WO2002052009A1 - Mutant de la proteine fgf23 humaine reduisant le taux de phosphore dans le sang - Google Patents

Mutant de la proteine fgf23 humaine reduisant le taux de phosphore dans le sang Download PDF

Info

Publication number
WO2002052009A1
WO2002052009A1 PCT/JP2001/011482 JP0111482W WO02052009A1 WO 2002052009 A1 WO2002052009 A1 WO 2002052009A1 JP 0111482 W JP0111482 W JP 0111482W WO 02052009 A1 WO02052009 A1 WO 02052009A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
mutant
amino acid
arginine
dna
fgf23
Prior art date
Application number
PCT/JP2001/011482
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Hirotaka Itoh
Naoshi Fukushima
Hitoshi Saito
Kenichiro Kusano
Original Assignee
Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha filed Critical Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
Priority to US10/451,942 priority Critical patent/US20040097414A1/en
Priority to EP01271888A priority patent/EP1354949A4/en
Priority to JP2002553490A priority patent/JPWO2002052009A1/ja
Priority to IL15650401A priority patent/IL156504A0/xx
Priority to KR10-2003-7008559A priority patent/KR20030074678A/ko
Priority to CA002433171A priority patent/CA2433171A1/en
Publication of WO2002052009A1 publication Critical patent/WO2002052009A1/ja
Priority to HK04105649A priority patent/HK1062835A1/xx

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0271—Chimeric vertebrates, e.g. comprising exogenous cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/12—Drugs for disorders of the metabolism for electrolyte homeostasis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/50—Fibroblast growth factor [FGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5082—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms
    • G01N33/5088—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms of vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy

