejemplo, residuos de aminoácidos en una secuencia señal de exportación de la proteína).
Por "complementario a una porción o a todo el ácido nucleico que codifica FGF23" se entiende una secuencia de ácido nucleico que no codifica la proteína FGF23. Más bien, la secuencia que es idéntica a la hebra no codificadora del ácido nucleico que codifica FGF23 y que por consiguiente, no codifica la proteína FGF23.
Los términos "complementario" y "antisentido" según se utilizan en el presente documento, no son completamente sinónimos. "Antisentido" se refiere particularmente a la secuencia de ácido nucleico de la hebra no codificadora de una molécula de ADN bicatenaria que codifica una proteína, o a una secuencia que es sustancialmente homóloga a la hebra no codificadora. "Complementario" según se utiliza en el presente documento se refiere al amplio concepto de complementariedad de secuencias de subunidades entre dos ácidos nucleicos, por ejemplo, dos moléculas de ADN. Cuando una posición de nucleótido en ambas moléculas está ocupada por nucleótidos normalmente capaces de aparear bases uno con el otro, entonces se considera que los ácidos nucleicos son complementarios uno con el otro en esta posición. Por consiguiente, dos ácidos nucleicos son complementarios uno con el otro cuando un número sustancial (al menos el 50%) de las posiciones correspondientes en cada una de las moléculas están ocupadas por nucleótidos que normalmente aparean bases uno con el otro (por ejemplo, pares de nucleótidos A: T y G: C). Según se define en el presente documento, una secuencia antisentido es complementaria a la secuencia de una molécula de ADN bicatenaria que codifica una proteína. No es necesario que la secuencia antisentido sea complementaria solamente a la porción codificadora de la hebra codificadora de la molécula de ADN. La secuencia antisentido puede ser complementaria a las secuencias reguladoras especificadas en la hebra codificadora de una molécula de ADN que codifica una proteína, cuyas secuencias reguladoras controlan la expresión de las secuencias codificadoras.
"Homólogo" se refiere a la similitud de secuencia de subunidades entre dos moléculas poliméricas, por ejemplo, entre dos moléculas de ácido nucleico, por ejemplo, dos moléculas de ADN o dos moléculas de ARN, o entre dos moléculas de polipéptidos. Cuando una posición de subunidad en las dos moléculas está ocupada por la misma subunidad monomérica, por ejemplo, si una posición en cada una de las dos moléculas de ADN está ocupada por adenina, entonces son homólogas en esta posición. La homología entre dos secuencias es una función directa del número de posiciones coincidentes u homólogas, por ejemplo, si la mitad (por ejemplo, cinco posiciones en un polímero con una longitud de diez subunidades) de las posiciones en dos secuencias del compuesto son homólogas entonces las dos secuencias son 50% homólogas, si el 90% de las posiciones, por ejemplo, 9 de 10, coinciden o son homólogas, las dos secuencias comparten el 90% de homología. A modo de ejemplo, las secuencias de ADN 3'ATTGCC5' y 3'TATGCG5' comparten el 50% de homología.
Un primer oligonucleótido hibrida con un segundo oligonucleótido con "alta rigurosidad" si los dos oligonucleótidos hibridan bajo condiciones por las que sólo los oligonucleótidos que son al menos aproximadamente 60%, de más preferencia al menos aproximadamente 65%, aún de más preferencia al menos aproximadamente 70%, todavía de más preferencia al menos aproximadamente 80%, y de preferencia al menos aproximadamente 90% o, de más preferencia, al menos aproximadamente 95%, complementarios hibridan uno con el otro. La rigurosidad de las condiciones utilizadas para hibridar dos oligonucleótidos es una función de, entre otros factores, la temperatura, la fuerza iónica del medio de hibridación, el período de incubación, la longitud de los oligonucleótidos, el contenido de G-C de los oligonucleótidos y el nivel esperado de falta de homología entre los dos oligonucleótidos, si se sabe. Los procedimientos para ajustar la rigurosidad de las condiciones de hibridación son conocidos (véase, por ejemplo, Sambrook y col., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York).
La determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos o de aminoácidos puede llevarse a cabo usando un algoritmo matemático. Por ejemplo, un algoritmo matemático útil para comparar dos secuencias es el algoritmo de Karlin y Altschul (1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-2268), modificado como en Karlin y Altschul (1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877). Este algoritmo está incorporado en los programas NBLAST y XBLAST de Altschul y col. (1990, J. Mol. Biol. 215: 403-410), y puede accederse, por ejemplo, en el sitio web del National Center for Biotechnology Information (NCBI) que tiene el localizador de recursos universal "http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/". Las búsquedas de nucleótidos con BLAST puede realizarse con el programa NBLAST (denominado "blastn" en el sitio web de NCBI), usando los siguientes parámetros: penalización de hueco = 5; penalización de extensión de hueco = 2; penalización de acoplamiento erróneo = 3; recompensa de coincidencia = 1; valor de expectativa 10,0; y tamaño de palabra = 11 para obtener las secuencias de nucleótidos homólogas a un ácido nucleico descrito en el presente documento. Las búsquedas de proteínas con BLAST pueden realizarse con el programa XBLAST (denominado "blastn" en el sitio web de NCBI) o el programa "blastp" del NCBI, usando los siguientes parámetros: valor de expectativa 10.0, matriz de puntuación BLOSUM62 para obtener las secuencias de aminoácidos homólogas a una molécula de proteína descrita en el presente documento.
Para obtener alineaciones con huecos con fines de comparación, puede utilizarse Gapped BLAST según se describe en Altschul y col. (1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). Como alternativa, pueden usarse PSI-Blast o PHI-Blast para realizar una búsqueda iterada que detecte relaciones distantes entre las moléculas (Id.) y relaciones entre las moléculas que comparten un patrón común. Cuando se utilizan los programas BLAST, Gapped BLAST, PSI-Blast y PHI-Blast, pueden usarse los parámetros por defecto de los respectivos programas (por ejemplo, XBLAST y NBLAST). Véase http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
El porcentaje de identidad entre dos secuencias puede determinarse usando técnicas similares a las descritas anteriormente, con o sin huecos permitidos. Al calcular el porcentaje de identidad, típicamente se cuentan las coincidencias exactas.
Según se utiliza en el presente documento, los términos "gen" y "gen recombinante" se refieren a moléculas de ácidos nucleicos que comprenden un marco de lectura abierto que codifican un polipéptido de la invención. Tales variaciones alélicas naturales pueden dar como resultado típicamente el 1-5% de varianza en la secuencia de nucleótidos de un gen dado. Los alelos alternativos pueden identificarse secuenciando el gen de interés en una serie de individuos diferentes. Esto puede realizarse fácilmente usando sondas de hibridación para identificar los mismos locus genéticos en una diversidad de individuos. Se pretende que todas y cada una de tales variaciones de nucleótidos y polimorfismos o variaciones de aminoácidos resultantes que son el resultado de la variación alélica natural y que no alteran la actividad funcional, estén dentro del ámbito de la invención.
"Codificar" se refiere a la propiedad inherente de secuencias de nucleótidos específicas en un polinucleótido, tales como un gen, un ADNc, o un ARNm, de servir como moldes para la síntesis de otros polímeros y macromoléculas en procesos biológicos que tienen una secuencia de nucleótidos definida (es decir, ARNr, ARNt y ARNm) o una secuencia de aminoácidos definida y las propiedades biológicas resultantes de los mismos. Por consiguiente, un gen codifica una proteína si la transcripción y la traducción del ARNm correspondiente a ese gen produce la proteína en una célula u otro sistema biológico. Puede decirse que tanto la hebra codificadora, cuya secuencia de nucleótidos es idéntica a la secuencia de ARNm y se proporciona habitualmente en los listados de secuencias, como la hebra no codificadora, usada como el molde para la transcripción de un gen o ADNc, codifican la proteína u otro producto de ese gen o ADNc.
A menos que se especifique de otra manera, una "secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos" incluye todas las secuencias de nucleótidos que son versiones degeneradas una de la otra y que codifica la misma secuencia de aminoácidos. Las secuencias de nucleótidos que codifican proteínas y el ARN pueden incluir intrones.
"Vector de expresión" se refiere a un vector que comprende un polinucleótido recombinante que comprende secuencias de control de la expresión unidas de manera operativa a una secuencia de nucleótidos a expresar. Un vector de expresión comprende suficientes elementos de actuación en cis; otros elementos para la expresión pueden ser suministrados por la célula huésped o en un sistema de expresión in vitro. Los vectores de expresión incluyen todos los conocidos en la técnica, tales como cósmidos, plásmidos (por ejemplo, desnudos o contenidos en liposomas) y virus (por ejemplo, retrovirus, adenovirus y virus adenoasociados) que incorporan el polinucleótido recombinante.
Según se utiliza en el presente documento, el término "fragmento" en relación a un ácido nucleico, puede tener normalmente una longitud de al menos aproximadamente 10 nucleótidos, típicamente al menos aproximadamente 20 nucleótidos, más típicamente, desde aproximadamente 20 hasta aproximadamente 50 nucleótidos, de preferencia al menos aproximadamente 50 hasta aproximadamente 100 nucleótidos, aún de más preferencia al menos aproximadamente 100 nucleótidos hasta aproximadamente 500 nucleótidos, todavía más de preferencia al menos aproximadamente 500 hasta aproximadamente 1.000, y de mayor preferencia, el fragmento de ácido nucleico tendrá una longitud mayor que aproximadamente 1.500 nucleótidos.
Según se utiliza en el presente documento, el término "fragmento" en relación a un polipéptido, puede tener normalmente una longitud de al menos aproximadamente siete aminoácidos contiguos, típicamente, al menos aproximadamente quince aminoácidos contiguos, más típicamente, al menos aproximadamente treinta aminoácidos contiguos, típicamente al menos aproximadamente cuarenta aminoácidos contiguos, de preferencia al menos aproximadamente cincuenta aminoácidos, aún de más preferencia al menos aproximadamente sesenta aminoácidos y de mayor preferencia, el fragmento del péptido tendrá una longitud mayor que aproximadamente setenta aminoácidos contiguos.
