JP2021534816A - Mmaの処置のための非破壊的遺伝子治療 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2018年8月10日に出願された米国仮出願第62/717,771号の優先権を主張し、その内容の全体が、参照により本明細書中に組み込まれる。
本発明は、米国保健福祉省の機関である国立衛生研究所との共同研究開発契約の履行において、および国立衛生研究所、国立ヒトゲノム研究所によるプロジェクト番号ZIA HG200318 14の下での政府の支援を受けてなされた。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
本願は、ASCIIフォーマットで電子的に提出された配列表を含有し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。2018年10月30日に作成された前記ASCIIコピーは、2012538_0062_SL.txtと名付けられ、サイズは78,203バイトである。
遺伝するかまたは胚発生の初期に獲得されるDNAの変化に端を発し得る一群のヒト疾患が存在する。遺伝子治療の開発者にとって特に興味深いのは、単一遺伝子疾患として知られている、単一遺伝子の変異によって引き起こされる疾患である。6,000を超える単一遺伝子疾患が存在すると考えられている。通例、遺伝された変異によって引き起こされる特定の遺伝性疾患は比較的まれであるが、総合すると、遺伝関連疾患の犠牲者数は多い。周知の遺伝性疾患には、嚢胞性線維症、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ハンチントン病、および鎌状赤血球症が挙げられる。他のクラスの遺伝性疾患には、有機酸血症ならびに機能不全の遺伝子が代謝過程の欠陥および短期および長期の両方で深刻な罹患率および死亡率をもたらし得る有毒な副産物の蓄積をもたらすリソソーム蓄積症などの代謝性障害が含まれる。
単一遺伝子疾患は、これらの疾患の病理が単純であると認識されていたため、生物医学の革新者にとって特に興味深いものであった。しかしながら、これらの疾患および障害の大部分は、実質的には処置不能なままである。したがって、当技術分野において長年感じられてきたこのような疾患の処置に対する要望がなお存在する。
遺伝子治療
遺伝子治療は、導入遺伝子と呼ばれる治療遺伝子を送達するプロセスである遺伝子導入によって、患者の細胞の遺伝子発現プロファイルを変化させる。薬剤開発者は、改変ウイルスをベクターとして使用して、導入遺伝子を細胞の核内に輸送し、細胞の能力を変更または増加させる。開発者は、さまざまなベクターを使用して、肝臓、目の網膜、骨髄の造血細胞などの組織内の細胞中に遺伝子を導入することに大きな進歩を遂げてきた。これらのアプローチは、承認された治療法をもたらす場合もあれば、臨床試験において非常に有望な結果を示している場合もある。
細胞が分裂し、組織が成長するときの希釈効果。エピソーム発現に基づく遺伝子治療の場合、導入遺伝子は宿主染色体中に組み込まれることが意図されておらず、したがって細胞分裂中に複製されないので、細胞が成長または組織再生の過程で分裂すると、治療の有益性は通常低減する。したがって、新たな各世代の細胞は、標的組織中で導入遺伝子を発現する細胞の割合をさらに低下させ、時間の経過とともに治療的有用性の低下または消失をもたらす。
遺伝子編集とは、外因的に送達された遺伝子編集機構を使用して細胞のDNA中に切断を導入することによって、異常な遺伝子を削除、変更または増強することである。導入されたDNA切断を細胞が迅速に修復しようとすることに一部起因して、不要なオンターゲットおよびオフターゲット修飾の割合が高く、遺伝子修正の効率が低いため、現在のほとんどの遺伝子編集アプローチは、その有効性が限定されてきた。遺伝子編集の現在の焦点は、機能不全の遺伝子を無効化すること、または遺伝子内の個々の有害な変異を修正もしくはスキップすることである。起こり得る変異の数が多いため、これらのアプローチはいずれも、完全な修正遺伝子の挿入によって対処される場合のように、特定の遺伝性疾患内の変異の集団全体に対処することはできない。
ヌクレアーゼベースの遺伝子編集は、操作されたまたは最初に細菌中で同定されたDNA切断酵素であるヌクレアーゼを使用する。ヌクレアーゼベースの遺伝子編集は2段階のプロセスである。まず、二本鎖DNA中の一方または両方の鎖を切断できる外因性ヌクレアーゼが、合成ガイドRNAによって所望の部位に向けられ、特異的な切断を行う。ヌクレアーゼが所望の1または複数の切断を行った後に、細胞のDNA修復機構が活性化され、NHEJを通じて、またはより一般的ではないがHDRを通じて編集プロセスを完了する。
ヌクレアーゼベースの遺伝子編集アプローチは、DNAを切断するための細菌ヌクレアーゼ酵素の使用と、導入遺伝子発現のための外因性プロモーターへの依存とによって制約される。これらの制約には、以下のことが含まれる。
GENERIDE(商標)は、ゲノムの忠実度を維持する天然に存在するDNA修復過程である相同組換えすなわちHRを利用するゲノム編集技術である。HRを使用することにより、GENERIDE(商標)は、DNAを切断するように操作された酵素である外因性ヌクレアーゼを使用せずに、導入遺伝子として知られる治療遺伝子を特定の標的ゲノム位置中に挿入することを可能にする。GENERIDE(商標)による導入遺伝子の組み込みは、外因性プロモーターの使用に関連付けられてきた有害な問題なしに高レベルの組織特異的遺伝子発現を促進するために、これらの標的とされる位置において内因性プロモーターを活用するように設計されている。
修正遺伝子をゲノム中のある特定の位置に送達するためにHRを使用するので、GENERIDE(商標)プラットフォームを用いるゲノム編集は、遺伝子編集とは異なる。GENERIDE(商標)は、修正遺伝子を正確に挿入し、ゲノム中での部位特異的な組み込みをもたらす。GENERIDE(商標)ゲノム編集アプローチは、外因性ヌクレアーゼまたはプロモーターの使用を要せず、代わりに、治療用導入遺伝子の転写を組み込み、開始するために、細胞の既存の機構を活用する。
MMAは、特定のアミノ酸の正常な代謝に関与する酵素をコードするいくつかの遺伝子中の変異によって引き起こされ得る。最も一般的な変異はMUTの遺伝子中にあり、その活性に完全なまたは部分的な欠損を引き起こす。その結果、メチルマロン酸と呼ばれる物質およびその他の潜在的に毒性のある化合物が蓄積し、MMAの徴候および症状を引き起こし得る。図6は、肝細胞におけるMUT欠損の影響を示す。
GENERIDE(商標)によるアッセイ処置のために、MMAのマウスモデルを使用することができる。MMAの例示的なマウスモデルが、図31Aおよび図31Bに図示されている。GENERIDE(商標)構築物の投与後におけるMMAマウスモデルの分析のための例示的な実験方法が図32に示されている。
本実施例は、アルブミン遺伝子座が肝臓からの導入遺伝子発現のための組み込み部位となり得ることを示す。
本実施例は、MMAの処置のための製品候補であるLB−001を記載する。LB−001はMMA患者において最も一般的な遺伝子欠損であるMUTをコードする導入遺伝子を含有する(図6)。LB−001は、肝細胞を標的とし、MUT導入遺伝子をアルブミン遺伝子座の中に挿入するように設計されている。
本実施例は、Mut−MCKマウスモデルにおけるLB−001代用物の例示的な用量設定研究デザインを実証する。このような分析から得られる結果は、静脈内投与された場合のMUTノックアウトマウスに対するLB−001代用物の有効用量を決定するために適用することができる。さらに、この分析から得られる結果は、非GLP毒性学的評価を提供し、より大規模な動物研究および臨床試験に影響を及ぼし得る。この例では、評価されている適応症はメチルマロン酸血症(MMA)である。同様の研究デザインを、他の適応症のために取り入れることができる。
本実施例は、MMAの2つのマウスモデルにおいて得られたLB−001の前臨床データを提供する。第一のモデルでは、Mutの遺伝子は完全に非機能的となった。Mutのこの非機能的形態は、Mut−/−と表される。この非機能的遺伝子を有するマウスは、患者のMMAの最も重篤な症例において見られるよりもさらに重度の欠損を有すると考えられる。処置せずに放置すると、これらのマウスは生後数日以内に死亡する。図8の上パネルに示されているように、LB−001のマウスGENERIDE(商標)構築物を新生仔マウス4匹中に単回腹腔内注射することによって、4匹中3匹のマウスの生存が延長され、2匹のマウスは1年より長く生存した。さらに、これらのマウスは、図8の下パネルに示されているように、自由に餌を与えると体重が増加した。
本実施例は、実施例4において提示された知見を確認する。実施例4と同様に、本実施例は、マウスアルブミン(Alb)遺伝子座中へのヒトMUTの部位特異的遺伝子付加を達成するために、相同組換えを用いるプロモーターレスAAVベクターを使用する。このベクター(AAV−Alb−2A−MUT)は、MUT遺伝子の近位に位置する2A−ペプチドコード配列に隣接する相同性のアームを含有し、組み込み後に内因性AlbプロモーターからMUT発現を生成する。以前のデータは、出生時に8.6E11〜2.5E12vg/仔1匹の用量で送達されたAAV−Alb−2A−MUTが、MMAのマウスモデルにおいて、疾患関連代謝物を低下させ、成長および生存を増加させることを示した(Chandler,R.J.ら、Rescue of Mice with Methylmalonic Acidemia from Immediate Neonatal Lethality Using an Albumin Targeted,Promoterless Adeno−Associated Viral Integrating Vector,Molecular Therapy,Abstract 26,25(5S1):page 13(May 2017))。本実施例は、実施例4と同様に、本明細書に開示されている構築物および方法によるMUT導入遺伝子送達が、MMAマウスモデルにおいて、より長期の有効性を与えるという発見を開示している。
本実施例は、マウスLB001でのMMAマウスモデルの処置に対して実施例4に提示された知見を確認する。
本実施例は、組換えAAV(hLB001)(LK−03−GENERIDE(商標)MUT)およびヒト化FRG KO/NODマウスモデルを使用して、MUT導入遺伝子のヒトALB遺伝子座中への部位特異的組み込みの有効性を評価するための例示的な分析を提供する。
材料
a.ドナーHHM19027/YTWによって80%以上ヒト肝細胞で置換された雌のヒト化Fah−/−/Rag2−/−/Il2rg−/−NODマウス3匹(Hu−FRGN)
b.ドナーHHF13022/RMGによって80%以上ヒト肝細胞で置換された雌のヒト化Fah−/−/Rag2−/−/Il2rg−/−NODマウス12匹(Hu−FRGN)、
c.YecurisヒトアルブミンELISA
d.29g針付きの無菌3/10ccシリンジ
e.29g針付きの無菌1ccシリンジ
f.クエン酸ナトリウムでコーティングされたチューブ、0.8mL
g.PBS、ビヒクル
h.予備調査の段階:rAAV、力価:6.43e13 vg/mL
i.第1相:rAAV力価:9.29e13 vg/mL
j.1.5mLチューブ、無菌
k.マウス麻酔カクテル(7.5mg/mLケタミン、1.5mg/mLキシラジンおよび0.25mg/mLアセプロマジン)
l.TissueTekカセット
m.新たに調製した10%中性(normal)緩衝ホルマリン
n.エタノール、70%
o.スクリューキャップ付き5mLポリプロピレンチューブ
p.液体窒素
研究に使用される全てのマウスは、研究開始の25日以上前にNTBCから、3日以上前にSMX/TMPから取り出す。ヒト化は、研究開始前7日以内に評価される。
ウイルスは、調製中および調製後に、解凍し、氷上に保持されるべきである。PBSは、37Cまたは室温で解凍され得る。調製の30分以上前にPBSを、5分以上前にウイルスを解凍することが推奨される。
a.化合物の調合:
i.1e14 vg/kgを与えるために、2e13vg/mLのウイルスストックを必要とする
ii.レベルIIのバイオセーフティキャビネット内で、6.43e13 vg/mLを2e13 vg/mLに希釈する。平均体重を25gと仮定する
iii.各マウスの体重を測定し、体重(BW)を記録する。
iv.各マウスのBW(g)に、vg/g単位で表した原液の濃度を乗じて、所望の用量を達成するために必要とされる化合物の総vgを決定する。
v.vgの総数をvg/μLで表した原液の濃度で除して、投与に使用するための原液の体積を決定する。
vi.投与前に、気化したイソフルランを使用してマウスに麻酔をかける。
vii.各マウスに対する計算された用量のウイルスを、3/10ccシリンジの無菌29G針へと引き込み、後眼窩洞静脈を介して送達する。
d.すべての動物を、麻酔からの回復を確実にするために投与直後にモニターし、投与の間、動物には意図的でない害を与えなかった。
e.すべてのマウスを、一般的な健康状態について毎日モニターする。マウスが瀕死であるまたは死亡していることが判明した場合、そのマウスに麻酔をかけ、以下の「最終の採取」のセクションに記載されているとおりに試料を収集する。
a.22日目(投与後3週)に、すべてのマウスの体重を測定し、体重に応じてマウスカクテルを使用して麻酔をかける。
b.27gの針付き1ccシリンジを用いた心臓穿刺によって、できるだけ多くの全血を収集する。クエン酸ナトリウムでコーティングされたチューブへと全血を移し、4℃で、15分間1500×gで遠心分離することによって血漿を単離する。血漿を100μLの一定分量に分配し、−80℃で保存する。
c.腹膜と胸腔を開いて肝臓を露出させ、肝臓を単離して、肝臓の重量を記録する。肝臓を個々の葉に切開し、各葉を2つの等しい部分にさらに切開する。
d.組織学的検査のために、各葉から1つの片をTissueTekカセット中に配置し、新たに調製した10%中性緩衝ホルマリン中において室温で16〜32時間固定した後、70%エタノールに移して室温で保存する。
