KR20030029111A - 신규 섬유아세포 성장 인자 (ｆｇｆ23) 및 그의 이용 방법 - Google Patents

신규 섬유아세포 성장 인자 (ｆｇｆ23) 및 그의 이용 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 섬유아세포 성장 인자-23 (FGF23)을 코딩하는 신규 핵산 및 그에 의해 코딩되는 단백질, 및 상염색체 우성 구루병 (ADHR)과 관련된 돌연변이에 관한 것이다. 본 발명은 또한 대상에서 FGF23의 생물학적 활성을 각각 억제 또는 자극하는 것을 포함하는, 저인산혈성 질환 및 고인산혈성 질환을 진단 및 치료하는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 대상에서 FGF23의 생물학적 활성을 자극하는 것을 포함하는, 골다공증, 피부근염 및 관상동맥 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.

Description

신규 섬유아세포 성장 인자 (ＦＧＦ23) 및 그의 이용 방법 {NOVEL FIBROBLAST GROWTH FACTOR (FGF23) AND METHODS FOR USE}
저인산혈증 및 고인산혈증으로 각각 언급되는 혈청 포스페이트 수준이 감소 또는 증가하는 증상은 임상적으로 중요한 아주 다양한 질병군과 관련이 있다. 신장 포스페이트 소모로부터 종종 발병하는 저인산혈증은 X-연관 저인산혈성 구루병 (XLH), 고칼슘뇨증을 동반하는 유전성 저인산혈성 구루병 (HHRH), 저인산혈성 골 질환 (HBD), 및 상염색체 우성 저인산혈성 구루병 (ADHR)을 비롯하여 다양한 유전성 질환에 의해 유발된다. 경증 신부전증 및 종양성 석회증을 앓는 환자에서 관찰되는 고인산혈증은 종종 연조직 석회화, 2차 부갑상선기능항진증, 3차 부갑상선기능항진증, 및 기타 대사 장애와 관련이 있을 수 있다.
혈청 포스페이트 농도가 적절하게 유지되는 분자 메카니즘에 대한 이해는 부족하다. 포스페이트 항상성의 이상을 포함하는 유전성 질환의 원인이 되는 유전자를 확인하는 것은 포스페이트 균형을 조절하는 대사 경로에 대한 이해를 제공할 수 있다. 현재, 저인산혈증 및 고인산혈증 증상을 보이는 환자에서 분명한 임상적인 특징에도 불구하고, 이 질환의 초기 진단, 등급화 및 단계화에 유용한 분자 마커는 이용가능하지 않다. 마찬가지로, 저인산혈성 질환 및 고인산혈성 질환을 앓는 환자에 대한 효과적인 치료 방법이 현재로서는 없기 때문에, 다른 치료법이 요구되고있는 실정이다. 본 발명은 이러한 요구를 충족시킨다.
<발명의 개요>
본 발명은 FGF23을 코딩하는 단리된 핵산 또는 그의 돌연변이체, 변이체, 동족체 또는 단편을 포함한다.
한 측면으로, FGF23을 코딩하는 단리된 핵산은 서열 1 및 서열 3 중 적어도 하나의 핵산 서열과 약 50％ 이상의 서열 동일성을 공유한다.
본 발명은 또한 FGF23을 코딩하는 단리된 핵산을 포함하며, 이 단리된 핵산은 서열 2 및 서열 4 중 적어도 하나의 아미노산 서열과 40％ 이상의 서열 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩한다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 단리된 핵산은 DSMZ 기탁 번호 제DSM 13530호로 기탁되었다.
본 발명의 한 측면으로, FGF23을 코딩하는 단리된 핵산은 태그 폴리펩티드를 코딩하는 핵산에 공유적으로 연결되어 있다. 바람직한 실시양태에서, 태그 폴리펩티드는 myc 태그 폴리펩티드, 글루타티온-S-트랜스퍼라제 태그 폴리펩티드, 녹색 형광 단백질 태그 폴리펩티드, myc-피루베이트 키나제 태그 폴리펩티드, His6 태그 폴리펩티드, 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 태그 폴리펩티드, 플래그 태그 폴리펩티드, 또는 말토스 결합 단백질 태그 폴리펩티드이다.
본 발명은 또한 프로모터/조절 서열을 지정하는 핵산에 작동가능하게 연결된 FGF23을 코딩하는 핵산을 포함한다.
본 발명은 FGF23을 코딩하는 단리된 핵산을 포함하는 벡터를 추가로 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 벡터는 프로모터/조절 서열에 작동가능하게 연결된 FGF23을 코딩하는 단리된 핵산을 포함한다.
본 발명은 FGF23을 코딩하는 단리된 핵산 또는 이를 포함하는 벡터를 포함하는 재조합 세포를 포함한다.
본 발명은 FGF23을 코딩하는 핵산에 상보적이며 안티센스 방향으로 존재하는 단리된 핵산 또는 그의 돌연변이체, 변이체, 동족체 또는 단편을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 상보적인 핵산은 서열 1 및 서열 3 중 적어도 하나의 서열을 갖는 핵산과 상보적인 핵산과 약 50％ 이상의 서열 동일성을 공유한다. 또한 본 발명은 안티센스 핵산을 포함하는 벡터, 및 프로모터/조절 서열을 지정하는 핵산에 작동가능하게 연결된 안티센스 핵산을 포함하는 벡터를 포함한다.
본 발명은 안티센스 핵산 및 이를 포함하는 벡터를 포함하는 재조합 세포를 추가로 포함한다.
본 발명은 FGF23을 코딩하는 단리된 핵산 또는 그의 돌연변이체, 변이체, 동족체 또는 단편을 포함하는 유전자변형 (transgenic) 비인간 포유동물을 포함한다.
본 발명은 FGF23 또는 그의 돌연변이체, 변이체, 동족체 또는 단편을 포함하는 단리된 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 단리된 폴리펩티드는 서열 2 및 서열 4 중 적어도 하나의 아미노산 서열과 약 40％ 이상의 서열 동일성을 공유한다.
본 발명은 FGF23 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 돌연변이체, 변이체, 동족체 또는 단편을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 인간화 항체, 키메라 항체 또는 합성 항체이다.
본 발명은 FGF23을 코딩하며, 돌연변이를 포함하는 단리된 핵산을 추가로 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 돌연변이는 FGF23에 대하여 증가된 안정성을 부여한다. 보다 바람직하게는, 돌연변이는 서열 2의 아미노산 176 (아르기닌) 또는 서열 2의 아미노산 179 (아르기닌)에 영향을 준다. 보다 더 바람직하게는, 돌연변이는 서열 1에 있어서 527G>A, 535C>T 및 536G>A로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또한 본 발명은 돌연변이를 포함하는 FGF23 폴리펩티드를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, FGF23 폴리펩티드는 증가된 안정성을 부여하는 돌연변이를 포함한다. 보다 바람직하게는, 돌연변이는 서열 2에 있어서 아미노산 176 (아르기닌)의 돌연변이 또는 서열 2에 있어서 아미노산 179 (아르기닌)의 돌연변이이다.
본 발명은 FGF23 억제제를 포함한다. 이 억제제는 FGF23 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA의 수준을 감소시키는 분자, FGF23 폴리펩티드의 수준을 감소시키는 분자, 또는 FGF23의 생물학적 활성을 감소시키는 분자일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 억제제는 안티센스 핵산 리보자임, 항체, 펩티드 또는 펩티드모방체이다. 보다 바람직하게는, 억제제는 FGF23과 특이적으로 결합하는 항체 또는 FGF23 수용체와 특이적으로 결합하는 항체이다.
본 발명은 FGF23을 코딩하는 단리된 핵산 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 포함한다.
또한 본 발명은 FGF23을 코딩하는 핵산에 상보적인 단리된 핵산 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 포함한다.
본 발명은 또한 단리된 FGF23 폴리펩티드 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 포함한다.
본 발명은 또한 FGF23과 특이적으로 결합하는 항체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 포함한다.
또한 본 발명은 FGF23의 돌연변이체 형태를 코딩하는 단리된 핵산 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 포함한다.
본 발명은 또한 증가된 안정성을 갖는 FGF23의 돌연변이체 형태를 코딩하는 단리된 핵산 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 포함한다.
본 발명은 또한 서열 2의 아미노산 176 (아르기닌)의 돌연변이 또는 서열 2의 아미노산 179 (아르기닌)의 돌연변이를 포함하는 FGF23의 돌연변이체 형태를 코딩하는 단리된 핵산 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 포함한다.
본 발명은 또한 돌연변이를 포함하는 단리된 FGF23 폴리펩티드 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 포함한다.
본 발명은 증가된 안정성을 부여하는 돌연변이를 포함하는 단리된 FGF23 폴리펩티드 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 포함한다.
또한 본 발명은 서열 2의 아미노산 176 (아르기닌)의 돌연변이 또는 서열 2의 아미노산 179 (아르기닌)의 돌연변이를 포함하는, 단리된 FGF23 폴리펩티드 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 포함한다.
본 발명은 또한 FGF23 억제제 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 포함한다.
본 발명은 포유동물에서 저인산혈성 질환을 진단하는 방법을 추가로 포함한다. 이 방법은 (a) 포유동물로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계; 및 (b) 이 생물학적 샘플을, FGF23을 코딩하는 핵산에서의 돌연변이의 존재 또는 부재를 검출하는 시약과 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서 상기 돌연변이의 존재에 의해 상기 포유동물이 저인산혈성 질환에 걸렸음을 알 수 있고, 이에 따라 상기 포유동물에서 저인산혈성 질환을 진단하게 된다.
바람직한 실시양태에서, 저인산혈성 질환은 상염색체 우성 저인산혈성 구루병 (ADHR)이다.
다른 바람직한 실시양태에서, 생물학적 샘플은 혈액 또는 소변이다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 시약은 핵산이다. 보다 바람직하게는, 시약은 검출가능하게 표지된다. 바람직한 표지로는 방사성동위원소, 생물발광 화합물, 화학발광 화합물, 형광 화합물, 금속 킬레이트 및 효소를 들 수 있다.
본 발명은 포유동물에서 저인산혈성 질환을 진단하는 방법을 포함한다. 이 방법은 (a) 포유동물로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계; 및 (b) 이 생물학적 샘플을, FGF23 폴리펩티드의 돌연변이체 형태의 존재 또는 부재를 검출하는 시약과 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서 FGF23 폴리펩티드의 돌연변이체 형태의 존재에 의해 상기 포유동물이 저인산혈성 질환에 걸렸음을 알 수 있고, 이에 따라 상기 포유동물에서 저인산혈성 질환을 진단하게 된다.
바람직한 실시양태에서, 저인산혈성 질환은 상염색체 우성 저인산혈성 구루병 (ADHR)이다.
다른 바람직한 실시양태에서, 생물학적 샘플은 혈액 또는 소변이다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 시약은 항체이다.
본 발명은 포유동물에서 저인산혈성 질환을 진단하는 방법을 포함한다. 이 방법은 (a) 포유동물로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계; 및 (b) 이 생물학적 샘플을, 샘플 중 FGF23 폴리펩티드의 수준을 검출하는 시약과 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서 대조군 포유동물의 FGF23 폴리펩티드의 수준과 비교해서 상기 샘플 중 FGF23 폴리펩티드의 수준이 증가된 것에 의해 상기 포유동물이 저인산혈성 질환에 걸렸음을 알 수 있고, 이에 따라 상기 포유동물에서 저인산혈성 질환을 진단하게 된다.
바람직한 실시양태에서, 저인산혈성 질환은 X-연관 유전성 구루병 (XLH), 유전성 저인산혈성 구루병 (HHRH), 저인산혈성 골 질환 (HBD), 상염색체 우성 저인산혈성 구루병 (ADHR), 종양 유도성 골연화증, 표피 모반 증후군, 섬유성 이형성증 및 신결석증으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 바람직한 실시양태에서, 생물학적 샘플은 혈액 또는 소변이다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 시약은 FGF23 항체이다. 보다 바람직하게는, 시약은 검출가능하게 표지된다. 바람직한 표지로는 방사성동위원소, 생물발광 화합물, 화학발광 화합물, 형광 화합물, 금속 킬레이트 및 효소를 들 수 있다.
본 발명은 대상에서 종양 유도성 골연화증을 진단하는 방법을 추가로 포함한다. 이 방법은 (a) 대상으로부터 종양 샘플을 얻는 단계; 및 (b) 이 종양에서 FGF23의 발현 또는 그의 결핍을 검출하는 단계를 포함하며, 여기서 FGF23의 발현에의해 상기 대상이 종양 유도성 골연화증에 걸렸음을 알 수 있다.
본 발명은 또한 포유동물에서 저인산혈성 질환을 치료하는 방법을 포함한다. 이 방법은 저인산혈성 질환을 앓는 포유동물에게 FGF23 억제제를 치료 유효량 투여하는 것을 포함한다. 이 억제제는 상기 포유동물에서 FGF23 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA의 수준을 감소시키는 억제제, 상기 포유동물에서 FGF23 폴리펩티드의 수준을 감소시키는 억제제, 또는 상기 포유동물에서 FGF23의 생물학적 활성의 억제제일 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 저인산혈성 질환은 X-연관 유전성 구루병 (XLH), 유전성 저인산혈성 구루병 (HHRH), 저인산혈성 골 질환 (HBD), 상염색체 우성 저인산혈성 구루병 (ADHR), 종양 유도성 골연화증, 표피 모반 증후군, 섬유성 이형성증 및 신결석증으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 바람직한 실시양태에서, 억제제는 안티센스 핵산, 리보자임, 항체, 펩티드 또는 펩티드모방체이다.
본 발명은 포유동물에서 고인산혈성 질환을 치료하는 방법을 추가로 포함한다. 이 방법은 상기 질환을 앓는 포유동물에게 FGF23을 코딩하는 단리된 핵산을 치료 유효량 투여하는 것을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 단리된 핵산은 그에 의해 코딩되는 FGF23 폴리펩티드에 증가된 안정성을 부여하는 돌연변이를 포함한다.
다른 바람직한 실시양태에서, 고인산혈성 질환은 경증 신부전증 또는 종양성 석회증이다.
또한 본 발명은 포유동물에서 고인산혈성 질환을 치료하는 방법을 포함한다. 이 방법은 상기 질환을 앓는 포유동물에게 단리된 FGF23 폴리펩티드를 치료 유효량 투여하는 것을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 단리된 FGF23 폴리펩티드는 증가된 안정성을 부여하는 돌연변이를 포함한다.
다른 바람직한 실시양태에서, 고인산혈성 질환은 경증 신부전증 또는 종양성 석회증이다.
본 발명은 포유동물에서 고인산혈성 질환을 치료하는 방법을 추가로 포함한다. 이 방법은 상기 질환을 앓는 포유동물에게, 이 포유동물에서 FGF23 폴리펩티드의 수준을 증가시키는 시약을 치료 유효량 투여하는 것을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 시약은 FGF23 폴리펩티드의 분해를 억제한다.
다른 바람직한 실시양태에서, 고인산혈성 질환은 경증 신부전증 또는 종양성 석회증이다.
본 발명은 포유동물에서 고인산혈증을 치료하는 방법을 추가로 포함한다. 이 방법은 상기 질환을 앓는 포유동물에게, FGF23을 코딩하는 단리된 핵산을 포함하는 세포 집단을 치료 유효량 투여하는 것을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 단리된 핵산은 그에 의해 코딩되는 FGF23에 증가된 안정성을 부여하는 돌연변이를 포함한다.
다른 바람직한 실시양태에서, 저인산혈성 질환은 경증 신부전증 또는 종양성 석회증이다.
본 발명은 포유동물에서 골다공증을 치료하는 방법을 포함한다. 이 방법은 상기 포유동물에게, FGF23, 또는 포유동물에서 FGF23 폴리펩티드의 수준을 증가시키는 시약을 치료 유효량 투여하는 것을 포함한다.
본 발명은 포유동물의 동맥 또는 연조직내 칼슘 및 포스페이트의 침착을 포함하는 증상을 치료하는 방법을 추가로 포함한다. 이 방법은 상기 포유동물에게, FGF23, 또는 FGF23 폴리펩티드의 수준을 증가시키는 시약을 치료 유효량 투여하는 것을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 증상은 피부근염이다.
본 발명은 포유동물에서 관상동맥 질환을 치료하는 방법을 추가로 포함한다. 이 방법은 관상동맥 질환을 앓는 포유동물의 관상동맥 세포에 FGF23을 코딩하는 핵산을 투여하는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 포유동물 저인산혈성 질환의 진단용 키트를 포함한다. 이 키트는 FGF23을 코딩하는 핵산 서열에서의 돌연변이의 존재 또는 부재를 검출하는 시약을 포함하며, 여기서 상기 돌연변이의 존재에 의해 상기 포유동물이 저인산혈성 질환에 걸렸음을 알 수 있다. 이 키트는 어플리케이터 (applicator) 및 사용 지침을 추가로 포함한다.
또한 본 발명은 포유동물 저인산혈성 질환의 진단용 키트를 포함한다. 이 키트는 FGF23 폴리펩티드의 수준을 검출하는 시약을 포함하며, 여기서 상기 FGF23 폴리펩티드의 증가된 수준에 의해 상기 포유동물이 저인산혈성 질환에 걸렸음을 알 수 있다. 이 키트는 어플리케이터 및 사용 지침을 추가로 포함한다.
본 발명은 또한 포유동물 저인산혈성 질환의 진단용 키트를 포함한다. 이 키트는 FGF23 폴리펩티드의 돌연변이체 형태의 존재 또는 부재를 검출하는 시약을 포함하며, 여기서 상기 FGF23의 돌연변이체 형태의 존재에 의해 상기 포유동물이 저인산혈성 질환에 걸렸음을 알 수 있다. 이 키트는 어플리케이터 및 사용 지침을 추가로 포함한다.
상기 개요, 및 하기 본 발명의 바람직한 실시양태의 상세한 설명은 첨부된 도면을 참고로 하면 더 잘 이해될 것이다. 본 발명의 설명을 위해, 첨부된 도면에는 바람직한 실시양태를 나타내었다. 그러나, 본 발명은 본원에 나타낸 것과 같은 특정한 배열 및 수단으로 한정되지 않음을 알아야 한다.
도면에서:
도 1A는 2개의 다른 ADHR 가계 (1406 및 1478)의 가계도내에서의 연관 분석을 나타내는 모식도이다.
도 1B는 3개의 다른 ADHR 가계 (1406, 1478 및 2318)에서의 돌연변이 분석을 나타내는 일련의 가계도의 모식도 및 아가로스 겔의 이미지이다.
도 2는 ADHR 영역의 물리적 지도를 나타내는 모식도이다. DNA 마커 및 BAC/PAC의 위치는 비종결 서열 데이타 (Baylor College of Medicine Human Genome Sequencing Center)에 의해 평가된 스케일로 나타내었다. 화살표는 클론 RP11-303E5 및 RP11-320N7과, 클론 RP11-103A11 및 RP11-935C2 사이의 게놈 서열내의 갭 (gap)을 나타낸다. D12S1624와 D12S1594 사이, 및 GPR46과 GDF2 사이의 유전자의대략적인 위치를 나타내었다.
도 3A 내지 3C는 FGF23 및 다른 포유동물 FGF 군 구성원들의 아미노산 서열 정렬 (도면에 나타낸 순서로 서열 14 내지 34)이다. 정렬은 12개의 반대로 평행한 (antiparallel) 베타 스트랜드로 구성된 코어 서열에 한정하였다. FGF-2 결정 구조에서 베타-쉬이트 배열을 갖는 세그먼트의 위치에는 밑줄이 그어져 있다. FGF23에서 돌연변이된 2개의 아르기닌 (도 3C; 별표(*)로 나타냄)은 마우스 FGF23 동족체에서 보존된다. 이 정렬은 CLUSTAL 및 PRETTYBOX로 생성되었다. 인간 및 마우스 FGF23은 PFAM 데이타베이스의 FGF 프로필 (4.6e-14, 1.9e-16)에 의해 확인되었다. 이들은 공통의 코어 서열에서 FGF 군의 다른 구성원들과 25％ 내지 36％의 아미노산 동일성을 공유한다.
도 4A는 FGF23의 조직 발현을 나타내는 아가로스 겔의 이미지이다. 인트론-스패닝 (spanning) 프라이머를 사용하여 인간 조직으로부터 RNA를 RT-PCR 분석한 결과, 인간 심장 (H), 간 (L), 갑상선/부갑상선 (TP), 소장 (SI), 고환 (T) 및 골격근 (SM)에서 650 bp의 생성물이 나타났지만, 뇌 (B) 및 신장 (K)에서는 음성이었다.
도 4B는 7일간의 노출 후, 여러 암세포주에서의 FGF23 발현을 나타내는 노던 블롯의 이미지이다. 만성 골수성 백혈병 세포주 K562에서 엄격 세척 조건하에 3 및 1.3 kb의 전사체가 관찰되었다 (레인 3). 다른 세포주는 3 또는 1.3 kb 전사체를 생성하였다 (레인 1 = HL-60; 레인 2 = HeLaS3; 레인 4 = MOLT-4; 레인 5 = RAJI; 레인 6 = SW480; 레인 7 = A549; 레인 8 = G-361).
도 5A는 인간 FGF23의 cDNA 서열 (서열 1)이다.
도 5B는 인간 FGF23의 아미노산 서열 (서열 2)이다.
도 6A는 마우스 FGF23의 cDNA서열 (서열 3)이다.
도 6B는 마우스 FGF23의 아미노산 서열 (서열 4)이다.
도 7A는 박테리아에 의해 생산되는 FGF23의 시험관내 발현을 나타내는 웨스턴 블롯의 이미지이다. 항-FGF23 항체는 IPTG-유도된(+) 박테리아로부터 27 kDa의 단백질을 인식하였지만, 히스티딘-태그된 FGF23 (FGF23-6xHis)으로 형질전환된, 비-유도된(-) 박테리아로부터는 인식하지 못하였다.
도 7B는 형질감염된 세포로부터의 FGF23의 발현을 나타내는 노던 블롯의 이미지이다. FGF23 프로브를 사용하여, FGF23-발현 벡터 (pFGF23; 레인 3)로 형질감염된 HEK293 세포로부터의 전체 RNA를 노던 블롯 분석한 결과, 1.1 kb의 단일 전사체가 나타났다 (레인 1 = 형질감염되지 않은 HEK293 세포; 레인 2 = 대조구 벡터 pcDNA3.1로 형질감염된 HEK293 세포).
도 7C는 형질감염된 세포로부터의 FGF23의 분비를 나타내는 웨스턴 블롯의 이미지이다. 항-FGF23 항체는 pFGF23으로 형질감염된 세포로부터 얻어진 농축된 조정 배지에서 32 및 12 kDa의 두가지 단백질 밴드를 인식하였지만 (레인 2, 4 및 6), 형질감염되지 않은 세포로부터 얻어진 것에서는 그렇지 않았다 (레인 1, 3 및 5).
도 8A는 종양발생성 저인산혈성 골연화증 (OHO) 종양에서 FGF23의 발현을 나타내는 노던 블롯의 이미지이다. 5가지 다른 OHO 종양 (레인 3 - 7)으로부터의 전체 RNA를 노던 블롯 분석한 결과, 30분의 노출 이후에 강하게 혼성화하는 1.3 및 3 kb의 FGF23 전사체, 및 희미한 2 kb 밴드를 나타내었지만, 대조군 조직은 음성이었다 (레인 1 = 인간 간; 레인 2 = 인간 부갑상선, 레인 8 = 마우스 뇌; 레인 9 = 마우스 심장; 레인 10 = 마우스 신장).
도 8B는 OHO 종양 샘플에서 FGF23 단백질 발현을 나타내는 웨스턴 블롯의 이미지이다. OHO 종양으로부터의 추출물 2 마이크로그램을 분석한 결과, 32 kDa의 단백질이 항-FGF23 항체에 의해서는 검출되었지만 (+), 면역 전 (pre-immune) 혈청에 의해서는 그렇지 않은 것으로 (-) 입증되었다.
도 9는 인간 FGF23의 아미노산 서열 (서열 2)이며, 예상 신호 펩티드 및 RXXR/S 프로테아제 절단 부위를 나타내었다.
도 10A는 FGF23 단백질의 야생형 및 ADHR 돌연변이체 형태의 발현 및 분비를 나타내는 일련의 웨스턴 블롯 이미지이다. 웨스턴 블롯 분석에서 항-FGF23 항체 및 2 마이크로그램의 조정 배지 (M), 또는 FGF23의 야생형 (FGF23) 또는 ADHR 돌연변이체 (R176Q, R179W, R179Q) 형태를 발현시키는 플라스미드로 형질감염된 HEK293 세포로부터 얻은 세포 용해물 (L) 50 마이크로그램을 사용하였다. 야생형 FGF23의 경우 조정 배지에서 32 및 12 kDa의 밴드가 검출되었지만, ADHR 돌연변이체의 경우 32 kDa 종만이 검출되었다. 세포 용해물은 모든 FGF23 형질감염에 대하여 음성이었으며, 모든 구조물은 유사한 형질감염 효율을 나타내었다.
도 10B는 인간 FGF23의 야생형 및 ADHR 돌연변이체 (R176Q, R179W, R179Q) 형태 (아미노산 172 내지 184)의 목록이다.
도 11A는 FLAG-태그된 FGF23의 발현을 나타내는 웨스턴 블롯의 이미지이다. FLAG (M2)에 대해 특이적인 모노클로날 항체를 사용하는 웨스턴 블롯 분석을 이용하여, FGF23의 야생형 또는 R176Q 돌연변이체 형태를 발현시키는 플라스미드로 형질감염된 HEK293 세포로부터 얻어진 조정 배지에서 N-말단 FLAG-태그된 야생형 (2개의 각 클론, 좌측 레인 2개) 또는 R176Q 돌연변이체 (2개의 각 클론, 우측 레인 2개) FGF23을 검출하였다. 야생형 FLAG-FGF23은 36 kDa 밴드 및 뚜렷한 26 kDa 단편으로 검출되었지만, FLAG-R176Q 돌연변이체는 주로 36 kDa 종으로 나타났고, 26 kDa에서는 희미한 밴드가 나타났다.
도 11B는 FGF23 단백질을 나타내는 모식도이며, FLAG 에피토프, 항-FGF23 에피토프 및 SPC 부위의 상대적인 위치가 나타나 있다.
도 12A는 FGF23 단백질의 HEK293 세포로의 세포외 노출을 나타내는 웨스턴 블롯의 이미지이다. FGF23에 대해 특이적인 항체를 사용하는 웨스턴 블롯 분석을, 5 x 106개의 HEK293 세포와 함께 24시간 동안 인큐베이션한 FGF23 조정 배지(+) 또는 공 (empty) 배양 디쉬(-)에서 수행하였다. 처리 후 32 및 12 kDa 밴드의 강도에 있어서의 차이는 없었다.
