JP2002534091A - ヒト・サイクリックヌクレオチド・ホスホジエステラーゼ - Google Patents

ヒト・サイクリックヌクレオチド・ホスホジエステラーゼ

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、ヒト・サイクリックヌクレオチド・ホスホジエステラーゼ（HSPDE10A）と、HSPDE10Aを同定しコードするポリヌクレオチドとを提供する。本発明はまた、発現ベクター及び宿主細胞、抗体、アゴニスト、アンタゴニストを提供する。更に、本発明は、HSPDE10Aの発現に関連する疾患の診断または治療方法、予防方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （技術分野） 本発明は、ヒト・サイクリックヌクレオチド・ホスホジエステラーゼの核酸配
列及びアミノ酸配列、並びにこれらの配列を用いた癌及び免疫異常症の診断及び
治療、予防に関する。
【０００２】 （発明の背景） サイクリックヌクレオチド（環状AMP及び環状GMP）は、ホルモン、光、及び神
経伝達物質を含む種々な細胞外の信号を伝達する細胞内のセカンドメッセンジャ
ーとして機能する。サイクリックヌクレオチド・ホスホジエステラーゼ（PDE）
は、サイクリックヌクレオチドを対応するリン酸モノエステルに分解して、サイ
クリックヌクレオチドの細胞内の濃度及びシグナル伝達におけるそれらの効果を
調節する。基質特異性及び親和性、補因子に対する感受性、阻害剤に対する感受
性に基づいて、少なくとも７つの哺乳動物PDEのファミリーが同定された（Beavo
, J.A. (1995) Physiol. Rev. 75:725-748）。これらのファミリーの幾つかは固
有の遺伝子を含み、その多くがスプライスバリアントとして種々の組織に発現す
る。ファミリーの中には、多数のアイソザイム、及びこれらのアイソザイムの多
数のスプライスバリアントが存在する。多数のPDEファミリー及びアイソザイム
、スプライスバリアントの存在は、サイクリックヌクレオチドのレベル及び機能
の調節の可能性を示すものである。
【０００３】 １型PDE（PDE1）は、Ca2+／カルモジュリン・依存性であり、それぞれが少な
くとも２つの異なったスプライスバリアントを有する３つの異なった遺伝子によ
ってコードされると思われる。PDE1は、肺及び心臓、脳にみられる。Ca2+／カル
モジュリン・依存性PDE1の幾つかは、リン酸化／脱リンによってin vitroで調節
できる。PDE1のリン酸化によって、カルモジュリンに対する酵素の親和性が低下
し、PDE活性が低下し、定常状態の環状AMPのレベルが上昇する。PDE2は、脳に局
在する環状GMP刺激PDEであり、カテコールアミンの分泌における環状AMPの効果
を仲介すると考えられる。PDE3は、血管平滑筋に見られるPDEの主なファミリー
の１つである。PDE3は環状GMPによって阻害され、基質としての環状AMPに対して
高い特異性を有し、心機能にある役割を果たす。PDE3の１つのアイソザイムは、
１種類或いはそれ以上のインスリン依存性キナーゼによって調節される。PDE4は
、殆どの炎症性の細胞において優勢なアイソエンザイムであり、その内の幾つか
は環状AMP依存性リン酸化によって活性化される。PDE5は、環状GMP特異的でると
思われ、また、環状AMPを加水分解し得る。高いレベルのPDE5が、平滑筋標本及
び血小板、腎臓に見られる。PDE6は視覚に有る役割を果たし、光及び環状GMPに
よって調節される。僅か１つの既知のメンバーからなるPDE7クラスは環状AMP特
異的であり、PDE4に最も密接に関連する。PDE7は、PDE4の特異的阻害剤ロリプラ
ムによって阻害されない（上記Beavo）。PDE8及びPDE9は、PDEの２つの新しいフ
ァミリーである。PDE8は、環状AMP特異的であってPDE4に最も密接に関連し、ロ
リプラムに対する感受性はなく、dipyridimoleに対して感受性がある。PDE9は、
環状GMP特異的であり、PDE阻害剤ザプリナストにのみ感受性がある。
【０００４】 PDEは、約２７０個のアミノ酸からなる触媒ドメイン、及び補因子の結合に関
与するN末端調節ドメインで構成され、機能が未知のC末端ドメインも含むことも
ある。保存されたモチーフであるHDXXHXGXXNは、全てのPDEの触媒ドメインで同
定された。PDE5は、N末端環状GMP結合ドメインは約３８０個のアミノ酸残基から
なり、保存された配列モチーフN(R/K)XnFX3DEの縦列反復配列を含む（McAlliste
r-Lucas, L.M. 他 (1993) J. Biol. Chem. 268:22863-22873）。NKXnDモチーフ
が、環状GMP結合に重要であることが突然変異誘発によって示された（Turko, IV
. 他 (1996) J. Biol. Chem. 271:22240-22244）。PDEファミリー間では触媒ド
メインにおいて約３０％のアミノ酸同一性を示すが、同じファミリーのアイソザ
イム間ではこの領域において一般に約８５〜９５％の同一性を示す（例えば、PD
E4AとPDE4B）。更に、あるファミリー内では、触媒ドメインの外側の領域におい
て６０％を超える高い同一性を示すが、ファミリー間では配列同一性が全くない
或いはあっても極僅かである。
【０００５】 免疫反応及び炎症反応の多くの作用は、細胞内の環状AMPのレベルを上昇させ
る薬剤によって阻害される（Verghese. MW. 他 (1995) Mol. Pharmacol. 47:116
4-1171）。PDE活性の上昇によって様々な疾患が起こり、それらの疾患はサイク
リックヌクレオチドのレベルの低下に関連する。マウスのある種の尿崩症はPDE4
活性の上昇に関連し、アトピー患者の白血球において低Km環状AMP PDE活性の上
昇が報告された。また、PDEの欠損は網膜疾患に関連する。PDE6B遺伝子の変異に
よって、rdマウスの網膜変性及びヒトの常染色体劣性色素性網膜炎、アイリッシ
ュセッター犬の杆体／錐体のI型異形成が発症する。PDE3は心疾患に関連する。
【０００６】 多くのPDEの阻害剤が発見され、臨床評価が行われた。PDE3阻害剤は、血小板
凝集阻止薬及び抗高血圧症薬、うっ血性心不全の治療に有用な強心薬として開発
された。PDE4阻害剤ロリプラムは、うつ病の治療に用いられており、別のPDE4阻
害剤は抗炎症剤として臨床評価が行われている。ロリプラムはまた、in vitroで
HIV-1の複製を促進するリポ多糖（LPS）誘発性TNF-αを阻害することが分かって
いる。従って、ロリプラムはHIV-1の複製を抑制すると思われる（Angel. J.B.
他 (1995) AIDS 9:1137-1144）。更に、ロリプラムがTNF-α及びTNF-β、インタ
ーフェロンγなどのサイトカインの産生を抑制することから、ロリプラムが脳脊
髄炎の治療に効果があることが分かった。ロリプラムはまた、錐体外路性終末欠
陥症候群の治療に効果があると思われ、実験動物モデルにおける多発性硬化症に
効果があった（Sommer,N. 他 (1995) Nat. Med. 1:244-248; Sasaki, H. 他 (19
95) Ear. J. Pharmacol 282:71-76）。
【０００７】 テオフィリンは、気管支喘息及び他の呼吸器疾患に用いられる非特異的PDE阻
害剤である。テオフィリンは、呼吸器疾患の治療における気道平滑筋（airway s
mooth muscle）機能、及び抗炎症即ち免疫調節能に作用すると考えられる（Bann
er, K.H. 及び C.P. Page (1995) Eur. Respir. J. 8:996-1000）。別の非特異
的PDE阻害剤ペントキシフィリンは、間欠性跛行及び糖尿病誘発性末梢血管疾患
の治療に用いられる。ペントキシフィリンは、TNF-αの産生を遮断するとして知
られ、HIV-1の複製を阻害すると考えられる（前出、Angel他）。
【０００８】 PDEはまた、種々の細胞型の細胞増殖に影響を与え、種々の癌に関係すると報
告された。Bang他（1994; Proc. NatI. Acad. Sci. USA 91:5330-5334）によっ
て、前立腺癌細胞株DU145及びLNCaPの成長が、環状AMP誘導体及びホスホジエス
テラーゼ阻害剤の送達によって阻害されることが報告された。これらの細胞はま
た、上皮性からニューロン形態に表現型が永久的に転換された。別の研究者は、
PDE阻害剤はメサンギウム細胞の増殖（Matousovic, K. 他 (1995)J. Clin. Inve
st. 96:401-410）及びリンパ球の増殖（Joulain. C.他 (1995) J. Lipid Mediat
. Cell Signal. 11:63-79）を調節する可能性があると提唱した。更に、Deonara
in及びEpenetos（1994; Br. J. Cancer 70:786-94）は、ホスホジエステラーゼ
を腫瘍の特定の細胞部位に送達して細胞死に至らせることを含む癌の治療を報告
した。
【０００９】 新規のヒト・サイクリックヌクレオチド・ホスホジエステラーゼ及びそれらを
コードするポリヌクレオチドの発見により、癌及び免疫異常症の診断及び治療、
予防に有用な新規の組成物を提供することで当分野のニーズに答えることができ
る。
【００１０】 （発明の要約） 本発明は、個別にはそれぞれ「HSPDE10A-1」及び「HSPDE10A-2」、総称して「
HSPDE10A」と呼ぶヒト・サイクリックヌクレオチド・ホスホジエステラーゼであ
る実質的に精製されたポリペプチドを提供する。本発明の一実施態様では、a）S
EQ ID NO:1−2からなる一群から選択されたアミノ酸配列、b）SEQ ID NO:1−2か
らなる一群から選択されたアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有する自然
発生のアミノ酸配列、c）SEQ ID NO:1−2からなる一群から選択されたアミノ酸
配列の生物学的に活性な断片、またはd）SEQ ID NO:1−2からなる一群から選択
されたアミノ酸配列の免疫原性断片を含む単離したポリペプチドを提供する。別
法では、SEQ ID NO:1−2のアミノ酸配列を含む単離したポリペプチドを提供する
。
【００１１】 本発明は、更に、a）SEQ ID NO:1−2からなる一群から選択されたアミノ酸配
列、b）SEQ ID NO:1−2からなる一群から選択されたアミノ酸配列と９０％以上
の配列同一性を有する自然発生のアミノ酸配列、c）SEQ ID NO:1−2からなる一
群から選択されたアミノ酸配列の生物学的に活性な断片、またはd）SEQ ID NO:1
−2からなる一群から選択されたアミノ酸配列の免疫原性断片むポリペプチドを
コードする単離したポリヌクレオチドを提供する。別法では、このポリヌクレオ
チドがSEQ ID NO:3−4からなる一群から選択される。
【００１２】 更に、本発明は、a）SEQ ID NO:1−2からなる一群から選択されたアミノ酸配
列、b）SEQ ID NO:1−2からなる一群から選択されたアミノ酸配列と９０％以上
の配列同一性を有する自然発生のアミノ酸配列、c）SEQ ID NO:1−2からなる一
群から選択されたアミノ酸配列の生物学的に活性な断片、またはd）SEQ ID NO:1
−2からなる一群から選択されたアミノ酸配列の免疫原性断片を含むポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチドと機能的に結合するプロモーター配列を含む組
換えポリヌクレオチドを提供する。別法では、本発明は、この組換えポリヌクレ
オチドで形質転換された細胞を提供する。更なる別法では、本発明は、この組換
えポリヌクレオチドを含む遺伝子組換え生物を含む。
【００１３】 更に、本発明は、a）SEQ ID NO:1−2からなる一群から選択されたアミノ酸配
列、b）SEQ ID NO:1−2からなる一群から選択されたアミノ酸配列と９０％以上
の配列同一性を有する自然発生のアミノ酸配列、c）SEQ ID NO:1−2からなる一
群から選択されたアミノ酸配列の生物学的に活性な断片、またはd）SEQ ID NO:1
−2からなる一群から選択されたアミノ酸配列の免疫原性断片を含むポリペプチ
ドの製造方法を提供する。この方法は、a）このポリペプチドの発現に好適な条
件の下で細胞を培養するステップであって、この細胞が、このポリペプチドをコ
ードするポリヌクレオチドと機能的に結合するプロモーター配列を含む組換えポ
リヌクレオチドで形質転換される、該ステップと、b）このように発現したポリ
ペプチドを回収するステップとを含む。
【００１４】 更に、本発明は、a）SEQ ID NO:1−2からなる一群から選択されたアミノ酸配
列、b）SEQ ID NO:1−2からなる一群から選択されたアミノ酸配列と９０％以上
の配列同一性を有する自然発生のアミノ酸配列、c）SEQ ID NO:1−2からなる一
群から選択されたアミノ酸配列の生物学的に活性な断片、またはd）SEQ ID NO:1
−2からなる一群から選択されたアミノ酸配列の免疫原性断片を含むポリペプチ
ドに特異的に結合する単離した抗体を提供する。
【００１５】 更に、本発明は、a）SEQ ID NO:3−4からなる一群から選択されたポリヌクレ
オチド配列、b）SEQ ID NO:3−4からなる一群から選択されたポリヌクレオチド
酸配列と７０％以上の配列同一性を有する自然発生のポリヌクレオチド配列、c
）前記a）に相補的なポリヌクレオチド配列、またはd）前記b）に相補的なポリ
ヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。別法では、こ
のポリヌクレオチドは、少なくとも６０個の連続するヌクレオチドである。
【００１６】 更に、本発明は、a）SEQ ID NO:3−4からなる一群から選択されたポリヌクレ
オチド配列、b）SEQ ID NO:3−4からなる一群から選択されたポリヌクレオチド
と７０％以上の配列同一性を有する自然発生のポリヌクレオチド配列、c）前記a
）に相補的なポリヌクレオチド配列、またはd）前記b）に相補的なポリヌクレオ
チド配列を含むポリヌクレオチド配列を有するサンプルの中の標的ポリヌクレオ
チドを検出する方法を提供する。この方法は、a）前記サンプル内の標的ポリヌ
クレオチドと相補的な配列を含む少なくとも１６個の連続するヌクレオチドを含
むプローブと前記サンプルをハイブリダイズさせるステップであって、前記プロ
ーブと前記標的ポリヌクレオチドとでハイブリダイゼーション複合体が形成され
る条件の下、前記プローブが特異的に前記標的ポリヌクレオチドにハイブリダイ
ズする、該ステップと、b）前記ハイブリダイゼーション複合体の存在の有無を
検出し、存在する場合には随意選択でその量を測定するステップとを含む。別法
では、前記プローブは、少なくとも３０個の連続するヌクレオチドを含む。更な
る別法では、前記プローブは、少なくとも６０個の連続するヌクレオチドを含む
。
【００１７】 更に、本発明は、a）SEQ ID NO:1−2からなる一群から選択されたアミノ酸配
列、b）SEQ ID NO:1−2からなる一群から選択されたアミノ酸配列と９０％以上
の配列同一性を有する自然発生のアミノ酸配列、c）SEQ ID NO:1−2からなる一
群から選択されたアミノ酸配列の生物学的に活性な断片、またはd）SEQ ID NO:1
−2からなる一群から選択されたアミノ酸配列の免疫原性断片を含む効果的な量
のポリペプチド及び好適な医薬用賦形剤を含む医薬品組成物を提供する。更に、
本発明は、患者にこの医薬品組成物を投与することを含む、機能的HSPDE10Aの発
現の低下に関連した疾患やその症状の治療方法を提供する。
【００１８】 更に、本発明は、a）SEQ ID NO:1−2からなる一群から選択されたアミノ酸配
列、b）SEQ ID NO:1−2からなる一群から選択されたアミノ酸配列と９０％以上
の配列同一性を有する自然発生のアミノ酸配列、c）SEQ ID NO:1−2からなる一
群から選択されたアミノ酸配列の生物学的に活性な断片、またはd）SEQ ID NO:1
−2からなる一群から選択されたアミノ酸配列の免疫原性断片を含むポリペプチ
ドのアゴニストとして効果的な化合物をスクリーニングする方法を提供する。こ
の方法は、a）前記ポリペプチドを含むサンプルを化合物に曝露するステップと
、b）前記サンプルのアゴニスト活性を検出するステップとを含む。別法では、
本発明は、前記方法によって同定されたアゴニスト化合物及び好適な医薬用賦形
剤を含む医薬品組成物を提供する。更なる別法では、本発明は、患者にこの医薬
品組成物を投与するステップを含む、機能的HSPDE10Aの発現の低下に関連した疾
患やその症状の治療方法を提供する。
【００１９】 更に、本発明は、a）SEQ ID NO:1−2からなる一群から選択されたアミノ酸配
列、b）SEQ ID NO:1−2からなる一群から選択されたアミノ酸配列と９０％以上
の配列同一性を有する自然発生のアミノ酸配列、c）SEQ ID NO:1−2からなる一
群から選択されたアミノ酸配列の生物学的に活性な断片、またはd）SEQ ID NO:1
−2からなる一群から選択されたアミノ酸配列の免疫原性断片含むポリペプチド
のアンタゴニストとして効果的な化合物をスクリーニングする方法を提供する。
この方法は、a）前記ポリペプチドを含むサンプルを化合物に曝露するステップ
と、b）前記サンプルのアンタゴニスト活性を検出するステップとを含む。別法
では、本発明は、前記方法によって同定されたアンタゴニスト化合物及び好適な
医薬用賦形剤を含む医薬品組成物を提供する。更なる別法では、本発明は、患者
にこの医薬品組成物を投与するステップを含む、機能的HSPDE10Aの過剰な発現に
関連した疾患やその症状の治療方法を提供する。
【００２０】 更に本発明は、SEQ ID NO:3−4からなる一群から選択された配列を含む標的ポ
リヌクレオチドの発現を変える効果的な化合物をスクリーニングする方法であっ
て、a）前記標的ポリヌクレオチドを含むサンプルを化合物に曝露するステップ
と、b）前記標的ポリヌクレオチドの発現の変化を検出するステップとを含む、
該スクリーニング方法を提供する。
【００２１】 （定義） 用語「HSPDE10A」は、天然、合成、半合成或いは組換え体など全ての種（特に
ウシ、ヒツジ、ブタ、マウス、ウマ及びヒトを含む哺乳動物）から得られる実質
的に精製されたHSPDE10Aのアミノ酸配列を指す。
【００２２】 用語「アゴニスト」は、HSPDE10Aの生物学的活性を強化したり、模倣する分子
を指す。このアゴニストは、HSPDE10Aに直接相互作用するか、或いはHSPDE10Aが
関与する生物学的経路の成分と作用して、HSPDE10Aの活性を調節するタンパク質
、核酸、糖質、小分子、任意の他の化合物や組成物を含み得る。
【００２３】 用語「アレル変異配列」は、HSPDE10Aをコードする遺伝子の別の形を指す。ア
レル変異配列は、核酸配列における少なくとも１つの変異によって生じ、変異ｍ
ＲＮＡ若しくは変異ポリペプチドになり、これらの構造や機能は変わる場合もあ
れば変わらない場合もある。ある遺伝子は、自然発生型のアレル変異配列が存在
しないもの、１つ或いは多数存在するものがある。一般にアレル変異配列を生じ
る変異は、ヌクレオチドの自然な欠失、付加、或いは置換による。これらの各変
異は、単独或いは他の変異と同時に起こり、所定の配列内で一回或いはそれ以上
生じる。
【００２４】 HSPDE10Aをコードする「変異」核酸配列は、様々なヌクレオチドの欠失、挿入
、或いは置換が起こっても、HSPDE10Aと同じポリペプチド或いはHSPDE10Aの機能
特性の少なくとも１つを備えるポリペプチドを指す。この定義には、HSPDE10Aを
コードするポリヌクレオチド配列の正常な染色体の遺伝子座ではない位置でのア
レル変異配列との不適当或いは予期しないハイブリダイゼーション、並びにHSPD
E10Aをコードするポリヌクレオチドの特定のオリゴヌクレオチドプローブを用い
て容易に検出可能な或いは検出困難な多形性を含む。コードされたタンパク質も
変異され得り、サイレント変化を生じHSPDE10Aと機能的に等価となるアミノ酸残
基の欠失、挿入、或いは置換を含み得る。意図的なアミノ酸置換は、生物学的或
いは免疫学的にHSPDE10Aの活性が保持される範囲で、残基の極性、電荷、溶解度
、疎水性、親水性、及び／または両親媒性についての類似性に基づいて成され得
る。例えば、負に荷電したアミノ酸にはアスパラギン酸及びグルタミン酸が含ま
れ、正に荷電したアミノ酸にはリシン及びアルギニンが含まれ得る。類似の親水
性の値をもち極性非荷電側鎖を有するアミノ酸には、アスパラギン、グルタミン
、セリン、トレオニンが含まれ得る。類似の親水性の値をもち非荷電側鎖を有す
るアミノ酸には、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、フェ
ニルアラニン及びチロシンが含まれ得る。
【００２５】 用語「アミノ酸」及び「アミノ酸配列」は、オリゴペプチド、ペプチド、ポリ
ペプチド、タンパク質配列、或いはそれらの任意の断片を指し、天然の分子及び
合成分子を含む。「アミノ酸配列」が自然発生のタンパク質分子である場合、「
アミノ酸配列」及び類似の用語は、アミノ酸配列を、記載したタンパク質分子に
関連する完全で元のままのアミノ酸配列に限定するものではない。
【００２６】 用語「増幅」は、核酸配列の複製物を作製することに関連する。一般に増幅は
、この技術分野で周知のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術によって行われる。
【００２７】 用語「アンタゴニスト」は、HSPDE10Aの生物学的活性を阻害或いは減弱する分
子である。アンタゴニストは、HSPDE10Aに直接相互作用するか、或いはHSPDE10A
が関与する生物学的経路の成分と作用して、HSPDE10Aの活性を調節する抗体、核
酸、糖質、小分子、任意の他の化合物や組成物などのタンパク質を含み得る。
【００２８】 用語「抗体」は、抗原決定基と結合可能なFab及びF(ab')2、及びそれらの断片
、Fv断片などの無傷の分子を指す。HSPDE10Aポリペプチドと結合する抗体は、抗
体を免疫する小ペプチドを含む無傷の分子またはその断片を用いて産生可能であ
る。動物（例えば、マウス、ラット、若しくはウサギ）を免疫化するのに使用さ
れるポリペプチド或いはオリゴペプチドは、RNAの翻訳から、或いは化学的に合
成可能であり、必要に応じて担体タンパク質と結合させることも可能である。ペ
プチドと化学的に結合した一般に用いられる担体は、ウシ血清アルブミン、チロ
グロブリン、及びキーホールリンペットヘモニアン（KLH）を含む。次ぎに、こ
の結合したペプチドを用いて動物を免疫化する。
【００２９】 用語「抗原決定基」は、特定の抗体と接触する分子の領域（即ちエピトープ）
を指す。タンパク質或いはタンパク質の断片が、宿主動物を免疫化するのに用い
られるとき、このタンパク質の種々の領域は、抗原決定基（タンパク質上の特定
の領域或いは三次元構造体）に特異的に結合する抗体の産生を誘発し得る。抗原
決定基は、抗体と結合するために無傷の抗原（即ち、免疫応答を引き出すために
用いられる免疫原）と競合し得る。
【００３０】 用語「アンチセンス」は、特定の核酸配列のセンス鎖に相補的な核酸配列を含
む任意の組成物を指す。アンチセンス分子は、合成や転写を含む任意の方法で作
り出すことができる。相補的ヌクレオチドは、一度細胞に導入されると、細胞に
よって作られた自然の配列と結合して二重鎖を形成し、転写や翻訳を阻害する。
「マイナス（−）」という表現はアンチセンス鎖、「プラス（＋）」という表現
はセンス鎖を指す。
【００３１】 用語「生物学的活性」は、自然発生分子の構造的、調節的、或いは生化学的な
機能を有するタンパク質を指す。同様に、用語「免疫学的に活性」は、天然或い
