JP2022526669A - ジストロフィン機能を修復するためのCRISPR/Casをベースにした塩基編集組成物 - Google Patents
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Abstract
CRISPR/Casをベースにした塩基編集組成物、およびジストロフィン機能を修復することによってデュシェンヌ筋ジストロフィーを処置する方法が本明細書中に開示されている。一態様では、本開示は、対象のゲノムDNA中にコードされているRNAスプライシング部位を変更するための、CRISPR/Casをベースにした塩基編集システムに関する。一部の実施形態では、ゲノムDNA中にコードされているRNAスプライシング部位を変更することは、RNA転写物中の少なくとも1個のエクソン配列の排除または包含をもたらす。
Description
関連出願の相互参照
本出願は、その全体で本明細書中に参考として組み込まれている、2019年4月12日に出願の米国仮特許出願第62/833,454号の優先権を主張するものである。
政府関与の記載
本発明は、政府支援で、国立衛生研究所によって授与された契約番号第R01AR069085号の下で行われた。米国政府が本発明の特定の権利を有する。
本開示は、CRISPR/Casをベースにした塩基編集組成物、およびジストロフィン機能を修復することによってデュシェンヌ筋ジストロフィーを処置する方法に向けられている。
本出願は、その全体で本明細書中に参考として組み込まれている、2019年4月12日に出願の米国仮特許出願第62/833,454号の優先権を主張するものである。
政府関与の記載
本発明は、政府支援で、国立衛生研究所によって授与された契約番号第R01AR069085号の下で行われた。米国政府が本発明の特定の権利を有する。
本開示は、CRISPR/Casをベースにした塩基編集組成物、およびジストロフィン機能を修復することによってデュシェンヌ筋ジストロフィーを処置する方法に向けられている。
序論
デュシェンヌ筋ジストロフィー(DMD)は、典型的にはジストロフィン遺伝子からの1個または複数個のエクソンの欠失によって引き起こされ、リーディングフレームの破壊がもたらされる。ジストロフィンタンパク質の発現は、1個または複数個の追加のエクソンの排除を誘導することによってリーディングフレームを補正することによって、修復することができる。mRNAスプライシング中のイントロンの除去および選択されたエクソンの包含は正常遺伝子機能にとって重大であり、遺伝子障害においてしばしば誤調節されている。mRNAプロセッシングおよびエクソンスキッピング手法などのエクソン選択を変調する技術を使用して、これらの疾患を研究および処置し得る。エクソンスキッピングは、スプライセオソームによるスプライシング配列の認識を遮断して隣接イントロンと共に特定のエクソンの除去をもたらすことによって、正しいリーディングフレームを修復するまたは選択的スプライシングを誘導することを目的としている。研究により、Cas9をエクソンのスプライスアクセプターに標的化することによって、DNA修復中に生じるインデルがスプライシング部位を破壊し、エクソンを排除する場合があることが示されている。しかし、ジストロフィン機能を完全におよび/または部分的に修復するためにジストロフィン遺伝子中のスプライシング部位を正確に変更する能力の必要性が残っている。
デュシェンヌ筋ジストロフィー(DMD)は、典型的にはジストロフィン遺伝子からの1個または複数個のエクソンの欠失によって引き起こされ、リーディングフレームの破壊がもたらされる。ジストロフィンタンパク質の発現は、1個または複数個の追加のエクソンの排除を誘導することによってリーディングフレームを補正することによって、修復することができる。mRNAスプライシング中のイントロンの除去および選択されたエクソンの包含は正常遺伝子機能にとって重大であり、遺伝子障害においてしばしば誤調節されている。mRNAプロセッシングおよびエクソンスキッピング手法などのエクソン選択を変調する技術を使用して、これらの疾患を研究および処置し得る。エクソンスキッピングは、スプライセオソームによるスプライシング配列の認識を遮断して隣接イントロンと共に特定のエクソンの除去をもたらすことによって、正しいリーディングフレームを修復するまたは選択的スプライシングを誘導することを目的としている。研究により、Cas9をエクソンのスプライスアクセプターに標的化することによって、DNA修復中に生じるインデルがスプライシング部位を破壊し、エクソンを排除する場合があることが示されている。しかし、ジストロフィン機能を完全におよび/または部分的に修復するためにジストロフィン遺伝子中のスプライシング部位を正確に変更する能力の必要性が残っている。
一態様では、本開示は、対象のゲノムDNA中にコードされているRNAスプライシング部位を変更するための、CRISPR/Casをベースにした塩基編集システムに関する。一部の実施形態では、ゲノムDNA中にコードされているRNAスプライシング部位を変更することは、RNA転写物中の少なくとも1個のエクソン配列の排除または包含をもたらす。一態様では、本開示は、対象におけるジストロフィン機能を修復するための、CRISPR/Casをベースにした塩基編集システムに関する。一部の実施形態では、対象は突然変異したジストロフィン遺伝子を有しており、少なくとも1個のガイドRNA(gRNA)は、対象の突然変異したジストロフィン遺伝子中のRNAスプライシング部位を標的とする。一部の実施形態では、対象へのCRISPR/Casをベースにした塩基編集システムの投与は、少なくとも1個のエクソン配列が対象のジストロフィン遺伝子のRNA転写物から排除またはその中に包含されること、および対象中のジストロフィン遺伝子のリーディングフレームが修復されることをもたらす。CRISPR/Casをベースにした塩基編集システムは、融合タンパク質および少なくとも1個のガイドRNA(gRNA)を含み得る。一部の実施形態では、少なくとも1個のgRNAは、配列番号1に対応するポリヌクレオチド配列と結合し、それを標的とする。一部の実施形態では、融合タンパク質は、Casタンパク質および塩基編集ドメインを含む。
さらなる一態様では、本開示は、前記CRISPR/Casをベースにした塩基編集システムをコードしている単離したポリヌクレオチドに関する。
本開示の別の態様は、前記単離したポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
さらなる一態様では、本開示は、前記CRISPR/Casをベースにした塩基編集システムをコードしている単離したポリヌクレオチドに関する。
本開示の別の態様は、前記単離したポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
本開示の別の態様は、前記単離したポリヌクレオチドまたは前記ベクターを含む細胞を提供する。
本開示の別の態様は、突然変異ジストロフィン遺伝子を有する細胞においてジストロフィン機能を修復するための組成物を提供する。一部の実施形態では、組成物は、前記CRISPR/Casをベースにした塩基編集システムを含む。
本開示の別の態様は、前記CRISPR/Casをベースにした塩基編集システム、前記単離したポリヌクレオチド、前記ベクター、前記細胞、および/または前記組成物を含むキットを提供する。
本開示の別の態様は、突然変異ジストロフィン遺伝子を有する細胞または対象においてジストロフィン機能を修復するための方法を提供する。本方法は、細胞または対象を、前記CRISPR/Casをベースにした塩基編集システムと接触させることを含み得る。一部の実施形態では、突然変異ジストロフィン遺伝子のエクソン45中の「AG」スプライスアクセプターが「AA」配列へと変換され、ジストロフィン機能がエクソン45スキッピングによって修復される。
本開示の別の態様は、突然変異ジストロフィン遺伝子を有する細胞においてジストロフィン機能を修復するための組成物を提供する。一部の実施形態では、組成物は、前記CRISPR/Casをベースにした塩基編集システムを含む。
本開示の別の態様は、前記CRISPR/Casをベースにした塩基編集システム、前記単離したポリヌクレオチド、前記ベクター、前記細胞、および/または前記組成物を含むキットを提供する。
本開示の別の態様は、突然変異ジストロフィン遺伝子を有する細胞または対象においてジストロフィン機能を修復するための方法を提供する。本方法は、細胞または対象を、前記CRISPR/Casをベースにした塩基編集システムと接触させることを含み得る。一部の実施形態では、突然変異ジストロフィン遺伝子のエクソン45中の「AG」スプライスアクセプターが「AA」配列へと変換され、ジストロフィン機能がエクソン45スキッピングによって修復される。
本開示は、CRISPR/Casをベースにした塩基編集組成物、およびジストロフィン機能を修復することによってデュシェンヌ筋ジストロフィー(DMD)を処置する方法を提供する。DMDは、典型的には、リーディングフレームを破壊するジストロフィン遺伝子中の欠失によって引き起こされる。内部で切断されたジストロフィンタンパク質は部分的に機能的であり続けることができることが示されているため、DMDを処置するための多くの戦略は、追加のエクソンを除去またはスキップすることによってリーディングフレームを修復することを目的としている。哺乳動物遺伝子中に、イントロンとエクソンとの間の境界を印す保存された配列が存在する。1個の重要なスプライシング部位は、エクソンに先行し、スプライスアクセプターと呼ばれる「AG」である。完全ヌクレアーゼCas9を使用して、ジストロフィンエクソンのスプライスアクセプターを標的としてスキッピングを強制しており、それによって、スプライシング部位を切断するために、DNA修復プロセス中に形成されたセミランダムインデルに依存している。本明細書中に開示するCRISPR/Casをベースにした塩基編集システムは、「AG」スプライスアクセプターを、エクソンスキッピングを促進する「AA」へと確かに変換するための、より正確な塩基編集方法を可能にする。慣用のCRISPR-Cas9システムによって生じたセミランダムインデルとは対照的に、二本鎖DNA切断を誘導せずに単一塩基対の正確な改変のために、塩基編集技術が開発されている。塩基エディターは、Cを直接Tに、または逆鎖上のGをAに変えることができ、これらは、mRNAスプライシングを変調するために様々なエクソンのスプライスドナー「GT」およびアクセプター「AG」の両方を標的とし得る。
1.定義
本明細書中で使用する用語「含む(comprise(s))」、「含む(include(s))」、「有する(having)」、「有する(has)」、「できる(can)」、「含有する(contain(s))」、およびその変形は、追加の動作または構造の可能性を排除しない、開放型の移行句、用語、または単語であることを意図する。単数形「a」、「and」、および「the」は、内容により明らかにそうでないと指示されない限りは、複数形の参照物を含む。また、本開示は、明確に記載されているかどうかにかかわらず、本明細書中に提示する実施形態または要素を「含む(comprising)」、「からなる(consisting of)」、および「から本質的になる(consisting essentially of)」他の実施形態も企図する。
本明細書中の数値範囲の列挙については、それらの間のそれぞれの介在する数値が同じ度合の精度で明確に企図される。たとえば、6~9の範囲では、6および9の数値に加えて7および8が企図され、6.0~7.0の範囲では、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、および7.0の数値が明確に企図される。
本明細書中で使用する用語「含む(comprise(s))」、「含む(include(s))」、「有する(having)」、「有する(has)」、「できる(can)」、「含有する(contain(s))」、およびその変形は、追加の動作または構造の可能性を排除しない、開放型の移行句、用語、または単語であることを意図する。単数形「a」、「and」、および「the」は、内容により明らかにそうでないと指示されない限りは、複数形の参照物を含む。また、本開示は、明確に記載されているかどうかにかかわらず、本明細書中に提示する実施形態または要素を「含む(comprising)」、「からなる(consisting of)」、および「から本質的になる(consisting essentially of)」他の実施形態も企図する。
本明細書中の数値範囲の列挙については、それらの間のそれぞれの介在する数値が同じ度合の精度で明確に企図される。たとえば、6~9の範囲では、6および9の数値に加えて7および8が企図され、6.0~7.0の範囲では、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、および7.0の数値が明確に企図される。
本明細書中で使用する用語「およそ」または「約」とは、当業者によって決定された特定の値について許容される誤差範囲内を意味し、これは、値がどのように測定または決定されるか、すなわち測定システムの制限に部分的に依存する。たとえば、「およそ」は、当分野における実施に従って、3以内または3を超える標準偏差を意味することができる。あるいは、「およそ」は、所定の値の20%まで、好ましくは10%まで、より好ましくは5%まで、さらにより好ましくは1%までの範囲を意味することができる。あるいは、特に生物系または生物学的過程に関して、この用語は、値の10倍以内、好ましくは5倍以内、より好ましくは2倍以内を意味することができる。
別段に定義しない限りは、本明細書中において使用するすべての技術および科学用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。矛盾する場合は、定義を含めた本文書が支配する。好ましい方法および材料は以下に記載されているが、本明細書中に記載のものと同様または均等の方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができる。本明細書中で言及するすべての出版物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体で参考として組み込まれている。本明細書中に開示する材料、方法、および例は、例示的のみであり、限定することを意図しない。
別段に定義しない限りは、本明細書中において使用するすべての技術および科学用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。矛盾する場合は、定義を含めた本文書が支配する。好ましい方法および材料は以下に記載されているが、本明細書中に記載のものと同様または均等の方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができる。本明細書中で言及するすべての出版物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体で参考として組み込まれている。本明細書中に開示する材料、方法、および例は、例示的のみであり、限定することを意図しない。
本明細書中で互換性があるように使用される「アデノ随伴ウイルス」または「AAV」とは、ヒトおよび一部の他の霊長類種に感染する、パルボウイルス(Parvoviridae)科のディペンドウイルス(Dependovirus)属に属する小さなウイルスをいう。AAVは現在、疾患を引き起こすことは知られておらず、したがって、このウイルスは非常に緩和な免疫応答を引き起こす。
本明細書中で使用する「アミノ酸」とは、天然に存在するおよび天然に存在しない合成のアミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸と同様の様式で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体をいう。天然に存在するアミノ酸は、遺伝暗号によってコードされているものである。アミノ酸は、その一般的に知られている三文字表記によって、またはIUPAC-IUB生化学命名法委員会によって推奨される一文字標記によってのどちらかで、本明細書中で言及することができる。アミノ酸は側鎖およびポリペプチド主鎖部分を含む。
本明細書中で使用する「アミノ酸」とは、天然に存在するおよび天然に存在しない合成のアミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸と同様の様式で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体をいう。天然に存在するアミノ酸は、遺伝暗号によってコードされているものである。アミノ酸は、その一般的に知られている三文字表記によって、またはIUPAC-IUB生化学命名法委員会によって推奨される一文字標記によってのどちらかで、本明細書中で言及することができる。アミノ酸は側鎖およびポリペプチド主鎖部分を含む。
本明細書中で使用する「結合領域」とは、CRISPR/Casをベースにした塩基編集システムによって認識されてそれと結合する、標的領域内の領域をいう。
本明細書中で使用する「クロマチン」とは、ヒストンに関連する染色体DNAの組織的な複合体をいう。
本明細書中で互換性があるように使用される「クラスター化された定期間隔の短い回文構造反復(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)」および「CRISPR」とは、配列決定された細菌の約40%および配列決定された古細菌の90%のゲノム中に見つかる、複数の短い直接反復を含有する座位をいう。
本明細書中で使用する「クロマチン」とは、ヒストンに関連する染色体DNAの組織的な複合体をいう。
本明細書中で互換性があるように使用される「クラスター化された定期間隔の短い回文構造反復(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)」および「CRISPR」とは、配列決定された細菌の約40%および配列決定された古細菌の90%のゲノム中に見つかる、複数の短い直接反復を含有する座位をいう。
本明細書中で使用する「コード配列」または「コードしている核酸」とは、タンパク質をコードしているポリヌクレオチド配列を含む核酸(RNAまたはDNA分子)を意味する。コード配列は、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含めた調節要素と作動可能に連結された、核酸を投与する個体または哺乳動物の細胞中において発現を指示することができる、開始および終止シグナルをさらに含むことができる。コード配列はコドン最適化されていてよい。
核酸に関して本明細書中で使用する「相補体」または「相補物」とは、核酸分子のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体間のワトソン-クリック(たとえばA-T/UおよびC-G)またはフーグスティーン塩基対合を形成することができる核酸を意味する。「相補性」とは、互いに逆平行にアラインメントされた際にそれぞれの位置でのヌクレオチド塩基が相補的となるような、2個の核酸配列間で共有される特性をいう。
核酸に関して本明細書中で使用する「相補体」または「相補物」とは、核酸分子のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体間のワトソン-クリック(たとえばA-T/UおよびC-G)またはフーグスティーン塩基対合を形成することができる核酸を意味する。「相補性」とは、互いに逆平行にアラインメントされた際にそれぞれの位置でのヌクレオチド塩基が相補的となるような、2個の核酸配列間で共有される特性をいう。
用語「対照」、「参照レベル」、および「参照」は、本明細書中で互換性があるように使用される。参照レベルは、測定した結果をそれに対して評価するためのベンチマークとして使用する、事前に決定された値または範囲であり得る。本明細書中で使用する「対照群」とは、対照対象の群をいう。事前に決定されたレベルは対照群からのカットオフ値であり得る。事前に決定されたレベルは対照群からの平均であり得る。カットオフ値(または事前に決定されたカットオフ値)は、適応的指標モデル(AIM)方法によって決定し得る。カットオフ値(または事前に決定されたカットオフ値)は、患者群の生体試料からの受信者動作曲線(ROC)分析によって決定し得る。生物分野において一般に知られているROC分析は、たとえば、CRCを有する患者の同定においてそれぞれのマーカーの性能を決定するための、1つの状態を別の状態から識別するための試験の能力の決定である。ROC分析の説明は、その開示がその全体で本明細書中に参考として組み込まれているP.J. Heagerty et al. (Biometrics 2000, 56, 337-44)中に提供されている。あるいは、カットオフ値は、患者群の生体試料の四分位数分析によって決定し得る。たとえば、カットオフ値は、25~75パーセンタイルの範囲内の任意の値に対応する値、好ましくは、25パーセンタイル、50パーセンタイル、または75パーセンタイル、より好ましくは75パーセンタイルに対応する値を選択することによって決定し得る。そのような統計分析は、当分野で知られている任意の方法を使用して行ってよく、任意数の市販のソフトウェアパッケージ(たとえば、Analyse-it Software Ltd.、英国Leeds、StataCorp LP、テキサス州College Station、SAS Institute Inc.、ノースカロライナ州Caryのもの)によって実装することができる。標的について、またはタンパク質活性についての健康または正常なレベルまたは範囲は、標準の実施に従って定義し得る。対照は、本明細書中に詳述するコンストラクトまたはシステムを有さない対象または細胞であり得る。対照は、その病状が既知である対象、またはそれ由来の試料であり得る。対象、またはそれ由来の試料は、健康、疾患状態、疾患状態で処置前、疾患状態で処置中、もしくは疾患状態で処置後、またはその組合せであり得る。
本明細書中で互換性があるように使用される「デュシェンヌ筋ジストロフィー」または「DMD」とは、筋変性および最終的には死をもたらす、劣性の致命的なX連鎖の障害をいう。DMDは、3500人に1人の男性に起こる、一般的な遺伝性の一遺伝子的疾患である。DMDは、ナンセンスまたはフレームシフトのジストロフィン遺伝子中の突然変異を引き起こす遺伝性または自発性の突然変異の結果である。DMDを引き起こすジストロフィン突然変異の大多数は、リーディングフレームを破壊し、ジストロフィン遺伝子の未熟な翻訳終止を引き起こす、エクソンの欠失である。DMD患者、典型的には、小児期中に自身を物理的に支持する能力を失い、ティーンエージ期中に進行的に脆弱になり、その二十代に亡くなる。
本明細書中で使用する「ジストロフィン」とは、筋線維の細胞骨格を、周囲の細胞外基質を通じて細胞膜に接続させるタンパク質複合体の一部である、桿形状の細胞質タンパク質をいう。ジストロフィンは、筋肉細胞の完全性および機能の調節を司っている細胞膜のジストログリカン複合体に構造的安定性をもたらす。本明細書中で互換性があるように使用されるジストロフィン遺伝子または「DMD遺伝子」は、座位Xp21で2.2メガ塩基である。一次転写物ではおよそ2,400kbが測定され、成熟mRNAはおよそ14kbである。79個のエクソンは、3500個のアミノ酸を超えるタンパク質をコードしている。
本明細書中で使用する「ジストロフィン」とは、筋線維の細胞骨格を、周囲の細胞外基質を通じて細胞膜に接続させるタンパク質複合体の一部である、桿形状の細胞質タンパク質をいう。ジストロフィンは、筋肉細胞の完全性および機能の調節を司っている細胞膜のジストログリカン複合体に構造的安定性をもたらす。本明細書中で互換性があるように使用されるジストロフィン遺伝子または「DMD遺伝子」は、座位Xp21で2.2メガ塩基である。一次転写物ではおよそ2,400kbが測定され、成熟mRNAはおよそ14kbである。79個のエクソンは、3500個のアミノ酸を超えるタンパク質をコードしている。
