JP2002541836A - 炭水化物修飾酵素 - Google Patents

炭水化物修飾酵素

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タング、ワイ・トム
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、ヒト炭水化物修飾酵素（CME）と、CMEを同定及びコードするポリヌクレオチドとを提供する。本発明はまた、発現ベクター及び宿主細胞、抗体、アゴニスト、アンタゴニストを提供する。更に、本発明は、CMEの発現に関連する疾患の診断方法、治療方法及び予防方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の技術分野） 本発明は、炭水化物修飾酵素（carbohydrate-modifying enzyme）の核酸配列
及びアミノ酸配列、並びにこれらの配列を用いた炭水化物代謝異常及び自己免疫
異常／炎症異常、癌の診断及び治療、予防に関連する。
【０００２】 （発明の背景） 糖、サッカリド、デンプン若しくはセルロースを含む炭水化物は、多数の水酸
基を含むアルデヒド化合物若しくはケトン化合物である。炭水化物代謝の重要性
は、血糖値を維持するための感受性の調節系（sensitive regulatory sysytem）
によって実証される。膵臓ホルモンであるインスリンは、細胞によるグルコース
の取込み及び貯蔵を増大させ、同じく膵臓ホルモンであるグルカゴンは細胞から
のグルコースの放出を増大させる。炭水化物は、哺乳動物細胞において３つの重
要な役割を果たす。第１の役割は、貯蔵エネルギー及び燃料、代謝中間体として
利用される。炭水化物は解糖プロセスにおいてエネルギーの形態に分解され、後
に利用するためにグリコーゲンとして貯蔵される。第２の役割は、糖デオキシリ
ボース及び糖リボースがそれぞれ、DNAの支持構造及びRNAの支持構造の一部を形
成する。第３の役割は、分泌経路を進む際、分泌及び膜タンパク質、分泌及び膜
脂質に炭水化物修飾がなされる。実際、真核細胞膜の成分の２〜１０％が、膜糖
タンパク質及び膜糖脂質におけるオリゴ糖である。炭水化物のオリゴ糖修飾によ
って構造上の広範な多様性が生まれる。糖タンパク質及び糖脂質における修飾は
、その殆どが細胞膜の細胞外部位にあるため、細胞内の認識に重要である（Stry
er, L. (1988) Biochemistry, W.H. Freeman and Company, New York NY, pp. 2
98-299, 331-347）。
【０００３】 N及びO結合オリゴ糖はタンパク質に輸送され、小胞体（ER）内及びゴルジ体内
で起こる一連の酵素反応において修飾される。オリゴ糖は、タンパク質のフォー
ルディング中及びその後タンパク質を安定化させ、膜内のタンパク質を方向付け
、タンパク質の可溶性を高め、リソソームターゲッティングのシグナルとして作
用する。糖脂質はリン酸脂質やコレステロールと共に細胞の膜を形成する。糖脂
質の例には、ニューロンのミエリン鞘内の赤血球及びガングリオシド上の血液型
抗原が挙げられる（Lodish, H. et al. (1995) Molecular Cell Biology, Scien
tific American Books, New York NY, pp. 612-615）。
【０００４】 炭水化物はまた、ポリサッカリドであるグリコサミノグリカン（GAG）を形成
する。このポリサッカリドは、２糖の繰り返し構造であって、分枝を持たない直
線である。GAGは、１或いは複数のGAGに付着したコアタンパク質からなる大きな
分子プロテオグリカンの一部として、或いは単独で存在する。GAGは、細胞表面
及び細胞内、細胞外マトリックスに存在する。GAG hyaluronanは滑液に豊富に存
在する（Pitsillides, A.A. et al. (1993) Int. J. Exp. Pathol. 74:27-34）
。軟骨などの結合組織の細胞外マトリックスにおけるプロテオグリカンは、荷重
関節への負荷の分配に必須である。細胞表面付着プロテオグリカンは、細胞を細
胞外マトリックスに固着する。細胞外プロテオグリカン及び細胞表面プロテオグ
リカンは何れも成長因子に結合し、それらの細胞表面受容体への結合を促進し、
それに続くシグナル伝達経路を開始させる（Lodish, 前出、pp. 1139-1142）。
【０００５】 Man9-マンノシダーゼは、N結合オリゴ糖の初期のプロセッシングに関与するα
1，2-マンノシダーゼ（グリコシルヒドロラーゼ）である。この酵素は、Man9-(G
lcNac)2及びMan5-(GlcNac)2におけるα1，2-マンノシダーゼ結合の特異的切断を
触媒する。多数のα1，2-マンノシダーゼが哺乳動物細胞で同定されており、異
なるクラスのN-糖タンパク質のプロセッシングには異なるα1，2-マンノシダー
ゼが必要であると思われる。Man9-マンノシダーゼは、短い細胞質尾部及び１回
膜貫通ドメイン、大きな管腔触媒ドメインを有するII型膜タンパク質である。ブ
タ肝臓Man9-マンノシダーゼはER及び一過性の小胞（transient vesicle）に局在
するが、ヒト腎臓Man9-マンノシダーゼはゴルジ体に局在する（Bause, E. et al
. (1993) Eur. J. Biochem. 217:535-540; Bieberich, E. and E. Bause (1995)
Eur. J. Biochem. 233:644-649）。
【０００６】 トランスフェラーゼは、炭水化物などの細胞成分の合成及び分解に必須の反応
に関与する。例えば、ガラクトースβ-1，4-N-アセチルグルコサミンの生成反応
を触媒するガラクトシルトランスフェラーゼは、ラクトースの合成にある役割を
果たし、また細胞膜の成分として細胞内認識及び／または接着において作用し得
る（Masri, K.A. et al. (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 157:657-663
）。
【０００７】 シンセターゼは、固有の細胞の機能化において重要な役割を果たす炭水化物修
飾酵素の別のクラスである。例えば、シアル酸付加複合糖質の合成には、シチジ
ン5'-1リン酸N-アセチルノイラミン酸（CMP-Neu5Ac）シンセターゼによって触媒
される反応であるCMP-Neu5Acの合成が必要である（Munster, A.K. et al. (1998
) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:9140-9145）。細胞表面糖タンパク質及び糖
脂質のシアル酸は、様々な組織における固有の構造及び機能に寄与している。
【０００８】 グルコシダーゼも炭水化物修飾酵素の別のクラスであり、様々なグルコシドに
おけるグルコシド結合の加水分解によって炭水化物からのグルコースの遊離を触
媒する。血液学的な異常によって特徴付けられる遺伝性異常症ゴーシェ病I型が
、白血球βグルコシダーゼ値のアッセイによって、ヘテロ接合性個体若しくはホ
モ接合性個体において見出され得る（Raghavan. S.S. et al. (1980) Am. J. Hu
m. Genet. 32:158-173）。
【０００９】 他の幾つかの異常症において炭水化物代謝が変わる。糖尿病の特徴は、血中の
糖の異常な上昇（高血糖症）である。I型糖尿病は、脾臓インスリン分泌細胞の
自己免疫に関連した欠損から起こる。II型糖尿病は、インスリン抵抗性及びグル
コースに応答するインスリン分泌の障害から起こり、肥満と関連性がある。血中
の糖の異常な低下、即ち低血糖症は、薬剤の使用及び炭水化物修飾酵素の遺伝的
欠陥、癌、肝臓疾患、腎臓疾患などから起こる（Berkow, R. et al. (1992) The Merck Manual of Diagnosis and Therapy , Internet Edition. Section 8, Cha
pter 91, Diabetes Mellitus, Hypoglycemia）。
【００１０】 グリコサミノグリカン（GAG）値の変化は、幾つかの自己免疫疾患と関連性が
ある。様々なGAGの低下及び上昇の双方が、自己免疫甲状腺疾患及び自己免疫糖
尿病の患者に見られる。GAGに対する抗体が、全身性エリテマトーデス及び自己
免疫性甲状腺疾患の患者で見出された（Hansen. C. et al. (1996) Clin. Exp.
Rheum. 14 (Suppl. 15):S59-S67）。
【００１１】 炭水化物代謝は癌と関連性があり、GAG及びプロテオグリカンの発現の低下は
、ヒト肺癌と関連性がある（Nackaerts, K. et al. (1997) Int. J. Cancer 74:
335-345）。炭水化物決定基であるシアリルルイスA及びシアリルルイスXは、ヒ
ト癌細胞で頻繁に発現する。これらの決定基は、細胞接着分子E-セレクチンのリ
ガンドであり、癌細胞の血管内皮への接着に関与し、癌の血行性転移に寄与する
（Kannagi, R. (1997) Glycoconj. 3. 14:577-584）。細胞表面糖タンパク質のN
結合炭水化物コア構造の変化は、大腸癌及び脾臓癌につながる（Schwarz, R.E.
et al. (1996) Cancer Lett. 107:285-291）。細胞表面糖脂質及び糖タンパク質
におけるSda血液型炭水化物構造（Sda blood group carbohydrate structure）
の発現の低下が、胃腸の癌で観察された（Dohi, T. et al. (1996) Int. J. Can
cer 67:626-631）。
【００１２】 新規の各炭水化物修飾酵素及びそれらをコードするポリヌクレオチドの発見に
より、炭水化物代謝異常及び自己免疫異常／炎症異常、癌の診断及び治療、予防
に有用な新規の組成物を提供することで当分野のニーズに答えることができる。
【００１３】 （発明の要約） 本発明は、総称して「CME」、個別にはそれぞれ「CME-1」及び「CME-2」、「C
ME-3」、「CME-4」、「CME-5」と呼ぶ炭水化物修飾酵素である精製されたポリペ
プチドを提供する。本発明の一実施態様では、a）SEQ ID NO:1−5からなる一群
から選択されたアミノ酸配列、b）SEQ ID NO:1−5からなる一群から選択された
アミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有する自然発生のアミノ酸配列、c）S
EQ ID NO:1−5からなる一群から選択されたアミノ酸配列の生物学的に活性な断
片、またはd）SEQ ID NO:1−5からなる一群から選択されたアミノ酸配列の免疫
原性断片を含む単離されたポリペプチドを提供する。別法では、SEQ ID NO:1−5
のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを提供する。
【００１４】 更に本発明は、a）SEQ ID NO:1−5からなる一群から選択されたアミノ酸配列
、b）SEQ ID NO:1−5からなる一群から選択されたアミノ酸配列と９０％以上の
配列同一性を有する自然発生のアミノ酸配列、c）SEQ ID NO:1−5からなる一群
から選択されたアミノ酸配列の生物学的に活性な断片、またはd）SEQ ID NO:1−
5からなる一群から選択されたアミノ酸配列の免疫原性断片むポリペプチドをコ
ードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。別法では、このポリヌクレオ
チドは、SEQ ID NO:6−10からなる一群から選択される。
【００１５】 更に、本発明は、a）SEQ ID NO:1−5からなる一群から選択されたアミノ酸配
列、b）SEQ ID NO:1−5からなる一群から選択されたアミノ酸配列と９０％以上
の配列同一性を有する自然発生のアミノ酸配列、c）SEQ ID NO:1−5からなる一
群から選択されたアミノ酸配列の生物学的に活性な断片、またはd）SEQ ID NO:1
−5からなる一群から選択されたアミノ酸配列の免疫原性断片を含むポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチドと機能的に結合されたプロモーター配列を含む
組換えポリヌクレオチドを提供する。別法では、本発明は、この組換えポリヌク
レオチドで形質転換された細胞を提供する。更なる別法では、本発明は、この組
換えポリヌクレオチドを含む遺伝子組換え生物を提供する。
【００１６】 また、本発明は、a）SEQ ID NO:1−5からなる一群から選択されたアミノ酸配
列、b）SEQ ID NO:1−5からなる一群から選択されたアミノ酸配列と９０％以上
の配列同一性を有する自然発生のアミノ酸配列、c）SEQ ID NO:1−5からなる一
群から選択されたアミノ酸配列の生物学的に活性な断片、またはd）SEQ ID NO:1
−5からなる一群から選択されたアミノ酸配列の免疫原性断片を含むポリペプチ
ドの製造方法を提供する。この方法は、a）このポリペプチドの発現に好適な条
件の下で、このポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと機能的に結合され
たプロモーター配列を含む組換えポリヌクレオチドで形質転換された細胞を培養
するステップと、b）このように発現したポリペプチドを回収するステップとを
含む。
【００１７】 更に、本発明は、a）SEQ ID NO:1−5からなる一群から選択されたアミノ酸配
列、b）SEQ ID NO:1−5からなる一群から選択されたアミノ酸配列と９０％以上
の配列同一性を有する自然発生のアミノ酸配列、c）SEQ ID NO:1−5からなる一
群から選択されたアミノ酸配列の生物学的に活性な断片、またはd）SEQ ID NO:1
−5からなる一群から選択されたアミノ酸配列の免疫原性断片を含むポリペプチ
ドに特異的に結合する単離された抗体を提供する。
【００１８】 更に、本発明は、a）SEQ ID NO:6−10からなる一群から選択されたポリヌクレ
オチド配列、b）SEQ ID NO:6−10からなる一群から選択されたポリヌクレオチド
配列と７０％以上の配列同一性を有する自然発生のポリヌクレオチド配列、c）
前記a）に相補的なポリヌクレオチド配列、またはd）前記b）に相補的なポリヌ
クレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。別法では、この
ポリヌクレオチドは、少なくとも６０個の連続するヌクレオチドを含む。
【００１９】 更に、本発明は、a）SEQ ID NO:6−10からなる一群から選択されたポリヌクレ
オチド配列、b）SEQ ID NO:6−10からなる一群から選択されたポリヌクレオチド
と７０％以上の配列同一性を有する自然発生のポリヌクレオチド配列、c）前記a
）に相補的なポリヌクレオチド配列、またはd）前記b）に相補的なポリヌクレオ
チド配列を含むポリヌクレオチド配列を有するサンプル中の標的ポリヌクレオチ
ドを検出する方法を提供する。この方法は、a）前記サンプル内の標的ポリヌク
レオチドと相補的な配列を含む少なくとも１６個の連続するヌクレオチドを含む
プローブと前記サンプルをハイブリダイズさせるステップであって、前記プロー
ブと前記標的ポリヌクレオチドとでハイブリダイゼーション複合体が形成される
条件の下、前記プローブが前記標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズ
する、該ステップと、b）前記ハイブリダイゼーション複合体の存在の有無を検
出し、存在する場合には随意選択でその量を測定するステップとを含む。別法で
は、前記プローブは、少なくとも３０個の連続するヌクレオチドを含む。更なる
別法では、前記プローブは、少なくとも６０個の連続するヌクレオチドを含む。
【００２０】 更に、本発明は、a）SEQ ID NO:1−5からなる一群から選択されたアミノ酸配
列、b）SEQ ID NO:1−5からなる一群から選択されたアミノ酸配列と９０％以上
の配列同一性を有する自然発生のアミノ酸配列、c）SEQ ID NO:1−5からなる一
群から選択されたアミノ酸配列の生物学的に活性な断片、またはd）SEQ ID NO:1
−5からなる一群から選択されたアミノ酸配列の免疫原性断片を含むポリペプチ
ド有効量と好適な医薬用賦形剤とを含む医薬品組成物を提供する。更に、本発明
は、患者にこの医薬品組成物を投与することを含む、機能的CMEの発現の低下に
関連した疾患やその症状の治療方法を提供する。
【００２１】 更に、本発明は、a）SEQ ID NO:1−5からなる一群から選択されたアミノ酸配
列、b）SEQ ID NO:1−5からなる一群から選択されたアミノ酸配列と９０％以上
の配列同一性を有する自然発生のアミノ酸配列、c）SEQ ID NO:1−5からなる一
群から選択されたアミノ酸配列の生物学的に活性な断片、またはd）SEQ ID NO:1
−5からなる一群から選択されたアミノ酸配列の免疫原性断片を含むポリペプチ
ドのアゴニストとして効果的な化合物をスクリーニングする方法を提供する。こ
の方法は、a）前記ポリペプチドを含むサンプルを化合物に曝露するステップと
、b）前記サンプルのアゴニスト活性を検出するステップとを含む。別法では、
本発明は、前記方法によって同定されたアゴニスト化合物と好適な医薬用賦形剤
とを含む医薬品組成物を提供する。更なる別法では、本発明は、この医薬品組成
物の患者への投与を含む、機能的CMEの発現の低下に関連した疾患やその症状の
治療方法を提供する。
【００２２】 更に、本発明は、a）SEQ ID NO:1−5からなる一群から選択されたアミノ酸配
列、b）SEQ ID NO:1−5からなる一群から選択されたアミノ酸配列と９０％以上
の配列同一性を有する自然発生のアミノ酸配列、c）SEQ ID NO:1−5からなる一
群から選択されたアミノ酸配列の生物学的に活性な断片、またはd）SEQ ID NO:1
−5からなる一群から選択されたアミノ酸配列の免疫原性断片含むポリペプチド
のアンタゴニストとして効果的な化合物をスクリーニングする方法を提供する。
この方法は、a）前記ポリペプチドを含むサンプルを化合物に曝露するステップ
と、b）前記サンプルのアンタゴニスト活性を検出するステップとを含む。別法
では、本発明は、前記方法によって同定されたアンタゴニスト化合物と好適な医
薬用賦形剤とを含む医薬品組成物を提供する。更なる別法では、本発明は、この
医薬品組成物の患者への投与を含む、機能的CMEの過剰な発現に関連した疾患や
その症状の治療方法を提供する。
【００２３】 更に本発明は、SEQ ID NO:6−10からなる一群から選択された配列を含む標的
ポリヌクレオチドの発現を変えるのに効果的な化合物をスクリーニングする方法
であって、a）前記標的ポリヌクレオチドを含むサンプルを化合物に曝露するス
テップと、b）前記標的ポリヌクレオチドの発現の変化を検出するステップとを
含む、該スクリーニング方法を提供する。
【００２４】 （本発明の記載について） 本発明のタンパク質及び核酸配列、方法について説明する前に、本発明は、こ
こに開示した特定の装置及び材料、方法に限定されず、その実施形態を変更でき
ることを理解されたい。また、ここで用いられる用語は、特定の実施例のみを説
明する目的で用いられたものであり、後述の請求の範囲によってのみ限定され、
本発明の範囲を限定することを意図したものではないということも理解されたい
。
【００２５】 本明細書及び請求の範囲において単数形を表す「或る」、「その（この等）」
は、文脈で明確に示していない場合は複数形を含むことに注意されたい。従って
、例えば「或る宿主細胞」は複数の宿主細胞を含み、その「抗体」は複数の抗体
は含まれ、当業者には周知の等価物なども含まれる。
【００２６】 本明細書で用いた全ての科学技術用語は、別の方法で定義されていない限り、
本発明の属する技術分野の一般的な技術者が普通に解釈する意味と同じである。
本明細書で記述したものと類似、或いは同等の全ての装置及び材料、方法は本発
明の実施及びテストに使用できるが、好適な装置及び材料、方法をここに記す。
本明細書に記載の全ての文献は、本発明に関連して使用する可能性のある文献に
記載された細胞系、プロトコル、試薬、ベクターを記述し開示するために引用し
た。従来の発明を引用したからと言って、本発明の新規性が損なわれると解釈さ
れるものではない。
【００２７】 （定義） 用語「CME」は、天然、合成、半合成或いは組換え体など全ての種（特にウシ
、ヒツジ、ブタ、マウス、ウマ及びヒトを含む哺乳動物）から得られる実質的に
精製されたCMEのアミノ酸配列を指す。
【００２８】 用語「アゴニスト」は、CMEの生物学的活性を強化したり、模倣する分子を指
す。このアゴニストは、CMEに直接相互作用するか、或いはCMEが関与する生物学
的経路の成分と作用して、CMEの活性を調節するタンパク質、核酸、糖質、小分
子、任意の他の化合物や組成物を含み得る。
【００２９】 用語「アレル変異配列」は、CMEをコードする遺伝子の別の形を指す。アレル
変異配列は、核酸配列における少なくとも１つの変異によって生じ、変異mRNA若
しくは変異ポリペプチドになり、これらの構造や機能は変わる場合もあれば変わ
らない場合もある。ある遺伝子は、自然発生型のアレル変異配列が存在しないも
の、１つ或いは多数存在するものがある。一般にアレル変異配列を生じる変異は
、ヌクレオチドの自然な欠失、付加、或いは置換による。これらの各変異は、単
独或いは他の変異と同時に起こり、所定の配列内で一回或いはそれ以上生じる。
【００３０】 CMEをコードする「変異」核酸配列は、様々なヌクレオチドの欠失、挿入、或
いは置換が起こっても、CMEと同じポリペプチド或いはCMEの機能特性の少なくと
も１つを備えるポリペプチドを指す。この定義には、CMEをコードするポリヌク
レオチド配列の正常な染色体の遺伝子座ではない位置でのアレル変異配列との不
適当或いは予期しないハイブリダイゼーション、並びにCMEをコードするポリヌ
クレオチドの特定のオリゴヌクレオチドプローブを用いて容易に検出可能な或い
は検出困難な多形性を含む。コードされたタンパク質も変異され得り、サイレン
ト変化を生じCMEと機能的に等価となるアミノ酸残基の欠失、挿入、或いは置換
を含み得る。意図的なアミノ酸置換は、生物学的或いは免疫学的にCMEの活性が
保持される範囲で、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び／または
両親媒性についての類似性に基づいて成され得る。例えば、負に荷電したアミノ
酸にはアスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれ、正に荷電したアミノ酸にはリ
シン及びアルギニンが含まれ得る。類似の親水性の値をもち極性非荷電側鎖を有
するアミノ酸には、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニンが含まれ得
る。類似の親水性の値をもち非荷電側鎖を有するアミノ酸には、ロイシン、イソ
ロイシン、バリン、グリシン、アラニン、フェニルアラニン及びチロシンが含ま
れ得る。
【００３１】 用語「アミノ酸」及び「アミノ酸配列」は、オリゴペプチド、ペプチド、ポリ
ペプチド、タンパク質配列、或いはそれらの任意の断片を指し、天然の分子及び
合成分子を含む。「アミノ酸配列」が自然発生のタンパク質分子である場合、「
アミノ酸配列」及び類似の用語は、アミノ酸配列を、記載したタンパク質分子に
関連する完全で元のままのアミノ酸配列に限定するものではない。
【００３２】 用語「増幅」は、核酸配列の複製物を作製することに関連する。一般に増幅は
、この技術分野で周知のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術によって行われる。
【００３３】 用語「アンタゴニスト」は、CMEの生物学的活性を阻害或いは減弱する分子で
ある。アンタゴニストは、CMEに直接相互作用するか、或いはCMEが関与する生物
学的経路の成分と作用して、CMEの活性を調節する抗体、核酸、糖質、小分子、
任意の他の化合物や組成物などのタンパク質を含み得る。
【００３４】 用語「抗体」は、抗原決定基と結合可能なFab及びF(ab')2、及びそれらの断片
、Fv断片などの無傷の分子を指す。CMEポリペプチドと結合する抗体は、抗体を
免疫する小ペプチドを含む無傷の分子またはその断片を用いて産生可能である。
動物（例えば、マウス、ラット、若しくはウサギ）を免疫化するのに使用される
ポリペプチド或いはオリゴペプチドは、RNAの翻訳から、或いは化学的に合成可
能であり、必要に応じて担体タンパク質と結合させることも可能である。ペプチ
ドと化学的に結合した一般に用いられる担体は、ウシ血清アルブミン、チログロ
ブリン、及びキーホールリンペットヘモニアン（KLH）を含む。次ぎに、この結
合したペプチドを用いて動物を免疫化する。
【００３５】 用語「抗原決定基」は、特定の抗体と接触する分子の領域（即ちエピトープ）
を指す。タンパク質或いはタンパク質の断片が、宿主動物を免疫化するのに用い
られるとき、このタンパク質の種々の領域は、抗原決定基（タンパク質上の特定
