KR20030074678A - 혈중 인농도를 저하시키는 인간 ｆｇｆ２３ 단백질 변이체 - Google Patents
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Abstract
인간 FGF23 단백질을 코드하는 전장 cDNA를 단리하고, 상기 cDNA에 변이도입법에 의하여 1 아미노산이 치환된 변이체를 구축하였다. 상기 변이체는 체내에서 발현됨으로써 혈중의 인농도를 저하시키는 효과를 가지고 있었다. 상기 변이체 및 상기 변이체를 코드하는 DNA는 고인혈증에 대한 치료약 또는 유전자 치료로의 응용이 기대된다.
Description
FGF23은 교토대학의 이토 등에 의하여 클로닝된 유전자로서 뇌에서 발현되고 있는 것이 확인되어 있다(Yamashita T. et al. (2000) Biochem. Biophys. Res. Commun. 277: 494-498, 국제공개 01/66596호 공보). 또한, LUETHY 등은 FGF23 유전자를 클로닝하고 상기 유전자를 발현하는 트랜스제닉 마우스를 작출하여, 상기 마우스의 표현형을 해석하고 있다(국제공개 01/61007호 공보).
한편, 선천적 저인혈증인 구루병 환자의 유전적 가계해석에 의하여 FGF23의 돌연변이(R176Q, R179Q, R179W)가 원인이라고 하는 보고가 이루어졌다(The ADHR Consortium (2000) Nat. Genet. 26: 345-348).
그러나, 이 보고에 있어서는 단백질 또는 전장(full-length) cDNA를 취득하였다는 기재는 없으며, 또한 FGF23 유전자로 보이는 상기의 변이와 저인혈증과의인과관계도 밝혀져 있지 않다.
본 발명은 혈중 인농도를 저하시키는 FGF23 단백질 변이체 및 상기 변이체의 용도에 관한 것이다.
발명의 개시
본 발명은 이러한 상황에 비추어 이루어진 것으로, 그 목적은 혈중 인농도를 저하시키는 FGF23 단백질의 변이체 및 상기 변이체를 코드하는 DNA 및 그들의 용도를 제공하는 데 있다.
본 발명자 등은 상기 과제를 해결하기 위해서 예의 연구를 행하여, 혈중 인농도를 저하시키는 것이 기대되는 FGF23 단백질의 변이체 제작을 시도하였다. 먼저, 인간 FGF23 유전자의 전장 cDNA의 단리를 행하고, 이어서 PCR법에 의하여 상기 변이체를 코드하는 DNA를 합성하여 발현벡터에 클로닝하였다. 상기 발현벡터를 정맥내 투여법에 의하여 마우스 체내로 도입하여 마우스 체내에서 상기 변이체를 발현시키고, 그 후 마우스의 혈중 인농도를 측정하였다. 그 결과, FGF23 변이체의 발현에 의하여 마우스의 혈중 인농도가 유의하게 저하되는 것을 발견하였다.
즉, 본 발명자 등은 FGF23 단백질 변이체를 제작하는 데 성공하는 동시에, 상기 변이체를 이용하여 마우스의 혈중 인농도를 저하시키는 데 성공함으로써 본 발명을 완성하기에 이르렀다. 본 발명의 FGF23 단백질 변이체는 이와 같이 혈중 인농도를 저하시키는 능력을 가지고 있기 때문에 고인혈증의 치료를 위한 약제가 될 것으로 크게 기대된다.
본 발명은 혈중 인농도를 저하시키는 FGF23 단백질 변이체 및 상기 변이체를코드하는 DNA 및 그들의 용도에 관한 것으로 보다 구체적으로는,
[1] 서열번호: 2에 기재된 아미노산 서열에 있어서, 176번 위치의 아르기닌이 글루타민, 179번 위치의 아르기닌이 글루타민 또는 179번 위치의 아르기닌이 트립토판으로 변이된 아미노산 서열로 된 단백질을 코드하는 DNA.
[2] 서열번호: 2에 기재된 아미노산 서열에 있어서, 176번 위치의 아르기닌이 글루타민, 179번 위치의 아르기닌이 글루타민 또는 179번 위치의 아르기닌이 트립토판으로 변이된 아미노산 서열로 된 단백질에 있어서의, 적어도 1부터 190번 위치까지의 아미노산 서열을 가지는 단편을 코드하는 DNA.
[3] [1] 또는 [2]의 DNA가 삽입된 벡터.
[4] [1] 또는 [2]의 DNA, 또는 [3]의 벡터를 보유하는 형질전환세포.
[5] 서열번호: 2에 기재된 아미노산 서열에 있어서, 176번 위치의 아르기닌이 글루타민, 179번 위치의 아르기닌이 글루타민 또는 179번 위치의 아르기닌이 트립토판으로 변이된 아미노산 서열로 된 단백질.
[6] 서열번호: 2에 기재된 아미노산 서열에 있어서, 176번 위치의 아르기닌이 글루타민, 179번 위치의 아르기닌이 글루타민 또는 179번 위치의 아르기닌이 트립토판으로 변이된 아미노산 서열로 된 단백질에 있어서의, 적어도 1부터 190번 위치까지의 아미노산 서열을 가지는 단편.
[7] [4]의 형질전환세포를 배양하여, 상기 형질전환세포 또는 그 배양상청으로부터 발현시킨 단백질을 회수하는 공정을 포함하는 [5] 또는 [6]의 단백질의 제조방법.
[8] [1] 또는 [2]의 DNA, [3]의 벡터 또는 [5] 또는 [6]의 단백질을 함유하는, 혈중 인농도를 저하시키기 위한 의약조성물.
[9] [8]에 있어서, 혈중 칼슘농도에는 영향을 주지 않는 의약조성물.
[10] [8] 또는 [9]에 있어서, 고인혈증 치료를 위한 의약조성물.
[11] [1] 또는 [2]의 DNA를 환자에게 투여하는 것을 포함하는 고인혈증을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 혈중 인농도를 저하시키는 FGF23 단백질 변이체를 코드하는 DNA를 제공한다. 본 발명의 DNA에 의하여 코드되는 변이체에는 서열번호: 2에 기재된 인간 FGF23 단백질의 아미노산 서열에 있어서, 176번 위치의 아르기닌 잔기가 글루타민으로 치환된 변이체, 179번 위치의 아르기닌 잔기가 글루타민으로 치환된 변이체 및 179번 위치의 아르기닌이 트립토판으로 치환된 변이체(이하, 각각 「R176Q 변이체」, 「R179Q 변이체」, 「R176W 변이체」라 칭하고, 이들을 통합하여 「FGF 변이체」라 칭한다)가 포함된다. 이들 변이체에 있어서 바람직한 변이체는 R176Q 변이체 및 R179Q 변이체이고, 가장 바람직한 변이체는 R179Q 변이체이다.
본 발명은 또한 이들 FGF 변이체의 단편을 제공한다. 바람직한 단편은 FGF 변이체에 있어서의, 적어도 1부터 190번 위치의 아미노산 서열을 포함하는 단편이다.
본 발명의 FGF23 변이체는 혈중 인농도를 저하시키는 기능을 가진다. 따라서, FGF23 변이체는 혈중의 고농도 인의 존재에 의하여 일어나는 질환에 대해서 치료 및 예방의 효과를 얻을 것이 기대된다. FGF23 변이체의 바람직한 태양에서는 혈중 칼슘농도에는 영향을 주지 않는다.
치료 또는 예방 효과가 기대되는 질환으로서는 예를 들면 고인혈증을 들 수 있다. 고인혈증은 일반적으로 신장으로부터의 PO4배설 감소의 결과로서 발증한다. 진행된 신부전(GFR이 20 mL/분 미만)은 혈장 PO4의 상승을 유도하기에 충분한 배설 감소를 초래한다. 신부전이 없어도 위성(pseudo) 부갑상선 기능저하증이나 부갑상선 기능저하증인 경우에는 신장의 PO4배설에 장애가 일어나는 경우가 있다. 고인혈증은 경구 PO4의 과잉투여나, 때로는 인산염을 함유하는 관장의 지나친 사용에 의해서도 발생하는 경우가 있다. 고인혈증은 또한 세포내 PO4의 세포외로의 이동 결과 발생하는 경우도 있다. 이것이 빈번하게 일어나는 것은 당뇨병 케토산증(전신의 PO4상실에도 불구하고)이나 좌상(挫傷), 비외상성 횡문근 융해증 그리고 전신성 감염증 및 종양 용해 증후군이다. 고인혈증은 2차성 부갑상선 기능항진증이나 장기간 투석을 받고 있는 환자의 신성 골형성장애(renal osteodystrophy)의 발증에도 결정적인 역할을 하고 있다.
본 발명의 DNA는 후술하는 본 발명의 변이체의in vivo나in vitro에 있어서의 생산에 이용되는 것 외에, 예를 들면 고 혈중 인농도에 기인하는 질환의 유전자 치료 등으로의 응용도 생각할 수 있다. 본 발명의 DNA는 본 발명의 변이체를 코드할 수 있는 것이라면 어떠한 형태여도 된다. 즉, mRNA로부터 합성된 cDNA인지, 게놈 DNA인지, 화학합성 DNA인지 등을 불문한다. 또한, 본 발명의 변이체를 코드할 수 있는 한 유전암호의 퇴보(degeneracy)를 토대로 하는 임의의 염기서열을 가지는DNA가 포함된다.