注意:4℃で固定しないこと。16時間より前または32時間より後に固定しないこと。固定が遅れると、RNAが分解され、シグナルが低下する、またはシグナルが発生しなくなることがある。より短い時間またはより低い温度は、固定不足をもたらす。
e.生物分析のために、各葉から得た第二の片を5mLポリプロピレンチューブに移し、液体窒素中で瞬間冷凍して−80℃で保存する。
a.化合物の調合:
i.1e14vg/kgを与えるために、2e13vg/mLのウイルスストックを必要とする。1e13vg/kgを与えるために、2e12vg/mLを必要とする。
ii.レベルIIのバイオセーフティキャビネット内で、9.29E+13 vg/mLをを2e13 vg/mLおよび2e12 vg/mLのストックに希釈する。平均体重を25gと仮定する
iii.各マウスの体重を測定し、体重(BW)を記録する。
iv.各マウスのBW(g)に、vg/g単位で表した原液の濃度を乗じて、所望の用量を達成するために必要とされる化合物の総vgを決定する。
v.vgの総数をvg/μLで表した原液の濃度で除して、投与に使用するための原液の体積を決定する。
vi.投与前に、気化したイソフルランを使用してマウスに麻酔をかける。
vii.各マウスに対する計算された用量のウイルスを、3/10ccシリンジの無菌29G針へと引き込み、後眼窩洞静脈を介して送達する。
d.すべての動物を、麻酔からの回復を確実にするために投与直後にモニターし、投与の間、動物には意図的でない害を与えなかった。
e.すべてのマウスを、一般的な健康状態について毎日モニターする。マウスが瀕死であるまたは死亡していることが判明した場合、そのマウスに麻酔をかけ、以下の「最終の採取」のセクションに記載されているとおりに試料を収集する。
a.22日目(投与後3週)に、マウスカクテルを使用して、全てのマウスに麻酔をかける。
b.27gの針付き1ccシリンジを用いた心臓穿刺によって、できるだけ多くの全血を収集する。クエン酸ナトリウムでコーティングされたチューブへと全血を移し、4℃で、15分間1500×gで遠心分離することによって血漿を単離する。血漿を100μLの一定分量に分配し、−80℃で保存する。
c.腹膜と胸腔を開いて肝臓を露出させ、肝臓を単離して、肝臓の重量を記録する。肝臓を個々の葉に切開し、各葉を2つの等しい部分にさらに切開する。
d.組織学的検査のために、各葉から1つの片をTissueTekカセット中に配置し、新たに調製した10%中性緩衝ホルマリン中において室温で16〜32時間固定した後、70%エタノールに移して室温で保存する。
注意:4℃で固定しないこと。16時間より前または32時間より後に固定しないこと。固定が遅れると、RNAが分解され、シグナルが低下する、またはシグナルが発生しなくなることがある。より短い時間またはより低い温度は、固定不足をもたらす。
e.生物分析のために、各葉から得た第二の片を5mLポリプロピレンチューブに移し、液体窒素中で瞬間冷凍して−80℃で保存する。
サンドイッチ培養系を使用して、初代ヒト肝細胞を培養した。培地を交換する前に、GENERIDE(商標)(商標)hLB001によって細胞を48時間感染させた。感染の7日後、細胞を採集し、Qiagen Allprepキット(カタログ番号/ID:80204)を使用してRNAを抽出した。
本実施例は、GENERIDE(商標)ベクターLB001がヒト初代肝細胞中のALB遺伝子座中へのMUTの効率的なゲノム編集を媒介することができるという点で、実施例8で観察された結果を確認する。
初代ヒト肝細胞サンドイッチ培養系を利用して、感染力、DNA組み込みおよびタンパク質レベルを分析した(図20)。ロングレンジ(LR)qPCRを使用して、部位特異的組み込み率を分析した(図21)。安定したHepG2−2A−PuroR細胞株を、DNAにおける陽性対照として使用した。
MUTおよびALBの相対的発現を評価した(図22)。さらなる研究のために、同じハプロタイプ1を有する3人の初代ヒト肝細胞ドナーを選択して、GENERIDE(商標)LB−001を試験した(図23〜25)。これらの結果は、GENERIDE(商標)LB−001が初代ヒト肝細胞中にMUT導入遺伝子を組み込み、発現することができることを確認する。
本実施例は、GENERIDE(商標)技術での適用のために、さまざまなMUT導入遺伝子を使用できることを示す。例えば、GENERIDE(商標)用途において、ヒトメチルマロニル−CoAムターゼ(synMUT)をコードする合成ポリヌクレオチドが使用され得る。synMUT構築物の例は、国際公開第2014/143884号および米国特許第9,944,918号に記載されており、いずれも参照により本明細書に組み込まれる。ヒトメチルマロニル−CoAムターゼ(synMUT1−4)をコードする例示的な最適化されたヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号9、12、13および14として列記されている。
肝臓は、多くの代謝および解毒過程に関与する重要な器官である。MMAを含む、数十の単一遺伝子疾患は、代謝経路に関与する肝臓酵素の欠損から生じる。別の稀な先天性代謝異常症であるクリグラー・ナジャー症候群に対処するために、動物モデルにおいて、さらなる概念実証データを生成した。クリグラー・ナジャーを有する患者では、ビリルビンを代謝して循環から取り除くことができず、生涯にわたって、神経の損傷と死亡のリスクをもたらす。クリグラー・ナジャー症候群の動物モデルにおける遺伝子欠損を修正するために、同様のGENERIDE(商標)構築物であるが、導入遺伝子としてビリルビンウリジン二リン酸グルクロノシルトランスフェラーゼまたはUGT1A1の遺伝子を有するGENERIDE(商標)構築物を使用した。図26に示されているように、マウス肝細胞中のアルブミン遺伝子座中へのUGT1A1の導入は、ビリルビンレベルの正常化およびUGT1A1を欠損したマウスの20日未満から少なくとも1年への長期生存をもたらした。このカテゴリーで探求することができるさらなる適応症としては、フェニルケトン尿症、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症および糖原病1A型が含まれる。
肝臓に対する治療品候補の特異性は、使用されるAAVキャプシドと宿主細胞のDNA中への組み込みの場所の両方によって決定される。LB−001は、ヒト肝臓の形質導入に関して非常に効率的であるように設計されたAAVキャプシド、LK03を利用する。肝臓指向型治療品候補のための導入遺伝子を、アルブミン遺伝子が最も高度に発現される遺伝子である肝臓において意味のあるレベルでのみ産生されるアルブミン遺伝子座へと挿入した。活性転写は相同組換えの割合を高め、アルブミン遺伝子の組織特異的な発現は肝臓中での導入遺伝子の産生を促すので、アルブミンを選択することは肝臓特異性を高めると考えられる。
本実施例は、GENERIDE(商標)の調節的設計(modulatory design)が肝臓の外で機能するタンパク質を産生するために適用できることを示す。
いくつかの遺伝子変異は、タンパク質の欠損と有害なタンパク質の過剰発現の両方をもたらし、病理発生に至る。このような疾患の1つがA1ATDである。A1ATDでは、患者は循環A1ATが欠乏しており、重度の肝障害を発症することがあり、このため肝移植が必要になり得る。これは、AATDが、正常なコピーが存在する場合でさえ遺伝子の欠陥性コピーに症状が伴うドミナントネガティブな遺伝性疾患であるからである。AATDは、LB−201のマウスGENERIDE(商標)構築物を使用してマウスモデルにおいて修正された別の遺伝性疾患である。マウスモデルにおいて使用されたGENERIDE(商標)構築物は、遺伝子の正常なコピーの他に、有害な遺伝子の発現を低下させるように設計されたマイクロRNAを含んだ。導入遺伝子の発現と変異遺伝子の下方調節が、これらのマウスにおいて、少なくとも8ヶ月間明瞭であった。
本実施例は、マウスに異なる用量で第IX因子を組み込むためのGENERIDE(商標)法の有効性を実証する。
血友病B新生仔マウスの処置のために、マウスあたり3e11、3e10、3e9および1e9ベクターゲノム(vg)(kg当たり1.5e14、1.5e13、1.5e12および5e11)の、ヒトFIXの超活性型バリアント;FIX−TripleLをコードするAAV−DJ GENERIDE(商標)(商標)ベクターを用いて、2日齢のF9tm1Dwsノックアウトマウスの腹腔内(IP)注射を行った。1.5E12 VG/kgという低い用量で、疾患の改善が実証された。活性化部分トロンボプラスチン時間アッセイ(aPTT)によって、注射後4週目での凝固時間を測定した。処置されたKOマウスにおける活性化部分トロンボプラスチン時間(aPTT)によって決定される機能的凝固は、野生型(WT)マウスのレベルと同様のレベルに回復した(図28〜29)。これらの結果は、オンターゲット組み込みに起因する高い治療的hFIX−TripleL発現レベルを実証する。
1.5E12 vg/kgのhFIX−TripleLは、4週間後に血友病B新生仔の出血性素因を改善し、12週間安定な状態を保つことが観察された。これは、ヌクレアーゼなしおよびベクター媒介プロモーターなしでのインビボ遺伝子ターゲティングに対する治療効果を実証する。rAAVに対する開示されたプロモーターレスおよびヌクレアーゼフリー遺伝子ターゲティング戦略の好ましい安全性プロファイルのため、この戦略は、血友病およびその他の遺伝的欠損の状況での臨床的評価の主要な候補となる。より一般的には、この戦略は、治療効果が分泌されるタンパク質によって伝えられるときには常に、または標的化が選択的有利性を与えるときに適用することができる。
本実施例は、異なるベクターバッチを用いて、相同性アームにミスマッチを有するGENERIDE(商標)の有効性および再現性を実証する。
C57bl/6成体マウスの処置のために、マウス当たり1e12ベクターゲノム(VG)(Kg当たり5e13)のヒトFIXの超活性型バリアント;ミスマッチのないFIX−TripleLをコードするAAV−DJ GENERIDE(商標)(商標)ベクターを用いて、9週齢のC57bl/6マウスの静脈内(IV)注射を行った。類似の変異を持つ(baring)合成マウスハプロタイプを有するベクターを設計し、GENERIDE(商標)(商標)はこのハプロタイプミスマッチによってほとんど影響を受けないことが明らかとなった。この観察は、1つのベクターデザインを患者のさまざまな集団に対して使用できることを裏付ける。独立かつ別個に作製された異なるベクター間に、高い一致性が見出された。10週間にわたって、血漿中にhFIXタンパク質が安定に存在することが観察された。
以前の結果は、1.5e12vg/kgの、hFIX−TripleLバリアントをコードするGENERIDE(商標)(商標)ベクターの成体または新生仔マウスへの単回注射後に、血友病Bマウスでの出血性素因の改善を実証した。本研究では、ミスマッチが一般的なヒトハプロタイプを模倣する場合、ベクター上の相同性アームと標的遺伝子座の間のミスマッチによってGENERIDE(商標)(商標)の効率は低下しないことが示された。本研究は、強固で一貫性のあるベクター生産能力も実証した。rAAVに対するプロモーターレスおよびヌクレアーゼフリー遺伝子ターゲティング戦略の好ましい有効性および安全性プロファイルのため、GENERIDE(商標)(商標)は、血友病およびその他の遺伝的欠損の状況での臨床評価の主要な候補となる。この治療効果は、すべての集団に適切であり得る1つのベクター設計によって達成することができる。
本実施例は、GENERIDE(商標)技術の用途で使用することができる例示的なキャプシドを提供する。GENERIDE(商標)を使用した導入遺伝子発現のために使用することができる例示的なキャプシドには、AAV8、AAV−DJ、LK03およびNP59が含まれる。
構築物およびキャプシドの設計から商業規模での製造まで、GENERIDE(商標)プラットフォームの重要な側面は最適化することができる。
・AAVキャプシド。AAVキャプシドは、肝臓などの特定の標的組織にその内容物を送達するのに極めて効率的であるように設計されている。肝臓およびその他の適応症での臨床使用により適したキャプシドが同定されている。例えば、LB−001中で使用されるAAVキャプシドであるLK03は、肝臓選択的であるように開発された。
・相同性アームと組み込み部位。ゲノム編集技術は、1つの治療法のための相同性アームと組換え部位とを、同一の組織を標的とする他の治療法に適用することができるという潜在的な利点を有する。相同組換えの割合と遺伝子発現レベルの最適化から得られた洞察は、その後の製品候補に対して適用することができる。
・標的。標的となり得るものとして、肝臓内で通常発現される遺伝子に対応する標的、肝臓発現に関連する他の組織および中枢神経系または筋肉などのその他の組織で直接対処することが最適である標的が挙げられる。
・選択。GENERIDE(商標)ゲノム編集技術の潜在的な利点は、染色体組み込みから生じるその持久性である。データは、遺伝子欠損の修正が選択的有利性を細胞に与え、導入遺伝子を含有する細胞の百分率の増大を促進し得る治療法が存在することを示す。導入遺伝子が細胞レベルで選択的有利性を与えない場合でさえ、処理された細胞に選択的有利性を与える方法も評価されている。このような方法の1つは、患者が外部作用物質(external agent)で処置されたときに要素を組み込んでいない細胞が選択的に不利とならないように、GENERIDE(商標)構築物にその要素を追加することを必要とする。これらおよび関連する方法により、所望の遺伝子を含有する細胞の数を増やすことが可能となり、患者は長期的な治療的有用性を確実に得ることができる。
配列
配列番号1は、AAV−DJのキャプシドタンパク質のアミノ酸配列である。
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMAAGGGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLSFKLFNIQVKEVTQNEGTKTIANNLTSTIQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLKTGNNFQFTYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQTTGGTTNTQTLGFSQGGPNTMANQAKNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADPPTTFNQSKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTSVDFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL
配列番号2は、AAV−DJのキャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列である。
atggctgccgatggttatcttccagattggctcgaggacactctctctgaaggaataagacagtggtggaagctcaaacctggcccaccaccaccaaagcccgcagagcggcataaggacgacagcaggggtcttgtgcttcctgggtacaagtacctcggacccttcaacggactcgacaagggagagccggtcaacgaggcagacgccgcggccctcgagcacgacaaagcctacgaccggcagctcgacagcggagacaacccgtacctcaagtacaaccacgccgacgccgagttccaggagcggctcaaagaagatacgtcttttgggggcaacctcgggcgagcagtcttccaggccaaaaagaggcttcttgaacctcttggtctggttgaggaagcggctaagacggctcctggaaagaagaggcctgtagagcactctcctgtggagccagactcctcctcgggaaccggaaaggcgggccagcagcctgcaagaaaaagattgaattttggtcagactggagacgcagactcagtcccagaccctcaaccaatcggagaacctcccgcagccccctcaggtgtgggatctcttacaatggctgcaggcggtggcgcaccaatggcagacaataacgagggcgccgacggagtgggtaattcctcgggaaattggcattgcgattccacatggatgggcgacagagtcatcaccaccagcacccgaacctgggccctgcccacctacaacaaccacctctacaagcaaatctccaacagcacatctggaggatcttcaaatgacaacgcctacttcggctacagcaccccctgggggtattttgactttaacagattccactgccacttttcaccacgtgactggcagcgactcatcaacaacaactggggattccggcccaagagactcagcttcaagctcttcaacatccaggtcaaggaggtcacgcagaatgaaggcaccaagaccatcgccaataacctcaccagcaccatccaggtgtttacggactcggagtaccagctgccgtacgttctcggctctgcccaccagggctgcctgcctccgttcccggcggacgtgttcatgattccccagtacggctacctaacactcaacaacggtagtcaggccgtgggacgctcctccttctactgcctggaatactttccttcgcagatgctgagaaccggcaacaacttccagtttacttacaccttcgaggacgtgcctttccacagcagctacgcccacagccagagcttggaccggctgatgaatcctctgattgaccagtacctgtactacttgtctcggactcaaacaacaggaggcacgacaaatacgcagactctgggcttcagccaaggtgggcctaatacaatggccaatcaggcaaagaactggctgccaggaccctgttaccgccagcagcgagtatcaaagacatctgcggataacaacaacagtgaatactcgtggactggagctaccaagtaccacctcaatggcagagactctctggtgaatccgggcccggccatggcaagccacaaggacgatgaagaaaagtttttttcctcagagcggggttctcatctttgggaagcaaggctcagagaaaacaaatgtggacattgaaaaggtcatgattacagacgaagaggaaatcaggacaaccaatcccgtggctacggagcagtatggttctgtatctaccaacctccagagaggcaacagacaagcagctaccgcagatgtcaacacacaaggcgttcttccaggcatggtctggcaggacagagatgtgtaccttcaggggcccatctgggcaaagattccacacacggacggacattttcacccctctcccctcatgggtggattcggacttaaacaccctccgcctcagatcctgatcaagaacacgcctgtacctgcggatcctccgaccaccttcaaccagtcaaagctgaactctttcatcacccagtattctactggccaagtcagcgtggagatcgagtgggagctgcagaaggaaaacagcaagcgctggaaccccgagatccagtacacctccaactactacaaatctacaagtgtggactttgctgttaatacagaaggcgtgtactctgaaccccgccccattggcacccgttacctcacccgtaatctgtaa
配列番号3は、AAV−2のキャプシドタンパク質のアミノ酸配列である。
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNRGLTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL
配列番号4は、AAV−8のキャプシドタンパク質のアミノ酸配列である。
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPKPKANQQKQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLQAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEGAKTAPGKKRPVEPSPQRSPDSSTGIGKKGQQPARKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPAAPSGVGPNTMAAGGGAPMADNNEGADGVGSSSGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNGTSGGATNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLSFKLFNIQVKEVTQNEGTKTIANNLTSTIQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFTYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQTTGGTANTQTLGFSQGGPNTMANQAKNWLPGPCYRQQRVSTTTGQNNNSNFAWTAGTKYHLNGRNSLANPGIAMATHKDDEERFFPSNGILIFGKQNAARDNADYSDVMLTSEEEIKTTNPVATEEYGIVADNLQQQNTAPQIGTVNSQGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADPPTTFNQSKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTSVDFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL
配列番号5は、AAV−LK03のキャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列である。
atggctgctgacggttatcttccagattggctcgaggacaacctttctgaaggcattcgagagtggtgggcgctgcaacctggagcccctaaacccaaggcaaatcaacaacatcaggacaacgctcggggtcttgtgcttccgggttacaaatacctcggacccggcaacggactcgacaagggggaacccgtcaacgcagcggacgcggcagccctcgagcacgacaaggcctacgaccagcagctcaaggccggtgacaacccctacctcaagtacaaccacgccgacgccgagttccaggagcggctcaaagaagatacgtcttttgggggcaacctcgggcgagcagtcttccaggccaaaaagaggcttcttgaacctcttggtctggttgaggaagcggctaagacggctcctggaaagaagaggcctgtagatcagtctcctcaggaaccggactcatcatctggtgttggcaaatcgggcaaacagcctgccagaaaaagactaaatttcggtcagactggcgactcagagtcagtcccagaccctcaacctctcggagaaccaccagcagcccccacaagtttgggatctaatacaatggcttcaggcggtggcgcaccaatggcagacaataacgagggtgccgatggagtgggtaattcctcaggaaattggcattgcgattcccaatggctgggcgacagagtcatcaccaccagcaccagaacctgggccctgcccacttacaacaaccatctctacaagcaaatctccagccaatcaggagcttcaaacgacaaccactactttggctacagcaccccttgggggtattttgactttaacagattccactgccacttctcaccacgtgactggcagcgactcattaacaacaactggggattccggcccaagaaactcagcttcaagctcttcaacatccaagttaaagaggtcacgcagaacgatggcacgacgactattgccaataaccttaccagcacggttcaagtgtttacggactcggagtatcagctcccgtacgtgctcgggtcggcgcaccaaggctgtctcccgccgtttccagcggacgtcttcatggtccctcagtatggatacctcaccctgaacaacggaagtcaagcggtgggacgctcatccttttactgcctggagtacttcccttcgcagatgctaaggactggaaataacttccaattcagctataccttcgaggatgtaccttttcacagcagctacgctcacagccagagtttggatcgcttgatgaatcctcttattgatcagtatctgtactacctgaacagaacgcaaggaacaacctctggaacaaccaaccaatcacggctgctttttagccaggctgggcctcagtctatgtctttgcaggccagaaattggctacctgggccctgctaccggcaacagagactttcaaagactgctaacgacaacaacaacagtaactttccttggacagcggccagcaaatatcatctcaatggccgcgactcgctggtgaatccaggaccagctatggccagtcacaaggacgatgaagaaaaatttttccctatgcacggcaatctaatatttggcaaagaagggacaacggcaagtaacgcagaattagataatgtaatgattacggatgaagaagagattcgtaccaccaatcctgtggcaacagagcagtatggaactgtggcaaataacttgcagagctcaaatacagctcccacgactagaactgtcaatgatcagggggccttacctggcatggtgtggcaagatcgtgacgtgtaccttcaaggacctatctgggcaaagattcctcacacggatggacactttcatccttctcctctgatgggaggctttggactgaaacatccgcctcctcaaatcatgatcaaaaatactccggtaccggcaaatcctccgacgactttcagcccggccaagtttgcttcatttatcactcagtactccactggacaggtcagcgtggaaattgagtgggagctacagaaagaaaacagcaaacgttggaatccagagattcagtacacttccaactacaacaagtctgttaatgtggactttactgtagacactaatggtgtttatagtgaacctcgccccattggcacccgttaccttacccgtcccctgtaa
配列番号6は、AAV−LK03のキャプシドタンパク質のアミノ酸配列である。
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALQPGAPKPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVDQSPQEPDSSSGVGKSGKQPARKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPAAPTSLGSNTMASGGGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKKLSFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLNRTQGTTSGTTNQSRLLFSQAGPQSMSLQARNWLPGPCYRQQRLSKTANDNNNSNFPWTAASKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPMHGNLIFGKEGTTASNAELDNVMITDEEEIRTTNPVATEQYGTVANNLQSSNTAPTTRTVNDQGALPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQIMIKNTPVPANPPTTFSPAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRPL
配列番号7は、AAV−NP59のキャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列である。
atggctgccgatggttatcttccagattggctcgaggacactctctctgaaggaataagacagtggtggaagctcaaacctggcccaccaccaccaaagcccgcagagcggcataaggacgacagcaggggtcttgtgcttcctgggtacaagtacctcggacccttcaacggactcgacaagggagagccggtcaacgaggcagacgccgcggccctcgagcacgacaaagcctacgaccggcagctcgacagcggagacaacccgtacctcaagtacaaccacgccgacgcggagtttcaggagcgccttaaagaagatacgtcttttgggggcaacctcggacgagcagtcttccaggcgaaaaagagggttcttgaacctctgggcctggttgaggaacctgttaagacggctccgggaaaaaagaggccggtagagcactctcctgtggagccagactcctcctcgggaaccggcaagacaggccagcagcccgctaaaaagagactcaattttggtcagactggcgactcagagtcagtcccagaccctcaacctctcggagaaccaccagcagccccctctggtctgggaactaatacgatggctacaggcagtggcgcaccaatggcagacaataacgagggcgccgacggagtgggtaattcctcgggaaattggcattgcgattccacatggatgggcgacagagtcatcaccaccagcacccgaacctgggccctgcccacctacaacaaccatctctacaagcaaatctccagccaatcaggagcttcaaacgacaaccactactttggctacagcaccccttgggggtattttgactttaacagattccactgccacttctcaccacgtgactggcagcgactcattaacaacaactggggattccggcccaagaaactcagcttcaagctcttcaacatccaagttaaagaggtcacgcagaacgatggcacgacgactattgccaataaccttaccagcacggttcaagtgtttactgactcggagtaccagctcccgtacgtcctcggctcggcgcatcaaggatgcctcccgccgttcccagcagacgtcttcatggtgccacagtatggatacctcaccctgaacaacgggagtcaggcagtaggacgctcttcattttactgcctggagtactttccttctcagatgctgcgtaccggaaacaactttaccttcagctacacttttgaggacgttcctttccacagcagctacgctcacagccagagtctggaccgtctcatgaatcctctcatcgaccagtacctgtattacttgagcagaacaaacactccaagtggaaccaccacgcagtcaaggcttcagttttctcaggccggagcgagtgacattcgggaccagtctaggaactggcttcctggaccctgttaccgccagcagcgagtatcaaagacatctgcggataacaacaacagtgaatactcgtggactggagctaccaagtaccacctcaatggcagagactctctggtgaatccgggcccggccatggcaagccacaaggacgatgaagaaaagttttttcctcagagcggggttctcatctttgggaagcaaggctcagagaaaacaaatgtggacattgaaaaggtcatgattacagacgaagaggaaatcaggacaaccaatcccgtggctacggagcagtatggttctgtatctaccaacctccagagaggcaacagacaagcagctaccgcagatgtcgacacacaaggcgttcttccaggcatggtctggcaggacagagatgtgtaccttcagggacccatctgggcaaagattccacacacggacggacattttcacccctctcccctcatgggtggattcggacttaaacaccctcctccacagattctcatcaagaacaccccggtacctgcgaatccttcgaccaccttcagtgcggcaaagtttgcttccttcatcacacagtactccacgggacaggtcagcgtggagatcgagtgggagctgcagaaggaaaacagcaaacgctggaatcccgaaattcagtacacttccaactacaacaagtctgttaatgtggactttactgtggacactaatggcgtgtattcagagcctcgccccattggcaccagatacctgactcgtaatctgtaa
配列番号8は、AAV−NP59のキャプシドタンパク質のアミノ酸配列である。
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKTGQQPAKKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKKLSFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVDTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL
配列番号9は、ヒトメチルマロニルCoAムターゼ(synMUT1)をコードする最適化されたヌクレオチド配列である。
atgctgagagccaaaaaccagctgttcctgctgagcccccactatctgagacaggtcaaagaaagttccgggagtagactgatccagcagagactgctgcaccagcagcagccactgcatcctgagtgggccgctctggccaagaaacagctgaagggcaaaaacccagaagacctgatctggcacactccagaggggatttcaatcaagcccctgtacagcaaaagggacactatggatctgccagaggaactgccaggagtgaagcctttcacccgcggaccttacccaactatgtatacctttcgaccctggacaattcggcagtacgccggcttcagtactgtggaggaatcaaacaagttttataaggacaacatcaaggctggacagcagggcctgagtgtggcattcgatctggccacacatcgcggctatgactcagataatcccagagtcaggggggacgtgggaatggcaggagtcgctatcgacacagtggaagatactaagattctgttcgatggaatccctctggagaaaatgtctgtgagtatgacaatgaacggcgctgtcattcccgtgctggcaaacttcatcgtcactggcgaggaacagggggtgcctaaggaaaaactgaccggcacaattcagaacgacatcctgaaggagttcatggtgcggaatacttacatttttccccctgaaccatccatgaaaatcattgccgatatcttcgagtacaccgctaagcacatgcccaagttcaactcaattagcatctccgggtatcatatgcaggaagcaggagccgacgctattctggagctggcttacaccctggcagatggcctggaatattctcgaaccggactgcaggcaggcctgacaatcgacgagttcgctcctagactgagtttcttttggggaattggcatgaacttttacatggagatcgccaagatgagggctggccggagactgtgggcacacctgatcgagaagatgttccagcctaagaactctaagagtctgctgctgcgggcccattgccagacatccggctggtctctgactgaacaggacccatataacaatattgtcagaaccgcaatcgaggcaatggcagccgtgttcggaggaacccagagcctgcacacaaactcctttgatgaggccctggggctgcctaccgtgaagtctgctaggattgcacgcaatacacagatcattatccaggaggaatccggaatcccaaaggtggccgatccctggggaggctcttacatgatggagtgcctgacaaacgacgtgtatgatgctgcactgaagctgattaatgaaatcgaggaaatggggggaatggcaaaggccgtggctgagggcattccaaaactgaggatcgaggaatgtgcagctaggcgccaggcacgaattgactcaggaagcgaagtgatcgtcggggtgaataagtaccagctggagaaagaagacgcagtcgaagtgctggccatcgataacacaagcgtgcgcaatcgacagattgagaagctgaagaaaatcaaaagctcccgcgatcaggcactggccgaacgatgcctggcagccctgactgagtgtgctgcaagcggggacggaaacattctggctctggcagtcgatgcctcccgggctagatgcactgtgggggaaatcaccgacgccctgaagaaagtcttcggagagcacaaggccaatgatcggatggtgagcggcgcttatagacaggagttcggggaatctaaagagattaccagtgccatcaagagggtgcacaagttcatggagagagaagggcgacggcccaggctgctggtggcaaagatgggacaggacggacatgatcgcggagcaaaagtcattgccaccgggttcgctgacctgggatttgacgtggatatcggccctctgttccagacaccacgagaggtcgcacagcaggcagtcgacgctgatgtgcacgcagtcggagtgtccactctggcagctggccataagaccctggtgcctgaactgatcaaagagctgaactctctgggcagaccagacatcctggtcatgtgcggcggcgtgatcccaccccaggattacgaattcctgtttgaggtcggggtgagcaacgtgttcggaccaggaaccaggatccctaaggccgcagtgcaggtcctggatgatattgaaaagtgtctggaaaagaaacagcagtcagtgtaa
配列番号10は、ヒトメチルマロニル−CoAムターゼの天然に存在する(wt)アミノ酸配列である。
MLRAKNQLFLLSPHYLRQVKESSGSRLIQQRLLHQQQPLHPEWAALAKKQLKGKNPEDLIWHTPEGISIKPLYSKRDTMDLPEELPGVKPFTRGPYPTMYTFRPWTIRQYAGFSTVEESNKFYKDNIKAGQQGLSVAFDLATHRGYDSDNPRVRGDVGMAGVAIDTVEDTKILFDGIPLEKMSVSMTMNGAVIPVLANFIVTGEEQGVPKEKLTGTIQNDILKEFMVRNTYIFPPEPSMKIIADIFEYTAKHMPKFNSISISGYHMQEAGADAILELAYTLADGLEYSRTGLQAGLTIDEFAPRLSFFWGIGMNFYMEIAKMRAGRRLWAHLIEKMFQPKNSKSLLLRAHCQTSGWSLTEQDPYNNIVRTAIEAMAAVFGGTQSLHTNSFDEALGLPTVKSARIARNTQIIIQEESGIPKVADPWGGSYMMECLTNDVYDAALKLINEIEEMGGMAKAVAEGIPKLRIEECAARRQARIDSGSEVIVGVNKYQLEKEDAVEVLAIDNTSVRNRQIEKLKKIKSSRDQALAEHCLAALTECAASGDGNILALAVDASRARCTVGEITDALKKVFGEHKANDRMVSGAYRQEFGESKEITSAIKRVHKFMEREGRRPRLLVAKMGQDGHDRGAKVIATGFADLGFDVDIGPLFQTPREVAQQAVDADVHAVGVSTLAAGHKTLVPELIKELNSLGRPDILVMCGGVIPPQDYEFLFEVGVSNVFGPGTRIPKAAVQVLDDIEKCLEKKQQSV
配列番号11は、天然に存在する(wt)ヌクレオチド配列であるヒトメチルマロニル−CoAムターゼ遺伝子(wtMUT)である。