の領域或いは三次元構造体）に特異的に結合する抗体の産生を誘発し得る。抗原
決定基は、抗体と結合するために無傷の抗原（即ち、免疫応答を引き出すために
用いられる免疫原）と競合し得る。
【００３６】 本明細書において「アンチセンス」は、特定の核酸配列のセンス鎖と塩基対を
形成し得る任意の組成物を指す。アンチセンス成分には、DNAと、RNAと、ペプチ
ド核酸（PNA）と、ホスホロチオネートやメチルホスホネート、ベンジルホスホ
ネート（benzylphosphonate）などの変更された背骨連結（backbone linkage）
を有するオリゴヌクレオチドと、2'-メトキシエチル糖または2'-メトキシエトキ
シ糖などの変更された糖を有するオリゴヌクレオチドと、5-メチルシトシンまた
は2'-deoxyuracil、7-deaza-2'-deoxyguanosineなどの変更された塩基を有する
オリゴヌクレオチドを含み得る。アンチセンス分子は、化学合成や転写を含む任
意の方法で作り出すことができる。相補的アンチセンス分子は、一度細胞に導入
されると、細胞によって作られた自然発生の核酸配列と塩基対となって二重鎖を
形成し、転写や翻訳を阻害する。「負」または「マイナス」という表現はアンチ
センス鎖であり、「正」または「プラス」という表現はセンス鎖である。
【００３７】 用語「生物学的に活性」は、自然発生分子の構造的、調節的、或いは生化学的
な機能を有するタンパク質を指す。同様に、用語「免疫学的に活性」は、天然或
いは組換え体のCME、合成のCMEまたはそれらの任意のオリゴペプチドが、適当な
動物或いは細胞の特定の免疫応答を誘発して特定の抗体と結合する能力を指す。
【００３８】 用語「相補的」及び「相補性」は、ポリヌクレオチド同士が自然に結合して塩
基対を形成することを指す。例えば、配列「５'Ａ−Ｇ−Ｔ３'」が相補的な配列
「３'Ｔ−Ｃ−Ａ５'」と結合する。２つの一本鎖分子間の相補性は、幾つかの核
酸のみが結合する部分的な場合、或いは一本鎖間に完全な相補性が存在して完全
な相補性となる場合もあり得る。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブ
リダイゼーションの効率及び強度に大きな影響を与える。このことは、核酸鎖間
の結合に左右される増幅反応、並びにペプチド核酸（PNA）分子の設計若しくは
使用において特に重要である。
【００３９】 「所定のポリヌクレオチド配列を含む組成物」または「所定のアミノ酸配列を
含む組成物」は広い意味で、所定のヌクレオチド配列若しくはアミノ酸配列を含
む任意の組成物を指す。この組成物は、乾燥した製剤或いは水溶液を含み得る。
CME若しくはCMEの断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む組成物は、ハイ
ブリダイゼーションプローブとして使用され得る。このプローブは、凍結乾燥状
態で保存可能であり、糖質などの安定化剤と結合させることが可能である。ハイ
ブリダイゼーションにおいて、プローブは、塩（例えば、NaCl）及び界面活性剤
（例えば、SDS：ドデシル硫酸ナトリウム）、その他の物質（例えば、デンハー
ト液、乾燥ミルク、サケ精子DNAなど）を含む水溶液に展開され得る。
【００４０】 「コンセンサス配列」は、不要な塩基を分離するためにシークエンシングされ
た核酸配列であって、XL-PCRTM（Perkin Elmer, Norwalk, CT）を用いて５'及び
／または３'の方向に伸長されてシークエンシングされた核酸配列、或いはGELVI
EW 断片構築システム（GCG, Madison, WI）などのフラグメントの構築のための
コンピュータプログラムを用いて１つ或いはそれ以上のインサイト社クローン、
及び場合によっては、１つ以上のパブリックのドメインESTの重複によって構築
された核酸配列を指す。伸長及び重複の両方によって構築されるコンセンサス配
列もある。
【００４１】 用語「保存的なアミノ酸置換」は、元のタンパク質の特性を殆ど変えない置換
を指す。即ち、置換によってそのタンパク質の構造や機能が大きくは変わらず、
そのタンパク質の構造、特にその機能が保存される。以下に、あるタンパク質の
元のアミノ酸が別のアミノ酸に置換される保存的なアミノ酸置換を示す。 元の残基 保存的な置換 Ala Gly, Set Arg His, Lys Asn Asp, Gln, His Asp Asn, Glu Cys Ala, Ser Gln Asn, Glu, His Glu Asp, Gln, His Gly Ala His Asn, Arg, Gln, Glu Ile Leu, Val Leu Ile, Val Lys Arg, Gln, Glu Met Leu, Ile Phe His, Met, Leu, Trp, Tyr Ser Cys, Thr Thr Ser, Val Trp Phe, Tyr Tyr His, Phe, Trp Val Ile. Leu, Thr 一般に、保存されたアミノ酸置換の場合は、a）置換された領域のポリペプチ
ドの骨格構造、例えば、βシートやαヘリックス高次構造、b）置換された部位
の分子の電荷または疎水性、及び／または、c）側鎖の大半が維持される。
【００４２】 用語「欠失」は、１個以上のアミノ酸残基が欠如するアミノ酸配列の変化、或
いは１個以上のヌクレオチドが欠如する核酸配列の変化を指す。
【００４３】 用語「誘導体」は、化学修飾されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指
す。ポリヌクレオチド配列の化学修飾には、例えば、アルキル基、アシル基、ヒ
ドロキシル基、或いはアミノ基による水素の置換がある。誘導体ポリヌクレオチ
ドは、自然分子（未修飾の分子）の生物学的或いは免疫学的機能の少なくとも１
つを維持するポリペプチドをコードする。誘導体ポリペプチドとは、もとのポリ
ペプチドの生物学的機能、或いは免疫学的機能の少なくとも１つを維持する、グ
リコシル化、ポリエチレングリコール化、或いは任意の同様のプロセスによって
修飾されたポリペプチドのことである。
【００４４】 用語「断片」は、CMEまたはCMEをコードするポリヌクレオチドの固有の部分で
あって、その親配列（parent sequence）と同一であるがその配列より長さが短
いものを指す。「断片」の最大の長さは、親配列から１つのヌクレオチド／アミ
ノ酸残基を差し引いた長さである。例えば、ある断片は、５〜１０００個の連続
するヌクレオチド或いはアミノ酸残基を含む。プローブ、プライマー、抗原、治
療用分子、またはその他の目的に用いる断片は、少なくとも５、１０、１５、１
６、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７５、１００、１５０、２５０若し
くは５００個の連続するヌクレオチド或いはアミノ酸残基の長さである。断片は
、優先的に分子の特定の領域から選択される場合もある。例えば、ポリペプチド
断片は、所定の配列に示された最初の２５０若しくは５００のアミノ酸（或いは
、ポリペプチドの最初の２５％または５０％）から選択された連続するアミノ酸
の所定の長さを含み得る。これらの長さは一例であり、配列表及び表、図面を含
む明細書に記載の任意の長さが、本発明の実施例に含まれ得る。
【００４５】 SEQ ID NO:6−10のある断片は、例えば、同じゲノム内の他の配列とは異なる
、SEQ ID NO:6−10を明確に同定する固有のポリヌクレオチド配列の領域を含む
。SEQ ID NO:6−10のある断片は、例えば、ハイブリダイゼーションや増幅技術
、またはSEQ ID NO:6−10を関連ポリヌクレオチド配列から区別する類似の方法
に有用である。ある断片と一致するSEQ ID NO:6−10の正確な断片の長さや領域
は、その断片の目的に基づいて当分野で一般的な技術によって日常的に測定でき
る。
【００４６】 SEQ ID NO:1−5のある断片は、SEQ ID NO:6−10のある断片によってコードさ
れる。SEQ ID NO:1−5のある断片は、特異的にSEQ ID NO:1−5を同定する固有の
アミノ酸配列の領域を含む。例えば、SEQ ID NO:1−5のある断片は、特異的にSE
Q ID NO:1−5を認識する抗体の作製用の免疫原性ペプチドとして有用である。あ
る断片と一致するSEQ ID NO:1−5の正確な断片の長さや領域は、その断片の目的
に基づいて当分野で一般的な技術によって日常的に測定できる。
【００４７】 用語「類似性」は相補性の程度を表す。これには、部分的類似性と完全な類似
性とがある。用語「同一性」を「類似性」とも言える。同一の配列と標的の核酸
とのハイブリダイゼーションが少なくとも部分的に阻止される部分的に相補的な
配列は、「実質的に類似」と呼ばれる。完全に相補的な配列と標的の配列とのハ
イブリダイゼーションの阻止は、緩いストリンジェントな条件の下、ハイブリダ
イゼーションアッセイ（サザンブロッティング或いはノーザンブロッティング法
、溶液ハイブリダイゼーション等）を用いて検査される。実質的に類似の配列或
いはハイブリダイゼーションプローブは、緩いストリンジェントな条件の下、完
全に類似（同一）の配列と標的の配列との結合に対して競合して抑制する。これ
は、緩いストリンジェントな条件の下では非特異的な結合が許容されるというこ
とではなく、緩いストリンジェントな条件では、２つの配列の互いへの結合が特
異的（即ち、選択的）に相互作用しなけらばならい。部分的な相補性ともいえな
い（例えば、３０％未満の類似性或いは同一性）第２の標的配列を用いて、非特
異的結合が存在しないことの検査が可能である。非特異的結合が存在しない場合
は、実質的に類似配列或いはプローブが第２の非相補的標的配列とハイブリダイ
ズしない。
【００４８】 ポリヌクレオチド配列についての用語「パーセントの同一性」又は「％の同一
性」とは、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされる、２つ以上
のポリヌクレオチド配列間の一致する残基の百分率のことである。このようなア
ルゴリズムは、標準化され再現できる方法で、２つの配列間のアラインメントを
最適化するべく、配列にギャップを挿入して、より意味をもつ２つの配列間の比
較を行うことができる。
【００４９】 ポリヌクレオチド配列間の同一性のパーセントは、MEGALIGN version 3.12e配
列アラインメントプログラムに組込まれるCLUSTAL Vアルゴリズムのデフォルト
パラメータを用いて決定可能である。このプログラムはLASERGENEソフトウェア
パッケージの一部であり、分子生物学分析プログラム一式（DNASTAR, Madison W
I）である。このCLUSTAL Vは、Higgins, D.G. 及び P.M. Sharp (1989) CABIOS
5:151-153、Higgins, D.G. 他 (1992) CABIOS 8:189-191に記載されている。ポ
リヌクレオチド配列の対のアライメントの場合、デフォルトパラメーターは、Kt
uple=2、gap penalty=5、window=4、「diagonals saved」=4と設定する。「重み
付けされた」残基重み付け表が、デフォルトとして選択された。同一性のパーセ
ントは、アラインメントされたポリヌクレオチド配列の対の「類似性のパーセン
ト」としてCLUSTAL Vによって報告される。
【００５０】 別法では、一般に用いられ、無料で入手可能な配列比較アルゴリズム一式が、
NCBI、Bethesda、MD、及びインターネット（http://WWW.ncbi.nlm.nih.gov/BLAS
T/）などから入手できるNational Center for Biotechnology Information (NCB
I) Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul, S.F. 他 (1990) J
. Mol. Biol. 215:403-410)によって得られる。このBLASTソフトウェア一式には
、既知のポリヌクレオチド配列と様々なデータベースの別のポリヌクレオチド配
列とのアラインメントに用いられる「blastn」を含む、様々な配列分析プログラ
ムが含まれる。「BLAST 2 Sequences」と呼ばれるツールが入手可能であり、２
つのヌクレオチド配列の対を直接比較するために用いられる。「BLAST 2 Sequen
ces」は、http://WWW.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/b12.htmlにアクセスして、対話形
式で利用ができる。「BLAST 2 Sequences」ツールは、blastn 及び blastp（以
下に記載）の両方に用いることができる。BLASTプログラムは、一般的には、デ
フォルトを設定するギャップ及び他のパラメーターと共に用いられる。例えば、
２つのヌクレオチド配列を比較する場合、ある者は、デフォルトパラメータに設
定された「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.12 (April-21-2000)でblast
nを使用するであろう。そのようなデフォルトパラメータは、例えば、以下のよ
うにする。 Matrix: BLOSUM62 Reward for match: 1 Penalty for mismatch: -2 Open Gap: 5 及び Extension Gap: 2 penalties Gap x drop-off: 50 Expect: 10 Word Size: 11 Filter: on 同一性のパーセントは、例えば、特定の配列番号で決められた、所定の配列の
全長に対して測定してもよいし、それより短い長さに対して、例えば、ある大き
な所定の配列から得られた断片、例えば、連続する少なくとも、２０または３０
、４０、５０、７０、１００、２００のヌクレオチドの断片の長さに対して測定
してもよい。このような長さは単なる例であり、配列表及び表、図面を含む明細
書に記載の配列の任意の長さの断片を用いて、同一性のパーセントが測定される
長さを示すことができる。
【００５１】 高い同一性を示さない核酸配列でも、遺伝子コードの縮重によって類似のアミ
ノ酸配列をコードし得る。縮重を利用して核酸配列を変え、それぞれが実質的に
同じタンパク質をコードする様々な核酸配列を作製できることを理解されたい。
【００５２】 ポリペプチド配列に用いられる用語「パーセントの同一性」又は「％の同一性
」とは、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされる２つ以上のポ
リペプチド配列間の一致する残基の百分率のことである。ポリペプチド配列アラ
インメントの方法は周知である。アラインメント方法の中には、保存的なアミノ
酸置換を考慮したものもある。詳細に上述したこのような保存的な置換は、一般
に、置換部位の電荷や疎水性が保存され、ポリペプチドの構造（従って機能も）
が保存される。
【００５３】 ポリペプチド配列間の同一性のパーセントは、MEGALIGN バージョン3.12e配列
アラインメントプログラム（上記）に組込まれるCLUSTAL Vアルゴリズムのデフ
ォルトパラメータを用いて決定可能である。CLUSTAL Vを用いる対方式のポリぺ
プチド配列のアライメントの場合、デフォルトパラメーターは、Ktuple=1、gap
penalty=3、window=5、及び「diagonals saved」=5と設定する。PAM250マトリク
スが、デフォルトの残基重み付け表として選択される。ポリヌクレオチドアライ
ンメントと同様に、アラインメントされたポリペプチド配列の対の同一性のパー
セントは、「類似性のパーセント」としてCLUSTAL Vによって報告される。
【００５４】 別法では、NCBI BLASTソフトウェア一式が用いられる。例えば、２つのポリペ
プチド配列を対で比較をする場合、ある者は、デフォルトパラメータで設定され
た「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.12 (April-21-2000)でblastpを使
用するであろう。そのようなデフォルトパラメータは、例えば、以下のようにす
る。 Matrix: BLOSUM62 Open Gap: 11 及び Extension Gap: 1 penalties Gap x drop-off: 50 Expect: 10 Word Size: 3 Filter: on 同一性のパーセントは、例えば、特定の配列番号で決められた、所定のポリペ
プチド配列の全長に対して測定してもよいし、それより短い長さに対して、例え
ば、ある大きな所定のポリペプチド配列から得られた断片、例えば、連続する少
なくとも１５、２０または３０、４０、５０、７０、１５０の残基の断片の長さ
に対して測定してもよい。このような長さは単なる例であり、配列表及び表、図
面を含む明細書に記載の配列の任意の長さの断片を用いて、同一性のパーセント
が測定される長さを示すことができる。
【００５５】 「ヒト人工染色体（HAC）」は、約６kb（キロベース）〜１０MbのサイズのDNA
配列を含み得り、安定した有糸分裂染色体の分離及び維持に必要な全ての要素を
含む直鎖状の小染色体である。
【００５６】 用語「ヒト化抗体」は、もとの結合能力を保持しつつよりヒトの抗体に似せる
ために、非抗原結合領域のアミノ酸配列が変えられた抗体分子を指す。
【００５７】 「ハイブリダイゼーション」とは、所定のハイブリダイゼーション条件の下で
、ある一本鎖ポリヌクレオチドがある相補的な一本鎖と塩基対を形成するアニー
リングのプロセスである。特異的なハイブリダイゼーションとは、２つの核酸配
列が高い同一性を有することを意味する。アニーリングが許容される条件の下で
、特異的なハイブリダイゼーション複合体が形成され、洗浄過程の後もハイブリ
ダイズしたままである。洗浄過程は、ハイブリダイゼーションプロセスの厳密性
即ちストリンジェント（stringency）の決定において特に重要であり、よりスト
リンジェントな条件では、非特異的な結合、即ち完全には一致しない核酸鎖間の
対の結合が減少する。核酸配列間のアニーリングが許容される条件は、当業者に
よって日常的に決定され、ハイブリダイゼーションの間は一定であるが、洗浄過
程は、目的のストリンジェントにするためにその最中に条件の変更が可能であり
、ハイブリダイゼーション特異性が得られる。アニーリングが許容される条件は
、例えば、温度が６８℃で、約６×SSC、約１％（w/v）のSDS、並びに約１００
μｇ／ｍｌのせん断して変性したサケ精子DNAが含まれる。
【００５８】 一般に、ハイブリダイゼーションのストリンジェントは、洗浄過程を行う際の
温度によっても左右される。この洗浄温度は通常、所定のイオン強度とｐＨにお
ける特定の配列の熱融点（Tm）より約５〜２０℃低く選択される。このTmは、（
所定のイオン強度とｐＨの下）標的の配列の５０％が完全に一致するプローブと
ハイブリダイズする温度である。Tmを計算する式及び核酸のハイブリダイゼーシ
ョンの条件は、周知であり、Sambrook, J. 他による, 1989, Molecular Cloning : A Laboratory Manual , 第2版の1-3巻, Cold Spring Harbor Press, Plainview
NY; 特に2巻の9章に記載されている。
【００５９】 本発明のポリヌクレオチド間の高いストリンジェントなハイブリダイゼーショ
ンでは、約０．２x SSC及び約１％のSDSの存在の下、約６８℃で１時間の洗浄過
程を含む。別法では、６５℃、６０℃、５５℃、４２℃の温度で行う。SSCの濃
度は、約０．１％のSDSが存在の下、約０．１〜２x SSCの範囲である。通常は、
遮断剤を用いて非特異的なハイブリダイゼーションを阻止する。このような遮断
剤には、例えば、約１００〜２００μｇ／ｍｌの変性したサケ精子DNAが含まれ
る。約３５〜５０％v/vの濃度のホルムアミドなどの有機溶剤が、例えば、RNAと
DNAのハイブリダイゼーションなどの特定の場合に用いることができる。これら
の洗浄条件の有用な改変は、当業者には周知である。特に高いストリンジェント
な条件でのハイブリダイゼーションは、ヌクレオチド間の進化における類似性を
示唆し得る。このような類似性は、それらのヌクレオチド及びコードされたポリ
ペプチドが類似の役割を果たしていることを強く示唆する。
【００６０】 用語「ハイブリダイゼーション複合体」は、相補的な塩基間の水素結合によっ
て、形成された２つの核酸配列の複合体を指す。ハイブリダイゼーション複合体
は溶液中（例えば、Ｃ０ｔまたはＲ０ｔ分析）で形成されるか、或いは溶液中の
１つの核酸配列と固体の支持物（例えば、紙、膜、フィルター、チップ、ピン、
或いはスライドガラス、または細胞及びその核酸を固定する任意の適当な基板）
に固定されたもう一つの核酸配列とで形成され得る。
【００６１】 用語「挿入」或いは「付加」は、１個以上のアミノ酸残基或いはヌクレオチド
がそれぞれ追加されるアミノ酸配列或いは核酸配列の変化を指す。
【００６２】 「免疫応答」は、炎症性疾患及び外傷、免疫異常、感染症、遺伝病などに関連
する症状を指す。これらの症状は、細胞系及び全身防衛系に影響を及ぼすサイト
カイン及びケモカイン、別の情報伝達分子などの様々な因子の発現という特徴を
もつ。
【００６３】 用語「マイクロアレイ」は、基板上に配列されたそれぞれ異なったポリヌクレ
オチドの配列を指す。
【００６４】 マイクロアレイの文脈に用いられる用語「要素」或いは「アレイ要素」は、基
板の表面に配列されたハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドを指す。
【００６５】 用語「変調」は、CMEの活性の変化を指す。例えば、変調によって、CMEのタン
パク質活性、或いは結合特性、またはその他の生物学的特性、機能的特性或いは
免疫学的特性の変化が起こる。
【００６６】 用語「核酸」及び「核酸配列」は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリ
ヌクレオチド、或いはそれらの断片を指す。また、一本鎖若しくは二本鎖であっ
て、センス鎖或いはアンチセンス鎖であるゲノム起源若しくは合成起源のDNA或
いはRNA、ペプチド核酸（PNA）、任意のＤＮＡ様物質、及びＲＮＡ様物質を指す
。
【００６７】 「機能的に結合した」は、第１の核酸配列と第２の核酸配列が機能的な関係に
ある状態を指す。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を
与える場合、そのプロモーターはそのコード配列に機能的に結合している。一般
に、機能的に結合したDNA配列は、同じ読み枠内で２つのタンパク質をコードす
る領域が結合する必要がある場合は、非常に近接或いは連続する。
【００６８】 「ペプチド核酸（PNA）」は、末端がリシンで終わるアミノ酸残基のペプチド
骨格に結合した、少なくとも約５ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドを含
む、アンチセンス分子又は抗遺伝子剤を指す。この末端のリシンにより、この組
成物が溶解性となる。PNAは、相補的な一本鎖DNAやRNAに優先的に結合して転写
物の伸長を止め、ポリエチレングリコール化して細胞における寿命を延ばし得る
。
【００６９】 「プローブ」とは、同一配列或いはアレル核酸配列、関連する核酸配列の検出
に用いる、CMEやそれらの相補配列、またはそれらの断片をコードする核酸配列
のことである。プローブは、検出可能な標識またはレポーター分子が結合され単
離されたオリゴヌクレオチドやポリヌクレオチドである。典型的な標識には、放
射性アイソトープ及びリガンド、化学発光試薬、酵素がある。「プライマー」と
は、相補的な塩基対を形成して標的のポリヌクレオチドにアニーリング可能な、
通常はDNAオリゴヌクレオチドである短い核酸である。プライマーがポリヌクレ
オチドにアニーリングした後、あるDNAポリメラーゼ酵素によって、標的のDNA一
本鎖に沿って伸長される。プライマーの組は、例えば、PCR法における核酸配列
の増幅（及び同定）に用いることができる。
【００７０】 本発明に用いられるプローブ及びプライマーは、既知の配列の少なくとも１５
の連続するヌクレオチドを含む。特異性を高めるために、より長いプローブ及び
プライマーが用いることも可能である。例えば、開示した核酸配列の連続する少
なくとも２０または２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００
、１５０のヌクレオチドを含む。プローブ及びプライマーは、上記した例より相
当長いものも用いることができ、本明細書の表及び図面、配列表に示された任意
の長さのヌクレオチドも用いることができることを理解されたい。
【００７１】 プローブ及びプライマーの準備及び使用方法については、例えば、Sambrook,
J.他による、1989年、名称「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」、第2
版の1-3巻(Cold Spring Harbor Press, Plainview NY)、またはAusubel, F.M.