Según se utiliza en el presente documento, la expresión "hibrida bajo condiciones rigurosas" pretende describir las condiciones para la hibridación y el lavado bajo las que las secuencias de nucleótidos al menos 60% (65%, 70%, de preferencia 75%) idénticas una a la otra permanecen típicamente hibridadas una a la otra. Tales condiciones rigurosas son conocidas por los expertos en la técnica y pueden encontrarse en: Current Protocols in Molecular Biology, en 6.3.1-6.3.6, John Wiley & Sons, N.Y. (1989). Un ejemplo de condiciones de hibridación rigurosas es la hibridación en 6x cloruro de sodio/citrato sódico (SSC) aproximadamente a 45ºC, seguida por uno o más lavados en 0,2x SSC, SDS al 0,1% a 50-65ºC. De preferencia, una molécula de ácido nucleico aislada de la invención que hibrida bajo condiciones rigurosas a la secuencia de cualquiera de ID. SEC. Nº 1 ó 3, o a uno de sus complementos, corresponde a una molécula de ácido nucleico que se presenta naturalmente. Según se usa en el presente documento, una molécula de ácido nucleico "que se presenta naturalmente" se refiere a una molécula de ARN o ADN que tiene una secuencia de nucleótidos que aparece en la naturaleza (por ejemplo, que codifica una proteína natural).
Un "ADN genómico" es una hebra de ADN que tiene una secuencia de nucleótidos homóloga con un gen. A modo de ejemplo, un fragmento de un cromosoma y un ADNc obtenido por transcripción inversa de un ARNm de mamífero son ADN genómicos.
Según se utiliza en el presente documento, "homología" se utiliza como sinónimo de "identidad".
Además, cuando el término "homología" se usa en el presente documento para referirse a ácidos nucleicos y proteínas, debe interpretarse que se aplica a la homología tanto al nivel del ácido nucleico y como de los aminoácidos.
Según se utiliza en el presente documento, un "material instructivo" incluye una publicación, una grabación, un diagrama, o cualquier otro medio de expresión que pueda usarse para comunicar la utilidad de la composición de la invención para su uso proyectado. El material instructivo del kit de la invención puede estar, por ejemplo, pegado a un recipiente que contiene la composición o puede transportarse junto con un recipiente que contiene la composición. Como alternativa, el material instructivo puede transportarse por separado del recipiente con la intención de que el material instructivo y la composición sean utilizados conjuntamente por el receptor.
Un "ácido nucleico aislado" se refiere a un segmento o fragmento de ácido nucleico que se ha separado de sus secuencias vecinas en el estado en que se presenta naturalmente, por ejemplo, un fragmento de ADN que se ha retirado de las secuencias que están normalmente adyacentes al fragmento, por ejemplo, las secuencias adyacentes al fragmento en un genoma en el que se presenta naturalmente. El término también se aplica a los ácidos nucleicos que se han purificado substancialmente de otros componentes que acompañan naturalmente al ácido nucleico, por ejemplo, ARN o ADN o proteínas, que lo acompañan naturalmente en la célula. El término incluye por consiguiente, por ejemplo, un ADN recombinante que se incorpora en un vector, en un plásmido o virus que se replica de manera autónoma, o en el ADN genómico de un procariota o un eucariota, o que existe como una molécula separada (por ejemplo, como un ADNc o un fragmento genómico o un fragmento de ADNc producido por PCR o digestión con enzimas de restricción) independiente de otras secuencias. También incluye un ADN recombinante que es parte de un gen híbrido que codifica secuencias polipeptídicas adicionales.
En el contexto de la presente invención, se usan las siguientes abreviaturas para las bases de ácidos nucleicos que aparecen comúnmente. "A" se refiere a adenosina, "C" se refiere a citidina, "G" se refiere a guanosina, "T" se refiere a timidina y "U" refiere a uridina.
Los "derivados" y las "variantes" de los péptidos de la invención (o del ADN que los codifica) son péptidos que pueden estar alterados en uno o más aminoácidos (o en uno o más pares de bases) tal que el péptido (o el ADN) no sea idéntico a las secuencias expuestas en el presente documento, pero tenga la misma propiedad que los péptidos dados a conocer en el presente documento, que el péptido tenga actividad biológica de FGF23.
La expresión "mutación en un ácido nucleico que codifica FGF23" significa cualquier cambio de pares de bases en la secuencia del ácido nucleico ya sea que cambie la estructura o la función de la proteína o que no tenga efecto. Algunas mutaciones, incluidas, pero no limitadas a, R176Q, R179Q, R179W y cualquier otra mutación en cualquiera de estas dos argininas, afectan la estabilidad de la proteína y, por consiguiente, pueden afectar la semivida en la sangre u otros efectos biológicos.
Al describir dos polinucleótidos como "unidos de manera operativa" se entiende que un resto monocatenario o bicatenario del ácido nucleico comprende los dos polinucleótidos organizados dentro del resto del ácido nucleico de manera que al menos uno de los dos polinucleótidos sea capaz de ejercer un efecto fisiológico por el que se caracteriza sobre el otro. A modo de ejemplo, un promotor unido de manera operativa a la región codificadora de un gen es capaz de promover la transcripción de la región codificadora.
De preferencia, cuando el ácido nucleico que codifica la proteína deseada comprende además una secuencia promotora/reguladora, el promotor/regulador está situado en el extremo 5' de la secuencia codificadora de la proteína deseada tal que dirige la expresión de la proteína deseada en una célula.
Según se utiliza en el presente documento, el término "secuencia promotora/reguladora" significa una secuencia de ácido nucleico que es necesaria para la expresión de un producto de un gen unido de manera operativa a la secuencia promotora/reguladora. Algunas veces, esta secuencia puede ser la secuencia promotora central y en otros casos, esta secuencia puede también incluir una secuencia potenciadora y otros elementos reguladores que son necesarios para la expresión del producto del gen. La secuencia promotora/reguladora puede ser, por ejemplo, una que exprese el producto del gen de una manera específica de tejido.
Un promotor "constitutivo" es una secuencia de nucleótidos que, cuando está unida de manera operativa con un polinucleótido que codifica o especifica un producto genético, provoca la producción del producto genético en una célula bajo la mayoría o todas las condiciones fisiológicas de la célula.
Un promotor "inducible" es una secuencia de nucleótidos que, cuando está unida de manera operativa con un polinucleótido que codifica o especifica un producto genético, provoca la producción del producto genético en una célula sustancialmente solo cuando en la célula está presente un inductor que corresponde al promotor.
Un promotor "específico de tejido" es una secuencia de nucleótidos que, cuando está unida de manera operativa con un polinucleótido que codifica o especifica un producto genético, provoca la producción del producto genético en una célula sustancialmente solo si la célula es una célula del tipo de tejido que corresponde al promotor.
La expresión "expresión de un ácido nucleico" según se utiliza en el presente documento significa la síntesis del producto proteico codificado por el ácido nucleico.
El uso del término "ADN codificador" debe interpretarse que incluye la secuencia de ADN que codifica la proteína deseada y cualquier región 5' ó 3' no traducida necesaria que acompaña la secuencia codificadora real.
Por el término "situado en el extremo 5'" según se utiliza en el presente documento, se entiende que la secuencia promotora/reguladora está unida de manera covalente al extremo 5' del ácido nucleico cuya expresión regula, en una posición suficientemente cercana al sitio de comienzo de de la transcripción 5' del ácido nucleico para dirigir su expresión.
Se hace referencia a la dirección de adición de nucleótidos 5' a 3' a las transcripciones nacientes de ARN como la dirección de la transcripción. La hebra de ADN que tiene la misma secuencia que un ARNm se denomina "hebra codificadora"; las secuencias en la hebra de ADN que están situadas en posición 5' a un punto de referencia en el ADN se denominan "secuencias secuencia arriba"; las secuencias en la hebra de ADN que están en posición 3' a un punto de referencia en el ADN se denominan "secuencias secuencia abajo".
Una "secuencia de poliadenilación" es una secuencia de polinucleótido que dirige la adición de una cola de poli A sobre una secuencia transcrita del ARN mensajero.
Un "polinucleótido" significa una hebra simple o hebras paralelas y antiparalelas de un ácido nucleico. Por consiguiente, un polinucleótido puede ser un ácido nucleico monocatenario o bicatenario.
El término "ácido nucleico" se refiere típicamente a polinucleótidos grandes.
El término "oligonucleótido" se refiere típicamente a polinucleótidos cortos, por lo general, no mayores que aproximadamente 50 nucleótidos. Se entenderá que cuando una secuencia de nucleótidos está representada por una secuencia de ADN (es decir, A, T, G, C), esto también incluye una secuencia de ARN (es decir, A, U, G, C) en la que "U" reemplaza a "T".
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La notación convencional se usa en el presente documento para describir las secuencias de polinucleótidos: el extremo izquierdo de una secuencia de polinucleótido monocatenario es el extremo 5'; la dirección izquierda de una secuencia de polinucleótido bicatenaria se denomina dirección 5'.
"Cebador" se refiere a un polinucleótido que es capaz de hibridar específicamente con un molde de polinucleótido designado y proporcionar un punto de inicio para la síntesis de un polinucleótido complementario. Tal síntesis tiene lugar cuando el cebador del polinucleótido se coloca bajo condiciones en las que se induce la síntesis, es decir, en presencia de nucleótidos, un molde de polinucleótidos complementario, y un agente para polimerización tal como la polimerasa de ADN. Un cebador es típicamente monocatenario, pero puede ser bicatenario. Los cebadores son típicamente ácidos desoxirribonucleicos, pero una gran variedad de cebadores sintéticos y que se presentan en la naturaleza son útiles para muchas aplicaciones. Un cebador es complementario al molde para el que está diseñado a hibridar para servir como el sitio de inicio de la síntesis, pero no es necesario que refleje la secuencia exacta del molde. En tal caso, la hibridación específica del cebador con el molde depende de la rigurosidad de las condiciones de hibridación. Los cebadores pueden marcarse con, por ejemplo, restos cromógenos, radioactivos, o fluorescentes y usarse como restos detectables.
