JP2002523045A - ヒトｒｎａ関連タンパク質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ヒトRNA関連タンパク質（RNAAP）と、RNAAPを同定しコードするポリヌクレオチドとを提供する。また、本発明は、発現ベクター及び宿主細胞、抗体、アゴニスト、アンタゴニストを提供する。更に、本発明は、RNAAPの発現に関連する疾患の診断または治療方法、予防方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 発明の技術分野 本発明は、ヒトRNA関連タンパク質の核酸配列及びアミノ酸配列、並びにこれ
らの配列を用いた、細胞増殖異常及び自己免疫異常／炎症性疾患、感染症の診断
及び治療、予防に関連する。

【０００２】 発明の背景 リボ核酸（RNA）は、アデノシン三リン酸（ATP）及びグアノシン三リン酸（GT
P）、ウリジン三リン酸（UTP）、シチジン三リン酸（CTP）の４種のヌクレオチ
ドからなる直線の一本鎖高分子である。殆どの生物において、RNAは、生物にお
ける遺伝物質であるデオキシリボ核酸（DNA）の複製として転写される。レトロ
ウイルスでは、DNAではなくRNAが遺伝物質である。遺伝物質の複製であるRNAは
タンパク質をコードし、また、生物における様々な構造的役割、触媒的役割、調
節的役割を果たす。RNAは、細胞内での局在部位及び機能によって分類される。
メッセンジャーRNA（ｍRNA）は、ポリペプチドをコードする。リボソームRNA（
ｒRNA）は、リボソームタンパク質と共にリボソームを構成する成分である。リ
ボソームは、ｍRNAをポリペプチドに翻訳する細胞小器官である。転移RNA（ｔRN
A）は、ｍRNAのコドンとそのコドンと一致するアミノ酸を認識して、ｍRNAの翻
訳において機能する細胞質アダプター分子である。

【０００３】 成熟ｍRNA転写物のスプライシングされていない前駆体は、ヘテロ核RNA（hnRN
A）転写物と呼ばれる。一般にhnRNAは、ｍRNAより大きくより不安定である。hnR
NAは、合成直後にヘテロ核リボ核タンパク質粒子（hnRNP）と呼ばれるタンパク
質含有複合体を形成する（例えば、Honore, B. 他. (1995) J. Biol. Chem. 270
:28780-28789を参照）。hnRNPは、hnRNPのイントロンのスプライシングにおいて
主に機能する安定なRNAタンパク質複合体である小さな核リボ核タンパク質粒子
（snRNP）と結合する。snRNPのそれぞれは、１種類のRNAと１０のタンパク質を
含む。snRNPのRNA成分は、hnRNAのイントロンの特定の配列を認識して塩基対を
形成する。５つの異なったsnRNPがhnRNAのイントロン部位で結合して、イントロ
ンの除去及びエキソンの再結合を触媒する多成分RNP複合体であるスプライソソ
ームを形成する。イントロンとsnRNPの相互作用を安定化させる様々な補助因子
もsnRNPに結合する。ヒトのこのような因子には、スプライソソーム関連タンパ
ク質49（SAP49）及びSAP145がある（Champion-Arnaud, P. 及び Reed, R. (1994
) Genes Dev. 8:1974-1983）。

【０００４】 DNAからRNAの転写及びRNAプロセシング、ｍRNAのタンパク質への翻訳のとき、
タンパク質がRNAに結合している。また、構造目的及び触媒目的、調節目的にタ
ンパク質が利用されるときも、タンパク質がRNAに結合する。RNAポリメラーゼは
、DNAからRNAを転写するタンパク質である。HIV Tatタンパク質は、ウイルスRNA
の特定の部位と結合して、中途での転写の終結を防止する。核内の転写されたRN
Aのプロセシングには、様々なタンパク質が必要である。前駆体ｍRNAのプロセシ
ングには、メチルグアノシンでの5'末端のキャップ構造の付加と、3'末端のポリ
アデニル化と、イントロンを除去するためのスプライシングとが含まれる。スプ
ライソソーム複合体は、U1及びU2、U4、U5、U6の５つの小さな核リボ核タンパク
質粒子（snRNP）で構成される。それぞれのsnRNPには、1種類のsnRNAと約１０の
タンパク質が含まれる。あるsnRNPのRNA成分が、イントロンコンセンサス配列を
認識して塩基対を形成する。タンパク質成分が、スプライソソームの形成及びス
プライシング反応を仲介する。snRNPタンパク質の自己抗体が、全身性エリテマ
トーデスの患者の血液で発見された（Stryer, L. (1995) Biochemistry WI.H. F
reeman and Company, New York NY, p. 863）。

【０００５】 スプライシングのプロセシングは、RNA転写物からあるイントロンを除去する
だけではない。例えば、RNA転写物は二者択一パターンのスプライシングを受け
、１つの一次転写物から異なる種類のmRNAに形成される。更に、ある転写物は、
エキソンが別の転写物のエキソンと結合する、トランススプライシング（trans-
splicing）を受ける。このような特異的な状況下では、スプライシングを仲介す
る特定のタンパク質補助因子が必要となる場合が多い。例えば、新規のスプライ
シング因子であるPR264が、ヒトの胸腺特異的c-myb転写物のトランススプライシ
ングに関係する（Vellard, M. 他 (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:2511
-2515）。

【０００６】 ヘテロ核リボ核タンパク質（hnRNP）は、スプライシング及び細胞質への成熟R
NAの輸送、ｍRNAの翻訳において役割を果たしていることがわかっている（Biamo
nti, G. 他 (1998) Clin. Exp. Rheumatol. 16:326−506）。hnRNPの例の中には
、RNAの3'末端の切断及びポリアデニル化に関与する酵母タンパク質Hrp1pと、RN
Aの5'末端のキャップ構造の付加に関与するCbp80pと、核からのmRNAの輸送に関
与する哺乳類hnRNP A1の相同体であるNp13pとがある（Shen, E.C. 他 (1998) Ge
nes Dev. 12:679-691）。hnRNPは、リウマチ病における自己免疫応答の重要な標
的であることがわかっている（Biamonti、前出）。

【０００７】 新生のtRNA転写物は、スプライソソームの機構とは異なる非通常性の機構によ
ってスプライシングされる。この場合、スプライシングは、tRNAの二次構造の特
徴を認識する特異的なリガーゼ及びエンドヌクレアーゼによって行われる。この
プロセスは、イントロンの特定のヌクレオチド配列が認識されるスプライソソー
ム反応とは対照的である。更に、tRNAは、5'配列の除去及び幾つかのヌクレオチ
ド塩基の化学修飾によって更なるプロセシングがなされる。tRNAのプロセシング
は、酵母において広範に研究され、tRNA特異的スプライシング因子が同定された
（例えば、Shen, W. C. 他 (1993) J. Biol. Chem. 268:19436-19444を参照）。

【０００８】 タンパク質はまた、細胞の翻訳機構の一部である。真核生物のリボソームは60
S（大きい）のサブユニットと40S（小さい）のサブユニットとで構成され、80S
のリボソームを形成する。更に、リボソームは、18S及び28S、5S、5.8SのrRNAに
加えて、50以上のタンパク質を含む。リボソームタンパク質には、属するサブユ
ニットを示すL（大きい）或いはS（小さい）の接頭辞が付いている。多数のサブ
ユニットを有するものが多い開始因子は、開始ｔRNAとmRNAとリボソーム40Sサブ
ユニットをまとめることに関与するタンパク質である。グアニンヌクレオチド結
合タンパク質である真核生物開始因子2（elF2）は、リボソーム40Sサブユニット
に開始ｔRNAを補充する。elF2は、GTPに結合した場合にのみ開始ｔRNAと結合す
る。グアニンヌクレオチド交換タンパク質であるelF2Bは、elF2のGDP結合不活性
型からGTP結合活性型への変換に関与する。他の開始因子には、elF1A及びelF3、
elF4F（elF4E及びelF4A、elf4Gを含む複合体）、elF5が含まれる。伸長因子であ
るEF1α、EF1βγ、EF2は、翻訳開始後のポリペプチド鎖の伸長に関与し、終結
因子eRFによって翻訳が停止される（例えば、V. M. Pain (1996) Fur. J. Bioch
em. 236:747-771を参照）。

【０００９】 翻訳に関与する他の重要なRNA関連酵素には、アミノアシル-tRNAシンテターゼ
がある。タンパク質の生合成は、好適なtRNAと連鎖を形成する各アミノ酸による
。アミノアシル-tRNAシンテターゼは、アミノ酸とそれと同族のtRNAとの結合の
開始及びその修正に関与する。２０のアミノアシル-tRNAシンテターゼ酵素は、
２つの構造的なクラスに分類でき、それぞれは触媒ドメインの固有の形態によっ
て特徴付けられる。クラスI酵素には、ヌクレオチド結合ロスマンフォールドに
基づいた触媒ドメインが含まれる。クラスII酵素には、C末端調節ドメインと、7
本鎖逆平行βシートモチーフからなる中央の触媒ドメインとが含まれる。クラス
II酵素は、その構造がヘテロ二量体構造であるかホモ二量体構造であるかによっ
て、２つのグループに分類でき、ホモ二量体のグループは、N及びC末端の調節ド
メインの構造によって更に細分化できる（Hartlein, M. 及び Cusack, S. (1995
) J. Mol. Evol. 40:519-530）。アミノアシル-tRNAに対する自己抗体が、皮膚
筋炎及び多発性筋炎の患者によって産生され、間質性肺疾患の合併症（ILD）と
密接な関連がある。これらの抗体は、ウイルス感染に応答して産生されると思わ
れるため、動物に実験的にウイルス性筋炎を誘発させるべくコクサッキーウイル
スを用いた。

【００１０】 mRNAの翻訳及び局在化、安定化は、mRNAの5'及び3'の未翻訳（UTR）領域に結
合する調節タンパク質によって調節される場合が多い。このようなタンパク質の
例には、マウス精細胞核周囲RNA結合タンパク質であるSpnrがある。このSpnrは
、RNAの輸送及び翻訳の開始、RNAの細胞質ミクロチューブへの局在化に関与する
と推定される（Schumacher, I. M. 他 (1995) J. Cell Biol. 129:1023-1032）
。RNA関連タンパク質は、RNAの高次構造及び二次構造を変え、調節すると思われ
る。これらのプロセスは、ATPの加水分解によるエネルギーを利用してRNA二重鎖
を不安定化して巻き戻すRNAヘリカーゼの介在によって起こる。最も特徴があり
、広範に分布するRNAヘリカーゼのファミリーは、DEADボックスファミリーであ
る。この名前は、このファミリーのタンパク質の特徴である保存されたB型ATP結
合モチーフからついた。40以上のDEADボックスヘリカーゼが、細菌及び昆虫、酵
母、両生類、哺乳類、植物などの様々な生物で同定された。DEADボックスヘリカ
ーゼは、翻訳の開始及びスプライシング、リボソーム形成、RNAの編集及び輸送
、安定化などの様々なプロセスにおいて機能する。DEADボックスヘリカーゼの中
には、精子形成及び胚形成において組織特異的及びステージ特異的役割を果たす
ものもある。全てのDEADボックスヘリカーゼには、約420以上ものアミノ酸に渡
る幾つかの保存された配列モチーフが含まれる。これらのモチーフには、A型ATP
結合モチーフ及びDEADボックス/B型ATP結合モチーフ、機能が未知のセリン/アル
ギニン/スレオニントリペプチド、基質の結合及び巻き戻しに役割を果たす可能
性のあるC末端多グリシンモチーフがある。更に、様々なDEADボックスヘリカー
ゼ配列のアラインメントによって、これらの配列の間に同一の37個のアミノ酸残
基があることがわかった。従って、保存されたこれらの残基がヘリカーゼ機能に
重要であると思われる（Linder, P. 他. (1989) Nature 337:121-122）。

【００１１】 DEADボックス１タンパク質（DDX1）の過剰な発現は、ニューロブラストーマ（
Nb）及び網膜芽細胞（Rb）腫瘍の進行にある役割を果たしていると推定される（
Godhout, R. 他 (1998) J. Biol. Chem. 273:21161-21168）。この知見は、DDX1
が、癌細胞におけるRNAの正常な二次構造及びRNAの発現レベルを変えて、腫瘍の
進行を促進し得ることを示唆している。他のDEADボックスは、腫瘍形成に直接的
或いは間接的に関与している（前出のGodhoutに記載されている）。例えば、紫
外線誘発腫瘍においてマウスp68の変異が見られ、ヒトDDX6がB細胞リンパ腫に関
連する染色体限界点に位置する。同様に、DDX10及びNUP98からなるキメラタンパ
クであるnucleoporinタンパク質は、ある骨髄悪性腫瘍に関与する可能性がある
。

【００１２】 リボヌクレアーゼ（RNA分解酵素）は、RNA鎖のホスホジエステル結合の加水分
解、即ちRNAの切断を触媒するRNA関連酵素である。例えば、RNA分解酵素Pは、tR
NAの成熟プロセスの一環としてtRNAの5'末端を切断するリボ核タンパク質酵素で
ある。RNA分解酵素Hは、RNA/DNAハイブリッドのRNA鎖を消化する。このようなハ
イブリッドは、レトロウイルスに侵された細胞で発生し、RNA分解酵素Hはレトロ
ウイルス複製サイクルに重要な酵素である。RNA分解酵素Hドメインは、逆転写酵
素と関係するドメインとして発見される場合が多い。血清及び細胞抽出物におけ
るRNA分解酵素の活性が、様々な癌及び感染症において上昇する（Schein, C.H.
(1997) Nat. Biotechnol. 15:529-536）。RNA分解酵素の活性を調節して、腫瘍
脈管形成及びアレルギー反応、ウイルス感染症及び複製、真菌感染をコントロー
ルできるか研究されてきた。

【００１３】 多くのsnRNP及びhnRNPタンパク質が、RNA認識モチーフ（RRM）によって特徴付
けられる（Birney, E. 他 (1993) Nucleic Acids Res. 21:5803-5816）。RRMは
約80個のアミノ酸の長さであり、α/βサンドイッチに配置された４つのβ鎖と
２つのαへリックスを形成する。RRMには、コアRNP-１オクタペプチドモチーフ
とその周りの保存された配列とが含まれる。SnRNPタンパク質の他に、上記のモ
チーフを含むRNA結合タンパク質の例には、二者択一のスプライシングを調節す
る因子及び新生のRNAを安定化する異核リボ核タンパク質（heteronuclear ribon
ucleoprotein）が含まれる。二者択一スプライシング因子には、キイロショウジ
ョウバエ及び線虫などの下位の真核生物で同定された発生的に調節されるタンパ
ク質が含まれる。これらのタンパク質は、パターン形成及び性決定などのそれぞ
れの発生プロセスにおいて重要な役割を果たす（例えば、Hodgkin, J. 他. (199
4) Development 120:3681-3689を参照）。RRMには、snRNPタンパク質及びhnRNP
タンパク質、スプライシング因子、mRNA結合タンパク質、転写調節タンパク質に
見られるリボ核タンパク質-１（RNP-1）RNA結合モチーフがある。RNA結合タンパ
ク質の他の特徴には、アルギニンとセリン残基の反復領域（RS反復）がある。

【００１４】 新規のヒトRNA関連タンパク質及びそれらをコードするポリヌクレオチドの発
見により、細胞増殖異常及び自己免疫異常／炎症性疾患、感染症の診断及び治療
、予防に有用な新規の組成物を提供することで当分野のニーズに答えることがで
きる。

【００１５】 発明の要約 本発明は、個別には、「RNAAP−1」及び「RNAAP−2」−「RNAAP−25」、総称
して「RNAAP」と呼ぶヒトRNA関連タンパク質である実質的に精製されたポリペプ
チドを提供する。本発明の一実施態様では、SEQ ID NO:1−25及びそれらの断片
からなる一群から選択されたアミノ酸配列を含む実質的に精製されたポリペプチ
ドを提供する。

【００１６】 更に本発明は、SEQ ID NO:1−25及びそれらの断片からなる一群から選択され
たアミノ酸配列の少なくとも１つと９０％以上のアミノ酸同一性を有する実質的
に精製された変異体を提供する。本発明はまた、SEQ ID NO:1−25及びそれらの
断片からなる一群から選択されたアミノ酸配を含むポリペプチドをコードする単
離され実質的に精製されたポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、SEQ ID
NO:1−25及びそれらの断片からなる一群から選択されたアミノ酸配列を含むポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチドと少なくとも７０％以上のポリヌクレ
オチド配列同一性を有する単離され精製されたポリヌクレオチド変異配列を提供
する。

【００１７】 更に、本発明は、SEQ ID NO:1−25及びそれらの断片からなる一群から選択さ
れたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと厳密な条
件の下でハイブリダイズする単離され精製されたポリヌクレオチドを提供する。
また本発明は、SEQ ID NO:1−25及びそれらの断片からなる一群から選択された
アミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと相補的な配列
を含む単離され精製されたポリヌクレオチドとを提供する。

【００１８】 本発明はまた、核酸を含むサンプルにおいて、ポリヌクレオチドを検出する方
法であって、（ａ）ポリヌクレオチド配列を、少なくとも１つのサンプルのポリ
ヌクレオチドとハイブリダイズして、ハイブリダイゼーション複合体を形成する
過程と、（ｂ）そのハイブリダイゼーション複合体を検出する過程とを含み、そ
のハイブリダイゼーション複合体の存在とサンプルにおけるポリヌクレオチドの
存在とが相関性を有する、検出方法を提供する。本発明の一実施態様では、ハイ
ブリダイゼーションの前にポリヌクレオチドを増幅する過程を含む。

【００１９】 本発明はまた、SEQ ID NO:26−50及びそれらの断片からなる一群から選択され
たポリヌクレオチド配列を含む単離され精製されたポリヌクレオチドを提供する
。また、本発明は、SEQ ID NO:26−50及びそれらの断片からなる一群から選択さ
れたポリヌクレオチド配列と７０％以上のポリヌクレオチド配列同一性を有する
単離され精製されたポリヌクレオチド変異配列を提供する。更に本発明は、SEQ
ID NO:26−50及びそれらの断片からなる一群から選択されたポリヌクレオチド配
列を含むポリヌクレオチドと相補的な配列を有する単離され精製されたポリヌク
レオチドを提供する。

【００２０】 本発明は更に、SEQ ID NO:1−25及びそれらの断片からなる一群から選択され
たアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの少なくとも
１つの断片を含む発現ベクターを提供する。別の実施態様では、発現ベクターは
宿主細胞内に含まれる 本発明はまた、ポリペプチドを製造する方法であって、（ａ）ポリペプチドの
発現に好適な条件の下、ポリヌクレオチドの少なくとも１つの断片を有する発現
ベクターを含む宿主細胞を培養する過程と、（ｂ）その宿主細胞の培地からその
ポリペプチドを回収する過程とを含む製造方法を提供する。

【００２１】 本発明はまた、SEQ ID NO:1−25及びそれらの断片からなる一群から選択され
たアミノ酸配列を有する実質的に精製されたポリペプチドを含む医薬品組成物を
好適な医薬用担体と共に提供する。

【００２２】 更に本発明は、SEQ ID NO:1−25及びそれらの断片からなる一群から選択され
たポリペプチドと結合する精製された抗体を提供する。また、本発明は、そのポ
リペプチドの精製されたアゴニスト及びアンタゴニストを提供する。

【００２３】 本発明はまた、RNAAPの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予
防が必要な患者にSEQ ID NO:1−25及びそれらの断片からなる一群から選択され
たアミノ酸配列を有する実質的に精製されたポリペプチドを含む医薬品組成物を
好適な医薬用担体と共に効果的な量投与することを含む、RNAAPの発現または活
性の低下に関連した疾患の治療または予防方法を提供する。

【００２４】 本発明はまた、RNAAPの発現または活性の増大に関連した疾患の治療または予
防が必要な患者にSEQ ID NO:1−25及びそれらの断片からなる一群から選択され
たアミノ酸配列を有するポリペプチドのアンタゴニストを効果的な量投与するこ
とを含む、RNAAPの発現または活性の増大に関連した疾患の治療または予防方法
を提供する。

【００２５】 本発明の記載について 本発明のタンパク質及び核酸配列、方法について説明する前に、本発明は、こ
こに開示した特定の装置及び材料、方法に限定されず、その実施形態を変更でき
ることを理解されたい。また、ここで用いられる用語は、特定の実施例のみを説
明する目的で用いられたものであり、後述の請求の範囲によってのみ限定され、
本発明の範囲を限定することを意図したものではないということも理解されたい
。

【００２６】 本明細書及び請求の範囲において単数形を表す「或る」、「その（この等）」
は、文脈で明確に示していない場合は複数形を含むことに注意されたい。従って
、例えば「或る宿主細胞」は複数の宿主細胞を含み、その「抗体」は複数の抗体
は含まれ、当業者には周知の等価物なども含まれる。

