KR20210049833A

KR20210049833A - Mma의 치료를 위한 비-붕괴적 유전자 요법

Info

Publication number: KR20210049833A
Application number: KR1020217007207A
Authority: KR
Inventors: 찰스 피. 벤디티; 랜디 제이. 챈들러; 비. 넬슨 차우; 카일 피. 치앙; 징 리아오
Original assignee: 로직바이오 테라퓨틱스, 인크.; 더 유나이티드 스테이츠 오브 어메리카, 애즈 리프리젠티드 바이 더 세크러테리, 디파트먼트 오브 헬쓰 앤드 휴먼 서비씨즈
Priority date: 2018-08-10
Filing date: 2018-10-30
Publication date: 2021-05-06
Also published as: EP3833755A4; BR112021002332A2; IL280684A; MA53252A; MX2021001062A; JP2021534816A; EP3833755A1; JP7473548B2; AU2018436152A1; CA3109114A1; JP2024019738A; CN113166748A; US20220218843A1; WO2020032986A1

Abstract

메틸말론산혈증의 치료를 위한 방법 및 기술.

Description

MMA의 치료를 위한 비-붕괴적 유전자 요법

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2018년 8월 10일에 출원된 미국 가출원 번호 62/717,771을 우선권 주장하며, 그의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

연방 후원 연구 또는 개발에 관한 진술

본 발명은 미국 보건복지부 산하 국립보건원과 협력 연구 및 개발 계약을 체결하고, 미국 국립보건원, 국립 인간 게놈 연구소에 의한 프로젝트 번호 ZIA HG200318 14 하에 정부 지원을 받아 이루어졌다. 미국 정부는 본 발명에 대한 특정 권리를 갖는다.

서열 목록

본 출원은 ASCII 포맷으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 함유하며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 2018년 10월 30일에 생성된 상기 ASCII 복사본은 파일명이 2012538_0062_SL.txt이고 크기가 78,203 바이트이다.

배아 발달 초기에 유전되거나 또는 획득되는 DNA의 변화를 추적될 수 있는 인간 질환의 하위세트가 있다. 유전자 요법의 개발자들에게 특히 관심있는 것은 단일유전자 질환으로 공지된, 단일 유전자의 돌연변이에 의해 유발되는 질환이다. 6,000개 초과의 단일유전자 질환이 있다고 믿어진다. 전형적으로, 유전된 돌연변이에 의해 유발되는 임의의 특정 유전 질환은 상대적으로 드물지만, 종합하면 유전-관련 질환의 발병률이 높다. 널리 공지된 유전 질환은 낭포성 섬유증, 뒤시엔느 근위축증, 헌팅톤병 및 겸상 적혈구 질환을 포함한다. 다른 부류의 유전 질환은 대사 장애, 예컨대 유기 산혈증, 및 기능장애 유전자가 대사 프로세스의 결함 및 단기간 및 장기간 둘 다에서 심각한 이환율 및 사망률로 이어질 수 있는 독성 부산물의 축적을 초래하는 리소좀 저장 질환을 포함한다.

단일유전자 질환은 이들의 질환 병리의 인지된 단순성으로 인해 생의학 혁신가들에게 특히 관심 대상이었다. 그러나, 이들 질환 및 장애의 거의 대부분은 실질적으로 치료불가능한 상태로 남아있다. 그러므로, 이러한 질환의 치료에 대한 관련 기술분야의 요구가 오랫동안 남아있다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 대상체에서 조직 내 적어도 세포 집단의 게놈으로 트랜스진을 통합하는 방법으로서, 상기 방법은 조직 내 세포가 유전자 산물에 의해 코딩되는 기능적 단백질을 발현하지 못하는 대상체에게 기능적 단백질을 코딩하는 트랜스진을 전달하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 조성물은 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열을 포함하며, 여기서 제1 핵산 서열은 트랜스진을 코딩하고; 제2 핵산 서열은 제1 핵산 서열에 대해 5' 또는 3'에 위치하고 세포의 게놈 내 표적 통합 부위로의 통합 시 2종의 독립적 유전자 산물의 생산을 촉진하는 것인 폴리뉴클레오티드 카세트, 폴리뉴클레오티드에 대해 5'에 위치하고 세포의 게놈 내 표적 통합 부위의 게놈 서열 5'과 실질적으로 상동성인 서열을 포함하는 제3 핵산 서열, 및 폴리뉴클레오티드에 대해 3'에 위치하고 세포의 게놈 내 표적 통합 부위의 게놈 서열 3'과 실질적으로 상동성인 서열을 포함하는 제4 핵산 서열을 포함하며, 여기서, 조성물을 투여한 후, 트랜스진은 세포 집단의 게놈으로 통합되는 것인 방법을 제공한다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 소정의 기간에 걸쳐 조직 내 트랜스진의 발현 수준을 증가시키는 방법으로서, 상기 방법은 그를 필요로 하는 대상체에게 대상체의 조직 내 적어도 세포 집단의 게놈으로 통합하는 트랜스진을 전달하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 조성물은 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열을 포함하며, 여기서 제1 핵산 서열은 트랜스진을 코딩하고; 제2 핵산 서열은 제1 핵산 서열에 대해 5' 또는 3'에 위치하고 세포의 게놈 내 표적 통합 부위로의 통합 시 2종의 독립적 유전자 산물의 생산을 촉진하는 것인 폴리뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드에 대해 5'에 위치하고 세포의 게놈 내 표적 통합 부위의 게놈 서열 5'과 실질적으로 상동성인 서열을 포함하는 제3 핵산 서열, 및 폴리뉴클레오티드에 대해 3'에 위치하고 세포의 게놈 내 표적 통합 부위의 게놈 서열 3'과 실질적으로 상동성인 서열을 포함하는 제4 핵산 서열을 포함하며, 여기서, 조성물을 투여한 후, 트랜스진은 세포 집단의 게놈으로 통합되고 조직 내 트랜스진의 발현 수준은 소정의 기간에 걸쳐 증가하는 것인 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 증가된 발현 수준은 트랜스진을 발현하는 조직 내 세포의 증가된 퍼센트를 포함한다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 투여 전에 세포에 의해 기능적으로 발현되지 않는 관심 산물을 코딩하는 트랜스진을 대상체의 조직 내 세포에 전달하는 조성물의 용량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법으로서, 여기서 트랜스진은 (i) 관심 산물을 코딩하고; (ii) 복수의 세포의 게놈 내 표적 통합 부위에서 통합하고; (iii) 통합되면 관심 산물을 기능적으로 발현하고; (iv) 조직 내 다른 세포에 비해 복수의 세포에 선택적 이점을 부여하여, 시간 경과에 따라, 조직이 달리 비교가능한 투여에 의해 달성된 것보다 더 높은 것으로 결정된 관심 산물의 기능적 발현 수준을 달성하며, 여기서 트랜스진이 통합된 세포는 투여 전에 관심 산물을 기능적으로 발현하고, 여기서 조성물은 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열을 포함하며, 여기서 제1 핵산 서열은 트랜스진을 코딩하고; 제2 핵산 서열은 제1 핵산 서열에 대해 5' 또는 3'에 위치하고 트랜스진이 표적 통합 부위에서 통합될 때 2종의 독립적 유전자 산물의 생산을 촉진하는 것인 폴리뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드에 대해 5'에 위치하고 표적 통합 부위의 게놈 서열 5'과 실질적으로 상동성인 서열을 포함하는 제3 핵산 서열, 및 폴리뉴클레오티드에 대해 3'에 위치하고 표적 통합 부위의 게놈 서열 3'과 실질적으로 상동성인 서열을 포함하는 제4 핵산 서열을 포함하는 것인 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 선택적 이점은 트랜스진을 발현하는 조직 내 세포의 증가된 퍼센트를 포함한다.

일부 실시양태에서, 조성물은 재조합 바이러스 벡터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 재조합 바이러스 벡터는 재조합 AAV 벡터이다. 일부 실시양태에서, 재조합 바이러스 벡터는 LK03, AAV8, AAV-DJ; AAV-LK03; 또는 AAVNP59의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 캡시드 단백질이거나 또는 그를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 AAV2 ITR 서열을 추가로 포함한다.

다양한 실시양태에 따라, 임의의 다양한 트랜스진은 본원에 기재된 방법 및 조성물에 따라 발현될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 트랜스진은 MUT 트랜스진이거나 또는 그를 포함한다. 일부 실시양태에서, MUT 트랜스진은 wt 인간 MUT; 코돈 최적화된 MUT; 합성 MUT; MUT 변이체; MUT 돌연변이체, 또는 MUT 단편이다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 세포의 게놈 내 표적 통합 부위로 트랜스진을 통합하기 위한 재조합 바이러스 벡터로서, 이는 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열을 포함하며, 여기서 제1 핵산 서열은 MUT 트랜스진을 포함하고; 제2 핵산 서열은 제1 핵산 서열에 대해 5' 또는 3'에 위치하고 세포의 게놈 내 표적 통합 부위로의 통합 시 2종의 독립적 유전자 산물의 생산을 촉진하는 것인 폴리뉴클레오티드 카세트, 폴리뉴클레오티드 카세트 벡터에 대해 5'에 위치하고 세포의 게놈 내 표적 통합 부위의 게놈 서열 5'과 실질적으로 상동성인 서열을 포함하는 제3 핵산 서열, 및 폴리뉴클레오티드 카세트 바이러스 벡터의 3'에 위치하고 세포의 게놈 내 표적 통합 부위의 게놈 서열 3'과 실질적으로 상동성인 서열을 포함하는 제4 핵산 서열을 포함하며, 여기서 바이러스 벡터는 LK03 AAV 캡시드를 포함하는 것인 재조합 바이러스 벡터를 제공한다.

본원에 기재된 바와 같이, 본 개시내용은 세포의 게놈으로의 하나 이상의 트랜스진의 통합에 관한 여러 이로운 인식을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 통합은 뉴클레아제 활성을 포함하지 않는다.

임의의 적용-적절한 조직이 표적화될 수 있지만, 일부 실시양태에서, 조직은 간이다.

본원에 기재된 바와 같이, 제공된 방법 및 조성물은 적어도 4종의 핵산 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 카세트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 핵산 서열은 a) 2A 펩티드, b) 내부 리보솜 진입 부위 (IRES), c) N-말단 인테인 스플라이싱 영역 및 C-말단 인테인 스플라이싱 영역, 또는 d) 스플라이스 공여자 및 스플라이스 수용자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제3 및 제4 핵산 서열은 트랜스진 및 제2 핵산 서열을 내인성 알부민 프로모터 및 내인성 알부민 유전자를 포함하는 내인성 알부민 유전자 로커스로 통합하는 상동성 아암이다. 일부 실시양태에서, 상동성 아암은 내인성 알부민 유전자의 시작 코돈의 바로 3'으로의 또는 내인성 알부민 유전자의 정지 코돈의 바로 5'으로의 폴리뉴클레오티드 카세트의 통합을 지시한다.

다양한 측면에 따라, 제3 및/또는 제4 핵산은 상당한 길이 (예를 들어, 길이가 적어도 800개 뉴클레오티드)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 제3 핵산은 800-1,200개 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 제4 핵산은 800-1,200개 뉴클레오티드이다.

일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 카세트는 프로모터 서열을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 세포의 게놈 내 표적 통합 부위로의 폴리뉴클레오티드 카세트의 통합 시, 트랜스진은 표적 통합 부위에서 내인성 프로모터의 제어 하에 발현된다. 일부 실시양태에서, 표적 통합 부위는 내인성 알부민 프로모터 및 내인성 알부민 유전자를 포함하는 알부민 로커스이다. 일부 실시양태에서, 세포의 게놈 내 표적 통합 부위로의 폴리뉴클레오티드 카세트의 통합 시, 트랜스진은 내인성 알부민 유전자 발현의 붕괴 없이 내인성 알부민 프로모터의 제어 하에 발현된다.

본 출원에서 사용된 바와 같이, 용어 "약" 및 "대략"은 등가물로서 사용된다. 본원에서 간행물, 특허 또는 특허 출원에 대한 임의의 인용은 그 전문이 참조로 포함된다. 본 출원에서 사용된 임의의 숫자 (약/대략과 함께 또는 약/대략 없이)는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해되는 임의의 정상적인 변동을 포함하는 것을 의미한다.

본 발명의 다른 특징, 목적 및 이점은 하기 상세한 설명에서 명백하다. 그러나, 상세한 설명은 본 발명의 실시양태를 나타내면서 제한이 아니라 단지 예시로서 주어진다는 것을 이해해야 한다. 본 발명의 범위 내에서 다양한 변화 및 변형은 상세한 설명으로부터 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백하게 될 것이다.