他による、1987年、名称「Current Protocols in Molecular Biology」(Greene
Pubi. Assoc. & Wiley-Intersciences, New York NY)、並びに Innis他による、
1990年、名称「PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications」(Acade
mic Press, San Diego CA.)を参照されたい。PCR用のプライマーの組は、例えば
、Primer (Version 0.5, 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research
, Cambridge MA)などのそのような目的のためのコンピュータプログラムを用い
て、ある既知の配列から引き出すことができる。
【００７２】 プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドは、当分野で周知のプライマー選
択用のコンピュータプログラムで選択される。例えば、OLIGO 4.06ソフトウェア
は、それぞれが最大１００ヌクレオチドまでのPCR用のプライマーの対の選択、
及び３２，０００塩基までの入力ポリヌクレオチド配列から最大５，０００ヌク
レオチドまでの大きなポリヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドの分析に有用で
ある。類似のプライマー選択用プログラムには、能力を拡大する追加の機能が含
まれている。例えば、PrimOUプライマー選択プログラム（Genome Center at Uni
versity of Texas South West Medical Center, Dallas TXより入手可能）は、
メガベース配列から特定のプライマーを選択できるため、ゲノムワイドスコープ
（genome-wide scope）におけるプライマーの設計に有用である。Primer3プライ
マー選択プログラム（Whitehead Institute/MIT Center for Genome Research,
Cambridge MA1より入手可能）によって、ユーザーは、プライマー結合部位とし
て避けたい配列を指定できる「非プライミングライブラリ（mispriming libaray
）」を入力できる。また、Primer3は、特にマイクロアレイのオリゴヌクレオチ
ドの選択に有用である（後の方の２つのプライマー選択プログラムのソースコー
ドは、それぞれのソースから得ることができ、ユーザーのニーズを満たすように
変更することもできる）。PrimerGenプログラム（UK Human Genome Mapping Pro
ject Resource Centre, Cambridge UK より入手可能）は、多数の配列アライン
メントに基づいてプライマーを設計するため、アラインメントされた核酸配列の
最も保存された領域或いは最も保存されていない領域のどちらかとハイブリダイ
ズするプライマーを選択することができる。従って、このプログラムは、固有及
び保存されたオリゴヌクレオチドやポリヌクレオチドの断片の同定に有用である
。上記した任意の選択方法で同定されたオリゴヌクレオチドやポリヌクレオチド
の断片は、例えば、PCR法やシークエンシングプライマー、マイクロアレイ要素
、或いはサンプルの核酸の完全或いは部分的に相補的なポリヌクレオチドを同定
する特定のプローブなどの、ハイブリダイゼーション技術に有用である。オリゴ
ヌクレオチドの選択方法は、上記した方法に制限されるものではない。
【００７３】 本明細書における「組換え核酸」は天然の配列ではなく、２つ以上の配列の離
れたセグメントを人工的に組み合わせた配列である。この人工の組み合せは、化
学合成によって作られる場合も多いが、前出のSambrook に記載されたような遺
伝子工学の技術を用いて核酸の離れたセグメントを人工的に操作する方がより一
般的である。この「組換え核酸」には、単に核酸の一部の追加または置換、欠失
によって変更された核酸も含む。組換え核酸は、あるプロモーター配列に機能的
に結合した核酸配列を含む場合もある。このような組換え核酸は、例えば、ある
細胞を形質転換するのに用いられるベクターの一部であり得る。
【００７４】 別法では、このような組換え核酸は、この組換え核酸を発現する哺乳動物のワ
クチン接種に用いると、その哺乳動物の防衛的な免疫応答を誘発する、ワクシニ
アウイルスに基づいたウイルスベクターの一部であり得る。
【００７５】 本明細書において、DNA配列に対する「RNA等価物」とは、基準となるDNA配列
と同じ直鎖の核酸配列から構成されるが、窒素性塩基のチミンがウラシルに置換
され、糖鎖の背骨がデオキシリボースではなくリボースからなる。
【００７６】 用語「サンプル」は、その最も広い意味で用いられている。CMEをコードする
核酸若しくはその断片、CME自体を含むと推定されるサンプルには、体液と、細
胞からの抽出物や細胞から単離された染色体や細胞内小器官、膜と、細胞と、溶
液中に存在する又は基板に固定されたゲノムDNA、RNA、cDNAと、組織又は組織プ
リント等も含まれ得る。
【００７７】 用語「特異的結合」及び「特異的に結合する」は、タンパク質若しくはペプチ
ドと、アゴニスト、抗体、アンタゴニスト、小分子、若しくは任意の天然若しく
は合成の結合組成物との間の相互作用を指す。この相互作用は、結合する分子に
よって認識される、例えば、抗原決定基つまりエピトープなどのタンパク質の特
定の構造の存在によって左右される。例えば、抗体がエピトープ「Ａ」に対して
特異的である場合、結合していない標識した「Ａ」及び抗体を含む反応液に、エ
ピトープＡを含むポリペプチド或いは結合していない無標識の「Ａ」が存在する
と、抗体と結合する標識Ａの量が減少する。
【００７８】 用語「実質的に精製された」は、自然の環境から取り除かれてから、単離或い
は分離された核酸配列或いはアミノ酸配列であって、自然に結合している組成物
が少なくとも約６０％以上除去されたものであり、好ましくは約７５％以上の除
去、最も好ましいくは９０％以上除去されたものを指す。
【００７９】 「置換」とは、一つ以上のアミノ酸またはヌクレオチドをそれぞれ別のアミノ
酸またはヌクレオチドに置き換えることである。
【００８０】 用語「基板」は、任意の好適な固体或いは半固体の支持物を指し、膜及びフィ
ルター、チップ、スライド、ウエハ、ファイバー、磁気または非磁気ビード、ゲ
ル、チューブ、プレート、ポリマー、微小粒子、毛細管が含まれる。この基板に
は、壁または塹壕、ピン、チャンネル、細孔などの様々な表面形態があり、そこ
にポリヌクレオチドやポリペプチドが結合する。
【００８１】 「形質転換」とは、外来DNAが入り込み受容体細胞を変化させるプロセスのこ
とである。形質転換は、当分野で周知の種々の方法により、自然或いは人工の条
件の下で起こり得り、原核宿主細胞若しくは真核宿主細胞の中に外来核酸配列を
挿入する任意の周知の方法によって行うことができる。この形質転換の方法は、
形質転換される宿主細胞のタイプによって選択される。この方法には、ウイルス
感染、電気穿孔法（エレクトロポレーション）、リポフェクション、及び微粒子
照射が含まれるが、これらに限定されるものではない。「形質転換された」細胞
には、導入されたDNAが自律的に複製するプラスミドとして或いは宿主染色体の
一部として複製可能である安定的に形質転換された細胞が含まれる。さらに、限
られた時間に一時的に導入DNA若しくは導入RNAを発現する細胞も含まれる。
【００８２】 本明細書における「遺伝子組換え生物」とは、当分野で周知の遺伝子組換え技
術などを用いて、人間が生物の１つ以上の細胞に異種の核酸を導入した任意の生
物であり、動物及び植物を含むが、それらに限定されるものではない。微量注入
や組換えウイルスに感染させるなどの慎重な遺伝子操作によって、細胞の前駆体
に直接或いは間接的に異種核酸を細胞に導入する。「遺伝子操作」とは、典型的
な交雑育種やin vitroでの受精ではなく、組換えDNA分子を導入することである
。本発明に従った遺伝子組換え生物には、細菌及びラン藻類、菌類、植物、動物
が含まれる。本発明の単離されたDNAは、当分野で周知の、例えば、感染、形質
移入、形質転換、トランス接合（transconjugation）などの方法によって、宿主
に導入することができる。本発明のDNAをそのような生物に導入する技術は周知
であり、前出のSambrook他（1989）に記載されている。
【００８３】 特定の核酸配列の「変異配列」とは、デフォルトパラメーター設定の「BLAST
2 Sequences」ツールVersion 2.0.9 (May-07-1999)を用いるblastnによって、あ
る核酸配列のある長さに対する該特定の核酸配列の同一性が、少なくとも４０％
と決定された核酸配列のことである。このような核酸の対は、ある長さにおいて
、例えば、少なくとも５０％または６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、
９５％、９８％、或いはそれ以上の同一性を示し得る。ある変異配列は、例えば
、「アレル」変異配列（上述）または「スプライス」変異配列、「種」変異配列
、「多型」変異配列と表すことができる。スプライス変異配列は基準分子と同一
性が極めて高い可能性があるが、mRNAプロセッシング中のエキソンの択一的スプ
ライシングによってポリヌクレオチドの数が多くなったり、少なくなったりする
。対応するポリペプチドは、基準分子に存在する追加の機能ドメインを有したり
、基準分子に存在するドメインが欠落したりし得る。種変異配列は、種によって
異なるポリヌクレオチド配列である。得られるポリペプチドは、互いに高いアミ
ノ酸同一性を有する。多型変異配列は、所定の種と種における特定の遺伝子のポ
リヌクレオチド配列が異なる。多型変異配列はまた、ポリヌクレオチド配列の１
つのヌクレオチドが異なる「１ヌクレオチド多型」（SNP）も含み得る。SNPの存
在は、例えば、或る集団（population）、病態、病態の特徴を表し得る。
【００８４】 特定のポリペプチド配列の「変異体」とは、デフォルトパラメーター設定の「
BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.9 (May-07-1999)を用いるblastpによっ
て、ある核酸配列のある長さに対する該特定のポリペプチド配列の同一性が、少
なくとも４０％と決定されたポリペプチド配列のことである。このようなポリペ
プチドの対は、ある長さにおいて、例えば、少なくとも５０％または６０％、７
０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、或いはそれ以上の同一性を示
し得る。
【００８５】 （発明） 本発明は、新規のヒト炭水化物修飾酵素（CME）及びCMEをコードするポリヌク
レオチドの発見に基づいた、炭水化物代謝異常及び自己免疫異常／炎症異常、癌
の診断、治療、及び予防におけるそれらの組成物の使用に関する。
【００８６】 表１は、CMEをコードする完全長のヌクレオチド配列の構築に用いたインサイ
ト社クローンを示す。列１及び列２はそれぞれ、ポリペプチド配列及びヌクレオ
チド配列の配列番号（SEQ ID NO）を示す。列３は、各CMEをコードする核酸が同
定されたIncyteクローンのクローンIDを示し、列４は、それらのクローンが単離
されたcDNAライブラリを示す。列５は、Incyteクローン及びそれらに対応するcD
NAライブラリを示す。cDNAライブラリが示されていないインサイト社クローンは
、プールされたcDNAライブラリに由来する。列５のインサイト社クローンは、各
CMEのコンセンサスヌクレオチド配列の構築に用いられ、ハイブリダイゼーショ
ン技術における断片として有用である。
【００８７】 表２の各列は、本発明の各ポリペプチドの様々な特性を示す。列１は配列番号
（SEQ ID NO）、列２は各ポリペプチドにおけるアミノ酸残基の数、列３は潜在
的なリン酸化部位、列４は潜在的なグリコシル化部位、列５はシグネチャ（sign
ature）配列及びモチーフを有するアミノ酸残基、列６は、BLAST分析によって同
定された相同配列を示す。列７は、分析方法、場合によってはその分析方法が適
用できる検索可能なデータベースを示す。列７の分析方法は、配列相同性及びタ
ンパク質モチーフによって各ポリペプチドを特長つけるために用いられた。
【００８８】 表３の列は、CMEをコードするヌクレオチド配列に関連した組織特異性及び疾
患、異常症、症状を示している。表３の列１は、ヌクレオチドの配列番号（SEQ
ID NO）を示している。列２は、列１のヌクレオチド配列の断片を示している。
これらの断片は、例えば、SEQ ID NO:6−10を同定し、SEQ ID NO:6−10と関連す
るポリヌクレオチド配列とを区別する、ハイブリダイゼーション若しくは増幅の
技術において有用である。これらの断片によってコードされるポリペプチドは、
例えば、免疫原性ペプチドとして有用である。列３は、CMEを発現する組織名、
及びCMEを発現する全組織におけるその割合を示す。列４は、CMEを発現する組織
に関連する疾患若しくは異常症、症状、並びにCMEを発現する全組織におけるそ
れらの割合を示す。列５は、各cDNAライブラリのサブクローニングに用いたベク
ターを示す。
【００８９】 表４の各列は、CMEをコードするcDNAのクローンが単離されたcDNAライブラリ
の作製に用いられた組織についての説明である。列１は、ヌクレオチドのSEQ ID
NOを示し、列２はそれらのクローンが単離されたcDNAライブラリを示し、列３
は列２のcDNAライブラリに関連する組織の由来及び詳細を示す。
【００９０】 本発明はまた、CMEの変異体も含む。好適なCMEの変異体は、CMEの機能的或い
は構造的特徴の少なくともどちらか一方を有し、かつCMEアミノ酸配列に対して
少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約９０％のアミノ
酸配列同一性、更には少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有する。
【００９１】 本発明はまた、CMEをコードするポリヌクレオチドを提供する。特定の実施例
において、本発明は、CMEをコードするSEQ ID NO:6−10からなる一群から選択さ
れた配列を含むポリヌクレオチド配列を提供する。配列表に示したSEQ ID NO:6
−10のポリヌクレオチド配列は、窒素系塩基のチミンがウラシルに置換され、糖
鎖の背骨がデオキシリボースではなくリボースからなるRNA配列等価物を含む。
【００９２】 本発明はまた、CMEをコードするポリヌクレオチド配列の変異配列を含む。詳
細には、このようなポリヌクレオチド配列の変異配列は、CMEをコードするポリ
ヌクレオチド配列と少なくとも７０％のポリヌクレオチド配列同一性、或いは少
なくとも８５％のポリヌクレオチド配列同一性、更には少なくとも９５％ものポ
リヌクレオチド配列同一性を有する。本発明の特定の実施形態は、SEQ ID NO:6
−10からなる一群から選択された核酸配列と少なくとも７０％のポリヌクレオチ
ド配列同一性、或いは少なくとも８５％のポリヌクレオチド配列同一性、更には
少なくとも９５％ものポリヌクレオチド配列同一性を有するSEQ ID NO:6−10か
らなる一群から選択された配列を含むポリヌクレオチド配列の変異配列を提供す
る。上記したポリヌクレオチド変異配列は何れも、CMEの機能的或いは構造的特
徴の少なくとも１つを有するアミノ酸配列をコードする。
【００９３】 遺伝暗号の縮重により作り出され得るCMEをコードする種々のポリヌクレオチ
ド配列には、既知の自然発生する任意の遺伝子のポリヌクレオチド配列と最小の
類似性しか有しないものも含まれることを、当業者は理解するであろう。したが
って本発明には、可能なコドン選択に基づいた組み合わせの選択によって作り出
され得る可能なポリヌクレオチド配列の変異の全てが含まれ得る。これらの組み
合わせは、自然発生のCMEのポリヌクレオチド配列に適用される標準的なトリプ
レット遺伝暗号を基に作られ、全ての変異が明確に開示されていると考慮する。
【００９４】 CMEをコードするヌクレオチド配列及びその変異配列は一般に、好適に選択さ
れたストリンジェントな条件の下で、自然発生のCMEのヌクレオチド配列とハイ
ブリダイズ可能であるが、非自然発生のコドンを含めるなどの実質的に異なった
使い方のコドンを有するCME或いはその誘導体をコードするヌクレオチド配列を
作ることは有利となり得る。特定のコドンが宿主によって利用される頻度に基づ
いてコドンを選択して、ペプチドの発現が特定の真核細胞又は原核宿主に発生す
る割合を高めることが可能である。コードされたアミノ酸配列を変えないで、CM
E及びその誘導体をコードするヌクレオチド配列を実質的に変更する別の理由は
、自然発生の配列から作られる転写物より例えば長い半減期など好ましい特性を
備えるRNA転写物を作ることにある。
【００９５】 本発明はまた、CME及びその誘導体をコードするDNA配列又はそれらの断片を完
全に合成化学によって作り出すことも含む。作製後にこの合成配列を、当分野で
良く知られた試薬を用いて、種々の入手可能な発現ベクター及び細胞系の何れの
中にも挿入可能である。更に、合成化学を用いて、CMEまたはその任意の断片を
コードする配列の中に突然変異を導入することも可能である。
【００９６】 更に本発明には、種々のストリンジェント条件の下で、請求項に記載されたポ
リヌクレオチド配列、特に、SEQ ID NO:6−10及びそれらの断片とハイブリダイ
ズ可能なポリヌクレオチド配列が含まれる(例えば、Wahl, G.M.及びS.L. Berger
(1987) Methods Enzymol. 152:399-407; and Kimmel. A.R. (1987) Methods En
zymol. 152:507-511.を参照)。アニーリング及び洗浄条件を含むハイブリダイゼ
ーションの条件は、「定義」に記載されている。
【００９７】 当分野で周知のDNAのシークエンシング方法を用いて、本発明の何れの実施例
も実行可能である。この方法には、例えばDNAポリメラーゼIのクレノウ断片、SE
QUENASE（US Biochemical, Cleveland OH）、Taqポリメラーゼ（Perkin Elmer）
、熱安定性T7ポリメラーゼ（Amersham, Pharmacia Biotech Piscataway NJ）、
或いはELONGASE増幅システム(Life Technologies, Gaithersburg MD)にみられる
ような校正エキソヌクレアーゼとポリメラーゼとの組み合わせなどの酵素が用い
られる。好ましくは、MICROLAB2200液体転移システム（Hamilton, Reno, NV）、
PTC200 Thermal Cycler200（MJ Research, Watertown MA）及びABI CATALYST 80
0 (Perkin-Elmer) などの装置を用いて配列の準備を自動化する。次に、ABI 373
或いは377 DNAシークエンシングシステム(Perkin-Elmer)、MEGABACE 1000 DNAシ
ークエンシングシステム(Molecular Dynamics. Sunnyvale CA)または当分野で周
知の他の方法を用いてシークエンシングを行う。得られた配列を当分野で周知の
様々なアルゴリズムを用いて分析する(例えば、Ausubel, F.M. (1997) Short Pr otocols in Molecular Biology , John Wiley & Sons, New York NY, unit 7.7;
Meyers, R.A. (1995) Molecular Biology and Biotechnology, Wiley VCH, New
York NY, pp. 856-853.を参照)。
【００９８】 当分野で周知のPCR法をベースにした種々の方法で、部分的なヌクレオチド配
列を利用して、CMEをコードする核酸配列を伸長し、プロモーターや調節要素な
どの上流にある配列を検出する。例えば制限部位PCR法を利用する１つの方法で