본 발명의 DNA는 인간 FGF23 cDNA를 개변하여 제작할 수 있다. 인간 FGF23 cDNA는 당업자에게 공지인 방법으로 조제할 수 있다. 예를 들면, FGF23을 발현하고 있는 세포로부터 cDNA 라이브러리를 제작하고, FGF23 cDNA의 서열(서열번호: 1)의 일부를 프로브로 하여 하이브리다이제이션을 행함으로써 조제할 수 있다. cDNA 라이브러리는 예를 들면 문헌(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))에 기재된 방법에 의하여 조제해도 되고, 시판의 DNA 라이브러리를 사용해도 된다. 또한, FGF23을 발현하고 있는 세포로부터 RNA를 조제하고, 역전사효소에 의하여 cDNA를 합성한 후 FGF23 cDNA의 서열(서열번호: 1)을 토대로 올리고 DNA를 합성하여 이것을 프라이머로서 사용하고, PCR 반응을 행하여 본 발명의 폴리펩티드를 코드하는 cDNA를 증폭시킴으로써 조제하는 것도 가능하다.
예를 들면 다음과 같이 하면 된다. 먼저, FGF23을 발현하는 세포, 조직, 장기로부터 mRNA를 단리한다. mRNA의 단리는 공지의 방법, 예를 들면 구아니딘 초원심법(Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299), AGPC법(Chomczynski, P. and Sacchi, N., Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159) 등에 의하여 전체 RNA를 조제하고 mRNA Purification Kit(Pharmacia사) 등을 사용하여 전체 RNA로부터 mRNA를 정제한다. 또한, QuickPrep mRNA Purification Kit(Pharmacia사)를 사용함으로써 mRNA를 직접 조제하는 것도 가능하다.
얻어진 mRNA로부터 역전사 효소를 사용하여 cDNA를 합성한다. cDNA의 합성은AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit(세이카가쿠 고교샤) 등을 사용하여 행하는 것도 가능하다. 또한, 서열번호: 1에 기재한 서열을 토대로 하여 제작한 프라이머 등을 사용하고, 5'-Ampli FINDER RACE Kit(Clontech제) 및 폴리머라아제 연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR)을 사용한 5'-RACE법(Frohman, M. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 8998-9002; Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932)에 따라 cDNA의 합성 및 증폭을 행할 수 있다.
얻어진 PCR 산물로부터 목적으로 하는 DNA 단편을 조제하여 벡터 DNA와 연결한다. 더욱이, 이것으로부터 재조합 벡터를 제작하여 대장균 등에 도입하고 콜로니를 선택하여 목적으로 하는 재조합 벡터를 조제한다. 목적으로 하는 DNA의 염기서열은 공지의 방법, 예를 들면 디데옥시 뉴클레오티드 체인 터미네이션법에 의하여 확인할 수 있다.
구체적으로는 예를 들면 실시예 1에 기재한 방법에 의하여 인간 FGF23 cDNA를 취득할 수 있다.
본 발명의 FGF23 변이체를 제작하기 위한 인간 FGF23 cDNA의 개변은 당업자에 의하여 일반적으로 행해지는 DNA 변이도입(DNA Mutagenesis) 기술에 의하여 실시할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면 실시예 2에 나타내는 방법에 의하여 행할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 본 발명의 DNA에 의하여 코드되는 변이체를 제공한다. 본 발명의 변이체는 후술하는 그것을 생산하는 세포나 숙주 또는 정제방법에 의하여 아미노산 서열, 분자량, 등전점 또는 당쇄의 유무나 형태 등이 다를 수 있다. 그러나, 얻어진 변이체가 혈중 인농도를 저하시키는 능력을 가지는 한 본 발명에 포함된다. 예를 들면, 본 발명의 변이체를 원핵세포, 예를 들면 대장균에서 발현시킨 경우, 본래 변이체의 아미노산 서열의 N 말단에 메티오닌 잔기가 부가되지만 이러한 변이체도 본 발명에 포함된다.
본 발명의 변이체는 당업자에게 공지의 방법에 의하여 재조합 폴리펩티드로서 조제하는 것이 가능하다. 재조합 폴리펩티드라면 본 발명의 변이체를 코드하는 DNA를 적당한 발현벡터에 삽입하고, 이것을 적당한 숙주세포에 도입하여 얻은 형질전환체를 회수하여 추출물을 얻은 후 이온교환, 역상, 겔여과 등의 크로마토그래피 또는 본 발명의 변이체에 대한 항체를 칼럼에 고정한 친화성 크로마토그래피로 분리함으로써, 또는 더욱이 이들 칼럼을 복수 조합함으로써 정제하여 조제하는 것이 가능하다.
또한, 본 발명의 변이체를 글루타티온 S-트랜스퍼라아제 단백질과의 융합 폴리펩티드로서, 또는 히스티딘을 복수 부가시킨 재조합 폴리펩티드로서 숙주세포(예를 들면, 동물세포나 대장균 등)내에서 발현시킨 경우에는, 발현시킨 재조합 폴리펩티드는 글루타티온 칼럼 또는 니켈 칼럼을 사용하여 정제할 수 있다. 융합 폴리펩티드의 정제 후, 필요에 따라 융합 폴리펩티드 중 목적으로 하는 변이체 이외의 영역을 트롬빈 또는 인자 Xa 등으로 절단하여 제거하는 것도 가능하다.
본 발명은 또한 본 발명의 DNA가 삽입된 벡터를 제공한다. 본 발명의 벡터는 숙주세포내에서 본 발명의 DNA를 보유하거나 본 발명의 변이체를 발현시키기 때문에 유용하다.
벡터로서는 예를 들면 대장균을 숙주로 하는 경우에는, 벡터를 대장균(예를 들면, JM109, DH5α, HB101, XL1Blue) 등에서 대량으로 증폭시켜 대량 조제하기 위해서 대장균에서 증폭되기 위한 「ori」를 가지고, 더욱이 형질전환된 대장균의 선발유전자(예를 들면 어떤 약제(암피실린이나 테트라사이클린, 카나마이신, 클로람페니콜)로 판별할 수 있는 약제내성 유전자)를 가지면 특별히 제한은 없다. 벡터의 예로서는 M13계 벡터, pUC계 벡터, pBR322, pBluescript, pCR-Script 등을 들 수 있다. 또한, cDNA의 서브클로닝, 잘라내어 반출함을 목적으로 한 경우 상기 벡터 외에, 예를 들면 pGEM-T, pDIRECT, pT7 등을 들 수 있다. 본 발명의 변이체를 생산할 목적으로 벡터를 사용하는 경우에는 특히 발현벡터가 유용하다. 발현벡터로서는 예를 들면 대장균에서의 발현을 목적으로 한 경우는 벡터가 대장균에서 증폭되는 상기 특징을 가지는 것 외에, 숙주를 JM109, DH5α, HB101, XL1-Blue 등의 대장균으로 한 경우에 있어서는 대장균에서 효율 좋게 발현할 수 있는 프로모터, 예를 들면 lacZ 프로모터(Ward 등, Nature (1989) 341, 544-546 ; FASEB J. (1992) 6, 2422-2427), araB 프로모터(Better 등, Science (1988) 240, 1041-1043) 또는 T7 프로모터 등을 가지고 있는 것이 불가결하다. 이러한 벡터로서는 상기 벡터 외에 pGEX-5X-1(Pharmacia사제), 「QIAexpress system」(QIAGEN사제), pEGFP 또는 pET(이 경우 숙주는 T7 RNA 폴리머라아제를 발현하고 있는 BL21이 바람직하다) 등을 들 수 있다.
또한, 벡터에는 폴리펩티드 분비를 위한 시그날 서열이 포함되어 있어도 된다. 폴리펩티드 분비를 위한 시그날 서열로서는 대장균의 주변세포질(periplasm)에 생산시키는 경우 pelB 시그날 서열(Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379)을 사용하면 된다. 숙주세포로의 벡터의 도입은 예를 들면 염화칼슘법, 일렉트로포레이션법을 사용하여 행할 수 있다.
대장균 이외에도 예를 들면 본 발명의 변이체를 제조하기 위한 벡터로서는 포유동물 유래의 발현벡터(예를 들면 pcDNA3(Invitrogen사제)이나 pEGF-BOS(Nucleic Acids. Res. 1990, 18(17), p5322), pEF, pCDM8), 곤충세포 유래의 발현벡터(예를 들면 「Bac-to-BAC baculovirus expression system」(GIBCO BRL사제), pBacPAK8), 식물 유래의 발현벡터(예를 들면 pMH1, pMH2), 동물바이러스 유래의 발현벡터(예를 들면 pHSV, pMV, pAdexLcw), 레트로바이러스 유래의 발현벡터(예를 들면 pZIPneo), 효모 유래의 발현벡터(예를 들면 「Pichia Expression Kit」(Invitrogen사제), pNV11, SP-Q01), 고초균 유래의 발현벡터(예를 들면 pPL608, pKTH50)를 들 수 있다.
