BR112019013962A2 - Estratégia otimizada para modificações que pulam éxons utilizando crispr/cas9 com sequências guias triplas - Google Patents

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Abstract

a edição genômica mediada por crispr/cas9 possui potencial clínico pa-ra o tratamento de doenças genéticas, tal como a distrofia muscular de duchenne (dmd), que é causada por mutações no gene da distrofina. aqui, a utilização de três promotores para controlar a expressão do mesmo rna guia de dmd, uma forma mais robusta e segura de edição genômica, foi conseguida em um modelo de camundongo humanizado para dmd com uma deleção no éxon 50 e em um cachorro ¿ex50-md.

Description

“ESTRATÉGIA OTIMIZADA PARA MODIFICAÇÕES QUE PULAM ÉXONS UTILIZANDO CRISPR/CAS9 COM SEQUÊNCIAS GUIAS TRIPLAS”
REIVINDICAÇÃO PRIORITÁRIA [001] O presente pedido de patente reivindica o benefício de prioridade ao Pedido de Patente Provisório U.S. No. 62/596.298, depositado em 8 de dezembro de 2017, ao Pedido de Patente Provisório U.S. No. 62/544.499, depositado em 11 de agosto de 2017 e ao Pedido de Patente Provisório U.S. No. 62/442.606, depositado em 5 de janeiro de 2017, cujo conteúdo inteiro é incorporado aqui como referência em suas totalidades.
CLÁUSULA DE APOIO FINANCEIRO FEDERAL [002] Esta invenção foi realizada com o apoio do Governo sob a concessão no. U54 HD 087351 outorgada pelos National Institutes of Health. O Governo tem certos direitos na invenção.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS [003] O presente pedido de patente contém uma Listagem de Sequências que foi submetida eletronicamente no formato ASCII e é incorporada aqui como referência em sua totalidade. A dita cópia de ASCII, criada em 5 de janeiro de 2018, é nomeada UTFD_P3178WO.txt e possui um tamanho de 1.316.974.
CAMPO DA DIVULGAÇÃO [004] A presente divulgação refere-se aos campos da biologia molecular, da medicina e da genética. Mais particularmente, a divulgação refere-se às composições e aos usos das mesmas para edição genômica para corrigir mutações in vivo utilizando uma abordagem de pulo do éxon.
ANTECEDENTE
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2/259 [005] Distrofias musculares (MD) são um grupo de mais de 30 doenças genéticas caracterizadas por fraqueza e degeneração progressivas dos músculos esqueléticos que controlam o movimento. A distrofia muscular de Duchenne (DMD) é a forma mais grave de MD que afeta aproximadamente 1 em 5000 meninos e é caracterizada por fraqueza muscular progressiva e morte prematura. Cardiomiopatia e insuficiência cardíaca são características incuráveis e letais comuns da DMD. A doença é causada por mutações no gene que codifica a distrofina (DMD), uma proteína intracelular grande que liga o complexo da distroglicana na superfície celular com o citoesqueleto subjacente, mantendo assim a integridade da membrana da célula muscular durante a contração. As mutações no gene da distrofina resultam na perda de expressão da distrofina, causando fragilidade na membrana muscular e atrofia muscular progressiva.
SUMÁRIO [006] Apesar dos esforços intensos de se descobrir curas através de uma variedade de abordagens, incluindo transferência de mioblastos, fornecimento de vírus e pulo de éxon mediado por oligonucleotídeo, continua a não haver cura para qualquer tipo de distrofia muscular. Os presentes inventores utilizaram recentemente edição genômica mediada por repetição palindrômica curta regularmente interespaçada em cluster/Cas9 (CRISPR/Cas9) para corrigir a mutação do gene da distrofina (DMD) em camundongos mdx após o nascimento, um modelo para DMD. O fornecimento mediado por AAV in vivo de componentes de edição gênica removeu de forma bem-sucedida a sequência genômica mutante através do pulo de éxons nas células musculares cardíacas e esqueléticas de camundongos mdx. Utilizando modos diferentes de fornecimento por AAV9, os inventores restauraram a expressão da proteína distrofina nos músculos cardíaco e esquelético de camundongos mdx. O modelo de camundongo mdx e do éxon de correção 23 utilizando o fornecimento por AAV do maquinário de mioedição foi bem-sucedido em exibir prova de conceito da abordagem de pulo de éxons utilizando inúmeros cortes na região genômica que abrange a mutação in vivo. Entretanto, abordagens mais eficientes e seguras para
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3/259 edição genômica e DMD forneceríam um meio mais poderoso de intervir nesta doença.
[007] Em algumas modalidades, um ácido nucleico compreende uma sequência que codifica um primeiro RNA guia de DMD que se direciona a uma primeira sequência genômica alvo, uma sequência que codifica um segundo RNA guia de DMD que se direciona a uma segunda sequência genômica alvo, uma sequência que codifica um primeiro promotor em que o primeiro promotor controla a expressão da sequência que codifica o primeiro RNA guia de DMD e uma sequência que codifica um segundo promotor em que o primeiro promotor controla a expressão da sequência que codifica o segundo RNA guia de DMD, em que cada uma da primeira sequência genômica alvo e da segunda sequência genômica alvo compreende um sítio aceitador de splice da distrofina. Em algumas modalidades, a sequência que codifica o primeiro promotor e a sequência que codifica o segundo promotor são idênticas. Em algumas modalidades, a sequência que codifica o primeiro promotor e a sequência que codifica o segundo promotor não são idênticas. Em algumas modalidades, a sequência que codifica o primeiro promotor e a sequência que codifica o segundo promotor compartilham pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 95% de identidade de sequência. Em algumas modalidades, a primeira sequência genômica alvo e a segunda sequência genômica alvo são idênticas. Em algumas modalidades, a primeira sequência genômica alvo e a segunda sequência genômica alvo não são idênticas. Em algumas modalidades, a primeira sequência genômica alvo e a segunda sequência genômica alvo compartilham pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 95% de identidade de sequência. Em algumas modalidades, a primeira sequência genômica alvo e a segunda sequência genômica alvo são complementares. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende ainda uma sequência que codifica um terceiro RNA guia de DMD que se direciona a uma terceira sequência genômica alvo e uma sequência que codifica um terceiro promotor em que o terceiro promotor controla a expressão da sequência que codifica o terceiro RNA guia de DMD e em que a terceira sequência genômica alvo
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4/259 compreende um sítio aceitador de splice da distrofina. Em algumas modalidades, pelo menos duas das sequências que codificam o primeiro promotor, a sequência que codifica o segundo promotor e a sequência que codifica o terceiro promotor são idênticas. Em algumas modalidades, pelo menos duas da sequência que codifica o primeiro promotor, da sequência que codifica o segundo promotor e da sequência que codifica o terceiro promotor não são idênticas. Em algumas modalidades, pelo menos duas das sequências que codificam o primeiro promotor, a sequência que codifica o segundo promotor e a sequência que codifica o terceiro promotor compartilham pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 95% de identidade de sequência. Em algumas modalidades, pelo menos duas da primeira sequência genômica alvo, da segunda sequência genômica alvo e da terceira sequência genômica alvo são idênticas. Em algumas modalidades, pelo menos duas da primeira sequência genômica alvo, da segunda sequência genômica alvo e da terceira sequência genômica alvo não são idênticas. Em algumas modalidades, pelo menos duas da primeira sequência genômica alvo, da segunda sequência genômica alvo e da terceira sequência genômica alvo compartilham pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 95% de identidade de sequência. Em algumas modalidades, pelo menos duas da primeira sequência genômica alvo, da segunda sequência genômica alvo e da terceira sequência genômica alvo são complementares. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende ainda uma sequência que codifica um quarto RNA guia de DMD que se direciona a uma quarta sequência genômica alvo e uma sequência que codifica um quarto promotor, em que o quarto promotor controla a expressão da quarta sequência que codifica um RNA guia de DMD, em que a quarta sequência genômica alvo compreende um sítio aceitador de splice da distrofina. Em algumas modalidades, pelo menos duas da sequência que codifica o primeiro promotor, da sequência que codifica o segundo promotor, da sequência que codifica o terceiro promotor e da sequência que codifica o quarto promotor são idênticas. Em algumas modalidades, pelo menos duas da sequência que codifica o primeiro promotor, da sequência que codifica o segundo promotor, da sequência que codifica o terceiro
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5/259 promotor e da sequência que codifica o quarto promotor não são idênticas. Em algumas modalidades, pelo menos duas da sequência que codifica o primeiro promotor, da sequência que codifica o segundo promotor, da sequência que codifica o terceiro promotor e da sequência que codifica o quarto promotor compartilham pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 95% de identidade de sequência. Em algumas modalidades, pelo menos duas da primeira sequência genômica alvo, da segunda sequência genômica alvo, da terceira sequência genômica alvo e da quarta sequência genômica alvo são idênticas. Em algumas modalidades, pelo menos duas da primeira sequência genômica alvo, da segunda sequência genômica alvo, da terceira sequência genômica alvo e da quarta sequência genômica alvo não são idênticas. Em algumas modalidades, pelo menos duas da primeira sequência genômica alvo, da segunda sequência genômica alvo, da terceira sequência genômica alvo e da quarta sequência genômica alvo compartilham pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 95% de identidade de sequência. Em algumas modalidades, pelo menos duas da primeira sequência genômica alvo, da segunda sequência genômica alvo, da terceira sequência genômica alvo e da quarta sequência genômica alvo são complementares. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende ainda uma sequência que codifica um quinto RNA guia de DMD que se direciona a uma quinta sequência genômica alvo e uma sequência que codifica um quinto promotor, em que o quinto promotor controla a expressão da sequência que codifica o quinto RNA guia de DMD, em que a quinta sequência genômica alvo compreende um sítio aceitador de splice da distrofina. Em algumas modalidades, pelo menos duas da sequência que codifica o primeiro promotor, da sequência que codifica o segundo promotor, da sequência que codifica o terceiro promotor, da sequência que codifica o quarto promotor e da sequência que codifica o quinto promotor são idênticas. Em algumas modalidades, pelo menos duas da sequência que codifica o primeiro promotor, da sequência que codifica o segundo promotor, da sequência que codifica o terceiro promotor, da sequência que codifica o quarto promotor e da sequência que codifica o quinto promotor não são idênticas. Em algumas modalidades, pelo menos duas da
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6/259 sequência que codifica o primeiro promotor, da sequência que codifica o segundo promotor, da sequência que codifica o terceiro promotor, da sequência que codifica o quarto promotor e da sequência que codifica o quinto promotor compartilham pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 95% de identidade de sequência. Em algumas modalidades, pelo menos duas da primeira sequência genômica alvo, da segunda sequência genômica alvo, da terceira sequência genômica alvo, da quarta sequência genômica alvo e da quinta sequência genômica alvo são idênticas. Em algumas modalidades, pelo menos duas da primeira sequência genômica alvo, da segunda sequência genômica alvo, da terceira sequência genômica alvo, da quarta sequência genômica alvo e da quinta sequência genômica alvo não são idênticas. Em algumas modalidades, pelo menos duas da primeira sequência genômica alvo, da segunda sequência genômica alvo, da terceira sequência genômica alvo, da quarta sequência genômica alvo e da quinta sequência genômica alvo compartilham pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 95% de identidade de sequência. Em algumas modalidades, pelo menos duas da primeira sequência genômica alvo, da segunda sequência genômica alvo, da terceira sequência genômica alvo, da quarta sequência genômica alvo e da quinta sequência genômica alvo são complementares. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende ainda pelo menos uma sequência que codifica um RNA guia de DMD adicional que se direciona a uma sequência genômica alvo e pelo menos um promotor adicional, em que o promotor adicional controla a expressão da sequência que codifica o RNA guia de DMD adicional, em que a sequência genômica alvo adicional compreende um sítio aceitador de splice da distrofina. Em algumas modalidades, o sítio aceitador de splice da distrofina compreende o sítio aceitador de splice a 5’ do éxon 51. Em algumas modalidades, a sequência que codifica o primeiro promotor ou a sequência que codifica o segundo promotor compreende uma sequência que codifica um promotor constitutivo. Em algumas modalidades, o primeiro promotor ou o segundo promotor compreende um promotor constitutivo. Em algumas modalidades, pelo menos uma da sequência que codifica o primeiro promotor, da sequência que codifica o segundo promotor, da
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7/259 sequência que codifica o terceiro promotor, da sequência que codifica o quarto promotor e da sequência que codifica o quinto promotor compreende uma sequência que codifica um promotor constitutivo. Em algumas modalidades, pelo menos um do primeiro promotor, do segundo promotor, do terceiro promotor, do quarto promotor e do quinto promotor compreende um promotor constitutivo. Em algumas modalidades, a sequência que codifica o primeiro promotor ou a sequência que codifica o segundo promotor compreende uma sequência que codifica um promotor induzível. Em algumas modalidades, pelo menos um do primeiro promotor, do segundo promotor, do terceiro promotor, do quarto promotor e do quinto promotor compreende um promotor induzível. Em algumas modalidades, a sequência que codifica o primeiro promotor ou a sequência que codifica o segundo promotor compreende uma sequência que codifica um promotor específico para o tipo de célula. Em algumas modalidades, pelo menos uma da sequência que codifica o primeiro promotor, da sequência que codifica o segundo promotor, da sequência que codifica o terceiro promotor, da sequência que codifica o quarto promotor e da sequência que codifica o quinto promotor compreende um promotor específico para o tipo de célula. Em algumas modalidades, o promotor específico para o tipo de célula compreende um promotor específico para o músculo. Em algumas modalidades, a sequência que codifica o primeiro promotor ou a sequência que codifica o segundo promotor compreende uma sequência que codifica um promotor U6, um promotor H1 ou um promotor 7SK. Em algumas modalidades, pelo menos uma da sequência que codifica o primeiro promotor, da sequência que codifica o segundo promotor, da sequência que codifica o terceiro promotor, da sequência que codifica o quarto promotor e da sequência que codifica o quinto promotor compreende um promotor U6, um promotor H1 ou um promotor 7SK. Em algumas modalidades, pelo menos uma da sequência que codifica o primeiro promotor, da sequência que codifica o segundo promotor, da sequência que codifica o terceiro promotor, da sequência que codifica o quarto promotor e da sequência que codifica o quinto promotor compreende um promotor U6. Em algumas modalidades, pelo menos uma da sequência que codifica o primeiro
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8/259 promotor, da sequência que codifica o segundo promotor, da sequência que codifica o terceiro promotor, da sequência que codifica o quarto promotor e da sequência que codifica o quinto promotor compreende um promotor H1. Em algumas modalidades, pelo menos uma da sequência que codifica o primeiro promotor, da sequência que codifica o segundo promotor, da sequência que codifica o terceiro promotor, da sequência que codifica o quarto promotor e da sequência que codifica o quinto promotor compreende um promotor 7SK. Em algumas modalidades, a sequência que codifica o primeiro RNA guia de DMD, a sequência que codifica o segundo RNA guia de DMD e sequência que codifica o terceiro RNA guia de DMD são idênticas e o sítio aceitador de splice a 5’ compreende um sítio aceitador de splice a 5’ do éxon 51. Em algumas modalidades, a sequência que codifica o primeiro promotor compreende uma sequência que codifica um promotor U6, a sequência que codifica o segundo promotor compreende uma sequência que codifica um promotor H1 e a sequência que codifica o terceiro promotor compreende um promotor 7SK. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende uma sequência de DNA. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende uma sequência de RNA. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende ainda uma ou mais sequências que codificam uma repetição terminal invertida (ITR). Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende ainda uma sequência que codifica uma repetição terminal invertida (ITR) a 5’ e uma sequência que codifica uma ITR a 3’. Em algumas modalidades, a sequência que codifica a repetição terminal invertida (ITR) a 5’ ou a sequência que codifica uma ITR a 3’ compreende uma sequência isolada ou derivada de um vírus associado a adeno (AAV). Em algumas modalidades, a sequência que codifica a repetição terminal invertida (ITR) a 5’ ou a sequência que codifica uma ITR a 3’ compreende uma sequência isolada ou derivada de um vírus associado a adeno (AAV) do sorotipo 2 (AAV2). Em algumas modalidades, a sequência que codifica a repetição terminal invertida (ITR) a 5’ e a sequência que codifica uma ITR a 3’ compreende uma sequência isolada ou derivada de um AAV2. Em algumas modalidades, a sequência que codifica a repetição terminal invertida (ITR) a 5’ ou a
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9/259 sequência que codifica uma ITR a 3’ compreende uma sequência isolada ou derivada de um vírus associado a adeno (AAV) do sorotipo 4 (AAV4). Em algumas modalidades, a sequência que codifica a repetição terminal invertida (ITR) a 5’ e a sequência que codifica uma ITR a 3’ compreende uma sequência isolada ou derivada de um AAV4. Em algumas modalidades, a sequência que codifica a repetição terminal invertida (ITR) a 5’ ou a sequência que codifica uma ITR a 3’ compreende ou consiste de 145 nucleotídeos. Em algumas modalidades, a sequência que codifica a repetição terminal invertida (ITR) a 5’ ou a sequência que codifica uma ITR a 3’ compreende ou consiste de 115 nucleotídeos. Em algumas modalidades, a sequência que codifica a repetição terminal invertida (ITR) a 5’ ou a sequência que codifica uma ITR a 3’ compreende ou consiste de 141 nucleotídeos. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende ainda uma sequência de poliadenosina (poliA). Em algumas modalidades, a sequência de poli A é uma sequência de mini poli A. Em algumas modalidades, a sequência que codifica o primeiro RNA guia de DMD ou a sequência que codifica o segundo RNA guia de DMD compreende a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs. 60-382, 706-708 e 712-789. Em algumas modalidades, a sequência que codifica o primeiro RNA guia de DMD ou a sequência que codifica o segundo RNA guia de DMD compreende a sequências da SEQ ID NO. 714.
[008] Também é fornecido um vetor que compreende um ácido nucleico que compreende uma sequência que codifica um primeiro RNA guia de DMD que se direciona a uma primeira sequência genômica alvo, uma sequência que codifica um segundo RNA guia de DMD que se direciona a uma segunda sequência genômica alvo, uma sequência que codifica um primeiro promotor em que o primeiro promotor controla a expressão da sequência que codifica o primeiro RNA guia de DMD e uma sequência que codifica um segundo promotor em que o primeiro promotor controla a expressão da sequência que codifica o segundo RNA guia de DMD, em que cada uma da primeira sequência genômica alvo e da segunda sequência genômica alvo compreende um sítio aceitador de splice da distrofina. Em algumas modalidades, o vetor compreende ainda uma sequência que codifica uma repetição terminal invertida
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10/259 de um elemento que pode sofrer transposição. Em algumas modalidades, o elemento que pode sofrer transposição é um transposon. Em algumas modalidades, o transposon é um transposon Tn7. Em algumas modalidades, o vetor é um vetor não viral. Em algumas modalidades, o vetor não viral é um plasmídeo. Em algumas modalidades, o vetor é um vetor viral. Em algumas modalidades, o vetor viral é um vetor viral associado a adeno (AAV). Em algumas modalidades, o vetor AAV é defeituoso em relação à replicação ou condicionalmente defeituoso em relação à replicação. Em algumas modalidades, o vetor AAV é um vetor AAV recombinante. Em algumas modalidades, o vetor AAV compreende uma sequência isolada ou derivada de um vetor AAV do sorotipo 1 (AAV1), 2 (AAV2), 3 (AAV3), 4 (AAV4), 5 (AAV5), 6 (AAV6), 7 (AAV7), 8 (AAV8), 9 (AAV9), 10 (AAV10), 11 (AAV11) ou qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, o vetor AAV compreende uma sequência isolada ou derivada de um vetor AAV do sorotipo 9 (AAV9). Em algumas modalidades, o vetor AAV compreende uma sequência isolada ou derivada de um vetor AAV do sorotipo 2 (AAV2). Em algumas modalidades, o vetor AAV compreende uma sequência isolada ou derivada de um AAV2 e uma sequência isolada ou derivada de um AAV9. Em algumas modalidades, o vetor AAV compreende uma sequência isolada ou derivada de um AAV4 e uma sequência isolada ou derivada de um AAV9. Em algumas modalidades, o vetor é otimizado para expressão em células de mamíferos. Em algumas modalidades, o vetor é otimizado para expressão em células humanas. Em algumas modalidades, o vetor compreende a sequências da SEQ ID NO. 914, SEQ ID NO. 915, SEQ ID NO. 916 ou SEQ ID NO. 917.
[009] Também é fornecido um ácido nucleico que compreende uma sequência que codifica um promotor e uma sequência que codifica a Cas9 ou um domínio de nuclease da mesma, em que a sequência que codifica o promotor compreende uma sequência que codifica um promotor específico para o músculo. Em algumas modalidades, a sequência que codifica o promotor específico para o músculo compreende uma sequência que codifica um promotor CK8. Em algumas modalidades, a sequência que codifica o promotor específico para o músculo
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11/259 compreende uma sequência que codifica um promotor CK8e. Em algumas modalidades, a sequência que codifica a Cas9 ou o domínio de nuclease da mesma é isolada ou derivada de uma sequência que codifica uma Cas9 de S. pyogenes ou um domínio de nuclease da mesma. Em algumas modalidades, a sequência que codifica a Cas9 ou o domínio de nuclease da mesma é isolada ou derivada de uma sequência que codifica a Cas9 de S. aureus ou um domínio de nuclease da mesma. Em algumas modalidades, a sequência que codifica a Cas9 ou o domínio de nuclease da mesma tem os códons otimizados para expressão em um mamífero. Em algumas modalidades, a sequência que codifica a Cas9 ou o domínio de nuclease da mesma tem os códons otimizados para expressão em um ser humano. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende ainda uma sequência de poliA. Em algumas modalidades, a sequência de poliA é uma sequência de mini poliA. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende ainda uma ou mais sequências que codificam uma repetição terminal invertida (ITR). Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende ainda uma sequência que codifica uma repetição terminal invertida (ITR) a 5’ e uma sequência que codifica uma ITR a 3’. Em algumas modalidades, a sequência que codifica a repetição terminal invertida (ITR) a 5’ ou a sequência que codifica uma ITR a 3’ compreende uma sequência isolada ou derivada de um vírus associado a adeno (AAV). Em algumas modalidades, a sequência que codifica a repetição terminal invertida (ITR) a 5’ ou a sequência que codifica uma ITR a 3’ compreende uma sequência isolada ou derivada de um vírus associado a adeno (AAV) do sorotipo 2 (AAV2). Em algumas modalidades, a sequência que codifica a repetição terminal invertida (ITR) a 5’ e a sequência que codifica uma ITR a 3’ compreende uma sequência isolada ou derivada de um AAV2. Em algumas modalidades, a sequência que codifica a repetição terminal invertida (ITR) a 5’ ou a sequência que codifica uma ITR a 3’ compreende uma sequência isolada ou derivada de um vírus associado a adeno (AAV) do sorotipo 4 (AAV4). Em algumas modalidades, a sequência que codifica a repetição terminal invertida (ITR) a 5’ e a sequência que codifica uma ITR a 3’ compreende uma sequência isolada ou derivada
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12/259 de um AAV4. Em algumas modalidades, a sequência que codifica a repetição terminal invertida (ITR) a 5’ ou a sequência que codifica uma ITR a 3’ compreende ou consiste de 145 nucleotídeos, 115 nucleotídeos ou 141 nucleotídeos. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende ainda um sinal de localização nuclear. Em algumas modalidades, o ácido nucleico é otimizado para expressão em células de mamíferos. Em algumas modalidades, o ácido nucleico é otimizado para expressão em células humanas.
[010] Também é fornecido um vetor que compreende um ácido nucleico que compreende uma sequência que codifica um promotor e uma sequência que codifica uma Cas9 ou um domínio de nuclease da mesma, em que a sequência que codifica o promotor compreende uma sequência que codifica um promotor específico para o músculo tal como o promotor CK8 ou CK8e. Em algumas modalidades, o vetor compreende ainda uma sequência que codifica uma repetição terminal invertida (ITR) de um elemento que pode sofrer transposição. Em algumas modalidades, o elemento que pode sofrer transposição é um transposon. Em algumas modalidades, o transposon é um transposon Tn7. Em algumas modalidades, o vetor compreende ainda uma sequência que codifica uma ITR a 5’ de um transposon T7 e uma sequência que codifica uma ITR a 3’ de um transposon T7. Em algumas modalidades, o vetor é um vetor não viral. Em algumas modalidades, o vetor não viral é um plasmídeo. Em algumas modalidades, o vetor é um vetor viral. Em algumas modalidades, o vetor viral é um vetor viral associado a adeno (AAV). Em algumas modalidades, o vetor AAV é defeituoso em relação à replicação ou condicionalmente defeituoso em relação à replicação. Em algumas modalidades, o vetor AAV é um vetor AAV recombinante. Em algumas modalidades, o vetor AAV compreende uma sequência isolada ou derivada de um vetor AAV do sorotipo 1 (AAV1), 2 (AAV2), 3 (AAV3), 4 (AAV4), 5 (AAV5), 6 (AAV6), 7 (AAV7), 8 (AAV8), 9 (AAV9), 10 (AAV10), 11 (AAV11) ou qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, o vetor AAV compreende uma sequência isolada ou derivada de um vetor AAV do sorotipo 9 (AAV9). Em algumas modalidades, o vetor AAV compreende uma sequência isolada
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13/259 ou derivada de um vetor AAV do sorotipo 2 (AAV2). Em algumas modalidades, o vetor AAV compreende uma sequência isolada ou derivada de um AAV2 e uma sequência isolada ou derivada de um AAV9. Em algumas modalidades, o vetor AAV compreende uma sequência isolada ou derivada de um vetor AAV do sorotipo 4 (AAV4). Em algumas modalidades, o vetor AAV compreende uma sequência isolada ou derivada de um AAV4 e uma sequência isolada ou derivada de um AAV9. Em algumas modalidades, em que o vetor é otimizado para expressão em células de mamíferos. Em algumas modalidades, o vetor é otimizado para expressão em células humanas. Em algumas modalidades, o vetor compreende a sequência de ácido nucléico da SEQ ID NO. 899, SEQ ID NO. 900, SEQ ID NO. 901 ou SEQ ID NO. 902.
[011] Também é fornecida uma célula que compreende um ou mais ácidos nucleicos da divulgação. Em algumas modalidades, a célula é uma célula humana. Em algumas modalidades, a célula é uma célula muscular ou uma célula satélite. Em algumas modalidades, a célula é uma célula tronco pluripotente induzida (IPS).
[012] Também é fornecida uma composição que compreende um ou mais ácidos nucleicos da divulgação. Em algumas modalidades, a composição compreende ainda um carreador farmaceuticamente aceitável.
[013] Também é fornecida uma composição que compreende uma célula que compreende um ou mais ácidos nucleicos da divulgação. Em algumas modalidades, a composição compreende ainda um carreador farmaceuticamente aceitável.
[014] Também é fornecida uma composição que compreende um ou mais vetores da divulgação. Em algumas modalidades, a composição compreende ainda um carreador farmaceuticamente aceitável.
[015] Também é fornecida uma célula que compreende uma composição que compreende um ou mais vetores da divulgação. Em algumas modalidades, a célula é uma célula humana. Em algumas modalidades, a célula é uma célula muscular ou uma célula satélite. Em algumas modalidades, a célula é uma célula tronco pluripotente induzida (IPS).
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14/259 [016] Em algumas modalidades, uma composição compreende (i) uma primeira sequência de ácido nucleico que compreende uma sequência que codifica um primeiro RNA guia de DMD que se direciona a uma primeira sequência genômica alvo, uma sequência que codifica um segundo RNA guia de DMD que se direciona a uma segunda sequência genômica alvo, uma sequência que codifica um primeiro promotor em que o primeiro promotor controla a expressão da sequência que codifica o primeiro RNA guia de DMD e uma sequência que codifica um segundo promotor em que o primeiro promotor controla a expressão da sequência que codifica o segundo RNA guia de DMD, em que cada uma da primeira sequência genômica alvo e da segunda sequência genômica alvo compreende um aceitador de splice da distrofina e (ii) uma segunda sequência de ácido nucleico que compreende uma sequência que codifica um promotor e uma sequência que codifica a Cas9 ou um domínio de nuclease da mesma, em que a sequência que codifica o promotor compreende uma sequência que codifica um promotor específico para o músculo tal como o promotor CK8 ou CK8e. Em algumas modalidades, a composição compreende ainda um carreador farmaceuticamente aceitável.
[017] Em algumas modalidades, uma composição compreende (i) um primeiro vetor que compreende uma sequência de ácido nucleico que compreende uma sequência que codifica um primeiro RNA guia de DMD que se direciona a uma primeira sequência genômica alvo, uma sequência que codifica um segundo RNA guia de DMD que se direciona a uma segunda sequência genômica alvo, uma sequência que codifica um primeiro promotor em que o primeiro promotor controla a expressão da sequência que codifica o primeiro RNA guia de DMD e uma sequência que codifica um segundo promotor em que o primeiro promotor controla a expressão da sequência que codifica o segundo RNA guia de DMD, em que cada uma da primeira sequência genômica alvo e da segunda sequência genômica alvo compreende um aceitador de splice da distrofina e (ii) um segundo vetor que compreende uma sequência de ácido nucleico que compreende uma sequência que codifica um promotor e uma sequência que codifica uma Cas9 ou um domínio de
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15/259 nuclease da mesma, em que a sequência que codifica o promotor compreende uma sequência que codifica um promotor específico para o músculo tal como o promotor CK8 ou CK8e. Em algumas modalidades, pelo menos um do primeiro vetor e dos segundos vetores é AAVs. Em algumas modalidades, a composição compreende ainda um carreador farmaceuticamente aceitável.
[018] Também é fornecido um método para correção de um defeito da distrofina, o método compreendendo o contato de uma célula com uma ou mais composições da divulgação sob condições adequadas para expressão do primeiro RNA guia de DMD, do segundo RNA guia de DMD e da proteína Cas9 ou de um domínio de nuclease da mesma, em que pelo menos um do primeiro RNA guia de DMD ou do segundo RNA guia de DMD forma um complexo com a proteína Cas9 ou o domínio de nuclease da mesma para formar pelo menos um complexo de RNA guia de DMD-Cas9, em que o pelo menos um complexo de RNA guia de DMD-Cas9 interrompe um sítio de splice da distrofina e induz o “pulo” seletivo de um éxon de DMD.
[019] Também é fornecido um método para correção de um defeito da distrofina, o método compreendendo o contato de uma célula com uma ou mais composições da divulgação sob condições adequadas para expressão do primeiro RNA guia de DMD, do segundo RNA guia de DMD e da proteína Cas9 ou de um domínio de nuclease da mesma, em que pelo menos um do primeiro RNA guia de DMD ou do segundo RNA guia de DMD forma um complexo com a proteína Cas9 ou o domínio de nuclease da mesma para formar pelo menos um complexo de RNA guia de DMD-Cas9, em que o pelo menos um complexo de RNA guia de DMD-Cas9 induz um reenquadramento de um quadro de leitura da distrofina. Em algumas modalidades, o reenquadramento de um quadro de leitura da distrofina induz uma inserção. Em algumas modalidades, a inserção compreende ou consiste de um único nucleotídeo de adenosina.
[020] Também é fornecido um método para indução do “pulo” seletivo de um éxon de DMD, o método compreendendo o contato de uma célula com uma ou mais
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16/259 composições da divulgação sob condições adequadas para expressão do primeiro RNA guia de DMD, do segundo RNA guia de DMD e da proteína Cas9 ou de um domínio de nuclease da mesma, em que pelo menos um do primeiro RNA guia de DMD ou do segundo RNA guia de DMD forma um complexo com a proteína Cas9 ou o domínio de nuclease da mesma para formar pelo menos um complexo de RNA guia de DMD-Cas9, em que o pelo menos um complexo de RNA guia de DMD-Cas9 interrompe um sítio de splice da distrofina e induz o “pulo” seletivo de um éxon de DMD.
[021] Também é fornecido um método para indução de um evento de reenquadramento no quadro de leitura da distrofina, o método compreendendo o contato de uma célula com uma ou mais composições da divulgação sob condições adequadas para expressão do primeiro RNA guia de DMD, do segundo RNA guia de DMD e da proteína Cas9 ou de um domínio de nuclease da mesma, em que pelo menos um do primeiro RNA guia de DMD ou do segundo RNA guia de DMD forma um complexo com a proteína Cas9 ou o domínio de nuclease da mesma para formar pelo menos um complexo de RNA guia de DMD-Cas9, em que o pelo menos um complexo de RNA guia de DMD-Cas9 interrompe um sítio de splice da distrofina e induz o “pulo” seletivo de um éxon de DMD. Em algumas modalidades, o pelo menos um complexo de RNA guia de DMD-Cas9 interrompe um sítio de splice da distrofina e induz o “pulo” seletivo do éxon 51 de um gene DMD humano.
[022] Também é fornecido um método de tratamento de distrofia muscular em um indivíduo que necessita do mesmo que compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficiente de uma ou mais composições da divulgação. Em algumas modalidades, a composição é administrada de forma local. Em algumas modalidades, a composição é administrada diretamente em um tecido muscular. Em algumas modalidades, a composição é administrada através de uma infusão ou uma injeção intramuscular. Em algumas modalidades, o tecido muscular compreende um tecido tibial anterior, um tecido do quadriceps, um tecido solear, um tecido do diafragma ou um tecido cardíaco. Em algumas modalidades, a composição
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17/259 é administrada através de uma injeção intracardíaca. Em algumas modalidades, a composição é administrada de forma sistêmica. Em algumas modalidades, a composição é administrada através de uma infusão ou uma injeção intravenosa. Em algumas modalidades, após a administração da composição, o indivíduo exibe miofibras positivas para distrofina normais e miofibras positivas para distrofina de mosaico contendo núcleos centralizados ou uma combinação das mesmas. Em algumas modalidades, após a administração da composição, o indivíduo exibe uma emergência ou um aumento em um nível de abundância de miofibras positivas para distrofina normais quando comparado a uma ausência ou um nível de abundância de miofibras positivas para distrofina normais antes da administração da composição. Em algumas modalidades, após a administração da composição, o indivíduo exibe uma emergência ou um aumento em um nível de abundância de miofibras positivas para distrofina de mosaico contendo núcleos centralizados quando comparado a uma ausência ou um nível de abundância de miofibras positivas para distrofina de mosaico contendo núcleos centralizados antes da administração da composição. Em algumas modalidades, após a administração da composição, o indivíduo exibe um nível de CK no soro reduzido quando comparado com um nível de CK no soro antes da administração da composição. Em alguma modalidade, após a administração da composição, o indivíduo exibe maior força de preensão quando comparada com uma força de preensão antes da administração da composição. Em algumas modalidades, o indivíduo é um recém-nascido, um bebê, uma criança, um jovem adulto ou um adulto. Em algumas modalidades, o indivíduo tem distrofia muscular. Em algumas modalidades, o indivíduo é um portador genético de distrofia muscular. Em algumas modalidades, o indivíduo é do sexo masculino. Em algumas modalidades, o indivíduo é do sexo feminino. Em algumas modalidades, o indivíduo parece ser assintomático e no qual um diagnóstico genético revela uma mutação em uma ou mais cópias de um gene DMD que prejudica a função do produto do gene DMD. Em algumas modalidades, o indivíduo apresenta um sinal ou um sintoma inicial de distrofia muscular. Em algumas modalidades, o sinal ou o sintoma inicial de distrofia muscular
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18/259 compreende perda de massa muscular ou fraqueza muscular proximal. Em algumas modalidades, a perda de massa muscular ou a fraqueza muscular proximal ocorre em uma ou ambas as pernas e/ou na pelve, seguida por um ou mais músculos do corpo superiores. Em algumas modalidades, o sinal ou o sintoma inicial de distrofia muscular compreende ainda pseudohipertrofia, baixa resistência, dificuldade de ficar de pé, dificuldade de andar, dificuldade de subir uma escada ou uma combinação das mesmas. Em algumas modalidades, o indivíduo apresenta um sinal ou um sintoma progressivo de distrofia muscular. Em algumas modalidades, o sinal ou o sintoma progressivo de distrofia muscular compreende perda do tecido muscular, substituição do tecido muscular por gordura ou substituição do tecido muscular por tecido fibrótico. Em algumas modalidades, o indivíduo apresenta um sinal ou um sintoma tardio de distrofia muscular. Em algumas modalidades, o sinal ou o sintoma tardio de distrofia muscular compreende desenvolvimento ósseo anormal, curvatura da coluna, perda de movimento e paralisia. Em algumas modalidades, o indivíduo apresenta um sinal ou um sintoma neurológico de distrofia muscular. Em algumas modalidades, o sinal ou o sintoma neurológico de distrofia muscular compreende deficiência intelectual e paralisia. Em algumas modalidades, a administração da composição ocorre antes de o indivíduo apresentar um ou mais sinais ou sintomas progressivos, tardios ou neurológicos de distrofia muscular. Em algumas modalidades, o indivíduo tem menos de 10 anos de idade, menos de 5 anos de idade ou menos de 2 anos de idade.
[023] Também é fornecido o uso de uma quantidade terapeuticamente eficiente de uma ou mais composições da divulgação para o tratamento de distrofia muscular em um indivíduo que necessita do mesmo.
[024] Como utilizado aqui no relatório descritivo, “um” ou “uma” pode significar um(a) ou mais. Como utilizadas aqui na(s) reivindicação(ões), quando utilizadas em associação à palavra “compreendendo”, as palavras “um” ou “uma” podem significar um(a) ou mais de um(a).
[025] O uso do termo “ou” nas reivindicações é feito para significar “e/ou” a não ser que seja explicitamente indicado como se referindo a alternativas apenas ou
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19/259 as alternativas são mutuamente exclusivas, embora a divulgação sustente uma definição que se refere às alternativas apenas e “e/ou”. Como utilizado aqui “outro(a)” pode significar pelo menos um(a) segundo(a) ou mais.
[026] Ao longo de todo este pedido de patente, o termo “aproximadamente” é utilizado para indicar que um valor inclui a variação de erro inerente do dispositivo, do método que será empregado para determinar o valor ou que existe dentre os indivíduos do estudo. Tal variação inerente pode ser uma variação de ±10% do valor citado.
[027] Ao longo de todo este pedido de patente, as sequências de nucleotídeos são listadas na direção 5’ para 3’ e as sequências de aminoácidos são listadas na direção N-terminal para C-terminal, a não ser que seja indicado o contrário.
[028] Outros objetivos, características e vantagens da presente invenção se tornarão evidentes partindo da descrição detalhada a seguir. Deve ser entendido, entretanto, que a descrição detalhada e os exemplos específicos, embora indiquem modalidades preferidas da invenção, são fornecidos apenas com a finalidade de ilustração, uma vez que várias alterações e modificações dentro do espírito e do âmbito da invenção se tornarão evidentes para os peritos na técnica partindo desta descrição detalhada.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [029] O arquivo da patente ou do pedido de patente contém pelo menos um desenho efetuado em cores. Cópias desta patente ou publicação de pedido de patente com desenho(s) em cores serão fornecidas pelo Escritório após requerimento e pagamento da taxa necessária.
[030] Os desenhos a seguir fazem parte do presente relatório descritivo e são incluídos para demonstrar adicionalmente certos aspectos da presente divulgação. A divulgação pode ser entendida melhor com referência a um ou mais destes desenhos em combinação com a descrição detalhada das modalidades específicas apresentadas aqui.
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20/259 [031] FIGS. 1A-F. Modelo de camundongo “Humanizado”-AEx50. (FIG. 1A) Estratégia que mostra a abordagem de edição genômica mediada por CRISPR/Cas9 para gerar um modelo de camundongo humanizado. (FIG. 1B) Análise de RT-PCR para validar a deleção do éxon 50 (ΔΕχ50). (FIG. 1C) Sequência do produto de RTPCR para validar a deleção do éxon 50 e a produção de uma sequência fora de quadro (sequência de ácido nucleico = SEQ ID NO: 1; sequência de aminoácidos = SEQ ID NO: 2). (FIG. 1E) Análise de Western blot da expressão da distrofina e da vinculina nos tecidos tibiais anteriores e cardíacos. (FIG. 1F) Níveis de CK no soro, um marcador de distrofia muscular que reflete danos nos músculos e vazamento da membrana que foram medidos nos camundongos do tipo selvagem (WT), ΔΕχ50 e mdx. (FIG. 1D) Histoquímica dos músculos cardíacos e esqueléticos por coloração com hematoxilina e eosina (H&E) e imunohistoquímica utilizando anticorpo para distrofina. Barra de escala: 50 pm.
[032] FIG. 2A-B. Pulo do éxon 51. (FIG. 2A) A RT-PCR do RNA de camundongos ΔΕχ50 3 semanas após injeção intramuscular indica deleção do éxon 51 (denominada ΔΕχ50-51, banda inferior). (FIG. 2B) A sequência dos produtos de RT-PCR da banda de ΔΕχ50-51 confirmou que o éxon 49 sofreu splice diretamente no éxon 52, excluindo o éxon 51 (sequência de ácido nucleico = SEQ ID NO: 3; sequência de aminoácidos = SEQ ID NO: 4).
[033] FIG. 3A-G. Correção da expressão da distrofina utilizando a estratégia de gRNA em triplicata 3 semanas após a injeção intramuscular. (FIG. 3A) Estratégia que mostra a abordagem de edição genômica mediada por CRISPR/Cas9 para corrigir o quadro de leitura no modelo de camundongo ΔΕχ50. (FIG. 3B) sgRNA que se direciona à sequência do sítio aceitador de splice (sgRNA-ex51-SA) e ilustração esquemática da posição de ligação do sgRNA. A Fig. 3B divulga as SEQ ID NOS 954957, respectivamente, na ordem de aparecimento. (FIG. 3C) Ilustração esquemática dos plasmídeos e da estratégia de injeção de AAV. Estratégia guia dupla utilizando plasmídeo rAAV9-sgRNA para sgRNA-ex51-SA e sgRNA-ex51-SD. Triplicata utilizando plasmídeo rAAV9-sgRNA contendo 3 cópias de sgRNA-ex51-SA. Promotor
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21/259 da creatina quinase muscular 8 (CK8) para expressar SpCas9. Promotor U6, H1 e 7SK para RNA polimerase III para expressar sgRNA. (FIG. 3D) Coloração imunohistoquimica da distrofina do músculo tibial anterior. (FIG. 3E) Quantificação de fibras postivas para distrofina normalizados por área. (FIG. 3F) Análise de Western blot da expressão da distrofina (DMD) e da vinculina (VCL) 3 semanas após a injeção intramuscular. (FIG. 3G) Quantificação de expressão da distrofina após a normalização na vinculina. Os dados são representados na forma da média ± SEM. **P<0,005. Barra de escala: 50 pm [034] FIG. 4A-B. Aprimoramento histológico do músculo injetado após 3 semanas. (FIG. 4A) Histoquímica do músculo tibial anterior por coloração com hematoxilina e eosina (H&E). (FIG. 4B) Quantificação do tamanho da fibra e da porcentagem de frequência. Os dados são representados na forma da média ± SEM. Barra de escala: 50 pm. Cada conjunto de quatro pontos de dados para certo tamanho de fibra é A50-CTL, WT-CTL, A50-AAV-TriSA e A50-AAV-SA+SD da esquerda para a direita.
[035] FIG. 5. Seleção de sgRNA em células 293 humanas e células 10T de camundongo. Produtos da PCR não digeridos (painel superior) e digestão com T7E1 (painel inferior) em um gel de agarose a 2%. M significa faixa de marcador de tamanho, pb indica o comprimento das bandas do marcador.
[036] FIG. 6. Coloração imunohistoquimica da distrofina do músculo tibial anterior inteiro.
[037] FIGS. 7A-B. Estratégia para a edição genômica mediada por CRISPR/Cas9 em camundongos ΔΕχ50. (FIG. 7A) Estratégia que mostra a abordagem de edição genômica mediada por CRISPR/Cas9 para corrigir o quadro de leitura no modelo de camundongo ΔΕχ50. (FIG. 7B) sgRNA que se direciona à sequência do sítio aceitador de splice (sgRNA-ex51-SA2) e ilustração esquemática da posição de ligação do sgRNA. A Fig. 7B divulga as SEQ ID NOS 958-959, respectivamente, na ordem de aparecimento.
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22/259 [038] FIG. 8A-F. análise genômica com sgRNA em células de camundongo e humanas (FIG. 8A) Cas9 foi expressa na presença ou na ausência de sgRNA-sgRNA51-SA2 de camundongo nas células 10T1 /2 e a edição gênica foi monitorada através do ensaio de T7E1 em células separadas com base na fluorescência (FACS) (+) e células não separadas (-). A GFP foi utilizada como um controle. Os produtos da PCR não digeridos (painel superior) e digestão com T7E1 (painel inferior) são mostrados em um gel de agarose a 2%. A ponta de seta preta indica a banda de PCR de 771 pb não digerida. As pontas de seta verdes no painel inferior indicam as bandas cortadas através do ensaio de T7E1. M significa faixa de marcador de tamanho, pb indica o comprimento das bandas do marcador. (FIG. 8B) Análise de sequenciamento genômico profundo dos amplicons da PCR gerados ao longo do sítio alvo do éxon 51 nas células 10T1 /2. Sequência dos indels representativos alinhados com a sequência de sgRNA (indicada em azul) revelando inserções (destacadas em verde) e deleções (destacadas em vermelho) (SEQ ID NOS 960-966, respectivamente, na ordem de aparecimento). A linha indica a sequência de intensificadores de splicing de éxon prevista (ESEs) localizada no sítio de sgRNA. A seta preta indica o sítio de divagem. (FIG. 8C) A sequência do Éxon 51 de Camundongo (SEQ ID NO: 967) com os intensificadores de splicing de éxon previstos (ESEs) localizada no sítio de sgRNA é indicada em vermelho. A sequência do Éxon 51 Humano (SEQ ID NO: 968) com os intensificadores de splicing de éxon previstos (ESEs) localizada no sítio de sgRNA é indicada em vermelho. (FIG. 8D) Sítios de ESSE do éxon 51 de camundongo e humanos previstos utilizando ESEfinder3. (FIG. 8E) A Cas9 foi expressa na presença ou na ausência de sgRNA-sgRNA-51-SA2 de camundongo em células 293 T humanas e a Edição gênica foi monitorada através do ensaio de T7E1 em células separadas com base na fluorescência (FACS) (+) e células não separadas (-). A GFP foi utilizada como um controle. Os produtos da PCR não digeridos (painel superior) e a digestão com T7E1 (painel inferior) são mostrados em um gel de agarose a 2%. A ponta de seta preta indica a banda de PCR de 771 pb não digerida. As pontas de seta verdes no painel inferior indicam as bandas cortadas através do ensaio de T7E1. M
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23/259 significa faixa de marcador de tamanho, pb indica o comprimento das bandas do marcador. (FIG. 8F) A sequência de indels representativos alinhada com a sequência de sgRNA (indicada em azul) revelando deleções e inserções (SEQ ID NOS 969-978, respectivamente, na ordem de aparecimento). A ponta de seta preta indica o sítio de divagem.
[039] FIG. 9A-B. Ilustração esquemática dos plasmídeos e da estratégia de injeção de AAV. (FIG. 9A) Promotor da creatina quinase muscular 8 (CK8) para expressar SpCas9. (FIG. 9B) Triplicata utilizando plasmídeo rAAV9-sgRNA contendo 3 cópias de sgRNA-ex51-SA2. Promotor U6, H1 e 7SK para RNA polimerase III para expressar sgRNA.
[040] FIG. 10A-B. Edição do gene Dmd in vivo. (FIG. 10A) Os produtos da PCR não digeridos (painel superior) e a digestão com T7E1 (painel inferior) são mostrados em um gel de agarose a 2% de amostras do músculo TA (tibial anterior) de camundongos WT e ΔΕχ50 3 semanas após a injeção intramuscular com AAV9sgRNA-SA2 e vetores de expressão de AAV9-Cas9. Os controles foram injetados apenas com AAV9-Cas9 sem AAV9-sgRNA-SA2. A ponta de seta preta no painel superior indica a banda de PCR de 771 pb. As pontas de seta verdes no painel inferior indicam as bandas cortadas através do ensaio de T7E1. M significa faixa de marcador de tamanho, pb indica o comprimento das bandas do marcador. N=4. (FIG. 10B) Análise de sequenciamento genômico profundo de amplicons da PCR gerados ao longo do sítio alvo do éxon 51 em camundongos ΔΕχ50 injetados com AAV9-sgRNA51-SA2 e AAV9-Cas9. A sequência de indels representativos alinhada com a sequência de sgRNA (indicada em azul) revelando inserções (destacadas em verde) e deleções (destacadas em vermelho). (SEQ ID NOS 979-1014, respectivamente, na ordem de aparecimento). A ponta de seta pretas indicam o sítio de divagem. n=3.
[041] FIG. 11A-D. Análise de RT-PCR de correção do quadro de leitura. (FIG. 11 A) RT-PCR do RNA dos músculos tibiais anteriores de camundongos do tipo selvagem (WT) e ΔΕχ50 3 semanas após a injeção intramuscular do sgRNA-51-SA2 e vetores de expressão de Cas9. As bandas de distrofina inferiores indicam a deleção
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24/259 do éxon 51. São indicadas as posições dos iniciadores nos éxons 48 e 53 (Fw, Rv). (FIG. 11B) Porcentagem dos eventos detectados no éxon 51 após tratamento com AAV9-sgRNA-51-SA2 utilizando a análise de sequência por RT-PCR de clones gerados por TOPO-TA. Para cada uma das 4 amostras diferentes, foram gerados e sequenciados 40 clones. Os produtos de RT-PCR foram divididos em 4 grupos: não editados (NE), com pulo do éxon 51 (SK), reenquadrados (RF) e fora de quadro (OF). (FIG. 11C) A sequência dos produtos de RT-PCR da banda inferior da distrofina de camundongo ΔΕχ50-51 confirmou que o éxon 49 sofreu splice diretamente no éxon 52, excluindo o éxon 51. Sequência dos produtos de RT-PCR da ΔΕχ50 reenquadrada (AEx50-RF). A Fig. 11C divulga as SEQ ID NOS 1015-1022, respectivamente, na ordem de aparecimento. (FIG. 11 D) Análise de sequenciamento profundo dos produtos de RT-PCR da banda superior contendo ΔΕχ50 não editada (NE) e ΔΕχ50RF. Sequência dos produtos de RT-PCR revelando inserções (destacadas em verde) e deleções (destacadas em vermelho). n=4. Os dados são representados na forma da média ± SEM. A Fig. 11D divulga as SEQ ID NOS 1023-1026, respectivamente, na ordem de aparecimento.
[042] FIG. 12A-D. A injeção intramuscular de AAV9-Cas9 e AAV9-sgRNA-51 SA2 corrige a expressão da distrofina. (FIG. 12A) Os músculos tibiais anteriores de camundongos ΔΕχ50 foram injetados com o vetor de AAV9 que codifica sgRNA e Cas9 e analisados 3 semanas depois por imunocoloração para distrofina. Camundongos de controle do tipo selvagem (WT-CTL) e controle de camundongos ΔΕχ50 (AEx50-CTL) receberam injeção de AAV9-Cas9 individualmente sem sgRNAs. As porcentagens de miofibras positivas para distrofina em camundongos AEx50-CTL e em camundongos ΔΕχ50 tratados (AEx50-AAV9-sgRNA-51-SA2 e AAV9-Cas9) comparados com WT-CTL são indicadas em cada painel. (FIG. 12B) Coloração com hematoxilina e eosina (H&E) dos músculos tibiais anteriores. (FIG. 12C) Análise de Western blot da expressão da distrofina (DMD) e da vinculina (VCL) nos músculos tibiais anteriores 3 semanas após a injeção intramuscular. (FIG. 12D) Quantificação de expressão da distrofina partindo dos blots após a normalização na vinculina. O
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25/259 asterisco indica bandas imunorreativas não específicas. n=5 para AAV9-sgRNA-51SA2. Barra de escala: 50 pm [043] FIG. 13. Recuperação da expressão da distrofina após injeções intramusculares de AAV9-Cas9 e AAV9-sgRNA-51-SA2 no modelo de camundongos ΔΕχ50. Distrofina imunohistoquímica do músculo tibial anterior inteiro. Os camundongos CTL receberam injeção de AAV9-Cas9 individualmente sem AAV9sgRNA-51-SA2. n=5 [044] FIG. 14. Aprimoramento histológico do músculo injetado após 3 semanas. Histoquímica do músculo tibial anterior por coloração com hematoxilina e eosina (H&E).
[045] FIG. 15A-B. Recuperação da expressão da distrofina após injeções intramusculares de AAV9-Cas9 combinadas com AAV9s diferentes expressando cópia única ou cópia tripla de sgRNA no modelo de camundongo ΔΕχ50. (FIG. 15A) Cada um dos promotores de U6, H1 e 7SK para RNA polimerase III foi individualmente utilizado para expressar sgRNA em uma cópia única (AAV9-U6-sgRNA-51-SA2; AAV9-H1-sgRNA-51-SA2; AAV9-7SK-sgRNA-51-SA2) ou cópia tripla. (FIG. 15B) Imunohistoquímica da distrofina do músculo tibial anterior inteiro. Os camundongos de controle (CTL) receberam injeção de AAV9-Cas9 individualmente sem AAV9sgRNA-51-SA2.
[046] FIG. 16A-B. Recuperação da expressão da distrofina 4 semanas após o fornecimento sistêmico de AAV9-Cas9 e AAV9-sgRNA-51-SA2 em camundongos ΔΕχ50. 16A) Imunocoloração da distrofina dois músculos tibial anterior (TA), do triceps, do diafragma e cardíacos 8 semanas após a injeção sistêmica de AAV9sgRNA-51. (FIG. 16B) Análise de Western blot da expressão da distrofina (DMD) e da vinculina (VCL) nos músculos TA, do triceps, do diafragma e coração. n=5 para cada grupo. Barra de escala: 50 pm.
[047] FIG. 17A-B. Recuperação da expressão da distrofina 8 semanas após o fornecimento sistêmico de AAV9-Cas9 e AAV9-sgRNA-51-SA2 em camundongos ΔΕχ50. (FIG. 17A) Imunocoloração da distrofina dos músculos tibial anterior (TA), do
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26/259 triceps, do diafragma e cardíacos 8 semanas após a injeção sistêmica de AAV9sgRNA-51. (FIG. 17B) Análise de Western blot da expressão da distrofina (DMD) e da vinculina (VCL) nos músculos TA, do triceps, do diafragma e coração. n=5 para cada grupo. Barra de escala: 50pm.
[048] FIG. 18A-B. Aprimoramento funcional 4 semanas após o fornecimento sistêmico de AAV9-Cas9 e AAV9-sgRNA-51-SA2 em camundongos ΔΕχ50. (FIG. 18A) Camundongos do tipo selvagem (WT), camundongos ΔΕχ50 de controle e camundongos ΔΕχ50 tratados com AAV9-sgRNA-51 (AEx50-AAV9-sgRNA-51) foram submetidos ao teste de força de preensão para medir o desempenho muscular (gramas de força). (FIG. 18B) A creatina quinase no soro (CK) foi medida em camundongos WT, ΔΕχ50 e AEx50-AAV9-sgRNA-51. n=5. O asterisco indica bandas imunorreativas não específicas. Os dados são representados na forma da média ± SEM.
[049] FIG. 19. Correção da expressão da distrofina 6 semanas após a injeção intramuscular em Cachorro AEx50-MD. Coloração imunohistoquímica da distrofina do músculo tibial cranial de um cachorro do tipo selvagem (Nathan), um Cachorro ΔΕχ50MD não tratado e dois Cachorros AEx50-MD (Norman e Newton) com músculo tibial cranial não injetado de forma contralateral e injetado com AAV9-Cas9-sgRNA. Barra de escala: 50 pm.
[050] FIGS. 20A-B. Correção da expressão da distrofina 6 semanas após a injeção intramuscular em Cachorro AEx50-MD. (FIG. 20A) Análise de Western blot da distrofina (DMD) e da vinculina (VCL) do músculo tibial cranial de um cachorro do tipo selvagem (Nathan), um Cachorro AEx50-MD não tratado e dois Cachorros ΔΕχ50MD Dogs (Norman e Newton) com músculo tibial cranial não injetado de forma contralateral e injetado com AAV9-Cas9-sgRNA. (FIG. 20B) Quantificação da expressão da distrofina partindo de dois blots independentes após a normalização na vinculina.
[051] FIG. 21. Aprimoramento histológico do músculo injetado após 6 semanas em Cachorro AEx50-MD. Histoquímica por coloração com hematoxilina e
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27/259 eosina (H&E) do músculo tibial cranial de cachorro do tipo selvagem (Nathan), Cachorros AEx50-MD (Norman e Newton) com músculo tibial cranial não injetado de forma contralateral e injetado com AAV9-Cas9-sgRNA. Barra de escala: 50 pm.
DESCRIÇÃO DETALHADA [052] DMD é uma nova síndrome causada por mutação com mais de 4.000 mutações independentes que foram identificadas em humanos (world-wide web em dmd.nl). A maioria das mutações dos pacientes inclui deleções que formam clusters em um hotspot e assim uma abordagem terapêutica para pular certos éxons se aplica a um grande número de pacientes. O fundamento lógico da abordagem de pular éxons se baseia na diferença genética entre pacientes com DMD e distrofia muscular de Becker (BMD). Nos pacientes com DMD, o quadro de leitura do mRNA da distrofina é interrompido resultando em proteínas distrofina não funcionais truncadas prematuramente. Os pacientes com BMD possuem mutações no gene DMD que mantêm o quadro de leitura permitindo a produção de distrofinas com deleções internas, mas parcialmente funcionais que levam a sintomas da doença muito mais brandos comparados com os pacientes com DMD.
[053] São fornecidos aqui composições e métodos para tratamento de DMD. Em algumas modalidades, é fornecida uma construção de AAV, em que a construção de AAV compreende um ácido nucléico que codifica três promotores dos quais cada um controlam a expressão de um RNA guia de DMD. Utilizando as composições e os métodos divulgados aqui, foi conseguida uma forma mais robusta e segura de edição genômica em um modelo de camundongo humanizado para DMD com uma deleção no éxon 50 e em um Cachorro AEx50-MD. Estes e outros aspectos da divulgação são reproduzidos a seguir.
I. Distrofia Muscular de Duchenne
A. Antecedente [054] A distrofia muscular de Duchenne (DMD) é uma forma ligada ao X recessiva de distrofia muscular, que afeta em torno de 1 em 5000 meninos, que resulta em degeneração muscular e morte prematura. O transtorno é causado por
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28/259 uma mutação no gene da distrofina (ver GenBank Accession NO. NC_000023.11), localizado no cromossomo X humano, que codifica a proteína distrofina (GenBank Accession No. AAA53189; SEQ ID NO: 5), cuja sequência é reproduzida a seguir:
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29/259 erkqqlekcl klsrkmrkem nvltewlaat dmeltkrsav egmpsnldse vawgkatqke iekqkvhlks itevgealkt vlgkketlve dklsllnsnw iavtsraeew Inllleyqkh metfdqnvdh itkwiiqadt lldesekkkp qqkedvlkrl kaelndirpk vdstrdqaan Imanrgdhcr klvepqisel nhrfaaishr iktgkasipl keleqfnsdi qkllepleae iqqgvnlkee dfnkdmnedn egtvkellqr gdnlqqritd erkreeikik qqllqtkhna Ikdlrsqrrk kaleishqwy qykrqaddll kclddiekkl aslpeprder kikeidrelq kkkeelnavr rqaeglsedg aamaveptqi qlskrwreie skfaqfrrln faqihtvree tmmvmtedmp leisyvpsty Iteithvsqa lleveqllna pdlcakdfed Ifkqeeslkn ikdslqqssg ridiihskkt aalqsatpve rvklqealsq Idfqwekvnk mykdrqgrfd rsvekwrrfh ydikifnqwl teaeqflrkt qipenwehak ykwylkelqd gigqrqtvvr tlnatgeeii qqssktdasi Iqeklgslnl rwqevckqls drkkrleeqk nilsefqrdl nefvlwleea dniasiplep gkeqqlkekl eqvkllveel plrqgilkql netggpvlvs apispeeqdk lenklkqtnl qwikvsralp ekqgeieaqi kdlgqlekkl edleeqlnhl llwlspirnq leiynqpnqe gpfdvqetei avqakqpdve eilskgqhly kekpatqpvk rkledlssew kavnrllqel rakqpdlapg Ittigasptq tvtlvtqpvv tketaiskle mpsslmlevp aladfnrawt eltdwlslld qviksqrvmv gdledinemi ikqkatmqdl eqrrpqleel itaaqnlknk tsnqeartii tdrieriqnq wdevqehlqn rrqqlnemlk dstqwleake eaeqvlgqar akleswkegp ytvdaiqkki tetkqlakdl rqwqtnvdva ndlalkllrd ysaddtrkvh miteninasw rsihkrvser eaaleethrl Iqqfpldlek flawlteaet tanvlqdatr kerlledskg vkelmkqwqd Iqgeieahtd vyhnldensq kilrslegsd davllqrrld nmnfkwselr kkslnirshl eassdqwkrl hlslqellvw Iqlkddelsr qapiggdfpa vqkqndvhra fkrelktkep vimstletvr ifIteqpleg leklyqepre Ippeeraqnv trllrkqaee vnteweklnl hsadwqrkid etlerlqelq eatdeldlkl rqaevikgsw qpvgdllids Iqdhlekvka Irgeiaplke nvshvndlar qlttlgiqls pynlstledl ntrwkllqva vedrvrqlhe ahrdfgpasq hflstsvqgp weraispnkv pyyinhetqt tcwdhpkmte lyqsladlnn vrfsayrtam klrrlqkalc Idllslsaac daldqhnlkq ndqpmdilqi inclttiydr leqehnnlvn vplcvdmcln wllnvydtgr tgrirvlsfk tgiislckah ledkyrylfk qvasstgfcd qrrlglllhd siqiprqlge vasfggsnie psvrscfqfa nnkpeieaal fldwmrlepq smvwlpvlhr
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3481 qdsplsqprs paqilisles eergeleril adleeenrnl qaeydrlkqq hehkglsplp
3541 sppemmptsp qsprdaelia eakllrqhkg rlearmqile dhnkqlesql hrlrqlleqp
3601 qaeakvngtt vsspstslqr sdssqpmllr vvgsqtsdsm geedllsppq dtstgleevm 3661 eqlnnsfpss rgrntpgkpm redtm.
[055] Em humanos, o mRNA da distrofina contém 79 éxons. O mRNA da distrofina é conhecido por sofrer splice alternativo, resultando em várias isoformas. Exemplos de isoformas da distrofina são listados na Tabela 1.
Tabela 1: Isoformas da distrofina
Nome da Sequên cia No. de Acesso do Ácido Nucleico SEQ ID NO do Ácido Nucleic o: No. de Acesso da Proteína SEQ ID NO da Protein a: Descrição
Sequên cia Genômi ca da DMD NC_000023.11 (posições 31119219 a 33339609) Nenhu m Nenhum Nenhu m Sequência do Cromossomo X Humano (nas posições Xp21.2 a p21.1) da Assembly GRCh38.p7 (GCF_000001405 .33)
Isoforma Dp427c da NM_000109.3 6 NP_000100.2 7 Variante do Produto da Transcrição: o
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distrofin produto da
a transcrição Dp427c é expresso predominanteme nte nos neurônios do córtex e das regiões de CA do hipocampo. Este utiliza um promotor/éxon 1 único localizado aproximadamente 130 kb a montante do promotor do produto da transcrição Dp427m. 0 produto da transcrição inclui o éxon 2 comum do produto da transcrição Dp427m e possui um comprimento similar de 14 kb. A isoforma Dp427c contém uma
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sequência MED N-terminal única, no lugar da sequência MLWWEEVEDC Y (SEQ ID NO: 949) da isoforma Dp427m. O restante da isoforma Dp427c é idêntico à isoforma Dp427m.
Isoforma Dp427m da distrofin a NM_004006.2 8 NP_003997.1 9 Variante do Produto da Transcrição: ο produto da transcrição Dp427m codifica a proteína distrofina principal encontrada no músculo. Como um resultado do uso de promotor alternativo, o éxon 1 codifica uma sequência de aa N-terminal
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única MLWWEEVEDC
Y (SEQ ID 949). NO:
Isoforma Dp427p 1 da distrofin a NM_004009.3 10 NP_004000.1 11 Variante do Produto da Transcrição: o produto da transcrição Dp427p1 começa partindo de urn promotor único/éxon 1 localizado no que corresponde ao primeiro intron do produto da transcrição Dp427m. O produto da transcrição adiciona o éxon 2 comum de Dp427m e possui um comprimento similar (14 kb). A isoforma Dp427p1 substitui o início de
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Dp427m MLWWEEVEDC Y (SEQ ID NO: 949) por uma sequência de aa N-terminal única MSEVSSD (SEQ ID NO: 950).
Isoforma Dp260-1 da distrofin a NM_004011.3 12 NP_004002.2 13 Variante do Produto da Transcrição: o produto da transcrição Dp260-1 utiliza os éxons 30-79 e se origina partindo de uma sequência de promotor/éxon 1 localizada no intron 29 do gene da distrofina. Como urn resultado, Dp2601 contém urn éxon 1 de 95 pb que codifica uma sequência de 16 aa N-terminal
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única MTEIILLIFFPAYF LN (SEQ ID NO: 951) que substitui os aminoácidos 11357 do produto da distrofina de comprimento completo (isoforma Dp427m).
Isoforma Dp260-2 da distrofin a NM_004012.3 14 NP_004003.1 15 Variante do Produto da Transcrição: o produto da transcrição Dp260-2 utiliza os éxons 30-79, começando a partir de uma sequência de promotor/éxon 1 localizada no intron 29 do gene da distrofina que alternativamente sofreu splice e não possui os aminoácidos N-
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terminal 1-1357 da distrofina de comprimento completo (isoforma Dp427m). 0 produto da transcrição Dp260-2 codifica uma sequência Nterminal única MSARKLRNLSY KK (SEQ ID NO: 952).
Isoforma Dpi 40 da distrofin a NM_004013.2 16 NP_004004.1 17 Variante do Produto da Transcrição: os produtos da transcrição Dpi 40 utilizam os éxons 45-79, começando em um promotor/éxon 1 localizado no íntron 44. Os produtos da transcrição Dp140 possuem
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uma 5’UTR longa (1 kb) uma vez que a tradução é iniciada no éxon 51 (correspondendo ao aa 2461 da distrofina). Em adição aos promotor e éxon 1 alternativos, o processo de splice diferencial dos éxons 71-74 e 78 produz pelo menos cinco isoformas Dp140. Destas, este produto da transcrição (Dp140) contém todos os éxons.
Isoforma Dp116 da distrofin a NM_004014.2 18 NP_004005.1 19 Variante do Produto da Transcrição: o produto da transcrição Dp116 utiliza os éxons 56-79,
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começando a partir de um promotor/éxon 1 dentro do íntron 55. Como um resultado, a isoforma Dp116 contém uma sequência de aa N-terminal única MLHRKTYHVK (SEQ ID NO: 953), no lugar dos aas 1-2739 da distrofina. P processo de splice diferencial produz vérios subtipos de Dp116. A isoforma Dp116 também é conhecida como S-distrofina ou apo-distrofina-2.
Isoforma Dp71 da distrofin a NM_004015.2 20 NP_004006.1 21 Variante do Produto da Transcrição: os produtos da
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transcrição Dp71 utilizam os éxons 63-79 com um novo éxon de 80 a 100 nt contendo um sítio de início ATG para uma nova sequência codificadora de 17 nt. A sequência codificadora curta está em quadro com a sequência da distrofina consecutiva do éxon 63. O processo de splice diferencial dos éxons 71 e 78 produz pelo menos quatro isoformas Dp71. Destas, este produto da transcrição (Dp71) inclui ambos os éxons 71 e 78.
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Isoforma Dp71b da distrofin a NM_004016.2 22 NP_004007.1 23 Variante do Produto da Transcrição: os produtos da transcrição Dp71 utilizam os éxons 63-79 com um novo éxon de 80 a 100 nt contendo um sítio de início ATG para uma nova sequência codificadora de 17 nt. A sequência codificadora curta está em quadro com a sequência da distrofina consecutiva do éxon 63. O processo de splice diferencial dos éxons 71 e 78 produz pelo menos quatro isoformas Dp71. Destas, este produto da
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transcrição (Dp71b) não possui o éxon 78 e codifica uma proteína com um terminal C diferente daquela das isoformas Dp71 e Dp71a.
Isoforma Dp71a da distrofin a NM_004017.2 24 NP_004008.1 25 Variante do Produto da Transcrição: os produtos da transcrição Dp71 utilizam os éxons 63-79 com um novo éxon de 80 a 100 nt contendo um sítio de início ATG para uma nova sequência codificadora de 17 nt. A sequência codificadora curta está em quadro com a sequência da distrofina consecutiva do
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éxon 63. O processo de splice diferencial dos éxons 71 e 78 produz pelo menos quatro isoformas Dp71. Destas, este produto da transcrição (Dp71a) não possui o éxon 71.
Isoforma Dp71ab da distrofin a NM_004018.2 26 NP_004009.1 27 Variante do Produto da Transcrição: os produtos da transcrição Dp71 utilizam os éxons 63-79 com um novo éxon de 80 a 100 nt contendo um sítio de início ATG para uma nova sequência codificadora de 17 nt. A sequência codificadora curta está em quadro
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com a sequência da distrofina consecutiva do éxon 63. O processo de splice diferencial dos éxons 71 e 78 produz pelo menos quatro isoformas Dp71. Destas, este produto da transcrição (Dp71ab) não possui ambos os éxons 71 e 78 e codifica uma proteína com um C-terminal similar ao da isoforma Dp71b.
Isoforma da Dp40 da distrofin a NM_004019.2 28 NP_004010.1 29 Variante do Produto da Transcrição: produto da transcrição Dp40 utiliza os éxons 63-70. A 5’ UTR e os primeiros 7 aa
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codificados são idênticos aqueles no produto da transcrição Dp71, mas o códon de terminação fica na junção de splice do éxon/íntron 70. A 3' UTR inclui nt do íntron 70 que inclui um sítio de poliadenilação alternativo. A isoforma Dp40 não possui a extremidade exterminai normal da distrofina de comprimento completo (aa 3409-3685).
Isoforma Dp140c da distrofin a NM_004020.3 30 NP_004011.2 31 Variante do Produto da Transcrição: os produtos da transcrição Dp140 utilizam os éxons 45-79,
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começando em um promotor/éxon 1 localizado no íntron 44. Os produtos da transcrição Dp140 possuem uma 5’ UTR longa (1 kb) uma vez que a tradução é iniciada no éxon 51 (correspondendo ao aa 2461 da distrofina). Em adição ao promotor e éxon 1 alternativos, o processo de splice diferencial dos éxons 71-74 e 78 produz pelo menos cinco isoformas de Dp140. Destas, este produto da transcrição (Dp140c) não
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possui éxons 71- 74.
Isoforma Dpi 40b da distrofin a NM_004021.2 32 NP_004012.1 33 Variante do Produto da Transcrição: os produtos da transcrição Dpi 40 utilizam os éxons 45-79, começando em um promotor/éxon 1 localizado no íntron 44. Os produtos da transcrição Dp140 possuem uma 5’ UTR longa (1 kb) uma vez que a tradução é iniciada no éxon 51 (correspondendo ao aa 2461 da distrofina). Em adição ao promotor e éxon 1 alternativos, o processo de
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splice diferencial dos éxons 71-74 e 78 produz pelo menos cinco isoformas de Dpi 40. Destas, este produto da transcrição (Dpi 40b) não possui o éxon 78 e codifica uma proteína com um C-terminal único.
Isoforma Dpi 40a b da distrofin a NM_004022.2 34 NP_004013.1 35 Variante do Produto da Transcrição: os produtos da transcrição Dp140 utilizam os éxons 45-79, começando em um promotor/éxon 1 localizado no íntron 44. Os produtos da transcrição Dp140 possuem uma 5’ UTR longa
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(1 kb) uma vez que a tradução é iniciada no éxon 51 (correspondendo ao aa 2461 da distrofina). Em adição ao promotor e éxon 1 alternativos, o processo de splice diferencial dos éxons 71-74 e 78 produz pelo menos cinco isoformas de Dp140. Destas, este produto da transcrição (Dp140ab) não possui éxons 71 e 78 e codifica uma proteína com um C-terminal único.