は、一般的なプライマー及びネスト化プライマーを用いてクローニングベクター
内のゲノムDNAから未知の配列を増幅する（例えば、Sarkar, G. (1993) PCR Met
hods Applic 2:318-322を参照）。逆PCR法を用いる別法では、広範な方向に伸長
して環状化した鋳型から未知の配列を増幅するプライマーを用いる。この鋳型は
、既知のゲノム遺伝子座及びその周辺の配列を含む制限断片に由来する（例えば
、Triglia, T.等（1988）Nucleic Acids Res 16:8186を参照）。キャプチャPCR
法を用いる第３の方法は、ヒト及び酵母菌人工染色体DNAの既知の配列に隣接す
るDNA断片のPCR増幅を含む（例えば、Lagerstrom, M.他（1991）PCR Methods Ap
plic 1:111-119を参照）。この方法では、多数の制限酵素による消化及びライゲ
−ションを用いて、PCRを行う前に未知の配列の領域の中に組換え二本鎖配列を
挿入することが可能である。また、当分野で周知の別の方法を用いて未知の配列
を得ることも可能である。(例えば、Parker, J.D. 他 (1991)Nucleic Acids Res
. 19:3055-3060を参照)。更に、PCR、ネスト化プライマー、PROMOTERFINDERライ
ブラリ（Clontech, Palo Alto CA）を用いれば、ゲノムDNA内の歩行が可能であ
る。この方法ではライブラリをスクリーニングする必要がなく、イントロン／エ
キソン接合部を探すのに有用である。全てのPCR法をベースにした方法では、プ
ライマーは、市販のOLIGO 4.06 Primer Analysis software（National Bioscien
ces, Plymouth MN）或いは別の好適なプログラムなどを用いて、長さが２２〜３
０ヌクレオチド、ＧＣ含有率が５０％以上、約６８℃〜７２℃の温度で鋳型に対
してアニーリングするよう設計される。
【００９９】 完全長のcDNAをスクリーニングする場合は、大きなcDNAを含むようにサイズが
選択されたライブラリを用いるのが好ましい。更に、オリゴd(T)ライブラリが完
全な長さのcDNAを産生できない場合は、遺伝子の５'領域を有する配列を含むも
のが多いランダムに初回抗原刺激を受けたライブラリが有用である。ゲノムライ
ブラリは、５'非転写調節領域への配列の伸長に有用であろう。
【０１００】 市販のキャピラリー電気泳動システムを用いて、シークエンシングまたはPCR
産物のヌクレオチド配列のサイズの分析、または確認が可能である。詳しくは、
キャピラリーシークエンシングには、電気泳動による分離のための流動性ポリマ
ー、及び４つの異なったヌクレオチドに特異的なレーザーで活性化される蛍光色
素、放出された波長の検出に利用するCCDカメラを使用することが可能である。
出力／光強度は、適切なソフトウエア（例えば、GENOTYPER及びSEQUENCE NAVIGA
TOR、Perkin-Elmer）を用いて電気信号に変換され、サンプルのローディングか
らコンピュータ分析までのプロセス及び電子データ表示がコンピュータ制御可能
である。キャピラリー電気泳動法は、特定のサンプルに少量しか存在しない場合
もあるDNAの小片のシークエンシングに特に適している。
【０１０１】 本発明の別の実施例では、CMEをコードするポリヌクレオチド配列またはその
断片を組換えDNA分子にクローニングして、適切な宿主細胞内にCME、その断片ま
たは機能的等価物を発現させることが可能である。遺伝暗号固有の縮重により、
実質的に同じ或いは機能的に等価のアミノ酸配列をコードする別のDNA配列が作
られ得り、これらの配列をCMEのクローン化及び発現に利用可能である。
【０１０２】 種々の目的でCMEをコードする配列を変えるために、当分野で一般的に知られ
ている方法を用いて、本発明のヌクレオチド配列を組換えることができる。この
目的には、遺伝子産物のクローン化、プロセッシング及び／または発現の調節が
含まれるが、これらに限定されるものではない。ランダムな断片によるDNAの混
合や遺伝子断片と合成オリゴヌクレオチドのPCR再組み立てを用いて、ヌクレオ
チド配列の組換えが可能である。例えば、オリゴヌクレオチド媒介性定方向突然
変異誘発を利用して、新しい制限部位を生成する突然変異の導入、グリコシル化
パターンの変更、コドン優先の変更、スプライスバリアントの作製等が可能であ
る。
【０１０３】 本発明のヌクレオチドを、MOLECULARBREEDING (Maxygen Inc., Santa Clara C
A; 米国特許第5,837,458号; Chang, C.-C. 他 (1999) Nat. Biotechnol. 17:793
-797; Christians, F.C. 他 (1999) Nat. Biotechnol. 17:259-264; Crameri, A
. 他 (1996) Nat. Biotechnol. 14:315-319)などのDNAシャフリング技術を用い
てシャフリングして、CMEの生物学的または酵素的な活性、或いは他の分子や化
合物と結合する能力などのCMEの生物学的特性を変更或いは改良することができ
る。DNAシャフリングは、PCR法による遺伝子断片の組換えで遺伝子変異体のライ
ブラリを作製するプロセスである。次に、このライブラリを、目的の特性を有す
る遺伝子変異体を同定するために選択或いはスクリーニングする。これらの好ま
しい変異体をプールし、DNAシャフリング及び選択／スクリーニングを繰り返す
。従って、人工的な育種及び急速な分子の進化によって多様な遺伝子が作られる
。例えば、ランダムな位置に変異がある１つの遺伝子の断片を、目的の特性が最
適化するまで、組換え及びスクリーニング、シャフリングを実施することもでき
る。別法では、所定の遺伝子の断片を、同じ或いは異なった種の同じ遺伝子ファ
ミリーの相同な遺伝子の断片で組換え、それによってプロトコルに従った調節可
能な方法で、多数の自然発生遺伝子の遺伝子多様性を最大にすることができる。
【０１０４】 別の実施例によれば、CMEをコードする配列は、当分野で周知の化学的方法を
用いて、全体或いは一部が合成可能である（例えば、Caruthers. M.H.等（1980
）Nucl. Acids Res. Symp. Ser 7:215-223; 及びHorn, T.他（1980）Nucl. Acid
s Res. Symp. Ser.225-232を参照）。別法として、化学的方法を用いてCME自体
またはその断片を合成することが可能である。例えば、ペプチド合成は種々の固
相技術を用いて実行可能である（例えば、Roberge, J.Y.等(1995) Science 269:
202-204を参照）。また、合成の自動化は例えばABI 431Aペプチドシンセサイザ
（Perkin Elmer）を用いて達成し得る。更にCMEのアミノ酸配列または任意のそ
の一部は、直接的な合成の際の変更、及び／または化学的方法を用いた他のタン
パク質または任意のその一部からの配列との組み合わせにより、変異体ポリペプ
チドを作ることが可能である。
【０１０５】 このペプチドは、分離用高速液体クロマトグラフィー(例えば、Chiez, R.M.
及び F.Z. Regnier (1990)Methods Enzymol. 182:392-421を参照)を用いて実質
的に精製可能である。合成されたペプチドの組成は、アミノ酸分析或いはシーク
エンシングにより確認することができる(例えば、Creighton. T. (1983) Protei ns, Structures and Molecular Properties , WH Freeman, New York, NYを参照)
。
【０１０６】 生物学的に活性なCMEを発現させるために、CMEをコードするヌクレオチド配列
またはその誘導体を好適な発現ベクターに挿入する。この発現ベクターは、好適
な宿主に挿入されたコーディング配列の転写及び翻訳の調節に必要な要素を含む
。これらの要素には、ベクター及びCMEをコードするポリヌクレオチド配列にお
けるエンハンサー、構成型及び発現誘導型のプロモーター、５'及び３'の非翻訳
領域などの調節配列が含まれる。このような要素は、その長さ及び特異性が様々
である。特定の開始シグナルによって、CMEをコードする配列のより効果的な翻
訳を達成することが可能である。このようなシグナルには、ＡＴＧ開始コドン及
びコザック配列などの近傍の配列が含まれる。CMEをコードする配列及びその開
始コドン、上流の調節配列が好適な発現ベクターに挿入された場合は、更なる転
写調節シグナルや翻訳調節シグナルは必要なくなるであろう。しかしながら、コ
ーディング配列或いはその断片のみが挿入された場合は、インフレームのＡＴＧ
開始コドンを含む外来性の翻訳調節シグナルが発現ベクターに含まれなければな
らない。外来性の翻訳要素及び開始コドンは、自然及び合成の様々なものから得
ることが可能である。用いられる特定の宿主細胞系に好適なエンハンサーを含め
ることで発現の効率を高めることが可能である。(例えば、Scharf, D. 他 (1994
) Results Probl. Cell Differ. 201−18-162.を参照)。
【０１０７】 当業者に周知の方法を用いて、CMEをコードする配列、好適な転写及び翻訳調
節要素を含む発現ベクターを作製することが可能である。これらの方法には、in vitro 組換えDNA技術、合成技術、及びin vivo遺伝子組換え技術が含まれる。(
例えば、 Sambrook, J. 他. (1989) Molecular Cloning. A Laboratory Manual,
Cold Spring Harbor Press, Plainview NY, 4章及び8章, 及び１6-17章; 及び
Ausubel, F.M. 他. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, John Wi
ley & Sons, New York NY, ch. 9章及び13章1−4章を参照)。
【０１０８】 種々の発現ベクター／宿主系を利用して、CMEをコードする配列の保持及び発
現が可能である。これらには、限定するものではないが、組換えバクテリオファ
ージ、プラスミド、またはコスミドDNA発現ベクターで形質転換された細菌など
の微生物や、酵母菌発現ベクターで形質転換された酵母菌や、ウイルス発現ベク
ター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系や、ウイルス発現ベク
ター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、CaMV；タバコモザイクウイルス
、TMV）または細菌発現ベクター（例えば、TiまたはpBR３２２プラスミド）で形
質転換された植物細胞系や、動物細胞系などが含まれる。本発明は使用される宿
主細胞によって限定されるものではない。
【０１０９】 細菌系では、多数のクローニングベクター及び発現ベクターが、CMEをコード
するポリヌクレオチド配列の使用目的に応じて選択可能である。例えば、CMEを
コードするポリヌクレオチド配列の日常的なクローニング、サブクローニング、
増殖には、PBLUESCRIPT(Stratagene, La Jolla CA)またはpSPORT１プラスミド(G
IBCO BRL)などの多機能の大腸菌ベクターを用いることができる。ベクターの多
数のクローニング部位にCMEをコードする配列をライゲーションするとlacＺ遺伝
子が破壊され、組換え分子を含む形質転換された細菌の同定のための比色スクリ
ーニング法が可能となる。更に、これらのベクターを用いて、クローニングされ
た配列のin vitroでの転写、ジデオキシンスクリーニング、ヘルパーファージに
よる一本鎖の救出、入れ子状態の欠失を作り出すことが可能である。(例えば、V
an Heeke, G.及びS.M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:5503-5509.を参照
)。例えば、抗体の産生のためなどに多量のCMEが必要な場合は、CMEの発現をハ
イレベルで誘導するベクターが使用できる。例えば、強力に発現を誘発するT5ま
たはT7バクテリオファージプロモーターを含むベクターを使用できる。
【０１１０】 CMEの発現に酵母の発現系の使用が可能である。α因子やアルコールオキシダ
ーゼやPGHプロモーターなどの構成型或いは誘導型のプロモーターを含む多種の
ベクターが、酵母菌サッカロミセス−セレビジエまたはPichia pastorisに使用
可能である。更に、このようなベクターは、発現したタンパク質の分泌か細胞内
への保持のどちらかを誘導し、安定した増殖のために宿主ゲノムの中に外来配列
を組み込む。(例えば、上記のAusubel.; 及びBitter, G.A. 他 (1987) Methods
Enzymol.153:51-794: Scorer. C. A. 他 (1994) Bio/Technology 121−181-184.
を参照) 植物系もCMEの発現に使用可能である。CMEをコードする配列の転写は、例えば
、CaMV由来の35S及び19Sプロモーターなどのウイルスプロモーターが単独で、或
いはTMV（Takamatsu, N.等（1987）EMBO J 6:307-311）由来のオメガリーダー配
列と組み合わせて促進される。これらの作製物は、直接のDNA形質転換或いは病
原体を介したトランスフェクションによって、植物細胞の中に導入可能である。
（例えば、The McGraw Hill Yearbook of Science and Technology（1992）McGr
aw Hill NY, pp.191-196を参照）。
【０１１１】 哺乳動物細胞では、多種のウイルスベースの発現系が利用され得る。アデノウ
イルスが発現ベクターとして用いられる場合、後発プロモーター及び３連リーダ
ー配列からなるアデノウイルス転写物／翻訳複合体にCMEをコードする配列を結
合し得る。ウイルスのゲノムの非必須のＥ１またはＥ３領域への挿入により、感
染した宿主細胞にCMEを発現する生ウイルスを得ることが可能である（Logan, J.
及びShenk, T.（1984）Proc. Natl. Acad. Sci. 81:3655-3659を参照）。さらに
、ラウス肉腫ウイルス（RSV）エンハンサーなどの転写エンハンサーを用いて、
哺乳動物宿主細胞における発現を増大させることが可能である。タンパク質を高
レベルで発現させるために、SV40またはEBVを基にしたベクターを用いることが
可能である。
【０１１２】 ヒト人工染色体（HAC）を用いて、プラスミドで発現しそれに含まれているも
のより大きなDNAの断片を供給可能である。治療のために約６kb〜１０MbのHACs
を作製し、従来の輸送方法（リポソーム、ポリカチオンアミノポリマー、または
ベシクル）で供給する。(例えば、Harrington. J.J. 他 (1997) Nat Genet.15:3
45-355.を参照)。
【０１１３】 哺乳動物系の組換えタンパク質の長期にわたる産生のためには、株化細胞にお
けるCMEの安定した発現が望ましい。例えば、発現ベクターを用いて、CMEをコー
ドする配列を株化細胞に形質転換することが可能である。このような発現ベクタ
ーは、ウイルス起源の複製及び／または内在性の発現要素や、同じ或いは別のベ
クターの上の選択マーカー遺伝子を含む。ベクターの導入の後、細胞を選択培地
に移す前に、強化培地で約１〜２日の間増殖させる。選択マーカーの目的は選択
的な媒介物に対する抵抗性を与えるとともに、その存在により導入された配列を
うまく発現する細胞の増殖及び回収が可能となる。安定的に形質転換された細胞
の耐性クローンは、その細胞型に好適な組織培養技術を用いて増殖可能である。
【０１１４】 任意の数の選択系を用いて、形質転換された細胞系を回収することが可能であ
る。選択系には、以下のものに限定はしないが、単純ヘルペスウイルスチミジン
キナーゼ遺伝子及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子が含まれ
、それぞれtk−又はapr−細胞において使用される。(例えば、Wigler, M. 他 (1
977) Cell 11:223-232; 及びLowy, I. 他(1980) Cell 22:817-823を参照)。また
代謝拮抗物質、抗生物質或いは除草剤への耐性を選択のベースとして用いること
ができる。例えばdhfrはメトトレキセートに対する耐性を与え、neoはアミノグ
リコシッドネオマイシン及びG-418に対する耐性を与え、als或いはpatはクロル
スルフロン（cCMEsulfuron）、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ
（phosphinotricin acetyltransferase）に対する耐性を与える(例えば、Wigler
, M. 他. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. 77:3567-3570; Colbere-Garapin, F.
他(1981) J. Mol. Biol. 150:1-14を参照)。さらに選択に利用できる遺伝子、
例えば、代謝のために細胞が必要なものを変えるtrpB及びhisDが文献に記載され
ている（例えば、Hartman, S.C.及びR.C. Mulligan（1988）Proc. Natl. Acad.
Sci. 85:8047-51を参照）。アニトシアニン、緑色蛍光タンパク質（GFP；Clonte
ch）、βグルクロニダーゼ及びその基質GUS，ルシフェラーゼ及びその基質ルシ
フェリンなどの可視マーカーが用いられる。緑色蛍光タンパク質（GFP）(Clonte
ch, Palo Alto, CA)も使用できる。これらのマーカーを用いて、トランスフォー
マントを特定するだけでなく、特定のベクター系に起因する一過性或いは安定し
たタンパク質発現を定量することが可能である（例えば、Rhodes, C.A.他（1995
）Methods Mol. Biol. 55:121-131を参照）。
【０１１５】 マーカー遺伝子の発現の存在／不在によって目的の遺伝子の存在が示されても
、その遺伝子の存在及び発現の確認が必要な場合もある。例えば、CMEをコード
する配列がマーカー遺伝子配列の中に挿入された場合、CMEをコードする配列を
含む形質転換された細胞は、マーカー遺伝子機能の欠落により特定可能である。
または、１つのプロモーターの制御下でマーカー遺伝子がCMEをコードする配列
と一列に配置することも可能である。誘導または選択に応答したマーカー遺伝子
の発現は、通常タンデム遺伝子の発現も示す。
【０１１６】 一般に、CMEをコードする核酸配列を含み、CMEを発現する宿主細胞は、当業者
に周知の種々の方法を用いて特定することが可能である。これらの方法には、DN
A−DNA或いはDNA−RNAハイブリダイゼーションや、PCR法、核酸或いはタンパク
質の検出及び／または数量化のための膜系、溶液ベース、或いはチップベースの
技術を含むタンパク質生物学的試験法または免疫学的アッセイが含まれるが、こ
れらに限定されるものではない。
【０１１７】 特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のどちらかを用いるCM
Eの発現の検出及び計測のための免疫学的な方法は、当分野で周知である。この
ような技法には、酵素に結合したイムノソルベントアッセイ（ELISA）、ラジオ
イムノアッセイ（RIA）、蛍光標示式細胞分取器（FACS）などがある。CME上の２
つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いた、２部位のモノク
ローナルベースイムノアッセイ（two-site, monoclonal-based immunoassay）が
好ましいが、競合の結合アッセイも用いることもできる。これらのアッセイ及び
その他のアッセイは、当分野では十分に知られている。(例えば、 Hampton. R.
他.(1990) Serological Methods, a Laboratory Manual. APS Press. St Paul.
