JP2020500541A - ヒト化デュシェンヌ型筋ジストロフィー変異を有するｄｍｄレポーターモデル - Google Patents

Abstract

CRISPR/Cas9によるゲノム編集は、ジストロフィン遺伝子における変異によって引き起こされるデュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）などの遺伝子疾患を処置するための臨床的可能性を持っている。遺伝子編集構成要素機構のインビボAAV媒介性送達は、DMDのモデルである出生後mdxマウスの心筋細胞および骨格筋細胞において、変異体配列を除去して、エクソンスキッピングを生じることに成功したことが示されている。様々な様式のAAV9送達を用いて、mdxマウスの心筋および骨格筋におけるジストロフィンタンパク質発現の回復が達成された。本明細書において、DMDを治癒させるゲノム編集の有効性試験を補助するために、DMDのヒト化マウスモデルを作製する。加えて、インビボでの非侵襲的様式におけるエクソンスキッピング戦略の解析を容易にするために、レポータールシフェラーゼノックインバージョンのマウスモデルを調製した。これらのヒト化マウスモデルは、インビボでDMDの原因となる変異の修正を研究する能力を提供する。

Description

優先権の主張
本出願は、2016年12月8日に出願された米国特許仮出願第62/431,699号の優先権の恩典を主張し、その内容全体は、参照により本明細書に組み入れられる。

連邦政府による資金援助の条項
本発明は、米国国立衛生研究所（National Institutes of Health）によって授与された助成金番号U54 HD 087351の下、政府援助で行われた。政府は、本発明においてある一定の権利を有する。

配列表
本出願は配列表を含み、それはASCII形式で電子的に提出されており、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。2017年12月7日に作成されたこのASCIIコピーはUTFD_P3125WO.txtという名称であり、サイズは186,485バイトである。

本開示の分野
本開示は、分子生物学、医学、および遺伝学の分野に関する。より詳しくは、本開示は、様々な形態のデュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）についての、各々が別個のDMD変異を含有するヒト化動物モデルを作製するための、ゲノム編集の使用に関する。

背景
筋ジストロフィー（MD）は、運動を制御する骨格筋の進行性の衰弱および変性を特徴とする、30種類を超える遺伝子疾患の群である。デュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）は、5000人におよそ1人の男児に影響を及ぼすMDの最も重篤な形態の1つであり、進行性の筋衰弱および早期死亡を特徴とする。心筋症および心不全が、DMDの一般的な不治の致死的な特徴である。この疾患は、細胞表面にあるジストログリカン複合体を下にある細胞骨格と連結し、それによって収縮中の筋細胞膜の完全性を維持する大きな細胞内タンパク質であるジストロフィンをコードする遺伝子（DMD）における変異によって引き起こされる。ジストロフィン遺伝子における変異は、ジストロフィンの発現の消失を結果としてもたらし、筋膜の脆弱性および進行性の筋消耗を引き起こす。

概要
筋芽細胞移入、ウイルス送達、およびオリゴヌクレオチド媒介性エクソンスキッピングを含む、様々なアプローチを通じた治療法を見出す熱心な努力にもかかわらず、筋ジストロフィーのいずれのタイプについてもいかなる治療法もないままである。本発明者らは、最近、CRISPR/Cas9（clustered regularly interspaced short palindromic repeat/Cas9）媒介性ゲノム編集を用いて、DMDについてのモデルである出生後mdxマウスにおいてジストロフィン遺伝子（DMD）変異を修正した。遺伝子編集構成要素のインビボでのAAV媒介性送達は、mdxマウスの心筋細胞および骨格筋細胞におけるエクソンスキッピングによって、変異体ゲノム配列を除去することに成功した。様々な様式のAAV9送達を用いて、本発明者らは、mdxマウスの心筋および骨格筋において、ジストロフィンタンパク質発現を回復した。mdxマウスモデル、および筋編集（myoediting）機構のAAV送達を用いた修正エクソン23は、インビボでの変異を包含するゲノム領域におけるいくつかの切断を用いたエクソンスキッピングアプローチの概念実証を示すのに有用である。しかし、種々の公知のDMD変異について、および発見され続けている新たな変異について、他のモデルが欠如している。

いくつかの態様において、組成物は、Cas9ポリペプチドをコードする配列、第1のゲノム標的配列を標的とする第1のガイドRNA（gRNA）をコードする配列、および第2のゲノム標的配列を標的とする第2のgRNAをコードする配列を含み、第1および第2のゲノム標的配列は各々、マウスジストロフィン遺伝子のエクソンを囲むイントロン配列を含む。いくつかの態様において、エクソンは、マウスジストロフィン遺伝子のエクソン50を含む。いくつかの態様において、Cas9ポリペプチドをコードする配列は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）Cas9ポリペプチドをコードする配列から単離されているか、またはそれに由来する。いくつかの態様において、Cas9ポリペプチドをコードする配列、第1のgRNAをコードする配列、または第2のgRNAをコードする配列のうちの少なくとも1つは、RNA配列を含む。いくつかの態様において、RNA配列は、mRNA配列を含む。いくつかの態様において、RNA配列は、少なくとも1個の化学的に修飾されたヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、Cas9ポリペプチドをコードする配列、第1のgRNAをコードする配列、または第2のgRNAをコードする配列のうちの少なくとも1つは、DNA配列を含む。

いくつかの態様において、第1のベクターが、Cas9ポリペプチドをコードする配列を含み、第2のベクターが、第1のgRNAをコードする配列または第2のgRNAをコードする配列のうちの少なくとも1つを含む。いくつかの態様において、第1のベクターまたはCas9ポリペプチドをコードする配列は、第1のポリA配列をさらに含む。いくつかの態様において、第2のベクターまたは第1のgRNAをコードする配列または第2のgRNAをコードする配列は、第2のポリA配列をコードする。いくつかの態様において、第1のベクターまたはCas9ポリペプチドをコードする配列は、第1のプロモーター配列をさらに含む。いくつかの態様において、第2のgRNAは、第2のプロモーター配列を含む。いくつかの態様において、第1のプロモーター配列と第2のプロモーター配列とは同一である。いくつかの態様において、第1のプロモーター配列と第2のプロモーター配列とは同一ではない。いくつかの態様において、第1のプロモーター配列または第2のプロモーター配列は、CK8プロモーター配列を含む。いくつかの態様において、第1のプロモーター配列または第2のプロモーター配列は、CK8eプロモーター配列を含む。いくつかの態様において、第1のプロモーター配列または第2のプロモーター配列は、構成的プロモーターを含む。いくつかの態様において、第1のプロモーター配列または第2のプロモーター配列は、誘導性プロモーターを含む。

いくつかの態様において、第1のベクターおよび第2のベクターのうちの少なくとも1つは、非ウイルスベクターである。いくつかの態様において、非ウイルスベクターはプラスミドである。いくつかの態様において、リポソームまたはナノ粒子が、非ウイルスベクターを含む。いくつかの態様において、第1のベクターおよび第2のベクターのうちの少なくとも1つは、ウイルスベクターである。いくつかの態様において、ウイルスベクターはアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターである。AAVベクターは、複製欠損型または条件付き複製欠損型であり得る。いくつかの態様において、AAVベクターは組換えAAVベクターである。いくつかの態様において、AAVベクターは、血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、またはそれらの任意の組み合わせのうちのAAVベクターから単離されたか、またはそれに由来する配列を含む。

いくつかの態様において、1つのベクターが、Cas9ポリペプチドをコードする配列、第1のgRNAをコードする配列、および第2のgRNAをコードする配列を含む。複数の態様において、ベクターはポリA配列をさらに含む。複数の態様において、ベクターはプロモーター配列をさらに含む。複数の態様において、プロモーター配列は構成的プロモーターを含む。複数の態様において、プロモーター配列は誘導性プロモーターを含む。複数の態様において、プロモーター配列はCK8プロモーター配列を含む。複数の態様において、プロモーター配列はCK8eプロモーター配列を含む。

複数の態様において、組成物は、哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化された配列を含む。複数の態様において、組成物は、ヒト細胞またはマウス細胞における発現のためにコドン最適化された配列を含む。いくつかの態様において、Cas9ポリペプチドをコードする配列は、ヒト細胞またはマウス細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの態様において、本開示の組成物は、薬学的担体をさらに含む。

いくつかの態様において、細胞が、本開示の組成物を含む。複数の態様において、細胞はマウス細胞である。いくつかの態様において、細胞は卵母細胞である。複数の態様において、組成物は、この細胞を含み得る。複数の態様において、遺伝子操作されたマウスが、この細胞を含み得る。いくつかの態様において、遺伝子操作されたマウスを作製するための方法は、この細胞をマウスと接触させる工程を含む。

いくつかの態様において、遺伝子操作されたマウスが提供され、このマウスのゲノムは、ジストロフィン遺伝子のエクソン51においてアウトオブフレームシフトおよび中途終止コドンを結果としてもたらす、ジストロフィン遺伝子のエクソン50の欠失を含む。いくつかの態様において、遺伝子操作されたマウスは、ジストロフィン遺伝子のエクソン79の下流にそれとインフレームで位置しかつジストロフィン3'-UTRの上流に位置するレポーター遺伝子であって、エクソン79がエクソン49とインフレームで翻訳される時に発現されるレポーター遺伝子を、さらに含む。いくつかの態様において、レポーター遺伝子はルシフェラーゼである。いくつかの態様において、遺伝子操作されたマウスは、レポーター遺伝子の上流にありそれとインフレームである、かつエクソン79の下流にありそれとインフレームである、プロテアーゼコード配列をさらに含む。いくつかの態様において、プロテアーゼは自己触媒性である。いくつかの態様において、プロテアーゼは2Aプロテアーゼである。

いくつかの態様において、遺伝子操作されたマウスは、欠失についてヘテロ接合性である。いくつかの態様において、遺伝子操作されたマウスは、欠失についてホモ接合性である。いくつかの態様において、マウスは、野生型マウスと比較して増大したクレアチンキナーゼレベルを呈する。いくつかの態様において、マウスは、心臓または骨格筋において検出可能なジストロフィンタンパク質を呈さない。

いくつかの態様において、遺伝子操作されたマウスを作製する方法は、受精した卵母細胞を、CRISPR/Cas9エレメントと、ジストロフィン遺伝子のエクソン50に隣接する配列を標的とする2種類のシングルガイドRNA（sgRNA）と接触させ、それによって改変卵母細胞を作製する工程であって、CRISPR/Cas9によるエクソン50の欠失が、ジストロフィン遺伝子のエクソン51においてアウトオブフレームシフトおよび中途終止コドンを結果としてもたらす、工程；ならびに、改変卵母細胞をレシピエント雌に移入する工程を含む。いくつかの態様において、卵母細胞は、ジストロフィン遺伝子のエクソン79の下流にそれとインフレームで位置しかつジストロフィン3'-UTRの上流に位置するレポーター遺伝子であって、エクソン79がエクソン49とインフレームで翻訳される時に発現されるレポーター遺伝子を有する、ジストロフィン遺伝子を含む。いくつかの態様において、レポーター遺伝子はルシフェラーゼである。いくつかの態様において、卵母細胞は、レポーター遺伝子の上流にありそれとインフレームである、かつエクソン79の下流にありそれとインフレームである、プロテアーゼコード配列を含む。複数の態様において、プロテアーゼは自己触媒性である。複数の態様において、プロテアーゼは2Aプロテアーゼである。複数の態様において、マウスは、欠失についてヘテロ接合性である。複数の態様において、マウスは、欠失についてホモ接合性である。複数の態様において、マウスは、野生型マウスと比較して増大したクレアチンキナーゼレベルを呈する。複数の態様において、マウスは、心臓または骨格筋において検出可能なジストロフィンタンパク質を呈さない。

いくつかの態様において、単離された細胞は、本開示の遺伝子操作されたマウスから取得される。いくつかの態様において、細胞は、ジストロフィン遺伝子のエクソン79の下流にそれとインフレームで位置しかつジストロフィン3'-UTRの上流に位置するレポーター遺伝子であって、エクソン79がエクソン49とインフレームで翻訳される時に発現されるレポーター遺伝子を含む。いくつかの態様において、レポーター遺伝子はルシフェラーゼである。いくつかの態様において、細胞は、レポーター遺伝子の上流にありそれとインフレームである、かつエクソン79の下流にありそれとインフレームである、プロテアーゼコード配列を含む。いくつかの態様において、プロテアーゼは自己触媒性である。いくつかの態様において、プロテアーゼは2Aプロテアーゼである。いくつかの態様において、細胞は、欠失についてヘテロ接合性である。いくつかの態様において、細胞は、欠失についてホモ接合性である。

いくつかの態様において、遺伝子操作されたマウスは、受精した卵母細胞を、CRISPR/Cas9エレメントと、ジストロフィン遺伝子のエクソン50に隣接する配列を標的とする2種類のシングルガイドRNA（sgRNA）とに接触させ、それによって改変卵母細胞を作製する工程であって、CRISPR/Cas9によるエクソン50の欠失が、ジストロフィン遺伝子のエクソン51においてアウトオブフレームシフトおよび中途終止コドンを結果としてもたらす、工程；ならびに、改変卵母細胞をレシピエント雌に移入する工程を含む、方法によって作製される。

いくつかの態様において、DMDエクソンスキッピング活性についての候補物質をスクリーニングする方法は、請求項43、46、47、または74のいずれか一項に記載のマウスを、候補物質と接触させる工程；ならびに、ジストロフィン遺伝子のエクソン79のインフレームの転写および／または翻訳を評価する工程を含み、エクソン79のインフレームの転写および／または翻訳の存在が、候補物質がエクソンスキッピング活性を呈することを示す。

いくつかの態様において、遺伝子操作されたマウスを作製する方法は、受精した卵母細胞を、CRISPR/Cpf1エレメントと、ジストロフィン遺伝子のエクソン50に隣接する配列を標的とする2種類のシングルガイドRNA（sgRNA）とに接触させ、それによって改変卵母細胞を作製する工程であって、CRISPR/Cpf1によるエクソン50の欠失が、ジストロフィン遺伝子のエクソン51においてアウトオブフレームシフトおよび中途終止コドンを結果としてもたらす、工程；ならびに、改変卵母細胞をレシピエント雌に移入する工程を含む。

いくつかの態様において、遺伝子操作されたマウスは、受精した卵母細胞を、CRISPR/Cpf1エレメントと、ジストロフィン遺伝子のエクソン50に隣接する配列を標的とする2種類のシングルガイドRNA（sgRNA）とに接触させ、それによって改変卵母細胞を作製する工程であって、CRISPR/Cpf1によるエクソン50の欠失が、ジストロフィン遺伝子のエクソン51においてアウトオブフレームシフトおよび中途終止コドンを結果としてもたらす、工程；ならびに、改変卵母細胞をレシピエント雌に移入する工程を含む、方法によって作製される。

本明細書に記載の任意の方法または組成物を、本明細書に記載の任意の他の方法または組成物に関して遂行できることが想定される。

本開示の他の目的、特徴、および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、本開示の精神および範囲内の様々な変更および改変がこの詳細な説明から当業者に明らかになるので、詳細な説明および具体例は、本開示の具体的な態様を示しながらも、例証の目的で与えられているにすぎないものと理解されるべきである。

以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本開示のある特定の局面をさらに実証するために含まれる。本開示は、本明細書に提示される具体的な態様の詳細な説明と組み合わせてこれらの図面の1つまたは複数を参照することによってさらによく理解されるであろう。
（図１）「ヒト化」ΔEx50マウスモデル。（図1A）マウスの生成のために用いたCRISPR/Cas9戦略の概略。（図1B）エクソン50の喪失を検証するためのRT-PCR解析。（図1C）エクソンの喪失およびアウトオブフレーム配列の生成を検証するためのRT-PCRバンドの配列解析。