本明細書中で使用する「エクソン45」とは、ジストロフィン遺伝子の45エクソンをいう。エクソン45は、DMD患者中においてフレームを破壊する欠失にしばしば隣接しており、オリゴヌクレオチドをベースにしたエクソンスキッピングについて臨床治験で標的とされている。
本明細書中で使用する「エンハンサー」とは、複数の活性化因子およびリプレッサー結合部位を含有する非コードDNA配列をいう。エンハンサーは、200bp~1kbの長さの範囲であり、近位、すなわち、プロモーターの5’上流側もしくは調節される遺伝子の第1のイントロン内、または遠位、すなわち、隣接遺伝子のイントロンもしくは座位からかなり離れた遺伝子間領域中のいずれかであり得る。DNAルーピングを通じて、活性エンハンサーは、コアDNA結合モチーフプロモーターの特異性に依存的に、プロモーターと接触する。4~5個のエンハンサーが1個のプロモーターと相互作用し得る。同様に、エンハンサーは、連結の制限なしに複数の遺伝子を調節する場合があり、より遠位のものを調節するために隣接遺伝子を「スキップ」する場合がある。転写調節は、プロモーターが存在するものとは異なる染色体中に位置する要素に関与していてもよい。隣接遺伝子の近位エンハンサーまたはプロモーターは、より遠位の要素を動員するためのプラットフォームとして役割と果たし得る。
本明細書中で使用する「エンハンサー」とは、複数の活性化因子およびリプレッサー結合部位を含有する非コードDNA配列をいう。エンハンサーは、200bp~1kbの長さの範囲であり、近位、すなわち、プロモーターの5’上流側もしくは調節される遺伝子の第1のイントロン内、または遠位、すなわち、隣接遺伝子のイントロンもしくは座位からかなり離れた遺伝子間領域中のいずれかであり得る。DNAルーピングを通じて、活性エンハンサーは、コアDNA結合モチーフプロモーターの特異性に依存的に、プロモーターと接触する。4~5個のエンハンサーが1個のプロモーターと相互作用し得る。同様に、エンハンサーは、連結の制限なしに複数の遺伝子を調節する場合があり、より遠位のものを調節するために隣接遺伝子を「スキップ」する場合がある。転写調節は、プロモーターが存在するものとは異なる染色体中に位置する要素に関与していてもよい。隣接遺伝子の近位エンハンサーまたはプロモーターは、より遠位の要素を動員するためのプラットフォームとして役割と果たし得る。
本明細書中で使用する「機能的」および「完全に機能的」とは、生物活性を有するタンパク質を説明する。「機能的遺伝子」とは、mRNAへと転写される遺伝子をいい、これが機能的タンパク質へと翻訳される。
本明細書中で使用する「融合タンパク質」とは、元は別々のタンパク質をコードしていた2個以上の遺伝子を結合させることによって作製した、キメラタンパク質をいう。融合遺伝子の翻訳は、元のタンパク質のそれぞれに由来する機能的特性を有する単一のポリペプチドをもたらす。
本明細書中で使用する「遺伝子コンストラクト」とは、タンパク質をコードしているポリヌクレオチド配列を含むDNAまたはRNA分子をいう。コード配列は、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含めた調節要素と作動可能に連結された、核酸分子を投与する個体の細胞中において発現を指示することができる、開始および終止シグナルを含む。本明細書中で使用する用語「発現可能な形態」とは、個体の細胞中に存在する場合にコード配列が発現されるように、タンパク質をコードしているコード配列と作動可能に連結されている、必要な調節要素を含有する遺伝子構築物をいう。
本明細書中で使用する「融合タンパク質」とは、元は別々のタンパク質をコードしていた2個以上の遺伝子を結合させることによって作製した、キメラタンパク質をいう。融合遺伝子の翻訳は、元のタンパク質のそれぞれに由来する機能的特性を有する単一のポリペプチドをもたらす。
本明細書中で使用する「遺伝子コンストラクト」とは、タンパク質をコードしているポリヌクレオチド配列を含むDNAまたはRNA分子をいう。コード配列は、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含めた調節要素と作動可能に連結された、核酸分子を投与する個体の細胞中において発現を指示することができる、開始および終止シグナルを含む。本明細書中で使用する用語「発現可能な形態」とは、個体の細胞中に存在する場合にコード配列が発現されるように、タンパク質をコードしているコード配列と作動可能に連結されている、必要な調節要素を含有する遺伝子構築物をいう。
本明細書中で使用する「ゲノム編集」とは、遺伝子を変えることをいう。ゲノム編集は、突然変異遺伝子を補修または修復することを含み得る。ゲノム編集は、スプライスアクセプター部位を変更するための塩基編集を含み得る。ゲノム編集、たとえば塩基編集は、目的遺伝子を変えることによって疾患を処置するまたは筋肉修復を増強させるために使用し得る。
本明細書中で使用する用語「異種」とは、自然においては互いに同じ関係性では見つからない2個以上の部分配列を含む核酸をいう。たとえば、組換え産生させた核酸は、典型的には、合成的に配置されて新しい機能的核酸を作る、関連性のない遺伝子由来の2個以上の配列、たとえば、1個の供給源由来のプロモーターおよび別の供給源由来のコード領域を有する。したがって、2個の核酸は、この文脈において互いに異種である。細胞に加えた際は、組換え核酸も細胞の内在遺伝子に対して異種となるであろう。したがって、染色体中において、異種核酸は、染色体内に組み込まれた非ネイティブ(天然に存在しない)核酸、または非ネイティブ(天然に存在しない)染色体外核酸を含むであろう。同様に、異種タンパク質は、タンパク質が、自然においては互いに同じ関係性では見つからない2個以上の部分配列(たとえば、2個の部分配列が単一の核酸配列によってコードされている「融合タンパク質」)を含むことを示す。
本明細書中で使用する用語「異種」とは、自然においては互いに同じ関係性では見つからない2個以上の部分配列を含む核酸をいう。たとえば、組換え産生させた核酸は、典型的には、合成的に配置されて新しい機能的核酸を作る、関連性のない遺伝子由来の2個以上の配列、たとえば、1個の供給源由来のプロモーターおよび別の供給源由来のコード領域を有する。したがって、2個の核酸は、この文脈において互いに異種である。細胞に加えた際は、組換え核酸も細胞の内在遺伝子に対して異種となるであろう。したがって、染色体中において、異種核酸は、染色体内に組み込まれた非ネイティブ(天然に存在しない)核酸、または非ネイティブ(天然に存在しない)染色体外核酸を含むであろう。同様に、異種タンパク質は、タンパク質が、自然においては互いに同じ関係性では見つからない2個以上の部分配列(たとえば、2個の部分配列が単一の核酸配列によってコードされている「融合タンパク質」)を含むことを示す。
2個以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈において本明細書中で使用する「同一」または「同一性」とは、配列が、指定された領域にわたって同じである、指定された残基百分率を有することを意味する。百分率は、2個の配列を最適にアラインメントすること、2個の配列を指定された領域にわたって比較すること、両方の配列中で同一の残基が存在する位置の数を決定して、一致した位置の数を得ること、一致した位置の数を指定された領域中の位置の総数で除算すること、および結果を100で乗算して配列同一性の百分率を得ることによって計算し得る。2個の配列が異なる長さのものである、またはアラインメントにより1個または複数個のねじれ型末端が生じ、指定された比較領域が単一の配列のみを含む場合は、単一配列の残基を計算の分母には含めるが分子には含めない。DNAおよびRNAを比較する場合、チミン(T)およびウラシル(U)は均等物としてみなし得る。同一性は、手動で、またはBLASTもしくはBLAST2.0などのコンピュータ配列アルゴリズムを使用することによって行い得る。
本明細書中で互換性があるように使用される「突然変異遺伝子」または「突然変異した遺伝子」とは、検出可能な突然変異を受けた遺伝子をいう。突然変異遺伝子は、遺伝子の正常な伝達および発現に影響を与える、遺伝物質の喪失、獲得、または交換などの変化を受けている。本明細書中で使用する「破壊された遺伝子」とは、未熟なストップコドンの原因となる突然変異を有する突然変異遺伝子をいう。破壊された遺伝子産物は、完全長の破壊されていない遺伝子産物と比較して切断されている。
本明細書中で使用する「正常遺伝子」とは、遺伝物質の喪失、獲得、または交換などの変化を受けていない遺伝子をいう。正常遺伝子は正常な遺伝子伝達および遺伝子発現を受ける。
本明細書中で使用する「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」とは、一緒に共有結合された少なくとも2個のヌクレオチドを意味する。単鎖の描写は相補鎖の配列も定義する。したがって、核酸は、示した単鎖の相補鎖も包含する。核酸の多くの変異体を同じ目的で所定の核酸として使用し得る。したがって、核酸は、実質的に同一の核酸およびその相補体も包含する。単鎖は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的配列とハイブリダイズし得るプローブを提供する。したがって、核酸は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするプローブも包含する。
本明細書中で使用する「正常遺伝子」とは、遺伝物質の喪失、獲得、または交換などの変化を受けていない遺伝子をいう。正常遺伝子は正常な遺伝子伝達および遺伝子発現を受ける。
本明細書中で使用する「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」とは、一緒に共有結合された少なくとも2個のヌクレオチドを意味する。単鎖の描写は相補鎖の配列も定義する。したがって、核酸は、示した単鎖の相補鎖も包含する。核酸の多くの変異体を同じ目的で所定の核酸として使用し得る。したがって、核酸は、実質的に同一の核酸およびその相補体も包含する。単鎖は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的配列とハイブリダイズし得るプローブを提供する。したがって、核酸は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするプローブも包含する。
核酸は、一本鎖もしくは二本鎖であり得るか、または、二本鎖および一本鎖の配列の両方の一部分を含有し得る。核酸は、DNA(ゲノムおよびcDNAの両方)、RNA、またはハイブリッドであってよく、核酸は、デオキシリボ-およびリボ-ヌクレオチドの組合せ、ならびにウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、およびイソグアニンを含めた塩基の組合せを含有し得る。核酸は、化学合成方法によってまたは組換え方法によって得られ得る。
本明細書中で使用する「作動可能に連結されている」とは、遺伝子の発現が、それが空間的に接続されているプロモーターの制御下にあることを意味する。プロモーターは、その制御下にある遺伝子の5’(上流)または3’(下流)に位置し得る。プロモーターと遺伝子との間の距離は、プロモーターが由来する遺伝子における、プロモーターとそれが制御する遺伝子との間の距離とほぼ同じであり得る。当分野で知られているように、この距離の変動は、プロモーター機能の喪失なしに適応され得る。
本明細書中で使用する「作動可能に連結されている」とは、遺伝子の発現が、それが空間的に接続されているプロモーターの制御下にあることを意味する。プロモーターは、その制御下にある遺伝子の5’(上流)または3’(下流)に位置し得る。プロモーターと遺伝子との間の距離は、プロモーターが由来する遺伝子における、プロモーターとそれが制御する遺伝子との間の距離とほぼ同じであり得る。当分野で知られているように、この距離の変動は、プロモーター機能の喪失なしに適応され得る。
核酸またはアミノ酸配列は、互いに機能的関係に配置されている場合に、「作動可能に連結されている」(または「稼働可能に連結されている」)。たとえば、プロモーターまたはエンハンサーは、コード配列の転写を調節する、またはその変調に寄与する場合に、コード配列と作動可能に連結されている。作動可能に連結されているDNA配列は典型的には連続的であり、作動可能に連結されているアミノ酸配列は、典型的には連続的であり、かつ同じリーディングフレーム中にある。しかし、エンハンサーは、一般に、プロモーターから数キロ塩基まで、またはそれより多く隔てられている場合に機能し、イントロン配列は可変の長さであってよいため、一部のポリヌクレオチド要素は作動可能に連結されているが連続的ではない場合がある。同様に、一次ポリペプチド配列中で非連続的である特定のアミノ酸配列は、たとえばポリペプチド鎖の折り畳みのおかげで、依然として作動可能に連結されている場合がある。融合ポリペプチドに関して、用語「稼働可能に連結されている」および「作動可能に連結されている」とは、構成要素のそれぞれが、他の構成要素と連結されて、そのように連結されていないかのように、同じ機能を行うことをいうことができる。
本明細書中で使用する「部分的に機能的」とは、突然変異遺伝子によってコードされており、機能的タンパク質よりも低いが非機能的タンパク質よりも高い生物活性を有するタンパク質を説明する。
本明細書中で使用する「部分的に機能的」とは、突然変異遺伝子によってコードされており、機能的タンパク質よりも低いが非機能的タンパク質よりも高い生物活性を有するタンパク質を説明する。
「ペプチド」または「ポリペプチド」は、ペプチド結合によって連結された2個以上のアミノ酸の連結配列である。ポリペプチドは、天然、合成、もしくは改変、または天然と合成の組合せであることができる。ペプチドおよびポリペプチドとしては、結合タンパク質、受容体、および抗体などのタンパク質が挙げられる。用語「ポリペプチド」、「タンパク質」、および「ペプチド」は、本明細書中で互換性があるように使用される。「一次構造」とは、特定のペプチドのアミノ酸配列をいう。「二次構造」とは、ポリペプチド内の局所的に秩序付けられた三次元構造をいう。これらの構造は、一般的に、ドメイン、たとえば、酵素ドメイン、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、ポアドメイン、および細胞質側末端ドメインとして知られる。「ドメイン」とは、コンパクトなポリペプチドユニットを形成し、典型的には15~350個のアミノ酸の長さである、ポリペプチドの一部分である。例示的なドメインとしては、酵素活性またはリガンド結合活性を有するドメインが挙げられる。典型的なドメインは、ベータシートおよびアルファヘリックスの区間などの、より組織性の低いセクションからなる。「三次構造」とは、ポリペプチド単量体の完全な三次元構造をいう。「四次構造」とは、独立した三次ユニットの非共有的会合によって形成された三次元構造をいう。「モチーフ」とは、ポリペプチド配列の一部分であり、少なくとも2個のアミノ酸を含む。モチーフは、たとえば、2~20、2~15、または2~10個のアミノ酸の長さであり得る。一部の実施形態では、モチーフは3、4、5、6、または7個の連続的なアミノ酸を含む。ドメインは、一連の同じ種類のモチーフからなり得る。
本明細書中で互換性があるように使用される「未熟なストップコドン」または「アウトオブフレームストップコドン」とは、野生型遺伝子中には通常見つからない位置にストップコドンをもたらす、DNAの配列中のナンセンス突然変異をいう。未熟なストップコドンは、タンパク質の完全長バージョンと比較してタンパク質が切断されるまたは短くなることを引き起こし得る。
本明細書中で使用する「プロモーター」とは、細胞中の核酸の発現を与える、活性化する、または増強させることができる、合成または天然由来の分子を意味する。プロモーターは、発現をさらに増強させるため、ならびに/またはその空間的発現および/もしくは時間的発現を変更するために、1個または複数個の特定の転写調節配列を含み得る。また、プロモーターは、遠位のエンハンサーまたはリプレッサー要素も含んでいてよく、これは、転写の開始部位から数千塩基対もの場所に位置していてよい。プロモーターは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫、および動物を含めた供給源に由来し得る。プロモーターは、構成的に、または発現が起こる細胞、組織、もしくは臓器に関して発現が起こる発生段階に関して示差的に、または生理的ストレス、病原体、金属イオン、もしくは誘導剤などの外部刺激に応答して、遺伝子構成要素の発現を調節し得る。プロモーターの代表的な例としては、バクテリオファージT7プロモーター、バクテリオファージT3プロモーター、SP6プロモーター、lacオペレータープロモーター、tacプロモーター、SV40後期プロモーター、SV40初期プロモーター、RSV-LTRプロモーター、CMV IEプロモーター、SV40初期プロモーター、またはSV40後期プロモーター、およびCMV IEプロモーターが挙げられる。
本明細書中で使用する「プロモーター」とは、細胞中の核酸の発現を与える、活性化する、または増強させることができる、合成または天然由来の分子を意味する。プロモーターは、発現をさらに増強させるため、ならびに/またはその空間的発現および/もしくは時間的発現を変更するために、1個または複数個の特定の転写調節配列を含み得る。また、プロモーターは、遠位のエンハンサーまたはリプレッサー要素も含んでいてよく、これは、転写の開始部位から数千塩基対もの場所に位置していてよい。プロモーターは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫、および動物を含めた供給源に由来し得る。プロモーターは、構成的に、または発現が起こる細胞、組織、もしくは臓器に関して発現が起こる発生段階に関して示差的に、または生理的ストレス、病原体、金属イオン、もしくは誘導剤などの外部刺激に応答して、遺伝子構成要素の発現を調節し得る。プロモーターの代表的な例としては、バクテリオファージT7プロモーター、バクテリオファージT3プロモーター、SP6プロモーター、lacオペレータープロモーター、tacプロモーター、SV40後期プロモーター、SV40初期プロモーター、RSV-LTRプロモーター、CMV IEプロモーター、SV40初期プロモーター、またはSV40後期プロモーター、およびCMV IEプロモーターが挙げられる。
たとえば、細胞、または核酸、タンパク質、もしくはベクターを参照して使用する用語「組換え」とは、細胞、核酸、タンパク質、またはベクターが、異種核酸もしくはタンパク質の導入またはネイティブ核酸もしくはタンパク質の変更によって改変されている、あるいは、細胞が、そのように改変した細胞に由来することを示す。したがって、たとえば、組換え細胞は、細胞のネイティブ(天然に存在する)形態内に見つからない遺伝子を発現する、あるいは、そうでなければ正常もしくは異常に発現される、過少発現される、または全く発現されない、ネイティブ遺伝子の第2のコピーを発現する。
本明細書中で使用する「骨格筋」とは、体性神経系の制御下にあり、腱として知られるコラーゲン線維の束によって骨に付着している、横紋筋の一種をいう。骨格筋は、筋細胞、または「筋肉細胞」として知られ、場合によっては口語的に「筋線維」と呼ばれる、個々の構成要素からなる。筋細胞は、筋形成として知られるプロセスにおける、発達筋芽細胞(筋肉細胞を生じさせる胚性前駆細胞の一種)の融合から形成される。これらの長い、円柱状、多核の細胞は筋原線維とも呼ばれる。
本明細書中で使用する「骨格筋」とは、体性神経系の制御下にあり、腱として知られるコラーゲン線維の束によって骨に付着している、横紋筋の一種をいう。骨格筋は、筋細胞、または「筋肉細胞」として知られ、場合によっては口語的に「筋線維」と呼ばれる、個々の構成要素からなる。筋細胞は、筋形成として知られるプロセスにおける、発達筋芽細胞(筋肉細胞を生じさせる胚性前駆細胞の一種)の融合から形成される。これらの長い、円柱状、多核の細胞は筋原線維とも呼ばれる。
本明細書中で使用する「骨格筋状態」とは、筋ジストロフィー、加齢、筋変性、創傷治癒、および筋力低下または萎縮などの、骨格筋に関連する状態をいう。
本明細書中で互換性があるように使用される「対象」および「患者」とは、それだけには限定されないが、哺乳動物(たとえば、ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット、およびマウス、非ヒト霊長類(たとえば、カニクイザルまたはアカゲザル、チンパンジーなどのサル)、ならびにヒト等)を含めた、任意の脊椎動物をいう。一部の実施形態では、対象はヒトまたは非ヒトであり得る。対象または患者は、他の形態の処置を受けていてもよい。対象は、たとえば、成人、青年、または乳児などの、任意の年齢または発生段階のものであり得る。一部の実施形態では、対象は特定の遺伝子マーカーを有する。
本明細書中で互換性があるように使用される「対象」および「患者」とは、それだけには限定されないが、哺乳動物(たとえば、ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット、およびマウス、非ヒト霊長類(たとえば、カニクイザルまたはアカゲザル、チンパンジーなどのサル)、ならびにヒト等)を含めた、任意の脊椎動物をいう。一部の実施形態では、対象はヒトまたは非ヒトであり得る。対象または患者は、他の形態の処置を受けていてもよい。対象は、たとえば、成人、青年、または乳児などの、任意の年齢または発生段階のものであり得る。一部の実施形態では、対象は特定の遺伝子マーカーを有する。
「処置する」、「処置すること」、または「処置」とは、本明細書中でそれぞれ互換性があるように使用され、そのような用語が適用される疾患、またはそのような疾患の1種もしくは複数種の症状の進行を逆転、軽減、または阻害することを説明する。対象の状態に応じて、この用語は疾患を防止することもいい、疾患の発症を防止すること、または疾患に関連する症状を防止することを含む。処置は、急性または慢性の様式のどちらかで行い得る。この用語はまた、疾患またはそのような疾患に関連する症状の重篤度を、疾患を罹患する前に低下させることもいう。そのような疾患の重篤度の、罹患前の防止または低下とは、本発明の抗体または医薬組成物を、投与時に疾患を患っていない対象に投与することをいう。「防止すること」とは、疾患またはそのような疾患に関連する1種もしくは複数種の症状の再発を防止することもいう。「処置」および「治療上」とは、上記定義した「処置すること」のように処置する行為をいう。
核酸に関して本明細書中で使用する「変異体」とは、(i)参照したポリヌクレオチド配列の一部分もしくは断片、(ii)参照したポリヌクレオチド配列もしくはその一部分の相補体、(iii)参照した核酸もしくはその相補体と実質的に同一である核酸、または(iv)ストリンジェントな条件下で、参照した核酸、その相補体、もしくはそれと実質的に同一である配列とハイブリダイズする核酸を意味する。
アミノ酸の挿入、欠失、または保存的置換によってアミノ酸配列が異なるが、少なくとも1種の生物活性を保持している、ペプチドまたはポリペプチドに関する「変異体」。また、変異体は、参照したタンパク質と実質的に同一であるアミノ酸配列を有しており、少なくとも1種の生物活性を保持しているアミノ酸配列を有するタンパク質も意味し得る。アミノ酸の保存的置換、すなわち、アミノ酸を、同様の特性(たとえば、親水性、荷電領域の度合および分布)の異なるアミノ酸で置き換えることは、当分野において、典型的には軽微な変化に関与するとして認識されている。これらの軽微な変化は、当分野において理解されるようにアミノ酸の疎水性親水性指標を考慮することによって、部分的に同定し得る。Kyte et al., J. Mol. Biol. 157:105-132 (1982)。アミノ酸の疎水性親水性指標は、その疎水性および荷電の考慮に基づく。同様の疎水性親水性指標のアミノ酸を置換しても、依然としてタンパク質機能を保持し得ることが、当分野で知られている。一態様では、±2の疎水性親水性指標を有するアミノ酸を置換する。また、アミノ酸の親水性を使用して、生物学的機能を保持しているタンパク質をもたらす置換も明らかにし得る。ペプチドの文脈におけるアミノ酸の親水性の考慮は、そのペプチドの最大局所平均親水性の計算を可能にする。置換は、互いに±2以内の親水性値を有するアミノ酸を用いて行い得る。アミノ酸の疎水性指標および親水性値はどちらも、そのアミノ酸の具体的な側鎖によって影響を受ける。この観察と一貫して、生物学的機能と適合性のあるアミノ酸置換は、疎水性、親水性、荷電、大きさ、および他の特性によって明らかにされる、アミノ酸の相対的類似度、具体的にはこれらのアミノ酸の側鎖に依存すると理解されている。
