JP2020503869A - トリプルガイド配列と共にｃｒｉｓｐｒ／ｃａｓ９を用いるエクソンスキッピング改変のための最適化戦略 - Google Patents

トリプルガイド配列と共にｃｒｉｓｐｒ／ｃａｓ９を用いるエクソンスキッピング改変のための最適化戦略 Download PDF

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Abstract

CRISPR/Cas9媒介性ゲノム編集は、ジストロフィン遺伝子における変異によって引き起こされるデュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）などの遺伝子疾患を処置するための臨床的可能性を有する。本明細書において、3つのプロモーターを用いて同じDMDガイドRNAの発現を駆動し、エクソン50中に欠失を有するDMDのヒト化マウスモデルおよびΔEx50-MDイヌにおいて、より堅牢で安全な形態のゲノム編集を達成した。

Description

優先権の主張
本出願は、2017年12月8日に出願された米国特許仮出願第62/596,298号、2017年8月11日に出願された米国特許仮出願第62/544,499号、および2017年1月5日に出願された米国特許仮出願第62/442,606号の優先権の恩典を主張し、それらの内容全体は、参照により全体として本明細書に組み入れられる。
連邦政府による資金援助の条項
本発明は、米国国立衛生研究所（National Institutes of Health）によって授与された助成金番号U54 HD 087351の下、政府援助で行われた。政府は、本発明においてある一定の権利を有する。
配列表
本出願は、配列表を含有しており、それはASCII形式で電子的に出願されており、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。2018年1月5日に作成されたこのASCIIコピーは、UTFD_P3178WO.txtという名称であり、サイズが1,316,974バイトである。
本開示の分野
本開示は、分子生物学、医学、および遺伝学の分野に関する。より詳しくは、本開示は、エクソンスキッピングアプローチを用いてインビボで変異を修正するための遺伝子編集についての、組成物およびその使用に関する。
背景
筋ジストロフィー（MD）は、運動を制御する骨格筋の進行性の衰弱および変性を特徴とする、30種類を超える遺伝子疾患の群である。デュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）は、5000人におよそ1人の男子に影響を及ぼすMDの最も重篤な形態の1つであり、進行性の筋衰弱および早期死亡を特徴とする。心筋症および心不全が、DMDの一般的な不治の致死的な特徴である。この疾患は、細胞表面にあるジストログリカン複合体を下にある細胞骨格と連結し、それによって収縮中の筋細胞膜の完全性を維持する大きな細胞内タンパク質である、ジストロフィンをコードする遺伝子（DMD）における変異によって引き起こされる。ジストロフィン遺伝子における変異は、ジストロフィンの発現の消失を結果としてもたらし、筋膜の脆弱性および進行性の筋肉消耗を引き起こす。
概要
筋芽細胞移入、ウイルス送達、およびオリゴヌクレオチド媒介性エクソンスキッピングを含む、様々なアプローチを通した治療法を見いだす熱心な努力にもかかわらず、筋ジストロフィーのいずれのタイプについてもいかなる治療法もないままである。本発明者らは、最近、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列反復（clustered regularly interspaced short palindromic repeat）/Cas9（CRISPR/Cas9）媒介性ゲノム編集を用いて、DMDについてのモデルである出生後mdxマウスにおいてジストロフィン遺伝子（DMD）変異を修正した。遺伝子編集構成要素のインビボでのAAV媒介性送達は、mdxマウスの心筋細胞および骨格筋細胞におけるエクソンスキッピングによって、変異体ゲノム配列を除去することに成功した。様々な様式のAAV9送達を用いて、本発明者らは、mdxマウスの心筋および骨格筋において、ジストロフィンタンパク質発現を回復した。mdxマウスモデル、および筋編集（myoediting）機構のAAV送達を用いた修正エクソン23は、インビボでの変異を包含するゲノム領域におけるいくつかの切断を用いたエクソンスキッピングアプローチの概念実証を示すのに有用である。しかし、ゲノム編集およびDMDに対するより効率的なかつ安全なアプローチは、この疾患に介入するためのより強力な手段を提供すると考えられる。
いくつかの態様において、核酸は、第1のゲノム標的配列を標的とする第1のDMDガイドRNAをコードする配列、第2のゲノム標的配列を標的とする第2のDMDガイドRNAをコードする配列、第1のDMDガイドRNAをコードする配列の発現を駆動する第1のプロモーターをコードする配列、および、第2のプロモーターをコードし、第1のプロモーターが第2のDMDガイドRNAをコードする配列の発現を駆動する配列を含み、第1のゲノム標的配列および第2のゲノム標的配列は各々、ジストロフィンスプライスアクセプター部位を含む。いくつかの態様において、第1のプロモーターをコードする配列および第2のプロモーターをコードする配列は、同一である。いくつかの態様において、第1のプロモーターをコードする配列および第2のプロモーターをコードする配列は、同一ではない。いくつかの態様において、第1のプロモーターをコードする配列および第2のプロモーターをコードする配列は、少なくとも50％、60％、70％、80％、90％、または95％の配列同一性を共有する。いくつかの態様において、第1のゲノム標的配列および第2のゲノム標的配列は、同一である。いくつかの態様において、第1のゲノム標的配列および第2のゲノム標的配列は、同一ではない。いくつかの態様において、第1のゲノム標的配列および第2のゲノム標的配列は、少なくとも50％、60％、70％、80％、90％、または95％の配列同一性を共有する。いくつかの態様において、第1のゲノム標的配列および第2のゲノム標的配列は、相補的である。いくつかの態様において、核酸は、第3のゲノム標的配列を標的とする第3のDMDガイドRNAをコードする配列、および第3のDMDガイドRNAをコードする配列の発現を駆動する第3のプロモーターをコードする配列をさらに含み、第3のゲノム標的配列は、ジストロフィンスプライスアクセプター部位を含む。いくつかの態様において、第1のプロモーターをコードする配列、第2のプロモーターをコードする配列、および第3のプロモーターをコードする配列のうちの少なくとも2つは、同一である。いくつかの態様において、第1のプロモーターをコードする配列、第2のプロモーターをコードする配列、および第3のプロモーターをコードする配列のうちの少なくとも2つは、同一ではない。いくつかの態様において、第1のプロモーターをコードする配列、第2のプロモーターをコードする配列、および第3のプロモーターをコードする配列のうちの少なくとも2つは、少なくとも50％、60％、70％、80％、90％、または95％の配列同一性を共有する。いくつかの態様において、第1のゲノム標的配列、第2のゲノム標的配列、および第3のゲノム標的配列のうちの少なくとも2つは、同一である。いくつかの態様において、第1のゲノム標的配列、第2のゲノム標的配列、および第3のゲノム標的配列のうちの少なくとも2つは、同一ではない。いくつかの態様において、第1のゲノム標的配列、第2のゲノム標的配列、および第3のゲノム標的配列のうちの少なくとも2つは、少なくとも50％、60％、70％、80％、90％、または95％の配列同一性を共有する。いくつかの態様において、第1のゲノム標的配列、第2のゲノム標的配列、および第3のゲノム標的配列のうちの少なくとも2つは、相補的である。いくつかの態様において、核酸は、第4のゲノム標的配列を標的とする第4のDMDガイドRNAをコードする配列、およびDMDガイドRNAをコードする第4の配列の発現を駆動する第4のプロモーターをコードする配列をさらに含み、第4のゲノム標的配列は、ジストロフィンスプライスアクセプター部位を含む。いくつかの態様において、第1のプロモーターをコードする配列、第2のプロモーターをコードする配列、第3のプロモーターをコードする配列、および第4のプロモーターをコードする配列のうちの少なくとも2つは、同一である。いくつかの態様において、第1のプロモーターをコードする配列、第2のプロモーターをコードする配列、第3のプロモーターをコードする配列、および第4のプロモーターをコードする配列のうちの少なくとも2つは、同一ではない。いくつかの態様において、第1のプロモーターをコードする配列、第2のプロモーターをコードする配列、第3のプロモーターをコードする配列、および第4のプロモーターをコードする配列のうちの少なくとも2つは、少なくとも50％、60％、70％、80％、90％、または95％の配列同一性を共有する。いくつかの態様において、第1のゲノム標的配列、第2のゲノム標的配列、第3のゲノム標的配列、および第4のゲノム標的配列のうちの少なくとも2つは、同一である。いくつかの態様において、第1のゲノム標的配列、第2のゲノム標的配列、第3のゲノム標的配列、および第4のゲノム標的配列のうちの少なくとも2つは、同一ではない。いくつかの態様において、第1のゲノム標的配列、第2のゲノム標的配列、第3のゲノム標的配列、および第4のゲノム標的配列のうちの少なくとも2つは、少なくとも50％、60％、70％、80％、90％、または95％の配列同一性を共有する。いくつかの態様において、第1のゲノム標的配列、第2のゲノム標的配列、第3のゲノム標的配列、および第4のゲノム標的配列のうちの少なくとも2つは、相補的である。
いくつかの態様において、核酸は、第5のゲノム標的配列を標的とする第5のDMDガイドRNAをコードする配列、および第5のDMDガイドRNAをコードする配列の発現を駆動する第5のプロモーターをコードする配列をさらに含み、第5のゲノム標的配列は、ジストロフィンスプライスアクセプター部位を含む。いくつかの態様において、第1のプロモーターをコードする配列、第2のプロモーターをコードする配列、第3のプロモーターをコードする配列、第4のプロモーターをコードする配列、および第5のプロモーターをコードする配列のうちの少なくとも2つは、同一である。いくつかの態様において、第1のプロモーターをコードする配列、第2のプロモーターをコードする配列、第3のプロモーターをコードする配列、第4のプロモーターをコードする配列、および第5のプロモーターをコードする配列のうちの少なくとも2つは、同一ではない。いくつかの態様において、第1のプロモーターをコードする配列、第2のプロモーターをコードする配列、第3のプロモーターをコードする配列、第4のプロモーターをコードする配列、および第5のプロモーターをコードする配列のうちの少なくとも2つは、少なくとも50％、60％、70％、80％、90％、または95％の配列同一性を共有する。いくつかの態様において、第1のゲノム標的配列、第2のゲノム標的配列、第3のゲノム標的配列、第4のゲノム標的配列、および第5のゲノム標的配列のうちの少なくとも2つは、同一である。いくつかの態様において、第1のゲノム標的配列、第2のゲノム標的配列、第3のゲノム標的配列、第4のゲノム標的配列、および第5のゲノム標的配列のうちの少なくとも2つは、同一ではない。いくつかの態様において、第1のゲノム標的配列、第2のゲノム標的配列、第3のゲノム標的配列、第4のゲノム標的配列、および第5のゲノム標的配列のうちの少なくとも2つは、少なくとも50％、60％、70％、80％、90％、または95％の配列同一性を共有する。いくつかの態様において、第1のゲノム標的配列、第2のゲノム標的配列、第3のゲノム標的配列、第4のゲノム標的配列、および第5のゲノム標的配列のうちの少なくとも2つは、相補的である。いくつかの態様において、核酸は、ゲノム標的配列を標的とする追加のDMDガイドRNAをコードする少なくとも1つの配列、および該追加のDMDガイドRNAをコードする配列の発現を駆動する少なくとも1つの追加のプロモーターをさらに含み、該追加のゲノム標的配列は、ジストロフィンスプライスアクセプター部位を含む。いくつかの態様において、ジストロフィンスプライスアクセプター部位は、エクソン51の5'スプライスアクセプター部位を含む。いくつかの態様において、第1のプロモーターをコードする配列または第2のプロモーターをコードする配列は、構成的プロモーターをコードする配列を含む。いくつかの態様において、第1のプロモーターまたは第2のプロモーターは、構成的プロモーターを含む。いくつかの態様において、第1のプロモーターをコードする配列、第2のプロモーターをコードする配列、第3のプロモーターをコードする配列、第4のプロモーターをコードする配列、および第5のプロモーターをコードする配列のうちの少なくとも1つは、構成的プロモーターをコードする配列を含む。いくつかの態様において、第1のプロモーター、第2のプロモーター、第3のプロモーター、第4のプロモーター、および第5のプロモーターのうちの少なくとも1つは、構成的プロモーターを含む。いくつかの態様において、第1のプロモーターをコードする配列または第2のプロモーターをコードする配列は、誘導性プロモーターをコードする配列を含む。いくつかの態様において、第1のプロモーター、第2のプロモーター、第3のプロモーター、第4のプロモーター、および第5のプロモーターのうちの少なくとも1つは、誘導性プロモーターを含む。いくつかの態様において、第1のプロモーターをコードする配列または第2のプロモーターをコードする配列は、細胞タイプ特異的プロモーターをコードする配列を含む。いくつかの態様において、第1のプロモーターをコードする配列、第2のプロモーターをコードする配列、第3のプロモーターをコードする配列、第4のプロモーターをコードする配列、および第5のプロモーターをコードする配列のうちの少なくとも1つは、細胞タイプ特異的プロモーターを含む。いくつかの態様において、細胞タイプ特異的プロモーターは、筋肉特異的プロモーターを含む。いくつかの態様において、第1のプロモーターをコードする配列または第2のプロモーターをコードする配列は、U6プロモーター、H1プロモーター、または7SKプロモーターをコードする配列を含む。いくつかの態様において、第1のプロモーターをコードする配列、第2のプロモーターをコードする配列、第3のプロモーターをコードする配列、第4のプロモーターをコードする配列、および第5のプロモーターをコードする配列のうちの少なくとも1つは、U6プロモーター、H1プロモーター、または7SKプロモーターを含む。いくつかの態様において、第1のプロモーターをコードする配列、第2のプロモーターをコードする配列、第3のプロモーターをコードする配列、第4のプロモーターをコードする配列、および第5のプロモーターをコードする配列のうちの少なくとも1つは、U6プロモーターを含む。いくつかの態様において、第1のプロモーターをコードする配列、第2のプロモーターをコードする配列、第3のプロモーターをコードする配列、第4のプロモーターをコードする配列、および第5のプロモーターをコードする配列のうちの少なくとも1つは、H1プロモーターを含む。いくつかの態様において、第1のプロモーターをコードする配列、第2のプロモーターをコードする配列、第3のプロモーターをコードする配列、第4のプロモーターをコードする配列、および第5のプロモーターをコードする配列のうちの少なくとも1つは、7SKプロモーターを含む。いくつかの態様において、第1のDMDガイドRNAをコードする配列、第2のDMDガイドRNAをコードする配列、および第3のDMDガイドRNAをコードする配列は同一であり、5'スプライスアクセプター部位は、エクソン51の5'スプライスアクセプター部位を含む。いくつかの態様において、第1のプロモーターをコードする配列は、U6プロモーターをコードする配列を含み、第2のプロモーターをコードする配列は、H1プロモーターをコードする配列を含み、かつ第3のプロモーターをコードする配列は、7SKプロモーターを含む。いくつかの態様において、核酸はDNA配列を含む。いくつかの態様において、核酸はRNA配列を含む。いくつかの態様において、核酸は、逆位末端反復（ITR）をコードする1つまたは複数の配列をさらに含む。いくつかの態様において、核酸は、5'逆位末端反復（ITR）をコードする配列および3' ITRをコードする配列をさらに含む。いくつかの態様において、5'逆位末端反復（ITR）をコードする配列または3' ITRをコードする配列は、アデノ随伴ウイルス（AAV）から単離されたまたはそれに由来する配列を含む。いくつかの態様において、5'逆位末端反復（ITR）をコードする配列または3' ITRをコードする配列は、アデノ随伴ウイルス（AAV）の血清型2（AAV2）から単離されたまたはそれに由来する配列を含む。いくつかの態様において、5'逆位末端反復（ITR）をコードする配列および3' ITRをコードする配列は、AAV2から単離されたまたはそれに由来する配列を含む。いくつかの態様において、5'逆位末端反復（ITR）をコードする配列または3' ITRをコードする配列は、アデノ随伴ウイルス（AAV）の血清型4（AAV4）から単離されたまたはそれに由来する配列を含む。いくつかの態様において、5'逆位末端反復（ITR）をコードする配列および3' ITRをコードする配列は、AAV4から単離されたまたはそれに由来する配列を含む。いくつかの態様において、5'逆位末端反復（ITR）をコードする配列または3' ITRをコードする配列は、145ヌクレオチドを含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、5'逆位末端反復（ITR）をコードする配列または3' ITRをコードする配列は、115ヌクレオチドを含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、5'逆位末端反復（ITR）をコードする配列または3' ITRをコードする配列は、141ヌクレオチドを含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、核酸は、ポリアデノシン（ポリA）配列をさらに含む。いくつかの態様において、ポリA配列はミニポリA配列である。いくつかの態様において、第1のDMDガイドRNAをコードする配列または第2のDMDガイドRNAをコードする配列は、SEQ ID NO. 60〜382、706〜708、および712〜789のいずれか1つの配列を含む。いくつかの態様において、第1のDMDガイドRNAをコードする配列または第2のDMDガイドRNAをコードする配列は、SEQ ID NO. 714の配列を含む。
また、第1のゲノム標的配列を標的とする第1のDMDガイドRNAをコードする配列、第2のゲノム標的配列を標的とする第2のDMDガイドRNAをコードする配列、第1のDMDガイドRNAをコードする配列の発現を駆動する第1のプロモーターをコードする配列、および、第2のプロモーターをコードし、第1のプロモーターが第2のDMDガイドRNAをコードする配列の発現を駆動する配列を含む核酸を含むベクターであって、第1のゲノム標的配列および第2のゲノム標的配列が各々ジストロフィンスプライスアクセプター部位を含む、ベクターも提供される。いくつかの態様において、ベクターは、転位因子の逆位末端反復をコードする配列をさらに含む。いくつかの態様において、転位因子はトランスポゾンである。いくつかの態様において、トランスポゾンはTn7トランスポゾンである。いくつかの態様において、ベクターは非ウイルスベクターである。いくつかの態様において、非ウイルスベクターはプラスミドである。いくつかの態様において、ベクターはウイルスベクターである。いくつかの態様において、ウイルスベクターはアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターである。いくつかの態様において、AAVベクターは、複製欠損型または条件付き複製欠損型である。いくつかの態様において、AAVベクターは組換えAAVベクターである。いくつかの態様において、AAVベクターは、AAVベクターの血清型1（AAV1）、血清型2（AAV2）、血清型3（AAV3）、血清型4（AAV4）、血清型5（AAV5）、血清型6（AAV6）、血清型7（AAV7）、血清型8（AAV8）、血清型9（AAV9）、血清型10（AAV10）、血清型11（AAV11）、またはそれらの任意の組み合わせから単離されたまたはそれに由来する配列を含む。いくつかの態様において、AAVベクターは、AAVベクターの血清型9（AAV9）から単離されたまたはそれに由来する配列を含む。いくつかの態様において、AAVベクターは、AAVベクターの血清型2（AAV2）から単離されたまたはそれに由来する配列を含む。いくつかの態様において、AAVベクターは、AAV2から単離されたまたはそれに由来する配列と、AAV9から単離されたまたはそれに由来する配列とを含む。いくつかの態様において、AAVベクターは、AAV4から単離されたまたはそれに由来する配列と、AAV9から単離されたまたはそれに由来する配列とを含む。いくつかの態様において、ベクターは、哺乳動物細胞における発現のために最適化されている。いくつかの態様において、ベクターは、ヒト細胞における発現のために最適化されている。いくつかの態様において、ベクターは、SEQ ID NO. 914、SEQ ID NO. 915、SEQ IDNO. 916、またはSEQ ID NO. 917の配列を含む。
また、プロモーターをコードする配列、およびCas9またはそのヌクレアーゼドメインをコードする配列を含む核酸であって、該プロモーターをコードする配列が、筋肉特異的プロモーターをコードする配列を含む、核酸も提供される。いくつかの態様において、筋肉特異的プロモーターをコードする配列は、CK8プロモーターをコードする配列を含む。いくつかの態様において、筋肉特異的プロモーターをコードする配列は、CK8eプロモーターをコードする配列を含む。いくつかの態様において、Cas9またはそのヌクレアーゼドメインをコードする配列は、化膿ブドウ球菌（S. pyogenes）Cas9またはそのヌクレアーゼドメインをコードする配列から単離されているか、またはそれに由来する。いくつかの態様において、Cas9またはそのヌクレアーゼドメインをコードする配列は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）Cas9またはそのヌクレアーゼドメインをコードする配列から単離されているか、またはそれに由来する。いくつかの態様において、Cas9またはそのヌクレアーゼドメインをコードする配列は、哺乳動物における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの態様において、Cas9またはそのヌクレアーゼドメインをコードする配列は、ヒトにおける発現のためにコドン最適化されている。いくつかの態様において、核酸は、ポリA配列をさらに含む。いくつかの態様において、ポリA配列はミニポリA配列である。いくつかの態様において、核酸は、逆位末端反復（ITR）をコードする1つまたは複数の配列をさらに含む。いくつかの態様において、核酸は、5'逆位末端反復（ITR）をコードする配列および3' ITRをコードする配列をさらに含む。いくつかの態様において、5'逆位末端反復（ITR）をコードする配列または3' ITRをコードする配列は、アデノ随伴ウイルス（AAV）から単離されたまたはそれに由来する配列を含む。いくつかの態様において、5'逆位末端反復（ITR）をコードする配列または3' ITRをコードする配列は、アデノ随伴ウイルス（AAV）の血清型2（AAV2）から単離されたまたはそれに由来する配列を含む。いくつかの態様において、5'逆位末端反復（ITR）をコードする配列および3' ITRをコードする配列は、AAV2から単離されたまたはそれに由来する配列を含む。いくつかの態様において、5'逆位末端反復（ITR）をコードする配列または3' ITRをコードする配列は、アデノ随伴ウイルス（AAV）の血清型4（AAV4）から単離されたまたはそれに由来する配列を含む。いくつかの態様において、5'逆位末端反復（ITR）をコードする配列および3' ITRをコードする配列は、AAV4から単離されたまたはそれに由来する配列を含む。いくつかの態様において、5'逆位末端反復（ITR）をコードする配列または3' ITRをコードする配列は、145ヌクレオチド、115ヌクレオチド、または141ヌクレオチドを含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、核酸は、核局在化シグナルをさらに含む。いくつかの態様において、核酸は、哺乳動物細胞における発現のために最適化されている。いくつかの態様において、核酸は、ヒト細胞における発現のために最適化されている。
また、プロモーターをコードする配列、およびCas9またはそのヌクレアーゼドメインをコードする配列を含む核酸を含むベクターであって、該プロモーターをコードする配列が、CK8プロモーターまたはCK8eプロモーターなどの筋肉特異的プロモーターをコードする配列を含む、ベクターが提供される。いくつかの態様において、ベクターは、転位因子の逆位末端反復（ITR）をコードする配列をさらに含む。いくつかの態様において、転位因子はトランスポゾンである。いくつかの態様において、トランスポゾンはTn7トランスポゾンである。いくつかの態様において、ベクターは、T7トランスポゾンの5' ITRをコードする配列およびT7トランスポゾンの3' ITRをコードする配列をさらに含む。いくつかの態様において、ベクターは非ウイルスベクターである。いくつかの態様において、非ウイルスベクターはプラスミドである。いくつかの態様において、ベクターはウイルスベクターである。いくつかの態様において、ウイルスベクターはアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターである。いくつかの態様において、AAVベクターは、複製欠損型または条件付き複製欠損型である。いくつかの態様において、AAVベクターは組換えAAVベクターである。いくつかの態様において、AAVベクターは、AAVベクターの血清型1（AAV1）、血清型2（AAV2）、血清型3（AAV3）、血清型4（AAV4）、血清型5（AAV5）、血清型6（AAV6）、血清型7（AAV7）、血清型8（AAV8）、血清型9（AAV9）、血清型10（AAV10）、血清型11（AAV11）、またはそれらの任意の組み合わせから単離されたまたはそれに由来する配列を含む。いくつかの態様において、AAVベクターは、AAVベクターの血清型9（AAV9）から単離されたまたはそれに由来する配列を含む。いくつかの態様において、AAVベクターは、AAVベクターの血清型2（AAV2）から単離されたまたはそれに由来する配列を含む。いくつかの態様において、AAVベクターは、AAV2から単離されたまたはそれに由来する配列と、AAV9から単離されたまたはそれに由来する配列とを含む。いくつかの態様において、AAVベクターは、AAVベクターの血清型4（AAV4）から単離されたまたはそれに由来する配列を含む。いくつかの態様において、AAVベクターは、AAV4から単離されたまたはそれに由来する配列と、AAV9から単離されたまたはそれに由来する配列とを含む。いくつかの態様において、ベクターは、哺乳動物細胞における発現のために最適化されている。いくつかの態様において、ベクターは、ヒト細胞における発現のために最適化されている。いくつかの態様において、ベクターは、SEQ ID NO. 899、SEQ ID NO. 900、SEQ ID NO. 901、またはSEQ ID NO. 902の核酸配列を含む。
また、本開示の1つまたは複数の核酸を含む細胞も提供される。いくつかの態様において、細胞はヒト細胞である。いくつかの態様において、細胞は、筋細胞または衛星細胞である。いくつかの態様において、細胞は、人工多能性幹（iPS）細胞である。
また、本開示の1つまたは複数の核酸を含む組成物も提供される。いくつかの態様において、組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。
また、本開示の1つまたは複数の核酸を含む細胞を含む組成物も提供される。いくつかの態様において、組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。
また、本開示の1つまたは複数のベクターを含む組成物も提供される。いくつかの態様において、組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。
また、本開示の1つまたは複数のベクターを含む組成物を含む細胞も提供される。いくつかの態様において、細胞はヒト細胞である。いくつかの態様において、細胞は、筋細胞または衛星細胞である。いくつかの態様において、細胞は、人工多能性幹（iPS）細胞である。
いくつかの態様において、組成物は、（i）第1の核酸配列であって、第1のゲノム標的配列を標的とする第1のDMDガイドRNAをコードする配列、第2のゲノム標的配列を標的とする第2のDMDガイドRNAをコードする配列、第1のDMDガイドRNAをコードする配列の発現を駆動する第1のプロモーターをコードする配列、および、第2のプロモーターをコードし、第1のプロモーターが第2のDMDガイドRNAをコードする配列の発現を駆動する配列を含み、第1のゲノム標的配列および第2のゲノム標的配列が各々ジストロフィンスプライスアクセプターを含む、第1の核酸配列、ならびに（ii）第2の核酸配列であって、プロモーターをコードする配列とCas9またはそのヌクレアーゼドメインをコードする配列とを含み、該プロモーターをコードする配列が、CK8プロモーターまたはCK8eプロモーターなどの筋肉特異的プロモーターをコードする配列を含む、第2の核酸配列を含む。いくつかの態様において、組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。
いくつかの態様において、組成物は、（i）第1のベクターであって、第1のゲノム標的配列を標的とする第1のDMDガイドRNAをコードする配列、第2のゲノム標的配列を標的とする第2のDMDガイドRNAをコードする配列、第1のDMDガイドRNAをコードする配列の発現を駆動する第1のプロモーターをコードする配列、および、第2のプロモーターをコードし、第1のプロモーターが第2のDMDガイドRNAをコードする配列の発現を駆動する配列を含む核酸配列を含み、第1のゲノム標的配列および第2のゲノム標的配列が各々ジストロフィンスプライスアクセプターを含む、第1のベクター、ならびに（ii）第2のベクターであって、プロモーターをコードする配列とCas9またはそのヌクレアーゼドメインをコードする配列とを含む核酸配列を含み、該プロモーターをコードする配列が、CK8プロモーターまたはCK8eプロモーターなどの筋肉特異的プロモーターをコードする配列を含む、第2のベクターを含む。いくつかの態様において、第1のベクターおよび第2のベクターのうちの少なくとも1つは、AAVである。いくつかの態様において、組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。
また、ジストロフィン欠損を修正するための方法であって、細胞を本開示の1つまたは複数の組成物と、第1のDMDガイドRNA、第2のDMDガイドRNA、およびCas9タンパク質またはそのヌクレアーゼドメインの発現に適している条件下で接触させる工程を含み、第1のDMDガイドRNAまたは第2のDMDガイドRNAのうちの少なくとも1つが、Cas9タンパク質またはそのヌクレアーゼドメインと複合体を形成して、少なくとも1つのDMDガイドRNA-Cas9複合体を形成し、該少なくとも1つのDMDガイドRNA-Cas9複合体が、ジストロフィンスプライス部位を破壊し、DMDエクソンの選択的スキッピングを誘導する、方法も提供される。
また、ジストロフィン欠損を修正するための方法であって、細胞を本開示の1つまたは複数の組成物と、第1のDMDガイドRNA、第2のDMDガイドRNA、およびCas9タンパク質またはそのヌクレアーゼドメインの発現に適している条件下で接触させる工程を含み、第1のDMDガイドRNAまたは第2のDMDガイドRNAのうちの少なくとも1つが、Cas9タンパク質またはそのヌクレアーゼドメインと複合体を形成して、少なくとも1つのDMDガイドRNA-Cas9複合体を形成し、該少なくとも1つのDMDガイドRNA-Cas9複合体が、ジストロフィンリーディングフレームのリフレーミングを誘導する、方法も提供される。いくつかの態様において、ジストロフィンリーディングフレームのリフレーミングは、挿入を誘導する。いくつかの態様において、挿入は、単一のアデノシンヌクレオチドを含むか、またはそれからなる。
また、DMDエクソンの選択的スキッピングを誘導するための方法であって、細胞を本開示の1つまたは複数の組成物と、第1のDMDガイドRNA、第2のDMDガイドRNA、およびCas9タンパク質またはそのヌクレアーゼドメインの発現に適している条件下で接触させる工程を含み、第1のDMDガイドRNAまたは第2のDMDガイドRNAのうちの少なくとも1つが、Cas9タンパク質またはそのヌクレアーゼドメインと複合体を形成して、少なくとも1つのDMDガイドRNA-Cas9複合体を形成し、該少なくとも1つのDMDガイドRNA-Cas9複合体が、ジストロフィンスプライス部位を破壊し、DMDエクソンの選択的スキッピングを誘導する、方法も提供される。
また、ジストロフィンリーディングフレームにおいてリフレーミング事象を誘導するための方法であって、細胞を本開示の1つまたは複数の組成物と、第1のDMDガイドRNA、第2のDMDガイドRNA、およびCas9タンパク質またはそのヌクレアーゼドメインの発現に適している条件下で接触させる工程を含み、第1のDMDガイドRNAまたは第2のDMDガイドRNAのうちの少なくとも1つが、Cas9タンパク質またはそのヌクレアーゼドメインと複合体を形成して、少なくとも1つのDMDガイドRNA-Cas9複合体を形成し、該少なくとも1つのDMDガイドRNA-Cas9複合体が、ジストロフィンスプライス部位を破壊し、DMDエクソンの選択的スキッピングを誘導する、方法も提供される。いくつかの態様において、少なくとも1つのDMDガイドRNA-Cas9複合体は、ジストロフィンスプライス部位を破壊し、ヒトDMD遺伝子のエクソン51の選択的スキッピングを誘導する。
また、本開示の1つまたは複数の組成物の治療的有効量を対象に投与する工程を含む、その必要がある対象において筋ジストロフィーを処置する方法も提供される。いくつかの態様において、組成物は局所投与される。いくつかの態様において、組成物は、筋組織に直接投与される。いくつかの態様において、組成物は、筋肉内注入または注射によって投与される。いくつかの態様において、筋組織は、前脛骨筋組織、四頭筋組織、ヒラメ筋組織、横隔膜組織、または心臓組織を含む。いくつかの態様において、組成物は、心臓内注射によって投与される。いくつかの態様において、組成物は全身投与される。いくつかの態様において、組成物は、静脈内注入または注射によって投与される。いくつかの態様において、組成物の投与後に、対象は、正常なジストロフィン陽性筋線維、および中心核を含有するモザイク状ジストロフィン陽性筋線維、またはそれらの組み合わせを呈する。いくつかの態様において、組成物の投与後に、対象は、組成物の投与前の正常なジストロフィン陽性筋線維の欠如または存在量レベルと比較した時に、正常なジストロフィン陽性筋線維の出現または存在量レベルの増加を呈する。いくつかの態様において、組成物の投与後に、対象は、組成物の投与前の中心核を含有するモザイク状ジストロフィン陽性筋線維の欠如または存在量レベルと比較した時に、中心核を含有するモザイク状ジストロフィン陽性筋線維の出現または存在量レベルの増加を呈する。いくつかの態様において、組成物の投与後に、対象は、組成物の投与前の血清CKレベルと比較した時に、減少した血清CKレベルを呈する。いくつかの態様において、組成物の投与後に、対象は、組成物の投与前の握力と比較した時に、改善された握力を呈する。いくつかの態様において、対象は、新生児、乳児、小児、若年成人、または成人である。いくつかの態様において、対象は、筋ジストロフィーを有する。いくつかの態様において、対象は、筋ジストロフィーについての遺伝的保因者である。いくつかの態様において、対象は男性である。いくつかの態様において、対象は女性である。いくつかの態様において、対象は、無症候性であるように見え、遺伝子診断により、DMD遺伝子産物の機能を損なうDMD遺伝子の一方または両方のコピーにおける変異が明らかになる。いくつかの態様において、対象は、筋ジストロフィーの初期の徴候または症状を示す。いくつかの態様において、筋ジストロフィーの初期の徴候または症状は、筋肉量の損失または近位筋衰弱を含む。いくつかの態様において、筋肉量の損失または近位筋衰弱は、一方または両方の脚および/または骨盤において起こり、その後1つまたは複数の上体筋肉において起こる。いくつかの態様において、筋ジストロフィーの初期の徴候または症状は、仮性肥大、低持久力、起立困難、歩行困難、階段上行困難、またはそれらの組み合わせをさらに含む。いくつかの態様において、対象は、筋ジストロフィーの進行性の徴候または症状を示す。いくつかの態様において、筋ジストロフィーの進行性の徴候または症状は、筋組織消耗、筋組織が脂肪で置き換えられること、または筋組織が線維組織置き換えられることを含む。いくつかの態様において、対象は、筋ジストロフィーの後期の徴候または症状を示す。いくつかの態様において、筋ジストロフィーの後期の徴候または症状は、異常な骨発生、脊柱の彎曲、運動の消失、および麻痺を含む。いくつかの態様において、対象は、筋ジストロフィーの神経学的な徴候または症状を示す。いくつかの態様において、筋ジストロフィーの神経学的な徴候または症状は、知的障害および麻痺を含む。いくつかの態様において、組成物の投与は、筋ジストロフィーの進行性の、後期の、または神経学的な徴候または症状の1つまたは複数を対象が示す前に起こる。いくつかの態様において、対象は、10歳未満、5歳未満、または2歳未満である。
また、その必要がある対象において筋ジストロフィーを処置するための、本開示の1つまたは複数の組成物の治療的有効量の使用も提供される。
本明細書において用いられる場合、「1つの（a, an）」は、1つまたは複数を意味し得る。特許請求の範囲において本明細書で用いられる場合に、「含む」という単語と共に用いられる時、「1つの」という単語は、1つまたは1つよりも多くを意味し得る。
特許請求の範囲における「または」という用語の使用は、代替物のみを指すように明確に示されない限り、または代替物が互いに排除的ではない限り、「および/または」を意味するように用いられるが、本開示は、代替物のみを指す定義ならびに「および/または」を支持する。本明細書において用いられる場合、「別の」とは、少なくとも2番目またはそれ以上を意味し得る。
本出願を通して、「約」という用語は、値が、装置についての、値を決定するために使用される方法についての、または研究対象の間に存在する誤差の固有の変動を含むことを示すために用いられる。そのような固有の変動は、述べられる値の±10％の変動であってもよい。