（図1D）筋損傷および膜漏出を反映する筋ジストロフィーのマーカーである血清クレアチンキナーゼ（CK）を、野生型（WT）、ΔEx50、およびmdxマウスにおいて測定した。（図1E）骨格筋および心筋のヘマトキシリン・エオシン（H＆E）染色およびジストロフィン染色。スケールバー：50μm。
（図２）ルシフェラーゼレポーターマウスモデル。（図2A）ジストロフィンレポーターマウスの作製のための戦略の模式図。ジストロフィン（Dmd）遺伝子をエクソンと共に、青色で示す。CRISPR/Cas9変異誘発を用いて、本発明者らは、ジストロフィンコード領域の3'末端にプロテアーゼ2A切断部位を有するルシフェラーゼレポーターを挿入した。（図2B）野生型（WT）およびDmdノックインルシフェラーゼレポーターマウスの生物発光イメージング。
（図３）ルシフェラーゼDmd変異体レポーターマウスモデル。（図3A）Δex50ルシフェラーゼレポーターマウスを生成するための戦略の模式的概略。（図3B）ΔEx50-Dmd-KI-ルシフェラーゼレポーターマウスの遺伝子型判定結果。フォワード（Fw）プライマーおよびリバース（Rv）プライマーでの遺伝子型判定戦略の模式的図解。（図3C）野生型（WT）、Dmdノックインルシフェラーゼレポーター、およびΔex50-Dmdノックインルシフェラーゼレポーターマウスの生物発光イメージング。（図3D）骨格筋および心臓組織におけるジストロフィン（DMD）、ルシフェリン、およびビンキュリン（VCL）発現のウェスタンブロット解析。
（図４）ΔEx50-KI-ルシフェラーゼマウスにおけるCRISPR/Cas9媒介性ゲノム編集のための戦略。（図4A）エクソン51をスキッピングすることによってΔEx50-KI-ルシフェラーゼマウスにおいてリーディングフレームを修正するための、CRISPR/Cas9媒介性ゲノム編集アプローチを示す略図。灰色のエクソンは、アウトオブフレームである。（図4B）sgRNA-ex51-SAについてのsgRNA結合位置および配列の図解。sgRNAについてのPAM配列を、赤色で示す。黒色矢印は、切断部位を示す。（図4C）10T1/2細胞においてエクソン51標的部位にわたって生成させたPCRアンプリコンのゲノムディープシークエンシング解析。挿入（緑色で強調）および欠失（赤色で強調）を明らかにする、sgRNA配列（青色で示す）と整列させた代表的なインデル（indel）の配列。線は、sgRNAの部位に位置する予測エクソンスプライシングエンハンサー（ESE）配列を示す。黒色矢印は、切断部位を示す。（図4C）筋肉クレアチンキナーゼ8（CK8e）プロモーターを、SpCas9を発現するために用いた。RNAポリメラーゼIIIのためのU6、H1、および7SKプロモーターを、sgRNAを発現するために用いた。
（図５）AAV9の筋肉内注射によるジストロフィン発現の修正のインビボ調査。（図5A）ΔEx50-KI-ルシフェラーゼマウスのTA筋に、sgRNAおよびCas9をコードするAAV9を注射した。ΔEx50-KI-ルシフェラーゼマウスを、生物発光によって毎週解析した。（図5B）sgRNAおよびCas9をコードするAAV9を注射した野生型（WT）、Dmd KI-ルシフェラーゼレポーター、およびΔEx50-KI-ルシフェラーゼレポーターマウスの、注射の1週間後および3週間後の生物発光イメージング。（図5C）sgRNAおよびCas9をコードするAAV9を注射した野生型（WT）、Dmd KI-ルシフェラーゼレポーター、およびΔEx50-KI-ルシフェラーゼレポーターマウスの前脛骨筋全体のジストロフィン免疫組織化学。（図5D）sgRNAおよびCas9をコードするAAV9を注射した野生型（WT）、Dmd KI-ルシフェラーゼレポーター、およびΔEx50-KI-ルシフェラーゼレポーターマウスの前脛骨筋のジストロフィン免疫組織化学。

詳細な説明
DMDは、ヒトにおいて4,000個を超える独立した変異の同定されている新たな変異症候群である（ワールドワイドウェブdmd.nl）。患者の変異の大多数は、ホットスポットに集中した欠失を保有しているため、ある特定のエクソンをスキッピングする治療アプローチは、多くの患者に適する。エクソンスキッピングアプローチの原理は、DMD患者とベッカー型筋ジストロフィー（BMD）患者との間の遺伝学的な差に基づく。DMD患者においては、ジストロフィンmRNAのリーディングフレームが破壊され、中途で短縮された非機能的なジストロフィンタンパク質を結果としてもたらす。BMD患者は、内部が欠失しているが部分的には機能的なジストロフィンの産生を可能にするリーディングフレームを維持する、DMD遺伝子における変異を有し、それは、DMD患者と比較してずっと軽度の疾患症状をもたらす。

DMDにおける1つの最も一般的なホットスポットは、エクソン45と51との間であり、エクソン51のスキッピングが、最大の群（すなわち、DMD変異の13〜14％）にあてはまると考えられる。さらに効率を評価し、インビボでのCRISPR/Cas9媒介性エクソンスキッピングを最適化するために、2種類のシングルガイドRNA（sgRNA）によって方向づけられるCRISPR/Cas9システムを用いてエクソン50を欠失させることによって、ヒト「ホットスポット」領域の模倣物をマウスモデルにおいて生成した。ΔEx50マウスモデルは、ジストロフィー筋線維および増大した血清クレアチンキナーゼレベルを呈するため、DMDの代表的なモデルを提供する。インビボでかつ非侵襲的様式でエクソンスキッピング戦略の解析を加速するために、ルシフェラーゼ発現カセットを、ルシフェラーゼがジストロフィンのエクソン79とインフレームで翻訳されるように、Dmd遺伝子の3'末端中へ挿入することによって、レポーターマウスを生成した。次いで、同じ2種類のsgRNAを用いて、Dmd-ルシフェラーゼ系統においてエクソン50を欠失させ、ΔEx50-Dmd-ルシフェラーゼマウスを生成した。Dmd-ルシフェラーゼ系統におけるエクソン50の欠失は、骨格筋および心臓において生物発光シグナルの減少を結果としてもたらした。本開示のこれらの局面および他の局面を、下記で再現する。

I. デュシェンヌ型筋ジストロフィー
A. 背景
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）は、男児のおよそ5000人に1人が罹患する、筋肉変性および早期死亡をもたらす劣性X連鎖型の筋ジストロフィーである。この障害は、以下に再現する配列のタンパク質ジストロフィン（GenBankアクセッション番号AAA53189; SEQ ID NO.383）をコードする、ヒトX染色体上に位置する遺伝子ジストロフィン（GenBankアクセッション番号NC_000023.11を参照のこと）の変異によって引き起こされる。

ヒトでは、ジストロフィンmRNAは、79のエクソンを含有する。ジストロフィンmRNAは、選択的にスプライシングされ、様々なアイソフォームをもたらすことが知られている。例示的なジストロフィンアイソフォームを表1に列挙する。

（表１）ジストロフィンアイソフォーム

マウスジストロフィンタンパク質は以下のアミノ酸配列を有する（Uniprotアクセッション番号P11531、SEQ. ID. NO. 786）：

ジストロフィンは、細胞膜のジストログリカン複合体（DGC）に構造的安定性を提供する、筋組織内の重要な成分である。どちらの性別も変異を保有し得るが、女性は骨格筋形態の疾患の影響を受けることはめったにない。

変異は、性質および頻度が異なる。大きな遺伝子欠失が症例の約60〜70％において見出され、大きな重複が症例の約10％において見出され、点変異または他の小さな変化が症例の約15〜30％を占める。約7000個の変異を検討したBladen et al. (2015)は、合計で5,682個の大きな変異（全変異の80％）をカタログ化し、そのうちの4,894個（86％）は欠失（1エクソンまたはそれよりも大きい）であり、784個（14％）は重複（1エクソンまたはそれよりも大きい）であった。1,445個の小さな変異（1エクソンよりも小さい、すべての変異の20％）があり、そのうちの 358個（25％）は小さな欠失であり、132個（9％）は小さな挿入であり、他方、199個（14％）はスプライス部位に影響を及ぼした。点変異は、合計で756個（小さな変異の52％）であり、726個（50％）がナンセンス変異、30個（2％）がミスセンス変異であった。最後に、22個（0.3％）のイントロン中変異が観察された。加えて、終止コドンリードスルー療法（全変異の10％）およびエクソンスキッピング療法（欠失の80％および全変異の55％）を含む、DMDについての新規遺伝子治療から恩恵を受けるであろう変異が、データベース内で特定された。

B. 症状
症状は、通常、2〜3歳の男児に現れ、早期幼児期に見られることもある。早期幼児期まで症状が現れなくても、検査室試験により、出生時に活性変異を保有する子供を特定することができる。筋肉量の損失に関連する脚および骨盤の進行性の近位筋衰弱が最初に観察される。最終的に、この衰弱は、腕、首、および他の領域に広がる。初期の徴候は、仮性肥大（ふくらはぎおよび三角筋の腫脹）、低持久力、および、助けなしで起立することが困難、または階段を上ることができないことを含み得る。病状が進行するにつれて、筋組織は、消耗を経験し、最終的には脂肪および線維性組織に置き換えられる（線維症）。10歳までに歩行を補助するために支持具が必要となることがあり、ほとんどの患者は、12歳までに車椅子に頼る。その後の症状は、脊椎湾曲を含め、骨格の変形を導く異常な骨発達を含み得る。進行性の筋肉劣化に起因して、運動の消失が起こり、最終的に麻痺に至る。知的障害が存在する可能性も、存在しない可能性もあるが、存在しても、子供が年を取るにつれて次第に悪化することはない。DMDに罹患している男性の平均余命は25歳前後である。

進行性の神経筋障害であるデュシェンヌ型筋ジストロフィーの主な症状は、筋肉消耗に伴う筋衰弱であり、随意筋、とりわけ臀部、骨盤領域、大腿部、肩部、およびふくらはぎの随意筋が最初に侵される。筋衰弱はまた、後に、腕、首、および他の領域でも生じる。ふくらはぎが腫脹することが多い。症状は、通常、6歳より前に現れ、早期幼児期に現れることもある。他の身体症状は以下のとおりである。
・ぎこちない歩き方、足踏み方、または走り方（患者は、ふくらはぎの筋肉緊張の増大のため、足の前部で歩く傾向がある。また、つま先歩きは、膝伸筋の衰弱に対する代償的適応である。）
・頻繁な転倒
・疲労
・運動技能（ランニング、ホッピング、ジャンピング）の障害
・股関節屈筋の短縮を導くおそれのある、腰椎の脊柱前彎過度。これは、姿勢全体、および歩き方、足踏み方、または走り方に影響を及ぼす。
・アキレス腱および膝腱の筋拘縮は、結合組織において筋線維が短くなり線維形成を起こすので、機能を損なう。
・進行性の歩行困難
・筋線維の変形
・舌およびふくらはぎの筋肉の仮性肥大（腫脹）。筋組織は最終的に脂肪および結合組織により置き換えられるため、仮性肥大という語を用いる。
・脳内のジストロフィンの非存在または機能不全の結果であると考えられる、神経行動障害（例えば、ADHD）、学習障害（失読症）、および特定の認知技能（特に短期言語記憶）の非進行性衰弱の高いリスク
・歩く能力の最終的損失（通常は12歳までに）
・骨格の変形（場合によっては脊柱側彎を含む）
・臥位または座位から起き上がることが困難

この病状は、しばしば、患者が最初の措置を講じたときから臨床的に観察することができ、通常、患者が9歳〜12歳の間に歩行能力が完全に失われる。DMDに罹患したほとんどの男性は、21歳までに、本質的に「首より下が麻痺する」ようになる。筋肉消耗は、脚および骨盤で始まり、次に肩および首の筋肉に進行し、続いて腕の筋肉および呼吸筋が損失する。ふくらはぎの筋肉の腫脹（仮性肥大）が一目瞭然である。心筋症、特に（拡張型心筋症）が一般的であり、鬱血性心不全または不整脈（不規則な心拍）の発症はごくまれである。

ガワーズ徴候陽性は、下肢筋肉のより重度の障害を反映する。子供は、上肢で起き上がる：初めに腕と膝で立ち上がり、次いで手を脚の上まで「歩行させて」直立する。罹患した子供は、通常、より疲れやすく、同等者よりも全体的な力が弱い。クレアチンキナーゼ（CPK-MM）の血流レベルは極めて高い。筋電図検査（EMG）は、衰弱が神経への損傷ではなく筋組織の破壊によって引き起こされていることを示す。遺伝子検査は、Xp21遺伝子の遺伝的誤りを明らかにすることができる。筋生検（免疫組織化学もしくは免疫ブロッティング）または遺伝子検査（血液検査）は、ジストロフィンの非存在を確認するが、遺伝子検査の改善によってこれは不要になることが多い。

その他の症状は以下を含む。
・異常な心筋（心筋症）
・鬱血性心不全または不規則な心拍リズム（不整脈）
・胸部および背部の変形（脊柱側彎）
・ふくらはぎ、臀部、および肩の筋腫脹（4歳または5歳前後）。これらの筋肉は最終的に、脂肪および結合組織により置き換えられる（仮性肥大）。
・筋肉量の損失（萎縮）
・かかと、脚の筋拘縮
・筋肉の変形
・食物または流体が肺に流入することに伴う肺炎および嚥下を含む、呼吸器障害（疾患の後期段階において）

C. 原因
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）は、X染色体の短腕に位置する遺伝子座Xp21のジストロフィン遺伝子の変異によって引き起こされる。ジストロフィンは、多くのサブユニットを含有するタンパク質複合体を通じて、各筋線維の細胞骨格を、基礎となる基底層（細胞外マトリックス）に接続する役割を担う。ジストロフィンが存在しないと、過剰なカルシウムが筋線維鞘（細胞膜）に浸透する。カルシウムおよびシグナル伝達経路の変化により水がミトコンドリアに侵入し、次いでミトコンドリアが破裂する。

骨格筋ジストロフィーでは、ミトコンドリア機能不全が、ストレス誘発性サイトゾルカルシウムシグナルの増幅およびストレス誘発性活性酸素種（ROS）産生の増幅を生じる。いくつかの経路を含むが明確に理解されていない複雑なカスケードプロセスにおいて、細胞内の酸化ストレスの増加が筋線維鞘に損傷を与え、最終的には細胞死をもたらす。筋線維が壊死を起こし、最終的に脂肪および結合組織に置き換えられる。

DMDは、X連鎖劣性パターンで遺伝する。女性が典型的にはこの疾患の保因者になり、男性が罹患する。典型的には、女性保因者は、罹患した息子を産むまでは変異を保有することに気付かないであろう。保因者の母親の息子は、母親から欠陥遺伝子を引き継ぐ可能性が50％ある。保因者の母親の娘は、保因者である可能性が50％であり、遺伝子の2つの正常コピーを有する可能性が50％ある。いかなる場合でも、罹患していない父親は、正常なYを息子に、または正常なXを娘に譲り渡す。DMDなどのX連鎖劣性状態の女性保因者は、X不活性化のパターンによっては症状を示し得る。

フレーム外エクソンを並列することによってオープンリーディングフレーム（ORF）を破壊する、ヒトDMD遺伝子のエクソン51の前のエクソン欠失が、最も一般的なタイプのヒトDMD変異である。エクソン51のスキッピングは、原理上、エクソン欠失を有するDMD患者の13％でDMD ORFを回復させることができる。

デュシェンヌ型筋ジストロフィーは、男児の5000人に1人の発生率を有する。ジストロフィン遺伝子内の変異は、生殖細胞系伝達の間に遺伝するかまたは自発的に発生し得る。例であって限定的でない変異および対応するモデルの表を以下に示す。

D. 診断
この障害の家族歴を有する人には、遺伝カウンセリングが推奨される。デュシェンヌ型筋ジストロフィーは、妊娠中に行われる遺伝子検査によって約95％の精度で検出できる。

DNA検査
ジストロフィン遺伝子の筋肉特異的アイソフォームは、79のエクソンから構成され、通常、DNA検査および分析で、影響を受けるエクソンの特定のタイプの変異を同定することができる。ほとんどの場合に、DNA検査が診断を確定する。

筋生検
DNA検査で変異を見つけられない場合は、筋生検検査が行われることがある。小さな筋組織サンプルを抽出し（通常は針の代わりにメスで）、ジストロフィンの存在を明らかにする色素を適用する。そのタンパク質の完全な非存在は、その病状を示唆する。

過去数年間に、病状を引き起こす多数の変異をより多く検出するDNA検査が開発されており、デュシェンヌの存在を確認するために頻繁に筋生検が必要となることはない。

出生前検査
DMDは、X連鎖劣性遺伝子によって運ばれる。男性はX染色体を1つしか持たないので、変異した遺伝子の1コピーがDMDを引き起こす。父親はX連鎖形質を息子に譲り渡すことができないので、変異は母親によって伝達される。

母親が保因者であって、2つのX染色体のうちの1つがDMD変異を有する場合、女児がその変異を2つのX染色体の1つとして引き継ぎ、保因者になる可能性が50％ある。男児がその変異を1つのX染色体として引き継ぎ、それ故DMDを有する可能性が50％ある。

出生前検査は、まだ生まれていない子供が最も一般的な変異を有するかどうかに答えることができる。DMDに関与する多くの変異が存在するが、一部は同定されていないので、遺伝子検査は、DMDを有する家族が同定されている変異を有する場合にのみ機能する。

侵襲的検査の前に、胎児の性別の判定が重要である。男性はこのX連鎖疾患の影響を受けることがあるが、女性のDMDは極めて稀である。これは、最近では無料の胎児DNA検査により16週以上の時点で超音波スキャンによって達成することができる。絨毛膜標本採取（CVS）は、11〜14週時に行うことができ、1％の流産リスクを有する。羊水穿刺は、15週後に行うことができ、0.5％の流産リスクを有する。胎児の採血は、約18週時に行うことができる。不明確な遺伝子検査結果の場合の別の選択肢は、胎児筋生検である。