CHO세포, COS세포, NIH3T3세포 등의 동물세포에서의 발현을 목적으로 한 경우에는 세포내에서 발현시키기 위해 필요한 프로모터, 예를 들면 SV40 프로모터(Mulligan 등, Nature (1979) 277, 108), MMLV-LTR 프로모터, EF1α 프로모터(Mizushima 등, Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322), CMV 프로모터 등을 가지고 있는 것이 불가결하고, 세포로의 형질전환을 선발하기 위한 유전자(예를 들면, 약제(네오마이신, G418 등)로 판별할 수 있는 약제내성 유전자)를 가지면 더욱 바람직하다. 이러한 특성을 가지는 벡터로서는 예를 들면, pMAM, pDR2, pBK-RSV,pBK-CMV, pOPRSV, pOP13 등을 들 수 있다.
더욱이, 유전자를 안정적으로 발현시키고, 또 세포내에서의 유전자 복제수의 증폭을 목적으로 하는 경우에는, 핵산 합성경로를 결손한 CHO세포에 그것을 상보하는 DHFR 유전자를 가지는 벡터(예를 들면 pCHOI 등)를 도입하여 메토트렉세이트(MTX)로 증폭시키는 방법을 들 수 있고, 또한 유전자의 일과성 발현을 목적으로 하는 경우에는, SV40 T항원을 발현하는 유전자를 염색체 상에 가지는 COS세포를 사용하여 SV40의 복제 기점을 가지는 벡터(pcD 등)로 형질전환하는 방법을 들 수 있다. 복제 개시점으로서는 또 폴리오마바이러스, 아데노바이러스, 소 파필로마바이러스(BPV) 등의 유래의 것을 사용할 수도 있다. 더욱이, 숙주세포계에서 유전자 복제수 증폭을 위하여 발현벡터는 선택 마커로서 아미노글리코시드 트랜스퍼라아제(APH) 유전자, 티미딘키나아제(TK) 유전자, 대장균 크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라아제(Ecogpt) 유전자, 디히드로엽산 환원효소(dhfr) 유전자 등을 포함할 수 있다.
한편, 동물의 생체내에서 본 발명의 DNA를 발현시키는 방법으로서는 본 발명의 DNA를 적당한 벡터에 삽입하고, 예를 들면 레트로바이러스법, 리포솜법, 양이온 리포솜법, 아데노바이러스법 등에 의하여 생체내에 도입하는 방법 등을 들 수 있다. 이것에 의하여 혈중 고농도 인의 존재에 기인하는 질환에 대한 유전자 치료를 행하는 것이 가능하다. 사용되는 벡터로서는 예를 들면 아데노바이러스 벡터(예를 들면 pAdexlcw)나 레트로바이러스 벡터(예를 들면 pZIPneo) 등을 들 수 있지만 이들에 제한되지 않는다. 벡터로의 본 발명의 DNA 삽입 등의 일반적인 유전자 조작은일반적인 방법에 따라 행하는 것이 가능하다(Molecular Cloning, 5.61-5.63). 생체내로의 투여는ex vivo법이어도 되고in vivo법이어도 된다.
또한, 본 발명은 본 발명의 벡터가 도입된 숙주세포를 제공한다. 본 발명의 벡터가 도입되는 숙주세포로서는 특별히 제한은 없어, 예를 들면 대장균이나 각종 동물세포 등을 사용하는 것이 가능하다. 본 발명의 숙주세포는 예를 들면, 본 발명의 변이체 제조나 발현을 위한 생산계로서 사용할 수 있다. 본 발명의 변이체 제조를 위한 생산계는in vitro및in vivo의 생산계가 있다.in vitro의 생산계로서는 진핵세포를 사용하는 생산계나 원핵세포를 사용하는 생산계를 들 수 있다.
진핵세포를 사용하는 경우 예를 들면, 동물세포, 식물세포, 진균세포를 숙주로 사용할 수 있다. 동물세포로서는 포유류세포, 예를 들면 CHO(J. Exp. Med. (1995) 108, 945), COS, 3T3, 골수종, BHK(baby hamster kidney), HeLa, Vero, 양생류세포, 예를 들면 아프리카 발톱 개구리 난모세포(Valle, et al., Nature (1981) 291, 358-340), 또는 곤충세포 예를 들면, Sf9, Sf21, Tn5가 알려져 있다. CHO 세포로서는 특히 DHFR 유전자를 결손한 CHO 세포인 dhfr-CHO(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, 4216-4220)나 CHO K-1(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1968) 60, 1275)을 적합하게 사용할 수 있다. 동물세포에 있어서 대량 발현을 목적으로 하는 경우에는 특히 CHO세포가 바람직하다. 숙주세포로의 벡터 도입은 예를 들면 인산칼슘법, DEAE 덱스트란법, 양이온 리포솜 DOTAP(BOEHRINGER MANNHEIM사제)를 사용한 방법, 일렉트로포레이션법, 리포펙션 등의 방법으로 행하는 것이 가능하다.
식물세포로서는 예를 들면 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum) 유래의 세포가 폴리펩티드 생산계로서 알려져 있고, 이것을 캘러스(callus) 배양하면 된다. 진균세포로서는 효모, 예를 들면 사카로마이세스(Saccharomyces)속, 예를 들면 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae), 사상균, 예를 들면 아스페르길루스(Aspergillus)속, 예를 들면 아스페르길루스 니가(Aspergillus niger)가 알려져 있다.
원핵세포를 사용하는 경우 세균세포를 사용하는 생산계가 있다. 세균세포로서는 대장균(E. coli), 예를 들면 JM109, DH5α, HB101 등을 들 수 있고, 그 밖에 고초균이 알려져 있다.
이들 세포를 목적으로 하는 DNA에 의하여 형질전환하고, 형질전환된 세포를in vitro로 배양함으로써 폴리펩티드가 얻어진다. 배양은 공지의 방법에 따라 행할 수 있다. 예를 들면, 동물세포의 배양액으로서 예를 들면 DMEM, MEM, RPMI1640, IMDM을 사용할 수 있다. 그 때, 소 태아 혈청(FCS) 등의 혈청 보액(補液)을 병용하는 것도 가능하고, 무혈청 배양해도 된다. 배양시의 pH는 약 6~8인 것이 바람직하다. 배양은 보통 약 30~40℃에서 약 15~200시간 행하고, 필요에 따라서 배지의 교환, 통기, 교반을 가한다.
한편,in vivo로 폴리펩티드를 생산시키는 계로서는 예를 들면 동물을 사용하는 생산계나 식물을 사용하는 생산계를 들 수 있다. 이들 동물 또는 식물에 본 발명의 변이체를 코드하는 DNA를 도입하여 동물 또는 식물 체내에서 상기 변이체를 생산시켜 회수한다. 본 발명에서의 「숙주」란 이들 동물, 식물을 포함한다.
동물을 사용하는 경우 포유류동물, 곤충을 사용하는 생산계가 있다. 포유류동물로서는 염소, 돼지, 양, 마우스, 소를 사용할 수 있다(Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993). 또한, 포유류동물을 사용하는 경우 트랜스제닉 동물을 사용할 수 있다.
예를 들면, 본 발명의 변이체를 코드하는 DNA를 염소 β카제인과 같은 유즙중에 고유하게 생산되는 폴리펩티드를 코드하는 유전자와의 융합유전자로서 조제한다. 이어서, 이 융합유전자를 포함하는 DNA 단편을 염소의 배아에 주입하고, 이 배아를 암컷 염소에 이식한다. 배아를 수용한 염소로부터 태어나는 트랜스제닉 염소 또는 그 자손이 생산하는 유즙으로부터 본 발명의 변이체를 얻을 수 있다. 트랜스제닉 염소로부터 생산되는 폴리펩티드를 포함하는 유즙량을 증가시키기 위해서 적절하게 호르몬을 트랜스제닉 염소에 사용해도 된다(Ebert, K.M. et al., Bio/Technology (1994) 12, 699-702).
또한, 곤충으로서는 예를 들면 누에를 사용할 수 있다. 누에를 사용하는 경우 본 발명의 변이체를 코드하는 DNA를 삽입한 바큘로바이러스를 누에에 감염시킴으로써, 이 누에의 체액으로부터 상기 변이체를 얻을 수 있다(Susumu, M. et al., Nature (1985) 315, 592-594).
더욱이, 식물을 사용하는 경우 예를 들면 담배를 사용할 수 있다. 담배를 사용하는 경우, 본 발명의 변이체를 코드하는 DNA를 식물발현용 벡터, 예를 들면 pMON 530에 삽입하고, 이 벡터를 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)와 같은 박테리아에 도입한다. 이 박테리아를 담배, 예를 들면 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum)에 감염시켜 본 담배잎으로부터 본 발명의 변이체를 얻을 수 있다(Julian K.-C. Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131-138).
이것으로 얻어진 본 발명의 변이체는 숙주세포내 또는 세포외(배지 등)로부터 단리하여 실질적으로 순수하게 균일한 폴리펩티드로서 정제할 수 있다. 폴리펩티드의 분리, 정제는 보통의 폴리펩티드의 정제로 사용되고 있는 분리, 정제방법을 사용하면 되고, 조금도 한정되지 않는다. 예를 들면, 크로마토그래피 칼럼, 필터, 한외여과, 염석, 용매침전, 용매추출, 증류, 면역침강, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 등전점 전기영동법, 투석, 재결정 등을 적절하게 선택하여 조합하면 폴리펩티드를 분리, 정제할 수 있다.