"Sonda" se refiere a un polinucleótido que es capaz de hibridar específicamente con una secuencia designada de otro polinucleótido. Una sonda hibrida específicamente con un polinucleótido complementario diana, pero no es necesario que refleje la secuencia complementaria exacta del molde. En tal caso, la hibridación específica de la sonda con la diana depende de la rigurosidad de las condiciones de hibridación. Las sondas pueden marcarse con, por ejemplo, restos cromogénicos, radioactivos, o fluorescentes y usarse como restos detectables.
"Polinucleótido recombinante" se refiere a un polinucleótido que tiene secuencias que no están naturalmente unidas juntas. Un polinucleótido recombinante amplificado o montado puede incluirse en un vector adecuado, y el vector puede usarse para transformar una célula huésped adecuada.
Un polinucleótido recombinante puede también tener una función no codificadora (por ejemplo, promotor, origen de replicación, sitio de unión de ribosomas, etc.).
Un "polipéptido recombinante" es uno que se produce tras la expresión de un polinucleótido recombinante.
Según se utiliza en el presente documento, el término "gen informador" significa un gen, cuya expresión puede detectarse usando un procedimiento conocido. A modo de ejemplo, el gen lacZ de Escherichia coli puede usarse como un gen informador en un medio porque la expresión del gen lacZ puede detectarse usando procedimientos conocidos añadiendo el sustrato cromógeno o-nitrofenil-\beta-galactósido al medio (Gerhardt y col., eds., 1994, Methods for General and Molecular Bacteriology, American Society for Microbiology, Washington, DC, pág. 574).
"Polipéptido" se refiere a un polímero compuesto de residuos de aminoácidos, variantes estructurales relacionadas que se presentan en la naturaleza y análogos sintéticos que no se presentan en la naturaleza de los mismos unidos por medio de enlaces peptídicos, variantes estructurales relacionadas que se presentan en la naturaleza y análogos sintéticos que no se presentan en la naturaleza de los mismos. Los polipéptidos sintéticos pueden sintetizarse, por ejemplo, usando un sintetizador de polipéptidos automatizado.
El término "proteína" se refiere típicamente a grandes polipéptidos.
El término "péptido" se refiere típicamente a polipéptidos cortos.
La notación convencional se usa en el presente documento para retratar secuencias de polipéptidos: el extremo izquierdo de una secuencia de polipéptidos es el extremo amino terminal; el extremo derecho de una secuencia de polipéptidos es el extremo carboxilo.
Un "sitio de restricción" es una parte de un ácido nucleico bicatenario que es reconocido por una endonucleasa de restricción.
Una parte de un ácido nucleico bicatenario es "reconocida" por una endonucleasa de restricción si la endonucleasa es capaz de escindir ambas hebras del ácido nucleico en la parte cuando el ácido nucleico y la endonucleasa se ponen en contacto.
Por la expresión "se une específicamente", según se usa en el presente documento, se entiende un compuesto, por ejemplo, una proteína, un ácido nucleico, un anticuerpo y similares, que reconoce y se une con una molécula específica, pero que no reconoce ni se une sustancialmente con otras moléculas en una muestra.
Un primer oligonucleótido hibrida con un segundo oligonucleótido "con alta rigurosidad" si los dos oligonucleótidos hibridan bajo condiciones por las que solo los oligonucleótidos que son al menos aproximadamente 60%, de preferencia al menos aproximadamente 65%, de más preferencia al menos aproximadamente 70%, aún de más preferencia al menos aproximadamente 75%, y de preferencia al menos aproximadamente 90% o al menos aproximadamente 95%, complementarios hibridan uno con el otro. La rigurosidad de las condiciones usadas para hibridar dos oligonucleótidos es una función de, entre otros factores, la temperatura, la fuerza iónica del medio de hibridación, el período de incubación, la longitud de los oligonucleótidos, el contenido de la G-C de los oligonucleótidos y el nivel esperado de falta de homología entre los dos oligonucleótidos, si se conoce. Los procedimientos para ajustar la rigurosidad de las condiciones de hibridación son conocidos (véase, por ejemplo, Sambrook y col., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York).
Según se utiliza en el presente documento, el término "sustancialmente puro" describe un compuesto, por ejemplo, un ácido nucleico, una proteína o polipéptido, que se ha preparado a partir de componentes que naturalmente lo acompañan. Típicamente, un compuesto es substancialmente puro cuando al menos aproximadamente el 10%, de preferencia al menos aproximadamente el 20%, de más preferencia al menos aproximadamente el 50%, aún de más preferencia al menos aproximadamente el 75%, todavía de más preferencia al menos aproximadamente el 90%, y de mayor preferencia al menos aproximadamente el 99% del material total (en volumen, en peso húmedo o seco, o en porcentaje molar o fracción molar) en una muestra es el compuesto de interés. La pureza puede medirse por cualquier procedimiento adecuado, por ejemplo, por cromatografía en columna, electroforesis en gel o análisis por HPLC.
Un compuesto, por ejemplo, un ácido nucleico, una proteína o polipéptido está también "sustancialmente purificado" cuando está esencialmente libre de componentes naturalmente asociados o cuando está separado de los contaminantes nativos que lo acompañan en su estado natural. Por consiguiente, una preparación "substancialmente pura" de un ácido nucleico, según se utiliza en el presente documento, se refiere a una secuencia de ácido nucleico que se ha purificado de las secuencias que le flanquean en el estado en que se presenta en la naturaleza, por ejemplo, un fragmento de ADN al que se le han eliminado las secuencias que están normalmente adyacentes al fragmento en un genoma en el que aparece naturalmente.
De manera similar, una preparación "sustancialmente pura" de una proteína o un polipéptido, según se utiliza en el presente documento, se refiere a una proteína o polipéptido que se ha purificado de los componentes con los que está normalmente asociado en su estado natural. Un péptido sustancialmente puro puede purificarse siguiendo procedimientos conocidos para la purificación de proteínas, en los que se usa un ensayo inmunológico, enzimático u otro ensayo para controlar la purificación en cada etapa en el procedimiento. Los procedimientos de purificación de proteínas son bien conocidos en la técnica, y se describen, por ejemplo en Deutscher y col. (1990, In: Guide to Protein Purification, Harcourt Brace Jovanovich, San Diego).
Por polipéptido "marcador" se entiende cualquier proteína que, cuando está unida por un enlace peptídico a una proteína de interés, puede usarse para localizar la proteína, para purificarla de un extracto celular, para inmovilizarla para uso en ensayos de unión, o de otra manera para estudiar sus propiedades biológicas y/o su función. Una proteína quimérica (es decir, de fusión) que contiene un epítopo "marcador" puede inmovilizarse en una resina que se une al marcador. Tales epítopos marcadores y las resinas que se unen específicamente a los mismos son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, epítopos marcadores que comprenden una pluralidad de residuos de histidina secuenciales (His6), que permiten el aislamiento de una proteína quimérica que comprende tal epítopo en níquel-ácido nitrilotriacético-agarosa, un epítopo marcador de hemaglutinina (HA) que permite a una proteína quimérica que comprende tal epítopo unirse con una matriz de afinidad de anticuerpos monoclonales anti-HA, un epítopo marcador myc que permite a una proteína quimérica que comprende tal epítopo unirse con una matriz de afinidad de anticuerpos monoclonales anti-myc, un epítopo marcador de glutatión S-transferasa, y un epítopo marcador de proteína de unión a la maltosa (MBP), que pueden inducir la unión entre una proteína que comprende tal epítopo y una columna glutationa-Sepharose o maltosa-Sepharose, respectivamente. La producción de proteínas que comprenden tales epítopos marcadores es bien conocido en la técnica y está descrita en tratados convencionales tales como Sambrook y col., 1989, y Ausubel y col., supra. Asimismo, los anticuerpos contra el epítopo marcador (por ejemplo, anticuerpo anti-myc 9E10, y similares) permiten la detección y la localización de la proteína de fusión en, por ejemplo, transferencias Western, ensayos ELISA, y en inmunotinción de células.
Según se utiliza en el presente documento, "tratar" significa reducir la frecuencia con la que un paciente experimenta síntomas.
Según se utiliza en el presente documento, un "inhibidor de FGF23" se define como cualquier molécula que sirve para reducir o para eliminar moléculas de proteína FGF23 o su actividad biológica. Tal inhibidores pueden ser ácidos nucleicos antisentido o ribozimas, moléculas que bloquean la interacción de FGF23 con su receptor o las que inhiben la activación del receptor de FGF23. Ejemplos específicos se analizaron anteriormente.
Por el término "vector" según se utiliza en el presente documento, se entiende cualquier plásmido o virus que codifica un ácido nucleico exógeno. Debe interpretarse que el término incluye también compuestos no plasmídicos y no virales que faciliten la transferencia de ácidos nucleicos a viriones o células tales como, por ejemplo, los compuestos de polilisina y similares. El vector puede ser un vector viral que sea adecuado como vehículo de administración para administrar el ácido nucleico que codifica la proteína deseada, o sus mutantes, a una célula, o el vector puede ser un vector no viral que resulte adecuado para el mismo propósito. Los ejemplos de vectores virales y no virales para administración de ADN a células y tejidos son bien conocido en la técnica y están descritos, por ejemplo, en Ma y col. (1997, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94: 12744-12746). Los ejemplos de vectores virales incluyen, pero no se limitan a, un virus vacunal recombinante, un adenovirus recombinante, un retrovirus recombinante, un virus adenoasociado recombinante, un poxvirus aviario recombinante, y similares (Cranage y col., 1986, EMBO J.5: 3057-3063; Solicitud de Patente internacional Nº WO94/17810, publicada el 18 de agosto de 1994; Solicitud de Patente internacional Nº WO94/23744, publicada el 27 de octubre de 1994). Los ejemplos de vectores no virales incluyen, pero no se limitan a, liposomas, derivados poliamina de ADN, y similares.