Definitions

  • the present invention relates to an FGF23 protein mutant that lowers the phosphorus concentration in blood, and a use of the mutant.
  • FGF23 is a gene cloned by Ito et al. Of Kyoto University and has been confirmed to be expressed in the brain (Yamashita T. et al. (2000) Biochem. Biophys. Res. Commun. 277: 494- 498, WO 01/66596). Further, LU ETHY et al. Cloned the FGF23 gene, created a transgenic mouse expressing the gene, and analyzed the phenotype of the mouse (WO 01/61007).
  • the present invention has been made in view of such circumstances, and it is an object of the present invention to provide a mutant of FGF23 protein that reduces blood phosphorus concentration, a DNA encoding the mutant, and uses thereof. It is in.
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above-mentioned problems, and have attempted to produce a mutant of the FGF23 protein, which is expected to reduce blood phosphorus concentration.
  • the full-length cDNA of the human FGF23 gene was isolated, and then MA encoding the mutant was synthesized by PCR, and cloned into an expression vector.
  • the expression vector was introduced into a mouse by an intravenous administration method, the mutant was expressed in the mouse, and the blood phosphorus concentration in the mouse was measured thereafter. As a result, they found that the expression of the FGF23 mutant significantly reduced the phosphorus concentration in mouse blood.
  • the present inventors succeeded in producing an FGF23 protein mutant and succeeded in reducing the concentration of phosphorus in mouse blood using the mutant, thereby contributing to the present invention. It was completed. Since the FGF23 protein mutant of the present invention has such a capability of lowering the phosphorus concentration in blood, it is expected to be a drug for the treatment of hyperphosphatemia.
  • the present invention relates to an FGF23 protein mutant that reduces blood phosphorus concentration, DNA encoding the mutant, and uses thereof, and more specifically,
  • amino acid sequence at position 176 is arginine
  • the arginine at position 179 is glutamine
  • the amino acid sequence at position 179 is mutated to tributofan.
  • the arginine at position 1-6 is glutamine
  • the arginine at position 179 is glutamine
  • the arginine at position 179 is mutated to tryptophan.
  • [3] A vector into which the DNA of [1] or [2] has been inserted.
  • [4] A transformed cell carrying the DNA of [1] or [2], or the vector of [3].
  • ' [5] In the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, the amino acid sequence at position 176 of arginine is glutamine, the position of arginine at position 179 is glutamine, or the sequence of amino acid at position 179 is arginine mutated to tributofan. protein.
  • the arginine at position 176 is glutamine
  • the arginine at position 179 is glutamine
  • the amino acid sequence at position 179 is mutated to tributophan.
  • the present invention provides a DNA encoding an FGF23 protein variant that reduces blood phosphorus levels.
  • the mutant encoded by the DNA of the present invention includes a mutant in which the arginine residue at position 176 in the amino acid sequence of the human FGF23 protein represented by SEQ ID NO: 2 has been substituted with glutamine, Variant in which the arginine residue at position is substituted with gluminine, and a variant in which arginine at position 179 is substituted with tryptophan (hereinafter referred to as “R176Q variant”, “R179Q variant” and “R179W variant, respectively” , And these are collectively referred to as “FGF variants”).
  • preferred variants are the R176Q variant and the R179Q variant, and the most preferred variant is the M79Q variant.
  • the present invention also provides fragments of these FGF variants. Preferred fragments are those that comprise at least the amino acid sequence of positions 1 to 190 in the FGF variant.
  • the FGF23 mutant of the present invention has a function of reducing blood phosphorus concentration. Therefore, FGF23 mutants are expected to have therapeutic and preventive effects against diseases caused by the presence of high concentrations of phosphorus in the blood. In a preferred embodiment of the FGF23 variant, it does not affect blood calcium levels.
  • Hyperphosphatemia generally to onset as a result of a reduction in the P0 4 excretion from kidney. Advanced renal failure (GFR is less than 20Ramuda / min) results in a decrease in excretion sufficient to guide the elevation of plasma P0 4. Even without renal failure, in the case of PSEUDOHYPOPARATHYROIDISM and hypoparathyroidism is sometimes failure occurs P0 4 excretion of kidney. Hyperphosphatemia may also occur overdose or oral P0 4, sometimes from overuse of an enema containing phosphate. Hyperphosphatemia also sometimes result from movement of the extracellular intracellular P0 4.
  • Hyperphosphatemia also plays a critical role in secondary hyperparathyroidism and the development of renal osteodystrophy in patients on long-term dialysis.
  • the DNA of the present invention is used not only for the production of the mutant of the present invention described below in vivo or in vivo but also for application to gene therapy for diseases caused by high blood phosphorus concentration, for example.
  • Can be The DNA of the present invention may be in any form as long as it can encode the mutant of the present invention. That is, it does not matter whether it is cMA synthesized from mA, genomic DNA, or chemically synthesized DNA.
  • DNAs having any nucleotide sequence based on the degeneracy of the genetic code are included as long as they can encode the mutant of the present invention.
  • the DNA of the present invention can be prepared by modifying human FGF23 cDNA.
  • Human FG F23 cDNA can be prepared by a method known to those skilled in the art. For example, it can be prepared by preparing a cDNA library from cells expressing FGF23, and performing hybridization using a part of the sequence of FGF23 cDNA (SEQ ID NO: 1) as a probe.
  • the cDNA library may be prepared, for example, by the method described in the literature (Sambrook, J. et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)), or using a commercially available DNA library. Is also good.
  • oligo DNA is synthesized based on the FGF23 cDNA sequence (SEQ ID NO: 1), and this is used as a primer. It can also be prepared by performing a PCR reaction and amplifying a cDNA encoding the polypeptide of the present invention.
  • mRNA is isolated from cells, tissues and organs that express FGF23.
  • mRNA can be isolated by known methods, for example, guanidine ultracentrifugation (Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299), and the AGPC method.
  • mA from total RNA using mRNA Purification Kit (Pharmacia). Purify. Alternatively, mMA can be directly prepared by using QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia).
  • CDNA is synthesized from the obtained mRNA using reverse transcriptase. cDNA synthesis, AMV
  • Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit (Shii-Dagaku Kogyo) can be used.
  • a primer prepared based on the sequence shown in SEQ ID NO: 1 a 5-Ampli FINDER RACE Kit (manufactured by Clontech) and a polymerase chain reaction (PCR) were used.
  • PCR polymerase chain reaction
  • a target DNA fragment is prepared from the obtained PCR product and ligated to a vector DNA. Further, a recombinant vector is prepared from this, introduced into E. coli, etc., and colonies are selected to prepare a desired recombinant vector.
  • the base sequence of the target DNA can be confirmed by a known method, for example, a dideoxynucleotide chain-one-minute method.
  • human FGF23 cDNA can be obtained by the method described in Example 1.
  • the modification of the human FGF23 cDNA to produce the FGF23 mutant of the present invention can be performed by a DNA mutation (DNA Mutagenesis) technique generally performed by those skilled in the art. Specifically, for example, it can be performed by the method described in the second embodiment.
  • DNA Mutagenesis DNA Mutagenesis
  • the present invention also provides a mutant encoded by the DNA of the present invention.
  • the mutant of the present invention may differ in amino acid sequence, molecular weight, isoelectric point, presence / absence and form of sugar chains, etc., depending on the cell, host or purification method that produces it, as described below. However, as long as the obtained mutant has the ability to reduce the phosphorus concentration in blood, it is included in the present invention.
  • a prokaryotic cell for example, Escherichia coli
  • a methionine residue is added to the N-terminal of the amino acid sequence of the original mutant, and such a mutant is also included in the present invention. It is.
  • the mutant of the present invention can be prepared as a recombinant polypeptide by a method known to those skilled in the art.
  • MA encoding the mutant of the present invention is inserted into an appropriate expression vector, and the resulting transformant is introduced into an appropriate host cell.
  • Chromatography such as ion exchange, reverse phase, gel filtration, or affinity chromatography in which an antibody against the mutant of the present invention is immobilized on a column, or a combination of a plurality of these columns. It can be purified and prepared.
  • the mutant of the present invention may be used as a fusion polypeptide with glutathione S-transferase protein or as a recombinant polypeptide to which a plurality of histidines are added in host cells (eg, animal cells and E. coli).
  • host cells eg, animal cells and E. coli.
  • the expressed recombinant polypeptide can be purified using a glutathione column or a nickel column. After purification of the fusion polypeptide, if necessary, a region other than the mutant of interest in the fusion polypeptide can be cleaved with thrombin or Factor-I Xa and removed.
  • the present invention also provides a vector into which the DNA of the present invention has been inserted.
  • the vector of the present invention is useful for retaining the DNA of the present invention in a host cell or expressing the mutant of the present invention.
  • the vector when using Escherichia coli as a host, the vector is amplified in Escherichia coli (E. coli, for example, JM109, DH5, XL1 ⁇ XLlBlue), etc. Especially if it has an "ori" to be transformed and further has a transformed E. coli selection gene (for example, a drug (a drug resistance gene that can be identified by ampicillin, tetracycline, kanamycin, chloramphenicol))
  • E. coli selection gene for example, a drug (a drug resistance gene that can be identified by ampicillin, tetracycline, kanamycin, chloramphenicol)
  • vectors include M13-based vectors, pUC-based vectors, pBR322, pBluescript pCR-Script, etc.
  • Examples include pGEM-Ts pDIRECT, pT7, etc.
  • a vector is used for producing the mutant of the present invention, special For example, in the case of expression in Escherichia coli, in addition to having the above-mentioned characteristics such that the vector is amplified in Escherichia coli, a host such as JM109 or DH5 can be used.
  • Such vectors include pGEX-5X-1 (Pharmacia), QIAexpress systemj (Qiagen), pEGFP, or PET (in this case, the host is T7 RNA polymerase) in addition to the vector described above.
  • BL21, which expresses) is preferred.
  • the vector may include a signal sequence for polypeptide secretion.
  • a signal sequence for polypeptide secretion the pelB signal sequence (Lei, SP. Et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379) may be used when produced in periplasm of Escherichia coli.
  • the introduction of the vector into a host cell can be carried out, for example, by using a calcium chloride method or an electroporation method.
  • vectors for producing the mutant of the present invention include mammalian expression vectors (for example, pcDNA3 (manufactured by Invitrogen) and pEG F-BOS (Nucleic Acids. Res. 1990, 18 (17), p5322), pEF ⁇ CDM8), insect cell-derived expression factor (e.g., ⁇ Bac-to-BAC baculovairus expression systemj
  • plant-derived expression vectors eg, ⁇ 1, pMH2
  • animal virus-derived expression vectors eg, pHSV, pMV, pAdexLcw
  • retrovirus-derived expression vectors eg, , PZIPneo
  • yeast-derived expression vectors eg, “Pichia Expression Kit” (manufactured by Invitrogen), pNVll, SP-Q01
  • Bacillus subtilis-derived expression vectors eg, pPL608, pKTH50.
  • a promoter necessary for expression in cells for example, SV40 promoter (Muligan et al., Nature (1979) 277, 108) MMLV-LTR Promoter Yuichi, EFlo: Promo — Yuichi (Mizushima et al., Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322), it is essential to have a CMV promoter, etc. It is more preferable to have a gene for selection of conversion (for example, a drug resistance gene that can be identified by a drug (neomycin, G418, etc.)).
  • a vector with such characteristics Is then, for example, p negation, pDR2, etc. pB -RSV pBK-CMV s pOPRSV, pOP13 , and the like.
  • a vector having a DHFR gene complementing the nucleic acid synthesis pathway-deficient CH0 cell. Eg, pCHOI
  • MTX methotrexate
  • a gene expressing the SV40 T antigen is An example is a method in which COS cells on the chromosome are used to transform with a vector (such as pcD) having an SV40 origin of replication.
  • a vector such as pcD
  • the replication origin those derived from poliovirus, adenovirus, sipapirovirus (BPV) and the like can also be used.
  • the expression vector is selected as a selection marker for amplification of the gene copy number in the host cell system, aminoglycoside transferase (APH) gene, thymidine kinase (TK) gene, Escherichia coli xanthinguanine phosphoribosyltransferase (Ecogp t) gene. And the dihydrofolate reductase (dhfr) gene.
  • APH aminoglycoside transferase
  • TK thymidine kinase
  • dhfr dihydrofolate reductase
  • the DNA of the present invention is incorporated into an appropriate vector, and the DNA is produced by, for example, the retrovirus method, ribosome method, cationic ribosome method, adenovirus method, or the like.
  • the vector used include, but are not limited to, an adenovirus vector (for example, pAdexlcw) and a retrovirus vector (for example, pZIPneo).
  • General genetic manipulations such as insertion of the DNA of the present invention into a vector can be performed according to a conventional method (Molecular Cloning, 5.61-5.63).
  • Administration into a living body may be performed by the ex J> O method or the in Wra method.
  • the present invention also provides a host cell into which the vector of the present invention has been introduced.
  • the host cell into which the vector of the present invention is introduced is not particularly limited. Various animal cells can be used.
  • the host cell of the present invention can be used, for example, as a production system for producing or expressing the mutant of the present invention. Production systems for the manufacture of the onset bright variants, the production systems of c in Wira which there are the production systems in iro and in vivo, production systems that use and the production system prokaryotic cells using eukaryotic cells Is mentioned.
  • animal cells for example, animal cells, plant cells, and fungal cells can be used as hosts.
  • animal cells mammalian cells, for example, CHO (J. Exp. Med. (1995) 108, 945), C0S, 3T3, myeloma, BHK (baby hamster kidney), HeLa, Vero amphibian cells, for example, African Megafrog Oocytes (Valle, et al . : Nature (1981) 291, 358-340) or insect cells such as Sf9, Sf21 and Tn5 are known.
  • Examples of the CH0 cells include dhfr-CHO (Proc. Natl. Acad. Sci.
  • the vector can be introduced into a host cell by, for example, a calcium phosphate method, a DEAE dextran method, a method using Cationic Ribosome D0TAP (manufactured by Behringer Mannheim), an electro-boration method, or a lipofection method. Is possible.
  • Nicotiana tabacum icotiana tabacum
  • a polypeptide production system which may be callus cultured.
  • Fungal cells include yeast, for example, Saccharomyces genus, such as Saccharomyces cerevisiae, filamentous fungi, such as Aspergillus, such as Aspergillus, for example, Aspergillus
  • ⁇ Aspergillus niger is known.
  • prokaryotic cells there are production systems using bacterial cells.
  • bacterial cells include Escherichia coli (. Coli), for example, JM109, DH5, HB101, and the like, and Bacillus subtilis.
  • the polypeptide is obtained by transforming these cells with the desired DNA and culturing the transformed cells in vitro.
  • Culture can be performed according to a known method. For example, as a culture solution of animal cells, for example, DMEM, MEM, RPMI 160 IMDM can be used. At that time, a serum replacement solution such as fetal calf serum (FCS) can be used together, or serum-free culture may be performed.
  • FCS fetal calf serum
  • the pH during the culturing is preferably about 6-8. Culture is usually performed at about 30 to 40 ° C for about 15 to 200 hours, and the medium is replaced, aerated, and agitated as necessary.
  • examples of a system for producing a polypeptide in in F include a production system using animals and a production system using plants.
  • a DNA encoding the mutant of the present invention is introduced into these animals or plants, and the mutant is produced in the animal or plant and collected.
  • the term "host" in the present invention includes a production system using mammals and insects when using c animals including these animals and plants. As mammals, goats, bushes, ovines, mice and mice can be used (Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993). When a mammal is used, a transgenic animal can be used.
  • DNA encoding the mutant of the present invention is prepared as a fusion gene with a gene encoding a polypeptide uniquely produced in milk, such as goat casein.
  • the DNA fragment containing the fusion gene is injected into a goat embryo, and the embryo is transplanted into a female goat.
  • the mutant of the present invention can be obtained from milk produced by a transgenic goat born from a goat that has received an embryo or a descendant thereof.
  • Hormones may optionally be used in transgenic goats to increase the amount of milk containing polypeptides produced by transgenic goats (Ebert, KM et a 1., Bio / Technology (1994) 12, 699). -702).
  • silkworms can be used as insects, for example.
  • the mutant in the case of using a silkworm, can be obtained from the body fluid of the silkworm by infecting the silkworm with a baculovirus into which the DNA encoding the mutant of the present invention has been inserted (Sus picture, M. et al. 5 Nature (1985) 315, 592-594).
  • tobacco when using a plant, for example, tobacco can be used.
  • the DNA encoding the mutant of the present invention is introduced into a vector for plant expression, for example, pM0N530, and the vector is introduced into a bacterium such as Agrobacterium tumefaciens. I do.
  • This bacterium is infected to tobacco, for example, Nicotiana tabacum, and the mutant of the present invention can be obtained from the leaves of this tobacco (Julian K. -C. Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131-138).
  • the thus obtained mutant of the present invention can be isolated from the inside or outside of a host cell (such as a medium) and purified as a substantially pure and uniform polypeptide.
  • the separation and purification of the polypeptide may be carried out by any of the separation and purification methods used in ordinary polypeptide purification, and is not limited at all. For example, chromatographic column, filtration, ultrafiltration, salting out, solvent precipitation, solvent extraction, distillation, immunoprecipitation, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, isoelectric focusing, dialysis, recrystallization, etc.
  • the polypeptides can be separated and purified by appropriate selection and combination.
  • chromatography include affinity chromatography, ion-exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration, and reverse-phase chromatography.
  • Oral chromatography, adsorption chromatography, and the like (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual-Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996).
  • These chromatographys can be performed using liquid phase chromatography, for example, liquid phase chromatography such as HPLC and FPLC.
  • the present invention also encompasses highly purified variants using these purification methods.
  • the mutant of the present invention can be arbitrarily modified or partially removed by reacting the mutant with an appropriate protein modifying enzyme before or after purification.
  • protein modifying enzyme include trypsin. Chymotrypsin, lysyl endopeptidase, protein kinase, glucosidase and the like are used.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for lowering blood phosphorus concentration, comprising a mutant of the present invention, DNA encoding the mutant, or a vector into which the DNA has been inserted.
  • the mutant of the present invention is used as a medicament for humans and other animals, for example, mice, rats, guinea pigs, rabbits, egrets, chickens, cats, dogs, sheep, bush dogs, monkeys, monkeys, baboons and chimpanzees
  • mice rats, guinea pigs, rabbits, egrets, chickens, cats, dogs, sheep, bush dogs, monkeys, monkeys, baboons and chimpanzees
  • administration in addition to directly administering the mutant itself to a patient, it is also possible to perform administration as a pharmaceutical composition formulated by a known pharmaceutical method.