MN, Sect. IV; Coligan, J. E. 他Current Protocols in Immunology, Greene P
ub. Associates and Wiley-Interscience, New York. NY; 及びPound, J.D. (19
90) Immunochemical Protocols, Humans Press, Totowa NJ)。
【０１１８】 種々の標識技術及び結合技術が当業者には周知であり、様々な核酸アッセイお
よびアミノ酸アッセイに用いられ得る。CMEをコードするポリヌクレオチドに関
連する配列を検出するための、標識されたハイブリダイゼーションプローブ或い
はPCRプローブを生成する方法には、オリゴ標識化、ニックトランスレーション
、末端標識化、または標識されたヌクレオチドを用いるPCR増幅が含まれる。別
法として、CMEをコードする配列、またはその任意の断片をmRNAプローブを生成
するためのベクターにクローニングすることも可能である。当分野では周知であ
り市販されているこのようなベクターを、T7，T3，またはSP6などの好適なRNAポ
リメラーゼ及び標識されたヌクレオチドの追加によって、in vitroでのRNAプロ
ーブの合成に用いることができる。これらの方法は、例えば、Amersham Pharmac
ia Biotech及びPromega（Madison WI）、U.S. Biochemical Corp（Cleveland OH
）が市販する種々のキットを用いて行うことができる。容易な検出のために用い
得る好適なレポーター分子或いは標識には、基質、コファクター、インヒビター
、磁気粒子、及び放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、色素産生剤などが含
まれる。
【０１１９】 CMEをコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、細胞培地で
のこのタンパク質の発現及び回収に好適な条件の下で培養される。形質転換され
た細胞から産生されたタンパク質が分泌されるか細胞内に留まるかは、使用され
るその配列及び／またはそのベクターによる。CMEをコードするポリヌクレオチ
ドを含む発現ベクターは、原核細胞膜及び真核細胞膜を透過するCMEの分泌を誘
導するシグナル配列を含むように設計できることは、当業者には理解されよう。
【０１２０】 更に、挿入した配列の発現調節能力または発現したタンパク質を所望の形にプ
ロセシングする能力によって宿主細胞株が選択される。このようなポリペプチド
の修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化（
lipidation）、及びアシル化が含まれるが、これらに限定されるものではない。
タンパク質の「prepro」または「pro」形を切断する翻訳後のプロセシングを利
用して、標的タンパク質、折りたたみ及び／または活性を特定することが可能で
ある。翻訳後の活性のための特定の細胞装置及び特徴のある機構をもつ種種の宿
主細胞（例えば、CHO、HeLa、MDCK、MEK293、WI38）がAmerican Type Culture C
ollection（ATCC; Bethesda, MD）より入手可能であり、外来のタンパク質の正
しい修飾及びプロセシングを確実にするために選択される。
【０１２１】 本発明の別の実施例では、CMEをコードする自然或いは変更された、または組
換えの核酸配列を上記した任意の宿主系の融合タンパク質の翻訳となる異種配列
に結合させる。例えば、市販の抗体によって認識できる異種部分を含むキメラCM
Eタンパク質が、CMEの活性のインヒビターに対するペプチドライブラリのスクリ
ーニングを促進し得る。また、異種タンパク質部分及び異種ペプチド部分が、市
販の親和性基質を用いて融合タンパク質の精製を促進し得る。このような部分に
は、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（GST）、マルトース結合タンパク質（M
BP）、チオレドキシン（Trx）、カルモジュリン結合ペプチド（CBP）、6−His、
FLAG、c−mc、赤血球凝集素（HA）が含まれるが、これらに限定されるものでは
ない。GST及びMBP、Trx、CBP、6−Hisによって、固定されたグルタチオン、マル
トース、フェニルアルシン酸化物（phenylarsine oxide）、カルモジュリン、金
属キレート樹脂のそれぞれで同族の融合タンパク質の精製が可能となる。FLAG、
c−mc、及び赤血球凝集素（HA）によって、これらのエピトープ標識を特異的に
認識する市販のモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を用いた融合タンパ
ク質の免疫親和性の精製ができる。また、CMEをコードする配列と異種タンパク
質配列との間にあるタンパク質分解切断部位を融合タンパク質が含むように遺伝
子操作すると、CMEが精製の後に異種部分から切断され得る。融合タンパク質の
発現と精製の方法は、Ausubel. (1995、前出 ch 10).に記載されている。市販さ
れている様々なキットを用いて、融合タンパク質の発現及び精製を促進できる。
【０１２２】 本発明の別の実施例では、TNTウサギ網状赤血球可溶化液またはコムギ胚芽抽
出系(Promega)を用いてin vitroで放射能標識したCMEの合成が可能である。これ
らの系は、T7またはT3、SP6プロモーターと機能的に結合したタンパク質をコー
ドする配列の転写と翻訳をつなげる。翻訳は、例えば、３５Ｓメチオニンである
放射能標識されたアミノ酸前駆体の存在の下で起こる。
【０１２３】 CMEの断片は、組換え生成物だけでなく固相技術を用いて直接的なペプチド合
成によって作製され得る(例えば、前出のCreighton, pp. 55-60.を参照)。タン
パク質の合成は、手動或いは自動で行われ得る。自動合成は、例えばABI 431Aペ
プチドシンセサイザ（Perkin Elmer）を用いて行うことが可能である。CMEの種
々の断片は別々に合成して、次ぎに結合させて完全長分子を作製する。
【０１２４】 （治療） CMEのある領域と炭水化物修飾酵素のある領域との間に、例えば配列及びモチ
ーフの文脈における化学的及び構造的類似性が存在する。更に、CMEの発現は、
心血管、発達、胃腸、造血／免疫、生殖、及び泌尿器組織に密接に関連する。従
って、CMEは、炭水化物代謝異常及び自己免疫異常／炎症異常、癌においてある
役割を果たすと考えられる。CMEの発現若しくは活性の増大に関連する疾患の治
療においては、CMEの発現または活性を低下させることが望ましい。また、CMEの
発現または活性の低下に関連する疾患の治療においては、CMEの発現または活性
を増大させることが望ましい。
【０１２５】 従って、一実施例において、CMEの発現または活性の低下に関連した疾患の治
療または予防のために、患者にCMEまたはその断片や誘導体を投与することが可
能である。限定するものではないが、このような疾患の例には炭水化物代謝異常
が含まれ、その中には糖尿病及びインスリン依存性糖尿病、インスリン非依存性
糖尿病、低血糖症、グルカゴノーマ、ガラクトース血症、遺伝性果糖不耐症、フ
ルクトースジホスファターゼ欠損症、肥満症、先天性II型異常造血性貧血、マン
ノシドーシス、ノイラミニダーゼ欠損症、ガラクトースエピメラーゼ欠損症、糖
原病、リソソーム蓄積症、フルクトース尿症、ペントース尿症、先天性ピルビン
酸代謝異常症が含まれ、また自己免疫異常／炎症異常が含まれ、その中には後天
性免疫不全症候群（AIDS）及び副腎機能不全、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー
、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免
疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クロー
ン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、リンパ球毒素性一時性リ
ンパ球減少症、赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチ
ャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性大腸
症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋又は心膜炎症、骨関節炎、骨粗しょ
う症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、リウマチ様関節炎、強皮症、
シェ−グレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身
性硬化症、血小板減少症、潰瘍性大腸炎、ウェルナー症候群、癌合併症、血液透
析、体外循環と、ウイルス感染症及び細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、
原虫感染症、蠕虫の感染症、外傷が含まれ、また癌が含まれ、その中には腺癌、
白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、奇形癌などがあり、詳しくは副腎、
膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、
肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、
胸腺、甲状腺、及び子宮の癌が含まれる。
【０１２６】 別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むCMEの発現
または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、CMEまたはその断
片や誘導体を発現し得るベクターを患者に投与することも可能である。
【０１２７】 更に別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むCMEの
発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、実質的に精製
されたCMEを含む医薬品組成物を好適な医薬用担体と共に患者に投与することも
可能である。
【０１２８】 更に別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むCMEの
発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、CMEの活性を
調節するアゴニストを患者に投与することも可能である。
【０１２９】 更なる実施例では、CMEの発現または活性の増大に関連した疾患の治療または
予防のために、患者にCMEのアンタゴニストを投与することが可能である。限定
するものではないが、このような疾患の例には、上記した炭水化物代謝異常及び
自己免疫異常／炎症異常、癌が含まれる。一実施態様では、CMEと特異的に結合
する抗体が直接アンタゴニストとして、或いはCMEを発現する細胞または組織に
薬剤を運ぶターゲッティング或いは運搬機構として間接的に用いられ得る。
【０１３０】 別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むCMEの発現
または活性の増大に関連した疾患の治療または予防のために、CMEをコードする
ポリヌクレオチドの相補配列を発現するベクターを患者に投与することも可能で
ある。
【０１３１】 別の実施例では、本発明の任意のタンパク質、アンタゴニスト、抗体、アゴニ
スト、相補的な配列、ベクターを別の好適な治療薬と組み合わせて投与すること
もできる。当業者は、従来の医薬原理にしたがって併用療法で用いる好適な治療
薬を選択可能である。治療薬との組み合わせにより、上に列記した種々の疾患の
治療または予防に相乗効果をもたらし得る。この方法を用いて少ない量の各薬剤
で医薬効果をあげることが可能であり、広範囲な副作用の可能性を低減し得る。
【０１３２】 CMEのアンタゴニストは、当分野で一般的な方法を用いて製造することが可能
である。詳しくは、精製されたCMEを用いて抗体を作ったり、治療薬のライブラ
リをスクリーニングしてCMEと特異的に結合するものを同定が可能である。CMEの
抗体も、当分野で一般的な方法を用いて製造することが可能である。このような
抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖、Fa
bフラグメント、及びFab発現ライブラリによって作られたフラグメントが含まれ
る。但し、これらに限定されるものではない。治療用には、中和抗体（即ち、二
量体の形成を阻害するもの）が特に好ましい。
【０１３３】 抗体の産生のためには、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒト及びその他のも
のを含む種々の宿主が、CMEまたは任意の断片、または免疫原性の特性を備える
そのオリゴペプチドの注入によって免疫化され得る。宿主の種に応じて、種々の
アジュバントを用いて免疫応答を高めることもできる。このようなアジュバント
にはフロイントアジュバント、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲルアジュバ
ント、リゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油性乳
剤、キーホールリンペットヘモシニアン、及びジニトロフェノールなどの界面活
性剤が含まれるが、これらに限定されるものではない。ヒトに用いられるアジュ
バントの中では、BCG（bacilli Calmette-Guerin）及びCorynebacterium parvum が特に好ましい。
【０１３４】 CMEに対する抗体を誘発するために用いられるオリゴペプチド、ペプチド、ま
たは断片は、少なくとも約５個のアミノ酸からなり、一般的には約１０個以上の
アミノ酸からなるものが好ましい。これらのオリゴペプチド或いはペプチド、ま
たはそれらの断片は、天然のタンパク質のアミノ酸配列の一部と同一であること
が望ましく、小さな自然発生の分子の全アミノ酸配列も含む。CMEアミノ酸の短
いストレッチは、KLHなどの別のタンパク質の配列と融合し、キメラ分子に対す
る抗体が産生され得る。
【０１３５】 CMEに対するモノクローナル抗体は、培地内の連続した細胞株によって、抗体
分子を産生する任意の技術を用いて作製することが可能である。これらの技術に
は、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、及びEBV−ハイブリ
ドーマ技術が含まれるが、これらに限定されるものではない（例えば、Kohler,
G. 等. (1975) Nature 256:495-497; Kozbor, D. 等. (1985) .J. Immunol. Met
hods 81−8-42; Cote, R.J. 等. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. 80:2026-2030
; Cole, S.P. 等. (1984) Mol. Cell Biol. 62:109-120を参照）。
【０１３６】 更に、「キメラ抗体」作製のために発達したヒト抗体遺伝子にマウス抗体遺伝
子をスプライシングするなどの技術が、好適な抗原特異性及び生物学的活性を備
える分子を得るために用いられる（例えば、Morrison, S.L.他. (1984) Proc. N
atl. Acad. Sci. 81−4851−4855; Neuberger, M.S.他. (1984) Nature 312:604
-608; Takeda, S.等. (1985) Nature 314:452,454を参照）。別法では、当分野
で周知の方法を用いて、一本鎖抗体の産生のための記載された技術を適用して、
CME特異性一本鎖抗体を生成する。関連する特異性を備えるが別のイディオタイ
プの組成の抗体は、ランダムな組み合わせの免疫グロブリンライブラリから鎖混
合によって生成することもできる（例えば、Burton D.R. (1991) Proc. Natl. A
cad. Sci. 88:11120-3を参照）。
【０１３７】 抗体は、リンパ球集団の中のin vivo産生を誘発することによって、または免
疫グロブリンライブラリのスクリーニング又は文献に示されているような、高度
に特異的な結合試薬のパネルをスクリーニングすることによって、産生すること
もできる（例えば、Orlandi, R. 他. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. 86: 3833
-3837; Winter, G. 他. (1991) Nature 349:293-299を参照）。
【０１３８】 CMEに対する特異的な結合部位を含む抗体も産生することができる。例えば、
このような断片には、抗体分子のペプシン消化によって生成されるF（ab'）に断
片と、F（ab'）に断片のジスルフィド架橋を減じることによって生成されるFab
断片が含まれるが、これらに限定されるものではない。別法では、Fab発現ライ
ブラリを作製することによって、所望の特異性とモノクローナルFab断片の迅速
且つ容易な同定が可能となる（例えば、Huse, W.D. 等. (1989) Science 254:12
75-1281を参照）。
【０１３９】 種々のイムノアッセイを用いてスクリーニングし、所望の特異性を有する抗体
を同定する。隔離された特異性を有するポリクローナル抗体またはモノクローナ
ル抗体の何れかを用いる競合的な結合、または免疫放射線活性のための数々のプ
ロトコルが、当分野では周知である。通常このようなイムノアッセイには、CME
とその特異性抗体との間の複合体調整の計測が含まれる。二つの非干渉性CMEエ
ピトープに対して反応性のモノクローナル抗体を用いる、２部位モノクローナル
ベースのイムノアッセイが一般に利用されるが、競合的結合アッセイも利用する
ことができる(Pound、前出)。
【０１４０】 ラジオイムノアッセイ技術と共にScatchard分析などの様々な方法を用いて、C
MEに対する抗体の親和性を評価する。親和性を結合定数Kaで表すが、このKaは、
平衡状態の下でCME抗体複合体のモル濃度を遊離抗体と遊離抗原のモル濃度で除
して得られる値である。多数のCMEエピトープに対して親和性が不均一なポリク
ローナル抗体医薬のＫａは、CMEに対する抗体の平均親和性または結合活性を表
す。特定のCMEエピトープに単一特異的なモノクローナル抗体医薬のＫａは、親
和性の真の測定値を表す。Ka値が１０９〜１０１２Ｌ／ｍｏｌの高親和性抗体医
薬は、CME抗体複合体が激しい操作に耐えなければならないイムノアッセイに用
いるのが好ましい。Ka値が１０６〜１０７Ｌ／ｍｏｌの低親和性抗体医薬は、CM
Eが抗体から最終的に活性化状態で解離する必要がある免疫精製（immunopurific
ation）及び類似の処理に用いるのが好ましい。(Catty, D. (1988) Antibodies, Volume I: A Practical Approach . IRL Press, Washington, DC; Liddell, J.
E. and Cryer, A. (1991) A Practical Guide to Monoclonal Antibodies, John
Wiley & Sons, New York NY)。
【０１４１】 ある下流での適用におけるこのような医薬品の品質及び適性を調べるために、
ポリクローナル抗体医薬の抗体価及び結合活性を更に評価する。例えば、少なく
とも１〜２ｍｇ／ｍｌの特異的な抗体、好ましくは５〜１０ｍｇ／ｍｌの特異的
な抗体を含むポリクローナル抗体医薬は一般に、CME抗体複合体を沈殿させなけ
ればならない処理に用いられる。様々な適用例における抗体の特異性及び抗体価
、結合活性、抗体の品質や使用法の指針は一般に入手可能である。(例えば、Cat
ty, 前出, 及びColigan 他、前出を参照)。
【０１４２】 本発明の別の実施例では、CMEをコードするポリヌクレオチド、またはその任
意の断片または相補配列が、治療目的で使用することができる。ある実施形態で
は、CMEをコードするポリヌクレオチドの相補配列がmRNAの転写を阻止するのに
好適である場合、これを使用することができる。特に細胞は、CMEをコードする
ポリヌクレオチドと相補的な配列で形質転換することもできる。したがって、相
補的分子または断片は、CMEの活性の調節、または遺伝子機能の調節のために使
用することができる。このような技術は当分野では周知であり、センスまたはア
ンチセンスオリゴヌクレオチドまたは大きな断片が、CMEをコードする配列の制
御領域から、またはコード領域に沿ったさまざまな位置から設計可能である。
【０１４３】 レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペス又はワクシニア、又は様々な細菌
性プラスミド由来の発現ベクターを用いて、ヌクレオチド配列を標的の器官、組
織又は細胞集団に運ぶこともできる。当業者に周知の方法を用いてCMEをコード
ポリヌクレオチドと相補的な核酸配列を発現するベクターを作製することができ
る(例えば、前出のSambrook 他、及び前出のAusubel 他によるものを参照)。
【０１４４】 CMEをコードする遺伝子は、CMEをコードするポリヌクレオチド又はその断片を
高いレベルで発現する発現ベクターで、細胞又は組織を形質転換することによっ
て止めることができる。このような作製物を用いて翻訳できないセンス又はアン
チセンス配列を細胞の中に導入することができる。DNAの中に組み入れられない
場合でも、このようなベクターは内在性のヌクレアーゼによって機能が損なわれ
るまでmRNA分子を転写し続ける。非複製ベクターでも一過性の発現を一ヶ月以上
に亘って続け、好適な複製要素がベクター系の一部である場合はさらに長く持続
し得る。
【０１４５】 上記した通り、遺伝子の発現は、CMEをコードする遺伝子の制御５’または調
節領域に対する相補的な配列またはアンチセンス分子（DNA或いはRNA、PNA）を
設計することによって調節することができる。例えば開始部位から約−１０から
約＋１０までの転写開始部位に由来するオリゴヌクレオチドを用いることが可能
である。同様に、「三重らせん」と塩基対合法を用いて阻止することができる。
三重らせん構造は、二重らせんがポリメラーゼ、転写因子、または調節分子の結
合のために十分に広がるのを阻止するため有用である。三重式DNAを用いる最近
の治療の進歩は文献に記載されている（例えば、Gee, J.E. 等. (1994) In: Hub
er, B.E. 及び B.I. Carr, Molecular and ImmunologiCMEproaches, Futura Pub
lishing Co., Mt. Kisco, NYを参照）。相補的な配列またはアンチセンス分子も
また、転写物がリボソームに結合するのを阻止することによってmRNAの翻訳を阻
止するように設計できる。
【０１４６】 酵素性RNA分子であるリボザイムは、RNAの特異的切断を触媒するために用いる
ことができる。リボザイム作用の機構には、相補的な標的RNAへのリボザイム分
子の配列特異性ハイブリダイゼーションが含まれ、ヌクレオチド鎖切断が続く。
例えば、CMEをコードする配列のヌクレオチド鎖切断を、特異的且つ効果的に触
媒する組換え型のハンマーヘッド型リボザイム分子が含まれる。
【０１４７】 任意の潜在的RNA標的内の特異的なリボザイム切断部位が、後続の配列ＧＵＡ
、ＧＵＵ、及びＧＵＣを含むリボザイム切断部位に対して、標的分子をスキャニ
ングすることによって初めに同定される。一度同定されると、切断部位を含む標
的遺伝子の領域に対応する１５個から２０個のリボヌクレオチドの短いRNA配列
を、オリゴヌクレオチドの機能を不全にする二次的な構造の特徴について評価す
ることが可能である。候補標的の適合性も、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用
いて、相補的なオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの容易性をテス
トすることによって評価することが可能である。
【０１４８】 本発明の相補的なリボ核酸分子及びリボザイムは、当分野で周知の方法を用い
て、核酸分子の合成のために作製することができる。これらの方法には、固相ホ
スホラミダイト化合物などのオリゴヌクレオチドを化学的に合成する方法が含ま
れる。別法では、RNA分子がin vitro及びin vivoでCMEをコードするDNA配列の転
写によって生成され得る、このようなDNA配列はT7またはSP6等の好適なRNAポリ
メラーゼプロモータを用いて、種々のベクターの中に組み入れることが可能であ
る。別法では、相補的なRNAを構成的または誘導的に合成するこれらのcDNA作製
物は、細胞株、細胞、または組織の中に導入することができる。