【００２７】 本明細書で用いた全ての科学技術用語は、別の方法で定義されていない限り、
本発明の属する技術分野の一般的な技術者が普通に解釈する意味と同じである。
本明細書で記述したものと類似、或いは同等の全ての装置及び材料、方法は本発
明の実施及びテストに使用できるが、好適な装置及び材料、方法をここに記す。
本明細書に記載の全ての文献は、本発明に関連して使用する可能性のある文献に
記載された細胞系、プロトコル、試薬、ベクターを記述し開示するために引用し
た。従来の発明を引用したからと言って、本発明の新規性が損なわれると解釈さ
れるものではない。

【００２８】 定義 本明細書において「RNAAP」とは、天然、合成、半合成或いは組換え体など全
ての種（特にウシ、ヒツジ、ブタ、マウス、ウマ及び好ましくは人類を含む哺乳
動物）から得られる実質的に精製されたRNAAPのアミノ酸配列のことである。

【００２９】 本明細書において「アゴニスト」とは、RNAAPと結合したとき、RNAAPの効果を
増大する、或いはその持続時間を延長する分子のことである。このアゴニストに
は、RNAAPに結合してその効果を変調するタンパク質、核酸、糖質、任意の他の
分子を含み得る。

【００３０】 本明細書において、「アレル変異配列」とは、RNAAPをコードする遺伝子の別
の形である。アレル変異配列は、核酸配列における少なくとも１つの変異によっ
て生じ、変異ｍＲＮＡ若しくは変異ポリペプチドになり、これらの構造や機能は
変わる場合もあれば変わらない場合もある。天然或いは組換え体のすべての遺伝
子には、アレル形が存在しないもの、１つ或いは多数存在するものがある。一般
にアレル変異配列を生じる変異は、ヌクレオチドの自然な欠失、付加、或いは置
換による。これらの各変異は、単独或いは他の変異と同時に起こり、所定の配列
内で一回或いはそれ以上生じる。

【００３１】 本明細書において、RNAAPをコードする「変異」核酸配列とは、様々なヌクレ
オチドの欠失、挿入、或いは置換が起こっても、RNAAPと同じポヌクレオチド或
いはRNAAPの機能特性の少なくとも１つを備えるポリペプチドのことである。こ
の定義には、RNAAPをコードするポリヌクレオチド配列の正常の染色体の遺伝子
座ではない位置でアレル変異配列と不適当或いは予期せずハイブリダイゼーショ
ン、及びRNAAPをコードするポリヌクレオチドの特定のオリゴヌクレオチドプロ
ーブを用いて、容易に検出可能な或いは検出困難な多形性を含む。コードされた
タンパク質も変異され得り、サイレント変化を生じRNAAPと機能的に等価となる
アミノ酸残基の欠失、挿入、或いは置換を含み得る。意図的なアミノ酸置換は、
生物学的或いは免疫学的にRNAAPの活性が保持される範囲で、残基の極性、電荷
、溶解度、疎水性、親水性、及び／または両親媒性についての類似性に基づいて
成され得る。たとえば、負の電荷をもつアミノ酸は、アスパラギン酸及びグルタ
ミン酸を含み得り、正の電荷をもつアミノ酸は、リジン及びアルギニンを含み得
り、そして近い親水性値をもち非電荷極性頭基を有するアミノ酸は、ロイシン、
イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリ
ン、トレオニン、フェニルアラニン及びチロシンを含みうる。

【００３２】 本明細書において「アミノ酸」及び「アミノ酸配列」とは、オリゴペプチド、
ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質配列及びその断片であり、天然の分子
または合成された分子である。RNAAPの断片である「断片」及び「免疫原性断片
」、「抗原性断片」は、好ましくはアミノ酸約５〜約１５個の長さであり、最も
好ましくはアミノ酸１４個の長さであり、RNAAPのある生物学的活性または免疫
学的活性を保持する。ここでは、「アミノ酸配列は自然発生タンパク質分子のア
ミノ酸配列であるが、アミノ酸配列及び類似の用語は、列記したタンパク質分子
に関連する完全で元のままのアミノ酸配列に限定されるわけではない。

【００３３】 本明細書において用語「増幅」とは、核酸配列の追加的な複製を生成すること
に関連する。増幅は、一般にはこの技術分野では周知のポリメラーゼ連鎖反応（
ＰＣＲ）技術を用いて行われる。

【００３４】 本明細書において、「アンタゴニスト」とは、RNAAPと結合したとき、RNAAPの
生物学的または免疫学的活性の効果の程度を低下させたり、その持続時間を短縮
する分子である。アンタゴニストは、タンパク質、核酸、糖質、抗体またはRNAA
Pの効果を減少させるの他の分子である。

【００３５】 本明細書において「抗体」とは、Fab及びＦ(ab')₂、及びそれらの断片、Ｆｖ
断片などの無傷の分子であり、抗原決定基と結合可能である。RNAAPポリペプチ
ドと結合する抗体は、抗体を免疫する目的の小さなペプチドを含む無傷の分子ま
たはその断片を用いて調整可能である。動物（例えば、マウス、ラット、若しく
はウサギ）を免疫化するのに使用されるポリペプチド或いはオリゴペプチドは、
ＲＮＡの翻訳から引き出されたり、化学的に合成され得り、必要に応じて担体プ
ロテインと結合することも可能である。ペプチドと化学的に結合した一般に用い
られる担体は、ウシ血清アルブミン、チログロビン、及びキーホールリンペット
ヘモニアン（ＫＬＨ）を含む。次ぎに、この結合したペプチドを用いて動物を免
疫化する。

【００３６】 本明細書において「抗原決定基」とは、特定の抗体と接触する分子のフラグメ
ント（即ちエピトープ）である。タンパク質或いはタンパク質の断片が、宿主動
物を免疫化するのに用いられるとき、このタンパク質の種々の領域は、抗原決定
基（タンパク質上の所定の領域或いは三次元構造体）に特異的に結合する抗体の
産生を誘発し得る。抗原決定基は、抗体と結合するために無傷の抗原（即ち、免
疫応答を引き出すために用いられる免疫原）と競合し得る。

【００３７】 本明細書において「アンチセンス」とは、特定の核酸配列のセンス鎖と相補的
な核酸配列を含む全ての組成物である。アンチセンス分子は、合成や転写を含む
任意の方法で作り出すことができる。相補的ヌクレオチドは、一度細胞に導入さ
れると、細胞によって作られた天然の配列と結合して二重鎖を形成し、転写や翻
訳を阻害する。「マイナス（−）」という表現はアンチセンス鎖と言え、「プラ
ス（＋）」という表現はセンス鎖と言える。

【００３８】 本明細書において「生物学的活性」とは、自然発生分子の構造的、調節的、或
いは生化学的機能を有するタンパク質のことである。同様に、「免疫学的に活性
」とは、天然或いは組換え体のRNAAP、合成のRNAAPまたはそれらの任意のオリゴ
ペプチドが、適当な動物或いは細胞の特定の免疫応答を誘発して特定の抗体と結
合する能力のことである。

【００３９】 本明細書において「相補的」若しくは「相補性の」とは、許容の塩と許容の温
度条件の下で、塩基対の形成によってポリヌクレオチドが自然に結合することで
ある。例えば、配列「Ａ−Ｇ−Ｔ」と相補的な配列「Ｔ−Ｃ−Ａ」と結合する。
２つの一本鎖分子間の相補性は、幾つかの核酸が結合するのみの部分的な場合、
或いは一本鎖間に完全な相補性が存在して完全な相補性となる場合があり得る。
核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率及び強度
に大きな影響を与える。このことは、核酸鎖間の結合に左右される増幅反応、並
びにペプチド核酸（ＰＮＡ）分子の設計若しくは使用において特に重要である。

【００４０】 本明細書において「所定のポリヌクレオチド配列を含む組成物」または「所定
のアミノ酸配列を含む組成物」とは広い意味で、所定のヌクレオチド配列或いは
アミノ酸配列を含む任意の組成物のことである。この組成物は、乾燥した製剤或
いは水溶液、無菌組成物を含み得る。RNAAP若しくはRNAAPの断片をコードするポ
リヌクレオチド配列を含む組成物は、ハイブリダイゼーションプローブとして使
用され得る。このプローブは、凍結乾燥状態で保存可能であり、糖質などの安定
化剤と結合可能である。ハイブリダイゼーションにおいて、プローブは、塩（例
えば、ＮａＣｌ）及び界面活性剤（例えば、ＳＤＳ）、その他の物質（例えば、
デンハート液、乾燥ミルク、サケ精子ＤＮＡ等）を含む水溶液に展開され得る。

【００４１】 本明細書において「コンセンサス配列」とは、不要な塩基を分離するために再
配列された核酸配列であって、ＸＬ−ＰＣＲ^ＴＭ（Perkin Elmer, Norwalk, CT
）を用いて５'及び／または３'の方向に延長されて再配列された核酸配列、或い
はGELVIEW Fragment Assembly system（GCG, Madison, WI）などのフラグメント
の構築のためのコンピュータプログラムを用いて２つ以上のインサイトクローン
社の重複配列から構築された核酸配列のことである。延長及び構築の両方によっ
てコンセンサス配列に構築されるものもある。

【００４２】 本明細書において「ポリヌクレオチドの発現と相関性を有する」とは、ノーザ
ン分析によるRNAAPをコードする核酸配列と同じ或いは関連する核酸の検出が、
サンプル内のRNAAPをコードする核酸の存在を示すことから、RNAAPをコードする
ポリヌクレオチドからの転写物の発現と相関性を有することを意味する。

【００４３】 本明細書において「欠失」とは、１個以上のアミノ酸残基若しくは核酸残基が
欠如するアミノ酸配列若しくは核酸配列の変化である。

【００４４】 本明細書において「誘導体」とは、ポリペプチド配列またはポリヌクレオチド
配列の化学修飾のことである。ポリヌクレオチド配列の化学修飾には、例えば、
アルキル基、アシル基、或いはアミノ基による水素の置換がある。誘導体ポリヌ
クレオチドは、自然分子（未修飾の分子）の生物学的或いは免疫学的機能を少な
くとも１つ保持するポリペプチドをコードする。誘導体ポリペプチドとは、もと
のポリペプチドの生物学的機能、或いは免疫学的機能を少なくとも１つ保持する
、グリコシル化、ポリエチレングリコール化、或いは任意の同様のプロセスによ
って修飾されたものである。

【００４５】 本明細書において「類似性」とは、相補性の程度を表すものである。これには
、部分的類似性と完全な類似性とがあり得る。この「同一性」は「類似性」とも
言える。同一の配列が標的の核酸とハイブリダイゼーションするのを少なくとも
部分的に阻止する部分的に相補的な配列は、「実質的に同様」と呼ばれる。完全
に相補的な配列と標的の配列とのハイブリダイゼーションの抑制は、厳密性を低
下させた条件の下ハイブリダイゼーションアッセイ（サザンブロッティング或い
はノーザンブロッティング法、溶液ハイブリダイゼーション等）を用いて検査さ
れる。実質的に同様の配列或いはハイブリダイゼーションプローブは、厳密性を
低下させた条件の下、完全に相補的な配列と標的の配列との結合に対して競合し
て抑制する。これは、厳密性を低下させた条件では、２つの配列の互いへの結合
が特異的（即ち、選択的）に相互作用しなけらばならず、厳密性を低下させた条
件の下では非特異的な結合が許容されるということではない。部分的な相補性と
もいえない（例えば、３０％未満の類似性或いは同一性）第２の標的配列を用い
て、非特異的結合が存在しないことの検査が可能である。非特異的結合が存在し
ない場合は、実質的に類似配列或いはプローブが第２の非相補的標的配列とハイ
ブリダイゼーションしない。

【００４６】 本明細書において「百分率同一性」又は「％同一性」とは、２つ以上のアミノ
酸配列或いは核酸配列の比較で見つかった配列類似性の百分率のことである。こ
の百分率同一性は、例えば、MEGALIGNプログラム(DNASTAR, Madison WI)など電
子装置を用いて決定可能である。このMEGALIGNプログラムは、様々な方法、例え
ば、クラスター方法 (例えば、Higgins, D.G.及びP.M. Sharp (1988) Gene73:23
7-244.を参照)に従って、２つ以上の配列間のアライメントを作り出すことが可
能である。クラスターアルゴリズムが、全ての組の間の距離を測って、配列を各
クラスターに分類する。これらのクラスターは、組によって整列され、次ぎにグ
ループに分けられる。２つのアミノ酸の配列間の百分率類似性、例えば配列Ａと
配列Ｂの百分率類似性は、配列Ａと配列Ｂの一致する残基の合計数を、配列Ａの
長さから配列Ａのギャップ残基数と配列Ｂのギャップ残基数とを差し引いたもの
で除し、それに１００を掛けることによって得られる。２つのアミノ酸配列間の
低い類似性或いは非類似性のギャップは、百分率類似性の決定には含まれない。
核酸配列間の百分率同一性はまた、クラスター法或いはJotun Hein法などの当分
野で周知の別の方法によってカウント或いは計算することも可能である(例えば
、Hein. J. (1990) Methods Enzymol. 183:626-645.を参照)。配列間の同一性は
また、例えば、ハイブリダイゼーションの条件を変えるなどの当分野で周知の別
の方法によって決定することも可能である。

【００４７】 「ヒト人工染色体（ＨＡＣ）」は、６Ｋｂ〜１０ＭｂのサイズのＤＮＡ配列を
含み得り、安定した分裂染色体の分離及び維持に必要な全ての要素を含む直鎖状
の微小染色体である（Harrington, J.J.等 (1997) Nat Genet. 15:345-355を参
照）。

【００４８】 本明細書において「ヒト化抗体」とは、もとの結合能力を保持しつつよりヒト
の抗体に似せるために、非抗原結合領域のアミノ酸配列が変異された抗体分子で
ある。

【００４９】 本明細書において「ハイブリダイゼーション」とは、核酸の一本鎖が相補的な
一本鎖と塩基対を形成して結合する全てのプロセスである。

【００５０】 本明細書において「ハイブリダイゼーション複合体」とは、相補的な塩基対間
の水素結合の形成によって、２つの核酸配列間に形成された複合体のことである
。ハイブリダイゼーション複合体は溶液中（例えば、Ｃ_０ｔまたはＲ_０ｔ分析）
で形成されるか、或いは溶液中の１つの核酸配列と固体の支持物（例えば、紙、
膜、フィルター、チップ、ピン、或いはスライドガラス、または細胞及びその核
酸を固定する任意の適当な基板）に固定されたもう一つの核酸配列との間で形成
され得る。

【００５１】 本明細書において「挿入」或いは「付加」とは、自然発生の分子の配列に対し
て、１個以上のアミノ酸残基或いはヌクレオチドがそれぞれ追加されるアミノ酸
配列或いは核酸配列の変化のことである。

【００５２】 本明細書において「免疫応答」とは、炎症性疾患及び外傷、免疫異常、感染症
、遺伝病などと関係する症状である。これらの症状は、細胞系及び全身防衛系に
影響を及ぼすサイトカイン及びケモカイン、別の情報伝達分子などの様々な因子
の発現によって特徴づけられ得る。

【００５３】 本明細書において「マイクロアレイ」とは、基板上に配列された様々なポリヌ
クレオチドのアレイのことである。

【００５４】 本明細書のマイクロアレイの記述における「要素」或いは「アレイ要素」とは
、基板の表面に配列されたハイブリダイゼーション可能なポリヌクレオチドのこ
とである。

【００５５】 本明細書において「変調」とは、RNAAPの活性の変化のことである。変調の例
として、RNAAPのタンパク質活性の特性、或いは結合特性、またはその他の生物
学的特性、機能的特性或いは免疫学的特性の変化がある。

【００５６】 本明細書において「核酸」或いは「核酸配列」とは、ヌクレオチド、オリゴヌ
クレオチド、ポリヌクレオチド、或いはそれらの断片を指す。また、一本鎖若し
くは二本鎖のセンス鎖或いはアンチセンス鎖であるゲノム若しくは合成起源のＤ
ＮＡ或いはＲＮＡと、またペプチド核酸（PNA）や任意のＤＮＡ様物質、ＲＮＡ
様物質も指す。本明細書において「断片（またはフラグメント）」とは、（例え
ば、同じゲノム内の任意の別の配列とは異なる）SEQ ID NO:26−50を特別に同定
する独特のポリヌクレオチド配列の領域を含む核酸配列のことである。例えば、
SEQ ID NO:26−50は、ハイブリダイゼーション及び増幅技術に有用であり、更に
、関連ポリヌクレオチド配列からSEQ ID NO:26−50を区別する類似性の検査にも
有用である。SEQ ID NO:26−50の断片は、少なくともヌクレオチド１５〜２０個
の長さである。この断片に対応するSEQ ID NO:26−50の正確な長さ及びSEQ ID N
O:26−50の領域は、断片の使用目的に基づいた当分野で一般的な技術の１つを用
いて日常業務的に決定できる。また、断片は翻訳された場合、完全長のポリペプ
チドの抗原性などのいくつかの機能的特徴或いはＡＴＰ結合部位などの構造的ド
メイン特徴を維持したポリペプチドを形成し得る。

【００５７】 本明細書において「機能的に関係した」及び「機能的に結合した」とは、機能
的に関係する核酸配列のことである。コードされたポリペプチドの転写をプロモ
ータが制御する場合、そのプロモーターはコードする配列と機能的に関係する或
いは機能的に結合する。機能的に関係した或いは機能的に結合した核酸配列は近
接して同じ読み枠内に存在し得るが、リプレッサー遺伝子などのある種の遺伝子
要素は、ポリペプチドをコードする配列とは近接して結合していないが、ポリペ
プチドの発現を調節するオペレーター配列とは結合したままである。

【００５８】 本明細書において「オリゴヌクレオチド」とは、ＰＣＲ増幅、ハイブリダイゼ
ーション、或いはマイクロアレイに使用可能な核酸配列のことであり、その長さ
は少なくとも６ヌクレオチドから６０ヌクレオチドである。好ましくは約１５か
ら３０ヌクレオチドであり、さらに好ましいくは約２０から２５のヌクレオチド
である。本明細書において、オリゴヌクレオチドは、当技術分野では同一と定義
される「アンプリマー」及び「プライマー」、「オリゴマー」と実質的に同じで
ある。

【００５９】 本明細書において「ペプチド核酸」（ＰＮＡ）とは、末端がリジンで終わるア
ミノ酸残基のペプチドバックボーンに結合した、約５ヌクレオチド以上の長さの
オリゴヌクレオチドを含むアンチセンス分子又は抗遺伝子剤のことである。この
末端のリジンにより、この組成物が溶解性を有する。ＰＮＡは、相補的な一本鎖
ＤＮＡやＲＮＡに優先的に結合して転写物の伸長を止め、ポリエチレングリコー
ル化して細胞において寿命を延ばし得る。（例えば、Nielsen, P.E.他(1993) An
ticancer Drug Des. 8:53-63を参照）。

【００６０】 本明細書において「サンプル」とは、その最も広い意味で用いられている。RN
AAPをコードする核酸若しくはその断片、RNAAP自体を含むと推測される生物学的
サンプルには、体液と、細胞からの抽出物や細胞から単離された染色体や細胞内
小器官、膜と、細胞と、溶液中又は固体の支持物に固定されたゲノムＤＮＡ，Ｒ
ＮＡ，ｃＤＮＡと、組織又は組織プリント等も含まれ得る。

【００６１】 本明細書において「特異的結合」または「特異的に結合する」とは、タンパク
質或いはペプチドとアゴニスト或いは抗体、アンタゴニストとの間の相互作用の
ことである。この相互作用は、結合する分子によって認識される、例えば、抗原
決定基つまりエピトープなどのタンパク質の特定の構造の存在によって左右され
る。例えば、抗体がエピトープ「Ａ」に対して特異的である場合、結合していな
い標識した「Ａ」及びその抗体を含む反応において、エピトープＡを含むポリペ
プチドが存在するか或いは結合していない無標識の「Ａ」が存在すると、抗体と
結合する標識Ａの量が減少する。

【００６２】 本明細書において「厳密な条件」とは、ポリヌクレオチドと請求項に記載され
たポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションが可能な条件である。厳密な条
件は、塩濃度及び有機溶剤（例えば、ホルムアミド）の濃度、温度、及び当分野
で周知の別の条件によって決められる。詳細には、塩の濃度を下げたり、ホルム
アミドの濃度を上げたり、またハイブリダイゼーションの温度を上げることで厳
密性を高めることができる。

【００６３】 本明細書において「実質的に精製された」とは、自然の環境から取り除かれて
から、単離或いは分離された核酸配列或いはアミノ酸配列であって、自然に結合
している構成要素が少なくとも約６０％以上除去されたものであり、好ましくは
約７５％以上の除去、最も好ましいのは約９０％以上除去されたものである。

【００６４】 本明細書において「置換」とは、一つ以上のアミノ酸またはヌクレオチドをそ
れぞれ別のアミノ酸またはヌクレオチドに置き換えることである。

【００６５】 本明細書において「基板」とは、膜、フィルター、チップ、スライド、ウエハ
、ファイバー、磁気或いは非磁気のビード、ゲル、管、プレート、ポリマー、微
細粒子、毛管を含む好適な固体或いは半固体の支持物のことである。基板は、ポ
リヌクレオチドやポリペプチドが結合する壁及び溝、ピン、チャンネル、孔など
の様々な表面形態を有する。