  • pharmacologically acceptable carriers or vehicles specifically, sterile water or saline, vegetable oils, emulsifiers, suspending agents, surfactants, stabilizers, flavoring agents, excipients, vehicles, preservatives It is possible to formulate a formulation by appropriately combining it with a drug, a binder and the like, and mixing it in a unit dosage form required for generally accepted pharmaceutical practice.
  • the amount of the active ingredient in these preparations is such that an appropriate dose in the specified range can be obtained.
  • Additives that can be incorporated into tablets and capsules include, for example, binders such as gelatin, corn starch, tragacanth gum, acacia, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, and alginic acid. Swelling agents, lubricants such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, and flavoring agents such as peppermint, cocoa oil or tea are used. In addition to the above materials, a liquid like oil and fat A carrier can be included. Sterile compositions for injection can be formulated according to normal pharmaceutical practice using a vehicle such as distilled water for injection.
  • Aqueous injection solutions include, for example, saline, isotonic solutions containing glucose and other adjuvants, such as D-sorbitol, D-mannose, D-mannitol, sodium chloride, and suitable solubilizing agents.
  • suitable solubilizing agents such as alcohols, specifically ethanol, polyalcohols such as propylene glycol, polyethylene glycol, nonionic surfactants such as polysorbate one DOO 80 TM, as good c oily liquid be used in combination with HC0-50 Sesame oil and soybean oil may be mentioned, and may be used in combination with benzyl benzoate or benzyl alcohol as a solubilizing agent.
  • a buffer for example, a phosphate buffer, a sodium acetate buffer, a soothing agent, for example, proforce hydrochloride, a stabilizer, for example, benzyl alcohol, phenol, or an antioxidant.
  • a buffer for example, a phosphate buffer, a sodium acetate buffer
  • a soothing agent for example, proforce hydrochloride
  • a stabilizer for example, benzyl alcohol, phenol, or an antioxidant.
  • the prepared injection solution is usually filled into an appropriate ampoule.
  • Administration to patients can be performed, for example, by intraarterial injection, intravenous injection, subcutaneous injection, etc., or intranasally, transbronchially, intramuscularly, transdermally, or orally by a method known to those skilled in the art. It can do better.
  • the dose varies depending on the weight and age of the patient, the administration method, and the like, but those skilled in the art can appropriately select an appropriate dose.
  • the dosage of the mutant of the present invention may vary depending on the administration target, the target organ, the symptoms and the administration method.
  • the usual dosage for an adult is 1 day. It is considered to be about 100 zg to 20 mg per.
  • the single dose varies depending on the subject of administration, target organ, symptoms and administration method.
  • injection usually in adults (with a body weight of 60 kg)
  • the dose can be administered in terms of the amount converted per 60 kg body weight or the amount converted per body surface area.
  • the DNA of the present invention is incorporated into a vector that guarantees its expression in a living body, for example, a retrovirus method, a ribosome method, and a cationic ribosome. It may be introduced into a living body by a method such as the adenovirus method. This makes it possible to carry out gene therapy for diseases caused by high blood phosphorus levels. For in vivo administration, the vivo method or the invi method can be used. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
  • FIG. 1 is a graph showing the effect of the FG23 mutant on the concentration of inorganic phosphorus in serum. Inorganic phosphorus in serum was measured for 4 days after introduction of the DNA vector. The overnight shows the average soil SEM. The numbers in the columns represent the number of animals. * P ⁇ 0.05 vs. MOCK control (unpaired t-test).
  • FIG. 2 is a graph showing the effect of FGF23 on the concentration of inorganic phosphorus in serum. Inorganic phosphorus in the serum was measured for 4 days after the introduction of the DNA vector. The night shows SEM. The numbers in the columns represent the number of animals. * P ⁇ 0.05 vs. MOCK control (unpaired t-test).
  • FIG. 5 is a photograph showing the result of SDS-PAGE analysis (CBB staining) of FGF-23 (mutant) M2-F.
  • M in the figure represents a molecular weight marker (BIO0-RAD, broad range).
  • FIG. 6 is a graph showing the serum phosphorus concentration lowering effect of the C2 terminal-deleted M2FGF23 mutant.
  • M0CK represents a mouse into which the parent vector pCAGGS has been introduced.
  • Normal indicates a normal mouse.
  • FIG. 1 is a graph showing the effect of PTH (1-34) and M2FGF23 on lowering serum phosphorus in TPTX rats.
  • FIG. 8 is a graph showing the effects of PTH (group 34) and M2FGF23 on TPTX rat serum calcium.
  • FIG. 9 is a graph showing the effects of PTH (1-34) and M2FGF23 on renal phosphorus excretion in TPTX rats.
  • PCR reaction 0.25 zl QIAGEN Taq DNA polymerase, 5.01 5x Q-solution, 0.5 ⁇ 1 Specific Forward PCR primer (50 ⁇ M, SEQ ID NO: 3), 0.5 ⁇ 1 Specific Reverse A PCR reaction was carried out using a thermal cycler ABI2400 under the following conditions with the addition of PCR primer (50 M, SEQ ID NO: 4) and 15-1 DDW to make a total amount of 25/1. Primary denaturation was performed at 95 ° C for 2 minutes, followed by 35 cycles of a 2-step shuttle PCR (40 seconds at 94 ° C, 1 minute at 60 ° C), and a final extension reaction at 72 ° C for 7 minutes. The PCR reaction was terminated.
  • T0P0 TA Cloning Kit (Invitorogen Cat. No. 45000-01)
  • Subcloning into the TA vector pCR2.1 was performed using the PCR reaction solution of 2 ⁇ 1. The operation was performed according to the protocol attached to the kit.
  • the nucleotide sequence analysis of TA cloned clone # 3 was analyzed using M13 M4 primer (TaKaRa Cat. No. 3832A), M13 RV primer (TaKaRa Cat. No. 3830A), and the primer described in SEQ ID NO: 5.
  • FGF-23 mutants R176Q (Ml), R179Q (M2), R179W (M3), R176Q + R179Q (M4), and R176Q + R179 (M5) were prepared using human FGF-23 as type II. According to the literature (Autosomal dominant hypophosphataemic rickets is associated with mutat ions in FGF23 Nature Genetics Vol. 26 p345-348.November 2000) from human 23.527G A (R176Q), 536G A (R179Q) ⁇ 535C ⁇ T (R179W) Types and their combinations M4 (R176Q + R179Q) and M5 (R176Q + R179W) were produced. Primer One synthesis was outsourced to a technology company. The nucleotide sequences of the primers used are as follows.
  • Mutagenesis generates partial fragments for mutagenesis in the 1st PCR, generates a type II full-length mutant containing the mutation by the 2nd PCR, and finally completes the mutation by the 3rd PCR This was done in a three-step process of getting a body. That is, 0.2 ⁇ 1 human FGF-23 clone # 3 (40 ng / ⁇ l), 5/1 TaKaR A EX lOxPCR buffer, dNTP mix (50 zM) ⁇ 0.51 TaKaRa EX Taq
  • a 2nd PCR reaction (to produce the full-length mutant type II) was performed.
  • 0.1 / 1 human FGF-23 clone # 3 (40 ng /// l)
  • 2.5 ⁇ 1 TaKaRa EX lOxPCR buffer (40 ng /// l)
  • 2 i1 dNTP mix (50 / M) 0.25 zl TaKaRa EX Taq DNA polymerase, as early as 1 8.
  • 15 l of DDW was added to make a total volume of 24 l, and a 2nd PCR reaction was performed using a thermal cycler ABI2400 under the following conditions.
  • the primary denaturation was performed at 95 ° C for 2 minutes, followed by 5 cycles of 3-step cycle PCR (94 ° C for 1 minute, 60 ° C for 1 minute, and 72 ° C for 1 minute), and the 2nd PCR was terminated. Subsequently, 0.5 ⁇ 1 Specific Forward PCR primer (50 ⁇ M, SEQ ID NO: 3) and 0.5 ⁇ 1 Specific Reverse PCR primer (50 ⁇ M, SEQ ID NO: 4) were added to the reaction solution, and the total amount was 25 ⁇ . As 1, a 3rd PCR reaction was carried out with a thermal cycler ABI2400 under the following conditions.
  • FGF-23 and various mutants were inserted into pCAGGS3 to prepare expression vectors for each clone. That is, cut Ri by the restriction enzyme EcoRI each clone, resulting EcoRI fragment QIAquick Gel Extraction kit (QIA GEN Inc. Cat. No. 28704) to afford, c each vector ⁇ the EcoRI cut pCAGGS3 Were named pCGF23, pCGFMl-5.
  • the plasmid was purified by a method to which endotoxin removal treatment was added. Specifically, Endofree plasmid Maxi Using a kit (QIAGEN Cat. No. 12362), endotoxin-free plasmid purification of pCGF23 and pCGFMl-5 was performed according to the attached protocol.
  • PCGF23 and PCGFM2 as the type III primers described in SEQ ID NO: 12 containing the sequence described in SEQ ID NO: 3 and the FLAG sequence
  • a mutant containing the FLAG sequence at the C-terminus was prepared.
  • PCGF23 and pCGFM2 (30 ng // l), 2.5 il TaKaRa EX lOxPCR buffer, dNTP mix (50 zM), 0.25 1 TaKaR a EX Taq DNA polymerase, 0.51 Specific Forward PCR primer (50 M ⁇ sequence) No .: 11 1), 0.5 il Specific Reverse PCR primer (50 ⁇ M, 5 ggAT CCgAATTCATATgTCACTTATCgTCgTCATCCTTgTAATCgATGAACTTggCgAAgg-3 '/ sequence number: 12), and 18.5 / 1 DDW Under the conditions, the PCR reaction was performed with a thermal cycler ABI2400.
  • the FGF23 expression vector with N-terminal FLAG-tag was constructed as follows using the PCR method. 3ng of pCG23 as a template, each of which is a lOOpmol of Specific Forward PCR primer and 23N FLAG R (GCCCTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCGGCTCTGAGGACGCTC / SEQ ID NO: 13) or ZSRKGGCTCGAGTCAGATGAACTTGGCGMGGZ SEQ ID NO: 14) and 23N FLAG FGGTCGATCGATCGATC No .: 15) as a set of primers, using Takara Ex Taq and its attached buffer, the first-stage PCR reaction (96 ° C for 15 seconds, 55 ° C for 15 seconds, 72 ° C for 2 minutes, 25 cycles) ) was done.
  • the PCR reaction product is applied to Millipore Microcon 30 to remove the primers.
  • the mixture of the PCR reaction products is used as a template, and FGF F and 23R1 are used as a primer set.
  • a second-stage PCR reaction was performed under the same conditions as described above. After completion of the reaction, the PCR reaction product is purified by agarose gel electrophoresis, this fragment is cloned using the T0P0 cloning kit (manufactured by Invitrogen), and the DNA sequence is read to confirm that the desired mutation has been introduced. It was confirmed that unnecessary mutations were not introduced.
  • the plasmid whose sequence was confirmed was prepared, digested with Eco RI, the fragment was recovered, and incorporated into pCAGGS3 which had been cut with Eco RI in advance. After confirming the orientation, the expression vector was finally named PCGF23NF.
  • An FGF23M2 tag with an N-terminal FLAG-tag was prepared in the same manner as described above, except that PCGFM2 was used as the template for the first-stage PCR, and named pCGFM2NF.
  • the naked DNA injection method was used to examine whether FGF23 and its variants directly or indirectly affect phosphorus metabolism in adult mice.
  • the materials used are as follows.
  • the dosage form was a solution, and the preparation method followed the protocol of TranslT In Vivo Gene Delivery System (Pan Vera) (TranslT® In Vivo Gene Delivery System (Pan Vera) standard protocol).
  • One MOCK vector or FGF23 expression vector or FGF23 mutant expression vector was used at a rate of 10 / g per animal.
  • 10 L of TranslT Polymer Solution and an appropriate amount of sterile water were added to make 200 L, and mixed in a 50 mL Falcon tube. After standing at room temperature for 5 minutes, 2.8 mL of 1X Delivery Solution was added to 200 ZL described above to make the total amount 3.0 OmL, and the solution was used as the administration solution.
  • a volume of 21 mL was prepared for 7 animals. The administration solution was used up on the day of preparation.
  • the animals used and breeding conditions are as follows.
  • CE-2 (CLEA Japan) is freely available
  • the administration route was intravenous, the dose was 3 ml, and the whole volume was administered within 8 seconds.
  • mice On day 3 after administration, the mice were placed in a metabolic cage made of glass (METABOLICA, Motogi Sugiyama), and accumulated urine was collected for 24 hours until day 4. Urine was stored in a freezer at a set temperature of -20 ° C until used for measurement.
  • METABOLICA Motogi Sugiyama
  • Serum or urine inorganic phosphorus (Pi), calcium (Ca), urea nitrogen (UN), and creatinine (CRE) were measured by an automatic analyzer (Hitachi 7-70 type).
  • Serum 25-hydroxyvitamin D and 24,25-dihydroxyvitamin D were measured by the CPBA method, and 1 ⁇ , 25-dihidroxyvitamin D was measured by the RIA2 antibody method.
  • the brush border membrane vesicles were purified by the magnesium precipitation method. That is, the collected kidney was caloried with ice-cold MET Buffer (60 mM mannitol, ImM EGTA, 2.5 mM Tris / HCl, pH 7.1), homogenized with a Hiscotron at 18,000 rpm for 1 minute, and 1/10 volume of 1 M MgCl 2 was added, stirred, and left on ice for 15 minutes. After removing the non-crushed fraction by low-speed centrifugation (2,000 X g, 15 minutes, 4 ° C), the supernatant was centrifuged at high speed (24,000 X g, 30 minutes, 4 ° C) to obtain a precipitate.
  • MET Buffer 60 mM mannitol, ImM EGTA, 2.5 mM Tris / HCl, pH 7.1
  • Hiscotron 18,000 rpm for 1 minute
  • 1/10 volume of 1 M MgCl 2 was added, stirred,
  • MET Buffer was added to the precipitate, and the mixture was further ground with a Teflon homogenizer (10,000 rpm, 10 strokes). Again, add 1/10 volume of 1M MgCl 2 and stir, ice for 15 minutes After the middle, low speed centrifugation (2,000 X g, 15 minutes, 4 ° C), and the supernatant were centrifuged at high speed (24,000 X g, 30 minutes, 4 ° C).
  • Transport Buffer-K (lOOmM mannitol, 20mM
  • HEPES Tris, pH 7.4 was added, and the suction and discharge were repeated with a plastic syringe (needle 20G and 27G) to obtain brush border membrane vesicles.
  • the reaction solution was immediately suction-filtered through a two-mouthed cellulose membrane (pore diameter: 0.45 / m, diameter: 2.5 cm), and the nitrocellulose membrane was washed with 5 mL of a reaction stop solution.
  • the radioactivity captured on the membrane was measured using a liquid scintillation counter TRI-CARB 2700TR (Beckman Co., Ltd.) to determine the total phosphorus transport activity.
  • the sodium-independent phosphorus transport activity was measured by changing 125 mM NaCl in the reaction solution to 125 mM KC1.
  • Sodium-dependent phosphorus transport activity was calculated from the difference between total phosphorus transport activity and sodium-independent phosphorus transport activity.
  • the amount of protein in brush-border membrane vesicles was measured using BCA Protein Assay Reagent (PIERCE), and the amount of phosphorus taken up per unit of protein per minute was measured.
  • PIERCE BCA Protein Assay Reagent
  • the sodium-dependent phosphorus transporter (Na / Pi) activity in the kidney was significantly lower in the FGF23-M2 administration group than in the MOCK administration group.
  • no change was observed in sodium-independent phosphorus transport activity.
  • the C2 terminal-deleted M2FGF23 mutant expression vector was constructed as follows using the PCR method. 3ng PCGFM2NF as template, each lOOpmol Specific Forward PCR primer and dC188 (GGCTCGAGTCAGTCCCGCTCCGAGTC / SEQ ID NO: 16), dC194 (GGCTCGAGTCACTTCAGCACGTTCAGGGG / SEQ ID NO: 17),
  • PCR reaction (96 ° C 15 seconds, 55 ° C 15 seconds, 72 ° C 2 minutes, 25 cycles) was performed using Takara Ex Taq and the buffer attached to it. Was. After completion of the reaction, the PCR reaction product is purified by agarose gel electrophoresis, the fragment is cloned using a T0P0 Cloning Kit (manufactured by Invitrogen), and the DNA sequence is read to find the desired mutation. It was confirmed that they had been introduced and that unnecessary mutations had not been introduced.
  • the plasmids confirmed in three rows of roosters were prepared, cut with Eco RI, and the fragments were collected and incorporated into pCAG GS3 that had been cut with Eco RI in advance.
  • These expression vectors are pC (MC188 (dC188), pCGdC194 (dC194), pCGdC200 (dC200), pCGdC210 (dC210), pCGdC217 (dC217), pCGdC223 (dC223), pCGdC240 (dC240), pCGdC245 (dC245), respectively. It was named.
  • COS cells After 1 ⁇ 10 5 COS cells were suspended in 1 ml of DMEM (10% FCS) medium (GIBC0), they were spread on a 6-well plate. After overnight culture, l ⁇ g expression vector (pCMcl88 to pCGdc245 shown in Example 8) was introduced into the cells using 3 ⁇ L of FuGene (manufactured by Behringa Co., Ltd.). Cultured. The next day, the medium was replaced with CH0-S-SFMII, and the culture was continued for another 2 days. Two days later, the medium was collected, and the mutant expressed in the medium was found. The protein was analyzed by Western blotting using anti-FLAG antibody (M2) (SIGMA), and the expression of the mutant protein was confirmed.
  • M2 anti-FLAG antibody
  • the sample was transferred to 0.4 cm (BIO-RAD) and electroporated using a Gene-pulser (BIO-RAD) under the conditions of 0.26 kv, a resistance value of ⁇ , and 960 mF. Then, 30 ml of DMEM (10% FCS) were suspended cell solution into the medium, 175 cm 2 was transferred to a flask (FALCON), C0 2 I matter Bae Isseki one (ESPEC) to 37 ° C for a day at static locations did. The next day, the medium was replaced with 30 ml of CH0-S-SMI I medium (GIBC0), and the cells were cultured for 3 days. The collected medium was centrifuged at 3000 rpm for 15 minutes to remove the cells, and the medium was analyzed by anti-FLAG antibody (M2) (SIGMA) by Western blotting.
  • M2 anti-FLAG antibody
  • Example 11 Purification of recombinant FGF-23 (M2) -F by affinity column Recombinant FGF-23 variant (M2)-using anti-FLAG antibody affinity column (SIGMA) F was purified. The chromatographic operation was performed using a Gradi-Frac system (Pharmacia). After equilibrating the affinity column with PBS-T, apply the prepared medium expressing the recombinant mutant (M2) -F of Example 10 and elute with glycine HC1 buffer (pH 3.5) Was done. Then, the main peak was fractionated and analyzed by SDS-PAGE. As a result, a band near the target molecular weight, which was almost uniform at the CBB staining level, was confirmed, and the preparation of the recombinant was completed (FIG. 5).
  • Example 12 Deletion mutant animal experiment Preparation of the administration agent followed the protocol of Trans IT In Vivo Gene Delivery System (PanVera). Expression vector shown in Fig. 6 per animal (MOCK is the same as in Example 7) Add 10 ⁇ L of TransIT Polymer Solution and an appropriate amount of sterile water to 10 ig, mix to 200 / L, and mix at room temperature for 5 minutes. After standing, 2.8 mL of 1X Delivery Solution was added to make the total volume 3.0 mL, and the solution was used. When administered to 6 animals, a volume of 21 mL was prepared for 7 animals. The administration solution was used up on the day of preparation.
  • mice 8- to 9-week-old female CD-1 (ICR) mice (35-40 g) purchased from Charles River Japan Co., Ltd. were acclimated for 1 week and then subjected to experiments. A total of 3 mL of the drug containing the expression vector was administered from the tail vein within 8 seconds. Four days after administration, whole blood was collected from the abdominal vena cava under ether anesthesia, and the collected blood was placed in Separapit Tube Mini (Sekisui Chemical Co., Ltd.) and eccentric (1400 xg, 10 minutes, 4 ° C), and serum was separated. did.
  • Serum inorganic phosphorus (Pi), calcium (Ca), urea nitrogen (UN), and creatinine (CRE) were measured by an automatic analyzer (Hitachi 7170E).
  • Fig. 6 shows the results.
  • the M2FGF23 mutant is composed of 251 amino acids, but the dC200 mutant up to amino acid 200 had the same serum phosphorus lowering effect when the C-terminal part was shortened. However, when the dC194 mutant up to position 194 and the dC188 mutant up to position 188 were further shortened, the effect weakened and was lost. Mutations in the amino acids at positions 176 and 179 in ADHR patients render FGF23 unregulated by evening degradation, resulting in hypophosphatemia due to the presence of excess FGF23 in the blood. Has been guessed. Therefore, from the results of this experiment, it is considered that there is a site important at the amino acid positions 179 to 200 for serum phosphorus lowering.
  • Example 13 Effect of FGF23 on parathyroid thyroidectomized rats Thyroid and parathyroidectomy (TPTX) of 8-week-old male SD rats, a few days later, measure ionized calcium, confirm the success of surgery, insert a catheter into femoral vein, urine sack and place in Ballman cage Fixed.
  • TPTX parathyroid thyroidectomized rats
  • the serum phosphorus concentration of the rats increased by TPTX was normalized by the administration of PTH (34). Normalization was similarly achieved by administration of M2FCT23.
  • the serum calcium concentration decreased by TPTX was corrected by the administration of PTH (34)
  • administration of M2FGF23 had almost no effect (Fig. 8). This revealed that M2FGF23 did not affect serum phosphorus concentration via PTH, but had no effect on serum calcium concentration.
  • an FGF23 protein mutant is provided. Since the FGF23 mutant of the present invention has an effect of lowering the phosphorus concentration in blood, it is expected to be a therapeutic and preventive agent for hyperphosphatemia.
  • DNA encoding the FGF23 mutant of the present invention can be expected to be applied to gene therapy for hyperphosphatemia because it reduces blood phosphorus concentration by being introduced and expressed in the body. You.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)