【０１４９】 RNA分子を修飾することによって、細胞内の安定性を高め、半減期を長くする
ことができる。可能な修飾には、分子の５’及び／または３’端部でのフランキ
ング配列の追加、または分子のバックボーン内でのホスホジエステラーゼ結合よ
りむしろホスホロチオネート又は２’Ｏメチルの使用が含まれる、がこれらに限
定されるものではない。PNAの生成に固有のこの概念は、内在性のエンドヌクレ
アーゼによって容易には認識されないアデニン、シチジン、グアニン、チミン、
及びウリジンのアセチル−、メチル−、チオ−、及び同様の修飾形態だけでなく
、イノシン、キュエオシン（queosine）、及びワイブトシン（wybutosine）など
の従来のものでない塩基を含めることによって、これらの分子の全体に拡大する
ことができる。
【０１５０】 ベクターを細胞又は組織に導入する多数の方法が利用でき、in vivo、in vitr o 、及びex vivoでの使用に等しく適している。ex vivoでの治療の場合、患者か
ら採取された肝細胞の中にベクターを導入して、自家移植で同じ患者に戻すため
にクローニング増殖される。トランスフェクション、リボソーム注入またはポリ
カチオンアミノポリマーによる運搬は、当分野で周知の方法を用いて実行するこ
とができる（例えば、Goldman, C.K. 他. (1997) Nature Biotechnology 15:462
-66:を参照）。
【０１５１】 上記したいかなる治療方法も、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサ
ギ及びサルなどの哺乳動物を含む、治療が必要な全ての被験者に適用できる。
【０１５２】 本発明の別の実施例は、上記した全ての治療効果のために、医学上認められる
担体と共に医薬品或いは無菌組成物の投与に関連する。このような医薬品組成物
は、CME、CMEの抗体、擬態、アゴニスト、アンタゴニスト、又はCMEのインヒビ
ターなどからなる。この組成物は、単体で、或いは安定剤などの１種類以上の別
の薬剤と共に、無菌の生体適合性医薬品担体に投与することができる。このよう
な医薬品担体には、生理食塩水、緩衝食塩水、ブドウ糖、及び水などが含まれる
がこれらに限定されるものではない。この組成物は、単独或いは薬物又はホルモ
ンなどの別の薬剤と共に投与することができる。
【０１５３】 本発明に用いられる医薬品組成物は、様々な経路を用いて投与するが可能であ
る。この経路には、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、クモ膜下、心室内
、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下、または直腸が含まれるがこ
れらに限定されるものではない。
【０１５４】 活性処方成分に加えて、これらの医薬品組成物には、活性化合物を医薬的に使
用可能な薬剤にするのを容易にする、医薬品添加物及び補助剤を含む好適な薬学
的に認められる担体が含まれ得る。製剤及び投与についての詳しい技術について
は、最新版のRemington's Pharmaceutical Sciences (Maack Publishing, PA)に
記載されている。
【０１５５】 経口投与用の医薬品組成物が、経口投与に好適な投与量において当分野で周知
の薬学的に許容される担体を用いて、製剤することができる。このような担体に
より、医薬品組成物が患者が摂取するために、錠剤、丸薬、糖衣剤、カプセル、
液体、ゲル状、シロップ剤、泥状物、懸濁液として製剤される。
【０１５６】 経口用に用いられる医薬品は、活性化合物と固体の薬品添加物とを混合し、得
られた顆粒の混合物を処理して、（所望に応じてすりつぶした後）タブレット或
いは糖衣錠コア（dragee cores）にする。好適な医薬品添加物とは、ラクトース
、スクロース、マンニトール、又はソルビトールを含む糖類、トウモロコシ、小
麦、米、ジャガイモ、又はその他の植物からのでんぷん、メチルセルロース、ヒ
ドロキシプロピルメチルセルロース、又はカルボキシメチルセルロースナトリウ
ムなどのセルロース、アラビアゴム及びトラガカントゴムを含むゴム、ゼラチン
及びコラーゲンなどのタンパク質などの炭水化物又はタンパク質賦形剤である。
必要に応じて、例えば、架橋結合したポリビニルピロリドン、かんてん、アルギ
ン酸、またはその塩であるアルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤または可溶化剤が
加えられる。
【０１５７】 糖衣錠コアは、濃縮糖溶剤などの好適なコーティングと共に用いられる。この
ような濃縮糖溶剤には、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カーボ
ポルゲル（carbopol gel）、ポリエチレングリコール、及び／または二酸化チタ
ン、ラッカー溶剤、及び好適な有機溶媒または混合溶剤などが含まれ得る。染料
または色素が、製品の識別又は活性化合物の量、即ち薬用量を示すため、錠剤ま
たは糖衣錠に加えられる。
【０１５８】 経口用に用いられる医薬品製剤には、ゼラチンから作られたプッシュ−フィッ
ト型のカプセル、グリセロールまたはソルビトールなどのコーティングとゼラチ
ンからなる封入されたカプセルが含まれる。プッシュ−フィット型のカプセルに
は、ラクトース又はスターチなどの賦形剤や結合材、タルク又はステアリン酸マ
グネシウムなどの潤滑剤、所望に応じて安定剤と混合された活性処方成分が含ま
れる。ソフトカプセルでは、活性化合物が、安定剤と共に或いは安定剤なしで、
脂肪油、溶液、またはポリエチレングリコール溶液などの好適な溶液に溶解或い
は懸濁され得る。
【０１５９】 非経口投与用に好適な医薬品剤が、水溶液で製剤されるが、ハンクス液、リン
ガー液、生理緩衝食塩水などの生理学的に適合性のある緩衝剤が好ましい。水性
懸濁注射液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、又はデ
キストランなどの懸濁液の粘性を高める物質を含み得る。更に、活性化合物の懸
濁液は、好適な油性注入懸濁液として製剤され得る。好適な親水性溶液または媒
体には、ごま油などの脂肪油、オレイン酸エチル、トリグリセリド又はリボソー
ムなどの合成脂肪酸が含まれる。非脂質ポリカチオンアミノポリマーが、運搬目
的で使用される。随意選択により、懸濁液は高濃度の溶液が可能となるよう化合
物の溶解性を高める好適な安定剤または薬剤を含み得る。
【０１６０】 局部または鼻腔投与のために、特定の障壁に浸透する好適な浸透剤が製剤に用
いられる。このような浸透剤は当業者には周知である。
【０１６１】 本発明の医薬品組成物は、当分野で周知の方法、例えば従来の混合、溶解、顆
粒化、糖衣化、溶離（levigating）、乳化、カプセル化、封入、または凍結乾燥
処理を用いて製造され得る。
【０１６２】 医薬品組成物は塩類として製剤され、限定されないが、塩酸、硫酸、酢酸、乳
酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸等の多くの酸と共に形成可能である。塩分は対
応する遊離塩基系よりも、水溶剤または他のプロトン溶剤に溶けやすい。別の薬
剤の形態には、1 mM〜50 mMヒスチジン、０．１％〜２％スクロース、及び２％
〜７％マンニトールの幾つか或いは全てを含み、ｐＨの範囲が４．５〜５．５で
あり、使用前に緩衝剤と結合する凍結乾燥粉末を用いることができる。
【０１６３】 医薬品組成物が調合された後、それらは適当な箱に詰められ、指定した症状の
薬としてラベルが貼られる。CMEの投与のため、このようなラベルには、量、頻
度、及び投与の方法が含まれるであろう。
【０１６４】 本発明に用いる好適な医薬品組成物には、目的を達成するため、効果的な量の
活性処方成分を含む組成物が含まれる。当業者は、自身の能力で十分に効果的な
服用量を決めることができる。
【０１６５】 どのような組成物であっても、治療に効果的な薬用量は、初めは、例えば腫瘍
細胞の腫瘍細胞アッセイで、或いは動物モデルのどちらかで推定することができ
る。通常、動物モデルには、マウス、ウサギ、イヌ、又はブタなどが用いられる
。動物モデルはまた、好適な濃縮範囲及び投与の経路を決めるのに用いることが
できる。このような治療をもとに、ヒトへの有益な薬用量及び投与経路を決定す
ることができる。
【０１６６】 医学的に効果的な薬用量は、症状や容態を回復させる、たとえばCME又はその
断片、CMEの抗体、CMEのアゴニストまたはアンタゴニスト、インヒビターなどの
活性処方成分の量に関連する。薬用有効度及び毒性は、たとえば、ED５０（服用
に対して集団の５０％に医薬的効果がある）またはLD５０（服用に対して集団の
５０％に致命的である）統計を計算するなど、細胞培養または動物実験における
標準的な薬剤手法によって決定することができる。毒性効果と治療効果との薬用
量比は治療指数であり、LD５０／ED５０と示すことができる。高い治療指数を示
す医薬品組成物が望ましい。細胞培養アッセイ及び動物実験から得られたデータ
が、ヒトへの適用のために、薬用量の範囲を調剤するのに用いられる。このよう
な組成物が含まれる薬用量は、毒性を殆ど或いは全く含まず、ED５０を含む血中
濃度の範囲であることが望ましい。薬用量は、用いられる投与形態及び患者の感
受性、投与の経路によって、この範囲内で様々である。
【０１６７】 正確な薬用量は、治療が必要な患者に関する要素を考慮して、実務者によって
決められるであろう。薬用量及び投与は、効果的なレベルの活性成分を与えるた
め或いは所望の効果を維持するために調節される。薬用量の要素として考慮され
るものには、疾患の重症度、患者の一般的な健康状態、年齢、体重、及び患者の
性別、投与の時間及び頻度、併用する薬剤、反応感受性、及び治療に対する応答
が含まれる。作用器官が長い医薬品組成物は、三日か四日に一度、一週間に一度
、二週間に一度、特定の製剤の半減期及びクリアランス率によって左右され、投
与され得る。
【０１６８】 通常の薬用量は投与の経路によって異なるが、約0.1〜100,000μgまでの最大
約１グラムまでである。特定の薬用量及び運搬の方法に関するガイダンスは文献
に記載されており、一般に当分野の実務者はそれを利用することができる。当業
者は、タンパク質またはインヒビターとは異なったヌクレオチドの製剤を利用す
るであろう。同様に、ポリヌクレオチド又はポリペプチドの運搬は、特定の細胞
、状態、位置などに対して特異的であろう。
【０１６９】 （診断） 別の実施例では、CMEに特異的に結合する抗体が、CMEの発現によって特徴付け
られる疾患の診断、またはCMEやCMEのアゴニストまたはアンタゴニスト、インヒ
ビターで治療を受けている患者をモニターするためのアッセイに用いられる。診
断に有用な抗体は、治療のところで記載した方法と同じ方法で製剤される。CME
の診断アッセイには、抗体及び標識を用いてヒトの体液或いは細胞や組織から採
取されたものからCMEを検出する方法が含まれる。これらの抗体は、修飾をして
或いはしないで使用され、レポーター分子の共有結合性或いは非共有結合性の接
着によって標識化され得る。当分野で周知の種々のレポーター分子が用いられる
が、その内の幾つかは上記した。
【０１７０】 CMEを測定するためのELISA，RIA，及びFACSを含む種々のプロトコルは、当分
野では周知であり、変わった或いは異常なレベルのCMEの発現を診断する元とな
るものを提供する。正常或いは標準的なCMEの発現の値は、複合体の形成に適し
た条件の下、正常な哺乳動物、例えばヒトなどの被験者から採取した体液または
細胞とCMEに対する抗体とを結合させることによって決定する。標準的な複合体
形成の量は、測光法（photometric）などの種々の方法で定量され得る。被験者
のCMEの発現の量、制御及び疾患、生検組織からのサンプルが基準値と比較され
る。基準値と被験者との間の偏差が、診断の指標となる。
【０１７１】 別の実施例によれば、CMEをコードするポリヌクレオチドを診断のために用い
ることもできる。用いられるポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド配列、
相補的なRNA及びDNA分子、及びPNAが含まれる。このポリヌクレオチドを用いて
、疾患と相関し得るCMEを発現する生検組織における遺伝子の発現を検出し定量
する。この診断アッセイを用いて、CMEの存在の有無、更に過剰な発現を調べ、
治療中のCME値の調節を監視する。
【０１７２】 ある実施形態では、CMEまたは近縁の分子をコードする遺伝子配列を含むポリ
ヌクレオチド配列を検出可能なPCRプローブを用いたハイブリダイゼーションに
よって、CMEをコードする核酸配列を同定することが可能である。例えば５'調節
領域である高度に特異的な領域か、例えば保存されたモチーフであるやや特異性
の低い領域から作られているかのプローブの特異性と、ハイブリダイゼーション
或いは増幅のストリンジェントは、プローブがCMEをコードする自然界の配列の
みを同定するかどうか、或いはアレルや関連配列コードする自然界の配列のみを
同定するかどうかによって決まるであろう。
【０１７３】 プローブはまた、関連する配列の検出に利用され、CMEをコードする任意の配
列と少なくとも５０％の配列同一性を有し得る。目的の本発明のハイブリダイゼ
ーションプローブには、DNAあるいはRNAが可能であり、SEQ ID NO:6−10の配列
、或いはCME遺伝子のプロモーター、エンハンサー、イントロンを含むゲノム配
列に由来し得る。
【０１７４】 CMEをコードするDNAに対して特異的なハイブリダイゼーションプローブの作製
方法には、CME及びCME誘導体をコードするポリヌクレオチド配列をmRNAプローブ
の作製のためのベクターにクローニングする方法がある。このようなベクターは
市販されており、当業者には周知であり、好適なRNAポリメラーゼ及び好適な標
識されたヌクレオチドを加えることによって、in vitroでRNAプローブを合成す
るために用いられる。ハイブリダイゼーションプローブは、例えば３２Ｐ或いは ３５ Ｓなどの放射性核種、或いはアビジン／ビオチン（biotin）結合系によって
プローブに結合されたアルカリホスファターゼなどの酵素標識等の種々のレポー
ターの集団によって標識され得る。
【０１７５】 CMEをコードするポリヌクレオチド配列を用いて、CMEの発現に関連する疾患を
診断することが可能である。限定するものではないが、このような疾患の例には
炭水化物代謝異常が含まれ、その中には糖尿病及びインスリン依存性糖尿病、イ
ンスリン非依存性糖尿病、低血糖症、グルカゴノーマ、ガラクトース血症、遺伝
性果糖不耐症、フルクトースジホスファターゼ欠損症、肥満症、先天性II型異常
造血性貧血、マンノシドーシス、ノイラミニダーゼ欠損症、ガラクトースエピメ
ラーゼ欠損症、糖原病、リソソーム蓄積症、フルクトース尿症、ペントース尿症
、先天性ピルビン酸代謝異常症が含まれ、また自己免疫異常／炎症異常が含まれ
、その中には後天性免疫不全症候群（AIDS）及び副腎機能不全、成人呼吸窮迫症
候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血、喘息、アテローム性動
脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、気管支炎、胆嚢炎、接
触皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、リンパ
球毒素性一時性リンパ球減少症、赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎
炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増
加症、過敏性大腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋又は心膜炎症、骨
関節炎、骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、リウマチ様
関節炎、強皮症、シェ−グレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテ
マトーデス、全身性硬化症、血小板減少症、潰瘍性大腸炎、ウェルナー症候群、
癌合併症、血液透析、体外循環と、ウイルス感染症及び細菌感染症、真菌感染症
、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫の感染症、外傷が含まれ、また癌が含まれ、
その中には腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、奇形癌などがあり
、詳しくは副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心
臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮
膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、及び子宮の癌が含まれる。CMEをコードするポ
リヌクレオチド配列は、サザーン法やノーザン法、ドットブロット法、或いはそ
の他の膜系の技術、PCR法、ディップスティック（dipstick）、ピン（pin）、EL
ISA式アッセイ、及び変異CMEの発現を検出するために患者から採取した体液或い
は組織を利用するマイクロアレイに使用することが可能である。このような質的
或いは量的方法は、当分野では周知である。
【０１７６】 ある実施態様では、CMEをコードするヌクレオチド配列は、関連する疾患、特
に上記した疾患を検出するアッセイにおいて有用であろう。CMEをコードするヌ
クレオチド配列は、標準的な方法で標識化され、ハイブリダイゼーション複合体
の形成に好適な条件の下、患者から採取した体液或いは組織のサンプルに加える
ことができるであろう。好適な培養期間の後、サンプルを洗浄し、シグナルを定
量して基準値と比較する。患者のサンプルのシグナルの量が、制御サンプルと較
べて著しく変わっている場合は、サンプル内のCMEをコードするヌクレオチド配
列の変異レベルにより、関連する疾患の存在が明らかになる。このようなアッセ
イを用いて、動物実験、臨床試験、或いは個人の患者の治療を監視における、特
定の治療効果を推定することが可能である。
【０１７７】 CMEの発現に関連する疾患の診断の基準となるものを提供するために、正常あ
るいは標準的な発現の概要が確立される。これは、ハイブリダイゼーション或い
は増幅に好適な条件の下、動物或いはヒトの何れかの正常な被験者から抽出され
た体液或いは細胞と、CMEをコードする配列或いはその断片とを結合させること
により達成され得る。標準的なハイブリダイゼーションは、正常な被験者から得
た値と周知の量の実質的に精製されたポリヌクレオチドが用いられる実験からの
値とを比較することによって定量可能である。正常なサンプルから得た標準的な
値を、疾患の症状を示す被験者から得た値と比較可能である。基準値と被験者の
値との偏差を用いて罹患しているかどうを決定する。
【０１７８】 疾患の存在が確定され、治療プロトコルが開始されると、ハイブリダイゼーシ
ョンアッセイを通常ベースで繰り返して、被験者における発現のレベルが正常な
患者に示される値に近づき始めたかどうかを推定することが可能である。繰り返
し行ったアッセイの結果を、数日から数ヶ月の期間の治療の効果を見るのに用い
ることができる。
【０１７９】 癌では、個体からの生体組織における異常な量の転写物が、疾患の発生の素因
を示し、また実際に臨床的症状が出る前に疾患を検出する方法を提供することが
可能である。この種のより明確な診断により、医療の専門家が予防方法或いは積
極的な治療法を早くから利用して、癌の発生または進行を防ぐことが可能となる
。
【０１８０】 CMEをコードする配列から設計されたオリゴヌクレオチドのさらなる診断への
利用には、PCRの利用が含まれ得る。このようなオリゴマーは、化学的な合成、
酵素を用いた生成、或いはin vitroで生成され得る。オリゴマーは、好ましくは
CMEをコードするポリヌクレオチドの断片、或いはCMEをコードするポリヌクレオ
チドと相補的なポリヌクレオチドの断片を含み、最適な条件の下、特定の遺伝子
や条件を識別するために利用される。また、オリゴマーは、やや緩いストリンジ
ェントな条件の下、近縁のDNA或いはRNA配列の検出及び／または定量のため用い
ることが可能である。
【０１８１】 CMEの発現を定量するために用いられ得る方法には、ヌクレオチドの放射標識
或いはビオチン標識、調節核酸の相互増幅（coamplification）、及び標準的な
曲線に結果が加えられたものが含まれる（例えば、Melby, P.C.等(1993) J. Imm
unol. Methods, 159:235-44；Duplaa, C.等(1993) Anal. Biochem. 229-236を参
照）。多数のサンプルの定量速度は、目的のオリゴマーが種々の希釈液に含まれ
、分光光度法或いは非色応答によって定量が迅速なハイスループット型のアッセ
イを用いることで加速された。
【０１８２】 別の実施例では、本明細書で記載した任意のポリヌクレオチド配列由来のオリ
ゴヌクレオチドまたはそれより長い断片を、マイクロアレイにおける標的として
用いる。マイクロアレイを用いて、同時に極めて多くの遺伝子の発現レベルを監
視し、遺伝子の変異、突然変異及び多形性を識別する。この情報は、遺伝子機能
の決定、疾患の遺伝的根拠の解釈、疾患の診断、及び治療薬剤の活性の監視及び
開発に有用である。
【０１８３】 当分野で周知の方法でマイクロアレイを準備して使用し、分析する。(例えば
、Brennan, T.M. 他 (1995) 米国特許第5,474,796号;Schena, M. 他 (1996) Pro
c. Natl. Acad. Sci. 93:10614-10619; Baldeschweiler 他(1995) PCT出願番号W
O95/251116; Shalon, D.他 (1995) PCT出願番号WO95/35505; Heller, R.A. 他(1
997) Proc. Natl. Acad. Sci. 94:2150-2155; 及び Heller, M.J. 他 (1997) 米
国特許第5,605,662号を参照) 本発明の別の実施例ではまた、CMEをコードする核酸配列を用いて、自然発生
のゲノム配列をマッピングするのに有用なハイブリダイゼーションプローブを生
成することが可能である。この配列は、以下のものに対してマッピングされる。
特定の染色体、染色体の特定領域または人工生成の染色体、例えば、ヒト人工染
色体（HAC）、酵母人工染色体（YAC）、細菌人工染色体（BAC）、細菌Ｐ１生成
物或いは単一染色体cDNAライブラリである。（例えば、Harrington, 1.3. 他 (1
997) Nat Genet. 15:345-355; Price, C.M. (1993) Blood Rev. 5−87-134, 及
びTrask, B.J. (1991) Trends Genet. 7:149-154を参照） in sit蛍光ハイブリダイゼーション（FISH）は、他の物理的染色体マッピング
技術及び遺伝マップデータと相関するであろう（例えば、Heinz-Ulrich, 他によ
る(1995) in Meyers, 前出, pp. 965-968.を参照）。遺伝子マップデータの例は
、種々の科学誌あるいはOnline Mendelian Inheritance in Man（OMIM）のワー
ルドワイドウェブのサイトで見付けることができる。物理的な染色体マップ上の
CMEをコードする遺伝子の位置と特定の疾患との相関性、或いは特定の疾患に対
する素因が、このような疾患と関係するDNAの領域を決定するのに役立つ。本発
明のヌクレオチド配列を用いて、正常者と、保有者、及び感染した者との遺伝子
配列における違いを検出することもある。
【０１８４】 染色体標本のin sitハイブリダイゼーション、及び確定した染色体マーカーを
用いた結合分析などの物理的マッピング技術を用いて、遺伝子マップを拡張する
こともできる。マウスなどの別の哺乳動物の染色体上での遺伝子の配置により、
たとえ特定のヒト染色体の数或いはアームが分かっていなくても、関連するマー
カーが明らかになることが多い。新規の配列を、物理的なマッピングによって、
染色体アームに割り付けることもできる。このことは、位置クローニング或いは
別の遺伝子発見技術を用いて遺伝的疾患の研究をしている研究者にとって、価値
ある情報である。疾患或いは症候群の位置が、例えば血管拡張性失調症の11q22-
23などの特定の遺伝子領域に遺伝子結合によって大まかに決定されると、その領
域に対するどの配列マッピングも、さらなる調査のための関連する遺伝子或いは
調節遺伝子を表す（例えば、Gatti, R.A.他による（1988）Nature 336:577-580
を参照）。また、目的の本発明のヌクレオチド配列を用いて、正常者、保有者、
即ち感染者の間の、転位置、反転などによる染色体位置の違いを検出することも
ある。
【０１８５】 本発明の別の実施例では、CME、その触媒作用断片或いは免疫原断片またはそ
のオリゴペプチドを、種々の任意の薬剤スクリーニング技術における化合物のラ
