CN106164255B - 细胞的核重编程的方法 - Google Patents

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Abstract

本文描述了用于增强体细胞的核重编程以变成多潜能干细胞的方法。具体地，本文所述的方法包括使用损伤相关分子模式分子(DAMP)。在某些实施方式中，DAMP是铝组合物，如氢氧化铝。已经意外并令人惊讶地发现这类DAMP增强重编程因子的核重编程效率，该重编程因子常用于诱导体细胞变成经诱导的多潜能干细胞。因此，本发明描述了核重编程的方法以及通过这类方法获得的细胞和使用这类细胞治疗可通过干细胞疗法治疗的疾病的疗法，以及用于这类用途的试剂盒。

Description

细胞的核重编程的方法
序列表
本申请包含通过EFS-Web以ASCII格式提交的序列表，并通过引用全文纳入本文。2013年9月20日创建的所述ASCII拷贝命名为0132-0004PR1_SL.txt，大小为39,860字节。
技术领域
本发明涉及干细胞重编程方法。
发明背景
将分化细胞转化成经诱导的多潜能干细胞(iPSC)为再生疗法提供了更易处理的多潜能细胞来源，已经彻底改变了干细胞生物学。从多种正常和疾病细胞来源衍生的iPSC已经能够生成干细胞，用于在细胞疗法和再生医药中的最终使用。
Yamanaka及同事的开创性工作揭示了某些转录因子的异位表达可能在体细胞中诱导多潜能。这些经诱导的多潜能干细胞自我更新并且分化成多种细胞类型，使得它们成为疾病和再生医学疗法的有吸引力的选项。它们已经用于对人类疾病成功建模，并且具有用于药物筛选和细胞疗法的巨大潜力。此外，从疾病细胞中生成的iPSC可用作研究疾病机制和潜在疗法的有用工具。然而，关于体细胞重编程为iPSC的背后机制仍有许多有待理解，并且在缺乏机制认知的情况下存在对潜在临床应用的担心。
用于重编程为多潜能的最初的因子组包括Oct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4、Lin28、和Nanog。Oct3/4和Sox2是在胚胎干细胞(ES)中保持多潜能的转录因子而Klf4和c-Myc是被认为加强iPSC生成效率的转录因子。转录因子c-Myc被认为修饰染色质结构以使得Oct3/4和Sox2更高效地接触重编程所需的基因而Klf4增强了由Oct3/4和Sox2对某些基因的激活。Nanog，与Oct3/4和Sox2类似，是一种在ES细胞中保持多潜能的转录因子，而Lin28是被认为在分化期间影响特异性mRNA的翻译或稳定性的mRNA-结合蛋白质。还已经显示，Oct3/4和Sox2的逆转录病毒表达以及共同给予丙戊酸、染色质稳定剂和组蛋白去乙酰化酶抑制剂足以将成纤维细胞重编程为iPSC。
已经显示几种类型的载体在过表达必需基因组合时诱导多潜能。最早的载体依赖于DNA-整合逆转录病毒和用于核重编程的转座子。虽然有效，但是它们本身产生对于由插入诱变或致癌重编程因子的再表达产生的潜在致肿瘤性的担心。虽然已经使用Cre-LoxP位点基因递送或PiggyBac转座子方法来在基因递送之后从宿主基因组中切除外来DNA，但是两种策略都没有消除诱变的风险，因为它们留下了一小段插入的残留外来DNA。
作为遗传修饰的替代，已经显示mRNA、附加体DNA质粒、和细胞渗透蛋白(CPP)是有效的重编程因子。
然而，由于它们特定的作用机制或由于它们实践的繁琐性，这些非整合因子在功能上通常导致重编程效率低下。因为，基于非整合和/或小分子的iPSC生成或转分化成不同体细胞类型的方法是临床上相关的载体，增加这类方法使用的稳定性、效率和便捷性变得重要。本发明解决了这些问题。
发明内容
本发明的一个方面涉及一种哺乳动物体细胞的核重编程方法，所述方法包括：将哺乳动物体细胞群与(a)有效剂量的损伤相关分子模式(DAMP)分子；和(b)重编程因子的混合物接触，接触时间足以将哺乳动物体细胞重编程为所需的感兴趣细胞类型。
在本发明的这一方面的一个实施方式中，DAMP是铝组合物。在另一个实施方式中，同时提供铝组合物和非整合重编程因子的混合物。在另一个实施方式中，依次提供铝组合物和非整合重编程因子的混合物。在另一个实施方式中，铝组合物选自下组：氢氧化铝、磷酸铝和硫酸铝。在另一个实施方式中，铝组合物是氢氧化铝。在另一个实施方式中，氢氧化铝以约或至少40-80微克/ml的浓度存在。在另一个实施方式中，氢氧化铝的有效剂量至少或约为30-60微克/ml。在另一个实施方式中，铝组合物是磷酸铝。在另一个实施方式中，铝组合物是硫酸铝。
在另一个实施方式中，哺乳动物体细胞是人细胞。在另一个实施方式中，重编程因子的混合物包括使用Oct4、Sox2、Lin28、和Nanog，并且细胞重编程为多潜能。在另一个实施方式中，重编程因子的混合物包括使用Oct4、Sox2、c-Myc、和Klf4，并且细胞重编程为多潜能。在另一个实施方式中，体细胞类型是外周血单核细胞(PBMC)、脐带血单核细胞或成纤维细胞。在另一个实施方式中，重编程因子提供为细胞穿透蛋白。在另一个实施方式中，重编程因子提供为编码重编程蛋白的核酸。在另一个实施方式中，所需的感兴趣细胞类型是经诱导的多潜能干(iPS)细胞。
本发明的另一个方面包括核重编程方法，其中核重编程效率高于如果不使用铝组合物进行的方法。在本发明的这一方面的一个实施方式中，就至少一个关键多潜能标记物的表达来看，核重编程效率高约1至约5倍。在另一个实施方式中，就产生的所需的感兴趣细胞类型的量来看，核重编程效率高约1至约5倍。
本发明的另一个方面涉及通过本发明的任意方法产生的经诱导的多潜能干细胞的群。在一个实施方式中，经诱导的多潜能干细胞是人类细胞。
