JP2003038174A - ヒトアミン受容体 - Google Patents
ヒトアミン受容体Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ヒトアミン受容体ポリペプチドおよびそのよ
うなポリペプチドをコードするＤＮＡ（ＲＮＡ）および
組換え技術によりそのようなポリペプチドを製造する方
法を開示する。 【解決手段】 そのようなポリペプチドに結合して活性
化するおよび結合して阻害する化合物を検出する方法お
よび本発明のヒトアミン受容体の過少発現および過剰発
現に関連した疾患を治療する化合物の使用を提供する。
さらに、該ポリペプチドをコードする核酸配列中の変異
および該ポリペプチドの可溶性形態のレベルの変化を検
出する方法も開示する。
うなポリペプチドをコードするＤＮＡ（ＲＮＡ）および
組換え技術によりそのようなポリペプチドを製造する方
法を開示する。 【解決手段】 そのようなポリペプチドに結合して活性
化するおよび結合して阻害する化合物を検出する方法お
よび本発明のヒトアミン受容体の過少発現および過剰発
現に関連した疾患を治療する化合物の使用を提供する。
さらに、該ポリペプチドをコードする核酸配列中の変異
および該ポリペプチドの可溶性形態のレベルの変化を検
出する方法も開示する。
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、新たに同定された
ポリヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチドにより
コードされるポリペプチドおよびそのようなポリヌクレ
オチドおよびポリペプチドの使用、ならびにそのような
ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの製造にも関す
る。より詳しくは、本発明のポリペプチドは７回膜貫通
型受容体であり、推定的にヒトアミン受容体として同定
されているものである。本発明はまた、そのようなポリ
ペプチドの作用を阻害することに関する。 【０００２】 【従来の技術】多くの医学的に重要な生物学的プロセス
が、例えばｃＡＭＰ（レフコゥイッツ（Ｌefkowitz）、
Ｎature、３５１：３５３−３５４（１９９１））など
のＧ−タンパク質および／または第２メッセンジャーに
関するシグナルトランスダクション経路に関するタンパ
ク質によって媒介されていることはよく確立されてい
る。本明細書のこれらのタンパク質はＧ−タンパク質ま
たはＰＰＧタンパク質を有する経路に関与するタンパク
質をいう。これらのタンパク質の例にはアドレナリン作
用性薬剤およびドーパミンに関するＧＰＣ受容体（コビ
ルカ（Ｋobilka，Ｂ.Ｋ.）ら、ＰＮＡＳ、８４：４６−
５０（１９８７）；コビルカら、Ｓcience、２３８：６
５０−６５６（１９８７）；バンゾウ（Ｂunzow，Ｊ．
Ｒ.）ら、Ｎature、３３６：７８３−７８７（１９８
８））、Ｇ−タンパク質自身、エフェクタータンパク
質、例えば、ホスホリパーゼＣ、アデニルシクラーゼお
よびホスホジエステラーゼおよびアクチュエータータン
パク質（actuator proteins）、例えば、プロテインキ
ナーゼＡおよびプロテインキナーゼＣ（シモン（Ｓimo
n，Ｍ.Ｉ.）ら、Ｓcience、２５２：８０２−８（１９
９１））が含まれる。 【０００３】例えば、シグナルトランスダクションの一
形態において、ホルモン結合の効果は酵素、アデニル酸
シクラーゼの細胞内部での活性化である。ホルモンによ
る酵素の活性化はヌクレオチドＧＴＰの存在に依存し、
ついでＧＴＰはまた、ホルモン結合に影響を及ぼす。Ｇ
−タンパク質はホルモン受容体をアデニル酸シクラーゼ
に結合する。Ｇ−タンパク質はホルモン受容体によって
活性化されるとＧＴＰを結合したＧＤＰに交換すること
を示している。ついで、ＧＴＰ−運搬形態は活性化した
アデニレートシクラーゼに結合する。ＧＴＰからＧＤＰ
への加水分解はＧ−タンパク質自身によって触媒化さ
れ、その基本の不活性形態Ｇ−タンパク質へと戻す。従
って、Ｇ−タンパク質は受容体からのシグナルをエフェ
クター送る中間体としておよびシグナルの持続時間をコ
ントロールする時計としての２つの役割として機能す
る。 【０００４】Ｇ−タンパク質結合型受容体の膜タンパク
質遺伝子スーパーファミリーは推定の７回膜貫通ドメイ
ンを有するものとして特徴付けられている。該ドメイン
は細胞外または細胞質ループによって結合した膜貫通α
−ヘリックスを代表すると信じられている。Ｇ−タンパ
ク質結合受容体には広範囲の生物学的に活性のある受容
体、ホルモン、ウイルス、増殖因子および神経受容体な
どを含む。 【０００５】Ｇ−タンパク質結合型受容体は多様な酵
素、イオンチャンネルおよびトランスポーターにヘテロ
トリマーＧ−タンパク質により細胞内的に結合すること
ができる（例えば、ジョンソン（Ｊohnson）ら、Ｅnd
c.，Ｒev.、１０：３１７−３３１（１９８９）参
照）。異なるＧ−タンパク質α−サブユニットは、好ま
しくは細胞中の多様な生物学的機能を調節するための特
定のエフェクターを刺激する。Ｇ−タンパク質結合型受
容体の細胞室の残基は、Ｇ−タンパク質結合型受容体の
幾つかを結合したＧ−タンパク質の調節のための重要な
メカニズムである。Ｇ−タンパク質結合受容体は哺乳動
物宿主内の多数の部位において見いだされる。 【０００６】 【発明が解決しようとする課題】本発明のヒトアミン受
容体はＧ−タンパク質結合型受容体である。知覚神経機
能および運動神経機能は神経伝達によって行われる。神
経伝達とは、シナプス前ニューロンと呼ばれる１つのニ
ューロンからシナプス後ニューロンと呼ばれるもう１つ
のニューロンへ向かってシナプス間隙を横切る、神経イ
ンパルスの伝導である。シナプス間隙を横切る神経イン
パルス伝達には、神経伝達物質の分泌が伴う。該神経伝
達物質はシナプス前ニューロンにおいて小胞に封入され
て、シナプス間隙に放出され、シナプス後ニューロンに
あるその受容体を見つける。神経インパルスの伝達は通
常は一時的である。 【０００７】シナプス伝達の不可欠な特性は、神経伝達
物質放出に続く迅速な作用の終了である。カテコールア
ミン、セロトニンおよびある種のアミノ酸（例えばγ−
アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、グルタミン酸およびグリシン
など）を含む多くの神経伝達物質の場合、シナプス作用
の迅速な終了はシナプス前末端および周辺の神経膠細胞
への神経伝達物質の取り込みによって達成される。この
迅速な神経伝達物質の再蓄積は、シナプス前末端による
再取り込みの結果である。 【０００８】シナプス前末端では、再取り込みのための
種々の分子構造が、コリンや生物起源のアミン（ドーパ
ミン、ノルエピネフリン、エピネフリン、セロトニンお
よびヒスタミンなどの低分子量神経伝達物質）といった
神経伝達物質に対して高い特異性を持つ。これらの分子
装置は、トランスポーターと呼ばれる受容体である。こ
れらのトランスポーターは神経伝達物質をシナプス間隙
からシナプス前ニューロンの細胞膜を逆に横切ってシナ
プス前末端の細胞質内へ動かすことによって、これらの
物質の機能を終了させる。神経伝達物質の取り込みの阻
害または刺激は、内因性神経伝達物質の作用を調節する
手段を提供する。神経伝達物質は運動障害、精神分裂
病、薬物嗜癖、不安、偏頭痛、てんかん、ミオクローヌ
ス、痙性麻痺、筋痙攣、精神分裂病、認識障害、抑鬱症
状、パーキンソン病およびアルツハイマー病などを含む
多数の病理生理学および治療に関する。 【０００９】該トランスポーターによる神経伝達物質の
再取り込みは、ナトリウム依存性でありうる。例えばＧ
ＡＢＡトランスポーターは、最近記されたナトリウム依
存性神経伝達物質トランスポーター遺伝子ファミリーの
メンバーである。これらのトランスポーターは細胞外部
位、膜貫通部位および細胞内部位を持つ膜貫通型受容体
錯体である。ナトリウム依存性神経伝達物質トランスポ
ータータンパク質の全ファミリーの膜貫通ドメインにお
いてはかなりの程度のホモロジーが存在し、同一のアミ
ノ酸を有する区間がかなりあるが、これらのドメインに
つながっている細胞内ループおよび細胞外ループにおい
て認められるホモロジーははるかに低い。特に細胞外ル
ープは、各トランスポーターに独特であるように思われ
る。この領域は基質特異性および／またはインヒビター
特異性に寄与するあろう。 【００１０】 【課題を解決するための手段】本発明のポリペプチドは
推定的にアミン受容体として同定されている。本同定は
ラットアミン受容体へのアミノ酸配列ホモロジーの結果
なされている。本発明の一つの態様により、新規な成熟
受容体ポリペプチドならびに生物学的に活性であり、診
断上または治療上有用なそのフラグメント、アナログお
よび誘導体を提供する。本発明の受容体ポリペプチドは
ヒト起源のものである。本発明の別の態様により、ｍＲ
ＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡを含め、本発明
の受容体ポリペプチドをコードする単離された核酸分
子、さらにはまた、そのアンチセンスアナログ、ならび
に生物学的に活性であって、診断上または治療上有用な
そのフラグメントを提供する。 【００１１】本発明のさらなる態様により、該ポリペプ
チドの発現および連続回収を促進するような条件下で、
本発明の受容体ポリペプチドをコードする核酸配列を含
む組換え原核生物および／または真核生物宿主細胞を培
養することを含む、組換え技術によるそのような受容体
ポリペプチドの製造方法を提供する。本発明のさらに別
の態様により、そのような受容体ポリペプチドに対する
抗体を提供する。本発明の他の態様により、本発明の受
容体ポリペプチドに結合し該ポリペプチドの活性化を活
性化または阻害する化合物のスクリーニングの方法を提
供する。 【００１２】本発明のさらに別の態様により、本発明の
アミノ受容体の過少発現から引き起こされる異常な状態
の予防および／または処置のために本発明の受容体ポリ
ペプチドに結合し、活性化する、宿主に化合物を投与す
る方法を提供する。本発明の他の態様により、該ポリペ
プチドの過少発現または受容体ポリペプチドに対するリ
ガンドの過少発現に関する状態を治療するため、遺伝子
治療を介して本発明の受容体ポリペプチドを投与する方
法を提供する。 【００１３】本発明のさらに別の態様により、本発明の
アミン受容体の発現から引き起こされる状態の予防およ
び／または治療のため、本発明の受容体ポリペプチドに
結合し、該ポリペプチドの活性化を阻害する化合物を投
与する方法を提供する。本発明のさらに別の態様によ
り、本発明のポリヌクレオチドの配列に特異的にハイブ
リダイズするのに十分な長さの核酸分子を含む核酸プロ
ーブを提供する。本発明のさらに別の態様により、その
ようなポリペプチドをコードする核酸配列中の変異に関
する疾患を検出する診断アッセイおよび該受容体ポリペ
プチドの可溶性形態のレベルの変化を検出する診断アッ
セイを提供する。 【００１４】本発明のさらに別の態様により、科学的研
究、ＤＮＡの合成およびＤＮＡベクターの製造に関連し
たイン・ビトロでの目的のためにそのような受容体ポリ
ペプチドまたはそのようなポリペプチドをコードするポ
リヌクレオチドを利用する方法を提供する。本発明のこ
れらの態様および他の態様は、本明細書中の教示から当
業者に明らかであろう。 【００１５】以下の図面は、本発明の態様を説明するも
のであって、請求の範囲により包含される本発明の範囲
を限定しようとするものではない。本発明のアミン受容
体は哺乳動物細胞中に存在するアミン神経伝達物質の１
またはいずれかの再取り込みの責任を負ってよい。その
ようなアミントランスポーターの例には、これらに限る
ものではないが、ドーパミン、ノルエピネフリン、エピ
ネフリン、セロトニンおよびヒスタミンおよびＧＡＢ
Ａ、グリシン、グルタミン酸が含まれる他のアミノ神経
伝達物質が含まれる。本発明の一つの態様により、図１
〜図３（配列番号：２）の推定アミノ酸配列を有する成
熟ポリペプチド、または１９９５年６月１日にＡＴＣＣ
受託番号第９７１８１号として寄託されたクローンのc
ＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドをコードす
る、単離された核酸(ポリヌクレオチド)を提供する。 【００１６】本発明のポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチドはヒト単球において見いだされてよい。本発
明のポリヌクレオチドはヒトゲノムライブラリーにおい
て発見された。該ポリヌクレオチドはＧ−タンパク質結
合受容体ファミリーに構造上関連する。該ポリヌクレオ
チドは３３７アミノ酸残基のタンパク質をコードするオ
ープンリーディングフレームを含む。該タンパク質は３
３０アミノ酸にわたってマウスβ−１アドレナリン受容
体に３２.０９９％の同一性および５５.８６４％の類似
性を有して最も高いホモロジーを示す。該タンパク質は
また、３１２アミノ酸にわたって、ヒトドーパミンＤ2
受容体に３２％の同一性および５８.３３３％の類似性
を有してホモロジーを示す。 【００１７】本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形
で、またはＤＮＡの形であり得、このＤＮＡには、cＤ
ＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡが含まれる。該
ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得、また一本鎖で
あるなら、コーディング鎖または非コーディング(アン
チ−センス)鎖であり得る。成熟ポリペプチドをコード
するコーディング配列は、図１〜図３（配列番号：１）
に示すコーディング配列または寄託されたクローンのコ
ーディング配列と同じであってよく、あるいは遺伝コー
ドの重複または縮重の結果として、図１〜図３（配列番
号：１）のＤＮＡまたは寄託されたcＤＮＡと同じ成熟
ポリペプチドをコードする異なったコーディング配列で
あってもよい。 【００１８】図１〜図３（配列番号：２）の成熟ポリペ
プチドまたは寄託されたcＤＮＡによりコードされる成
熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドには、以
下のものが含まれ得る：成熟ポリペプチドのコーディン
グ配列のみ；成熟ポリペプチドのコーディング配列およ
び付加的コーディング配列；成熟ポリペプチドのコーデ
ィング配列(また場合により、付加的コーディング配
列)、および成熟ポリペプチドのコーディング配列のイ
ントロンまたは非コーディング配列５'および／または
３'といったような非コーディング配列。 【００１９】従って、「ポリペプチドをコードするポリ
ヌクレオチド」という用語は、ポリペプチドのコーディ
ング配列のみが含まれるポリヌクレオチド、さらにはま
た、付加的コーディングおよび／または非コーディング
配列が含まれるポリヌクレオチドを包含する。本発明は
さらに、図１〜図３（配列番号：２）の推定アミノ酸配
列を有するポリペプチドまたは寄託されたクローンのc
ＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフラグメン
ト、アナログおよび誘導体をコードする、上記のポリヌ
クレオチドの変異体に関する。ポリヌクレオチドの変異
体は、ポリヌクレオチドの天然に存在するアレル変異体
またはポリヌクレオチドの天然には存在しない変異体で
あり得る。 【００２０】従って、本発明には、図１〜図３（配列番
号：２）に示すのと同じ成熟ポリペプチドまたは寄託さ
れたクローンのcＤＮＡによりコードされる同じ成熟ポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチド、さらにはま
た、そのようなポリヌクレオチドの変異体が含まれ、こ
れらの変異体は、図１〜図３（配列番号：２）のポリペ
プチドまたは寄託されたクローンのcＤＮＡによりコー
ドされるポリペプチドのフラグメント、誘導体またはア
ナログをコードする。そのようなヌクレオチド変異体に
は、欠失変異体、置換変異体並びに付加および挿入変異
体が含まれる。 【００２１】先に示したように、該ポリヌクレオチド
は、図１〜図３（配列番号：１）に示すコーディング配
列の天然に存在するアレル変異体または寄託されたクロ
ーンのコーディング配列の天然に存在するアレル変異体
であるコーディング配列を有し得る。当該技術分野で知
られているように、アレル変異体は、１つまたはそれ以
上のヌクレオチドの置換、欠失または付加を有し得る別
の形のポリヌクレオチド配列であり、これは、コードさ
れるポリペプチドの機能を実質的には変えない。該ポリ
ヌクレオチドはまた、本発明の完全長のポリペプチドの
ＴＭおよび細胞内ドメインから開裂されているポリペプ
チドの細胞外部位であるアミン受容体ポリペプチドの可
溶性形態をコードしてもよい。 【００２２】本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明
のポリペプチドの精製を可能とするマーカー配列にイン
・フレームで融合したコーディング配列も有し得る。細
菌宿主の場合には、そのマーカー配列は、マーカーに融
合した成熟ポリペプチドの精製を提供するための、pＱ
Ｅ−９ベクターにより与えられるヘキサ−ヒスチジンタ
グ(tag)であってよく、または、哺乳動物宿主、例え
ば、ＣＯＳ−７細胞を使用する場合には、そのマーカー
配列は、赤血球凝集素(ＨＡ)タグであってよい。ＨＡタ
グは、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質から得ら
れるエピトープに対応する(ウィルソン（Ｗilson,Ｉ.）
ら、Ｃell、３７：７６７（１９８４）)。 【００２３】本発明の全長の遺伝子のフラグメントは、
全長のｃＤＮＡおよび該遺伝子に高い類似性を有するか
または同様の生物学的活性を有する他のｃＤＮＡを単離
するためのcＤＮＡライブラリーのハイブリダイゼーシ
ョンプローブとして使用してよい。このタイプのプロー
ブは、好ましくは少なくとも３０塩基を有し、例えば、
５０またはそれより多くの塩基を含んでいてよい。該プ
ローブはまた、全長の転写物およびゲノムクローンまた
は調節領域およびプロモーター領域、エクソンおよびイ
ントロンを含む完全な遺伝子を含むクローンに対応する
cＤＮＡクローンを同定するのに使用してよい。スクリ
ーニングの例には、オリゴヌクレオチドプローブを合成
するための公知のＤＮＡ配列を使用することによって該
遺伝子のコーディング領域を単離することを含む。本発
明の遺伝子の配列に相補的な配列を有する標識したオリ
ゴヌクレオチドはヒトcＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはmＲ
ＮＡのライブラリーをスクリーニングして該プローブが
ライブラリーのどのメンバーにハイブリダイズするのか
を決定するのに使用する。 【００２４】本発明はさらに、配列間に少なくとも７０
％、また好ましくは少なくとも９０％およびより好まし
くは少なくとも９５％の同一性がある場合に、上記の配
列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本
発明は特に、ストリンジェント条件下、上記のポリヌク
レオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドに関す
る。本明細書中で使用する場合、「ストリンジェント条
件」という用語は、配列間に少なくとも９５％、また好
ましくは少なくとも９７％の同一性がある場合にのみ、
ハイブリダイゼーションが起こるであろうことを意味す
る。好ましい態様では、上記のポリヌクレオチドにハイ
ブリダイズするポリヌクレオチドは、図１〜図３（配列
番号：１）のcＤＮＡもしくは寄託されたcＤＮＡにより
コードされる成熟ポリペプチドと実質的に同じ生物学的
機能もしくは活性を保持する、すなわち、ポリペプチド
が、例えば、第２メッセンジャー応答を引き起こすこと
によって膜結合アミン受容体として機能しないとして
も、該受容体のリガンドに結合することができる能力を
を保持することによって可溶性アミン受容体として機能
するポリペプチドをコードする。 【００２５】かわりに、該ポリペプチドは本発明のポリ
ヌクレオチドにハイブリダイズし、および該ポリヌクレ
オチドに上記に示すように同一性を有し、活性は保有し
ているかまたはいない少なくとも２０塩基、好ましくは
３０塩基およびより好ましくは少なくとも５０塩基を有
する。そのようなポリペプチドは配列番号：１のポリヌ
クレオチド、例えば該ポリヌクレオチドの回収のための
プローブとして、または診断プローブまたはＰＣＲプラ
イマーとして使用してよい。 【００２６】従って、本発明は配列番号：２のポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチドに少なくとも７０％
の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、およ
びより好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するポ
リヌクレオチドならびにそのフラグメント（該フラグメ
ントは少なくとも３０塩基および好ましくは少なくとも
５０塩基を有する）およびそのようなポリヌクレオチド
によりコードされるポリペプチドに関する。 【００２７】本明細書中でいう寄託は、特許手続上の微
生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約の条件の
下に保持されるであろう。これらの寄託は、単に当業者
への便宜として与えられるものであって、寄託が３５
Ｕ.Ｓ.Ｃ. §１１２下に要求されることを承認するもの
ではない。寄託された物質中に含まれるポリヌクレオチ
ドの配列、さらにはまた、それによりコードされるポリ
ペプチドのアミノ酸配列は、本明細書の一部を構成し
て、本明細書中の配列のいずれかの記載と矛盾する際に
は該寄託された物質中の配列が優先する。寄託された物
質を製造し、使用し、または販売するには、実施許諾が
要求され得、またそのような実施許諾は、ここでは付与
されない。 【００２８】本発明はさらに、図１〜図３（配列番号：
２）の推定アミノ酸配列を有する、または寄託されたc
ＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有するヒトア
ミン受容体ポリペプチド、さらにはまた、そのようなポ
リペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体に関
する。図１〜図３（配列番号：２）のポリペプチドまた
は寄託されたcＤＮＡによりコードされるポリペプチド
を示す場合、「フラグメント」、「誘導体」および「ア
ナログ」という用語は、そのようなポリペプチドと本質
的に同じ生物学的機能もしくは活性を保持する、すなわ
ち、アミン受容体として機能するかまたは、たとえ該ポ
リペプチドが例えば該受容体の可溶性形態などＧ−タン
パク質結合受容体として機能しないとしても該受容体の
リガンドに結合する能力を有するポリペプチドを意味す
る。本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天
然ポリペプチドまたは合成ポリペプチド、好ましくは組
換えポリペプチドであってよい。 【００２９】図１〜図３（配列番号：２）のポリペプチ
ドまたは寄託されたcＤＮＡによりコードされるポリペ
プチドのフラグメント、誘導体またはアナログは、
（ｉ）１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が同型または
非同型アミノ酸残基(好ましくは、同型アミノ酸残基)で
置換されており、またそのような置換アミノ酸残基が遺
伝コードによりコードされるものであってもよく、また
はコードされたものでなくてもよいもの、（ii）１つま
たはそれ以上のアミノ酸残基に置換基が含まれるもの、
または（iii）成熟ポリペプチドが、該ポリペプチドの
半減期を増加させる化合物(例えば、ポリエチレングリ
コール)のような、他の化合物と融合しているもの、ま
たは（iv）成熟ポリペプチドの精製に使用される付加的
アミノ酸が成熟ポリペプチドに融合しているもの（v）
該ポリペプチドのフラグメントが可溶性であり、すなわ
ち膜結合ではないが膜結合受容体に対するリガンドを結
合するものであり得る。そのようなフラグメント、誘導
体およびアナログは、本明細書中の教示から当業者の範
囲内であると思われる。 【００３０】本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオ
チドは、単離された形で提供されるのが好ましく、好ま
しくは、均一となるまで精製される。本発明のポリペプ
チドは配列番号：２のポリペプチドならびに配列番号：
２のポリペプチドに少なくとも７０％の類似性（好まし
くは少なくとも７０％の同一性）およびより好ましくは
少なくとも９０％の類似性（より好ましくは少なくとも
９０％の同一性）およびさらになおより一層好ましくは
９５％の類似性（さらになお好ましくは、少なくとも９
５％の同一性）を有する配列番号：２のポリペプチドを
含み、また、そのようなポリペプチドの部分をも含み、
そのようなポリペプチドの部分は一般的には少なくとも
３０アミノ酸およびより好ましくは少なくとも５０アミ
ノ酸を含む。 【００３１】当該技術分野において知られているよう
に、２つのポリペプチドの間の「類似性」は、１つのポ
リペプチドのアミノ酸配列およびその保存されたアミノ
酸置換基を第２のポリペプチドの配列に対して比較する
ことにより決定される。本発明のポリペプチドのフラグ
メントまたは一部は、ペプチド合成による対応する完全
長のポリペプチドを調製するのに使用してよい；それゆ
え、該フラグメントは完全長ポリペプチドを産生するた
めの中間体として使用されてよい。本発明のポリヌクレ
オチドのフラグメントまたは一部は、本発明の完全長ポ
リヌクレオチドを合成するために使用してよい。 【００３２】「遺伝子」なる語は、ポリペプチド鎖を産
生することに関するＤＮＡセグンメントを意味する：コ
ーディング領域の前および後に続く領域（リーダーおよ
びトレーラー）ならびに個々のコーディングセグメント
（エクソン）間の介在配列（イントロン）を含む。「単
離された」という用語は、物質がその元の環境(例え
ば、それが天然に存在するなら、天然の環境)から除去
されていることを意味する。例えば、生存動物中にある
天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは
単離されていないが、天然の系における共存物質のいく
つかまたは全てから分離された同じポリヌクレオチドま
たはポリペプチドは単離されている。そのようなポリヌ
クレオチドはベクターの一部となり得、および／または
そのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは組成
物の部分となり得、またそのようなベクターまたは組成
物はその天然の環境の一部ではないという点で、なお単
離されている。 【００３３】本発明のポリペプチドは配列番号：２のポ
リペプチドならびに配列番号：２のポリペプチドに少な
くとも７０％の類似性（好ましくは少なくとも７０％の
同一性）およびより好ましくは少なくとも９０％の類似
性（より好ましくは少なくとも９０％の同一性）および
さらになおより一層好ましくは９５％の類似性（さらに
なお好ましくは、少なくとも９５％の同一性）を有する
配列番号：２のポリペプチドを含み、また、そのような
ポリペプチドの部分をも含み、そのようなポリペプチド
の部分は一般的には少なくとも３０アミノ酸およびより
好ましくは少なくとも５０アミノ酸を含む。 【００３４】当該技術分野において知られているよう
に、２つのポリペプチドの間の「類似性」は、１つのポ
リペプチドのアミノ酸配列およびその保存されたアミノ
酸置換基を第２のポリペプチドの配列に対して比較する
ことにより決定される。本発明のポリペプチドのフラグ
メントまたは一部は、ペプチド合成による対応する完全
長のポリペプチドを調製するのに使用してよい；それゆ
え、該フラグメントは完全長ポリペプチドを産生するた
めの中間体として使用されてよい。本発明のポリヌクレ
オチドのフラグメントまたは一部は、本発明の完全長ポ
リヌクレオチドを合成するために使用してよい。 【００３５】本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド
が含まれるベクター、本発明のベクターで遺伝的に操作
された宿主細胞、および本発明のポリペプチドの組換え
技術による製造にも関する。宿主細胞は、例えば、クロ
ーニングベクターまたは発現ベクターであり得る本発明
のベクターで遺伝的に操作される（トランスデュースさ
れ、または形質転換され、またはトランスフェクトされ
る）。該ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒
子、ファージ等の形であり得る。操作された宿主細胞
は、プロモーターを活性化し、トランスフォーマントを
選択し、または本発明の遺伝子を増幅するのに適するよ
う改変された従来の栄養培地で培養することができる。
温度、ｐＨ等といったような培養条件は、発現用に選択
された宿主細胞で先に使用した培養条件であって、当業
者に明らかであろう。 【００３６】本発明のポリヌクレオチドは、ポリペプチ
ドを組換え技術により製造するのに使用することができ
る。従って、例えば、該ポリヌクレオチドを、ポリペプ
チドを発現するための様々な発現ベクターのいずれか１
つに含ませることができる。そのようなベクターには、
染色体、非染色体および合成ＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ
４０の誘導体；細菌プラスミド；ファージＤＮＡ；バキ
ュロウイルス；酵母プラスミド；プラスミドとファージ
ＤＮＡとの組合せから得られるベクター；ワクシニア、
アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病といったよ
うなウイルスＤＮＡが含まれる。しかし、他のいずれの
ベクターも、それが宿主中で複製可能であって、生存可
能である限り、使用することができる。 【００３７】適当なＤＮＡ配列を様々な方法によりベク
ターに挿入することができる。一般には、ＤＮＡ配列を
当業界で公知の方法により適当な制限エンドヌクレアー