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La invención se describe con más detalle por referencia a los siguientes ejemplos experimentales. Estos ejemplos se proporcionan sólo con fines ilustrativos, y no pretenden ser limitantes a menos que se especifique de otra manera. Por consiguiente, la invención no debe interpretarse como limitada de ninguna manera a los siguientes ejemplos, sino al contenido definido en las reivindicaciones.
Ejemplo 1 Análisis de ligamiento y mutacional de familias con ADHR
Los datos en el presente documento demuestran el descubrimiento de un gen nuevo, FGF23. También está demostrado a continuación el descubrimiento de que el ADHR se localiza en el brazo corto del cromosoma 12 en 12p13.3, FGF23 se localiza en esta región y FGF23 está mutado en los individuos que sufren ADHR.
A continuación se describen los materiales y procedimientos utilizados en los experimentos presentados en este ejemplo.
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Análisis de linaje
Se analizaron los linajes de familias de origen británico (familia 2318), alemán (familia 329) y norteamericano (familias 1406 y 1478). Las familias ADHR+ 1406, 1478 y 2318 se han descrito previamente (Econs, y col. 1992, J. Clin. Endocrinol. Metab. 82: 674-681; Bainchine, y col. 1971, Birth Defects Orig. Aric. Ser. 7: 287-295; Rowe, y col. 1992, Hum. Genet. 89: 539-542). El estudio fue aprobado por la Indiana University School of Medicine y la Ludwig-Maximilians-Universität Faculty of Medicine Institutional Review Boards, y todos los pacientes dieron su consentimiento informado antes de participar.
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Selección de mutaciones
El ADN de los pacientes se evaluó de la siguiente manera: se amplificaron los exones con cebadores intrónicos (Tabla 2) y los fragmentos amplificados se analizaron por secuenciación directa o SSCP. Los SSCP se realizaron usando poliacrilamida convencional o Serdogel SSCP 2x (Serva Electrophresis GmbH, Heidelberg, Alemania) a 20ºC con y sin glicerol. Las muestras se visualizaron por medio de tinción con Tt4cslistraGreen y detección con un Fluorlmager (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) o por autorradiografía después de la amplificación de los exones por PCR en presencia de [^{32}P]dCTP. Las bandas de las variantes se amplificaron nuevamente para la secuenciación. La secuenciación directa con el cebador sentido y el cebador antisentido se realizó usando un kit de secuenciación Taq DyeDeoxy Terminator Cycle (ABI) o usando un Kit Sequenase (USB) y la incorporación de los [^{33}P]didesoxinucleótidos. El análisis mutacional se realizó usando ADN de los pacientes de 4 familias, 1406, 1478, 2318 y 329, que tenían transmisión varón a varón y características clínicas compatibles con ADHR, así como con ADN de 18 pacientes con raquitismo hipofosfatémico que eran negativos para las mutaciones del gen PHEX. Además, se analizó una familia con hipofosfatemia, anormalidades craneofaciales importantes y extremidades superiores e inferiores cortas (Cabral, y col., 80th Annual Endocrine Society Meeting 1998) así como una familia con HBD que contenía una transmisión varón a varón.
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RT-PCR/RACE
La RT-PCR se realizó usando 1-2 ng de ADNc de FGF23 humano o de ratón (Figura 5 ó 6) como moldes. La RACE se realizó usando kits de amplificación de ADNc Marathon (ClonTech Inc. Palo Alto, CA). Los cebadores diseñados de las secuencias de ADNc predichas se utilizaron para la amplificación de productos de 0,2-3,5 kb (Tabla 2) y están disponibles bajo petición. Los cultivos celulares fetales de condrocitos fetales humanos se prepararon como está descrito por Bonaventure, y col. 1994, Exp. Cell Res 212: 97-104, y se comprobó la expresión de COL2A1.
A continuación se describen los resultados presentados en este ejemplo.
El análisis de ligamiento en un gran linaje de ADHR, familia 1406, demostró puntuaciones LOD significativas para un intervalo de 18 cM en el cromosoma 12p13.3 entre los marcadores D12S100 y D12S397. La puntuación LOD de dos puntos para el marcador D12S1624 fue 7,68. Una segunda línea de parentesco más pequeña con ADHR, familia 1478, presentó una puntuación LOD de 1,1 en D12S1624. Asumiendo que el locus de la enfermedad en esta familia estaba asociado al mismo intervalo, se seleccionaron los eventos de recombinación únicos en estas dos familias y se correlacionó el locus de la enfermedad a la región de 1,5 MB entre los marcadores D12S1685 y S12S1594 (Figura 2). En la familia 1406, los individuos 1306 y 0142 tenían eventos de recombinación próximos en D12S1685 y eventos de recombinación distal en D12S397. La familia 1478 mostró recombinación en D12S1050 y D12S1594 en los individuos 001 y 0100, respectivamente (Figura 1A).
Las secuencias genómicas de 12p13.3 están disponibles a partir del trabajo público del genoma humano. Una anotación de secuencias acabadas e inacabadas entre D12S685 y D12S1623 reveló 37 genes dentro de esta región, de los que 13 son nuevos. Las secuencias codificadoras completas de los genes nuevos se obtuvieron por RT-PCR, RACE y/o por secuenciación de clones IMAGE.
En base a los estudios de ligamiento anteriores, la selección de mutaciones se concentró en la región de 1,5 MB entre D12S1685 y D12S1594. Esta región contiene 7 genes conocidos, 4 genes nuevos y 1 fragmento genético (Tabla 1). Se seleccionaron las mutaciones de los siguientes genes por amplificación de exones con cebadores basados en límites exón-intrón: (i) MIBOO3 (AJ272206): (ii) proteína cinasa DYRK4 (AF263541); (iii) proteína de unión a proteína cinasa A AKAP110 (AF093408); (iv) GaINAc-T8 (AJ271385)9. Además, varios genes fuera de esta región fueron considerados candidatos. Dos de ellos, el factor 3 de diferenciación de crecimiento (GDF3, AF263538), así como un receptor acoplado a la proteína G nuevo (GPCR46, AJ272207) fueron investigados. Se detectaron pocas variaciones y la secuenciación de los alelos de control reveló que todos ellos eran polimorfismos (Tabla 1).
TABLA 1
3
También se investigó un miembro nuevo de la familia del factor de crecimiento de fibroblastos de esta región, FGF23. La secuenciación directa de los exones de FGF23 de las anteriores familias con ADHR reveló tres cambios sin sentido que afectan a dos argininas, separadas por tres aminoácidos. Las familias 1406 y 1478 compartían el mismo cambio, R176Q (527 > A), que interrumpe un sitio AciI. El producto de PCR de control se digirió formando fragmentos de 112,49, y 33 pb, mientras que los alelos mutantes produjeron sólo fragmentos de 112 y 82 pb cuando se analizaron por electroforesis en gel de agarosa. En la familia 2318, se encontró un cambio R179W (535C > T) en FGF23 mutante que crea un sitio BmpI. El análisis RFLP mostró que el producto de PCR del alelo normal no estaba no digerido, dejando el producto original de 194 pb, mientras que los alelos mutantes estaban cortados una sola vez dando como resultado fragmentos de 118 y 87 pb (Figura 1B). En la familia 329, se encontró un cambio R179Q (536G > A) en FGF23 mutante que no crea ni destruye un sitio de restricción. Además, se presentó un polimorfismo en el exón 3, 716/T (239/M). Se encontró treonina en 182 de 214 alelos, y se encontró metionina en 22 de 214 alelos. La secuenciación de la región codificadora completa y de la región secuencia arriba del codón de inicio (450 pb) no reveló mutaciones en la familia con HBD, en la familia con hipofosfatemia y anormalidades congénitas múltiples, así como en los dieciocho pacientes con XLH. Las mutaciones sin sentido se segregaron con la enfermedad en cada familia y no se encuentran en los 214 alelos de control secuenciados. Además, las mutaciones en las familias 1406 y 1478, y en la familia 2318 se excluyeron por análisis RFLP en 800 y 752 alelos de control, respectivamente (Figura 1B). Los parientes 1406 y 1478, que tenían idénticas mutaciones de FGF23, provienen de regiones geográficas separadas y no se sabe que estén relacionados. En apoyo de esto, las dos familias tienen diferentes alelos en D12S1624 y D12S1725, loci a una distancia de sólo 200 kb y 70 kb del gen mutante, respectivamente. En resumen, es evidente que las mutaciones de FGF23 R176Q, R179Q y R179W son causantes de ADHR.
FGF23 se encuentra en posición 54 kb telomérica de FGF-6 en el genoma humano y comprende tres exones, que se extienden aproximadamente 10 kb de la secuencia genómica. El producto de RT-PCR más largo de FGF23 obtenido tiene 1612 pb y contiene un marco de lectura abierto (ORF) predicho de 251 aminoácidos. El 5'-UTR está constituido por 146 pb sin presencia de codón de parada en marco secuencia arriba del sitio de inicio predicho. El 3'-UTR estaba constituido por 710 pb con una señal de poliadenilación predicha 831 pb secuencia abajo del codón de parada. El FGF23 humano y de ratón se identificaron por el perfil de FGF de la base de datos PFAM (4,6e-14,1,9e-16). Se generó una alineación de secuencias de aminoácidos entre FGF23 y otros miembros de la familia FGF usando CLUSTAL y PRETTYBOX (Figura 3A-3C). Comparten del 25% al 36% de identidad de aminoácidos con los otros miembros de la familia FGF en la secuencia central común. El análisis del árbol indica que FGF23 está relacionado de manera más próxima a FGF-21. Dado el hecho de que FGF23 tiene 251 aminoácidos, es, hasta la fecha, el FGF más largo caracterizado por una parte C-terminal grande de la proteína. El análisis con Signal P indicó que FGF23 contiene un péptido señal y la escisión del péptido más probablemente entre el residuos alanina en posición 24 y la tirosina en posición 25.