本发明的另一个方面涉及用于实施本发明的方法的试剂盒。在一个实施方式中，该试剂盒包含重编程因子和铝组合物。在另一个实施方式中，该试剂盒还包含体细胞。另一个实施方式涉及用于体内给药的治疗性组合物，其包含DAMP组合物如铝组合物，和一个或多个重编程因子、和/或编码其的核酸、和/或小分子，用于治疗性调节细胞和/或组织表型。另一个方面涉及通过向患者给予治疗有效量的本发明的治疗组合物来治疗有此需要的患者的方法。
附图说明
当考虑附图及相应详细描述时，可以更完整地理解本发明。附图所示实施方式仅仅是举例说明发明，不应考虑为将发明限制于所示实施方式。
图1显示了使用本文所述的方法获得iPSC的过程图像。
图2、3、4和5显示了使用本文所述的方法在缺氧和正常氧压条件下使用不同浓度的氢氧化铝从多种供体中获得iPSC的实验结果。
发明详述
本文描述了用于增强体细胞的核重编程以变成多潜能干细胞的方法。具体地，本文所述的方法包括使用损伤相关分子模式分子(DAMP)。在某些实施方式中，DAMP是铝组合物，如氢氧化铝。已经意外并令人惊讶地发现这类DAMP增强重编程因子的核重编程效率，该重编程因子常用于诱导体细胞变成经诱导的多潜能干细胞。因此，本发明描述了核重编程的方法以及通过这类方法获得的细胞和使用这类细胞治疗可通过干细胞疗法治疗的疾病的疗法，以及用于这类用途的试剂盒。
应理解本发明不限于所述特定方法、方案、细胞系、动物种或属以及试剂，因为这些可能会有变化。还应理解，本文所用术语的目的仅是描述具体实施方式，不应用来限制本发明的范围，本发明的范围仅受所附权利要求书的限制。
词语“一”或“一个”当与“包含”在权利要求和说明书中联用时，可表示“一”，但也与“一个或多个”，“至少一个”和“一或多于一个”的意思一致。
在整篇申请中，术语“约”用于表示包括装置，用于测定数值的方法，或存在于研究对象中的差异造成的包括固有误差的固有变动的值。通常术语表示视情况而定包括大约或少于1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％或20％可变性。
在权利要求中使用术语“或”表示“和/或”，除非特别指出仅替代方式，或替代方式互相排除，但公开内容支持仅指替代方式和“和/或”的定义。
如本说明书和权利要求中所使用的，词语“包含”(和任何形式的包含，例如“含有”和“含”)，“具有”(以及任何形式的“具有”，例如“有”和“拥有”)，“包括”(以及任何形式的“包括”，例如“囊括”和“括入”)或“含有”(以及任何形式的“含有”，例如“含入”和“包含”)都是纳入性或开放性的，并不排除额外的未提到的元素或方法步骤。考虑本说明书中所讨论的任何实施方式可以用任何本发明的方法或组合物实现，反之亦然。另外，本发明的组合物可用于实现本发明的方法。
本文所述的“全能性”指一个细胞分裂和/或分化产生一个生物体中所有分化后细胞(包括胚胎外组织)的能力。全能性细胞包括芽孢和受精卵。在一些生物体内，细胞能分化并保持全能性。
“多潜能”在本文中指能分化成三胚层中任一的潜能：内胚层(例如内部胃内壁、胃肠道、肺)、中胚层(例如肌肉、骨、血液、泌尿生殖系统)或外胚层(例如表皮组织和神经系统)。
“多潜能干细胞”包括天然多能干细胞和经诱导的多潜能干细胞。它们可形成任何胎儿或成人细胞类型。然而，它们单独并不能发育成胎儿或成年生物体，因为缺乏生成胚胎外组织(例如胎盘)的能力。
“经诱导的多潜能干细胞”或(“iPSC”)与天然多潜能干细胞，例如胚胎干细胞(ES)在许多方面类似，例如表达一些干细胞基因和/或蛋白，染色质甲基化模式，倍增时间，胚状体形成，畸胎瘤形成，存活的嵌合体形成以及潜能和可分化性。经诱导的多潜能干细胞可从例如成体胃、肝、皮肤细胞和血细胞中衍生。iPSC可通过将某些干细胞相关基因转染到非多潜能细胞，例如成体成纤维细胞中来衍生。在一些实施方式中，可通过病毒载体，例如逆转录病毒，和非病毒或附加体载体等实现转染。转染的基因可包括但不限于主要转录调节因子Oct-3/4(Pou5f1)、Klf4、c-myc、Sox2、Oct-4、Nanog和Lin28转基因。转染细胞的亚群能开始变得与多潜能干细胞形态和生化上类似，可通过形态选择、倍增时间或通过报道基因和抗生素筛选分离。
本领域普通技术人员已知的一种或多种“关键的多能性标记物”包括但不限于碱性磷酸酶、SSEA3、SSEA4、Sox2、Oct3/4、Nanog、TRA160、TRA181、TDGF 1、Dnmt3b、FoxD3、GDF3、Cyp26a1、TERT和zfp42的基因和/或蛋白质表达。
本文所述的“多能性”指多能祖细胞，其具有产生多种细胞类型，但谱系数比起多潜能干细胞来说更有限。例如，多能干细胞是造血细胞，其能发育成多种血细胞，但不能发育成脑细胞或其他类型的细胞。
本文所用的“重编程因子”是指一种生物活性多肽(或编码其的核酸，例如DNA或RNA)或小分子或其混合物，其作用于细胞上以改变转录，并且其在表达后，将体细胞重编程为不同的细胞类型，或多能或多潜能。在一些实施方式中，重编程因子可以是非整合的，即以不导致外源DNA整合到受体细胞的基因组的形式向受体体细胞提供。
在一些实施方式中，重编程因子是转录因子，包括但不限于Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc、和Nanog。还感兴趣的重编程因子是Lin28，其是被认为在分化期间影响具体mRNA的翻译或稳定性的mRNA-结合蛋白。
感兴趣的重编程因子也包括可用于转分化的因子，其中体细胞被再编程成不同的体细胞。出于使一种体细胞转分化成另一种基本不同的体细胞类型的体细胞的目的，发现不同组的重编程因子的用处。例如，为了将成纤维细胞转分化成心肌细胞，可使用细胞穿透肽Gata4、Mef2c和Tbx5(Leda等，Cell，第142卷，第3期，375-386，2010年8月6日，其通过引用具体纳入本文)。