Isoforma Dpi 40b c da distrofin a NM_004023.2 36 NP_004014.1 37 Variante do Produto da Transcrição: os produtos da transcrição
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Dp140 utilizam os éxons 45-79, começando em um promotor/éxon 1 localizado no íntron 44. Os produtos da transcrição Dp140 possuem uma 5’ UTR longa (1 kb) uma vez que a tradução é iniciada no éxon 51 (correspondendo ao aa 2461 da distrofina). Em adição ao promotor e éxon 1 alternativos, o processo de splice diferencial dos éxons 71-74 e 78 produz pelo menos cinco isoformas de Dp140. Destas, este produto da
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transcrição (Dp140bc) não possui éxons 7174 e 78 e codifica uma proteína com urn C-terminal único.
Isoforma XM_00672446 38 XP_00672453 39
X2 da 9.3 2.1
distrofin
a
Isoforma XM_01154546 40 XP_01154376 41
X5 da 7.1 9.1
distrofin
a
Isoforma XM_00672447 42 XP_00672453 43
X6 da 3.2 6.1
distrofin
a
Isoforma XM_00672447 44 XP_00672453 45
X8 da 5.2 8.1
distrofin
a
Isoforma XM_01702932 46 XP-01688481 47
X4 da 8.1 7.1
distrofin
a
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Isoforma XM_00672446 48 XP_00672453 49
X1 da 8.2 1.1
distrofin
a
Isoforma XM_01702933 50 XP-01688482 51
X13 da 1.1 0.1
distrofin
a
Isoforma XM_00672447 52 XP_00672453 53
X3 da 0.3 3.1
distrofin
a
Isoforma XM_00672447 54 XP_00672453 55
X7 da 4.3 7.1
distrofin
a
Isoforma XM_01154546 56 XP_01154377 57
X9 da 8.2 0.1
distrofin
a
Isoforma XM_01702933 58 XP-01688481 59
X11 da 0.1 9.1
distrofin
a
Isoforma XM_01702932 865 XP-01688481 866
X10 da 9.1 8.1
distrofin
a
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Isoforma XM_01154546 867 XP_01154377 868
X12 da 9.1 1.1
distrofin
a
[056] A proteína distrofina de camundongo possui a sequência de aminoácidos a seguir (Uniprot Accession No. P11531, SEQ. ID. NO: 869):
MWWVDCYRDV KKTTKWNASK GKHDNSDDGK RDGTGKKKGS TRVHANNVNK ARVKNNVDVN
GSTDVDGNHK TGWNHWVKNV MKTMAGTNSK SWVRSTRNYV NVNTSSWSDG ANAHSHRDDW
121 NSVVSHSATR HANAKCGKDD VATTYDKKSM YTSVVSAVMR TSSKVTRHHH MHYSTVSAGY
181 TSSSKRKSYA TAAYVATSDS TSYSHARDKS DSSMTVNDSY TAVSWSADTR AGSNDVVKHA
241 HGMMDTSHGV GNVGSVGKGK SDAVMNNSRW CRVASMKSKH KVMDNKKDDW TKTRTKKMGD
301 DKCVHKVDVR VNSTHMVVVV DSSGDHATAA KVGDRWANCR WTDRWVDKWH TCSTWSKDAM
361 KNTSGKDNMM SSHKSTKDKK KTMKSSNDSA KNKSVTKMWM NARWDNTKKS SASAVTTTST
421 TTVMTVTMVT TRMVKHAKKR TVDSRKRDVD THSWTRSAVS SAVYRKGNSD KVNAARKAKR
481 KDASRSAAVM ANGVNASRAS NSRWTCSRVN WYTNTYNMTT
TANKTSTTST AKSKCKDVNR
541 SAKSKKGGMD ADVATNHNHD GVRAKKTDTM RYTMSSRTWS
SKSVYSVTYM RGKASSKNGN
601 YSDTVKMAKK ASCKYSGHWK KSSVSCKHMN KRKNHKTKWM
AVDVKWAGDA KKKCRVGDTS
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661 NSVNGGKKSA ASRTRNTWDH CRVYTRKAKA GDKTVSKDSM
HWMTAYRDYK TDTAVMKRAK
721 AKTKVKTTVN SVAHASAAKK TTTNYWCTRN GKCKTVWACW
HSYKANKWNV KKTMNVAGTV
781 SNMHHSNNRA TTDGGVMDNT NSRWRHAVRK KSSAKSHSDK
AAYTDKVDAA MAKSDTSHSM
841 KKHNGKDANR VSDVAKKDVS MKRKANRSKM DVKMHATKSV
VSSHCVNYKS SVKSVMVKTG
901 RVKKTNKDRV TAKHYNGAKV TRKKCKSRKM RKMNVTWAAT DTTKRSAVGM SNDSVAWGKA
961 TKKKAHKSVT GSKMVGKKTV DKSNSNWAVT SRVWNYKHMT
DNTKWHADDS KKKKDKRKAM
1021 NDMRKVDSTR DAAKMANRGD HCRKVVSNRR AASHRKTGKA
SKNSDKAGVN KDNKDMSDNG
1081 TVNRGDNRTD RKRKKTKHNA KDRSRRKKAS HWYYKRADDK
CDKKASRDRK KDRKKKNAVR
1141 RAGSNGAAMA VTSKRWRSNA RRNAHTHTMV VTTDMDVSYV STYTSHASVD HNTCAKDDKS
1201 KNKDNSGRDH KKKTAASATS MKVKVAVAMD GKHRMYKRGR DRSVKWRHHY DMKVNWNVKK
1261 TNNWHAKYKW YKDGGRAVVR TNATGSSKTD VNKGSSRWHD CKARRKRKNV SRDNVWADNA
1321 TGDKVKARGK NTGGAVVSAR DKKKKTNWKV SRAKGVHKDR DHWSRNYNSA GDKVTVHGKA
1381 DVRSKGHYKK STVKRKDRSW AVNHRRTKDR AGSTTGASAS TVTVTSVVTK TVSKMSSVAA
1441 DNRAWTTDWS DRVKSRVMVG DDNMKKATDR RTAANKNKTS NARTTDRRWD VNRRNMKDST
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1501 WAKAVGVRGK DSWKGHTVDA KKTTKAKDRR SVDVANDAKR DYSADDTRKV HMTNNTSWGN
1561 HKRVSAATHR DKSWTATTAN VDASRKKDSR GVRMKWDGTH TDYHNDNGKR SGSDARRDNM
1621 NKWSKKSNRS HASSDWKRHS VWKDDSRAGG DAVKNDHRAK RKTKVMSTTV RTGKYRRANV
1681 TRRKAVNAWD KNRSADWRKD ARAADDKRAV KGSWVGDDSD HKVKARGAKN VNRVNDAHTT
1741 GSYNSTDNTR WRVAVDRVRH AHRDGASHST SVGWRASNKV YYNHTTTCWD HKMTYSADNN
1801 VRSAYRTAMK RRKACDSSAA CDADHNKNDM DNCTTYDRHN NVNVCVDMCN WNVYDTGRTG
1861 RRVSKTGSCK AHDKYRYKVA SSTGCDRRGH DSRGVASGGS NSVRSCANNK AADWMRSMVW
1921 VHRVAAATAK HAKCNCKCGR YRSKHNYDCS CSGRVAKGHK MHYMVYCTTT SGDVRDAKVK
1981 NKRTKRYAKH RMGYVTVGDN MTVTNWVDSA ASSSHDDTHS RHYASRAMNS NGSYNDSSNS
2041 DDHHYCSNDS SRSASSRGRA DNRNAYDRKH HKGSSMMTSS RDAAAKRHKG RARMDHNKSH
2101 RRAAKVNGTT VSSSTSRSDS SMRVVGSTSS MGDSDTSTGV MNNSSSRGRN AGKMRDTM [057] A distrofina é um componente importante dentro do tecido muscular que fornece estabilidade estrutural ao complexo de distroglicana (DGC) da membrana celular. Embora ambos os sexos possam carregar a mutação, as fêmeas são raramente afetadas com a forma muscular esquelética da doença.
[058] A mutações variam em relação à natureza e à frequência. Deleções genéticas grandes são encontradas em aproximadamente 60-70% dos casos, duplicações grandes são encontradas em aproximadamente 10% dos casos e
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55/259 mutantes pontuais ou outras alterações pequenas são responsáveis por aproximadamente 15-30% dos casos. Bladen et al. (2015), que examinaram aproximadamente 7000 mutações, catalogaram um total de 5.682 mutações grandes (80% das mutações totais), das quais 4.894 (86%) eram deleções (1 éxon ou mais) e 784 (14%) eram duplicações (1 éxon ou mais). Havia 1.445 mutações pequenas (menores que 1 éxon, 20% de todas as mutações), das quais 358 (25%) eram deleções pequenas e 132 (9%) inserções pequenas, enquanto que 199 (14%) afetavam os sítios de splice. A mutações pontuais totalizaram 756 (52% das mutações pequenas) com 726 (50%) mutações nonsense (sem sentido) e 30 (2%) mutações missense (com sentido errado). Finalmente, foram observadas 22 (0,3%) mutações dos introns do meio. Em adição, as mutações foram identificadas dentro do banco de dados que poderíam potencialmente beneficiar novas terapias genéticas para DMD incluindo terapias “read-through” até o códon de terminação “read-through” (10% das mutações totais) e terapia de pulo de éxons (80% das deleções e 55% das mutações totais).
B. Sintomas [059] Os sintomas geralmente aparecem em meninos com idades entre 2 e 3 anos e podem ser visíveis no início da infância. Muito embora os sintomas não apareçam até o início da infância, testes de laboratório podem identificar as crianças que carregam a mutação ativa no nascimento. É primeiramente observada a fraqueza muscular proximal progressiva nas pernas e na pelve associada com a perda de massa muscular. Eventualmente esta fraqueza se espalha para os braços, o pescoço e outras áreas. Os sinais iniciais podem incluir pseudohipertrofia (aumento dos músculos da panturrilha e deltoide), baixa resistência e dificuldades de ficar de pé sem ajuda ou incapacidade de subir escadas. À medida que a condição progride, o tecido muscular sofre perda e é eventualmente substituído por gordura e tecido fibrótico (fibrose). Aos 10 anos de idade, podem ser necessárias órteses para ajudar a andar, mas a maioria dos pacientes é dependente de cadeira de rodas aos 12 anos de idade. Os sintomas tardios podem incluir desenvolvimento ósseo anormal que leva
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56/259 a deformidades esqueléticas, incluindo curvatura da coluna. Devido à deterioração progressiva dos músculos, ocorre perda de movimento, eventualmente levando à paralisia. Deficiência intelectual pode ou não estar presente, mas se presente, não piora progressivamente à medida que a criança cresce. A expectativa de vida média para meninos afligidos com DMD é em torno de 25.
[060] O sintoma principal da distrofia muscular de Duchenne, um transtorno neuromuscular progressivo, é fraqueza muscular associada com a perda muscular com os músculos voluntários sendo afetados primeiro, especialmente aqueles do quadril, da área pélvica, das coxas, dos ombros e das panturrilhas. A fraqueza muscular também ocorre mais tarde, nos braços, no pescoço e outras áreas. As panturrilhas são frequentemente aumentadas. Os sintomas geralmente aparecem antes dos 6 anos de idade e podem aparecer no início da infância. Outros sintomas físicos são:
1. Forma desajeitada de andar, pisar ou correr - (os pacientes tendem a andar na ponta dos pés, devido ao tônus dos músculos da panturrilha aumentado. Ainda, caminhar nas pontas dos pés é uma adaptação de compensação para a fraqueza do extensor dos joelhos.)
2. Quedas frequentes.
3. Fadiga.
4. Dificuldade de motricidade (correr, saltar, pular).
5. Hiperlordose lombar, que possivelmente leva ao encurtamento dos músculos flexores do quadril. Isto tem um efeito sobre a postura total e uma forma de andar, pisar ou correr.
6. Contraturas musculares do tendão de Aquiles e hamstrings prejudicam a funcionalidade devido ao encurtamento das fibras musculares e à fibrose nos tecidos conjuntivos.
7. Dificuldade de andar progressiva.
8. Deforminadas nas fibras musculares.
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9. Pseudohipertrofia (aumento) dos músculos da lingua e da panturrilha. O tecido muscular é eventualmente substituído por gordura e tecido conjuntivo, portanto, o termo pseudohipertrofia.
10. Risco maior de transtornos neurocomportamentais (por exemplo, ADHD), transtornos de aprendizagem (dislexia) e redução não progressiva em tarefas cognitivas específicas (em particular, memória verbal de curto prazo), que se acredita que sejam o resultado da distrofina ausente ou disfuncional no cérebro.
11. Perda eventual na capacidade de andar (geralmente aos 12 anos de idade).
12. Deformidades esqueléticas (incluindo escoliose em alguns casos).
13. Dificuldade de levantar quando está deitado ou sentado.
[061] A condição pode ser frequentemente observada clinicamente desde o momento que o paciente começa a dar seus primeiros passos e a capacidade de andar geralmente é eliminada completamente no momento que o menino está 9 a 12 anos de idade. A maioria dos homens afetados com DMD fica essencialmente “paralisado do pescoço para baixo” aos 21 anos. A perda muscular começa nas pernas e na pelve, então avança para os músculos dos ombros e do pescoço, seguida pela perda dos músculos dos braços e dos músculos respiratórios. O aumento dos músculos da panturrilha (pseudohipertrofia) é bastante óbvio. A cardiomiopatia particularmente (cardiomiopatia dilatada) é comum, mas o desenvolvimento de insuficiência cardíaca congestiva ou arritmia (batimentos cardíacos irregulares) é apenas ocasional.
[062] Um sinal de Gowers positivo reflete os danos mais graves dos músculos dos membros inferiores. A criança se levanta com a ajuda dos membros superiores: primeiramente se elevando para ficar de pé com seus braços e joelhos e então percorrendo suas pernas com as mãos para se aprumar verticalmente. As crianças afetadas geralmente se cansam mais rapidamente e possuem menos força geral que seus coleguinhas. Os níveis de creatina quinase (CPK-MM) na corrente sanguínea são extremamente altos. Uma eletromiografia (EMG) mostra que a fraqueza é
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58/259 causada pela destruição do tecido muscular ao invés de danos nos nervos. Testes genéticos podem revelar erros genéticos no gene Xp21. Uma biopsia muscular (imunohistoquímica ou imunoblotting) ou um teste genético (teste sanguíneo) confirma a ausência da distrofina, embora aprimoramentos nos testes genéticos frequentemente tornem isto desnecessário.
[063] Pacientes com DMD podem sofrer de:
1. Músculo cardíaco anormal (cardiomiopatia).
2. Insuficiência cardíaca congestiva ou ritmo cardíaco irregular (arritmia).
3. Deformidades no peito e nas costas (escoliose).
4. Músculos das panturrilhas, das nádegas e dos ombros aumentados (aproximadamente aos 4 ou 5 anos de idade). Estes músculos são eventualmente substituídos por gordura e tecido conjuntivo (pseudohipertrofia).
5. Perda de massa muscular (atrofia).
6. Contraturas musculares nos calcanhares, nas pernas.
7. Deformidades musculares.
8. Distúrbios respiratórios, incluindo pneumonia e deglutição de alimento ou fluido para dentro dos pulmões (nos estágios tardios da doença).
C. Causas [064] A distrofia muscular de Duchenne (DMD) é causada por uma mutação do gene da distrofina no lócus Xp21, localizado no braço curto do cromossomo X. A distrofina é responsável por conectar o citoesqueleto de cada fibra muscular à lâmina basal subjacente (matriz extracelular), através de um complexo de proteínas contendo muitas subunidades. A ausência da distrofina permite que um excesso de cálcio penetre no sarcolema (a membrana celular). Alterações no cálcio e nas vias de sinalização fazem com que a água entre nas mitocôndrias, que então se rompem.
[065] Na distrofia muscular esquelética, a disfunção mitocondrial dá origem a uma amplificação dos sinais de cálcio do citosol induzidos por estresse e uma amplificação da produção de espécies de oxigênio reativas (ROS) induzida por estresse. Em um processo em cascata complexo que envolve várias vias e não é
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59/259 claramente entendido, o estresse oxidativo aumentado dentro da célula danifica o sarcolema e resulta eventualmente na morte da célula. As fibras musculares sofrem necrose e são por fim substituídas por tecido adipose e conjuntivo.
[066] A DMD é herdada em um padrão recessivo ligado ao X. As mulheres serão geralmente portadoras desta doença enquanto que os homens serão afetados. Tipicamente, uma mulher portadora não estará ciente de carregar uma mutação até que tenha um filho afligido. O filho de uma mãe portadora tem uma chance de 50% de herdar o gene defeituoso de sua mãe. A filha de uma portadora possui uma chance de 50% de ser portadora e uma chance de 50% de ter duas cópias normais do gene. Em todos os casos, um pai não afetado passará um Y normal para seu filho ou um X normal para sua filha. As mulheres portadoras de uma condição recessiva ligada ao X, tal como DMD, podem exibir sintomas dependendo de seu padrão de inativação do X.
[067] As deleções de éxons que precedem o éxon 51 do gene DMD humano, que interrompe o quadro aberto de leitura (ORF) por justaposição fora dos éxons do quadro, representam o tipo mais comum de mutação de DMD humana. O pulo do éxon 51 pode, em princípio, restaurar a ORF de DMD em 13% dos pacientes com DMD com deleções de éxons.
[068] A distrofia muscular de Duchenne possui uma incidência de 1 em 5000 meninos. As mutações dentro do gene da distrofina podem ser herdadas ou ocorrer espontaneamente durante a transmissão da linhagem germinativa. Uma tabela de exemplos de mutações, mas não limitantes e modelos correspondentes é apresentada a seguir:
Tabela 2: Mutações da distrofina e modelos correspondentes com camundongos
Deleção, inserção pequena e mutações nonsense (sem sentido) Nome do Modelo de Camundongo
Éxon 44 ΔΕχ44
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Éxon 52 ΔΕχ52
Éxon 43 ΔΕχ43
D. Diagnóstico [069] O aconselhamento genético é recomendado para pessoas com um histórico familiar do transtorno. A distrofia muscular de Duchenne pode ser detectada com aproximadamente 95% de acurácia por estudos genéticos realizados durante a gravidez.
Teste de DNA. A isoforma específica para os músculos do gene da distrofina é composta de 79 éxons e o teste e a análise de DNA podem geralmente identificar o tipo específico da mutação do éxon ou éxons que são afetados. O teste de DNA confirma o diagnóstico na maioria dos casos.
Biópsia do músculo. Se o teste de DNA falhar em encontrar a mutação, pode ser realizado um teste de biópsia do músculo. Uma pequena amostra de tecido muscular é extraída (geralmente com um bisturi ao invés de uma agulha) e é aplicado um corante que revela a presença da distrofina. A ausência completa da proteína indica a condição.
Ao longo de vários anos foram desenvolvidos testes de DNA que detectam mais das muitas mutações que causam a condição e a biópsia muscular não é necessária tão frequentemente para confirmar a presença de Duchenne.
Testes pré-natais. A DMD é carregada por um gene recessivo ligado ao X. Os homens possuem apenas um cromossomo X de forma que uma cópia do gene mutado causará DMD. Os pais não podem passar características ligadas ao X para seus filhos homens, assim a mutação é transmitida pela mãe.
[070] Se a mãe for uma portadora e, portanto, um de seus dois cromossomos X tiver uma mutação de DMD, há uma chance de 50% de que a menina herdará esta mutação na forma de um de seus dois cromossomos X e será uma portadora. Há uma chance de 50% de que um menino herdará esta mutação na forma de seu cromossomo X e, portanto, terá DMD.
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61/259 [071] Testes pré-natais podem dizer se a criança que ainda não nasceu tem as mutações mais comuns. Há muitas mutações responsáveis pela DMD e algumas não foram identificadas, de forma que os testes genéticos funcionam apenas quando os membros com DMD da família possuem uma mutação que foi identificada.
[072] Antes do teste invasivo é importante a determinação do sexo do feto; embora os meninos sejam frequentemente afetados por esta doença ligada ao X, a DMD em meninas DMD é extremamente rara. Isto pode ser realizado por teste de ultrassom em 16 semanas ou mais recentemente por teste de DNA fetal livre. A amostragem das vilosidades coriônicas (CVS) pode ser realizada em 11-14 semanas e possui um risco de 1% de aborto. A amniocentese pode ser realizada após 15 semanas e possui um risco de 0,5% de aborto. A amostragem do sangue fetal pode ser realizada em aproximadamente 18 semanas. Outra opção no caso de resultados de testes genéticos não esclarecedores é a biópsia muscular do feto.
E. Tratamento [073] Não há atualmente cura para DMD e uma necessidade médica atual foi reconhecida por autoridades reguladoras. Testes em Fase 1-2a com tratamento com pulo de éxon para certas mutações interromperam o declínio e produziram pequenas melhoras clínicas na capacidade de andar. O tratamento é geralmente voltado para o controle do início dos sintomas para maximizar a qualidade de vida e pode incluir o seguinte:
1. Corticosteroides tais como prednisolona e deflazacort aumentam a energia e a força e retardam a gravidade de alguns sintomas.
2. Testes de controle aleatórios mostraram que beta-2-agonistas aumentam a força muscular, mas não modificam a progressão da doença. O tempo de acompanhamento para a maior parte de RCTs sobre os beta2-agonistas é apenas de aproximadamente 12 meses e assim os resultados não podem ser extrapolados além de tal período de tempo.
3. Atividade física agradável suave tal como a natação é estimulada. A inatividade (tal como ficar de cama) pode piorar a doença muscular.
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4. Fisioterapia ajuda a manter a força, a flexibilidade e a função muscular.
5. Aparelhos ortopédicos (tais como órteses e cadeiras de rodas) podem aprimorar a mobilidade e a capacidade de se cuidar. Órteses removíveis ajustadas à forma para as pernas que mantém o tornozelo no lugar durante o sono podem retardar o início das contraturas.
6. Suporte respiratório apropriado à medida que a doença progride é importante.
[074] Padrões de cuidado/normas de procedimento multidisciplinares abrangentes para DMD foram desenvolvidos pelos Centers for Disease Control and Prevention (CDC) e estão disponíveis em wwe.treat-nmd.eu/dmd/care/diagnosismanagement-DMD.
[075] A DMD geralmente progride através de cinco estágios, que são descritos em Bushby etal., Lancet Neurol., 9(1): 77-93 (2010) e Bushby etal., Lancet Neurol., 9(2): 177-198 (2010), incorporados como referência em suas totalidades. Durante o estágio pré-sintomático, os pacientes tipicamente apresentam retardo no desenvolvimento, mas sem alteração da marcha. Durante o estágio ambulatório inicial, os pacientes tipicamente apresentam o sinal de Gowers, marcha anserina e andar na ponta dos pés. Durante o estágio ambulatório tardio, os pacientes tipicamente exibem uma marcha cada vez mais difícil e começam a perder sua capacidade de subir escadas e se levantar do chão. Durante o estágio não ambulatório inicial, os pacientes são tipicamente capazes de se impulsionar durante algum tempo, são capazes de manter a postura e podem desenvolver escoliose. Durante o estágio não ambulatorial tardio, a função dos membros superiores e a manutenção da postura são cada vez mais limitadas.
[076] Em algumas modalidades, o tratamento é iniciado no estágio présintomático da doença. Em algumas modalidades, o tratamento é iniciado no estágio ambulatório inicial. Em algumas modalidades, o tratamento é iniciado no estágio ambulatório tardio. Nas modalidades, o tratamento é iniciado durante o estágio não
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63/259 ambulatório inicial. Nas modalidades, o tratamento é iniciado durante o estágio não ambulatório tardio.
1. Fisioterapia [077] Os fisioterapeutas se preocupam em possibilitar que os pacientes atinjam seu potencial físico máximo. Seu objetivo é:
1. minimizar o desenvolvimento de contraturas e deformidades através do desenvolvimento de um programa de alongamentos e exercícios quando apropriado,
2. prever e minimizar outras complicações secundárias de natureza física através da recomendação de órteses e equipamento médico durável e
3. monitorar a função respiratória e recomendar técnicas para auxiliar com exercícios de respiração e métodos de eliminação de secreções.
2. Assistência Respiratória [078] “Ventiladores/respiradores de volume” modernos, que fornecem um volume (quantidade) ajustável de ar para a pessoa a cada respiração, são importantes no tratamento de pessoas com problemas respiratórios relacionados à distrofia muscular. O ventilador pode requerer um tubo endotraqueal ou de traqueotomia invasivo através do qual o ar é fornecido diretamente, mas, para algumas pessoas o fornecimento não invasivo através de uma máscara ou bocal é suficiente. Máquinas de pressão positiva nas vias aéreas, particularmente aquelas de dois níveis, são algumas vezes utilizadas desta última maneira. O equipamento respiratório pode ser facilmente ligado a uma bandeja ventiladora na parte de baixo ou atrás de uma cadeira de rodas motorizada com uma batería externa para portabilidade.
[079] O tratamento com ventilação pode começar na metade ou no final da adolescência quando os músculos respiratórios começam a sofrer colapso. Se a capacidade vital tiver caído abaixo de 40% do normal, um volume ventilador/respirador pode ser utilizado durante as horas de sono, um momento durante o qual é mais provável que a pessoa fique underventilação (“hipoventilação”). A hipoventilação durante o sono é determinada através de um histórico abrangente
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64/259 de distúrbio do sono com um estudo de oximetria e gás nos capilares sanguíneos (Ver Teste de Função Pulmonar). Um dispositivo para auxiliar a tosse pode ajudar no muco em excesso nos pulmões por hiperenchimento dos pulmões com pressão positiva do ar, então com pressão negativa para levar o muco para cima. Se a capacidade vital continuar a diminuir até menos de 30 por cento do normal, um ventilador/respirador de volume também pode ser necessário durante o dia para maior assistência. A pessoa aumentará gradualmente a quantidade de tempo de utilização do ventilador/respirador durante o dia quando necessário.
F. Prognóstico [080] A distrofia muscular de Duchenne é uma doença progressiva que eventualmente afeta todos os músculos voluntários e envolve os músculos cardíacos e respiratórios nos estágios tardios. A expectativa de vida atualmente é estimada como sendo de aproximadamente 25 anos, mas varia de paciente para paciente. Avanços recentes na medicina estão prolongando as vidas dos afligidos. A Muscular Dystrophy Campaign, que é uma instituição beneficente do Reino Unido importante que se concentra em todas as doenças musculares, declara que “com altos padrões de cuidado médico homens jovens com distrofia muscular de Duchenne estão frequentemente vivendo bem até seus 30 anos”.
[081] Em casos raros, foi observado que pessoas com DMD sobreviveram até os quarenta anos ou cinquenta e poucos anos, com o uso de posicionamento apropriado em cadeiras de rodas e camas, o suporte do ventilador (através de traqueostomia ou bocal), desobstrução das vias aéreas e medicações para o coração, se necessário. O planejamento precoce dos suportes necessários para cuidado posteriormente na vida mostrou maior longevidade em pessoas que vivem com DMD.
[082] Curiosamente, no modelo de camundongo mdx de distrofia muscular de Duchenne, a falta da distrofina está associada com níveis aumentados de cálcio e mionecrose do músculo esquelético. Os músculos intrínsecos da laringe (ILM) são protegidos e não sofrem mionecrose. Os ILM possuem um perfil de sistema de
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65/259 regulação de cálcio que sugere uma melhora capacidade de lidar com trocas de cálcio em comparação com outros músculos e isto pode fornecer uma compreensão mecanicista para suas propriedades patofisiológicas únicas. Os ILM podem facilitar o desenvolvimento de novas estratégias para a prevenção e o tratamento da perda muscular em uma variedade de cenários clínicos.
II. Outras Doenças que se Beneficiam da Edição Genômica [083] Em adição à descoberta da aplicação no tratamento de DMD, a abordagem com vários guias dos inventores pode ser vantajosamente aplicada em outros estados de doença em que tal intervenção podería resultar na correção dos defeitos genéticos causais subjacentes. Alguns destes são descritos sucintamente abaixo.
Distrofia Muscular de Cinturas. A distrofia muscular de cinturas (LGMD) ou distrofia muscular de Erb é um grupo geneticamente e clinicamente heterogêneos de distrofias musculares raras. É caracterizada por atrofia muscular progressiva que afeta predominantemente os músculos do quadril e dos ombros. A LGMD possui um padrão de herança autossômico e atualmente não há cura conhecida. Os sintomas de um indivíduo com distrofia muscular de cinturas (LGMD) geralmente possui dificuldade de andar, subir e descer escadas e levantar de uma cadeira. Dificuldade de se curvar e quedas frequentes também são comuns. Dificuldade de erguer certos objetos também é uma apresentação comum da LGMD bem como a dificuldade erguer seus braços ou levantar acima da cabeça. Eventualmente a capacidade de andar/correr deteriora-se.
[084] A doença fica inevitavelmente pior ao longo do tempo, embora a progressão seja mais rápida em alguns pacientes do que em outros. Eventualmente a doença pode afetar outros músculos tais como aqueles localizados na face. A doença comumente leva à dependência de uma cadeira de rodas dentro de anos desde o início dos sintomas, mas há uma alta variabilidade interpacientes, com alguns pacientes mantendo a mobilidade.
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66/259 [085] A fraqueza muscular é geralmente simétrica, proximal e lentamente progressiva. Na maioria dos casos, não há dor com a LGMD e a função mental não é afetada. A LGMD pode começar na infância, na adolescência, no início da idade adulta ou até mesmo mais tarde, a idade de início é geralmente entre 10 e 30 anos. Ambos os gêneros são afetados igualmente, quando a distrofia muscular de cinturas começa na infância a progressão parece ser mais rápida e a doença é mais incapacitante. Quando o transtorno começa na adolescência ou na idade adulta a doença geralmente não é tão grave e progride mais lentamente. Não há neuropatia sensorial ou disfunção autonômica ou visceral na apresentação.
[086] Em termos da genética da LGMD esta é um transtorno hereditário, posto que pode ser herdado na forma de um defeito genético dominante ou recessivo. O resultado do defeito é que os músculos não podem formar apropriadamente certas proteínas necessárias para a função muscular normal. Várias proteínas diferentes podem ser afetadas e a proteína específica que está ausente ou defeituosa identifica o tipo específico de distrofia muscular. Dentre as proteínas afetadas na LGMD estão α, β, y e δ sarcoglicanas. As sarcoglicanopatias possivelmente poderíam ser tratáveis com terapia gênica.
Disferlinopatia. A disferlinopatia é um transtorno muscular autossômico recessivo causado por uma deficiência de proteína disferlina funcional devido a mutações no gene da disferlina. A disferlinopatia é caracterizada por atrofia muscular progressiva e é mais frequentemente diagnosticada clinicamente como Distrofia muscular de cinturas do tipo 2B (LGMD2B) ou distrofia muscular de Miyoshi 1 (MMD1; um tipo de distrofia muscular distai), dependendo do padrão inicial de envolvimento muscular no diagnóstico. A disferlinopatia é uma doença rara, cuja incidência exata ainda não foi determinada.
[087] Os sintomas da disferlinopatia geralmente se manifestam no início da fase adulta entre os 16 e 25 de idades e afetam primariamente o músculo esquelético dos membros ou das cinturas dos membros (quadris e ombros), deixando músculos críticos tais como o coração e o diafragma em basicamente não afetados. A maioria
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67/259 dos pacientes com disferlinopatia não conseguem mais andar dentro de 10-20 anos do diagnóstico, mas a expectativa de vida é normal. Há uma grande quantidade de variabilidade na idade do início do início e da progressão da doença.
[088] Embora ambas as LGMD2B e MMD1 sejam causadas por deficiência da disferlina, um diagnóstico de LGMD2B é dado quando a fraqueza se apresenta inicialmente nos músculos proximais (coxas e antebraços) enquanto que um diagnóstico de MMD1 é dado quando a fraqueza se apresenta inicialmente nos músculos distais (panturrilhas e braços). Em ambos os casos, a fraqueza eventualmente progride incluindo tanto os músculos distais quanto proximais. Tanto a LGMD2B quanto a MMD1 são muito difíceis de diagnosticar e os pacientes frequentemente recebem diagnóstico errado muitas vezes antes de serem diagnosticado de forma bem-sucedida com disferlinopatia.
[089] Embora a “disferlinopatia” simplesmente se refira à ausência da proteína disferlina, a LGMD2B e a miopatia de Miyoshi 1 são o diagnóstico confirmado apenas quando puderem ser detectadas mutações no gene da disferlina. É essencial que os pacientes recebam um diagnóstico genético pela participação em estudos e testes clínicos específicos para disferlinopatia. A Jain Foundation é uma organização familiar não lucrativa (www.jain-foundation.org) que ajuda pacientes com distrofia muscular de cinturas a conseguirem um diagnóstico genético através da organização dos testes e cobrindo o custo.
Miopatia de Titina. Titina, também conhecida como conectina, é uma proteína que, em humanos, é codificado pelo gene TTN. A titina é uma proteína gigante, maior que 1 pm de comprimento que funciona como uma mola molecular que é responsável pela elasticidade passiva do músculo. É composta de 244 domínios de proteínas dobradas individualmente conectados por sequências peptídicas não estruturadas. Estes domínios se desdobram quando a proteína é esticada e se dobram de novo quando a tensão é removida.
[090] A titina é importante na contração de tecidos musculares estriados. Esta conecta a linha Z com a linha M no sarcômero. A proteína contribui para a transmissão
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68/259 da força na linha Zea liberação da tensão na região da banda I. Isto limita a faixa de movimento do sarcômero na tensão, contribuindo assim para a rigidez passiva do músculo. Variações na sequência da titina entre os tipos deferentes de músculos (por exemplo, cardíacos ou esqueléticos) foram correlacionadas com diferenças nas propriedades mecânicas destes músculos.
[091] A titina é uma proteína abundante grande do músculo estriado. As funções primárias da titina são estabilizar o filamento grosso, centralizá-lo entre os filamentos finos, prevenir o superesticamento do sarcômero e retrair o sarcômero como uma mola após este ser esticado. Uma região do disco Z N-terminal e uma região de linha M C-terminal se ligam à linha Z e à linha M do sarcômero, respectivamente, de forma que uma única molécula de titina alcance metade do comprimento de um sarcômero. A titina contém ainda sítios de ligação para proteínas associadas aos músculos de forma que esta serve como um molde de adesão para a montagem do maquinário contrátil nas células musculares. Esta também foi identificada como uma proteína estrutural para os cromossomos. Existe uma variabilidade considerável nas regiões da banda I, da linha M e do disco Z da titina. A variabilidade na região da banda I contribui para as diferenças na elasticidade da isoforma de titina diferente e, portanto, para as diferenças na elasticidade de tipos de músculos diferentes. Das muitas variantes da titina identificadas, cinco estão descritas com informação completa sobre o produto da transcrição disponível.
[092] Mutações em qualquer lugar dentro da sequência não usualmente longa deste gene podem causar códons de término prematuros ou outros defeitos. As mutações da titina estão associadas à miopatia hereditária com insuficiência respiratória precoce, miopatia de início precoce com cardiomiopatia fatal, miopatia do tipo core com doença cardíaca, miopatia centronuclear, distrofia muscular de cinturas do tipo 2J, cardiomiopatia dilatada familiar 9, cardiomiopatia hipertrófica e distrofia muscular tibial. Uma pesquisa adicional sugere que nenhuma forma ligada geneticamente de qualquer distrofia ou miopatia pode ser excluída de forma segura de ser causada por uma mutação no gene TTN. Mutações de truncamento nos
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69/259 pacientes com cardiomiopatia dilatada são mais comumente encontradas na região A; embora possa ser esperado que truncamentos na região I a montante impeçam a tradução da região A inteiramente, um splicing alternativo cria alguns produtos da transcrição que não encontram o códon de término prematuro, melhorando seu efeito. Autoanticorpos para titina são produzidos em pacientes com a doença autoimune escleroderma.
Miopatia congênita “doença do tipo core central” causada por mutação no receptor de rianodina (mutação com pseudoéxons). A doença do tipo core central (CCD), também conhecida como central miopatia do tipo core, é uma miopatia congênita autossômica dominante (transtorno muscular inato). Foi primeiramente descrita por Shy e Magee em 1956. É caracterizada pelo aparecimento da miofibrila no microscópio.
[093] Os sintomas de CCD são variáveis, mas geralmente envolvem hipotonia (tônus muscular reduzido) no nascimento, retardo brando no desenvolvimento da criança (altamente variável entre os casos), fraqueza dos músculos faciais e malformações esqueléticas tais como escoliose e deslocamento do quadril.
[094] Os sintomas podem estar presentes no nascimento ou podem aparecer em qualquer estágio da vida. Parece haver um número crescente de pessoas que não se tornam sintomáticas até a idade adulta à meia idade. Embora geralmente não progressiva, novamente parece haver um número crescente de pessoas que sofrem uma progressão clinicamente significativa lenta da sintomatologia. Estes casos podem hipoteticamente ser causados pelo grande número de mutações gênicas de mau funcionamento do receptor de rianodina e com pesquisa contínua podem ser descobertas de fato como sendo variantes clínicas.
[095] O diagnóstico é constituído da combinação de sintomas típicos e da aparência na biópsia (amostra de tecido) do músculo. O nome deriva da aparência típica da biópsia na microscopia óptica, na qual as células musculares possuem núcleos (cores) que são desprovidos de mitocôndrias e enzimas específicas. A
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70/259 insuficiência respiratória se desenvolve em uma pequena proporção dos casos. A creatina quinase e a eletromiografia (EMG) tendem a ser normais.
[096] A doença do tipo core central é herdada de uma maneira autossômica dominante. A maioria dos casos possui mutações que podem ser demonstradas no gene do receptor de rianodina do tipo 1 (RYR1), que são frequentemente de novo (recém-desenvolvidas). Pessoas com CCD estão em risco de hipertermia maligna (MH) quando recebem anestesia geral.
[097] Não há tratamento específico, mas anestésicos gatilhos são evitados e parentes são verificados em relação às mutações do RYR1 como aquelas que os tornam suscetíveis à MH.
Distrofia Miotônica. A distrofia miotônica é um transtorno genético em longo prazo que afeta a função muscular. Os sintomas incluem o agravamento gradual da perda e da fraqueza muscular. Os músculos frequentemente se contraem e são incapazes de relaxamento. Outros sintomas podem incluir cataratas, deficiência intelectual e problemas de condução cardíaca. Nos homens pode haver calvice precoce e uma incapacidade de ter filhos.
[098] A distrofia miotônica é um transtorno autossômico dominante que é tipicamente herdado dos pais do indivíduo. Há dois tipos principais: tipo 1 (DM1) causado por mutações no gene DMPKe tipo 2 (DM2) causado por mutações no gene CNBP. O transtorno geralmente se agrava a cada geração. Um tipo de DM1 pode ser evidente no nascimento. DM2 é geralmente mais branda. Estes são tipos de distrofia muscular. O diagnóstico é confirmado através de testes genéticos.
[099] Não há cura. Os tratamentos podem incluir órteses ou cadeiras de rodas, marcapassos e ventilação com pressão positiva não invasiva. Os medicamentos mexiletina ou carbamazepina são ocasionalmente úteis. Dor, se esta ocorrer, pode ser tratada como antidepressivos tricíclicos e fármacos antiinflamatórios não esteroides (NSAIDs).
[0100] A distrofia miotônica afeta mais de 1 em 8.000 pessoas no mundo todo. Embora a distrofia miotônica possa ocorrer em qualquer idade, o início ocorre
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71/259 tipicamente aos 20 e 30 anos. É a forma mais comum de distrofia muscular que começa na idade adulta. Foi primeiramente descrita em 1909 com a causa subjacente do tipo 1 determinada em 1992.
[0101] A apresentação dos sintomas e dos sinais varia consideravelmente com a forma (DM1/DM2), a gravidade e ainda fenótipos de DM2 não usuais. Os sintomas de DM1 para DM2 incluem problemas com a função executiva (por exemplo, organização, concentração, capacidade de encontrar palavras) e hipersonia. Anormalizadas de condução são mais comuns na DM1 do que na DM2, mas todas as pessoas são aconselhadas a fazer uma ECG anual. Ambos os tipos também estão associados à resistência à insulina. A distrofia miotônica também pode ter uma catarata cortical com o aparecimento de um ponto azul ou uma catarata subcapsular posterior.
[0102] A DM2 é geralmente mais branda que a DM1, com geralmente menos pessoas com DM2 necessitando de tecnologia assistiva do que pessoas com DM1. Em adição, a forma congênita grave que afeta bebês na DM1 não foi observada na DM2 e é citado na literatura médica que o início precoce dos sintomas raramente aparece em pessoas mais jovens.
[0103] Os sintomas podem aparecer em qualquer momento da infância até a idade adulta. A DM causa fraqueza geral, que geralmente começa nos músculos das mãos, dos pés, do pescoço ou da face. Esta progride lentamente envolvendo outros grupos musculares, inclusive o coração. A DM também afeta uma ampla variedade de outros sistemas de órgãos.
[0104] A distrofia miotônica é uma condição genética que é herdada em um padrão autossômico dominante e assim será passada adiante para 50% de uma prole de portadores, em média. A distrofia miotônica é um dos vários transtornos de repetições trinucleotídicas conhecidos. Certas áreas do DNA possuem sequências repetidas de dois ou três nucleotídeos.
[0105] A distrofia miotônica (DM) é uma doença herdada. Uma forma grave da DM, distrofia miotônica congênita, pode aparecer em recém-nascidos de
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72/259 mães que têm DM. A distrofia miotônica congênita também pode ser herdada através do gene paterno, embora seja dito que é relativamente raro. Congênita significa que a condição está presente desde o nascimento.
[0106] Na DM1, o gene afetado é chamado de DMPK, que codifica proteína quinase da distrofia miotônica, uma proteína expressa predominantemente no músculo esquelético. O gene fica localizado no braço longo do cromossomo 19.
[0107] Na DM1, há uma expansão da repetição tripla de citosina-timinaguanina (CTG) no gene DMPK. Entre 5 e 37 repetições é considerada normal, enquanto que indivíduos com entre 38 e 49 repetições são considerados como possuindo uma pré-mutação e estão em risco de ter crianças com repetições adicionalmente expandidas e, portanto, doença sintomática. Os indivíduos com mais de 50 repetições são quase invariavelmente sintomáticos, com algumas exceções observadas. Repetições mais longas são geralmente associadas ao início mais precoce e à doença mais grave.
[0108] Os alelos DMPK com mais de 37 repetições são instáveis e repetições trinucleotídicas adicionais podem ser inseridas durante a divisão celular na mitose e na meiose. Consequentemente, os filhos de indivíduos com pré-mutações ou mutações herdam alelos de DMPK que são mais longos que dos seus pais e, portanto, há maior probabilidade de serem afetados ou exibirem um início mais precoce e maior gravidade da condição, um fenômeno conhecido como antecipação. De forma interessante, a transmissão paterna da condição é muito incomum, possivelmente devido às pressões de seleção contra os espermatozóides com repetições expandidas, mas a antecipação tende a ser menos grave que nos casos de herança materna.
[0109] O RNA da região com repetições trinucleotídicas expandida forma hairpin loops intranucleoplasmáticos devido à ligação de hidrogênio extensiva entre os pares de bases C-G e foi demonstrado que estes sequestram o regulador de splicing MBNL1 para formar foci distintivos através de sua marcação com GFP e um oligonucleotídeo de sonda com o corante fluorescente vermelho Cyanineõ (Cy5).
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73/259 [0110] A DM2 é causada por um defeito no gene ZNF9 no cromossomo 3. O defeito específico é uma repetição do tetranucleotídeo citosina-citosina-timinaguanosina (CCTG) no gene ZNF9. Uma vez que envolve a repetição de quatro nucleotídeos, não é um transtorno de repetições trinucleotídicas, mas sim um transtorno de repetições tetranucleotídicas.
[0111] A expansão das repetições para a DM2 é muito maior que para a DM1, variando de 75 até mais de 11.000 repetições. Diferentemente que na DM1, o tamanho da expansão de DNA repetida na DM2 não parece fazer uma diferença na idade do início ou na gravidade da doença. A antecipação parece ser menos significativa na DM2 e revisões mais atuais relatam apenas uma antecipação branda como uma característica da DM2.
Ataxia de Friedreich. A ataxia de Friedreich é uma doença hereditária autossômica recessiva que causa danos progressivos no sistema nervoso. Esta se manifesta nos sintomas iniciais de coordenação deficiente tal como alteração da marcha; também pode levar à escoliose, à doença cardíaca e ao diabetes, mas não afeta a função cognitiva. A doença progride até que uma cadeira de rodas seja necessária para mobilidade. Sua incidência na população geral é de aproximadamente 1 em 50.000.
[0112] A mutação gênica particular (expansão de uma repetição tripla de GAA intrônica no gene FXN) leva à expressão reduzida da proteína frataxina mitocondrial. Ao longo do tempo esta deficiência causa os danos mencionados anteriormente, bem como fadiga frequente causada por efeitos sobre o metabolismo celular.
[0113] A ataxia da ataxia de Friedreich resulta da degeneração do tecido nervoso na medula espinhal, em particular dos neurônios sensoriais essenciais (através de conexões com o cerebelo) para direcionar o movimento muscular dos braços e das pernas. A medula espinhal fica mais fina e as células nervosas perdem parte de sua bainha de mielina (a cobertura de isolamento sobre algumas células nervosas que ajuda a conduzir os impulsos nervosos).
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74/259 [0114] Os sintomas tipicamente começam em algum momento entre os 5 a 15 anos de idade, mas na Late Onset FA (AF de Início Tardio) podem ocorrer aos 20 ou 30 anos de idade. Os sintomas incluem qualquer combinação, mas não necessariamente todos, de fraqueza muscular nos braços e nas pernas, perda de coordenação, danos na visão, danos na audição, fala arrastada, curvatura da coluna, arcos plantares altos (deformidade pes cavus dos pés), diabetes (aproximadamente 20% das pessoas com ataxia de Friedreich desenvolvem intolerância a carboidratos e 10% desenvolvem diabetes mellitus) e distúrbios no coração (por exemplo, fibrilação atrial e taquicardia resultante (frequência cardíaca alta) e cardiomiopatia hipertrófica).
[0115] Se apresenta antes dos 22 anos de idade com marcha cambaleante ou com tropeços progressiva e quedas frequentes. As extremidades inferiores são mais gravemente envolvidas. Os sintomas são lentos e progressivos. Uma observação em longo prazo mostra que muitos pacientes atingem um platô nos sintomas na idade adulta inicial dos pacientes. Na média, após 10-15 anos com a doença, os pacientes geralmente ficam dependentes da cadeira de rodas e necessitam de assistência em todas as atividades da vida diária.
[0116] Os sinais físicos a seguir podem ser detectados no exame físico: sinais cerebelares tais como nistagmo, movimentos dos olhos sacádicos rápidos, ataxia troncular, disartria, dismetria; lesões de neurônios motores inferiores, tais como reflexos de tendões profundos ausentes; sinais piramidais tais como respostas do reflexo plantar e fraqueza distai são comumente observados; aspectos da coluna dorsal, de forma que ocorra perda da sensação vibratória e proprioceptiva. O envolvimento cardíaco ocorre em 91% dos pacientes, incluindo cardiomegalia (até cardiomiopatia dilatada), hipertrofia simétrica, sopros no coração e defeitos de condução. A média de idade de morte é de 35 anos, enquanto que mulheres têm melhor prognóstico com uma sobrevivência de 20 anos de 100% quando comparados com 63% nos homens. Vinte por cento dos casos são observados em associação com diabetes mellitus.
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75/259 [0117] A ataxia de Friedreich é um transtorno autossômica recessivo que ocorre quando o gene FXN contém repetições de GAA intrônicas amplificadas (um exemplo de expansão de repetições trinucleotídicas). O gene FXN codifica a proteína frataxina. A expansão de repetições de GAA faz com que os níveis de frataxina sejam reduzidos. A frataxina é uma proteína que se liga ao ferro responsável pela formação de agrupamentos de ferro-enxofre. Um resultado da deficiência de frataxina é a sobrecarga de ferro nas mitocôndrias que pode causar danos a muitas proteínas. A função exata da frataxina na fisiologia normal continua incerta. O gene fica localizado no cromossomo 9.
[0118] O gene mutante contém repetições de tripletos de GAA expandidas no primeiro íntron; em algumas linhagens, foram detectadas mutações pontuais. Uma vez que o defeito fica localizado em um íntron (que é removido do produto da transcrição do mRNA entre a transcrição e a tradução), esta mutação não resulta na produção de proteínas frataxina anormais. Ao invés disso, a mutação causa silenciamento gênico (isto é, a mutação diminui a transcrição do gene) através da indução de uma estrutura de heterocromatina de uma maneira similar à variegação do efeito de posição.
[0119] Além de reduzir a expressão de frataxina, extensões longas de repetições de GAA induzem quebras no cromossomo em estudos com leveduras in vivo.
Doença de Huntington. A doença de Huntington (HD), também conhecida como coréia de Huntington, é um transtorno hereditário que resulta na morte de células cerebrais. Os sintomas mais precoces são frequentemente problemas sutis no humor ou nas capacidades mentais. Vem frequentemente a seguir uma falta de coordenação geral e uma marcha instável. À medida que a doença avança, movimentos corporais espasmódicos descoordenados se tornam mais evidentes. As capacidades físicas pioram gradualmente até que o movimento coordenado fique difícil e a pessoa fique incapaz de falar. As capacidades mentais declinam até a demência. Os sintomas específicos variam de alguma maneira entre as pessoas. Os
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76/259 sintomas geralmente começam entre os 30 e 50 anos de idade, mas podem começar em qualquer idade. A doença pode se desenvolver mais cedo durante a vida em cada geração sucessiva. Aproximadamente 8% dos casos começam antes dos 20 anos de idade e tipicamente apresentam sintomas mais similares aos da doença de Parkinson. Pessoas com HD frequentemente subestimam o grau de seus problemas.
[0120] A HD é tipicamente herdada dos pais da pessoa com 10% dos casos causados por uma nova mutação. A doença é causada por uma mutação autossômica dominante em qualquer uma das duas cópias de um indivíduo de um gene chamado Huntingtin. Isto significa que uma criança de uma pessoa afetada tipicamente tem uma chance de 50% de herdar a doença. O gene Huntingtin fornece a informação genética para uma proteína que é também chamada de “huntingtina”. A expansão de repetições dos tripletos de CAG (citosina-adenina-guanina) no gene que codifica a proteína Huntingtina resulta em uma proteína anormal, que gradualmente danifica as células no cérebro, através de mecanismos que não são completamente entendidos. O diagnóstico é através de teste genético, que pode ocorrer em qualquer ponto do tempo independentemente do fato dos sintomas estarem ou não presentes. Este fato gera vários debates éticos: a idade na qual um indivíduo é considerado maduro o suficiente para escolher testar; se os pais têm o direito de testar suas crianças; e controle de confidencialidade e divulgação dos resultados do teste.
[0121] Não há cura para HD. É necessário cuidado em tempo integral nos estágios tardios da doença. Tratamentos podem aliviar alguns sintomas e em alguns melhorar a qualidade de vida. A melhor evidência para o tratamento dos problemas de movimento é com a tetrabenazina. A HD afeta aproximadamente 4 a 15 em 100.000 pessoas de descendência europeia. É rara entre os japoneses e ocorre a uma taxa desconhecida na África. A doença afeta homens e mulheres igualmente. Complicações tais como pneumonia, doença cardíaca e danos físicos causados pelas quedas reduzem a expectativa de vida. Suicídio é a causa de morte em aproximadamente 9% dos casos. A morte ocorre tipicamente quinze a vinte anos desde que a doença foi primeiramente detectada.
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77/259 [0122] Os sintomas da doença de Huntington se tornam mais comumente notáveis entre as idades de 35 e 44 anos, mas podem começar em qualquer idade desde a infância até a velhice. Nos estágios iniciais, há alterações sutis na personalidade, na cognição e nas habilidades físicas. Os sintomas físicos são geralmente os primeiros a serem notados, uma vez que os sintomas cognitivos e comportamentais geralmente não são graves o suficiente para serem reconhecidos por si só nos estágios iniciais. Quase todo mundo com a doença de Huntington eventualmente exibe sintomas físicos similares, mas o início, a progressão e a extensão dos sintomas cognitivos e comportamentais variam significativamente entre os indivíduos.
[0123] Os sintomas físicos iniciais mais característicos são movimentos espasmódicos, aleatórios e incontroláveis chamados coréia. A coréia pode ser inicialmente exibida como agitação geral, pequenos movimentos iniciados não intencionalmente ou incompletos, falta de coordenação ou movimentos dos olhos sacádicos retardados. Estas anormalidades motoras menores geralmente precedem sinais mais óbvios de disfunção motora em pelo menos três anos. O aparecimento evidente de sintomas tal como rigidez, atetose ou postura anormal ocorre à medida que o transtorno evolui. Estes são sinais de que o sistema no cérebro que é responsável pelo movimento foi afetado. Funções psicomotoras se tornam cada vez mais prejudicadas, de forma que qualquer ação que necessite de controle muscular seja afetada. As consequências comuns são instabilidade física, expressão facial anormal e dificuldades de mastigar, engolir e falar. As dificuldades de comer comumente causam perda de peso e podem levar à desnutrição. Perturbações do sono também são sintomas associados. A HD juvenil difere nos sintomas pelo fato de que geralmente progride mais rápido e a coréia é exibida sucintamente, se exibida, com a rigidez sendo o sintoma dominante. Convulsões são um sintoma comum desta forma de HD.
[0124] As capacidades cognitivas são progressivamente prejudicadas. São especialmente afetadas as funções executivas que incluem planejamento,
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78/259 flexibilidade cognitiva, pensamento abstrato, aquisição de regras, iniciação de ações apropriadas e inibição de ações inapropriadas. À medida que a doença progride, tendem a aparecer déficits de memória. Os danos relatados variam de déficits de memória de curto prazo até dificuldades de memória de longo prazo, incluindo déficits na memória episódica (memória da vida do indivíduo), procedural (memória do corpo de como realizar uma atividade) e de trabalho. Os problemas cognitivos tendem a piorar ao longo do tempo, finalmente levando à demência. Este padrão de déficits foi chamado de síndrome de demência subcortical para distingui-lo dos efeitos típicos de demências corticais, por exemplo, doença de Alzheimer.
[0125] As manifestações neuropsiquiátricas relatadas são ansiedade, depressão, uma demonstração de emoções reduzida (embotamento afetivo), egocentrismo, agressividade e comportamento compulsivo, dos quais o último pode causar ou piorar vícios, incluindo alcoolismo, jogos de azar e hipersexualidade. Foram também observadas dificuldades de reconhecer expressões negativas de outras pessoas. A prevalência destes sintomas é altamente variável entre os estudos, com taxas estimadas para prevalência ao longo da vida de transtornos psiquiátricos entre 33% e 76%. Para muitos daqueles que sofrem e suas famílias, estes sintomas estão entre os aspectos mais penosos da doença, afetando frequentemente as atividades da vida diária e constituindo motivo para institucionalização. Pensamentos suicidas e tentativas de suicídio são mais comuns do que na população geral. Os indivíduos frequentemente possuem consciência reduzida dos danos da coréia, cognitivos e emocionais.
[0126] A Huntingtina mutante é expressa ao longo do corpo todo e está associada a anormalidades nos tecidos periféricos que são diretamente causadas por tal expressão fora do cérebro. Estas anormalidades incluem atrofia muscular, insuficiência cardíaca, tolerância prejudicada à glicose, perda de peso, osteoporose e atrofia dos testículos.
[0127] Todos os seres humanos possuem duas cópias do gene da Huntingtina (HTT), que codifica a proteína Huntingtina (HTT). O gene é também
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79/259 chamado de HD e IT15, que significa 'produto da transcrição de interesse 15'. Parte deste gene é uma seção repetida chamada de repetição trinucleotídica, que varia em comprimento entre os indivíduos e pode mudar o comprimento entre as gerações. Se a repetição estiver presente em um gene saudável, uma mutação dinâmica pode aumentar a contagem da repetição e resultar em um gene defeituoso. Quando o comprimento desta seção repetida atinge certo limite, isto produz uma forma alterada da proteína, chamada de proteína Huntingtina mutante (mHTT). As funções diferentes destas proteínas são a causa de alterações patológicas que por sua vez causam os sintomas da doença. A mutação da doença de Huntington é geneticamente dominante e quase completamente penetrante: a mutação de qualquer um dos alelos HTT de uma pessoa causa a doença. Esta não é herdada de acordo com o sexo, mas o comprimento da seção repetida do gene e, consequentemente, sua gravidade podem ser influenciados pelo sexo do progenitor afetado.
[0128] A HD é um dos vários transtornos de repetições trinucleotídicas que são causados pelo comprimento de uma seção repetida de um gene que excede uma faixa normal. O gene HTT está localizado no braço curto do cromossomo 4 em 4p16.3. HTT contém uma sequência de três bases de DNA—citosina-adeninaguanina (CAG)—repetida várias vezes (isto é, ... CAGCAGCAG ...), conhecida como uma repetição trinucleotídica. CAG é o código genético de 3 letras (códon) para o aminoácido glutamina, assim, uma série destes resulta na produção de uma cadeia de glutamina conhecida como uma expansão de poliglutamina (ou expansão polyQ) e a parte repetida do gene, a região PolyQ.
[0129] Geralmente, as pessoas possuem menos de 36 glutaminas repetidas na região polyQ o que resulta na produção da proteína citoplasmática Huntingtina. Entretanto, uma sequência de 36 ou mais glutaminas resulta na produção de uma proteína que possui características diferentes. Esta forma alterada, chamada de huntingtina mutante (mHTT), aumenta a taxa de deterioração de certos tipos de neurônios. Regiões do cérebro possuem quantidades e dependência diferentes destes tipos de neurônios e são consequentemente afetadas. Geralmente, o número
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80/259 de repetições CAG está relacionado a quanto desse processo é afetado e é responsável por aproximadamente 60% da variação da idade do início dos sintomas. A variação restante é atribuída ao ambiente e outros genes que modificam o mecanismo da HD. 36-39 repetições resultam em uma forma de penetrância reduzida da doença, com um início mais tarde e uma progressão mais lenta dos sintomas. Em alguns casos o início pode ocorrer tão tardiamente que os sintomas são nunca notados. Com contagens de repetições muito grandes, a HD possui penetrância complete e pode ocorrer abaixo dos 20 anos de idade, quando é então referida como HD juvenil, HD acinética-rígida ou de variante de Westphal. Isto ocorre em aproximadamente 7% dos portadores de HD.
Ataxia telangiectasia. A ataxia-telangiectasia (AT ou A-T), também referida como síndrome de ataxia-telangiectasia ou síndrome de Louis-Bar, é uma doença autossômica recessiva neurodegenerativa rara que causa incapacidade grave. Ataxia refere-se à coordenação deficiente e telangiectasia a pequenos vasos sanguíneos dilatados, dos quais ambos são características distintivas da doença.
[0130] A A-T afeta muitas partes do corpo. Prejudica certas áreas do cérebro incluindo o cerebelo, causando dificuldade de movimento e coordenação. Enfraquece o sistema imunológico, causando uma predisposição à infecção. Impede o reparo do DNA quebrado, aumentando o risco de câncer.
[0131] Os sintomas aparecem primeiro mais frequentemente no início da infância (no estágio de 1 a 3 anos) quando a criança começa a andar. Embora geralmente comecem a andar na idade normal, cambaleiam ou inclinam-se para os lados quando andam, quando ficam paradas de pé ou sentadas e quase pode parecer como se estivessem bêbadas. Na idade do final da pré-escola e na idade do início da escola, desenvolvem dificuldade de mover seus olhos de uma maneira natural de um local para o seguinte (apraxia oculomotora). Desenvolvem fala arrastada ou distorcida e problemas de deglutição. Alguns têm um número aumentado de infecções do trato respiratório (infecções no ouvido, sinusite, bronquite e pneumonia). Uma vez que nem todas as crianças se desenvolvem da mesma maneira ou na mesma velocidade,
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81/259 podem passar anos até que a A-T seja diagnosticada apropriadamente. A maioria das crianças com A-T tem sintomas neurológicos estáveis durante os primeiros 4-5 anos de vida, mas começam a exibir problemas crescentes nos primeiros anos escolares.
[0132] A A-T é causada por um defeito no gene ATM, que é responsável pelo controle da resposta das células a várias formas de estresse incluindo quebras de filamento duplo no DNA. Em termos simples, a proteína produzida pelo gene ATM reconhece que há uma quebra no DNA, recruta outras proteínas para consertar as quebras e faz com que a célula pare de produzir no DNA até que o reparo seja concluído.
[0133] Há uma variabilidade substancial na gravidade das características da A-T entre os indivíduos e em idades diferentes. Os sintomas ou problemas a seguir são características comuns ou importantes da A-T:
Ataxia (dificuldade de controle dos movimentos) que é evidente logo no início, mas piora na escola até a pré-adolescência.
Apraxia oculomotora (dificuldade de coordenação da cabeça e movimento dos olhos quando desvia o olhar de um lugar para outro).
Movimentos involuntários.
Telangiectasia (vasos sanguíneos dilatados) ao longo do branco (esclera) dos olhos, fazendo-os parecer injetados de sangue. Isto não é evidente na infância e pode aparecer primeiro na idade de 5-8 anos. A telangiectasia também pode aparecer nas áreas da pele expostas ao sol.
Problemas de infecções, especialmente dos olhos, seios da face e pulmões.
Maior incidência de câncer (primariamente, mas não exclusivamente, linfomas e leucemias).
Início retardado ou desenvolvimento da puberdade incompleto e menopausa muito precoce.
Taxa de crescimento retardada (peso e/ou altura).
Salivação particularmente nas crianças pequenas quando estão cansadas ou se concentrando nas atividades.
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Disartria (sons da fala arrastados, lentos ou distorcidos).
Diabetes na adolescência ou mais tarde.
Alteração prematuras nos cabelos e na pele.
[0134] Muitas crianças recebem inicialmente diagnóstico errado como tendo paralisia cerebral atáxica. O diagnóstico da A-T pode não ser feito até a idade pré-escolar quando os sintomas neurológicos de marcha prejudicada, coordenação manual, fala e movimento dos olhos aparecem ou agravam-se e a telangiectasia aparece pela primeira vez. Uma vez que a A-T é tão rara, os médicos podem não estar familiarizados com os sintomas ou os métodos de realizar um diagnóstico. O aparecimento tardio da telangiectasia pode ser uma barreira para o diagnóstico. Pode levar algum tempo antes que os médicos considerem a A-T como uma possibilidade devido à estabilidade logo no início dos sintomas e dos sinais.
[0135] A A-T é causada por mutações no gene ATM (ATM com mutação de serina/treonina quinase ou ataxia-telangiectasia), que foi clonado em 1995. O ATM está localizado no cromossomo 11 humano (11q22.3) e é constituído de 69 éxons espalhados ao longo de 150kb do DNA genômico.
[0136] O modo de herança da A-T é autossômico recessivo. Cada um dos pais é um portador, significando que possuem uma cópia normal do gene da A-T (ATM) e uma cópia que é mutada. A A-T ocorre se uma criança herdar o gene de AT mutado de cada um dos pais, de forma que em uma família com dois pais portadores, há 1 chance em 4 de uma criança nascida ter o transtorno. O diagnóstico pré-natal (e a detecção de portadores) pode ser realizado nas famílias se os erros (mutação) forem identificados nos dois genes ATM da criança afetada. O processo para fazer isso pode ser complicado e, uma vez que requer tempo, deve ser providenciado antes da concepção.
[0137] A pesquisa de mutações no gene ATM de uma pessoa não relacionada (por exemplo, a esposa de um portador de A-T conhecido) apresenta desafios significativos. Os gene frequentemente possuem ortografias variantes (polimorfismos) que não afetam a função. Em um gene tão grande quanto o ATM, é
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83/259 provável que ocorram tais ortografias variantes e os médicos nem sempre podem prever se uma variante específica irá ou não causar doença. O aconselhamento genético pode ajudar os membros da família de um paciente com A-T a entender o que pode ou não ser testado e como os resultados devem ser interpretados.
[0138] Os portadores de A-T, tais como os pais de uma pessoa com AT, possuem uma cópia mutada do gene ATM e uma cópia normal. São geralmente saudáveis, mas há um risco aumentado de câncer de mama nas mulheres. Esta descoberta foi confirmada através de uma variedade de maneiras diferentes e é o assunto da pesquisa atual. A vigilância padrão (que inclui autoexames da mama mensais e mamografia no cronograma usual para a idade) é recomendada, a não ser que testes adicionais sejam indicados devido ao fato de a pessoa ter outros fatores de risco (por exemplo, histórico familiar de câncer de mama).
Neurofibromatose dos tipos 1 e 2. A neurofibromatose (NF) é um grupo de três condições nas quais crescem tumores no sistema nervoso. Os três tipos são neurofibromatose do tipo 1 (NF1), neurofibromatose do tipo 2 (NF2) e schwannomatose. Na NF1 os sintomas incluem manchas marrom claro sobre a pele, sardas nas axilas e na virilha, pequenos inchaços dentro dos nervos e escoliose. Na NF2 pode ocorrer perda de audição, cataratas na juventude, problemas de equilíbrio, acroncórdons cor de carne e perda muscular. Os tumores são geralmente não cancerosos.
[0139] A causa é uma mutação genética em certos genes. Na metade dos casos estes são herdados dos pais de uma pessoa enquanto no resto ocorrem durante o início do desenvolvimento. Os tumores envolvem o suporte de células no sistema nervoso ao invés de nos neurônios. Na NF1 os tumores são neurofibromas (tumores dos nervos periféricos) enquanto que na NF2 e na schwannomatose tumores de células de Schwann são mais comuns. O diagnóstico se baseia tipicamente nos sinais e nos sintomas e é ocasionalmente sustentado por testes genéticos.
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84/259 [0140] Não há prevenção ou cura conhecida. Pode ser feita cirurgia para remover os tumores que estão causando os problemas ou que se tornaram cancerosos. Radiação e quimioterapia também podem ser utilizadas se ocorrer câncer. Um implante coclear ou um implante auditivo de tronco encefálico pode ajudar alguns daqueles que perderam a audição.
[0141] Nos Estados Unidos aproximadamente 1 em 3.500 pessoas têm NF1 e 1 em 25.000 tem NF2. Homens e mulheres são afetados de forma igualmente frequente. Na NF1 os sintomas estão frequentemente presentes no Nascimento e se desenvolvem de outra maneira antes dos 10 anos de idade. Embora a condição tipicamente piore com o tempo, a maioria das pessoas com NF1 possui uma expectativa de vida normal. Na NF2 os sintomas podem não se tornar evidentes até o início da idade adulta. A NF2 aumenta o risco de morte precoce. Descrições da condição ocorrem desde o século 1.
[0142] A neurofibromatose (NF1) no início da vida pode causar problemas de aprendizado e comportamentais - aproximadamente 60% das crianças que têm NF1 possuem uma forma branda de dificuldade na escola. Em termos de sinais o indivíduo podería ter os seguintes: seis ou mais manchas dermatológicas marrom claro (“manchas café com leite ), pelo menos dois neurofibromas, pelo menos dois crescimentos na íris do olho e crescimento anormal da coluna vertebral (escoliose).
[0143] A neurofibromatose é um transtorno autossômica dominante, que significa que apenas uma cópia do gene afetado é necessária para que o transtorno se desenvolva. Portanto, se apenas um dos pais tiver neurofibromatose, seus filhos terão uma chance de 50% de também desenvolver a condição. A criança afetada podería ter NF1 branda muito embora tenha herdado de um dos pais com uma forma grave do transtorno. Há dois tipos de neurofibromatose. A neurofibromatose do tipo I é caracterizada pelo crescimento de tecido nervoso em tumores (neurofibromas) que podem ser benignos e podem causar danos graves através da compressão dos nervos e de outros tecidos. A neurofibromatose do tipo II exibe neuromas acústicos
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85/259 bilaterais (tumores do nervo vestibulococlear ou do nervo craniano 8 (CN VIII) também conhecidos como schwannomas), que frequentemente levam à perda da audição.
[0144] Schwannomatose, na qual schwannomas dolorosos se desenvolvem nos nervos espinhais e periféricos.
Mutação CEP290 na amaurose congênita de Leber. A proteína centrossômica de 290 kDa é uma proteína que em humanos é codificada pelo gene CEP290. CEP290 fica localizado no braço Q do cromossomo 12. O gene CEP290 é uma proteína centrossômica que desempenha uma função importante no desenvolvimento dos centrossomos e dos cílios. Este gene é vital na formação do cílio primário, pequenas projeções similares à antena da membrana celular que desempenham uma função importante nos fotorreceptores na parte de trás da retina (que detectam luz e cor) e nos rins, no cérebro e muitos outros órgãos do corpo. A queda dos níveis do produto da transcrição do gene CEP290 resultou na supressão drástica da ciliogênese nas células epiteliais de pigmento da retina em cultura, provando o quão importante é CEP290 para a formação de cílios.
[0145] Em um nível molecular, foi mostrado que CEP290 desempenha uma função reguladora e estrutural crítica na formação primária dos cílios. Estudos recentes implicaram CEP290 como uma proteína de ligação a microtúbulos e membranas que podería servir como uma ligação estrutural entre o núcleo do microtúbulo do cílio e a membrana ciliar de revestimento. Foi mostrado que a interrupção do domínio de ligação a microtúbulos de CEP290 no modelo de camundongo rd16 de doença de CEP290 resulta na degeneração rápida e drástica da retina, demonstrando a importância da ligação a microtúbulos de CEP290 na doença. A função de CEP290 de promover a ciliogênese é inibida tanto pelos domínios autorreguladores encontrados em cada uma das extremidades da proteína CEP290 quanto através da interação de CEP290 com a proteína inibidora CP110.
[0146] A descoberta do gene CEP290 levou os pesquisadores a encontrar outro gene crítico na função da retina, LCA5. Foram iniciados na Filadélfia testes clínicos envolvendo a substituição gênica destes dois genes, nos quais os
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86/259 pesquisadores estão esperançosos que a Amaurose Congênita de Leber será curada um dia.
[0147] Este gene codifica uma proteína com 13 supostos domínios de mola enrolados, uma região com homologia com as ATPases de segregação do cromossomo SMC, seis motivos KID, três domínios de homologia com a tropomiosina e um motivo A do sítio de ligação de ATP/GTP. A proteína fica localizada no centrossomo e nos cílios e possui sítios para N-glicosilação, sulfação de tirosina, fosforilação, N-miristoilação e amidação.
[0148] Mutações nestes genes foram associadas à sindrome de Joubert e à nefronoftise e recentemente a uma forma frequente de Amaurose Congênita de Leber, chamada LCA10. A presença de anticorpos contra esta proteína está associada a várias formas de câncer.
[0149] Uma mutação neste gene leva à cegueira em bebês e crianças, uma doença conhecida como Amaurose Congênita de Leber. Até agora, 35 mutações diferentes em CEP290 são responsáveis por causar LCA. Outras mutações em CEP290 também foram identificadas como causando Sindrome de Meckel e Sindrome de Joubert, algumas entre muitas síndromes. Um gene CEP290 defeituoso é geralmente a causa destes transtornos devido aos cílios anormais. Não é sabido como uma mutação em um gene pode causar tantos tipos diferentes de síndromes, dos quais particularmente muitos afetam o Sistema Nervoso Central.
III. Sistemas CRISPR
A. CRISPRs
1°15°] As CRISPRs (repetições palindrômicas curtas interespaçadas regularmente em clusters) são loci de DNA que contêm repetições curtas de sequências de bases. Cada repetição é seguida por segmentos curtos de “DNA espaçador” provenientes de exposições prévias a um vírus. As CRISPRs são encontradas em aproximadamente 40% dos genomas de eubactérias sequenciados e 90% das archaeas sequenciadas. As CRISPRs estão frequentemente associadas aos genes Cas que codificam proteínas relacionadas às CRISPRs. O sistema
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CRISPR/Cas é um sistema imunológico procariótico que confere resistência a elementos genéticos estranhos tais como plasmídeos e fagos e fornece uma forma de imunidade adquirida. Os espaçadores de CRISPR reconhecem e silenciam estes elementos genéticos exógenos como RNAi em organismos eucarióticos.