は組換え体のHSPDE10A、合成のHSPDE10Aまたはそれらの任意のオリゴペプチドが
、適当な動物或いは細胞の特定の免疫応答を誘発して特定の抗体と結合する能力
を指す。
【００３２】 用語「相補的」及び「相補性」は、ポリヌクレオチド同士が塩基対を形成して
自然に結合することを指す。例えば、配列「５'Ａ−Ｇ−Ｔ３'」が相補的な配列
「３'Ｔ−Ｃ−Ａ５'」と結合する。２つの一本鎖分子間の相補性は、幾つかの核
酸のみが結合する部分的な場合、或いは一本鎖間に完全な相補性が存在して完全
な相補性となる場合もあり得る。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブ
リダイゼーションの効率及び強度に大きな影響を与える。このことは、核酸鎖間
の結合に左右される増幅反応、並びにペプチド核酸（PNA）分子の設計若しくは
使用において特に重要である。
【００３３】 「所定のポリヌクレオチド配列を含む組成物」または「所定のアミノ酸配列を
含む組成物」は広い意味で、所定のヌクレオチド配列若しくはアミノ酸配列を含
む任意の組成物を指す。この組成物は、乾燥した製剤或いは水溶液を含み得る。
HSPDE10A若しくはHSPDE10Aの断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む組成
物は、ハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。このプローブは、
凍結乾燥状態で保存可能であり、糖質などの安定化剤と結合させることが可能で
ある。ハイブリダイゼーションにおいて、プローブは、塩（例えば、NaCl）及び
界面活性剤（例えば、SDS：ドデシル硫酸ナトリウム）、その他の物質（例えば
、デンハート液、乾燥ミルク、サケ精子DNAなど）を含む水溶液に展開され得る
。
【００３４】 「コンセンサス配列」は、不要な塩基を分離するためにシークエンシングされ
た核酸配列であって、XL-PCRTM（Perkin Elmer, Norwalk, CT）を用いて５'及び
／または３'の方向に延長されてシークエンシングされた核酸配列、或いはGELVI
EW 断片構築システム（GCG, Madison, WI）などのフラグメントの構築のための
コンピュータプログラムを用いて１つ或いはそれ以上のインサイト社クローン、
及び場合によっては、１つ以上のパブリックのドメインESTの重複によって構築
された核酸配列を指す。延長及び重複の両方によって構築されるコンセンサス配
列もある。
【００３５】 用語「保存的なアミノ酸置換」は、元のタンパク質の特性を殆ど変えない置換
を指す。即ち、置換によってそのタンパク質の構造や機能が大きくは変わらず、
そのタンパク質の構造、特にその機能が保存される。以下に、あるタンパク質の
元のアミノ酸が別のアミノ酸に置換される保存的なアミノ酸置換を示す。 元の残基 保存的な置換 Ala Gly, Set Arg His, Lys Asn Asp, Gln, His Asp Asn, Glu Cys Ala, Ser Gln Asn, Glu, His Glu Asp, Gln, His Gly Ala His Asn, Arg, Gln, Glu Ile Leu, Val Leu Ile, Val Lys Arg, Gln, Glu Met Leu, Ile Phe His, Met, Leu, Trp, Tyr Ser Cys, Thr Thr Ser, Val Trp Phe, Tyr Tyr His, Phe, Trp Val Ile. Leu, Thr 一般に、保存されたアミノ酸置換の場合は、a）置換された領域のポリペプチ
ドの骨格構造、例えば、βシートやαヘリックス高次構造、b）置換された部位
の分子の電荷または疎水性、及び／または、c）側鎖の大半が維持される。
【００３６】 用語「欠失」は、１個以上のアミノ酸残基が欠如するアミノ酸配列の変化、或
いは１個以上のヌクレオチドが欠如する核酸配列の変化を指す。
【００３７】 用語「誘導体」は、化学修飾されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指
す。ポリヌクレオチド配列の化学修飾には、例えば、アルキル基、アシル基、ヒ
ドロキシル基、或いはアミノ基による水素の置換がある。誘導体ポリヌクレオチ
ドは、自然分子（未修飾の分子）の生物学的或いは免疫学的機能の少なくとも１
つを維持するポリペプチドをコードする。誘導体ポリペプチドとは、もとのポリ
ペプチドの生物学的機能、或いは免疫学的機能の少なくとも１つを維持する、グ
リコシル化、ポリエチレングリコール化、或いは任意の同様のプロセスによって
修飾されたポリペプチドのことである。
【００３８】 用語「断片」は、HSPDE10AまたはHSPDE10Aをコードするポリヌクレオチドの固
有の部分であって、その親配列（parent sequence）と同一であるがその配列よ
り長さが短いものを指す。「断片」の最大の長さは、親配列から１つのヌクレオ
チド／アミノ酸残基を差し引いた長さである。例えば、ある断片は、５〜１００
０個の連続するヌクレオチド或いはアミノ酸残基を含む。プローブ、プライマー
、抗原、治療用分子、またはその他の目的に用いる断片は、少なくとも５、１０
、１５、１６、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７５、１００、１５０、
２５０若しくは５００個の連続するヌクレオチド或いはアミノ酸残基の長さであ
る。断片は、優先的に分子の特定の領域から選択される場合もある。例えば、ポ
リペプチド断片は、所定の配列に示された最初の２５０若しくは５００のアミノ
酸（或いは、ポリペプチドの最初の２５％または５０％）から選択された連続す
るアミノ酸の所定の長さを含み得る。これらの長さは一例であり、配列表及び表
、図面を含む明細書に記載の任意の長さが、本発明の実施例に含まれ得る。
【００３９】 SEQ ID NO:3−4のある断片は、例えば、同じゲノム内の他の配列とは異なる、
SEQ ID NO:3−4を特異的に同定する固有のポリヌクレオチド配列の領域を含む。
SEQ ID NO:3−4のある断片は、例えば、ハイブリダイゼーションや増幅技術、ま
たはSEQ ID NO:3−4を関連ポリヌクレオチド配列から区別する類似の方法に有用
である。ある断片と一致するSEQ ID NO:3−4の正確な断片の長さや領域は、その
断片の目的に基づいて当分野で一般的な技術によって日常的に測定できる。
【００４０】 SEQ ID NO:1−2のある断片は、SEQ ID NO:3−4のある断片によってコードされ
る。SEQ ID NO:1−2のある断片は、特異的にSEQ ID NO:1−2を同定する固有のア
ミノ酸配列の領域を含む。例えば、SEQ ID NO:1−2のある断片は、特異的にSEQ
ID NO:1−2を認識する抗体の作製用の免疫原性ペプチドとして有用である。ある
断片と一致するSEQ ID NO:1−2の正確な断片の長さや領域は、その断片の目的に
基づいて当分野で一般的な技術によって日常的に測定できる。
【００４１】 用語「類似性」は相補性の程度を表す。これには、部分的類似性と完全な類似
性とがある。用語「同一性」を「類似性」とも言える。同一の配列と標的の核酸
とのハイブリダイゼーションが少なくとも部分的に阻止される部分的に相補的な
配列は、「実質的に類似」と呼ばれる。完全に相補的な配列と標的の配列とのハ
イブリダイゼーションの阻止は、緩いストリンジェントな条件の下、ハイブリダ
イゼーションアッセイ（サザンブロッティング或いはノーザンブロッティング法
、溶液ハイブリダイゼーション等）を用いて検査される。実質的に類似の配列或
いはハイブリダイゼーションプローブは、緩いストリンジェントな条件の下、完
全に類似（同一）の配列と標的の配列との結合に対して競合して抑制する。これ
は、緩いストリンジェントな条件の下では非特異的な結合が許容されるというこ
とではなく、緩いストリンジェントな条件では、２つの配列の互いへの結合が特
異的（即ち、選択的）に相互作用しなけらばならい。部分的な相補性ともいえな
い（例えば、３０％未満の類似性或いは同一性）第２の標的配列を用いて、非特
異的結合が存在しないことの検査が可能である。非特異的結合が存在しない場合
は、実質的に類似配列或いはプローブが第２の非相補的標的配列とハイブリダイ
ズしない。
【００４２】 ポリヌクレオチド配列についての用語「パーセントの同一性」又は「％の同一
性」とは、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされる、２つ以上
のポリヌクレオチド配列間の一致する残基の百分率のことである。このようなア
ルゴリズムは、標準化され再現できる方法で、２つの配列間のアラインメントを
最適化するべく、配列にギャップを挿入して、より意味をもつ２つの配列間の比
較を行うことができる。
【００４３】 ポリヌクレオチド配列間の同一性のパーセントは、MEGALIGN version 3.12e配
列アラインメントプログラムに組込まれるCLUSTAL Vアルゴリズムのデフォルト
パラメータを用いて決定可能である。このプログラムはLASERGENEソフトウェア
パッケージの一部であり、分子生物学分析プログラム一式（DNASTAR, Madison W
I）である。このCLUSTAL Vは、Higgins, D.G. 及び P.M. Sharp (1989) CABIOS
5:151-153、Higgins, D.G. 他 (1992) CABIOS 8:189-191に記載されている。ポ
リヌクレオチド配列の対のアライメントの場合、デフォルトパラメーターは、Kt
uple=2、gap penalty=5、window=4、「diagonals saved」=4と設定する。「重み
付けされた」残基重み付け表が、デフォルトとして選択された。同一性のパーセ
ントは、アラインメントされたポリヌクレオチド配列の対の「類似性のパーセン
ト」としてCLUSTAL Vによって報告される。
【００４４】 別法では、一般に用いられ、無料で入手可能な配列比較アルゴリズム一式が、
NCBI、Bethesda、MD、及びインターネット（http://WWW.ncbi.nlm.nih.gov/BLAS
T/）などから入手できるNational Center for Biotechnology Information (NCB
I) Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul, S.F. 他 (1990) J
. Mol. Biol. 215:403-410)によって得られる。このBLASTソフトウェア一式には
、既知のポリヌクレオチド配列と様々なデータベースの別のポリヌクレオチド配
列とのアラインメントに用いられる「blastn」を含む、様々な配列分析プログラ
ムが含まれる。「BLAST 2 Sequences」と呼ばれるツールが入手可能であり、２
つのヌクレオチド配列の対を直接比較するために用いられる。「BLAST 2 Sequen
ces」は、http://WWW.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/b12.htmlにアクセスして、対話形
式で利用ができる。「BLAST 2 Sequences」ツールは、blastn 及び blastp（以
下に記載）の両方に用いることができる。BLASTプログラムは、一般的には、デ
フォルトを設定するギャップ及び他のパラメーターと共に用いられる。例えば、
２つのヌクレオチド配列を比較する場合、ある者は、デフォルトパラメータに設
定された「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.12 (April-21-2000)でblast
nを使用するであろう。そのようなデフォルトパラメータは、例えば、以下のよ
うにする。 Matrix: BLOSUM62 Reward for match: 1 Penalty for mismatch: -2 Open Gap: 5 及び Extension Gap: 2 penalties Gap x drop-off: 50 Expect: 10 Word Size: 11 Filter: on 同一性のパーセントは、例えば、特定の配列番号で決められた、所定の配列の
全長に対して測定してもよいし、それより短い長さに対して、例えば、ある大き
な所定の配列から得られた断片、例えば、連続する少なくとも、２０または３０
、４０、５０、７０、１００、２００のヌクレオチドの断片の長さに対して測定
してもよい。このような長さは単なる例であり、配列表及び表、図面を含む明細
書に記載の配列の任意の長さの断片を用いて、同一性のパーセントが測定される
長さを示すことができる。
【００４５】 高い同一性を示さない核酸配列でも、遺伝子コードが縮重するため、類似のア
ミノ酸配列をコードし得る。縮重を利用して核酸配列を変え、それぞれが実質的
に同じタンパク質をコードする多数の核酸配列を作ることができる。
【００４６】 ポリペプチド配列に用いられる用語「同一性のパーセント」又は「同一性の％
」とは、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされる２つ以上のポ
リペプチド配列間の一致する残基の百分率のことである。ポリペプチド配列アラ
インメントの方法は周知である。アラインメント方法の中には、保存的なアミノ
酸置換を考慮したものもある。詳細に上述したこのような保存的な置換は、一般
に、置換部位の電荷や疎水性が保存され、ポリペプチドの構造（従って機能も）
が保存される。
【００４７】 ポリペプチド配列間の同一性のパーセントは、MEGALIGN バージョン3.12e配列
アラインメントプログラム（上記）に組込まれるCLUSTAL Vアルゴリズムのデフ
ォルトパラメータを用いて決定可能である。CLUSTAL Vを用いる対方式のポリぺ
プチド配列のアライメントの場合、デフォルトパラメーターは、Ktuple=1、gap
penalty=3、window=5、及び「diagonals saved」=5と設定する。PAM250マトリク
スが、デフォルトの残基重み付け表として選択される。ポリヌクレオチドアライ
ンメントと同様に、アラインメントされたポリペプチド配列の対の同一性のパー
セントは、「類似性のパーセント」としてCLUSTAL Vによって報告される。
【００４８】 別法では、NCBI BLASTソフトウェア一式が用いられる。例えば、２つのポリペ
プチド配列を対で比較をする場合、ある者は、デフォルトパラメータで設定され
た「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.12 (April-21-2000)でblastpを使
用するであろう。そのようなデフォルトパラメータは、例えば、以下のようにす
る。 Matrix: BLOSUM62 Open Gap: 11 及び Extension Gap: 1 penalties Gap x drop-off: 50 Expect: 10 Word Size: 3 Filter: on 同一性のパーセントは、例えば、特定の配列番号で決められた、所定のポリペ
プチド配列の全長に対して測定してもよいし、それより短い長さに対して、例え
ば、ある大きな所定のポリペプチド配列から得られた断片、例えば、連続する少
なくとも１５、２０または３０、４０、５０、７０、１５０の残基の断片の長さ
に対して測定してもよい。このような長さは単なる例であり、配列表及び表、図
面を含む明細書に記載の配列の任意の長さの断片を用いて、同一性のパーセント
が測定される長さを示すことができる。
【００４９】 「ヒト人工染色体（HAC）」は、約６kb（キロベース）〜１０MbのサイズのDNA
配列を含み得り、安定した有糸分裂染色体の分離及び維持に必要な全ての要素を
含む直鎖状の小染色体である。
【００５０】 用語「ヒト化抗体」は、もとの結合能力を保持しつつよりヒトの抗体に似せる
ために、非抗原結合領域のアミノ酸配列が変えられた抗体分子を指す。
【００５１】 「ハイブリダイゼーション」とは、所定のハイブリダイゼーション条件の下で
、ある一本鎖ポリヌクレオチドがある相補的な一本鎖と塩基対を形成するアニー
リングのプロセスである。特異的なハイブリダイゼーションとは、２つの核酸配
列が高い同一性を有することを意味する。アニーリングが許容される条件の下で
、特異的なハイブリダイゼーション複合体が形成され、洗浄過程の後もハイブリ
ダイズしたままである。洗浄過程は、ハイブリダイゼーションプロセスの厳密性
即ちストリンジェント（stringency）の決定において特に重要であり、よりスト
リンジェントな条件では、非特異的な結合、即ち完全には一致しない核酸鎖間の
対の結合が減少する。核酸配列間のアニーリングが許容される条件は、当業者に
よって日常的に決定され、ハイブリダイゼーションの間は一定であるが、洗浄過
程は、目的のストリンジェントにするためにその最中に条件の変更が可能であり
、ハイブリダイゼーション特異性が得られる。アニーリングが許容される条件は
、例えば、温度が６８℃で、約６×SSC、約１％（w/v）のSDS、並びに約１００
μｇ／ｍｌのせん断して変性したサケ精子DNAが含まれる。
【００５２】 一般に、ハイブリダイゼーションのストリンジェントは、洗浄過程を行う温度
で部分的に表すことができる。この洗浄温度は通常、所定のイオン強度とｐＨに
おける特定の配列の熱融点（Tm）より約５〜２０℃低く選択される。このTmは、
（所定のイオン強度とｐＨの下）標的の配列の５０％が完全に一致するプローブ
とハイブリダイズする温度である。Tmを計算する式及び核酸のハイブリダイゼー
ションの条件は、周知であり、Sambrook, J. 他による, 1989, Molecular Cloni ng: A Laboratory Manual , 第2版の1-3巻, Cold Spring Harbor Press, Plainvi
ew NY; 特に2巻の9章に記載されている。
【００５３】 本発明のポリヌクレオチド間の高いストリンジェントなハイブリダイゼーショ
ンでは、約０．２×SSC及び約１％のSDSの存在の下、約６８℃で１時間の洗浄過
程を含む。別法では、６５℃、６０℃、５５℃、４２℃の温度で行う。SSCの濃
度は、約０．１％のSDSが存在の下、約０．１〜２×SSCの範囲である。通常は、
遮断剤を用いて非特異的なハイブリダイゼーションを阻止する。このような遮断
剤には、例えば、約１００〜２００μｇ／ｍｌの変性したサケ精子DNAが含まれ
る。約３５〜５０％v/vの濃度のホルムアミドなどの有機溶剤が、例えば、RNAと
DNAのハイブリダイゼーションなどの特定の場合に用いることができる。これら
の洗浄条件の有用な改変は、当業者には周知である。特に高いストリンジェント
な条件でのハイブリダイゼーションは、ヌクレオチド間の進化における類似性を
示唆し得る。このような類似性は、それらのヌクレオチド及びコードされたポリ
ペプチドが類似の役割を果たしていることを強く示唆する。
【００５４】 用語「ハイブリダイゼーション複合体」は、相補的な塩基間の水素結合によっ
て、形成された２つの核酸配列の複合体を指す。ハイブリダイゼーション複合体
は溶液中（例えば、Ｃ０ｔまたはＲ０ｔ分析）で形成されるか、或いは溶液中の
１つの核酸配列と固体の支持物（例えば、紙、膜、フィルター、チップ、ピン、
或いはスライドガラス、または細胞及びその核酸を固定する任意の適当な基板）
に固定されたもう一つの核酸配列とで形成され得る。
【００５５】 用語「挿入」或いは「付加」は、１個以上のアミノ酸残基或いはヌクレオチド
がそれぞれ追加されるアミノ酸配列或いは核酸配列の変化を指す。
【００５６】 「免疫応答」は、炎症性疾患及び外傷、免疫異常、感染症、遺伝病などに関連
する症状を指す。これらの症状は、細胞系及び全身防衛系に影響を及ぼすサイト
カイン及びケモカイン、別の情報伝達分子などの様々な因子の発現という特徴を
もつ。
【００５７】 用語「マイクロアレイ」は、基板上に配列されたそれぞれ異なったポリヌクレ
オチドの配列を指す。
【００５８】 マイクロアレイの文脈に用いられる用語「要素」或いは「アレイ要素」は、基
板の表面に配列されたハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドを指す。
【００５９】 用語「変調」は、HSPDE10Aの活性の変化を指す。例えば、変調によって、HSPD
E10Aのタンパク質活性、或いは結合特性、またはその他の生物学的特性、機能的
特性或いは免疫学的特性の変化が起こる。
【００６０】 用語「核酸」或いは「核酸配列」は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポ
リヌクレオチド、或いはそれらの断片を指す。また、一本鎖若しくは二本鎖であ
って、センス鎖或いはアンチセンス鎖であるゲノム起源若しくは合成起源のＤＮ
Ａ或いはＲＮＡ、ペプチド核酸（PNA）、任意のＤＮＡ様物質、及びＲＮＡ様物
質を指す。
【００６１】 「機能的に結合した」は、第１の核酸配列と第２の核酸配列が機能的な関係に
ある状態を指す。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を
与える場合、そのプロモーターはそのコード配列に機能的に結合している。一般
に、機能的に結合したDNA配列は、同じ読み枠内で２つのタンパク質をコードす
る領域が結合する必要がある場合は、非常に近接或いは連続する。
【００６２】 「ペプチド核酸（PNA）」は、末端がリシンで終わるアミノ酸残基のペプチド
骨格に結合した、少なくとも約５ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドを含
む、アンチセンス分子又は抗遺伝子剤を指す。この末端のリシンにより、この組
成物が溶解性となる。PNAは、相補的な一本鎖DNAやRNAに優先的に結合して転写
物の伸長を止め、ポリエチレングリコール化して細胞における寿命を延ばし得る
。
【００６３】 「プローブ」とは、同一配列或いはアレル核酸配列、関連する核酸配列の検出
に用いる、HSPDE10Aやそれらの相補配列、またはそれらの断片をコードする核酸
配列のことである。プローブは、検出可能な標識またはレポーター分子が結合さ
れ単離されたオリゴヌクレオチドやポリヌクレオチドである。典型的な標識には
、放射性アイソトープ及びリガンド、化学発光試薬、酵素がある。「プライマー
」とは、相補的な塩基対を形成して標的のポリヌクレオチドにアニーリング可能
な、通常はDNAオリゴヌクレオチドである短い核酸である。プライマーがポリヌ
クレオチドにアニーリングした後、あるDNAポリメラーゼ酵素によって、標的のD
NA一本鎖に沿って延長される。プライマーの組は、例えば、PCR法における核酸
配列の増幅（及び同定）に用いることができる。
【００６４】 本発明に用いられるプローブ及びプライマーは、既知の配列の少なくとも１５
の連続するヌクレオチドを含む。特異性を高めるために、より長いプローブ及び
プライマーが用いることも可能である。例えば、開示した核酸配列の連続する少
なくとも２０または２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００
、１５０のヌクレオチドを含む。プローブ及びプライマーは、上記した例より相
当長いものも用いることができ、本明細書の表及び図面、配列表に示された任意
の長さのヌクレオチドも用いることができることを理解されたい。
【００６５】 プローブ及びプライマーの準備及び使用方法については、例えば、Sambrook,
J.他による、1989年、名称「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」、第2
版の1-3巻(Cold Spring Harbor Press, Plainview NY)、またはAusubel, F.M.