アミノ酸の挿入、欠失、または保存的置換によってアミノ酸配列が異なるが、少なくとも1種の生物活性を保持している、ペプチドまたはポリペプチドに関する「変異体」。また、変異体は、参照したタンパク質と実質的に同一であるアミノ酸配列を有しており、少なくとも1種の生物活性を保持しているアミノ酸配列を有するタンパク質も意味し得る。アミノ酸の保存的置換、すなわち、アミノ酸を、同様の特性(たとえば、親水性、荷電領域の度合および分布)の異なるアミノ酸で置き換えることは、当分野において、典型的には軽微な変化に関与するとして認識されている。これらの軽微な変化は、当分野において理解されるようにアミノ酸の疎水性親水性指標を考慮することによって、部分的に同定し得る。Kyte et al., J. Mol. Biol. 157:105-132 (1982)。アミノ酸の疎水性親水性指標は、その疎水性および荷電の考慮に基づく。同様の疎水性親水性指標のアミノ酸を置換しても、依然としてタンパク質機能を保持し得ることが、当分野で知られている。一態様では、±2の疎水性親水性指標を有するアミノ酸を置換する。また、アミノ酸の親水性を使用して、生物学的機能を保持しているタンパク質をもたらす置換も明らかにし得る。ペプチドの文脈におけるアミノ酸の親水性の考慮は、そのペプチドの最大局所平均親水性の計算を可能にする。置換は、互いに±2以内の親水性値を有するアミノ酸を用いて行い得る。アミノ酸の疎水性指標および親水性値はどちらも、そのアミノ酸の具体的な側鎖によって影響を受ける。この観察と一貫して、生物学的機能と適合性のあるアミノ酸置換は、疎水性、親水性、荷電、大きさ、および他の特性によって明らかにされる、アミノ酸の相対的類似度、具体的にはこれらのアミノ酸の側鎖に依存すると理解されている。
本明細書中で使用する「ベクター」とは、複製起点を含有する核酸配列を意味する。ベクターは、ウイルスベクター、バクテリオファージ、細菌人工染色体、または酵母人工染色体であり得る。ベクターはDNAまたはRNAベクターであり得る。ベクターは、自己複製する染色体外ベクターであってよく、好ましくはDNAプラスミドである。たとえば、ベクターは、配列番号7もしくは配列番号8、および/または配列番号1の少なくとも1個のgRNAポリヌクレオチド配列などの融合タンパク質をコードしているポリヌクレオチド配列を含む、本明細書中に記載するCRISPR/Casをベースにした塩基編集システムをコードしていてよい。
2.ジストロフィンを修復するためのCRISPR/Casをベースにした塩基編集システム
CRISPR/Casをベースにした塩基編集システムを本明細書中で提供する。CRISPR/Casをベースにした塩基編集システムは、対象のゲノムDNA中にコードされているRNAスプライシング部位を変更するために使用し得る。CRISPR/Casをベースにした塩基編集システムは、ジストロフィン遺伝子機能の修復において使用するためのものであり得る。CRISPR/Casをベースにした塩基編集システムは、融合タンパク質および少なくとも1個のガイドRNA(gRNA)を含み得る。一部の実施形態では、少なくとも1個のgRNAは、配列番号1に対応するポリヌクレオチド配列と結合し、それを標的とする。一部の実施形態では、少なくとも1個のgRNAは、配列番号1のポリヌクレオチド配列によってコードされている。融合タンパク質は2個の異種ポリペプチドドメインを含むことができる。一部の実施形態では、融合タンパク質は、Casタンパク質および塩基編集ドメインを含む。一部の実施形態では、少なくとも1個のgRNAは、a)配列番号1の断片、b)配列番号1の相補体、またはその断片、c)配列番号1と実質的に同一である核酸、またはその相補体、あるいはd)ストリンジェントな条件下で配列番号1とハイブリダイズする核酸、その相補体、またはそれに実質的に同一な配列に対応するポリヌクレオチド配列と結合し、それを標的とする。一部の実施形態では、少なくとも1個のgRNAは、配列番号1に対応するポリヌクレオチド配列、またはその変異体を含む。
CRISPR/Casをベースにした塩基編集システムを本明細書中で提供する。CRISPR/Casをベースにした塩基編集システムは、対象のゲノムDNA中にコードされているRNAスプライシング部位を変更するために使用し得る。CRISPR/Casをベースにした塩基編集システムは、ジストロフィン遺伝子機能の修復において使用するためのものであり得る。CRISPR/Casをベースにした塩基編集システムは、融合タンパク質および少なくとも1個のガイドRNA(gRNA)を含み得る。一部の実施形態では、少なくとも1個のgRNAは、配列番号1に対応するポリヌクレオチド配列と結合し、それを標的とする。一部の実施形態では、少なくとも1個のgRNAは、配列番号1のポリヌクレオチド配列によってコードされている。融合タンパク質は2個の異種ポリペプチドドメインを含むことができる。一部の実施形態では、融合タンパク質は、Casタンパク質および塩基編集ドメインを含む。一部の実施形態では、少なくとも1個のgRNAは、a)配列番号1の断片、b)配列番号1の相補体、またはその断片、c)配列番号1と実質的に同一である核酸、またはその相補体、あるいはd)ストリンジェントな条件下で配列番号1とハイブリダイズする核酸、その相補体、またはそれに実質的に同一な配列に対応するポリヌクレオチド配列と結合し、それを標的とする。一部の実施形態では、少なくとも1個のgRNAは、配列番号1に対応するポリヌクレオチド配列、またはその変異体を含む。
a)ジストロフィン遺伝子
ジストロフィンは、筋線維の細胞骨格を、周囲の細胞外基質を通じて細胞膜に接続させるタンパク質複合体の一部である、棹形状の細胞質タンパク質である。ジストロフィンは、細胞膜のジストログリカン複合体に構造的安定性をもたらす。ジストロフィン遺伝子は、座位Xp21で2.2メガ塩基である。一次転写物ではおよそ2,400kbが測定され、成熟mRNAはおよそ14kbである。79個のエクソンは3500個のアミノ酸を超えるタンパク質をコードしている。正常な骨格筋組織は少量のみのジストロフィンを含有するが、異常発現によるジストロフィンの非存在は重篤かつ不治の症状の発生をもたらす。ジストロフィン遺伝子中の一部の突然変異は、罹患患者において欠損ジストロフィンの産生および重篤なジストロフィー表現型をもたらす。ジストロフィン遺伝子中の一部の突然変異は、罹患患者において、部分的に機能的なジストロフィンタンパク質およびはるかにより緩和なジストロフィー表現型をもたらす。
ジストロフィンは、筋線維の細胞骨格を、周囲の細胞外基質を通じて細胞膜に接続させるタンパク質複合体の一部である、棹形状の細胞質タンパク質である。ジストロフィンは、細胞膜のジストログリカン複合体に構造的安定性をもたらす。ジストロフィン遺伝子は、座位Xp21で2.2メガ塩基である。一次転写物ではおよそ2,400kbが測定され、成熟mRNAはおよそ14kbである。79個のエクソンは3500個のアミノ酸を超えるタンパク質をコードしている。正常な骨格筋組織は少量のみのジストロフィンを含有するが、異常発現によるジストロフィンの非存在は重篤かつ不治の症状の発生をもたらす。ジストロフィン遺伝子中の一部の突然変異は、罹患患者において欠損ジストロフィンの産生および重篤なジストロフィー表現型をもたらす。ジストロフィン遺伝子中の一部の突然変異は、罹患患者において、部分的に機能的なジストロフィンタンパク質およびはるかにより緩和なジストロフィー表現型をもたらす。
DMDは、ジストロフィン遺伝子中のナンセンスまたはフレームシフトの突然変異を引き起こす遺伝性または自発性の突然変異の結果である。天然に存在する突然変異およびその結果は、DMDについて比較的よく理解されている。桿状ドメイン内に含有されるエクソン45~55領域中に起こるインフレーム欠失が、高度に機能的なジストロフィンタンパク質を産生することができ、多くのキャリアは無症候性であるか、緩和な症状を表示することが知られている。さらに、60%を超える患者が、理論的には、ジストロフィン遺伝子のこの領域中のエクソンを標的化することによって処置し得る。mRNAスプライシング中に非必須エクソンをスキップすること(たとえばエクソン45スキッピング)して、内部欠失であるが機能的なジストロフィンタンパク質を生じさせることによって、DMD患者中の破壊されたジストロフィンリーディングフレームを修復する努力がなされている。内部ジストロフィンエクソンの欠失(たとえばエクソン45の欠失)は、適切なリーディングフレームを保持しており、内部的に切断されているが部分的に機能的なジストロフィンタンパク質を生じることができる。ジストロフィンのエクソン45~55の間の欠失は、DMDと比較してはるかにより緩和な表現型をもたらす。
ある特定の実施形態では、リーディングフレームを修復するためのエクソン45の切除は、欠失突然変異を有するDMD対象を含めたDMD対象において表現型を寛解させる。ある特定の実施形態では、ジストロフィン遺伝子のエクソン45とは、ジストロフィン遺伝子の45番目のエクソンをいう。エクソン45は、DMD患者中においてフレームを破壊する欠失にしばしば隣接しており、オリゴヌクレオチドをベースにしたエクソンスキッピングについて臨床治験において標的とされている。
本明細書中に詳述するCRISPR/Casをベースにした塩基編集システムは、対象のゲノムDNA中にコードされているRNAスプライシング部位を変更するために使用し得る。一部の実施形態では、ゲノムDNA中にコードされているRNAスプライシング部位を変更することは、RNA転写物中の少なくとも1個のエクソン配列の排除または包含をもたらす。本明細書中に詳述するCRISPR/Casをベースにした塩基編集システムは、対象におけるジストロフィン機能を修復するために使用し得る。一部の実施形態では、対象は突然変異したジストロフィン遺伝子を有しており、少なくとも1個のガイドRNA(gRNA)は、対象の突然変異したジストロフィン遺伝子中のRNAスプライシング部位を標的とする。一部の実施形態では、対象へのCRISPR/Casをベースにした塩基編集システムの投与は、少なくとも1個のエクソン配列が対象のジストロフィン遺伝子のRNA転写物から排除またはその中に包含されること、および対象中のジストロフィン遺伝子のリーディングフレームが修復されることをもたらす。
本明細書中に開示するシステムおよびベクターは、ジストロフィン遺伝子、たとえばヒトジストロフィン遺伝子中のエクソン45でスプライスアクセプター部位を変更することができる。スプライスアクセプター部位の変更は、エクソン45がジストロフィンタンパク質産物から欠失すること(すなわちエクソン45スキッピング)をもたらす可能性があり、コードされているジストロフィンタンパク質の機能もしくは活性を増加させる、または対象の病状の改善をもたらす可能性がある。ある特定の実施形態では、エクソン45スキッピングは、ジストロフィンリーディングフレームを修復することができる。一部の実施形態では、エクソン45でのスプライスアクセプター部位は、配列番号1のポリヌクレオチド配列を含む配列内にある。
本明細書中に開示するシステムまたは遺伝子コンストラクト(たとえばベクター)は、ジストロフィン遺伝子(たとえばヒトジストロフィン遺伝子)の高効率のエクソン45スキッピングを媒介することができる。本明細書中に開示するシステムまたは遺伝子コンストラクト(たとえばベクター)は、DMD患者由来の細胞中におけるジストロフィンタンパク質発現を修復し得る。エクソン45は、DMD中においてフレームを破壊する欠失にしばしば隣接している。エクソンスキッピングによるジストロフィン転写物からのエクソン45の除去を使用して、全DMD患者の約8%を処置することができる。本明細書中に開示するシステムまたは遺伝子コンストラクト(たとえばベクター)を、ヒトDMD細胞内に形質移入させ、正しいリーディングフレームへの効率的な遺伝子の改変および変換を媒介し得る。タンパク質修復はフレーム修復と同時であってよく、CRISPR/Casをベースにした塩基編集システムで処置した細胞のバルク集団中において検出する。
本明細書中に開示するシステムまたは遺伝子コンストラクト(たとえばベクター)は、ジストロフィン遺伝子(たとえばヒトジストロフィン遺伝子)の高効率のエクソン45スキッピングを媒介することができる。本明細書中に開示するシステムまたは遺伝子コンストラクト(たとえばベクター)は、DMD患者由来の細胞中におけるジストロフィンタンパク質発現を修復し得る。エクソン45は、DMD中においてフレームを破壊する欠失にしばしば隣接している。エクソンスキッピングによるジストロフィン転写物からのエクソン45の除去を使用して、全DMD患者の約8%を処置することができる。本明細書中に開示するシステムまたは遺伝子コンストラクト(たとえばベクター)を、ヒトDMD細胞内に形質移入させ、正しいリーディングフレームへの効率的な遺伝子の改変および変換を媒介し得る。タンパク質修復はフレーム修復と同時であってよく、CRISPR/Casをベースにした塩基編集システムで処置した細胞のバルク集団中において検出する。
b)融合タンパク質
CRISPR/Casをベースにした塩基編集システムは、融合タンパク質または融合タンパク質をコードしている核酸配列を含む。融合タンパク質は、Casタンパク質および塩基編集ドメインを含む。一部の実施形態では、融合タンパク質をコードしている核酸配列はDNAである。一部の実施形態では、融合タンパク質をコードしている核酸配列はRNAである。
i)Casタンパク質
Casタンパク質はgRNAの3’末端と複合体を形成する。CRISPRをベースにしたシステムの特異性は2個の要因、すなわち標的化配列およびプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)に依存する。標的化または認識配列はgRNAの5’末端に位置しており、プロトスペーサーとして知られている正しいDNA配列で、宿主DNA上の塩基対(標的核酸または標的DNA)と対合するように設計されている。単にgRNAの認識配列を交換することによって、Casタンパク質を新しいゲノム標的に向けることができる。PAM配列は変更したいDNA上に位置しており、Casタンパク質によって認識される。Casタンパク質のPAM認識配列は種特異的であることができる。
CRISPR/Casをベースにした塩基編集システムは、融合タンパク質または融合タンパク質をコードしている核酸配列を含む。融合タンパク質は、Casタンパク質および塩基編集ドメインを含む。一部の実施形態では、融合タンパク質をコードしている核酸配列はDNAである。一部の実施形態では、融合タンパク質をコードしている核酸配列はRNAである。
i)Casタンパク質
Casタンパク質はgRNAの3’末端と複合体を形成する。CRISPRをベースにしたシステムの特異性は2個の要因、すなわち標的化配列およびプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)に依存する。標的化または認識配列はgRNAの5’末端に位置しており、プロトスペーサーとして知られている正しいDNA配列で、宿主DNA上の塩基対(標的核酸または標的DNA)と対合するように設計されている。単にgRNAの認識配列を交換することによって、Casタンパク質を新しいゲノム標的に向けることができる。PAM配列は変更したいDNA上に位置しており、Casタンパク質によって認識される。Casタンパク質のPAM認識配列は種特異的であることができる。
一部の実施形態では、CRISPR/Casをベースにした塩基編集システムは、触媒的に死んだdCas9などのCas9タンパク質を含み得る。Cas9タンパク質は核酸を切断するエンドヌクレアーゼであり、CRISPR座位によってコードされており、II型CRISPRシステムに関与している。Cas9分子は、1個または複数個のgRNA分子と相互作用することができ、gRNA分子と協同して、標的ドメイン、ある特定の実施形態ではPAM配列を含む部位に局在化する。PAM配列を認識するCas9分子の能力は、たとえば以前に記載されている形質転換アッセイ(Jinek 2012)を使用して決定することができる。一部の実施形態では、Cas9タンパク質は化膿性連鎖球菌に由来する。一部の実施形態では、Cas9タンパク質は配列番号2のポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、Cas9タンパク質は黄色ブドウ球菌に由来する。一部の実施形態では、Cas9タンパク質は配列番号3のポリペプチド配列を含む。
一部の実施形態では、ヌクレアーゼ活性が低下または失活するように、Cas9タンパク質を突然変異させ得る。立体障害によって遺伝子発現をサイレンシングするために、エンドヌクレアーゼ活性を有さない失活したCas9タンパク質(「iCas9」、「dCas9」とも呼ばれる)を、gRNAによって、細菌、酵母、およびヒト細胞中の遺伝子に標的化してよい。化膿性連鎖球菌Cas9配列を参照した、ヌクレアーゼ活性を低下または失活させるための例示的な突然変異としては、D10A、E762A、H840A、N854A、N863A、および/またはD986Aが挙げられる。黄色ブドウ球菌Cas9配列を参照とした、ヌクレアーゼ活性を失活させるための例示的な突然変異としては、D10AおよびN580Aが挙げられる。一部の実施形態では、化膿性連鎖球菌由来の失活したCas9タンパク質(iCas9、「dCas9」とも呼ばれる、配列番号5)を使用し得る。本明細書中で使用する「iCas9」および「dCas9」はどちらも、アミノ酸置換D10AおよびH840Aを有しており、そのヌクレアーゼ活性が失活しているCas9タンパク質を指し得る。一部の実施形態では、Casタンパク質は、アミノ酸置換D10Aを有する突然変異Cas9タンパク質であることができる(「nCas9」と呼ばれ、ニッカーゼ活性を有する、たとえば配列番号4)。
Cas9タンパク質または突然変異Cas9タンパク質は、化膿性連鎖球菌、黄色ブドウ球菌、ストレプトコッカス・サーモフィルス(Streptococcus thermophiles)、または髄膜炎菌(Neisseria meningitides)などの、任意の細菌または古細菌の種由来であり得る。一部の実施形態では、Casタンパク質または突然変異Cas9タンパク質は、ストレプトコッカス属(Streptococcus)、スタフィロコッカス属(Staphylococcus)、ブレビバシラス属(Brevibacillus)、コリネバクター属(Corynebacter)、スッテレラ属(Sutterella)、レジオネラ属(Legionella)、フランシセラ属(Francisella)、トレポネーマ属(Treponema)、フィリファクター属(Filifactor)、ユーバクテリウム属(Eubacterium)、ラクトバチルス属(Lactobacillus)、バクテロイデス属(Bacteroides)、フラビイボラ属(Flaviivola)、フラボバクテリウム属(Flavobacterium)、スフェロヘータ属(Sphaerochaeta)、アゾスピリルム属(Azospirillum)、グルコンアセトバクター属(Gluconacetobacter)、ナイセリア属(Neisseria)、ロゼブリア属(Roseburia)、パルビバキュラム属(Parvibaculum)、スタフィロコッカス属、ニトラチフラクター属(Nitratifractor)、マイコプラズマ属(Mycoplasma)、またはカンピロバクター属(Campylobacter)の細菌属に由来するCas9タンパク質である。一部の実施形態では、Cas9タンパク質または突然変異Cas9タンパク質は、それだけには限定されないが、化膿性連鎖球菌、フランシセラ・ノビシダ(Francisella novicida)、黄色ブドウ球菌、髄膜炎菌、ストレプトコッカス・サーモフィルス、トレポネーマ・デンティコラ(Treponema denticola)、ブレビバチルス・ラテロスポラス)Brevibacillus laterosporus、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)、ジフテリア菌(Corynebacterium diphtheria)、ユーバクテリウム・ベントリオスム(Eubacterium ventriosum)、ストレプトコッカス・パステリアヌス(Streptococcus pasteurianus)、ラクトバチルス・ファルシミニス(Lactobacillus farciminis)、スフェロヘータ・グロバス(Sphaerochaeta globus)、アゾルピリルム属(Azospirillum)、グルコンアセトバクター・ジアトロフィカス(Gluconacetobacter diazotrophicus)、ナイセリア・シネレア(Neisseria cinerea)、ロゼブリア・インテスティナリス(Roseburia intestinalis)、パルビバキュラム・ラバメンチボランス(Parvibaculum lavamentivorans)、ニトラチフラクター・サルスギニス(Nitratifractor salsuginis)、およびカンピロバクター・ラリ(Campylobacter lari)を含めた群から選択される。
ある特定の実施形態では、標的核酸と相互作用してそれを切断する、Cas9分子または突然変異Cas9タンパク質の能力は、PAM配列依存性である。PAM配列は標的核酸中の配列である。ある特定の実施形態では、標的核酸の切断はPAM配列から上流で起こる。様々な細菌種由来のCas9分子は、様々な配列モチーフ(たとえばPAM配列)を認識することができる。ある特定の実施形態では、化膿性連鎖球菌のCas9分子は、標的核酸配列の切断を、その配列から1~10、たとえば3~5bp上流で指示する、配列モチーフNGG(配列番号10)を認識する(たとえばMali 2013を参照)。ある特定の実施形態では、黄色ブドウ球菌Cas9分子は、標的核酸配列の切断を、その配列から1~10、たとえば3~5bp上流で指示する、配列モチーフNNGRR(R=AまたはG)(配列番号12)を認識する。ある特定の実施形態では、黄色ブドウ球菌のCas9分子は、標的核酸配列の切断を、その配列から1~10、たとえば3~5bp上流で指示する、配列モチーフNNGRRN(R=AまたはG)(配列番号13)を認識する。ある特定の実施形態では、黄色ブドウ球菌のCas9分子は、標的核酸配列の切断を、その配列から1~10、たとえば3~5bp上流で指示する、配列モチーフNNGRRT(R=AまたはG)(配列番号14)を認識する。ある特定の実施形態では、黄色ブドウ球菌のCas9分子は、標的核酸配列の切断を、その配列から1~10、たとえば3~5bp上流で指示する、配列モチーフNNGRRV(R=AまたはG、V=AまたはCまたはG)(配列番号15)を認識する。前述の実施形態では、Nは、任意のヌクレオチド残基、たとえば、A、G、C、またはTのうちの任意のものであることができる。Cas9分子を操作して、Cas9分子のPAM特異性を変更することができる。