ゼ部位に挿入する。そのような方法および他の方法は、
当業者の範囲内であると思われる。発現ベクターのＤＮ
Ａ配列は、適当な発現制御配列（プロモーター）に作動
可能に結合し、ｍＲＮＡ合成を行う。そのようなプロモ
ーターの代表例として、以下のものが挙げられる：ＬＴ
ＲまたはＳＶ４０プロモーター、大腸菌(Ｅ．coli)、la
cまたはtrp、ファージラムダＰLプロモーター、および
原核もしくは真核細胞またはそれらのウイルスでの遺伝
子の発現を制御することが知られている他のプロモータ
ー。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム
結合部位および転写終結区も含む。該ベクターはまた、
発現を増幅するのに適当な配列も含み得る。 【００３８】さらに、発現ベクターは、真核細胞培養の
場合にはジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン
耐性といったような、または大腸菌ではテトラサイクリ
ンまたはアンピシリン耐性といったような、形質転換さ
れた宿主細胞の選択のための表現型特性を与えるため
に、１つまたはそれ以上の選択可能なマーカー遺伝子を
含むのが好ましい。上記のような適当なＤＮＡ配列、さ
らにはまた、適当なプロモーターまたは制御配列を含む
ベクターを、適当な宿主を形質転換するために使用し
て、その宿主がタンパク質を発現するのを可能にするこ
とができる。 【００３９】適当な宿主の代表例として、以下のものが
挙げられる：大腸菌、ストレプトマイセス（Streptomyc
es）、サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typ
himurium）といったような細菌細胞；酵母のような真菌
細胞；Drosophila Ｓ２およびSpodoptera Ｓｆ９といっ
たような昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳまたはBowesメラノ
ーマといったような動物細胞；アデノウイルス；植物細
胞等。適当な宿主の選択は、本明細書中の教示から当業
者の範囲内であると思われる。 【００４０】とりわけ、本発明にはまた、先に広く記載
した配列を１つまたはそれ以上含む組換え構築物も含ま
れる。その構築物は、本発明の配列が順または逆方向で
挿入されている、プラスミドまたはウイルスベクターと
いったようなベクターを含む。この実施態様の好ましい
態様では、該構築物はさらに、例えば、該配列に作動可
能に結合したプロモーターを含め、制御配列を含む。適
当なベクターおよびプロモーターが多数、当業者に知ら
れており、市販されている。以下のベクターを例として
挙げる。細菌用：pＱＥ７０、pＱＥ６０、pＱＥ−９
（キアゲン（Ｑiagen））、pＢＳ、pＤ１０、ファージ
スクリプト（phagescript）、psiＸ１７４、pbluescrip
t ＳＫ、pbsks、pＮＨ８Ａ、pＮＨ１６a、pＮＨ１８
Ａ、pＮＨ４６Ａ（ストラタジーン（Ｓtratagene））；
pＴＲＣ９９a、pＫＫ２２３−３、pＫＫ２３３−３、p
ＤＲ５４０、pＲＩＴ５（ファルマシア（Ｐharmaci
a））。真核生物用：pＷＬＮＥＯ、pＳＶ２ＣＡＴ、pＯ
Ｇ４４、pＸＴ１、pＳＧ（ストラタジーン）、pＳＶＫ
３、pＢＰＶ、pＭＳＧ、pＳＶＬ（ファルマシア）。し
かし、他のいずれのプラスミドまたはベクターも、それ
らが宿主中で複製可能であって、生存可能である限り、
使用することができる。 【００４１】プロモーター領域は、ＣＡＴ（クロラムフ
ェニコールトランスフェラーゼ）ベクターまたは選択可
能なマーカーを有する他のベクターを用いて、いずれか
の所望の遺伝子から選択することができる。２つの適当
なベクターは、ＰＫＫ２３２−８およびＰＣＭ７であ
る。個々に名付けられた細菌プロモーターには、lac
Ｉ、lacＺ、Ｔ３、Ｔ７、gpt、ラムダＰR、ＰLおよびtr
pが含まれる。真核プロモーターには、ＣＭＶ前初期（i
mmediate early）、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期およ
び後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来のＬＴＲ、および
マウスのメタロチオネイン−Ｉが含まれる。適当なベク
ターおよびプロモーターの選択は、十分、当業者のレベ
ルの範囲内である。 【００４２】さらなる態様では、本発明は、上記の構築
物を含む宿主細胞に関する。その宿主細胞は、哺乳動物
細胞のような高等真核細胞、酵母細胞のような下等真核
細胞であり得て、または該宿主細胞は、細菌細胞のよう
な原核細胞であり得る。構築物の宿主細胞への導入は、
リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥデキ
ストラン媒介トランスフェクションまたはエレクトロポ
レーションにより行うことができる。（デイビス（Ｄav
is，Ｌ.）、ディブナー（Ｄibner，Ｍ.）、バッティー
（Ｂattey，Ｉ.）、ベーシック・メソッズ・イン・モレ
キュラー・バイオロジー（Ｂasic Ｍethods in Ｍolecu
lar Ｂiology）（１９８６））。 【００４３】宿主細胞中の構築物を通常の方法で使用し
て、組換え配列によりコードされる遺伝子産物を製造す
ることができる。あるいはまた、本発明のポリペプチド
は、従来のペプチド合成装置により合成的に製造するこ
とができる。成熟タンパク質は、適当なプロモーターの
制御下、哺乳動物細胞、酵母、細菌、または他の細胞中
で発現させることができる。そのようなタンパク質を、
本発明のＤＮＡ構築物から得られるＲＮＡを用いて製造
するために、無細胞翻訳系もまた使用することができ
る。原核および真核生物宿主で使用するのに適当なクロ
ーニングおよび発現ベクターは、サンブルック（Ｓambr
ook）ら、モレキュラー・クローニング（Ｍolecular Ｃ
loning）：ア・ラボラトリー・マニュアル（ＡＬaborat
ory Ｍanual）、第２版、コールド・スプリング・ハー
バー（Ｃold Ｓpring Ｈarbor）、ニューヨーク、（１
９８９）により記載されており、この開示は、本明細書
の一部を構成する。 【００４４】本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ
の高等真核生物による転写は、エンハンサー配列をベク
ターに挿入することにより増加する。エンハンサーは、
プロモーターに作用してその転写を増加させる、通常、
約１０〜３００bpの、ＤＮＡのシス作用性要素である。
例には、bp １００〜２７０の、複製起点の後期側にあ
るＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プ
ロモーターエンハンサー、複製起点の後期側にあるポリ
オーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサ
ーが含まれる。 【００４５】通例、組換え発現ベクターには、複製起
点、および宿主細胞の形質転換を可能にする選択可能な
マーカー、例えば、大腸菌のアンピシリン耐性遺伝子お
よびサッカロミセス・セレビシエ（S. cerevisiae） Ｔ
ＲＰ１遺伝子、並びに下流の構造配列の転写を行わせる
ために高度に発現される遺伝子から得られるプロモータ
ーが含まれるであろう。そのようなプロモーターは、と
りわけ、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）の
ような解糖系酵素、α−因子、酸性ホスファターゼ、ま
たは熱ショックタンパク質などをコードするオペロンか
ら得ることができる。ヘテロロガス構造配列は、翻訳開
始および終結配列と共に、適当な相（phase）で構築さ
れる。場合により、そのヘテロロガス配列は、所望の特
性、例えば、発現された組換え産物の安定化または精製
の簡易化を与えるＮ−末端同定ペプチドが含まれる融合
タンパク質をコードすることができる。 【００４６】細菌で使用するのに有用な発現ベクター
は、所望のタンパク質をコードする構造ＤＮＡ配列を、
適当な翻訳開始および終結シグナルと共に、機能的なプ
ロモーターを有する作動可能なリーディング相に挿入す
ることにより構築される。そのベクターは、ベクターの
維持を確実なものとするために、また所望により、宿主
内での増幅を与えるために、１つまたはそれ以上の表現
型の選択可能なマーカーおよび複製起点を含むであろ
う。形質転換に適当な原核宿主には、大腸菌、バシラス
・サチリス（Bacillus subtilis）、サルモネラ・ティ
フィムリウム、ならびにシュードモナス（Pseudomona
s）属、ストレプトマイセス属、およびスタフィロコッ
カス（Staphylococcus）属の範囲内の様々な種が含まれ
るが、他のものもまた、選択物質として使用することが
できる。 【００４７】代表的であるが、非限定的な例として、細
菌で使用するのに有用なベクターは、よく知られたクロ
ーニングベクター pＢＲ３２２（ＡＴＣＣ ３７０１
７）の遺伝要素を含む市販のプラスミドから得られる、
選択可能なマーカーおよび細菌の複製起点を含み得る。
そのような市販のベクターには、例えば、pＫＫ２２３
−３（ファルマシア・ファイン・ケミカルズ（Ｐharmac
ia Ｆine Ｃhemicals）、ウプサラ（Ｕppsala）、スウ
ェーデン）およびＧＥＭ１（プロメガ・バイオテク（Ｐ
romega Ｂiotec）、マディソン、ウィスコンシン、米
国）が含まれる。これらのpＢＲ３２２「骨核」部分を
適当なプロモーターおよび発現されるべき構造配列と組
み合わせる。 【００４８】適当な宿主株を形質転換して、その宿主株
を適当な細胞密度まで増殖させた後、選択されたプロモ
ーターを適当な方法（例えば、温度シフトまたは化学誘
導）により誘導して、細胞をさらなる期間培養する。細
胞を、典型的には、遠心分離により収集し、物理的また
は化学的方法により破壊して、その結果得られた粗製の
抽出物を更なる精製のために保持する。タンパク質の発
現に使用される微生物細胞は、凍結−解凍サイクル、超
音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を含
め、いずれの便利な方法によっても破壊でき、そのよう
な方法は、当業者に周知である。 【００４９】組換えタンパク質を発現させるために、様
々な哺乳動物細胞培養系もまた使用することができる。
哺乳動物発現系の例には、ガルツマン（Ｇluzman）、Ｃ
ell、２３：１７５（１９８１）により記載されてい
る、サルの腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７系、および適合
可能なベクターを発現させることができる他の細胞系、
例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨeＬaおよびＢＨ
Ｋ細胞系が含まれる。哺乳動物発現ベクターは、複製起
点、適当なプロモーターおよびエンハンサー、またいず
れかの必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部
位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、転写終
結配列、および５’に隣接する非転写配列もまた含むで
あろう。ＳＶ４０のスプライシングから得られるＤＮＡ
配列、およびポリアデニル化部位を使用して、必要とさ
れる非転写遺伝要素を与えることができる。 【００５０】ヒトアミン受容体ポリペプチドは、硫酸ア
ンモニウムまたはエタノール沈降、酸抽出、陰イオンま
たは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロー
スクロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフ
ィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシ
ルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロ
マトグラフィーが含まれる方法により、組換え細胞培養
物から回収して、精製することができる。必要に応じ
て、タンパク質の再生工程を、成熟タンパク質の立体配
置を完成するのに使用することができる。最後に、高性
能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を最終精製工程
に使用することができる。 【００５１】本発明のポリペプチドは、天然に精製され
た産物、もしくは化学合成法の産物であり得るか、また
は原核もしくは真核宿主から（例えば、培養物中の細
菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞によっ
て）組換え技術により製造することができる。組換え製
造方法で使用する宿主により、本発明のポリペプチド
は、グリコシル化され得るか、またはグリコシル化され
得ない。本発明のポリペプチドにはまた、最初のメチオ
ニンアミノ酸残基が含まれ得る。 【００５２】全長のヒトアミントランスポーター遺伝子
のフラグメントは、全長の遺伝子および該遺伝子に高い
類似性を有するかまたは同様の生物学的活性を有する他
の遺伝子を単離するためのcＤＮＡライブラリーのハイ
ブリダイゼーションプローブとして使用してよい。この
タイプのプローブは、少なくとも２０塩基、好ましくは
少なくとも３０塩基、最も好ましくは少なくとも５０ま
たはそれより多くの塩基を含んでいてよい。該プローブ
はまた、全長の転写物およびゲノムクローンまたは調節
領域およびプロモーター領域、エクソンおよびイントロ
ンを含む完全なヒトアミントランスポーター遺伝子を含
むクローンに対応するcＤＮＡを同定するのに使用して
よい。スクリーニングの例には、オリゴヌクレオチドプ
ローブを合成するため公知のＤＮＡ配列を使用すること
によって、ヒトアミントランスポーター遺伝子のコーデ
ィング領域を単離することを含む。本発明の遺伝子の配
列に相補的な配列を有する標識したオリゴヌクレオチド
はヒトcＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはmＲＮＡのライブラ
リーをスクリーニングして該プローブがライブラリーの
どのメンバーにハイブリダイズするのかを決定するのに
使用する。 【００５３】本発明は、本発明のヒトアミン受容体によ
って輸送されるアミン神経伝達物質を決定する方法を提
供する。これらの神経伝達物質を同定するアッセイの一
例では、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼをコードする組換え
ワクシニアウイルスＶＴＦ−７株に哺乳動物細胞を感染
させた後、ベクター（例えばpＢＳＳＫII（−））を使
用して、リポソーム媒介トランスフェクション法で、本
発明のアミン受容体遺伝子に感染させる。等量のベクタ
ーのみを用いて、対照トランスフェクションをも行な
う。アッセイは、トランスフェクションの８時間後に、
改良クレブス-リンゲル-ＨＥＰＥＳ緩衝液中で行なう。
ついで、細胞を［3Ｈ］神経伝達物質（例えばＧＡＢ
Ａ、ドーパミン、セロトニンなど）と共に培養する。細
胞を氷上に置くことによって取り込みを停止させる。細
胞を１％ＳＤＳ中で可溶化し、蓄積した放射能の量を液
体シンチレーションカウンティングで決定する。各アッ
セイについてpＢＳＳＫIIによる対照トランスフェクシ
ョンを用いてバックグラウンドを測定し、特定のアミン
神経伝達物質について決定したシグナルからその値を差
し引くことによって、有意な量が取り込まれていたら、
その特定の神経伝達物質が本発明のヒトアミン受容体に
よって取り込まれることが確定される。 【００５４】本発明は、アミン受容体をコードするｍＲ
ＮＡの存在を検出することによる、細胞表面における本
発明のアミン受容体の発現を検出する方法をも提供す
る。この方法では、当該技術分野においてよく知られた
方法で細胞から総ｍＲＮＡを得て、そのようにして得ら
れたｍＲＮＡを、少なくとも１０ヌクレオチドからな
り、かつ、本発明のヒトアミン受容体をコードする核酸
分子の配列内に含まれる配列と特異的にハイブリダイズ
することのできる核酸プローブと、ハイブリダイズ条件
下に接触させ、該プローブにハイブリダイズしたｍＲＮ
Ａの存在を検出し、それによってその細胞によるアミン
受容体の発現を検出する。ｍＲＮＡ分子などの標的核酸
分子に対するプローブのハイブリダイゼーションには、
当該技術分野において公知の技術を使用する。しかし、
本発明の一態様では、溶解した細胞から沈殿によって核
酸を抽出し、ｍＲＮＡ分子のポリＡテールを結合するカ
ラムを用いて、その抽出物からｍＲＮＡを単離する。次
に、ニトロセルロース膜上でそのｍＲＮＡを、放射能で
標識したプローブにさらす。この際、プローブは相補的
なｍＲＮＡ配列にハイブリダイズすることによって、そ
の相補的ｍＲＮＡ配列を標識する。結合はオートラジオ
グラフィーまたはシンチレーションカウンティングによ
って検出できる。しかし、これらの段階を行なう他の方
法も当業者には良く知られている。 【００５５】別法として、ヒトアミン受容体に対する抗
体を、該トランスポーターに該抗体が結合し、かつ、細
胞表面におけるその受容体の存在を検出することのでき
る条件下に使用してもよい。そのような方法は、ある所
定の細胞がアミン受容体の発現に欠陥を持つか否かを決
定するために使用してよい。検出法としては、抗体に結
合した蛍光マーカーが挙げられる。 【００５６】本発明は、ヒトアミン受容体に特異的に結
合しうることが知られていない化合物が、ヒトアミン受
容体に特異的に結合できるか否かを決定する方法であっ
て、哺乳動物細胞での発現に適合させたプラスミド（こ
のプラスミドは細胞表面に該アミン受容体を発現させる
ＤＮＡをも含有する）を含む哺乳動物細胞を、アミン受
容体に結合することがわかっているリガンドの結合が可
能な条件下に、上記化合物と接触させ、該哺乳動物アミ
ン受容体に結合した化合物の存在を検出することからな
り、結合した化合物が存在すれば、該化合物がヒトアミ
ン受容体に特異的に結合できることが示されるという方
法をも提供する。 【００５７】本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプ
チドは研究試薬およびヒトの疾患の治療剤および診断薬
の発見のための道具として使用してよい。本発明のアミ
ン受容体は本発明の受容体ポリペプチドの活性化を活性
化する（アゴニスト）または活性化を阻害する（アンタ
ゴニスト）化合物をスクリーニングする工程において使
用してよい。 【００５８】概して、そのようなスクリーニング手段は
本発明の受容体ポリペプチドをその表面に発現する適切
な細胞を提供することに関する。そのような細胞は哺乳
動物、酵母、ショウジョウバエまたは大腸菌からの細胞
を含む。特に、本発明の受容体をコードするポリヌクレ
オチドは細胞をトランスフェクションし、それによって
該アミン受容体を発現する。ついで、該発現された受容
体を試験化合物と接触させ、結合、機能的な応答の刺激
または阻害を観察する。そのようなスクリーニングの手
法の一つは本発明のアミン受容体を発現するためトラン
スフェクションする黒色素胞の使用に関する。そのよう
なスクリーニング技術は１９９２年２月６日に発行され
たＰＣＴ ＷＯ９２／０１８１０において記載されてい
る。 【００５９】従って、例えば、そのようなアッセイを該
受容体をコードする黒色素胞を受容体リガンドおよびス
クリーニングすべき化合物の両方と接触させることによ
って本発明の受容体ポリペプチドの活性化を阻害する化
合物のスクリーニングのために使用してよい。該リガン
ドによって産生されたシグナルの阻害は該化合物が該受
容体に対する潜在的なアンタゴニストである、すなわち
該受容体の活性化を抑制することを示している。該スク
リーニングはそのような細胞とスクリーニングされるべ
き化合物を接触させることによって該受容体を活性化す
る化合物を決定するおよび、そのような化合物がシグナ
ルを産生する、すなわち該受容体を活性化するか否かを
決定するために使用してよい。 【００６０】他のスクリーニング技術には、例えば、Ｓ
cience、Ｖolume ２４６、１８１−２９６（１９８９年
１０月）に記載されているように受容体の活性化によっ
て引き起こされる細胞外ｐＨの変化を測定する系におい
て、該アミン受容体を発現する細胞（例えば、トランス
フェクションされたＣＨＯ細胞）の使用を含む。例え
ば、化合物は本発明の受容体ポリペプチドを発現する細
胞に接触し、ついで第二メッセンジャー応答、例えばシ
グナルトランスダクションまたはｐＨの変化などが該可
能性のある化合物が該受容体を活性化するかまたは阻害
するかを決定するため測定してよい。 【００６１】他のそのようなスクリーニング技術は該ア
ミン受容体をコードするＲＮＡをツメガエル（Ｘenopu
s）の卵母細胞に導入して該受容体を位置時的に発現さ
せることに関する。ついで、該受容体卵母細胞を該受容
体リガンドおよびスクリーニングすべき化合物に接触さ
せ、該受容体の活性化を阻害すると考えられている化合
物のスクリーニングの場合においてカルシウムシグナル
の抑制または活性化の検出を行ってよい。 【００６２】他のスクリーニング技術には、該受容体が
ホスホリパーゼＣまたはＤに結合した該アミン受容体を
発現することに関する。そのような細胞の代表的な例と
して、内皮細胞、平滑筋細胞、胎児腎臓細胞などが挙げ
られる。該スクリーニング上記のようにホスホリパーゼ
第二シグナルからの受容体の活性化または活性化の阻害
を検出することによって行われてよい。 【００６３】他の方法は、その表面に受容体を有する細
胞に対する標識されたリガンドの結合の阻害を決定する
ことによって、本発明のアンタゴニスト受容体ポリペプ
チドの活性化を抑制する化合物のスクリーニングに関す
る。そのような方法は真核生物細胞を該細胞がその表面
に該受容体を発現するようなアミン受容体をコードする
ＤＮＡとトランスフェクションすることおよび該細胞を
公知のリガンドの標識された形態の存在下の化合物と接
触させることに関する。該リガンドは例えば、放射能な
どで標識することができる。標識された該受容体に結合
したリガンドの量は、例えば該受容体の放射能を測定す
ることによって測定する。該化合物が該受容体に結合す
る標識されたリガンドの量の減少によって決定されるな
ら、該受容体に対する標識されたリガンドの結合は阻害
される。 【００６４】アミン受容体は哺乳動物宿主においていた
るところに存在しており、多くの病理学を含む多くの生
物学的機能に責任を負っている。従って、一方でアミン
受容体を刺激する化合物および薬剤を見いだし、他方で
アミン受容体の機能を抑制することができる化合物およ
び薬剤を見いだすことは望ましい。本発明のアミン受容
体に結合し抑制する化合物の例には抗体、場合によって
は該アミン受容体に結合し、該アミン受容体の活性が保
存されるような第二メッセンジャー応答を引き出しては
いないオリゴペプチドを含む。 【００６５】抗体には抗体の抗原結合部位に一般的に関
する独特の決定要因を認識する抗イディオタイプ抗体を
含む。他の例には該アミン受容体のリガンドに密接に関
連しているタンパク質、すなわちリガンドのフラグンメ
ントであって生物学的機能は喪失しており、該アミン受
容体に結合する場合には、何の応答も引き出さないタン
パク質を含む。 【００６６】アンチセンス技術の利用によって調製され
たアンチセンス構築物は、三重らせん形成またはアンチ
センスＤＮＡもしくはＲＮＡによって（この方法は両方
とも、ポリヌクレオチドのＤＮＡまたはＲＮＡへの結合
に基づく）ことによって遺伝子発現を制御するために使
用してよい。例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコー
ドする、ポリヌクレオチド配列の５'コーディング部位
を使用して、長さ約１０〜４０塩基対のアンチセンスＲ
ＮＡオリゴヌクレオチドを設計する。ＤＮＡオリゴヌク
レオチドを、転写に関与する遺伝子領域に対して相補的
であるよう設計し(三重らせん−リー（Ｌee）ら、Ｎuc
l.Ａcids Ｒes.、６：３０７３（１９７９）；クーニー
（Ｃooney）ら、Ｓcience、２４１：４５６（１９８
８）；およびダーバン（Ｄervan）ら、Ｓcience、２５
１：１３６０（１９９１）を参照)、そのことによっ
て、転写およびアミン受容体の産生を妨げる。アンチセ
ンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、イン・ビボにおいて
mＲＮＡにハイブリダイズして、mＲＮＡ分子のアミン受
容体への翻訳をブロックする(アンチセンス−オカノ(Ｏ
kano)、Ｊ. Ｎeurochem.、５６：５６０（１９９１）；
オリゴデオキシヌクレオチズ・アズ・アンチセンス・イ
ンヒビターズ・オブ・ジーン・エクスプレッション（Ｏ
ligodeoxynucleotides as Ａntisense Ｉnhibitors of
Ｇene Ｅxpression）、ＣＲＣプレス（ＣＲＣ Ｐres
s）、ボカ・レイトン（Ｂoca Ｒaton）、フロリダ（１
９８８）)。上記のオリゴヌクレオチドをまた、細胞に
送り込むことから、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡを
イン・ビボにおいて発現させて、アミン受容体の産生を
阻害することができる。 【００６７】該アミン受容体に結合する小分子は、例え
ば、小ペプチドまたはペプチド様分子などの通常の生物
学的活性が妨害されているようにリガンドに接近できな
いようにして、本発明の受容体ポリペプチドの活性化を
阻害すためにも使用してよい。該アミン受容体の可溶性
形態、例えば受容体のフラグメントなどは、本発明の受
容体ポリペプチドに該リガンドを結合し膜結合アミン受
容体と相互作用することからリガンドを妨害することに
よって該受容体を活性化することを抑制するのに使用し
てよい。 【００６８】本発明は、さらに本発明のアミン受容体の
発現に関する異常な状態を処置する方法を提供し、被験
体に上記の阻害性化合物をヒトアミン受容体が該受容体
に特異的に結合することができるように結合するのに有
効な量で製薬学的に許容し得る担体とともに投与し、そ
の投与には、ヒトアミン受容体に特異的に結合しうるこ
とが知られていない化合物が、ヒトアミン受容体に特異
的に結合できるか否かを決定する方法であって、哺乳類
細胞での発現に適合させたプラスミド（このプラスミド
は細胞表面にアミン受容体を発現させるＤＮＡをも含有
する）を含む哺乳類細胞を、アミン受容体に結合するこ
とがわかっているリガンドの結合が可能な条件下に、上
記化合物と接触させ、その哺乳類アミン受容体に結合し
た化合物の存在を検出することからなり、結合した化合
物が存在すれば、その化合物がヒトアミン受容体に特異
的に結合できることが示されるという方法をも提供す
る。 【００６９】本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプ
チドは研究試薬およびヒトの疾患の治療剤および診断薬
の発見のための道具として使用してよい。本発明のアミ
ン受容体は本発明の受容体ポリペプチドの活性化を活性
化する（アゴニスト）または活性化を阻害する（アンタ
ゴニスト）化合物をスクリーニングする工程において使
用してよい。 【００７０】概して、そのようなスクリーニング手段は
本発明の受容体ポリペプチドをその表面に発現する適切
な細胞を提供することに関する。そのような細胞は哺乳
動物、酵母、ショウジョウバエまたは大腸菌からの細胞
を含む。特に、本発明の受容体をコードするポリヌクレ
オチドは細胞をトランスフェクションし、それによって
該アミン受容体を発現する。本発明はまた、本発明の医
薬組成物の成分を１つまたはそれ以上充填した、１つま
たはそれ以上の容器を含む医薬品パックまたはキットも
提供する。そのような容器に関連して、製薬学的または
生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府当
局により規定された形の通知を付してもよく、この通知
は、ヒトへの投与のための製造、使用または販売の、該
当局による承認を表わす。さらに、該医薬組成物は、他
の治療化合物と共に使用することができる。 【００７１】該医薬組成物は、経口、局所、静脈内、腹
腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内または皮内経路といったよ
うな、便利な方法で投与することができる。該医薬組成
物は、具体的な徴候を治療および／または予防するのに
有効な量で投与される。一般に、それらは、少なくとも
約１０μg／kg（体重）の量で投与され、たいていの場
合、それらは、１日当たり約８mg／kg（体重）を超えな
い量で投与されるであろう。ほとんどの場合、投与経路
および症状等を考慮に入れて、投薬量は、毎日約１０μ
g／kg〜約１mg／kg（体重）である。 【００７２】ポリペプチドであるヒトアミン受容体およ
びアゴニストおよびアンタゴニスト化合物はまた、「遺
伝子治療」と呼ばれることが多い、そのようなポリペプ
チドのイン・ビボにおける発現により、本発明に従って
使用してよい。従って、例えば、患者由来の細胞を、エ
クス・ビボにおいてポリペプチドをコードするポリヌク
レオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）で操作した後、操作し
た細胞を該ペプチドで処置すべき患者に与える。そのよ
うな方法は、当該技術分野でよく知られている。例え
ば、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレ
トロウイルス粒子の使用によって、細胞を当該技術分野
でよく知られた方法により操作することができる。 【００７３】同様に、例えば、当該技術分野で公知の方
法により、ポリペプチドのイン・ビボにおける発現のた
めに、細胞をイン・ビボにおいて操作することができ
る。当該技術分野において知られているように、細胞を
イン・ビボにおいて操作してポリペプチドをイン・ビボ
において発現させるために、本発明のポリペプチドをコ
ードするＲＮＡを含むレトロウイルス粒子を製造するた
めのプロデューサー細胞を患者に投与することができ
る。そのような方法により本発明のポリペプチドを投与
するためのこれらの方法および他の方法は、本発明の教
示から当業者に明らかであろう。例えば、細胞を操作す
るための発現ビヒクルは、レトロウイルス以外のもの、