他による、1987年、名称「Current Protocols in Molecular Biology」(Greene
Pubi. Assoc. & Wiley-Intersciences, New York NY)、並びに Innis他による、
1990年、名称「PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications」(Acade
mic Press, San Diego CA.)を参照されたい。PCR用のプライマーの組は、例えば
、Primer (Version 0.5, 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research
, Cambridge MA)などのそのような目的のためのコンピュータプログラムを用い
て、ある既知の配列から引き出すことができる。
【００６６】 プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドは、当分野で周知のプライマー選
択用のコンピュータプログラムで選択される。例えば、OLIGO 4.06ソフトウェア
は、それぞれが最大１００ヌクレオチドまでのPCR用のプライマーの対の選択、
及び３２，０００塩基までの入力ポリヌクレオチド配列から最大５，０００ヌク
レオチドまでの大きなポリヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドの分析に有用で
ある。類似のプライマー選択用プログラムには、能力を拡大する追加の機能が含
まれている。例えば、PrimOUプライマー選択プログラム（Genome Center at Uni
versity of Texas South West Medical Center, Dallas TXより入手可能）は、
メガベース配列から特定のプライマーを選択できるため、ゲノムワイドスコープ
（genome-wide scope）におけるプライマーの設計に有用である。Primer3プライ
マー選択プログラム（Whitehead Institute/MIT Center for Genome Research,
Cambridge MA1より入手可能）によって、ユーザーは、プライマー結合部位とし
て避けたい配列を指定できる「非プライミングライブラリ（mispriming libaray
）」を入力できる。また、Primer3は、特にマイクロアレイのオリゴヌクレオチ
ドの選択に有用である（後の方の２つのプライマー選択プログラムのソースコー
ドは、それぞれのソースから得ることができ、ユーザーのニーズを満たすように
変更することもできる）。PrimerGenプログラム（UK Human Genome Mapping Pro
ject Resource Centre, Cambridge UK より入手可能）は、多数の配列アライン
メントに基づいてプライマーを設計するため、アラインメントされた核酸配列の
最も保存された領域或いは最も保存されていない領域のどちらかとハイブリダイ
ズするプライマーを選択することができる。従って、このプログラムは、固有及
び保存されたオリゴヌクレオチドやポリヌクレオチドの断片の同定に有用である
。上記した任意の選択方法で同定されたオリゴヌクレオチドやポリヌクレオチド
の断片は、例えば、PCR法やシークエンシングプライマー、マイクロアレイ要素
、或いはサンプルの核酸の完全或いは部分的に相補的なポリヌクレオチドを同定
する特定のプローブなどの、ハイブリダイゼーション技術に有用である。オリゴ
ヌクレオチドの選択方法は、上記した方法に制限されるものではない。
【００６７】 本明細書における「組換え核酸」は天然の配列ではなく、２つ以上の配列の離
れたセグメントを人工的に組み合わせた配列である。この人工の組み合せは、化
学合成によって作られる場合も多いが、前出のSambrook に記載されたような遺
伝子工学の技術を用いて核酸の離れたセグメントを人工的に操作する方がより一
般的である。この「組換え核酸」には、単に核酸の一部の追加または置換、欠失
によって変更された核酸も含む。組換え核酸は、あるプロモーター配列に機能的
に結合した核酸配列を含む場合もある。このような組換え核酸は、例えば、ある
細胞を形質転換するのに用いられるベクターの一部であり得る。
【００６８】 別法では、このような組換え核酸は、この組換え核酸を発現する哺乳動物のワ
クチン接種に用いると、その哺乳動物の防衛的な免疫応答を誘発する、ワクシニ
アウイルスに基づいたウイルスベクターの一部であり得る。
【００６９】 用語「サンプル」は、その最も広い意味で用いられている。HSPDE10Aをコード
する核酸若しくはその断片、HSPDE10A自体を含むと推定されるサンプルには、体
液と、細胞からの抽出物や細胞から単離された染色体や細胞内小器官、膜と、細
胞と、溶液中に存在する又は基板に固定されたゲノムDNA、RNA、cDNAと、組織又
は組織プリント等も含まれ得る。
【００７０】 用語「特異的結合」及び「特異的に結合する」は、タンパク質若しくはペプチ
ドと、アゴニスト、抗体、アンタゴニスト、小分子、若しくは任意の天然若しく
は合成の結合組成物との間の相互作用を指す。この相互作用は、結合する分子に
よって認識される、例えば、抗原決定基つまりエピトープなどのタンパク質の特
定の構造の存在によって左右される。例えば、抗体がエピトープ「Ａ」に対して
特異的である場合、結合していない標識した「Ａ」及び抗体を含む反応液に、エ
ピトープＡを含むポリペプチド或いは結合していない無標識の「Ａ」が存在する
と、抗体と結合する標識Ａの量が減少する。
【００７１】 用語「実質的に精製された」は、自然の環境から取り除かれてから、単離或い
は分離された核酸配列或いはアミノ酸配列であって、自然に結合している組成物
が少なくとも約６０％以上除去されたものであり、好ましくは約７５％以上の除
去、最も好ましいのは約９０％以上除去されたものを指す。
【００７２】 「置換」とは、一つ以上のアミノ酸またはヌクレオチドをそれぞれ別のアミノ
酸またはヌクレオチドに置き換えることである。
【００７３】 用語「基板」は、任意の好適な固体或いは半固体の支持物を指し、膜及びフィ
ルター、チップ、スライド、ウエハ、ファイバー、磁気または非磁気ビード、ゲ
ル、チューブ、プレート、ポリマー、微小粒子、毛細管が含まれる。この基板に
は、壁または塹壕、ピン、チャンネル、細孔などの様々な表面形態があり、そこ
にポリヌクレオチドやポリペプチドが結合する。
【００７４】 「形質転換」とは、外来DNAが入り込み受容体細胞を変化させるプロセスのこ
とである。形質転換は、当分野で周知の種々の方法により、自然或いは人工の条
件の下で起こり得り、原核宿主細胞若しくは真核宿主細胞の中に外来核酸配列を
挿入する任意の周知の方法によって行うことができる。この形質転換の方法は、
形質転換される宿主細胞のタイプによって選択される。この方法には、ウイルス
感染、電気穿孔法（エレクトロポレーション）、リポフェクション、及び微粒子
照射が含まれるが、これらに限定されるものではない。「形質転換された」細胞
には、導入されたDNAが自律的に複製するプラスミドとして或いは宿主染色体の
一部として複製可能である安定的に形質転換された細胞が含まれる。さらに、限
られた時間に一時的に導入DNA若しくは導入RNAを発現する細胞も含まれる。
【００７５】 特定の核酸配列の「変異配列」とは、デフォルトパラメーター設定の「BLAST
2 Sequences」ツールVersion 2.0.9 (May-07-1999)を用いるblastnによって、あ
る核酸配列のある長さに対する該特定の核酸配列の同一性が、少なくとも４０％
と決定された核酸配列のことである。このような核酸の対は、ある長さにおいて
、例えば、少なくとも５０％または６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、
９５％、９８％、或いはそれ以上の同一性を示し得る。ある変異配列は、例えば
、「アレル」変異配列（上述）または「スプライス」変異配列、「種」変異配列
、「多型」変異配列と表すことができる。スプライス変異配列は基準分子と同一
性が極めて高い可能性があるが、mRNAプロセッシング中のエキソンの択一的スプ
ライシングによってポリヌクレオチドの数が多くなったり、少なくなったりする
。対応するポリペプチドは、基準分子に存在する追加の機能ドメインを有したり
、基準分子に存在するドメインが欠落したりし得る。種変異配列は、種によって
異なるポリヌクレオチド配列である。得られるポリペプチドは、互いに高いアミ
ノ酸同一性を有する。多型変異配列は、所定の種と種における特定の遺伝子のポ
リヌクレオチド配列が異なる。多型変異配列はまた、ポリヌクレオチド配列の１
つのヌクレオチドが異なる「１ヌクレオチド多型」（SNP）も含み得る。SNPの存
在は、例えば、或る集団（population）、病態、病態の特徴を表し得る。
【００７６】 特定のポリペプチド配列の「変異体」とは、デフォルトパラメーター設定の「
BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.9 (May-07-1999)を用いるblastpによっ
て、ある核酸配列のある長さに対する該特定のポリペプチド配列の同一性が、少
なくとも４０％と決定された核酸配列のことである。このようなポリペプチドの
対は、ある長さにおいて、例えば、少なくとも５０％または６０％、７０％、８
０％、８５％、９０％、９５％、９８％、或いはそれ以上の同一性を示し得る。
【００７７】 （発明） 本発明は、新規のヒト・サイクリックヌクレオチド・ホスホジエステラーゼ（
HSPDE10A）及びHSPDE10Aをコードするポリヌクレオチドの発見に基づき、癌及び
免疫異常症の診断、治療、及び予防におけるそれらの組成物の使用に関する。
【００７８】 本発明のHSPDE10A-1をコードする核酸は、LIFESEQデータベース（Incyte Phar
maceuticals, Palo Alto CA）に対する問い合わせ配列としてヒトPDE5（GI 3355
606）を用いてBLAST分析によって、前立腺cDNAライブラリ（PROSTUT04）のイン
サイトクローン番号826776で同定された。HSPDE10Aの完全長のcDNA配列は、ハイ
ブリダイゼーションプローブとしてインサイトクローン番号826776の完全なcDNA
を用いてヒト骨格筋ライブラリから得られた。
【００７９】 一実施例では、本発明は、SEQ ID NO:1のアミノ酸配列を含むポリペプチドを
提供する。図１Ａ−図１Ｅに示されているように、HSPDE10A-1はアミノ酸４９０
個の長さであり、SEQ ID NO:1の配列N88RLDGKPFDDADの推定上の環状GMP結合モチ
ーフ、及びSEQ ID NO:1のH260DLDHRGTNNにおけるPDEシグネチャモチーフを有す
る。図３Ａ−図３Ｅに示されているように、HSPDE10A-1は、ヒトPDE5であるHSPD
E5A1（GI 3355606; SEQ ID NO:5）と化学的及び構造的類似性を有する。特に、H
SPDE10A1とHSPDE5A1との同一性は４２％である。全てのPDEに見られる約２７０
個のアミノ酸からなる触媒ドメインは、HSPDE10A1の概ねF196残基からR458残基
の範囲に存在し、この領域におけるHSPDE5A1との同一性は５０％である。N88残
基から始まるHSPDE10A1の推定上の環状GMP結合モチーフは、N472残基から始まる
HSPDE5A1の環状GMP結合の縦列反復配列と一致し、H260残基から始まるHSPDE10A1
のPDEシグネチャ配列がHSPDE5A1に保存されている。HSPDE10A1は、他のPDEファ
ミリー1及び2、3、4、6、7、8、9と比較的相同性が低く、２５〜４４％の間であ
る（データは示さない）。SEQ ID NO:3のヌクレオチドの概ね1168から1212まで
の断片は、SEQ ID NO:3の同定、及びSEQ ID NO:3と関連配列とを区別するハイブ
リダイゼーションまたは増幅技術に有用である。
【００８０】 別の実施例では、本発明は、SEQ ID NO:2のアミノ酸配列を含むポリペプチド
を提供する。図２Ａ−図２Ｅに示されているように、HSPDE10A2はアミノ酸３６
７個の長さであり、SEQ ID NO:2のN88RLDGKPFDDADにおける推定上の環状GMP結合
モチーフ、及びSEQ ID NO:2のH260DLDHRGTNNにおけるPDEシグネチャモチーフを
含む。図３Ａ−図３Ｅに示されているように、HSPDE10A2は、M1残基からE338残
基の範囲ではHSPDE10A1と同一であるが、分子のE339残基からY367残基のC末端部
分では異なる。HSPDE10A2はまた、HSPDE5A1と４０％の同一性を有する。SEQ ID
NO:4のヌクレオチドの概ね1183から1227までの断片は、SEQ ID NO:4の同定、及
びSEQ ID NO:4と関連配列とを区別するハイブリダイゼーションまたは増幅技術
に有用である。
【００８１】 HSPDE10A1の完全長のアミノ酸配列をコードするcDNA作成物は、バキュロウイ
ルス移入ベクターpFASTBACにクローニングされてSf9細胞で発現し、この酵素は
酵素アッセイのためにこれらの細胞から部分的に精製される。図４Ａ及び図４Ｂ
はそれぞれ、環状AMP（図４Ａ）及び環状GMP（図４Ｂ）を基質とした場合のHSPD
E10A1の酵素活性の変化を示す。双方の基質は類似の速度で加水分解され（環状A
MPのVmaxは0.23マイクロモル/分/μｌ 酵素、環状GMPのVmaxは0.21マイクロモル
/分/μｌ 酵素）、HSPDE10A1に対する親和性も類似している（環状AMPに対するK m は1.04μM、環状GMPに対するKmは0.52μM）。これらのデータから、HSPDE10A1
は、生理学的に適正な濃度において環状AMP及び環状GMPの双方を加水分解できる
PDEである。基質に環状GMPを用いるHSPDE10A1の活性に対する既知の種々のPDE阻
害剤の効果が表１に示されている。HSPDE10A1は、PDE3に選択的なミルリノン及
びPDE4に選択的なロリプラムの双方に対して比較的感受性が低く、ミルリノンの
IC50（５０％抑制濃度）の値は200μMを超え、ロリプラムのIC50の値は160μMで
ある。非選択的PDE阻害剤IBMX（3-isobutyl-1-metlylxanthine）はHSPDE10A1を
阻害した。この場合のIC50の値は40μMであり、IBMX非感受性PDE8を除けば、他
のPDEに見られる範囲内である。PDE5及びPDE6に選択的な環状GMP PDE特異的阻害
剤と呼ばれるザプリナストは、IC50の値が8μM（PDE5及び6より10〜40倍高い）
であってHSPDE10A1に対して中程度に阻害する。
【００８２】 HSPDE10A1と他の代表的なPDEファミリーとの触媒ドメインにおける類似性の程
度（２５〜５０％）は、様々なPDEファミリー間の類似性（約３０％）と一致す
る。更に、HSPDE10A1は、環状AMP及び環状GMP双方への特性、及び既知のPDE阻害
剤による阻害パターンから既知の他のファミリーと区別できる。従って、HSPDE1
0A1は、サイクリック・ヌクレオチド・ホスホジエステラーゼの新メンバーPDE10
と考えられる。
【００８３】 膜系ノーザン分析（図５Ａ及び図５Ｂ）によって、骨格筋組織及び前立腺組織
に約７.５kbの主転写物として発現したHSPDE10Aが示されている。また、前立腺
にのみ、約３.０kbの追加のmRNAが検出された。顕著でない約１.５kbの転写物が
、精巣及び筋骨格で発現した。LIFESEQデータベース（Incyte Pharmaceuticals
）を用いた電子式ノーザン分析によって、前立腺癌組織におけるHSPDE10Aの発現
が示された。
【００８４】 標識の付けられていないcDNA作成物を含むバキュロウイルスが導入されたSf9
細胞の細胞可溶化物におけるHSPDE10A1の発現が図６に示されている。約５６kDa
のポリペプチドが、Coomassie青色染色（未処置HSPDE10A1、図６）、或いは抗FL
AG抗体を用いるFLAG標識HSPDE10A1のウェスタン免疫ブロット法の何れかによっ
て検出可能である。
【００８５】 本発明はまた、HSPDE10Aの変異体も含む。好適なHSPDE10Aの変異体は、HSPDE1
0Aの機能的或いは構造的特徴の少なくともどちらか一方を有し、かつHSPDE10Aア
ミノ酸配列に対して少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくと
も約９０％のアミノ酸配列同一性、更には少なくとも９５％のアミノ酸配列同一
性を有する。
【００８６】 本発明はまた、HSPDE10Aをコードするポリヌクレオチドを提供する。特定の実
施例において、本発明は、HSPDE10AをコードするSEQ ID NO:3−4からなる一群か
ら選択された配列を含むポリヌクレオチド配列を提供する。
【００８７】 本発明はまた、HSPDE10Aをコードするポリヌクレオチド配列の変異配列を含む
。詳細には、このようなポリヌクレオチド配列の変異配列は、HSPDE10Aをコード
するポリヌクレオチド配列と少なくとも７０％のポリヌクレオチド配列同一性、
或いは少なくとも８５％のポリヌクレオチド配列同一性、更には少なくとも９５
％ものポリヌクレオチド配列同一性を有する。本発明の特定の実施形態は、SEQ
ID NO:3−4からなる一群から選択された核酸配列と少なくとも７０％のポリヌク
レオチド配列同一性、或いは少なくとも８５％のポリヌクレオチド配列同一性、
更には少なくとも９５％ものポリヌクレオチド配列同一性を有するSEQ ID NO:3
−4からなる一群から選択された配列を含むポリヌクレオチド配列の変異配列を
提供する。上記したポリヌクレオチド変異配列は何れも、HSPDE10Aの機能的或い
は構造的特徴の少なくとも１つを有するアミノ酸配列をコードする。
【００８８】 遺伝暗号の縮重により作り出され得るHSPDE10Aをコードする種々のポリヌクレ
オチド配列には、既知の自然発生する任意の遺伝子のポリヌクレオチド配列と最
小の類似性しか有しないものも含まれることを、当業者は理解するであろう。し
たがって本発明には、可能なコドン選択に基づいた組み合わせの選択によって作
り出され得る可能なポリヌクレオチド配列の変異の全てが含まれ得る。これらの
組み合わせは、自然発生のHSPDE10Aのポリヌクレオチド配列に適用される標準的
なトリプレット遺伝暗号を基に作られ、全ての変異が明確に開示されていると考
慮する。
【００８９】 HSPDE10Aをコードするヌクレオチド配列及びその変異配列は、好適に選択され
たストリンジェントな条件の下で、自然発生のHSPDE10Aのヌクレオチドとハイブ
リダイズ可能なことが望ましいが、非自然発生のコドンを含めるなどの実質的に
異なったコドンの使用を有するHSPDE10A或いはその誘導体をコードするヌクレオ
チド配列を作り出すことは有益となり得る。特定のコドンが宿主によって利用さ
れる頻度に基づいてコドンを選択して、ペプチドの発現が特定の真核細胞又は原
核宿主に発生する割合を高めることが可能である。コードされたアミノ酸配列を
変えないで、HSPDE10A及びその誘導体をコードするヌクレオチド配列を実質的に
変更する別の理由は、自然発生の配列から作られる転写物より例えば長い半減期
など好ましい特性を備えるRNA転写物を作ることにある。
【００９０】 本発明はまた、HSPDE10A及びその誘導体をコードするDNA配列又はそれらの断
片を完全に合成化学によって作り出すことも含む。作製後にこの合成配列を、当
分野で良く知られた試薬を用いて、種々の入手可能な発現ベクター及び細胞系の
何れの中にも挿入可能である。更に、合成化学を用いて、HSPDE10Aまたはその任
意の断片をコードする配列の中に突然変異を導入することも可能である。
【００９１】 更に本発明には、種々のストリンジェント条件の下で、請求項に記載されたポ
リヌクレオチド配列、特に、SEQ ID NO:3−4及びそれらの断片とハイブリダイズ
可能なポリヌクレオチド配列が含まれる(例えば、Wahl, G.M.及びS.L. Berger (
1987) Methods Enzymol. 152:399-407; and Kimmel. A.R. (1987) Methods Enzy
mol. 152:507-511.を参照)。アニーリング及び洗浄条件を含むハイブリダイゼー
ションの条件は、「定義」に記載されている。
【００９２】 当分野で周知のDNAのシークエンシング方法を用いて、本発明の何れの実施例
も実行可能である。この方法には、例えばDNAポリメラーゼIのクレノウ断片、SE
QUENASE（US Biochemical, Cleveland OH）、Taqポリメラーゼ（Perkin Elmer）
、熱安定性T7ポリメラーゼ（Amersham, Pharmacia Biotech Piscataway NJ）、
或いはELONGASE増幅システム(Life Technologies, Gaithersburg MD)にみられる
ような校正エキソヌクレアーゼとポリメラーゼとの組み合わせなどの酵素が用い
られる。好ましくは、MICROLAB2200液体転移システム（Hamilton, Reno, NV）、
PTC200 Thermal Cycler200（MJ Research, Watertown MA）及びABI CATALYST 80
0 (Perkin-Elmer) などの装置を用いて配列の準備を自動化する。次に、ABI 373
或いは377 DNAシークエンシングシステム(Perkin-Elmer)、MEGABACE 1000 DNAシ
ークエンシングシステム(Molecular Dynamics. Sunnyvale CA)または当分野で周
知の他の方法を用いてシークエンシングを行う。得られた配列を当分野で周知の
様々なアルゴリズムを用いて分析する(例えば、Ausubel, F.M. (1997) Short Pr otocols in Molecular Biology , John Wiley & Sons, New York NY, unit 7.7;
Meyers, R.A. (1995) Molecular Biology and Biotechnology, Wiley VCH, New
York NY, pp. 856-853.を参照)。
【００９３】 当分野で周知のPCR法をベースにした種々の方法で、部分的なヌクレオチド配
列を利用して、HSPDE10Aをコードする核酸配列を伸長し、プロモーターや調節要
素などの上流にある配列を検出する。例えば制限部位PCR法を利用する１つの方
法では、一般的なプライマー及びネスト化プライマーを用いてクローニングベク
ター内のゲノムDNAから未知の配列を増幅する（例えば、Sarkar, G. (1993) PCR
Methods Applic 2:318-322を参照）。逆PCR法を用いる別法では、広範な方向に
伸長して環状化した鋳型から未知の配列を増幅するプライマーを用いる。この鋳
型は、既知のゲノム遺伝子座及びその周辺の配列を含む制限断片に由来する（例
えば、Triglia, T.等（1988）Nucleic Acids Res 16:8186を参照）。キャプチャ
PCR法を用いる第３の方法は、ヒト及び酵母菌人工染色体DNAの既知の配列に隣接
するDNA断片のPCR増幅を含む（例えば、Lagerstrom, M.他（1991）PCR Methods
Applic 1:111-119を参照）。この方法では、多数の制限酵素による消化及びライ
ゲ−ションを用いて、PCRを行う前に未知の配列の領域の中に組換え二本鎖配列
を挿入することが可能である。また、当分野で周知の別の方法を用いて未知の配
列を得ることも可能である。(例えば、Parker, J.D. 他 (1991)Nucleic Acids R
es. 19:3055-3060を参照)。更に、PCR、ネスト化プライマー、PROMOTERFINDERラ
イブラリ（Clontech, Palo Alto CA）を用いれば、ゲノムDNA内の歩行が可能で
ある。この方法ではライブラリをスクリーニングする必要がなく、イントロン／
エキソン接合部を探すのに有用である。全てのPCR法をベースにした方法では、
プライマーは、市販のOLIGO 4.06 Primer Analysis software（National Biosci
ences, Plymouth MN）或いは別の好適なプログラムなどを用いて、長さが２２〜
３０ヌクレオチド、ＧＣ含有率が５０％以上、約６８℃〜７２℃の温度で鋳型に
対してアニーリングするよう設計される。
【００９４】 完全な長さのcDNAのスクリーニングの際は、大きなcDNAを含むようにサイズが
選択されたライブラリを用いるのが好ましい。更に、オリゴd(T)ライブラリが完
全な長さのcDNAを産生できない場合は、遺伝子の５'領域を有する配列を含むも
のが多いランダムに初回抗原刺激を受けたライブラリが有用である。ゲノムライ
ブラリは、５'非転写調節領域への配列の伸長に有用であろう。
【００９５】 市販のキャピラリー電気泳動システムを用いて、シークエンシングまたはPCR
産物のヌクレオチド配列のサイズの分析、または確認が可能である。詳しくは、
キャピラリーシークエンシングには、電気泳動による分離のための流動性ポリマ
ー、及び４つの異なったヌクレオチドに特異的なレーザーで活性化される蛍光色
素、放出された波長の検出に利用するCCDカメラを使用することが可能である。
出力／光強度は、適切なソフトウエア（例えば、GENOTYPER及びSEQUENCE NAVIGA
TOR、Perkin-Elmer）を用いて電気信号に変換され、サンプルのローディングか
らコンピュータ分析までのプロセス及び電子データ表示がコンピュータ制御可能
である。キャピラリー電気泳動法は、特定のサンプルに少量しか存在しない場合
もあるDNAの小片のシークエンシングに特に適している。
【００９６】 本発明の別の実施例では、HSPDE10Aをコードするポリヌクレオチド配列または
その断片を組換えDNA分子に用いて、適切な宿主細胞内にHSPDE10A、その断片ま
たは機能的等価物を発現させることが可能である。遺伝暗号固有の宿重により、
実質的に同じ或いは機能的に等価のアミノ酸配列をコードする別のDNA配列が作
られ得り、これらの配列をHSPDE10Aのクローン化及び発現に利用可能である。
【００９７】 種々の目的でHSPDE10Aをコードする配列を変えるために、当分野で一般的に知
られている方法を用いて、本発明のヌクレオチド配列を組換えることができる。
この目的には、遺伝子産物のクローン化、プロセッシング及び／または発現の調
節が含まれるが、これらに限定されるものではない。ランダムな断片によるDNA
の混合や遺伝子断片と合成オリゴヌクレオチドのPCR再組み立てを用いて、ヌク
レオチド配列の組換えが可能である。例えば、オリゴヌクレオチドの仲介による
定方向突然変異誘発を利用して、新しい制限部位を生成する突然変異の導入、グ
リコシル化パターンの変更、コドン優先の変更、スプライスバリアントの生成等
が可能である。
【００９８】 別の実施例によれば、HSPDE10Aをコードする配列は、当分野で周知の化学的方
法を用いて、全体或いは一部が合成可能である（例えば、Caruthers. M.H.等（1
980）Nucl. Acids Res. Symp. Ser 7:215-223; 及びHorn, T.他（1980）Nucl. A
cids Res. Symp. Ser.225-232を参照）。別法として、化学的方法を用いてHSPDE
10A自体またはその断片を合成することが可能である。例えば、ペプチド合成は
種々の固相技術を用いて実行可能である（例えば、Roberge, J.Y.等(1995) Scie
nce 269:202-204を参照）。また、合成の自動化は例えばABI 431Aペプチドシン
セサイザ（Perkin Elmer）を用いて達成し得る。更にHSPDE10Aのアミノ酸配列ま
たは任意のその一部は、直接的な合成の際の変更、及び／または化学的方法を用
いた他のタンパク質または任意のその一部からの配列との組み合わせにより、変
異体ポリペプチドを作ることが可能である。
【００９９】 このペプチドは、分離用高速液体クロマトグラフィー(例えば、Chiez, R.M.
