JPWO2002052009A1 - 血中リン濃度を低下させるヒトfgf23タンパク質変異体 - Google Patents
血中リン濃度を低下させるヒトfgf23タンパク質変異体 Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2002052009A1 JPWO2002052009A1 JP2002553490A JP2002553490A JPWO2002052009A1 JP WO2002052009 A1 JPWO2002052009 A1 JP WO2002052009A1 JP 2002553490 A JP2002553490 A JP 2002553490A JP 2002553490 A JP2002553490 A JP 2002553490A JP WO2002052009 A1 JPWO2002052009 A1 JP WO2002052009A1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- mutant
- arginine
- dna
- fgf23
- protein
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 54
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 title claims abstract description 54
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 title claims abstract description 54
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 title claims abstract description 32
- 239000008280 blood Substances 0.000 title claims abstract description 32
- 101100281001 Homo sapiens FGF23 gene Proteins 0.000 title abstract description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 59
- 201000005991 hyperphosphatemia Diseases 0.000 claims abstract description 12
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 47
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 39
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 claims description 27
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 25
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 25
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 22
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 17
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 14
- 239000011575 calcium Substances 0.000 claims description 12
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 claims description 10
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 9
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 9
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 claims description 8
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 4
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 32
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 abstract description 22
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 abstract description 17
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 5
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 abstract description 5
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 abstract description 5
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 abstract description 5
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 abstract 1
- 102100024802 Fibroblast growth factor 23 Human genes 0.000 description 49
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 48
- 101001051973 Homo sapiens Fibroblast growth factor 23 Proteins 0.000 description 44
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 43
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 40
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 32
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 31
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 25
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 19
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 19
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 19
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 18
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 16
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 15
- 108090000569 Fibroblast Growth Factor-23 Proteins 0.000 description 12
- DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N creatinine Chemical compound CN1CC(=O)NC1=N DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 12
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 12
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 11
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 11
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 10
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 10
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 9
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 9
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 9
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 9
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 9
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 8
- 108090000445 Parathyroid hormone Proteins 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 8
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 8
- 210000000110 microvilli Anatomy 0.000 description 8
- 102000003982 Parathyroid hormone Human genes 0.000 description 7
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 7
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 7
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 7
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 7
- 239000000199 parathyroid hormone Substances 0.000 description 7
- OGBMKVWORPGQRR-UMXFMPSGSA-N teriparatide Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CO)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1N=CNC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1N=CNC=1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CNC=N1 OGBMKVWORPGQRR-UMXFMPSGSA-N 0.000 description 7
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 6
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 6
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 6
- 229940109239 creatinine Drugs 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 5
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 5
- -1 for example Proteins 0.000 description 5
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 5
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 4
- 241000255789 Bombyx mori Species 0.000 description 4
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 4
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 4
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 4
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 4
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 description 4
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 4
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 4
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 4
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 4
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 3
- WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N Benzyl alcohol Chemical compound OCC1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000029663 Hypophosphatemia Diseases 0.000 description 3
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 3
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 3
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 3
- PNNCWTXUWKENPE-UHFFFAOYSA-N [N].NC(N)=O Chemical compound [N].NC(N)=O PNNCWTXUWKENPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 3
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 3
- 201000003674 autosomal dominant hypophosphatemic rickets Diseases 0.000 description 3
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 3
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 3
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 3
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 3
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 3
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 3
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 3
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 3
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 3
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 238000011870 unpaired t-test Methods 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 2
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 2
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 241000701822 Bovine papillomavirus Species 0.000 description 2
- 229920002261 Corn starch Polymers 0.000 description 2
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 2
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 2
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000001647 Renal Insufficiency Diseases 0.000 description 2
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 2
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 2
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- SESFRYSPDFLNCH-UHFFFAOYSA-N benzyl benzoate Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(=O)OCC1=CC=CC=C1 SESFRYSPDFLNCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 239000008120 corn starch Substances 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 2
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 201000006370 kidney failure Diseases 0.000 description 2
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 2
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- KSXTUUUQYQYKCR-LQDDAWAPSA-M 2,3-bis[[(z)-octadec-9-enoyl]oxy]propyl-trimethylazanium;chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC(C[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC KSXTUUUQYQYKCR-LQDDAWAPSA-M 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001763 2-hydroxyethyl(trimethyl)azanium Substances 0.000 description 1
- UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 4-isocyanato-4'-methyldiphenylmethane Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1CC1=CC=C(N=C=O)C=C1 UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000215068 Acacia senegal Species 0.000 description 1
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 101100136076 Aspergillus oryzae (strain ATCC 42149 / RIB 40) pel1 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000000035 BCA protein assay Methods 0.000 description 1
- 241000167854 Bourreria succulenta Species 0.000 description 1
- 241000724266 Broad bean mottle virus Species 0.000 description 1
- 101100256223 Caenorhabditis elegans cho-1 gene Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 102000011632 Caseins Human genes 0.000 description 1