重编程因子可以生物上有活性的分离的肽(即无细胞形式)的组合物，或编码其的核酸(例如，DNA，RNA)提供。可由具体DNA结合试验，或通过确定因子在改变细胞转录的效果来确定生物活性。本发明的组合物可提供一种或多种生物上有活性的重编程因子。该组合物可包含至少约50μg/ml、至少约100μg/ml、至少约150μg/ml、至少约200μg/ml、至少约250μg/ml、至少约300μg/ml、或更多的可溶重编程因子。
Klf4多肽是包含与人Klf4(即Kruppel-样因子4)的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽，其序列可见于GenBank登录号NP_004226(SEQ ID NO：1)和NM_004235(SEQID NO：2)。发现Klf4多肽，例如，与GenBank登录号NM_004235中提供的序列(SEQ ID NO：2)至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、95％、97％、99％、或100％相同的那些以及编码其的核酸用作本发明中的重编程因子的用处。
c-Myc多肽是包含与人c-Myc(即骨髓细胞瘤病毒癌基因同源物)的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽，其序列可见于GenBank登录号NP_002458(SEQ ID NO：3)和NM_002467(SEQ ID NO：4)。发现c-Myc多肽，例如，与GenBank登录号NM_002467中提供的序列(SEQ ID NO：4)至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、95％、97％、99％、或100％相同的那些以及编码其的核酸用作本发明中的重编程因子的用处。
Nanog多肽是包含与人Nanog(即Nanog同源框)的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽，其序列可见于GenBank登录号NP_079141(SEQ ID NO：5)和NM_024865(SEQID NO：6)。发现Nanog多肽，例如与GenBank登录号NM_024865中提供的序列(SEQ ID NO：6)至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、95％、97％、99％、或100％相同的那些以及编码其的核酸用作本发明中的重编程因子的用处。
Lin-28多肽是包含与人Lin-28(即秀丽新杆线虫(C.elegans)的Lin-28同源物)的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽，其序列可见于GenBank登录号NP_078950(SEQ ID NO：7)和NM_024674(SEQ ID NO：8)。发现Lin-28多肽，例如与GenBank登录号NM_024674中提供的序列(SEQ ID NO：8)至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、95％、97％、99％、或100％相同的那些以及编码其的核酸用作本发明中的重编程因子的用处。
Oct3/4多肽是包含与人Oct3/4(也称为智人POU 5类同源框1(POU5F1))的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽，其序列可见于GenBank登录号NP_002692(SEQ IDNO：9)和NM_002701(SEQ ID NO：10)。发现Oct3/4多肽，例如与GenBank登录号NM_002701中提供的序列(SEQ ID NO：10)至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、95％、97％、99％、或100％相同的那些以及编码其的核酸用作本发明中的重编程因子的用处。
Sox2多肽是包含与人Sox2(即性别决定区Y-盒2蛋白)的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽，其序列可见于GenBank登录号NP_003097(SEQ ID NO：11)和NM_003106(SEQ ID NO：12)。发现Sox2多肽，例如与GenBank登录号NM_003106中提供的序列(SEQ ID NO：12)至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、95％、97％、99％、或100％相同的那些以及编码其的核酸用作本发明中的重编程因子的用处。
已经描述小分子，包括但不限于丙戊酸、BIX-01294和BayK8644可用于重编程细胞(参见Shi等，(2008)Cell Stem Cell 6；3(5)：568-574和Huangfu等，(2008)NatureBiotechnology 26：795-797，各自通过引用具体纳入本文)。
“损伤相关分子模式分子”(DAMP)也称为危险相关分子模式分子，如本文所述是可在非感染性炎性反应中引发并永久持续免疫应答的分子。相反，病原体相关分子模式分子(PAMP)引发并永久持续感染性病原体炎性反应。DAMP可以是核或胞质蛋白质。当组织损伤后在细胞外释放或暴露于细胞表面上时，它们可从还原环境移向氧化环境，这可导致它们变性。在坏死之后，肿瘤DNA释放到核外和细胞外，其可变为DAMP。DAMP的示例可包括但不限于HMGB1、DNA、RNA、S100分子、嘌呤代谢物、尿酸、纳米颗粒、石棉、铝组合物如铝盐、β-淀粉样、二氧化硅、胆固醇晶体、疟色素、无水焦磷酸钙等。在某些实施方式中，由于接触重编程因子，DAMP的存在能够增强重编程的效率。