及び F.Z. Regnier (1990)Methods Enzymol. 182:392-421を参照)を用いて実質
的に精製可能である。合成されたペプチドの組成は、アミノ酸分析或いはシーク
エンシングにより確認することができる(例えば、Creighton. T. (1983) Protei ns, Structures and Molecular Properties , WH Freeman, New York, NYを参照)
。
【０１００】 生物学的に活性なHSPDE10Aを発現させるために、HSPDE10Aをコードするヌクレ
オチド配列またはその誘導体を好適な発現ベクターに挿入する。この発現ベクタ
ーは、好適な宿主に挿入されたコーディング配列の転写及び翻訳の調節に必要な
要素を含む。これらの要素には、ベクター及びHSPDE10Aをコードするポリヌクレ
オチド配列におけるエンハンサー、構成型及び発現誘導型のプロモーター、５'
及び３'の非翻訳領域などの調節配列が含まれる。このような要素は、その長さ
及び特異性が様々である。特定の開始シグナルによって、HSPDE10Aをコードする
配列のより効果的な翻訳を達成することが可能である。このようなシグナルには
、ＡＴＧ開始コドン及びコザック配列などの近傍の配列が含まれる。HSPDE10Aを
コードする配列及びその開始コドン、上流の調節配列が好適な発現ベクターに挿
入された場合は、更なる転写調節シグナルや翻訳調節シグナルは必要なくなるで
あろう。しかしながら、コーディング配列或いはその断片のみが挿入された場合
は、インフレームのＡＴＧ開始コドンを含む外来性の翻訳調節シグナルが発現ベ
クターに含まれなければならない。外来性の翻訳要素及び開始コドンは、自然及
び合成の様々なものから得ることが可能である。用いられる特定の宿主細胞系に
好適なエンハンサーを含めることで発現の効率を高めることが可能である。(例
えば、Scharf, D. 他 (1994) Results Probl. Cell Differ. 201−18-162.を参
照)。
【０１０１】 当業者に周知の方法を用いて、HSPDE10Aをコードする配列、好適な転写及び翻
訳調節要素を含む発現ベクターを作製することが可能である。これらの方法には
、in vitro組換えDNA技術、合成技術、及びin vivo遺伝子組換え技術が含まれる
。(例えば、 Sambrook, J. 他. (1989) Molecular Cloning. A Laboratory Manu al , Cold Spring Harbor Press, Plainview NY, 4章及び8章, 及び１6-17章; 及
び Ausubel, F.M. 他. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, John
Wiley & Sons, New York NY, ch. 9章及び13章1−4章を参照)。
【０１０２】 種々の発現ベクター／宿主系を利用して、HSPDE10Aをコードする配列の保持及
び発現が可能である。これらには、限定するものではないが、組換えバクテリオ
ファージ、プラスミド、またはコスミドDNA発現ベクターで形質転換された細菌
などの微生物や、酵母菌発現ベクターで形質転換された酵母菌や、ウイルス発現
ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系や、ウイルス発現
ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、CaMV；タバコモザイクウイ
ルス、ＴＭＶ）または細菌発現ベクター（例えば、TiまたはpBR３２２プラスミ
ド）で形質転換された植物細胞系や、動物細胞系などが含まれる。本発明は使用
される宿主細胞によって限定されるものではない。
【０１０３】 細菌系では、多数のクローニングベクター及び発現ベクターが、HSPDE10Aをコ
ードするポリヌクレオチド配列の使用目的に応じて選択可能である。例えば、HS
PDE10Aをコードするポリヌクレオチド配列の日常的なクローニング、サブクロー
ニング、増殖には、PBLUESCRIPT(Stratagene, La Jolla CA)またはpSPORT１プラ
スミド(GIBCO BRL)などの多機能の大腸菌ベクターを用いることができる。ベク
ターの多数のクローニング部位にHSPDE10Aをコードする配列をライゲーションす
るとlacＺ遺伝子が破壊され、組換え分子を含む形質転換された細菌の同定のた
めの比色スクリーニング法が可能となる。更に、これらのベクターを用いて、ク
ローニングされた配列のin vitroでの転写、ジデオキシンスクリーニング、ヘル
パーファージによる一本鎖の救出、入れ子状態の欠失を作り出すことが可能であ
る。(例えば、Van Heeke, G.及びS.M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:55
03-5509.を参照)。例えば、抗体の産生のためなどに多量のHSPDE10Aが必要な場
合は、HSPDE10Aの発現をハイレベルで誘導するベクターが使用できる。例えば、
強力に発現を誘発するT5またはT7バクテリオファージプロモーターを含むベクタ
ーを使用できる。
【０１０４】 HSPDE10Aの発現に酵母の発現系の使用が可能である。α因子やアルコールオキ
シダーゼやPGHプロモーターなどの構成型或いは誘導型のプロモーターを含む多
種のベクターが、酵母菌サッカロミセス−セレビジエまたはPichia pastorisに
使用可能である。更に、このようなベクターは、発現したタンパク質の分泌か細
胞内への保持のどちらかを誘導し、安定した増殖のために宿主ゲノムの中に外来
配列を組み込む。(例えば、上記のAusubel.; 及びBitter, G.A. 他 (1987) Meth
ods Enzymol.153:51-794: Scorer. C. A. 他 (1994) Bio/Technology 121−181-
184.を参照) 植物系もHSPDE10Aの発現に使用可能である。HSPDE10Aをコードする配列の転写
は、例えば、CaMV由来の35S及び19Sプロモーターなどのウイルスプロモーターが
単独で、或いはTMV（Takamatsu, N.等（1987）EMBO J 6:307-311）由来のオメガ
リーダー配列と組み合わせて促進される。これらの作製物は、直接のDNA形質転
換或いは病原体を介したトランスフェクションによって、植物細胞の中に導入可
能である。（例えば、The McGraw Hill Yearbook of Science and Technology（
1992）McGraw Hill NY, pp.191-196を参照）。
【０１０５】 哺乳動物細胞では、多種のウイルスベースの発現系が利用され得る。アデノウ
イルスが発現ベクターとして用いられる場合、後発プロモーター及び３連リーダ
ー配列からなるアデノウイルス転写物／翻訳複合体にHSPDE10Aをコードする配列
を結合し得る。ウイルスのゲノムの非必須のＥ１またはＥ３領域への挿入により
、感染した宿主細胞にHSPDE10Aを発現する生ウイルスを得ることが可能である（
Logan, J.及びShenk, T.（1984）Proc. Natl. Acad. Sci. 81:3655-3659を参照
）。さらに、ラウス肉腫ウイルス（RSV）エンハンサーなどの転写エンハンサー
を用いて、哺乳動物宿主細胞における発現を増大させることが可能である。タン
パク質を高レベルで発現させるために、SV40またはEBVを基にしたベクターを用
いることが可能である。
【０１０６】 ヒト人工染色体（HAC）を用いて、プラスミドで発現しそれに含まれているも
のより大きなDNAの断片を供給可能である。治療のために約６kb〜１０MbのHACs
を作製し、従来の輸送方法（リポソーム、ポリカチオンアミノポリマー、または
ベシクル）で供給する。(例えば、Harrington. J.J. 他 (1997) Nat Genet.15:3
45-355.を参照)。
【０１０７】 哺乳動物系の組換えタンパク質の長期にわたる産生のためには、株化細胞にお
けるHSPDE10Aの安定した発現が望ましい。例えば、発現ベクターを用いて、HSPD
E10Aをコードする配列を株化細胞に形質転換することが可能である。このような
発現ベクターは、ウイルス起源の複製及び／または内在性の発現要素や、同じ或
いは別のベクターの上の選択マーカー遺伝子を含む。ベクターの導入の後、細胞
を選択培地に移す前に、強化培地で約１〜２日の間増殖させる。選択マーカーの
目的は選択的な媒介物に対する抵抗性を与えるとともに、その存在により導入さ
れた配列をうまく発現する細胞の増殖及び回収が可能となる。安定的に形質転換
された細胞の耐性クローンは、その細胞型に好適な組織培養技術を用いて増殖可
能である。
【０１０８】 任意の数の選択系を用いて、形質転換された細胞系を回収することが可能であ
る。選択系には、以下のものに限定はしないが、単純ヘルペスウイルスチミジン
キナーゼ遺伝子及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子が含まれ
、それぞれtk−又はapr−細胞において使用される。(例えば、Wigler, M. 他 (1
977) Cell 11:223-232; 及びLowy, I. 他(1980) Cell 22:817-823を参照)。また
代謝拮抗物質、抗生物質或いは除草剤への耐性を選択のベースとして用いること
ができる。例えばdhfrはメトトレキセートに対する耐性を与え、neoはアミノグ
リコシッドネオマイシン及びG-418に対する耐性を与え、als或いはpatはクロル
スルフロン（cHSPDE10Asulfuron）、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェ
ラーゼ（phosphinotricin acetyltransferase）に対する耐性を与える(例えば、
Wigler, M. 他. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. 77:3567-3570; Colbere-Garap
in, F. 他(1981) J. Mol. Biol. 150:1-14を参照)。さらに選択に利用できる遺
伝子、例えば、代謝のために細胞が必要なものを変えるtrpB及びhisDが文献に記
載されている（例えば、Hartman, S.C.及びR.C. Mulligan（1988）Proc. Natl.
Acad. Sci. 85:8047-51を参照）。アニトシアニン、緑色蛍光タンパク質（GFP；
Clontech）、βグルクロニダーゼ及びその基質GUS，ルシフェラーゼ及びその基
質ルシフェリンなどの可視マーカーが用いられる。緑色蛍光タンパク質（GFP）(
Clontech, Palo Alto, CA)も使用できる。これらのマーカーを用いて、トランス
フォーマントを特定するだけでなく、特定のベクター系に起因する一過性或いは
安定したタンパク質発現を定量することが可能である（例えば、Rhodes, C.A.他
（1995）Methods Mol. Biol. 55:121−791を参照）。
【０１０９】 マーカー遺伝子の発現の存在／不在によって目的の遺伝子の存在が示されても
、その遺伝子の存在及び発現の確認が必要な場合もある。例えば、HSPDE10Aをコ
ードする配列がマーカー遺伝子配列の中に挿入された場合、HSPDE10Aをコードす
る配列を含む形質転換された細胞は、マーカー遺伝子機能の欠落により特定可能
である。または、１つのプロモーターの制御下でマーカー遺伝子がHSPDE10Aをコ
ードする配列と一列に配置することも可能である。誘導または選択に応答したマ
ーカー遺伝子の発現は、通常タンデム遺伝子の発現も示す。
【０１１０】 一般に、HSPDE10Aをコードする核酸配列を含み、HSPDE10Aを発現する宿主細胞
は、当業者に周知の種々の方法を用いて特定することが可能である。これらの方
法には、DNA−DNA或いはDNA−RNAハイブリダイゼーションや、PCR法、核酸或い
はタンパク質の検出及び／または数量化のための膜系、溶液ベース、或いはチッ
プベースの技術を含むタンパク質生物学的試験法または免疫学的アッセイが含ま
れるが、これらに限定されるものではない。
【０１１１】 特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のどちらかを用いるHS
PDE10Aの発現の検出及び計測のための免疫学的な方法は、当分野で周知である。
このような技法には、酵素に結合したイムノソルベントアッセイ（ELISA）、ラ
ジオイムノアッセイ（RIA）、蛍光標示式細胞分取器（FACS）などがある。HSPDE
10A上の２つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いた、２部
位のモノクローナルベースイムノアッセイ（two-site, monoclonal-based immun
oassay）が好ましいが、競合の結合アッセイも用いることもできる。これらのア
ッセイ及びその他のアッセイは、当分野では十分に知られている。(例えば、 Ha
mpton. R. 他.(1990) Serological Methods, a Laboratory Manual. APS Press.
St Paul. MN, Sect. IV; Coligan, J. E. 他Current Protocols in Immunology , Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience, New York. NY; 及びPound
, J.D. (1990) Immunochemical Protocols, Humans Press, Totowa NJ)。
【０１１２】 種々の標識方法及び結合方法が当業者には周知であり、様々な核酸アッセイお
よびアミノ酸アッセイに用いられ得る。HSPDE10Aをコードするポリヌクレオチド
に関連する配列を検出するための、標識されたハイブリダイゼーションプローブ
或いはPCRプローブを生成する方法には、オリゴ標識化、ニックトランスレーシ
ョン、末端標識化、または標識されたヌクレオチドを用いるPCR増幅が含まれる
。別法として、HSPDE10Aをコードする配列、またはその任意の断片をmRNAプロー
ブを生成するためのベクターにクローニングすることも可能である。当分野では
周知であり市販されているこのようなベクターを、T7，T3，またはSP6などの好
適なRNAポリメラーゼ及び標識されたヌクレオチドの追加によって、in vitroで
のRNAプローブの合成に用いることができる。これらの方法は、例えば、Amersha
m Pharmacia Biotech及びPromega（Madison WI）、U.S. Biochemical Corp（Cle
veland OH）が市販する種々のキットを用いて行うことができる。容易な検出の
ために用い得る好適なレポーター分子或いは標識には、基質、コファクター、イ
ンヒビター、磁気粒子、及び放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、色素産生
剤などが含まれる。
【０１１３】 HSPDE10Aをコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、細胞培
地でのこのタンパク質の発現及び回収に好適な条件の下で培養される。形質転換
された細胞から産生されたタンパク質が分泌されるか細胞内に留まるかは、使用
されるその配列及び／またはそのベクターによる。HSPDE10Aをコードするポリヌ
クレオチドを含む発現ベクターは、原核細胞膜及び真核細胞膜を透過するHSPDE1
0Aの分泌を誘導するシグナル配列を含むように設計できることは、当業者には理
解されよう。
【０１１４】 更に、挿入した配列の発現調節能力または発現したタンパク質を所望の形にプ
ロセシングする能力によって宿主細胞株が選択される。このようなポリペプチド
の修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化（
lipidation）、及びアシル化が含まれるが、これらに限定されるものではない。
タンパク質の「prepro」または「pro」形を切断する翻訳後のプロセシングを利
用して、標的タンパク質、折りたたみ及び／または活性を特定することが可能で
ある。翻訳後の活性のための特定の細胞装置及び特徴のある機構をもつ種種の宿
主細胞（例えば、CHO、HeLa、MDCK、MEK293、WI38）がAmerican Type Culture C
ollection（ATCC; Bethesda, MD）より入手可能であり、外来のタンパク質の正
しい修飾及びプロセシングを確実にするために選択される。
【０１１５】 本発明の別の実施例では、HSPDE10Aをコードする自然或いは変更された、また
は組換えの核酸配列を上記した任意の宿主系の融合タンパク質の翻訳となる異種
配列に結合させる。例えば、市販の抗体によって認識できる異種部分を含むキメ
ラHSPDE10Aタンパク質が、HSPDE10Aの活性のインヒビターに対するペプチドライ
ブラリのスクリーニングを促進し得る。また、異種タンパク質部分及び異種ペプ
チド部分が、市販の親和性基質を用いて融合タンパク質の精製を促進し得る。こ
のような部分には、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（GST）、マルトース結
合タンパク質（MBP）、チオレドキシン（Trx）、カルモジュリン結合ペプチド（
CBP）、6−His、FLAG、c−mc、赤血球凝集素（HA）が含まれるが、これらに限定
されるものではない。GST及びMBP、Trx、CBP、6−Hisによって、固定されたグル
タチオン、マルトース、フェニルアルシン酸化物（phenylarsine oxide）、カル
モジュリン、金属キレート樹脂のそれぞれで同族の融合タンパク質の精製が可能
となる。FLAG、c−mc、及び赤血球凝集素（HA）によって、これらのエピトープ
標識を特異的に認識する市販のモノクロナール抗体及びポリクロナール抗体を用
いた融合タンパク質の免疫親和性の精製ができる。また、HSPDE10Aをコードする
配列と異種タンパク質配列との間にあるタンパク質分解切断部位を融合タンパク
質が含むように遺伝子操作すると、HSPDE10Aが精製の後に異種部分から切断され
得る。融合タンパク質の発現と精製の方法は、Ausubel. (1995、前出 ch 10).に
記載されている。市販されている様々なキットを用いて、融合タンパク質の発現
及び精製を促進できる。
【０１１６】 本発明の別の実施例では、TNTウサギ網状赤血球可溶化液またはコムギ胚芽抽
出系(Promega)を用いてin vitroで放射能標識したHSPDE10Aの合成が可能である
。これらの系は、T7またはT3、SP6プロモーターと機能的に結合したタンパク質
をコードする配列の転写と翻訳をつなげる。翻訳は、例えば、３５Ｓメチオニン
である放射能標識されたアミノ酸前駆体の存在の下で起こる。
【０１１７】 HSPDE10Aの断片は、組換え生成物だけでなく固相技術を用いて直接的なペプチ
ド合成によって作製され得る(例えば、前出のCreighton, pp. 55-60.を参照)。
タンパク質の合成は、手動或いは自動で行われ得る。自動合成は、例えば431Aペ
プチドシンセサイザ（Perkin Elmer）を用いて行うことが可能である。HSPDE10A
の種々の断片は別々に合成して、次ぎに結合させて完全長分子を生成する。
【０１１８】 （治療） HSPDE10A-1のある領域とヒト・サイクリックヌクレオチド・ホスホジエステラ
ーゼのある領域との間に、例えば配列及びモチーフの文脈における化学的及び構
造的類似性が存在する。更に、HSPDE10Aの発現は、骨格筋組織、正常或いは癌性
の前立腺組織と密接に関連する。従って、HSPDE10Aは、癌及び免疫異常症におい
てある役割を果たすと考えられる。特に、PDEの阻害剤は、この種の疾患に有用
であることが明らかである。HSPDE10Aの発現若しくは活性の増大に関連する疾患
の治療においては、HSPDE10Aの発現または活性を低下させることが望ましい。ま
た、HSPDE10Aの発現または活性の低下に関連する疾患の治療においては、HSPDE1
0Aの発現または活性を増大させることが望ましい。
【０１１９】 従って、一実施例において、HSPDE10Aの発現または活性の低下に関連した疾患
の治療または予防のために、患者にHSPDE10Aまたはその断片や誘導体を投与する
ことが可能である。限定するものではないが、このような疾患の例には、癌が含
まれ、その中には腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、奇形癌など
があり、詳しくは副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化
管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液
腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、及び子宮の癌が含まれ、また、免疫異常
症も含まれ、その中には後天性免疫不全症候群（AIDS）及び副腎機能不全、成人
呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血、喘息、アテ
ローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性
多腺性内分泌カンジダ性外胚葉ジストロフィ（APECED）、気管支炎、胆嚢炎、接
触皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、リンパ
球毒素性一時性リンパ球減少症、赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎
炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増
加症、過敏性大腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋又は心膜炎症、骨
関節炎、骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、リウマチ様
関節炎、強皮症、シェ−グレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテ
マトーデス、全身性硬化症、血小板減少症、潰瘍性大腸炎、ウェルナー症候群、
癌合併症、血液透析、体外循環と、ウイルス感染症及び細菌感染症、真菌感染症
、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫の感染症、外傷が含まれる。
【０１２０】 別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むHSPDE10Aの
発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、HSPDE10Aまた
はその断片や誘導体を発現し得るベクターを患者に投与することも可能である。
【０１２１】 更に別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むHSPDE1
0Aの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、実質的に
精製されたHSPDE10Aを含む医薬品組成物を好適な医薬用担体と共に患者に投与す
ることも可能である。
【０１２２】 更に別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むHSPDE1
0Aの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、HSPDE10A
の活性を調節するアゴニストを患者に投与することも可能である。
【０１２３】 更なる実施例では、HSPDE10Aの発現または活性の増大に関連した疾患の治療ま
たは予防のために、患者にHSPDE10Aのアンタゴニストを投与することが可能であ
る。限定するものではないが、このような疾患の例には、上記した癌及び免疫異
常症が含まれる。一実施態様では、HSPDE10Aと特異的に結合する抗体が直接アン
タゴニストとして、或いはHSPDE10Aを発現する細胞または組織に薬剤を運ぶター
ゲッティング或いは運搬機構として間接的に用いられ得る。
【０１２４】 別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むHSPDE10Aの
発現または活性の増大に関連した疾患の治療または予防のために、HSPDE10Aをコ
ードするポリヌクレオチドの相補体（complement）を発現するベクターを患者に
投与することも可能である。
【０１２５】 別の実施例では、本発明の任意のタンパク質、アンタゴニスト、抗体、アゴニ
スト、相補的な配列、ベクターを別の好適な治療薬と組み合わせて投与すること
もできる。当業者は、従来の医薬原理にしたがって併用療法で用いる好適な治療
薬を選択可能である。治療薬との組み合わせにより、上に列記した種々の疾患の
治療または予防に相乗効果をもたらし得る。この方法を用いて少ない量の各薬剤
で医薬効果をあげることが可能であり、広範囲な副作用の可能性を低減し得る。
【０１２６】 HSPDE10Aのアンタゴニストは、当分野で一般的な方法を用いて製造することが
可能である。詳しくは、精製されたHSPDE10Aを用いて抗体を作ったり、治療薬の
ライブラリをスクリーニングしてHSPDE10Aと特異的に結合するものを同定が可能
である。HSPDE10Aの抗体も、当分野で一般的な方法を用いて製造することが可能
である。このような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメ
ラ抗体、一本鎖、Fabフラグメント、及びFab発現ライブラリによって作られたフ
ラグメントが含まれる。但し、これらに限定されるものではない。治療用には、
中和抗体（即ち、二量体の形成を阻害するもの）が特に好ましい。
【０１２７】 抗体の産生のためには、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒト及びその他のも
のを含む種々の宿主が、HSPDE10Aまたは任意の断片、または免疫原性の特性を備
えるそのオリゴペプチドの注入によって免疫化され得る。宿主の種に応じて、種
々のアジュバントを用いて免疫応答を高めることもできる。このようなアジュバ
ントにはフロイントアジュバント、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲルアジ
ュバント、リゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油
性乳剤、キーホールリンペットヘモシニアン、及びジニトロフェノールなどの界
面活性剤が含まれるが、これらに限定されるものではない。ヒトに用いられるア
ジュバントの中では、BCG（bacilli Calmette-Guerin）及びCorynebacterium pa rvum が特に好ましい。
【０１２８】 HSPDE10Aに対する抗体を誘発するために用いられるオリゴペプチド、ペプチド
、または断片は、少なくとも約５のアミノ酸からなり、一般的には約１０以上の
アミノ酸からなるものが好ましい。これらのオリゴペプチド或いはペプチド、ま
たはそれらの断片は、天然のタンパク質のアミノ酸配列の一部と同一であること
が望ましく、小さな自然発生の分子の全アミノ酸配列も含む。HSPDE10Aアミノ酸
の短い伸展部は、KLHなどの別のタンパク質の配列と融合し、キメラ分子に対す
る抗体が産生され得る。
【０１２９】 HSPDE10Aに対するモノクローナル抗体は、培地内の連続した細胞株によって、
抗体分子を産生する任意の技術を用いて作製することが可能である。これらの技
術には、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、及びEBV−ハイ
ブリドーマ技術が含まれるが、これらに限定されるものではない（例えば、Kohl
er, G. 等. (1975) Nature 256:495-497; Kozbor, D. 等. (1985) .J. Immunol.