Se secuenciaron los BAC del cromosoma 6 de ratón dentro de la región homóloga al cromosoma 12pa13.3 humano. Uno de estos BAC (número de acceso de GenBank ACO15538) contenía el homólogo FGF23 de ratón. Se usaron cebadores procedentes de la región correspondiente para amplificar FGF23 a partir de ADNc de embriones de ratón de 17 días. El ADNc murino tiene un ORF predicho de la misma longitud que la proteína humana, con un 73%de identidad a nivel de nucleótidos y 70% de identidad a nivel de aminoácidos. Además, el análisis del gráfico de puntos indicó conservación sustancial de secuencias entre la secuencia de ratón y humana 500 pb secuencia arriba del codón de iniciación.
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Ejemplo 2 Expresión de FGF23
Los datos en el presente documento demuestran la expresión de FGF23 en tejidos humanos y en líneas celulares del cáncer. También se demuestra en este ejemplo la generación de un anticuerpo específico para FGF23 y su uso para detectar el FGF23 producido en células bacterianas y de mamíferos. Los datos presentados en este ejemplo demuestran además que el FGF23 es una proteína secretada y que FGF23 se expresa de manera abundante en los tumores oncogénicos de osteomalacia hipofosfatémica (OHO).
A continuación se describen los materiales y los procedimientos utilizados en los experimentos presentados en este ejemplo.
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Análisis de transferencia Northern
Se incubaron múltiples transferencias Northern de tejidos que contenían 2 \mug de polyA^{+}-ARN de cada tejido (ClonTech Inc. Palo Alto, CA) con sonda de FGF23 de longitud completa (Figura 5A o 6A) en tampón de hibridación (NaCl 270 mM, Na_{2}HPO_{4} 15 mM, EDTA 15 mM, SDS al 1%, sulfato de dextrano al 10% y leche en polvo desnatada al 0,5%) a 65ºC lavando en 0,01X SSC a 60ºC.
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Producción bacteriana de FGF23
Se produjo un ADNc de FGF23 humano por amplificación por PCR de ARN de corazón humano (ClonTech Inc. Palo Alto, CA) usando polimerasa Pfu (Gibco-BRL, Rockville, MD). Se clonó de manera direccional un inserto que comprendía los nucleótidos 73-756, que codifica el FGF23 de longitud completa sin el péptido señal predicho, en el vector pQE30 en marco con un marcador 6xHis N terminal usando el kit Qiaexpress tipo IV (Qiagen, Inc., Valencia, CA). Posteriormente se usó el plásmido, FGF23-6xHis pQE, para la transformación de células M15 [pREP4] y se añadió IPTG durante cuatro horas para inducir la expresión de proteínas. Se purificó la proteína FGF236xHis por medio de minipreps de cromatografía de níquel como está descrito por el fabricante (Qiagen Inc., Valencia, CA).
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Análisis de transferencia Western
Se sometieron a electroforesis muestras y patrones de proteínas en mini geles de SDS-PAGE al 15% (BioRad) y se electrotransfirieron sobre membranas de nitrocelulosa. Se incubaron las membranas con 2,5 \mug/ml de anticuerpo anti FGF23 humano o anticuerpo anti pentaHis de ratón, y posteriormente con anticuerpo secundario anti conejo o anti ratón-HRP de cabra (1:1000) (Amersham, Inc., Piscataway, NJ), y se visualizaron por quimioluminiscencia potenciada (ECL) (Amersham, Inc., Piscataway, NJ).
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Producción de FGF23 en células de mamífero
Para producir FGF23 en células de mamíferos, se transfectaron de manera transitoria células OK-E, COS-7 y HEK293 con un plásmido que expresa FGF23 humano, denominado pFGF23. Para construir el pFGF23, se amplificó el ORF de FGF23 precedido por la secuencia de Kozak (pb-3 hasta 756) por RT-PCR del ARN total de corazón. El ADNc resultante se insertó de manera direccional en el plásmido de expresión pADNc3.1 (+) (Invitrogen). La integridad del pFGF23 se confirmó por secuenciación del ADN.
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Preparación de muestras de tumores OHO
Se obtuvieron seis tumores diferentes de pacientes con OHO por resección quirúrgica de: a) muslo izquierdo (hemangiopericitoma); b) mandíbula (tumor mixto de tejido conectivo); c) muslo izquierdo (angiodisplasia); d) planta del pie (hemangiopericitoma); e) nariz (hemangiopericitoma); y f) fémur distal (osteosarcoma osteoblástico) (Figura 8A). Todos los pacientes mostraron anormalidades bioquímicas características de OHO, que se resolvieron tras eliminar el tumor. Se resuspendieron aproximadamente 100 mg de muestra de tumor en 0,5 ml de disolución salina tamponada de fosfato (PBS) helada suplementada con inhibidor de proteasas AEBSF 75 g/ml. Se homogeneizó la muestra durante 30 segundos en hielo, a continuación se centrifugó a 1500 g y posteriormente se usó el homogeneizado transparente para otros experimentos. Se determinaron las concentraciones de proteína por el ensayo de proteínas de Bradford (Bio-Rad, Inc., Hercules, CA) con albúmina sérica de bovino como patrón.
A continuación se describen los resultados de los experimentos presentados en esta sección.
Para evaluar la expresión de FGF23 en tejidos humanos específicos así como en líneas celulares de cáncer, se realizó RT-PCR y análisis de hibridación del ARN obtenido de tejidos humanos y líneas celulares de cáncer según los procedimientos convencionales. Se mostró que FGF23 se transcribió en niveles bajos en tejidos específicos, tales como el corazón, hígado, y tiroides/paratiroides humanos (Figura 4A). Además, pudieron amplificarse productos más débiles de feto completo, condrocitos fetales, intestino delgado, testículo y músculo esquelético. El pulmón, cerebro, riñón, las células de osteosarcoma (SaOS), y las células endoteliales (HMEC-1) fueron negativas para la transcripción de FGF23. En ratones, la RT-PCR anidada fue positiva en embriones de ratón de 17 días, pero no en cultivos celulares primarios de hueso de cráneo, células de yemas de extremidades, osteoblastos (células MC3T3), y una línea celular estimulada de condrocitos. La hibridación in situ radioactiva en secciones sagitales de embriones de ratón en diferentes estadios de desarrollo, así como en secciones de parafina de diversos tejidos, tales como pulmón, ovario, páncreas, testículo, timo, riñón, cerebro, y corazón adultos y secciones congeladas de tibias E18.5 fueron negativas para la transcripción de FGF23. La hibridación de transferencias Northern de múltiples tejidos de dieciséis órganos específicos fue negativa. El análisis por transferencia Northern del ARN obtenido de líneas celulares de cáncer mostró una señal positiva de aproximadamente 3 y 1,3 kb en la línea celular de leucemia mieloide crónica K562 cuando se sondeó con el ADNc de FGF23, mientras que otras varias líneas celulares de tumores expresaron sólo la transcripción de 3,0 o de 1,3 kb (Figura 4B).
Para generar un reactivo inmunológico útil para la detección de FGF23, se produjeron anticuerpos policlonales anti FGF23 humano de conejo usando protocolos convencionales contra el péptido CSQELPSAEDNSPMASD-COOH (SEC. ID. Nº 5), que corresponde a los residuos 206-222 del FGF23 humano (Zymed Laboratories, Inc., South San Francisco, CA). El antisuero se purificó por afinidad contra el péptido.
Para evaluar la especificidad del anticuerpo anti-FGF23, se produjo FGF23 humano recombinante en bacterias como se describió anteriormente. Los lisados preparados a partir de bacterias transformadas con FGF23-6xHis pQ se analizaron por análisis de transferencia Western usando el anticuerpo anti-FGF23 purificado por afinidad. El anticuerpo anti-FGF23 reconoció una proteína de aproximadamente 27 kDa de bacterias inducidas por IPTG, mientras que no se detectaron proteínas en los cultivos sin inducir (Figura 7A). La misma proteína se detectó también con un anticuerpo anti-His, indicando que ambos anticuerpos reconocieron proteínas idénticas. El suero preinmune no detectó proteínas en ningún experimento. Estos resultados confirman que el anticuerpo anti-FGF23 purificado por afinidad reconoció la proteína FGF23 humana recombinante.
Para evaluar la expresión de FGF23 en células transfectadas, se recogieron células 24 horas después de la transfección, se extrajo el ARN total y se realizó el análisis de transferencia Northern usando una sonda de ADNc de FGF23 marcada con ^{32}P. En las tres líneas celulares transfectadas con pFGF23, una única especie de ARNm de 1,1 kb hibridó con la sonda de FGF23, mientras que las células transfectadas con pcDNA3.1 vacío no expresaron una transcripción de FGF23 (Figura 7B).
Para determinar si FGF23 es una proteína secretada, se realizó un análisis de transferencia Western usando medio acondicionado procedente de las tres líneas celulares transfectadas y anticuerpo anti-FGF23. Se detectaron proteínas inmunorreactivas de aproximadamente 32 kDa y de 12 kDa en el medio acondicionado obtenido de las células transfectadas con pFGF23, pero no de las células transfectadas con pcDNA3.1 (Figura 7C). La banda de 32 kDa era la forma madura de FGF23, y la especie de 12 kDa representa un producto de degradación C terminal de FGF23 porque la banda más pequeña sólo se detectó tras la incubación prolongada de las células en medio sin suero. Además, la forma secretada de FGF23 era mayor que su tamaño predicho muy probablemente por glicosilación central, según se probó en la transcripción y la traducción in vitro de pFGF23 en presencia de microsomas pancreáticos. Tomados juntos, estos resultados demuestran que las células de mamífero que expresan de manera transitoria FGF23 pueden generar una transcripción de FGF23 y pueden secretar eficientemente la proteína.