크로마토그래피로서는 예를 들면 친화성 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 겔여과, 역상 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피 등을 들 수 있다(Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996). 이들 크로마토그래피는 액상 크로마토그래피, 예를 들면 HPLC, FPLC 등의 액상 크로마토그래피를 사용하여 행할 수 있다. 본 발명은 이들 정제방법을 사용하여 고도로 정제된 변이체도 포함한다.
또한, 본 발명의 변이체를 정제 전 또는 정제 후에 적당한 단백질 수식효소를 작용시킴으로써, 임의로 수식을 가하거나 부분적으로 펩티드를 제거하는 것도 가능하다. 단백질 수식효소로서는 예를 들면 트립신, 키모트립신, 리실 엔도펩티다아제, 프로테인 키나아제, 글루코시다아제 등이 사용된다.
본 발명은 또한 본 발명의 변이체, 상기 변이체를 코드하는 DNA, 또는 상기 DNA가 삽입된 벡터를 함유하는 혈중 인농도를 저하시키기 위한 의약조성물을 제공한다.
본 발명의 변이체를 인간이나 다른 동물, 예를 들면 마우스, 래트, 모르모트, 토끼, 닭, 고양이, 개, 양, 돼지, 소, 원숭이, 망토비비, 침팬지의 의약으로서 사용하는 경우에는, 변이체 자체를 직접 환자에게 투여하는 것 이외에 공지의 제제학적 방법에 따라 제제화한 의약조성물로서 투여하는 것도 가능하다. 예를 들면, 필요에 따라 당의를 행한 정제, 캡슐제, 엘릭실제, 마이크로캡슐제로서 경구적으로, 또는 물 또는 그 이외의 약학적으로 허용할 수 있는 액과의 무균성 용액, 또는 현탁액제의 주사제 형태로 비경구적으로 사용할 수 있다. 예를 들면, 약리학상 허용되는 담체 또는 매체, 구체적으로는 멸균수나 생리식염수, 식물유, 유화제, 현탁제, 계면활성제, 안정제, 향미제, 부형제, 비히클, 방부제, 결합제 등과 적절하게 조합하여 일반적으로 인정된 제약실시에 요구되는 단위용량 형태로 혼화함으로써 제제화하는 것을 생각할 수 있다. 이들 제제의 유효 성분량은 지시된 범위의 적당한 용량이 얻어지도록 하는 것이다.
정제, 캡슐제에 혼화할 수 있는 첨가제로서는 예를 들면 젤라틴, 콘스타치, 트라가칸타 고무, 아라비아 고무와 같은 결합제, 결정성 셀룰로오스와 같은 부형제, 콘스타치, 젤라틴, 알긴산과 같은 팽화제, 스테아린산 마그네슘과 같은 윤활제, 자당, 젖당 또는 사카린과 같은 감미제, 박하, 아카모노유 또는 체리와 같은 향미제가 사용된다. 조제단위 형태가 캡슐인 경우에는 상기 재료에 추가로 유지와같은 액상 담체를 함유할 수 있다. 주사를 위한 무균조성물은 주사용 증류수와 같은 비히클을 사용하여 보통의 제제실시에 따라 처방할 수 있다.
주사용 수용액으로서는 예를 들면 생리식염수, 포도당이나 그 밖의 보조약을 포함하는 등장액, 예를 들면 D-소르비톨, D-만노오스, D-만니톨, 염화나트륨을 들 수 있고, 적당한 용해보조제, 예를 들면 알코올, 구체적으로는 에탄올, 폴리알코올, 예를 들면 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 비이온성 계면활성제, 예를 들면 폴리소르베이트 80TM, HCO-50과 병용해도 된다.
유성액으로서는 참기름, 대두유를 들 수 있고, 용해보조제로서 안식향산 벤질, 벤질알코올과 병용해도 된다. 또한, 완충제, 예를 들면 인산염 완충액, 초산나트륨 완충액, 무통화제, 예를 들면 염산프로카인, 안정제, 예를 들면 벤질알코올, 페놀, 산화방지제와 배합해도 된다. 조제된 주사액은 보통 적당한 앰플에 충전시킨다.
환자로의 투여는 예를 들면, 동맥내주사, 정맥내주사, 피하주사 등 외에 비강내적, 경기관지적, 근내적, 경피적 또는 경구적으로 당업자에게 공지의 방법에 의하여 행할 수 있다. 투여량은 환자의 체중이나 연령, 투여방법 등에 따라 변동되지만, 당업자라면 적당한 투여량을 적절하게 선택하는 것이 가능하다.
본 발명의 변이체의 투여량은 그 1회 투여량은 투여대상, 대상장기, 증상, 투여방법에 따라서도 다르지만, 예를 들면 주사제의 형태로는 보통 성인(체중 60 kg으로 하여)에 있어서는 1일당 약 100 ㎍에서 20 mg으로 생각된다.
비경구적으로 투여하는 경우는 그 1회 투여량은 투여대상, 대상장기, 증상, 투여방법에 따라서도 다르지만, 예를 들면 주사제의 형태로는 보통 성인(체중 60 kg으로 하여)에 있어서는 보통 1일당 약 0.01에서 30 mg, 바람직하게는 약 0.1에서 20 mg, 보다 바람직하게는 약 0.1에서 10 mg 정도를 정맥주사에 의하여 투여하는 것이 적합하다고 생각된다. 다른 동물의 경우도 체중 60 kg 기준으로 환산한 양 또는 체표면적 기준으로 환산한 양을 투여할 수 있다.
또한, 본 발명의 DNA를 의약조성물로서 사용하는 경우에는 상술한 바와 같이 본 발명의 DNA를 생체내에서 그 발현을 보증하는 벡터에 삽입하고, 예를 들면 레트로바이러스법, 리포솜법, 양이온 리포솜법, 아데노바이러스법 등에 의하여 생체내에 도입하면 된다. 이에 따라 고 혈중 인농도에 기인하는 질환에 대한 유전자 치료를 행하는 것이 가능하다. 생체내로의 투여에 있어서는ex vivo법이나in vivo법을 이용할 수 있다.
도면의 간단한 설명
도 1은 혈청 중의 무기인 농도에 대한 FGF23 변이체의 효과를 나타내는 그래프이다. 혈청 중의 무기인은 DNA 벡터를 도입한 후 4일간 계측하였다. 데이터는 평균값 ±SEM을 나타낸다. 칼럼내의 수치는 동물의 수를 나타낸다. *P<0.05 대 MOCK 대조(대응이 없는 t 검정).
도 2는 혈청 중의 무기인 농도에 대한 FGF23의 효과를 나타내는 그래프이다. 혈청 중의 무기인은 DNA 벡터를 도입한 후 4일간 계측하였다. 데이터는 평균값±SEM을 나타낸다. 칼럼내의 수치는 동물의 수를 나타낸다. *P<0.05 대 MOCK 대조(대응이 없는 t 검정).
도 3은 혈청 중의 1α,25(OH)2D3농도에 있어서의 FGF23 및 FGF23 변이체의 효과를 나타내는 그래프이다. 혈청중의 1α,25(OH)2D3는 DNA 벡터를 도입한 후 4일간 계측하였다. 계측에는 세 동물로부터 얻은 혈청을 혼합하여 사용하였다(n=2, 6마리/군). 데이터는 평균값을 나타낸다.
도 4는 신장으로부터 단리한 BBMV에 있어서의 인 수송 활성에 대한 FGF23 변이체의 효과를 나타내는 그래프이다. naked 벡터 DNA 도입 마우스에 있어서의 신장 쇄자연막 소포 중에서의 Pi 업테이크(도입 후 4일간). 계측에는 두 동물로부터 얻은 신장을 사용하였다(n=3, 6마리/군). 데이터는 평균값 ±SEM을 나타낸다.
도 5는 FGF-23(변이체) M2-F의 SDS-PAGE 해석(CBB 염색)의 결과를 나타내는 사진이다. 도 중의 M은 분자량 마커(BIO-RAD, 브로드 레인지)를 나타낸다.
도 6은 C 말단 결실 M2FGF23 변이체의 혈청 인농도 저하작용을 나타내는 그래프이다. 「MOCK」는 부모벡터인 pCAGGS를 도입한 마우스를 나타낸다. 「Normal 」은 정상 마우스를 나타낸다.
도 7은 PTH(1-34)와 M2FGF23의 TPTX 래트 혈청 인 저하작용을 나타내는 그래프이다.
도 8은 PTH(1-34)와 M2FGF23의 TPTX 래트 혈청 칼슘에 대한 작용을 나타내는 그래프이다.
도 9는 PTH(1-34)와 M2FGF23의 TPTX 래트의 신장 인 배설에 대한 작용을 나타내는 그래프이다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명하지만 본 발명은 이들 실시예에 제한되지 않는다.