本出願を通して、別の方法で示されない限り、ヌクレオチド配列は、5'から3'への方向で列挙され、アミノ酸配列は、N末端からC末端への方向で列挙される。
本発明の他の目的、特徴、および利点が、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、本発明の精神および範囲内の種々の変化および改変は、この詳細な説明から当業者に明らかになると考えられるため、詳細な説明および具体例は、本発明の好ましい態様を示すが、例証としてのみ与えられることが理解されるべきである。
特許または出願ファイルは、カラーで仕上げられた少なくとも1つの図面を含有する。カラーの図面を有する本特許または特許出願公開のコピーは、請求および必要手数料の支払い時に、庁によって提供されるであろう。
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本開示のある特定の局面をさらに実証するために含まれる。本開示は、本明細書に提示される具体的な態様の詳細な説明と組み合わせてこれらの図面の1つまたは複数を参照することによって、より良好に理解されるであろう。
「ヒト化」ΔEx50マウスモデル。（図1A）ヒト化マウスモデルを生成するためのCRISPR/Cas9媒介性ゲノム編集アプローチを示す戦略。（図1B）エクソン50の欠失（ΔEx50）を検証するためのRT-PCR解析。（図1C）エクソン50欠失およびアウトオブフレーム配列の生成を検証するためのRT-PCR産物の配列（核酸配列＝SEQ ID NO: 1；アミノ酸配列＝SEQ ID NO: 2）。（図1E）前脛骨筋および心臓組織におけるジストロフィンおよびビンキュリンの発現のウェスタンブロット解析。（図1F）筋損傷および膜漏出を反映する筋ジストロフィーのマーカーである血清CKのレベルを、野生型（WT）、ΔEx50、およびmdxマウスにおいて測定した。（図1D）ヘマトキシリン・エオシン（H&E）染色による心筋および骨格筋の組織化学、およびジストロフィン抗体を用いた免疫組織化学。スケールバー：50μm。 エクソン51スキッピング。（図2A）筋肉内注射の3週間後のΔEx50マウス由来のRNAのRT-PCRは、エクソン51の欠失を示す（ΔEx50-51と称する、下のバンド）。（図2B）ΔEx50-51バンドのRT-PCR産物の配列により、エクソン49が、エクソン51を排除してエクソン52に直接接合したことが確認された（核酸配列＝SEQ ID NO: 3；アミノ酸配列＝SEQ ID NO: 4）。 筋肉内注射の3週間後の、三重gRNA戦略を用いたジストロフィン発現の修正。（図3A）ΔEx50マウスモデルにおいてリーディングフレームを修正するためのCRISPR/Cas9媒介性ゲノム編集アプローチを示す戦略。（図3B）スプライスアクセプター部位を標的とするsgRNA（sgRNA-ex51-SA）の配列およびsgRNA結合位置の模式的図解。図3Bは、出現の順序で、それぞれSEQ ID NO: 954〜957を開示する。（図3C）AAV注射プラスミドおよび戦略の模式的図解。sgRNA-ex51-SAおよびsgRNA-ex51-SDのためのrAAV9-sgRNAプラスミドを用いたダブルガイド戦略。3コピーのsgRNA-ex51-SAを含有するrAAV9-sgRNAプラスミドを用いた三重化。SpCas9を発現するための筋肉クレアチンキナーゼ8（CK8）プロモーター。sgRNAを発現するRNAポリメラーゼIIIのためのU6、H1、および7SKプロモーター。（図3D）前脛骨筋のジストロフィン免疫組織化学染色。（図3E）面積によって正規化したジストロフィン陽性線維の定量。（図3F）筋肉内注射の3週間後のジストロフィン（DMD）およびビンキュリン（VCL）の発現のウェスタンブロット解析。（図3G）ビンキュリンに対する正規化後のジストロフィン発現の定量。データを平均±SEMとして表す。**P＜0.005。スケールバー：50μm。 3週間後の注射した筋肉の組織学的改善。（図4A）ヘマトキシリン・エオシン（H&E）染色による前脛骨筋の組織化学。（図4B）線維サイズの定量および頻度のパーセンテージ。データを平均±SEMとして表す。スケールバー：50μm。所与の線維サイズについての4つのデータ点の各セットは、左から右へ、Δ50-CTL、WT-CTL、Δ50-AAV-TriSA、およびΔ50-AAV-SA+SDである。 ヒト293細胞およびマウス10T細胞におけるsgRNAのスクリーニング。2％アガロースゲル上の未消化PCR産物（上のパネル）およびT7E1消化（下のパネル）。Mは、サイズマーカーレーンを意味する。bpは、マーカーバンドの長さを示す。 前脛骨筋全体のジストロフィン免疫組織化学染色。 ΔEx50マウスにおけるCRISPR/Cas9媒介性ゲノム編集のための戦略。（図7A）ΔEx50マウスモデルにおいてリーディングフレームを修正するためのCRISPR/Cas9媒介性ゲノム編集アプローチを示す戦略。（図7B）スプライスアクセプター部位を標的とするsgRNA（sgRNA-ex51-SA2）の配列およびsgRNA結合位置の模式的図解。図7Bは、出現の順序で、それぞれSEQ ID NO: 958〜959を開示する。 マウス細胞およびヒト細胞におけるsgRNAゲノム解析。（図8A）Cas9を、10T1/2細胞においてマウスsgRNA-sgRNA-51-SA2の存在下または非存在下で発現させ、遺伝子編集を、蛍光ベース細胞選別（FACS）細胞（＋）および非選別細胞（−）においてT7E1アッセイによってモニターした。GFPを対照として用いた。未消化PCR産物（上のパネル）およびT7E1消化（下のパネル）を、2％アガロースゲル上に示す。黒色矢頭は、未消化の771bp PCRバンドを示す。下のパネルにおける緑色矢頭は、T7E1アッセイによる切断バンドを示す。Mは、サイズマーカーレーンを意味する。bpは、マーカーバンドの長さを示す。（図8B）10T1/2細胞においてエクソン51標的部位にわたって生成されたPCRアンプリコンのゲノムディープシークエンシング解析。挿入（緑色で強調）および欠失（赤色で強調）を明らかにする、sgRNA配列（青色で示す）と整列させた代表的なインデル（indel）の配列（出現の順序で、それぞれSEQ ID NO: 960〜966）。線は、sgRNAの部位に位置する予測エクソンスプライシングエンハンサー（ESE）配列を示す。黒色矢印は、切断部位を示す。（図8C）sgRNAの部位に位置する予測エクソンスプライシングエンハンサー（ESE）を伴うマウスエクソン51配列（SEQ ID NO: 967）を、赤色で示す。sgRNAの部位に位置する予測エクソンスプライシングエンハンサー（ESE）を伴うヒトエクソン51配列（SEQ ID NO: 968）を、赤色で示す。（図8D）ESEfinder3を用いて予測されたエクソン51のマウスおよびヒトのESE部位。（図8E）Cas9を、293 Tヒト細胞においてマウスsgRNA-sgRNA-51-SA2の存在下または非存在下で発現させ、遺伝子編集を、蛍光ベース細胞選別（FACS）細胞（＋）および非選別細胞（−）においてT7E1アッセイによってモニターした。GFPを対照として用いた。未消化PCR産物（上のパネル）およびT7E1消化（下のパネル）を、2％アガロースゲル上に示す。黒色矢頭は、未消化の771bp PCRバンドを示す。下のパネルにおける緑色矢頭は、T7E1アッセイによる切断バンドを示す。Mは、サイズマーカーレーンを意味する。bpは、マーカーバンドの長さを示す。（図8F）欠失および挿入を明らかにする、sgRNA配列（青色で示す）と整列させた代表的なインデルの配列（出現の順序で、それぞれSEQ ID NO: 969〜978）。黒色矢頭は、切断部位を示す。 AAV注射プラスミドおよび戦略の模式的図解。（図9A）SpCas9を発現するための筋肉クレアチンキナーゼ8（CK8）プロモーター。（図9B）3コピーのsgRNA-ex51-SA2を含有するrAAV9-sgRNAプラスミドを用いた三重化。sgRNAを発現するRNAポリメラーゼIIIのためのU6、H1、および7SKプロモーター。 インビボでのDmd遺伝子編集。（図10A）AAV9-sgRNA-SA2およびAAV9-CAS9発現ベクターの筋肉内注射の3週間後のWTおよびΔEx50マウス由来のTA（前脛骨）筋試料の2％アガロースゲル上に、未消化PCR産物（上のパネル）およびT7E1消化（下のパネル）を示す。対照は、AAV9-sgRNA-SA2ではなくAAV9-Cas9のみを注射した。上のパネルにおける黒色矢頭は、771bp PCRバンドを示す。下のパネルにおける緑色矢頭は、T7E1アッセイによる切断バンドを示す。Mは、サイズマーカーレーンを意味する。bpは、マーカーバンドの長さを示す。N＝4。（図10B）AAV9-sgRNA-51-SA2およびAAV9-Cas9を注射したΔEx50マウスにおいてエクソン51標的部位にわたって生成されたPCRアンプリコンのゲノムディープシークエンシング解析。挿入（緑色で強調）および欠失（赤色で強調）を明らかにする、sgRNA配列（青色で示す）と整列させた代表的なインデルの配列（出現の順序で、それぞれSEQ ID NO: 979〜1014）。黒色矢頭は、切断部位を示す。n＝3。 リーディングフレームの修正のRT-PCR解析。（図11A）sgRNA-51-SA2およびCas9発現ベクターの筋肉内注射の3週間後の野生型（WT）およびΔEx50マウスの前脛骨筋由来のRNAのRT-PCR。下のジストロフィンバンドは、エクソン51の欠失を示す。エクソン48および53におけるプライマー位置を示す（Fw、Rv）。（図11B）TOPO-TA生成クローンのRT-PCR配列解析を用いた、AAV9-sgRNA-51-SA2処置後にエクソン51で検出された事象のパーセンテージ。4種類の異なる試料の各々について、40クローンを生成してシークエンシングした。RT-PCR産物を、非編集（NE）、エクソン51スキップ（SK）、リフレーム（RF）、およびアウトオブフレーム（OF）の4群に分けた。（図11C）ΔEx50-51マウスジストロフィンの下のバンドのRT-PCR産物の配列により、エクソン49が、エクソン51を排除して、エクソン52に直接接合したことが確認された。ΔEx50リフレーム（ΔEx50-RF）のRT-PCR産物の配列。図11Cは、出現の順序で、それぞれSEQ ID NO: 1015〜1022を開示する。（図11D）ΔEx50非編集（NE）およびΔEx50-RFを含有する上のバンド由来のRT-PCR産物のディープシークエンシング解析。挿入（緑色で強調）および欠失（赤色で強調）を明らかにする、RT-PCR産物の配列。n＝4。データを平均±SEMとして表す。図11Dは、出現の順序で、それぞれSEQ ID NO: 1023〜1026を開示する。 AAV9-Cas9およびAAV9-sgRNA-51-SA2の筋肉内注射はジストロフィン発現を修正する。（図12A）ΔEx50マウスの前脛骨筋に、sgRNAおよびCas9をコードするAAV9ベクターを注射し、3週間後にジストロフィンについての免疫染色によって解析した。野生型対照（WT-CTL）マウスおよびΔEx50マウス対照（ΔEx50-CTL）に、sgRNAを伴わずにAAV9-Cas9単独を注射した。WT-CTLと比較したΔEx50-CTLマウスおよび処置ΔEx50マウス（ΔEx50-AAV9-sgRNA-51-SA2およびAAV9-Cas9）におけるジストロフィン陽性筋線維のパーセンテージを、各パネルに示す。（図12B）前脛骨筋のヘマトキシリン・エオシン（H&E）染色。（図12C）筋肉内注射の3週間後の前脛骨筋におけるジストロフィン（DMD）およびビンキュリン（VCL）の発現のウェスタンブロット解析。（図12D）ビンキュリンに対する正規化後の、ブロット由来のジストロフィン発現の定量。星印は、非特異的な免疫反応性バンドを示す。AAV9-sgRNA-51-SA2についてn＝5。スケールバー：50μm。 ΔEx50マウスモデルにおけるAAV9-Cas9およびAAV9-sgRNA-51-SA2の筋肉内注射後のジストロフィン発現の救出。前脛骨筋全体のジストロフィン免疫組織化学。CTLマウスに、AAV9-sgRNA-51-SA2を伴わずにAAV9-Cas9単独を注射した。n＝5。 3週間後の注射した筋肉の組織学的改善。ヘマトキシリン・エオシン（H&E）染色による前脛骨筋の組織化学。 ΔEx50マウスモデルにおける、シングルコピーまたはトリプルコピーのsgRNAを発現する様々なAAV9と組み合わせたAAV9-Cas9の筋肉内注射後のジストロフィン発現の救出。（図15A）RNAポリメラーゼIIIのU6、H1、および7SKプロモーターの各々を個々に用いて、シングルコピー（AAV9-U6-sgRNA-51-SA2；AAV9-H1-sgRNA-51-SA2；AAV9-7SK-sgRNA-51-SA2）またはトリプルコピーにおいてsgRNAを発現した。（図15B）前脛骨筋全体のジストロフィン免疫組織化学。対照（CTL）マウスに、AAV9-sgRNA-51-SA2を伴わずにAAV9-Cas9単独を注射した。 ΔEx50マウスにおけるAAV9-Cas9およびAAV9-sgRNA-51-SA2の全身送達の4週間後のジストロフィン発現の救出。（図16A）AAV9-sgRNA-51の全身注射の8週間後の前脛骨筋（TA）、三頭筋、横隔膜、および心筋のジストロフィン免疫染色。（図16B）TA、三頭筋、横隔膜筋、および心臓におけるジストロフィン（DMD）およびビンキュリン（VCL）の発現のウェスタンブロット解析。各群についてn＝5。スケールバー：50μm。 ΔEx50マウスにおけるAAV9-Cas9およびAAV9-sgRNA-51-SA2の全身送達の8週間後のジストロフィン発現の救出。（図17A）AAV9-sgRNA-51の全身注射の8週間後の前脛骨筋（TA）、三頭筋、横隔膜、および心筋のジストロフィン免疫染色。（図17B）TA、三頭筋、横隔膜筋、および心臓におけるジストロフィン（DMD）およびビンキュリン（VCL）の発現のウェスタンブロット解析。各群についてn＝5。スケールバー：50μm。 ΔEx50マウスにおけるAAV9-Cas9およびAAV9-sgRNA-51-SA2の全身送達の4週間後の機能的改善。（図18A）野生型（WT）マウス、対照ΔEx50マウス、およびAAV9-sgRNA-51で処置したΔEx50マウス（ΔEx50-AAV9-sgRNA-51）を握力試験に供して、筋肉の性能（力のグラム）を測定した。（図18B）血清クレアチンキナーゼ（CK）を、WT、ΔEx50、およびΔEx50-AAV9-sgRNA-51マウスにおいて測定した。n＝5。星印は、非特異的な免疫反応性バンドを示す。データを平均±SEMとして表す。 ΔEx50-MDイヌにおける筋肉内注射の6週間後のジストロフィン発現の修正。野生型イヌ（Nathan）、無処置のΔEx50-MDイヌ、および反対側は未注射で、前脛骨筋にAAV9-Cas9-sgRNAを注射した2匹のΔEx50-MDイヌ（NormanおよびNewton）の前脛骨筋のジストロフィン免疫組織化学染色。スケールバー：50μm。 ΔEx50-MDイヌにおける筋肉内注射の6週間後のジストロフィン発現の修正。（図20A）野生型イヌ（Nathan）、無処置のΔEx50-MDイヌ、および反対側は未注射で、前脛骨筋にAAV9-Cas9-sgRNAを注射した2匹のΔEx50-MDイヌ（NormanおよびNewton）の前脛骨筋のジストロフィン（DMD）およびビンキュリン（VCL）のウェスタンブロット解析。（図20B）ビンキュリンに対する正規化後の、2つの独立したブロット由来のジストロフィン発現の定量。 ΔEx50-MDイヌにおける6週間後の注射した筋肉の組織学的改善。野生型イヌ（Nathan）、反対側は未注射で、前脛骨筋にAAV9-Cas9-sgRNAを注射したΔEx50-MDイヌ（NormanおよびNewton）の前脛骨筋のヘマトキシリン・エオシン（H&E）染色による組織化学。スケールバー：50μm。
詳細な説明
DMDは、ヒトにおいて4,000個を超える独立した変異の同定されている新たな変異症候群である（ワールドワイドウェブdmd.nl）。患者の変異の大多数は、ホットスポットに集中した欠失を含むため、ある特定のエクソンをスキッピングする治療アプローチは、多くの患者に適する。エクソンスキッピングアプローチの原理は、DMD患者とベッカー型筋ジストロフィー（BMD）患者との間の遺伝学的な差に基づく。DMD患者においては、ジストロフィンmRNAのリーディングフレームが破壊され、中途で短縮された非機能的なジストロフィンタンパク質を結果としてもたらす。BMD患者は、内部が欠失しているが部分的には機能的なジストロフィンの産生を可能にするリーディングフレームを維持する、DMD遺伝子における変異を有し、それは、DMD患者と比較してずっと軽度の疾患症状をもたらす。
DMDを処置するための組成物および方法が、本明細書において提供される。いくつかの態様において、DMDガイドRNAの発現を各々駆動する3つのプロモーターをコードする核酸を含むAAV構築物が提供される。本明細書において開示される組成物および方法を用いて、より堅牢なかつ安全な形態のゲノム編集が、エクソン50中に欠失を有するDMDについてのヒト化マウスモデルにおいて、およびΔEx50-MDイヌにおいて達成された。本開示のこれらの局面および他の局面を、下記で再現する。
I. デュシェンヌ型筋ジストロフィー
A. 背景
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）は、男児のおよそ5000人に1人が罹患する、筋肉変性および早期死亡をもたらす潜性X連鎖型の筋ジストロフィーである。この障害は、以下に再現する配列のタンパク質ジストロフィン（GenBankアクセッション番号AAA53189; SEQ ID NO: 5）をコードする、ヒトX染色体上に位置する遺伝子ジストロフィン（GenBankアクセッション番号NC_000023.11を参照のこと）の変異によって引き起こされる。
Figure 2020503869
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ヒトでは、ジストロフィンmRNAは、79のエクソンを含有する。ジストロフィンmRNAは、選択的にスプライシングされ、様々なアイソフォームをもたらすことが知られている。例示的なジストロフィンアイソフォームを表1に列挙する。
（表１）ジストロフィンアイソフォーム
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マウスジストロフィンタンパク質は以下のアミノ酸配列を有する（Uniprotアクセッション番号P11531、SEQ. ID. NO: 869）。
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ジストロフィンは、細胞膜のジストログリカン複合体（DGC）に構造的安定性を提供する、筋組織内の重要な成分である。どちらの性別も変異を保有し得るが、女性は骨格筋形態の疾患の影響を受けることはめったにない。
変異は、性質および頻度が異なる。大きな遺伝子欠失が症例の約60〜70％において見出され、大きな重複が症例の約10％において見出され、点変異または他の小さな変化が症例の約15〜30％を占める。約7000個の変異を検討したBladen et al. (2015)は、合計で5,682個の大きな変異（全変異の80％）をカタログ化し、そのうちの4,894個（86％）は欠失（1エクソンまたはそれよりも大きい）であり、784個（14％）は重複（1エクソンまたはそれよりも大きい）であった。1,445個の小さな変異（1エクソンよりも小さい、すべての変異の20％）があり、そのうちの 358個（25％）は小さな欠失であり、132個（9％）は小さな挿入であり、他方、199個（14％）はスプライス部位に影響を及ぼした。点変異は、合計で756個（小さな変異の52％）であり、726個（50％）がナンセンス変異、30個（2％）がミスセンス変異であった。最後に、22個（0.3％）のイントロン中変異が観察された。加えて、終止コドンリードスルー療法（全変異の10％）およびエクソンスキッピング療法（欠失の80％および全変異の55％）を含む、DMDについての新規遺伝子治療から恩恵を受けるであろう変異が、データベース内で特定された。
B. 症状
症状は、通常、2〜3歳の男児に現れ、早期幼児期に見られることもある。早期幼児期まで症状が現れなくても、検査室試験により、出生時に活性変異を保有する子供を特定することができる。筋肉量の損失に関連する脚および骨盤の進行性の近位筋衰弱が最初に観察される。最終的に、この衰弱は、腕、首、および他の領域に広がる。初期の徴候は、仮性肥大（ふくらはぎおよび三角筋の腫脹）、低持久力、および、助けなしで起立することが困難、または階段を上ることができないことを含み得る。病状が進行するにつれて、筋組織は、消耗を経験し、最終的には脂肪および線維性組織に置き換えられる（線維症）。10歳までに歩行を補助するために支持具が必要となることがあり、ほとんどの患者は、12歳までに車椅子に頼る。その後の症状は、脊椎湾曲を含め、骨格の変形を導く異常な骨発達を含み得る。進行性の筋肉劣化に起因して、運動の消失が起こり、最終的に麻痺に至る。知的障害が存在する可能性も、存在しない可能性もあるが、存在しても、子供が年を取るにつれて次第に悪化することはない。DMDに罹患している男性の平均余命は25歳前後である。
進行性の神経筋障害であるデュシェンヌ型筋ジストロフィーの主な症状は、筋肉消耗に伴う筋衰弱であり、随意筋、とりわけ臀部、骨盤領域、大腿部、肩部、およびふくらはぎの随意筋が最初に侵される。筋衰弱はまた、後に、腕、首、および他の領域でも生じる。ふくらはぎが腫脹することが多い。症状は、通常、6歳より前に現れ、早期幼児期に現れることもある。他の身体症状は以下のとおりである。
1. ぎこちない歩き方、足踏み方、または走り方（患者は、ふくらはぎの筋肉緊張の増大のため、足の前部で歩く傾向がある。また、つま先歩きは、膝伸筋の衰弱に対する代償的適応である。）
2. 頻繁な転倒
3. 疲労
4. 運動技能（ランニング、ホッピング、ジャンピング）の障害
5. 股関節屈筋の短縮を導くおそれのある、腰椎の脊柱前彎過度。これは、姿勢全体、および歩き方、足踏み方、または走り方に影響を及ぼす。
6. アキレス腱および膝腱の筋拘縮は、結合組織において筋線維が短くなり線維形成を起こすので、機能を損なう。
7. 進行性の歩行困難
8. 筋線維の変形
9. 舌およびふくらはぎの筋肉の仮性肥大（腫脹）。筋組織は最終的に脂肪および結合組織により置き換えられるため、仮性肥大という語を用いる。
10. 脳内のジストロフィンの非存在または機能不全の結果であると考えられる、神経行動障害（例えば、ADHD）、学習障害（失読症）、および特定の認知技能（特に短期言語記憶）の非進行性衰弱の高いリスク
11. 歩く能力の最終的消失（通常は12歳までに）
12. 骨格の変形（場合によっては脊柱側彎を含む）
13. 臥位または座位から起き上がることが困難
この病状は、しばしば、患者が最初の措置を講じたときから臨床的に観察することができ、通常、当該男児が9歳〜12歳の間に歩行能力が完全に失われる。DMDに罹患したほとんどの男性は、21歳までに、本質的に「首より下が麻痺する」ようになる。筋肉消耗は、脚および骨盤で始まり、次に肩および首の筋肉に進行し、続いて腕の筋肉および呼吸筋が損失する。ふくらはぎの筋肉の腫脹（仮性肥大）が一目瞭然である。心筋症、特に（拡張型心筋症）が一般的であり、鬱血性心不全または不整脈（不規則な心拍）の発症はごくまれである。
ガワーズ徴候陽性は、下肢筋肉のより重度の障害を反映する。子供は、上肢で起き上がる：初めに腕と膝で立ち上がり、次いで手を脚の上まで「歩行させて」直立する。罹患した子供は、通常、より疲れやすく、同等者よりも全体的な力が弱い。クレアチンキナーゼ（CPK-MM）の血流レベルは極めて高い。筋電図検査（EMG）は、衰弱が神経への損傷ではなく筋組織の破壊によって引き起こされていることを示す。遺伝子検査は、Xp21遺伝子の遺伝的誤りを明らかにすることができる。筋生検（免疫組織化学もしくは免疫ブロッティング）または遺伝子検査（血液検査）は、ジストロフィンの非存在を確認するが、遺伝子検査の改善によってこれは不要になることが多い。
DMD患者は以下の症状に悩まされうる。
1. 異常な心筋（心筋症）
2. 鬱血性心不全または不規則な心拍リズム（不整脈）
3. 胸部および背部の変形（脊柱側彎）
4. ふくらはぎ、臀部、および肩の筋腫脹（4歳または5歳前後）。これらの筋肉は最終的に、脂肪および結合組織により置き換えられる（仮性肥大）。
5. 筋肉量の損失（萎縮）
6. かかと、脚の筋拘縮
7. 筋肉の変形
8. 食物または流体が肺に流入することに伴う肺炎および嚥下を含む、呼吸器障害（疾患の後期段階において）
C. 原因
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）は、X染色体の短腕に位置する遺伝子座Xp21のジストロフィン遺伝子の変異によって引き起こされる。ジストロフィンは、多くのサブユニットを含有するタンパク質複合体を通じて、各筋線維の細胞骨格を、基礎となる基底層（細胞外マトリックス）に接続する役割を担う。ジストロフィンが存在しないと、過剰なカルシウムが筋線維鞘（細胞膜）に浸透する。カルシウムおよびシグナル伝達経路の変化により水がミトコンドリアに侵入し、次いでミトコンドリアが破裂する。
骨格筋ジストロフィーでは、ミトコンドリア機能不全が、ストレス誘発性サイトゾルカルシウムシグナルの増幅およびストレス誘発性活性酸素種（ROS）産生の増幅を生じる。いくつかの経路を含むが明確に理解されていない複雑なカスケードプロセスにおいて、細胞内の酸化ストレスの増加が筋線維鞘に損傷を与え、最終的には細胞死をもたらす。筋線維が壊死を起こし、最終的に脂肪および結合組織に置き換えられる。
DMDは、X連鎖潜性パターンで遺伝する。女性が典型的にはこの疾患の保因者になり、男性が罹患する。典型的には、女性保因者は、罹患した息子を産むまでは変異を保有することに気付かないであろう。保因者の母親の息子は、母親から欠陥遺伝子を引き継ぐ可能性が50％ある。保因者の母親の娘は、保因者である可能性が50％であり、遺伝子の2つの正常コピーを有する可能性が50％ある。いかなる場合でも、罹患していない父親は、正常なYを息子に、または正常なXを娘に譲り渡す。DMDなどのX連鎖潜性状態の女性保因者は、X不活性化のパターンによっては症状を示し得る。
フレーム外エクソンを並列することによってオープンリーディングフレーム（ORF）を破壊する、ヒトDMD遺伝子のエクソン51の前のエクソン欠失が、最も一般的なタイプのヒトDMD変異である。エクソン51のスキッピングは、原理上、エクソン欠失を有するDMD患者の13％でDMD ORFを回復させることができる。
デュシェンヌ型筋ジストロフィーは、男児の5000人に1人の発生率を有する。ジストロフィン遺伝子内の変異は、生殖細胞系伝達の間に遺伝する、または自発的に発生し得る。例であって限定的でない変異および対応するモデルの表を以下に示す。
（表２）ジストロフィン変異および対応するマウスモデル
Figure 2020503869
D. 診断
この障害の家族歴を有する人には、遺伝カウンセリングが推奨される。デュシェンヌ型筋ジストロフィーは、妊娠中に行われる遺伝子検査によって約95％の精度で検出できる。
DNA検査
ジストロフィン遺伝子の筋肉特異的アイソフォームは、79のエクソンから構成され、通常、DNA検査および分析で、影響を受けるエクソンの特定のタイプの変異を同定することができる。ほとんどの場合に、DNA検査が診断を確定する。
筋生検
DNA検査で変異を見つけられない場合は、筋生検検査が行われることがある。小さな筋組織サンプルを抽出し（通常は針の代わりにメスで）、ジストロフィンの存在を明らかにする色素を適用する。そのタンパク質の完全な非存在は、その病状を示唆する。
過去数年間に、病状を引き起こす多数の変異をより多く検出するDNA検査が開発されており、デュシェンヌの存在を確認するために頻繁に筋生検が必要となることはない。
出生前検査
DMDは、X連鎖潜性遺伝子によって運ばれる。男性はX染色体を1つしか持たないので、変異した遺伝子の1コピーがDMDを引き起こす。父親はX連鎖形質を息子に譲り渡すことができないので、変異は母親によって伝達される。
母親が保因者であって、2つのX染色体のうちの1つがDMD変異を有する場合、女児がその変異を2つのX染色体の1つとして引き継ぎ、保因者になる可能性が50％ある。男児がその変異を1つのX染色体として引き継ぎ、それ故DMDを有する可能性が50％ある。
出生前検査は、まだ生まれていない子供が最も一般的な変異を有するかどうかに答えることができる。DMDに関与する多くの変異が存在するが、一部は同定されていないので、遺伝子検査は、DMDを有する家族が同定されている変異を有する場合にのみ機能する。
侵襲的検査の前に、胎児の性別の判定が重要である。男性はこのX連鎖疾患の影響を受けることがあるが、女性のDMDは極めて稀である。これは、最近では無料の胎児DNA検査により16週以上の時点で超音波スキャンによって達成することができる。絨毛膜標本採取（CVS）は、11〜14週時に行うことができ、1％の流産リスクを有する。羊水穿刺は、15週後に行うことができ、0.5％の流産リスクを有する。胎児の採血は、約18週時に行うことができる。不明確な遺伝子検査結果の場合の別の選択肢は、胎児筋生検である。
E. 処置
DMDに対する現行の治癒法はなく、継続的な医学的必要性が規制当局によって認識されている。ある特定の変異に対するエクソンスキッピング処置を用いた第1〜2a相試験は、歩行の減退を中断し、わずかな臨床的改善をもたらした。処置は、一般に、生活の質を最大限にするために症状の発症を制御することを目的とし、以下を含みうる。
1. プレドニゾロンおよびデフラザコートなどのコルチコステロイドは、エネルギーおよび強度を高め、いくつかの症状の重症化を遅らせる。
2. ランダム化比較試験は、ベータ-2-アゴニストが筋力を増加させるが、疾患の進行を改変しないことを示している。ベータ2-アゴニストでのほとんどのRCTの経過観察時間は、わずか12ヶ月前後であり、よってその時間枠を超えて結果を推定することはできない。
3. 水泳などの、軽度な不快でない身体活動が推奨される。不活動であること（ベッドでの静養など）は、筋肉疾患を悪化させ得る。
4. 理学療法は、筋力、柔軟性、および機能を維持するのに役立つ。
5. 矯正装具（支持具および車椅子など）は、移動性および自己ケア能力を改善し得る。睡眠中に足首を適切な位置で支える、体にぴったり合った取り外し可能な脚支持具は、拘縮の発症を遅らせることができる。
6. 疾患の進行に応じて適切な呼吸補助が重要である。
DMDの包括的な集学的ケアスタンダード/ガイドラインは、疾病管理予防センター（CDC）によって開発されており、www.treat-nmd.eu/dmd/care/diagnosis-management-DMDで入手可能である。
DMDは、Bushby et al., Lancet Neurol., 9(1): 77-93 (2010) および Bushby et al., Lancet Neurol., 9(2): 177-198 (2010)（参照によってその全体が組み入れられる）に概説されているように、一般に5つの段階を経て進行する。発症前期の間、患者は、典型的には、発達遅延を示すが、歩行障害はない。初期の歩行可能期の間、患者は、典型的には、ガワーズ徴候、動揺歩行、およびつま先歩きを示す。後期の歩行可能期の間、患者は、典型的には、次第に苦しい歩行を見せ、階段を上るおよび床から起き上がる能力が失われ始める。初期の非歩行可能期の間、患者は、典型的には、しばらくの間は自力で進むことができ、姿勢を保つことができ、脊柱側彎を発症し得る。後期の非歩行可能期の間、上肢機能および姿勢保持は、次第に制限される。
いくつかの態様において、処置は、疾患の発症前期に開始される。いくつかの態様において、処置は、初期の歩行可能期に開始される。いくつかの態様において、処置は、後期の歩行可能期に開始される。複数の態様において、処置は、初期の非歩行可能期の間に開始される。複数の態様において、処置は、後期の非歩行可能期の間に開始される。
1. 理学療法
理学療法士は、患者が身体的潜在性を最大限に発揮できるようにすることに携わる。彼らの目的は、以下を行うことである：
1. 必要に応じてストレッチおよび運動のプログラムを開発することによって拘縮および変形の発症を最小限に抑えること、
2. 固定具および耐久性のある医療機器を推薦することによって、身体的な性質の他の二次的合併症を予測し、最小限に抑えること、ならびに
3. 呼吸機能を監視し、呼吸運動を補助するための技法および分泌物を取り除く方法について助言すること。
2. 呼吸補助
呼吸のたびに調節可能な体積（量）の空気を人に送達する最新の「従量式酸素吸入器/人工呼吸器」が、筋ジストロフィーに関連した呼吸障害を有する人の処置において有益である。酸素吸入器は、空気を直接送達する侵襲性の気管内チューブまたは気管切開チューブを必要とすることもあるが、一部の人には、フェイスマスクまたはマウスピースによる非侵襲性の送達で十分である。この後者の方法においては、気道陽圧装置、特に二相性の気道陽圧装置が使用されることもある。呼吸具は、携行性のために外部バッテリを備えた電動車椅子の底面または背面の酸素吸入器トレイに容易に適合し得る。
呼吸筋が崩壊し始める可能性があるとき、酸素吸入器処置を十代の半ばから後半に始め得る。肺活量が正常の40％未満に低下した場合、人が換気低下状態（「低換気」）にある可能性が最も高い時間である睡眠時間中に、従量式酸素吸入器/人工呼吸器を使用し得る。睡眠中の低換気は、睡眠障害の詳しい病歴と酸素測定試験および毛細血管血のガスとによって判定される（肺機能検査を参照のこと）。咳補助装置は、肺の過膨張による肺内の過剰な粘液を陽気圧で、次いで陰圧で粘液を上昇させることに役立ち得る。肺活量が正常の30パーセント未満に減少し続ける場合、さらなる補助のため日中にも従量式酸素吸入器/人工呼吸器が必要となり得る。必要に応じて、人は、日中に酸素吸入器/人工呼吸器を使用する時間を徐々に増加させるであろう。
F. 予後
デュシェンヌ型筋ジストロフィーは、最終的に全ての随意筋に影響を及ぼしかつ後期に心筋および呼吸筋を侵す、進行性疾患である。平均余命は、現在25歳前後と推定されているが、これは患者によって異なる。最近の医学の進歩は、罹患者の生存を延長させている。全ての筋疾患に焦点を当てた有力な英国慈善団体であるThe Muscular Dystrophy Campaignは、「高い水準の医学的ケアにより、デュシェンヌ型筋ジストロフィーを有する若年男性は、30代を優に超えるまで生きることが多い」と述べている。
稀な事例では、DMDを有する人は、必要に応じて、車椅子およびベッドでの適正な位置調整、酸素吸入器の補助（気管切開術またはマウスピースを介した）、気道浄化、ならびに心臓薬の使用によって、40代または50代前半まで生存することが分かっている。晩年のケアのための早期の必要な支援計画は、DMDを抱えながら生きている人において長寿が示されている。
不思議なことに、デュシェンヌ型筋ジストロフィーのmdxマウスモデルにおいて、ジストロフィンの欠如は、カルシウムレベルの上昇および骨格筋の筋壊死と関連している。内喉頭筋（ILM）は、保護されており、筋壊死を起こさない。ILMは、他の筋肉と比較してカルシウムの変化を処理する能力がより優れていることを示唆するカルシウム調節系プロファイルを有しており、これは、それらのユニークな病態生理学的特性についての機構的洞察を提供し得る。ILMは、種々の臨床シナリオにおける筋肉消耗の予防および治療のための新規戦略の開発を容易にし得る。
II. ゲノム編集から恩恵を受ける他の疾患
本発明者らのマルチプルガイドアプローチは、DMDの処置における適用を見いだすことに加えて、そのような介入が根底にある原因の遺伝子欠損の修正を結果としてもたらし得る他の疾患状態に有利に適用することができる。これらのうちのいくつかを、下記に簡潔に説明する。
肢帯型筋ジストロフィー
肢帯型筋ジストロフィー（LGMD）またはエルプ筋ジストロフィーは、希少筋ジストロフィーの遺伝学的にかつ臨床的に不均質の群である。これは、主に股関節および肩の筋肉に影響を及ぼす進行性の筋肉消耗を特徴とする。LGMDは、常染色体型の遺伝を有し、現在、公知の治療法を有さない。肢帯型筋ジストロフィー（LGMD）を有する個体の症状は、概して、歩行、階段の昇降両方、および椅子からの立ち上がりに困難を有する。体をかがめることの困難および日常的な転倒もまた、一般的である。ある特定の物体を持ち上げることの困難、および腕を頭の外または上で保持することの困難もまた、LGMDの一般的な提示である。最終的に、歩く/走る能力が衰退する。
この疾患は不可避的に時間と共に悪くなるが、一部の患者では他の患者よりも進行がより急速である。最終的に疾患は、顔に位置するものなどの他の筋肉に影響を及ぼし得る。疾患は一般的に、症状の発症の数年以内に車椅子への依存をもたらすが、患者間の変動性は大きく、一部の患者は移動性を維持する。
筋衰弱は、概して対称性、近位性であり、かつゆっくりと進行する。ほとんどの症例において、LGMDでは痛みはなく、精神機能は影響を受けない。LGMDは、小児期、青年期、若年成人期、またはさらに後期に始まる可能性があり、発症の年齢は、通常10〜30歳の間である。両方の性別が同等に影響を受け、肢帯型筋ジストロフィーが小児期に始まる場合、進行はより速く、疾患はより大きな障害を起こすようである。疾患が青年期または成人期に始まる場合、疾患は概してそれほど重篤ではなく、よりゆっくりと進行する。提示時に、感覚神経障害、または自律神経性もしくは内臓性の機能不全はない。
LGMDの遺伝学の点では、遺伝性障害であるが、顕性または潜性の遺伝子欠損として遺伝され得る。欠損の結果は、筋肉が、正常な筋肉機能に必要とされるある特定のタンパク質を適正に形成できないことである。いくつかの異なるタンパク質が影響を受ける可能性があり、欠如しているまたは欠損している特異的タンパク質が、筋ジストロフィーの特異的タイプを特定する。LGMDにおいて影響を受けるタンパク質の中には、α、β、γ、およびδサルコグリカンがある。サルコグリカン異常症は、恐らく遺伝子治療に適用できるであろう。
ジスフェリン異常症
ジスフェリン異常症は、ジスフェリン遺伝子における変異による機能的ジスフェリンタンパク質の欠損によって引き起こされる、常染色体潜性神経筋障害である。ジスフェリン異常症は、進行性筋肉消耗を特徴とし、診断時の筋病変の最初のパターンに応じて、ほとんどの場合、肢帯型筋ジストロフィー2B型（LGMD2B）または三好型筋ジストロフィー1（MMD1；遠位筋ジストロフィーの型）として臨床的に診断される。ジスフェリン異常症は希少疾患であり、その正確な発生率はまだ決定されていない。
ジスフェリン異常症の症状は、通常、16〜25歳の年齢の間の早期成人期に現れ、肢および肢帯（股関節および肩）の骨格筋に主として影響を及ぼし、心臓および横隔膜などの重要な筋肉は大きく影響を受けないままである。ジスフェリン異常症患者の大多数は、診断の10〜20年以内に歩行不可能になるが、期待寿命は正常である。発症の年齢および疾患の進行には、大量の変動性がある。