例えば、適当な運搬ビヒクルと組み合わせた後、細胞を
イン・ビボにおいて操作するために使用することができ
るアデノウイルスであってもよい。 【００７４】前記レトロウイルスプラスミドベクターが
由来するレトロウイルスは、以下に限られるものではな
いが、モロニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイル
ス、レトロウイルス、例えば、ラウス肉腫ウイルス、ハ
ーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、テナガザル
白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、アデノウイル
ス、骨髄増殖肉腫ウイルスおよび乳癌ウイルスを含む。
１つの態様において、レトロウイルスプラスミドベクタ
ーは、モロニーマウス白血病ウイルスから得られる。 【００７５】該ベクターは１つまたはそれ以上のプロモ
ーターを含む。使用されてよい適切なプロモーターに
は、以下に限られるものではないが、レトロウイルス
ＬＴＲ；ＳＶ４０プロモーター；およびミラー（Ｍille
r)ら、Biotechniques、Ｖol.７、Ｎo.９、９８０−９９
０（１９８９）に記載のヒトサイトメガロウイルス（Ｃ
ＭＶ）プロモーター、またはその他のプロモーター（例
えば、以下に限るものではないが、ヒストン、polIIIお
よびβ−アクチンプロモーターを含む真核生物細胞のプ
ロモーターなどの細胞プロモーター）が含まれる。使用
されてよい他のウイルスプロモーターは、以下に限るも
のではないが、アデノウイルスプロモーター、チミジン
キナーゼ（ＴＫ）プロモーターおよびＢ１９ パルボウ
イルスプロモーターを含む。適切なプロモーターの選択
は、本明細書中の教示から当業者には明らかであろう。 【００７６】本発明のポリペプチドをコードする核酸配
列は適切なプロモーターの調節下にある。使用されてよ
い適切なプロモーターには、以下に限られるものではな
いが、アデノウイルス主要後期プロモーター（major la
te promoter）などのアデノウイルスプロモーター；ま
たはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターなど
の異種プロモーター；呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）
プロモーター；ＭＭＴプロモーター、メタロチオネイン
プロモーターなどの誘導可能なプロモーター；熱ショッ
クプロモーター；アルブミンプロモーター；ＡpoＡＩプ
ロモーター；ヒトグロブリンプロモーター；単純ヘルペ
スチミジンキナーゼプロモーターなどのウイルスチミジ
ンキナーゼプロモーター；レトロウイルスＬＴＲｓ（上
記の修飾したレトロウイルスＬＴＲｓを含む）；β−ア
クチンプロモーター；およびヒト成長ホルモンプロモー
ターが含まれる。該プロモーターはまた、該ポリペプチ
ドをコードする遺伝子を調節する本来のプロモーターで
あってよい。 【００７７】レトロウイルスプラスミドベクターはプロ
デューサー細胞株を形成するためパッケージング細胞株
をトランスデュースするのに使用してよい。トランスフ
ェクションしてよいパッケージング細胞の例には、以下
に限るものではないが、ＰＥ５０１、ＰＡ３１７、ψ−
２、ψ−ＡＭ、ＰＡ１２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９
−１７−Ｈ２、ψＣＲＥ、ψＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８
６、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２およびＤＡＮ細胞株が含まれ
（ミラー、Human Gene Therapy、Ｖol.１、５−１４頁
（１９９０）に記載）（参照のため本明細書に内容を引
用する）。該ベクターは当該技術分野において公知の方
法によりパッケージング細胞をトランスデュースする。
このような方法には、以下に限るものではないが、エレ
クトロポレーション、リポソームの使用、ＣａＰＯ4沈
降が含まれる。１つの別法として、該レトロウイルスプ
ラスミドベクターはリポソーム中にカプセル化して入れ
られてよく、または脂質と結合され、ついで宿主に投与
されてよい。 【００７８】該プロデューサー細胞株は該ポリペプチド
をコードする核酸配列を含む感染性レトロウイルスベク
ター粒子を産生する。このようなレトロウイルスベクタ
ー粒子はイン・ビトロであれイン・ビボであれ、真核生
物細胞をトランスデュースするため使用してよい。トラ
ンスデュースした真核生物細胞は該ポリペプチドをコー
ドする核酸配列を発現するであろう。トランスデュース
されてよい真核生物細胞には、以下に限られるものでは
ないが、胎児幹細胞、胎児癌細胞、ならびに造血幹細
胞、肝細胞、線維芽細胞、筋芽細胞、ケラチノサイト、
内皮細胞および気管支上皮細胞が含まれる。 【００７９】本発明はまた、該ヒトアミン受容体遺伝子
における変異の存在に関連した疾患または疾患の罹患し
易さを検出するための診断アッセイの一部として、該ヒ
トアミン受容体遺伝子を使用することにも関する。その
ような疾患はヒトアミン受容体の過少発現に関連する。 【００８０】ヒトアミン受容体遺伝子における変異を有
する個体を、多様な技術によってＤＮＡレベルで検出し
てよい。診断用の核酸は、患者の細胞から、例えば、血
液、尿、唾液、組織生検および剖検資料などから得られ
る。ゲノムＤＮＡを直接検出に使用してもよいし、分析
前にＰＣＲ（サイキ（Ｓaiki）ら、Nature、３２４：１
６３−１６６（１９８６））により酵素的に増幅しても
よい。同様の目的のため、ＲＮＡまたはcＤＮＡもまた
使用してよい。一例として、本発明のヒトアミン受容体
タンパク質をコードする核酸に相補的なＰＣＲプライマ
ーは、ヒトアミン受容体の変異を同定し分析するのに使
用することができる。例えば、欠失および挿入は、通常
の遺伝子型に比較して増幅した産物の大きさにおける変
化によって検出することができる。点突然変異は、増幅
したＤＮＡを放射性標識したヒトアミン受容体ＲＮＡま
たは、別法として放射性標識したヒトアミン受容体アン
チセンスＤＮＡ配列にハイブリダイズさせることによっ
て同定することができる。完全にマッチした配列はＲＮ
アーゼＡ消化または融点における相違によってミスマッ
チの二本鎖から区別することができる。 【００８１】ＤＮＡ配列の相違に基づく遺伝的検査は、
変性剤を使用するかまたは使用しないゲルにおけるＤＮ
Ａフラグメントの電気泳動の移動度における変化の検出
によって行われる。小さな配列の欠失および挿入は高分
離（high resolution）ゲル電気泳動によって可視化す
ることができる。異なる配列のＤＮＡフラグメントは、
別々のＤＮＡフラグメントが、その特異的な融点または
部分的な融点に従って別個の位置でゲルにて減速される
変性ホルムアミド濃度勾配ゲル上で区別してよい（例え
ば、マイヤーズ（Ｍyers）ら、Science、２３０：１２
４２(１９８５)）。 【００８２】特定の位置での配列の変化はまた、ＲＮア
ーゼおよびＳ１保護または化学的開裂方法（例えばコッ
トン（Ｃotton）ら、ＰＮＡＳ、ＵＳＡ、８５：４３９
７−４４０１（１９８５））などのヌクレアーゼ保護ア
ッセイによって明らかにされてよい。従って、特異的な
ＤＮＡ配列の検出は、ハイブリダイゼーション、ＲＮア
ーゼ保護、化学的開裂、直接ＤＮＡシークエンシングま
たは制限酵素の使用（例えば、制限フラグメント長多型
（ＲＦＬＰ））およびゲノムＤＮＡのサザンブロットな
どの方法により行われてよい。 【００８３】より一層従来のゲル電気泳動およびＤＮＡ
シークエンシングに加えて、イン・サイチュ分析によっ
ても検出されてよい。本発明はまた、該アミン受容体の
過少発現に関連した疾患の診断に使用してよい多様な組
織における本発明のアミン受容体ポリペプチドの可溶性
形態のレベルの変化を検出するための診断アッセイにも
関する。宿主由来のサンプル中の可溶性の受容体ポリペ
プチドのレベルを検出するために使用したアッセイは当
業者によく知られており、かつラジオイムノアッセイ、
競合結合アッセイ、ウエスタンブロットアッセイおよび
好ましくはＥＬＩＳＡアッセイなどを含む。 【００８４】ＥＬＩＳＡアッセイは最初に本発明のアミ
ン受容体ポリペプチドの抗原に特異的な抗体、好ましく
はモノクローナル抗体を調製することを含む。さらに、
リポーター抗体は該モノクローナル抗体に対して調製さ
れる。リポーター抗体には放射能、蛍光、または本例に
おいては西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素などの検出可
能な試薬を結合させる。サンプルを宿主から除去し、例
えばサンプル中の該タンパク質をサンプル中で結合させ
るポリスチレン皿などの固相支持体上でインキュベート
する。該皿上の任意の遊離のタンパク質結合部位を、つ
いでウシ血清アルブミンのような非特異的なタンパク質
とインキュベートすることによって覆う。次に、モノク
ローナル抗体を皿の中でインキュベートすると、その間
にポリスチレン皿に結合した任意のアミン受容体タンパ
ク質にモノクローナル抗体が結合する。全ての未結合モ
ノクローナル抗体をバッファーで洗い流す。西洋ワサビ
ペルオキシダーゼに結合したリポーター抗体を皿に入れ
ると、アミン受容体タンパク質に結合した任意のモノク
ローナル抗体にリポーター抗体が結合する。結合してい
ないリポーター抗体を洗い流す。ついでペルオキシダー
ゼ基質を皿に加え、ついで所定の時間での発色量を標準
曲線に対して比較すると、患者のサンプルの所定量にお
いて存在するアミン受容体タンパク質の量が測定され
る。 【００８５】本発明の配列はまた、染色体同定にも有益
である。該配列を個々のヒト染色体上の特定の位置に対
して特異的に標的化して、ハイブリダイズさせることが
できる。そのうえ、現在、染色体上の特定の部位を同定
する必要がある。実際の配列データ（反復多型性）に基
づいた染色体マーキング試薬は、現在、染色体位置をマ
ークするのにはほとんど利用できない。本発明によるＤ
ＮＡの染色体へのマッピングは、それらの配列を疾患関
連遺伝子と関係づける重要な第一段階である。 【００８６】簡単に言えば、cＤＮＡからのＰＣＲプラ
イマー（好ましくは、１５−２５bp）を調製することに
より、配列を染色体にマッピングすることができる。
３'未翻訳領域のコンピューター分析を使用して、ゲノ
ムＤＮＡ中の１を越えるエクソンにまたがらないプライ
マーを迅速に選択することから、増幅過程を複雑なもの
とする。ついで、これらのプライマーを、個々のヒト染
色体を含む体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニング
に使用する。プライマーに対応するヒト遺伝子を含むハ
イブリッドのみが、増幅されたフラグメントを与えるで
あろう。 【００８７】体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピング
は、特定のＤＮＡを特定の染色体に帰属させるための迅
速な方法である。同じオリゴヌクレオチドプライマーを
用いての本発明を利用して、サブローカリゼーション
は、特異的な染色体または大きいゲノムクローンのプー
ル由来のフラグメントのパネルを用いる類似の方法で達
成することができる。その染色体へマッピングするのに
同様に利用することができる他のマッピング方法には、
イン・サイチュハイブリダイゼーション、標識化フロー
−ソーティッド（flow-sorted）染色体を用いてのプレ
スクリーニング、および染色体特異的ｃＤＮＡライブラ
リーを構築するためのハイブリダイゼーションによるプ
レセレクションが含まれる。 【００８８】ｃＤＮＡクローンの中期染色体スプレッド
（spread）への蛍光イン・サイチュハイブリダイゼーシ
ョン（ＦＩＳＨ）を利用して、正確な染色体位置を一工
程で与えることができる。この技術は、５０または６０
塩基という短いｃＤＮＡで利用することができる。この
技術の概説には、ベルマ（Ｖerma）ら、ヒューマン・ク
ロモソームズ（Ｈuman Ｃhromosomes）：ア・マニュア
ル・オブ・ベーシック・テクニクス（a Ｍanual of Ｂa
sic Ｔechniques）、パガモン・プレス（Ｐergamon Ｐr
ess）、ニューヨーク（１９８８）を参照。 【００８９】ある配列が正確な染色体位置に一度マッピ
ングされると、染色体上の配列の物理的位置を遺伝マッ
プデータと関連付けることができる。そのようなデータ
は、例えば、マックジック（Ｖ．ＭcＫusick）、メンデ
リアン・インヘリタンス・イン・マン（Ｍendelian Ｉn
heritance in Ｍan）（ジョーンズ・ホプキンス・ユニ
バーシティー・ウェルチ・メディカル・ライブラリー
（Ｊohns Ｈopkins Ｕniversity Ｗelch Ｍedical Ｌib
rary）を介してオンラインで利用できる）に見出され
る。ついで、同じ染色体領域にマップされている遺伝子
と疾患との間の関係を連鎖分析（物理的に隣接した遺伝
子の共遺伝（coinheritance））によって確認する。 【００９０】次に、罹患した個体と罹患していない個体
との間のｃＤＮＡまたはゲノム配列の相違を決定する必
要がある。変異が、罹患した個体のいくつかまたは全て
において認められるが、いずれの正常な個体においても
認められないなら、その変異は疾患の原因となるもので
あるらしい。現在の物理的マッピングおよび遺伝的マッ
ピング技術の解析から、疾患と関連する染色体領域に正
確に局在化したｃＤＮＡは、５０〜５００の原因である
可能性がある遺伝子の１つとなり得るであろう。（これ
は、１メガベースのマッピング分析および２０kb当り１
つの遺伝子を仮定する）。 【００９１】ポリペプチド、それらのフラグメントもし
くは他の誘導体、もしくはそれらのアナログ、またはそ
れらを発現する細胞を免疫原として使用して、それらに
対する抗体を製造することができる。これらの抗体は、
例えば、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であ
り得る。本発明にはまた、キメラ、単鎖、およびヒト化
抗体、さらにはまた、Ｆabフラグメント、またはＦab発
現ライブラリーの生成物も含まれる。当該技術分野で公
知の様々な方法を、そのような抗体およびフラグメント
の製造に使用することができる。 【００９２】本発明の配列に対応するポリペプチドに対
して生成される抗体は、ポリペプチドを動物に直接注入
することにより、またはポリペプチドを動物、好ましく
はヒトでない動物に投与することにより得ることができ
る。ついで、そのようにして得られた抗体は、そのポリ
ペプチド自体に結合するであろう。この方法では、ポリ
ペプチドのフラグメントのみをコードする配列さえも、
完全な天然のポリペプチドを結合する抗体を製造するの
に使用することができる。ついで、そのような抗体を使
用して、そのポリペプチドを発現する組織からポリペプ
チドを単離することができる。 【００９３】モノクローナル抗体を調製するには、連続
的な細胞系培養により産生される抗体を与える任意の技
術を使用することができる。例には、ハイブリドーマ法
（コーラー（Ｋohler)およびミルシュタイン（Ｍilstei
n）、１９７５、Ｎature、２５６：４９５−４９７）、
トリオーマ（trioma）法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法
（コズボール（Ｋozbor）ら、１９８３、Ｉmmunology
Ｔoday ４：７２）、およびヒトモノクローナル抗体を
製造するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ法（コール（Ｃ
ole）ら、１９８５、モノクローナル・アンチボディー
ズ・アンド・キャンサー・セラピー（Ｍonoclonal Ａnt
ibodies and Ｃancer Ｔherapy）、アラン・アール・リ
ス、インク（Ａlan Ｒ．Ｌiss，Ｉnc.）、７７−９６頁
において）が含まれる。 【００９４】単鎖抗体の産生に関して記載されている技
術（米国特許第４,９４６,７７８号）は、本発明の免疫
原性ポリペプチド産物に対する単鎖抗体を製造するのに
適合し得る。また、トランスジェニックマウスは本発明
の免疫原性ポリペプチド産物に対するヒト化した抗体を
発現させるために使用してよい。本発明をさらに、以下
の実施例に関して記載する；しかしながら、本発明は、
そのような実施例に限定されないことを理解すべきであ
る。部または量は全て、特にことわらない限り、重量単
位である。 【００９５】 【実施例】以下の実施例の理解を容易にするために、幾
つかの頻繁に出てくる方法および／または用語を記載す
る。「プラスミド」は、前置きする小文字のｐおよび／
または続けて大文字および／または数字により示す。本
明細書中の出発プラスミドは、市販されているか、限定
されない基盤の下に公に入手可能であるか、または公開
された方法により入手可能なプラスミドから構築でき
る。さらに、記載したプラスミドと同等のプラスミド
は、当該技術分野で公知であって、当業者に明らかであ
ろう。 【００９６】ＤＮＡの「消化」は、ＤＮＡのある配列に
のみ作用する制限酵素でＤＮＡを触媒開裂することを示
す。本明細書中で使用する様々な制限酵素は市販されて
おり、それらの反応条件、補因子および他の必要条件
は、当業者に知られているように使用した。分析目的に
は、典型的に、緩衝溶液約２０μl中、１μgのプラスミ
ドまたはＤＮＡフラグメントを約２単位の酵素と共に使
用する。プラスミド構築のためのＤＮＡフラグメントを
単離する目的には、より多量の容積中、一般にＤＮＡ５
〜５０μgを２０〜２５０単位の酵素で消化する。特定
の制限酵素に適当な緩衝液および基質量は、製造者によ
り指定されている。３７℃で約１時間のインキュベーシ
ョン時間が通常利用されるが、供給者の指示に従って変
えてもよい。消化後、その反応物をポリアクリルアミド
上で直接電気泳動して、所望のフラグメントを単離す
る。 【００９７】開裂したフラグメントのサイズ分離は、ゲ
ッデル（Ｇoeddel，Ｄ.）ら、Ｎucleic Ａcids Ｒes.、
８：４０５７（１９８０）により記載されている８％
ポリアクリルアミドゲルを用いて行う。「オリゴヌクレ
オチド」は、化学的に合成することができる、一本鎖ポ
リデオキシヌクレオチド、または２つの相補的なポリデ
オキシヌクレオチド鎖を示す。そのような合成オリゴヌ
クレオチドは５’リン酸を有さないことから、キナーゼ
の存在下、ＡＴＰとともにリン酸を加えることなしに
は、別のオリゴヌクレオチドにライゲーションしないで
あろう。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化されて
いないフラグメントにライゲーションするであろう。 【００９８】「ライゲーション」は、２つの二本鎖核酸
フラグメントの間にホスホジエステル結合を形成する過
程をいう（マニアチス（Ｍaniatis,Ｔ.）ら、同上、１
４６頁）。特にことわらない限り、ライゲーションは、
ライゲートさせるべきＤＮＡフラグメントのほぼ等モル
量の０.５μg当り１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（「リ
ガーゼ」）と共に、既知の緩衝液および条件を用いて成
し遂げることができる。特にことわらない限り、形質転
換は、グラハム（Ｇraham，Ｆ.）およびファン・デル・
エブ（Ｖan der Ｅb，Ａ.）、Ｖirology、５２：４５６
−４５７（１９７３）の方法に記載されているようにし
て行った。 【００９９】実施例１ ヒトアミン受容体の細菌発現および精製 最初に、ヒトアミン受容体をコードするＤＮＡ配列、Ａ
ＴＣＣ受託番号第９７１８１号を、プロセシングしたア
ミン受容体核酸配列の５'および３'末端配列（シグナル
ペプチド配列を含まない）に対応するＰＣＲオリゴヌク
レオチドプライマーを利用して増幅する。アミン受容体
遺伝子に対応する別のヌクレオチドをそれぞれ５'およ
び３'配列に加える。５'オリゴヌクレオチドプライマー
は、配列 5' CGGAATTCCTUATGAGAGCTGTCTTCATC 3' （配列番号：３）を有し、Ｅco ＲＩ制限酵素部位を含
み、続いて、プロセシングタンパク質の推定末端アミノ
酸から開始する１８ヌクレオチドのヒトアミン受容体コ
ーディング配列を含む。 【０１００】３'配列は 5' CGGAAGCTTCGTCATTCTTGGTACAAATCAAC 3' （配列番号：４）は、Ｈind III部位に相補的な配列を
含み、続いて、該ヒトアミン受容体遺伝子の１８ヌクレ
オチドを含む。その制限酵素部位は、細菌発現ベクター
pＱＥ−９（キアゲン、インク（Ｑiagen，Ｉnc.）、チ
ャッツワース（Ｃhatsworth）、カリフォルニア)の制限
酵素部位に一致する。pＱＥ−９は、抗生物質耐性(Ａmp
r)、細菌の複製起点(ori)、ＩＰＴＧ−調節可能なプロ
モーター／オペレーター(Ｐ／Ｏ)、リボソーム結合部位
(ＲＢＳ)、６−Ｈisタグおよび制限酵素部位をコードす
る。ついでpＱＥ−９をＨindIIIおよびＥcoＲＩで消化
する。増幅した配列をｐＱＥ−９にライゲーションし、
ヒスチジンタグをコードする配列およびＲＳＢとともに
イン・フレームで挿入する。 【０１０１】ついでそのライゲーション混合物を使用し
て、例えば、Ｍ１５／rep４（キアゲン、インク）であ
る大腸菌株をサンブルック（Ｓambrook，Ｊ.）ら、モレ
キュラー・クローニング（Ｍolecular Ｃloning）：ア
・ラボラトリー・マニュアル（Ａ Ｌaboratory Ｍanua
l）、コールド・スプリング・ラボラトリー・プレス
（Ｃold Ｓpring Ｌaboratory Ｐress)、（１９８９）
に記載された方法によって形質転換した。Ｍ１５／rep
４はプラスミドpＲＥＰ４の多重コピーを含み、これ
は、lacＩリプレッサーを発現して、またカナマイシン
耐性(Ｋanr)も与える。トランスフォーマントを、それ
らが、ＬＢプレートで増殖する能力により同定しついで
アンピシリン／カナマイシン耐性コロニーを選択する。
プラスミドＤＮＡを制限分析により単離し確認する。所
望の構築物を含むクローンを、Ａmp（１００μg／ml）
およびＫan（２５μg／ml）の両方を補った、ＬＢ培地
中での液体培養で一晩増殖させた(Ｏ／Ｎ)。そのＯ／Ｎ
培養物を使用して、大きな培養物に１：１００〜１：２
５０の割合で播種する。細胞が、０.４〜０.６の間の光
学密度６００(Ｏ.Ｄ.600)まで増殖させる。 【０１０２】ついで、ＩＰＴＧ(「イソプロピル−Ｂ−
Ｄ−チオガラクトピラノシド」)を、最終濃度が１mＭと
なるまで加えた。ＩＰＴＧは、lacＩリプレッサーを不
活性化し、Ｐ／Ｏをクリアリングし、遺伝子発現を増加
させることにより誘導する。細胞をさらに３−４時間増
殖する。ついで、細胞を遠心分離により収集した。細胞
ペレットをカオトロピック剤である６モルのグアニジン
ＨＣl中で可溶化した。清澄後、この溶液から６−Ｈis
タグを含むタンパク質による強固な結合を可能にする条
件下、ニッケルキレートカラムでのクロマトグラフィー
により、可溶化したタンパク質を精製する（ホチュリ
（Ｈochuli，Ｅ.）ら、Ｊ．Ｃhromatography４１１：１
７７−１８４（１９８４））。ヒトアミン受容体タンパ
ク質をpＨ５.０の６モルのグアニジンＨＣｌのカラムか
ら溶出し、３モルのグアニジンＨＣl、１００mＭのリン
酸ナトリウム、１０ミリモルのグルタチオン（還元型）
および２ミリモルのグルタチオン（酸化型）に合わせ
た。この溶液で１２時間インキュベートした後、該タン
パク質を１０ミリモルのリン酸ナトリウムで透析した。 【０１０３】実施例２ バキュロウイルス発現システムを用いてのヒトアミン受
容体のクローニングおよび発現 完全長ヒトアミン受容体タンパク質をコードするＤＮＡ
配列、ＡＴＣＣ受託番号第９７１８１号を、該遺伝子の
５'および３'配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチド
プライマーを利用して増幅する。 ５'プライマーは、配列： 5' CGGGATCCCTCCATGAGAGCTGTCTTCATC 3' （配列番号：５）を有し、該配列はＢam ＨＩ制限酵素
部位、続いて、ヒトアミン受容体遺伝子の最初の１８ヌ
クレオチドのちょうど後の真核生物細胞中の翻訳開始の
有効なシグナルに類似した４ヌクレオチドを含む（コザ
ック（Ｋozak，Ｍ.）、Ｊ．Ｍol．Ｂiol.、１９６：９
４７−９５０（１９８７））。 【０１０４】３'プライマーは、配列 5' cgggatcccgctcattcttggtacaaatc 3' （配列番号：６）を有し、制限エンドヌクレアーゼＢam
ＨＩの開裂部位およびヒトアミン受容体遺伝子の３'未
翻訳配列に相補的な１８ヌクレオチドを含む。増幅され
た配列を、市販されており、利用できるキット（「ジー
ンクリーン（Ｇeneclean）」、ＢＩＯ １０１Ｉnc.、ラ
・ホラ（Ｌa Ｊola）、カリフォルニア）を用いて、１
％アガロースゲルから単離する。次に、そのフラグメン
トをエンドヌクレアーゼＢamＨＩで消化した後、１％ア
ガロースゲル上で精製した。このフラグメントをＦ２と
命名する。 【０１０５】ベクターｐＲＧ１（ｐＶＬ９４１ベクター
を改良したもの、後述）をバキュロウイルス発現系を用
いてヒトアミン受容体タンパク質の発現のために使用す
る（概説には、サマーズ（Ｓummers，Ｍ.Ｄ.）およびス
ミス（Ｓmith，Ｇ.Ｅ.）１９８７、Ａ manual of metho
ds for baculovirus vectors and insct cell culture
procedures，Ｔexas Ａgricultural Ｅxperimental Ｓt
ation Ｂulletin Ｎo.１５５５を参照）。この発現ベク
ターはオートグラファ・カリフォルニカ核多角体病ウイ
ルス（Ａutographa californica nuclear polyhedrosis
virus）（ＡcＭＮＰＶ)の強力なポリヒドリン（polyhe
drin）プロモーターとそれに続く制限エンドヌクレアー
ゼＢamＨＩの認識部位を含む。効率の良いポリアデニル
化のために、シミアンウイルス（ＳＶ）４０のポリアデ
ニル化部位を使用する。組換えウイルスの選択を簡単に
するため、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子が
ポリヒドリン遺伝子のポリアデニル化シグナルに先行す
るポリヒドリンプロモーターと同じ方向に挿入される。
該ポリヒドリン配列の両端には、同時にトランスフェク
ションされる野生型ウイルスＤＮＡの細胞媒介の同種の
組換えに関するウイルスの配列が隣接する。ｐＲＧ１の
代わりに、ｐＡｃ３７３、ｐＶＬ９４１およびｐＡｃＩ
Ｍ１（ラッコウ（Ｌuckow，Ｖ．Ａ.）およびサマーズ、
Ｖirology，１７９：３１−３９）などといった他の多
くのバキュロウイルスベクターを使用することができ
る。 【０１０６】該プラスミドを制限酵素ＢamＨＩで消化し
た後、ウシ腸ホスファターゼを用いて当該技術分野にお
いて公知の手法で脱リン酸化する。ついでそのＤＮＡを
市販されており、利用できるキット（「ジーンクリー
ン」ＢＩＯ １０１ Ｉnc.、ラ・ホラ、カリフォルニ
ア）を用いて１％アガロースゲルから単離する。このベ
クターＤＮＡをＶ２と命名する。フラグメントＦ２およ
び脱リン酸化プラスミドＶ２をＴ４ＤＮＡリガーゼでラ
イゲーションする。ついで大腸菌ＨＢ１０１細胞を形質
転換し、ヒトアミン受容体遺伝子を持つプラスミド（ｐ
Ｂac−ヒトアミン受容体）を含む細菌を酵素ＢamＨＩを
用いて同定する。クローニングされたフラグメントをＤ
ＮＡシークエンシングを用いて確認する。 【０１０７】リポフェクション法(フェルグナー（Ｆelg
ner）ら、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ、８４：７４
１３−７４１７（１９８７）)を利用して、プラスミドp
Ｂac結腸特異的遺伝子５μgを市販の線形化バキュロウ
イルス(「ＢaculoＧoldTM バキュロウイルス ＤＮ
Ａ」、ファーミンゲン（Ｐharmingen）、サン・ディエ
ゴ（Ｓan Ｄiego）、カリフォルニア)１.０μgと共に同
時トランスフェクションする。 【０１０８】ＢaculoＧoldTMウイルスＤＮＡ １μgおよ
びプラスミドpＢac結腸特異的遺伝子５μgを、無血清グ
レイス(Ｇrace's)培地(ライフ・テクノロジーズ・イン
ク（Ｌife Ｔechnologies Ｉnc.）、ゲイザーズバーグ
（Ｇaithersburg）、メリーランド)５０μlを含むマイ
クロタイタープレートの無菌ウェル中で混合する。その
後、リポフェクチン(Ｌipofectin)１０μlとグレイス培
地９０μlを加え、混合して、室温で１５分間インキュ
ベートする。ついで、トランスフェクション混合物を、
無血清グレイス培地１mlを含む、３５mmの組織培養プレ
ートに播種したＳf９昆虫細胞(ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１
１)に滴加する。そのプレートを前後に揺り動かして、
新たに加えた溶液を混合する。ついで、そのプレートを
２７℃で５時間インキュベートする。５時間後、そのト
ランスフェクション溶液をプレートから除去して、１０
％ ウシ胎児血清を補ったグレイス昆虫培地１mlを加え
る。そのプレートをインキュベーターに戻して、２７℃
で４日間培養し続ける。 【０１０９】４日後、上清を集めて、サマーズおよびス
ミス(上記)により記載されたようにして、プラークアッ
セイを行う。変法として、「Ｂlue Ｇal」(ライフ・テ
クノロジーズ・インク、ゲイザーズバーグ)を含むアガ
ロースゲルを使用したが、このことにより、青色に染色
されたプラークを容易に単離することが可能となる。
(「プラークアッセイ」の詳細な記述はまた、昆虫細胞
培養に関する利用者のガイド、およびライフ・テクノロ
ジーズ・インク、ゲイザーズバーグにより配布されたバ
キュロウイルス学、９−１０頁にも見出すことができ
る)。 【０１１０】４日後、連続希釈のウイルスを細胞に加え
て、青色に染色されたプラークをエッペンドルフピペッ
トの先端で採取する。ついで、組換えウイルスを含む寒
天を、グレイス培地２００μlを含むエッペンドルフチ
ューブ内で再懸濁させる。その寒天を短時間の遠心分離
により除去して、組換えバキュロウイルスを含む上清
を、３５mmの皿に播種したＳf９細胞を感染させるのに