Description

明細書 血中リン濃度を低下させるヒ卜 FGF23夕ンパク質変異体 技術分野
本発明は、 血中のリン濃度を低下させる FGF23タンパク質変異体、 並ぴに該 変異体の用途に関する。 背景技術
FGF23は、 京都大学の伊藤らによってクローニングされた遺伝子であり、 脳で 発現されていることが確認されている （Yamashita T. et al . (2000 ) Biochem. Biophys . Res . Commun. 277 : 494-498、 国際公開 01/66596号公報）。 また、 LU ETHYらは、 FGF23遺伝子をクローニングし、 該遺伝子を発現するトランスジェ ニックマウスの作出を行い、 該マウスの表現型を解析している （国際公開 01/61 007号公報） 。
一方、 先天的低リン血症であるクル病患者の遺伝的家系解析により FGF23の 突然変異（R176Q、 R179Q、 R179W)が原因であるという報告がなされた（The ADIffi Consortium ( 2000 ) Nat. Genet. 26 : 345-348 )0
しかしながら、 この報告においては、 タンパク質または全長 cDNAを取得した との記載はなく、 また、 FGF23遺伝子に見られる上記の変異と低リン血症との因 果関係も明らかになっていない。 発明の開示
本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、 その目的は血中のリン 濃度を低下させる FGF23夕ンパク質の変異体および該変異体をコードする DNA、 並びにそれらの用途を提供することにある。 本発明者らは、 上記課題を解決すべく鋭意研究を行い、 血中のリン濃度を低下 させることが期待される FGF23タンパク質の変異体の作製を試みた。 まず、 ヒ ト FGF23遺伝子の全長 cDNAの単離を行い、 次いで、 PCR法により該変異体をコ —ドする MAを合成し、 発現ベクターへクロ一ニングした。 該発現ベクターを 静脈内投与法によりマウス体内へ導入し、 マウス体内で該変異体を発現させ、 そ の後のマウスにおける血中リン濃度を測定した。 その結果、 FGF23変異体の発現 により、 マウス血中のリン濃度が有意に低下することを見出した。
即ち、 本発明者らは、 FGF23タンパク質変異体を作製することに成功するとと もに、 該変異体を利用してマウス血中のリン濃度を低下させることに成功し、 こ れにより本発明を完成するに至った。 本発明の FGF23タンパク質変異体は、 こ のように血中のリン濃度を低下させる能力を有することから、 高リン血症の治療 のための薬剤となるものと大いに期待される。
本発明は、 血中のリン濃度を低下させる FGF23夕ンパク質変異体、 および該 変異体をコードする DNA、 並びにそれらの用途に関し、 より具体的には、
〔 1〕 配列番号： 2に記載アミノ酸配列において、 1 7 6位のアルギニンがグ ル夕ミン、 1 7 9位のアルギニンがグルタミン、 または 1 7 9位のアルギニンが トリブトフアンに変異したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする DNA。
〔2〕 配列番号： 2に記載アミノ酸配列において、 1 Ί 6位のアルギニンがグル 夕ミン、 1 7 9位のアルギニンがグル夕ミン、 または 1 7 9位のアルギニンがト リブトファンに変異したアミノ酸配列からなるタンパク質における、 少なくとも 1から 1 9 0位までのアミノ酸配列を有する断片をコードする DNA。
〔3〕 〔1〕 または 〔2〕 に記載の DNAが挿入されたベクター。
〔4〕 〔1〕 若しくは 〔2〕 に記載の DNA、 または 〔3〕 に記載のベクターを 保持する形質転換細胞。 ' 〔5〕 配列番号： 2に記載アミノ酸配列において、 1 7 6位のアルギニンがグ ル夕ミン、 1 7 9位のアルギニンがグルタミン、 または 1 7 9位のアルギニンが トリブトファンに変異したアミノ酸配列からなるタンパク質。
〔6〕 配列番号： 2に記載アミノ酸配列において、 1 7 6位のアルギニンがグ ル夕ミン、 1 7 9位のアルギニンがグルタミン、 または 1 7 9位のアルギニンが トリブトファンに変異したアミノ酸配列からなるタンパク質における、 少なくと も 1から 1 9 0位までのアミノ酸配列を有する断片。
〔7〕 〔4〕 に記載の形質転換細胞を培養し、 該形質転換細胞またはその培養 上清から発現させたタンパク質を回収する工程を含む、 〔5〕 または 〔6〕 に記 載のタンパク質の製造方法。
〔8〕 〔1〕 もしくは 〔2〕 に記載の MA、 〔3〕 に記載のベクタ一、 または 〔5〕 もしくは 〔6〕 に記載のタンパク質を含有する、 血中リン濃度を低下させ るための医薬組成物。
〔9〕 血中カルシウム濃度には影響を与えない、 〔8〕 に記載の医薬組成物。 〔 1 0〕 高リン血症の治療のための 〔8〕 または 〔9〕 に記載の医薬組成物。 〔1 1〕 〔 1〕 または 〔2〕 に記載の DNAを患者へ投与することを含む高リン 血症を治療する方法、 を提供するものである。
本発明は、 血中リン濃度を低下させる FGF23タンパク質変異体をコードする D NAを提供する。 本発明の DNAによりコードされる変異体には、 配列番号： 2に 記載のヒト FGF23タンパク質のアミノ酸配列において、 1 7 6位のアルギニン 残基がグル夕ミンへ置換された変異体、 1 7 9位のアルギニン残基がグル夕ミン へ置換された変異体、 および 1 7 9位のアルギニンがトリプトファンへ置換され た変異体 （以下、 それぞれ 「R176Q変異体」 、 「R179Q変異体」 、 「R179W変異 体」 と称し、 これらをまとめて 「FGF変異体」 と称する） が含まれる。 これら変 異体において、 好ましい変異体は R176Q変異体および R179Q変異体であり、 最 も好ましい変異体は、 M79Q変異体である。 本発明は、 また、 これら FGF変異体の断片を提供する。 好ましい断片は、 FGF 変異体における、 少なくとも 1から 190位のアミノ酸配列を含む断片である。 本発明の FGF23変異体は、 血中のリン濃度を低下させる機能を有する。 従つ て、 FGF23変異体は、 血中における高濃度のリンの存在によって引き起こされる 疾患に対して、 治療および予防の効果を奏することが期待される。 FGF23変異体 の好ましい態様においては、 血中カルシウム濃度には影響を与えない。
治療または予防効果が期待される疾患としては、 例えば、 高リン血症を挙げる ことができる。 高リン血症は、 一般的に腎からの P04排泄の減少の結果として発 症する。 進行した腎不全（GFRが 20Λ/分未満）は、 血漿 P04の上昇を導くに足る 排泄の減少をもたらす。 腎不全がなくとも、 偽性副甲状腺機能低下症や副甲状腺 機能低下症の場合には、 腎の P04排泄に障害が起こることがある。 高リン血症は 経口 P04の過剰投与や、 ときにはリン酸塩を含有する浣腸の使いすぎからも発生 することがある。 高リン血症はまた、 細胞内 P04の細胞外への移動の結果生じる こともある。 これが頻繁に起こるのは、 糖尿病ケトアシドーシス （全身の P04喪 失にも関わらず） や、 挫傷、 非外傷性横紋筋融解症、 それから全身性の感染症お よび腫瘍溶解症候群である。 高リン血症は、 二次性副甲状腺機能亢進症や、 長期 間透析を受けている患者の腎性骨ジストロフィの発症にも決定的な役割を演じて いる。
本発明の DNAは、 後述する本発明の変異体の //? vivoや in iiroにおける生 産に利用される他、 例えば、 高血中リン濃度に起因する疾患の遺伝子治療などへ の応用も考えられる。 本発明の DNAは、 本発明の変異体をコードしうるもので あればいかなる形態でもよい。 即ち、 m Aから合成された cMAであるか、 ゲノ ム DNAであるか、 化学合成 DNAであるかなどを問わない。 また、 本発明の変異 体をコードしうる限り、 遺伝暗号の縮重に基づく任意の塩基配列を有する DNA が含まれる。 本発明の DNAは、 ヒト FGF23 cDNAを改変して作製することができる。 ヒト FG F23 cDNAは、 当業者に公知の方法により調製することができる。 例えば、 FGF23 を発現している細胞より cDNAライブラリ一を作製し、 FGF23 cDNAの配列 （配列 番号： 1 ) の一部をプローブにしてハイブリダィゼ一シヨンを行うことにより調 製できる。 cDNAライブラリ一は、 例えば、 文献 （Sambrook， J. et al . , Molec ular Cloning、 Cold Spring Harbor Laboratory Press ( 1989) ) に記載の方法 により調製してもよいし、 市販の DNAライブラリ一を用いてもよい。 また、 FGF 23を発現している細胞より を調製し、 逆転写酵素により cDNAを合成した後、 FGF23 cDNAの配列 （配列番号： 1 ) に基づいてオリゴ DNAを合成し、 これをプ ライマ一として用いて PCR反応を行い、 本発明のポリべプチドをコ一ドする cDN Aを増幅させることにより調製することも可能である。
例えば、 次のようにすればよい。 まず、 FGF23を発現する細胞、 組織、 臓器か ら、 mRNAを単離する。 mRNAの単離は、 公知の方法、 例えば、 グァニジン超遠心 法（Chirgwin, J. M. et al . , Biochemistry ( 1979 ) 18, 5294-5299)、 AGPC法
(Chomczynski, P. and Sacchi, N.， Anal . Biochem. ( 1987) 162, 156-159) 等により全 RNAを調製し、 mRNA Purification Kit (Pharmacia社) 等を使用し て全 RNAから m Aを精製する。 また、 QuickPrep mRNA Purification Kit (Pha rmacia社） を用いることにより mMAを直接調製することもできる。
得られた mRNAから逆転写酵素を用いて cDNAを合成する。 cDNAの合成は、 AMV
Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit (生ィ匕学工業社) 等を用いて行うこともできる。 また、 配列番号： 1に記載した配列を基にして作 製したプライマ一等を用いて、 5，-Ampli FINDER RACE Kit (Clontech製）およ びポリメラ一ゼ連鎖反応 (polymerase chain reaction ； PCR) を用いた 5， - RA CE法（Frohman, M. A. et al . , Proc. Natl . Acad. Sci . U. S.A. ( 1988) 85, 8 998-9002 ； Belyavsky, A. et al . , Nucleic Acids Res. ( 1989) 17, 2919-29 32) に従い、 cDNAの合成および増幅を行うことができる。 得られた PCR産物から目的とする DNA断片を調製し、 ベクター DNAと連結する。 さらに、 これより組換えベクターを作製し、 大腸菌等に導入してコロニーを選択 して所望の組換えベクターを調製する。 目的とする DNAの塩基配列は、 公知の 方法、 例えば、 ジデォキシヌクレオチドチェイン夕一ミネーシヨン法により確認 することができる。
具体的には、 例えば実施例 1に記載した方法により、 ヒト FGF23 cDNAを取得 することができる。
本発明の FGF23変異体を作製するための、 ヒト FGF23 cDNAの改変は、 当業者 によって一般的に行われる DNA変異導入（DNA Mutagenesis )技術によって実施す ることができる。 具体的には、 例えば実施例 2に示す方法によって行うことがで きる。
本発明は、 また、 上記本発明の DNAによりコードされる変異体を提供する。 本発明の変異体は、 後述するそれを産生する細胞や宿主あるいは精製方法により、 アミノ酸配列、 分子量、 等電点又は糖鎖の有無や形態などが異なり得る。 しかし ながら、 得られた変異体が、 血中におけるリン濃度を低下させる能力を有する限 り、 本発明に含まれる。 例えば、 本発明の変異体を原核細胞、 例えば大腸菌で発 現させた場合、 本来の変異体のアミノ酸配列の N末端にメチォニン残基が付加 されるが、 このような変異体も本発明に含まれる。
本発明の変異体は、 当業者に公知の方法により、 組み換えポリペプチドとして 調製することが可能である。 組み換えポリペプチドであれば、 本発明の変異体を コードする MAを、 適当な発現ベクターに組み込み、 これを適当な宿主細胞に 導入して得た形質転換体を回収し、 抽出物を得た後、 イオン交換、 逆相、 ゲル濾 過などのクロマトグラフィー、 あるいは本発明の変異体に対する抗体をカラムに 固定したァフィ二ティークロマトグラフィーにかけることにより、 または、 さら にこれらのカラムを複数組み合わせることにより精製し、 調製することが可能で ある。 また、 本発明の変異体をグル夕チオン S-トランスフェラ一ゼ蛋白質との融合 ポリペプチドとして、 あるいはヒスチジンを複数付加させた組み換えポリべプチ ドとして宿主細胞 （例えば、 動物細胞や大腸菌など） 内で発現させた場合には、 発現させた組み換えポリペプチドはグル夕チオンカラムあるいはニッケルカラム を用いて精製することができる。 融合ポリペプチドの精製後、 必要に応じて融合 ポリペプチドのうち、 目的の変異体以外の領域を、 トロンビンまたはファクタ一 Xaなどにより切断し、 除去することも可能である。
本発明は、 また、 本発明の DNAが挿入されたベクターを提供する。 本発明の ベクターは、 宿主細胞内において本発明の DNAを保持したり、 本発明の変異体 を発現させるために有用である。
ぺク夕一としては、 例えば、 大腸菌を宿主とする場合には、 ベクターを大腸菌 (例えば、 JM109、 DH5ひ、 讓1ヽ XLlBlue) などで大量に増幅させ大量調製す るために、 大腸菌で増幅されるための 「ori」 をもち、 さらに形質転換された大 腸菌の選抜遺伝子 （例えば、 なんらかの薬剤 （アンピシリンやテトラサイクリン、 カナマイシン、 クロラムフヱニコ一ルにより判別できるような薬剤耐性遺伝子） を有すれば特に制限はない。 ベクターの例としては、 M13系ベクター、 pUC系べ クタ一、 pBR322、 pBluescript pCR- Scriptなどが挙げられる。 また、 cDNAの サブクロ一ニング、 切り出しを目的とした場合、 上記ベクターの他に、 例えば、 pGEM-Ts pDIRECT, pT7などが挙げられる。 本発明の変異体を生産する目的にお いてベクターを使用する場合には、 特に、 発現ベクターが有用である。 発現べク 夕一としては、 例えば、 大腸菌での発現を目的とした場合は、 ベクターが大腸菌 で増幅されるような上記特徴を持つほかに、 宿主を JM109、 DH5 a、 HB101S XLlBlueなどの大腸菌とした場合においては、 大腸菌で効率よく発現できるような プロモーター、 例えば、 lacZプロモー夕一 （Wardら， Nature ( 1989) 341, 54 4-546； FASEB J. ( 1992 ) 6, 2422-2427) 、 araBプロモーター (Betterら， Sci ence ( 1988) 240, 1041-1043 ) 、 または T7プロモーターなどを持っているこ とが不可欠である。 このようなベクターとしては、 上記べクタ一の他に pGEX - 5 X-1 (フアルマシア社製） 、 「QIAexpress systemj (キアゲン社製） 、 pEGFP、 または PET (この場合、 宿主は T7 RNAポリメラ一ゼを発現している BL21が好ま しい）などが挙げられる。
また、 ベクタ一には、 ポリペプチド分泌のためのシグナル配列が含まれていて もよい。 ポリぺプチド分泌のためのシグナル配列としては、 大腸菌のペリプラズ ムに産生させる場合、 pelBシグナル配列 （Lei, S. P . et al J. Bacteriol . ( 1987) 169, 4379) を使用すればよい。 宿主細胞へのベクタ一の導入は、 例え ば塩化カルシウム法、 エレクトロボレ一シヨン法を用いて行うことができる。 大腸菌以外にも、 例えば、 本発明の変異体を製造するためのベクタ一としては、 哺乳動物由来の発現べクタ一 （例えば、 pcDNA3 (インビトロゲン社製） や、 pEG F-BOS (Nucleic Acids . Res. 1990, 18( 17) , p5322)、 pEFヽ CDM8) 、 昆虫細胞由 来の発現ぺク夕一 (例えば 「Bac - to - BAC baculovairus expression systemj