本文所用的“铝组合物”是指含有单质铝、铝盐、铝离子和/或共价或离子结合至另一种元素的铝的分子。在一些实施方式中，该术语是指铝盐、氢氧化铝、硫酸铝和磷酸铝。
“铝”是硼族化学元素，符号位Al并且原子数为13。其是银白色、软、延展性金属。铝是第三丰富元素(在氧和硅之后)，并且是地壳中最丰富的金属。大多数的化合物，包括所有的含铝矿物和所有市售的显著铝化合物，特征在于氧化态3+的铝。这类化合物的配位数不同，但是一般Al3+是六配位或四配位的。几乎所有的铝(III)的化合物是无色的。铝形成一种稳定的氧化物，其矿物名称称为刚玉。蓝宝石和红宝石是掺杂痕量的其它金属的不纯的刚玉。两种氧化物-氢氧化物，AlO(OH)，是勃姆石和硬水铝石。存在三种氢氧化物：拜三水铝石、三水铝石和诺三水铝石，它们的晶体结构不同(多晶型物)。大多数通过多种使用酸和碱的湿法从矿石中产生。加热氢氧化物导致形成刚玉。
“氢氧化铝”在本文中是指Al(OH)3，ATH，有时错误地称为氧化铝的水合物，以矿物三水铝矿(也称为水铝矿)及其三种更罕见的多晶形物：拜三水铝石、督三水铝石和诺三水铝石见于自然中。刚沉淀的氢氧化铝形成凝胶，其是在水纯化中将铝盐用作絮凝剂的基础。这种凝胶随着时间结晶。可将氢氧化铝凝胶脱水(例如，使用水混溶性溶剂如乙醇)来形成无定形氢氧化铝粉末，其易溶于酸中。在小心控制的条件下已经加热至升高的温度的氢氧化铝粉末已知是活化的氧化铝并用作干燥剂，吸附剂，在气体纯化中，用作Claus催化剂载体，水纯化，和催化剂的吸附剂，在通过Sclairtech法制备聚乙烯期间。三水铝矿具有带氢键的一般金属氢氧化物结构。其构成双层羟基，铝离子占据两层之间的三分之二的八面体洞。
可通过拜耳法商业制备氢氧化铝，其包括在高至270℃的温度下在氢氧化钠中溶解铝土矿。分离红色泥状的剩余固体并且从剩余的溶液中沉淀氧化铝。产生的氧化铝可通过与水反应转化成氢氧化铝。
“磷酸铝”(AlPO4)是在自然中以矿物块磷铝矿发现为其无水形式的化学化合物。也已知许多合成形式的无水磷酸铝。它们具有与沸石类似的框架结构并且一些用作催化剂或分子筛。已知一种水合形式AlPO4·1.5H2O。磷酸铝凝胶也是市售可得的。存在大量的磷酸铝分子筛，一般称为“ALPO”。它们有与AlPO4相同的化学组成并且具有带微孔空腔的框架结构，并且构架由交替的AlO4和PO4四面体组成。更致密的空腔更少的晶体AlPO4矿物，磷铝矿有相同的交替的AlO4和PO4四面体。铝磷酸盐框架结构AlO4四面体和PO4四面体的取向中互相不同以形成不同尺寸的空腔并且在这一方面，它们与差异在于带不同电的框架的铝硅酸盐沸石相似。铝磷酸盐的一般制备包括在有机胺存在下，在受控的pH下，磷酸与氢氧化物形式的铝，铝盐如硝酸铝盐或醇盐的水热反应。这些有机分子作用是模板(现在称为结构导向剂以引导多孔框架的生长)。
“硫酸铝”是式Al2(SO4)3的化学化合物。其可溶于水并且主要用作饮用水纯化中的絮凝剂。硫酸铝有时称为一种类型的明矾。明矾是表示为AB(SO4)212·H2O的一类相关化合物。自然中的无水形式是紫铁铝矿，见于例如火山环境中和燃烧煤矿废料堆之后。即使有，硫酸铝也很少是无水盐。其形成多种不同的水合物，其中十六水合物Al2(SO4)3·16H2O和十八水合物Al2(SO4)3·18H2O最常见。化学式可写成[Al(H2O)6]2(SO4)3·5H2O的十七水合物在自然中以矿物毛矾石出现。
本发明的方法中有效的DAMP(例如，铝组合物)的剂量是相对于在没有DAMP的情况下进行的相同方法增加细胞或细胞群的重编程效率的剂量。本文所用的术语“重编程”表示在体外或体内，体细胞经核重编程为多潜能细胞(例如，成纤维细胞至经诱导的多潜能细胞)或体细胞经核重编程为明显不同的体细胞(例如，成纤维细胞至内皮细胞)。后一种过程也称为转分化。
在某些实施方式中，正在重编程的细胞接触一定浓度的DAMP，如铝组合物，其浓度为约或至少或正好1、10、102或103倍的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、181、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100纳克、微克、毫克或克/ml细胞培养基。在另一个实施方式中，在体细胞接触重编程因子之前、之后或期间，细胞接触这种浓度持续约或至少或正好1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、181、19、20、21、22、23、24分钟、小时或天。
术语“重编程效率”可用于指代细胞在接触重编程因子时产生iPS细胞集落的能力。证明增强的重编程为多潜能的效率的体细胞将证明与重编程因子接触时相对于对照增强的产生iPSC的能力。术语“重编程效率”也可指代体细胞重编程为基本不同的体细胞类型的能力，一种称为转分化的过程。用本发明的方法重编程的效率随着体细胞、导入重编程因子的方法、和诱导重编程之后培养方法的具体组合而变化。
在某些实施方式中，DAMP的存在导致1)一种或多种关键多潜能标记物的表达水平；或2)形成的iPSC的数量的约或至少或正好1、10、102或103倍的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、181、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％增加，其各自与缺少DAMP的相同的重编程方法(即，对照)比较。