[0151] As repetições CRISPR variam em tamanho de 24 a 48 pares de bases. Estas exibem geralmente alguma simetria de díade, implicando na formação de uma estrutura secundária tal como um grampo de cabelo (hairpin), mas não são verdadeiramente palindrômicas. As repetições são separadas por espaçadores de comprimento similar. Algumas das sequências espaçadoras de CRISPR se combinam exatamente com as sequências de plasmídeos e fagos, embora alguns espaçadores se combinem com o genoma de procariotos (espaçadores de autodirecionamento). Novos espaçadores podem ser adicionados rapidamente em resposta à infecção com fagos.
B. Cas Nucleases [0152] Os genes associados a CRISPR (cas) estão frequentemente associados aos arranjos espaçadores de repetições CRISPR. Até 2013, mais de quarenta famílias de proteínas Cas diferentes tinham sido descritas. Destas famílias de proteínas, Cas1 parece ser ubíqua dentre os sistemas de CRISPR/Cas diferentes. Combinações particulares de genes cas e estruturas de repetição foram utilizadas para definir 8 subtipos de CRISPR (Ecoli, Ypest, Nmeni, Dvulg, Tneap, Hmari, Apern e Mtube), dos quais alguns estão associados a um módulo gênico adicional que codifica proteínas misteriosas associadas a repetições (RAMPs). Mais de um subtipo de CRISPR pode ocorrer em um único genoma. A distribuição esporádica dos subtipos de CRISPR/Cas sugere que o sistema é submetido à transferência gênica horizontal durante a evolução microbiana.
[0153] O DNA exógeno é aparentemente processado pelas proteínas codificadas pelos genes Cas em pequenos elementos (~30 pares de bases de comprimento), que são então de alguma maneira inseridos no lócus CRISPR próximo da sequência líder. Os RNAs dos loci CRISPR são expressos de forma constitutiva e
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88/259 são processados por proteínas Cas em pequenos RNAs compostos de elementos de sequência derivados de forma exógena individuais com uma sequência de repetição flanqueadora. Os RNAs guiam outras proteínas Cas para silenciar elementos genéticos exógenos no nível de RNA ou de DNA. Uma evidência sugere diversidade funcional entre subtipos de CRISPR. As proteínas Cse (Cas subtipo Ecoli) (chamadas de CasA-E em E. coli) formam um complexo funcional, Cascade, que processa os produtos da transcrição de RNA de CRISPR em unidades de repetição espaçadoras que mantêm Cascade. Em outros procariotos, Cas6 processa os produtos da transcrição de CRISPR. De forma interessante, a inativação de fagos baseada em CRISPR em E. coli requer Cascade e Cas3, mas não Cas1 e Cas2. As proteínas Cmr (modulo RAMP de Cas) encontradas em Pyrococcus furiosus e outros procariotos formam um complexo funcional com RNAs de CRISPR pequenos que reconhece e cliva RNAs alvos complementares. As enzimas CRISPR guiadas por RNA são classificadas como enzimas de restrição do tipo V.
[0154] Cas9 é uma nuclease, uma enzima especializada em cortar DNA, com dois sítios de corte ativos, um para cada filamento da dupla hélice. A equipe demonstrou que podería desativar um ou ambos os sítios enquanto que a capacidade de Cas9 de localizar seu DNA alvo é preservada. Jinek et al. (2012) combinaram tracrRNA e RNA espaçador em uma molécula de RNA guia único que, misturada com Cas9, pode encontrar e cortar os alvos de DNA corretos e tais RNAs guias sintéticos são utilizados para edição gênica.
[0155] As proteínas Cas9 são altamente enriquecidas em bactérias patogênicas e comensais. A regulação gênica mediada por CRISPR/Cas pode contribuir para a regulação de genes bacterianos endógenos, particularmente durante a interação bacteriana com hospedeiros eucarióticos. Por exemplo, a proteína Cas Cas9 de Francisella novicida utiliza um RNA associado a CRISPR/Cas pequeno único (scaRNA) para reprimir um produto da transcrição endógeno que codifica uma lipoproteína bacteriana que é crítica para que F. novicida suprima a resposta do hospedeiro e promova virulência. Wang et al. (2013) mostraram que a coinjeção de
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89/259 mRNA de Cas9 e sgRNAs na linhagem germinativa (zigotos) gerava camundongos com mutações. O fornecimento das sequências de DNA de Cas9 também é considerado.
[0156] Os sistemas CRISPR/Cas são separados em três classes. A classe 1 utiliza várias proteínas Cas junto com os RNAs de CRISPR (crRNA) para construir uma endonuclease funcional. Os sistemas CRISPR de classe 2 utilizam uma única proteína Cas com um crRNA. Cpf 1 foi identificada recentemente como sistemas CRISPR/Cas do Tipo V de Classe II contendo uma proteína de 1.300 aminoácidos. Ver também a Publicação de Patente U.S. 2014/0068797, que é incorporada como referência em sua totalidade.
[0157] Em algumas modalidades, as composições da divulgação incluem uma versão pequena de uma Cas9 da bactéria Staphylococcus aureus (UniProt Accession No. J7RUA5). A versão pequena da Cas9 fornece vantagens em relação à Cas9 do tipo selvagem ou de comprimento completo. Em algumas modalidades a Cas9 é uma spCas9 (AddGene).
C. Cpf1 Nucleases 101581 Repetições Palindrômicas Curtas Interespaçadas Regularmente em Clusters de Prevotella e Francisella 1 ou CRISPR/Cpf1 é uma tecnologia de edição de DNA que compartilha algumas similaridades com o sistema CRISPR/Cas9. Cpf 1 é uma endonuclease guiada por RNA de um sistema CRISPR/Cas de classe II. Este mecanismo de imunidade adquirido é encontrado em bactérias Prevotella e Francisella. Este previne danos genéticos causados por vírus. Os genes Cpf 1 estão associados ao lócus CRISPR, que codifica uma endonuclease que utiliza um RNA guia para encontrar e clivar DNA viral. Cpf1 é uma endonuclease menor e mais simples que Cas9, superando algumas das limitações dos sistemas CRISPR/Cas9.
[0159] A Cpf1 aparece em muitas espécies de bactérias. A última Cpf1 endonuclease que foi desenvolvida como uma ferramenta para edição genômica foi obtida de uma das primeiras 16 espécies conhecidas por carregarem a mesma.
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90/259 [0160] Nas modalidades, a Cpf1 é uma enzima Cpf1 de
Acidaminococcus (espécie BV3L6, UniProt Accession No. U2UMQ6; SEQ ID NO:
870), que possui a sequência apresentada a seguir:
1 MTQFEGFTNL YQVSKTLRFE LIPQGKTLKH IQEQGFIEED
KARNDHYKEL KPIIDRIYKT
61 YADQCLQLVQ LDWENLSAAI DSYRKEKTEE TRNALIEEQA
TYRNAIHDYF IGRTDNLTDA
121 INKRHAEIYK GLFKAELFNG KVLKQLGTVT TTEHENALLR
SFDKFTTYFS GFYENRKNVF
181 SAEDISTAIP HRIVQDNFPK FKENCHIFTR LITAVPSLRE
HFENVKKAIG IFVSTSIEEV
241 FSFPFYNQLL TQTQIDLYNQ LLGGISREAG TEKIKGLNEV
LNLAIQKNDE TAHIIASLPH
301 RFIPLFKQIL SDRNTLSFIL EEFKSDEEVI QSFCKYKTLL
RNENVLETAE ALFNELNSID
361 LTHIFISHKK LETISSALCD HWDTLRNALY ERRISELTGK
ITKSAKEKVQ RSLKHEDINL
421 QEIISAAGKE LSEAFKQKTS EILSHAHAAL DQPLPTTLKK
QEEKEILKSQ LDSLLGLYHL
481 LDWFAVDESN EVDPEFSARL TGIKLEMEPS LSFYNKARNY
ATKKPYSVEK FKLNFQMPTL
541 ASGWDVNKEK NNGAILFVKN GLYYLGIMPK QKGRYKALSF
EPTEKTSEGF DKMYYDYFPD
601 AAKMIPKCST QLKAVTAHFQ THTTPILLSN NFIEPLEITK
EIYDLNNPEK EPKKFQTAYA
661 KKTGDQKGYR EALCKWIDFT RDFLSKYTKT TSIDLSSLRP
SSQYKDLGEY YAELNPLLYH
721 ISFQRIAEKE IMDAVETGKL YLFQIYNKDF AKGHHGKPNL
HTLYWTGLFS PENLAKTSIK
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781 LNGQAELFYR PKSRMKRMAH RLGEKMLNKK LKDQKTPIPD TLYQELYDYV NHRLSHDLSD
841 EARALLPNVI TKEVSHEIIK DRRFTSDKFF FHVPITLNYQ
AANSPSKFNQ RVNAYLKEHP
901 ETPIIGIDRG ERNLIYITVI DSTGKILEQR SLNTIQQFDY QKKLDNREKE
RVAARQAWSV
961 VGTIKDLKQG YLSQVIHEIV DLMIHYQAVV VLENLNFGFK
SKRTGIAEKA VYQQFEKMLI
1021 DKLNCLVLKD YPAEKVGGVL NPYQLTDQFT SFAKMGTQSG
FLFYVPAPYT SKIDPLTGFV
1081 DPFVWKTIKN HESRKHFLEG FDFLHYDVKT GDFILHFKMN
RNLSFQRGLP GFMPAWDIVF
1141 EKNETQFDAK GTPFIAGKRI VPVIENHRFT GRYRDLYPAN
ELIALLEEKG IVFRDGSNIL
1201 PKLLENDDSH AIDTMVALIR SVLQMRNSNA ATGEDYINSP
VRDLNGVCFD SRFQNPEWPM
1261 DADANGAYHI ALKGQLLLNH LKESKDLKLQ NGISNQDWLA
YIQELRN [0161] Em algumas modalidades, a Cpf1 é uma enzima Cpf1 de Lachnospiraceae (espécie ND2006, UniProt Accession No. A0A182DWE3; SEQ ID NO: 871), que possui a sequência apresentada a seguir:
AASKLEKFTN CYSLSKTLRF KAIPVGKTQE NIDNKRLLVE DEKRAEDYKG VKKLLDRYYL
SFINDVLHSI KLKNLNNYIS LFRKKTRTEK ENKELENLEI NLRKEIAKAF KGAAGYKSLF
121 KKDIIETILP EAADDKDEIA LVNSFNGFTT AFTGFFDNRE
NMFSEEAKST SIAFRCINEN
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181 LTRYISNMDI
FEKVDAIFDK
HEVQEIKEKI
FEGEFFNFVL TQEGIDVYNA
241 IIGGFVTESG
EKIKGLNEYI
NLYNAKTKQA
VLSDRESLSF YGEGYTSDEE
301 VLEVFRNTLN
KNSEIFSSIK
KLEKLFKNFD
NGPAISTISK DIFGEWNLIR
361 DKWNAEYDDI
HLKKKAVVTE
KYEDDRRKSF
LQEYADADLS VVEKLKEIII
421 QKVDEIYKVY
GSSEKLFDAD
FVLEKSLKKN
LDSVKSFENY IKAFFGEGKE
481 TNRDESFYGD
FVLAYDILLK
VDHIYDAIRN
KFKLYFQNPQ FMGGWDKDKE
541 TDYRATILRY
GSKYYLAIMD
KKYAKCLQKI
KINYKLLPGP NKMLPKVFFS
601 KKWMAYYNPS
EDIQKIYKNG
TFKKGDMFNL
KDSISRYPKW SNAYDFNFSE
661 TEKYKDIAGF
YREVEEQGYK
VSFESASKKE
YMFQIYNKDF SDKSHGTPNL
721 HTMYFKLLFD
ENNHGQIRLS
GGAELFMRRA
PANSPIANKN PDNPKKTTTL
781 SYDVYKDKRF
SEDQYELHIP
IAINKCPKNI
LKHDDNPYVI GIDRGERNLL
841 YIVVVDGKGN
IVEQYSLNEI
INNFNGIRIK
EKERFEARQN WTSIENIKEL
901 KAGYISQVVH
KICELVEKYD
AVIALEDLNS
KQVYQKFEKM LIDKLNYMVD
961 KKSNPCATGG
ALKGYQITNK
FESFKSMSTQ
LNSDYDVEDF
LPKFKPLYKQ
EYSSAGIFVK
KKIGSFSLEQ
DAVVAIMKDL YVTQKPYSKD DKDDVNGNYE
NDCHKLIDFF VDKLVEEGKL SLKKEELVVH FKINTEVRVL TDYHSLLDKK GFKNSRVKVE NGFIFYIPAW
LTSKIDPSTG FVNLLKTKYT
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1021 SIADSKKFIS SFDRIMYVPE EDLFEFALDY KNFSRTDADY
IKKWKLYSYG NRIRIFAAAK
1081 KNNVFAWEEV CLTSAYKELF NKYGINYQQG DIRALLCEQS
DKAFYSSFMA LMSLMLQMRN
1141 SITGRTDVDF LISPVKNSDG IFYDSRNYEA QENAILPKNA
DANGAYNIAR KVLWAIGQFK
1201 KAEDEKLDKV KIAISNKEWL EYAQTSVK [0162] Em algumas modalidades, a Cpf 1 tem os códons otimizados para expressão em células de mamíferos. Em algumas modalidades, a Cpf 1 tem os códons otimizados para expressão em células humanas ou células de camundongo.
[0163] O lócus Cpf1 contém um domínio alfa/beta misto, uma RuvC-l seguida por uma região de hélice, uma RuvC-ll e um domínio similar a dedo de zinco. A proteína Cpf 1 possui um domínio de endonuclease similar à RuvC que é similar ao domínio RuvC de Cas9. Além disso, Cpf 1 não possui um domínio de endonuclease HNH e o N-terminal de Cpf 1 não possui o lobo de reconhecimento em alfa-hélice de Cas9.
[0164] A arquitetura do domínio CRISPR-Cas de Cpf1 mostra que a Cpf 1 é funcionalmente única, sendo classificado como sistema CRISPR do tipo V de Classe 2. Os loci de Cpf 1 codificam as proteínas Cas1, Cas2 e Cas4 mais similares aos tipos I e III do que aos sistemas do tipo II. Pesquisas nos bancos de dados sugerem a abundância de proteínas da família Cpf 1 em muitas espécies de bactérias.
[0165] Uma Cpf 1 funcional não requer um tracrRNA, portanto, somente o crRNA é necessário. Isto beneficia a edição genômica porque a Cpf 1 não somente é menor que Cas9, mas também possui uma molécula de sgRNA menor (aproximadamente a metade dos nucleotídeos da Cas9).
[0166] O complexo Cpf1-crRNA cliva o DNA ou o RNA alvo através da identificação de um motivo adjacente do protoespaçador 5’-YTN-3’ (em que Y é uma pirimidina e N é qualquer nucleobase) ou 5'-TTN-3', em contraste com o PAM rico
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94/259 em G direcionado por Cas9. Após a identificação de PAM, Cpf 1 introduz uma quebra de filamento duplo de DNA similar à ponta coesiva de 4 ou 5 nucleotideos pendurados.
[0167] O sistema CRISPR/Cpf1 consiste de uma enzima Cpf 1 e um RNA guia que encontra e posiciona o complexo no ponto correto sobre a dupla hélice para clivar o DNA alvo. A atividade dos sistemas CRISPR/Cpf1 possui três estágios:
Adaptação, durante a qual as proteínas Cas1 e Cas2 facilitam a adaptação de fragmentos pequenos de DNA dentro do arranjo de CRISPR;
Formação de crRNAs: processamento de pré-cr-RNAs produzindo crRNAs maduros para guiar a proteína Cas; e
Interferência, na qual a Cpf 1 é ligada a um crRNA para formar um complexo binário para identificar e clivar uma sequência de DNA alvo.
D. gRNA [0168] Como uma proteína guiada pelo RNA, a Cas9 requer um RNA curto para direcionar o reconhecimento dos alvos de DNA. Embora a Cas9 preferencialmente interrogar as sequências de DNA que contêm uma sequência NGG de PAM que pode se ligar ali sem um alvo de protoespaçador. Entretanto, o complexo Cas9-gRNA requer uma combinação compatível concisa com o gRNA para criar uma quebra de filamento duplo. As sequências de CRISPR nas bactérias são expressas em vários RNAs e então processadas para criar filamentos guias para o RNA. Uma vez que os sistemas Eucarióticos não possuem algumas das proteínas requeridas para processar os RNAs de CRISPR RNAs o gRNA de construção sintética foi criado para combinar os pedaços essenciais de RNA para Cas9 que se direciona para dentro de um RNA único expresso com o promotor U6 da RNA polimerase do tipo III. Os gRNAs sintéticos têm ligeiramente mais de 100 pb no comprimento mínimo e contêm uma porção se direciona aos 20 nucleotideos do protoespaçador que precedem imediatamente a sequência NGG de PAM; os gRNAs não contêm uma sequência de PAM.
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95/259 [0169] Em algumas modalidades, o gRNA se direciona a um sítio dentro de um gene da distrofina do tipo selvagem. Em algumas modalidades, o gRNA se direciona a um sítio dentro de um gene da distrofina mutante. Em algumas modalidades, o gRNA se direciona a um íntron da distrofina. Em algumas modalidades, o gRNA se direciona a um éxon da distrofina. Em algumas modalidades, o gRNA se direciona a um sítio em um éxon da distrofina que é expresso e está presente em uma ou mais das isoformas da distrofina mostradas na Tabela 1. Nas modalidades, o gRNA se direciona a um sítio de splice da distrofina. Em algumas modalidades, o gRNA se direciona a um sítio doador de splice no gene da distrofina. Nas modalidades, o gRNA se direciona a um sítio aceitador de splice no gene da distrofina.
[0170] Nas modalidades, o RNA guia se direciona a um éxon de DMD mutante. Em algumas modalidades, o éxon mutante é o éxon 23 ou 51. Em algumas modalidades, o RNA guia se direciona a pelo menos um dos éxons 1,23, 41,44, 46, 47, 48, 49, 50, 51,52, 53, 54 ou 55 do gene da distrofina. Nas modalidades, o RNA guia se direciona a pelo menos um dos introns 44, 45, 50, 51, 52, 53, 54 ou 55 do gene da distrofina. Em modalidades preferidas, os RNAs guias são projetados para induzir o pulo do éxon 51 ou do éxon 23. Nas modalidades, o gRNA é direcionado para um sítio aceitador de splice do éxon 51 ou do éxon 23.
[0171] Os gRNAs adequados para uso em várias composições e métodos divulgados aqui são fornecidos como as SEQ ID NOs. 383-705, 709-711, 715-717, 790-862, 864. (Tabelas 7, 9, 11, 13 e 15). Em modalidades preferidas, o gRNA é selecionado de qualquer um da SEQ ID No: 790 a SEQ ID No: 862.
[0172] Em algumas modalidades, os gRNAs da divulgação compreendem uma sequência que é complementar a uma sequência alvo dentro de uma sequência codificadora ou uma sequência não codificadora que corresponde ao gene DMD e, portanto, se hibridizam com a sequência alvo. Em algumas modalidades, os gRNAs para Cpf 1 compreendem um único crRNA que contém uma sequência estrutural com repetições diretas seguida por 24 nucleotídeos da
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96/259 sequência guia. Em algumas modalidades, uma sequência “guia” do crRNA compreende uma sequência do gRNA que é complementar a uma sequência alvo. Em algumas modalidades, o crRNA da divulgação compreende uma sequência do gRNA que não é complementar a uma sequência alvo. As sequências “estruturais” da divulgação ligam o gRNA com o polipeptídeo de Cpf 1. As sequências “estruturais” da divulgação não são equivalentes a uma sequência de tracrRNA de uma construção gRNA-Cas9.
[0173] Em algumas modalidades, um ácido nucleico pode compreender uma ou mais sequências que codificam um gRNA. Em algumas modalidades, um ácido nucleico pode compreender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 sequências que codificam um gRNA. Em algumas modalidades, todas as sequências codificam o mesmo gRNA. Em algumas modalidades, todas as sequências codificam gRNAs diferentes. Em algumas modalidades, pelo menos 2 das sequências codificam o mesmo gRNA, por exemplo, pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 das sequências codificam o mesmo gRNA.
E. Cas9 versus Cpf 1 [0174] A Cas9 requer duas moléculas de RNA para cortar o DNA enquanto que a Cpf 1 precisa de uma. As proteínas também cortam o DNA em locais diferentes, oferecendo aos pesquisadores mais opções quando se seleciona um sítio de edição. A Cas9 corta ambos os filamentos em uma molécula de DNA na mesma posição, deixando para trás pontas “cegas”. A Cpf 1 deixa um filamento mais longo que o outro, criando pontas “coesivas” que são mais fáceis de se trabalhar. A Cpf 1 parece ser mais capaz de inserir novas sequências no sítio de corte, comparada com a Cas9. Embora o sistema CRISPR/Cas9 possa ser desabilitar eficientemente os genes, é um desafio inserir genes ou gerar uma inserção forçada. A Cpf 1 não possui tracrRNA, utiliza um PAM rico em T e cliva o DNA através de uma DSB de DNA escalonada.
[0175] Em resumo, as diferenças importantes entre os sistemas de Cpf 1 e Cas9 são que a Cpf 1 reconhece PAMs diferentes, gerando novas possibilidades de
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97/259 direcionamento, cria pontas coesivas longas de 4-5 nt, ao invés das pontas cegas produzidas pela Cas9, aumentando a eficiência das inserções genéticas e a especificidade durante NHEJ ou HDR e corta o DNA alvo bem afastado do PAM, bem longe do sítio de corte de Cas9, gerando novas possibilidades para a divagem do DNA.
Tabela 3: Diferenças entre Cas9 e Cpf1
Característica Cas9 Cpf1
Estrutura Dois RNA necessários (Ou 1 produto da transcrição de fusão (crRN A+tracrRN A=g RN A)) Um RNA necessário
Mecanismo de corte Cortes com pontas cegas Pontas de extremidades escalonadas
Sítio de corte Próximo ao sítio de reconhecimento Longe do sítio de reconhecimento
Sítios alvos PAM rico em G PAM rico em T
F. Edição gênica mediada por CRISPR [0176] A primeira etapa na edição do gene DMD utilizando CRISPR/Cpf1 ou CRISPR/Cas9 é identificar a sequência genômica alvo. O alvo genômico para os gRNAs da divulgação pode ser qualquer sequência de DNA de ~24 nucleotídeos sequência de DNA, contanto que a sequência seja única comparada com o resto do genoma. Em algumas modalidades, a sequência genômica alvo corresponde a uma sequência dentro do éxon 51, éxon 45, éxon 44, éxon 53, éxon 46, éxon 52, éxon 50, éxon 43, éxon 6, éxon 7, éxon 8 e/ou éxon 55 do gene da distrofina humano. Em algumas modalidades, a sequência genômica alvo é um sítio de splice a 5’ ou a 3’ do éxon 51, éxon 45, éxon 44, éxon 53, éxon 46, éxon 52, éxon 50, éxon 43, éxon 6, éxon 7, éxon 8 e/ou éxon 55 do gene da distrofina humano. Em
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98/259 algumas modalidades, a sequência genômica alvo corresponde a uma sequência dentro de um íntron imediatamente a montante ou a jusante do éxon 51, éxon 45, éxon 44, éxon 53, éxon 46, éxon 52, éxon 50, éxon 43, éxon 6, éxon 7, éxon 8 e/ou éxon 55 do gene da distrofina humano. Exemplos de sequências genômicas alvos podem ser encontrados nas T abelas 6,8, 10, 12e 14.
[0177] A etapa seguinte na edição do gene DMD é identificar todas as sequências do Motivo Adjacente Protoespaçador (PAM) sequências dentro da região genética que será direcionada. A sequência alvo tem que estar imediatamente a montante de um PAM. Uma vez que todas as sequências de PAM possíveis e os supostos sítios alvos foram identificados, a etapa seguinte é escolher qual sítio provavelmente resultará na divagem no alvo mais eficiente. A sequência de direcionamento do gRNA precisa ser compatível com a sequência alvo e a sequência de direcionamento do gRNA não pode ser compatível com sítios adicionais dentro do genoma. Em modalidades preferidas, a sequência de direcionamento do gRNA possui homologia perfeita com o alvo sem homologia com outro local no genoma. Em algumas modalidades, uma sequência de direcionamento do gRNA fornecida terá sítios adicionais ao longo de todo o genoma onde existe homologia parcial. Estes sítios são chamados de “fora do alvo” (“off-targets”) e devem ser considerados quando se projeta um gRNA. Em geral, os sítios fora do alvo não são clivados de forma tão eficiente quando ocorrem combinações erradas próximas à sequência de PAM, de maneira que os gRNAs sem homologia ou aqueles com combinações erradas próximos à sequência de PAM terão a especificidade mais alta. Em adição à “atividade fora do alvo”, têm que ser considerados os fatores que maximizam a divagem da sequência alvo desejada (“atividade no alvo”). Também é sabido pelos peritos na técnica que duas sequências de direcionamento do gRNA, cada uma possuindo 100% de homologia com o DNA alvo podem não resultar na eficiência de divagem equivalente. Na verdade, a eficiência de divagem pode aumentar ou diminuir dependendo dos nucleotídeos específicos dentro da sequência alvo selecionada. Um exame minucioso da atividade no alvo e fora do alvo prevista de
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99/259 cada sequência de direcionamento do gRNA potencial é necessário para se projetar o melhor gRNA. Foram desenvolvidos vários programas para projetar o gRNA que são capazes de localizar sequências de PAM e alvos potenciais e classificar os gRNAs associados com base em sua atividade no alvo e fora do alvo (por exemplo, CRISPRdirect, disponível em www.crispr.dbcls.jp).
[0178] A etapa seguinte é sintetizar e clonar gRNAs desejados. Os oligos de direcionamento podem ser sintetizados, anelados e inseridos em plasmídeos contendo a estrutura do gRNA utilizando clonagem por restrição-ligação padronizada. Entretanto, a estratégia de clonagem exata dependerá do vetor de gRNA que é escolhido. Os gRNAs para Cpf 1 são notavelmente mais simples que os gRNAs para Cas9 e consistem apenas de um único crRNA contendo sequência estrutural de repetição direta seguida por ~24 nucleotídeos da sequência guia.
[0179] Cada gRNA deve então ser validado em uma ou mais linhagens de células alvos. Por exemplo, após a Cas9 ou a Cpf 1 e o gRNA terem sido fornecidos para a célula, a região genômica alvo pode ser amplificada utilizando PCR e sequenciada de acordo com os métodos conhecidos pelos peritos na técnica.
[0180] Em algumas modalidades, a edição gênica pode ser realizada in vitro ou ex vivo. Em algumas modalidades, as células são colocadas em contato in vitro ou ex vivo com uma Cas9 ou uma Cpf 1 e um gRNA que se direcionam para urn sítio de splice da distrofina. Em algumas modalidades, as células são colocadas em contato com um ou mais ácidos nucleicos que codificam a Cas9 ou a Cpf 1 e o RNA guia. Em algumas modalidades, o um ou mais ácidos nucleicos são introduzidos nas células utilizando, por exemplo, lipofecção ou eletroporação. A edição gênica também pode ser realizada em zigotos. Nas modalidades, os zigotos podem receber injeção de um ou mais ácidos nucleicos que codificam Cas9 ou Cpf 1 e um gRNA que se direciona para um sítio de splice da distrofina. Os zigotos podem ser subsequentemente injetados em um hospedeiro.
[0181] Nas modalidades, a Cas9 ou a Cpf1 é fornecida em um vetor. Nas modalidades, o vetor contém uma Cas9 derivada de S. pyogenes (SpCas9, SEQ
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ID NO. 872). Nas modalidades, o vetor contém uma Cas9 derivada de S. aureus (SaCas9, SEQ ID NO. 873). Nas modalidades, o vetor contém uma sequência de Cpf1 derivada de uma bactéria Lachnospiraceae. Ver, por exemplo, Uniprot Accession No. A0A182DWE3; SEQ ID NO. 871. Nas modalidades, o vetor contém uma sequência de Cpf1 derivada de uma bactéria Acidaminococcus. Ver, por exemplo, Uniprot Accession No. U2UMQ6; SEQ ID NO. 870. Em algumas modalidades, a sequência de Cas9 ou Cpf 1 tem os códons otimizados para expressão em células humanas ou células de camundongo. Em algumas modalidades, o vetor contém ainda uma sequência que codifica uma proteína fluorescente, tal como GFP, que permite que as células que expressam Cas 9 ou Cpf 1 sejam separas utilizando separação de células ativada por fluorescência (FACS). Em algumas modalidades, o vetor é um vetor viral tal como um vetor viral associado a adeno.
[0182] Nas modalidades, o gRNA é fornecido em um vetor. Em algumas modalidades, o vetor é um vetor viral tal como um vetor viral associado a adeno. Nas modalidades, a Cas9 ou a Cpf 1 e o RNA guia são fornecidos no mesmo vetor. Nas modalidades, a Cas9 ou a Cpf 1 e o RNA guia são fornecidos em vetores diferentes.
[0183] Em algumas modalidades, as células são adicionalmente colocadas em contato com um oligonucleotídeo de DMD de filamento simples para realizar o reparo direcionado pela homologia. Em algumas modalidades, INDELs pequenas restauram o quadro de leitura da proteína distrofina (estratégia de “reenquadramento”). Quando a estratégia de reenquadramento é utilizada, as células podem ser colocadas em contato com um único gRNA. Nas modalidades, um sítio doador de splice ou aceitador de splice é interrompido, que resulta no pulo do éxon e na restauração do quadro de leitura da proteína (estratégia de “pulo do éxon”). Quando a estratégia de pulo do éxon é utilizada, as células podem ser colocadas em contato com dois ou mais gRNAs.
[0184] A eficiência da divagem de DNA mediada por Cas9 ou Cpf1 in vitro ou ex vivo pode ser avaliada utilizando técnicas conhecidas pelos peritos na técnica, tal como o ensaio de T7 E1. A restauração da expressão de DMD pode ser
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101/259 confirmada utilizando técnicas conhecidas pelos peritos na técnica, tais como RTPCR, Western blotting e imunocitoquímica.
[0185] Em algumas modalidades, a edição gênica in vitro ou ex vivo é realizada em uma célula muscular ou satélite. Em algumas modalidades, a edição gênica é realizada em células iPSC ou iCM. Nas modalidades, as células iPSC são diferenciadas após a edição gênica. Por exemplo, as células iPSC podem ser diferenciadas em uma célula muscular ou uma célula satélite após a edição. Nas modalidades, as células iPSC são diferenciadas em células musculares cardíacas, células musculares esqueléticas ou células musculares lisas. Nas modalidades, as células iPSC são diferenciadas em cardiomiócitos. As células iPSC podem ser induzidas para se diferenciarem de acordo com métodos conhecidos pelos peritos na técnica.
[0186] Em algumas modalidades, o contato da célula com a Cas9 ou a Cpf 1 e o gRNA restaura a expressão da distrofina. Nas modalidades, as células que foram editadas in vitro ou ex vivo ou as células células derivadas das mesmas, exibem níveis de proteína distrofina que são comparáveis com o das células do tipo selvagem. Nas modalidades, as células editadas ou as células células derivadas das mesmas, expressam distrofina em um nível que é 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou qualquer porcentagem dentro dos níveis de expressão da distrofina do tipo selvagem expressão. Nas modalidades, as células que foram editadas in vitro ou ex vivo ou células derivadas das mesmas, possuem um número de mitocôndrias que é comparável com aquele das células do tipo selvagem. Nas modalidades as células editadas ou as células derivadas das mesmas, possuem 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou qualquer porcentagem dentre a quantidade de mitocôndrias das células do tipo selvagem. Nas modalidades, as células editadas ou as células derivadas das mesmas, exibem um aumento na taxa de consumo de oxigênio (OCR) comparada com a das células não editadas na linha de base.
G. RNA Pol III e Promotores de Pol III
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102/259 [0187] Nos eucariotos, a RNA polimerase III (também chamada de Pol III) transcreve o DNA para sintetizar o rRNA ribossomal 5S, o tRNA e outros RNAs pequenos. Os genes transcritos pela RNA Pol III se encaixam na categoria de genes “housekeeping” (de manutenção) cuja expressão é necessária em todos os tipos de células e na maioria das condições ambientais. Portanto, a regulação da transcrição de Pol III está primariamente atada à regulação do crescimento celular e ao ciclo celular, requerendo assim menos proteínas reguladoras que a RNA polimerase II. Sob condições de estresse, entretanto, a proteína Maf1 reprime a atividade da Pol III.
[0188] No processo de transcrição (por qualquer polimerase) há três estágios principais: (i) iniciação, que requer a construção do complexo da RNA polimerase sobre o promotor gênico; (ii) alongamento, a síntese do produto da transcrição do RNA; e (iii) terminação, a interrupção da transcrição do RNA e o desarranjo do complexo da RNA polimerase.
[0189] Os promotores sob o controle da RNA Pol III incluem aqueles para rRNA ribossomal 5S, tRNA e alguns outros RNAs pequenos tais como RNA spliceossomal U6, RNase P e RNase MRP RNA, 7SL RNA (o componente de RNA das partículas de reconhecimento de sinal), Vault RNAs, Y RNA, SINEs (elementos repetitivos interespaçados curtos), 7SK RNA, dois microRNAs, vários RNAs nucleolares pequenos e alguns RNAs antissenso reguladores.
IV. Fornecimento de Ácidos Nucleicos [0190] Como discutido anteriormente, em certas modalidades, são empregados cassetes de expressão para expressar um produto de fator de transcrição, para purificação subsequente e fornecimento para uma célula/indivíduo ou para uso diretamente em uma abordagem de fornecimento de base genética. São fornecidos aqui vetores de expressão que contêm um ou mais ácidos nucleicos que codificam Cas9 ou Cpf 1 e pelo menos um RNA guia de DMD que se direciona para um sítio de splice da distrofina. Em algumas modalidades, um ácido nucleico que codifica Cas9 ou Cpf1 e um ácido nucleico que codifica pelo menos um RNA guia são fornecidos no mesmo vetor. Em modalidades adicionais, um ácido nucleico que
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103/259 codifica Cas9 ou Cpf 1 e um ácido nucleico que codifica pelo menos um RNA guia são fornecidos em vetores separados.
[0191 ] A expressão requer que sinais apropriados sejam fornecidos nos vetores e estes incluem vários elementos reguladores tais como intensificadores/promotores provenientes tanto de fontes virais quanto de mamíferos que controlam a expressão dos genes de interesse nas células. Os elementos planejados para otimizar a estabilidade e a capacidade de tradução do RNA mensageiro nas células hospedeiras também são definidos. As condições para o uso de um número de marcadores de seleção com drogas dominantes para estabelecer clones de células estáveis permanentes que expressam os produtos também são fornecidas, assim como um elemento que liga a expressão dos marcadores de seleção com drogas à expressão do polipeptídeo.
A. Elementos Reguladores [0192] Ao longo de todo este pedido de patente, é entendido que o termo “cassete de expressão” inclui qualquer tipo de construção genética que contém um ácido nucleico que codifica um produto gênico em que parte ou toda a sequência que codifica o ácido nucleico é capaz de ser transcrita e traduzida, isto é, está sob o controle de um promotor. Um “promotor” refere-se a uma sequência de DNA reconhecida pelo maquinário de síntese da célula ou pelo maquinário de síntese introduzido, necessária para iniciar a transcrição específica de um gene. A expressão “sob controle transcricional” significa que o promotor está na localização e na orientação corretas em relação ao ácido nucleico para controlar a iniciação da RNA polimerase e a expressão do gene. É entendido que um “vetor de expressão” inclui cassetes de expressão compreendidos em uma construção genética que é capaz de se replicar e assim inclui uma ou mais origens de replicação, sinais de terminação da transcrição, regiões de poli-A, marcadores selecionáveis e sítios de clonagem para várias finalidades.
[0193] O termo promotor será utilizado aqui para se referir a um grupo de módulos de controle da transcrição que estão dispostos em clusters em torno do
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104/259 sítio de iniciação para a RNA polimerase II. Muito do pensamento de como os promotores são organizados deriva de análises de vários promotores virais, incluindo aqueles para a timidina quinase (tk) de HSV e as unidades de transcrição inicial do SV40. Estes estudos, aumentados por trabalho mais recente, mostraram que os promotores são compostos de módulos funcionais distintos, cada um consistindo de aproximadamente 7-20 pb de DNA e contendo um ou mais sítios de reconhecimento para proteínas ativadoras ou repressoras da transcrição.
[0194] Pelo menos um modulo em cada promotor funciona para posicionar o sítio de início para síntese de RNA. O melhor exemplo conhecido deste estudo é o TATA box, mas em alguns promotores que não possuem um TATA box, tal como o promotor para o gene da desoxinucleotidil transferase terminal de mamíferos e o promotor para os genes tardios do SV40, um elemento distinto que cobre o próprio sítio de início ajuda a fixar o local de início.
[0195] Em algumas modalidades, as construções de Cas9 ou Cpf1 da divulgação são expressas por um promotor específico às células musculares. Este promotor específico às células musculares pode ser constitutivamente ativo ou pode ser um promotor induzível.
[0196] Elementos promotores adicionais regulam a frequência do início da transcrição. Tipicamente, estes estão localizados na região de 30-110 pb a montante do sítio de início, embora tenha sido mostrado recentemente que um número de promotores também contém elementos funcionais a jusante do sítio de início. O espaçamento entre os elementos promotores frequentemente é flexível, de forma que a função do promotor seja preservada quando os elementos são invertidos ou movidos em relação uns aos outros. No promotor da tk, o espaçamento entre os elementos promotores pode ser aumentado até 50 pb de distância antes que a atividade comece a diminuir. Dependendo do promotor, parece que elementos individuais podem funcionar de forma cooperativa ou independentemente para ativar a transcrição.
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105/259 [0197] Em certas modalidades, promotores virais tais como o promotor dos genes iniciais imediatos do citomegalovírus (CMV) humano, o promotor inicial do SV40, a repetição terminal longa do vírus de sarcoma de Rous, o promotor da insulina de rato e gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase podem ser utilizados para a obtenção de expressão em altos níveis da sequência codificadora de interesse. O uso de outros promotores virais, de células de mamíferos ou de fagos bacterianos que são bem conhecidos na técnica para conseguir a expressão de uma sequência codificadora de interesse também é considerado, contanto que os níveis de expressão sejam suficientes para certa finalidade. Através do emprego de um promotor com propriedades bem conhecidas, o nível e o padrão de expressão da proteína de interesse após a transfecção ou a transformação podem ser otimizados. Ainda, a seleção de um promotor que é regulada em resposta a sinais fisiológicos específicos pode permitir a expressão induzível do produto gênico.
[0198] Os intensificadores são elementos genéticos que aumentam a transcrição partindo de um promotor localizado em uma posição distante na mesma molécula de DNA. Os intensificadores são organizados de forma muito similar à dos promotores. Ou seja, estes são compostos de muitos elementos individuais, dos quais cada um se liga a uma ou mais proteínas de transcrição. A distinção básica entre os intensificadores e os promotores é operacional. Uma região intensificadora como um todo tem que ser capaz de estimular a transcrição a uma distância; isto não precisa ser verdadeiro para uma região promotora ou seus elementos componentes. Por outro lado, um promotor tem que ter um ou mais elementos que direcionam a iniciação da síntese de RNA em um sítio particular e em uma orientação particular, enquanto que os intensificadores não possuem essas especificidades. Os promotores e os intensificadores são frequentemente sobrepostos e contíguos, frequentemente parecendo que possuem uma organização modular muito similar.
[0199] A seguir está uma lista de promotores/intensificadores e promotores/intensificadores induzíveis que poderíam ser utilizados em combinação com o ácido nucleico que codifica um gene de interesse em uma construção de
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106/259 expressão. Adicionalmente, qualquer combinação de promotor/intensificador (como para o Eukaryotic Promoter Data Base EPDB) também podería ser utilizada para controlar a expressão do gene. As células eucarióticas podem suportar a transcrição citoplasmática partindo de certos promotores bacterianos se a polimerase bacteriana apropriada for fornecida, como parte do complexo de fornecimento ou como uma construção de expressão gênica adicional.
[0200] O promotor e/ou o intensificador pode ser, por exemplo, cadeia leve de imunoglobulina, cadeia pesada de imunoglobulina, receptor celulars T, HLA DQ a e/ou DQ β, β-interferon, interleucina-2, receptor de interleucina-2, MHC de classe II 5, MHC de classe II HLA-Dra, β-Actin, creatina quinase muscular (MCK), préalbumina (transtiretina), elastase I, metalotioneína (MTII), colagenase, albumina, ccfetoproteína, t-globina, β-globina, c-fos, c-HA-ras, insulina, molécula de adesão de célula neural (NCAM), cci-antitripaína, H2B (TH2B) histona, colágeno de camundongo e/ou do tipo I, proteínas reguladas por glicose (GRP94 e GRP78), hormônio de crescimento de rato, amiloide A do soro humano (SAA), troponina I (TN I), fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF), distrofia muscular de Duchenne, SV40, polioma, retrovirus, papiloma vírus, hepatitis B vírus, vírus de imunodeficiência humana, citomegalovírus (CMV) e vírus da leucemia do macaco gibão.
[0201] Em algumas modalidades, podem ser utilizados elementos induzíveis. Em algumas modalidades, o elemento induzível é, por exemplo, MTII, MMTV (vírus de tumor mamário de camundongo), β-interferon, E2 de adenovirus 5, colagenase, estromelisina, SV40, gene MX de camundongo, gene GRP78, cc-2macroglobulina, vimentina, gene H-2kó de MHC de classe I, HSP70, proliferina, fator de necrose de tumor e/ou gene cc do hormônio estimulador da tireoide. Em algumas modalidades, o indutor é éster de forbol (TFA), metais pesados, glicocorticoides, poli(rl)x, poli(rc), EIA, éster de forbol (TPA), interferon, Vírus da Doença de Newcastle, A23187, IL-6, soro, interferon, antígeno T grande do SV40, PMA e/ou hormônio da tireoide. Qualquer um dos elementos induzíveis descritos aqui pode ser utilizado com qualquer um dos indutores descritos aqui.
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107/259 [0202] São de interesse particular os promotores específicos. Estes incluem o promotor da cadeia leve 2 da miosina, o promotor da α-actina, o promotor da troponina 1; os promotores de trocadores de Na+/Ca2+, o promotor da distrofina, o promotor da a7 integrin, o promotor do peptídeo natriurético cerebral e o promotor da αΒ-cristalina/proteína de choque térmico pequena, promotor da cadeia pesada da amiosina e o promotor de ANF. Em algumas modalidades, o promotor específico para os músculos é o promotor CK8. O promotor CK8 possui a sequência a seguir (SEQ ID NO. 874):
CTAGACTAGC ATGCTGCCCA TGTAAGGAGG CAAGGCCTGG
GGACACCCGA GATGCCTGGT
TATAATTAAC CCAGACATGT GGCTGCCCCC CCCCCCCCAA
CACCTGCTGC CTCTAAAAAT
121 AACCCTGCAT GCCATGTTCC CGGCGAAGGG CCAGCTGTCC
CCCGCCAGCT AGACTCAGCA
181 CTTAGTTTAG GAACCAGTGA GCAAGTCAGC CCTTGGGGCA
GCCCATACAA GGCCATGGGG
241 CTGGGCAAGC TGCACGCCTG GGTCCGGGGT GGGCACGGTG CCCGGGCAAC GAGCTGAAAG
301 CTCATCTGCT CTCAGGGGCC CCTCCCTGGG GACAGCCCCT CCTGGCTAGT CACACCCTGT
361 AGGCTCCTCT ATATAACCCA GGGGCACAGG GGCTGCCCTC ATTCTACCAC CACCTCCACA
421 GCACAGACAG ACACTCAGGA GCCAGCCAGC [0203] Em algumas modalidades, o promotor específico para células musculares é uma variante do promotor CK8, chamado CK8e. O promotor CK8e possui a sequência a seguir (SEQ ID NO. 875):
TGCCCATGTA AGGAGGCAAG GCCTGGGGAC ACCCGAGATG CCTGGTTATA ATTAACCCAG
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ACATGTGGCT GCCCCCCCCC CCCCAACACC TGCTGCCTCT AAAAATAACC CTGCATGCCA
121 TGTTCCCGGC GAAGGGCCAG CTGTCCCCCG CCAGCTAGAC TCAGCACTTA GTTTAGGAAC
181 CAGTGAGCAA GTCAGCCCTT GGGGCAGCCC ATACAAGGCC ATGGGGCTGG GCAAGCTGCA
241 CGCCTGGGTC CGGGGTGGGC ACGGTGCCCG GGCAACGAGC TGAAAGCTCA TCTGCTCTCA
301 GGGGCCCCTC CCTGGGGACA GCCCCTCCTG GCTAGTCACA CCCTGTAGGC TCCTCTATAT
361 AACCCAGGGG CACAGGGGCT GCCCTCATTC TACCACCACC TCCACAGCAC AGACAGACAC
421 TCAGGAGCCA GCCAGC [0204] Quando um inserto de cDNA é empregado, será tipicamente desejado incluir um sinal de poliadenilação para realizar a poliadenilação apropriada do produto da transcrição gênica. Qualquer sequência poliadenilação pode ser empregada tais como os sinais de poliadenilação do hormônio de crescimento humano e do SV40. Um terminador também é considerado como um elemento do cassete de expressão. Estes elementos podem server para aumentar os níveis de mensagens e para minimizar a leitura através do cassete para outras sequências.
B. 2A Peptídeo [0205] Em algumas modalidades, é utilizado um domínio de autoclivagem similar ao 2A do vírus de inseto Thosea asigna (peptídeo 2A de TaV)(SEQ ID NO. 876, EGRGSLLTCGDVEENPGP). Foi mostrado que estes domínios similares a 2A funcionam nos eucariotos e fazem com que a divagem dos aminoácidos ocorra de forma simultânea à tradução dentro do domínio do peptídeo similar ao 2A. Portanto, a inclusão do peptídeo 2A de TaV permite a expressão de várias proteínas de um único produto da transcrição do mRNA. De maneira
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109/259 importante, o domínio de TaV quanto testado em sistemas eucarióticos mostrou atividade de divagem maior que 99%. Outros peptídeos similares a 2A aceitáveis incluem, mas não são limitados a, peptídeo 2A do vírus da rinite equina A (ERAV) (SEQ ID NO. 877; QCTNYALLKLAGDVESNPGP), peptídeo 2A do teschovírus-1 suíno (PTV1) (SEQ ID NO. 878; ATNFSLLKQAGDVEENPGP) e peptídeo 2A do vírus da febre aftosa (FMDV) (SEQ ID NO. 879; PVKQLLNFDLLKLAGDVESNPGP) ou versões modificadas dos mesmos.
[0206] Em algumas modalidades, o peptídeo 2A é utilizado para expressar um repórter e uma Cas9 ou uma Cpf 1 simultaneamente. O repórter pode ser, por exemplo, GFP.
[0207] Outros peptídeos de autoclivagem que podem ser utilizados incluem, mas não são limitados à protease da proteína de inclusão nuclear a (Nia), uma protease P1, uma protease 3C, uma protease L, uma protease similar a 3C ou versões modificadas das mesmas.
C. Fornecimento de Vetores de Expressão [0208] Há um número de maneiras através das quais os vetores de expressão podem ser introduzidos nas células. Em certas modalidades, a construção de expressão compreende um vírus ou uma construção engenheirada derivada de um genoma viral. A capacidade de certos vírus entrarem nas células através de endocitose mediada por receptor, para se integrarem no genoma da célula hospedeira e expressarem genes virais de forma estável e eficiente os tornou candidatos atrativos para a transferência de genes estranhos para dentro de células de mamíferos. Estes possuem uma capacidade relativamente baixa de sequências de DNA estranhas e possuem um espectro de hospedeiros restrito. Além disso, seu potencial oncogênico e efeitos citopáticos em células permissivas levantam preocupações em relação à segurança. Estes podem acomodar somente até 8 kB de material genético estranho, mas podem ser facilmente introduzidos em uma variedade de linhagens de células e animais de laboratório.
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110/259 [0209] Um dos métodos preferidos para fornecimento in vivo envolve ο uso de um vetor de expressão de adenovirus. É entendido que “vetor de expressão de adenovirus” inclui aquelas construções que contêm sequências de adenovirus suficientes para (a) suportar o empacotamento da construção e (b) expressar um polinucleotídeo antissenso que foi clonado ali. Neste contexto, a expressão não requer que o produto gênico seja sintetizado.
[0210] O vetor de expressão compreende uma forma geneticamente engenheirada de adenovirus. O conhecimento da organização genética do adenovirus, um vírus de DNA de filamento duplo linear de 36 kB, permite a substituição de pedaços grandes de DNA adenoviral por sequências estranhas de até 7 kB. Em contraste ao retrovirus, a infecção adenoviral das células hospedeiras não resulta na integração cromossômica por que o DNA adenoviral pode se replicar de uma maneira epissomal sem genotoxicidade potencial. Ainda, os adenovirus são estruturalmente estáveis e nenhum rearranjo genômico foi detectado após amplificação extensiva. O adenovirus pode infectar virtualmente todas as células epiteliais independentemente de seu estágio do ciclo celular. Até agora, a infecção adenoviral parece estar ligada apenas à doença branda tal como a doença respiratória aguda em humanos.
[0211] O adenovirus é particularmente adequado para uso como um vetor de transferência gênica devido ao seu genoma de tamanho médio, sua facilidade de manipulação, seu alto título, sua faixa ampla de células alvos e sua alta capacidade de infecção. Ambas as extremidades do genoma viral contêm repetições invertidas (ITRs) de 100-200 pares de bases, que são elementos em cis necessários para a replicação e o empacotamento do DNA viral. As regiões iniciais (E) e tardias (L) do genoma contêm unidades de transcrição diferentes que são divididas pelo início da replicação do DNA viral. A região E1 (E1A e E1B) codifica proteínas responsáveis pela regulação da transcrição do genoma viral e alguns genes celulares. A expressão da região E2 (E2A e E2B) resulta na síntese das proteínas para replicação do DNA viral. Estas proteínas estão envolvidas na replicação do DNA, na expressão de genes
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111/259 tardios e no desligamento da célula hospedeira. Os produtos dos genes tardios, incluindo a maioria das proteínas do capsídeo viral, são expressos apenas após o processamento significativo de um único produto da transcrição primário produzido pelo promotor tardio principal (MLP). O MLP, (localizado a 16,8 m.u.) é particularmente eficiente durante a fase tardia da infecção e todos os mRNAs produzidos partindo deste promotor possuem uma sequência líder 5□-tripartida (TPL) que os torna mRNAs preferidos para tradução. Em um sistema, um adenovirus recombinante é gerado partindo da recombinação homóloga entre o vetor bifuncional e o vetor pró-viral. Devido à possível recombinação entre dois vetores pró-virais, um adenovirus do tipo selvagem pode ser gerado partindo deste processo. Portanto, é crítico isolar um único clone do vírus partindo de uma placa individual e verificar sua estrutura genômica.
[0212] A produção e a propagação dos vetores de adenovirus atuais, que são deficientes em relação à replicação, dependem de uma única linhagem de células helper, denominada 293, que foi transformada partindo de células renais embrionárias humanas com fragmentos de DNA de Ad5 e expressa de forma constitutiva proteínas E1. Uma vez que a região E3 é dispensável do genoma do adenovirus, os vetores de adenovirus atuais, com o auxílio das células 293, carregam DNA estranho na E1, na D3 ou em ambas as regiões. Na natureza, o adenovirus pode empacotar aproximadamente 105% do genoma do tipo selvagem, fornecendo capacidade para aproximadamente 2 kb de DNA extras. Combinada com os aproximadamente 5,5 kb de DNA que podem ser substituídos nas regiões E1 e E3, a capacidade máxima do vetor de adenovirus atual é menor que 7,5 kb ou aproximadamente 15% do comprimento total do vetor. Mais de 80% do genoma viral de adenovirus permanecem na estrutura do vetor e são a fonte de citotoxicidade causada pelo vetor. Ainda, a deficiência de replicação do vírus com deleção de E1 é incompleta.
[0213] As linhagens de células helper podem ser derivadas de células humanas tais como células renais embrionárias humanas, células musculares, células
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112/259 hematopoiéticas ou outras células mesenquimais ou epiteliais embrionárias humanas. Alternativamente, as células helper podem ser derivadas das células de outras espécies de mamíferos que são permissivas em relação ao adenovirus humano. Tais células incluem, por exemplo, células Vero ou outras células mesenquimais ou epiteliais embrionárias de macaco. Como determinado anteriormente, a linhagem de célula helper preferida é 293.
[0214] Métodos aprimorados para cultura de células 293 e de propagação de adenovirus são conhecidos na técnica. Em um formato, agregados de células naturais são crescidos através da inoculação de células individuais em frascos de centrifugação siliconizados de 1 litro (Techne, Cambridge, UK) contendo 100-200 mL de meio. Após agitação a 40 rpm, a viabilidade das células é estimada com azul de tripano. Em outro formato, microcarreadores Fibra-Cel (Bibby Sterlin, Stone, UK) (5 g/l) são empregados como a seguir. Um inóculo de células, ressuspensas em 5 mL de meio, é adicionado ao carreador (50 mL) em um frasco Erlenmeyer de 250 mL e deixado estacionário, com agitação ocasional, durante 1 a 4 h. O meio é então substituído por 50 mL de meio fresco e a agitação é iniciada. Para produção de vírus, é permitido que as células cresçam até aproximadamente 80% de confluência, após tal período de tempo o meio é substituído (até 25% do volume final) e o adenovirus é adicionado a uma MOI de 0,05. As culturas são mantidas estacionárias durante toda a noite, após tal período de tempo o volume é aumentado até 100% e a agitação é iniciada durante mais 72 h.
[0215] Os adenovirus da divulgação são defeituosos em relação à replicação ou pelo menos condicionalmente defeituosos em relação à replicação. O adenovirus pode ser qualquer um dos 42 sorotipos conhecidos diferentes ou dos subgrupos A-F. O adenovirus tipo 5 do subgrupo C é o material de partida preferido para a obtenção do vetor de adenovirus defeituoso em relação à replicação condicional para uso na presente divulgação.
[0216] Como determinado anteriormente, o vetor típico de acordo com a presente divulgação é defeituoso em relação à replicação e não terá uma região E1
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113/259 do adenovirus. Assim, será mais conveniente introduzir o gene de interesse que codifica o polinucleotídeo na posição da qual as sequências que codificam E1 foram removidas. Entretanto, a posição de inserção da construção dentro das sequências de adenovirus não é crítica. O gene de interesse que codifica o polinucleotídeo também pode ser inserido in lieu da região E3 deletada nos vetores de substituição de E3 ou na região E4 em que uma linhagem de células helper ou vírus helper complementa o defeito de E4.
[0217] O adenovirus é fácil de crescer e manipular e exibe uma faixa ampla de hospedeiros in vitro e in vivo. Este grupo de vírus pode ser obtido em altos títulos, por exemplo, 109-1012 unidades formadoras de placas por mL e é altamente infeccioso. O ciclo de vida do adenovirus não requer integração no genoma de célula hospedeira. Os genes estranhos fornecidos pelos vetores de adenovirus são epissomais e, portanto, possuem baixa genotoxicidade para as células hospedeiras. Nenhum efeito colateral foi relatado nos estudos de vacinação com adenovirus do tipo selvagem, demonstrando sua segurança e potencial terapêutico como vetores de transferência gênica in vivo.
[0218] Os vetores de adenovirus têm sido utilizados na expressão gênica em eucariotos e no desenvolvimento de vacinas. Estudos com animais sugeriram que o adenovirus recombinante podería ser utilizado para terapia gênica. Os estudos na administração de adenovirus recombinante a tecidos diferentes incluem instilação na traqueia, injeção muscular, injeções intravenosas periféricas e inoculação estereotáxica no cérebro.
[0219] Os retrovirus são um grupo de vírus de RNA de filamento simples caracterizados por uma capacidade de converter seu RNA em DNA de filamento duplo em células infectadas através de um processo de transcrição reversa. O DNA resultante então se integra de forma estável nos cromossomos celulares na forma de um pró-vírus e direciona a síntese de proteínas virais. A integração resulta na retenção de sequências gênicas virais na célula receptoras e seus descendentes. O genoma retroviral contém três genes, gag, pol e env que codificam as proteínas do
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114/259 capsídeo, a enzima polimerase e os componentes do envelope, respectivamente. Uma sequência encontrada a montante do gene gag contém um sinal para empacotamento do genoma em virions. Duas sequências de repetições terminais longas (LTR) estão presentes nas extremidades a 5’ e a 3’ do genoma viral. Estas contêm sequências promotoras e intensificadoras fortes e também são requeridas para a integração no genoma da célula hospedeira.
[0220] Para construir um vetor retroviral, um gene de interesse que codifica um ácido nucleico é inserido no genoma viral no lugar de certas sequências virais para produzir um vírus que é defeituoso em relação à replicação. Para produzir virions, é construída uma linhagem de células de empacotamento que contém os genes gag, pole env, mas sem a LTR e os componentes de empacotamento. Quando um plasmídeo recombinante que contém um cDNA, junto com a LTR retroviral e sequências de empacotamento, é introduzido nesta linhagem de célula (por precipitação com fosfato de cálcio, por exemplo), a sequência de empacotamento permite que o produto da transcrição do RNA do plasmídeo recombinante seja empacotada em partículas virais, que são então secretadas no meio de cultura. O meio que contém os retrovirus recombinantes é então coletado, opcionalmente concentrado e utilizado para transferência gênica. Os vetores retrovirais são capazes de infectar uma ampla variedade de tipos celulares. Entretanto, a integração e a expressão estável requerem a divisão das células hospedeiras.
[0221] Uma nova abordagem projetada para permitir o direcionamento específico dos vetores retrovirais foi desenvolvida recentemente com base na modificação química de um retrovirus através da adição química de resíduos de lactose no envelope viral. Esta modificação podería permitir a infecção específica de hepatócitos através de receptores de sialoglicoproteína.
[0222] Pode ser utilizada uma abordagem diferente para o direcionamento de retrovirus recombinantes, na qual são utilizados anticorpos biotinilados contra uma proteína do envelope retroviral e contra um receptor celular específico. Os anticorpos são acoplados através dos componentes de biotina
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115/259 utilizando estreptavidina. Utilizando anticorpos contra os antígenos de complexo principal de histocompatibilidade de classe I e de classe II, foi demonstrada a infecção de uma variedade de células humanas que carregam estes antígenos de superfície com um vírus ecotrópico in vitro (Roux et al., 1989).
[0223] Há certas limitações ao uso de vetores retrovirais em todos os aspectos da presente divulgação. Por exemplo, os vetores retrovirais geralmente se integram em sítios aleatórios no genoma da célula. Isto pode levar à mutagênese por inserção através da interrupção dos genes hospedeiros ou através da inserção de sequências reguladoras virais que podem interferir na função de genes flanqueadores. Outra preocupação com o uso de vetores retrovirais defeituosos é o surgimento potencial de vírus competentes em relação à replicação do tipo selvagem nas células de empacotamento. Isto pode resultar dos eventos de recombinação nos quais a sequência intacta do vírus recombinante se insere a montante das sequências de gag, pol, env integradas no genoma da célula hospedeira. Entretanto, estão disponíveis agora novas linhagens de células de empacotamento que devem reduzir bastante a probabilidade de recombinação (ver, por exemplo, Markowitz etal., 1988; Hersdorffer etal., 1990).
[0224] Outros vetores virais podem ser empregados como construções de expressão na presente divulgação. Os vetores derivados de vírus tais como vírus associados a adeno de vírus vaccinia (AAV) e herpesvirus podem ser empregados. Estes oferecem várias características atrativas para várias células de mamíferos.
[0225] Nas modalidades, o vetor AAV é defeituoso em relação à replicação ou condicionalmente defeituoso em relação à replicação. Nas modalidades, o vetor AAV é um vetor AAV recombinante. Em algumas modalidades, o vetor AAV compreende uma sequência isolada ou derivada de um vetor AAV do sorotipo AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 ou qualquer combinação dos mesmos.
[0226] Em algumas modalidades, um único vetor viral é utilizado para fornecer um ácido nucleico que codifica uma Cas9 ou uma Cpf 1 e pelo menos um
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116/259 gRNA a uma célula. Em algumas modalidades, Cas9 ou Cpf 1 é fornecida a uma célula utilizando um primeiro vetor viral e pelo menos um gRNA é fornecido à célula utilizando um segundo vetor viral.
[0227] Em algumas modalidades, um único vetor viral é utilizado para fornecer um ácido nucleico que codifica Cas9 ou Cpf 1 e pelo menos um gRNA a uma célula. Em algumas modalidades, Cas9 ou Cpf 1 é fornecida a uma célula utilizando um primeiro vetor viral e pelo menos um gRNA é fornecido à célula utilizando um segundo vetor viral. Para realizar a expressão de construções gênicas senso ou antissenso, a construção de expressão tem que ser fornecida dentro de uma célula. A célula pode ser uma célula muscular, uma célula satélite, um mesangioblasto, uma célula derivada da medula óssea, uma célula de estroma ou uma célula tronco mesenquimal. Nas modalidades, a célula é uma célula muscular cardíaca, uma célula muscular esquelética ou uma célula muscular lisa. Nas modalidades, a célula é uma célula no tibial anterior, nos quadriceps, no sóleo, no diafragma ou no coração. Em algumas modalidades, a célula é uma célula tronco pluripotente induzida (iPSC) ou uma célula de massa de célula interna (iCM). Em modalidades adicionais, a célula é uma iPSC humana ou uma iCM humana. Em algumas modalidades, as iPSCs humanas ou as iCMs humanas da divulgação podem ser derivadas de uma linhagem de célula tronco cultivada, uma célula tronco adulta, uma célula tronco placentária ou de outra fonte de células tronco adultas ou embrionárias que não requer a destruição de um embrião humano. O fornecimento a uma célula pode ser realizado in vitro, como nos procedimentos de laboratório para a transformação de linhagens de células ou in vivo ou ex vivo, como no tratamento de certos estados de doença. Um mecanismo para fornecimento é através de infecção viral na qual a construção de expressão é encapsidada em uma partícula viral infecciosa.
[0228] Vários métodos não virais para a transferência de construções de expressão para dentro de células de mamíferos em cultura também são considerados pela presente divulgação. Estes incluem precipitação com fosfato de cálcio, DEAE-dextran, eletroporação, microinjeção direta, lipossomos carregados
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117/259 com DA e complexos de lipofectamina-DNA, tratamento das células com ultrassom, bombardeio gênico utilizando microprojéteis de alta velocidade e transfecção mediada por receptor. Algumas destas técnicas podem ser adaptadas de forma bem-sucedida para uso in vivo ou ex vivo.
[0229] Uma vez que a construção de expressão fornecida dentro da célula o gene de interesse que codifica o ácido nucleico pode ser posicionado e expresso em sítios diferentes. Em certas modalidades, o gene que codifica o ácido nucleico pode ser integrado de forma estável no genoma da célula. Esta integração pode ocorrer na localização e na orientação cognatas através de recombinação homóloga (substituição gênica) ou pode ser integrada em uma localização não específica aleatória (aumento gênico). Ainda em modalidades adicionais, o ácido nucleico pode ser mantido de forma estável na célula na forma de um segmento de DNA epissomal separado. Tais segmentos de ácido nucleico ou “epissomos” codificam sequências suficientes para permitir a manutenção e a replicação independentes de ou em sincronia com o ciclo da célula hospedeira. A maneira através da qual a construção de expressão é fornecida a uma célula e onde na célula o ácido nucleico fica é dependente do tipo de construção de expressão empregado.
[0230] Em outra modalidade, a construção de expressão pode simplesmente consistir de DNA recombinante nu ou plasmídeos. A transferência da construção pode ser realizada através de qualquer um dos métodos mencionados anteriormente que permeabilizam física- ou quimicamente a membrana celular. Isto é particularmente aplicável para transferência in vitro, mas pode ser aplicado também para uso in vivo. Dubensky et al. (1984) injetaram de forma bem-sucedida DNA de poliomavírus na forma de precipitados de fosfato de cálcio no fígado e no baço de camundongos adultos e recém-nascidos demonstrando replicação viral ativa e infecção aguda. Benvenisty e Neshif (1986) também demonstraram que a injeção intraperitoneal direta de plasmídeos precipitados com fosfato de cálcio resulta na expressão dos genes transfectados. O DNA que codifica um gene de interesse
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118/259 também pode ser transferido de uma maneira similar in vivo e expressar o produto gênico.
[0231] Ainda em outra modalidade para transferir uma construção de expressão de DNA nu para dentro das células pode haver o envolvimento de bombardeio de partículas. Este método depende da capacidade de acelerar microprojéteis revestidos com DNA até uma velocidade alta que permite que estes perfurem membranas celulares e entrem nas células sem mata-las. Vários dispositivos para acelerar partículas pequenas foram desenvolvidos. Um desses dispositivos se baseia em uma descarga de alta voltagem para gerar uma corrente elétrica que por sua vez fornece a força motriz. Os microprojéteis utilizados consistiam de substâncias biologicamente inertes tais como esferas de tungstênio ou ouro.
[0232] Em algumas modalidades, a construção de expressão é fornecida diretamente no fígado, na pele e/ou no tecido muscular de um indivíduo. Isto pode requerer exposição cirúrgica do tecido ou das células, para eliminar qualquer tecido interposto entre a pistola e o órgão alvo, isto é, tratamento ex vivo. Novamente, o DNA que codifica um gene particular pode ser fornecido através deste método e ainda ser incorporado pela presente divulgação.
[0233] Em uma modalidade adicional, a construção de expressão pode estar capturada dentro de um lipossomo. Os lipossomos são estruturas vesiculares caracterizadas por uma membrana em bicamada de fosfolipídeos e um meio aquoso interno. Os lipossomos multilamelares possuem várias camadas lipídicas separadas por meio aquoso. Estes se formam espontaneamente quando os fosfolipídeos são suspensos em um excesso de solução aquosa. Os componentes lipídicos sofrem autorrearranjo antes da formação de estruturas fechadas e captura água e solutos dissolvidos entre as bicamadas lipídicas. Também são considerados complexos de lipofectamina-DNA.
[0234] O fornecimento de ácidos nucleicos mediado por lipossomos e a expressão do DNA estranho in vitro têm sido muito bem-sucedidos. Um reagente
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119/259 conhecido como Lipofectamina 2000™ é amplamente utilizado e está disponível comercialmente.
[0235] Em certas modalidades, o lipossomo pode ser complexado com um vírus da hemaglutinina vírus (HVJ) para facilitar a fusão com a membrana celular e promover a entrada nas células do DNA encapsulado pelo lipossomo. Em outras modalidades, o lipossomo pode ser complexado ou empregado em associação com proteínas cromossômicas nucleares que não são histonas (HMG-1). Ainda em modalidades adicionais, o lipossomo pode ser complexado ou empregado em associação tanto com HVJ quanto com HMG-1. Uma vez que estas construções de expressão têm sido empregadas de forma bem-sucedida na transferência e na expressão de ácido nucleico in vitro e in vivo, então estas são aplicáveis para a presente divulgação. Quando um promotor bacteriano é empregado na construção de DNA, também será desejável incluir incluem dentro do lipossomo uma polimerase bacteriana apropriada.
[0236] Outras construções de expressão que podem ser empregadas para fornecer um ácido nucleico que codifica um gene particular dentro das células são veículos de fornecimento mediados por receptores. Estes tiram vantagem da captação seletiva de macromoléculas através da endocitose mediada por receptor em quase todas as células eucarióticas. Devido à distribuição específica para o tipo de célula de vários receptores, o fornecimento pode ser altamente específico.
[0237] Os veículos de direcionamento gênico mediado por receptores consistem geralmente de dois componentes: um ligante específico para o receptor celular e um agente de ligação com o DNA. Vários ligantes foram utilizados para transferência gênica mediada por receptores. Os ligantes mais extensivamente caracterizados são asialoorosomucoide (ASOR) e transferrina. Uma neoglicoproteína sintética, que reconhece o mesmo receptor que ASOR, foi utilizada como um veículo de fornecimento gênico e o fator de crescimento epidérmico (EGF) também foi utilizado para fornecer genes às células de carcinoma escamoso.
D. Vetores AAV-Cas9
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120/259 [0238] Em algumas modalidades, uma Cas9 pode ser empacotada dentro de um vetor AAV. Em algumas modalidades, o vetor AAV é um vetor AAV do tipo selvagem. Em algumas modalidades, o vetor AAV contém uma ou mais mutações. Em algumas modalidades, o vetor AAV é isolado ou derivado de um vetor AAV do sorotipo AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 ou qualquer combinação dos mesmos.
[0239] Exemplos de vetores AAV-Cas9 contêm duas sequências ITR (repetição terminal invertida) que flanqueiam uma região de sequência central que compreende a sequência de Cas9. Em algumas modalidades, as ITRs são isoladas ou derivadas de um vetor AAV do sorotipo AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 ou qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, as ITRs compreendem ou consistem de sequências de comprimento completo e/ou do tipo selvagem para um sorotipo de AAV. Em algumas modalidades, as ITRs compreendem ou consistem de sequências truncadas para um sorotipo de AAV. Em algumas modalidades, as ITRs compreendem ou consistem de sequências alongadas para um sorotipo de AAV. Em algumas modalidades, as ITRs compreendem ou consistem de sequências que compreende uma variação de sequência comparada com uma sequência do tipo selvagem para o mesmo sorotipo de AAV. Em algumas modalidades, a variação de sequência compreende uma ou mais de uma substituição, uma deleção, uma inserção, uma inversão ou uma transposição. Em algumas modalidades, as ITRs compreendem ou consistem de pelo menos 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131,
132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148,
149 ou 150 pares de bases. Em algumas modalidades, as ITRs compreendem ou consistem de 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113,
114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130,
131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147,
148, 149 ou 150 pares de bases. Em algumas modalidades, as ITRs possuem um
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121/259 comprimento de 110 ± 10 pares de bases. Em algumas modalidades, as ITRs possuem um comprimento de 120 ± 10 pares de bases. Em algumas modalidades, as ITRs possuem um comprimento de 130 ± 10 pares de bases. Em algumas modalidades, as ITRs possuem um comprimento de 140 ± 10 pares de bases. Em algumas modalidades, as ITRs possuem um comprimento de 150 ± 10 pares de bases. Em algumas modalidades, as ITRs possuem um comprimento de 115, 145 ou 141 pares de bases. Em algumas modalidades, as ITRs possuem uma sequência selecionada da SEQ. ID. NO: 880, SEQ ID NO: 881, SEQ ID NO; 882, SEQ ID NO: 883 e SEQ ID. NO: 946.
[0240] Em algumas modalidades, o vetor AAV-Cas9 pode conter um ou mais sinais de localização nuclear (NLS). Em algumas modalidades, o vetor AAVCas9 contém 1,2, 3, 4 ou 5 sinais de localização nuclear. Exemplos de NLS incluem o NLS de c-myc (SEQ ID NO: 884), o NLS de SV40 (SEQ ID NO: 885), o NLS de hnRNPAI M9 (SEQ ID NO: 886), o NLS da nucleoplasmina (SEQ ID NO: 887), a sequência RMRKFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELRKAKKDEQILKRRNV (SEQ ID NO: 888) do domínio de IBB da importina-alfa, as sequências VSRKRPRP (SEQ ID NO: 889) e PPKKARED (SEQ ID NO: 890) da proteína T de mioma, a sequência PQPKKKPL (SEQ ID NO: 891) de p53 humano, a sequência SALIKKKKKMAP (SEQ ID NO: 892) de c-abl IV de camundongo, as sequências DRLRR (SEQ ID NO: 893) e PKQKKRK (SEQ ID NO: 894) de NS1 do vírus influenza, a sequência RKLKKKIKKL (SEQ ID NO: 895) do antígeno delta do vírus da Hepatite e a sequência REKKKFLKRR (SEQ ID NO: 896) da proteína Mx1 de camundongo. Sinais de localização nuclear adicionalmente aceitáveis incluem sequências de localização nuclear bipartidas tal como a sequência KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK (SEQ ID NO: 897) da poli(ADP-ribose) polimerase humana ou a sequência RKCLQAGMNLEARKTKK (SEQ ID NO: 898) dos receptores de hormônios esteroides (humanos) glicocorticoide.