(ギブコ BRL社製） 、 pBacPAK8) 、 植物由来の発現べクタ一 （例えば ρΜΗ1、 pMH 2) 、 動物ウィルス由来の発現ベクター （例えば、 pHSV、 pMV、 pAdexLcw) 、 レ トロウィルス由来の発現ベクター （例えば、 pZIPneo) 、 酵母由来の発現べクタ 一 （例えば、 「Pichia Expression Kit」 (インビトロゲン社製) 、 pNVll、 SP- Q01) 、 枯草菌由来の発現べクタ一 （例えば、 pPL608、 pKTH50) が挙げられる。
CH0細胞、 COS細胞、 NIH3T3細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、 細胞内で発現させるために必要なプロモーター、 例えば SV40プロモーター （Mu lliganら， Nature ( 1979 ) 277, 108) 、 MMLV-LTRプロモー夕一、 EFl o:プロモ —夕一 （Mizushimaら， Nucleic Acids Res. ( 1990 ) 18, 5322) 、 CMVプロモ一 ターなどを持っていることが不可欠であり、 細胞への形質転換を選抜するための 遺伝子 （例えば、 薬剤 （ネオマイシン、 G418など） により判別できるような薬 剤耐性遺伝子） を有すればさらに好ましい。 このような特性を有するベクタ一と しては、 例えば、 p匪、 pDR2、 pB -RSV pBK-CMVs pOPRSV, pOP13などが挙げ られる。
さらに、 遺伝子を安定的に発現させ、 かつ、 細胞内での遺伝子のコピー数の増 幅を目的とする場合には、 核酸合成経路を欠損した CH0細胞にそれを相補する D HFR遺伝子を有するベクター （例えば、 pCHOIなど） を導入し、 メ トトレキセー ト （MTX) により増幅させる方法が挙げられ、 また、 遺伝子の一過性の発現を目 的とする場合には、 SV40 T抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つ COS細胞を 用いて SV40の複製起点を持つベクター （pcDなど） で形質転換する方法が挙げ られる。 複製開始点としては、 また、 ポリオ一マウィルス、 アデノウイルス、 ゥ シパピロ一マウィルス （BPV) 等の由来のものを用いることもできる。 さらに、 宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、 発現ベクターは選択マ一カーとして、 アミノグリコシドトランスフェラーゼ （APH) 造伝子、 チミジンキナーゼ （TK) 遺伝子、 大腸菌キサンチングァニンホスホリボシルトランスフェラーゼ （Ecogp t) 遺伝子、 ジヒドロ葉酸還元酵素 （dhfr) 遺伝子等を含むことができる。
一方、 動物の生体内で本発明の DNAを発現させる方法としては、 本発明の DNA を適当なベクターに組み込み、 例えば、 レトロウィルス法、 リボソーム法、 カチ ォニックリボソーム法、 アデノウイルス法などにより生体内に導入する方法など が挙げられる。 これにより、 血中における高濃度のリンの存在に起因する疾患に 対する遺伝子治療を行うことが可能である。 用いられるベクタ一としては、 例え ば、 アデノウィルスベクター (例えば pAdexlcw) やレトロウイルスベクター（例 えば pZ IPneo )などが挙げられるが、 これらに制限されない。 ベクタ一への本発 明の DNAの挿入などの一般的な遺伝子操作は、 常法に従って行うことが可能で ある （Molecular Cloning, 5.61-5.63) 。 生体内への投与は、 ex J>O法であ つても、 in Wra法であってもよい。
また、 本発明は、 本発明のベクターが導入された宿主細胞を提供する。 本発明 のべクタ一が導入される宿主細胞としては特に制限はなく、 例えば、 大腸菌や 種々の動物細胞などを用いることが可能である。 本発明の宿主細胞は、 例えば、 本発明の変異体の製造や発現のための産生系として使用することができる。 本発 明の変異体の製造のための産生系は、 in iroおよび in vivoの産生系がある c in Wiraの産生系としては、 真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する 産生系が挙げられる。
真核細胞を使用する場合、 例えば、 動物細胞、 植物細胞、 真菌細胞を宿主に用 いることができる。 動物細胞としては、 哺乳類細胞、 例えば、 CHO (J. Exp. Me d. (1995) 108, 945) 、 C0S、 3T3、 ミエローマ、 BHK (baby hamster kidney) 、 HeLa、 Vero 両生類細胞、 例えばアフリカヅメガエル卵母細胞 （Valle, et al.: Nature (1981) 291, 358-340) 、 あるいは昆虫細胞、 例えば、 Sf9、 Sf21、 Tn5 が知られている。 CH0細胞としては、 特に、 DH 遺伝子を欠損した CH0細胞で ある dhfr-CHO (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, 4216-4220) や CHO K-l (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1968) 60, 1275) を好適に使用することが できる。 動物細胞において、 大量発現を目的とする場合には特に CH0細胞が好 ましい。 宿主細胞へのベクタ一の導入は、 例えば、 リン酸カルシウム法、 DEAE デキストラン法、 カチォニックリボソーム D0TAP (ベ一リンガーマンハイム社 製） を用いた方法、 エレクトロボレ一シヨン法、 リポフエクシヨンなどの方法で 行うことが可能である。
植物細胞としては、 例えば、 ニコチアナ '夕バカム ( icotiana tabacum) 由 来の細胞がポリべプチド生産系として知られており、 これをカルス培養すればよ い。 真菌細胞としては、 酵母、 例えば、 サヅカロミセス Saccharomyces 属、 例えば、 サヅカロミセス 'セレビシェ (Saccharomyces cerevisiae) 、 糸状菌、 例えば、 ァスペルギルス Aspergillus 属、 例えば、 ァスペルギルス '二ガ一
{Aspergillus niger) が知られている。 原核細胞を使用する場合、 細菌細胞を用いる産生系がある。 細菌細胞としては、 大腸菌 ( . coli) 、 例えば、 JM109、 DH5 、 HB101等が挙げられ、 その他、 枯 草菌が知られている。
これらの細胞を目的とする DNAにより形質転換し、 形質転換された細胞を in iiroで培養することによりポリペプチドが得られる。 培養は、 公知の方法に従 い行うことができる。 例えば、 動物細胞の培養液として、 例えば、 DMEM、 MEM、 RPMI 16 0 IMDMを使用することができる。 その際、 牛胎児血清 （FCS) 等の血清 補液を併用することもできるし、 無血清培養してもよい。 培養時の pHは、 約 6 〜8であるのが好ましい。 培養は、 通常、 約 30〜40°Cで約 15〜200時間行い、 必要に応じて培地の交換、 通気、 攪拌を加える。
一方、 in F )でポリペプチドを産生させる系としては、 例えば、 動物を使用 する産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。 これらの動物又は植物に本発 明の変異体をコードする DNAを導入し、 動物又は植物の体内で該変異体を産生 させ、 回収する。 本発明における 「宿主」 とは、 これらの動物、 植物を包含する c 動物を使用する場合、 哺乳類動物、 昆虫を用いる産生系がある。 哺乳類動物と しては、 ャギ、 ブ夕、 ヒヅジ、 マウス、 ゥシを用いることができる (Vicki Gla ser, SPECTRUM Biotechnology Appl ications, 1993) 。 また、 哺乳類動物を用 いる場合、 トランスジヱニック動物を用いることができる。
例えば、 本発明の変異体をコードする DNAを、 ャギ ?カゼインのような乳汁 中に固有に産生されるポリペプチドをコードする遺伝子との融合遺伝子として調 製する。 次いで、 この融合遺伝子を含む DNA断片をャギの胚へ注入し、 この胚 を雌のャギへ移植する。 胚を受容したャギから生まれるトランスジエニックャギ 又はその子孫が産生する乳汁から、 本発明の変異体を得ることができる。 トラン スジヱニックャギから産生されるポリペプチドを含む乳汁量を増加させるために、 適宜ホルモンをトランスジエニックャギに使用してもよい (Ebert, K.M. et a 1. , Bio/Technology ( 1994) 12, 699-702) 。 また、 昆虫としては、 例えばカイコを用いることができる。 カイコを用いる場 合、 本発明の変異体をコードする DNAを挿入したバキュロウィルスをカイコに 感染させることにより、 このカイコの体液から該変異体を得ることができる （S us画, M. et al . 5 Nature ( 1985 ) 315, 592-594) 。
さらに、 植物を使用する場合、 例えばタバコを用いることができる。 タバコを 用いる場合、 本発明の変異体をコードする DNAを植物発現用べクタ一、 例えば p M0N 530に揷入し、 このベクターをァグロバクテリウム ·ヅメファシエンス ざ robacterium tumefaciens) のようなバクテリアに導入する。 このバクテリアを タバコ、 例えば、 ニコチアナ '夕バカム ( icotiam tabacum) に感染させ、 本 タバコの葉より本発明の変異体を得ることができる （Jul ian K. -C . Ma et al .， Eur . J . Immunol . ( 1994) 24, 131-138) 。
これにより得られた本発明の変異体は、 宿主細胞内または細胞外 （培地など） から単離し、 実質的に純粋で均一なポリぺプチドとして精製することができる。 ポリペプチドの分離、 精製は、 通常のポリペプチドの精製で使用されている分離、 精製方法を使用すればよく、 何ら限定されるものではない。 例えば、 クロマトグ ラフィーカラム、 フィル夕一、 限外濾過、 塩析、 溶媒沈殿、 溶媒抽出、 蒸留、 免 疫沈降、 SDS-ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動、 等電点電気泳動法、 透析、 再 結晶等を適宜選択、 組み合わせればポリペプチドを分離、 精製することができる クロマトグラフィーとしては、 例えばァフィ二ティークロマトグラフィー、 ィ オン交換ク口マトグラフィー、 疎水性ク口マトグラフィ一、 ゲル濾過、 逆相ク口 マトグラフィー、 吸着クロマトグラフィー等が挙げられる （Strategies for Pr otein Purif ication and Characterization : A Laboratory Course Manual - E d Danie l R. Marshak et al . , Cold Spring Harbor Laboratory Press , 199 6) 。 これらのクロマトグラフィーは、 液相クロマトグラフィー、 例えば HPLC、 FPLC等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。 本発明は、 これ らの精製方法を用い、 高度に精製された変異体も包含する。 なお、 本発明の変異体を精製前又は精製後に適当な蛋白質修飾酵素を作用させ ることにより、 任意に修飾を加えたり部分的にペプチドを除去することもできる 蛋白質修飾酵素としては、 例えば、 トリプシン、 キモトリブシン、 リシルエンド ぺプチダーゼ、 プロテインキナーゼ、 グルコシダーゼなどが用いられる。
本発明はまた、 本発明の変異体、 該変異体をコードする DNA、 または該 DNAが 挿入されたべクタ一を含有する血中リン濃度を低下させるための医薬組成物を提 供する。
本発明の変異体を、 ヒトゃ他の動物、 例えばマウス、 ラット、 モルモット、 ゥ サギ、 ニヮトリ、 ネコ、 ィヌ、 ヒヅジ、 ブ夕、 ゥシ、 サル、 マントヒヒ、 チンパ ンジ一の医薬として使用する場合には、 変異体自体を直接患者に投与する以外に、 公知の製剤学的方法により製剤化した医薬組成物として投与を行うことも可能で ある。 例えば、 必要に応じて糖衣を施した錠剤、 カプセル剤、 エリキシル剤、 マ ィクロカプセル剤として経口的に、 あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容 し得る液との無菌性溶液、 又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。 例えば、 薬理学上許容される担体もしくは媒体、 具体的には、 滅菌水や生理食塩 水、 植物油、 乳化剤、 懸濁剤、 界面活性剤、 安定剤、 香味剤、 賦形剤、 ぺヒクル、 防腐剤、 結合剤などと適宜組み合わせて、 一般に認められた製薬実施に要求され る単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。 これら製 剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするもの である。
錠剤、 カプセル剤に混和することができる添加剤としては、 例えばゼラチン、 コーンスターチ、 トラガントガム、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性セル口 ースのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸のような膨化剤、 ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖又 (まサッカリンのよう な甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油又はチヱリーのような香味剤が用いられる 調剤単位形態が力プセルである場合には、 上記の材料にさらに油脂のような液状 担体を含有することができる。 注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のような べヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水溶液としては、 例えば生理食塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬を含 む等張液、 例えば D-ソルビトール、 D-マンノース、 D-マンニトール、 塩化ナト リゥムが挙げられ、 適当な溶解補助剤、 例えばアルコール、 具体的にはエタノー ル、 ポリアルコール、 例えばプロピレングリコール、 ポリエチレングリコール、 非イオン性界面活性剤、 例えばポリソルべ一ト 80™、 HC0-50 と併用してもよい c 油性液としてはゴマ油、 大豆油があげられ、 溶解補助剤として安息香酸ベンジ ル、 ベンジルアルコールと併用してもよい。 また、 緩衝剤、 例えばリン酸塩緩衝 液、 酢酸ナトリウム緩衝液、 無痛化剤、 例えば、 塩酸プロ力イン、 安定剤、 例え ばペンジルアルコール、 フエノール、 酸化防止剤と配合してもよい。 調製された 注射液は通常、 適当なアンプルに充填させる。
患者への投与は、 例えば、 動脈内注射、 静脈内注射、 皮下注射などのほか、 鼻 腔内的、 経気管支的、 筋内的、 経皮的、 または経口的に当業者に公知の方法によ り行いうる。 投与量は、 患者の体重や年齢、 投与方法などにより変動するが、 当 業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。
本発明の変異体の投与量は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法によっても異なるが、 例えば注射剤の形では通常成人 （体重 60kgとし て） においては、 1日あたり約 100 zgから 20mgであると考えられる。
非経口的に投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投 与方法によっても異なるが、 例えば注射剤の形では通常成人 （体重 60kgとし て） においては、 通常、 1 日当り約 0. 01から 30mg、 好ましくは約 0.1から 20mg、 より好ましくは約 0 · 1から 1 Omg程度を静脈注射により投与するのが好都合であ ると考えられる。 他の動物の場合も、 体重 60kg当たりに換算した量、 あるいは 体表面積あたりに換算した量を投与することができる。 また、 本発明の DNAを医薬組成物として用いる場合には、 上述したように本 発明の DNAを生体内でその発現を保証するベクターに組み込み、 例えば、 レト ロウィルス法、 リボソーム法、 カチォニックリボソーム法、 アデノウイルス法な どにより生体内に導入すればよい。 これにより、 高血中リン濃度に起因する疾患 に対する遺伝子治療を行うことが可能である。 生体内への投与においては、 vi vo法や in vi 法を利用することができる。 図面の簡単な説明