E. 処置
DMDに対する現行の治癒法はなく、継続的な医学的必要性が規制当局によって認識されている。ある特定の変異に対するエクソンスキッピング処置を用いた第1〜2a相試験は、歩行の減退を中断し、わずかな臨床的改善をもたらした。処置は、一般に、生活の質を最大限にするために症状の発症を制御することを目的とし、以下を含む：
・プレドニゾロンおよびデフラザコートなどのコルチコステロイドは、エネルギーおよび強度を高め、いくつかの症状の重症化を遅らせる。
・ランダム化比較試験は、ベータ-2-アゴニストが筋力を増加させるが、疾患の進行を改変しないことを示している。ベータ2-アゴニストでのほとんどのRCTの経過観察時間は、わずか12ヶ月前後であり、よってその時間枠を超えて結果を推定することはできない。
・水泳などの、軽度な不快でない身体活動が推奨される。不活動であること（ベッドでの静養など）は、筋肉疾患を悪化させ得る。
・理学療法は、筋力、柔軟性、および機能を維持するのに役立つ。
・矯正装具（支持具および車椅子など）は、移動性および自己ケア能力を改善し得る。睡眠中に足首を適切な位置で支える、体にぴったり合った取り外し可能な脚支持具は、拘縮の発症を遅らせることができる。
・疾患の進行に応じて適切な呼吸補助が重要である。

DMDの包括的な集学的ケアスタンダード/ガイドラインは、疾病管理予防センター（CDC）によって開発されており、www.treat-nmd.eu/dmd/care/diagnosis-management-DMDで入手可能である。

DMDは、Bushby et al., Lancet Neurol., 9(1): 77-93 (2010) および Bushby et al., Lancet Neurol., 9(2): 177-198 (2010)（参照によってその全体が組み入れられる）に概説されているように、一般に5つの段階を経て進行する。発症前期の間、患者は、典型的には、発達遅延を示すが、歩行障害はない。初期の歩行可能期の間、患者は、典型的には、ガワーズ徴候、動揺歩行、およびつま先歩きを示す。後期の歩行可能期の間、患者は、典型的には、次第に苦しい歩行を見せ、階段を上るおよび床から起き上がる能力が失われ始める。初期の非歩行可能期の間、患者は、典型的には、しばらくの間は自力で進むことができ、姿勢を保つことができ、脊柱側彎を発症し得る。後期の非歩行可能期の間、上肢機能および姿勢保持は、次第に制限される。

いくつかの態様において、処置は、疾患の発症前期に開始される。いくつかの態様において、処置は、初期の歩行可能期に開始される。いくつかの態様において、処置は、後期の歩行可能期に開始される。複数の態様において、処置は、初期の非歩行可能期の間に開始される。複数の態様において、処置は、後期の非歩行可能期の間に開始される。

1. 理学療法
理学療法士は、患者が身体的潜在性を最大限に発揮できるようにすることに携わる。彼らの目的は、以下を行うことである：
・必要に応じてストレッチおよび運動のプログラムを開発することによって拘縮および変形の発症を最小限に抑えること
・固定具および耐久性のある医療機器を推薦することによって、身体的な性質の他の二次的合併症を予測し、最小限に抑えること
・呼吸機能を監視し、呼吸運動を補助するための技法および分泌物を取り除く方法について助言すること。

2. 呼吸補助
呼吸のたびに調節可能な体積（量）の空気を人に送達する最新の「従量式酸素吸入器/人工呼吸器」が、筋ジストロフィーに関連した呼吸障害を有する人の処置において有益である。酸素吸入器は、空気を直接送達する侵襲性の気管内チューブまたは気管切開チューブを必要とすることもあるが、一部の人には、フェイスマスクまたはマウスピースによる非侵襲性の送達で十分である。この後者の方法においては、気道陽圧装置、特に二相性の気道陽圧装置が使用されることもある。呼吸具は、携行性のために外部バッテリを備えた電動車椅子の底面または背面の酸素吸入器トレイに容易に適合し得る。

呼吸筋が崩壊し始める可能性があるとき、酸素吸入器処置を十代の半ばから後半に始め得る。肺活量が正常の40％未満に低下した場合、人が換気低下状態（「低換気」）にある可能性が最も高い時間である睡眠時間中に、従量式酸素吸入器/人工呼吸器を使用し得る。睡眠中の低換気は、睡眠障害の詳しい病歴と酸素測定試験および毛細血管血のガスとによって判定される（肺機能検査を参照のこと）。咳補助装置は、肺の過膨張による肺内の過剰な粘液を陽気圧で、次いで陰圧で粘液を上昇させることに役立ち得る。肺活量が正常の30パーセント未満に減少し続ける場合、さらなる補助のため日中にも従量式酸素吸入器/人工呼吸器が必要となり得る。必要に応じて、人は、日中に酸素吸入器/人工呼吸器を使用する時間を徐々に増加させるであろう。

F. 予後
デュシェンヌ型筋ジストロフィーは、最終的に全ての随意筋に影響を及ぼしかつ後期に心筋および呼吸筋を侵す、進行性疾患である。平均余命は、現在25歳前後と推定されているが、これは患者によって異なる。最近の医学の進歩は、罹患者の生存を延長させている。全ての筋疾患に焦点を当てた有力な英国慈善団体であるThe Muscular Dystrophy Campaignは、「高い水準の医学的ケアにより、デュシェンヌ型筋ジストロフィーを有する若年男性は、30代を優に超えるまで生きることが多い」と述べている。

稀な事例では、DMDを有する人は、必要に応じて、車椅子およびベッドでの適正な位置調整、酸素吸入器の補助（気管切開術またはマウスピースを介した）、気道浄化、ならびに心臓薬の使用によって、40代または50代前半まで生存することが分かっている。晩年のケアのための早期の必要な支援計画は、DMDを抱えながら生きている人において長寿が示されている。

不思議なことに、デュシェンヌ型筋ジストロフィーのmdxマウスモデルにおいて、ジストロフィンの欠如は、カルシウムレベルの上昇および骨格筋の筋壊死と関連している。内喉頭筋（ILM）は、保護されており、筋壊死を起こさない。ILMは、他の筋肉と比較してカルシウムの変化を処理する能力がより優れていることを示唆するカルシウム調節系プロファイルを有しており、これは、それらのユニークな病態生理学的特性についての機構的洞察を提供し得る。ILMは、種々の臨床シナリオにおける筋肉消耗の予防および治療のための新規戦略の開発を容易にし得る。

II. CRISPRシステム
A. CRISPR
CRISPR（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列反復）は、塩基配列の短い反復を含有するDNA遺伝子座である。各反復の後に、ウイルスへの事前曝露由来の「スペーサーDNA」の短いセグメントが続く。CRISPRは、配列決定された真正細菌ゲノムの約40％および配列決定された古細菌の90％に見いだされる。CRISPRは、CRISPRに関連するタンパク質をコードするcas遺伝子と関連していることが多い。CRISPR/Casシステムは、プラスミドおよびファージなどの外来遺伝エレメントに対する耐性を付与し、かつ獲得免疫の一形態を提供する、原核生物の免疫系である。CRISPRスペーサーは、真核生物におけるRNAiのように、これらの外因性遺伝エレメントを認識およびサイレンシングする。

CRISPR反復は、サイズが24〜48塩基対の範囲にある。これらは通常、ある程度の二分対称性を示す、つまりヘアピンなどの二次構造の形成を暗示するが、真に回文であるわけではない。反復は、同様の長さのスペーサーで隔てられている。いくつかのスペーサーは原核生物のゲノムと一致するが（自己ターゲティングスペーサー）、いくつかのCRISPRスペーサー配列は、プラスミドおよびファージ由来の配列と正確に一致する。新たなスペーサーは、ファージ感染に応答して迅速に付加され得る。

B. Casヌクレアーゼ
CRISPR関連（cas）遺伝子は、CRISPR反復-スペーサーアレイに関連していることが多い。2013年現在、40種を超える異なるCasタンパク質ファミリーが記述されている。これらのタンパク質ファミリーのうち、Cas1は、異なるCRISPR/Casシステムの間で遍在しているようである。8つのCRISPRサブタイプ（Ecoli、Ypest、Nmeni、Dvulg、Tneap、Hmari、Apern、およびMtube）を定義するためにcas遺伝子および反復構造の特定の組み合わせが使用されており、その一部は、RAMP（repeat-associated mysterious protein）をコードする追加の遺伝子モジュールと関連している。単一のゲノム内に2つ以上のCRISPRサブタイプが存在し得る。CRISPR/Casサブタイプの散在的分布は、システムが微生物の進化中に遺伝子水平伝播を受けることを示唆している。

外因性DNAは、外見上、Cas遺伝子によりコードされたタンパク質によって小さなエレメント（長さがおよそ30塩基対）へとプロセッシングされ、これが次に、リーダー配列の近くのCRISPR遺伝子座に何らかの形で挿入される。CRISPR遺伝子座からのRNAは、構成的に発現され、Casタンパク質によって個々の外部に由来する配列エレメントと隣接する反復配列とから構成される小さなRNAへとプロセッシングされる。RNAは、他のCasタンパク質をガイドして、外因性遺伝エレメントをRNAまたはDNAレベルでサイレンシングする。CRISPRサブタイプ間の機能的多様性を、証拠が示唆している。Cse（CasサブタイプEcoli）タンパク質（大腸菌（E. coli）中のCasA〜Eと呼ばれる）は機能的複合体Cascadeを形成し、これが、CRISPR RNA転写物をCascadeの保持するスペーサー反復単位にプロセッシングする。他の原核生物では、Cas6がCRISPR転写物をプロセッシングする。興味深いことに、大腸菌でのCRISPRに基づくファージ不活性化は、CascadeおよびCas3を必要とするが、Cas1およびCas2を必要としない。パイロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）および他の原核生物において見いだされるCmr（Cas RAMPモジュール）タンパク質は、相補的な標的RNAを認識および切断する小さなCRISPR RNAとの機能的複合体を形成する。RNAガイドCRISPR酵素は、V型制限酵素として分類される。

Cas9は、ヌクレアーゼ、すなわちDNAを切断するために特化した酵素であり、二重らせんの各鎖に対して1つずつの、2つの活性切断部位を有する。チームは、標的DNAを探し当てるCas9の能力を保持しながら、一方または両方の部位を無効にできることを実証した。tracrRNAとスペーサーRNAを組み合わせて「単一ガイドRNA」分子にし、これをCas9と混合することで正しいDNA標的を発見および切断することができるので、そのような合成ガイドRNAを遺伝子編集に使用できる。

Cas9タンパク質は、病原細菌および共生細菌において高度に濃縮されている。CRISPR/Cas媒介性遺伝子調節は、特に真核生物宿主との細菌の相互作用中の、内因性細菌遺伝子の調節に寄与し得る。例えば、フランシセラ・ノビシダ（Francisella novicida）のCasタンパク質Cas9は、ユニークな小さいCRISPR/Cas関連RNA（scaRNA）を使用して、F.ノビシダが宿主応答を弱め病原性を促進するのに不可欠な細菌性リポタンパク質をコードする内因性転写物を抑制する。Wangら（2013）は、生殖細胞系（接合体）へのCas9 mRNAおよびsgRNAの共注射が、変異と上手く適合したことを示した。また、Cas9 DNA配列の送達も想定される。

CRISPR/Casシステムは、3種類のクラスに分けられる。クラス1は、いくつかのCasタンパク質をCRISPR RNA（crRNA）と一緒に使用して、機能的エンドヌクレアーゼを構築する。クラス2 CRISPRシステムは、単一のCasタンパク質をcrRNAと共に使用する。Cpf1は、1,300のアミノ酸タンパク質を含有するクラスIIのV型CRISPR/Casシステムとして最近同定された。米国特許公報第2014/0068797号（参照によってその全体が組み入れられる）も参照されたい。

いくつかの態様において、本開示の組成物は、細菌である黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）由来の小型バージョンのCas9（UniProtアクセッション番号J7RUA5）を含む。小型バージョンのCas9は、野生型または完全長Cas9に勝る利点を提供する。いくつかの態様において、Cas9はspCas9（AddGene）である。

C. Cpf1ヌクレアーゼ
プレボテラおよびフランシセラ1由来のクラスター化して規則的な配置の短い回文配列反復、すなわちCRISPR/Cpf1は、CRISPR/Cas9システムといくつかの類似性を有するDNA編集技術である。Cpf1は、クラスII CRISPR/CasシステムのRNAガイドエンドヌクレアーゼである。この獲得免疫機構は、プレボテラ細菌およびフランシセラ細菌に見いだされる。それは、ウイルスによる遺伝子損傷を防止する。Cpf1遺伝子は、CRISPR遺伝子座に関連しており、ガイドRNAを使用してウイルスDNAを発見および切断するエンドヌクレアーゼをコードする。Cpf1は、Cas9よりも小さくかつ単純なエンドヌクレアーゼであり、CRISPR/Cas9システムの制限の一部を克服する。

Cpf1は、多くの細菌種に見られる。ゲノム編集のためのツールへと発展した究極的なCpf1エンドヌクレアーゼは、それを保有していることが知られた最初の16種のうちの1種から採取された。

複数の態様において、Cpf1は、以下に示す配列を有する、アシダミノコッカス由来のCpf1酵素である（BV3L6種、UniProtアクセッション番号U2UMQ6; SEQ ID NO.442）。

いくつかの態様において、Cpf1は、以下に示す配列を有する、ラクノスピラ科由来のCpf1酵素である（ND2006種、UniProtアクセッション番号A0A182DWE3; SEQ ID NO.443）。

いくつかの態様において、Cpf1は、哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化される。いくつかの態様において、Cpf1は、ヒト細胞またはマウス細胞における発現のためにコドン最適化される。

Cpf1遺伝子座は、混合アルファ/ベータドメイン、RuvC-Iとそれに続くらせん領域、RuvC-IIおよびジンクフィンガー様ドメインを含有する。Cpf1タンパク質は、Cas9のRuvCドメインに似たRuvC様エンドヌクレアーゼドメインを有する。さらに、Cpf1は、HNHエンドヌクレアーゼドメインを有さず、Cpf1のN末端は、Cas9のアルファ-らせん認識ローブを有さない。

Cpf1 CRISPR-Casドメインアーキテクチャは、Cpf1が機能的にユニークであることを示し、クラス2のV型CRISPRシステムとして分類されている。Cpf1遺伝子座は、II型システムよりもI型およびIII型に似たCas1、Cas2、およびCas4タンパク質をコードする。データベース検索は、Cpf1ファミリータンパク質が多くの細菌種に豊富にあることを示唆している。

機能的なCpf1は、tracrRNAを必要としない。それ故、本開示の機能的なCpf1 gRNAは、crRNAを含んでもそれからなってもよい。Cpf1は、Cas9よりも小さいヌクレアーゼであるだけでなく、より小さいsgRNA分子（Cas9のヌクレオチド数のおよそ半分）も有するので、このことによってゲノム編集に利益をもたらす。

Cpf1-gRNA（例えば、Cpf1-crRNA）複合体は、Cas9によって標的とされるGリッチPAMとは対照的に、プロトスペーサー隣接モチーフ5'-YTN-3'（式中、「Y」はピリミジンであり、「N」は任意の核酸塩基である）または5'-TTN-3'の同定によって、標的DNAまたはRNAを切断する。PAMの同定後、Cpf1は、4または5ヌクレオチドオーバーハングの付着末端様DNA二本鎖切断を導入する。

CRISPR/Cpf1システムは、Cpf1酵素と、二重らせん上の修正スポットを発見して複合体を位置付けて標的DNAを切断するガイドRNAとを含むか、またはそれらからなる。そのネイティブの細菌宿主では、CRISPR/Cpf1システム活性は、3つの段階を有する：
適応：Cas1およびCas2タンパク質が、小さなDNA断片のCRISPRアレイへの適応を容易にする;
crRNAの形成：Casタンパク質をガイドする成熟crRNAを産生する、プレ-cr-RNAのプロセシング；および
干渉：Cpf1がcrRNAに結合して、二成分複合体を形成し、標的DNA配列を同定および切断する。

このシステムは、哺乳動物細胞などの非細菌細胞においてCpf1を所望の標的配列にガイドする、天然に存在しないcrRNAを利用するように修飾されている。

D. gRNA
RNAにガイドされるタンパク質として、Cas9は、DNA標的の認識を指令する短いRNAを必要とする。Cas9は、PAM配列NGGを含有するDNA配列を選択的に調べるが、それはプロトスペーサー標的なしでここに結合することができる。しかしながら、Cas9-gRNA複合体は、二本鎖切断を生じるためにgRNAとの厳密な一致を必要とする。細菌におけるCRISPR配列は、複数のRNAで発現され、次いでRNAのガイド鎖を生じるためにプロセッシングされる。真核生物系は、CRISPR RNAをプロセッシングするために必要なタンパク質の一部を欠いているため、RNAポリメラーゼIII型プロモーターU6で発現される単一RNAにCas9ターゲティングに不可欠なRNA片を組み合わせるために合成構築物gRNAが作られた。合成gRNAは、最小長で100bpをわずかに上回り、PAM配列NGGの直前の20のプロトスペーサーヌクレオチドを標的とする部分を含む；gRNAは、PAM配列を含まない。