[실시예 1] 인간 FGF23의 전장 cDNA(ORF 부분)의 클로닝
FGF-23의 전장 cDNA(ORF 부분) 클로닝은 PCR법에 의하여 행하였다. 프라이머는 Genbank data(액세션 No.AB037973)를 토대로 하고, 거기에 EcoRI 사이트 및 XhoI 사이트를 부가하여 디자인하였다(5'- ggAATTCTCgAgCCACCATgTTgggggCCCgCCTCAggCTCTg-3'/서열번호: 3, 5'- ggAATTCTCgAgCTACTAgATgAACTTggCgAAgg-3'/서열번호: 4). 더욱이 5'측의 프라이머에는 개시코돈 ATG의 상류에 코작크 서열(kozak sequence)(CCACC)을 부가하고, 3'측의 서열에는 종지코돈 TGA를 두개 부가하였다. 프라이머 제작은 SAWADY Technology사에 외주하였다. 주형에는 human heart cDNA(Origene사의 Multiple cDNA kit, Cat. No. CH-1101)를 사용하고, PCR 반응에는 QIAGEN PCR kit(QIAGEN사 Cat. No. 201223)를 사용하였다. 즉, 0.75 ㎕의 human heart cDNA(Origene사의 Multiple cDNA kit), 2.5 ㎕의 QIAGEN 10 ×PCR 버퍼, 0.5 ㎕의 dNTP mix(200 mM), 0.25 ㎕의 QIAGEN Taq DNA 폴리머라아제, 5.0 ㎕의 5 ×Q-solution, 0.5 ㎕의 Specific Forward PCR primer(50 μM, 서열번호: 3), 0.5 ㎕의 Specific Reverse PCRprimer(50 μM, 서열번호: 4), 그리고 15 ㎕의 DDW를 가하여 전량 25 ㎕로 하고, 이하의 조건에서 PCR 반응을 Thermal cycler ABI2400을 사용하여 행하였다. 1차변성은 95℃에서 2분, 그리고 35 사이클의 2단계 셔틀 PCR(94℃에서 40초, 60℃에서 1분)을 행하고, 마지막으로 신장(伸長)반응을 72℃에서 7분 행하여 PCR 반응을 종료하였다. PCR 반응에 의한 증폭산물을 1.0% 아가로스 전기영동으로 확인한 결과, 단일 특이적 밴드가 약 750 bp 부근에서 확인되었기 때문에, TOPO TA 클로닝 키트(Invitrogen사 Cat. No. K45000-01)에 의하여 2 ㎕의 PCR 반응액을 사용하여 TA 벡터 pCR2.1로의 서브클로닝을 행하였다. 조작은 키트에 첨부된 프로토콜에 따라 행하였다. 그리고, TA 클로닝된 클론 #3의 염기서열 해석을 M13 M4 프라이머(TaKaRa사 Cat. No. 3832A), M13 RV 프라이머(TaKaRa사 Cat. No. 3830A), 서열번호: 5에 기재된 프라이머(5'- CgCACCCCATCAgACCATCT -3') 및 서열번호: 6에 기재된 프라이머(5'- gCAgTTCTCCgggTCgAAATA -3')를 사용하고 ABI377 DNA 시퀀서에 의하여 해석하였다. 그 결과, 클론 #3의 내부서열은 인간 FGF-23과 완전히 일치하여 FGF-23의 클로닝을 완료하였다.
[실시예 2] 인간 FGF 변이체(R176Q, R179Q, R179W, R176Q+R179Q, R176Q+R179W)의 제작
인간 FGF-23을 주형으로 FGF-23 변이체 R176Q(M1), R179Q(M2), R179W(M3), R176Q+R179Q(M4), R176Q+R179W(M5)의 제작을 행하였다. 인간 FGF-23으로부터 문헌(Autosomal dominant hypophosphataemic rickets is associated withmutations in FGF23 Nature Genetics Vol.26 p345-348. November 2000)에 따라 527G →A(R176Q), 536G →A(R179Q), 535C →T(R179W)의 3종류 및 그들의 조합 M4(R176Q+R179Q)와 M5(R176Q+R179W)의 제작을 행하였다. 프라이머 합성은 SAWADY Technology사에 외주하였다. 사용한 프라이머의 염기서열은 다음과 같다.
·5'- CACggCAgCACACCCggAgC -3'(서열번호: 7)
·5'- CACggCggCACACCCAgAgC -3'(서열번호: 8)
·5'- CACggCggCACACCTggAgC -3'(서열번호: 9)
·5'- CACggCAgCACACCCAgAgC -3'(서열번호: 10)
·5'- CACggCAgCACACCTggAgC -3'(서열번호: 11)
변이도입(Mutagenesis)은 1차 PCR에 있어서 변이도입을 위한 부분 프래그먼트를 제작하고, 2차 PCR에 의하여 변이가 들어 있는 전장 변이체의 주형을 제작하고, 최종적으로 3차 PCR에 의하여 완전한 변이체를 얻는다고 하는 3단계에 의한 방법으로 행하였다. 즉, 0.2 ㎕의 인간 FGF-23의 클론 #3(40 ng/㎕), 5 ㎕의 TaKaRa EX 10 ×PCR 버퍼, 4 ㎕의 dNTP mix(50 μM), 0.5 ㎕의 TaKaRa EX Taq DNA 폴리머라아제, 0.5 ㎕의 Specific mutant primer(50 μM, 서열번호: 7,8,9,10,11), 0.5 ㎕의 Specific Reverse PCR primer(50 μM, 서열번호: 4), 그리고 39.3 ㎕의 DDW를 가하여 전량 50 ㎕로 하고, 이하의 조건에서 PCR 반응을 Thermal cycler ABI2400에 의하여 행하였다. 1차변성은 95℃에서 2분, 그리고 35 사이클의 2단계 셔틀 PCR(94℃에서 40초, 60℃에서 30초)을 행하고, 마지막으로 신장반응을 72℃에서 4분 행하여 PCR 반응을 종료하였다. PCR 반응에 의한 증폭산물을 1.0% 아가로스 전기영동으로 확인한 결과, 단일 특이적 밴드가 약 200 bp 부근에서 확인되었다. 이 겔로부터 각각의 특이적 증폭 프래그먼트(R176Q와 R179Q)를 QIAquick Gel Extraction kit(QIAGEN사 Cat. No. 28704)에 의하여 키트에 첨부된 프로토콜에 따라 정제하였다. 그 정제 프래그먼트(변이체 부분서열)를 사용하여, 이어서 2차 PCR 반응(변이체 전장의 주형을 제작)을 행하였다. 1 ㎕의 정제 프래그먼트를 프라이머로서 사용하고, 0.1 ㎕의 인간 FGF-23의 클론 #3(40 ng/㎕), 2.5 ㎕의 TaKaRa EX 10 ×PCR 버퍼, 2 ㎕의 dNTP mix(50 μM), 0.25 ㎕의 TaKaRa EX Taq DNA 폴리머라아제, 그리고 18.15 ㎕의 DDW를 가하여 전량 24 ㎕로 하고, 이하의 조건에서 2차 PCR 반응을 Thermal cycler ABI2400을 사용하여 행하였다. 1차변성은 95℃에서 2분, 그리고 5 사이클의 3단계 사이클 PCR(94℃에서 1분, 60℃에서 1분, 72℃에서 1분)을 행하여, 2차 PCR을 종료하였다. 계속해서, 이 반응액에 0.5 ㎕의 Specific Forward PCR primer(50 μM, 서열번호: 3), 0.5 ㎕의 Specific Reverse PCR primer(50 μM, 서열번호: 4)를 가하여 전량 25 ㎕로 하고, 이하의 조건에서 3차 PCR 반응을 Thermal cycler ABI2400에 의하여 행하였다. 1차변성은 95℃에서 2분, 그리고 35 사이클의 2단계 셔틀 PCR(94℃에서 40초, 60℃에서 1분)을 행하고, 마지막으로 신장반응을 72℃에서 7분 행하여 PCR 반응을 종료하였다. 최종적으로 얻어진 PCR 반응에 의한 증폭산물을 1.0% 아가로스 전기영동으로 확인한 결과, 특이적으로 증폭된 약 750 bp 부근의 밴드가 확인되었다.
이후의 해석은 실시예 1과 동일한 방법으로 내부서열의 TA 클로닝을 행하고, 동일한 방법으로 내부서열의 염기서열 해석을 행한 바, 각종 변이체에 대해서 목적변이가 삽입된 클론 제작에 성공하였다.
[실시예 3] 발현벡터의 제작
FGF-23 및 각종 변이체(M1~M5)의 내부서열을 pCAGGS3에 삽입하여 각 클론의 발현벡터를 제작하였다. 즉, 각 클론을 제한효소 EcoRI에 의하여 절단하고, 얻어진 EcoRI 프래그먼트를 QIAquick Gel Extraction kit(QIAGEN사 Cat. No. 28704)에 의하여 정제하여 EcoRI 컷팅된 pCAGGS3에 삽입하였다. 각 벡터를 pCGF23, pCGFM1~5라 명명하였다.
[실시예 4] 엔도톡신 프리 플라스미드의 조제
플라스미드 DNA를 직접in vivo에 투여하기 위하여 엔도톡신 제거처리를 가한 방법으로 플라스미드 정제를 행하였다. 구체적으로는 Endofree plasmid Maxi kit(QIAGEN사 Cat. No. 12362)를 사용하여, pCGF23, pCGFM1~5의 엔도톡신 프리의 플라스미드 정제를 첨부된 프로토콜에 따라 행하였다.