Methods 81−8-42; Cote, R.J. 等. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. 80:2026-
2030; Cole, S.P. 等. (1984) Mol. Cell Biol. 62:109-120を参照）。
【０１３０】 更に、「キメラ抗体」の作製のために発達したヒト抗体遺伝子にマウス抗体遺
伝子をスプライシングするなどの技術が、好適な抗原特異性及び生物学的活性を
備える分子を得るために用いられる（例えば、Morrison, S.L.他. (1984) Proc.
Natl. Acad. Sci. 81−4851−4855; Neuberger, M.S.他. (1984) Nature 312:6
04-608; Takeda, S.等. (1985) Nature 314:452,454を参照）。別法では、当分
野で周知の方法を用いて、一本鎖抗体の産生のための記載された技術を適用して
、HSPDE10A特異性一本鎖抗体を生成する。関連する特異性を備えるが別のイディ
オタイプの組成の抗体は、ランダムな組み合わせの免疫グロブリンライブラリか
ら鎖混合によって生成することもできる（例えば、Burton D.R. (1991) Proc. N
atl. Acad. Sci. 88:11120-3を参照）。
【０１３１】 抗体は、リンパ球集団の中のin vivo産生を誘発することによって、または免
疫グロブリンライブラリのスクリーニング又は文献に示されているような、高度
に特異的な結合試薬のパネルをスクリーニングすることによって、産生すること
もできる（例えば、Orlandi, R. 他. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. 86: 3833
-3837; Winter, G. 他. (1991) Nature 349:293-299を参照）。
【０１３２】 HSPDE10Aに対する特異的な結合部位を含む抗体も産生することができる。例え
ば、このような断片には、抗体分子のペプシン消化によって生成されるF（ab'）
に断片と、F（ab'）に断片のジスルフィド架橋を減じることによって生成される
Fab断片が含まれるが、これらに限定されるものではない。別法では、Fab発現ラ
イブラリを作製することによって、所望の特異性とモノクローナルFab断片の迅
速且つ容易な同定が可能となる（例えば、Huse, W.D. 等. (1989) Science 254:
1275-1281を参照）。
【０１３３】 種々のイムノアッセイを用いてスクリーニングし、所望の特異性を有する抗体
を同定する。隔離された特異性を有するポリクローナル抗体またはモノクローナ
ル抗体の何れかを用いる競合的な結合、または免疫放射線活性のための数々のプ
ロトコルが、当分野では周知である。通常このようなイムノアッセイには、HSPD
E10Aとその特異性抗体との間の複合体調整の計測が含まれる。二つの非干渉性HS
PDE10Aエピトープに対して反応性のモノクローナル抗体を用いる、２部位モノク
ローナルベースのイムノアッセイが一般に利用されるが、競合的結合アッセイも
利用することができる(Pound、前出)。
【０１３４】 ラジオイムノアッセイ技術と共にScatchard分析などの様々な方法を用いて、H
SPDE10A抗体の親和性を評価する。親和性を結合定数Kaで表すが、このKaは、平
衡状態の下でHSPDE10A抗体複合体のモル濃度を遊離抗体と遊離抗原のモル濃度で
割ったものである。多数のHSPDE10Aエピトープに対して親和性が不均一なポリク
ロナール抗体試薬の測定値Ｋａは、HSPDE10A抗体の平均親和性または結合活性を
表す。特定のHSPDE10Aエピトープに単一特異的なモノクロナール抗体試薬のＫａ
は、親和性の真の測定値を表す。Ka値が１０９〜１０１２Ｌ／ｍｏｌの高親和性
抗体試薬は、HSPDE10A抗体複合体が激しい操作に耐えなければならないイムノア
ッセイに用いるのが好ましい。Ka値が１０６〜１０７Ｌ／ｍｏｌの低親和性抗体
試薬は、HSPDE10Aが抗体から最終的に活性化状態で解離する必要がある免疫精製
（immunopurification）及び類似の処理に用いるのが好ましい。(Catty, D. (19
88) Antibodies, Volume I: A Practical Approach. IRL Press, Washington, D
C; Liddell, J. E. and Cryer, A. (1991) A Practical Guide to Monoclonal A ntibodies , John Wiley & Sons, New York NY)。
【０１３５】 ポリクロナール抗体試薬の抗体価及び結合活性を更に評価して、ある下流の適
用例に対するこのような試薬の品質及び適性を調べる。例えば、少なくとも１〜
２ｍｇ／ｍｌの特異的な抗体、好ましくは５〜１０ｍｇ／ｍｌの特異的な抗体を
含むポリクロナール抗体試薬は一般に、HSPDE10A抗体複合体を沈殿させなければ
ならない処理に用いられる。様々な適用例における抗体の特異性及び抗体価、結
合活性、抗体の品質や使用法の指針は一般に入手可能である。(例えば、Catty,
前出, 及びColigan 他、前出を参照)。
【０１３６】 本発明の別の実施例では、HSPDE10Aをコードするポリヌクレオチド、またはそ
の任意の断片または相補配列が、治療目的で使用することができる。ある実施形
態では、HSPDE10Aをコードするポリヌクレオチドの相補配列がmRNAの転写を阻止
するのに好適である場合、これを使用することができる。特に細胞は、HSPDE10A
をコードするポリヌクレオチドと相補的な配列で形質転換することもできる。し
たがって、相補的分子または断片は、HSPDE10Aの活性の調節、または遺伝子機能
の調節のために使用することができる。このような技術は当分野では周知であり
、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは大きな断片が、HSPDE10A
をコードする配列の制御領域から、またはコード領域に沿ったさまざまな位置か
ら設計可能である。
【０１３７】 レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペス又はワクシニア、又は様々な細菌
性プラスミド由来の発現ベクターを用いて、ヌクレオチド配列を標的の器官、組
織又は細胞集団に運ぶこともできる。当業者に周知の方法を用いてHSPDE10Aをコ
ードポリヌクレオチドと相補的な核酸配列を発現するベクターを作製することが
できる(例えば、前出のSambrook 他、及び前出のAusubel 他によるものを参照)
。
【０１３８】 HSPDE10Aをコードする遺伝子は、HSPDE10Aをコードするポリヌクレオチド又は
その断片を高いレベルで発現する発現ベクターで、細胞又は組織を形質転換する
ことによって止めることができる。このような作製物を用いて翻訳できないセン
ス又はアンチセンス配列を細胞の中に導入することができる。DNAの中に組み入
れられない場合でも、このようなベクターは内在性のヌクレアーゼによって機能
が損なわれるまでmRNA分子を転写し続ける。非複製ベクターでも一過性の発現を
一ヶ月以上に亘って続け、好適な複製要素がベクター系の一部である場合はさら
に長く持続し得る。
【０１３９】 上記した通り、遺伝子の発現は、HSPDE10Aをコードする遺伝子の制御５’また
は調節領域に対する相補的な配列またはアンチセンス分子（DNA或いはRNA、PNA
）を設計することによって調節することができる。例えば開始部位から約−１０
から約＋１０までの転写開始部位に由来するオリゴヌクレオチドを用いることが
可能である。同様に、「三重らせん」と塩基対合法を用いて阻止することができ
る。三重らせん構造は、二重らせんがポリメラーゼ、転写因子、または調節分子
の結合のために十分に広がるのを阻止するため有用である。三重式DNAを用いる
最近の治療の進歩は文献に記載されている（例えば、Gee, J.E. 等. (1994) In:
Huber, B.E. 及び B.I. Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futur
a Publishing Co., Mt. Kisco, NYを参照）。相補的な配列またはアンチセンス
分子もまた、転写物がリボソームに結合するのを阻止することによってmRNAの翻
訳を阻止するように設計できる。
【０１４０】 酵素性RNA分子であるリボザイムは、RNAの特異的切断を触媒するために用いる
ことができる。リボザイム作用の機構には、相補的な標的RNAへのリボザイム分
子の配列特異性ハイブリダイゼーションが含まれ、ヌクレオチド鎖切断が続く。
例えば、HSPDE10Aをコードする配列のヌクレオチド鎖切断を、特異的且つ効果的
に触媒する組換え型のハンマーヘッド型リボザイム分子が含まれる。
【０１４１】 任意の潜在的RNA標的の中の特異的なリボザイム切断部位が、後続の配列ＧＵ
Ａ、ＧＵＵ、及びＧＵＣを含むリボザイム切断部位に対して、標的分子をスキャ
ニングすることによって初めに同定される。一度同定されると、切断部位を含む
標的遺伝子の領域に対応する１５個から２０個のリボヌクレオチドの短いRNA配
列を、オリゴヌクレオチドの機能を不全にする二次的な構造の特徴について評価
することが可能である。候補標的の適合性も、リボヌクレアーゼ保護アッセイを
用いて、相補的なオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの容易性をテ
ストすることによって評価することが可能である。
【０１４２】 本発明の相補的なリボ核酸分子及びリボザイムは、当分野で周知の方法を用い
て、核酸分子の合成のために作製することができる。これらの方法には、固相ホ
スホラミダイト化合物などのオリゴヌクレオチドを化学的に合成する方法が含ま
れる。別法では、RNA分子がin vitro及びin vivoでHSPDE10AをコードするDNA配
列の転写によって生成され得る、このようなDNA配列はT7またはSP6等の好適なRN
Aポリメラーゼプロモータを用いて、種々のベクターの中に組み入れることが可
能である。別法では、相補的なRNAを構成的または誘導的に合成するこれらのcDN
A作製物は、細胞株、細胞、または組織の中に導入することができる。
【０１４３】 RNA分子を修飾することによって、細胞内の安定性を高め、半減期を長くする
ことができる。可能な修飾には、分子の５’及び／または３’端部でのフランキ
ング配列の追加、または分子のバックボーン内でのホスホジエステラーゼ結合よ
りむしろホスホロチオネート又は２’Ｏメチルの使用が含まれる、がこれらに限
定されるものではない。PNAの生成に固有のこの概念は、内在性のエンドヌクレ
アーゼによって容易には認識されないアデニン、シチジン、グアニン、チミン、
及びウリジンのアセチル−、メチル−、チオ−、及び同様の修飾形態だけでなく
、イノシン、キュエオシン（queosine）、及びワイブトシン（wybutosine）など
の従来のものでない塩基を含めることによって、これらの分子の全体に拡大する
ことができる。
【０１４４】 ベクターを細胞又は組織に導入する多数の方法が利用でき、in vivo、in vitr o 、及びex vivoでの使用に等しく適している。ex vivoでの治療の場合、患者か
ら採取された肝細胞の中にベクターを導入して、自家移植で同じ患者に戻すため
にクローニング増殖される。トランスフェクション、リボソーム注入またはポリ
カチオンアミノポリマーによる運搬は、当分野で周知の方法を用いて実行するこ
とができる（例えば、Goldman, C.K. 他. (1997) Nature Biotechnology 15:462
-66:を参照）。
【０１４５】 上記したいかなる治療方法も、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサ
ギ及びサルなどの哺乳動物を含む、治療が必要な全ての被験者に適用できる。
【０１４６】 本発明の別の実施例は、上記した全ての治療効果のために、医学上認められる
担体と共に医薬品或いは無菌組成物の投与に関連する。このような医薬品組成物
は、HSPDE10A、HSPDE10Aに対する抗体、擬態、アゴニスト、アンタゴニスト、又
はHSPDE10Aのインヒビターなどからなる。この組成物は、単体で、或いは安定剤
などの１種類以上の別の薬剤と共に、無菌の生体適合性医薬品担体に投与するこ
とができる。このような医薬品担体には、生理食塩水、緩衝食塩水、ブドウ糖、
及び水などが含まれるがこれらに限定されるものではない。この組成物は、単独
或いは薬物又はホルモンなどの別の薬剤と共に投与することができる。
【０１４７】 本発明に用いられる医薬品組成物は、任意の数の経路を用いて投与することも
できる。この経路には、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、クモ膜下腔内
、心室内、経皮性、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、異所性、舌下、または直腸が
含まれるがこれらに限定されるものではない。
【０１４８】 活性処方成分に加えて、これらの医薬品組成物には、活性化合物を医薬的に使
用可能な薬剤にするのを容易にする、医薬品添加物及び補助剤を含む好適な薬学
的に認められる担体が含まれ得る。製剤及び投与についての詳しい技術について
は、最新版のRemington's Pharmaceutical Sciences (Maack Publishing, PA)に
記載されている。
【０１４９】 経口投与用の医薬品組成物が、経口投与に好適な投与量において当分野で周知
の薬学的に許容される担体を用いて、製剤することができる。このような担体に
より、医薬品組成物が患者が摂取するために、錠剤、丸薬、糖衣剤、カプセル、
液体、ゲル状、シロップ剤、泥状物、懸濁液として製剤される。
【０１５０】 経口用に用いられる医薬品は、活性化合物と固体の薬品添加物とを混合し、得
られた顆粒の混合物を処理して、（所望に応じてすりつぶした後）タブレット或
いは糖衣錠コア（dragee cores）にする。好適な医薬品添加物とは、ラクトース
、スクロース、マンニトール、又はソルビトールを含む糖類、トウモロコシ、小
麦、米、ジャガイモ、又はその他の植物からのでんぷん、メチルセルロース、ヒ
ドロキシプロピルメチルセルロース、又はカルボキシメチルセルロースナトリウ
ムなどのセルロース、アラビアゴム及びトラガカントゴムを含むゴム、ゼラチン
及びコラーゲンなどのタンパク質などの炭水化物又はタンパク質賦形剤である。
必要に応じて、例えば、架橋結合したポリビニルピロリドン、かんてん、アルギ
ン酸、またはその塩であるアルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤または可溶化剤が
加えられる。
【０１５１】 糖衣錠コアは、濃縮糖溶剤などの好適なコーティングと共に用いられる。この
ような濃縮糖溶剤には、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カーボ
ポルゲル（carbopol gel）、ポリエチレングリコール、及び／または二酸化チタ
ン、ラッカー溶剤、及び好適な有機溶媒または混合溶剤などが含まれ得る。染料
または色素が、製品の識別又は活性化合物の量、即ち薬用量を示すため、錠剤ま
たは糖衣錠に加えられる。
【０１５２】 経口用に用いられる医薬品製剤には、ゼラチンから作られたプッシュ−フィッ
ト型のカプセル、グリセロールまたはソルビトールなどのコーティングとゼラチ
ンからなる封入されたカプセルが含まれる。プッシュ−フィット型のカプセルに
は、ラクトース又はスターチなどの賦形剤や結合材、タルク又はステアリン酸マ
グネシウムなどの潤滑剤、所望に応じて安定剤と混合された活性処方成分が含ま
れる。ソフトカプセルでは、活性化合物が、安定剤と共に或いは安定剤なしで、
脂肪油、溶液、またはポリエチレングリコール溶液などの好適な溶液に溶解或い
は懸濁され得る。
【０１５３】 非経口投与用に好適な医薬品剤が、水溶液で製剤されるが、ハンクス液、リン
ガー液、生理緩衝食塩水などの生理学的に適合性のある緩衝剤が好ましい。水性
懸濁注射液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、又はデ
キストランなどの懸濁液の粘性を高める物質を含み得る。更に、活性化合物の懸
濁液は、好適な油性注入懸濁液として製剤され得る。好適な親水性溶液または媒
体には、ごま油などの脂肪油、オレイン酸エチル、トリグリセリド又はリボソー
ムなどの合成脂肪酸が含まれる。非脂質ポリカチオンアミノポリマーが、運搬目
的で使用される。随意選択により、懸濁液は高濃度の溶液が可能となるよう化合
物の溶解性を高める好適な安定剤または薬剤を含み得る。
【０１５４】 局部または鼻腔投与のために、特定の障壁に浸透する好適な浸透剤が製剤に用
いられる。このような浸透剤は当業者には周知である。
【０１５５】 本発明の医薬品組成物は、当分野で周知の方法、例えば従来の混合、溶解、顆
粒化、糖衣化、溶離（levigating）、乳化、カプセル化、封入、または凍結乾燥
処理を用いて製造され得る。
【０１５６】 医薬品組成物は塩類として製剤され、限定されないが、塩酸、硫酸、酢酸、乳
酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸等の多くの酸と共に形成可能である。塩分は対
応する遊離塩基系よりも、水溶剤または他のプロトン溶剤に溶けやすい。別の薬
剤の形態には、１ｍＭ〜５０ｍＭヒスチジン、０．１％〜２％スクロース、及び
２％〜７％マンニトールの幾つか或いは全てを含み、ｐＨの範囲が４．５〜５．
５であり、使用前に緩衝剤と結合する凍結乾燥粉末を用いることができる。
【０１５７】 医薬品組成物が調合された後、それらは適当な箱に詰められ、指定した症状の
薬としてラベルが貼られる。HSPDE10Aの投与のため、このようなラベルには、量
、頻度、及び投与の方法が含まれるであろう。
【０１５８】 本発明に用いる好適な医薬品組成物には、目的を達成するため、効果的な量の
活性処方成分を含む組成物が含まれる。当業者は、自分の能力で十分に効果的な
服用量を決めることができる。
【０１５９】 どのような組成物であっても、治療に効果的な薬用量は、初めは、例えば腫瘍
細胞の腫瘍細胞アッセイで、或いは動物モデルのどちらかで推定することができ
る。通常、動物モデルには、マウス、ウサギ、イヌ、又はブタなどが用いられる
。動物モデルはまた、好適な濃縮範囲及び投与の経路を決めるのに用いることが
できる。このような治療をもとに、ヒトへの有益な薬用量及び投与経路を決定す
ることができる。
【０１６０】 医学的に効果的な薬用量は、症状や容態を回復させる、たとえばHSPDE10A又は
その断片、HSPDE10Aの抗体、HSPDE10Aのアゴニストまたはアンタゴニスト、イン
ヒビターなどの活性処方成分の量に関連する。薬用有効度及び毒性は、たとえば
、ED５０（服用に対して集団の５０％に医薬的効果がある）またはLD５０（服用
に対して集団の５０％に致命的である）統計を計算するなど、細胞培養または動
物実験における標準的な薬剤手法によって決定することができる。毒性効果と治
療効果との薬用量比は治療指数であり、LD５０／ED５０と示すことができる。高
い治療指数を示す医薬品組成物が望ましい。細胞培養アッセイ及び動物実験から
得られたデータが、ヒトへの適用のために、薬用量の範囲を調剤するのに用いら
れる。このような組成物が含まれる薬用量は、毒性を殆ど或いは全く含まず、ED ５０ を含む血中濃度の範囲であることが望ましい。薬用量は、用いられる投与形
態及び患者の感受性、投与の経路によって、この範囲内で様々である。
【０１６１】 正確な薬用量は、治療が必要な患者に関する要素を考慮して、実務者によって
決められるであろう。薬用量及び投与は、効果的なレベルの活性成分を与えるた
め或いは所望の効果を維持するために調節される。薬用量の要素として考慮され
るものには、疾患の重症度、患者の一般的な健康状態、年齢、体重、及び患者の
性別、投与の時間及び頻度、併用する薬剤、反応感受性、及び治療に対する応答
が含まれる。作用器官が長い医薬品組成物は、三日か四日に一度、一週間に一度
、二週間に一度、特定の製剤の半減期及びクリアランス率によって左右され、投
与され得る。
【０１６２】 通常の薬用量は投与の経路によって異なるが、約０．１〜１００，０００μｇ
までの最大約１グラムまでである。特定の薬用量及び運搬の方法に関するガイダ
ンスは文献に記載されており、一般に当分野の実務者はそれを利用することがで
きる。当業者は、タンパク質またはインヒビターとは異なったヌクレオチドの製
剤を利用するであろう。同様に、ポリヌクレオチド又はポリペプチドの運搬は、
特定の細胞、状態、位置などに対して特異的であろう。
【０１６３】 （診断） 別の実施例では、HSPDE10Aに特異的に結合する抗体が、HSPDE10Aの発現によっ
て特徴付けられる疾患の診断、またはHSPDE10AやHSPDE10Aのアゴニストまたはア
ンタゴニスト、インヒビターで治療を受けている患者をモニターするためのアッ
セイに用いられる。診断に有用な抗体は、治療のところで記載した方法と同じ方
法で製剤される。HSPDE10Aの診断アッセイには、抗体及び標識を用いてヒトの体
液或いは細胞や組織から採取されたものからHSPDE10Aを検出する方法が含まれる
。これらの抗体は、修飾をして或いはしないで使用され、レポーター分子の共有
結合性或いは非共有結合性の接着によって標識化され得る。当分野で周知の種々
のレポーター分子が用いられるが、その内の幾つかは上記した。
【０１６４】 HSPDE10Aを測定するためのELISA，RIA，及びFACSを含む種々のプロトコルは、
当分野では周知であり、変わった或いは異常なレベルのHSPDE10Aの発現を診断す
る元となるものを提供する。正常或いは標準的なHSPDE10Aの発現の値は、複合体