LGMD2BおよびMMD1は両方とも、ジスフェリン欠損によって引き起こされるが、LGMD2Bの診断は、衰弱が最初に近位筋（大腿および上腕）にある時に与えられ、他方、MMD1の診断は、衰弱が最初に遠位筋（ふくらはぎおよび前腕）にある時に与えられる。両方の症例において、衰弱は、最終的に、遠位筋および近位筋の両方を含むように進行する。LGMD2BおよびMMD1は両方とも診断するのが非常に困難であり、患者は多くの場合に、ジスフェリン異常症と正しく診断される前に何度も誤診される。
「ジスフェリン異常症」は、ジスフェリンタンパク質の欠如を単純に指すが、LGMD2Bおよび三好型ミオパチー1は、ジスフェリン遺伝子における変異が検出できる時のみに確認される診断である。ジスフェリン異常症に特異的な臨床研究および試験への参加のためには、患者が遺伝子診断を受けることが不可欠である。Jain Foundationは、試験を組織化し、費用をカバーすることによって、肢帯型筋ジストロフィーを有する患者が遺伝子診断を達成することを手助けする、非営利的家族組織である（www.jain-foundation.org）。
タイチンミオパチー
コネクチンとしても公知のタイチンは、ヒトにおいて、TTN遺伝子によってコードされているタンパク質である。タイチンは、長さが1μmを超える巨大タンパク質であり、筋肉の受動的弾性を担う分子スプリングとして機能する。それは、構造化されていないペプチド配列によって接続されている244種類の個々にフォールディングしたタンパク質ドメインから構成されている。これらのドメインは、タンパク質が伸びた時にアンフォールディングし、張力が除去された時にリフォールディングする。
タイチンは、横紋筋組織の収縮において重要である。それは、筋節においてZ線をM線に接続する。タンパク質は、Z線での力の伝達およびI帯領域における静止張力に寄与する。それは、張力における筋節の運動の範囲を限定し、したがって、筋肉の受動的な硬直に寄与する。異なるタイプの筋肉（例えば、心筋または骨格筋）の間のタイチンの配列におけるバリエーションは、これらの筋肉の機械的特性における差と相関している。
タイチンは、横紋筋の非常に豊富なタンパク質である。タイチンの主たる機能は、太いフィラメントを安定化すること、それを細いフィラメントの間の中心に置くこと、筋節の過伸展を阻止すること、およびそれが伸びた後にスプリングのように筋節をリコイルすることである。N末端のZ板領域およびC末端のM線領域が、単一タイチン分子が筋節の長さの半分にわたるように、それぞれ筋節のZ線およびM線に結合する。タイチンはまた、筋肉関連タンパク質に対する結合部位も含有し、そのため、筋細胞において収縮機構のアセンブリのための接着鋳型として働く。それはまた、染色体のための構造タンパク質としても特定されている。考慮すべき変動性が、タイチンのI帯、M線、およびZ板領域に存在する。I帯領域における変動性は、様々なタイチンアイソフォームの弾性における差に寄与し、そのため、様々な筋肉タイプの弾性における差に寄与する。特定されている多くのタイチンバリアントのうち、5種類が、利用可能な完全な転写物情報と共に記述されている。
この遺伝子の異常に長い配列内のいずれかでの変異は、中途終止コドンまた他の欠損を引き起こす可能性がある。タイチン変異は、早期呼吸不全を伴う遺伝性ミオパチー、致命的な心筋症を伴う早期発症ミオパチー、心臓疾患を伴うコアミオパチー、中心核ミオパチー、肢帯型筋ジストロフィー2J型、家族性拡張心筋症9、肥大性心筋症、および脛骨筋ジストロフィーと関連している。さらなる研究はまた、任意のジストロフィーまたはミオパチーのいかなる遺伝学的に連鎖した形態も、TTN遺伝子上の変異によって引き起こされることから安全に除外できないことも示唆している。拡張心筋症患者における短縮変異は、A領域において最も一般的に見いだされ；上流I領域における短縮は、A領域の翻訳を全体的に阻止することが期待され得るが、選択的スプライシングが、中途終止コドンに遭遇しないいくつかの転写物を生成し、その効果を寛解させる。タイチンに対する自己抗体が、自己免疫疾患の強皮症を有する患者において産生される。
リアノジン受容体における変異（偽エクソンを伴う変異）によって引き起こされる先天性ミオパチー「セントラルコア病」
セントラルコアミオパチーとしても公知のセントラルコア病（CCD）は、常染色体顕性先天性ミオパチー（先天筋障害）である。それは、1956年にShyおよびMageeによって最初に記述された。顕微鏡下での筋原線維の出現を特徴とする。
CCDの症状は、変動するが、通常、誕生時の低血圧（筋緊張の減少）、小児発育の軽度の遅延（症例間で高度に変動性である）、顔面筋の衰弱、ならびに脊柱側彎および股関節脱臼などの骨格奇形を含む。
症状は、誕生時に存在する場合があり、または人生のいずれかの時期に現れる場合がある。成人期から中年まで症候性にならない人々の数が増えているようである。概して進行性ではないが、再び、総体的症状のゆっくりした臨床的に有意な進行を経験する人々の数が増えているようである。これらの症例は、仮説として、リアノジン受容体の多数の遺伝子変異のために機能失調である可能性があり、継続的な研究により、臨床的バリアントであることが実際に見いだされる可能性がある。
診断は、典型的な症状と、筋肉由来の生検（組織試料）の外観との組み合わせに基づいて行われる。名称は、筋細胞が、ミトコンドリアおよび特異的酵素が欠けているコアを有する、光学顕微鏡上の生検の典型的な外観に由来する。呼吸不全が、症例の小さな比率において発生する。クレアチンキナーゼおよび筋電図（EMG）は、正常である傾向がある。
セントラルコア病は、常染色体顕性様式で遺伝される。ほとんどの症例は、多くの場合に新生である（新しく発生した）、リアノジン受容体1型（RYR1）遺伝子における実証可能な変異を有する。CCDを有する人々は、全身麻酔を受けた時に、悪性高熱症（MH）のリスクがある。
特異的な処置はないが、トリガーになる麻酔薬を回避し、親戚をRYR1変異について、これらが彼らをMHに感受性にさせ得るためスクリーニングする。
筋緊張性ジストロフィー
筋緊張性ジストロフィーは、筋機能に影響を及ぼす長期の遺伝子障害である。症状には、徐々に悪化する筋損失および衰弱が含まれる。筋肉は収縮し、弛緩することができないことが多い。他の症状には、白内障、知的障害、および心臓刺激伝導問題が含まれ得る。男性においては、早期禿頭および子供を持てない可能性があり得る。
筋緊張性ジストロフィーは、典型的には人の親から遺伝する常染色体顕性障害である。1型（DM1）および2型（DM2）の2つの主要なタイプがあり、DM1はDMPK遺伝子における変異によるもので、DM2はCNBP遺伝子における変異によるものである。障害は概して、世代ごとに悪化する。DM1のタイプは、誕生時に明らかである場合がある。DM2は、概してより軽度である。それらは、筋ジストロフィーのタイプである。診断は、遺伝子試験によって確認される。
治療法はない。処置には、装具または車椅子、ペースメーカー、および非侵襲性陽圧換気が含まれ得る。薬剤のメキシレチンまたはカルバマゼピンが助けになることがある。痛みは、起こる場合には、三環系抗うつ薬および非ステロイド性抗炎症薬（NSAID）で処置され得る。
筋緊張性ジストロフィーは、世界中で8,000人に1人よりも多くに影響を及ぼす。筋緊張性ジストロフィーは、いずれの年齢でも起こる可能性があるが、発症は、典型的には20代および30代である。それは、成人期に始まる筋ジストロフィーの最も一般的な形態である。それは、1909年に最初に記述され、1型の根底にある原因は1992年に決定された。
症状および徴候の提示は、形態（DM1/DM2）、重篤度、およびさらに異常なDM2表現型によってかなり変動する。DM2についてのDM1症状には、実行機能（例えば、組織化、集中、単語発見）での問題、および過剰睡眠が含まれる。伝導異常は、DM2よりもDM1においてより一般的であるが、全ての人々は、年1回のECGを有するように勧められる。両タイプとも、インスリン耐性にも関連している。筋緊張性ジストロフィーは、青い斑点の外観を有する皮質部白内障、または後嚢下白内障を有する場合がある。
DM2は、概してDM1よりも軽度であり、介助装置を必要とするDM2の人々は、DM1の人々よりも概して少ない。加えて、DM1において赤ちゃんに影響を及ぼす重篤な先天性形態がDM2においては見いだされておらず、症状の早期の発症は、医学文献においてより若い人々に現れるとはめったに記述されていない。
症状は、乳児期から成人期までのいずれかの時に現れ得る。DMは通常、手、足、首、または顔の筋肉において始まる、一般的な衰弱を引き起こす。それは、心臓を含む他の筋肉群を含むようにゆっくりと進行する。DMは、多種多様の他の器官系に同様に影響を及ぼす。
筋緊張性ジストロフィーは、常染色体顕性パターンで遺伝する遺伝学的状態であり、したがって、平均で保因者の子孫の50％に伝わることになる。筋緊張性ジストロフィーは、いくつかの公知のトリヌクレオチドリピート障害のうちの1つである。DNAのある特定の区域が、2個または3個のヌクレオチドの反復配列を有する。
筋緊張性ジストロフィー（DM）は、遺伝性疾患である。DMの重篤な形態である先天性筋緊張性ジストロフィーは、DMを有する母親の新生児において現れる場合がある。先天性筋緊張性ジストロフィーはまた、父性遺伝子を介して遺伝する可能性もあるが、それは相対的にまれであると言われている。先天性とは、状態が誕生から存在することを意味する。
DM1において、影響を受ける遺伝子は、DMPKと呼ばれ、骨格筋において主として発現しているタンパク質である筋緊張性ジストロフィータンパク質キナーゼをコードしている。遺伝子は、第19番染色体の長腕上に位置している。
DM1においては、DMPK遺伝子中にシトシン-チミン-グアニン（CTG）トリプレットリピートの増大がある。5〜37個の間のリピートが正常とみなされ、他方、38〜49個の間のリピートを有する個体は、前変異を有するとみなされ、さらに増大したリピートを有し、そのために症候性疾患を有する子供を持つリスクがある。50個よりも多いリピートを有する個体は、いくつかの記述されている例外があるが、ほぼ不変に症候性である。より長いリピートは、通常、より早期の発症およびより重篤な疾患に関連している。
37個よりも多いリピートを有するDMPKアレルは、不安定であり、追加のトリヌクレオチドリピートが、有糸分裂および減数分裂における細胞分裂中に挿入され得る。その結果、前変異または変異を有する個体の子供は、その親よりも長いDMPKアレルを受け継ぎ、そのため、罹患するか、または状態のより早期の発症およびより大きな重篤度を示す可能性がより高く、これは表現促進として公知の現象である。興味深いことに、状態の父性伝達は非常に珍しい（恐らく、増大したリピートを有する精子に対する選択圧のため）が、表現促進は、母性遺伝の症例におけるよりも重篤度が低い傾向がある。
増大したトリヌクレオチドリピート領域由来のRNAは、C-G塩基対間の広範な水素結合のために核細胞質内ヘアピンループを形成し、これらがスプライシング調節因子MBNL1を隔離して特有の巣状部を形成することが、それをGFPで標識し、プローブオリゴヌクレオチドを赤色蛍光色素シアニン5（Cy5）で標識することによって、実証されている。
DM2は、第3番染色体上のZNF9遺伝子の欠陥によって引き起こされる。具体的な欠陥は、ZNF9遺伝子中のシトシン-シトシン-チミン-グアノシン（CCTG）テトラヌクレオチドのリピートである。それは、4個のヌクレオチドのリピートを含むため、トリヌクレオチドリピート障害ではなく、より正確にはテトラヌクレオチドリピート障害である。
DM2についてのリピート増大は、DM1についてよりもずっと大きく、75個から11,000個を上回るリピートの範囲にわたる。DM1においてとは異なり、DM2における反復DNA増大のサイズは、発症の年齢または疾患重篤度における差を生じないようである。表現促進は、DM2においてはより有意でないようであり、ほとんどの現在の総説は、DM2の特徴として軽度の表現促進を報告しているだけである。
フリードライヒ運動失調症
フリードライヒ運動失調症は、神経系に対する進行性の損傷を引き起こす、常染色体潜性遺伝性疾患である。それは、歩行障害などの不十分な協調の最初の症状を現し；また、脊柱側彎、心疾患、および糖尿病ももたらす可能性があるが、認知機能には影響を及ぼさない。疾患は、移動のために車椅子が必要とされるまで進行する。一般集団におけるその発生率は、だいたい50,000人に1人である。
特定の遺伝子変異（FXN遺伝子中のイントロンGAAトリプレットリピートの増大）が、ミトコンドリアタンパク質フラタキシンンの発現の低減をもたらす。時間と共に、この欠損が、前述の損傷、および、細胞代謝に対する効果のために頻繁な疲労を引き起こす。
フリードライヒ運動失調症の運動失調は、脊髄、特に（小脳との接続を通して）腕および脚の筋肉の運動を方向づけるのに不可欠な感覚ニューロンにおける神経組織の変性に起因する。脊髄は、より細くなり、神経細胞は、そのミエリン鞘（神経インパルスを伝導する手助けをする一部の神経細胞上の絶縁被覆）のうちの一部を失う。
症状は典型的には、5〜15歳の間のどこかの年齢で始まるが、後期発症FAにおいては、20代または30代で起こる場合もある。症状には、腕および脚における筋衰弱、協調の消失、視力障害、聴力障害、不明瞭発語、脊柱の彎曲、高度な足底弓（足の凹足変形）、糖尿病（フリードライヒ運動失調症を有する人々の約20％が、炭水化物不耐性を発症し、10％は新生糖尿病を発症する）、ならびに心臓障害（例えば、心房細動、ならびに結果として生じる頻脈（速い心拍）および肥大性心筋症）のいずれかの組み合わせが含まれるが、必ずしも全部は含まれない。
それは、22歳よりも前に、進行性のよろめき歩行またはつまずき歩行、および頻繁な転倒を示す。下肢が、より重篤に関わる。症状は、ゆっくりかつ進行性である。長期の観察により、多くの患者が、患者の早期成人期に症状がプラトーに達することが示されている。平均で、疾患を有して10〜15年後に、患者は、通常車椅子に縛られ、全ての日常生活動作で介助を必要とする。
以下の身体的徴候が、身体検査で検出され得る：小脳徴候、例えば眼振、速い断続性眼球運動、体幹運動失調、構音障害、測定障害；下位運動ニューロン病変、例えば深部腱反射の欠如；錐体徴候、例えば伸筋性足底応答、および遠位衰弱が一般に見いだされる；後柱局面、例えば振動性および固有受容感覚の損失が起こる。心臓肥大（拡張心筋症まで）、対称性肥大、心雑音、および伝導欠陥を含む心臓関与が、患者の91％において起こる。中央死亡年齢が35歳である一方で、女性は、より良好な予後を有し、20年生存率が、男性における63％と比較して100％である。症例の20パーセントは、真性糖尿病に関連して見いだされる。
フリードライヒ運動失調症は、FXN遺伝子が増幅されたイントロンGAAリピート（トリヌクレオチドリピート増大の例）を含有する時に起こる、常染色体潜性障害である。FXN遺伝子は、タンパク質フラタキシンをコードしている。GAAリピート増大は、フラタキシンレベルを低減させる。フラタキシンは、鉄-硫黄クラスターの形成を担う鉄結合タンパク質である。フラタキシン欠損の1つの結果は、ミトコンドリア鉄過負荷であり、これは、多くのタンパク質に対して損傷を引き起こす可能性がある。正常な生理機能におけるフラタキシンの正確な役割は不明瞭なままである。遺伝子は第9番染色体上に位置する。
変異体遺伝子は、第1イントロン中に増大したGAAトリプレットリピートを含有し；少数の家系においては、点変異が検出されている。欠陥は、イントロン（転写と翻訳の間にmRNA転写物から除去される）に位置するため、この変異は、異常なフラタキシンタンパク質の産生は結果としてもたらさない。その代わりに、変異は、斑入り位置効果に類似した様式でのヘテロクロマチン構造の誘導を通した遺伝子サイレンシングを引き起こす（すなわち、変異が遺伝子の転写を減少させる）。
GAAリピートの長い域は、フラタキシンの発現を低減させることに加えて、インビボ酵母研究において染色体切断を誘導する。
ハンチントン病
ハンチントン舞踏病としても公知のハンチントン病（HD）は、脳細胞の死を結果としてもたらす遺伝性障害である。最も初期の症状は、多くの場合、気分または精神能力を伴うわずかな問題である。協調の一般的欠如および不安定歩行が、多くの場合、後に続く。疾患が進むにつれて、非協調的な律動性の体の運動が、より明らかになる。協調運動が困難になり、当人が話すことができなくなるまで、身体能力は徐々に悪化する。精神能力は概して低下し、認知症になる。具体的な症状は、人々の間でいくぶん変動する。症状は通常、30〜50歳の間の年齢で始まるが、いずれの年齢でも開始する可能性がある。疾患は、各々の連続的な世代において、人生のより早期に発症する場合がある。症例の約8％は、20歳よりも前に開始し、典型的には、パーキンソン病により類似した症状を伴って現れる。HDを有する人々は、多くの場合、彼らの問題の程度を過少評価する。
HDは典型的に、人の親から遺伝し、症例の10％は、新たな変異のためである。疾患は、ハンチンチンと呼ばれる遺伝子の個体の2コピーのうちのいずれかにおける常染色体顕性変異によって引き起こされる。これは、罹患した人の子供は典型的に、疾患を受け継ぐ50％の確率を有することを意味する。ハンチンチン遺伝子は、同じく「ハンチンチン」と呼ばれるタンパク質についての遺伝子情報を提供する。ハンチンチンタンパク質をコードする遺伝子におけるCAG（シトシン-アデニン-グアニン）トリプレットリピートの増大は、完全には理解されていない機構を通して、脳における細胞を徐々に損傷する異常なタンパク質を結果としてもたらす。診断は、症状があるか否かにかかわらず、いずれの時点でも行うことができる遺伝子試験による。この事実は、以下のいくつかの倫理的議論を生じる：試験を選ぶのに十分なほど個体が成熟しているとみなされる年齢；子供を試験させる権利が親にあるのかどうか；ならびに、試験結果の機密性および開示の管理。
HDについての治療法はない。疾患の後期の段階においては、常時のケアが必要とされる。処置は、いくつかの症状を軽減し、いくつかにおいては生活の質を改善することができる。運動問題の処置についての最良の証拠は、テトラベナジンを伴う。HDは、ヨーロッパ系の100,000人の人々において約4〜15人に影響を及ぼす。日本人の間ではまれであり、アフリカにおいては未知の割合で起こる。疾患は、男性および女性に同等に影響を及ぼす。肺炎、心疾患、および転倒による身体負傷などの合併症が、期待寿命を低減する。症例の約9％において自殺が死亡の原因である。死亡は典型的に、疾患が最初に検出された時から15〜20年で起こる。
ハンチントン病の症状は、もっとも一般的には、35〜44歳の間の年齢で顕著になるが、乳児期から老年期までのいずれの年齢でも始まる可能性がある。初期の段階では、人格、認知、および身体技能における微妙な変化がある。認知症状および行動症状は概して、より初期の段階ではそれ自体で認識されるのに十分なほど重篤ではないため、身体症状が通常、最初に気づかれる。ハンチントン病を有するほぼ全員が、類似した身体症状を最終的に呈するが、認知症状および行動症状の発症、進行、および程度は、個体間で有意に変動する。
最も特徴的な最初の身体症状は、舞踏病と呼ばれる律動性の、ランダムな、かつ制御不可能な運動である。舞踏病は、最初に、全身の不穏状態、小さな故意ではなく開始されるかもしくは未完成の動作、協調の欠如、または遅くなった断続的眼球運動として呈され得る。これらの軽微な運動異常は、通常、運動機能不全のより明白な徴候よりも少なくとも3年、先行する。硬直、苦悶動作、または異常な姿勢などの症状の明瞭な外観が、障害が進行するにつれて現れる。これらは、運動を担う脳における系が影響を受けていることの徴候である。筋肉制御を必要とする任意の動きが影響を受けるように、精神運動機能が漸進的に損なわれるようになる。一般的な結果は、身体的不安定性、異常な顔の表情、ならびに咀嚼、嚥下、および発語の困難である。摂食困難は一般的に、体重減少を引き起こし、栄養失調をもたらし得る。睡眠撹乱もまた、関連症状である。若年性HDは、概してより速く進行し、舞踏病を（仮にあったとしても）短時間に呈する点で、これらの症状とは異なり、硬直が主要な症状である。発作もまた、この形態のHDの一般的症状である。
認知能力は進行性に損なわれる。特に、計画、認知柔軟性、抽象的思考、ルール習得、適切な動作の開始、および不適切な動作の阻害を含む実行機能が、影響を受ける。疾患が進行するにつれて、記憶欠損が現れる傾向がある。報告されている障害は、短期記憶欠損から長期記憶困難までの範囲にわたり、エピソード記憶（人の人生の記憶）、手続き記憶（活動をいかに行うかの身体の記憶）、および作業記憶における欠損を含む。認知問題は、時間と共に悪化する傾向があり、究極的に認知症をもたらす。このパターンの欠損は、それを、皮質認知症、例えば、アルツハイマー病の典型的な効果から区別するために、皮質下認知症症候群と呼ばれている。
報告されている神経精神症状発現は、不安、うつ、感情の表示の低減（情動鈍麻）、自己中心性、攻撃性、および強迫行動であり、後者は、アルコール依存症、ギャンブル、および性行動亢進を含む耽溺を引き起こすか、または悪化させる可能性がある。他の人々のネガティブな表情の認識における困難も観察されている。これらの症状の罹患率は、研究間で非常に変動し、精神障害の生涯罹患率についての推定比率は、33％〜76％の間である。多くの罹患者およびその家族にとって、これらの症状は、疾患の最も悲惨な局面の中にあり、多くの場合、日常の機能に影響を及ぼし、施設収容の理由となる。自殺念慮および自殺未遂が、一般集団におけるよりも一般的である。多くの場合、個体は、舞踏病、認知障害、および感情障害の自覚が低減している。
変異体ハンチンチンは、体全体で発現され、脳の外側でのそのような発現によって直接引き起こされる末梢組織における異常に関連している。これらの異常には、筋萎縮症、心不全、グルコース耐性の障害、体重減少、骨粗しょう症、および精巣萎縮症が含まれる。
全てのヒトは、タンパク質ハンチンチン（HTT）をコードするハンチンチン遺伝子（HTT）を2コピー有する。この遺伝子はHDおよびIT15とも呼ばれ、IT15は「興味深い転写物15」を意味する。この遺伝子の一部は、個体間で長さが変動し、世代間で長さが変化し得る、トリヌクレオチドリピートと呼ばれる反復セクションである。リピートが健常遺伝子に存在する場合には、動的変異が、リピート数を増加させ、欠陥遺伝子を結果としてもたらし得る。この反復セクションの長さがある特定の閾値に達すると、それは、変異体ハンチンチンタンパク質（mHTT）と呼ばれる、変更された形態のタンパク質を産生する。これらのタンパク質の異なる機能が、次に疾患症状を引き起こす、病理学的変化の原因である。ハンチントン病の変異は、遺伝学的に顕性で、ほぼ完全に浸透性である：人のHTTアレルのいずれかの変異が疾患を引き起こす。それは、性別によっては遺伝しないが、遺伝子の反復セクションの長さ、およびしたがってその重篤度は、罹患した親の性別によって影響を受ける可能性がある。
HDは、正常範囲を超える遺伝子の反復セクションの長さによって引き起こされる、いくつかのトリヌクレオチドリピート障害のうちの1つである。HTT遺伝子は、第4番染色体の短腕上の4p16.3に位置する。HTTは、トリヌクレオチドリピートとして公知の、3個のDNA塩基であるシトシン-アデニン-グアニン（CAG）が複数回反復した配列（すなわち、...CAGCAGCAG...）を含有する。CAGは、アミノ酸であるグルタミンについての3文字遺伝コード（コドン）であり、そのため、それらの一続きは、ポリグルタミン鎖（またはポリQ鎖）として公知のグルタミンの鎖、および遺伝子の反復部分、ポリQ領域の産生を結果としてもたらす。
概して、人々は、ポリQ領域において36個よりも少ない反復グルタミンを有し、これは、細胞質タンパク質ハンチンチンの産生を結果としてもたらす。しかし、36個以上のグルタミンの配列は、異なる特徴を有するタンパク質の産生を結果としてもたらす。変異体ハンチンチン（mHTT）と呼ばれるこの変更された形態は、ある特定のタイプのニューロンの崩壊速度を増加させる。脳の複数の領域は、これらのタイプのニューロンについて異なる量および依存度を有し、それにしたがって影響を受ける。概して、CAGリピートの数は、このプロセスがどれほど影響を受けるかに関連し、症状の発症の年齢のバリエーションの約60％を占める。残りのバリエーションは、環境、およびHDの機構を改変する他の遺伝子に帰する。36〜39個のリピートは、症状のずっと後期の発症およびよりゆっくりの進行を伴う、疾患の浸透度が低減した形態を結果としてもたらす。いくつかの症例において、発症は、症状が全く気づかれないほど後期である場合がある。非常に大きなリピート数を伴うと、HDは、完全な浸透度を有し、20歳よりも下で起こる可能性があり、その時は、若年性HD、無動-硬性（akinetic-rigid）、またはウェストファルバリアントHDと呼ばれる。これは、HD保因者の約7％を占める。
毛細血管拡張性運動失調症
毛細血管拡張性運動失調症候群またはルイ-バー症候群とも呼ばれる、毛細血管拡張性運動失調症（ATまたはA-T）は、重篤な能力障害を引き起こす、希少神経変性常染色体潜性疾患である。運動失調症は、不十分な協調および拡張した小血管への毛細血管拡張を指し、その両方が、疾患の特徴である。
A-Tは、身体の多くの部分に影響を及ぼす。それは、小脳を含む脳のある特定の区域を損ない、運動および協調での困難を引き起こす。それは、免疫系を弱め、感染症への素因を引き起こす。それは、壊れたDNAの修復を阻止し、がんのリスクを増加させる。
症状は、最も多くの場合、小児が歩き始める時の早期小児期（幼児段階）に最初に現れる。彼らは通常、正常年齢で歩行を開始するが、歩く時、静止して立つ時、または座る時によろめきまたはぐらつき、まるで酔っぱらっているかのように見え得る。就学前後期および早期学童期に、彼らは、1つの場所から次へと自然な態度で目を動かすことの困難（眼球運動失行症）を発症する。彼らは、不明瞭なまたは歪んだ発語、および嚥下問題を発症する。呼吸器感染症（耳感染症、副鼻腔炎、気管支炎、および肺炎）の数を増加させる人もいる。全ての小児が、同じ様式でまたは同じ速度で発症するわけではないため、A-Tが適正に診断される前に数年が過ぎる場合がある。A-Tを有するほとんどの小児は、人生の最初の4〜5年間は、安定な神経症状を有するが、早期学校時代に問題の増加を示し始める。
A-Tは、DNA中の二本鎖切断を含む複数の形態のストレスに対する細胞の応答の管理を担う、ATM遺伝子における欠陥によって引き起こされる。簡単に言えば、ATM遺伝子によって産生されるタンパク質は、DNAに切断があることを認識し、その切断を直すように他のタンパク質を動員し、修復が完了するまで細胞が新たなDNAを作製することを停止する。
罹患した個体の間で、および異なる年齢で、A-Tの特徴の重篤度には実質的な変動性がある。以下の症状または問題は、A-Tの一般的であるか重要であるかのいずれかの特徴である。
早期に明らかであるが、学童期から思春期前に悪化する運動失調症（運動制御の困難）。
眼球運動失調症（1つの場所から次へと注視を移動させる時の頭および眼の運動の協調の困難）。
不随意運動。
白眼を充血して見えるようにする、白眼（強膜）にわたる毛細血管拡張（拡張した血管）。これらは、乳児期においては明らかではなく、5〜8歳の年齢で最初に現れ得る。毛細血管拡張はまた、皮膚の日光に曝露された区域上にも現れ得る。
特に耳、副鼻腔、および肺の感染症での問題。
がん（主に、しかし排他的ではなく、リンパ腫および白血病）の発生率の増加。
遅延した開始または不完全な思春期発生、および非常に早期の閉経。
遅くなった成長速度（体重および/または身長）。
特に幼い小児における、彼らが疲れた時または活動に集中している時の流涎。
構語障害（不明瞭な、遅い、または歪んだ言語音）。
青年期またはそれよりも後期の糖尿病。
髪および皮膚における時期尚早な変化。
多くの小児が、最初に、失調性脳性麻痺を有するとして誤診される。損なわれた歩行、手の協調、発語、および眼運動の神経症状が現れるまたは悪化する、ならびに運動失調症が最初に現れる時である就学前の年まで、A-Tの診断がなされない場合がある。A-Tは非常にまれであるため、医師は、症状、または診断を行う方法に精通していない場合がある。運動失調症の後期の出現は、診断にとって障壁であり得る。症状および徴候の早期安定性のために、医師が可能性としてA-Tを考える前にいくらか時間がかかる場合がある。
A-Tは、1995年にクローニングされたATM（ATMセリン/スレオニンキナーゼまたは毛細血管拡張性運動失調症変異）遺伝子における変異によって引き起こされる。ATMは、ヒト第11番染色体（11q22.3）上に位置し、150kbのゲノムDNAにわたって広がる69個のエクソンから成り立っている。
A-Tについての遺伝の様式は、常染色体潜性である。各親が保因者であり、これは、彼らがA-T遺伝子（ATM）の1つの正常なコピーおよび変異している1つのコピーを有することを意味する。A-Tは、子供が各親から変異したA-T遺伝子を受け継ぐ場合に起こり、そのため、2人の保因者の親を有する家族においては、親から生まれた子供が障害を有する確率は4分の1である。影響を受ける子供の2つのATM遺伝子における誤り（変異）が特定されている場合には、出生前診断（および保因者検出）を家族において実行することができる。これをやり終えるプロセスは、複雑である可能性があり、時間を必要とするため、受胎前に手配するべきである。
血縁関係にない人（例えば、既知のA-T保因者の配偶者）のATM遺伝子において変異を探すことは、大きな難題を生じる。遺伝子は、多くの場合、機能に影響を及ぼさないバリアントスペリング（多型）を有する。ATMのように大きい遺伝子においては、そのようなバリアントスペリングが起こる可能性が高く、医師は、特定のバリアントが疾患を引き起こすか否かを常に予測することはできない。何を試験することができるかまたはできないか、および試験結果をどのように解釈するべきかを、A-T患者の家族員が理解するのを、遺伝カウンセリングで手助けすることができる。
A-Tの保因者、例えば、A-Tを有する人の親は、ATM遺伝子の1つの変異したコピー、および1つの正常コピーを有する。彼らは、概して健康であるが、女性においては乳がんのリスクが増加している。この知見は、様々な異なるやり方で確認されており、現在の研究の対象である。標準的な監視（毎月の乳房自己診断、および年齢について通常のスケジュールでのマンモグラフィー）が、個体が他のリスク因子（例えば、乳がんの家族歴）を有するために追加の試験が指示されない限り、推奨される。
神経線維腫症1型および2型
神経線維腫症（NF）は、神経系において腫瘍が成長する3つの状態の群である。3つのタイプは、神経線維腫症1型（NF1）、神経線維腫症2型（NF2）、および神経鞘腫症である。NF1において、症状には、皮膚上の薄茶色の斑点、腋窩および鼠径部における雀斑、神経内の小さな隆起、および脊柱側彎が含まれる。NF2においては、聴力損失、若い年齢での白内障、平衡問題、肌色の皮膚弁、および筋肉消耗がある場合がある。腫瘍は、概して非がん性である。
原因は、ある特定の遺伝子における遺伝子変異である。症例の半分において、これらは人の親から遺伝し、残りにおいては、初期発生中に起こる。腫瘍は、ニューロンよりもむしろ神経系における支持細胞を含む。NF1において、腫瘍は神経線維腫（末梢神経の腫瘍）であり、NF2および神経鞘腫症においては、シュワン細胞の腫瘍がより一般的である。診断は典型的には徴候および症状に基づき、時折、遺伝子試験によって裏付けられる。
公知の予防策または治療法はない。問題を引き起こしているまたはがん性になった腫瘍を除去するために、手術が行われ得る。放射線および化学療法も、がんが起こった場合には用いられ得る。蝸牛インプラントまたは聴性脳幹インプラントで、聴力損失を有する一部の人を手助けし得る。
米国においては、3,500人の人々に約1人がNF1を有し、25,000人に1人がNF2を有する。男性および女性は同等に頻繁に影響を受ける。NF1において、症状は、多くの場合は誕生時に存在し、そうでなければ10歳よりも前に発症する。状態は典型的には時間と共に悪化するが、NF1を有するほとんどの人々は正常な期待寿命を有する。NF2において、症状は早期成人期まで明らかにならない場合がある。NF2は、早期死亡のリスクを増加させる。この状態の記述は、1世紀というはるか昔に遡る。
人生の早期における神経線維腫症（NF1）は、学習および行動の問題を引き起こす場合があり、NF1を有する小児の約60％は、学校において軽度な形態の困難を有する。徴候の点では、個体は、以下を有し得る：6個以上の薄茶色の皮膚科学的斑点（「カフェオレ斑点」）、少なくとも2個の神経線維腫、少なくとも2個の眼の虹彩上の腫瘤、および脊柱の異常な成長（脊柱側彎）。
神経線維腫症は、常染色体顕性障害であり、これは、影響を受けた遺伝子の1コピーのみが、障害が発生するのに必要とされることを意味する。そのため、1人の親のみが神経線維腫症を有する場合は、彼または彼女の子供は、同様に状態を発症する50％の確率を有する。影響を受けた子供は、重篤な形態の障害を有する親から受け継いだとしても、軽度のNF1を有する可能性がある。2つのタイプの神経線維腫症がある。神経線維腫症I型は、良性である場合があり、かつ、神経および他の組織を圧迫することによって重大な損傷を引き起こす場合がある腫瘍（神経線維腫）への、神経組織の成長を特徴とする。神経線維腫症II型は、多くの場合に聴力損失をもたらす、両側性聴神経腫（神経鞘腫としても公知の、前庭蝸牛神経または脳神経8（CN VIII）の腫瘍）を呈する。
神経鞘腫症では、有痛性神経鞘腫が脊髄神経および末梢神経上に発生する。
レーバー先天性黒内障におけるCEP290変異
290 kDaの中心体タンパク質は、ヒトにおいてCEP290遺伝子によってコードされているタンパク質である。CEP290は、第12番染色体のQ腕上に位置する。遺伝子CEP290は、中心体および繊毛の発生において重要な役割を果たす中心体タンパク質である。この遺伝子は、（光および色を検出する）網膜の背部の光受容体において、ならびに、腎臓、脳、および多くの他の身体の器官において重要な役割を果たす、細胞膜の小さなアンテナ様突起である一次繊毛の形成においてきわめて重要である。CEP290遺伝子転写物のレベルのノックダウンは、培養中の網膜色素上皮細胞において繊毛形成の劇的な抑制を結果としてもたらし、CEP290が繊毛形成にとっていかに重要であるかをまさに証明した。
分子レベルで、CEP290は、一次繊毛形成において重要な調節的かつ構造的役割を果たすことが示されている。最近の研究により、CEP290は、繊毛の微小管コアと上に覆いかぶさる繊毛膜との間の構造的連結として働き得る微小管および膜結合タンパク質と関係があるとされている。CEP290疾患のrd16マウスモデルにおけるCEP290の微小管結合ドメインの破壊は、急速なかつ劇的な網膜変性を結果としてもたらすことが示され、これは、疾患におけるCEP290微小管結合の重要性を実証する。繊毛形成の促進におけるCEP290の役割は、CEP290タンパク質のいずれかの末端に見いだされる自己調節ドメインによって、およびCEP290と阻害性タンパク質CP110との相互作用を通しての両方で阻害される。
CEP290遺伝子の発見は、研究者が、網膜機能において重大である別の遺伝子、LCA5を見いだすように導いた。これらの2種類の遺伝子の遺伝子置換を含む臨床試験が、フィラデルフィアにおいて始まり、研究者は、レーバー先天性黒内障がいつか治癒するであろうと希望をいだいている。
この遺伝子は、13個の推定コイルドコイルドメイン、SMC染色体分離ATPアーゼに対して相同性を有する領域、6個のKIDモチーフ、3個のトロポミオシン相同性ドメイン、およびATP/GTP結合部位モチーフAを有するタンパク質をコードしている。タンパク質は、中心体および繊毛に局在化し、N-グリコシル化、チロシン硫酸化、リン酸化、N-ミリストイル化、およびアミド化のための部位を有する。
この遺伝子における変異は、ジュベール症候群およびネフロン癆に関連しており、最近では、LCA10と呼ばれるレーバー先天性黒内障の高頻度の形態に関連している。このタンパク質に対する抗体の存在は、いくつかの形態のがんに関連している。
この遺伝子における変異は、レーバー先天性黒内障として公知の疾患である、乳児および小児の失明をもたらす。今日の時点で、CEP290における35個の異なる変異が、LCAの原因を担う。CEP290における他の変異はまた、多くの症候群の中の少数であるメッケル症候群およびジュベール症候群を引き起こすことが特定されている。欠陥CEP290遺伝子は、通常、異常な繊毛のためにこれらの障害の原因である。遺伝子における1個の変異がどのようにして、特にその多くが中枢神経系に影響を及ぼす、それほど多くの異なるタイプの症候群を引き起こすことができるかは、未知である。
III. CRISPRシステム
A. CRISPR
CRISPR（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列反復）は、塩基配列の短い反復を含有するDNA遺伝子座である。各反復の後に、ウイルスへの事前曝露由来の「スペーサーDNA」の短いセグメントが続く。CRISPRは、配列決定された真正細菌ゲノムの約40％および配列決定された古細菌の90％に見いだされる。CRISPRは、CRISPRに関連するタンパク質をコードするcas遺伝子と関連していることが多い。CRISPR/Casシステムは、プラスミドおよびファージなどの外来遺伝エレメントに対する耐性を付与し、かつ獲得免疫の一形態を提供する、原核生物の免疫系である。CRISPRスペーサーは、真核生物におけるRNAiのように、これらの外因性遺伝エレメントを認識およびサイレンシングする。
CRISPR反復は、サイズが24〜48塩基対の範囲にある。これらは通常、ある程度の二分対称性を示す、つまりヘアピンなどの二次構造の形成を暗示するが、真に回文であるわけではない。反復は、同様の長さのスペーサーで隔てられている。いくつかのスペーサーは原核生物のゲノムと一致するが（自己ターゲティングスペーサー）、いくつかのCRISPRスペーサー配列は、プラスミドおよびファージ由来の配列と正確に一致する。新たなスペーサーは、ファージ感染に応答して迅速に付加され得る。
B. Casヌクレアーゼ
CRISPR関連（cas）遺伝子は、CRISPR反復-スペーサーアレイに関連していることが多い。2013年現在、40種を超える異なるCasタンパク質ファミリーが記述されている。これらのタンパク質ファミリーのうち、Cas1は、異なるCRISPR/Casシステムの間で遍在しているようである。8つのCRISPRサブタイプ（Ecoli、Ypest、Nmeni、Dvulg、Tneap、Hmari、Apern、およびMtube）を定義するためにcas遺伝子および反復構造の特定の組み合わせが使用されており、その一部は、RAMP（repeat-associated mysterious protein）をコードする追加の遺伝子モジュールと関連している。単一のゲノム内に2つ以上のCRISPRサブタイプが存在し得る。CRISPR/Casサブタイプの散在的分布は、システムが微生物の進化中に遺伝子水平伝播を受けることを示唆している。