Para evaluar la expresión de FGF23 en tumores OHO, se realizó el análisis de transferencia Northern usando el ARN total aislado de cinco de los seis tumores. La sonda de FGF23 radiomarcada hibridó con transcripciones de FGF23 de 3,0 y 1,3 kb, así como con una banda débil en aproximadamente 2,0 kb en los cinco tumores; en cambio, los ARN de control de otros varios tejidos no demostraron bandas de hibridación (Figura 8A). Para determinar si la proteína FGF23 está presente en los tumores OHO, se examinaron extractos de un sexto tumor por análisis de transferencia Western usando el anticuerpo anti FGF23. El anticuerpo contra FGF23 detectó una proteína de 32 kDa a partir de los extractos del tumor (Figura 8B). En resumen, los análisis de transferencias Northern y Western indicaron que FGF23 es una proteína secretada que se expresa ampliamente en los tumores OHO.
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Ejemplo 3 Los efectos de las mutaciones de ADHR en la escisión de la proteína FGF23 y la unión a heparina
Los datos en el presente documento demuestran que las mutaciones de FGF23 que están ligadas al ADHR dan como resultado niveles aumentados de las especies de proteína más grandes de FGF23, por una incapacidad de las proteasas para escindir de manera eficaz el FGF23 en un sitio SPC de consenso. En este ejemplo también se demuestra la capacidad de las formas mutantes de FGF23 para unirse a la heparina en niveles comparables a FGF23 de tipo natural.
A continuación se describen los materiales y procedimientos utilizados en los experimentos presentados en este ejemplo.
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Mutagénesis de FGF23
Las mutaciones sin sentido de ADHR, R176Q, R179W, R179Q, se introdujeron en el ADNc de FGF23 usando un enfoque de mutagénesis dirigida al sitio con PCR anidada. La polimerasa de ADN de alta fidelidad Pfu (Promega, Inc., Madison, WI) se usó en todas las reacciones de PCR usando pFGF23 (estructura centra de pADNc3.1) como molde. Para el sitio inicial de PCR, se apareó cada cebador mutagénico directo que contenía la mutación sin sentido adecuada con el cebador inverso 3'FGF23 y cada cebador mutagénico inverso se apareó con el cebador directo 5'FGF23. Los cebadores mutagénicos se presentan a continuación en la Tabla 2. Los sitios de BamHI y EcoRI localizados dentro de los cebadores 5'FGF23 y 3'FGF23, respectivamente, están en itálicas y subrayados. La base mutada dentro de cada cebador está subrayada.
TABLA 2
4
Las condiciones de PCR para todos los experimentos fueron: 1 minuto a 95ºC, seguido por 35 ciclos de 1 minuto a 95ºC, 1 minuto a 55ºC, 2 minutos a 72ºC, y una extensión final de 7 minutos a 72ºC. Los productos resultantes del ADNc del primer ciclo de PCR se purificaron en gel usando el kit Wizard Prep (Promega Corp., Madison, WI). El segundo ciclo de PCR se utilizó para producir ADNc mutantes de longitud total. Se combinó un \mul de cada una de las dos reacciones de PCR iniciales para un mutante específico en un único tubo de reacción y se amplificó esta mezcla de dos ADNc con los cebadores 5'FGF23 y 3'FGF23. Los productos resultantes se digirieron a continuación con BamHI y EcoRI y se unieron de manera direccional en el plásmido de expresión pcDNA3.1(+) para crear los clones mutantes pR176Q, pR179W y pR179Q. Se secuenció cada inserto del clon mutante para confirmar que se habían introducido las mutaciones adecuadas, así como para asegurar la integridad del ORF.
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Construcción de FGF23 marcado con FLAG
Se amplificaron pFGF23 y pR176Q por separado con los cebadores directo (contiene el sitio de EcoRI, subrayado) 5'GGAATTCATATCCCAATGCCTCCCCA3' (ID. SEC. Nº 7) e inverso (contiene el sitio de BamHI, subrayado) 5'CGGGATCCCTAGATGAACTTGGCGAA3' (ID. SEC. Nº 6). Los ADNc resultantes se digirieron con EcoRI y BamHI, y se unieron de manera direccional en el vector de expresión pFLAG-CMV-3 (Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO) para generar los plásmidos que expresan FLAG-FGF23 y FLAG-R176Q. Debe señalarse que el vector pFLAG-CMV-3 original usa la secuencia líder de preprotripsina para premitir la secreción de las proteínas de fusión marcadas con FLAG en el extremo N terminal. Los insertos de los clones se secuenciaron para confirmar el marco de lectura apropiado de la proteína de fusión.
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Ensayo de unión a heparina
Se incubó el medio acondicionado (0,5 ml) obtenido de las células HEK293 transfectadas 1:1 con 1X PBS, pH 7,4, así como con 50 \mul de una suspensión 1:1 de heparina sepharose: 1X PBS (Amersham Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ). La mezcla se colocó en una plataforma giratoria a 4ºC durante cuatro horas, a continuación se centrifugó durante 1 minuto. Se retiró el sobrenadante y la sepharose se lavó cuatro veces con 1X PBS helado. Se añadió tampón de muestras Laemmli (50 \mul) a la sepharose y la suspensión se agitó brevemente con vórtice, y a continuación se hirvió durante 5 minutos. Se centrifugó la muestra durante 1 minuto y se retiró el sobrenadante. Se analizaron diez \mul del sobrenadante (material que se unió a heparina sepharose) por transferencia Western usando anticuerpo anti-FGF23.
A continuación se describen los resultados de los experimentos presentados en este ejemplo.
Para evaluar la expresión y la secreción de las formas mutantes de FGF23 de ADHR en células de mamíferos, se construyeron plásmidos de expresión de FGF23 que contenían las mutaciones sin sentido de ADHR (R176Q, R179W, R179Q) como se describió anteriormente. La secuencia señal predicha y el sitio de escisión de proteasas predicho están indicados dentro de la secuencia de aminoácidos de FGF23 (Figura 9). La expresión y la secreción de FGF23 mutante se analizó transfectando células HEK293 con plásmidos que expresan FGF23 de tipo natural, R176Q, R179Q y R179W. El análisis de transferencia Western se realizó en medio acondicionado y en lisados celulares totales procedentes de células transfectadas usando un anticuerpo policlonal contra FGF23 humano. Se detectaron proteínas inmunorreactivas de aproximadamente 32 kDa y un doblete en 12 kDa en el medio acondicionado obtenido de las células transfectadas con pFGF23 (Figura 10A). En cambio, se detectó solamente la banda de 32 kD en el medio acondicionado obtenido de las células mutantes transfectadas con pFGF23, y no hubo diferencia evidente en el nivel de expresión entre FGF23 de tipo natural y mutante (Figura 10A). Además, los lisados celulares totales fueron negativos para la proteína FGF23 de tipo natural o mutante, como los fueron las transfecciones de vectores de control (Figura 10A). Los cambios de aminoácidos en las proteínas FGF23 mutantes se muestran en la Figura 10B. Estos resultados indican que las líneas celulares de mamífero transfectadas de manera transitoria secretan FGF23 que contiene las mutaciones humanas de ADHR. Sin embargo, solamente las especies de proteínas más grandes pudieron detectarse en el medio de las células con expresión de las formas mutantes de FGF23 usando un anticuerpo policlonal. Debe notarse que el epítopo para el anticuerpo anti-FGF23 está en posición C terminal al sitio de escisión SPC potencial en los residuos 176-179 presente en la proteína FGF23 de tipo natural, y por consiguiente, las bandas de 12 kDa pueden representar los fragmentos del extremo C terminal de las especies de FGF23 de 32 kDa. Si la especie de 12 kDa es un producto degradado de la banda de 32 kDa, un anticuerpo corriente arriba del sitio de escisión SPC se unirá tanto a la especie más grande de la proteína así como al fragmento N terminal de la proteína.
Esta posibilidad se probó definitivamente usando plásmidos que expresan FGF23 de tipo natural y de tipo mutante (R176Q) marcado con epítopo FLAG en el extremo N terminal construidos como se describió anteriormente. Para determinar si las especies de proteínas FGF23 eran detectables con un anticuerpo contra el extremo N terminal de la proteína, se transfectaron de manera transitoria células HEK293 un control de vector, o plásmidos que expresan FLAG-FGF23 y FLAG-R176Q. El medio acondicionado obtenido de las células transfectadas se analizó por transferencia Western usando un anticuerpo monoclonal anti-FLAG (M5; Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO). En el medio acondicionado obtenido de células transfectadas con FLAG-FGF23, el anticuerpo anti-FLAG reconoció dos bandas de 36 y 26 kDa, mientras que en el medio de las células transfectadas con FLAG-R176Q, el anticuerpo reconoció sobre todo la banda de 36 kDa, con una banda muy pequeña detectable en 26 kDa (Figura 11A). El medio del control del vector no produjo bandas reactivas ni lo hicieron los lisados celulares. La especie más grande de la proteína FLAG-FGF23 detectada en el medio migró en 36 kDa, en comparación con los 32 kDa según lo observado anteriormente, debido a los residuos adicionales del marcador FLAG. Esto se confirmó por el análisis de transferencia Western del mismo medio usando el anticuerpo policlonal anti-FGF23 que detectó el FGF23 de tipo natral y mutante marcado con FLAG de 36 kDa. La localización del epítopo FLAG, del epítopo anti-FGF23 y del sitio de escisión SPC se muestran en la Figura 11B. Estos resultados indican que las bandas más pequeñas en la transferencia Western del FGF23 de tipo natural son de hecho los fragmentos de FGF23 de los extremos C y N terminal, y que las formas mutantes de FGF23 de ADHR se secretan principalmente como la especie de proteína más grande. Estos resultados indican que las mutaciones de ADHR en los aminoácidos 176 y 179 estabilizan la especie de la proteína FGF23 de 32 kDa. En base a la observación de que las formas mutantes de FGF23 que están asociados con pérdida de fosfato en pacientes con ADHR no se escinden de manera tan eficaz como el FGF23 del tipo natural, la estabilización y secreción del FGF23 de longitud total, en comparación con la secreción de los fragmentos proteolíticos, da lugar probablemente a la pérdida renal de fosfato. Además, estos resultados sugieren que las mutaciones de ADHR probablemente potencian, más que inactivan, la actividad biológica de FGF23 en una función de pérdida de fosfato.