atgttaagagctaagaatcagctttttttactttcacctcattacctgaggcaggtaaaagaatcatcaggctccaggctcatacagcaacgacttctacaccagcaacagccccttcacccagaatgggctgccctggctaaaaagcagctgaaaggcaaaaacccagaagacctaatatggcacaccccggaagggatctctataaaacccttgtattccaagagagatactatggacttacctgaagaacttccaggagtgaagccattcacacgtggaccatatcctaccatgtatacctttaggccctggaccatccgccagtatgctggttttagtactgtggaagaaagcaataagttctataaggacaacattaaggctggtcagcagggattatcagttgcctttgatctggcgacacatcgtggctatgattcagacaaccctcgagttcgtggtgatgttggaatggctggagttgctattgacactgtggaagataccaaaattctttttgatggaattcctttagaaaaaatgtcagtttccatgactatgaatggagcagttattccagttcttgcaaattttatagtaactggagaagaacaaggtgtacctaaagagaagcttactggtaccatccaaaatgatatactaaaggaatttatggttcgaaatacatacatttttcctccagaaccatccatgaaaattattgctgacatatttgaatatacagcaaagcacatgccaaaatttaattcaatttcaattagtggataccatatgcaggaagcaggggctgatgccattctggagctggcctatactttagcagatggattggagtactctagaactggactccaggctggcctgacaattgatgaatttgcaccaaggttgtctttcttctggggaattggaatgaatttctatatggaaatagcaaagatgagagctggtagaagactctgggctcacttaatagagaaaatgtttcagcctaaaaactcaaaatctcttcttctaagagcacactgtcagacatctggatggtcacttactgagcaggatccctacaataatattgtccgtactgcaatagaagcaatggcagcagtatttggagggactcagtctttgcacacaaattcttttgatgaagctttgggtttgccaactgtgaaaagtgctcgaattgccaggaacacacaaatcatcattcaagaagaatctgggattcccaaagtggctgatccttggggaggttcttacatgatggaatgtctcacaaatgatgtttatgatgctgctttaaagctcattaatgaaattgaagaaatgggtggaatggccaaagctgtagctgagggaatacctaaacttcgaattgaagaatgtgctgcccgaagacaagctagaatagattctggttctgaagtaattgttggagtaaataagtaccagttggaaaaagaagacgctgtagaagttctggcaattgataatacttcagtgcgaaacaggcagattgaaaaacttaagaagatcaaatccagcagggatcaagctttggctgaacgttgtcttgctgcactaaccgaatgtgctgctagcggagatggaaatatcctggctcttgcagtggatgcatctcgggcaagatgtacagtgggagaaatcacagatgccctgaaaaaggtatttggtgaacataaagcgaatgatcgaatggtgagtggagcatatcgccaggaatttggagaaagtaaagagataacatctgctatcaagagggttcataaattcatggaacgtgaaggtcgcagacctcgtcttcttgtagcaaaaatgggacaagatggccatgacagaggagcaaaagttattgctacaggatttgctgatcttggttttgatgtggacataggccctcttttccagactcctcgtgaagtggcccagcaggctgtggatgcggatgtgcatgctgtgggcataagcaccctcgctgctggtcataaaaccctagttcctgaactcatcaaagaacttaactcccttggacggccagatattcttgtcatgtgtggaggggtgataccacctcaggattatgaatttctgtttgaagttggtgtttccaatgtatttggtcctgggactcgaattccaaaggctgccgttcaggtgcttgatgatattgagaagtgtttggaaaagaagcagcaatctgtataa
配列番号12は、ヒトメチルマロニルCoAムターゼ(synMUT2)をコードする最適化されたヌクレオチド配列である。
atgctgcgagcgaaaaatcagctttttctgttgagcccacactacctgaggcaggttaaagaatccagcgggagccggctgattcagcagcgactgctccaccagcagcagcctttgcatcccgaatgggctgctttggcgaagaagcagctcaaggggaagaaccctgaagatcttatttggcacaccccagagggcatcagcatcaagcctttgtattccaaaagggacaccatggatctgcctgaagaattgcccggggtcaaaccattcacacgggggccatatccaaccatgtacaccttccggccatggactatcagacagtatgcaggctttagcactgtcgaggaatccaataagttctataaagacaatatcaaagctggccagcaaggtctgtccgtggcattcgatctggctacacatagaggttatgattctgacaatccaagagtacggggagacgtcggaatggcgggagttgccattgacacagtggaggacaccaagatacttttcgatgggattccattggagaaaatgtctgtgtcaatgacgatgaacggcgctgtgattcccgttttggcgaacttcatcgtcaccggggaagagcagggcgtcccgaaggaaaagctcaccgggacaatccaaaacgacattcttaaagaattcatggtgagaaatacctacatctttcctcctgagccttccatgaagatcatcgcggacatctttgaatacacggctaaacacatgcctaaatttaactcaatcagcataagcgggtaccacatgcaggaggccggcgctgacgctatacttgagctcgcatataccctggcagatggactggaatactcaaggaccgggctccaggctggactgacaatcgacgagtttgccccccgactcagttttttctggggtatcgggatgaatttctacatggagatagcgaagatgagggcgggcagacggctttgggcgcatctgatcgagaaaatgttccagcccaagaattcaaagagtctgctgctgagagcccactgccagacctcaggctggagcctgactgaacaggacccatacaacaacattgttagaaccgccatcgaggcgatggcagcggttttcggtgggacacagtcattgcacactaactcatttgacgaagccctcggtctgcctaccgtgaagtcagctcggatcgctaggaacacacagatcatcatccaggaggagagtggcatcccaaaagtcgccgatccttggggaggaagttacatgatggaatgcctcacgaatgacgtatacgatgccgcactcaagctgattaacgagatcgaggaaatgggaggcatggcaaaagctgtcgccgagggcattccaaagctgcgcatagaggagtgtgccgcccgaagacaggcccgcattgactccggctctgaggtgatagtgggcgttaataaatatcagctagagaaggaagacgccgtcgaagttctggcgatagataatacctctgtgcgaaatagacagattgagaaactgaagaagatcaagtcaagccgagaccaggccttggccgagaggtgtctggcagccctcactgagtgcgcggcatctggggacggcaacatattggcacttgccgtcgatgcctccagggcccgatgtacggtcggcgaaattaccgatgccctcaagaaggtttttggcgagcacaaggctaacgacaggatggttagtggagcatacagacaggagtttggcgaaagcaaggaaattacttccgcgattaaaagagtgcacaaattcatggaacgggagggtaggcgaccgaggctcctcgttgccaaaatgggtcaggacggccacgaccggggcgccaaggttatcgctaccggtttcgctgacctgggcttcgatgtggatatcggaccactgtttcaaacccccagagaagttgcccaacaagccgttgacgctgacgtacacgctgtaggcatctccactctcgccgccgggcataagactctcgtcccagagctgataaaggagcttaacagcctcggaagacccgacatcctggttatgtgcggtggagtgattccgccgcaggattacgaattcctcttcgaagtaggagtgtcaaacgtgttcggcccaggcactcggatacccaaggctgccgttcaggtgcttgacgacattgaaaaatgtctggagaagaagcaacaatctgtataa
配列番号13は、ヒトメチルマロニルCoAムターゼ(synMUT3)をコードする最適化されたヌクレオチド配列である。
atgttgagggctaaaaaccagctctttctgttgagtccacactaccttaggcaagtgaaggaatctagcggtagcaggctgatccagcagcgcctgctgcaccagcagcagcccctgcaccctgagtgggctgcattggcaaagaaacaactgaagggtaaaaatcctgaagatctgatttggcacacaccggaggggatttccataaaacctctctactctaaacgcgatactatggatctgcccgaggaattgccaggagtgaaaccctttacaagggggccctaccccactatgtacacgttcagaccctggactatacgccagtatgccggattttctaccgttgaggaatccaacaagttttataaggacaacatcaaagccgggcagcagggactgtcagtggcatttgatctcgccacccaccgcgggtacgactccgacaacccaagagtccgcggtgacgtcggcatggcaggggttgccattgacacagtagaggatactaaaattttgtttgatgggatccccctagagaagatgtccgtgtctatgacgatgaacggcgcggtaatcccagtgcttgccaacttcatagtcacaggggaagagcagggcgtaccaaaggagaagctcacaggaacaatccaaaatgacattctgaaggaattcatggtgagaaatacttatatctttcctcccgagccctctatgaagattattgccgacatttttgaatacaccgcaaaacatatgcccaagttcaattccatatctattagtggataccacatgcaagaagctggggctgatgcaatacttgagcttgcctacaccctggccgacggactggagtattctcgcactggcctgcaagccgggctgacaattgacgagttcgccccacgccttagcttcttctggggcatcggcatgaatttctatatggagatcgcaaagatgagagcagggcggcgcttgtgggcccatctgatcgaaaagatgtttcagcctaagaatagtaagagcctgctcctgcgggctcactgtcagacgtcaggctggagcctcacagagcaggatccttacaataacatcgtccggactgctattgaggcgatggctgcagtattcggaggaacacaaagcctgcacactaattctttcgatgaggctttggggctccctaccgtgaagtcagccagaattgcaagaaacacccaaataatcatccaagaagaatcagggatcccaaaagttgccgacccctggggaggaagttatatgatggagtgcctgaccaatgacgtctacgacgccgctttgaagctgattaacgagattgaagagatgggcggaatggccaaggcggtcgctgagggcattccgaaactgcgcatagaggagtgtgctgctcgcaggcaggccagaattgattccggttccgaagtgatcgtgggggttaataagtatcaactggaaaaagaggacgctgtcgaagtcctcgcaatcgataataccagcgttagaaaccgacaaattgagaagctgaaaaagatcaaaagttcaagggaccaggccttggctgagcggtgtctcgccgcactgaccgaatgtgccgccagcggcgatggtaacatcctcgccctcgctgtggacgcttccagagcccggtgcaccgtgggcgaaattacggacgcgctgaaaaaagtctttggcgaacacaaggccaatgatagaatggtgagtggcgcctataggcaggagttcggcgagagtaaagaaataacatccgccatcaagagggtccacaaatttatggagcgggaaggacgcagacctagacttctcgtggccaaaatgggtcaggacggtcatgaccggggagccaaagtcatcgcaacgggcttcgccgatttggggtttgacgtggatatcggtcccttgtttcaaacccccagggaggtggctcagcaggctgtggacgctgacgtccacgcagtgggcatttctacactggcagccgggcacaagacgttggtgccagaactgatcaaagagttgaacagcctgggacgccctgacatcctggtaatgtgcggtggggtaatccccccccaagactacgagttccttttcgaagtgggtgtttctaacgtgttcggacctggaacaagaatccctaaggcggcagtgcaggtgcttgacgatatcgagaagtgcctggagaaaaagcaacaatccgtttaa