使用する。４日後、これらの培養皿の上清を収集した
後、４℃で保存する。 【０１１１】Ｓf９細胞を、１０％ 熱不活性化ＦＢＳを
補ったグレイス培地で増殖させる。その細胞に、感染多
重度(ＭＯＩ) ２で組換えバキュロウイルス Ｖ−結腸特
異的遺伝子を感染させる。６時間後、その培地を除去し
て、メチオニンおよびシステインを含まないＳＦ９００
II 培地(ライフ・テクノロジーズ・インク、ゲイザー
ズバーグ)に替える。４２時間後、５μＣiの35Ｓ−メチ
オニンおよび５μＣiの35Ｓシステイン５μＣi(アマシ
ャム（Ａmersham)）を加える。該細胞をさらに１６時間
インキュベートして、遠心して回収し、ついでＳＤＳ−
ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーによって該標識
したタンパク質を可視化する。 【０１１２】実施例３ ＣＯＳ細胞における組換えヒトアミン受容体の発現 プラスミド、ヒトアミン受容体ＨＡの発現は、1）ＳＶ
４０複製起点、2）アンピシリン耐性遺伝子、3）大腸菌
複製起点、4）ＣＭＶプロモーターとそれに続くポリリ
ンカー領域、ＳＶ４０イントロンおよびポリアデニル化
部位を含有するベクターpcＤＮＡＩ／Ａmp（インビトロ
ゲン（Ｉnvitrogen））から得る。全ヒトアミン受容体
前駆体と、その３'末端にイン・フレームで融合したＨ
ＡタグとをコードするＤＮＡフラグメントを、ベクター
のポリリンカー領域にクローニングする。したがって、
その組換えタンパク質の発現はＣＭＶプロモーターに制
御される。ＨＡタグは、既に記述されたインフルエンザ
血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに相当する
（ウィルソン（Ｉ.Ｗilson）ら、Ｃell、３７：７６７
（１９８４））。標的タンパク質にＨＡタグを注入する
ことにより、ＨＡエピトープを認識する抗体で組換えタ
ンパク質を容易に検出できるようになる。 【０１１３】プラスミド構築法は次の通りである。ヒト
アミン受容体をコードするＤＮＡ配列、ＡＴＣＣ受託番
号第９７１８１号を、次の２つのプライマーを用いるＰ
ＣＲで構築する。５'プライマー 5' GTCCAAGCTTGCCACCATGAGAGCTGTCTTCATC 3' （配列番号：７）は、ＨindIII部位と、それに続く、開
始コドンから始まるヒトアミン受容体コーディング配列
の18ヌクレオチドとを含有する；３'配列 5' CTAGCTCGAGTCAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGCATTCT
TGGTACAAATCAAC 3' （配列番号：８）は、ＸhoI部位に相補的な配列、翻訳
停止コドン、ＨＡタグおよびヒトアミン受容体コーディ
ング配列の最後の１８ヌクレオチド（停止コドンを除
く）を含有する。したがって、ＰＣＲ産物は、ＨindIII
部位、ヒトアミン受容体コーディング領域、それに続
く、イン・フレームで融合したＨＡタグ、ＨＡタグに続
く翻訳終結停止コドンおよびＨindIII部位を含有する。 【０１１４】そのＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメントとベク
ターpcＤＮＡＩ／ＡmpをＨindIIIおよびＸhoＩ制限酵素
で消化し、ライゲーションする。そのライゲーション混
合物で大菌ＳＵＲＥ株（ストラタジーン・クローニング
・システムズ（ＳtratageneＣloning Ｓystems）、ラ・
ホラ、カリフォルニア）を形質転換し、その形質転換培
養をアンピシリン培地プレートで培養して、耐性コロニ
ーを選択する。プラスミドＤＮＡをトランスフォーマン
トから単離し、制限分析によって正しい断片の存在を調
べる。 【０１１５】この組換えアミン受容体を発現させるた
め、ＤＥＡＥ−デキストラン法（サンブルック、フリッ
チュ（Ｅ.Ｆritsch）、マニアチス（Ｔ. Ｍaniatis）、
モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マ
ニュアル、コールド・スプリング・ラボラトリー・プレ
ス（Ｃold Ｓpring Ｌaboratory Ｐress）（１９８
９））によって、ＣＯＳ細胞を発現ベクターでトランス
フェクションする。ヒトアミン受容体ＨＡタンパク質の
発現は、放射線標識と免疫沈降法（ハーロウ（Ｅ．Ｈar
low）、レーン（Ｄ. Ｌane）、アンチボディーズ（Ａnt
ibodies）：ア・ラボラトリー・マニュアル、コールド
・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（１９
８８））によって検出する。トランスフェクションの２
日後に、細胞を 35Ｓ-システインで８時間標識する。次
に、培養培地を集め、細胞を界面活性剤（ＲＩＰＡ緩衝
液（１５０mＭ ＮaＣl、 １％ＮＰ−４０、０.１％ＳＤ
Ｓ、１％ＮＰ−４０、０.５％ＤＯＣ、５０mＭ Ｔris、
pＨ７.５）で溶解する（ウィルソン（Ｗilson, I.）
ら、同上、３７：７６７（１９８４））。細胞溶解液と
培養培地の両方をＨＡ特異的モノクローナル抗体で沈殿
させる。沈殿したタンパク質を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ゲルで分析する。 【０１１６】実施例４ ヒト組織におけるヒトアミン受容体の発現パターン ヒト組織におけるヒトアミン受容体の発現レベルを調べ
るために、ノーザンブロット分析を行なう。総細胞ＲＮ
Ａ試料をＲＮＡzolTM Ｂシステム（バイオテックス・ラ
ボラトリーズ・インク（Ｂiotecx Ｌaboratories, Ｉn
c.）、ヒューストン、テキサス）で単離する。各ヒト組
織から単離した約１０μgの総ＲＮＡを１％アガロース
ゲルで分離し、ナイロンフィルターにブロットする（サ
ンブルック、フリッチュ、マニアチス、 モレキュラー
・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル、コー
ルド・スプリング・ラボラトリー・プレス（１９８
９））。標識反応は、５０ngのＤＮＡフラグメントを用
いて、ストラタジーン・プライム（Ｐrime）-イット（I
t）キットに従って行なう。標識されたＤＮＡをセレク
ト（Ｓelect）-Ｇ-５０カラム（５プライム−３プライ
ム、インク（５ Ｐrime-３ Ｐrime Ｉnc.）、ブールダ
ー、コロラド）で精製する。次に、フィルターを、０.
５Ｍ ＮaＰＯ4、 pＨ７.４および７％ＳＤＳ中、６５℃
で終夜、放射能標識した完全長ヒトアミン受容体遺伝子
１,０００,０００cpm/mlと、ハイブリダイズさせる。
０.５×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳを用いて室温で２回、６
０℃で２回洗浄した後、増幅スクリーンを用いて、フィ
ルターを−７０℃で終夜、露出する。 【０１１７】実施例５ 遺伝子治療を介する発現 線維芽細胞を皮膚生検により被験体より得る。得られた
組織を組織培養培地中に置き、ついで小片に分ける。そ
の組織の小塊を組織培養フラスコの湿った表面に置く
（各フラスコ当たり約１０個の塊を置く）。該フラスコ
の上下をひっくり返し、固く閉め、室温にて一晩放置す
る。室温で２４時間後、該フラスコを逆さにし、ついで
組織の塊はフラスコの底に固定したままにし、ついで、
１０％ＦＢＳ、ペニシリンおよびストレプトマイシンを
含む新鮮培地（例えば、ハムＦ１２培地（Ｈam's Ｆ１
２ media））を添加する。ついでこれを３７℃で約１週
間インキュベートする。このとき、新鮮培地を添加し引
き続き数日毎に変える。さらに２週間の後、培養液中に
線維芽細胞の単層が現れる。その単層をトリプシン処理
しついでさらに大きなフラスコに合わせて調整する。 【０１１８】モロニーマウス肉腫ウイルスの長い末端反
復配列によりフランキングされたｐＭＶ−７（キルシュ
メイエル（Ｋirschmeier，Ｐ．Ｔ.）ら、ＤＮＡ、７：
２１９−２５（１９８８））をＥcoＲＩおよびＨindIII
で消化し、続いて仔ウシ腸ホスファターゼで処理する。
線形ベクターをアガロースゲル上で分画化し、ガラスビ
ーズを使用して精製する。 【０１１９】本発明のポリペプチドをコードするｃＤＮ
Ａをそれぞれ５'端および３'端配列に対応するＰＣＲプ
ライマーを使用して増幅する。５'プライマーはＥcoＲ
Ｉ部位を含み３'プライマーはＨindIII部位を含む。モ
ロニーマウス肉腫ウイルスの線形骨格およびＥcoＲＩお
よびＨindIIIフラグメントの等量をＴ４ＤＮＡリガーゼ
の存在下で一緒に添加する。得られた混合物を２つのフ
ラグメントのライゲーションに適した条件下で維持す
る。ライゲーション混合物を細菌ＨＢ１０１を形質転換
するのに使用し、ついで該菌をベクターが所望の適切に
挿入された遺伝子を有することを確認するためカナマイ
シン含有寒天上に播種する。 【０１２０】両栄養性のｐＡ３１７またはＧp+am１２パ
ッケージング細胞を、１０％ 仔ウシ血清（ＣＳ）、ペ
ニシリンおよびストレプトマイシンを有するダルベッコ
改変イーグル培地（Ｄulbecco's Ｍodified Ｅagles Ｍ
edium）（ＤＭＥＭ）中で全面密度になるまで組織培養
にて増殖させる。該遺伝子を有するＭＳＶベクターをつ
いで培地に添加し、パッケージング細胞を該ベクターで
トランスデュースする。今度はパッケージング細胞は、
該遺伝子を含む感染性ウイルス粒子を産生する（パッケ
ージング細胞を以後、プロデューサー細胞という）。 【０１２１】新鮮培地をトランスデュースしたプロデュ
ーサー細胞に添加し、引き続き培地を１０cmプレート全
面のプロデューサー細胞から回収する。感染性ウイルス
粒子を含む使用し尽くした培地をミリポアフィルターで
濾過して分離したプロデューサー細胞を除去し、ついで
この培地を線維芽細胞を感染させるのに使用する。培地
を線維芽細胞のサブ全面プレートから除去し、プロデュ
ーサー細胞からの培地とすばやく取り替える。この培地
を除去し、新鮮培地で置き換える。ウイルス力価が高い
場合、本質的にすべての線維芽細胞が感染し、選択は一
切必要ないであろう。力価が非常に低い場合は、neoま
たはhisなどの選択可能なマーカーを有するレトロウイ
ルスベクターを使用する必要がある。 【０１２２】操作された線維芽細胞を、単独またはサイ
トデックス・３・ミクロキャリア・ビーズ（cytodex ３
microcarrier beads）上全面に増殖した後に、宿主に
注入する。該線維芽細胞はタンパク質産物を産生する。
先の教示から見て、本発明の多数の変更および変化が可
能であることから、追記する請求の範囲内で、詳しく記
載した以外に、本発明を行うことができる。 【０１２３】 SEQUENCE LISTING <110> Human Genome Sciences, Inc. <120> Human Amine Receptor <130> 184365 <160> 10 <210> 1 <211> 1380 <212> DNA <213> Homo Sapiens <220> <221> CDS <222> (252)...(1262) <400> 1 ctagagctag caggagtaac tctcatggaa ccttggaaac cattcttcaa ttgaatttca 60 gggcacattt gaatcagtac ccaggggcac tgtactatgc tcccagctgg accttagttt 120 cctcctcctc gtttcaccct gtgagtaatt aacagacaaa attttttttt tttttttttt 180 tttttttttt tttttgccct ccagtggaga aggtggccag ttctcagaca gaggaagagt 240 agaaatcata a atg aga gct gtc ttc atc caa ggt gct gaa gag cac cct 290 Met Arg Ala Val Phe Ile Gln Gly Ala Glu Glu His Pro 1 5 10 gcg gca ttc tgc tac cag gtg aat ggg tct tgc ccc agg aca gta cat 338 Ala Ala Phe Cys Tyr Gln Val Asn Gly Ser Cys Pro Arg Thr Val His 15 20 25 act ctg ggc atc cag ttg gtc atc tac ctg acc tgt gca gca ggc atg 386 Thr Leu Gly Ile Gln Leu Val Ile Tyr Leu Thr Cys Ala Ala Gly Met 30 35 40 45 ctg att atc gtg cta ggg aat gta ttt gtg gca ttt gct gtg tcc tac 434 Leu Ile Ile Val Leu Gly Asn Val Phe Val Ala Phe Ala Val Ser Tyr 50 55 60 ttc aaa gcg ctt cac acg ccc acc aac ttc ctg ctg ctc tcc ctg gcc 482 Phe Lys Ala Leu His Thr Pro Thr Asn Phe Leu Leu Leu Ser Leu Ala 65 70 75 ctg gct gac atg ttt ctg ggt ctg ctg gtg ctg ccc ctc agc acc att 530 Leu Ala Asp Met Phe Leu Gly Leu Leu Val Leu Pro Leu Ser Thr Ile 80 85 90 cgc tca gtg gag agc tgc tgg ttc ttc ggg gac ttc ctc tgc cgc ctg 578 Arg Ser Val Glu Ser Cys Trp Phe Phe Gly Asp Phe Leu Cys Arg Leu 95 100 105 cac acc tac ctg gac acc ctc ttc tgc ctc acc tcc atc ttc cat ctc 626 His Thr Tyr Leu Asp Thr Leu Phe Cys Leu Thr Ser Ile Phe His Leu 110 115 120 125 tgt ttc att tcc att gac cgc cac tgt gcc atc tgt gac ccc ctg ctc 674 Cys Phe Ile Ser Ile Asp Arg His Cys Ala Ile Cys Asp Pro Leu Leu 130 135 140 tat ccc tcc aag ttc aca gtg agg gtg gct ctc agg tac atc ctg gca 722 Tyr Pro Ser Lys Phe Thr Val Arg Val Ala Leu Arg Tyr Ile Leu Ala 145 150 155 gga tgg ggg gtg ccc gca gca tac act tcg tta ttc ctc tac aca gat 770 Gly Trp Gly Val 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Leu Pro Phe Thr Ile Asp Thr 260 265 270 Met Val Asp Ser Leu Leu His Phe Ile Thr Pro Pro Leu Val Phe Asp 275 280 285 Ile Phe Ile Trp Phe Ala Tyr Phe Asn Ser Ala Cys Asn Pro Ile Ile 290 295 300 Tyr Val Phe Ser Tyr Gln Trp Phe Arg Lys Ala Leu Lys Leu Thr Leu 305 310 315 320 Ser Gln Lys Val Phe Ser Pro Gln Thr Arg Thr Val Asp Leu Tyr Gln 325 330 335 Glu <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 cggaattcct uatgagagct gtcttcatc 29 <210> 4 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 cggaagcttc gtcattcttg gtacaaatca ac 32 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 cgggatccct ccatgagagc tgtcttcatc 30 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 cgggatcccg ctcattcttg gtacaaatc 29 <210> 7 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 gtccaagctt gccaccatga gagctgtctt catc 34 <210> 8 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 8 ctagctcgag tcaagcgtag tctgggacgt cgtatgggta gcattcttgg tacaaatcaa 60 c 61 <210> 9 <211> 365 <212> PRT <213> Mouse <220> <223> β-1 Adrenoreceptor <400> 9 Ala Arg Leu Leu Val Leu Ala Ser Pro Pro Ala Ser Leu Leu Pro Pro 1 5 10 15 Ala Ser Glu Gly Ser Ala Pro Leu Ser Gln Gln Trp Thr Ala Gly Met 20 25 30 Gly Leu Leu Val Ala Leu Ile Val Leu Leu Ile Val Val Gly Asn Val 35 40 45 Leu Val Ile Val Ala Ile Ala Lys Thr Pro Arg Leu Gln Thr Leu Thr 50 55 60 Asn Leu Phe Ile Met Ser Leu Ala Ser Ala Asp Leu Val Met Gly Leu 65 70 75 80 Leu Val Val Pro Phe Gly Ala Thr Ile Val Val Trp Gly Arg Trp Glu 85 90 95 Tyr Gly Ser Phe Phe Cys Glu Leu Trp Thr Ser Val Asp Val Leu Cys 100 105 110 Val Thr Ala Ser Ile Glu Thr Leu Cys Val Ile Ala Leu Asp Arg Tyr 115 120 125 Leu Ala Ile Thr Ser Pro Phe Arg Tyr Gln Ser Leu Leu Thr Arg Ala 130 135 140 Arg Ala Arg Ala Leu Val Cys Thr Val Trp Ala Ile Ser Ala Leu Val 145 150 155 160 Ser Phe Leu Pro Ile Leu Met His Trp Trp Arg Ala Glu Ser Asp Glu 165 170 175 Ala Arg Arg Cys Tyr Asn Asp Pro Lys Cys Cys Asp Phe Val Thr Asn 180 185 190 Arg Ala Tyr Ala Ile Ala Ser Ser Val Val Ser Phe Tyr Val Pro Leu 195 200 205 Cys Ile Met Ala Phe Val Tyr Leu Arg Val Phe Arg Glu Ala Gln Lys 210 215 220 Gln Val Lys Lys Ile Asp Ser Cys Glu Arg Arg Phe Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ala Arg Pro Pro Ser Pro Glu Pro Ser Pro Ser Pro Gly Pro Pro Arg 245 250 255 Pro Ala Asp Ser Leu Ala Asn Gly Arg Ser Ser Lys Arg Arg Pro Ser 260 265 270 Arg Leu Val Ala Leu Arg Glu Gln Lys Ala Leu Lys Thr Leu Gly Ile 275 280 285 Ile Met Gly Val Phe Thr Leu Cys Trp Leu Pro Phe Phe Leu Ala Asn 290 295 300 Val Val Lys Ala Phe His Arg Asp Leu Val Pro Asp Arg Leu Phe Val 305 310 315 320 Phe Phe Asn Trp Leu Gly Tyr Ala Asn Ser Ala Phe Asn Pro Ile Ile 325 330 335 Tyr Cys Arg Ser Pro Asp Phe Arg Lys Ala Phe Gln Arg Leu Leu Cys 340 345 350 Cys Ala Arg Arg Ala Ala Cys Arg Arg Arg Ala Ala His 355 360 365 <210> 10 <211> 353 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <223> Dopamine D2 receptor <400> 10 Asp Asp Asp Leu Glu Arg Gln Asn Trp Ser Arg Pro Phe Asn Gly Ser 1 5 10 15 Asp Gly Lys Ala Asp Arg Pro His Tyr Asn Tyr Tyr Ala Thr Leu Leu 20 25 30 Thr Leu Leu Ile Ala Val Ile Val Phe Gly Asn Val Leu Val Cys Met 35 40 45 Ala Val Ser Arg Glu Lys Ala Leu Gln Thr Thr Thr Asn Tyr Leu Ile 50 55 60 Val Ser Leu Ala Val Ala Asp Leu Leu Val Ala Thr Leu Val Met Pro 65 70 75 80 Trp Val Val Tyr Leu Glu Val Val Gly Glu Trp Lys Phe Ser Arg Ile 85 90 95 His Cys Asp Ile Phe Val Thr Leu Asp Val Met Met Cys Thr Ala Ser 100 105 110 Ile Leu Asn Leu Cys Ala Ile Ser Ile Asp Arg Tyr Thr Ala Val Ala 115 120 125 Met Pro Met Leu Tyr Asn Thr Arg Tyr Ser Ser Lys Arg Arg Val Thr 130 135 140 Val Met Ile Ser Ile Val Trp Val Leu Ser Phe Thr Ile Ser Cys Pro 145 150 155 160 Leu Leu Phe Gly Leu Asn Asn Ala Asp Gln Asn Glu Cys Ile Ile Ala 165 170 175 Asn Pro Ala Phe Val Val Tyr Ser Ser Ile Val Ser Phe Tyr Val Pro 180 185 190 Phe Ile Val Thr Leu Leu Val Tyr Ile Lys Ile Tyr Ile Val Leu Arg 195 200 205 Arg Arg Arg Lys Arg Val Asn Thr Lys Arg Ser Ser Arg Ala Phe Arg 210 215 220 Ala His Leu Arg Ala Pro Leu Lys Glu Ala Ala Arg Arg Glu Lys Asn 225 230 235 240 Gly His Ala Lys Asp His Pro Lys Ile Ala Lys Ile Phe Glu Ile Gln 245 250 255 Thr Met Pro Asn Gly Lys Thr Arg Thr Ser Leu Lys Thr Met Ser Arg 260 265 270 Arg Lys Leu Ser Gln Gln Lys Glu Lys Lys Ala Thr Gln Met Leu Ala 275 280 285 Ile Val Leu Gly Val Phe Ile Ile Cys Trp Leu Pro Phe Phe Ile Thr 290 295 300 His Ile Leu Asn Ile His Cys Asp Cys Asn Ile Pro Pro Val Leu Tyr 305 310 315 320 Ser Ala Phe Thr Trp Leu Gly Tyr Val Asn Ser Ala Val Asn Pro Ile 325 330 335 Ile Tyr Thr Thr Phe Asn Ile Glu Phe Arg Lys Ala Phe Leu Lys Ile 340 345 350 Leu
ポリヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチドにより
コードされるポリペプチドおよびそのようなポリヌクレ
オチドおよびポリペプチドの使用、ならびにそのような
ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの製造にも関す
る。より詳しくは、本発明のポリペプチドは７回膜貫通
型受容体であり、推定的にヒトアミン受容体として同定
されているものである。本発明はまた、そのようなポリ
ペプチドの作用を阻害することに関する。 【０００２】 【従来の技術】多くの医学的に重要な生物学的プロセス
が、例えばｃＡＭＰ（レフコゥイッツ（Ｌefkowitz）、
Ｎature、３５１：３５３−３５４（１９９１））など
のＧ−タンパク質および／または第２メッセンジャーに
関するシグナルトランスダクション経路に関するタンパ
ク質によって媒介されていることはよく確立されてい
る。本明細書のこれらのタンパク質はＧ−タンパク質ま
たはＰＰＧタンパク質を有する経路に関与するタンパク
質をいう。これらのタンパク質の例にはアドレナリン作
用性薬剤およびドーパミンに関するＧＰＣ受容体（コビ
ルカ（Ｋobilka，Ｂ.Ｋ.）ら、ＰＮＡＳ、８４：４６−
５０（１９８７）；コビルカら、Ｓcience、２３８：６
５０−６５６（１９８７）；バンゾウ（Ｂunzow，Ｊ．
Ｒ.）ら、Ｎature、３３６：７８３−７８７（１９８
８））、Ｇ−タンパク質自身、エフェクタータンパク
質、例えば、ホスホリパーゼＣ、アデニルシクラーゼお
よびホスホジエステラーゼおよびアクチュエータータン
パク質（actuator proteins）、例えば、プロテインキ
ナーゼＡおよびプロテインキナーゼＣ（シモン（Ｓimo
n，Ｍ.Ｉ.）ら、Ｓcience、２５２：８０２−８（１９
９１））が含まれる。 【０００３】例えば、シグナルトランスダクションの一
形態において、ホルモン結合の効果は酵素、アデニル酸
シクラーゼの細胞内部での活性化である。ホルモンによ
る酵素の活性化はヌクレオチドＧＴＰの存在に依存し、
ついでＧＴＰはまた、ホルモン結合に影響を及ぼす。Ｇ
−タンパク質はホルモン受容体をアデニル酸シクラーゼ
に結合する。Ｇ−タンパク質はホルモン受容体によって
活性化されるとＧＴＰを結合したＧＤＰに交換すること
を示している。ついで、ＧＴＰ−運搬形態は活性化した
アデニレートシクラーゼに結合する。ＧＴＰからＧＤＰ
への加水分解はＧ−タンパク質自身によって触媒化さ
れ、その基本の不活性形態Ｇ−タンパク質へと戻す。従
って、Ｇ−タンパク質は受容体からのシグナルをエフェ
クター送る中間体としておよびシグナルの持続時間をコ
ントロールする時計としての２つの役割として機能す
る。 【０００４】Ｇ−タンパク質結合型受容体の膜タンパク
質遺伝子スーパーファミリーは推定の７回膜貫通ドメイ
ンを有するものとして特徴付けられている。該ドメイン
は細胞外または細胞質ループによって結合した膜貫通α
−ヘリックスを代表すると信じられている。Ｇ−タンパ
ク質結合受容体には広範囲の生物学的に活性のある受容
体、ホルモン、ウイルス、増殖因子および神経受容体な
どを含む。 【０００５】Ｇ−タンパク質結合型受容体は多様な酵
素、イオンチャンネルおよびトランスポーターにヘテロ
トリマーＧ−タンパク質により細胞内的に結合すること
ができる（例えば、ジョンソン（Ｊohnson）ら、Ｅnd
c.，Ｒev.、１０：３１７−３３１（１９８９）参
照）。異なるＧ−タンパク質α−サブユニットは、好ま
しくは細胞中の多様な生物学的機能を調節するための特
定のエフェクターを刺激する。Ｇ−タンパク質結合型受
容体の細胞室の残基は、Ｇ−タンパク質結合型受容体の
幾つかを結合したＧ−タンパク質の調節のための重要な
メカニズムである。Ｇ−タンパク質結合受容体は哺乳動
物宿主内の多数の部位において見いだされる。 【０００６】 【発明が解決しようとする課題】本発明のヒトアミン受
容体はＧ−タンパク質結合型受容体である。知覚神経機
能および運動神経機能は神経伝達によって行われる。神
経伝達とは、シナプス前ニューロンと呼ばれる１つのニ
ューロンからシナプス後ニューロンと呼ばれるもう１つ
のニューロンへ向かってシナプス間隙を横切る、神経イ
ンパルスの伝導である。シナプス間隙を横切る神経イン
パルス伝達には、神経伝達物質の分泌が伴う。該神経伝
達物質はシナプス前ニューロンにおいて小胞に封入され
て、シナプス間隙に放出され、シナプス後ニューロンに
あるその受容体を見つける。神経インパルスの伝達は通
常は一時的である。 【０００７】シナプス伝達の不可欠な特性は、神経伝達
物質放出に続く迅速な作用の終了である。カテコールア
ミン、セロトニンおよびある種のアミノ酸（例えばγ−
アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、グルタミン酸およびグリシン
など）を含む多くの神経伝達物質の場合、シナプス作用
の迅速な終了はシナプス前末端および周辺の神経膠細胞