Para determinar si la escisión de FGF23 observada usando células HEK293 tuvo lugar de manera intra o extracelular, se incubó el medio acondicionado de FGF23 en ausencia de células o con células HEK293 de control (que no expresan FGF23) durante 24 horas a 37ºC en CO_{2} al 5%. Tras la incubación, se recogió el medio, se concentró hasta volúmenes iguales y se sometió al análisis de transferencia Western usando el anticuerpo anti-FGF23 C terminal. No hubo cambios en la proporción de la banda de 32 kDa a la banda de 12 kDa independientemente del tratamiento (Figura 12A), indicando que la escisión de FGF23 se produjo de manera intracelular, antes o durante la secreción celular y no por las proteasas extracelulares expresadas en las células HEK293. La tinción con azul de Coomassie de las muestras sometidas a electroforesis en paralelo confirmó igual carga del gel (Figura 12B).
Las mutaciones de ADHR en R176 y R179 están adyacentes a las hebras \beta que contienen motivos de unión a heparina de FGF. Para probar si las mutaciones de ADHR interfieren con la capacidad de FGF23 de unirse a heparina, se incubó el medio acondicionado obtenido de células HEK293 transfectadas con plásmidos que expresan FGF23 de tipo natural o las formas mutantes con heparina sepharose como se describió anteriormente. La especie de la proteína de 32 kDa se detectó en las muestras del medio de células transfectadas con tipo FGF23 mutante y de tipo natural, mientras que las muestras del medio de células transfectadas con vectores vacíos fueron negativas, indicando que ambas formas de FGF23, de tipo natural y de tipo mutante, se unen eficazmente a la heparina (Figura 13). En experimentos similares usando medio obtenido en células transfectadas con plásmidos que expresan FGF23 marcado con FLAG, la especie de 36 kDa de FGF23 de tipo natural y mutante marcada con FLAG también se unen a la heparina (Figura 13). Estos resultados demuestran que la especie de 32 kDa del FGF23 se une específicamente a la heparina, y proporciona pruebas bioquímicas de que FGF23 es de hecho un miembro de la familia de FGF que se une a la heparina. Además, la observación de que las formas mutantes de FGF23 retienen la unión a la heparina indica que las mutaciones sin sentido de ADHR no alteran en gran medida la estructura proteica del FGF23.
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Ejemplo 4 Análisis de FGF23 en ratones
Los datos en el presente documento demuestran la generación y el análisis de los ratones que sobreexpresan FGF23, que expresan formas mutantes de FGF23, o que están expuestos a dietas con supresión de fosfato o enriquecidas en fosfato.
Para evaluar la correlación entre la expresión de FGF23 y la homeostasis alterada del fosfato en ratones, se producen ratones transgénicos que sobreexpresan FGF23 murino en el hígado y se comparan las concentraciones de fósforo en muestras de suero y orina de ratones transgénicos y de control. Los ratones se pesan y se examinan de manera regular para determinar si se presenta alguna diferencia fenotípica externa. De manera coherente con la sobreexpresión de FGF23 en los tumores humanos asociados con pérdida renal de fosfato, los ratones transgénicos que sobreexpresan FGF23 exhibirán pérdida renal de fosfato y la hipofosfatemia resultante. Por otra parte, estos ratones mostrarán niveles disminuidos de ARNm de Npt2 (el principal transportador de fosfato dependiente del sodio) y de la proteína en el riñón. Se comparan los niveles séricos de 1, 25 dihidroxi vitamina D entre ratones transgénicos para FGF23, ratones de control y ratones de control que tienen concentraciones séricas de fosfato equivalentes que se inducen por supresión o por exceso de fosfato en la dieta. De manera similar, los ratones a los que se inyecta FGF23 purificado mostrarán pérdida renal de fosfato y se volverán hipofosfatémicos.
Se producen ratones transgénicos que comprenden las mismas mutaciones observadas en los pacientes humanos con ADHR (R176Q, R179Q, R179W, o cualquier otra mutación en las argininas 176 ó 179) y deben servir como buenos modelos animales para el trastorno humano. Según se describió anteriormente, se examinarán las concentraciones en suero y en orina de fósforo así como de 1, 25 dihidroxi vitamina D en suero. Los ratones heterocigóticos para la mutación manifestarán pérdida renal de fosfato e hipofosfatemia al igual que los seres humanos que tienen ADHR, mientras que los ratones que son homocigóticos para la mutación tendrán un fenotipo más grave. Los ratones mutantes también mostrarán niveles disminuidos de ARNm de Npt2 y de la proteína en el riñón.
La administración a ratones de una dieta con supresión de fosfato o enriquecida en fosfato altera las concentraciones de fosfato en el suero y debe alterar los niveles de expresión de FGF23 en tiroides/paratiroides, corazón o hígado. La hiperfosfatemia aumentará la expresión de ARNm de FGF23 en estos tejidos, mientras que la hipofosfatemia disminuirá la expresión de ARNm de FGF23 en estos tejidos.
Los niveles de la expresión de FGF23 en ratones Hyp machos y hembras, que tienen mutaciones en el gen Phex y que son el modelo murino del raquitismo hipofosfatémico ligado al cromosoma X humano, se comparan con los de los controles de la camada normal o con la camada con dieta alterada en fosfato. Los ratones Hyp deben tener expresión y concentraciones séricas aumentadas de FGF23.
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Ejemplo 5 Detección de FGF23 en pacientes con osteomalacia inducida por tumores
Los datos en el presente documento demuestran el uso de un protocolo de detección de FGF23 para diagnosticar la osteomalacia inducida por tumores en un paciente.
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Se extirpa quirúrgicamente un tumor de un paciente que muestra síntomas clínicos de osteomalacia inducida por tumores. Las células tumorales se cultivan a continuación en matraces de cultivo celular durante 48 horas. Se aísla el ARN de las células tumorales usando protocolos convencionales. Se realiza RT-PCR en el ARN del tumor usando cebadores de PCR específicos para FGF23. Se amplifica una banda de ADNc del tamaños adecuado a partir del ARN del tumor, pero no del ARN de células tumorales que no se sometió a transcripción inversa previo a la PCR (control negativo). Por consiguiente, la detección de ARNm de FGF23 en la muestra del tumor es indicativa de osteomalacia inducida por tumores, y por consiguiente sirve como una herramienta de diagnóstico valiosa para esta enfermedad.
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Ejemplo 6 Seguridad del FGF23 en seres humanos
Los datos en el presente documento demuestran la seguridad del FGF23 en seres humanos.
En algunos pacientes con osteomalacia inducida por tumores, los tumores no son detectables. Tras el tratamiento con altas dosis de 1,25 dihidroxi vitamina D y fosfato, la afección de estos pacientes mejora. Una vez que se corrige la hipofosfatemia en estos pacientes, no quedan síntomas a pesar del hecho de que la concentración de FGF23 en su sangre es muy alta. Lo mismo es válido en los pacientes con ADHR, los que tienen presumiblemente altas concentraciones séricas de FGF23 secundarias a su incapacidad para degradar el FGF23 mutante. Por consiguiente, los niveles altos de FGF23 no tienen malos efectos evidentes en los seres humanos.
Aunque esta invención se ha dado a conocer con referencia a formas de realización específicas, resulta evidente que otros expertos en la técnica pueden idear otras formas de realización y variaciones de esta invención sin apartarse del alcance de la invención según se reivindica en las reivindicaciones adjuntas.
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<110> INSTITUTO DE INVESTIGACIÓN Y TECNOLOGÍA AVANZADA DE LA UNIVERSIDAD LUDWIG-MAXIMILLANS, MÚNICH
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<120> FACTOR DE CRECIMIENTO DE FIBROBLASTOS (FGF23) NUEVO Y PROCEDIMIENTOS PARA EL USO
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<130> 053884-5001WO
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<140> NO ASIGNADO AÚN
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<141> 10-07-2000
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<150> 60/219.137
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<151> 19-07-2000
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<160> 34
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<170> PatentIn version 3.0
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<400> 26
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28
29 
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<210> 27
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<211> 144
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<400> 30
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<210> 32
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<211> 139
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<400> 34
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39

Claims (49)

1. Un ácido nucleico aislado que comprende ID. SEC. Nº 1, codificando dicho ácido nucleico un factor 23 de crecimiento de fibroblastos (FGF23).
2. Un ácido nucleico aislado incluido en el Depósito DSMZ con el Nº DSM 13530.
3. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 1, comprendiendo dicho ácido nucleico aislado además un ácido nucleico que codifica un polipéptido marcador unido de manera covalente al mismo.
4. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 3, en el que dicho polipéptido marcador se selecciona del grupo constituido por un polipéptido marcador myc, un polipéptido marcador de glutatión S-transferasa, un polipéptido marcador de proteína fluorescente verde, un polipéptido marcador myc-piruvato cinasa, un polipéptido marcador His6, un polipéptido marcador de hemaglutinina del virus de la gripe, un polipéptido marcador flag y un polipéptido marcador de proteína de unión a la maltosa.
5. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 1, comprendiendo dicho ácido nucleico además un ácido nucleico que especifica una secuencia promotora/reguladora unida de manera operativa al mismo.