도 12B는 쿠마지 (Coomassie) 블루-염색된 겔의 이미지이다. 도 12A에 나타낸 샘플을 평행하게 전기영동하고, 쿠마지 염색으로 해당 겔 로딩을 확인하였다.
도 13은 야생형 및 ADHR 돌연변이체 FGF23의 헤파린으로의 결합을 나타내는 웨스턴 블롯의 이미지이다. FGF23의 야생형 또는 돌연변이체 형태 및 FGF23의FLAG-태그된 야생형 또는 돌연변이체 형태로 형질감염된 HEK293 세포로부터 얻어진 조정 배지를 헤파린-세파로스와 함께 인큐베이션하고, 결합된 물질을 항-FGF23 항체를 이용하여 웨스턴 블롯으로 분석하였다. 32 kDa 종은 야생형 또는 돌연변이체 FGF23 결합된 헤파린에 상응한다. 대조구 벡터의 경우, 배지는 음성이었다. 몇몇 샘플에서 약 28 kDa에서의 희미한 밴드의 기원은 알려져 있지 않다 (레인 1 = 천연 FGF23; 레인 2 = R176Q; 레인 3 = R179W; 레인 4 = R179Q; 레인 5 = CMV 벡터; 레인 6 = FLAG-FGF23; 레인 7 = FLAG-176Q; 레인 8 = FLAG 벡터).
본 발명은 포유동물 섬유아세포 성장 인자-23 (FGF23)을 코딩하는 신규 핵산 및 그에 따라 코딩되는 단백질의 발견에 관한 것이다. 본 발명은 섬유아세포 성장 인자 군의 신규 구성원을 개시하며, 여기서 상기 핵산 및 그에 의해 코딩되는 단백질은 저인산혈성 질환 및 고인산혈성 질환의 진단 및 치료를 위한 진단 및 치료 시약의 개발에 있어서 유용하다.
신장은 혈청의 포스포이트 농도를 적절하게 유지하는데 중요한 역할을 한다. 포스페이트 조절의 손상에 따른 희귀한 유전성 질환을 일으키는 유전자를 확인하는 것은 미네랄 이온 밸런스를 조절하는 신장 대사 경로를 찾아내는 기회를 제공한다.
본원에 개시된 초기 실험에서, 상염색체 우성 저인산혈성 구루병 (ADHR)의 원인이 되는 유전자를 찾아내었으며, FGF23으로 명명하였다. ADHR은 작은 키, 골 통증, 골절 및 하지 변형을 특징으로 한다. 또한 본원에서 FGF23은 후천성 신장 포스페이트 소모 질환인 종양발생성 저인산혈성 골연화증을 초래하는 종양에서 과다발현되는 것으로 밝혀졌다. 종양발생성 저인산혈성 골연화증을 앓는 환자는 ADHR 환자와 생화학적 및 임상적 유사성을 공유한다. 이들은 대상에서 FGF23의 수준 및(또는) 활성을 감소시켜 치료할 수 있는 여러 저인산혈성 질환 중 2가지이다. FGF23 억제제로 치료될 수 있는 기타 저인산혈성 질환으로는 XLH, HHRH, HBD, 표피 모반 증후군, 섬유성 이형성증 및 신결석증 등을 들 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다.
신장 포스페이트 소모 및 낮은 혈청 포스페이트를 특징으로 하는 저인산혈성 질환과는 달리, 경증 신부전증 및 종양성 석회증 등을 비롯한 고인산혈성 질환은 혈청 중 과량의 포스페이트를 특징으로 한다. FGF23의 투여는 소변 중 포스페이트의 배출을 자극하며, 이에 따라 혈청 중 포스페이트 수준을 감소시킨다. 따라서, 고인산혈성 질환은 천연 FGF23 또는 대상에서 FGF23 폴리펩티드의 수준을 증가시키는 분자를 투여하여 치료할 수 있다. 또한, 돌연변이체 FGF23을 사용하여 고인산혈증, 특히 상기 돌연변이체가 천연 FGF23보다 더 긴 반감기를 갖는 경우를 치료할 수 있다. 더 긴 반감기를 갖는 FGF23의 특정 돌연변이체가 본원에 개시되어 있다.
따라서, 본 발명에서 FGF23이 동물의 저인산혈성 증상 및 고인산혈성 증상 둘 다에 관련될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 본질적으로, 동물에서 FGF23의 수준이 비정상적으로 증가된 경우, 일반적으로 단백질이 과다발현되거나 또는 유전자 돌연변이로 인해 증가된 능력을 갖는 경우, 동물은 증가된 포스페이트 소모로 인해 저인산혈증을 나타낸다. FGF23의 비정상적 수준이 고인산혈증을 유발하는 역할을 하는지는 아직 결정되지 않았지만, 동물에서 혈청 포스페이트 수준을 감소시키는FGF23의 능력은 FGF23이 포스페이트 항상성을 조절하는데 있어서 중요한 역할을 한다는 것을 분명히 나타낸다.
본 발명은 FGF23을 코딩하는 단리된 핵산을 포함한다. 본원에 개시된 바와 같이, FGF23을 코딩하는 단리된 핵산을 인간 세포 및 쥐 세포 모두로부터 단리하였다 (예를 들어, 각각 도 5A 및 6A; 서열 1 및 서열 3 참조). FGF23을 코딩하는 바람직한 핵산은 DNA이다. 또한, 인간 및 쥐 FGF23 핵산 및 단백질이 본원에 예시되기는 하였지만, 본 발명이 이러한 포유동물 종으로부터 얻어진 FGF23 만으로 한정되는 것으로 생각해서는 안된다. 오히려, 본 발명은 본원에 정의된 바와 같은 FGF23의 생물학적 활성을 갖는 FGF23 또는 그의 임의의 돌연변이체, 변이체 또는 동족체를 코딩하는 임의의 단리된 핵산을 포함하는 것으로 이해해야 한다. 바람직하게는, 본 발명의 FGF23을 코딩하는 DNA는 서열 1 또는 서열 3과 약 50％의 상동성을 공유한다. 보다 바람직하게는, 상기 DNA는 서열 1 또는 서열 3과 약 60％, 보다 바람직하게는 약 70％, 보다 더 바람직하게는 약 80％, 특히 바람직하게는 약 90％, 특히 더 바람직하게는 약 95％, 가장 바람직하게는 약 99 내지 100％의 상동성을 공유한다.
본 발명은 태그 폴리펩티드를 코딩하는 핵산이 공유적으로 연결되어 있는, FGF23을 코딩하는 핵산을 포함한다. 즉, 본 발명은 태그 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열이 FGF23 폴리펩티드를 코딩하는 핵산에 공유적으로 연결되어 있는 키메라 핵산을 포함한다. 이러한 태그 폴리펩티드는 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를들어 녹색 형광 단백질 (GFP), myc, myc-피루베이트 키나제 (myc-PK), His6, 말토스 결합 단백질 (MBP), 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 태그 폴리펩티드, 플래그 태그 폴리펩티드 (FLAG), 및 글루타티온-S-트랜스퍼라제 (GST) 태그 폴리펩티드를 들 수 있다. 그러나, 어떤 식으로든지 본 발명이 상기 나열된 태그 폴리펩티드를 코딩하는 핵산으로만 한정되는 것으로는 생각되지 않는다. 오히려, 이러한 태그 폴리펩티드와 실질적으로 유사한 방식으로 작용할 수 있는 폴리펩티드를 코딩하는 임의의 핵산 서열이 본 발명에 포함되는 것으로 생각해야 한다.
태그 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 핵산을 이용하여 세포, 조직 및(또는) 전체 유기체 (예, 포유동물 배 (embryo))내에서 FGF23을 위치화하고, 세포로부터 분비된 FGF23을 검출하고, 세포에서 FGF23의 역할(들)을 연구할 수 있다. 또한, 태그 폴리펩티드를 첨가하여 본 발명의 단백질이 용이하게 생산 및 정제될 수 있도록 "태그된" 단백질의 단리 및 정제를 촉진시킨다.
또한 본 발명에는 FGF23을 코딩하는 핵산이 포함되는데, 이 핵산은 작동가능하게 연결된 프로모터/조절 서열을 지정한다. 바람직하게는, 프로모터/조절 서열을 지정하는 핵산은 그가 세포내에서 목적하는 단백질의 발현을 유도하도록 FGF23 코딩 서열의 5' 말단에 위치한다.
관련된 다른 측면으로, 본 발명은 FGF23을 코딩하는 단리된 핵산을 포함하는 벡터를 포함한다. 바람직하게는, 벡터는 벡터-함유 세포에서 FGF23의 발현을 지시할 수 있다. 본 발명에 사용하기에 적합한 벡터로는 FGF23을 코딩하는 여러 카피수의 핵산 생성을 촉진시키는 벡터, 또는 원핵세포 또는 진핵세포 또는 이들 모두에서 FGF23 단백질의 발현을 촉진시키는 벡터를 들 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 따라서, 본 발명은 임의의 공지된 벡터 시스템으로 한정되는 것으로 생각해서는 안되며, 오히려 여러 카피수의 FGF23 코딩 핵산의 생성을 촉진시키거나 또는 세포에서 FGF23의 발현을 촉진시키는 적합한 모든 공지된 벡터 또는 아직 알려지지 않은 벡터를 포함해야 한다. 적합한 벡터의 예로는 박테리아에서 복제 및 발현을 위한 박테리오파아지 T7-계 발현 벡터, 포유동물 세포에서 복제 및 발현을 위한 pMSXND 발현 벡터, 및 곤충 세포에서의 복제 및 발현을 위한 바쿨로바이러스-유래의 벡터를 들 수 있다. 또한 아데노바이러스, 레트로바이러스 및 다른 바이러스 벡터가 본 발명에 포함된다.
바람직하게는, 본 발명의 단리된 핵산 분자는 본 발명의 재조합 벡터에서 프로모터/조절 요소 및 다른 조절 요소, 예를 들어 종결 신호 및 폴리아데닐화 신호 등에 작동가능하게 연결되며, 이들 각각은 세포에서 FGF23의 효과적인 복제 및 발현을 보장한다. 본 발명이 FGF23의 발현을 유도하는 임의의 특정 프로모터/조절 서열로 한정되지는 않는다. 오히려, 본 발명이 임의의 바람직한 진핵세포 또는 원핵세포에서 FGF23을 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결되어 그로부터 FGF23의 발현을 수행할 수 있는 임의의 모든 적합한 프로모터/조절 서열을 포함하는 것으로 생각해야 한다. 적합한 프로모터 서열을 핵산에 연결하는 기술은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 문헌 (Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York), in Ausubel etal. (1997, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York), and in Gerhardt et al. (eds., 1994, Methods for General and Molecular Bacteriology, American Society for Microbiology, Washington, DC))에 기재되어 있다.
본 발명은 본 발명의 벡터를 포함하는 세포를 추가로 포함하며, 이 세포는 원핵세포 또는 진핵세포 즉, 예를 들어 포유동물, 박테리아, 곤충 또는 효모 세포이다. FGF23 단백질은 본원에 기재된 바와 같은 이러한 벡터-함유 세포를 이용하여 제조할 수 있다. 마찬가지로, 본 발명이 FGF23을 발현시키는데 사용되는 특정 유형의 세포로 한정되는 것으로 생각해서는 안된다.
본 발명은 FGF23을 코딩하는 단리된 핵산의 전부 또는 일부에 대하여 안티센스 방향으로 존재하는 (즉, 상보적인) 서열을 갖는 단리된 핵산을 추가로 포함한다. 한 측면으로, 본 발명은 안티센스 RNA 서열을 포함하는데, 이 서열은 FGF23을 코딩하는 mRNA에 결합함으로써 FGF23의 합성을 억제시킬 수 있는 것을 특징으로 한다. 마찬가지로, 벡터, 예컨대 상기 핵산이 프로모터/조절 요소에 작동가능하게 연결되어 있는 벡터, 및 안티센스 FGF23 단리된 핵산 서열을 포함하는 세포가 본 발명에 포함된다.
다른 측면으로, 본 발명은 FGF23을 코딩하는 mRNA에 상보적인 RNA 서열을 포함하는 리보자임을 포함하며, 따라서 이 리보자임은 상기 mRNA에 결합하여 그를 절단하고, mRNA에 의해 코딩되는 FGF23의 합성을 억제시킬 수 있다. 리보자임은 표적 RNA, 예를 들어 FGF23 mRNA를 분자내에서 절단할 수 있는 단일 가닥 RNA 쇄로구성된다. 당업계의 기술문헌 (예, Tanner et al., IN: Antisense Research and Applications, CRC Press INC. 1993, pp415-426)에 기재된 방법에 따라 특정 표적 부위에서 RNA를 절단할 수 있는 리보자임을 구성할 수 있다. 이러한 리보자임에 대한 두가지 주요한 요건은 촉매 도메인, 및 표적 RNA에 상보적이고 이들을 기질에 결합시킬 수 있는 (절단을 위한 예비요건) 영역이 있어야 한다는 것이다. 안티센스 RNA 및 리보자임은 FGF23 발현의 억제제로서 유용하다. 바람직하게는, 본 발명의 안티센스 RNA 및 리보자임은 FGF23을 코딩하는 mRNA의 5' 말단에 상보적이다. 안티센스 단편 및 리보자임을 발생시킬 수 있는 당업자라면, 본원에 제공된 서열을 기초로, 안티센스 분자 또는 리보자임에 의해 FGF23 mRNA 서열을 표적화하여 FGF23 발현을 억제할 수 있음을 알 것이다.
2가지 기본적인 유형의 리보자임, 즉 테트라히메나 (tetrahymena)-유형 (Hasselhoff, 1988, Nature 334: 585) 및 햄머헤드 (hammerhead)-유형이 존재한다. 테트라히메나-유형 리보자임은 염기 4개 길이의 서열을 인식하지만, 햄머헤드-유형 리보자임은 염기 11 내지 18개 길이의 서열을 인식한다. 서열의 길이가 더 길수록, 서열이 표적 mRNA 종에서 배타적으로 존재할 가능성이 커진다. 따라서, 햄머헤드-유형 리보자임은 바람직하게는 특정 mRNA 종을 실활화하기 위한 테트라히메나-유형 리보자임이며, 18개의 염기 인식 서열은 바람직하게는 관련되지 않은 다양한 mRNA 분자내에서 랜덤하게 존재할 수 있는 더 짧은 인식 서열이다.
표적 서열을, FGF23에 의해 코딩되는 FGF23의 mRNA 서열에 상보적이거나, 서열 1 및 서열 3 중 적어도 하나와 약 50％ 이상의 서열 동일성을 갖는 기본 리보자임 구조로 혼입시켜 FGF23의 발현을 억제하는데 유용한 리보자임을 설계할 수 있다. FGF23을 표적화하는 리보자임은 시판 시약 (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA)을 사용하여 합성하거나, 그를 코딩하는 DNA로부터 유전적으로 발현시킬 수 있다.
본 발명은 기능적 형태의 FGF23이 결여되어 있어서 FGF23의 생물학적 활성이 제거된 게놈을 갖는 비인간 유전자변형 포유동물을 추가로 포함한다. 한 예에서, 비인간 유전자변형 포유동물은 그의 게놈내의 목적하는 부위에 삽입된 외래 핵산을 포함하며, 따라서 FGF23의 코딩 영역이 결실되고, 즉 녹-아웃 (knock-out) 유전자변형 포유동물이 생성된다. 이러한 동물은 FGF23의 돌연변이와 관련된 인간 질환의 증상을 연구하는데 있어서 유용한 모델을 제공한다. 바람직하게는, 유전자변형 포유동물은 마우스이다. FGF23의 기능이 녹-아웃된 마우스는 고인산혈증 형질 또는 비-포스페이트 형질을 갖는다.
또한, 본 발명은 FGF23을 코딩하는 외래 핵산이 게놈 부위내에 삽입된 유전자변형 비인간 포유동물, 즉 "녹-인 (knock-in)" 유전자변형 포유동물을 포함한다. 삽입된 녹-인 형질전이유전자 (transgene)는 예를 들어 태그 폴리펩티드를 코딩하는 다양한 핵산, 및 일반적으로 세포에 존재하지 않는 FGF23을 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결되거나, 통상적으로 FGF23에 작동가능하게 연결되지 않은 프로모터/조절 영역을 포함할 수 있다. FGF23 녹-인 형질전이유전자의 발현은 이러한 동물에서 저인산혈증을 유발시켜, 종양발생성 저인산혈성 골연화증 및 ADHR과 유사한 형질을 나타낼 수 있다. FGF23의 야생형 및 돌연변이체 형태 둘 다를 포유동물의 게놈내에 삽입시킬 수 있다. 특히, 본원에 개시된 돌연변이체의 삽입은 보다 안정한 형태의 FGF23을 생성시키며, 따라서 상기 동물에서 지연 또는 증강된 저인산혈증 증상을 나타낼 수 있다.
본 발명의 비인간 유전자변형 포유동물의 생성은 바람직하게는 하기 기재된 방법을 이용하여 달성한다. 그러나, 어떤 식으로든지 본 발명이 이러한 방법의 이용으로만 한정되는 것으로 생각해서는 안되며, 즉 다른 방법을 이용하여 원하는 녹-아웃 포유동물을 생성시킬 수 있다.
비인간 유전자변형 포유동물을 생성시키는 바람직한 방법에서, 본 발명의 형질전이유전자를 포함하는 ES 세포를 생성시키고, 이어서 이 세포를 사용하여 본질적으로 문헌 (Nagy and Rossant (1993, In: Gene Targeting, A Practical Approach, pp. 146-179, Joyner ed., IRL Press))에 기재된 바와 같은 녹-아웃 동물을 생성시킨다. ES 세포는, 이들이 숙주의 포배 (blastocyst)로 주입되어 배 환경으로 복귀하거나 할구 단계의 배와 응집하는 경우 정상적인 배아 세포로서 작용한다. 이와 같이 복귀하는 경우, 세포는 배의 모든 계를 따라 발생하는 완전한 잠재력을 갖는다. 따라서, ES 세포를 얻고, 여기에 원하는 DNA를 도입한 다음, 세포를 배 환경으로 복귀시켜, 목적하는 DNA를 발현시킬 수 있는 성숙 포유동물 세포를 발생시킬 수 있다.
유전자변형 마우스를 발생시키는 상세한 프로토콜은 문헌 (Nagy and Rossant (1993, In : Gene Targeting, A Practical Approach, Joyner ed. IRL Press, pp. 146-179))에 개시되어 있으며, 따라서 본원에서는 이를 반복하여 적지 않는다. ES세포를 형질감염 또는 형질도입시켜 목적하는 DNA를 이들 세포에 도입하는 것은 예를 들어 문헌 (Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York), and in Ausubel et al. (1997, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York))에 기재된 것과 같은 표준 프로토콜을 이용하여 달성한다. 바람직하게는, ES 세포를 전기천공하여 본 발명의 형질전이유전자내에 포함된 목적 DNA를 넣고, 이 세포를 문헌 Soriano et al. (1991, Cell 64: 693-702))에 기재된 바와 같이 증식시킨다.
단리된 핵산을 포유동물의 수정란에 도입하는 것은 유전자변형 기술 (Hogan et al., 1986, Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY)의 다수의 표준 기법에 의해 달성된다. 가장 통상적으로, 미세주입에 의해 핵산을 배내에 도입한다.
핵산을 수정란내에 도입하는 경우, 수정란을 단시간 동안 인큐베이션한 다음, 예를 들어 문헌 (Hogan et al. (1986, Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY))에 기재된 바와 같이 수정란을 얻은 동일한 종의 가임신 포유동물로 전달한다. 통상적으로, 실험마다 많은 수정란을 주입하며, 대략 이들의 2/3가 실험 동안 생존한다. 이어서 약 20개의 생존 수정란을 가임신 동물로 전달하며, 이와 같이 전달된 생존 수정란 중 일반적으로 4개 내지 10개가 생존하여 포유동물 새끼로 성장한다.
임의의 포유동물 FGF23 유전자를 본원에 기재된 방법에서 이용하여 FGF23 유전자의 전부 또는 일부의 결실을 포함하는 형질전이유전자를 보유하는 유전자변형포유동물 또는 유전자변형 세포를 생성시킬 수 있다. 바람직하게는, FGF23 유전자, 예를 들어 마우스 FGF23 (서열 3)이 사용되며, 인간 FGF23 (서열 1) 유전자도 사용된다.
본 발명의 유전자변형 포유동물은 임의의 포유동물 종일수 있다. 따라서, 본 발명은 키메라 핵산을 코딩하는 유전자변형 포유동물의 발생을 포함하는 것으로 이해되어야 하며, 이러한 포유동물로는 마우스, 햄스터, 래트, 토끼, 돼지, 양 및 소를 들 수 있다. 임의의 포유동물 종을 이용하여, 유전자변형 마우스의 생성을 위한 본원에 개시된 방법을 유사하게 적용할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 유전자변형 포유동물은 설치류이고, 보다 바람직하게는 본 발명의 유전자변형 포유동물은 마우스이다. 예를 들어, 문헌 (Lukkarinen et al. (1997, Stroke 28: 639-645))은 유전자변형 마우스를 생성시킬 수 있는 유전자 구조물이 또한, 래트를 비롯한 다른 유전자변형 설치류를 생성시킬 수도 있음을 교시한다. 유사하게, 한가지 동물 종의 유전자 로커스에서의 무효 (nullizygous) 돌연변이를 제1 종과 매우 상동성인 유전자 로커스를 갖는 다른 종의 동물에서 복제할 수 있다.
본 발명의 유전자변형 포유동물을 확인하기 위해, 서던 블롯 혼성화, PCR 및(또는) RT-PCR과 같은 표준 기술을 이용하여 포유동물 새끼를 단리된 핵산의 존재에 대하여 조사하였다. 포유동물의 세포 및 조직에서의 핵산의 발현은 또한 본원에 기재된 통상의 기술을 이용하여 평가한다. 또한, 유전자변형 동물의 순환 혈액 중 FGF23의 존재 또는 부재는, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같이 (예, 웨스턴 블롯 분석) 또는 당업계에 잘 알려진 단백질 검출용 표준 방법을 이용하여 결정할수 있다.
또한 본원에서 사용되는 용어로 "유전자변형 세포"라고도 하는, 본 발명의 유전자변형 포유동물로부터 얻어진 세포로는 본원에 기재된 FGF23 (+/-) 및 (-/-) 유전자변형 비인간 포유동물로부터 얻어진 것과 같은 세포가 포함되며, FGF23 발현 수준의 변화와 관련되는 것으로 믿어지는 포유동물의 질환 및 증상을 모델링하는데 유용한 시스템이다.
본원에 기재된 비인간 녹-아웃 또는 녹-인 유전자변형 포유동물의 조직으로부터 유도되는 세포가 특히 적합하며, 이 세포에서 FGF23 유전자를 포함하는 형질전이유전자가 발현되거나, 다양한 조직에서 FGF23의 발현을 억제한다. 예를 들어, 이러한 세포가 유도되는 세포 유형으로는 (1) FGF23 (+/+), (+/-) 및 (-/-) 비인간 유전자변형 정상출산 포유동물의 섬유아세포 및 내피세포, (2) FGF23 (+/+), (-/-) 또는 (+/-) 동물 태아의 섬유아세포 및 내피세포, 및 (3) FGF23 및 (+/-) 태아 및 정상출산 포유동물로부터 얻은 태반 세포주를 들 수 있다.
본 발명은 FGF23 핵산에 의해 코딩되는 단리된 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 본원의 도 5B 및 6B에는 인간 및 마우스 FGF23 DNA에 의해 코딩되는 아미노산 서열이 각각 서열 2 및 서열 4로서 제공되어 있다. 상기 언급한 바와 같이, 본 발명이 어떤 식으로든지 인간 및 쥐 종으로부터 단리된 FGF23에 한정되는 것으로 생각해서는 안된다. 오히려, 본 발명이 본원에 정의된 바와 같은 FGF23의 생물학적 활성을 갖는 임의의 단리된 FGF23 폴리펩티드 또는 그의 임의의 돌연변이체, 변이체 또는 동족체를 포함하는 것으로 이해해야 한다.
인간 FGF23 단백질의 바람직한 아미노산 서열은 서열 2이고 마우스 FGF23 단백질은 서열 4이지만, 본 발명이 이러한 서열들로 한정되는 것으로 생각해서는 안된다. 오히려, 인간 및 마우스 FGF23의 아미노산 서열은 본원에 기재된 바와 같은 FGF23의 생물학적 활성을 갖는 임의의 돌연변이체, 변이체 또는 동족체인 것으로 생각해야 한다. 바람직하게는, FGF23의 아미노산 서열은 서열 2 또는 서열 4와 약 40％의 서열 동일성을 공유한다. 보다 바람직하게는, 이 아미노산 서열은 서열 2 또는 서열 4와 약 50％, 보다 바람직하게는 약 60％, 보다 더 바람직하게는 약 70％, 보다 바람직하게는 약 80％, 특히 바람직하게는 약 90％, 특히 더 바람직하게는 약 95％, 가장 바람직하게는 약 99 내지 100％의 상동성을 공유한다.
본 발명은 또한 FGF23 유전자에 의해 코딩되는 단백질 또는 펩티드의 동족체를 제공한다. 본원에 정의된 바와 같은 동족체는 자연 발생적인 단백질 또는 펩티드와는, 보존적 아미노산 서열 차이 또는 서열에 영향을 주지 않는 변형, 또는 이들 둘 다에서 차이가 있을 수 있다.
전장 펩티드 이외에도, 본 발명은 본원에 정의된 바와 같은, FGF23의 생물학적 활성을 갖는 펩티드를 제공한다. 당업자라면 본원에 개시된 서열을 기초로, 예를 들어 문헌 (Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York) and Ausubel et al. (1997, Current Protocols in Molecular Biology, Green & Wiley, New York))에 기재된 표준 재조합 기술을 이용하여 FGF23의 중복되는 단편을 생성시킬 수 있음을 알 것이다. 당업자라면 본원에 제공된 개시내용을 기초로, FGF23 단편을 마우스에 주입하고, 주입받은 마우스가 포스페이트 소모를 나타내는지를 평가하여 FGF23 단편의 생물학적 활성을 시험할 수 있다는 것을 알 것이다. 포스페이트 소모의 유도는 FGF23 단편이 생물학적 활성을 보유하였음을 나타내는 역할을 한다. 또한, 시험관내 분석을 이용하여 FGF23의 생물학적 활성을 시험할 수 있다. 예를 들어, 단리된 신세뇨관을 FGF23 단편으로 관류하고, 야생형 FGF23과 비교하여 포스페이트 운반에서의 변화를 평가할 수 있다. 유사하게, 필요한 FGF23 신호전달 수단 (즉, FGF 수용체 및 나트륨 운반체)을 보유하는 세포 배양 모델을 FGF23 단편으로 형질감염시키고, 이어서 야생형 FGF23과 비교하여 포스페이트 운반에 있어서의 변화를 시험할 수 있다.