配列番号14は、ヒトメチルマロニル−CoAムターゼ(synMUT4)をコードする最適化されたヌクレオチド配列である。
atgcttcgcgccaagaaccaactgttcctgctgtccccccactacctccgacaagtcaaggagagctcgggaagccgcctgattcagcagcggctgctgcaccagcagcagcccctgcatccggaatgggcagcgttggcaaagaagcagctgaagggaaagaaccctgaggacctgatctggcacaccccggagggaatctcgatcaagccactgtactccaaaagggacaccatggacttgcctgaagaacttccgggcgtgaagccttttacccgggggccatacccaacaatgtacactttccgcccctggaccatcagacagtacgccggtttctccaccgtcgaagaatccaacaagttctataaggacaacatcaaggccgggcagcagggactgagcgtcgcgtttgacctggcaacccatcgcggctacgactccgacaaccctcgcgtgcggggggacgtgggaatggccggagtggctatcgacaccgtggaggacaccaagattctcttcgacggaatcccgctggaaaagatgtcggtgtccatgaccatgaatggcgccgtgatcccggtgctcgcgaacttcatcgtgacgggagaggaacagggagtgccgaaagagaagctgaccgggactattcagaatgacatcctcaaggagttcatggtccgcaacacttacattttccctcctgaaccctcgatgaagatcatcgctgacatcttcgagtacaccgcgaagcacatgccgaagttcaactcgatctccatctcgggctaccacatgcaggaggccggggccgacgccattctcgaactggcgtacactctggcggatggtctggaatactcacgcaccggactgcaggccggactgacaatcgacgagttcgccccgaggctgtccttcttctggggcattgggatgaacttctatatggaaatcgcgaagatgagagctggaaggcggctgtgggcgcacctgatcgagaagatgttccagcccaagaacagcaaaagccttctcctccgcgcccactgccaaacttccggctggtcactgaccgagcaggatccgtacaacaacattgtccggactgccattgaggccatggccgctgtgttcggaggcactcagtccctccacactaactccttcgacgaggccctgggtctgccgaccgtgaagtccgcccggatagccagaaatactcaaatcattatccaggaggaaagcggaatccccaaggtcgccgacccttggggaggatcttacatgatggagtgtttgaccaatgacgtctacgacgccgccctgaagctcattaacgaaatcgaagagatgggcggaatggccaaggccgtggctgagggcatcccgaagctgagaatcgaggaatgcgccgcccggagacaggcccgcattgatagcggcagcgaggtcattgtgggcgtgaacaagtaccagcttgaaaaggaggacgccgtggaagtgctggcaatcgataacacctccgtgcgcaaccggcagatcgaaaagctcaagaagattaagtcctcacgggaccaggcactggcggagagatgcctcgccgcgctgaccgaatgcgctgcctcgggagatggcaacattctggccctggcagtggacgcctctcgggctcggtgcactgtgggggagatcaccgacgccctcaagaaagtgttcggtgaacataaggccaacgaccggatggtgtccggagcgtaccgccaggaatttggcgaatcaaaggaaatcacgtccgcaatcaagagggtgcacaaattcatggaacgggagggcagacggcccagactgctcgtggctaaaatgggacaagatggtcacgaccgcggcgccaaggtcatcgcgactggcttcgccgatctcggattcgacgtggacatcggacctctgtttcaaactccccgggaagtggcccagcaggccgtggacgcggacgtgcatgccgtcgggatctcaaccctggcggccggccataagaccctggtgccggaactgatcaaggagctgaactcgctcggccgccccgacatcctcgtgatgtgtggcggagtgattccgccacaagactacgagttcctgttcgaagtcggggtgtccaacgtgttcggtcccggaaccagaatcccgaaggctgcggtccaagtgctggatgatattgagaagtgccttgagaaaaagcaacagtcagtgtga
配列番号16は、マウス中でMutを発現するための構築物をコードするヌクレオチド配列である。これは、LB−001のマウス配列である。配列の成分には、以下のものが含まれる。ITR(逆位末端配列);相同性アーム;P2A;およびSynMut。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される:
(項目1)
対象中の組織内の細胞の少なくとも一集団のゲノム中に導入遺伝子を組み込む方法であって、
前記組織内の細胞が遺伝子産物によってコードされる機能的タンパク質を発現することができない対象に、前記機能的タンパク質をコードする導入遺伝子を送達する組成物を投与することを含み、ここで、
前記組成物が、ポリヌクレオチドカセットであって、
第1の核酸配列および第2の核酸配列と(ここで、前記第1の核酸配列が前記導入遺伝子をコードし、前記第2の核酸配列が、前記第1の核酸配列に対して5’側または3’側に位置しており、前記細胞のゲノム中の標的組み込み部位中に組み込まれると、2つの独立した遺伝子産物の産生を促進する)、
前記ポリヌクレオチドに対して5’側に位置し、前記細胞のゲノム中の前記標的組み込み部位の5’側のゲノム配列と実質的に相同である配列を含む第3の核酸配列と、
前記ポリヌクレオチドに対して3’側に位置し、前記細胞のゲノム中の前記標的組み込み部位の3’側のゲノム配列と実質的に相同である配列を含む第4の核酸配列と、
を含むポリヌクレオチドカセットを含み、
前記組成物を投与した後に、前記細胞の前記集団の前記ゲノム中に、前記導入遺伝子が組み込まれる、方法。
(項目2)
前記組み込みがヌクレアーゼ活性を含まない、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記組成物が組換えウイルスベクターを含む、項目1に記載の方法。
(項目4)
前記組換えウイルスベクターが組換えAAVベクターである、項目3に記載の方法。
(項目5)
前記組換えウイルスベクターが、LK03、AAV8、AAV−DJ、AAV−LK03またはAAVNP59のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質である、または前記キャプシドタンパク質を含む、項目4に記載の方法。
(項目6)
前記導入遺伝子がMUT導入遺伝子である、またはMUT導入遺伝子を含む、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目7)
前記組成物がAAV2 ITR配列をさらに含む、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目8)
前記ポリヌクレオチドカセットがプロモーター配列を含まない、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目9)
前記ポリヌクレオチドカセットが前記細胞のゲノム中の前記標的組み込み部位中に組み込まれると、前記導入遺伝子が、前記標的組み込み部位において内因性プロモーターの制御下で発現される、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目10)
前記標的組み込み部位が、内因性アルブミンプロモーターと内因性アルブミン遺伝子とを含むアルブミン遺伝子座である、項目9に記載の方法。
(項目11)
前記ポリヌクレオチドカセットが細胞のゲノム中の前記標的組み込み部位中に組み込まれると、前記導入遺伝子が、前記内因性アルブミン遺伝子発現を破壊することなく、前記内因性アルブミンプロモーターの制御下で発現される、項目10に記載の方法。
(項目12)
前記組織が肝臓である、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目13)
前記第2の核酸配列が、
a)2Aペプチド;
b)内部リボソーム侵入部位(IRES);
c)N末端インテインスプライシング領域およびC末端インテインスプライシング領域;または
d)スプライスドナーおよびスプライスアクセプター;
を含む、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目14)
前記第3および第4の核酸配列が、前記導入遺伝子および前記第2の核酸配列を、内因性アルブミンプロモーターと内因性アルブミン遺伝子とを含む内因性アルブミン遺伝子座中に組み込む相同性アームである、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目15)
前記相同性アームが、前記内因性アルブミン遺伝子の開始コドンのすぐ3’側にまたは前記内因性アルブミン遺伝子の停止コドンのすぐ5’側にポリヌクレオチドカセットの組み込みを指示する、項目14に記載の方法。
(項目16)
前記MUT導入遺伝子が、wtヒトMUT、コドン最適化されたMUT、合成MUT、MUTバリアント、MUT変異体またはMUT断片である、項目6に記載の方法。
(項目17)
ある期間にわたって組織中の導入遺伝子の発現のレベルを増加させる方法であって、
それを必要とする対象に、前記対象の前記組織中の細胞の少なくとも一集団のゲノム中に組み込む導入遺伝子を送達する組成物を投与することを含み、
前記組成物が、
第1の核酸配列および第2の核酸配列を含むポリヌクレオチドであって、前記第1の核酸配列が前記導入遺伝子をコードし、前記第2の核酸配列が、前記第1の核酸配列に対して5’側または3’側に位置しており、前記細胞のゲノム中の標的組み込み部位中に組み込まれると、2つの独立した遺伝子産物の産生を促進する、ポリヌクレオチドと、
前記ポリヌクレオチドに対して5’側に位置し、前記細胞のゲノム中の前記標的組み込み部位の5’側のゲノム配列と実質的に相同である配列を含む第3の核酸配列と、
前記ポリヌクレオチドに対して3’側に位置し、前記細胞のゲノム中の前記標的組み込み部位の3’側のゲノム配列と実質的に相同である配列を含む第4の核酸配列と、
を含み、
前記組成物を投与した後に、細胞の前記集団のゲノム中に、前記導入遺伝子が組み込まれ、前記組織中の前記導入遺伝子の発現の前記レベルがある期間にわたって増加する、方法。
(項目18)
前記導入遺伝子の前記組み込みがヌクレアーゼ活性を含まない、項目17に記載の方法。
(項目19)
発現の前記レベルの増加が、前記導入遺伝子を発現する前記組織中の細胞のパーセントの増加を含む、項目17または18に記載の方法。
(項目20)
前記組成物が組換えウイルスベクターを含む、項目17〜19のいずれか一項に記載の方法。
(項目21)
前記組換えウイルスベクターが組換えAAVベクターである、項目20に記載の方法。
(項目22)
前記組換えウイルスベクターが、LK03、AAV8、AAV−DJ、AAV−LK03またはAAVNP59のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質である、または前記キャプシドタンパク質を含む、項目21に記載の方法。
(項目23)
前記導入遺伝子がMUT導入遺伝子である、またはMUT導入遺伝子を含む、項目17〜22のいずれか一項に記載の方法。
(項目24)
前記組成物がAAV2 ITR配列をさらに含む、項目17〜23のいずれか一項に記載の方法。
(項目25)
前記ポリヌクレオチドカセットがプロモーター配列を含まない、項目17〜24のいずれか一項に記載の方法。
(項目26)
前記ポリヌクレオチドカセットが前記細胞のゲノム中の前記標的組み込み部位中に組み込まれると、前記導入遺伝子が、前記標的組み込み部位において内因性プロモーターの制御下で発現される、項目17〜25のいずれか一項に記載の方法。
(項目27)
前記標的組み込み部位が、内因性アルブミンプロモーターと内因性アルブミン遺伝子とを含むアルブミン遺伝子座である、項目26に記載の方法。
(項目28)
前記ポリヌクレオチドカセットが細胞のゲノム中の前記標的組み込み部位中に組み込まれると、前記導入遺伝子が、前記内因性アルブミン遺伝子発現を破壊することなく、前記内因性アルブミンプロモーターの制御下で発現される、項目27に記載の方法。
(項目29)
前記組織が肝臓である、項目17〜28のいずれか一項に記載の方法。
(項目30)
前記第2の核酸配列が、
a)2Aペプチド;
b)内部リボソーム侵入部位(IRES);
c)N末端インテインスプライシング領域およびC末端インテインスプライシング領域;または
d)スプライスドナーとスプライスアクセプター;
を含む、項目17〜29のいずれか一項に記載の方法。
(項目31)