도 1은 상동성 지정 복구 (HDR) 및 비-상동성 단부 연결 (NHEJ) DNA 복구 경로를 도시한다.
도 2는 통합 (AAV) 전 및 표적화된 알부민 또는 ALB 로커스에서 게놈으로의 HR-매개 통합 후 진라이드(GENERIDE)™ 구축물의 개략도를 제시한다. 표적화된 로커스로부터의 발현은 ALB 유전자에 의해 코딩되는, 동등한 수준으로 별도의 단백질로서 알부민 및 트랜스진의 생산을 초래한다.
도 3은 최고 (ALB)로부터 숫자 2,000까지 순위화된, 간에서 발현된 가장 풍부한 유전자를 제시한다. 각 원은 개별 유전자를 나타낸다. 간에서의 대부분의 유전자는 알부민의 수준의 작은 분획에서 발현된다. TPM = 백만당 전사체.
도 4는 간이 거의 모든 알부민이 체내에서 발현되는 기관임을 나타낸다. ALB 로커스를 표적화하는 간-특이적 진라이드™ 구축물은 간에서 우세하게 발현될 것이다.
도 5는 알부민 발현 수준이 단일유전자 질환과 연관된 다른 선택 간 유전자보다 100x 더 높다는 것을 제시한다. (PAH: 페닐케톤뇨증, F9: 혈우병 B, MUT: MMA, UGT1A1: 크리글러-나자르 증후군).
도 6은 MUT의 돌연변이가 분지쇄 아미노산, 구체적으로 메티오닌, 트레오닌, 발린 및 이소류신에 대한 대사 경로의 장애를 초래하는 방법을 예시한다.
도 7a-도 7b는 LB-001 진라이드™ 구축물의 구조를 예시한다. 도 7a) LK03 AAV 캡시드 내부의 LB-001에 대한 진라이드™ 구축물. 도 7b) 인간 Mut 서열 (서열식별번호(SEQ ID NO): 15)을 발현하기 위해 AAV-LK03 캡시드와 함께 사용될 수 있는 핵산.
도 8은 Mut^-/- 마우스가 LB-001의 뮤린 진라이드™ 구축물로 신생아 처리 후 향상된 생존 (상부 패널) 및 체중 증가 (하부 패널)를 나타낸다는 것을 제시한다. 오차 막대는 평균의 표준 오차 또는 SEM을 나타낸다. 대조군 마우스는 이 연구에서 헤드-투-헤드 비교기로서 포함되지 않았으며; 대조군 마우스 데이터는 다른 마우스가 완료한 연구로부터 유래된다.
도 9는 LB-001의 뮤린 진라이드™ 구축물로 처리된 MCK-Mut 마우스가 신생아 투여 후 1개월에 성장의 유의한 개선을 나타냄을 제시한다. *는 p-값 <0.05를 나타낸다.
도 10은 LB-001의 뮤린 진라이드™ 구축물로 처리된 MCK-Mut 마우스가 신생아 투여 후 1개월에 2종의 순환 질환 관련 대사물질의 유의한 감소를 나타냄을 제시한다. 상부 패널은 혈장 메틸말론산 농도의 감소를 제시한다. 하부 패널은 혈장 메틸시트레이트 농도의 감소를 제시한다. 미처리된 모든 마우스가 헤드-투-헤드 비교기로서 포함된 것은 아니다. 미처리된 마우스 데이터는 과거 대조군 마우스를 포함한다. *는 p-값 <0.05를 나타낸다.
도 11은 진라이드™를 사용한 처리가 변형된 간 세포에 대한 선택적 이점을 가져올 수 있음을 제시한다. 상부 패널: LB-001의 뮤린 진라이드™ 구축물로 처리된 마우스로부터의 간 섹션의 RNA스코프 분석. 간에서 Mut의 기능적 카피 없이 (좌측) 및 이를 사용하여 (우측) 유전적으로 조작된 마우스를 신생아 처리하였다. 1년 초과 후, 간에서 Mut의 자연적 기능적 카피가 결여된 마우스에서 진라이드™ 구축물에 특이적인 Mut mRNA를 발현하는 세포 (어두운 염색 영역)가 증가되었으며, 이는 LB-001의 진라이드™ 구축물의 유익한 선택적 이점을 시사한다. 하부 패널: 독립적인 병리학자에 의해 수행된 RNA스코프 섹션의 정량화.
도 12는 마우스에서 MUT 진라이드™ 구축물의 단일 신생아 투여 1년 초과 후 진라이드™ 특이적 Mut 유전자의 통합된 카피를 함유하는 간 세포의 퍼센트를 제시한다. 알부민 로커스에서 통합된 Mut 유전자를 갖는 DNA의 LR-qPCR 정량화. 오차 막대는 SEM을 나타낸다. LR-qPCR = 장거리 정량적 PCR.
도 13은 시간 경과에 따라 관찰된 통합된 진라이드™ 구축물을 갖는 세포의 증가를 나타낸다. 간 Mut가 결핍된 마우스에게 신생아로서 진라이드™ 구축물을 투여하였다. 알부민 로커스에서의 통합을 위한 DNA 분석을 투약 후 1개월 및 1년 초과에 LR-qPCR에 의해 수행하였다. 오차 막대는 SEM을 나타낸다.
도 14 미처리된 및 처리된 Mut ^-/- ;Mck-Mut 마우스 (MMA의 하이포모르픽 모델)에서 혈장 메틸말론산 수준. 처리된 마우스는 처리후 1, 2 및 12-15개월에 미처리된 마우스와 비교하여 유의하게 감소된 혈장 메틸말론산 수준을 가졌다 (독립표본 t-검정; p>0.041). 혈장 메틸말론산 수준은 처리된 Mut ^-/- ;Mck-Mut 동물에서 시간 경과에 따라 감소하였다.
도 15a-도 15b는 전달 후 바이러스 게놈 및 간세포 트랜스진 통합을 제시한다. 도 15a) 주사후 1개월 (n=3); 2개월 (n=3); 및 12-15개월 (n=5)에 간에서 디지털 액적 PCR에 의해 검출된 숙주 게놈 (Gapdh)에 비한 바이러스 게놈 (MUT)의 수. 바이러스 게놈의 급속한 손실은 이전에 기재된 신생아 유전자 전달 후 발생한다. (1개월 대 2 또는 12-15개월에 바이러스 게놈; 일원 ANOVA; p> 0.001). 도 15b) 알부민으로의 트랜스진 통합을 갖는 간세포의 퍼센트. qPCR에 의해 결정된 통합 백분율은 처리된 MMA 마우스에서 1-2개월 (n=6)에서 12-15개월 (n=5)로 유의하게 증가하였다 (독립표본 t 검정; p>0.043). 그러나, 12-15개월에 처리된 야생형 동물은 처리된 MMA 마우스보다 더 적은 통합을 갖는다.
도 16은 처리된 마우스에서 간 MUT 단백질 발현을 제시한다. AAV-Alb-2A-MUT 처리된 마우스에서 총 간 MUT 단백질 발현은 웨스턴 블롯에 의해 결정되었다. 처리된 마우스에서 MUT 단백질은 야생형 대조군 한배 새끼의 백분율로서 표현되고, 뮤린 베타-액틴으로 정규화되었다. 처리된 마우스에서 MUT 단백질의 양은 처리후 1-2개월 (n=6)을 12-15개월 (n=5)과 비교할 때 시간 경과에 따라 증가한다 (독립표본 t-검정; p>0.015).
도 17은 MUT mRNA 양성 세포를 검출하기 위한 AAV-Alb-2A-MUT 처리된 마우스의 RNA스코프를 제시한다. 처리후 2개월과 비교할 때 처리후 12-15개월 마우스에서 MUT 양성 세포의 증가가 있다. 반대로, 처리후 12-15개월에 AAV-Alb-2A-MUT 처리된 야생형 마우스 (n=5)는 처리후 12-15개월에 이들의 MMA 한배 새끼보다 더 적은 MUT 양성 세포를 갖는다 (n=5) (p>0.03).
도 18a-도 18b는 뮤린 LB001 대용물의 나열된 용량을 출생 후 1일에 안면 정맥을 통해 IV 투여한 후 LR-qPCR 검정으로 결정된 gDNA 통합 퍼센트를 제시한다. 지정된 시점에서 간 샘플을 수확하였다. 도 18a)는 Mut ^-/- ;MCK ⁺ 마우스에 대한 데이터를 제시한다. 도 18b)는 이형접합체 Mut^+/- 마우스에 대한 데이터를 제시한다.
도 19 1차 인간 간세포로부터의 융합된 mRNA. 엑손 12 및 15는 상동성 아암의 외부에 있다. 도면은 출현 순서대로 각각 서열식별번호: 17-19를 개시한다.
도 20은 1차 인간 간세포 샌드위치 배양 시스템을 도시한다.
도 21a-도 21b는 DNA 통합에 대한 검정을 예시한다. 도 21a) 안정적 HepG2-2A-PuroR 세포주는 DNA 통합 검정에서 양성 대조군으로서 사용되었다. 도 21b) 장거리 (LR) qPCR은 부위-특이적 통합 비율을 결정하는데 사용되었다.
도 22는 1차 인간 간세포 (PHH)에서 MUT 및 ALB의 상대적 발현을 제시한다.
도 23a-도 23b는 진라이드™ LB-001을 검정하기 위해 선택된 동일한 일배체형 1을 갖는 3명의 1차 인간 간세포 (PHH) 공여자를 제시한다. 도 23a) 22명의 PHH 공여자로부터의 일배체형 스크리닝. 도 23b) 일배체형 정보.
도 24는 AAV-LK03-LSP-GFP를 사용한 1차 인간 간세포 (PHH)의 형질도입 조건의 최적화를 제시한다. 형질도입 효율은 3명의 선택된 공여자로부터의 PHH로 표시된다.
도 25는 1차 인간 간세포 (PHH)에서 진라이드™ LB001 처리 후 ALB-2a 및 MUT 발현의 웨스턴 블롯팅 결과를 도시한다.
도 26은 UGT1A1을 전달하는 진라이드™ 구축물의 신생아 투여 후 크리글러-나자르 증후군의 마우스 모델에서 증가된 생존을 제시한다 (Porro et al. EMBO Mol Med 2017). 미처리된 동물 (n=6)은 모두 지속적인 청색광 요법 없이 출생 20일 내에 사망하였다. 독성 빌리루빈 수준의 클리어런스 및 감소를 촉진하는 처리인 청색광 요법은 출생부터 제8일까지 적용되었다. 지속적인 청색광 요법 없이, 진라이드™ 구축물로 처리된 동물 (n=5)은 1년 동안 생존하였다.
도 27 LB-101의 뮤린 진라이드™ 구축물을 사용한 인간 인자 IX의 치료적 및 안정적 수준 (Barzel et al. Nature 2015). 신생아 투여 후 간으로부터 인자 IX 생산의 안정적 및 치료적 수준은 투여 후 20주 동안 지속되었으며, 심지어 8주령에 PH를 수행한 경우에도 지속되었다 (점선 및 음영 영역으로 제시된 정상적인 인자 IX의 5% 내지 20%의 인자 IX의 치료적 수준). 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
도 28은 과다-활성 hFIX를 코딩하는 진라이드™ 벡터를 사용하여 혈우병 B 마우스에서 출혈 체질의 호전을 제시한다. AAV-DJ-WThFIX, 비히클과 비교하여 및 지정된 용량에서 야생형 (WT), 9주령 수컷 혈우병 B (FIX-KO) 마우스에 비해 AAV-DJ-hFIX 변이체 (V-hFIX)의 꼬리 정맥 주사 2주 후 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간 (aPTT)에 의한 응고 효율의 측정. 삼각형은 동일한 용량에서 AAV-DJ-V-hFIX 및 WT-hFIX의 차이를 나타낸다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. * p < 0.01, ** p < 0.001.
도 29는 독점적 과다-활성 hFIX를 코딩하는 진라이드™ 벡터를 사용하여 혈우병 B 신생아 마우스에서 출혈 체질의 호전을 제시한다. 비히클와 비교하여 및 WT 참조에 비해 AAV-V-hFIX의 복강내 (IP) 주사 후 4주 (좌측 패널) 및 12주 (우측 패널)에 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간 (aPTT)에 의한 응고 효율의 측정. 혈우병 B 신생아 마우스의 처리를 위해, 본 발명자들은 hFIX 변이체를 코딩하는 AAV-DJ 진라이드™ 벡터의 킬로그램 (kg)당 1.5e14, 1.5e13, 1.5e12 및 5e11 벡터 게놈 (vg)을 사용하여 2일령 F9tm1Dws 녹아웃 수컷 마우스의 복강내 (IP) 주사를 수행하였다. 본 발명자들은 1.5e12 vg/kg만큼 낮은 용량에서 질환 호전을 입증하였다. 처리된 KO 수컷 마우스에서 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간 (aPTT)에 의해 결정된 바와 같은 기능적 응고는 야생형 (WT) 마우스와 유사한 수준으로 회복되었다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. * p < 0.01, ** p < 0.001.
도 30a-도 30c는 진라이드™가 미스매치된 상동성 아암으로 효과적임을 제시한다. 인간 알부민 로커스에서 2종의 주요 일배체형이 도시된다. 일배체형은 5' 상동성 아암에 상응하는 서열에서 5개의 SNP만큼 상이하다. 도 30a) 정지 코돈에 걸친 인간 알부민 로커스의 세그먼트는 수평 얇은 직사각형으로서 도시된다. 짧은 세로선은 인간 집단에서 2개의 가장 일반적인 일배체형인 일배체형 1 및 일배체형 2 사이의 뉴클레오티드 다형성의 상대적 위치를 나타낸다. 인간 집단에서 알부민 대립유전자의 95%는 오직 6개 뉴클레오티드만큼 상이한 관련 세그먼트에서 이들 2개의 일배체형 사이에 고르게 분포되어 있다. 일배체형 1 및 2에서 다형성 위치에 있는 특정 뉴클레오티드는 각각 라인 위 및 아래에 표시된다. 도 30b) 마우스 알부민 로커스로 독점적 인간 FIX 변이체 (V-hFIX)를 표적화하는 2개의 진라이드™ AAV 벡터가 도시된다. 상부 벡터 "야생형 아암 (WTA)"에서 상동성 아암은 B6 마우스에서 알부민 정지 코돈에 걸친 게놈 서열과 동일하다. 하단 벡터 "미스매치된 아암 (MA)"에서 상동성 아암은 인간 일배체형: 일배체형 1 및 일배체형 2 사이의 차이를 시뮬레이션하는 방식으로 WT 아암과 상이하다. 짧은 세로선은 2개의 벡터 사이의 뉴클레오티드 다형성의 상대적 위치를 나타낸다. 2개의 벡터에서 다형성 위치에 있는 특정 뉴클레오티드는 각 라인 위에 표시된다. 도 30c) AAV V-hFIX-WTA 실험 구축물 (n = 5), 또는 3개의 독립적 배치로부터의 일배체형 미스매치된 AAV V-hFIX-MA (n = 5/그룹)의 vg/kg당 5e13을 사용한 9주령 B6 마우스의 꼬리 정맥 주사 후 ELISA에 의해 측정된 hFIX 혈장. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
도 31a-도 31b는 MMA의 뮤린 모델을 도시한다. 도 31a) Mut 엑손 3 녹아웃을 갖는 Mut^-/- 마우스 모델. 이 마우스는 신생아 치명적이다. 이전에 문헌 [Chandler et al. BMC Med Genet. 2007]에 제공되었다. 도 31b) Mut^-/-MCK⁺ 마우스 모델. 이 마우스 모델은 근육 특이적 Mut 발현을 가지며, 마우스는 생존가능하다.
도 32는 진라이드™ 구축물의 투여 후 MMA 마우스 모델의 분석을 위한 실험 설계를 도시한다.

유전자 요법

유전자 요법은 트랜스진이라고 하는 치료용 유전자를 전달하는 프로세스인 유전자 전달에 의해 환자의 세포의 유전자 발현 프로파일을 변경한다. 약물 개발자들은 변형된 바이러스를 벡터로서 사용하여 트랜스진을 세포의 핵으로 이동시켜 세포의 능력을 변경하거나 또는 증대시킨다. 개발자들은 다양한 벡터를 사용하여 조직 내 세포, 예컨대 간, 눈의 망막 및 골수의 혈액-형성 세포에 유전자를 도입하는데 큰 진전을 이루었다. 이들 접근법은 일부 경우에는 승인된 요법으로 이어졌고, 다른 경우에는 임상 시험에서 매우 유망한 결과를 제시하였다.

여러 유전자 요법 접근법이 있다. 통상적인 AAV 유전자 요법에서, 트랜스진은 숙주 세포의 핵에 도입되지만, 염색체 DNA에서 통합하는 것으로 의도되지 않는다. 트랜스진은 핵 내부에 존재하는 에피솜이라고 하는 통합되지 않은 유전 요소로부터 발현된다. 제2 유형의 유전자 요법은 트랜스진과 함께 염색체 DNA로, 그러나 임의의 부위에서 그 자체 삽입하는 상이한 유형의 바이러스, 예컨대 렌티바이러스의 용도를 활용한다.

유전자의 에피솜 발현은 외인성 프로모터에 의해 유도되어야 하며, 이는 질환 상태를 교정하거나 또는 호전시키는 단백질의 생산을 유발한다.

유전자 요법의 한계

세포가 분열하고 조직이 성장함에 따른 희석 효과. 에피솜 발현을 기반으로 하는 유전자 요법의 경우에, 성장 또는 조직 재생의 프로세스 동안 세포가 분열할 때, 트랜스진이 숙주 염색체에 통합하도록 의도되지 않았으므로 세포 분열 동안 복제되지 않기 때문에 요법의 이점이 전형적으로 감소한다. 그러므로 각각의 새로운 세포 세대는 표적 조직에서 트랜스진을 발현하는 세포의 비율을 추가로 감소시켜, 시간 경과에 따라 치료 이점의 감소 또는 제거를 초래한다.

삽입 부위를 제어할 수 없음. 바이러스 매개된 삽입을 사용하는 일부 유전자 요법의 사용은 유전자가 숙주 염색체에 삽입되기 때문에 장기간 이점을 제공할 잠재력을 갖지만, 유전자가 삽입되는 위치를 제어할 수 있는 능력이 없으며, 이는 필수 유전자를 붕괴하거나 또는 원치않는 효과, 예컨대 종양 형성을 촉진할 수 있는 위치로 삽입할 위험을 제공한다. 이러한 이유로, 이들 통합 유전자 요법 접근법은 주로 생체외 접근법으로 제한되며, 여기서 세포는 신체 외부에서 처리된 다음 재삽입된다.

외인성 프로모터의 사용은 종양 형성의 위험을 증가시킨다. 유전자 요법 접근법 둘 다의 공통적인 특징은 트랜스진이 외인성 프로모터와 함께 세포에 도입된다는 것이다. 프로모터는 궁극적으로 단백질로 번역되는 전령 RNA 또는 mRNA로의 DNA의 전사 및 증폭을 개시하는데 필요하다. 유전자 요법 트랜스진으로부터 치료용 단백질의 높은 수준의 발현은 강한 조작된 프로모터를 필요로 한다. 이들 프로모터는 단백질 발현에 필수적이지만, 동물 모델에서 다른 사람들에 의해 수행된 이전 연구는 유전자 요법 벡터의 비특이적 통합이 종양 발생의 유의한 증가를 초래할 수 있음을 제시하였다. 프로모터의 강도는 이들 종양 발생의 증가에서 중요한 역할을 한다. 그러므로, 강한 프로모터로 높은 발현 수준을 유도하려는 시도는 장기간 해로운 결과를 초래할 수 있다.

유전자 편집

유전자 편집은 외인적으로 전달된 유전자 편집 메카니즘을 사용하여 세포의 DNA에 파단을 도입함으로써 비정상적인 유전자의 결실, 변경 또는 증대이다. 대부분의 현재 유전자 편집 접근법은 원치않는 온- 및 오프-타겟 변형의 높은 비율 및 유전자 교정의 낮은 효율로 인해 이들의 효능이 제한되어, 부분적으로 도입된 DNA 파단을 빠르게 복구하려는 세포의 결과로 이어졌다. 유전자 편집의 현재 초점은 기능장애 유전자를 불능화시키거나 또는 유전자 내의 개별 해로운 돌연변이를 교정하거나 또는 스키핑하는 것이다. 가능한 돌연변이의 수로 인해, 이들 접근법은 완전한 교정 유전자의 삽입에 의해 해결되는 것처럼 특정 유전 질환 내의 돌연변이의 전체 집단을 다룰 수 없다.

유전자 요법 접근법과는 달리, 유전자 편집은 복구된 유전자 영역이 정상적인 세포 분열을 통해 새로운 세포 세대로 번식하도록 허용한다. 더욱이, 원하는 단백질은 세포 자체의 조절 기계를 사용하여 발현될 수 있다. 유전자 편집에 대한 전통적인 접근법은 뉴클레아제-기반이며, 이는 박테리아로부터 유래된 뉴클레아제 효소를 사용하여, 결실을 일으키거나 변경을 만들거나 신체의 DNA에 교정 서열을 적용하기 위해 특정 위치에서 DNA를 절단한다.

