WO2005082402A1

WO2005082402A1 - 臓器線維症予防・治療剤

Info

Publication number: WO2005082402A1
Application number: PCT/JP2005/004024
Authority: WO
Inventors: Yasuo Kokai
Original assignee: Hokkaido Technology Licensing Office Co., Ltd.
Priority date: 2004-03-02
Filing date: 2005-03-02
Publication date: 2005-09-09
Also published as: WO2005084702A1

Abstract

本発明は、線維化を予防し、臓器線維症を予防、治療することのできる臓器線維症予防・治療剤を提供することを目的とする。本発明の臓器繊維症予防・治療剤は、顆粒球コロニー刺激因子を含有する。本発明の臓器繊維症予防・治療剤は、抗繊維化効果を有し、従来、有効な治療方法のなかった臓器繊維症の予防・治療に有効である。

Description

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明細書臓器線維症予防 ·治療剤技術分野

本発明は、従来、治療方法のなかった臓器線維症を予防 ·治療することのできる、臓器線維症予防 ·治療剤に関する。背景技術

肺線維症、皮膚硬化症、肝硬変等の臓器線維症は、細胞外マトリックスが組織に沈着することにより引き起こされる疾患であるとされている。'過剰に沈着した細胞外マトリックスは、組織の非可逆的な変化を引き起こし、臓器不全に至る予後不良の病態を引き起こす。

例えば、肺線維症は胞壁における慢性的な炎症、及び膠原線維の増加により肺胞構造の破壊をきたし、終局的には呼吸不全に至る疾患である。

また、肝臓は再生力の非常に強い臓器として知られているが、慢性肝疾患においては持続的な肝細胞壊死後の再生過程において線維化が起こり、正常な肝細胞の再生を妨げることにより起こると考えられている。

また、皮膚硬化症は皮膚が硬化することが特徴であり、慢性に経過する疾患である。全身性の場合は、内臓が硬化し、心筋の周囲に硬い線維が蓄積し、拘束型の心筋症の原因ともなる。

臓器線維症は、生体内のあらゆる臓器で発生し得るものであり、通常は組織の機能低下と密接に関わるものである。特に、種々の疾患の末期症状において臓器線維症が発生することが報告されている。生体内部の組織の繊維化については、通常はエコー等の検査や組織の一部を採取し、例えばハイドロキシプロリンの定量を行うことによって検査をすることができる。しかしながら、組織の繊維化を検査し、組織の繊維化が発見されたとしても、繊維化を対象とする有効な治療方法については知られていないのが現状である。臓器線維症を予防 ·抑制する医薬品としては、例えば特開平 8— 2 6 8 9 0 6号公報には、肝臓増殖因子を有効成分として含有する肺線維症予防剤が、特開平 1 1 - 2 6 9 0 7 6号公報には、ケラタン硫酸オリゴ糖を有効成分とする抗線維化剤が、特開 2 0 0 2— 3 7 1 0 0 6号公報には、ト口ンボモジュリン様タンパク質を有効成分として含有する肺線維症の予防 ·進行防止剤が開示されている。

しかし、上記特許文献に開示された予防剤等によっては、完全に臓器線維症を予防、治療等することはできなかった。

また、臨床血液 3 5 : 2 1 9 9 3年発行第 1 3 5〜 1 4 0頁には、慢性骨髄性白血病に伴う骨髄繊維化の治療に G— C S F投与が有効である可能性があることが開示されている。しかしながら、特許文献 1は、慢性骨髄性白血病に伴う骨髄繊維化に G— C S Fが有効であることを開示しており、 G— C S Fの有する造血作用によって上記効果を発揮するものと思われる。

従って、上記公報等に開示された予防剤等によっては、臓器線維症を完全に予防、治療することは困難であった。

一方、腎機能が低下している患者に対しては、その治療として人工透析が行なわれている。人工透析を長期に続けた場合、患者の血管において血管石灰化障害が顕著に認められる。この血管石灰化に対しては、効果的な治療方法が確立されていないのが現状である。

従って、本発明の目的は、線維化を予防し、臓器線維症を予防、治療することのできる臓器線維症予防 '治療剤を提供することにある。また、本発明の目的は、血管石灰化を予防、治療することのできる、血管石灰化予防 ·治療剤を提供することにある。発明め開示

本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意検討した結果、造血系細胞に選択的に作用し、好中球の分化や増殖を促進するサイト力インである、顆粒球コロニー刺激因子が抗線維化作用を有することを見出し、顆粒球コロニー刺激因子が臓器線維症を予防 ·治療し得るという知見を得、本発明を完成させた。本発明は上記知見に基づいてなされたものであり、顆粒球コロニー刺激因子を含有することを特徴とする臓器線維症予防 ·治療剤を提供するものである。