【００６６】 本明細書において「形質転換」とは、外来ＤＮＡが入り込み受容体細胞を変化
させるプロセスのことである。形質転換は、当分野で周知の種々の方法により、
自然或いは人工の条件の下で起こり得り、原核宿主細胞若しくは真核宿主細胞の
中に外来核酸配列を挿入する任意の周知の方法によって行うことができる。この
形質転換の方法は、形質転換される宿主細胞のタイプによって選択される。この
方法には、ウイルス感染、電気穿孔法（エレクトロポレーション）、リポフェク
ション、及び微粒子照射が含まれるが、限定されるものではない。「形質転換さ
れた」細胞には、導入されたＤＮＡが自律的に複製するプラスミドとして或いは
宿主染色体の一部として複製可能である安定的に形質転換された細胞が含まれる
。さらに、限られた時間に一時的に導入ＤＮＡ若しくは導入ＲＮＡを発現する細
胞も含まれる。

【００６７】 本命鎖書において「変異体」とは、一つ以上のアミノ酸が変異したアミノ酸配
列である。この変異体には、例えばロイシンとイソロシンとの置換のような、置
換されたアミノ酸が類似の構造或いは類似の化学特性を有する「保存的」変異が
含まれる。稀ではあるが、変異体には、グリシンをトリプトファンで置換する「
非保存的」変異も含まれる。また、類似の小さな変異には、アミノ酸の欠失、挿
入、或いはその両方が含まれる。当分野で周知の例えばＬＡＳＥＲＧＥＮＥ^ＴＭ ソフトウエアを用いて、生物学的或いは免疫学的活性を損なうことなく、どのア
ミノ酸残基を置換、挿入、或いは欠失させるかを決めることができるであろう。

【００６８】 ポリヌクレオチド配列の文脈の中で用いられる「変異配列」とは、RNAAPに関
連したポリヌクレオチド配列を含み得る。この定義は、例えば、「アレル」、「
スプライス」、「種」、「多形性」変異配列についてもあてはまる。スプライ変
異配列は基準分子と極めて同一性が高い可能性があるが、ｍＲＮＡプロセシング
中のエキソンの交互のスプライシングによってポリヌクレオチドの数が多くなっ
たり、少なくなったりする。対応するポリペプチドは、機能ドメインが加わった
り、ドメインが減ったりし得る。種変異配列は、種によって異なるポリヌクレオ
チド配列である。できたポリペプチドは、互いに高いアミノ酸同一性を有する。
多形性変異配列は、所定の種と種の間の特定の遺伝子のポリヌクレオチド配列に
おける変異である。多形性変異配列はまた、ポリヌクレオチド配列の１つの塩基
が異なる「１つのヌクレオチド多形性」（ＳＮＰ）も含み得る。ＳＮＰの存在は
、例えば、或る集団、病態、病態の特徴を表し得る。

【００６９】 発明 本発明は、新規のヒトRNA関連タンパク質(RNAAP)、及びRNAAPをコードするポ
リヌクレオチドの発見に基づいた、細胞増殖異常及び自己免疫異常／炎症性疾患
、感染症の診断及び治療、予防におけるこれらの組成物の使用法に関する。

【００７０】 表１は、RNAAPをコードする完全長のヌクレオチド配列を得るために用いたイ
ンサイト社クローンのリストである。列１及び列２は、ポリペプチド及び核酸の
配列番号（SEQ ID NO）を示す。列３は、それぞれのRNAAPをコードする核酸が同
定されたインサイト社クローンのクローンＩＤを示し、列４は、これらのクロー
ンを単離したｃＤＮＡライブラリを示す。列５は、インサイト社クローン、それ
ぞれに対応するｃＤＮＡライブラリを示す。ｃＤＮＡライブラリが示されていな
いクローンは、プールされたｃＤＮＡライブラリに由来する。列５のクローンは
、各RNAAPのコンセンサスヌクレオチド配列の構築に用いられ、ハイブリダイゼ
ーション技術における断片として有用である。

【００７１】 表２の各列は、本発明の各ポリペプチドの様々な特性を示す。列１はアミノ酸
の配列番号(SEQ ID NO)、列２はそれぞれのポリペプチドのアミノ酸残基の数、
列３及び列４はそれぞれ、潜在リン酸化部位、潜在グリコシル化部位を示す。列
５はサイン配列及びモチーフを含むアミノ酸残基を示す。列６は、各タンパク質
の識別を示す。列７は各タンパク質の相同配列、列７は配列相同性及びタンパク
質モチーフによって各タンパク質を同定するために用いた分析方法をそれぞれ示
す。

【００７２】 表３の各列は、RNAAPをコードするヌクレオチド配列に関連する、組織特異性
及び疾患、異常症、症状を示す。表３の列１はヌクレオチド配列番号を示す。列
２は、RNAAPを発現する組織、及び全組織におけるその組織の発現割合を示す。
列３は、RNAAPを発現する組織と関連する疾患、異常症、病態を示す。列４は、
ｃＤＮＡライブラリのサブクローニングに用いたベクターを示す。

【００７３】 表４の各列は、RNAAPをコードするｃＤＮＡクローンを単離したｃＤＮＡライ
ブラリの作製に用いた組織の説明である。列１は、ヌクレオチド配列番号を示し
、列２は、それぞれのクローンを単離したｃＤＮＡライブラリを示し、列３は、
組織の由来及び列２のｃＤＮＡライブラリに関する説明である。

【００７４】 以下に示すRNAAPをコードするヌクレオチド配列の断片は、SEQ ID NO:26−50
を同定し、SEQ ID NO:26−50と関連ポリヌクレオチド配列とを区別するハイブリ
ダイゼーションまたは増幅技術等に有用である。有用な断片は、SEQ ID NO:26の
概ねヌクレオチド586から615までの断片と、SEQ ID NO:27の概ねヌクレオチド39
9から428までの断片と、SEQ ID NO:28の概ねヌクレオチド234から263までの断片
と、SEQ ID NO:29の概ねヌクレオチド40から69までの断片と、SEQ ID NO:30の概
ねヌクレオチド20から49までの断片と、SEQ ID NO:31の概ねヌクレオチド40から
80までの断片と、SEQ ID NO:32の概ねヌクレオチド672から713までの断片と、SE
Q ID NO:33の概ねヌクレオチド226から276までの断片と、SEQ ID NO:34の概ねヌ
クレオチド719から761までの断片と、SEQ ID NO:35の概ねヌクレオチド77から16
7までの断片及び概ねヌクレオチド168から259までの断片と、SEQ ID NO:36の概
ねヌクレオチド465から506までの断片と、SEQ ID NO:37の概ねヌクレオチド76か
ら117までの断片と、SEQ ID NO:38の概ねヌクレオチド136から180までの断片と
、SEQ ID NO:39の概ねヌクレオチド215から262までの断片及び概ねヌクレオチド
683から727までの断片、概ねヌクレオチド1805から1852までの断片と、SEQ ID N
O:40の概ねヌクレオチド162から206までの断片と、SEQ ID NO:41の概ねヌクレオ
チド379から423までの断片と、SEQ ID NO:42の概ねヌクレオチド164から208まで
の断片と、SEQ ID NO:43の概ねヌクレオチド1から42までの断片と、SEQ ID NO:4
4の概ねヌクレオチド249から296までの断片と、SEQ ID NO:45の概ねヌクレオチ
ド196から240までの断片と、SEQ ID NO:46の概ねヌクレオチド1から54までの断
片と、SEQ ID NO:47の概ねヌクレオチド463から507までの断片と、SEQ ID NO:48
の概ねヌクレオチド551から595までの断片及び概ねヌクレオチド866から910まで
の断片、概ねヌクレオチド1406から1450までの断片と、SEQ ID NO:49の概ねヌク
レオチド218から263までの断片及び概ねヌクレオチド758から802までの断片、概
ねヌクレオチド1190から1234までの断片と、SEQ ID NO:50の概ねヌクレオチド11
から70までの断片とである。

【００７５】 本発明はまた、RNAAPの変異体を含む。RNAAPの変異体は、RNAAPのアミノ酸配
列と好ましくは約８０％以上の配列同一性、更に好ましくは約９０％以上の配列
同一性、最も好ましくは約９５％以上の配列同一性を有し、RNAAPの機能的特性
或いは構造的特性のうちの少なくとも１つを含む。

【００７６】 本発明はまた、RNAAPをコードするポリヌクレオチドを含む。特定の実施例に
おいて、本発明は、RNAAPをコードするSEQ ID NO:26−50からなる一群から選択
された配列を有するポリヌクレオチド配列を含む。

【００７７】 本発明はまた、RNAAPをコードするポリヌクレオチド配列の変異配列を含む。
詳細には、このようなポリヌクレオチド配列の変異配列は、好ましくはRNAAPを
コードするポリヌクレオチド配列と約７０％以上の配列同一性、更に好ましくは
約８５％以上の配列同一性、最も好ましくは約９５％以上の配列の同一性を有す
る。また本発明の特定の実施態様では、SEQ ID NO:26−50からなる一群から選択
された核酸配列と少なくとも約７０％の配列同一性、好ましくは約８５％以上の
配列同一性、最も好ましくは約９５％以上の配列同一性を有するSEQ ID NO:26−
50からなる一群から選択された配列を含むポリヌクレオチド配列の変異配列を含
む。上記の各ポリヌクレオチド変異配列のすべてが、RNAAPの機能的或いは構造
的特徴の少なくとも１つを有するアミノ酸配列をコードする。

【００７８】 遺伝暗号の縮重により作り出され得るRNAAPをコードする種々のポリヌクレオ
チド配列には、既知の自然発生する任意の遺伝子のポリヌクレオチド配列と最小
の類似性しか有しないものも含まれることを、当業者は理解するであろう。した
がって本発明には、可能なコドン選択に基づいた組み合わせの選択によって作り
出され得る可能なポリヌクレオチド配列の変異の全てが含まれ得る。これらの組
み合わせは、自然発生のRNAAPのポリヌクレオチド配列に適用される標準的なト
リプレット遺伝暗号を基に作られ、全ての変異が明確に開示されていると考慮す
る。

【００７９】 RNAAPをコードするヌクレオチド配列及びその変異配列は、好適に選択された
厳密な条件の下で、自然発生のRNAAPのヌクレオチドとハイブリダイズ可能なこ
とが望ましいが、非自然発生のコドンを含めるなどの実質的に異なったコドンの
使用を有するRNAAP又はその誘導体をコードするヌクレオチド配列を作り出すこ
とは有益となり得る。特定のコドンが宿主によって利用される頻度に基づいてコ
ドンを選択して、ペプチドの発現が特定の真核細胞又は原核宿主に発生する割合
を高めることが可能である。コードされたアミノ酸配列を変えないで、RNAAP及
びその誘導体をコードするヌクレオチド配列を実質的に変更する別の理由は、自
然発生の配列から作られる転写物より例えば長い半減期など好ましい特性を備え
るＲＮＡ転写物を作ることにある。

【００８０】 本発明はまた、RNAAP及びその誘導体をコードするＤＮＡ配列又はそれらの断
片を完全に合成化学によって作り出すことも含む。作製後にこの合成配列を、当
分野で良く知られた試薬を用いて、種々の入手可能な発現ベクター及び細胞系の
何れの中にも挿入可能である。更に、合成化学を用いて、RNAAPまたはその任意
の断片をコードする配列の中に突然変異を導入することも可能である。

【００８１】 更に本発明には、種々の厳密性条件の下で、請求項に記載されたポリヌクレオ
チド配列とハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド配列が含まれる。詳しくは、
記載のSEQ ID NO:26−50またはその断片とハイブリダイズ可能なポリヌクレオチ
ド配列が含まれる。(例えば、Wahl, G.M.及びS.L. Berger (1987) Methods Enzy
mol. 152:399-407; 及び Kimmel. A.R. (1987) Methods Enzymol. 152:507-511.
を参照)。例えば、厳密な塩濃度は、通常は約７５０ｍＭ未満の塩化ナトリウム
と約７５ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウムであり、好ましくは約５００ｍＭ未満
の塩化ナトリウムと約５０ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウムであり、最も好まし
くは約２５０ｍＭ未満の塩化ナトリウムと約２５ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウ
ムである。例えば、ホルムアミドなどの有機溶剤を使用しないと、厳密性の低い
ハイブリダイゼーションになり、約３５％以上のホルムアミド、更に好ましくは
５０％以上のホルムアミドを使用すると、厳密性の高いハイブリダイゼーション
になる。温度の厳密条件は、通常は約３０℃以上であり、より好ましくは約３７
℃以上であり、最も好ましくは約４２℃以上である。その他の変更できるパラメ
ーターには、ハイブリダイゼーション時間、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）
などの薬品の濃度、キャリアＤＮＡの含有の有無があり、当分野の技術者には周
知である。必要な様々な条件を組み合わせることで、厳密性の程度を変えること
ができる。好適な実施例では、ハイブリダイゼーションは、温度が３０℃で、７
５０ｍＭの塩化ナトリウムと７５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、１％のＳＤＳで
行う。より好適な実施例では、温度が３７℃で、５００ｍＭの塩化ナトリウムと
５０ｍＭのクエン酸三ナトリウム、１％のＳＤＳ、３５％のホルムアミド、１０
０μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）で行う。最も好適な実施例で
は、温度が４２℃で、２５０ｍＭの塩化ナトリウムと２５ｍＭのクエン酸三ナト
リウム、１％のＳＤＳ、５０％のホルムアミド、２００μｇ／ｍｌのｓｓＤＮＡ
で行う。これらの条件の有用な変更は、当分野の技術者には明らかである。

【００８２】 ハイブリダイゼーションの後の洗浄過程にも、様々な厳密性の程度がある。洗
浄の厳密な条件は、塩濃度と温度によって決められる。上記したように、塩濃度
を下げること或いは温度を上げることで洗浄の厳密性を高めることができる。例
えば、洗浄過程での塩濃度の厳密な条件は、好ましくは約３０ｍＭ未満の塩化ナ
トリウムと約３ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウムであり、更に好ましくは約１５
ｍＭ未満の塩化ナトリウムと約１．５ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウムである。
洗浄過程の温度の厳密な条件は、通常は約２５℃以上であり、好ましくは約４２
℃以上であり、更に好ましくは約６８℃以上である。好適な実施例では、洗浄過
程は、温度が２５℃で、３０ｍＭの塩化ナトリウムと３ｍＭのクエン酸三ナトリ
ウム、０．１％ＳＤＳで行われる。より好適な実施例では、洗浄過程は、温度が
４２℃で、１５ｍＭの塩化ナトリウムと１．５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、０
．１％ＳＤＳで行われる。最も好適な実施例では、洗浄過程は、温度が６８℃で
、１５ｍＭの塩化ナトリウムと１．５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、０．１％Ｓ
ＤＳで行われる。更なるこれらの条件の変更は、当分野の技術者には明らかであ
る。

【００８３】 当分野で周知のＤＮＡのシークエンシング方法を用いて、本発明の何れの実施
例も実行可能である。この方法には、例えばＤＮＡポリメラーゼIのクレノウ断
片、SEQUENASE（US Biochemical, Cleveland OH）、Taqポリメラーゼ（Perkin E
lmer）、熱安定性T7ポリメラーゼ（Amersham, Pharmacia Biotech Piscataway N
J）、或いはELONGASE増幅システム(Life Technologies, Gaithersburg MD)にみ
られるような校正エキソヌクレアーゼとポリメラーゼとの組み合わせなどの酵素
が用いられる。好ましくは、MICROLAB2200（Hamilton, Reno, NV）、Peltier Th
ermal Cycler（PTC200；MJ Research, Watertown MA）、ABI CATALYST 800 (Per
kin-Elmer) を用いて自動化する。次に、ABI 373または377 DNAシークエンシン
グシステム(Perkin-Elmer)、MEGABACE 1000 DNAシークエンシングシステム(Mole
cular Dynamics. Sunnyvale CA)、または当分野で周知のシステムを用いてシー
クエンシングを行う。得られた配列を当分野で周知の様々なアルゴリズムを用い
て分析する(例えば、Ausubel, F.M. (1997) Short Protocols in Molecular Bio
logy, John Wiley & Sons, New York NY, unit 7.7; Meyers, R.A. (1995) Mole
cular Biology and Biotechnology, Wiley VCH, New York NY, pp. 856-853.を
参照)。

【００８４】 部分的なヌクレオチド配列を利用し、当分野で周知のＰＣＲ法をベースにした
種々の方法を用いてRNAAPをコードする核酸配列を伸長し、プロモーターや調節
要素などの上流にある配列を検出する。例えば制限部位ＰＣＲ法を利用する１つ
の方法では、一般的なプライマー及びネスト化プライマーを用いてクローニング
ベクター内のゲノムＤＮＡから未知の配列を増幅する。（例えば、Sarkar, G. (
1993) PCR Methods Applic 2:318-322を参照）。逆ＰＣＲ法を用いる別法では、
広範な方向に伸長して環状化した鋳型から未知の配列を増幅するプライマーを用
いる。この鋳型は、既知のゲノム遺伝子座及びその周辺の配列を含む制限断片に
由来する。（例えば、Triglia, T.等（1988）Nucleic Acids Res. 16:8186を参
照）。キャプチャＰＣＲ法を用いる第３の方法は、ヒト及び酵母菌人工染色体Ｄ
ＮＡの既知の配列に隣接するＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅を含む。（例えば、Lagers
trom, M.他（1991）PCR Methods Applic 1:111-119を参照）。この方法では、多
数の制限酵素による消化及びライゲ−ションを用いて、ＰＣＲを行う前に未知の
配列の領域の中に組換え二本鎖配列を挿入することが可能である。また、当分野
で周知の別の方法を用いて未知の配列を得ることも可能である。(例えば、Parke
r, J.D. 他 (1991)Nucleic Acids Res. 19:3055-3060を参照)。更に、ＰＣＲ、
ネスト化プライマー、PROMTERFINDERライブラリを用いれば、ゲノムＤＮＡ内の
歩行が可能である（Clontech, Palo Alto CA）。この方法ではライブラリをスク
リーニングする必要がなく、イントロン／エキソン接合部を探すのに有用である
。全てのＰＣＲ法をベースにした方法では、プライマーは、市販のOLIGO 4.06 P
rimer Analysis software（National Biosciences社, Plymouth MN）或いは別の
好適なプログラムなどを用いて、長さが２２〜３０ヌクレオチド、ＧＣ含有率が
５０％以上、約６８℃〜７２℃の温度で鋳型に対してアニールするよう設計され
る。

【００８５】 完全長ｃＤＮＡのスクリーニングのときは、大きなｃＤＮＡを含むようにサイ
ズが選択されたライブラリを用いるのが好ましい。更に、オリゴｄ（Ｔ）ライブ
ラリが完全な長さのｃＤＮＡを産生できない場合は、遺伝子の５'領域を有する
配列を含むものが多いランダムに初回抗原刺激を受けたライブラリが有用である
。ゲノムライブラリは、５'非転写調節領域への配列の伸長に有用であろう。

【００８６】 市販のキャピラリー電気泳動システムを用いて、シークエンシングまたはＰＣ
Ｒ産物のヌクレオチド配列のサイズの分析、または確認が可能である。詳しくは
、キャピラリーシークエンシングには、電気泳動による分離のための流動性ポリ
マー、及び４つの異なったヌクレオチドに特異的なレーザーで活性化される蛍光
色素、放出された波長の検出に利用するＣＣＤカメラを使用することが可能であ
る。出力／光強度は、適切なソフトウェア（例えば、GENOTYPER 及び SEQUENCE
NAVIGATOR, Perkin-Elmerを参照）を用いて電気信号に変換され、サンプルのロ
ーディングからコンピュータ分析までのプロセス及び電子データ表示がコンピュ
ータ制御可能である。キャピラリー電気泳動法は、特定のサンプルに少量しか存
在しない場合もあるＤＮＡの小片のシークエンシングに特に適している。

【００８７】 本発明の別の実施例では、RNAAPをコードするポリヌクレオチド配列またはそ
の断片を組換えＤＮＡ分子に用いて、適切な宿主細胞内にRNAAP、その断片また
は機能的等価物を発現させることが可能である。遺伝暗号固有の宿重により、実
質的に同じ或いは機能的に等価のアミノ酸配列をコードする別のＤＮＡ配列が作
られ得り、これらの配列をRNAAPのクローン化及び発現に利用可能である。

【００８８】 種々の目的でRNAAPをコードする配列を変えるために、当分野で一般的に知ら
れている方法を用いて、本発明のヌクレオチド配列を組換えることができる。こ
の目的には、遺伝子産物のクローン化、プロセシング及び／または発現の調節が
含まれるが、これらに限定されるものではない。ランダムな断片によるＤＮＡの
混合や遺伝子断片と合成オリゴヌクレオチドのＰＣＲ再組み立てを用いて、ヌク
レオチド配列の組換えが可能である。例えば、オリゴヌクレオチドの仲介による
定方向突然変異誘発を利用して、新しい制限部位を生成する突然変異の導入、グ
リコシル化パターンの変更、コドン優先の変更、スプライスバリアントの生成等
が可能である。