イブラリのスクリーニングに用いることができる。このようなスクリーニングに
用いる断片は、溶液に遊離、固体支持物に固定、細胞の表面上に保持、或いは細
胞内に存在する。CMEと検査する薬剤との結合による複合体の形成を測定しても
よい。
【０１８６】 薬剤スクリーニングに用いる別の方法は、目的のタンパク質に対して、好適な
結合親和性を有する化合物のスクリーニング処理能力を高めるために用いられる
（例えば、Geysen,他による(1984) PCT出願番号 WO84/03564を参照）。この方法
では、相当な数の異なる小さな試験用化合物が、プラスチックピン或いは他の基
板の上に合成される。試験用化合物は、CME、或いはその断片と反応してから洗
浄される。次ぎに、結合されたCMEが、当分野で周知の方法で検出される。精製
されたCMEはまた、前記した薬剤をスクリーニングする技術に用いられるプレー
ト上で直接被覆することもできる。別法では、非中和抗体を用いて、ペプチドを
捕らえ、固体支持物に固定することもできる。
【０１８７】 別の実施例では、CMEと結合可能な中和抗体がCMEと結合するため試験用化合物
と特に競合する、競合的薬剤スクリーニングアッセイを用いることができる。こ
の方法では、抗体が、CMEと１つ以上の抗原決定因子を共有するどのペプチドの
存在も検出する。
【０１８８】 別の実施例では、発展途上の分子生物学技術にCMEをコードするヌクレオチド
配列を用いて、限定はされないが、現在知られているトリプレット暗号及び特異
的な塩基対相互作用などのヌクレオチド配列の特性に依存する新しい技術を提供
することができる。
【０１８９】 当分野の技術者であれば、更なる説明がなくても前述の説明だけで最大限に本
発明を利用できるであろう。したがって、以下に記載する特定の好適な実施例は
、例示目的であって本発明を限定するものではない。
【０１９０】 前述した及び以下に記載した全ての特許出願、特許、刊行物、特に米国特許出
願通し番号60/130,383に言及することをもって本明細書の一部とする。
【０１９１】 （実施例） １ cDNAライブラリの作製 RNAは、Clontech社から購入、或いは表４に列記した組織から単離した。まず
、この組織の一部をホモジナイズしてグアニジニウムイソチオシアネート溶液に
溶解する一方、この組織の別の一部をホモジナイズしてフェノールに溶解するか
、或いはTRIZOL (Life Technologies)、グアニジニウムイソチオシアネート及び
フェノールの単相溶液などの好適な変性剤の混合液に溶解した。この溶解物を塩
化セシウムにおいて遠心分離またはクロロホルムで抽出した。イソプロパノール
或いは酢酸ナトリウムのどちらかとエタノール、或いは別の方法でこの溶解物か
らRNAを沈殿させた。
【０１９２】 RNAの純度を高めるためにRNAのフェノールによる抽出及び沈殿を必要な回数繰
り返した。場合によっては、DNA分解酵素でRNAを処理する。殆どのライブラリで
は、オリゴd(T)連結常磁性粒子(Promega)またはOLIGOTEXラテックス粒子(QIAGEN
. Valencia CA)、OLIGOTEX mRNA精製キット(QIAGEN)を用いてポリ（A＋）RNAを
単離した。別法では、POLY(A)PURE mRNA精製キット(Ambion, Austin TX)などの
別のRNA単離キットを用いて組織溶解物から直接単離した。
【０１９３】 ある場合には、Stratagene社にRNAを提供し、Stratagene社が対応するcDNAラ
イブラリを作製した。そうでない場合は、UNIZAPベクターシステム(Stratagene)
またはSUPERSCRIPT プラスミドシステム(Life Technologies)を用いて当分野で
周知の推奨方法または類似の方法でcDNAを合成してcDNAライブラリを作製した。
(例えば、Ausubel, 1997,前出,ユニット5.1-6.6を参照)。逆転写は、オリゴd(T)
またはランダムプライマーを用いて開始した。合成オリゴヌクレオチドアダプタ
ーを二本鎖cDNAに結合させてから、好適な１つの制限酵素或いは複数の制限酵素
でcDNAを消化した。殆どのライブラリでは、SEPHACRYL S 1000または SEPHAROSE
CL2B、SEPHAROSE CL4Bカラムクロマトグラフィー(Amersham Pharmacia Biotech
)、アガロースゲル電気泳動法によってcDNAの大きさ（300〜1000bp）を選択した
。PBLUESCRIPTプラスミド(Stratagene)またはpSPORT1プラスミド(Life Technolo
gies)、pcDNA2.1プラスミド(Invitrogen Carlsbad CA)、plNCYプラスミド(Incyt
e Pharmaceuticals, Palo Alto CA)などの好適なプラスミドのポリリンカーの適
合性制限酵素部位にcDNAを結合させた。この組換えプラスミドを、Stratagene社
のXL1-Blue, XL1-BIueMRF、SOLR、またはLife Technologies社のDH5αまたはDH
10B、ELECTROMAX DH 10Bを含むコンピテント大腸菌細胞に導入し組み込んだ。
【０１９４】 ２ cDNAクローンの単離 UNIZAPベクターシステム(Stratagene)或いは細胞溶解を利用して、in vivo切
除によって宿主細胞からプラスミドを回収した。MagicまたはWIZARD Minipreps
DNA精製システム(Promega)、及びAGTC Miniprep精製キット(Edge Biosystems, G
aithersburg MD)、QIAGEN社のQIAWELL 8 Plasmid、QIAWELL 8 Plus Plasmid、QI
AWELL 8 Ultra Plasmid 精製システム、REAL Prep 96プラスミドキットの内の少
なくとも１つを用いてプラスミドを精製した。沈殿させた後、０．１ｍｌの蒸留
水に再懸濁して、凍結乾燥して或いは凍結乾燥しないで４℃で保管した。
【０１９５】 別法では、ハイスループットの直接結合PCR法によって宿主細胞溶解物からプ
ラスミドDNAを増幅した。(Rao, V.B. (1994) Anal. Biochem. 216:1-14)。宿主
細胞の溶解及び熱サイクリング過程を単一反応混合液で行った。サンプルを処理
してから３８４−ウェルプレートに移して保管し、増幅したプラスミドDNAの濃
度をPICOGREEN色素(Molecular Probes, Eugene OR)及びFluoroskan II蛍光スキ
ャナー(Labsystems Oy, Helsinki, Finland)を用いて蛍光定量的に測定した。
【０１９６】 ３ シークエンシング及び分析 cDNAのシークエンシング反応は、標準的な方法で、或いはABI CATALYST 800 (
Perkin-Elmer) thermal cyclerまたはPTC-200 thermal cycler (MJ Research)と
HYDRAマイクロディスペンサー(Robbins Scientific) またはMICROLAB 2200 (Ham
ilton) 液体転移システムとの組み合わせなどのハイスループット装置で行った
。cDNAのシークエンシング反応の準備には、Amersham Pharmacia Biotech社の試
薬、またはABI PRISM BIGDYE Terminator cycle sequencing ready reactionキ
ット(Perkin-Elmer)などのABIシークエンシングキットに含まれる試薬を用いた
。cDNAのシークエンシング反応の電気泳動的な分離及び標識したポリヌクレオチ
ドの検出には、MEGABACE 1000 DNAシークエンシングシステム(Molecular Dynami
cs)、標準ABIプロトコル及び塩基対呼び出しソフトウェアを用いるABI PRISM 37
3または377シークエンシングシステム(Perkin-Elmer)、当分野で周知のその他の
配列解析システムを用いた。cDNA配列の読み枠は、標準的な方法(Ausubel, 1997
, 前出, unit 7.7)を用いて決定した。cDNA配列の幾つかを選択して、本実施例
の５に記載した方法で配列を伸長した。
【０１９７】 cDNAのシークエンシングから得たポリヌクレオチド配列の構築及び解析は、当
分野の技術者に周知のアルゴリズムを利用したソフトウェアを組合せて行った。
表５は、利用したツール、ソフトウェア、アルゴリズム、それらの説明、引用文
献、閾値パラメーターの概要を示す。表５の列１は用いたツール及びプログラム
、アルゴリズム、列２はそれらの簡単な説明、列３は引用することで本明細書の
一部とした引用文献、列４の記載部分は２つの配列の一致度の評価に用いたスコ
ア及び確率値、他のパラメータを示す（確率値が高ければ高いほど配列間の相同
性が高くなる）。配列の解析には、MACDNASIS PROソフトウェア(Hitachi Softwa
re Engineering, S. San Francisco CA)及びLASERGENEソフトウェア (DNASTAR)
を用いた。
【０１９８】 ポリヌクレオチド配列の確証は、BLAST及び動的計画法、ジヌクレオチド最近
接分析に基づいたプログラム及びアルゴリズムを用いて、ベクター及びリンカー
、ポリＡ配列を取り除き、あいまいな塩基対をマスクすることで行った。次に、
BLAST及びFASTA、BLIMPSに基づいたプログラムを用いて、公共のデータベースで
あるGenBankの霊長類及びげっ歯類、哺乳類、脊椎動物、真核生物のデータベー
スやBLOCKS、PRINTS、DOMO、PRODOM及びPFAMなどのデータベースから選択した配
列に対してこれらの配列を問合わせて注釈を得た。Phred及びPhrap、Consedに基
づいたプログラムを用いて完全長のポリヌクレオチド配列の中にこれらの配列を
構築して、BLAST及びFASTA、BLIMPSに基づいたプログラムでオープンリーディン
グフレームのためにスクリーニングした。完全長のポリヌクレオチド配列を翻訳
して対応する完全長のアミノ酸配列を引き出し、GenBankデータベース(上記)及
びSwissProt、BLOCKS、PRINTS、DOMO、PRODOM及びPrositeなどのデータベース、
またはPFAMなどの隠れマルコフモデル(HMM)に基づいたタンパク質ファミリーデ
ータベースに対して問い合わせてこれらの完全長の配列を分析した。HMMは、確
率を利用して遺伝子ファミリーのコンセンサス一次構造を解析する（例えば、Ed
dy, S.R. (1996) Curr. Opin. Struct. Biol. 6:361-365を参照）。
【０１９９】 完全長のポリヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の構築及び分析に用いる上記
のプログラムは、SEQ ID NO:6−10からのポリヌクレオチド配列の断片の同定に
も使用できる。約２０〜４０００個までのヌクレオチドの断片はハイブリダイゼ
ーション及び増幅に有用であり、上記の発明で説明した。
【０２００】 ４ ノーザン分析 ノーザン分析は、遺伝子の転写物の存在を検出するために用いられる実験用技
術であり、特定の細胞種或いは組織からのRNAが結合されている膜への標識され
たヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションを伴う(例えば、Sambrook,前出,
7章; 及び Ausubel. F.M. 他、前出, 4章及び16章を参照)。
【０２０１】 BLASTに用いる類似のコンピュータ技術を用いて、GenBank或いはLIFESEQ（Inc
yte Pharmaceuticals）のようなヌクレオチドデータベース内の同一或いは関連
する分子を検索する。この分析は多くの膜系ハイブリダイゼーションより非常に
速度が速い。さらにコンピュータ検索の感度を変更して、任意の特定の一致が、
厳密な一致或いは相同的一致の何れかとして分類されるかを確定することができ
る。検索の基準は、 （％配列同一性×％最大BLASTスコア）／１００ として定義される積スコアである。積スコアは、２つの配列間の類似度及び配列
一致の長さの両方を考慮する。例えば、積スコア４０の場合、その一致は１〜２
％誤差の範囲内で正確であり、７０ではその一致は正確であろう。類似分子は通
常、１５〜４０の範囲の積スコアを示す分子を選択することにより同定されるが
、それより低いスコアでも関連した分子が同定される場合もある。
【０２０２】 ノーザン分析の結果は、CMEをコードする転写物が発生したライブラリの分布
割合として報告される。分析には、器官／組織及び疾患によるcDNAライブラリの
分類も含まれる。器官／組織のカテゴリーには、心血管、皮膚、発生、内分泌、
胃腸、造血／免疫、筋骨格、神経、生殖、泌尿器が含まれる。疾患のカテゴリー
には、癌、炎症、外傷、細胞増殖、神経、貯留(pooled)が含まれる。カテゴリー
別に、目的の配列を発現するライブラリの数を数えて、それを全ての範囲のライ
ブラリの数で除した。各組織に特異的に発現する割合（パーセント）と各疾患で
発現する割合を表３に示した。
【０２０３】 ５ CMEをコードするポリヌクレオチドの伸長 SEQ ID NO:6−10の完全長の核酸配列は、完全長分子の好適な断片から設計し
たオリゴヌクレオチドプライマーを用いてその完全長分子の好適な断片を伸長し
て作製した。一方のプライマーは既知の断片の５'の伸長を開始するために合成
し、他方のプライマーは既知の断片の３'の伸長を開始するために合成した。開
始プライマーは、OLIGO 4．06ソフトウェア（National Biosciences）或いは他
の適切なプログラムを用いて、約２２個から約３０個のヌクレオチドの長さで約
５０％以上のＧＣ含量を有し、かつ約６８〜７２℃の温度で標的配列にアニール
するように設計した。ヘアピン構造及びプライマー−プライマー二量体が生じな
いようにヌクレオチドを伸長した。
【０２０４】 選択されたヒトcDNAライブラリを用いてこの配列を伸長した。２段階以上の伸
長が必要な場合、若しくは望ましい場合は、追加或いはネスト化プライマーの組
を設計する。
【０２０５】 当分野で既知の方法を利用したPCR法で高い忠実度で増幅した。PCRはPTC-200
thermal cycler (MJ Research, Inc.)用いて96ウェルブロックプレートで行った
。反応混合液は、鋳型DNA及び200 nmolの各プライマー、Mg２+と(NH4)2SO4とβ
−メルカプトエタノールを含むバッファー、Taq DNAポリメラーゼ(Amersham Pha
rmacia Biotech)、ELONGASE酵素(Life Technologies)、Pfu DNAポリメラーゼ(St
ratagene)を含む。プライマーの組、PCI AとPCI Bに対して以下のパラメーター
で増幅を行った。 ステップ１ ９４℃で３分間 ステップ２ ９４℃で１５秒 ステップ３ ６０℃で１分間 ステップ４ ６８℃で２分間 ステップ５ ステップ２、３、及び４を２０回繰り返す ステップ６ ６８℃で５分間 ステップ７ ４℃で保管 別法では、プライマーの組、T7とSK+に対して以下のパラメーターで増幅を行っ
た。 ステップ１ ９４℃で３分間 ステップ２ ９４℃で１５秒 ステップ３ ５７℃で１分間 ステップ４ ６８℃で２分間 ステップ５ ステップ２、３、及び４を２０回繰り返す ステップ６ ６８℃で５分間 ステップ７ ４℃で保管。
【０２０６】 各ウェルのDNA濃度は、１X TE及び0.5μlの希釈していないPCR産物に溶解した
100μlのPICOGREEN定量試薬(0.25% (v/v) PICOGREEN; Molecular Probes, Eugen
e OR)を不透明な蛍光光度計プレート(Coming Costar, Acton MA)の各ウェルに分
配してDNAが試薬と結合できるようにして測定する。このプレートをFluoroskan
II (Labsystems Oy, Helsinki, Finland)でスキャンして、サンプルの蛍光を計
測してDNAの濃度を定量化する。反応混合物の5〜10μlのアリコットを１％のア
ガロースミニゲル上での電気泳動によって解析し、何れの反応物が配列を伸長す
ることに成功したかを決定する。
【０２０７】 伸長したヌクレオチドを脱塩及び濃縮してから384ウェルプレートに移し、Cvi
JIコレラウィルスエンドヌクレアーゼ(Molecular Biology Research, Madison W
I)で消化し、pUC 18ベクター(Amersham Pharmacia Biotech)に再連結する前に音
波処理またはせん断を行った。ショットガンシークエンシングのために、消化し
たヌクレオチドを低濃度（０．６〜０．８％）のアガロースゲル上に分離して断
片を切断し、寒天をAgar ACE (Promega)で消化した。T4リガーゼ(New England B
iolabs, Beverly MA)を用いて伸長したクローンをpUC 18ベクター(Amersham Pha
rmacia Biotech)に再連結し、Pfu DNAポリメラーゼ(Stratagene)で制限部位の延
び出しを処理してコンピテント大腸菌細胞に形質移入した。形質移入した細胞を
選択して抗生物質を含む培地に移し、それぞれのコロニーを切りとってLB/2Xカ
ルベニシリン培養液の384ウェルプレートに３７℃で一晩培養した。
【０２０８】 細胞を溶解して、Taq DNAポリメラーゼ(Amersham Pharmacia Biotech)及びPfu
DNAポリメラーゼ(Stratagene)を用いて以下の手順でDNAをPCR増幅した。 ステップ１ ９４℃で３分間 ステップ２ ９４℃で１５秒 ステップ３ ６０℃で１分間 ステップ４ ７２℃で２分間 ステップ５ ステップ２、３、及び４を２９回繰り返す ステップ６ ７２℃で５分間 ステップ７ ４℃で保管。 上記したようにPICOGREEN試薬(Molecular Probes)でDNAを定量化した。DNA回収
率の悪いサンプルは、上記した条件で再び増幅した。サンプルを20％のジメチル
サルホサイド（dimethysulphoxide）(1:2, v/v)で希釈し、DYENAMIC DIRECTキッ
ト(Amersham Pharmacia Biotech)またはABI PRISM BIGDYE Terminator cycle se
quencing ready reactionキット(Perkin-Elmer)を用いてシークエンシングした
。
【０２０９】 同様に上述の手順で、SEQ ID NO:6−10のヌクレオチド配列を利用し、この伸
長のために設計したオリゴヌクレオチドと好適な遺伝子ライブラリを用いて５′
調節配列を得た。
【０２１０】 ６ 個々のハイブリダイゼーションプローブの標識及び使用 SEQ ID NO:6−10から導き出されたハイブリダイゼーションプローブを用いて
、cDNA、mRNA、またはゲノムDNAをスクリーニングする。約２０塩基対からなる
オリゴヌクレオチドの標識について特に記すが、より大きなcDNAフラグメントの
場合でも基本的に同じ手順を用いる。オリゴヌクレオチドを、OLIGO4.06ソフト
ウェア（National Bioscience）のような最新式のソフトウェアを用いてデザイ
ンし、50pmolの各オリゴマーと、250μCiの[γ‐３２Ｐ]アデノシン三リン酸（A
mersham, Chicago, IL）及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（DuPont NEN、Bost
on MA）とを組み合わせて用いることにより標識する。標識されたオリゴヌクレ
オチドを、SEPHADEX G-25超精細排除デキストランビードカラム（Amersham Phar
macia Biotech）を用いて実質的に精製する。毎分１０７カウントの標識された
プローブを含むアリコットを、次のエンドヌクレアーゼ、Ase I、Bgl II、Eco R
I、Pst I、Xba1或いはPvu II（DuPont NEN）の１つを用いて切断したヒトゲノム
DNAの典型的な膜ベースのハイブリダイゼーション解析において用いる。
【０２１１】 各切断物からのDNAを、0.7％アガロースゲル上で分画して、ナイロン製メンブ
ラン（Nytran Plus, Schleicher & Schuell, Durham NH）に転写する。ハイブリ
ダイゼーションは４０℃で１６時間かけて行う。非特異的シグナルを取り除くた
め、例えば、最大０．１ｘクエン酸ナトリウム食塩水及び０．５％ドデシル硫酸
ナトリウムの条件の下、ブロットを順次室温にて洗浄する。ハイブリダイゼーシ
ョンパターンをオートラジオグラフィー或いは別のイメージ化手段で視覚化して
比較する。
【０２１２】 ７ マイクロアレイ 化学結合方法及びインクジェット装置を用いて、基板の表面上でアレイ要素を
合成することが可能である（例えば、上記Baldeschweilerを参照）。ドットブロ
ット法またはスロットブロット法に類似したアレイを利用し、要素を熱、ＵＶ、
機械的または化学的結合方法を用いて基板の表面に配置し結合させる。典型的な
アレイは、手作業または利用可能な方法や機械を用いて作製することができ、任
意の適正な数の要素を含み得る。ハイブリダイゼーションの後、ハイブリダイズ
していないプローブを取り除き、スキャナーを用いて蛍光のレベル及びパターン
を決定する。スキャンした画像を分析して、マイクロアレイ上で要素にハイブリ
ダイズする各プローブの相補性の程度及び相対的な量／発現レベルを調べること
が可能である。
【０２１３】 完全長のcDNA、発現遺伝子配列断片（EST）、或いはそれらの断片が、マイク
ロアレイの要素となり得る。ハイブリダイゼーションに好適な断片を、LASERGEN
Eソフトウェア（DNASTAR）などの当分野で周知のソフトウェアを用いて選択する
ことが可能である。本発明の核酸配列の１つに対応する完全長のcDNA、EST、或
いはそれらの断片、或いは本発明に関連するcDNAライブラリから任意に選択され
たcDNAを、ガラススライドなどの好適な基板に整列する。cDNAは、例えばＵＶ交
差結合（UV cross-linking）を利用してスライドに固定してから、熱処理及び化
学処理を施し、最後に乾燥させる(例えば、 Schena, M. 他. (1995) Science 27
0:467-470; 及び Shalon, D. 他. (1996) Genome Res. 6:639-645を参照)。蛍光
プローブを準備して、基板上の要素にハイブリダイゼーションするために用いる
。上記した方法でこの基板を分析する。
【０２１４】 ８ 相補的ポリヌクレオチド CMEをコードする配列或いはその任意の一部に対して相補的な配列は、自然発
生のCMEの発現を低下させるため即ち阻害するために用いられる。約１５〜約３
０個の塩基対を含むオリゴヌクレオチドの使用について記すが、より小さな或い
はより大きな配列の断片の場合でも本質的に同じ方法を用いることができる。Ol
igo4.06ソフトウェア（National Biosciences）及びCMEのコーディング配列を用
いて、適切なオリゴヌクレオチドを設計する。転写を阻害するためには、最も独
特な５′配列から相補的なオリゴヌクレオチドを設計し、これを用いてプロモー
ターがコーディング配列に結合するのを阻害する。翻訳を阻害するためには、相
補的なオリゴヌクレオチドを設計して、リボソームがCMEをコードする転写物に
結合するのを阻害する。
【０２１５】 ９ CMEの発現 CMEの発現及び精製は、細菌若しくはウイルスを基にした発現系を用いて行う
ことができる。細菌でCMEが発現するために、抗生物質耐性及びcDNAの転写レベ
ルを高める誘導性のプロモーターを含む好適なベクターにcDNAをサブクローニン
グする。このようなプロモーターには、lacオペレーター調節要素に関連するT5
またはT7バクテリオファージプロモーター及びtrp-lac(tac)ハイブリッドプロモ
ーターが含まれるが、これらに限定されるものではない。組換えベクターを、BL
21(DE3)などの好適な細菌宿主に形質転換する。抗生物質耐性をもつ細菌が、イ
ソプロピルβ−Dチオガラクトピラノシド(IPTG)で誘発されるとCMEを発現する。
真核細胞でのCMEの発現は、昆虫細胞株または哺乳動物細胞株に一般にバキュロ
ウイスルスとして知られているAutographica californica核多面性ウイルス(AcM
NPV)を感染させて行う。バキュロウイルスの非必須ポリヘドリン遺伝子を、相同
組換え或いは転移プラスミドの媒介を伴う細菌の媒介による遺伝子転移のどちら
かによって、CMEをコードするcDNAと置換する。ウイルスの感染力は維持され、
強いポリヘドリンプロモータによって高いレベルのcDNAの転写が行われる。組換
えバキュロウイルスは、多くの場合はSpodoptera frugiperda (Sf9)昆虫細胞に
感染に用いられるが、ヒト肝細胞の感染にも用いられることもある。後者の感染
の場合は、バキュロウイルスの更なる遺伝的変更が必要になる。(例えば、Engel
hard. E. K.他 (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3224-3227; Sandig, V.