[0241 ] Em algumas modalidades, o vetor AAV-Cas9 pode compreender elementos adicionais para facilitar o empacotamento do vetor e a expressão da Cas9.
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Em algumas modalidades, o vetor AAV-Cas9 pode compreender uma sequência poliA. Em algumas modalidades, a sequência de poli A pode ser uma sequência de mini-poliA. Em algumas modalidades, o vetor AAV-Cas9 pode compreender um elemento que pode sofrer transposição. Em algumas modalidades, o vetor AAV-Cas9 pode compreender um elemento regulador. Em algumas modalidades, o elemento regulador é um ativador ou um repressor.
[0242] Em algumas modalidades, o AAV-Cas9 pode conter um ou mais promotores. Em algumas modalidades, o um ou mais promotores controlam a expressão da Cas9. Em algumas modalidades, o um ou mais promotores são promotores específicos para os músculos. Exemplos de promotores específicos para os músculos incluem o promotor da cadeia leve 2 da miosina, o promotor da a-actina, o promotor da troponina 1, o promotor de trocador de Na+/Ca2+, o promotor da distrofina, o promotor da a7 integrina, o promotor do peptídeo natriurético cerebral, o promotor de αΒ-cristalina/proteína de choque térmico pequena, o promotor da cadeia pesada da a-miosina, o promotor de ANF, o promotor CK8 e o promotor CK8e.
[0243] Em algumas modalidades, o vetor AAV-Cas9 pode ser otimizado para produção em levedura, bactérias, células de insetos ou células de mamíferos. Em algumas modalidades, o vetor AAV-Cas9 pode ser otimizado para expressão em células humanas. Em algumas modalidades, o vetor AAV-Cas9 pode ser otimizado para expressão em um sistema de expressão de bacculovírus.
[0244] Em algumas modalidades, o vetor AAV-Cas9 compreende uma sequência selecionada da SEQ ID NO: 899, SEQ ID NO: 900, SEQ ID NO: 901 ou SEQ ID NO: 902, que são mostradas na Tabela 4.
Tabela 4: Exemplos de construções para edição gênica (de ITR a ITR para fornecimento através do vetor AAV)
Q ID NO: Sequência
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899
GGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGAC CAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGC GAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTC CTTGTAGTTAATGATTAACCCGCCATGCTACTTATCTACGTAGCCATGC TCTAGATTAATTAATGCCCATGTAAGGAGGCAAGGCCTGGGGACACCC GAGATGCCTGGTTATAATTAACCCAGACATGTGGCTGCCCCCCCCCCC CCAACACCTGCTGCCTCTAAAAATAACCCTGCATGCCATGTTCCCGGC GAAGGGCCAGCTGTCCCCCGCCAGCTAGACTCAGCACTTAGTTTAGGA ACCAGTGAGCAAGTCAGCCCTTGGGGCAGCCCATACAAGGCCATGGG GCTGGGCAAGCTGCACGCCTGGGTCCGGGGTGGGCACGGTGCCCGG GCAACGAGCTGAAAGCTCATCTGCTCTCAGGGGCCCCTCCCTGGGGA CAGCCCCTCCTGGCTAGTCACACCCTGTAGGCTCCTCTATATAACCCA GGGGCACAGGGGCTGCCCTCATTCTACCACCACCTCCACAGCACAGA CAGACACTCAGGAGCCAGCCAGCGCTAGCGCCACCATGATGGCCCCA AAGAAGAAGCGGAAGGTCGGTATCCACGGAGTCCCAGCAGCCGACAA GAAGTACAGCATCGGCCTGGACATCGGCACCAACTCTGTGGGCTGGG CCGTGATCACCGACGAGTACAAGGTGCCCAGCAAGAAATTCAAGGTGC TGGGCAACACCGACCGGCACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGAGCC CTGCTGTTCGACAGCGGCGAAACAGCCGAGGCCACCCGGCTGAAGAG AACCGCCAGAAGAAGATACACCAGACGGAAGAACCGGATCTGCTATCT GCAAGAGATCTTCAGCAACGAGATGGCCAAGGTGGACGACAGCTTCTT CCACAGACTGGAAGAGTCCTTCCTGGTGGAAGAGGATAAGAAGCACGA GCGGCACCCCATCTTCGGCAACATCGTGGACGAGGTGGCCTACCACG AGAAGTACCCCACCATCTACCACCTGAGAAAGAAACTGGTGGACAGCA CCGACAAGGCCGACCTGCGGCTGATCTATCTGGCCCTGGCCCACATG ATCAAGTTCCGGGGCCACTTCCTGATCGAGGGCGACCTGAACCCCGA CAACAGCGACGTGGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTGCAGACCTACAA CCAGCTGTTCGAGGAAAACCCCATCAACGCCAGCGGCGTGGACGCCA AGGCCATCCTGTCTGCCAGACTGAGCAAGAGCAGACGGCTGGAAAATC
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TGATCGCCCAGCTGCCCGGCGAGAAGAAGAATGGCCTGTTCGGCAAC CTGATTGCCCTGAGCCTGGGCCTGACCCCCAACTTCAAGAGCAACTTC GACCTGGCCGAGGATGCCAAACTGCAGCTGAGCAAGGACACCTACGA CGACGACCTGGACAACCTGCTGGCCCAGATCGGCGACCAGTACGCCG ACCTGTTTCTGGCCGCCAAGAACCTGTCCGACGCCATCCTGCTGAGCG ACATCCTGAGAGTGAACACCGAGATCACCAAGGCCCCCCTGAGCGCCT CTATGATCAAGAGATACGACGAGCACCACCAGGACCTGACCCTGCTGA AAGCTCTCGTGCGGCAGCAGCTGCCTGAGAAGTACAAAGAGATTTTCT TCGACCAGAGCAAGAACGGCTACGCCGGCTACATTGACGGCGGAGCC AGCCAGGAAGAGTTCTACAAGTTCATCAAGCCCATCCTGGAAAAGATG GACGGCACCGAGGAACTGCTCGTGAAGCTGAACAGAGAGGACCTGCT GCGGAAGCAGCGGACCTTCGACAACGGCAGCATCCCCCACCAGATCC ACCTGGGAGAGCTGCACGCCATTCTGCGGCGGCAGGAAGATTTTTACC CATTCCTGAAGGACAACCGGGAAAAGATCGAGAAGATCCTGACCTTCC GCATCCCCTACTACGTGGGCCCTCTGGCCAGGGGAAACAGCAGATTC GCCTGGATGACCAGAAAGAGCGAGGAAACCATCACCCCCTGGAACTTC GAGGAAGTGGTGGACAAGGGCGCTTCCGCCCAGAGCTTCATCGAGCG GATGACCAACTTCGATAAGAACCTGCCCAACGAGAAGGTGCTGCCCAA GCACAGCCTGCTGTACGAGTACTTCACCGTGTATAACGAGCTGACCAA AGTGAAATACGTGACCGAGGGAATGAGAAAGCCCGCCTTCCTGAGCG GCGAGCAGAAAAAGGCCATCGTGGACCTGCTGTTCAAGACCAACCGG AAAGTGACCGTGAAGCAGCTGAAAGAGGACTACTTCAAGAAAATCGAG TGCTTCGACTCCGTGGAAATCTCCGGCGTGGAAGATCGGTTCAACGCC TCCCTGGGCACATACCACGATCTGCTGAAAATTATCAAGGACAAGGAC TTCCTGGACAATGAGGAAAACGAGGACATTCTGGAAGATATCGTGCTG ACCCTGACACTGTTTGAGGACAGAGAGATGATCGAGGAACGGCTGAAA ACCTATGCCCACCTGTTCGACGACAAAGTGATGAAGCAGCTGAAGCGG CGGAGATACACCGGCTGGGGCAGGCTGAGCCGGAAGCTGATCAACGG CATCCGGGACAAGCAGTCCGGCAAGACAATCCTGGATTTCCTGAAGTC
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CGACGGCTTCGCCAACAGAAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACAG CCTGACCTTTAAAGAGGACATCCAGAAAGCCCAGGTGTCCGGCCAGG GCGATAGCCTGCACGAGCACATTGCCAATCTGGCCGGCAGCCCCGCC ATTAAGAAGGGCATCCTGCAGACAGTGAAGGTGGTGGACGAGCTCGT GAAAGTGATGGGCCGGCACAAGCCCGAGAACATCGTGATCGAAATGG CCAGAGAGAACCAGACCACCCAGAAGGGACAGAAGAACAGCCGCGAG AGAATGAAGCGGATCGAAGAGGGCATCAAAGAGCTGGGCAGCCAGAT CCTGAAAGAACACCCCGTGGAAAACACCCAGCTGCAGAACGAGAAGCT GTACCTGTACTACCTGCAGAATGGGCGGGATATGTACGTGGACCAGGA ACTGGACATCAACCGGCTGTCCGACTACGATGTGGACCATATCGTGCC TCAGAGCTTTCTGAAGGACGACTCCATCGACAACAAGGTGCTGACCAG AAGCGACAAGAACCGGGGCAAGAGCGACAACGTGCCCTCCGAAGAGG TCGTGAAGAAGATGAAGAACTACTGGCGGCAGCTGCTGAACGCCAAGC TGATTACCCAGAGAAAGTTCGACAATCTGACCAAGGCCGAGAGAGGCG GCCTGAGCGAACTGGATAAGGCCGGCTTCATCAAGAGACAGCTGGTG GAAACCCGGCAGATCACAAAGCACGTGGCACAGATCCTGGACTCCCG GATGAACACTAAGTACGACGAGAATGACAAGCTGATCCGGGAAGTGAA AGTGATCACCCTGAAGTCCAAGCTGGTGTCCGATTTCCGGAAGGATTT CCAGTTTTACAAAGTGCGCGAGATCAACAACTACCACCACGCCCACGA CGCCTACCTGAACGCCGTCGTGGGAACCGCCCTGATCAAAAAGTACCC TAAGCTGGAAAGCGAGTTCGTGTACGGCGACTACAAGGTGTACGACGT GCGGAAGATGATCGCCAAGAGCGAGCAGGAAATCGGCAAGGCTACCG CCAAGTACTTCTTCTACAGCAACATCATGAACTTTTTCAAGACCGAGATT ACCCTGGCCAACGGCGAGATCCGGAAGCGGCCTCTGATCGAGACAAA CGGCGAAACCGGGGAGATCGTGTGGGATAAGGGCCGGGATTTTGCCA CCGTGCGGAAAGTGCTGAGCATGCCCCAAGTGAATATCGTGAAAAAGA CCGAGGTGCAGACAGGCGGCTTCAGCAAAGAGTCTATCCTGCCCAAG AGGAACAGCGATAAGCTGATCGCCAGAAAGAAGGACTGGGACCCTAA GAAGTACGGCGGCTTCGACAGCCCCACCGTGGCCTATTCTGTGCTGGT
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GGTGGCCAAAGTGGAAAAGGGCAAGTCCAAGAAACTGAAGAGTGTGAA AGAGCTGCTGGGGATCACCATCATGGAAAGAAGCAGCTTCGAGAAGAA TCCCATCGACTTTCTGGAAGCCAAGGGCTACAAAGAAGTGAAAAAGGA CCTGATCATCAAGCTGCCTAAGTACTCCCTGTTCGAGCTGGAAAACGG CCGGAAGAGAATGCTGGCCTCTGCCGGCGAACTGCAGAAGGGAAACG AACTGGCCCTGCCCTCCAAATATGTGAACTTCCTGTACCTGGCCAGCC ACTATGAGAAGCTGAAGGGCTCCCCCGAGGATAATGAGCAGAAACAGC TGTTTGTGGAACAGCACAAGCACTACCTGGACGAGATCATCGAGCAGA TCAGCGAGTTCTCCAAGAGAGTGATCCTGGCCGACGCTAATCTGGACA AAGTGCTGTCCGCCTACAACAAGCACCGGGATAAGCCCATCAGAGAGC AGGCCGAGAATATCATCCACCTGTTTACCCTGACCAATCTGGGAGCCC CTGCCGCCTTCAAGTACTTTGACACCACCATCGACCGGAAGAGGTACA CCAGCACCAAAGAGGTGCTGGACGCCACCCTGATCCACCAGAGCATC ACCGGCCTGTACGAGACACGGATCGACCTGTCTCAGCTGGGAGGCGA CAAGCGTCCTGCTGCTACTAAGAAAGCTGGTCAAGCTAAGAAAAAGAA ATGAATCGATTAGCAATAAAGGATCGTTTA1 1 1 1CATTGGAAGCGTGTG TTGGT1 1 1 1TGATCAGGCGCGGGTACCAGGTCGCGGCCGCTCTAGAGC ATGGCTACGTAGATAAGTAGCATGGCGGGTTAATCATTAACTACAAGGA ACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCT CACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCC GGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGA
900 CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCA AAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGA GCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT GTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTTGTAGTTAATGATTAACCCGC CATGCTACTTATCTACGTAGCCATGCTCTAGATTAATTAATGCCCATGTA AGGAGGCAAGGCCTGGGGACACCCGAGATGCCTGGTTATAATTAACCC AGACATGTGGCTGCCCCCCCCCCCCCAACACCTGCTGCCTCTAAAAAT
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AACCCTGCATGCCATGTTCCCGGCGAAGGGCCAGCTGTCCCCCGCCA GCTAGACTCAGCACTTAGTTTAGGAACCAGTGAGCAAGTCAGCCCTTG GGGCAGCCCATACAAGGCCATGGGGCTGGGCAAGCTGCACGCCTGG GTCCGGGGTGGGCACGGTGCCCGGGCAACGAGCTGAAAGCTCATCTG CTCTCAGGGGCCCCTCCCTGGGGACAGCCCCTCCTGGCTAGTCACAC CCTGTAGGCTCCTCTATATAACCCAGGGGCACAGGGGCTGCCCTCATT CTACCACCACCTCCACAGCACAGACAGACACTCAGGAGCCAGCCAGC GCTAGCGCCACCATGATGGCCCCAAAGAAGAAGCGGAAGGTCGGTAT CCACGGAGTCCCAGCAGCCGACAAGAAGTACAGCATCGGCCTGGACA TCGGCACCAACTCTGTGGGCTGGGCCGTGATCACCGACGAGTACAAG GTGCCCAGCAAGAAATTCAAGGTGCTGGGCAACACCGACCGGCACAG CATCAAGAAGAACCTGATCGGAGCCCTGCTGTTCGACAGCGGCGAAAC AGCCGAGGCCACCCGGCTGAAGAGAACCGCCAGAAGAAGATACACCA GACGGAAGAACCGGATCTGCTATCTGCAAGAGATCTTCAGCAACGAGA TGGCCAAGGTGGACGACAGCTTCTTCCACAGACTGGAAGAGTCCTTCC TGGTGGAAGAGGATAAGAAGCACGAGCGGCACCCCATCTTCGGCAAC ATCGTGGACGAGGTGGCCTACCACGAGAAGTACCCCACCATCTACCAC CTGAGAAAGAAACTGGTGGACAGCACCGACAAGGCCGACCTGCGGCT GATCTATCTGGCCCTGGCCCACATGATCAAGTTCCGGGGCCACTTCCT GATCGAGGGCGACCTGAACCCCGACAACAGCGACGTGGACAAGCTGT TCATCCAGCTGGTGCAGACCTACAACCAGCTGTTCGAGGAAAACCCCA TCAACGCCAGCGGCGTGGACGCCAAGGCCATCCTGTCTGCCAGACTG AGCAAGAGCAGACGGCTGGAAAATCTGATCGCCCAGCTGCCCGGCGA GAAGAAGAATGGCCTGTTCGGCAACCTGATTGCCCTGAGCCTGGGCCT GACCCCCAACTTCAAGAGCAACTTCGACCTGGCCGAGGATGCCAAACT GCAGCTGAGCAAGGACACCTACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGG CCCAGATCGGCGACCAGTACGCCGACCTGTTTCTGGCCGCCAAGAAC CTGTCCGACGCCATCCTGCTGAGCGACATCCTGAGAGTGAACACCGAG ATCACCAAGGCCCCCCTGAGCGCCTCTATGATCAAGAGATACGACGAG
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CACCACCAGGACCTGACCCTGCTGAAAGCTCTCGTGCGGCAGCAGCT GCCTGAGAAGTACAAAGAGATTTTCTTCGACCAGAGCAAGAACGGCTA CGCCGGCTACATTGACGGCGGAGCCAGCCAGGAAGAGTTCTACAAGT TCATCAAGCCCATCCTGGAAAAGATGGACGGCACCGAGGAACTGCTCG TGAAGCTGAACAGAGAGGACCTGCTGCGGAAGCAGCGGACCTTCGAC AACGGCAGCATCCCCCACCAGATCCACCTGGGAGAGCTGCACGCCAT TCTGCGGCGGCAGGAAGATTTTTACCCATTCCTGAAGGACAACCGGGA AAAGATCGAGAAGATCCTGACCTTCCGCATCCCCTACTACGTGGGCCC TCTGGCCAGGGGAAACAGCAGATTCGCCTGGATGACCAGAAAGAGCG AGGAAACCATCACCCCCTGGAACTTCGAGGAAGTGGTGGACAAGGGC GCTTCCGCCCAGAGCTTCATCGAGCGGATGACCAACTTCGATAAGAAC CTGCCCAACGAGAAGGTGCTGCCCAAGCACAGCCTGCTGTACGAGTA CTTCACCGTGTATAACGAGCTGACCAAAGTGAAATACGTGACCGAGGG AATGAGAAAGCCCGCCTTCCTGAGCGGCGAGCAGAAAAAGGCCATCG TGGACCTGCTGTTCAAGACCAACCGGAAAGTGACCGTGAAGCAGCTGA AAGAGGACTACTTCAAGAAAATCGAGTGCTTCGACTCCGTGGAAATCTC CGGCGTGGAAGATCGGTTCAACGCCTCCCTGGGCACATACCACGATCT GCTGAAAATTATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAATGAGGAAAACGA GGACATTCTGGAAGATATCGTGCTGACCCTGACACTGTTTGAGGACAG AGAGATGATCGAGGAACGGCTGAAAACCTATGCCCACCTGTTCGACGA CAAAGTGATGAAGCAGCTGAAGCGGCGGAGATACACCGGCTGGGGCA GGCTGAGCCGGAAGCTGATCAACGGCATCCGGGACAAGCAGTCCGGC AAGACAATCCTGGATTTCCTGAAGTCCGACGGCTTCGCCAACAGAAAC TTCATGCAGCTGATCCACGACGACAGCCTGACCTTTAAAGAGGACATC CAGAAAGCCCAGGTGTCCGGCCAGGGCGATAGCCTGCACGAGCACAT TGCCAATCTGGCCGGCAGCCCCGCCATTAAGAAGGGCATCCTGCAGA CAGTGAAGGTGGTGGACGAGCTCGTGAAAGTGATGGGCCGGCACAAG CCCGAGAACATCGTGATCGAAATGGCCAGAGAGAACCAGACCACCCA GAAGGGACAGAAGAACAGCCGCGAGAGAATGAAGCGGATCGAAGAGG
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GCATCAAAGAGCTGGGCAGCCAGATCCTGAAAGAACACCCCGTGGAAA ACACCCAGCTGCAGAACGAGAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAATG GGCGGGATATGTACGTGGACCAGGAACTGGACATCAACCGGCTGTCC GACTACGATGTGGACCATATCGTGCCTCAGAGCTTTCTGAAGGACGAC TCCATCGACAACAAGGTGCTGACCAGAAGCGACAAGAACCGGGGCAA GAGCGACAACGTGCCCTCCGAAGAGGTCGTGAAGAAGATGAAGAACTA CTGGCGGCAGCTGCTGAACGCCAAGCTGATTACCCAGAGAAAGTTCGA CAATCTGACCAAGGCCGAGAGAGGCGGCCTGAGCGAACTGGATAAGG CCGGCTTCATCAAGAGACAGCTGGTGGAAACCCGGCAGATCACAAAGC ACGTGGCACAGATCCTGGACTCCCGGATGAACACTAAGTACGACGAGA ATGACAAGCTGATCCGGGAAGTGAAAGTGATCACCCTGAAGTCCAAGC TGGTGTCCGATTTCCGGAAGGATTTCCAGTTTTACAAAGTGCGCGAGAT CAACAACTACCACCACGCCCACGACGCCTACCTGAACGCCGTCGTGG GAACCGCCCTGATCAAAAAGTACCCTAAGCTGGAAAGCGAGTTCGTGT ACGGCGACTACAAGGTGTACGACGTGCGGAAGATGATCGCCAAGAGC GAGCAGGAAATCGGCAAGGCTACCGCCAAGTACTTCTTCTACAGCAAC ATCATGAACTTTTTCAAGACCGAGATTACCCTGGCCAACGGCGAGATC CGGAAGCGGCCTCTGATCGAGACAAACGGCGAAACCGGGGAGATCGT GTGGGATAAGGGCCGGGATTTTGCCACCGTGCGGAAAGTGCTGAGCA TGCCCCAAGTGAATATCGTGAAAAAGACCGAGGTGCAGACAGGCGGCT TCAGCAAAGAGTCTATCCTGCCCAAGAGGAACAGCGATAAGCTGATCG CCAGAAAGAAGGACTGGGACCCTAAGAAGTACGGCGGCTTCGACAGC CCCACCGTGGCCTATTCTGTGCTGGTGGTGGCCAAAGTGGAAAAGGG CAAGTCCAAGAAACTGAAGAGTGTGAAAGAGCTGCTGGGGATCACCAT CATGGAAAGAAGCAGCTTCGAGAAGAATCCCATCGACTTTCTGGAAGC CAAGGGCTACAAAGAAGTGAAAAAGGACCTGATCATCAAGCTGCCTAA GTACTCCCTGTTCGAGCTGGAAAACGGCCGGAAGAGAATGCTGGCCTC TGCCGGCGAACTGCAGAAGGGAAACGAACTGGCCCTGCCCTCCAAAT ATGTGAACTTCCTGTACCTGGCCAGCCACTATGAGAAGCTGAAGGGCT
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CCCCCGAGGATAATGAGCAGAAACAGCTGTTTGTGGAACAGCACAAGC ACTACCTGGACGAGATCATCGAGCAGATCAGCGAGTTCTCCAAGAGAG TGATCCTGGCCGACGCTAATCTGGACAAAGTGCTGTCCGCCTACAACA AGCACCGGGATAAGCCCATCAGAGAGCAGGCCGAGAATATCATCCACC TGTTTACCCTGACCAATCTGGGAGCCCCTGCCGCCTTCAAGTACTTTGA CACCACCATCGACCGGAAGAGGTACACCAGCACCAAAGAGGTGCTGG ACGCCACCCTGATCCACCAGAGCATCACCGGCCTGTACGAGACACGG ATCGACCTGTCTCAGCTGGGAGGCGACAAGCGTCCTGCTGCTACTAAG AAAGCTGGTCAAGCTAAGAAAAAGAAATGAATCGATTAGCAATAAAGGA TCGTTTAI I I I CA I IGGAAGCG IG IG I IGG I I I I ITGATCAGGCGCGGG TACCAGGTCGCGGCCGCTCTAGAGCATGGCTACGTAGATAAGTAGCAT GGCGGGTTAATCATTAACTACAAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTAGGA ACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCT CACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCC GGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG
901 AAGATGACGGTTTGTCACATGGAGTTGGCAGGATGTTTGATTAAAAACA TAACAGGAAGAAAAATGCCCCGCTGTGGGCGGACAAAATAGTTGGGAA CTGGGAGGGGTGGAAATGGAGTTTTTAAGGATTATTTAGGGAAGAGTG ACAAAATAGATGGGAACTGGGTGTAGCGTCGTAAGCTAATACGAAAATT AAAAATGACAAAATAGTTTGGAACTAGATTTCACTTATCTGGTTCGGATC T CCT AGGCG AT AT CAGT G AT CAcggatctcgaccaattgacattattgaagcaACT AGT AT CG ATtttatcagggttattgtctcagaCCTGCAGGCAGCTGCGCGCT CGCT CGC TCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGT CGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCA ACTCCATCACTAGGGGTTCCTGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCC TTGTAGTTAATGATTAACCCGCCATGCTACTTATCTACGTAGCCATGCT CTAGATTAATTAATGCCCATGTAAGGAGGCAAGGCCTGGGGACACCCG AGATGCCTGGTTATAATTAACCCAGACATGTGGCTGCCCCCCCCCCCC
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CAACACCTGCTGCCTCTAAAAATAACCCTGCATGCCATGTTCCCGGCG AAGGGCCAGCTGTCCCCCGCCAGCTAGACTCAGCACTTAGTTTAGGAA CCAGTGAGCAAGTCAGCCCTTGGGGCAGCCCATACAAGGCCATGGGG CTGGGCAAGCTGCACGCCTGGGTCCGGGGTGGGCACGGTGCCCGGG CAACGAGCTGAAAGCTCATCTGCTCTCAGGGGCCCCTCCCTGGGGAC AGCCCCTCCTGGCTAGTCACACCCTGTAGGCTCCTCTATATAACCCAG GGGCACAGGGGCTGCCCTCATTCTACCACCACCTCCACAGCACAGACA GACACTCAGGAGCCAGCCAGCGCTAGCGCCACCATGATGGCCCCAAA GAAGAAGCGGAAGGTCGGTATCCACGGAGTCCCAGCAGCCGACAAGA AGTACAGCATCGGCCTGGACATCGGCACCAACTCTGTGGGCTGGGCC GTGATCACCGACGAGTACAAGGTGCCCAGCAAGAAATTCAAGGTGCTG GGCAACACCGACCGGCACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGAGCCCT GCTGTTCGACAGCGGCGAAACAGCCGAGGCCACCCGGCTGAAGAGAA CCGCCAGAAGAAGATACACCAGACGGAAGAACCGGATCTGCTATCTGC AAGAGATCTTCAGCAACGAGATGGCCAAGGTGGACGACAGCTTCTTCC ACAGACTGGAAGAGTCCTTCCTGGTGGAAGAGGATAAGAAGCACGAGC GGCACCCCATCTTCGGCAACATCGTGGACGAGGTGGCCTACCACGAG AAGTACCCCACCATCTACCACCTGAGAAAGAAACTGGTGGACAGCACC GACAAGGCCGACCTGCGGCTGATCTATCTGGCCCTGGCCCACATGATC AAGTTCCGGGGCCACTTCCTGATCGAGGGCGACCTGAACCCCGACAA CAGCGACGTGGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTGCAGACCTACAACCA GCTGTTCGAGGAAAACCCCATCAACGCCAGCGGCGTGGACGCCAAGG CCATCCTGTCTGCCAGACTGAGCAAGAGCAGACGGCTGGAAAATCTGA TCGCCCAGCTGCCCGGCGAGAAGAAGAATGGCCTGTTCGGCAACCTG ATTGCCCTGAGCCTGGGCCTGACCCCCAACTTCAAGAGCAACTTCGAC CTGGCCGAGGATGCCAAACTGCAGCTGAGCAAGGACACCTACGACGA CGACCTGGACAACCTGCTGGCCCAGATCGGCGACCAGTACGCCGACC TGTTTCTGGCCGCCAAGAACCTGTCCGACGCCATCCTGCTGAGCGACA TCCTGAGAGTGAACACCGAGATCACCAAGGCCCCCCTGAGCGCCTCTA
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TGATCAAGAGATACGACGAGCACCACCAGGACCTGACCCTGCTGAAAG CTCTCGTGCGGCAGCAGCTGCCTGAGAAGTACAAAGAGATTTTCTTCG ACCAGAGCAAGAACGGCTACGCCGGCTACATTGACGGCGGAGCCAGC CAGGAAGAGTTCTACAAGTTCATCAAGCCCATCCTGGAAAAGATGGAC GGCACCGAGGAACTGCTCGTGAAGCTGAACAGAGAGGACCTGCTGCG GAAGCAGCGGACCTTCGACAACGGCAGCATCCCCCACCAGATCCACC TGGGAGAGCTGCACGCCATTCTGCGGCGGCAGGAAGATTTTTACCCAT TCCTGAAGGACAACCGGGAAAAGATCGAGAAGATCCTGACCTTCCGCA TCCCCTACTACGTGGGCCCTCTGGCCAGGGGAAACAGCAGATTCGCCT GGATGACCAGAAAGAGCGAGGAAACCATCACCCCCTGGAACTTCGAG GAAGTGGTGGACAAGGGCGCTTCCGCCCAGAGCTTCATCGAGCGGAT GACCAACTTCGATAAGAACCTGCCCAACGAGAAGGTGCTGCCCAAGCA CAGCCTGCTGTACGAGTACTTCACCGTGTATAACGAGCTGACCAAAGT GAAATACGTGACCGAGGGAATGAGAAAGCCCGCCTTCCTGAGCGGCG AGCAGAAAAAGGCCATCGTGGACCTGCTGTTCAAGACCAACCGGAAAG TGACCGTGAAGCAGCTGAAAGAGGACTACTTCAAGAAAATCGAGTGCT TCGACTCCGTGGAAATCTCCGGCGTGGAAGATCGGTTCAACGCCTCCC TGGGCACATACCACGATCTGCTGAAAATTATCAAGGACAAGGACTTCCT GGACAATGAGGAAAACGAGGACATTCTGGAAGATATCGTGCTGACCCT GACACTGTTTGAGGACAGAGAGATGATCGAGGAACGGCTGAAAACCTA TGCCCACCTGTTCGACGACAAAGTGATGAAGCAGCTGAAGCGGCGGA GATACACCGGCTGGGGCAGGCTGAGCCGGAAGCTGATCAACGGCATC CGGGACAAGCAGTCCGGCAAGACAATCCTGGATTTCCTGAAGTCCGAC GGCTTCGCCAACAGAAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACAGCCTG ACCTTTAAAGAGGACATCCAGAAAGCCCAGGTGTCCGGCCAGGGCGAT AGCCTGCACGAGCACATTGCCAATCTGGCCGGCAGCCCCGCCATTAA GAAGGGCATCCTGCAGACAGTGAAGGTGGTGGACGAGCTCGTGAAAG TGATGGGCCGGCACAAGCCCGAGAACATCGTGATCGAAATGGCCAGA GAGAACCAGACCACCCAGAAGGGACAGAAGAACAGCCGCGAGAGAAT
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GAAGCGGATCGAAGAGGGCATCAAAGAGCTGGGCAGCCAGATCCTGA AAGAACACCCCGTGGAAAACACCCAGCTGCAGAACGAGAAGCTGTACC TGTACTACCTGCAGAATGGGCGGGATATGTACGTGGACCAGGAACTGG ACATCAACCGGCTGTCCGACTACGATGTGGACCATATCGTGCCTCAGA GCTTTCTGAAGGACGACTCCATCGACAACAAGGTGCTGACCAGAAGCG ACAAGAACCGGGGCAAGAGCGACAACGTGCCCTCCGAAGAGGTCGTG AAGAAGATGAAGAACTACTGGCGGCAGCTGCTGAACGCCAAGCTGATT ACCCAGAGAAAGTTCGACAATCTGACCAAGGCCGAGAGAGGCGGCCT GAGCGAACTGGATAAGGCCGGCTTCATCAAGAGACAGCTGGTGGAAA CCCGGCAGATCACAAAGCACGTGGCACAGATCCTGGACTCCCGGATG AACACTAAGTACGACGAGAATGACAAGCTGATCCGGGAAGTGAAAGTG ATCACCCTGAAGTCCAAGCTGGTGTCCGATTTCCGGAAGGATTTCCAG TTTTACAAAGTGCGCGAGATCAACAACTACCACCACGCCCACGACGCC TACCTGAACGCCGTCGTGGGAACCGCCCTGATCAAAAAGTACCCTAAG CTGGAAAGCGAGTTCGTGTACGGCGACTACAAGGTGTACGACGTGCG GAAGATGATCGCCAAGAGCGAGCAGGAAATCGGCAAGGCTACCGCCA AGTACTTCTTCTACAGCAACATCATGAACTTTTTCAAGACCGAGATTACC CTGGCCAACGGCGAGATCCGGAAGCGGCCTCTGATCGAGACAAACGG CGAAACCGGGGAGATCGTGTGGGATAAGGGCCGGGATTTTGCCACCG TGCGGAAAGTGCTGAGCATGCCCCAAGTGAATATCGTGAAAAAGACCG AGGTGCAGACAGGCGGCTTCAGCAAAGAGTCTATCCTGCCCAAGAGG AACAGCGATAAGCTGATCGCCAGAAAGAAGGACTGGGACCCTAAGAAG TACGGCGGCTTCGACAGCCCCACCGTGGCCTATTCTGTGCTGGTGGT GGCCAAAGTGGAAAAGGGCAAGTCCAAGAAACTGAAGAGTGTGAAAGA GCTGCTGGGGATCACCATCATGGAAAGAAGCAGCTTCGAGAAGAATCC CATCGACTTTCTGGAAGCCAAGGGCTACAAAGAAGTGAAAAAGGACCT GATCATCAAGCTGCCTAAGTACTCCCTGTTCGAGCTGGAAAACGGCCG GAAGAGAATGCTGGCCTCTGCCGGCGAACTGCAGAAGGGAAACGAAC TGGCCCTGCCCTCCAAATATGTGAACTTCCTGTACCTGGCCAGCCACT
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ATGAGAAGCTGAAGGGCTCCCCCGAGGATAATGAGCAGAAACAGCTGT TTGTGGAACAGCACAAGCACTACCTGGACGAGATCATCGAGCAGATCA GCGAGTTCTCCAAGAGAGTGATCCTGGCCGACGCTAATCTGGACAAAG TGCTGTCCGCCTACAACAAGCACCGGGATAAGCCCATCAGAGAGCAG GCCGAGAATATCATCCACCTGTTTACCCTGACCAATCTGGGAGCCCCT GCCGCCTTCAAGTACTTTGACACCACCATCGACCGGAAGAGGTACACC AGCACCAAAGAGGTGCTGGACGCCACCCTGATCCACCAGAGCATCAC CGGCCTGTACGAGACACGGATCGACCTGTCTCAGCTGGGAGGCGACA AGCGTCCTGCTGCTACTAAGAAAGCTGGTCAAGCTAAGAAAAAGAAAT GAATCGATTAGCAATAAAGGATCGTTTATTTTCATTGGAAGCGTGTGTT GGTTTTTTGATCAGGCGCGGGTACCAGGTCGCGGCCGCTCTAGAGCAT GGCTACGTAGATAAGTAGCATGGCGGGTTAATCATTAACTACAAGGAA CCCCTAGTGATGGAGTTaggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcg ctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtga gcgagcgagcgcgcagctgcctgcaggCATGCAAGCT GT AGCCAACCACT AGAAC TATAGCTAGAGTCCTGGGCGAACAAACGATGCTCGCCTTCCAGAAAAC CGAGGATGCGAACCACTTCATCCGGGGTCAGCACCACCGGCAAGCGC CGCGACGGCCGAGGTCTTCCGATCTCCTGAAGCCAGGGCAGATCCGT GCACAGCACCTTGCCGTAGAAGAACAGCAAGGCCGCCAATGCCTGAC GATGCGTGGAGACCGAAACCTTGCGCTCGTTCGCCAGCCAGGACAGA AATGCCTCGACTTCGCTGCTGCCCAAGGTTGCCGGGTGACGCACACC GTGGAAACGGATGAAGGCACGAACCCAGTTGACATAAGCCTGTTCGGT TCGTAAACTGTAATGCAAGTAGCGTATGCGCTCACGCAACTGGTCCAG AACCTTGACCGAACGCAGCGGTGGTAACGGCGCAGTGGCGGTTTTCAT GGCTTGTTATGACTGTTTTTTTGTACAGTCTATGCCTCGGGCATCCAAG CAGCAAGCGCGTTACGCCGTGGGTCGATGTTTGATGTTATGGAGCAGC AACGATGTTACGCAGCAGCAACGATGTTACGCAGCAGGGCAGTCGCC CTAAAACAAAGTTAGGTGGCTCAAGTATGGGCATCATTCGCACATGTAG GCTCGGCCCTGACCAAGTCAAATCCATGCGGGCTGCTCTTGATCTTTT
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CGGTCGTGAGTTCGGAGACGTAGCCACCTACTCCCAACATCAGCCGGA CTCCGATTACCTCGGGAACTTGCTCCGTAGTAAGACATTCATCGCGCTT GCTGCCTTCGACCAAGAAGCGGTTGTTGGCGCTCTCGCGGCTTACGTT CTGCCCAAGTTTGAGCAGCCGCGTAGTGAGATCTATATCTATGATCTCG CAGTCTCCGGCGAGCACCGGAGGCAGGGCATTGCCACCGCGCTCATC AATCTCCTCAAGCATGAGGCCAACGCGCTTGGTGCTTATGTGATCTAC GTGCAAGCAGATTACGGTGACGATCCCGCAGTGGCTCTCTATACAAAG TTGGGCATACGGGAAGAAGTGATGCACTTTGATATCGACCCAAGTACC GCCACCTAACAATTCGTTCAAGCCGAGATCGGCTTCCCGGCCGCGGA GTTGTTCGGTAAATTGTCACAACGCCGCGAATATAGTCTTTACCATGCC CTTGGCCACGCCCCTCTTTAATACGACGGGCAATTTGCACTTCAGAAAA TGAAGAGTTTGCTTTAGCCATAACAAAAGTCCAGTATGC1 1 1 1TCACAG CATAACTGGACTGATTTCAGTTTACAACTATTCTGTCTAGTTTAAGACTT TATTGTCATAGTTTAGATCTA1 1 1 1GTTCAGTTTAAGACTTTATTGTCCGC CCACACCCGCTTACGC
902 AAGATGACGGTTTGTCACATGGAGTTGGCAGGATGTTTGATTAAAAACA TAACAGGAAGAAAAATGCCCCGCTGTGGGCGGACAAAATAGTTGGGAA CTGGGAGGGGTGGAAATGGAGTTTTTAAGGATTATTTAGGGAAGAGTG ACAAAATAGATGGGAACTGGGTGTAGCGTCGTAAGCTAATACGAAAATT AAAAATGACAAAATAGTTTGGAACTAGATTTCACTTATCTGGTTCGGATC T CCT AGGCG AT AT CAGT G AT CAcggatctcgaccaattgacattattgaagcaACT AGT AT CG ATtttatcagggttattgtctcagaGGCCACT CCCT CT CTGCGCGCT CGCT CG CTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGC CCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCC AACTCCATCACTAGGGGTTCCTTGTAGTTAATGATTAACCCGCCATGCT ACTTATCTACGTAGCCATGCTCTAGATTAATTAATGCCCATGTAAGGAG GCAAGGCCTGGGGACACCCGAGATGCCTGGTTATAATTAACCCAGACA TGTGGCTGCCCCCCCCCCCCCAACACCTGCTGCCTCTAAAAATAACCC
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TGCATGCCATGTTCCCGGCGAAGGGCCAGCTGTCCCCCGCCAGCTAG ACTCAGCACTTAGTTTAGGAACCAGTGAGCAAGTCAGCCCTTGGGGCA GCCCATACAAGGCCATGGGGCTGGGCAAGCTGCACGCCTGGGTCCGG GGTGGGCACGGTGCCCGGGCAACGAGCTGAAAGCTCATCTGCTCTCA GGGGCCCCTCCCTGGGGACAGCCCCTCCTGGCTAGTCACACCCTGTA GGCTCCTCTATATAACCCAGGGGCACAGGGGCTGCCCTCATTCTACCA CCACCTCCACAGCACAGACAGACACTCAGGAGCCAGCCAGCGCTAGC GCCACCATGATGGCCCCAAAGAAGAAGCGGAAGGTCGGTATCCACGG AGTCCCAGCAGCCGACAAGAAGTACAGCATCGGCCTGGACATCGGCA CCAACTCTGTGGGCTGGGCCGTGATCACCGACGAGTACAAGGTGCCC AGCAAGAAATTCAAGGTGCTGGGCAACACCGACCGGCACAGCATCAAG AAGAACCTGATCGGAGCCCTGCTGTTCGACAGCGGCGAAACAGCCGA GGCCACCCGGCTGAAGAGAACCGCCAGAAGAAGATACACCAGACGGA AGAACCGGATCTGCTATCTGCAAGAGATCTTCAGCAACGAGATGGCCA AGGTGGACGACAGCTTCTTCCACAGACTGGAAGAGTCCTTCCTGGTGG AAGAGGATAAGAAGCACGAGCGGCACCCCATCTTCGGCAACATCGTG GACGAGGTGGCCTACCACGAGAAGTACCCCACCATCTACCACCTGAGA AAGAAACTGGTGGACAGCACCGACAAGGCCGACCTGCGGCTGATCTAT CTGGCCCTGGCCCACATGATCAAGTTCCGGGGCCACTTCCTGATCGAG GGCGACCTGAACCCCGACAACAGCGACGTGGACAAGCTGTTCATCCA GCTGGTGCAGACCTACAACCAGCTGTTCGAGGAAAACCCCATCAACGC CAGCGGCGTGGACGCCAAGGCCATCCTGTCTGCCAGACTGAGCAAGA GCAGACGGCTGGAAAATCTGATCGCCCAGCTGCCCGGCGAGAAGAAG AATGGCCTGTTCGGCAACCTGATTGCCCTGAGCCTGGGCCTGACCCCC AACTTCAAGAGCAACTTCGACCTGGCCGAGGATGCCAAACTGCAGCTG AGCAAGGACACCTACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCCCAGAT CGGCGACCAGTACGCCGACCTGTTTCTGGCCGCCAAGAACCTGTCCG ACGCCATCCTGCTGAGCGACATCCTGAGAGTGAACACCGAGATCACCA AGGCCCCCCTGAGCGCCTCTATGATCAAGAGATACGACGAGCACCACC
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AGGACCTGACCCTGCTGAAAGCTCTCGTGCGGCAGCAGCTGCCTGAG AAGTACAAAGAGATTTTCTTCGACCAGAGCAAGAACGGCTACGCCGGC TACATTGACGGCGGAGCCAGCCAGGAAGAGTTCTACAAGTTCATCAAG CCCATCCTGGAAAAGATGGACGGCACCGAGGAACTGCTCGTGAAGCT GAACAGAGAGGACCTGCTGCGGAAGCAGCGGACCTTCGACAACGGCA GCATCCCCCACCAGATCCACCTGGGAGAGCTGCACGCCATTCTGCGG CGGCAGGAAGATTTTTACCCATTCCTGAAGGACAACCGGGAAAAGATC GAGAAGATCCTGACCTTCCGCATCCCCTACTACGTGGGCCCTCTGGCC AGGGGAAACAGCAGATTCGCCTGGATGACCAGAAAGAGCGAGGAAAC CATCACCCCCTGGAACTTCGAGGAAGTGGTGGACAAGGGCGCTTCCG CCCAGAGCTTCATCGAGCGGATGACCAACTTCGATAAGAACCTGCCCA ACGAGAAGGTGCTGCCCAAGCACAGCCTGCTGTACGAGTACTTCACCG TGTATAACGAGCTGACCAAAGTGAAATACGTGACCGAGGGAATGAGAA AGCCCGCCTTCCTGAGCGGCGAGCAGAAAAAGGCCATCGTGGACCTG CTGTTCAAGACCAACCGGAAAGTGACCGTGAAGCAGCTGAAAGAGGAC TACTTCAAGAAAATCGAGTGCTTCGACTCCGTGGAAATCTCCGGCGTG GAAGATCGGTTCAACGCCTCCCTGGGCACATACCACGATCTGCTGAAA ATTATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAATGAGGAAAACGAGGACATT CTGGAAGATATCGTGCTGACCCTGACACTGTTTGAGGACAGAGAGATG ATCGAGGAACGGCTGAAAACCTATGCCCACCTGTTCGACGACAAAGTG ATGAAGCAGCTGAAGCGGCGGAGATACACCGGCTGGGGCAGGCTGAG CCGGAAGCTGATCAACGGCATCCGGGACAAGCAGTCCGGCAAGACAA TCCTGGATTTCCTGAAGTCCGACGGCTTCGCCAACAGAAACTTCATGC AGCTGATCCACGACGACAGCCTGACCTTTAAAGAGGACATCCAGAAAG CCCAGGTGTCCGGCCAGGGCGATAGCCTGCACGAGCACATTGCCAAT CTGGCCGGCAGCCCCGCCATTAAGAAGGGCATCCTGCAGACAGTGAA GGTGGTGGACGAGCTCGTGAAAGTGATGGGCCGGCACAAGCCCGAGA ACATCGTGATCGAAATGGCCAGAGAGAACCAGACCACCCAGAAGGGA CAGAAGAACAGCCGCGAGAGAATGAAGCGGATCGAAGAGGGCATCAA
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AGAGCTGGGCAGCCAGATCCTGAAAGAACACCCCGTGGAAAACACCC AGCTGCAGAACGAGAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAATGGGCGG GATATGTACGTGGACCAGGAACTGGACATCAACCGGCTGTCCGACTAC GATGTGGACCATATCGTGCCTCAGAGCTTTCTGAAGGACGACTCCATC GACAACAAGGTGCTGACCAGAAGCGACAAGAACCGGGGCAAGAGCGA CAACGTGCCCTCCGAAGAGGTCGTGAAGAAGATGAAGAACTACTGGCG GCAGCTGCTGAACGCCAAGCTGATTACCCAGAGAAAGTTCGACAATCT GACCAAGGCCGAGAGAGGCGGCCTGAGCGAACTGGATAAGGCCGGCT TCATCAAGAGACAGCTGGTGGAAACCCGGCAGATCACAAAGCACGTGG CACAGATCCTGGACTCCCGGATGAACACTAAGTACGACGAGAATGACA AGCTGATCCGGGAAGTGAAAGTGATCACCCTGAAGTCCAAGCTGGTGT CCGATTTCCGGAAGGATTTCCAGTTTTACAAAGTGCGCGAGATCAACAA CTACCACCACGCCCACGACGCCTACCTGAACGCCGTCGTGGGAACCG CCCTGATCAAAAAGTACCCTAAGCTGGAAAGCGAGTTCGTGTACGGCG ACTACAAGGTGTACGACGTGCGGAAGATGATCGCCAAGAGCGAGCAG GAAATCGGCAAGGCTACCGCCAAGTACTTCTTCTACAGCAACATCATGA ACTTTTTCAAGACCGAGATTACCCTGGCCAACGGCGAGATCCGGAAGC GGCCTCTGATCGAGACAAACGGCGAAACCGGGGAGATCGTGTGGGAT AAGGGCCGGGATTTTGCCACCGTGCGGAAAGTGCTGAGCATGCCCCA AGTGAATATCGTGAAAAAGACCGAGGTGCAGACAGGCGGCTTCAGCAA AGAGTCTATCCTGCCCAAGAGGAACAGCGATAAGCTGATCGCCAGAAA GAAGGACTGGGACCCTAAGAAGTACGGCGGCTTCGACAGCCCCACCG TGGCCTATTCTGTGCTGGTGGTGGCCAAAGTGGAAAAGGGCAAGTCCA AGAAACTGAAGAGTGTGAAAGAGCTGCTGGGGATCACCATCATGGAAA GAAGCAGCTTCGAGAAGAATCCCATCGACTTTCTGGAAGCCAAGGGCT ACAAAGAAGTGAAAAAGGACCTGATCATCAAGCTGCCTAAGTACTCCCT GTTCGAGCTGGAAAACGGCCGGAAGAGAATGCTGGCCTCTGCCGGCG AACTGCAGAAGGGAAACGAACTGGCCCTGCCCTCCAAATATGTGAACT TCCTGTACCTGGCCAGCCACTATGAGAAGCTGAAGGGCTCCCCCGAG
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GATAATGAGCAGAAACAGCTGTTTGTGGAACAGCACAAGCACTACCTG GACGAGATCATCGAGCAGATCAGCGAGTTCTCCAAGAGAGTGATCCTG GCCGACGCTAATCTGGACAAAGTGCTGTCCGCCTACAACAAGCACCGG GATAAGCCCATCAGAGAGCAGGCCGAGAATATCATCCACCTGTTTACC CTGACCAATCTGGGAGCCCCTGCCGCCTTCAAGTACTTTGACACCACC ATCGACCGGAAGAGGTACACCAGCACCAAAGAGGTGCTGGACGCCAC CCTGATCCACCAGAGCATCACCGGCCTGTACGAGACACGGATCGACCT GTCTCAGCTGGGAGGCGACAAGCGTCCTGCTGCTACTAAGAAAGCTG GTCAAGCTAAGAAAAAGAAATGAATCGATTAGCAATAAAGGATCGTTTA TTTTCATTGGAAGCGTGTGTTGGTTTTTTGATCAGGCGCGGGTACCAG GTCGCGGCCGCTCTAGAGCATGGCTACGTAGATAAGTAGCATGGCGG GTTAATCATTAACTACAAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCC TCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGC CCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCG CGCAGAGAGGGACATGCAAGCTGTAGCCAACCACTAGAACTATAGCTA GAGTCCTGGGCGAACAAACGATGCTCGCCTTCCAGAAAACCGAGGATG CGAACCACTTCATCCGGGGTCAGCACCACCGGCAAGCGCCGCGACGG CCGAGGTCTTCCGATCTCCTGAAGCCAGGGCAGATCCGTGCACAGCA CCTTGCCGTAGAAGAACAGCAAGGCCGCCAATGCCTGACGATGCGTG GAGACCGAAACCTTGCGCTCGTTCGCCAGCCAGGACAGAAATGCCTC GACTTCGCTGCTGCCCAAGGTTGCCGGGTGACGCACACCGTGGAAAC GGATGAAGGCACGAACCCAGTTGACATAAGCCTGTTCGGTTCGTAAAC TGTAATGCAAGTAGCGTATGCGCTCACGCAACTGGTCCAGAACCTTGA CCGAACGCAGCGGTGGTAACGGCGCAGTGGCGGTTTTCATGGCTTGT TATGACTGTTTTTTTGTACAGTCTATGCCTCGGGCATCCAAGCAGCAAG CGCGTTACGCCGTGGGTCGATGTTTGATGTTATGGAGCAGCAACGATG TTACGCAGCAGCAACGATGTTACGCAGCAGGGCAGTCGCCCTAAAACA AAGTTAGGTGGCTCAAGTATGGGCATCATTCGCACATGTAGGCTCGGC CCTGACCAAGTCAAATCCATGCGGGCTGCTCTTGATCTTTTCGGTCGT
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GAGTTCGGAGACGTAGCCACCTACTCCCAACATCAGCCGGACTCCGAT TACCTCGGGAACTTGCTCCGTAGTAAGACATTCATCGCGCTTGCTGCC TTCGACCAAGAAGCGGTTGTTGGCGCTCTCGCGGCTTACGTTCTGCCC AAGTTTGAGCAGCCGCGTAGTGAGATCTATATCTATGATCTCGCAGTCT CCGGCGAGCACCGGAGGCAGGGCATTGCCACCGCGCTCATCAATCTC CTCAAGCATGAGGCCAACGCGCTTGGTGCTTATGTGATCTACGTGCAA GCAGATTACGGTGACGATCCCGCAGTGGCTCTCTATACAAAGTTGGGC ATACGGGAAGAAGTGATGCACTTTGATATCGACCCAAGTACCGCCACC TAACAATTCGTTCAAGCCGAGATCGGCTTCCCGGCCGCGGAGTTGTTC GGTAAATTGTCACAACGCCGCGAATATAGTCTTTACCATGCCCTTGGCC ACGCCCCTCTTTAATACGACGGGCAATTTGCACTTCAGAAAATGAAGAG TTTGCTTTAGCCATAACAAAAGTCCAGTATGCT1 1 1 1CACAGCATAACTG GACTGATTTCAGTTTACAACTATTCTGTCTAGTTTAAGACTTTATTGTCA TAGTTTAGATCTA1 1 1 1GTTCAGTTTAAGACTTTATTGTCCGCCCACACC CGCTTACGC
[0245] Em algumas modalidades das construções para edição gênica da divulgação, que incluem as modalidades que abrangem as SEQ ID NOs: 899-902, a construção compreende ou consiste de um promotor e uma nuclease. Em algumas modalidades, a construção compreende ou consiste de um promotor CK8e e uma nuclease Cas9. Em algumas modalidades, a construção compreende ou consiste de um promotor CK8e e uma nuclease Cas9 isolada ou derivada de Staphylococcus pyogenes (“SpCas9”). Em algumas modalidades, o promotor CK8e compreende ou consiste de uma sequência de nucleotídeos de TGCCCATGTAAGGAGGCAAGGCCTGGGGACACCCGAGATGCCTGGTTATAATT AACCCAGACATGTGGCTGCCCCCCCCCCCCCAACACCTGCTGCCTCTAAAAAT AACCCTGCATGCCATGTTCCCGGCGAAGGGCCAGCTGTCCCCCGCCAGCTAGA CTCAGCACTTAGTTTAGGAACCAGTGAGCAAGTCAGCCCTTGGGGCAGCCCAT ACAAGGCCATGGGGCTGGGCAAGCTGCACGCCTGGGTCCGGGGTGGGCACG
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GTGCCCGGGCAACGAGCTGAAAGCTCATCTGCTCTCAGGGGCCCCTCCCTGG GGACAGCCCCTCCTGGCTAGTCACACCCTGTAGGCTCCTCTATATAACCCAGG GGCACAGGGGCTGCCCTCATTCTACCACCACCTCCACAGCACAGACAGACACT CAGGAGCCAGCCAGC (SEQ ID NO: 875). Em algumas modalidades, a nuclease SpCas9 compreende ou consiste de uma sequência de nucleotideos de GACAAGAAGTACAGCATCGGCCTGGACATCGGCACCAACTCTGTGGGCTGGGC CGTGATCACCGACGAGTACAAGGTGCCCAGCAAGAAATTCAAGGTGCTGGGCA ACACCGACCGGCACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGAGCCCTGCTGTTCGAC AGCGGCGAAACAGCCGAGGCCACCCGGCTGAAGAGAACCGCCAGAAGAAGAT ACACCAGACGGAAGAACCGGATCTGCTATCTGCAAGAGATCTTCAGCAACGAG ATGGCCAAGGTGGACGACAGCTTCTTCCACAGACTGGAAGAGTCCTTCCTGGT GGAAGAGGATAAGAAGCACGAGCGGCACCCCATCTTCGGCAACATCGTGGAC GAGGTGGCCTACCACGAGAAGTACCCCACCATCTACCACCTGAGAAAGAAACT GGTGGACAGCACCGACAAGGCCGACCTGCGGCTGATCTATCTGGCCCTGGCC CACATGATCAAGTTCCGGGGCCACTTCCTGATCGAGGGCGACCTGAACCCCGA CAACAGCGACGTGGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTGCAGACCTACAACCAGC TGTTCGAGGAAAACCCCATCAACGCCAGCGGCGTGGACGCCAAGGCCATCCTG TCTGCCAGACTGAGCAAGAGCAGACGGCTGGAAAATCTGATCGCCCAGCTGCC CGGCGAGAAGAAGAATGGCCTGTTCGGCAACCTGATTGCCCTGAGCCTGGGC CTGACCCCCAACTTCAAGAGCAACTTCGACCTGGCCGAGGATGCCAAACTGCA GCTGAGCAAGGACACCTACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCCCAGATC GGCGACCAGTACGCCGACCTGTTTCTGGCCGCCAAGAACCTGTCCGACGCCAT CCTGCTGAGCGACATCCTGAGAGTGAACACCGAGATCACCAAGGCCCCCCTGA GCGCCTCTATGATCAAGAGATACGACGAGCACCACCAGGACCTGACCCTGCTG AAAGCTCTCGTGCGGCAGCAGCTGCCTGAGAAGTACAAAGAGATTTTCTTCGAC CAGAGCAAGAACGGCTACGCCGGCTACATTGACGGCGGAGCCAGCCAGGAAG AGTTCTACAAGTTCATCAAGCCCATCCTGGAAAAGATGGACGGCACCGAGGAA CTGCTCGTGAAGCTGAACAGAGAGGACCTGCTGCGGAAGCAGCGGACCTTCG ACAACGGCAGCATCCCCCACCAGATCCACCTGGGAGAGCTGCACGCCATTCTG
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CGGCGGCAGGAAGATTTTTACCCATTCCTGAAGGACAACCGGGAAAAGATCGA
GAAGATCCTGACCTTCCGCATCCCCTACTACGTGGGCCCTCTGGCCAGGGGAA
ACAGCAGATTCGCCTGGATGACCAGAAAGAGCGAGGAAACCATCACCCCCTGG
AACTTCGAGGAAGTGGTGGACAAGGGCGCTTCCGCCCAGAGCTTCATCGAGCG
GATGACCAACTTCGATAAGAACCTGCCCAACGAGAAGGTGCTGCCCAAGCACA
GCCTGCTGTACGAGTACTTCACCGTGTATAACGAGCTGACCAAAGTGAAATACG
TGACCGAGGGAATGAGAAAGCCCGCCTTCCTGAGCGGCGAGCAGAAAAAGGC
CATCGTGGACCTGCTGTTCAAGACCAACCGGAAAGTGACCGTGAAGCAGCTGA
AAGAGGACTACTTCAAGAAAATCGAGTGCTTCGACTCCGTGGAAATCTCCGGC
GTGGAAGATCGGTTCAACGCCTCCCTGGGCACATACCACGATCTGCTGAAAATT
ATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAATGAGGAAAACGAGGACATTCTGGAAGA
TATCGTGCTGACCCTGACACTGTTTGAGGACAGAGAGATGATCGAGGAACGGC
TGAAAACCTATGCCCACCTGTTCGACGACAAAGTGATGAAGCAGCTGAAGCGG
CGGAGATACACCGGCTGGGGCAGGCTGAGCCGGAAGCTGATCAACGGCATCC
GGGACAAGCAGTCCGGCAAGACAATCCTGGATTTCCTGAAGTCCGACGGCTTC
GCCAACAGAAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACAGCCTGACCTTTAAAGAG
GACATCCAGAAAGCCCAGGTGTCCGGCCAGGGCGATAGCCTGCACGAGCACA
TTGCCAATCTGGCCGGCAGCCCCGCCATTAAGAAGGGCATCCTGCAGACAGTG
AAGGTGGTGGACGAGCTCGTGAAAGTGATGGGCCGGCACAAGCCCGAGAACA
TCGTGATCGAAATGGCCAGAGAGAACCAGACCACCCAGAAGGGACAGAAGAAC
AGCCGCGAGAGAATGAAGCGGATCGAAGAGGGCATCAAAGAGCTGGGCAGCC
AGATCCTGAAAGAACACCCCGTGGAAAACACCCAGCTGCAGAACGAGAAGCTG
TACCTGTACTACCTGCAGAATGGGCGGGATATGTACGTGGACCAGGAACTGGA
CATCAACCGGCTGTCCGACTACGATGTGGACCATATCGTGCCTCAGAGCTTTCT
GAAGGACGACTCCATCGACAACAAGGTGCTGACCAGAAGCGACAAGAACCGG
GGCAAGAGCGACAACGTGCCCTCCGAAGAGGTCGTGAAGAAGATGAAGAACTA
CTGGCGGCAGCTGCTGAACGCCAAGCTGATTACCCAGAGAAAGTTCGACAATC
TGACCAAGGCCGAGAGAGGCGGCCTGAGCGAACTGGATAAGGCCGGCTTCAT
CAAGAGACAGCTGGTGGAAACCCGGCAGATCACAAAGCACGTGGCACAGATCC
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TGGACTCCCGGATGAACACTAAGTACGACGAGAATGACAAGCTGATCCGGGAA GTGAAAGTGATCACCCTGAAGTCCAAGCTGGTGTCCGATTTCCGGAAGGATTTC CAGTTTTACAAAGTGCGCGAGATCAACAACTACCACCACGCCCACGACGCCTA CCTGAACGCCGTCGTGGGAACCGCCCTGATCAAAAAGTACCCTAAGCTGGAAA GCGAGTTCGTGTACGGCGACTACAAGGTGTACGACGTGCGGAAGATGATCGCC AAGAGCGAGCAGGAAATCGGCAAGGCTACCGCCAAGTACTTCTTCTACAGCAA CATCATGAACTTTTTCAAGACCGAGATTACCCTGGCCAACGGCGAGATCCGGAA GCGGCCTCTGATCGAGACAAACGGCGAAACCGGGGAGATCGTGTGGGATAAG GGCCGGGATTTTGCCACCGTGCGGAAAGTGCTGAGCATGCCCCAAGTGAATAT CGTGAAAAAGACCGAGGTGCAGACAGGCGGCTTCAGCAAAGAGTCTATCCTGC CCAAGAGGAACAGCGATAAGCTGATCGCCAGAAAGAAGGACTGGGACCCTAAG AAGTACGGCGGCTTCGACAGCCCCACCGTGGCCTATTCTGTGCTGGTGGTGGC CAAAGTGGAAAAGGGCAAGTCCAAGAAACTGAAGAGTGTGAAAGAGCTGCTGG GGATCACCATCATGGAAAGAAGCAGCTTCGAGAAGAATCCCATCGACTTTCTGG AAGCCAAGGGCTACAAAGAAGTGAAAAAGGACCTGATCATCAAGCTGCCTAAGT ACTCCCTGTTCGAGCTGGAAAACGGCCGGAAGAGAATGCTGGCCTCTGCCGGC GAACTGCAGAAGGGAAACGAACTGGCCCTGCCCTCCAAATATGTGAACTTCCT GTACCTGGCCAGCCACTATGAGAAGCTGAAGGGCTCCCCCGAGGATAATGAGC AGAAACAGCTGTTTGTGGAACAGCACAAGCACTACCTGGACGAGATCATCGAG CAGATCAGCGAGTTCTCCAAGAGAGTGATCCTGGCCGACGCTAATCTGGACAA AGTGCTGTCCGCCTACAACAAGCACCGGGATAAGCCCATCAGAGAGCAGGCCG AGAATATCATCCACCTGTTTACCCTGACCAATCTGGGAGCCCCTGCCGCCTTCA AGTACTTTGACACCACCATCGACCGGAAGAGGTACACCAGCACCAAAGAGGTG CTGGACGCCACCCTGATCCACCAGAGCATCACCGGCCTGTACGAGACACGGAT CGACCTGTCTCAGCTGGGAGGCGAC (SEQ ID NO:872). Em algumas modalidades, a construção que compreende um promotor e uma nuclease compreende ainda pelo menos duas sequências de repetição terminal invertida (ITR). Em algumas modalidades, a construção que compreende um promotor e uma nuclease compreende ainda pelo menos duas sequências de ITR isolada ou derivada
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144/259 de um AAV do sorotipo 2 (AAV2). Em algumas modalidades, a construção que compreende um promotor e uma nuclease compreende ainda pelo menos duas sequências de ITR cada uma compreendendo ou consistindo de uma sequência de nucleotídeos de
GGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAG GTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCG CGCAGAGAGGGA (SEQ ID NO:880). Em algumas modalidades, a construção que compreende um promotor e uma nuclease compreende ainda pelo menos duas sequências de ITR, em que a primeira sequência de ITR compreende ou consiste de uma sequência de nucleotídeos de
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCC CGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCG CAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT (SEQ ID NO: 881) e a segunda sequência de ITR compreende ou consiste de uma sequência de nucleotídeos de
AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTC ACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCG GCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG (SEQ ID NO: 882). Em algumas modalidades, a construção compreende ou consiste de 5’ a 3’ de uma primeira ITR, uma sequência que codifica um promotor, uma sequência que codifica a nuclease e uma segunda ITR. Em algumas modalidades, a construção compreende ou consiste de 5’ a 3’ de uma primeira ITR de AAV2, uma sequência que codifica um promotor CK8e, uma sequência que codifica uma nuclease SpCas9 e uma segunda ITR de AAV2. Em algumas modalidades, a construção que compreende ou consiste de 5’ a 3’ de uma primeira ITR, uma sequência que codifica um promotor, uma sequência que codifica a nuclease e uma segunda ITR, compreende ainda uma sequência de poli A. Em algumas modalidades, a sequência de poli A compreende ou consiste de uma sequência de minipoliA. Exemplos de sequências de minipoliA da divulgação compreendem ou consistem de uma sequência de nucleotídeos de
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TAGCAATAAAGGATCGTTTATTTTCATTGGAAGCGTGTGTTGGTTTTTTGATCAG GCGCG (SEQ ID NO: 903). Em algumas modalidades, a construção compreende ou consiste de 5’ a 3’ de uma primeira ITR, uma sequência que codifica um promotor, uma sequência que codifica uma nuclease, uma sequência de poli A e uma segunda ITR. Em algumas modalidades, a construção compreende ou consiste de 5’ a 3’ de uma primeira ITR, uma sequência que codifica um promotor, uma sequência que codifica uma nuclease, uma sequência de minipoli A e uma segunda ITR. Em algumas modalidades, a construção compreende ou consiste de 5’ a 3’ de uma primeira ITR de AAV2, uma sequência que codifica um promotor CK8e, uma sequência que codifica uma nuclease SpCas9, uma sequência de minipoli A e uma segunda ITR de AAV2. Em algumas modalidades, a construção que compreende de 5’ a 3’ uma primeira ITR, uma sequência que codifica um promotor, uma sequência que codifica uma nuclease, uma sequência de poli A e uma segunda ITR, compreende ainda pelo menos um sinal de localização nuclear. Em algumas modalidades, a construção que compreende de 5’ a 3’ uma primeira ITR, uma sequência que codifica um promotor, uma sequência que codifica uma nuclease, uma sequência de poli A e uma segunda ITR, compreende ainda pelo menos dois sinais de localização nuclear. Exemplos de sinais de localização nuclear da divulgação compreendem ou consistem de uma sequência de nucleotídeos de
AAGCGTCCTGCTGCTACTAAGAAAGCTGGTCAAGCTAAGAAAAAGAAA (SEQ ID NO. 887) ou uma sequência de nucleotídeos de ATGGCCCCAAAGAAGAAGCGGAAGGTCGGTATCCACGGAGTCCCAGCAGCC (SEQ ID NO. 885). Em algumas modalidades, a construção compreende ou consiste de 5’ a 3’ de uma primeira ITR, uma sequência que codifica um promotor, uma sequência que codifica um primeiro sinal de localização nuclear, uma sequência que codifica uma nuclease, uma sequência de poli A e uma segunda ITR. Em algumas modalidades, a construção compreende ou consiste de 5’ a 3’ de uma primeira ITR, uma sequência que codifica um promotor, uma sequência que codifica um primeiro sinal de localização nuclear, uma sequência que codifica uma nuclease, uma
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146/259 sequência que codifica um segundo sinal de localização nuclear, uma sequência de poli A e uma segunda ITR. Em algumas modalidades, a construção compreende ou consiste de 5’ a 3’ de uma primeira ITR de AAV2, uma sequência que codifica um promotor CK8e, um sinal de localização nuclear que possui uma sequência da SEQ ID NO: 885, uma sequência que codifica uma nuclease SpCas9, uma sequência de minipoli A e uma segunda ITR de AAV2. Em algumas modalidades, a construção compreende ou consiste de 5’ a 3’ de uma primeira ITR de AAV2, uma sequência que codifica um promotor CK8e, uma sequência que codifica uma nuclease SpCas9, um sinal de localização nuclear que possui uma sequência da SEQ ID NO: 887, uma sequência de minipoli A e uma segunda ITR de AAV2. Em algumas modalidades, a construção compreende ou consiste de 5’ a 3’ de uma primeira ITR de AAV2, uma sequência que codifica um promotor CK8e, um sinal de localização nuclear que possui uma sequência da SEQ ID NO. 885, uma sequência que codifica uma nuclease SpCas9, um sinal de localização nuclear que possui uma sequência da SEQ ID NO: 887, uma sequência de minipoli A e uma segunda ITR de AAV2. Em algumas modalidades, a construção que compreende de 5’ a 3’ uma primeira ITR, uma sequência que codifica um promotor, uma sequência que codifica um primeiro sinal de localização nuclear, uma sequência que codifica uma nuclease, uma sequência que codifica um segundo sinal de localização nuclear, uma sequência de poli A e uma segunda ITR, compreende ainda um códon de terminação. O códon de terminação pode ter uma sequência de TAG (SEQ ID NO. 904), TAA (SEQ ID NO. 905) ou TGA (SEQ ID NO. 906). Em algumas modalidades, a construção compreende ou consiste de 5’ a 3’ de uma primeira ITR, uma sequência que codifica um promotor, uma sequência que codifica um primeiro sinal de localização nuclear, uma sequência que codifica uma nuclease, uma sequência que codifica um segundo sinal de localização nuclear, um códon de terminação, uma sequência de poli A e uma segunda ITR. Em algumas modalidades, a construção compreende ou consiste de 5’ a 3’ de uma primeira ITR de AAV2, uma sequência que codifica um promotor CK8e, um sinal de localização nuclear que possui uma sequência da SEQ ID NO: 885, uma sequência
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147/259 que codifica uma nuclease SpCas9, um códon de terminação, uma sequência de minipoli A e uma segunda ITR de AAV2. Em algumas modalidades, a construção compreende ou consiste de 5’ a 3’ de uma primeira ITR de AAV2, uma sequência que codifica um promotor CK8e, uma sequência que codifica uma nuclease SpCas9, um sinal de localização nuclear que possui uma sequência da SEQ ID NO: 887, um códon de terminação, uma sequência de minipoli A e uma segunda ITR de AAV2. Em algumas modalidades, a construção compreende ou consiste de 5’ a 3’ de uma primeira ITR de AAV2, uma sequência que codifica um promotor CK8e, um sinal de localização nuclear que possui uma sequência da SEQ ID NO. 885, uma sequência que codifica uma nuclease SpCas9, um sinal de localização nuclear que possui uma sequência da SEQ ID NO: 887, um códon de terminação, uma sequência de minipoli A e uma segunda ITR de AAV2. Em algumas modalidades, a construção que compreende ou consiste de 5’ a 3’ de uma primeira ITR, uma sequência que codifica um promotor, uma sequência que codifica um primeiro sinal de localização nuclear, uma sequência que codifica uma nuclease, uma sequência que codifica um segundo sinal de localização nuclear, um códon de terminação, uma sequência de poli A e uma segunda ITR, compreende ainda repetições invertidas de elementos que podem sofrer transposição. Exemplos de repetições invertidas de elementos que podem sofrer transposição da divulgação compreendem ou consistem de uma sequência de nucleotideos de
TGTGGGCGGACAAAATAGTTGGGAACTGGGAGGGGTGGAAATGGAGTTTTTAA GGATTATTTAGGGAAGAGTGACAAAATAGATGGGAACTGGGTGTAGCGTCGTAA GCTAATACGAAAATTAAAAATGACAAAATAGTTTGGAACTAGATTTCACTTATCT GGTT (SEQ ID NO. 907) e/ou uma sequência de nucleotideos de GAATATAGTCTTTACCATGCCCTTGGCCACGCCCCTCTTTAATACGACGGGCAA TTTGCACTTCAGAAAATGAAGAGTTTGCTTTAGCCATAACAAAAGTCCAGTATGC TTTTTCACAGCATAACTGGACTGATTTCAGTTTACAACTATTCTGTCTAGTTTAAG ACTTTATTGTCATAGTTTAGATCTATTTTGTTCAGTTTAAGACTTTATTGTCCGCC CACA (SEQ ID NO. 908). Em algumas modalidades, a construção compreende ou
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148/259 consiste de 5’ a 3’ de uma primeira repetição invertida de elemento que pode sofrer transposição, uma primeira ITR, uma sequência que codifica um promotor, uma sequência que codifica um primeiro sinal de localização nuclear, uma sequência que codifica uma nuclease, uma sequência que codifica um segundo sinal de localização nuclear, um códon de terminação, uma sequência de poli A, uma segunda ITR e uma segunda repetição invertida de elemento que pode sofrer transposição. Em algumas modalidades, a construção compreende ou consiste de 5’ a 3’ de uma primeira repetição invertida de elemento que pode sofrer transposição que possui uma sequência da SEQ ID NO. 907, uma primeira ITR de AAV2, uma sequência que codifica um promotor CK8e, um sinal de localização nuclear que possui uma sequência da SEQ ID NO. 885, uma sequência que codifica uma nuclease SpCas9, um sinal de localização nuclear que possui uma sequência da SEQ ID NO: 887, um códon de terminação, uma sequência de minipoli A, uma segunda ITR de AAV2 e uma segunda repetição invertida de elemento que pode sofrer transposição que possui uma sequência da SEQ ID NO. 908. Em algumas modalidades, a construção que compreende ou consiste, de 5’ a 3’, de uma primeira repetição invertida de elemento que pode sofrer transposição, uma primeira ITR, uma sequência que codifica um promotor, uma sequência que codifica um primeiro sinal de localização nuclear, uma sequência que codifica uma nuclease, uma sequência que codifica um segundo sinal de localização nuclear, um códon de terminação, uma sequência de poli A, uma segunda ITR e uma segunda repetição invertida de elemento que pode sofrer transposição, compreende ainda uma sequência reguladora. Exemplos de sequências reguladoras da divulgação compreendem ou consistem de uma sequência de nucleotídeos de
CATGCAAGCTGTAGCCAACCACTAGAACTATAGCTAGAGTCCTGGGCGAACAAA CGATGCTCGCCTTCCAGAAAACCGAGGATGCGAACCACTTCATCCGGGGTCAG CACCACCGGCAAGCGCCGCGACGGCCGAGGTCTTCCGATCTCCTGAAGCCAG GGCAGATCCGTGCACAGCACCTTGCCGTAGAAGAACAGCAAGGCCGCCAATGC CTGACGATGCGTGGAGACCGAAACCTTGCGCTCGTTCGCCAGCCAGGACAGAA
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ATGCCTCGACTTCGCTGCTGCCCAAGGTTGCCGGGTGACGCACACCGTGGAAA CGGATGAAGGCACGAACCCAGTTGACATAAGCCTGTTCGGTTCGTAAACTGTAA TGCAAGTAGCGTATGCGCTCACGCAACTGGTCCAGAACCTTGACCGAACGCAG CGGTGGTAACGGCGCAGTGGCGGTTTTCATGGCTTGTTATGACTGTTTTTTTGT ACAGTCTATGCCTCGGGCATCCAAGCAGCAAGCGCGTTACGCCGTGGGTCGAT GTTTGATGTTATGGAGCAGCAACGATGTTACGCAGCAGCAACGATGTTACGCAG CAGGGCAGTCGCCCTAAAACAAAGTTAGGTGGCTCAAGTATGGGCATCATTCG CACATGTAGGCTCGGCCCTGACCAAGTCAAATCCATGCGGGCTGCTCTTGATC TTTTCGGTCGTGAGTTCGGAGACGTAGCCACCTACTCCCAACATCAGCCGGAC TCCGATTACCTCGGGAACTTGCTCCGTAGTAAGACATTCATCGCGCTTGCTGCC TTCGACCAAGAAGCGGTTGTTGGCGCTCTCGCGGCTTACGTTCTGCCCAAGTTT GAGCAGCCGCGTAGTGAGATCTATATCTATGATCTCGCAGTCTCCGGCGAGCA CCGGAGGCAGGGCATTGCCACCGCGCTCATCAATCTCCTCAAGCATGAGGCCA ACGCGCTTGGTGCTTATGTGATCTACGTGCAAGCAGATTACGGTGACGATCCC GCAGTGGCTCTCTATACAAAGTTGGGCATACGGGAAGAAGTGATGCACTTTGAT ATCGACCCAAGTACCGCCACCTAACAATTCGTTCAAGCCGAGATCGGCTTCCC GGCCGCGGAGTTGTTCGGTAAATTGTCACAACGCCG (SEQ ID NO. 909). Em algumas modalidades, a construção compreende ou consiste de 5’ a 3’ de uma primeira repetição invertida de elemento que pode sofrer transposição, uma primeira ITR, uma sequência que codifica um promotor, uma sequência que codifica um primeiro sinal de localização nuclear, uma sequência que codifica uma nuclease, uma sequência que codifica um segundo sinal de localização nuclear, um códon de terminação, uma sequência de poli A, uma segunda ITR, uma sequência reguladora e uma segunda repetição invertida de elemento que pode sofrer transposição. Em algumas modalidades, a construção compreende ou consiste de 5’ a 3’ de uma primeira repetição invertida de elemento que pode sofrer transposição que possui uma sequência da SEQ ID NO. 907, uma primeira ITR de AAV2, uma sequência que codifica um promotor CK8e, um sinal de localização nuclear que possui uma sequência da SEQ ID NO. 885, uma sequência que codifica uma nuclease SpCas9,
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150/259 um sinal de localização nuclear que possui uma sequência da SEQ ID NO: 887, um códon de terminação, uma sequência de minipoli A, uma segunda ITR de AAV2, uma sequência reguladora que possui uma sequência da SEQ ID NO. 909 e uma segunda repetição invertida de elemento que pode sofrer transposição que possui uma sequência da SEQ ID NO. 908. Em algumas modalidades, a construção pode compreender ainda uma ou mais sequências espaçadoras. Exemplos de sequências espaçadoras da divulgação possuem comprimento de 1-1500 nucleotídeos, inclusive todas as faixas intermediárias. Em algumas modalidades, as sequências espaçadoras podem estar localizada a 5’ ou a 3’ de uma ITR, um promotor, uma sequência de localização nuclear, uma nuclease, um códon de terminação, uma sequência poliA, uma repetição invertida de elemento que pode sofrer transposição e/ou um elemento regulador. Em algumas modalidades, a construção pode ter uma sequência que compreende ou consiste da SEQ ID NO: 899, SEQ ID NO: 900, SEQ ID NO: 901 ou SEQ ID NO: 902.