への神経伝達物質の取り込みによって達成される。この
迅速な神経伝達物質の再蓄積は、シナプス前末端による
再取り込みの結果である。 【０００８】シナプス前末端では、再取り込みのための
種々の分子構造が、コリンや生物起源のアミン（ドーパ
ミン、ノルエピネフリン、エピネフリン、セロトニンお
よびヒスタミンなどの低分子量神経伝達物質）といった
神経伝達物質に対して高い特異性を持つ。これらの分子
装置は、トランスポーターと呼ばれる受容体である。こ
れらのトランスポーターは神経伝達物質をシナプス間隙
からシナプス前ニューロンの細胞膜を逆に横切ってシナ
プス前末端の細胞質内へ動かすことによって、これらの
物質の機能を終了させる。神経伝達物質の取り込みの阻
害または刺激は、内因性神経伝達物質の作用を調節する
手段を提供する。神経伝達物質は運動障害、精神分裂
病、薬物嗜癖、不安、偏頭痛、てんかん、ミオクローヌ
ス、痙性麻痺、筋痙攣、精神分裂病、認識障害、抑鬱症
状、パーキンソン病およびアルツハイマー病などを含む
多数の病理生理学および治療に関する。 【０００９】該トランスポーターによる神経伝達物質の
再取り込みは、ナトリウム依存性でありうる。例えばＧ
ＡＢＡトランスポーターは、最近記されたナトリウム依
存性神経伝達物質トランスポーター遺伝子ファミリーの
メンバーである。これらのトランスポーターは細胞外部
位、膜貫通部位および細胞内部位を持つ膜貫通型受容体
錯体である。ナトリウム依存性神経伝達物質トランスポ
ータータンパク質の全ファミリーの膜貫通ドメインにお
いてはかなりの程度のホモロジーが存在し、同一のアミ
ノ酸を有する区間がかなりあるが、これらのドメインに
つながっている細胞内ループおよび細胞外ループにおい
て認められるホモロジーははるかに低い。特に細胞外ル
ープは、各トランスポーターに独特であるように思われ
る。この領域は基質特異性および／またはインヒビター
特異性に寄与するあろう。 【００１０】 【課題を解決するための手段】本発明のポリペプチドは
推定的にアミン受容体として同定されている。本同定は
ラットアミン受容体へのアミノ酸配列ホモロジーの結果
なされている。本発明の一つの態様により、新規な成熟
受容体ポリペプチドならびに生物学的に活性であり、診
断上または治療上有用なそのフラグメント、アナログお
よび誘導体を提供する。本発明の受容体ポリペプチドは
ヒト起源のものである。本発明の別の態様により、ｍＲ
ＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡを含め、本発明
の受容体ポリペプチドをコードする単離された核酸分
子、さらにはまた、そのアンチセンスアナログ、ならび
に生物学的に活性であって、診断上または治療上有用な
そのフラグメントを提供する。 【００１１】本発明のさらなる態様により、該ポリペプ
チドの発現および連続回収を促進するような条件下で、
本発明の受容体ポリペプチドをコードする核酸配列を含
む組換え原核生物および／または真核生物宿主細胞を培
養することを含む、組換え技術によるそのような受容体
ポリペプチドの製造方法を提供する。本発明のさらに別
の態様により、そのような受容体ポリペプチドに対する
抗体を提供する。本発明の他の態様により、本発明の受
容体ポリペプチドに結合し該ポリペプチドの活性化を活
性化または阻害する化合物のスクリーニングの方法を提
供する。 【００１２】本発明のさらに別の態様により、本発明の
アミノ受容体の過少発現から引き起こされる異常な状態
の予防および／または処置のために本発明の受容体ポリ
ペプチドに結合し、活性化する、宿主に化合物を投与す
る方法を提供する。本発明の他の態様により、該ポリペ
プチドの過少発現または受容体ポリペプチドに対するリ
ガンドの過少発現に関する状態を治療するため、遺伝子
治療を介して本発明の受容体ポリペプチドを投与する方
法を提供する。 【００１３】本発明のさらに別の態様により、本発明の
アミン受容体の発現から引き起こされる状態の予防およ
び／または治療のため、本発明の受容体ポリペプチドに
結合し、該ポリペプチドの活性化を阻害する化合物を投
与する方法を提供する。本発明のさらに別の態様によ
り、本発明のポリヌクレオチドの配列に特異的にハイブ
リダイズするのに十分な長さの核酸分子を含む核酸プロ
ーブを提供する。本発明のさらに別の態様により、その
ようなポリペプチドをコードする核酸配列中の変異に関
する疾患を検出する診断アッセイおよび該受容体ポリペ
プチドの可溶性形態のレベルの変化を検出する診断アッ
セイを提供する。 【００１４】本発明のさらに別の態様により、科学的研
究、ＤＮＡの合成およびＤＮＡベクターの製造に関連し
たイン・ビトロでの目的のためにそのような受容体ポリ
ペプチドまたはそのようなポリペプチドをコードするポ
リヌクレオチドを利用する方法を提供する。本発明のこ
れらの態様および他の態様は、本明細書中の教示から当
業者に明らかであろう。 【００１５】以下の図面は、本発明の態様を説明するも
のであって、請求の範囲により包含される本発明の範囲
を限定しようとするものではない。本発明のアミン受容
体は哺乳動物細胞中に存在するアミン神経伝達物質の１
またはいずれかの再取り込みの責任を負ってよい。その
ようなアミントランスポーターの例には、これらに限る
ものではないが、ドーパミン、ノルエピネフリン、エピ
ネフリン、セロトニンおよびヒスタミンおよびＧＡＢ
Ａ、グリシン、グルタミン酸が含まれる他のアミノ神経
伝達物質が含まれる。本発明の一つの態様により、図１
〜図３（配列番号：２）の推定アミノ酸配列を有する成
熟ポリペプチド、または１９９５年６月１日にＡＴＣＣ
受託番号第９７１８１号として寄託されたクローンのc
ＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドをコードす
る、単離された核酸(ポリヌクレオチド)を提供する。 【００１６】本発明のポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチドはヒト単球において見いだされてよい。本発
明のポリヌクレオチドはヒトゲノムライブラリーにおい
て発見された。該ポリヌクレオチドはＧ−タンパク質結
合受容体ファミリーに構造上関連する。該ポリヌクレオ
チドは３３７アミノ酸残基のタンパク質をコードするオ
ープンリーディングフレームを含む。該タンパク質は３
３０アミノ酸にわたってマウスβ−１アドレナリン受容
体に３２.０９９％の同一性および５５.８６４％の類似
性を有して最も高いホモロジーを示す。該タンパク質は
また、３１２アミノ酸にわたって、ヒトドーパミンＤ2
受容体に３２％の同一性および５８.３３３％の類似性
を有してホモロジーを示す。 【００１７】本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形
で、またはＤＮＡの形であり得、このＤＮＡには、cＤ
ＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡが含まれる。該
ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得、また一本鎖で
あるなら、コーディング鎖または非コーディング(アン
チ−センス)鎖であり得る。成熟ポリペプチドをコード
するコーディング配列は、図１〜図３（配列番号：１）
に示すコーディング配列または寄託されたクローンのコ
ーディング配列と同じであってよく、あるいは遺伝コー
ドの重複または縮重の結果として、図１〜図３（配列番
号：１）のＤＮＡまたは寄託されたcＤＮＡと同じ成熟
ポリペプチドをコードする異なったコーディング配列で
あってもよい。 【００１８】図１〜図３（配列番号：２）の成熟ポリペ
プチドまたは寄託されたcＤＮＡによりコードされる成
熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドには、以
下のものが含まれ得る：成熟ポリペプチドのコーディン
グ配列のみ；成熟ポリペプチドのコーディング配列およ
び付加的コーディング配列；成熟ポリペプチドのコーデ
ィング配列(また場合により、付加的コーディング配
列)、および成熟ポリペプチドのコーディング配列のイ
ントロンまたは非コーディング配列５'および／または
３'といったような非コーディング配列。 【００１９】従って、「ポリペプチドをコードするポリ
ヌクレオチド」という用語は、ポリペプチドのコーディ
ング配列のみが含まれるポリヌクレオチド、さらにはま
た、付加的コーディングおよび／または非コーディング
配列が含まれるポリヌクレオチドを包含する。本発明は
さらに、図１〜図３（配列番号：２）の推定アミノ酸配
列を有するポリペプチドまたは寄託されたクローンのc
ＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフラグメン
ト、アナログおよび誘導体をコードする、上記のポリヌ
クレオチドの変異体に関する。ポリヌクレオチドの変異
体は、ポリヌクレオチドの天然に存在するアレル変異体
またはポリヌクレオチドの天然には存在しない変異体で
あり得る。 【００２０】従って、本発明には、図１〜図３（配列番
号：２）に示すのと同じ成熟ポリペプチドまたは寄託さ
れたクローンのcＤＮＡによりコードされる同じ成熟ポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチド、さらにはま
た、そのようなポリヌクレオチドの変異体が含まれ、こ
れらの変異体は、図１〜図３（配列番号：２）のポリペ
プチドまたは寄託されたクローンのcＤＮＡによりコー
ドされるポリペプチドのフラグメント、誘導体またはア
ナログをコードする。そのようなヌクレオチド変異体に
は、欠失変異体、置換変異体並びに付加および挿入変異
体が含まれる。 【００２１】先に示したように、該ポリヌクレオチド
は、図１〜図３（配列番号：１）に示すコーディング配
列の天然に存在するアレル変異体または寄託されたクロ
ーンのコーディング配列の天然に存在するアレル変異体
であるコーディング配列を有し得る。当該技術分野で知
られているように、アレル変異体は、１つまたはそれ以
上のヌクレオチドの置換、欠失または付加を有し得る別
の形のポリヌクレオチド配列であり、これは、コードさ
れるポリペプチドの機能を実質的には変えない。該ポリ
ヌクレオチドはまた、本発明の完全長のポリペプチドの
ＴＭおよび細胞内ドメインから開裂されているポリペプ
チドの細胞外部位であるアミン受容体ポリペプチドの可
溶性形態をコードしてもよい。 【００２２】本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明
のポリペプチドの精製を可能とするマーカー配列にイン
・フレームで融合したコーディング配列も有し得る。細
菌宿主の場合には、そのマーカー配列は、マーカーに融
合した成熟ポリペプチドの精製を提供するための、pＱ
Ｅ−９ベクターにより与えられるヘキサ−ヒスチジンタ
グ(tag)であってよく、または、哺乳動物宿主、例え
ば、ＣＯＳ−７細胞を使用する場合には、そのマーカー
配列は、赤血球凝集素(ＨＡ)タグであってよい。ＨＡタ
グは、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質から得ら
れるエピトープに対応する(ウィルソン（Ｗilson,Ｉ.）
ら、Ｃell、３７：７６７（１９８４）)。 【００２３】本発明の全長の遺伝子のフラグメントは、
全長のｃＤＮＡおよび該遺伝子に高い類似性を有するか
または同様の生物学的活性を有する他のｃＤＮＡを単離
するためのcＤＮＡライブラリーのハイブリダイゼーシ
ョンプローブとして使用してよい。このタイプのプロー
ブは、好ましくは少なくとも３０塩基を有し、例えば、
５０またはそれより多くの塩基を含んでいてよい。該プ
ローブはまた、全長の転写物およびゲノムクローンまた
は調節領域およびプロモーター領域、エクソンおよびイ
ントロンを含む完全な遺伝子を含むクローンに対応する
cＤＮＡクローンを同定するのに使用してよい。スクリ
ーニングの例には、オリゴヌクレオチドプローブを合成
するための公知のＤＮＡ配列を使用することによって該
遺伝子のコーディング領域を単離することを含む。本発
明の遺伝子の配列に相補的な配列を有する標識したオリ
ゴヌクレオチドはヒトcＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはmＲ
ＮＡのライブラリーをスクリーニングして該プローブが
ライブラリーのどのメンバーにハイブリダイズするのか
を決定するのに使用する。 【００２４】本発明はさらに、配列間に少なくとも７０
％、また好ましくは少なくとも９０％およびより好まし
くは少なくとも９５％の同一性がある場合に、上記の配
列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本
発明は特に、ストリンジェント条件下、上記のポリヌク
レオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドに関す
る。本明細書中で使用する場合、「ストリンジェント条
件」という用語は、配列間に少なくとも９５％、また好
ましくは少なくとも９７％の同一性がある場合にのみ、
ハイブリダイゼーションが起こるであろうことを意味す
る。好ましい態様では、上記のポリヌクレオチドにハイ
ブリダイズするポリヌクレオチドは、図１〜図３（配列
番号：１）のcＤＮＡもしくは寄託されたcＤＮＡにより
コードされる成熟ポリペプチドと実質的に同じ生物学的
機能もしくは活性を保持する、すなわち、ポリペプチド
が、例えば、第２メッセンジャー応答を引き起こすこと
によって膜結合アミン受容体として機能しないとして
も、該受容体のリガンドに結合することができる能力を
を保持することによって可溶性アミン受容体として機能
するポリペプチドをコードする。 【００２５】かわりに、該ポリペプチドは本発明のポリ
ヌクレオチドにハイブリダイズし、および該ポリヌクレ
オチドに上記に示すように同一性を有し、活性は保有し
ているかまたはいない少なくとも２０塩基、好ましくは
３０塩基およびより好ましくは少なくとも５０塩基を有
する。そのようなポリペプチドは配列番号：１のポリヌ
クレオチド、例えば該ポリヌクレオチドの回収のための
プローブとして、または診断プローブまたはＰＣＲプラ
イマーとして使用してよい。 【００２６】従って、本発明は配列番号：２のポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチドに少なくとも７０％
の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、およ
びより好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するポ
リヌクレオチドならびにそのフラグメント（該フラグメ
ントは少なくとも３０塩基および好ましくは少なくとも
５０塩基を有する）およびそのようなポリヌクレオチド
によりコードされるポリペプチドに関する。 【００２７】本明細書中でいう寄託は、特許手続上の微
生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約の条件の
下に保持されるであろう。これらの寄託は、単に当業者
への便宜として与えられるものであって、寄託が３５
Ｕ.Ｓ.Ｃ. §１１２下に要求されることを承認するもの
ではない。寄託された物質中に含まれるポリヌクレオチ
ドの配列、さらにはまた、それによりコードされるポリ
ペプチドのアミノ酸配列は、本明細書の一部を構成し
て、本明細書中の配列のいずれかの記載と矛盾する際に
は該寄託された物質中の配列が優先する。寄託された物
質を製造し、使用し、または販売するには、実施許諾が
要求され得、またそのような実施許諾は、ここでは付与
されない。 【００２８】本発明はさらに、図１〜図３（配列番号：
２）の推定アミノ酸配列を有する、または寄託されたc
ＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有するヒトア
ミン受容体ポリペプチド、さらにはまた、そのようなポ
リペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体に関
する。図１〜図３（配列番号：２）のポリペプチドまた
は寄託されたcＤＮＡによりコードされるポリペプチド
を示す場合、「フラグメント」、「誘導体」および「ア
ナログ」という用語は、そのようなポリペプチドと本質
的に同じ生物学的機能もしくは活性を保持する、すなわ
ち、アミン受容体として機能するかまたは、たとえ該ポ
リペプチドが例えば該受容体の可溶性形態などＧ−タン
パク質結合受容体として機能しないとしても該受容体の
リガンドに結合する能力を有するポリペプチドを意味す
る。本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天
然ポリペプチドまたは合成ポリペプチド、好ましくは組
換えポリペプチドであってよい。 【００２９】図１〜図３（配列番号：２）のポリペプチ
ドまたは寄託されたcＤＮＡによりコードされるポリペ
プチドのフラグメント、誘導体またはアナログは、
（ｉ）１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が同型または
非同型アミノ酸残基(好ましくは、同型アミノ酸残基)で
置換されており、またそのような置換アミノ酸残基が遺
伝コードによりコードされるものであってもよく、また
はコードされたものでなくてもよいもの、（ii）１つま
たはそれ以上のアミノ酸残基に置換基が含まれるもの、
または（iii）成熟ポリペプチドが、該ポリペプチドの
半減期を増加させる化合物(例えば、ポリエチレングリ
コール)のような、他の化合物と融合しているもの、ま
たは（iv）成熟ポリペプチドの精製に使用される付加的
アミノ酸が成熟ポリペプチドに融合しているもの（v）
該ポリペプチドのフラグメントが可溶性であり、すなわ
ち膜結合ではないが膜結合受容体に対するリガンドを結
合するものであり得る。そのようなフラグメント、誘導
体およびアナログは、本明細書中の教示から当業者の範
囲内であると思われる。 【００３０】本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオ
チドは、単離された形で提供されるのが好ましく、好ま
しくは、均一となるまで精製される。本発明のポリペプ
チドは配列番号：２のポリペプチドならびに配列番号：
２のポリペプチドに少なくとも７０％の類似性（好まし
くは少なくとも７０％の同一性）およびより好ましくは
少なくとも９０％の類似性（より好ましくは少なくとも
９０％の同一性）およびさらになおより一層好ましくは
９５％の類似性（さらになお好ましくは、少なくとも９
５％の同一性）を有する配列番号：２のポリペプチドを
含み、また、そのようなポリペプチドの部分をも含み、
そのようなポリペプチドの部分は一般的には少なくとも
３０アミノ酸およびより好ましくは少なくとも５０アミ
ノ酸を含む。 【００３１】当該技術分野において知られているよう
に、２つのポリペプチドの間の「類似性」は、１つのポ
リペプチドのアミノ酸配列およびその保存されたアミノ
酸置換基を第２のポリペプチドの配列に対して比較する
ことにより決定される。本発明のポリペプチドのフラグ
メントまたは一部は、ペプチド合成による対応する完全
長のポリペプチドを調製するのに使用してよい；それゆ
え、該フラグメントは完全長ポリペプチドを産生するた
めの中間体として使用されてよい。本発明のポリヌクレ
オチドのフラグメントまたは一部は、本発明の完全長ポ
リヌクレオチドを合成するために使用してよい。 【００３２】「遺伝子」なる語は、ポリペプチド鎖を産
生することに関するＤＮＡセグンメントを意味する：コ
ーディング領域の前および後に続く領域（リーダーおよ
びトレーラー）ならびに個々のコーディングセグメント
（エクソン）間の介在配列（イントロン）を含む。「単
離された」という用語は、物質がその元の環境(例え
ば、それが天然に存在するなら、天然の環境)から除去
されていることを意味する。例えば、生存動物中にある
天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは
単離されていないが、天然の系における共存物質のいく
つかまたは全てから分離された同じポリヌクレオチドま
たはポリペプチドは単離されている。そのようなポリヌ
クレオチドはベクターの一部となり得、および／または
そのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは組成
物の部分となり得、またそのようなベクターまたは組成
物はその天然の環境の一部ではないという点で、なお単
離されている。 【００３３】本発明のポリペプチドは配列番号：２のポ
リペプチドならびに配列番号：２のポリペプチドに少な
くとも７０％の類似性（好ましくは少なくとも７０％の
同一性）およびより好ましくは少なくとも９０％の類似
性（より好ましくは少なくとも９０％の同一性）および
さらになおより一層好ましくは９５％の類似性（さらに
なお好ましくは、少なくとも９５％の同一性）を有する
配列番号：２のポリペプチドを含み、また、そのような
ポリペプチドの部分をも含み、そのようなポリペプチド
の部分は一般的には少なくとも３０アミノ酸およびより
好ましくは少なくとも５０アミノ酸を含む。 【００３４】当該技術分野において知られているよう
に、２つのポリペプチドの間の「類似性」は、１つのポ
リペプチドのアミノ酸配列およびその保存されたアミノ
酸置換基を第２のポリペプチドの配列に対して比較する
ことにより決定される。本発明のポリペプチドのフラグ
メントまたは一部は、ペプチド合成による対応する完全
長のポリペプチドを調製するのに使用してよい；それゆ
え、該フラグメントは完全長ポリペプチドを産生するた
めの中間体として使用されてよい。本発明のポリヌクレ
オチドのフラグメントまたは一部は、本発明の完全長ポ
リヌクレオチドを合成するために使用してよい。 【００３５】本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド
が含まれるベクター、本発明のベクターで遺伝的に操作
された宿主細胞、および本発明のポリペプチドの組換え
技術による製造にも関する。宿主細胞は、例えば、クロ
ーニングベクターまたは発現ベクターであり得る本発明
のベクターで遺伝的に操作される（トランスデュースさ
れ、または形質転換され、またはトランスフェクトされ
る）。該ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒
子、ファージ等の形であり得る。操作された宿主細胞
は、プロモーターを活性化し、トランスフォーマントを
選択し、または本発明の遺伝子を増幅するのに適するよ
う改変された従来の栄養培地で培養することができる。
温度、ｐＨ等といったような培養条件は、発現用に選択
された宿主細胞で先に使用した培養条件であって、当業
者に明らかであろう。 【００３６】本発明のポリヌクレオチドは、ポリペプチ
ドを組換え技術により製造するのに使用することができ
る。従って、例えば、該ポリヌクレオチドを、ポリペプ
チドを発現するための様々な発現ベクターのいずれか１
つに含ませることができる。そのようなベクターには、
染色体、非染色体および合成ＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ
４０の誘導体；細菌プラスミド；ファージＤＮＡ；バキ
ュロウイルス；酵母プラスミド；プラスミドとファージ
ＤＮＡとの組合せから得られるベクター；ワクシニア、
アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病といったよ
うなウイルスＤＮＡが含まれる。しかし、他のいずれの
ベクターも、それが宿主中で複製可能であって、生存可
能である限り、使用することができる。 【００３７】適当なＤＮＡ配列を様々な方法によりベク
ターに挿入することができる。一般には、ＤＮＡ配列を
当業界で公知の方法により適当な制限エンドヌクレアー
ゼ部位に挿入する。そのような方法および他の方法は、
当業者の範囲内であると思われる。発現ベクターのＤＮ
Ａ配列は、適当な発現制御配列（プロモーター）に作動
可能に結合し、ｍＲＮＡ合成を行う。そのようなプロモ
ーターの代表例として、以下のものが挙げられる：ＬＴ
ＲまたはＳＶ４０プロモーター、大腸菌(Ｅ．coli)、la
cまたはtrp、ファージラムダＰLプロモーター、および
原核もしくは真核細胞またはそれらのウイルスでの遺伝
子の発現を制御することが知られている他のプロモータ
ー。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム
結合部位および転写終結区も含む。該ベクターはまた、
発現を増幅するのに適当な配列も含み得る。 【００３８】さらに、発現ベクターは、真核細胞培養の
場合にはジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン
耐性といったような、または大腸菌ではテトラサイクリ
ンまたはアンピシリン耐性といったような、形質転換さ
れた宿主細胞の選択のための表現型特性を与えるため
に、１つまたはそれ以上の選択可能なマーカー遺伝子を
含むのが好ましい。上記のような適当なＤＮＡ配列、さ
らにはまた、適当なプロモーターまたは制御配列を含む
ベクターを、適当な宿主を形質転換するために使用し
て、その宿主がタンパク質を発現するのを可能にするこ
とができる。 【００３９】適当な宿主の代表例として、以下のものが
挙げられる：大腸菌、ストレプトマイセス（Streptomyc
es）、サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typ
himurium）といったような細菌細胞；酵母のような真菌
細胞；Drosophila Ｓ２およびSpodoptera Ｓｆ９といっ
たような昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳまたはBowesメラノ
ーマといったような動物細胞；アデノウイルス；植物細
胞等。適当な宿主の選択は、本明細書中の教示から当業
者の範囲内であると思われる。 【００４０】とりわけ、本発明にはまた、先に広く記載
した配列を１つまたはそれ以上含む組換え構築物も含ま
れる。その構築物は、本発明の配列が順または逆方向で
挿入されている、プラスミドまたはウイルスベクターと
いったようなベクターを含む。この実施態様の好ましい
態様では、該構築物はさらに、例えば、該配列に作動可
能に結合したプロモーターを含め、制御配列を含む。適
当なベクターおよびプロモーターが多数、当業者に知ら
れており、市販されている。以下のベクターを例として
挙げる。細菌用：pＱＥ７０、pＱＥ６０、pＱＥ−９
（キアゲン（Ｑiagen））、pＢＳ、pＤ１０、ファージ
スクリプト（phagescript）、psiＸ１７４、pbluescrip
t ＳＫ、pbsks、pＮＨ８Ａ、pＮＨ１６a、pＮＨ１８
Ａ、pＮＨ４６Ａ（ストラタジーン（Ｓtratagene））；
pＴＲＣ９９a、pＫＫ２２３−３、pＫＫ２３３−３、p
ＤＲ５４０、pＲＩＴ５（ファルマシア（Ｐharmaci
a））。真核生物用：pＷＬＮＥＯ、pＳＶ２ＣＡＴ、pＯ
Ｇ４４、pＸＴ１、pＳＧ（ストラタジーン）、pＳＶＫ
３、pＢＰＶ、pＭＳＧ、pＳＶＬ（ファルマシア）。し
かし、他のいずれのプラスミドまたはベクターも、それ
らが宿主中で複製可能であって、生存可能である限り、
使用することができる。 【００４１】プロモーター領域は、ＣＡＴ（クロラムフ
ェニコールトランスフェラーゼ）ベクターまたは選択可
能なマーカーを有する他のベクターを用いて、いずれか
の所望の遺伝子から選択することができる。２つの適当
なベクターは、ＰＫＫ２３２−８およびＰＣＭ７であ
る。個々に名付けられた細菌プロモーターには、lac
Ｉ、lacＺ、Ｔ３、Ｔ７、gpt、ラムダＰR、ＰLおよびtr
pが含まれる。真核プロモーターには、ＣＭＶ前初期（i
mmediate early）、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期およ
び後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来のＬＴＲ、および
マウスのメタロチオネイン−Ｉが含まれる。適当なベク
ターおよびプロモーターの選択は、十分、当業者のレベ
ルの範囲内である。 【００４２】さらなる態様では、本発明は、上記の構築
物を含む宿主細胞に関する。その宿主細胞は、哺乳動物
細胞のような高等真核細胞、酵母細胞のような下等真核
細胞であり得て、または該宿主細胞は、細菌細胞のよう
な原核細胞であり得る。構築物の宿主細胞への導入は、
リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥデキ
ストラン媒介トランスフェクションまたはエレクトロポ
レーションにより行うことができる。（デイビス（Ｄav
is，Ｌ.）、ディブナー（Ｄibner，Ｍ.）、バッティー
（Ｂattey，Ｉ.）、ベーシック・メソッズ・イン・モレ
キュラー・バイオロジー（Ｂasic Ｍethods in Ｍolecu
lar Ｂiology）（１９８６））。 【００４３】宿主細胞中の構築物を通常の方法で使用し
て、組換え配列によりコードされる遺伝子産物を製造す
ることができる。あるいはまた、本発明のポリペプチド
は、従来のペプチド合成装置により合成的に製造するこ
とができる。成熟タンパク質は、適当なプロモーターの
制御下、哺乳動物細胞、酵母、細菌、または他の細胞中
で発現させることができる。そのようなタンパク質を、
本発明のＤＮＡ構築物から得られるＲＮＡを用いて製造
するために、無細胞翻訳系もまた使用することができ
る。原核および真核生物宿主で使用するのに適当なクロ
ーニングおよび発現ベクターは、サンブルック（Ｓambr
ook）ら、モレキュラー・クローニング（Ｍolecular Ｃ
loning）：ア・ラボラトリー・マニュアル（ＡＬaborat
ory Ｍanual）、第２版、コールド・スプリング・ハー
バー（Ｃold Ｓpring Ｈarbor）、ニューヨーク、（１
９８９）により記載されており、この開示は、本明細書
の一部を構成する。 【００４４】本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ
の高等真核生物による転写は、エンハンサー配列をベク
ターに挿入することにより増加する。エンハンサーは、