本発明の臓器線維症予防 ·治療剤に含有される顆粒球コロニー刺激因子は、遺伝子組み換え型顆粒球コロニー刺激因子であってもよい。

本発明の臓器線維症予防 ·治療剤は、徐放性製剤であることが好ましい。

また、徐放性製剤は、少なくとも 7日間にわたって顆粒球コロニー刺激因子を放出するように製剤化されてなることが好ましく、 .医療ポンプであってもよい。

また、本発明は、顆粒球コ口ニー刺激因子遺伝子を含有することを特徴とする臓器線維症予防 ·治療剤を提供するものである。

また、本発明は、上記臓器線維症予防 ·治療剤を用いることを特徴とする臓器線維症予防 ·治療方法を提供するものである。図面の簡単な説明

図 1は、マウスの膠原繊維の太さを測定した結果を示すグラフである。

図 2は、マウスの臓器中のデコリン及び T G F— の発現をゥ.ヱスタンプロット法で調べた結果である。

図 3は、マウスの膠原繊維の電子顕微鏡写真である。

図 4は、マウスの膠原繊維の太さを測定した結果を示すグラフである。

図 5は、' 肺線維症の抑制効果を調べた結果を示す写真である。

図 6は、肺線維症の抑制効果を調べた結果を示すグラフである。発明を実施するための最良の形態

以下、まず本発明の臓器線維症予防 ·治療剤について説明する。

本発明の臓器線維症予防，治療剤は、顆粒球コロニー刺激因子（以下、本明細書において「G— C S F」ともいう）を含有する。本発明の臓器線維症予防 ·治療剤に含有される G— C S Fは、造血系細胞に選択的に作用し、好中球の分化や増殖を促進するサイトカインであると定義され、この定義に包含される G— C S F活性を有するポリペプチドであればいずれでもよく、例えば天然物（人の生体試料等）から抽出、分離、精製したもの、 G_C S F産生細胞を培養し、その培養上清から単離したもの、細胞融合法を用いて G— C S F産生ハイプリドーマを形成し、これから取得したもの、遣伝子組み換えによって、大腸菌、動物細胞等の宿主を形質転換して得た形質転換体から産生せしめ単離精製したもの、又はそれを化学修飾したもの等のいずれも使用可能である。

本発明においては、上述した G— C S Fのいずれかと一定以上の相同性を有するものであれば使用可能である。この相同性に関しては、好ましくは 30%以上であり、更に好ましくは 50%以上である。

本発明においては、遺伝子組み換え型 G— C S Fを用いてもよい。遺伝子組み換え技術を利用して G— C S Fを調製する場合には、 G_C S Fをコードする遺伝子、例えば配列番号： 1で表わされる塩基配列の情報に基づき、適当な DNA部分を P CRプライマーとして用い、例えば RT— P CRプライマー反応を行うことによつてクローニングすることができる。該クローニングは、例えば、 Molecular Cloning;A Laboratory Manual 2^ηα Ed. , Cold Spring Harbor Labroratory Press (1989)等の本書に従い、当業者であれば容易に実施することができる。また、本発明において用いられる G— C S F遺伝子は、配列番号： 1で表わされるものに限定されず、活性を損なわない程度の改変等を有するものであってもよい。

例えば、（i)配列番号： 1で表わされる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズする DNA、又は（ii)配列番号： 1で表わされる DNAが発現することにより得られるタンパク質のアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたァミノ酸配列からなるタンパク質をコードする D N Aであって、かつ発現することにより、 G— C S F活性を示し得る DNAであれば、本発明において用いることができる。上記（i)の DNAは、通常のハイブリダィゼーシヨン法により得ることができ、上記（ii)の DNAは、上記（i)の DNAに変異を導入することによって得ることができる。 DNAに変異を導入する方法としては、例えば Kunkel 法、 Gapped duple法等の公知の手法又はこれに準ずる方法を採用することができる。例えば、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（Mutant-K (TAKARA 社製）や Mutant- G (TAKARA社製））等を用いて、変異の導入を行うことができる。また、「ストリンジェントな条件」としては、上述した Molecular Cloningに記載のハイプリダイゼーシヨンの条件等が挙げられ、具体的には、 DIG DNA Labeling (口シュ ·ダイァグノスティックス社製）でプローブをラベルした場合に、 32°Cの DIG Easy Hyb溶液（ロシュ · ダイァグノスティックス社製）中でハイプリダイズさせ、 4 0°Cの O.lxSSC 溶液（0. l%[w/v]SDS を含む）中でメンプレンを洗浄する条件（lxSSC は 0.15M NaCl, 0.015M クェン酸ナトリウムである）でのサザンプットハイプリダイゼーションで上記 D N Aプローブにハイプリダイズする程度の条件をいう。本発明において用いられる G— C S Fの調製は、上記 DNAを含有する組換べクターを、当該技術分野で公知の方法によって作成し、得られた組換ベクターを宿主細胞に形質転換し、該形質転換体を培養し、 G— CS Fを生成、蓄積し、該タンパク質を採取することにより製造することができる。培養し、前記タンパク質が蓄積されるのは、培養上清のほか、培養細胞もしくは培養菌体又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。本発明において形質転換体を培養する方法は、特に制限はなく、宿主の培養において用いられる通常の方法でよい。

用いられるベクターとしては、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えばプラスミド DNA、ファージ DNA等が挙げられる。配列番号： 1で表わされる DN Aを含有する DN A断片を切り出し、該 DN A断片を適当な発現ベクター中のプロモーター下流に連結することにより実施される。ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、 p BR322, p B R 3 25 , pUC 1 8、 pUC 1 9、 p UC 1 1 8又は p B l u e s c r i p t等）、枯草菌由来のプラスミド（例、 p U B 1 1 0 , p TP 5又は！） C 1 94)、酵母由来プラスミド（例、： S H 1 9、 p S H 1 5、 YE p 1 3又は YC p 50等）、 λファージ等のバタテリオファージ、レト口ウィルス，ヮクシニアウィルス又はバキュ口ウィルス等の動物ウィルス等を利用することができる。本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応した適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、宿主が大腸菌である場合は、 t r pプロモーター、 l a cプロモーター、 r e c A プロモーター、 PLプロモーター、 1 p ρプロモーター、 T7プロモーター、 T3プ口モーター、 _araBAD プロモーター等が、宿主がバチルス属菌である場合は、 SP01 プロモーター、 penP プロモーター、 XYL プロモータ一、 HWP プロモーター、 CWP プロモーター等が、宿主が枯草菌である場合は、 S P〇 1プロモーター、 S P〇 2 プロモーター、 p e n Pプロモーター等、宿主が酵母である場合は、 PH05プロモーター、 P GKプロモーター、 GAPプロモーター、 ADHプロモーター等が好ましい。動物細胞を宿主として用いる場合は、 S R aプロモーター、 SV4 0プロモーター、 LTRプロモーター、 CMVプロモーター、 H S V—TKプロモーター等が挙げられる。また、昆虫細胞を宿主として用いる場合はポリヘドリンプロモータ一、 OplE2プロモーター等が好ましい。