상기 언급한 바와 같이, 본 발명은 FGF23에 의해 코딩되는 단백질 또는 펩티드의 동족체를 제공한다. 유사체는 자연 발생적인 단백질 또는 펩티드와는, 보존적 아미노산 서열 차이 또는 서열에 영향을 주지 않는 변형, 또는 이들 둘 다에서 차이가 있을 수 있다. 많은 방법에 의해, 예를 들어 문헌 (Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York) and Ausubel et al. (1997, Current Protocols in Molecular Biology, Green & Wiley, New York))에 기재된 것과 같은 당업계에 잘 알려진 재조합 DNA 방법을 이용하여 FGF23의 돌연변이체, 유도체 또는 변이체 형태를 생성시킬 수 있다.
예를 들어, 보존적 아미노산 변화가 수행될 수 있는데, 이들은 단백질 또는 펩티드의 1차 서열을 변형시키기는 하지만, 일반적으로 그의 기능은 변화시키지 않는다. 보존적 아미노산 치환은 통상적으로 하기 군 내에서의 치환을 포함한다:
글리신, 알라닌;
발린, 이소루이신, 루이신;
아스파르트산, 글루탐산;
아스파라긴, 글루타민;
세린, 쓰레오닌;
리신, 아르기닌 (단백질분해 효소 인식 부위와는 다른 위치에서); 및
페닐알라닌, 티로신.
변형 (일반적으로 1차 서열을 변형시키지 않음)은 폴리펩티드의 생체내 또는 시험관내 화학적 유도체화, 예를 들어 아세틸화 또는 카르복실화를 포함한다. 또한, 글리코실화의 변형, 예를 들어 폴리펩티드의 글리코실화 패턴을 그의 합성 및 프로세싱 동안 또는 추가의 프로세싱 단계에서 변형시켜, 예컨대 폴리펩티드를, 글리코실화에 영향을 주는 효소, 예를 들어 포유동물 글리코실화 또는 탈글리코실화 효소에 노출시켜 얻어진 것이 포함된다. 또한, 인산화된 아미노산 잔기, 예를 들어 포스포티로신, 포스포세린 또는 포스포쓰레오닌을 갖는 서열이 포함된다.
통상의 분자 생물학적 기술을 이용하여 변형시킴으로써 단백질분해에 대하여 내성이 향상되거나, 용해 특성이 최적화되거나, 치료제로서 보다 적합하게 만들어진 폴리펩티드가 또한 포함된다. 이러한 폴리펩티드의 동족체로는 자연 발생적인 L-아미노산과는 다른 잔기, 예를 들어 D-아미노산 또는 비-자연 발생적인 합성 아미노산을 포함하는 것들을 들 수 있다. 본 발명의 펩티드는 본원에 나열된 특정의예시적인 방법들 중 어느 하나의 생성물로 한정되지 않는다.
본원에 사용된 "FGF23의 생물학적 활성"이라는 용어는 FGF 수용체에 결합하여 생체내 또는 시험관내에서 포스페이트 운반을 변화시키는 분자의 능력을 의미한다. 당업자라면 또한 본원의 개시를 기초로 본 발명이 FGF23의 능력을 평가하는 어떤 특정의 방법에 한정되지 않으며, 당업계에 공지되어 있거나 향후에 개발될, FGF23의 능력을 평가하기 위한 임의의 분석을 포함한다는 것을 알 것이다.
본 발명은 단리된 FGF23 단백질, 그의 펩티드, 동족체 및 단편뿐 아니라 이들의 제조 방법도 제공한다. 본 발명의 한 측면으로, FGF23 단백질, 그의 펩티드, 동족체 및 단편은 이 단백질의 합성이 가능한 조건하에 FGF23 핵산을 포함하는 벡터를 포함하는 세포를 배양하여 생성시킬 수 있다. 재조합적으로 생산된 FGF23 단백질, 폴리펩티드, 단편 등을 단리 및 정제하는 것은, 예를 들어 항-FGF23 항체를 사용하여 크로마토그래피, 친화성 및 면역-기초 분리를 비롯한 통상의 수단에 의해 수행할 수 있다. 이러한 방법의 각각은 예를 들어 문헌 (Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York), in Ausubel et al. (1997, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York), and in Gerhardt et al. (eds., 1994, Methods for General and Molecular Bacteriology, American Society for Microbiology, Washington, DC))과 같은 표준 참고 문헌에 기재되어 있다.
본 발명은 FGF23 또는 그의 단편과 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 FGF23의 생물학적 활성을 억제하는 항체를 포함한다. 이 항체는 FGF23 수준과 관련된 질환이 있는 포유동물에서 FGF23의 수준을 측정하기 위한 진단 분석으로 FGF23을 확인하는데 유용하다. 또한, FGF23과 특이적으로 결합하는 항체는 FGF23과 그의 동족 수용체 사이의 상호작용을 차단하는데 유용하며, 따라서 본원에 기재된 바와 같이 FGF23 관련 질환의 치료를 위한 치료에 있어서도 유용하다.
FGF23에 대한 2가지 수용체가 확인되었고, 이는 FGFR2 및 FGFR4를 포함하지만; 이들이 FGF23 수용체의 유일한 2가지라고는 믿어지지 않는다. 다른 FGF 수용체를 확인하기 위해, 다음과 같은 분석을 이용할 수 있다. FGF23의 그의 수용체로의 결합은, 시판되는 FGF 수용체-Fc 키메라를 침전시키기 위해 고정된 단백질 A를 사용하는 것을 비롯한 표준 단백질 결합 분석을 이용하여 검출할 수 있다. 또한, 당업계에 공지된 표준 방법에 의해 발현 라이브러리를 스크리닝하여, FGF와 결합하는 것으로 알려진 것 이외의 다른 수용체에 FGF23이 결합하는 것을 검출할 수 있다. 따라서, 본원에 제공된 실험에 따라, 다른 FGF23 수용체가 확인될 수 있다.
본원에 기재된 유전적 또는 비-유전적 수단에 의해 FGFR2 및 FGFR4 또는 다른 FGF23 수용체를 대상에게 투여하는 것은 FGF23의 상호작용 및 그에 따른 활성화를 억제함으로써 저인산혈증을 치료할 수 있다. 유사하게, FGF23과 그의 수용체의 상호작용을 차단시키는 항체 및 다른 소분자는 FGF23 또는 그의 수용체에 결합함으로써 FGF23 활성을 억제시키는 기능을 할 수 있다. 당업자라면 본원에 제공된 개시를 기초로, 다수의 잘 특성화된 단백질 결합 분석 중 한가지를 이용하여, FGF23-수용체 상호작용을 차단시키기는 능력에 대하여 화합물들을 스크리닝함으로써FGF23 수용체 차단제가 확인될 수 있다는 사실을 알 것이다.
FGF23에 특이적으로 결합하는 항체의 생성은 이 섹션의 실험 세부사항에 기재되어 있다. 그러나, 본 발명이 본원에 구체적으로 개시된 항체들로만 한정되는 것으로 생각해서는 안되며, 오히려 FGF23과 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 모든 항체를 포함하는 것으로 생각해야 한다. 예를 들어, 폴리클로날 항체의 생성은, 원하는 동물을 항원으로 접종시키고, 항원과 특이적으로 결합하는 항체를 단리하여 달성할 수 있다.
단백질 또는 펩티드의 전장 또는 펩티드 단편에 대하여 지시되는 모노클로날 항체는, 예를 들어 문헌 (Harlow et al. (1988, In: Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY) and in Tuszynski et al. (1988, Blood, 72: 109-115))에 기재된 것과 같은 임의의 잘 알려진 모노클로날 항체 제조 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 화학 합성 기술을 이용하여 목적하는 펩티드의 양을 합성할 수도 있다. 또는, 다량의 펩티드 생성에 적합한 세포에서 적절한 프로모터 서열로부터 목적하는 펩티드를 코딩하는 DNA를 클로닝 및 발현시킬 수 있다. 펩티드에 대하여 지시되는 모노클로날 항체는 본원에 인용된 표준 방법을 이용하여 펩티드로 면역화된 마우스로부터 생성시킨다.
본원에 기재된 방법을 이용하여 얻어진 모노클로날 항체를 코딩하는 핵산은, 당업계에서 이용할 수 있으며, 예를 들어 문헌 (Wright et al. (1992, Critical Rev. in Immunol. 12 (3,4): 125-168)) 및 이 문헌에 인용된 참고문헌에 기재된 기술을 이용하여 클로닝하고 서열화할 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 문헌(Wright et al., (supra)), 이 문헌에 인용된 참고문헌, 및 문헌 (Gu et al. (1997, Thrombosis and Hematocyst 77 (4): 755-759))에 기재된 기술을 이용하여 "인간화"할 수 있다.
파아지 항체 라이브러리를 생성시키기 위해, 파아지 표면상에 발현되는 목적하는 단백질, 예를 들어 목적하는 항체를 발현시키는 세포, 예를 들어 하이브리도마로부터 단리된 mRNA로부터 cDNA 라이브러리를 먼저 얻는다. 역전사효소를 사용하여 mRNA의 cDNA 카피를 생성시켰다. 이뮤노글로불린 단편을 지정하는 cDNA를 PCR에 의해 얻고, 생성된 DNA를 적합한 박테리오파아지 벡터에 클로닝하여, 이뮤노글로불린 유전자를 지정하는 DNA를 포함하는 박테리오파아지 DNA 라이브러리를 생성시킨다. 이종 DNA를 포함하는 박테리오파아지 라이브러리를 제조하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 문헌 (Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY))에 기재되어 있다.
목적하는 항체를 코딩하는 박테리오파아지는, 이 단백질이 파아지 표면상에 나타나서 그의 상응하는 결합 단백질, 예를 들어 항체가 지시되는 항원에 결합할 수 있도록 조작할 수 있다. 따라서, 특정 항체를 발현시키는 박테리오파아지를, 상응하는 항원을 발현시키는 세포의 존재하에 인큐베이션하는 경우, 박테리오파아지는 세포에 결합할 것이다. 항체를 발현시키지 않는 박테리오파아지는 세포에 결합하지 않을 것이다. 이러한 패닝 (panning) 기술은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 문헌 (Wright et al., (supra))에 기재되어 있다.
M13 박테리오파아지 디스플레이 (Burton et al., 1994, Adv. Immunol. 57:191-280)를 이용하여 인간 항체를 생산하기 위해 상기 기재된 것과 같은 방법을 개발하였다. 본질적으로, 항체-생산 세포 집단으로부터 얻어진 mRNA로부터 cDNA 라이브러리를 생성시킨다. 이 mRNA는 재배열된 이뮤노글로불린 유전자를 코딩하며, 따라서 cDNA는 같은 것을 코딩한다. 증폭된 cDNA를 M13 발현 벡터내에 클로닝하여 인간 Fab 단편을 표면상에 발현시키는 파아지 라이브러리를 생성시킨다. 대상 항체를 나타내는 파아지는 항원 결합에 의해 선택되며, 이를 박테리아에서 증식시켜 가용성 인간 Fab 이뮤노글로불린을 제조한다. 따라서, 통상의 모노클로날 항체 합성과는 다르게, 이 방법은 인간 이뮤노글로불린을 발현시키는 세포보다는 인간 이뮤노글로불린을 코딩하는 DNA를 불멸화한다.
제시된 방법은 항체 분자의 Fab 부위를 코딩하는 파아지의 생성에 대하여 기술한다. 그러나, 본 발명이 Fab 항체를 코딩하는 파아지를 생성시키는 것만으로 한정되는 것으로 생각해서는 안된다. 오히려, 단쇄 항체 (scFV/파아지 항체 라이브러리)를 코딩하는 파아지가 또한 본 발명에 포함된다. Fab 분자들은 전체 Ig 경쇄를 포함하는데, 즉 이들은 경쇄의 가변 및 불변 영역을 모두 포함하지만, 중쇄의 가변 영역 및 제1 불변 영역 도메인 (CH1)만을 포함한다. 단쇄 항체 분자는 Ig Fv 단편을 포함하는 단백질의 단쇄를 포함한다. Ig Fv 단편은 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역만을 포함하며, 항체에 포함된 불변 영역을 포함하지는 않는다. scFv DNA를 포함하는 파아지 라이브러리는 문헌 (Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222: 581-597)에 기재된 방법에 따라 생성시킬 수 있다. 목적하는 항체의 단리를 위해 생성시킨 파아지의 패닝은 Fab DNA를 포함하는 파아지 라이브러리에 대하여기재된 것과 유사한 방식으로 수행한다.
본 발명은 또한 중쇄 및 경쇄 가변 영역이 거의 모든 가능한 특성을 포함하도록 합성될 수 있는 합성 파아지 디스플레이 라이브러리를 포함하는 것으로 이해해야 한다 (Barbas, 1995, Nature Medicine 1: 837-839; de Kruif et al. 1995, J. Mol. Biol. 248: 97-105).
본 발명은 FGF23의 돌연변이체 형태를 추가로 포함한다. 즉, 본 발명은 FGF23의 돌연변이체 형태를 코딩하는 단리된 핵산뿐아니라 그에 의해 코딩되는 단백질을 포함한다. 본 발명은 FGF23 단백질의 생물학적 활성 또는 안정성에 영향을 주는 모든 돌연변이를 의미하는 것으로 이해해야 한다. 바람직하게는, 돌연변이는 저인산혈증 또는 고인산혈증 증상과 관련이 있으며, 이들 증상의 일부, 예를 들어 ADHR은 본원에 제공된 데이타에 의해 입증된 바와 같이 유전될 수 있다. 이 섹션의 실험 세부사항에 기재된 바와 같이, FGF23의 여러 돌연변이체 형태는 FGF23을 이 단백질의 자연 발생적인 야생형 형태보다 더 안정하게 만든다. 따라서, 이러한 안정한 형태의 FGF23은 증가된 혈청 포스페이트 수준의 결과로 인한 FGF23 관련 질환의 치료를 위한 치료 화합물로서 유용하다. 핵산이 프로모터/조절 요소에 작동가능하게 연결된 것을 비롯한 벡터, 및 더 안정한 형태의 FGF23을 코딩하는 핵산을 포함하는 세포가 또한 본 발명에 포함된다.
본원에 개시된 바와 같이, FGF23의 돌연변이는 FGF23 단백질의 증가된 안정성을 나타내는 것으로 확인되었다. R176Q, R179W 및 R179Q를 포함하지만 이에 한정되지 않는 돌연변이는 켄센서스 프로테아제 절단 부위를 제거하여 단백질 분해를억제함으로써 단백질의 안정성을 증가시키는 것으로 알려져 있다. FGF23의 이러한 돌연변이체 형태의 연장된 반감기는 고인산혈증 증상을 치료하는데 있어서 분명히 유리한데, 이는 효과적인 치료에 필요한 돌연변이체 FGF23의 투여 빈도가 천연 FGF23의 것보다 상당히 낮을 수 있기 때문이다. 위치 176 및 179의 아르기닌을 임의의 아미노산으로 치환하는 돌연변이가 또한 단백질 안정성을 증가시킨다. 본 발명이 본원에 예시된 돌연변이들만으로 한정되는 것으로 생각해서는 안된다. 이 섹션의 실험 세부사항에서는, 당업자가 FGF23 유전자의 다른 돌연변이를 확인할 수 있게 하는 적절한 교시가 제공되어 있으며, 여기서 돌연변이체 FGF23은 야생형 FGF23에 비해 증가된 안정성 등을 가질 수 있다.
본 발명은 포유동물의 세포 또는 체액에서 FGF23의 발현 및(또는) 활성을 조절할 수 있는 분자를 제공한다.
포유동물은 바람직하게는 인간이다.
본원에 사용된 FGF23의 "조절제"라는 용어는 FGF23의 생물학적 활성에 영항을 주는 화합물을 의미하며, 본원에 정의된 바와 같이, 이 활성은 조절제의 부재하에서의 FGF23의 활성과 비교해서 조절제의 존재하에서 더 높거나 더 낮다.
따라서, 조절제는 FGF23 발현 또는 활성의 억제제 또는 증가제일 수 있다. FGF23 발현을 억제하는 조절제로는 FGF23 코딩 핵산에 결합하고(하거나) 그를 절단하는 안티센스 분자 및 리보자임을 들 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명은 FGF23 단백질 분자를 감소시키거나 제거하는 작용을 하는 FGF23의 억제제를 제공한다. 이러한 억제제는 상기 설명한 바와 같이 안티센스 핵산 또는리보자임일 수 있다. 억제제는 문헌 (Elbashir et al., 2001, Nature, 411: 428-429; Carthew, 2001, Curr. Opin. Cell Biol., 13: 244-248)에 기재된 바와 같이 RNA 간섭에 의해 FGF23 mRNA의 수준을 감소시키는 작용을 하는 이중 가닥 RNA 분자일 수도 있다.
본 발명은 FGF23의 생물학적 활성을 억제하는 작용을 하는 FGF23 억제제, 예를 들어 FGF23과 그의 수용체의 상호작용을 차단시키는 분자 또는 FGF23 수용체의 활성화를 억제하는 분자를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 구체적인 예로는 FGF23 또는 그의 수용체에 결합하여 FGF23의 생물학적 활성을 억제하는 FGFR2, FGFR4 및 다른 FGF23 수용체, 항체, 펩티드 및 펩티드모방체가 포함되지만 이에 한정되지는 않는다. 따라서, 본 발명에는 임의의 유형의 FGF23 억제제가 포함되며, 이 억제제는 FGF23의 발현 또는 생물학적 활성을 억제시킨다.
당업자라면, 본원에 개시된 FGF23의 서열을 기초로, FGF23의 억제제로서 유용한 펩티드모방체 및 다른 소분자를 생성시킬 수 있다. 구체적으로, 펩티드모방체는 PCT/US93/01201에 기재된 기술을 이용하여 생성시킬 수 있다.
본원의 개시에 따르면 FGF23 발현의 조절제 또는 그의 생물학적 활성의 조절제를 확인하는 것은 비교적 간단한 문제이다. 예를 들어, 본래 FGF23을 발현시키거나, FGF23 코딩 핵산으로 형질감염된 다음 FGF23을 발현시키는 세포를 시험 화합물과 접촉시킬 수 있다. 이어서 시험 화합물의 존재 또는 부재하에 FGF23의 발현 수준을 측정하며, 이 때 시험 화합물의 부재하에서의 FGF23 발현 수준과 비교해서 시험 화합물의 존재하에 FGF23의 발현 수준이 더 높거나 더 낮은 것은 시험 화합물이 FGF23 발현의 조절제임을 나타낸다. 시험 화합물의 부재하에서의 FGF23의 발현 수준과 비교해서 시험 화합물의 존재하에서 FGF23의 수준이 증가하는 경우, 시험 화합물은 FGF23 발현의 증가제인 것으로 생각된다. 반대로, 시험 화합물의 부재하에서의 FGF23의 발현 수준과 비교해서 시험 화합물의 존재하에서 FGF23 발현의 수준이 감소되는 경우, 시험 화합물은 FGF23 발현의 억제제인 것으로 생각된다.
유사하게, FGF23의 생물학적 활성은 포유동물의 세포, 혈청 또는 소변에서 측정될 수 있다. 이러한 경우, 시험 화합물의 존재 또는 부재하에 세포에 의해 생산되는 FGF23의 생물학적 활성의 수준을 측정하며, 이 때 시험 화합물의 부재하에서의 FGF23의 활성 수준과 비교해서 시험 화합물의 존재하에 FGF23의 활성 수준이 더 높거나 더 낮은 것은 시험 화합물이 FGF23의 생물학적 활성의 조절제이라는 것을 나타낸다. FGF23의 활성 수준이 시험 화합물의 부재하에서의 FGF23의 활성 수준과 비교해서 시험 화합물의 존재하에 증가되는 경우, 시험 화합물은 FGF23의 생물학적 활성의 증가제인 것으로 고려된다. 반대로, FGF23의 활성 수준이 시험 화합물의 부재하에서의 FGF23의 활성 수준과 비교해서 시험 화합물의 존재하에 감소되는 경우, 시험 화합물은 FGF23의 생물학적 활성의 억제제인 것으로 고려된다.
FGF23의 발현은 RT-PCR 기술, RNAse 보호 및 노던 블롯팅 등과 같은 임의의 통상의 분자 생물학 기술을 이용하여 측정할 수 있다. 또는, 발현에 대한 영향은 FGF23 프로모터 서열을 적합한 리포터 유전자에 작동가능하게 연결시키고, 세포를 생성된 DNA 구조물로 형질감염시켜 측정할 수 있다. 시험 화합물에 대해 반응하는 프로모터 활성은 시험 화합물과 접촉하는 세포에서 리포터 유전자의 발현 수준을측정하고, 이러한 세포에서의 리포터 유전자의 발현 수준을 시험 화합물과 접촉하지 않은 세포와 비교하여 측정할 수 있다. 적합한 리포터 유전자로는 베타-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제 및 녹색 형광 단백질 등을 들 수 있지만 이들로 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 FGF23의 생물학적 활성을 갖는 단리된 폴리펩티드를 제조하는 방법을 제공하며, 본원에 기재된 바와 같이, FGF23을 코딩하는 벡터를 포함하는 숙주 세포를, 상기 단백질의 합성을 허용하는 조건하에서 배양한다. 이어서, 이 단백질을 배양된 세포 및(또는) 배양된 배지로부터 단리한다. 재조합적으로 생산된 단백질의 단리 및 정제는 예비 크로마토그래피, 및 FGF23과 특이적으로 결합하는 항체를 사용하는 친화성 크로마토그래피를 포함하는 친화성 및 면역학적 분리를 비롯한 통상의 방법에 의해 수행할 수 있다.
본 발명은 대상에서 저인산혈성 및 고인산활성 질환을 진단하는 방법을 제공한다. 본원에 제공된 한 예에서, 얻어진 데이타에 의해, ADHR을 앓는 대상이 FGF23에서 돌연변이를 가지며, FGF23은 ADHR의 검출을 위한 진단 도구로서 유용하다는 것을 알아내었다. 본원에 예시된 이 방법은 대상으로부터 얻어진 생물학적 샘플을, FGF23 (또는 FGF23에서의 돌연변이), 즉 이 단백질을 코딩하는 핵산 또는 이 단백질 자체를 검출하는 시약과 접촉시키는 것을 포함한다. 샘플에서 FGF23의 검출 또는 FGF23의 검출의 부재로 FGF23 관련된 저인산혈증 및 고인산혈증 증상을 진단한다.
대상으로부터 얻어진 생물학적 샘플은 FGF23 핵산 또는 단백질이 검출될 수있는 임의의 체액 또는 조직일 수 있다. 바람직하게는, 샘플은 혈액 또는 소변이다. 그러나, 본 발명이 대상으로부터 얻어진 어떤 특정한 생물학적 샘플에 한정되는 것으로 생각해서는 안된다.
FGF23 핵산의 검출을 위한 바람직한 시약으로는 FGF23을 코딩하는 핵산에 상보적인 핵산을 들 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. FGF23 단백질의 검출에 바람직한 시약으로는 항체가 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 시약은 FGF23 핵산 또는 단백질의 검출을 촉진시키기 위해서는 표지되는 것이 더 바람직하다. 당업자라면, 본원의 개시를 기초로, 방사성동위원소, 생물발광 화합물, 화학발광 화합물, 형광 화합물, 금속 킬레이트 또는 효소를 비롯한 여러 적합한 표지를 사용하여 FGF23 검출용 시약을 표지할 수 있음을 알 것이다.
또한, 본 발명에는 저인산혈증 증상에 대한 혈청, 혈장 또는 기타 혈액 분석뿐 아니라, 소변 또는 다른 체액에 대한 분석도 포함된다. 이러한 분석을 이용하여 상기 나열된 저인산혈성 질환을 앓는 대상을 진단할 수 있다. FGF23 분석은 FGF23뿐 아니라, FGF23의 일부에 상응하는 특정 펩티드를 측정하기 위해 설계된 경쟁적 분석이다. 이 분석은 각 반응 혼합물에서 FGF23 펩티드에 대해 특이적인 제한된 양의 항체에 결합하는 표지된125I-FGF23 펩티드와 비표지된 펩티드 (FGF23을 포함하는 체액의 표준량 또는 미지의 양)의 경쟁을 기초로 한다. 반응에서 표준량 또는 미지의 양이 증가함에 따라, 펩티드에 결합할 수 있는125I-FGF23 펩티드의 양은 감소된다.125I-FGF23 펩티드의 양을, 표준 반응 혼합물 중 비표지된 FGF23 펩티드의 농도 함수로 측정하여, 표준 그래프를 작성하고, 이로부터 체액 중 FGF23의 농도를 결정할 수 있다.
상기 기술한 경쟁 분석을 설계하여 대상의 생물학적 샘플에 존재하는 FGF23의 수준을 정량한다. 주어진 대상의 샘플 중 FGF23 폴리펩티드의 수준을 포스페이트 질환에 걸리지 않은 것으로 알려진 대상의 수준과 비교하여, FGF23의 수준이 증가된 것에 의해 주어진 대상이 저인산혈성 질환에 걸렸음을 알 수 있다. 이 분석은 이용가능한 유전적 진단 수단이 없는 질환을 비롯하여 많은 저인산혈성 질환에 유용할 수 있다. 이러한 분석이 유용할 수 있는 저인산혈성 질환으로는 XLH, HHRH, HBD, ADHR, 종양 유도성 골연화증, 표피 모반 증후군, 섬유성 이형성증 및 신결석증을 들 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 바와 같이, ADHR에 걸린 환자는 FGF23 단백질의 분해를 억제하는 돌연변이로 인해 증가된 수준의 FGF23을 가질 것이다.
또한 본 발명은 대상에서 종양 유도성 골연화증을 진단하는 방법을 포함하며, 본원에 개시된 바와 같이, 대상의 종양 샘플에서 FGF23의 존재에 의해 이 질환을 알 수 있다. 대상으로부터 제거된 종양 샘플은, RT-PCR, 노던 블롯 분석 및 RNase 보호 분석을 포함하지만 이에 한정되지 않는, FGF23을 검출하기 위해 설계된 다양한 방법으로 처리할 수 있다. 따라서, 종양 유도성 골연화증의 임상적 증상을 나타내는 대상은 이러한 FGF-23 기초 방법을 이용하여 보다 명확하게 진단할 수 있다.