[실시예 5] FGF-23 및 M2(R179Q)의 C 말단 FLAG-taq의 부가
pCGF23 및 pCGFM2를 주형으로 서열번호: 3에 기재된 서열 및 FLAG 서열을 포함하는 서열번호: 12에 기재된 프라이머를 사용하여, C 말단에 FLAG 서열을 포함하는 변이체를 제작하였다. 즉 1 ㎕의 pCGF23 및 pCGFM2(30 ng/㎕), 2.5 ㎕의 TaKaRa EX 10 ×PCR 버퍼, 2 ㎕의 dNTP mix(50 μM), 0.25 ㎕의 TaKaRa EX Taq DNA 폴리머라아제, 0.5 ㎕의 Specific PCR primer(50 μM, 서열번호: 11), 0.5 ㎕의 Specific Reverse PCR primer(50 μM, 5'-ggATCCgAATTCATATgTCACTTATCgTCgTCATCCTTgTAATCgATGAACTTggCgAAgg-3'/서열번호: 12), 그리고 18.5 ㎕의 DDW를 가하여 전량 25 ㎕로 하고, 이하의 조건에서 PCR 반응을 Thermal cycler ABI2400에 의하여 행하였다. 1차변성은 95℃에서 2분, 그리고 30 사이클의 2단계 사이클 PCR(94℃에서 30초, 60℃에서 1분)을 행하고, 마지막으로 신장반응을 72℃에서 7분 행하여 PCR 반응을 종료하였다. 최종적으로 얻어진 PCR 반응에 의한 증폭산물을 1.0% 아가로스 전기영동으로 확인한 결과, 특이적으로 증폭된 약 800 bp 부근의 밴드가 확인되었다. 이후의 해석은 실시예 1~4의 방법에 준하여 행하고, 최종적으로 발현벡터 pCGF23-F 및 pCGFM2-F를 제작하였다.
[실시예 6] FGF-23 및 M2(R179Q)의 N 말단 FLAG-tag의 부가
N 말단 FLAG-tag 부가 FGF23 발현벡터는 PCR법을 사용하여 이하와 같이 구축하였다. 3 ng의 pCG23을 템플레이트, 각각 100 pmol의 Specific Forward PCR primer와 23N FLAG R(GCCCTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCGGCTCTGAGGACGCTC/서열번호: 13) 또는 23R1(GGCTCGAGTCAGATGAACTTGGCGAAGG/서열번호: 14)과 23N FLAG F(GATGACGACGATAAGGGCGGAGGTTCCAGAGCCTATCCCAATG/서열번호: 15)를 프라이머 세트로서 사용하고, Takara Ex Taq와 거기에 첨부된 버퍼를 사용하여 1단계의 PCR 반응(96℃에서 15초, 55℃에서 15초, 72℃에서 2분, 25 사이클)을 행하였다. PCR 반응 생성물을 밀리포어사의 마이크로콘 30에 걸어 프라이머를 제거한 후, 각각의PCR 반응 생성물을 혼합한 것을 템플레이트, FGF F와 23R1을 프라이머 세트로서 사용하여, 1단계와 동일한 조건에서 2단계의 PCR 반응을 행하였다. 반응종료 후 아가로스 겔 전기영동에 의하여 PCR 반응 생성물을 정제하고, 이 프래그먼트를 TOPO 클로닝 키트(Invitrogen사제)를 사용하여 클로닝하고 DNA서열을 읽음으로써, 목적으로 하는 변이가 도입되어 있는 것과 불필요한 변이가 도입되어 있지 않은 것을 확인하였다. 서열이 확인된 플라스미드를 조정하고, Eco RI로 절단하여 프래그먼트를 회수하고, 미리 Eco RI로 절단해 둔 pCAGGS3에 삽입하였다. 방향성을 확인한 후 최종적으로 발현벡터를 pCGF23NF라 명명하였다.
N 말단 FLAG-tag 부가 FGF23M2 벡터는 1단계의 PCR용 템플레이트에 pCGFM2를 사용한 것 이외에 상기와 동일한 방법으로 제작하여 pCGFM2NF라 명명하였다.
[실시예 7] naked DNA injection 동물실험용 발현벡터 제작
naked DNA injection법을 사용하여 마우스 성체에 있어서 FGF23과 그 변이체가 직접 또는 간접적으로 인의 대사에 영향을 미치는지의 여부를 검증하였다.
사용한 재료는 이하와 같다.
FGF23 발현벡터(pCGF23)
R176QFGF23 변이체 발현벡터(pCGFM1)
R179QFGF23 변이체 발현벡터(pCGFM2)
R179WFGF23 변이체 발현벡터(pCGFM3)
R176QR179QFGF23 변이체 발현벡터(pCGFM4)
R176QR179WFGF23 변이체 발현벡터(pCGFM5)
<대조물질(음성 대조물질)>
MOCK 벡터(pCAGGS)
형상: 10 mM Tris/1 mM EDTA(pH8.0) 용액
보존: -20℃, 암소
<조제방법>
투여제형은 용액이고, 조제법은 TransIT In Vivo Gene Delivery System(PanVera사)의 프로토콜에 따랐다(TransIT?In Vivo Gene Delivery System(PanVera사) standard protocol). MOCK 벡터 또는 FGF23 발현벡터 또는 FGF23 변이체 발현벡터를 투여 1마리당 10 ㎍ 사용하였다. 10 μL의 TransIT Polymer Solution과 적당량의 멸균수를 가하여 200 μL로 하고 50 mL 팔콘 튜브중에서 혼합하였다. 5분간 실온에 방치한 후, 상기의 200 μL당 2.8 mL의 1 ×Delivery Solution을 가하여 전량을 3.0 mL로 하고 투여액으로 하였다. 6마리에 투여하는 경우에는 7마리분의 양 21 mL를 조제하였다. 투여액은 조제 당일 전부 사용하였다.
사용동물 및 사육조건은 이하와 같다.
<사용동물>
동물종: 마우스
계통: Jcl: CD-1(ICR) 또는 Crj: CD-1(ICR)
성별: 수컷
체중: 35~40 g
주령: 투여시 8~9주령
입수처: 일본 클레아 또는 일본 찰스리버
안락사법: 마취하 방혈
순화기간: 약 2주간
군 분류법: 무작위 추출
<사육환경>
실온: 24 ±2℃
상대습도: 55 ±10%
환기횟수: 10~30회/시
조명시간: 5:00~19:00
사료: CE-2(일본 클레아 가부시키가이샤)를 자유섭취
음료수: 수돗물을 자유섭취
<시험방법>
투여경로는 정맥내 투여, 투여량은 3 ml로 하여 전량을 8초 이내에 투여하였다.
<샘플채취>
(1) 혈청
투여 4일 후에 에테르 마취하에 복부 대정맥으로부터 전혈 채혈하였다. 채취한 혈액은 세파라피트 튜브 미니(세키스이 카가쿠 고교)에 넣고 원심(1400 ×g, 10분간, 4℃)하여 혈청을 분리하였다. 혈청은 측정할 때까지 설정온도 -20℃의 냉동고에 보존하였다.
(2) 뇨
투여후 3일째에 마우스를 유리제의 대사 케이지(METABOLICA, 스기야마 겐 이리키)에 넣어 4일째까지 24시간 축적된 뇨를 채취하였다. 뇨는 측정할 때까지 설정온도 -20℃의 냉동고에 보존하였다.
(3) 신장
혈청 채취 후 양쪽 신장을 적출하고 피막을 박리제거하여 쇄자연막 소포의 정제에 사용하였다.
<각 파라미터의 측정>
혈청 중 또는 뇨 중의 무기인(Pi), 칼슘(Ca), 요소질소(UN), 크레아티닌(CRE)은 자동분석장치(히타치 7170E형)로 측정하였다. 혈청 중의 25-히드록시비타민 D,24,25-디히드록시비타민 D는 CPBA법으로, 1α,25-디히드록시비타민 D는 RIA2 항체법으로 측정하였다.
<통계학적 해석방법>
MOCK 벡터 투여군과 FGF23 발현벡터 투여군 또는 각 FGF23 변이체 발현벡터 투여군 사이에서 대응이 없는 t 검정을 행하였다. 유의수준은 양쪽 5%로 하였다. 해석 소프트웨어는 SAS ver.6.12를 사용하였다.
결과, 혈청 생화학값에 대한 작용은 도 1에 나타낸 바와 같이 ADHR 환자에서 동정된 점변이를 도입한 3종류의 FGF23 변이체 발현벡터인 FGF23-M1, FGF23-M2 및FGF23-M3을 투여한 군에서는, 변이체의 종류에 관계없이 MOCK 투여군에 비하여 유의한 혈중 인값의 저하가 관찰되었다. 그러나, 이들 점변이를 조합한 이중 변이체 발현벡터, FGF23-M4, FGF23-M5를 투여한 군에서는 동일하게 혈청 인 저하작용은 관찰되었지만, 점변이를 조합한 것에 의한 상가 ·상승효과는 인지되지 않았다. 야생형 FGF23(FGF23-Wild)을 투여한 군에서는 혈청 인 저하작용은 인지되지 않았다(도 2).