の形成に適した条件の下、正常な哺乳動物、例えばヒトなどの被験者から採取し
た体液または細胞とHSPDE10Aに対する抗体とを結合させることによって決定する
。標準的な複合体形成の量は、測光法（photometric）などの種々の方法で定量
され得る。被験者のHSPDE10Aの発現の量、制御及び疾患、生検組織からのサンプ
ルが標準値と比較される。標準値と被験者との間の偏差が、疾患を診断するパラ
メーターとなる。
【０１６５】 別の実施例によれば、HSPDE10Aをコードするポリヌクレオチドを診断のために
用いることもできる。用いられるポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド配
列、相補的なRNA及びDNA分子、及びPNAが含まれる。このポリヌクレオチドを用
いて、疾患と相関し得るHSPDE10Aを発現する生検組織における遺伝子の発現を検
出し定量する。この診断アッセイを用いて、HSPDE10Aの不在、存在、及び過度の
発現を調べ、治療中のHSPDE10Aレベルの制御を監視する。
【０１６６】 ある実施形態では、HSPDE10Aまたは近縁の分子をコードする遺伝子配列を含む
ポリヌクレオチド配列を検出可能なPCRプローブを用いたハイブリダイゼーショ
ンによって、HSPDE10Aをコードする核酸配列を同定することが可能である。例え
ば５'調節領域である高度に特異的な領域か、例えば保存されたモチーフである
やや特異性の低い領域から作られているかのプローブの特異性と、ハイブリダイ
ゼーション或いは増幅のストリンジェントは、プローブがHSPDE10Aをコードする
自然界の配列のみを同定するかどうか、或いはアレルや関連配列コードする自然
界の配列のみを同定するかどうかによって決まるであろう。
【０１６７】 プローブはまた、関連する配列の検出に利用され、HSPDE10Aをコードする任意
の配列と少なくとも５０％の配列同一性を有し得る。目的の本発明のハイブリダ
イゼーションプローブには、DNAあるいはRNAが可能であり、SEQ ID NO:3−4の配
列、或いはHSPDE10A遺伝子のプロモーター、エンハンサー、イントロンを含むゲ
ノム配列に由来し得る。
【０１６８】 HSPDE10AをコードするDNAに対して特異的なハイブリダイゼーションプローブ
の作製方法には、HSPDE10A及びHSPDE10A誘導体をコードするポリヌクレオチド配
列をmRNAプローブの作製のためのベクターにクローニングする方法がある。この
ようなベクターは市販されており、当業者には周知であり、好適なRNAポリメラ
ーゼ及び好適な標識されたヌクレオチドを加えることによって、in vitroでRNA
プローブを合成するために用いられる。ハイブリダイゼーションプローブは、例
えば３２Ｐ或いは３５Ｓなどの放射性核種、或いはアビジン／ビオチン（biotin
）結合系によってプローブに結合されたアルカリホスファターゼなどの酵素標識
等の種々のレポーターの集団によって標識され得る。
【０１６９】 HSPDE10Aをコードするポリヌクレオチド配列を用いて、HSPDE10Aの発現に関連
する疾患を診断することが可能である。限定するものではないが、このような疾
患の例には、癌が含まれ、その中には腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫
、肉腫、奇形癌などがあり、詳しくは副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、
胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、
陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、及び子宮の癌が含ま
れ、また、免疫異常症も含まれ、その中には後天性免疫不全症候群（AIDS）及び
副腎機能不全、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症
、貧血、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲
状腺炎、自己免疫性多腺性内分泌カンジダ性外胚葉ジストロフィ（APECED）、気
管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿
病、肺気腫、リンパ球毒素性一時性リンパ球減少症、赤芽球症、結節性紅斑、萎
縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲
状腺炎、過好酸球増加症、過敏性大腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心
筋又は心膜炎症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター
症候群、リウマチ様関節炎、強皮症、シェ−グレン症候群、全身性アナフィラキ
シー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、血小板減少症、潰瘍性大腸炎、
ウェルナー症候群、癌合併症、血液透析、体外循環と、ウイルス感染症及び細菌
感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫の感染症、外傷が含まれ
る。HSPDE10Aをコードするポリヌクレオチド配列は、サザーン法やノーザン法、
ドットブロット法、或いはその他の膜系の技術、PCR法、ディップスティック（d
ipstick）、ピン（pin）、ELISA式アッセイ、及び変異HSPDE10Aの発現を検出す
るために患者から採取した体液或いは組織を利用するマイクロアレイに使用する
ことが可能である。このような質的或いは量的方法は、当分野では周知である。
【０１７０】 特定の形態において、HSPDE10Aをコードするヌクレオチド配列は、関連する疾
患、特に上記した疾患を検出するアッセイにおいて有用であろう。HSPDE10Aをコ
ードするヌクレオチド配列は、標準的な方法で標識化され、ハイブリダイゼーシ
ョン複合体の形成に好適な条件の下、患者から採取した体液或いは組織のサンプ
ルに加えることができるであろう。好適な培養期間の後、サンプルを洗浄し、シ
グナルを定量して標準値と比較する。患者のサンプルのシグナルの量が、制御サ
ンプルと較べて著しく変わっている場合は、サンプル内のHSPDE10Aをコードする
ヌクレオチド配列の変異レベルにより、関連する疾患の存在が明らかになる。こ
のようなアッセイを用いて、動物実験、臨床試験、或いは個人の患者の治療を監
視における、特定の治療効果を推定することが可能である。
【０１７１】 HSPDE10Aの発現に関連する疾患の診断の基準となるものを提供するために、正
常あるいは標準的な発現の概要が確立される。これは、ハイブリダイゼーション
或いは増幅に好適な条件の下、動物或いはヒトの何れかの正常な被験者から抽出
された体液或いは細胞と、HSPDE10Aをコードする配列或いはその断片とを結合さ
せることにより達成され得る。標準的なハイブリダイゼーションは、正常な被験
者から得た値と周知の量の実質的に精製されたポリヌクレオチドが用いられる実
験からの値とを比較することによって定量可能である。正常なサンプルから得た
標準的な値を、疾患の症状を示す被験者から得た値と比較可能である。標準値と
被験者の値との偏差を用いて疾患の存在を確定する。
【０１７２】 疾患の存在が確定され治療プロトコルが開始されると、ハイブリダイゼーショ
ンアッセイを通常ベースで繰り返して、被験者における発現のレベルが正常な患
者に示される値に近づき始めたかどうかを推定することが可能である。繰り返し
行ったアッセイの結果を、数日から数ヶ月の期間の治療の効果を見るのに用いる
ことができる。
【０１７３】 癌では、個体からの生体組織における異常な量の転写物が、疾患の発生の素因
を示し、また実際に臨床的症状が出る前に疾患を検出する方法を提供することが
可能である。この種のより明確な診断により、医療の専門家が予防方法或いは積
極的な治療法を早くから利用して、癌の発生または進行を防ぐことが可能となる
。
【０１７４】 HSPDE10Aをコードする配列から設計されたオリゴヌクレオチドのさらなる診断
への利用には、PCRの利用が含まれ得る。このようなオリゴマーは、化学的な合
成、酵素を用いた生成、或いはin vitroで生成され得る。オリゴマーは、好まし
くはHSPDE10Aをコードするポリヌクレオチドの断片、或いはHSPDE10Aをコードす
るポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドの断片を含み、最適な条件の下
、特定の遺伝子や条件を識別するために利用される。また、オリゴマーは、やや
緩いストリンジェントな条件の下、近縁のDNA或いはRNA配列の検出及び／または
定量のため用いることが可能である。
【０１７５】 HSPDE10Aの発現を定量するために用いられ得る方法には、ヌクレオチドの放射
標識或いはビオチン標識、調節核酸の相互増幅（coamplification）、及び標準
的な曲線に結果が加えられたものが含まれる（例えば、Melby, P.C.等(1993) J.
Immunol. Methods, 159:235-44；Duplaa, C.等(1993) Anal. Biochem. 229-236
を参照）。多数のサンプルの定量速度は、目的のオリゴマーが種々の希釈液に含
まれ、分光光度法或いは非色応答によって定量が迅速な高スループット型のアッ
セイを用いることで加速された。
【０１７６】 別の実施例では、本明細書で記載した任意のポリヌクレオチド配列由来のオリ
ゴヌクレオチドまたはそれより長い断片を、マイクロアレイにおける標的として
用いる。マイクロアレイを用いて、同時に極めて多くの遺伝子の発現レベルを監
視し、遺伝子の変異、突然変異及び多形性を識別する。この情報は、遺伝子機能
の決定、疾患の遺伝的根拠の解釈、疾患の診断、及び治療薬剤の活性の監視及び
開発に有用である。
【０１７７】 当分野で周知の方法でマイクロアレイを準備して使用し、分析する。(例えば
、Brennan, T.M. 他 (1995) 米国特許第5,474,796号;Schena, M. 他 (1996) Pro
c. Natl. Acad. Sci. 93:10614-10619; Baldeschweiler 他(1995) PCT出願番号W
O95/251116; Shalon, D.他 (1995) PCT出願番号WO95/35505; Heller, R.A. 他(1
997) Proc. Natl. Acad. Sci. 94:2150-2155; 及び Heller, M.J. 他 (1997) 米
国特許第5,605,662号を参照) 本発明の別の実施例ではまた、HSPDE10Aをコードする核酸配列を用いて、自然
発生のゲノム配列をマッピングするのに有用なハイブリダイゼーションプローブ
を生成することが可能である。この配列は、以下のものに対してマッピングされ
る。特定の染色体、染色体の特定領域または人工生成の染色体、例えば、ヒト人
工染色体（HAC）、酵母人工染色体（YAC）、細菌人工染色体（BAC）、細菌Ｐ１
生成物或いは単一染色体cDNAライブラリである。（例えば、Harrington, 1.3.
他 (1997) Nat Genet. 15:345-355; Price, C.M. (1993) Blood Rev. 5−87-134
, 及びTrask, B.J. (1991) Trends Genet. 7:149-154を参照） in sit蛍光ハイブリダイゼーション（FISH）は、他の物理的染色体マッピング
技術及び遺伝マップデータと相関するであろう（例えば、Heinz-Ulrich, 他によ
る(1995) in Meyers, 前出, pp. 965-968.を参照）。遺伝子マップデータの例は
、種々の科学誌あるいはOnline Mendelian Inheritance in Man（OMIM）のワー
ルドワイドウェブのサイトで見付けることができる。物理的な染色体マップ上の
HSPDE10Aをコードする遺伝子の位置と特定の疾患との相関性、或いは特定の疾患
に対する素因が、このような疾患と関係するDNAの領域を決定するのに役立つ。
本発明のヌクレオチド配列を用いて、正常者と、保有者、及び感染した者との遺
伝子配列における違いを検出することもある。
【０１７８】 染色体標本のin sitハイブリダイゼーション、及び確定した染色体マーカーを
用いた結合分析などの物理的マッピング技術を用いて、遺伝子マップを拡張する
こともできる。マウスなどの別の哺乳動物の染色体上での遺伝子の配置により、
たとえ特定のヒト染色体の数或いはアームが分かっていなくても、関連するマー
カーが明らかになることが多い。新規の配列を、物理的なマッピングによって、
染色体アームに割り付けることもできる。このことは、位置クローニング或いは
別の遺伝子発見技術を用いて遺伝的疾患の研究をしている研究者にとって、価値
ある情報である。疾患或いは症候群の位置が、例えば血管拡張性失調症の11q22-
23などの特定の遺伝子領域に遺伝子結合によって大まかに決定されると、その領
域に対するどの配列マッピングも、さらなる調査のための関連する遺伝子或いは
調節遺伝子を表す（例えば、Gatti, R.A.他による（1988）Nature 336:577-580
を参照）。また、目的の本発明のヌクレオチド配列を用いて、正常者、保有者、
即ち感染者の間の、転位置、反転などによる染色体位置の違いを検出することも
ある。
【０１７９】 本発明の別の実施例では、HSPDE10A、その触媒作用断片或いは免疫原断片また
はそのオリゴペプチドを、種々の任意の薬剤スクリーニング技術における化合物
のライブラリのスクリーニングに用いることができる。このようなスクリーニン
グに用いる断片は、溶液に遊離、固体支持物に固定、細胞の表面上に保持、或い
は細胞内に存在する。HSPDE10Aとテストされる薬剤との複合体を結合することに
よる形成は計測されることもある。
【０１８０】 薬剤スクリーニングに用いる別の方法は、目的のタンパク質に対して、好適な
結合親和性を有する化合物のスクリーニング処理能力を高めるために用いられる
（例えば、Geysen,他による(1984) PCT出願番号 WO84/03564を参照）。この方法
では、相当な数の異なる小さな試験用化合物が、プラスチックピン或いは他の基
板の上に合成される。試験用化合物は、HSPDE10A、或いはその断片と反応してか
ら洗浄される。次ぎに、結合されたHSPDE10Aが、当分野で周知の方法で検出され
る。精製されたHSPDE10Aはまた、前記した薬剤をスクリーニングする技術に用い
られるプレート上で直接被覆することもできる。別法では、非中和抗体を用いて
、ペプチドを捕らえ、固体支持物に固定することもできる。
【０１８１】 別の実施例では、HSPDE10Aと結合可能な中和抗体がHSPDE10Aと結合するため試
験用化合物と特に競合する、競合的薬剤スクリーニングアッセイを用いることが
できる。この方法では、抗体が、HSPDE10Aと１つ以上の抗原決定因子を共有する
どのペプチドの存在も検出する。
【０１８２】 別の実施例では、発展途上の分子生物学技術にHSPDE10Aをコードするヌクレオ
チド配列を用いて、限定はされないが、現在知られているトリプレット暗号及び
特異的な塩基対相互作用などのヌクレオチド配列の特性に依存する新しい技術を
提供することができる。
【０１８３】 当分野の技術者であれば、更なる説明がなくても前述の説明だけで最大限に本
発明を利用できるであろう。したがって、以下に記載する特定の好適な実施例は
、例示目的であって本発明を限定するものではない。
【０１８４】 前出及び以下に記載した全ての特許出願、特許、刊行物、特に米国出願通し番
号09/226,741に言及することをもって本明細書の一部とする。
【０１８５】 （実施例） １ cDNAライブラリの作製 PROSNOT06 cDNAライブラリは、57歳の白人男性から採取された顕微鏡的に正常
な前立腺組織から作製した。病理学的には、関連腫瘍組織は、前立腺左右周辺の
腺癌（Greasonグレード3+3）であった。前立腺周囲の組織に関係して、神経周囲
への浸潤があった。患者の既往症には、大腸の良性新生物及び虫垂切除、アデノ
イド切除を伴う扁桃摘出術があった。家族歴には、前立腺の悪性新生物及びI型
糖尿病があった。
【０１８６】 この凍結組織を、Polytron PT-3000ホモジナイザー(Brinkmann Instruments,
Westhury NJ)を用いてホモジナイズし、グアニジンイソチオシアネート液に溶解
する。この溶解物を、Stratagene's RNA単離プロトコル(Stratagene, San Diego
CA)に従って、等倍量の酸性フェノールで１回抽出する。このRNAを、pH4.7の酸
性フェノールで２回目の抽出を行い、0.3Mの酢酸ナトリウムと2.5倍量のエタノ
ールで沈殿させ、DEPC処理水で再懸濁し、３７℃で２５分間DNA分解酵素で処理
した。OLIGOTEXキット(QIAGEN, Chatsworth CA)を用いてmRNAを単離し、このmRN
Aを用いてcDNAライブラリを作製した。cDNAをSEPHAROSE CL4Bカラム(Amersham P
harmacia Biotech)上に分画し、400bpを超えるcDNAをPSPORT1に結合させた。次
に、PSPORT1プラスミドをDHαコンピテント細胞（Life Technologies）の中に導
入した。
【０１８７】 ２ cDNAクローンの単離 UNIZAPベクターシステム(Stratagene)或いは細胞溶解を利用して、in vivo切
除によって宿主細胞からプラスミドを回収した。MagicまたはWIZARD Minipreps
DNA精製システム(Promega)、及びAGTC Miniprep精製キット(Edge Biosystems, G
aithersburg MD)、QIAGEN社のQIAWELL 8 Plasmid、QIAWELL 8 Plus Plasmid、QI
AWELL 8 Ultra Plasmid 精製システム、REAL Prep 96プラスミドキットの内の少
なくとも１つを用いてプラスミドを精製した。沈殿させた後、０．１ｍｌの蒸留
水に再懸濁して、凍結乾燥して或いは凍結乾燥しないで４℃で保管した。
【０１８８】 別法では、ハイスループットの直接結合PCR法によって宿主細胞溶解物からプ
ラスミドDNAを増幅した。(Rao, V.B. (1994) Anal. Biochem. 216:1-14)。宿主
細胞の溶解及び熱サイクリング過程を単一反応混合液で行った。サンプルを処理
してから３８４ウェルプレートに移して保管し、増幅したプラスミドDNAの濃度
をPICOGREEN色素(Molecular Probes, Eugene OR)及びFluoroskan II蛍光スキャ
ナー(Labsystems Oy, Helsinki, Finland)を用いて蛍光定量的に測定した。
【０１８９】 ３ シークエンシング及び分析 cDNAのシークエンシング反応は、標準的な方法で、或いはABI CATALYST 800 (
Perkin-Elmer) thermal cyclerまたはPTC-200 thermal cycler (MJ Research)と
HYDRAマイクロディスペンサー(Robbins Scientific) またはMICROLAB 2200 (Ham
ilton) 液体転移システムとの組み合わせなどの高スループット装置で行った。c
DNAのシークエンシング反応の準備には、Amersham Pharmacia Biotech社の試薬
、またはABI PRISM BIGDYE Terminator cycle sequencing ready reactionキッ
ト(Perkin-Elmer)などのABIシークエンシングキットに含まれる試薬を用いた。c
DNAのシークエンシング反応の電気泳動的な分離及び標識したポリヌクレオチド
の検出には、MEGABACE 1000 DNAシークエンシングシステム(Molecular Dynamics
)、標準ABIプロトコル及び塩基対呼び出しソフトウェアを用いるABI PRISM 373
または377シークエンシングシステム(Perkin-Elmer)、当分野で周知のその他の
配列解析システムを用いた。cDNA配列の読み枠は、標準的な方法(Ausubel, 1997
, 前出, unit 7.7)を用いて決定した。cDNA配列の幾つかを選択して、本実施例
の５に記載した方法で配列を延長した。
【０１９０】 cDNAのシークエンシングから得たポリヌクレオチド配列の構築及び解析は、当
分野の技術者に周知のアルゴリズムを利用したソフトウェアを組合せて行った。
表２は、利用したツール、ソフトウェア、アルゴリズム、それらの説明、引用文
献、閾値パラメーターの概要を示す。表２の列１は用いたツール及びプログラム
、アルゴリズム、列２はそれらの簡単な説明、列３は引用することで本明細書の
一部とした引用文献、列４の記載部分は２つの配列の一致度の評価に用いたスコ
ア及び確率値、他のパラメータを示す（確率値が高ければ高いほど配列間の相同
性が高くなる）。配列の解析には、MACDNASIS PROソフトウェア(Hitachi Softwa
re Engineering, S. San Francisco CA)及びLASERGENEソフトウェア (DNASTAR)
を用いた。
【０１９１】 ポリヌクレオチド配列の確証は、BLAST及び動的計画法、ジヌクレオチド最近
接分析に基づいたプログラム及びアルゴリズムを用いて、ベクター及びリンカー
、ポリＡ配列を取り除き、あいまいな塩基対をマスクすることで行った。次に、
BLAST及びFASTA、BLIMPSに基づいたプログラムを用いて、公共のデータベースで
あるGenBankの霊長類及びげっ歯類、哺乳類、脊椎動物、真核生物のデータベー
スやBLOCKS、PRINTS、DOMO、PRODOM及びPFAMなどのデータベースから選択した配
列に対してこれらの配列を問合わせて注釈を得た。Phred及びPhrap、Consedに基