外因性DNAは、外見上、Cas遺伝子によりコードされたタンパク質によって小さなエレメント（長さがおよそ30塩基対）へとプロセッシングされ、これが次に、リーダー配列の近くのCRISPR遺伝子座に何らかの形で挿入される。CRISPR遺伝子座からのRNAは、構成的に発現され、Casタンパク質によって個々の外部に由来する配列エレメントと隣接する反復配列とから構成される小さなRNAへとプロセッシングされる。RNAは、他のCasタンパク質をガイドして、外因性遺伝エレメントをRNAまたはDNAレベルでサイレンシングする。CRISPRサブタイプ間の機能的多様性を、証拠が示唆している。Cse（CasサブタイプEcoli）タンパク質（大腸菌（E. coli）中のCasA〜Eと呼ばれる）は機能的複合体Cascadeを形成し、これが、CRISPR RNA転写物をCascadeの保持するスペーサー反復単位にプロセッシングする。他の原核生物では、Cas6がCRISPR転写物をプロセッシングする。興味深いことに、大腸菌でのCRISPRに基づくファージ不活性化は、CascadeおよびCas3を必要とするが、Cas1およびCas2を必要としない。パイロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）および他の原核生物において見いだされるCmr（Cas RAMPモジュール）タンパク質は、相補的な標的RNAを認識および切断する小さなCRISPR RNAとの機能的複合体を形成する。RNAガイドCRISPR酵素は、V型制限酵素として分類される。
Cas9は、ヌクレアーゼ、すなわちDNAを切断するために特化した酵素であり、二重らせんの各鎖に対して1つずつの、2つの活性切断部位を有する。チームは、標的DNAを探し当てるCas9の能力を保持しながら、一方または両方の部位を無効にできることを実証した。Jinek et al. (2012)は、tracrRNAとスペーサーRNAを組み合わせることにより、Cas9と混合することで正しいDNA標的を発見および切断することができる「単一ガイドRNA」分子としたが、そのような合成ガイドRNAは遺伝子編集に使用される。
Cas9タンパク質は、病原細菌および共生細菌において高度に濃縮されている。CRISPR/Cas媒介性遺伝子調節は、特に真核生物宿主との細菌の相互作用中の、内因性細菌遺伝子の調節に寄与し得る。例えば、フランシセラ・ノビシダ（Francisella novicida）のCasタンパク質Cas9は、ユニークな小さいCRISPR/Cas関連RNA（scaRNA）を使用して、F.ノビシダが宿主応答を弱め病原性を促進するのに不可欠な細菌性リポタンパク質をコードする内因性転写物を抑制する。Wangら（2013）は、生殖細胞系（接合体）へのCas9 mRNAおよびsgRNAの共注射により、変異を有するマウスが生成されたことを示した。また、Cas9 DNA配列の送達も想定される。
CRISPR/Casシステムは、3種類のクラスに分けられる。クラス1は、いくつかのCasタンパク質をCRISPR RNA（crRNA）と一緒に使用して、機能的エンドヌクレアーゼを構築する。クラス2 CRISPRシステムは、単一のCasタンパク質をcrRNAと共に使用する。Cpf1は、1,300のアミノ酸タンパク質を含有するクラスIIのV型CRISPR/Casシステムとして最近同定された。米国特許公報第2014/0068797号（参照によってその全体が組み入れられる）も参照されたい。
いくつかの態様において、本開示の組成物は、細菌である黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）由来の小型バージョンのCas9（UniProtアクセッション番号J7RUA5）を含む。小型バージョンのCas9は、野生型または完全長Cas9に勝る利点を提供する。いくつかの態様において、Cas9はspCas9（AddGene）である。
C. Cpf1ヌクレアーゼ
プレボテラおよびフランシセラ1由来のクラスター化して規則的な配置の短い回文配列反復、すなわちCRISPR/Cpf1は、CRISPR/Cas9システムといくつかの類似性を有するDNA編集技術である。Cpf1は、クラスII CRISPR/CasシステムのRNAガイドエンドヌクレアーゼである。この獲得免疫機構は、プレボテラ細菌およびフランシセラ細菌に見いだされる。それは、ウイルスによる遺伝子損傷を防止する。Cpf1遺伝子は、CRISPR遺伝子座に関連しており、ガイドRNAを使用してウイルスDNAを発見および切断するエンドヌクレアーゼをコードする。Cpf1は、Cas9よりも小さくかつ単純なエンドヌクレアーゼであり、CRISPR/Cas9システムの制限の一部を克服する。
Cpf1は、多くの細菌種に見られる。ゲノム編集のためのツールへと発展した究極的なCpf1エンドヌクレアーゼは、それを保有していることが知られた最初の16種のうちの1種から採取された。
複数の態様において、Cpf1は、以下に示す配列を有する、アシダミノコッカス由来のCpf1酵素である（BV3L6種、UniProtアクセッション番号U2UMQ6; SEQ ID NO: 870）。
Figure 2020503869
Figure 2020503869
いくつかの態様において、Cpf1は、以下に示す配列を有する、ラクノスピラ科由来のCpf1酵素である（ND2006種、UniProtアクセッション番号A0A182DWE3; SEQ ID NO: 871）。
Figure 2020503869
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Figure 2020503869
いくつかの態様において、Cpf1は、哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化される。いくつかの態様において、Cpf1は、ヒト細胞またはマウス細胞における発現のためにコドン最適化される。
Cpf1遺伝子座は、混合アルファ/ベータドメイン、RuvC-Iとそれに続くらせん領域、RuvC-IIおよびジンクフィンガー様ドメインを含有する。Cpf1タンパク質は、Cas9のRuvCドメインに似たRuvC様エンドヌクレアーゼドメインを有する。さらに、Cpf1は、HNHエンドヌクレアーゼドメインを有さず、Cpf1のN末端は、Cas9のアルファ-らせん認識ローブを有さない。
Cpf1 CRISPR-Casドメインアーキテクチャは、Cpf1が機能的にユニークであることを示し、クラス2のV型CRISPRシステムとして分類されている。Cpf1遺伝子座は、II型システムよりもI型およびIII型に似たCas1、Cas2、およびCas4タンパク質をコードする。データベース検索は、Cpf1ファミリータンパク質が多くの細菌種に豊富にあることを示唆している。
機能的なCpf1は、tracrRNAを必要としないため、crRNAのみが必要とされる。Cpf1は、Cas9よりも小さいだけでなく、より小さいsgRNA分子（Cas9のヌクレオチド数のおよそ半分）も有するので、このことによってゲノム編集に利益をもたらす。
Cpf1-crRNA複合体は、Cas9によって標的とされるGリッチPAMとは対照的に、プロトスペーサー隣接モチーフ5'-YTN-3'（式中、「Y」はピリミジンであり、「N」は任意の核酸塩基である）または5'-TTN-3'の同定によって、標的DNAまたはRNAを切断する。PAMの同定後、Cpf1は、4または5ヌクレオチドオーバーハングの付着末端様DNA二本鎖切断を導入する。
CRISPR/Cpf1システムは、Cpf1酵素と、二重らせん上の修正スポットを発見して複合体を位置付けて標的DNAを切断するガイドRNAとからなる。CRISPR/Cpf1システム活性は、3つの段階を有する：
適応：Cas1およびCas2タンパク質が、小さなDNA断片のCRISPRアレイへの適応を容易にする；
crRNAの形成：Casタンパク質をガイドする成熟crRNAを産生する、プレ-cr-RNAのプロセシング；および
干渉：Cpf1がcrRNAに結合して、二成分複合体を形成し、標的DNA配列を同定および切断する。
D. gRNA
RNAにガイドされるタンパク質として、Cas9は、DNA標的の認識を指令する短いRNAを必要とする。Cas9は、PAM配列NGGを含有するDNA配列を選択的に調べるが、それはプロトスペーサー標的なしでここに結合することができる。しかしながら、Cas9-gRNA複合体は、二本鎖切断を生じるためにgRNAとの厳密な一致を必要とする。細菌におけるCRISPR配列は、複数のRNAで発現され、次いでRNAのガイド鎖を生じるためにプロセッシングされる。真核生物系は、CRISPR RNAをプロセッシングするために必要なタンパク質の一部を欠いているため、RNAポリメラーゼIII型プロモーターU6で発現される単一RNAにCas9ターゲティングに不可欠なRNA片を組み合わせるために合成構築物gRNAが作られた。合成gRNAは、最小長で100bpをわずかに上回り、PAM配列NGGの直前の20のプロトスペーサーヌクレオチドを標的とする部分を含む；gRNAは、PAM配列を含まない。
いくつかの態様において、gRNAは、野生型ジストロフィン遺伝子内の部位を標的とする。いくつかの態様において、gRNAは、変異体ジストロフィン遺伝子内の部位を標的とする。いくつかの態様において、gRNAは、ジストロフィンイントロンを標的とする。いくつかの態様において、gRNAは、ジストロフィンエクソンを標的とする。いくつかの態様において、gRNAは、表1に示されるジストロフィンアイソフォームの1つまたは複数で発現されかつ存在するジストロフィンエクソン中の部位を標的とする。複数の態様において、gRNAは、ジストロフィンスプライス部位を標的とする。いくつかの態様において、gRNAは、ジストロフィン遺伝子上のスプライスドナー部位を標的とする。複数の態様において、gRNAは、ジストロフィン遺伝子上のスプライスアクセプター部位を標的とする。
複数の態様において、ガイドRNAは、変異体DMDエクソンを標的とする。いくつかの態様において、変異体エクソンは、エクソン23または51である。いくつかの態様において、ガイドRNAは、ジストロフィン遺伝子のエクソン1、23、41、44、46、47、48、49、50、51、52、53、54、または55の少なくとも1つを標的とする。複数の態様において、ガイドRNAは、ジストロフィン遺伝子のイントロン44、45、50、51、52、53、54、または55の少なくとも1つを標的とする。好ましい態様において、ガイドRNAは、エクソン51またはエクソン23のスキッピングを誘導するように設計される。複数の態様において、gRNAは、エクソン51またはエクソン23のスプライスアクセプター部位を標的とする。
本明細書に開示の様々な組成物および方法において使用するための好適なgRNAは、SEQ ID NO: 383〜705、709〜711、715〜717、790〜862、864 (表7、9、11、13、および15)の通り提供される。好ましい態様において、gRNAは、SEQ ID No: 790〜SEQ ID No: 862のいずれか1つから選択される。
いくつかの態様において、本開示のgRNAは、DMD遺伝子に対応するコード配列または非コード配列内の標的配列に相補的である配列を含み、それ故、標的配列にハイブリダイズする。いくつかの態様において、Cpf1のためのgRNAは、直接反復骨格配列とそれに続く24ヌクレオチドのガイド配列を含有する、単一crRNAを含む。いくつかの態様において、crRNAの「ガイド」配列は、標的配列に相補的であるgRNAの配列を含む。いくつかの態様において、本開示のcrRNAは、標的配列に相補的ではないgRNAの配列を含む。本開示の「骨格」配列は、gRNAをCpf1ポリペプチドに連結する。本開示の「骨格」配列は、gRNA-Cas9構築物のtracrRNA配列と等価ではない。
いくつかの態様において、核酸は、gRNAをコードする1つまたは複数の配列を含み得る。いくつかの態様において、核酸は、gRNAをコードする1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個の配列を含み得る。いくつかの態様において、これら配列の全ては、同じgRNAをコードする。いくつかの態様において、これら配列の全ては、異なるgRNAをコードする。いくつかの態様において、これら配列のうちの少なくとも2つは、同じgRNAをコードし、例えば、これら配列のうちの少なくとも3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個は、同じgRNAをコードする。
E. Cas9 対 Cpf1
Cas9は、DNAを切断するために2つのRNA分子を必要とする一方で、Cpf1は1つ必要とする。これらタンパク質はまた、DNAを異なる場所で切断し、編集部位を選択する際に研究者により多くの選択肢を提供する。Cas9は、DNA分子において両方の鎖を同じ位置で切断し、「平滑」末端を残す。Cpf1は、一方の鎖を他方よりも長く残し、扱いやすい「付着」末端を生じる。Cpf1は、Cas9と比較して、切断部位に新たな配列をより多く挿入できるようである。CRISPR/Cas9システムは遺伝子を効率的に無効にすることができるが、遺伝子を挿入することもノックインを生成することも困難である。Cpf1は、tracrRNAを欠き、TリッチPAMを利用し、DNAを突出型のDNA DSBを介して切断する。
まとめると、Cpf1システムとCas9システムとの間の重要な違いは、Cpf1が、異なるPAMを認識して、新たな標的可能性を実現すること、Cas9によって産生される平滑末端の代わりに4〜5ntの長い付着末端を生み出し、遺伝子挿入の効率およびNHEJまたはHDRの間の特異性を増強すること、ならびに、Cas9切断部位からさらに離れたPAMからさらに離れた標的DNAを切断して、DNAの新たな切断可能性を実現することである。
（表３）Cas9とCpf1の違い
Figure 2020503869
F. CRISPR媒介性遺伝子編集
CRISPR/Cpf1またはCRISPR/Cas9を使用してDMD遺伝子を編集する際の最初の工程は、ゲノム標的配列を同定することである。本開示のgRNAのためのゲノム標的は、任意の約24ヌクレオチドのDNA配列であることができるが、但し、その配列がゲノムの残部と比較してユニークであるものとする。いくつかの態様において、ゲノム標的配列は、ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン51、エクソン45、エクソン44、エクソン53、エクソン46、エクソン52、エクソン50、エクソン43、エクソン6、エクソン7、エクソン8、および/またはエクソン55内の配列に対応する。いくつかの態様において、ゲノム標的配列は、ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン51、エクソン45、エクソン44、エクソン53、エクソン46、エクソン52、エクソン50、エクソン43、エクソン6、エクソン7、エクソン8、および/またはエクソン55の5’または3’スプライス部位である。いくつかの態様において、ゲノム標的配列は、ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン51、エクソン45、エクソン44、エクソン53、エクソン46、エクソン52、エクソン50、エクソン43、エクソン6、エクソン7、エクソン8、および/またはエクソン55のすぐ上流または下流にあるイントロン内の配列に対応する。例示的なゲノム標的配列を表6、8、10、12、および14に見いだすことができる。
DMD遺伝子を編集する際の次の工程は、標的とする遺伝子領域内の全てのプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）配列を同定することである。標的配列は、PAMのすぐ上流でなければならない。全ての可能なPAM配列および推定標的部位が同定されたら、次の工程は、最も効率的なオンターゲット切断をもたらす可能性の高い部位を選択することである。gRNAターゲティング配列は標的配列と一致することが必要であり、gRNAターゲティング配列はゲノム内の追加の部位と一致してはならない。好ましい態様において、gRNAターゲティング配列は、標的と完全な相同性を有するが、ゲノムの他の場所では相同性を有さない。いくつかの態様において、所与のgRNAターゲティング配列は、ゲノム全体にわたり部分的な相同性が存在する追加の部位を有する。これらの部位は、「オフターゲット」と呼ばれ、gRNAを設計するときに考慮されるべきである。一般に、オフターゲット部位は、PAM配列の近くにミスマッチがある場合は効率的に切断されないので、相同性のないgRNAまたはPAM配列に近いミスマッチを有するものが最も高い特異性を有する。「オフターゲット活性」に加えて、所望の標的配列の切断（「オンターゲット活性」）を最大限にする要因が考慮されなければならない。各々が標的DNAと100％の相同性を有する2つのgRNAターゲティング配列が等価な切断効率をもたらすわけではないことは、当業者に公知である。実際に、切断効率は、選択された標的配列内の具体的なヌクレオチドに応じて増加も減少もし得る。最良のgRNAを設計するために、各々の潜在的なgRNAターゲティング配列の予測オンターゲット活性およびオフターゲット活性の詳細な調査が必要となる。潜在的なPAM配列および標的配列を探し、関連するgRNAをそれらの予測オンターゲット活性およびオフターゲット活性に基づいてランク付けできる、いくつかのgRNA設計プログラムが開発されている（例えば、CRISPRdirect、www.crispr.dbcls.jpで入手可能）。
次の工程は、所望のgRNAを合成およびクローン化することである。ターゲティングオリゴを合成し、アニーリングし、gRNA骨格を含有するプラスミドに標準的な制限-ライゲーションクローニングを使用して挿入することができる。しかしながら、正確なクローニング戦略は、選択されるgRNAベクターに依存する。Cpf1のためのgRNAは、Cas9のためのgRNAと比べ特に単純で、直接反復骨格配列とそれに続く約24ヌクレオチドのガイド配列を含有する単一crRNAからのみなる。
各gRNAは、次いで、1つまたは複数の標的細胞株において検証されるべきである。例えば、Cas9またはCpf1およびgRNAが細胞に送達された後に、ゲノム標的領域を、PCRを使用して増幅し、当業者に公知の方法に従って配列決定してよい。
いくつかの態様において、遺伝子編集は、インビトロで実施してもエクスビボで実施してもよい。いくつかの態様において、インビトロまたはエクスビボで、細胞を、Cas9またはCpf1と、ジストロフィンスプライス部位を標的とするgRNAとに接触させる。いくつかの態様において、細胞を、Cas9またはCpf1およびガイドRNAをコードする1つまたは複数の核酸と接触させる。いくつかの態様において、1つまたは複数の核酸を、細胞に、例えば、リポフェクションまたはエレクトロポレーションを使用して導入する。また、遺伝子編集を接合体で実施してもよい。複数の態様において、接合体に、Cas9またはCpf1およびジストロフィンスプライス部位を標的とするgRNAをコードする1つまたは複数の核酸を注射してよい。その後、接合体を宿主に注射してよい。
複数の態様において、Cas9またはCpf1は、ベクター上に提供される。複数の態様において、ベクターは、化膿ブドウ球菌に由来するCas9（SpCas9、SEQ ID NO. 872）を含む。複数の態様において、ベクターは、黄色ブドウ球菌に由来するCas9（SaCas9、SEQ ID NO. 873）を含む。複数の態様において、ベクターは、ラクノスピラ科細菌に由来するCpf1配列を含有する。例えば、Uniprotアクセッション番号A0A182DWE3; SEQ ID NO. 871を参照されたい。複数の態様において、ベクターは、アシダミノコッカス細菌に由来するCpf1配列を含有する。例えば、Uniprotアクセッション番号U2UMQ6; SEQ ID NO. 870を参照されたい。いくつかの態様において、Cas9またはCpf1配列は、ヒト細胞またはマウス細胞における発現のためにコドン最適化される。いくつかの態様において、ベクターは、蛍光活性化セルソーティング（FACS）を使用してCas9またはCpf1発現細胞を選別することを可能とするGFPなどの蛍光タンパク質をコードする配列をさらに含有する。いくつかの態様において、ベクターは、アデノ随伴ウイルスベクターなどのウイルスベクターである。
複数の態様において、gRNAはベクター上に提供される。いくつかの態様において、ベクターは、アデノ随伴ウイルスベクターなどのウイルスベクターである。複数の態様において、Cas9またはCpf1およびガイドRNAは、同じベクター上に提供される。複数の態様において、Cas9またはCpf1およびガイドRNAは、異なるベクター上に提供される。
いくつかの態様において、相同組換え修復を達成するために、細胞を一本鎖DMDオリゴヌクレオチドと追加で接触させる。いくつかの態様において、小さいINDELが、ジストロフィンのタンパク質リーディングフレームを回復させる（「リフレーミング」戦略）。リフレーミング戦略を使用するとき、細胞を単一gRNAと接触させてよい。複数の態様において、スプライスドナーまたはスプライスアクセプター部位が破壊され、それが、エクソンスキッピングおよびタンパク質リーディングフレームの回復をもたらす（「エクソンスキッピング」戦略）。エクソンスキッピング戦略を使用するとき、細胞を2以上のgRNAと接触させてよい。
インビトロまたはエクスビボのCas9またはCpf1媒介性DNA切断の効率を、T7 E1アッセイなどの当業者に公知の技術を使用して評価してよい。DMD発現の回復を、RT-PCR、ウエスタンブロッティング、および免疫細胞化学などの当業者に公知の技術を使用して確認してよい。
いくつかの態様において、インビトロまたはエクスビボ遺伝子編集は、筋細胞または衛星細胞で実施される。いくつかの態様において、遺伝子編集は、iPSC細胞またはiCM細胞で実施される。複数の態様において、iPSC細胞を遺伝子編集後に分化させる。例えば、iPSC細胞は、編集後に筋細胞または衛星細胞へと分化させ得る。複数の態様において、iPSC細胞を、心筋細胞、骨格筋細胞、または平滑筋細胞へと分化させる。複数の態様において、iPSC細胞を心筋細胞へと分化させる。当業者に公知の方法に従って分化するようにiPSC細胞を誘導し得る。
いくつかの態様において、細胞をCas9またはCpf1およびgRNAと接触させることは、ジストロフィン発現を回復させる。複数の態様において、インビトロもしくはエクスビボで編集された細胞またはそれらに由来する細胞は、野生型細胞と同程度のジストロフィンタンパク質のレベルを示す。複数の態様において、編集された細胞またはそれらに由来する細胞は、ジストロフィンを、野生型ジストロフィン発現レベルの50％、60％、70％、80％、90％、95％、またはその間の任意の百分率のレベルで発現する。複数の態様において、インビトロもしくはエクスビボで編集された細胞またはそれらに由来する細胞は、野生型細胞ものと同程度のミトコンドリア数を有する。複数の態様において、編集された細胞またはそれらに由来する細胞は、野生型細胞の50％、60％、70％、80％、90％、95％、またはその間の任意の百分率の数のミトコンドリアを有する。複数の態様において、編集された細胞またはそれらに由来する細胞は、ベースラインで非編集細胞と比較して酸素消費率（OCR）の増加を示す。
G. RNA Pol IIIおよびPol IIIプロモーター
真核生物において、RNAポリメラーゼIII（Pol IIIとも呼ばれる）は、DNAを転写して、リボソーム5S rRNA、tRNA、および他の低分子RNAを合成する。RNA Pol IIIによって転写される遺伝子は、その発現が全ての細胞タイプおよびほとんどの環境条件において必要とされる「ハウスキーピング」遺伝子のカテゴリーに入る。そのため、Pol III転写の調節は、主として細胞成長および細胞周期の調節に結び付けられ、したがって、RNAポリメラーゼIIよりも少ない調節タンパク質を必要とする。しかし、ストレス条件下では、タンパク質Maf1が、Pol III活性を抑制する。
転写のプロセス（いずれかのポリメラーゼによる）には、以下の3つの主要な段階がある：（i）遺伝子のプロモーター上でのRNAポリメラーゼ複合体の構築を必要とする、開始；（ii）RNA転写物の合成である、伸長；ならびに（iii）RNA転写の仕上げおよびRNAポリメラーゼ複合体の分解である、終結。
RNA Pol IIIの制御下のプロモーターには、リボソーム5S rRNA、tRNA、およびわずかな他の低分子RNA、例えば、U6スプライセオソームRNA、RNアーゼPおよびRNアーゼMRP RNA、7SL RNA（シグナル認識粒子のRNA構成要素）、ヴォールトRNA、YRNA、SINE（短鎖散在反復配列）、7SK RNA、2種類のマイクロRNA、いくつかの核小体低分子RNA、およびいくつかのわずかな調節性アンチセンスRNAのためのものが含まれる。
IV. 核酸送達
上で考察した通り、ある特定の態様において、その後の精製および細胞/対象への送達のため、または遺伝子に基づく送達アプローチで直接使用するため、発現カセットを用いて転写因子産物を発現させる。Cas9またはCpf1およびジストロフィンスプライス部位を標的とする少なくとも1つのDMDガイドRNAをコードする1つまたは複数の核酸を含有する発現ベクターが本明細書に提供される。いくつかの態様において、Cas9またはCpf1をコードする核酸および少なくとも1つのガイドRNAをコードする核酸は、同じベクター上に提供される。さらなる態様において、Cas9またはCpf1をコードする核酸および少なくとも1つのガイドRNAをコードする核酸は、別々のベクター上に提供される。
発現は、ベクター内に適切なシグナルが提供されることを必要とし、このシグナルは、細胞において関心対象の遺伝子の発現を駆動するウイルスおよび哺乳動物の両供給源に由来するエンハンサー/プロモーターなどの様々な調節エレメントを含む。また、宿主細胞におけるメッセンジャーRNAの安定性および翻訳可能性を最適化するように設計されたエレメントも特定される。産物を発現する永続的な安定細胞クローンを樹立するための多数のドミナント薬物選択マーカーの使用条件も提供され、薬物選択マーカーの発現をポリペプチドの発現と関連付けるエレメントも提供される。
A. 調節エレメント
本出願全体を通して、「発現カセット」という用語は、核酸コード配列の一部または全てが転写および翻訳されることができる、すなわち、プロモーターの制御下にある、遺伝子産物をコードする核酸を含有する任意のタイプの遺伝子構築物を含むことを意味する。「プロモーター」は、遺伝子の特異的な転写を開始するために必要とされる、細胞の合成機構または導入された合成機構によって認識されるDNA配列を指す。「転写制御下」という語句は、プロモーターが、RNAポリメラーゼ開始および遺伝子の発現を制御するため、核酸に対して正確な位置および方向にあることを意味する。「発現ベクター」は、複製可能な遺伝子構築物に含まれており、したがって、複製起点、転写終結シグナル、ポリA領域、選択可能マーカー、および多目的クローニング部位の1つまたは複数を含む、発現カセットを含むことを意味する。
プロモーターという用語は、RNAポリメラーゼIIのための開始部位の周辺に密集した転写制御モジュールの一群を指すために本明細書において使用される。どのようにプロモーターが組織化されるかについての考えの大部分は、HSVチミジンキナーゼ（tk）およびSV40初期転写単位のためのものを含む、いくつかのウイルスプロモーターの分析に由来する。より最近の研究によって拡大されたこれらの研究は、プロモーターが個別の機能的モジュールから構成されることを示しており、機能的モジュールは各々、およそ7〜20bpのDNAからなり、転写活性化タンパク質または抑制タンパク質のための1つまたは複数の認識部位を含有している。
各プロモーター内の少なくとも1つのモジュールは、RNA合成のための開始部位を位置付けるように機能する。これの最もよく知られている例は、TATAボックスであるが、哺乳動物末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺伝子のためのプロモーターおよびSV40後期遺伝子のためのプロモーターなどのTATAボックスを欠くいくつかのプロモーターにおいては、開始部位自体を覆う個別エレメントが、開始の場所を固定するのを助ける。
いくつかの態様において、本開示のCas9またはCpf1構築物は、筋細胞特異的プロモーターによって発現される。この筋細胞特異的プロモーターは、構成的に活性なプロモーターであっても、誘導性プロモーターであってもよい。
追加のプロモーターエレメントは、転写開始の頻度を調節する。典型的には、これらは開始部位の30〜110bp上流の領域に位置するが、多数のプロモーターが開始部位の下流にも機能的エレメントを含有していることが最近になって示された。エレメントが反転したり互い相対的に移動したりするときにもプロモーター機能が保存されるように、プロモーターエレメント間の間隔はフレキシブルであることが多い。tkプロモーターでは、プロモーターエレメント間の間隔を50bp間隔にまで増加させることができ、そこからは活性が減退し始める。プロモーターに依存して、個々のエレメントは、協同的にまたは独立に機能して転写を活性化できるようである。
ある特定の態様において、ヒトサイトメガロウイルス（CMV）前初期遺伝子プロモーター、SV40初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス長末端反復、ラットインスリンプロモーター、およびグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼなどのウイルスプロモーターを、関心対象のコード配列の高レベルの発現を得るために使用できる。発現のレベルが所与の目的に十分であるという条件で、関心対象のコード配列の発現を達成するための、当技術分野において周知である他のウイルスまたは哺乳動物細胞または細菌ファージのプロモーターの使用も同じく想定される。周知の特性を有するプロモーターを用いることによって、トランスフェクションまたは形質転換の後の関心対象のタンパク質の発現のレベルおよびパターンを最適化することができる。さらに、特定の生理学的シグナルに応答して調節されるプロモーターを選択することにより、遺伝子産物の誘導性発現が可能となる。
エンハンサーは、同じDNA分子上の遠位に位置するプロモーターからの転写を増加させる遺伝エレメントである。エンハンサーは、プロモーターと同様に組織化される。すなわち、それらは、各々が1つまたは複数の転写タンパク質と結合する多くの個々のエレメントから構成される。エンハンサーとプロモーターとの間の基本的な差異は、機能性である。エンハンサー領域は全体として離れて転写を刺激することができなければならない；このことは、プロモーター領域またはその成分エレメントには当てはまる必要がない。その一方で、プロモーターは、特定の部位において特定の方向でRNA合成の開始を指令する1つまたは複数のエレメントを有さなければならないが、エンハンサーはこれらの特異性を欠いている。プロモーターおよびエンハンサーは、重複しかつ連続していることが多く、極めて類似したモジュール機構を有することが多いと見られる。
以下は、発現構築物において関心対象の遺伝子をコードする核酸と組み合わせて使用できるプロモーター/エンハンサーおよび誘導性プロモーター/エンハンサーの一覧である。加えて、プロモーター/エンハンサーの任意の組み合わせ（Eukaryotic Promoter Data Base EPDBによる）を遺伝子の発現を駆動するために使用することができる。真核細胞は、送達複合体の一部としてまたは追加の遺伝子発現構築物として適切な細菌ポリメラーゼが提供されれば、ある特定の細菌プロモーターからの細胞質転写を支援することができる。
プロモーターおよび/またはエンハンサーは、例えば、免疫グロブリン軽鎖、免疫グロブリン重鎖、T細胞受容体、HLA DQ aおよび/またはDQ β、β-インターフェロン、インターロイキン-2、インターロイキン-2受容体、MHCクラスII 5、MHCクラスII HLA-Dra、β-アクチン、筋肉クレアチンキナーゼ（MCK）、プレアルブミン（トランスサイレチン）、エラスターゼI、メタロチオネイン（MTII）、コラゲナーゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン、t-グロビン、β-グロビン、c-fos、c-HA-ras、インスリン、神経細胞接着分子（NCAM）、α1-アンチトリパイン（antitrypain）、H2B（TH2B）ヒストン、マウスおよび/またはI型コラーゲン、グルコース調節タンパク質（GRP94およびGRP78）、ラット成長ホルモン、ヒト血清アミロイドA（SAA）、トロポニンI（TN I）、血小板由来成長因子（PDGF）、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、SV40、ポリオーマ、レトロウイルス、パピローマウイルス、B型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、サイトメガロウイルス（CMV）、ならびにテナガザル白血病ウイルスであってよい。
いくつかの態様において、誘導性エレメントを使用してよい。いくつかの態様において、誘導性エレメントは、例えば、MTII、MMTV（マウス乳腺腫瘍ウイルス）、β-インターフェロン、アデノウイルス5 E2、コラゲナーゼ、ストロメリシン、SV40、ネズミ科MX遺伝子、GRP78遺伝子、α-2-マクログロブリン、ビメンチン、MHCクラスI遺伝子H-2κb、HSP70、プロリフェリン、腫瘍壊死因子、および/または甲状腺刺激ホルモンα遺伝子である。いくつかの態様において、誘導因子は、ホルボールエステル（TFA）、重金属、糖質コルチコイド、ポリ（rI）x、ポリ（rc）、ElA、ホルボールエステル（TPA）、インターフェロン、ニューカッスル病ウイルス、A23187、IL-6、血清、インターフェロン、SV40巨大T抗原、PMA、および/または甲状腺ホルモンである。本明細書に記載の誘導性エレメントのいずれかを本明細書に記載の誘導因子のいずれかと共に使用してよい。
特に興味深いものは、筋肉特異的プロモーターである。これらは、ミオシン軽鎖-2プロモーター、α-アクチンプロモーター、トロポニン1プロモーター；Na+/Ca2+交換体プロモーター、ジストロフィンプロモーター、α7インテグリンプロモーター、脳性ナトリウム利尿ペプチドプロモーターおよびαB-クリスタリン/低分子量熱ショックタンパク質プロモーター、α-ミオシン重鎖プロモーター、ならびにANFプロモーターを含む。いくつかの態様において、筋肉特異的プロモーターは、CK8プロモーターである。CK8プロモーターは、以下の配列（SEQ ID NO: 874）を有する。
Figure 2020503869
いくつかの態様において、筋肉細胞の細胞特異的プロモーターは、CK8eと呼ばれる、CK8プロモーターのバリアントである。CK8eプロモーターは以下の配列（SEQ ID NO: 875）を有する。
Figure 2020503869
cDNAインサートが用いられる場合、典型的には、遺伝子転写物の適正なポリアデニル化を達成するため、ポリアデニル化シグナルを含めることが望ましい。ヒト成長ホルモンおよびSV40ポリアデニル化シグナルなどの任意のポリアデニル化配列を用いてよい。また、ターミネーターも発現カセットのエレメントとして想定される。これらのエレメントは、メッセージレベルを増強し、カセットから他の配列へのリードスルーを最小限に抑えるために役立つことができる。
B. 2Aペプチド
いくつかの態様において、昆虫ウイルスであるトセア・アシグナ（Thosea asigna）由来の2A様自己切断ドメイン（TaV 2Aペプチド）
Figure 2020503869
が用いられる。これらの2A様ドメインは、真核生物全体で機能することが示されており、アミノ酸の切断を、2A様ペプチドドメイン内で同時翻訳的に起こさせる。それ故、TaV 2Aペプチドを含めることで、単一のmRNA転写物から複数のタンパク質の発現が可能となる。重要なことに、真核生物系で試験したとき、TaVのドメインは、99％を超える切断活性を示した。他の許容される2A様ペプチドは、ウマ鼻炎Aウイルス（ERAV）2Aペプチド
Figure 2020503869
、ブタテシオウイルス-1（PTV1）2Aペプチド
Figure 2020503869
および口蹄疫ウイルス（FMDV）2Aペプチド
Figure 2020503869
またはそれらの修飾型バージョンを含むが、これらに限定されない。
いくつかの態様において、2Aペプチドを使用して、レポーターおよびCas9またはCfp1を同時に発現させる。レポーターは、例えば、GFPであってよい。
使用し得る他の自己切断ペプチドは、核封入タンパク質a（Nia）プロテアーゼ、P1プロテアーゼ、3Cプロテアーゼ、Lプロテアーゼ、3C様プロテアーゼ、またはそれらの修飾型バージョンを含むが、これらに限定されない。
C. 発現ベクターの送達
発現ベクターを細胞に導入できる多数の方法が存在する。ある特定の態様において、発現構築物は、ウイルス、またはウイルスゲノムに由来する改変された構築物を含む。受容体媒介性エンドサイトーシスを介して細胞に侵入し、宿主細胞ゲノムに組み込まれ、ウイルス遺伝子を安定的かつ効率的に発現することができるある特定のウイルスは、哺乳動物細胞に外来遺伝子を移入するための魅力的な候補である。これらは、比較的低い外来DNA配列の収容量を有し、限定された宿主範囲を有する。さらに、許容細胞における発がん潜在性および細胞変性効果は、安全性の問題を提起する。これらは、8kBまでの外来遺伝物質しか収容できないが、種々の細胞株および実験動物に容易に導入することができる。
インビボ送達のための好ましい方法の1つは、アデノウイルス発現ベクターの使用を伴う。「アデノウイルス発現ベクター」は、（a）構築物のパッケージングを支援すること、および（b）その中にクローニングされたアンチセンスポリヌクレオチドを発現することに十分な、アデノウイルス配列を含有する構築物を含むことを意味する。これに関して、発現は、遺伝子産物が合成されることを必要としない。
発現ベクターは、遺伝子改変された形態のアデノウイルスを含む。36kBの直鎖状二本鎖DNAウイルスであるアデノウイルスの遺伝子組織化に関する知識は、アデノウイルスDNAの大断片を7kBまでの外来配列で置換することを可能にする。レトロウイルスとは対照的に、アデノウイルスDNAは、潜在的な遺伝毒性なしに、エピソーム様式で複製できるため、宿主細胞のアデノウイルス感染は、染色体組み込みをもたらさない。また、アデノウイルスは、構造的に安定しており、広範な増幅の後にもゲノム再編成は検出されていない。アデノウイルスは、細胞周期に関わらず、事実上全ての上皮細胞に感染することができる。現在のところ、アデノウイルス感染は、ヒトにおいて急性呼吸器疾患などの軽度の疾患にのみ関連付けられているようである。