いくつかの態様において、gRNAは、野生型ジストロフィン遺伝子内の部位を標的とする。いくつかの態様において、gRNAは、変異体ジストロフィン遺伝子内の部位を標的とする。いくつかの態様において、gRNAは、ジストロフィンイントロンを標的とする。いくつかの態様において、gRNAは、ジストロフィンエクソンを標的とする。いくつかの態様において、gRNAは、表1に示されるジストロフィンアイソフォームの1つまたは複数で発現されかつ存在するジストロフィンエクソン中の部位を標的とする。複数の態様において、gRNAは、ジストロフィンスプライス部位を標的とする。いくつかの態様において、gRNAは、ジストロフィン遺伝子上のスプライスドナー部位を標的とする。複数の態様において、gRNAは、ジストロフィン遺伝子上のスプライスアクセプター部位を標的とする。

複数の態様において、ガイドRNAは、変異体DMDエクソンを標的とする。いくつかの態様において、変異体エクソンは、エクソン23または51である。いくつかの態様において、ガイドRNAは、ジストロフィン遺伝子のエクソン1、23、41、44、46、47、48、49、50、51、52、53、54、または55の少なくとも1つを標的とする。複数の態様において、ガイドRNAは、ジストロフィン遺伝子のイントロン44、45、50、51、52、53、54、または55の少なくとも1つを標的とする。好ましい態様において、ガイドRNAは、エクソン51またはエクソン23のスキッピングを誘導するように設計される。複数の態様において、gRNAは、エクソン51またはエクソン23のスプライスアクセプター部位を標的とする。

本明細書に開示の様々な組成物および方法において使用するための好適なgRNAは、SEQ ID NO.448〜770の通り提供される（表E）。好ましい態様において、gRNAは、SEQ ID No.448〜SEQ ID No.770のいずれか1つから選択される。

いくつかの態様において、本開示のgRNAは、DMD遺伝子に対応するコード配列または非コード配列内の標的配列に相補的である配列を含み、それ故、標的配列にハイブリダイズする。いくつかの態様において、Cpf1のためのgRNAは、直接反復骨格配列とそれに続く24ヌクレオチドのガイド配列を含有する、単一crRNAを含む。いくつかの態様において、crRNAの「ガイド」配列は、標的配列に相補的であるgRNAの配列を含む。いくつかの態様において、本開示のcrRNAは、標的配列に相補的ではないgRNAの配列を含む。本開示の「骨格」配列は、gRNAをCpf1ポリペプチドに連結する。本開示の「骨格」配列は、gRNA-Cas9構築物のtracrRNA配列と等価ではない。

E. Cas9 対 Cpf1
Cas9は、DNAを切断するために2つのRNA分子を必要とする一方で、Cpf1は1つ必要とする。これらタンパク質はまた、DNAを異なる場所で切断し、編集部位を選択する際に研究者により多くの選択肢を提供する。Cas9は、DNA分子において両方の鎖を同じ位置で切断し、「平滑」末端を残す。Cpf1は、一方の鎖を他方よりも長く残し、扱いやすい「付着」末端を生じる。Cpf1は、Cas9と比較して、切断部位に新たな配列をより多く挿入できるようである。CRISPR/Cas9システムは遺伝子を効率的に無効にすることができるが、遺伝子を挿入することもノックインを生成することも困難である。Cpf1は、tracrRNAを欠き、TリッチPAMを利用し、DNAを突出型のDNA DSBを介して切断する。

まとめると、Cpf1システムとCas9システムとの間の重要な違いは、Cpf1が、異なるPAMを認識して、新たな標的可能性を実現すること、Cas9によって産生される平滑末端の代わりに4〜5ntの長い付着末端を生み出し、遺伝子挿入の効率およびNHEJまたはHDRの間の特異性を増強すること、ならびに、Cas9切断部位からさらに離れたPAMからさらに離れた標的DNAを切断して、DNAの新たな切断可能性を実現することである。

F. CRISPR/Cpf1媒介性遺伝子編集
CRISPR/Cpf1を使用してDMD遺伝子を編集する際の最初の工程は、ゲノム標的配列を同定することである。本開示のgRNAのためのゲノム標的は、ジストロフィン遺伝子内の任意の約24ヌクレオチドのDNA配列であることができるが、但し、その配列がゲノムの残部と比較してユニークであるものとする。いくつかの態様において、ゲノム標的配列は、ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン51、エクソン45、エクソン44、エクソン53、エクソン46、エクソン52、エクソン50、エクソン43、エクソン6、エクソン7、エクソン8、および/またはエクソン55内の配列に対応する。いくつかの態様において、ゲノム標的配列は、ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン51、エクソン45、エクソン44、エクソン53、エクソン46、エクソン52、エクソン50、エクソン43、エクソン6、エクソン7、エクソン8、および/またはエクソン55の5’または3’スプライス部位である。いくつかの態様において、ゲノム標的配列は、ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン51、エクソン45、エクソン44、エクソン53、エクソン46、エクソン52、エクソン50、エクソン43、エクソン6、エクソン7、エクソン8、および/またはエクソン55のすぐ上流または下流にあるイントロン内の配列に対応する。例示的なゲノム標的配列を表Dに見いだすことができる。

CRISPR/Cpf1を使用してDMD遺伝子を編集する際の次の工程は、標的とする遺伝子領域内の全てのプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）配列を同定することである。Cpf1は、TリッチPAM配列（TTTN、ここで、Nは任意のヌクレオチドである）を利用する。標的配列は、PAMのすぐ上流でなければならない。全ての可能なPAM配列および推定標的部位が同定されたら、次の工程は、最も効率的なオンターゲット切断をもたらす可能性の高い部位を選択することである。gRNAターゲティング配列は標的配列と一致することが必要であり、gRNAターゲティング配列はゲノム内の追加の部位と一致してはならない。好ましい態様において、gRNAターゲティング配列は、標的と完全な相同性を有するが、ゲノムの他の場所では相同性を有さない。いくつかの態様において、所与のgRNAターゲティング配列は、ゲノム全体にわたり部分的な相同性が存在する追加の部位を有する。これらの部位は、「オフターゲット」と呼ばれ、gRNAを設計するときに考慮されるべきである。一般に、オフターゲット部位は、PAM配列の近くにミスマッチがある場合は効率的に切断されないので、相同性のないgRNAまたはPAM配列に近いミスマッチを有するものが最も高い特異性を有する。「オフターゲット活性」に加えて、所望の標的配列の切断（「オンターゲット活性」）を最大限にする要因が考慮されなければならない。各々が標的DNAと100％の相同性を有する2つのgRNAターゲティング配列が等価な切断効率をもたらすわけではないことは、当業者に公知である。実際に、切断効率は、選択された標的配列内の具体的なヌクレオチドに応じて増加も減少もし得る。最良のgRNAを設計するために、各々の潜在的なgRNAターゲティング配列の予測オンターゲット活性およびオフターゲット活性の詳細な調査が必要となる。潜在的なPAM配列および標的配列を探し、関連するgRNAをそれらの予測オンターゲット活性およびオフターゲット活性に基づいてランク付けできる、いくつかのgRNA設計プログラムが開発されている（例えば、CRISPRdirect、www.crispr.dbcls.jpで入手可能）。

次の工程は、所望のgRNAを合成およびクローン化することである。ターゲティングオリゴを合成し、アニーリングし、gRNA骨格を含有するプラスミドに標準的な制限-ライゲーションクローニングを使用して挿入することができる。しかしながら、正確なクローニング戦略は、選択されるgRNAベクターに依存する。Cpf1のためのgRNAは、Cas9のためのgRNAと比べ特に単純で、直接反復骨格配列とそれに続く約24ヌクレオチドのガイド配列を含有する単一crRNAからのみなる。Cpf1は、検出可能なDNA切断を達成するために最低16ヌクレオチドのガイド配列を、インビトロで効率的なDNA切断を達成するために最低18ヌクレオチドのガイド配列を必要する。いくつかの態様において、20〜24ヌクレオチドのガイド配列が使用される。Cpf1 gRNAのシード領域は、一般に、ガイド配列の5'端の最初の5ヌクレオチド内にある。Cpf1は、標的ゲノムDNAにおいて突出型切断を行う。AsCpf1およびLbCpf1では、切断は、標的とされた（+）鎖上のPAMの19bp後で、他方の鎖上の23bpで起こる。

各gRNAは、次いで、1つまたは複数の標的細胞株において検証されるべきである。例えば、CRISPRおよびgRNAが細胞に送達された後に、ゲノム標的領域を、PCRを使用して増幅し、当業者に公知の方法に従って配列決定してよい。

いくつかの態様において、遺伝子編集は、インビトロで実施してもエクスビボで実施してもよい。いくつかの態様において、インビトロまたはエクスビボで、細胞を、Cpf1と、ジストロフィンスプライス部位を標的とするgRNAとに接触させる。いくつかの態様において、細胞を、Cpf1およびガイドRNAをコードする1つまたは複数の核酸と接触させる。いくつかの態様において、1つまたは複数の核酸を、細胞に、例えば、リポフェクションまたはエレクトロポレーションを使用して導入する。また、遺伝子編集を接合体で実施してもよい。複数の態様において、接合体に、Cpf1およびジストロフィンスプライス部位を標的とするgRNAをコードする1つまたは複数の核酸を注射してよい。その後、接合体を宿主に注射してよい。

複数の態様において、Cpf1は、ベクター上に提供される。複数の態様において、ベクターは、ラクノスピラ科細菌に由来するCpf1配列を含有する。例えば、Uniprotアクセッション番号A0A182DWE3; SEQ ID NO.443を参照されたい。複数の態様において、ベクターは、アシダミノコッカス細菌に由来するCpf1配列を含有する。例えば、Uniprotアクセッション番号U2UMQ6; SEQ ID NO.442を参照されたい。いくつかの態様において、Cpf1配列は、ヒト細胞またはマウス細胞における発現のためにコドン最適化される。いくつかの態様において、ベクターは、蛍光活性化セルソーティング（FACS）を使用してCpf1発現細胞を選別することを可能とするGFPなどの蛍光タンパク質をコードする配列をさらに含有する。いくつかの態様において、ベクターは、アデノ随伴ウイルスベクターなどのウイルスベクターである。

複数の態様において、gRNAはベクター上に提供される。いくつかの態様において、ベクターは、アデノ随伴ウイルスベクターなどのウイルスベクターである。複数の態様において、Cpf1およびガイドRNAは、同じベクター上に提供される。複数の態様において、Cpf1およびガイドRNAは、異なるベクター上に提供される。

いくつかの態様において、相同組換え修復を達成するために、細胞を一本鎖DMDオリゴヌクレオチドと追加で接触させる。いくつかの態様において、小さいINDELが、ジストロフィンのタンパク質リーディングフレームを回復させる（「リフレーミング」戦略）。リフレーミング戦略を使用するとき、細胞を単一gRNAと接触させてよい。複数の態様において、スプライスドナーまたはスプライスアクセプター部位が破壊され、それが、エクソンスキッピングおよびタンパク質リーディングフレームの回復をもたらす（「エクソンスキッピング」戦略）。エクソンスキッピング戦略を使用するとき、細胞を2以上のgRNAと接触させてよい。

インビトロまたはエクスビボのCpf1媒介性DNA切断の効率を、T7 E1アッセイなどの当業者に公知の技術を使用して評価してよい。DMD発現の回復を、RT-PCR、ウエスタンブロッティング、および免疫細胞化学などの当業者に公知の技術を使用して確認してよい。

いくつかの態様において、インビトロまたはエクスビボ遺伝子編集は、筋細胞または衛星細胞で実施される。いくつかの態様において、遺伝子編集は、iPSC細胞またはiCM細胞で実施される。複数の態様において、iPSC細胞を遺伝子編集後に分化させる。例えば、iPSC細胞は、編集後に筋細胞または衛星細胞へと分化させ得る。複数の態様において、iPSC細胞を、心筋細胞、骨格筋細胞、または平滑筋細胞へと分化させる。複数の態様において、iPSC細胞を心筋細胞へと分化させる。当業者に公知の方法に従って分化するようにiPSC細胞を誘導し得る。

いくつかの態様において、細胞をCpf1およびgRNAと接触させることは、ジストロフィン発現を回復させる。複数の態様において、インビトロもしくはエクスビボで編集された細胞またはそれらに由来する細胞は、野生型細胞と同程度のジストロフィンタンパク質のレベルを示す。複数の態様において、編集された細胞またはそれらに由来する細胞は、ジストロフィンを、野生型ジストロフィン発現レベルの50％、60％、70％、80％、90％、95％、またはその間の任意の百分率のレベルで発現する。複数の態様において、インビトロもしくはエクスビボで編集された細胞またはそれらに由来する細胞は、野生型細胞ものと同程度のミトコンドリア数を有する。複数の態様において、編集された細胞またはそれらに由来する細胞は、野生型細胞の50％、60％、70％、80％、90％、95％、またはその間の任意の百分率の数のミトコンドリアを有する。複数の態様において、編集された細胞またはそれらに由来する細胞は、ベースラインで非編集細胞と比較して酸素消費率（OCR）の増加を示す。

III. 核酸送達
上で考察した通り、ある特定の態様において、その後の精製および細胞/対象への送達のため、または遺伝子に基づく送達アプローチで直接使用するため、発現カセットを用いて転写因子産物を発現させる。Cpf1およびジストロフィンスプライス部位を標的とする少なくとも1つのDMDガイドRNAをコードする1つまたは複数の核酸を含有する発現ベクターが本明細書に提供される。いくつかの態様において、Cpf1をコードする核酸および少なくとも1つのガイドRNAをコードする核酸は、同じベクター上に提供される。さらなる態様において、Cpf1をコードする核酸および少なくとも1つのガイドRNAをコードする核酸は、別々のベクター上に提供される。

発現は、ベクター内に適切なシグナルが提供されることを必要とし、このシグナルは、細胞において関心対象の遺伝子の発現を駆動するウイルスおよび哺乳動物の両供給源に由来するエンハンサー/プロモーターなどの様々な調節エレメントを含む。また、宿主細胞におけるメッセンジャーRNAの安定性および翻訳可能性を最適化するように設計されたエレメントも定義される。産物を発現する永続的な安定細胞クローンを樹立するための多数のドミナント薬物選択マーカーの使用条件も提供され、薬物選択マーカーの発現をポリペプチドの発現と関連付けるエレメントも提供される。

A. 調節エレメント
本出願全体を通して、「発現カセット」という用語は、核酸コード配列の一部または全てが転写および翻訳されることができる、すなわち、プロモーターの制御下にある、遺伝子産物をコードする核酸を含有する任意のタイプの遺伝子構築物を含むことを意味する。「プロモーター」は、遺伝子の特異的な転写を開始するために必要とされる、細胞の合成機構または導入された合成機構によって認識されるDNA配列を指す。「転写制御下」という語句は、プロモーターが、RNAポリメラーゼ開始および遺伝子の発現を制御するため、核酸に対して正確な位置および方向にあることを意味する。「発現ベクター」は、複製可能な遺伝子構築物に含まれており、したがって、複製起点、転写終結シグナル、ポリA領域、選択可能マーカー、および多目的クローニング部位の1つまたは複数を含む、発現カセットを含むことを意味する。

プロモーターという用語は、RNAポリメラーゼIIのための開始部位の周辺に密集した転写制御モジュールの一群を指すために本明細書において使用される。どのようにプロモーターが組織化されるかについての考えの大部分は、HSVチミジンキナーゼ（tk）およびSV40初期転写単位のためのものを含む、いくつかのウイルスプロモーターの分析に由来する。より最近の研究によって拡大されたこれらの研究は、プロモーターが個別の機能的モジュールから構成されることを示しており、機能的モジュールは各々、およそ7〜20bpのDNAからなり、転写活性化タンパク質または抑制タンパク質のための1つまたは複数の認識部位を含有している。

各プロモーター内の少なくとも1つのモジュールは、RNA合成のための開始部位を位置付けるように機能する。これの最もよく知られている例は、TATAボックスであるが、哺乳動物末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺伝子のためのプロモーターおよびSV40後期遺伝子のためのプロモーターなどのTATAボックスを欠くいくつかのプロモーターにおいては、開始部位自体を覆う個別エレメントが、開始の場所を固定するのを助ける。

いくつかの態様において、本開示のCpf1構築物は、筋細胞特異的プロモーターによって発現される。この筋細胞特異的プロモーターは、構成的に活性なプロモーターであっても、誘導性プロモーターであってもよい。