본 발명은 저인산혈성 질환에 걸린 동물을 치료하는 방법을 제공하며, 이 방법에서 FGF23의 발현 및(또는) 생물학적 활성을 감소시키는 치료 유효량의 시약을 상기 포유동물에게 투여한다. 치료될 수 있는 저인산혈성 질환으로는 X-연관 저인산혈성 구루병 (XLH), 고칼슘뇨증을 동반하는 유전성 저인산혈성 구루병 (HHRH), 저인산혈성 골 질환 (HBD), 상염색체 우성 저인산혈성 구루병 (ADHR), 종양 유도성 골연화증 (TIO), 또는 종양발생성 저인산혈성 골연화증 (OHO), 표피 모반 증후군, 섬유성 이형성증 및 신결석증 등을 들 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다. 본원에 개시된 바와 같이, 저인산혈성 질환은 FGF23의 과다발현, FGF23을 분해하는 효소의 돌연변이 또는 다른 억제, 또는 단백질 안정성을 증가시키는 FGF23 돌연변이를 특징으로 하며, 이들 모두는 혈청 포스페이트 수준의 감소에 의해 수반되는 포스페이트 소모를 증가시킨다. 따라서, FGF23의 발현 및(또는) 생물학적 활성을 감소시키는 시약은 저인산혈성 환자에서 정상적인 포스페이트 항상성을 회복시킬 것이다. FGF23의 발현을 감소시키는 시약의 예로는 안티센스 핵산 및 리보자임이 포함되지만 이들로 한정되는 것은 아니다. FGF23의 생물학적 활성을 감소시키는 시약의 예로는 FGF23과 그의 수용체 사이의 상호작용을 차단시키는 항체 및 다른 소분자를 들 수 있지만 이들로 한정되는 것은 아니다.
또한 본 발명은 포유동물에서 고인산혈성 질환을 치료하는 방법을 제공하며, 이 방법에서 FGF23, 즉 핵산 또는 그에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는 FGF23 폴리펩티드의 수준을 증가시키는 시약을 치료 유효량으로 포유동물에게 투여한다. FGF23 폴리펩티드의 수준을 증가시키는 시약의 예로는 프로테아제 억제제가 있다. 본원에 제공된 실시예에 기재된 바와 같이, FGF23은 SPC 프로테아제에 의해 분해되고, FGF23의 SPC 절단의 억제는 그의 반감기를 연장시켜 FGF23을 더 높은 수준으로 나타낸다. 치료될 수 있는 고인산혈성 질환으로는 경증 신부전증 및 종양성 석회증 등에 걸린 대상이 포함되지만 이들로 한정되는 것은 아니다. 고인산혈증 환자에서 혈청 포스페이트 수준의 증가는 FGF23, 또는 FGF23의 수준을 증가시키는 시약을 투여하여 극복할 수 있으며, 이들 모두는 포스페이트 소모를 자극하여 혈청 포스페이트 수준을 감소시킨다. FGF23은 표준 유전자 치료 방법에 의해 투여하는 것 뿐 아니라, 정맥내, 피하 및 근육내 주사를 포함하지만 이에 한정되지 않는 방법에 의해 FGF23 폴리펩티드를 직접 주사하여 투여할 수 있다. 본 발명은 천연 FGF23을 투여하는 것 뿐 아니라, 본원에 개시된, FGF23 단백질의 안정성을 증가시키는 작용을 하는 돌연변이체를 포함하지만 이에 한정되지 않는 FGF23의 돌연변이체 형태를 투여하는 것도 포함하는 것으로 생각해야 한다.
또한 본 발명은 FGF23을 발현시키는 세포 집단을 치료 유효량 사용하여 고인산혈성 질환을 치료하는 방법을 포함한다. 이 방법은 본원에 나타낸 바와 같이 FGF23이 분비 단백질이기 때문에 FGF23을 투여하는 효과적인 방법일 수 있다. 또한 본 발명에는 이러한 목적을 위해 FGF2 폴리펩티드의 돌연변이체 형태를 발현시키는 세포를 투여하는 것이 포함된다. 바람직한 돌연변이로는 본원에 개시된 돌연변이와 같은, FGF23 폴리펩티드에 대하여 증가된 안정성을 부여하는 것들이 포함된다.
본 발명은 포유동물의 골다공증을 치료하는 방법을 추가로 제공하며, 이 방법에서 FGF23, 또는 FGF23의 발현을 증가시키는 시약을 치료 유효량으로 포유동물에게 투여한다. 저인산혈성 질환인 XLH에 걸린 환자는 이 질환이 없는 환자에 비해 덜 빈번한 골절로도 고통을 받는다 (Econs et. al., 1994, Bone and Min., 24: 17-24). FGF23, 또는 FGF23의 수준을 증가시키는 시약을 투여하는 것은 일시적인 저인산혈증을 나타내며, 골 밀도 및 강도에 대하여 수반하는 영향을 준다. 따라서, FGF23은 포스페이트 항상성을 조절하는 역할 이외에도 생체내에서 골경화 작용을 할 수 있다. 이들로 한정하고자 하는 것은 아니지만, 저인산혈증이 골 질량의 증가를 초래하는 기전은 1,25-디히드록시 비타민 D를 포함할 수 있다. 구체적으로, FGF23 (또는 돌연변이체 FGF23) 또는 FGF23의 발현을 증가시키는 시약을 간헐적으로 투여하는 것은 포스페이트 재흡수를 일시적으로 감소시킬 수 있으며, 즉 이 반응은 포스페이트 재흡수 증가를 자극하며, 다양한 골 질환에 효과적인 치료제인 1,25-디히드록시 비타민 D의 생성 증가를 자극한다.
본 발명은 포유동물의 동맥 또는 연조직내 칼슘 및 포스페이트의 침착을 포함하는 증상을 치료하는 방법을 추가로 제공하며, 이 방법에서는 하기 설명된 바와 같이 FGF23 (또는 돌연변이체 FGF23), 또는 FGF23의 발현을 증가시키는 시약을 치료 유효량으로 포유동물에 투여한다. 혈청 포스페이트 수준의 증가로 인해, 경증 신부전증을 앓는 환자는 통상적으로 그의 관상동맥 및 다른 동맥에서 칼슘 및 인의 침착을 나타낸다. 관상동맥 질환으로 언급되는 동맥 벽내의 칼슘 및 포스페이트의 침착은 이러한 동맥을 통해 혈액 흐름을 감소시켜 심근 경색을 유발할 수 있다. 따라서, 관상동맥 질환을 치료하는 것은 심근 경색의 발병 위험을 감소시킨다.
FGF23, 또는 FGF23의 수준을 증가시키는 시약은 혈청 포스페이트 수준을 감소시키며, 따라서 고인산혈증 환자를 촉진된 심혈관계 및 관상동맥 질환으로부터 보호할 것이다. FGF23을 코딩하는 핵산은 유전자 치료법을 포함하지만 이에 한정되지 않는 방법에 의해 관상동맥 세포에 전달할 수 있다. 또한, 조직 특이적 프로모터를 사용하여 혈관 평활근 세포 또는 내피 세포에서 FGF23의 선택적 발현을 촉진시킬 수 있다.
유사하게, FGF23, 또는 FGF23의 수준을 증가시키는 시약은 피부근염 및 종양성 석회증을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 연조직내 칼슘 및 포스페이트의 침착을 포함하는 다른 증상을 치료하는데 있어서 유용할 수 있다. 종양성 석회증은 신장 포스페이트 재흡수 증가 및 1,25-디히드록시 비타민 D의 농도 증가를 특징으로 하는 질환이다. 그 결과, 대상들은 칼슘 및 포스페이트가 침착되는 것으로 인해 연조직이 석회화되는 것으로 나타났다. 임의의 수단을 이용하여 천연 또는 돌연변이체 FGF23을 연조직에 투여하는 것은 생화학적 결함을 반전시킬 것이다.
본 발명은 화합물, 예를 들어 FGF23을 코딩하는 핵산, FGF23과 특이적으로 결합하는 항체, FGF23을 코딩하는 핵산에 상보적이며 전사에 있어서 안티센스 방향으로 존재하는 핵산, 및(또는) 본 발명의 조성물, 어플리케이터 (applicator), 및 상기 화합물을 사용하여 본 발명의 방법을 수행하는 것을 설명한 지침을 포함하는 다양한 키트를 포함한다. 예시적인 키트가 하기에 설명되어 있음에도 불구하고, 다른 유용한 기트도 본원의 개시에 비추어 볼 때 당업자에게는 분명할 것이다. 이러한 각각의 키트가 본 발명에 포함된다.
한 측면으로, 본 발명은 FGF23의 이상 발현에 의해 매개되는 질환을 완화시키는 키트를 포함한다. 이 키트는 본 발명에 개시된 방법에 따라 사용된다. 요컨대, 이 키트를 사용하여 세포를, FGF23을 코딩하는 핵산에 상보적인 핵산 (여기서, 핵산은 안티센스 방향으로 존재하여 FGF23의 발현을 감소시킴) 또는 FGF23과 특이적으로 결합하는 항체 (여기서, FGF23의 감소된 발현, 양 또는 활성은 유익한 효과를 매개함)와 접촉시킬 수 있다. 또한, 이 키트는 어플리케이터, 및 키트의 사용을 위한 지침을 포함한다. 이 지침은 본원에 제공된 예를 간략하게 구현한다.
이 키트는 제약상 허용되는 담체를 포함한다. 조성물은 본원에 기재된 적합한 양으로 제공된다. 또한, 투여 경로 및 투여 빈도는 본원에서 앞서 기재된 것과 같다.
당업자라면, 본원에 제공된 개시를 기초로, FGF23의 수준을 감소시키기 위해 리보자임, 안티센스 조성물, 및 FGF23과 특이적으로 결합하는 항체 등을 포함하는 키트가 본 발명에 포함된다는 것을 알 것이다.
또한, 본 발명은 포유동물 FGF23을 코딩하는 핵산을 포함하는 키트를 포함한다. 이러한 키트는 FGF23의 증가가 요구되는 본 발명의 방법에 따라 사용할 수 있다. 즉, 질병, 질환 또는 증상이 FGF23의 정상적인 비-질환 수준과 비교해서 FGF23 수준의 감소와 관련되거나 그에 의해서 매개되는 경우, 본원에 개시된 교시에 따라 키트를 사용하여 FGF23을, FGF23의 수준이 다른 동일한 정상 (즉, 병에 걸리지 않은) 세포의 FGF23 수준 미만인 세포, 및(또는) 이러한 세포를 포함하는 동물에게 제공할 수 있다. 비-돌연변이체 형태보다 더 안정한, 본원에 개시된 바와 같은 FGF23의 돌연변이체 형태가 이러한 키트에 특히 유용하다.
제약 조성물
본 발명은 또한 본 발명의 방법을 실시하기 위한 적절한 FGF23 조절제의 제약 조성물, 즉 적절한 FGF23 조절제 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "제약상 허용되는 담체"는 적절한 FGF23 조절제가 배합될 수 있는 화학 조성물을 의미하며, 이 조합에 따라 사용하여 적절한 FGF23 조절제를 포유동물에게 투여할 수 있다.
본 발명의 실시에 유용한 제약 조성물을 1 ng/kg/일 내지 100 mg/kg/일의 투여량으로 투여하여 전달할 수 있다.
본 발명의 방법에 유용한 제약 조성물은 경구 고형 제제, 에어로졸, 국소 또는 기타 유사한 제제로 전신에 투여할 수 있다. 이러한 제약 조성물은 적절한 FGF23 조절제 이외에도 제약상 허용되는 담체, 및 약물 투여를 증가 및 촉진시키는 것으로 알려진 다른 성분을 포함할 수 있다. 다른 가능한 제제, 예를 들어 나노입자, 리포좀, 리실링된 (resealed) 적혈구, 및 면역학적 기초 시스템을 사용하여 본 발명의 방법에 따라 적절한 FGF23 조절제를 투여할 수 있다.
본원에 기재된 방법들 중 어느 것을 이용하여 확인되는 화합물을 제제화하여, 하기에서 설명될 본원에 개시된 질환의 치료를 위해 포유동물에게 투여할 수 있다.
본 발명은 본원에 개시된 질병의 치료에 유용한 화합물을 활성 성분으로 포함하는 제약 조성물의 제조 및 용도를 포함한다. 이러한 제약 조성물은 대상에게투여하기에 적합한 형태의 활성 성분 단독으로 구성되거나, 또는 활성 성분 및 1종 이상의 제약상 허용되는 담체, 1종 이상의 추가의 성분, 또는 이들의 어떤 조합을 포함할 수 있다. 활성 성분은 당업계에 잘 알려져 있는 바와 같이 제약 조성물 중에서 생리학적으로 허용되는 에스테르 또는 염의 형태로, 예를 들어 생리학적으로 허용되는 양이온 또는 음이온과 결합하여 존재할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "제약상 허용되는 담체"라는 용어는 활성 성분이 배합될 수 있는 화학 조성물을 의미하며, 이러한 조합에 따라 활성 성분을 대상에게 투여할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "생리학적으로 허용되는" 에스테르 또는 염이라는 용어는 조성물이 투여되는 대상에게 유해하지 않은, 제약 조성물의 임의의 다른 성분들과 혼화성인 활성 성분의 에스테르 또는 염 형태를 의미한다.
본원에 기재된 제약 조성물의 제제는 제약 분야에 공지되거나 향후 개발될 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 이러한 제조 방법은 활성 성분을 담체 또는 1종 이상의 다른 부가 성분들과 혼합하는 단계, 및 필요하거나 바람직한 경우 생성물을 바람직한 단일- 도는 다중-투여 단위로 성형 또는 포장하는 단계를 포함한다.
본원에 제공된 제약 조성물의 기재가 원칙적으로 처방에 따라 인간에게 투여하기에 적합한 제약 조성물에 관한 것임에도 불구하고, 당업자라면 이러한 조성물이 일반적으로 모든 종류의 동물에게 투여하기에 적합하다는 것을 알 것이다. 인간에게 투여하기에 적합한 제약 조성물을, 다양한 동물에게 투여하기에 적합하도록만들기 위해 개질하는 것은 잘 알려져 있으며, 통상의 기술을 가진 수의 약리학자라면 통상의 실험만으로도 이러한 변형을 설계하고 수행할 수 있을 것이다. 본 발명의 제약 조성물의 투여가 고려되는 대상으로는 인간 및 다른 영장류, 및 기타 포유동물이 포함되지만 이들로 한정되지는 않는다.
본 발명의 방법에 유용한 제약 조성물은 경구, 비경구, 폐, 비내, 구강, 또는 다른 투여 경로에 적합한 제제로 제조, 포장 또는 판매될 수 있다. 기타 고려되는 제제로는 사출 나노입자, 리포좀 제제, 활성 성분을 포함하는 리실링된 적혈구, 및 면역학적-기초의 제제를 들 수 있다.
본 발명의 제약 조성물은 단일 단위 투여 또는 다수개의 단일 단위 투여로서 대량으로 제조, 포장 또는 판매될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "단위 투여"란 소정량의 활성 성분을 포함하는 제약 조성물의 분리된 양이다. 활성 성분의 양은 일반적으로 대상에게 투여되는 활성 성분의 투여량, 또는 예를 들어 이러한 투여량의 1/2 또는 1/3과 같은 편리한 분량에 해당한다.
본 발명의 제약 조성물 중 활성 성분, 제약상 허용되는 담체 및 임의의 추가 성분의 상대적인 양은 치료될 대상의 실체, 사이즈 및 상태에 따라 달라지며, 조성물이 투여되는 투여 경로에 따라 추가로 달라질 것이다. 예를 들어, 조성물은 활성 성분을 0.1％ 내지 100％ (w/w) 포함할 수 있다.
본 발명의 제약 조성물은 활성 성분 이외에도 1종 이상의 추가의 제약상 활성 물질을 더 포함할 수 있다. 특히 고려되는 추가의 물질로는 진토제 및 스캐빈저, 예를 들어 시아니드 및 시아네이트 스캐빈저를 들 수 있다.
본 발명의 제약 조성물의 조절- 또는 지속-방출성 제제는 통상의 기술을 이용하여 제조할 수 있다.
경구 투여에 적합한 본 발명의 제약 조성물의 제제는 소정량의 활성 성분을 포함하는 정제, 경질 또는 연질 캡슐, 카세제, 트로키 또는 로젠지를 포함하지만 이에 한정되지 않는 개별 고형 투여 단위 형태로 제조, 포장 또는 판매될 수 있다. 경구 투여에 적합한 다른 제제로는 분말 또는 과립 제제, 수성 또는 오일 현탁액, 수성 또는 오일 용액, 또는 에멀젼이 포함되지만 이에 한정되지는 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, "오일성" 액체는 탄소 함유 액체 분자를 포함하며 물보다 극성 특징을 적게 나타내는 것이다.
활성 성분을 포함하는 정제는, 예를 들어 활성 성분을 임의로 1종 이상의 다른 성분과 압착 또는 성형하여 제조할 수 있다. 압착된 정제는 적합한 장치에서 활성 성분을 임의로 1종 이상의 결합제, 윤활제, 부형제, 표면 활성제 및 분산제와 함께 혼합시킨 자유-유동 형태, 예를 들어 분말 또는 과립 제제로 압착시켜 제조할 수 있다. 성형 정제는 적합한 장치에서 활성 성분, 제약상 허용되는 담체, 및 적어도 혼합물을 습윤화하기에는 충분한 양의 액체의 혼합물을 성형하여 제조할 수 있다. 정제의 제조에 사용되는 제약상 허용되는 부형제로는 불활성 희석제, 과립화제 및 붕해제, 결합제, 및 윤활제를 들 수 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 공지된 분산제로는 감자 전분 및 소듐 스타치 글리콜레이트를 들 수 있지만 이들로 한정되지는 않는다. 공지된 표면활성제로는 소듐 라우릴 술페이트가 포함되지만 이것으로 한정되지는 않는다. 공지된 희석제로는 탄산칼슘, 탄산나트륨,락토스, 미세결정질 셀룰로스, 인산칼슘, 인산수소칼슘 및 인산나트륨이 포함되지만 이들로 한정되는 것은 아니다. 공지된 과립화제 및 붕해제로는 옥수수 전분 및 알긴산을 들 수 있지만 이들로 한정되지는 않는다. 공지된 결합제로는 젤라틴, 아카시아, 예비-젤라틴화 옥수수 전분, 폴리비닐피롤리돈 및 히드록시프로필 메틸셀룰로스가 포함되지만 이에 한정되지는 않는다. 공지된 윤활제로는 스테아르산마그네슘, 스테아르산, 실리카 및 탈크가 포함되지만 이들로 한정되지는 않는다.
정제를 코딩하지 않거나 또는 공지된 방법으로 코딩하여 대상의 위장관에서 지연된 붕해를 달성함으로써 활성 성분의 지속적인 방출 및 흡수를 제공할 수 있다. 예를 들어, 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트와 같은 물질을 사용하여 정제를 코팅할 수 있다. 다른 예로는, 미국 특허 제4,256,108호; 동 제4,160,452호; 및 동 제4,265,874호에 기재된 방법으로 정제를 코딩하여 삼투적으로 조절된 방출 정제를 제조할 수 있다. 약제학적으로 보기 좋으며 입에 잘 맞는 제제를 제공하기 위해, 정제에 감미제, 향미제, 착색제, 보존제, 또는 이들의 여러 조합을 추가로 포함시킬 수 있다.
활성 성분을 포함하는 경질 캡슐은 예를 들어 젤라틴과 같은 생리학적으로 분해가능한 조성물을 사용하여 제조할 수 있다. 이러한 경질 캡슐은 활성 성분을 포함하며, 예를 들어 불활성 고형 희석제, 예컨대 탄산칼슘, 인산칼슘, 또는 카올린을 비롯한 추가의 성분을 더 포함할 수 있다.
활성 성분을 포함하는 연질 젤라틴 캡슐은 예를 들어 젤라틴과 같은 생리학적으로 분해가능한 조성물을 사용하여 제조할 수 있다. 이러한 연질 캡슐은 물 또는 오일 매질, 예를 들어 땅콩 오일, 액상 파라핀 또는 올리브 오일과 함께 혼합될 수 있는 활성 성분을 포함한다.
경구 투여에 적합한 본 발명의 제약 조성물의 액상 제제는 액체 형태, 또는 사용에 앞서 물 또는 다른 적합한 비히클로 재구성해야 하는 건조 생성물 형태로 제조, 포장 및 판매될 수 있다.
통상의 방법을 이용하여 액체 현탁액을 제조하여 수성 또는 오일 비히클 중 활성 성분의 현탁액을 얻을 수 있다. 수성 비히클로는 예를 들어 물 및 등장성 염수가 포함된다. 오일 비히클로는 예를 들어 아몬드 오일, 오일 에스테르, 에틸 알콜, 식물성 오일, 예를 들어 아라키스, 올리브, 세삼, 또는 코코넛 오일, 분류된 식물성 오일, 및 미네랄 오일, 예를 들어 액상 파라핀을 들 수 있다. 액체 현탁액은 현탁제, 분산제 또는 습윤제, 유화제, 진통제, 보존제, 완충제, 염, 향미제, 착색제 및 감미제를 포함하지만 이에 한정되지 않는 1종 이상의 추가의 성분을 더 포함할 것이다. 오일 현탁액은 증점제를 추가로 포함할 수 있다. 공지된 현탁제로는 소르비톨, 시럽, 수소화 식용 지방, 알긴산나트륨, 폴리비닐피롤리돈, 트라가칸쓰 검, 아카시아 검, 및 셀룰로스 유도체, 예를 들어 소듐 카르복시메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 히드록시프로필메틸셀룰로스를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 공지된 분산제 또는 습윤제로는 자연 발생적인 포스파티드, 예를 들어 레시틴; 알킬렌 옥시드와, 지방산, 장쇄 지방족 알콜, 지방산 및 헥시톨로부터 유도된 부분 에스테르, 또는 지방산 및 헥시톨 무수물로부터 유도된 부분 에스테르와의 축합 생성물 (예를 들어, 각각 폴리옥시에틸렌 스테아레이트, 헵타데카에틸렌옥시세탄올,폴리옥시에틸렌 소르비톨 모노올레에이트, 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트)을 들 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 공지된 유화제로는 레시틴 및 아카시아가 포함되지만 이들로 한정되지는 않는다. 공지된 보존제로는 메틸, 에틸, 또는 n-프로필-파라히드록시벤조에이트, 아스코르브산 및 소르브산을 들 수 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 공지된 감미제로는 예를 들어 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 소르비톨, 수크로스 및 사카린이 포함된다. 오일 현탁액을 위한 공지된 증점제로는 예를 들어 밀랍, 경화 파라핀 및 세틸 알콜을 들 수 있다.
수성 또는 오일 용매 중 활성 성분의 액체 용액은 액상 현탁액과 실질적으로 동일한 방식으로 제조할 수 있으며, 주요한 차이는 활성 성분이 용매 중에 현탁되기보다는 용해된다는 것이다. 본 발명의 제약 조성물의 액체 용액은 액체 현탁액에 대하여 기재된 성분들 각각을 포함할 수 있으며, 현탁제는 용매 중 활성 성분의 용해를 반드시 보조하지는 않는 것으로 이해된다. 수성 용매로는 예를 들어 물 및 등장성 염수가 포함된다. 오일 용매로는 예를 들어 아몬드 오일, 오일 에스테르, 에틸 알콜, 식물성 오일, 예를 들어 아라키스, 올리브, 세삼 또는 코코넛 오일, 분류된 식물성 오일, 및 미네랄 오일, 예를 들어 액상 파라핀을 들 수 있다.
본 발명의 제약 제제의 분말 및 과립 제제는 공지된 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 이러한 제제는 대상에게 직접 투여될 수 있으며, 예를 들어 정제를 제조하거나, 캡슐을 충전하거나, 또는 수성 또는 오일 비히클을 가하여 수성 또는 오일 현탁액 또는 용액을 제조하는데 사용될 수 있다. 이러한 제제 각각은 1종 이상의 분산제 또는 습윤제, 현탁제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 제제 중에는 또한 추가의 부형제, 예를 들어 충전제 및 감미제, 향미제 또는 착색제를 포함시킬 수도 있다.
또한 본 발명의 제약 조성물은 수중유 에멀젼 또는 유중수 에멀젼 형태로 제조, 포장 또는 판매할 수도 있다. 오일상은 식물성 오일, 예를 들어 올리브 또는 아라키스 오일, 미네랄 오일, 예를 들어 액상 파라핀, 또는 이들의 조합일 수 있다. 이러한 조성물은 1종 이상의 유화제, 예를 들어 자연 발생적인 검, 예컨대 아카시아 검 또는 트라가칸쓰 검, 자연 발생적인 포스파티드, 예를 들어 대두 또는 레시틴 포스파티드, 지방산 및 헥시톨 무수물의 조합으로부터 유도된 에스테르 또는 부분 에스테르, 예를 들어 소르비탄 모노올레에이트, 및 이러한 부분 에스테르와 에틸렌 옥시드와의 축합 생성물, 예를 들어 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트를 추가로 포함할 수 있다. 또한 이러한 에멀젼은 예를 들어 감미제 또는 향미제를 비롯하여 추가의 성분들을 포함할 수도 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 제약 조성물의 "비경구 투여"는 대상 조직의 물리적인 침입을 특징으로 하는 임의의 투여 경로 및 조직내 침입을 통한 제약 조성물의 투여를 포함한다. 따라서 비경구 투여로는 제약 조성물의 주사, 외과적 절개를 통한 조성물의 적용, 및 조직을 통과하는 비수술적 상처를 통한 조성물의 적용 등에 의해 제약 조성물을 투여하는 것을 들 수 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 특히, 비경구 투여는 피하, 복강내, 근육내, 간내 (intrastemal) 주사, 및 신장 투석 주입 기술을 포함하지만 이에 한정되지는 않는 것으로 생각된다.