E. Vetores AAV-sgRNA [0246] Em algumas modalidades, pelo menos uma primeira sequência que codifica um gRNA e uma segunda sequência que codifica um gRNA podem ser empacotadas dentro de um vetor AAV. Em algumas modalidades, pelo menos uma primeira sequência que codifica um gRNA, uma segunda sequência que codifica um gRNA e uma terceira sequência que codifica um gRNA podem ser empacotadas dentro de um vetor AAV. Em algumas modalidades, pelo menos uma primeira sequência que codifica um gRNA, uma segunda sequência que codifica um gRNA, uma terceira sequência que codifica um gRNA e uma quarta sequência que codifica um gRNA podem ser empacotadas dentro de um vetor AAV. Em algumas modalidades, pelo menos uma primeira sequência que codifica um gRNA, uma segunda sequência que codifica um gRNA, uma terceira sequência que codifica um gRNA, uma quarta sequência que codifica um gRNA e uma quinta sequência que codifica um gRNA podem ser empacotadas dentro de um vetor AAV. Em algumas modalidades, um grande número de sequências que codificam um gRNA é
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151/259 empacotado dentro de um vetor AAV. Por exemplo, 1,2,3, 4, 5, 6,7,8,9,10,11,12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 sequências que codificam um gRNA podem ser empacotadas dentro de um vetor AAV. Em algumas modalidades, cada sequência que codifica um gRNA é diferente. Em algumas modalidades, pelo menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 das sequências que codificam um gRNA são as mesmas. Em algumas modalidades, todas as sequências que codificam um gRNA são as mesmas.
[0247] Em algumas modalidades, o vetor AAV é um vetor AAV do tipo selvagem. Em algumas modalidades, o vetor AAV contém uma ou mais mutações. Em algumas modalidades, o vetor AAV é isolado ou derivado de um vetor AAV do sorotipo AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 ou qualquer combinação dos mesmos.
[0248] Exemplos de vetores AAV-sgRNA contêm duas sequências ITR (repetição terminal invertida) que flanqueiam uma região de sequência central que compreende as sequências de sgRNA. Em algumas modalidades, as ITRs são isoladas ou derivadas de um vetor AAV do sorotipo AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 ou qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, as ITRs são isoladas ou derivadas de um vetor AAV de um primeiro sorotipo e uma sequência que codifica uma proteína de capsídeo do vetor AAV-sgRNA é isolada ou derivada de um vetor AAV de um segundo sorotipo. Em algumas modalidades, primeiro sorotipo e o segundo sorotipo são os mesmos. Em algumas modalidades, o primeiro sorotipo e o segundo sorotipo não são os mesmos. Em algumas modalidades, o primeiro sorotipo é AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 ou AAV11. Em algumas modalidades, o segundo sorotipo é AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 ou AAV11. Em algumas modalidades, o primeiro sorotipo é AAV2 e o segundo sorotipo é AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 ou AAV11. Em algumas modalidades, o primeiro sorotipo é AAV2 e o segundo sorotipo é AAV9.
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152/259 [0249] Exemplos de vetores AAV-sgRNA contêm duas sequências ITR (repetição terminal invertida) que flanqueiam uma região de sequência central que compreende as sequências de gRNA. Em algumas modalidades, as ITRs são isoladas ou derivadas de um vetor AAV do sorotipo AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 ou qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, uma primeira ITR é isolada ou derivada de um vetor AAV de um primeiro sorotipo, uma segunda ITR é isolada ou derivada de um vetor AAV de um segundo sorotipo e uma sequência que codifica uma proteína de capsídeo do vetor AAV-sgRNA é isolada ou derivada de um vetor AAV de um terceiro sorotipo. Em algumas modalidades, primeiro sorotipo e o segundo sorotipo são os mesmos. Em algumas modalidades, primeiro sorotipo e o segundo sorotipo não são os mesmos. Em algumas modalidades, primeiro sorotipo, o segundo sorotipo e o terceiro sorotipo são os mesmos. Em algumas modalidades, o primeiro sorotipo, o segundo sorotipo e o terceiro sorotipo não são os mesmos. Em algumas modalidades, o primeiro sorotipo é AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 ou AAV11. Em algumas modalidades, o segundo sorotipo é AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 ou AAV11. Em algumas modalidades, o terceiro sorotipo é AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 ou AAV11. Em algumas modalidades, o primeiro sorotipo é AAV2, o segundo sorotipo é AAV4 e o terceiro sorotipo é AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 ou AAV11. Em algumas modalidades, o primeiro sorotipo é AAV2, o segundo sorotipo é AAV4 e o terceiro sorotipo é AAV9. Exemplos de vetores AAVsgRNA contêm duas sequências ITR (repetição terminal invertida) que flanqueiam uma região de sequência central que compreende as sequências de sgRNA. Em algumas modalidades, as ITRs são isoladas ou derivadas de um vetor AAV do sorotipo AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 ou qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, as ITRs compreendem ou consistem de sequências de comprimento completo e/ou do tipo selvagem para um sorotipo de AAV. Em algumas modalidades, as ITRs
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153/259 compreendem ou consistem de sequências truncadas para um sorotipo de AAV. Em algumas modalidades, as ITRs compreendem ou consistem de sequências alongadas para um sorotipo de AAV. Em algumas modalidades, as ITRs compreendem ou consistem de sequências que compreende uma variação de sequência comparada com uma sequência do tipo selvagem para o mesmo sorotipo de AAV. Em algumas modalidades, a variação de sequência compreende uma ou mais de uma substituição, uma deleção, uma inserção, uma inversão ou uma transposição. Em algumas modalidades, as ITRs compreendem ou consistem de pelo menos 100,101,102,103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120,
121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136,137,
138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149 ou 150 pares de bases.
Em algumas modalidades, as ITRs compreendem ou consistem de 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118,119,
120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135,136,
137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149 ou 150 pares de bases. Em algumas modalidades, as ITRs possuem um comprimento de 110 ± 10 pares de bases. Em algumas modalidades, as ITRs possuem um comprimento de 120 ± 10 pares de bases. Em algumas modalidades, as ITRs possuem um comprimento de 130 ± 10 pares de bases. Em algumas modalidades, as ITRs possuem um comprimento de 140 ± 10 pares de bases. Em algumas modalidades, as ITRs possuem um comprimento de 150 ± 10 pares de bases. Em algumas modalidades, as ITRs possuem um comprimento de 115, 145 ou 141 pares de bases. Em algumas modalidades, as ITRs possuem uma sequência selecionada da SEQ ID NO: 880, SEQ ID NO: 881, SEQ ID NO: 882 ou SEQ ID NO: 883.
[0250] Em algumas modalidades, o vetor AAV-sgRNA pode compreender elementos adicionais para facilitar o empacotamento do vetor e a expressão do sgRNA. Em algumas modalidades, o vetor AAV-sgRNA pode compreender um elemento que pode sofrer transposição. Em algumas modalidades, o vetor AAV-sgRNA pode compreender um elemento regulador. Em algumas
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154/259 modalidades, o elemento regulador compreende um ativador ou um repressor. Em algumas modalidades, a sequência de AAV-sgRNA pode compreender uma sequência não funcional ou “stuffer”. Os exemplos de sequências stuffer da divulgação podem ter alguma (uma porcentagem sem ser zero de) identidade ou homologia com uma sequência genômica de um mamífero (incluindo um ser humano). Alternativamente, exemplos de sequências stuffer da divulgação podem ter nenhuma identidade ou homologia com uma sequência genômica de um mamífero (incluindo um ser humano). Exemplos de sequências stuffer da divulgação podem compreender ou consistir de sequências não codificadoras que ocorrem naturalmente ou sequências que não são transcritas nem traduzidas após a administração do vetor AAV a um indivíduo.
[0251] Em algumas modalidades, o vetor AAV-sgRNA pode ser otimizado para produção em levedura, bactérias, células de insetos ou células de mamíferos. Em algumas modalidades, o vetor AAV-sgRNA pode ser otimizado para expressão em células humanas. Em algumas modalidades, o vetor AAV-Cas9 pode ser otimizado para expressão em um sistema de expressão de bacculovírus.
[0252] Em algumas modalidades, o vetor AAV-sgRNA compreende pelo menos um promotor. Em algumas modalidades, o vetor AAV-sgRNA compreende pelo menos dois promotores. Em algumas modalidades, o vetor AAV-sgRNA compreende pelo menos três promotores. Em algumas modalidades, o vetor AAVsgRNA compreende pelo menos quatro promotores. Em algumas modalidades, o vetor AAV-sgRNA compreende pelo menos cinco promotores. Exemplos de promotores incluem, por exemplo, cadeia leve de imunoglobulina, cadeia pesada de imunoglobulina, receptor de células T, HLA DQ a e/ou DQ β, β-interferon, interleucina2, receptor de interleucina-2, MHCde classe II 5, MHCde classe II HLA-Dra, β-Actina, creatina quinase muscular (MCK), pré-albumina (transtiretina), elastase I, metalotioneína (MTII), colagenase, albumina, cc-fetoproteina, t-globina, β-globina, cfos, c-HA-ras, insulina, molécula de adesão de célula neural (NCAM), cci-antitripaína, histona H2B (TH2B), colágeno de camundongo e/ou do tipo I, proteínas reguladas
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155/259 pela glicose (GRP94 e GRP78), hormônio de crescimento de rato, amiloide A do soro humano (SAA), troponina I (TN I), fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF), distrofia muscular de Duchenne, SV40, polioma, retrovirus, papiloma vírus, vírus da hepatite B, vírus da imunodeficiência humana, citomegalovírus (CMV) e vírus da leucemia do macaco gibão. Exemplos adicionais de promotores incluem o promotor U6, o promotor H1 e o promotor 7SK.
[0253] Em algumas modalidades, a sequência que codifica o gRNA compreende uma sequência selecionada das SEQ ID Nos: 383-705, 709-711, 715717, 790-862 e 864.
[0254] Em algumas modalidades, o vetor AAV compreende uma primeira sequência que codifica um gRNA e uma segunda sequência que codifica um gRNA, um primeiro promotor controla a expressão da primeira sequência que codifica um gRNA e um segundo promotor controla a expressão da segunda sequência que codifica um gRNA. Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo promotores são os mesmos. Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo promotores são diferentes. Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo promotores são selecionados do promotor H1, do promotor U6 e do promotor 7SK. Em algumas modalidades, a primeira sequência que codifica um gRNA e a segunda sequência que codifica um gRNA são idênticas. Em algumas modalidades, a primeira sequência que codifica um gRNA e a segunda sequência que codifica um gRNA não são idênticas.
[0255] Em algumas modalidades, o vetor AAV compreende uma primeira sequência que codifica um gRNA, uma segunda sequência que codifica um gRNA e uma terceira sequência que codifica um gRNA, um primeiro promotor controla a expressão da primeira sequência que codifica um gRNA, um segundo promotor controla a expressão da segunda sequência que codifica um gRNA e um terceiro promotor controla a expressão de uma terceira sequência que codifica um gRNA. Em algumas modalidades, pelo menos dois do primeiro, do segundo e do terceiro promotores são os mesmos. Em algumas modalidades, cada um do primeiro, do segundo e do terceiro promotores são diferentes. Em algumas modalidades, o
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156/259 primeiro, o segundo e o terceiro promotores são selecionados do promotor H1, do promotor U6 e do promotor 7SK. Em algumas modalidades, o primeiro promotor é o promotor U6. Em algumas modalidades, o segundo promotor é o promotor H1. Em algumas modalidades, o terceiro promotor é o promotor 7SK. Em algumas modalidades, o primeiro promotor é o promotor U6, o segundo promotor é o promotor H1 e o terceiro promotor é o promotor 7SK. Em algumas modalidades, a primeira sequência que codifica um gRNA, a segunda sequência que codifica um gRNA e a terceira sequência que codifica um gRNA são idênticas. Em algumas modalidades, a primeira sequência que codifica um gRNA, a segunda sequência que codifica um gRNA e a terceira sequência que codifica um gRNA não são idênticas.
[0256] Em algumas modalidades, o vetor AAV compreende uma primeira sequência que codifica um gRNA, uma segunda sequência que codifica um gRNA, uma terceira sequência que codifica um gRNA e uma quarta sequência que codifica um gRNA, um primeiro promotor controla a expressão da primeira sequência que codifica um gRNA, um segundo promotor controla a expressão da segunda sequência que codifica um gRNA, um terceiro promotor controla a expressão da terceira sequência que codifica um gRNA e um quarto promotor controla a expressão da quarta sequência que codifica um gRNA. Em algumas modalidades, pelo menos dois do primeiro, do segundo, do terceiro e do quarto promotores são os mesmos. Em algumas modalidades, cada um do primeiro, do segundo, do terceiro e do quarto promotores são diferentes. Em algumas modalidades, cada um do primeiro, do segundo, do terceiro e do quarto promotores são selecionados do promotor H1, do promotor U6 e do promotor 7SK. Em algumas modalidades, a primeira sequência que codifica um gRNA, a segunda sequência que codifica um gRNA, a terceira sequência que codifica um gRNA e uma quarta sequência que codifica um gRNA são idênticas. Em algumas modalidades, a primeira sequência que codifica um gRNA, a segunda sequência que codifica um gRNA, a terceira sequência que codifica um gRNA e a quarta sequência que codifica um gRNA não são idênticas.
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157/259 [0257] Em algumas modalidades, o vetor AAV compreende uma primeira sequência que codifica um gRNA, uma segunda sequência que codifica um gRNA, uma terceira sequência que codifica um gRNA, uma quarta sequência que codifica um gRNA e uma quinta sequência que codifica um gRNA, um primeiro promotor controla a expressão da primeira sequência que codifica um gRNA, um segundo promotor controla a expressão da segunda sequência que codifica um gRNA, um terceiro promotor controla a expressão da terceira sequência que codifica um gRNA, um quarto promotor controla a expressão da quarta sequência que codifica um gRNA e um quinto promotor controla a expressão da quinta sequência que codifica um gRNA. Em algumas modalidades, pelo menos dois do primeiro, do segundo, do terceiro, do quarto e do quinto promotores são os mesmos. Em algumas modalidades, cada um do primeiro, do segundo, do terceiro, do quarto e do quinto promotores são diferentes. Em algumas modalidades, cada um do primeiro, do segundo, do terceiro e do quarto promotores são diferentes. Em algumas modalidades, cada um do primeiro, do segundo, do terceiro, do quarto e do quinto promotores são selecionados do promotor H1, do promotor U6 e do promotor 7SK. Em algumas modalidades, a primeira sequência que codifica um gRNA, a segunda sequência que codifica um gRNA, a terceira sequência que codifica um gRNA, a quarta sequência que codifica um gRNA e a quinta sequência que codifica um gRNA são idênticas. Em algumas modalidades, a primeira sequência que codifica um gRNA, a segunda sequência que codifica um gRNA, a terceira sequência que codifica um gRNA, a quarta sequência que codifica um gRNA e a quinta sequência que codifica um gRNA não são idênticas.
[0258] Em algumas modalidades, o vetor AAV-sgRNA compreende uma sequência selecionada da SEQ ID NO: 910, SEQ ID NO: 911, SEQ ID NO: 912 ou SEQ ID NO: 913. Em algumas modalidades, o vetor AAV-sgRNA compreende uma sequência selecionada da SEQ ID NO: 914, SEQ ID NO: 915, SEQ ID NO: 916 ou SEQ ID NO: 917. Em algumas modalidades, o vetor AAV-sgRNA compreende uma sequência selecionada da SEQ ID NO: 918, SEQ ID NO: 919, SEQ ID NO: 920 ou SEQ ID NO: 921. Exemplos de vetores AAV-sgRNA são fornecidos na Tabela 5.
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Tabela 5. Exemplos de vetores AAV-sgRNA.
SE Q ID NO Sequência
91 0 CCACTCCCTCTATGCGCGCTCGCTCACTCACTCGGCCCTGGAGACCAA AGGTCTCCAGACTGCCGGCCTCTGGCCGGCAGGGCCGAGTGAGTGAG CGAGCGCGCATAGAGGGAGTGGGTACCTCCATCATCTAGGTTTGCCAG ATCTGATATCGGCGCGCCCCTGGGCGCGCCCGAGTCCAACACCCGTG GGAATCCCATGGGCACCATGGCCCCTCGCTCCAAAAATGCTTTCGCGT CGCGCAGACACTGCTCGGTAGTTTCGGGGATCAGCGTTTGAGTAAGAG CCCGCGTCTGAACCCTCCGCGCCGCCCCGGCCCCAGTGGAAAGACGC GCAGGCAAAACGCACCACGTGACGGAGCGTGACCGCGCGCCGAGCGC GCGCCAAGGTCGGGCAGGAAGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCAT ATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATTTG ACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATA ATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATG I I I IAAAATGGACTATCA TATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTT GTGGAAAGGACGAAACACCGCACTAGAGTAACAGTCTGACGTTTAAGA GCTATGCTGGAAACAGCATAGCAAGTTTAAATAAGGCTAGTCCGTTATC AACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTGCGGCCGCGCTC GGCGCGCCCATATTTGCATGTCGCTATGTGTTCTGGGAAATCACCATAA ACGTGAAATGTCTTTGGATTTGGGAATCTTATAAGTTCTGTATGAGACCA CGGTACACCGCACTAGAGTAACAGTCTGACGTTTAAGAGCTATGCTGGA AACAGCATAGCAAGTTTAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAG TGGCACCGAGTCGGTGCI I I ITTTGCGGCCGCTGACGGCGCGCCCTGC AGTATTTAGCATGCCCCACCCATCTGCAAGGCATTCTGGATAGTGTCAA AACAGCCGGAAATCAAGTCCGTTTATCTCAAACTTTAGCATI I IGGGAAT
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AAATGATATTTGCTATGCTGGTTAAATTAGATTTTAGTTAAATTTCCTGCT GAAGCTCTAGTACGATAAGTAACTTGACCTAAGTGTAAAGTTGAGATTTC CTTCAGGTTTATATAGCTTGTGCGCCGCCTGGGTACACCGCACTAGAGT AACAGTCTGACGTTTAAGAGCTATGCTGGAAACAGCATAGCAAGTTTAA ATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCT TTTTTTGCGGCCGCGCTTGCGGCCGCCTCGAGTGATCAAAAAAACCAA CACACGCTTCCAATGAAAATAAACGATCCTTTATTGCTAGCCTTTACTTG TACAGCTCGTCCATGCCGAGAGTGATCCCGGCGGCGGTCACGAACTCC AGCAGGACCATGTGATCGCGCTTCTCGTTGGGGTCTTTGCTCAGGGCG GACTGGGTGCTCAGGTAGTGGTTGTCGGGCAGCAACACGGGGCCGTC GCCGATGGGGGTGTTCTGCTGGTAGTGGTCGGCGAGCTGCACGCTGC CGTCCTCGATGTTGTGGCGGATCTTGAAGTTCACCTTGATGCCGTTCTT CTGCTTGTCGGCCATGATATAGACGTTGTGGCTGTTGTAGTTGTACTCC AGCTTGTGCCCCAGGATGTTGCCGTCCTCCTTGAAGTCGATGCCCTTCA GCTCGATGCGGTTCACCAGGGTGTCGCCCTCGAACTTCACCTCGGCGC GGGTCTTGTAGTTGCCGTCGTCCTTGAAGAAGATGGTGCGCTCCTGGA CGTAGCCTTCGGGCATGGCGGACTTGAAGAAGTCGTGCTGCTTCATGT GGTCGGGGTAGCGGCTGAAGCACTGCACGCCGTAGGTCAGGGTGGTC ACGAGGGTGGGCCAGGGCACGGGCAGCTTGCCGGTGGTGCAGATGAA CTTCAGGGTCAGCTTGCCGTAGGTGGCATCGCCCTCGCCCTCGCCGGA CACGCTGAACTTGTGGCCGTTTACGTCGCCGTCCAGCTCGACCAGGAT GGGCACCACCCCGGTGAACAGCTCCTCGCCCTTGCTCACCATGGTGGC GACCGGTGGATCCCGGGCCCGCGGGGTGGCTTTACCAACAGTACCCG GAATGCCAAGCTTACTTAGATCGCAGTCTCGACGCTGGCTGGCTCCTG AGTGTCTGTCTGTGCTGTGGAGGTGGTGGTAGAATGAGGGCAGCCCCT GTGCCCCTGGGTTATATAGAGGAGCCTACAGGGTGTGACTAGCCAGGA GGGGCTGTCCCCAGGGAGGGGCCCCTGAGAGCAGATGAGCTTTCAGC TCGTTGCCCGGGCACCGTGCCCACCCCGGACCCAGGCGTGCAGCTTG CCCAGCCCCATGGCCTTGTATGGGCTGCCCCAAGGGCTGACTTGCTCA
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CTGGTTCCTAAACTAAGTGCTGAGTCTAGCTGGCGGGGGACAGCTGGC CCTTCGCCGGGAACATGGCATGCAGGGTTATI I I IAGAGGCAGCAGGT GTTGGGGGGGGGGGGGCAGCCACATGTCTGGGTTAATTATAACCAGG CATCTCGGGTGTCCCCAGGCCTTGCCTCCTTACATGGGCACGTCGACG ATATCAGATCTAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTG CGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCG GGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAG AGGGAGTGG
91 8 CCACTCCCTCTATGCGCGCTCGCTCACTCACTCGGCCCTGGAGACCAA AGGTCTCCAGACTGCCGGCCTCTGGCCGGCAGGGCCGAGTGAGTGAG CGAGCGCGCATAGAGGGAGTGGGTACCTCCATCATCTAGGTTTGCCAG ATCTGATATCGGCGCGCCCCTGGGCGCGCCCGAGTCCAACACCCGTG GGAATCCCATGGGCACCATGGCCCCTCGCTCCAAAAATGCTTTCGCGT CGCGCAGACACTGCTCGGTAGTTTCGGGGATCAGCGTTTGAGTAAGAG CCCGCGTCTGAACCCTCCGCGCCGCCCCGGCCCCAGTGGAAAGACGC GCAGGCAAAACGCACCACGTGACGGAGCGTGACCGCGCGCCGAGCGC GCGCCAAGGTCGGGCAGGAAGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCAT ATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATTTG ACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATA ATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATG I I I IAAAATGGACTATCA TATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTT GTGGAAAGGACGAAACACCGCACCAGAGTAACAGTCTGACGTTTAAGA GCTATGCTGGAAACAGCATAGCAAGTTTAAATAAGGCTAGTCCGTTATC AACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTGCGGCCGCGCTC GGCGCGCCCATATTTGCATGTCGCTATGTGTTCTGGGAAATCACCATAA ACGTGAAATGTCTTTGGATTTGGGAATCTTATAAGTTCTGTATGAGACCA CGGTACACCGCACCAGAGTAACAGTCTGACGTTTAAGAGCTATGCTGG AAACAGCATAGCAAGTTTAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAA
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GTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTGCGGCCGCTGACGGCGCGCCCTG CAGTATTTAGCATGCCCCACCCATCTGCAAGGCATTCTGGATAGTGTCA AAACAGCCGGAAATCAAGTCCGTTTATCTCAAACTTTAGCATTTTGGGAA TAAATGATATTTGCTATGCTGGTTAAATTAGATTTTAGTTAAATTTCCTGC TGAAGCTCTAGTACGATAAGTAACTTGACCTAAGTGTAAAGTTGAGATTT CCTTCAGGTTTATATAGCTTGTGCGCCGCCTGGGTACACCGCACCAGA GTAACAGTCTGACGTTTAAGAGCTATGCTGGAAACAGCATAGCAAGTTT AAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTG CTTTTTTTGCGGCCGCGCTGTTTAAACCAACAAAATCAGCAGCTAATGA AGGCAAGTCAGCAGGTCACTCATCATTTTCCACTTCGGCAATGCAGTGG GATTATTCCAACAGAGGTTTTTCACAGCATTCCTTCAGTTAACTGGAGAT CGAATCTTGATTTTCACAGATATACTTGGCAAGGTCCGCCCTGTCATCA GCACATTCAAGCAGATCTCCATGGCAGCATTCCGTGTGGACTTAGGTAA GATCTGTCACTAACTTGGAAACTTCTGCAAACTCAGCTTAGGGAAATCT CTGGCTCAGGCGAGCTACTGCCTCAGCTTAGAAAGCTCTTTCTCCAAAT TATTGGAGACTGGCACACTTAAGTCCCTGTTAGGCAGACGAAGCCTTCC CTTCATCCCGAAGTTCATCGAGCTTTGGCAACAGGCAGGCAGCTTTATC AGCAGCTTGGCAACATTCTGTAAAAGCAGCTTTATACCTTTAAGCAAAGA AAAGGAGTTCCGGGGCATAAAAGTAAGGATGTCTTCTGGCAATTTATAA TAAGTATTTTTTCAAAAATGTCTCTTCATTGTCATGAAAAGCAGTGCATCA CACATCAACCTCTGGTCTCACCAATCGGGGGAGGTTTGGGTTGTTTACT TAGTGTTGCAAGAATTATTTTATTCTCTCAGGTTCTTGTTTTGCACAGCA GTCAGCTCATTCACCATAGGTTTCACGAAGAGTTGCTGCGGCCGCCTC GATAATACGACTCACTATAGGGTCGACGATATCAGATCTAGGAACCCCT AGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGA GGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCG GCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGG
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CCACTCCCTCTATGCGCGCTCGCTCACTCACTCGGCCCTGGAGACCAA
AGGTCTCCAGACTGCCGGCCTCTGGCCGGCAGGGCCGAGTGAGTGAG
CGAGCGCGCATAGAGGGAGTGGGTACCTCCATCATCTAGGTTTGCCAG
ATCTGATATCGGCGCGCCCCTGGGCGCGCCCGAGTCCAACACCCGTG
GGAATCCCATGGGCACCATGGCCCCTCGCTCCAAAAATGCTTTCGCGT
CGCGCAGACACTGCTCGGTAGTTTCGGGGATCAGCGTTTGAGTAAGAG
CCCGCGTCTGAACCCTCCGCGCCGCCCCGGCCCCAGTGGAAAGACGC
GCAGGCAAAACGCACCACGTGACGGAGCGTGACCGCGCGCCGAGCGC
GCGCCAAGGTCGGGCAGGAAGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCAT
ATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATTTG
ACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATA
ATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCA
TATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTT
GTGGAAAGGACGAAACACCGCACCAGAGTAACAGTCTGAGGTTTAAGA
GCTATGCTGGAAACAGCATAGCAAGTTTAAATAAGGCTAGTCCGTTATC
AACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTGCGGCCGCGCTC
GGCGCGCCCATATTTGCATGTCGCTATGTGTTCTGGGAAATCACCATAA
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CGGTACACCGCACCAGAGTAACAGTCTGAGGTTTAAGAGCTATGCTGG
AAACAGCATAGCAAGTTTAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAA
GTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTGCGGCCGCTGACGGCGCGCCCTG
CAGTATTTAGCATGCCCCACCCATCTGCAAGGCATTCTGGATAGTGTCA
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GTAACAGTCTGAGGTTTAAGAGCTATGCTGGAAACAGCATAGCAAGTTT
AAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTG
CTTTTTTTGCGGCCGCGCTGTTTAAACCAACAAAATCAGCAGCTAATGA
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AGGCAAGTCAGCAGGTCACTCATCAI I I ICCACTTCGGCAATGCAGTGG GATTATTCCAACAGAGGTI I I ICACAGCATTCCTTCAGTTAACTGGAGAT CGAATCTTGATTTTCACAGATATACTTGGCAAGGTCCGCCCTGTCATCA GCACATTCAAGCAGATCTCCATGGCAGCATTCCGTGTGGACTTAGGTAA GATCTGTCACTAACTTGGAAACTTCTGCAAACTCAGCTTAGGGAAATCT CTGGCTCAGGCGAGCTACTGCCTCAGCTTAGAAAGCTCTTTCTCCAAAT TATTGGAGACTGGCACACTTAAGTCCCTGTTAGGCAGACGAAGCCTTCC CTTCATCCCGAAGTTCATCGAGCTTTGGCAACAGGCAGGCAGCTTTATC AGCAGCTTGGCAACATTCTGTAAAAGCAGCTTTATACCTTTAAGCAAAGA AAAGGAGTTCCGGGGCATAAAAGTAAGGATGTCTTCTGGCAATTTATAA TAAGTAI I I ITTCAAAAATGTCTCTTCATTGTCATGAAAAGCAGTGCATCA CACATCAACCTCTGGTCTCACCAATCGGGGGAGGTTTGGGTTGTTTACT TAGTGTTGCAAGAATTAI I I IATTCTCTCAGGTTCTTGTTTTGCACAGCA GTCAGCTCATTCACCATAGGTTTCACGAAGAGTTGCTGCGGCCGCCTC GATAATACGACTCACTATAGGGTCGACGATATCAGATCTAGGAACCCCT AGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGA GGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCG GCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGG
91 1 CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCA AAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGA GCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT AGATCTGATATCGGCGCGCCCCTGGGCGCGCCCGAGTCCAACACCCG TGGGAATCCCATGGGCACCATGGCCCCTCGCTCCAAAAATGCTTTCGC GTCGCGCAGACACTGCTCGGTAGTTTCGGGGATCAGCGTTTGAGTAAG AGCCCGCGTCTGAACCCTCCGCGCCGCCCCGGCCCCAGTGGAAAGAC GCGCAGGCAAAACGCACCACGTGACGGAGCGTGACCGCGCGCCGAGC GCGCGCCAAGGTCGGGCAGGAAGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTC ATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATT
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TGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAA TAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTAT CATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATC TTGTGGAAAGGACGAAACACCGCACTAGAGTAACAGTCTGACGTTTAAG AGCTATGCTGGAAACAGCATAGCAAGTTTAAATAAGGCTAGTCCGTTAT CAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTGCGGCCGCGCT CGGCGCGCCCATATTTGCATGTCGCTATGTGTTCTGGGAAATCACCATA AACGTGAAATGTCTTTGGATTTGGGAATCTTATAAGTTCTGTATGAGACC ACGGTACACCGCACTAGAGTAACAGTCTGACGTTTAAGAGCTATGCTGG AAACAGCATAGCAAGTTTAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAA GTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTGCGGCCGCTGACGGCGCGCCCTG CAGTATTTAGCATGCCCCACCCATCTGCAAGGCATTCTGGATAGTGTCA AAACAGCCGGAAATCAAGTCCGTTTATCTCAAACTTTAGCATTTTGGGAA TAAATGATATTTGCTATGCTGGTTAAATTAGATTTTAGTTAAATTTCCTGC TGAAGCTCTAGTACGATAAGTAACTTGACCTAAGTGTAAAGTTGAGATTT CCTTCAGGTTTATATAGCTTGTGCGCCGCCTGGGTACACCGCACTAGAG TAACAGTCTGACGTTTAAGAGCTATGCTGGAAACAGCATAGCAAGTTTA
AATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC TTTTTTTGCGGCCGCGCTTGCGGCCGCCTCGAGTGATCAAAAAAACCAA CACACGCTTCCAATGAAAATAAACGATCCTTTATTGCTAGCCTTTACTTG TACAGCTCGTCCATGCCGAGAGTGATCCCGGCGGCGGTCACGAACTCC AGCAGGACCATGTGATCGCGCTTCTCGTTGGGGTCTTTGCTCAGGGCG GACTGGGTGCTCAGGTAGTGGTTGTCGGGCAGCAACACGGGGCCGTC GCCGATGGGGGTGTTCTGCTGGTAGTGGTCGGCGAGCTGCACGCTGC CGTCCTCGATGTTGTGGCGGATCTTGAAGTTCACCTTGATGCCGTTCTT CTGCTTGTCGGCCATGATATAGACGTTGTGGCTGTTGTAGTTGTACTCC AGCTTGTGCCCCAGGATGTTGCCGTCCTCCTTGAAGTCGATGCCCTTCA GCTCGATGCGGTTCACCAGGGTGTCGCCCTCGAACTTCACCTCGGCGC GGGTCTTGTAGTTGCCGTCGTCCTTGAAGAAGATGGTGCGCTCCTGGA
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CGTAGCCTTCGGGCATGGCGGACTTGAAGAAGTCGTGCTGCTTCATGT GGTCGGGGTAGCGGCTGAAGCACTGCACGCCGTAGGTCAGGGTGGTC ACGAGGGTGGGCCAGGGCACGGGCAGCTTGCCGGTGGTGCAGATGAA CTTCAGGGTCAGCTTGCCGTAGGTGGCATCGCCCTCGCCCTCGCCGGA CACGCTGAACTTGTGGCCGTTTACGTCGCCGTCCAGCTCGACCAGGAT GGGCACCACCCCGGTGAACAGCTCCTCGCCCTTGCTCACCATGGTGGC GACCGGTGGATCCCGGGCCCGCGGGGTGGCTTTACCAACAGTACCCG GAATGCCAAGCTTACTTAGATCGCAGTCTCGACGCTGGCTGGCTCCTG AGTGTCTGTCTGTGCTGTGGAGGTGGTGGTAGAATGAGGGCAGCCCCT GTGCCCCTGGGTTATATAGAGGAGCCTACAGGGTGTGACTAGCCAGGA GGGGCTGTCCCCAGGGAGGGGCCCCTGAGAGCAGATGAGCTTTCAGC TCGTTGCCCGGGCACCGTGCCCACCCCGGACCCAGGCGTGCAGCTTG CCCAGCCCCATGGCCTTGTATGGGCTGCCCCAAGGGCTGACTTGCTCA CTGGTTCCTAAACTAAGTGCTGAGTCTAGCTGGCGGGGGACAGCTGGC CCTTCGCCGGGAACATGGCATGCAGGGTTATI I I IAGAGGCAGCAGGT GTTGGGGGGGGGGGGGCAGCCACATGTCTGGGTTAATTATAACCAGG CATCTCGGGTGTCCCCAGGCCTTGCCTCCTTACATGGGCACGTCGACG ATATCAGATCTAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTG CGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACG CCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCT GCCTGCAGG
91 9 CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCA AAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGA GCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT AGATCTGATATCGGCGCGCCCCTGGGCGCGCCCGAGTCCAACACCCG TGGGAATCCCATGGGCACCATGGCCCCTCGCTCCAAAAATGCTTTCGC GTCGCGCAGACACTGCTCGGTAGTTTCGGGGATCAGCGTTTGAGTAAG AGCCCGCGTCTGAACCCTCCGCGCCGCCCCGGCCCCAGTGGAAAGAC
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GCGCAGGCAAAACGCACCACGTGACGGAGCGTGACCGCGCGCCGAGC GCGCGCCAAGGTCGGGCAGGAAGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTC ATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATT TGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAA TAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTAT CATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATC TTGTGGAAAGGACGAAACACCGCACCAGAGTAACAGTCTGACGTTTAAG AGCTATGCTGGAAACAGCATAGCAAGTTTAAATAAGGCTAGTCCGTTAT CAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTGCGGCCGCGCT CGGCGCGCCCATATTTGCATGTCGCTATGTGTTCTGGGAAATCACCATA AACGTGAAATGTCTTTGGATTTGGGAATCTTATAAGTTCTGTATGAGACC ACGGTACACCGCACCAGAGTAACAGTCTGACGTTTAAGAGCTATGCTG GAAACAGCATAGCAAGTTTAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAA AGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTGCGGCCGCTGACGGCGCGCCCT GCAGTATTTAGCATGCCCCACCCATCTGCAAGGCATTCTGGATAGTGTC AAAACAGCCGGAAATCAAGTCCGTTTATCTCAAACTTTAGCATTTTGGGA ATAAATGATATTTGCTATGCTGGTTAAATTAGATTTTAGTTAAATTTCCTG CTGAAGCTCTAGTACGATAAGTAACTTGACCTAAGTGTAAAGTTGAGATT TCCTTCAGGTTTATATAGCTTGTGCGCCGCCTGGGTACACCGCACCAGA GTAACAGTCTGACGTTTAAGAGCTATGCTGGAAACAGCATAGCAAGTTT AAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTG CTTTTTTTGCGGCCGCGCTGTTTAAACCAACAAAATCAGCAGCTAATGA AGGCAAGTCAGCAGGTCACTCATCATTTTCCACTTCGGCAATGCAGTGG GATTATTCCAACAGAGGTTTTTCACAGCATTCCTTCAGTTAACTGGAGAT CGAATCTTGATTTTCACAGATATACTTGGCAAGGTCCGCCCTGTCATCA GCACATTCAAGCAGATCTCCATGGCAGCATTCCGTGTGGACTTAGGTAA GATCTGTCACTAACTTGGAAACTTCTGCAAACTCAGCTTAGGGAAATCT CTGGCTCAGGCGAGCTACTGCCTCAGCTTAGAAAGCTCTTTCTCCAAAT TATTGGAGACTGGCACACTTAAGTCCCTGTTAGGCAGACGAAGCCTTCC
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CTTCATCCCGAAGTTCATCGAGCTTTGGCAACAGGCAGGCAGCTTTATC AGCAGCTTGGCAACATTCTGTAAAAGCAGCTTTATACCTTTAAGCAAAGA AAAGGAGTTCCGGGGCATAAAAGTAAGGATGTCTTCTGGCAATTTATAA TAAGTAI I I ITTCAAAAATGTCTCTTCATTGTCATGAAAAGCAGTGCATCA CACATCAACCTCTGGTCTCACCAATCGGGGGAGGTTTGGGTTGTTTACT TAGTGTTGCAAGAATTAI I I IATTCTCTCAGGTTCTTGTTTTGCACAGCA GTCAGCTCATTCACCATAGGTTTCACGAAGAGTTGCTGCGGCCGCCTC GATAATACGACTCACTATAGGGTCGACGATATCAGATCTAGGAACCCCT AGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGA GGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCG GCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG
91 5 CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCA AAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGA GCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT AGATCTGATATCGGCGCGCCCCTGGGCGCGCCCGAGTCCAACACCCG TGGGAATCCCATGGGCACCATGGCCCCTCGCTCCAAAAATGCTTTCGC GTCGCGCAGACACTGCTCGGTAGTTTCGGGGATCAGCGTTTGAGTAAG AGCCCGCGTCTGAACCCTCCGCGCCGCCCCGGCCCCAGTGGAAAGAC GCGCAGGCAAAACGCACCACGTGACGGAGCGTGACCGCGCGCCGAGC GCGCGCCAAGGTCGGGCAGGAAGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTC ATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATT TGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAA TAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATG I I I IAAAATGGACTAT CATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATC TTGTGGAAAGGACGAAACACCGCACCAGAGTAACAGTCTGAGGTTTAA GAGCTATGCTGGAAACAGCATAGCAAGTTTAAATAAGGCTAGTCCGTTA TCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCI I I ITTTGCGGCCGCGCT CGGCGCGCCCATATTTGCATGTCGCTATGTGTTCTGGGAAATCACCATA
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AACGTGAAATGTCTTTGGATTTGGGAATCTTATAAGTTCTGTATGAGACC ACGGTACACCGCACCAGAGTAACAGTCTGAGGTTTAAGAGCTATGCTG GAAACAGCATAGCAAGTTTAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAA AGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTGCGGCCGCTGACGGCGCGCCCT GCAGTATTTAGCATGCCCCACCCATCTGCAAGGCATTCTGGATAGTGTC AAAACAGCCGGAAATCAAGTCCGTTTATCTCAAACTTTAGCATTTTGGGA ATAAATGATATTTGCTATGCTGGTTAAATTAGATTTTAGTTAAATTTCCTG CTGAAGCTCTAGTACGATAAGTAACTTGACCTAAGTGTAAAGTTGAGATT TCCTTCAGGTTTATATAGCTTGTGCGCCGCCTGGGTACACCGCACCAGA GTAACAGTCTGAGGTTTAAGAGCTATGCTGGAAACAGCATAGCAAGTTT AAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTG CTTTTTTTGCGGCCGCGCTGTTTAAACCAACAAAATCAGCAGCTAATGA AGGCAAGTCAGCAGGTCACTCATCATTTTCCACTTCGGCAATGCAGTGG GATTATTCCAACAGAGGTTTTTCACAGCATTCCTTCAGTTAACTGGAGAT CGAATCTTGATTTTCACAGATATACTTGGCAAGGTCCGCCCTGTCATCA GCACATTCAAGCAGATCTCCATGGCAGCATTCCGTGTGGACTTAGGTAA GATCTGTCACTAACTTGGAAACTTCTGCAAACTCAGCTTAGGGAAATCT CTGGCTCAGGCGAGCTACTGCCTCAGCTTAGAAAGCTCTTTCTCCAAAT TATTGGAGACTGGCACACTTAAGTCCCTGTTAGGCAGACGAAGCCTTCC CTTCATCCCGAAGTTCATCGAGCTTTGGCAACAGGCAGGCAGCTTTATC AGCAGCTTGGCAACATTCTGTAAAAGCAGCTTTATACCTTTAAGCAAAGA AAAGGAGTTCCGGGGCATAAAAGTAAGGATGTCTTCTGGCAATTTATAA TAAGTATTTTTTCAAAAATGTCTCTTCATTGTCATGAAAAGCAGTGCATCA CACATCAACCTCTGGTCTCACCAATCGGGGGAGGTTTGGGTTGTTTACT TAGTGTTGCAAGAATTATTTTATTCTCTCAGGTTCTTGTTTTGCACAGCA GTCAGCTCATTCACCATAGGTTTCACGAAGAGTTGCTGCGGCCGCCTC GATAATACGACTCACTATAGGGTCGACGATATCAGATCTAGGAACCCCT AGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGA
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GGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCG GCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG
91 2 AAGATGACGGTTTGTCACATGGAGTTGGCAGGATGTTTGATTAAAAACA TAACAGGAAGAAAAATGCCCCGCTGTGGGCGGACAAAATAGTTGGGAA CTGGGAGGGGTGGAAATGGAGTTTTTAAGGATTATTTAGGGAAGAGTGA CAAAATAGATGGGAACTGGGTGTAGCGTCGTAAGCTAATACGAAAATTA AAAATGACAAAATAGTTTGGAACTAGATTTCACTTATCTGGTTCGGATCT CCTAGGCGATATCAGTGATCACGGATCTCGACCAATTGACATTATTGAA GCAACTAGTATCGATTTTATCAGGGTTATTGTCTCAGACCTGCAGGCAG CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCG TCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCA GAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTAGATCTGATATC GGCGCGCCCCTGGGCGCGCCCGAGTCCAACACCCGTGGGAATCCCAT GGGCACCATGGCCCCTCGCTCCAAAAATGCTTTCGCGTCGCGCAGACA CTGCTCGGTAGTTTCGGGGATCAGCGTTTGAGTAAGAGCCCGCGTCTG AACCCTCCGCGCCGCCCCGGCCCCAGTGGAAAGACGCGCAGGCAAAA CGCACCACGTGACGGAGCGTGACCGCGCGCCGAGCGCGCGCCAAGGT CGGGCAGGAAGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATA CGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATTTGACTGTAAACAC AAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGT AGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCG TAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGA CGAAACACCGCACTAGAGTAACAGTCTGACGTTTAAGAGCTATGCTGGA AACAGCATAGCAAGTTTAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAG TGGCACCGAGTCGGTGCI I I ITTTGCGGCCGCGCTTCGGCGCGCCCAT ATTTGCATGTCGCTATGTGTTCTGGGAAATCACCATAAACGTGAAATGTC TTTGGATTTGGGAATCTTATAAGTTCTGTATGAGACCACGGTACACCGC ACTAGAGTAACAGTCTGACG I I IAAGAGCTATGCTGGAAACAGCATAGC
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AAGTTTAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAG TCGGTGCTTTTTTTGCGGCCGCTGACGGCGCGCCCTGCAGTATTTAGC ATGCCCCACCCATCTGCAAGGCATTCTGGATAGTGTCAAAACAGCCGG AAATCAAGTCCGTTTATCTCAAACTTTAGCATTTTGGGAATAAATGATATT TGCTATGCTGGTTAAATTAGATTTTAGTTAAATTTCCTGCTGAAGCTCTA GTACGATAAGTAACTTGACCTAAGTGTAAAGTTGAGATTTCCTTCAGGTT TATATAGCTTGTGCGCCGCCTGGGTACACCGCACTAGAGTAACAGTCTG ACGTTTAAGAGCTATGCTGGAAACAGCATAGCAAGTTTAAATAAGGCTA GTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTGCG GCCGCGCTGCGGCCGCCTCGAGTGATCAAAAAAACCAACACACGCTTC CAATGAAAATAAACGATCCTTTATTGCTAGCCTTTACTTGTACAGCTCGT CCATGCCGAGAGTGATCCCGGCGGCGGTCACGAACTCCAGCAGGACC ATGTGATCGCGCTTCTCGTTGGGGTCTTTGCTCAGGGCGGACTGGGTG CTCAGGTAGTGGTTGTCGGGCAGCAACACGGGGCCGTCGCCGATGGG GGTGTTCTGCTGGTAGTGGTCGGCGAGCTGCACGCTGCCGTCCTCGAT GTTGTGGCGGATCTTGAAGTTCACCTTGATGCCGTTCTTCTGCTTGTCG GCCATGATATAGACGTTGTGGCTGTTGTAGTTGTACTCCAGCTTGTGCC CCAGGATGTTGCCGTCCTCCTTGAAGTCGATGCCCTTCAGCTCGATGC GGTTCACCAGGGTGTCGCCCTCGAACTTCACCTCGGCGCGGGTCTTGT AGTTGCCGTCGTCCTTGAAGAAGATGGTGCGCTCCTGGACGTAGCCTT CGGGCATGGCGGACTTGAAGAAGTCGTGCTGCTTCATGTGGTCGGGGT AGCGGCTGAAGCACTGCACGCCGTAGGTCAGGGTGGTCACGAGGGTG GGCCAGGGCACGGGCAGCTTGCCGGTGGTGCAGATGAACTTCAGGGT CAGCTTGCCGTAGGTGGCATCGCCCTCGCCCTCGCCGGACACGCTGAA CTTGTGGCCGTTTACGTCGCCGTCCAGCTCGACCAGGATGGGCACCAC CCCGGTGAACAGCTCCTCGCCCTTGCTCACCATGGTGGCGACCGGTGG ATCCCGGGCCCGCGGGGTGGCTTTACCAACAGTACCCGGAATGCCAAG CTTACTTAGATCGCAGTCTCGACGCTGGCTGGCTCCTGAGTGTCTGTCT GTGCTGTGGAGGTGGTGGTAGAATGAGGGCAGCCCCTGTGCCCCTGG
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GTTATATAGAGGAGCCTACAGGGTGTGACTAGCCAGGAGGGGCTGTCC CCAGGGAGGGGCCCCTGAGAGCAGATGAGCTTTCAGCTCGTTGCCCG GGCACCGTGCCCACCCCGGACCCAGGCGTGCAGCTTGCCCAGCCCCA TGGCCTTGTATGGGCTGCCCCAAGGGCTGACTTGCTCACTGGTTCCTA AACTAAGTGCTGAGTCTAGCTGGCGGGGGACAGCTGGCCCTTCGCCG GGAACATGGCATGCAGGGTTATTTTTAGAGGCAGCAGGTGTTGGGGGG GGGGGGGCAGCCACATGTCTGGGTTAATTATAACCAGGCATCTCGGGT GTCCCCAGGCCTTGCCTCCTTACATGGGCACGTCGACGATATCAGATCT AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCT CGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTT GCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG CATGCAAGCTGTAGCCAACCACTAGAACTATAGCTAGAGTCCTGGGCG AACAAACGATGCTCGCCTTCCAGAAAACCGAGGATGCGAACCACTTCAT CCGGGGTCAGCACCACCGGCAAGCGCCGCGACGGCCGAGGTCTTCCG ATCTCCTGAAGCCAGGGCAGATCCGTGCACAGCACCTTGCCGTAGAAG AACAGCAAGGCCGCCAATGCCTGACGATGCGTGGAGACCGAAACCTTG CGCTCGTTCGCCAGCCAGGACAGAAATGCCTCGACTTCGCTGCTGCCC AAGGTTGCCGGGTGACGCACACCGTGGAAACGGATGAAGGCACGAAC CCAGTTGACATAAGCCTGTTCGGTTCGTAAACTGTAATGCAAGTAGCGT ATGCGCTCACGCAACTGGTCCAGAACCTTGACCGAACGCAGCGGTGGT AACGGCGCAGTGGCGGTTTTCATGGCTTGTTATGACTGTTTTTTTGTAC AGTCTATGCCTCGGGCATCCAAGCAGCAAGCGCGTTACGCCGTGGGTC GATGTTTGATGTTATGGAGCAGCAACGATGTTACGCAGCAGCAACGATG TTACGCAGCAGGGCAGTCGCCCTAAAACAAAGTTAGGTGGCTCAAGTAT GGGCATCATTCGCACATGTAGGCTCGGCCCTGACCAAGTCAAATCCAT GCGGGCTGCTCTTGATCTTTTCGGTCGTGAGTTCGGAGACGTAGCCAC CTACTCCCAACATCAGCCGGACTCCGATTACCTCGGGAACTTGCTCCGT AGTAAGACATTCATCGCGCTTGCTGCCTTCGACCAAGAAGCGGTTGTTG GCGCTCTCGCGGCTTACGTTCTGCCCAAGTTTGAGCAGCCGCGTAGTG
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AGATCTATATCTATGATCTCGCAGTCTCCGGCGAGCACCGGAGGCAGG GCATTGCCACCGCGCTCATCAATCTCCTCAAGCATGAGGCCAACGCGC TTGGTGCTTATGTGATCTACGTGCAAGCAGATTACGGTGACGATCCCGC AGTGGCTCTCTATACAAAGTTGGGCATACGGGAAGAAGTGATGCACTTT GATATCGACCCAAGTACCGCCACCTAACAATTCGTTCAAGCCGAGATCG GCTTCCCGGCCGCGGAGTTGTTCGGTAAATTGTCACAACGCCGCGAAT ATAGTCTTTACCATGCCCTTGGCCACGCCCCTCTTTAATACGACGGGCA ATTTGCACTTCAGAAAATGAAGAGTTTGCTTTAGCCATAACAAAAGTCCA GTATGCT1 1 1 1CACAGCATAACTGGACTGATTTCAGTTTACAACTATTCT GTCTAGTTTAAGACTTTATTGTCATAGTTTAGATCTATTTTGTTCAGTTTA AGACTTTATTGTCCGCCCACACCCGCTTACGC
92 AAGATGACGGTTTGTCACATGGAGTTGGCAGGATGTTTGATTAAAAACA
0 TAACAGGAAGAAAAATGCCCCGCTGTGGGCGGACAAAATAGTTGGGAA CTGGGAGGGGTGGAAATGGAGTTTTTAAGGATTATTTAGGGAAGAGTGA CAAAATAGATGGGAACTGGGTGTAGCGTCGTAAGCTAATACGAAAATTA AAAATGACAAAATAGTTTGGAACTAGATTTCACTTATCTGGTTCGGATCT CCTAGGCGATATCAGTGATCACGGATCTCGACCAATTGACATTATTGAA GCAACTAGTATCGATTTTATCAGGGTTATTGTCTCAGACCTGCAGGCAG CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCG TCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCA GAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTAGATCTGATATC GGCGCGCCCCTGGGCGCGCCCGAGTCCAACACCCGTGGGAATCCCAT GGGCACCATGGCCCCTCGCTCCAAAAATGCTTTCGCGTCGCGCAGACA CTGCTCGGTAGTTTCGGGGATCAGCGTTTGAGTAAGAGCCCGCGTCTG AACCCTCCGCGCCGCCCCGGCCCCAGTGGAAAGACGCGCAGGCAAAA CGCACCACGTGACGGAGCGTGACCGCGCGCCGAGCGCGCGCCAAGGT CGGGCAGGAAGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATA CGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATTTGACTGTAAACAC
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AAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGT AGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCG TAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGA CGAAACACCGCACCAGAGTAACAGTCTGACGTTTAAGAGCTATGCTGGA AACAGCATAGCAAGTTTAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAG TGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTGCGGCCGCGCTCGGCGCGCCCATA TTTGCATGTCGCTATGTGTTCTGGGAAATCACCATAAACGTGAAATGTCT TTGGATTTGGGAATCTTATAAGTTCTGTATGAGACCACGGTACACCGCA CCAGAGTAACAGTCTGACGTTTAAGAGCTATGCTGGAAACAGCATAGCA AGTTTAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGT CGGTGCTTTTTTTGCGGCCGCTGACGGCGCGCCCTGCAGTATTTAGCA TGCCCCACCCATCTGCAAGGCATTCTGGATAGTGTCAAAACAGCCGGA AATCAAGTCCGTTTATCTCAAACTTTAGCATTTTGGGAATAAATGATATTT GCTATGCTGGTTAAATTAGATTTTAGTTAAATTTCCTGCTGAAGCTCTAG TACGATAAGTAACTTGACCTAAGTGTAAAGTTGAGATTTCCTTCAGGTTT ATATAGCTTGTGCGCCGCCTGGGTACACCGCACCAGAGTAACAGTCTG ACGTTTAAGAGCTATGCTGGAAACAGCATAGCAAGTTTAAATAAGGCTA GTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTGCG GCCGCGCTGTTTAAACCAACAAAATCAGCAGCTAATGAAGGCAAGTCAG CAGGTCACTCATCATTTTCCACTTCGGCAATGCAGTGGGATTATTCCAA CAGAGGTTTTTCACAGCATTCCTTCAGTTAACTGGAGATCGAATCTTGAT TTTCACAGATATACTTGGCAAGGTCCGCCCTGTCATCAGCACATTCAAG CAGATCTCCATGGCAGCATTCCGTGTGGACTTAGGTAAGATCTGTCACT AACTTGGAAACTTCTGCAAACTCAGCTTAGGGAAATCTCTGGCTCAGGC GAGCTACTGCCTCAGCTTAGAAAGCTCTTTCTCCAAATTATTGGAGACT GGCACACTTAAGTCCCTGTTAGGCAGACGAAGCCTTCCCTTCATCCCGA AGTTCATCGAGCTTTGGCAACAGGCAGGCAGCTTTATCAGCAGCTTGG CAACATTCTGTAAAAGCAGCTTTATACCTTTAAGCAAAGAAAAGGAGTTC CGGGGCATAAAAGTAAGGATGTCTTCTGGCAATTTATAATAAGTATTTTT
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TCAAAAATGTCTCTTCATTGTCATGAAAAGCAGTGCATCACACATCAACC TCTGGTCTCACCAATCGGGGGAGGTTTGGGTTGTTTACTTAGTGTTGCA AGAATTATTTTATTCTCTCAGGTTCTTGTTTTGCACAGCAGTCAGCTCAT TCACCATAGGTTTCACGAAGAGTTGCTGCGGCCGCCTCGATAATACGAC TCACTATAGGGTCGACGATATCAGATCTAGGAACCCCTAGTGATGGAGT TGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGA CCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAG CGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGGCATGCAAGCTGTAGCCAACCA CTAGAACTATAGCTAGAGTCCTGGGCGAACAAACGATGCTCGCCTTCCA GAAAACCGAGGATGCGAACCACTTCATCCGGGGTCAGCACCACCGGCA AGCGCCGCGACGGCCGAGGTCTTCCGATCTCCTGAAGCCAGGGCAGA TCCGTGCACAGCACCTTGCCGTAGAAGAACAGCAAGGCCGCCAATGCC TGACGATGCGTGGAGACCGAAACCTTGCGCTCGTTCGCCAGCCAGGAC AGAAATGCCTCGACTTCGCTGCTGCCCAAGGTTGCCGGGTGACGCACA CCGTGGAAACGGATGAAGGCACGAACCCAGTTGACATAAGCCTGTTCG GTTCGTAAACTGTAATGCAAGTAGCGTATGCGCTCACGCAACTGGTCCA GAACCTTGACCGAACGCAGCGGTGGTAACGGCGCAGTGGCGGTTTTCA TGGCTTGTTATGACTGTTTTTTTGTACAGTCTATGCCTCGGGCATCCAAG CAGCAAGCGCGTTACGCCGTGGGTCGATGTTTGATGTTATGGAGCAGC AACGATGTTACGCAGCAGCAACGATGTTACGCAGCAGGGCAGTCGCCC TAAAACAAAGTTAGGTGGCTCAAGTATGGGCATCATTCGCACATGTAGG CTCGGCCCTGACCAAGTCAAATCCATGCGGGCTGCTCTTGATCTTTTCG GTCGTGAGTTCGGAGACGTAGCCACCTACTCCCAACATCAGCCGGACT CCGATTACCTCGGGAACTTGCTCCGTAGTAAGACATTCATCGCGCTTGC TGCCTTCGACCAAGAAGCGGTTGTTGGCGCTCTCGCGGCTTACGTTCT GCCCAAGTTTGAGCAGCCGCGTAGTGAGATCTATATCTATGATCTCGCA GTCTCCGGCGAGCACCGGAGGCAGGGCATTGCCACCGCGCTCATCAA TCTCCTCAAGCATGAGGCCAACGCGCTTGGTGCTTATGTGATCTACGTG CAAGCAGATTACGGTGACGATCCCGCAGTGGCTCTCTATACAAAGTTGG
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GCATACGGGAAGAAGTGATGCACTTTGATATCGACCCAAGTACCGCCA CCTAACAATTCGTTCAAGCCGAGATCGGCTTCCCGGCCGCGGAGTTGT TCGGTAAATTGTCACAACGCCGCGAATATAGTCTTTACCATGCCCTTGG CCACGCCCCTCTTTAATACGACGGGCAATTTGCACTTCAGAAAATGAAG AGTTTGCTTTAGCCATAACAAAAGTCCAGTATGCTI I I ICACAGCATAAC TGGACTGATTTCAGTTTACAACTATTCTGTCTAGTTTAAGACTTTATTGTC ATAGTTTAGATCTAI I I IGTTCAGTTTAAGACTTTATTGTCCGCCCACAC CCGCTTACGC
91 6 AAGATGACGGTTTGTCACATGGAGTTGGCAGGATGTTTGATTAAAAACA TAACAGGAAGAAAAATGCCCCGCTGTGGGCGGACAAAATAGTTGGGAA CTGGGAGGGGTGGAAATGGAGTTTTTAAGGATTATTTAGGGAAGAGTGA CAAAATAGATGGGAACTGGGTGTAGCGTCGTAAGCTAATACGAAAATTA AAAATGACAAAATAGTTTGGAACTAGATTTCACTTATCTGGTTCGGATCT CCTAGGCGATATCAGTGATCACGGATCTCGACCAATTGACATTATTGAA GCAACTAGTATCGATTTTATCAGGGTTATTGTCTCAGACCTGCAGGCAG CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCG TCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCA GAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTAGATCTGATATC GGCGCGCCCCTGGGCGCGCCCGAGTCCAACACCCGTGGGAATCCCAT GGGCACCATGGCCCCTCGCTCCAAAAATGCTTTCGCGTCGCGCAGACA CTGCTCGGTAGTTTCGGGGATCAGCGTTTGAGTAAGAGCCCGCGTCTG AACCCTCCGCGCCGCCCCGGCCCCAGTGGAAAGACGCGCAGGCAAAA CGCACCACGTGACGGAGCGTGACCGCGCGCCGAGCGCGCGCCAAGGT CGGGCAGGAAGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATA CGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATTTGACTGTAAACAC AAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGT AGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCG TAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGA
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CGAAACACCGCACCAGAGTAACAGTCTGAGGTTTAAGAGCTATGCTGG AAACAGCATAGCAAGTTTAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAA GTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTGCGGCCGCGCTCGGCGCGCCCAT ATTTGCATGTCGCTATGTGTTCTGGGAAATCACCATAAACGTGAAATGTC TTTGGATTTGGGAATCTTATAAGTTCTGTATGAGACCACGGTACACCGC ACCAGAGTAACAGTCTGAGGTTTAAGAGCTATGCTGGAAACAGCATAGC AAGTTTAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAG TCGGTGCTTTTTTTGCGGCCGCTGACGGCGCGCCCTGCAGTATTTAGC ATGCCCCACCCATCTGCAAGGCATTCTGGATAGTGTCAAAACAGCCGG AAATCAAGTCCGTTTATCTCAAACTTTAGCATTTTGGGAATAAATGATATT TGCTATGCTGGTTAAATTAGATTTTAGTTAAATTTCCTGCTGAAGCTCTA GTACGATAAGTAACTTGACCTAAGTGTAAAGTTGAGATTTCCTTCAGGTT TATATAGCTTGTGCGCCGCCTGGGTACACCGCACCAGAGTAACAGTCT GAGGTTTAAGAGCTATGCTGGAAACAGCATAGCAAGTTTAAATAAGGCT AGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTGC GGCCGCGCTGTTTAAACCAACAAAATCAGCAGCTAATGAAGGCAAGTCA GCAGGTCACTCATCATTTTCCACTTCGGCAATGCAGTGGGATTATTCCA ACAGAGGTTTTTCACAGCATTCCTTCAGTTAACTGGAGATCGAATCTTGA TTTTCACAGATATACTTGGCAAGGTCCGCCCTGTCATCAGCACATTCAA GCAGATCTCCATGGCAGCATTCCGTGTGGACTTAGGTAAGATCTGTCAC TAACTTGGAAACTTCTGCAAACTCAGCTTAGGGAAATCTCTGGCTCAGG CGAGCTACTGCCTCAGCTTAGAAAGCTCTTTCTCCAAATTATTGGAGAC TGGCACACTTAAGTCCCTGTTAGGCAGACGAAGCCTTCCCTTCATCCCG AAGTTCATCGAGCTTTGGCAACAGGCAGGCAGCTTTATCAGCAGCTTGG CAACATTCTGTAAAAGCAGCTTTATACCTTTAAGCAAAGAAAAGGAGTTC CGGGGCATAAAAGTAAGGATGTCTTCTGGCAATTTATAATAAGTATTTTT TCAAAAATGTCTCTTCATTGTCATGAAAAGCAGTGCATCACACATCAACC TCTGGTCTCACCAATCGGGGGAGGTTTGGGTTGTTTACTTAGTGTTGCA AGAATTATTTTATTCTCTCAGGTTCTTGTTTTGCACAGCAGTCAGCTCAT
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TCACCATAGGTTTCACGAAGAGTTGCTGCGGCCGCCTCGATAATACGAC TCACTATAGGGTCGACGATATCAGATCTAGGAACCCCTAGTGATGGAGT TGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGA CCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAG CGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGGCATGCAAGCTGTAGCCAACCA CTAGAACTATAGCTAGAGTCCTGGGCGAACAAACGATGCTCGCCTTCCA GAAAACCGAGGATGCGAACCACTTCATCCGGGGTCAGCACCACCGGCA AGCGCCGCGACGGCCGAGGTCTTCCGATCTCCTGAAGCCAGGGCAGA TCCGTGCACAGCACCTTGCCGTAGAAGAACAGCAAGGCCGCCAATGCC TGACGATGCGTGGAGACCGAAACCTTGCGCTCGTTCGCCAGCCAGGAC AGAAATGCCTCGACTTCGCTGCTGCCCAAGGTTGCCGGGTGACGCACA CCGTGGAAACGGATGAAGGCACGAACCCAGTTGACATAAGCCTGTTCG GTTCGTAAACTGTAATGCAAGTAGCGTATGCGCTCACGCAACTGGTCCA GAACCTTGACCGAACGCAGCGGTGGTAACGGCGCAGTGGCGGTTTTCA TGGCTTGTTATGACTGTTTTTTTGTACAGTCTATGCCTCGGGCATCCAAG CAGCAAGCGCGTTACGCCGTGGGTCGATGTTTGATGTTATGGAGCAGC AACGATGTTACGCAGCAGCAACGATGTTACGCAGCAGGGCAGTCGCCC TAAAACAAAGTTAGGTGGCTCAAGTATGGGCATCATTCGCACATGTAGG CTCGGCCCTGACCAAGTCAAATCCATGCGGGCTGCTCTTGATCTTTTCG GTCGTGAGTTCGGAGACGTAGCCACCTACTCCCAACATCAGCCGGACT CCGATTACCTCGGGAACTTGCTCCGTAGTAAGACATTCATCGCGCTTGC TGCCTTCGACCAAGAAGCGGTTGTTGGCGCTCTCGCGGCTTACGTTCT GCCCAAGTTTGAGCAGCCGCGTAGTGAGATCTATATCTATGATCTCGCA GTCTCCGGCGAGCACCGGAGGCAGGGCATTGCCACCGCGCTCATCAA TCTCCTCAAGCATGAGGCCAACGCGCTTGGTGCTTATGTGATCTACGTG CAAGCAGATTACGGTGACGATCCCGCAGTGGCTCTCTATACAAAGTTGG GCATACGGGAAGAAGTGATGCACTTTGATATCGACCCAAGTACCGCCA CCTAACAATTCGTTCAAGCCGAGATCGGCTTCCCGGCCGCGGAGTTGT TCGGTAAATTGTCACAACGCCGCGAATATAGTCTTTACCATGCCCTTGG
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CCACGCCCCTCTTTAATACGACGGGCAATTTGCACTTCAGAAAATGAAG AGTTTGCTTTAGCCATAACAAAAGTCCAGTATGCTI I I ICACAGCATAAC TGGACTGATTTCAGTTTACAACTATTCTGTCTAGTTTAAGACTTTATTGTC ATAGTTTAGATCTAI I I IGTTCAGTTTAAGACTTTATTGTCCGCCCACAC CCGCTTACGC
91 3 AAGATGACGGTTTGTCACATGGAGTTGGCAGGATGTTTGATTAAAAACA TAACAGGAAGAAAAATGCCCCGCTGTGGGCGGACAAAATAGTTGGGAA CTGGGAGGGGTGGAAATGGAGTTTTTAAGGATTATTTAGGGAAGAGTGA CAAAATAGATGGGAACTGGGTGTAGCGTCGTAAGCTAATACGAAAATTA AAAATGACAAAATAGTTTGGAACTAGATTTCACTTATCTGGTTCGGATCT CCTAGGCGATATCAGTGATCACGGATCTCGACCAATTGACATTATTGAA GCAACTAGTATCGATTTTATCAGGGTTATTGTCTCAGACCACTCCCTCTA TGCGCGCTCGCTCACTCACTCGGCCCTGGAGACCAAAGGTCTCCAGAC TGCCGGCCTCTGGCCGGCAGGGCCGAGTGAGTGAGCGAGCGCGCATA GAGGGAGTGGGTACCTCCATCATCTAGGTTTGCCAGATCTGATATCGG CGCGCCCCTGGGCGCGCCCGAGTCCAACACCCGTGGGAATCCCATGG GCACCATGGCCCCTCGCTCCAAAAATGCTTTCGCGTCGCGCAGACACT GCTCGGTAGTTTCGGGGATCAGCGTTTGAGTAAGAGCCCGCGTCTGAA CCCTCCGCGCCGCCCCGGCCCCAGTGGAAAGACGCGCAGGCAAAACG CACCACGTGACGGAGCGTGACCGCGCGCCGAGCGCGCGCCAAGGTCG GGCAGGAAGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACG ATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATTTGACTGTAAACACAA AGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAG TTTGCAG I I I IAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTA ACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACG AAACACCGCACTAGAGTAACAGTCTGACGTTTAAGAGCTATGCTGGAAA CAGCATAGCAAGTTTAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTG GCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTGCGGCCGCGCTTCGGCGCGCCCATAT
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TTGCATGTCGCTATGTGTTCTGGGAAATCACCATAAACGTGAAATGTCTT TGGATTTGGGAATCTTATAAGTTCTGTATGAGACCACGGTACACCGCAC TAGAGTAACAGTCTGACGTTTAAGAGCTATGCTGGAAACAGCATAGCAA GTTTAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTC GGTGCTTTTTTTGCGGCCGCTGACGGCGCGCCCTGCAGTATTTAGCAT GCCCCACCCATCTGCAAGGCATTCTGGATAGTGTCAAAACAGCCGGAA ATCAAGTCCGTTTATCTCAAACTTTAGCATTTTGGGAATAAATGATATTTG CTATGCTGGTTAAATTAGATTTTAGTTAAATTTCCTGCTGAAGCTCTAGT ACGATAAGTAACTTGACCTAAGTGTAAAGTTGAGATTTCCTTCAGGTTTA TATAGCTTGTGCGCCGCCTGGGTACACCGCACTAGAGTAACAGTCTGA CGTTTAAGAGCTATGCTGGAAACAGCATAGCAAGTTTAAATAAGGCTAG TCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTGCGG CCGCGCTGCGGCCGCCTCGAGTGATCAAAAAAACCAACACACGCTTCC AATGAAAATAAACGATCCTTTATTGCTAGCCTTTACTTGTACAGCTCGTC CATGCCGAGAGTGATCCCGGCGGCGGTCACGAACTCCAGCAGGACCA TGTGATCGCGCTTCTCGTTGGGGTCTTTGCTCAGGGCGGACTGGGTGC TCAGGTAGTGGTTGTCGGGCAGCAACACGGGGCCGTCGCCGATGGGG GTGTTCTGCTGGTAGTGGTCGGCGAGCTGCACGCTGCCGTCCTCGATG TTGTGGCGGATCTTGAAGTTCACCTTGATGCCGTTCTTCTGCTTGTCGG CCATGATATAGACGTTGTGGCTGTTGTAGTTGTACTCCAGCTTGTGCCC CAGGATGTTGCCGTCCTCCTTGAAGTCGATGCCCTTCAGCTCGATGCG GTTCACCAGGGTGTCGCCCTCGAACTTCACCTCGGCGCGGGTCTTGTA GTTGCCGTCGTCCTTGAAGAAGATGGTGCGCTCCTGGACGTAGCCTTC GGGCATGGCGGACTTGAAGAAGTCGTGCTGCTTCATGTGGTCGGGGTA GCGGCTGAAGCACTGCACGCCGTAGGTCAGGGTGGTCACGAGGGTGG GCCAGGGCACGGGCAGCTTGCCGGTGGTGCAGATGAACTTCAGGGTC AGCTTGCCGTAGGTGGCATCGCCCTCGCCCTCGCCGGACACGCTGAAC TTGTGGCCGTTTACGTCGCCGTCCAGCTCGACCAGGATGGGCACCACC CCGGTGAACAGCTCCTCGCCCTTGCTCACCATGGTGGCGACCGGTGGA