追加のプロモーターエレメントは、転写開始の頻度を調節する。典型的には、これらは開始部位の30〜110bp上流の領域に位置するが、多数のプロモーターが開始部位の下流にも機能的エレメントを含有していることが最近になって示された。エレメントが反転したり互い相対的に移動したりするときにもプロモーター機能が保存されるように、プロモーターエレメント間の間隔はフレキシブルであることが多い。tkプロモーターでは、プロモーターエレメント間の間隔を50bp間隔にまで増加させることができ、そこからは活性が減退し始める。プロモーターに依存して、個々のエレメントは、協同的にまたは独立に機能して転写を活性化できるようである。

ある特定の態様において、ヒトサイトメガロウイルス（CMV）前初期遺伝子プロモーター、SV40初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス長末端反復、ラットインスリンプロモーター、およびグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼなどのウイルスプロモーターを、関心対象のコード配列の高レベルの発現を得るために使用できる。発現のレベルが所与の目的に十分であるという条件で、関心対象のコード配列の発現を達成するための、当技術分野において周知である他のウイルスまたは哺乳動物細胞または細菌ファージのプロモーターの使用も同じく想定される。周知の特性を有するプロモーターを用いることによって、トランスフェクションまたは形質転換の後の関心対象のタンパク質の発現のレベルおよびパターンを最適化することができる。さらに、特定の生理学的シグナルに応答して調節されるプロモーターを選択することにより、遺伝子産物の誘導性発現が可能となる。

エンハンサーは、同じDNA分子上の遠位に位置するプロモーターからの転写を増加させる遺伝エレメントである。エンハンサーは、プロモーターと同様に組織化される。すなわち、それらは、各々が1つまたは複数の転写タンパク質と結合する多くの個々のエレメントから構成される。エンハンサーとプロモーターとの間の基本的な差異は、機能性である。エンハンサー領域は全体として離れて転写を刺激することができなければならない；このことは、プロモーター領域またはその成分エレメントには当てはまる必要がない。その一方で、プロモーターは、特定の部位において特定の方向でRNA合成の開始を指令する1つまたは複数のエレメントを有しなければならないが、エンハンサーはこれらの特異性を欠いている。プロモーターおよびエンハンサーは、重複しかつ連続していることが多く、極めて類似したモジュール機構を有することが多いと見られる。

以下は、発現構築物において関心対象の遺伝子をコードする核酸と組み合わせて使用できるプロモーター/エンハンサーおよび誘導性プロモーター/エンハンサーの一覧である。加えて、プロモーター/エンハンサーの任意の組み合わせ（Eukaryotic Promoter Data Base EPDBによる）を遺伝子の発現を駆動するために使用することができる。真核細胞は、送達複合体の一部としてまたは追加の遺伝子発現構築物として適切な細菌ポリメラーゼが提供されれば、ある特定の細菌プロモーターからの細胞質転写を支援することができる。

プロモーターおよび/またはエンハンサーは、例えば、免疫グロブリン軽鎖、免疫グロブリン重鎖、T細胞受容体、HLA DQ aおよび/またはDQ β、β-インターフェロン、インターロイキン-2、インターロイキン-2受容体、MHCクラスII 5、MHCクラスII HLA-Dra、β-アクチン、筋肉クレアチンキナーゼ（MCK）、プレアルブミン（トランスサイレチン）、エラスターゼI、メタロチオネイン（MTII）、コラゲナーゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン、t-グロビン、β-グロビン、c-fos、c-HA-ras、インスリン、神経細胞接着分子（NCAM）、α₁-アンチトリパイン（antitrypain）、H2B（TH2B）ヒストン、マウスおよび/またはI型コラーゲン、グルコース調節タンパク質（GRP94およびGRP78）、ラット成長ホルモン、ヒト血清アミロイドA（SAA）、トロポニンI（TN I）、血小板由来成長因子（PDGF）、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、SV40、ポリオーマ、レトロウイルス、パピローマウイルス、B型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、サイトメガロウイルス（CMV）、ならびにテナガザル白血病ウイルスであってよい。

いくつかの態様において、誘導性エレメントを使用してよい。いくつかの態様において、誘導性エレメントは、例えば、MTII、MMTV（マウス乳腺腫瘍ウイルス）、β-インターフェロン、アデノウイルス5 E2、コラゲナーゼ、ストロメリシン、SV40、ネズミ科MX遺伝子、GRP78遺伝子、α-2-マクログロブリン、ビメンチン、MHCクラスI遺伝子H-2κb、HSP70、プロリフェリン、腫瘍壊死因子、および/または甲状腺刺激ホルモンα遺伝子である。いくつかの態様において、誘導因子は、ホルボールエステル（TFA）、重金属、糖質コルチコイド、ポリ（rI）x、ポリ（rc）、ElA、ホルボールエステル（TPA）、インターフェロン、ニューカッスル病ウイルス、A23187、IL-6、血清、インターフェロン、SV40巨大T抗原、PMA、および/または甲状腺ホルモンである。本明細書に記載の誘導性エレメントのいずれかを本明細書に記載の誘導因子のいずれかと共に使用してよい。

特に興味深いものは、筋肉特異的プロモーターである。これらは、ミオシン軽鎖-2プロモーター、α-アクチンプロモーター、トロポニン1プロモーター；Na⁺/Ca²⁺交換体プロモーター、ジストロフィンプロモーター、α7インテグリンプロモーター、脳性ナトリウム利尿ペプチドプロモーターおよびαB-クリスタリン/低分子量熱ショックタンパク質プロモーター、α-ミオシン重鎖プロモーター、ならびにANFプロモーターを含む。いくつかの態様において、筋肉特異的プロモーターは、以下の配列（SEQ ID NO: 787）を有するCK8プロモーターである。

いくつかの態様において、筋肉細胞の細胞特異的プロモーターは、CK8eと呼ばれる、CK8プロモーターのバリアントである。CK8eプロモーターは以下の配列（SEQ ID NO: 788）を有する。

cDNAインサートが用いられる場合、典型的には、遺伝子転写物の適正なポリアデニル化を達成するため、ポリアデニル化シグナルを含めることが望ましい。ヒト成長ホルモンおよびSV40ポリアデニル化シグナルなどの任意のポリアデニル化配列を用いてよい。また、ターミネーターも発現カセットのエレメントとして想定される。これらのエレメントは、メッセージレベルを増強し、カセットから他の配列へのリードスルーを最小限に抑えるために役立つことができる。

B. 2Aペプチド
本発明者は、昆虫ウイルスであるトセア・アシグナ（Thosea asigna）由来の2A様自己切断ドメイン（TaV 2Aペプチド; SEQ ID NO.444; EGRGSLLTCGDVEENPGP）（Chang et al., 2009）を利用する。これらの2A様ドメインは、真核生物全体で機能することが示されており、アミノ酸の切断を、2A様ペプチドドメイン内で同時翻訳的に起こさせる。それ故、TaV 2Aペプチドを含めることで、単一のmRNA転写物から複数のタンパク質の発現が可能となる。重要なことに、真核生物系で試験したとき、TaVのドメインは、99％を超える切断活性を示した。他の許容される2A様ペプチドは、ウマ鼻炎Aウイルス（ERAV）2Aペプチド

、ブタテシオウイルス-1（PTV1）2Aペプチド

および口蹄疫ウイルス（FMDV）2Aペプチド

またはそれらの修飾型バージョンを含むが、これらに限定されない。

いくつかの態様において、2Aペプチドを使用して、レポーターおよびCfp1を同時に発現させる。レポーターは、例えば、GFPであってよい。

使用し得る他の自己切断ペプチドは、核封入タンパク質a（Nia）プロテアーゼ、P1プロテアーゼ、3Cプロテアーゼ、Lプロテアーゼ、3C様プロテアーゼ、またはそれらの修飾型バージョンを含むが、これらに限定されない。

C. 発現ベクターの送達
発現ベクターを細胞に導入できる多数の方法が存在する。ある特定の態様において、発現構築物は、ウイルス、またはウイルスゲノムに由来する改変された構築物を含む。受容体媒介性エンドサイトーシスを介して細胞に侵入し、宿主細胞ゲノムに組み込まれ、ウイルス遺伝子を安定的かつ効率的に発現することができるある特定のウイルスは、哺乳動物細胞に外来遺伝子を移入するための魅力的な候補である。これらは、比較的低い外来DNA配列の収容量を有し、限定された宿主範囲を有する。さらに、許容細胞における発がん潜在性および細胞変性効果は、安全性の問題を提起する。これらは、8kBまでの外来遺伝物質しか収容できないが、種々の細胞株および実験動物に容易に導入することができる。

インビボ送達のための好ましい方法の1つは、アデノウイルス発現ベクターの使用を伴う。「アデノウイルス発現ベクター」は、（a）構築物のパッケージングを支援すること、および（b）その中にクローニングされたアンチセンスポリヌクレオチドを発現することに十分な、アデノウイルス配列を含有する構築物を含むことを意味する。これに関して、発現は、遺伝子産物が合成されることを必要としない。

発現ベクターは、遺伝子改変された形態のアデノウイルスを含む。36kBの直鎖状二本鎖DNAウイルスであるアデノウイルスの遺伝子組織化に関する知識は、アデノウイルスDNAの大断片を7kBまでの外来配列で置換することを可能にする。レトロウイルスとは対照的に、アデノウイルスDNAは、潜在的な遺伝毒性なしに、エピソーム様式で複製できるため、宿主細胞のアデノウイルス感染は、染色体組み込みをもたらさない。また、アデノウイルスは、構造的に安定しており、広範な増幅の後にもゲノム再編成は検出されていない。アデノウイルスは、細胞周期に関わらず、事実上全ての上皮細胞に感染することができる。現在のところ、アデノウイルス感染は、ヒトにおいて急性呼吸器疾患などの軽度の疾患にのみ関連付けられているようである。

アデノウイルスは、ゲノムのサイズが中程度であり、操作が容易であり、力価が高く、標的細胞範囲が広く、感染性が高いため、遺伝子移入ベクターとして使用するのに特に適している。ウイルスゲノムの両端は、ウイルスDNAの複製およびパッケージングに必要なシスエレメントである100〜200塩基対逆方向反復（ITR）を含有する。ゲノムの初期（E）領域および後期（L）領域は、ウイルスDNA複製の開始によって分割される異なる転写単位を含有する。E1領域（E1AおよびE1B）は、ウイルスゲノムおよび少数の細胞遺伝子の転写の調節を担うタンパク質をコードする。E2領域（E2AおよびE2B）の発現は、ウイルスDNA複製のためのタンパク質の合成をもたらす。これらのタンパク質は、DNA複製、後期遺伝子発現、および宿主細胞シャットオフに関与している。ウイルスカプシドタンパク質の大半を含む後期遺伝子の産物は、主要後期プロモーター（MLP）によって生じた単一の一次転写物の有意なプロセッシングの後にのみ発現される。MLP（16.8 m.u.に位置する）は、感染の後期に特に効率的であり、このプロモーターから生じたmRNAは全て、5'トリパータイトリーダー（TPL）配列を保有しており、このため翻訳のための好ましいmRNAである。

あるシステムにおいて、組換えアデノウイルスは、シャトルベクターとプロウイルスベクターとの間の相同組換えから生成される。2種のプロウイルスベクター間の可能性のある組換えのため、このプロセスから野生型アデノウイルスが生成され得る。それ故、個々のプラークからウイルスの単一クローンを単離し、そのゲノム構造を調査することが重要である。

複製欠損型である現在のアデノウイルスベクターの生成および増殖は、Ad5 DNA断片によってヒト胎児腎細胞から形質転換され、E1タンパク質を構成的に発現する、293と名付けられたユニークなヘルパー細胞株に依存する。E3領域は、アデノウイルスゲノムにとって不可欠でないため、現在のアデノウイルスベクターは、293細胞の補助により、E1領域、D3領域のいずれかまたは両方に外来DNAを保持する。本来、アデノウイルスは、野生型ゲノムのおよそ105％をパッケージングすることができ、それによって、約2kb余分のDNAを収容できる。E1領域およびE3領域において置換可能なおよそ5.5kbのDNAと組み合わせると、現在のアデノウイルスベクターの最大収容量は、7.5kb、またはベクターの全長の約15％未満である。アデノウイルスのウイルスゲノムの80％超が、ベクター骨格に残存し、ベクター媒介性の細胞傷害の起源となる。また、E1欠失ウイルスの複製欠損は不完全である。

ヘルパー細胞株は、ヒト胎児腎細胞、筋細胞、造血細胞、または他のヒト胎児間葉系もしくは上皮系細胞などのヒト細胞に由来してよい。あるいは、ヘルパー細胞は、ヒトアデノウイルスに許容性の他の哺乳動物種の細胞に由来してもよい。そのような細胞は、例えば、Vero細胞または他のサル胎仔間葉系もしくは上皮系細胞を含む。上述の通り、好ましいヘルパー細胞株は、293である。

Racher et al. (1995) は、293細胞を培養し、アデノウイルスを増殖させるための、改善された方法を開示した。あるフォーマットにおいて、培地100〜200mlを含有する1リットルのシリコン処理スピナーフラスコ（Techne, Cambridge, UK）へ個々の細胞を接種することによって、天然細胞凝集物を成長させる。40rpmで撹拌した後、細胞生存能をトリパンブルーにより推定する。別のフォーマットにおいて、Fibra-Celマイクロキャリア（Bibby Sterlin, Stone, UK）（5g/l）を以下の通り用いる。培地5mlに再懸濁した細胞接種材料を、250mlの三角フラスコ内の担体（50ml）へ添加し、1〜4時間、時々撹拌しながら、静置する。次いで、培地を新鮮な培地50mlに交換し、振盪を開始する。ウイルス産生のため、細胞を、約80％コンフルエントにまで増殖させ、その後、培地を交換し（最終体積の25％に）、アデノウイルスを0.05のMOIで添加する。培養物を一晩静置し、その後、体積を100％に増加させ、さらに72時間、振盪を開始する。

本開示のアデノウイルスは、複製欠損型であるかまたは少なくとも条件付きで複製欠損型である。アデノウイルスは、42種類の異なる公知の血清型またはサブグループA〜Fのいずれかのものであってよい。サブグループCの5型アデノウイルスは、本開示において使用するための条件付き複製欠損アデノウイルスベクターを得るための好ましい出発材料である。

上述の通り、本開示に係る典型的なベクターは、複製欠損型であり、アデノウイルスE1領域を有しない。したがって、E1コード配列が除去された位置に、関心対象の遺伝子をコードするポリヌクレオチドを導入することが、最も便利である。しかしながら、アデノウイルス配列内の構築物の挿入の位置は重要ではない。Karlsson et al. (1986) により記載されている通り、E3置換ベクターの欠失E3領域の代わりに、またはヘルパー細胞株もしくはヘルパーウイルスがE4欠損を補完するE4領域に、関心対象の遺伝子をコードするポリヌクレオチドを挿入してもよい。

アデノウイルスは、増殖および操作が容易であり、インビトロおよびインビボで広い宿主範囲を示す。このウイルス群は、高い力価、例えば、1ml当たり10⁹〜10¹²のプラーク形成単位で得ることができ、高度に感染性である。アデノウイルスの生活環は、宿主細胞ゲノムへの組み込みを必要としない。アデノウイルスベクターによって送達される外来遺伝子は、エピソームであり、それ故、宿主細胞に対して低い遺伝毒性を有する。野生型アデノウイルスを用いた予防接種の研究において、副作用は報告されておらず（Couch et al., 1963; Top et al., 1971）、このことは、インビボ遺伝子移入ベクターとしての安全性および治療的潜在性を実証している。

アデノウイルスベクターは、真核生物遺伝子発現およびワクチン開発において使用されている。動物研究は、組換えアデノウイルスが遺伝子治療にも使用できることを示唆した。異なる組織への組換えアデノウイルスの投与における研究は、気管滴注、筋肉注射、末梢静脈内注射、および脳への定位接種を含む。

レトロウイルスは、逆転写のプロセスによって感染細胞においてそれらのRNAを二本鎖DNAへ変換できることを特徴とする、一本鎖RNAウイルスの一群である。次いで、生じたDNAは、プロウイルスとして細胞染色体へ安定的に組み込まれ、ウイルスタンパク質の合成を指令する。組み込みは、レシピエント細胞およびその子孫におけるウイルス遺伝子配列の保持をもたらす。レトロウイルスゲノムは、カプシドタンパク質、ポリメラーゼ酵素、およびエンベロープ成分をそれぞれコードする3種の遺伝子gag、pol、およびenvを含有する。gag遺伝子から上流に見いだされる配列は、ゲノムのビリオンへのパッケージングのためのシグナルを含有する。2つの長い末端反復（LTR）配列が、ウイルスゲノムの5'端および3'端に存在する。これらは、強力なプロモーター配列およびエンハンサー配列を含有し、宿主細胞ゲノムへの組み込みのためにも必要とされる。