一部の実施形態では、Cas9タンパク質または突然変異Cas9タンパク質は、PAM配列NGG(配列番号10)またはNGA(配列番号19)を認識することができる。一部の実施形態では、Cas9タンパク質または突然変異Cas9タンパク質は、PAM配列NNNRRT(配列番号11)を認識することができる。一部の実施形態では、Cas9タンパク質または突然変異Cas9タンパク質は黄色ブドウ球菌のCas9タンパク質であり、配列モチーフNNGRR(R=AもしくはG)(配列番号12)、NNGRRN(R=AもしくはG)(配列番号13)、NNGRRT(R=AもしくはG)(配列番号14)、またはNNGRRV(R=AもしくはG)(配列番号15)を認識する。前述の実施形態では、Nは、任意のヌクレオチド残基、たとえば、A、G、C、またはTのうちの任意のものであることができる。Cas9分子を操作して、Cas9分子のPAM特異性を変更することができる。
それに加えてまたはその代わりに、Cas9分子またはCas9ポリペプチドをコードしている核酸は核移行配列(NLS)を含み得る。核移行配列は当分野で知られている。
それに加えてまたはその代わりに、Cas9分子またはCas9ポリペプチドをコードしている核酸は核移行配列(NLS)を含み得る。核移行配列は当分野で知られている。
ii)塩基編集ドメイン
融合タンパク質は、Casタンパク質および塩基編集ドメインを含む。塩基編集は、二本鎖DNA切断(DSB)を必要とせずに、標的ゲノム座位での、特定のDNA塩基から別の塩基への直接的な不可逆的変換を可能にする。図1Dは塩基エディターの1個の設計プロセスを示す。一部の実施形態では、塩基編集ドメインは(i)シチジンデアミナーゼドメインおよび(ii)少なくとも1個のウラシルグリコシラーゼ阻害剤(UGI)ドメインを含む。
シチジンデアミナーゼドメインは、DNA塩基シトシンをウラシルへと変換することができる(図1C参照)。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼドメインは、アポリポタンパク質B mRNA編集酵素、触媒的ポリペプチド様(APOBEC)ファミリーデアミナーゼを含むことができる。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼドメインは、APOBEC1デアミナーゼ、APOBEC2デアミナーゼ、APOBEC3Aデアミナーゼ、APOBEC3Bデアミナーゼ、APOBEC3Cデアミナーゼ、APOBEC3Dデアミナーゼ、APOBEC3Fデアミナーゼ、APOBEC3Gデアミナーゼ、APOBEC3Hデアミナーゼ、またはその組合せを含むことができる。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼドメインはAPOBEC1デアミナーゼを含む。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼドメインはラットAPOBEC1デアミナーゼを含む。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼ酵素(たとえばrAPOBEC1)をdCasのN末端と融合させて、BE1と命名される塩基編集酵素を生じることができる。
融合タンパク質は、Casタンパク質および塩基編集ドメインを含む。塩基編集は、二本鎖DNA切断(DSB)を必要とせずに、標的ゲノム座位での、特定のDNA塩基から別の塩基への直接的な不可逆的変換を可能にする。図1Dは塩基エディターの1個の設計プロセスを示す。一部の実施形態では、塩基編集ドメインは(i)シチジンデアミナーゼドメインおよび(ii)少なくとも1個のウラシルグリコシラーゼ阻害剤(UGI)ドメインを含む。
シチジンデアミナーゼドメインは、DNA塩基シトシンをウラシルへと変換することができる(図1C参照)。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼドメインは、アポリポタンパク質B mRNA編集酵素、触媒的ポリペプチド様(APOBEC)ファミリーデアミナーゼを含むことができる。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼドメインは、APOBEC1デアミナーゼ、APOBEC2デアミナーゼ、APOBEC3Aデアミナーゼ、APOBEC3Bデアミナーゼ、APOBEC3Cデアミナーゼ、APOBEC3Dデアミナーゼ、APOBEC3Fデアミナーゼ、APOBEC3Gデアミナーゼ、APOBEC3Hデアミナーゼ、またはその組合せを含むことができる。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼドメインはAPOBEC1デアミナーゼを含む。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼドメインはラットAPOBEC1デアミナーゼを含む。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼ酵素(たとえばrAPOBEC1)をdCasのN末端と融合させて、BE1と命名される塩基編集酵素を生じることができる。
一部の実施形態では、少なくとも1個のUGIドメインは、ウラシル-DNAグリコシラーゼ(UDG)活性を阻害することができるドメインを含む。UDG活性は、N-グリコシド結合を切断することによってウラシルを核酸から除去することを含み得る。UDG活性は塩基切除修復(BER)経路を開始し得る。UDG活性を阻害することができるUGIドメインは、続くU:GミスマッチがC:G塩基対へと修復されて戻ることを防止し、したがって、細胞DNA修復プロセスを操作して所望の結果(たとえばT:A塩基対)の収率を増加させることができる。一部の実施形態では、少なくとも1個のUGIドメインは、配列番号20のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。一部の実施形態では、少なくとも1個のUGIドメインは、配列番号6または配列番号18のポリヌクレオチド配列によってコードされているアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、塩基編集ドメインは、1個のUGIドメインまたは2個のUGIドメインを含む。複数個のUGIドメインが塩基編集ドメイン中に存在する場合、UGIドメインのわずかに異なるまたは変異の配列を使用して、2つの同一配列が同じコンストラクト上で互いに隣接している場合にそれらが組み換える傾向を回避し得る。一部の実施形態では、UGIを、dCasのN末端と融合したシチジンデアミナーゼ酵素(たとえばrAPOBEC1)と融合させて、BE2と命名される塩基編集酵素を生じることができる。一部の実施形態では、2個のUGIを、dCasのN末端と融合したシチジンデアミナーゼ酵素(たとえばrAPOBEC1)と融合させて、BE4と命名される塩基編集酵素を生じることができる。
一部の実施形態では、融合タンパク質は以下の構造:NH2-[シチジンデアミナーゼドメイン]-[Casタンパク質]-[UGIドメイン]-COOH(式中、「-」のそれぞれの記号(instance)は任意選択のリンカーを含む)を含むことができる。リンカーは任意のアミノ酸配列であり得る。リンカーは、たとえば、およそ2~10、およそ5~10、およそ5~20、またはおよそ10~25個のアミノ酸の長さであり得る。リンカーは、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、または少なくとも20個のアミノ酸の長さであり得る。リンカーは、30個未満、29個未満、28個未満、27個未満、26個未満、25個未満、24個未満、23個未満、22個未満、21個未満、20個未満、19個未満、18個未満、17個未満、16個未満、15個未満、14個未満、13個未満、12個未満、11個未満、または10個未満個のアミノ酸の長さであり得る。一部の実施形態では、リンカーはXTENリンカー(16個のアミノ酸)を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は以下の構造:NH2-[シチジンデアミナーゼドメイン]-[Casタンパク質]-[UGIドメイン]-[UGIドメイン]-COOH(式中、「-」のそれぞれの記号は任意選択のリンカーを含む)を含むことができる。一部の実施形態では、融合タンパク質は核移行配列(NLS)をさらに含むことができる。一部の実施形態では、融合タンパク質は、以下の構造:NH2-[シチジンデアミナーゼドメイン]-[Cas9タンパク質]-[UGIドメイン]-[NLS]-COOH(式中、「-」のそれぞれの記号は任意選択のリンカーを含む)を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号7または配列番号8によってコードされているまたはそれに対応するアミノ酸配列を含むことができる。
c)gRNA
CRISPR/Casをベースにした塩基編集システムは少なくとも1個のgRNAを含み得る。gRNAは、ジストロフィン遺伝子を標的とし得る。gRNAはジストロフィン遺伝子の一部分と結合し、それを標的とし得る。gRNAは、ジストロフィン遺伝子中のRNAスプライシング部位を標的とし得る。gRNAは、突然変異したジストロフィン遺伝子中のRNAスプライシング部位を標的とし得る。少なくとも1個のgRNAは、配列番号1を含む核酸配列を標的とし得る。一部の実施形態では、少なくとも1個のgRNAは、配列番号1を含む核酸配列によってコードされている。gRNAは、CRISPR/Casをベースにした塩基編集システムの標的化をもたらす。gRNAは、2個の非コードRNA、すなわちcrRNAおよびtracrRNAの融合物である。sgRNAは、標的化特異性を与える20bpのプロトスペーサーをコードしている配列を、相補的塩基対合によって、所望のDNA標的と交換することによって、任意の所望のDNA配列を標的とし得る。gRNAは、II型エフェクターシステムに関与している天然に存在するcrRNA:tracrRNA二重鎖を模倣する。たとえば42個のヌクレオチドのcrRNAおよび75個のヌクレオチドのtracrRNAを含み得るこの二重鎖は、Cas9のガイドとして役割を果たす。
CRISPR/Casをベースにした塩基編集システムは少なくとも1個のgRNAを含み得る。gRNAは、ジストロフィン遺伝子を標的とし得る。gRNAはジストロフィン遺伝子の一部分と結合し、それを標的とし得る。gRNAは、ジストロフィン遺伝子中のRNAスプライシング部位を標的とし得る。gRNAは、突然変異したジストロフィン遺伝子中のRNAスプライシング部位を標的とし得る。少なくとも1個のgRNAは、配列番号1を含む核酸配列を標的とし得る。一部の実施形態では、少なくとも1個のgRNAは、配列番号1を含む核酸配列によってコードされている。gRNAは、CRISPR/Casをベースにした塩基編集システムの標的化をもたらす。gRNAは、2個の非コードRNA、すなわちcrRNAおよびtracrRNAの融合物である。sgRNAは、標的化特異性を与える20bpのプロトスペーサーをコードしている配列を、相補的塩基対合によって、所望のDNA標的と交換することによって、任意の所望のDNA配列を標的とし得る。gRNAは、II型エフェクターシステムに関与している天然に存在するcrRNA:tracrRNA二重鎖を模倣する。たとえば42個のヌクレオチドのcrRNAおよび75個のヌクレオチドのtracrRNAを含み得るこの二重鎖は、Cas9のガイドとして役割を果たす。
一部の実施形態では、少なくとも1個のgRNAは、標的領域を標的としてそれと結合し得る。一部の実施形態では、1~20個のgRNAを、標的遺伝子を変更する、たとえばスプライスアクセプター部位を変更するために使用し得る。たとえば、1個のgRNA~20個のgRNA、1個のgRNA~15個のgRNA、1個のgRNA~10個のgRNA、1個のgRNA~5個のgRNA、2個のgRNA~20個のgRNA、2個のgRNA~15個のgRNA、2個のgRNA~10個のgRNA、2個のgRNA~5個のgRNA、5個のgRNA~20個のgRNA、5個のgRNA~15個のgRNA、または5個のgRNA~10個のgRNAを、CRISPR/Casをベースにした塩基編集システム中に含めて、スプライスアクセプター部位を変更するために使用し得る。一部の実施形態では、少なくとも1個のgRNA、少なくとも2個のgRNA、少なくとも3個のgRNA、少なくとも4個のgRNA、少なくとも5個のgRNA、少なくとも6個のgRNA、少なくとも7個のgRNA、少なくとも8個のgRNA、少なくとも9個のgRNA、少なくとも10個のgRNA、少なくとも11個のgRNA、少なくとも12個のgRNA、少なくとも13個のgRNA、少なくとも14個のgRNA、少なくとも15個のgRNA、または少なくとも20個のgRNAを、CRISPR/Casをベースにした塩基編集システム中に含めて、スプライスアクセプター部位を変更するために使用し得る。一部の実施形態では、20個未満のgRNA、19個未満のgRNA、18個未満のgRNA、17個未満のgRNA、16個未満のgRNA、15個未満のgRNA、14個未満のgRNA、13個未満のgRNA、12個未満のgRNA、11個未満のgRNA、10個未満のgRNA、9個未満のgRNA、8個未満のgRNA、7個未満のgRNA、6個未満のgRNA、5個未満のgRNA、4個未満のgRNA、または3個未満のgRNAをCRISPR/Casをベースにした塩基編集システム中に含めて、スプライスアクセプター部位を変更するために使用し得る。
CRISPR/Casをベースにした塩基編集システムは、様々な配列および長さのgRNAを使用し得る。gRNAは、配列番号1を含む標的配列、または配列番号1を含む標的配列の相補的ポリヌクレオチド配列などの、標的DNA配列の相補的ポリヌクレオチド配列、続いてNGGを含み得る。gRNAは、相補的ポリヌクレオチド配列の5’末端に「G」を含み得る。gRNAは、5~40塩基対、5~35塩基対、5~30塩基対、10~35塩基対、または10~30塩基対の、標的DNA配列の相補的ポリヌクレオチド配列、続いてNGGを含み得る。gRNAは、少なくとも10塩基対、少なくとも11塩基対、少なくとも12塩基対、少なくとも13塩基対、少なくとも14塩基対、少なくとも15塩基対、少なくとも16塩基対、少なくとも17塩基対、少なくとも18塩基対、少なくとも19塩基対、少なくとも20塩基対、少なくとも21塩基対、少なくとも22塩基対、少なくとも23塩基対、少なくとも24塩基対、少なくとも25塩基対、少なくとも30塩基対、または少なくとも35塩基対の標的DNA配列の相補的ポリヌクレオチド配列、続いてNGGを含み得る。gRNAは、40塩基対未満、35塩基対未満、30塩基対未満、25塩基対未満、24塩基対未満、23塩基対未満、22塩基対未満、21塩基対未満、20塩基対未満、19塩基対未満、18塩基対未満、17塩基対未満、16塩基対未満、または15塩基対未満の、標的DNA配列の相補的ポリヌクレオチド配列、続いてNGGを含み得る。gRNAは、標的遺伝子のプロモーター領域、エンハンサー領域、または転写された領域のうちの少なくとも1個を標的とし得る。gRNAは、配列番号1、その相補体、その変異体、またはその断片のうちの少なくとも1種に対応する核酸配列を含み得る。
3.ジストロフィン機能を修復するための組成物
本発明は、エクソン45のスプライスアクセプター部位を変更または除去することによってジストロフィン機能を修復するための組成物に向けられている。組成物は上述のCRISPR/Casをベースにした塩基編集システムを含み得る。組成物はウイルス送達系も含み得る。たとえば、ウイルス送達系は、アデノ随伴ウイルスベクターまたは改変レンチウイルスベクターを含み得る。
核酸を宿主細胞内に導入する方法は当分野で知られており、任意の既知の方法を使用して核酸(たとえば発現コンストラクト)を細胞内に導入することができる。適切な方法としては、たとえば、ウイルスまたはバクテリオファージ感染、形質移入、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、ポリカチオンまたは脂質:核酸コンジュゲート、リポフェクション、電気穿孔、ヌクレオフェクション、免疫リポソーム、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン(PEI)媒介性形質移入、DEAE-デキストラン媒介性形質移入、リポソーム媒介性形質移入、粒子銃技術、リン酸カルシウム沈殿、直接マクロ注入、ナノ粒子媒介性核酸送達などが挙げられる。一部の実施形態では、組成物は、mRNA送達およびリボ核タンパク質(RNP)複合体送達によって送達し得る。
本発明は、エクソン45のスプライスアクセプター部位を変更または除去することによってジストロフィン機能を修復するための組成物に向けられている。組成物は上述のCRISPR/Casをベースにした塩基編集システムを含み得る。組成物はウイルス送達系も含み得る。たとえば、ウイルス送達系は、アデノ随伴ウイルスベクターまたは改変レンチウイルスベクターを含み得る。
核酸を宿主細胞内に導入する方法は当分野で知られており、任意の既知の方法を使用して核酸(たとえば発現コンストラクト)を細胞内に導入することができる。適切な方法としては、たとえば、ウイルスまたはバクテリオファージ感染、形質移入、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、ポリカチオンまたは脂質:核酸コンジュゲート、リポフェクション、電気穿孔、ヌクレオフェクション、免疫リポソーム、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン(PEI)媒介性形質移入、DEAE-デキストラン媒介性形質移入、リポソーム媒介性形質移入、粒子銃技術、リン酸カルシウム沈殿、直接マクロ注入、ナノ粒子媒介性核酸送達などが挙げられる。一部の実施形態では、組成物は、mRNA送達およびリボ核タンパク質(RNP)複合体送達によって送達し得る。
a)コンストラクトおよびプラスミド
上述の組成物は、本明細書中に開示するCRISPR/Casをベースにした塩基編集システムをコードしている遺伝子コンストラクトを含み得る。プラスミドまたは発現ベクターなどの遺伝子コンストラクトは、CRISPR/Casをベースにした塩基編集システムをコードしている核酸および/またはgRNAのうちの少なくとも1個を含み得る。上述の組成物は、改変アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターをコードしている遺伝子コンストラクト、および本明細書中に開示するCRISPR/Casをベースにした塩基編集システムをコードしている核酸配列を含み得る。一部の実施形態では、上述の組成物は、改変アデノウイルスベクターをコードしている遺伝子コンストラクト、および本明細書中に開示するCRISPR/Casをベースにした塩基編集システムをコードしている核酸配列を含み得る。プラスミドなどの遺伝子コンストラクトは、CRISPR/Casをベースにした塩基編集システムをコードしている核酸を含み得る。上述の組成物は、改変レンチウイルスベクターをコードしている遺伝子コンストラクトを含み得る。プラスミドなどの遺伝子コンストラクトは、融合タンパク質をコードしている核酸および少なくとも1個のgRNAを含み得る。遺伝子コンストラクトは、機能的な染色体外分子として細胞中に存在し得る。遺伝子コンストラクトは、セントロメア、テロメア、またはプラスミド、またはコスミドを含めた直鎖状のミニ染色体であり得る。
上述の組成物は、本明細書中に開示するCRISPR/Casをベースにした塩基編集システムをコードしている遺伝子コンストラクトを含み得る。プラスミドまたは発現ベクターなどの遺伝子コンストラクトは、CRISPR/Casをベースにした塩基編集システムをコードしている核酸および/またはgRNAのうちの少なくとも1個を含み得る。上述の組成物は、改変アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターをコードしている遺伝子コンストラクト、および本明細書中に開示するCRISPR/Casをベースにした塩基編集システムをコードしている核酸配列を含み得る。一部の実施形態では、上述の組成物は、改変アデノウイルスベクターをコードしている遺伝子コンストラクト、および本明細書中に開示するCRISPR/Casをベースにした塩基編集システムをコードしている核酸配列を含み得る。プラスミドなどの遺伝子コンストラクトは、CRISPR/Casをベースにした塩基編集システムをコードしている核酸を含み得る。上述の組成物は、改変レンチウイルスベクターをコードしている遺伝子コンストラクトを含み得る。プラスミドなどの遺伝子コンストラクトは、融合タンパク質をコードしている核酸および少なくとも1個のgRNAを含み得る。遺伝子コンストラクトは、機能的な染色体外分子として細胞中に存在し得る。遺伝子コンストラクトは、セントロメア、テロメア、またはプラスミド、またはコスミドを含めた直鎖状のミニ染色体であり得る。
また、遺伝子コンストラクトは、組換えレンチウイルス、組換えアデノウイルス、および組換えアデノウイルス関連ウイルスを含めた組換えウイルスベクターのゲノムの一部であり得る。遺伝子コンストラクトは、弱毒化した生きた微生物中の遺伝物質の一部または細胞中に生きる組換え微生物ベクターであり得る。遺伝子コンストラクトは、核酸のコード配列の遺伝子発現のための調節要素を含み得る。調節要素は、プロモーター、エンハンサー、開始コドン、ストップコドン、またはポリアデニル化シグナルであり得る。
核酸配列は、ベクターであり得る遺伝子コンストラクトを構成し得る。ベクターは、CRISPR/Casをベースにした塩基編集システムなどの融合タンパク質を哺乳動物の細胞中で発現させることができ得る。ベクターは組換えであり得る。ベクターは、CRISPR/Casをベースにした塩基編集システムなどの融合タンパク質をコードしている異種核酸を含み得る。ベクターはプラスミドであり得る。ベクターは、CRISPR/Casをベースにした塩基編集システムをコードしている核酸で細胞を形質移入するために有用である場合があり、形質転換させた宿主細胞は、CRISPR/Casをベースにした塩基編集システムの発現が起こる条件下で培養および維持する。
コード配列は、安定性および高い発現レベルのために最適化し得る。一部の例では、コドンは、分子内結合が原因で形成されるものなどの、RNAの二次構造形成を減らすように選択される。
コード配列は、安定性および高い発現レベルのために最適化し得る。一部の例では、コドンは、分子内結合が原因で形成されるものなどの、RNAの二次構造形成を減らすように選択される。
ベクターは、CRISPR/Casをベースにした塩基編集システムをコードしている異種核酸を含んでいてよく、CRISPR/Casをベースにした塩基編集システムのコード配列の上流であり得る開始コドン、およびCRISPR/Casをベースにした塩基編集システムのコード配列の下流であり得るストップコドンをさらに含んでいてよい。開始および終止コドンは、CRISPR/Casをベースにした塩基編集システムのコード配列とインフレームであり得る。また、ベクターは、CRISPR/Casをベースにした塩基編集システムのコード配列と作動可能に連結されているプロモーターも含み得る。CRISPR/Casをベースにした塩基編集システムは、空間および時間における塩基編集のダイナミック制御を可能にするために、光誘導性または化学誘導性の制御下であり得る。CRISPR/Casをベースにした塩基編集システムのコード配列と作動可能に連結されているプロモーターは、シミアンウイルス40(SV40)由来のプロモーター、マウス乳癌ウイルス(MMTV)プロモーター、ウシ免疫不全ウイルス(BIV)末端反復配列(LTR)プロモーターなどのヒト免疫不全ウイルス(HIV)プロモーター、モロニーウイルスプロモーター、トリ白血症ウイルス(ALV)プロモーター、CMV前初期プロモーターなどのサイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、エプスタイン・バーウイルス(EBV)プロモーター、またはラウス肉腫ウイルス(RSV)プロモーターであり得る。また、プロモーターは、ヒトユビキチンC(hUbC)、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、またはヒトメタロチオネインなどの、ヒト遺伝子由来のプロモーターであり得る。また、プロモーターは、天然または合成の、筋肉または皮膚特異的プロモーターなどの組織特異的プロモーターであってもよい。そのようなプロモーターの例は、その内容がその全体で本明細書中に組み込まれている米国特許出願公開US20040175727号に記載されている。