発現ベクターには、以上の他に、所望により当該技術分野で公知の、ェンハンサ一、スプライシングシグナル、ポリ A付加シグナル、選択マーカ一、 SV4 0複製オリジン（以下、 SV 40 o r i と略称する場合がある）等を付加することができる。また、必要に応じて、本発明の DNAにコードされた蛋白質を他の蛋白質（例えば、ダルタチオン S トランスフェラーゼ及びプロテイン A) との融合蛋白質として発現させることも可能である。このような融合蛋白質は、部位特異的プロテア一ゼを使用して切断し、それぞれの蛋白質に分離することができる。

宿主細胞としては、例えば、ェシエリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞等が用いられる。ェシエリヒア属菌の具体例としては、ェシエリヒァ ' コリ（Escherichia coli) K 1 2 ■ D Η 1 (Proc. Natl. Acad. Sci. US A, 6 0卷， 1 6 0 (1 9 6 8))， JM1 0 3 (Nucleic Acids Research, 9卷， 3 0 9 (1 9 8 1 ))， J A 2 2 1 (Journal of Molecular Biology, 1 20卷， 5 1 7 (1 9 7 8)), HB 1 0 1 (Journal of Molecular Biology, 4 1卷， 4 5 9 (1 9 6 9))、 DH 5 α及び J Ml 0 9等が用いられる。バチルス属.菌としては、例えば、パチルス ·サチルス（Bacillus subtilis) M I 1 1 4 (Gene, 24卷， 25 5 (1 9 8 3)), 2 0 7 - 2 1 [Journal of Biochemistry, 9 5卷， 8 7 (1 9 8 4)〕及ぴバチルス · ブレビス等が用いられる。酵母としては、例えば、サッカロマイセスセレビシェ (Saccaromyces cerevisiae) AH 2 2 , AH 2 2 R—， N A 8 7 - 1 1 A, DKD 一 5 D， 2 0 B— 1 2、シゾサッカロマイセスボンべ (Schizosaccaromyces pombe) NCYC 1 9 1 3, NCYC 2 0 3 6、ピキアパストリス（Pichia pastoris) 及ぴハンセヌラ ·ポリモーフ了 (Hansenula polymorph)等が用いられる。動物細胞としては、例えば、サル細胞 CO S— 7， Vero, チャイニーズハムスター細胞 C H O (以下、 CHO細胞と略記）， d h f r遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞 C HO (以下、 CHO ( d h f r -) 細胞と略記），マウス L細胞，マウス A t T— 2 0 , マウスミエローマ細胞，ラット GH 3, ヒト F L細胞及び HEK 2 9 3細胞等が用いられる。

上述した窄主細胞の形質転換は、当該技術分野で公知の方法に従って行うことができる。例えば、以下に記載の文献に宿主細胞を形質転換する方法が記載されている。 Proc. Natl. Acad. Sci. U SA, 6 9卷， 2 1 1 0 (1 9 7 2) ; Gene, 1 7 卷， 1 0 7 (1 9 8 2) ； Molecular & General Genetics, 1 6 8卷， 1 1 1 (1 9 7 9) ; Methods in Enzymology, 1 9 4卷， 1 8 2— 1 8 7 ( 1 9 9 1 )； Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 7 5卷， 1 9 2 9 (1 9 78) ;細胞工学別冊 8 新細胞工学実験プロトコール. 2 6 3— 26 7 ( 1 9 9 5) (秀潤社発行）；及び Virology, 5 2卷， 4 5 6 (1 9 7 3)。

大腸菌等の細菌への耝換ベクターの導入方法は、細菌に DN Aを導入することのできる方法であれば特に限定されるものではなく、例えばカルシウムイオンを用いる方法（Cohen, S.N. et al.： Proc. Natl. Acad. Sci. , USA, 69： 2110 (1972) , エレクト口ポレーシヨン法等が挙げられる。

酵母を宿主とする場合は、酵母への組換ベクターの導入方法は、酵母に DNAを導入することのできる方法であれば特に限定されず、例えばエレクト口ポレーション法、スフエロプラスト法、酢酸リチウム法等が挙げられる。

動物細胞を宿主とする場合は、動物細胞への組換ぺクタ一の導入方法は、動物細胞に DNAを導入することのできる方法であれば特に限定されず、例えばエレクト口ポレーシヨン法、リン酸カルシウム法、リボフヱクシヨン法等が挙げられる。昆虫細胞を宿主とする場合は、昆虫細胞への組換ベクターの導入方法は、昆虫細胞に D N Aを導入することのできる方法であれば特に限定されず、例えばリン酸力ルシゥム法、リポフエクシヨン法、エレクト口ポレーシヨン法等が挙げられる。遺伝子が宿主に組み込まれたか否かを確認するための方法としては、例えば P C R法、サザンハイブリダィゼーシヨン法、ノーザンハイ；/リダィゼーシヨン法等により行うことができる。例えば、形質転換体から D N Aを調製し、 D N A特異的プライマーを設計して P C Rを行う。 P C Rは、前記プラスミドを調製するために用いた条件と同様の条件にて行われる。次いで、増幅産物についてァガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキヤピラリー電気泳動等を行い、臭化工チジゥム、 SYBR Green液等により染色し、次いで増幅産物を 1本のパンドとして検出し、形質転換されたことを確認することができる。予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いて： P C Rを行い、增幅産物を検出してもよい。更に、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させた後、蛍光又は酵素反応を用いて増幅産物を確認する方法を用いることもできる。

本発明の臓器線維症予防 ·治療剤に用いられる G— C S Fは、前記形質転換体を培養し、 G— C S Fを生成、蓄積し、該タンパク質を採取することにより製造することができる。 G _ C S Fが蓄積されるのは、培養上清のほか、培養細胞もしくは培養菌体又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。本発明において形質転換体を培養する方法は、特に制限はなく、宿主の培養において用いられる通常の方法でよい。