レトロウイルスベクターを構築するために、ある特定のウイルス配列の代わりに、関心対象の遺伝子をコードする核酸をウイルスゲノムに挿入し、複製欠損型ウイルスを生産する。ビリオンを生産するため、gag遺伝子、pol遺伝子、およびenv遺伝子を含有するがLTRおよびパッケージング成分を有しないパッケージング細胞株を構築する。レトロウイルスLTRおよびパッケージング配列と一緒にcDNAを含有する組換えプラスミドをこの細胞株に導入したとき（例えば、リン酸カルシウム沈殿によって）、パッケージング配列は、組換えプラスミドのRNA転写物がウイルス粒子へパッケージングされることを可能にし、次いで、それが培養培地へ分泌される。次いで、組換えレトロウイルスを含有する培地を収集し、場合により濃縮し、遺伝子移入のために使用する。レトロウイルスベクターは、多種多様な細胞タイプに感染することができる。しかしながら、組み込みおよび安定的発現は、宿主細胞の分裂を必要とする。

ウイルスエンベロープへの乳糖残基の化学的付加によるレトロウイルスの化学的修飾に基づいて、レトロウイルスベクターの特異的なターゲティングを可能にするように設計された新規アプローチが最近開発された。この修飾は、シアロ糖タンパク質受容体を介した肝細胞の特異的感染を可能とすることもできる。

レトロウイルスエンベロープタンパク質および特異的細胞受容体に対するビオチン化抗体が使用される、組換えレトロウイルスのターゲティングのための異なるアプローチを使用してよい。抗体は、ストレプトアビジンを使用することによってビオチン成分を介してカップリングされる。主要組織適合複合体クラスI抗原およびクラスII抗原に対する抗体を使用することで、それらの表面抗原を保有する種々のヒト細胞へのエコトロピックウイルスのインビトロ感染が実証された（Roux et al., 1989）。

本開示の全ての局面において、レトロウイルスベクターの使用に関してある特定の制限がある。例えば、レトロウイルスベクターは、通常、細胞ゲノム内のランダムな部位に組み込まれる。これは、宿主遺伝子の中断を通してまたはウイルス調節配列の挿入を通して挿入変異誘発を導くことができ、これが隣接遺伝子の機能に干渉し得る。欠損レトロウイルスベクターの使用に関する別の懸念は、パッケージング細胞における複製能を有する野生型ウイルスの潜在的な出現である。これは、宿主細胞ゲノムに組み込まれたgag配列、pol配列、env配列の上流に組換えウイルス由来のインタクトな配列を挿入する、組換え事象からもたらされ得る。しかしながら、組換えの可能性を大幅に減少させるはずである新たなパッケージング細胞株が、現在入手可能である（例えば、Markowitz et al., 1988; Hersdorffer et al., 1990を参照のこと）。

他のウイルスベクターを本開示において発現構築物として用いてよい。ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス（AAV）、およびヘルペスウイルスなどのウイルスに由来するベクターを用いてよい。これらは、様々な哺乳動物細胞のためのいくつかの魅力的な特徴を提供する。

複数の態様において、AAVベクターは、複製欠損型または条件付き複製欠損型である。複数の態様において、AAVベクターは、組換えAAVベクターである。いくつかの態様において、AAVベクターは、血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、またはそれらの任意の組み合わせのAAVベクターから単離されるかまたはそれに由来する配列を含む。いくつかの態様において、AAVベクターは、AAV9ベクターではない。

いくつかの態様において、単一のウイルスベクターを使用して、Cpf1および少なくとも1つのgRNAをコードする核酸を細胞に送達する。いくつかの態様において、第一のウイルスベクターを使用してCpf1が細胞に提供され、第二のウイルスベクターを使用して少なくとも1つのgRNAが細胞に提供される。センスまたはアンチセンスの遺伝子構築物の発現を達成するために、発現構築物を細胞へ送達しなければならない。細胞は、筋細胞、衛星細胞、メサンジオブラスト（mesangioblast）、骨髄由来細胞、間質細胞、または間葉系幹細胞であってよい。複数の態様において、細胞は、心筋細胞、骨格筋細胞、または平滑筋細胞である。複数の態様において、細胞は、前脛骨筋、大腿四頭筋、ヒラメ筋、隔膜、または心臓における細胞である。いくつかの態様において、細胞は、人工多能性幹細胞（iPSC）または内部細胞塊細胞（iCM）である。さらなる態様において、細胞は、ヒトiPSCまたはヒトiCMである。いくつかの態様において、本開示のヒトiPSCまたはヒトiCMは、培養幹細胞株、成人幹細胞、胎盤幹細胞に由来しても、ヒト胚の破壊を必要としない成人または胚性幹細胞の別の起源に由来してもよい。細胞への送達は、細胞株の形質転換のための実験手順の場合のようにインビトロで達成しても、特定の疾患状態の処置の場合のようにインビボまたはエクスビボで達成してもよい。1つの送達機構は、発現構築物が感染性のウイルス粒子にカプシド封入されるウイルス感染を介する。

培養哺乳動物細胞への発現構築物の移入のためのいくつかの非ウイルス法も本開示によって想定される。これらは、リン酸カルシウム沈殿、DEAE-デキストラン、エレクトロポレーション、直接マイクロインジェクション、DNA負荷リポソームおよびリポフェクタミン-DNA複合体、細胞超音波処理、高速度微粒子弾を使用した遺伝子銃、ならびに受容体媒介性トランスフェクションを含む。これらの技術のいくつかを、インビボまたはエクスビボ使用にうまく適合させ得る。

発現構築物を細胞に送達したら、関心対象の遺伝子をコードする核酸を、異なる部位において位置付けおよび発現してよい。ある特定の態様において、遺伝子をコードする核酸を、細胞のゲノムへ安定的に組み込んでよい。この組み込みは、相同組み換え（遺伝子置換）を介して類似の位置および方向であっても、ランダムな非特異的位置に組み込んでもよい（遺伝子強化）。なおさらなる態様において、核酸を、DNAの別個のエピソームセグメントとして細胞内に安定的に維持してよい。そのような核酸セグメントまたは「エピソーム」は、宿主細胞周期と無関係にまたは同期的に、維持および複製させるのに十分な配列をコードする。どのように発現構築物が細胞へ送達されるか、および細胞内のどこに核酸が残存するかは、用いられる発現構築物のタイプに依存する。

なお別の態様において、発現構築物は、単純に裸の組換えDNAまたはプラスミドからなっていてもよい。構築物の移入は、物理的にまたは化学的に細胞膜を透過処理する前述の方法のいずれかによって実施してよい。これは、インビトロ移入に特に適用可能であるが、インビボ使用にも同様に適用してもよい。Dubensky et al. (1984)は、ポリオーマウイルスDNAを、成体マウスおよび新生仔マウスの肝臓および脾臓に、リン酸カルシウム沈殿物の形態で注射することに成功したが、このことは、活発なウイルス複製および急性感染を実証している。Benvenisty and Neshif (1986)はまた、リン酸カルシウムで沈殿させたプラスミドの直接腹腔内注射が、トランスフェクトされた遺伝子の発現をもたらすことを実証した。また、関心対象の遺伝子をコードするDNAを、類似の様式でインビボ移入して、遺伝子産物を発現させてもよい。

さらに別の態様において、細胞への裸のDNA発現構築物の移入は、粒子銃を含んでよい。この方法は、細胞膜を貫通し、細胞を死滅させることなく細胞に侵入することを可能にする高速度まで、DNAコート微粒子弾を加速させる能力に依存する。小さな粒子を加速させるためのいくつかの装置が開発されている。そのような装置の1つは、電流を発生させるために高電圧放出に依存し、次に、その電流が原動力を提供する。使用される微粒子弾は、タングステンまたは金のビーズなどの生物学的に不活性な物質からなる。

いくつかの態様において、発現構築物は、対象の肝臓、皮膚、および/または筋組織に直接送達される。これは、銃と標的器官との間の任意の介在組織を排除するための、組織または細胞の外科的露出、すなわち、エクスビボ処置を必要し得る。この場合もやはり、特定の遺伝子をコードするDNAをこの方法を介して送達してもよく、なお本開示に組み入れられる。

さらなる態様において、発現構築物をリポソーム中に捕捉させてよい。リポソームは、リン脂質二重膜および内部水性媒体を特徴とする小胞構造である。多層リポソームは、水性媒体によって分離された複数の脂質層を有する。これらは、リン脂質を過剰の水性溶液に懸濁させたときに自然に形成される。脂質成分が自己再配置を受けた後、閉じた構造を形成し、脂質二重層間に水および溶解した溶質を捕捉する。また、リポフェクタミン-DNA複合体も想定される。

インビトロでの外来DNAのリポソーム媒介性核酸送達および発現は大きな成功を収めている。Lipofectamine 2000（商標）として公知の試薬が広く使用され、市販されている。

ある特定の態様において、リポソームを血球凝集性ウイルス（HVJ）と複合体化して、細胞膜との融合を容易にし、リポソームに封入されたDNAの細胞侵入を促進することができる。他の態様において、リポソームを、核の非ヒストン染色体タンパク質（HMG-1）と複合体化しても、一緒に使用してもよい。なおさらなる態様において、リポソームを、HVJおよびHMG-1の両方と複合体化しても、一緒に使用してもよい。そのような発現構築物は、インビトロおよびインビボでの核酸の移入および発現での使用に成功しており、これらを本開示に適用可能である。細菌プロモーターがDNA構築物において用いられる場合、リポソーム内に適切な細菌ポリメラーゼを含めることも望ましい。

特定の遺伝子をコードする核酸を細胞へ送達するために用いることができる他の発現構築物は、受容体媒介性送達ビヒクルである。これらは、ほぼ全ての真核細胞において受容体媒介性エンドサイトーシスによる巨大分子の選択的取り込みを利用する。様々な受容体の細胞タイプ特異的な分布のため、送達は高度に特異的であることができる。

受容体媒介性遺伝子ターゲティングビヒクルは一般に、細胞受容体特異的なリガンドおよびDNA結合剤の2種の成分からなる。いくつかのリガンドが、受容体媒介性遺伝子移入のために使用されている。最も広範に特徴付けられているリガンドは、アシアロオロソムコイド（ASOR）およびトランスフェリンである。ASORと同じ受容体を認識する合成ネオ糖タンパク質が遺伝子送達ビヒクルとして使用されており、また、上皮増殖因子（EGF）も扁平上皮がん細胞へ遺伝子を送達するために使用されている。

IV. トランスジェニックマウスを作製する方法
特定の態様は、ジストロフィン遺伝子に変異を有するトランスジェニック動物を提供する。また、トランスジェニック動物は、変異体または正常のジストロフィン遺伝子産物の産生を反映するマーカーを発現してもよい。

一般的な局面において、トランスジェニック動物は、上記した方法を用いて導入遺伝子の発現を可能にするように、所与の構築物をゲノム中へ組み込むことによって作製される。トランスジェニック動物を作製するための方法は、概して、Wagner and Hoppe（米国特許第4,873,191号；参照により本明細書に組み入れられる）、およびBrinster et al.（1985；参照により本明細書に組み入れられる）によって記述されている。

典型的には、構築物を、マイクロインジェクションによって受精卵に移入する。マイクロインジェクションした卵を宿主の雌に移植し、子孫を導入遺伝子の発現についてスクリーニングする。トランスジェニック動物は、爬虫類、両生類、鳥類、哺乳類、および魚類を含むがそれらに限定されない多数の動物由来の受精卵から産生され得る。

マイクロインジェクション用のDNAは、当技術分野において公知の任意の手段によって調製することができる。例えば、標準的な技法を用いて、マイクロインジェクション用のDNAを、細菌プラスミド配列を除去するために適切な酵素で切断し、DNA断片を、TBE緩衝液において1％アガロースゲルで電気泳動することができる。DNAバンドを、臭化エチジウムでの染色によって可視化し、発現配列を含有するバンドを切り出す。切り出したバンドを、次いで、0.3 M酢酸ナトリウム、pH 7.0を含有する透析バック中に置く。DNAを、透析バッグ中へ電気溶出し、1：1フェノール：クロロホルム溶液で抽出して、2倍体積のエタノールによって沈殿させる。DNAを、1 mlの低塩緩衝液（0.2 M NaCl、20 mMトリス、pH 7.4、および1 mM EDTA）中に再溶解し、Elutip-D（登録商標）カラムで精製する。カラムを、最初に3 mlの高塩緩衝液（1 M NaCl、20 mMトリス、pH 7.4、および1 mM EDTA）でプライミングし、その後、5 mlの低塩緩衝液での洗浄を行う。DNAをカラムマトリックスに結合させるために、DNA溶液を3回、カラムを通過させる。3 mlの低塩緩衝液での1回の洗浄後、DNAを、0.4 ml高塩緩衝液で溶出し、2倍体積のエタノールによって沈殿させる。DNA濃度を、UV分光光度計において260 nmでの吸収によって測定する。マイクロインジェクションのために、DNA濃度を、5 mMトリス、pH 7.4 および0.1 mM EDTA中、3μg/mlに調整する。当業者に公知のマイクロインジェクション用のDNAの精製のための他の方法を用いてもよい。

例示的なマイクロインジェクション手順において、6週齢の雌マウスを、妊馬血清ゴナドトロピン（PMSG；Sigma）の5 IU注射（0.1 cc、ip）および48時間後のヒト絨毛性ゴナドトロピン（hCG；Sigma）の5 IU注射（0.1 cc、ip）で、過剰排卵するように誘導する。hCG注射の直後に、雌を雄と共に置く。hCG注射の21時間後に、交尾した雌を、CO₂窒息または頸椎脱臼によって屠殺し、切り出した卵管から胚を回収して、0.5％ウシ血清アルブミン（BSA；Sigma）を含むダルベッコリン酸緩衝生理食塩水中に置く。周囲の卵丘細胞を、ヒアルロニダーゼ（1 mg/ml）で除去する。前核胚を、次いで洗浄し、インジェクションの時まで、5％ CO₂、95％空気の加湿した環境空気を有する37.5℃のインキュベーターにおいて、0.5％ BSAを含有するアール平衡塩溶液（EBSS）中に置く。胚を、2細胞期に移植することができる。

ランダムなサイクルの成体雌マウスを、精管切除した雄とつがいにする。C57BL/6マウスもしくはスイスマウスまたは他の同様な系統を、この目的で用いることができる。レシピエント雌を、ドナー雌と同じ時に交尾させる。胚移入の時には、レシピエント雌を、体重1グラムあたり0.015 mlの2.5％ avertinの腹腔内注射で麻酔する。単一の背側正中線切開によって、卵管を曝露させる。次いで、卵管の直上の体壁を通して、切開を行う。次いで、卵嚢を、時計工ピンセットで破る。移入する胚を、DPBS（ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水）中で、移入ピペットの先端部に置く（約10〜12個の胚）。ピペット先端部を卵管漏斗中に挿入し、胚を移入する。移入後、2回の縫合によって切開部を閉じる。

VI. DMDのマウスモデル
本明細書において、DMDの新規マウスモデルとそれを作る方法が提供される。本開示は、種々のDMD変異についての新規マウスモデルを作製するために用いることができる。

いくつかの態様において、マウスは、CRISPR/Cas9システムまたはCRISPR/Cpf1システムを用いて生成される。複数の態様において、1種類のgRNAが、標的DNA配列を欠失させるかまたは改変するために用いられる。複数の態様において、2種類以上のgRNAが、標的DNA配列を欠失させるかまたは改変するために用いられる。いくつかの態様において、標的DNA配列はイントロンである。いくつかの態様において、標的DNA配列はエクソンである。複数の態様において、標的DNAは、スプライスドナー部位またはスプライスアクセプター部位である。

複数の態様において、マウスは、受精した卵母細胞を、CRISPR/Cas9エレメントと、マウスジストロフィンのエクソンに隣接する配列を標的とする2種類のシングルガイドRNA（sgRNA）とに最初に接触させる工程によって生成されてよい。いくつかの態様において、エクソンはエクソン50であり、いくつかの態様において、標的とする配列は、エクソン50を囲むイントロン領域である。受精した卵母細胞を、CRISPR/Cas9エレメントと2種類のsgRNAとに接触させる工程は、エクソンの切除をもたらし、それによって改変卵母細胞を作製する。例えば、CRISPR/Cas9によるエクソン50の欠失は、エクソン51においてアウトオブフレームシフトおよび中途終止コドンを結果としてもたらす。改変卵母細胞を、次いで、レシピエント雌に移入する。

複数の態様において、受精した卵母細胞は、野生型マウスに由来する。複数の態様において、受精した卵母細胞は、そのゲノムが外来性レポーター遺伝子を含有するマウスに由来する。いくつかの態様において、外来性レポーター遺伝子はルシフェラーゼである。いくつかの態様において、外来性レポーター遺伝子は、GFPなどの蛍光タンパク質である。いくつかの態様において、レポーター遺伝子発現カセットは、ルシフェラーゼがジストロフィンのエクソン79とインフレームで翻訳されるように、ジストロフィン遺伝子の3'末端中に挿入される。いくつかの態様において、レポーターが翻訳後にタンパク質から放出されるように、プロテアーゼ2Aなどの自己切断ペプチドを、ジストロフィンとルシフェラーゼの間の切断部位に設計する。