【００８９】 別の実施例によれば、RNAAPをコードする配列は、当分野で周知の化学的方法
を用いて、全体或いは一部が合成可能である（例えば、Caruthers. M.H.等（198
0）Nucl. Acids Res. Symp. Ser 7:215-223; 及びHorn, T.他（1980）Nucl. Aci
ds Res. Symp. Ser.225-232を参照）。別法として、化学的方法を用いてRNAAP自
体またはその断片を合成することが可能である。例えば、ペプチド合成は種々の
固相技術を用いて実行可能である（例えば、Roberge, J.Y.等(1995) Science 26
9:202-204を参照）。また、合成の自動化は例えばABI 431Aペプチドシンセサイ
ザ（Perkin Elmer）を用いて達成し得る。更にRNAAPのアミノ酸配列または任意
のその一部は、直接的な合成の際の変更、及び／または化学的方法を用いた他の
タンパク質または任意のその一部からの配列との組み合わせにより、変異体ポリ
ペプチドを作ることが可能である。

【００９０】 このペプチドは、分離用高速液体クロマトグラフィー(例えば、Chiez, R.M.
及び F.Z. Regnier (1990)Methods Enzymol. 182:392-421を参照)を用いて実質
的に精製可能である。合成されたペプチドの組成は、アミノ酸分析或いはシーク
エンシングにより確認することができる(例えば、Creighton. T. (1983) Protei
ns, Structures and Molecular Properties, WH Freeman, New York, NYを参照)
。

【００９１】 生物学的に活性なRNAAPを発現させるために、RNAAPをコードするヌクレオチド
配列またはその誘導体を好適な発現ベクターに挿入する。この発現ベクターは、
好適な宿主に挿入されたコーディング配列の転写及び翻訳の調節に必要な要素を
含む。これらの要素には、ベクター及びRNAAPをコードするポリヌクレオチド配
列におけるエンハンサー、構成型及び発現誘導型のプロモーター、５'及び３'の
非翻訳領域などの調節配列が含まれる。このような要素は、その長さ及び特異性
が様々である。特定の開始シグナルによって、RNAAPをコードする配列のより効
果的な翻訳を達成することが可能である。このようなシグナルには、ＡＴＧ開始
コドン及びコザック配列などの近傍の配列が含まれる。RNAAPをコードする配列
及びその開始コドン、上流の調節配列が好適な発現ベクターに挿入された場合は
、更なる転写調節シグナルや翻訳調節シグナルは必要なくなるであろう。しかし
ながら、コーディング配列或いはその断片のみが挿入された場合は、インフレー
ムのＡＴＧ開始コドンを含む外来性の翻訳調節シグナルが発現ベクターに含まれ
なければならない。外来性の翻訳要素及び開始コドンは、自然及び合成の様々な
ものから得ることが可能である。用いられる特定の宿主細胞系に好適なエンハン
サーを含めることで発現の効率を高めることが可能である。(例えば、Scharf, D
. 他 (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:125-162.を参照)。

【００９２】 当業者に周知の方法を用いて、RNAAPをコードする配列、好適な転写及び翻訳
調節要素を含む発現ベクターを作製することが可能である。これらの方法には、 in vitro 組換えＤＮＡ技術、合成技術、及びin vivo遺伝子組換え技術が含まれ
る。(例えば、 Sambrook, J. 他. (1989) Molecular Cloning. A Laboratory Ma
nual, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY, 4章及び8章, 及び１6-17章;
及び Ausubel, F.M. 他. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Jo
hn Wiley & Sons, New York NY, ch. 9章及び13章、16章を参照)。

【００９３】 種々の発現ベクター／宿主系を利用して、RNAAPをコードする配列の保持及び
発現が可能である。これらには、限定するものではないが、組換えバクテリオフ
ァージ、プラスミド、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌
などの微生物や、酵母菌発現ベクターで形質転換された酵母菌や、ウイルス発現
ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系や、ウイルス発現
ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイク
ウイルス、ＴＭＶ）または細菌発現ベクター（例えば、ＴｉまたはｐＢＲ３２２
プラスミド）で形質転換された植物細胞系や、動物細胞系などが含まれる。本発
明は使用される宿主細胞によって限定されるものではない。

【００９４】 細菌系では、多数のクローニングベクター及び発現ベクターが、RNAAPをコー
ドするポリヌクレオチド配列の使用目的に応じて選択可能である。例えば、RNAA
Pをコードするポリヌクレオチド配列の日常的なクローニング、サブクローニン
グ、増殖には、PBLUESCRIPT(Stratagene, La Jolla CA)またはpSPORT１プラスミ
ド(GIBCO BRL)などの多機能の大腸菌ベクターを用いることができる。ベクター
の多数のクローニング部位にＨＬＯＲをコードする配列をライゲーションすると
lacＺ遺伝子が破壊され、組換え分子を含む形質転換された細菌の同定のための
比色スクリーニング法が可能となる。更に、これらのベクターを用いて、クロー
ニングされた配列のin vitroでの転写、ジデオキシンスクリーニング、ヘルパー
ファージによる一本鎖の救出、入れ子状態の欠失を作り出すことが可能である。
(例えば、Van Heeke, G.及びS.M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:5503-5
509.を参照)。例えば、抗体の産生のためなどに多量のRNAAPが必要な場合は、RN
AAPの発現をハイレベルで誘導するベクターが使用できる。例えば、強力に発現
を誘発するＴ５またはＴ７バクテリオファージプロモーターを含むベクターを使
用できる。

【００９５】 RNAAPの発現に酵母の発現系の使用が可能である。酵母菌サッカロミセス−セ
レビジエでは、α因子やアルコールオキシダーゼやＰＧＨなどの構成型或いは誘
導型のプロモーターを含む多種のベクターが使用可能である。更に、このような
ベクターは、発現したタンパク質の分泌か細胞内への保持のどちらかを誘導し、
安定した増殖のために宿主ゲノムの中に外来配列を組み込む。(例えば、上記のA
usubel.; 及び Grant 他 (1987) Methods Enzymol.153:51-794: Scorer. C. A.
他 (1994) Bio/Technology 12:181-184.を参照) 植物系もRNAAPの発現に使用可能である。RNAAPをコードする配列の転写は、例
えば、ＣａＭＶ由来の３５Ｓ及び１９Ｓプロモーターなどのウイルスプロモータ
ーが単独で、或いはＴＭＶ（Takamatsu, N.等（1987）EMBO J 6:307-311）由来
のオメガリーダー配列と組み合わせて促進される。これらの作製物は、直接のＤ
ＮＡ形質転換或いは病原体を介したトランスフェクションによって、植物細胞の
中に導入可能である。（例えば、McGraw Hill Yearbook of Science and Techno
logy（1992）McGraw Hill NY, pp.191-196を参照）。

【００９６】 哺乳動物細胞では、多種のウイルスベースの発現系が利用され得る。アデノウ
イルスが発現ベクターとして用いられる場合、後発プロモーター及び３連リーダ
ー配列からなるアデノウイルス転写物／翻訳複合体にRNAAPをコードする配列を
結合し得る。ウイルスのゲノムの非必須のＥ１またはＥ３領域への挿入により、
感染した宿主細胞にRNAAPを発現する生ウイルスを得ることが可能である（Logan
, J.及びShenk, T.（1984）Proc. Natl. Acad. Sci. 81:3655-3659を参照）。さ
らに、ラウス肉腫ウイルス（RSV）エンハンサーなどの転写エンハンサーを用い
て、哺乳動物宿主細胞における発現を増大させることが可能である。タンパク質
を高レベルで発現させるために、ＳＶ４０またはＥＢＶを基にしたベクターを用
いることが可能である。

【００９７】 ヒト人工染色体（HAC）を用いて、プラスミドで発現しそれに含まれているも
のより大きなＤＮＡの断片を供給可能である。治療のために約６ｋｂ〜１０Ｍｂ
のＨＡＣｓを作製し、従来の輸送方法（リポソーム、ポリカチオンアミノポリマ
ー、またはベシクル）で供給する。(例えば、Harrington. J.J. 他 (1997) Nat
Genet.15:345-355.を参照)。

【００９８】 哺乳動物系の組換えタンパク質の長期にわたる産生のためには、株化細胞にお
けるRNAAPの安定した発現が望ましい。例えば、発現ベクターを用いて、RNAAPを
コードする配列を株化細胞に形質転換することが可能である。このような発現ベ
クターは、ウイルス起源の複製及び／または内在性の発現要素や、同じ或いは別
のベクターの上の選択マーカー遺伝子を含む。ベクターの導入の後、細胞を選択
培地に移す前に、強化培地で約１〜２日の間増殖させる。選択マーカーの目的は
選択的な媒介物に対する抵抗性を与えるとともに、その存在により導入された配
列をうまく発現する細胞の増殖及び回収が可能となる。安定的に形質転換された
細胞の耐性クローンは、その細胞型に好適な組織培養技術を用いて増殖可能であ
る。

【００９９】 任意の数の選択系を用いて、形質転換された細胞系を回収することが可能であ
る。選択系には、以下のものに限定はしないが、単純ヘルペスウイルスチミジン
キナーゼ遺伝子及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子が含まれ
、それぞれtk⁻又はapr⁻細胞において使用される。(例えば、Wigler, M. 他 (1
977) Cell 11:223-232; 及びLowy, I. 他(1980) Cell 22:817-823を参照)。また
代謝拮抗物質、抗生物質或いは除草剤への耐性を選択のベースとして用いること
ができる。例えばdhfrはメトトレキセートに対する耐性を与え、neoはアミノグ
リコシッドネオマイシン及びG-418に対する耐性を与え、als或いはpatはクロル
スルフロン（chlorsulfuron）、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラー
ゼ（phosphinotricin acetyltransferase）に対する耐性を与える(例えば、Wigl
er, M. 他. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. 77:3567-3570; Colbere-Garapin,
F. 他(1981) J. Mol. Biol. 150:1-14を参照)。さらに選択に利用できる遺伝子
、例えば、代謝のために細胞が必要なものを変えるtrpB及びhisDが文献に記載さ
れている（例えば、Hartman, S.C.及びR.C. Mulligan（1988）Proc. Natl. Acad
. Sci. 85:8047-51を参照）。アニトシアニン、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ；C
lontech)、βグルクロニダーゼ及びその基質ＧＵＳ，ルシフェラーゼ及びその基
質ルシフェリンなどの可視マーカーが用いられる。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ
）(Clontech, Palo Alto, CA)も使用できる。これらのマーカーを用いて、トラ
ンスフォーマントを特定するだけでなく、特定のベクター系に起因する一過性或
いは安定したタンパク質発現を定量することが可能である（例えば、Rhodes, C.
A.他（1995）Methods Mol. Biol. 55:121−791を参照）。

【０１００】 マーカー遺伝子の発現の存在／不在によって目的の遺伝子の存在が示されても
、その遺伝子の存在及び発現の確認が必要な場合もある。例えば、RNAAPをコー
ドする配列がマーカー遺伝子配列の中に挿入された場合、RNAAPをコードする配
列を含む形質転換された細胞は、マーカー遺伝子機能の欠落により特定可能であ
る。または、１つのプロモーターの制御下でマーカー遺伝子がRNAAPをコードす
る配列と一列に配置することも可能である。誘導または選択に応答したマーカー
遺伝子の発現は、通常タンデム遺伝子の発現も示す。

【０１０１】 一般に、RNAAPをコードする核酸配列を含み、RNAAPを発現する宿主細胞は、当
業者に周知の種々の方法を用いて特定することが可能である。これらの方法には
、ＤＮＡ−ＤＮＡ或いはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションや、ＰＣＲ法、
核酸或いはタンパク質の検出及び／または数量化のための膜系、溶液ベース、或
いはチップベースの技術を含むタンパク質生物学的試験法または免疫学的アッセ
イが含まれるが、これらに限定されるものではない。

【０１０２】 特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のどちらかを用いるRN
AAPの発現の検出及び計測のための免疫学的な方法は、当分野で周知である。こ
のような技法には、酵素に結合したイムノソルベントアッセイ（ELISA）、ラジ
オイムノアッセイ（RIA）、蛍光標示式細胞分取器（FACS）などがある。RNAAP上
の２つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いた、２部位のモ
ノクローナルベースイムノアッセイ（two-site, monoclonal-based immunoassay
）が好ましいが、競合の結合アッセイも用いることもできる。これらのアッセイ
及びその他のアッセイは、当分野では十分に知られている。(例えば、 Hampton.
R. 他.(1990) Serological Methods, a Laboratory Manual. APS Press. St Pa
ul. MN, Sect. IV; Coligan, J. E. 他Current Protocols in Immunology, Gree
ne Pub. Associates and Wiley-Interscience, New York. NY; 及びPound, J.D.
(1990) Immunochemical Protocols, Humans Press, Totowa NJ)。

【０１０３】 種々の標識方法及び結合方法が当業者には周知であり、様々な核酸アッセイお
よびアミノ酸アッセイに用いられ得る。RNAAPをコードするポリヌクレオチドに
関連する配列を検出するための、標識されたハイブリダイゼーションプローブ或
いはＰＣＲプローブを生成する方法には、オリゴ標識化、ニックトランスレーシ
ョン、末端標識化、または標識されたヌクレオチドを用いるＰＣＲ増幅が含まれ
る。別法として、RNAAPをコードする配列、またはその任意の断片をｍＲＮＡプ
ローブを生成するためのベクターにクローニングすることも可能である。当分野
では周知であり市販されているこのようなベクターを、Ｔ７，Ｔ３，またはＳＰ
６などの好適なＲＮＡポリメラーゼ及び標識されたヌクレオチドの追加によって
、in vitroでのＲＮＡプローブの合成に用いることができる。これらの方法は、
例えば、Amersham Pharmacia Biotech及びPromega（Madison WI）、U.S. Bioche
mical Corp（Cleveland OH）が市販する種々のキットを用いて行うことができる
。容易な検出のために用い得る好適なレポーター分子或いは標識には、基質、コ
ファクター、インヒビター、磁気粒子、及び放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発
光剤、色素産生剤などが含まれる。

【０１０４】 RNAAPをコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、細胞培地
でのこのタンパク質の発現及び回収に好適な条件の下で培養される。形質転換さ
れた細胞から産生されたタンパク質が分泌されるか細胞内に留まるかは、使用さ
れるその配列及び／またはそのベクターによる。RNAAPをコードするポリヌクレ
オチドを含む発現ベクターは、原核細胞膜及び真核細胞膜を透過するRNAAPの分
泌を誘導するシグナル配列を含むように設計できることは、当業者には理解され
よう。

【０１０５】 更に、挿入した配列の発現調節能力または発現したタンパク質を所望の形にプ
ロセシングする能力によって宿主細胞株が選択される。このようなポリペプチド
の修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化（
lipidation）、及びアシル化が含まれるが、これらに限定されるものではない。
タンパク質の「prepro」形を切断する翻訳後のプロセシングを利用して、標的タ
ンパク質、折りたたみ及び／または活性を特定することが可能である。翻訳後の
活性のための特定の細胞装置及び特徴のある機構をもつ種種の宿主細胞（例えば
、CHO、HeLa、MDCK、MEK293、WI38）がAmerican Type Culture Collection（ATC
C; Bethesda, MD）より入手可能であり、外来のタンパク質の正しい修飾及びプ
ロセシングを確実にするために選択される。

【０１０６】 本発明の別の実施例では、RNAAPをコードする自然或いは変更された、または
組換えの核酸配列を上記した任意の宿主系の融合タンパク質の翻訳となる異種配
列に結合させる。例えば、市販の抗体によって認識できる異種部分を含むキメラ
RNAAPタンパク質が、RNAAPの活性のインヒビターに対するペプチドライブラリの
スクリーニングを促進し得る。また、異種タンパク質部分及び異種ペプチド部分
が、市販の親和性基質を用いて融合タンパク質の精製を促進し得る。このような
部分には、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タン
パク質（ＭＢＰ）、チオレドキシン（Ｔｒｘ）、カルモジュリン結合ペプチド（
ＣＢＰ）、６−Ｈｉｓ、ＦＬＡＧ、ｃ−ｍｃ、赤血球凝集素（ＨＡ）が含まれる
が、これらに限定されるものではない。ＧＳＴ及びＭＢＰ、Ｔｒｘ、ＣＢＰ、６
−Ｈｉｓによって、固定されたグルタチオン、マルトース、フェニルアルシン酸
化物（phenylarsine oxide）、カルモジュリン、金属キレート樹脂のそれぞれで
同族の融合タンパク質の精製が可能となる。ＦＬＡＧ、ｃ−ｍｃ、及び赤血球凝
集素（ＨＡ）によって、これらのエピトープ標識を特異的に認識する市販のモノ
クロナール抗体及びポリクロナール抗体を用いた融合タンパク質の免疫親和性の
精製ができる。また、RNAAPをコードする配列と異種タンパク質配列との間にあ
るタンパク質分解切断部位を融合タンパク質が含むように遺伝子操作すると、RN
AAPが精製の後に異種部分から切断され得る。融合タンパク質の発現と精製の方
法は、Ausubel. (1995、前出 ch 10).に記載されている。市販されている様々な
キットを用いて、融合タンパク質の発現及び精製を促進できる。

【０１０７】 本発明の別の実施例では、ＴＮＴウサギ網状赤血球可溶化液またはコムギ胚芽
抽出系(Promega)を用いてin vitroで放射能標識したRNAAPの合成が可能である。
これらの系は、Ｔ７またはＴ３、ＳＰ６プロモーターと機能的に結合したタンパ
ク質をコードする配列の転写と翻訳をつなげる。翻訳は、好ましくは^３５Ｓメチ
オニンである放射能標識されたアミノ酸前駆体の存在の下で起こる。

【０１０８】 RNAAPの断片は、組換え生成物だけでなく固相技術を用いて直接的なペプチド
合成によって作製され得る(例えば、前出のCreighton, pp. 55-60.を参照)。タ
ンパク質の合成は、手動或いは自動で行われ得る。自動合成は、例えば431Aペプ
チドシンセサイザ（Perkin Elmer）を用いて行うことが可能である。RNAAPの種
々の断片は別々に合成して、次ぎに結合させて完全長分子を生成する。

【０１０９】 治療 例えば配列及びモチーフにおける化学的及び構造的類似性が、RNAAPの領域とR
NA関連タンパク質の領域との間に存在する。更に、RNAAPの発現は、癌及び胎児
発達、細胞増殖、炎症、免疫応答と密接な関係がある。従って、RNAAPは、細胞
増殖異常及び自己免疫異常／炎症性疾患、感染症において、ある役割を果たすと
考えられる。従って、RNAAPの発現または活性の増大に関連する疾患の治療にお
いて、RNAAPの発現または活性を低下させることが望ましい。また、RNAAPの発現
または活性の低下に関連する疾患の治療において、RNAAPの発現または活性を増
大させることが望ましい。

【０１１０】 従って、一実施例において、RNAAPの発現または活性の低下に関連した疾患の
治療または予防のために、患者にRNAAPまたはその断片や誘導体を投与すること
が可能である。このような疾患の例には、細胞増殖異常が含まれ、その中には、
日光性角化症及びアテローム性動脈硬化、滑液包炎、硬変、肝炎、混合型結合組
織病（ＭＣＴＤ）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾
癬、原発性血小板血症、並びに腺癌及び白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉
腫、及び奇形癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、
神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、
前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、子宮の癌などが含まれ、また、自己
免疫異常／炎症性疾患も含まれ、その中には後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）
及び副腎機能不全、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイ
ド症、貧血、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫
性甲状腺炎、自己免疫性多腺性内分泌カンジダ性外胚葉ジストロフィ（APECED）
、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、
糖尿病、肺気腫、リンパ球毒素性一時性リンパ球減少症、赤芽球症、結節性紅斑
、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋
本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性大腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症
、心筋又は心膜炎症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライ
ター症候群、リウマチ様関節炎、強皮症、シェ−グレン症候群、全身性アナフィ
ラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、血小板減少症、潰瘍性大腸
炎、ウェルナー症候群、癌合併症、血液透析、体外循環と、ウィルス感染症及び
細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫の感染症、外傷が含
まれ、また、感染症が含まれ、その中には、アデノウイルス及びアレナウイルス
、ブンヤウイルス、カリチウイルス、コロナウイルス、フィロウイルス、ヘパド
ナウイルス、ヘルペスウイルス、フラビウイルス、オルソミクソウイルス、パル
ボウイルス、パポーバウイルス、パラミキソウイルス、ピコルナウイルス、ポッ
クスウイルス、レオウイルス、レトロウイルス、ラブドウイルス、トガウイルス
に分類されるウイルス病原体による感染と、肺炎球菌及びブドウ球菌、連鎖球菌
、桿菌、コリネバクテリウム、クロストリジウム属、髄膜炎菌、淋菌、リステリ
ア、モラクセラ属、キンゲラ、ヘモフィルス属、レジオネラ、ボルデテラ、グラ
ム陰性腸内細菌（赤痢菌属及びサルモネラ、カンピロバクターを含む）、シュー
ドモナス、ビブリオ属、ブルセラ、フランシセラ、エルシニア、バルトネラ、no
rcardium、アクチノミセス、ミコバクテリア、スピロヘターレス、リケッチア、
クラミジア、マイコプラズマに分類される細菌病原体による感染症と、コウジカ
ビ及びブラストマイセス、皮膚糸状菌、クリプトコッカス、コクシジオイデス、
malasezzia、ヒストプラスマ、及び様々な真菌症を引き起こすその他の真菌病原
体に分類される真菌病原体による感染症と、プラスモディウムまたはマラリアを
引き起こす体内寄生性アメーバ及びレーシュマニア、トリパノソーマ属、トキソ
プラズマ、ニューモシスチス‐カリニ、ジアルジア属などの腸内原生動物、トリ
コモナス、旋毛虫などの組織線形動物、回虫属などの腸内線形動物、リンパのフ
ィラリア性線形動物、住血吸虫及び条虫（サナダムシ）などの線形動物に分類さ
れる寄生虫による感染症が含まれるが、ここに列記したものに限定されるわけで
はない。