プロモーターに作用してその転写を増加させる、通常、
約１０〜３００bpの、ＤＮＡのシス作用性要素である。
例には、bp １００〜２７０の、複製起点の後期側にあ
るＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プ
ロモーターエンハンサー、複製起点の後期側にあるポリ
オーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサ
ーが含まれる。 【００４５】通例、組換え発現ベクターには、複製起
点、および宿主細胞の形質転換を可能にする選択可能な
マーカー、例えば、大腸菌のアンピシリン耐性遺伝子お
よびサッカロミセス・セレビシエ（S. cerevisiae） Ｔ
ＲＰ１遺伝子、並びに下流の構造配列の転写を行わせる
ために高度に発現される遺伝子から得られるプロモータ
ーが含まれるであろう。そのようなプロモーターは、と
りわけ、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）の
ような解糖系酵素、α−因子、酸性ホスファターゼ、ま
たは熱ショックタンパク質などをコードするオペロンか
ら得ることができる。ヘテロロガス構造配列は、翻訳開
始および終結配列と共に、適当な相（phase）で構築さ
れる。場合により、そのヘテロロガス配列は、所望の特
性、例えば、発現された組換え産物の安定化または精製
の簡易化を与えるＮ−末端同定ペプチドが含まれる融合
タンパク質をコードすることができる。 【００４６】細菌で使用するのに有用な発現ベクター
は、所望のタンパク質をコードする構造ＤＮＡ配列を、
適当な翻訳開始および終結シグナルと共に、機能的なプ
ロモーターを有する作動可能なリーディング相に挿入す
ることにより構築される。そのベクターは、ベクターの
維持を確実なものとするために、また所望により、宿主
内での増幅を与えるために、１つまたはそれ以上の表現
型の選択可能なマーカーおよび複製起点を含むであろ
う。形質転換に適当な原核宿主には、大腸菌、バシラス
・サチリス（Bacillus subtilis）、サルモネラ・ティ
フィムリウム、ならびにシュードモナス（Pseudomona
s）属、ストレプトマイセス属、およびスタフィロコッ
カス（Staphylococcus）属の範囲内の様々な種が含まれ
るが、他のものもまた、選択物質として使用することが
できる。 【００４７】代表的であるが、非限定的な例として、細
菌で使用するのに有用なベクターは、よく知られたクロ
ーニングベクター pＢＲ３２２（ＡＴＣＣ ３７０１
７）の遺伝要素を含む市販のプラスミドから得られる、
選択可能なマーカーおよび細菌の複製起点を含み得る。
そのような市販のベクターには、例えば、pＫＫ２２３
−３（ファルマシア・ファイン・ケミカルズ（Ｐharmac
ia Ｆine Ｃhemicals）、ウプサラ（Ｕppsala）、スウ
ェーデン）およびＧＥＭ１（プロメガ・バイオテク（Ｐ
romega Ｂiotec）、マディソン、ウィスコンシン、米
国）が含まれる。これらのpＢＲ３２２「骨核」部分を
適当なプロモーターおよび発現されるべき構造配列と組
み合わせる。 【００４８】適当な宿主株を形質転換して、その宿主株
を適当な細胞密度まで増殖させた後、選択されたプロモ
ーターを適当な方法（例えば、温度シフトまたは化学誘
導）により誘導して、細胞をさらなる期間培養する。細
胞を、典型的には、遠心分離により収集し、物理的また
は化学的方法により破壊して、その結果得られた粗製の
抽出物を更なる精製のために保持する。タンパク質の発
現に使用される微生物細胞は、凍結−解凍サイクル、超
音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を含
め、いずれの便利な方法によっても破壊でき、そのよう
な方法は、当業者に周知である。 【００４９】組換えタンパク質を発現させるために、様
々な哺乳動物細胞培養系もまた使用することができる。
哺乳動物発現系の例には、ガルツマン（Ｇluzman）、Ｃ
ell、２３：１７５（１９８１）により記載されてい
る、サルの腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７系、および適合
可能なベクターを発現させることができる他の細胞系、
例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨeＬaおよびＢＨ
Ｋ細胞系が含まれる。哺乳動物発現ベクターは、複製起
点、適当なプロモーターおよびエンハンサー、またいず
れかの必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部
位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、転写終
結配列、および５’に隣接する非転写配列もまた含むで
あろう。ＳＶ４０のスプライシングから得られるＤＮＡ
配列、およびポリアデニル化部位を使用して、必要とさ
れる非転写遺伝要素を与えることができる。 【００５０】ヒトアミン受容体ポリペプチドは、硫酸ア
ンモニウムまたはエタノール沈降、酸抽出、陰イオンま
たは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロー
スクロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフ
ィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシ
ルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロ
マトグラフィーが含まれる方法により、組換え細胞培養
物から回収して、精製することができる。必要に応じ
て、タンパク質の再生工程を、成熟タンパク質の立体配
置を完成するのに使用することができる。最後に、高性
能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を最終精製工程
に使用することができる。 【００５１】本発明のポリペプチドは、天然に精製され
た産物、もしくは化学合成法の産物であり得るか、また
は原核もしくは真核宿主から（例えば、培養物中の細
菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞によっ
て）組換え技術により製造することができる。組換え製
造方法で使用する宿主により、本発明のポリペプチド
は、グリコシル化され得るか、またはグリコシル化され
得ない。本発明のポリペプチドにはまた、最初のメチオ
ニンアミノ酸残基が含まれ得る。 【００５２】全長のヒトアミントランスポーター遺伝子
のフラグメントは、全長の遺伝子および該遺伝子に高い
類似性を有するかまたは同様の生物学的活性を有する他
の遺伝子を単離するためのcＤＮＡライブラリーのハイ
ブリダイゼーションプローブとして使用してよい。この
タイプのプローブは、少なくとも２０塩基、好ましくは
少なくとも３０塩基、最も好ましくは少なくとも５０ま
たはそれより多くの塩基を含んでいてよい。該プローブ
はまた、全長の転写物およびゲノムクローンまたは調節
領域およびプロモーター領域、エクソンおよびイントロ
ンを含む完全なヒトアミントランスポーター遺伝子を含
むクローンに対応するcＤＮＡを同定するのに使用して
よい。スクリーニングの例には、オリゴヌクレオチドプ
ローブを合成するため公知のＤＮＡ配列を使用すること
によって、ヒトアミントランスポーター遺伝子のコーデ
ィング領域を単離することを含む。本発明の遺伝子の配
列に相補的な配列を有する標識したオリゴヌクレオチド
はヒトcＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはmＲＮＡのライブラ
リーをスクリーニングして該プローブがライブラリーの
どのメンバーにハイブリダイズするのかを決定するのに
使用する。 【００５３】本発明は、本発明のヒトアミン受容体によ
って輸送されるアミン神経伝達物質を決定する方法を提
供する。これらの神経伝達物質を同定するアッセイの一
例では、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼをコードする組換え
ワクシニアウイルスＶＴＦ−７株に哺乳動物細胞を感染
させた後、ベクター（例えばpＢＳＳＫII（−））を使
用して、リポソーム媒介トランスフェクション法で、本
発明のアミン受容体遺伝子に感染させる。等量のベクタ
ーのみを用いて、対照トランスフェクションをも行な
う。アッセイは、トランスフェクションの８時間後に、
改良クレブス-リンゲル-ＨＥＰＥＳ緩衝液中で行なう。
ついで、細胞を［3Ｈ］神経伝達物質（例えばＧＡＢ
Ａ、ドーパミン、セロトニンなど）と共に培養する。細
胞を氷上に置くことによって取り込みを停止させる。細
胞を１％ＳＤＳ中で可溶化し、蓄積した放射能の量を液
体シンチレーションカウンティングで決定する。各アッ
セイについてpＢＳＳＫIIによる対照トランスフェクシ
ョンを用いてバックグラウンドを測定し、特定のアミン
神経伝達物質について決定したシグナルからその値を差
し引くことによって、有意な量が取り込まれていたら、
その特定の神経伝達物質が本発明のヒトアミン受容体に
よって取り込まれることが確定される。 【００５４】本発明は、アミン受容体をコードするｍＲ
ＮＡの存在を検出することによる、細胞表面における本
発明のアミン受容体の発現を検出する方法をも提供す
る。この方法では、当該技術分野においてよく知られた
方法で細胞から総ｍＲＮＡを得て、そのようにして得ら
れたｍＲＮＡを、少なくとも１０ヌクレオチドからな
り、かつ、本発明のヒトアミン受容体をコードする核酸
分子の配列内に含まれる配列と特異的にハイブリダイズ
することのできる核酸プローブと、ハイブリダイズ条件
下に接触させ、該プローブにハイブリダイズしたｍＲＮ
Ａの存在を検出し、それによってその細胞によるアミン
受容体の発現を検出する。ｍＲＮＡ分子などの標的核酸
分子に対するプローブのハイブリダイゼーションには、
当該技術分野において公知の技術を使用する。しかし、
本発明の一態様では、溶解した細胞から沈殿によって核
酸を抽出し、ｍＲＮＡ分子のポリＡテールを結合するカ
ラムを用いて、その抽出物からｍＲＮＡを単離する。次
に、ニトロセルロース膜上でそのｍＲＮＡを、放射能で
標識したプローブにさらす。この際、プローブは相補的
なｍＲＮＡ配列にハイブリダイズすることによって、そ
の相補的ｍＲＮＡ配列を標識する。結合はオートラジオ
グラフィーまたはシンチレーションカウンティングによ
って検出できる。しかし、これらの段階を行なう他の方
法も当業者には良く知られている。 【００５５】別法として、ヒトアミン受容体に対する抗
体を、該トランスポーターに該抗体が結合し、かつ、細
胞表面におけるその受容体の存在を検出することのでき
る条件下に使用してもよい。そのような方法は、ある所
定の細胞がアミン受容体の発現に欠陥を持つか否かを決
定するために使用してよい。検出法としては、抗体に結
合した蛍光マーカーが挙げられる。 【００５６】本発明は、ヒトアミン受容体に特異的に結
合しうることが知られていない化合物が、ヒトアミン受
容体に特異的に結合できるか否かを決定する方法であっ
て、哺乳動物細胞での発現に適合させたプラスミド（こ
のプラスミドは細胞表面に該アミン受容体を発現させる
ＤＮＡをも含有する）を含む哺乳動物細胞を、アミン受
容体に結合することがわかっているリガンドの結合が可
能な条件下に、上記化合物と接触させ、該哺乳動物アミ
ン受容体に結合した化合物の存在を検出することからな
り、結合した化合物が存在すれば、該化合物がヒトアミ
ン受容体に特異的に結合できることが示されるという方
法をも提供する。 【００５７】本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプ
チドは研究試薬およびヒトの疾患の治療剤および診断薬
の発見のための道具として使用してよい。本発明のアミ
ン受容体は本発明の受容体ポリペプチドの活性化を活性
化する（アゴニスト）または活性化を阻害する（アンタ
ゴニスト）化合物をスクリーニングする工程において使
用してよい。 【００５８】概して、そのようなスクリーニング手段は
本発明の受容体ポリペプチドをその表面に発現する適切
な細胞を提供することに関する。そのような細胞は哺乳
動物、酵母、ショウジョウバエまたは大腸菌からの細胞
を含む。特に、本発明の受容体をコードするポリヌクレ
オチドは細胞をトランスフェクションし、それによって
該アミン受容体を発現する。ついで、該発現された受容
体を試験化合物と接触させ、結合、機能的な応答の刺激
または阻害を観察する。そのようなスクリーニングの手
法の一つは本発明のアミン受容体を発現するためトラン
スフェクションする黒色素胞の使用に関する。そのよう
なスクリーニング技術は１９９２年２月６日に発行され
たＰＣＴ ＷＯ９２／０１８１０において記載されてい
る。 【００５９】従って、例えば、そのようなアッセイを該
受容体をコードする黒色素胞を受容体リガンドおよびス
クリーニングすべき化合物の両方と接触させることによ
って本発明の受容体ポリペプチドの活性化を阻害する化
合物のスクリーニングのために使用してよい。該リガン
ドによって産生されたシグナルの阻害は該化合物が該受
容体に対する潜在的なアンタゴニストである、すなわち
該受容体の活性化を抑制することを示している。該スク
リーニングはそのような細胞とスクリーニングされるべ
き化合物を接触させることによって該受容体を活性化す
る化合物を決定するおよび、そのような化合物がシグナ
ルを産生する、すなわち該受容体を活性化するか否かを
決定するために使用してよい。 【００６０】他のスクリーニング技術には、例えば、Ｓ
cience、Ｖolume ２４６、１８１−２９６（１９８９年
１０月）に記載されているように受容体の活性化によっ
て引き起こされる細胞外ｐＨの変化を測定する系におい
て、該アミン受容体を発現する細胞（例えば、トランス
フェクションされたＣＨＯ細胞）の使用を含む。例え
ば、化合物は本発明の受容体ポリペプチドを発現する細
胞に接触し、ついで第二メッセンジャー応答、例えばシ
グナルトランスダクションまたはｐＨの変化などが該可
能性のある化合物が該受容体を活性化するかまたは阻害
するかを決定するため測定してよい。 【００６１】他のそのようなスクリーニング技術は該ア
ミン受容体をコードするＲＮＡをツメガエル（Ｘenopu
s）の卵母細胞に導入して該受容体を位置時的に発現さ
せることに関する。ついで、該受容体卵母細胞を該受容
体リガンドおよびスクリーニングすべき化合物に接触さ
せ、該受容体の活性化を阻害すると考えられている化合
物のスクリーニングの場合においてカルシウムシグナル
の抑制または活性化の検出を行ってよい。 【００６２】他のスクリーニング技術には、該受容体が
ホスホリパーゼＣまたはＤに結合した該アミン受容体を
発現することに関する。そのような細胞の代表的な例と
して、内皮細胞、平滑筋細胞、胎児腎臓細胞などが挙げ
られる。該スクリーニング上記のようにホスホリパーゼ
第二シグナルからの受容体の活性化または活性化の阻害
を検出することによって行われてよい。 【００６３】他の方法は、その表面に受容体を有する細
胞に対する標識されたリガンドの結合の阻害を決定する
ことによって、本発明のアンタゴニスト受容体ポリペプ
チドの活性化を抑制する化合物のスクリーニングに関す
る。そのような方法は真核生物細胞を該細胞がその表面
に該受容体を発現するようなアミン受容体をコードする
ＤＮＡとトランスフェクションすることおよび該細胞を
公知のリガンドの標識された形態の存在下の化合物と接
触させることに関する。該リガンドは例えば、放射能な
どで標識することができる。標識された該受容体に結合
したリガンドの量は、例えば該受容体の放射能を測定す
ることによって測定する。該化合物が該受容体に結合す
る標識されたリガンドの量の減少によって決定されるな
ら、該受容体に対する標識されたリガンドの結合は阻害
される。 【００６４】アミン受容体は哺乳動物宿主においていた
るところに存在しており、多くの病理学を含む多くの生
物学的機能に責任を負っている。従って、一方でアミン
受容体を刺激する化合物および薬剤を見いだし、他方で
アミン受容体の機能を抑制することができる化合物およ
び薬剤を見いだすことは望ましい。本発明のアミン受容
体に結合し抑制する化合物の例には抗体、場合によって
は該アミン受容体に結合し、該アミン受容体の活性が保
存されるような第二メッセンジャー応答を引き出しては
いないオリゴペプチドを含む。 【００６５】抗体には抗体の抗原結合部位に一般的に関
する独特の決定要因を認識する抗イディオタイプ抗体を
含む。他の例には該アミン受容体のリガンドに密接に関
連しているタンパク質、すなわちリガンドのフラグンメ
ントであって生物学的機能は喪失しており、該アミン受
容体に結合する場合には、何の応答も引き出さないタン
パク質を含む。 【００６６】アンチセンス技術の利用によって調製され
たアンチセンス構築物は、三重らせん形成またはアンチ
センスＤＮＡもしくはＲＮＡによって（この方法は両方
とも、ポリヌクレオチドのＤＮＡまたはＲＮＡへの結合
に基づく）ことによって遺伝子発現を制御するために使
用してよい。例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコー
ドする、ポリヌクレオチド配列の５'コーディング部位
を使用して、長さ約１０〜４０塩基対のアンチセンスＲ
ＮＡオリゴヌクレオチドを設計する。ＤＮＡオリゴヌク
レオチドを、転写に関与する遺伝子領域に対して相補的
であるよう設計し(三重らせん−リー（Ｌee）ら、Ｎuc
l.Ａcids Ｒes.、６：３０７３（１９７９）；クーニー
（Ｃooney）ら、Ｓcience、２４１：４５６（１９８
８）；およびダーバン（Ｄervan）ら、Ｓcience、２５
１：１３６０（１９９１）を参照)、そのことによっ
て、転写およびアミン受容体の産生を妨げる。アンチセ
ンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、イン・ビボにおいて
mＲＮＡにハイブリダイズして、mＲＮＡ分子のアミン受
容体への翻訳をブロックする(アンチセンス−オカノ(Ｏ
kano)、Ｊ. Ｎeurochem.、５６：５６０（１９９１）；
オリゴデオキシヌクレオチズ・アズ・アンチセンス・イ
ンヒビターズ・オブ・ジーン・エクスプレッション（Ｏ
ligodeoxynucleotides as Ａntisense Ｉnhibitors of
Ｇene Ｅxpression）、ＣＲＣプレス（ＣＲＣ Ｐres
s）、ボカ・レイトン（Ｂoca Ｒaton）、フロリダ（１
９８８）)。上記のオリゴヌクレオチドをまた、細胞に
送り込むことから、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡを
イン・ビボにおいて発現させて、アミン受容体の産生を
阻害することができる。 【００６７】該アミン受容体に結合する小分子は、例え
ば、小ペプチドまたはペプチド様分子などの通常の生物
学的活性が妨害されているようにリガンドに接近できな
いようにして、本発明の受容体ポリペプチドの活性化を
阻害すためにも使用してよい。該アミン受容体の可溶性
形態、例えば受容体のフラグメントなどは、本発明の受
容体ポリペプチドに該リガンドを結合し膜結合アミン受
容体と相互作用することからリガンドを妨害することに
よって該受容体を活性化することを抑制するのに使用し
てよい。 【００６８】本発明は、さらに本発明のアミン受容体の
発現に関する異常な状態を処置する方法を提供し、被験
体に上記の阻害性化合物をヒトアミン受容体が該受容体
に特異的に結合することができるように結合するのに有
効な量で製薬学的に許容し得る担体とともに投与し、そ
の投与には、ヒトアミン受容体に特異的に結合しうるこ
とが知られていない化合物が、ヒトアミン受容体に特異
的に結合できるか否かを決定する方法であって、哺乳類
細胞での発現に適合させたプラスミド（このプラスミド
は細胞表面にアミン受容体を発現させるＤＮＡをも含有
する）を含む哺乳類細胞を、アミン受容体に結合するこ
とがわかっているリガンドの結合が可能な条件下に、上
記化合物と接触させ、その哺乳類アミン受容体に結合し
た化合物の存在を検出することからなり、結合した化合
物が存在すれば、その化合物がヒトアミン受容体に特異
的に結合できることが示されるという方法をも提供す
る。 【００６９】本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプ
チドは研究試薬およびヒトの疾患の治療剤および診断薬
の発見のための道具として使用してよい。本発明のアミ
ン受容体は本発明の受容体ポリペプチドの活性化を活性
化する（アゴニスト）または活性化を阻害する（アンタ
ゴニスト）化合物をスクリーニングする工程において使
用してよい。 【００７０】概して、そのようなスクリーニング手段は
本発明の受容体ポリペプチドをその表面に発現する適切
な細胞を提供することに関する。そのような細胞は哺乳
動物、酵母、ショウジョウバエまたは大腸菌からの細胞
を含む。特に、本発明の受容体をコードするポリヌクレ
オチドは細胞をトランスフェクションし、それによって
該アミン受容体を発現する。本発明はまた、本発明の医
薬組成物の成分を１つまたはそれ以上充填した、１つま
たはそれ以上の容器を含む医薬品パックまたはキットも
提供する。そのような容器に関連して、製薬学的または
生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府当
局により規定された形の通知を付してもよく、この通知
は、ヒトへの投与のための製造、使用または販売の、該
当局による承認を表わす。さらに、該医薬組成物は、他
の治療化合物と共に使用することができる。 【００７１】該医薬組成物は、経口、局所、静脈内、腹
腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内または皮内経路といったよ
うな、便利な方法で投与することができる。該医薬組成
物は、具体的な徴候を治療および／または予防するのに
有効な量で投与される。一般に、それらは、少なくとも
約１０μg／kg（体重）の量で投与され、たいていの場
合、それらは、１日当たり約８mg／kg（体重）を超えな
い量で投与されるであろう。ほとんどの場合、投与経路
および症状等を考慮に入れて、投薬量は、毎日約１０μ
g／kg〜約１mg／kg（体重）である。 【００７２】ポリペプチドであるヒトアミン受容体およ
びアゴニストおよびアンタゴニスト化合物はまた、「遺
伝子治療」と呼ばれることが多い、そのようなポリペプ
チドのイン・ビボにおける発現により、本発明に従って
使用してよい。従って、例えば、患者由来の細胞を、エ
クス・ビボにおいてポリペプチドをコードするポリヌク
レオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）で操作した後、操作し
た細胞を該ペプチドで処置すべき患者に与える。そのよ
うな方法は、当該技術分野でよく知られている。例え
ば、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレ
トロウイルス粒子の使用によって、細胞を当該技術分野
でよく知られた方法により操作することができる。 【００７３】同様に、例えば、当該技術分野で公知の方
法により、ポリペプチドのイン・ビボにおける発現のた
めに、細胞をイン・ビボにおいて操作することができ
る。当該技術分野において知られているように、細胞を
イン・ビボにおいて操作してポリペプチドをイン・ビボ
において発現させるために、本発明のポリペプチドをコ
ードするＲＮＡを含むレトロウイルス粒子を製造するた
めのプロデューサー細胞を患者に投与することができ
る。そのような方法により本発明のポリペプチドを投与
するためのこれらの方法および他の方法は、本発明の教
示から当業者に明らかであろう。例えば、細胞を操作す
るための発現ビヒクルは、レトロウイルス以外のもの、
例えば、適当な運搬ビヒクルと組み合わせた後、細胞を
イン・ビボにおいて操作するために使用することができ
るアデノウイルスであってもよい。 【００７４】前記レトロウイルスプラスミドベクターが
由来するレトロウイルスは、以下に限られるものではな
いが、モロニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイル
ス、レトロウイルス、例えば、ラウス肉腫ウイルス、ハ
ーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、テナガザル
白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、アデノウイル
ス、骨髄増殖肉腫ウイルスおよび乳癌ウイルスを含む。
１つの態様において、レトロウイルスプラスミドベクタ
ーは、モロニーマウス白血病ウイルスから得られる。 【００７５】該ベクターは１つまたはそれ以上のプロモ
ーターを含む。使用されてよい適切なプロモーターに
は、以下に限られるものではないが、レトロウイルス
ＬＴＲ；ＳＶ４０プロモーター；およびミラー（Ｍille
r)ら、Biotechniques、Ｖol.７、Ｎo.９、９８０−９９
０（１９８９）に記載のヒトサイトメガロウイルス（Ｃ
ＭＶ）プロモーター、またはその他のプロモーター（例
えば、以下に限るものではないが、ヒストン、polIIIお
よびβ−アクチンプロモーターを含む真核生物細胞のプ
ロモーターなどの細胞プロモーター）が含まれる。使用
されてよい他のウイルスプロモーターは、以下に限るも
のではないが、アデノウイルスプロモーター、チミジン
キナーゼ（ＴＫ）プロモーターおよびＢ１９ パルボウ
イルスプロモーターを含む。適切なプロモーターの選択
は、本明細書中の教示から当業者には明らかであろう。 【００７６】本発明のポリペプチドをコードする核酸配
列は適切なプロモーターの調節下にある。使用されてよ
い適切なプロモーターには、以下に限られるものではな
いが、アデノウイルス主要後期プロモーター（major la
te promoter）などのアデノウイルスプロモーター；ま
たはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターなど
の異種プロモーター；呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）
プロモーター；ＭＭＴプロモーター、メタロチオネイン
プロモーターなどの誘導可能なプロモーター；熱ショッ
クプロモーター；アルブミンプロモーター；ＡpoＡＩプ
ロモーター；ヒトグロブリンプロモーター；単純ヘルペ
スチミジンキナーゼプロモーターなどのウイルスチミジ
ンキナーゼプロモーター；レトロウイルスＬＴＲｓ（上
記の修飾したレトロウイルスＬＴＲｓを含む）；β−ア
クチンプロモーター；およびヒト成長ホルモンプロモー
ターが含まれる。該プロモーターはまた、該ポリペプチ
ドをコードする遺伝子を調節する本来のプロモーターで
あってよい。 【００７７】レトロウイルスプラスミドベクターはプロ
デューサー細胞株を形成するためパッケージング細胞株
をトランスデュースするのに使用してよい。トランスフ
ェクションしてよいパッケージング細胞の例には、以下
に限るものではないが、ＰＥ５０１、ＰＡ３１７、ψ−
２、ψ−ＡＭ、ＰＡ１２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９
−１７−Ｈ２、ψＣＲＥ、ψＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８
６、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２およびＤＡＮ細胞株が含まれ
（ミラー、Human Gene Therapy、Ｖol.１、５−１４頁
（１９９０）に記載）（参照のため本明細書に内容を引
用する）。該ベクターは当該技術分野において公知の方
法によりパッケージング細胞をトランスデュースする。
このような方法には、以下に限るものではないが、エレ
クトロポレーション、リポソームの使用、ＣａＰＯ4沈
降が含まれる。１つの別法として、該レトロウイルスプ
ラスミドベクターはリポソーム中にカプセル化して入れ
られてよく、または脂質と結合され、ついで宿主に投与
されてよい。 【００７８】該プロデューサー細胞株は該ポリペプチド
をコードする核酸配列を含む感染性レトロウイルスベク
ター粒子を産生する。このようなレトロウイルスベクタ
ー粒子はイン・ビトロであれイン・ビボであれ、真核生
物細胞をトランスデュースするため使用してよい。トラ
ンスデュースした真核生物細胞は該ポリペプチドをコー
ドする核酸配列を発現するであろう。トランスデュース
されてよい真核生物細胞には、以下に限られるものでは
ないが、胎児幹細胞、胎児癌細胞、ならびに造血幹細
胞、肝細胞、線維芽細胞、筋芽細胞、ケラチノサイト、
内皮細胞および気管支上皮細胞が含まれる。 【００７９】本発明はまた、該ヒトアミン受容体遺伝子
における変異の存在に関連した疾患または疾患の罹患し
易さを検出するための診断アッセイの一部として、該ヒ
トアミン受容体遺伝子を使用することにも関する。その
ような疾患はヒトアミン受容体の過少発現に関連する。 【００８０】ヒトアミン受容体遺伝子における変異を有
する個体を、多様な技術によってＤＮＡレベルで検出し
てよい。診断用の核酸は、患者の細胞から、例えば、血
液、尿、唾液、組織生検および剖検資料などから得られ
る。ゲノムＤＮＡを直接検出に使用してもよいし、分析
前にＰＣＲ（サイキ（Ｓaiki）ら、Nature、３２４：１
６３−１６６（１９８６））により酵素的に増幅しても
よい。同様の目的のため、ＲＮＡまたはcＤＮＡもまた
使用してよい。一例として、本発明のヒトアミン受容体
タンパク質をコードする核酸に相補的なＰＣＲプライマ
ーは、ヒトアミン受容体の変異を同定し分析するのに使
用することができる。例えば、欠失および挿入は、通常
の遺伝子型に比較して増幅した産物の大きさにおける変
化によって検出することができる。点突然変異は、増幅
したＤＮＡを放射性標識したヒトアミン受容体ＲＮＡま
たは、別法として放射性標識したヒトアミン受容体アン
チセンスＤＮＡ配列にハイブリダイズさせることによっ
て同定することができる。完全にマッチした配列はＲＮ
アーゼＡ消化または融点における相違によってミスマッ
チの二本鎖から区別することができる。 【００８１】ＤＮＡ配列の相違に基づく遺伝的検査は、