体外诱导多潜能的方法
体细胞的起始群与如上所述的组合和量的重编程因子接触，该量足以在用有效剂量的DAMP活化体细胞之前、同时或之后重编程该细胞为多潜能。在本发明的一个实施方式中，铝组合物是氢氧化铝。可向体细胞提供单独的或单一组合物(即重编程因子的预混组合物)形式的重编程因子。在另一个实施方式中，体细胞的起始群是外周血单核细胞(PBMC)、脐带血单核细胞或成纤维细胞。
在一些实施方式中，细胞的起始群接触有效剂量的DAMP持续约1至约18天的一段时间，例如，约1至约5天，并且可以是约2-3天。
可以不同次数向对象细胞同时或依次加入重编程因子，并且可与DAMP组合添加。在一些实施方式中，加入一组至少3种纯化的重编程因子，例如，Oct3/4多肽，Sox2多肽，和Klf4、c-myc、nanog或lin28多肽。在一些实施方式中，向细胞提供一组4种纯化的重编程因子，例如，Oct3/4多肽、Sox2多肽、Klf4多肽和c-Myc多肽；或Oct3/4多肽、Sox2多肽、lin28多肽和nanog多肽。
用于将重编程因子引入体细胞的方法包括向细胞提供纯化的蛋白质因子或编码其的核酸。在一些实施方式中，重编程因子将包括与多肽穿透结构域融合的重编程因子的多肽序列。本领域已知许多渗透结构域并可用于本发明的核作用的非整合多肽，包括肽、肽模拟物和非肽运载体。例如，渗透肽可衍生自称为穿膜肽(penetratin)的果蝇(Drosophilamelanogaster)转录因子触角足蛋白(Antennapaedia)的第三α螺旋，其包含氨基酸序列RQIKIWFQNRRMKWKK(SEQ ID NO：13)。另一个示例中，所述渗透肽包括HIV-1tat基本区氨基酸序列，其可包括例如天然产生的tat蛋白的氨基酸49-57。其他渗透结构域包括多精氨酸基序，例如HIV-1rev蛋白质的氨基酸34-56区、九精氨酸(SEQ ID NO：14)、八精氨酸(SEQ IDNO：15)等。(参见，例如，Futaki等，(2003)Curr Protein Pept Sci.2003年4月；4(2)：87-96；和Wender等，(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 2000年11月21日；97(24)：13003-8；公开的美国专利申请20030220334；20030083256；20030032593；和20030022831，在本文中通过引用具体纳入用于教导移位肽和类肽)。九精氨酸(R9)(SEQ ID NO：14)序列是已经表征的最高效的PTD之一(Wender等，2000；Uemura等，2002)。
在这类实施方式中，在纯化的重编程因子存在下孵育细胞约30分钟至约72小时，例如，2小时、4小时、8小时、12小时、18小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、或约30分钟至约72小时的任何其它时间段。一般地，4次向对象细胞提供重编程因子，并且允许细胞与重编程因子孵育48小时，之后用新鲜培养基置换培养基并且进一步培养细胞(参见，例如，Zhou等，(2009)Cell Stem Cells 4(5)；381-384)。可向对象细胞提供重编程因子持续约1至约4周，例如，约2至约3周。
重编程因子的剂量将随着细胞性质、因子、培养条件等变化。在一些实施方式中，剂量将是各因子约1nM至约1μM，更通常约10nM至约500nM，或约100至200nM。在一些实施方式中，细胞在接触重编程因子期间初始接触铝组合物持续至少约1天、至少约2天、至少约4天、至少约6天或一周，并且可接触持续整个重编程过程，或更少。剂量将取决于具体DAMP，但是可以是约1ng/ml至约1μg/ml、约10ng/ml至约500ng/ml。每次提供后可用重组因子孵育16-24小时2次，之后用新型培养基置换培养基并进一步培养细胞。
在一些实施方式中，使用没有整合到体细胞基因组中的载体。有许多可用于将外源基因转入靶哺乳动物细胞的载体。这些载体可保持在附加体中，例如作为质粒，病毒衍生的载体如巨细胞病毒、腺病毒等。用于向对象细胞提供重编程因子如核酸的载体通常包含合适的启动子用于驱动重编程因子核酸的表达，即转录活化。这可包括广泛作用的启动子，例如，CMV-β-肌动蛋白启动器，或诱导型启动子，如在具体细胞群中有活性或者响应药物如四环素存在的启动子。通过转录活化，预期靶细胞中的转录将在基线水平上增加至少或约2、3、4、5、6、7、8、9、10、100或1000倍。
在引入重编程因子之后，体细胞可保持在包含饲细胞层的常规培养基中，或者可在没有饲细胞层的情况下培养，即除了诱导为多潜能的那些以外没有体细胞。无饲细胞层培养可采用蛋白质涂覆的表面，例如，基质胶等。体细胞也可保持悬浮或附连至微运载体。
通过本发明的方法诱导如此变化的iPSC可具有hESC-样形态，以具有大细胞核-胞质比、确定的边界和显著细胞核的平板集落生长。另外，iPSC能够表达本领域普通技术人员已知的一种或多种关键的多能性标记物，包括但不限于碱性磷酸酶、SSEA3、SSEA4、Sox2、Oct3/4、Nanog、TRA160、TRA181、TDGF 1、Dnmt3b、FoxD3、GDF3、Cyp26a1、TERT和zfp42。另外，iPSC能够形成畸胎瘤。另外，它们能够形成活生物体中的外胚层、中胚层或内胚层组织，或对于形成活生物体中的外胚层、中胚层或内胚层组织起作用。