비경구 투여에 적합한 제약 조성물의 제제는 활성 성분을 제약상 허용되는담체, 예를 들어 무균수 또는 무균 등장성 염수와 함께 포함한다. 이러한 제제는 볼루스 투여 또는 지속 투여에 적합한 형태로 제조, 포장 또는 판매될 수 있다. 주사용 제제는 단위 투여 형태, 예를 들어 보존제를 포함하는 앰플 또는 다중-투여 용기로 제조, 포장 또는 판매될 수 있다. 비경구 투여용 제제로는 현탁액제, 용액제, 오일 또는 수성 비히클 중 에멀젼제, 페이스트, 및 이식가능한 지속-방출형 또는 생분해성 제제를 들 수 있지만 이들로 한정되지는 않는다. 이러한 제제는 현탁제, 안정화제 또는 분산제를 포함하지만 이에 한정되지 않는 1종 이상의 추가의 성분을 더 포함할 수 있다. 비경구 투여용 제제의 한 실시양태에서, 활성 성분은 적합한 비히클 (예, 발열물질-무함유 무균수)로 재구성한 다음, 재구성된 조성물을 비경구 투여하기 위한 건조 (즉, 분말 또는 과립) 형태로 제공된다.
제약 조성물은 무균 주사용 수성 또는 오일 현탁액 또는 용액 형태로 제조, 포장 또는 판매될 수 있다. 이러한 현탁액 또는 용액은 공지된 기술에 따라 제제화할 수 있으며, 활성 성분 이외에 본원에 기재된 분산제, 습윤제 또는 현탁제와 같은 추가의 성분을 포함할 수 있다. 이러한 무균 주사용 제제는 비독성의 비경구-허용가능한 희석제 또는 용매, 예를 들어 물 또는 1,3-부탄디올을 사용하여 제조할 수 있다. 기타 허용되는 희석제 및 용매로는 링거 (Ringer's) 용액, 등장성 염화나트륨 용액, 및 비휘발성 오일, 예를 들어 합성 모노- 또는 디-글리세리드를 들 수 있지만 이들로 한정되는 것은 아니다. 유용한 다른 비경구-투여가능한 제제로는 활성 성분을 미세결정질 형태로, 리포좀 제제 중, 또는 생분해성 중합체 시스템의 성분으로 포함하는 것을 들 수 있다. 지속 방출형 또는 이식용 조성물은제약상 허용되는 중합성 또는 소수성 물질, 예를 들어 에멀젼, 이온 교환 수지, 저 용해성 중합체 또는 저 용해성 염을 포함할 수 있다.
본 발명의 제약 조성물은 구강을 통한 폐 투여에 적합한 제제로서 제조, 포장 또는 판매될 수 있다. 이러한 제제는 활성 성분을 포함하며 약 0.5 내지 약 7 나노미터, 바람직하게는 약 1 내지 약 6 나노미터의 직경을 갖는 건조 입자를 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 편리하게는 건조 분말 형태이며, 분말을 분산시키기 위해 추진제 스트림이 지시될 수 있는 건조 분말 용기를 포함하는 장치, 또는 자가-추진 용매/분말-분배 용기, 예를 들어 실링된 용기에서 저-비점 추진제 중에 용해 또는 현탁된 활성 성분을 포함하는 장치를 사용하여 투여한다. 바람직하게는, 이러한 분말은 입자의 98％ (중량) 이상이 0.5 나노미터를 넘는 직경을 가지며, 입자의 95％ (수) 이상이 7 나노미터 미만의 미만의 직경을 갖는 입자를 포함한다. 보다 바람직하게는, 입자의 95％ (중량) 이상이 1 나노미터를 넘는 직경을 가지며, 입자의 90％ (수) 이상이 6 나노미터 미만의 직경을 갖는다. 건조 분말 조성물은 바람직하게는 고상 미세 분말 희석제, 예를 들어 슈가를 포함하며, 편리하게는 단위 투여 형태로 제공된다.
저비점 추진제는 일반적으로 대기압에서 65도 (℉) 미만의 비점을 갖는 액체 추진제를 포함한다. 일반적으로, 추진제는 조성물의 50 내지 99.9％ (w/w)를 구성할 수 있고, 활성 성분은 조성물의 0.1 내지 20％ (w/w)를 구성할 수 있다. 추진제는 추가의 성분, 예를 들어 액상 비이온성 또는 고상 음이온성 계면활성제 또는 고상 희석제 (바람직하게는, 활성 성분을 포함하는 입자와 동일한 정도의 입도를가짐)를 더 포함할 수 있다.
폐 전달을 위해 제제화된 본 발명의 제약 조성물은 또한 활성 성분을 용액 또는 현탁액의 액적 형태로 제공할 수도 있다. 이러한 제제는 임의로 활성 성분을 포함하는 무균의 수성 또는 희석 알콜 용액 또는 현탁액으로 제조, 포장 또는 판매될 수 있으며, 유리하게는 임의의 분무 (nebulization) 또는 분무 (atomization) 장치를 이용하여 투여될 수 있다. 이러한 제제는 향미제, 예를 들어 사카린 나트륨, 휘발성 오일, 완충제, 표면활성제, 또는 보존제, 예를 들어 메틸히드록시벤조에이트를 포함하지만 이에 한정되지 않는 1종 이상의 추가의 성분을 더 포함할 수 있다. 이러한 투여 경로에 의해 제공되는 액적은 바람직하게는 약 0.1 내지 약 200 나노미터 범위의 평균 입경을 갖는다.
폐 전달에 유용한 것으로 본원에 기재된 제제는 또한 본 발명의 제약 조성물의 비내 전달에 있어서도 유용하다.
비내 투여에 적합한 다른 제제는 활성 성분을 포함하며 약 0.2 내지 500 마이크로미터의 평균 입자를 갖는 조 분말이다. 이러한 제제는 비내 흡입, 즉 콧구멍 가까이에 위치시킨 분말 용기로부터 비내 경로를 통하여 빠르게 흡입하는 방식으로 투여된다.
비강 투여에 적합한 제제는 예를 들어 활성 성분을 대략 0.1％ (w/w)와 같이 적은 양으로부터 100％ (w/w)와 같이 많은 양으로 포함할 수 있으며, 본원에 기재된 1종 이상의 추가의 성분을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 제약 조성물은 구강 투여에 적합한 제제로 제조, 포장 또는 판매될 수 있다. 이러한 제제는 예를 들어 통상의 방법을 이용하여 만들어진 정제 또는 로젠지 형태일 수 있으며, 예를 들어 활성 성분 0.1 내지 20％ (w/w), 경구 용해성 또는 생분해성 조성물을 포함하는 밸런스, 및 임의로 본원에 기재된 1종 이상의 추가의 성분을 포함할 수 있다. 또는, 구강 투여에 적합한 제제는 활성 성분을 포함하는 분말 또는 에어로졸화 또는 분무 용액 또는 현탁액을 포함할 수 있다. 이러한 분말화되거나, 에어로졸화되거나, 또는 분산시킬 때 에어로졸화되는 제제는 약 0.1 내지 약 200 나노미터 범위의 평균 입자 또는 액적 크기를 가지며, 본원에 기재된 1종 이상의 추가의 성분을 더 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "추가의 성분"으로는 부형제; 표면활성제; 분산제; 불활성 희석제; 과립화제 및 붕해제; 결합제; 윤활제; 감미제; 향미제; 착색제; 보존제; 물리적으로 분해가능한 조성물, 예를 들어 젤라틴; 수성 비히클 및 용매; 오일 비히클 및 용매; 현탁제; 분산제 또는 습윤제; 유화제; 진통제; 완충제; 염; 증점제; 충전제, 유화제; 항산화제; 항생제; 항진균제; 안정화제; 및 제약상 허용되는 중합체 또는 소수성 물질 중 한가지 이상이 포함되지만 이것들로 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 제약 조성물 중에 포함될 수 있는 다른 "추가 성분"은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 본원에 참고로 포함되는 문헌 (Genaro, ed., 1985, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA)에 기재되어 있다.
통상적으로, 동물, 바람직하게는 인간에 투여될 수 있는 본 발명의 화합물의 투여량은 동물의 체중 1 킬로그램 당 1 마이크로그램 내지 약 100 그램의 양이다.투여될 정확한 투여량은 동물의 유형 및 치료될 질병 증상의 유형, 동물의 연령 및 투여 경로를 포함하지만 이에 한정되지는 않는 다수의 임의의 인자에 따라 달라질 것이다. 바람직하게는, 화합물의 투여는 동물의 체중 1 킬로그램 당 약 1 mg 내지 약 10 g의 범위에서 달라질 것이다. 더 바람직하게는, 투여량은 동물의 체중 1 킬로그램 당 약 10 mg 내지 약 1 g의 범위에서 달라질 것이다.
화합물은 매일 수회와 같이 빈번하게 동물에게 투여되거나, 하루에 1회, 1주마다 1회, 2주마다 1회, 1개월마다 1회와 같이 덜 빈번하게 투여되거나, 또는 수개월마다 1회 또는 심지어 1년이하마다 1회와 같이 훨씬 덜 빈번하게 투여될 수 있다. 투여 빈도는 당업자에게는 자명할 것이며, 치료될 질병의 유형 및 심도, 동물의 유형 및 연령 등과 같지만 이에 한정되지는 않는 다수의 인자에 따라 달라질 것이다.
기탁
특허 절차의 목적상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약의 협약하에서, FGF23 DNA를 포함하는 핵산을 2000년 6월 14일자로 독일 미생물 및 세포 배양물 기탁기관 (DSMZ)에 기탁하여 기탁 번호 제DSM 13530호를 배정받았다.
기탁된 클론의 뉴클레오티드 서열은 기탁된 클론을 공지된 방법에 따라 서열화하여 쉽게 결정할 수 있다. 이어서, 상기 기탁물로부터 아미노산 서열을 확인할 수 있다. 또한, 기탁된 클론에 의해 코딩되는 단백질의 아미노산 서열은 펩티드 서열화에 의해, 또는 기탁된 FGF23-코딩 DNA를 포함하는 적합한 숙주 세포에서 상기 단백질을 발현시키고, 단백질을 회수하고, 그의 서열을 결정하여 직접적으로 결정할 수 있다.
출원인의 양수인인 어드밴스드 리서치 앤드 테크놀러지 인스티튜트 (Advanced Research and Technology Institute) 및 LMU 뮌헨은 DSMZ가 기탁물을 영구히 보존하는 기탁기관이라는 것과, 특허가 허여되는 경우 이 기탁물이 공개적으로 이용될 수 있다는 것을 나타낸다. 이와 같이 기탁된 물질의 공개적 이용가능성에 대한 모든 제한은 특허 허여시에 철회할 수 없도록 제거된다. 이 물질은 특허 출원의 계류 동안에는 37 C.F.R. 1.14 및 35 U.S.C. 122하에서 미국 특허청장에 의해 자격을 부여받은 것으로 결정된 자에 의해 용이하게 이용될 것이다. 기탁된 물질은 필요한 모든 주의를 기울여서, 기탁된 물질 샘플의 제공에 대한 가장 최근의 요청 후 적어도 5년의 기간, 어떤 경우 기탁일 이후 적어도 30년, 또는 특허 실시가능 기간 중에서 더 긴 기간 동안 생존해 있으며 오염되지 않은 상태로 유지될 것이다. 출원인의 양수인은 기탁기관이 기탁물의 상태로 인해 요청된 샘플을 제공할 수 없게 되었을 때에는 기탁물을 대체하여야 할 의무가 있다.
정의
본원에 사용된 바와 같이, 하기 각각의 용어는 이 섹션에서 그와 관련된 의미를 갖는다.
관사 "하나 (a)" 및 "하나 (an)"는 이 관사의 문법적인 목적물의 하나 또는 하나 이상 (즉, 하나 이상)을 의미한다. 예를 들어, "하나의 요소"는 하나의 요소 또는 하나 이상의 요소를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "대립유전자 변이체"라는 용어는 주어진 로커스에존재하는 뉴클레오티드 서열 또는 이 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 아미노산은 하기 표에 나타낸 바와 같이 그의 전체 이름, 그에 상응하는 3문자 코드, 또는 그에 상응하는 1문자 코드로 나타내었다:
전체 이름 3문자 코드 1문자 코드
아스파르트산 Asp D
글루탐산 Glu E
리신 Lys K
아르기닌 Arg R
히스티딘 His H
티로신 Tyr Y
시스테인 Cys C
아스파라긴 Asn N
글루타민 Gln Q
세린 Ser S
쓰레오닌 Thr T
글리신 Gly G
알라닌 Ala A
발린 Val V
루이신 Leu L
이소루이신 Ile I
메티오닌 Met M
프롤린 Pro P
페닐알라닌 Phe F
트립토판 Trp W
본원에 사용된 바와 같이, "완화되는" 것은 FGF23에 의해 매개되거나 FGF23과 관련된 질병, 질환 또는 증상이다.
본원에 사용된 "항체"라는 용어는 항원상의 특정 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 이뮤노글로불린 분자를 의미한다. 항체는 천연 공급원 또는 재조합 공급원으로부터 유도된 온전한 이뮤노글로불린일 수 있고, 온전한 이뮤노글로불린의 면역반응성 부위일 수도 있다. 항체는 통상적으로 이뮤노글로불린 분자의 사합체이다. 본 발명의 항체는 예를 들어 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, Fv, Fab 및 F(ab)2뿐만 아니라 단쇄 항체 및 인간화 항체 (Harlow et al., 1999, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 : 5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242: 423-426)를 비롯한 다양한 형태로 존재할 수 있다.
본원에 사용된 "합성 항체"라는 용어는 재조합 DNA 기술을 이용하여 생성된 항체, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같이 박테리오파아지에 의해 발현되는 항체를 의미한다. 이 용어는 또한 항체를 코딩하는 DNA 분자의 합성에 의해 생성된 항체를 의미하는 것으로 생각해야 하며, 상기 DNA 분자는 항체 단백질, 또는 항체를 지정하는 아미노산 서열을 발현시키고, 여기서 DNA 또는 아미노산 서열은 당업계에 잘 알려진 이용가능한 합성 DNA 또는 아미노산 서열 기술을 이용하여 얻는다.
"안티센스"는 특히, 단백질을 코딩하는 이중 가닥 DNA 분자의 비-코딩 스트랜드의 핵산 서열, 또는 비-코딩 스트랜드에 실질적으로 상동성인 서열을 의미한다. 본원에 정의된 바와 같이, 안티센스 서열은 단백질을 코딩하는 이중 가닥 DNA 분자의 서열에 상보적이다. 안티센스 서열이 DNA 분자의 코딩 스트랜드의 코딩 부위에만 상보적일 필요는 없다. 안티센스 서열은 단백질을 코딩하는 DNA 분자의 코딩 스트랜드상에 지정된 조절 서열에 상보적일 수 있으며, 이 조절 서열은 코딩 서열의 발현을 조절한다.
"어플리케이터 (applicator)"라는 용어는, 본원에 사용된 바와 같이, 본 발명의 핵산, 단백질 및(또는) 조성물을 포유동물에게 투여하기 위한 피하 주사기, 피펫 및 분무기 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는 임의의 장치를 의미한다.
유전자의 "코딩 영역"은 유전자의 전사에 의해 생성되는 mRNA 분자의 코딩 영역에 각각 상동성이거나 상보적인 유전자의 코딩 스트랜드의 뉴클레오티드 잔기 및 유전자의 비-코딩 스트랜드의 뉴클레오티드로 구성된다.
mRNA 분자의 "코딩 영역"은 또한 mRNA 분자의 번역 동안 트랜스퍼 RNA 분자의 안티코돈 영역과 매치되거나 종결 코돈을 코딩하는 mRNA 분자의 뉴클레오티드 잔기로 구성된다. 따라서, 코딩 영역은 mRNA 분자에 의해 코딩되는 성숙 단백질에 존재하지 않는 아미노산 잔기 (예를 들어, 단백질 배출 신호 서열내의 아미노산 잔기)에 상응하는 뉴클레오티드 잔기를 포함할 수 있다.
"FGF23을 코딩하는 핵산의 일부 또는 전부에 상보적인"이라는 용어는 FGF23 단백질을 코딩하지 않는 핵산의 서열을 의미한다. 오히려, 이 서열은 FGF23을 코딩하는 핵산의 비-코딩 스트랜드와 동일하며, 따라서 FGF23 단백질을 코딩하지 않는다.
"상보적인" 및 "안티센스"라는 용어는 본원에 사용된 바와 같이 완전히 같은 의미는 아니다. "안티센스"는 특히, 단백질을 코딩하는 이중 가닥 DNA 분자의 비-코딩 스트랜드의 핵산 서열을 의미하거나, 비-코딩 스트랜드에 실질적으로 상동성인 서열을 의미한다. 본원에 사용된 "상보적"이라는 용어는 2개의 핵산, 예를 들어 2개의 DNA 분자 사이의 서브유닛 서열 상보성의 넓은 개념을 의미한다. 일반적으로 서로 염기쌍을 이룰 수 있는 뉴클레오티드가 두 분자에서 하나의 뉴클레오티드 위치를 차지하는 경우, 핵산은 이 위치에서 서로 상보적인 것으로 고려된다. 따라서, 일반적으로 서로 염기쌍을 이루는 뉴클레오티드 (예, A:T 및 G:C 뉴클레오티드 쌍)가 각 분자에서 상응하는 위치의 실질적인 수 (50％ 이상)를 차지하는 경우, 두 핵산은 서로 상보적인 것이다. 본원에 정의된 바와 같이, 안티센스 서열은 단백질을 코딩하는 이중 가닥 DNA 분자의 서열에 상보적이다. 안티센스 분자가 DNA 분자의 코딩 스트랜드의 코딩 부위에만 상보적일 필요는 없다. 안티센스 분자는 단백질을 코딩하는 DNA 분자의 코딩 스트랜드상에 지정된 조절 서열에 상보적일 수 있으며, 이 조절 서열은 코딩 서열의 발현을 조절한다.
"상동성"은 두 중합체 분자 사이, 예를 들어 두 핵산 분자, 예컨대 두 DNA 분자 또는 두 RNA 분자, 또는 두 폴리펩티드 분자 사이의 서브유닛 서열의 유사성을 의미한다. 두 분자 모두에서 서브유닛 위치를 동일한 단량체 서브유닛이 차지하는 경우, 예를 들어 아데닌이 두 DNA 분자의 각각에서 하나의 위치를 차지하는 경우, 이들은 그 위치에서 상동성이 있다. 두 서열 사이의 상동성은 매칭하거나 상동성인 위치의 수에 대한 정함수이며, 예를 들어 두 화합물 서열에서 위치의 절반 (예, 서브유닛 10개 길이의 중합체에서 5개의 위치)이 상동성이면, 두 서열의 상동성은 50％이고, 위치의 90％, 예를 들어 10개 중 9개가 매치하거나 상동성이면, 두 서열은 90％의 상동성을 공유한다. 예를 들어, DNA 서열 3'ATTGCC5' 및 3'TATGCG5'은 50％의 상동성을 공유한다.
2개의 올리고뉴클레오티드가 약 60％ 이상, 보다 바람직하게는 약 65％ 이상, 보다 더 바람직하게는 약 70％ 이상, 훨씬 더 바람직하게는 약 80％ 이상, 바람직하게는 약 90％ 이상, 보다 바람직하게는 약 95％ 이상의 상보성을 가지고 서로 어닐링하는 조건하에서 제1 올리고뉴클레오티드는 제2 올리고뉴클레오티드와 "고 염격성"으로 어닐링한다. 두 올리고뉴클레오티드를 어닐링하는데 사용되는 조건의 엄격성은 알려져 있다면 다른 인자들 중에서 온도, 어닐링 매질의 이온 농도, 인큐베이션 기간, 올리고뉴클레오티드의 길이, 올리고뉴클레오티드의 G-C 함량 및 두 올리고뉴클레오티드 사이의 비-상동성의 예상 정도의 함수이다. 어닐링 조건의 엄격성을 조절하는 방법은 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York) 참조).
두 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 동일성 (％)의 결정은 수학적 알고리즘을 이용하여 달성할 수 있다. 예를 들어, 두 서열을 비교하는데 유용한 수학적 알고리즘은 카를린 (Karlin) 및 알츠슐 (Altschul)의 문헌 (1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877)에서와 같이 변형된, 카를린 및 알츠슐의 알고리즘 (1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-2268)이다. 이 알고리즘은 문헌 (Altschul, et al. (1990, J. Mol. Biol. 215: 403-410))의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램에 도입되었으며, 예를 들어 국립 생물공학정보센터 (NCBI) 웰드 와이드 웹 사이트 ("http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/")에서 접근할 수 있다. BLAST 뉴클레오티드 검색은 본원에 기재된 핵산에 대하여 상동성인 뉴클레오티드 서열을 얻기 위해 다음과 같은 파라메타를 이용하여 NBLAST 프로그램 (NCBI 웹 사이트에서"blastn"으로 명명)으로 수행할 수 있다: 갭 패널티 = 5; 갭 연장 패널티 = 2; 미스매치 페널티 = 3; 매치 보상 (reward) = 1; 예상값 10.0; 및 워드 사이즈 = 11. BLAST 단백질 검색은 본원에 기재된 단백질 분자에 대해 상동성인 아미노산 서열을 얻기 위해 다음과 같은 파라메타를 이용하여 XBLAST 프로그램 (NCBI 웹 사이트에서 "blastn"으로 명명) 또는 NCBI "blastp" 프로그램으로 수행할 수 있다: 예상값 10.0, BLOSUM62 스코어링 매트릭스.
비교 목적을 위한 갭을 갖는 배열을 얻기 위해, 갭을 갖는 BLAST를 문헌 (Altschul et al. (1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402))에 기재된 바와 같이 이용하였다. 또는, PSI-Blast 또는 PHI-Blast를 이용하여 분자들 (Id.) 사이의 먼 관계 및 공통의 패턴을 공유하는 분자들 사이의 관계를 검출하는 반복 검색을 수행할 수 있다. BLAST, 갭을 갖는 BLAST, PSI-Blast 및 PHI-Blast 프로그램을 이용하는 경우, 각 프로그램 (예, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 파라메타를 이용할 수 있다 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov. 참조).
두 서열 사이의 동일성 (％)은 갭을 갖거나 갖지 않은채로 상기 기재된 것들과 유사한 기술을 이용하여 결정할 수 있다. 동일성 (％)을 계산하는데 있어서는, 통상적으로 정확한 매치를 계수한다.
본원에 사용된 바와 같이, "유전자" 및 "재조합 유전자"라는 용어는 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 핵산 분자를 의미한다. 이러한 천연 대립유전자 변이는 통상적으로 주어진 유전자의 뉴클레오티드 서열에서 1 내지 5％의 변이를 일으킬 수 있다. 다수의 다른 개체에서 대상 유전자를 서열화하여 다른 대립유전자를 확인할 수 있다. 이는 다양한 개체에서 동일한 유전자 로커스를 확인하기 위한 혼성화 프로브를 사용하여 쉽게 수행할 수 있다. 자연적인 대립유전자 변이의 결과이며 기능적 활성을 변경시키지 않는 임의의 모든 이러한 뉴클레오티드 변화 및 그로 인한 아미노산 다형성 또는 변형은 본 발명의 범위내인 것으로 의도된다.
"코딩하는"이란 생물학적 프로세스에서 정의된 뉴클레오티드 서열을 갖거나 (즉, rRNA, tRNA 및 mRNA) 정의된 아미노산 서열을 갖는 다른 중합체 및 거대분자의 합성에 대한 템플레이트로 작용하는 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 유전자, cDNA 또는 mRNA에서 특정 뉴클레오티드 서열의 고유의 특성, 및 그로부터 얻어지는 생물학적 특성을 의미한다. 따라서, 해당 유전자에 상응하는 mRNA의 전사 및 번역이 세포 또는 다른 생물학적 시스템에서 단백질을 생성하는 경우, 유전자는 단백질을 코딩하는 것이다. mRNA 서열과 동일하고 일반적으로 서열 목록으로 제공되는 뉴클레오티드 서열인 코딩 스트랜드와, 유전자 또는 cDNA의 전사를 위한 템플레이트로 사용되는 비-코딩 스트랜드는 둘 다 유전자 또는 cDNA의 단백질 또는 기타 생성물을 코딩하는 것으로 언급될 수 있다.
달리 지시되지 않는다면, "아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열"은 여러가지 다양한 형태이면서 동일한 이미노산 서열을 코딩하는 모든 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 단백질 및 RNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 인트론을 포함할 수 있다.
"발현 벡터"는 발현될 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 발현 조절서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 의미한다. 발현 벡터는 발현을 위한 충분한 시스-작용성 요소를 포함하며; 발현을 위한 다른 요소는 숙주 세포에 의해 또는 시험관내 발현계에서 제공될 수 있다. 발현 벡터로는 당업계에 공지된 모든 것, 예를 들어 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 코스미드, 플라스미드 (예를 들어, 네이키드 (naked)이거나, 리포좀내에 포함됨) 및 바이러스 (예, 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노계 바이러스)를 들 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 핵산에 적용되는 "단편"이라는 용어는 통상적으로 뉴클레오티드 약 10개 이상의 길이, 전형적으로 뉴클레오티드 약 20개 이상의 길이, 보다 전형적으로 뉴클레오티드 약 20개 내지 약 50개의 길이, 바람직하게는 적어도 뉴클레오티드 약 50개 내지 약 100개의 길이, 보다 더 바람직하게는 적어도 뉴클레오티드 약 100개 내지 500개의 길이, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 뉴클레오티드 약 500개 내지 약 1000개의 길이일 수 있으며, 가장 바람직하게는 핵산 단편은 뉴클레오티드 약 1500개보다 더 긴 길이일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 폴리펩티드에 적용되는 "단편"이라는 용어는 통상적으로 약 7개 이상의 인접하는 아미노산, 전형적으로 약 15개 이상의 인접하는 아미노산, 보다 전형적으로 약 30개 이상의 인접하는 아미노산, 전형적으로 약 40개 이상의 인접하는 아미노산, 바람직하게는 약 50개 이상의 아미노산, 보다 더 바람직하게는 약 60개 이상의 아미노산일 수 있으며, 가장 바람직하게는 펩티드 단편은 약 70개의 인접하는 아미노산의 길이보다 더 길 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, "엄격 조건하에 혼성화하는"이라는 용어는 서로에대하여 동일한 60％ (65％, 70％, 바람직하게는 75％) 이상의 뉴클레오티드 서열이 전형적으로 서로 혼성화된 채로 남아있는 혼성화 및 세척 조건을 설명하는 의미이다. 이러한 엄격 조건은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 문헌 (Current Protocols in Molecular Biology, at 6.3.1-6.3.6, John Wiley & Sons, N. Y. (1989))에서 찾을 수 있다. 엄격 혼성화 조건의 한 예는 약 45 ℃에서 6 x 염화나트륨/시트르산나트륨 (SSC) 중의 혼성화 이후에 50 내지 65 ℃에서 0.2 x SSC, 0.1％ SDS 중에서 1회 이상 세척하는 것이다. 바람직하게는, 엄격 조건하에 서열 1 또는 3, 또는 이들의 상보체 중 어떤 것의 서열에 대하여 혼성화하는 본 발명의 단리된 핵산 분자는 자연 발생적인 핵산 분자에 상응한다. 본원에 사용된 바와 같이, "자연 발생적인" 핵산 분자란 천연에 존재하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 (예를 들어, 천연 단백질을 코딩하는) RNA 또는 DNA 분자를 의미한다.