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TCCCGGGCCCGCGGGGTGGCTTTACCAACAGTACCCGGAATGCCAAG CTTACTTAGATCGCAGTCTCGACGCTGGCTGGCTCCTGAGTGTCTGTCT GTGCTGTGGAGGTGGTGGTAGAATGAGGGCAGCCCCTGTGCCCCTGG GTTATATAGAGGAGCCTACAGGGTGTGACTAGCCAGGAGGGGCTGTCC CCAGGGAGGGGCCCCTGAGAGCAGATGAGCTTTCAGCTCGTTGCCCG GGCACCGTGCCCACCCCGGACCCAGGCGTGCAGCTTGCCCAGCCCCA TGGCCTTGTATGGGCTGCCCCAAGGGCTGACTTGCTCACTGGTTCCTA AACTAAGTGCTGAGTCTAGCTGGCGGGGGACAGCTGGCCCTTCGCCG GGAACATGGCATGCAGGGTTATTTTTAGAGGCAGCAGGTGTTGGGGGG GGGGGGGCAGCCACATGTCTGGGTTAATTATAACCAGGCATCTCGGGT GTCCCCAGGCCTTGCCTCCTTACATGGGCACGTCGACGATATCAGATCT AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCT CGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTT GGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGG CATGCAAGCTGTAGCCAACCACTAGAACTATAGCTAGAGTCCTGGGCG AACAAACGATGCTCGCCTTCCAGAAAACCGAGGATGCGAACCACTTCAT CCGGGGTCAGCACCACCGGCAAGCGCCGCGACGGCCGAGGTCTTCCG ATCTCCTGAAGCCAGGGCAGATCCGTGCACAGCACCTTGCCGTAGAAG AACAGCAAGGCCGCCAATGCCTGACGATGCGTGGAGACCGAAACCTTG CGCTCGTTCGCCAGCCAGGACAGAAATGCCTCGACTTCGCTGCTGCCC AAGGTTGCCGGGTGACGCACACCGTGGAAACGGATGAAGGCACGAAC CCAGTTGACATAAGCCTGTTCGGTTCGTAAACTGTAATGCAAGTAGCGT ATGCGCTCACGCAACTGGTCCAGAACCTTGACCGAACGCAGCGGTGGT AACGGCGCAGTGGCGGTTTTCATGGCTTGTTATGACTGTTTTTTTGTAC AGTCTATGCCTCGGGCATCCAAGCAGCAAGCGCGTTACGCCGTGGGTC GATGTTTGATGTTATGGAGCAGCAACGATGTTACGCAGCAGCAACGATG TTACGCAGCAGGGCAGTCGCCCTAAAACAAAGTTAGGTGGCTCAAGTAT GGGCATCATTCGCACATGTAGGCTCGGCCCTGACCAAGTCAAATCCAT GCGGGCTGCTCTTGATCTTTTCGGTCGTGAGTTCGGAGACGTAGCCAC
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CTACTCCCAACATCAGCCGGACTCCGATTACCTCGGGAACTTGCTCCGT AGTAAGACATTCATCGCGCTTGCTGCCTTCGACCAAGAAGCGGTTGTTG GCGCTCTCGCGGCTTACGTTCTGCCCAAGTTTGAGCAGCCGCGTAGTG AGATCTATATCTATGATCTCGCAGTCTCCGGCGAGCACCGGAGGCAGG GCATTGCCACCGCGCTCATCAATCTCCTCAAGCATGAGGCCAACGCGC TTGGTGCTTATGTGATCTACGTGCAAGCAGATTACGGTGACGATCCCGC AGTGGCTCTCTATACAAAGTTGGGCATACGGGAAGAAGTGATGCACTTT GATATCGACCCAAGTACCGCCACCTAACAATTCGTTCAAGCCGAGATCG GCTTCCCGGCCGCGGAGTTGTTCGGTAAATTGTCACAACGCCGCGAAT ATAGTCTTTACCATGCCCTTGGCCACGCCCCTCTTTAATACGACGGGCA ATTTGCACTTCAGAAAATGAAGAGTTTGCTTTAGCCATAACAAAAGTCCA GTATGCTI I I ICACAGCATAACTGGACTGATTTCAGTTTACAACTATTCT GTCTAGTTTAAGACTTTATTGTCATAGTTTAGATCTATTTTGTTCAGTTTA AGACTTTATTGTCCGCCCACACCCGCTTACGC
92 1 AAGATGACGGTTTGTCACATGGAGTTGGCAGGATGTTTGATTAAAAACA TAACAGGAAGAAAAATGCCCCGCTGTGGGCGGACAAAATAGTTGGGAA CTGGGAGGGGTGGAAATGGAGTTTTTAAGGATTATTTAGGGAAGAGTGA CAAAATAGATGGGAACTGGGTGTAGCGTCGTAAGCTAATACGAAAATTA AAAATGACAAAATAGTTTGGAACTAGATTTCACTTATCTGGTTCGGATCT CCTAGGCGATATCAGTGATCACGGATCTCGACCAATTGACATTATTGAA GCAACTAGTATCGATTTTATCAGGGTTATTGTCTCAGACCACTCCCTCTA TGCGCGCTCGCTCACTCACTCGGCCCTGGAGACCAAAGGTCTCCAGAC TGCCGGCCTCTGGCCGGCAGGGCCGAGTGAGTGAGCGAGCGCGCATA GAGGGAGTGGGTACCTCCATCATCTAGGTTTGCCAGATCTGATATCGG CGCGCCCCTGGGCGCGCCCGAGTCCAACACCCGTGGGAATCCCATGG GCACCATGGCCCCTCGCTCCAAAAATGCTTTCGCGTCGCGCAGACACT GCTCGGTAGTTTCGGGGATCAGCGTTTGAGTAAGAGCCCGCGTCTGAA
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CCCTCCGCGCCGCCCCGGCCCCAGTGGAAAGACGCGCAGGCAAAACG CACCACGTGACGGAGCGTGACCGCGCGCCGAGCGCGCGCCAAGGTCG GGCAGGAAGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACG ATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATTTGACTGTAAACACAA AGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAG TTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTA ACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACG AAACACCGCACCAGAGTAACAGTCTGACGTTTAAGAGCTATGCTGGAAA CAGCATAGCAAGTTTAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTG GCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTGCGGCCGCGCTCGGCGCGCCCATATT TGCATGTCGCTATGTGTTCTGGGAAATCACCATAAACGTGAAATGTCTTT GGATTTGGGAATCTTATAAGTTCTGTATGAGACCACGGTACACCGCACC AGAGTAACAGTCTGACGTTTAAGAGCTATGCTGGAAACAGCATAGCAAG TTTAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCG GTGCTTTTTTTGCGGCCGCTGACGGCGCGCCCTGCAGTATTTAGCATG CCCCACCCATCTGCAAGGCATTCTGGATAGTGTCAAAACAGCCGGAAAT CAAGTCCGTTTATCTCAAACTTTAGCATTTTGGGAATAAATGATATTTGC TATGCTGGTTAAATTAGATTTTAGTTAAATTTCCTGCTGAAGCTCTAGTA CGATAAGTAACTTGACCTAAGTGTAAAGTTGAGATTTCCTTCAGGTTTAT ATAGCTTGTGCGCCGCCTGGGTACACCGCACCAGAGTAACAGTCTGAC GTTTAAGAGCTATGCTGGAAACAGCATAGCAAGTTTAAATAAGGCTAGT CCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTGCGGC CGCGCTGTTTAAACCAACAAAATCAGCAGCTAATGAAGGCAAGTCAGCA GGTCACTCATCATTTTCCACTTCGGCAATGCAGTGGGATTATTCCAACA GAGGTTTTTCACAGCATTCCTTCAGTTAACTGGAGATCGAATCTTGATTT TCACAGATATACTTGGCAAGGTCCGCCCTGTCATCAGCACATTCAAGCA GATCTCCATGGCAGCATTCCGTGTGGACTTAGGTAAGATCTGTCACTAA CTTGGAAACTTCTGCAAACTCAGCTTAGGGAAATCTCTGGCTCAGGCGA GCTACTGCCTCAGCTTAGAAAGCTCTTTCTCCAAATTATTGGAGACTGG
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CACACTTAAGTCCCTGTTAGGCAGACGAAGCCTTCCCTTCATCCCGAAG TTCATCGAGCTTTGGCAACAGGCAGGCAGCTTTATCAGCAGCTTGGCAA CATTCTGTAAAAGCAGCTTTATACCTTTAAGCAAAGAAAAGGAGTTCCG GGGCATAAAAGTAAGGATGTCTTCTGGCAATTTATAATAAGTATTTTTTC AAAAATGTCTCTTCATTGTCATGAAAAGCAGTGCATCACACATCAACCTC TGGTCTCACCAATCGGGGGAGGTTTGGGTTGTTTACTTAGTGTTGCAAG AATTATTTTATTCTCTCAGGTTCTTGTTTTGCACAGCAGTCAGCTCATTCA CCATAGGTTTCACGAAGAGTTGCTGCGGCCGCCTCGATAATACGACTCA CTATAGGGTCGACGATATCAGATCTAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGG CCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAA AGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAG CGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCATGCAAGCTGTAGCCAACCACTAG AACTATAGCTAGAGTCCTGGGCGAACAAACGATGCTCGCCTTCCAGAAA ACCGAGGATGCGAACCACTTCATCCGGGGTCAGCACCACCGGCAAGC GCCGCGACGGCCGAGGTCTTCCGATCTCCTGAAGCCAGGGCAGATCC GTGCACAGCACCTTGCCGTAGAAGAACAGCAAGGCCGCCAATGCCTGA CGATGCGTGGAGACCGAAACCTTGCGCTCGTTCGCCAGCCAGGACAGA AATGCCTCGACTTCGCTGCTGCCCAAGGTTGCCGGGTGACGCACACCG TGGAAACGGATGAAGGCACGAACCCAGTTGACATAAGCCTGTTCGGTT CGTAAACTGTAATGCAAGTAGCGTATGCGCTCACGCAACTGGTCCAGAA CCTTGACCGAACGCAGCGGTGGTAACGGCGCAGTGGCGGTTTTCATGG CTTGTTATGACTGTTTTTTTGTACAGTCTATGCCTCGGGCATCCAAGCAG CAAGCGCGTTACGCCGTGGGTCGATGTTTGATGTTATGGAGCAGCAAC GATGTTACGCAGCAGCAACGATGTTACGCAGCAGGGCAGTCGCCCTAA AACAAAGTTAGGTGGCTCAAGTATGGGCATCATTCGCACATGTAGGCTC GGCCCTGACCAAGTCAAATCCATGCGGGCTGCTCTTGATCTTTTCGGTC GTGAGTTCGGAGACGTAGCCACCTACTCCCAACATCAGCCGGACTCCG ATTACCTCGGGAACTTGCTCCGTAGTAAGACATTCATCGCGCTTGCTGC CTTCGACCAAGAAGCGGTTGTTGGCGCTCTCGCGGCTTACGTTCTGCC
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CAAGTTTGAGCAGCCGCGTAGTGAGATCTATATCTATGATCTCGCAGTC TCCGGCGAGCACCGGAGGCAGGGCATTGCCACCGCGCTCATCAATCTC CTCAAGCATGAGGCCAACGCGCTTGGTGCTTATGTGATCTACGTGCAA GCAGATTACGGTGACGATCCCGCAGTGGCTCTCTATACAAAGTTGGGC ATACGGGAAGAAGTGATGCACTTTGATATCGACCCAAGTACCGCCACCT AACAATTCGTTCAAGCCGAGATCGGCTTCCCGGCCGCGGAGTTGTTCG GTAAATTGTCACAACGCCGCGAATATAGTCTTTACCATGCCCTTGGCCA CGCCCCTCTTTAATACGACGGGCAATTTGCACTTCAGAAAATGAAGAGT TTGCTTTAGCCATAACAAAAGTCCAGTATGCI I I ITCACAGCATAACTGG ACTGATTTCAGTTTACAACTATTCTGTCTAGTTTAAGACTTTATTGTCATA GTTTAGATCTATTTTGTTCAGTTTAAGACTTTATTGTCCGCCCACACCCG CTTACGC
91 7 AAGATGACGGTTTGTCACATGGAGTTGGCAGGATGTTTGATTAAAAACA TAACAGGAAGAAAAATGCCCCGCTGTGGGCGGACAAAATAGTTGGGAA CTGGGAGGGGTGGAAATGGAGTTTTTAAGGATTATTTAGGGAAGAGTGA CAAAATAGATGGGAACTGGGTGTAGCGTCGTAAGCTAATACGAAAATTA AAAATGACAAAATAGTTTGGAACTAGATTTCACTTATCTGGTTCGGATCT CCTAGGCGATATCAGTGATCACGGATCTCGACCAATTGACATTATTGAA GCAACTAGTATCGATTTTATCAGGGTTATTGTCTCAGACCACTCCCTCTA TGCGCGCTCGCTCACTCACTCGGCCCTGGAGACCAAAGGTCTCCAGAC TGCCGGCCTCTGGCCGGCAGGGCCGAGTGAGTGAGCGAGCGCGCATA GAGGGAGTGGGTACCTCCATCATCTAGGTTTGCCAGATCTGATATCGG CGCGCCCCTGGGCGCGCCCGAGTCCAACACCCGTGGGAATCCCATGG GCACCATGGCCCCTCGCTCCAAAAATGCTTTCGCGTCGCGCAGACACT GCTCGGTAGTTTCGGGGATCAGCGTTTGAGTAAGAGCCCGCGTCTGAA CCCTCCGCGCCGCCCCGGCCCCAGTGGAAAGACGCGCAGGCAAAACG CACCACGTGACGGAGCGTGACCGCGCGCCGAGCGCGCGCCAAGGTCG GGCAGGAAGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACG
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ATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATTTGACTGTAAACACAA AGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAG TTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTA ACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACG AAACACCGCACCAGAGTAACAGTCTGAGGTTTAAGAGCTATGCTGGAAA CAGCATAGCAAGTTTAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTG GCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTGCGGCCGCGCTCGGCGCGCCCATATT TGCATGTCGCTATGTGTTCTGGGAAATCACCATAAACGTGAAATGTCTTT GGATTTGGGAATCTTATAAGTTCTGTATGAGACCACGGTACACCGCACC AGAGTAACAGTCTGAGGTTTAAGAGCTATGCTGGAAACAGCATAGCAAG TTTAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCG GTGCTTTTTTTGCGGCCGCTGACGGCGCGCCCTGCAGTATTTAGCATG CCCCACCCATCTGCAAGGCATTCTGGATAGTGTCAAAACAGCCGGAAAT CAAGTCCGTTTATCTCAAACTTTAGCATTTTGGGAATAAATGATATTTGC TATGCTGGTTAAATTAGATTTTAGTTAAATTTCCTGCTGAAGCTCTAGTA CGATAAGTAACTTGACCTAAGTGTAAAGTTGAGATTTCCTTCAGGTTTAT ATAGCTTGTGCGCCGCCTGGGTACACCGCACCAGAGTAACAGTCTGAG GTTTAAGAGCTATGCTGGAAACAGCATAGCAAGTTTAAATAAGGCTAGT CCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTGCGGC CGCGCTGTTTAAACCAACAAAATCAGCAGCTAATGAAGGCAAGTCAGCA GGTCACTCATCATTTTCCACTTCGGCAATGCAGTGGGATTATTCCAACA GAGGTTTTTCACAGCATTCCTTCAGTTAACTGGAGATCGAATCTTGATTT TCACAGATATACTTGGCAAGGTCCGCCCTGTCATCAGCACATTCAAGCA GATCTCCATGGCAGCATTCCGTGTGGACTTAGGTAAGATCTGTCACTAA CTTGGAAACTTCTGCAAACTCAGCTTAGGGAAATCTCTGGCTCAGGCGA GCTACTGCCTCAGCTTAGAAAGCTCTTTCTCCAAATTATTGGAGACTGG CACACTTAAGTCCCTGTTAGGCAGACGAAGCCTTCCCTTCATCCCGAAG TTCATCGAGCTTTGGCAACAGGCAGGCAGCTTTATCAGCAGCTTGGCAA CATTCTGTAAAAGCAGCTTTATACCTTTAAGCAAAGAAAAGGAGTTCCG
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GGGCATAAAAGTAAGGATGTCTTCTGGCAATTTATAATAAGTATTTTTTC AAAAATGTCTCTTCATTGTCATGAAAAGCAGTGCATCACACATCAACCTC TGGTCTCACCAATCGGGGGAGGTTTGGGTTGTTTACTTAGTGTTGCAAG AATTATTTTATTCTCTCAGGTTCTTGTTTTGCACAGCAGTCAGCTCATTCA CCATAGGTTTCACGAAGAGTTGCTGCGGCCGCCTCGATAATACGACTCA CTATAGGGTCGACGATATCAGATCTAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGG CCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAA AGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAG CGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCATGCAAGCTGTAGCCAACCACTAG AACTATAGCTAGAGTCCTGGGCGAACAAACGATGCTCGCCTTCCAGAAA ACCGAGGATGCGAACCACTTCATCCGGGGTCAGCACCACCGGCAAGC GCCGCGACGGCCGAGGTCTTCCGATCTCCTGAAGCCAGGGCAGATCC GTGCACAGCACCTTGCCGTAGAAGAACAGCAAGGCCGCCAATGCCTGA CGATGCGTGGAGACCGAAACCTTGCGCTCGTTCGCCAGCCAGGACAGA AATGCCTCGACTTCGCTGCTGCCCAAGGTTGCCGGGTGACGCACACCG TGGAAACGGATGAAGGCACGAACCCAGTTGACATAAGCCTGTTCGGTT CGTAAACTGTAATGCAAGTAGCGTATGCGCTCACGCAACTGGTCCAGAA CCTTGACCGAACGCAGCGGTGGTAACGGCGCAGTGGCGGTTTTCATGG CTTGTTATGACTGTTTTTTTGTACAGTCTATGCCTCGGGCATCCAAGCAG CAAGCGCGTTACGCCGTGGGTCGATGTTTGATGTTATGGAGCAGCAAC GATGTTACGCAGCAGCAACGATGTTACGCAGCAGGGCAGTCGCCCTAA AACAAAGTTAGGTGGCTCAAGTATGGGCATCATTCGCACATGTAGGCTC GGCCCTGACCAAGTCAAATCCATGCGGGCTGCTCTTGATCTTTTCGGTC GTGAGTTCGGAGACGTAGCCACCTACTCCCAACATCAGCCGGACTCCG ATTACCTCGGGAACTTGCTCCGTAGTAAGACATTCATCGCGCTTGCTGC CTTCGACCAAGAAGCGGTTGTTGGCGCTCTCGCGGCTTACGTTCTGCC CAAGTTTGAGCAGCCGCGTAGTGAGATCTATATCTATGATCTCGCAGTC TCCGGCGAGCACCGGAGGCAGGGCATTGCCACCGCGCTCATCAATCTC CTCAAGCATGAGGCCAACGCGCTTGGTGCTTATGTGATCTACGTGCAA
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GCAGATTACGGTGACGATCCCGCAGTGGCTCTCTATACAAAGTTGGGC ATACGGGAAGAAGTGATGCACTTTGATATCGACCCAAGTACCGCCACCT AACAATTCGTTCAAGCCGAGATCGGCTTCCCGGCCGCGGAGTTGTTCG GTAAATTGTCACAACGCCGCGAATATAGTCTTTACCATGCCCTTGGCCA CGCCCCTCTTTAATACGACGGGCAATTTGCACTTCAGAAAATGAAGAGT TTGCTTTAGCCATAACAAAAGTCCAGTATGC1 1 1 1TCACAGCATAACTGG ACTGATTTCAGTTTACAACTATTCTGTCTAGTTTAAGACTTTATTGTCATA GTTTAGATCTATTTTGTTCAGTTTAAGACTTTATTGTCCGCCCACACCCG CTTACGC
[0259] Em algumas modalidades das construções para edição gênica da divulgação, que incluem as modalidades que abrangem as SEQ ID NOs: 910 to 921, a construção compreende ou consiste de um primeiro promotor, uma primeira sequência que codifica um gRNA, um segundo promotor e uma segunda sequência que codifica um gRNA, um terceiro promotor e uma terceira sequência que codifica um gRNA. Exemplos de sequências que codificam gRNAs da divulgação são SEQ ID NO. 383-705, 709-711, 715-717, 790-862, 864. Em algumas modalidades, a sequência que codifica o gRNA é CACTAGAGTAACAGTCTGAC (SEQ ID NO. 708). Em algumas modalidades, a sequência que codifica o gRNA é CACCAGAGTAACAGTCTGAG (SEQ ID NO. 714). Em algumas modalidades, a sequência que codifica o gRNA é CACCAGAGTAACAGTCTGAG (SEQ ID NO. 863). Em algumas modalidades, a construção compreende, de 5’ a 3’, um primeiro promotor, a sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO. 708, um segundo promotor, uma segunda sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO. 708, um terceiro promotor e uma terceira sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO. 708. Em algumas modalidades, a construção compreende, de 5’ a 3’, um primeiro promotor, a sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO. 714, um segundo promotor, uma segunda sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO. 714, um
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188/259 terceiro promotor e uma terceira sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO. 714. Em algumas modalidades, a construção compreende, de 5’ a 3’, um primeiro promotor, a sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO. 863, um segundo promotor, uma segunda sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO. 863, um terceiro promotor e uma terceira sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO. 863. Exemplos de promotores da divulgação incluem o promotor U6 que possui uma sequência de
CGAGTCCAACACCCGTGGGAATCCCATGGGCACCATGGCCCCTCGCTCCAAAA ATGCTTTCGCGTCGCGCAGACACTGCTCGGTAGTTTCGGGGATCAGCGTTTGA GTAAGAGCCCGCGTCTGAACCCTCCGCGCCGCCCCGGCCCCAGTGGAAAGAC GCGCAGGCAAAACGCACCACGTGACGGAGCGTGACCGCGCGCCGAGCGCGC GCCAAGGTCGGGCAGGAAGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCAT ATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATTTGACTGTAAACACAA AGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGC AGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGT ATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAA (SEQ ID NO: 922), o promotor H1 que possui uma sequência de GCTCGGCGCGCCCATATTTGCATGTCGCTATGTGTTCTGGGAAATCACCATAAA CGTGAAATGTCTTTGGATTTGGGAATCTTATAAGTTCTGTATGAGACCACGGTA (SEQ ID. No923) e o promotor 7SK que possui uma sequência de TGACGGCGCGCCCTGCAGTATTTAGCATGCCCCACCCATCTGCAAGGCATTCT GGATAGTGTCAAAACAGCCGGAAATCAAGTCCGTTTATCTCAAACTTTAGCATTT TGGGAATAAATGATATTTGCTATGCTGGTTAAATTAGATTTTAGTTAAATTTCCTG CTGAAGCTCTAGTACGATAAGTAACTTGACCTAAGTGTAAAGTTGAGATTTCCTT CAGGTTTATATAGCTTGTGCGCCGCCTGGGTA (SEQ ID NO. 924). Em algumas modalidades, o primeiro, o segundo e o terceiro promotores são cada um individualmente selecionados do promotor U6 (SEQ ID NO: 922), do promotor H1 (SEQ ID NO: 923) e do promotor 7SK (SEQ ID NO: 924). Em algumas modalidades, o primeiro, o segundo e o terceiro promotores são cada um individualmente
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189/259 selecionados do promotor U6 (SEQ ID NO: 922) e do promotor H1 (SEQ ID NO: 923). Em algumas modalidades, a construção compreende, de 5’ a 3’, um promotor U6, uma primeira sequência que codifica um gRNA, um promotor H1, uma segunda sequência que codifica um gRNA, um promotor 7SK e uma terceira sequência que codifica um gRNA. Em algumas modalidades, a construção compreende, de 5’ a 3’, o promotor U6, a sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 708, o promotor H1, uma segunda sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 708, o promotor 7SK e uma terceira sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 708. Em algumas modalidades, a construção compreende, de 5’ a 3’, o promotor U6, a sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 714, o promotor H1, uma segunda sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 714, o promotor 7SK e uma terceira sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 714. Em algumas modalidades, a construção compreende, de 5’ a 3’, o promotor U6, a sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 863, o promotor H1, uma segunda sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 863, o promotor 7SK e uma terceira sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 863. Em algumas modalidades, a construção que compreende um primeiro promotor, uma primeira sequência que codifica um gRNA, um segundo promotor e uma segunda sequência que codifica um gRNA, um terceiro promotor e uma terceira sequência que codifica um gRNA compreende ainda pelo menos duas sequências de repetição terminal invertida (ITR). Em algumas modalidades, a construção que compreende um primeiro promotor, uma primeira sequência que codifica um gRNA, um segundo promotor e uma segunda sequência que codifica um gRNA, um terceiro promotor e uma terceira sequência que codifica um gRNA compreende ainda pelo menos duas sequências de ITR isolada ou derivada de um AAV do sorotipo 2 (AAV2). Em algumas modalidades, a construção que compreende um primeiro promotor, uma primeira sequência que codifica um gRNA, um segundo promotor e uma segunda sequência que codifica um gRNA, um terceiro promotor e uma terceira sequência que codifica um gRNA compreende ainda pelo menos duas sequências de ITR, em que a primeira sequência de ITR é isolada ou derivada de um AAV do sorotipo 4 (AAV4) e
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190/259 a segunda sequência de ITR é isolada ou derivada de um AAV do sorotipo 2 (AAV2). Exemplos de sequências de ITR são
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCC CGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCG CAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT (SEQ ID NO: 881), CCACTCCCTCTATGCGCGCTCGCTCACTCACTCGGCCCTGGAGACCAAAGGTC TCCAGACTGCCGGCCTCTGGCCGGCAGGGCCGAGTGAGTGAGCGAGCGCGCA TAGAGGGAGTGGGTACCTCCATCATCTAGGTTTGCC (SEQ ID NO. 883), AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTC ACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCG GCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGG (SEQ ID NO. 946) e AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTC ACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCG GCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG (SEQ ID 882). Em algumas modalidades, a construção compreende ou consiste, de 5’ a 3’, de uma primeira ITR, um primeiro promotor, uma primeira sequência que codifica um gRNA, um segundo promotor e uma segunda sequência que codifica um gRNA, um terceiro promotor, uma terceira sequência que codifica um gRNA e uma segunda ITR. Em algumas modalidades, a construção compreende ou consiste, de 5’ a 3’, de uma primeira ITR, um promotor U6, uma primeira sequência que codifica um gRNA, um promotor H1 e uma segunda sequência que codifica um gRNA, um promotor 7SK, uma terceira sequência que codifica um gRNA e uma segunda ITR. Em algumas modalidades, a construção compreende ou consiste, de 5’ a 3’, de uma primeira ITR, um primeiro promotor, a sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 708, um segundo promotor e a sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 708, um terceiro promotor, a sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 708 e uma segunda ITR. Em algumas modalidades, a construção compreende ou consiste, de 5’ a 3’, de uma primeira ITR, um primeiro promotor, a sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 714, um segundo promotor e a sequência que codifica um gRNA da
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SEQ ID NO: 714, um terceiro promotor, a sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 714 e uma segunda ITR. Em algumas modalidades, a construção compreende ou consiste, de 5’ a 3’, de uma primeira ITR, um primeiro promotor, a sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 863, um segundo promotor e a sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 863, um terceiro promotor, a sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO.: 863 e uma segunda ITR. Em algumas modalidades, a construção compreende ou consiste, de 5’ a 3’, de uma primeira ITR, um U6, a sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 708, um promotor H1 e a sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 708, um promotor 7SK, a sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 708 e uma segunda ITR. Em algumas modalidades, a construção compreende ou consiste, de 5’ a 3’, de uma primeira ITR, a U6, a sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 714, um promotor H1 e a sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 714, um promotor 7SK, a sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 714 e uma segunda ITR. Em algumas modalidades, a construção que compreende de 5’ a 3’ uma primeira ITR, um primeiro promotor, uma primeira sequência que codifica um gRNA, um segundo promotor e uma segunda sequência que codifica um gRNA, um terceiro promotor, uma terceira sequência que codifica um gRNA e uma segunda ITR, compreende ainda uma sequência de poli A. Em algumas modalidades, a sequência de poliA compreende ou consiste de uma sequência de minipoliA. Exemplos de sequências de minipoliA da divulgação compreendem ou consistem de uma sequência de nucleotídeos de TAGCAATAAAGGATCGTTTATTTTCATTGGAAGCGTGTGTTGGTTTTTTGATCAG GCGCG (SEQ ID NO: 903). Em algumas modalidades, a construção compreende ou consiste, de 5’ a 3’, de uma primeira ITR, um primeiro promotor, uma primeira sequência que codifica um gRNA, um segundo promotor e uma segunda sequência que codifica um gRNA, um terceiro promotor, uma terceira sequência que codifica um gRNA, uma sequência de minipoliA e uma segunda ITR. Em algumas modalidades, a construção compreende ou consiste de 5’ a 3’ de uma primeira ITR, o promotor U6, uma primeira sequência que codifica um gRNA, o promotor H1, uma segunda
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192/259 sequência que codifica um gRNA, o promotor 7SK, uma terceira sequência que codifica um gRNA, uma sequência de minipoliA e uma segunda ITR. Em algumas modalidades, a construção compreende ou consiste de 5’ a 3’ de uma primeira ITR, um primeiro promotor, a sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 708, um segundo promotor, a sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 708, um terceiro promotor, a sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 708, uma sequência de minipoliA e uma segunda ITR. Em algumas modalidades, a construção compreende ou consiste de 5’ a 3’ de uma primeira ITR, um primeiro promotor, a sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 714, um segundo promotor, a sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO. 714, um terceiro promotor, a sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 714, uma sequência de minipoliA e uma segunda ITR. Em algumas modalidades, a construção compreende ou consiste de 5’ a 3’ de uma primeira ITR, um primeiro promotor, a sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 863, um segundo promotor, a sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 863, um terceiro promotor, a sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 863, uma sequência de minipoliA e uma segunda ITR. Em algumas modalidades, a construção compreende ou consiste de 5’ a 3’ de uma primeira ITR, o promotor U6, a sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 708, o promotor H1, a sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 708, o promotor 7SK, a sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 708, uma sequência de minipoliA e uma segunda ITR. Em algumas modalidades, a construção compreende ou consiste de 5’ a 3’ de uma primeira ITR, o promotor U6, a sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 714, o promotor H1, a sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 714, o promotor 7SK, a sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 714, uma sequência de minipoliA e uma segunda ITR. Em algumas modalidades, a construção que compreende de 5’ a 3’ uma primeira ITR, um primeiro promotor, uma primeira sequência que codifica um gRNA, um segundo promotor e uma segunda sequência que codifica um gRNA, um terceiro promotor, uma terceira sequência que codifica um gRNA, uma sequência de minipoliA e uma segunda ITR compreende ainda repetições
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193/259 invertidas de elementos que podem sofrer transposição. Exemplos de repetições invertidas de elementos que podem sofrer transposição da divulgação compreendem ou consistem de uma sequência de nucleotídeos de TGTGGGCGGACAAAATAGTTGGGAACTGGGAGGGGTGGAAATGGAGTTTTTAA GGATTATTTAGGGAAGAGTGACAAAATAGATGGGAACTGGGTGTAGCGTCGTAA GCTAATACGAAAATTAAAAATGACAAAATAGTTTGGAACTAGATTTCACTTATCT GGTT (SEQ ID NO: 907) e/ou uma sequência de nucleotídeos de GAATATAGTCTTTACCATGCCCTTGGCCACGCCCCTCTTTAATACGACGGGCAA TTTGCACTTCAGAAAATGAAGAGTTTGCTTTAGCCATAACAAAAGTCCAGTATGC TTTTTCACAGCATAACTGGACTGATTTCAGTTTACAACTATTCTGTCTAGTTTAAG ACTTTATTGTCATAGTTTAGATCTATTTTGTTCAGTTTAAGACTTTATTGTCCGCC CACA (SEQ ID NO: 908). Em algumas modalidades, a construção compreende ou consiste, de 5’ a 3’, de uma primeira repetição invertida de elemento que pode sofrer transposição, uma primeira ITR, um primeiro promotor, uma primeira sequência que codifica um gRNA, um segundo promotor, uma segunda sequência que codifica um gRNA, um terceiro promotor, uma terceira sequência que codifica um gRNA, uma sequência de minipoliA, uma segunda ITR e uma segunda repetição invertida de elemento que pode sofrer transposição. Em algumas modalidades, a construção compreende ou consiste, de 5’ a 3’, de uma primeira repetição invertida de elemento que pode sofrer transposição, uma primeira ITR, o promotor U6, uma primeira sequência que codifica um gRNA, o promotor H1, uma segunda sequência que codifica um gRNA, o promotor 7SK, uma terceira sequência que codifica um gRNA, uma sequência de minipoliA, uma segunda ITR e uma segunda repetição invertida de elemento que pode sofrer transposição. Em algumas modalidades, a construção compreende ou consiste, de 5’ a 3’, de uma primeira repetição invertida de elemento que pode sofrer transposição, uma primeira ITR, um primeiro promotor, a sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 708, um segundo promotor, a sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 708, um terceiro promotor, a sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 708, uma sequência de minipoliA, uma segunda ITR e uma
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194/259 segunda repetição invertida de elemento que pode sofrer transposição. Em algumas modalidades, a construção compreende ou consiste, de 5’ a 3’, de uma primeira repetição invertida de elemento que pode sofrer transposição, uma primeira ITR, um primeiro promotor, a sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 714, um segundo promotor, a sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 714, um terceiro promotor, a sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 714, uma sequência de minipoliA, uma segunda ITR e uma segunda repetição invertida de elemento que pode sofrer transposição. Em algumas modalidades, a construção compreende ou consiste, de 5’ a 3’, de uma primeira repetição invertida de elemento que pode sofrer transposição, uma primeira ITR, um primeiro promotor, a sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 863, um segundo promotor, a sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 863, um terceiro promotor, a sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 863, uma sequência de minipoliA, uma segunda ITR e uma segunda repetição invertida de elemento que pode sofrer transposição. Em algumas modalidades, a construção compreende ou consiste, de 5’ a 3’, de uma primeira repetição invertida de elemento que pode sofrer transposição, uma primeira ITR, o promotor U6, a sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 708, o promotor H1, a sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 708, o promotor 7SK, a sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 708, uma sequência de minipoliA, uma segunda ITR e uma segunda repetição invertida de elemento que pode sofrer transposição. Em algumas modalidades, a construção compreende ou consiste, de 5’ a 3’, de uma primeira repetição invertida de elemento que pode sofrer transposição, uma primeira ITR, o promotor U6, a sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 714, o promotor H1, a sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 714, o promotor 7SK, a sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 714, uma sequência de minipoliA, uma segunda ITR e uma segunda repetição invertida de elemento que pode sofrer transposição. Em algumas modalidades, a construção que compreende uma primeira repetição invertida de elemento que pode sofrer transposição, uma primeira ITR, um primeiro promotor, uma primeira sequência que
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195/259 codifica um gRNA, um segundo promotor, uma segunda sequência que codifica um gRNA, um terceiro promotor, uma terceira sequência que codifica um gRNA, uma sequência de minipoliA, uma segunda ITR, uma segunda repetição invertida de elemento que pode sofrer transposição, compreende ainda uma sequência reguladora. Exemplos de sequências reguladoras da divulgação compreendem ou consistem de uma sequência de nucleotídeos de CATGCAAGCTGTAGCCAACCACTAGAACTATAGCTAGAGTCCTGGGCGAACAAA CGATGCTCGCCTTCCAGAAAACCGAGGATGCGAACCACTTCATCCGGGGTCAG CACCACCGGCAAGCGCCGCGACGGCCGAGGTCTTCCGATCTCCTGAAGCCAG GGCAGATCCGTGCACAGCACCTTGCCGTAGAAGAACAGCAAGGCCGCCAATGC CTGACGATGCGTGGAGACCGAAACCTTGCGCTCGTTCGCCAGCCAGGACAGAA ATGCCTCGACTTCGCTGCTGCCCAAGGTTGCCGGGTGACGCACACCGTGGAAA CGGATGAAGGCACGAACCCAGTTGACATAAGCCTGTTCGGTTCGTAAACTGTAA TGCAAGTAGCGTATGCGCTCACGCAACTGGTCCAGAACCTTGACCGAACGCAG CGGTGGTAACGGCGCAGTGGCGGTTTTCATGGCTTGTTATGACTGTTTTTTTGT ACAGTCTATGCCTCGGGCATCCAAGCAGCAAGCGCGTTACGCCGTGGGTCGAT GTTTGATGTTATGGAGCAGCAACGATGTTACGCAGCAGCAACGATGTTACGCAG CAGGGCAGTCGCCCTAAAACAAAGTTAGGTGGCTCAAGTATGGGCATCATTCG CACATGTAGGCTCGGCCCTGACCAAGTCAAATCCATGCGGGCTGCTCTTGATC TTTTCGGTCGTGAGTTCGGAGACGTAGCCACCTACTCCCAACATCAGCCGGAC TCCGATTACCTCGGGAACTTGCTCCGTAGTAAGACATTCATCGCGCTTGCTGCC TTCGACCAAGAAGCGGTTGTTGGCGCTCTCGCGGCTTACGTTCTGCCCAAGTTT GAGCAGCCGCGTAGTGAGATCTATATCTATGATCTCGCAGTCTCCGGCGAGCA CCGGAGGCAGGGCATTGCCACCGCGCTCATCAATCTCCTCAAGCATGAGGCCA ACGCGCTTGGTGCTTATGTGATCTACGTGCAAGCAGATTACGGTGACGATCCC GCAGTGGCTCTCTATACAAAGTTGGGCATACGGGAAGAAGTGATGCACTTTGAT ATCGACCCAAGTACCGCCACCTAACAATTCGTTCAAGCCGAGATCGGCTTCCC GGCCGCGGAGTTGTTCGGTAAATTGTCACAACGCCG (SEQ ID NO: 909). Em algumas modalidades, a construção compreende ou consiste de 5’ a 3’ de uma
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196/259 primeira repetição invertida de elemento que pode sofrer transposição, uma primeira ITR, um primeiro promotor, uma primeira sequência que codifica um gRNA, um segundo promotor, uma segunda sequência que codifica um gRNA, um terceiro promotor, uma terceira sequência que codifica um gRNA, uma sequência de minipoliA, uma segunda ITR, uma sequência reguladora e uma segunda repetição invertida de elemento que pode sofrer transposição. Em algumas modalidades, a construção compreende ou consiste de 5’ a 3’ de uma primeira repetição invertida de elemento que pode sofrer transposição, uma primeira ITR, o promotor U6, uma primeira sequência que codifica um gRNA, o promotor H1, uma segunda sequência que codifica um gRNA, o promotor 7SK, uma terceira sequência que codifica um gRNA, uma sequência de minipoliA, uma segunda ITR, uma sequência reguladora e uma segunda repetição invertida de elemento que pode sofrer transposição. Em algumas modalidades, a construção compreende ou consiste de 5’ a 3’ de uma primeira repetição invertida de elemento que pode sofrer transposição, uma primeira ITR, um primeiro promotor, a sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 708, um segundo promotor, a sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 708, um terceiro promotor, a sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 708, uma sequência de minipoliA, uma segunda ITR, uma sequência reguladora e uma segunda repetição invertida de elemento que pode sofrer transposição. Em algumas modalidades, a construção compreende ou consiste de 5’ a 3’ de uma primeira repetição invertida de elemento que pode sofrer transposição, uma primeira ITR, um primeiro promotor, a sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 714, um segundo promotor, a sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 714, um terceiro promotor, a sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 714, uma sequência de minipoliA, uma segunda ITR, uma sequência reguladora e uma segunda repetição invertida de elemento que pode sofrer transposição. Em algumas modalidades, a construção compreende ou consiste de 5’ a 3’ de uma primeira repetição invertida de elemento que pode sofrer transposição, uma primeira ITR, um primeiro promotor, a sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 863, um
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197/259 segundo promotor, a sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 863, um terceiro promotor, a sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 863, uma sequência de minipoliA, uma segunda ITR, uma sequência reguladora e uma segunda repetição invertida de elemento que pode sofrer transposição. Em algumas modalidades, a construção compreende ou consiste de 5’ a 3’ de uma primeira repetição invertida de elemento que pode sofrer transposição, uma primeira ITR, o promotor U6, a sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 708, o promotor H1, a sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO. 708, o promotor 7SK, a sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 708, uma sequência de minipoliA, uma segunda ITR, uma sequência reguladora e uma segunda repetição invertida de elemento que pode sofrer transposição. Em algumas modalidades, a construção compreende ou consiste de 5’ a 3’ de uma primeira repetição invertida de elemento que pode sofrer transposição, uma primeira ITR, o promotor U6, uma sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 714, o promotor H1, uma sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 714, o promotor 7SK, uma sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 714, uma sequência de minipoliA, uma segunda ITR, uma sequência reguladora e uma segunda repetição invertida de elemento que pode sofrer transposição. Em algumas modalidades, a construção que compreende uma primeira ITR, um primeiro promotor, uma primeira sequência que codifica um gRNA, um segundo promotor e uma segunda sequência que codifica um gRNA, um terceiro promotor, uma terceira sequência que codifica um gRNA, uma sequência de minipoliA e uma segunda ITR, compreende ainda uma sequência stuffer. Em algumas modalidades, a construção compreende ou consiste de 5’ a 3’ de uma primeira ITR, o promotor U6, uma primeira sequência que codifica um gRNA, o promotor H1, uma segunda sequência que codifica um gRNA, o promotor 7SK, uma terceira sequência que codifica um gRNA, uma sequência stuffer, uma sequência de minipoliA e uma segunda ITR. Em algumas modalidades, a construção compreende ou consiste de 5’ a 3’ de uma primeira ITR, um primeiro promotor, a sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 708, um segundo promotor, a sequência que codifica um gRNA da
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SEQ ID NO: 708, um terceiro promotor, a sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 708, uma sequência stuffer uma sequência de minipoliA e uma segunda ITR. Em algumas modalidades, a construção compreende ou consiste de 5’ a 3’ de uma primeira ITR, um primeiro promotor, a sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 714, um segundo promotor, a sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 714, um terceiro promotor, a sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO. 714, uma sequência stuffer, uma sequência de minipoliA e uma segunda ITR. Em algumas modalidades, a construção compreende ou consiste de 5’ a 3’ de uma primeira ITR, um primeiro promotor, a sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 863, um segundo promotor, a sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 863, um terceiro promotor, a sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 863, uma sequência stuffer, uma sequência de minipoliA e uma segunda ITR. Em algumas modalidades, a construção compreende ou consiste de 5’ a 3’ de uma primeira ITR, o promotor U6, a sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 708, o promotor H1, a sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 708, o promotor 7SK, a sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 708, uma sequência stuffer, uma sequência de minipoliA e uma segunda ITR. Em algumas modalidades, a construção compreende ou consiste de 5’ a 3’ de uma primeira ITR, o promotor U6, a sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 714, o promotor H1, a sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 714, o promotor 7SK, a sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 714, uma sequência stuffer, uma sequência de minipoliA e uma segunda ITR Em algumas modalidades, a construção compreende ou consiste de 5’ a 3’ de uma primeira repetição invertida de elemento que pode sofrer transposição, uma primeira ITR, um primeiro promotor, uma primeira sequência que codifica um gRNA, um segundo promotor, uma segunda sequência que codifica um gRNA, um terceiro promotor, uma terceira sequência que codifica um gRNA, uma sequência stuffer, uma sequência de minipoliA, uma segunda ITR, uma sequência reguladora e uma segunda repetição invertida de elemento que pode sofrer transposição. Em algumas modalidades, a construção compreende ou consiste de 5’ a 3’ de uma
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199/259 primeira repetição invertida de elemento que pode sofrer transposição, uma primeira ITR, o promotor U6, uma primeira sequência que codifica um gRNA, o promotor H1, uma segunda sequência que codifica um gRNA, o promotor 7SK, uma terceira sequência que codifica um gRNA, uma sequência stuffer, uma sequência de minipoliA, uma segunda ITR, uma sequência reguladora e uma segunda repetição invertida de elemento que pode sofrer transposição. Em algumas modalidades, a construção compreende ou consiste de 5’ a 3’ de uma primeira repetição invertida de elemento que pode sofrer transposição, uma primeira ITR, um primeiro promotor, a sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 708, um segundo promotor, a sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 708, um terceiro promotor, a sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 708, uma sequência stuffer, uma sequência de minipoliA, uma segunda ITR, uma sequência reguladora e uma segunda repetição invertida de elemento que pode sofrer transposição. Em algumas modalidades, a construção compreende ou consiste de 5’ a 3’ de uma primeira repetição invertida de elemento que pode sofrer transposição, uma primeira ITR, um primeiro promotor, a sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 714, um segundo promotor, a sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 714, um terceiro promotor, a sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 714, uma sequência stuffer, uma sequência de minipoliA, uma segunda ITR, uma sequência reguladora e uma segunda repetição invertida de elemento que pode sofrer transposição. Em algumas modalidades, a construção compreende ou consiste de 5’ a 3’ de uma primeira repetição invertida de elemento que pode sofrer transposição, uma primeira ITR, um primeiro promotor, a sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 863, um segundo promotor, a sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 863, um terceiro promotor, a sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 863, uma sequência stuffer, uma sequência de minipoliA, uma segunda ITR, uma sequência reguladora e uma segunda repetição invertida de elemento que pode sofrer transposição. Em algumas modalidades, a construção compreende ou consiste de 5’ a 3’ de uma primeira repetição invertida de elemento que pode sofrer transposição,
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200/259 uma primeira ITR, o promotor U6, a sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 708, o promotor H1, a sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 708, o promotor 7SK, a sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 708, uma sequência stutter, uma sequência de minipoliA, uma segunda ITR, uma sequência reguladora e uma segunda repetição invertida de elemento que pode sofrer transposição. Em algumas modalidades, a construção compreende ou consiste de 5’ a 3’ de uma primeira repetição invertida de elemento que pode sofrer transposição, uma primeira ITR, o promotor U6, uma sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 714, o promotor H1, uma sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 714, o promotor 7SK, uma sequência que codifica um gRNA da SEQ ID NO: 714, uma sequência stutter, uma sequência de minipoliA, uma segunda ITR, uma sequência reguladora e uma segunda repetição invertida de elemento que pode sofrer transposição. Em algumas modalidades, a construção pode compreender ainda uma ou mais sequências espaçadoras. Exemplos de sequências espaçadoras da divulgação possuem comprimento de 1-1500 nucleotídeos, inclusive todas as faixas intermediárias. Em algumas modalidades, as sequências espaçadoras podem estar localizadas em uma posição que fica a 5’ ou a 3’ de uma ITR, um promotor, uma sequência que codifica um gRNA, uma sequência poliA, uma repetição invertida de elemento que pode sofrer transposição, uma sequência stutter e/ou um elemento regulador.
V. Composições Farmacêuticas e Métodos de Fornecimento [0260] Para aplicações clínicas, as composições farmacêuticas são preparadas em uma forma apropriada para a aplicação pretendida. Geralmente, isto requer a preparação de composições que são essencialmente livres de agentes pirogênicos, bem como outras impurezas que poderíam ser prejudiciais aos seres humanos ou aos animais.
[0261 ] Sais e tampões apropriados são utilizados para tornar fármacos, proteínas ou vetores de fornecimento estáveis e permitir a captação pelas células alvos. Composições aquosas da presente divulgação compreendem uma quantidade
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201/259 eficiente do fármaco, do vetor ou das proteínas, dissolvida ou dispersa em um carreador farmaceuticamente aceitável ou meio aquoso. A expressão “farmaceuticamente ou farmacologicamente aceitável” refere-se a entidades moleculares e composições que não produzem reações adversas, alérgicas ou outras desagradáveis quando administradas a um animal ou um ser humano. Como utilizado aqui, “carreador farmaceuticamente aceitável” inclui solventes, tampões, soluções, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e de retardo da absorção e similares aceitáveis para uso na formulação de produtos farmacêuticos, tais como, produtos farmacêuticos adequados para administração a seres humanos. O uso destes meios e agentes para substâncias farmaceuticamente ativas é bem conhecido na técnica. Pode ser feito uso de qualquer meio ou agente convencional que não seja incompatível com os ingredientes ativos da presente divulgação em composições terapêuticas. Ingredientes ativos suplementares também podem ser incorporados nas composições, contanto que não inativem os vetores ou as células das composições.
[0262] Em algumas modalidades, as composições ativas da presente divulgação podem incluir preparações farmacêuticas clássicas. A administração destas composições de acordo com a presente divulgação pode ocorrer através de qualquer rota comum contanto que o tecido alvo esteja disponível através desta rota, mas geralmente incluindo administração sistêmica. Esta inclui oral, nasal ou bucal. Alternativamente, a administração pode ocorrer através de injeção intradérmica, subcutânea, intramuscular, intraperitoneal ou intravenosa ou através de injeção direta no tecido muscular. Tais composições seriam normalmente administradas na forma de composições farmaceuticamente aceitáveis, como descrito supra.
[0263] Os compostos ativos também podem ser administrados de forma parenteral ou intraperitoneal. Com a finalidade de ilustração, soluções dos compostos ativos na forma de base livre ou sais farmacologicamente aceitáveis podem ser preparadas em água adequadamente misturada com um tensoativo, tal como hidroxipropilcelulose. Dispersões também podem ser preparadas em glicerol,
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202/259 polietileno glicóis líquidos e misturas dos mesmos e em óleos. Sob condições comuns de armazenamento e uso, estas preparações geralmente contêm um conservante para prevenir o crescimento de micro-organismos.
[0264] As formas farmacêuticas adequadas para uso injetável incluem, por exemplo, soluções ou dispersões aquosas esterilizadas e pós esterilizados para preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis esterilizadas. Geralmente, estas preparações são esterilizadas e fluidas até a extensão de que possam ser facilmente injetadas. As preparações devem ser estáveis sob as condições de manufatura e armazenamento e devem ser conservadas contra a ação de contaminação de micro-organismos, tais como bactérias e fungos. Os solventes ou os meios de dispersão apropriados podem conter, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol e polietileno glicol líquido e similares, suas misturas adequadas e óleos vegetais. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, através do uso de um revestimento, tal como lecitina, através da manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersão e através do uso de tensoativos. A prevenção da ação de micro-organismos pode ser obtida através de vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal e similares. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares ou cloreto de sódio. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser causada pelo uso nas composições de agentes que retardam a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.
[0265] As soluções injetáveis esterilizadas podem ser preparadas através da incorporação dos compostos ativos em uma quantidade apropriada em um solvente junto com quaisquer outros ingredientes (por exemplo, como enumerado acima) quando desejado, seguida por esterilização por filtração. Geralmente, as dispersões são preparadas através da incorporação dos vários ingredientes ativos esterilizados em um veículo esterilizado que contém o meio de dispersão básico e os outros ingredientes desejados, por exemplo, como enumerado acima. No caso de pós
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203/259 esterilizados para a preparação de soluções injetáveis esterilizadas, os métodos de preparação preferidos incluem técnicas de secagem a vácuo e de secagem por congelamento que produzem um pó do(s) ingrediente(s) ativo(s) mais qualquer ingrediente desejado adicional partindo de uma solução previamente esterilizada por filtração do mesmo.
[0266] Em algumas modalidades, as composições da presente divulgação são formuladas em uma forma neutra ou de sal. Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem, por exemplo, sais de adição de ácido (formados com os grupos amino livres da proteína) derivados de ácidos inorgânicos (por exemplo, ácidos clorídricos ou fosfóricos) ou de ácidos orgânicos (por exemplo, acético, oxálico, tartárico, mandélico e similares). Os sais formados com os grupos carboxila livres da proteína também podem ser derivados de bases inorgânicas (por exemplo, hidróxidos de sódio, potássio, amônio, cálcio ou férrico) ou de bases orgânicas (por exemplo, isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína) e similares.
[0267] Após a formulação, as soluções são preferencialmente administradas de uma maneira compatível com a formulação de dosagem e em tal quantidade que seja terapeuticamente eficiente. As formulações podem ser facilmente administradas em uma variedade de formas de dosagem tais como soluções injetáveis, cápsulas de liberação de fármaco e similares. Para administração parenteral em uma solução aquosa, por exemplo, a solução geralmente é adequadamente tamponada e o diluente líquido é primeiramente tornado isotônico, por exemplo, com solução salina ou glicose suficiente. Tais soluções aquosas podem ser utilizadas, por exemplo, para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea e intraperitoneal. Preferivelmente, são empregados meios aquosos esterilizados que são conhecidos pelos peritos na técnica, particularmente à luz da presente divulgação. Com a finalidade de ilustração, uma dose única pode ser dissolvida em 1 mL de solução de NaCI isotônica e adicionada a 1000 mL de fluido de hipodermóclise ou injetada no local de infusão proposto, (ver, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences 15th Edition, páginas 1035-1038 e 1570Petição 870190085920, de 02/09/2019, pág. 208/285
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1580). Necessariamente irá ocorrer alguma variação na dosagem dependendo da condição que será tratada do indivíduo. A pessoa responsável pela administração irá, em qualquer evento, determinar a dose apropriada para o indivíduo. Além disso, para administração a um ser humano, as preparações devem satisfazer padrões de esterilidade, pirogenicidade, segurança geral e pureza que são requeridos pelo FDA Office of Biologies Standards.
[0268] Em algumas modalidades, a Cas9 ou a Cpf1 e os gRNAs descritos aqui podem ser fornecidos ao paciente utilizando transferência adotiva de células (ACT). Na transferência adotiva de células, uma ou mais construções de expressão são fornecidas ex vivo às células que foram produzidas pelo paciente (autólogas) ou por um ou mais indivíduo(s) sem ser o paciente (alogenéticas). As células são subsequentemente introduzidas ou reintroduzidas no paciente. Assim, em algumas modalidades, um ou mais ácidos nucleicos que codificam Cas9 ou Cpf 1 e um RNA guia que se direciona para um sítio de splice da distrofina são fornecidos a uma célula ex vivo antes da célula ser introduzida ou reintroduzida em um paciente.
[0269] As tabelas a seguir fornecem exemplos de iniciador e sequências de direcionamento genômico para uso em associação com as composições e os métodos divulgados aqui.
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TABELA 6 - Sequências Genômicas Alvos
Éxon de gRNA direcionado Guia # Filamento Sequência Genômica Alvo* PAM SEQ ID NO.