アデノウイルスは、ゲノムのサイズが中程度であり、操作が容易であり、力価が高く、標的細胞範囲が広く、感染性が高いため、遺伝子移入ベクターとして使用するのに特に適している。ウイルスゲノムの両端は、ウイルスDNAの複製およびパッケージングに必要なシスエレメントである100〜200塩基対逆方向反復（ITR）を含有する。ゲノムの初期（E）領域および後期（L）領域は、ウイルスDNA複製の開始によって分割される異なる転写単位を含有する。E1領域（E1AおよびE1B）は、ウイルスゲノムおよび少数の細胞遺伝子の転写の調節を担うタンパク質をコードする。E2領域（E2AおよびE2B）の発現は、ウイルスDNA複製のためのタンパク質の合成をもたらす。これらのタンパク質は、DNA複製、後期遺伝子発現、および宿主細胞シャットオフに関与している。ウイルスカプシドタンパク質の大半を含む後期遺伝子の産物は、主要後期プロモーター（MLP）によって生じた単一の一次転写物の有意なプロセッシングの後にのみ発現される。MLP（16.8 m.u.に位置する）は、感染の後期に特に効率的であり、このプロモーターから生じたmRNAは全て、5'トリパータイトリーダー（TPL）配列を保有しており、このため翻訳のための好ましいmRNAである。あるシステムにおいて、組換えアデノウイルスは、シャトルベクターとプロウイルスベクターとの間の相同組換えから生成される。2種のプロウイルスベクター間の可能性のある組換えのため、このプロセスから野生型アデノウイルスが生成され得る。それ故、個々のプラークからウイルスの単一クローンを単離し、そのゲノム構造を調査することが重要である。
複製欠損型である現在のアデノウイルスベクターの生成および増殖は、Ad5 DNA断片によってヒト胎児腎細胞から形質転換され、E1タンパク質を構成的に発現する、293と名付けられたユニークなヘルパー細胞株に依存する。E3領域は、アデノウイルスゲノムにとって不可欠でないため、現在のアデノウイルスベクターは、293細胞の補助により、E1領域、D3領域のいずれかまたは両方に外来DNAを保持する。本来、アデノウイルスは、野生型ゲノムのおよそ105％をパッケージングすることができ、それによって、約2kb余分のDNAを収容できる。E1領域およびE3領域において置換可能なおよそ5.5kbのDNAと組み合わせると、現在のアデノウイルスベクターの最大収容量は、7.5kb、またはベクターの全長の約15％未満である。アデノウイルスのウイルスゲノムの80％超が、ベクター骨格に残存し、ベクター媒介性の細胞傷害の起源となる。また、E1欠失ウイルスの複製欠損は不完全である。
ヘルパー細胞株は、ヒト胎児腎細胞、筋細胞、造血細胞、または他のヒト胎児間葉系もしくは上皮系細胞などのヒト細胞に由来してよい。あるいは、ヘルパー細胞は、ヒトアデノウイルスに許容性の他の哺乳動物種の細胞に由来してもよい。そのような細胞は、例えば、Vero細胞または他のサル胎仔間葉系もしくは上皮系細胞を含む。上述の通り、好ましいヘルパー細胞株は、293である。
293細胞を培養してアデノウイルスを増殖させるための改善された方法は、当技術分野において公知である。あるフォーマットにおいて、培地100〜200mlを含有する1リットルのシリコン処理スピナーフラスコ（Techne, Cambridge, UK）へ個々の細胞を接種することによって、天然細胞凝集物を成長させる。40rpmで撹拌した後、細胞生存能をトリパンブルーにより推定する。別のフォーマットにおいて、Fibra-Celマイクロキャリア（Bibby Sterlin, Stone, UK）（5g/l）を以下の通り用いる。培地5mlに再懸濁した細胞接種材料を、250mlの三角フラスコ内の担体（50ml）へ添加し、1〜4時間、時々撹拌しながら、静置する。次いで、培地を新鮮な培地50mlに交換し、振盪を開始する。ウイルス産生のため、細胞を、約80％コンフルエントにまで増殖させ、その後、培地を交換し（最終体積の25％に）、アデノウイルスを0.05のMOIで添加する。培養物を一晩静置し、その後、体積を100％に増加させ、さらに72時間、振盪を開始する。
本開示のアデノウイルスは、複製欠損型である、または少なくとも条件付きで複製欠損型である。アデノウイルスは、42種類の異なる公知の血清型またはサブグループA〜Fのいずれかのものであってよい。サブグループCの5型アデノウイルスは、本開示において使用するための条件付き複製欠損アデノウイルスベクターを得るための好ましい出発材料である。
上述の通り、本開示に係る典型的なベクターは、複製欠損型であり、アデノウイルスE1領域を有さない。したがって、E1コード配列が除去された位置に、関心対象の遺伝子をコードするポリヌクレオチドを導入することが、最も便利である。しかしながら、アデノウイルス配列内の構築物の挿入の位置は重要ではない。E3置換ベクターの欠失E3領域の代わりに、またはヘルパー細胞株もしくはヘルパーウイルスがE4欠損を補完するE4領域に、関心対象の遺伝子をコードするポリヌクレオチドを挿入してもよい。
アデノウイルスは、増殖および操作が容易であり、インビトロおよびインビボで広い宿主範囲を示す。このウイルス群は、高い力価、例えば、1ml当たり109〜1012のプラーク形成単位で得ることができ、高度に感染性である。アデノウイルスの生活環は、宿主細胞ゲノムへの組み込みを必要としない。アデノウイルスベクターによって送達される外来遺伝子は、エピソームであり、それ故、宿主細胞に対して低い遺伝毒性を有する。野生型アデノウイルスを用いた予防接種の研究において、副作用は報告されておらず、このことは、インビボ遺伝子移入ベクターとしての安全性および治療的潜在性を実証している。
アデノウイルスベクターは、真核生物遺伝子発現およびワクチン開発において使用されている。動物研究は、組換えアデノウイルスが遺伝子治療にも使用できることを示唆した。異なる組織への組換えアデノウイルスの投与における研究は、気管滴注、筋肉注射、末梢静脈内注射、および脳への定位接種を含む。
レトロウイルスは、逆転写のプロセスによって感染細胞においてそれらのRNAを二本鎖DNAへ変換できることを特徴とする、一本鎖RNAウイルスの一群である。次いで、生じたDNAは、プロウイルスとして細胞染色体へ安定的に組み込まれ、ウイルスタンパク質の合成を指令する。組み込みは、レシピエント細胞およびその子孫におけるウイルス遺伝子配列の保持をもたらす。レトロウイルスゲノムは、カプシドタンパク質、ポリメラーゼ酵素、およびエンベロープ成分をそれぞれコードする3種の遺伝子gag、pol、およびenvを含有する。gag遺伝子から上流に見いだされる配列は、ゲノムのビリオンへのパッケージングのためのシグナルを含有する。2つの長い末端反復（LTR）配列が、ウイルスゲノムの5'端および3'端に存在する。これらは、強力なプロモーター配列およびエンハンサー配列を含有し、宿主細胞ゲノムへの組み込みのためにも必要とされる。
レトロウイルスベクターを構築するために、ある特定のウイルス配列の代わりに、関心対象の遺伝子をコードする核酸をウイルスゲノムに挿入し、複製欠損型ウイルスを生産する。ビリオンを生産するため、gag遺伝子、pol遺伝子、およびenv遺伝子を含有するがLTRおよびパッケージング成分を有さないパッケージング細胞株を構築する。レトロウイルスLTRおよびパッケージング配列と一緒にcDNAを含有する組換えプラスミドをこの細胞株に導入したとき（例えば、リン酸カルシウム沈殿によって）、パッケージング配列は、組換えプラスミドのRNA転写物がウイルス粒子へパッケージングされることを可能にし、次いで、それが培養培地へ分泌される。次いで、組換えレトロウイルスを含有する培地を収集し、場合により濃縮し、遺伝子移入のために使用する。レトロウイルスベクターは、多種多様な細胞タイプに感染することができる。しかしながら、組み込みおよび安定的発現は、宿主細胞の分裂を必要とする。
ウイルスエンベロープへの乳糖残基の化学的付加によるレトロウイルスの化学的修飾に基づいて、レトロウイルスベクターの特異的なターゲティングを可能にするように設計された新規アプローチが最近開発された。この修飾は、シアロ糖タンパク質受容体を介した肝細胞の特異的感染を可能とすることもできる。
レトロウイルスエンベロープタンパク質および特異的細胞受容体に対するビオチン化抗体が使用される、組換えレトロウイルスのターゲティングのための異なるアプローチを使用してよい。抗体は、ストレプトアビジンを使用することによってビオチン成分を介してカップリングされる。主要組織適合複合体クラスI抗原およびクラスII抗原に対する抗体を使用することで、それらの表面抗原を保有する種々のヒト細胞へのエコトロピックウイルスのインビトロ感染が実証された（Roux et al., 1989）。
本開示の全ての局面において、レトロウイルスベクターの使用に関してある特定の制限がある。例えば、レトロウイルスベクターは、通常、細胞ゲノム内のランダムな部位に組み込まれる。これは、宿主遺伝子の中断を通してまたはウイルス調節配列の挿入を通して挿入変異誘発を導くことができ、これが隣接遺伝子の機能に干渉し得る。欠損レトロウイルスベクターの使用に関する別の懸念は、パッケージング細胞における複製能を有する野生型ウイルスの潜在的な出現である。これは、宿主細胞ゲノムに組み込まれたgag配列、pol配列、env配列の上流に組換えウイルス由来のインタクトな配列を挿入する、組換え事象からもたらされ得る。しかしながら、組換えの可能性を大幅に減少させるはずである新たなパッケージング細胞株が、現在入手可能である（例えば、Markowitz et al., 1988; Hersdorffer et al., 1990を参照のこと）。
他のウイルスベクターを本開示において発現構築物として用いてよい。ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス（AAV）、およびヘルペスウイルスなどのウイルスに由来するベクターを用いてよい。これらは、様々な哺乳動物細胞のためのいくつかの魅力的な特徴を提供する。
複数の態様において、AAVベクターは、複製欠損型または条件付き複製欠損型である。複数の態様において、AAVベクターは、組換えAAVベクターである。いくつかの態様において、AAVベクターは、血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、またはそれらの任意の組み合わせのAAVベクターから単離されるまたはそれに由来する配列を含む。
いくつかの態様において、単一のウイルスベクターを使用して、Cas9またはCpf1および少なくとも1つのgRNAをコードする核酸を細胞に送達する。いくつかの態様において、第1のウイルスベクターを使用してCas9またはCpf1を細胞に提供し、第2のウイルスベクターを使用して少なくとも1つのgRNAを細胞に提供する。
いくつかの態様において、単一のウイルスベクターを使用して、Cas9またはCpf1および少なくとも1つのgRNAをコードする核酸を細胞に送達する。いくつかの態様において、第一のウイルスベクターを使用してCpf1が細胞に提供され、第二のウイルスベクターを使用して少なくとも1つのgRNAが細胞に提供される。センスまたはアンチセンスの遺伝子構築物の発現を達成するために、発現構築物を細胞へ送達しなければならない。細胞は、筋細胞、衛星細胞、メサンジオブラスト（mesangioblast）、骨髄由来細胞、間質細胞、または間葉系幹細胞であってよい。複数の態様において、細胞は、心筋細胞、骨格筋細胞、または平滑筋細胞である。複数の態様において、細胞は、前脛骨筋、大腿四頭筋、ヒラメ筋、隔膜、または心臓における細胞である。いくつかの態様において、細胞は、人工多能性幹細胞（iPSC）または内部細胞塊細胞（iCM）である。さらなる態様において、細胞は、ヒトiPSCまたはヒトiCMである。いくつかの態様において、本開示のヒトiPSCまたはヒトiCMは、培養幹細胞株、成体幹細胞、胎盤幹細胞に由来しても、ヒト胚の破壊を必要としない成体または胚性幹細胞の別の起源に由来してもよい。細胞への送達は、細胞株の形質転換のための実験手順の場合のようにインビトロで達成しても、特定の疾患状態の処置の場合のようにインビボまたはエクスビボで達成してもよい。1つの送達機構は、発現構築物が感染性のウイルス粒子にカプシド封入されるウイルス感染を介する。
培養哺乳動物細胞への発現構築物の移入のためのいくつかの非ウイルス法も本開示によって想定される。これらは、リン酸カルシウム沈殿、DEAE-デキストラン、エレクトロポレーション、直接マイクロインジェクション、DNA負荷リポソームおよびリポフェクタミン-DNA複合体、細胞超音波処理、高速度微粒子弾を使用した遺伝子銃、ならびに受容体媒介性トランスフェクションを含む。これらの技術のいくつかを、インビボまたはエクスビボ使用にうまく適合させ得る。
発現構築物を細胞に送達したら、関心対象の遺伝子をコードする核酸を、異なる部位において位置付けおよび発現してよい。ある特定の態様において、遺伝子をコードする核酸を、細胞のゲノムへ安定的に組み込んでよい。この組み込みは、相同組み換え（遺伝子置換）を介して類似の位置および方向であっても、ランダムな非特異的位置に組み込んでもよい（遺伝子強化）。なおさらなる態様において、核酸を、DNAの別個のエピソームセグメントとして細胞内に安定的に維持してよい。そのような核酸セグメントまたは「エピソーム」は、宿主細胞周期と無関係にまたは同期的に、維持および複製させるのに十分な配列をコードする。どのように発現構築物が細胞へ送達されるか、および細胞内のどこに核酸が残存するかは、用いられる発現構築物のタイプに依存する。
なお別の態様において、発現構築物は、単純に裸の組換えDNAまたはプラスミドからなっていてもよい。構築物の移入は、物理的にまたは化学的に細胞膜を透過処理する前述の方法のいずれかによって実施してよい。これは、インビトロ移入に特に適用可能であるが、インビボ使用にも同様に適用してもよい。Dubensky et al. (1984)は、ポリオーマウイルスDNAを、成体マウスおよび新生仔マウスの肝臓および脾臓に、リン酸カルシウム沈殿物の形態で注射することに成功したが、このことは、活発なウイルス複製および急性感染を実証している。Benvenisty and Neshif (1986)はまた、リン酸カルシウムで沈殿させたプラスミドの直接腹腔内注射が、トランスフェクトされた遺伝子の発現をもたらすことを実証した。また、関心対象の遺伝子をコードするDNAを、類似の様式でインビボ移入して、遺伝子産物を発現させてもよい。
さらに別の態様において、細胞への裸のDNA発現構築物の移入は、粒子銃を含んでよい。この方法は、細胞膜を貫通し、細胞を死滅させることなく細胞に侵入することを可能にする高速度まで、DNAコート微粒子弾を加速させる能力に依存する。小さな粒子を加速させるためのいくつかの装置が開発されている。そのような装置の1つは、電流を発生させるために高電圧放出に依存し、次に、その電流が原動力を提供する。使用される微粒子弾は、タングステンまたは金のビーズなどの生物学的に不活性な物質からなる。
いくつかの態様において、発現構築物は、対象の肝臓、皮膚、および/または筋組織に直接送達される。これは、銃と標的器官との間の任意の介在組織を排除するための、組織または細胞の外科的露出、すなわち、エクスビボ処置を必要し得る。この場合もやはり、特定の遺伝子をコードするDNAをこの方法を介して送達してもよく、なお本開示に組み入れられる。
さらなる態様において、発現構築物をリポソーム中に捕捉させてよい。リポソームは、リン脂質二重膜および内部水性媒体を特徴とする小胞構造である。多層リポソームは、水性媒体によって分離された複数の脂質層を有する。これらは、リン脂質を過剰の水性溶液に懸濁させたときに自然に形成される。脂質成分が自己再配置を受けた後、閉じた構造を形成し、脂質二重層間に水および溶解した溶質を捕捉する。また、リポフェクタミン-DNA複合体も想定される。
インビトロでの外来DNAのリポソーム媒介性核酸送達および発現は大きな成功を収めている。Lipofectamine 2000（商標）として公知の試薬が広く使用され、市販されている。
ある特定の態様において、リポソームを血球凝集性ウイルス（HVJ）と複合体化して、細胞膜との融合を容易にし、リポソームに封入されたDNAの細胞侵入を促進することができる。他の態様において、リポソームを、核の非ヒストン染色体タンパク質（HMG-1）と複合体化しても、一緒に使用してもよい。なおさらなる態様において、リポソームを、HVJおよびHMG-1の両方と複合体化しても、一緒に使用してもよい。そのような発現構築物は、インビトロおよびインビボでの核酸の移入および発現での使用に成功しており、これらを本開示に適用可能である。細菌プロモーターがDNA構築物において用いられる場合、リポソーム内に適切な細菌ポリメラーゼを含めることも望ましい。
特定の遺伝子をコードする核酸を細胞へ送達するために用いることができる他の発現構築物は、受容体媒介性送達ビヒクルである。これらは、ほぼ全ての真核細胞において受容体媒介性エンドサイトーシスによる巨大分子の選択的取り込みを利用する。様々な受容体の細胞タイプ特異的な分布のため、送達は高度に特異的であることができる。
受容体媒介性遺伝子ターゲティングビヒクルは一般に、細胞受容体特異的なリガンドおよびDNA結合剤の2種の成分からなる。いくつかのリガンドが、受容体媒介性遺伝子移入のために使用されている。最も広範に特徴付けられているリガンドは、アシアロオロソムコイド（ASOR）およびトランスフェリンである。ASORと同じ受容体を認識する合成ネオ糖タンパク質が遺伝子送達ビヒクルとして使用されており、また、上皮増殖因子（EGF）も扁平上皮がん細胞へ遺伝子を送達するために使用されている。
D. AAV-Cas9ベクター
いくつかの態様において、Cas9は、AAVベクター中にパッケージングされてもよい。いくつかの態様において、AAVベクターは、野生型AAVベクターである。いくつかの態様において、AAVベクターは、1つまたは複数の変異を含有する。いくつかの態様において、AAVベクターは、血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、またはそれらの任意の組み合わせのうちのAAVベクターから単離されているか、またはそれに由来する。
例示的なAAV-Cas9ベクターは、Cas9配列を含む中央配列領域に隣接する、2つのITR（逆位末端反復）配列を含有する。いくつかの態様において、ITRは、血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、またはそれらの任意の組み合わせのうちのAAVベクターから単離されているか、またはそれに由来する。いくつかの態様において、ITRは、AAV血清型について完全長および/または野生型の配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、ITRは、AAV血清型について短縮された配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、ITRは、AAV血清型について伸長された配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、ITRは、同じAAV血清型についての野生型配列と比較して配列バリエーションを含む配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、配列バリエーションは、置換、欠失、挿入、逆位、または転位のうちの1つまたは複数を含む。いくつかの態様において、ITRは、少なくとも100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、または150塩基対を含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、ITRは、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、または150塩基対を含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、ITRは、110±10塩基対の長さを有する。いくつかの態様において、ITRは、120±10塩基対の長さを有する。いくつかの態様において、ITRは、130±10塩基対の長さを有する。いくつかの態様において、ITRは、140±10塩基対の長さを有する。いくつかの態様において、ITRは、150±10塩基対の長さを有する。いくつかの態様において、ITRは、115、145、または141塩基対の長さを有する。いくつかの態様において、ITRは、SEQ ID NO: 880、SEQ ID NO: 881、SEQ ID NO: 882、SEQ ID NO: 883、およびSEQ ID NO: 946から選択される配列を有する。
いくつかの態様において、AAV-Cas9ベクターは、1つまたは複数の核局在化シグナル（NLS）を含有してもよい。いくつかの態様において、AAV-Cas9ベクターは、1、2、3、4、または5つの核局在化シグナルを含有する。例示的なNLSには、c-myc NLS（SEQ ID NO: 884）、SV40 NLS（SEQ ID NO: 885）、hnRNPAI M9 NLS（SEQ ID NO: 886）、ヌクレオプラスミンNLS（SEQ ID NO: 887）、インポーチン-α由来のIBBドメインの配列
Figure 2020503869
筋腫Tタンパク質の配列VSRKRPRP（SEQ ID NO: 889）およびPPKKARED（SEQ ID NO: 890）、ヒトp53の配列PQPKKKPL（SEQ ID NO: 891）、マウスc-abl IVの配列
Figure 2020503869
インフルエンザウイルスNS1の配列DRLRR（SEQ ID NO: 893）およびPKQKKRK（SEQ ID NO: 894）、肝炎ウイルスデルタ抗原の配列
Figure 2020503869
ならびにマウスMx1タンパク質の配列
Figure 2020503869
が含まれる。さらに許容される核局在化シグナルには、二分核局在化配列、例えば、ヒトポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼの配列
Figure 2020503869
またはステロイドホルモン受容体（ヒト）グルココルチコイドの配列
Figure 2020503869
が含まれる。
いくつかの態様において、AAV-Cas9ベクターは、ベクターのパッケージングおよびCas9の発現を容易にするための追加のエレメントを含んでもよい。いくつかの態様において、AAV-Cas9ベクターは、ポリA配列を含んでもよい。いくつかの態様において、ポリA配列は、ミニポリA配列であってもよい。いくつかの態様において、AAV-Cas9ベクターは、転位因子を含んでもよい。いくつかの態様において、AAV-Cas9ベクターは、調節エレメントを含んでよい。いくつかの態様において、調節エレメントは、活性化因子または抑制因子である。
いくつかの態様において、AAV-Cas9は、1つまたは複数のプロモーターを含有してもよい。いくつかの態様において、1つまたは複数のプロモーターは、Cas9の発現を駆動する。いくつかの態様において、1つまたは複数のプロモーターは、筋肉特異的プロモーターである。例示的な筋肉特異的プロモーターには、ミオシン軽鎖-2プロモーター、α-アクチンプロモーター、トロポニン1プロモーター、Na+/Ca2+交換輸送体プロモーター、ジストロフィンプロモーター、α7インテグリンプロモーター、脳ナトリウム利尿ペプチドプロモーター、αB-クリスタリン/低分子量熱ショックタンパク質プロモーター、α-ミオシン重鎖プロモーター、ANFプロモーター、CK8プロモーター、およびCK8eプロモーターが含まれる。
いくつかの態様において、AAV-Cas9ベクターは、酵母、細菌、昆虫細胞、または哺乳動物細胞における産生のために最適化されてもよい。いくつかの態様において、AAV-Cas9ベクターは、ヒト細胞における発現のために最適化されてもよい。いくつかの態様において、AAV-Cas9ベクターは、バキュロウイルス発現系における発現のために最適化されてもよい。
いくつかの態様において、AAV-Cas9ベクターは、表4に示されるような、SEQ ID NO: 899、SEQ ID NO: 900、SEQ ID NO: 901、またはSEQ ID NO: 902から選択される配列を含む。
（表４）例示的な遺伝子編集構築物（AAVベクターを介した送達のためのITRからITRまで）
Figure 2020503869
Figure 2020503869
Figure 2020503869
Figure 2020503869
Figure 2020503869
Figure 2020503869
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Figure 2020503869
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Figure 2020503869
Figure 2020503869
SEQ ID NO: 899〜902を包含するそれらの態様を含む、本開示の遺伝子編集構築物のいくつかの態様において、構築物は、プロモーターおよびヌクレアーゼを含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、構築物は、CK8eプロモーターおよびCas9ヌクレアーゼを含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、構築物は、CK8eプロモーター、および化膿ブドウ球菌（Staphylococcus pyogenes）から単離されたまたはそれに由来するCas9ヌクレアーゼ（「SpCas9」）を含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、CK8eプロモーターは、
Figure 2020503869
のヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、SpCas9ヌクレアーゼは、
Figure 2020503869
Figure 2020503869
Figure 2020503869
のヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、プロモーターおよびヌクレアーゼを含む構築物は、少なくとも2つの逆位末端反復（ITR）配列をさらに含む。いくつかの態様において、プロモーターおよびヌクレアーゼを含む構築物は、AAVの血清型2（AAV2）から単離されたまたはそれに由来する少なくとも2つのITR配列をさらに含む。いくつかの態様において、プロモーターおよびヌクレアーゼを含む構築物は、各々が
Figure 2020503869
のヌクレオチド配列を含むまたはそれからなる、少なくとも2つのITR配列をさらに含む。いくつかの態様において、プロモーターおよびヌクレアーゼを含む構築物は、少なくとも2つのITR配列をさらに含み、第1のITR配列は、
Figure 2020503869
のヌクレオチド配列を含むまたはそれからなり、第2のITR配列は、
Figure 2020503869
のヌクレオチド配列を含むまたはそれからなる。いくつかの態様において、構築物は、5'から3'へ、第1のITR、プロモーターをコードする配列、ヌクレアーゼをコードする配列、および第2のITRを含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、構築物は、5'から3'へ、第1のAAV2 ITR、CK8eプロモーターをコードする配列、SpCas9ヌクレアーゼをコードする配列、および第2のAAV2 ITRを含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、5'から3'へ、第1のITR、プロモーターをコードする配列、ヌクレアーゼをコードする配列、および第2のITRを含むまたはそれからなる構築物は、ポリA配列をさらに含む。いくつかの態様において、ポリA配列は、ミニポリA配列を含むか、またはそれからなる。本開示の例示的なミニポリA配列は、
Figure 2020503869
のヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、構築物は、5'から3'へ、第1のITR、プロモーターをコードする配列、ヌクレアーゼをコードする配列、ポリA配列、および第2のITRを含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、構築物は、5'から3'へ、第1のITR、プロモーターをコードする配列、ヌクレアーゼをコードする配列、ミニポリA配列、および第2のITRを含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、構築物は、5'から3'へ、第1のAAV2 ITR、CK8eプロモーターをコードする配列、SpCas9ヌクレアーゼをコードする配列、ミニポリA配列、および第2のAAV2 ITRを含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、5'から3'へ、第1のITR、プロモーターをコードする配列、ヌクレアーゼをコードする配列、ポリA配列、および第2のITRを含む構築物は、少なくとも1つの核局在化シグナルをさらに含む。いくつかの態様において、5'から3'へ、第1のITR、プロモーターをコードする配列、ヌクレアーゼをコードする配列、ポリA配列、および第2のITRを含む構築物は、少なくとも2つの核局在化シグナルをさらに含む。本開示の例示的な核局在化シグナルは、
Figure 2020503869
のヌクレオチド配列、または
Figure 2020503869
のヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、構築物は、5'から3'へ、第1のITR、プロモーターをコードする配列、第1の核局在化シグナルをコードする配列、ヌクレアーゼをコードする配列、ポリA配列、および第2のITRを含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、構築物は、5'から3'へ、第1のITR、プロモーターをコードする配列、第1の核局在化シグナルをコードする配列、ヌクレアーゼをコードする配列、第2の核局在化シグナルをコードする配列、ポリA配列、および第2のITRを含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、構築物は、5'から3'へ、第1のAAV2 ITR、CK8eプロモーターをコードする配列、SEQ ID NO: 885の配列を有する核局在化シグナル、SpCas9ヌクレアーゼをコードする配列、ミニポリA配列、および第2のAAV2 ITRを含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、構築物は、5'から3'へ、第1のAAV2 ITR、CK8eプロモーターをコードする配列、SpCas9ヌクレアーゼをコードする配列、SEQ ID NO: 887の配列を有する核局在化シグナル、ミニポリA配列、および第2のAAV2 ITRを含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、構築物は、5'から3'へ、第1のAAV2 ITR、CK8eプロモーターをコードする配列、SEQ ID NO: 885の配列を有する核局在化シグナル、SpCas9ヌクレアーゼをコードする配列、SEQ ID NO: 887の配列を有する核局在化シグナル、ミニポリA配列、および第2のAAV2 ITRを含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、5'から3'へ、第1のITR、プロモーターをコードする配列、第1の核局在化シグナルをコードする配列、ヌクレアーゼをコードする配列、第2の核局在化シグナルをコードする配列、ポリA配列、および第2のITRを含む構築物は、終止コドンをさらに含む。終止コドンは、TAG（SEQ ID NO. 904）、TAA（SEQ ID NO. 905）、またはTGA（SEQ ID NO. 906）の配列を有し得る。いくつかの態様において、構築物は、5'から3'へ、第1のITR、プロモーターをコードする配列、第1の核局在化シグナルをコードする配列、ヌクレアーゼをコードする配列、第2の核局在化シグナルをコードする配列、終止コドン、ポリA配列、および第2のITRを含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、構築物は、5'から3'へ、第1のAAV2 ITR、CK8eプロモーターをコードする配列、SEQ ID NO: 885の配列を有する核局在化シグナル、SpCas9ヌクレアーゼをコードする配列、終止コドン、ミニポリA配列、および第2のAAV2 ITRを含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、構築物は、5'から3'へ、第1のAAV2 ITR、CK8eプロモーターをコードする配列、SpCas9ヌクレアーゼをコードする配列、SEQ ID NO: 887の配列を有する核局在化シグナル、終止コドン、ミニポリA配列、および第2のAAV2 ITRを含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、構築物は、5'から3'へ、第1のAAV2 ITR、CK8eプロモーターをコードする配列、SEQ ID NO: 885の配列を有する核局在化シグナル、SpCas9ヌクレアーゼをコードする配列、SEQ ID NO: 887の配列を有する核局在化シグナル、終止コドン、ミニポリA配列、および第2のAAV2 ITRを含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、5'から3'へ、第1のITR、プロモーターをコードする配列、第1の核局在化シグナルをコードする配列、ヌクレアーゼをコードする配列、第2の核局在化シグナルをコードする配列、終止コドン、ポリA配列、および第2のITRを含むまたはそれからなる構築物は、転位因子逆方向反復をさらに含む。本開示の例示的な転位因子逆方向反復は、
Figure 2020503869
のヌクレオチド配列、および/または
Figure 2020503869
のヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、構築物は、5'から3'へ、第1の転位因子逆方向反復、第1のITR、プロモーターをコードする配列、第1の核局在化シグナルをコードする配列、ヌクレアーゼをコードする配列、第2の核局在化シグナルをコードする配列、終止コドン、ポリA配列、第2のITR、および第2の転位因子逆方向反復を含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、構築物は、5'から3'へ、SEQ ID NO. 907の配列を有する第1の転位因子逆方向反復、第1のAAV2 ITR、CK8eプロモーターをコードする配列、SEQ ID NO. 885の配列を有する核局在化シグナル、SpCas9ヌクレアーゼをコードする配列、SEQ ID NO: 887の配列を有する核局在化シグナル、終止コドン、ミニポリA配列、第2のAAV2 ITR、およびSEQ ID NO. 908の配列を有する第2の転位因子逆方向反復を含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、5'から3'へ、第1の転位因子逆方向反復、第1のITR、プロモーターをコードする配列、第1の核局在化シグナルをコードする配列、ヌクレアーゼをコードする配列、第2の核局在化シグナルをコードする配列、終止コドン、ポリA配列、第2のITR、および第2の転位因子逆方向反復を含むまたはそれからなる構築物は、調節配列をさらに含む。本開示の例示的な調節配列は、
Figure 2020503869
のヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、構築物は、5'から3'へ、第1の転位因子逆方向反復、第1のITR、プロモーターをコードする配列、第1の核局在化シグナルをコードする配列、ヌクレアーゼをコードする配列、第2の核局在化シグナルをコードする配列、終止コドン、ポリA配列、第2のITR、調節配列、および第2の転位因子逆方向反復を含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、構築物は、5'から3'へ、SEQ ID NO. 907の配列を有する第1の転位因子逆方向反復、第1のAAV2 ITR、CK8eプロモーターをコードする配列、SEQ ID NO. 885の配列を有する核局在化シグナル、SpCas9ヌクレアーゼをコードする配列、SEQ ID NO: 887の配列を有する核局在化シグナル、終止コドン、ミニポリA配列、第2のAAV2 ITR、SEQ ID NO. 909の配列を有する調節配列、およびSEQ ID NO. 908の配列を有する第2の転位因子逆方向反復を含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、構築物は、1つまたは複数のスペーサー配列をさらに含んでもよい。本開示の例示的なスペーサー配列は、1〜1500ヌクレオチドの長さを、その間の全ての範囲を含んで有する。いくつかの態様において、スペーサー配列は、ITR、プロモーター、核局在化シグナル、ヌクレアーゼ、終止コドン、ポリA配列、転位因子逆方向反復、および/または調節エレメントの5'または3'のいずれかに位置してもよい。いくつかの態様において、構築物は、SEQ ID NO: 899、SEQ ID NO: 900、SEQ ID NO: 901、またはSEQ ID NO: 902を含むまたはそれからなる配列を有してもよい。
E. AAV-sgRNAベクター
いくつかの態様において、少なくとも、gRNAをコードする第1の配列およびgRNAをコードする第2の配列は、AAVベクター中にパッケージングされてもよい。いくつかの態様において、少なくとも、gRNAをコードする第1の配列、gRNAをコードする第2の配列、およびgRNAをコードする第3の配列は、AAVベクター中にパッケージングされてもよい。いくつかの態様において、少なくとも、gRNAをコードする第1の配列、gRNAをコードする第2の配列、gRNAをコードする第3の配列、およびgRNAをコードする第4の配列は、AAVベクター中にパッケージングされてもよい。いくつかの態様において、少なくとも、gRNAをコードする第1の配列、gRNAをコードする第2の配列、gRNAをコードする第3の配列、gRNAをコードする第4の配列、およびgRNAをコードする第5の配列は、AAVベクター中にパッケージングされてもよい。いくつかの態様において、gRNAをコードする配列の複数が、AAVベクター中にパッケージングされる。例えば、gRNAをコードする1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個の配列が、AAVベクター中にパッケージングされてもよい。いくつかの態様において、gRNAをコードする各配列は異なる。いくつかの態様において、gRNAをコードする配列のうちの少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個は同じである。いくつかの態様において、gRNAをコードする配列の全ては同じである。