"게놈 DNA"는 유전자와 상동성인 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 스트랜드이다. 예를 들어, 염색체 단편 및 포유동물 mRNA의 역전사에 의해 유도되는 cDNA는 게놈 DNA이다.
본원에 사용된 바와 같이, "상동성"은 "동일성"과 같은 의미로 사용된다.
또한, "상동성"이라는 용어가 본원에서 핵산 및 단백질을 의미하는데 사용되는 경우, 이는 핵산 및 아미노산 수준 둘 다에서의 상동성으로 이해하여야 한다.
본원에 사용된 바와 같이, "지침"은 본 발명의 조성물이 지시된 용도에 유용하다는 것을 알려주는데 사용될 수 있는 인쇄물, 기록물, 도해, 또는 어떤 다른 표시 수단을 포함한다. 본 발명의 키트의 지침은, 예를 들어 조성물을 포함하는 용기에 부착되거나, 조성물을 포함하는 용기와 함께 포함될 수 있다. 또는, 지침은 지침과 조성물이 사용자에 의해 함께 사용될 의도로 용기와 별도로 포함될 수 있다.
"단리된 핵산"은 자연 발생적인 상태에서 그의 양쪽에 있는 서열들로부터 분리된 핵산 절편 또는 단편, 예를 들어 일반적으로 단편에 인접한 서열로부터 제거된 DNA 단편, 예컨대 게놈에서 자연적으로 발생하는 단편에 인접하는 서열을 의미한다. 이 용어는 또한 본래 핵산, 예를 들어 RNA 또는 DNA, 또는 단백질을 포함하는, 즉 세포내에 본래 이들을 포함하는 다른 성분들로부터 실질적으로 정제된 핵산을 의미한다. 따라서, 이 용어는, 예를 들어 벡터, 자율적으로 복제하는 플라스미드 또는 바이러스, 또는 원핵세포 또는 진핵세포의 게놈 DNA내로 혼입되거나, 다른 서열과는 독립적인 별도의 분자 (예를 들어, PCR 또는 제한 효소 절단에 의해 생성되는 cDNA 또는 게놈 또는 cDNA 단편)로 존재하는 재조합 DNA를 포함한다. 이 용어는 또한 다른 폴리펩티드 서열을 코딩하는 하이브리드 유전자의 일부인 재조합 DNA를 포함한다.
본 발명에 있어서, 일반적으로 발생하는 핵산 염기에 대하여 다음과 같은 약자가 사용된다. "A"는 아데노신을, "C"는 시티딘을, "G"는 구아노신을, "T"는 티미딘을 의미하며, "U"는 우리딘을 의미한다.
본 발명의 펩티드 (또는 이를 코딩하는 DNA)의 "유도체" 및 "변이체"란 펩티드 (또는 DNA)가 본원에 인용된 서열과 동일하지 않지만 FGF23의 생물학적 활성을 갖는다는 점에서 본원에 개시된 펩티드와 동일한 특성을 갖도록 하나 이상의 아미노산 (또는 하나 이상의 염기쌍)에서 변형될 수 있는 펩티드를 말한다.
"FGF23을 코딩하는 핵산의 돌연변이"라는 용어는 그가 단백질의 구조 또는 기능을 변화시키는지 또는 그렇지 않은지의 여부에는 상관없이 핵산 서열에서의 어떤 염기쌍의 변화를 의미한다. R176Q, R179Q, R179W, 및 이러한 두 아르기닌 중 어떤 것에서의 임의의 다른 돌연변이를 포함하지만 이에 한정되지 않는 어떤 돌연변이는 단백질의 안정성에 영향을 주며, 따라서 혈중 반감기 또는 다른 생물학적 효과에 영향을 줄 수 있다.
두 폴리펩티드를 "작동가능한게 연결된" 것으로 기술하는 것은 두 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나가 다른 하나의 폴리뉴클레오티드의 특징을 이루는 생리학적 효과를 나타낼 수 있도록 하는 방식으로 단일 가닥 또는 이중 가닥 핵산 잔기가 핵산 잔기내에 배열된 두 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 의미한다. 예를 들어, 유전자의 코딩 영역에 작동가능하게 연결된 프로모터는 코딩 영역의 전사를 촉진시킬 수 있다.
바람직하게는, 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산이 프로모터/조절 서열을 추가로 포함하는 경우, 프로모터/조절 서열은 그가 세포내에서 목적하는 단백질의 발현을 유도하도록 목적하는 단백질 코딩 서열의 5' 말단에 위치한다.
본원에 사용된 바와 같이, "프로모터/조절 서열"이라는 용어는 프로모터/조절 서열에 작동가능하게 연결된 유전자 생성물의 발현에 필요한 핵산 서열을 의미한다. 어떤 경우, 이 서열은 코어 프로모터 서열일 수 있고, 다른 경우, 이 서열은 유전자 생성물의 발현에 필요한 인핸서 서열 및 다른 조절 요소를 포함할 수도있다. 프로모터/조절 서열은, 예를 들어 조직 특이적 방식으로 유전자 생성물을 발현시키는 하나의 서열일 수 있다.
"구성적" 프로모터란 유전자 생성물을 코딩하거나 지정하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결되었을 때 세포의 대부분 또는 모든 생리학적 조건하에 세포에서 유전자 생성물을 생성시키는 뉴클레오티드 서열을 말한다.
"유도성" 프로모터란 유전자 생성물을 코딩하거나 지정하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결되었을 때 프로모터에 상응하는 인듀서 (inducer)가 세포에 존재하는 경우에만 세포에서 실질적으로 유전자 생성물을 생성시키는 뉴클레오티드 서열을 말한다.
"조직-특이적" 프로모터란 유전자 생성물을 코딩하거나 지정하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결되었을 때 세포가 프로모터에 상응하는 조직 유형의 세포인 경우에만 세포에서 실질적으로 유전자 생성물을 생성시키는 뉴클레오티드 서열을 말한다.
본원에 사용된 "핵산의 발현"이라는 용어는 핵산에 의해 코딩되는 단백질 생성물의 합성을 의미한다.
"코딩 DNA"이라는 용어는 목적하는 단백질을 코딩하는 DNA 서열 및 실제 코딩 서열을 포함하는 임의의 필요한 5' 또는 3' 비번역 영역을 포함하는 것으로 이해하여야 한다.
본원에 사용된 바와 같이 "5' 말단에 위치하는"이라는 용어는 프로모터/조절 서열이, 핵산 전사의 5' 개시 부위에 충분히 가까운 위치에서 그의 발현을 유도하도록 그가 조절하는 핵산의 5' 말단에 공유적으로 결합되어 있는 것을 의미한다.
뉴클레오티드가 초기 RNA 전사체에 대하여 5'에서 3'으로 부가되도록 지시하는 것은 전사 방향으로 언급된다. mRNA와 동일한 서열을 갖는 DNA 스트랜드는 "코딩 스트랜드"로 언급되고; DNA 상의 일정 지점에 대하여 5'에 위치하는 DNA 스트랜드 상의 서열은 "상류 서열"로서 언급되며; DNA 상의 일정 지점에 대하여 3'에 위치하는 DNA 스트랜드 상의 서열은 "하류 서열"로서 언급된다.
"폴리아데닐화 서열"은 폴리 A 테일이, 전사되는 메신저 RNA 서열상으로 부가되도록 지시하는 폴리뉴클레오티드 서열을 말한다.
"폴리뉴클레오티드"는 핵산의 단일 스트랜드 또는 평행한 스트랜드 및 반대로 평행한 스트랜드를 의미한다. 따라서, 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥이거나 이중 가닥인 핵산일 수 있다.
"핵산"이라는 용어는 통상적으로 거대한 폴리뉴클레오티드를 의미한다.
"올리고뉴클레오티드"라는 용어는 통상적으로 짧은 폴리뉴클레오티드, 일반적으로 약 50개 이하의 뉴클레오티드를 의미한다. 뉴클레오티드 서열은 DNA 서열 (즉, A, T, G, C)로 나타내어지는 경우, 또한 "U"가 "T"를 대신하는 RNA 서열 (즉, A, U, G, C)을 포함하는 것으로 이해될 것이다.
본원에서 통상의 기호는 단일 가닥 폴리뉴클레오티드 서열의 좌선 (left-hand) 말단이 5'-말단이고, 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 서열의 좌선 방향이 5'-방향으로 언급되는 폴리뉴클레오티드 서열을 기술하기 위해 사용된다.
"프라이머"는 명명된 폴리뉴클레오티드 템플레이트에 특이적으로 혼성화하며, 상보적인 폴리뉴클레오티드의 합성에 대한 개시점을 제공할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 이러한 합성은 폴리뉴클레오티드 프라이머가 합성이 유도되는 조건, 즉 뉴클레오티드, 상보적 폴리뉴클레오티드 템플레이트, 및 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재하에 있는 경우에 일어난다. 프라이머는 통상적으로 단일 가닥이지만, 이중 가닥일 수도 있다. 프라이머는 통상적으로 데옥시리보핵산이지만, 많은 경우에 있어서 매우 다양한 합성 프라이머 및 자연 발생적인 프라이머가 유용하다. 프라이머는 그가 혼성화되어 합성 개시 부위로 작용하도록 설계된 템플레이트에 대하여 상보적이지만, 템플레이트의 정확한 서열을 반영할 필요는 없다. 이러한 경우, 프라이머의 템플레이트로의 특이적 혼성화는 혼성화 조건의 엄격도에 따라 달라진다. 프라이머는 예를 들어 발색성, 방사활성 또는 형광성 잔기로 표지되어 검출가능한 잔기로 사용될 수 있다.
"프로브"는 다른 폴리뉴클레오티드의 지정된 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 프로브는 표적의 상보적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 혼성화하지만, 템플레이트의 정확한 상보적 서열을 반영할 필요는 없다. 이러한 경우, 프로브의 표적으로의 특이적 혼성화는 혼성화 조건의 엄격도에 따라 달라진다. 프로브는 예를 들어 발색성, 방사활성 또는 형광성 잔기로 표지되어 검출가능한 잔기로 사용될 수 있다.
"재조합 폴리뉴클레오티드"는 자연적으로는 함께 연결되지 않는 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 증폭되거나 어셈블리된 재조합 폴리뉴클레오티드는 적합한 벡터내에 포함될 수 있으며, 이 벡터는 적합한 숙주 세포를 형질전환시키는데 사용될 수 있다.
또한 재조합 폴리뉴클레오티드는 비-코딩 기능 (예, 프로모터, 복제 기점, 리보좀 결합 부위 등)을 할 수도 있다.
"재조합 폴리펩티드"는 재조합 폴리뉴클레오티드의 발현시에 생성되는 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, "리포터 유전자"라는 용어는 공지된 방법을 이용하여 그의 발현을 검출할 수 있는 유전자를 의미한다. 예를 들어, 이셰리키아 콜라이 lacZ 유전자의 발현은 발색성 기질인 o-니트로페닐-β-갈락토시드를 배지에 첨가하는 공지된 방법 (Gerhardt et al., eds., 1994, Methods for General and Molecular Bacteriology, American Society for Microbiology, Washington, DC, p. 574)을 이용하여 검출할 수 있기 때문에, lacZ 유전자를 배지에서 리포터 유전자로 사용할 수 있다.
"폴리펩티드"는 아미노산 잔기들로 이루어진 중합체, 관련된 자연 발생적인 구조 변이체, 및 펩티드 결합을 통해 연결된 합성의 비-자연 발생적인 동족체, 관련된 자연 발생적인 구조 변이체, 및 합성의 비-자연 발생적인 동족체를 의미한다. 합성 폴리펩티드는 예를 들어 자동 폴리펩티드 합성기를 이용하여 합성할 수 있다.
"단백질"이라는 용어는 통상적으로 긴 폴리펩티드를 의미한다.
"펩티드"라는 용어는 통상적으로 짧은 폴리펩티드를 의미한다.
본원에 사용된 통상의 기호는 폴리펩티드 서열의 좌선 말단이 아미노-말단이고; 폴리펩티드 서열의 우선 말단이 카르복시-말단인 폴리펩티드 서열을 기술하기위해 사용된다.
"제한 부위"는 제한 엔도누클레아제에 의해 인식되는 이중 가닥 핵산의 부분을 말한다.
엔도누클레아제가 핵산과 접촉하는 부위에서 엔도누클레아제가 핵산의 두 스트랜드를 절단할 수 있는 경우, 이중 가닥 핵산의 일부가 제한 엔도누클레아제에 의해 "인식된다"고 말한다.
본원에 사용된 바와 같이 "특이적으로 결합하는"이라는 용어는 화합물, 예를 들어 단백질, 핵산 및 항체 등이 특정 분자를 인식하여 그와 결합하지만, 실질적으로 샘플 중의 다른 분자를 인식하거나 그와 결합하지는 않는 것을 의미한다.
제1 올리고뉴클레오티드 및 제2 올리고뉴클레오티드가 약 60％ 이상, 바람직하게는 약 65％ 이상, 보다 바람직하게는 약 70％ 이상, 보다 더 바람직하게는 약 75％ 이상, 바람직하게는 약 90％ 이상 또는 약 95％ 이상의 상보성으로 서로 어닐링하는 조건하에 상기 두 올리고뉴클레오티드가 어닐링하는 경우, 제1 올리고뉴클레오티드는 제2 올리고뉴클레오티드와 "높은 엄격성"으로 어닐링하는 것이다. 두 올리고뉴클레오티드를 어닐링하는데 사용되는 조건의 엄격성은 알려져 있다면 다른 인자들 중에서 온도, 어닐링 매질의 이온 농도, 인큐베이션 기간, 올리고뉴클레오티드의 길이, 올리고뉴클레오티드의 G-C 함량 및 두 올리고뉴클레오티드 사이의 비-상동성의 예상 정도의 함수이다. 어닐링 조건의 엄격성을 조절하는 방법은 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York) 참조).
본원에 사용된 바와 같이, "실질적으로 순수한"이라는 용어는 화합물, 예를 들어 핵산, 단백질 또는 폴리펩티드가, 본래 이들을 포함하는 성분들로부터 단리된 것을 의미한다. 전형적으로, 샘플 중에서 전체 물질의 약 10％ 이상, 바람직하게는 약 20％ 이상, 보다 바람직하게는 약 50％ 이상, 보다 더 바람직하게는 약 75％ 이상, 훨씬 더 바람직하게는 약 90％ 이상, 가장 바람직하게는 약 99％ 이상 (부피 단위, 습윤 또는 건조 중량 단위, 또는 몰 퍼센트 또는 몰 비율)이 해당 화합물인 경우에 화합물이 실질적으로 순수하다고 한다. 순도는 임의의 적절한 방법, 예를 들어 컬럼 크로마토그래피, 겔 전기영동 또는 HPLC 분석에 의해 측정할 수 있다.
화합물, 예를 들어 핵산, 단백질 또는 폴리펩티드는 또한 그가 자연적으로 결합하는 성분들을 본질적으로 포함하지 않거나, 그를 천연 상태로 포함하는 천연 오염물로부터 단리된 경우 "실질적으로 정제된" 것이다. 따라서, "실질적으로 순수한" 핵산의 제조는, 본원에 사용된 바와 같이, 자연 발생적인 상태에서 그의 양쪽에 있는 서열로부터 정제된 핵산 서열, 예를 들어 그가 본래 존재하는 게놈의 단편에 일반적으로 인접한 서열로부터 제거된 DNA 단편을 의미한다.
유사하게, "실질적으로 순수한" 단백질 또는 폴리펩티드의 제조는 본원에 사용된 바와 같이 단백질 또는 폴리펩티드가 일반적으로 그의 자연 발생적인 상태에서 결합하는 성분들로부터 정제된 것을 의미한다. 실질적으로 순수한 펩티드는 단백질 정제를 위한 하기의 공지된 방법에 의해 정제될 수 있으며, 여기서 면역학적, 효소적 또는 다른 분석을 이용하여 이 방법의 각 단계에서의 정제를 모니터링한다. 단백질 정제 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 문헌 (Deutscher etal. (1990, In: Guide to Protein Purification, Harcourt Brace Jovanovich, San Diego))에 기재되어 있다.
"태그" 폴리펩티드는 펩티드 결합에 의해 대상 단백질에 연결되는 경우 단백질을 위치화하거나, 단백질을 세포 추출물로부터 정제하거나, 결합 분석에 사용하기 위해 단백질을 고정하거나, 또는 단백질의 생물학적 특성 및(또는) 기능을 연구하는데 사용될 수 있는 임의의 단백질을 의미한다. "태그" 에피토프를 포함하는 키메라 (즉, 융합) 단백질은 태그와 결합하는 수지상에 고정될 수 있다. 이러한 태그 에피토프 및 그와 특이적으로 결합하는 수지는 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 니켈-니트릴로트리아세트산-아가로스상에서 에피토프를 포함하는 키메라 단백질의 단리를 허용하는, 다수의 연속하는 히스티딘 잔기 (His6)를 포함하는 태그 에피토프, 에피토프를 포함하는 키메라 단백질이 항-HA-모노클로날 항체 친화성 매트릭스와 결합할 수 있도록 하는 헤마글루티닌 (HA) 태그 에피토프, 에피토프를 포함하는 키메라 단백질이 항-myc-모노클로날 항체 친화성 매트릭스와 결합할 수 있도록 하는 myc 태그 에피토프, 글루타티온-S-트랜스퍼라제 태그 에피토프 및 말토스 결합 단백질 (MBP) 태그 에피토프 (이러한 에피토프를 포함하는 단백질과 각각 글루타티온- 또는 말토스-세파로스 칼럼 사이의 결합을 유도할 수 있음)가 포함된다. 이러한 태그 에피토프를 포함하는 단백질의 제조는 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 표준 문헌 (Sambrook et al., 1989, and Ausubel et al., supra)에 기술되어 있다. 유사하게, 태그 에피토프에 대한 항체 (예, 항-HA 및 항-myc 항체 9E10 등)는 예를 들어 웨스턴 블롯, ELISA 분석 및 세포의 면역염색에서 융합단백질을 검출하고 위치화할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "치료하는 것"이란 대상이 경험하는 증상의 빈도를 줄이는 것을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "FGF23 억제제"는 FGF23 단백질 분자 또는 그의 생물학적 활성을 감소시키거나 제거하는 작용을 하는 임의의 분자로서 정의된다. 이러한 억제제는 안티센스 핵산 또는 리보자임, FGF23과 그의 수용체의 상호작용을 차단시키는 분자, 또는 FGF23 수용체의 활성화를 억제하는 것들일 수 있다. 구체적인 예는 상기에 기재되어 있다.
본원에 사용된 "벡터"라는 용어는 외래 핵산을 코딩하는 임의의 플라스미드 또는 바이러스를 의미한다. 이 용어는 또한 핵산의 비리온 또는 세포로의 전달을 촉진시키는 비-플라스미드 및 비-바이러스 화합물, 예를 들어 폴리리신 화합물 등을 포함하는 것으로 이해해야 한다. 벡터는 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 또는 그의 돌연변이체의 세포로의 전달을 위한 전달 비히클로서 적합한 바이러스 벡터이거나, 동일한 목적에 적합한 비-바이러스 벡터일 수 있다. DNA의 세포 및 조직으로의 전달을 위한 바이러스 및 비-바이러스 벡터의 예는 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 문헌 (Ma et al. (1997, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94: 12744-12746))에 기재되어 있다. 바이러스 벡터의 예로는 재조합 백시니아 바이러스, 재조합 아데노바이러스, 재조합 레트로바이러스, 재조합 아데노계 바이러스 및 재조합 조류 폭스 바이러스 등을 들 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다 (Cranage et al., 1986, EMBO J. 5: 3057-3063; 국제 특허 출원 제W094/17810호, 1994년 8월18일 공개됨; 국제 특허 출원 제W094/23744호, 1994년 10월 27일 공개됨). 비-바이러스 벡터의 예로는 리포좀 및 DNA의 폴리아민 유도체 등이 포함되지만 이에 한정되지는 않는다.
본 발명은 하기 실험 실시예를 참고로 보다 상세히 기술되어 있다. 이러한 실시예는 단지 설명을 위한 것일뿐이며, 달리 지시되지 않는 한 본 발명을 한정하고자 하는 것은 아니다. 따라서, 본 발명이 어떤 식으로든지 하기 실시예로 제한되는 것으로 생각해서는 안되며, 오히려 본원에 제공된 교시의 결과로서 분명해지는 임의의 모든 변형을 포함하는 것으로 생각해야 한다.
실시예 1: ADHR 가계의 연관 및 돌연변이 분석
이 데이타는 신규 유전자인 FGF23의 발견을 입증한다. 또한 하기 내용은 ADHR이 염색체 12의 짧은 아암 (arm)에서 12p13.3에 맵핑되고, FGF23은 이 영역에 맵핑되며, ADHR을 앓는 개체는 FGF23이 돌연변이된다는 발견을 입증한다.
이 실시예에 제공된 실험에 이용된 재료 및 방법은 하기에 기술되어 있다.
가계도 분석
영국인 (가계 2318), 독일인 (가계 329) 및 미국인 (가계 1406 및 1478) 기원의 가계들의 가계도를 분석하였다. ADHR+ 가계 1406, 1478 및 2318은 이미 기술된 바 있다 (Econs, et al. 1992, J. Clin. Endocrinol. Metab. 82: 674-681; Bainchine, et al. 1971, Birth Defects Orig. Aric. Ser. 7: 287-295; Rowe, et al. 1992, Hum. Genet. 89: 539-542). 이 연구는 인디애나 대학 의학 스쿨(Indiana University School of Medicine) 및 루드비히-막시밀리안스-우니베르지타트 의학부 (Ludwig-Maximilians-Universitat Faculty of Medicine Institutional Review Boards)에 의해 후원받은 것이며, 모든 환자들에게서 참여에 앞서 동의를 구하였다.
돌연변이 스크리닝
환자의 DNA를 다음과 같이 평가하였다: 인트론 프라이머 (표 2)를 사용하여 엑손을 증폭시키고, 증폭된 단편을 직접적인 서열화 또는 SSCP에 의해 분석하였다. 20 ℃에서 글리세롤 있거나 없이 표준 폴리아크릴아미드 또는 세르도겔 (Serdogel) SSCP 2x (Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany)를 이용하여 SSCP를 수행하였다. Tt4cslistraGreen으로 염색하고 Fluorlmager (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA)로 검출하거나, [32P]dCTP의 존재하에 엑손을 PCR 증폭시킨 다음 오토라디오그래피하여 샘플을 시각화하였다. 변이체 밴드를 서열화를 위해 재증폭시켰다. Taq DyeDeoxy 터미네이터 사이클 서열화 키트 (ABI)를 이용하거나, Sequenase 키트 (USB) 및 [33P]디데옥시뉴클레오티드의 혼입을 이용하여 센스 및 안티센스 프라이머 둘 다를 사용한 직접적인 서열화를 수행하였다. 남성에서 남성으로 전달되며 ADHR에 적합한 임상적 특징을 갖는 4개의 가계, 즉 1406, 1478, 2318 및 329의 색인된 환자들로부터의 DNA, 및 PHEX 유전자 돌연변이에 대하여 네가티브였던 저인산혈성 구루병을 앓는 18명의 환자들로부터의 DNA를 사용하여 돌연변이 분석을 수행하였다. 또한, 저인산혈증, 주요 두개안면 이상증 및 짧은 상지 및 하지 (Cabral, et al., 80th Annual Endocrine Society Meeting 1998)를 갖는 가계 및 남성에서 남성으로의 전달을 포함하는 HBD를 갖는 가계를 분석하였다.
RT-PCR/RACE
템플레이트로 인간 또는 마우스 FGF23 cDNA (도 5 또는 6) 1 내지 2 ng을 사용하여 RT-PCR을 수행하였다. 마라톤 cDNA 증폭 키트 (ClonTech Inc. Palo Alto, CA)를 사용하여 RACE를 수행하였다. 예상 cDNA 서열로부터 설계된 프라이머는 0.2-3.5 kb의 생성물 (표 2)을 증폭시키기 위해 사용되었으며, 요청시에 이용할 수 있었다. 문헌 (Bonaventure, et al. 1994, Exp. Cell Res 212: 97-104)에 기재된 바와 같이 인간 태아의 연골세포 배양물을 제조하였으며, COL2A1의 발현에 대하여 확인하였다.
이 실시예에 제공된 결과는 하기에 기술되어 있다.
큰 ADHR 가계도인 가계 1406에서의 연관 분석은 유의한 LOD가 마커 D12S100과 D12S397 사이의 염색체 12p13.3 상에서 18 cM 간격으로 점수가 매겨진다는 것을 입증하였다. 마커 D12S1624에 대한 두 점 LOD 점수는 7.68이었다. 제2의 작은 ADHR 친족인 가계 1478은 D12S1624에서 1.1의 LOD 점수를 나타내었다. 이 가계에서 질환 로커스가 동일한 간격으로 연관되었다는 것을 가정하여, 이들 두 가계에서 단일 재조합 발생에 대하여 스크리닝하고, 질환 로커스를 마커 D12S1685와 S12S1594 사이의 1.5 MB 영역에 맵핑하였다 (도 2). 가계 1406에서, 개체 1306 및 0142는 D12S1685에서의 근위 재조합 발생 및 D12S397에서의 원위 재조합 발생을 나타내었다. 가계 1478은 각각 개체 001 및 0100에 있어서 D12S1050 및 D12S1594에서의 재조합을 나타내었다 (도 1A).
12p13.3으로부터의 게놈 서열은 공개된 휴먼 게놈 계획으로부터 이용할 수 있다. D12S685와 D12S1623 사이의 완료 및 비완료된 서열의 주석은 이 영역내에서 37개의 유전자를 밝혀내었으며, 이 중 13개가 신규한 것이다. 신규 유전자의 완전한 코딩 서열을 IMAGE 클론의 RT-PCR, RACE 및(또는) 서열화에 의해 얻었다.