일단 뉴클레아제가 DNA를 절단하면, 전통적인 유전자 편집 기술은 두 가지 경로를 사용하여 DNA를 변형시킨다: 상동성-지정 복구 또는 HDR 및 비-상동성 단부 연결 또는 NHEJ. HDR은 DNA 손상 부위에 상보적인 올바른 DNA 서열의 고도로 정확한 혼입을 포함한다. HDR은 높은 충실도로 DNA를 복구할 수 있고 교정 부위에서 원치않는 돌연변이의 도입을 회피한다는 점에서 핵심 이점을 갖는다. NHEJ는 파손된 DNA의 말단을 빠르게 봉합하는 덜 선택적이고 더 오류가 발생하기 쉬운 프로세스로, 파단 부위에서 높은 빈도의 삽입 또는 결실을 초래한다.

뉴클레아제-기반 유전자 편집

뉴클레아제-기반 유전자 편집은 DNA를 절단하는 박테리아에서 조작되거나 또는 초기에 확인된 효소인 뉴클레아제를 사용한다. 뉴클레아제-기반 유전자 편집은 2-단계 프로세스이다. 첫째, 이중-가닥 DNA에서 한 가닥 또는 두 가닥을 절단할 수 있는 외인성 뉴클레아제는 합성 가이드 RNA에 의해 원하는 부위로 지정되고, 특이적 절단을 만든다. 뉴클레아제가 원하는 절단 또는 절단들을 만든 후, 세포의 DNA 복구 기계는 활성화되고 NHEJ 또는 덜 일반적으로 HDR을 통해 편집 프로세스를 완료한다.

NHEJ는 DNA 절단을 복구할 때 세포가 카피할 DNA 주형의 부재에서 발생할 수 있다. 이는 세포가 이중-가닥 파단을 복구하는데 사용하는 1차 또는 디폴트 경로이다. NHEJ 메카니즘은 indel로서 공지된 작은 삽입 또는 결실을 도입하는데 사용될 수 있으며, 이는 유전자의 기능의 녹아웃을 초래한다. NHEJ는 복구 방식으로 인해 DNA에서 삽입 및 결실을 생성하고, 또한 염색체 이상을 포함하여 오프-타겟, 원치않는 돌연변이의 도입을 초래할 수 있다.

뉴클레아제-매개 HDR은 절단된 DNA와 유사한 뉴클레아제, 가이드 RNA 및 DNA 주형의 공동전달과 함께 발생한다. 결과적으로, 세포는 이 주형을 사용하여 복구 DNA를 구축할 수 있으며, 이는 결함이 있는 유전자 서열을 올바른 것으로 대체할 수 있다. 본 발명자들은 HDR 메카니즘이 높은 충실도로 인해 교정 서열을 삽입하기 위해 뉴클레아제-기반 접근법을 사용할 때 바람직한 복구 경로라고 믿는다. 그러나, 뉴클레아제로 절단된 후 게놈 복구의 대부분은 NHEJ 메카니즘을 계속 사용한다. 더 빈번한 NHEJ 복구 경로는 절단 부위에서 원치않는 돌연변이를 유발할 잠재력을 가지므로, 이때에 임의의 뉴클레아제-기반 유전자 편집 접근법이 표적화할 수 있는 질환의 범위를 제한한다.

게놈 편집에 사용되는 상동성-지정 및 비-상동성 단부-연결 DNA 복구 경로는 도 1에 예시되어 있다.

전통적인 유전자 편집은 세 가지 뉴클레아제-기반 접근법 중 하나를 사용하였다: 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제, 또는 TALEN; 클러스터링된, 규칙적으로 이격된 짧은 회문구조 반복부 연관 단백질-9, 또는 CRISPR/ Cas9; 및 아연 핑거 뉴클레아제, 또는 ZFN. 이들 접근법은 이미 연구 및 제품 개발에서 상당한 발전에 기여하였지만, 본 발명자들은 고유한 한계를 갖는 것으로 믿는다.

뉴클레아제-기반 유전자 편집의 한계

뉴클레아제-기반 유전자 편집 접근법은 DNA를 절단하기 위한 박테리아 뉴클레아제 효소의 이들의 사용 및 트랜스진 발현을 위한 외인성 프로모터에 대한 이들의 의존에 의해 제한된다. 이들 한계는 하기를 포함한다:

뉴클레아제는 온- 및 오프-타겟 돌연변이를 유발한다. 통상적인 유전자 편집 기술은 오류-유발 NHEJ 프로세스 및 잠재적 오프-타겟 뉴클레아제 활성을 기반으로 하는 염색체 변경을 포함하는 유전독성을 초래할 수 있다.

유전자 편집 성분의 세포로의 전달은 복잡하다. 유전자 편집은 여러 성분이 동시에 동일한 세포로 전달되는 것을 필요로 한다. 이는 기술적으로 어렵고, 현재 여러 벡터의 사용을 필요로 한다.

박테리아 유래 뉴클레아제는 면역원성이다. 통상적인 유전자 편집 접근법에 사용되는 뉴클레아제는 대부분 박테리아에서 유래되었기 때문에, 면역원성에 대한 더 높은 잠재력을 가지며, 이는 결국 이들의 유용성을 제한한다.

이들 한계 때문에, 유전자 편집은 주로 세포, 예컨대 조혈 세포에서 생체외 적용으로 제한되었다.

진라이드™ 기술 플랫폼

진라이드™는 게놈의 충실도를 유지하는 자연 발생 DNA 복구 프로세스인 상동성 재조합 또는 HR을 활용하는 게놈 편집 기술이다. HR을 사용함으로써, 진라이드™는 DNA를 절단하도록 조작된 효소인 외인성 뉴클레아제를 사용하지 않고 트랜스진으로 공지된 치료용 유전자를 특이적 표적화된 게놈 위치에 삽입하는 것을 허용한다. 진라이드™-지정 트랜스진 통합은 이들 표적화된 위치에서 내인성 프로모터를 활용하여 외인성 프로모터의 사용과 연관된 해로운 문제 없이 높은 수준의 조직-특이적 유전자 발현을 유도하도록 설계된다.

진라이드™ 기술은 안정적 치료 효과를 제공하기 위해 교정 유전자를 환자의 게놈에 정확하게 통합하도록 설계된다. 진라이드™는 이러한 오래가는 치료 효과를 갖도록 설계되었기 때문에, 비가역성 질환 병리가 발생할 수 있기 전에 환자의 생애 초기에 치료를 제공하는 것이 중요한 소아 환자에서 희귀 간 장애를 표적화하는데 적용될 수 있다. 예시적인 제품 후보인 LB-001은 출생 시 나타나는 생명을 위협하는 질환인 메틸말론산혈증 또는 MMA의 치료를 위해 본원에 기재되어 있다.

진라이드™ 플랫폼 기술은 특히 소아 환자에서 유전 질환을 치료하기에 잘 위치한 방식으로 전통적인 유전자 요법 및 통상적인 유전자 편집 접근법 둘 다의 핵심 한계 중 일부를 극복하는 잠재력을 갖는다. 진라이드™는 유전자를 세포의 핵으로 전달하기 위해 AAV 벡터를 사용한다. 그 후, HR을 사용하여 교정 유전자를 내인성 프로모터에 의해 조절되는 위치에서 수용자의 게놈으로 안정적으로 통합하여, 심지어 신체가 시간 경과에 따라 성장하고 변화하더라도 평생 단백질 생산에 대한 잠재력을 유발하며, 이는 통상적인 AAV 유전자 요법으로 실행가능하지 않다.

진라이드™는 외인성 프로모터 및 뉴클레아제에 의존하는 유전자 요법 및 유전자 편집 기술에 비해 여러 핵심 이점을 제공한다. HR의 자연 발생 프로세스를 활용함으로써, 진라이드™는 조작된 박테리아 뉴클레아제 효소에 의존하는 유전자 편집 접근법과 연관된 동일한 문제에 직면하지 않는다. 이들 효소의 사용은 숙주 세포의 DNA에서 원치않고 잠재적으로 위험한 변형의 유의하게 증가된 위험과 연관되어 있으며, 이는 종양 형성의 증가된 위험을 초래할 수 있다. 더욱이, 통상적인 유전자 요법과는 대조적으로, 진라이드™는 교정 유전자의 숙주 세포의 염색체로의 정확하고 부위-특이적이고 안정적이고 오래가는 통합을 제공하는 것을 목적으로 한다. 진라이드™ 구축물을 사용한 전임상 동물 연구에서, 게놈에서 특이적 위치에 있는 교정 유전자의 통합이 관찰된다. 이는 게놈으로 통합하지 않고 세포가 분열함에 따라 이들의 효과를 상실하는 유전자 요법 기술보다 더 오래가는 접근법을 제공하는 잠재력을 제공한다. 이들 이점은 진라이드™가 특히 소아 환자에서 유전 질환을 치료하기에 유리하게 만든다.

본원에 개시된 모듈식 접근법은 진라이드™가 동일한 조직으로 전달되는 상이한 치료제에 걸쳐 재현가능할 강건한 조직-특이적 유전자 발현을 전달할 수 있게 하도록 적용될 수 있다. 진라이드™ 구축물 내에서 상이한 트랜스진을 치환시킴으로써, 해당 트랜스진은 구축물의 다른 모든 성분을 실질적으로 유지하면서 새로운 치료 적응증을 다루기 위해 전달될 수 있다. 이 접근법은 상이한 진라이드™ 제품 후보에 걸쳐 공통 제조 공정 및 분석의 영향력을 허용할 것이며, 다른 치료 프로그램의 개발 공정을 단축할 수 있었다.

비-붕괴적 유전자 표적화에 대한 이전 연구는 본원에 참조로 포함된 WO 2013/158309에 기재되어 있다. 뉴클레아제를 사용하지 않는 게놈 편집에 대한 이전 연구는 본원에 참조로 포함된 WO 2015/143177에 기재되어 있다.

진라이드™를 사용한 게놈 편집: 메카니즘 및 속성

진라이드™ 플랫폼을 사용한 게놈 편집은 HR을 사용하여 게놈에서 하나의 특이적 위치에 교정 유전자를 전달하기 때문에 유전자 편집과 상이하다. 진라이드™는 정확한 방식으로 교정 유전자를 삽입하여 게놈에서 부위-특이적 통합에 이르게 한다. 진라이드™ 게놈 편집 접근법은 외인성 뉴클레아제 또는 프로모터의 사용을 필요로 하지 않으며; 대신, 세포의 기존 기계를 활용하여 치료용 트랜스진을 통합하고 그의 전사를 개시한다.

도 2는 진라이드™ 구축물이 HR을 사용하여 알부민 유전자 옆의 특이적 포인트에 트랜스진을 삽입하는 방법을 제시한다.

진라이드™ 기술은 세 가지 기본 성분으로 이루어지며, 이들 각각은 진라이드™ 접근법의 잠재적 이점에 기여한다.

수백개의 뉴클레오티드로 구성된 상동성 아암. 상동성 아암으로 공지된 플랭킹 서열은 부위-특이적 통합을 지시하고 구축물의 오프-타겟 삽입을 제한한다. CRISPR/Cas9에서 사용되는 가이드 서열과는 대조적으로 각 아암은 수백개의 뉴클레오티드 길이이며, 이는 오직 수십개의 염기 쌍 길이이며, 이 증가된 길이는 개선된 정밀도 및 부위-특이적 통합을 촉진할 수 있다. 진라이드™의 상동성 아암은 고도로 발현된 유전자 바로 뒤에 트랜스진의 통합을 지시하며, 이는 동물 모델에서 외인성 프로모터를 도입할 필요 없이 높은 발현 수준을 초래하는 것으로 관찰된다.

트랜스진. 트랜스진으로 공지된 교정 유전자는 숙주 세포의 게놈으로 통합하도록 선택된다. 이들 트랜스진은 환자의 세포에서 발견되는 질환 연관 유전자의 기능적 버전이다. 트랜스진 및 상동성 아암의 조합된 크기는 이들 트랜스진이 캡시드에 효율적으로 패키징되기에 적합한 서열 길이일 가능성을 증가시키기 위해 최적화될 수 있으며, 이는 트랜스진이 궁극적으로 환자에서 적절하게 전달될 가능성을 증가시킬 수 있다.

폴리시스트론 발현을 위한 2A 펩티드. 2A 펩티드를 코딩하는 짧은 서열은 다수의 중요한 역할을 한다. 첫째, 2A 펩티드는 동일한 mRNA로부터 2종의 별개의 단백질을 생산하는 폴리시스트론 발현을 용이하게 한다. 결국, 이는 강한 내인성 프로모터에 의해 구동되는 관심 조직에서 고도로 발현된 표적 유전자에 트랜스진의 전사를 커플링함으로써 비-붕괴적 방식으로 트랜스진의 통합을 허용한다. LB-001을 포함하는 간-지정 치료 프로그램의 경우, 알부민 로커스는 통합 부위로서 기능할 수 있다. 리보솜 스키핑으로 공지된 프로세스를 통해 2A 펩티드는 각 변형된 세포에서 알부민과 동일한 수준으로 치료용 단백질의 생산을 용이하게 하다. 둘째, 트랜스진의 성공적인 통합 및 발현을 나타내는 순환 바이오마커로서 역할을 하는 C-말단 태그의 첨가를 제외하고는 환자의 알부민이 정상적으로 생성된다. 알부민에 대한 이러한 변형은 다른 알부민 단백질 융합체의 임상 시험 결과를 기반으로 그의 기능에 대한 최소 효과를 가질 것이다. 2A 펩티드는 다른 잠재적 치료제, 예컨대 T 세포 수용체 키메라 항원 수용체, 또는 CAR-T에 혼입되었다 (Qasim et al. Sci Transl Med 2017).

진라이드™ 플랫폼을 적용하는 핵심 단계는 통합을 위한 표적 로커스를 확인하는 것이다. 이는 위치가 트랜스진 발현, 구체적으로 단백질이 생산될 수준 및 조직의 조절을 지시할 것이기 때문에 중요하다. LB-001을 포함하는 간-지정 치료 프로그램의 경우, 알부민 로커스는 통합 부위로서 사용될 수 있다 (도 3 및 도 4 참조).

알부민 로커스를 표적화하는 것은 트랜스진의 발현을 최대화하기 위해 높은 수준의 알부민 생산을 구동하는 강한 내인성 프로모터의 영향력을 허용한다. 트랜스진의 발현을 알부민에 연결하는 것은 대부분의 표적 세포에서 외인성 프로모터의 첨가 또는 트랜스진의 통합을 요구하지 않고 치료적 수준에서 트랜스진의 발현을 허용할 수 있다.

이는 MMA, 혈우병 B 및 크리글러-나자르 증후군의 동물 모델에 의해 뒷받침된다. 이들 모델에서, 세포의 대략 1%로의 트랜스진의 통합은 치료 이점을 유발하였다. 알부민 프로모터의 강도는 중간 수준의 통합을 극복하여 잠재적으로 치료적 수준의 트랜스진 발현을 산출한다.

도 5는 MMA를 갖는 환자에서 결핍된 유전자인 메틸말로닐-CoA 뮤타제 또는 MUT를 포함하는 간에서 선택 질환-관련 유전자와 비교하여 알부민의 상대적 발현 수준을 제시한다.

진라이드™는 질환의 전임상적 마우스 모델, 비-인간 영장류 및 인간 세포 (시험관내)에서 알부민 로커스에서 교정 유전자의 통합을 유도한다. 또한, 진라이드™를 사용한 트랜스진 발현에 필요한 HR의 효율은 활성 전사 부위에서 향상되며, 알부민이 능동적으로 발현되지 않는 조직에서 낮을 가능성이 높다. 이 특징은 통합을 위해 알부민 로커스를 사용하는 프로그램에 걸쳐 온-타겟 및 오프-타겟 통합 둘 다를 보다 예측가능한 프로세스로 만들어야 한다. 또한, 진라이드™ 플랫폼은 HR을 사용하기 때문에, 진라이드™ 제품 후보는 어떠한 박테리아 뉴클레아제도 함유하지 않으므로 박테리아 뉴클레아제와 연관된 다른 부위로의 온-타겟 또는 오프-타겟 통합의 위험을 해결한다. 진라이드™ 치료 접근법은 게놈에서 다른 조직 및 표적 위치에 적용될 수 있다. 시험관내 실행가능성 연구에서, 진라이드™는 rDNA, LAMA3 및 COL7A1을 포함하는 다른 게놈 로커스에서 통합에 따라야 하였다.