例えば、宿主が大腸菌や酵母等の微生物の場合、形質転換体を培養する培地は、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、例えばグルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアル 'コール類が挙げられる。窒素源としては、例えばアンモニア、塩化アンモニゥム、硫酸アンモニゥム、酢酸アンモニゥム、リン酸アンモ-ゥム等の無機酸又は有機酸のアンモニゥム塩、又はその他の含窒素化合物の他、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカ一等が挙げられる。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第ー鐡、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が挙げられる。培赛は、通常、浸透培養又は通気攪拌培養等の好気的条件の下で行う。培養温度、培養時間は、宿主が大腸菌の場合、約 1 5〜4 3 °Cの温度で約 1 2〜4 8時間行う。宿主がバチルス属菌の場合、約 3 0〜 4 0 °Cの温度で約 1 2〜 1 0 0時間行う。宿主が酵母の場合は、約 2 0〜 3 5 °Cの温度で約 2 4〜： L 0 0時間行う。また、必要に応じて通気や攪拌を加えることができる。 p Hの調製を行う必要がある場合、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。

プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養する場合は、必要に応じてィンデューサーを培地に添加して培養を行う。

動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する場合、用いられる培地としては、一般に用いられている RPMI1640培地、 DMEM培地又はこれらの培地に牛胎児血清等を添加した培地が挙げられる。培養は、好ましくは、 5 %程度の二酸化炭素の存在下で約 3 7 °Cの温度で 1〜 3 0日間行う。

培養後、 G— C S Fが菌体内又は細胞内に生産される場合には、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよびまたは凍結融解等によって菌体又は細胞を破壌したのち、遠心分離やろ過により蛋白質の粗抽出液を得る方法が挙げられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グァニジン等の蛋白質変性剤や、トリトン X— 1 0 0 (登録商標）等の界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中に G— C S Fが分泌される場合には、培養終了後、公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上淸を集める。このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれる蛋白質の精製は、公知の分離 ·精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。すなわち、例えば硫酸アンモニゥム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ァフィ二ティーク口マトグラフィ一等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、目的のタンパク質を生成することができる。

こうして得られた G— C S Fは、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換する' 'ことができる。更に、組換え体が産生する蛋白質を、精製前または精製後に、トリプシン及ぴキモトリプシンのような適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任意に断片化することもできる。また、キナーゼ等のタンパク質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えることもできる。 G— C S Fの存在は、様々な結合アツセィ及び特異抗体を用いたェンザィムィムノアッセィ等により測定することができる。

本発明の臓器線維症予防 '治療剤に用いられる G— C S Fは、そのままで用いてもよく、又は必要に応じて、それら自体公知の薬理学的に許容される担体、賦形剤等と混合して医薬耝成物として、経口又は非経口的に投与することができる。

経口投与のための剤型としては、例えば錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等が挙げられる。 iのような剤型は、自体公知の方法によつて製造することができ、製剤分野において通常に用いられる担体又は賦形剤を含有するものである。担体としては、錠剤用の担体が挙げられ、賦形剤としては、ラクトース、マルトース、サッカロース、でんぷん、ステアリン酸マグネシウム等が挙げられる。

非経口投与のための剤型としては、例えば、軟膏剤、注射剤、湿布剤、塗布剤、座薬、経鼻吸収剤、経肺吸収剤、経皮吸収剤、局所徐放剤等が挙げられる。溶液製剤は、自体公知の方法、例えば、 G— C S Fを通常、注射剤に用いられる無菌の水溶液に溶解、又は抽出液に懸濁、更に乳化してリボソームに包埋させた状態で用い得る。

固体製剤としては、それら自体公知の方法、例えば G— C S Fにマンニトール、トレハロース、ソルビトール、ラタトース、グルコース等を賦形剤として加え、凍結乾燥物として調製することができる。さらに、この凍結乾燥物を粉体化して用いてもよい。また、粉体化した凍結乾燥物をポリ乳酸ゃグリコール酸等と混ぜて固体ィ匕して用いてもよい。また、ゲル化して用いてもよい。

本発明の臓器線維症予防 ·治療剤は徐放性製剤として用いることが好ましい。徐放性製剤とは、有効成分の放出の全てが、投与の直後に行われるのではなく、いくらかの期間だけ遅延されるものを意味する。この放出は一時に行うようにすることもでき、又は徐々に連続して行うことも可能である。なお、徐放性製剤は、少なくとも 7日間にわたって G— C S Fを放出するように製剤化されているものを用いることが好ましい。さらには、 1 4日間にわたって G— C S Fを放出するように製剤ィ匕されているものを用いることが好ましい。このような徐放性製剤としては、例えば医療ポンプ（ォスモチックポンプ）等が挙げられる。ォスモチックポンプを用いることにより、連続的に G— C S Fが放出される。

本発明の Jfe器線維症予防 .治療剤の投与量は、 G— C S Fの量が好ましくは 0 . l〜l g / k g /日になるように投与する。本発明の臓器線維症予防 ·治療剤中の G— C S F含有量に特に制限はなく、上記投与量になるよう,に含有させればよい。次に、本発明の顆粒球コロニー刺激因子遺伝子を含有する、臓器線維症予防 ·治療剤（以下、本明細書において「遺伝子含有臓器線維症予防，治療剤」ともいう）について説明する。本発明の G— C S F遺伝子を含有する臓器線維症予防 ·治療剤において用いられる遺伝子は、配列番号： 1で表わされる塩基配列の情幸に基づき、適当な D N A部分を P C Rプライマーとして用い、例えば R T— P C Rプライマー反応を行うことによってクロニングすることができる。上記遺伝子は、上述した臓器線維症予防 ·治療剤において用いられるものを用いることができる。

本発明の G— C S F遺伝子を含有する臓器線維症予防 ·治療剤の投与方法としては、非ウィルスベクターを用いる場合、及びウィルスベクターを用いる場合が挙げられる。このような投与方法については、例えば、別冊実験医学、遺伝子治療の基礎技術、羊土社、 1996、別冊実験医学、遺伝子導入 &発現解析実験法、羊土社、 1997、日本遺伝子治療学会編遺伝子治療開発研究ハンドプック、ェヌ ·ティー ·エス、 1999 等の実験手引き書に詳しく解説されている。それらの方法について以下、簡単に説明する。 .