Éxon 51 Humano 4 1 tctttttcttcttttttccttttt tttt 60
Éxon 51 Humano 5 1 ctttttcttcttttttcctttttG tttt 61
Éxon 51 Humano 6 1 tttttcttcttttttcctttttGC tttc 62
Éxon 51 Humano 7 1 t ctt ctttttt c cttttt G CA A A A tttt 63
Éxon 51 Humano 8 1 ctt ctttttt ccttttt G CA A A A A tttt 64
Éxon 51 Humano 9 1 ttcttttttcctttttGCAAAAAC tttc 65
Éxon 51 Humano 10 1 ttcctttttG C AA AAACCC AA AAT tttt 66
Éxon 51 Humano 11 1 tcctttttGCAAAAACCCAAAAT A tttt 67
Éxon 51 Humano 12 1 cctttttGCAA AAACCC AA AAT AT tttt 68
Éxon 51 Humano 13 1 ctttttGCAA AAACCC AA AAT ATT tttc 69
Éxon 51 Humano 14 1 tGCAAAAACCCAAAATA I I I IAGC tttt 70
Éxon 51 Humano 15 1 GCAAAAACCCAAAATAI I I IAGCT tttt 71
Éxon 51 Humano 16 1 CAAAAACCCAAAATAI I I IAGCTC tttG 72
Éxon 51 Humano 17 1 AGCTCCTACTCAGACTGTTACTCT I I I I 73
Éxon 51 Humano 18 1 GCTCCTACTCAGACTGTTACTCTG TTTA 74
Éxon 51 Humano 19 -1 CTTAGTAACCACAGGTTGTGTCAC TTTC 75
Éxon 51 Humano 20 -1 GAGATGGCAGTTTCCTTAGTAACC TTTG 76
Éxon 51 Humano 21 -1 TAGTTTGGAGATGGCAGTTTCCTT TTTC 77
Éxon 51 Humano 22 -1 TTCTCATACCTTCTGCTTGATGAT I I I I 78
Éxon 51 Humano 23 -1 TCATI I I I ICI CA I ACC I ICIGCI TTTA 79
Éxon 51 Humano 24 -1 ATCAI I I I I ICI CA I ACC I ICIGC I I I I 80
Éxon 51 Humano 25 -1 AAGAAAAACTTCTGCCAACTTTTA TTTA 81
Éxon 51 Humano 26 -1 AAAGAAAAACTTCTGCCAACI I I I I I I I 82
Éxon 51 Humano 27 1 TCTTTAAAATGAAGATTTTCCACC I I I I 83
Éxon 51 Humano 28 1 CI I IAAAAIGAAGAI I I ICCACCA I I I I 84
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Éxon 51 Humano 29 1 TTTAAAATGAAGAI I I ICCACCAA TTTC 85
Éxon 51 Humano 30 1 AAATGAAGAI I I ICCACCAAICAC TTTA 86
Éxon 51 Humano 31 1 CCACCAATCACTTTACTCTCCTAG I I I I 87
Éxon 51 Humano 32 1 CACCAATCACTTTACTCTCCTAGA TTTC 88
Éxon 51 Humano 33 1 CTCTCCTAGACCATTTCCCACCAG TTTA 89
Éxon 45 Humano 1 -1 agaaaagattaaacagtgtgctac tttg 90
Éxon 45 Humano 2 -1 tttq agaaaag attaaacagtgtg TTTa 91
Éxon 45 Humano 3 -1 atttgagaaaagattaaacagtgt I I I I 92
Éxon 45 Humano 4 -1 T atttgagaaaagattaaacagtg I I I I 93
Éxon 45 Humano 5 1 atcttttctcaaatAAAAAGACAT ttta 94
Éxon 45 Humano 6 1 ctcaaat AA AAAG AC AT G G G G CTT tttt 95
Éxon 45 Humano 7 1 tcaaatAAAAAGACATGGGGCTTC tttc 96
Éxon 45 Humano 8 1 TG I I I IGCCI I I I IGG IAICI I AC I I I I 97
Éxon 45 Humano 9 1 GTTTTGCCTTTTTGGTATCTTACA I I I I 98
Éxon 45 Humano 10 1 I I I I GCC I I I I I GG IAICI IACAG TTTG 99
Éxon 45 Humano 11 1 GCCTTTTTGGTATCTTACAGGAAC I I I I 100
Éxon 45 Humano 12 1 CCI I I I I GG IAICI IACAGGAACI TTTG 101
Éxon 45 Humano 13 1 TGGTATCTTACAGGAACTCCAGGA I I I I 102
Éxon 45 Humano 14 1 GGTATCTTACAGGAACTCCAGGAT I I I I 103
Éxon 45 Humano 15 -1 AGGATTGCTGAATTATTTCTTCCC TTTG 104
Éxon 45 Humano 16 -1 GAGGATTGCTGAATTATTTCTTCC I I I I 105
Éxon 45 Humano 17 -1 TGAGGATTGCTGAATTATTTCTTC I I I I 106
Éxon 45 Humano 18 -1 CTGTAGAATACTGGCATCTGTTTT TTTC 107
Éxon 45 Humano 19 -1 CCTGTAGAATACTGGCATCTGTTT I I I I 108
Éxon 45 Humano 20 -1 TCCTGTAGAATACTGGCATCTGTT I I I I 109
Éxon 45 Humano 21 -1 CAGACCTCCTGCCACCGCAGATTC TTTG 110
Éxon 45 Humano 22 -1 TGTCTGACAGCTGTTTGCAGACCT TTTC 111
Éxon 45 Humano 23 -1 CTGTCTGACAGCTGTTTGCAGACC I I I I 112
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Éxon 45 Humano 24 -1 TCTGTCTGACAGCTGTTTGCAGAC I I I I 113
Éxon 45 Humano 25 -1 TTCTGTCTGACAGCTGTTTGCAGA I I I I 114
Éxon 45 Humano 26 -1 ATTCCTATTAGATCTGTCGCCCTA TTTC 115
Éxon 45 Humano 27 -1 CATTCCTATTAGATCTGTCGCCCT I I I I 116
Éxon 45 Humano 28 1 AGCAGACTTTTTAAGCTTTCTTTA I I I I 117
Éxon 45 Humano 29 1 GCAGACTI I I IAAGCI I ICI I I AG TTTA 118
Éxon 45 Humano 30 1 TAAGCTTTCTTTAGAAGAATATTT I I I I 119
Éxon 45 Humano 31 1 AAGCTTTCTTTAGAAGAATATTTC I I I I 120
Éxon 45 Humano 32 1 AGCTTTCTTTAGAAGAATATTTCA TTTA 121
Éxon 45 Humano 33 1 TTTAGAAGAATATTTCATGAGAGA TTTC 122
Éxon 45 Humano 34 1 GAAGAATATTTCATGAGAGATTAT TTTA 123
Éxon 44 Humano 1 1 TCAGTATAACCAAAAAATATACGC TTTG 124
Éxon 44 Humano 2 1 acataatccatctatttttcttg a tttt 125
Éxon 44 Humano 3 1 cataatccatctatttttcttgat ttta 126
Éxon 44 Humano 4 1 tcttgatccatatgcttttACCT G tttt 127
Éxon 44 Humano 5 1 cttg atccatatg ctttt ACCT G C tttt 128
Éxon 44 Humano 6 1 ttq atccatatg ctttt ACCT G CA tttc 129
Éxon 44 Humano 7 -1 TCAACAGATCTGTCAAATCGCCTG TTTC 130
Éxon 44 Humano 8 1 ACCTGCAGGCGATTTGACAGATCT tttt 131
Éxon 44 Humano 9 1 CCTGCAGGCGATTTGACAGATCTG tttA 132
Éxon 44 Humano 10 1 ACAGATCTGTTGAGAAATGGCGGC TTTG 133
Éxon 44 Humano 11 -1 TATCATAATGAAAACGCCGCCATT TTTA 134
Éxon 44 Humano 12 1 CATTATGATATAAAGATATTTAAT I I I I 135
Éxon 44 Humano 13 -1 TATTTAGCATGTTCCCAATTCTCA TTTG 136
Éxon 44 Humano 14 -1 GAAAAAACAAATCAAAGACTTACC TTTC 137
Éxon 44 Humano 15 1 ATTTGTI I I I ICGAAAI IGIAI I I TTTG 138
Éxon 44 Humano 16 1 I I I I I I CGAAAIIGIAIIIAICII TTTG 139
Éxon 44 Humano 17 1 TTCGAAATTGTATTTATCTTCAGC I I I I 140
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Éxon 44 Humano 18 1 TCGAAATTGTATTTATCTTCAGCA I I I I 141
Éxon 44 Humano 19 1 CGAAATTGTATTTATCTTCAGCAC I I I I 142
Éxon 44 Humano 20 1 GAAATTGTATTTATCTTCAGCACA TTTC 143
Éxon 44 Humano 21 -1 AGAAGTTAAAGAGTCCAGATGTGC TTTA 144
Éxon 44 Humano 22 1 TCTTCAGCACATCTGGACTCTTTA TTTA 145
Éxon 44 Humano 23 -1 CATCACCCTTCAGAACCTGATCTT TTTC 146
Éxon 44 Humano 24 1 ACTTCTTAAAGATCAGGTTCTGAA TTTA 147
Éxon 44 Humano 25 1 GACTGTTGTTGTCATCATTATATT I I I I 148
Éxon 44 Humano 26 1 ACTGTTGTTGTCATCATTATATTA TTTG 149
Éxon 53 Humano 1 -1 AACTAGAATAAAAGGAAAAATAAA TTTC 150
Éxon 53 Humano 2 1 CTACTATATATTTATI I I I CO I I I TTTA 151
Éxon 53 Humano 3 1 I I I I I CO I I I IAI ICI AG I IGAAA TTTA 152
Éxon 53 Humano 4 1 TCCTTTTATTCTAGTTGAAAGAAT I I I I 153
Éxon 53 Humano 5 1 CCI I I IAI ICI AG I IGAAAGAAI I I I I I 154
Éxon 53 Humano 6 1 CI I I IAI ICI AG I IGAAAGAAI IC TTTC 155
Éxon 53 Humano 7 1 ATTCTAGTTGAAAGAATTCAGAAT I I I I 156
Éxon 53 Humano 8 1 TTCTAGTTGAAAGAATTCAGAATC TTTA 157
Éxon 53 Humano 9 -1 ATTCAACTGTTGCCTCCGGTTCTG TTTC 158
Éxon 53 Humano 10 -1 ACATTTCATTCAACTGTTGCCTCC TTTA 159
Éxon 53 Humano 11 -1 CI I I IGGAI I GCA ICI AC IG IAIA I I I I 160
Éxon 53 Humano 12 -1 TGTGAI I I ICI I I I GGA I I GCA IC TTTC 161
Éxon 53 Humano 13 -1 ATACTAACCTTGGTTTCTGTGATT TTTG 162
Éxon 53 Humano 14 -1 AAAAGGTATCTTTGATACTAACCT TTTA 163
Éxon 53 Humano 15 -1 AAAAAGGTATCTTTGATACTAACC I I I I 164
Éxon 53 Humano 16 -1 I I I IAAAAAGGIAICI I I GA I AC I TTTA 165
Éxon 53 Humano 17 -1 AI I I IAAAAAGGIAICI I I GA I AC I I I I 166
Éxon 46 Humano 1 -1 TTAATGCAAACTGGGACACAAACA TTTG 167
Éxon 46 Humano 2 1 TAAATTGCCATGTTTGTGTCCCAG I I I I 168
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Éxon 46 Humano 3 1 AAATTGCCATGTTTGTGTCCCAGT llll 169
Éxon 46 Humano 4 1 AATTGCCATGTTTGTGTCCCAGTT TTTA 170
Éxon 46 Humano 5 1 TGTCCCAGTTTGCATTAACAAATA TTTG 171
Éxon 46 Humano 6 -1 CAACATAGTTCTCAAACTATTTGT tttc 172
Éxon 46 Humano 7 -1 CCAACATAGTTCTCAAACTATTTG tttt 173
Éxon 46 Humano 8 -1 tCCAACATAGTTCTCAAACTATTT tttt 174
Éxon 46 Humano 9 -1 tttCCAACATAGTTCTCAAACTAT tttt 175
Éxon 46 Humano 10 -1 ttttCCAACATAGTTCTCAAACTA tttt 176
Éxon 46 Humano 11 -1 tttttCCAACATAGTTCTCAAACT tttt 177
Éxon 46 Humano 12 1 CATTAACAAATAGTTTGAGAACTA TTTG 178
Éxon 46 Humano 13 1 AG AACT AT GTTGGaaaaaaaaaT A TTTG 179
Éxon 46 Humano 14 -1 GTTCTTCTAGCCTGGAGAAAGAAG llll 180
Éxon 46 Humano 15 1 ATTCTTCTTTCTCCAGGCTAGAAG llll 181
Éxon 46 Humano 16 1 TTCTTCTTTCTCCAGGCTAGAAGA TTTA 182
Éxon 46 Humano 17 1 TCCAGGCTAGAAGAACAAAAGAAT TTTC 183
Éxon 46 Humano 18 -1 AAATTCTGACAAGATATTCTTTTG TTTG 184
Éxon 46 Humano 19 -1 CI I I I AG I IGCIGCICI I I ICCAG llll 185
Éxon 46 Humano 20 -1 AGAAAATAAAATTACCTTGACTTG TTTG 186
Éxon 46 Humano 21 -1 TGCAAGCAGGCCCTGGGGGATTTG TTTA 187
Éxon 46 Humano 22 1 AI I I ICICAAAICCCCCAGGGCCI llll 188
Éxon 46 Humano 23 1 I I I ICI CAAA I CCCCCAGGGCC IG TTTA 189
Éxon 46 Humano 24 1 CTCAAATCCCCCAGGGCCTGCTTG llll 190
Éxon 46 Humano 25 1 TCAAATCCCCCAGGGCCTGCTTGC TTTC 191
Éxon 46 Humano 26 1 TTAATTCAATCATTGG I I I ICIGC llll 192
Éxon 46 Humano 27 1 TAATTCAATCATTGGTTTTCTGCC llll 193
Éxon 46 Humano 28 1 AATTCAATCATTGG I I I ICIGCCC llll 194
Éxon 46 Humano 29 1 ATTCAATCATTGGTTTTCTGCCCA TTTA 195
Éxon 46 Humano 30 -1 GCAAGGAACTATGAATAACCTAAT TTTA 196
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Éxon 46 Humano 31 1 CTGCCCATTAGGTTATTCATAGTT I I I I 197
Éxon 46 Humano 32 1 TGCCCATTAGGTTATTCATAGTTC TTTC 198
Éxon 52 Humano 1 -1 TAGAAAACAATTTAACAGGAAATA TTTA 199
Éxon 52 Humano 2 1 CTGTTAAATTGTTTTCTATAAACC TTTC 200
Éxon 52 Humano 3 -1 GAAATAAAAAAGATGTTACTGTAT TTTA 201
Éxon 52 Humano 4 -1 AGAAATAAAAAAGATGTTACTGTA I I I I 202
Éxon 52 Humano 5 1 CTATAAACCCTTATACAGTAACAT I I I I 203
Éxon 52 Humano 6 1 TATAAACCCTTATACAGTAACATC TTTC 204
Éxon 52 Humano 7 1 TTATTTCTAAAAGTG I I I IGGCIG I I I I 205
Éxon 52 Humano 8 1 TATTTCTAAAAGTGTTTTGGCTGG I I I I 206
Éxon 52 Humano 9 1 ATTTCTAAAAGTG I I I IGGCIGG I I I I I 207
Éxon 52 Humano 10 1 TTTCTAAAAGTGTTTTGGCTGGTC TTTA 208
Éxon 52 Humano 11 1 TAAAAGTGI I I IGGCIGG ICICAC TTTC 209
Éxon 52 Humano 12 -1 CATAATACAAAGTAAAGTACAATT TTTA 210
Éxon 52 Humano 13 -1 ACATAATACAAAGTAAAGTACAAT I I I I 211
Éxon 52 Humano 14 1 GGCTGGTCTCACAATTGTACTTTA I I I I 212
Éxon 52 Humano 15 1 GCTGGTCTCACAATTGTACTTTAC TTTG 213
Éxon 52 Humano 16 1 CIIIGIAIIAIGIAAAAGGAAI AC TTTA 214
Éxon 52 Humano 17 1 TATTATGTAAAAGGAATACACAAC TTTG 215
Éxon 52 Humano 18 1 TTCTTACAGGCAACAATGCAGGAT TTTG 216
Éxon 52 Humano 19 1 GAACAGAGGCGTCCCCAGTTGGAA TTTG 217
Éxon 52 Humano 20 -1 GGCAGCGGTAATGAGTTCTTCCAA TTTG 218
Éxon 52 Humano 21 -1 TCAAATTTTGGGCAGCGGTAATGA I I I I 219
Éxon 52 Humano 22 1 AAAAACAAGACCAGCAATCAAGAG TTTG 220
Éxon 52 Humano 23 -1 TGTGTCCCATGCTTGTTAAAAAAC TTTG 221
Éxon 52 Humano 24 1 TTAACAAGCATGGGACACACAAAG I I I I 222
Éxon 52 Humano 25 1 TAACAAGCATGGGACACACAAAGC I I I I 223
Éxon 52 Humano 26 1 AACAAGCATGGGACACACAAAGCA I I I I 224
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Éxon 52 Humano 27 1 ACAAGCATGGGACACACAAAGCAA TTTA 225
Éxon 52 Humano 28 -1 TTGAAACTTGTCATGCATCTTGCT TTTA 226
Éxon 52 Humano 29 -1 ATTGAAACTTGTCATGCATCTTGC I I I I 227
Éxon 52 Humano 30 -1 TATTGAAACTTGTCATGCATCTTG I I I I 228
Éxon 52 Humano 31 1 AATAAAAACTTAAGTTCATATATC TTTC 229
Éxon 50 Humano 1 -1 GTGAATATATTATTGGATTTCTAT TTTG 230
Éxon 50 Humano 2 -1 AAGATAATTCATGAACATCTTAAT TTTG 231
Éxon 50 Humano 3 -1 ACAGAAAAGCATACACATTACTTA TTTA 232
Éxon 50 Humano 4 1 CTGTTAAAGAGGAAGTTAGAAGAT I I I I 233
Éxon 50 Humano 5 1 TGTTAAAGAGGAAGTTAGAAGATC TTTC 234
Éxon 50 Humano 6 -1 CCGCCTTCCACTCAGAGCTCAGAT TTTA 235
Éxon 50 Humano 7 -1 CCCTCAGCTCTTGAAGTAAACGGT TTTG 236
Éxon 50 Humano 8 1 CTTCAAGAGCTGAGGGCAAAGCAG TTTA 237
Éxon 50 Humano 9 -1 AACAAATAGCTAGAGCCAAAGAGA TTTG 238
Éxon 50 Humano 10 -1 GAACAAATAGCTAGAGCCAAAGAG I I I I 239
Éxon 50 Humano 11 1 GCTCTAGCTATTTGTTCAAAAGTG TTTG 240
Éxon 50 Humano 12 1 TTCAAAAGTGCAACTATGAAGTGA TTTG 241
Éxon 50 Humano 13 -1 TCTCTCACCCAGTCATCACTTCAT TTTC 242
Éxon 50 Humano 14 -1 CTCTCTCACCCAGTCATCACTTCA I I I I 243
Éxon 43 Humano 1 1 tatatatatatatatTTTT CT CTT TTTG 244
Éxon 43 Humano 2 1 TCTCTTTCTATAGACAGCTAATTC tTTT 245
Éxon 43 Humano 3 1 CTCTTTCTATAGACAGCTAATTCA I I I I 246
Éxon 43 Humano 4 -1 AAACAGTAAAAAAATGAATTAGCT TTTA 247
Éxon 43 Humano 5 1 TCTTTCTATAGACAGCTAATTCAT TTTC 248
Éxon 43 Humano 6 -1 AAAACAGTAAAAAAATGAATTAGC I I I I 249
Éxon 43 Humano 7 1 TATAGACAGCTAATTCAI I I I I I I TTTC 250
Éxon 43 Humano 8 -1 TATTCTGTAATATAAAAATTTTAA TTTA 251
Éxon 43 Humano 9 -1 ATATTCTGTAATATAAAAAI I I IA I I I I 252
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Éxon 43 Humano 10 1 TTTACTG I I I IAAAAI I I I IAIAI I I I I 253
Éxon 43 Humano 11 1 TTACTGTTTTAAAAI I I I IAIAI I I I I I 254
Éxon 43 Humano 12 1 TACTG I I I IAAAAI I I I IAIAI IA I I I I 255
Éxon 43 Humano 13 1 ACTGTTTTAAAAI I I I IAIAI I AC I I I I 256
Éxon 43 Humano 14 1 CTG I I I I AAAA I I I I IAIAI IACA TTTA 257
Éxon 43 Humano 15 1 AAAA I I I I IAIAI IACAGAAIAIA I I I I 258
Éxon 43 Humano 16 1 AAATTTTTATATTACAGAATATAA TTTA 259
Éxon 43 Humano 17 -1 TTGTAGACTATCTTTTATATTCTG TTTG 260
Éxon 43 Humano 18 1 TATATTACAGAATATAAAAGATAG I I I I 261
Éxon 43 Humano 19 1 ATATTACAGAATATAAAAGATAGT I I I I 262
Éxon 43 Humano 20 1 TATTACAGAATATAAAAGATAGTC TTTA 263
Éxon 43 Humano 21 -1 CAATGCTGCTGTCTTCTTGCTATG TTTG 264
Éxon 43 Humano 22 1 CAATGGGAAAAAGTTAACAAAATG TTTC 265
Éxon 43 Humano 23 -1 TGCAAGTATCAAGAAAAATATATG TTTC 266
Éxon 43 Humano 24 1 TCTTGATACTTGCAGAAATGATTT I I I I 267
Éxon 43 Humano 25 1 CTTGATACTTGCAGAAATGATTTG I I I I 268
Éxon 43 Humano 26 1 TTGATACTTGCAGAAATGATTTGT TTTC 269
Éxon 43 Humano 27 1 I I I ICAGGGAACIG IAGAAI I IAI TTTG 270
Éxon 43 Humano 28 -1 CATGGAGGGTACTGAAATAAATTC TTTC 271
Éxon 43 Humano 29 -1 CCATGGAGGGTACTGAAATAAATT I I I I 272
Éxon 43 Humano 30 1 CAGGGAACTGTAGAATTTATTTCA I I I I 273
Éxon 43 Humano 31 -1 TCCATGGAGGGTACTGAAATAAAT I I I I 274
Éxon 43 Humano 32 1 AGGGAACTGTAGAATTTATTTCAG TTTC 275
Éxon 43 Humano 33 -1 TTCCATGGAGGGTACTGAAATAAA I I I I 276
Éxon 43 Humano 34 -1 CCTGTCI I I I I I CCA IGGAGGG IA TTTC 277
Éxon 43 Humano 35 -1 CCCTGTCI I I I I I CCA I GGAGGG I I I I I 278
Éxon 43 Humano 36 -1 TCCCTGTCTI I I I I CCA I GGAGGG I I I I 279
Éxon 43 Humano 37 1 TTTCAGTACCCTCCATGGAAAAAA TTTA 280
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Éxon 43 Humano 38 1 AGTACCCTCCATGGAAAAAAGACA TTTC 281
Éxon 6 Humano 1 1 AGTTTGCATGGTTCTTGCTCAAGG TTTA 282
Éxon 6 Humano 2 -1 ATAAGAAAATGCATTCCTTGAGCA TTTC 283
Éxon 6 Humano 3 -1 CATAAGAAAATGCATTCCTTGAGC I I I I 284
Éxon 6 Humano 4 1 CATGGTTCTTGCTCAAGGAATGCA TTTG 285
Éxon 6 Humano 5 -1 ACCTACATGTGGAAATAAAI I I IC TTTG 286
Éxon 6 Humano 6 -1 GACCTACATGTGGAAATAAAI I I I I I I I 287
Éxon 6 Humano 7 -1 TGACCTACATGTGGAAATAAATTT I I I I 288
Éxon 6 Humano 8 1 CTTATGAAAATTTATTTCCACATG I I I I 289
Éxon 6 Humano 9 1 TTATGAAAATTTATTTCCACATGT TTTC 290
Éxon 6 Humano 10 -1 ATTACAI I I I IGACCIACAIG IGG TTTC 291
Éxon 6 Humano 11 -1 CATTACAI I I I I GACCIACAIGIG I I I I 292
Éxon 6 Humano 12 -1 TCATTACATI I I I GACCIACAIGI I I I I 293
Éxon 6 Humano 13 1 TTTCCACATGTAGGTCAAAAATGT TTTA 294
Éxon 6 Humano 14 1 CACATGTAGGTCAAAAATGTAATG TTTC 295
Éxon 6 Humano 15 -1 TTGCAATCCAGCCATGATATTTTT TTTG 296
Éxon 6 Humano 16 -1 ACTGTTGGTTTGTTGCAATCCAGC TTTC 297
Éxon 6 Humano 17 -1 CACTGTTGGTTTGTTGCAATCCAG I I I I 298
Éxon 6 Humano 18 1 AATGCTCTCATCCATAGTCATAGG TTTG 299
Éxon 6 Humano 19 -1 ATGTCTCAGTAATCTTCTTACCTA TTTA 300
Éxon 6 Humano 20 -1 CAAGTTATTTAATGTCTCAGTAAT TTTA 301
Éxon 6 Humano 21 -1 ACAAGTTATTTAATGTCTCAGTAA I I I I 302
Éxon 6 Humano 22 1 GACTCTGATGACATATI I I ICCCC TTTA 303
Éxon 6 Humano 23 1 TCCCCAGTATGGTTCCAGATCATG I I I I 304
Éxon 6 Humano 24 1 CCCCAGTATGGTTCCAGATCATGT I I I I 305
Éxon 6 Humano 25 1 CCCAGTATGGTTCCAGATCATGTC TTTC 306
Éxon 7 Humano 1 1 T ATTT GT CTTtgtgtatgtgtgta TTTA 307
Éxon 7 Humano 2 1 T CTTtgtgtatgtgtgtatgtgta TTTG 308
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Éxon 7 Humano 3 1 tçjtatgtçjtçjtatgtgtatçjtçjtt TTtg 309
Éxon 7 Humano 4 1 AGGCCAGACCTATTTGACTGGAAT ttTT 310
Éxon 7 Humano 5 1 GGCCAGACCTATTTGACTGGAATA tTTA 311
Éxon 7 Humano 6 1 ACTGGAATAGTGTGGTTTGCCAGC TTTG 312
Éxon 7 Humano 7 1 CCAGCAGTCAGCCACACAACGACT TTTG 313
Éxon 7 Humano 8 -1 TCTATGCCTAATTGATATCTGGCG TTTC 314
Éxon 7 Humano 9 -1 CCAACCTTCAGGATCGAGTAGTTT TTTA 315
Éxon 7 Humano 10 1 TGGACTACCACTGCTTTTAGTATG TTTC 316
Éxon 7 Humano 11 1 AGTATGGTAGAGTTTAATGTTTTC I I I I 317
Éxon 7 Humano 12 1 GTATGGTAGAGTTTAATGTTTTCA TTTA 318
Éxon 8 Humano 1 -1 AGACTCTAAAAGGATAATGAACAA TTTG 319
Éxon 8 Humano 2 1 ACTTTGATTTGTTCATTATCCTTT TTTA 320
Éxon 8 Humano 3 -1 TATATTTGAGACTCTAAAAGGATA TTTC 321
Éxon 8 Humano 4 1 ATTTGTTCATTATCCI I I IAGAG I TTTG 322
Éxon 8 Humano 5 -1 GTTTCTATATTTGAGACTCTAAAA TTTG 323
Éxon 8 Humano 6 -1 GGTTTCTATATTTGAGACTCTAAA I I I I 324
Éxon 8 Humano 7 -1 TGGTTTCTATATTTGAGACTCTAA I I I I 325
Éxon 8 Humano 8 1 TTCATTATCCTTTTAGAGTCTCAA TTTG 326
Éxon 8 Humano 9 1 AGAGTCTCAAATATAGAAACCAAA I I I I 327
Éxon 8 Humano 10 1 GAGTCTCAAATATAGAAACCAAAA TTTA 328
Éxon 8 Humano 11 -1 CACTTCCTGGATGGCTTCAATGCT TTTC 329
Éxon 8 Humano 12 1 GCCTCAACAAGTGAGCATTGAAGC I I I I 330
Éxon 8 Humano 13 1 CCTCAACAAGTGAGCATTGAAGCC TTTG 331
Éxon 8 Humano 14 -1 GGTGGCCTTGGCAACATTTCCACT TTTA 332
Éxon 8 Humano 15 -1 GTCACTTTAGGTGGCCTTGGCAAC TTTA 333
Éxon 8 Humano 16 -1 ATGATGTAACTGAAAATGTTCTTC TTTG 334
Éxon 8 Humano 17 -1 CCTGTTGAGAATAGTGCATTTGAT TTTA 335
Éxon 8 Humano 18 1 CAGTTACATCATCAAATGCACTAT I I I I 336
Petição 870190085920, de 02/09/2019, pág. 219/285
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Éxon 8 Humano 19 1 AGTTACATCATCAAATGCACTATT TTTC 337
Éxon 8 Humano 20 -1 CACACTTTACCTGTTGAGAATAGT TTTA 338
Éxon 8 Humano 21 1 CTG I I I IAIAI GCA I I I I IAGG IA I I I I 339
Éxon 8 Humano 22 1 TGI I I IAIAI GCA I I I I IAGGIAI TTTC 340
Éxon 8 Humano 23 1 ATATGCATTTTTAGGTATTACGTG I I I I 341
Éxon 8 Humano 24 1 TATGCATI I I I AGG IAI IACG IGC TTTA 342
Éxon 8 Humano 25 1 TAGGTATTACGTGCACatatatat I I I I 343
Éxon 8 Humano 26 1 AGGT ATT ACGTGCACatatatata I I I I 344
Éxon 8 Humano 27 1 GGT ATT ACGTGCACatatatatat TTTA 345
Éxon 55 Humano 1 -1 AGCAACAACTATAATATTGTGCAG TTTA 346
Éxon 55 Humano 2 1 GTTCCTCCATCTTTCTCTTTTTAT TTTA 347
Éxon 55 Humano 3 1 TCTTTTTATGGAGTTCACTAGGTG TTTC 348
Éxon 55 Humano 4 1 TATGGAGTTCACTAGGTGCACCAT I I I I 349
Éxon 55 Humano 5 1 ATGGAGTTCACTAGGTGCACCATT I I I I 350
Éxon 55 Humano 6 1 TGGAGTTCACTAGGTGCACCATTC TTTA 351
Éxon 55 Humano 7 1 ATAATTGCATCTGAACATTTGGTC TTTA 352
Éxon 55 Humano 8 1 GTCCTTTGCAGGGTGAGTGAGCGA TTTG 353
Éxon 55 Humano 9 -1 TTCCAAAGCAGCCTCTCGCTCACT TTTC 354
Éxon 55 Humano 10 1 CAGGGTGAGTGAGCGAGAGGCTGC TTTG 355
Éxon 55 Humano 11 1 GAAGAAACTCATAGATTACTGCAA TTTG 356
Éxon 55 Humano 12 -1 CAGGTCCAGGGGGAACTGTTGCAG TTTC 357
Éxon 55 Humano 13 -1 CCAGGTCCAGGGGGAACTGTTGCA I I I I 358
Éxon 55 Humano 14 -1 AGCTTCTGTAAGCCAGGCAAGAAA TTTC 359
Éxon 55 Humano 15 1 TTGCCTGGCTTACAGAAGCTGAAA TTTC 360
Éxon 55 Humano 16 -1 CTTACGGGTAGCATCCTGTAGGAC TTTC 361
Éxon 55 Humano 17 -1 CTCCCTTGGAGTCTTCTAGGAGCC TTTA 362
Éxon 55 Humano 18 -1 ACTCCCTTGGAGTCTTCTAGGAGC I I I I 363
Éxon 55 Humano 19 -1 ATCAGCTCTTTTACTCCCTTGGAG TTTC 364
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Éxon 55 Humano 20 1 CGCTTTAGCACTCTTGTGGATCCA TTTC 365
Éxon 55 Humano 21 1 GCACTCTTGTGGATCCAATTGAAC TTTA 366
Éxon 55 Humano 22 -1 TCCCTGGCTTGTCAGTTACAAGTA TTTG 367
Éxon 55 Humano 23 -1 GTCCCTGGCTTGTCAGTTACAAGT I I I I 368
Éxon 55 Humano 24 -1 I I I IG ICCCIGGCI IG ICAG I I AC TTTG 369
Éxon 55 Humano 25 -1 GTTTTGTCCCTGGCTTGTCAGTTA I I I I 370
Éxon 55 Humano 26 1 TACTTGTAACTGACAAGCCAGGGA TTTG 371
Éxon 51 G1 Humano 1 gCTCCTACTCAGACTGTTACTCTG TTTA 372
Éxon 51 G2 Humano 1 taccatgtattgctaaacaaagta TTTC 373
Éxon 51 G3 Humano -1 attgaagagtaacaatttgagcca TTTA 374
Éxon 23-G1 de camundongo 1 aggctctgcaaagttctTT GAAAG TTTG 375
Éxon 23-G2 de camundongo 1 AAAG AGCAACAAAATGGCttcaac TTTG 376
Éxon 23-G3 de camundongo 1 AAAGAGCAATAAAATGGCttcaac TTTG 377
Éxon 23-G4 de camundongo -1 AAAG AACTTTGCAG AGCctcaaaa TTTC 378
Éxon 23-G5 de camundongo -1 ctg aatatctatg cattaataact TTTA 379
Éxon 23-G6 de camundongo -1 tattatattacagggcatattata TTTC 380
Éxon 23-G7 de camundongo 1 Aggtaagccgaggtttggccttta TTTC 381
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Éxon 23-G8 de camundongo 1 cccag ag tccttcaaag atattg a TTTA 382
* Nesta tabela, as letras maiúsculas representam nucleotideos que se alinham com a sequência do éxon do gene. As letras minúsculas representam nucleotideos que se alinham com a sequência do intron do gene.
TABELA 7 - sequências de gRNA
Éxon de gRNA direcionado Guia # Filamento sequência de gRNA* PAM SEQ ID NO.
Éxon 51 Humano 4 1 aaaaaggaaaaaagaagaaaaaga tttt 383
Éxon 51 Humano 5 1 Caaaaaggaaaaaagaagaaaaag tttt 384
Éxon 51 Humano 6 1 GCaaaaaggaaaaaagaagaaaaa tttc 385
Éxon 51 Humano 7 1 U U U U G Caaaaagg aaaaaag aaga tttt 386
Éxon 51 Humano 8 1 U U U U U G Caaaaagg aaaaaag aag tttt 387
Éxon 51 Humano 9 1 G U U U U U G Caaaaagg aaaaaag aa tttc 388
Éxon 51 Humano 10 1 AUUUUGGGUUUUUGCaaaaaggaa tttt 389
Éxon 51 Humano 11 1 UAUUUUGGGUUUUUGCaaaaagga tttt 390
Éxon 51 Humano 12 1 AUAUUUUGGGUUUUUGCaaaaagg tttt 391
Éxon 51 Humano 13 1 AAUAUUUUGGGUUUUUGCaaaaag tttc 392
Éxon 51 Humano 14 1 GCUAAAAUAUUUUGGGUUUUUGCa tttt 393
Éxon 51 Humano 15 1 AGCUAAAAUAUUUUGGGUUUUUGC tttt 394
Éxon 51 Humano 16 1 GAGCUAAAAUAUUUUGGGUUUUUG tttG 395
Éxon 51 Humano 17 1 AGAGUAACAGUCUGAGUAGGAGCU I I I I 396
Éxon 51 Humano 18 1 CAGAGUAACAGUCUGAGUAGGAGC TTTA 397
Éxon 51 Humano 19 -1 GUGACACAACCUGUGGUUACUAAG TTTC 398
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Éxon 51 Humano 20 -1 GGUUACUAAGGAAACUGCCAUCU TTTG 399
Éxon 51 Humano 21 -1 AAGGAAACUGCCAUCUCCAAACUA TTTC 400
Éxon 51 Humano 22 -1 AUCAUCAAGCAGAAGGUAUGAGAA I I I I 401
Éxon 51 Humano 23 -1 AGCAGAAGGUAUGAGAAAAAAUGA TTTA 402
Éxon 51 Humano 24 -1 GCAGAAGGUAUGAGAAAAAAUGAU I I I I 403
Éxon 51 Humano 25 -1 UAAAAGUUGGCAGAAGUUUUUCUU TTTA 404
Éxon 51 Humano 26 -1 AAAAGUUGGCAGAAGUUUUUCUUU I I I I 405
Éxon 51 Humano 27 1 GGUGGAAAAUCUUCAUUUUAAAGA I I I I 406
Éxon 51 Humano 28 1 UGGUGGAAAAUCUUCAUUUUAAAG I I I I 407
Éxon 51 Humano 29 1 UUGGUGGAAAAUCUUCAUUUUAAA TTTC 408
Éxon 51 Humano 30 1 GUGAUUGGUGGAAAAUCUUCAUUU TTTA 409
Éxon 51 Humano 31 1 CUAGGAGAGUAAAGUGAUUGGUGG I I I I 410
Éxon 51 Humano 32 1 UCUAGGAGAGUAAAGUGAUUGGUG TTTC 411
Éxon 51 Humano 33 1 CUGGUGGGAAAUGGUCUAGGAGA TTTA 412
Éxon 45 Humano 1 -1 guagcacacuguuuaaucuuuucu tttg 413
Éxon 45 Humano 2 -1 cacacuguuuaaucuuuucucaaa TTTa 414
Éxon 45 Humano 3 -1 acacuguuuaaucuuuucucaaau I I I I 415
Éxon 45 Humano 4 -1 cacuguuuaaucuuuucucaaauA I I I I 416
Éxon 45 Humano 5 1 AUGUCUUUUUauuugagaaaagau ttta 417
Éxon 45 Humano 6 1 AAGCCCCAUGUCUUUUUauuugag tttt 418
Éxon 45 Humano 7 1 GAAGCCCCAUGUCUUUUUauuuga tttc 419
Éxon 45 Humano 8 1 GUAAGAUACCAAAAAGGCAAAACA I I I I 420
Éxon 45 Humano 9 1 UGUAAGAUACCAAAAAGGCAAAAC I I I I 421
Éxon 45 Humano 10 1 CUGUAAGAUACCAAAAAGGCAAAA TTTG 422
Éxon 45 Humano 11 1 GUUCCUGUAAGAUACCAAAAAGGC I I I I 423
Éxon 45 Humano 12 1 AGUUCCUGUAAGAUACCAAAAAGG TTTG 424
Éxon 45 Humano 13 1 UCCUGGAGUUCCUGUAAGAUACCA I I I I 425
Éxon 45 Humano 14 1 AUCCUGGAGUUCCUGUAAGAUACC I I I I 426
Petição 870190085920, de 02/09/2019, pág. 223/285
219/259
Éxon 45 Humano 15 -1 GGGAAGAAAUAAUUCAGCAAUCCU TTTG 427
Éxon 45 Humano 16 -1 GGAAGAAAUAAUUCAGCAAUCCUC I I I I 428
Éxon 45 Humano 17 -1 GAAGAAAUAAUUCAGCAAUCCUCA I I I I 429
Éxon 45 Humano 18 -1 AAAACAGAUGCCAGUAUUCUACAG TTTC 430
Éxon 45 Humano 19 -1 AAACAGAUGCCAGUAUUCUACAGG I I I I 431
Éxon 45 Humano 20 -1 AACAGAUGCCAGUAUUCUACAGGA I I I I 432
Éxon 45 Humano 21 -1 GAAUCUGCGGUGGCAGGAGGUCUG TTTG 433
Éxon 45 Humano 22 -1 AGGUCUGCAAACAGCUGUCAGACA TTTC 434
Éxon 45 Humano 23 -1 GGUCUGCAAACAGCUGUCAGACAG I I I I 435
Éxon 45 Humano 24 -1 GUCUGCAAACAGCUGUCAGACAGA I I I I 436
Éxon 45 Humano 25 -1 UCUGCAAACAGCUGUCAGACAGAA I I I I 437
Éxon 45 Humano 26 -1 UAGGGCGACAGAUCUAAUAGGAAU TTTC 438
Éxon 45 Humano 27 -1 AGGGCGACAGAUCUAAUAGGAAUG I I I I 439
Éxon 45 Humano 28 1 UAAAGAAAGCUUAAAAAGUCUGCU I I I I 440
Éxon 45 Humano 29 1 CUAAAGAAAGCUUAAAAAGUCUGC TTTA 441
Éxon 45 Humano 30 1 AAAUAUUCUUCUAAAGAAAGCUUA I I I I 442
Éxon 45 Humano 31 1 GAAAUAUUCUUCUAAAGAAAGCUU I I I I 443
Éxon 45 Humano 32 1 UGAAAUAUUCUUCUAAAGAAAGCU TTTA 444
Éxon 45 Humano 33 1 UCUCUCAUGAAAUAUUCUUCUAAA TTTC 445
Éxon 45 Humano 34 1 AUAAUCUCUCAUGAAAUAUUCUUC TTTA 446
Éxon 44 Humano 1 1 GCGUAUAUUUUUUGGUUAUACUGA TTTG 447
Éxon 44 Humano 2 1 ucaagaaaaauagauggauuaugu tttt 448
Éxon 44 Humano 3 1 aucaagaaaaauagauggauuaug ttta 449
Éxon 44 Humano 4 1 CAGGUaaaagcauauggaucaaga tttt 450
Éxon 44 Humano 5 1 GCAGGUaaaagcauauggaucaag tttt 451
Éxon 44 Humano 6 1 UGCAGGUaaaagcauauggaucaa tttc 452
Éxon 44 Humano 7 -1 CAGGCGAUUUGACAGAUCUGUUGA TTTC 453
Éxon 44 Humano 8 1 AGAUCUGUCAAAUCGCCUGCAGGU tttt 454
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220/259
Éxon 44 Humano 9 1 CAGAUCUGUCAAAUCGCCUGCAGG tttA 455
Éxon 44 Humano 10 1 GCCGCCAUUUCUCAACAGAUCUGU TTTG 456
Éxon 44 Humano 11 -1 AAUGGCGGCGUUUUCAUUAUGAUA TTTA 457
Éxon 44 Humano 12 1 AUUAAAUAUCUUUAUAUCAUAAUG I I I I 458
Éxon 44 Humano 13 -1 UGAGAAUUGGGAACAUGCUAAAUA TTTG 459
Éxon 44 Humano 14 -1 GGUAAGUCUUUGAUUUGUUUUUUC TTTC 460
Éxon 44 Humano 15 1 AAAUACAAUUUCGAAAAAACAAAU TTTG 461
Éxon 44 Humano 16 1 AAGAUAAAUACAAUUUCGAAAAAA TTTG 462
Éxon 44 Humano 17 1 GCUGAAGAUAAAUACAAUUUCGAA I I I I 463
Éxon 44 Humano 18 1 UGCUGAAGAUAAAUACAAUUUCGA I I I I 464
Éxon 44 Humano 19 1 GUGCUGAAGAUAAAUACAAUUUCG I I I I 465
Éxon 44 Humano 20 1 UGUGCUGAAGAUAAAUACAAUUUC TTTC 466
Éxon 44 Humano 21 -1 GCACAUCUGGACUCUUUAACUUCU TTTA 467
Éxon 44 Humano 22 1 UAAAGAGUCCAGAUGUGCUGAAGA TTTA 468
Éxon 44 Humano 23 -1 AAGAUCAGGUUCUGAAGGGUGAUG TTTC 469
Éxon 44 Humano 24 1 UUCAGAACCUGAUCUUUAAGAAGU TTTA 470
Éxon 44 Humano 25 1 AAUAUAAUGAUGACAACAACAGUC I I I I 471
Éxon 44 Humano 26 1 UAAUAUAAUGAUGACAACAACAGU TTTG 472
Éxon 53 Humano 1 -1 UUUAUUUUUCCUUUUAUUCUAGUU TTTC 473
Éxon 53 Humano 2 1 AAAGGAAAAAUAAAUAUAUAGUAG TTTA 474
Éxon 53 Humano 3 1 UUUCAACUAGAAUAAAAGGAAAAA TTTA 475
Éxon 53 Humano 4 1 AUUCUUUCAACUAGAAUAAAAGGA I I I I 476
Éxon 53 Humano 5 1 AAUUCUUUCAACUAGAAUAAAAGG I I I I 477
Éxon 53 Humano 6 1 GAAUUCUUUCAACUAGAAUAAAAG TTTC 478
Éxon 53 Humano 7 1 AUUCUGAAUUCUUUCAACUAGAAU I I I I 479
Éxon 53 Humano 8 1 GAUUCUGAAUUCUUUCAACUAGAA TTTA 480
Éxon 53 Humano 9 -1 CAGAACCGGAGGCAACAGUUGAAU TTTC 481
Éxon 53 Humano 10 -1 GGAGGCAACAGUUGAAUGAAAUGU TTTA 482
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Éxon 53 Humano 11 -1 UAUACAGUAGAUGCAAUCCAAAAG I I I I 483
Éxon 53 Humano 12 -1 GAUGCAAUCCAAAAGAAAAUCACA TTTC 484
Éxon 53 Humano 13 -1 AAUCACAGAAACCAAGGUUAGUAU TTTG 485
Éxon 53 Humano 14 -1 AGGUUAGUAUCAAAGAUACCUUU TTTA 486
Éxon 53 Humano 15 -1 GGUUAGUAUCAAAGAUACCUUUUU I I I I 487
Éxon 53 Humano 16 -1 AGUAUCAAAGAUACCUUUUUAAAA TTTA 488
Éxon 53 Humano 17 -1 GUAUCAAAGAUACCUUUUUAAAAU I I I I 489
Éxon 46 Humano 1 -1 UGUUUGUGUCCCAGUUUGCAUUAA TTTG 490
Éxon 46 Humano 2 1 CUGGGACACAAACAUGGCAAUUUA I I I I 491
Éxon 46 Humano 3 1 ACUGGGACACAAACAUGGCAAUUU I I I I 492
Éxon 46 Humano 4 1 AACUGGGACACAAACAUGGCAAUU TTTA 493
Éxon 46 Humano 5 1 UAUUUGUUAAUGCAAACUGGGACA TTTG 494
Éxon 46 Humano 6 -1 ACAAAUAGUUUGAGAACUAUGUUG tttc 495
Éxon 46 Humano 7 -1 CAAAUAGUUUGAGAACUAUGUUGG tttt 496
Éxon 46 Humano 8 -1 AAAUAGUUUGAGAACUAUGUUGGa tttt 497
Éxon 46 Humano 9 -1 AUAGUUUGAGAACUAUGUUGGaaa tttt 498
Éxon 46 Humano 10 -1 UAGUUUGAGAACUAUGUUGGaaaa tttt 499
Éxon 46 Humano 11 -1 AGUUUGAGAACUAUGUUGGaaaaa tttt 500
Éxon 46 Humano 12 1 UAGUUCUCAAACUAUUUGUUAAUG TTTG 501
Éxon 46 Humano 13 1 UAuuuuuuuuuCCAACAUAGUUCU TTTG 502
Éxon 46 Humano 14 -1 CUUCUUUCUCCAGGCUAGAAGAAC I I I I 503
Éxon 46 Humano 15 1 CUUCUAGCCUGGAGAAAGAAGAAU I I I I 504
Éxon 46 Humano 16 1 UCUUCUAGCCUGGAGAAAGAAGAA TTTA 505
Éxon 46 Humano 17 1 AUUCUUUUGUUCUUCUAGCCUGGA TTTC 506
Éxon 46 Humano 18 -1 CAAAAGAAUAUCUUGUCAGAAUUU TTTG 507
Éxon 46 Humano 19 -1 CUGGAAAAGAGCAGCAACUAAAAG I I I I 508
Éxon 46 Humano 20 -1 CAAGUCAAGGUAAUUUUAUUUUCU TTTG 509
Éxon 46 Humano 21 -1 CAAAUCCCCCAGGGCCUGCUUGCA TTTA 510
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Éxon 46 Humano 22 1 AGGCCCUGGGGGAUUUGAGAAAAU I I I I 511
Éxon 46 Humano 23 1 CAGGCCCUGGGGGAUUUGAGAAAA TTTA 512
Éxon 46 Humano 24 1 CAAGCAGGCCCUGGGGGAUUUGAG I I I I 513
Éxon 46 Humano 25 1 GCAAGCAGGCCCUGGGGGAUUUGA TTTC 514
Éxon 46 Humano 26 1 GCAGAAAACCAAUGAUUGAAUUAA I I I I 515
Éxon 46 Humano 27 1 GGCAGAAAACCAAUGAUUGAAUUA I I I I 516
Éxon 46 Humano 28 1 GGGCAGAAAACCAAUGAUUGAAUU I I I I 517
Éxon 46 Humano 29 1 UGGGCAGAAAACCAAUGAUUGAAU TTTA 518
Éxon 46 Humano 30 -1 AUUAGGUUAUUCAUAGUUCCUUGC TTTA 519
Éxon 46 Humano 31 1 AACUAUGAAUAACCUAAUGGGCAG I I I I 520
Éxon 46 Humano 32 1 GAACUAUGAAUAACCUAAUGGGCA TTTC 521
Éxon 52 Humano 1 -1 UAUUUCCUGUUAAAUUGUUUUCUA TTTA 522
Éxon 52 Humano 2 1 GG U U UAUAGAAAACAAU U UAACAG TTTC 523
Éxon 52 Humano 3 -1 AUACAGUAACAUCUUUUUUAUUUC TTTA 524
Éxon 52 Humano 4 -1 UACAGUAACAUCUUUUUUAUUUCU I I I I 525
Éxon 52 Humano 5 1 AUGUUACUGUAUAAGGGUUUAUAG I I I I 526
Éxon 52 Humano 6 1 GAUGUUACUGUAUAAGGGUUUAUA TTTC 527
Éxon 52 Humano 7 1 CAGCCAAAACACUUUUAGAAAUAA I I I I 528
Éxon 52 Humano 8 1 CCAGCCAAAACACUUUUAGAAAUA I I I I 529
Éxon 52 Humano 9 1 ACCAGCCAAAACACUUUUAGAAAU I I I I 530
Éxon 52 Humano 10 1 GACCAGCCAAAACACU U U UAGAAA TTTA 531
Éxon 52 Humano 11 1 GUGAGACCAGCCAAAACACUUUUA TTTC 532
Éxon 52 Humano 12 -1 AAUUGUACUUUACUUUGUAUUAUG TTTA 533
Éxon 52 Humano 13 -1 AUUGUACUUUACUUUGUAUUAUGU I I I I 534
Éxon 52 Humano 14 1 UAAAGUACAAUUGUGAGACCAGCC I I I I 535
Éxon 52 Humano 15 1 GUAAAGUACAAUUGUGAGACCAGC TTTG 536
Éxon 52 Humano 16 1 GUAUUCCUUUUACAUAAUACAAAG TTTA 537
Éxon 52 Humano 17 1 GUUGUGUAUUCCUUUUACAUAAUA TTTG 538
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223/259
Éxon 52 Humano 18 1 AUCCUGCAUUGUUGCCUGUAAGAA TTTG 539
Éxon 52 Humano 19 1 UUCCAACUGGGGACGCCUCUGUUC TTTG 540
Éxon 52 Humano 20 -1 UUGGAAGAACUCAUUACCGCUGCC TTTG 541
Éxon 52 Humano 21 -1 UCAUUACCGCUGCCCAAAAUUUGA I I I I 542
Éxon 52 Humano 22 1 CUCUUGAUUGCUGGUCUUGUUUUU TTTG 543
Éxon 52 Humano 23 -1 GUUUUUUAACAAGCAUGGGACACA TTTG 544
Éxon 52 Humano 24 1 CUUUGUGUGUCCCAUGCUUGUUAA I I I I 545
Éxon 52 Humano 25 1 GCUUUGUGUGUCCCAUGCUUGUUA I I I I 546
Éxon 52 Humano 26 1 UGCUUUGUGUGUCCCAUGCUUGUU I I I I 547
Éxon 52 Humano 27 1 UUGCUUUGUGUGUCCCAUGCUUGU TTTA 548
Éxon 52 Humano 28 -1 AGCAAGAUGCAUGACAAGUUUCAA TTTA 549
Éxon 52 Humano 29 -1 GCAAGAUGCAUGACAAGUUUCAAU I I I I 550
Éxon 52 Humano 30 -1 CAAGAUGCAUGACAAGUUUCAAUA I I I I 551
Éxon 52 Humano 31 1 GAUAUAUGAACUUAAGUUUUUAUU TTTC 552
Éxon 50 Humano 1 -1 AUAGAAAUCCAAUAAUAUAUUCAC TTTG 553
Éxon 50 Humano 2 -1 AUUAAGAUGUUCAUGAAUUAUCUU TTTG 554
Éxon 50 Humano 3 -1 UAAGUAAUGUGUAUGCUUUUCUGU TTTA 555
Éxon 50 Humano 4 1 AUCUUCUAACUUCCUCUUUAACAG I I I I 556
Éxon 50 Humano 5 1 GAUCUUCUAACUUCCUCUUUAACA TTTC 557
Éxon 50 Humano 6 -1 AUCUGAGCUCUGAGUGGAAGGCGG TTTA 558
Éxon 50 Humano 7 -1 ACCGUUUACUUCAAGAGCUGAGGG TTTG 559
Éxon 50 Humano 8 1 CUGCUUUGCCCUCAGCUCUUGAAG TTTA 560
Éxon 50 Humano 9 -1 UCUCUUUGGCUCUAGCUAUUUGUU TTTG 561
Éxon 50 Humano 10 -1 CUCUUUGGCUCUAGCUAUUUGUUC I I I I 562
Éxon 50 Humano 11 1 CACUUUUGAACAAAUAGCUAGAGC TTTG 563
Éxon 50 Humano 12 1 UCACUUCAUAGUUGCACUUUUGAA TTTG 564
Éxon 50 Humano 13 -1 AUGAAGUGAUGACUGGGUGAGAGA TTTC 565
Éxon 50 Humano 14 -1 UGAAGUGAUGACUGGGUGAGAGAG I I I I 566
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Éxon 43 Humano 1 1 AAGAGAAAAauauauauauauaua TTTG 567
Éxon 43 Humano 2 1 GAAUUAGCUGUCUAUAGAAAGAGA tTTT 568
Éxon 43 Humano 3 1 UGAAUUAGCUGUCUAUAGAAAGAG I I I I 569
Éxon 43 Humano 4 -1 AGCUAAUUCAUUUUUUUACUGUUU TTTA 570
Éxon 43 Humano 5 1 AUGAAUUAGCUGUCUAUAGAAAGA TTTC 571
Éxon 43 Humano 6 -1 GCUAAUUCAUUUUUUUACUGUUUU I I I I 572
Éxon 43 Humano 7 1 AAAAAAAUGAAUUAGCUGUCUAUA TTTC 573
Éxon 43 Humano 8 -1 UUAAAAUUUUUAUAUUACAGAAUA TTTA 574
Éxon 43 Humano 9 -1 UAAAAUUUUUAUAUUACAGAAUAU I I I I 575
Éxon 43 Humano 10 1 AUAUAAAAAU U U UAAAACAG UAAA I I I I 576
Éxon 43 Humano 11 1 AAUAUAAAAAU U U UAAAACAG UAA I I I I 577
Éxon 43 Humano 12 1 UAAUAUAAAAAU U U UAAAACAG UA I I I I 578
Éxon 43 Humano 13 1 G UAAUAUAAAAAU U U UAAAACAG U I I I I 579
Éxon 43 Humano 14 1 UG UAAUAUAAAAAU U U UAAAACAG TTTA 580
Éxon 43 Humano 15 1 UAUAUUCUGUAAUAUAAAAAUUUU I I I I 581
Éxon 43 Humano 16 1 UUAUAUUCUGUAAUAUAAAAAUUU TTTA 582
Éxon 43 Humano 17 -1 CAGAAUAUAAAAGAUAGUCUACAA TTTG 583
Éxon 43 Humano 18 1 CUAUCUUUUAUAUUCUGUAAUAUA I I I I 584
Éxon 43 Humano 19 1 ACUAUCUUUUAUAUUCUGUAAUAU I I I I 585
Éxon 43 Humano 20 1 GACUAUCUUUUAUAUUCUGUAAUA TTTA 586
Éxon 43 Humano 21 -1 CAUAGCAAGAAGACAGCAGCAUUG TTTG 587
Éxon 43 Humano 22 1 CAUUUUGUUAACUUUUUCCCAUUG TTTC 588
Éxon 43 Humano 23 -1 CAUAUAUUUUUCUUGAUACUUGCA TTTC 589
Éxon 43 Humano 24 1 AAAUCAUUUCUGCAAGUAUCAAGA I I I I 590
Éxon 43 Humano 25 1 CAAAUCAUUUCUGCAAGUAUCAAG I I I I 591
Éxon 43 Humano 26 1 ACAAAUCAUUUCUGCAAGUAUCAA TTTC 592
Éxon 43 Humano 27 1 AUAAAUUCUACAGUUCCCUGAAAA TTTG 593
Éxon 43 Humano 28 -1 GAAUUUAUUUCAGUACCCUCCAUG TTTC 594
Petição 870190085920, de 02/09/2019, pág. 229/285
225/259
Éxon 43 Humano 29 -1 AAUUUAUUUCAGUACCCUCCAUGG I I I I 595
Éxon 43 Humano 30 1 UGAAAUAAAUUCUACAGUUCCCUG I I I I 596
Éxon 43 Humano 31 -1 AUUUAUUUCAGUACCCUCCAUGGA I I I I 597
Éxon 43 Humano 32 1 CUGAAAUAAAUUCUACAGUUCCCU TTTC 598
Éxon 43 Humano 33 -1 UUUAUUUCAGUACCCUCCAUGGAA I I I I 599
Éxon 43 Humano 34 -1 UACCCUCCAUGGAAAAAAGACAGG TTTC 600
Éxon 43 Humano 35 -1 ACCCUCCAUGGAAAAAAGACAGGG I I I I 601
Éxon 43 Humano 36 -1 CCCUCCAUGGAAAAAAGACAGGGA I I I I 602
Éxon 43 Humano 37 1 UUUUUUCCAUGGAGGGUACUGAAA TTTA 603
Éxon 43 Humano 38 1 UGUCUUUUUUCCAUGGAGGGUACU TTTC 604
Éxon 6 Humano 1 1 CCUUGAGCAAGAACCAUGCAAACU TTTA 605
Éxon 6 Humano 2 -1 UGCUCAAGGAAUGCAUUUUCUUAU TTTC 606
Éxon 6 Humano 3 -1 GCUCAAGGAAUGCAUUUUCUUAUG I I I I 607
Éxon 6 Humano 4 1 UGCAUUCCUUGAGCAAGAACCAUG TTTG 608
Éxon 6 Humano 5 -1 GAAAAUUUAUUUCCACAUGUAGGU TTTG 609
Éxon 6 Humano 6 -1 AAAAUUUAUUUCCACAUGUAGGUC I I I I 610
Éxon 6 Humano 7 -1 AAAUUUAUUUCCACAUGUAGGUCA I I I I 611
Éxon 6 Humano 8 1 CAUGUGGAAAUAAAUUUUCAUAAG I I I I 612
Éxon 6 Humano 9 1 ACAUGUGGAAAUAAAUUUUCAUAA TTTC 613
Éxon 6 Humano 10 -1 CCACAUGUAGGUCAAAAAUGUAAU TTTC 614
Éxon 6 Humano 11 -1 CACAUGUAGGUCAAAAAUGUAAUG I I I I 615
Éxon 6 Humano 12 -1 ACAUGUAGGUCAAAAAUGUAAUGA I I I I 616
Éxon 6 Humano 13 1 ACAUUUUUGACCUACAUGUGGAAA TTTA 617
Éxon 6 Humano 14 1 CAUUACAUUUUUGACCUACAUGUG TTTC 618
Éxon 6 Humano 15 -1 AAAAAUAUCAUGGCUGGAUUGCAA TTTG 619
Éxon 6 Humano 16 -1 GCUGGAUUGCAACAAACCAACAGU TTTC 620
Éxon 6 Humano 17 -1 CUGGAUUGCAACAAACCAACAGUG I I I I 621
Éxon 6 Humano 18 1 CCUAUGACUAUGGAUGAGAGCAUU TTTG 622
Petição 870190085920, de 02/09/2019, pág. 230/285
226/259
Éxon 6 Humano 19 -1 UAGGUAAGAAGAUUACUGAGACAU TTTA 623
Éxon 6 Humano 20 -1 AUUACUGAGACAUUAAAUAACUUG TTTA 624
Éxon 6 Humano 21 -1 UUACUGAGACAUUAAAUAACUUGU llll 625
Éxon 6 Humano 22 1 GGGGAAAAAUAUGUCAUCAGAGUC TTTA 626
Éxon 6 Humano 23 1 CAUGAUCUGGAACCAUACUGGGGA llll 627
Éxon 6 Humano 24 1 ACAUGAUCUGGAACCAUACUGGGG llll 628
Éxon 6 Humano 25 1 GACAUGAUCUGGAACCAUACUGGG TTTC 629
Éxon 7 Humano 1 1 uacacacauacacaAAGACAAAUA TTTA 630
Éxon 7 Humano 2 1 uacacauacacacau acaca A AG A TTTG 631
Éxon 7 Humano 3 1 aacacauacacauacacacauaca TTtg 632
Éxon 7 Humano 4 1 AUUCCAGUCAAAUAGGUCUGGCCU ttTT 633
Éxon 7 Humano 5 1 UAUUCCAGUCAAAUAGGUCUGGCC tTTA 634
Éxon 7 Humano 6 1 GCUGGCAAACCACACUAUUCCAGU TTTG 635
Éxon 7 Humano 7 1 AGUCGUUGUGUGGCUGACUGCUGG TTTG 636
Éxon 7 Humano 8 -1 CGCCAGAUAUCAAUUAGGCAUAGA TTTC 637
Éxon 7 Humano 9 -1 AAACUACUCGAUCCUGAAGGUUGG TTTA 638
Éxon 7 Humano 10 1 CAUACUAAAAGCAGUGGUAGUCCA TTTC 639
Éxon 7 Humano 11 1 GAAAACAUUAAACUCUACCAUACU llll 640
Éxon 7 Humano 12 1 UGAAAACAUUAAACUCUACCAUAC TTTA 641
Éxon 8 Humano 1 -1 UUGUUCAUUAUCCUUUUAGAGUCU TTTG 642
Éxon 8 Humano 2 1 AAAGGAUAAUGAACAAAUCAAAGU TTTA 643
Éxon 8 Humano 3 -1 UAUCCUUUUAGAGUCUCAAAUAUA TTTC 644
Éxon 8 Humano 4 1 ACUCUAAAAGGAUAAUGAACAAAU TTTG 645
Éxon 8 Humano 5 -1 UUUUAGAGUCUCAAAUAUAGAAAC TTTG 646
Éxon 8 Humano 6 -1 UUUAGAGUCUCAAAUAUAGAAACC llll 647
Éxon 8 Humano 7 -1 UUAGAGUCUCAAAUAUAGAAACCA llll 648
Éxon 8 Humano 8 1 UUGAGACUCUAAAAGGAUAAUGAA TTTG 649
Éxon 8 Humano 9 1 UUUGGUUUCUAUAUUUGAGACUCU llll 650
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227/259
Éxon 8 Humano 10 1 UUUUGGUUUCUAUAUUUGAGACUC TTTA 651
Éxon 8 Humano 11 -1 AGCAUUGAAGCCAUCCAGGAAGUG TTTC 652
Éxon 8 Humano 12 1 GCUUCAAUGCUCACUUGUUGAGGC I I I I 653
Éxon 8 Humano 13 1 GGCUUCAAUGCUCACUUGUUGAGG TTTG 654
Éxon 8 Humano 14 -1 AGUGGAAAUGUUGCCAAGGCCACC TTTA 655
Éxon 8 Humano 15 -1 GUUGCCAAGGCCACCUAAAGUGAC TTTA 656
Éxon 8 Humano 16 -1 GAAGAACAUUUUCAGUUACAUCAU TTTG 657
Éxon 8 Humano 17 -1 AUCAAAUGCACUAUUCUCAACAGG TTTA 658
Éxon 8 Humano 18 1 AUAGUGCAUUUGAUGAUGUAACUG I I I I 659
Éxon 8 Humano 19 1 AAUAGUGCAUUUGAUGAUGUAACU TTTC 660
Éxon 8 Humano 20 -1 ACUAUUCUCAACAGGUAAAGUGUG TTTA 661
Éxon 8 Humano 21 1 UACCUAAAAAUGCAUAUAAAACAG I I I I 662
Éxon 8 Humano 22 1 AUACCUAAAAAUGCAUAUAAAACA TTTC 663
Éxon 8 Humano 23 1 CACGUAAUACCUAAAAAUGCAUAU I I I I 664
Éxon 8 Humano 24 1 GCACGUAAUACCUAAAAAUGCAUA TTTA 665
Éxon 8 Humano 25 1 auauauauGUGCACGUAAUACCUA I I I I 666
Éxon 8 Humano 26 1 uauauauauGUGCACGUAAUACCU I I I I 667
Éxon 8 Humano 27 1 auauauauauGUGCACGUAAUACC TTTA 668
Éxon 55 Humano 1 -1 CUGCACAAUAUUAUAGUUGUUGCU TTTA 669
Éxon 55 Humano 2 1 AUAAAAAGAGAAAGAUGGAGGAAC TTTA 670
Éxon 55 Humano 3 1 CACCUAGUGAACUCCAUAAAAAGA TTTC 671
Éxon 55 Humano 4 1 AUGGUGCACCUAGUGAACUCCAUA I I I I 672
Éxon 55 Humano 5 1 AAUGGUGCACCUAGUGAACUCCAU I I I I 673
Éxon 55 Humano 6 1 GAAUGGUGCACCUAGUGAACUCCA TTTA 674
Éxon 55 Humano 7 1 GACCAAAUGUUCAGAUGCAAUUAU TTTA 675
Éxon 55 Humano 8 1 UCGCUCACUCACCCUGCAAAGGAC TTTG 676
Éxon 55 Humano 9 -1 AGUGAGCGAGAGGCUGCUUUGGAA TTTC 677
Éxon 55 Humano 10 1 GCAGCCUCUCGCUCACUCACCCUG TTTG 678
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Éxon 55 Humano 11 1 UUGCAGUAAUCUAUGAGUUUCUUC TTTG 679
Éxon 55 Humano 12 -1 CUGCAACAGUUCCCCCUGGACCUG TTTC 680
Éxon 55 Humano 13 -1 UGCAACAGUUCCCCCUGGACCUGG I I I I 681
Éxon 55 Humano 14 -1 UUUCUUGCCUGGCUUACAGAAGCU TTTC 682
Éxon 55 Humano 15 1 UUUCAGCUUCUGUAAGCCAGGCAA TTTC 683
Éxon 55 Humano 16 -1 GUCCUACAGGAUGCUACCCGUAAG TTTC 684
Éxon 55 Humano 17 -1 GGCUCCUAGAAGACUCCAAGGGAG TTTA 685
Éxon 55 Humano 18 -1 GCUCCUAGAAGACUCCAAGGGAGU I I I I 686
Éxon 55 Humano 19 -1 CUCCAAGGGAGUAAAAGAGCUGAU TTTC 687
Éxon 55 Humano 20 1 UGGAUCCACAAGAGUGCUAAAGCG TTTC 688
Éxon 55 Humano 21 1 GUUCAAUUGGAUCCACAAGAGUGC TTTA 689
Éxon 55 Humano 22 -1 UACUUGUAACUGACAAGCCAGGGA TTTG 690
Éxon 55 Humano 23 -1 ACUUGUAACUGACAAGCCAGGGAC I I I I 691
Éxon 55 Humano 24 -1 GUAACUGACAAGCCAGGGACAAAA TTTG 692
Éxon 55 Humano 25 -1 UAACUGACAAGCCAGGGACAAAAC I I I I 693
Éxon 55 Humano 26 1 UCCCUGGCUUGUCAGUUACAAGUA TTTG 694
Éxon 51 G1 Humano 1 CAGAGUAACAGUCUGAGUAGGAGc TTTA 695
Éxon 51 G2 Humano 1 uacuuuguuuagcaauacauggua TTTC 696
Éxon 51 G3 Humano -1 uggcucaaauuguuacucuucaau TTTA 697
Éxon 23-G1 de camundongo 1 CUUUCAAagaacuuugcagagccu TTTG 698
Éxon 23-G2 de camundongo 1 guugaaGCCAUUUUGUUGCUCUUU TTTG 699
Éxon 23-G3 de camundongo 1 guugaaGCCAUUUUAUUGCUCUUU TTTG 700
Éxon 23-G4 de camundongo -1 uuuugagGCUCUGCAAAGUUCUUU TTTC 701
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Éxon 23-G5 de camundongo -1 aguuauuaaugcauagauauucag TTTA 702
Éxon 23-G6 de camundongo -1 uauaauaugcccuguaauauaaua TTTC 703
Éxon 23-G7 de camundongo 1 uaaaggccaaaccucggcuuaccU TTTC 704
Éxon 23-G8 de camundongo 1 ucaauaucuuugaaggacucuggg TTTA 705
* Nesta tabela, as letras maiúsculas representam sgRNA nucleotídeos que se alinham com a sequência do éxon do gene. As letras minúsculas representam sgRNA nucleotídeos que se alinham com a sequência do intron do gene.
VI. Tabelas de Sequências
Tabela 8: Sítios genômicos alvos para sgRNA no éxon 51 do Dmd de camundongo
ID do sgRNA Filamento Sítio alvo SEQ ID NO: PAM
Ex51-SA1 3’ AGAGTAACAGTCTGACTGG 706 CAG
Ex51-SD 5’ GAAATGATCATCAAACAGA 707 AGG
Ex51-SA-2 3’ CACTAGAGTAACAGTCTGAC 708 TGG
Tabela 9: Sequências de gRNA que se direcionam ao éxon 51 do Dmd de camundongo
ID do sgRNA Filamento Sítio alvo SEQ ID NO: PAM
Ex51-SA1 3’ CCAGUCAGACUGUUACUCU 709 CAG
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Ex51-SD 5’ UCUGUUUGAUGAUCAUUUC 710 AGG
Ex51-SA-2 3’ GUCAGACUGUUACUCUAGUG 711 TGG
Tabela 10: Sequências genômicas alvos para sgRNAs que se direcionam ao éxon 51 do Dmd humano
ID do sgRNA Filamento Sítio alvo SEQ ID NO: PAM
Ex51-SA 3’ AGAGTAACAGTCTGAGTAG 712 GAG
Ex51-SD 5’ GAGATGATCATCAAGCAGA 713 AGG
Ex51-SA-2 3’ CACCAGAGTAACAGTCTGAG 714 TAG
Tabela 11: Sequências de sgRNA que se direcionam ao éxon 51 do Dmd humano
ID do sgRNA Filamento Sítio alvo SEQ ID NO: PAM
Ex51-SA 3’ CUACUCAGACUGUUACUCU 715 GAG
Ex51-SD 5’ UCUGCUUGAUGAUCAUCUC 716 AGG
Ex51-SA-2 3’ CUCAGACUGUUACUCUGGUG 717 TAG
Tabela 12: Sequências genômicas alvos para sgRNAs que se direcionam aos sítios em vários éxons do Dmd humano
ID do sgRNA Filamento Sítio alvo SEQ ID NO: PAM
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Éxon51-#1 3’ CAGAGTAACAGTCTGAGTAG 947 GAG
Éxon51-#2 3’ CACCAGAGTAACAGTCTGAG 718 TAG
Éxon51-#3 3’ TATTTTGGGTI I I IGCAAAA 719 AGG
Éxon51-#4 3’ AGTAGGAGCTAAAATATTTT 720 GGG
Éxon51-#5 3’ GAGTAGGAGCTAAAATATTT 721 TGG
Éxon51-#6 3’ ACCAGAGTAACAGTCTGAGT 722 AGG
Éxon51-#7 5’ TCCTACTCAGACTGTTACTC 723 TGG
Éxon51-#8 5’ TACTCTGGTGACACAACCTG 724 TGG
Éxon51-#9 3’ GCAGTTTCCTTAGTAACCAC 725 AGG
Éxon51-#10 5’ GACACAACCTGTGGTTACTA 726 AGG
Éxon51-#11 3’ TGTCACCAGAGTAACAGTCT 727 GAG
Éxon51-#12 3’ AGGTTGTGTCACCAGAGTAA 728 CAG
Éxon51-#13 3’ AACCACAGGTTGTGTCACCA 729 GAG
Éxon51-#14 3’ GTAACCACAGGTTGTGTCAC 730 CAG
Éxon53-#1 5’ ATTTAI I I I ICCI I I IATTC 731 TAG
Éxon53-#2 5’ TTTCCTTTTATTCTAGTTGA 732 AAG
Éxon53-#3 3’ TGATTCTGAATTCTTTCAAC 733 TAG
Éxon53-#4 3’ AATTCTTTCAACTAGAATAA 734 AAG
Éxon53-#6 5’ TTATTCTAGTTGAAAGAATT 735 CAG
Éxon53-#7 5’ TAGTTGAAAGAATTCAGAAT 736 CAG
Éxon53-#8 5’ AATTCAGAATCAGTGGGATG 737 AAG
Éxon53-#9 3’ ATTCTTTCAACTAGAATAAA 738 AGG
Éxon53-#10 5’ TTGAAAGAATTCAGAATCAG 739 TGG
Éxon53-#11 5’ TGAAAGAATTCAGAATCAGT 740 GGG
Éxon53-#12 3’ ACTGTTGCCTCCGGTTCTGA 741 AGG
Éxon44-#1 3’ CAGATCTGTCAAATCGCCTG 742 CAG
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Éxon44-#2 3’ AAAACGCCGCCATTTCTCAA 743 CAG
Éxon44-#3 3’ AGATCTGTCAAATCGCCTGC 744 AGG
Éxon44-#4 3’ TATGGATCAAGAAAAATAGA 745 TGG
Éxon44-#5 3’ CGCCTGCAGGTAAAAGCATA 746 TGG
Éxon44-#6 5’ ATCCATATGCTTTTACCTGC 747 AGG
Éxon44-#8 5’ TTGACAGATCTGTTGAGAAA 748 TGG
Éxon44-#9 5’ ACAGATCTGTTGAGAAATGG 749 CGG
Éxon44-#11 5’ GGCGATTTGACAGATCTGTT 750 GAG
Éxon44-#13 5’ GGCGTTTTCATTATGATATA 751 AAG
Éxon44-#14 5’ ATGATATAAAGATATTTAAT 752 CAG
Éxon44-#15 5’ GATATTTAATCAGTGGCTAA 753 CAG
Éxon44-#16 5’ ATTTAATCAGTGGCTAACAG 754 AAG
Éxon44-#17 3’ AGAAACTGTTCAGCTTCTGT 755 TAG
Éxon43-#1 5’ GTTTTAAAAI I I ITATATTA 756 CAG
Éxon43-#2 5’ I I I IATATTACAGAATATAA 757 AAG
Éxon43-#3 5’ ATATTACAGAATATAAAAGA 758 TAG
Éxon45-#1 3’ GTTCCTGTAAGATACCAAAA 759 AGG
Éxon45-#2 5’ TTGCCI I I ITGGTATCTTAC 760 AGG
Éxon45-#3 5’ TGGTATCTTACAGGAACTCC 761 AGG
Éxon45-#4 5’ ATCTTACAGGAACTCCAGGA 762 TGG
Éxon45-#5 3’ GCCGCTGCCCAATGCCATCC 763 TGG
Éxon45-#6 5’ CAGGAACTCCAGGATGGCAT 764 TGG
Éxon45-#7 5’ AGGAACTCCAGGATGGCATT 765 GGG
Éxon45-#8 5’ TCCAGGATGGCATTGGGCAG 766 CGG
Éxon45-#9 5’ GTCAGAACATTGAATGCAAC 767 TGG
Éxon45-#10 3’ AGTTCCTGTAAGATACCAAA 768 AAG
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Éxon45-#11 3’ TGCCATCCTGGAGTTCCTGT 769 AAG
Éxon45-#12 5’ TTGGTATCTTACAGGAACTC 770 CAG
Éxon45-#13 3’ CGCTGCCCAATGCCATCCTG 771 GAG
Éxon45-#14 5’ AACTCCAGGATGGCATTGGG 772 CAG
Éxon45-#15 5’ GGGCAGCGGCAAACTGTTGT 773 CAG
Éxon52-#1 3’ AGATCTGTCAAATCGCCTGC 774 AGG
Éxon52-#2 3’ AATCCTGCATTGTTGCCTGT 775 AAG
Éxon52-#3 5’ CGCTGAAGAACCCTGATACT 776 AAG
Éxon52-#4 3’ GAACAAATATCCCTTAGTAT 777 CAG
Éxon52-#5 3’ CTGTAAGAACAAATATCCCT 778 TAG
Éxon52-#6 5’ CTAAGGGATATTTGTTCTTA 779 CAG
Éxon52-#8 5’ TGTTCTTACAGGCAACAATG 780 CAG
Éxon52-#9 5’ CAACAATGCAGGATTTGGAA 781 CAG
Éxon52-#10 5’ ACAATGCAGGATTTGGAACA 782 GAG
Éxon52-#11 5’ ATTTGGAACAGAGGCGTCCC 783 CAG
Éxon52-#12 5’ ACAGAGGCGTCCCCAGTTGG 784 AAG
Éxon2-#1 5’ TAT I I I I I IATTTTGCATTT 785 TAG
Éxon2-#2 5’ TTAI I I IGCATTTTAGATGA 786 AAG
Éxon2-#3 5’ AI I I IGCATTTTAGATGAAA 787 GAG
Éxon2-#4 5’ TTGCAI I I IAGATGAAAGAG 788 AAG
Éxon2-#5 5’ ATGAAAGAGAAGATGTTCAA 789 AAG
Tabela 13: Sequências de gRNA para o direcionamento aos sítios em vários éxons do Dmd humano
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ID do sgRNA Filamento Sítio alvo SEQ ID NO: PAM
Éxon51-#1 3’ CUACUCAGACUGUUACUCUG 790 GAG
Éxon51-#2 3’ CUCAGACUGUUACUCUGGUG 791 TAG
Éxon51-#3 3’ UUUUGCAAAAACCCAAAAUA 792 AGG
Éxon51 -#4 3’ AAAAUAUUUUAGCUCCUACU 793 GGG
Éxon51-#5 3’ AAAUAUUUUAGCUCCUACUC 794 TGG
Éxon51-#6 3’ ACUCAGACUGUUACUCUGGU 795 AGG
Éxon51-#7 5’ GAGUAACAGUCUGAGUAGGA 796 TGG
Éxon51-#8 5’ CAGGUUGUGUCACCAGAGUA 797 TGG
Éxon51-#9 3’ GUGGUUACUAAGGAAACUGC 798 AGG
Éxon51-#10 5’ UAGUAACCACAGGUUGUGUC 799 AGG
Éxon51-#11 3’ AGACUGUUACUCUGGUGACA 800 GAG
Éxon51-#12 3’ UUACUCUGGUGACACAACCU 801 CAG
Éxon51-#13 3’ UGGUGACACAACCUGUGGUU 802 GAG
Éxon51-#14 3’ GUGACACAACCUGUGGUUAC 803 CAG
Éxon53-#1 5’ GAAUAAAAGGAAAAAUAAAU 804 TAG
Éxon53-#2 5’ UCAACUAGAAUAAAAGGAAA 805 AAG
Éxon53-#3 3’ GUUGAAAGAAUUCAGAAUCA 806 TAG
Éxon53-#4 3’ UUAUUCUAGUUGAAAGAAUU 807 AAG
Éxon53-#6 5’ AAUUCUUUCAACUAGAAUAA 808 CAG
Éxon53-#7 5’ AUUCUGAAUUCUUUCAACUA 809 CAG
Éxon53-#8 5’ CAUCCCACUGAUUCUGAAUU 810 AAG
Éxon53-#9 3’ UUUAUUCUAGUUGAAAGAAU 811 AGG
Éxon53-#10 5’ CUGAUUCUGAAUUCUUUCAA 812 TGG
Éxon53-#11 5’ ACUGAUUCUGAAUUCUUUCA 813 GGG
Éxon53-#12 3’ UCAGAACCGGAGGCAACAGU 814 AGG
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Éxon44-#1 3’ CAGGCGAUUUGACAGAUCUG 815 CAG
Éxon44-#2 3’ UUGAGAAAUGGCGGCGUUUU 816 CAG
Éxon44-#3 3’ GCAGGCGAUUUGACAGAUCU 817 AGG
Éxon44-#4 3’ UCUAUUUUUCUUGAUCCAUA 818 TGG
Éxon44-#5 3’ UAUGCUUUUACCUGCAGGCG 819 TGG
Éxon44-#6 5’ GCAGGUAAAAGCAUAUGGAU 820 AGG
Éxon44-#8 5’ UUUCUCAACAGAUCUGUCAA 821 TGG
Éxon44-#9 5’ CCAUUUCUCAACAGAUCUGU 822 CGG
Éxon44-#11 5’ AACAGAUCUGUCAAAUCGCC 823 GAG
Éxon44-#13 5’ UAUAUCAUAAUGAAAACGCC 824 AAG
Éxon44-#14 5’ AUUAAAUAUCUUUAUAUCAU 825 CAG
Éxon44-#15 5’ UUAGCCACUGAUUAAAUAUC 826 CAG
Éxon44-#16 5’ CUGUUAGCCACUGAUUAAAU 827 AAG
Éxon44-#17 3’ ACAGAAGCUGAACAGUUUCU 828 TAG
Éxon43-#1 5’ UAAUAUAAAAAUUUUAAAAC 829 CAG
Éxon43-#2 5’ UUAUAUUCUGUAAUAUAAAA 830 AAG
Éxon43-#3 5’ UCUUUUAUAUUCUGUAAUAU 831 TAG
Éxon45-#1 3’ UUUUGGUAUCUUACAGGAAC 832 AGG
Éxon45-#2 5’ GUAAGAUACCAAAAAGGCAA 833 AGG
Éxon45-#3 5’ GGAGUUCCUGUAAGAUACCA 834 AGG
Éxon45-#4 5’ UCCUGGAGUUCCUGUAAGAU 835 TGG
Éxon45-#5 3’ GGAUGGCAUUGGGCAGCGGC 836 TGG
Éxon45-#6 5’ AUGCCAUCCUGGAGUUCCUG 837 TGG
Éxon45-#7 5’ AAUGCCAUCCUGGAGUUCCU 838 GGG
Éxon45-#8 5’ CUGCCCAAUGCCAUCCUGGA 839 CGG
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Éxon45-#9 5’ GUUGCAUUCAAUGUUCUGAC 840 TGG
Éxon45-#10 3’ UUUGGUAUCUUACAGGAACU 841 AAG
Éxon45-#11 3’ ACAGGAACUCCAGGAUGGCA 842 AAG
Éxon45-#12 5’ GAGUUCCUGUAAGAUACCAA 843 CAG
Éxon45-#13 3’ CAGGAUGGCAUUGGGCAGCG 844 GAG
Éxon45-#14 5’ CCCAAUGCCAUCCUGGAGUU 845 CAG
Éxon45-#15 5’ ACAACAGUUUGCCGCUGCCC 846 CAG
Éxon52-#1 3’ GCAGGCGAUUUGACAGAUCU 847 AGG
Éxon52-#2 3’ ACAGGCAACAAUGCAGGAUU 848 AAG
Éxon52-#3 5’ AGUAUCAGGGUUCUUCAGCG 849 AAG
Éxon52-#4 3’ AUACUAAGGGAUAUUUGUUC 850 CAG
Éxon52-#5 3’ AGGGAUAUUUGUUCUUACAG 851 TAG
Éxon52-#6 5’ UAAGAACAAAUAUCCCUUAG 852 CAG
Éxon52-#8 5’ CAUUGUUGCCUGUAAGAACA 853 CAG
Éxon52-#9 5’ UUCCAAAUCCUGCAUUGUUG 854 CAG
Éxon52-#10 5’ UGUUCCAAAUCCUGCAUUGU 855 GAG
Éxon52-#11 5’ GGGACGCCUCUGUUCCAAAU 856 CAG
Éxon52-#12 5’ CCAACUGGGGACGCCUCUGU 857 AAG
Éxon2-#1 5’ ACAGAGGCGUCCCCAGUUGG 858 TAG
Éxon2-#2 5’ UCAUCUAAAAUGCAAAAUAA 859 AAG
Éxon2-#3 5’ UUUCAUCUAAAAUGCAAAAU 860 GAG
Éxon2-#4 5’ CUCUUUCAUCUAAAAUGCAA 861 AAG
Éxon2-#5 5’ UUGAACAUCUUCUCUUUCAU 862 AAG
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Tabela 14: Sequência de direcionamento genômico para sgRNAs que se direcionam
ao éxon 51 d o Dmdde cachorro
ID do sgRNA Filamento Sítio alvo SEQ ID NO: PAM
Ex51-SA- 2 3’ CACCAGAGTAACAGTCTGAC 863 TGG
Tabela 15: Sequência de gRNA para direcionamento ao éxon 51 do Dmdde cachorro
ID do sgRNA Filamento Sítio alvo SEQ ID NO: PAM
Ex51-SA- 2 3’ GUCAGACUGUUACUCUGGUG 864 TGG
VII. Exemplos [0270] Os exemplos a seguir são incluídos para demonstrar as modalidades preferidas da divulgação. Deve ser considerado pelos peritos na técnica que as técnicas divulgadas nos exemplos a seguir representam técnicas descobertas pelo inventor que funcionam bem na prática da divulgação e assim podem ser consideradas como constituindo os modos preferidos para sua prática. Entretanto, os peritos na técnica devem, à luz da presente divulgação, considerar que podem ser feitas muitas alterações nas modalidades específicas que são divulgadas e ainda obtêm um resultado parecido ou similar sem se afastar do espírito e do âmbito da divulgação.