【０１１１】 別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むRNAAPの発
現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、RNAAPまたはそ
の断片や誘導体を発現し得るベクターを患者に投与することも可能である。

【０１１２】 更に別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むRNAAP
の発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、実質的に精
製されたRNAAPを含む医薬品組成物を好適な医薬用担体と共に患者に投与するこ
とも可能である。

【０１１３】 更に別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むRNAAP
の発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、RNAAPの活
性を調節するアゴニストを患者に投与することも可能である。

【０１１４】 更なる実施例では、RNAAPの発現または活性の増大に関連した疾患の治療また
は予防のために、患者にRNAAPのアンタゴニストを投与することが可能である。
このような疾患の例には、上記した細胞増殖異常及び自己免疫異常／炎症性疾患
、感染症が含まれるが、ここに列記したものに限定されるわけではない。一実施
態様では、RNAAPと特異的に結合する抗体が直接アンタゴニストとして、或いはR
NAAPを発現する細胞または組織に薬剤を運ぶ標的或いは運搬機構として間接的に
用いられ得る。

【０１１５】 別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むRNAAPの発
現または活性の増大に関連した疾患の治療または予防のために、RNAAPまたはそ
の断片や誘導体を発現し得るベクターを患者に投与することも可能である。

【０１１６】 別の実施例では、本発明の任意のタンパク質、アンタゴニスト、抗体、アゴニ
スト、相補的な配列、ベクターを別の好適な治療薬と組み合わせて投与すること
もできる。当業者は、従来の医薬原理にしたがって併用療法で用いる好適な治療
薬を選択可能である。治療薬との組み合わせにより、上に列記した種々の疾患の
治療または予防に相乗効果をもたらし得る。この方法を用いて少ない量の各薬剤
で医薬効果をあげることが可能であり、広範囲な副作用の可能性を低減し得る。

【０１１７】 RNAAPのアンタゴニストは、当分野で一般的な方法を用いて製造することが可
能である。詳しくは、精製されたRNAAPを用いて抗体を作ったり、治療薬のライ
ブラリをスクリーニングしてRNAAPと特異的に結合するものを同定が可能である
。RNAAPの抗体も、当分野で一般的な方法を用いて製造することが可能である。
このような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、
一本鎖、Ｆａｂフラグメント、及びＦａｂ発現ライブラリによって作られたフラ
グメントが含まれる。但し、これらに限定されるものではない。治療用には、中
和抗体（即ち、二量体の形成を阻害するもの）が特に好ましい。

【０１１８】 抗体の産生のためには、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒト及びその他のも
のを含む種々の宿主が、RNAAPまたは任意の断片、または免疫原性の特性を備え
るそのオリゴペプチドの注入によって免疫化され得る。宿主の種に応じて、種々
のアジュバントを用いて免疫応答を高めることもできる。このようなアジュバン
トにはフロイントアジュバント、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲルアジュ
バント、リゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油性
乳剤、キーホールリンペットヘモシニアン、及びジニトロフェノールなどの界面
活性剤が含まれるが、これらに限定されるものではない。ヒトに用いられるアジ
ュバントの中では、ＢＣＧ（bacilli Calmette-Guerin）及びCorynebacterium p
arvumが特に好ましい。

【０１１９】 RNAAPに対する抗体を誘発するために用いられるオリゴペプチド、ペプチド、
または断片は、約５以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列が望ましく、更に望ま
しいのは約１０以上のアミノ酸からなるものである。これらのオリゴペプチド或
いはペプチド、またはそれらの断片は、天然のタンパク質のアミノ酸配列の一部
と同一であることが望ましく、小さな自然発生の分子のアミノ酸配列全体も含む
。RNAAPアミノ酸の短い伸展部は、ＫＬＨなどの別のタンパク質の配列と融合し
、キメラ分子に対する抗体が産生され得る。

【０１２０】 RNAAPに対するモノクローナル抗体は、培地内の連続した細胞株によって、抗
体分子を産生する任意の技術を用いて作製することが可能である。これらの技術
には、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、及びＥＢＶ−ハイ
ブリドーマ技術が含まれるが、これらに限定されるものではない（例えば、Kohl
er, G. 等. (1975) Nature 256:495-497; Kozbor, D. 等. (1985) .J. Immunol.
Methods 81−8-42; Cote, R.J. 等. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. 80:2026-
2030; Cole, S.P. 等. (1984) Mol. Cell Biol. 62:109-120を参照）。

【０１２１】 更に、「キメラ抗体」の作製のために発達したヒト抗体遺伝子にマウス抗体遺
伝子をスプライシングするなどの技術が、好適な抗原特異性及び生物学的活性を
備える分子を得るために用いられる（例えば、Morrison, S.L.他. (1984) Proc.
Natl. Acad. Sci. 81:6851-6855; Neuberger, M.S.他. (1984) Nature 312:604
-608; Takeda, S.等. (1985) Nature 314:452,454を参照）。別法では、当分野
で周知の方法を用いて、一本鎖抗体の産生のための記載された技術を適用して、
RNAAP特異性一本鎖抗体を生成する。関連する特異性を備えるが別のイディオタ
イプの組成の抗体は、ランダムな組み合わせの免疫グロブリンライブラリから鎖
混合によって生成することもできる（例えば、Burton D.R. (1991) Proc. Natl.
Acad. Sci. 88:11120-3を参照）。

【０１２２】 抗体は、リンパ球集団の中のin vivo生成を誘発することによって、または免
疫グロブリンライブラリのスクリーニング又は文献に示されているような、高度
に特異的な結合試薬のパネルをスクリーニングすることによって、産生すること
もできる（例えば、Orlandi, R. 他. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. 86: 3833
-3837; Winter, G. 他. (1991) Nature 349:293-299を参照）。

【０１２３】 RNAAPに対する特異的な結合部位を含む抗体も産生することができる。例えば
、このような断片には、抗体分子のペプシン消化によって生成されるＦ（ａｂ’
）２断片と、Ｆ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を減じることによって生成
されるＦａｂ断片が含まれるが、これらに限定されるものではない。別法では、
Ｆａｂ発現ライブラリを作製することによって、所望の特異性とモノクローナル
Ｆａｂ断片の迅速且つ容易な同定が可能となる（例えば、Huse, W.D. 等. (1989
) Science 254:1275-1281を参照）。

【０１２４】 種々のイムノアッセイを用いてスクリーニングし、所望の特異性を有する抗体
を同定する。隔離された特異性を有するポリクローナル抗体またはモノクローナ
ル抗体の何れかを用いる競合的な結合、または免疫放射線活性のための数々のプ
ロトコルが、当分野では周知である。通常このようなイムノアッセイには、RNAA
Pとその特異性抗体との間の複合体調整の計測が含まれる。二つの非干渉性RNAAP
エピトープに対して反応性のモノクローナル抗体を用いる、２部位モノクローナ
ルベースのイムノアッセイが好ましいが、競合的結合アッセイも利用することが
できる(Pound、前出）。

【０１２５】 ラジオイムノアッセイ技術と共にScatchard分析などの様々な方法を用いて、R
NAAP抗体の親和性を評価する。親和性を結合定数Ｋａで表すが、このＫａは、平
衡状態の下でRNAAP抗体複合体のモル濃度を遊離抗体と遊離抗原のモル濃度で割
ったものである。多数のRNAAPエピトープに対して親和性が不均一なポリクロナ
ール抗体試薬の測定値Ｋａは、RNAAP抗体の平均親和性または結合活性を表す。
特定のRNAAPエピトープに単一特異的なモノクロナール抗体試薬のＫａは、親和
性の真の測定値を表す。Ｋａ値が１０^９〜１０^１２Ｌ／ｍｏｌの高親和性抗体試
薬は、RNAAP抗体複合体が激しい操作に耐えなければならないイムノアッセイに
用いるのが好ましい。Ｋａ値が１０^６〜１０^７Ｌ／ｍｏｌの低親和性抗体試薬は
、RNAAPが抗体から最終的に活性化状態で解離する必要がある免疫精製（immunop
urification）及び類似の処理に用いるのが好ましい。(Catty, D. (1988) Antib
odies, Volume I: A Practical Approach. IRL Press, Washington, DC; Liddel
l, J. E. and Cryer, A. (1991) A Practical Guide to Monoclonal Antibodies
, John Wiley & Sons, New York NY)。

【０１２６】 ポリクロナール抗体試薬の抗体価及び結合活性を更に評価して、あるダウンス
トリーム適用に対するこのような試薬の品質及び適性を調べる。例えば、少なく
とも１〜２ｍｇ／ｍｌの特異的な抗体、好ましくは５〜１０ｍｇ／ｍｌの特異的
な抗体を含むポリクロナール抗体試薬の使用は、RNAAP抗体複合体を沈殿させな
ければならない処理に適している。様々な適用例における抗体の特異性及び抗体
価、結合活性、抗体の品質や使用法の指針は一般に入手可能である。(例えば、C
atty, 前出, 及びColigan 他、前出を参照)。

【０１２７】 本発明の別の実施例では、RNAAPをコードするポリヌクレオチド、またはその
任意の断片または相補配列が、治療目的で使用することができる。ある実施形態
では、RNAAPをコードするポリヌクレオチドの相補配列がｍＲＮＡの転写を阻止
するのに好適である場合、これを使用することができる。特に細胞は、RNAAPを
コードするポリヌクレオチドと相補的な配列で形質転換することもできる。した
がって、相補的分子または断片は、RNAAPの活性の調節、または遺伝子機能の調
節のために使用することができる。このような技術は当分野では周知であり、セ
ンスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは大きな断片が、RNAAPをコー
ドする配列の制御領域から、またはコード領域に沿ったさまざまな位置から設計
可能である。

【０１２８】 レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペス又はワクシニア、又は様々な細菌
性プラスミド由来の発現ベクターを用いて、ヌクレオチド配列を標的の器官、組
織又は細胞集団に運ぶこともできる。当業者に周知の方法を用いてRNAAPをコー
ドポリヌクレオチドと相補的な核酸配列を発現するベクターを作製することがで
きる(例えば、前出のSambrook 他、及び前出のAusubel 他によるものを参照)。

【０１２９】 RNAAPをコードする遺伝子は、RNAAPをコードするポリヌクレオチド又はその断
片を高いレベルで発現する発現ベクターで、細胞又は組織を形質転換することに
よって止めることができる。このような作製物を用いて翻訳できないセンス又は
アンチセンス配列を細胞の中に導入することができる。ＤＮＡの中に組み入れら
れない場合でも、このようなベクターは内在性のヌクレアーゼによって機能が損
なわれるまでｍＲＮＡ分子を転写し続ける。非複製ベクターでも一過性の発現を
一ヶ月以上に亘って続け、好適な複製要素がベクター系の一部である場合はさら
に長く持続し得る。

【０１３０】 上記した通り、遺伝子の発現は、RNAAPをコードする遺伝子の制御５’または
調節領域に対する相補的な配列またはアンチセンス分子（ＤＮＡ或いはＲＮＡ、
ＰＮＡ）を設計することによって調節することができる。転写開始部位、即ち開
始部位から−１０と＋１０との間の領域に由来するオリゴヌクレオチドが好適で
ある場合と同様に、「三重らせん」と塩基対合法を用いて阻止することができる
。三重らせん構造は、二重らせんがポリメラーゼ、転写因子、または調節分子の
結合のために十分に広がるのを阻止するため有益である。三重式ＤＮＡを用いる
最近の治療の進歩は文献に記載されている（例えば、Gee, J.E. 等. (1994) In:
Huber, B.E. 及び B.I. Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futur
a Publishing Co., Mt. Kisco, NYを参照）。相補的な配列またはアンチセンス
分子もまた、転写物がリボソームに結合するのを阻止することによってｍＲＮＡ
の翻訳を阻止するように設計できる。

【０１３１】 酵素性ＲＮＡ分子であるリボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒するために
用いることができる。リボザイム作用の機構には、相補的な標的ＲＮＡへのリボ
ザイム分子の配列特異性ハイブリダイゼーションが含まれ、ヌクレオチド鎖切断
が続く。例えば、RNAAPをコードする配列のヌクレオチド鎖切断を、特異的且つ
効果的に触媒する組換え型のハンマーヘッド型リボザイム分子が含まれる。

【０１３２】 任意の潜在的ＲＮＡ標的の中の特異的なリボザイム切断部位が、後続の配列Ｇ
ＵＡ、ＧＵＵ、及びＧＵＣを含むリボザイム切断部位に対して、標的分子をスキ
ャニングすることによって初めに同定される。一度同定されると、切断部位を含
む標的遺伝子の領域に対応する１５個から２０個のリボヌクレオチドの短いＲＮ
Ａ配列を、オリゴヌクレオチドの機能を不全にする二次的な構造の特徴について
評価することが可能である。候補標的の適合性も、リボヌクレアーゼ保護アッセ
イを用いて、相補的なオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの容易性
をテストすることによって評価することが可能である。

【０１３３】 本発明の相補的なリボ核酸分子及びリボザイムは、当分野で周知の方法を用い
て、核酸分子の合成のために作製することができる。これらの方法には、固相ホ
スホラミダイト化合物などのオリゴヌクレオチドを化学的に合成する方法が含ま
れる。別法では、ＲＮＡ分子がin vitro及びin vivoでRNAAPをコードするＤＮＡ
配列の転写によって生成され得る、このようなＤＮＡ配列はＴ７またはＳＰ６等
の好適なＲＮＡポリメラーゼプロモータを用いて、種々のベクターの中に組み入
れることが可能である。別法では、相補的なＲＮＡを構成的または誘導的に合成
するこれらのｃＤＮＡ作製物は、細胞株、細胞、または組織の中に導入すること
ができる。

【０１３４】 ＲＮＡ分子を修飾することによって、細胞内の安定性を高め、半減期を長くす
ることができる。可能な修飾には、分子の５’及び／または３’端部でのフラン
キング配列の追加、または分子のバックボーン内でのホスホジエステラーゼ結合
よりむしろホスホロチオネート又は２’Ｏメチルの使用が含まれる、がこれらに
限定されるものではない。ＰＮＡの生成に固有のこの概念は、内在性のエンドヌ
クレアーゼによって容易には認識されないアデニン、シチジン、グアニン、チミ
ン、及びウリジンのアセチル−、メチル−、チオ−、及び同様の修飾形態だけで
なく、イノシン、キュエオシン（queosine）、及びワイブトシン（wybutosine）
などの従来のものでない塩基を含めることによって、これらの分子の全体に拡大
することができる。

【０１３５】 ベクターを細胞又は組織に導入する多数の方法が利用でき、in vivo、in vitr
o、及びex vivoでの使用に等しく適している。ex vivoでの治療の場合、患者か
ら採取された肝細胞の中にベクターを導入して、自家移植で同じ患者に戻すため
にクローニング増殖される。トランスフェクション、リボソーム注入またはポリ
カチオンアミノポリマーによる運搬は、当分野で周知の方法を用いて実行するこ
とができる（例えば、Goldman, C.K. 他. (1997) Nature Biotechnology 15:462
-66:を参照）。

【０１３６】 上記したいかなる治療方法も、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル
、及び最も好ましいヒトなどの哺乳動物を含む、治療が必要な全ての被験者に適
用できる。

【０１３７】 本発明の別の実施例は、上記した全ての治療効果のために、医学上認められる
担体と共に医薬品或いは無菌組成物の投与に関連する。このような医薬品組成物
は、RNAAP、RNAAPに対する抗体、擬態、アゴニスト、アンタゴニスト、又はRNAA
Pのインヒビターなどからなる。この組成物は、単体で、或いは安定剤などの１
種類以上の別の薬剤と共に、無菌の生体適合性医薬品担体に投与することができ
る。このような医薬品担体には、生理食塩水、緩衝食塩水、ブドウ糖、及び水な
どが含まれるがこれらに限定されるものではない。この組成物は、単独或いは薬
物又はホルモンなどの別の薬剤と共に投与することができる。

【０１３８】 本発明に用いられる医薬品組成物は、任意の数の経路を用いて投与することも
できる。この経路には、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、クモ膜下腔内
、心室内、経皮性、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、異所性、舌下、または直腸が
含まれるがこれらに限定されるものではない。

【０１３９】 活性処方成分に加えて、これらの医薬品組成物には、活性化合物を医薬的に使
用可能な薬剤にするのを容易にする、医薬品添加物及び補助剤を含む好適な薬学
的に認められる担体が含まれ得る。製剤及び投与についての詳しい技術について
は、最新版のRemington's Pharmaceutical Sciences (Maack Publishing, PA)に
記載されている。

【０１４０】 経口投与用の医薬品組成物が、経口投与に好適な投与量において当分野で周知
の薬学的に許容される担体を用いて、製剤することができる。このような担体に
より、医薬品組成物が患者が摂取するために、錠剤、丸薬、糖衣剤、カプセル、
液体、ゲル状、シロップ剤、泥状物、懸濁液として製剤される。

【０１４１】 経口用に用いられる医薬品は、活性化合物と固体の薬品添加物とを混合し、得
られた顆粒の混合物を処理して、（所望に応じてすりつぶした後）タブレット或
いは糖衣錠コア（dragee cores）にする。好適な医薬品添加物とは、ラクトース
、スクロース、マンニトール、又はソルビトールを含む糖類、トウモロコシ、小
麦、米、ジャガイモ、又はその他の植物からのでんぷん、メチルセルロース、ヒ
ドロキシプロピルメチルセルロース、又はカルボキシメチルセルロースナトリウ
ムなどのセルロース、アラビアゴム及びトラガカントゴムを含むゴム、ゼラチン
及びコラーゲンなどのタンパク質などの炭水化物又はタンパク質賦形剤である。
必要に応じて、例えば、架橋結合したポリビニルピロリドン、かんてん、アルギ
ン酸、またはその塩であるアルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤または可溶化剤が
加えられる。

【０１４２】 糖衣錠コアは、濃縮糖溶剤などの好適なコーティングと共に用いられる。この
ような濃縮糖溶剤には、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カーボ
ポルゲル（carbopol gel）、ポリエチレングリコール、及び／または二酸化チタ
ン、ラッカー溶剤、及び好適な有機溶媒または混合溶剤などが含まれ得る。染料
または色素が、製品の識別又は活性化合物の量、即ち薬用量を示すため、錠剤ま
たは糖衣錠に加えられる。

【０１４３】 経口用に用いられる医薬品製剤には、ゼラチンから作られたプッシュ−フィッ
ト型のカプセル、グリセロールまたはソルビトールなどのコーティングとゼラチ
ンからなる封入されたカプセルが含まれる。プッシュ−フィット型のカプセルに
は、ラクトース又はスターチなどの賦形剤や結合材、タルク又はステアリン酸マ
グネシウムなどの潤滑剤、所望に応じて安定剤と混合された活性処方成分が含ま
れる。ソフトカプセルでは、活性化合物が、安定剤と共に或いは安定剤なしで、
脂肪油、溶液、またはポリエチレングリコール溶液などの好適な溶液に溶解或い
は懸濁され得る。

【０１４４】 非経口投与用に好適な医薬品剤が、水溶液で製剤されるが、ハンクス液、リン
ガー液、生理緩衝食塩水などの生理学的に適合性のある緩衝剤が好ましい。水性
懸濁注射液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、又はデ
キストランなどの懸濁液の粘性を高める物質を含み得る。更に、活性化合物の懸
濁液は、好適な油性注入懸濁液として製剤され得る。好適な親水性溶液または媒
体には、ごま油などの脂肪油、オレイン酸エチル、トリグリセリド又はリボソー
ムなどの合成脂肪酸が含まれる。非脂質ポリカチオンアミノポリマーが、運搬目
的で使用される。随意選択により、懸濁液は高濃度の溶液が可能となるよう化合
物の溶解性を高める好適な安定剤または薬剤を含み得る。