非ウィルスベクターを用いて投与する方法としては、慣用の遺伝子発現ベクターに G— C S F遺伝子が組み込まれた組換え発現ベクターを用いて、以下のような手法により G— C S F遺伝子を細胞や組織に導入することができる。

細胞への遣伝子導入法としては、例えばリン酸一カルシウム共沈法；微小ガラス管を用いた D N Aの直接注入法等が挙げられる。

また、組織への遺伝子導入法としては、例えば、内包型リボソーム（internal type liposome)による遺伝子導入法、静電気型リボソーム（electrostatic type liposome ) による遺伝子導入法、 HV J—リポソーム法、改良型 H V J―リポソーム法（HVJ- AVE リボソーム法）、受容体介在性遗伝子導入法、パーティクル銃で担体（金属粒子）とともに DNA 分子を細胞に移入する方法、 n a k e d -DNA の直接導入法、正電荷ポリマーによる導入法等が挙げられる。このような方法によって、組換え発現べクターを細胞内に取り込ませることが可能である。

上述した方法において用いられる発現ベクターとしては、例えば、 p CAGGS (Gene 108, 193— 200(1991)) や、 p BK— CMV、 p c DNA 3. 1、 Z e o S V (インビ卜ロゲン社、ストラタジーン社）等が挙げられる。

また、ウィルスベクターを用いる場合、ウィルスベクターとしては、例えば、組換えアデノウイルス、レトロウイルス等が挙げられる。更に具体的には、無毒化したレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウィルス、ヘルぺスウィルス、ヮクシニアウィルス、ボックスウィルス、ポリオウイルス、シンビスウィルス、センダイウィルス、 SV40、免疫不全症ウィルス（H I V) 等の DNAウィルス又は RNA ウィルスに本発明の PGIS遺伝子を導入し、細胞に組換えウィルスを感染させることによって、細胞内に G— CS FR遺伝子を導入することが可能である。

上述したウィルスベクターのうち、アデノウイルスの感染効率は、他のウィルスベクターを用いた場合よりもはるかに髙いことが知られている。従って、アデノウィルスべクタ一系を用いることが好ましい。

本発明の遺伝子含有臓器線維症予防 ·治療剤の患者への導入法としては、遺伝子含有臓器線維症予防 ·治療剤を直接体内に導入する i n V i V o法、及び、ヒトからある種の細胞を取り出して体外で遺伝子含有臓器線維症予防 ·治療剤を該細胞に導入し、その細胞を体内に戻す e x v i v o法がある（例えば、日経サイェンス， 1994年 4月号， 20-45頁、月刊薬事， 36(1), 23- 48， 1994、実験医学增刊， 12(15), 1994、日本遺伝子治療学会編遺伝子治療開発研究ハンドブック，ェヌ ·ティー ·エス， 1999 等参照）。本発明においては、遣伝子含有臓器線維症予防 ·治療剤を導入した細胞において臓器線維症予防 ·治療効果が誘導されるため、 i n V i V o法によることが好ましい。

i n V i V o法により遣伝子含有臓器線維症予防 ·治療剤を投与する場合は、対象となる細胞、組織、標的臓器等に応じた適当な投与経路により投与され得る。例えば、静脈、動脈、皮下、皮内、筋肉内などに投与するか、又は臓器線維症予防 - 治療効果を期待する臓器そのものに直接局所投与してもよい。

製剤形態としては、上記の各投与形態に合った、液剤等の製剤形態でよい。例えば、有効成分の D N A を含有した注射剤の場合には、該注射剤は常法により調製することができる。例えば、適切な溶剤（P B S等の緩衝液、生理食.塩水、滅菌水等）に溶解した後、必要に応じてフィルタ一等で濾過滅菌した後、無菌的な容器に充填することにより調製することができる。該注射剤には、必要に応じて通常に用いられる担体等を加えてもよい。

疾患部位の周囲に遺伝子を存在し易くするために、徐放性の製剤（ミ-ペレット製剤等）を調製し患部近くに埋め込むことも可能であり、あるいはォスモチックポンプなどを用いて患部に連続的に徐々に投与することも可能である。

前記製剤中の G— C S F遺伝子の含有量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調節することができる。例えば、有効成分の D N A量として好ましくは 0 . 0 0 0 1〜 1 0 O m gであり、更に好ましくは 0 . 0 0 1 ~ 1 0 m gである。本発明の臓器線維症予防 ·治療剤（G— C S Fを含有する臓器線維症予防 ·治療剤及び遺伝子含有臓器線維症予防 ·治療剤）は、抗線維抗効果を有しており、肺線維症、皮膚硬化症、肝硬変、動脈硬化症、間質性心筋炎、間質性膀胱炎、糸級体腎炎、血管炎、糖尿病性腎症、高血圧性腎硬化症、 H I V腎症、 I g A腎症、ループス腎症、間質性腎炎、アルツハイマー病、肝線維症、クローン病、線維形成性膊炎、慢性気管支炎、放射性線維症、嚢胞性線維症等の予防及び治療に用いることができる。

また、血管石灰化症は、その発生過程において、臓器の繊維化が発生した後、繊維化した細胞が石灰化し、徐々に骨化することが知られており、従って、本発明の臓器線維症予防 ·治療剤は、血管石灰化症の予防 '治療にも有効なものである。本発明の臓器線維症予防 ·治療剤は、上述した臓器線維症のみでなく、通常に知られている臓器線維症の予防 '治療に用いることができる。例えば、ブレオマイシン又はその誘導体等の化学物質を投与することによって誘発される、副作用である、肺繊維症等にも有効である。

また、本発明の臓器線維症予防 ·治療剤は、ヒトの他、哺乳動物（例えば、ゥシ、ゥマ、プタ、ヒッジ、ィヌ、ネコ）等における、上記疾病の予防及び治療に適用される。

本発明の臓器繊維症予防 ·治療方法は、上述した本発明の臓器繊維症予防 ·治療剤を用いるものである。実施例

以下に、実施例を示し、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。 .