진라이드™ 접근법의 잠재적 이점은 하기를 포함한다:

게놈으로의 트랜스진의 표적화된 통합. 통상적인 유전자 요법 접근법은 치료용 트랜스진을 표적 세포에 전달한다. 이들 접근법의 대부분의 주요 단점은 일단 유전자가 세포 내부에 있으면 숙주 세포의 염색체로 통합하지 않고, 세포 분열 동안 DNA의 복제 및 분리로 이어지는 자연적 프로세스로부터 이점을 얻지 못한다는 것이다. 이는 통상적인 유전자 요법이 환자의 생애 초기에 도입될 때 특히 문제가 되며, 이는 아동의 정상적인 발달 동안 조직의 급속한 성장이 희석을 초래하고 궁극적으로 트랜스진과 연관된 치료 이점의 상실을 초래하기 때문이다. DNA의 별도의 가닥에서 게놈 외부에서 발현되는 통합되지 않은 유전자는 에피솜이라고 한다. 이 에피솜 발현은 형질도입된 초기 세포에서 효과적일 수 있으며, 그 중 일부는 장기간 동안 또는 환자의 생애 동안 지속될 수 있다. 그러나, 에피솜 발현은 전형적으로 표적 조직, 예컨대 간에서 일시적이며, 세포의 회전율이 높고 소아 환자의 생애 동안 크기가 상당히 성장하는 경향이 있다. 진라이드™ 기술을 사용하여, 트랜스진이 게놈으로 통합되며, 이는 세포가 분열하고 환자의 조직이 성장함에 따라 안정적이고 오래가는 트랜스진 발현을 제공하는 잠재력을 갖고 오래가는 치료 이점을 가져올 수 있다.

외인성 프로모터 없이 트랜스진 발현. 진라이드™ 기술을 사용하여, 트랜스진은 강력한 내인성 프로모터에 의해 조절되는 위치에서 발현된다. 구체적으로, 긴 상동성 아암은 알부민 프로모터와 같은 강력한 내인성 프로모터의 제어 하에 발현되는 게놈의 정확한 부위에 트랜스진을 삽입하는데 사용될 수 있다. 트랜스진의 발현을 구동하기 위해 외인성 프로모터를 사용하지 않음으로써, 이 기술은 암의 증가된 위험과 연관된 프로모터의 오프-타겟 통합에 대한 잠재성을 회피한다. 강한 내인성 프로모터의 선택은 고도로 정확하고 신뢰할 수 있는 HR 프로세스의 전형적인 중간 통합 비율로 트랜스진으로부터 단백질 발현의 치료적 수준에 도달할 수 있게 할 것이다. 트랜스진의 정확한 삽입 및 생체내 동물 모델 및 시험관내 인간 세포에서 세포에 의한 발현은 진라이드™ 기술로 관찰되었다.

뉴클레아제-무함유 게놈 편집. HR의 자연 발생 프로세스를 활용함으로써, 진라이드™는 통상적인 유전자 편집 기술에서 사용되는 외인성 뉴클레아제와 연관된 원치않는 부작용을 회피하도록 설계된다. 이들 조작된 효소의 사용은 이중-가닥 DNA 절단의 오류-유발 DNA 복구로 인한 염색체 변경을 포함하는 유전독성과 연관되었다. 뉴클레아제 사용의 회피는 또한 세포에 전달하는데 필요한 외인성 성분의 수를 감소시킨다.

모듈성. 모듈식 접근법은 진라이드™가 동일한 조직을 표적화하는 상이한 치료제에 걸쳐 재현가능한 강건한 조직-특이적 유전자 발현을 전달하도록 허용할 것이다. AAV 캡시드는 나머지 성분을 신체의 세포로 전달할 수 있는 비히클로서 역할을 한다. 벡터는 이들의 내용물을 특이적 표적 조직, 예컨대 간에 전달하는데 고도로 효율적이도록 설계될 수 있다. 트랜스진과 독립적인 상동성 아암은 각각이 수백개의 염기 길이인 DNA의 세그먼트이며, 표적 유전자를 게놈에서 정확한 위치로 통합하도록 지시한다. 이 위치는 트랜스진을 발현할 내인성 프로모터를 결정하기 때문에 중요하다. 예를 들어, 트랜스진의 간 발현을 기반으로 하는 새로운 요법은 LB-001로부터 MUT 유전자를 대체하는 새로운 요법을 위한 트랜스진과 함께 LB-001과 동일한 캡시드 및 상동성 아암을 사용할 수 있었다. 진라이드™ 구축물 내에서 상이한 트랜스진을 치환시킴으로써, 해당 트랜스진은 구축물의 다른 모든 성분을 실질적으로 유지하면서 새로운 치료 적응증을 다루기 위해 전달될 수 있다. 이 접근법은 향후 진라이드™ 제품 후보에 대한 공통 제조 공정 및 분석의 영향력을 허용할 것이며, 잠재적으로 향후 프로그램의 개발 공정을 단축할 수 있었다.

MMA

MMA는 특정 아미노산의 정상적인 대사를 담당하는 효소를 코딩하는 여러 유전자의 돌연변이에 의해 유발될 수 있다. 가장 일반적인 돌연변이는 MUT에 대한 유전자에 있으며, 이는 그의 활성에 완전 또는 부분 결핍을 유발한다. 결과적으로, 메틸말론산이라는 물질 및 다른 잠재적으로 독성인 화합물이 축적되어, MMA의 징후 및 증상을 유발할 수 있다. 도 6은 간 세포에서 MUT 결핍의 효과를 예시한다.

MMA를 갖는 환자는 관찰된 심각한 이환율 및 조기 사망을 설명하는 대사 불안정성의 빈번하고 잠재적으로 치명적인 삽화를 겪는다. MMA의 효과는 무기력, 구토, 탈수 및 성장 장애를 포함하는 증상과 함께 보통 영아기 초기에 나타난다. MMA를 갖는 환자는 수유 문제, 지적 장애, 신장 질환 및 췌장염을 포함하는 장기간 합병증을 갖는다. 치료하지 않으면, MMA는 혼수 및 사망으로 이어진다. 현재 MMA에 대해 승인된 요법이 없으며, MMA 환자에 대한 전망은 여전히 열악하다. 질환의 관리는 MUT 경로에 의해 정상적으로 프로세싱되는 아미노산이 결여된 저단백질 고칼로리 식이로 제한된다. 식이 관리 및 경계 관리에도 불구하고, MMA 환자, 특히 MUT에서 가장 중증의 결핍이 있는 환자는 종종 상해, 감염 또는 질병이 신체에서 단백질의 분해를 촉발할 때 이화작용 스트레스의 기간 동안 악화되는 신경학적 및 신장 손상을 겪는다. MMA를 갖는 환자에 대한 기대 수명은 지난 수십년 동안 증가하였지만, 여전히 대략 20 내지 30년으로 제한되는 것으로 추정된다. 환자 및 이들의 가족 및 간병인 양쪽의 삶의 질은 학교 생활 및 사회적 기능에 대한 제약으로 인해 질환의 영향을 상당히 받는다. 이 취약한 집단에서 조기 개입은 비가역성 임상 질환 병리의 발현과 싸우는데 필수적이다.

미국에서 MMA 발병률은 출생 50,000명 중 1명인 것으로 보고되며, 현재 유병률은 미국에서 대략 1,600 내지 2,400명의 환자이다. Mut 돌연변이를 갖는 MMA 환자의 비율은 총 MMA 인구의 대략 63%로 추정된다. LB-001에 의해 표적화되는 유전적 결핍을 갖는 MMA 환자의 수는 핵심 글로벌 시장에서 3,400 내지 5,100명의 환자인 것으로 추정되며, 이 중 1,000 내지 1,500명의 환자가 미국에 있다.

시간 경과에 따라, MMA를 갖는 환자는 전형적으로 청소년기에 신장 이식을 필요로 하는 말기 신장 질환을 발병한다. 조합된 간-신장 이식 또는 조기 간 이식은 대사 제어를 개선하기 위한 개입으로 등장하였다. 그러나, 한정된 수의 간 공여자, 수술과 연관된 상당한 위험, 높은 시술 비용 (미국에서, 간 이식의 경우 평균 대략 $740,000 및 조합된 간 및 신장 이식의 경우 평균 $120만 (밀리만(Milliman) 연구 리포터, 2014년 미국 장기 및 조직 이식 비용 추정액)) 및 면역억제제 약물에 대한 평생 의존성은 MMA를 갖는 환자에서 간 이식의 광범위한 구현을 제한한다.

MUT는 미토콘드리아 효소이기 때문에, 기능적 효소를 혈류에 주입하는 효소 대체 요법에 의해 MUT의 결핍을 교정하기 어렵거나 또는 불가능할 수 있다. 세포 내부에서 MUT효소를 얻는 가장 효율적인 방법은 그곳에서 합성하는 것이다. MUT를 코딩하는 mRNA를 세포에 직접 도입하거나 또는 바이러스 벡터를 사용하여 MUT에 대한 유전자를 세포에 도입하는 것을 포함하여 이를 성취하기 위해 동물 모델에서 여러 상이한 접근법이 탐색되었다. 이들 접근법 둘 다는 기능적 MUT 유전자의 도입이 증상을 호전시킬 수 있음을 검증하는데 도움이 되지만, 또한 각각 치료 이점이 일시적이라는 점에서 핵심 한계를 갖는다. mRNA 요법의 경우에, MUT의 치료적 수준을 유지하기 위해 MUT mRNA의 매주 정맥내 투여가 필요했지만, 이 요법이 환자에서 얼마나 빈번하게 투여될 필요가 있는지는 분명하지 않다. MUT 유전자 요법의 경우에, MUT 수준은 시간 경과에 따라 감소하였다. 오래가는 치료가 없으면, 다중 용량이 필요할 것이다. 그러나, MUT 유전자 요법을 전달하는데 사용되는 바이러스 벡터에 대한 환자의 중화 항체 개발은 후속 용량을 투여하는 능력을 제한한다. 또한, 강한 외인성 프로모터를 보유하는 AAV 벡터의 투여는 신생아 전달 후 간세포 암종과 상관관계가 있다.

MUT 유전자의 기능적 카피를 MMA 환자의 게놈으로 도입하는 것은 훨씬 더 나은 접근법을 나타내며, 잠재적으로 단일 투여로부터 평생 치료 이점을 제공한다.

MMA는 미충족 의료 필요성이 높고 치료적 치료가 부족한 유기 산혈증이다. 진라이드™는 치료적 내구성을 전달하도록 설계되었기 때문에, 비가역성 기능 저하가 발생할 수 있기 전에 비정상적인 유전자의 기능을 회복시키는 치료를 생애 초기에 개입함으로써 MMA 환자에게 평생 이점을 제공할 수 있다. 일부 실시양태에서, 치료용 트랜스진는 간에서 가장 고도로 발현되는 유전자인 알부민을 코딩하는 유전자 바로 뒤에 통합하도록 설계된 진라이드™ 구축물을 사용하여 전달된다. 트랜스진의 발현은 알부민 발현에 대해 "피기백"하며, 이는 간에서 높은 수준의 알부민 발현이 제공된 바람직한 단백질의 충분한 치료적 수준을 제공할 수 있다.

MMA 마우스 모델

MMA의 뮤린 모델은 진라이드™를 사용한 치료를 검정하는데 사용될 수 있다. MMA의 예시적인 뮤린 모델은 도 31a 및 도 31b에 도시되어 있다. 진라이드™ 구축물의 투여 후 MMA 마우스 모델의 분석을 위한 예시적인 실험 방법은 도 32에 예시되어 있다.

MMA 마우스 모델의 한 예에서, Mut에 대한 유전자는 완전히 비기능적으로 된다. Mut의 이 비기능적 대립유전자는 Mut ^-/ ^-라고 한다. 이 비기능적 대립유전자를 보유하는 마우스는 환자에서 가장 심각한 MMA 사례에서 보여지는 것보다 더 심각한 결핍을 갖는 것으로 믿어진다. 미처리된 상태로 방치되면 이들 마우스는 생후 처음 며칠 내에 사망한다.

Mut ^-/- 마우스의 변형은 Mut ^-/- ;Tg^INS-MCK- ^Mut 라고 하는 MMA의 또 다른 마우스 모델이다. 본원에서 사용된 바와 같은 Mut ^-/- ;Tg^INS-MCK- ^Mut 는 MCK-Mut 또는 Mut ^-/- ;Mck-Mut 또는 Mut^-/-MCK⁺로서 지칭될 수 있다. 이 마우스 모델에서, 크레아틴 키나제 프로모터의 제어 하에 배치된 마우스 Mut 유전자의 기능적 카피가 있다. 이는 근육 세포에서 Mut 발현을 가능하게 하며, 이는 결국 MMA 환자에서 보여지는 많은 표현형 변화를 여전히 나타내면서 마우스가 더 오래 생존할 수 있도록 한다.

예시

실시예 1: 진라이드™와의 트랜스진 통합을 위한 게놈 로커스로서의 알부민

본 실시예는 알부민 로커스가 간으로부터 트랜스진 발현을 위한 통합 부위일 수 있음을 예시한다.

알부민 로커스는 트랜스진 발현을 위한 로커스로서 여러 매력적인 특징을 갖는다. 강한 내인성 프로모터는 높은 수준의 알부민 생산을 구동하며, 이 강한 프로모터는 외인성 프로모터의 첨가 없이 치료적 수준에 도달하도록 트랜스진의 발현을 최대화하는데 활용될 수 있다. 도 4에 예시된 바와 같이, 알부민은 다른 조직과 비교하여 간에서 고도로 발현된다. 이 간-연관 발현 패턴은 우세하게 간으로 진라이드™ 구축물의 발현을 국소화하는데 사용될 수 있다. 또한, 도 3에 제시된 바와 같이, 알부민은 간에서 가장 고도로 발현되는 유전자이며, 관련하여, 간에서 질환-관련 유전자의 발현에 비해 더 높은 알부민 발현은 치료적 수준의 트랜스진 발현에 도달하는데 기여할 수 있다. 예를 들어, 도 5는 알부민 발현 수준이 MMA를 포함하는 단일유전자 질환과 연관된 다른 선택 간 유전자보다 100X 더 높다는 것을 예시한다.

실시예 2: 메틸말론산혈증 (MMA)의 치료를 위한 LB-001

본 실시예는 MMA의 치료를 위한 제품 후보인 LB-001을 설명한다. LB-001은 MMA를 갖는 환자에서 가장 일반적인 유전자 결핍인 MUT를 코딩하는 트랜스진을 함유한다 (도 6). LB-001은 간 세포를 표적화하고 MUT 트랜스진을 알부민 로커스에 삽입하도록 설계된다.

LB-001은 AAV 캡시드에 캡슐화된 인간 MUT 효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 DNA 구축물로 이루어진다 (도 7a). MUT 효소 코딩 서열은 2A 펩티드 서열에 커플링되고, MUT 유전자 및 2A 펩티드 서열을 알부민 유전자에 대한 염색체 로커스로 통합시키는 것을 구동하는 상동성 아암에 의해 둘러싸여 있다. 구축물이 알부민 로커스로 통합하는 방식에 기반하여, MUT 유전자가 발현되어 MUT 효소가 알부민으로부터 별도의 단백질로서 합성된다. 인간 간 세포를 표적화하는데 최적화된 AAV 캡시드인 LK03이 LB-001에 사용된다.

인간 Mut 서열을 발현하기 위해 AAV-LK03 캡시드와 함께 사용될 수 있는 예시적인 핵산은 도 7b에 도시되어 있다. 핵산은 AAV2로부터의 ITR, 알부민 서열에 상응하는 1000개 염기 길이의 5' 및 3' 상동성 아암, 및 리보솜 스키핑을 용이하게 하기 위해 2A-펩티드가 선행하는 합성 인간 Mut 서열을 포함한다. 이 구축물에 대한 임상적 적응증은 식이 관리와 조합하여 중증 메틸말론산혈증 (MMA)의 치료를 포함한다. 진라이드™ 기술을 사용하여 MMA 환자의 간세포에 메틸말로닐-CoA 뮤타제 (Mut) 유전자의 기능적 카피를 전달하는 것은 독성 대사물질의 축적을 제거하고 차단하려는 것이다. 연구 등급 LB-001은 HEK 세포로의 삼중 형질감염으로 생성되었다. 임상적 물질의 제조는 바큘로바이러스 발현 벡터 시스템 (BEVS) 플랫폼을 사용하는 것을 포함하여 관련 기술분야에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다.

실시예 3: 뮤린 용량 결과 분석

본 실시예는 Mut-MCK 마우스 모델에서 LB-001 대용물의 예시적인 용량 결과 연구 설계를 입증한다. 이러한 분석으로부터의 결과는 IV 투여 시 MUT 녹아웃 마우스에서 LB-001 대용물의 효능있는 용량을 결정하는데 적용될 수 있다. 또한, 이 분석으로부터의 결과는 비-GLP 독성 평가를 제공하고 대규모 동물 연구 및 임상 시험에 영향을 미칠 수 있다. 본 실시예의 경우, 평가 중인 적응증은 메틸말론산혈증 (MMA)이다. 유사한 연구 설계는 다른 적응증에 혼입될 수 있다.

이 연구에서, LB-001 대용물은 1000 bp 5' 및 3' 상동성 아암을 포함한다. 벡터 (Vt-20 배치 4 (CMRI))를 하기 3종의 용량으로 투여하였다: 6e12 (낮은), 6e13 (중간), 6e14 (높은) vg/kg. 마우스 균주는 Mut-MCK이다. 동물의 예상되는 한배 새끼 크기는 6-8마리이다. 각 치료 그룹에 대해, 5-6마리의 한배 새끼가 필요할 것으로 추정된다. 표 1은 연구에서의 치료 그룹을 요약한다.

표 1: 용량 결과 분석을 위한 치료 그룹의 요약.