図 1は、 血清中の無機リン濃度に対する FG23変異体の効果を示すグラフであ る。 血清中の無機リンは、 DNAベクターを導入後 4日間計測した。 デ一夕は平均 値土 SEMを表す。 カラム内の数値は動物の数を表す。 * Pく 0. 05対 MOCK対照 （対 応のない t検定） 。
図 2は、 血清中の無機リン濃度に対する FGF23の効果を示すグラフである。 血清中の無機リンは、 DNAベクタ一を導入後 4日間計測した。 デ一夕は士 SEMを 表す。 カラム内の数値は動物の数を表す。 *Pく 0. 05対 MOCK対照 （対応のない t 検定） 。
図 3は、 血清中の 1ひ， 25 ( 0H)2D3濃度における FGF23および FGF23変異体の効 果を示すグラフである。 血清中の 1ひ， 25( 0H)2D3は、 DNAベクターを導入後 4日 間計測した。 計測には、 3動物から得た血清を混合して使用した （n=2, 6匹/ 群） 。 データは平均値を表す。
図 4は、 腎臓から単離した BBMVにおけるリン輸送活性に対する FGF23変異体 の効果を示すグラフである。 naked ベクター DNA導入マウスにおける腎臓刷子縁 膜小胞中における P i取込み （導入後 4日間） 。 計測には、 2動物から得た腎臓 を使用した （n=3, 6匹/群） 。 デ一夕は平均値士 SEMを表す。
図 5は、 FGF- 23 (変異体) M2-Fの SDS- PAGE解析 （CBB染色） の結果を示す写真 である。 図中の Mは、 分子量マーカ一 （B I0-RAD、 ブロードレンジ） を表す。 図 6は、 C末端欠失 M2FGF23変異体の血清リン濃度低下作用を示すグラフであ る。 「M0CK」 は親ベクターである pCAGGSを導入したマウスを表す。 「Normal」 は、 正常マウスを表す。
図 Ίは、 PTH( 1- 34)と M2FGF23の TPTXラヅト血清リン低下作用を示すグラフ である。
図 8は、 PTH (卜 34)と M2FGF23の TPTXラヅ ト血清カルシウムに対する作用を 示すグラフである。
図 9は、 PTH( 1- 34)と M2FGF23の TPTXラットにおける腎リン排泄に対する作 用を示すグラフである。
発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、 本発明はこれら実施例 に制限されるものではない。
[実施例 1 ] ヒト FGF23の全長 cDNA (0RF部分） のクローニング
FGF-23の全長 cDNA (0RF部分） クロ一ニングは PCR法により行った。 プライ マ一は Genbank data (ァクセッション No. AB037973) を基にし、 そこに EcoRI サイ トおよび Xholサイ トを付加してデザインした （5，- ggAATTCTCgAgCCACCATg TTgggggCCCgCCTCAggCTCTg - 3' Z配列番号： 3、 5' - ggAATTCTCgAgCTACTAgATgAA CTTggCgAAgg -3' /配列番号： 4 ) 。 さらに 5'側のプライマーには開始コドン A TGの上流にコザック配列 （CCACC) を付加し、 3'側の配列には終止コドン TGAを 二つ付加した。 プライマ一作製はサヮディ一テクノロジ一社に外注した。 錡型に は human heart cDNA (Origene社の M dtiple cDNA kit, Cat . No. CH-1101) を使用し、 PCR反応には QIAGEN PCR kit (QIAGEN社 Cat. No. 201223) を使 用した。 すなわち、 0.75 / 1の human heart cDNA (Origene社の Multiple cDNA kit) 、 2. 5 z lの QIAGEN lOxPCRバッファ一、 0. 5〃1の dNTP mix (200 mM)ヽ . 0.25 z lの QIAGEN Taq DNAポリメラーゼ、 5. 0 1の 5 x Q- solution、 0. 5 ^ 1 の Spec ific Forward PCR primer (50〃M、 配列番号： 3 ) 、 0. 5〃1の Specif i c Reverse PCR primer (50〃M、 配列番号： 4 ) 、 そして 15〃1の DDWを加え、 全量 25 / 1 として、 以下の条件で PCR反応をサーマルサイクラ一 ABI2400を用い て行った。 一次変性は 95°Cで 2分、 そして 35サイクルの 2ステップシャトル P CR (94°Cで 40秒、 60°Cで 1分） を行い、 最後に伸長反応を 72°Cで 7分行い、 PC R反応を終了した。 PCR反応による増幅産物を 1. 0%ァガロース電気泳動で確認し た結果、 単一の特異的バンドが約 750bp付近で確認されたため、 T0P0 TAクロ一 ニングキット （Invitorogen社 Cat. No. 45000-01) により、 2〃1の PCR反応 液を使用して TAベクター pCR2. 1へのサブクロ一ニングを行った。 操作はキヅト 添付のプロトコールに従って行つた。 そして、 TAクローニングされたクローン # 3の塩基配列解析を M13 M4プライマー （TaKaRa社 Cat. No. 3832A) 、 M13 RV プライマ一 （TaKaRa社 Cat. No. 3830A) 、 配列番号： 5に記載のプライマ一（5 ， - CgCACCCCATCAgACCATCT -3，）、 および配列番号： 6に記載のプライマー（5， - gCAgTTCTCCgggTCgAAATA -3' )を使用し、 AB I377 DNAシーケンサ一により解析を 行った。 その結果、 クローン #3の内部配列はヒト FGF- 23と完全に一致し、 FGF- 23のクローニングを完了した。
[実施例 2 ] ヒト FGF変異体 (R176Q, R179Qヽ R179WS R176Q+R179Q, R176Q +R179W) の作製
ヒト FGF- 23を鍊型に FGF-23変異体 R176Q (Ml )ヽ R179Q (M2 )、 R179W (M3 )、 R176Q+R179Q (M4)、 R176Q+R179 (M5 )の作製を行った。 ヒト 23より文献 (Autosomal dominant hypophosphataemic rickets is associated with mutat ions in FGF23 Nature Genetics Vol .26 p345-348. November 2000 )に従って. 527G A(R176Q)、 536G A(R179Q)ヽ 535C→T(R179W)の 3種類およびそれらの組 み合わせ M4 (R176Q +R179Q) と M5 (R176Q+R179W) の作製を行った。 プライマ 一合成はサヮディ一テクノロジ一社に外注した。 使用したプライマーの塩基配列 は次の通りである。
• 5'- CACggCAgCACACCCggAgC -3， (配列番号： 7)
• 5 CACggCggCACACCCAgAgC - 3， (配列番号： 8)
• 5， - CACggCggCACACCTggAgC -3， （配列番号： 9 )
- 5， - CACggCAgCACACCCAgAgC -3， （配列番号： 10)
■ 5' - CACggCAgCACACCTggAgC -3' (配列番号： 11)
変異導入 (Mutagenesis)は 1st PCRにおいて、 変異導入のための部分フラグメ ントを作製し、 2nd PCRにより変異の入っている全長変異体の錄型を作製し、 最 終的に 3rd PCRにより完全な変異体を得るという 3ステップによる方法にて行 つた。 すなわち、 0.2〃1のヒト FGF- 23のクローン #3(40ng/〃l)、 5 /1の TaKaR A EX lOxPCRバッファ一、 の dNTP mix (50 zM)ヽ 0.5 1の TaKaRa EX Taq
DNAポリメラーゼ、 0.5 /1の Specific mutant primer (50〃M、 配列番号： 7、
8、 9、 10、 1 1) 、 0.5 ilの Specific Reverse PCR primer (50〃M、 配列 番号： 4) 、 そして 39.3〃1の DDWを加え、 全量 50〃1として、 以下の条件で P 反応をサ一マルサイクラ一 ABI2400により行った。 一次変性は 95°Cで 2分、 そして 35サイクルの 2ステップシャトル PCR (94°Cで 40秒、 60°Cで 30秒） を 行い、 最後に伸長反応を 72°Cで 4分を行い、 PCR反応を終了した。 PCR反応によ る増幅産物を 1.0%ァガロース電気泳動で確認した結果、 単一の特異的バンドが 約 200bp付近で確認された。 このゲルからそれぞれの特異的増幅フラグメント
(R176Qと を QIAquick Gel Extraction kit (QIAGEN社 Cat. No. 2870 4) によりキット添付のプロトコールに従って精製した。 その精製フラグメント
(変異体部分配列） を用いて次に 2nd PCR反応 （変異体の全長の錶型を作製） を行った。 の精製フラグメントをプライマ一として使用し、 0.1 /1のヒト FGF - 23のクローン #3(40ng///l)、 2.5〃1の TaKaRa EX lOxPCRバッファー、 2 i 1の dNTP mix (50/ M) 0.25 zlの TaKaRa EX Taq DNAポリメラーゼ、 早して 1 8. 15 lの DDWを加え、 全量 24 l として、 以下の条件で 2nd PCR反応をサ一マ ルサイクラ一 ABI2400を用いて行った。 一次変性は 95°Cで 2分、 そして 5サイ クルの 3ステヅプサイクル PCR (94°Cで 1分、 60°Cで 1分、 72°Cで 1分） を行い、 2nd PCRを終了した。 引き続き、 この反応液に 0.5〃1の Specific Forward PCR primer (50〃M、 配列番号： 3 ) 、 0.5〃1の Specific Reverse PCR primer (5 0〃M、 配列番号： 4 ) を加え、 全量 25〃1として、 以下の条件で 3rd PCR反応 をサ一マルサイクラ一 ABI2400により行った。 一次変性は 95°Cで 2分、 そして 3 5サイクルの 2ステップシャトル PCR (94°Cで 40秒、 60°Cで 1分） を行い、 最 後に伸長反応を 72°Cで 7分を行い、 PCR反応を終了した。 最終的に得られた PCR 反応による増幅産物を 1.0%ァガロース電気泳動で確認した結果、 特異的に増幅 された約 75 Obp付近のバンドが確認された。
以降の解析は実施例 1と同様の方法で内部配列の TAクローニングを行い、 同 様の方法で内部配列の塩基配列解析を行ったところ、 各種変異体に対して目的変 異を挿入されたクローンの作製に成功した。
[実施例 3 ] 発現ベクターの作製
FGF- 23および各種変異体 （M1〜M5) の内部配列を pCAGGS3に挿入し、 各クロ —ンの発現べクタ一を作製した。 すなわち、 各クローンを制限酵素 EcoRIによ り切断し、 得られた EcoRIフラグメントを QIAquick Gel Extraction kit (QIA GEN社 Cat. No. 28704) により精製し、 EcoRIカットされた pCAGGS3に揷入した c 各ベクターを pCGF23、 pCGFMl〜5と命名した。
[実施例 4 ] ェンドトキシンフリ一プラスミ ドの調製
プラスミ ド DNAを直接 in 'raに投与するため、 ェンドトキシン除去処理を 加えた方法によりプラスミ ド精製を行った。 具体的には Endofree plasmid Maxi kit (QIAGEN社 Cat. No. 12362) を使用し、 pCGF23、 pCGFMl〜5のエンドトキ シンフリーのプラスミ ド精製を添付されたプロトコ一ルに従って行った。
[実施例 5 ] FGF-23および M2(R179Q)の C末端 FLAG- taqの付加
PCGF23および PCGFM2を錶型に配列番号： 3に記載の配列および FLAG配列を 含む配列番号： 1 2に記載のプライマーを使用し、 C末端に FLAG配列を含む変 異体を作製した。 すなわち の pCGF23および pCGFM2 ( 30ng/ / l )、 2.5 i l の TaKaRa EX lOxPCRバッファー、 の dNTP mix (50 zM), 0.25 1の TaKaR a EX Taq DNA ポリメラーゼ、 0.5 1 の Specific Forward PCR primer (50 Mヽ 配列番号： 1 1 ) 、 0.5 i lの Specific Reverse PCR primer (50〃M、 5 ggAT CCgAATTCATATgTCACTTATCgTCgTCATCCTTgTAATCgATGAACTTggCgAAgg -3' /配列番 号： 1 2 ) 、 そして 18.5 / 1の DDWを加え、 全量 25〃1として、 以下の条件で P CR反応をサーマルサイクラ一 ABI2400により行った。 一次変性は 95°Cで 2分、 そして 30サイクルの 2ステップサイクル PCR ( 94°Cで 30秒、 60°Cで 1分） を行 い、 最後に伸長反応を 72°Cで 7分を行って PCR反応を終了した。 最終的に得ら れた PCR反応による増幅産物を 1.0%ァガロース電気泳動で確認した結果、 特異 的に増幅された約 800bp付近のバンドが確認された。 以降の解析は実施例 1〜 4の方法に準じて行い、 最終的に発現ベクター PCGF23-Fおよび PCGFM2-Fを作製 した。
[実施例 6 ] FGF-23及び M2 (R179Q) の N末端 FLAG- tagの付加
N末端 FLAG-tagつき FGF23発現べク夕一は、 PCR法を使い以下のように構築 した。 3ngの pCG23をテンプレート、 それそれ lOOpmolの Specif ic Forward PCR primerと 23N FLAG R(GCCCTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCGGCTCTGAGGACGCTC/ 配列番号： 1 3 )あるいは ZSRKGGCTCGAGTCAGATGAACTTGGCGMGGZ配列番号： 1 4 )と 23N FLAG F(GATGACGACGATMGGGCGGAGGTTCCAGAGCCTATCCCAATG/配列番 号： 1 5 )をプライマ一セットとして使い、 Takara Ex Taqとそれに添付のバッ ファーを使い、 1段階目の PCR反応（96°C15秒、 55°C 15秒、 72°C2分、 25サイク ル）を行った。 PCR反応生成物を、 ミリポア社のマイクロコン 30にかけ、 プライ マーを除去した後、 それそれの PCR反応生成物を混ぜ合わせたものをテンプレ ート、 FGF Fと 23R1をプライマーセヅトとして使い、 1段階目と同じ条件で 2 段階目の PCR反応を行った。 反応終了後、 ァガロースゲル電気泳動により、 PCR 反応生成物を精製し、 このフラグメントを T0P0クローニングキット（インビト ロージェン社製）使いクローニングして DNA配列を読むことにより、 目的の変異 が導入されていることおよび不必要な変異が導入されていないことを確認した。 配列の確認されたプラスミ ドを調整し、 Eco RIで切断しフラグメントを回収し て、 あらかじめ Eco RIで切断しておいた pCAGGS3に組み込んだ。 方向性を確認 した後、 最終的に発現ベクターを PCGF23NFと命名した。
N末端 FLAG- tagつき FGF23M2ぺク夕一は 1段階目の PCR用のテンプレートに PCGFM2を使った以外、 上記と同様の方法で行い作製し、 pCGFM2NFと命名した。
[実施例 7 ] naked DNA injection動物実験用発現べク夕一作製
naked DNA injection法を用いてマウス成体において FGF23とその変異体が直 接または間接的にリン代謝に影響を及ぼすかどうかを検証した。
使用した材料は以下の通りである。
FGF23発現べク夕一 (pCGF23)
R176Q FGF23変異体発現べク夕一 (pCGFMl)
R179QFGF23変異体発現ベクター (pCGFM2)
R179WFGF23変異体発現ベクター (pCGFM3)
R176QR179QFGF23変異体発現べク夕一 (pCGFM4)
R176QR179WFGF23変異体発現ベクター (pCGFM5)
<対照物質 （陰性対照物質） > MOCKベクタ— (pCAGGS)
形状： lOmM Tris/1 mM EDTA (pH8.0)溶液
保存： -20°C、 喑所
<調製方法 >
投与剤型は溶液であり、 調製法は TranslT In Vivo Gene Delivery System ( PanVera社)のプロトコールに従った (TranslT® In Vivo Gene Delivery System (Pan Vera社） standard protocol) 。 MOCKベクタ一または FGF23発現べクタ一ま たは FGF23変異体発現ベクターを投与 1匹当たり 10 /g使用した。 10 Lの TranslT Polymer Solutionと適当量の滅菌水を加えて 200 Lとし 50mLフアルコ ンチューブ中で混合した。 5分間室温に放置後、 上記の 200 Z L当たり 2.8mLの 1 X Delivery Solutionを加えて全量を 3. OmLとして投与液とした。 6匹に投与す る場合には 7匹分の量 21mLを調製した。 投与液は調製当日に使い切った。 使用動物および飼育条件は、 以下の通りである。