実施例 1

ヒト顆粒球コロニー刺激因子（以下、 1^0—〇3 とぃぅ）を発現するトランスジエニックマウスを作製した。 h G-C S Fを発現するトランスジエニックマウスを作製するために、 hG— C S Fを誘導する SRaプロモーターを用いた。 SRa プロモーターは、ヒト T細胞白血病ウィルスの RU 5シークェンス及ぴ SV40初期プロモーターから構築されている。 p SR296プラスミドの E c o R Iサイトに h G— C S Fの全長 c DNA (配列番号： 1で表わされる）を揷入し、導入遺伝子の発現ユニットは S a 1 Iで切断し p S R a hG—C S Fを得た。 p S R α hG— C S Fの 2. 3キロペース S a 1 I断片をガラスパウダー（旭硝子社製、 D NA PREP) で精製し、 1 0 mM T r i s— HC 1、 0. 1 mM EDTA ( p H 7. 5) に、マイクロインジェクションをするために 10 μ g/m 1になるように溶解した。マウスの受精卵は、 BDF 1ォスマウスと交尾した過排卵の（C 57 B L/6 XDB A2) B D F 1メスマウスの卵管の卵丘から採取した。上記 D NA断片を受精卵の最も利用しやすい前核に注入した（l〜5 f 1 ) 。 DNAが注入された胚を 0. 5日後に偽妊娠 MCH— I CRマウスの卵管に移植し、分娩させ、 h G-C S Fを発現するトランスジエニックマウスを得た。

上述のようにして得られたトランスジエニックマウスにおける hG— C S Fの発現は、 hG— C S Fタンパク質の定量、及び hG— C S Fの生物学的活性測定により確認した。 hG— C SFタンパク質の定量は EL I SA法により行い、 liG— C S Fの生物学的活性測定は、 hG— C S F依存マウス前骨髄性白血病細胞系（NS F 60) を用いた検定により行った。

トランスジエニックマウスの血中 hG— CS Fタンパク質濃度は 490 p g/m 1であり、コントロールマウスの血中 hG— CS Fタンパク質濃度は 8〜14 p g /m 1であった。

上述のようにして得られたトランスジエニックマウスの 5週齢のォス、メス、 1 2週齢のメス、及び 3 2週齢のメスについて、抗線維化効果を調べた。抗線維化効果については以下のようにしてマウスの膠原線維の太さを測定することにより検定を行った。

マウスの皮膚を背部から採取し、伸展固定を行い、 2. 5%ダルタールアルデヒド中で一昼夜放置した。次いで、常法に従い電顕資料を作成した。すなわち、固定された組織を 1 mmのサイズに細切し、オスミウム酸にて後固定し、アルコールにより脱水した。その後、エボン包埋した組織をガラスナイフで薄切し、トルイジンブルーにて染色し、電子顕微鏡観察部位を決定した。決定された部位の超薄切切片を作製し、酢酸ウランにて染色し電子顕微鏡で観察した。なお、膠原線維の太さの測定は、 1， 000本について行った。

また、コントロールとして、 MCH— I CRマウスについても、同様に、 5週齢のォス、メス、 1 2週齢のメス、及び 32週齢のメスについて膠原繊維の太さを測定した。

結果を図 1に示す。図 1は、 hG— CS Fを産生するトランスジエニックマウス、及ぴ通常のマウスの膠原繊維の太さを測定した結果を示すグラフである。トランスジエニックマウスについての測定結果を図 1 (b) に、通常のマウスについての測定結果を図 1 (a) に示す。図 1 ) 及び（b) のグラフにおいては、横軸は膠原線維の太さであり、縦軸は膠原線維の本数である。

図 1 (a) に示すように、 h G— C S Fを産生していないマウスの膠原線維の太さは、 5週齢のォス（L 5 ）、メス（L 5早）、 1 2週齢のメス（L 1 2早）、 32週齢のメス（L 3 2早）において、 60〜70 nm又は 70〜80 nmにピークがあることがわかる。これに対し、 III 1 (b) に示すように、トランスジェニックマウスは、 5週齢のォスの膠原繊維の太さのピークは 70〜80 timであるが、 5週齢のメス、 1 2週齢のメスについては太さのピークは 60〜70 nmであり、 32週齢のメスは 40〜 50 nmであった。

この結果から明らかなように、 G— C S Fを産生するトランスジエニックマウスにおいては、膠原線維の重合が抑制され、臓器の線維化を抑制する効果があることがわかる。実施例 2

実施例 1で得られた、 hG— C S Fを発現するトランスジエニックマウスの皮膚中のデコリン及ぴ TGF— J3発現についてゥスタンプ口ット法にて測定した。ゥエスタンプロット法に用いる試料は以下のようにして調製した。

すなわち、マウス背部より真皮を取り出し、 1%N'P— 40を含む抽出液を調製し、 SDS— PAGEを行った。 SDS— PAGEの後にタンパク質を PVDF膜に電気的に転写し、膜上で TGF— b及びデコリンの同定を行った。

また、コントロールとして通常のマウスにつ.いても測定を行った。なお、 TGF— βは臓器の線維化を促進し、デコリンは臓器の線維化を抑制することが知られている（細胞第 3 5卷 4号 200 3年細胞外マトリックスの分子病理学等）。