他 (1996) Hum. Gene Ther. 7:1937-1945.を参照)。
【０２１６】 殆どの発現系では、CMEが、例えばグルタチオンＳトランスフェラーゼ(GST)、
またはFLAGや6-Hisなどのペプチドエピトープ標識で合成された融合タンパク質
となるため、未精製の細胞溶解物からの組換え融合タンパク質の親和性ベースの
精製が素早く１回で行うことができる。Schistosoma japonicumからの２６キロ
ダルトンの酵素GSTによって、タンパク質の活性及び抗原性を維持した状態で固
定されたグルタチオンで融合タンパク質の精製が可能となる(Amersham Pharmaci
a Biotech)。精製の後、GST部分を特定の操作部位でCMEからタンパク分解的に切
断できる。アミノ酸８個のペプチドであるFLAGで、市販のモノクローナル及びポ
リクローナル抗FLAG抗体(Eastman Kodak)を用いた免疫親和性の精製が可能とな
る。６個の連続するヒスチジン残基のストレッチである6-Hisによって、金属キ
レート樹脂(QIAGEN)で精製が可能となる。タンパク質の発現及び精製の方法は、
Ausubel (1995,前出, ch 10, 16)に記載されている。これらの方法で精製したCM
Eを直接用いて以下のアッセイを行うことができる。
【０２１７】 １０ CMEの活性の実証 CMEのガラクトシルトランスフェラーゼの活性は、放射性アッセイにおいて、
ガラクトースのUDP-ガラクトースからGlcNAc終結オリゴ糖鎖への移行を測定して
決定する（Hennet. T. et al. (1998) J. Biol. Chem. 273:58-65）。CMEのアリ
コットを、14μlのアッセイ保存溶液（180 mMカコジル酸ナトリウム、pH 6.5、1
mg/mlのウシ血清アルブミン、0.26 mM UDP-ガラクトース、2μlのUDP-[3H]ガラ
クトース）及び1μlのMnCl2 (500mM)、2.5μlのGlcNAcβO-(CH2)8 CO2Me (ジメ
チルスルホキシドにおいて37 mg/ml)で、３７℃で６０分間インキュベートする
。1mlの水を加えて反応を消光してC 18 Sep-Pak カートリッジ (Waters)に移し
、反応しなかったUDP-[3H]ガラクトースを除去するために5mlの水で２回洗浄す
る。水で洗浄中も[3H]ガラクトシル化GlcNAcβO-(CH2)8-CO2Meはカラムに結合し
たままであり、それを５mlのメタノールで希釈する。希釈した溶液における放射
能を液体シンチレーションカウンタで測定し、その測定量がCMEガラクトシルト
ランスフェラーゼの活性に比例する。
【０２１８】 CMEのマンノシダーゼ活性は、マンノースをMan9(GlcNAc)2オリゴ糖から遊離さ
せる能力から測定する（Schweden, J. et al. (1986) Eur. J. Biochem. 157:56
3-570）。200 mM リン酸緩衝液、pH 6.5、1％のTriton X-100において、CMEを最
終容量30μlの[14C](Man9)(GlcNAc)2と３７℃で６０分間混合する(2〜3×10３ c
pm)。30μlの氷酢酸を追加してこの反応を終了させる。2-プロパノール／酢酸／
水（容量比：29／4／9）においてペーパークロマトグラフィーで分析した遊離 [ 14 C]マンノースの量が開始サンプルのCMEの活性に比例する。
【０２１９】 １１ 機能的アッセイ CMEの機能は、哺乳動物細胞培養系において生理学的に高められたレベルでのC
MEをコードする配列の発現によって評価する。cDNAを、cDNAを高いレベルで発現
する強いプロモーターを含む哺乳動物発現ベクターにサブクローニングする。こ
のようなベクターには、pCMV SPORTTM (Life Technologies.)及びpCR 3.1 (Invi
trogen, Carlsbad, CA)が含まれ、どちらもサイトメガロウイルスプロモーター
を含んでいる。５〜１０μgの組換えベクターを、例えば内皮由来か造血由来の
ヒト細胞株にリポソーム製剤或いは電気穿孔法によって一時的に形質移入する。
更に、標識タンパク質をコードする配列を含む１〜２μｇのプラスミドを同時に
形質移入する。標識タンパク質の発現により、形質移入された細胞と形質移入さ
れていない細胞とを区別できる。また、標識タンパク質の発現によって、cDNAの
組換えベクターからの発現を正確に予想できる。このような標識タンパク質には
、緑色蛍光タンパク質(GFP；Clontech)、及びCD64またはCD64-GFP融合タンパク
質が含まれる。レーザー光学に基づいた技術を利用した自動流動細胞計測法(FCM
)を用いて、GFPまたはCD64-GFPを発現する形質移入された細胞を同定し、その細
胞のアポトーシス状態や他の細胞特性を評価する。また、FCMで、先行した或い
は同時の細胞死の現象を診断する蛍光分子の取り込みを検出して計量する。これ
らの現象には、プロピジウムヨウ化物でのDNAの染色によって計測される核DNA内
容物の変化と、ブロモデオキシウリジンの取り込み量の低下によって計測される
DNA合成の下方調節と、特異的な抗体との反応性によって計測される細胞表面及
び細胞内のタンパンク質の発現の変化と、蛍光複合アネキシンＶタンパク質の細
胞表面への結合によって計測される原形質膜組成の変化とが含まれる。流動細胞
計測法は、Ormerod, M. G.による (1994) Flow Cytometry Oxford, New York, N
Y.に記載されている。
【０２２０】 遺伝子発現におけるCMEの影響は、CMEをコードする配列とCD64またはCD64-GFP
のどちらかが形質移入された高度に精製された細胞集団を用いて評価することが
できる。CD64またはCD64-GFPは形質転換された細胞表面で発現し、ヒト免疫グロ
ブリンG(IgG)の保存された領域と結合する。形質転換された細胞と形質転換され
ない細胞とは、ヒトIgGかCD64に対する抗体のどちらかで被覆された磁気ビード
を用いて分離することができる(DYNAL. Lake Success. NY)。mRNAは、当分野で
周知の方法で細胞から精製することができる。CME及び目的の他の遺伝子をコー
ドするmRNAの発現は、ノーザン分析やマイクロアレイ技術で分析することができ
る。
【０２２１】 １２ CMEに特異的な抗体の作製 ポリアクリルアミドゲル電気泳動法(PAGE；例えば、Harrington, M.G. (1990)
Methods Enzymol. 1816−3088-495を参照)または他の精製技術で実質的に精製
されたCMEを用いて、標準的なプロトコルでウサギを免疫化して抗体を作り出す
。
【０２２２】 別法では、CMEアミノ酸配列をLASERGENEソフトウェア（DNASTAR）を用いて解
析して免疫原性の高い領域を決定し、対応するオリゴペプチドを合成してこれを
用いて当業者に周知の方法で抗体を生産する。Ｃ末端付近の、或いは隣接する親
水性領域内のエピトープなどの適切なエピトープの選択については、当分野で周
知である(例えば、前出のAusubel, 1995,11章を参照)。
【０２２３】 通常、約１５残基の長さのオリゴペプチドを、Applied BiosystemsのABI 431A
ペプチドシンセサイザ（Perkin-Elmer）を用いてfmoc法のケミストリにより合成
し、Ｎ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（MBS
）を用いた反応によりKLH（Sigma-Aldrich, St. Louis MO）に結合させて、免疫
原性を高める(例えば、前出のAusubel, 1995を参照)。フロイントの完全アジュ
バントにおいてオリゴペプチド−KLH複合体を用いてウサギを免疫化する。得ら
れた抗血清の抗ペプチド活性及び抗CME活性を検査するには、ペプチドまたはCME
を基板に結合し、１％BSAを用いてブロックし、ウサギ抗血清と反応させて洗浄
し、さらに放射性ヨウ素標識されたヤギ抗ウサギIgGと反応させる。
【０２２４】 １３ 特異的抗体を用いる自然発生CMEの精製 自然発生CME或いは組換えCMEを、CMEに特異的な抗体を用いるイムノアフィニ
ティークロマトグラフィにより実質的に精製する。イムノアフィニティーカラム
は、CNBr-活性化SEPHAROSE（Amersham Pharmacia Biotech）のような活性化クロ
マトグラフィー用レジンと抗CME抗体とを共有結合させることにより形成する。
結合の後、そのレジンを製造者の使用説明書に従って、ブロックし洗浄する。
【０２２５】 CMEを含む培養液をイムノアフィニティーカラムに通し、CMEを優先的に吸着で
きる条件で（例えば、界面活性剤の存在下において高イオン強度のバッファーで
）そのカラムを洗浄する。そのカラムを、抗体とCMEとの結合を切るような条件
で（例えば、ｐＨ２〜３のバッファー、或いは高濃度の尿素またはチオシアン酸
塩イオンのようなカオトロピックイオンで）溶出させ、CMEを回収する。
【０２２６】 １４ CMEと相互作用する分子の同定 CME又は生物学的に活性なその断片を、１２５Ｉボルトンハンター試薬（例え
ば、Bolton A.E.及びW.M. Hunter (1973) Biochem. J. 133:529を参照）で標識
する。マルチウェルプレートに予め配列しておいた候補の分子を、標識したCME
と共にインキュベートし、洗浄して、標識したCME複合体を有する全てのウェル
をアッセイする。様々なCME濃度で得られたデータを用いて、候補分子と結合し
たCMEの数量及び親和性、会合についての値を計算する。
【０２２７】 別法では、CMEと相互作用する分子を、Fields, S.及びO. Song(1989, Nature
340:245-246)に記載の酵母２−ハイブリッドシステム（yeast two-hybrid syste
m）やMATCHMAKERシステム(Clontech)などの２−ハイブリッドシステムに基づい
た市販のキットを用いて分析する。
【０２２８】 当業者は、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく本発明の記載した方法
及びシステムの種々の改変を行うことができるであろう。特定の好適実施例に基
づいて本発明を説明したが、本発明の範囲が、そのような特定の実施例に不当に
制限されるべきではないことを理解されたい。実際に、分子生物学或いは関連す
る分野の専門家には明らかな、本明細書に記載の本発明の実施方法の様々な改変
は、特許請求の範囲に含まれる。
【０２２９】 （表の簡単な説明） 表１は、CMEをコードする完全長の配列を作り出すために用いた、ポリペプチ
ド配列及びヌクレオチド配列の配列番号(SEQ ID NO)、クローン識別番号、cDNA
ライブラリ、及びcDNA断片を示す。
【０２３０】 表２は、潜在モチーフ及び相同配列を含む各ポリペプチド配列の特徴、並びに
CMEの解析に用いた方法、アルゴリズム、及び検索可能なデータベースを示す。
【０２３１】 表３は、各核酸配列の選択された断片と、ノーザン分析によって決定された各
核酸配列の組織特異的発現パターンと、これらの組織に関連した疾患、異常症及
び症状と、各DNAがクローニングされたベクターとを示す。
【０２３２】 表４は、CMEをコードするcDNAクローンを単離したcDNAライブラリの作製に用
いた組織を示す。
【０２３３】 表５は、CMEの分析に用いたツール、プログラム、及びアルゴリズム、並びに
その説明、引用文献、閾値パラメーターを示す。
【表１】
【表２】
【表３】
【表４】
【表５】
【表６】
【表７】
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 29/00 Ｃ０７Ｋ 16/40 ４Ｃ０８４ 35/00 Ｃ１２Ｎ 1/15 ４Ｈ０４５ 37/02 1/19 Ｃ０７Ｋ 16/40 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/15 9/24 1/19 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 1/21 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 5/10 33/50 Ｚ 9/24 33/53 Ｍ Ｃ１２Ｑ 1/68 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/15 33/68 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/53 5/00 Ａ 33/566 Ａ６１Ｋ 37/02 33/68 37/48 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｕ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ， ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，Ｌ Ｋ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ， ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，Ｔ Ｍ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 タング、ワイ・トム アメリカ合衆国カリフォルニア州95054・ サンノゼ・ランウィックコート 4230 (72)発明者 ヒルマン、ジェニファー・エル アメリカ合衆国カリフォルニア州94040・ マウンテンビュー・＃12・モンロードライ ブ 230 (72)発明者 ボーグン、マライア・アール アメリカ合衆国カリフォルニア州94577・ サンレアンドロ・サンティアゴロード 14244 (72)発明者 ヤング、ジュンミング アメリカ合衆国カリフォルニア州95129・ サンノゼ・バークレーン 7125 Ｆターム(参考） 2G045 AA25 AA26 AA34 AA35 AA40 BB20 CB01 DA12 DA13 DA14 DA36 DA77 DA78 FB02 4B024 AA01 AA11 BA12 CA03 DA02 DA06 EA02 EA04 FA02 GA11 HA12 HA15 4B050 CC03 DD07 LL01 LL03 4B063 QA19 QA20 QQ08 QQ44 QR08 QR42 QR56 QS25 QS34 QX07 4B065 AA26X AA90X AA93Y AB01 BA02 CA31 CA44 CA46 4C084 AA02 AA06 AA07 BA01 BA02 BA08 BA22 BA23 CA53 CA56 DC01 NA14 ZB082 ZB262 ZC192 ZC352 4H045 AA11 CA40 DA75 EA20 EA50 FA72

Claims (23)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 単離されたポリペプチドであって、 ａ）SEQ ID NO:1乃至SEQ ID NO:5（SEQ ID NO:1−5）からなる一群から選択さ
    れたアミノ酸配列と、 ｂ）SEQ ID NO:1−5からなる一群から選択されたアミノ酸配列と少なくとも９
    ０％の配列同一性を有する自然発生のアミノ酸配列と、 ｃ）SEQ ID NO:1−5からなる一群から選択されたアミノ酸配列の生物学的に活
    性な断片と、 ｄ）SEQ ID NO:1−5からなる一群から選択されたアミノ酸配列の免疫原性断片
    とで構成される一群から選択されたアミノ酸配列を含むことを特徴とする単離さ
    れたポリペプチド。
  2. 【請求項２】 SEQ ID NO:1−5からなる一群から選択された請求項１の単
    離されたポリペプチド。
  3. 【請求項３】 請求項１のポリペプチドをコードする単離されたポリヌク
    レオチド。
  4. 【請求項４】 SEQ ID NO:6−10からなる一群から選択された請求項３の
    単離されたポリヌクレオチド。
  5. 【請求項５】 請求項３のポリヌクレオチドに機能的に結合されたプロモ
    ーター配列を含む組換えポリヌクレオチド。
  6. 【請求項６】 請求項５の組換えポリヌクレオチドで形質転換された細胞
    。
  7. 【請求項７】 請求項５の組換えポリヌクレオチドを含む遺伝子組換え生
    物。
  8. 【請求項８】 請求項１のポリペプチドを作製する方法であって、 ａ）前記ポリペプチドの発現に好適な条件の下で、請求項１のポリペプチドを
    コードするポリヌクレオチドに機能的に結合されたプロモーター配列を含む組換
    えポリヌクレオチドで形質転換された細胞を培養するステップと、 ｂ）そのように発現したポリペプチドを回収するステップとを含むことを特徴
    とする請求項１のポリペプチドの作製方法。
  9. 【請求項９】 請求項１のポリペプチドに特異的に結合する単離された抗
    体。
  10. 【請求項１０】 単離されたポリヌクレオチドであって、 ａ）SEQ ID NO:6−10からなる一群から選択されたポリヌクレオチド配列と、 ｂ）SEQ ID NO:6−10からなる一群から選択されたポリヌクレオチド配列と少
    なくとも７０％の配列同一性を有する自然発生のポリヌクレオチド配列と、 ｃ）前記ａ）に相補的なポリヌクレオチド配列と、 ｄ）前記ｂ）に相補的なポリヌクレオチド配列と、 ｅ）前記ａ）−ｄ）のRNA等価物とで構成される一群から選択されたポリヌク
    レオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド。
  11. 【請求項１１】 請求項１０のポリヌクレオチドの少なくとも６０個の連
    続するヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチド。
  12. 【請求項１２】 請求項１０のポリヌクレオチド配列を有するサンプル内
    の標的ポリヌクレオチドを検出する方法であって、 ａ）前記サンプル内の前記標的ポリヌクレオチドと相補的な配列を含む少なく
    とも１６個の連続するヌクレオチドを含むプローブと前記サンプルとをハイブリ
    ダイズするステップであって、前記プローブと前記標的ポリヌクレオチドとによ
    ってハイブリダイゼーション複合体が形成される条件の下で、前記プローブが前
    記標的ポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズする、該ステップと、 ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体の存在の有無を検出し、存在する場合
    には随意選択でその収量を測定するステップとを含むことを特徴とする標的ポリ
    ヌクレオチドの検出方法。
  13. 【請求項１３】 前記プローブが少なくとも３０個の連続するヌクレオチ
    ドを含むことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 前記プローブが少なくとも６０個の連続するヌクレオチ
    ドを含むことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 有効量の請求項１のポリペプチド及び医薬的に容認でき
    る賦形剤を含む医薬品組成物。
  16. 【請求項１６】 機能的CME（炭水化物修飾酵素である精製されたポリペ
    プチド）の発現の低下に関連する疾患やその症状の治療方法であって、請求項１
    ５の医薬品組成物をそのような治療が必要な患者に投与することを含むことを特
    徴とする治療方法。
  17. 【請求項１７】 請求項１のポリペプチドのアゴニストとして効果的な化
    合物をスクリーニングする方法であって、 ａ）請求項１のポリペプチドを含むサンプルを化合物に曝露するステップと、 ｂ）前記サンプルのアゴニスト活性を検出するステップとを含むことを特徴と
    するスクリーニング方法。
  18. 【請求項１８】 請求項１７のスクリーニング方法によって同定されたア
    ゴニスト化合物及び医薬的に容認できる賦形剤を含む医薬品組成物。
  19. 【請求項１９】 機能的CMEの発現の低下に関連する疾患やその症状の治
    療方法であって、請求項１８の医薬品組成物をそのような治療が必要な患者に投
    与することを含むことを特徴とする治療方法。
  20. 【請求項２０】 請求項１のポリペプチドのアンタゴニストとして効果的
    な化合物をスクリーニングする方法であって、 ａ）請求項１のポリペプチドを含むサンプルを化合物に曝露するステップと、 ｂ）前記サンプルのアンタゴニスト活性を検出するステップとを含むことを特
    徴とするスクリーニング方法。
  21. 【請求項２１】 請求項２０のスクリーニング方法によって同定されたア
    ンタゴニスト化合物及び医薬的に容認できる賦形剤を含む医薬品組成物。
  22. 【請求項２２】 機能的CMEの過剰な発現に関連する疾患やその症状の治
    療方法であって、請求項２１の医薬品組成物をそのような治療が必要な患者に投
    与することを含むことを特徴とする治療方法。
  23. 【請求項２３】 請求項４の配列を含む標的ポリヌクレオチドの発現量を
    効果的に変化させる化合物をスクリーニングする方法であって、 ａ）前記標的ポリヌクレオチドを含むサンプルを化合物に曝露するステップと
    、 ｂ）前記標的ポリヌクレオチドの発現の変化を検出するステップとを含むこと
    を特徴とするスクリーニング方法。
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