前記第3および第4の核酸配列が、前記導入遺伝子および前記第2の核酸配列を、内因性アルブミンプロモーターと内因性アルブミン遺伝子とを含む内因性アルブミン遺伝子座中に組み込む相同性アームである、項目17〜30のいずれか一項に記載の方法。
(項目32)
前記相同性アームが、前記内因性アルブミン遺伝子の開始コドンのすぐ3’側にまたは前記内因性アルブミン遺伝子の停止コドンのすぐ5’側に前記ポリヌクレオチドカセットの組み込みを指示する、項目31に記載の方法。
(項目33)
前記MUT導入遺伝子が、wtヒトMUT、コドン最適化されたMUT、合成MUT、MUTバリアント、MUT変異体またはMUT断片である、項目23に記載の方法。
(項目34)
細胞のゲノム中の標的組み込み部位中に導入遺伝子を組み込むための組換えウイルスベクターであって、
(i)第1の核酸配列および第2の核酸配列を含むポリヌクレオチドカセットであって、前記第1の核酸配列がMUT導入遺伝子を含み、前記第2の核酸配列が、前記第1の核酸配列に対して5’側または3’側に位置し、前記細胞のゲノム中の前記標的組み込み部位中に組み込まれると、2つの独立した遺伝子産物の産生を促進する、ポリヌクレオチドカセットと、
(ii)前記ポリヌクレオチドカセットベクターに対して5’側に位置し、前記細胞のゲノム中の前記標的組み込み部位の5’側のゲノム配列と実質的に相同である配列を含む第3の核酸配列と、
(iii)前記ポリヌクレオチドカセットウイルスベクターの3’側に位置し、前記細胞のゲノム中の前記標的組み込み部位の3’側のゲノム配列と実質的に相同である配列を含む第4の核酸配列と、
を含み、
前記ウイルスベクターが、LK03 AAVキャプシドを含む、組換えウイルスベクター。
(項目35)
前記第3の核酸が800〜1,200ヌクレオチドである、項目34に記載の組換えウイルスベクター。
(項目36)
前記第4の核酸が800〜1,200ヌクレオチドである、項目34または項目35に記載の組換えウイルスベクター。
(項目37)
前記組換えウイルスベクターが組換えAAVベクターである、項目34〜36のいずれか一項に記載の組換えウイルスベクター。
(項目38)
前記組換えウイルスベクターが、AAV8、AAV−DJ、AAV−LK03またはAAV−NP59のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質である、または前記キャプシドタンパク質を含む、項目37に記載の組換えウイルスベクター。
(項目39)
AAV2 ITR配列をさらに含む、項目34〜38のいずれか一項に記載の組換えウイルスベクター。
(項目40)
前記ポリヌクレオチドカセットがプロモーター配列を含まない、項目34〜39のいずれか一項に記載の組換えウイルスベクター。
(項目41)
前記ポリヌクレオチドカセットが細胞のゲノム中の前記標的組み込み部位中に組み込まれると、前記MUT導入遺伝子が前記標的組み込み部位において内因性プロモーターの制御下で発現される、項目34〜40のいずれか一項に記載の組換えウイルスベクター。
(項目42)
前記標的組み込み部位が、内因性アルブミンプロモーターと内因性アルブミン遺伝子とを含むアルブミン遺伝子座である、項目41のいずれか一項に記載の組換えウイルスベクター。
(項目43)
前記ポリヌクレオチドカセットが細胞のゲノム中の前記標的組み込み部位中に組み込まれると、前記MUT導入遺伝子が、内因性アルブミン遺伝子発現を破壊することなく、前記内因性アルブミンプロモーターの制御下で発現される、項目41に記載の組換えウイルスベクター。
(項目44)
前記2つの独立した遺伝子産物が、前記MUT導入遺伝子から発現されるMUTタンパク質および内因性アルブミン遺伝子から発現される内因性アルブミンタンパク質である、項目34〜43のいずれか一項に記載の組換えウイルスベクター。
(項目45)
前記細胞が肝細胞である、項目34〜44のいずれか一項に記載の組換えウイルスベクター。
(項目46)
前記第2の核酸配列が、
a)2Aペプチド;
b)内部リボソーム侵入部位(IRES);
c)N末端インテインスプライシング領域およびC末端インテインスプライシング領域;または
d)スプライスドナーとスプライスアクセプター;
を含む、項目34〜45のいずれか一項に記載の組換えウイルスベクター。
(項目47)
前記第3および第4の核酸配列が、前記MUT導入遺伝子および前記第2の核酸配列を、内因性アルブミンプロモーターと内因性アルブミン遺伝子とを含む内因性アルブミン遺伝子座中に組み込む相同性アームである、項目34〜46のいずれかに記載の組換えウイルスベクター。
(項目48)
前記第3および第4の核酸配列が、前記内因性アルブミンプロモーターおよび前記内因性アルブミン遺伝子とインフレームに、前記MUT導入遺伝子および前記第2の核酸配列を内因性アルブミン遺伝子座中に組み込む相同性アームである、項目47に記載の組換えウイルスベクター。
(項目49)
前記相同性アームが、前記内因性アルブミン遺伝子の開始コドンのすぐ3’側にまたは前記内因性アルブミン遺伝子の停止コドンのすぐ5’側に前記ポリヌクレオチドカセットの組み込みを指示する、項目47または項目48に記載の組換えウイルスベクター。
(項目50)
前記MUT導入遺伝子が、wtヒトMUT、コドン最適化されたMUT、合成MUT、MUTバリアント、MUT変異体またはMUT断片である、項目34〜49のいずれか一項に記載の組換えウイルスベクター。
(項目51)
対象の組織中の細胞に、投与前には前記細胞によって機能的に発現されていない関心対象の産物をコードする導入遺伝子を送達する組成物の用量を前記対象に投与するステップを含む方法であって、前記導入遺伝子が、(i)前記関心対象の産物をコードし、(ii)複数の前記細胞のゲノム中の標的組み込み部位に組み込み、(iii)組み込まれると、前記関心対象の産物を機能的に発現し、(iv)時間の経過につれて、前記組織が、他の方法では同等の投与によって達成されるものより高いことが決定されている前記関心対象の産物の機能的発現のレベルを達成するように、前記組織中の他の細胞と比べて選択的有利性を前記複数の細胞に付与し、その中に前記導入遺伝子が組み込まれた前記細胞が、前記投与するステップ前に、前記関心対象の産物を機能的に発現し、
前記組成物が、
第1の核酸配列および第2の核酸配列を含むポリヌクレオチドであって、前記第1の核酸配列が前記導入遺伝子をコードし、前記第2の核酸配列が、前記第1の核酸配列に対して5’側または3’側に位置しており、前記導入遺伝子が前記標的組み込み部位に組み込まれたときに、2つの独立した遺伝子産物の産生を促進する、ポリヌクレオチドと、
前記ポリヌクレオチドに対して5’側に位置し、前記標的組み込み部位の5’側のゲノム配列に実質的に相同である配列を含む第3の核酸配列と、
前記ポリヌクレオチドに対して3’側に位置し、前記標的組み込み部位の3’側のゲノム配列に実質的に相同である配列を含む第4の核酸配列と、
を含む、方法。
(項目52)
前記導入遺伝子の前記組み込みがヌクレアーゼ活性を含まない、項目51に記載の方法。
(項目53)
前記選択的有利性が、前記導入遺伝子を発現する前記組織中の細胞のパーセント増加を含む、項目51または52に記載の方法。
(項目54)
前記組成物が組換えウイルスベクターを含む、項目51〜53のいずれか一項に記載の方法。
(項目55)
前記組換えウイルスベクターが組換えAAVベクターである、項目54に記載の方法。
(項目56)
前記組換えウイルスベクターが、LK03、AAV8、AAV−DJ、AAV−LK03またはAAVNP59のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質である、または前記キャプシドタンパク質を含む、項目55に記載の方法。
(項目57)
前記導入遺伝子がMUT導入遺伝子である、またはMUT導入遺伝子を含む、項目51〜56のいずれか一項に記載の方法。
(項目58)
前記組成物がAAV2 ITR配列をさらに含む、項目51〜57のいずれか一項に記載の方法。
(項目59)
前記ポリヌクレオチドカセットがプロモーター配列を含まない、項目51〜58のいずれか一項に記載の方法。
(項目60)
前記ポリヌクレオチドカセットが前記細胞のゲノム中の前記標的組み込み部位中に組み込まれると、前記導入遺伝子が、前記標的組み込み部位において内因性プロモーターの制御下で発現される、項目51〜59のいずれか一項に記載の方法。
(項目61)
前記標的組み込み部位が、内因性アルブミンプロモーターと内因性アルブミン遺伝子とを含むアルブミン遺伝子座である、項目60に記載の方法。
(項目62)
前記ポリヌクレオチドカセットが細胞のゲノム中の前記標的組み込み部位中に組み込まれると、前記導入遺伝子が、前記内因性アルブミン遺伝子発現を破壊することなく、前記内因性アルブミンプロモーターの制御下で発現される、項目61に記載の方法。
(項目63)
前記組織が肝臓である、項目51〜62のいずれか一項に記載の方法。
(項目64)
前記第2の核酸配列が、
a)2Aペプチド;
b)内部リボソーム侵入部位(IRES);
c)N末端インテインスプライシング領域およびC末端インテインスプライシング領域;または
d)スプライスドナーとスプライスアクセプター;
を含む、項目51〜63のいずれか一項に記載の方法。
(項目65)
前記第3および第4の核酸配列が、前記導入遺伝子および前記第2の核酸配列を、内因性アルブミンプロモーターと内因性アルブミン遺伝子とを含む内因性アルブミン遺伝子座中に組み込む相同性アームである、項目51〜64のいずれか一項に記載の方法。
(項目66)
前記相同性アームが、前記内因性アルブミン遺伝子の開始コドンのすぐ3’側にまたは前記内因性アルブミン遺伝子の停止コドンのすぐ5’側に前記ポリヌクレオチドカセットの組み込みを指示する、項目65に記載の方法。
(項目67)
前記MUT導入遺伝子が、wtヒトMUT、コドン最適化されたMUT、合成MUT、MUTバリアント、MUT変異体またはMUT断片である、項目57に記載の方法。
Claims (67)
- 対象中の組織内の細胞の少なくとも一集団のゲノム中に導入遺伝子を組み込む方法であって、
前記組織内の細胞が遺伝子産物によってコードされる機能的タンパク質を発現することができない対象に、前記機能的タンパク質をコードする導入遺伝子を送達する組成物を投与することを含み、ここで、
前記組成物が、ポリヌクレオチドカセットであって、
第1の核酸配列および第2の核酸配列と(ここで、前記第1の核酸配列が前記導入遺伝子をコードし、前記第2の核酸配列が、前記第1の核酸配列に対して5’側または3’側に位置しており、前記細胞のゲノム中の標的組み込み部位中に組み込まれると、2つの独立した遺伝子産物の産生を促進する)、
前記ポリヌクレオチドに対して5’側に位置し、前記細胞のゲノム中の前記標的組み込み部位の5’側のゲノム配列と実質的に相同である配列を含む第3の核酸配列と、
前記ポリヌクレオチドに対して3’側に位置し、前記細胞のゲノム中の前記標的組み込み部位の3’側のゲノム配列と実質的に相同である配列を含む第4の核酸配列と、
を含むポリヌクレオチドカセットを含み、
前記組成物を投与した後に、前記細胞の前記集団の前記ゲノム中に、前記導入遺伝子が組み込まれる、方法。 - 前記組み込みがヌクレアーゼ活性を含まない、請求項1に記載の方法。
- 前記組成物が組換えウイルスベクターを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記組換えウイルスベクターが組換えAAVベクターである、請求項3に記載の方法。
- 前記組換えウイルスベクターが、LK03、AAV8、AAV−DJ、AAV−LK03またはAAVNP59のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質である、または前記キャプシドタンパク質を含む、請求項4に記載の方法。
- 前記導入遺伝子がMUT導入遺伝子である、またはMUT導入遺伝子を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組成物がAAV2 ITR配列をさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドカセットがプロモーター配列を含まない、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドカセットが前記細胞のゲノム中の前記標的組み込み部位中に組み込まれると、前記導入遺伝子が、前記標的組み込み部位において内因性プロモーターの制御下で発現される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的組み込み部位が、内因性アルブミンプロモーターと内因性アルブミン遺伝子とを含むアルブミン遺伝子座である、請求項9に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドカセットが細胞のゲノム中の前記標的組み込み部位中に組み込まれると、前記導入遺伝子が、前記内因性アルブミン遺伝子発現を破壊することなく、前記内因性アルブミンプロモーターの制御下で発現される、請求項10に記載の方法。
- 前記組織が肝臓である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2の核酸配列が、
a)2Aペプチド;
b)内部リボソーム侵入部位(IRES);
c)N末端インテインスプライシング領域およびC末端インテインスプライシング領域;または
d)スプライスドナーおよびスプライスアクセプター;
を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。 - 前記第3および第4の核酸配列が、前記導入遺伝子および前記第2の核酸配列を、内因性アルブミンプロモーターと内因性アルブミン遺伝子とを含む内因性アルブミン遺伝子座中に組み込む相同性アームである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記相同性アームが、前記内因性アルブミン遺伝子の開始コドンのすぐ3’側にまたは前記内因性アルブミン遺伝子の停止コドンのすぐ5’側にポリヌクレオチドカセットの組み込みを指示する、請求項14に記載の方法。
- 前記MUT導入遺伝子が、wtヒトMUT、コドン最適化されたMUT、合成MUT、MUTバリアント、MUT変異体またはMUT断片である、請求項6に記載の方法。