【０１４５】 局部または鼻腔投与のため、特定の障壁に浸透する好適な浸透剤が製剤に用い
られる。このような浸透剤は当業者には周知である。

【０１４６】 本発明の医薬品組成物は、当分野で周知の方法、例えば従来の混合、溶解、顆
粒化、糖衣化、溶離（levigating）、乳化、カプセル化、封入、または凍結乾燥
処理を用いて製造され得る。

【０１４７】 医薬品組成物は塩類として製剤され、限定されないが、塩酸、硫酸、酢酸、乳
酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸等の多くの酸と共に形成可能である。塩分は対
応する遊離塩基系よりも、水溶剤または他のプロトン溶剤に溶けやすい。別の場
合の好ましい薬剤の形態には、１から５０ｍＭヒスチジン、０．１％〜２％スク
ロース、及び２〜７％マンニトールの幾つか或いは全てを含み、ｐＨの範囲が４
．５〜５．５であり、使用前に緩衝剤と結合する凍結乾燥粉末を用いることがで
きる。

【０１４８】 医薬品組成物が調合された後、それらは適当な箱に詰められ、指定した症状の
薬としてラベルが貼られる。RNAAPの投与のため、このようなラベルには、量、
頻度、及び投与の方法が含まれるであろう。

【０１４９】 本発明に用いる好適な医薬品組成物には、目的を達成するため、効果的な量の
活性処方成分を含む組成物が含まれる。当業者は、自分の能力で十分に効果的な
服用量を決めることができる。

【０１５０】 どのような組成物であっても、治療に効果的な薬用量は、初めは、例えば腫瘍
細胞の腫瘍細胞アッセイで、或いは動物モデルのどちらかで推定することができ
る。通常、動物モデルには、マウス、ウサギ、イヌ、又はブタなどが用いられる
。動物モデルはまた、好適な濃縮範囲及び投与の経路を決めるのに用いることが
できる。このような治療をもとに、ヒトへの有益な薬用量及び投与経路を決定す
ることができる。

【０１５１】 医学的に効果的な薬用量は、症状や容態を回復させる、たとえばRNAAP又はそ
の断片、RNAAPの抗体、RNAAPのアゴニストまたはアンタゴニスト、インヒビター
などの活性処方成分の量に関連する。薬用有効度及び毒性は、たとえば、ＥＤ_{５ ０} （服用に対して集団の５０％に医薬的効果がある）またはＬＤ_５０（服用に対
して集団の５０％に致命的である）統計を計算するなど、細胞培養または動物実
験における標準的な薬剤手法によって決定することができる。毒性効果と治療効
果との薬用量比は治療指数であり、ＬＤ_５０／ＥＤ_５０と示すことができる。高
い治療指数を示す医薬品組成物が望ましい。細胞培養アッセイ及び動物実験から
得られたデータが、ヒトへの適用のために、薬用量の範囲を調剤するのに用いら
れる。このような組成物が含まれる薬用量は、毒性を殆ど或いは全く含まず、Ｅ
Ｄ_５０を含む血中濃度の範囲であることが望ましい。薬用量は、用いられる投与
形態及び患者の感受性、投与の経路によって、この範囲内で様々である。

【０１５２】 正確な薬用量は、治療が必要な患者に関する要素を考慮して、実務者によって
決められるであろう。薬用量及び投与は、効果的なレベルの活性成分を与えるた
め或いは所望の効果を維持するために調節される。薬用量の要素として考慮され
るものには、疾患の重症度、患者の一般的な健康状態、年齢、体重、及び患者の
性別、投与の時間及び頻度、併用する薬剤、反応感受性、及び治療に対する応答
が含まれる。作用器官が長い医薬品組成物は、三日か四日に一度、一週間に一度
、二週間に一度、特定の製剤の半減期及びクリアランス率によって左右され、投
与され得る。

【０１５３】 通常の薬用量は投与の経路によって異なるが、約０．１〜１００，０００μｇ
までの最大約１グラムまでである。特定の薬用量及び運搬の方法に関するガイダ
ンスは文献に記載されており、一般に当分野の実務者はそれを利用することがで
きる。当業者は、タンパク質またはインヒビターとは異なったヌクレオチドの製
剤を利用するであろう。同様に、ポリヌクレオチド又はポリペプチドの運搬は、
特定の細胞、状態、位置などに対して特異的であろう。

【０１５４】 診断 別の実施例では、RNAAPに特異的に結合する抗体が、RNAAPの発現によって特徴
付けられる疾患の診断、またはRNAAPやRNAAPのアゴニストまたはアンタゴニスト
、インヒビターで治療を受けている患者をモニターするためのアッセイに用いら
れる。診断に有用な抗体は、治療のところで記載した方法と同じ方法で製剤され
る。RNAAPの診断アッセイには、抗体及び標識を用いてヒトの体液或いは細胞や
組織から採取されたものからRNAAPを検出する方法が含まれる。これらの抗体は
、修飾をして或いはしないで使用され、レポーター分子の共有結合性或いは非共
有結合性の接着によって標識化され得る。当分野で周知の種々のレポーター分子
が用いられるが、その内の幾つかは上記した。

【０１５５】 RNAAPを測定するためのＥＬＩＳＡ，ＲＩＡ，及びＦＡＣＳを含む種々のプロ
トコルは、当分野では周知であり、変わった或いは異常なレベルのRNAAPの発現
を診断する元となるものを提供する。正常或いは標準的なRNAAPの発現の値は、
複合体の形成に適した条件の下、正常な哺乳動物、好ましくはヒトである被験者
から採取した体液または細胞とRNAAPに対する抗体とを結合させることによって
決定する。標準的な複合体形成の量は種々の方法で定量され得るが、測光法（ph
otometric）が好ましい。被験者のRNAAPの発現の量、制御及び疾患、生検組織か
らのサンプルが標準値と比較される。標準値と被験者との間の偏差が、疾患を診
断するパラメーターとなる。

【０１５６】 別の実施例によれば、RNAAPをコードするポリヌクレオチドを診断のために用
いることもできる。用いられるポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド配列
、相補的なＲＮＡ及びＤＮＡ分子、及びＰＮＡが含まれる。ポリヌクレオチドを
用いて、疾患と相関し得るRNAAPを発現する生検組織における遺伝子の発現を検
出及び定量する。この診断アッセイを用いて、RNAAPの不在、存在、及び過度の
発現を調べ、治療中のRNAAPレベルの制御を監視する。

【０１５７】 ある実施形態では、RNAAPまたは近縁の分子をコードする遺伝子配列を含むポ
リヌクレオチド配列を検出可能なＰＣＲプローブを用いたハイブリダイゼーショ
ンによって、RNAAPをコードする核酸配列を同定することが可能である。例えば
５'調節領域である高度に特異的な領域か、例えば保存されたモチーフであるや
や特異性の低い領域から作られているかのプローブの特異性と、ハイブリダイゼ
ーション或いは増幅の厳密性（最大、高い、中間、または低い）は、プローブが
RNAAPをコードする自然界の配列のみを同定するかどうか、或いはアレルや関連
配列コードする自然界の配列のみを同定するかどうかによって決まるであろう。

【０１５８】 プローブはまた、関連する配列の検出に利用され、RNAAPをコードする任意の
配列からのヌクレオチドを５０％以上含むのが望ましい。目的の本発明のハイブ
リダイゼーションプローブには、ＤＮＡあるいはＲＮＡが可能であり、SEQ ID N
O:26−50の配列、或いはRNAAP遺伝子のプロモーター、エンハンサー、イントロ
ンを含むゲノム配列に由来し得る。

【０１５９】 RNAAPをコードするＤＮＡに対して特異的なハイブリダイゼーションプローブ
の作製方法には、RNAAP及びRNAAP誘導体をコードするポリヌクレオチド配列をｍ
ＲＮＡプローブの作製のためのベクターにクローニングする方法がある。このよ
うなベクターは市販されており、当業者には周知であり、好適なＲＮＡポリメラ
ーゼ及び好適な標識されたヌクレオチドを加えることによって、in vitroでＲＮ
Ａプローブを合成するために用いられる。ハイブリダイゼーションプローブは、
例えば^３２Ｐ或いは^３５Ｓなどの放射性核種、或いはアビジン／ビオチン（biot
in）結合系によってプローブに結合されたアルカリホスファターゼなどの酵素標
識等の種々のレポーターの集団によって標識され得る。

【０１６０】 RNAAPをコードするポリヌクレオチド配列を用いて、RNAAPの発現に関連する疾
患を診断することが可能である。このような疾患の例には、細胞増殖異常が含ま
れ、その中には、日光性角化症及びアテローム性動脈硬化、滑液包炎、硬変、肝
炎、混合型結合組織病（ＭＣＴＤ）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症
、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに腺癌及び白血病、リンパ腫、黒
色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳
房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、
副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、子宮の癌などが含
まれ、また、自己免疫異常／炎症性疾患も含まれ、その中には後天性免疫不全症
候群（ＡＩＤＳ）及び副腎機能不全、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性
脊椎炎、アミロイド症、貧血、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血
性貧血、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性多腺性内分泌カンジダ性外胚葉ジスト
ロフィ（APECED）、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン病、アトピー性皮
膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、リンパ球毒素性一時性リンパ球減少症、赤芽
球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、
グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性大腸症候群、多発性硬化
症、重症筋無力症、心筋又は心膜炎症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、多発性
筋炎、乾癬、ライター症候群、リウマチ様関節炎、強皮症、シェ−グレン症候群
、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、血小板減
少症、潰瘍性大腸炎、ウェルナー症候群、癌合併症、血液透析、体外循環と、ウ
ィルス感染症及び細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫の
感染症、外傷が含まれ、また、感染症が含まれ、その中には、アデノウイルス及
びアレナウイルス、ブンヤウイルス、カリチウイルス、コロナウイルス、フィロ
ウイルス、ヘパドナウイルス、ヘルペスウイルス、フラビウイルス、オルソミク
ソウイルス、パルボウイルス、パポーバウイルス、パラミキソウイルス、ピコル
ナウイルス、ポックスウイルス、レオウイルス、レトロウイルス、ラブドウイル
ス、トガウイルスに分類されるウイルス病原体による感染と、肺炎球菌及びブド
ウ球菌、連鎖球菌、桿菌、コリネバクテリウム、クロストリジウム属、髄膜炎菌
、淋菌、リステリア、モラクセラ属、キンゲラ、ヘモフィルス属、レジオネラ、
ボルデテラ、グラム陰性腸内細菌（赤痢菌属及びサルモネラ、カンピロバクター
を含む）、シュードモナス、ビブリオ属、ブルセラ、フランシセラ、エルシニア
、バルトネラ、norcardium、アクチノミセス、ミコバクテリア、スピロヘターレ
ス、リケッチア、クラミジア、マイコプラズマに分類される細菌病原体による感
染症と、コウジカビ及びブラストマイセス、皮膚糸状菌、クリプトコッカス、コ
クシジオイデス、malasezzia、ヒストプラスマ、及び様々な真菌症を引き起こす
その他の真菌病原体に分類される真菌病原体による感染症と、プラスモディウム
またはマラリアを引き起こす体内寄生性アメーバ及びレーシュマニア、トリパノ
ソーマ属、トキソプラズマ、ニューモシスチス‐カリニ、ジアルジア属などの腸
内原生動物、トリコモナス、旋毛虫などの組織線形動物、回虫属などの腸内線形
動物、リンパのフィラリア性線形動物、住血吸虫及び条虫（サナダムシ）などの
線形動物に分類される寄生虫による感染症が含まれるが、ここに列記したものに
限定されるわけではない。RNAAPをコードするポリヌクレオチド配列は、サザー
ン法やノーザン法、ドットブロット法、或いはその他の膜系の技術、ＰＣＲ法、
ディップスティック（dipstick）、ピン（pin）、ＥＬＩＳＡ式アッセイ、及び
変異RNAAPの発現を検出するために患者から採取した体液或いは組織を利用する
マイクロアレイに使用することが可能である。このような質的或いは量的方法は
、当分野では周知である。

【０１６１】 特定の形態において、RNAAPをコードするヌクレオチド配列は、関連する疾患
、特に上記した疾患を検出するアッセイにおいて有用であろう。RNAAPをコード
するヌクレオチド配列は、標準的な方法で標識化され、ハイブリダイゼーション
複合体の形成に好適な条件の下、患者から採取した体液或いは組織のサンプルに
加えることができるであろう。好適な培養期間の後、サンプルを洗浄し、シグナ
ルを定量して標準値と比較する。患者のサンプルのシグナルの量が、制御サンプ
ルと較べて著しく変わっている場合は、サンプル内のRNAAPをコードするヌクレ
オチド配列の変異レベルにより、関連する疾患の存在が明らかになる。このよう
なアッセイを用いて、動物実験、臨床試験、或いは個人の患者の治療を監視にお
ける、特定の治療効果を推定することが可能である。

【０１６２】 RNAAPの発現に関連する疾患の診断の基準となるものを提供するために、正常
あるいは標準的な発現の概要が確立される。これは、ハイブリダイゼーション或
いは増幅に好適な条件の下、動物或いはヒトの何れかの正常な被験者から抽出さ
れた体液或いは細胞と、RNAAPをコードする配列或いはその断片とを結合させる
ことにより達成され得る。標準的なハイブリダイゼーションは、正常な被験者か
ら得た値と周知の量の実質的に精製されたポリヌクレオチドが用いられる実験か
らの値とを比較することによって定量可能である。正常なサンプルから得た標準
的な値を、疾患の症状を示す被験者から得た値と比較可能である。標準値と被験
者の値との偏差を用いて疾患の存在を確定する。

【０１６３】 疾患の存在が確定され治療プロトコルが開始されると、ハイブリダイゼーショ
ンアッセイを通常ベースで繰り返して、被験者における発現のレベルが正常な患
者に示される値に近づき始めたかどうかを推定することが可能である。繰り返し
行ったアッセイの結果を、数日から数ヶ月の期間の治療の効果を見るのに用いる
ことができる。

【０１６４】 癌では、個体からの生体組織における異常な量の転写物が、疾患の発生の素因
を示し、また実際に臨床的症状が出る前に疾患を検出する方法を提供することが
可能である。この種のより明確な診断により、医療の専門家が予防方法或いは積
極的な治療法を早くから利用して、癌の発生または進行を防ぐことが可能となる
。

【０１６５】 RNAAPをコードする配列から設計されたオリゴヌクレオチドのさらなる診断へ
の利用には、ＰＣＲの利用が含まれ得る。このようなオリゴマーは、化学的な合
成、酵素を用いた生成、或いはin vitroで生成され得る。オリゴマーは、好まし
くはRNAAPをコードするポリヌクレオチドの断片、或いはRNAAPをコードするポリ
ヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドの断片を含み、最適な条件の下、特定
の遺伝子や条件を識別するために利用される。また、オリゴマーは、やや緩い厳
密性条件の下、近縁のＤＮＡ或いはＲＮＡ配列の検出及び／または定量のため用
いることが可能である。

【０１６６】 RNAAPの発現を定量するために用いられ得る方法には、ヌクレオチドの放射標
識或いはビオチン標識、調節核酸の相互増幅（coamplification）、及び標準的
な曲線に結果が加えられたものが含まれる（例えば、Melby, P.C.等(1993) J. I
mmunol. Methods, 159:235-44；Duplaa, C.等(1993) Anal. Biochem. 229-236を
参照）。多数のサンプルの定量速度が、目的のオリゴマーが種々の希釈液に含ま
れ、分光光度法或いは非色応答により迅速に定量するＥＬＩＳＡ型のアッセイを
用いることによって加速された。

【０１６７】 別の実施例では、本明細書で記載した任意のポリヌクレオチド配列由来のオリ
ゴヌクレオチドまたはそれより長い断片を、マイクロアレイにおける標的として
用いる。マイクロアレイを用いて、同時に極めて多くの遺伝子の発現レベルを監
視し、遺伝子の変異、突然変異及び多形性を識別する。この情報は、遺伝子機能
の決定、疾患の遺伝的根拠の解釈、疾患の診断、及び治療薬剤の活性の監視及び
開発に有用である。

【０１６８】 当分野で周知の方法でマイクロアレイを準備して使用し、分析する。(例えば
、Brennan, T.M. 他 (1995) 米国特許第5,474,796号;Schena, M. 他 (1996) Pro
c. Natl. Acad. Sci. 93:10614-10619; Baldeschweiler 他(1995) PCT出願番号W
O95/251116; Shalon, D.他 (1995) PCT出願番号WO95/35505; Heller, R.A. 他(1
997) Proc. Natl. Acad. Sci. 94:2150-2155; 及び Heller, M.J. 他 (1997) 米
国特許第5,605,662号を参照) 本発明の別の実施例ではまた、RNAAPをコードする核酸配列を用いて、自然発
生のゲノム配列をマッピングするのに有用なハイブリダイゼーションプローブを
生成することが可能である。この配列は、以下のものに対してマッピングされる
。特定の染色体、染色体の特定領域または人工生成の染色体、例えば、ヒト人工
染色体（ＨＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、細
菌Ｐ１生成物或いは単一染色体ｃＤＮＡライブラリである。（例えば、Harringt
on, 1.3. 他 (1997) Nat Genet. 15:345-355; Price, C.M. (1993) Blood Rev.
7:127-134, 及びTrask, B.J. (1991) Trends Genet. 7:149-154を参照） in sit蛍光ハイブリダイゼーション（FISH）は、他の物理的染色体マッピング
技術及び遺伝マップデータと相関するであろう（例えば、Heinz-Ulrich, 他によ
る(1995) in Meyers, 前出, pp. 965-968.を参照）。遺伝子マップデータの例は
、種々の科学誌あるいはOnline Mendelian Inheritance in Man（OMIM）のサイ
トで見付けることができる。物理的な染色体マップ上のRNAAPをコードする遺伝
子の位置と特定の疾患との相関性、或いは特定の疾患に対する素因が、このよう
な疾患と関係するＤＮＡの領域を決定するのに役立つ。本発明のヌクレオチド配
列を用いて、正常者と、保有者、及び感染した者との遺伝子配列における違いを
検出することもある。

【０１６９】 染色体標本のin sitハイブリダイゼーション、及び確定した染色体マーカーを
用いた結合分析などの物理的マッピング技術を用いて、遺伝子マップを拡張する
こともできる。マウスなどの別の哺乳動物の染色体上での遺伝子の配置により、
たとえ特定のヒト染色体の数或いはアームが分かっていなくても、関連するマー
カーが明らかになることが多い。新規の配列を、物理的なマッピングによって、
染色体アームに割り付けることもできる。このことは、位置クローニング或いは
別の遺伝子発見技術を用いて遺伝的疾患の研究をしている研究者にとって、価値
ある情報である。疾患或いは症候群の位置が、例えば血管拡張性失調症の11q22-
23などの特定の遺伝子領域に遺伝子結合によって大まかに決定されると、その領
域に対するどの配列マッピングも、さらなる調査のための関連する遺伝子或いは
調節遺伝子を表す（例えば、Gatti, R.A.他による（1988）Nature 336:577-580
を参照）。また、目的の本発明のヌクレオチド配列を用いて、正常者、保有者、
即ち感染者の間の、転位置、反転などによる染色体位置の違いを検出することも
ある。

【０１７０】 本発明の別の実施例では、RNAAP、その触媒作用断片或いは免疫原断片または
そのオリゴペプチドを、種々の任意の薬剤スクリーニング技術における化合物の
ライブラリのスクリーニングに用いることができる。このようなスクリーニング
に用いる断片は、溶液に遊離、固体支持物に固定、細胞の表面上に保持、或いは
細胞内に存在する。RNAAPとテストされる薬剤との複合体を結合することによる
形成は計測されることもある。

【０１７１】 薬剤スクリーニングに用いる別の方法は、目的のタンパク質に対して、好適な
結合親和性を有する化合物のスクリーニング処理能力を高めるために用いられる
（例えば、Geysen,他による(1984) PCT出願番号 WO84/03564を参照）。この方法
では、相当な数の異なる小さな試験用化合物が、プラスチックピン或いは他の基
板の上に合成される。試験用化合物は、RNAAP、或いはその断片と反応してから
洗浄される。次ぎに、結合されたRNAAPが、当分野で周知の方法で検出される。
精製されたRNAAPはまた、前記した薬剤をスクリーニングする技術に用いられる
プレート上で直接被覆することもできる。別法では、非中和抗体を用いて、ペプ
チドを捕らえ、固体支持物に固定することもできる。

【０１７２】 別の実施例では、RNAAPと結合可能な中和抗体がRNAAPと結合するため試験用化
合物と特に競合する、競合的薬剤スクリーニングアッセイを用いることができる
。この方法では、抗体が、RNAAPと１つ以上の抗原決定因子を共有するどのペプ
チドの存在も検出する。

【０１７３】 別の実施例では、発展途上の分子生物学技術にRNAAPをコードするヌクレオチ
ド配列を用いて、限定はされないが、現在知られているトリプレット暗号及び特
異的な塩基対相互作用などのヌクレオチド配列の特性に依存する新しい技術を提
供することができる。

【０１７４】 当分野の技術者であれば、更なる説明がなくても前述の説明だけで十分に本発
明を利用できるであろう。したがって、以下に記載する特定の実施例は、例示目
的であって本発明を限定するものではない。