- 108010076119 Caseins Proteins 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 235000019743 Choline chloride Nutrition 0.000 description 1
- 208000013725 Chronic Kidney Disease-Mineral and Bone disease Diseases 0.000 description 1
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- 241000725101 Clea Species 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 1
- 208000034656 Contusions Diseases 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- 230000009946 DNA mutation Effects 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 208000001380 Diabetic Ketoacidosis Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000792859 Enema Species 0.000 description 1
- 101900252899 Escherichia coli Xanthine-guanine phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 206010015548 Euthanasia Diseases 0.000 description 1
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102000004366 Glucosidases Human genes 0.000 description 1
- 108010056771 Glucosidases Proteins 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 1
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 1
- 229920000084 Gum arabic Polymers 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 1
- 208000000038 Hypoparathyroidism Diseases 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 108010053229 Lysyl endopeptidase Proteins 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000246386 Mentha pulegium Species 0.000 description 1
- 235000016257 Mentha pulegium Nutrition 0.000 description 1
- 235000004357 Mentha x piperita Nutrition 0.000 description 1
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091061960 Naked DNA Proteins 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 description 1
- 241000282579 Pan Species 0.000 description 1
- 241000282520 Papio Species 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 241001505332 Polyomavirus sp. Species 0.000 description 1
- HCBIBCJNVBAKAB-UHFFFAOYSA-N Procaine hydrochloride Chemical compound Cl.CCN(CC)CCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1 HCBIBCJNVBAKAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 206010039020 Rhabdomyolysis Diseases 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 208000005770 Secondary Hyperparathyroidism Diseases 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 1
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- 229920001615 Tragacanth Polymers 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 101100068489 Vicia faba AGPC gene Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 241000269370 Xenopus <genus> Species 0.000 description 1
- 239000000205 acacia gum Substances 0.000 description 1
- 235000010489 acacia gum Nutrition 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 239000000783 alginic acid Substances 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 229960001126 alginic acid Drugs 0.000 description 1
- 150000004781 alginic acids Chemical class 0.000 description 1
- 229940126575 aminoglycoside Drugs 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000000305 astragalus gummifer gum Substances 0.000 description 1
- WZSDNEJJUSYNSG-UHFFFAOYSA-N azocan-1-yl-(3,4,5-trimethoxyphenyl)methanone Chemical compound COC1=C(OC)C(OC)=CC(C(=O)N2CCCCCCC2)=C1 WZSDNEJJUSYNSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019445 benzyl alcohol Nutrition 0.000 description 1
- 229960002903 benzyl benzoate Drugs 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000001364 causal effect Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 235000019693 cherries Nutrition 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- SGMZJAMFUVOLNK-UHFFFAOYSA-M choline chloride Chemical compound [Cl-].C[N+](C)(C)CCO SGMZJAMFUVOLNK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229960003178 choline chloride Drugs 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000003750 conditioning effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 1
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 210000003717 douglas' pouch Anatomy 0.000 description 1
- 239000008298 dragée Substances 0.000 description 1
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 1
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 238000011013 endotoxin removal Methods 0.000 description 1
- 239000007920 enema Substances 0.000 description 1
- 229940079360 enema for constipation Drugs 0.000 description 1
- 210000003191 femoral vein Anatomy 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 description 1
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 239000007973 glycine-HCl buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000000703 high-speed centrifugation Methods 0.000 description 1
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical class [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 235000001050 hortel pimenta Nutrition 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- 239000000644 isotonic solution Substances 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000000464 low-speed centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L magnesium chloride Substances [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 1
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 239000007758 minimum essential medium Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 238000001668 nucleic acid synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000000174 oncolytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000849 parathyroid Effects 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 101150040383 pel2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150050446 pelB gene Proteins 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- 229940021222 peritoneal dialysis isotonic solution Drugs 0.000 description 1
- WVDDGKGOMKODPV-ZQBYOMGUSA-N phenyl(114C)methanol Chemical compound O[14CH2]C1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-ZQBYOMGUSA-N 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 239000013630 prepared media Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 229960001309 procaine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 238000012514 protein characterization Methods 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 208000006078 pseudohypoparathyroidism Diseases 0.000 description 1
- 238000001953 recrystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 201000006409 renal osteodystrophy Diseases 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 208000007442 rickets Diseases 0.000 description 1
- CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N saccharin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)NS(=O)(=O)C2=C1 CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019204 saccharin Nutrition 0.000 description 1
- 229940081974 saccharin Drugs 0.000 description 1
- 239000000901 saccharin and its Na,K and Ca salt Substances 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 235000011803 sesame oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008159 sesame oil Substances 0.000 description 1
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- 229960002920 sorbitol Drugs 0.000 description 1
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Polymers 0.000 description 1
- 239000007940 sugar coated tablet Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 1
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000000472 traumatic effect Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 125000000430 tryptophan group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C2=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C12 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 235000021247 β-casein Nutrition 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0271—Chimeric vertebrates, e.g. comprising exogenous cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/12—Drugs for disorders of the metabolism for electrolyte homeostasis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/50—Fibroblast growth factor [FGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5082—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms
- G01N33/5088—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms of vertebrates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Hematology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Diabetes (AREA)
Abstract
ヒトFGF23タンパク質をコードする全長cDNAを単離し、該cDNAに変異導入法により、1アミノ酸が置換された変異体を構築した。該変異体は、体内で発現することにより血中のリン濃度を低下させる効果を有していた。該変異体および該変異体をコードするDNAは、高リン血症に対する治療薬または遺伝子治療への応用が期待される。
Description
技術分野
本発明は、血中のリン濃度を低下させるFGF23タンパク質変異体、並びに該変異体の用途に関する。
背景技術
FGF23は、京都大学の伊藤らによってクローニングされた遺伝子であり、脳で発現されていることが確認されている(Yamashita T.et al.(2000)Biochem.Biophys.Res.Commun.277:494−498、国際公開01/66596号公報)。また、LUETHYらは、FGF23遺伝子をクローニングし、該遺伝子を発現するトランスジェニックマウスの作出を行い、該マウスの表現型を解析している(国際公開01/61007号公報)。
一方、先天的低リン血症であるクル病患者の遺伝的家系解析によりFGF23の突然変異(R176Q、R179Q、R179W)が原因であるという報告がなされた(The ADHR Consorium(2000)Nat.Genet.26:345−348)。
しかしながら、この報告においては、タンパク質または全長cDNAを取得したとの記載はなく、また、FGF23遺伝子に見られる上記の変異と低リン血症との因果関係も明らかになっていない。
発明の開示
本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は血中のリン濃度を低下させるFGF23タンパク質の変異体および該変異体をコードするDNA、並びにそれらの用途を提供することにある。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行い、血中のリン濃度を低下させることが期待されるFGF23タンパク質の変異体の作製を試みた。まず、ヒトFGF23遺伝子の全長cDNAの単離を行い、次いで、PCR法により該変異体をコードするDNAを合成し、発現ベクターへクローニングした。該発現ベクターを静脈内投与法によりマウス体内へ導入し、マウス体内で該変異体を発現させ、その後のマウスにおける血中リン濃度を測定した。その結果、FGF23変異体の発現により、マウス血中のリン濃度が有意に低下することを見出した。
即ち、本発明者らは、FGF23タンパク質変異体を作製することに成功するとともに、該変異体を利用してマウス血中のリン濃度を低下させることに成功し、これにより本発明を完成するに至った。本発明のFGF23タンパク質変異体は、このように血中のリン濃度を低下させる能力を有することから、高リン血症の治療のための薬剤となるものと大いに期待される。
本発明は、血中のリン濃度を低下させるFGF23タンパク質変異体、および該変異体をコードするDNA、並びにそれらの用途に関し、より具体的には、
〔1〕 配列番号:2に記載アミノ酸配列において、176位のアルギニンがグルタミン、179位のアルギニンがグルタミン、または179位のアルギニンがトリプトファンに変異したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA。
〔2〕配列番号:2に記載アミノ酸配列において、176位のアルギニンがグルタミン、179位のアルギニンがグルタミン、または179位のアルギニンがトリプトファンに変異したアミノ酸配列からなるタンパク質における、少なくとも1から190位までのアミノ酸配列を有する断片をコードするDNA。
〔3〕 〔1〕または〔2〕に記載のDNAが挿入されたベクター。