変性剤を使用するかまたは使用しないゲルにおけるＤＮ
Ａフラグメントの電気泳動の移動度における変化の検出
によって行われる。小さな配列の欠失および挿入は高分
離（high resolution）ゲル電気泳動によって可視化す
ることができる。異なる配列のＤＮＡフラグメントは、
別々のＤＮＡフラグメントが、その特異的な融点または
部分的な融点に従って別個の位置でゲルにて減速される
変性ホルムアミド濃度勾配ゲル上で区別してよい（例え
ば、マイヤーズ（Ｍyers）ら、Science、２３０：１２
４２(１９８５)）。 【００８２】特定の位置での配列の変化はまた、ＲＮア
ーゼおよびＳ１保護または化学的開裂方法（例えばコッ
トン（Ｃotton）ら、ＰＮＡＳ、ＵＳＡ、８５：４３９
７−４４０１（１９８５））などのヌクレアーゼ保護ア
ッセイによって明らかにされてよい。従って、特異的な
ＤＮＡ配列の検出は、ハイブリダイゼーション、ＲＮア
ーゼ保護、化学的開裂、直接ＤＮＡシークエンシングま
たは制限酵素の使用（例えば、制限フラグメント長多型
（ＲＦＬＰ））およびゲノムＤＮＡのサザンブロットな
どの方法により行われてよい。 【００８３】より一層従来のゲル電気泳動およびＤＮＡ
シークエンシングに加えて、イン・サイチュ分析によっ
ても検出されてよい。本発明はまた、該アミン受容体の
過少発現に関連した疾患の診断に使用してよい多様な組
織における本発明のアミン受容体ポリペプチドの可溶性
形態のレベルの変化を検出するための診断アッセイにも
関する。宿主由来のサンプル中の可溶性の受容体ポリペ
プチドのレベルを検出するために使用したアッセイは当
業者によく知られており、かつラジオイムノアッセイ、
競合結合アッセイ、ウエスタンブロットアッセイおよび
好ましくはＥＬＩＳＡアッセイなどを含む。 【００８４】ＥＬＩＳＡアッセイは最初に本発明のアミ
ン受容体ポリペプチドの抗原に特異的な抗体、好ましく
はモノクローナル抗体を調製することを含む。さらに、
リポーター抗体は該モノクローナル抗体に対して調製さ
れる。リポーター抗体には放射能、蛍光、または本例に
おいては西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素などの検出可
能な試薬を結合させる。サンプルを宿主から除去し、例
えばサンプル中の該タンパク質をサンプル中で結合させ
るポリスチレン皿などの固相支持体上でインキュベート
する。該皿上の任意の遊離のタンパク質結合部位を、つ
いでウシ血清アルブミンのような非特異的なタンパク質
とインキュベートすることによって覆う。次に、モノク
ローナル抗体を皿の中でインキュベートすると、その間
にポリスチレン皿に結合した任意のアミン受容体タンパ
ク質にモノクローナル抗体が結合する。全ての未結合モ
ノクローナル抗体をバッファーで洗い流す。西洋ワサビ
ペルオキシダーゼに結合したリポーター抗体を皿に入れ
ると、アミン受容体タンパク質に結合した任意のモノク
ローナル抗体にリポーター抗体が結合する。結合してい
ないリポーター抗体を洗い流す。ついでペルオキシダー
ゼ基質を皿に加え、ついで所定の時間での発色量を標準
曲線に対して比較すると、患者のサンプルの所定量にお
いて存在するアミン受容体タンパク質の量が測定され
る。 【００８５】本発明の配列はまた、染色体同定にも有益
である。該配列を個々のヒト染色体上の特定の位置に対
して特異的に標的化して、ハイブリダイズさせることが
できる。そのうえ、現在、染色体上の特定の部位を同定
する必要がある。実際の配列データ（反復多型性）に基
づいた染色体マーキング試薬は、現在、染色体位置をマ
ークするのにはほとんど利用できない。本発明によるＤ
ＮＡの染色体へのマッピングは、それらの配列を疾患関
連遺伝子と関係づける重要な第一段階である。 【００８６】簡単に言えば、cＤＮＡからのＰＣＲプラ
イマー（好ましくは、１５−２５bp）を調製することに
より、配列を染色体にマッピングすることができる。
３'未翻訳領域のコンピューター分析を使用して、ゲノ
ムＤＮＡ中の１を越えるエクソンにまたがらないプライ
マーを迅速に選択することから、増幅過程を複雑なもの
とする。ついで、これらのプライマーを、個々のヒト染
色体を含む体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニング
に使用する。プライマーに対応するヒト遺伝子を含むハ
イブリッドのみが、増幅されたフラグメントを与えるで
あろう。 【００８７】体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピング
は、特定のＤＮＡを特定の染色体に帰属させるための迅
速な方法である。同じオリゴヌクレオチドプライマーを
用いての本発明を利用して、サブローカリゼーション
は、特異的な染色体または大きいゲノムクローンのプー
ル由来のフラグメントのパネルを用いる類似の方法で達
成することができる。その染色体へマッピングするのに
同様に利用することができる他のマッピング方法には、
イン・サイチュハイブリダイゼーション、標識化フロー
−ソーティッド（flow-sorted）染色体を用いてのプレ
スクリーニング、および染色体特異的ｃＤＮＡライブラ
リーを構築するためのハイブリダイゼーションによるプ
レセレクションが含まれる。 【００８８】ｃＤＮＡクローンの中期染色体スプレッド
（spread）への蛍光イン・サイチュハイブリダイゼーシ
ョン（ＦＩＳＨ）を利用して、正確な染色体位置を一工
程で与えることができる。この技術は、５０または６０
塩基という短いｃＤＮＡで利用することができる。この
技術の概説には、ベルマ（Ｖerma）ら、ヒューマン・ク
ロモソームズ（Ｈuman Ｃhromosomes）：ア・マニュア
ル・オブ・ベーシック・テクニクス（a Ｍanual of Ｂa
sic Ｔechniques）、パガモン・プレス（Ｐergamon Ｐr
ess）、ニューヨーク（１９８８）を参照。 【００８９】ある配列が正確な染色体位置に一度マッピ
ングされると、染色体上の配列の物理的位置を遺伝マッ
プデータと関連付けることができる。そのようなデータ
は、例えば、マックジック（Ｖ．ＭcＫusick）、メンデ
リアン・インヘリタンス・イン・マン（Ｍendelian Ｉn
heritance in Ｍan）（ジョーンズ・ホプキンス・ユニ
バーシティー・ウェルチ・メディカル・ライブラリー
（Ｊohns Ｈopkins Ｕniversity Ｗelch Ｍedical Ｌib
rary）を介してオンラインで利用できる）に見出され
る。ついで、同じ染色体領域にマップされている遺伝子
と疾患との間の関係を連鎖分析（物理的に隣接した遺伝
子の共遺伝（coinheritance））によって確認する。 【００９０】次に、罹患した個体と罹患していない個体
との間のｃＤＮＡまたはゲノム配列の相違を決定する必
要がある。変異が、罹患した個体のいくつかまたは全て
において認められるが、いずれの正常な個体においても
認められないなら、その変異は疾患の原因となるもので
あるらしい。現在の物理的マッピングおよび遺伝的マッ
ピング技術の解析から、疾患と関連する染色体領域に正
確に局在化したｃＤＮＡは、５０〜５００の原因である
可能性がある遺伝子の１つとなり得るであろう。（これ
は、１メガベースのマッピング分析および２０kb当り１
つの遺伝子を仮定する）。 【００９１】ポリペプチド、それらのフラグメントもし
くは他の誘導体、もしくはそれらのアナログ、またはそ
れらを発現する細胞を免疫原として使用して、それらに
対する抗体を製造することができる。これらの抗体は、
例えば、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であ
り得る。本発明にはまた、キメラ、単鎖、およびヒト化
抗体、さらにはまた、Ｆabフラグメント、またはＦab発
現ライブラリーの生成物も含まれる。当該技術分野で公
知の様々な方法を、そのような抗体およびフラグメント
の製造に使用することができる。 【００９２】本発明の配列に対応するポリペプチドに対
して生成される抗体は、ポリペプチドを動物に直接注入
することにより、またはポリペプチドを動物、好ましく
はヒトでない動物に投与することにより得ることができ
る。ついで、そのようにして得られた抗体は、そのポリ
ペプチド自体に結合するであろう。この方法では、ポリ
ペプチドのフラグメントのみをコードする配列さえも、
完全な天然のポリペプチドを結合する抗体を製造するの
に使用することができる。ついで、そのような抗体を使
用して、そのポリペプチドを発現する組織からポリペプ
チドを単離することができる。 【００９３】モノクローナル抗体を調製するには、連続
的な細胞系培養により産生される抗体を与える任意の技
術を使用することができる。例には、ハイブリドーマ法
（コーラー（Ｋohler)およびミルシュタイン（Ｍilstei
n）、１９７５、Ｎature、２５６：４９５−４９７）、
トリオーマ（trioma）法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法
（コズボール（Ｋozbor）ら、１９８３、Ｉmmunology
Ｔoday ４：７２）、およびヒトモノクローナル抗体を
製造するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ法（コール（Ｃ
ole）ら、１９８５、モノクローナル・アンチボディー
ズ・アンド・キャンサー・セラピー（Ｍonoclonal Ａnt
ibodies and Ｃancer Ｔherapy）、アラン・アール・リ
ス、インク（Ａlan Ｒ．Ｌiss，Ｉnc.）、７７−９６頁
において）が含まれる。 【００９４】単鎖抗体の産生に関して記載されている技
術（米国特許第４,９４６,７７８号）は、本発明の免疫
原性ポリペプチド産物に対する単鎖抗体を製造するのに
適合し得る。また、トランスジェニックマウスは本発明
の免疫原性ポリペプチド産物に対するヒト化した抗体を
発現させるために使用してよい。本発明をさらに、以下
の実施例に関して記載する；しかしながら、本発明は、
そのような実施例に限定されないことを理解すべきであ
る。部または量は全て、特にことわらない限り、重量単
位である。 【００９５】 【実施例】以下の実施例の理解を容易にするために、幾
つかの頻繁に出てくる方法および／または用語を記載す
る。「プラスミド」は、前置きする小文字のｐおよび／
または続けて大文字および／または数字により示す。本
明細書中の出発プラスミドは、市販されているか、限定
されない基盤の下に公に入手可能であるか、または公開
された方法により入手可能なプラスミドから構築でき
る。さらに、記載したプラスミドと同等のプラスミド
は、当該技術分野で公知であって、当業者に明らかであ
ろう。 【００９６】ＤＮＡの「消化」は、ＤＮＡのある配列に
のみ作用する制限酵素でＤＮＡを触媒開裂することを示
す。本明細書中で使用する様々な制限酵素は市販されて
おり、それらの反応条件、補因子および他の必要条件
は、当業者に知られているように使用した。分析目的に
は、典型的に、緩衝溶液約２０μl中、１μgのプラスミ
ドまたはＤＮＡフラグメントを約２単位の酵素と共に使
用する。プラスミド構築のためのＤＮＡフラグメントを
単離する目的には、より多量の容積中、一般にＤＮＡ５
〜５０μgを２０〜２５０単位の酵素で消化する。特定
の制限酵素に適当な緩衝液および基質量は、製造者によ
り指定されている。３７℃で約１時間のインキュベーシ
ョン時間が通常利用されるが、供給者の指示に従って変
えてもよい。消化後、その反応物をポリアクリルアミド
上で直接電気泳動して、所望のフラグメントを単離す
る。 【００９７】開裂したフラグメントのサイズ分離は、ゲ
ッデル（Ｇoeddel，Ｄ.）ら、Ｎucleic Ａcids Ｒes.、
８：４０５７（１９８０）により記載されている８％
ポリアクリルアミドゲルを用いて行う。「オリゴヌクレ
オチド」は、化学的に合成することができる、一本鎖ポ
リデオキシヌクレオチド、または２つの相補的なポリデ
オキシヌクレオチド鎖を示す。そのような合成オリゴヌ
クレオチドは５’リン酸を有さないことから、キナーゼ
の存在下、ＡＴＰとともにリン酸を加えることなしに
は、別のオリゴヌクレオチドにライゲーションしないで
あろう。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化されて
いないフラグメントにライゲーションするであろう。 【００９８】「ライゲーション」は、２つの二本鎖核酸
フラグメントの間にホスホジエステル結合を形成する過
程をいう（マニアチス（Ｍaniatis,Ｔ.）ら、同上、１
４６頁）。特にことわらない限り、ライゲーションは、
ライゲートさせるべきＤＮＡフラグメントのほぼ等モル
量の０.５μg当り１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（「リ
ガーゼ」）と共に、既知の緩衝液および条件を用いて成
し遂げることができる。特にことわらない限り、形質転
換は、グラハム（Ｇraham，Ｆ.）およびファン・デル・
エブ（Ｖan der Ｅb，Ａ.）、Ｖirology、５２：４５６
−４５７（１９７３）の方法に記載されているようにし
て行った。 【００９９】実施例１ ヒトアミン受容体の細菌発現および精製 最初に、ヒトアミン受容体をコードするＤＮＡ配列、Ａ
ＴＣＣ受託番号第９７１８１号を、プロセシングしたア
ミン受容体核酸配列の５'および３'末端配列（シグナル
ペプチド配列を含まない）に対応するＰＣＲオリゴヌク
レオチドプライマーを利用して増幅する。アミン受容体
遺伝子に対応する別のヌクレオチドをそれぞれ５'およ
び３'配列に加える。５'オリゴヌクレオチドプライマー
は、配列 5' CGGAATTCCTUATGAGAGCTGTCTTCATC 3' （配列番号：３）を有し、Ｅco ＲＩ制限酵素部位を含
み、続いて、プロセシングタンパク質の推定末端アミノ
酸から開始する１８ヌクレオチドのヒトアミン受容体コ
ーディング配列を含む。 【０１００】３'配列は 5' CGGAAGCTTCGTCATTCTTGGTACAAATCAAC 3' （配列番号：４）は、Ｈind III部位に相補的な配列を
含み、続いて、該ヒトアミン受容体遺伝子の１８ヌクレ
オチドを含む。その制限酵素部位は、細菌発現ベクター
pＱＥ−９（キアゲン、インク（Ｑiagen，Ｉnc.）、チ
ャッツワース（Ｃhatsworth）、カリフォルニア)の制限
酵素部位に一致する。pＱＥ−９は、抗生物質耐性(Ａmp
r)、細菌の複製起点(ori)、ＩＰＴＧ−調節可能なプロ
モーター／オペレーター(Ｐ／Ｏ)、リボソーム結合部位
(ＲＢＳ)、６−Ｈisタグおよび制限酵素部位をコードす
る。ついでpＱＥ−９をＨindIIIおよびＥcoＲＩで消化
する。増幅した配列をｐＱＥ−９にライゲーションし、
ヒスチジンタグをコードする配列およびＲＳＢとともに
イン・フレームで挿入する。 【０１０１】ついでそのライゲーション混合物を使用し
て、例えば、Ｍ１５／rep４（キアゲン、インク）であ
る大腸菌株をサンブルック（Ｓambrook，Ｊ.）ら、モレ
キュラー・クローニング（Ｍolecular Ｃloning）：ア
・ラボラトリー・マニュアル（Ａ Ｌaboratory Ｍanua
l）、コールド・スプリング・ラボラトリー・プレス
（Ｃold Ｓpring Ｌaboratory Ｐress)、（１９８９）
に記載された方法によって形質転換した。Ｍ１５／rep
４はプラスミドpＲＥＰ４の多重コピーを含み、これ
は、lacＩリプレッサーを発現して、またカナマイシン
耐性(Ｋanr)も与える。トランスフォーマントを、それ
らが、ＬＢプレートで増殖する能力により同定しついで
アンピシリン／カナマイシン耐性コロニーを選択する。
プラスミドＤＮＡを制限分析により単離し確認する。所
望の構築物を含むクローンを、Ａmp（１００μg／ml）
およびＫan（２５μg／ml）の両方を補った、ＬＢ培地
中での液体培養で一晩増殖させた(Ｏ／Ｎ)。そのＯ／Ｎ
培養物を使用して、大きな培養物に１：１００〜１：２
５０の割合で播種する。細胞が、０.４〜０.６の間の光
学密度６００(Ｏ.Ｄ.600)まで増殖させる。 【０１０２】ついで、ＩＰＴＧ(「イソプロピル−Ｂ−
Ｄ−チオガラクトピラノシド」)を、最終濃度が１mＭと
なるまで加えた。ＩＰＴＧは、lacＩリプレッサーを不
活性化し、Ｐ／Ｏをクリアリングし、遺伝子発現を増加
させることにより誘導する。細胞をさらに３−４時間増
殖する。ついで、細胞を遠心分離により収集した。細胞
ペレットをカオトロピック剤である６モルのグアニジン
ＨＣl中で可溶化した。清澄後、この溶液から６−Ｈis
タグを含むタンパク質による強固な結合を可能にする条
件下、ニッケルキレートカラムでのクロマトグラフィー
により、可溶化したタンパク質を精製する（ホチュリ
（Ｈochuli，Ｅ.）ら、Ｊ．Ｃhromatography４１１：１
７７−１８４（１９８４））。ヒトアミン受容体タンパ
ク質をpＨ５.０の６モルのグアニジンＨＣｌのカラムか
ら溶出し、３モルのグアニジンＨＣl、１００mＭのリン
酸ナトリウム、１０ミリモルのグルタチオン（還元型）
および２ミリモルのグルタチオン（酸化型）に合わせ
た。この溶液で１２時間インキュベートした後、該タン
パク質を１０ミリモルのリン酸ナトリウムで透析した。 【０１０３】実施例２ バキュロウイルス発現システムを用いてのヒトアミン受
容体のクローニングおよび発現 完全長ヒトアミン受容体タンパク質をコードするＤＮＡ
配列、ＡＴＣＣ受託番号第９７１８１号を、該遺伝子の
５'および３'配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチド
プライマーを利用して増幅する。 ５'プライマーは、配列： 5' CGGGATCCCTCCATGAGAGCTGTCTTCATC 3' （配列番号：５）を有し、該配列はＢam ＨＩ制限酵素
部位、続いて、ヒトアミン受容体遺伝子の最初の１８ヌ
クレオチドのちょうど後の真核生物細胞中の翻訳開始の
有効なシグナルに類似した４ヌクレオチドを含む（コザ
ック（Ｋozak，Ｍ.）、Ｊ．Ｍol．Ｂiol.、１９６：９
４７−９５０（１９８７））。 【０１０４】３'プライマーは、配列 5' cgggatcccgctcattcttggtacaaatc 3' （配列番号：６）を有し、制限エンドヌクレアーゼＢam
ＨＩの開裂部位およびヒトアミン受容体遺伝子の３'未
翻訳配列に相補的な１８ヌクレオチドを含む。増幅され
た配列を、市販されており、利用できるキット（「ジー
ンクリーン（Ｇeneclean）」、ＢＩＯ １０１Ｉnc.、ラ
・ホラ（Ｌa Ｊola）、カリフォルニア）を用いて、１
％アガロースゲルから単離する。次に、そのフラグメン
トをエンドヌクレアーゼＢamＨＩで消化した後、１％ア
ガロースゲル上で精製した。このフラグメントをＦ２と
命名する。 【０１０５】ベクターｐＲＧ１（ｐＶＬ９４１ベクター
を改良したもの、後述）をバキュロウイルス発現系を用
いてヒトアミン受容体タンパク質の発現のために使用す
る（概説には、サマーズ（Ｓummers，Ｍ.Ｄ.）およびス
ミス（Ｓmith，Ｇ.Ｅ.）１９８７、Ａ manual of metho
ds for baculovirus vectors and insct cell culture
procedures，Ｔexas Ａgricultural Ｅxperimental Ｓt
ation Ｂulletin Ｎo.１５５５を参照）。この発現ベク
ターはオートグラファ・カリフォルニカ核多角体病ウイ
ルス（Ａutographa californica nuclear polyhedrosis
virus）（ＡcＭＮＰＶ)の強力なポリヒドリン（polyhe
drin）プロモーターとそれに続く制限エンドヌクレアー
ゼＢamＨＩの認識部位を含む。効率の良いポリアデニル
化のために、シミアンウイルス（ＳＶ）４０のポリアデ
ニル化部位を使用する。組換えウイルスの選択を簡単に
するため、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子が
ポリヒドリン遺伝子のポリアデニル化シグナルに先行す
るポリヒドリンプロモーターと同じ方向に挿入される。
該ポリヒドリン配列の両端には、同時にトランスフェク
ションされる野生型ウイルスＤＮＡの細胞媒介の同種の
組換えに関するウイルスの配列が隣接する。ｐＲＧ１の
代わりに、ｐＡｃ３７３、ｐＶＬ９４１およびｐＡｃＩ
Ｍ１（ラッコウ（Ｌuckow，Ｖ．Ａ.）およびサマーズ、
Ｖirology，１７９：３１−３９）などといった他の多
くのバキュロウイルスベクターを使用することができ
る。 【０１０６】該プラスミドを制限酵素ＢamＨＩで消化し
た後、ウシ腸ホスファターゼを用いて当該技術分野にお
いて公知の手法で脱リン酸化する。ついでそのＤＮＡを
市販されており、利用できるキット（「ジーンクリー
ン」ＢＩＯ １０１ Ｉnc.、ラ・ホラ、カリフォルニ
ア）を用いて１％アガロースゲルから単離する。このベ
クターＤＮＡをＶ２と命名する。フラグメントＦ２およ
び脱リン酸化プラスミドＶ２をＴ４ＤＮＡリガーゼでラ
イゲーションする。ついで大腸菌ＨＢ１０１細胞を形質
転換し、ヒトアミン受容体遺伝子を持つプラスミド（ｐ
Ｂac−ヒトアミン受容体）を含む細菌を酵素ＢamＨＩを
用いて同定する。クローニングされたフラグメントをＤ
ＮＡシークエンシングを用いて確認する。 【０１０７】リポフェクション法(フェルグナー（Ｆelg
ner）ら、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ、８４：７４
１３−７４１７（１９８７）)を利用して、プラスミドp
Ｂac結腸特異的遺伝子５μgを市販の線形化バキュロウ
イルス(「ＢaculoＧoldTM バキュロウイルス ＤＮ
Ａ」、ファーミンゲン（Ｐharmingen）、サン・ディエ
ゴ（Ｓan Ｄiego）、カリフォルニア)１.０μgと共に同
時トランスフェクションする。 【０１０８】ＢaculoＧoldTMウイルスＤＮＡ １μgおよ
びプラスミドpＢac結腸特異的遺伝子５μgを、無血清グ
レイス(Ｇrace's)培地(ライフ・テクノロジーズ・イン
ク（Ｌife Ｔechnologies Ｉnc.）、ゲイザーズバーグ
（Ｇaithersburg）、メリーランド)５０μlを含むマイ
クロタイタープレートの無菌ウェル中で混合する。その
後、リポフェクチン(Ｌipofectin)１０μlとグレイス培
地９０μlを加え、混合して、室温で１５分間インキュ
ベートする。ついで、トランスフェクション混合物を、
無血清グレイス培地１mlを含む、３５mmの組織培養プレ
ートに播種したＳf９昆虫細胞(ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１
１)に滴加する。そのプレートを前後に揺り動かして、
新たに加えた溶液を混合する。ついで、そのプレートを
２７℃で５時間インキュベートする。５時間後、そのト
ランスフェクション溶液をプレートから除去して、１０
％ ウシ胎児血清を補ったグレイス昆虫培地１mlを加え
る。そのプレートをインキュベーターに戻して、２７℃
で４日間培養し続ける。 【０１０９】４日後、上清を集めて、サマーズおよびス
ミス(上記)により記載されたようにして、プラークアッ
セイを行う。変法として、「Ｂlue Ｇal」(ライフ・テ
クノロジーズ・インク、ゲイザーズバーグ)を含むアガ
ロースゲルを使用したが、このことにより、青色に染色
されたプラークを容易に単離することが可能となる。
(「プラークアッセイ」の詳細な記述はまた、昆虫細胞
培養に関する利用者のガイド、およびライフ・テクノロ
ジーズ・インク、ゲイザーズバーグにより配布されたバ
キュロウイルス学、９−１０頁にも見出すことができ
る)。 【０１１０】４日後、連続希釈のウイルスを細胞に加え
て、青色に染色されたプラークをエッペンドルフピペッ
トの先端で採取する。ついで、組換えウイルスを含む寒
天を、グレイス培地２００μlを含むエッペンドルフチ
ューブ内で再懸濁させる。その寒天を短時間の遠心分離
により除去して、組換えバキュロウイルスを含む上清
を、３５mmの皿に播種したＳf９細胞を感染させるのに
使用する。４日後、これらの培養皿の上清を収集した
後、４℃で保存する。 【０１１１】Ｓf９細胞を、１０％ 熱不活性化ＦＢＳを
補ったグレイス培地で増殖させる。その細胞に、感染多
重度(ＭＯＩ) ２で組換えバキュロウイルス Ｖ−結腸特
異的遺伝子を感染させる。６時間後、その培地を除去し
て、メチオニンおよびシステインを含まないＳＦ９００
II 培地(ライフ・テクノロジーズ・インク、ゲイザー
ズバーグ)に替える。４２時間後、５μＣiの35Ｓ−メチ
オニンおよび５μＣiの35Ｓシステイン５μＣi(アマシ
ャム（Ａmersham)）を加える。該細胞をさらに１６時間
インキュベートして、遠心して回収し、ついでＳＤＳ−
ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーによって該標識
したタンパク質を可視化する。 【０１１２】実施例３ ＣＯＳ細胞における組換えヒトアミン受容体の発現 プラスミド、ヒトアミン受容体ＨＡの発現は、1）ＳＶ
４０複製起点、2）アンピシリン耐性遺伝子、3）大腸菌
複製起点、4）ＣＭＶプロモーターとそれに続くポリリ
ンカー領域、ＳＶ４０イントロンおよびポリアデニル化
部位を含有するベクターpcＤＮＡＩ／Ａmp（インビトロ
ゲン（Ｉnvitrogen））から得る。全ヒトアミン受容体
前駆体と、その３'末端にイン・フレームで融合したＨ
ＡタグとをコードするＤＮＡフラグメントを、ベクター
のポリリンカー領域にクローニングする。したがって、
その組換えタンパク質の発現はＣＭＶプロモーターに制
御される。ＨＡタグは、既に記述されたインフルエンザ
血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに相当する
（ウィルソン（Ｉ.Ｗilson）ら、Ｃell、３７：７６７
（１９８４））。標的タンパク質にＨＡタグを注入する
ことにより、ＨＡエピトープを認識する抗体で組換えタ
ンパク質を容易に検出できるようになる。 【０１１３】プラスミド構築法は次の通りである。ヒト
アミン受容体をコードするＤＮＡ配列、ＡＴＣＣ受託番
号第９７１８１号を、次の２つのプライマーを用いるＰ
ＣＲで構築する。５'プライマー 5' GTCCAAGCTTGCCACCATGAGAGCTGTCTTCATC 3' （配列番号：７）は、ＨindIII部位と、それに続く、開
始コドンから始まるヒトアミン受容体コーディング配列
の18ヌクレオチドとを含有する；３'配列 5' CTAGCTCGAGTCAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGCATTCT
TGGTACAAATCAAC 3' （配列番号：８）は、ＸhoI部位に相補的な配列、翻訳
停止コドン、ＨＡタグおよびヒトアミン受容体コーディ
ング配列の最後の１８ヌクレオチド（停止コドンを除
く）を含有する。したがって、ＰＣＲ産物は、ＨindIII
部位、ヒトアミン受容体コーディング領域、それに続
く、イン・フレームで融合したＨＡタグ、ＨＡタグに続
く翻訳終結停止コドンおよびＨindIII部位を含有する。 【０１１４】そのＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメントとベク
ターpcＤＮＡＩ／ＡmpをＨindIIIおよびＸhoＩ制限酵素
で消化し、ライゲーションする。そのライゲーション混
合物で大菌ＳＵＲＥ株（ストラタジーン・クローニング
・システムズ（ＳtratageneＣloning Ｓystems）、ラ・
ホラ、カリフォルニア）を形質転換し、その形質転換培
養をアンピシリン培地プレートで培養して、耐性コロニ
ーを選択する。プラスミドＤＮＡをトランスフォーマン
トから単離し、制限分析によって正しい断片の存在を調
べる。 【０１１５】この組換えアミン受容体を発現させるた
め、ＤＥＡＥ−デキストラン法（サンブルック、フリッ
チュ（Ｅ.Ｆritsch）、マニアチス（Ｔ. Ｍaniatis）、
モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マ
ニュアル、コールド・スプリング・ラボラトリー・プレ
ス（Ｃold Ｓpring Ｌaboratory Ｐress）（１９８
９））によって、ＣＯＳ細胞を発現ベクターでトランス
フェクションする。ヒトアミン受容体ＨＡタンパク質の
発現は、放射線標識と免疫沈降法（ハーロウ（Ｅ．Ｈar
low）、レーン（Ｄ. Ｌane）、アンチボディーズ（Ａnt
ibodies）：ア・ラボラトリー・マニュアル、コールド
・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（１９
８８））によって検出する。トランスフェクションの２
日後に、細胞を 35Ｓ-システインで８時間標識する。次
に、培養培地を集め、細胞を界面活性剤（ＲＩＰＡ緩衝
液（１５０mＭ ＮaＣl、 １％ＮＰ−４０、０.１％ＳＤ
Ｓ、１％ＮＰ−４０、０.５％ＤＯＣ、５０mＭ Ｔris、
pＨ７.５）で溶解する（ウィルソン（Ｗilson, I.）
ら、同上、３７：７６７（１９８４））。細胞溶解液と
培養培地の両方をＨＡ特異的モノクローナル抗体で沈殿
させる。沈殿したタンパク質を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ゲルで分析する。 【０１１６】実施例４ ヒト組織におけるヒトアミン受容体の発現パターン ヒト組織におけるヒトアミン受容体の発現レベルを調べ
るために、ノーザンブロット分析を行なう。総細胞ＲＮ
Ａ試料をＲＮＡzolTM Ｂシステム（バイオテックス・ラ
ボラトリーズ・インク（Ｂiotecx Ｌaboratories, Ｉn
c.）、ヒューストン、テキサス）で単離する。各ヒト組
織から単離した約１０μgの総ＲＮＡを１％アガロース
ゲルで分離し、ナイロンフィルターにブロットする（サ
ンブルック、フリッチュ、マニアチス、 モレキュラー
・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル、コー
ルド・スプリング・ラボラトリー・プレス（１９８
９））。標識反応は、５０ngのＤＮＡフラグメントを用
いて、ストラタジーン・プライム（Ｐrime）-イット（I
t）キットに従って行なう。標識されたＤＮＡをセレク
ト（Ｓelect）-Ｇ-５０カラム（５プライム−３プライ
ム、インク（５ Ｐrime-３ Ｐrime Ｉnc.）、ブールダ
ー、コロラド）で精製する。次に、フィルターを、０.