ベクターは、CRISPR/Casをベースにした塩基編集システムの下流であり得るポリアデニル化シグナルも含み得る。ポリアデニル化シグナルは、SV40ポリアデニル化シグナル、LTRポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン(bGH)ポリアデニル化シグナル、ヒト成長ホルモン(hGH)ポリアデニル化シグナル、またはヒトβ-グロビンポリアデニル化シグナルであり得る。SV40ポリアデニル化シグナルは、pCEP4ベクター(Invitrogen、カリフォルニア州San Diego)からのポリアデニル化シグナルであり得る。
ベクターは、CRISPR/Casをベースにした塩基編集システムまたはsgRNAの上流にエンハンサーも含み得る。エンハンサーはDNA発現に必要であり得る。エンハンサーは、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、または、CMV、HA、RSV、もしくはEBV由来のものなどのウイルスエンハンサーであり得る。ポリヌクレオチド機能エンハンサーは、それぞれの内容が参考として完全に組み込まれている、米国特許第5,593,972号、第5,962,428号、およびWO94/016737号に記載されている。ベクターは、ベクターを染色体外に維持し、細胞中でベクターの複数コピーを生じるために、哺乳動物複製起点も含み得る。ベクターは、ベクターを投与した哺乳動物またはヒト細胞中での遺伝子発現によく適している場合がある調節配列も含み得る。また、ベクターは、緑色蛍光タンパク質(「GFP」)などのレポーター遺伝子および/またはハイグロマイシン(「Hygro」)などの選択マーカーを含んでいてもよい。
ベクターは、CRISPR/Casをベースにした塩基編集システムまたはsgRNAの上流にエンハンサーも含み得る。エンハンサーはDNA発現に必要であり得る。エンハンサーは、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、または、CMV、HA、RSV、もしくはEBV由来のものなどのウイルスエンハンサーであり得る。ポリヌクレオチド機能エンハンサーは、それぞれの内容が参考として完全に組み込まれている、米国特許第5,593,972号、第5,962,428号、およびWO94/016737号に記載されている。ベクターは、ベクターを染色体外に維持し、細胞中でベクターの複数コピーを生じるために、哺乳動物複製起点も含み得る。ベクターは、ベクターを投与した哺乳動物またはヒト細胞中での遺伝子発現によく適している場合がある調節配列も含み得る。また、ベクターは、緑色蛍光タンパク質(「GFP」)などのレポーター遺伝子および/またはハイグロマイシン(「Hygro」)などの選択マーカーを含んでいてもよい。
ベクターは、参考として完全に組み込まれているSambrook et al., Molecular Cloning and Laboratory Manual, Second Ed., Cold Spring Harbor (1989)を含めた、ルーチン技法および容易に入手可能な出発物質によってタンパク質を産生させるための発現ベクターまたはシステムであり得る。一部の実施形態では、ベクターは、融合タンパク質をコードしている核酸配列と、配列番号1の核酸配列、その相補体、その変異体、またはその断片を含む、少なくとも1個のgRNAをコードしている核酸配列とを含む、CRISPR/Casをベースにした塩基編集システムをコードしている核酸配列を含み得る。
一部の実施形態では、組成物は、mRNAおよびタンパク質/RNA複合体(リボ核タンパク質(RNP))によって送達する。たとえば、精製融合タンパク質をガイドRNAと組み合わせてRNP複合体を形成することができる。
一部の実施形態では、組成物は、mRNAおよびタンパク質/RNA複合体(リボ核タンパク質(RNP))によって送達する。たとえば、精製融合タンパク質をガイドRNAと組み合わせてRNP複合体を形成することができる。
b)改変レンチウイルスベクター
エクソン45のスプライスアクセプター部位を変更するための組成物は、改変レンチウイルスベクターを含み得る。改変レンチウイルスベクターは、融合タンパク質コードしている第1のポリヌクレオチド配列および少なくとも1個のgRNAをコードしている第2のポリヌクレオチド配列を含む。第1のポリヌクレオチド配列は、プロモーターと作動可能に連結されていてよい。プロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、抑制性プロモーター、または調節可能プロモーターであり得る。
第2のポリヌクレオチド配列は、少なくとも1個のgRNAをコードしている。たとえば、第2のポリヌクレオチド配列は、1個のgRNA~20個のgRNA、1個のgRNA~15個のgRNA、1個のgRNA~10個のgRNA、1個のgRNA~5個のgRNA、2個のgRNA~20個のgRNA、2個のgRNA~15個のgRNA、2個のgRNA~10個のgRNA、2個のgRNA~5個のgRNA、5個のgRNA~20個のgRNA、5個のgRNA~15個のgRNA、または5個のgRNA~10個のgRNAをコードしていてよい。第2のポリヌクレオチド配列は、少なくとも1個のgRNA、少なくとも2個のgRNA、少なくとも3個のgRNA、少なくとも4個のgRNA、少なくとも5個のgRNA、少なくとも6個のgRNA、少なくとも7個のgRNA、少なくとも8個のgRNA、少なくとも9個のgRNA、少なくとも10個のgRNA、少なくとも11個のgRNA、少なくとも12個のgRNA、少なくとも13個のgRNA、少なくとも14個のgRNA、少なくとも15個のgRNA、少なくとも16個のgRNA、少なくとも17個のgRNA、少なくとも18個のgRNA、少なくとも19個のgRNA、または少なくとも20個のgRNAをコードしていてよい。第2のポリヌクレオチド配列は、20個未満のgRNA、19個未満のgRNA、18個未満のgRNA、17個未満のgRNA、16個未満のgRNA、15個未満のgRNA、14個未満のgRNA、13個未満のgRNA、12個未満のgRNA、11個未満のgRNA、10個未満のgRNA、9個未満のgRNA、8個未満のgRNA、7個未満のgRNA、6個未満のgRNA、5個未満のgRNA、4個未満のgRNA、または3個未満のgRNAをコードしていてよい。第2のポリヌクレオチド配列は、プロモーターと作動可能に連結されていてよい。プロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、抑制性プロモーター、または調節可能プロモーターであり得る。少なくとも1個のgRNAは、エクソン45のスプライスアクセプター部位を含む標的領域などの標的遺伝子または座位と結合し得る。
エクソン45のスプライスアクセプター部位を変更するための組成物は、改変レンチウイルスベクターを含み得る。改変レンチウイルスベクターは、融合タンパク質コードしている第1のポリヌクレオチド配列および少なくとも1個のgRNAをコードしている第2のポリヌクレオチド配列を含む。第1のポリヌクレオチド配列は、プロモーターと作動可能に連結されていてよい。プロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、抑制性プロモーター、または調節可能プロモーターであり得る。
第2のポリヌクレオチド配列は、少なくとも1個のgRNAをコードしている。たとえば、第2のポリヌクレオチド配列は、1個のgRNA~20個のgRNA、1個のgRNA~15個のgRNA、1個のgRNA~10個のgRNA、1個のgRNA~5個のgRNA、2個のgRNA~20個のgRNA、2個のgRNA~15個のgRNA、2個のgRNA~10個のgRNA、2個のgRNA~5個のgRNA、5個のgRNA~20個のgRNA、5個のgRNA~15個のgRNA、または5個のgRNA~10個のgRNAをコードしていてよい。第2のポリヌクレオチド配列は、少なくとも1個のgRNA、少なくとも2個のgRNA、少なくとも3個のgRNA、少なくとも4個のgRNA、少なくとも5個のgRNA、少なくとも6個のgRNA、少なくとも7個のgRNA、少なくとも8個のgRNA、少なくとも9個のgRNA、少なくとも10個のgRNA、少なくとも11個のgRNA、少なくとも12個のgRNA、少なくとも13個のgRNA、少なくとも14個のgRNA、少なくとも15個のgRNA、少なくとも16個のgRNA、少なくとも17個のgRNA、少なくとも18個のgRNA、少なくとも19個のgRNA、または少なくとも20個のgRNAをコードしていてよい。第2のポリヌクレオチド配列は、20個未満のgRNA、19個未満のgRNA、18個未満のgRNA、17個未満のgRNA、16個未満のgRNA、15個未満のgRNA、14個未満のgRNA、13個未満のgRNA、12個未満のgRNA、11個未満のgRNA、10個未満のgRNA、9個未満のgRNA、8個未満のgRNA、7個未満のgRNA、6個未満のgRNA、5個未満のgRNA、4個未満のgRNA、または3個未満のgRNAをコードしていてよい。第2のポリヌクレオチド配列は、プロモーターと作動可能に連結されていてよい。プロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、抑制性プロモーター、または調節可能プロモーターであり得る。少なくとも1個のgRNAは、エクソン45のスプライスアクセプター部位を含む標的領域などの標的遺伝子または座位と結合し得る。
c)アデノ随伴ウイルスベクター
AAVは、様々なコンストラクト立体配置を使用して組成物を細胞に送達するために使用し得る。たとえば、AAVは、融合タンパク質およびgRNA発現カセットを別々のベクター上で送達し得る。あるいは、融合タンパク質および2個までのgRNA発現カセットの両方を、単一のAAVベクター中で4.7kbのパッケージング限界内で組み合わせ得る。
AAVは、様々なコンストラクト立体配置を使用して組成物を細胞に送達するために使用し得る。たとえば、AAVは、融合タンパク質およびgRNA発現カセットを別々のベクター上で送達し得る。あるいは、融合タンパク質および2個までのgRNA発現カセットの両方を、単一のAAVベクター中で4.7kbのパッケージング限界内で組み合わせ得る。
上述の組成物は改変アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを含む。改変AAVベクターは、哺乳動物の細胞中において部位特異的ヌクレアーゼを送達および発現させることでき得る。たとえば、改変AAVベクターはAAV-SASTGベクターであり得る(Piacentino et al. (2012) Human Gene Therapy 23:635-646)。改変AAVベクターは、AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV8、およびAAV9を含めたいくつかのカプシド型のうちの1種または複数種に基づき得る。改変AAVベクターは、全身性および局所的な送達によって骨格筋または心筋に効率的に形質導入する、AAV2/1、AAV2/6、AAV2/7、AAV2/8、AAV2/9、AAV2.5、およびAAV/SASTGベクターなどの代替筋肉向性AAVカプシドを有するAAV2偽型に基づき得る(Seto et al. Current Gene Therapy (2012) 12:139-151)。
4.突然変異ジストロフィン遺伝子を有する対象においてジストロフィン機能を修復する方法
DMDを患っているおよび/または突然変異ジストロフィン遺伝子を有する細胞および/または対象において、ジストロフィン機能(たとえば、突然変異ジストロフィン遺伝子、たとえば突然変異ヒトジストロフィン遺伝子)を修復する方法を、本明細書中に提供する。また、それを必要としている対象において、デュシェンヌ筋ジストロフィーを処置する方法も、本明細書中に提供する。また、対象のゲノムDNA中にコードされているRNAスプライシング部位を変更する方法も、本明細書中に提供する。本方法は、本明細書中に詳述する、CRISPR/Casをベースにした遺伝子編集システム、前記CRISPR/Casをベースにした遺伝子編集システムをコードしているポリヌクレオチドもしくはベクター、または前記CRISPR/Cas9をベースにした遺伝子編集システムの組成物を、細胞または対象もしくはその細胞に投与することを含むことができる。一部の実施形態では、対象はデュシェンヌ筋ジストロフィーを患っている。
DMDを患っているおよび/または突然変異ジストロフィン遺伝子を有する細胞および/または対象において、ジストロフィン機能(たとえば、突然変異ジストロフィン遺伝子、たとえば突然変異ヒトジストロフィン遺伝子)を修復する方法を、本明細書中に提供する。また、それを必要としている対象において、デュシェンヌ筋ジストロフィーを処置する方法も、本明細書中に提供する。また、対象のゲノムDNA中にコードされているRNAスプライシング部位を変更する方法も、本明細書中に提供する。本方法は、本明細書中に詳述する、CRISPR/Casをベースにした遺伝子編集システム、前記CRISPR/Casをベースにした遺伝子編集システムをコードしているポリヌクレオチドもしくはベクター、または前記CRISPR/Cas9をベースにした遺伝子編集システムの組成物を、細胞または対象もしくはその細胞に投与することを含むことができる。一部の実施形態では、対象はデュシェンヌ筋ジストロフィーを患っている。
本方法は、上述の本明細書中に開示する遺伝子コンストラクト(たとえばベクター)またはそれを含む組成物を、細胞または対象に投与することを含むことができる。本方法は、対象の骨格筋または心筋に、上述の骨格筋または心筋中のゲノム編集、たとえば塩基編集のための本明細書中に開示する遺伝子コンストラクト(たとえばベクター)またはそれを含む組成物を投与することを含むことができる。CRISPR/Casをベースにした遺伝子編集システムを骨格筋または心筋に送達するための、本明細書中に開示する遺伝子コンストラクト(たとえばベクター)またはそれを含む組成物の使用は、完全に機能的または部分的に機能的なタンパク質の発現を修復し得る。CRISPR/Casをベースにした遺伝子編集システム、功を奏したかつ効率的な遺伝子改変の率が高いことで、高度なゲノム編集の利点を有する。
本方法は、融合タンパク質、前記融合タンパク質をコードしているポリヌクレオチド配列、および/または、配列番号1、その相補体、その変異体、もしくはその断片を含む、もしくはそれによってコードされている、もしくはそれに対応する、少なくとも1個のgRNAを投与することなど、CRISPR/Casをベースにした遺伝子編集システムを投与することを含み得る。
本方法は、融合タンパク質、前記融合タンパク質をコードしているポリヌクレオチド配列、および/または、配列番号1、その相補体、その変異体、もしくはその断片を含む、もしくはそれによってコードされている、もしくはそれに対応する、少なくとも1個のgRNAを投与することなど、CRISPR/Casをベースにした遺伝子編集システムを投与することを含み得る。
5.医薬組成物
CRISPR/Casをベースにした塩基編集システムは医薬組成物中であり得る。医薬組成物は、およそ1ng~およそ10mgの、CRISPR/Casをベースにした塩基編集システムをコードしているDNAを含み得る。本発明による医薬組成物は、使用する投与様式に従って配合する。医薬組成物が注射用医薬組成物である場合、これらは無菌的であり、発熱物質を含まず、粒子を含まない。等張配合物を好ましくは使用する。一般に、等張性のための添加剤としては、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、およびラクトースを挙げ得る。一部の事例では、リン酸緩衝生理食塩水などの等張溶液が好ましい。安定化剤としてはゼラチンおよびアルブミンが挙げられる。一部の実施形態では、血管狭窄剤を配合物に加える。
CRISPR/Casをベースにした塩基編集システムを含有する医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含み得る。薬学的に許容される賦形剤は、ビヒクル、アジュバント、担体、または希釈剤などの機能的分子であり得る。薬学的に許容される賦形剤は形質移入促進剤であってよく、免疫刺激複合体(ISCOMS)などの界面活性剤、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリル脂質Aを含めたLPS類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体、スクアレンおよびスクアレンなどの小胞、ヒアルロン酸、脂質、リポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、もしくはナノ粒子、または他の既知の形質移入促進剤を挙げ得る。
CRISPR/Casをベースにした塩基編集システムは医薬組成物中であり得る。医薬組成物は、およそ1ng~およそ10mgの、CRISPR/Casをベースにした塩基編集システムをコードしているDNAを含み得る。本発明による医薬組成物は、使用する投与様式に従って配合する。医薬組成物が注射用医薬組成物である場合、これらは無菌的であり、発熱物質を含まず、粒子を含まない。等張配合物を好ましくは使用する。一般に、等張性のための添加剤としては、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、およびラクトースを挙げ得る。一部の事例では、リン酸緩衝生理食塩水などの等張溶液が好ましい。安定化剤としてはゼラチンおよびアルブミンが挙げられる。一部の実施形態では、血管狭窄剤を配合物に加える。
CRISPR/Casをベースにした塩基編集システムを含有する医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含み得る。薬学的に許容される賦形剤は、ビヒクル、アジュバント、担体、または希釈剤などの機能的分子であり得る。薬学的に許容される賦形剤は形質移入促進剤であってよく、免疫刺激複合体(ISCOMS)などの界面活性剤、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリル脂質Aを含めたLPS類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体、スクアレンおよびスクアレンなどの小胞、ヒアルロン酸、脂質、リポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、もしくはナノ粒子、または他の既知の形質移入促進剤を挙げ得る。
形質移入促進剤は、ポリアニオン、ポリ-L-グルタミン酸(LGS)を含めたポリカチオン、または脂質である。形質移入促進剤はポリ-L-グルタミン酸であり、より好ましくは、ポリ-L-グルタミン酸は、CRISPR/Casをベースにした塩基編集システムを含有する医薬組成物中に6mg/ml未満の濃度で存在する。形質移入促進剤は、免疫刺激複合体(ISCOMS)などの界面活性剤、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリル脂質Aを含めたLPS類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体、ならびにスクアレンおよびスクアレンなどの小胞も含んでいてよく、また、ヒアルロン酸も遺伝子コンストラクトと併せて投与して使用し得る。一部の実施形態では、CRISPR/Casをベースにした塩基編集システムをコードしているDNAベクターは、脂質、レシチンリポソームもしくは当分野で知られている他のリポソームなどのリポソームをDNA-リポソーム混合物として(たとえばW09324640号を参照)、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、もしくはナノ粒子、または他の既知の形質移入促進剤などの形質移入促進剤も含み得る。好ましくは、形質移入促進剤は、ポリアニオン、ポリ-L-グルタミン酸(LGS)を含めたポリカチオン、または脂質である。
6.送達方法
CRISPR/Casをベースにした塩基編集システムの遺伝子コンストラクトおよび/またはタンパク質を提供するために、CRISPR/Casをベースにした塩基編集システムの医薬配合物を送達する方法を、本明細書中に提供する。CRISPR/Casをベースにした塩基編集システムの送達は、細胞中に発現されて細胞の表面へと送達される1個または複数個の核酸分子としての、CRISPR/Casをベースにした塩基編集システムの形質移入または電気穿孔であり得る。CRISPR/Casをベースにした塩基編集システムタンパク質を細胞に送達し得る。核酸分子は、BioRad Gene Pulser XcellもしくはAmaxa Nucleofector IIb装置または他の電気穿孔装置を使用して電気穿孔し得る。BioRad電気穿孔溶液、Sigmaリン酸緩衝生理食塩水製品番号D8537(PBS)、Invitrogen OptiMEM I(OM)、またはAmaxa Nucleofector溶液V(N.V.)を含めたいくつかの異なる緩衝液を使用し得る。形質移入は、Lipofectamine 2000などの形質移入試薬を含み得る。
CRISPR/Casをベースにした塩基編集システムの遺伝子コンストラクトおよび/またはタンパク質を提供するために、CRISPR/Casをベースにした塩基編集システムの医薬配合物を送達する方法を、本明細書中に提供する。CRISPR/Casをベースにした塩基編集システムの送達は、細胞中に発現されて細胞の表面へと送達される1個または複数個の核酸分子としての、CRISPR/Casをベースにした塩基編集システムの形質移入または電気穿孔であり得る。CRISPR/Casをベースにした塩基編集システムタンパク質を細胞に送達し得る。核酸分子は、BioRad Gene Pulser XcellもしくはAmaxa Nucleofector IIb装置または他の電気穿孔装置を使用して電気穿孔し得る。BioRad電気穿孔溶液、Sigmaリン酸緩衝生理食塩水製品番号D8537(PBS)、Invitrogen OptiMEM I(OM)、またはAmaxa Nucleofector溶液V(N.V.)を含めたいくつかの異なる緩衝液を使用し得る。形質移入は、Lipofectamine 2000などの形質移入試薬を含み得る。
CRISPR/Casをベースにした塩基編集システムタンパク質をコードしているベクターは、in vivo電気穿孔、リポソーム媒介性、ナノ粒子促進性、および/または組換えベクターを用いたまたは用いないDNA注入(DNAワクチン接種とも呼ばれる)によって、哺乳動物に送達し得る。組換えベクターは、任意のウイルス様式によって送達し得る。ウイルス様式は、組換えレンチウイルス、組換えアデノウイルス、および/または組換えアデノ随伴ウイルスであり得る。
CRISPR/Casをベースにした塩基編集システムタンパク質をコードしているポリヌクレオチドを細胞内に導入して、標的遺伝子の遺伝子発現を誘導し得る。たとえば、標的遺伝子に向けられたCRISPR/Casをベースにした塩基編集システムをコードしている1個または複数個のポリヌクレオチド配列を、哺乳動物細胞内に導入し得る。CRISPR/Casをベースにした塩基編集システムを細胞に、その結果ベクターを哺乳動物の細胞に送達した際、形質移入した細胞はCRISPR/Casをベースにした塩基編集システムを発現する。CRISPR/Casをベースにした塩基編集システムを哺乳動物に投与して、哺乳動物における標的遺伝子の遺伝子発現を誘導または変調し得る。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、アンテロープ、バイソン、水牛、ウシ科動物、シカ、ハリネズミ、ゾウ、ラマ、アルパカ、マウス、ラット、またはニワトリ、好ましくはヒト、ウシ、ブタ、またはニワトリであり得る。