EXEMPLO 1 - Materiais e Métodos
Aprovação do Estudo. Todos os procedimentos experimentais envolvendo animais neste estudo foram revisados e aprovados pelo University of Texas Southwestern Medical Center’s Institutional Animal Care and Use Committee.
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Deleção do éxon 50 mediada por CRISPR/Cas9 em camundongos. Dois RNA guias simples (sgRNA) específicos para a região intrônica que circunda a sequência do éxon 50 do lócus Dmd de camundongo foram clonados dentro do vetor px330 utilizando os iniciadores a seguir: Dmd exon 50_F1: 5’CACCGAAATGATGAGTGAAGTTATAT-3’ (SEQ ID NO: 926); Dmd exon 50_R1: 5’AAACATATAACTTCACTCATCATTTC-3’ (SEQ ID NO: 927); Dmd exon 50_F2: 5’ CACCGGTTTGTTCAAAAGCGTGGCT-3’ (SEQ ID NO: 928); Dmd exon 50_R2: 5’AAACAGCCACGCTTTTGAACAAAC-3’ (SEQ ID NO: 929).
[0271] Para a transcrição do sgRNA in vitro, a sequência do promotor T7 foi adicionada ao molde do sgRNA através de PCR utilizando os iniciadores a seguir: Dmd exon 50_T7-F1:
GAATTGTAATACGACTCACTATAGGAATGATGAGTGAAGTTATAT (SEQ ID NO:
930) ; Dmd exon 50_T7-F2:
GAATTGTAATACGACTCACTATAGGGTTTGTTCAAAAGCGTGGCT (SEQ ID NO:
931) ; Dmdexon 50_T7-Rv: AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC (SEQ ID NO: 932).
[0272] Os produtos da PCR purificados em gel foram utilizados como molde para a transcrição in vitro utilizando o MEGAshortscript T7 Kit (Life Technologies). O sgRNA foi purificado através do MEGAclear Kit (Life Technologies) e eluído com água livre de nucleases (Ambion). A concentração de RNA guia foi medida através de um equipamento NanoDrop (Thermo Scientific).
Genotipagem de camundongos ΔΕχ50. Os camundongos ΔΕχ50 foram genotipados utilizando iniciadores que abrangem a região alvo: Geno50-F: 5’GGATTGACTGAAATGATGGCCAAGG-3’ (SEQ ID NO: 937); Geno50-R: 5’CTGCCACGATTACTCTGCTTCCAG-3’ (SEQ ID NO: 938). Biópsias das caudas foram digeridas em 100 pL de 25 mM de NaOH, 0,2 mM de EDTA (pH 12) durante 20 min a 95 °C. As caudas foram brevemente centrifugadas seguida pela adição de 100 pL de 40 mM de Tris-HCI (pH 5) e misturadas para homogeneizar. Dois microlitros desta reação foram utilizados para as reações de PCR subsequentes com os iniciadores abaixo, seguidas por eletroforese em gel.
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Plasmídeos. O plasmídeo pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) contendo o gene SpCas9 com otimização de códon humano com 2A-EGFP e a estrutura de sgRNA foi obtido na Addgene (Plasmídeo #48138). Os plasmídeos AAV TRIPSR foram obtidos com o Dr. Dirk Grimm (Heidelberg University Hospital). A clonagem de sgRNA foi realizada utilizando um sítio de Bbsl. O plasmídeo pGL3-CK8e foi obtido com o Dr. Stephen Hauschka (Department of Biochemistry, University of Washington, Seattle, USA). O plasmídeo AAV-miniCMV-Cas9-shortPolyA foi obtido com o Dr. Dirk Grimm (Heidelberg University Hospital). Para produzir o vetor AAV9-CK8-CRISPR/Cas9 final utilizado neste manuscrito, o AAV-miniCMV-Cas9-short-PolyA foi digerido com as enzimas Pad e Nhel para remover o promotor miniCMV. O promotor CK8 foi amplificado partindo do plasmídeo pGL3-CK8e utilizando iniciadores contendo as sequências dos sítios de Pad e Nhel e clonado no vetor digerido para gerar o plasmídeo AAV-CK8-Cas9-shortPolyA.
Identificação e Clonagem de sgRNA para pular o éxon 51. Os RNA guias do éxon 51 de Dmdforam definidos utilizando crispr.mit.edu. As sequências guias foram clonadas no plasmídeo Addgene #42230 (6), um presente de Feng Zhang, utilizando os iniciadores a seguir: Dmd exon 51_F1: 5'- CACCGAGAGTAACAGTCTGACTGG 3’ (SEQ ID NO: 942); Dmd exon 51_R1: 5'- AAACGTCAGACTGTTACTCTAGTGC-3' (SEQ ID NO: 943); Dmd exon 51_F2: 5'- CACCGCACTAGAGTAACAGTCTGAC -3' (SEQ ID NO: 944); Dmd exon 51_R2: 5'- AAACCCAGTCAGACTGTTACTCTC -3' (SEQ ID NO: 945). As sequências guias foram testadas em cultura utilizando células 10T1/2 antes da clonagem na estrutura de AAV.
Montagem de sgRNA em triplicata na estrutura de AAV utilizando o sistema Golden Gate. A montagem do sistema de clonagem da estrutura de AAV TRISPR se baseia em duas etapas consecutivas de Golden Gate Assembly. Primeira etapa montagem do gRNA dentro do plasmídeo doador. O anelamento é realizado através do aquecimento de uma reação contendo 2,5 pL de cada oligo (0,5 μΜ), 5 pL de NEBuffer 2 (NEB) e 40 pL de ddH2Ü a 95 °C durante 5 minutos utilizando bloco de aquecimento. Para a reação de montagem dentro do plasmídeo doador misturar 40
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240/259 fmoles (-100 ng) da estrutura de destino, 1 μΙ_ de oligos anelados diluídos, 0,75 μΙ_ de Esp3l, 1 pl_ de tampão tango (ambos da Thermo Scientific), 1 pL de T4 DNA Ligase (400 U/pL) (NEB) bem como ATP e DTT a uma concentração final de 1 mM no volume total de 10 pL. Utilizando um termociclador, realizar 25 a 50 ciclos de 37°C/3 min seguidos por 20 °C/5 minutos. Desnaturar a enzima de restrição e a ligase através do aquecimento a 80 °C durante 20 minutos. Utilizar 3 pL desta reação para transformação de bactérias quimio competentes, recuperar em SOC (37 °C, 800 rpm, 40 min) e espalhar sobre placas de LB-Agar contendo cloranfenicol (25 pg/mL). Os oligonucleotídeos anelados que codificam o sgRNA são clonados dentro dos plasmídeos doadores que carregam o marcador de seleção negativa ccdB (para reduzir o “ruído” durante a clonagem) bem como o gene de resistência ao cloranfenicol. Para testar a montagem correta o plasmídeo é sequenciado utilizando o iniciador Dono-R-5’-GTATGTTGTGTGGAATTGTGAG-3’ (SEQ ID NO: 948). A segunda etapa é que três destes plasmídeos doadores que controlam a expressão de um sgRNA sob o controle transcricional do promotor U6, H1 ou 7SK são agrupados em uma segunda montagem com Golden Gate junto com um plasmídeo receptor que carrega AAV ITRs. A reação de montagem conterá todos os quatro plasmídeos: plasmídeo doador-#1-U6-sgRNA, plasmídeo doador-#2-H1-sgRNA, plasmídeo doador-#3-7SK-sgRNA e plasmídeo receptor contendo a ITR. A digestão com Bbsl irá gerar pontas penduradas únicas para cada fragmento (U6, H1, 7SK, estrutura receptora). Durante o procedimento de ligação, o anelamento destas pontas penduradas com um plasmídeo circularizado é obtido apenas quando os três cassetes se combinam um com os outros.
Medida da creatina quinase no soro (CK). A CK no soro de camundongos foi medida pelo Metabolic Phenotyping Core at UT Southwestern Medical Center. O sangue foi coletado da veia submandibular e o nível de CK no soro foi medido por VITROS Chemistry 7 Products CK Slides para medir quantitativamente a atividade de CK utilizando VITROS 250 Chemistry System.
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Estudos in vivo em cachorros. Foram realizadas injeções intramusculares (IM) em cachorros ΔΕ50 MD de 1 mês de idade sob anestesia geral ventilada. Foi realizada uma única injeção em 4 locais diferentes no músculo tibial cranial esquerdo. Todos os cachorros receberam pré-medicação de um opiato (buprenorfina), antibiose perioperatória e 4 dias de analgesia pós-operatória (carprofeno). Dois cachorros afetados receberam rAAV misturado com componentes de mioedição, AAV-Cas9 e AAV-sgRNA-ex51, que foram preparados em solução de Ringer com lactato a uma concentração final de 1 E13vg por músculo injetado.
EXEMPLO 2 - Resultados
Um modelo de DMD humanizado. A região de mutação “hot spot” mais comum nos pacientes com DMD é a região entre os éxons 45 a 51 e o pulo do éxon 51 podería ser utilizado para tratar o grupo maior (13-14%) de pacientes. Para investigar pulo do éxon 51 mediado por CRISPR/Cas9 in vivo, os inventores geraram um modelo de camundongo que imita a região “hot spot” humana através da deleção do éxon 50 utilizando o sistema CRISPR/Cas9 direcionado por 2 sgRNAs (FIG. 1A). A deleção do éxon 50 foi confirmada pelo sequenciamento do DNA (FIG. 1B). A deleção do éxon 50 colocou o gene da distrofina fora de quadro levando à ausência da proteína distrofina no músculo esquelético e no coração (FIGS. 1C-E). Os camundongos que não possuíam o éxon 50 exibiram alterações musculares distróficas pronunciadas aos 2 meses de idade (FIG. 1E). A análise do soro de camundongos delta-éxon 50 mostrou um aumento significativo nos níveis de creatina quinase (CK), indicativo de danos nos músculos (FIG. 1F). Considerados juntos, a expressão da proteína distrofina, a histologia dos músculos e os níveis de CK no soro validaram o fenótipo distrófico do modelo de camundongosAEx50.
Restauração da expressão da distrofina utilizando a estratégia de um único corte para pular o éxon 51. A Cas9 de S. pyogenes requer NAG/NGG como uma sequência PAM para gerar uma quebra de DNA de filamento duplo. De forma interessante, os sítios aceitadores e doadores de splice universais dos éxons contêm NAG ou NGG (FIG. 3B). Portanto, para corrigir o quadro de leitura e a expressão da
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242/259 distrofina no modelo de camundongos ΔΕχ50, os inventores geraram sgRNA que se direcionava aos sítios aceitadores e doadores de splice do éxon 51 para deleta-lo, recriando assim a proteína distrofina em quadro. Para testar se os sgRNAs guias eram capazes de cortar eficientemente, os inventores avaliaram primeiro sua efetividade nas linhagens de células de camundongos e humanas (FIG. 5). Para determinar a maneira mais eficiente para corrigir o quadro de leitura de DMD, os inventores compararam 2 estratégias diferentes: (1) estratégia de guia duplo na qual uma cópia de um primeiro sgRNA que se direciona ao sítio aceitador de splice (sgRNA-SA) e uma cópia de um segundo sgRNA que se direciona ao sítio aceitador do doador (sgRNA-SD) foram clonadas no vetor rAAV9-sgRNA; (2) estratégia em triplicata na qual os inventores clonaram 3 cópias do mesmo sgRNA (sgRNA-SA) no vetor rAAV9sgRNA (FIG. 3C). A expressão de cada cópia de sgRNA-AS foi controlada por um promotor de RNA diferente (U6, H1 e 7SK). Os inventores geraram AAV-Cas9 utilizando um vetor AAV-Cas9 (CK8-Cas9-shortPolyA), que emprega um promotor CK8 para controlar a expressão da SpCas9 humanizada especificamente nos tecidos de músculo esquelético e do coração. Após injeção intramuscular (IM) de camundongos P12 com AAVs, foram analisados os tecidos musculares. A RT-PCR do RNA de camundongos ΔΕχ50 injetados com AAV-Tri-SA e AAV-SA+SD mostrou que a deleção do éxon 51 (ΔΕχ50-51) permitiu o splicing do éxon 49 em 52 (FIG. 2A, banda inferior). O sequenciamento dos produtos de RT-PCR da banda de ΔΕχ50-51 confirmou que o éxon 49 sofreu splice no éxon 52 (FIG. 2B). De forma inesperada, a análise de RT-PCR mostrou que a estratégia de um único corte utilizando uma versão em triplicata de sgRNA-SA (AAV-Tri-SA) é tão eficiente quanto a utilização de dois sgRNAs - sgRNA-SA e sgRNA-SD (AAV-SA+SD).
[0273] Para avaliar adicionalmente a eficiência da estratégia de edição com AAV-Tri-SA, os inventores realizaram uma análise histológica do músculo injetado para avaliar o número de fibras que expressa distrofina ao longo de seções musculares inteiras. De forma interessante, a imunocoloração da distrofina de criosseções musculares de camundongos ΔΕχ50 que receberam injeção de AAV-Tri
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SA revelou números significativamente mais altos de fibras positivas para distrofina (média de 43 ± 0,9%) comparadas com o músculo de camundongos ΔΕχ50 que receberam injeção de AAV-SA+SD (média de 31 ± 0,1%) (FIGS. 3D-E, FIG. 6). A análise de Western blot confirmou a restauração da expressão da distrofina no músculo esquelético. (FIGS. 3F-G). A coloração com hematoxilina e eosina (H&E) do músculo mostrou que as características histopatológicas da distrofia muscular, tais como miofibras necróticas, foram reduzidas no músculo TA 3 semanas após o fornecimento de AAV (FIG. 4A). A análise quantitativa da distribuição de áreas de miofibras mostrou um aumento evidente no tamanho das fibras para músculos tratados tanto com AAV-Tri-SA quanto com AAV-SA-SD comparados com músculos ΔΕχ50 (FIG. 4B). Entretanto, os músculos tratados com AAV-Tri-SA revelaram uma redução maior na frequência de fibras pequenas (<500 pm) comparados com músculos tratados com AAV-SA+SD. Juntos, estes resultados demonstram que o direcionamento para o sítio aceitador de splice do éxon 51 com um único corte utilizando AAV-Tri-SA é altamente eficiente na restauração da expressão da distrofina na DMD. Esta abordagem possui utilidade para muitos transtornos que podem ser corrigidos pelo pulo de éxons.
Customização da estratégia de edição genômica de um único corte de DNA. A Cas9 de S. pyogenes guiada por sgRNAs se liga ao lócus genômico alvo próximo de um PAM e gera uma quebra de DNA de filamento duplo (DSB) 3 nucleotídeos antes da sequência de PAM. Para avaliar adicionalmente a eficiência do método através do direcionamento para o sítio aceitador de splice, os inventores projetaram uma segunda construção guia tripla de sgRNA (sgRNA-ex51-SA2), que se direciona para uma região adjacente ao sítio aceitador de splice do éxon 51. Este gRNA utiliza uma sequência de PAM 3 nucleotídeos mais para dentro do éxon para gerar a DSB próxima do sítio aceitador de splice para o éxon 51 (FIG. 7A-FIG. 7B). O corte na vizinhança da região aceitadora de splice e dentro da sequência do éxon resultou em eventos de reenquadramento e eventos de pulo do éxon. Além disso, o planejamento
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244/259 do sgRNA na sequência do éxon que exibe maior conservação que a sequência do íntron ao longo das espécies facilita a tradução do sgRNA para outras espécies.
[0274] A atividade de corte de DNA de Cas9 acoplada ao sgRNA-ex51 SA2 foi avaliada em fibroblastos de camundongos 10T1/2 utilizando o ensaio da endonuclease I de T7 (T7E1) específica para pareamentos errados (FIG. 8A). Para investigar o tipo de mutações gerado pela Cas9 acoplada ao sgRNA-51-SA2, foi realizada a análise de sequenciamento genômico profundo. A análise de sequenciamento revelou que 9,3% das mutações continham a inserção de uma única adenosina (A) localizada 3 nucleotídeos a 3’ da sequência de PAM. Em adição, 7,3% das mutações continham deleções que cobram o sítio aceitador de splice e um sítio intensificador de splice exônico altamente previsto para o éxon 51 (FIG. 8B). O sgRNA-ex51-SA2 corresponde a uma região altamente conservada do gene Dmd (FIGS. 8C-D) e os inventores testaram a capacidade de Cas9 e sgRNA-51 humano de cortar o lócus de Dmd humano nas células 293T. O ensaio de T7E1 revelou divagem clara no sítio previsto (FIG. 8E). Similarmente, a análise de sequência revelou que a Cas9 acoplada ao sgRNA-ex51-SA2 humano gerou a mesma inserção de adenosina (A) e uma faixa diferente de deleções em torno do sítio de divagem (FIG. 8F).
[0275] Para o fornecimento in vivo de Cas9 e sgRNA-ex51-SA2 nos tecidos muscular esquelético e cardíaco, foi utilizado o vírus associado a adeno 9 (AAV9), que exibe tropismo preferencial para estes tecidos. Para aumentar adicionalmente a expressão específica para os músculos, foi empregado um vetor AAV9-Cas9 (CK8e-Cas9-shortPolyA), que contém um cassete regulador de CK específico para os músculos, referido como o promotor CK8e, que é altamente específico para expressão no músculo e no coração (FIG. 9A). Juntos, este cassete específico para os músculos de 436 pb e o cDNA de Cas9 de 4101 pb estão dentro do limite de empacotamento do AAV9. A expressão de cada sgRNA foi controlada por um dos três promotores da RNA polimerase III (U6, H1 e 7SK) (FIG. 9B).
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Correção do quadro de leitura da distrofina em camundongos ΔΕχ50 por um único corte de DNA. O sgRNA-ex51-SA2 foi fornecido aos camundongos em cópia tripla (AAV-Tri-SA2), junto com uma Cas9 (AAV-Cas9), através de injeção intramuscular (IM). Após a injeção, os tecidos musculares foram analisados. A eficiência de direcionamento in vivo foi estimada por RT-PCR com iniciadores para sequências no éxons 48 e 53 e o ensaio de T7E1 para as regiões genômicas alvos. Para investigar se a divagem alvo eficiente foi conseguida, os inventores amplificaram uma região de 771 pb que abrange o sítio alvo e a analisaram utilizando o ensaio de T7EI (FIG. 10A). A atividade de SpCas9 com o sgRNA correspondente foi analisada no sítio alvo. Os ensaios de T7EI revelaram mutagênese do lócus Dmd após o fornecimento de AAV-Cas9 e AAV9-sgRNA-51-SA2 (FIG. 10A). Para investigar o tipo de mutações gerado nos camundongos ΔΕχ50 que receberam injeção de Cas9 e AAV9s expressando sgRNA, os produtos de amplificação genômica da PCR abrangendo o sítio alvo foram analisados através da análise de sequenciamento profundo dos amplicons. O sequenciamento profundo da região alvo indicou que 27,9% das leituras totais continham alterações no sítio genômico alvo (FIG. 10B). Em média, 15% das mutações identificadas continham a mesma inserção de A observada nas linhagens de células 10T1/2 de camundongo e 293 humana in vitro. As deleções identificadas utilizando este método abrangiam um sítio intensificador de splicing exônico altamente previsto para o éxon 51 (FIG. 10B).
[0276] Os produtos da RT-PCR do RNA proveniente do músculo de camundongos ΔΕχ50 que receberam injeção intramuscular de AAV9-Cas9 e AAV9sgRNA-51 mostraram que a deleção do éxon 51 (ΔΕχ50-51) permitiu o splicing do éxon 49 no 52 (FIG. 11 A, banda inferior). Através dos produtos de sequenciamento da RT-PCR da banda ΔΕχ50-51, foi confirmado que o éxon 49 sofreu splice no éxon 52. Para definir adicionalmente as mutações introduzidas pela estratégia de edição gênica dos presentes inventores, os produtos da amplificação da RT-PCR de 4 amostras foram submetidos diretamente à clonagem de timidina a adenosina baseada na topoisomerase (TOPO-TA) sem purificação em gel e então sequenciados.
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Surpreendentemente, a análise das sequências de 40 clones de cada amostra mostrou que em adição aos produtos de cDNA com pulo do éxon 51 (ΔΕχ50-51) identificados em 15% dos clones sequenciados, os camundongos ΔΕχ50 que receberam injeção de AAV9-Cas9 e AAV9-sgRNA-51 exibiram uma alta frequência de eventos de reenquadramento. Dos clones sequenciados, 63% continha a inserção de um único nucleotídeo na sequência do éxon 51 (FIGS. 11 B-C). A mutação de inserção mais dominante observada era uma inserção de A.
[0277] Nos géis, a inserção de A era indistinguível em relação ao tamanho dos produtos de cDNA não editados, dessa maneira a análise de sequenciamento profundo foi realizada para determinar a abundância desta inserção comparada com outras inserções pequenas. O sequenciamento profundo da banda superior contendo o produto de cDNA não editado e os produtos de cDNA reenquadrados indicou que 69,22% das leituras totais continham produtos de cDNA reenquadrados com uma inserção de A, 17,71% continham o produto de cDNA não editado e o restante continha deleções e inserções pequenas (FIG. 11 D). A análise de sequenciamento profundo de camundongos ΔΕχ50 que não receberam injeção confirmou que a inserção de A é um resultado da edição gerada por Cas9. Estes resultados do sequenciamento profundo dos amplicons confirmaram os resultados da clonagem de TOPO-TA e do sequenciamento. Considerados juntos, a análise de RTPCR revelou que os camundongos ΔΕχ50 que receberam injeção de AAV9-Cas9 e AAV9-sgRNA-51-SA2 exibiam uma alta frequência de eventos de reenquadramento com os produtos de cDNA contendo uma inserção de A na sequência do éxon 51 em adição aos eventos de pulo do éxon 51 resultantes da deleção em uma região intensificadora de splicing exônico altamente conservada.
Restauração da expressão da distrofina após fornecimento com AAV9 intramuscular de Cas9 e sgRNA-51-SA2. Notavelmente, a imunocoloração da distrofina de criosseções musculares de camundongos ΔΕχ50 que receberam injeção de AAV-Tri-SA2 revelou números significativamente mais altos de fibras positivas para distrofina com uma média de 99% restauração de fibras normais (FIG. 12A, FIG.
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13). A análise de Western blot confirmou a restauração da expressão da distrofina no músculo esquelético. (FIG. 12C, FIG. 12D). A coloração com hematoxilina e eosina (H&E) do músculo mostrou que as características histopatológicas da distrofia muscular, tais como miofibras necróticas, foram corrigidas no músculo TA 3 semanas após o fornecimento de AAV (FIG. 12B e FIG. 14). Este método, utilizando um projeto de sgRNA distinto, representa um avanço importante na eficiência da correção da DMD com aplicabilidade direta para os pacientes com as mutações de distrofina mais comuns.
Recuperação da expressão da distrofina após injeções intramusculares de AAV9-Cas9 combinadas com AAV9s diferentes que expressam cópia única ou cópia tripla de sgRNA. Para avaliar o benefício da expressão com promotores triplos de sgRNA-ex51-SA2 in vivo, foram investigadas construções diferentes, nas quais a expressão de sgRNA foi controlada por um único promotor da RNA polimerase III (U6 ou H1 ou 7SK) e, separadamente, por três promotores da RNA polimerase III (U6, H1 e 7SK) (FIG. 15A). Os inventores forneceram o sgRNA-ex51-SA2 em cópia única controlado separadamente pelo promotor U6 (AAV9-U6-sgRNA-51-SA2), pelo promotor H1 (AAV9-H1-sgRNA-51-SA2), pelo promotor 7SK (AAV9-7SK-sgRNA-51SA2) e cópia tripla (AAV9-Triple-sgRNA-51-SA2). Após a injeção intramuscular (IM) de camundongos P12 com AAV9s, os tecidos musculares foram analisados. De forma inesperada, a imunocoloração da distrofina de criosseções musculares de camundongos ΔΕχ50 que receberam injeção de AAV9-Triple-sgRNA-51-SA2 revelou números significativamente mais altos de fibras positivas para distrofina com uma média de 95% de restauração das fibras normais comparados com camundongos ΔΕχ50 que receberam injeção de AAV9-U6-sgRNA-51-SA2, AAV-H1-sgRNA-51-SA2 e AAV-7SK-sgRNA-51 -SA2 com uma média de 70%; 40% e 50% de restauração das fibras normais respectivamente (FIGS. 15B).
Recuperação da estrutura e da função dos músculos após o fornecimento sistêmico de AAV9-Cas9 e AAV9-sgRNA-51-SA2. O fornecimento sistêmico de AAV9-Cas9 e AAV9-sgRNA-51-SA2 aos camundongos P4 ΔΕχ50 produziu a
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248/259 expressão amplamente difundida da distrofina no coração, nos triceps, no músculo tibial anterior (TA) e no diafragma nos camundongos ΔΕχ50 com gene editado 4 e 8 semanas após a injeção (FIG. 16A e FIG. 17A). A análise de Western blot confirmou a restauração da expressão da distrofina nos músculos esqueléticos e cardíacos (FIG. 16B e FIG. 17B). O teste de força de preensão também mostrou um aumento significativo na força muscular de camundongos ΔΕχ50 4 semanas após a injeção intraperitoneal de AAV9 comparados com os camundongos ΔΕχ50 de controle (controle do tipo selvagem 92,6±1,63; controle de ΔΕχ50 50,5±1,85; AEx50-AAV9sgRNA-51 79,7±2,63) (FIG. 18A). De forma consistente, os camundongos ΔΕχ50 com gene editado com AAV9-sgRNA-51 -SA2 também exibiram reduções significativas nas concentrações de CK no soro comparados com os camundongos ΔΕχ50 de controle (FIG. 18B).
Correção da expressão da distrofina em um modelo de cachorro de distrofia muscular de Duchenne. Para avaliar adicionalmente a eficiência e o potencial terapêutico desta nova abordagem, os inventores investigaram a correção da mutação que causa a doença em um modelo de cachorro de DMD, o cachorro ΔΕ50MD, que carrega uma mutação de sentido errado no sítio doador de splice a 5’ do éxon 50 que resulta na deleção do éxon 50 ((Walmsley etal., 2010). O cachorro ΔΕ50MD é um modelo de cachorro ideal para a investigação da edição gênica como uma abordagem para corrigir permanentemente as mutações de DMD mais comuns em humanos.
[0278] Os inventores utilizaram sgRNA (sgRNA-ex51-SA2) que se direcionam ao mesmo genômico da região aceitadora de splice. A sequência de sgRNA-ex51 -SA2 é altamente conservada. As sequências alvos do sgRNA-ex51 -SA2 de camundongo e do sgRNA-ex51-SA2 de cachorro (sgRNA-D-ex51-SA2) diferem apenas em um único nucleotídeo (Tabela 4). Os inventores forneceram o sgRNA-Dex51-SA2 em cópia tripla (AAV-D-Tri-SA2). Após a injeção intramuscular (IM) de cachorros de 1 mês de idade com AAVs, os tecidos musculares foram analisados. Notavelmente, a imunocoloração da distrofina das criosseções musculares de
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249/259 camundongos ΔΕχ50 que receberam injeção de AAV-Tri-SA2 revelou números significativamente maiores de fibras positivas para distrofina (FIG. 19). A análise de Western blot confirmou a restauração da expressão da distrofina no músculo esquelético (FIG. 20). A coloração com hematoxilina e eosina (H&E) do músculo mostrou que as características histopatológicas da distrofia muscular, tais como miofibras necróticas, foram reduzidas no músculo tibial cranial 6 semanas após o fornecimento de AAV (FIG. 21). Este método, que utiliza um projeto de sgRNA distinto, representa um avanço importante na eficiência da correção da DMD com aplicabilidade direta para os pacientes com as mutações da distrofina mais comuns.
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250/259 [0279] Todas as composições e/ou os métodos descritos e reivindicados aqui podem ser feitos e executados sem experimentos desnecessários à luz da presente divulgação. Embora as composições e os métodos desta divulgação tenham sido descritos em termos de modalidades preferidas, será evidente para os peritos na técnica que variações podem ser aplicadas às composições e/ou aos métodos e nas etapas ou na sequência de etapas do método descrito aqui sem se afastar do conceito, do espírito e do âmbito da divulgação. Mais especificamente, será evidente que certos agentes que são tanto quimicamente quanto fisiologicamente relacionados podem ser substituídos pelos agentes descritos aqui enquanto que os mesmos ou resultados similares serão atingidos. Todos os substitutos similares e as modificações evidentes para os peritos na técnica são considerados como estando dentro do espírito, do âmbito e do conceito da divulgação que são definidos pelas reivindicações em anexo.
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VII. Referências [0280] As referências a seguir, até a extensão em que fornecem exemplos de procedimentos ou outros detalhes suplementares àqueles apresentados aqui, são especificamente incorporadas aqui como referência.
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Claims (186)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Ácido nucleico CARACTERIZADO pelo fato de que compreende:
    uma sequência que codifica um primeiro RNA guia de DMD que se direciona a uma primeira sequência genômica alvo, uma sequência que codifica um segundo RNA guia de DMD que se direciona a uma segunda sequência genômica alvo, uma sequência que codifica um primeiro promotor, em que o primeiro promotor controla a expressão da sequência que codifica o primeiro RNA guia de DMD e uma sequência que codifica um segundo promotor, em que o segundo promotor controla a expressão da sequência que codifica o segundo RNA guia de DMD, em que cada uma da primeira sequência genômica alvo e da segunda sequência genômica alvo compreende um sítio aceitador de splice da distrofina.
  2. 2. Ácido nucleico da reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a sequência que codifica o primeiro promotor e a sequência que codifica o segundo promotor são idênticas.
  3. 3. Ácido nucleico da reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a sequência que codifica o primeiro promotor e a sequência que codifica o segundo promotor não são idênticas.
  4. 4. Ácido nucleico de qualquer uma das reivindicações 1-3, CARACTERIZADO pelo fato de que a primeira sequência genômica alvo e a segunda sequência genômica alvo são idênticas.
  5. 5. Ácido nucleico de qualquer uma das reivindicações 1-3, CARACTERIZADO pelo fato de que a primeira sequência genômica alvo e a segunda sequência genômica alvo não são idênticas.
  6. 6. Ácido nucleico de qualquer uma das reivindicações 1-5, CARACTERIZADO pelo fato de que o ácido nucleico compreende ainda:
    uma sequência que codifica um terceiro RNA guia de DMD que se direciona
    Petição 870190062794, de 05/07/2019, pág. 11/36
    2/24 a uma terceira sequência genômica alvo e uma sequência que codifica um terceiro promotor, em que o terceiro promotor controla a expressão da sequência que codifica o terceiro RNA guia de DMD, em que a terceira sequência genômica alvo compreende um sítio aceitador de splice da distrofina.
  7. 7. Ácido nucleico da reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos duas da sequência que codifica o primeiro promotor, da sequência que codifica o segundo promotor e da sequência que codifica o terceiro promotor são idênticas.
  8. 8. Ácido nucleico da reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos duas da sequência que codifica o primeiro promotor, da sequência que codifica o segundo promotor e da sequência que codifica o terceiro promotor não são idênticas.
  9. 9. Ácido nucleico de qualquer uma das reivindicações 6-8, CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos duas da primeira sequência genômica alvo, da segunda sequência genômica alvo e da terceira sequência genômica alvo são idênticas.
  10. 10. Ácido nucleico de qualquer uma das reivindicações 6-8, CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos duas da primeira sequência genômica alvo, da segunda sequência genômica alvo e da terceira sequência genômica alvo não são idênticas.
  11. 11. Ácido nucleico de qualquer uma das reivindicações 6-10, CARACTERIZADO pelo fato de que o ácido nucleico compreende ainda:
    uma sequência que codifica um quarto RNA guia de DMD que se direciona a uma quarta sequência genômica alvo e uma sequência que codifica um quarto promotor, em que o quarto promotor controla a expressão da quarta sequência que codifica um RNA guia de DMD, em que a quarta sequência genômica alvo compreende um sítio aceitador de
    Petição 870190062794, de 05/07/2019, pág. 12/36
    3/24 splice da distrofina.
  12. 12. Ácido nucleico da reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos duas da sequência que codifica o primeiro promotor, da sequência que codifica o segundo promotor, da sequência que codifica o terceiro promotor e da sequência que codifica o quarto promotor são idênticas.
  13. 13. Ácido nucleico da reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos duas da sequência que codifica o primeiro promotor, da sequência que codifica o segundo promotor, da sequência que codifica o terceiro promotor e da sequência que codifica o quarto promotor não são idênticas.
  14. 14. Ácido nucleico de qualquer uma das reivindicações 11-13, CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos duas da primeira sequência genômica alvo, da segunda sequência genômica alvo, da terceira sequência genômica alvo e da quarta sequência genômica alvo são idênticas.
  15. 15. Ácido nucleico de qualquer uma das reivindicações 11-13, CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos duas da primeira sequência genômica alvo, da segunda sequência genômica alvo, da terceira sequência genômica alvo e da quarta sequência genômica alvo não são idênticas.
  16. 16. Ácido nucleico de qualquer uma das reivindicações 11-15, CARACTERIZADO pelo fato de que o ácido nucleico compreende ainda:
    uma sequência que codifica um quinto RNA guia de DMD que se direciona a uma quinta sequência genômica alvo e uma sequência que codifica um quinto promotor, em que o quinto promotor controla a expressão da sequência que codifica o quinto RNA guia de DMD, em que a quinta sequência genômica alvo compreende um sítio aceitador de splice da distrofina.
  17. 17. Ácido nucleico da reivindicação 16, CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos duas da sequência que codifica o primeiro promotor, da sequência que
    Petição 870190062794, de 05/07/2019, pág. 13/36
    4/24 codifica o segundo promotor, da sequência que codifica o terceiro promotor, da sequência que codifica o quarto promotor e da sequência que codifica o quinto promotor são idênticas.
  18. 18. Ácido nucleico da reivindicação 16, CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos duas da sequência que codifica o primeiro promotor, da sequência que codifica o segundo promotor, da sequência que codifica o terceiro promotor, da sequência que codifica o quarto promotor e da sequência que codifica o quinto promotor não são idênticas.
  19. 19. Ácido nucleico de qualquer uma das reivindicações 16-18, CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos duas da primeira sequência genômica alvo, da segunda sequência genômica alvo, da terceira sequência genômica alvo, da quarta sequência genômica alvo e da quinta sequência genômica alvo são idênticas.
  20. 20. Ácido nucleico de qualquer uma das reivindicações 16-18, CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos duas da primeira sequência genômica alvo, da segunda sequência genômica alvo, da terceira sequência genômica alvo, da quarta sequência genômica alvo e da quinta sequência genômica alvo não são idênticas.
  21. 21. Ácido nucleico de qualquer uma das reivindicações 16-20, CARACTERIZADO pelo fato de que o ácido nucleico compreende ainda:
    pelo menos uma sequência que codifica um RNA guia de DMD adicional que se direciona a uma sequência genômica alvo e pelo menos um promotor adicional, em que o promotor adicional controla a expressão da sequência que codifica o RNA guia de DMD adicional, em que a sequência genômica alvo adicional compreende um sítio aceitador de splice da distrofina.
  22. 22. Ácido nucleico de qualquer uma das reivindicações 1-21,
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    CARACTERIZADO pelo fato de que o sítio aceitador de splice da distrofina é o sítio aceitador de splice a 5’ do éxon 51.
  23. 23. Ácido nucleico de qualquer uma das reivindicações 1-23, CARACTERIZADO pelo fato de que a sequência que codifica o primeiro promotor ou a sequência que codifica o segundo promotor compreende uma sequência que codifica um promotor constitutivo.
  24. 24. Ácido nucleico de qualquer uma das reivindicações 1-23, CARACTERIZADO pelo fato de que o primeiro promotor ou o segundo promotor compreende um promotor constitutivo.
  25. 25. Ácido nucleico da reivindicação 20, CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos uma da sequência que codifica o primeiro promotor, da sequência que codifica o segundo promotor, da sequência que codifica o terceiro promotor, da sequência que codifica o quarto promotor e da sequência que codifica o quinto promotor compreende uma sequência que codifica um promotor constitutivo.
  26. 26. Ácido nucleico da reivindicação 20, CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos um do primeiro promotor, do segundo promotor, do terceiro promotor, do quarto promotor e do quinto promotor compreende um promotor constitutivo.
  27. 27. Ácido nucleico de qualquer uma das reivindicações 1-23, CARACTERIZADO pelo fato de que a sequência que codifica o primeiro promotor ou a sequência que codifica o segundo promotor compreende uma sequência que codifica um promotor induzível.
  28. 28. Ácido nucleico da reivindicação 20, CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos um do primeiro promotor, do segundo promotor, do terceiro promotor, do quarto promotor e do quinto promotor compreende um promotor induzível.
  29. 29. Ácido nucleico de qualquer uma das reivindicações 1-23, CARACTERIZADO pelo fato de que a sequência que codifica o primeiro promotor ou a sequência que codifica o segundo promotor compreende uma sequência que
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    6/24 codifica um promotor específico para o tipo de célula.
  30. 30.Ácido nucleico da reivindicação 20, CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos uma da sequência que codifica o primeiro promotor, da sequência que codifica o segundo promotor, da sequência que codifica o terceiro promotor, da sequência que codifica o quarto promotor e da sequência que codifica o quinto promotor compreende um promotor específico para o tipo de célula.
  31. 31 .Ácido nucleico da reivindicação 29 ou 30, CARACTERIZADO pelo fato de que a sequência que codifica um promotor específico para o tipo de célula compreende uma sequência que codifica um promotor específico para o músculo.
  32. 32. Ácido nucleico de qualquer uma das reivindicações 1-22, CARACTERIZADO pelo fato de que a sequência que codifica o primeiro promotor ou a sequência que codifica o segundo promotor compreende uma sequência que codifica um promotor U6, um promotor H1 ou um promotor 7SK.
  33. 33. Ácido nucleico da reivindicação 20, CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos uma da sequência que codifica o primeiro promotor, da sequência que codifica o segundo promotor, da sequência que codifica o terceiro promotor, da sequência que codifica o quarto promotor e da sequência que codifica o quinto promotor compreende uma sequência que codifica um promotor U6, uma sequência que codifica um promotor H1 ou uma sequência que codifica um promotor 7SK.
  34. 34. Ácido nucleico da reivindicação 20, CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos uma da sequência que codifica o primeiro promotor, da sequência que codifica o segundo promotor, da sequência que codifica o terceiro promotor, da sequência que codifica o quarto promotor e da sequência que codifica o quinto promotor compreende uma sequência que codifica um promotor U6.
  35. 35. Ácido nucleico da reivindicação 20, CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos uma da sequência que codifica o primeiro promotor, da sequência que codifica o segundo promotor, da sequência que codifica o terceiro promotor, da
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    7/24 sequência que codifica o quarto promotor e da sequência que codifica o quinto promotor compreende uma sequência que codifica um promotor H1.
  36. 36. Ácido nucleico da reivindicação 20, CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos uma da sequência que codifica o primeiro promotor, da sequência que codifica o segundo promotor, da sequência que codifica o terceiro promotor, da sequência que codifica o quarto promotor e da sequência que codifica o quinto promotor compreende uma sequência que codifica um promotor 7SK.
  37. 37. Ácido nucleico da reivindicação 6,
    CARACTERIZADO pelo fato de que a sequência que codifica o primeiro RNA guia de DMD, a sequência que codifica o segundo RNA guia de DMD e a sequência que codifica o terceiro RNA guia de DMD são idênticas, em que a sequência que codifica o primeiro promotor, a sequência que codifica o segundo promotor e a sequência que codifica o terceiro promotor não são idênticas e em que o sítio aceitador de splice a 5’ compreende um sítio aceitador de splice a 5’ do éxon 51.
  38. 38. Ácido nucleico da reivindicação 37, CARACTERIZADO pelo fato de que a sequência que codifica o primeiro promotor compreende uma sequência que codifica um promotor U6, a sequência que codifica o segundo promotor compreende uma sequência que codifica um promotor H1 e a sequência que codifica o terceiro promotor compreende uma sequência que codifica um promotor 7SK.
  39. 39. Ácido nucleico de qualquer uma das reivindicações 1-38, CARACTERIZADO pelo fato de que o ácido nucleico compreende uma sequência de DNA.
  40. 40. Ácido nucleico de qualquer uma das reivindicações 1-38, CARACTERIZADO pelo fato de que o ácido nucleico compreende uma sequência de RNA.
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  41. 41 .Ácido nucleico de qualquer uma das reivindicações 1-40, CARACTERIZADO pelo fato de que o ácido nucleico compreende ainda uma ou mais sequências que codificam uma repetição terminal invertida (ITR).
  42. 42. Ácido nucleico de qualquer uma das reivindicações 1-40, CARACTERIZADO pelo fato de que o ácido nucleico compreende ainda uma sequência que codifica uma repetição terminal invertida (ITR) a 5’ e uma sequência que codifica uma ITR a 3’.
  43. 43. Ácido nucleico da reivindicação 42, CARACTERIZADO pelo fato de que a sequência que codifica a repetição terminal invertida (ITR) a 5’ ou a sequência que codifica uma ITR a 3’ compreende uma sequência isolada ou derivada de um vírus associado a adeno (AAV).
  44. 44. Ácido nucleico da reivindicação 43, CARACTERIZADO pelo fato de que a sequência que codifica a repetição terminal invertida (ITR) a 5’ ou a sequência que codifica uma ITR a 3’ compreende uma sequência isolada ou derivada de um vírus associado a adeno (AAV) do sorotipo 2 (AAV2).
  45. 45. Ácido nucleico da reivindicação 43, CARACTERIZADO pelo fato de que a sequência que codifica a repetição terminal invertida (ITR) a 5’ e a sequência que codifica uma ITR a 3’ compreende uma sequência isolada ou derivada de um AAV2.
  46. 46. Ácido nucleico da reivindicação 43, CARACTERIZADO pelo fato de que a sequência que codifica a repetição terminal invertida (ITR) a 5’ ou a sequência que codifica uma ITR a 3’ compreende uma sequência isolada ou derivada de um vírus associado a adeno (AAV) do sorotipo 4 (AAV4).
  47. 47. Ácido nucleico da reivindicação 46, CARACTERIZADO pelo fato de que a sequência que codifica a repetição terminal invertida (ITR) a 5’ e a sequência que codifica uma ITR a 3’ compreende uma sequência isolada ou derivada de um AAV4.
  48. 48. Ácido nucleico de qualquer uma das reivindicações 43-47, CARACTERIZADO pelo fato de que a sequência que codifica a repetição terminal
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    9/24 invertida (ITR) a 5’ ou a sequência que codifica uma ITR a 3’ compreende ou consiste de 145 nucleotídeos.
  49. 49. Ácido nucleico de qualquer uma das reivindicações 43-47, CARACTERIZADO pelo fato de que a sequência que codifica a repetição terminal invertida (ITR) a 5’ ou a sequência que codifica uma ITR a 3’ compreende ou consiste de 115 nucleotídeos.
  50. 50. Ácido nucleico de qualquer uma das reivindicações 43-47, CARACTERIZADO pelo fato de que a sequência que codifica a repetição terminal invertida (ITR) a 5’ ou a sequência que codifica uma ITR a 3’ compreende ou consiste de 141 nucleotídeos.
  51. 51. Ácido nucleico de qualquer uma das reivindicações 1-50, CARACTERIZADO pelo fato de que o ácido nucleico compreende ainda uma sequência de poliadenosina (poliA).
  52. 52. Ácido nucleico da reivindicação 51, CARACTERIZADO pelo fato de que a sequência de poli A é uma sequência de mini poli A.
  53. 53. Ácido nucleico de qualquer uma das reivindicações 6-52, CARACTERIZADO pelo fato de que a sequência que codifica o primeiro RNA guia de DMD, a sequência que codifica o segundo RNA guia de DMD ou a sequência que codifica o terceiro RNA guia de DMD compreende a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs. 60-382, 706-708 e 712-719.
  54. 54. Ácido nucleico de qualquer uma das reivindicações 6-52, CARACTERIZADO pelo fato de que a sequência que codifica o primeiro RNA guia de DMD, a sequência que codifica o segundo RNA guia de DMD ou a sequência que codifica o terceiro RNA guia de DMD compreende a sequência da SEQ ID NO: 714.
  55. 55. Ácido nucleico de qualquer uma das reivindicações 6-52, CARACTERIZADO pelo fato de que a sequência que codifica o primeiro RNA guia de DMD, a sequência que codifica o segundo RNA guia de DMD e a sequência que
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    10/24 codifica o terceiro RNA guia de DMD compreende a sequência da SEQ ID NO: 714.
  56. 56. Célula CARACTERIZADA pelo fato de que compreende o ácido nucleico de qualquer uma das reivindicações 1-55.
  57. 57. Composição CARACTERIZADA pelo fato de que compreende o ácido nucleico de qualquer uma das reivindicações 1-55.
  58. 58. Célula CARACTERIZADA pelo fato de que compreende a composição da reivindicação 56.
  59. 59. Composição CARACTERIZADA pelo fato de que compreende a célula da reivindicação 58.
  60. 60. Vetor CARACTERIZADO pelo fato de que compreende o ácido nucleico de qualquer uma das reivindicações 1-55.
  61. 61. Vetor da reivindicação 60, CARACTERIZADO pelo fato de que o vetor compreende ainda uma sequência que codifica uma repetição terminal invertida (ITR) de um elemento que pode sofrer transposição.
  62. 62. Vetor da reivindicação 61, CARACTERIZADO pelo fato de que o elemento que pode sofrer transposição é um transposon.
  63. 63. Vetor da reivindicação 62, CARACTERIZADO pelo fato de que o transposon é um transposon Tn7.
  64. 64. Vetor da reivindicação 63, CARACTERIZADO pelo fato de que o vetor compreende ainda uma sequência que codifica uma ITR a 5’ de um transposon T7 e uma sequência que codifica uma ITR a 3’ de um transposon T7.
  65. 65. Vetor de qualquer uma das reivindicações 60-64, CARACTERIZADO pelo fato de que o vetor é um vetor não viral.
  66. 66. Vetor da reivindicação 65, CARACTERIZADO pelo fato de que o vetor não viral é um plasmídeo.
  67. 67. Vetor de qualquer uma das reivindicações 60-64, CARACTERIZADO pelo fato de que o vetor é um vetor viral.
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  68. 68. Vetor da reivindicação 67, CARACTERIZADO pelo fato de que o vetor viral é um vetor viral associado a adeno (AAV).
  69. 69. Vetor da reivindicação 69, CARACTERIZADO pelo fato de que o vetor AAV é defeituoso em relação à replicação ou condicionalmente defeituoso em relação à replicação.
  70. 70. Vetor da reivindicação 68 ou 69, CARACTERIZADO pelo fato de que o vetor AAV é um vetor AAV recombinante.
  71. 71. Vetor de qualquer uma das reivindicações 68-70, CARACTERIZADO pelo fato de que o vetor AAV compreende uma sequência isolada ou derivada de um vetor AAV do sorotipo 1 (AAV1), 2 (AAV2), 3 (AAV3), 4 (AAV4), 5 (AAV5), 6 (AAV6),7 (AAV7), 8 (AAV8), 9 (AAV9), 10 (AAV10), 11 (AAV11) ou qualquer combinação dos mesmos.
  72. 72. Vetor de qualquer uma das reivindicações 68-71, CARACTERIZADO pelo fato de que o vetor AAV compreende uma sequência isolada ou derivada de um vetor AAV do sorotipo 9 (AAV9).
  73. 73. Vetor de qualquer uma das reivindicações 68-72, CARACTERIZADO pelo fato de que o vetor AAV compreende uma sequência isolada ou derivada de um vetor AAV do sorotipo 2 (AAV2).
  74. 74. Vetor de qualquer uma das reivindicações 68-73, CARACTERIZADO pelo fato de que o vetor AAV compreende uma sequência isolada ou derivada de um AAV2 e uma sequência isolada ou derivada de um AAV9.
  75. 75. Vetor de qualquer uma das reivindicações 68-72, CARACTERIZADO pelo fato de que o vetor AAV compreende uma sequência isolada ou derivada de um vetor AAV do sorotipo 4 (AAV4).
  76. 76. Vetor de qualquer uma das reivindicações 68-72 ou 75, CARACTERIZADO pelo fato de que o vetor AAV compreende uma sequência isolada ou derivada de um AAV4 e uma sequência isolada ou derivada de um AAV9.
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  77. 77. Vetor de qualquer uma das reivindicações 60-76, CARACTERIZADO pelo fato de que o vetor é otimizado para expressão em células de mamíferos.
  78. 78. Vetor de qualquer uma das reivindicações 60-77, CARACTERIZADO pelo fato de que o vetor é otimizado para expressão em células humanas.
  79. 79. Vetor de qualquer uma das reivindicações 60-78, CARACTERIZADO pelo fato de que o vetor compreende a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO. 914, SEQ ID NO. 915, SEQ ID NO. 916 ou SEQ ID NO. 917.
  80. 80. Composição CARACTERIZADA pelo fato de que compreende o vetor de qualquer uma das reivindicações 60-79.
  81. 81. Composição da reivindicação 80, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende ainda um carreador farmaceuticamente aceitável.
  82. 82. Célula CARACTERIZADA pelo fato de que compreende a composição de 80 ou 81.
  83. 83. Célula da reivindicação 82, CARACTERIZADA pelo fato de que a célula é uma célula humana.
  84. 84. Célula da reivindicação 82 ou 83, CARACTERIZADA pelo fato de que a célula é uma célula muscular ou uma célula satélite.
  85. 85. Célula da reivindicação 82 ou 83, CARACTERIZADA pelo fato de que a célula é uma célula tronco pluripotente induzida (iPS).
  86. 86. Composição CARACTERIZADA pelo fato de que compreende a célula de qualquer uma das reivindicações 82-85.
  87. 87. Ácido nucleico CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: uma sequência que codifica um promotor e uma sequência que codifica uma proteína Cas9 ou um domínio de nuclease da mesma, em que a sequência que codifica o promotor compreende uma sequência que codifica um promotor específico para o músculo.
  88. 88. Ácido nucleico da reivindicação 87, CARACTERIZADO pelo fato de que
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    13/24 a sequência que codifica o promotor específico para o músculo compreende uma sequência que codifica um promotor CK8.
  89. 89. Ácido nucleico da reivindicação 87 ou 88, CARACTERIZADO pelo fato de que a sequência que codifica o promotor específico para o músculo compreende uma sequência que codifica um promotor CK8e.
  90. 90. Ácido nucleico de qualquer uma das reivindicações 87-89, CARACTERIZADO pelo fato de que a sequência que codifica a proteína Cas9 ou o domínio de nuclease da mesma é isolada ou derivada de uma sequência que codifica uma proteína Cas9 de S. pyogenes ou um domínio de nuclease da mesma.
  91. 91 .Proteína Cas9 ou domínio de nuclease da mesma CARACTERIZADO pelo fato de que é isolado ou derivado de uma sequência que codifica uma proteína Cas9 de S. aureus ou um domínio de nuclease da mesma.
  92. 92. Ácido nucleico de qualquer uma das reivindicações 87-91, CARACTERIZADO pelo fato de que a sequência que codifica a proteína Cas9 ou o domínio de nuclease da mesma tem os códons otimizados para expressão em um mamífero.
  93. 93. Ácido nucleico de qualquer uma das reivindicações 87-91, CARACTERIZADO pelo fato de que a sequência que codifica a proteína Cas9 ou o domínio de nuclease da mesma tem os códons otimizados para expressão em um ser humano.
  94. 94. Ácido nucleico de qualquer uma das reivindicações 87-93, CARACTERIZADO pelo fato de que o ácido nucleico compreende ainda uma sequência poliA.
  95. 95. Ácido nucleico da reivindicação 94, CARACTERIZADO pelo fato de que a sequência de poliA é uma sequência de mini poliA.
  96. 96. Ácido nucleico de qualquer uma das reivindicações 1-94, CARACTERIZADO pelo fato de que o ácido nucleico compreende ainda uma ou mais
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    14/24 sequências que codificam uma repetição terminal invertida (ITR).
  97. 97.Ácido nucleico de qualquer uma das reivindicações 1-94, CARACTERIZADO pelo fato de que o ácido nucleico compreende ainda uma sequência que codifica uma repetição terminal invertida (ITR) a 5’ e uma sequência que codifica uma ITR a 3’.
  98. 98 Ácido nucleico da reivindicação 97, CARACTERIZADO pelo fato de que a sequência que codifica a repetição terminal invertida (ITR) a 5’ ou a sequência que codifica uma ITR a 3’ compreende uma sequência isolada ou derivada de um vírus associado a adeno (AAV).
  99. 99. Ácido nucleico da reivindicação 98, CARACTERIZADO pelo fato de que a sequência que codifica a repetição terminal invertida (ITR) a 5’ ou a sequência que codifica uma ITR a 3’ compreende uma sequência isolada ou derivada de um vírus associado a adeno (AAV) do sorotipo 2 (AAV2).
  100. 100. Ácido nucleico da reivindicação 99, CARACTERIZADO pelo fato de que a sequência que codifica a repetição terminal invertida (ITR) a 5’ e a sequência que codifica uma ITR a 3’ compreende uma sequência isolada ou derivada de um AAV2.
  101. 101. Ácido nucleico da reivindicação 98, CARACTERIZADO pelo fato de que a sequência que codifica a repetição terminal invertida (ITR) a 5’ ou a sequência que codifica uma ITR a 3’ compreende uma sequência isolada ou derivada de um vírus associado a adeno (AAV) do sorotipo 4 (AAV4).
  102. 102. Ácido nucleico da reivindicação 46, CARACTERIZADO pelo fato de que a sequência que codifica a repetição terminal invertida (ITR) a 5’ e a sequência que codifica uma ITR a 3’ compreende uma sequência isolada ou derivada de um AAV4.
  103. 103. Ácido nucleico de qualquer uma das reivindicações 96-102, CARACTERIZADO pelo fato de que a sequência que codifica a repetição terminal invertida (ITR) a 5’ ou a sequência que codifica uma ITR a 3’ compreende ou consiste de 145 nucleotídeos.
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  104. 104. Ácido nucléico de qualquer uma das reivindicações 96-102, CARACTERIZADO pelo fato de que a sequência que codifica a repetição terminal invertida (ITR) a 5’ ou a sequência que codifica uma ITR a 3’ compreende ou consiste de 115 nucleotídeos.
  105. 105. Ácido nucléico de qualquer uma das reivindicações 96-102, CARACTERIZADO pelo fato de que a sequência que codifica a repetição terminal invertida (ITR) a 5’ ou a sequência que codifica uma ITR a 3’ compreende ou consiste de 141 nucleotídeos.
  106. 106. Ácido nucléico de qualquer uma das reivindicações 1-55 ou 87-105, CARACTERIZADO pelo fato de que o ácido nucléico compreende ainda um sinal de localização nuclear.
  107. 107. Ácido nucléico de qualquer uma das reivindicações 87-106, CARACTERIZADO pelo fato de que o ácido nucléico é otimizado para expressão em células de mamíferos.
  108. 108. Ácido nucléico de qualquer uma das reivindicações 87-107, CARACTERIZADO pelo fato de que o ácido nucléico é otimizado para expressão em células humanas.
  109. 109. Composição CARACTERIZADA pelo fato de que compreende o ácido nucléico de qualquer uma das reivindicações 87-108.
  110. 110. Célula CARACTERIZADA pelo fato de que compreende o ácido nucléico de qualquer uma das reivindicações 87-108.
  111. 111 .Célula CARACTERIZADA pelo fato de que compreende a composição da reivindicação 109.
  112. 112. Composição CARACTERIZADA pelo fato de que compreende a célula da reivindicação 110 ou 111.
  113. 113. Vetor CARACTERIZADO pelo fato de que compreende o ácido nucléico de qualquer uma das reivindicações 87-108.
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    16/24
  114. 114. Vetor da reivindicação 113, CARACTERIZADO pelo fato de que o vetor compreende ainda uma sequência que codifica uma repetição terminal invertida (ITR) de um elemento que pode sofrer transposição.
  115. 115. Vetor da reivindicação 114, CARACTERIZADO pelo fato de que o elemento que pode sofrer transposição é um transposon.
  116. 116. Vetor da reivindicação 115, CARACTERIZADO pelo fato de que o transposon é um transposon Tn7.
  117. 117. Vetor da reivindicação 116, CARACTERIZADO pelo fato de que o vetor compreende ainda uma sequência que codifica uma ITR a 5’ de um transposon T7 e uma sequência que codifica uma ITR a 3’ de um transposon T7.
  118. 118. Vetor de qualquer uma das reivindicações 113-117, CARACTERIZADO pelo fato de que o vetor é um vetor não viral.
  119. 119. Vetor da reivindicação 118, CARACTERIZADO pelo fato de que o vetor não viral é um plasmídeo.
  120. 120. Vetor de qualquer uma das reivindicações 113-117, CARACTERIZADO pelo fato de que o vetor é um vetor viral.
  121. 121. Vetor da reivindicação 120, CARACTERIZADO pelo fato de que o vetor viral é um vetor viral associado a adeno (AAV).
  122. 122. Vetor da reivindicação 121, CARACTERIZADO pelo fato de que o vetor AAV é defeituoso em relação à replicação ou condicionalmente defeituoso em relação à replicação.
  123. 123. Vetor das reivindicações 121 ou 122, CARACTERIZADO pelo fato de que o vetor AAV é um vetor AAV recombinante.
  124. 124. Vetor de qualquer uma das reivindicações 121-123, CARACTERIZADO pelo fato de que o vetor AAV compreende uma sequência isolada ou derivada de um vetor AAV do sorotipo 1 (AAV1), 2 (AAV2), 3 (AAV3), 4 (AAV4), 5 (AAV5), 6 (AAV6), 7 (AAV7), 8 (AAV8), 9 (AAV9), 10 (AAV10), 11 (AAV11) ou qualquer combinação dos
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    17/24 mesmos.
  125. 125. Vetor de qualquer uma das reivindicações 121-124, CARACTERIZADO pelo fato de que o vetor AAV compreende uma sequência isolada ou derivada de um vetor AAV do sorotipo 9 (AAV9).
  126. 126. Vetor de qualquer uma das reivindicações 121-125, CARACTERIZADO pelo fato de que o vetor AAV compreende uma sequência isolada ou derivada de um vetor AAV do sorotipo 2 (AAV2).
  127. 127. Vetor de qualquer uma das reivindicações 121-126, CARACTERIZADO pelo fato de que o vetor AAV compreende uma sequência isolada ou derivada de um AAV2 e uma sequência isolada ou derivada de um AAV9.
  128. 128. Vetor de qualquer uma das reivindicações 121 -125, CARACTERIZADO pelo fato de que o vetor AAV compreende uma sequência isolada ou derivada de um vetor AAV do sorotipo 4 (AAV4).
  129. 129. Vetor de qualquer uma das reivindicações 121-125 ou 128, CARACTERIZADO pelo fato de que o vetor AAV compreende uma sequência isolada ou derivada de um AAV4 e uma sequência isolada ou derivada de um AAV9.
  130. 130. Vetor de qualquer uma das reivindicações 121-129, CARACTERIZADO pelo fato de que o vetor é otimizado para expressão em células de mamíferos.
  131. 131. Vetor de qualquer uma das reivindicações 121-130, CARACTERIZADO pelo fato de que o vetor é otimizado para expressão em células humanas.
  132. 132. Vetor de qualquer uma das reivindicações 113-132, CARACTERIZADO pelo fato de que o vetor compreende a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO. 899, SEQ ID NO. 900, SEQ ID NO. 901 ou SEQ ID NO. 902.
  133. 133. Composição CARACTERIZADA pelo fato de que compreende o vetor de qualquer uma das reivindicações 113-132.
  134. 134. Composição da reivindicação 133, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende ainda um carreador farmaceuticamente aceitável.
    Petição 870190062794, de 05/07/2019, pág. 27/36
    18/24
  135. 135. Célula CARACTERIZADA pelo fato de que compreende a composição da reivindicação 133 ou 134.
  136. 136. Célula CARACTERIZADA pelo fato de que compreende o vetor de qualquer uma das reivindicações 113-132.
  137. 137. Célula da reivindicação 135 ou 136, CARACTERIZADA pelo fato de que a célula é uma célula humana.
  138. 138. Célula de qualquer uma das reivindicações 135-137, CARACTERIZADA pelo fato de que a célula é uma célula muscular ou uma célula satélite.
  139. 139. Célula de qualquer uma das reivindicações 135-137, CARACTERIZADA pelo fato de que a célula é uma célula iPS ou iCM.
  140. 140. Composição CARACTERIZADA pelo fato de que compreende a célula de qualquer uma das reivindicações 135-139.
  141. 141 .Composição CARACTERIZADA pelo fato de que compreende:
    uma primeira sequência de ácido nucleico que compreende uma sequência de ácido nucleico de qualquer uma das reivindicações 1-55 e uma segunda sequência de ácido nucleico que compreende uma sequência de ácido nucleico de qualquer uma das reivindicações 87-108.
  142. 142. Composição CARACTERIZADA pelo fato de que compreende um primeiro vetor que compreende uma sequência de ácido nucleico de qualquer uma das reivindicações 1-55 e um segundo vetor que compreende uma sequência de ácido nucleico de qualquer uma das reivindicações 87-108.
  143. 143. Composição CARACTERIZADA pelo fato de que compreende um vetor de qualquer uma das reivindicações 60-79 e um vetor de qualquer uma das reivindicações 113-132.
  144. 144. Composição de qualquer uma das reivindicações 141-143, CARACTERIZADA pelo fato de que a composição compreende ainda um carreador
    Petição 870190062794, de 05/07/2019, pág. 28/36
    19/24 farmaceuticamente aceitável.
  145. 145. Método para correção de um defeito da distrofina, o método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende o contato de uma célula e uma composição de qualquer uma das reivindicações 141-144 sob condições adequadas para expressão do primeiro RNA guia de DMD, do segundo RNA guia de DMD e da proteína Cas9 ou um domínio de nuclease da mesma, em que pelo menos um do primeiro RNA guia de DMD ou do segundo RNA guia de DMD forma um complexo com a proteína Cas9 ou o domínio de nuclease da mesma para formar pelo menos um complexo de RNA guia de DMD-Cas9, em que o pelo menos um complexo de RNA guia de DMD-Cas9 interrompe um sítio de splice da distrofina e induz o “pulo” seletivo de um éxon de DMD.
  146. 146. Método para correção de um defeito da distrofina, o método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende o contato de uma célula e uma composição de qualquer uma das reivindicações 141-144 sob condições adequadas para expressão do primeiro RNA guia de DMD, do segundo RNA guia de DMD e da proteína Cas9 ou um domínio de nuclease da mesma, em que pelo menos um do primeiro RNA guia de DMD ou do segundo RNA guia de DMD forma um complexo com a proteína Cas9 ou o domínio de nuclease da mesma para formar pelo menos um complexo de RNA guia de DMD-Cas9, em que o pelo menos um complexo de RNA guia de DMD-Cas9 induz um reenquadramento de um quadro de leitura da distrofina.
  147. 147. Método da reivindicação 146, CARACTERIZADO pelo fato de que o reenquadramento de um quadro de leitura da distrofina induz uma inserção.
  148. 148. Método da reivindicação 147, CARACTERIZADO pelo fato de que a inserção compreende ou consiste de um único nucleotídeo de adenosina.
  149. 149. Método para indução do “pulo” seletivo de um éxon de DMD, o método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende o contato de uma célula e uma composição de qualquer uma das reivindicações 141-144 sob condições adequadas para
    Petição 870190062794, de 05/07/2019, pág. 29/36
    20/24 expressão do primeiro RNA guia de DMD, do segundo RNA guia de DMD e da proteína Cas9 ou um domínio de nuclease da mesma, em que pelo menos um do primeiro RNA guia de DMD ou do segundo RNA guia de DMD forma um complexo com a proteína Cas9 ou o domínio de nuclease da mesma para formar pelo menos um complexo de RNA guia de DMD-Cas9, em que o pelo menos um complexo de RNA guia de DMD-Cas9 interrompe um sítio de splice da distrofina e induz o “pulo” seletivo de um éxon de DMD.
  150. 150. Método para indução de um evento de reenquadramento no quadro de leitura da distrofina, o método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende o contato de uma célula e uma composição de qualquer uma das reivindicações 141144 sob condições adequadas para expressão do primeiro RNA guia de DMD, do segundo RNA guia de DMD e da proteína Cas9 ou um domínio de nuclease da mesma, em que pelo menos um do primeiro RNA guia de DMD ou do segundo RNA guia de DMD forma um complexo com a proteína Cas9 ou o domínio de nuclease da mesma para formar pelo menos um complexo de RNA guia de DMD-Cas9, em que o pelo menos um complexo de RNA guia de DMD-Cas9 interrompe um sítio de splice da distrofina e induz o reenquadramento do quadro de leitura da distrofina.
  151. 151. Método de qualquer uma das reivindicações 145-150, CARACTERIZADO pelo fato de que o pelo menos um complexo de RNA guia de DMD-Cas9 interrompe um sítio de splice da distrofina e induz o “pulo” seletivo do éxon 51 de um gene DMD humano.
  152. 152. Célula CARACTERIZADA pelo fato de que é produzida através do método de qualquer uma das reivindicações 145-151.
  153. 153. Método de tratamento da distrofia muscular em um indivíduo que necessita do mesmo CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficiente de uma composição de qualquer uma das reivindicações 141 -144.
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    21/24
  154. 154. Método da reivindicação 153, CARACTERIZADO pelo fato de que a composição é administrada de forma local.
  155. 155. Método da reivindicação 153 ou 154, CARACTERIZADO pelo fato de que a composição é administrada diretamente em um tecido muscular.
  156. 156. Método de qualquer uma das reivindicações 153-155, CARACTERIZADO pelo fato de que a composição é administrada através de uma infusão ou uma injeção intramuscular.
  157. 157. Método da reivindicação 155 ou 156, CARACTERIZADO pelo fato de que o tecido muscular compreende um tecido tibial anterior, um tecido do quadriceps, um tecido solear, um tecido do diafragma ou um tecido cardíaco.
  158. 158. Método de qualquer uma das reivindicações 153-157, CARACTERIZADO pelo fato de que a composição é administrada através de uma injeção intracardíaca.
  159. 159. Método da reivindicação 153, CARACTERIZADO pelo fato de que a composição é administrada de forma sistêmica.
  160. 160. Método da reivindicação 159, CARACTERIZADO pelo fato de que a composição é administrada através de uma infusão ou uma injeção intravenosa.
  161. 161. Método de qualquer uma das reivindicações 153-160, CARACTERIZADO pelo fato de que, após a administração da composição, o indivíduo exibe miofibras positivas para distrofina normais e miofibras positivas para distrofina de mosaico contendo núcleos centralizados ou uma combinação das mesmas.
  162. 162. Método de qualquer uma das reivindicações 153-161, CARACTERIZADO pelo fato de que, após a administração da composição, o indivíduo exibe uma emergência ou um aumento em um nível de abundância de miofibras positivas para distrofina normais quando comparado com uma ausência ou um nível de abundância de miofibras positivas para distrofina normais antes da administração da composição.
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    22/24
  163. 163. Método de qualquer uma das reivindicações 153-162, CARACTERIZADO pelo fato de que, após a administração da composição, o indivíduo exibe uma emergência ou um aumento em um nível de abundância de miofibras positivas para distrofina de mosaico contendo núcleos centralizados quando comparado com uma ausência ou um nível de abundância de miofibras positivas para distrofina de mosaico contendo núcleos centralizados antes da administração da composição.
  164. 164. Método de qualquer uma das reivindicações 153-163, CARACTERIZADO pelo fato de que, após a administração da composição, o indivíduo exibe um nível de CK no soro reduzido quando comparado com um nível de CK no soro antes da administração da composição.
  165. 165. Método de qualquer uma das reivindicações 153-164, CARACTERIZADO pelo fato de que, após a administração da composição, o indivíduo exibe maior força de preensão quando comparado com uma força de preensão antes da administração da composição.
  166. 166. Método de qualquer uma das reivindicações 153-165, CARACTERIZADO pelo fato de que o indivíduo é um recém-nascido, um bebê, uma criança, um jovem adulto ou um adulto.
  167. 167. Método de qualquer uma das reivindicações 153-166,
    CARACTERIZADO pelo fato de que o indivíduo tem distrofia muscular.
  168. 168. Método de qualquer uma das reivindicações 153-167,
    CARACTERIZADO pelo fato de que o indivíduo é um portador genético de distrofia muscular.
  169. 169. Método de qualquer uma das reivindicações 153-168,
    CARACTERIZADO pelo fato de que o indivíduo é do sexo masculino.
  170. 170. Método de qualquer uma das reivindicações 153-168,
    CARACTERIZADO pelo fato de que o indivíduo é do sexo feminino.
    Petição 870190062794, de 05/07/2019, pág. 32/36
    23/24
  171. 171. Método de qualquer uma das reivindicações 153-170, CARACTERIZADO pelo fato de que o indivíduo parece ser assintomático e em que um diagnóstico genético revela uma mutação em uma ou mais cópias de um gene DMD que prejudica a função do produto do gene DMD.
  172. 172. Método de qualquer uma das reivindicações 153-171, CARACTERIZADO pelo fato de que o indivíduo apresenta um sinal ou um sintoma inicial de distrofia muscular.
  173. 173. Método da reivindicação 172, CARACTERIZADO pelo fato de que o sinal ou o sintoma inicial de distrofia muscular compreende perda de massa muscular ou fraqueza muscular proximal.
  174. 174. Método da reivindicação 173, CARACTERIZADO pelo fato de que a perda de massa muscular ou a fraqueza muscular proximal ocorre em uma ou ambas as pernas e/ou na pelve, seguida por um ou mais músculos corporais superiores.
  175. 175. Método da reivindicação 174, CARACTERIZADO pelo fato de que o sinal ou o sintoma inicial de distrofia muscular compreende ainda pseudohipertrofia, baixa resistência, dificuldade de ficar de pé, dificuldade de andar, dificuldade de subir uma escada ou uma combinação das mesmas.
  176. 176. Método de qualquer uma das reivindicações 153-175, CARACTERIZADO pelo fato de que o indivíduo apresenta um sinal ou um sintoma progressivo de distrofia muscular.
  177. 177. Método da reivindicação 176, CARACTERIZADO pelo fato de que o sinal ou o sintoma progressivo de distrofia muscular compreende perda do tecido muscular, substituição do tecido muscular por gordura ou substituição do tecido muscular por tecido fibrótico.
  178. 178. Método de qualquer uma das reivindicações 153-177, CARACTERIZADO pelo fato de que o indivíduo apresenta um sinal ou um sintoma tardio de distrofia muscular.
    Petição 870190062794, de 05/07/2019, pág. 33/36
    24/24
  179. 179. Método da reivindicação 178, CARACTERIZADO pelo fato de que o sinal ou o sintoma tardio de distrofia muscular compreende desenvolvimento ósseo anormal, curvatura da coluna, perda de movimento e paralisia.
  180. 180. Método de qualquer uma das reivindicações 153-179, CARACTERIZADO pelo fato de que o indivíduo apresenta um sinal ou um sintoma neurológico de distrofia muscular.
  181. 181 .Método da reivindicação 180, CARACTERIZADO pelo fato de que o sinal ou o sintoma neurológico de distrofia muscular compreende deficiência intelectual e paralisia.
  182. 182. Método de qualquer uma das reivindicações 153-181, CARACTERIZADO pelo fato de que a administração da composição ocorre antes do indivíduo apresentar um ou mais sinais ou sintomas progressivos, tardios ou neurológicos de distrofia muscular.
  183. 183. Método de qualquer uma das reivindicações 153-182, CARACTERIZADO pelo fato de que o indivíduo tem menos de 10 anos de idade.
  184. 184. Método da reivindicação 183, CARACTERIZADO pelo fato de que o indivíduo tem menos de 5 anos de idade.
  185. 185. Método da reivindicação 184, CARACTERIZADO pelo fato de que o indivíduo tem menos de 2 anos de idade.
  186. 186. Uso de uma quantidade terapeuticamente eficiente de uma composição de qualquer uma das reivindicações 141-144 CARACTERIZADO pelo fato de que é para tratamento de distrofia muscular em um indivíduo que necessita do mesmo.
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