結果を図 2に示す。図 2は、 hG— C S Fを産生するトランスジエニックマウス、及び通常のマウスの臓器中のデコリン及ぴ TGF— )3の発現をウェスタンプロット法で調べた結果である。図 2 (a) はデコリンについての結果であり、図 2 (b) は TGF— j3についての結果である。図 2 (a) 及び（b) において、レーン 1は 5週齢の通常マウス、レーン 2は 1 2週齢の通常マウス、レーン 3は 5週齢のトランスジエニックマウス、レーン 4は 1 2週齢のトランスジェニックマウスについての結果である。図 2 (a) から明らかなように、トランスジエニックマウスにおいてはデコリンの産生量が通常のマウスよりも増加していた。これに対し、図 2 (b) に示すように、トランスジエニックマウスにおいては TGF— の産生量が通常のマウスよりも減少していた。結果は図示しないが、図 2 (a) 及ぴ（b) の結果をスキャナーで読み取り、それぞれの強度比を比較したところ、 G— CS Fを産生するトランスジエニックマウスにおいては、デコリンの産生量はコントロールマウスの約 2倍であり、 TGF— /3の産生量はコントロールマウスの約 1ノ 4であった _e なお、マウズのアキレス腱、皮膚、大動脈、肺、肝、腎、角膜において同様の結果が得られた。上記結果より、 hG— C S Fを産生するトランスジヱニックマウス中の臓器においては、通常のマウスよりも、臓器の線維化を促進する TGF— j3の量が少なく、臓器の繊維化を抑制するデコリンの量が多くなつており、 hG— CS F は臓器の繊維化を抑制する機能を有することがわかる。実施例 3

h G-C S Fを発現するトランスジエニックマウスの骨髄細胞を、 h G— C S F を発現していないマウスに投与した場合の臓器繊維化抑制効果について調べた。実施例 1で得られた、 hG_C S Fを発現するトランスジエニックマウスの大腿骨力、ら、 23 Gの注射針でフラッシングして骨髄細胞を採取し、 27Gの注射針でピペッティングすることにより、 1個ずつの細胞の懸濁液とした。ナイロンメッシュに通すことにより、細胞のごみや組織の残骸を除去した。次いで、 Du 1 b e c c oのリン酸緩衝生理食塩水で 2回洗浄し、骨髄移植用の骨髄細胞とした。

C 5 7 B L 6マウスに酸性水及びネオマイシンを放射線照射の 7日前に投与した。致死量の放射線（900 c Gyの X線、 25 0 c G y/分) を照射して 3時間以内に、 500 μ 1の骨髄細胞（ 5 , 000，。。。個ノ!!^ ) を尻尾の側脈から注入して骨髄細胞を移植した。骨髄細胞を移植してから 1 2週、及び 3 2週経過した後、実施例 1と同様に抗線維化効果を調べた。

実施例 1と同様にして膠原繊維を採取し、その膠原繊維の電子顕微鏡写真を撮影した。撮影した写真を図 3に示す。図 3 (a) は、骨髄細胞を移植してから 1 2週経過したマウスの膠原繊維の写真であり、図 3 (b) は、骨髄細胞を注入してから 3 2週経過したマウスの膠原繊維の写真である。図 3 (a) 及び（b) から明らかなように、骨髄細胞を移植してから 32週経過したマウスの膠原細胞は、 1 2週経過したマウスのものよりも細くなっていた。次いで、実施例 1と同様にして、膠原繊維を電子顕微鏡で観察し、膠原繊維の太さを測定した。測定結果を図 4に示す。図 4は、 h G— C S Fを産生するトランスジヱニックマウスの骨髄細胞を移植したマゥスの膠原繊維の太さを測定した結果を示すグラフである。図 4においては、横軸が膠原線維の太さであり、縦軸が膠原線維の本数である。図 4 ίこおいて、破線は骨髄細胞を移植して 1 2週経過したマウスについての結果であり、実線は骨髄細胞を移植して 3 2週経過したマウスについての結果である。

図 4に示すように、骨髄細胞を移植して 1 2週経過したマウスの膠原繊維の太さは 5 0〜7 0 n mにピークがあることがわかる。これに対し、骨髄細胞を移植して 3 2週経過したマウスの膠原繊維の太さは 5 0 n mにピークがあることがわかる。この結果から明らかなように、 G - C S Fを産生するトランスジエニックマウスの骨髄細胞を移植されたマウスにおいては、時間の経過とともに、膠原繊維が細くなつていくことがわかる。

従って、 G— C S Fを産生するトランスジヱニックマウスの骨髄細胞を移植されたマウスにおいては、膠原繊維の重合が抑制され、臓器の繊維化を抑制する効果があることがわかる。実施例 4

ブレオマイシン誘導肺線維症モデルマウスを以下のように作製した。マウス（種類： C57BL6、ォス、 1 2週齢） 3 0匹に、ブレオマイシンを、体重 1 g当たり 0 . 0 0 1 5 Uとなるように気管内注入し、ブレオマイシン誘導肺線維症モデルマウスを作製した。

ブレオマイシンを気管内注入して 2週間経過した後、上記マウスを 3分し、 1 0匹に G— C S F ' (中外製薬（株）製、 rG- CSF) を、 1 日当たり 2 5 μ g / k gとなるように、浸透圧ポンプ（米国 DURE社製、商品名「alzet mini-osmotic pump MODEL²00²」）を用いて 4週間皮下持続注入した。また、コントロール群として、マウス 1 0匹に G— C S Fに代えて生理食塩水を浸透圧ポンプで皮下持続注入した。