いくつかの態様において、AAVベクターは、野生型AAVベクターである。いくつかの態様において、AAVベクターは、1つまたは複数の変異を含有する。いくつかの態様において、AAVベクターは、血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、またはそれらの任意の組み合わせのうちのAAVベクターから単離されているか、またはそれに由来する。
例示的なAAV-sgRNAベクターは、sgRNA配列を含む中央配列領域に隣接する、2つのITR（逆位末端反復）配列を含有する。いくつかの態様において、ITRは、血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、またはそれらの任意の組み合わせのうちのAAVベクターから単離されているか、またはそれに由来する。いくつかの態様において、ITRは、第1の血清型のAAVベクターから単離されているまたはそれに由来し、AAV-sgRNAベクターのキャプシドタンパク質をコードする配列は、第2の血清型のAAVベクターから単離されているまたはそれに由来する。いくつかの態様において、第1の血清型および第2の血清型は、同じである。いくつかの態様において、第1の血清型および第2の血清型は、同じではない。いくつかの態様において、第1の血清型は、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、またはAAV11である。いくつかの態様において、第2の血清型は、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、またはAAV11である。いくつかの態様において、第1の血清型はAAV2であり、第2の血清型は、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、またはAAV11である。いくつかの態様において、第1の血清型はAAV2であり、第2の血清型はAAV9である。
例示的なAAV-sgRNAベクターは、gRNA配列を含む中央配列領域に隣接する、2つのITR（逆位末端反復）配列を含有する。いくつかの態様において、ITRは、血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、またはそれらの任意の組み合わせのうちのAAVベクターから単離されているか、またはそれに由来する。いくつかの態様において、第1のITRは、第1の血清型のAAVベクターから単離されているまたはそれに由来し、第2のITRは、第2の血清型のAAVベクターから単離されているまたはそれに由来し、かつAAV-sgRNAベクターのキャプシドタンパク質をコードする配列は、第3の血清型のAAVベクターから単離されているまたはそれに由来する。いくつかの態様において、第1の血清型および第2の血清型は、同じである。いくつかの態様において、第1の血清型および第2の血清型は、同じではない。いくつかの態様において、第1の血清型、第2の血清型、および第3の血清型は、同じである。いくつかの態様において、第1の血清型、第2の血清型、および第3の血清型は、同じではない。いくつかの態様において、第1の血清型は、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、またはAAV11である。いくつかの態様において、第2の血清型は、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、またはAAV11である。いくつかの態様において、第3の血清型は、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、またはAAV11である。いくつかの態様において、第1の血清型はAAV2であり、第2の血清型はAAV4であり、第3の血清型は、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、またはAAV11である。いくつかの態様において、第1の血清型はAAV2であり、第2の血清型はAAV4であり、第3の血清型はAAV9である。例示的なAAV-sgRNAベクターは、sgRNA配列を含む中央配列領域に隣接する、2つのITR（逆位末端反復）配列を含有する。いくつかの態様において、ITRは、血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、またはそれらの任意の組み合わせのうちのAAVベクターから単離されているか、またはそれに由来する。いくつかの態様において、ITRは、AAV血清型について完全長および/または野生型の配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、ITRは、AAV血清型について短縮された配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、ITRは、AAV血清型について伸長された配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、ITRは、同じAAV血清型についての野生型配列と比較して配列バリエーションを含む配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、配列バリエーションは、置換、欠失、挿入、逆位、または転位のうちの1つまたは複数を含む。いくつかの態様において、ITRは、少なくとも100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、または150塩基対を含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、ITRは、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、または150塩基対を含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、ITRは、110±10塩基対の長さを有する。いくつかの態様において、ITRは、120±10塩基対の長さを有する。いくつかの態様において、ITRは、130±10塩基対の長さを有する。いくつかの態様において、ITRは、140±10塩基対の長さを有する。いくつかの態様において、ITRは、150±10塩基対の長さを有する。いくつかの態様において、ITRは、115、145、または141塩基対の長さを有する。いくつかの態様において、ITRは、SEQ ID NO: 880、SEQ ID NO: 881、SEQ ID NO: 882、またはSEQ ID NO: 883から選択される配列を有する。
いくつかの態様において、AAV-sgRNAベクターは、ベクターのパッケージングおよびsgRNAの発現を容易にするための追加のエレメントを含んでもよい。いくつかの態様において、AAV-sgRNAベクターは、転位因子を含んでもよい。いくつかの態様において、AAV-sgRNAベクターは、調節エレメントを含んでもよい。いくつかの態様において、調節エレメントは、活性化因子または抑制因子を含む。いくつかの態様において、AAV-sgRNA配列は、非機能的または「スタッファー」配列を含んでもよい。本開示の例示的なスタッファー配列は、（ヒトを含む）哺乳動物のゲノム配列に対していくらかの（パーセンテージがゼロでない）同一性または相同性を有してもよい。あるいは、本開示の例示的なスタッファー配列は、（ヒトを含む）哺乳動物のゲノム配列に対していかなる同一性または相同性も有さなくてもよい。本開示の例示的なスタッファー配列は、天然に存在する非コード配列、またはAAVベクターの対象への投与後に転写も翻訳もされない配列を含んでもよく、またはそれからなってもよい。
いくつかの態様において、AAV-sgRNAベクターは、酵母、細菌、昆虫細胞、または哺乳動物細胞における産生のために最適化されてもよい。いくつかの態様において、AAV-sgRNAベクターは、ヒト細胞における発現のために最適化されてもよい。いくつかの態様において、AAV-Cas9ベクターは、バキュロウイルス発現系における発現のために最適化されてもよい。
いくつかの態様において、AAV-sgRNAベクターは、少なくとも1つのプロモーターを含む。いくつかの態様において、AAV-sgRNAベクターは、少なくとも2つのプロモーターを含む。いくつかの態様において、AAV-sgRNAベクターは、少なくとも3つのプロモーターを含む。いくつかの態様において、AAV-sgRNAベクターは、少なくとも4つのプロモーターを含む。いくつかの態様において、AAV-sgRNAベクターは、少なくとも5つのプロモーターを含む。例示的なプロモーターには、例えば、免疫グロブリン軽鎖、免疫グロブリン重鎖、T細胞受容体、HLA DQ aおよび/またはDQ β、β-インターフェロン、インターロイキン-2、インターロイキン-2受容体、MHCクラスII 5、MHCクラスII HLA-Dra、β-アクチン、筋肉クレアチンキナーゼ（MCK）、プレアルブミン（トランスサイレチン）、エラスターゼI、メタロチオネイン（MTII）、コラゲナーゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン、t-グロビン、β-グロビン、c-fos、c-HA-ras、インスリン、神経細胞接着分子（NCAM）、α1-アンチトリパイン、H2B（TH2B）ヒストン、マウスおよび/またはI型コラーゲン、グルコース調節タンパク質（GRP94およびGRP78）、ラット成長ホルモン、ヒト血清アミロイドA（SAA）、トロポニンI（TN I）、血小板由来成長因子（PDGF）、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、SV40、ポリオーマ、レトロウイルス、パピローマウイルス、B型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、サイトメガロウイルス（CMV）、ならびにテナガザル白血病ウイルスが含まれる。さらなる例示的なプロモーターには、U6プロモーター、H1プロモーター、および7SKプロモーターが含まれる。
いくつかの態様において、gRNAをコードする配列は、SEQ ID NO: 383〜705、709〜711、715〜717、790〜862、および864から選択される配列を含む。
いくつかの態様において、AAVベクターは、gRNAをコードする第1の配列およびgRNAをコードする第2の配列を含み、第1のプロモーターが、gRNAをコードする第1の配列の発現を駆動し、かつ第2のプロモーターが、gRNAをコードする第2の配列の発現を駆動する。いくつかの態様において、第1および第2のプロモーターは、同じである。いくつかの態様において、第1および第2のプロモーターは、異なる。いくつかの態様において、第1および第2のプロモーターは、H1プロモーター、U6プロモーター、および7SKプロモーターから選択される。いくつかの態様において、gRNAをコードする第1の配列およびgRNAをコードする第2の配列は、同一である。いくつかの態様において、gRNAをコードする第1の配列およびgRNAをコードする第2の配列は、同一ではない。
いくつかの態様において、AAVベクターは、gRNAをコードする第1の配列、gRNAをコードする第2の配列、およびgRNAをコードする第3の配列を含み、第1のプロモーターが、gRNAをコードする第1の配列の発現を駆動し、第2のプロモーターが、gRNAをコードする第2の配列の発現を駆動し、かつ第3のプロモーターが、gRNAをコードする第3の配列の発現を駆動する。いくつかの態様において、第1、第2、および第3のプロモーターのうちの少なくとも2つは、同じである。いくつかの態様において、第1、第2、および第3のプロモーターの各々は、異なる。いくつかの態様において、第1、第2、および第3のプロモーターは、H1プロモーター、U6プロモーター、および7SKプロモーターから選択される。いくつかの態様において、第1のプロモーターはU6プロモーターである。いくつかの態様において、第2のプロモーターはH1プロモーターである。いくつかの態様において、第3のプロモーターは7SKプロモーターである。いくつかの態様において、第1のプロモーターはU6プロモーターであり、第2のプロモーターはH1プロモーターであり、かつ第3のプロモーターは7SKプロモーターである。いくつかの態様において、gRNAをコードする第1の配列、gRNAをコードする第2の配列、およびgRNAをコードする第3の配列は、同一である。いくつかの態様において、gRNAをコードする第1の配列、gRNAをコードする第2の配列、およびgRNAをコードする第3の配列は、同一ではない。
いくつかの態様において、AAVベクターは、gRNAをコードする第1の配列、gRNAをコードする第2の配列、gRNAをコードする第3の配列、およびgRNAをコードする第4の配列を含み、第1のプロモーターが、gRNAをコードする第1の配列の発現を駆動し、第2のプロモーターが、gRNAをコードする第2の配列の発現を駆動し、第3のプロモーターが、gRNAをコードする第3の配列の発現を駆動し、かつ第4のプロモーターが、gRNAをコードする第4の配列の発現を駆動する。いくつかの態様において、第1、第2、第3、および第4のプロモーターのうちの少なくとも2つは、同じである。いくつかの態様において、第1、第2、第3、および第4のプロモーターの各々は、異なる。いくつかの態様において、第1、第2、第3、および第4のプロモーターの各々は、H1プロモーター、U6プロモーター、および7SKプロモーターから選択される。いくつかの態様において、gRNAをコードする第1の配列、gRNAをコードする第2の配列、gRNAをコードする第3の配列、およびgRNAをコードする第4の配列は、同一である。いくつかの態様において、gRNAをコードする第1の配列、gRNAをコードする第2の配列、gRNAをコードする第3の配列、およびgRNAをコードする第4の配列は、同一ではない。
いくつかの態様において、AAVベクターは、gRNAをコードする第1の配列、gRNAをコードする第2の配列、gRNAをコードする第3の配列、gRNAをコードする第4の配列、およびgRNAをコードする第5の配列を含み、第1のプロモーターが、gRNAをコードする第1の配列の発現を駆動し、第2のプロモーターが、gRNAをコードする第2の配列の発現を駆動し、第3のプロモーターが、gRNAをコードする第3の配列の発現を駆動し、第4のプロモーターが、gRNAをコードする第4の配列の発現を駆動し、かつ第5のプロモーターが、gRNAをコードする第5の配列の発現を駆動する。いくつかの態様において、第1、第2、第3、第4、および第5のプロモーターのうちの少なくとも2つは、同じである。いくつかの態様において、第1、第2、第3、第4、および第5のプロモーターの各々は、異なる。いくつかの態様において、第1、第2、第3、および第4のプロモーターの各々は、異なる。いくつかの態様において、第1、第2、第3、第4、および第5のプロモーターの各々は、H1プロモーター、U6プロモーター、および7SKプロモーターから選択される。いくつかの態様において、gRNAをコードする第1の配列、gRNAをコードする第2の配列、gRNAをコードする第3の配列、gRNAをコードする第4の配列、およびgRNAをコードする第5の配列は、同一である。いくつかの態様において、gRNAをコードする第1の配列、gRNAをコードする第2の配列、gRNAをコードする第3の配列、gRNAをコードする第4の配列、およびgRNAをコードする第5の配列は、同一ではない。
いくつかの態様において、AAV-sgRNAベクターは、SEQ ID NO: 910、SEQ ID NO: 911、SEQ ID NO: 912、またはSEQ ID NO: 913から選択される配列を含む。いくつかの態様において、AAV-sgRNAベクターは、SEQ ID NO: 914、SEQ ID NO: 915、SEQ ID NO: 916、またはSEQ ID NO: 917から選択される配列を含む。いくつかの態様において、AAV-sgRNAベクターは、SEQ ID NO: 918、SEQ ID NO: 919、SEQ ID NO: 920、またはSEQ ID NO: 921から選択される配列を含む。例示的なAAV-sgRNAベクターを、表5に提供する。
（表５）例示的なAAV-sgRNAベクター
Figure 2020503869
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Figure 2020503869
Figure 2020503869
SEQ ID NO: 910〜921を包含するそれらの態様を含む、本開示の遺伝子編集構築物のいくつかの態様において、構築物は、第1のプロモーター、gRNAをコードする第1の配列、第2のプロモーター、およびgRNAをコードする第2の配列、第3のプロモーター、ならびにgRNAをコードする第3の配列を含むか、またはそれからなる。本開示のgRNAをコードする例示的な配列は、SEQ ID NO. 383〜705、709〜711、715〜717、790〜862、864である。いくつかの態様において、gRNAをコードする配列は、
Figure 2020503869
である。いくつかの態様において、gRNAをコードする配列は、
Figure 2020503869
である。いくつかの態様において、gRNAをコードする配列は、
Figure 2020503869
である。いくつかの態様において、構築物は、5'から3'へ、第1のプロモーター、SEQ ID NO. 708のgRNAをコードする配列、第2のプロモーター、SEQ ID NO. 708のgRNAをコードする第2の配列、第3のプロモーター、およびSEQ ID NO. 708のgRNAをコードする第3の配列を含む。いくつかの態様において、構築物は、5'から3'へ、第1のプロモーター、SEQ ID NO. 714のgRNAをコードする配列、第2のプロモーター、SEQ ID NO. 714のgRNAをコードする第2の配列、第3のプロモーター、およびSEQ ID NO. 714のgRNAをコードする第3の配列を含む。いくつかの態様において、構築物は、5'から3'へ、第1のプロモーター、SEQ ID NO. 863のgRNAをコードする配列、第2のプロモーター、SEQ ID NO. 863のgRNAをコードする第2の配列、第3のプロモーター、およびSEQ ID NO. 863のgRNAをコードする第3の配列を含む。本開示の例示的なプロモーターには、
Figure 2020503869
の配列を有するU6プロモーター、
Figure 2020503869
の配列を有するH1プロモーター、および
Figure 2020503869
の配列を有する7SKプロモーターが含まれる。いくつかの態様において、第1、第2、および第3のプロモーターは、各々が個々に、U6プロモーター（SEQ ID NO: 922）、H1プロモーター（SEQ ID NO: 923）、および7SKプロモーター（SEQ ID NO: 924）から選択される。いくつかの態様において、第1、第2、および第3のプロモーターは、各々が個々に、U6プロモーター（SEQ ID NO: 922）、およびH1プロモーター（SEQ ID NO: 923）から選択される。いくつかの態様において、構築物は、5'から3'へ、U6プロモーター、gRNAをコードする第1の配列、H1プロモーター、gRNAをコードする第2の配列、7SKプロモーター、およびgRNAをコードする第3の配列を含む。いくつかの態様において、構築物は、5'から3'へ、U6プロモーター、SEQ ID NO: 708のgRNAをコードする配列、H1プロモーター、SEQ ID NO: 708のgRNAをコードする第2の配列、7SKプロモーター、およびSEQ ID NO: 708のgRNAをコードする第3の配列を含む。いくつかの態様において、構築物は、5'から3'へ、U6プロモーター、SEQ ID NO: 714のgRNAをコードする配列、H1プロモーター、SEQ ID NO: 714のgRNAをコードする第2の配列、7SKプロモーター、およびSEQ ID NO: 714のgRNAをコードする第3の配列を含む。いくつかの態様において、構築物は、5'から3'へ、U6プロモーター、SEQ ID NO: 863のgRNAをコードする配列、H1プロモーター、SEQ ID NO: 863のgRNAをコードする第2の配列、7SKプロモーター、およびSEQ ID NO: 863のgRNAをコードする第3の配列を含む。いくつかの態様において、第1のプロモーター、gRNAをコードする第1の配列、第2のプロモーター、およびgRNAをコードする第2の配列、第3のプロモーター、ならびにgRNAをコードする第3の配列を含む構築物は、少なくとも2つの逆位末端反復（ITR）配列をさらに含む。いくつかの態様において、第1のプロモーター、gRNAをコードする第1の配列、第2のプロモーター、およびgRNAをコードする第2の配列、第3のプロモーター、ならびにgRNAをコードする第3の配列を含む構築物は、AAVの血清型2（AAV2）から単離されたまたはそれに由来する少なくとも2つのITR配列をさらに含む。いくつかの態様において、第1のプロモーター、gRNAをコードする第1の配列、第2のプロモーター、およびgRNAをコードする第2の配列、第3のプロモーター、ならびにgRNAをコードする第3の配列を含む構築物は、少なくとも2つのITR配列をさらに含み、第1のITR配列は、AAVの血清型4（AAV4）から単離されているまたはそれに由来し、かつ第2のITR配列は、AAVの血清型2（AAV2）から単離されているまたはそれに由来する。例示的なITR配列は、
Figure 2020503869
である。いくつかの態様において、構築物は、5'から3'へ、第1のITR、第1のプロモーター、gRNAをコードする第1の配列、第2のプロモーター、およびgRNAをコードする第2の配列、第3のプロモーター、gRNAをコードする第3の配列、ならびに第2のITRを含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、構築物は、5'から3'へ、第1のITR、U6プロモーター、gRNAをコードする第1の配列、H1プロモーター、およびgRNAをコードする第2の配列、7SKプロモーター、gRNAをコードする第3の配列、ならびに第2のITRを含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、構築物は、5'から3'へ、第1のITR、第1のプロモーター、SEQ ID NO: 708のgRNAをコードする配列、第2のプロモーター、およびSEQ ID NO: 708のgRNAをコードする配列、第3のプロモーター、SEQ ID NO: 708のgRNAをコードする配列、ならびに第2のITRを含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、構築物は、5'から3'へ、第1のITR、第1のプロモーター、SEQ ID NO: 714のgRNAをコードする配列、第2のプロモーター、およびSEQ ID NO: 714のgRNAをコードする配列、第3のプロモーター、SEQ ID NO: 714のgRNAをコードする配列、ならびに第2のITRを含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、構築物は、5'から3'へ、第1のITR、第1のプロモーター、SEQ ID NO: 863のgRNAをコードする配列、第2のプロモーター、およびSEQ ID NO: 863のgRNAをコードする配列、第3のプロモーター、SEQ ID NO: 863のgRNAをコードする配列、ならびに第2のITRを含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、構築物は、5'から3'へ、第1のITR、U6、SEQ ID NO: 708のgRNAをコードする配列、H1プロモーター、およびSEQ ID NO: 708のgRNAをコードする配列、7SKプロモーター、SEQ ID NO: 708のgRNAをコードする配列、ならびに第2のITRを含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、構築物は、5'から3'へ、第1のITR、U6、SEQ ID NO: 714のgRNAをコードする配列、H1プロモーター、およびSEQ ID NO: 714のgRNAをコードする配列、7SKプロモーター、SEQ ID NO: 714のgRNAをコードする配列、ならびに第2のITRを含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、5'から3'へ、第1のITR、第1のプロモーター、gRNAをコードする第1の配列、第2のプロモーター、およびgRNAをコードする第2の配列、第3のプロモーター、gRNAをコードする第3の配列、ならびに第2のITRを含む構築物は、ポリA配列をさらに含む。いくつかの態様において、ポリA配列は、ミニポリA配列を含むか、またはそれからなる。本開示の例示的なミニポリA配列は、
Figure 2020503869
のヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、構築物は、5'から3'へ、第1のITR、第1のプロモーター、gRNAをコードする第1の配列、第2のプロモーター、およびgRNAをコードする第2の配列、第3のプロモーター、gRNAをコードする第3の配列、ミニポリA配列、ならびに第2のITRを含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、構築物は、5'から3'へ、第1のITR、U6プロモーター、gRNAをコードする第1の配列、H1プロモーター、gRNAをコードする第2の配列、7SKプロモーター、gRNAをコードする第3の配列、ミニポリA配列、および第2のITRを含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、構築物は、5'から3'へ、第1のITR、第1のプロモーター、SEQ ID NO: 708のgRNAをコードする配列、第2のプロモーター、SEQ ID NO: 708のgRNAをコードする配列、第3のプロモーター、SEQ ID NO: 708のgRNAをコードする配列、ミニポリA配列、および第2のITRを含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、構築物は、5'から3'へ、第1のITR、第1のプロモーター、SEQ ID NO: 714のgRNAをコードする配列、第2のプロモーター、SEQ ID NO: 714のgRNAをコードする配列、第3のプロモーター、SEQ ID NO: 714のgRNAをコードする配列、ミニポリA配列、および第2のITRを含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、構築物は、5'から3'へ、第1のITR、第1のプロモーター、SEQ ID NO: 863のgRNAをコードする配列、第2のプロモーター、SEQ ID NO: 863のgRNAをコードする配列、第3のプロモーター、SEQ ID NO: 863のgRNAをコードする配列、ミニポリA配列、および第2のITRを含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、構築物は、5'から3'へ、第1のITR、U6プロモーター、SEQ ID NO: 708のgRNAをコードする配列、H1プロモーター、SEQ ID NO: 708のgRNAをコードする配列、7SKプロモーター、SEQ ID NO: 708のgRNAをコードする配列、ミニポリA配列、および第2のITRを含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、構築物は、5'から3'へ、第1のITR、U6プロモーター、SEQ ID NO: 714のgRNAをコードする配列、H1プロモーター、SEQ ID NO: 714のgRNAをコードする配列、7SKプロモーター、SEQ ID NO: 714のgRNAをコードする配列、ミニポリA配列、および第2のITRを含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、5'から3'へ、第1のITR、第1のプロモーター、gRNAをコードする第1の配列、第2のプロモーター、およびgRNAをコードする第2の配列、第3のプロモーター、gRNAをコードする第3の配列、ミニポリA配列、ならびに第2のITRを含む構築物は、転位因子逆方向反復をさらに含む。本開示の例示的な転位因子逆方向反復は、
Figure 2020503869
のヌクレオチド配列、および/または
Figure 2020503869
のヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、構築物は、5'から3'へ、第1の転位因子逆方向反復、第1のITR、第1のプロモーター、gRNAをコードする第1の配列、第2のプロモーター、gRNAをコードする第2の配列、第3のプロモーター、gRNAをコードする第3の配列、ミニポリA配列、第2のITR、および第2の転位因子逆方向反復を含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、構築物は、5'から3'へ、第1の転位因子逆方向反復、第1のITR、U6プロモーター、gRNAをコードする第1の配列、H1プロモーター、gRNAをコードする第2の配列、7SKプロモーター、gRNAをコードする第3の配列、ミニポリA配列、第2のITR、および第2の転位因子逆方向反復を含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、構築物は、5'から3'へ、第1の転位因子逆方向反復、第1のITR、第1のプロモーター、SEQ ID NO: 708のgRNAをコードする配列、第2のプロモーター、SEQ ID NO: 708のgRNAをコードする配列、第3のプロモーター、SEQ ID NO: 708のgRNAをコードする配列、ミニポリA配列、第2のITR、および第2の転位因子逆方向反復を含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、構築物は、5'から3'へ、第1の転位因子逆方向反復、第1のITR、第1のプロモーター、SEQ ID NO: 714のgRNAをコードする配列、第2のプロモーター、SEQ ID NO: 714のgRNAをコードする配列、第3のプロモーター、SEQ ID NO: 714のgRNAをコードする配列、ミニポリA配列、第2のITR、および第2の転位因子逆方向反復を含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、構築物は、5'から3'へ、第1の転位因子逆方向反復、第1のITR、第1のプロモーター、SEQ ID NO: 863のgRNAをコードする配列、第2のプロモーター、SEQ ID NO: 863のgRNAをコードする配列、第3のプロモーター、SEQ ID NO: 863のgRNAをコードする配列、ミニポリA配列、第2のITR、および第2の転位因子逆方向反復を含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、構築物は、5'から3'へ、第1の転位因子逆方向反復、第1のITR、U6プロモーター、SEQ ID NO: 708のgRNAをコードする配列、H1プロモーター、SEQ ID NO: 708のgRNAをコードする配列、7SKプロモーター、SEQ ID NO: 708のgRNAをコードする配列、ミニポリA配列、第2のITR、および第2の転位因子逆方向反復を含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、構築物は、5'から3'へ、第1の転位因子逆方向反復、第1のITR、U6プロモーター、SEQ ID NO: 714のgRNAをコードする配列、H1プロモーター、SEQ ID NO: 714のgRNAをコードする配列、7SKプロモーター、SEQ ID NO: 714のgRNAをコードする配列、ミニポリA配列、第2のITR、および第2の転位因子逆方向反復を含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、第1の転位因子逆方向反復、第1のITR、第1のプロモーター、gRNAをコードする第1の配列、第2のプロモーター、gRNAをコードする第2の配列、第3のプロモーター、gRNAをコードする第3の配列、ミニポリA配列、第2のITR、第2の転位因子逆方向反復を含む構築物は、調節配列をさらに含む。本開示の例示的な調節配列は、
Figure 2020503869
のヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、構築物は、5'から3'へ、第1の転位因子逆方向反復、第1のITR、第1のプロモーター、gRNAをコードする第1の配列、第2のプロモーター、gRNAをコードする第2の配列、第3のプロモーター、gRNAをコードする第3の配列、ミニポリA配列、第2のITR、調節配列、および第2の転位因子逆方向反復を含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、構築物は、5'から3'へ、第1の転位因子逆方向反復、第1のITR、U6プロモーター、gRNAをコードする第1の配列、H1プロモーター、gRNAをコードする第2の配列、7SKプロモーター、gRNAをコードする第3の配列、ミニポリA配列、第2のITR、調節配列、および第2の転位因子逆方向反復を含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、構築物は、5'から3'へ、第1の転位因子逆方向反復、第1のITR、第1のプロモーター、SEQ ID NO: 708のgRNAをコードする配列、第2のプロモーター、SEQ ID NO: 708のgRNAをコードする配列、第3のプロモーター、SEQ ID NO: 708のgRNAをコードする配列、ミニポリA配列、第2のITR、調節配列、および第2の転位因子逆方向反復を含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、構築物は、5'から3'へ、第1の転位因子逆方向反復、第1のITR、第1のプロモーター、SEQ ID NO: 714のgRNAをコードする配列、第2のプロモーター、SEQ ID NO: 714のgRNAをコードする配列、第3のプロモーター、SEQ ID NO: 714のgRNAをコードする配列、ミニポリA配列、第2のITR、調節配列、および第2の転位因子逆方向反復を含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、構築物は、5'から3'へ、第1の転位因子逆方向反復、第1のITR、第1のプロモーター、SEQ ID NO: 863のgRNAをコードする配列、第2のプロモーター、SEQ ID NO: 863のgRNAをコードする配列、第3のプロモーター、SEQ ID NO: 863のgRNAをコードする配列、ミニポリA配列、第2のITR、調節配列、および第2の転位因子逆方向反復を含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、構築物は、5'から3'へ、第1の転位因子逆方向反復、第1のITR、U6プロモーター、SEQ ID NO: 708のgRNAをコードする配列、H1プロモーター、SEQ ID NO: 708のgRNAをコードする配列、7SKプロモーター、SEQ ID NO: 708のgRNAをコードする配列、ミニポリA配列、第2のITR、調節配列、および第2の転位因子逆方向反復を含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、構築物は、5'から3'へ、第1の転位因子逆方向反復、第1のITR、U6プロモーター、SEQ ID NO: 714のgRNAをコードする配列、H1プロモーター、SEQ ID NO: 714のgRNAをコードする配列、7SKプロモーター、SEQ ID NO: 714のgRNAをコードする配列、ミニポリA配列、第2のITR、調節配列、および第2の転位因子逆方向反復を含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、第1のITR、第1のプロモーター、gRNAをコードする第1の配列、第2のプロモーター、およびgRNAをコードする第2の配列、第3のプロモーター、gRNAをコードする第3の配列、ミニポリA配列、ならびに第2のITRを含む構築物は、スタッファー配列をさらに含む。いくつかの態様において、構築物は、5'から3'へ、第1のITR、U6プロモーター、gRNAをコードする第1の配列、H1プロモーター、gRNAをコードする第2の配列、7SKプロモーター、gRNAをコードする第3の配列、スタッファー配列、ミニポリA配列、および第2のITRを含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、構築物は、5'から3'へ、第1のITR、第1のプロモーター、SEQ ID NO: 708のgRNAをコードする配列、第2のプロモーター、SEQ ID NO: 708のgRNAをコードする配列、第3のプロモーター、SEQ ID NO: 708のgRNAをコードする配列、スタッファー配列、ミニポリA配列、および第2のITRを含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、構築物は、5'から3'へ、第1のITR、第1のプロモーター、SEQ ID NO: 714のgRNAをコードする配列、第2のプロモーター、SEQ ID NO: 714のgRNAをコードする配列、第3のプロモーター、SEQ ID NO: 714のgRNAをコードする配列、スタッファー配列、ミニポリA配列、および第2のITRを含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、構築物は、5'から3'へ、第1のITR、第1のプロモーター、SEQ ID NO: 863のgRNAをコードする配列、第2のプロモーター、SEQ ID NO: 863のgRNAをコードする配列、第3のプロモーター、SEQ ID NO: 863のgRNAをコードする配列、スタッファー配列、ミニポリA配列、および第2のITRを含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、構築物は、5'から3'へ、第1のITR、U6プロモーター、SEQ ID NO: 708のgRNAをコードする配列、H1プロモーター、SEQ ID NO: 708のgRNAをコードする配列、7SKプロモーター、SEQ ID NO: 708のgRNAをコードする配列、スタッファー配列、ミニポリA配列、および第2のITRを含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、構築物は、5'から3'へ、第1のITR、U6プロモーター、SEQ ID NO: 714のgRNAをコードする配列、H1プロモーター、SEQ ID NO: 714のgRNAをコードする配列、7SKプロモーター、SEQ ID NO: 714のgRNAをコードする配列、スタッファー配列、ミニポリA配列、および第2のITRを含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、構築物は、5'から3'へ、第1の転位因子逆方向反復、第1のITR、第1のプロモーター、gRNAをコードする第1の配列、第2のプロモーター、gRNAをコードする第2の配列、第3のプロモーター、gRNAをコードする第3の配列、スタッファー配列、ミニポリA配列、第2のITR、調節配列、および第2の転位因子逆方向反復を含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、構築物は、5'から3'へ、第1の転位因子逆方向反復、第1のITR、U6プロモーター、gRNAをコードする第1の配列、H1プロモーター、gRNAをコードする第2の配列、7SKプロモーター、gRNAをコードする第3の配列、スタッファー配列、ミニポリA配列、第2のITR、調節配列、および第2の転位因子逆方向反復を含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、構築物は、5'から3'へ、第1の転位因子逆方向反復、第1のITR、第1のプロモーター、SEQ ID NO: 708のgRNAをコードする配列、第2のプロモーター、SEQ ID NO: 708のgRNAをコードする配列、第3のプロモーター、SEQ ID NO: 708のgRNAをコードする配列、スタッファー配列、ミニポリA配列、第2のITR、調節配列、および第2の転位因子逆方向反復を含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、構築物は、5'から3'へ、第1の転位因子逆方向反復、第1のITR、第1のプロモーター、SEQ ID NO: 714のgRNAをコードする配列、第2のプロモーター、SEQ ID NO: 714のgRNAをコードする配列、第3のプロモーター、SEQ ID NO: 714のgRNAをコードする配列、スタッファー配列、ミニポリA配列、第2のITR、調節配列、および第2の転位因子逆方向反復を含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、構築物は、5'から3'へ、第1の転位因子逆方向反復、第1のITR、第1のプロモーター、SEQ ID NO: 863のgRNAをコードする配列、第2のプロモーター、SEQ ID NO: 863のgRNAをコードする配列、第3のプロモーター、SEQ ID NO: 863のgRNAをコードする配列、スタッファー配列、ミニポリA配列、第2のITR、調節配列、および第2の転位因子逆方向反復を含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、構築物は、5'から3'へ、第1の転位因子逆方向反復、第1のITR、U6プロモーター、SEQ ID NO: 708のgRNAをコードする配列、H1プロモーター、SEQ ID NO: 708のgRNAをコードする配列、7SKプロモーター、SEQ ID NO: 708のgRNAをコードする配列、スタッファー配列、ミニポリA配列、第2のITR、調節配列、および第2の転位因子逆方向反復を含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、構築物は、5'から3'へ、第1の転位因子逆方向反復、第1のITR、U6プロモーター、SEQ ID NO: 714のgRNAをコードする配列、H1プロモーター、SEQ ID NO: 714のgRNAをコードする配列、7SKプロモーター、SEQ ID NO: 714のgRNAをコードする配列、スタッファー配列、ミニポリA配列、第2のITR、調節配列、および第2の転位因子逆方向反復を含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、構築物は、1つまたは複数のスペーサー配列をさらに含んでもよい。本開示の例示的なスペーサー配列は、1〜1500ヌクレオチドの長さを、その間の全ての範囲を含んで有する。いくつかの態様において、スペーサー配列は、ITR、プロモーター、gRNAをコードする配列、ポリA配列、転位因子逆方向反復、スタッファー配列、および/または調節エレメントの5'または3'である位置に、位置してもよい。