상기의 연관 연구를 기초로, 돌연변이 스크린을 D12S1685와 D12S1594 사이의 1.5 MB 영역에 집중시켰다. 이 영역은 7개의 공지된 유전자, 4개의 신규 유전자 및 1개의 유전자 단편을 포함한다 (표 1). 엑손-인트론 경계를 기초로 한 프라이머를 사용하여 엑손을 증폭시켜 다음 유전자를 돌연변이에 대하여 스크리닝하였다: (i) MIB003 (AJ272206): (ii) DYRK4 단백질 키나제 (AF263541); (iii) 단백질 키나제 A 결합 단백질 AKAP110 (AF093408); (iv) GalNAc-T8 (AJ271385)9. 또한, 이 영역 바깥의 여러 유전자들이 후보로서 고려되었다. 이들 중 2개, 즉 성장 분화 인자 3 (GDF3, AF263538), 및 신규 G-단백질 커플링 수용체 (GPCR46, AJ272207)를 조사하였다. 적은 변이가 검출되었으며, 대조구 대립유전자의 서열화한 결과 이들 모두가 다형성을 갖는 것으로 밝혀졌다 (표 1).
Acc 번호 유전자 기호 ORF(aa) 엑손 pter-qter 다형성
M90813 CCND2 289
AJ272206* C12orf5 270 6 정방향 716C/T(T293M)
AF263537 FGF23 251 3 역방향
X63454 FGF6 198 3 역방향
AJ272205 C12orf4 552 14 역방향
AF006259 PIR51 335 9 정방향
AF263541* DYRK4 >541 >11 정방향 351C/T(V117V)632A/G(M211S)1041C/T(A347A)
AF093408* AKAP3 853 5 역방향
AF050641 NDUFA9 377 11 정방향
AJ271385* GALNT8 637 11 정방향 800A/G(E267G)
X17622 KCNA6 529 1 정방향
L02750 KCNA1 495 1 정방향
또한 이 영역으로부터의 신규 섬유아세포 성장 인자 군의 구성원인 FGF23을 조사하였다. 상기 ADHR 가계로부터의 FGF23 엑손의 직접적인 서열화는 아미노산 3개의 거리를 두고 떨어져 있는 2개의 아르기닌에 영향을 주는 3가지 미스센스 변화를 밝혀내었다. 가계 1406 및 1478은 AciI 부위를 붕괴시키는 동일한 변화인 R176Q (527>A)를 공유하였다. 대조구 PCR 생성물은 112, 49 및 33 bp의 단편으로 절단되었지만, 돌연변이체 대립유전자는 아가로스 겔 전기영동으로 분석하였을 때 112 및 82 bp의 단편만을 생성시켰다. 가계 2318에서, 돌연변이체 FGF23에서의 R179W (535C>T) 변화는 새로운 BmpI 부위를 생성시키는 것으로 밝혀졌다. RFLP 분석 결과는 정상 대립유전자로부터의 PCR 생성물이 절단되지 않아서 194 bp의 원래의 생성물을 남겨 놓았지만 돌연변이체 대립유전자는 한 부분이 절단되어 118 및 87 bp의 단편을 형성시켰다는 것을 보여주었다 (도 1B). 가계 329에 있어서, 돌연변이체 FGF23에서의 R179Q (536G>A) 변화는 제한 부위를 형성시키거나 파괴시키지 않는 것으로 밝혀졌다. 또한, 다형성은 엑손 3,716/T (239/M)에 존재하였다. 쓰레오닌은 214개의 대립유전자들 중 182개에서 발견되었으며, 메티오닌은 214개의 대립유전자들 중 22개에서 발견되었다. 전체 코딩 영역 및 개시 코돈 (450 bp)의 상류 영역의 서열화 결과, HBD를 갖는 가계, 저인산혈증 및 여러 선천성 장애를 갖는 가계, 및 XLH를 갖는 18명의 환자들에서 돌연변이는 확인되지 않았다. 미스센스 돌연변이는 각 가계에서 질환과 함께 분리되며, 214개의 서열화 대조구 대립유전자에서는 나타나지 않았다. 또한, 가계 1406 및 1478, 및 가계 2318에서의 돌연변이는 각각 800 및 752개의 대조구 대립유전자에서 RFLP 분석에 의해 배제되었다 (도 1B). 동일한 FGF23 돌연변이를 갖는 친족 1406 및 1478은 분리된 지리학적 영역으로부터의 것이며, 관련이 없는 것으로 알려져 있다. 이에 대한 지지로서, 두 가계들은 각각 돌연변이 유전자로부터 단지 200 kb 및 70 kb 떨어져 있는 로커스인 D12S1624 및 D12S1725에서 다른 대립유전자를 갖는다. 요컨대, FGF23 돌연변이인 R176Q, R179Q 및 R179W가 ADHR에 대한 원인이라는 것이 분명하다.
FGF23은 인간 게놈에서 FGF-6의 54 kb 텔로미어에 있으며, 게놈 서열의 약 10 kb에 걸쳐 있는 3개의 엑손으로 구성된다. 얻어진 가장 긴 FGF23 RT-PCR 생성물은 1612 bp이며, 아미노산 251개의 예상 오픈 리딩 프레임 (ORF)을 포함한다. 5'-UTR은 예상 출발 부위의 상류에 존재하는 프레임내 종결 코돈을 갖지 않는 146 bp로 구성된다. 3'-UTR은 종결 코돈의 831 bp 하류에서 예측되는 폴리아데닐화 신호를 갖는 710 bp로 구성되었다. 인간 및 마우스 FGF23이 PFAM 데이타베이스의 FGF 프로필 (4.6e-14, 1.9e-16)에 의해 확인되었다. CLUSTAL 및 PRETTYBOX를 이용하여 FGF23과, FGF 군의 다른 구성원들 사이에서 아미노산 서열 정렬을 수행하였다(도 3A-3C). 이들은 공통의 코어 서열에서 FGF 군의 다른 구성원들과 25％ 내지 36％의 아미노산 동일성을 공유한다. 트리 (tree) 분석은 FGF23이 FGF-21과 가장 밀접하게 관련된다는 것을 암시한다. FGF23이 251개의 아미노산을 갖는다는 사실로부터, 가장 큰 FGF는 이 단백질의 큰 C-말단 부위를 특징으로 한다는 것이 최근에 밝혀졌다. 신호 P를 사용한 분석은 FGF23이 신호 펩티드, 및 위치 24의 알라닌 잔기와 위치 25의 티로신 잔기 사이에 존재할 가능성이 가장 높은 펩티드 절단부를 포함한다는 것을 나타내었다.
마우스 염색체 6으로부터의 BAC를 인간 염색체 12p13.3에 대한 상동성 영역내에서 서열화하였다. 이러한 BAC들 중 하나 (GenBank 기탁 번호 AC015538)는 마우스 FGF23 동족체를 포함하였다. 상응하는 영역으로부터 유도된 프라이머를 사용하여 17일된 마우스 배 cDNA로부터의 FGF23을 증폭시켰다. 쥐의 cDNA는 뉴클레오티드 수준에서 73％의 동일성 및 아미노산 수준에서 70％의 동일성으로 인간 단백질과 동일한 길이의 예상된 ORF를 갖는다. 또한, 도트 그래프 분석은 개시 코돈에서 500 bp 상류의 마우스 및 인간 서열 사이의 실질적인 서열 보존을 나타냈다.
실시예 2: FGF23의 발현
이 데이타는 인간 조직 및 암세포주에서 FGF23의 발현을 입증한다. 또한 이 실시예는 FGF23에 대해 특이적인 항체를 생성시키는 것과, 이를 사용하여 박테리아 및 포유동물 세포에서 생성된 FGF23을 검출하는 것을 입증한다. 추가로, 이 실시예에 제공된 데이타는 FGF23이 분비 단백질이며, FGF23이 종양발생성 저인산혈성 골연화증 (OHO) 종양에서 풍부하게 발현된다는 것을 입증한다.
이 실시예에 제공된 실험에 사용된 재료 및 방법은 하기에 기술되어 있다.
노던 블롯 분석
각 조직으로부터의 폴리A+-RNA (ClonTech Inc. Palo Alto, CA)를 2 ㎍ 포함하는 여러 조직의 노던 블롯을 65 ℃에서 혼성화 완충액 (270 mM NaCl, 15 mM Na2HP04, 15 mM EDTA, 1％ SDS, 10％ 덱스트란 술페이트 0.5％ 탈지 분유) 중에서 전장 FGF23 (도 5A 또는 6A) 프로브와 함께 인큐베이션하고, 60 ℃에서 0.01 X SSC 중에서 세척하였다.
박테리아의 FGF23 생산
Pfu 중합효소 (Gibco-BRL, Rockville, MD)를 사용하여 인간 심장으로부터의 DNA (ClonTech Inc. Palo Alto, CA)를 PCR 증폭시켜 인간 FGF23 cDNA를 제조하였다. 타입 IV Qiaexpress 키트 (Qiagen, Inc., Valencia, CA)를 사용하여, 뉴클레오티드 73 내지 756을 포함하며 예상 신호 펩티드를 갖지 않는 전장 FGF23을 코딩하는 삽입체를, pQE30 벡터내의 프레임내에서 N-말단 6xHis 태그와 함께 방향에 맞게 클로닝하였다. 이어서 플라스미드 FGF23-6xHis pQE를 사용하여 M15[pREP4] 세포를 형질전환시키고, IPTG를 4시간 동안 첨가하여 단백질 발현을 유도하였다. FGF23-6xHis 단백질을 제조자의 지침 (Qiagen Inc., Valencia, CA)에 기재된 바와 같이 니켈 크로마토그래피 미니프렙에 의해 정제하였다.
웨스턴 블롯 분석
단백질 샘플 및 표준물을 15％ SDS-PAGE 미니-겔 (BioRad) 상에서 전기영동하고, 니트로셀룰로스 막상에 전기블롯팅하였다. 막을 2.5 ㎍/ml 항-인간 FGF23 항체 또는 마우스 항-펜타His 항체에 이어서 염소 항-토끼 또는 항-마우스 HRP 2차 항체 (1:1000) (Amersham, Inc., Piscataway, NJ)와 함께 인큐베이션하고, 증가된 화학발광 (ECL) (Amersham, Inc., Piscataway, NJ)에 의해 시각화하였다.
포유동물 세포에서 FGF23의 생산
포유동물 세포에서 FGF23을 생산하기 위해, OK-E, COS-7 및 HEK293 세포를, 인간 FGF23을 발현시키는 플라스미드 (pFGF23으로 명명됨)로 일시적으로 형질감염시켰다. pFGF23를 구성하기 위해, 코작 (Kozak) 서열 (bp -3 내지 756)이 앞에 존재하는 FGF23 ORF를 심장의 전체 RNA로부터 RT-PCR에 의해 증폭시켰다. 생성된 cDNA를 발현 플라스미드 pcDNA3.1(+) (Invitrogen) 내에 방향에 맞게 삽입하였다. pFGF23의 일체성은 DNA 서열화에 의해 확인하였다.
OHO 종양 샘플의 제조
OHO 환자들로부터의 6가지 다른 종양을 a) 좌측 넓적다리 (혈관주위세포종); b) 하악 (혼합성 결합 조직 종양); c) 좌측 넓적다리 (혈관이형성증); d) 발바닥 (혈관주위세포종); e) 코 (혈관주위세포종); 및 f) 원위 대퇴부 (골모세포 골육종) (도 8A)로부터의 수술적 제거에 의해 얻었다. 모든 환자들은 OHO의 특징인 생화학적 이상을 나타내었으며, 종양을 제거 하여 이를 해결하였다. 종양 샘플 약 100 mg을, AEBSF 프로테아제 억제제 75 ㎍/ml를 보충한 빙냉 포스페이트-완충 염수 (PBS) 0.5 ml 중에 재현탁시켰다. 샘플을 얼음상에서 30초 동안 균질화한 다음, 1500 g에서 원심분리하고, 이어서 투명해진 균질물을 추가의 실험에서 사용하였다.단백질 농도는 표준물로서 우 혈청 알부민을 사용하여 브래드포드 (Bradford) 단백질 분석 (Bio-Rad, Inc., Hercules, CA)에 의해 결정하였다.
이 섹션에 제공된 실험의 결과는 하기에 기술되어 있다.
특정 인간 조직 및 암 세포주에서의 FGF23의 발현을 평가하기 위해, 인간 조직 및 암세포주로부터 얻은 RNA의 RT-PCR 및 혼성화 분석을 통상의 방법에 따라 수행하였다. FGF23은 특정 조직, 예를 들어 인간 심장, 간, 및 갑상선/부갑상선에서 낮은 수준으로 전사되는 것으로 알려져 있었다 (도 4A). 또한, 희미한 생성물을 태아 전체, 태아 연골세포, 소장, 고환 및 골격근으로부터 증폭시킬 수 있었다. 폐, 뇌, 신장, 골육종 세포 (SaOS), 및 내피 세포 (HMEC-1)는 FGF23 전사체에 대하여 음성이었다. 마우스에서 네스티드 (nested) RT-PCR은 17일된 마우스 배에서 양성이었지만, 두개관, 지아 (limb bud) 세포, 골세포 (MC3T3 세포) 및 자극된 연골세포 세포주로부터의 1차 골세포 배양물에서는 그렇지 않았다. 여러 발생 단계의 마우스 배의 시상 절편에 대한 것뿐 아니라, 성인 폐, 난소, 췌장, 고환, 흉선, 신장, 뇌 및 심장과 같은 다양한 조직의 파라핀 절편 및 E18.5 정강이뼈의 동결 절편에 대한 방사활성 계내 혼성화는 FGF23 전사체에 대하여 음성이었다. 16개의 특정 기관으로부터의 여러 조직의 노던 블롯 혼성화는 음성이었다. 암세포주로부터 얻어진 RNA의 노던 블롯 분석은 FGF23 cDNA를 사용하여 프로빙했을 때 만성 골수성 백혈병 세포주 K562에서 약 3 및 1.3 kb의 양성 신호를 나타냈지만, 여러 다른 종양 세포주는 3.0 또는 1.3 kb 전사체만을 발현시켰다 (도 4B).
FGF23의 검출에 유용한 면역학적 시약을 생성시키기 위해 표준 프로토콜을이용하여, 인간 FGF23 (Zymed Laboratories, Inc., South San Francisco, CA)의 잔기 206 내지 222에 상응하는 펩티드 CSQELPSAEDNSPMASD-COOH (서열 5)에 대하여 토끼 항-인간 FGF23 폴리클로날 항체를 제조하였다. 항혈청을 펩티드에 대하여 친화성 정제하였다.
항-FGF23 항체의 특이성을 평가하기 위해, 재조합 인간 FGF23을 상기 설명한 바와 같이 박테리아에서 제조하였다. 친화성-정제된 항-FGF23 항체를 사용하는 웨스턴 블롯 분석에 의해, FGF23-6xHis pQ-형질전환된 박테리아로부터 제조된 용해물을 분석하였다. 항-FGF23 항체는 IPTG-유도된 박테리아로부터 약 27 kDa의 단백질을 인식하였지만, 유도되지 않은 배양물에서는 단백질이 검출되지 않았다 (도 7A). 또한 항-His 항체를 이용하여 동일한 단백질을 검출하였으며, 이는 상기 두 항체가 동일한 단백질을 인식하였다는 것을 나타낸다. 면역전 혈청은 모든 실험에서 단백질을 검출하지 못하였다. 이러한 결과에 의해 친화성-정제된 항-FGF23 항체가 재조합 인간 FGF23 단백질을 인식하였음을 확인하였다.
형질감염된 세포에서 FGF23의 발현을 평가하기 위해, 형질감염시킨지 24시간 후에 세포를 수획하고, 전체 RNA를 추출하고,32P-표지된 FGF23 cDNA 프로브를 사용하여 노던 블롯 분석을 수행하였다. pFGF23으로 형질감염된 3가지 세포주 모두에서, 1.1 kb의 단일 mRNA 종이 FGF23 프로브에 혼성화하였지만, 공 (empty) pcDNA3.1로 형질감염된 세포는 FGF23 전사체를 발현시키지 않았다 (도 7B).
FGF23이 분비 단백질인지를 결정하기 위해, 상기 3가지 형질감염된 세포주로부터 유도된 조정 배지, 및 항-FGF23 항체를 사용하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 약 32 kDa 및 12 kDa의 면역반응성 단백질이 pFGF23-형질감염된 세포로부터 얻어진 조정 배지에서 검출되었지만, pcDNA3.1-형질감염된 세포에서는 검출되지 않았다 (도 7C). 32 kDa 밴드는 FGF23의 성숙한 형태이었으며, 더 작은 밴드가 혈청 무함유 배지에서 세포의 연장된 인큐베이션 후에만 검출되었기 때문에 12 kDa 종은 FGF23의 C-말단의 분해 생성물을 나타낸다. 또한, FGF23의 분비 형태는 췌장 미소구의 존재하에서 pFGF23의 시험관내 전사 및 번역에 의해 시험된 바와 같이 대부분 코어 글리코실화로 인해 그의 예상 크기보다 더 컸다. 함께 고려하면, 이러한 결과는 FGF23을 일시적으로 발현시키는 포유동물 세포가 FGF23 전사체를 생성시키고, 이 단백질을 효율적으로 분비할 수 있다는 것을 입증한다.
OHO 종양에서의 FGF23 발현을 평가하기 위해, 6가지 종양 중 5가지로부터 단리된 전체 RNA를 사용하여 노던 블롯 분석을 수행하였다. 방사성 표지된 FGF23 프로브는 5가지 종양 모두에서 3.0 및 1.3 kb의 FGF23 전사체, 및 약 2.0 kb의 희미한 밴드와 혼성화하였지만, 대조적으로 여러 다른 조직으로부터의 대조군 RNA는 혼성화 밴드가 없는 것으로 입증되었다 (도 8A). FGF23 단백질이 OHO 종양에 존재하는지를 결정하기 위해, 항-FGF23 항체를 사용하는 웨스턴 블롯 분석에 의해 제6의 종양으로부터의 추출물을 조사하였다. FGF23 항체는 종양 추출물로부터의 32 kDa 단백질을 검출하였다 (도 8B). 요컨대, 노던 및 웨스턴 블롯 분석은 FGF23이 OHO 종양에서 고도로 발현되는 분비 단백질임을 나타낸다.
실시예 3: FGF23 단백질 절단 및 헤파린 결합에 있어서 ADHR 돌연변이의 효과
이 데이타는 ADHR에 연관된 FGF23 돌연변이가, 컨센서스 SPC 부위에서 FGF23을 효과적으로 절단하는 프로테아제의 불활성으로 인해, 더 큰 FGF23 단백질 종의 수준을 증가시킨다는 것을 입증한다. 또한 이 실시예는 야생형 FGF23에 필적하는 수준으로 헤파린과 결합하는 FGF23의 돌연변이체 형태의 능력을 입증한다.
이 실시예에 제공된 실험에서 이용된 재료 및 방법은 하기 기술되어 있다.
FGF23의 돌연변이유발
네스티드 PCR, 부위-지시적 돌연변이유발법을 이용하여, ADHR 미스센스 돌연변이인 R176Q, R179W, R179Q를 FGF23 cDNA내에 도입하였다. 템플레이트로 pFGF23 (pcDNA3.1 백본)을 사용하는 모든 PCR 반응에서 고-충실성 (high-fidelity) DNA 중합효소 Pfu (Promega, Inc., Madison, WI)를 사용하였다. 초기 PCR 라운드에서, 적절한 미스센스를 포함하는 정방향 돌연변이 프라이머 각각을 역방향 3'FGF23 프라이머와 쌍을 이루게 하고, 역방향 돌연변이 프라이머 각각을 정방향 5'FGF23 프라이머와 쌍을 이루게 하였다. 돌연변이 프라이머는 하기 표 2에 나열되어 있다. 각각 5'FGF23 및 3'FGF23 프라이머내에 위치하는 BamHI 및 EcoRI 부위를 이탤릭체로 나타내었다. 각 프라이머에서 돌연변이 염기는 굵은 글씨로 나타내었다.
프라이머 명/서열 프라이머 방향 서열 (5'-3')
5'FGF23 프라이머 (서열 6) 정방향 CGGGATCCACGATGTTGG
3'FGF23 프라이머 (서열 7) 역방향 GGAATTCCTAGATGAACT
R176Q (G527A) (서열 8) 정방향 ATACCACGGCAGCACAC
R176Q (G527A) (서열 9) 역방향 CCGGGTGTGCTGCCGTG
R179W (C535T) (서열 10) 정방향 GCGGCACACCTGGAGCG
R179W (C535T) (서열 11) 역방향 TCGGCGCTCCAGGTGTGC
R179Q (G536A) (서열 12) 정방향 CGGCACACCCAGAGCGC
R179W (G536A) (서열 13) 역방향 CTCGGCGCTCTGGGTGTG
모든 실험에 대한 PCR 조건은 다음과 같았다: 95 ℃에서 1분에 이어서; 95 ℃에서 1분, 55 ℃에서 1분, 72 ℃에서 2분의 35 사이클; 및 72 ℃에서 7분의 최종 연장. 위저드 프렙 키트 (Wizard Prep Kit (Promega Corp., Madison, WI))를 사용하여, PCR의 제1 라운드로부터 생성된 cDNA 생성물을 겔 정제하였다. PCR의 제2 라운드를 이용하여 전장 돌연변이체 cDNA를 제조하였다. 특정 돌연변이체에 대한 2가지 초기 PCR 반응물 각각 1 ㎕를 단일 반응 튜브내에 모으고, 두 cDNA의 혼합물을 5'FGF23 및 3'FGF23 프라이머를 사용하여 증폭시켰다. 이어서 생성된 산물을 BamHI 및 EcoRI으로 절단하고, 발현 플라스미드 pcDNA3.1(+)내에 방향에 맞게 라이게이션하여 돌연변이체 클론 pR176Q, pR179W, pR179Q를 생성시켰다. 각 돌연변이 클론 삽입체를 서열화하여, 적절한 돌연변이가 도입되었는지뿐만 아니라 ORF의 일체성이 보장되는지를 확인하였다.
FLAG-태그된 FGF23의 구성
정방향 프라이머 (밑줄친 EcoRI 부위를 포함) 5'GGAATTCATATCCCAATGCCTCCCCA3' (서열 7) 및 역방향 프라이머 (밑줄친 BamHI 부위를 포함) 5'CGGGATCCCTAGATGAACTTGGCGAA3' (서열 6)를 사용하여 pFGF23 및 pR176Q를 따로 증폭시켰다. 생성된 cDNA를 EcoRI 및 BamHI으로 절단하고, pFLAG-CMV-3 발현 벡터 (Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO)내에 방향에 맞게 라이게이션하여 FLAG-FGF23 및 FLAG-R176Q를 발현시키는 플라스미드를 생성하였다. 모 pFLAG-CMV-3 벡터는 N-말단의 FLAG 태그된 융합 단백질을 분비시킬 수 있는 프리프로트립신 리더 서열을 사용한다는 것을 유의해야 한다. 클론 삽입체를 서열화하여 융합 단백질의 적절한 리딩 프레임을 확인하였다.
헤파린-결합 분석
형질감염된 HEK293 세포로부터 얻은 조정 배지 (0.5 ml)를 1X PBS (pH 7.4)뿐 아니라, 1:1 헤파린 세파로스:1X PBS (Amersham Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ) 현탁액 50 ㎕와 함께 1:1 인큐베이션하였다. 혼합물을 4 ℃에서 4시간 동안 회전 플랫폼상에 위치시킨 다음, 1분 동안 원심분리하였다. 상청액을 제거하고, 세파로스를 빙냉 1X PBS로 4회 세척하였다. 래믈리 (Laemmli) 샘플 완충액 (50 ㎕)을 세파로스에 가하고, 현탁액을 잠깐 동안 볼텍싱 (vortexing)한 다음, 5분 동안 비등시켰다. 샘플을 1분 동안 원심분리하고, 상청액을 제거하였다. 항-FGF23 항체를 사용하는 웨스턴 블롯 분석에 의해 상청액 10 ㎕ (헤파린 세파로스에 결합한 물질)를 분석하였다.
이 실시예에 제공된 실험 결과는 하기 기술되어 있다.
포유동물 세포에서 FGF23의 ADHR 돌연변이체 형태의 발현 및 분비를 평가하기 위해, ADHR 미스센스 돌연변이 (R176Q, R179W, R179Q)를 포함하는 FGF23 발현 플라스미드를 상기 설명한 바와 같이 구성하였다. 예상 신호 서열 및 예상 프로테아제 절단 부위를 FGF23 아미노산 서열내에 나타내었다 (도 9). 야생형 FGF23, R176Q, R179Q 및 R179W를 발현시키는 플라스미드로 HEK293 세포를 형질감염시켜 돌연변이체 FGF23의 발현 및 분비를 분석하였다. 인간 FGF23에 대한 폴리클로날 항체를 사용하여 조정 배지, 및 형질감염된 세포로부터 유도된 전체 세포 용해물에 대하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. pFGF23-형질감염된 세포로부터 얻어진 조정 배지에서 약 32 kDa, 및 이중의 12 kDa의 면역반응성 단백질이 검출되었다 (도 10A). 대조적으로, 돌연변이체 pFGF23-형질감염된 세포로부터 얻어진 조정 배지에서는 32 kDa 밴드만이 검출되었으며, 야생형 및 돌연변이체 FGF23 사이의 발현 수준에 있어서의 뚜렷한 차이는 없었다 (도 10A). 또한, 벡터-조절 형질감염에서와 같이, 전체 세포 용해물은 야생형 또는 돌연변이체 FGF23 단백질에 대하여 음성이었다 (도 10A). 돌연변이체 FGF23 단백질에서의 아미노산 변화는 도 10B에 나타나 있다. 이러한 결과는 일시적으로 형질감염된 포유동물 세포주가 인간 ADHR 돌연변이를 포함하는 FGF23을 분비한다는 것을 나타낸다. 그러나 폴리클로날 항체를 사용하면, FGF23의 돌연변이체 형태를 발현시키는 세포의 배지중에서 큰 단백질 종만이 검출될 수 있다. 항-FGF23 항체에 대한 에피토프는 야생형 FGF23 단백질에 존재하는 잔기 176 내지 179에서 잠재적인 SPC 절단 부위에 대하여 C-말단에 있으며, 따라서 12 kDa 밴드가 FGF23의 32 kDa 종의 C-말단 단편을 나타낼 수 있다는 것에 유의해야 한다. 12 kDa 종이 32 kDa 밴드의 분해 생성물인 경우, SPC 절단 부위 상류의 항체는 큰 단백질 종뿐 아니라 N-말단의 단백질 단편에도 결합한다.