可以为了多种目的向体细胞或体细胞衍生的iPSC中导入基因，例如为了取代具有功能缺失突变的基因、提供标记基因等。或者，可引入表达反义mRNA或核酶的载体，从而阻断不需要的基因表达。基因治疗的其他方法是引入药物抗性基因以使正常祖细胞具有优势并经受选择压力，所述药物抗性基因例如多重耐药基因(MDR)或抗凋亡基因如bcl-2。本领域已知的各种技术可用于将核酸引入靶细胞，所述技术例如上述的电穿孔、钙沉淀DNA、融合、转染、脂质体转染、感染等。DNA引入的具体方法对实施本发明不重要。
通过上述方法产生的iPSC可用于重建或补充接受者中正在分化或经分化的细胞。经诱导的细胞可分化成各种谱系的细胞类型。经分化的细胞的示例包括任何来自外胚层(例如，神经元和成纤维细胞)、中胚层(例如，心肌细胞)或内胚层(例如，胰腺细胞)谱系的经分化的细胞。经分化的细胞可以是以下的一种或多种：胰腺β细胞、神经干细胞、神经元(例如，多巴胺能神经元)、少突胶质细胞、少突胶质细胞祖细胞、肝实质细胞、肝干细胞、星形细胞、肌细胞、造血细胞或心肌细胞。
存在多种将经诱导的细胞分化成更具体的细胞类型的方法。分化经诱导的细胞的方法可与用于分化干细胞，尤其是ES细胞、MSC、MAPC、MIAMI、造血干细胞(HSC)的那些方法类似。在一些情况中，分化离体发生；在一些情况中，分化体内发生。
所述经诱导的细胞，或从经诱导的细胞分化的细胞可用作治疗疾病(如遗传缺陷)的疗法。所述疗法可针对治疗所述疾病的原因；或者，所述疗法可治疗所述疾病或症状的影响。经诱导的细胞可转至或接近对象的损伤位置；或所述细胞可以细胞迁移或驻留在损伤位置的方式引入所述对象。经转移的细胞宜替代受损或受伤细胞并使对象的总体病症改善。在一些情况中，经转移的细胞可刺激组织再生或修复。
经转移的细胞可以是从经诱导的细胞分化的细胞。经转移的细胞也可以是从经诱导的细胞分化的多能干细胞。在一些情况中，经转移的细胞可以是未经分化的经诱导的细胞。
向对象给予治疗的次数可变化。将经诱导的和/或经分化的细胞引入所述对象可为一次事件；但在某些情况中，所述治疗可在有限的时间引起改善并需要持续的一系列重复治疗。在其它情况中，在观察到效果之前可能需要多次给予细胞。确切的方案取决于疾病或病症、疾病的阶段和正接受治疗的个体对象的参数。
可通过任意以下途径向对象引入细胞：胃肠外、静脉内、动脉内、肌内、皮下、透皮、气管内、腹膜内、或进入脊液。
可以任意生理上可接受的培养基给予iPSC。它们可单独或与合适的物质或基质一起提供，例如，以支持它们在其植入的组织中的生长和/或组织。通常，将给予至少1x105个细胞，优选1x106或更多。可通过注射、导管等引入细胞。细胞在液氮温度下冷冻并且长期储存，能够在解冻后使用。若冷冻，所述细胞通常储存于10％DMSO、50％FCS、40％RPMI 1640培养基中。一旦解冻，所述细胞可用有关祖细胞增殖和分化的细胞因子和/或基质细胞扩增。
可提供试剂盒，其中，试剂盒包括有效剂量的DAMP，如铝组合物。在一些实施方式中，该铝组合物是氢氧化铝。该试剂盒还可包括一种或多种重编程因子，例如，以与穿透结构域融合的蛋白质的形式。
“治疗”或“处理”在本文中指对对象施用一种物质，以治愈、减轻、缓解、治疗、预防或改善疾病、疾病症状、由疾病引发的疾病状态或发生疾病的倾向。“有效量”是能在经治疗对象中产生如本文所定义的医学上理想结果的物质量。医学上理想的结果可以是客观的(即通过测试或标记物可测量的)或主观的(即治疗对象表示出迹象或感觉到效果)。
本文所述的“适合干细胞疗法治疗的疾病”表示能够通过给予干细胞如iPSC治疗的任何程序、病症、失调、微恙和/或疾病。这些疾病包括但不限于骨髓、皮肤、心脏和角膜移植，移植物抗宿主病，肝肾衰竭，肺损伤，类风湿性关节炎，自身免疫病的治疗(例如克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、多发性硬化、狼疮和糖尿病)；神经疾病、心血管疾病和同种异体移植排斥的预防；以及急性淋巴细胞白血病(ALL)，急性髓细胞性白血病(AML)，伯基特淋巴瘤，慢性髓细胞性白血病(CML)，幼年型粒单核细胞白血病(JMML)，非霍奇金氏淋巴瘤，霍奇金氏淋巴瘤，淋巴瘤样肉芽肿病，髓发育不良综合症(MDS)，慢性粒单核细胞白血病(CMML)，骨髓衰竭综合征，低巨核细胞性血小板减少症，自身免疫性嗜中性白血球减少症(重症)，先天性红细胞生成障碍性贫血，周期性中性白细胞减少，戴-布二氏贫血，伊文综合征，范科尼贫血，血小板无力症，幼年型皮肌炎，Kostmann综合症，红细胞发育不全，施瓦赫曼综合征，严重再生障碍性贫血，先天性铁粒幼红细胞性贫血，血小板减少并桡骨缺乏(TAR综合征)，先天性角化不良，血液疾病，镰刀形细胞贫血(血色素SS)，HbSC病，镰刀形βo地中海贫血，α-重型地中海贫血(胎儿水肿)，β-重型地中海贫血(库利氏贫血)，β-中间型地中海贫血，E-βo地中海贫血，E-β+地中海贫血，代谢疾病，肾上腺脑白质失养病(婴儿)，异染性脑白质病变，克拉伯病(球形细胞脑白质营养不良)，先天性红细胞生成性卟啉病，赫曼斯基-普德拉克综合征，赫尔利综合征，胡-射二氏综合征，亨特综合征，圣菲利波综合征，马-兰二氏综合征，II型、III型粘多糖症，α甘露糖苷贮积症，A型或B型尼曼-匹克综合征，桑德霍夫综合征，泰-萨克斯病，巴藤病(遗传样神经元腊样脂褐质症)，高原酸血症，免疫缺陷病，运动失调性毛细血管扩张症，慢性肉芽肿性疾病，迪格奥尔格综合征，IKK-γ缺陷，免疫失调性多内分泌病变，II型X-连锁粘多糖贮积症，先天性骨髓粒细胞缺乏症X-连锁免疫缺陷，重症联合免疫缺陷，腺苷脱胺酶缺陷，威斯科特-奥尔德里奇综合征，X-连锁血中丙球蛋白贫乏，X-连锁淋巴(细胞)增生症，Omenn综合征，网状结构不良，胸腺发育不全，白细胞粘附缺陷，其他骨硬化症，朗格汉斯细胞组织细胞增生症，噬血细胞淋巴组织细胞增生症，急性和慢性肾病，阿尔茨海默氏病，抗衰老，关节炎，哮喘，心脏干细胞治疗，脑梗塞(中风)，脑瘫(中风)，慢性阻塞性肺疾患(COPD)，充血性心力衰竭，糖尿病(I型和II型)，纤维肌痛，免疫缺陷，缺血性心脏病，狼疮，多发性硬化，心肌梗塞，骨关节炎，骨质疏松，帕金森氏病，外周动脉疾病，类风湿性关节炎，整容手术中的干细胞治疗，创伤性大脑损伤和神经性疾病。