<使用動物 >
動物種： マウス
系統： Jcl: CD-I (ICR) または Crj: CD-I (ICR)
性別
35〜40g
週齢 投与時で 8〜9週齢
入手先： 日本クレアまたは日本チャールズリバー
安楽死法 麻酔下放血
馴化期間 約 2週間
群分け法 無作為抽出
<飼育環境 >
室温： 24±2°C
相対湿度： 55 ± 10% 換気回数： 10〜30回/時
照明時間： 5:00〜19:00
飼料： CE-2 (日本クレア株式会社) を自由摂取
飲料水： 水道水を自由摂取
<試験方法 >
投与経路は静脈内投与、 投与量は 3 mlとし、 全量を 8秒以内に投与した。
<サンプル採取 >
(1) 血清
投与後 4日後にエーテル麻酔下にて腹部大静脈より全採血した。 採取した血液 はセパラピットチューブミニ （積水化学工業） に入れ遠心 (1400 X g , 10分間， 4°C)し、 血清を分離した。 血清は測定に供するまで設定温度- 20°Cの冷凍庫に保 存した。
(2) 尿
投与後 3日目にマウスをガラス製の代謝ケージ （METABOLICA, 杉山元医理 器） に入れ、 4日目まで 24時間蓄積尿を採取した。 尿は測定に供するまで設定 温度- 20°Cの冷凍庫に保存した。
(3) 腎臓
血清採取後、 両腎臓を摘出し被膜を剥離除去し、 刷子縁膜小胞の精製に供した ( <各パラメ一夕の測定 >
血清中または尿中の無機リン （Pi) 、 カルシウム （Ca) 、 尿素窒素 （UN) 、 クレアチニン (CRE)は自動分析装置 （日立 7Γ70Ε形） にて測定した。 血清中の 25-hydroxyvitamin D, 24,25-dihydroxyvitamin Dは CPBA法で， 1α,25- dihidroxyvitamin Dは RIA2抗体法で測定した。
<統計学的解析方法 > MOCKベクタ一投与群と FGF23発現べク夕一投与群または各 FGF23変異体発 現べクタ一投与群間で、 対応のない t検定を行った。 有意水準は両側 5%とした c 解析ソフトは SAS ver. 6.12を用いた。
結果、 血清生化学値に対する作用は、 図 1に示したように ADHR患者で同定 された点変異を導入した 3種類の FGF23変異体発現べクタ一である FGF23-M1、 FGF23-M2および FGF23-M3を投与した群では、 変異体の種類に関わらず、
MOCK投与群に比べて有意な血中リン値の低下が観察された。 しかしながら、 これらの点変異を組み合わせた二重変異体発現べクタ一、 FGF23-M4、 FGF23- M5を投与した群では同様に血清リン低下作用は観察されたものの、 点変異を組 み合わせたことによる相加 ·相乗効果は認められなかった。 野生型
FGF23(FGF23-Wild)を投与した群では、 血清リン低下作用は認められなかった (図 2 ) 。
表 1に示すように、 その他の血清生化学パラメ一夕 （カルシウム、 クレアチニ ン、 尿素窒素） では MOCK群と FGF23-Wild群及び FGF23-M2群で著明な差は 認、められなかった。
表 1
Figure imgf000025_0001
また、 尿中生化学値に対する作用を表す結果は、 表 2に示したように FGF23- M2投与群では、 MOCK群に比較して一日当たりのリン排泄量が増加する傾向が 見られたが、 有意な差ではなかった。
表 2
Figure imgf000026_0001
また、 血清中 loc,25(OH)2D3に対する作用を示す結果は、 図 3に示したように MOCK投与群に比較して、 FGF23-M2投与群および FGF23-Wild群では著明に lcc,25(OH)2 D3量が低下していた。 FGF23-Wild群では MOCK群の約半分、
FGF23-M2投与群では測定感度以下まで低下していた。
一方、 生体内の前駆体である 25(OH) D3量は MOCK投与群、 FGF23-Wild投与 群、 FGF23-M2投与群で有意な差は認められなかった。 また 24,25(OH)2 D3量は FGF23-Wild投与群では MOCK投与群と差は見られなかったものの FGF23-M2投 与群では著明に低下していた （表 3 ) 。
表 3
Figure imgf000026_0002
ぐ刷子縁膜小胞精製 >
刷子縁膜小胞の精製は、 マグネシウム沈殿法にて行った。 すなわち、 採取した 腎臓に氷冷した MET Buffer (60mM mannitol, ImM EGTA, 2.5mM Tris/HCl, pH7.1) をカロえ、 ヒスコトロンで 18,000rpm、 1分間、 ホモジナイズした後に、 1/10量の 1M MgCl2を加えて攪拌、 15分間氷中に放置した。 低速遠心 (2,000 X g、 15分間、 4°C)にて非粉碎画分を除去後、 上清を高速遠心 (24,000 X g、 30分間、 4°C)し、 沈 殿を得た。 沈殿に MET Bufferを加えてテフロンホモジナイザー (l,000rpm、 10ス トローク）で更に粉碎した。 再度、 1/10量の lM MgCl2を加えて攪拌、 15分間氷 中後、 低速遠心 (2,000 X g、 15分間、' 4°C)、 上清を高速遠心 (24，000 X g、 30分間、 4°C)した。 得られた沈殿に Transport Buffer-K (lOOmM mannitol, 20mM
HEPES Tris， pH7.4)を加え、 プラスチックシリンジ (針 20Gおよび 27G) で吸引 排出を繰り返し、 刷子縁膜小胞を得た。
<リン輸送活性測定 >
刷子縁膜を用いたリン輸送活性の測定は、 迅速濾過法を用いた。 すなわち、 20 /Lの刷子縁膜小胞と 80 /Lの反応液 （lOOmM mannitol, 20mM HEPES/Tris, pH7.4, 125mM NaCl, 125nM 32P-KH2P04) を 25°Cで 1分間反応させ、 反応停止液 (lOOmM mannitol, lOOmM choline chloride, 20mM MgS04, 5mM KH2P04， 20mM HEPES/Tris, pH7.4)を 1 mL加えて反応を停止させた。 反応液は、 直ちに二ト口 セルロース膜 （孔径 0.45 /m 直径 2.5cm) で吸引濾過し、 ニトロセルロース膜 を 5mLの反応停止液で洗浄した。 膜上に捕獲された放射活性を液体シンチレ一 シヨンカウンター TRI-CARB 2700TR (ベックマン株式会社）を用いて測定し、 全リ ン輸送活性とした。 ナ十リウム非依存性リン輸送活性の測定は、 反応液中の 125mM NaClを 125mMの KC1に変更して行った。 ナトリウム依存性リン輸送活 性は、 全リン輸送活性とナトリウム非依存性リン輸送活性の差より算出した。 い ずれの活性も、 刷子縁膜小胞中の夕ンパク量を BCA Protein Assay Reagent (PIERCE)を用いて測定し、 1分間に単位タンパク量が取り込んだリン量
(pmoles/mg protein/min »として gS j した。
結果、 図 4に示したように FGF23-M2投与群では MOCK投与群に対して腎臓 におけるナトリゥム依存性リン輸送担体 (Na/Pi)活性は有意に低下していた。一 方、 ナトリウム非依存性リン輸送活性に変化は認められなかった。
[実施例 8 ] C末端欠失 M2FGF23変異体発現べクタ一の構築
C末端欠失 M2FGF23変異体発現べクタ一は、 PCR法を使い以下のように構築し た。 3ngの PCGFM2NFをテンプレート、 それぞれ lOOpmolの Specif ic Forward PCR primerと dC188 (GGCTCGAGTCAGTCCCGCTCCGAGTC/配列番号： 1 6 )、 dC194(GGCTCGAGTCACTTCAGCACGTTCAGGGG/配列番号 1 7 )、
dC200 ( GGCTCGAGTCAGGTCATCCGGGCCCGGGG/配列番号 1 8 )、
dC210 ( GGCTCGAGTCAGAGCTCCTGTGMCAGGA/配列番号 1 9 )、
dC217( GGCTCGAGTCAGCTGTTGTCCTCGGCGCT/配列番号 2 0 )、
dC223(GGCTCGACTCAGTCACTG(iCCATCGGGCT/配列番号 2 1 )、
dC240 ( GGCTCGAGTCAGCCCGTTCCCCCAGCGTG /配列番号 2 2 )あるいは
dC245 ( GGCTCGAGTCAGCGGCAGCCTTCCGGGCC/配列番号 2 3 )をプライマーセヅト として使い、 Takara Ex Taqとそれに添付のバッファ一を使い、 PCR反応（96°C 15秒、 55°C15秒、 72°C2分、 25サイクル）を行った。 反応終了後、 ァガロース ゲル電気泳動により、 PCR反応生成物を精製し、 このフラグメントを T0P0ク口 —ニングキット（インビトロジェン社製）を使いクローニングして、 DNA配列を読 むことにより、 目的の変異が導入されていることおよび不必要な変異が導入され ていないことを確認した。 酉 3列の確認されたプラスミ ドを調整し、 Eco RIで切 断しフラグメントを回収して、 あらかじめ Eco RIで切断しておいた pCAG GS3 に組み込んだ。 これらの発現べクタ一は各々、 pC(MC188 (dC188)、 pCGdC194 (dC194)、 pCGdC200 (dC200 )、 pCGdC210 (dC210)、 pCGdC217 (dC217)、 pCGdC223 (dC223)、 pCGdC240 (dC240 )、 pCGdC245 (dC245 )と命名した。
[実施例 9 ] C末端欠失 M2FGF23変異体たんぱく質の発現
1 X 105個の COS細胞を 1 mlの DMEM (10% FCS) 培地 (GIBC0) に懸濁後、 6 ゥエルプレートにまいた。 一晩培養後、 l〃gの発現べクタ一 （実施例 8に示し た pCMcl88〜pCGdc245) を 3〃Lの FuGene (ベ一リンガ一社製）をを使い細胞に 導入した後、 さらに一晩培養した。 次の日培地を、 CH0- S- SFMI Iに交換し、 さら に 2日培養を続けた。 2日後培地を回収し、 その培地中に発現している変異体た んぱく質を、 anti- FLAG抗体 (M2) (SIGMA) によりウエスタンブロッテイング法 により解析を行い、 変異体たんぱく質の発現を確認した。
[実施例 1 0 ] COS細胞による FGF-23変異体 (M2 )組み換え体の一過性発現
5 X 106個の COS細胞を 400〃1の DMEM ( 10% FCS) 培地 (GIBC0) に懸濁後、 10 igの発現ベクター pCGFM2-Fを加えてエレクトロポレーシヨンキュべヅト
0.4cm (B IO-RAD) に移し、 Gene- pulser (BIO-RAD) を用いて 0.26kv、 抵抗値∞、 960mFの条件でエレクトロポレ一シヨンを行った。 その後、 30 mlの DMEM (10% FCS) 培地に細胞溶液を懸濁して、 175 cm2のフラスコ （FALCON) に移し、 C02ィ キュぺ一夕一 （ESPEC) に 37°Cで一昼夜静地した。 翌日、 30 mlの CH0-S- SMI I 培地 （GIBC0) に培地交換して、 3日間培養した。 回収した培地を 3000 rpm、 15 分間遠心して細胞を取り除き、 その培地を anti- FLAG抗体 (M2 ) (SIGMA) により ウエスタンプロッティング法により解析を行い、 組み換え体 23変異体
(M2 )-Fの発現を確認した。
[実施例 1 1 ] 組み換え体 FGF- 23(M2 )- Fのァフィ二ティ一カラムによる精製 anti- FLAG抗体ァフィ二ティ一カラム （SIGMA) を用いて組み換え体 FGF- 23変 異体 (M2 )-Fの精製を行った。 クロマトグラフィー操作はグラディフラックシス テム （フアルマシア） を用いた。 ァフィ二ティーカラムを PBS-Tにより平衡化 した後、 実施例 1 0の組み換え体 変異体 (M2 )- Fの発現している調製培地 をアプライし、 グリシン HC1緩衝液 （pH3. 5) で溶出を行った。 そしてメインピ —クを分画し、 SDS- PAGEにより分析したところ、 CBB染色レベルでほぼ均一な 目的分子量付近のバンドを確認し、 組み換え体の調製を終了した（図 5 )。
[実施例 1 2 ] 欠失変異体動物実験 投与剤の調製は、 Trans IT In Vivo Gene Delivery System (PanVera社）の プロトコールに従った。 投与 1匹当たり図 6に示した発現ベクター （MOCKは、 実施例 7と同じ） 10 igに 10〃Lの TransIT Polymer Solutionと適当量の滅菌 水を加えて 200 /Lとして混合、 5分間室温に放置後、 当たり 2.8mLの 1 X Delivery Solutionを加えて全量を 3.0mLとして投与液とした。 6匹に投与す る場合には 7匹分の量 21mLを調製した。 投与液は調製当日に使い切った。
日本チャールズリバ一社から購入した 8〜9週齢の雌性 CD- 1 ( ICR) マウス (35-40g)を 1週間馴化後、 実験に供した。 尾静脈から発現ベクターを含む投与 剤 3 mLを 8秒以内に全量投与した。 投与後 4日後にエーテル麻酔下にて腹部大 静脈より全採血し、 採取した血液はセパラピットチューブミニ （積水化学工業） に入れ違心（1400 x g , 10分間， 4°C )し、 血清を分離した。
血清中の無機リン （Pi) 、 カルシウム （Ca) 、 尿素窒素 （UN) 、 クレアチニ ン（CRE)は自動分析装置 （日立 7170E形） にて測定した。
結果を図 6に示す。
M2FGF23変異体はアミノ酸 251個で構成されているが、 C末端部分を短くして いくとアミノ酸 200位までの dC200変異体でも同等の血清リン低下作用を有し ていた。 しかしながら 194位までの dC194変異体、 188位までの dC188変異体と 更に短くすると、 作用は弱まり、 失われていった。 ADHR患者では 176位もしく は 179位のアミノ酸に変異が入ると FGF23が夕ンパク分解による調節を受けに くくなり、 結果的に過剰な FGF23が血中に存在することで低リン血症になると 推測されている。 従って本実験結果からアミノ酸 179位〜 200位の部分に血清リ ン低下作用に重要な部位があると考えられた。
[実施例 1 3 ] FGF23の副甲状腺甲状腺切除ラットに対する作用 8週齢の雄性 SDラットを甲状腺 ·副甲状腺切除 (TPTX)し、 数日後、 イオン化 カルシウムを測定、 手術の成否を確認した後に大腿静脈にカテーテルを挿入し、 尿サックをしてボールマンケージに固定した。
Harvard Infusion Pumpで PTH( 1-34) ( 0.3nmol/mL )または C- FLAG夕グ付き M2FGF23タンパク （6〃g/mL)またはぺヒクル (0.05% Tween 80 / Saline)を lml/hrの速度で 6時間、 infusion投与した。 infusion開始後 4時間目から投与 終了 6時間目まで採尿し、 投与終了後、 腹部大静脈より全血採血した。 3000rpm X lOmin遠心して血清と尿の不溶画分を分離し、 日立 7170形オートアナライザ 一で無機リン、 カルシウム、 クレアチニンを測定した。 結果を図 7から図 9に示 す。
図 7より TPTXにより上昇したラットの血清リン濃度は PTH(卜 34)投与により 正常化した。 また M2FCT23投与によっても同様に正常化した。 一方、 TPTXによ り低下した血清カルシゥム濃度は PTH(卜 34)投与で是正されるものの、 M2FGF23 投与では殆んど効果がなかった （図 8 ) 。 このことから M2FGF23は PTHを介し て血清リン濃度に作用を及ぼしているのではなく、 血清カルシウム濃度に作用を 示さないことが明らかとなった。 PTH( 1- 34)では尿中の無機リン /クレアチニン 値が上昇していることから血清中のリンは尿中に排泄されたと考えられるが、 M2FGF23では無機リン/クレアチニン値が、 変化していないことから、 血清中の リンは骨にハイ ドロキシァパタイ トとして戻った可能性がある （図 9 ) 。 産業上の利用の可能性
本発明により、 FGF23タンパク質変異体が提供された。 本発明の FGF23変異体 は、 血中のリン濃度を低下させる効果を有することから、 高リン血症の治療およ び予防薬になるものと期待される。 また、 本発明の FGF23変異体をコードする D NAは、 体内に導入し発現させることにより、 血中リン濃度を低下させることか ら、 高リン血症に対する遣伝子治療への応用が期待される。