〔4〕 〔1〕若しくは〔2〕に記載のDNA、または〔3〕に記載のベクターを保持する形質転換細胞。
〔5〕 配列番号:2に記載アミノ酸配列において、176位のアルギニンがグルタミン、179位のアルギニンがグルタミン、または179位のアルギニンがトリプトファンに変異したアミノ酸配列からなるタンパク質。
〔6〕 配列番号:2に記載アミノ酸配列において、176位のアルギニンがグルタミン、179位のアルギニンがグルタミン、または179位のアルギニンがトリプトファンに変異したアミノ酸配列からなるタンパク質における、少なくとも1から190位までのアミノ酸配列を有する断片。
〔7〕 〔4〕に記載の形質転換細胞を培養し、該形質転換細胞またはその培養上清から発現させたタンパク質を回収する工程を含む、〔5〕または〔6〕に記載のタンパク質の製造方法。
〔8〕 〔1〕もしくは〔2〕に記載のDNA、〔3〕に記載のベクター、または〔5〕もしくは〔6〕に記載のタンパク質を含有する、血中リン濃度を低下させるための医薬組成物。
〔9〕 血中カルシウム濃度には影響を与えない、〔8〕に記載の医薬組成物。
〔10〕 高リン血症の治療のための〔8〕または〔9〕に記載の医薬組成物。
〔11〕〔1〕または〔2〕に記載のDNAを患者へ投与することを含む高リン血症を治療する方法、を提供するものである。
本発明は、血中リン濃度を低下させるFGF23タンパク質変異体をコードするDNAを提供する。本発明のDNAによりコードされる変異体には、配列番号:2に記載のヒトFGF23タンパク質のアミノ酸配列において、176位のアルギニン残基がグルタミンへ置換された変異体、179位のアルギニン残基がグルタミンへ置換された変異体、および179位のアルギニンがトリプトファンへ置換された変異体(以下、それぞれ「R176Q変異体」、「R179Q変異体」、「R179W変異体」と称し、これらをまとめて「FGF変異体」と称する)が含まれる。これら変異体において、好ましい変異体はR176Q変異体およびR179Q変異体であり、最も好ましい変異体は、R179Q変異体である。
本発明は、また、これらFGF変異体の断片を提供する。好ましい断片は、FGF変異体における、少なくとも1から190位のアミノ酸配列を含む断片である。
本発明のFGF23変異体は、血中のリン濃度を低下させる機能を有する。従って、FGF23変異体は、血中における高濃度のリンの存在によって引き起こされる疾患に対して、治療および予防の効果を奏することが期待される。FGF23変異体の好ましい態様においては、血中カルシウム濃度には影響を与えない。
治療または予防効果が期待される疾患としては、例えば、高リン血症を挙げることができる。高リン血症は、一般的に腎からのPO4排泄の減少の結果として発症する。進行した腎不仝(GFRが20mL/分未満)は、血漿PO4の上昇を導くに足る排泄の減少をもたらす。腎不全がなくとも、偽性副甲状腺機能低下症や副甲状腺機能低下症の場合には、腎のPO4排泄に障害が起こることがある。高リン血症は経口PO4の過剰投与や、ときにはリン酸塩を含有する浣腸の使いすぎからも発生することがある。高リン血症はまた、細胞内PO4の細胞外への移動の結果生じることもある。これが頻繁に起こるのは、糖尿病ケトアシドーシス(全身のPO4喪失にも関わらず)や、挫傷、非外傷性横紋筋融解症、それから全身性の感染症および腫瘍溶解症候群である。高リン血症は、二次性副甲状腺機能亢進症や、長期間透析を受けている患者の腎性骨ジストロフィの発症にも決定的な役割を演じている。
本発明のDNAは、後述する本発明の変異体のin vivoやin vitroにおける生産に利用される他、例えば、高血中リン濃度に起因する疾患の遺伝子治療などへの応用も考えられる。本発明のDNAは、本発明の変異体をコードしうるものであればいかなる形態でもよい。即ち、mRNAから合成されたcDNAであるか、ゲノムDNAであるか、化学合成DNAであるかなどを問わない。また、本発明の変異体をコードしうる限り、遺伝暗号の縮重に基づく任意の塩基配列を有するDNAが含まれる。
本発明のDNAは、ヒトFGF23 cDNAを改変して作製することができる。ヒトFGF23 cDNAは、当業者に公知の方法により調製することができる。例えば、FGF23を発現している細胞よりcDNAライブラリーを作製し、FGF23 cDNAの配列(配列番号:1)の一部をプローブにしてハイブリダイゼーションを行うことにより調製できる。cDNAライブラリーは、例えば、文献(Sambrook,J.et al.,Molecular Cloning、Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))に記載の方法により調製してもよいし、市販のDNAライブラリーを用いてもよい。また、FGF23を発現している細胞よりRNAを調製し、逆転写酵素によりcDNAを合成した後、FGF23 cDNAの配列(配列番号:1)に基づいてオリゴDNAを合成し、これをプライマーとして用いてPCR反応を行い、本発明のポリペプチドをコードするcDNAを増幅させることにより調製することも可能である。
例えば、次のようにすればよい。まず、FGF23を発現する細胞、組織、臓器から、mRNAを単離する。mRNAの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法(Chirgwin,J.M.et al.,Biochemistry(1979)18,5294−5299)、AGPC法(Chomczynski,P.and Sacchi,N.,Anal.Biochem.(1987)162,156−159)等により全RNAを調製し、mRNA Purification Kit(Pharmacia社)等を使用して全RNAからmRNAを精製する。また、QuickPrep mRNA Purification Kit(Pharmacia社)を用いることによりmRNAを直接調製することもできる。
得られたmRNAから逆転写酵素を用いてcDNAを合成する。cDNAの合成は、AMV Reverse Transcriptase First−strand cDNA Synthesis Kit(生化学工業社)等を用いて行うこともできる。また、配列番号:1に記載した配列を基にして作製したプライマー等を用いて、5’−Ampli FINDER RACE Kit(Clontech製)およびポリメラーゼ連鎖反応(polymerase chain reaction;PCR)を用いた5’−RACE法(Frohman,M.A.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1988)85,8998−9002;Belyavsky,A.et al.,Nucleic Acids Res.(1989)17,2919−2932)に従い、cDNAの合成および増幅を行うことができる。
得られたPCR産物から目的とするDNA断片を調製し、ベクターDNAと連結する。さらに、これより組換えベクターを作製し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。目的とするDNAの塩基配列は、公知の方法、例えば、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法により確認することができる。
具体的には、例えば実施例1に記載した方法により、ヒトFGF23 cDNAを取得することができる。
本発明のFGF23変異体を作製するための、ヒトFGF23 cDNAの改変は、当業者によって一般的に行われるDNA変異導入(DNA Mutagenesis)技術によって実施することができる。具体的には、例えば実施例2に示す方法によって行うことができる。
本発明は、また、上記本発明のDNAによりコードされる変異体を提供する。本発明の変異体は、後述するそれを産生する細胞や宿主あるいは精製方法により、アミノ酸配列、分子量、等電点又は糖鎖の有無や形態などが異なり得る。しかしながら、得られた変異体が、血中におけるリン濃度を低下させる能力を有する限り、本発明に含まれる。例えば、本発明の変異体を原核細胞、例えば大腸菌で発現させた場合、本来の変異体のアミノ酸配列のN末端にメチオニン残基が付加されるが、このような変異体も本発明に含まれる。
本発明の変異体は、当業者に公知の方法により、組み換えポリペプチドとして調製することが可能である。組み換えポリペプチドであれば、本発明の変異体をコードするDNAを、適当な発現ベクターに組み込み、これを適当な宿主細胞に導入して得た形質転換体を回収し、抽出物を得た後、イオン交換、逆相、ゲル濾過などのクロマトグラフィー、あるいは本発明の変異体に対する抗体をカラムに固定したアフィニティークロマトグラフィーにかけることにより、または、さらにこれらのカラムを複数組み合わせることにより精製し、調製することが可能である。
また、本発明の変異体をグルタチオンS−トランスフェラーゼ蛋白質との融合ポリペプチドとして、あるいはヒスチジンを複数付加させた組み換えポリペプチドとして宿主細胞(例えば、動物細胞や大腸菌など)内で発現させた場合には、発現させた組み換えポリペプチドはグルタチオンカラムあるいはニッケルカラムを用いて精製することができる。融合ポリペプチドの精製後、必要に応じて融合ポリペプチドのうち、目的の変異体以外の領域を、トロンビンまたはファクターXaなどにより切断し、除去することも可能である。
本発明は、また、本発明のDNAが挿入されたベクターを提供する。本発明のベクターは、宿主細胞内において本発明のDNAを保持したり、本発明の変異体を発現させるために有用である。
ベクターとしては、例えば、大腸菌を宿主とする場合には、ベクターを大腸菌(例えば、JM109、DH5α、HB101、XL1Blue)などで大量に増幅させ大量調製するために、大腸菌で増幅されるための「ori」をもち、さらに形質転換された大腸菌の選抜遺伝子(例えば、なんらかの薬剤(アンピシリンやテトラサイクリン、カナマイシン、クロラムフェニコールにより判別できるような薬剤耐性遺伝子)を有すれば特に制限はない。ベクターの例としては、M13系ベクター、pUC系ベクター、pBR322、pBluescript、pCR−Scriptなどが挙げられる。また、cDNAのサブクローニング、切り出しを目的とした場合、上記ベクターの他に、例えば、pGEM−T、pDIRECT、pT7などが挙げられる。本発明の変異体を生産する目的においてベクターを使用する場合には、特に、発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、例えば、大腸菌での発現を目的とした場合は、ベクターが大腸菌で増幅されるような上記特徴を持つほかに、宿主をJM109、DH5α、HB101、XL1−Blueなどの大腸菌とした場合においては、大腸菌で効率よく発現できるようなプロモーター、例えば、lacZプロモーター(Wardら,Nature(1989)341,544−546;FASEB J.(1992)6,2422−2427)、araBプロモーター(Betterら,Science(1988)240,1041−1043)、またはT7プロモーターなどを持っていることが不可欠である。このようなベクターとしては、上記ベクターの他にpGEX−5X−1(ファルマシア社製)、「QIAexpress system」(キアゲン社製)、pEGFP、またはpET(この場合、宿主はT7 RNAポリメラーゼを発現しているBL21が好ましい)などが挙げられる。
また、ベクターには、ポリペプチド分泌のためのシグナル配列が含まれていてもよい。ポリペプチド分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、pelBシグナル配列(Lei,S.P.et al J.Bacteriol.(1987)169,4379)を使用すればよい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法を用いて行うことができる。
大腸菌以外にも、例えば、本発明の変異体を製造するためのベクターとしては、哺乳動物由来の発現ベクター(例えば、pcDNA3(インビトロゲン社製)や、pEGF−BOS(Nucleic Acids.Res.1990,18(17),p5322)、pEF、pCDM8)、昆虫細胞由来の発現ベクター(例えば「Bac−to−BAC baculovairus expression system」(ギブコBRL社製)、pBacPAK8)、植物由来の発現ベクター(例えばpMH1、pMH2)、動物ウィルス由来の発現ベクター(例えば、pHSV、pMV、pAdexLcw)、レトロウィルス由来の発現ベクター(例えば、pZIPneo)、酵母由来の発現ベクター(例えば、「Pichia Expression Kit」(インビトロゲン社製)、pNV11、SP−Q01)、枯草菌由来の発現ベクター(例えば、pPL608、pKTH50)が挙げられる。
CHO細胞、COS細胞、NIH3T3細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えばSV40プロモーター(Mulliganら,Nature(1979)277,108)、MMLV−LTRプロモーター、EF1αプロモーター(Mizushimaら,Nucleic Acids Res.(1990)18,5322)、CMVプロモーターなどを持っていることが不可欠であり、細胞への形質転換を選抜するための遺伝子(例えば、薬剤(ネオマイシン、G418など)により判別できるような薬剤耐性遺伝子)を有すればさらに好ましい。このような特性を有するベクターとしては、例えば、pMAM、pDR2、pBK−RSV、pBK−CMV、pOPRSV、pOP13などが挙げられる。
さらに、遺伝子を安定的に発現させ、かつ、細胞内での遺伝子のコピー数の増幅を目的とする場合には、核酸合成経路を欠損したCHO細胞にそれを相補するDHFR遺伝子を有するベクター(例えば、pCHOIなど)を導入し、メトトレキセート(MTX)により増幅させる方法が挙げられ、また、遺伝子の一過性の発現を目的とする場合には、SV40 T抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つCOS細胞を用いてSV40の複製起点を持つベクター(pcDなど)で形質転換する方法が挙げられる。複製開始点としては、また、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス(BPV)等の由来のものを用いることもできる。さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドトランスフェラーゼ(APH)遺伝子、チミジンキナーゼ(TK)遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Ecogpt)遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素(dhfr)遺伝子等を含むことができる。
一方、動物の生体内で本発明のDNAを発現させる方法としては、本発明のDNAを適当なベクターに組み込み、例えば、レトロウィルス法、リポソーム法、カチオニックリポソーム法、アデノウィルス法などにより生体内に導入する方法などが挙げられる。これにより、血中における高濃度のリンの存在に起因する疾患に対する遺伝子治療を行うことが可能である。用いられるベクターとしては、例えば、アデノウイルスベクター(例えばpAdexlcw)やレトロウイルスベクター(例えばpZIPneo)などが挙げられるが、これらに制限されない。ベクターへの本発明のDNAの挿入などの一般的な遺伝子操作は、常法に従って行うことが可能である(Molecular Cloning,5.61−5.63)。生体内への投与は、ex vivo法であっても、in vivo法であってもよい。
また、本発明は、本発明のベクターが導入された宿主細胞を提供する。本発明のベクターが導入される宿主細胞としては特に制限はなく、例えば、大腸菌や種々の動物細胞などを用いることが可能である。本発明の宿主細胞は、例えば、本発明の変異体の製造や発現のための産生系として使用することができる。本発明の変異体の製造のための産生系は、in vitroおよびin vivoの産生系がある。in vitroの産生系としては、真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。
真核細胞を使用する場合、例えば、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を宿主に用いることができる。動物細胞としては、哺乳類細胞、例えば、CHO(J.Exp.Med.(1995)108,945)、COS、3T3、ミエローマ、BHK(baby hamster kidney)、HeLa、Vero、両生類細胞、例えばアフリカツメガエル卵母細胞(Valle,et al.,Nature(1981)291,358−340)、あるいは昆虫細胞、例えば、Sf9、Sf21、Tn5が知られている。CHO細胞としては、特に、DHFR遺伝子を欠損したCHO細胞であるdhfr−CHO(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1980)77,4216−4220)やCHOK−1(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1968)60,1275)を好適に使用することができる。動物細胞において、大量発現を目的とする場合には特にCHO細胞が好ましい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法、カチオニックリボソームDOTAP(ベーリンガーマンハイム社製)を用いた方法、エレクトロポレーション法、リポフェクションなどの方法で行うことが可能である。
植物細胞としては、例えば、ニコチアナ・タバカム(Nicotiana tabacum)由来の細胞がポリペプチド生産系として知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス(Saccharomyces)属、例えば、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、糸状菌、例えば、アスペルギルス(Aspergillus)属、例えば、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)が知られている。
原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌(E.coli)、例えば、JM109、DH5α、HB101等が挙げられ、その他、枯草菌が知られている。
これらの細胞を目的とするDNAにより形質転換し、形質転換された細胞をin vitroで培養することによりポリペプチドが得られる。培養は、公知の方法に従い行うことができる。例えば、動物細胞の培養液として、例えば、DMEM、MEM、RPMI1640、IMDMを使用することができる。その際、牛胎児血清(FCS)等の血清補液を併用することもできるし、無血清培養してもよい。培養時のpHは、約6〜8であるのが好ましい。培養は、通常、約30〜40℃で約15〜200時間行い、必要に応じて培地の交換、通気、攪拌を加える。
一方、in vivoでポリペプチドを産生させる系としては、例えば、動物を使用する産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。これらの動物又は植物に本発明の変異体をコードするDNAを導入し、動物又は植物の体内で該変異体を産生させ、回収する。本発明における「宿主」とは、これらの動物、植物を包含する。
動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系がある。哺乳類動物としては、ヤギ、ブタ、ヒツジ、マウス、ウシを用いることができる(Vicki Glaser,SPECTRUM Biotechnology Applications,1993)。また、哺乳類動物を用いる場合、トランスジェニック動物を用いることができる。
例えば、本発明の変異体をコードするDNAを、ヤギβカゼインのような乳汁中に固有に産生されるポリペプチドをコードする遺伝子との融合遺伝子として調製する。次いで、この融合遺伝子を含むDNA断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ移植する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギ又はその子孫が産生する乳汁から、本発明の変異体を得ることができる。トランスジェニックヤギから産生されるポリペプチドを含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい(Ebert,K.M.et al.,Bio/Technology(1994)12,699−702)。
また、昆虫としては、例えばカイコを用いることができる。カイコを用いる場合、本発明の変異体をコードするDNAを挿入したバキュロウィルスをカイコに感染させることにより、このカイコの体液から該変異体を得ることができる(Susumu,M.et al.,Nature(1985)315,592−594)。
さらに、植物を使用する場合、例えばタバコを用いることができる。タバコを用いる場合、本発明の変異体をコードするDNAを植物発現用ベクター、例えばpMON 530に挿入し、このベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)のようなバクテリアに導入する。このバクテリアをタバコ、例えば、ニコチアナ・タバカム(Nicotiana tabacum)に感染させ、本タバコの葉より本発明の変異体を得ることができる(Julian K.−C.Ma et al.,Eur.J.Immunol.(1994)24,131−138)。
これにより得られた本発明の変異体は、宿主細胞内または細胞外(培地など)から単離し、実質的に純粋で均一なポリペプチドとして精製することができる。ポリペプチドの分離、精製は、通常のポリペプチドの精製で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、組み合わせればポリペプチドを分離、精製することができる。