연구를 위한 샘플 수집은 하기를 포함한다: (1) 혈청; (2) 혈장 (EDTA 튜브); (3) 간 (신선 동결 (드라이 아이스), -80℃에서 저장)); 및 간, 신장, 심장, 폐, 뇌, 및 골격근 (밤새 10% 포르말린 고정되고 70% 에탄올에서 실온에서 저장됨). 표 2는 연구를 위한 샘플 수집을 요약한다.

표 2: 용량 결과 분석을 위한 샘플링의 요약.

연구를 위한 판독은 하기를 포함한다: (1) 생존; (2) 체중, 매주 기준으로 매주 1회 측정됨; (3) D30, D60 및 D90에서 시작하는 MMA 혈장 수준; 및 (4) 연구 종료 시 간 조직에서 통합 (D90).

실시예 4: 마우스 모델에서 MUT 트랜스진 전달의 효능

본 실시예는 MMA의 두 마우스 모델에서 생성된 LB-001에 대한 전임상 데이터를 제공한다. 제1 모델에서, Mut에 대한 유전자는 완전히 비기능적이 되었다. 이 비기능적 형태의 Mut는 Mut-/-라고 한다. 이 비기능적 유전자를 보유하는 마우스는 환자에서 가장 심각한 MMA 사례에서 보여진 것보다 더 심각한 결핍을 갖는 것으로 믿어진다. 미처리된 상태로 방치되면 이들 마우스는 생후 처음 며칠 내에 사망한다. 도 8의 상단 패널에 제시된 바와 같이, 4마리의 신생아 마우스에게 LB-001의 뮤린 진라이드™ 구축물의 단일 복강내 주사는 4마리의 마우스 중 3마리에서 증가된 생존을 초래하였으며, 2마리의 마우스는 1년 초과 동안 생존하였다. 또한, 도 8의 하단 패널에 제시된 바와 같이, 이들 마우스는 자유롭게 먹이를 주었을 때 체중이 증가하였다.

MCK-Mut라고 불리는 MMA의 제2 마우스 모델은 마우스 Mut 유전자의 기능적 카피가 크레아틴 키나제 프로모터의 제어 하에 배치된 Mut-/- 마우스의 변형이다. 이는 근육 세포에서 Mut 발현을 허용하며, 이는 결국 MMA 환자에서 보여진 많은 표현형 변화를 여전히 나타내면서 마우스가 더 오래 생존할 수 있게 한다. 5마리의 신생아 MCK-Mut 마우스는 LB-001의 뮤린 진라이드™ 구축물의 단일 주사를 투여받았다. 이들 마우스에서 Mut의 발현이 관찰되었다. 도 9에 제시된 바와 같이, 1개월령에, 이들 마우스는 미처리된 MCK-Mut 마우스와 비교하여 체중 증가의 유의한 개선을 가졌다. 이들 결과는 통계적으로 유의하였다. P-값은 통계적 유의성의 표준 측정이며, 0.05 미만의 p-값은 우연히 결과를 수득할 수 있는 20분의 1 미만의 확률을 나타내며, 일반적으로 통계적으로 유의한 것으로 간주된다.

도 10에 제시된 바와 같이, 진라이드™-처리 MCK-Mut 마우스는 또한 MMA를 갖는 환자에서 축적되는 질환-관련 독성 대사물질 및 진단적 바이오마커인 메틸시트레이트 및 메틸말론산의 혈장 수준의 상당한 감소를 가졌다.

놀랍게도, AAV-지정 HR 유전자 편집에 의해 달성된 염색체 통합의 상대적으로 낮은 비율에도 불구하고, 이러한 방법은 기능적 Mut 효소의 치료적 발현 수준을 초래한다. 어떠한 이론에도 구속되기를 원치 않지만, 이 성공은 LB-001 구축물의 특정 특징 때문이라는 가설을 세웠다.

첫째, 사용된 AAV 캡시드인 LK03은 인간 간 세포를 표적화하기 위해 최적화되었다. 둘째, 게놈 삽입은 알부민 유전자에 대한 로커스로 표적화된다. 알부민은 간에서 가장 고도로 발현되는 단백질이며, 대부분의 다른 단백질의 정상적인 발현은 알부민의 분획에 불과하다. 따라서, 심지어 중간 통합 비율 조차도 치료적 수준의 단백질을 발현할 수 있다. 전사적으로 활성인 유전자 (알부민이 이 중 하나임)는 HR을 사용한 트랜스진 통합에 대해 더 감수성이다.

셋째, 기능적 Mut 효소의 존재 자체가 Mut이 결여된 것보다 간세포에 선택적 이점을 제공하는 것으로 관찰되었다. 시간 경과에 따라, 이러한 선택적 이점은 Mut의 기능적 카피를 함유하는 간 세포의 증가된 비율을 유발한다. 이는 뮤린 진라이드™ 구축물이 간에서 Mut의 기능적 카피가 있거나 없는 마우스에 도입된 마우스에서 관찰될 수 있다. 양쪽 마우스 세트에서 초기 진라이드™ 통합 빈도는 4% 미만이었다. 시간 경과에 따라, 변형된 세포의 수는 간에서 Mut를 자연적으로 발현하는 마우스에서 동일하게 유지되었다 (간에서의 Mut+/-). 그러나, 1년 초과 후, 간 Mut가 유전적으로 결핍된 마우스 (간에서의 Mut-/-)에서, Mut를 발현하는 세포의 퍼센트는 도 11에 제시된 바와 같이 24%로 증가하였다. 어떠한 이론에도 구속되기를 원치 않지만, 이러한 선택적 이점은 Mut 발현 및 결핍된 아미노산 대사 경로의 회복의 결과로 미토콘드리아 기능의 개선에 기인할 수 있다.

이들 마우스에서 선택적 이점에 대한 추가의 뒷받침 증거는 (i) 도 12에 제시된 바와 같이 직교 장거리 정량적 중합효소 연쇄 반응 또는 LR-qPCR에 의해 알부민 로커스에서 통합된 Mut 유전자를 갖는 세포의 정량화 및 (ii) 도 13에 제시된 바와 같이 투약 후 1개월과 비교하여 1년 초과에서 LR-qPCR에 의한 알부민 로커스에서의 증가된 통합 비율의 검출을 포함한다.

세포가 복제하고 바이러스로 코딩되는 트랜스진을 상실함에 따라 요법을 함유하는 세포의 백분율이 시간 경과에 따라 감소하는 통상적인 AAV 유전자 요법 접근법과는 대조적으로, MMA 마우스 연구에서, Mut 진라이드™ 구축물을 함유하는 세포의 백분율은 시간 경과에 따라 증가하였다. 이들 결과는 단일 투여가 평생 이점을 제공할 수 있다는 가능성을 뒷받침한다.

실시예 5: 마우스 모델에서 MUT 트랜스진 전달의 효능

본 실시예는 실시예 4에서 제시된 결과를 확인한다. 실시예 4에서와 같이, 본 실시예는 마우스 알부민 (Alb) 로커스에 인간 MUT의 부위-특이적 유전자 첨가를 달성하기 위해 상동성 재조합을 이용하는 프로모터 없는 AAV 벡터를 사용한다. 이 벡터 (AAV-Alb-2A-MUT)는 MUT 유전자에 근접한 2A-펩티드 코딩 서열을 플랭킹하는 상동성 아암을 함유하고, 통합 후 내인성 Alb 프로모터로부터 MUT 발현을 생성한다. 이전 데이터는 출생 시 8.6E11-2.5E12 vg/마리의 용량으로 전달된 AAV-Alb-2A-MUT가 MMA의 뮤린 모델에서 질환 관련 대사물질을 감소시키고 성장 및 생존을 증가시켰음을 나타내었다 (Chandler, R.J. et al., Rescue of Mice with Methylmalonic Acidemia from Immediate Neonatal Lethality Using an Albumin Targeted, Promoterless Adeno-Associated Viral Integrating Vector, Molecular Therapy, Abstract 26, 25(5S1): page 13 (May 2017)). 실시예 4와 같은 본 실시예는 본원에 개시된 구축물 및 방법을 사용한 MUT 트랜스진 전달이 MMA 마우스 모델에서 장기간 효능을 부여한다는 결과를 개시한다.

실시예 4에 제시된 바와 같이, 본 실시예는 진라이드™를 사용한 하이포모르픽 MMA 뮤린 모델의 처리가 메틸말론산의 혈장 수준의 감소를 초래함을 확인한다 (도 14). 또한 실시예 4에 나타낸 바와 같이, 본 실시예는 MUT 트랜스진 통합이 MMA를 갖는 마우스에서 간세포 성장 이점을 부여함을 확인한다. 예를 들어, 간 MUT 단백질 발현, MUT mRNA 세포의 백분율, 및 Alb-통합의 수가 처리된 MMA 마우스에서 시간 경과에 따라 증가한 것으로 관찰되었다 (도 15-17). 치료후 13-15개월 야생형 마우스 및 처리후 2개월 MMA 마우스에서 관찰된 낮은 수준의 트랜스진 통합 및 낮은 수의 MUT mRNA 양성 세포 (도 15 및 17)는 생체내 상동성 재조합에 의한 교정의 특징이다.

또한, 실시예 4에서와 같이, 본 실시예는 AAV-Alb-2A-MUT 처리된 MMA 마우스의 RNA스코프가 강건한 MUT 발현을 나타내었고, MUT 양성 간세포가 클론 확장 패턴과 일치하는 별개의 광범위하게 분산된 클러스터로 나타났다는 것을 제시한다. RNA스코프 연구는 또한 처리된 MMA 마우스에서 간세포의 대략 5-40% 대 야생형 대조군에서 1%에 MUT 발현이 존재하였음을 제시한다 (도 17). 실시예 4 및 본 실시예의 결과는 MUT 진라이드™를 사용한 처리 후 MMA의 뮤린 모델에서 교정된 간세포에 대한 선택적 이점이 달성될 수 있음을 나타낸다. 이러한 관찰은 MMA 환자 치료에 임상적 관련성을 갖는다.

실시예 6: 마우스 모델에서 MUT 트랜스진 전달의 효능

본 실시예는 뮤린 LB001을 사용한 MMA 마우스 모델의 처리에 대해 실시예 4에 제시된 결과를 확인한다.

실시예 4에서와 같이, 본 실시예는 간 MUT가 결핍된 MMA 마우스 모델에 대한 시간 경과에 따른 DNA 통합의 증가를 개시한다 (도 18). 이러한 증가가 상이한 용량의 트랜스진 구축물에 대해 관찰되었다. 어떠한 이론에도 구속되기를 원치 않지만, 본원에 개시된 구축물 및 방법을 사용한 트랜스진 통합의 이러한 증가, 이러한 관찰된 선택적 이점은 환자에게 구축물 투여의 안전한 용량으로 트랜스진 발현의 치료적 수준을 달성할 목적으로 활용될 수 있다. 예를 들어, 상대적으로 낮은 용량의 구축물로 시작하여, MMA를 앓고 있는 환자는 결국 중증도를 감소시키거나 또는 질환을 치료하기에 충분한 수준의 MUT 트랜스진에 도달할 수 있었다. 환자에서 시간 경과에 따라 증가된 트랜스진 통합의 관찰은 모니터 치료를 확인하는데 사용될 수 있었다.

실시예 7: 인간화된 마우스 모델에서 hLB001의 생체내 활성 조사

본 실시예는 재조합 AAV (hLB001) (LK-03-진라이드™ MUT) 및 인간화된 FRG KO/NOD 뮤린 모델을 사용하여 인간 ALB 로커스로의 MUT 트랜스진의 부위-특이적 통합의 효능을 평가하기 위한 예시적인 분석을 제공한다.

이 분석을 위한 벡터는 2종의 투약 수준 (1e13 및 1e14 vg/kg)으로 인간화된 간을 갖는 FRG 마우스에게 투여된 hLB001이다. 이 분석에 대한 종점은 하기를 포함한다: (1) 게놈 통합의 백분율 및 (2) ALB-2A-MUT 융합된 mRNA의 발현. 분석할 시점은 감염 후 21일을 포함한다.

재료, 방법 및 샘플링

재료

a. 3마리, 암컷 인간화된 Fah^-/-/Rag2^-/-/Il2rg^-/- NOD 마우스 (Hu-FRGN), 공여자 HHM19027/YTW로 ≥ 80% 인간 간세포 대체

b. 12마리, 암컷 인간화된 Fah^-/-/Rag2^-/-/Il2rg^-/- NOD 마우스 (Hu-FRGN), 공여자 HHF13022/RMG로 ≥ 80% 인간 간세포 대체

c. 예쿠리스(Yecuris) 인간 알부민 ELISA

d. 29g 바늘을 갖는 멸균 3/10cc 시린지

e. 29g 바늘을 갖는 멸균 1cc 시린지

f. 시트르산나트륨 코팅된 튜브, 0.8mL

g. PBS, 비히클

h. 예비 단계: rAAV, 역가: 6.43e13 vg/mL

i. 단계 1: rAAV 역가: 9.29e13 vg/mL

j. 1.5mL 튜브, 멸균

k. 마우스 마취제 칵테일 (7.5 mg/mL 케타민, 1.5 mg/mL 크실라진 및 0.25 mg/mL 아세프로마진)

l. 티슈텍(TissueTek) 카세트

m. 10% 정상 완충 포르말린, 신선하게 제조됨

n. 에탄올, 70%

o. 스크류 캡을 갖는 5 mL 폴리프로필렌 튜브

p. 액체 질소

방법

투약전 마우스 준비:

연구에 사용되는 모든 마우스를 연구 개시 전 NTBC ≥ 25일 및 SMX/TMP ≥ 3일에서 제거하였다. 인간화를 연구 시작 전 ≤ 7일에 평가하였다.

투약을 위한 바이러스 준비:

바이러스를 해동하고, 준비 동안 및 준비 후에 얼음 위에 보관해야 하였다. PBS는 37C 또는 실온에서 해동할 수 있었다. 준비 전 PBS ≥ 30분 및 바이러스 ≥ 5분에 해동하도록 제안되었다.

예비 연구 - 파일럿:

a. 화합물 제형:

i. 1e14 vg/kg을 전달하기 위해 2e13vg/mL 바이러스 스톡이 필요함

ii. 생물안전성 캐비닛, 레벨 II 내부에서, 6.43e13 vg/mL를 2e13 vg/mL로 희석함. 25 g의 평균 체중을 가정함

b. HHM19027/YTW로 이식된 4개의 HuFRGN을 두 그룹으로 나누고, 하기 차트에 요약된 표시된 용량으로 표시된 화합물을 투약함

c. 제1일에 각 그룹은 29g 바늘을 갖는 멸균 3/10cc 바늘을 사용하여 안와후 정맥동을 통한 정맥내 전달에 의해 각 화합물의 지정된 용량을 투여받음:

iii. 각 마우스의 체중을 측정하고, 체중 (BW)을 기록함.

iv. 원하는 용량을 달성하는데 필요한 화합물의 총 vg을 결정하기 위해 각 마우스의 BW (g)에 스톡 용액의 농도 (vg/g)를 곱함.

v. 투약에 사용할 스톡 용액의 부피를 결정하기 위해 총 vg 수를 스톡 용액의 농도 (vg/μL)로 나눔.

vi. 투약 전에 기화된 이소플루란을 사용하여 마우스를 마취시킴.

vii. 각 마우스에 대해 계산된 바이러스 용량을 3/10cc 시린지의 멸균 29G 바늘로 취하고 안와후 정맥동을 통해 전달함.

d. 모든 동물을 투약 후 즉시 모니터링하여 마취로부터 회복을 보장하고, 투약 동안 동물에게 의도하지 않은 피해가 가해지지 않았음.

e. 모든 마우스를 일반적인 건강에 대해 매일 모니터링하였다. 마우스가 빈사 상태이거나 또는 사망한 경우, 마우스를 마취하고, "최종 수확" 섹션에 하기 기재된 바와 같이 샘플을 수집함.

최종 수확

a. 제22일 (투약 후 3주)에 모든 마우스의 체중을 측정하고, 체중에 따라 마우스 칵테일을 사용하여 마취시켰다.

b. 27g 바늘을 갖는 1cc 시린지를 사용하여 심장 천자를 통해 가능한 한 많은 전혈을 수집하였다. 전혈을 시트르산나트륨 코팅된 튜브로 옮기고, 혈장을 1500 x g에서 15분 동안 4℃에서 원심분리함으로써 단리하였다. 혈장은 100 μL 분취액으로 분배하고, -80℃에서 저장하였다.

c. 복막 및 흉강을 열어 간을 노출시키고, 간을 단리하고 간의 중량을 기록하였다. 간을 개별 엽으로 절개하고, 각 엽을 2개의 동일한 부분으로 추가로 절개하였다.

d. 조직학을 위해, 각 엽으로부터의 한 조각을 티슈텍 카세트에 위치시키고, 신선하게 준비한 10% 정상 완충 포르말린에서 16-32시간 동안 실온에서 고정시킨 후, 70% 에탄올로 옮기고, 실온에서 저장하였다.