づいたプログラムを用いて完全長のポリヌクレオチド配列の中にこれらの配列を
構築して、BLAST及びFASTA、BLIMPSに基づいたプログラムでオープンリーディン
グフレームのためにスクリーンした。完全長のポリヌクレオチド配列を翻訳して
対応する完全長のアミノ酸配列を引き出し、GenBankデータベース(上記)及びSwi
ssProt、BLOCKS、PRINTS、DOMO、PRODOM及びPrositeなどのデータベース、また
はPFAMなどのHidden Markov Model (HMM)に基づいたタンパク質ファミリーデー
タベースに対して問い合わせてこれらの完全長の配列を分析した。HMMは、確率
を利用して遺伝子ファミリーのコンセンサス一次構造を解析する（例えば、Eddy
, S.R. (1996) Curr. Opin. Struct. Biol. 6:361-365を参照）。
【０１９２】 完全長のポリヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の構築及び分析に用いる上記
のプログラムは、SEQ ID NO:3−4からのポリヌクレオチド配列の断片の同定にも
使用できる。約２０から４０００までのヌクレオチドの断片はハイブリダイゼー
ション及び増幅に有用であり、上記の発明で説明した。
【０１９３】 ４ HSPDE10Aをコードするポリヌクレオチドの延長 SEQ ID NO:3−4の完全長の核酸配列は、完全長分子の好適な断片から設計した
オリゴヌクレオチドプライマーを用いてその完全長分子の好適な断片を延長して
作製した。一方のプライマーは既知の断片の５'の延長を開始するために合成し
、他方のプライマーは既知の断片の３'の延長を開始するために合成した。開始
プライマーは、OLIGO 4．06ソフトウェア（National Biosciences）或いは他の
適切なプログラムを用いて、約２２個から約３０個のヌクレオチドの長さで約５
０％以上のＧＣ含量を有し、かつ約６８〜７２℃の温度で標的配列にアニールす
るように設計した。ヘアピン構造及びプライマー−プライマー二量体が生じない
ようにヌクレオチドを延長した。
【０１９４】 選択されたヒトcDNAライブラリを用いてこの配列を延長した。２段階以上の延
長が必要な場合、若しくは望ましい場合は、追加或いはネスト化プライマーの組
を設計する。
【０１９５】 当分野で既知の方法を利用したPCR法で高い忠実度で増幅した。PCRはPTC-200
thermal cycler (MJ Research, Inc.)用いて96ウェルブロックプレートで行った
。反応混合液は、鋳型DNA及び200 nmolの各プライマー、Mg２+と(NH4)2SO4とβ
−メルカプトエタノールを含むバッファー、Taq DNAポリメラーゼ(Amersham Pha
rmacia Biotech)、ELONGASE酵素(Life Technologies)、Pfu DNAポリメラーゼ(St
ratagene)を含む。プライマーの組、PCI AとPCI Bに対して以下のパラメーター
で増幅を行った。 ステップ１ ９４℃で３分間 ステップ２ ９４℃で１５秒 ステップ３ ６０℃で１分間 ステップ４ ６８℃で２分間 ステップ５ ステップ２、３、及び４を２０回繰り返す ステップ６ ６８℃で５分間 ステップ７ ４℃で保管 別法では、プライマーの組、T7とSK+に対して以下のパラメーターで増幅を行っ
た。 ステップ１ ９４℃で３分間 ステップ２ ９４℃で１５秒 ステップ３ ５７℃で１分間 ステップ４ ６８℃で２分間 ステップ５ ステップ２、３、及び４を２０回繰り返す ステップ６ ６８℃で５分間 ステップ７ ４℃で保管。
【０１９６】 各ウェルのDNA濃度は、１X TE及び0.5μlの希釈していないPCR産物に溶解した
100μlのPICOGREEN定量試薬(0.25% (v/v) PICOGREEN; Molecular Probes, Eugen
e OR)を不透明な蛍光光度計プレート(Coming Costar, Acton MA)の各ウェルに分
配してDNAが試薬と結合できるようにして測定する。このプレートをFluoroskan
II (Labsystems Oy, Helsinki, Finland)でスキャンして、サンプルの蛍光を計
測してDNAの濃度を定量化する。反応混合物の5〜10μlのアリコットを１％のア
ガロースミニゲル上での電気泳動によって解析し、何れの反応物が配列を延長す
ることに成功したかを決定する。
【０１９７】 延長したヌクレオチドを脱塩及び濃縮してから384ウェルプレートに移し、Cvi
JIコレラウイルスエンドヌクレアーゼ(Molecular Biology Research, Madison W
I)で消化し、pUC 18ベクター(Amersham Pharmacia Biotech)に再連結する前に音
波処理またはせん断を行った。ショットガンシークエンシングのために、消化し
たヌクレオチドを低濃度（０．６〜０．８％）のアガロースゲル上に分離して断
片を切断し、寒天をAgar ACE (Promega)で消化した。T4リガーゼ(New England B
iolabs, Beverly MA)を用いて延長したクローンをpUC 18ベクター(Amersham Pha
rmacia Biotech)に再連結し、Pfu DNAポリメラーゼ(Stratagene)で制限部位の延
び出しを処理してコンピテント大腸菌細胞に形質移入した。形質移入した細胞を
選択して抗生物質を含む培地に移し、それぞれのコロニーを切りとってLB/2Xカ
ルベニシリン培養液の384ウェルプレートに３７℃で一晩培養した。
【０１９８】 細胞を溶解して、Taq DNAポリメラーゼ(Amersham Pharmacia Biotech)及びPfu
DNAポリメラーゼ(Stratagene)を用いて以下の手順でDNAをPCR増幅した。 ステップ１ ９４℃で３分間 ステップ２ ９４℃で１５秒 ステップ３ ６０℃で１分間 ステップ４ ７２℃で２分間 ステップ５ ステップ２、３、及び４を２９回繰り返す ステップ６ ７２℃で５分間 ステップ７ ４℃で保管。 上記したようにPICOGREEN試薬(Molecular Probes)でDNAを定量化した。DNA回収
率の悪いサンプルは、上記した条件で再び増幅した。サンプルを20％のジメチル
サルホサイド（dimethysulphoxide）( 1−15, v/v)で希釈し、DYENAMIC DIRECT
キット(Amersham Pharmacia Biotech)またはABI PRISM BIGDYE Terminator cycl
e sequencing ready reactionキット(Perkin-Elmer)を用いてシークエンシング
した。
【０１９９】 同様に上述の手順で、SEQ ID NO:3−4のヌクレオチド配列を利用し、この延長
のために設計したオリゴヌクレオチドと好適な遺伝子ライブラリを用いて５′調
節配列を得た。
【０２００】 ５ 完全長のHSPDE10Aのクローニング インサイトクローン番号826776の完全なcDNA挿入断片をSalI/NotI制限酵素断
片として単離して[α-32P]dCTPで標識し、ハイブリダイゼーションプローブとし
て用いて、ヒト骨格筋5'-STRETCH PLUSλgtl0 cDNAライブラリ(Clontech)から約
1×106個のプラーク形成単位をスクリーニングした。各cDNA挿入断片をEcoRI制
限酵素断片として回収し、PBLUESCRIPT KS+ (Stratagene)にサブクローニングし
た。１つのλクローン（クローン1a.1）は、3.9kbのcDNA挿入断片を含む。１つ
の長いオープンリーディングフレームを同定し、両鎖のシークエンシングによっ
てコンセンサスヌクレオチド配列SEQ ID NO:3を作成した。HSPDE10A1のC末端ス
プライスバリアントであるHSPDE10A2もまた、λClontechヒト骨格筋cDNAライブ
ラリのハイブリダイゼーションスクリーニングによって単離した。クローンを単
離して十分にシークエンシングすることによって、cDNA挿入断片がHSPDE10A1に
類似の５'コーディング領域及び元のインサイトクローン826776（図１Ａ−図１
Ｅ）の３'末端に類似の３'末端を有することが明らかになった。
【０２０１】 ６ ノーザン分析 ノーザン分析は、遺伝子転写物の存在の検出に用いられる実験用技術であり、
特定の細胞種或いは組織由来のRNAを結合した膜に対する標識されたヌクレオチ
ド配列のハイブリダイゼーションを含む(例えば、Sambrook,前出, 7章; 及び Au
subel. F.M. 他、前出, 4章及び16章を参照)。
【０２０２】 Multiple Tissueノーザンブロット(Clontech)によって、様々なヒト組織から
のRNAサンプルを用いて膜系ノーザン分析を行った。ヒトHSPDE10A1を検出するた
めに、インサイトクローン826776の約1kbのcDNA挿入断片(SalI/NotI restrictio
n fragment)を用いた。このcDNA挿入断片は、108bpの５'触媒ドメインと、HSPDE
10A1及びHSPDE10A2の双方に共通した429bpの触媒ドメインとを含む。特にHSPDE1
0A1を調べるために、447bpの３'触媒ドメイン及び約1.2kbの３'非翻訳領域を有
する約1.7kbのλクローン1a.1のEcoRI制限酵素断片を用いた。
【０２０３】 各プローブを、MEGAPRIMEキット(Amersham, Buckinghamshire, UK)を用いて[
α-32P]dCTPで標識し、反応生成物（プローブ）を、CHROMASPIN-30カラム(Clonr
ech)を用いて精製した。Multiple Tissueノーザンブロットを、EXPRESSHYB (Clo
nsech)において６８℃で１時間プレハイブリダイズしてから、６８℃で一晩ハイ
ブリダイズ（約1×106 cpmプローブ／ml）した。Multiple Tissueノーザンブロ
ットを、５０℃の2ｘSSPE、0.05％（ｗ/ｖ）SDSで洗浄し（１５分間×４回）、
更に５０℃の0.1ｘSSPE、0.1％（ｗ/ｖ）SDSで１時間洗浄してから、２〜７日間
フィルムに曝す。ヒトβアクチンcDNAプローブを用いて、各レーンにおけるポリ
(A)+RNAが等量であるかどうかMultiple Tissueノーザンブロットを検査する。
【０２０４】 ノーザン分析によって、HSPDE10A1が約7.5kbの主転写物として骨格筋及び前立
腺で発現し、約3kbのmRNAが前立腺でのみ発現し、顕著でない約1.5kbの転写物が
精巣及び筋骨格で発現することが示された（図５Ａ及び図５Ｂ）。従って、少な
くとも３つのPDE10Aのスプライスバリアントの存在が明らかになった。
【０２０５】 BLASTに用いる類似のコンピュータ技術を用いて、GenBank或いはLIFESEQ（Inc
yte Pharmaceuticals）のようなヌクレオチドデータベース内の同一或いは関連
する分子を検索する。この分析は多くの膜系ハイブリダイゼーションよりも速度
が非常に速い。さらにコンピュータ検索の感度を変更して、任意の特定の一致が
、厳密な一致或いは相同的一致の何れかとして分類されるかを確定することがで
きる。検索の基準は、 （％配列同一性×％最大BLASTスコア）／１００ として定義される積スコアである。積スコアは、２つの配列間の類似度及び配列
一致の長さの両方を考慮する。例えば、積スコア４０の場合、その一致は１〜２
％誤差の範囲内で正確であり、７０ではその一致は正確であろう。類似分子は通
常、１５〜４０の範囲の積スコアを示す分子を選択することにより同定されるが
、それより低いスコアでも関連した分子が同定される場合もある。
【０２０６】 ノーザン分析の結果は、HSPDE10Aをコードする転写物が発生したライブラリの
分布割合として報告される。分析には、器官／組織及び疾患によるcDNAライブラ
リの分類も含まれる。器官／組織のカテゴリーには、心血管、皮膚、発生、内分
泌、胃腸、造血／免疫、筋骨格、神経、生殖、泌尿器が含まれる。疾患のカテゴ
リーには、癌及び炎症、外傷、細胞増殖、神経、貯留(pooled)が含まれる。カテ
ゴリー別に、目的の配列を発現するライブラリの数を数えて、それを全ての範囲
のライブラリの数で除した。各組織に特異的に発現する割合（パーセント）と各
疾患で発現する割合を本明細書に記載した。
【０２０７】 ７ 個々のハイブリダイゼーションプローブの標識及び使用 SEQ ID NO:3−4から導き出されたハイブリダイゼーションプローブを用いて、
cDNA、mRNA、またはゲノムDNAをスクリーニングする。約２０塩基対からなるオ
リゴヌクレオチドの標識について特に記すが、より大きなcDNAフラグメントの場
合でも基本的に同じ手順を用いる。オリゴヌクレオチドを、OLIGO4.06ソフトウ
ェア（National Bioscience）のような最新式のソフトウェアを用いてデザイン
し、50pmolの各オリゴマーと、250μCiの[γ‐３２Ｐ]アデノシン三リン酸（Ame
rsham, Chicago, IL）及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（DuPont NEN、Boston
MA）とを組み合わせて用いることにより標識する。標識されたオリゴヌクレオ
チドを、SEPHADEX G-25超精細排除デキストランビードカラム（Amersham Pharma
cia Biotech）を用いて実質的に精製する。毎分１０７カウントの標識されたプ
ローブを含むアリコットを、次のエンドヌクレアーゼ、Ase I、Bgl II、Eco RI
、Pst I、Xba1或いはPvu II（DuPont NEN）の１つを用いて切断したヒトゲノムD
NAの典型的な膜ベースのハイブリダイゼーション解析において用いる。
【０２０８】 各切断物からのDNAを、0.7％アガロースゲル上で分画して、ナイロン製メンブ
ラン（Nytran Plus, Schleicher & Schuell, Durham NH）に転写する。ハイブリ
ダイゼーションは４０℃で１６時間かけて行う。非特異的シグナルを取り除くた
め、例えば、最大０．１ｘクエン酸ナトリウム食塩水及び０．５％ドデシル硫酸
ナトリウムの条件の下、ブロットを順次室温にて洗浄する。ハイブリダイゼーシ
ョンパターンをオートラジオグラフィー或いは別のイメージ化手段で視覚化して
比較する。
【０２０９】 ８ マイクロアレイ 化学結合方法及びインクジェット装置を用いて、基板の表面上でアレイ要素を
合成することが可能である（例えば、上記Baldeschweilerを参照）。ドットブロ
ット法またはスロットブロット法に類似したアレイを利用し、要素を熱、ＵＶ、
機械的または化学的結合方法を用いて基板の表面に配置し結合させる。典型的な
アレイは、手作業または利用可能な方法や機械を用いて作製することができ、任
意の適正な数の要素を含み得る。ハイブリダイゼーションの後、ハイブリダイズ
していないプローブを取り除き、スキャナーを用いて蛍光のレベル及びパターン
を決定する。スキャンした画像を分析して、マイクロアレイ上で要素にハイブリ
ダイズする各プローブの相補性の程度及び相対的な量／発現レベルを調べること
が可能である。
【０２１０】 完全長のcDNA、発現遺伝子配列断片（EST）、或いはそれらの断片が、マイク
ロアレイの要素を構成し得る。ハイブリダイゼーションに好適な断片を、LASERG
ENEソフトウェア（DNASTAR）などの当分野で公知のソフトウェアを用いて選択す
ることが可能である。本発明の核酸配列の１つに対応する完全長のcDNA、EST、
或いはそれらの断片、或いは本発明に関連するcDNAライブラリから任意に選択さ
れたcDNAを、ガラススライドなどの好適な基板に整列する。cDNAは、例えばＵＶ
交差結合（UV cross-linking）を利用してスライドに固定してから、熱処理及び
化学処理を施し、最後に乾燥させる(例えば、 Schena, M. 他. (1995) Science
270:467-470; 及び Shalon, D. 他. (1996) Genome Res. 6:639-645を参照)。蛍
光プローブを準備して、基板上の要素にハイブリダイゼーションするために用い
る。上記した方法でこの基質を分析する。
【０２１１】 ９ 相補的ポリヌクレオチド HSPDE10Aをコードする配列或いはその任意の一部に対して相補的な配列は、自
然発生のHSPDE10Aの発現の低下即ち阻害するために用いられる。約１５〜約３０
個の塩基対を含むオリゴヌクレオチドの使用について記すが、より小さな或いは
より大きな配列の断片の場合でも本質的に同じ方法を用いることができる。Olig
o4.06ソフトウェア（National Biosciences）及びHSPDE10Aのコーディング配列
を用いて、適切なオリゴヌクレオチドを設計する。転写を阻害するためには、最
も独特な５′配列から相補的なオリゴヌクレオチドを設計し、これを用いてプロ
モーターがコーディング配列に結合するのを阻害する。翻訳を阻害するためには
、相補的なオリゴヌクレオチドを設計して、リボソームがHSPDE10Aをコードする
転写物に結合するのを阻害する。
【０２１２】 １０ HSPDE10Aのサブクローニング及び発現 バキュロウイルスベクターを用いて昆虫細胞で発現させるべく、完全長のヒト
HSPDE10A1酵素（N末端エピトープタグが付加された若しくは取り除かれた）をコ
ードする２つの作成物を作製した。完全長のヒトHSPDE10A1は、下線部の開始コ
ドン及びRsrII制限酵素断片を含む5'-CCAAATCCCGGTCCGAGATGTCCCCAAAGTGCAGTGCT
GATGC-3; (SEQ ID NO:6) センスプライマーと、下線部の停止コドン及びタンデ
ム停止コドン（tandem stop codon）、XhoI制限酵素断片を含む5'-CGGGTACCTCGA
GTTATTAGTTCCTGTCTTCCTTGGCTACC-3'; (SEQ ID NO:7) アンチセンスプライマーと
を用いて、λクローン1a.1からPCR法によって単離した。PCRは、Expand High Fi
delity PCRシステム(Boebringer Manuheim, West Sussex, UK)を用いて、９４℃
で１分４５秒を１サイクル、９４℃で１５秒及び６５℃で３０秒、７２℃で１分
４５秒を２０サイクル、７２℃で５分を１サイクルの手順で行った。PCR産物はR
srII/XhoIで消化し、得られた制限酵素断片を、バキュロウイスル移入ベクターP
FASTBAC (Life Technologies)及び５'FLAGエピトープタグを含むように予め変更
されたPFASTBACの双方のRsrII/XhoI部位に結合させた（Kunz, D. 他 (1992) J.
Biol. Chem. 267:9101-9106）。各作成物の挿入断片の配列を両鎖について決定
し、未処理のHSPDE10A1をコードする配列に対する同一性を確認する。このコー
ド化された配列は、未処理のHSPDE10A1或いはN末端FLAG標識HSPDE10A1の何れか
である。
【０２１３】 Bac-to-Bacシステム(Life Technologies)を用いて、製造者のプロトコルに従
って組み換えウイルスのストックを準備し、Sf9細胞をSf900II無血清培地(Life
Technologies)で２７℃で培養する。発現のために、30ml中の3×107個の細胞を
１の感染効率で感染させた。アッセイのために細胞を感染後４８時間で収集した
。酵素活性のアッセイのためのHSPDE10Aを、収集したトランスフェクトSf9細胞
から準備し、超音波処理で分裂させた。細胞片を、12,000gで１５分間遠心分離
して取り除いてから0.2μmのフィルターでろ過し、澄んだ上澄を溶液（20 mM HE
PES、pH 7.4、1 mM EDTA、150 mM NaCl）に対して４℃で一晩透析した。1 ml Mo
no Q HR(5/5)カラム（Pharmacia Biotech, Uppasla, Sweden）を用いたイオン交
換クロマトグラフィーによって、透析した上澄からHSPDE10Aをある程度まで精製
した。NaCl線形勾配を用いてカラムを最大1Mまで溶出し、高い活性（７０％を超
える基質ターンオーバー）を有する断片を貯めて、アリコットにして‐７０℃で
保存した。
【０２１４】 １１ HSPDE10AのPAGE（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）及びウェスタン分 析 トランスフェクトされたSf9細胞を遠心分離（3,000gで１０分間）して収集し
、1 ml当たり1×107個の細胞で、均質化バッファ（20 mM HEPES、pH 7.2、1 mM
EDTA、20 mMスクロース、150 mM NaCl、50 ml当たり一錠のプロテアーゼ阻害剤(
Boehringer)を含む）に再懸濁し、超音波処理で分裂させた。細胞片を遠心分離
（12,000gで１５分間）して取り除き、上澄をアリコットにして‐７０℃で保存
した。
【０２１５】 ヒトPDE10A感染細胞溶解物及びヒトPDE10A模擬感染溶解物（基準）（Coomassi
e染色のための約6.4×104個相当の細胞、ウエスターン分析のための約640個相当
の細胞）を、NuPAGEミニゲルシステム(Novex, San Diego CA)を用いる変性PAGE
によって分離し、Coomassie染色するか或いは免疫ブロットブロット法のためにp
olyvinylidene difiuoride膜(Novex)に移す。製造者のプロトコルに従って、二
次抗体として1：500に希釈した抗FLAG抗体(Sigma, Dorset, UK)及び1：1,000に
希釈した西洋わさびペルオキシダーゼ結合抗マウスIgG (Bio-Rad, Herts, UK)を
用いて、強化化学ルミネッセンス(Amershain)によってウェスタンブロット法を
実施した。
【０２１６】 １２ HSPDE10Aの活性の実証 HSPDE10AのPDE活性は、Hurwitz法(Hurwitz, R.L. 他 (1984) J. Biol. Chem.