クロマトグラフィーとしては、例えばアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる(Strategies for Protein Purification and Characterization:A Laboratory Course Manual.Ed Daniel R.Marshak et al.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1996)。これらのクロマトグラフィーは、液相クロマトグラフィー、例えばHPLC、FPLC等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。本発明は、これらの精製方法を用い、高度に精製された変異体も包含する。
なお、本発明の変異体を精製前又は精製後に適当な蛋白質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり部分的にペプチドを除去することもできる。蛋白質修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、リシルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グルコシダーゼなどが用いられる。
本発明はまた、本発明の変異体、該変異体をコードするDNA、または該DNAが挿入されたベクターを含有する血中リン濃度を低下させるための医薬組成物を提供する。
本発明の変異体を、ヒトや他の動物、例えばマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ニワトリ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、サル、マントヒヒ、チンパンジーの医薬として使用する場合には、変異体自体を直接患者に投与する以外に、公知の製剤学的方法により製剤化した医薬組成物として投与を行うことも可能である。例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤として経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
錠剤、カプセル剤に混和することができる添加剤としては、例えばゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸のような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖又はサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油又はチェリーのような香味剤が用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記の材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばD−ソルビトール、D−マンノース、D−マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート80TM、HCO−50と併用してもよい。
油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。
患者への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射などのほか、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、経皮的、または経口的に当業者に公知の方法により行いうる。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。
本発明の変異体の投与量は、その1回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法によっても異なるが、例えば注射剤の形では通常成人(体重60kgとして)においては、1日あたり約100μgから20mgであると考えられる。
非経口的に投与する場合は、その1回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法によっても異なるが、例えば注射剤の形では通常成人(体重60kgとして)においては、通常、1日当り約0.01から30mg、好ましくは約0.1から20mg、より好ましくは約0.1から10mg程度を静脈注射により投与するのが好都合であると考えられる。他の動物の場合も、体重60kg当たりに換算した量、あるいは体表面積あたりに換算した量を投与することができる。
また、本発明のDNAを医薬組成物として用いる場合には、上述したように本発明のDNAを生体内でその発現を保証するベクターに組み込み、例えば、レトロウィルス法、リポソーム法、カチオニックリポソーム法、アデノウィルス法などにより生体内に導入すればよい。これにより、高血中リン濃度に起因する疾患に対する遺伝子治療を行うことが可能である。生体内への投与においては、ex vivo法やin vivo法を利用することができる。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
[実施例1] ヒトFGF23の全長cDNA(ORF部分)のクローニング
FGF−23の全長cDNA(ORF部分)クローニングはPCR法により行った。プライマーはGenbank data(アクセッションNo.ABO37973)を基にし、そこにEcoRIサイトおよびXhoIサイトを付加してデザインした(5’−ggAATTCTCgAgCCACCATgTTgggggCCCgCCTCAggCTCTg−3’/配列番号:3、5’−ggAATTCTCgAgCTACTAgATgAACTTggCgAAgg−3’/配列番号:4)。さらに5’側のプライマーには開始コドンATGの上流にコザック配列(CCACC)を付加し、3’側の配列には終止コドンTGAを二つ付加した。プライマー作製はサワディーテクノロジー社に外注した。鋳型にはhuman heart cDNA(Origene社のMultiple cDNA kit、Cat.No.CH−1101)を使用し、PCR反応にはQIAGEN PCR kit(QIAGEN社 Cat.No.201223)を使用した。すなわち、0.75μlのhuman heart cDNA(Origene社のMultiple cDNA kit)、2.5μlのQIAGEN 10xPCRバッファー、0.5μlのdNTP mix(200mM)、0.25μlのQIAGEN Taq DNAポリメラーゼ、5.0μlの5 x Q−solution、0.5μlのSpecific Forward PCR primer(50μM、配列番号:3)、0.5μlのSpecific Reverse PCR primer(50μM、配列番号:4)、そして15μlのDDWを加え、全量25μlとして、以下の条件でPCR反応をサーマルサイクラーABI2400を用いて行った。一次変性は95℃で2分、そして35サイクルの2ステップシャトルPCR(94℃で40秒、60℃で1分)を行い、最後に伸長反応を72℃で7分行い、PCR反応を終了した。PCR反応による増幅産物を1.0%アガロース電気泳動で確認した結果、単一の特異的バンドが約750bp付近で確認されたため、TOPO TAクローニングキット(Invitorogen社Cat.No.K45000−01)により、2μlのPCR反応液を使用してTAベクターpCR2.1へのサブクローニングを行った。操作はキット添付のプロトコールに従って行った。そして、TAクローニングされたクローン#3の塩基配列解析をM13 M4プライマー(TaKaRa社Cat.No.3832A)、M13 RVプライマー(TaKaRa社Cat.No.3830A)、配列番号:5に記載のプライマー(5’−CgCACCCCATCAgACCATCT−3’)、および配列番号:6に記載のプライマー(5’−gCAgTTCTCCgggTCgAAATA−3’)を使用し、ABI377 DNAシーケンサーにより解析を行った。その結果、クローン#3の内部配列はヒトFGF−23と完全に一致し、FGF−23のクローニングを完了した。
[実施例2] ヒトFGF変異体(R176Q、R179Q、R179W、R176Q+R179Q、R176Q+R179W)の作製
ヒトFGF−23を鋳型にFGF−23変異体R176Q(M1)、R179Q(M2)、R179W(M3)、R176Q+R179Q(M4)、R176Q+R179W(M5)の作製を行った。ヒトFGF−23より文献(Autosomal dominant hypophosphataemic rickets is associated with mutations in FGF23 Nature Genetics Vol.26 p345−348.November 2000)に従って、527G→A(R176Q)、536G→A(R179Q)、535C→T(R179W)の3種類およびそれらの組み合わせM4(R176Q+R179Q)とM5(R176Q+R179W)の作製を行った。プライマー合成はサワディーテクノロジー社に外注した。使用したプライマーの塩基配列は次の通りである。
・5’−CACggCAgCACACCCggAgC−3’(配列番号:7)
・5’−CACggCggCACACCCAgAgC−3’(配列番号:8)
・5’−CACggCggCACACCTggAgC−3’(配列番号:9)
・5’−CACggCAgCACACCCAgAgC−3’(配列番号:10)
・5’−CACggCAgCACACCTggAgC−3’(配列番号:11)
変異導入(Mutagenesis)は1st PCRにおいて、変異導入のための部分フラグメントを作製し、2nd PCRにより変異の入っている全長変異体の鋳型を作製し、最終的に3rd PCRにより完全な変異体を得るという3ステップによる方法にて行った。すなわち、0.2μlのヒトFGF−23のクローン#3(40ng/μl)、5μlのTaKaRA EX 10xPCRバッファー、4μlのdNTP mix(50μM)、0.5μlのTaKaRa EX Taq DNAポリメラーゼ、0.5μlのSpecific mutant primer(50μM、配列番号:7、8、9、10、11)、0.5μlのSpecific Reverse PCR primer(50μM、配列番号:4)、そして39.3μlのDDWを加え、全量50μlとして、以下の条件でPCR反応をサーマルサイクラーABI2400により行った。一次変性は95℃で2分、そして35サイクルの2ステップシャトルPCR(94℃で40秒、60℃で30秒)を行い、最後に伸長反応を72℃で4分を行い、PCR反応を終了した。PCR反応による増幅産物を1.0%アガロース電気泳動で確認した結果、単一の特異的バンドが約200bp付近で確認された。このゲルからそれぞれの特異的増幅フラグメント(R176QとR179Q)をQIAquick Gel Extraction kit(QIAGEN社Cat.No.28704)によりキット添付のプロトコールに従って精製した。その精製フラグメント(変異体部分配列)を用いて次に2nd PCR反応(変異体の全長の鋳型を作製)を行った。1μlの精製フラグメントをプライマーとして使用し、0.1μlのヒトFGF−23のクローン#3(40ng/μl)、2.5μlのTaKaRa EX 10xPCRバッファー、2μlのdNTP mix(50μM)、0.25μlのTaKaRa EX Taq DNAポリメラーゼ、そして18.15μlのDDWを加え、全量24μlとして、以下の条件で2nd PCR反応をサーマルサイクラーABI2400を用いて行った。一次変性は95℃で2分、そして5サイクルの3ステップサイクルPCR(94℃で1分、60℃で1分、72℃で1分)を行い、2nd PCRを終了した。引き続き、この反応液に0.5μlのSpecific Forward PCR primer(50μM、配列番号:3)、0.5μlのSpecific Reverse PCR primer(50μM、配列番号:4)を加え、全量25μlとして、以下の条件で3rd PCR反応をサーマルサイクラーABI2400により行った。一次変性は95℃で2分、そして35サイクルの2ステップシャトルPCR(94℃で40秒、60℃で1分)を行い、最後に伸長反応を72℃で7分を行い、PCR反応を終了した。最終的に得られたPCR反応による増幅産物を1.0%アガロース電気泳動で確認した結果、特異的に増幅された約750bp付近のバンドが確認された。
以降の解析は実施例1と同様の方法で内部配列のTAクローニングを行い、同様の方法で内部配列の塩基配列解析を行ったところ、各種変異体に対して目的変異を挿入されたクローンの作製に成功した。
[実施例3] 発現ベクターの作製
FGF−23および各種変異体(M1〜M5)の内部配列をpCAGGS3に挿入し、各クローンの発現ベクターを作製した。すなわち、各クローンを制限酵素EcoRIにより切断し、得られたEcoRIフラグメントをQIAquick Gel Extraction kit(QIAGEN社Cat.No.28704)により精製し、EcoRIカットされたpCAGGS3に挿入した。各ベクターをpCGF23、pCGFM1〜5と命名した。
[実施例4] エンドトキシンフリープラスミドの調製
プラスミドDNAを直接in vivoに投与するため、エンドトキシン除去処理を加えた方法によりプラスミド精製を行った。具体的にはEndofree plasmid Maxi kit(QIAGEN社Cat.No.12362)を使用し、pCGF23、pCGFM1〜5のエンドトキシンフリーのプラスミド精製を添付されたプロトコールに従って行った。
[実施例5] FGF−23およびM2(R179Q)のC末端FLAG−taqの付加
pCGF23およびpCGFM2を鋳型に配列番号:3に記載の配列およびFLAG配列を含む配列番号:12に記載のプライマーを使用し、C末端にFLAG配列を含む変異体を作製した。すなわち1μlのpCGF23およびpCGFM2(30ng/μl)、2.5μlのTaKaRa EX 10xPCRバッファー、2μlのdNTP mix(50μM)、0.25μlのTaKaRa EX Taq DNAポリメラーゼ、0.5μlのSpecific Forward PCR primer(50μM、配列番号:11)、0.5μlのSpecific Reverse PCR primer(50μM、5’−ggATCCgAATTCATATgTCACTTATCgTCgTCATCCTTgTAATCgATGAACTTggCgAAgg−3’/配列番号:12)、そして18.5μlのDDWを加え、全量25μlとして、以下の条件でPCR反応をサーマルサイクラーABI2400により行った。一次変性は95℃で2分、そして30サイクルの2ステップサイクルPCR(94℃で30秒、60℃で1分)を行い、最後に伸長反応を72℃で7分を行ってPCR反応を終了した。最終的に得られたPCR反応による増幅産物を1.0%アガロース電気泳動で確認した結果、特異的に増幅された約800bp付近のバンドが確認された。以降の解析は実施例1〜4の方法に準じて行い、最終的に発現ベクターpCGF23−FおよびpCGFM2−Fを作製した。
[実施例6] FGF−23及びM2(R179Q)のN末端FLAG−tagの付加
N末端FLAG−tagつきFGF23発現ベクターは、PCR法を使い以下のように構築した。3ngのpCG23をテンプレート、それぞれ100pmolのSpecific Forward pCR primerと23N FLAG R(GCCCTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCGGCTCTGAGGACGCTC/配列番号:13)あるいは23R1(GGCTCGAGTCAGATGAACTTGGCGAAGG/配列番号:14)と23N FLAG F(GATGACGACGATAAGGGCGGAGGTTCCAGAGCCTATCCCAATG/配列番号:15)をプライマーセットとして使い、Takara Ex Taqとそれに添付のバッファーを使い、1段階目のPCR反応(96℃15秒、55℃15秒、72℃2分、25サイクル)を行った。PCR反応生成物を、ミリポア社のマイクロコン30にかけ、プライマーを除去した後、それぞれのPCR反応生成物を混ぜ合わせたものをテンプレート、FGF Fと23R1をプライマーセットとして使い、1段階目と同じ条件で2段階目のPCR反応を行った。反応終了後、アガロースゲル電気泳動により、PCR反応生成物を精製し、このフラグメントをTOPOクローニングキット(インビトロージェン社製)使いクローニングしてDNA配列を読むことにより、目的の変異が導入されていることおよび不必要な変異が導入されていないことを確認した。配列の確認されたプラスミドを調整し、Eco RIで切断しフラグメントを回収して、あらかじめEco RIで切断しておいたpCAGGS3に組み込んだ。方向性を確認した後、最終的に発現ベクターをpCGF23NFと命名した。
N末端FLAG−tagつきFGF23M2ベクターは1段階目のPCR用のテンプレートにpCGFM2を使った以外、上記と同様の方法で行い作製し、pCGFM2NFと命名した。
[実施例7] naked DNA injection動物実験用発現ベクター作製
naked DNA injection法を用いてマウス成体においてFGF23とその変異体が直接または間接的にリン代謝に影響を及ぼすかどうかを検証した。
使用した材料は以下の通りである。
FGF23発現ベクター(pCGF23)
R176QFGF23変異体発現ベクター(pCGFM1)
R179QFGF23変異体発現ベクター(pCGFM2)
R179WFGF23変異体発現ベクター(pCGFM3)
R176QR179QFGF23変異体発現ベクター(pCGFM4)
R176QR179WFGF23変異体発現ベクター(pCGFM5)
<対照物質(陰性対照物質)>
MOCKベクター(pCAGGS)
形状: 10mM Tris/1mM EDTA(pH8.0)溶液
保存: −20℃、暗所
<調製方法>
投与剤型は溶液であり、調製法はTransIT In Vivo Gene Delivery System(PanVera社)のプロトコールに従った(TransIT登録商標 In Vivo Gene Delivery System(Pan Vera社)standard protocol)。MOCKベクターまたはFGF23発現ベクターまたはFGF23変異体発現ベクターを投与1匹当たり10μg使用した。10μLのTransIT Polymer Solutionと適当量の滅菌水を加えて200μLとし50mLファルコンチューブ中で混合した。5分間室温に放置後、上記の200μL当たり2.8mLの1xDelivery Solutionを加えて全量を3.0mLとして投与液とした。6匹に投与する場合には7匹分の量21mLを調製した。投与液は調製当日に使い切った。
使用動物および飼育条件は、以下の通りである。
<使用動物>
動物種: マウス
系統: Jcl:CD−1(ICR)またはCrj:CD−1(ICR)
性別: 雄
体重: 35〜40g
週齢: 投与時で8〜9週齢
入手先: 日本クレアまたは日本チャールズリバー
安楽死法: 麻酔下放血
馴化期間: 約2週間
群分け法: 無作為抽出
<飼育環境>
室温: 24±2℃
相対湿度: 55±10%
換気回数: 10〜30回/時
照明時間: 5:00〜19:00
飼料: CE−2(日本クレア株式会社)を自由摂取
飲料水: 水道水を自由摂取
<試験方法>
投与経路は静脈内投与、投与量は3mlとし、全量を8秒以内に投与した。
<サンプル採取>
(1)血清
投与後4日後にエーテル麻酔下にて腹部大静脈より全採血した。採取した血液はセパラピットチューブミニ(積水化学工業)に入れ遠心(1400×g,10分間,4℃)し、血清を分離した。血清は測定に供するまで設定温度−20℃の冷凍庫に保存した。
(2)尿
投与後3日目にマウスをガラス製の代謝ケージ(METABOLICA,杉山元医理器)に入れ、4日目まで24時間蓄積尿を採取した。尿は測定に供するまで設定温度−20℃の冷凍庫に保存した。
(3)腎臓
血清採取後、両腎臓を摘出し被膜を剥離除去し、刷子縁膜小胞の精製に供した。
<各パラメータの測定>
血清中または尿中の無機リン(Pi)、カルシウム(Ca)、尿素窒素(UN)、クレアチニン(CRE)は自動分析装置(日立7170E形)にて測定した。血清中の25−hydroxyvitamin D,24,25−dihydroxyvitamin DはCPBA法で,1α,25−dihidroxyvitamin DはRIA2抗体法で測定した。
<統計学的解析方法>
MOCKベクター投与群とFGF23発現ベクター投与群または各FGF23変異体発現ベクター投与群間で、対応のないt検定を行った。有意水準は両側5%とした。解析ソフトはSAS ver.6.12を用いた。
結果、血清生化学値に対する作用は、図1に示したようにADHR患者で同定された点変異を導入した3種類のFGF23変異体発現ベクターであるFGF23−M1、FGF23−M2およびFGF23−M3を投与した群では、変異体の種類に関わらず、MOCK投与群に比べて有意な血中リン値の低下が観察された。しかしながら、これらの点変異を組み合わせた二重変異体発現ベクター、FGF23−M4、FGF23−M5を投与した群では同様に血清リン低下作用は観察されたものの、点変異を組み合わせたことによる相加・相乗効果は認められなかった。野生型FGF23(FGF23−Wild)を投与した群では、血清リン低下作用は認められなかった(図2)。
表1に示すように、その他の血清生化学パラメータ(カルシウム、クレアチニン、尿素窒素)ではMOCK群とFGF23−Wild群及びFGF23−M2群で著明な差は認められなかった。
また、尿中生化学値に対する作用を表す結果は、表2に示したようにFGF23−M2投与群では、MOCK群に比較して一日当たりのリン排泄量が増加する傾向が見られたが、有意な差ではなかった。
また、血清中1α,25(OH)2D3に対する作用を示す結果は、図3に示したようにMOCK投与群に比較して、FGF23−M2投与群およびFGF23−Wild群では著明に1α,25(OH)2D3量が低下していた。FGF23−Wild群ではMOCK群の約半分、FGF23−M2投与群では測定感度以下まで低下していた。