주의: 4℃에서 고정시키지 않는다. < 16시간 또는 >32시간 동안 고정시키지 않는다. 지연된 고정은 RNA를 분해하고, 더 낮은 신호를 생성하거나 또는 신호를 생성하지 않을 수 있다. 더 짧은 시간 또는 더 낮은 온도는 고정이 되지 않는 결과를 가져올 것이다.

e. 생분석을 위해 각 엽으로부터의 두 번째 조각을 5 mL 폴리프로필렌 튜브로 옮기고, 액체 질소에서 속성 동결시키고 -80℃에서 저장하였다.

연구 - 단계 1

a. 화합물 제형:

i. 1e14vg/kg을 전달하기 위해 2e13vg/mL 바이러스 스톡이 필요함. 1e13vg/kg을 전달하기 위해 2e12vg/mL가 필요함.

ii. 생물안전성 캐비닛, 레벨 II 내부에서, 9.29E+13 vg/mL를 2e13 vg/mL 및 2e12 vg/mL 스톡으로 희석함. 25g의 평균 체중을 가정함

b. HHF13022/RMG로 이식된 12개의 HuFRGN을 세 그룹으로 나누고, 하기 차트에 요약된 표시된 용량으로 표시된 화합물을 투약함.

iii. 각 마우스의 체중을 측정하고, 체중 (BW)을 기록함.

최종 수확

a. 제22일 (투약 후 3주)에 모든 마우스를 마우스 칵테일을 사용하여 마취시켰다.

실시예 8: 1차 인간 간세포에 대한 진라이드™

샌드위치 배양 시스템을 사용하여 1차 인간 간세포를 배양하였다. 배지 변경 전 48시간 동안 진라이드™ hLB001에 의해 세포를 감염시켰다. 감염 7일 후, 세포를 수확하고, 퀴아젠(Qiagen) 올프렙(Allprep) 키트 (Cat No./ID: 80204)를 사용하여 RNA를 추출하였다.

RNA 추출 후, 고용량 cDNA 역전사 키트 (써모피셔 4368814)에 의해 1μg의 RNA를 역전사에 사용하였다. 프라이머 235/267 (도 19)에 의한 다운스트림 PCR 증폭을 위한 주형으로서 cDNA를 사용하였다. PCR 산물을 프라이머 235로 서열분석하였다.

서열분석 결과는 정지 코돈 전 ALB 엑손 12, 엑손 13, 엑손 14 및 1차 인간 간세포에서 진라이드™에 의해 매개된 정확한 통합으로부터 융합된 mRNA의 올바른 발현을 나타내는 2a 서열의 융합된 mRNA를 제시한다.

실시예 9: 1차 인간 간세포에 대한 진라이드™

본 실시예는 진라이드™ 벡터 LB001이 인간 1차 간세포에서 ALB 로커스로의 MUT의 효율적인 게놈 편집을 매개할 수 있다는 점에서 실시예 8에서 관찰된 결과를 확인한다.

방법

1차 인간 간세포 샌드위치 배양 시스템을 사용하여 감염성, DNA 통합, 및 단백질 수준을 분석하였다 (도 20). 장거리 (LR) qPCR을 사용하여 부위-특이적 통합 비율을 분석하였다 (도 21). 안정적 HepG2-2A-PuroR 세포주를 DNA에서 양성 대조군으로서 사용하였다.

결과

MUT 및 ALB의 상대적 발현을 평가하였다 (도 22). 추가 연구를 위해, 진라이드™ LB-001을 시험하기 위해 동일한 일배체형 1을 갖는 3명의 1차 인간 간세포 공여자를 선택하였다 (도 23-25). 이들 결과는 진라이드™ LB-001이 1차 인간 간세포에서 MUT 트랜스진을 통합하고 발현할 수 있음을 확인한다.

실시예 10: MMA를 치료하기 위한 진라이드™ 기술 적용을 위한 MUT 트랜스진

본 실시예는 상이한 MUT 트랜스진이 진라이드™ 기술 적용을 위해 사용될 수 있음을 제시한다. 예를 들어, 인간 메틸말로닐-CoA 뮤타제 (synMUT)를 코딩하는 합성 폴리뉴클레오티드를 진라이드™ 적용에 사용할 수 있다. synMUT 구축물의 예는 WO/2014/143884 및 미국 특허 번호 9,944,918에 기재되어 있으며, 둘 다는 본원에 참조로 포함된다. 인간 메틸말로닐-CoA 뮤타제 (synMUT1-4)를 코딩하는 예시적인 최적화된 뉴클레오티드 서열은 각각 서열식별번호: 9, 12, 13 및 14로 나열된다.

실시예 11: 선천성 대사 오류

간은 많은 대사 및 해독 과정을 담당하는 핵심 기관이다. MMA를 포함하는 수십 가지의 단일유전자 질환은 대사 경로에 관여하는 간 효소의 결핍으로 인해 발생한다. 또 다른 희귀 선천성 대사 오류인 크리글러-나자르 증후군을 해결하기 위해 동물 모델에서 개념 데이터의 추가 증명을 생성하였다. 크리글러-나자르를 갖는 환자는 빌리루빈을 대사하고 순환으로부터 제거할 수 없으므로, 신경학적 손상 및 사망의 평생 위험을 초래한다. 유사한 진라이드™ 구축물이지만, 빌리루빈 우리딘 디포스페이트 글루쿠로노실 트랜스퍼라제 또는 UGT1A1에 대한 유전자를 트랜스진으로서 사용하여 크리글러-나자르 증후군의 동물 모델에서 유전자 결핍을 교정하였다. 도 26에 제시된 바와 같이, 마우스 간 세포에서 알부민 로커스로의 UGT1A1의 도입은 빌리루빈 수준의 정규화 및 UGT1A1이 결핍된 마우스의 장기간 생존이 20일 미만에서 적어도 1년으로 되게 하였다. 이 범주에서 추구될 수 있는 추가 적응증은 페닐케톤뇨증, 오르니틴 트랜스카르바밀라제 결핍 및 글리코겐 저장 질환 유형 1A를 포함한다.

실시예 12: 다른 간-지정 요법

간에 대한 치료제 제품 후보의 특이성을 사용된 AAV 캡시드 및 숙주 세포의 DNA로의 통합 위치 둘 다에 의해 결정하였다. LB-001은 인간 간의 형질도입에 고도로 효율적으로 설계된 AAV 캡시드인 LK03을 사용한다. 간 지정 치료제 제품 후보에 대한 트랜스진을 알부민 유전자 로커스에 삽입하며, 이는 간에서 의미있는 수준에서만 생성되며, 여기서 이는 가장 고도로 발현된 유전자이다. 알부민의 선택은 활성 전사가 상동성 재조합 속도를 향상시키고 알부민 유전자의 조직-특이적 발현이 간에서 트랜스진의 생산을 구동하기 때문에 간 특이성을 향상시키는 것으로 간주된다.

실시예 13: 생체내 단백질 공장으로서 간 사용

본 실시예는 진라이드™의 조정 설계가 간 외부에서 기능하는 단백질의 생산에 적용될 수 있음을 예시한다.

간은 순환에서 발견되는 많은 단백질을 생산하는 주요 분비성 기관이다. 이 속성은 간세포가 유전적 결핍을 갖는 환자에게 핵심 치료용 단백질을 전달하도록 허용할 수 있다. 예를 들어, 이는 응고 결핍을 교정하기 위해 인간 응고 인자 IX를 코딩하는 LB-101의 뮤린 진라이드™ 구축물을 사용하여 혈우병 B의 동물 모델에서 입증되었다. 이 모델에서, 인간 응고 인자 IX의 발현 및 혈액 응고는 신생아 및 성인 질환 마우스에서 단일 처리 후 정상적인 수준으로 회복되었다.

또한, 도 27에 제시된 바와 같이, 인간 인자 IX의 안정적 및 치료적 수준은 부분 간절제술 또는 PH 후에도 LB-101의 뮤린 진라이드™ 구축물의 투여 후 신생아 야생형 마우스에서 20주 동안 지속되었다. PH는 간의 2/3을 제거하여 재생 기관 성장을 촉발하는 시술이다. 통상적인 AAV 유전자 요법을 사용하면, PH에 따른 트랜스진 발현이 극적으로 감소한다.

실시예 14: 다기관 질환

일부 유전적 돌연변이는 단백질 결핍 및 해로운 단백질의 과다발현 둘 다을 초래하여 발병기전을 유발한다. 이러한 질환 중 하나가 A1ATD이다. A1ATD에서, 환자는 순환 A1AT의 결핍을 갖고, 중증 간 손상을 발병할 수 있으며, 간 이식을 필요로 할 수 있다. 이는 AATD가 우성 음성 유전 질환으로, 유전자의 결함이 있는 카피가 정상적인 카피의 존재에도 증상과 연관되기 때문이다. AATD는 LB-201의 뮤린 진라이드™ 구축물을 사용하여 마우스 모델에서 교정된 또 다른 유전 질환이다. 마우스 모델에 사용된 진라이드™ 구축물은 해로운 유전자의 발현을 감소시키도록 설계된 microRNA 뿐만 아니라 유전자의 정상적인 카피를 포함하였다. 트랜스진의 발현 및 돌연변이체 유전자의 하향조절은 적어도 8개월 동안 이들 마우스에서 분명하였다.

실시예 15: 혈우병 B 마우스에서의 용량 반응 분석

본 실시예는 마우스에서 상이한 용량으로 인자 IX를 통합하는 진라이드™ 방법의 효능을 입증한다.

AAV DJ 혈청형을 사용하여 강건한 간-특이적 마우스 Alb 프로모터로부터의 통합 후 발현을 위해 인간 FIX-트리플L을 표적화하였다. 어떠한 이론에도 구속되기를 원치 않지만, 다음과 같이 상정하였다: Alb 프로모터는 통합이 간세포의 작은 분획에서만 발생하더라도 높은 수준의 응고 인자 생산을 허용해야 하고; Alb 로커스에서 높은 전사 활성은 상동성 재조합에 의한 트랜스진 통합에 더 민감하게 만들어야 한다.

진라이드™ 기술에 기초한 생체내 유전자 표적화 접근법을 적용하여 FIX 결핍된 마우스 모델에서 뉴클레아제를 사용하지 않고 치료적 cDNA의 프로모터 없는 버전을 알부민 로커스에 특이적으로 삽입하였다. 인간 FIX 변이체인 FIX-트리플L (FIX-V86A/E277A/R338L)을 사용하였다. 혈우병 B 마우스에서 아데노-연관 바이러스 (AAV)의 유전자 전달은 FIX-트리플L이 FIX-WT보다 15배 더 높은 특이적 응고 활성을 가졌으며, 이 활성이 FIX-트리플 (10배) 또는 FIX-R338L (6배)보다 유의하게 우수하였음을 나타내었다. 더 낮은 바이러스 용량에서, FIX-트리플L은 FIX 활성을 하위 치료로부터 치료적 수준으로 개선하였다. 생리학적 조건 하에서, 장기간 AAV-FIX-처리 C57Bl/6 마우스에서 유해 혈전 사건의 징후가 관찰되지 않았다 (Kao et al. Thrombosis and Haemostasis 2013).

재료 및 방법:

실험 설계의 요약은 표 3에 나타낸다.

표 3: 실험 설계의 요약.

동물 취급: 미국 국립 보건원 (NIH) 및 실험 동물 관리 평가 및 인증 협회 (AAALAC) 둘 다에서의 동물 관리 지침에 따라 동물을 수용하고 취급하였다. 실험 절차는 동물 실험을 위한 이스라엘 위원회에 의해 검토되고 승인되었다. 표준 식이 및 물을 무제한으로 제공하면서 12/12시간 명암 주기로 온도-제어된 환경에 마우스를 보관하였다.

플라스미드 구축: 마우스 게놈 Alb 세그먼트 (NCBI 참조 서열에서 90474003-90476720: NC_000071.6)를 PCR-증폭하고, 변형된 pTRUF 백본에서 BSRGI 및 SPEI 제한 부위로 AAV2 ITR 사이에 삽입하였다. 게놈 세그먼트는 Alb 정지 코돈에서 1.3 Kb 업스트림 및 1.4 Kb 다운스트림에 걸쳐 있다. 그 후, 본 발명자들은 링커 코딩 서열 (글리신-세린-글리신), 이어서 최적화된 P2A 코딩 서열 및 이어서 NHEI 제한 부위를 BPU10I 제한 부위에 삽입하였다. 최종적으로, 본 발명자들은 코돈 최적화된 (벡터 NTI) hFIX-트리플L cDNA를 NHEI 부위에 삽입하여 DJ 벡터의 구축에 사용된 LB-Pm-0005 (pAAV-288)를 얻었다. 엔도프리(EndoFree) 플라스미드 메가프렙(Megaprep) 키트 (퀴아젠)를 사용하여 최종 rAAV 생산 플라스미드를 생산하였다.

AAV 생산: AAV-FIX-트리플L (LB-Vt-0001) 벡터 로트# 170824 (1.13E13 총 vg)를 CsCl 정제 방법으로 생산하였다.

마우스 주사 및 출혈: F9tm1Dws 녹아웃 마우스를 잭슨 래보러토리(Jackson Laboratory)로부터 구입하여 신생아 주사를 위한 자손을 생산하는 번식 쌍을 제공하였다. 2일령 F9tm1Dws 녹아웃 수컷에게 AAV-hFIX-트리플L의 마우스당 3e11, 3e10, 3e9 및 1e9 벡터 게놈을 복강내로 주사하고, ELISA 및 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간 검정 (IDEXX Coag Dx 분석기 사용)을 위한 안와후 출혈에 의해 생애 제4주에 출혈을 시작하였다. 모든 마우스를 제12주에 희생시키고, DNA/단백질 분석을 위해 간을 취하였다.

혈장에서 FIX 결정: FIX에 대한 ELISA를 하기 항체로 수행하였다; 1: 500의 마우스 항-인간 FIX IgG 1차 항체 (시그마(Sigma) F2645), 및 1: 4,200의 폴리클로날 염소 항-인간 FIX 퍼옥시다제-접합 IgG 2차 항체 (엔자임 리써치(Enzyme Research) GAFIX-APHRP).

LR-qPCR 검정에 의한 Alb 로커스 표적화 비율의 평가: 원치않는 벡터 증폭이 아닌 통합된 게놈 Alb의 증폭은 상동성 아암 외부의 프라이머 어닐링 및 통합된 DNA를 위한 프라이머를 사용하여 수행하였다. LR-PCR 앰플리콘을 TaqMan qPCR 정량화 검정을 위한 주형으로 사용하였다. 본 발명자들은 최종적으로 참조 통합된 샘플의 표준 곡선에 의해 통합 수준을 계산하였다.

결과:

혈우병 B 신생아 마우스의 처리를 위해, 인간 FIX의 과다활성 변이체; FIX-트리플L을 코딩하는 AAV-DJ 진라이드™ 벡터의 마우스당 3e11, 3e10, 3e9 및 1e9 벡터 게놈 (vg) (Kg당 1.5e14, 1.5e13, 1.5e12 및 5e11)으로 2일령 F9tm1Dws 녹아웃 마우스의 복강내 (IP) 주사를 수행하였다. 1.5E12 VG/kg의 낮은 용량에서 질환 호전이 나타났다. 주사 후 제4주에 응고 시간을 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간 검정 (aPTT)에 의해 측정하였다. 처리된 KO 마우스에서 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간 (aPTT)에 의해 결정된 바와 같은 기능적 응고는 야생형 (WT) 마우스와 유사한 수준으로 회복되었다 (도 28-29). 이들 결과는 온-타겟 통합으로부터 기인된 높은 치료적 hFIX-트리플L 발현 수준을 입증한다.

논의:

1.5E12 vg/kg of hFIX-트리플L은 4주 후 혈우병 B 신생아에서 출혈 체질을 호전시키고 12주 동안 안정적으로 유지되는 것으로 관찰되었다. 이는 뉴클레아제 없이 및 벡터-매개 프로모터 없이 생체내 유전자 표적화에 대한 치료 효과를 입증한다. rAAV에 대한 개시된 프로모터 없는 뉴클레아제-무함유 유전자 표적화 전략의 유리한 안전성 프로파일은 혈우병 및 다른 유전적 결핍의 맥락에서 임상적 평가를 위한 주요 후보를 만든다. 보다 일반적으로, 이 전략은 치료 효과가 분비된 단백질에 의해 전달되거나 또는 표적화가 선택적 이점을 부여할 때 적용될 수 있었다.

실시예 16: 상동성 아암에서 일배체형 미스매치

본 실시예는 상이한 벡터 배치를 사용하여 상동성 아암에서 미스매치 및 반복성을 갖는 진라이드™의 효능을 입증한다.

상기 논의된 바와 같이, 진라이드™에서, 치료용 유전자의 프로모터 없는 코딩 서열은 알부민 로커스로의 자연 오류-없는 상동성 재조합 (HR)에 의해 표적화된다. 치료용 유전자의 발현은 2A 펩티드를 통해 강건한 간 알부민 발현에 연결된다. 관련 인간 알부민 로커스에는 집단의 95%를 차지하는 두 가지 주요 일배체형이 있다. 일배체형은 5' 상동성 아암에 상응하는 서열에서 5개의 SNP가 상이하다 (도 30a-도 30c).