표 1에 나타내는 바와 같이 그 밖의 혈청 생화학 파라미터(칼슘, 크레아티닌, 요소질소)로는 MOCK군과 FGF23-Wild군 및 FGF23-M2군에서 현저한 차는 인지되지 않았다.
| 무기인(mg/dL) | 칼슘(mg/dL) | 크레아티닌(mg/dL) | 요소질소(mg/dL) | |
| MOCK | 8.3±0.3 | 9.2±0.2 | 0.34±0.01 | 22.7±1.4 |
| FGF23-Wild | 8.6±0.4 | 9.4±0.1 | 0.41±0.06 | 31.1±3.7 |
| FGF23-M2 | 6.0±0.1 | 8.9±0.1 | 0.33±0.01 | 23.4±1.3 |
또한, 뇨 중 생화학값에 대한 작용을 나타내는 결과는 표 2에 나타낸 바와 같이 FGF23-M2 투여군에서는 MOCK군에 비하여 1일당 인 배설량이 증가하는 경향이 보였지만, 유의한 차는 아니었다.
| 무기인 배설량(mg/일) | 칼슘 배설량(mg/일) | |
| MOCK | 3.29±0.87 | 0.07±0.02 |
| FGF23-M2 | 4.79±0.92 | 0.16±0.01 |
또한, 혈청 중 1α,25(OH)2D3에 대한 작용을 나타내는 결과는 도 3에 나타낸 바와 같이 MOCK 투여군에 비교하여 FGF23-M2 투여군 및 FGF23-Wild군에서는 현저하게 1α,25(OH)2D3량이 저하되어 있었다. FGF23-Wild군에서는 MOCK군의 약 절반, FGF23-M2 투여군에서는 측정감도 이하까지 저하되어 있었다.
한편, 생체내의 전구체인 25(OH)D3량은 MOCK 투여군, FGF23-Wild 투여군, FGF23-M2 투여군에서 유의한 차는 인지되지 않았다. 또한 24,25(OH)2D3량은 FGF23-Wild 투여군에서는 MOCK 투여군과 차는 보이지 않았지만, FGF23-M2 투여군에서는 현저하게 저하되어 있었다(표 3).
| 25-히드록시비타민 D3(ng/mL) | 24,25-디히드록시비타민 D3(ng/mL) | |
| MOCK | 20.8 | 14.1 |
| FGF23-Wild | 25.2 | 12.0 |
| FGF23-M2 | 18.3 | 4.1 |
<쇄자연막 소포 정제>
쇄자연막 소포의 정제는 마그네슘 침전법으로 행하였다. 즉, 채취한 신장에 빙냉한 MET Buffer(60 mM 만니톨, 1 mM EGTA, 25 mM Tris/HCl, pH 7.1)를 가하여 히스코트론으로 18,000 rpm, 1분간, 균질화한 후에 1/10량의 1M MgCl2를 가하여 교반하고 15분간 얼음속에 방치하였다. 저속원심(2,000 ×g, 15분간, 4℃)으로 비분쇄 획분을 제거한 후 상청을 고속원심(24,000 ×g, 30분간, 4℃)하여 침전을 얻었다. 침전에 MET Buffer를 가하고 테프론 호모게나이저(1,000 rpm, 10 스트로크)로 더욱이 분쇄하였다. 다시 1/10량의 1M MgCl2를 가하여 교반하고 15분간 얼음속에 방치한 후 저속원심(2,000 ×g, 15분간, 4℃)하고, 상청을 고속원심(24,000 ×g, 30분간, 4℃)하였다. 얻어진 침전에 Transport Buffer-K(100 mM 만니톨, 20 mM HEPES/Tris, pH 7.4)를 가하여 플라스틱 시린지(침 20 G 및 27 G)로 흡인 배출을 반복하여 쇄자연막 소포를 얻었다.
<인 수송 활성 측정>
쇄자연막을 사용한 인 수송 활성의 측정은 신속여과법을 사용하였다. 즉, 20 μL의 쇄자연막 소포와 80 μL의 반응액(100 mM 만니톨, 20 mM HEPES/Tris, pH 7.4, 125 mM NaCl, 125 nM32P-KH2PO4)을 25℃에서 1분간 반응시키고, 반응정지액(100 mM 만니톨, 100 mM 염화콜린, 20 mM MgSO4, 5 mM KH2PO4, 20 mM HEPES/Tris, pH 7.4)을 1 mL 가하여 반응을 정지시켰다. 반응액은 즉시 니트로셀룰로오스막(공경 0.45 ㎛, 직경 2.5 cm)으로 흡인 여과하고, 니트로셀룰로오스막을 5 mL의 반응정지액으로 세척하였다. 막상에 포획된 방사활성을 액체 신틸레이션 카운터 TRI-CARB 2700TR(벡크만 가부시키가이샤)을 사용하여 측정하여 전체 인 수송 활성으로 하였다. 나트륨 비의존성 인 수송 활성의 측정은 반응액 중의 125 mM NaCl을 125 mM의 KCl로 변경하여 행하였다. 나트륨 의존성 인 수송 활성은 전체 인 수송 활성과 나트륨 비의존성 인 수송 활성의 차로 산출하였다. 활성 모두 쇄자연막 소포 중의 단백량을 BCA Protein Assay Reagent(PIERCE)를 사용하여 측정하고, 1분동안에 단위 단백량이 업테이크한 인의 양(pmoles/mg protein/min)으로 표시하였다.
결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 FGF23-M2 투여군에서는 MOCK 투여군에 대해서 신장의 나트륨 의존성 인 수송 담체(Na/Pi)활성은 유의하게 저하되어 있었다. 한편, 나트륨 비의존성 인 수송 활성에 변화는 인지되지 않았다.
[실시예 8] C 말단 결실 M2FGF23 변이체 발현벡터의 구축
C 말단 결실 M2FGF23 변이체 발현벡터는 PCR법을 사용하여 이하와 같이 구축하였다. 3 ng의 pCGFM2NF를 템플레이트, 각각 100 pmol의 Specific Forward PCR primer와 dC188 (GGCTCGAGTCAGTCCCGCTCCGAGTC／서열번호: 16),
dC194(GGCTCGAGTCACTTCAGCACGTTCAGGGG／서열번호:17),
dC200(GGCTCGAGTCAGGTCATCCGGGCCCGGGG／서열번호: 18),
dC210(GGCTCGAGTCAGAGCTCCTGTGAACAGGA／서열번호: 19),
dC217(GGCTCGAGTCAGCTGTTGTCCTCGGCGCT／서열번호: 20),
dC223(GGCTCGAGTCAGTCACTGGCCATCGGGCT／서열번호: 21),
dC240(GGCTCGAGTCAGCCCGTTCCCCCAGCGTG／서열번호: 22) 또는
dC245(GGCTCGAGTCAGCGGCAGCCTTCCGGGCC／서열번호: 23)를 프라이머 세트로서 사용하고, Takara Ex Taq와 거기에 첨부된 버퍼를 사용하여 PCR 반응(96℃에서 15초, 55℃에서 15초, 72℃에서 2분, 25사이클)을 행하였다. 반응종료 후 아가로스 겔 전기영동에 의하여 PCR 반응 생성물을 정제하고, 이 프래그먼트를 TOPO 클로닝키트(Invitrogen사제)를 사용하여 클로닝하고, DNA 서열을 읽음으로써 목적 변이가 도입되어 있는 것과 불필요한 변이가 도입되어 있지 않은 것을 확인하였다. 서열이 확인된 플라스미드를 조정하고, Eco RI로 절단하여 프래그먼트를 회수하고, 미리 Eco RI로 절단해 둔 pCAG GS3에 삽입하였다. 이들 발현벡터는 각각 pCGdC188(dC188), pCGdC194(dC194), pCGdC200(dC200), pCGdC210(dC210), pCGdC217(dC217), pCGdC223(dC223), pCGdC240(dC240), pCGdC245(dC245)라 명명하였다.
[실시예 9] C 말단 결실 M2FGF23 변이체 단백질의 발현
1 ×105개의 COS세포를 1 ml의 DMEM(10% FCS) 배지(GIBCO)에 현탁한 후 6웰 플레이트에 분배하였다. 하룻밤 배양한 후 1 ㎍의 발현벡터(실시예 8에 나타낸 pCGdc188~pCGdc245)를 3 μL의 FuGene(BOEHRINGER사제)을 사용하여 세포에 도입한 후 추가로 하룻밤 배양하였다. 다음날 배지를 CHO-S-SFMII로 교환하여 이틀 더 배양을 계속하였다. 이틀 후 배지를 회수하고, 그 배지 중에 발현하고 있는 변이체 단백질을 anti-FLAG 항체(M2)(SIGMA)에 의하여 웨스턴 블로팅법으로 해석하여 변이체 단백질의 발현을 확인하였다.