Claims

請求の範囲
1 . 配列番号： 2に記載アミノ酸配列において、 1 Ί 6位のアルギニンがグル 夕ミン、 1 7 9位のアルギニンがグルタミン、 または 1 7 9位のアルギニン がトリブトフアンに変異したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする DNA。
2 . 配列番号： 2に記載アミノ酸配列において、 1 Ί 6位のアルギニンがグル 夕ミン、 1 7 9位のアルギニンがグルタミン、 または 1 7 9位のアルギニンがト リブトフアンに変異したァミノ酸配列からなるタンパク質における、 少なくとも 1から 1 9 0位までのアミノ酸配列を有する断片をコ一ドする DNA。
3 . 請求項 1または 2に記載の DNAが挿入されたべクタ一。
4 . 請求項 1もしくは 2に記載の DNA、 または請求項 3に記載のベクターを保 持する形質転換細胞。
5 . 配列番号： 2に記載アミノ酸配列において、 1 7 6位のアルギニンがグル 夕ミン、 1 7 9位のアルギニンがダル夕ミン、 または 1 7 9位のアルギニン がトリブトフアンに変異したアミノ酸配列からなるタンパク質。
6 . 配列番号： 2に記載アミノ酸配列において、 1 7 6位のアルギニンがグル 夕ミン、 1 7 9位のアルギニンがグル夕ミン、 または 1 7 9位のアルギニン がトリブトファンに変異したァミノ酸配列からなるタンパク質における、 少 なくとも 1から 1 9 0位までのアミノ酸配列を有する断片。
7 . 請求項 4に記載の形質転換細胞を培養し、 該形質転換細胞またはその培養 上清から発現させたタンパク質を回収する工程を含む、 請求項 5または 6に 記載の夕ンパク質の製造方法。
8 . 請求項 1もしくは 2に記載の DNA、 請求項 3に記載のベクター、 または請 求項 5もしくは 6に記載の夕ンパク質を含有する、 血中リン濃度を低下させ るための医薬組成物。
9. 血中カルシウム濃度には影響を与えない、 請求項 8に記載の医薬組成物 c
10. 高リン血症の治療のための請求項 8または 9に記載の医薬組成物。
1 1. 請求項 1または 2に記載の DNAを患者へ投与することを含む髙リン血 症を治療する方法。
PCT/JP2001/011482 2000-12-26 2001-12-26 Mutant de la proteine fgf23 humaine reduisant le taux de phosphore dans le sang WO2002052009A1 (fr)

Priority Applications (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US10/451,942 US20040097414A1 (en) 2000-12-26 2001-12-26 Human fgf23 protein mutants lowering blood phosphorus level
EP01271888A EP1354949A4 (en) 2000-12-26 2001-12-26 HUMAN FGF23 PROTEIN MUTANT FOR REDUCING THE BLOOD PHOSPHORUS MIRROR
JP2002553490A JPWO2002052009A1 (ja) 2000-12-26 2001-12-26 血中リン濃度を低下させるヒトｆｇｆ２３タンパク質変異体
IL15650401A IL156504A0 (en) 2000-12-26 2001-12-26 Human fgf23 protein mutant lowering blood phosphorus level
KR10-2003-7008559A KR20030074678A (ko) 2000-12-26 2001-12-26 혈중 인농도를 저하시키는 인간 ｆｇｆ２３ 단백질 변이체
CA002433171A CA2433171A1 (en) 2000-12-26 2001-12-26 Human fgf23 protein mutants decreasing blood phosphorus level
HK04105649A HK1062835A1 (en) 2000-12-26 2004-07-31 Human fgf23 protein mutant lowering blood phosphorus level

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2000396316 2000-12-26
JP2000-396316 2000-12-26
JP2001-161370 2001-05-29
JP2001161370 2001-05-29

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2002052009A1 true WO2002052009A1 (fr) 2002-07-04

Family

ID=26606754

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2001/011482 WO2002052009A1 (fr) 2000-12-26 2001-12-26 Mutant de la proteine fgf23 humaine reduisant le taux de phosphore dans le sang

Country Status (10)

Country Link
US (1) US20040097414A1 (ja)
EP (1) EP1354949A4 (ja)
JP (1) JPWO2002052009A1 (ja)
KR (1) KR20030074678A (ja)
CN (1) CN1269960C (ja)
CA (1) CA2433171A1 (ja)
HK (1) HK1062835A1 (ja)
IL (1) IL156504A0 (ja)
RU (1) RU2003123108A (ja)
WO (1) WO2002052009A1 (ja)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8889621B2 (en) * 2009-10-30 2014-11-18 New York University Inhibiting binding of FGF23 to the binary FGFR-Klotho complex for the treatment of hypophosphatemia
WO2013027191A1 (en) * 2011-08-25 2013-02-28 Novartis Ag Methods and compositions using fgf23 fusion polypeptides
JP6190871B2 (ja) * 2012-03-30 2017-08-30 ノバルティス アーゲー 低リン血症性障害の処置に使用するためのｆｇｆｒ阻害剤
US9657075B2 (en) 2012-06-07 2017-05-23 New York University Chimeric fibroblast growth factor 23 proteins and methods of use
CN103224557B (zh) * 2012-08-08 2014-10-01 温州医学院 一种长效型成纤维细胞生长因子-23拮抗剂的开发
US9550820B2 (en) 2013-02-22 2017-01-24 New York University Chimeric fibroblast growth factor 23/fibroblast growth factor 19 proteins and methods of use
CN106456714A (zh) 2014-03-28 2017-02-22 纽约大学 Fgf23融合蛋白

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000073454A1 (en) * 1999-06-02 2000-12-07 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2184296A1 (en) * 2000-07-19 2010-05-12 Advanced Research And Technology Institute, Inc. Fibroblast growth factor (fgf23) and methods for use

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000073454A1 (en) * 1999-06-02 2000-12-07 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"The ADHR consortium, autosomal dominant hypophosphataemic rickets is associated with mutations in FGF23", NAT. GENET., vol. 26, November 2000 (2000-11-01), pages 345 - 348, XP001000443 *
See also references of EP1354949A4 *
YAMASHITA, T. ET AL.: "Identification of a novel fibroblast growth factor, FGF-23, preferentially expressed in the ventrolateral thalamic nucleus of the brain", BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMUN., vol. 277, no. 2, October 2000 (2000-10-01), pages 494 - 498, XP001055003 *

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2002052009A1 (ja) 2004-04-30
HK1062835A1 (en) 2004-11-26
CN1269960C (zh) 2006-08-16
CA2433171A1 (en) 2002-07-04
RU2003123108A (ru) 2005-02-27
IL156504A0 (en) 2004-01-04
EP1354949A1 (en) 2003-10-22
US20040097414A1 (en) 2004-05-20
KR20030074678A (ko) 2003-09-19
CN1492927A (zh) 2004-04-28
EP1354949A4 (en) 2004-05-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE60025241T2 (de) HäMOPOIETINREZEPTOR-PROTEIN, NR12
ES2339843T3 (es) Proteina receptora de hematopoyetina novedosa, nr10.
JP5395767B2 (ja) トランスポーター遺伝子ｏａｔｐ−ｂ、ｃ、ｄ、およびｅ
US20070072236A1 (en) Novel type II Na/Pi cotransporters and type II Na/Pi cotransporter expression regulatory factors
KR20010006534A (ko) Ⅱ형 ｔｇｆ-베타 수용체／면역글로불린 불변 영역 융합 단백질
WO2002052009A1 (fr) Mutant de la proteine fgf23 humaine reduisant le taux de phosphore dans le sang
WO2005082402A1 (ja) 臓器線維症予防・治療剤
US20070122866A1 (en) Protein having PGE2 synthase activity and use thereof
JP2000515727A (ja) 腫瘍壊死因子関連ポリペプチド
JP4979870B2 (ja) 腎不全治療剤
US20090197317A1 (en) TSG-Like Gene
JP2000502902A (ja) 膵臓癌に関連する新規ポリヌクレオチドｐａｎｃ１ａ及びｐａｎｃ１ｂ
JPWO2002020770A1 (ja) Ａｒｆタンパクとｈｋ３３タンパクの相互作用を利用した抗腫瘍作用を持つ薬剤のスクリーニング方法
EP1312675B1 (en) Protein induced by homogeneous blood transfusion and dna encoding the same
JP2001517944A (ja) 新規なヒトサイトカイン／ステロイド受容体タンパク質
JP2002300878A (ja) 新規ｂＨＬＨ型転写因子遺伝子、ＤＥＣ２
US20020041870A1 (en) Novel genes expressed in obese rat hypothalamus
WO2024184649A1 (en) Synthetic promoters
WO2001066720A1 (fr) Genes de souris d&#39;origine adipocyte
JPWO2004055184A1 (ja) グルコース及び／又はフルクトーストランスポータＮａＧＬＴ１及びその遺伝子
WO1999006547A2 (fr) Produits de therapie genique et proteique de la mucoviscidose et inducteurs d&#39;une fonction de glutathion-s-transferase
WO2001044470A1 (fr) Nouvelle helicase d&#39;arn humain appelee helicaine
JP2001161379A (ja) サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ遺伝子
JP2004267003A (ja) ヒト白血球型抗原領域に存在する新規遺伝子
JPWO2004074483A1 (ja) Ｔｓｇ遺伝子ノックアウト動物

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NO NZ OM PH PL PT RO RU SD SE SG SI SK SL TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2002553490

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 156504

Country of ref document: IL

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1020037008559

Country of ref document: KR

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2433171

Country of ref document: CA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2002217522

Country of ref document: AU

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2001271888

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 018228356

Country of ref document: CN

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 1020037008559

Country of ref document: KR

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2001271888

Country of ref document: EP

REG Reference to national code

Ref country code: DE

Ref legal event code: 8642

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 10451942

Country of ref document: US

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Ref document number: 2001271888

Country of ref document: EP