V. 薬学的組成物および送達法
臨床適用のために、薬学的組成物が、意図する適用に適した形態で調製される。一般に、これは、発熱性物質およびヒトまたは動物にとって有害であり得る他の不純物を本質的に含まない組成物を調製することを要する。
薬物、タンパク質、または送達ベクターを安定化し、標的細胞による取り込みを可能にするため、適切な塩および緩衝液が使用される。本開示の水性組成物は、薬学的に許容される担体または水性媒体に溶解または分散された有効量の薬物、ベクター、またはタンパク質を含む。「薬学的にまたは薬理学的に許容される」という語句は、動物またはヒトに投与されたときに有害反応、アレルギー反応、または他の不都合な反応を生じない分子実体および組成物を指す。本明細書において使用される場合、「薬学的に許容される担体」は、ヒトへの投与に適した医薬などの医薬の製剤化において使用するために許容される、溶媒、緩衝液、溶液、分散媒、コーティング剤、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤などを含む。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体および作用物質の使用は、当技術分野において周知である。治療用組成物における使用において、本開示の活性成分と非適合性でないあらゆる慣用の媒体または作用物質を使用してよい。組成物のベクターまたは細胞を不活化しない条件で、補足的な活性成分を組成物に組み込むこともできる。
いくつかの態様において、本開示の活性組成物は、従来の薬学的調製物を含みうる。本開示に係るこれらの組成物の投与は、標的組織が任意の一般的な経路を介して利用可能である限り、その経路を介するものであってよいが、一般には全身投与を含む。これは、経口、経鼻、または経頬を含む。あるいは、投与は、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、腹腔内注射、もしくは静脈内注射によっても、筋組織への直接注射によってもよい。前述のように、そのような組成物は、通常、薬学的に許容される組成物として投与されるであろう。
活性化合物は、非経口投与されても腹腔内投与されてもよい。例として、遊離塩基または薬理学的に許容される塩としての活性化合物の溶液を、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水中で調製することができる。グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物中で、ならびに油中で、分散液を調製することもできる。通常の保管および使用条件下で、これらの調製物は、一般に、微生物の増殖を防止するための保存剤を含有する。
注射可能な使用に適した薬学的形態は、例えば、無菌の水性の溶液または分散液、および無菌の注射可能な溶液または分散液の即時調製のための無菌の粉末を含む。一般に、これらの調製物は、無菌であり、容易な注射可能性が存在する程度に流動性である。調製物は、製造および保管条件下で安定であるべきであり、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護されるべきである。適切な溶媒または分散媒は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それらの好適な混合物、および植物油を含有してよい。適正な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用によって、分散液の場合には必要とされる粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン類、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含めることが好ましい。注射可能組成物の吸収の延長は、吸収を遅延させる作用物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に使用することによってもたらされ得る。
無菌の注射可能溶液は、活性化合物を適切な量で、所望により任意の他の成分（例えば、上に列挙した通り）と共に、溶媒に組み込み、続いて、濾過減菌することによって調製してよい。一般に、分散液は、例えば上に列挙した通りの基本的な分散媒および所望の他の成分を含有する無菌の媒体に、様々な滅菌された活性成分を組み込むことによって調製される。無菌の注射可能溶液の調製のための無菌の粉末の場合、好ましい調製の方法は、事前に滅菌濾過された溶液から活性成分と任意の追加の所望の成分との粉末を与える、真空乾燥および凍結乾燥の技術を含む。
いくつかの態様において、本開示の組成物は、中性または塩の形態で製剤化される。薬学的に許容される塩は、例えば、無機酸（例えば、塩酸もしくはリン酸）からまたは有機酸（例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸など）から得られる、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基と形成される）を含む。また、タンパク質の遊離カルボキシル基と形成される塩を、無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、もしくは水酸化鉄）からまたは有機塩基（例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカイン）などから得ることもできる。
製剤化の後、溶液は、好ましくは、投薬製剤と適合性の様式で、かつ、治療的に有効であるような量で投与される。製剤は、注射可能溶液、薬物放出カプセルなどのような種々の剤形で容易に投与してよい。水性溶液での非経口投与のために、例えば、溶液は、一般に、適切に緩衝され、最初に、液体希釈剤が、例えば、十分な生理食塩水またはグルコースで等張にされる。そのような水性溶液を、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、および腹腔内投与に使用してよい。好ましくは、特に本開示に照らして、当業者に公知であるような無菌の水性媒体が用いられる。例として、単一用量を、等張NaCl溶液1mlに溶解し、皮下注入液1000mlに添加しても、提案された注入部位に注射してもよい（例えば、"Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, pages 1035-1038 and 1570-1580を参照のこと）。処置される対象の状態に応じて、投薬量のある程度の変動が必然的に起こる。いずれにしても、投与責任者が、個々の対象のための適切な用量を決める。さらに、ヒトへの投与のために、調製物は、FDA Office of Biologics standardsによって必要とされるような無菌性、発熱性、一般的安全性、および純度の基準を満たすべきである。
いくつかの態様において、本明細書に記載のCas9またはCpf1およびgRNAを、養子細胞移入（ACT）を使用して患者に送達してよい。養子細胞移入では、1つまたは複数の発現構築物が、患者を起源とする細胞（自己由来）または患者以外の1つまたは複数の個体を起源とする細胞（同種異系）にエクスビボで提供される。細胞は、その後、患者に導入または再導入される。したがって、いくつかの態様において、Cas9またはCpf1およびジストロフィンスプライス部位を標的とするガイドRNAをコードする1つまたは複数の核酸が、細胞が患者に導入または再導入される前に、細胞にエクスビボで提供される。
以下の表は、本明細書に開示の組成物および方法と一緒に使用するための例示的なプライマー配列およびゲノムターゲティング配列を提供する。
（表６）ゲノム標的配列
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* この表において、大文字は、遺伝子のエクソン配列と整列しているヌクレオチドを表す。小文字は、遺伝子のイントロン配列と整列しているヌクレオチドを表す。
（表７）gRNA配列
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* この表において、大文字は、遺伝子のエクソン配列と整列しているsgRNAヌクレオチドを表す。小文字は、遺伝子のイントロン配列と整列しているsgRNAヌクレオチドを表す。
VI. 配列の表
（表８）マウスDmdエクソン51におけるsgRNAについてのゲノム標的部位
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（表９）マウスDmdエクソン51を標的とするgRNA配列
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（表１０）ヒトDmdエクソン51を標的とするsgRNAについてのゲノム標的配列
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（表１１）ヒトDmdエクソン51を標的とするsgRNA配列
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（表１２）種々のヒトDmdエクソンにおける部位を標的とするsgRNAについてのゲノム標的配列
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（表１３）種々のヒトDmdエクソンにおける部位を標的とするためのgRNA配列
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（表１４）イヌDmdエクソン51を標的とするsgRNAについてのゲノムターゲティング配列
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（表１５）イヌDmdエクソン51を標的とするためのgRNA配列
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VII. 実施例
以下の実施例は、本開示の好ましい態様を実証するために含まれる。以下の実施例において開示される技術が、本開示の実践において良好に機能すると本発明者によって発見された技術を代表するものであり、したがって、これがその実践のための好ましい様式に相当するとみなすことができると、当業者は理解するはずである。しかしながら、当業者は、本開示に照らして、本開示の精神および範囲から逸脱することなく、開示されている具体的な態様において多くの変更を行うことができ、それでも同様のまたは類似の結果を得ることができるものと理解するはずである。
実施例1‐材料および方法
研究の承認
本研究における動物に関与する全ての実験手順は、University of Texas Southwestern Medical CenterのInstitutional Animal Care and Use Committeeによって審査され、承認された。
マウスにおけるCRISPR/Cas9媒介性エクソン50欠失
マウスDmd遺伝子座のエクソン50配列を囲むイントロン領域に特異的な2種類のシングルガイドRNA（sgRNA）を、以下のプライマーを用いてベクターpx330中にクローニングした。
Dmdエクソン50_F1：
Figure 2020503869
Dmdエクソン50_R1：
Figure 2020503869
Dmdエクソン50_F2：
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Dmdエクソン50_R2：
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sgRNAのインビトロ転写のために、T7プロモーター配列を、以下のプライマーを用いてPCRによってsgRNA鋳型に付加した。
Dmdエクソン50_T7-F1：
Figure 2020503869
Dmdエクソン50_T7-F2：
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Dmdエクソン50_T7-Rv：
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ゲル精製したPCR産物を、MEGAshortscript T7キット（Life Technologies）を用いたインビトロ転写のための鋳型として用いた。sgRNAを、MEGAclearキット（Life Technologies）によって精製し、ヌクレアーゼを含まない水（Ambion）で溶出した。ガイドRNAの濃度を、NanoDrop機器（Thermo Scientific）によって測定した。
ΔEx50マウスの遺伝子型判定
ΔEx50マウスを、標的領域を包含するプライマーを用いて遺伝子型判定した。
Geno50-F：
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Geno50-R：
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尾生検を、100μLの25 mM NaOH、0.2 mM EDTA（pH 12）において20分間、95℃で消化した。尾を短時間、遠心分離して、その後100μLの40 mM トリス・HCl（pH 5）を添加し、混合して均質化した。2マイクロリットルのこの反応液を、下記のプライマーでのその後のPCR反応に用い、その後ゲル電気泳動を行った。
プラスミド
2A-EGFPを伴うヒトコドン最適化SpCas9遺伝子およびsgRNAのバックボーンを含有するpSpCas9(BB)-2A-GFP（PX458）プラスミドを、Addgeneから購入した（プラスミド番号48138）。AAV TRIPSRプラスミドは、Dirk Grimm博士（Heidelberg University Hospital）から入手した。sgRNAのクローニングは、BbsI部位を用いて行った。pGL3-CK8eプラスミドは、Stephen Hauschka博士（Department of Biochemistry, University of Washington, Seattle, USA）から入手した。AAV-miniCMV-Cas9-shortPolyAプラスミドは、Dirk Grimm博士（Heidelberg University Hospital）から入手した。本原稿において用いた最終的なAAV9-CK8-CRISPR/Cas9ベクターを生成するために、AAV-miniCMV-Cas9-short-PolyAをPacI酵素およびNheI酵素で消化して、miniCMVプロモーターを除去した。CK8プロモーターを、PacI部位およびNheI部位の配列を含有するプライマーを用いてpGL3-CK8eプラスミドから増幅し、消化したベクター中にクローニングして、AAV-CK8-Cas9-shortPolyAプラスミドを生成した。
エクソン51のスキッピングのためのsgRNAの特定およびクローニング
Dmdエクソン51 ガイドRNAを、crispr.mit.eduを用いて定義した。ガイド配列を、以下のプライマーを用いて、Feng Zhangからの寄贈物であるAddgeneプラスミド番号42230（6）中にクローニングした。
Dmdエクソン51_F1：
Figure 2020503869
Dmdエクソン51_R1：
Figure 2020503869
Dmdエクソン51_F2：
Figure 2020503869
Dmdエクソン51_R2：
Figure 2020503869
ガイド配列を、AAVバックボーンへのクローニングの前に、10T1/2細胞を用いて培養において試験した。
Golden Gateシステムを用いたAAVバックボーンにおける三重sgRNAアセンブリ
AAV TRISPRバックボーンクローニングシステムのアセンブリは、Golden Gate Assemblyの2つの連続した段階に頼る。ドナープラスミドへのgRNAの第1段階アセンブリ。オリゴヌクレオチドのアニーリングを、2.5μlの各オリゴ（0.5μM）、5μl NEBuffer 2（NEB）、および40μL ddH2Oを含有する反応液を、加熱ブロックを用いて95℃へ5分間加熱することによって行った。ドナープラスミドへのアセンブリ反応のために、40 fmol（約100 ng）の目的バックボーン、1μLのアニーリングし、希釈したオリゴ、0.75μLのEsp3I、1μL バッファーtango（両方ともThermo Scientific）、1μLのT4 DNA Ligase（400 U/μL）（NEB）、ならびにATPおよびDTT（10μL総体積において1 mMの最終濃度）を混合する。サーモサイクラーを用いて、37℃/3分およびその後20℃/5分の25〜50サイクルを実施する。80℃へ20分間加熱することによって、制限酵素およびリガーゼを変性させる。化学的にコンピテントな細菌の形質転換のために3μLのこの反応液を用い、SOCにおいて回復させて（37℃、800 rpm、40分）、クロラムフェニコール（25μg/mL）を含有するLB-寒天プレート上に広げる。sgRNAをコードするアニーリングしたオリゴヌクレオチドを、（クローニング中のバックグラウンドを低減させるための）ネガティブ選択マーカーccdBおよびクロラムフェニコール耐性遺伝子を保有するドナープラスミド中にクローニングする。正確なアセンブリを試験するために、プラスミドを、プライマー
Figure 2020503869
を用いてシークエンシングする。第2段階は、U6、H1、または7SKプロモーターの転写制御下で1種類のsgRNAの発現を駆動するこれらのドナープラスミドのうちの3種類を、AAV ITRを保有するレシピエントプラスミドと共に第2のGolden Gate assemblyにおいてプールする。アセンブリ反応液は、ドナープラスミド-#1-U6-sgRNA、ドナープラスミド-#2-H1-sgRNA、ドナープラスミド-#3-7SK-sgRNA、およびITRを含有するレシピエントプラスミドの、4種類のプラスミド全てを含有することになる。BbsIでの消化により、各断片（U6、H1、7SK、レシピエントバックボーン）について固有のオーバーハングが生成する。ライゲーション手順の最中に、これらのオーバーハングがアニーリングし、3種類のカセットが互いに合致する場合に、環状化プラスミドのみが得られる。
血清クレアチンキナーゼ（CK）の測定
マウス血清CKを、UT Southwestern Medical CenterのMetabolic Phenotyping Coreによって測定した。血液を顎下静脈から収集し、VITROS 250 Chemistry Systemを用いてCK活性を定量的に測定するために、VITROS Chemistry 7 Products CK Slidesによって血清CKレベルを測定した。
インビボでのイヌの研究
筋肉内（IM）注射を、人工呼吸全身麻酔下で、1か月齢のΔE50 MDイヌにおいて行った。1回の単一注射を、左前脛骨筋の4か所の異なる部位で行った。全てのイヌは、オピエート（ブプレノルフィン）の前投薬、周術期抗生作用、および4日の術後鎮痛法（カルプロフェン）を受けた。2匹の罹患したイヌは、乳酸加リンガー溶液において注射筋肉あたり1E13vgの最終濃度に調製した筋編集構成要素AAV-Cas9およびAAV-sgRNA-ex51と混合したrAAVを受けた。
実施例2‐結果
DMDのヒト化モデル
DMD患者における最も一般的なホットスポット変異領域は、エクソン45〜51の間の領域であり、エクソン51のスキッピングを、患者の最大の群（13〜14％）を処置するために用いることができる。インビボでCRISPR/Cas9媒介性エクソン51スキッピングを調査するために、本発明者らは、2種類のsgRNAによって方向づけられるCRISPR/Cas9システムを用いてエクソン50を欠失させることによって、ヒト「ホットスポット」領域を模倣するマウスモデルを生成した（図1A）。エクソン50の欠失は、DNAシークエンシングによって確認した（図1B）。エクソン50の欠失は、ジストロフィン遺伝子をフレーム外に置き、骨格筋および心臓におけるジストロフィンタンパク質の欠如をもたらした（図1C〜E）。エクソン50が欠けているマウスは、2か月齢までに明白なジストロフィー性筋肉変化を示した（図1E）。Δエクソン50マウスの血清解析により、筋損傷を示すクレアチンキナーゼ（CK）レベルの有意な増加が示された（図1F）。まとめると、ジストロフィンタンパク質発現、筋肉組織学、および血清CKレベルにより、ΔEx50マウスモデルのジストロフィー表現型が検証された。
エクソン51をスキップするための単一切断戦略を用いたジストロフィン発現の回復
化膿ブドウ球菌Cas9は、二本鎖DNA切断を生じるためのPAM配列として、NAG/NGGを必要とする。興味深いことに、エクソンのユニバーサルスプライスアクセプターおよびドナー部位はNAGまたはNGGを含有する（図3B）。そのため、ΔEx50マウスモデルにおいてリーディングフレームおよびジストロフィン発現を修正するために、本発明者らは、エクソン51のスプライスアクセプターおよびドナー部位を標的としてそれを欠失させ、それによってインフレームジストロフィンタンパク質を再生成するsgRNAを作製した。sgRNAガイドが効率的に切断することができるかどうかを試験するために、本発明者らは、最初に、マウスおよびヒトの細胞株においてそれらの有効性を評定した（図5）。DMDリーディングフレームを修正する最も効率的なやり方を判定するために、本発明者らは、以下の2つの異なる戦略を比較した：（1）スプライスアクセプター部位を標的とする1コピーの第1のsgRNA（sgRNA-SA）およびドナーアクセプター部位を標的とする1コピーの第2のsgRNA（sgRNA-SD）をrAAV9-sgRNAベクター中にクローニングしたダブルガイド戦略；（2）本発明者らが3コピーの同じsgRNA（sgRNA-SA）をrAAV9-sgRNAベクター中にクローニングした三重戦略（図3C）。各コピーのsgRNA-SAの発現は、異なるRNAプロモーター（U6、H1、および7SK）によって駆動された。本発明者らは、CK8プロモーターを使用して骨格筋および心臓組織において特異的にヒト化SpCas9の発現を駆動する、AAV-Cas9ベクターを用いたAAV-Cas9（CK8-Cas9-shortPolyA）を作製した。AAVのP12マウスへの筋肉内（IM）注射後に、筋組織を解析した。AAV-Tri-SAおよびAAV-SA+SDを注射したΔEx50マウス由来のRNAのRT-PCRにより、エクソン51の欠失（ΔEx50-51）がエクソン49から52までのスプライシングを可能にしたことが示された（図2A、下のバンド）。ΔEx50-51バンドのRT-PCR産物のシークエンシングにより、エクソン49がエクソン52に接合したことが確認された（図2B）。予想外なことに、RT-PCR解析により、sgRNA-SAの三重バージョン（AAV-Tri-SA）を用いた単一切断戦略が、sgRNA-SAおよびsgRNA-SDの2種類のsgRNA（AAV-SA+SD）を用いるのと同様に効率的であることが示された。
AAV-Tri-SA編集戦略の効率をさらに評価するために、本発明者らは、注射した筋肉の組織学的解析を行って、筋肉切片全体を通してジストロフィンを発現する線維の数を評定した。興味深いことに、AAV-Tri-SAを注射したΔEx50マウス由来の筋肉凍結切片のジストロフィン免疫染色により、AAV-SA+SDを注射したΔEx50マウス由来の筋肉（平均31±0.1％）と比較して、有意により多い数のジストロフィン陽性線維が明らかになった（平均43±0.9％）（図3D〜E、図6）。ウェスタンブロット解析により、骨格筋におけるジストロフィン発現の回復が確認された（図3F〜G）。筋肉のヘマトキシリン・エオシン（H&E）染色により、壊死筋線維などの筋ジストロフィーの組織病理学的特徴が、AAV送達の3週間後にTA筋において減少したことが示された（図4A）。筋線維区域の分布の定量解析により、AAV-Tri-SAで処置した筋肉およびAAV-SA-SDで処置した筋肉の両方について、ΔEx50筋肉と比較して線維サイズの明瞭な増加が示された（図4B）。しかし、AAV-Tri-SAで処置した筋肉は、AAV-SA+SDで処置した筋肉と比較して、小さな線維（＜500μm）の頻度のより大きな減少を明らかにした。合わせて、これらの結果は、AAV-Tri-SAを用いた1回の単一切断でのエクソン51のスプライスアクセプター部位のターゲティングが、DMDにおけるジストロフィン発現の回復において非常に効率的であることを実証する。このアプローチは、エクソンスキッピングによって修正することができる多くの障害について有用性を有する。
単一DNA切断ゲノム編集戦略のあつらえ
sgRNAによってガイドされる化膿ブドウ球菌Cas9は、PAMの隣の標的ゲノム遺伝子座に結合し、PAM配列を3ヌクレオチド超えて二本鎖DNA切断（DSB）を生じる。スプライスアクセプター部位のターゲティングによる方法の効率をさらに評価するために、本発明者らは、エクソン51スプライスアクセプター部位に隣接した領域を標的とする、第2のsgRNAトリプルガイド構築物（sgRNA-ex51-SA2）を設計した。このgRNAは、エクソン51についてのスプライスアクセプター部位の近くにDSBを生じるために、エクソンのさらに3ヌクレオチド内部のPAM配列を用いる（図7A〜図7B）。スプライスアクセプター領域の近傍およびエクソン配列内の切断は、リフレーミング事象およびエクソンスキッピング事象を結果としてもたらした。そのうえ、種にわたってイントロン配列よりも高い保存を示すエクソン配列においてsgRNAを設計することは、他の種へのsgRNAの橋渡しを容易にする。
sgRNA-ex51-SA2とカップリングしたCas9のDNA切断活性を、ミスマッチ特異的T7エンドヌクレアーゼI（T7E1）アッセイを用いて、10T1/2マウス線維芽細胞において評定した（図8A）。sgRNA-51-SA2とカップリングしたCas9によって生成された変異のタイプを調査するために、ゲノムディープシークエンシング解析を行った。シークエンシング解析により、変異の9.3％は、PAM配列の3ヌクレオチド3'に位置する単一のアデノシン（A）挿入を含有していたことが明らかになった。加えて、変異の7.3％は、スプライスアクセプター部位およびエクソン51についての高度に予測されるエクソンスプライシングエンハンサー部位にわたる欠失を含有していた（図8B）。sgRNA-ex51-SA2は、Dmd遺伝子の高度に保存された領域に対応し（図8C〜D）、本発明者らは、293T細胞においてヒトDmd遺伝子座を切断するCas9およびヒトsgRNA-51の能力を試験した。T7E1アッセイにより、予測された部位での明瞭な切断が明らかになった（図8E）。同様に、配列解析により、ヒトsgRNA-ex51-SA2とカップリングしたCas9が、切断部位の周りに同じアデノシン（A）挿入および異なる範囲の欠失を生成したことが明らかになった（図8F）。
Cas9およびsgRNA-ex51-SA2の骨格筋および心臓組織へのインビボ送達のために、これらの組織に対して優先的な指向性を示すアデノ随伴ウイルス9（AAV9）を用いた。筋肉特異的発現をさらに増強するために、筋肉および心臓における発現について高度に特異的な、CK8eプロモーターと呼ばれる筋肉特異的CK調節カセットを含有する、AAV9-Cas9ベクター（CK8e-Cas9-shortPolyA）を使用した（図9A）。合わせて、この436 bpの筋肉特異的カセットおよび4101 bpのCas9 cDNAは、AAV9のパッケージング限界内である。各sgRNAの発現を、3種類のRNAポリメラーゼIIIプロモーター（U6、H1、および7SK）のうちの1種類によって駆動した（図9B）。
単一DNA切断によるΔEx50マウスにおけるジストロフィンリーディングフレームの修正
sgRNA-ex51-SA2を、筋肉内（IM）注射によって、Cas9（AAV-Cas9）と共に、トリプルコピー（AAV-Tri-SA2）においてマウスに送達した。注射後、筋組織を解析した。インビボターゲティング効率を、エクソン48および53における配列についてのプライマーでのRT-PCR、および標的ゲノム領域についてのT7E1アッセイによって概算した。効率的な標的切断が達成されたかどうかを調査するために、本発明者らは、標的部位にわたる771 bp領域を増幅し、T7EIアッセイを用いてそれを解析した（図10A）。対応するsgRNAを伴うSpCas9の活性を、標的部位上で解析した。T7EIアッセイにより、AAV-Cas9およびAAV9-sgRNA-51-SA2の送達後のDmd遺伝子座の変異誘発が明らかになった（図10A）。Cas9およびsgRNAを発現するAAV9を注射したΔEx50マウスにおいて生成された変異のタイプを調査するために、標的部位にわたるゲノムPCRアンプリコン産物を、アンプリコンディープシークエンシング解析によって解析した。標的領域のディープシークエンシングにより、総読み取りの27.9％が、標的ゲノム部位に変化を含有していたことが示された（図10B）。平均で、特定された変異の15％は、インビトロでマウス10T1/2細胞およびヒト293細胞において見られたものと同じA挿入を含有していた。本方法を用いて特定された欠失は、エクソン51についての高度に予測されるエクソンスプライシングエンハンサー部位を包含していた（図10B）。
AAV9-Cas9およびAAV9-sgRNA-51を筋肉内に注射したΔEx50マウスの筋肉由来のRNAのRT-PCR産物は、エクソン51の欠失（ΔEx50-51）がエクソン49から52までのスプライシングを可能にしたことを示した（図11A、下のバンド）。ΔEx50-51バンドのRT-PCR産物のシークエンシングによって、エクソン49がエクソン52に接合したことが確認された。本発明者らの遺伝子編集戦略によって導入された変異をさらに特定するために、4種類の試料由来のRT-PCR増幅産物を、ゲル精製を伴わずにトポイソメラーゼベースのチミジン-アデノシン（TOPO-TA）クローニングに直接供し、次いでシークエンシングした。驚くべきことに、各試料由来の40クローンの配列解析により、AAV9-Cas9およびAAV9-sgRNA-51を注射したΔEx50マウスは、シークエンシングしたクローンの15％において特定されたエクソン51がスキップされたcDNA産物（ΔEx50-51）に加えて、高頻度のリフレーミング事象を示したことが示された。シークエンシングしたクローンのうち、63％は、エクソン51の配列中に単一のヌクレオチド挿入を含有していた（図11B〜C）。見られた最も優勢な挿入変異は、A挿入であった。
ゲル上で、A挿入は、非編集cDNA産物からサイズでは区別不可能であったため、ディープシークエンシング解析を行って、他の小さな挿入と比較したこの挿入の存在量を判定した。非編集cDNA産物およびリフレーミングされたcDNA産物を含有する上のバンドのディープシークエンシングにより、総読み取りの69.22％は、A挿入を有するリフレーミングされたcDNA産物を含有し、17.71％は、非編集cDNA産物を含有し、残りは、小さな欠失および挿入を含有していたことが示された（図11D）。未注射ΔEx50マウスのディープシークエンシング解析により、A挿入は、Cas9が生成した編集の結果であることが確認された。これらのアンプリコンディープシークエンシングの結果により、TOPO-TAクローニングおよびシークエンシングの結果が確認された。まとめると、RT-PCR解析により、AAV9-Cas9およびAAV9-sgRNA-51-SA2を注射したΔEx50マウスは、高度に保存されたエクソンスプライシングエンハンサー領域における欠失に起因するエクソン51スキッピング事象に加えて、エクソン51の配列中にA挿入を含有するcDNA産物を伴う高頻度のリフレーミング事象を示したことが明らかになった。
Cas9およびsgRNA-51-SA2の筋肉内AAV9送達後のジストロフィン発現の回復
注目すべきことに、AAV-Tri-SA2を注射したΔEx50マウス由来の筋肉凍結切片のジストロフィン免疫染色により、平均99％の正常線維の回復を伴う、有意により多い数のジストロフィン陽性線維が明らかになった（図12A、図13）。ウェスタンブロット解析により、骨格筋におけるジストロフィン発現の回復が確認された（図12C、図12D）。筋肉のヘマトキシリン・エオシン（H&E）染色により、壊死筋線維などの筋ジストロフィーの組織病理学的特徴が、AAV送達の3週間後にTA筋において修正されたことが示された（図12Bおよび図14）。別個のsgRNA設計を用いた本方法は、DMD修正の効率において大きな進歩を表し、最も一般的なジストロフィン変異を有する患者に対して直接適用性を有する。
シングルコピーまたはトリプルコピーのsgRNAを発現する様々なAAV9と組み合わせたAAV9-Cas9の筋肉内注射後の、ジストロフィン発現の救出
インビボでsgRNA-ex51-SA2のトリプルプロモーター発現の有益性を評定するために、sgRNA発現が、単一のRNAポリメラーゼIIIプロモーター（U6またはH1または7SK）によって駆動されるものと、またそれとは別に、3種類のRNAポリメラーゼIIIプロモーター（U6、H1、および7SK）によって駆動される、様々な構築物を調査した（図15A）。本発明者らは、sgRNA-ex51-SA2を、U6プロモーターによって個別に駆動されるシングルコピー（AAV9-U6-sgRNA-51-SA2）、H1プロモーターによって個別に駆動されるシングルコピー（AAV9-H1-sgRNA-51-SA2）、7SKプロモーターによって個別に駆動されるシングルコピー（AAV9-7SK-sgRNA-51-SA2）と、トリプルコピー（AAV9-Triple-sgRNA-51-SA2）とにおいて送達した。AAV9のP12マウスへの筋肉内（IM）注射後に、筋組織を解析した。予想外なことに、それぞれ平均70％、40％、および50％の正常線維の回復を伴うAAV9-U6-sgRNA-51-SA2、AAV-H1-sgRNA-51-SA2、およびAAV-7SK-sgRNA-51-SA2を注射したΔEx50マウスと比較して、AAV9-Triple-sgRNA-51-SA2を注射したΔEx50マウス由来の筋肉凍結切片のジストロフィン免疫染色により、平均95％の正常線維の回復を伴う、有意により多い数のジストロフィン陽性線維が明らかになった（図15B）。
AAV9-Cas9およびAAV9-sgRNA-51-SA2の全身送達後の、筋肉の構造および機能の救出