次いで、ァザン染色を行い、膠原繊維の染色を行った。すなわち、ホルマリン固定パラフィン切片標本を脱パラフィンした後、以下の操作により、ァザン染色を行つた。ホルマリン固定パラフィン切片標本を蒸留水染色後、 1 0%重クロム酸カリゥム、 1 0%トリクロール酢酸液中で 1 0分間水洗し、ァゾカルミン G液に 30分 '浸潰した後、水洗を行った。次いで、、ァ-リン 'アルコール、酢酸アルコールに 1 分間浸潰し、水洗した後、 5%燐タングステン酸に 1時間浸潰し、水洗した。次いで、ァニリン青オレンジ G液に 45分間シンセキし、 1 ◦ 0%エタノールにて分配した後、キシロール透徹後封入して、顕微鏡観察に供した。染色は、コントロール群のマウス、 G— C S F投与群マウスについて行った。 G_C S F投与群マウスについては、 2週間投与したもの及ぴ 4週間投与したものについて行った。

結果を図 5に示す。図 5において、（a) はコントロール群マウス、（b) は G— C S F 2週間投与群マウス、（c) は G— C S F 4週間投与群マウスの結果である。図 5に示すように、コントロール群マウスにおいては、肺線維症が見られたのに対し、 G— C S F 2週間投与群マウスにおいては、肺線維症が抑制されており、 G— C S F 4週間投与群マウスにおいては、肺線維症の抑制は更に顕著であった。

次いで、膠原繊維の量をハイドロキシプロリンを定量することによって測定した。ハイドロキシプロリンの定量は以下のように行った。試料を 1M塩酸中にて水解後、水に溶解し、クロラミン T液（1. 4 gのクロラミン Tを 20m lの水に溶解したもの、 30m 1のメチルセ口ソルブ、 50 m 1のリン酸緩衝液（ρΗ6.0)) に 20 分間室温でインキュベーションした。その後、 1 m lの過塩素酸溶液（70%過塩素酸 27m 1を水にて 1 0 Om 1にしたもの）を加え、 5分間、室温でインキュべーシヨンした。次いで、 1 m 1の p—ジメチルァミノベンツアルデヒド溶液（20 ■ gの p—ジメチルァミノベンズアルデヒドをメチルセロスルブに溶解して 1 00m 1にしたもの）を加え、 6 0°Cで 20分間加熱した後、水で室温まで冷却し、 5 6 O nmにて比色定量した。

ハイド口.キシプロリンの定量は、ブレオマイシンを投与する代わりに、生理食塩水を投与したマウスについても行った。ハイドロキシプロリンの定量は、 G— C S F又は生理食塩水を投与開始してから 2週間後、及び 4週間後に行った。結果を図 6に示す。図 6 (a)は、ブレオマイシンを投与した後に生理食塩水を 2週間投与したマウス、 (b)はブレオマイシンを投与した後に生理食塩水を 4週間投与したマウス、（c)はブレオマイシンを投与した後に G- CSFを 2週間投与したマウス、（d)はブレオマイシンを投与した後に G- CSF を 4週間投与したマウス、（e) はブレオマイシンを投与せずに生理食塩水を 2週間投与したマウス、（f)はブレオマイシンを投与せずに生理食塩水を 4週間投与したマウスの結果である。

図 6に示すように、ハイドロキシプロリンの量は、コントロール群マウスにおいて、肺あたり 2 5 0 g以上であつたのに対し、 G— C S F投与群マウスにおいては、 2週間投与したマウスにおいて、肺あたり約 1 7 0 Z gであり、 4週間投与したマウスにおいては、約 9 0 gであり、コントロール群と比較し、 1 / 3以下であった。なお、ブレオマイシンに代えて生理食塩水を投与したマウスにおいては、ハイドロキシプロリンは微量検出された。

結果から明らかなように、 G— C S Fは、ブレオマイシンによって誘導される肺線維症を抑制することがわかる。

以上詳述した通り、顆粒球コ口ニー刺激因子が抗繊維化効果を有することが見出された。本発明の臓器繊維症予防 ·治療剤は、抗繊維化効果を有しており、従来、治療方法のなかった臓器繊維症の予防 ·治療に有効な効果を発揮する。

また、本発明の臓器繊維症予防 ·治療方法は、従来、治療方法のなかった臓器繊維症の予防 ·治療に有効である。

Claims

1 . 顆粒球コロニー刺激因子を含有することを特徴とする臓器線維症予防 ·治療剤。

2 . 前記顆粒球コロニー刺激因子が、遺伝子組み換え型顆粒球コロニー刺激因子である、請求項 1に記載の臓器線維症予防 ·治療剤。

3 . 徐放性製剤である、請求項青 1又は 2に記載の臓器線維症予防 ·治療剤。

4 . 徐放性製剤が、少なくとも 7 ·日求間にわたって顆粒球コロニー刺激因子を放出するように製剤化されてなる、請求項 3にの記載の臓器線維症予防 ·治療剤。

5 . 徐放性製剤が医療ポンプである、請求項 3に記載の臓器線維症予防 ·治療剤。

囲

6 . 顆粒球コロニー刺激因子遺伝子を含有することを特徴とする臓器線維症予防 ·治療剤。

7 . 臓器線維症が、肺線維症、皮膚硬化症、動脈硬化症、間質性心筋炎、間質性膀胱炎、桑級体腎炎、血管炎、糖尿病性腎症、高血圧性腎硬化症、 H I V腎症、 I g A腎症、ループス腎症、間質性腎炎、肝線維症、クローン病、線維形成性腌炎、慢性気管支炎、放射性線維症、嚢胞性線維症又は血管石灰症である、請求項 1又は 6に記載の臓器線維症予防 ·治療剤。

8 . 臓器線維症が化学物質により誘発されたものである、請求項 1又は 6に記載の臓器線維症予防 ·治療剤。 '

9 . 化学物質がブレオマイシン又はその誘導体であり、臓器線維症が肺線維症である、請求項 7に記載の臓器線維症予防 ·治療剤。 '

1 0 . 請求項 1〜 9のいずれか 1項に記載の臓器線維症予防 '治療剤を用いることを特徴とする、臓器線維症予防 ·治療方法。