강건한 간-특이적 마우스 Alb 프로모터로부터의 통합 후 발현을 위해 인간 FIX-트리플L을 표적화하기 위해 AAV DJ 혈청형을 사용하였다. 진라이드™ 기술을 사용하여 야생형 C57bl/6 마우스에서 뉴클레아제를 사용하지 않고 치료적 cDNA의 프로모터 없는 버전을 알부민 로커스에 특이적으로 삽입하였다. 야생형 인간 FIX 변이체, FIX-트리플L (FIX-V86A/E277A/R338L) 및 상동성 아암에서 6개의 SNP를 갖는 일배체형 미스매치 hFIX-트리플L을 사용하였다. 일배체형은 5' 상동성 아암에 상응하는 서열에서 5개의 SNP 및 3' 상동성 아암에 상응하는 서열에서 1개의 SNP가 상이하다.

재료 및 방법:

실험 설계의 요약은 표 4에 나타낸다.

표 4: 실험 설계의 요약.

플라스미드 구축: 마우스 게놈 Alb 세그먼트 (NCBI 참조 서열에서 90474003-90476720: NC_000071.6)를 PCR-증폭하고, 변형된 pTRUF 백본에서 BSRGI 및 SPEI 제한 부위로 AAV2 ITR 사이에 삽입하였다. 게놈 세그먼트는 Alb 정지 코돈에서 1.3 Kb 업스트림 및 1.4 Kb 다운스트림에 걸쳐 있다. 그 후, 본 발명자들은 링커 코딩 서열 (글리신-세린-글리신), 이어서 최적화된 P2A 코딩 서열 및 이어서 NHEI 제한 부위를 BPU10I 제한 부위에 삽입하였다. 최종적으로, 본 발명자들은 코돈 최적화된 (벡터 NTI) hFIX-트리플L cDNA를 NHEI 부위에 삽입하여 DJ 벡터의 구축에 사용된 LB-Pm-0005 (pAAV-288)를 얻었다. 엔도프리 플라스미드 메가프렙 키트 (퀴아젠)를 사용하여 최종 rAAV 생산 플라스미드를 생산하였다.

AAV 생산: AAV-FIX-트리플L (LB-Vt-0001) 벡터 로트# 171102를 양성 대조군으로서 사용하고, 일배체형 미스매치 로트# 171102, 171116, 171130의 및 3개의 상이한 벡터 배치를 CsCl 정제 방법으로 생산하였다.

마우스 주사 및 출혈: 9주령 C57bl/6 암컷 마우스에게 미스매치 없는 AAV-hFIX-트리플L의 마우스당 1e12 벡터 게놈을 복강내로 주사하고, ELISA에 의한 단백질 수준 측정을 위해 안와후 출혈에 의해 주사후 2, 4, 7 및 10주에 출혈시켰다. 모든 마우스를 제10주에 희생시키고, DNA 통합 비율 분석을 위해 간을 취하였다.

혈장에서 FIX 결정: FIX에 대한 ELISA를 하기 항체로 수행하였다; 1: 500의 마우스 항-인간 FIX IgG 1차 항체 (시그마 F2645), 및 1: 4,200의 폴리클로날 염소 항-인간 FIX 퍼옥시다제-접합 IgG 2차 항체 (엔자임 리써치 GAFIX-APHRP).

결과:

C57bl/6 성인 마우스의 처리를 위해, 인간 FIX의 과다활성 변이체; 미스매치 없는 FIX-트리플L을 코딩하는 AAV-DJ 진라이드™ 벡터의 마우스당 1e12 벡터 게놈 (VG) (Kg당 5e13)으로 9주령 C57bl/6 마우스의 정맥내 (IV) 주사를 수행하였다. 유사 돌연변이를 보유하는 합성 마우스 일배체형을 갖는 벡터를 설계하고, 진라이드™가 이러한 일배체형 미스매치에 의해 크게 영향을 받지 않는 것으로 밝혀졌다. 이 관찰은 상이한 환자 집단에 대해 하나의 벡터 설계를 사용하는 능력을 뒷받침한다. 독립적으로 및 별도로 생산된 상이한 벡터 간에 높은 일관성이 발견되었다. 10주 동안 혈장에서 hFIX 단백질의 안정적 존재가 관찰되었다.

논의:

이전 결과는 hFIX-트리플L 변이체를 코딩하는 진라이드™ 벡터의 1.5e12 vg/kg의 성체 또는 신생아 마우스에 단일 주사 후 혈우병 B 마우스에서 출혈 체질의 호전을 입증하였다. 이 연구에서, 미스매치가 일반적인 인간 일배체형을 시뮬레이션할 때 진라이드™ 효율이 벡터의 상동성 아암 및 표적 로커스 간의 미스매치에 의해 감소되지 않는 것으로 제시되었다. 이 작업은 또한 강건하고 일관된 벡터 생산 능력을 입증하였다. rAAV에 대한 프로모터 없는 뉴클레아제-무함유 유전자 표적화 전략의 유리한 효능 및 안전성 프로파일은 진라이드™를 혈우병 및 다른 유전적 결핍의 맥락에서 임상적 평가를 위한 주요 후보로 만든다. 이러한 치료 효과는 모든 집단에 적합할 수 있는 하나의 벡터 설계로 달성할 수 있다.

실시예 17: 진라이드™ 기술 적용을 위한 캡시드

본 실시예는 진라이드™ 기술의 적용에 사용될 수 있는 예시적인 캡시드를 제공한다. 진라이드™를 사용하여 트랜스진 발현에 사용될 수 있는 예시적인 캡시드는 AAV8, AAV-DJ, LK03, 및 NP59를 포함한다.

서열식별번호: 1은 AAV-DJ의 캡시드 단백질의 아미노산 서열이다. 서열식별번호: 2는 AAV-DJ의 캡시드 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이다. AAV-DJ에 대한 추가 정보는 본원에 참조로 포함된 WO/2007/120542에서 찾을 수 있다.

서열식별번호: 5는 AAV-LK03의 캡시드 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이다. 서열식별번호: 6은 AAV-LK03의 캡시드 단백질의 아미노산 서열이다. LK03에 대한 추가 정보는 본원에 참조로 포함된 WO/2013/029030에서 찾을 수 있다.

서열식별번호: 7은 AAV-NP59의 캡시드 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이다. 서열식별번호: 8은 AAV-NP59의 캡시드 단백질의 아미노산 서열이다. NP59에 대한 추가 정보는 본원에 참조로 포함된 WO/2017/143100에서 찾을 수 있다.

실시예 18: 진라이드™ 플랫폼의 지속적인 발전

구축물 및 캡시드의 설계로부터 상업적 규모의 제조에 이르기까지 진라이드™ 플랫폼의 핵심 측면을 최적화할 수 있다.

AAV 캡시드. AAV 캡시드는 특정 표적 조직, 예컨대 간에 이들의 내용물을 전달하는데 고도로 효율적으로 설계되었다. 간 및 다른 적응증에서 임상적 사용에 더 적합한 캡시드를 확인하였다. 예를 들어, LB-001에 사용된 AAV 캡시드인 LK03을 간 선택적인 것으로 개발하였다.

상동성 아암 및 통합 부위. 게놈 편집 기술은 하나의 요법에 대한 상동성 아암 및 통합 부위가 동일한 조직을 표적화하는 다른 요법에 적용될 수 있다는 잠재적 이점을 갖는다. 상동성 재조합 비율 및 유전자 발현 수준의 최적화로부터 얻은 통찰력은 후속 제품 후보에 적용될 수 있다.

표적. 잠재적 표적은 간, 간 발현과 관련된 다른 조직에서 정상적으로 발현되는 유전자에 상응하는 것, 및 다른 조직, 예컨대 CNS 또는 근육에서 직접적으로 최상으로 처리되는 표적을 포함한다.

선택. 진라이드™ 게놈 편집 기술의 잠재적 이점은 염색체 통합으로부터 발생하는 그의 내구성이다. 데이터는 유전자 결핍의 교정이 세포에 선택적 이점을 제공하고 트랜스진을 함유하는 세포의 백분율의 확장을 구동할 수 있는 요법이 있음을 나타낸다. 트랜스진이 세포 수준에서 선택 이점을 제공하지 않는 경우에도 처리된 세포에 선택적 이점을 제공하는 방법이 또한 평가되고 있다. 이러한 방법 중 하나는 요소를 진라이드™ 구축물에 첨가하여 환자가 외부 작용제로 치료될 때 요소를 혼입하지 않는 세포가 선택적으로 불리하게 되도록 하는 것을 포함한다. 이들 및 관련된 방법은 원하는 유전자를 함유하는 세포의 수를 풍부하게 하여 환자가 장기간 치료 이점을 얻는 것을 보장할 수 있도록 할 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> VENDITTI, Charles P. CHANDLER, Randy J. CHAU, B. Nelson CHIANG, Kyle P. LIAO, Jing <120> NON-DISRUPTIVE GENE THERAPY FOR THE TREATMENT OF MMA <130> 2012538-0062 <150> 62/717,771 <151> 2018-08-10 <160> 19 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 737 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 1 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro 20 25 30 Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala 85 90 95 Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Leu Leu Glu Pro 115 120 125 Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140 Pro Val Glu His Ser Pro Val Glu Pro Asp 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gtcaaggctt 1380 cagttttctc aggccggagc gagtgacatt cgggaccagt ctaggaactg gcttcctgga 1440 ccctgttacc gccagcagcg agtatcaaag acatctgcgg ataacaacaa cagtgaatac 1500 tcgtggactg gagctaccaa gtaccacctc aatggcagag actctctggt gaatccgggc 1560 ccggccatgg caagccacaa ggacgatgaa gaaaagtttt ttcctcagag cggggttctc 1620 atctttggga agcaaggctc agagaaaaca aatgtggaca ttgaaaaggt catgattaca 1680 gacgaagagg aaatcaggac aaccaatccc gtggctacgg agcagtatgg ttctgtatct 1740 accaacctcc agagaggcaa cagacaagca gctaccgcag atgtcgacac acaaggcgtt 1800 cttccaggca tggtctggca ggacagagat gtgtaccttc agggacccat ctgggcaaag 1860 attccacaca cggacggaca ttttcacccc tctcccctca tgggtggatt cggacttaaa 1920 caccctcctc cacagattct catcaagaac accccggtac ctgcgaatcc ttcgaccacc 1980 ttcagtgcgg caaagtttgc ttccttcatc acacagtact ccacgggaca ggtcagcgtg 2040 gagatcgagt gggagctgca gaaggaaaac agcaaacgct ggaatcccga aattcagtac 2100 acttccaact acaacaagtc tgttaatgtg gactttactg tggacactaa tggcgtgtat 2160 tcagagcctc gccccattgg caccagatac ctgactcgta atctgtaa 2208 <210> 8 <211> 735 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 8 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro 20 25 30 Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala 85 90 95 Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro 115 120 125 Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140 Pro Val Glu His Ser Pro Val Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly 145 150 155 160 Lys Thr Gly Gln Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr 165 170 175 Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln 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acatatttga atatacagca aagcacatgc caaaatttaa ttcaatttca 780 attagtggat accatatgca ggaagcaggg gctgatgcca ttctggagct ggcctatact 840 ttagcagatg gattggagta ctctagaact ggactccagg ctggcctgac aattgatgaa 900 tttgcaccaa ggttgtcttt cttctgggga attggaatga atttctatat ggaaatagca 960 aagatgagag ctggtagaag actctgggct cacttaatag agaaaatgtt tcagcctaaa 1020 aactcaaaat ctcttcttct aagagcacac tgtcagacat ctggatggtc acttactgag 1080 caggatccct acaataatat tgtccgtact gcaatagaag caatggcagc agtatttgga 1140 gggactcagt ctttgcacac aaattctttt gatgaagctt tgggtttgcc aactgtgaaa 1200 agtgctcgaa ttgccaggaa cacacaaatc atcattcaag aagaatctgg gattcccaaa 1260 gtggctgatc cttggggagg ttcttacatg atggaatgtc tcacaaatga tgtttatgat 1320 gctgctttaa agctcattaa tgaaattgaa gaaatgggtg gaatggccaa agctgtagct 1380 gagggaatac ctaaacttcg aattgaagaa tgtgctgccc gaagacaagc tagaatagat 1440 tctggttctg aagtaattgt tggagtaaat aagtaccagt tggaaaaaga agacgctgta 1500 gaagttctgg caattgataa tacttcagtg cgaaacaggc agattgaaaa acttaagaag 1560 atcaaatcca gcagggatca 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gcaggttaaa 60 gaatccagcg ggagccggct gattcagcag cgactgctcc accagcagca gcctttgcat 120 cccgaatggg ctgctttggc gaagaagcag ctcaagggga agaaccctga agatcttatt 180 tggcacaccc cagagggcat cagcatcaag cctttgtatt ccaaaaggga caccatggat 240 ctgcctgaag aattgcccgg ggtcaaacca ttcacacggg ggccatatcc aaccatgtac 300 accttccggc catggactat cagacagtat gcaggcttta gcactgtcga ggaatccaat 360 aagttctata aagacaatat caaagctggc cagcaaggtc tgtccgtggc attcgatctg 420 gctacacata gaggttatga ttctgacaat ccaagagtac ggggagacgt cggaatggcg 480 ggagttgcca ttgacacagt ggaggacacc aagatacttt tcgatgggat tccattggag 540 aaaatgtctg tgtcaatgac gatgaacggc gctgtgattc ccgttttggc gaacttcatc 600 gtcaccgggg aagagcaggg cgtcccgaag gaaaagctca ccgggacaat ccaaaacgac 660 attcttaaag aattcatggt gagaaatacc tacatctttc ctcctgagcc ttccatgaag 720 atcatcgcgg acatctttga atacacggct aaacacatgc ctaaatttaa ctcaatcagc 780 ataagcgggt accacatgca ggaggccggc gctgacgcta tacttgagct cgcatatacc 840 ctggcagatg gactggaata ctcaaggacc gggctccagg ctggactgac aatcgacgag 900 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ggacaggacg gacatgatcg cggagcaaaa gtcattgcca 3120 ccgggttcgc tgacctggga tttgacgtgg atatcggccc tctgttccag acaccacgag 3180 aggtcgcaca gcaggcagtc gacgctgatg tgcacgcagt cggagtgtcc actctggcag 3240 ctggccataa gaccctggtg cctgaactga tcaaagagct gaactctctg ggcagaccag 3300 acatcctggt catgtgcggc ggcgtgatcc caccccagga ttacgaattc ctgtttgagg 3360 tcggggtgag caacgtgttc ggaccaggaa ccaggatccc taaggccgca gtgcaggtcc 3420 tggatgatat tgaaaagtgt ctggaaaaga aacagcagtc agtgtaacat cacatttaaa 3480 agcatctcag gtaactatat tttgaatttt ttaaaaaagt aactataata gttattatta 3540 aaatagcaaa gattgaccat ttccaagagc catatagacc agcaccgacc actattctaa 3600 actatttatg tatgtaaata ttagctttta aaattctcaa aatagttgct gagttgggaa 3660 ccactattat ttctattttg tagatgagaa aatgaagata aacatcaaag catagattaa 3720 gtaattttcc aaagggtcaa aattcaaaat tgaaaccaaa gtttcagtgt tgcccattgt 3780 cctgttctga cttatatgat gcggtacaca gagccatcca agtaagtgat ggctcagcag 3840 tggaatactc tgggaattag gctgaaccac atgaaagagt gctttatagg gcaaaaacag 3900 ttgaatatca gtgatttcac 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tcattcccgt 1800 gctggcaaac ttcatcgtca ctggcgagga acagggggtg cctaaggaaa aactgaccgg 1860 cacaattcag aacgacatcc tgaaggagtt catggtgcgg aatacttaca tttttccccc 1920 tgaaccatcc atgaaaatca ttgccgatat cttcgagtac accgctaagc acatgcccaa 1980 gttcaactca attagcatct ccgggtatca tatgcaggaa gcaggagccg acgctattct 2040 ggagctggct tacaccctgg cagatggcct ggaatattct cgaaccggac tgcaggcagg 2100 cctgacaatc gacgagttcg ctcctagact gagtttcttt tggggaattg gcatgaactt 2160 ttacatggag atcgccaaga tgagggctgg ccggagactg tgggcacacc tgatcgagaa 2220 gatgttccag cctaagaact ctaagagtct gctgctgcgg gcccattgcc agacatccgg 2280 ctggtctctg actgaacagg acccatataa caatattgtc agaaccgcaa tcgaggcaat 2340 ggcagccgtg ttcggaggaa cccagagcct gcacacaaac tcctttgatg aggccctggg 2400 gctgcctacc gtgaagtctg ctaggattgc acgcaataca cagatcatta tccaggagga 2460 atccggaatc ccaaaggtgg ccgatccctg gggaggctct tacatgatgg agtgcctgac 2520 aaacgacgtg tatgatgctg cactgaagct gattaatgaa atcgaggaaa tggggggaat 2580 ggcaaaggcc gtggctgagg gcattccaaa actgaggatc gaggaatgtg 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Claims