- ある期間にわたって組織中の導入遺伝子の発現のレベルを増加させる方法であって、
それを必要とする対象に、前記対象の前記組織中の細胞の少なくとも一集団のゲノム中に組み込む導入遺伝子を送達する組成物を投与することを含み、
前記組成物が、
第1の核酸配列および第2の核酸配列を含むポリヌクレオチドであって、前記第1の核酸配列が前記導入遺伝子をコードし、前記第2の核酸配列が、前記第1の核酸配列に対して5’側または3’側に位置しており、前記細胞のゲノム中の標的組み込み部位中に組み込まれると、2つの独立した遺伝子産物の産生を促進する、ポリヌクレオチドと、
前記ポリヌクレオチドに対して5’側に位置し、前記細胞のゲノム中の前記標的組み込み部位の5’側のゲノム配列と実質的に相同である配列を含む第3の核酸配列と、
前記ポリヌクレオチドに対して3’側に位置し、前記細胞のゲノム中の前記標的組み込み部位の3’側のゲノム配列と実質的に相同である配列を含む第4の核酸配列と、
を含み、
前記組成物を投与した後に、細胞の前記集団のゲノム中に、前記導入遺伝子が組み込まれ、前記組織中の前記導入遺伝子の発現の前記レベルがある期間にわたって増加する、方法。 - 前記導入遺伝子の前記組み込みがヌクレアーゼ活性を含まない、請求項17に記載の方法。
- 発現の前記レベルの増加が、前記導入遺伝子を発現する前記組織中の細胞のパーセントの増加を含む、請求項17または18に記載の方法。
- 前記組成物が組換えウイルスベクターを含む、請求項17〜19のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組換えウイルスベクターが組換えAAVベクターである、請求項20に記載の方法。
- 前記組換えウイルスベクターが、LK03、AAV8、AAV−DJ、AAV−LK03またはAAVNP59のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質である、または前記キャプシドタンパク質を含む、請求項21に記載の方法。
- 前記導入遺伝子がMUT導入遺伝子である、またはMUT導入遺伝子を含む、請求項17〜22のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組成物がAAV2 ITR配列をさらに含む、請求項17〜23のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドカセットがプロモーター配列を含まない、請求項17〜24のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドカセットが前記細胞のゲノム中の前記標的組み込み部位中に組み込まれると、前記導入遺伝子が、前記標的組み込み部位において内因性プロモーターの制御下で発現される、請求項17〜25のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的組み込み部位が、内因性アルブミンプロモーターと内因性アルブミン遺伝子とを含むアルブミン遺伝子座である、請求項26に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドカセットが細胞のゲノム中の前記標的組み込み部位中に組み込まれると、前記導入遺伝子が、前記内因性アルブミン遺伝子発現を破壊することなく、前記内因性アルブミンプロモーターの制御下で発現される、請求項27に記載の方法。
- 前記組織が肝臓である、請求項17〜28のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2の核酸配列が、
a)2Aペプチド;
b)内部リボソーム侵入部位(IRES);
c)N末端インテインスプライシング領域およびC末端インテインスプライシング領域;または
d)スプライスドナーとスプライスアクセプター;
を含む、請求項17〜29のいずれか一項に記載の方法。 - 前記第3および第4の核酸配列が、前記導入遺伝子および前記第2の核酸配列を、内因性アルブミンプロモーターと内因性アルブミン遺伝子とを含む内因性アルブミン遺伝子座中に組み込む相同性アームである、請求項17〜30のいずれか一項に記載の方法。
- 前記相同性アームが、前記内因性アルブミン遺伝子の開始コドンのすぐ3’側にまたは前記内因性アルブミン遺伝子の停止コドンのすぐ5’側に前記ポリヌクレオチドカセットの組み込みを指示する、請求項31に記載の方法。
- 前記MUT導入遺伝子が、wtヒトMUT、コドン最適化されたMUT、合成MUT、MUTバリアント、MUT変異体またはMUT断片である、請求項23に記載の方法。
- 細胞のゲノム中の標的組み込み部位中に導入遺伝子を組み込むための組換えウイルスベクターであって、
(i)第1の核酸配列および第2の核酸配列を含むポリヌクレオチドカセットであって、前記第1の核酸配列がMUT導入遺伝子を含み、前記第2の核酸配列が、前記第1の核酸配列に対して5’側または3’側に位置し、前記細胞のゲノム中の前記標的組み込み部位中に組み込まれると、2つの独立した遺伝子産物の産生を促進する、ポリヌクレオチドカセットと、
(ii)前記ポリヌクレオチドカセットベクターに対して5’側に位置し、前記細胞のゲノム中の前記標的組み込み部位の5’側のゲノム配列と実質的に相同である配列を含む第3の核酸配列と、
(iii)前記ポリヌクレオチドカセットウイルスベクターの3’側に位置し、前記細胞のゲノム中の前記標的組み込み部位の3’側のゲノム配列と実質的に相同である配列を含む第4の核酸配列と、
を含み、
前記ウイルスベクターが、LK03 AAVキャプシドを含む、組換えウイルスベクター。 - 前記第3の核酸が800〜1,200ヌクレオチドである、請求項34に記載の組換えウイルスベクター。
- 前記第4の核酸が800〜1,200ヌクレオチドである、請求項34または請求項35に記載の組換えウイルスベクター。
- 前記組換えウイルスベクターが組換えAAVベクターである、請求項34〜36のいずれか一項に記載の組換えウイルスベクター。
- 前記組換えウイルスベクターが、AAV8、AAV−DJ、AAV−LK03またはAAV−NP59のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質である、または前記キャプシドタンパク質を含む、請求項37に記載の組換えウイルスベクター。
- AAV2 ITR配列をさらに含む、請求項34〜38のいずれか一項に記載の組換えウイルスベクター。
- 前記ポリヌクレオチドカセットがプロモーター配列を含まない、請求項34〜39のいずれか一項に記載の組換えウイルスベクター。
- 前記ポリヌクレオチドカセットが細胞のゲノム中の前記標的組み込み部位中に組み込まれると、前記MUT導入遺伝子が前記標的組み込み部位において内因性プロモーターの制御下で発現される、請求項34〜40のいずれか一項に記載の組換えウイルスベクター。
- 前記標的組み込み部位が、内因性アルブミンプロモーターと内因性アルブミン遺伝子とを含むアルブミン遺伝子座である、請求項41のいずれか一項に記載の組換えウイルスベクター。
- 前記ポリヌクレオチドカセットが細胞のゲノム中の前記標的組み込み部位中に組み込まれると、前記MUT導入遺伝子が、内因性アルブミン遺伝子発現を破壊することなく、前記内因性アルブミンプロモーターの制御下で発現される、請求項41に記載の組換えウイルスベクター。
- 前記2つの独立した遺伝子産物が、前記MUT導入遺伝子から発現されるMUTタンパク質および内因性アルブミン遺伝子から発現される内因性アルブミンタンパク質である、請求項34〜43のいずれか一項に記載の組換えウイルスベクター。
- 前記細胞が肝細胞である、請求項34〜44のいずれか一項に記載の組換えウイルスベクター。
- 前記第2の核酸配列が、
a)2Aペプチド;
b)内部リボソーム侵入部位(IRES);
c)N末端インテインスプライシング領域およびC末端インテインスプライシング領域;または
d)スプライスドナーとスプライスアクセプター;
を含む、請求項34〜45のいずれか一項に記載の組換えウイルスベクター。 - 前記第3および第4の核酸配列が、前記MUT導入遺伝子および前記第2の核酸配列を、内因性アルブミンプロモーターと内因性アルブミン遺伝子とを含む内因性アルブミン遺伝子座中に組み込む相同性アームである、請求項34〜46のいずれかに記載の組換えウイルスベクター。
- 前記第3および第4の核酸配列が、前記内因性アルブミンプロモーターおよび前記内因性アルブミン遺伝子とインフレームに、前記MUT導入遺伝子および前記第2の核酸配列を内因性アルブミン遺伝子座中に組み込む相同性アームである、請求項47に記載の組換えウイルスベクター。
- 前記相同性アームが、前記内因性アルブミン遺伝子の開始コドンのすぐ3’側にまたは前記内因性アルブミン遺伝子の停止コドンのすぐ5’側に前記ポリヌクレオチドカセットの組み込みを指示する、請求項47または請求項48に記載の組換えウイルスベクター。
- 前記MUT導入遺伝子が、wtヒトMUT、コドン最適化されたMUT、合成MUT、MUTバリアント、MUT変異体またはMUT断片である、請求項34〜49のいずれか一項に記載の組換えウイルスベクター。
- 対象の組織中の細胞に、投与前には前記細胞によって機能的に発現されていない関心対象の産物をコードする導入遺伝子を送達する組成物の用量を前記対象に投与するステップを含む方法であって、前記導入遺伝子が、(i)前記関心対象の産物をコードし、(ii)複数の前記細胞のゲノム中の標的組み込み部位に組み込み、(iii)組み込まれると、前記関心対象の産物を機能的に発現し、(iv)時間の経過につれて、前記組織が、他の方法では同等の投与によって達成されるものより高いことが決定されている前記関心対象の産物の機能的発現のレベルを達成するように、前記組織中の他の細胞と比べて選択的有利性を前記複数の細胞に付与し、その中に前記導入遺伝子が組み込まれた前記細胞が、前記投与するステップ前に、前記関心対象の産物を機能的に発現し、
前記組成物が、
第1の核酸配列および第2の核酸配列を含むポリヌクレオチドであって、前記第1の核酸配列が前記導入遺伝子をコードし、前記第2の核酸配列が、前記第1の核酸配列に対して5’側または3’側に位置しており、前記導入遺伝子が前記標的組み込み部位に組み込まれたときに、2つの独立した遺伝子産物の産生を促進する、ポリヌクレオチドと、
前記ポリヌクレオチドに対して5’側に位置し、前記標的組み込み部位の5’側のゲノム配列に実質的に相同である配列を含む第3の核酸配列と、
前記ポリヌクレオチドに対して3’側に位置し、前記標的組み込み部位の3’側のゲノム配列に実質的に相同である配列を含む第4の核酸配列と、
を含む、方法。 - 前記導入遺伝子の前記組み込みがヌクレアーゼ活性を含まない、請求項51に記載の方法。
- 前記選択的有利性が、前記導入遺伝子を発現する前記組織中の細胞のパーセント増加を含む、請求項51または52に記載の方法。
- 前記組成物が組換えウイルスベクターを含む、請求項51〜53のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組換えウイルスベクターが組換えAAVベクターである、請求項54に記載の方法。
- 前記組換えウイルスベクターが、LK03、AAV8、AAV−DJ、AAV−LK03またはAAVNP59のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質である、または前記キャプシドタンパク質を含む、請求項55に記載の方法。
- 前記導入遺伝子がMUT導入遺伝子である、またはMUT導入遺伝子を含む、請求項51〜56のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組成物がAAV2 ITR配列をさらに含む、請求項51〜57のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドカセットがプロモーター配列を含まない、請求項51〜58のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドカセットが前記細胞のゲノム中の前記標的組み込み部位中に組み込まれると、前記導入遺伝子が、前記標的組み込み部位において内因性プロモーターの制御下で発現される、請求項51〜59のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的組み込み部位が、内因性アルブミンプロモーターと内因性アルブミン遺伝子とを含むアルブミン遺伝子座である、請求項60に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドカセットが細胞のゲノム中の前記標的組み込み部位中に組み込まれると、前記導入遺伝子が、前記内因性アルブミン遺伝子発現を破壊することなく、前記内因性アルブミンプロモーターの制御下で発現される、請求項61に記載の方法。
- 前記組織が肝臓である、請求項51〜62のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2の核酸配列が、
a)2Aペプチド;
b)内部リボソーム侵入部位(IRES);
c)N末端インテインスプライシング領域およびC末端インテインスプライシング領域;または
d)スプライスドナーとスプライスアクセプター;
を含む、請求項51〜63のいずれか一項に記載の方法。 - 前記第3および第4の核酸配列が、前記導入遺伝子および前記第2の核酸配列を、内因性アルブミンプロモーターと内因性アルブミン遺伝子とを含む内因性アルブミン遺伝子座中に組み込む相同性アームである、請求項51〜64のいずれか一項に記載の方法。
- 前記相同性アームが、前記内因性アルブミン遺伝子の開始コドンのすぐ3’側にまたは前記内因性アルブミン遺伝子の停止コドンのすぐ5’側に前記ポリヌクレオチドカセットの組み込みを指示する、請求項65に記載の方法。
- 前記MUT導入遺伝子が、wtヒトMUT、コドン最適化されたMUT、合成MUT、MUTバリアント、MUT変異体またはMUT断片である、請求項57に記載の方法。
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