CRISPR/Casをベースにした塩基編集システムタンパク質をコードしているポリヌクレオチドを細胞内に導入して、標的遺伝子の遺伝子発現を誘導し得る。たとえば、標的遺伝子に向けられたCRISPR/Casをベースにした塩基編集システムをコードしている1個または複数個のポリヌクレオチド配列を、哺乳動物細胞内に導入し得る。CRISPR/Casをベースにした塩基編集システムを細胞に、その結果ベクターを哺乳動物の細胞に送達した際、形質移入した細胞はCRISPR/Casをベースにした塩基編集システムを発現する。CRISPR/Casをベースにした塩基編集システムを哺乳動物に投与して、哺乳動物における標的遺伝子の遺伝子発現を誘導または変調し得る。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、アンテロープ、バイソン、水牛、ウシ科動物、シカ、ハリネズミ、ゾウ、ラマ、アルパカ、マウス、ラット、またはニワトリ、好ましくはヒト、ウシ、ブタ、またはニワトリであり得る。
本明細書中に開示する遺伝子コンストラクトまたは組成物を組織に、その結果ベクターを哺乳動物の細胞内に送達した際、形質移入した細胞はgRNA分子およびCas9分子を発現する。遺伝子コンストラクトまたは組成物を哺乳動物に投与して、遺伝子発現を変更し得る、またはゲノムを再操作もしくは変更し得る。たとえば、遺伝子コンストラクトまたは組成物は、哺乳動物においてジストロフィン機能を修復するために、哺乳動物に投与し得る。哺乳動は、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、アンテロープ、バイソン、水牛、ウシ科動物、シカ、ハリネズミ、ゾウ、ラマ、アルパカ、マウス、ラット、またはニワトリ、好ましくはヒト、ウシ、ブタ、またはニワトリであり得る。
gRNA分子およびCas9分子をコードしている遺伝子コンストラクト(たとえばベクター)は、in vivo電気穿孔、リポソーム媒介性、ナノ粒子促進性、および/または組換えベクターを用いたまたは用いないDNA注入(DNAワクチン接種とも呼ばれる)によって、哺乳動物に送達することができる。組換えベクターは、任意のウイルス様式によって送達することができる。ウイルス様式は、組換えレンチウイルス、組換えアデノウイルス、および/または組換えアデノ随伴ウイルスであることができる。
gRNA分子およびCas9分子をコードしている遺伝子コンストラクト(たとえばベクター)は、in vivo電気穿孔、リポソーム媒介性、ナノ粒子促進性、および/または組換えベクターを用いたまたは用いないDNA注入(DNAワクチン接種とも呼ばれる)によって、哺乳動物に送達することができる。組換えベクターは、任意のウイルス様式によって送達することができる。ウイルス様式は、組換えレンチウイルス、組換えアデノウイルス、および/または組換えアデノ随伴ウイルスであることができる。
本明細書中に開示する遺伝子コンストラクト(たとえばベクター)またはそれを含む組成物を細胞内に導入して、ジストロフィン遺伝子(たとえばヒトジストロフィン遺伝子)のジストロフィン機能を遺伝子修復することができる。ある特定の実施形態では、本明細書中に開示する遺伝子コンストラクト(たとえばベクター)またはそれを含む組成物をDMD患者由来の筋芽細胞内に導入する。ある特定の実施形態では、遺伝子コンストラクト(たとえばベクター)またはそれを含む組成物をDMD患者由来の繊維芽細胞内に導入し、遺伝子補正した繊維芽細胞をMyoDで処置して筋芽細胞への分化を誘導することができ、補正されたジストロフィンタンパク質が機能的であるかを検証するため、および/または対象を処置するために、これを対象の損傷筋肉などの対象内に移植することができる。改変細胞は、人工多能性幹細胞、骨髄由来前駆体、骨格筋前駆体、DMD患者由来のヒト骨格筋芽細胞、CD133+細胞、中血管芽細胞、およびMyoDもしくはPax7で形質導入した細胞、または他の筋原性前駆細胞などの幹細胞であることもできる。たとえば、CRISPR/Casをベースにした遺伝子編集システムは、人工多能性幹細胞の神経性または筋原性の分化を引き起こし得る。
7.投与経路
CRISPR/Casをベースにした塩基編集システムおよびその組成物は、経口、非経口、舌下、経皮、直腸、経粘膜、外用、吸入を介する、頬側投与を介する、胸膜内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鼻腔内、くも膜下腔内、および関節内、またはその組合せを含めた様々な経路によって、対象に投与し得る。獣医学的使用には、組成物は、通常の獣医学的実施に従った適切に許容される配合物として投与し得る。獣医師が、具体的な動物に最も適切である投薬レジメンおよび投与経路を容易に決定し得る。CRISPR/Casをベースにした塩基編集システムおよびその組成物は、従来のシリンジ、無針注入装置、「微粒子衝撃遺伝子銃」、または電気穿孔(「EP」)、「流体力学的方法」、もしくは超音波などの他の物理的方法によって投与し得る。組成物は、in vivo電気穿孔、リポソーム媒介性、ナノ粒子促進性、組換えレンチウイルス、組換えアデノウイルス、および組換えアデノウイルス関連ウイルスなどの組換えベクターを用いたまたは用いないDNA注入(DNAワクチン接種とも呼ばれる)を含めたいくつかの技術によって哺乳動物に送達し得る。
CRISPR/Casをベースにした塩基編集システムおよびその組成物は、経口、非経口、舌下、経皮、直腸、経粘膜、外用、吸入を介する、頬側投与を介する、胸膜内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鼻腔内、くも膜下腔内、および関節内、またはその組合せを含めた様々な経路によって、対象に投与し得る。獣医学的使用には、組成物は、通常の獣医学的実施に従った適切に許容される配合物として投与し得る。獣医師が、具体的な動物に最も適切である投薬レジメンおよび投与経路を容易に決定し得る。CRISPR/Casをベースにした塩基編集システムおよびその組成物は、従来のシリンジ、無針注入装置、「微粒子衝撃遺伝子銃」、または電気穿孔(「EP」)、「流体力学的方法」、もしくは超音波などの他の物理的方法によって投与し得る。組成物は、in vivo電気穿孔、リポソーム媒介性、ナノ粒子促進性、組換えレンチウイルス、組換えアデノウイルス、および組換えアデノウイルス関連ウイルスなどの組換えベクターを用いたまたは用いないDNA注入(DNAワクチン接種とも呼ばれる)を含めたいくつかの技術によって哺乳動物に送達し得る。
本明細書中に開示する遺伝子コンストラクト(たとえばベクター)またはそれを含む組成物は、経口、非経口、舌下、経皮、直腸、経粘膜、外用、吸入を介する、頬側投与を介する、胸膜内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鼻腔内、くも膜下腔内、および関節内、またはその組合せを含めた様々な経路によって、対象に投与し得る。ある特定の実施形態では、本明細書中に開示する遺伝子コンストラクト(たとえばベクター)または組成物は、筋肉内、静脈内、またはその組合せで対象(たとえばDMDを患っている対象)に投与する。獣医学的使用には、本明細書中に開示する遺伝子コンストラクト(たとえばベクター)または組成物は、通常の獣医学的実施に従った適切に許容される配合物として投与し得る。獣医師が、具体的な動物に最も適切である投薬レジメンおよび投与経路を容易に決定し得る。組成物は、従来のシリンジ、無針注入装置、「微粒子衝撃遺伝子銃」、または電気穿孔(「EP」)、「流体力学的方法」、もしくは超音波などの他の物理的方法によって投与し得る。
本明細書中に開示する遺伝子コンストラクト(たとえばベクター)または組成物は、in vivo電気穿孔、リポソーム媒介性、ナノ粒子促進性、組換えレンチウイルス、組換えアデノウイルス、および組換えアデノウイルス関連ウイルスなどの組換えベクターを用いたまたは用いないDNA注入(DNAワクチン接種とも呼ばれる)を含めたいくつかの技術によって哺乳動物に送達し得る。組成物は、骨格筋または心筋内に注射し得る。たとえば、組成物は、前脛骨筋または尾部内に注射し得る。
一部の実施形態では、本明細書中に開示する遺伝子コンストラクト(たとえばベクター)またはその組成物は、1)成体マウス内への尾部静脈注入(全身性)、2)成体マウスへの筋肉内注射、たとえば、TAもしくは腓腹筋などの筋肉内への局所注入、3)P2マウス内への腹腔内注射、または4)P2マウス内への顔面静脈注入(全身性)によって投与する。
一部の実施形態では、本明細書中に開示する遺伝子コンストラクト(たとえばベクター)またはその組成物は、1)成体マウス内への尾部静脈注入(全身性)、2)成体マウスへの筋肉内注射、たとえば、TAもしくは腓腹筋などの筋肉内への局所注入、3)P2マウス内への腹腔内注射、または4)P2マウス内への顔面静脈注入(全身性)によって投与する。
8.細胞種
これらの送達方法および/または投与経路のうちの任意のものを、本明細書中に記載した(descibed)塩基編集システムを無数の細胞種に送達するために利用することができる。たとえば、細胞種としては、それだけには限定されないが、野生型およびDMD患者由来の株などの不死化筋芽細胞、一次DMD真皮線維芽細胞、人工多能性幹細胞、骨髄由来前駆体、骨格筋前駆体、DMD患者由来のヒト骨格筋芽細胞、CD133+細胞、中血管芽細胞、心筋細胞、肝細胞、軟骨細胞、間葉前駆細胞、造血幹細胞、平滑筋細胞、およびMyoDもしくはPax7で形質導入した細胞、または他の筋原性前駆細胞が挙げられ得る。ヒト筋原細胞の不死化は、遺伝子補正した筋原細胞のクローン誘導に使用することができる。ゲノム中のタンパク質コード領域中に遺伝子補正または修復されたジストロフィン遺伝子を含み、他のヌクレアーゼで導入された突然変異を含まない不死化DMD筋芽細胞のクローン集団を単離および拡大するために、細胞をex vivoで改変することができる。あるいは、非ウイルス性もしくは非組込み型ウイルス遺伝子移入による、または精製タンパク質および細胞透過モチーフを含有するgRNAの直接送達による、CRISPR/Casをベースにしたシステムの一過性in vivo送達は、外因性DNAの組込みのリスクが最小限またはない、特異性の高いin situの補正および/または修復を可能にし得る。
これらの送達方法および/または投与経路のうちの任意のものを、本明細書中に記載した(descibed)塩基編集システムを無数の細胞種に送達するために利用することができる。たとえば、細胞種としては、それだけには限定されないが、野生型およびDMD患者由来の株などの不死化筋芽細胞、一次DMD真皮線維芽細胞、人工多能性幹細胞、骨髄由来前駆体、骨格筋前駆体、DMD患者由来のヒト骨格筋芽細胞、CD133+細胞、中血管芽細胞、心筋細胞、肝細胞、軟骨細胞、間葉前駆細胞、造血幹細胞、平滑筋細胞、およびMyoDもしくはPax7で形質導入した細胞、または他の筋原性前駆細胞が挙げられ得る。ヒト筋原細胞の不死化は、遺伝子補正した筋原細胞のクローン誘導に使用することができる。ゲノム中のタンパク質コード領域中に遺伝子補正または修復されたジストロフィン遺伝子を含み、他のヌクレアーゼで導入された突然変異を含まない不死化DMD筋芽細胞のクローン集団を単離および拡大するために、細胞をex vivoで改変することができる。あるいは、非ウイルス性もしくは非組込み型ウイルス遺伝子移入による、または精製タンパク質および細胞透過モチーフを含有するgRNAの直接送達による、CRISPR/Casをベースにしたシステムの一過性in vivo送達は、外因性DNAの組込みのリスクが最小限またはない、特異性の高いin situの補正および/または修復を可能にし得る。
9.キット
突然変異したジストロフィン遺伝子を補正するおよび/またはジストロフィン機能を修復するために使用し得るキットを本明細書中に提供する。キットは、ジストロフィン機能を修復するための、配列番号1のポリヌクレオチド配列、その相補体、その変異体、またはその断片と結合し、それを標的とする、またはそれによってコードされている、またはそれに対応する、少なくとも1個のgRNAと、CRISPR/Casをベースにした編集システムを使用するための指示とを含む。また、骨格筋または心筋中のジストロフィン遺伝子の塩基編集に使用し得るキットも本明細書中に提供する。キットは、上述の骨格筋または心筋中のゲノム編集、たとえば塩基編集のための遺伝子コンストラクト(たとえばベクター)またはそれを含む組成物、および前記組成物を使用するための指示を含む。
突然変異したジストロフィン遺伝子を補正するおよび/またはジストロフィン機能を修復するために使用し得るキットを本明細書中に提供する。キットは、ジストロフィン機能を修復するための、配列番号1のポリヌクレオチド配列、その相補体、その変異体、またはその断片と結合し、それを標的とする、またはそれによってコードされている、またはそれに対応する、少なくとも1個のgRNAと、CRISPR/Casをベースにした編集システムを使用するための指示とを含む。また、骨格筋または心筋中のジストロフィン遺伝子の塩基編集に使用し得るキットも本明細書中に提供する。キットは、上述の骨格筋または心筋中のゲノム編集、たとえば塩基編集のための遺伝子コンストラクト(たとえばベクター)またはそれを含む組成物、および前記組成物を使用するための指示を含む。
キット中に含められる指示は、梱包材料に貼り得る、または添付文書として含められ得る。指示は典型的には文書または印刷された物体であるが、これらはそれに限定されない。そのような指示を記憶し、それらを最終使用者に伝達することができる任意の媒体が、本開示によって企図される。そのような媒体としては、それだけには限定されないが、電子記憶媒体(たとえば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ)、光学的媒体(たとえばCD ROM)などが挙げられる。本明細書中で使用する用語「指示」としては、指示を提供するインターネットサイトのアドレスを挙げ得る。
骨格筋または心筋中のジストロフィン機能を修復するための遺伝子コンストラクト(たとえばベクター)またはそれを含む組成物は、ジストロフィン遺伝子の一領域と特異的に結合してそれを切断する、上述のgRNA分子および融合タンパク質を含む改変AAVベクターを含み得る。上述のCRISPR/Casをベースにした遺伝子編集システムは、突然変異したジストロフィン遺伝子中の特定の領域、たとえばエクソン45スプライスアクセプター含有領域と特異的に結合し、それを標的とするために、キットに含め得る。
骨格筋または心筋中のジストロフィン機能を修復するための遺伝子コンストラクト(たとえばベクター)またはそれを含む組成物は、ジストロフィン遺伝子の一領域と特異的に結合してそれを切断する、上述のgRNA分子および融合タンパク質を含む改変AAVベクターを含み得る。上述のCRISPR/Casをベースにした遺伝子編集システムは、突然変異したジストロフィン遺伝子中の特定の領域、たとえばエクソン45スプライスアクセプター含有領域と特異的に結合し、それを標的とするために、キットに含め得る。
10.実施例
前述の記載は、例示目的で提示し、本発明の範囲を限定することを意図しない以下の実施例を参照することによって、より良好に理解させ得る。以下の非限定的な例によって例示されるように本発明は複数の態様を有する。
前述の記載は、例示目的で提示し、本発明の範囲を限定することを意図しない以下の実施例を参照することによって、より良好に理解させ得る。以下の非限定的な例によって例示されるように本発明は複数の態様を有する。
(実施例1)
PAMの利用可能性に基づいてスプライスアクセプターを塩基編集するように、gRNAを設計した(図2Aおよび図2B参照)。化膿性連鎖球菌および黄色ブドウ球菌Cas9タンパク質の両方を有するDNA塩基エディターシステム(図1Aおよび図1B)を、エクソン45~55の間のDMD遺伝子欠失のホットスポット中のヒトジストロフィンエクソンに標的化するように、gRNAを設計した。図1Bに記載したBE4max(Addgene#112093)およびAncBE4max(Addgene#112094)の設計は、発現レベルが限定されていた図1Aにおける設計よりも低い濃度でより良好に作動した。BE4maxおよびAncBE4maxの設計は同様の性能であった。gRNAは、すべての設計間で一定であるCas9部分と結合するため、同じgRNAを複数世代の塩基エディターを通して使用することができる(Cas9種が同じままである限り)。
PAMの利用可能性に基づいてスプライスアクセプターを塩基編集するように、gRNAを設計した(図2Aおよび図2B参照)。化膿性連鎖球菌および黄色ブドウ球菌Cas9タンパク質の両方を有するDNA塩基エディターシステム(図1Aおよび図1B)を、エクソン45~55の間のDMD遺伝子欠失のホットスポット中のヒトジストロフィンエクソンに標的化するように、gRNAを設計した。図1Bに記載したBE4max(Addgene#112093)およびAncBE4max(Addgene#112094)の設計は、発現レベルが限定されていた図1Aにおける設計よりも低い濃度でより良好に作動した。BE4maxおよびAncBE4maxの設計は同様の性能であった。gRNAは、すべての設計間で一定であるCas9部分と結合するため、同じgRNAを複数世代の塩基エディターを通して使用することができる(Cas9種が同じままである限り)。
400ngのgRNAプラスミドおよび400ngのBE4maxまたはAncBE4maxプラスミドを用いた、ヒトHEK293T細胞のプラスミド形質移入(Lipofectamine 2000)によって、スプライスアクセプターG>A塩基編集を様々なジストロフィンエクソンでアッセイした。MiSeqシステム(Illumina)を使用した標的部位のディープシーケンシングを行って、%G>A塩基編集を決定した。表1を参照されたい。一部のエクソンは乏しい編集効率(すなわち<0.1%の編集)を示した一方で、対立遺伝子の7~8%が、5’-GTTCCTGTAAGATACCAAAA-3’(配列番号1)のエクソン45 gRNA配列を使用してエクソン45で編集されたことが観察された。エクソン45は、その除去が2番目に大きなDMD患者群(約8%)を処置する可能性があるジストロフィンエクソンである(Aartsma-Rus et al. Human Mutation (2009) 30(3):293-9)。
400ngのgRNAプラスミドおよび400ngまたは1000ngのBE4maxプラスミドを用いた、ヒトHEK293T細胞のプラスミド形質移入(Lipofectamine 2000)によって、スプライスアクセプターG>A塩基編集をエクソン44および45でアッセイした。MiSeqシステム(Illumina)を使用した標的部位のディープシーケンシングを行って、%G>A塩基編集を決定した。塩基編集を増加するためにBE3maxプラスミドの量を増加することによって、形質移入条件を最適化した。図3Bおよび図3Cに示すように、塩基編集はエクソン45 gRNAで7~8%まで増加した。図3Aに示すようにG1およびG2の両方を編集することで、適切なエクソンスキッピングが提供され得る。
エクソンスキッピングに対するスプライシング部位の破壊の効果を試験するために、ジストロフィンエクソン44の欠失を保有するヒト人工多能性幹細胞(iPSC)株を作製した。図4A~4Dを参照されたい。この多能性細胞株は、エクソン45の除去によって補正可能な、DMD遺伝子の破壊されたリーディングフレームを有する遺伝性のDMD突然変異をモデリングしている。iPSCはジストロフィンを発現しないため、編集したエクソンがスキップされているかどうかを決定するのは困難である。iPSC中のMyoDの過剰発現を使用してジストロフィンを発現させて、RNAおよびタンパク質レベルを分析した(図5)。
MyoD cDNAのレンチウイルス形質導入によるこのΔ44 iPSC株の筋原性分化により、突然変異がジストロフィンタンパク質発現を除去することが確認される。図6を参照されたい。化膿性連鎖球菌dCas9をベースにしたAncBE4maxおよびgRNAカセットを、これらの細胞にレンチウイルス形質導入によって送達した。図7に手順のアウトラインを示す。200μLの20×ウイルスをBE4maxおよびAncBE4maxの形質導入に使用した。図8Aおよび図9Aは、それぞれBE4maxおよびAncBE4maxの%G>A塩基編集事象を示す。図8Bおよび図9Bは、それぞれBE4maxおよびAncBE4maxのすべてのgVG03 d12編集事象を示す。コンストラクト設計中のAPOBEC酵素はG>Aを変換するはずであるが、場合によってはG>TまたはG>Cの事象も起こる。Gの除去をもたらすこれらの事例のうちの任意のものがスプライシングを破壊するはずであり、したがって、「非G」事象の合計は有効編集率を与える。図10は、BE4maxおよびAncBE4maxを使用した12日後のΔ44 iPSC編集(任意の他の塩基へと編集されたGを有するリードの%)を示す。ディープシーケンシングにより、スプライスアクセプターの22%が12日後に破壊されたことが示された。図12は、レンチウイルス(lentivrus)によって送達した、AncBE4maxを使用したΔ44 iPSC中の%非G塩基編集事象を示す。図13は、電気穿孔によって送達した、AncBE4maxを使用したΔ44 iPSC中の%非G塩基編集事象を示す。細胞は、gRNAレンチウイルスで7日間(D7)および14日間(D14)処置した後に収集した。
この編集したΔ44 iPSC株中でのMyoDの過剰発現、続いてRT-PCRにより、スプライスアクセプター塩基編集がエクソン45のスキッピングをもたらし、これがジストロフィンリーディングフレームを修復することが確認された。AncBE4maxがより高い編集を示したため、これらの編集した細胞をMyoDで分化させ、RNAを収集してスキッピングを探した。図11は、以下のプライマーを用いた35回の増幅サイクル後のRT-PCR結果を示す:5’-CTACAACAAAGCTCAGGTCG-3’(配列番号16)および5’-TTCTCAGGTAAAGCTCTGGAAAC-3’(配列番号17)。エクソン45の頑強なスキッピングが、エクソン45 gRNAで処置した細胞において観察されたが、gRNAなしの対照では観察されなかった。
この編集したΔ44 iPSC株中でのMyoDの過剰発現、続いてウエスタンブロット分析により、スプライスアクセプター塩基編集がエクソン45のスキッピングをもたらし、これがジストロフィンリーディングフレームを修復することがさらに確認された。AncBE4maxレンチウイルスおよびgRNAレンチウイルス、またはWT iPSCで形質導入したΔ44 iPSC細胞を、上記図11のようにMyoDで分化させた。細胞溶解液を収集し、ジストロフィンタンパク質およびGAPDHに対する抗体を用いてウエスタンブロットを行った。ウエスタンブロット(図14)は、未処置のΔ44 iPSC細胞は、特に最も大きなアイソフォームではるかに低下したジストロフィンタンパク質発現を有していたが、塩基編集(gRNAあり)が一部のジストロフィンタンパク質発現を修復することができたことを示す。
この編集したΔ44 iPSC株中でのMyoDの過剰発現、続いてウエスタンブロット分析により、スプライスアクセプター塩基編集がエクソン45のスキッピングをもたらし、これがジストロフィンリーディングフレームを修復することがさらに確認された。AncBE4maxレンチウイルスおよびgRNAレンチウイルス、またはWT iPSCで形質導入したΔ44 iPSC細胞を、上記図11のようにMyoDで分化させた。細胞溶解液を収集し、ジストロフィンタンパク質およびGAPDHに対する抗体を用いてウエスタンブロットを行った。ウエスタンブロット(図14)は、未処置のΔ44 iPSC細胞は、特に最も大きなアイソフォームではるかに低下したジストロフィンタンパク質発現を有していたが、塩基編集(gRNAあり)が一部のジストロフィンタンパク質発現を修復することができたことを示す。