いくつかの態様において、本明細書に記載される遺伝子操作されたマウスは、ジストロフィン遺伝子のエクソン45〜51の間の領域に変異を有する。複数の態様において、遺伝子操作されたマウスは、ジストロフィン遺伝子のエクソン51においてアウトオブフレームシフトおよび中途終止コドンを結果としてもたらす、ジストロフィン遺伝子のエクソン50の欠失を有する。欠失および変異は、DNAシークエンシングなどの、当業者に公知の方法によって確認することができる。

いくつかの態様において、遺伝子操作されたマウスは、レポーター遺伝子を有する。いくつかの態様において、レポーター遺伝子は、ジストロフィン遺伝子のエクソン79の下流にそれとインフレームで、かつジストロフィン3'-UTRの上流に位置し、レポーター遺伝子は、エクソン79がエクソン49とインフレームで翻訳される時に発現される。いくつかの態様において、レポータータンパク質が翻訳後にジストロフィンから放出されるように、自己触媒的に切断されるプロテアーゼ2Aを、タンパク質間の切断部位に設計する。いくつかの態様において、レポーター遺伝子は緑色蛍光タンパク質（GFP）である。いくつかの態様において、レポーター遺伝子はルシフェラーゼである。

複数の態様において、マウスは、1種または複数種の組織において、例えば、骨格筋および/または心臓においてジストロフィンタンパク質を発現しない。複数の態様において、マウスは、野生型マウスと比較してクレアチンキナーゼ（CK）レベルの有意な増大を呈する。上昇したCKレベルは、筋損傷の徴候である。

V. 薬学的組成物および送達法
臨床適用のために、薬学的組成物が、意図する適用に適した形態で調製される。一般に、これは、発熱性物質およびヒトまたは動物にとって有害であり得る他の不純物を本質的に含まない組成物を調製することを要する。

薬物、タンパク質、または送達ベクターを安定化し、標的細胞による取り込みを可能にするため、適切な塩および緩衝液が使用される。本開示の水性組成物は、薬学的に許容される担体または水性媒体に溶解または分散された有効量の薬物、ベクター、またはタンパク質を含む。「薬学的にまたは薬理学的に許容される」という語句は、動物またはヒトに投与されたときに有害反応、アレルギー反応、または他の不都合な反応を生じない分子実体および組成物を指す。本明細書において使用される場合、「薬学的に許容される担体」は、ヒトへの投与に適した医薬などの医薬の製剤化において使用するために許容される、溶媒、緩衝液、溶液、分散媒、コーティング剤、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤などを含む。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体および作用物質の使用は、当技術分野において周知である。治療用組成物における使用において、本開示の活性成分と非適合性でないあらゆる慣用の媒体または作用物質を使用してよい。組成物のベクターまたは細胞を不活化しない条件で、補足的な活性成分を組成物に組み込むこともできる。

いくつかの態様において、本開示の活性組成物は、従来の薬学的調製物を含む。本開示に係るこれらの組成物の投与は、標的組織が任意の一般的な経路を介して利用可能である限り、その経路を介するものであってよいが、一般には全身投与を含む。これは、経口、経鼻、または経頬を含む。あるいは、投与は、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、腹腔内注射、もしくは静脈内注射によっても、筋組織への直接注射によってもよい。前述のように、そのような組成物は、通常、薬学的に許容される組成物として投与される。

活性化合物は、非経口投与されても腹腔内投与されてもよい。例として、遊離塩基または薬理学的に許容される塩としての活性化合物の溶液を、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水中で調製することができる。グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物中で、ならびに油中で、分散液を調製することもできる。通常の保管および使用条件下で、これらの調製物は、一般に、微生物の増殖を防止するための保存剤を含有する。

注射可能な使用に適した薬学的形態は、例えば、無菌の水性の溶液または分散液、および無菌の注射可能な溶液または分散液の即時調製のための無菌の粉末を含む。一般に、これらの調製物は、無菌であり、容易な注射可能性が存在する程度に流動性である。調製物は、製造および保管条件下で安定であるべきであり、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護されるべきである。適切な溶媒または分散媒は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それらの好適な混合物、および植物油を含有してよい。適正な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用によって、分散液の場合には必要とされる粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン類、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含めることが好ましい。注射可能組成物の吸収の延長は、吸収を遅延させる作用物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に使用することによってもたらされ得る。

無菌の注射可能溶液は、活性化合物を適切な量で、所望により任意の他の成分（例えば、上に列挙した通り）と共に、溶媒に組み込み、続いて、濾過減菌することによって調製してよい。一般に、分散液は、例えば上に列挙した通りの基本的な分散媒および所望の他の成分を含有する無菌の媒体に、様々な滅菌された活性成分を組み込むことによって調製される。無菌の注射可能溶液の調製のための無菌の粉末の場合、好ましい調製の方法は、事前に滅菌濾過された溶液から活性成分と任意の追加の所望の成分との粉末を与える、真空乾燥および凍結乾燥の技術を含む。

いくつかの態様において、本開示の組成物は、中性または塩の形態で製剤化される。薬学的に許容される塩は、例えば、無機酸（例えば、塩酸もしくはリン酸）からまたは有機酸（例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸など）から得られる、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基と形成される）を含む。また、タンパク質の遊離カルボキシル基と形成される塩を、無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、もしくは水酸化鉄）からまたは有機塩基（例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなど）から得ることもできる。

製剤化の後、溶液は、好ましくは、投薬製剤と適合性の様式で、かつ、治療的に有効であるような量で投与される。製剤は、注射可能溶液、薬物放出カプセルなどのような種々の剤形で容易に投与してよい。水性溶液での非経口投与のために、例えば、溶液は、一般に、適切に緩衝され、最初に、液体希釈剤が、例えば、十分な生理食塩水またはグルコースで等張にされる。そのような水性溶液を、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、および腹腔内投与に使用してよい。好ましくは、特に本開示に照らして、当業者に公知であるような無菌の水性媒体が用いられる。例として、単一用量を、等張NaCl溶液1mlに溶解し、皮下注入液1000mlに添加しても、提案された注入部位に注射してもよい（例えば、"Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, pages 1035-1038 and 1570-1580を参照のこと）。処置される対象の状態に応じて、投薬量のある程度の変動が必然的に起こる。いずれにしても、投与責任者が、個々の対象のための適切な用量を決める。さらに、ヒトへの投与のために、調製物は、FDA Office of Biologics standardsによって必要とされるような無菌性、発熱性、一般的安全性、および純度の基準を満たすべきである。

いくつかの態様において、本明細書に記載のCpf1およびgRNAを、養子細胞移入（ACT）を使用して患者に送達してよい。養子細胞移入では、1つまたは複数の発現構築物が、患者を起源とする細胞（自己由来）または患者以外の1つまたは複数の個体を起源とする細胞（同種異系）にエクスビボで提供される。細胞は、その後、患者に導入されるかまたは再導入される。したがって、いくつかの態様において、Cpf1およびジストロフィンスプライス部位を標的とするガイドRNAをコードする1つまたは複数の核酸が、細胞が患者に導入されるかまたは再導入される前に、細胞にエクスビボで提供される。

以下の表は、本明細書に開示の組成物および方法と一緒に使用するための例示的なプライマー配列およびゲノムターゲティング配列を提供する。

（表Ｃ）プライマー配列

（表Ｄ）ゲノム標的配列

* この表において、大文字は、遺伝子のエクソン配列と整列しているヌクレオチドを表す。小文字は、遺伝子のイントロン配列と整列しているヌクレオチドを表す。

（表Ｅ）gRNA配列

* この表において、大文字は、遺伝子のエクソン配列と整列しているsgRNAヌクレオチドを表す。小文字は、遺伝子のイントロン配列と整列しているsgRNAヌクレオチドを表す。

VI. 配列の表
（表３）マウスモデルを生成するためのDmdエクソン50およびエクソン79を標的とするsgRNAについてのプライマーの配列

（表４）sgRNAのインビトロ転写のためのプライマーの配列

（表５）遺伝子型判定のためのプライマーの配列

（表６）リーディングフレームの修正のためのDmdエクソン51を標的とするsgRNAについてのプライマーの配列

（表７）アンプリコンディープシークエンシング解析のためのプライマーの配列

VII. 実施例
以下の実施例は、本開示の好ましい態様を実証するために含まれる。以下の実施例において開示される技術が、本開示の実践において良好に機能すると本発明者によって発見された技術を代表するものであり、したがって、これがその実践のための好ましい様式に相当すると見なすことができると、当業者は理解するはずである。しかしながら、当業者は、本開示に照らして、本開示の精神および範囲から逸脱することなく、開示されている具体的な態様において多くの変更を行うことができ、それでも同様のまたは類似の結果を得ることができるものと理解するはずである。

実施例1‐材料および方法
研究の承認
本研究における動物に関与するすべての実験手順は、University of Texas Southwestern Medical CenterのInstitutional Animal Care and Use Committeeによって審査され、承認された。

マウスにおけるCRISPR/Cas9媒介性エクソン50欠失
マウスDmd遺伝子座のエクソン50配列を囲むイントロン領域に特異的な2種類のシングルガイドRNA（sgRNA）を、表3に記載のプライマーを用いてベクターpx330中にクローニングした。sgRNAのインビトロ転写のために、T7プロモーター配列を、表4に記載のプライマーを用いてPCRによってsgRNA鋳型に付加した。ゲル精製したPCR産物を、MEGAshortscript T7キット（Life Technologies）を用いたインビトロ転写のための鋳型として用いた。sgRNAを、MEGAclearキット（Life Technologies）によって精製し、ヌクレアーゼを含まない水（Ambion）で溶出した。ガイドRNAの濃度を、NanoDrop機器（Thermo Scientific）によって測定した。

マウスにおけるCRISPR/Cas9媒介性相同組換え
マウスDmd遺伝子座のエクソン79配列に特異的なシングルガイドRNA（sgRNA）を、表3に記載のプライマーを用いてベクターpx330中にクローニングした。sgRNAのインビトロ転写のために、T7プロモーター配列を、表4に記載のプライマーを用いてPCRによってsgRNA鋳型に付加した。プロテアーゼ2A配列およびルシフェラーゼレポーター配列を含有するドナーベクターを、Dmd遺伝子座に特異的な短い5'および3'相同アームを組み込むことによって構築した。

ΔEx50マウスおよびDmd-ルシフェラーゼマウスの遺伝子型判定
ΔEx50、Dmd-ルシフェラーゼ、およびΔEx50-Dmd-ルシフェラーゼマウスを、表5に記載の標的領域を包含するプライマーを用いて遺伝子型判定した。尾生検を、100μLの25mM NaOH、0.2mM EDTA（pH 12）において20分間、95℃で消化した。尾を短時間、遠心分離して、その後100μLの40mM トリス・HCl（pH 5）を添加し、混合して均質化した。2マイクロリットルのこの反応液を、下記のプライマーでのその後のPCR反応に用い、その後ゲル電気泳動を行った。

プラスミド
2A-EGFPを伴うヒトコドン最適化SpCas9遺伝子およびsgRNAのバックボーンを含有するpSpCas9(BB)-2A-GFP（PX458）プラスミドを、Addgeneから購入した（プラスミド番号48138）。sgRNAのクローニングは、Bbs I部位を用いて行った。

AAV9戦略およびΔEx50-KI-ルシフェラーゼマウスへの送達
Dmdエクソン51 sgRNAを、crispr.mit.eduを用いて選択した。sgRNA配列を、表4中のプライマーを用いてpx330中にクローニングした。sgRNAを、rAAV9バックボーンへのクローニングの前に、以前に記述されているように（Long et al., 2016）10T1/2細胞を用いて組織培養において試験した。

AAV9注射の前に、ΔEx50-KI-ルシフェラーゼマウスを、ケタミンおよびキシラジンの麻酔カクテルの腹腔内（IP）注射によって麻酔した。筋肉内（IM）注射については、P12雄ΔEx50マウスの前脛骨（TA）筋に、50μlのAAV9（1E12 vg/ml）調製物または食塩溶液を注射した。

標的ディープDNAシークエンシング
10T1/2マウス線維芽細胞由来のゲノムDNAのPCRを、それぞれの標的領域およびオフターゲット部位に対して設計したプライマーを用いて行った（表5）。2回目のPCRで、プライマー配列の5'末端に、Illuminaフローセル結合配列および実験特異的バーコードを付加した（表2）。シークエンシングの前に、DNAライブラリーを、Bioanalyzer High Sensitivity DNA Analysis Kit（Agilent）を用いて解析した。次いで、ライブラリー濃度を、IlluminaプラットフォームのためのKAPA Library Quantification Kitを用いたqPCRによって決定した。結果として生じたPCR産物を、プールして、Illumina MiSeq機器で300 bpペアエンドの読み取りでシークエンシングした。試料を、割り当てられたバーコード配列にしたがって多重分離した。FASTQ形式データを、CRISPRessoソフトウェアパッケージバージョン1.0.8を用いて解析した（Pinello et al., 2016）。

ウェスタンブロット解析
ウェスタンブロットを、以前に記述されているように行った（Long et al., 2016）。ジストロフィンに対する抗体（1:1000、D8168、Sigma-Aldrich）、ルシフェリンに対する抗体（1:1000、Abcam ab21176）、ビンキュリンに対する抗体（1:1000、V9131、Sigma-Aldrich）、ヤギ抗マウスおよびヤギ抗ウサギのHRPコンジュゲート二次抗体（1:3000、Bio-Rad）を、記載した実験のために用いた。

実施例2‐結果
新たなヒト化モデルは筋ジストロフィー表現型を再現する
DMD患者における第1のホットスポット変異領域はエクソン45〜51の間の領域であり、エクソン51のスキッピングが最大の群（すなわち、DMD患者の13〜14％）に適すると考えられる。インビボでCRISPR/Cas9媒介性エクソン51スキッピングを調査するために、ヒト「ホットスポット」領域の模倣物を、2種類のシングルガイドRNA（sgRNA）によって方向づけられるCRISPR/Cas9システムを用いてエクソン50を欠失させることによって、マウスモデルにおいて生成した（図1A）。エクソン50の欠失は、DNAシークエンシングによって確認した（図1B）。エクソン50の欠失は、ジストロフィン遺伝子をフレーム外に置き、骨格筋および心臓におけるジストロフィンタンパク質の欠如をもたらした（図1C）。エクソン50が欠けているマウスは、2か月齢マウスにおいて明白なジストロフィー性筋肉変化を示した。Δエクソン50マウスの血清解析により、筋損傷の徴候であるクレアチンキナーゼ（CK）レベルの有意な増大が示される。まとめると、ジストロフィンタンパク質発現、筋肉組織学、および血清により、ΔEx50マウスモデルのジストロフィー表現型が検証された。

ヒト化DMDレポーター系統
インビボでの非侵襲的様式におけるエクソンスキッピング戦略の解析を容易にする努力において、ルシフェラーゼがジストロフィンのエクソン79とインフレームで翻訳されるように、ルシフェラーゼ発現カセットをDmd遺伝子の3'末端へ挿入することによって、レポーターマウスを生成した。これを、図2A〜Bに示すように、Dmd-KI-ルシフェラーゼと呼ぶ。ルシフェラーゼがジストロフィンタンパク質を不安定化する可能性を回避するため、自己触媒的に切断されるプロテアーゼ2Aを、タンパク質間の切断部位に設計した（図2A）。したがって、レポータータンパク質は、翻訳後にジストロフィンから放出されることになる。レポーターのDmd-ルシフェラーゼレポーター系統を生成し、DNAシークエンシングによって検証することに成功した。マウスの生物発光イメージングにより、Dmd-ルシフェラーゼマウスにおけるルシフェラーゼ発現の高い発現レベルおよび筋肉特異性が示される（図2B）。ΔEx50-Dmd-ルシフェラーゼレポーター系統マウスを生成するために、2種類のsgRNAを用いて、Dmd-ルシフェラーゼレポーター系統においてエクソン50を欠失させた（図3A）。エクソン50の欠失をDNAシークエンシングによって確認した。エクソン50の欠失は、ジストロフィン遺伝子をフレーム外に置き、ジストロフィンタンパク質の欠如および減少した生物発光シグナルをもたらした（図3C）。エクソン50の欠失は、Dmd遺伝子をフレーム外に置き、骨格筋および心臓におけるジストロフィンタンパク質の産生を阻止した（図3D）。このように、ルシフェラーゼレポータータンパク質発現はジストロフィン翻訳に連結されているため、エクソン50の欠失は、ΔEx50-KI-ルシフェラーゼマウスにおいてルシフェリンタンパク質発現の欠如をもたらす（図3D）。