一方、生体内の前駆体である25(OH)D3量はMOCK投与群、FGF23−Wild投与群、FGF23−M2投与群で有意な差は認められなかった。また24,25(OH)2D3量はFGF23−Wild投与群ではMOCK投与群と差は見られなかったもののFGF23−M2投与群では著明に低下していた(表3)。
<刷子縁膜小胞精製>
刷子縁膜小胞の精製は、マグネシウム沈殿法にて行った。すなわち、採取した腎臓に氷冷したMET Buffer(60mM mannitol,1mM EGTA,2.5mM Tris/HCl,pH7.1)を加え、ヒスコトロンで18,000rpm、1分間、ホモジナイズした後に、1/10量の1M MgCl2を加えて攪拌、15分間氷中に放置した。低速遠心(2,000×g、15分間、4℃)にて非粉砕画分を除去後、上清を高速遠心(24,000×g、30分間、4℃)し、沈殿を得た。沈殿にMET Bufferを加えてテフロンホモジナイザー(1,000rpm、10ストローク)で更に粉砕した。再度、1/10量の1M MgCl2を加えて攪拌、15分間氷中後、低速遠心(2,000×g、15分間、4℃)、上清を高速遠心(24,000×g、30分間、4℃)した。得られた沈殿にTransport Buffer−K(100mM mannitol,20mM HEPES/Tris,pH7.4)を加え、プラスチックシリンジ(針20Gおよび27G)で吸引排出を繰り返し、刷子縁膜小胞を得た。
<リン輸送活性測定>
刷子縁膜を用いたリン輸送活性の測定は、迅速濾過法を用いた。すなわち、20μLの刷子縁膜小胞と80μLの反応液(100mM mannitol,20mM HEPES/Tris,pH7.4,125mM NaCl,125nM 32P−KH2PO4)を25℃で1分間反応させ、反応停止液(100mM mannitol,100mM choline chloride,20mM MgSO4,5mM KH2PO4,20mM HEPES/Tris,pH7.4)を1mL加えて反応を停止させた。反応液は、直ちにニトロセルロース膜(孔径0.45μm、直径2.5cm)で吸引濾過し、ニトロセルロース膜を5mLの反応停止液で洗浄した。膜上に捕獲された放射活性を液体シンチレーションカウンターTRI−CARB 2700TR(ベックマン株式会社)を用いて測定し、全リン輸送活性とした。ナトリウム非依存性リン輸送活性の測定は、反応液中の125mM NaClを125mMのKClに変更して行った。ナトリウム依存性リン輸送活性は、全リン輸送活性とナトリウム非依存性リン輸送活性の差より算出した。いずれの活性も、刷子縁膜小胞中のタンパク量をBCA Protein Assay Reagent(PIERCE)を用いて測定し、1分間に単位タンパク量が取り込んだリン量(pmoles/mg protein/min)として表示した。
結果、図4に示したようにFGF23−M2投与群ではMOCK投与群に対して腎臓におけるナトリウム依存性リン輸送担体(Na/Pi)活性は有意に低下していた。一方、ナトリウム非依存性リン輸送活性に変化は認められなかった。
[実施例8] C末端欠失M2FGF23変異体発現ベクターの構築
C末端欠失M2FGF23変異体発現ベクターは、PCR法を使い以下のように構築した。3ngのpCGFM2NFをテンプレート、それぞれ100pmolのSpecific Forward PCR primerとdC188(GGCTCGAGTCAGTCCCGCTCCGAGTC/配列番号:16)、
dC194(GGCTCGAGTCACTTCAGCACGTTCAGGGG/配列番号:17)、
dC200(GGCTCGAGTCAGGTCATCCGGGCCCGGGG/配列番号:18)、
dC210(GGCTCGAGTCAGAGCTCCTGTGAACAGGA/配列番号:19)、
dC217(GGCTCGAGTCAGCTGTTGTCCTCGGCGCT/配列番号:20)、
dC223(GGCTCGAGTCAGTCACTGGCCATCGGGCT/配列番号:21)、
dC240(GGCTCGAGTCAGCCCGTTCCCCCAGCGTG/配列番号:22)あるいは
dC245(GGCTCGAGTCAGCGGCAGCCTTCCGGGCC/配列番号:23)をプライマーセットとして使い、Takara Ex Taqとそれに添付のバッファーを使い、PCR反応(96℃15秒、55℃15秒、72℃2分、25サイクル)を行った。反応終了後、アガロースゲル電気泳動により、PCR反応生成物を精製し、このフラグメントをTOPOクローニングキット(インビトロジェン社製)を使いクローニングして、DNA配列を読むことにより、目的の変異が導入されていることおよび不必要な変異が導入されていないことを確認した。配列の確認されたプラスミドを調整し、Eco RIで切断しフラグメントを回収して、あらかじめEco RIで切断しておいたpCAG GS3に組み込んだ。これらの発現ベクターは各々、pCGdC188(dC188)、pCGdC194(dC194)、pCGdC200(dC200)、pCGdC210(dC210)、pCGdC217(dC217)、pCGdC223(dC223)、pCGdC240(dC240)、pCGdC245(dC245)と命名した。
[実施例9] C末端欠失M2FGF23変異体たんぱく質の発現
1x105個のCOS細胞を1mlのDMEM(10%FCS)培地(GIBCO)に懸濁後、6ウェルプレートにまいた。一晩培養後、1μgの発現ベクター(実施例8に示したpCGdc188〜pCGdc245)を3μLのFuGene(ベーリンガー社製)をを使い細胞に導入した後、さらに一晩培養した。次の日培地を、CHO−S−SFMIIに交換し、さらに2日培養を続けた。2日後培地を回収し、その培地中に発現している変異体たんばく質を、anti−FLAG抗体(M2)(SIGMA)によりウエスタンブロッティング法により解析を行い、変異体たんぱく質の発現を確認した。
[実施例10] COS細胞によるFGF−23変異体(M2)組み換え体の一過性発現
5x106個のCOS細胞を400μlのDMEM(10%FCS)培地(GIBCO)に懸濁後、10μgの発現ベクターpCGFM2−Fを加えてエレクトロポレーションキュベット0.4cm(BIO−RAD)に移し、Gene−pulser(BIO−RAD)を用いて0.26kv、抵抗値∞、960mFの条件でエレクトロポレーションを行った。その後、30mlのDMEM(10%FCS)培地に細胞溶液を懸濁して、175cm2のフラスコ(FALCON)に移し、CO2イキュベーター(ESPEC)に37℃で一昼夜静地した。翌日、30mlのCHO−S−SFMII培地(GIBCO)に培地交換して、3日間培養した。回収した培地を3000rpm、15分間遠心して細胞を取り除き、その培地をanti−FLAG抗体(M2)(SIGMA)によりウエスタンブロッティング法により解析を行い、組み換え体FGF−23変異体(M2)−Fの発現を確認した。
[実施例11] 組み換え体FGF−23(M2)−Fのアフィニティーカラムによる精製
anti−FLAG抗体アフィニティーカラム(SIGMA)を用いて組み換え体FGF−23変異体(M2)−Fの精製を行った。クロマトグラフィー操作はグラディフラックシステム(ファルマシア)を用いた。アフィニティーカラムをPBS−Tにより平衡化した後、実施例10の組み換え体FGF−23変異体(M2)−Fの発現している調製培地をアプライし、グリシンHCl緩衝液(pH3.5)で溶出を行った。そしてメインピークを分画し、SDS−PAGEにより分析したところ、CBB染色レベルでほぼ均一な目的分子量付近のバンドを確認し、組み換え体の調製を終了した(図5)。
[実施例12] 欠失変異体動物実験
投与剤の調製は、TransIT In Vivo Gene Delivery System(PanVera社)のプロトコールに従った。投与1匹当たり図6に示した発現ベクター(MOCKは、実施例7と同じ)10μgに10μLのTransIT Polymer Solutionと適当量の滅菌水を加えて200μLとして混合、5分間室温に放置後、200μL当たり2.8mLの1x Delivery Solutionを加えて全量を3.0mLとして投与液とした。6匹に投与する場合には7匹分の量21mLを調製した。投与液は調製当日に使い切った。
日本チャールズリバー社から購入した8〜9週齢の雌性CD−1(lCR)マウス(35−40g)を1週間馴化後、実験に供した。尾静脈から発現ベクターを含む投与剤3mLを8秒以内に全量投与した。投与後4日後にエーテル麻酔下にて腹部大静脈より全採血し、採取した血液はセパラピットチューブミニ(積水化学工業)に入れ遠心(1400×g,10分間,4℃)し、血清を分離した。
血清中の無機リン(Pi)、カルシウム(Ca)、尿素窒素(UN)、クレアチニン(CRE)は自動分析装置(日立7170E形)にて測定した。
結果を図6に示す。
M2FGF23変異体はアミノ酸251個で構成されているが、C末端部分を短くしていくとアミノ酸200位までのdC200変異体でも同等の血清リン低下作用を有していた。しかしながら194位までのdC194変異体、188位までのdC188変異体と更に短くすると、作用は弱まり、失われていった。ADHR患者では176位もしくは179位のアミノ酸に変異が入るとFGF23がタンパク分解による調節を受けにくくなり、結果的に過剰なFGF23が血中に存在することで低リン血症になると推測されている。従って本実験結果からアミノ酸179位〜200位の部分に血清リン低下作用に重要な部位があると考えられた。
[実施例13] FGF23の副甲状腺甲状腺切除ラットに対する作用
8週齢の雄性SDラットを甲状腺・副甲状腺切除(TPTX)し、数日後、イオン化カルシウムを測定、手術の成否を確認した後に大腿静脈にカテーテルを挿入し、尿サックをしてボールマンケージに固定した。
Harvard Infusion PumpでPTH(1−34)(0.3nmol/mL)またはC−FLAGタグ付きM2FGF23タンパク(6μg/mL)またはベヒクル(0.05% Tween 80/Saline)を1ml/hrの速度で6時間、infusion投与した。infusion開始後4時間目から投与終了6時間目まで採尿し、投与終了後、腹部大静脈より全血採血した。3000rpm x 10min遠心して血清と尿の不溶画分を分離し、日立7170形オートアナライザーで無機リン、カルシウム、クレアチニンを測定した。結果を図7から図9に示す。
図7よりTPTXにより上昇したラットの血清リン濃度はPTH(1−34)投与により正常化した。またM2FGF23投与によっても同様に正常化した。一方、TPTXにより低下した血清カルシウム濃度はPTH(1−34)投与で是正されるものの、M2FGF23投与では殆んど効果がなかった(図8)。このことからM2FGF23はPTHを介して血清リン濃度に作用を及ぼしているのではなく、血清カルシウム濃度に作用を示さないことが明らかとなった。PTH(1−34)では尿中の無機リン/クレアチニン値が上昇していることから血清中のリンは尿中に排泄されたと考えられるが、H2FGF23では無機リン/クレアチニン値が、変化していないことから、血清中のリンは骨にハイドロキシアパタイトとして戻った可能性がある(図9)。
産業上の利用の可能性
本発明により、FGF23タンパク質変異体が提供された。本発明のFGF23変異体は、血中のリン濃度を低下させる効果を有することから、高リン血症の治療および予防薬になるものと期待される。また、本発明のFGF23変異体をコードするDNAは、体内に導入し発現させることにより、血中リン濃度を低下させることから、高リン血症に対する遺伝子治療への応用が期待される。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図1は、血清中の無機リン濃度に対するFG23変異体の効果を示すグラフである。血清中の無機リンは、DNAベクターを導入後4日間計測した。データは平均値±SEMを表す。カラム内の数値は動物の数を表す。*P<0.05対MOCK対照(対応のないt検定)。
図2は、血清中の無機リン濃度に対するFGF23の効果を示すグラフである。血清中の無機リンは、DNAベクターを導入後4日間計測した。データは±SEMを表す。カラム内の数値は動物の数を表す。*P<0.05対MOCK対照(対応のないt検定)。
図3は、血清中の1α,25(OH)2D3濃度におけるFGF23およびFGF23変異体の効果を示すグラフである。血清中の1α,25(OH)2D3は、DNAベクターを導入後4日間計測した。計測には、3動物から得た血清を混合して使用した(n=2,6匹/群)。データは平均値を表す。
図4は、腎臓から単離したBBMVにおけるリン輸送活性に対するFGF23変異体の効果を示すグラフである。nakedベクターDNA導入マウスにおける腎臓刷子縁膜小胞中におけるPi取込み(導入後4日間)。計測には、2動物から得た腎臓を使用した(n=3,6匹/群)。データは平均値±SEMを表す。
図5は、FGF−23(変異体)M2−FのSDS−PAGE解析(CBB染色)の結果を示す写真である。図中のMは、分子量マーカー(BIO−RAD、ブロードレンジ)を表す。
図6は、C末端欠失M2FGF23変異体の血清リン濃度低下作用を示すグラフである。「MOCK」は親ベクターであるpCAGGSを導入したマウスを表す。「Normal」は、正常マウスを表す。
図7は、PTH(1−34)とH2FGF23のTPTXラット血清リン低下作用を示すグラフである。
図8は、PTH(1−34)とM2FGF23のTPTXラット血清カルシウムに対する作用を示すグラフである。
図9は、PTH(1−34)とM2FGF23のTPTXラットにおける腎リン排泄に対する作用を示すグラフである。
本発明は、血中のリン濃度を低下させるFGF23タンパク質変異体、並びに該変異体の用途に関する。
背景技術
FGF23は、京都大学の伊藤らによってクローニングされた遺伝子であり、脳で発現されていることが確認されている(Yamashita T.et al.(2000)Biochem.Biophys.Res.Commun.277:494−498、国際公開01/66596号公報)。また、LUETHYらは、FGF23遺伝子をクローニングし、該遺伝子を発現するトランスジェニックマウスの作出を行い、該マウスの表現型を解析している(国際公開01/61007号公報)。
一方、先天的低リン血症であるクル病患者の遺伝的家系解析によりFGF23の突然変異(R176Q、R179Q、R179W)が原因であるという報告がなされた(The ADHR Consorium(2000)Nat.Genet.26:345−348)。
しかしながら、この報告においては、タンパク質または全長cDNAを取得したとの記載はなく、また、FGF23遺伝子に見られる上記の変異と低リン血症との因果関係も明らかになっていない。
発明の開示
本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は血中のリン濃度を低下させるFGF23タンパク質の変異体および該変異体をコードするDNA、並びにそれらの用途を提供することにある。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行い、血中のリン濃度を低下させることが期待されるFGF23タンパク質の変異体の作製を試みた。まず、ヒトFGF23遺伝子の全長cDNAの単離を行い、次いで、PCR法により該変異体をコードするDNAを合成し、発現ベクターへクローニングした。該発現ベクターを静脈内投与法によりマウス体内へ導入し、マウス体内で該変異体を発現させ、その後のマウスにおける血中リン濃度を測定した。その結果、FGF23変異体の発現により、マウス血中のリン濃度が有意に低下することを見出した。
即ち、本発明者らは、FGF23タンパク質変異体を作製することに成功するとともに、該変異体を利用してマウス血中のリン濃度を低下させることに成功し、これにより本発明を完成するに至った。本発明のFGF23タンパク質変異体は、このように血中のリン濃度を低下させる能力を有することから、高リン血症の治療のための薬剤となるものと大いに期待される。
本発明は、血中のリン濃度を低下させるFGF23タンパク質変異体、および該変異体をコードするDNA、並びにそれらの用途に関し、より具体的には、
〔1〕 配列番号:2に記載アミノ酸配列において、176位のアルギニンがグルタミン、179位のアルギニンがグルタミン、または179位のアルギニンがトリプトファンに変異したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA。
〔2〕配列番号:2に記載アミノ酸配列において、176位のアルギニンがグルタミン、179位のアルギニンがグルタミン、または179位のアルギニンがトリプトファンに変異したアミノ酸配列からなるタンパク質における、少なくとも1から190位までのアミノ酸配列を有する断片をコードするDNA。
〔3〕 〔1〕または〔2〕に記載のDNAが挿入されたベクター。
〔4〕 〔1〕若しくは〔2〕に記載のDNA、または〔3〕に記載のベクターを保持する形質転換細胞。
〔5〕 配列番号:2に記載アミノ酸配列において、176位のアルギニンがグルタミン、179位のアルギニンがグルタミン、または179位のアルギニンがトリプトファンに変異したアミノ酸配列からなるタンパク質。
〔6〕 配列番号:2に記載アミノ酸配列において、176位のアルギニンがグルタミン、179位のアルギニンがグルタミン、または179位のアルギニンがトリプトファンに変異したアミノ酸配列からなるタンパク質における、少なくとも1から190位までのアミノ酸配列を有する断片。
〔7〕 〔4〕に記載の形質転換細胞を培養し、該形質転換細胞またはその培養上清から発現させたタンパク質を回収する工程を含む、〔5〕または〔6〕に記載のタンパク質の製造方法。
〔8〕 〔1〕もしくは〔2〕に記載のDNA、〔3〕に記載のベクター、または〔5〕もしくは〔6〕に記載のタンパク質を含有する、血中リン濃度を低下させるための医薬組成物。
〔9〕 血中カルシウム濃度には影響を与えない、〔8〕に記載の医薬組成物。
〔10〕 高リン血症の治療のための〔8〕または〔9〕に記載の医薬組成物。
〔11〕〔1〕または〔2〕に記載のDNAを患者へ投与することを含む高リン血症を治療する方法、を提供するものである。
本発明は、血中リン濃度を低下させるFGF23タンパク質変異体をコードするDNAを提供する。本発明のDNAによりコードされる変異体には、配列番号:2に記載のヒトFGF23タンパク質のアミノ酸配列において、176位のアルギニン残基がグルタミンへ置換された変異体、179位のアルギニン残基がグルタミンへ置換された変異体、および179位のアルギニンがトリプトファンへ置換された変異体(以下、それぞれ「R176Q変異体」、「R179Q変異体」、「R179W変異体」と称し、これらをまとめて「FGF変異体」と称する)が含まれる。これら変異体において、好ましい変異体はR176Q変異体およびR179Q変異体であり、最も好ましい変異体は、R179Q変異体である。
本発明は、また、これらFGF変異体の断片を提供する。好ましい断片は、FGF変異体における、少なくとも1から190位のアミノ酸配列を含む断片である。
本発明のFGF23変異体は、血中のリン濃度を低下させる機能を有する。従って、FGF23変異体は、血中における高濃度のリンの存在によって引き起こされる疾患に対して、治療および予防の効果を奏することが期待される。FGF23変異体の好ましい態様においては、血中カルシウム濃度には影響を与えない。
治療または予防効果が期待される疾患としては、例えば、高リン血症を挙げることができる。高リン血症は、一般的に腎からのPO4排泄の減少の結果として発症する。進行した腎不仝(GFRが20mL/分未満)は、血漿PO4の上昇を導くに足る排泄の減少をもたらす。腎不全がなくとも、偽性副甲状腺機能低下症や副甲状腺機能低下症の場合には、腎のPO4排泄に障害が起こることがある。高リン血症は経口PO4の過剰投与や、ときにはリン酸塩を含有する浣腸の使いすぎからも発生することがある。高リン血症はまた、細胞内PO4の細胞外への移動の結果生じることもある。これが頻繁に起こるのは、糖尿病ケトアシドーシス(全身のPO4喪失にも関わらず)や、挫傷、非外傷性横紋筋融解症、それから全身性の感染症および腫瘍溶解症候群である。高リン血症は、二次性副甲状腺機能亢進症や、長期間透析を受けている患者の腎性骨ジストロフィの発症にも決定的な役割を演じている。
本発明のDNAは、後述する本発明の変異体のin vivoやin vitroにおける生産に利用される他、例えば、高血中リン濃度に起因する疾患の遺伝子治療などへの応用も考えられる。本発明のDNAは、本発明の変異体をコードしうるものであればいかなる形態でもよい。即ち、mRNAから合成されたcDNAであるか、ゲノムDNAであるか、化学合成DNAであるかなどを問わない。また、本発明の変異体をコードしうる限り、遺伝暗号の縮重に基づく任意の塩基配列を有するDNAが含まれる。
本発明のDNAは、ヒトFGF23 cDNAを改変して作製することができる。ヒトFGF23 cDNAは、当業者に公知の方法により調製することができる。例えば、FGF23を発現している細胞よりcDNAライブラリーを作製し、FGF23 cDNAの配列(配列番号:1)の一部をプローブにしてハイブリダイゼーションを行うことにより調製できる。cDNAライブラリーは、例えば、文献(Sambrook,J.et al.,Molecular Cloning、Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))に記載の方法により調製してもよいし、市販のDNAライブラリーを用いてもよい。また、FGF23を発現している細胞よりRNAを調製し、逆転写酵素によりcDNAを合成した後、FGF23 cDNAの配列(配列番号:1)に基づいてオリゴDNAを合成し、これをプライマーとして用いてPCR反応を行い、本発明のポリペプチドをコードするcDNAを増幅させることにより調製することも可能である。