５Ｍ ＮaＰＯ4、 pＨ７.４および７％ＳＤＳ中、６５℃
で終夜、放射能標識した完全長ヒトアミン受容体遺伝子
１,０００,０００cpm/mlと、ハイブリダイズさせる。
０.５×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳを用いて室温で２回、６
０℃で２回洗浄した後、増幅スクリーンを用いて、フィ
ルターを−７０℃で終夜、露出する。 【０１１７】実施例５ 遺伝子治療を介する発現 線維芽細胞を皮膚生検により被験体より得る。得られた
組織を組織培養培地中に置き、ついで小片に分ける。そ
の組織の小塊を組織培養フラスコの湿った表面に置く
（各フラスコ当たり約１０個の塊を置く）。該フラスコ
の上下をひっくり返し、固く閉め、室温にて一晩放置す
る。室温で２４時間後、該フラスコを逆さにし、ついで
組織の塊はフラスコの底に固定したままにし、ついで、
１０％ＦＢＳ、ペニシリンおよびストレプトマイシンを
含む新鮮培地（例えば、ハムＦ１２培地（Ｈam's Ｆ１
２ media））を添加する。ついでこれを３７℃で約１週
間インキュベートする。このとき、新鮮培地を添加し引
き続き数日毎に変える。さらに２週間の後、培養液中に
線維芽細胞の単層が現れる。その単層をトリプシン処理
しついでさらに大きなフラスコに合わせて調整する。 【０１１８】モロニーマウス肉腫ウイルスの長い末端反
復配列によりフランキングされたｐＭＶ−７（キルシュ
メイエル（Ｋirschmeier，Ｐ．Ｔ.）ら、ＤＮＡ、７：
２１９−２５（１９８８））をＥcoＲＩおよびＨindIII
で消化し、続いて仔ウシ腸ホスファターゼで処理する。
線形ベクターをアガロースゲル上で分画化し、ガラスビ
ーズを使用して精製する。 【０１１９】本発明のポリペプチドをコードするｃＤＮ
Ａをそれぞれ５'端および３'端配列に対応するＰＣＲプ
ライマーを使用して増幅する。５'プライマーはＥcoＲ
Ｉ部位を含み３'プライマーはＨindIII部位を含む。モ
ロニーマウス肉腫ウイルスの線形骨格およびＥcoＲＩお
よびＨindIIIフラグメントの等量をＴ４ＤＮＡリガーゼ
の存在下で一緒に添加する。得られた混合物を２つのフ
ラグメントのライゲーションに適した条件下で維持す
る。ライゲーション混合物を細菌ＨＢ１０１を形質転換
するのに使用し、ついで該菌をベクターが所望の適切に
挿入された遺伝子を有することを確認するためカナマイ
シン含有寒天上に播種する。 【０１２０】両栄養性のｐＡ３１７またはＧp+am１２パ
ッケージング細胞を、１０％ 仔ウシ血清（ＣＳ）、ペ
ニシリンおよびストレプトマイシンを有するダルベッコ
改変イーグル培地（Ｄulbecco's Ｍodified Ｅagles Ｍ
edium）（ＤＭＥＭ）中で全面密度になるまで組織培養
にて増殖させる。該遺伝子を有するＭＳＶベクターをつ
いで培地に添加し、パッケージング細胞を該ベクターで
トランスデュースする。今度はパッケージング細胞は、
該遺伝子を含む感染性ウイルス粒子を産生する（パッケ
ージング細胞を以後、プロデューサー細胞という）。 【０１２１】新鮮培地をトランスデュースしたプロデュ
ーサー細胞に添加し、引き続き培地を１０cmプレート全
面のプロデューサー細胞から回収する。感染性ウイルス
粒子を含む使用し尽くした培地をミリポアフィルターで
濾過して分離したプロデューサー細胞を除去し、ついで
この培地を線維芽細胞を感染させるのに使用する。培地
を線維芽細胞のサブ全面プレートから除去し、プロデュ
ーサー細胞からの培地とすばやく取り替える。この培地
を除去し、新鮮培地で置き換える。ウイルス力価が高い
場合、本質的にすべての線維芽細胞が感染し、選択は一
切必要ないであろう。力価が非常に低い場合は、neoま
たはhisなどの選択可能なマーカーを有するレトロウイ
ルスベクターを使用する必要がある。 【０１２２】操作された線維芽細胞を、単独またはサイ
トデックス・３・ミクロキャリア・ビーズ（cytodex ３
microcarrier beads）上全面に増殖した後に、宿主に
注入する。該線維芽細胞はタンパク質産物を産生する。
先の教示から見て、本発明の多数の変更および変化が可
能であることから、追記する請求の範囲内で、詳しく記
載した以外に、本発明を行うことができる。 【０１２３】 SEQUENCE LISTING <110> Human Genome Sciences, Inc. <120> Human Amine Receptor <130> 184365 <160> 10 <210> 1 <211> 1380 <212> DNA <213> Homo Sapiens <220> <221> CDS <222> (252)...(1262) <400> 1 ctagagctag caggagtaac tctcatggaa ccttggaaac cattcttcaa ttgaatttca 60 gggcacattt gaatcagtac ccaggggcac tgtactatgc tcccagctgg accttagttt 120 cctcctcctc gtttcaccct gtgagtaatt aacagacaaa attttttttt tttttttttt 180 tttttttttt tttttgccct ccagtggaga aggtggccag ttctcagaca gaggaagagt 240 agaaatcata a atg aga gct gtc ttc atc caa ggt gct gaa gag cac cct 290 Met Arg Ala Val Phe Ile Gln Gly Ala Glu Glu His Pro 1 5 10 gcg gca ttc tgc tac cag gtg aat ggg tct tgc ccc agg aca gta cat 338 Ala Ala Phe Cys Tyr Gln Val Asn Gly Ser Cys Pro Arg Thr Val His 15 20 25 act ctg ggc atc cag ttg gtc atc tac ctg acc tgt gca gca ggc atg 386 Thr Leu Gly Ile Gln Leu Val Ile Tyr Leu Thr Cys Ala Ala Gly Met 30 35 40 45 ctg att atc gtg cta ggg aat gta ttt gtg gca ttt gct gtg tcc tac 434 Leu Ile Ile Val Leu 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Pro Ala Ala Tyr Thr Ser Leu Phe Leu Tyr Thr Asp 160 165 170 gtg gta gag aca agg ctc agc cag tgg ctg gaa gag atg cct tgt gtg 818 Val Val Glu Thr Arg Leu Ser Gln Trp Leu Glu Glu Met Pro Cys Val 175 180 185 ggc agt tgc cag ctg ctg ctc aat aaa ttt tgg ggc tgg tta aac ttc 866 Gly Ser Cys Gln Leu Leu Leu Asn Lys Phe Trp Gly Trp Leu Asn Phe 190 195 200 205 cct ttg ttc ttt gtc ccc tgc ctc att atg atc agc ttg tat gtg aag 914 Pro Leu Phe Phe Val Pro Cys Leu Ile Met Ile Ser Leu Tyr Val Lys 210 215 220 atc ttt gtg gtt gct acc aga cag gct cag cag att acc aca ttg agc 962 Ile Phe Val Val Ala Thr Arg Gln Ala Gln Gln Ile Thr Thr Leu Ser 225 230 235 aaa agc ctg gct ggg gct gcc aag cat gag aga aaa gct gcc aag acc 1010 Lys Ser Leu Ala Gly Ala Ala Lys His Glu Arg Lys Ala Ala Lys Thr 240 245 250 ctg ggc att gtt gtg ggc ata tac ctc ttg tgc tgg ctg ccc ttc acc 1058 Leu Gly Ile Val Val Gly Ile Tyr Leu Leu Cys Trp Leu Pro Phe Thr 255 260 265 ata gac acg atg gtc gac agc ctc ctt cac ttt atc aca ccc cca ctg 1106 Ile Asp Thr Met Val Asp Ser Leu Leu His Phe Ile Thr Pro Pro Leu 270 275 280 285 gtc ttt gac atc ttt atc tgg ttt gct tac ttc aac tca gcc tgc aac 1154 Val Phe Asp Ile Phe Ile Trp Phe Ala Tyr Phe Asn Ser Ala Cys Asn 290 295 300 ccc atc atc tat gtc ttt tcc tac cag tgg ttt cgg aag gca ctg aaa 1202 Pro Ile Ile Tyr Val Phe Ser Tyr Gln Trp Phe Arg Lys Ala Leu Lys 305 310 315 ctc aca ctg agc cag aag gtc ttc tca ccg cag aca cgc act gtt gat 1250 Leu Thr Leu Ser Gln Lys Val Phe Ser Pro Gln Thr Arg Thr Val Asp 320 325 330 ttg tac caa gaa tgattccttc tactaaatgc aggcaaggag taggacctca 1302 Leu Tyr Gln Glu 335 caggaaagat aagtggcact gtgaccgcgg gctgtgtggt gttgagtttg tgggcatgct 1362 tccaggacag catgggtt 1380 <210> 2 <211> 337 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 2 Met Arg Ala Val Phe Ile Gln Gly Ala Glu Glu His Pro Ala Ala Phe 1 5 10 15 Cys Tyr Gln Val Asn Gly Ser Cys Pro Arg Thr Val His Thr Leu Gly 20 25 30 Ile Gln Leu Val Ile Tyr Leu Thr Cys Ala Ala Gly Met Leu Ile Ile 35 40 45 Val Leu Gly Asn Val Phe Val Ala Phe Ala Val Ser Tyr Phe Lys Ala 50 55 60 Leu His Thr Pro Thr Asn Phe Leu Leu Leu Ser Leu Ala Leu Ala Asp 65 70 75 80 Met Phe Leu Gly Leu Leu Val Leu Pro Leu Ser Thr Ile Arg Ser Val 85 90 95 Glu Ser Cys Trp Phe Phe Gly Asp Phe Leu Cys Arg Leu His Thr Tyr 100 105 110 Leu Asp Thr Leu Phe Cys Leu Thr Ser Ile Phe His Leu Cys Phe Ile 115 120 125 Ser Ile Asp Arg His Cys Ala Ile Cys Asp Pro Leu Leu Tyr Pro Ser 130 135 140 Lys Phe Thr Val Arg Val Ala Leu Arg Tyr Ile Leu Ala Gly Trp Gly 145 150 155 160 Val Pro Ala Ala Tyr Thr Ser Leu Phe Leu Tyr Thr Asp Val Val Glu 165 170 175 Thr Arg Leu Ser Gln Trp Leu Glu Glu Met Pro Cys Val Gly Ser Cys 180 185 190 Gln Leu Leu Leu Asn Lys Phe Trp Gly Trp Leu Asn Phe Pro Leu Phe 195 200 205 Phe Val Pro Cys Leu Ile Met Ile Ser Leu Tyr Val Lys Ile Phe Val 210 215 220 Val Ala Thr Arg Gln Ala Gln Gln Ile Thr Thr Leu Ser Lys Ser Leu 225 230 235 240 Ala Gly Ala Ala Lys His Glu Arg Lys Ala Ala Lys Thr Leu Gly Ile 245 250 255 Val Val Gly Ile Tyr Leu Leu Cys Trp Leu Pro Phe Thr Ile Asp Thr 260 265 270 Met Val Asp Ser Leu Leu His Phe Ile Thr Pro Pro Leu Val Phe Asp 275 280 285 Ile Phe Ile Trp Phe Ala Tyr Phe Asn Ser Ala Cys Asn Pro Ile Ile 290 295 300 Tyr Val Phe Ser Tyr Gln Trp Phe Arg Lys Ala Leu Lys Leu Thr Leu 305 310 315 320 Ser Gln Lys Val Phe Ser Pro Gln Thr Arg Thr Val Asp Leu Tyr Gln 325 330 335 Glu <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 cggaattcct uatgagagct gtcttcatc 29 <210> 4 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 cggaagcttc gtcattcttg gtacaaatca ac 32 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 cgggatccct ccatgagagc tgtcttcatc 30 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 cgggatcccg ctcattcttg gtacaaatc 29 <210> 7 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 gtccaagctt gccaccatga gagctgtctt catc 34 <210> 8 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> 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Ala Arg Arg Cys Tyr Asn Asp Pro Lys Cys Cys Asp Phe Val Thr Asn 180 185 190 Arg Ala Tyr Ala Ile Ala Ser Ser Val Val Ser Phe Tyr Val Pro Leu 195 200 205 Cys Ile Met Ala Phe Val Tyr Leu Arg Val Phe Arg Glu Ala Gln Lys 210 215 220 Gln Val Lys Lys Ile Asp Ser Cys Glu Arg Arg Phe Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ala Arg Pro Pro Ser Pro Glu Pro Ser Pro Ser Pro Gly Pro Pro Arg 245 250 255 Pro Ala Asp Ser Leu Ala Asn Gly Arg Ser Ser Lys Arg Arg Pro Ser 260 265 270 Arg Leu Val Ala Leu Arg Glu Gln Lys Ala Leu Lys Thr Leu Gly Ile 275 280 285 Ile Met Gly Val Phe Thr Leu Cys Trp Leu Pro Phe Phe Leu Ala Asn 290 295 300 Val Val Lys Ala Phe His Arg Asp Leu Val Pro Asp Arg Leu Phe Val 305 310 315 320 Phe Phe Asn Trp Leu Gly Tyr Ala Asn Ser Ala Phe Asn Pro Ile Ile 325 330 335 Tyr Cys Arg Ser Pro Asp Phe Arg Lys Ala Phe Gln Arg Leu Leu Cys 340 345 350 Cys Ala Arg Arg Ala Ala Cys Arg Arg Arg Ala Ala His 355 360 365 <210> 10 <211> 353 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <223> Dopamine D2 receptor <400> 10 Asp Asp Asp Leu Glu Arg Gln Asn Trp Ser Arg Pro Phe Asn Gly Ser 1 5 10 15 Asp Gly Lys Ala Asp Arg Pro His Tyr Asn Tyr Tyr Ala Thr Leu Leu 20 25 30 Thr Leu Leu Ile Ala Val Ile Val Phe Gly Asn Val Leu Val Cys Met 35 40 45 Ala Val Ser Arg Glu Lys Ala Leu Gln Thr Thr Thr Asn Tyr Leu Ile 50 55 60 Val Ser Leu Ala Val Ala Asp Leu Leu Val Ala Thr Leu Val Met Pro 65 70 75 80 Trp Val Val Tyr Leu Glu Val Val Gly Glu Trp Lys Phe Ser Arg Ile 85 90 95 His Cys Asp Ile Phe Val Thr Leu Asp Val Met Met Cys Thr Ala Ser 100 105 110 Ile Leu Asn Leu Cys Ala Ile Ser Ile Asp Arg Tyr Thr Ala Val Ala 115 120 125 Met Pro Met Leu Tyr Asn Thr Arg Tyr Ser Ser Lys Arg Arg Val Thr 130 135 140 Val Met Ile Ser Ile Val Trp Val Leu Ser Phe Thr Ile Ser Cys Pro 145 150 155 160 Leu Leu Phe Gly Leu Asn Asn Ala Asp Gln Asn Glu Cys Ile Ile Ala 165 170 175 Asn Pro Ala Phe Val Val Tyr Ser Ser Ile Val Ser Phe Tyr Val Pro 180 185 190 Phe Ile Val Thr Leu Leu Val Tyr Ile Lys Ile Tyr Ile Val Leu Arg 195 200 205 Arg Arg Arg Lys Arg Val Asn Thr Lys Arg Ser Ser Arg Ala Phe Arg 210 215 220 Ala His Leu Arg Ala Pro Leu Lys Glu Ala Ala Arg Arg Glu Lys Asn 225 230 235 240 Gly His Ala Lys Asp His Pro Lys Ile Ala Lys Ile Phe Glu Ile Gln 245 250 255 Thr Met Pro Asn Gly Lys Thr Arg Thr Ser Leu Lys Thr Met Ser Arg 260 265 270 Arg Lys Leu Ser Gln Gln Lys Glu Lys Lys Ala Thr Gln Met Leu Ala 275 280 285 Ile Val Leu Gly Val Phe Ile Ile Cys Trp Leu Pro Phe Phe Ile Thr 290 295 300 His Ile Leu Asn Ile His Cys Asp Cys Asn Ile Pro Pro Val Leu Tyr 305 310 315 320 Ser Ala Phe Thr Trp Leu Gly Tyr Val Asn Ser Ala Val Asn Pro Ile 325 330 335 Ile Tyr Thr Thr Phe Asn Ile Glu Phe Arg Lys Ala Phe Leu Lys Ile 340 345 350 Leu
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明のヒトアミン受容体のｃＤＮＡ配列お
よび対応する推定アミノ酸配列を示す。アミノ酸に関す
る標準的な１文字略号を使用している。シークエンシン
グは３７３自動化ＤＮＡシークエンサー（３７３ Autom
ated ＤＮＡsequencer）（アプライド・バイオシステム
ズ、インク（Applied Biosystems, Inc.）を用いて行っ
た。 【図２】 本発明のヒトアミン受容体のｃＤＮＡ配列お
よび対応する推定アミノ酸配列を示す。アミノ酸に関す
る標準的な１文字略号を使用している。シークエンシン
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た。 【図３】 本発明のヒトアミン受容体のｃＤＮＡ配列お
よび対応する推定アミノ酸配列を示す。アミノ酸に関す
る標準的な１文字略号を使用している。シークエンシン
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た。 【図４】 本発明のアミントランスポーター（上段）お
よびマウスβ−１アドレナリン受容体（下段）間のアミ
ノ酸ホモロジーアラインメントを示す。 【図５】 本発明のアミントランスポーター（上段）お
よびマウスβ−１アドレナリン受容体（下段）間のアミ
ノ酸ホモロジーアラインメントを示す。 【図６】 本発明のアミントランスポーター（上段）お
よびヒトドーパミンＤ２受容体（下段）の間のアミノ酸
ホモロジーアラインメントを示す。 【図７】 本発明のアミントランスポーター（上段）お
よびヒトドーパミンＤ２受容体（下段）の間のアミノ酸
ホモロジーアラインメントを示す。
よび対応する推定アミノ酸配列を示す。アミノ酸に関す
る標準的な１文字略号を使用している。シークエンシン
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た。 【図２】 本発明のヒトアミン受容体のｃＤＮＡ配列お
よび対応する推定アミノ酸配列を示す。アミノ酸に関す
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よび対応する推定アミノ酸配列を示す。アミノ酸に関す
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た。 【図４】 本発明のアミントランスポーター（上段）お
よびマウスβ−１アドレナリン受容体（下段）間のアミ
ノ酸ホモロジーアラインメントを示す。 【図５】 本発明のアミントランスポーター（上段）お
よびマウスβ−１アドレナリン受容体（下段）間のアミ
ノ酸ホモロジーアラインメントを示す。 【図６】 本発明のアミントランスポーター（上段）お
よびヒトドーパミンＤ２受容体（下段）の間のアミノ酸
ホモロジーアラインメントを示す。 【図７】 本発明のアミントランスポーター（上段）お
よびヒトドーパミンＤ２受容体（下段）の間のアミノ酸
ホモロジーアラインメントを示す。
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(72)発明者 リ・イ
アメリカ合衆国20878メリーランド州ゲイ
ザーズバーグ、ハワード・ランディング・
ドライブ16125番
(72)発明者 スティーブン・エム・ルーベン
アメリカ合衆国20832メリーランド州オー
ルニ、ヘリティッジ・ヒルズ・ドライブ
18528番
Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA63 CA02 DA02 EA04
GA13 HA01 HA13 HA17
4H045 AA10 BA10 CA40 DA50 EA20
FA74
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 【請求項１】 明細書に記載のヒトアミン受容体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002164126A JP2003038174A (ja) | 2002-06-05 | 2002-06-05 | ヒトアミン受容体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002164126A JP2003038174A (ja) | 2002-06-05 | 2002-06-05 | ヒトアミン受容体 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9500375A Division JPH11507813A (ja) | 1995-06-06 | 1995-06-06 | ヒトアミン受容体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003038174A true JP2003038174A (ja) | 2003-02-12 |
Family
ID=19195015
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002164126A Pending JP2003038174A (ja) | 2002-06-05 | 2002-06-05 | ヒトアミン受容体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2003038174A (ja) |
-
2002
- 2002-06-05 JP JP2002164126A patent/JP2003038174A/ja active Pending
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20050913 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20060221 |