単一DNA切断によるΔEx50-KI-ルシフェラーゼマウスにおけるジストロフィンリーディングフレームの修正のインビボモニタリング
ΔEx50-KI-ルシフェラーゼマウスにおいてジストロフィンリーディングフレームを修正するために（図4A）、sgRNAを、エクソン51スプライスアクセプター部位に隣接する領域を標的とするように設計した（sgRNA-SAと呼ぶ）（図4B）。二本鎖DNA切断を生成するためのプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）配列としてNAG/NGGを必要とする化膿連鎖球菌（S. pyogenes）Cas9を、インビボ修正のために用いた。

最初に、sgRNA-SAとカップリングしたCas9のDNA切断活性を、10T1/2マウス線維芽細胞において評定した。sgRNA-SAとカップリングしたCas9によって生成された変異のタイプを調査するために、ゲノムディープシークエンシング解析を行った。シークエンシング解析により、変異の9.3％は、PAM配列の4ヌクレオチド3'側に単一のアデノシン（A）挿入を含有し、7.3％は、スプライスアクセプター部位およびエクソン51についての高度に予測されるESE部位にわたる欠失を含有していたことが明らかになった（図4C）。

骨格筋および心臓組織へのCas9およびsgRNA-SAのインビボ送達のために、これらの組織に対して優先的な指向性を示すアデノ随伴ウイルス9（AAV9）を用いた。筋肉特異的発現をさらに増強するために、筋肉および心臓における発現について高度に特異的な、CK8eプロモーターと呼ばれる、筋肉特異的クレアチンキナーゼ（CK）調節カセットを含有するAAV9-Cas9ベクター（CK8e-Cas9-shortPolyA）を用いた（図4D）。この436 bpの筋肉特異的カセットおよび4101 bpのCas9 cDNAは合わせて、AAV9のパッケージング限界内である。各sgRNAの発現を、3種類のRNAポリメラーゼIIIプロモーター（U6、H1、および7SK）によって駆動した（図4D）。

5E10のAAV9ウイルスゲノム（vg）の出生後（P）12日目でのマウスの筋肉内（IM）注射後に、左前脛骨（TA）筋を4週間、生物発光により解析してモニタリングした（図5A）。インビボ生物発光解析により、注射の1週間後に、注射した脚においてシグナルの出現が示された。シグナルは、その後の週にわたって徐々に増大し、後肢筋全体に広がった（図5B）。

AAV9注射したTA筋の組織学的解析を行って、ジストロフィンを発現した線維の数、および生物発光シグナルとの相関を評定した。AAV9-SAを注射したΔEx50-KI-ルシフェラーゼマウス由来の筋肉のジストロフィン免疫組織化学により、ジストロフィンの回復が明らかになった（図5C〜D）。まとめると、これらの結果により、ΔEx50-KI-ルシフェラーゼマウスにおけるジストロフィンリーディングフレームの修正のインビボ評価が実証される。ΔEx50-KI-ルシフェラーゼマウスは、DMD病因の寛解について多くの異なる戦略を試験するためのプラットフォームとして有用であろう。

本明細書において開示および主張された組成物および/または方法は全て、本開示に照らして、過度の実験なしに作製および実施することができる。本開示の組成物および方法は、好ましい態様に関して記載されているが、本明細書に記載の組成物および/または方法ならびにその方法の工程または工程の順序に対して、本開示の概念、精神、および範囲から逸脱することなしに変更を適用してよいことは、当業者に明らかなことであろう。より具体的には、化学的にも生理学的にも関連しているある特定の作用物質を本明細書に記載の作用物質の代わりに使用しても、同じまたは類似の結果が達成されることが明らかであろう。当業者に明らかなそのような類似の代用物および修飾は全て、添付の特許請求の範囲によって定義される本開示の精神、範囲、および概念内にあるものと見なされる。

VII. 参照文献
以下の参照文献は、本明細書において記載されたものを補足する例示的な手順または他の詳細を提供するという限りにおいて、参照によって本明細書に具体的に組み入れられる。

Claims (77)

1. Cas9ポリペプチドをコードする配列、第1のゲノム標的配列を標的とする第1のガイドRNA（gRNA）をコードする配列、および第2のゲノム標的配列を標的とする第2のgRNAをコードする配列を含む組成物であって、第1および第2のゲノム標的配列が各々、マウスジストロフィン遺伝子のエクソンを囲むイントロン配列を含む、組成物。
2. 前記エクソンがマウスジストロフィン遺伝子のエクソン50を含む、請求項1に記載の組成物。
3. Cas9ポリペプチドをコードする配列が、黄色ブドウ球菌（S. aureus）Cas9ポリペプチドをコードする配列から単離されているか、またはそれに由来する、請求項1または2に記載の組成物。
4. Cas9ポリペプチドをコードする配列、第1のgRNAをコードする配列、または第2のgRNAをコードする配列のうちの少なくとも1つが、RNA配列を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の組成物。
5. 前記RNA配列がmRNA配列を含む、請求項4に記載の組成物。
6. 前記RNA配列が、少なくとも1個の化学的に修飾されたヌクレオチドを含む、請求項4または5に記載の組成物。
7. Cas9ポリペプチドをコードする配列、第1のgRNAをコードする配列、または第2のgRNAをコードする配列のうちの少なくとも1つが、DNA配列を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の組成物。
8. 第1のベクターが、Cas9ポリペプチドをコードする配列を含み、第2のベクターが、第1のgRNAをコードする配列または第2のgRNAをコードする配列のうちの少なくとも1つを含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の組成物。
9. 第1のベクターまたはCas9ポリペプチドをコードする配列が、第1のポリA配列をさらに含む、請求項8に記載の組成物。
10. 第2のベクターまたは第1のgRNAをコードする配列または第2のgRNAをコードする配列が、第2のポリA配列をコードする、請求項8に記載の組成物。
11. 第1のベクターまたはCas9ポリペプチドをコードする配列が、第1のプロモーター配列をさらに含む、請求項8に記載の組成物。
12. 第2のベクターまたは第1のgRNAをコードする配列または第2のgRNAをコードする配列が、第2のプロモーター配列を含む、請求項8に記載の組成物。
13. 第1のプロモーター配列と第2のプロモーター配列とが同一である、請求項11または12に記載の組成物。
14. 第1のプロモーター配列と第2のプロモーター配列とが同一ではない、請求項11または12に記載の組成物。
15. 第1のプロモーター配列または第2のプロモーター配列が、CK8プロモーター配列を含む、請求項11〜14のいずれか一項に記載の組成物。
16. 第1のプロモーター配列または第2のプロモーター配列が、CK8eプロモーター配列を含む、請求項11〜14のいずれか一項に記載の組成物。
17. 第1のプロモーター配列または第2のプロモーター配列が、構成的プロモーターを含む、請求項11〜14のいずれか一項に記載の組成物。
18. 第1のプロモーター配列または第2のプロモーター配列が、誘導性プロモーターを含む、請求項11〜14のいずれか一項に記載の組成物。
19. 1つのベクターが、Cas9ポリペプチドをコードする配列、第1のgRNAをコードする配列、および第2のgRNAをコードする配列を含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の組成物。
20. 前記ベクターがポリA配列をさらに含む、請求項19に記載の組成物。
21. 前記ベクターがプロモーター配列をさらに含む、請求項20または21に記載の組成物。
22. 前記プロモーター配列が構成的プロモーターを含む、請求項21に記載の組成物。
23. 前記プロモーター配列が誘導性プロモーターを含む、請求項21に記載の組成物。
24. 前記プロモーター配列がCK8プロモーター配列を含む、請求項21に記載の組成物。
25. 前記プロモーター配列がCK8eプロモーター配列を含む、請求項21に記載の組成物。
26. 哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化された配列を含む、請求項1〜25のいずれか一項に記載の組成物。
27. ヒト細胞またはマウス細胞における発現のためにコドン最適化された配列を含む、請求項1〜16のいずれか一項に記載の組成物。
28. Cas9ポリペプチドをコードする配列が、ヒト細胞またはマウス細胞における発現のためにコドン最適化されている、請求項27に記載の組成物。
29. 第1のベクターおよび第2のベクターのうちの少なくとも1つが、非ウイルスベクターである、請求項8〜18のいずれか一項に記載の組成物。
30. 非ウイルスベクターがプラスミドである、請求項29に記載の組成物。
31. リポソームまたはナノ粒子が前記非ウイルスベクターを含む、請求項29または30に記載の組成物。
32. 第1のベクターおよび第2のベクターのうちの少なくとも1つが、ウイルスベクターである、請求項8〜18のいずれか一項に記載の組成物。
33. 前記ベクターがウイルスベクターである、請求項19〜28のいずれか一項に記載の組成物。
34. ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターである、請求項32または33に記載の組成物。
35. AAVベクターが複製欠損型または条件付き複製欠損型である、請求項34に記載の組成物。
36. AAVベクターが組換えAAVベクターである、請求項34または35に記載の組成物。
37. AAVベクターが、血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、またはそれらの任意の組み合わせのうちのAAVベクターから単離されたか、またはそれに由来する配列を含む、請求項34〜36のいずれか一項に記載の組成物。
38. 薬学的担体をさらに含む、請求項1〜37のいずれか一項に記載の組成物。
39. 請求項1〜38のいずれか一項に記載の組成物を含む、細胞。
40. マウス細胞である、請求項39に記載の細胞。
41. 卵母細胞である、請求項39または40に記載の細胞。
42. 請求項39〜41のいずれか一項に記載の細胞を含む、組成物。
43. 請求項39〜41のいずれか一項に記載の細胞を含む、遺伝子操作されたマウス。
44. 請求項39〜41のいずれか一項に記載の細胞をマウスと接触させる工程を含む、遺伝子操作されたマウスを作製する方法。
45. マウスの細胞を、請求項1〜38のいずれか一項に記載の組成物と接触させる工程を含む、遺伝子操作されたマウスを作製する方法。
46. 請求項44または45に記載の方法によって生成される、遺伝子操作されたマウス。
47. マウスのゲノムが、ジストロフィン遺伝子のエクソン50の欠失を含み、結果としてジストロフィン遺伝子のエクソン51においてアウトオブフレームシフトおよび中途終止コドンをもたらす、遺伝子操作されたマウス。
48. ジストロフィン遺伝子のエクソン79の下流にそれとインフレームで位置しかつジストロフィン3'-UTRの上流に位置するレポーター遺伝子であって、エクソン79がエクソン49とインフレームで翻訳される時に発現されるレポーター遺伝子
    をさらに含む、請求項47に記載の遺伝子操作されたマウス。
49. レポーター遺伝子がルシフェラーゼである、請求項48に記載の遺伝子操作されたマウス。
50. レポーター遺伝子の上流にありそれとインフレームである、かつエクソン79の下流にありそれとインフレームである、プロテアーゼコード配列
    をさらに含む、請求項47〜49のいずれか一項に記載の遺伝子操作されたマウス。
51. プロテアーゼが自己触媒性である、請求項50に記載の遺伝子操作されたマウス。
52. プロテアーゼが2Aプロテアーゼである、請求項50または51に記載の遺伝子操作されたマウス。
53. 欠失についてヘテロ接合性である、請求項47〜52のいずれか一項に記載の遺伝子操作されたマウス。
54. 欠失についてホモ接合性である、請求項47〜52のいずれか一項に記載の遺伝子操作されたマウス。
55. 野生型マウスと比較して増大したクレアチンキナーゼレベルを呈する、請求項47〜54のいずれか一項に記載の遺伝子操作されたマウス。
56. 心臓または骨格筋において検出可能なジストロフィンタンパク質を呈さない、請求項47〜55のいずれか一項に記載の遺伝子操作されたマウス。
57. （a）受精した卵母細胞を、CRISPR/Cas9エレメントと、ジストロフィン遺伝子のエクソン50に隣接する配列を標的とする2種類のシングルガイドRNA（sgRNA）とに接触させ、それによって改変卵母細胞を作製する工程であって、CRISPR/Cas9によるエクソン50の欠失が、ジストロフィン遺伝子のエクソン51においてアウトオブフレームシフトおよび中途終止コドンを結果としてもたらす、工程；
    （b）該改変卵母細胞をレシピエント雌に移入する工程
    を含む、請求項47〜56のいずれか一項に記載の遺伝子操作されたマウスを作製する方法。
58. ジストロフィン遺伝子のエクソン79の下流にそれとインフレームで位置しかつジストロフィン3'-UTRの上流に位置するレポーター遺伝子であって、エクソン79がエクソン49とインフレームで翻訳される時に発現されるレポーター遺伝子
    を有するジストロフィン遺伝子を卵母細胞が含む、請求項57に記載の方法。
59. レポーター遺伝子がルシフェラーゼである、請求項58に記載の方法。
60. レポーター遺伝子の上流にありそれとインフレームである、かつエクソン79の下流にありそれとインフレームである、プロテアーゼコード配列
    をさらに含む、請求項57〜59のいずれか一項に記載の方法。
61. プロテアーゼが自己触媒性である、請求項60に記載の方法。
62. プロテアーゼが2Aプロテアーゼである、請求項60または61に記載の方法。
63. マウスが、欠失についてヘテロ接合性である、請求項57〜62のいずれか一項に記載の方法。
64. 前記マウスが、欠失についてホモ接合性である、請求項57〜62のいずれか一項に記載の方法。
65. マウスが、野生型マウスと比較して増大したクレアチンキナーゼレベルを呈する、請求項57〜64のいずれか一項に記載の方法。
66. マウスが、心臓または骨格筋において検出可能なジストロフィンタンパク質を呈さない、請求項57〜65のいずれか一項に記載の方法。
67. 請求項46〜56のいずれか一項に記載の遺伝子操作されたマウスから取得された、単離された細胞。
68. ジストロフィン遺伝子のエクソン79の下流にそれとインフレームで位置しかつジストロフィン3'-UTRの上流に位置するレポーター遺伝子であって、エクソン79がエクソン49とインフレームで翻訳される時に発現されるレポーター遺伝子
    をさらに含み、特に該レポーターがルシフェラーゼである、請求項67に記載の細胞。
69. レポーター遺伝子の上流にありそれとインフレームである、かつエクソン79の下流にありそれとインフレームである、プロテアーゼコード配列
    をさらに含む、請求項66〜68のいずれか一項に記載の細胞。
70. プロテアーゼが自己触媒性である、請求項69に記載の細胞。
71. プロテアーゼが2Aプロテアーゼである、請求項69または70に記載の細胞、請求項25に記載の細胞。
72. 欠失についてヘテロ接合性である、請求項69〜71のいずれか一項に記載の細胞。
73. 欠失についてホモ接合性である、請求項67〜71のいずれか一項に記載の細胞。
74. （a）受精した卵母細胞を、CRISPR/Cas9エレメントと、ジストロフィン遺伝子のエクソン50に隣接する配列を標的とする2種類のシングルガイドRNA（sgRNA）と接触させ、それによって改変卵母細胞を作製する工程であって、CRISPR/Cas9によるエクソン50の欠失が、ジストロフィン遺伝子のエクソン51においてアウトオブフレームシフトおよび中途終止コドンを結果としてもたらす、工程；
    （b）該改変卵母細胞をレシピエント雌に移入する工程
    を含む方法によって作製される、遺伝子操作されたマウス。
75. DMDエクソンスキッピング活性についての候補物質をスクリーニングする方法であって、
    （a）請求項43、46、47、または74のいずれか一項に記載のマウスを候補物質と接触させる工程；ならびに
    （b）ジストロフィン遺伝子のエクソン79のインフレームの転写および／または翻訳を評価する工程
    を含み、
    エクソン79のインフレームの転写および／または翻訳の存在が、候補物質がエクソンスキッピング活性を呈することを示す、該方法。
76. （a）受精した卵母細胞を、CRISPR/Cpf1エレメントと、ジストロフィン遺伝子のエクソン50に隣接する配列を標的とする2種類のシングルガイドRNA（sgRNA）とに接触させ、それによって改変卵母細胞を作製する工程であって、CRISPR/Cpf1によるエクソン50の欠失が、ジストロフィン遺伝子のエクソン51においてアウトオブフレームシフトおよび中途終止コドンを結果としてもたらす、工程；
    （b）該改変卵母細胞をレシピエント雌に移入する工程
    を含む、請求項47〜56のいずれか一項に記載の遺伝子操作されたマウスを作製する方法。
77. （a）受精した卵母細胞を、CRISPR/Cpf1エレメントと、ジストロフィン遺伝子のエクソン50に隣接する配列を標的とする2種類のシングルガイドRNA（sgRNA）とに接触させ、それによって改変卵母細胞を作製する工程であって、CRISPR/Cpf1によるエクソン50の欠失が、ジストロフィン遺伝子のエクソン51においてアウトオブフレームシフトおよび中途終止コドンを結果としてもたらす、工程；
    （b）該改変卵母細胞をレシピエント雌に移入する工程
    を含む方法によって作製された、遺伝子操作されたマウス。

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