本文所用的“患者”指诊断或怀疑患有或发生适合干细胞疗法的疾病，例如心血管疾病的哺乳动物对象。示范性的患者可以是人、猿、犬、猪、牛、猫、马、山羊、绵羊、啮齿动物和其他哺乳动物，其可获益于干细胞治疗。
“给予”在本文中指向患者提供本发明的iPSC。通过举例而不是限制，可通过静脉内(i.v.)注射，皮下(s.c.)注射，皮内(i.d.)注射，腹膜内(i.p.)注射，或肌肉内(i.m.)注射给予组合物。可采用一种或多种这样的途径。胃肠外施用可以是例如通过推注或逐渐随时间灌注。或者或同时，可通过口服途径给药。另外，也可通过手术放置大丸剂或细胞团块，或放置其中装载细胞的医疗装置例如支架来给药。优选的，在疾病的位点，例如疾病损伤(例如血管狭窄/堵塞，坏死组织或坏疽感染位点)处或附近(例如距离约或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50毫米处)给予本发明的组合物。
本文所述的“有此需要的患者”指诊断出或怀疑适合干细胞疗法的疾病的患者。
实施例
在无饲细胞条件下用附加体质粒和氢氧化铝重编程人脐带血CD34+细胞或外周血单核细胞。
该程序通过使用附加体质粒、Lonza 4D-NucleofectorTM系统、Lonza#7PSC培养基和人玻连蛋白基质重编程人脐带血CD34+细胞或PBMC来生成人经诱导的多潜能干细胞(iPSC)。
使用的材料包括：人脐带血CD34+细胞(隆萨公司(Lonza)，目录号2C-101)或人外周血单核细胞(隆萨公司，目录号CC-2702)；血细胞培养基，含有无血清基础培养基，50％IMDM(英杰公司(Invitrogen)，目录号12440-053)，50％Ham’s F12(英杰公司，目录号11765054)，1x化学限定的脂质浓缩物(英杰公司，目录号11905-031)，1x胰岛素-转铁蛋白-硒-X(ITS-X)(英杰公司，目录号51500)，50ug/mL抗坏血酸(西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)，目录号49752)，5mg/mL牛白蛋白组分V溶液(英杰公司，目录号15260-037)，2mMGlutaMaxTM-I(英杰公司，目录号35050)以及脐带血特异性生长因子包括100ng/mL重组人SCF(派普技术公司(Peprotech)，目录号AF-300-07)、100ng/mL重组人Flt3-配体(派普技术公司，目录号AF-300-19)，20ng/mL重组人TPO(派普技术公司，目录号300-18)、和10ng/mL重组人IL-3(派普技术公司，目录号200-03)以及PBMC特异性生长因子如200μM 1-硫代甘油(西格玛公司(Sigma)#M6145)、100μg/mL全转铁蛋白(R&D系统公司#2914-HT)、1μM地塞米松(西格玛公司#D1756)、100ng/mL(派普技术公司#300-07)、2U/mL EPO(R&D系统公司#287-TC-500)、10ng/mL IL-3(派普技术公司#200-03)、和Alro 40ng/mL IGF-1(派普技术公司#100-11)。还使用了cGMP-级pEB-C5和pEB-Tg质粒；或者pCE-OCT3/4、pCE-hSK、pCE-hUL、pCE-p53mDD、pCE-EBNA1、Alhydrogel 2％(英杰公司vac-alu-50)、隆萨#7多潜能干细胞(PSC)培养基、0.4％台盼蓝溶液(英杰公司，目录号15250061)、1xDPBS(隆萨公司，目录号17-512F)、1xDPBS++(隆萨公司，目录号17-513F)和P3原代细胞4D-核转染仪TM X试剂盒L(隆萨公司，目录号V4XP-3012)。
使用的设备包括隆萨4D-NucleofectorTM系统(隆萨公司，目录号AAF-1001B，AAF-1001X)、37℃±2℃下含5％CO2±2％，3.8％O2的加湿孵育器、生物危险品垃圾容器、组织培养罩、血细胞计数器、显微镜、37℃水浴、带15mL管用转子的200xg离心机、CostarStripette纸包一次性聚苯乙烯血清学移液管10mL(赛默飞世尔公司(Thermofisher)，目录号07-200-574)、Costar Stripette纸包一次性聚苯乙烯血清学移液管10mL(赛默飞世尔公司，目录号07-200-573)、Drummond便携式移液管-辅助填充器/分散器XP(赛默飞世尔公司，目录号13-681-15E)、认证的无菌Costar无RNA酶微离心管1.7mL Natural(赛默飞世尔公司，目录号07-200-534)、无菌1000μL过滤微量移液管尖头(瑞宁公司(Rainin)，目录号RT-1000F)、无菌200μL过滤微量移液管尖头(瑞宁公司，目录号RT-200F)、无菌20μL过滤微量移液管尖头(瑞宁公司，目录号RT-20F)、无菌10μL过滤微量移液管尖头(瑞宁公司，目录号RT-10GF)、移液管-Lite XLS 1000μL微量移液管(瑞宁公司，目录号SL-STARTXLS)、移液管-Lite XLS 200μL微量移液管(瑞宁公司，目录号SL-STARTXLS)、移液管-Lite XLS 20μL微量移液管(瑞宁公司，目录号SL-STARTXLS)、移液管-Lite XLS带有RFID 0.1-2μL微量移液管(瑞宁公司，目录号SL-2XLS)、康宁12-孔组织培养平板(康宁公司，目录号3513)、6-孔组织培养平板(赛默飞世尔公司，目录号08-772-1B)、Falcon 15mL锥形离心管(赛默飞世尔公司，目录号14-959-70C)。