대상체에서 조직 내 적어도 세포 집단의 게놈으로 트랜스진을 통합하는 방법으로서, 상기 방법은
조직 내 세포가 유전자 산물에 의해 코딩되는 기능적 단백질을 발현하지 못하는 대상체에게 기능적 단백질을 코딩하는 트랜스진을 전달하는 조성물을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 조성물은
하기를 포함하는 폴리뉴클레오티드 카세트:
제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열, 여기서 제1 핵산 서열은 트랜스진을 코딩하고; 제2 핵산 서열은 제1 핵산 서열에 대해 5' 또는 3'에 위치하고 세포의 게놈 내 표적 통합 부위로의 통합 시 2종의 독립적 유전자 산물의 생산을 촉진함;
폴리뉴클레오티드에 대해 5'에 위치하고 세포의 게놈 내 표적 통합 부위의 게놈 서열 5'과 실질적으로 상동성인 서열을 포함하는 제3 핵산 서열; 및
폴리뉴클레오티드에 대해 3'에 위치하고 세포의 게놈 내 표적 통합 부위의 게놈 서열 3'과 실질적으로 상동성인 서열을 포함하는 제4 핵산 서열
을 포함하며;
여기서, 조성물을 투여한 후, 트랜스진은 세포 집단의 게놈으로 통합되는 것인
방법.
제1항에 있어서, 통합이 뉴클레아제 활성을 포함하지 않는 것인 방법.
제1항에 있어서, 조성물이 재조합 바이러스 벡터를 포함하는 것인 방법.
제3항에 있어서, 재조합 바이러스 벡터가 재조합 AAV 벡터인 방법.
제4항에 있어서, 재조합 바이러스 벡터가 LK03, AAV8, AAV-DJ; AAV-LK03; 또는 AAVNP59의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 캡시드 단백질이거나 또는 그를 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 트랜스진이 MUT 트랜스진이거나 또는 그를 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 AAV2 ITR 서열을 추가로 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 카세트가 프로모터 서열을 포함하지 않는 것인 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 세포의 게놈 내 표적 통합 부위로의 폴리뉴클레오티드 카세트의 통합 시, 트랜스진이 표적 통합 부위에서 내인성 프로모터의 제어 하에 발현되는 것인 방법.
제9항에 있어서, 표적 통합 부위가 내인성 알부민 프로모터 및 내인성 알부민 유전자를 포함하는 알부민 로커스인 방법.
제10항에 있어서, 세포의 게놈 내 표적 통합 부위로의 폴리뉴클레오티드 카세트의 통합 시, 트랜스진이 내인성 알부민 유전자 발현의 붕괴 없이 내인성 알부민 프로모터의 제어 하에 발현되는 것인 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 조직이 간인 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 핵산 서열이 하기를 포함하는 것인 방법:
a) 2A 펩티드;
b) 내부 리보솜 진입 부위 (IRES);
c) N-말단 인테인 스플라이싱 영역 및 C-말단 인테인 스플라이싱 영역; 또는
d) 스플라이스 공여자 및 스플라이스 수용자.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 및 제4 핵산 서열이 트랜스진 및 제2 핵산 서열을 내인성 알부민 프로모터 및 내인성 알부민 유전자를 포함하는 내인성 알부민 유전자 로커스로 통합하는 상동성 아암인 방법.
제14항에 있어서, 상동성 아암이 내인성 알부민 유전자의 시작 코돈의 바로 3'으로의 또는 내인성 알부민 유전자의 정지 코돈의 바로 5'으로의 폴리뉴클레오티드 카세트의 통합을 지시하는 것인 방법.
제6항에 있어서, MUT 트랜스진이 wt 인간 MUT; 코돈 최적화된 MUT; 합성 MUT; MUT 변이체; MUT 돌연변이체, 또는 MUT 단편인 방법.
소정의 기간에 걸쳐 조직 내 트랜스진의 발현 수준을 증가시키는 방법으로서, 상기 방법은
소정의 기간에 걸쳐 트랜스진의 발현 수준 증가를 필요로 하는 대상체에게 대상체의 조직 내 적어도 세포 집단의 게놈으로 통합하는 트랜스진을 전달하는 조성물을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 조성물은 하기를 포함하며:
제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열을 포함하며, 여기서 제1 핵산 서열은 트랜스진을 코딩하고; 제2 핵산 서열은 제1 핵산 서열에 대해 5' 또는 3'에 위치하고 세포의 게놈 내 표적 통합 부위로의 통합 시 2종의 독립적 유전자 산물의 생산을 촉진하는 것인 폴리뉴클레오티드;
폴리뉴클레오티드에 대해 5'에 위치하고 세포의 게놈 내 표적 통합 부위의 게놈 서열 5'과 실질적으로 상동성인 서열을 포함하는 제3 핵산 서열; 및
폴리뉴클레오티드에 대해 3'에 위치하고 세포의 게놈 내 표적 통합 부위의 게놈 서열 3'과 실질적으로 상동성인 서열을 포함하는 제4 핵산 서열;
여기서, 조성물을 투여한 후, 트랜스진은 세포 집단의 게놈으로 통합되고 조직 내 트랜스진의 발현 수준은 소정의 기간에 걸쳐 증가하는 것인
방법.
제17항에 있어서, 트랜스진의 통합이 뉴클레아제 활성을 포함하지 않는 것인 방법.
제17항 또는 제18항에 있어서, 증가된 발현 수준이 트랜스진을 발현하는 조직 내 세포의 증가된 퍼센트를 포함하는 것인 방법.
제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 재조합 바이러스 벡터를 포함하는 것인 방법.
제20항에 있어서, 재조합 바이러스 벡터가 재조합 AAV 벡터인 방법.
제21항에 있어서, 재조합 바이러스 벡터가 LK03, AAV8, AAV-DJ; AAV-LK03; 또는 AAVNP59의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 캡시드 단백질이거나 또는 그를 포함하는 것인 방법.
제17항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 트랜스진이 MUT 트랜스진이거나 또는 그를 포함하는 것인 방법.
제17항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 AAV2 ITR 서열을 추가로 포함하는 것인 방법.
제17항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 카세트가 프로모터 서열을 포함하지 않는 것인 방법.
제17항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 세포의 게놈 내 표적 통합 부위로의 폴리뉴클레오티드 카세트의 통합 시, 트랜스진이 표적 통합 부위에서 내인성 프로모터의 제어 하에 발현되는 것인 방법.
제26항에 있어서, 표적 통합 부위가 내인성 알부민 프로모터 및 내인성 알부민 유전자를 포함하는 알부민 로커스인 방법.
제27항에 있어서, 세포의 게놈 내 표적 통합 부위로의 폴리뉴클레오티드 카세트의 통합 시, 트랜스진이 내인성 알부민 유전자 발현의 붕괴 없이 내인성 알부민 프로모터의 제어 하에 발현되는 것인 방법.
제17항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 조직이 간인 방법.
제17항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 핵산 서열이 하기를 포함하는 것인 방법:
a) 2A 펩티드;
b) 내부 리보솜 진입 부위 (IRES);
c) N-말단 인테인 스플라이싱 영역 및 C-말단 인테인 스플라이싱 영역; 또는
d) 스플라이스 공여자 및 스플라이스 수용자.
제17항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 및 제4 핵산 서열이 트랜스진 및 제2 핵산 서열을 내인성 알부민 프로모터 및 내인성 알부민 유전자를 포함하는 내인성 알부민 유전자 로커스로 통합하는 상동성 아암인 방법.
제31항에 있어서, 상동성 아암이 내인성 알부민 유전자의 시작 코돈의 바로 3'으로의 또는 내인성 알부민 유전자의 정지 코돈의 바로 5'으로의 폴리뉴클레오티드 카세트의 통합을 지시하는 것인 방법.
제23항에 있어서, MUT 트랜스진이 wt 인간 MUT; 코돈 최적화된 MUT; 합성 MUT; MUT 변이체; MUT 돌연변이체, 또는 MUT 단편인 방법.
하기를 포함하는, 세포의 게놈 내 표적 통합 부위로 트랜스진을 통합하기 위한 재조합 바이러스 벡터로서,
(i) 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열을 포함하며, 여기서 제1 핵산 서열은 MUT 트랜스진을 포함하고; 제2 핵산 서열은 제1 핵산 서열에 대해 5' 또는 3'에 위치하고 세포의 게놈 내 표적 통합 부위로의 통합 시 2종의 독립적 유전자 산물의 생산을 촉진하는 것인 폴리뉴클레오티드 카세트;
(ii) 폴리뉴클레오티드 카세트 벡터에 대해 5'에 위치하고 세포의 게놈 내 표적 통합 부위의 게놈 서열 5'과 실질적으로 상동성인 서열을 포함하는 제3 핵산 서열; 및
(iii) 폴리뉴클레오티드 카세트 바이러스 벡터의 3'에 위치하고 세포의 게놈 내 표적 통합 부위의 게놈 서열 3'과 실질적으로 상동성인 서열을 포함하는 제4 핵산 서열;
여기서 바이러스 벡터는 LK03 AAV 캡시드를 포함하는 것인
재조합 바이러스 벡터.
제34항에 있어서, 제3 핵산이 800-1,200개 뉴클레오티드인 재조합 바이러스 벡터.
제34항 또는 제35항에 있어서, 제4 핵산이 800-1,200개 뉴클레오티드인 재조합 바이러스 벡터.
제34항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 바이러스 벡터가 재조합 AAV 벡터인 재조합 바이러스 벡터.
제37항에 있어서, 재조합 바이러스 벡터가 AAV8, AAV-DJ; AAV-LK03; 또는 AAV-NP59의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 캡시드 단백질이거나 또는 그를 포함하는 것인 재조합 바이러스 벡터.
제34항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, AAV2 ITR 서열을 추가로 포함하는 재조합 바이러스 벡터.
제34항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 카세트가 프로모터 서열을 포함하지 않는 것인 재조합 바이러스 벡터.
제34항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 세포의 게놈 내 표적 통합 부위로의 폴리뉴클레오티드 카세트의 통합 시, MUT 트랜스진이 표적 통합 부위에서 내인성 프로모터의 제어 하에 발현되는 것인 재조합 바이러스 벡터.
제41항에 있어서, 표적 통합 부위가 내인성 알부민 프로모터 및 내인성 알부민 유전자를 포함하는 알부민 로커스인 재조합 바이러스 벡터.
제41항에 있어서, 세포의 게놈 내 표적 통합 부위로의 폴리뉴클레오티드 카세트의 통합 시, MUT 트랜스진이 내인성 알부민 유전자 발현의 붕괴 없이 내인성 알부민 프로모터의 제어 하에 발현되는 것인 재조합 바이러스 벡터.
제34항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 2종의 독립적 유전자 산물이 MUT 트랜스진으로부터 발현된 MUT 단백질 및 내인성 알부민 유전자로부터 발현된 내인성 알부민 단백질인 재조합 바이러스 벡터.
제34항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 간 세포인 재조합 바이러스 벡터.
제34항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 핵산 서열이 하기를 포함하는 것인 재조합 바이러스 벡터:
a) 2A 펩티드;
b) 내부 리보솜 진입 부위 (IRES);
c) N-말단 인테인 스플라이싱 영역 및 C-말단 인테인 스플라이싱 영역; 또는
d) 스플라이스 공여자 및 스플라이스 수용자.
제34항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 및 제4 핵산 서열이 MUT 트랜스진 및 제2 핵산 서열을 내인성 알부민 프로모터 및 내인성 알부민 유전자를 포함하는 내인성 알부민 유전자 로커스로 통합하는 상동성 아암인 재조합 바이러스 벡터.
제47항에 있어서, 제3 및 제4 핵산 서열이 MUT 트랜스진 및 제2 핵산 서열을 내인성 알부민 프로모터 및 내인성 알부민 유전자를 갖는 프레임내 내인성 알부민 유전자 로커스로 통합하는 상동성 아암인 재조합 바이러스 벡터.
제47항 또는 제48항에 있어서, 상동성 아암이 내인성 알부민 유전자의 시작 코돈의 바로 3'으로의 또는 내인성 알부민 유전자의 정지 코돈의 바로 5'으로의 폴리뉴클레오티드 카세트의 통합을 지시하는 것인 재조합 바이러스 벡터.
제34항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, MUT 트랜스진이 wt 인간 MUT; 코돈 최적화된 MUT; 합성 MUT; MUT 변이체; MUT 돌연변이체, 또는 MUT 단편인 재조합 바이러스 벡터.
투여 전에 세포에 의해 기능적으로 발현되지 않는 관심 산물을 코딩하는 트랜스진을 대상체의 조직 내 세포에 전달하는 조성물의 용량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법으로서, 여기서 트랜스진은 (i) 관심 산물을 코딩하고; (ii) 복수의 세포의 게놈 내 표적 통합 부위에서 통합하고; (iii) 통합되면 관심 산물을 기능적으로 발현하고; (iv) 조직 내 다른 세포에 비해 복수의 세포에 선택적 이점을 부여하여, 시간 경과에 따라, 조직이 달리 비교가능한 투여에 의해 달성된 것보다 더 높은 것으로 결정된 관심 산물의 기능적 발현 수준을 달성하며, 여기서 트랜스진이 통합된 세포는 투여 전에 관심 산물을 기능적으로 발현하고, 여기서 조성물은
제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열을 포함하며, 여기서 제1 핵산 서열은 트랜스진을 코딩하고; 제2 핵산 서열은 제1 핵산 서열에 대해 5' 또는 3'에 위치하고 트랜스진이 표적 통합 부위에서 통합될 때 2종의 독립적 유전자 산물의 생산을 촉진하는 것인 폴리뉴클레오티드;
폴리뉴클레오티드에 대해 5'에 위치하고 표적 통합 부위의 게놈 서열 5'과 실질적으로 상동성인 서열을 포함하는 제3 핵산 서열; 및
폴리뉴클레오티드에 대해 3'에 위치하고 표적 통합 부위의 게놈 서열 3'과 실질적으로 상동성인 서열을 포함하는 제4 핵산 서열
을 포함하는 것인 방법.
제51항에 있어서, 트랜스진의 통합이 뉴클레아제 활성을 포함하지 않는 것인 방법.
제51항 또는 제52항에 있어서, 선택적 이점이 트랜스진을 발현하는 조직 내 세포의 증가된 퍼센트를 포함하는 것인 방법.
제51항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 재조합 바이러스 벡터를 포함하는 것인 방법.
제54항에 있어서, 재조합 바이러스 벡터가 재조합 AAV 벡터인 방법.
제55항에 있어서, 재조합 바이러스 벡터가 LK03, AAV8, AAV-DJ; AAV-LK03; 또는 AAVNP59의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 캡시드 단백질이거나 또는 그를 포함하는 것인 방법.
제51항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 트랜스진이 MUT 트랜스진이거나 또는 그를 포함하는 것인 방법.
제51항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 AAV2 ITR 서열을 추가로 포함하는 것인 방법.
제51항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 카세트가 프로모터 서열을 포함하지 않는 것인 방법.
제51항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 세포의 게놈 내 표적 통합 부위로의 폴리뉴클레오티드 카세트의 통합 시, 트랜스진이 표적 통합 부위에서 내인성 프로모터의 제어 하에 발현되는 것인 방법.
제60항에 있어서, 표적 통합 부위가 내인성 알부민 프로모터 및 내인성 알부민 유전자를 포함하는 알부민 로커스인 방법.
제61항에 있어서, 세포의 게놈 내 표적 통합 부위로의 폴리뉴클레오티드 카세트의 통합 시, 트랜스진이 내인성 알부민 유전자 발현의 붕괴 없이 내인성 알부민 프로모터의 제어 하에 발현되는 것인 방법.
제51항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 조직이 간인 방법.
제51항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 핵산 서열이 하기를 포함하는 것인 방법:
a) 2A 펩티드;
b) 내부 리보솜 진입 부위 (IRES);
c) N-말단 인테인 스플라이싱 영역 및 C-말단 인테인 스플라이싱 영역; 또는
d) 스플라이스 공여자 및 스플라이스 수용자.
제51항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 및 제4 핵산 서열이 트랜스진 및 제2 핵산 서열을 내인성 알부민 프로모터 및 내인성 알부민 유전자를 포함하는 내인성 알부민 유전자 로커스로 통합하는 상동성 아암인 방법.
제65항에 있어서, 상동성 아암이 내인성 알부민 유전자의 시작 코돈의 바로 3'으로의 또는 내인성 알부민 유전자의 정지 코돈의 바로 5'으로의 폴리뉴클레오티드 카세트의 통합을 지시하는 것인 방법.
제57항에 있어서, MUT 트랜스진이 wt 인간 MUT; 코돈 최적화된 MUT; 합성 MUT; MUT 변이체; MUT 돌연변이체, 또는 MUT 단편인 방법.