例えば、次のようにすればよい。まず、FGF23を発現する細胞、組織、臓器から、mRNAを単離する。mRNAの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法(Chirgwin,J.M.et al.,Biochemistry(1979)18,5294−5299)、AGPC法(Chomczynski,P.and Sacchi,N.,Anal.Biochem.(1987)162,156−159)等により全RNAを調製し、mRNA Purification Kit(Pharmacia社)等を使用して全RNAからmRNAを精製する。また、QuickPrep mRNA Purification Kit(Pharmacia社)を用いることによりmRNAを直接調製することもできる。
得られたmRNAから逆転写酵素を用いてcDNAを合成する。cDNAの合成は、AMV Reverse Transcriptase First−strand cDNA Synthesis Kit(生化学工業社)等を用いて行うこともできる。また、配列番号:1に記載した配列を基にして作製したプライマー等を用いて、5’−Ampli FINDER RACE Kit(Clontech製)およびポリメラーゼ連鎖反応(polymerase chain reaction;PCR)を用いた5’−RACE法(Frohman,M.A.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1988)85,8998−9002;Belyavsky,A.et al.,Nucleic Acids Res.(1989)17,2919−2932)に従い、cDNAの合成および増幅を行うことができる。
得られたPCR産物から目的とするDNA断片を調製し、ベクターDNAと連結する。さらに、これより組換えベクターを作製し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。目的とするDNAの塩基配列は、公知の方法、例えば、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法により確認することができる。
具体的には、例えば実施例1に記載した方法により、ヒトFGF23 cDNAを取得することができる。
本発明のFGF23変異体を作製するための、ヒトFGF23 cDNAの改変は、当業者によって一般的に行われるDNA変異導入(DNA Mutagenesis)技術によって実施することができる。具体的には、例えば実施例2に示す方法によって行うことができる。
本発明は、また、上記本発明のDNAによりコードされる変異体を提供する。本発明の変異体は、後述するそれを産生する細胞や宿主あるいは精製方法により、アミノ酸配列、分子量、等電点又は糖鎖の有無や形態などが異なり得る。しかしながら、得られた変異体が、血中におけるリン濃度を低下させる能力を有する限り、本発明に含まれる。例えば、本発明の変異体を原核細胞、例えば大腸菌で発現させた場合、本来の変異体のアミノ酸配列のN末端にメチオニン残基が付加されるが、このような変異体も本発明に含まれる。
本発明の変異体は、当業者に公知の方法により、組み換えポリペプチドとして調製することが可能である。組み換えポリペプチドであれば、本発明の変異体をコードするDNAを、適当な発現ベクターに組み込み、これを適当な宿主細胞に導入して得た形質転換体を回収し、抽出物を得た後、イオン交換、逆相、ゲル濾過などのクロマトグラフィー、あるいは本発明の変異体に対する抗体をカラムに固定したアフィニティークロマトグラフィーにかけることにより、または、さらにこれらのカラムを複数組み合わせることにより精製し、調製することが可能である。
また、本発明の変異体をグルタチオンS−トランスフェラーゼ蛋白質との融合ポリペプチドとして、あるいはヒスチジンを複数付加させた組み換えポリペプチドとして宿主細胞(例えば、動物細胞や大腸菌など)内で発現させた場合には、発現させた組み換えポリペプチドはグルタチオンカラムあるいはニッケルカラムを用いて精製することができる。融合ポリペプチドの精製後、必要に応じて融合ポリペプチドのうち、目的の変異体以外の領域を、トロンビンまたはファクターXaなどにより切断し、除去することも可能である。
本発明は、また、本発明のDNAが挿入されたベクターを提供する。本発明のベクターは、宿主細胞内において本発明のDNAを保持したり、本発明の変異体を発現させるために有用である。
ベクターとしては、例えば、大腸菌を宿主とする場合には、ベクターを大腸菌(例えば、JM109、DH5α、HB101、XL1Blue)などで大量に増幅させ大量調製するために、大腸菌で増幅されるための「ori」をもち、さらに形質転換された大腸菌の選抜遺伝子(例えば、なんらかの薬剤(アンピシリンやテトラサイクリン、カナマイシン、クロラムフェニコールにより判別できるような薬剤耐性遺伝子)を有すれば特に制限はない。ベクターの例としては、M13系ベクター、pUC系ベクター、pBR322、pBluescript、pCR−Scriptなどが挙げられる。また、cDNAのサブクローニング、切り出しを目的とした場合、上記ベクターの他に、例えば、pGEM−T、pDIRECT、pT7などが挙げられる。本発明の変異体を生産する目的においてベクターを使用する場合には、特に、発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、例えば、大腸菌での発現を目的とした場合は、ベクターが大腸菌で増幅されるような上記特徴を持つほかに、宿主をJM109、DH5α、HB101、XL1−Blueなどの大腸菌とした場合においては、大腸菌で効率よく発現できるようなプロモーター、例えば、lacZプロモーター(Wardら,Nature(1989)341,544−546;FASEB J.(1992)6,2422−2427)、araBプロモーター(Betterら,Science(1988)240,1041−1043)、またはT7プロモーターなどを持っていることが不可欠である。このようなベクターとしては、上記ベクターの他にpGEX−5X−1(ファルマシア社製)、「QIAexpress system」(キアゲン社製)、pEGFP、またはpET(この場合、宿主はT7 RNAポリメラーゼを発現しているBL21が好ましい)などが挙げられる。
また、ベクターには、ポリペプチド分泌のためのシグナル配列が含まれていてもよい。ポリペプチド分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、pelBシグナル配列(Lei,S.P.et al J.Bacteriol.(1987)169,4379)を使用すればよい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法を用いて行うことができる。
大腸菌以外にも、例えば、本発明の変異体を製造するためのベクターとしては、哺乳動物由来の発現ベクター(例えば、pcDNA3(インビトロゲン社製)や、pEGF−BOS(Nucleic Acids.Res.1990,18(17),p5322)、pEF、pCDM8)、昆虫細胞由来の発現ベクター(例えば「Bac−to−BAC baculovairus expression system」(ギブコBRL社製)、pBacPAK8)、植物由来の発現ベクター(例えばpMH1、pMH2)、動物ウィルス由来の発現ベクター(例えば、pHSV、pMV、pAdexLcw)、レトロウィルス由来の発現ベクター(例えば、pZIPneo)、酵母由来の発現ベクター(例えば、「Pichia Expression Kit」(インビトロゲン社製)、pNV11、SP−Q01)、枯草菌由来の発現ベクター(例えば、pPL608、pKTH50)が挙げられる。
CHO細胞、COS細胞、NIH3T3細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えばSV40プロモーター(Mulliganら,Nature(1979)277,108)、MMLV−LTRプロモーター、EF1αプロモーター(Mizushimaら,Nucleic Acids Res.(1990)18,5322)、CMVプロモーターなどを持っていることが不可欠であり、細胞への形質転換を選抜するための遺伝子(例えば、薬剤(ネオマイシン、G418など)により判別できるような薬剤耐性遺伝子)を有すればさらに好ましい。このような特性を有するベクターとしては、例えば、pMAM、pDR2、pBK−RSV、pBK−CMV、pOPRSV、pOP13などが挙げられる。
さらに、遺伝子を安定的に発現させ、かつ、細胞内での遺伝子のコピー数の増幅を目的とする場合には、核酸合成経路を欠損したCHO細胞にそれを相補するDHFR遺伝子を有するベクター(例えば、pCHOIなど)を導入し、メトトレキセート(MTX)により増幅させる方法が挙げられ、また、遺伝子の一過性の発現を目的とする場合には、SV40 T抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つCOS細胞を用いてSV40の複製起点を持つベクター(pcDなど)で形質転換する方法が挙げられる。複製開始点としては、また、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス(BPV)等の由来のものを用いることもできる。さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドトランスフェラーゼ(APH)遺伝子、チミジンキナーゼ(TK)遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Ecogpt)遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素(dhfr)遺伝子等を含むことができる。
一方、動物の生体内で本発明のDNAを発現させる方法としては、本発明のDNAを適当なベクターに組み込み、例えば、レトロウィルス法、リポソーム法、カチオニックリポソーム法、アデノウィルス法などにより生体内に導入する方法などが挙げられる。これにより、血中における高濃度のリンの存在に起因する疾患に対する遺伝子治療を行うことが可能である。用いられるベクターとしては、例えば、アデノウイルスベクター(例えばpAdexlcw)やレトロウイルスベクター(例えばpZIPneo)などが挙げられるが、これらに制限されない。ベクターへの本発明のDNAの挿入などの一般的な遺伝子操作は、常法に従って行うことが可能である(Molecular Cloning,5.61−5.63)。生体内への投与は、ex vivo法であっても、in vivo法であってもよい。
また、本発明は、本発明のベクターが導入された宿主細胞を提供する。本発明のベクターが導入される宿主細胞としては特に制限はなく、例えば、大腸菌や種々の動物細胞などを用いることが可能である。本発明の宿主細胞は、例えば、本発明の変異体の製造や発現のための産生系として使用することができる。本発明の変異体の製造のための産生系は、in vitroおよびin vivoの産生系がある。in vitroの産生系としては、真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。
真核細胞を使用する場合、例えば、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を宿主に用いることができる。動物細胞としては、哺乳類細胞、例えば、CHO(J.Exp.Med.(1995)108,945)、COS、3T3、ミエローマ、BHK(baby hamster kidney)、HeLa、Vero、両生類細胞、例えばアフリカツメガエル卵母細胞(Valle,et al.,Nature(1981)291,358−340)、あるいは昆虫細胞、例えば、Sf9、Sf21、Tn5が知られている。CHO細胞としては、特に、DHFR遺伝子を欠損したCHO細胞であるdhfr−CHO(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1980)77,4216−4220)やCHOK−1(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1968)60,1275)を好適に使用することができる。動物細胞において、大量発現を目的とする場合には特にCHO細胞が好ましい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法、カチオニックリボソームDOTAP(ベーリンガーマンハイム社製)を用いた方法、エレクトロポレーション法、リポフェクションなどの方法で行うことが可能である。
植物細胞としては、例えば、ニコチアナ・タバカム(Nicotiana tabacum)由来の細胞がポリペプチド生産系として知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス(Saccharomyces)属、例えば、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、糸状菌、例えば、アスペルギルス(Aspergillus)属、例えば、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)が知られている。
原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌(E.coli)、例えば、JM109、DH5α、HB101等が挙げられ、その他、枯草菌が知られている。
これらの細胞を目的とするDNAにより形質転換し、形質転換された細胞をin vitroで培養することによりポリペプチドが得られる。培養は、公知の方法に従い行うことができる。例えば、動物細胞の培養液として、例えば、DMEM、MEM、RPMI1640、IMDMを使用することができる。その際、牛胎児血清(FCS)等の血清補液を併用することもできるし、無血清培養してもよい。培養時のpHは、約6〜8であるのが好ましい。培養は、通常、約30〜40℃で約15〜200時間行い、必要に応じて培地の交換、通気、攪拌を加える。
一方、in vivoでポリペプチドを産生させる系としては、例えば、動物を使用する産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。これらの動物又は植物に本発明の変異体をコードするDNAを導入し、動物又は植物の体内で該変異体を産生させ、回収する。本発明における「宿主」とは、これらの動物、植物を包含する。
動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系がある。哺乳類動物としては、ヤギ、ブタ、ヒツジ、マウス、ウシを用いることができる(Vicki Glaser,SPECTRUM Biotechnology Applications,1993)。また、哺乳類動物を用いる場合、トランスジェニック動物を用いることができる。
例えば、本発明の変異体をコードするDNAを、ヤギβカゼインのような乳汁中に固有に産生されるポリペプチドをコードする遺伝子との融合遺伝子として調製する。次いで、この融合遺伝子を含むDNA断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ移植する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギ又はその子孫が産生する乳汁から、本発明の変異体を得ることができる。トランスジェニックヤギから産生されるポリペプチドを含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい(Ebert,K.M.et al.,Bio/Technology(1994)12,699−702)。
また、昆虫としては、例えばカイコを用いることができる。カイコを用いる場合、本発明の変異体をコードするDNAを挿入したバキュロウィルスをカイコに感染させることにより、このカイコの体液から該変異体を得ることができる(Susumu,M.et al.,Nature(1985)315,592−594)。
さらに、植物を使用する場合、例えばタバコを用いることができる。タバコを用いる場合、本発明の変異体をコードするDNAを植物発現用ベクター、例えばpMON 530に挿入し、このベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)のようなバクテリアに導入する。このバクテリアをタバコ、例えば、ニコチアナ・タバカム(Nicotiana tabacum)に感染させ、本タバコの葉より本発明の変異体を得ることができる(Julian K.−C.Ma et al.,Eur.J.Immunol.(1994)24,131−138)。
これにより得られた本発明の変異体は、宿主細胞内または細胞外(培地など)から単離し、実質的に純粋で均一なポリペプチドとして精製することができる。ポリペプチドの分離、精製は、通常のポリペプチドの精製で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、組み合わせればポリペプチドを分離、精製することができる。
クロマトグラフィーとしては、例えばアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる(Strategies for Protein Purification and Characterization:A Laboratory Course Manual.Ed Daniel R.Marshak et al.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1996)。これらのクロマトグラフィーは、液相クロマトグラフィー、例えばHPLC、FPLC等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。本発明は、これらの精製方法を用い、高度に精製された変異体も包含する。
なお、本発明の変異体を精製前又は精製後に適当な蛋白質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり部分的にペプチドを除去することもできる。蛋白質修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、リシルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グルコシダーゼなどが用いられる。
本発明はまた、本発明の変異体、該変異体をコードするDNA、または該DNAが挿入されたベクターを含有する血中リン濃度を低下させるための医薬組成物を提供する。
本発明の変異体を、ヒトや他の動物、例えばマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ニワトリ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、サル、マントヒヒ、チンパンジーの医薬として使用する場合には、変異体自体を直接患者に投与する以外に、公知の製剤学的方法により製剤化した医薬組成物として投与を行うことも可能である。例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤として経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
錠剤、カプセル剤に混和することができる添加剤としては、例えばゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸のような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖又はサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油又はチェリーのような香味剤が用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記の材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばD−ソルビトール、D−マンノース、D−マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート80TM、HCO−50と併用してもよい。
油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。
患者への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射などのほか、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、経皮的、または経口的に当業者に公知の方法により行いうる。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。
本発明の変異体の投与量は、その1回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法によっても異なるが、例えば注射剤の形では通常成人(体重60kgとして)においては、1日あたり約100μgから20mgであると考えられる。
非経口的に投与する場合は、その1回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法によっても異なるが、例えば注射剤の形では通常成人(体重60kgとして)においては、通常、1日当り約0.01から30mg、好ましくは約0.1から20mg、より好ましくは約0.1から10mg程度を静脈注射により投与するのが好都合であると考えられる。他の動物の場合も、体重60kg当たりに換算した量、あるいは体表面積あたりに換算した量を投与することができる。
また、本発明のDNAを医薬組成物として用いる場合には、上述したように本発明のDNAを生体内でその発現を保証するベクターに組み込み、例えば、レトロウィルス法、リポソーム法、カチオニックリポソーム法、アデノウィルス法などにより生体内に導入すればよい。これにより、高血中リン濃度に起因する疾患に対する遺伝子治療を行うことが可能である。生体内への投与においては、ex vivo法やin vivo法を利用することができる。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
[実施例1] ヒトFGF23の全長cDNA(ORF部分)のクローニング