完全性の理由のため、本発明の様々な態様を以下の付番した条項中に記載する:
条項1.融合タンパク質および少なくとも1個のガイドRNA(gRNA)を含み、融合タンパク質がCasタンパク質および塩基編集ドメインを含む、対象のゲノムDNA中にコードされているRNAスプライシング部位を変更するための、CRISPR/Casをベースにした塩基編集システム。
条項2.ゲノムDNA中にコードされているRNAスプライシング部位を変更することが、RNA転写物中の少なくとも1個のエクソン配列の排除または包含をもたらす、条項1に記載のCRISPR/Casをベースにした塩基編集システム。
条項3.融合タンパク質および少なくとも1個のガイドRNA(gRNA)を含み、融合タンパク質がCasタンパク質および塩基編集ドメインを含む、対象におけるジストロフィン機能を修復するためのCRISPR/Casをベースにした塩基編集システム。
条項4.対象が突然変異したジストロフィン遺伝子を有しており、少なくとも1個のガイドRNA(gRNA)が、対象の突然変異したジストロフィン遺伝子中のRNAスプライシング部位を標的とする、条項3に記載のCRISPR/Casをベースにした塩基編集システム。
条項1.融合タンパク質および少なくとも1個のガイドRNA(gRNA)を含み、融合タンパク質がCasタンパク質および塩基編集ドメインを含む、対象のゲノムDNA中にコードされているRNAスプライシング部位を変更するための、CRISPR/Casをベースにした塩基編集システム。
条項2.ゲノムDNA中にコードされているRNAスプライシング部位を変更することが、RNA転写物中の少なくとも1個のエクソン配列の排除または包含をもたらす、条項1に記載のCRISPR/Casをベースにした塩基編集システム。
条項3.融合タンパク質および少なくとも1個のガイドRNA(gRNA)を含み、融合タンパク質がCasタンパク質および塩基編集ドメインを含む、対象におけるジストロフィン機能を修復するためのCRISPR/Casをベースにした塩基編集システム。
条項4.対象が突然変異したジストロフィン遺伝子を有しており、少なくとも1個のガイドRNA(gRNA)が、対象の突然変異したジストロフィン遺伝子中のRNAスプライシング部位を標的とする、条項3に記載のCRISPR/Casをベースにした塩基編集システム。
条項5.対象へのCRISPR/Casをベースにした塩基編集システムの投与が、少なくとも1個のエクソン配列が対象のジストロフィン遺伝子のRNA転写物から排除またはその中に包含されること、および対象中のジストロフィン遺伝子のリーディングフレームが修復されることをもたらす、条項4に記載のCRISPR/Casをベースにした塩基編集システム。
条項6.少なくとも1個のガイドRNA(gRNA)が、配列番号1に対応するポリヌクレオチド配列と結合し、それを標的とする、条項1~5のいずれか1項に記載のCRISPR/Casをベースにした塩基編集システム。
条項7.少なくとも1個のgRNAが、a)配列番号1の断片、b)配列番号1の相補体もしくはその断片、c)配列番号1と実質的に同一である核酸もしくはその相補体、またはd)ストリンジェントな条件下で配列番号1とハイブリダイズする核酸、その相補体、もしくはそれに実質的に同一な配列に対応するポリヌクレオチド配列と結合し、それを標的とする、条項6に記載のCRISPR/Casをベースにした塩基編集システム。
条項8.少なくとも1個のgRNAが、配列番号1に対応するポリヌクレオチド配列、またはその変異体を含む、条項6に記載のCRISPR/Casをベースにした塩基編集システム。
条項6.少なくとも1個のガイドRNA(gRNA)が、配列番号1に対応するポリヌクレオチド配列と結合し、それを標的とする、条項1~5のいずれか1項に記載のCRISPR/Casをベースにした塩基編集システム。
条項7.少なくとも1個のgRNAが、a)配列番号1の断片、b)配列番号1の相補体もしくはその断片、c)配列番号1と実質的に同一である核酸もしくはその相補体、またはd)ストリンジェントな条件下で配列番号1とハイブリダイズする核酸、その相補体、もしくはそれに実質的に同一な配列に対応するポリヌクレオチド配列と結合し、それを標的とする、条項6に記載のCRISPR/Casをベースにした塩基編集システム。
条項8.少なくとも1個のgRNAが、配列番号1に対応するポリヌクレオチド配列、またはその変異体を含む、条項6に記載のCRISPR/Casをベースにした塩基編集システム。
条項9.Casタンパク質がCas9を含み、Cas9が、Cas9のヌクレアーゼ活性を除去する少なくとも1個のアミノ酸突然変異を含む、条項1~8のいずれか1項に記載のCRISPR/Casをベースにした塩基編集システム。
条項10.少なくとも1個のアミノ酸突然変異が、配列番号2または3に対応するアミノ酸配列中のD10A、H840A、またはその組合せのうちの少なくとも1個である、条項9に記載のCRISPR/Casをベースにした塩基編集システム。
条項11.Casタンパク質が、化膿性連鎖球菌Cas9タンパク質または黄色ブドウ球菌Cas9タンパク質である、条項1~10のいずれか1項に記載のCRISPR/Casをベースにした塩基編集システム。
条項12.Casタンパク質が、配列番号4または5のアミノ酸配列を含む、条項1~11のいずれか1項に記載のCRISPR/Casをベースにした塩基編集システム。
条項13.塩基編集ドメインが、(i)シチジンデアミナーゼドメインおよび(ii)少なくとも1個のウラシルグリコシラーゼ阻害剤(UGI)ドメインを含む、条項1~12のいずれか1項に記載のCRISPR/Casをベースにした塩基編集システム。
条項10.少なくとも1個のアミノ酸突然変異が、配列番号2または3に対応するアミノ酸配列中のD10A、H840A、またはその組合せのうちの少なくとも1個である、条項9に記載のCRISPR/Casをベースにした塩基編集システム。
条項11.Casタンパク質が、化膿性連鎖球菌Cas9タンパク質または黄色ブドウ球菌Cas9タンパク質である、条項1~10のいずれか1項に記載のCRISPR/Casをベースにした塩基編集システム。
条項12.Casタンパク質が、配列番号4または5のアミノ酸配列を含む、条項1~11のいずれか1項に記載のCRISPR/Casをベースにした塩基編集システム。
条項13.塩基編集ドメインが、(i)シチジンデアミナーゼドメインおよび(ii)少なくとも1個のウラシルグリコシラーゼ阻害剤(UGI)ドメインを含む、条項1~12のいずれか1項に記載のCRISPR/Casをベースにした塩基編集システム。
条項14.シチジンデアミナーゼドメインが、アポリポタンパク質B mRNA編集酵素、触媒的ポリペプチド様(APOBEC)デアミナーゼを含む、条項13に記載のCRISPR/Casをベースにした塩基編集システム。
条項15.シチジンデアミナーゼドメインがAPOBEC1デアミナーゼを含む、条項13または14に記載のCRISPR/Casをベースにした塩基編集システム。
条項16.シチジンデアミナーゼドメインがラットAPOBEC1デアミナーゼを含む、条項13~15のいずれか1項に記載のCRISPR/Casをベースにした塩基編集システム。
条項17.少なくとも1個のUGIドメインが、UDG活性を阻害することができるドメインを含む、条項13~16のいずれか1項に記載のCRISPR/Casをベースにした塩基編集システム。
条項18.少なくとも1個のUGIドメインが、配列番号20のアミノ酸配列、または配列番号6もしくは配列番号18のポリヌクレオチド配列によってコードされているアミノ酸配列を含む、条項17に記載のCRISPR/Casをベースにした塩基編集システム。
条項15.シチジンデアミナーゼドメインがAPOBEC1デアミナーゼを含む、条項13または14に記載のCRISPR/Casをベースにした塩基編集システム。
条項16.シチジンデアミナーゼドメインがラットAPOBEC1デアミナーゼを含む、条項13~15のいずれか1項に記載のCRISPR/Casをベースにした塩基編集システム。
条項17.少なくとも1個のUGIドメインが、UDG活性を阻害することができるドメインを含む、条項13~16のいずれか1項に記載のCRISPR/Casをベースにした塩基編集システム。
条項18.少なくとも1個のUGIドメインが、配列番号20のアミノ酸配列、または配列番号6もしくは配列番号18のポリヌクレオチド配列によってコードされているアミノ酸配列を含む、条項17に記載のCRISPR/Casをベースにした塩基編集システム。
条項19.塩基編集ドメインが、1個のUGIドメインまたは2個のUGIドメインを含む、条項1~18のいずれか1項に記載のCRISPR/Casをベースにした塩基編集システム。
条項20.融合タンパク質が以下の構造:NH2-[シチジンデアミナーゼドメイン]-[Casタンパク質]-[UGIドメイン]-COOH(式中、「-」のそれぞれの記号は任意選択のリンカーを含む)を含む、条項1~19のいずれか1項に記載のCRISPR/Casをベースにした塩基編集システム。
条項21.融合タンパク質が以下の構造:NH2-[シチジンデアミナーゼドメイン]-[Casタンパク質]-[UGIドメイン]-[UGIドメイン]-COOH(式中、「-」のそれぞれの記号は任意選択のリンカーを含む)を含む、条項1~20のいずれか1項に記載のCRISPR/Casをベースにした塩基編集システム。
条項22.融合タンパク質が、核移行配列(NLS)をさらに含む、条項21に記載のCRISPR/Casをベースにした塩基編集システム。
条項23.融合タンパク質が以下の構造:NH2-[シチジンデアミナーゼドメイン]-[Cas9タンパク質]-[UGIドメイン]-[NLS]-COOH(式中、「-」のそれぞれの記号は任意選択のリンカーを含む)を含む、条項22に記載のCRISPR/Casをベースにした塩基編集システム。
条項20.融合タンパク質が以下の構造:NH2-[シチジンデアミナーゼドメイン]-[Casタンパク質]-[UGIドメイン]-COOH(式中、「-」のそれぞれの記号は任意選択のリンカーを含む)を含む、条項1~19のいずれか1項に記載のCRISPR/Casをベースにした塩基編集システム。
条項21.融合タンパク質が以下の構造:NH2-[シチジンデアミナーゼドメイン]-[Casタンパク質]-[UGIドメイン]-[UGIドメイン]-COOH(式中、「-」のそれぞれの記号は任意選択のリンカーを含む)を含む、条項1~20のいずれか1項に記載のCRISPR/Casをベースにした塩基編集システム。
条項22.融合タンパク質が、核移行配列(NLS)をさらに含む、条項21に記載のCRISPR/Casをベースにした塩基編集システム。
条項23.融合タンパク質が以下の構造:NH2-[シチジンデアミナーゼドメイン]-[Cas9タンパク質]-[UGIドメイン]-[NLS]-COOH(式中、「-」のそれぞれの記号は任意選択のリンカーを含む)を含む、条項22に記載のCRISPR/Casをベースにした塩基編集システム。
条項24.融合タンパク質が、配列番号7または配列番号8に対応するポリヌクレオチドによってコードされているアミノ酸配列を含む、条項1~23のいずれか1項に記載のCRISPR/Casをベースにした塩基編集システム。
条項25.条項1~24のいずれか1項に記載のCRISPR/Casをベースにした塩基編集システムをコードしている単離したポリヌクレオチド。
条項26.ポリヌクレオチドが、融合タンパク質をコードしている第1のポリヌクレオチドおよびgRNAをコードしている第2のポリヌクレオチドを含む、条項25に記載の単離したポリヌクレオチド。
条項27.条項25もしくは26に記載の単離したポリヌクレオチドを含むベクター。
条項28.ベクターが、単離したポリヌクレオチドの発現を駆動する異種プロモーターを含む、条項27に記載のベクター。
条項29.条項25もしくは26に記載の単離したポリヌクレオチドまたは条項27もしくは28に記載のベクターを含む細胞。
条項25.条項1~24のいずれか1項に記載のCRISPR/Casをベースにした塩基編集システムをコードしている単離したポリヌクレオチド。
条項26.ポリヌクレオチドが、融合タンパク質をコードしている第1のポリヌクレオチドおよびgRNAをコードしている第2のポリヌクレオチドを含む、条項25に記載の単離したポリヌクレオチド。
条項27.条項25もしくは26に記載の単離したポリヌクレオチドを含むベクター。
条項28.ベクターが、単離したポリヌクレオチドの発現を駆動する異種プロモーターを含む、条項27に記載のベクター。
条項29.条項25もしくは26に記載の単離したポリヌクレオチドまたは条項27もしくは28に記載のベクターを含む細胞。
条項30.条項1~24のいずれか1項に記載のCRISPR/Casをベースにした塩基編集システムを含む、突然変異ジストロフィン遺伝子を有する細胞においてジストロフィン機能を修復するための組成物。
条項31.条項1~24のいずれか1項に記載のCRISPR/Casをベースにした塩基編集システム、条項25もしくは26に記載の単離したポリヌクレオチド、条項27もしくは28に記載のベクター、条項29に記載の細胞、または条項30に記載の組成物を含む、キット。
条項32.細胞または対象を、条項1~24のいずれか1項に記載のCRISPR/Casをベースにした塩基編集システムと接触させることを含む、突然変異ジストロフィン遺伝子を有する細胞または対象においてジストロフィン機能を修復するための方法。
条項33.突然変異ジストロフィン遺伝子のエクソン45中の「AG」スプライスアクセプターが「AA」配列へと変換され、ジストロフィン機能がエクソン45スキッピングによって修復される、条項32に記載の方法。
条項34.対象がデュシェンヌ筋ジストロフィーを患っている、条項32または33に記載の方法。
条項31.条項1~24のいずれか1項に記載のCRISPR/Casをベースにした塩基編集システム、条項25もしくは26に記載の単離したポリヌクレオチド、条項27もしくは28に記載のベクター、条項29に記載の細胞、または条項30に記載の組成物を含む、キット。
条項32.細胞または対象を、条項1~24のいずれか1項に記載のCRISPR/Casをベースにした塩基編集システムと接触させることを含む、突然変異ジストロフィン遺伝子を有する細胞または対象においてジストロフィン機能を修復するための方法。
条項33.突然変異ジストロフィン遺伝子のエクソン45中の「AG」スプライスアクセプターが「AA」配列へと変換され、ジストロフィン機能がエクソン45スキッピングによって修復される、条項32に記載の方法。
条項34.対象がデュシェンヌ筋ジストロフィーを患っている、条項32または33に記載の方法。
配列
エクソン45 gRNAの標的配列(配列番号1)
GTTCCTGTAAGATACCAAAA
化膿性連鎖球菌Cas9(配列番号2)
MDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD
エクソン45 gRNAの標的配列(配列番号1)
GTTCCTGTAAGATACCAAAA
化膿性連鎖球菌Cas9(配列番号2)
MDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD
黄色ブドウ球菌Cas9分子(配列番号3)
MKRNYILGLDIGITSVGYGIIDYETRDVIDAGVRLFKEANVENNEGRRSKRGARRLKRRRRHRIQRVKKLLFDYNLLTDHSELSGINPYEARVKGLSQKLSEEEFSAALLHLAKRRGVHNVNEVEEDTGNELSTKEQISRNSKALEEKYVAELQLERLKKDGEVRGSINRFKTSDYVKEAKQLLKVQKAYHQLDQSFIDTYIDLLETRRTYYEGPGEGSPFGWKDIKEWYEMLMGHCTYFPEELRSVKYAYNADLYNALNDLNNLVITRDENEKLEYYEKFQIIENVFKQKKKPTLKQIAKEILVNEEDIKGYRVTSTGKPEFTNLKVYHDIKDITARKEIIENAELLDQIAKILTIYQSSEDIQEELTNLNSELTQEEIEQISNLKGYTGTHNLSLKAINLILDELWHTNDNQIAIFNRLKLVPKKVDLSQQKEIPTTLVDDFILSPVVKRSFIQSIKVINAIIKKYGLPNDIIIELAREKNSKDAQKMINEMQKRNRQTNERIEEIIRTTGKENAKYLIEKIKLHDMQEGKCLYSLEAIPLEDLLNNPFNYEVDHIIPRSVSFDNSFNNKVLVKQEENSKKGNRTPFQYLSSSDSKISYETFKKHILNLAKGKGRISKTKKEYLLEERDINRFSVQKDFINRNLVDTRYATRGLMNLLRSYFRVNNLDVKVKSINGGFTSFLRRKWKFKKERNKGYKHHAEDALIIANADFIFKEWKKLDKAKKVMENQMFEEKQAESMPEIETEQEYKEIFITPHQIKHIKDFKDYKYSHRVDKKPNRELINDTLYSTRKDDKGNTLIVNNLNGLYDKDNDKLKKLINKSPEKLLMYHHDPQTYQKLKLIMEQYGDEKNPLYKYYEETGNYLTKYSKKDNGPVIKKIKYYGNKLNAHLDITDDYPNSRNKVVKLSLKPYRFDVYLDNGVYKFVTVKNLDVIKKENYYEVNSKCYEEAKKLKKISNQAEFIASFYNNDLIKINGELYRVIGVNNDLLNRIEVNMIDITYREYLENMNDKRPPRIIKTIASKTQSIKKYSTDILGNLYEVKSKKHPQIIKKG
MKRNYILGLDIGITSVGYGIIDYETRDVIDAGVRLFKEANVENNEGRRSKRGARRLKRRRRHRIQRVKKLLFDYNLLTDHSELSGINPYEARVKGLSQKLSEEEFSAALLHLAKRRGVHNVNEVEEDTGNELSTKEQISRNSKALEEKYVAELQLERLKKDGEVRGSINRFKTSDYVKEAKQLLKVQKAYHQLDQSFIDTYIDLLETRRTYYEGPGEGSPFGWKDIKEWYEMLMGHCTYFPEELRSVKYAYNADLYNALNDLNNLVITRDENEKLEYYEKFQIIENVFKQKKKPTLKQIAKEILVNEEDIKGYRVTSTGKPEFTNLKVYHDIKDITARKEIIENAELLDQIAKILTIYQSSEDIQEELTNLNSELTQEEIEQISNLKGYTGTHNLSLKAINLILDELWHTNDNQIAIFNRLKLVPKKVDLSQQKEIPTTLVDDFILSPVVKRSFIQSIKVINAIIKKYGLPNDIIIELAREKNSKDAQKMINEMQKRNRQTNERIEEIIRTTGKENAKYLIEKIKLHDMQEGKCLYSLEAIPLEDLLNNPFNYEVDHIIPRSVSFDNSFNNKVLVKQEENSKKGNRTPFQYLSSSDSKISYETFKKHILNLAKGKGRISKTKKEYLLEERDINRFSVQKDFINRNLVDTRYATRGLMNLLRSYFRVNNLDVKVKSINGGFTSFLRRKWKFKKERNKGYKHHAEDALIIANADFIFKEWKKLDKAKKVMENQMFEEKQAESMPEIETEQEYKEIFITPHQIKHIKDFKDYKYSHRVDKKPNRELINDTLYSTRKDDKGNTLIVNNLNGLYDKDNDKLKKLINKSPEKLLMYHHDPQTYQKLKLIMEQYGDEKNPLYKYYEETGNYLTKYSKKDNGPVIKKIKYYGNKLNAHLDITDDYPNSRNKVVKLSLKPYRFDVYLDNGVYKFVTVKNLDVIKKENYYEVNSKCYEEAKKLKKISNQAEFIASFYNNDLIKINGELYRVIGVNNDLLNRIEVNMIDITYREYLENMNDKRPPRIIKTIASKTQSIKKYSTDILGNLYEVKSKKHPQIIKKG
化膿性連鎖球菌Cas9(D10Aを有する)(配列番号4)
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD
化膿性連鎖球菌Cas9(D10A、H849Aを有する)(配列番号5)
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDAIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDAIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD
UGI-1をコードしているポリヌクレオチド(配列番号6)
ACTAATCTGAGCGACATCATTGAGAAGGAGACTGGGAAACAGCTGGTCATTCAGGAGTCCATCCTGATGCTGCCTGAGGAGGTGGAGGAAGTGATCGGCAACAAGCCAGAGTCTGACATCCTGGTGCACACCGCCTACGACGAGTCCACAGATGAGAATGTGATGCTGCTGACCTCTGACGCCCCCGAGTATAAGCCTTGGGCCCTGGTCATCCAGGATTCTAACGGCGAGAATAAGATCAAGATGCTG
ACTAATCTGAGCGACATCATTGAGAAGGAGACTGGGAAACAGCTGGTCATTCAGGAGTCCATCCTGATGCTGCCTGAGGAGGTGGAGGAAGTGATCGGCAACAAGCCAGAGTCTGACATCCTGGTGCACACCGCCTACGACGAGTCCACAGATGAGAATGTGATGCTGCTGACCTCTGACGCCCCCGAGTATAAGCCTTGGGCCCTGGTCATCCAGGATTCTAACGGCGAGAATAAGATCAAGATGCTG
pCMV_BE4max配列(配列番号7)
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pCMV_AncBE4max配列(配列番号8)