상기 설명한 바와 같이 구성된 N-말단의 FLAG 에피토프-태그된 야생형 및 돌연변이체 (R176Q) FGF23을 발현시키는 플라스미드를 이용하여 이러한 가능성을 제한적으로 시험하였다. FGF23 단백질 종이 이 단백질의 N-말단에 대한 항체로 검출가능한지를 결정하기 위해, HEK293 세포를 벡터 대조구, 또는 FLAG FGF23 및 FLAG-R176Q를 발현시키는 플라스미드로 일시적으로 형질감염시켰다. 형질감염된 세포로부터 얻어진 조정 배지를 항-FLAG 모노클로날 항체 (M5; Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO)를 사용하는 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하였다. FLAG-FGF23-형질감염된 세포로부터 얻은 조정 배지에서, 항-FLAG 항체는 36 및 26 kDa의 두 밴드를 인식하였지만, FLAG-R176Q-형질감염된 세포로부터 얻은 배지에서 항체는, 26 kDa에서 검출가능한 매우 작은 밴드와 함께, 주로 36 kDa 밴드를 인식하였다 (도 11A). 벡터 대조구 배지는 반응성 밴드를 나타내지 않았으며, 세포 용해물 중 어떤 것도 그러하지 않았다. 배지에서 검출된 더 큰 FLAG-FGF23 단백질 종은 FLAG 태그로부터의 추가의 잔기로 인해 상기 관찰된 32 kDa과는 다르게 36 kDa로 이동하였다. 36 kDa 야생형 및 돌연변이체 FLAG-태그된 FGF23을 검출한 폴리클로날 항-FGF23 항체를 사용하여 동일한 배지를 웨스턴 블롯 분석함으로써 이를 확인하였다. FLAG 에피토프, 항-FGF23 에피토프 및 SPC 절단 부위의 위치는 도 11B에 나타나 있다. 이러한 결과는 야생형 FGF23으로부터의 웨스턴 블롯에서 더 작은 밴드가 또한 FGF23의 C- 및 N-말단의 단편이며, FGF23의 ADHR 돌연변이체 형태는 주로 더 큰 단백질 종으로 분비된다는 것을 암시한다. 이러한 결과는 아미노산 176 및 179에서의 ADHR 돌연변이가 32 kDa FGF23 단백질 종을 안정시킨다는 것을 암시한다. ADHR 환자에서 포스페이트 소모와 관련되는 FGF23의 돌연변이체 형태가 야생형 FGF23만큼효과적으로 절단되지 않는다는 관찰에 기초하여, 전장 FGF23의 안정화 및 분비는 단백질분해 단편의 분비와는 반대로 신장의 포스페이트 소모를 일으킬 수 있다. 또한, 이러한 결과는 ADHR 돌연변이가 포스페이트 소모 역할에 있어서 FGF23의 생물학적 활성을 불활성화하기보다는 증가시킬 수 있다는 것을 시사한다.
HEK293 세포를 사용하여 관찰되는 FGF23의 절단이 세포내 또는 세포외에서 일어났는지를 결정하기 위해, FGF23 조정 배지를 5％ CO2하에 37 ℃에서 24시간 동안 세포의 부재하에 또는 대조구 HEK293 세포 (FGF23을 발현시키지 않음)와 함께 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에, 배지를 수획하고, 동등한 부피로 농축시키고, C-말단의 항-FGF23 항체를 사용하여 웨스턴 블롯 분석으로 처리하였다. 처리와는 무관하게 12 kDa 밴드에 대한 32 kDa 밴드의 비율은 변화가 없었으며 (도 12A), 이는 FGF23의 절단이 세포의 분비에 앞서 또는 그 동안에 세포내에서 일어나며, HEK293 세포상에서 발현되는 세포외 프로테아제에 의해서는 일어나지 않는다는 것을 암시한다. 평행하게 전기영동된 샘플을 쿠마지 (Coomassie) 블루 염색하여 동등한 겔 로딩을 확인하였다 (도 12B).
R176 및 R179에서의 ADHR 돌연변이는 FGF 헤파린 결합 모티프를 포함하는 β스트랜드에 인접한다. FGF23이 헤파린에 결합하는 능력을 ADHR 돌연변이가 방해하는지를 시험하기 위해, FGF23의 야생형 또는 돌연변이체 형태를 발현시키는 플라스미드로 형질감염된 HEK293 세포로부터 얻어진 조정 배지를 상기 기재된 바와 같이 헤파린 세파로스와 함께 인큐베이션하였다. 32 kDa 단백질 종은 야생형 및 돌연변이체 FGF23 형질감염된 세포 배지의 샘플에서 검출되었지만, 공 (empty) 벡터-형질감염된 세포 배지의 샘플은 음성이었으며, 이는 FGF23의 야생형 및 돌연변이체 형태 모두가 헤파린과 효율적으로 결합하였음을 암시한다 (도 13). FLAG-태그된 FGF23을 발현시키는 플라스미드로 형질감염된 세포로부터 얻어진 배지를 사용하는 유사한 실험에서, FLAG-태그된 야생형 및 돌연변이체 FGF23의 36 kDa 종이 또한 헤파린과 결합하였다 (도 13). 이러한 결과는 FGF23의 32 kDa 종이 헤파린과 특이적으로 결합한다는 것을 입증하며, FGF23이 또한 헤파린-결합성 FGF 군의 구성원이라는 생화학적 증거를 제공한다. 또한, FGF23의 돌연변이체 형태가 헤파린 결합을 보유한다는 관찰은 ADHR 미스센스 돌연변이가 FGF23의 단백질 구조를 크게 변화시키지 않는다는 것을 암시한다.
실시예 4: 마우스에서 FGF23 분석
이 데이타는 FGF23을 과다발현시키거나, FGF23의 돌연변이체 형태를 발현시키거나, 또는 포스페이트-고갈된 또는 포스페이트-풍부한 식이를 제공받은 마우스의 생성 및 분석을 입증한다.
마우스에서 FGF23 발현과 변경된 포스페이트 항상성 사이의 상관관계를 평가하기 위해, 간에서 쥐의 FGF23을 과다발현시키는 유전자변형 마우스를 만들고, 유전자변형 마우스 및 대조군 마우스로부터의 혈청 및 소변 샘플 중 인 농도를 비교하였다. 마우스의 체중을 재고, 규칙적으로 조사하여 외부의 어떤 형태적 차이가 있는지를 결정하였다. 신장 포스페이트 소모와 관련되는 인간 종양에서 FGF23의 과다발현과 일치하는 것으로, FGF23을 과다발현시키는 유전자변형 마우스는 신장포스페이트 소모 및 이로 인한 저인산혈증을 나타낸다. 또한, 이러한 마우스는 신장에서 Npt2 (주요 나트륨 의존성 포스페이트 운반체) mRNA 및 단백질의 감소된 수준을 나타낸다. FGF23 유전자변형 마우스, 대조구 마우스, 및 식이성 포스페이트 고갈 또는 과다에 의해 유도되는 동등한 혈청 포스페이트 농도를 갖는 대조군 마우스 사이에서 혈청 1,25-디히드록시 비타민 D 농도의 수준을 비교하였다. 유사하게, 정제된 FGF23을 주사한 마우스는 신장 포스페이트 소모를 나타내었으며, 저인산혈성으로 되었다.
인간 ADHR 환자에서 관찰되는 동일한 돌연변이 (R176Q, R179Q, R179W, 또는 아르기닌 176 또는 179에서의 임의의 다른 돌연변이)를 포함하는 유전자변형 마우스가 만들어지며, 인간의 질환에 대한 우수한 동물 모델의 역할을 한다. 상기 기술된 바와 같이, 혈청 및 소변의 인, 및 혈청 1,25 디히드록시 비타민 D 농도를 조사한다. 돌연변이에 대하여 이형접합성인 마우스는 ADHR을 앓는 인간과 공통적으로 신장의 포스페이트 소모 및 저인산혈증을 나타내지만, 돌연변이에 대하여 동형접합성인 마우스는 보다 심각한 증상을 나타낸다. 돌연변이체 마우스는 또한 신장에서 Npt2 mRNA 및 단백질을 감소된 수준으로 나타낸다.
포스페이트-고갈된 또는 포스페이트-풍부한 식이를 마우스에게 투여하는 것은 혈청 포스페이트 농도를 변화시키며, 갑상선/부갑상선, 심장 또는 간에서 FGF23 발현 수준을 변화시킨다. 고인산혈증은 이러한 조직에서 FGF23 mRNA의 발현을 증가시키지만, 저인산혈증은 이러한 조직에서 FGF23 mRNA의 발현을 감소시킨다.
Phex 유전자에서 돌연변이를 가지며 인간 X-연관 저인산혈성 구루병의 쥐 모델인 수컷 및 암컷 Hyp 마우스에서의 FGF23의 발현 수준을, 정상의 한배 새끼 (littermate) 대조군 또는 포스페이트-변경된 식이를 공급받은 한배 새끼에서의 수준과 비교하였다. Hyp 마우스는 FGF23의 발현 및 혈청 농도를 증가시켰다.
실시예 5: 종양 유도성 골연화증 환자에서 FGF23의 검출
이 데이타는 환자에서 종양 유도성 골연화증을 진단하기 위한 FGF23 검출 프로토콜의 용도를 입증한다.
종양 유도성 골연화증의 임상적 증상을 나타내는 환자로부터 종양을 수술적으로 절개하였다. 이어서 종양 세포를 세포 배양 플라스크에서 48시간 동안 배양하였다. 표준 프로토콜을 이용하여 종양 세포로부터 RNA를 단리하였다. FGF23에 대하여 특이적인 PCR 프라이머를 사용하여 종양으로부터의 RNA에 대하여 RT-PCR을 수행하였다. 적절한 크기의 cDNA 밴드가 종양의 RNA로부터 증폭되었지만, PCR에 앞서 역전사되지 않은 종양 세포 RNA (음성 대조군)로부터는 증폭되지 않았다. 따라서, 종양 샘플에서 FGF23 mRNA의 검출은 종양 유도성 골연화증을 나타내며, 따라서 이러한 질환에 대한 가치있는 진단 수단으로서의 역할을 한다.
실시예 6: 인간에서 FGF23의 안정성
이 데이타는 인간에서 FGF23의 안전성을 입증한다.
종양 유도성 골연화증을 앓는 어떤 환자에서, 종양은 검출되지 않았다. 1,25 디히드록시 비타민 D 및 포스페이트를 높은 투여량으로 처리하자, 이러한 환자들의 증상이 개선되었다. 이러한 환자들의 저인산혈증을 치료한 경우, 이들의 혈중 FGF23 농도가 매우 높다는 사실에도 불구하고, 증상은 남아있지 않았다. 이는 ADHR 환자들에게서도 사실이었는데, 이들 모두는 아마도 높은 FGF23 혈청 농도를 가지며, 그로 인해 돌연변이체 FGF23을 분해할 수 없었다. 따라서, FGF23의 높은 수준은 인간에게서 분명한 악영향을 나타내지 않는다.
본원에 인용된 각각의 모든 특허문헌, 특허 출원 및 간행물의 개시 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
특정 실시양태를 참고로 하여 본 발명이 개시되었지만, 당업자라면 본 발명의 진정한 사상 및 범위를 벗어남이 없이 본 발명의 다른 실시양태 및 변형을 계획할 수 있음은 물론이다. 첨부된 청구의 범위는 이러한 모든 실시양태 및 동등한 변형을 포함하는 것으로 의도된다.

Claims (83)

  1. 섬유아세포 성장 인자-23 (FGF23)을 코딩하는 단리된 핵산 또는 그의 돌연변이체, 변이체, 동족체 또는 단편.
  2. 서열 1 및 서열 3 중 적어도 하나의 핵산 서열과 약 50％ 이상의 서열 동일성을 공유하는, 섬유아세포 성장 인자-23 (FGF23)을 코딩하는 단리된 핵산.
  3. 서열 2 및 서열 4 중 적어도 하나의 아미노산 서열과 40％ 이상의 서열 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는, 섬유아세포 성장 인자-23 (FGF23)을 코딩하는 단리된 핵산.
  4. DSMZ 기탁 번호 제DSM 13530호로 기탁된 단리된 핵산.
  5. 제1항에 있어서, 공유적으로 연결된 태그 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 추가로 포함하는 단리된 핵산.
  6. 제5항에 있어서, 상기 태그 폴리펩티드가 myc 태그 폴리펩티드, 글루타티온-S-트랜스퍼라제 태그 폴리펩티드, 녹색 형광 단백질 태그 폴리펩티드, myc-피루베이트 키나제 태그 폴리펩티드, His6 태그 폴리펩티드, 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 태그 폴리펩티드, 플래그 태그 폴리펩티드 및 말토스 결합 단백질 태그 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단리된 핵산.
  7. 제1항에 있어서, 작동가능하게 연결된 프로모터/조절 서열을 지정하는 핵산을 추가로 포함하는 단리된 핵산.
  8. 제1항의 단리된 핵산을 포함하는 벡터.
  9. 제8항에 있어서, 작동가능하게 연결된 프로모터/조절 서열을 지정하는 핵산을 추가로 포함하는 벡터.
  10. 제1항의 단리된 핵산을 포함하는 재조합 세포.
  11. 제8항의 벡터를 포함하는 재조합 세포.
  12. 섬유아세포 성장 인자-23 (FGF23)을 코딩하는 핵산에 상보적이며 안티센스 방향으로 존재하는 단리된 핵산 또는 그의 돌연변이체, 변이체, 동족체 또는 단편.
  13. 제12항에 있어서, 서열 1 및 서열 3 중 적어도 하나의 서열을 갖는 핵산과 상보적인 핵산과 50％ 이상의 서열 동일성을 공유하는 단리된 핵산.
  14. 제12항의 단리된 핵산을 포함하는 벡터.
  15. 제14항에 있어서, 작동가능하게 연결된 프로모터/조절 서열을 지정하는 핵산을 추가로 포함하는 벡터.
  16. 제12항의 단리된 핵산을 포함하는 재조합 세포.
  17. 섬유아세포 성장 인자-23 (FGF23)을 코딩하는 단리된 핵산 또는 그의 돌연변이체, 변이체, 동족체 또는 단편을 포함하는 유전자변형 (transgenic) 비인간 포유동물.
  18. 섬유아세포 성장 인자-23 (FGF23) 또는 그의 돌연변이체, 변이체, 동족체 또는 단편을 포함하는 단리된 폴리펩티드.
  19. 제18항에 있어서, 상기 FGF23의 아미노산 서열이 서열 2 및 서열 4 중 적어도 하나의 아미노산 서열과 약 40％ 이상의 서열 동일성을 공유하는 것인 단리된 폴리펩티드.
  20. 섬유아세포 성장 인자-23 (FGF23) 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 항체또는 그의 돌연변이체, 변이체, 동족체 또는 단편.
  21. 제20항에 있어서, 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 인간화 항체, 키메라 항체 및 합성 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체.
  22. 섬유아세포 성장 인자-23 (FGF23)을 코딩하며, 돌연변이를 포함하는 단리된 핵산.
  23. 제22항에 있어서, 상기 돌연변이가 상기 FGF23에 대하여 증가된 안정성을 부여하는 것인 단리된 핵산.
  24. 제22항에 있어서, 상기 돌연변이가 서열 2의 아미노산 176 (아르기닌)을 코딩하는 핵산에서의 돌연변이 및 서열 2의 아미노산 179 (아르기닌)를 코딩하는 핵산에서의 돌연변이로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단리된 핵산.
  25. 돌연변이를 포함하는, 단리된 섬유아세포 성장 인자-23 (FGF23) 폴리펩티드.
  26. 섬유아세포 성장 인자-23 (FGF23)에 대하여 증가된 안정성을 부여하는 돌연변이를 포함하는 FGF23 폴리펩티드.
  27. 제26항에 있어서, 상기 돌연변이가 서열 2의 아미노산 176 (아르기닌)에서의 돌연변이 및 서열 2의 아미노산 179 (아르기닌)에서의 돌연변이로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단리된 폴리펩티드.
  28. FGF23 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA의 수준을 감소시키는 분자, FGF23 폴리펩티드의 수준을 감소시키는 분자 및 FGF23의 생물학적 활성을 감소시키는 분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 섬유아세포 성장 인자-23 (FGF23) 억제제.
  29. 제28항에 있어서, 안티센스 핵산, 리보자임, 항체, 펩티드 및 펩티드모방체로 이루어진 군으로부터 선택되는 억제제.
  30. 제28항에 있어서, FGF23과 특이적으로 결합하는 항체 및 FGF23 수용체와 특이적으로 결합하는 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체인 억제제.
  31. 제28항에 있어서, FGF23 폴리펩티드를 코딩하는 상기 mRNA의 수준을 RNA 간섭에 의해 감소시키는 이중 가닥 RNA인 억제제.
  32. 제1항의 단리된 핵산 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
  33. 제12항의 단리된 핵산 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
  34. 제18항의 단리된 폴리펩티드 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
  35. 제20항의 항체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
  36. 제22항의 단리된 핵산 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
  37. 제23항의 단리된 핵산 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
  38. 제24항의 단리된 핵산 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
  39. 제25항의 단리된 FGF23 폴리펩티드 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
  40. 제26항의 단리된 FGF23 폴리펩티드 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
  41. 제27항의 단리된 FGF23 폴리펩티드 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
  42. 제28항의 억제제 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
  43. (a) 섬유아세포 성장 인자-23 (FGF23)의 생물학적 활성을 갖는 단리된 단백질이 발현되는 조건하에 제11항의 재조합 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 상기 단백질의 제조 방법.
  44. (a) 포유동물로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계; 및 (b) 이 생물학적 샘플을, 섬유아세포 성장 인자-23 (FGF23)을 코딩하는 핵산에서의 돌연변이의 존재 또는 부재를 검출하는 시약과 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서 상기 돌연변이의 존재에 의해 상기 포유동물이 저인산혈성 질환에 걸렸음을 알 수 있고, 이에 따라 상기 포유동물에서 저인산혈성 질환을 진단하는 것인, 포유동물 저인산혈성 질환의 진단 방법.
  45. 제44항에 있어서, 상기 저인산혈성 질환이 상염색체 우성 저인산혈성 구루병 (ADHR)인 방법.
  46. 제44항에 있어서, 상기 생물학적 샘플이 혈액 및 소변으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  47. 제44항에 있어서, 상기 시약이 핵산인 방법.
  48. 제44항에 있어서, 상기 시약이 검출가능하게 표지된 것인 방법.
  49. 제44항에 있어서, 상기 시약이 방사성동위원소, 생물발광 화합물, 화학발광 화합물, 형광 화합물, 금속 킬레이트 및 효소로 이루어진 군으로부터 선택되는 표지로 검출가능하게 표지된 것인 방법.
  50. (a) 포유동물로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계; 및 (b) 이 생물학적 샘플을, 섬유아세포 성장 인자-23 (FGF23) 폴리펩티드의 돌연변이체 형태의 존재 또는 부재를 검출하는 시약과 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서 FGF23 폴리펩티드의 상기 돌연변이체 형태의 존재에 의해 상기 포유동물이 저인산혈성 질환에 걸렸음을 알 수 있고, 이에 따라 상기 포유동물에서 저인산혈성 질환을 진단하는 것인, 포유동물 저인산혈성 질환의 진단 방법.
  51. 제50항에 있어서, 상기 저인산혈성 질환이 상염색체 우성 저인산혈성 구루병 (ADHR)인 방법.
  52. 제50항에 있어서, 상기 생물학적 샘플이 혈액 및 소변으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  53. 제50항에 있어서, 상기 시약이 항체인 방법.
  54. (a) 포유동물로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계; 및 (b) 이 생물학적 샘플을, 샘플 중 섬유아세포 성장 인자-23 (FGF23) 폴리펩티드의 수준을 검출하는 시약과 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서 대조군 포유동물로부터 얻어진 샘플 중 FGF23 폴리펩티드의 수준과 비교해서 상기 샘플 중 FGF23 폴리펩티드의 수준이 증가된 것에 의해 상기 포유동물이 저인산혈성 질환에 걸렸음을 알 수 있고, 이에 따라 상기 포유동물에서 저인산혈성 질환을 진단하는 것인, 포유동물 저인산혈성 질환의 진단 방법.
  55. 제54항에 있어서, 상기 저인산혈성 질환이 X-연관 유전성 구루병 (XLH), 유전성 저인산혈성 구루병 (HHRH), 저인산혈성 골 질환 (HBD), 상염색체 우성 저인산혈성 구루병 (ADHR), 종양 유도성 골연화증, 표피 모반 증후군, 섬유성 이형성증 및 신결석증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  56. 제54항에 있어서, 상기 생물학적 샘플이 혈액 및 소변으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  57. 제54항에 있어서, 상기 시약이 FGF23 항체인 방법.
  58. 제54항에 있어서, 상기 시약이 검출가능하게 표지된 것인 방법.
  59. 제54항에 있어서, 상기 시약이 방사성동위원소, 생물발광 화합물, 화학발광 화합물, 형광 화합물, 금속 킬레이트 및 효소로 이루어진 군으로부터 선택되는 표지로 검출가능하게 표지된 것인 방법.
  60. (a) 대상으로부터 종양 샘플을 얻는 단계; 및 (b) 이 종양에서 FGF23의 발현 또는 그의 결핍을 검출하는 단계를 포함하며, FGF23의 발현에 의해 상기 대상이 종양 유도성 골연화증에 걸렸음을 알 수 있는 것인, 종양 유도성 골연화증의 진단 방법.
  61. 저인산혈성 질환을 앓는 포유동물에게, 이 포유동물에서 FGF23 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA의 수준을 감소시키는 억제제, 상기 포유동물에서 FGF23 폴리펩티드의 수준을 감소시키는 억제제, 및 상기 포유동물의 FGF23의 생물학적 활성 억제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 섬유아세포 성장 인자-23 (FGF23) 억제제를 치료 유효량 투여하는 것을 포함하는, 포유동물 저인산혈성 질환의 치료 방법.
  62. 제61항에 있어서, 상기 저인산혈성 질환이 X-연관 유전성 구루병 (XLH), 유전성 저인산혈성 구루병 (HHRH), 저인산혈성 골 질환 (HBD), 상염색체 우성 저인산혈성 구루병 (ADHR), 종양 유도성 골연화증, 표피 모반 증후군, 섬유성 이형성증및 신결석증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  63. 제61항에 있어서, 상기 억제제가 안티센스 핵산, 리보자임, 항체, 펩티드 및 펩티드모방체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  64. 고인산혈성 질환을 앓는 포유동물에게 섬유아세포 성장 인자-23 (FGF23)을 코딩하는 단리된 핵산을 치료 유효량 투여하는 것을 포함하는, 포유동물 고인산혈성 질환의 치료 방법.
  65. 제64항에 있어서, 상기 단리된 핵산이 그에 의해 코딩되는 FGF23 폴리펩티드에 증가된 안정성을 부여하는 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
  66. 제64항에 있어서, 상기 고인산혈성 질환이 경증 신부전증 및 종양성 석회증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  67. 고인산혈성 질환을 앓는 포유동물에게 단리된 섬유아세포 성장 인자-23 (FGF23) 폴리펩티드를 치료 유효량 투여하는 것을 포함하는, 포유동물 고인산혈성 질환의 치료 방법.
  68. 제67항에 있어서, 상기 단리된 FGF23 폴리펩티드가 이 폴리펩티드에 증가된안전성을 부여하는 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
  69. 제67항에 있어서, 상기 고인산혈성 질환이 경증 신부전증 및 종양성 석회증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  70. 고인산혈성 질환을 앓는 포유동물에게, 이 동물에서 섬유아세포 성장 인자-23 (FGF23) 폴리펩티드의 수준을 증가시키는 시약을 치료 유효량 투여하는 것을 포함하는, 포유동물 고인산혈성 질환의 치료 방법.
  71. 제70항에 있어서, 상기 시약이 상기 FGF23 폴리펩티드의 분해를 억제하는 것인 방법.
  72. 제70항에 있어서, 상기 고인산혈성 질환이 경증 신부전증 및 종양성 석회증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  73. 고인산혈성 질환을 앓는 포유동물에게, 섬유아세포 성장 인자-23 (FGF23)을 코딩하는 단리된 핵산을 포함하는 세포 집단을 치료 유효량 투여하는 것을 포함하는, 포유동물 고인산혈성 질환의 치료 방법.
  74. 제73항에 있어서, 상기 단리된 핵산이 그에 의해 코딩되는 상기 FGF23에 증가된 안정성을 부여하는 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
  75. 제73항에 있어서, 상기 저인산혈성 질환이 경증 신부전증 및 종양성 석회증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  76. 포유동물에게, 섬유아세포 성장 인자-23 (FGF23), 또는 상기 포유동물에서 FGF23 폴리펩티드의 수준을 증가시키는 시약을 치료 유효량 투여하는 것을 포함하는, 포유동물 골다공증의 치료 방법.
  77. 포유동물에게, 섬유아세포 성장 인자-23 (FGF23), 또는 FGF23 폴리펩티드의 수준을 증가시키는 시약을 치료 유효량 투여하는 것을 포함하는, 상기 포유동물의 동맥 또는 연조직내 칼슘 및 포스페이트의 침착을 포함하는 증상의 치료 방법.
  78. 제77항에 있어서, 상기 증상이 피부근염인 방법.
  79. 관상동맥 질환을 앓는 포유동물의 관상동맥 세포에 섬유아세포 성장 인자-23 (FGF23)을 코딩하는 핵산을 투여하는 것을 포함하는, 포유동물 관상동맥 질환의 치료 방법.
  80. 섬유아세포 성장 인자-23 (FGF23)을 코딩하는 핵산 서열에서의 돌연변이의존재 또는 부재를 검출하는 시약, 및 추가로 어플리케이터 (applicator) 및 사용 지침을 포함하며, 여기서 상기 돌연변이의 존재에 의해 상기 포유동물이 저인산혈성 질환에 걸렸음을 알 수 있는 것인, 포유동물 저인산혈성 질환의 진단용 키트.
  81. 섬유아세포 성장 인자-23 (FGF23) 폴리펩티드의 수준을 검출하는 시약, 및 추가로 어플리케이터 및 사용 지침을 포함하며, 여기서 상기 FGF23 폴리펩티드의 증가된 수준에 의해 상기 포유동물이 저인산혈성 질환에 걸렸음을 알 수 있는 것인, 포유동물 저인산혈성 질환의 진단용 키트.
  82. 섬유아세포 성장 인자-23 (FGF23) 폴리펩티드의 돌연변이체 형태의 존재 또는 부재를 검출하는 시약, 및 추가로 어플리케이터 및 사용 지침을 포함하며, 여기서 상기 FGF23의 돌연변이체 형태의 존재에 의해 상기 포유동물이 저인산혈성 질환에 걸렸음을 알 수 있는 것인, 포유동물 저인산혈성 질환의 진단용 키트.
  83. 제24항에 있어서, 상기 돌연변이가 서열 1에 있어서 527G>A, 535C>T 및 536G>A로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단리된 핵산.
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