FGF−23の全長cDNA(ORF部分)クローニングはPCR法により行った。プライマーはGenbank data(アクセッションNo.ABO37973)を基にし、そこにEcoRIサイトおよびXhoIサイトを付加してデザインした(5’−ggAATTCTCgAgCCACCATgTTgggggCCCgCCTCAggCTCTg−3’/配列番号:3、5’−ggAATTCTCgAgCTACTAgATgAACTTggCgAAgg−3’/配列番号:4)。さらに5’側のプライマーには開始コドンATGの上流にコザック配列(CCACC)を付加し、3’側の配列には終止コドンTGAを二つ付加した。プライマー作製はサワディーテクノロジー社に外注した。鋳型にはhuman heart cDNA(Origene社のMultiple cDNA kit、Cat.No.CH−1101)を使用し、PCR反応にはQIAGEN PCR kit(QIAGEN社 Cat.No.201223)を使用した。すなわち、0.75μlのhuman heart cDNA(Origene社のMultiple cDNA kit)、2.5μlのQIAGEN 10xPCRバッファー、0.5μlのdNTP mix(200mM)、0.25μlのQIAGEN Taq DNAポリメラーゼ、5.0μlの5 x Q−solution、0.5μlのSpecific Forward PCR primer(50μM、配列番号:3)、0.5μlのSpecific Reverse PCR primer(50μM、配列番号:4)、そして15μlのDDWを加え、全量25μlとして、以下の条件でPCR反応をサーマルサイクラーABI2400を用いて行った。一次変性は95℃で2分、そして35サイクルの2ステップシャトルPCR(94℃で40秒、60℃で1分)を行い、最後に伸長反応を72℃で7分行い、PCR反応を終了した。PCR反応による増幅産物を1.0%アガロース電気泳動で確認した結果、単一の特異的バンドが約750bp付近で確認されたため、TOPO TAクローニングキット(Invitorogen社Cat.No.K45000−01)により、2μlのPCR反応液を使用してTAベクターpCR2.1へのサブクローニングを行った。操作はキット添付のプロトコールに従って行った。そして、TAクローニングされたクローン#3の塩基配列解析をM13 M4プライマー(TaKaRa社Cat.No.3832A)、M13 RVプライマー(TaKaRa社Cat.No.3830A)、配列番号:5に記載のプライマー(5’−CgCACCCCATCAgACCATCT−3’)、および配列番号:6に記載のプライマー(5’−gCAgTTCTCCgggTCgAAATA−3’)を使用し、ABI377 DNAシーケンサーにより解析を行った。その結果、クローン#3の内部配列はヒトFGF−23と完全に一致し、FGF−23のクローニングを完了した。
[実施例2] ヒトFGF変異体(R176Q、R179Q、R179W、R176Q+R179Q、R176Q+R179W)の作製
ヒトFGF−23を鋳型にFGF−23変異体R176Q(M1)、R179Q(M2)、R179W(M3)、R176Q+R179Q(M4)、R176Q+R179W(M5)の作製を行った。ヒトFGF−23より文献(Autosomal dominant hypophosphataemic rickets is associated with mutations in FGF23 Nature Genetics Vol.26 p345−348.November 2000)に従って、527G→A(R176Q)、536G→A(R179Q)、535C→T(R179W)の3種類およびそれらの組み合わせM4(R176Q+R179Q)とM5(R176Q+R179W)の作製を行った。プライマー合成はサワディーテクノロジー社に外注した。使用したプライマーの塩基配列は次の通りである。
・5’−CACggCAgCACACCCggAgC−3’(配列番号:7)
・5’−CACggCggCACACCCAgAgC−3’(配列番号:8)
・5’−CACggCggCACACCTggAgC−3’(配列番号:9)
・5’−CACggCAgCACACCCAgAgC−3’(配列番号:10)
・5’−CACggCAgCACACCTggAgC−3’(配列番号:11)
変異導入(Mutagenesis)は1st PCRにおいて、変異導入のための部分フラグメントを作製し、2nd PCRにより変異の入っている全長変異体の鋳型を作製し、最終的に3rd PCRにより完全な変異体を得るという3ステップによる方法にて行った。すなわち、0.2μlのヒトFGF−23のクローン#3(40ng/μl)、5μlのTaKaRA EX 10xPCRバッファー、4μlのdNTP mix(50μM)、0.5μlのTaKaRa EX Taq DNAポリメラーゼ、0.5μlのSpecific mutant primer(50μM、配列番号:7、8、9、10、11)、0.5μlのSpecific Reverse PCR primer(50μM、配列番号:4)、そして39.3μlのDDWを加え、全量50μlとして、以下の条件でPCR反応をサーマルサイクラーABI2400により行った。一次変性は95℃で2分、そして35サイクルの2ステップシャトルPCR(94℃で40秒、60℃で30秒)を行い、最後に伸長反応を72℃で4分を行い、PCR反応を終了した。PCR反応による増幅産物を1.0%アガロース電気泳動で確認した結果、単一の特異的バンドが約200bp付近で確認された。このゲルからそれぞれの特異的増幅フラグメント(R176QとR179Q)をQIAquick Gel Extraction kit(QIAGEN社Cat.No.28704)によりキット添付のプロトコールに従って精製した。その精製フラグメント(変異体部分配列)を用いて次に2nd PCR反応(変異体の全長の鋳型を作製)を行った。1μlの精製フラグメントをプライマーとして使用し、0.1μlのヒトFGF−23のクローン#3(40ng/μl)、2.5μlのTaKaRa EX 10xPCRバッファー、2μlのdNTP mix(50μM)、0.25μlのTaKaRa EX Taq DNAポリメラーゼ、そして18.15μlのDDWを加え、全量24μlとして、以下の条件で2nd PCR反応をサーマルサイクラーABI2400を用いて行った。一次変性は95℃で2分、そして5サイクルの3ステップサイクルPCR(94℃で1分、60℃で1分、72℃で1分)を行い、2nd PCRを終了した。引き続き、この反応液に0.5μlのSpecific Forward PCR primer(50μM、配列番号:3)、0.5μlのSpecific Reverse PCR primer(50μM、配列番号:4)を加え、全量25μlとして、以下の条件で3rd PCR反応をサーマルサイクラーABI2400により行った。一次変性は95℃で2分、そして35サイクルの2ステップシャトルPCR(94℃で40秒、60℃で1分)を行い、最後に伸長反応を72℃で7分を行い、PCR反応を終了した。最終的に得られたPCR反応による増幅産物を1.0%アガロース電気泳動で確認した結果、特異的に増幅された約750bp付近のバンドが確認された。
以降の解析は実施例1と同様の方法で内部配列のTAクローニングを行い、同様の方法で内部配列の塩基配列解析を行ったところ、各種変異体に対して目的変異を挿入されたクローンの作製に成功した。
[実施例3] 発現ベクターの作製
FGF−23および各種変異体(M1〜M5)の内部配列をpCAGGS3に挿入し、各クローンの発現ベクターを作製した。すなわち、各クローンを制限酵素EcoRIにより切断し、得られたEcoRIフラグメントをQIAquick Gel Extraction kit(QIAGEN社Cat.No.28704)により精製し、EcoRIカットされたpCAGGS3に挿入した。各ベクターをpCGF23、pCGFM1〜5と命名した。
[実施例4] エンドトキシンフリープラスミドの調製
プラスミドDNAを直接in vivoに投与するため、エンドトキシン除去処理を加えた方法によりプラスミド精製を行った。具体的にはEndofree plasmid Maxi kit(QIAGEN社Cat.No.12362)を使用し、pCGF23、pCGFM1〜5のエンドトキシンフリーのプラスミド精製を添付されたプロトコールに従って行った。
[実施例5] FGF−23およびM2(R179Q)のC末端FLAG−taqの付加
pCGF23およびpCGFM2を鋳型に配列番号:3に記載の配列およびFLAG配列を含む配列番号:12に記載のプライマーを使用し、C末端にFLAG配列を含む変異体を作製した。すなわち1μlのpCGF23およびpCGFM2(30ng/μl)、2.5μlのTaKaRa EX 10xPCRバッファー、2μlのdNTP mix(50μM)、0.25μlのTaKaRa EX Taq DNAポリメラーゼ、0.5μlのSpecific Forward PCR primer(50μM、配列番号:11)、0.5μlのSpecific Reverse PCR primer(50μM、5’−ggATCCgAATTCATATgTCACTTATCgTCgTCATCCTTgTAATCgATGAACTTggCgAAgg−3’/配列番号:12)、そして18.5μlのDDWを加え、全量25μlとして、以下の条件でPCR反応をサーマルサイクラーABI2400により行った。一次変性は95℃で2分、そして30サイクルの2ステップサイクルPCR(94℃で30秒、60℃で1分)を行い、最後に伸長反応を72℃で7分を行ってPCR反応を終了した。最終的に得られたPCR反応による増幅産物を1.0%アガロース電気泳動で確認した結果、特異的に増幅された約800bp付近のバンドが確認された。以降の解析は実施例1〜4の方法に準じて行い、最終的に発現ベクターpCGF23−FおよびpCGFM2−Fを作製した。
[実施例6] FGF−23及びM2(R179Q)のN末端FLAG−tagの付加
N末端FLAG−tagつきFGF23発現ベクターは、PCR法を使い以下のように構築した。3ngのpCG23をテンプレート、それぞれ100pmolのSpecific Forward pCR primerと23N FLAG R(GCCCTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCGGCTCTGAGGACGCTC/配列番号:13)あるいは23R1(GGCTCGAGTCAGATGAACTTGGCGAAGG/配列番号:14)と23N FLAG F(GATGACGACGATAAGGGCGGAGGTTCCAGAGCCTATCCCAATG/配列番号:15)をプライマーセットとして使い、Takara Ex Taqとそれに添付のバッファーを使い、1段階目のPCR反応(96℃15秒、55℃15秒、72℃2分、25サイクル)を行った。PCR反応生成物を、ミリポア社のマイクロコン30にかけ、プライマーを除去した後、それぞれのPCR反応生成物を混ぜ合わせたものをテンプレート、FGF Fと23R1をプライマーセットとして使い、1段階目と同じ条件で2段階目のPCR反応を行った。反応終了後、アガロースゲル電気泳動により、PCR反応生成物を精製し、このフラグメントをTOPOクローニングキット(インビトロージェン社製)使いクローニングしてDNA配列を読むことにより、目的の変異が導入されていることおよび不必要な変異が導入されていないことを確認した。配列の確認されたプラスミドを調整し、Eco RIで切断しフラグメントを回収して、あらかじめEco RIで切断しておいたpCAGGS3に組み込んだ。方向性を確認した後、最終的に発現ベクターをpCGF23NFと命名した。
N末端FLAG−tagつきFGF23M2ベクターは1段階目のPCR用のテンプレートにpCGFM2を使った以外、上記と同様の方法で行い作製し、pCGFM2NFと命名した。
[実施例7] naked DNA injection動物実験用発現ベクター作製
naked DNA injection法を用いてマウス成体においてFGF23とその変異体が直接または間接的にリン代謝に影響を及ぼすかどうかを検証した。
使用した材料は以下の通りである。
FGF23発現ベクター(pCGF23)
R176QFGF23変異体発現ベクター(pCGFM1)
R179QFGF23変異体発現ベクター(pCGFM2)
R179WFGF23変異体発現ベクター(pCGFM3)
R176QR179QFGF23変異体発現ベクター(pCGFM4)
R176QR179WFGF23変異体発現ベクター(pCGFM5)
<対照物質(陰性対照物質)>
MOCKベクター(pCAGGS)
形状: 10mM Tris/1mM EDTA(pH8.0)溶液
保存: −20℃、暗所
<調製方法>
投与剤型は溶液であり、調製法はTransIT In Vivo Gene Delivery System(PanVera社)のプロトコールに従った(TransIT登録商標 In Vivo Gene Delivery System(Pan Vera社)standard protocol)。MOCKベクターまたはFGF23発現ベクターまたはFGF23変異体発現ベクターを投与1匹当たり10μg使用した。10μLのTransIT Polymer Solutionと適当量の滅菌水を加えて200μLとし50mLファルコンチューブ中で混合した。5分間室温に放置後、上記の200μL当たり2.8mLの1xDelivery Solutionを加えて全量を3.0mLとして投与液とした。6匹に投与する場合には7匹分の量21mLを調製した。投与液は調製当日に使い切った。
使用動物および飼育条件は、以下の通りである。
<使用動物>
動物種: マウス
系統: Jcl:CD−1(ICR)またはCrj:CD−1(ICR)
性別: 雄
体重: 35〜40g
週齢: 投与時で8〜9週齢
入手先: 日本クレアまたは日本チャールズリバー
安楽死法: 麻酔下放血
馴化期間: 約2週間
群分け法: 無作為抽出
<飼育環境>
室温: 24±2℃
相対湿度: 55±10%
換気回数: 10〜30回/時
照明時間: 5:00〜19:00
飼料: CE−2(日本クレア株式会社)を自由摂取
飲料水: 水道水を自由摂取
<試験方法>
投与経路は静脈内投与、投与量は3mlとし、全量を8秒以内に投与した。
<サンプル採取>
(1)血清
投与後4日後にエーテル麻酔下にて腹部大静脈より全採血した。採取した血液はセパラピットチューブミニ(積水化学工業)に入れ遠心(1400×g,10分間,4℃)し、血清を分離した。血清は測定に供するまで設定温度−20℃の冷凍庫に保存した。
(2)尿
投与後3日目にマウスをガラス製の代謝ケージ(METABOLICA,杉山元医理器)に入れ、4日目まで24時間蓄積尿を採取した。尿は測定に供するまで設定温度−20℃の冷凍庫に保存した。
(3)腎臓
血清採取後、両腎臓を摘出し被膜を剥離除去し、刷子縁膜小胞の精製に供した。
<各パラメータの測定>
血清中または尿中の無機リン(Pi)、カルシウム(Ca)、尿素窒素(UN)、クレアチニン(CRE)は自動分析装置(日立7170E形)にて測定した。血清中の25−hydroxyvitamin D,24,25−dihydroxyvitamin DはCPBA法で,1α,25−dihidroxyvitamin DはRIA2抗体法で測定した。
<統計学的解析方法>
MOCKベクター投与群とFGF23発現ベクター投与群または各FGF23変異体発現ベクター投与群間で、対応のないt検定を行った。有意水準は両側5%とした。解析ソフトはSAS ver.6.12を用いた。
結果、血清生化学値に対する作用は、図1に示したようにADHR患者で同定された点変異を導入した3種類のFGF23変異体発現ベクターであるFGF23−M1、FGF23−M2およびFGF23−M3を投与した群では、変異体の種類に関わらず、MOCK投与群に比べて有意な血中リン値の低下が観察された。しかしながら、これらの点変異を組み合わせた二重変異体発現ベクター、FGF23−M4、FGF23−M5を投与した群では同様に血清リン低下作用は観察されたものの、点変異を組み合わせたことによる相加・相乗効果は認められなかった。野生型FGF23(FGF23−Wild)を投与した群では、血清リン低下作用は認められなかった(図2)。
表1に示すように、その他の血清生化学パラメータ(カルシウム、クレアチニン、尿素窒素)ではMOCK群とFGF23−Wild群及びFGF23−M2群で著明な差は認められなかった。
また、尿中生化学値に対する作用を表す結果は、表2に示したようにFGF23−M2投与群では、MOCK群に比較して一日当たりのリン排泄量が増加する傾向が見られたが、有意な差ではなかった。
また、血清中1α,25(OH)2D3に対する作用を示す結果は、図3に示したようにMOCK投与群に比較して、FGF23−M2投与群およびFGF23−Wild群では著明に1α,25(OH)2D3量が低下していた。FGF23−Wild群ではMOCK群の約半分、FGF23−M2投与群では測定感度以下まで低下していた。
一方、生体内の前駆体である25(OH)D3量はMOCK投与群、FGF23−Wild投与群、FGF23−M2投与群で有意な差は認められなかった。また24,25(OH)2D3量はFGF23−Wild投与群ではMOCK投与群と差は見られなかったもののFGF23−M2投与群では著明に低下していた(表3)。
<刷子縁膜小胞精製>
刷子縁膜小胞の精製は、マグネシウム沈殿法にて行った。すなわち、採取した腎臓に氷冷したMET Buffer(60mM mannitol,1mM EGTA,2.5mM Tris/HCl,pH7.1)を加え、ヒスコトロンで18,000rpm、1分間、ホモジナイズした後に、1/10量の1M MgCl2を加えて攪拌、15分間氷中に放置した。低速遠心(2,000×g、15分間、4℃)にて非粉砕画分を除去後、上清を高速遠心(24,000×g、30分間、4℃)し、沈殿を得た。沈殿にMET Bufferを加えてテフロンホモジナイザー(1,000rpm、10ストローク)で更に粉砕した。再度、1/10量の1M MgCl2を加えて攪拌、15分間氷中後、低速遠心(2,000×g、15分間、4℃)、上清を高速遠心(24,000×g、30分間、4℃)した。得られた沈殿にTransport Buffer−K(100mM mannitol,20mM HEPES/Tris,pH7.4)を加え、プラスチックシリンジ(針20Gおよび27G)で吸引排出を繰り返し、刷子縁膜小胞を得た。
<リン輸送活性測定>
刷子縁膜を用いたリン輸送活性の測定は、迅速濾過法を用いた。すなわち、20μLの刷子縁膜小胞と80μLの反応液(100mM mannitol,20mM HEPES/Tris,pH7.4,125mM NaCl,125nM 32P−KH2PO4)を25℃で1分間反応させ、反応停止液(100mM mannitol,100mM choline chloride,20mM MgSO4,5mM KH2PO4,20mM HEPES/Tris,pH7.4)を1mL加えて反応を停止させた。反応液は、直ちにニトロセルロース膜(孔径0.45μm、直径2.5cm)で吸引濾過し、ニトロセルロース膜を5mLの反応停止液で洗浄した。膜上に捕獲された放射活性を液体シンチレーションカウンターTRI−CARB 2700TR(ベックマン株式会社)を用いて測定し、全リン輸送活性とした。ナトリウム非依存性リン輸送活性の測定は、反応液中の125mM NaClを125mMのKClに変更して行った。ナトリウム依存性リン輸送活性は、全リン輸送活性とナトリウム非依存性リン輸送活性の差より算出した。いずれの活性も、刷子縁膜小胞中のタンパク量をBCA Protein Assay Reagent(PIERCE)を用いて測定し、1分間に単位タンパク量が取り込んだリン量(pmoles/mg protein/min)として表示した。
結果、図4に示したようにFGF23−M2投与群ではMOCK投与群に対して腎臓におけるナトリウム依存性リン輸送担体(Na/Pi)活性は有意に低下していた。一方、ナトリウム非依存性リン輸送活性に変化は認められなかった。
[実施例8] C末端欠失M2FGF23変異体発現ベクターの構築
C末端欠失M2FGF23変異体発現ベクターは、PCR法を使い以下のように構築した。3ngのpCGFM2NFをテンプレート、それぞれ100pmolのSpecific Forward PCR primerとdC188(GGCTCGAGTCAGTCCCGCTCCGAGTC/配列番号:16)、
dC194(GGCTCGAGTCACTTCAGCACGTTCAGGGG/配列番号:17)、
dC200(GGCTCGAGTCAGGTCATCCGGGCCCGGGG/配列番号:18)、
dC210(GGCTCGAGTCAGAGCTCCTGTGAACAGGA/配列番号:19)、
dC217(GGCTCGAGTCAGCTGTTGTCCTCGGCGCT/配列番号:20)、
dC223(GGCTCGAGTCAGTCACTGGCCATCGGGCT/配列番号:21)、
dC240(GGCTCGAGTCAGCCCGTTCCCCCAGCGTG/配列番号:22)あるいは
dC245(GGCTCGAGTCAGCGGCAGCCTTCCGGGCC/配列番号:23)をプライマーセットとして使い、Takara Ex Taqとそれに添付のバッファーを使い、PCR反応(96℃15秒、55℃15秒、72℃2分、25サイクル)を行った。反応終了後、アガロースゲル電気泳動により、PCR反応生成物を精製し、このフラグメントをTOPOクローニングキット(インビトロジェン社製)を使いクローニングして、DNA配列を読むことにより、目的の変異が導入されていることおよび不必要な変異が導入されていないことを確認した。配列の確認されたプラスミドを調整し、Eco RIで切断しフラグメントを回収して、あらかじめEco RIで切断しておいたpCAG GS3に組み込んだ。これらの発現ベクターは各々、pCGdC188(dC188)、pCGdC194(dC194)、pCGdC200(dC200)、pCGdC210(dC210)、pCGdC217(dC217)、pCGdC223(dC223)、pCGdC240(dC240)、pCGdC245(dC245)と命名した。
[実施例9] C末端欠失M2FGF23変異体たんぱく質の発現