AAV9-Cas9およびAAV9-sgRNA-51-SA2のP4 ΔEx50マウスへの全身送達は、注射の4および8週間後に遺伝子編集ΔEx50マウスにおいて、心臓、三頭筋、前脛骨（TA）筋、および横隔膜における広範なジストロフィン発現を生じた（図16Aおよび図17A）。ウェスタンブロット解析により、骨格筋および心筋におけるジストロフィン発現の回復が確認された（図16Bおよび図17B）。握力試験もまた、ΔEx50対照マウスと比較して、腹腔内AAV9注射の4週間後に、ΔEx50マウスの筋力の有意な増加を示した（野生型対照92.6±1.63；ΔEx50対照50.5±1.85；ΔEx50-AAV9-sgRNA-51 79.7±2.63）（図18A）。一貫して、AAV9-sgRNA-51-SA2遺伝子編集ΔEx50マウスはまた、ΔEx50対照マウスと比較して血清CK濃度の有意な低減も示した（図18B）。
デュシェンヌ型筋ジストロフィーのイヌモデルにおけるジストロフィン発現の修正
この新たなアプローチの効率および治療可能性をさらに評価するために、本発明者らは、DMDのイヌモデルである、エクソン50の欠失を結果としてもたらすエクソン50の5'ドナースプライス部位におけるミスセンス変異を有するΔE50-MDイヌ（Walmsley et al., 2010）において、疾患を引き起こす変異の修正を調査した。ΔE50-MDイヌは、ヒトにおけるもっとも一般的なDMD変異を恒久的に修正するアプローチとしての遺伝子編集の調査にとって、理想的なイヌモデルである。
本発明者らは、スプライスアクセプター領域の同じゲノム遺伝子座を標的とするsgRNA（sgRNA-ex51-SA2）を用いた。sgRNA-ex51-SA2配列は高度に保存されている。マウスsgRNA-ex51-SA2およびイヌsgRNA-ex51-SA2（sgRNA-D-ex51-SA2）の標的配列は、1個の単一ヌクレオチドのみが異なっている（表4）。本発明者らは、sgRNA-D-ex51-SA2をトリプルコピー（AAV-D-Tri-SA2）において送達した。AAVの1か月齢イヌへの筋肉内（IM）注射後に、筋組織を解析した。注目すべきことに、AAV-Tri-SA2を注射したΔEx50マウス由来の筋肉凍結切片のジストロフィン免疫染色により、有意により多い数のジストロフィン陽性線維が明らかになった（図19）。ウェスタンブロット解析により、骨格筋におけるジストロフィン発現の回復が確認された（図20）。筋肉のヘマトキシリン・エオシン（H&E）染色により、壊死筋線維などの筋ジストロフィーの組織病理学的特徴が、AAV送達の6週間後に前脛骨筋において減少したことが示された（図21）。別個のsgRNA設計を用いた本方法は、DMD修正の効率において大きな進歩を表し、最も一般的なジストロフィン変異を有する患者に対して直接適用性を有する。
本明細書において開示および主張された組成物および/または方法の全ては、本開示に照らして、過度の実験なしに作製および実施することができる。本開示の組成物および方法は、好ましい態様に関して記載されているが、本明細書に記載の組成物および/または方法ならびにその方法の工程または工程の順序に対して、本開示の概念、精神、および範囲から逸脱することなしに変更を適用してよいことは、当業者に明らかなことであろう。より具体的には、化学的にも生理学的にも関連しているある特定の作用物質を本明細書に記載の作用物質の代わりに使用しても、同じまたは類似の結果が達成されることが明らかであろう。当業者に明らかなそのような類似の代用物および修飾は全て、添付の特許請求の範囲によって定義される本開示の精神、範囲、および概念内にあるものとみなされる。
VII. 参照文献
以下の参照文献は、本明細書において記載されたものを補足する例示的な手順または他の詳細を提供するという限りにおいて、参照によって本明細書に具体的に組み入れられる。
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Claims (186)

  1. 第1のゲノム標的配列を標的とする第1のDMDガイドRNAをコードする配列、
    第2のゲノム標的配列を標的とする第2のDMDガイドRNAをコードする配列、
    第1のDMDガイドRNAをコードする配列の発現を駆動する第1のプロモーターをコードする配列、および
    第2のDMAガイドRNAをコードする配列の発現を駆動する第2のプロモーターをコードする配列
    を含む核酸であって、
    第1のゲノム標的配列および第2のゲノム標的配列が各々、ジストロフィンスプライスアクセプター部位を含む、
    前記核酸。
  2. 第1のプロモーターをコードする配列および第2のプロモーターをコードする配列が同一である、請求項1に記載の核酸。
  3. 第1のプロモーターをコードする配列および第2のプロモーターをコードする配列が同一ではない、請求項1に記載の核酸。
  4. 第1のゲノム標的配列および第2のゲノム標的配列が同一である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の核酸。
  5. 第1のゲノム標的配列および第2のゲノム標的配列が同一ではない、請求項1〜3のいずれか一項に記載の核酸。
  6. 第3のゲノム標的配列を標的とする第3のDMDガイドRNAをコードする配列と
    第3のDMDガイドRNAをコードする配列の発現を駆動する第3のプロモーターをコードする配列と
    をさらに含み、第3のゲノム標的配列がジストロフィンスプライスアクセプター部位を含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の核酸。
  7. 第1のプロモーターをコードする配列、第2のプロモーターをコードする配列、および第3のプロモーターをコードする配列のうちの少なくとも2つが同一である、請求項6に記載の核酸。
  8. 第1のプロモーターをコードする配列、第2のプロモーターをコードする配列、および第3のプロモーターをコードする配列のうちの少なくとも2つが同一ではない、請求項6に記載の核酸。
  9. 第1のゲノム標的配列、第2のゲノム標的配列、および第3のゲノム標的配列のうちの少なくとも2つが同一である、請求項6〜8のいずれか一項に記載の核酸。
  10. 第1のゲノム標的配列、第2のゲノム標的配列、および第3のゲノム標的配列のうちの少なくとも2つが同一ではない、請求項6〜8のいずれか一項に記載の核酸。
  11. 第4のゲノム標的配列を標的とする第4のDMDガイドRNAをコードする配列と
    DMDガイドRNAをコードする第4の配列の発現を駆動する第4のプロモーターをコードする配列と
    をさらに含み、第4のゲノム標的配列がジストロフィンスプライスアクセプター部位を含む、請求項6〜10のいずれか一項に記載の核酸。
  12. 第1のプロモーターをコードする配列、第2のプロモーターをコードする配列、第3のプロモーターをコードする配列、および第4のプロモーターをコードする配列のうちの少なくとも2つが同一である、請求項11に記載の核酸。
  13. 第1のプロモーターをコードする配列、第2のプロモーターをコードする配列、第3のプロモーターをコードする配列、および第4のプロモーターをコードする配列のうちの少なくとも2つが同一ではない、請求項11に記載の核酸。
  14. 第1のゲノム標的配列、第2のゲノム標的配列、第3のゲノム標的配列、および第4のゲノム標的配列のうちの少なくとも2つが同一である、請求項11〜13のいずれか一項に記載の核酸。
  15. 第1のゲノム標的配列、第2のゲノム標的配列、第3のゲノム標的配列、および第4のゲノム標的配列のうちの少なくとも2つが同一ではない、請求項11〜13のいずれか一項に記載の核酸。
  16. 第5のゲノム標的配列を標的とする第5のDMDガイドRNAをコードする配列と
    第5のDMDガイドRNAをコードする配列の発現を駆動する第5のプロモーターをコードする配列と
    をさらに含み、第5のゲノム標的配列がジストロフィンスプライスアクセプター部位を含む、請求項11〜15のいずれか一項に記載の核酸。
  17. 第1のプロモーターをコードする配列、第2のプロモーターをコードする配列、第3のプロモーターをコードする配列、第4のプロモーターをコードする配列、および第5のプロモーターをコードする配列のうちの少なくとも2つが同一である、請求項16に記載の核酸。
  18. 第1のプロモーターをコードする配列、第2のプロモーターをコードする配列、第3のプロモーターをコードする配列、第4のプロモーターをコードする配列、および第5のプロモーターをコードする配列のうちの少なくとも2つが同一ではない、請求項16に記載の核酸。
  19. 第1のゲノム標的配列、第2のゲノム標的配列、第3のゲノム標的配列、第4のゲノム標的配列、および第5のゲノム標的配列のうちの少なくとも2つが同一である、請求項16〜18のいずれか一項に記載の核酸。
  20. 第1のゲノム標的配列、第2のゲノム標的配列、第3のゲノム標的配列、第4のゲノム標的配列、および第5のゲノム標的配列のうちの少なくとも2つが同一ではない、請求項16〜18のいずれか一項に記載の核酸。
  21. ゲノム標的配列を標的とする追加のDMDガイドRNAをコードする少なくとも1つの配列と
    該追加のDMDガイドRNAをコードする配列の発現を駆動する少なくとも1つの追加のプロモーターと
    をさらに含み、該追加のゲノム標的配列がジストロフィンスプライスアクセプター部位を含む、請求項16〜20のいずれか一項に記載の核酸。
  22. ジストロフィンスプライスアクセプター部位がエクソン51の5'スプライスアクセプター部位である、請求項1〜21のいずれか一項に記載の核酸。
  23. 第1のプロモーターをコードする配列または第2のプロモーターをコードする配列が、構成的プロモーターをコードする配列を含む、請求項1〜23のいずれか一項に記載の核酸。
  24. 第1のプロモーターまたは第2のプロモーターが構成的プロモーターを含む、請求項1〜23のいずれか一項に記載の核酸。
  25. 第1のプロモーターをコードする配列、第2のプロモーターをコードする配列、第3のプロモーターをコードする配列、第4のプロモーターをコードする配列、および第5のプロモーターをコードする配列のうちの少なくとも1つが、構成的プロモーターをコードする配列を含む、請求項20に記載の核酸。
  26. 第1のプロモーター、第2のプロモーター、第3のプロモーター、第4のプロモーター、および第5のプロモーターのうちの少なくとも1つが、構成的プロモーターを含む、請求項20に記載の核酸。
  27. 第1のプロモーターをコードする配列または第2のプロモーターをコードする配列が、誘導性プロモーターをコードする配列を含む、請求項1〜23のいずれか一項に記載の核酸。
  28. 第1のプロモーター、第2のプロモーター、第3のプロモーター、第4のプロモーター、および第5のプロモーターのうちの少なくとも1つが、誘導性プロモーターを含む、請求項20に記載の核酸。
  29. 第1のプロモーターをコードする配列または第2のプロモーターをコードする配列が、細胞タイプ特異的プロモーターをコードする配列を含む、請求項1〜23のいずれか一項に記載の核酸。
  30. 第1のプロモーターをコードする配列、第2のプロモーターをコードする配列、第3のプロモーターをコードする配列、第4のプロモーターをコードする配列、および第5のプロモーターをコードする配列のうちの少なくとも1つが、細胞タイプ特異的プロモーターを含む、請求項20に記載の核酸。
  31. 細胞タイプ特異的プロモーターをコードする配列が、筋肉特異的プロモーターをコードする配列を含む、請求項29または30に記載の核酸。
  32. 第1のプロモーターをコードする配列または第2のプロモーターをコードする配列が、U6プロモーター、H1プロモーター、または7SKプロモーターをコードする配列を含む、請求項1〜22のいずれか一項に記載の核酸。
  33. 第1のプロモーターをコードする配列、第2のプロモーターをコードする配列、第3のプロモーターをコードする配列、第4のプロモーターをコードする配列、および第5のプロモーターをコードする配列のうちの少なくとも1つが、U6プロモーターをコードする配列、H1プロモーターをコードする配列、または7SKプロモーターをコードする配列を含む、請求項20に記載の核酸。
  34. 第1のプロモーターをコードする配列、第2のプロモーターをコードする配列、第3のプロモーターをコードする配列、第4のプロモーターをコードする配列、および第5のプロモーターをコードする配列のうちの少なくとも1つが、U6プロモーターをコードする配列を含む、請求項20に記載の核酸。
  35. 第1のプロモーターをコードする配列、第2のプロモーターをコードする配列、第3のプロモーターをコードする配列、第4のプロモーターをコードする配列、および第5のプロモーターをコードする配列のうちの少なくとも1つが、H1プロモーターをコードする配列を含む、請求項20に記載の核酸。
  36. 第1のプロモーターをコードする配列、第2のプロモーターをコードする配列、第3のプロモーターをコードする配列、第4のプロモーターをコードする配列、および第5のプロモーターをコードする配列のうちの少なくとも1つが、7SKプロモーターをコードする配列を含む、請求項20に記載の核酸。
  37. 第1のDMDガイドRNAをコードする配列、第2のDMDガイドRNAをコードする配列、および第3のDMDガイドRNAをコードする配列が同一であり、
    第1のプロモーターをコードする配列、第2のプロモーターをコードする配列、および第3のプロモーターをコードする配列が同一ではなく、かつ
    5'スプライスアクセプター部位がエクソン51の5'スプライスアクセプター部位を含む、
    請求項6に記載の核酸。
  38. 第1のプロモーターをコードする配列が、U6プロモーターをコードする配列を含み、第2のプロモーターをコードする配列が、H1プロモーターをコードする配列を含み、かつ第3のプロモーターをコードする配列が、7SKプロモーターをコードする配列を含む、請求項37に記載の核酸。
  39. DNA配列を含む、請求項1〜38のいずれか一項に記載の核酸。
  40. RNA配列を含む、請求項1〜38のいずれか一項に記載の核酸。
  41. 逆位末端反復（ITR）をコードする1つまたは複数の配列をさらに含む、請求項1〜40のいずれか一項に記載の核酸。
  42. 5'逆位末端反復（ITR）をコードする配列および3' ITRをコードする配列をさらに含む、請求項1〜40のいずれか一項に記載の核酸。
  43. 5'逆位末端反復（ITR）をコードする配列または3' ITRをコードする配列が、アデノ随伴ウイルス（AAV）から単離されたまたはそれに由来する配列を含む、請求項42に記載の核酸。
  44. 5'逆位末端反復（ITR）をコードする配列または3' ITRをコードする配列が、アデノ随伴ウイルス（AAV）の血清型2（AAV2）から単離されたまたはそれに由来する配列を含む、請求項43に記載の核酸。
  45. 5'逆位末端反復（ITR）をコードする配列および3' ITRをコードする配列が、AAV2から単離されたまたはそれに由来する配列を含む、請求項43に記載の核酸。
  46. 5'逆位末端反復（ITR）をコードする配列または3' ITRをコードする配列が、アデノ随伴ウイルス（AAV）の血清型4（AAV4）から単離されたまたはそれに由来する配列を含む、請求項43に記載の核酸。
  47. 5'逆位末端反復（ITR）をコードする配列および3' ITRをコードする配列が、AAV4から単離されたまたはそれに由来する配列を含む、請求項46に記載の核酸。
  48. 5'逆位末端反復（ITR）をコードする配列または3' ITRをコードする配列が、145ヌクレオチドを含むか、またはそれからなる、請求項43〜47のいずれか一項に記載の核酸。
  49. 5'逆位末端反復（ITR）をコードする配列または3' ITRをコードする配列が、115ヌクレオチドを含むか、またはそれからなる、請求項43〜47のいずれか一項に記載の核酸。
  50. 5'逆位末端反復（ITR）をコードする配列または3' ITRをコードする配列が、141ヌクレオチドを含むか、またはそれからなる、請求項43〜47のいずれか一項に記載の核酸。
  51. ポリアデノシン（ポリA）配列をさらに含む、請求項1〜50のいずれか一項に記載の核酸。
  52. ポリA配列がミニポリA配列である、請求項51に記載の核酸。
  53. 第1のDMDガイドRNAをコードする配列、第2のDMDガイドRNAをコードする配列、または第3のDMDガイドRNAをコードする配列が、SEQ ID NO. 60〜382、706〜708、および712〜719のいずれか1つの配列を含む、請求項6〜52のいずれか一項に記載の核酸。
  54. 第1のDMDガイドRNAをコードする配列、第2のDMDガイドRNAをコードする配列、または第3のDMDガイドRNAをコードする配列が、SEQ ID NO: 714の配列を含む、請求項6〜52のいずれか一項に記載の核酸。
  55. 第1のDMDガイドRNAをコードする配列、第2のDMDガイドRNAをコードする配列、および第3のDMDガイドRNAをコードする配列が、SEQ ID NO: 714の配列を含む、請求項6〜52のいずれか一項に記載の核酸。
  56. 請求項1〜55のいずれか一項に記載の核酸を含む、細胞。
  57. 請求項1〜55のいずれか一項に記載の核酸を含む、組成物。
  58. 請求項56に記載の組成物を含む、細胞。
  59. 請求項58に記載の細胞を含む、組成物。
  60. 請求項1〜55のいずれか一項に記載の核酸を含む、ベクター。
  61. 転位因子の逆位末端反復（ITR）をコードする配列をさらに含む、請求項60に記載のベクター。
  62. 転位因子がトランスポゾンである、請求項61に記載のベクター。
  63. トランスポゾンがTn7トランスポゾンである、請求項62に記載のベクター。
  64. T7トランスポゾンの5' ITRをコードする配列およびT7トランスポゾンの3' ITRをコードする配列をさらに含む、請求項63に記載のベクター。
  65. 非ウイルスベクターである、請求項60〜64のいずれか一項に記載のベクター。
  66. 非ウイルスベクターがプラスミドである、請求項65に記載のベクター。
  67. ウイルスベクターである、請求項60〜64のいずれか一項に記載のベクター。
  68. ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターである、請求項67に記載のベクター。
  69. AAVベクターが複製欠損型または条件付き複製欠損型である、請求項69に記載のベクター。
  70. AAVベクターが組換えAAVベクターである、請求項68または69に記載のベクター。
  71. AAVベクターが、AAVベクターの血清型1（AAV1）、血清型2（AAV2）、血清型3（AAV3）、血清型4（AAV4）、血清型5（AAV5）、血清型6（AAV6）、血清型7（AAV7）、血清型8（AAV8）、血清型9（AAV9）、血清型10（AAV10）、血清型11（AAV11）、またはそれらの任意の組み合わせから単離されたまたはそれに由来する配列を含む、請求項68〜70のいずれか一項に記載のベクター。
  72. AAVベクターが、AAVベクターの血清型9（AAV9）から単離されたまたはそれに由来する配列を含む、請求項68〜71のいずれか一項に記載のベクター。
  73. AAVベクターが、AAVベクターの血清型2（AAV2）から単離されたまたはそれに由来する配列を含む、請求項68〜72のいずれか一項に記載のベクター。
  74. AAVベクターが、AAV2から単離されたまたはそれに由来する配列と、AAV9から単離されたまたはそれに由来する配列とを含む、請求項68〜73のいずれか一項に記載のベクター。
  75. AAVベクターが、AAVベクターの血清型4（AAV4）から単離されたまたはそれに由来する配列を含む、請求項68〜72のいずれか一項に記載のベクター。
  76. AAVベクターが、AAV4から単離されたまたはそれに由来する配列と、AAV9から単離されたまたはそれに由来する配列とを含む、請求項68〜72または75のいずれか一項に記載のベクター。
  77. 哺乳動物細胞における発現のために最適化されている、請求項60〜76のいずれか一項に記載のベクター。
  78. ヒト細胞における発現のために最適化されている、請求項60〜77のいずれか一項に記載のベクター。
  79. SEQ ID NO. 914、SEQ ID NO. 915、SEQ ID NO. 916、またはSEQ ID NO. 917の核酸配列を含む、請求項60〜78のいずれか一項に記載のベクター。
  80. 請求項60〜79のいずれか一項に記載のベクターを含む、組成物。
  81. 薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項80に記載の組成物。
  82. 請求項80または81に記載の組成物を含む、細胞。
  83. ヒト細胞である、請求項82に記載の細胞。
  84. 筋細胞または衛星細胞である、請求項82または83に記載の細胞。
  85. 人工多能性幹（iPS）細胞である、請求項82または83に記載の細胞。
  86. 請求項82〜85のいずれか一項に記載の細胞を含む、組成物。
  87. プロモーターをコードする配列と、Cas9タンパク質またはそのヌクレアーゼドメインをコードする配列とを含む核酸であって、
    該プロモーターをコードする配列が、筋肉特異的プロモーターをコードする配列を含む、
    前記核酸。
  88. 筋肉特異的プロモーターをコードする配列が、CK8プロモーターをコードする配列を含む、請求項87に記載の核酸。
  89. 筋肉特異的プロモーターをコードする配列が、CK8eプロモーターをコードする配列を含む、請求項87または88に記載の核酸。
  90. Cas9タンパク質またはそのヌクレアーゼドメインをコードする配列が、化膿ブドウ球菌（S. pyogenes）Cas9タンパク質またはそのヌクレアーゼドメインをコードする配列から単離されているか、またはそれに由来する、請求項87〜89のいずれか一項に記載の核酸。
  91. Cas9タンパク質またはそのヌクレアーゼドメインが、黄色ブドウ球菌（S. aureus）Cas9タンパク質またはそのヌクレアーゼドメインをコードする配列から単離されているか、またはそれに由来する。
  92. Cas9タンパク質またはそのヌクレアーゼドメインをコードする配列が、哺乳動物における発現のためにコドン最適化されている、請求項87〜91のいずれか一項に記載の核酸。
  93. Cas9タンパク質またはそのヌクレアーゼドメインをコードする配列が、ヒトにおける発現のためにコドン最適化されている、請求項87〜91のいずれか一項に記載の核酸。
  94. ポリA配列をさらに含む、請求項87〜93のいずれか一項に記載の核酸。
  95. ポリA配列がミニポリA配列である、請求項94に記載の核酸。
  96. 逆位末端反復（ITR）をコードする1つまたは複数の配列をさらに含む、請求項1〜94のいずれか一項に記載の核酸。
  97. 5'逆位末端反復（ITR）をコードする配列および3' ITRをコードする配列をさらに含む、請求項1〜94のいずれか一項に記載の核酸。
  98. 5'逆位末端反復（ITR）をコードする配列または3' ITRをコードする配列が、アデノ随伴ウイルス（AAV）から単離されたまたはそれに由来する配列を含む、請求項97に記載の核酸。
  99. 5'逆位末端反復（ITR）をコードする配列または3' ITRをコードする配列が、アデノ随伴ウイルス（AAV）の血清型2（AAV2）から単離されたまたはそれに由来する配列を含む、請求項98に記載の核酸。
  100. 5'逆位末端反復（ITR）をコードする配列および3' ITRをコードする配列が、AAV2から単離されたまたはそれに由来する配列を含む、請求項99に記載の核酸。
  101. 5'逆位末端反復（ITR）をコードする配列または3' ITRをコードする配列が、アデノ随伴ウイルス（AAV）の血清型4（AAV4）から単離されたまたはそれに由来する配列を含む、請求項98に記載の核酸。
  102. 5'逆位末端反復（ITR）をコードする配列および3' ITRをコードする配列が、AAV4から単離されたまたはそれに由来する配列を含む、請求項46に記載の核酸。
  103. 5'逆位末端反復（ITR）をコードする配列または3' ITRをコードする配列が、145ヌクレオチドを含むか、またはそれからなる、請求項96〜102のいずれか一項に記載の核酸。
  104. 5'逆位末端反復（ITR）をコードする配列または3' ITRをコードする配列が、115ヌクレオチドを含むか、またはそれからなる、請求項96〜102のいずれか一項に記載の核酸。
  105. 5'逆位末端反復（ITR）をコードする配列または3' ITRをコードする配列が、141ヌクレオチドを含むか、またはそれからなる、請求項96〜102のいずれか一項に記載の核酸。
  106. 核局在化シグナルをさらに含む、請求項1〜55または87〜105のいずれか一項に記載の核酸。
  107. 哺乳動物細胞における発現のために最適化されている、請求項87〜106のいずれか一項に記載の核酸。
  108. ヒト細胞における発現のために最適化されている、請求項87〜107のいずれか一項に記載の核酸。
  109. 請求項87〜108のいずれか一項に記載の核酸を含む、組成物。
  110. 請求項87〜108のいずれか一項に記載の核酸を含む、細胞。
  111. 請求項109に記載の組成物を含む、細胞。
  112. 請求項110または111に記載の細胞を含む、組成物。
  113. 請求項87〜108のいずれか一項に記載の核酸を含む、ベクター。
  114. 転位因子の逆位末端反復（ITR）をコードする配列をさらに含む、請求項113に記載のベクター。
  115. 転位因子がトランスポゾンである、請求項114に記載のベクター。
  116. トランスポゾンがTn7トランスポゾンである、請求項115に記載のベクター。
  117. T7トランスポゾンの5' ITRをコードする配列およびT7トランスポゾンの3' ITRをコードする配列をさらに含む、請求項116に記載のベクター。
  118. 非ウイルスベクターである、請求項113〜117のいずれか一項に記載のベクター。
  119. 非ウイルスベクターがプラスミドである、請求項118に記載のベクター。
  120. ウイルスベクターである、請求項113〜117のいずれか一項に記載のベクター。
  121. ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターである、請求項120に記載のベクター。
  122. AAVベクターが複製欠損型または条件付き複製欠損型である、請求項121に記載のベクター。
  123. AAVベクターが組換えAAVベクターである、請求項121または122に記載のベクター。
  124. AAVベクターが、AAVベクターの血清型1（AAV1）、血清型2（AAV2）、血清型3（AAV3）、血清型4（AAV4）、血清型5（AAV5）、血清型6（AAV6）、血清型7（AAV7）、血清型8（AAV8）、血清型9（AAV9）、血清型10（AAV10）、血清型11（AAV11）、またはそれらの任意の組み合わせから単離されたまたはそれに由来する配列を含む、請求項121〜123のいずれか一項に記載のベクター。
  125. AAVベクターが、AAVベクターの血清型9（AAV9）から単離されたまたはそれに由来する配列を含む、請求項121〜124のいずれか一項に記載のベクター。
  126. AAVベクターが、AAVベクターの血清型2（AAV2）から単離されたまたはそれに由来する配列を含む、請求項121〜125のいずれか一項に記載のベクター。
  127. AAVベクターが、AAV2から単離されたまたはそれに由来する配列と、AAV9から単離されたまたはそれに由来する配列とを含む、請求項121〜126のいずれか一項に記載のベクター。
  128. AAVベクターが、AAVベクターの血清型4（AAV4）から単離されたまたはそれに由来する配列を含む、請求項121〜125のいずれか一項に記載のベクター。
  129. AAVベクターが、AAV4から単離されたまたはそれに由来する配列と、AAV9から単離されたまたはそれに由来する配列とを含む、請求項121〜125または128のいずれか一項に記載のベクター。
  130. 哺乳動物細胞における発現のために最適化されている、請求項121〜129のいずれか一項に記載のベクター。
  131. ヒト細胞における発現のために最適化されている、請求項121〜130のいずれか一項に記載のベクター。
  132. SEQ ID NO. 899、SEQ ID NO. 900、SEQ ID NO. 901、またはSEQ ID NO. 902の核酸配列を含む、請求項113〜132のいずれか一項に記載のベクター。
  133. 請求項113〜132のいずれか一項に記載のベクターを含む、組成物。
  134. 薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項133に記載の組成物。
  135. 請求項133または134に記載の組成物を含む、細胞。
  136. 請求項113〜132のいずれか一項に記載のベクターを含む、細胞。
  137. ヒト細胞である、請求項135または136に記載の細胞。
  138. 筋細胞または衛星細胞である、請求項135〜137のいずれか一項に記載の細胞。
  139. iPSまたはiCM細胞である、請求項135〜137のいずれか一項に記載の細胞。
  140. 請求項135〜139のいずれか一項に記載の細胞を含む、組成物。
  141. 請求項1〜55のいずれか一項に記載の核酸配列を含む第1の核酸配列と
    請求項87〜108のいずれか一項に記載の核酸配列を含む第2の核酸配列と
    を含む、組成物。
  142. 請求項1〜55のいずれか一項に記載の核酸配列を含む第1のベクターと
    請求項87〜108のいずれか一項に記載の核酸配列を含む第2のベクターと
    を含む、組成物。
  143. 請求項60〜79のいずれか一項に記載のベクターと
    請求項113〜132のいずれか一項に記載のベクターと
    を含む、組成物。
  144. 薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項141〜143のいずれか一項に記載の組成物。
  145. ジストロフィン欠損を修正するための方法であって、
    細胞と請求項141〜144のいずれか一項に記載の組成物とを、第1のDMDガイドRNA、第2のDMDガイドRNA、およびCas9タンパク質またはそのヌクレアーゼドメインの発現に適している条件下で接触させる工程を含み、
    第1のDMDガイドRNAまたは第2のDMDガイドRNAのうちの少なくとも1つが、Cas9タンパク質またはそのヌクレアーゼドメインと複合体を形成して、少なくとも1つのDMDガイドRNA-Cas9複合体を形成し、該少なくとも1つのDMDガイドRNA-Cas9複合体が、ジストロフィンスプライス部位を破壊し、DMDエクソンの選択的スキッピングを誘導する、
    前記方法。
  146. ジストロフィン欠損を修正するための方法であって、
    細胞と請求項141〜144のいずれか一項に記載の組成物とを、第1のDMDガイドRNA、第2のDMDガイドRNA、およびCas9タンパク質またはそのヌクレアーゼドメインの発現に適している条件下で接触させる工程を含み、
    第1のDMDガイドRNAまたは第2のDMDガイドRNAのうちの少なくとも1つが、Cas9タンパク質またはそのヌクレアーゼドメインと複合体を形成して、少なくとも1つのDMDガイドRNA-Cas9複合体を形成し、該少なくとも1つのDMDガイドRNA-Cas9複合体が、ジストロフィンリーディングフレームのリフレーミングを誘導する、
    前記方法。
  147. ジストロフィンリーディングフレームのリフレーミングが挿入を誘導する、請求項146に記載の方法。
  148. 前記挿入が、単一のアデノシンヌクレオチドを含むか、またはそれからなる、請求項147に記載の方法。
  149. DMDエクソンの選択的スキッピングを誘導するための方法であって、
    細胞と請求項141〜144のいずれか一項に記載の組成物とを、第1のDMDガイドRNA、第2のDMDガイドRNA、およびCas9タンパク質またはそのヌクレアーゼドメインの発現に適している条件下で接触させる工程を含み、
    第1のDMDガイドRNAまたは第2のDMDガイドRNAのうちの少なくとも1つが、Cas9タンパク質またはそのヌクレアーゼドメインと複合体を形成して、少なくとも1つのDMDガイドRNA-Cas9複合体を形成し、該少なくとも1つのDMDガイドRNA-Cas9複合体が、ジストロフィンスプライス部位を破壊し、DMDエクソンの選択的スキッピングを誘導する、
    前記方法。
  150. ジストロフィンリーディングフレームにおいてリフレーミング事象を誘導するための方法であって、
    細胞と請求項141〜144のいずれか一項に記載の組成物とを、第1のDMDガイドRNA、第2のDMDガイドRNA、およびCas9タンパク質またはそのヌクレアーゼドメインの発現に適している条件下で接触させる工程を含み、
    第1のDMDガイドRNAまたは第2のDMDガイドRNAのうちの少なくとも1つが、Cas9タンパク質またはそのヌクレアーゼドメインと複合体を形成して、少なくとも1つのDMDガイドRNA-Cas9複合体を形成し、該少なくとも1つのDMDガイドRNA-Cas9複合体が、ジストロフィンスプライス部位を破壊し、ジストロフィンリーディングフレームのリフレーミングを誘導する、
    前記方法。
  151. 前記少なくとも1つのDMDガイドRNA-Cas9複合体が、ジストロフィンスプライス部位を破壊し、ヒトDMD遺伝子のエクソン51の選択的スキッピングを誘導する、請求項145〜150のいずれか一項に記載の方法。
  152. 請求項145〜151のいずれか一項に記載の方法によって作製される、細胞。
  153. 請求項141〜144のいずれか一項に記載の組成物の治療的有効量を対象に投与する工程を含む、その必要がある対象において筋ジストロフィーを処置する方法。
  154. 前記組成物が局所投与される、請求項153に記載の方法。
  155. 前記組成物が筋組織に直接投与される、請求項153または154に記載の方法。
  156. 前記組成物が筋肉内注入または注射によって投与される、請求項153〜155のいずれか一項に記載の方法。
  157. 前記筋組織が、前脛骨筋組織、四頭筋組織、ヒラメ筋組織、横隔膜組織、または心臓組織を含む、請求項155または156に記載の方法。
  158. 前記組成物が心臓内注射によって投与される、請求項153〜157のいずれか一項に記載の方法。
  159. 前記組成物が全身投与される、請求項153に記載の方法。
  160. 前記組成物が静脈内注入または注射によって投与される、請求項159に記載の方法。
  161. 組成物の投与後に、対象が、正常なジストロフィン陽性筋線維、および中心核を含有するモザイク状ジストロフィン陽性筋線維、またはそれらの組み合わせを呈する、請求項153〜160のいずれか一項に記載の方法。
  162. 組成物の投与前の正常なジストロフィン陽性筋線維の欠如または存在量レベルと比較した時に、組成物の投与後に、対象が、正常なジストロフィン陽性筋線維の出現または存在量レベルの増加を呈する、請求項153〜161のいずれか一項に記載の方法。
  163. 組成物の投与前の中心核を含有するモザイク状ジストロフィン陽性筋線維の欠如または存在量レベルと比較した時に、組成物の投与後に、対象が、中心核を含有するモザイク状ジストロフィン陽性筋線維の出現または存在量レベルの増加を呈する、請求項153〜162のいずれか一項に記載の方法。
  164. 組成物の投与前の血清CKレベルと比較した時に、組成物の投与後に、対象が、減少した血清CKレベルを呈する、請求項153〜163のいずれか一項に記載の方法。
  165. 組成物の投与前の握力と比較した時に、組成物の投与後に、対象が、改善された握力を呈する、請求項153〜164のいずれか一項に記載の方法。
  166. 前記対象が、新生児、乳児、小児、若年成人、または成人である、請求項153〜165のいずれか一項に記載の方法。
  167. 前記対象が筋ジストロフィーを有する、請求項153〜166のいずれか一項に記載の方法。
  168. 前記対象が、筋ジストロフィーについての遺伝的保因者である、請求項153〜167のいずれか一項に記載の方法。
  169. 前記対象が男性である、請求項153〜168のいずれか一項に記載の方法。
  170. 前記対象が女性である、請求項153〜168のいずれか一項に記載の方法。
  171. 前記対象が無症候性であるように見え、遺伝子診断により、DMD遺伝子産物の機能を損なうDMD遺伝子の一方または両方のコピーにおける変異が明らかになる、請求項153〜170のいずれか一項に記載の方法。
  172. 前記対象が筋ジストロフィーの初期の徴候または症状を示す、請求項153〜171のいずれか一項に記載の方法。
  173. 筋ジストロフィーの初期の徴候または症状が、筋肉量の損失または近位筋衰弱を含む、請求項172に記載の方法。
  174. 筋肉量の損失または近位筋衰弱が、一方または両方の脚および/または骨盤において起こり、その後1つまたは複数の上体筋肉において起こる、請求項173に記載の方法。
  175. 筋ジストロフィーの初期の徴候または症状が、仮性肥大、低持久力、起立困難、歩行困難、階段上行困難、またはそれらの組み合わせをさらに含む、請求項174に記載の方法。
  176. 前記対象が筋ジストロフィーの進行性の徴候または症状を示す、請求項153〜175のいずれか一項に記載の方法。
  177. 筋ジストロフィーの進行性の徴候または症状が、筋組織消耗、筋組織が脂肪で置き換えられること、または筋組織が線維組織で置き換えられることを含む、請求項176に記載の方法。
  178. 前記対象が筋ジストロフィーの後期の徴候または症状を示す、請求項153〜177のいずれか一項に記載の方法。
  179. 筋ジストロフィーの後期の徴候または症状が、異常な骨発生、脊柱の彎曲、運動の消失、および麻痺を含む、請求項178に記載の方法。
  180. 前記対象が筋ジストロフィーの神経学的な徴候または症状を示す、請求項153〜179のいずれか一項に記載の方法。
  181. 筋ジストロフィーの神経学的な徴候または症状が、知的障害および麻痺を含む、請求項180に記載の方法。
  182. 筋ジストロフィーの進行性の、後期の、または神経学的な徴候または症状の1つまたは複数を対象が示す前に、組成物の投与が行われる、請求項153〜181のいずれか一項に記載の方法。
  183. 前記対象が10歳未満である、請求項153〜182のいずれか一項に記載の方法。
  184. 前記対象が5歳未満である、請求項183に記載の方法。
  185. 前記対象が2歳未満である、請求項184に記載の方法。
  186. その必要がある対象において筋ジストロフィーを処置するための、請求項141〜144のいずれか一項に記載の組成物の治療的有効量の使用。
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