259:8612-8618)を一部変更したシンチレーション近接アッセイ（Scintillation
Proximity Assay (SPA)）に基づいて測定した。反応を開始させるために、50μl
の溶液（20 mM Tris-HCl、pH 7.4、5 mM MgCl2、必要な濃度のサイクリックヌク
レオチドを含む）を50μlの希釈酵素（或いは背景調節用の酵素を含まない）溶
液（20 mM Tris-HCl、pH 7.4、5 mM MgCl、2 mg/mlのウシ血清アルブミンを含む
）に加えた。標識していないものと[3H]で標識したものとの比率が3：1の環状AM
P及び環状GMPの両方を基質（最終濃度が0.15〜10μM）として用いた。生産物阻
害に関連する非直線性を回避するために、基質のターンオーバーが２５％より低
くなる時間、３０℃で３つのMicrofluorプレート(Dynex Technologies, Chantil
ly VA)において反応させた。反応は、50μlのPDE SPAビーズ(水1 ml当たり20 mg
のイットリウムケイ酸塩（Yttrium Silicate）; Amersham International)、及
び過剰な標識していないサイクリックヌクレオチド（環状AMP若しくは環状GMP）
（最終濃度：1 mM）を加えて停止させた。次にプレートを密閉して、ビーズがヌ
クレオチド産物と結合するように１０分間振盪した。最後に、SPAビーズが定着
するように３０分おいてから、TopCount微量定量プレート読取り装置(Packard,
Meriden CT)でプレートを読み取った。
【０２１７】 酵素のKm及びVmaxを決定するために、一定量の希釈酵素用いて５〜６０分間の
間、様々な基質濃度（例えば、0.15〜10μm）において、環状AMP及び環状GMPの
加水分解の比率を測定した。反応の線形部分のデータの各点を用いて、Microsof
t Excel拡張プログラム「Fit Curve」によって、Km及びVmaxをミハエリス‐メン
テン・プロット（Michaclis-Menten plot）から計算した。
【０２１８】 以下の変更点を加えて上記のアッセイを用いて阻害剤の研究を行った。その変
更点とは、dimethylsulphoxide (DMSO)に溶解して好適に希釈した好適な阻害剤
を、必要な最終濃度（1〜200μM）となるように希釈した酵素に加えた。基質を
加えて反応を開始した。環状GMPを、0.17μMの最終濃度の基質として用いた。こ
の最終濃度は1/3Kmに等しく、５０％抑制濃度（Ki）である。３０℃で３０分間
のインキュベーションの間、基質のターンオーバーが約２５％となるように十分
な酵素を加えた。
【０２１９】 １３ 機能的アッセイ HSPDE10Aの機能は、哺乳動物細胞培養系において生理学的に高められたレベル
でのHSPDE10Aをコードする配列の発現によって評価する。cDNAを、cDNAを高いレ
ベルで発現する強いプロモーターを含む哺乳動物発現ベクターにサブクローニン
グする。このようなベクターには、pCMV SPORTTM (Life Technologies.)及びpCR
3.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA)が含まれ、どちらもサイトメガロウイルスプ
ロモーターを含んでいる。５〜１０μｇの組換えベクターを、例えば内皮由来か
造血由来のヒト細胞株にリポソーム製剤或いは電気穿孔法によって一時的に形質
移入する。更に、標識タンパク質をコードする配列を含む１〜２μｇのプラスミ
ドを同時に形質移入する。標識タンパク質の発現により、形質移入された細胞と
形質移入されていない細胞とを区別できる。また、標識タンパク質の発現によっ
て、cDNAの組換えベクターからの発現を正確に予想できる。このような標識タン
パク質には、緑色蛍光タンパク質(GFP；Clontech)、及びCD64またはCD64-GFP融
合タンパク質が含まれる。レーザー光学に基づいた技術を利用した自動流動細胞
計測法(FCM)を用いて、GFPまたはCD64-GFPを発現する形質移入された細胞を同定
し、その細胞のアポトーシス状態や他の細胞特性を評価する。また、FCMで、先
行した或いは同時の細胞死の現象を診断する蛍光分子の取り込みを検出して計量
する。これらの現象には、プロピジウムヨウ化物でのDNAの染色によって計測さ
れる核DNA内容物の変化と、ブロモデオキシウリジンの取り込み量の低下によっ
て計測されるDNA合成の下方調節と、特異的な抗体との反応性によって計測され
る細胞表面及び細胞内のタンパンク質の発現の変化と、蛍光複合アネキシンＶタ
ンパク質の細胞表面への結合によって計測される原形質膜組成の変化とが含まれ
る。流動細胞計測法は、Ormerod, M. G.による (1994) Flow Cytometry Oxford,
New York, NY.に記載されている。
【０２２０】 遺伝子発現におけるHSPDE10Aの影響は、HSPDE10Aをコードする配列とCD64また
はCD64-GFPのどちらかが形質移入された高度に精製された細胞集団を用いて評価
することができる。CD64またはCD64-GFPは形質転換された細胞表面で発現し、ヒ
ト免疫グロブリンG(IgG)の保存された領域と結合する。形質転換された細胞と形
質転換されない細胞とは、ヒトIgGかCD64に対する抗体のどちらかで被覆された
磁気ビードを用いて分離することができる(DYNAL. Lake Success. NY)。mRNAは
、当分野で公知の方法で細胞から精製することができる。HSPDE10A及び目的の他
の遺伝子をコードするmRNAの発現は、ノーザン分析やマイクロアレイ技術で分析
することができる。
【０２２１】 １４ HSPDE10Aに特異的な抗体の産生 ポリアクリルアミドゲル電気泳動法(PAGE；例えば、Harrington, M.G. (1990)
Methods Enzymol. 1816−3088-495を参照)または他の精製技術で実質的に精製
されたHSPDE10Aを用いて、標準的なプロトコルでウサギを免疫化して抗体を作り
出す。
【０２２２】 別法では、HSPDE10Aアミノ酸配列をLASERGENEソフトウェア（DNASTAR）を用い
て解析して免疫原性の高い領域を決定し、対応するオリゴペプチドを合成してこ
れを用いて当業者に周知の方法で抗体を産生させる。Ｃ末端付近の、或いは隣接
する親水性領域内のエピトープなどの適切なエピトープの選択については、当分
野で周知である(例えば、前出のAusubel, 1995,11章を参照)。
【０２２３】 通常、約１５残基の長さのオリゴペプチドを、Applied Biosystemsのペプチド
シンセサイザABI 431Aペプチドシンセサイザー（Perkin-Elmer）を用いてfmoc法
のケミストリにより合成し、Ｎ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシ
ンイミドエステル（MBS）を用いた反応によりKLH（Sigma-Aldrich, St. Louis M
O）に結合させて、免疫原性を高める(例えば、前出のAusubel, 1995を参照)。フ
ロイントの完全アジュバントにおいてオリゴペプチド−ＫＬＨ複合体を用いてウ
サギを免疫化する。得られた抗血清の抗ペプチド活性及び抗HSPDE10A活性を検査
するには、ペプチドまたはHSPDE10Aを基板に結合し、１％BSAを用いてブロック
し、ウサギ抗血清と反応させて洗浄し、さらに放射性ヨウ素標識されたヤギ抗ウ
サギIgGと反応させる。
【０２２４】 １５ 特異的抗体を用いる自然発生HSPDE10Aの精製 自然発生HSPDE10A或いは組換えHSPDE10Aを、HSPDE10Aに特異的な抗体を用いる
イムノアフィニティークロマトグラフィにより実質的に精製する。イムノアフィ
ニティーカラムは、CNBr-活性化SEPHAROSE（Amersham Pharmacia Biotech）のよ
うな活性化クロマトグラフィー用レジンと抗HSPDE10A抗体とを共有結合させるこ
とにより構築する。結合の後、そのレジンを製造者の使用説明書に従って、ブロ
ックし洗浄する。
【０２２５】 HSPDE10Aを含む培養液をイムノアフィニティーカラムに通し、HSPDE10Aを優先
的に吸着できる条件で（例えば、界面活性剤の存在下において高イオン強度のバ
ッファーで）そのカラムを洗浄する。そのカラムを、抗体とHSPDE10Aとの結合を
切るような条件で（例えば、ｐＨ２〜３のバッファー、或いは高濃度の尿素また
はチオシアン酸塩イオンのようなカオトロピックイオンで）溶出させ、HSPDE10A
を回収する。
【０２２６】 １６ HSPDE10Aと相互作用する分子の同定 HSPDE10A又は生物学的に活性なその断片を、１２５Ｉボルトンハンター試薬（
例えば、Bolton A.E.及びW.M. Hunter (1973) Biochem. J. 133:529を参照）で
標識する。マルチウェルプレートに予め配列しておいた候補の分子を、標識した
HSPDE10Aと共にインキュベートし、洗浄して、標識したHSPDE10A複合体を有する
全てのウェルをアッセイする。様々なHSPDE10A濃度で得られたデータを用いて、
候補の分子とHSPDE10Aとの関連、親和性、数について数値を計算する。
【０２２７】 当業者は、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく本発明の記載した方法
及びシステムの種々の改変を行うことができるであろう。特定の好適実施例に基
づいて本発明を説明したが、本発明の範囲が、そのような特定の実施例に不当に
制限されるべきではないことを理解されたい。実際に、分子生物学或いは関連す
る分野の専門家には明らかな、本明細書に記載の本発明の実施方法の様々な改変
は、特許請求の範囲に含まれる。
【０２２８】 （表の簡単な説明） 表１は、HSPDE101の活性に対する種々のPDE阻害剤の効果を示す。アッセイは
、0.17μMの濃度（環状GMPのKm値の約1/3に等しい）の環状GMPを基質として用い
て実施した。約0.5〜110μMの様々な濃度範囲において阻害剤を検査した。IC50
（若しくはKi）値は、線量効果曲線から推定した。
【０２２９】 表２は、HSPDE10Aの分析に用いたツール、プログラム、及びアルゴリズム、並
びにその説明、引用文献、閾値パラメーターを示す。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】 HSPDE10A-1のアミノ酸配列（SEQ ID NO:1）及び核酸配列（SEQ ID NO:3）を示
す。このアラインメントは、MACDNASIS PROソフトウェア（Hitachi Software En
gineering. South. San Francisco CA）を用いて作成した。
【図１Ｂ】 HSPDE10A-1のアミノ酸配列（SEQ ID NO:1）及び核酸配列（SEQ ID NO:3）を示
す。このアラインメントは、MACDNASIS PROソフトウェア（Hitachi Software En
gineering. South. San Francisco CA）を用いて作成した。
【図１Ｃ】 HSPDE10A-1のアミノ酸配列（SEQ ID NO:1）及び核酸配列（SEQ ID NO:3）を示
す。このアラインメントは、MACDNASIS PROソフトウェア（Hitachi Software En
gineering. South. San Francisco CA）を用いて作成した。
【図１Ｄ】 HSPDE10A-1のアミノ酸配列（SEQ ID NO:1）及び核酸配列（SEQ ID NO:3）を示
す。このアラインメントは、MACDNASIS PROソフトウェア（Hitachi Software En
gineering. South. San Francisco CA）を用いて作成した。
【図１Ｅ】 HSPDE10A-1のアミノ酸配列（SEQ ID NO:1）及び核酸配列（SEQ ID NO:3）を示
す。このアラインメントは、MACDNASIS PROソフトウェア（Hitachi Software En
gineering. South. San Francisco CA）を用いて作成した。
【図２Ａ】 HSPDE10A-2のアミノ酸配列（SEQ ID NO:2）及び核酸配列（SEQ ID NO:4）を示
す。このアラインメントは、MACDNASIS PROソフトウェア（Hitachi Software En
gineering）を用いて作成した。
【図２Ｂ】 HSPDE10A-2のアミノ酸配列（SEQ ID NO:2）及び核酸配列（SEQ ID NO:4）を示
す。このアラインメントは、MACDNASIS PROソフトウェア（Hitachi Software En
gineering）を用いて作成した。
【図２Ｃ】 HSPDE10A-2のアミノ酸配列（SEQ ID NO:2）及び核酸配列（SEQ ID NO:4）を示
す。このアラインメントは、MACDNASIS PROソフトウェア（Hitachi Software En
gineering）を用いて作成した。
【図２Ｄ】 HSPDE10A-2のアミノ酸配列（SEQ ID NO:2）及び核酸配列（SEQ ID NO:4）を示
す。このアラインメントは、MACDNASIS PROソフトウェア（Hitachi Software En
gineering）を用いて作成した。
【図２Ｅ】 HSPDE10A-2のアミノ酸配列（SEQ ID NO:2）及び核酸配列（SEQ ID NO:4）を示
す。このアラインメントは、MACDNASIS PROソフトウェア（Hitachi Software En
gineering）を用いて作成した。
【図２Ｆ】 HSPDE10A-2のアミノ酸配列（SEQ ID NO:2）及び核酸配列（SEQ ID NO:4）を示
す。このアラインメントは、MACDNASIS PROソフトウェア（Hitachi Software En
gineering）を用いて作成した。
【図３Ａ】 MEGALIONプログラム（DNASTAR, Madison WI）を用いて作成した、HSPDE10A1（
SEQ ID NO: 1）及びHSPDE10A2（SEQ ID NO:2）、ヒトPDE5、HPDE5A1（GI 335560
6; SEQ ID NO:5）との間のアミノ酸配列アラインメントを示す。
【図３Ｂ】 MEGALIONプログラム（DNASTAR, Madison WI）を用いて作成した、HSPDE10A1（
SEQ ID NO: 1）及びHSPDE10A2（SEQ ID NO:2）、ヒトPDE5、HPDE5A1（GI 335560
6; SEQ ID NO:5）との間のアミノ酸配列アラインメントを示す。
【図３Ｃ】 MEGALIONプログラム（DNASTAR, Madison WI）を用いて作成した、HSPDE10A1（
SEQ ID NO: 1）及びHSPDE10A2（SEQ ID NO:2）、ヒトPDE5、HPDE5A1（GI 335560
6; SEQ ID NO:5）との間のアミノ酸配列アラインメントを示す。
【図３Ｄ】 MEGALIONプログラム（DNASTAR, Madison WI）を用いて作成した、HSPDE10A1（
SEQ ID NO: 1）及びHSPDE10A2（SEQ ID NO:2）、ヒトPDE5、HPDE5A1（GI 335560
6; SEQ ID NO:5）との間のアミノ酸配列アラインメントを示す。
【図３Ｅ】 MEGALIONプログラム（DNASTAR, Madison WI）を用いて作成した、HSPDE10A1（
SEQ ID NO: 1）及びHSPDE10A2（SEQ ID NO:2）、ヒトPDE5、HPDE5A1（GI 335560
6; SEQ ID NO:5）との間のアミノ酸配列アラインメントを示す。
【図４Ａ】 環状AMPを基質として用いたHSPDE10A1の活性のアッセイを示す。X軸は基質濃
度（μM）、Y軸は酵素の反応速度（ピコモル／分／μｌ 酵素）を表す。基質に
対する酵素活性の値、Km及びVmaxは、Microsoft Excel拡張プログラム「Fit Cur
ve」を用いて、ミハエリス‐メンテン・プロット（Michuelis-Menten plot）か
ら計算した。
【図４Ｂ】 環状GMPを基質として用いたHSPDE10A1の活性のアッセイを示す。X軸は基質濃
度（μM）、Y軸は酵素の反応速度（ピコモル／分／μｌ 酵素）を表す。基質に
対する酵素活性の値、Km及びVmaxは、Microsoft Excel拡張プログラム「Fit Cur
ve」を用いて、ミハエリス‐メンテン・プロットから計算した。
【図５Ａ】 ヒト組織におけるHSPDE10A発現を表す膜系ノーザン分析結果を示す。X軸は分
析した組織を示し、Y軸はマーカーのサイズを示す。矢印は、HSPDE10Aの主転写
物（約7.5Kb）の位置を示す。
【図５Ｂ】 ヒト組織におけるHSPDE10A発現を表す膜系ノーザン分析結果を示す。X軸は分
析した組織を示し、Y軸はマーカーのサイズを示す。矢印は、HSPDE10Aの主転写
物（約7.5Kb）の位置を示す。
【図６】 Sf9細胞における完全長のHSPDEA10Aの発現を示す（矢印は、約56キロダルトン
の予想分子量）。第１レーンはマーカーのサイズ及びそれらの分子量を示す。第
２レーン及び第４レーンはそれぞれ、64,000及び12,800個相当の細胞で感染した
細胞のHSPDE10A1を示す。第３レーン及び第５レーンはそれぞれ、64,000及び12,
800個相当の細胞で膜擬感染した細胞であり、HSPDE10A1の存在が示されていない
。
【表１】
【表２】
【表３】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 3/10 Ａ６１Ｐ 7/00 ４Ｃ０８４ 5/14 7/06 ４Ｈ０４５ 7/00 9/10 １０１ 7/06 11/00 9/10 １０１ 11/06 11/00 13/12 11/06 17/00 13/12 17/02 17/00 17/12 17/02 19/02 17/12 19/06 19/02 19/10 19/06 21/00 19/10 21/04 21/00 25/28 21/04 29/00 25/28 １０１ 29/00 31/04 １０１ 31/10 31/04 31/12 31/10 35/00 31/12 35/02 35/00 37/00 35/02 37/02 37/00 37/08 37/02 43/00 １１１ 37/08 Ｃ０７Ｋ 16/40 43/00 １１１ Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ０７Ｋ 16/40 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 9/16 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 9/16 33/50 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｇ０１Ｎ 33/15 5/00 Ａ 33/50 Ａ６１Ｋ 37/48 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ， ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，Ｃ Ｚ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ， ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，Ｌ Ｒ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ， ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，Ｔ Ｒ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ランフィアー、ジェリー イギリス国ケント州・アシュフォード・グ レートチャート・ニンレーン・ニンコテー ジス ２ (72)発明者 フォーセット、リンゼー イギリス国ケント州・カンタベリー・ロチ ェスターアベニュー 35 (72)発明者 バンドマン、オルガ アメリカ合衆国カリフォルニア州94043・ マウンテンビュー・アンナアベニュー 366 (72)発明者 ハロー、イアン イギリス国ケント州・ハーンベイ・ブルー ムフィールド・ピートリーロード 147 Ｆターム(参考） 2G045 AA34 AA35 BB01 BB07 BB14 BB20 BB41 BB46 BB48 CB01 DA13 DA36 FB02 FB13 GC15 4B024 AA01 AA12 BA11 CA04 DA02 EA02 FA02 GA11 HA12 HA15 4B050 CC03 DD11 LL01 LL03 4B063 QA01 QA18 QA19 QQ20 QQ42 QR32 QR40 QR56 QR62 QR82 QS25 QS34 4B065 AA90X AA93Y AB01 AC14 BA02 CA31 CA44 CA46 4C084 AA02 AA06 AA07 AA17 BA03 CA53 DC01 ZA152 ZA452 ZA512 ZA552 ZA592 ZA682 ZA752 ZA812 ZA892 ZA942 ZA962 ZA972 ZB052 ZB072 ZB132 ZB152 ZB262 ZB332 ZB352 ZB372 ZB382 ZC062 ZC202 ZC312 ZC352 4H045 AA11 AA30 CA40 DA76 DA89 EA22 EA28 EA50 EA51 FA74 GA26 【要約の続き】

Claims (23)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 単離されたポリペプチドであって、ａ）SEQ ID NO:1及びS
    EQ ID NO:2（SEQ ID NO:1−2）からなる一群から選択されたアミノ酸配列、ｂ）
    SEQ ID NO:1−2からなる一群から選択されたアミノ酸配列と少なくとも９０％の
    配列同一性を有する自然発生のアミノ酸配列、ｃ）SEQ ID NO:1−2からなる一群
    から選択されたアミノ酸配列の生物学的に活性な断片、またはｄ）SEQ ID NO:1
    −2からなる一群から選択されたアミノ酸配列の免疫原性断片を含むことを特徴
    とする単離されたポリペプチド。
  2. 【請求項２】 SEQ ID NO:1−2からなる一群から選択されたアミノ酸配列
    を含むことを特徴とする請求項１の単離されたポリペプチド。
  3. 【請求項３】 請求項１のポリペプチドをコードする単離されたポリヌク
    レオチド。
  4. 【請求項４】 SEQ ID NO:3−4からなる一群から選択された配列を含むこ
    とを特徴とする請求項３の単離されたポリヌクレオチド。
  5. 【請求項５】 請求項３のポリヌクレオチドに機能的に結合するプロモー
    ター配列を含む組換えポリヌクレオチド。
  6. 【請求項６】 請求項５の組換えポリヌクレオチドで形質転換された細胞
    。
  7. 【請求項７】 請求項５の組換えポリヌクレオチドを含む遺伝子組換え生
    物。
  8. 【請求項８】 請求項１のポリペプチドを製造する方法であって、 ａ）前記ポリペプチドの発現に好適な条件の下で細胞を培養するステップであ
    って、前記細胞が、請求項１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機
    能的に結合するプロモーター配列を含む組換えポリヌクレオチドで形質転換され
    る、該ステップと、 ｂ）そのように発現したポリペプチドを回収するステップとを含むことを特徴
    とする請求項１のポリペプチドの製造方法。
  9. 【請求項９】 請求項１のポリペプチドに特異的に結合する単離された抗
    体。
  10. 【請求項１０】 単離されたポリヌクレオチドであって、ａ）SEQ ID NO:
    3−4からなる一群から選択されたポリヌクレオチド配列、ｂ）SEQ ID NO: 3−4
    からなる一群から選択されたポリヌクレオチド配列と少なくとも７０％の配列同
    一性を有する自然発生のポリヌクレオチド配列、ｃ）前記ａ）に相補的なポリヌ
    クレオチド配列、またはｄ）前記ｂ）に相補的なポリヌクレオチド配列を含むこ
    とを特徴とする単離されたポリヌクレオチド。
  11. 【請求項１１】 請求項１０のポリヌクレオチドの６０個以上の連続する
    ヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチド。
  12. 【請求項１２】 請求項１０のポリヌクレオチド配列を有するサンプル内
    の標的ポリヌクレオチドを検出する方法であって、 ａ）前記サンプル中の前記標的ポリヌクレオチドと相補的な配列を含む少なく
    とも１６個の連続するヌクレオチドを含むプローブと前記サンプルとをハイブリ
    ダイズするステップであって、前記プローブと前記標的ポリヌクレオチドとによ
    ってハイブリダイゼーション複合体が形成される条件の下で、前記プローブが前
    記標的ポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズする、該ステップと、 ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体の存在の有無を検出し、存在する場合
    には随意選択でその量を測定するステップとを含むことを特徴とする標的ポリヌ
    クレオチドを検出する方法。
  13. 【請求項１３】 前記プローブが少なくとも３０個の連続するヌクレオチ
    ドを含むことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 前記プローブが少なくとも６０個の連続するヌクレオチ
    ドを含むことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 有効量の請求項１のポリペプチド及び医薬的に容認でき
    る賦形剤を含む医薬品組成物。
  16. 【請求項１６】 請求項１５の医薬品組成物を患者に投与することを含む
    、機能的HSPDE10Aの発現の低下に関連する疾患やその症状の治療方法。
  17. 【請求項１７】 請求項１のポリペプチドのアゴニストとして効果的な化
    合物をスクリーニングする方法であって、 ａ）請求項１のポリペプチドを含むサンプルを化合物に曝露するステップと、 ｂ）前記サンプルのアゴニスト活性を検出するステップとを含むことを特徴と
    するスクリーニング方法。
  18. 【請求項１８】 請求項１７のスクリーニング方法によって同定されたア
    ゴニスト化合物及び医薬的に容認できる賦形剤を含む医薬品組成物。
  19. 【請求項１９】 請求項１８の医薬品組成物を患者に投与することを含む
    、機能的HSPDE10Aの発現の低下に関連する疾患やその症状の治療方法。
  20. 【請求項２０】 請求項１のポリペプチドのアンタゴニストとして効果的
    な化合物をスクリーニングする方法であって、 ａ）請求項１のポリペプチドを含むサンプルを化合物に曝露するステップと、 ｂ）前記サンプルのアンタゴニスト活性を検出するステップとを含むことを特
    徴とするスクリーニング方法。
  21. 【請求項２１】 請求項２０のスクリーニング方法によって同定されたア
    ンタゴニスト化合物及び医薬的に容認できる賦形剤を含む医薬品組成物。
  22. 【請求項２２】 請求項２１の医薬品組成物を患者に投与することを含む
    、機能的HSPDE10Aの過剰な発現に関連する疾患やその症状の治療方法。
  23. 【請求項２３】 請求項４の配列を含む標的ポリヌクレオチドの発現を効
    果的に変える化合物をスクリーニングする方法であって、 ａ）前記標的ポリヌクレオチドを含むサンプルを化合物に曝露するステップと
    、 ｂ）前記標的ポリヌクレオチドの発現の変化を検出するステップとを含むこと
    を特徴とするスクリーニング方法。
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