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ATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGAGATCCGCGGCCGCTAATACGACTCACTATAGGGAGAGCCGCCACCATGAAACGGACAGCCGACGGAAGCGAGTTCGAGTCACCAAAGAAGAAGCGGAAAGTCAGCAGTGAAACCGGACCAGTGGCAGTGGACCCAACCCTGAGGAGACGGATTGAGCCCCATGAATTTGAAGTGTTCTTTGACCCAAGGGAGCTGAGGAAGGAGACATGCCTGCTGTACGAGATCAAGTGGGGCACAAGCCACAAGATCTGGCGCCACAGCTCCAAGAACACCACAAAGCACGTGGAAGTGAATTTCATCGAGAAGTTTACCTCCGAGCGGCACTTCTGCCCCTCTACCAGCTGTTCCATCACATGGTTTCTGTCTTGGAGCCCTTGCGGCGAGTGTTCCAAGGCCATCACCGAGTTCCTGTCTCAGCACCCTAACGTGACCCTGGTCATCTACGTGGCCCGGCTGTATCACCACATGGACCAGCAGAACAGGCAGGGCCTGCGCGATCTGGTGAATTCTGGCGTGACCATCCAGATCATGACAGCCCCAGAGTACGACTATTGCTGGCGGAACTTCGTGAATTATCCACCTGGCAAGGAGGCACACTGGCCAAGATACCCACCCCTGTGGATGAAGCTGTATGCACTGGAGCTGCACGCAGGAATCCTGGGCCTGCCTCCATGTCTGAATATCCTGCGGAGAAAGCAGCCCCAGCTGACATTTTTCACCATTGCTCTGCAGTCTTGTCACTATCAGCGGCTGCCTCCTCATATTCTGTGGGCTACAGGCCTGAAGTCTGGAGGATCTAGCGGAGGATCCTCTGGCAGCGAGACACCAGGAACAAGCGAGTCAGCAACACCAGAGAGCAGTGGCGGCAGCAGCGGCGGCAGCGACAAGAAGTACAGCATCGGCCTGGCCATCGGCACCAACTCTGTGGGCTGGGCCGTGATCACCGACGAGTACAAGGTGCCCAGCAAGAAATTCAAGGTGCTGGGCAACACCGACCGGCACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGAGCCCTGCTGTTCGACAGCGGCGAAACAGCCGAGGCCACCCGGCTGAAGAGAACCGCCAGAAGAAGATACACCAGACGGAAGAACCGGATCTGCTATCTGCAAGAGATCTTCAGCAACGAGATGGCCAAGGTGGACGACAGCTTCTTCCACAGACTGGAAGAGTCCTTCCTGGTGGAAGAGGATAAGAAGCACGAGCGGCACCCCATCTTCGGCAACATCGTGGACGAGGTGGCCTACCACGAGAAGTACCCCACCATCTACCACCTGAGAAAGAAACTGGTGGACAGCACCGACAAGGCCGACCTGCGGCTGATCTATCTGGCCCTGGCCCACATGATCAAGTTCCGGGGCCACTTCCTGATCGAGGGCGACCTGAACCCCGACAACAGCGACGTGGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTGCAGACCTACAACCAGCTGTTCGAGGAAAACCCCATCAACGCCAGCGGCGTGGACGCCAAGGCCATCCTGTCTGCCAGACTGAGCAAGAGCAGACGGCTGGAAAATCTGATCGCCCAGCTGCCCGGCGAGAAGAAGAATGGCCTGTTCGGAAACCTGATTGCCCTGAGCCTGGGCCTGACCCCCAACTTCAAGAGCAACTTCGACCTGGCCGAGGATGCCAAACTGCAGCTGAGCAAGGACACCTACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCCCAGATCGGCGACCAGTACGCCGACCTGTTTCTGGCCGCCAAGAACCTGTCCGACGCCATCCTGCTGAGCGACATCCTGAGAGTGAACACCGAGATCACCAAGGCCCCCCTGAGCGCCTCTATGATCAAGAGATACGACGAGCACCACCAGGACCTGACCCTGCTGAAAGCTCTCGTGCGGCAGCAGCTGCCTGAGAAGTACAAAGAGATTTTCTTCGACCAGAGCAAGAACGGCTACGCCGGCTACATTGACGGCGGAGCCAGCCAGGAAGAGTTCTACAAGTTCATCAAGCCCATCCTGGAAAAGATGGACGGCACCGAGGAACTGCTCGTGAAGCTGAACAGAGAGGACCTGCTGCGGAAGCAGCGGACCTTCGACAACGGCAGCATCCCCCACCAGATCCACCTGGGAGAGCTGCACGCCATTCTGCGGCGGCAGGAAGATTTTTACCCATTCCTGAAGGACAACCGGGAAAAGATCGAGAAGATCCTGACCTTCCGCATCCCCTACTACGTGGGCCCTCTGGCCAGGGGAAACAGCAGATTCGCCTGGATGACCAGAAAGAGCGAGGAAACCATCACCCCCTGGAACTTCGAGGAAGTGGTGGACAAGGGCGCTTCCGCCCAGAGCTTCATCGAGCGGATGACCAACTTCGATAAGAACCTGCCCAACGAGAAGGTGCTGCCCAAGCACAGCCTGCTGTACGAGTACTTCACCGTGTATAACGAGCTGACCAAAGTGAAATACGTGACCGAGGGAATGAGAAAGCCCGCCTTCCTGAGCGGCGAGCAGAAAAAGGCCATCGTGGACCTGCTGTTCAAGACCAACCGGAAAGTGACCGTGAAGCAGCTGAAAGAGGACTACTTCAAGAAAATCGAGTGCTTCGACTCCGTGGAAATCTCCGGCGTGGAAGATCGGTTCAACGCCTCCCTGGGCACATACCACGATCTGCTGAAAATTATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAATGAGGAAAACGAGGACATTCTGGAAGATATCGTGCTGACCCTGACACTGTTTGAGGACAGAGAGATGATCGAGGAACGGCTGAAAACCTATGCCCACCTGTTCGACGACAAAGTGATGAAGCAGCTGAAGCGGCGGAGATACACCGGCTGGGGCAGGCTGAGCCGGAAGCTGATCAACGGCATCCGGGACAAGCAGTCCGGCAAGACAATCCTGGATTTCCTGAAGTCCGACGGCTTCGCCAACAGAAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACAGCCTGACCTTTAAAGAGGACATCCAGAAAGCCCAGGTGTCCGGCCAGGGCGATAGCCTGCACGAGCACATTGCCAATCTGGCCGGCAGCCCCGCCATTAAGAAGGGCATCCTGCAGACAGTGAAGGTGGTGGACGAGCTCGTGAAAGTGATGGGCCGGCACAAGCCCGAGAACATCGTGATCGAAATGGCCAGAGAGAACCAGACCACCCAGAAGGGACAGAAGAACAGCCGCGAGAGAATGAAGCGGATCGAAGAGGGCATCAAAGAGCTGGGCAGCCAGATCCTGAAAGAACACCCCGTGGAAAACACCCAGCTGCAGAACGAGAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAATGGGCGGGATATGTACGTGGACCAGGAACTGGACATCAACCGGCTGTCCGACTACGATGTGGACCATATCGTGCCTCAGAGCTTTCTGAAGGACGACTCCATCGACAACAAGGTGCTGACCAGAAGCGACAAGAACCGGGGCAAGAGCGACAACGTGCCCTCCGAAGAGGTCGTGAAGAAGATGAAGAACTACTGGCGGCAGCTGCTGAACGCCAAGCTGATTACCCAGAGAAAGTTCGACAATCTGACCAAGGCCGAGAGAGGCGGCCTGAGCGAACTGGATAAGGCCGGCTTCATCAAGAGACAGCTGGTGGAAACCCGGCAGATCACAAAGCACGTGGCACAGATCCTGGACTCCCGGATGAACACTAAGTACGACGAGAATGACAAGCTGATCCGGGAAGTGAAAGTGATCACCCTGAAGTCCAAGCTGGTGTCCGATTTCCGGAAGGATTTCCAGTTTTACAAAGTGCGCGAGATCAACAACTACCACCACGCCCACGACGCCTACCTAAACGCCGTCGTGGGAACCGCCCTGATCAAAAAGTACCCTAAGCTGGAAAGCGAGTTCGTGTACGGCGACTACAAGGTGTACGACGTGCGGAAGATGATCGCCAAGAGCGAGCAGGAAATCGGCAAGGCTACCGCCAAGTACTTCTTCTACAGCAACATCATGAACTTTTTCAAGACCGAGATTACCCTGGCCAACGGCGAGATCCGGAAGCGGCCTCTGATCGAGACAAACGGCGAAACCGGGGAGATCGTGTGGGATAAGGGCCGGGATTTTGCCACCGTGCGGAAAGTGCTGAGCATGCCCCAAGTGAATATCGTGAAAAAGACCGAGGTGCAGACAGGCGGCTTCAGCAAAGAGTCTATCCTGCCCAAGAGGAACAGCGATAAGCTGATCGCCAGAAAGAAGGACTGGGACCCTAAGAAGTACGGCGGCTTCGACAGCCCCACCGTGGCCTATTCTGTGCTGGTGGTGGCCAAAGTGGAAAAGGGCAAGTCCAAGAAACTGAAGAGTGTGAAAGAGCTGCTGGGGATCACCATCATGGAAAGAAGCAGCTTCGAGAAGAATCCCATCGACTTTCTGGAAGCCAAGGGCTACAAAGAAGTGAAAAAGGACCTGATCATCAAGCTGCCTAAGTACTCCCTGTTCGAGCTGGAAAACGGCCGGAAGAGAATGCTGGCCTCTGCCGGCGAACTGCAGAAGGGAAACGAACTGGCCCTGCCCTCCAAATATGTGAACTTCCTGTACCTGGCCAGCCACTATGAGAAGCTGAAGGGCTCCCCCGAGGATAATGAGCAGAAACAGCTGTTTGTGGAACAGCACAAGCACTACCTGGACGAGATCATCGAGCAGATCAGCGAGTTCTCCAAGAGAGTGATCCTGGCCGACGCTAATCTGGACAAAGTGCTGTCCGCCTACAACAAGCACCGGGATAAGCCCATCAGAGAGCAGGCCGAGAATATCATCCACCTGTTTACCCTGACCAATCTGGGAGCCCCTGCCGCCTTCAAGTACTTTGACACCACCATCGACCGGAAGAGGTACACCAGCACCAAAGAGGTGCTGGACGCCACCCTGATCCACCAGAGCATCACCGGCCTGTACGAGACACGGATCGACCTGTCTCAGCTGGGAGGTGACAGCGGCGGGAGCGGCGGGAGCGGGGGGAGCACTAATCTGAGCGACATCATTGAGAAGGAGACTGGGAAACAGCTGGTCATTCAGGAGTCCATCCTGATGCTGCCTGAGGAGGTGGAGGAAGTGATCGGCAACAAGCCAGAGTCTGACATCCTGGTGCACACCGCCTACGACGAGTCCACAGATGAGAATGTGATGCTGCTGACCTCTGACGCCCCCGAGTATAAGCCTTGGGCCCTGGTCATCCAGGATTCTAACGGCGAGAATAAGATCAAGATGCTGAGCGGAGGATCCGGAGGATCTGGAGGCAGCACCAACCTGTCTGACATCATCGAGAAGGAGACAGGCAAGCAGCTGGTCATCCAGGAGAGCATCCTGATGCTGCCCGAAGAAGTCGAAGAAGTGATCGGAAACAAGCCTGAGAGCGATATCCTGGTCCATACCGCCTACGACGAGAGTACCGACGAAAATGTGATGCTGCTGACATCCGACGCCCCAGAGTATAAGCCCTGGGCTCTGGTCATCCAGGATTCCAACGGAGAGAACAAAATCAAAATGCTGTCTGGCGGCTCAAAAAGAACCGCCGACGGCAGCGAATTCGAGCCCAAGAAGAAGAGGAAAGTCTAACCGGTCATCATCACCATCACCATTGAGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCGATACCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTAGGATGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGAAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACACTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCGACGGATCGGGAGATCGATCTCCCGATCCCCTAGGGTCGACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATCTGCTCCCTGCTTGTGTGTTGGAGGTCGCTGAGTAGTGCGCGAGCAAAATTTAAGCTACAACAAGGCAAGGCTTGACCGACAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATC
エクソン44 gRNAの標的配列(配列番号9)
CGCCTGCAGGTAAAAGCATA
PAM(配列番号10)
NGG
PAM(配列番号11)
NNNRRT
PAM(配列番号12)
NNGRR(R=AまたはG)
CGCCTGCAGGTAAAAGCATA
PAM(配列番号10)
NGG
PAM(配列番号11)
NNNRRT
PAM(配列番号12)
NNGRR(R=AまたはG)
PAM(配列番号13)
NNGRRN(R=AまたはG)
PAM(配列番号14)
NNGRRT(R=AまたはG)
PAM(配列番号15)
NNGRRV(R=AまたはG、V=A、C、またはG)
RT-PCRプライマー(配列番号16)
CTACAACAAAGCTCAGGTCG
RT-PCRプライマー(配列番号17)
TTCTCAGGTAAAGCTCTGGAAAC
NNGRRN(R=AまたはG)
PAM(配列番号14)
NNGRRT(R=AまたはG)
PAM(配列番号15)
NNGRRV(R=AまたはG、V=A、C、またはG)
RT-PCRプライマー(配列番号16)
CTACAACAAAGCTCAGGTCG
RT-PCRプライマー(配列番号17)
TTCTCAGGTAAAGCTCTGGAAAC
UGI-2をコードしているポリヌクレオチド(配列番号18)
ACCAACCTGTCTGACATCATCGAGAAGGAGACAGGCAAGCAGCTGGTCATCCAGGAGAGCATCCTGATGCTGCCCGAAGAAGTCGAAGAAGTGATCGGAAACAAGCCTGAGAGCGATATCCTGGTCCATACCGCCTACGACGAGAGTACCGACGAAAATGTGATGCTGCTGACATCCGACGCCCCAGAGTATAAGCCCTGGGCTCTGGTCATCCAGGATTCCAACGGAGAGAACAAAATCAAAATGCTG
PAM(配列番号19)
NGA
UGIポリペプチド(配列番号20)
TNLSDIIEKETGKQLVIQESILMLPEEVEEVIGNKPESDILVHTAYDESTDENVMLLTSDAPEYKPWALVIQDSNGENKIKML
ACCAACCTGTCTGACATCATCGAGAAGGAGACAGGCAAGCAGCTGGTCATCCAGGAGAGCATCCTGATGCTGCCCGAAGAAGTCGAAGAAGTGATCGGAAACAAGCCTGAGAGCGATATCCTGGTCCATACCGCCTACGACGAGAGTACCGACGAAAATGTGATGCTGCTGACATCCGACGCCCCAGAGTATAAGCCCTGGGCTCTGGTCATCCAGGATTCCAACGGAGAGAACAAAATCAAAATGCTG
PAM(配列番号19)
NGA
UGIポリペプチド(配列番号20)
TNLSDIIEKETGKQLVIQESILMLPEEVEEVIGNKPESDILVHTAYDESTDENVMLLTSDAPEYKPWALVIQDSNGENKIKML
Claims (34)
- 融合タンパク質および少なくとも1個のガイドRNA(gRNA)を含み、融合タンパク質がCasタンパク質および塩基編集ドメインを含む、対象のゲノムDNA中にコードされているRNAスプライシング部位を変更するための、CRISPR/Casをベースにした塩基編集システム。
- ゲノムDNA中にコードされているRNAスプライシング部位を変更することが、RNA転写物中の少なくとも1個のエクソン配列の排除または包含をもたらす、請求項1に記載のCRISPR/Casをベースにした塩基編集システム。
- 融合タンパク質および少なくとも1個のガイドRNA(gRNA)を含み、融合タンパク質がCasタンパク質および塩基編集ドメインを含む、対象におけるジストロフィン機能を修復するためのCRISPR/Casをベースにした塩基編集システム。
- 対象が突然変異したジストロフィン遺伝子を有しており、少なくとも1個のガイドRNA(gRNA)が、対象の突然変異したジストロフィン遺伝子中のRNAスプライシング部位を標的とする、請求項3に記載のCRISPR/Casをベースにした塩基編集システム。
- 対象へのCRISPR/Casをベースにした塩基編集システムの投与が、少なくとも1個のエクソン配列が対象のジストロフィン遺伝子のRNA転写物から排除またはその中に包含されること、および対象中のジストロフィン遺伝子のリーディングフレームが修復されることをもたらす、請求項4に記載のCRISPR/Casをベースにした塩基編集システム。
- 少なくとも1個のガイドRNA(gRNA)が、配列番号1に対応するポリヌクレオチド配列と結合し、それを標的とする、請求項1~5のいずれか1項に記載のCRISPR/Casをベースにした塩基編集システム。
- 少なくとも1個のgRNAが、
a)配列番号1の断片、
b)配列番号1の相補体もしくはその断片、
c)配列番号1と実質的に同一である核酸もしくはその相補体、または
d)ストリンジェントな条件下で配列番号1とハイブリダイズする核酸、その相補体、もしくはそれに実質的に同一な配列
に対応するポリヌクレオチド配列と結合し、それを標的とする、請求項6に記載のCRISPR/Casをベースにした塩基編集システム。 - 少なくとも1個のgRNAが、配列番号1に対応するポリヌクレオチド配列、またはその変異体を含む、請求項6に記載のCRISPR/Casをベースにした塩基編集システム。
- Casタンパク質がCas9を含み、Cas9が、Cas9のヌクレアーゼ活性を除去する少なくとも1個のアミノ酸突然変異を含む、請求項1~8のいずれか1項に記載のCRISPR/Casをベースにした塩基編集システム。
- 少なくとも1個のアミノ酸突然変異が、配列番号2または3に対応するアミノ酸配列中のD10A、H840A、またはその組合せのうちの少なくとも1個である、請求項9に記載のCRISPR/Casをベースにした塩基編集システム。
- Casタンパク質が、化膿性連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9タンパク質または黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)Cas9タンパク質である、請求項1~10のいずれか1項に記載のCRISPR/Casをベースにした塩基編集システム。
- Casタンパク質が、配列番号4または5のアミノ酸配列を含む、請求項1~11のいずれか1項に記載のCRISPR/Casをベースにした塩基編集システム。
- 塩基編集ドメインが、(i)シチジンデアミナーゼドメインおよび(ii)少なくとも1個のウラシルグリコシラーゼ阻害剤(UGI)ドメインを含む、請求項1~12のいずれか1項に記載のCRISPR/Casをベースにした塩基編集システム。
- シチジンデアミナーゼドメインが、アポリポタンパク質B mRNA編集酵素、触媒的ポリペプチド様(APOBEC)デアミナーゼを含む、請求項13に記載のCRISPR/Casをベースにした塩基編集システム。
- シチジンデアミナーゼドメインがAPOBEC1デアミナーゼを含む、請求項13または14に記載のCRISPR/Casをベースにした塩基編集システム。
- シチジンデアミナーゼドメインがラットAPOBEC1デアミナーゼを含む、請求項13~15のいずれか1項に記載のCRISPR/Casをベースにした塩基編集システム。
- 少なくとも1個のUGIドメインが、UDG活性を阻害することができるドメインを含む、請求項13~16のいずれか1項に記載のCRISPR/Casをベースにした塩基編集システム。
- 少なくとも1個のUGIドメインが、配列番号20のアミノ酸配列、または配列番号6もしくは配列番号18のポリヌクレオチド配列によってコードされているアミノ酸配列を含む、請求項17に記載のCRISPR/Casをベースにした塩基編集システム。
- 塩基編集ドメインが、1個のUGIドメインまたは2個のUGIドメインを含む、請求項1~18のいずれか1項に記載のCRISPR/Casをベースにした塩基編集システム。
- 融合タンパク質が以下の構造:NH2-[シチジンデアミナーゼドメイン]-[Casタンパク質]-[UGIドメイン]-COOH(式中、「-」のそれぞれの記号は任意選択のリンカーを含む)を含む、請求項1~19のいずれか1項に記載のCRISPR/Casをベースにした塩基編集システム。
- 融合タンパク質が以下の構造:NH2-[シチジンデアミナーゼドメイン]-[Casタンパク質]-[UGIドメイン]-[UGIドメイン]-COOH(式中、「-」のそれぞれの記号は任意選択のリンカーを含む)を含む、請求項1~20のいずれか1項に記載のCRISPR/Casをベースにした塩基編集システム。
- 融合タンパク質が、核移行配列(NLS)をさらに含む、請求項21に記載のCRISPR/Casをベースにした塩基編集システム。
- 融合タンパク質が以下の構造:NH2-[シチジンデアミナーゼドメイン]-[Cas9タンパク質]-[UGIドメイン]-[NLS]-COOH(式中、「-」のそれぞれの記号は任意選択のリンカーを含む)を含む、請求項22に記載のCRISPR/Casをベースにした塩基編集システム。
- 融合タンパク質が、配列番号7または配列番号8に対応するポリヌクレオチドによってコードされているアミノ酸配列を含む、請求項1~23のいずれか1項に記載のCRISPR/Casをベースにした塩基編集システム。
- 請求項1~24のいずれか1項に記載のCRISPR/Casをベースにした塩基編集システムをコードしている単離したポリヌクレオチド。
- ポリヌクレオチドが、融合タンパク質をコードしている第1のポリヌクレオチドおよびgRNAをコードしている第2のポリヌクレオチドを含む、請求項25に記載の単離したポリヌクレオチド。
- 請求項25または26に記載の単離したポリヌクレオチドを含むベクター。
- ベクターが、単離したポリヌクレオチドの発現を駆動する異種プロモーターを含む、請求項27に記載のベクター。
- 請求項25もしくは26に記載の単離したポリヌクレオチドまたは請求項27もしくは28に記載のベクターを含む細胞。
- 請求項1~24のいずれか1項に記載のCRISPR/Casをベースにした塩基編集システムを含む、突然変異ジストロフィン遺伝子を有する細胞においてジストロフィン機能を修復するための組成物。
- 請求項1~24のいずれか1項に記載のCRISPR/Casをベースにした塩基編集システム、請求項25もしくは26に記載の単離したポリヌクレオチド、請求項27もしくは28に記載のベクター、請求項29に記載の細胞、または請求項30に記載の組成物を含むキット。
- 細胞または対象を、請求項1~24のいずれか1項に記載のCRISPR/Casをベースにした塩基編集システムと接触させることを含む、突然変異ジストロフィン遺伝子を有する細胞または対象においてジストロフィン機能を修復するための方法。
- 突然変異ジストロフィン遺伝子のエクソン45中の「AG」スプライスアクセプターが「AA」配列へと変換され、ジストロフィン機能がエクソン45スキッピングによって修復される、請求項32に記載の方法。
- 対象がデュシェンヌ筋ジストロフィーを患っている、請求項32または33に記載の方法。
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