[실시예 10] COS세포에 의한 FGF-23 변이체(M2) 재조합체의 일과성 발현
5 ×106개의 COS세포를 400 ㎕의 DMEM(10% FCS) 배지(GIBCO)에 현탁한 후 10㎍의 발현벡터 pCGFM2-F를 가하여 일렉트로포레이션 큐벳 0.4 cm(BIO-RAD)에 옮기고, Gene-pulser(BIO-RAD)를 사용하여 0.26 kv, 저항값 ∞, 960 mF의 조건에서 일렉트로포레이션을 행하였다. 그 후, 30 ml의 DMEM(10% FCS) 배지에 세포용액을 현탁하고, 175 ㎠의 플라스크(FALCON)에 옮겨 CO2인큐베이터(ESPEC)에 37℃로 하루 정치하였다. 다음날, 30 ml의 CHO-S-SFMII 배지(GIBCO)로 배지를 교환하여 3일간 배양하였다. 회수한 배지를 3000 rpm, 15분간 원심하여 세포를 제거하고 그 배지를 anti-FLAG 항체(M2)(SIGMA)에 의하여 웨스턴블로팅법으로 해석하여 재조합체 FGF-23 변이체(M2)-F의 발현을 확인하였다.
[실시예 11] 재조합체 FGF-23(M2)-F의 친화성 칼럼에 의한 정제
anti-FLAG 항체 친화성 칼럼(SIGMA)을 사용하여 재조합체 FGF-23 변이체(M2)-F의 정제를 행하였다. 크로마토그래피 조작은 그라디프락 시스템(Pharmacia)을 사용하였다. 친화성 칼럼을 PBS-T에 의하여 평형화한 후 실시예 10의 재조합체 FGF-23 변이체(M2)-F가 발현되고 있는 조제 배지를 적용하여 글리신 HCl 완충액(pH 3.5)으로 용출을 행하였다. 그리고 메인 피크를 분획하여 SDS-PAGE로 분석한 바, CBB 염색 레벨에서 거의 균일한 목적 분자량 부근의 밴드를 확인하고 재조합체의 조제를 종료하였다(도 5).
[실시예 12] 결실 변이체 동물실험
투여제의 조제는 TransIT In Vivo Gene Delivery System(PanVera사)의 프로토콜에 따랐다. 투여 1마리당 도 6에 나타낸 발현벡터(MOCK는 실시예 7과 동일) 10 ㎍에 10 μL의 TransIT Polymer Solution과 적당량의 멸균수를 가하여 200 μL로 하여 혼합하고, 5분간 실온에 방치한 후 200 μL당 2.8 mL의 1 ×Delivery Solution을 가하고 전량을 3.0 mL로 하여 투여액으로 하였다. 6마리에 투여하는 경우에는 7마리분의 양 21 mL를 조제하였다. 투여액은 조제 당일에 전부 사용하였다.
일본 찰스리버사로부터 구입한 8~9주령의 암컷 CD-1(ICR) 마우스(35-40 g)를 일주일 순화한 후 실험에 사용하였다. 꼬리정맥으로부터 발현벡터를 포함하는 투여제 3 mL를 8초 이내에 전량 투여하였다. 투여 4일 후에 에테르 마취하에서 복부 대정맥으로부터 전혈 채혈하고, 채취한 혈액은 세파라피트 튜브 미니(세키스이 카가쿠 고교)에 넣고 원심(1400 ×g, 10분간, 4℃)하여 혈청을 분리하였다.
혈청 중의 무기인(Pi), 칼슘(Ca), 요소질소(UN), 크레아티닌(CRE)은 자동분석장치(히타치 7170E형)로 측정하였다.
결과를 도 6에 나타낸다.
M2FGF23 변이체는 아미노산 251개로 구성되어 있지만, C 말단 부분을 짧게 해가면 아미노산 200번 위치까지의 dC200 변이체에서도 동등한 혈청 인 저하작용을 가지고 있었다. 그러나 194번 위치까지의 dC194 변이체, 188번 위치까지의 dC188 변이체로 더욱 짧게 하면 작용은 약해져 상실되어 갔다. ADHR 환자에서는 176번 위치 또는 179번 위치의 아미노산에 변이가 들어가면 FGF23이 단백분해에 의한 조절을 받기 어려워져, 결과적으로 과잉 FGF23이 혈중에 존재함으로써 저인혈증이 된다고 추측되고 있다. 따라서 본 실험결과로부터 아미노산 179번 위치~200번 위치의 부분에 혈청 인 저하작용에 중요한 부위가 있다고 생각되었다.
[실시예 13] FGF23의 부갑상선 갑상선 절제 래트에 대한 작용
8주령의 수컷 SD 래트를 갑상선 ·부갑상선 절제(TPTX)하고, 며칠 후 이온화칼슘을 측정하여 수술의 성공여부를 확인한 후에, 대퇴정맥에 카테터를 삽입하여 채뇨하고 볼만 케이지(bollman cage)에 고정하였다.
Harvard Infusion Pump로 PTH(1-34)(0.3 nmol/mL) 또는 C-FLAG 태그 부가 M2FGF23 단백(6 ㎍/mL) 또는 비히클(0.05% Tween 80/Saline)을 1 ml/시간의 속도로 6시간 infusion 투여하였다. infusion 개시 후 4시간째부터 투여종료 6시간째까지 채뇨하고, 투여종료 후 복부 대정맥으로부터 전혈 채혈하였다. 3000 rpm ×10분 원심하여 혈청과 뇨의 불용 획분을 분리하고, 히타치 7170형 자동분석장치로 무기인, 칼슘, 크레아티닌을 측정하였다. 결과를 도 7 내지 도 9에 나타낸다.
도 7로부터 TPTX에 의하여 상승한 래트의 혈청 인농도는 PTH(1-34) 투여로 정상화되었다. 또한 M2FGF23 투여로도 동일하게 정상화되었다. 한편, TPTX에 의하여 저하된 혈청 칼슘농도는 PTH(1-34) 투여로 시정되지만, M2FGF23 투여로는 거의 효과가 없었다(도 8). 이러한 사실로부터, M2FGF23은 PTH를 매개로 하여 혈청 인농도에 작용을 미치고 있을 뿐만 아니라 혈청 칼슘농도에 작용을 보이지 않는 것이 명백해졌다. PTH(1-34)에서는 뇨 중의 무기인/크레아티닌값이 상승하고 있기 때문에 혈청 중의 인은 뇨 중에 배설되었다고 생각되지만, M2FGF23에서는 무기인/크레아티닌값이 변화하고 있지 않기 때문에 혈청 중의 인은 뼈에 히드록시아파타이트로서 되돌아갔을 가능성이 있다(도 9).
본 발명에 의하여 FGF23 단백질 변이체가 제공되었다. 본 발명의 FGF23 변이체는 혈중 인농도를 저하시키는 효과를 가지고 있기 때문에, 고인혈증의 치료 및 예방약이 될 것으로 기대된다. 또한, 본 발명의 FGF23 변이체를 코드하는 DNA는 체내에 도입하여 발현시킴으로써 혈중 인농도를 저하시키기 때문에 고인혈증에 대한 유전자 치료로의 응용이 기대된다.
Claims (11)
- 서열번호: 2에 기재된 아미노산 서열에 있어서, 176번 위치의 아르기닌이 글루타민, 179번 위치의 아르기닌이 글루타민 또는 179번 위치의 아르기닌이 트립토판으로 변이된 아미노산 서열로 된 단백질을 코드하는 DNA.
- 서열번호: 2에 기재된 아미노산 서열에 있어서, 176번 위치의 아르기닌이 글루타민, 179번 위치의 아르기닌이 글루타민 또는 179번 위치의 아르기닌이 트립토판으로 변이된 아미노산 서열로 된 단백질에 있어서의, 적어도 1부터 190번 위치까지 아미노산 서열을 가지는 단편을 코드하는 DNA.
- 제1항 또는 제2항의 DNA가 삽입된 벡터.
- 제1항 또는 제2항의 DNA, 또는 제3항의 벡터를 보유하는 형질전환세포.
- 서열번호: 2에 기재된 아미노산 서열에 있어서, 176번 위치의 아르기닌이 글루타민, 179번 위치의 아르기닌이 글루타민 또는 179번 위치의 아르기닌이 트립토판으로 변이된 아미노산 서열로 된 단백질.
- 서열번호: 2에 기재된 아미노산 서열에 있어서, 176번 위치의 아르기닌이 글루타민, 179번 위치의 아르기닌이 글루타민 또는 179번 위치의 아르기닌이 트립토판으로 변이된 아미노산 서열로 된 단백질에 있어서의, 적어도 1부터 190번 위치까지 아미노산 서열을 가지는 단편.
- 제4항의 형질전환세포를 배양하고, 상기 형질전환세포 또는 그 배양상청으로부터 발현시킨 단백질을 회수하는 공정을 포함하는 제5항 또는 제6항의 단백질의 제조방법.
- 제1항 또는 제2항의 DNA, 제3항의 벡터 또는 제5항 또는 제6항의 단백질을 함유하는, 혈중 인농도를 저하시키기 위한 의약조성물.
- 제8항에 있어서, 혈중 칼슘농도에는 영향을 주지 않는 의약조성물.
- 제8항 또는 제9항에 있어서, 고인혈증 치료를 위한 의약조성물.
- 제1항 또는 제2항의 DNA를 환자에게 투여하는 것을 포함하는 고인혈증을 치료하는 방법.
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