6. Un vector que comprende el ácido nucleico aislado de la reivindicación 1.
7. El vector de la reivindicación 6, comprendiendo dicho vector además un ácido nucleico que especifica una secuencia promotora/reguladora unida de manera operativa al mismo.
8. Una célula recombinante aislada que comprende el ácido nucleico aislado de la reivindicación 1, no siendo la célula recombinante una célula madre embrionaria humana.
9. Una célula recombinante aislada que comprende el vector de la reivindicación 6, no siendo la célula recombinante una célula madre embrionaria humana.
10. Un ácido nucleico aislado complementario a un ácido nucleico de la reivindicación 1, estando dicho ácido nucleico complementario en una orientación antisentido.
11. Un vector que comprende el ácido nucleico aislado de la reivindicación 10.
12. El vector de la reivindicación 11, comprendiendo dicho vector además un ácido nucleico que especifica una secuencia promotora/reguladora unida de manera operativa al mismo.
13. Una célula recombinante aislada que comprende el ácido nucleico aislado de la reivindicación 10.
14. Un mamífero transgénico no humano que comprende un ácido nucleico aislado de la reivindicación 1.
15. Un ácido nucleico aislado, que comprende una secuencia que tiene 99-100% de identidad con ID. SEC. Nº 1, teniendo el polipéptido codificado por el ácido nucleico la capacidad de unirse a un receptor de FGF y de alterar el transporte de fosfato.
16. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 15, que comprende una mutación que confiere mayor estabilidad en dicho FGF23.
17. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 15, en el que dicha mutación se selecciona del grupo constituido por una mutación en el ácido nucleico que codifica el aminoácido 176 (arginina) con relación a ID. SEC. Nº 2 y una mutación en el ácido nucleico que codifica el aminoácido 179 (arginina) con relación a ID. SEC. Nº 2.
18. Un polipéptido aislado que comprende un factor 23 de crecimiento de fibroblastos (FGF23) codificado por el ácido nucleico de la reivindicación 1, comprendiendo dicho polipéptido una mutación que confiere mayor estabilidad en dicho FGF23, y en el que dicha mutación se selecciona del grupo constituido por una mutación en el aminoácido 176 (arginina) con relación a ID. SEC. Nº 2 y una mutación en el aminoácido 179 (arginina) con relación a ID. SEC. Nº 2.
19. Un anticuerpo que se une específicamente al polipéptido de la reivindicación 18.
20. Un anticuerpo que inhibe una actividad del polipéptido de la reivindicación 18.
21. Una composición que comprende el anticuerpo de la reivindicación 19 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
\newpage
22. Una composición que comprende el anticuerpo de la reivindicación 20 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
23. Un inhibidor del factor 23 de crecimiento de fibroblastos (FGF23), siendo dicho inhibidor una molécula que reduce el nivel de ARNm que codifica el polipéptido FGF23, una molécula que reduce el nivel del polipéptido FGF23 o una molécula que reduce una actividad biológica del FGF23; estando dicho polipéptido codificado por un ácido nucleico de la reivindicación 1 y dicho inhibidor se selecciona de
a)
un anticuerpo que se une específicamente con un receptor de FGF23, siendo el receptor de FGF23 FGFR2 o FGFR4; o
b)
una molécula de ARN bicatenaria que reduce el nivel de dicho ARNm que codifica el polipéptido FGF23 por interferencia de ARN.
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24. Una composición que comprende el ácido nucleico aislado de la reivindicación 1 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
25. Una composición que comprende el ácido nucleico aislado de la reivindicación 10 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
26. Una composición que comprende el ácido nucleico aislado de la reivindicación 15 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
27. Una composición que comprende el ácido nucleico aislado de la reivindicación 16 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
28. Una composición que comprende el ácido nucleico aislado de la reivindicación 17 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
29. Una composición que comprende el polipéptido FGF23 aislado de la reivindicación 18 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
30. Un procedimiento para producir una proteína aislada que tiene la actividad biológica del factor 23 de crecimiento de fibroblastos (FGF23) que comprende
a)
cultivar la célula recombinante de la reivindicación 9 bajo condiciones tales que se exprese dicha proteína; y
b)
recuperar dicha proteína.
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31. Un procedimiento in vitro para diagnosticar un trastorno hipofosfatémico en un mamífero, comprendiendo dicho procedimiento poner una muestra biológica obtenida de dicho mamífero en contacto con un reactivo que detecta la presencia o ausencia de un ácido nucleico según la reivindicación 17, en el que la presencia de dicho ácido nucleico es una indicación de que dicho mamífero está afectado con dicho trastorno hipofosfatémico, diagnosticando de ese modo dicho trastorno hipofosfatémico en dicho mamífero, en el que el factor 23 de crecimiento de fibroblastos (FGF23) está codificado por un ácido nucleico según la reivindicación 1.
32. El procedimiento de la reivindicación 31, en el que dicho trastorno hipofosfatémico es el raquitismo hipofosfatémico autosómico dominante (ADHR).
33. El procedimiento de la reivindicación 31, en el que dicha muestra biológica se selecciona del grupo constituido por sangre y orina.
34. El procedimiento de la reivindicación 31, en el que dicho reactivo es un ácido nucleico.
35. El procedimiento de la reivindicación 31, en el que dicho reactivo está marcado de manera detectable.
36. El procedimiento de la reivindicación 31, en el que dicho reactivo está marcado de manera detectable con un marcador seleccionado del grupo constituido por un radioisótopo, un compuesto bioluminescente, un compuesto quimioluminiscente, un compuesto fluorescente, un quelato metálico y una enzima.
37. Un procedimiento in vitro para diagnosticar un trastorno hipofosfatémico en un mamífero, comprendiendo dicho procedimiento poner dicha muestra biológica obtenida de dicho mamífero en contacto con un reactivo que detecta la presencia o ausencia de un polipéptido aislado según la reivindicación 18, en el que la presencia de dicha forma mutante del polipéptido FGF23 es una indicación de que dicho mamífero está afectado con dicho trastorno hipofosfatémico, diagnosticando de ese modo dicho trastorno hipofosfatémico en dicho mamífero.
38. El procedimiento de la reivindicación 37, en el que dicho trastorno hipofosfatémico es el raquitismo hipofosfatémico autosómico dominante (ADHR).
39. El procedimiento de la reivindicación 37, en el que dicha muestra biológica se selecciona del grupo constituido por sangre y orina.
40. El procedimiento de la reivindicación 37, en el que dicho reactivo es un anticuerpo.
41. Un procedimiento in vitro para diagnosticar un trastorno hipofosfatémico en un mamífero, comprendiendo dicho procedimiento poner dicha muestra biológica obtenida de dicho mamífero en contacto con un reactivo que detecta el nivel del polipéptido del factor 23 de crecimiento de fibroblastos (FGF23) en dicha muestra, en el que un nivel elevado del polipéptido FGF23 en dicha muestra, con relación al nivel del polipéptido FGF23 en una muestra obtenida en un mamífero de control, es una indicación de que dicho mamífero está afectado con dicho trastorno hipofosfatémico, diagnosticando de ese modo dicho trastorno hipofosfatémico en dicho mamífero, en el que dicho factor 23 de crecimiento de fibroblastos (FGF23) está codificado por un ácido nucleico según la reivindicación 1 ó 15.
42. El procedimiento de la reivindicación 41, en el que dicho trastorno hipofosfatémico se selecciona del grupo constituido por el raquitismo hereditario ligado al cromosoma X (XLH), el raquitismo hipofosfatémico hereditario (HHRH), la enfermedad hipofosfatémica de los huesos (HBD), el raquitismo hipofosfatémico autosómico dominante (ADHR), la osteomalacia inducida por tumores, el síndrome del nevus epidérmico, la displasia fibrosa y la nefrolitiasis.
43. El procedimiento de la reivindicación 41, en el que dicha muestra biológica se selecciona del grupo constituido por sangre y orina.
44. El procedimiento de la reivindicación 41, en el que dicho reactivo es un anticuerpo contra FGF23.
45. El procedimiento de la reivindicación 41, en el que dicho reactivo está marcado de manera detectable.
46. El procedimiento de la reivindicación 41, en el que dicho reactivo está marcado de manera detectable con un marcador seleccionado del grupo constituido por un radioisótopo, un compuesto bioluminescente, un compuesto quimioluminiscente, un compuesto fluorescente, un quelato metálico y una enzima.
47. Un procedimiento in vitro para diagnosticar la osteomalacia inducida por tumores en un paciente, comprendiendo dicho procedimiento detectar la expresión o falta de la misma de FGF23 en dicho tumor obtenido de dicho paciente, en el que la expresión de FGF23 es indicativa de que dicho paciente tiene osteomalacia inducida por tumores, en el que dicho factor 23 de crecimiento de fibroblastos (FGF23) está codificado por un ácido nucleico según la reivindicación 1 ó 15.
48. Uso de un inhibidor del factor 23 de crecimiento de fibroblastos (FGF23) según la reivindicación 23 o un anticuerpo que se une específicamente con FGF23 para la preparación de un medicamento para tratar un trastorno hipofosfatémico en un mamífero, en el que dicho inhibidor se selecciona del grupo constituido por un inhibidor que reduce el nivel de ARNm que codifica el polipéptido FGF23 en dicho mamífero, un inhibidor que reduce el nivel del polipéptido FGF23 en dicho mamífero y un inhibidor de la actividad biológica del FGF23 en dicho mamífero.
49. El procedimiento de la reivindicación 48, en el que dicho trastorno hipofosfatémico se selecciona del grupo constituido por el raquitismo hereditario ligado al cromosoma X (XLH), el raquitismo hipofosfatémico hereditario (HHRH), la enfermedad hipofosfatémica de los huesos (HBD), el raquitismo hipofosfatémico autosómico dominante (ADHR), la osteomalacia inducida por tumores, el síndrome del nevus epidérmico, la displasia fibrosa y la nefrolitiasis.
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