【０１７５】 前出及び以下に記載した全ての特許出願、特許、刊行物、特に米国出願６０／
１１５、６３９、米国出願６０／０９７、５５０を引用することをもって本明細
書の一部とする。

【０１７６】

【実施例】

１ ｃＤＮＡライブラリの作製 ＲＮＡにはClontech社から購入したものと、表４に列記した組織から単離した
ものとがある。ある組織をホモジナイズしてグアニジニウムイソチオシアネート
溶液に溶解した。一方で別の組織をホモジナイズしてフェノールに溶解するか、
或いはTRIZOL (Life Technologies)、グアニジニウムイソチオシアネート及びフ
ェノールの単相溶液などの好適な変性剤の混合液に溶解した。この溶解物を塩化
セシウムにおいて遠心分離またはクロロホルムで抽出した。イソプロパノール或
いは酢酸ナトリウムのどちらかとエタノール、或いは別の方法でこの溶解物から
ＲＮＡを沈殿させた。

【０１７７】 ＲＮＡの純度を高めるためにＲＮＡのフェノールによる抽出及び沈殿を必要な
回数繰り返した。場合によっては、ＤＮＡ分解酵素でＲＮＡを処理する。殆どの
ライブラリでは、オリゴd(T)連結常磁性粒子(Promega)またはOLIGOTEXラテック
ス粒子(QIAGEN. Valencia CA)、OLIGOTEX mRNA精製キット(QIAGEN)を用いてポリ
（Ａ＋）ＲＮＡを単離した。別法では、POLY(A)PURE mRNA精製キット(Ambion, A
ustin TX)などの別のＲＮＡ単離キットを用いて組織溶解物から直接単離した。

【０１７８】 ある場合には、Stratagene社にＲＮＡを提供しStratagene社が対応するｃＤＮ
Ａライブラリを作製した。そうでない場合は、UNIZAPベクターシステム(Stratag
ene)またはSUPERSCRIPT プラスミドシステム(Life Technologies)を用いて当分
野で公知の推奨方法または類似の方法でｃＤＮＡを合成してｃＤＮＡライブラリ
を作製した。(例えば、Ausubel, 1997,前出,ユニット5.1-6.6を参照)。逆転写は
、オリゴd(T)またはランダムプライマーを用いて開始した。合成オリゴヌクレオ
チドアダプターを二本鎖ｃＤＮＡに結合させてから、好適な１つの制限酵素或い
は複数の制限酵素でｃＤＮＡを消化した。殆どのライブラリでは、SEPHACRYL S
1000または SEPHAROSE CL2B、SEPHAROSE CL4Bカラムクロマトグラフィー(Amersh
am Pharmacia Biotech)、アガロースゲル電気泳動法によってｃＤＮＡの大きさ
（300〜1000bp）を選択した。PBLUESCRIPTプラスミド(Stratagene)またはpSPORT
1プラスミド(Life Technologies)、plNCY (Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto
CA)などの好適なプラスミドのポリリンカーの適合性制限酵素部位にｃＤＮＡを
結合させた。この組換えプラスミドを、Stratagene社のXL1-Blue, XL1-BIueMRF
、SOLR、またはLife Technologies社のDH5αまたはDH 10B、ELECTROMAX DH 10B
を含むコンピテント大腸菌細胞に形質転換した。

【０１７９】 ２ ｃＤＮＡクローンの単離 UNIZAPベクターシステム(Stratagene)或いは細胞溶解を利用して、in vivo切
除によって宿主細胞からプラスミドを回収した。MagicまたはWIZARD Minipreps
DNA精製システム(Promega)、及びAGTC Miniprep精製キット(Edge Biosystems, G
aithersburg MD)、QIAGEN社のQIAWELL 8 Plasmid、QIAWELL 8 Plus Plasmid、QI
AWELL 8 Ultra Plasmid 精製システム、REAL Prep 96プラスミドキットの内の少
なくとも１つを用いてプラスミドを精製した。沈殿させた後、０．１ｍｌの蒸留
水に再懸濁して、凍結乾燥して或いは凍結乾燥しないで４℃で保管した。

【０１８０】 別法では、高スループットの直接結合ＰＣＲ法によって宿主細胞溶解物からプ
ラスミドＤＮＡを増幅した。(Rao, V.B. (1994) Anal. Biochem. 216:1-14)。宿
主細胞の溶解及び熱サイクリング過程を単一反応混合液で行った。サンプルを処
理してから３８４−ウエルプレートに移して保管し、増幅したプラスミドＤＮＡ
の濃度をPICOGREEN色素(Molecular Probes, Eugene OR)及びFluoroskan II蛍光
スキャナー(Labsystems Oy, Helsinki, Finland)を用いて蛍光定量的に測定した
。

【０１８１】 ３ シークエンシング及び分析 ｃＤＮＡのシークエンシング反応は、標準的な方法で、或いはABI CATALYST 8
00 (Perkin-Elmer) thermal cyclerまたはPTC-200 thermal cycler (MJ Researc
h)とHYDRAマイクロディスペンサー(Robbins Scientific) またはMICROLAB 2200
(Hamilton) 液体転移システムとの組み合わせなどの高スループット装置で行っ
た。ｃＤＮＡのシークエンシング反応の準備には、Amersham Pharmacia Biotech
社の試薬、またはABI PRISM BIGDYE Terminator cycle sequencing ready react
ionキット(Perkin-Elmer)などのABIシークエンシングキットに含まれる試薬を用
いた。ｃＤＮＡのシークエンシング反応の電気泳動的な分離及び標識したポリヌ
クレオチドの検出には、MEGABACE 1000 DNAシークエンシングシステム(Molecula
r Dynamics)、標準ABIプロトコル及び塩基対呼び出しソフトウェアを用いるABI
PRISM 373または377シークエンシングシステム(Perkin-Elmer)、当分野で周知の
その他の配列解析システムを用いた。ｃＤＮＡ配列の読み枠は、標準的な方法(A
usubel, 1997, 前出, unit 7.7)を用いて決定した。ｃＤＮＡ配列の幾つかを選
択して、本実施例の５に記載した方法で配列を延長した。

【０１８２】 ｃＤＮＡのシークエンシングから得たポリヌクレオチド配列の構築及び解析は
、当分野の技術者に周知のアルゴリズムを利用したソフトウェアを組合せて行っ
た。表５は、利用したツール、ソフトウェア、アルゴリズム、それらの説明、引
用文献、閾値パラメーターの概要を示す。表５の列１は用いたツール及びプログ
ラム、アルゴリズム、列２はそれらの簡単な説明、列３は引用することで本明細
書の一部とした引用文献、列４の記載部分は２つの配列の一致度の評価に用いた
スコア及び確率値、他のパラメータを示す（確率値が高ければ高いほど配列間の
相同性が高くなる）。配列の解析には、MACDNASIS PROソフトウェア(Hitachi So
ftware Engineering, S. San Francisco CA)及びLASERGENEソフトウェア (DNAST
AR)を用いた。

【０１８３】 ポリヌクレオチド配列の確証は、BLAST及び動的計画法、ジヌクレオチド最近
接分析に基づいたプログラム及びアルゴリズムを用いて、ベクター及びリンカー
、ポリＡ配列を取り除き、あいまいな塩基対をマスクすることで行った。次に、
BLAST及びFASTA、BLIMPSに基づいたプログラムを用いて、公共のデータベースで
あるGenBankの霊長類及びげっ歯類、哺乳類、脊椎動物、真核生物のデータベー
スやBLOCKSデータベースなどから選択した配列に対してこれらの配列を問合わせ
て注釈を得た。Phred及びPhrap、Consedに基づいたプログラムを用いて完全長の
ポリヌクレオチド配列の中にこれらの配列を構築して、BLAST及びFASTA、BLIMPS
に基づいたプログラムでオープンリーディングフレームのためにスクリーンした
。完全長のポリヌクレオチド配列を翻訳して対応する完全長のアミノ酸配列を引
き出し、GenBankデータベース(上記)及びSwissProt、BLOCKS、PRINTS、PFAM、Pr
ositeなどのデータベース、またはPFAMなどのHidden Markov Model (HMM)に基づ
いたタンパク質ファミリーデータベースに対して問い合わせてこれらの完全長の
配列を分析した。HMMは、確率を利用して遺伝子ファミリーのコンセンサス一次
構造を解析する（例えば、Eddy, SR. (1996) Curr. Opin. Str. Biol. 6:361-36
5を参照）。

【０１８４】 完全長のポリヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の構築及び分析に用いる上記
のプログラムは、SEQ ID NO:26−50からのポリヌクレオチド配列の断片の同定に
も使用できる。約２０から４０００までのヌクレオチドの断片はハイブリダイゼ
ーション及び増幅に有用であり、上記の発明で説明した。

【０１８５】 ４ ノーザン分析 ノーザン分析は、遺伝子の転写物の存在を検出するために用いられる実験用技
術であり、特定の細胞種或いは組織からのＲＮＡが結合されている膜への標識さ
れたヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションを伴う(例えば、Sambrook,前出
, 7章; 及び Ausubel. F.M. 他、前出, 4章及び16章を参照)。

【０１８６】 ＢＬＡＳＴに用いる類似のコンピュータ技術を用いて、GenBank或いはLIFESEQ
（Incyte Pharmaceuticals）のようなヌクレオチドデータベース内の同一或いは
関連する分子を検索する。この分析は多くの膜系ハイブリダイゼーションより非
常に速度が速い。さらにコンピュータ検索の感度を変更して、任意の特定の一致
が、厳密な一致或いは相同的一致の何れかとして分類されるかを確定することが
できる。検索の基準は、 （％配列同一性×％最大ＢＬＡＳＴスコア）／１００ として定義される積スコアである。積スコアは、２つの配列間の類似度及び配列
一致の長さの両方を考慮する。例えば、積スコア４０の場合、その一致は１〜２
％誤差の範囲内で正確であり、７０ではその一致は正確であろう。類似分子は通
常、１５〜４０の範囲の積スコアを示す分子を選択することにより同定されるが
、それより低いスコアでも関連した分子が同定される場合もある。

【０１８７】 ノーザン分析の結果は、RNAAPをコードする転写物が発生したライブラリの分
布割合として報告される。分析には、器官／組織及び疾患によるｃＤＮＡライブ
ラリの分類も含まれる。器官／組織のカテゴリーには、心血管、皮膚、発生、内
分泌、胃腸、造血／免疫、筋骨格、神経、生殖、泌尿が含まれる。疾患のカテゴ
リーには、癌、炎症／外傷、胎児、神経、貯留(pooled)が含まれる。それぞれの
カテゴリーについて、目的の配列を発現するライブラリの数を数えて、それを全
ての範囲のライブラリの数で割った。各組織に特異的に発現する割合（パーセン
ト）と各疾患で発現する割合を表３に示した。

【０１８８】 ５ RNAAPをコードするポリヌクレオチドの延長 SEQ ID NO:26−50の完全長の核酸配列は、完全長分子の好適な断片から設計し
たオリゴヌクレオチドプライマーを用いてその完全長分子の好適な断片を延長し
て作製した。一方のプライマーは既知の断片の５'の延長を開始するために合成
し、他方のプライマーは既知の断片の３'の延長を開始するために合成した。開
始プライマーは、ＯＬＩＧＯ ４．０６ソフトウェア（National Biosciences）
或いは他の適切なプログラムを用いて、約２２個から約３０個のヌクレオチドの
長さで約５０％以上のＧＣ含量を有し、かつ約６８〜７２℃の温度で標的配列に
アニールするように設計した。ヘアピン構造及びプライマー−プライマー二量体
が生じないようにヌクレオチドを延長した。

【０１８９】 選択されたヒトｃＤＮＡライブラリーを用いてこの配列を延長した。２段階以
上の延長が必要な場合、若しくは望ましい場合は、追加或いはネスト化プライマ
ーの組を設計する。

【０１９０】 当分野で既知の方法を利用したＰＣＲ法で高い忠実度で増幅した。ＰＣＲはPT
C-200 thermal cycler (MJ Research, Inc.)用いて９６ウェルブロックプレート
で行った。反応混合液は、鋳型ＤＮＡ及び２００ｎｍｏｌの各プライマー、Mg^{２ +} と(NH₄)₂SO₄とβ−メルカプトエタノールを含むバッファー、Taq DNAポリメラ
ーゼ(Amersham Pharmacia Biotech)、ELONGASE酵素(Life Technologies)、Pfu D
NAポリメラーゼ(Stratagene)を含む。プライマーの組、PCI AとPCI Bに対して以
下のパラメーターで増幅を行った。 ステップ１ ９４℃で３分間 ステップ２ ９４℃で１５秒 ステップ３ ６０℃で１分間 ステップ４ ６８℃で２分間 ステップ５ ステップ２及び３、４を２０回繰り返す ステップ６ ６８℃で５分間 ステップ７ ４℃で保管 別法では、プライマーの組、T7とSK+に対して以下のパラメータで増幅を行った
。 ステップ１ ９４℃で３分間 ステップ２ ９４℃で１５秒 ステップ３ ５７℃で１分間 ステップ４ ６８℃で２分間 ステップ５ ステップ２及び３、４を２０回繰り返す ステップ６ ６８℃で５分間 ステップ７ ４℃で保管。

【０１９１】 各ウェルのＤＮＡ濃度は、１X TE及び０．５μlの希釈していないＰＣＲ産物
に溶解した１００μｌのPICOGREEN定量試薬(0.25% (v/v) PICOGREEN; Molecular
Probes, Eugene OR)を不透明な蛍光光度計プレート(Coming Costar, Acton MA)
の各ウェルに分配してＤＮＡが試薬と結合できるようにして測定する。このプレ
ートをFluoroskan II (Labsystems Oy, Helsinki, Finland)でスキャンして、サ
ンプルの蛍光を計測してＤＮＡの濃度を定量化する。反応混合物の５〜１０μｌ
のアリコットを１％のアガロースミニゲル上での電気泳動によって解析し、何れ
の反応物が配列を延長することに成功したかを決定する。

【０１９２】 延長したヌクレオチドを脱塩及び濃縮してから３８４ウェルのプレートに移し
、CviJIコレラウィルスエンドヌクレアーゼ(Molecular Biology Research, Madi
son WI)で消化し、pUC 18ベクター(Amersham Pharmacia Biotech)に再連結する
前に音波処理またはせん断を行った。ショットガンシークエンシングのために、
消化したヌクレオチドを低濃度（０．６〜０．８％）のアガロースゲル上に分離
して断片を切断し、寒天をAgar ACE (Promega)で消化した。T4リガーゼ(New Eng
land Biolabs, Beverly MA)を用いて延長したクローンをpUC 18ベクター(Amersh
am Pharmacia Biotech)に再連結し、Pfu DNAポリメラーゼ(Stratagene)で制限部
位の延び出しを処理してコンピテント大腸菌細胞に形質移入した。形質移入した
細胞を選択して抗生物質を含む培地に移し、それぞれのコロニーを切りとってLB
/2Xカルベニシリン培養液の384ウェルプレートに３７℃で一晩培養した。

【０１９３】 細胞を溶解して、Taq DNAポリメラーゼ(Amersham Pharmacia Biotech)及びPfu
DNAポリメラーゼ(Stratagene)を用いて以下の手順でＤＮＡをＰＣＲ増幅した。
ステップ１ ９４℃で３分間 ステップ２ ９４℃で１５秒 ステップ３ ６０℃で１分間 ステップ４ ７２℃で２分間 ステップ５ ステップ２及び３、４を２９回繰り返す ステップ６ ７２℃で５分間 ステップ７ ４℃で保管。 上記したようにPICOGREEN試薬(Molecular Probes)でＤＮＡを定量化した。ＤＮ
Ａ回収率の悪いサンプルは、上記した条件で再び増幅した。サンプルを２０％の
ジメチルサルホサイド（dimethysulphoxide）( 1:2, v/v)で希釈し、DYENAMIC D
IRECTキット(Amersham Pharmacia Biotech)またはABI PRISM BIGDYE Terminator
cycle sequencing ready reactionキット(Perkin-Elmer)を用いてシークエンシ
ングした。

【０１９４】 同様に上述の手順で、SEQ ID NO:26−50のヌクレオチド配列を利用し、この延
長のために設計したオリゴヌクレオチドと好適な遺伝子ライブラリを用いて５′
調節配列を得た。

【０１９５】 ６ 個々のハイブリダイゼーションプローブの標識及び使用 SEQ ID NO:26−50から導き出されたハイブリダイゼーションプローブを用いて
、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡをスクリーニングする。約２０塩基
対からなるオリゴヌクレオチドの標識について特に記すが、より大きなｃＤＮＡ
フラグメントの場合でも基本的に同じ手順を用いる。オリゴヌクレオチドを、OL
IGO4.06ソフトウェア（National Bioscience）のような最新式のソフトウェアを
用いてデザインし、５０ｐｍｏｌの各オリゴマーと、２５０μＣｉの[γ‐^３２
Ｐ]アデノシン三リン酸（Amersham, Chicago, IL）及びＴ４ポリヌクレオチドキ
ナーゼ（DuPont NEN、Boston MA）とを組み合わせて用いることにより標識する
。標識されたオリゴヌクレオチドを、SEPHADEX G-25超精細排除デキストランビ
ードカラム（Amersham Pharmacia Biotech）を用いて実質的に精製する。毎分１
０^７カウントの標識されたプローブを含むアリコットを、次のエンドヌクレアー
ゼ、Ase I、Bgl II、Eco RI、Pst I、Xba1或いはPvu II（DuPont NEN）の１つを
用いて切断したヒトゲノムＤＮＡの典型的な膜ベースのハイブリダイゼーション
解析において用いる。

【０１９６】 各切断物からのＤＮＡを、０．７％アガロースゲル上で分画して、ナイロン製
メンブラン（Nytran Plus, Schleicher & Schuell, Durham NH）に転写する。ハ
イブリダイゼーションは４０℃で１６時間かけて行う。非特異的シグナルを取り
除くため、ブロットを、段階的に厳密性が増す条件で最大０．１ｘクエン酸ナト
リウム食塩水及び０．５％ドデシル硫酸ナトリウムまで順次室温にて洗浄する。
ハイブリダイゼーションパターンをオートラジオグラフィーで視覚化して比較す
る。

【０１９７】 ７ マイクロアレイ 化学結合方法及びインクジェット装置を用いて、基板の表面上でアレイ要素を
合成することが可能である（例えば、上記Baldeschweilerを参照）。ドットブロ
ット法またはスロットブロット法に類似したアレイを利用し、要素を熱、ＵＶ、
機械的または化学的結合方法を用いて基板の表面に配置し結合させる。典型的な
アレイは、手作業または利用可能な方法や機械を用いて作製することができ、任
意の適正な数の要素を含み得る。ハイブリダイゼーションの後、ハイブリダイズ
していないプローブを取り除き、スキャナーを用いて蛍光のレベル及びパターン
を決定する。スキャンした画像を分析して、マイクロアレイ上で要素にハイブリ
ダイズする各プローブの相補性の程度及び相対的な量／発現レベルを調べること
が可能である。

【０１９８】 完全長のｃＤＮＡ、発現配列タグ（ＥＳＴ）、或いはそれらの断片が、マイク
ロアレイの要素を含み得る。ハイブリダイゼーションに好適な断片を、LASERGEN
Eソフトウェア（DNASTAR）などの当分野で公知のソフトウェアを用いて選択する
ことが可能である。本発明の核酸配列の１つに対応する完全長のｃＤＮＡ、ＥＳ
Ｔ、或いはそれらの断片、或いは本発明に関連するｃＤＮＡライブラリから任意
に選択されたｃＤＮＡを、ガラススライドなどの好適な基質に整列する。ｃＤＮ
Ａは、例えばＵＶ交差結合（UV cross-linking）を利用してスライドに固定して
から、熱処理及び化学処理を施し、最後に乾燥させる(例えば、 Schena, M. 他.
(1995) Science 270:467-470; 及び Shalon, D. 他. (1996) Genome Res. 6:63
9-645を参照)。蛍光プローブを準備して、基質上の要素にハイブリダイゼーショ
ンするために用いる。上記した方法でこの基質を分析する。

【０１９９】 ８ 相補的ポリヌクレオチド RNAAPをコードする配列或いはその任意の一部に対して相補的な配列は、自然
発生のRNAAPの発現の低下即ち阻害するために用いられる。約１５〜約３０個の
塩基対を含むオリゴヌクレオチドの使用について記すが、より小さな或いはより
大きな配列の断片の場合でも本質的に同じ方法を用いることができる。Oligo4.0
6ソフトウェア（National Biosciences）及びRNAAPのコーディング配列を用いて
、適切なオリゴヌクレオチドを設計する。転写を阻害するためには、最も独特な
５′配列から相補的なオリゴヌクレオチドを設計し、これを用いてプロモーター
がコーディング配列に結合するのを阻害する。翻訳を阻害するためには、相補的
なオリゴヌクレオチドを設計して、リボソームがRNAAPをコードする転写物に結
合するのを阻害する。