1x105個のCOS細胞を1mlのDMEM(10%FCS)培地(GIBCO)に懸濁後、6ウェルプレートにまいた。一晩培養後、1μgの発現ベクター(実施例8に示したpCGdc188〜pCGdc245)を3μLのFuGene(ベーリンガー社製)をを使い細胞に導入した後、さらに一晩培養した。次の日培地を、CHO−S−SFMIIに交換し、さらに2日培養を続けた。2日後培地を回収し、その培地中に発現している変異体たんばく質を、anti−FLAG抗体(M2)(SIGMA)によりウエスタンブロッティング法により解析を行い、変異体たんぱく質の発現を確認した。
[実施例10] COS細胞によるFGF−23変異体(M2)組み換え体の一過性発現
5x106個のCOS細胞を400μlのDMEM(10%FCS)培地(GIBCO)に懸濁後、10μgの発現ベクターpCGFM2−Fを加えてエレクトロポレーションキュベット0.4cm(BIO−RAD)に移し、Gene−pulser(BIO−RAD)を用いて0.26kv、抵抗値∞、960mFの条件でエレクトロポレーションを行った。その後、30mlのDMEM(10%FCS)培地に細胞溶液を懸濁して、175cm2のフラスコ(FALCON)に移し、CO2イキュベーター(ESPEC)に37℃で一昼夜静地した。翌日、30mlのCHO−S−SFMII培地(GIBCO)に培地交換して、3日間培養した。回収した培地を3000rpm、15分間遠心して細胞を取り除き、その培地をanti−FLAG抗体(M2)(SIGMA)によりウエスタンブロッティング法により解析を行い、組み換え体FGF−23変異体(M2)−Fの発現を確認した。
[実施例11] 組み換え体FGF−23(M2)−Fのアフィニティーカラムによる精製
anti−FLAG抗体アフィニティーカラム(SIGMA)を用いて組み換え体FGF−23変異体(M2)−Fの精製を行った。クロマトグラフィー操作はグラディフラックシステム(ファルマシア)を用いた。アフィニティーカラムをPBS−Tにより平衡化した後、実施例10の組み換え体FGF−23変異体(M2)−Fの発現している調製培地をアプライし、グリシンHCl緩衝液(pH3.5)で溶出を行った。そしてメインピークを分画し、SDS−PAGEにより分析したところ、CBB染色レベルでほぼ均一な目的分子量付近のバンドを確認し、組み換え体の調製を終了した(図5)。
[実施例12] 欠失変異体動物実験
投与剤の調製は、TransIT In Vivo Gene Delivery System(PanVera社)のプロトコールに従った。投与1匹当たり図6に示した発現ベクター(MOCKは、実施例7と同じ)10μgに10μLのTransIT Polymer Solutionと適当量の滅菌水を加えて200μLとして混合、5分間室温に放置後、200μL当たり2.8mLの1x Delivery Solutionを加えて全量を3.0mLとして投与液とした。6匹に投与する場合には7匹分の量21mLを調製した。投与液は調製当日に使い切った。
日本チャールズリバー社から購入した8〜9週齢の雌性CD−1(lCR)マウス(35−40g)を1週間馴化後、実験に供した。尾静脈から発現ベクターを含む投与剤3mLを8秒以内に全量投与した。投与後4日後にエーテル麻酔下にて腹部大静脈より全採血し、採取した血液はセパラピットチューブミニ(積水化学工業)に入れ遠心(1400×g,10分間,4℃)し、血清を分離した。
血清中の無機リン(Pi)、カルシウム(Ca)、尿素窒素(UN)、クレアチニン(CRE)は自動分析装置(日立7170E形)にて測定した。
結果を図6に示す。
M2FGF23変異体はアミノ酸251個で構成されているが、C末端部分を短くしていくとアミノ酸200位までのdC200変異体でも同等の血清リン低下作用を有していた。しかしながら194位までのdC194変異体、188位までのdC188変異体と更に短くすると、作用は弱まり、失われていった。ADHR患者では176位もしくは179位のアミノ酸に変異が入るとFGF23がタンパク分解による調節を受けにくくなり、結果的に過剰なFGF23が血中に存在することで低リン血症になると推測されている。従って本実験結果からアミノ酸179位〜200位の部分に血清リン低下作用に重要な部位があると考えられた。
[実施例13] FGF23の副甲状腺甲状腺切除ラットに対する作用
8週齢の雄性SDラットを甲状腺・副甲状腺切除(TPTX)し、数日後、イオン化カルシウムを測定、手術の成否を確認した後に大腿静脈にカテーテルを挿入し、尿サックをしてボールマンケージに固定した。
Harvard Infusion PumpでPTH(1−34)(0.3nmol/mL)またはC−FLAGタグ付きM2FGF23タンパク(6μg/mL)またはベヒクル(0.05% Tween 80/Saline)を1ml/hrの速度で6時間、infusion投与した。infusion開始後4時間目から投与終了6時間目まで採尿し、投与終了後、腹部大静脈より全血採血した。3000rpm x 10min遠心して血清と尿の不溶画分を分離し、日立7170形オートアナライザーで無機リン、カルシウム、クレアチニンを測定した。結果を図7から図9に示す。
図7よりTPTXにより上昇したラットの血清リン濃度はPTH(1−34)投与により正常化した。またM2FGF23投与によっても同様に正常化した。一方、TPTXにより低下した血清カルシウム濃度はPTH(1−34)投与で是正されるものの、M2FGF23投与では殆んど効果がなかった(図8)。このことからM2FGF23はPTHを介して血清リン濃度に作用を及ぼしているのではなく、血清カルシウム濃度に作用を示さないことが明らかとなった。PTH(1−34)では尿中の無機リン/クレアチニン値が上昇していることから血清中のリンは尿中に排泄されたと考えられるが、H2FGF23では無機リン/クレアチニン値が、変化していないことから、血清中のリンは骨にハイドロキシアパタイトとして戻った可能性がある(図9)。
産業上の利用の可能性
本発明により、FGF23タンパク質変異体が提供された。本発明のFGF23変異体は、血中のリン濃度を低下させる効果を有することから、高リン血症の治療および予防薬になるものと期待される。また、本発明のFGF23変異体をコードするDNAは、体内に導入し発現させることにより、血中リン濃度を低下させることから、高リン血症に対する遺伝子治療への応用が期待される。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図1は、血清中の無機リン濃度に対するFG23変異体の効果を示すグラフである。血清中の無機リンは、DNAベクターを導入後4日間計測した。データは平均値±SEMを表す。カラム内の数値は動物の数を表す。*P<0.05対MOCK対照(対応のないt検定)。
図2は、血清中の無機リン濃度に対するFGF23の効果を示すグラフである。血清中の無機リンは、DNAベクターを導入後4日間計測した。データは±SEMを表す。カラム内の数値は動物の数を表す。*P<0.05対MOCK対照(対応のないt検定)。
図3は、血清中の1α,25(OH)2D3濃度におけるFGF23およびFGF23変異体の効果を示すグラフである。血清中の1α,25(OH)2D3は、DNAベクターを導入後4日間計測した。計測には、3動物から得た血清を混合して使用した(n=2,6匹/群)。データは平均値を表す。
図4は、腎臓から単離したBBMVにおけるリン輸送活性に対するFGF23変異体の効果を示すグラフである。nakedベクターDNA導入マウスにおける腎臓刷子縁膜小胞中におけるPi取込み(導入後4日間)。計測には、2動物から得た腎臓を使用した(n=3,6匹/群)。データは平均値±SEMを表す。
図5は、FGF−23(変異体)M2−FのSDS−PAGE解析(CBB染色)の結果を示す写真である。図中のMは、分子量マーカー(BIO−RAD、ブロードレンジ)を表す。
図6は、C末端欠失M2FGF23変異体の血清リン濃度低下作用を示すグラフである。「MOCK」は親ベクターであるpCAGGSを導入したマウスを表す。「Normal」は、正常マウスを表す。
図7は、PTH(1−34)とH2FGF23のTPTXラット血清リン低下作用を示すグラフである。
図8は、PTH(1−34)とM2FGF23のTPTXラット血清カルシウムに対する作用を示すグラフである。
図9は、PTH(1−34)とM2FGF23のTPTXラットにおける腎リン排泄に対する作用を示すグラフである。
Claims (11)
- 配列番号:2に記載アミノ酸配列において、176位のアルギニンがグルタミン、179位のアルギニンがグルタミン、または179位のアルギニンがトリプトファンに変異したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA。
- 配列番号:2に記載アミノ酸配列において、176位のアルギニンがグルタミン、179位のアルギニンがグルタミン、または179位のアルギニンがトリプトファンに変異したアミノ酸配列からなるタンパク質における、少なくとも1から190位までのアミノ酸配列を有する断片をコードするDNA。
- 請求項1または2に記載のDNAが挿入されたベクター。
- 請求項1もしくは2に記載のDNA、または請求項3に記載のベクターを保持する形質転換細胞。
- 配列番号:2に記載アミノ酸配列において、176位のアルギニンがグルタミン、179位のアルギニンがグルタミン、または179位のアルギニンがトリプトファンに変異したアミノ酸配列からなるタンパク質。
- 配列番号:2に記載アミノ酸配列において、176位のアルギニンがグルタミン、179位のアルギニンがグルタミン、または179位のアルギニンがトリプトファンに変異したアミノ酸配列からなるタンパク質における、少なくとも1から190位までのアミノ酸配列を有する断片。
- 請求項4に記載の形質転換細胞を培養し、該形質転換細胞またはその培養上清から発現させたタンパク質を回収する工程を含む、請求項5または6に記載のタンパク質の製造方法。
- 請求項1もしくは2に記載のDNA、請求項3に記載のベクター、または請求項5もしくは6に記載のタンパク質を含有する、血中リン濃度を低下させるための医薬組成物。
- 血中カルシウム濃度には影響を与えない、請求項8に記載の医薬組成物。
- 高リン血症の治療のための請求項8または9に記載の医薬組成物。
- 請求項1または2に記載のDNAを患者へ投与することを含む高リン血症を治療する方法。
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2000396316 | 2000-12-26 | ||
JP2000396316 | 2000-12-26 | ||
JP2001161370 | 2001-05-29 | ||
JP2001161370 | 2001-05-29 | ||
PCT/JP2001/011482 WO2002052009A1 (fr) | 2000-12-26 | 2001-12-26 | Mutant de la proteine fgf23 humaine reduisant le taux de phosphore dans le sang |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2002052009A1 true JPWO2002052009A1 (ja) | 2004-04-30 |
Family
ID=26606754
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2002553490A Pending JPWO2002052009A1 (ja) | 2000-12-26 | 2001-12-26 | 血中リン濃度を低下させるヒトfgf23タンパク質変異体 |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20040097414A1 (ja) |
EP (1) | EP1354949A4 (ja) |
JP (1) | JPWO2002052009A1 (ja) |
KR (1) | KR20030074678A (ja) |
CN (1) | CN1269960C (ja) |
CA (1) | CA2433171A1 (ja) |
HK (1) | HK1062835A1 (ja) |
IL (1) | IL156504A0 (ja) |
RU (1) | RU2003123108A (ja) |
WO (1) | WO2002052009A1 (ja) |
Families Citing this family (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US8889621B2 (en) | 2009-10-30 | 2014-11-18 | New York University | Inhibiting binding of FGF23 to the binary FGFR-Klotho complex for the treatment of hypophosphatemia |
WO2013027191A1 (en) * | 2011-08-25 | 2013-02-28 | Novartis Ag | Methods and compositions using fgf23 fusion polypeptides |
RU2643326C2 (ru) | 2012-03-30 | 2018-01-31 | Новартис Аг | Ингибитор рецептора фрф для применения в лечении гипофосфатемических заболеваний |
US9657075B2 (en) | 2012-06-07 | 2017-05-23 | New York University | Chimeric fibroblast growth factor 23 proteins and methods of use |
CN103224557B (zh) * | 2012-08-08 | 2014-10-01 | 温州医学院 | 一种长效型成纤维细胞生长因子-23拮抗剂的开发 |
WO2014130659A1 (en) | 2013-02-22 | 2014-08-28 | New York University | Chimeric fibroblast growth factor 23 proteins and methods of use |
AU2015237176A1 (en) | 2014-03-28 | 2016-10-20 | New York University | FGF23 fusion proteins |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2000073454A1 (en) * | 1999-06-02 | 2000-12-07 | Genentech, Inc. | Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same |
EP1303536B1 (en) * | 2000-07-19 | 2010-03-17 | Advanced Research And Technology Institute, Inc. | Novel fibroblast growth factor (fgf23) and methods for use |
-
2001
- 2001-12-26 KR KR10-2003-7008559A patent/KR20030074678A/ko not_active Application Discontinuation
- 2001-12-26 IL IL15650401A patent/IL156504A0/xx unknown
- 2001-12-26 JP JP2002553490A patent/JPWO2002052009A1/ja active Pending
- 2001-12-26 WO PCT/JP2001/011482 patent/WO2002052009A1/ja not_active Application Discontinuation
- 2001-12-26 RU RU2003123108/13A patent/RU2003123108A/ru not_active Application Discontinuation
- 2001-12-26 CN CNB018228356A patent/CN1269960C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2001-12-26 CA CA002433171A patent/CA2433171A1/en not_active Abandoned
- 2001-12-26 EP EP01271888A patent/EP1354949A4/en not_active Withdrawn
- 2001-12-26 US US10/451,942 patent/US20040097414A1/en not_active Abandoned
-
2004
- 2004-07-31 HK HK04105649A patent/HK1062835A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN1269960C (zh) | 2006-08-16 |
EP1354949A4 (en) | 2004-05-19 |
EP1354949A1 (en) | 2003-10-22 |
RU2003123108A (ru) | 2005-02-27 |
IL156504A0 (en) | 2004-01-04 |
US20040097414A1 (en) | 2004-05-20 |
CN1492927A (zh) | 2004-04-28 |
HK1062835A1 (en) | 2004-11-26 |
WO2002052009A1 (fr) | 2002-07-04 |
KR20030074678A (ko) | 2003-09-19 |
CA2433171A1 (en) | 2002-07-04 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
KR102619197B1 (ko) | Hsd17b13 변종 및 이것의 용도 | |
JP2020036596A (ja) | 新規ヘモポエチン受容体蛋白質、nr10 | |
US20070072236A1 (en) | Novel type II Na/Pi cotransporters and type II Na/Pi cotransporter expression regulatory factors | |
AU2012358384A1 (en) | Methods of increasing the viability or longevity of an organ or organ explant | |
RU2747734C2 (ru) | Композиции и способы для снижения экспрессии tau | |
JP5395767B2 (ja) | トランスポーター遺伝子oatp−b、c、d、およびe | |
KR100886276B1 (ko) | 인산 대사, 칼슘 대사, 석회화 및 비타민 d 대사를조절하는 폴리펩티드 및 그것을 코딩하는 dna | |
JPWO2002052009A1 (ja) | 血中リン濃度を低下させるヒトfgf23タンパク質変異体 | |
US20070122866A1 (en) | Protein having PGE2 synthase activity and use thereof | |
JP2002516101A (ja) | ヒトsocsタンパク質 | |
JP4979870B2 (ja) | 腎不全治療剤 | |
JPWO2002020770A1 (ja) | Arfタンパクとhk33タンパクの相互作用を利用した抗腫瘍作用を持つ薬剤のスクリーニング方法 | |
WO2005084702A1 (ja) | 臓器線維症予防・治療剤 | |
JP2000502902A (ja) | 膵臓癌に関連する新規ポリヌクレオチドpanc1a及びpanc1b | |
US20020168721A1 (en) | TSG-like gene | |
JP4008481B2 (ja) | 腎臓の薬物排泄機能に関与する有機アニオントランスポーター | |
US20020041870A1 (en) | Novel genes expressed in obese rat hypothalamus | |
US20020192220A1 (en) | Compositions and methods relating to colon specific genes and proteins | |
JP2002541836A (ja) | 炭水化物修飾酵素 | |
JP4189456B2 (ja) | Arfタンパクとa10タンパクの相互作用を調節する薬剤のスクリーニング方法 | |
JPWO2004055184A1 (ja) | グルコース及び/又はフルクトーストランスポータNaGLT1及びその遺伝子 | |
JP2002300878A (ja) | 新規bHLH型転写因子遺伝子、DEC2 | |
US20020123083A1 (en) | Nucleic acid endocing growth factor protein | |
US20030064378A1 (en) | Compositions and methods relating to lung specific genes and proteins | |
US20030068624A1 (en) | Compositions and methods relating to lung specific genes and proteins |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20041216 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20070221 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20070620 |