【０２００】 ９ RNAAPの発現 RNAAPの発現及び精製は、細菌またはウイルスを基にした発現系を用いて行う
ことができる。細菌でRNAAPが発現するために、抗生物質耐性及びｃＤＮＡの転
写レベルを高める誘導性のプロモーターを含む好適なベクターにｃＤＮＡをサブ
クローニングする。このようなプロモーターには、lacオペレーター調節要素に
関連するＴ５またはＴ７バクテリオファージプロモーター及びtrp-lac(tac)ハイ
ブリッドプロモーターが含まれるが、これらに限定されるものではない。組換え
ベクターを、BL21(DE3)などの好適な細菌宿主に形質転換する。抗生物質耐性を
もつ細菌が、イソプロピルβ−Ｄチオガラクトピラノシド(IPTG)で誘発されると
ＨＬＯＲを発現する。真核細胞でのRNAAPの発現は、昆虫細胞株または哺乳動物
細胞株に一般にバキュロウイスルスとして知られているAutographica californi
ca核多面性ウイルス(AcMNPV)を感染させて行う。バキュロウイルスの非必須ポリ
ヘドリン遺伝子を、相同組換え或いは転移プラスミドの媒介を伴う細菌の媒介に
よる遺伝子転移のどちらかによって、RNAAPをコードするｃＤＮＡと置換する。
ウイルスの感染力は維持され、強いポリヘドリンプロモータによって高いレベル
のｃＤＮＡの転写が行われる。組換えバキュロウイルスは、多くの場合はSpodop
tera frugiperda (Sf9)昆虫細胞に感染に用いられるが、ヒト肝細胞の感染にも
用いられることもある。後者の感染の場合は、バキュロウイルスの更なる遺伝的
変更が必要になる。(例えば、Engelhard. E. K.他 (1994) Proc. Natl. Acad. S
ci. USA 91:3224-3227; Sandig, V. 他 (1996) Hum. Gene Ther. 7:1937-1945.
を参照)。

【０２０１】 殆どの発現系では、RNAAPが、例えばグルタチオンＳトランスフェラーゼ(GST)
、またはFLAGや6-Hisなどのペプチドエピトープ標識で合成された融合タンパク
質となるため、未精製の細胞溶解物からの組換え融合タンパク質の親和性ベース
の精製が素早く１回で行うことができる。Schistosoma japonicumからの２６キ
ロダルトンの酵素ＧＳＴによって、タンパク質の活性及び抗原性を維持した状態
で固定されたグルタチオンで融合タンパク質の精製が可能となる(Amersham Phar
macia Biotech)。精製の後、ＧＳＴ部分を特定の操作部位でＨＬＯＲからタンパ
ク分解的に切断できる。アミノ酸８個のペプチドであるＦＬＡＧで、市販のモノ
クロナール及びポリクロナール抗FLAG抗体(Eastman Kodak)を用いた免疫親和性
の精製が可能となる。６個のヒスチジン残基が連続して伸展した6-Hisによって
、金属キレート樹脂(QIAGEN)で精製が可能となる。タンパク質の発現及び精製の
方法は、Ausubel (1995,前出, ch 10, 16)に記載されている。これらの方法で精
製したRNAAPを直接用いて以下のアッセイを行うことができる。

【０２０２】 １０ RNAAP活性の実証 RNAAPの活性は、RNAAP−RNA複合体の形成をポリアクリルアミドゲル易動度シ
フトアッセイによって検出することで実証できる。このアッセイの準備のために
、COS7またはHeLa、CHOなどの哺乳類株化細胞をRNAAP cDNAを含む真核生物発現
ベクターで形質転換してRNAAPを発現させる。形質転換の後、この細胞をRNAAPの
発現及び蓄積が許容される条件下で４８〜７２時間インキュベートする。当分野
で周知の方法で、RNAAPを発現する細胞から可溶化タンパク質を含む抽出物を準
備できる。RNAAPを含む抽出物の一部を[^３２P]標識したRNAに加える。放射性RNA
は、当分野で周知の技術でin vitro 合成が可能である。バッファー条件で、こ
の混合物をRNA分解酵素の存在の下、２５℃で５〜１０分間インキュベートする
。インキュベーションの後、このサンプルをポリアクリルアミドゲル電気泳動法
及びそれに続くオートラジオグラフィーで分析する。オートラジオグラム上の高
分子量バンドは、RNAAPと放射性転写物との複合体が形成されたことを示す。極
めて低い分子量のバンドが、形質転換しない細胞から用意した制御用抽出物を用
いて準備したサンプルに存在する。RNAAP−RNA複合体の量は、リン光画像（phos
pho-rimage）分析によって測定でき、その量はRNAAPの活性に比例する。

【０２０３】 別法では、RNAAPまたはその生物学的に活性な断片を^１２５Iボルトンハンター
試薬で標識する（例えば、Bolton 他 (1973) Biochem. 1. 133:529を参照）。予
めマルチウェルプレートに配置された候補分子を、標識したRNAAPでインキュベ
ートし、次に洗浄し、標識したRNAAP複合体のあるウェルをアッセイする。異な
った濃度のRNAAPで収集したデータを用いて、その合計数及び親和性、候補分子
とRNNAPとの関係を数値化する。

【０２０４】 １１ 機能的アッセイ RNAAPの機能は、哺乳動物細胞培養系において生理学的に高められたレベルで
のRNAAPをコードする配列の発現によって評価する。ｃＤＮＡを、ｃＤＮＡを高
いレベルで発現する強いプロモーターを含む哺乳動物発現ベクターにサブクロー
ニングする。このようなベクターには、pCMV SPORT^TM (Life Technologies.)及
びpCR 3.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA)が含まれ、どちらもサイトメガロウイル
スプロモーターを含んでいる。５〜１０μｇの組換えベクターを、好ましくは内
皮由来か造血由来のヒト細胞株にリポソーム製剤或いは電気穿孔法によって一過
性に形質移入する。更に、標識タンパク質をコードする配列を含む１〜２μｇの
プラスミドを同時に形質移入する。標識タンパク質の発現により、形質移入され
た細胞と形質移入されていない細胞とを区別できる。また、標識タンパク質の発
現によって、ｃＤＮＡの組換えベクターからの発現を正確に予想できる。このよ
うな標識タンパク質には、緑色蛍光タンパク質(GFP；Clontech)、及びCD64また
はCD64-GFP融合タンパク質が含まれる。レーザー光学に基づいた技術を利用した
自動流動細胞計測法(FCM)を用いて、GFPまたはCD64-GFPを発現する形質移入され
た細胞を同定し、その細胞のアポトーシス状態や他の細胞特性を評価する。また
、ＦＣＭで、先行した或いは同時の細胞死の現象を診断する蛍光分子の取り込み
を検出して計量する。これらの現象には、プロピジウムヨウ化物でのＤＮＡの染
色によって計測される核ＤＮＡ内容物の変化と、ブロモデオキシウリジンの取り
込み量の低下によって計測されるＤＮＡ合成の下方調節と、特異的な抗体との反
応性によって計測される細胞表面及び細胞内のタンパンク質の発現の変化と、蛍
光複合アネキシンＶタンパク質の細胞表面への結合によって計測される原形質膜
組成の変化とが含まれる。流動細胞計測法は、Ormerod, M. G.による (1994) Fl
ow Cytometry Oxford, New York, NY.に記載されている。

【０２０５】 遺伝子発現におけるRNAAPの影響は、RNAAPをコードする配列とCD64またはCD64
-GFPのどちらかが形質移入された高度に精製された細胞集団を用いて評価するこ
とができる。CD64またはCD64-GFPは形質転換された細胞表面で発現し、ヒト免疫
グロブリンG(IgG)の保存された領域と結合する。形質転換された細胞と形質転換
されない細胞とは、ヒトIgGかCD64に対する抗体のどちらかで被覆された磁気ビ
ードを用いて分離することができる(DYNAL. Lake Success. NY)。ｍＲＮＡは、
当分野で公知の方法で細胞から精製することができる。RNAAP及び目的の他の遺
伝子をコードするｍＲＮＡの発現は、ノーザン分析やマイクロアレイ技術で分析
することができる。

【０２０６】 １２ RNAAPに特異的な抗体の産生 ポリアクリルアミドゲル電気泳動法(PAGE；例えば、Harrington, M.G. (1990)
Methods Enzymol. 182:488-495を参照)または他の精製技術で実質的に精製され
たRNAAPを用いて、標準的なプロトコルでウサギを免疫化して抗体を作り出す。

【０２０７】 別法では、RNAAPアミノ酸配列をＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェア（DNASTAR）
を用いて解析して免疫原性の高い領域を決定し、対応するオリゴペプチドを合成
してこれを用いて当業者に周知の方法で抗体を産生させる。Ｃ末端付近の、或い
は隣接する親水性領域内のエピトープなどの適切なエピトープの選択については
、当分野で周知である(例えば、前出のAusubel, 1995,11章を参照)。

【０２０８】 通常、約１５残基の長さのオリゴペプチドを、Applied Biosystemsのペプチド
シンセサイザABI 431Aペプチドシンセサイザー（Perkin-Elmer）を用いてｆｍｏ
ｃ法のケミストリにより合成し、Ｎ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシス
クシンイミドエステル（ＭＢＳ）を用いた反応によりＫＬＨ（Sigma-Aldrich, S
t. Louis MO）に結合させて、免疫原性を高める(例えば、前出のAusubel, 1995
を参照)。フロイントの完全アジュバントにおいてオリゴペプチド−ＫＬＨ複合
体を用いてウサギを免疫化する。得られた抗血清の抗ペプチド活性を検査するに
は、例えばペプチドをプラスチックに結合し、１％ＢＳＡを用いてブロックし、
ウサギ抗血清と反応させて洗浄し、さらに放射性ヨウ素標識されたヤギ抗ウサギ
ＩｇＧと反応させる。

【０２０９】 １３ 特異的抗体を用いる自然発生RNAAPの精製 自然発生RNAAP或いは組換えRNAAPを、RNAAPに特異的な抗体を用いるイムノア
フィニティークロマトグラフィにより実質的に精製する。イムノアフィニティー
カラムは、CNBr-活性化SEPHAROSE（Amersham Pharmacia Biotech）のような活性
化クロマトグラフィー用レジンとRNAAP抗体とを共有結合させることにより構築
する。結合の後、そのレジンを製造者の使用説明書に従って、ブロックし洗浄す
る。

【０２１０】 RNAAPを含む培養液をイムノアフィニティーカラムに通し、RNAAPを優先的に吸
着できる条件で（例えば、界面活性剤の存在下において高イオン強度のバッファ
ーで）そのカラムを洗浄する。そのカラムを、抗体とRNAAPとの結合を切るよう
な条件で（例えば、ｐＨ２〜３のバッファー、或いは高濃度の尿素またはチオシ
アン酸塩イオンのようなカオトロピックイオンで）溶出させ、RNAAPを回収する
。

【０２１１】 １４ RNAAPと相互作用する分子の同定 RNAAP又は生物学的に活性なその断片を、^１２５Ｉボルトンハンター試薬（例
えば、Bolton他 (1973) Biochem. J. 133:529を参照）で標識する。マルチウェ
ルプレートに予め配列しておいた候補の分子を、標識したRNAAPと共にインキュ
ベートし、洗浄して、標識したRNAAP複合体を有する全てのウェルをアッセイす
る。様々なRNAAP濃度で得られたデータを用いて、候補の分子とRNAAPとの結合、
親和性、数について数値を計算する。

【０２１２】 当業者は、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく本発明の記載した方法
及びシステムの種々の改変を行うことができるであろう。特定の好適実施例に基
づいて本発明を説明したが、本発明の範囲が、そのような特定の実施例に不当に
制限されるべきではないことを理解されたい。実際に、分子生物学或いは関連す
る分野の専門家には明らかな本明細書に記載の本発明の実施のための方法の様々
な改変は、特許請求の範囲に含まれることが意図されている。

【０２１３】 表の簡単な説明 表１は、RNAAPをコードする完全長の配列を作り出すために用いた、ポリペプ
チド配列及びヌクレオチド配列の配列番号(SEQ ID NO)、クローンＩＤ番号、ｃ
ＤＮＡライブラリ、ｃＤＮＡ断片を示す。

【０２１４】 表２は、潜在モチーフ及び相同配列を含む各ポリペプチド配列の特徴、及びRN
AAPの同定に用いた方法及びアルゴリズムを示す。

【０２１５】 表３は、ノーザン分析によって決定された各核酸配列の組織特異的発現パター
ンと、これらの組織に関連した疾患や異常症、症状と、各ＤＮＡがクローニング
されたベクターとを示す。

【０２１６】 表４は、RNAAPをコードするｃＤＮＡクローンを単離したｃＤＮＡライブラリ
を作製するために用いた組織を示す。

【０２１７】 表５は、RNAAPの分析に用いたツール及びプログラム、アルゴリズム、その説
明、引用文献、閾値パラメーターを示す。

【表１】

【表２】

【表３】

【表４】

【表５】

【表６】

【表７】

【表８】

【表９】

【表１０】

【表１１】

【表１２】

【表１３】

【表１４】

【表１５】

【表１６】

【表１７】

【表１８】

【表１９】

【表２０】

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 1/04 Ａ６１Ｐ 3/00 ４Ｃ０８４ 1/16 3/10 ４Ｈ０４５ 1/18 7/00 3/00 7/06 3/10 9/00 7/00 11/00 7/06 11/06 9/00 13/12 11/00 17/00 11/06 17/06 13/12 19/00 17/00 19/02 17/06 19/06 19/00 19/10 19/02 21/00 19/06 21/04 19/10 29/00 21/00 １０１ 21/04 31/00 29/00 31/04 １０１ 31/10 31/00 31/12 31/04 31/18 31/10 31/22 31/12 35/00 31/18 35/02 31/22 37/00 35/00 37/08 35/02 Ｃ０７Ｋ 14/47 37/00 16/18 37/08 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ０７Ｋ 14/47 1/19 16/18 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/19 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 1/21 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 5/10 33/50 Ｚ Ｃ１２Ｐ 21/02 33/53 Ｍ Ｃ１２Ｑ 1/68 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｐ 21/08 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/53 5/00 Ａ 33/566 Ａ６１Ｋ 37/02 // Ｃ１２Ｐ 21/08 37/64 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，Ｇ Ｈ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ， ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ユエ、ヘンリー アメリカ合衆国カリフォルニア州94087・ サニーベイル・ルイスアベニュー 826 (72)発明者 タング、ワイ・トム アメリカ合衆国カリフォルニア州95118・ サンノゼ・ランウィックコート 4230 (72)発明者 コーレイ、ニール・シー アメリカ合衆国カリフォルニア州94040・ マウンテンビュー・＃30・デールアベニュ ー 1240 (72)発明者 ゲグラー、カール・ジェイ アメリカ合衆国カリフォルニア州94025・ メンロパーク・オークランドアベニュー 1048 (72)発明者 ゴルゴン、ジーナ・エイ アメリカ合衆国カリフォルニア州95006・ ボールダークリーク・パインクレストドラ イブ 1253 (72)発明者 パターソン、チャンドラ アメリカ合衆国カリフォルニア州94025・ メンロパーク・＃１・シャーウッドウェイ 490 (72)発明者 ボーグン、マライア・アール アメリカ合衆国カリフォルニア州94577・ サンレアンドロ・サンティアゴロード 14244 (72)発明者 ラル、プリーティ アメリカ合衆国カリフォルニア州95054・ サンタクララ・ラスドライブ 2382 (72)発明者 バンドマン、オルガ アメリカ合衆国カリフォルニア州94043・ マウンテンビュー・アンナアベニュー 366 (72)発明者 レディ、ルーパ アメリカ合衆国カリフォルニア州94086・ サニーベイル・ウェストマッキンレードラ イブ 1233 (72)発明者 アジムザイ、ヤルダ アメリカ合衆国カリフォルニア州94545・ ヘイワード・ロックスプリングスドライブ 2045 (72)発明者 シー、レオ・エル アメリカ合衆国カリフォルニア州94304・ パロアルト・アパートメント ビー・タン ランドドライブ 1081 (72)発明者 ヤング、ジュンミング アメリカ合衆国カリフォルニア州95129・ サンノゼ・クラレンドンストリート 7136 (72)発明者 リュ、デュング・アイナ・エム アメリカ合衆国カリフォルニア州95126・ サンノゼ・パークベルモントプレイス 55 Ｆターム(参考） 2G045 AA34 AA35 AA40 CB01 DA12 DA13 DA14 DA36 DA77 FB02 4B024 AA01 AA11 AA13 BA80 CA04 DA06 EA04 GA11 GA19 HA01 HA12 HA15 4B063 QA01 QA18 QA19 QQ42 QQ52 QR32 QR40 QR56 QR62 QR84 QS25 QS34 QX01 QX07 4B064 AG01 AG27 CA02 CA19 CC24 CE13 DA01 DA13 DA15 4B065 AA26X AA93Y AB01 AC14 CA24 CA44 CA46 4C084 AA02 AA16 AA17 BA01 BA08 BA21 BA22 BA35 BA44 CA01 CA17 CA53 DA27 DC32 NA14 ZA362 ZA452 ZA512 ZA552 ZA592 ZA662 ZA682 ZA752 ZA812 ZA892 ZA942 ZA962 ZA972 ZB012 ZB112 ZB132 ZB152 ZB262 ZB312 ZB322 ZB332 ZB352 ZB372 ZB382 ZB392 ZC312 ZC412 ZC552 ZC612 4H045 AA11 AA20 AA30 BA10 CA40 DA76 DA86 EA22 EA28 EA29 EA50 EA51 EA52 FA74 GA26

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 SEQ ID NO:1−25（配列番号：1−25）及びそれらの断片か
   らなる一群から選択されたアミノ酸配列を含む実質的に精製されたポリペプチド
   。
2. 【請求項２】 請求項１のアミノ酸配列と９０％以上のアミノ酸配列同一
   性を有する実質的に精製された変異体。
3. 【請求項３】 請求項１のポリペプチドをコードする単離され精製された
   ポリヌクレオチド。
4. 【請求項４】 請求項３のポリヌクレオチドと７０％以上のポリヌクレオ
   チド配列同一性を有する単離され精製されたポリヌクレオチド変異配列。
5. 【請求項５】 厳密な条件の下で請求項３のポリヌクレオチドとハイブリ
   ダイズする単離され精製されたポリヌクレオチド。
6. 【請求項６】 請求項３のポリヌクレオチドと相補的な配列を有する単離
   され精製されたポリヌクレオチド。
7. 【請求項７】 ポリヌクレオチドを検出する方法であって、 （ａ）請求項６のポリヌクレオチドをサンプルの少なくとも１つの核酸とハイ
   ブリダイズさせて、ハイブリダイゼーション複合体を形成する過程と、 （ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体を検出する過程であって、前記ハイ
   ブリダイゼーション複合体の存在が、前記サンプルに前記ポリヌクレオチドが存
   在することと相関性を有する、該過程とを含むことを特徴とする検出方法。
8. 【請求項８】 前記ハイブリダイゼーションの前に前記ポリヌクレオチド
   を増幅する過程を更に含むことを特徴とする請求項７に記載の方法。
9. 【請求項９】 SEQ ID NO:26−50及びそれらの断片からなる一群から選択
   されたポリヌクレオチド配列を含む単離され精製されたポリヌクレオチド。
10. 【請求項１０】 請求項９のポリヌクレオチドと７０％以上のポリヌクレ
    オチド配列同一性を有する単離され精製されたポリヌクレオチド変異配列。
11. 【請求項１１】 請求項９のポリヌクレオチドと相補的な配列を有する単
    離され精製されたポリヌクレオチド。
12. 【請求項１２】 請求項３のポリヌクレオチドの少なくとも１つの断片を
    含む発現ベクター。
13. 【請求項１３】 請求項１２の発現ベクターを含む宿主細胞。
14. 【請求項１４】 ポリペプチドの製造方法であって、 （ａ）前記ポリペプチドの発現に好適な条件の下で、請求項１３の宿主細胞を
    培養する過程と、 （ｂ）前記宿主細胞の培地から前記ポリペプチドを回収する過程とを含むこと
    を特徴とする製造方法。
15. 【請求項１５】 好適な医薬用担体と共に請求項１のポリペプチドを含む
    医薬品組成物。
16. 【請求項１６】 請求項１のポリペプチドと特異的に結合する精製された
    抗体。
17. 【請求項１７】 請求項１のポリペプチドの精製されたアゴニスト。
18. 【請求項１８】 請求項１のポリペプチドの精製されたアンタゴニスト。
19. 【請求項１９】 RNAAPの発現または活性の低下に関連する疾患の治療ま
    たは予防が必要な患者に、請求項１５の医薬品組成物を効果的な量投与する過程
    を含む、RNAAPの発現または活性の低下に関連する疾患を治療または予防する方
    法。
20. 【請求項２０】 RNAAPの発現または活性の増大に関連する疾患の治療ま
    たは予防が必要な患者に、請求項１８のアンタゴニストを効果的な量投与する過
    程を含む、RNAAPの発現または活性の増加に関連する疾患を治療または予防する
    方法。