在第0天，过程包括如下的细胞核转染：含1mL的10μg/mL浓度的玻连蛋白的包被组织培养平板(9.6cm2/孔)。允许包被以孵育1小时。通过涡旋确保Alhydrogel均匀悬浮。将Alhydrogel个SFM以3μL/mL SFM的比率混合。对于各转染样品，将2mL的SFM转移到6-孔板的1个孔中。将板放置在37℃的加湿孵育器中以预热培养基。在Falcon 15mL锥形管中收集人血细胞。取10μL细胞悬浮液并与10μL的台盼蓝充分混合。在显微镜下使用血细胞计数器来对活细胞计数。对于各转染样品，将106个或细胞置于新的15mL管中并在200g下离心细胞持续5分钟。去除上清。在干冰上迅速冷冻细胞并储存在-80℃下用于未来的STR分析。将来自P3原代细胞4D-NucleofectorTM X试剂盒L的82μL P3溶液和18μL补充物在无菌微量离心管中混合。分别以8∶2或0.63∶0.63∶0.63∶0.63∶0.5μg的比率加入pEB-C5：pEB-Tg或pCE-OCT3/4：pCE-hSK：pCE-hUL：pCE-p53mDD：pCE-EBNA1并充分混合。用之前制备的预混合的NucleofectionTM溶液重悬细胞。用微量移液管充分混合并转移到NucleofectionTM样品池(由试剂盒提供)中。使用采用程序EO-100的4D-NucleofectorTM来核转染细胞。在核转染之后，在组织培养罩中，取0.5mL预热的SFM并使用微量移液管来加入样品池。然后使用NucleofectionTM试剂盒提供的转移移液管来将细胞转移置6孔板的1个孔中的预热SFM中。将平板置于加湿的孵育器中。
在第2天，过程如下：将40μL的250μg/mL玻连蛋白稀释到1mL的1x DPBS++中并加入6孔板的1个孔中。在孵育器中包被该平板3小时。将核转染的CD34+细胞转移到15mL管中并在200g下对细胞离心5分钟。去除培养基并在2mL隆萨#7培养基中重悬细胞。向细胞悬浮液中加入0.2μL的10μM A8301(f.c.1μM)。从孔中吸出玻连蛋白并在其中接种细胞。将平板放入孵育器中。
在第2天和第4天，过程包括如下步骤：隔天加入1.5mL L7直至孔体积超过5mL。
在第6天，过程如下：当孔体积超过6mL时，吸出上清留下体积约为1mL的培养基。温和操作培养基以不破坏覆盖孔底部的细胞。加入1.5mL隆萨#7PSC培养基。
重复第2、4和6天的过程，直至在大约第14-18天之间出现集落。
在第16天，制备24孔玻连蛋白包被的平板。
在第18-20天，过程包括如下的集落挑取步骤：从12孔板中吸出玻连蛋白涂层。为了排空孔，加入250μL L7培养基。在相衬显微镜下，基于形态标记集落用于挑取。进行以下步骤，一次一个集落。在解剖范围中，用移液管尖头刮擦来自孔表面的集落。将移液管尖头中的集落放入约30μL的体积。将集落转移到24孔板中。在已经收集集落之后，将24孔板放入加湿的5％CO2，20％O2，37℃孵育器中。
除非另外定义，否则，本文中所使用的所有技术和科学术语都具有本发明领域普通技术人员通常所理解的同样含义。尽管可以任何组合物、方法、试剂盒和手段来传播与本文所述的类似或等价的信息，来实施本发明，本发明描述了优选的组合物、方法、试剂盒和传播信息的手段。
本文所引用的所有文献以法律允许的最大程度引入以供参考。这些文献的讨论内容仅仅是为了总结其作者的主张。并不承认任何文献(或任何文献的一部分)是相关现有技术。申请人保留攻击任何引用文献的准确性和相关性的权利。
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Claims (15)

1.一种用于非治疗目的的增强哺乳动物体细胞核重编程的方法，所述方法包括：将哺乳动物体细胞群与(a)有效剂量的氢氧化铝；和(b)重编程因子的混合物接触，接触时间足以将所述哺乳动物体细胞重编程为经诱导的多潜能干细胞，其中所述哺乳动物体细胞是脐带血单核细胞。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，依次或同时提供所述氢氧化铝和重编程因子。
3.如权利要求1-2中任一项所述的方法，其特征在于，氢氧化铝的有效剂量是至少40-80微克/ml。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，氢氧化铝的有效剂量是至少60微克/ml。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物体细胞是人细胞。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重编程因子的混合物包括使用编码Oct4、Sox2、Lin28和Nanog的核酸，或其相应细胞穿透肽，并且所述细胞经重编程为多潜能。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重编程因子的混合物包括使用编码Oct4、Sox2、c-Myc和KLF4的核酸，或其相应细胞穿透肽，并且所述细胞经重编程为多潜能。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重编程因子以细胞穿透蛋白提供。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重编程因子以编码蛋白质的核酸提供。
10.如权利要求1所述的方法，所述方法产生核重编程效率，其中所述核重编程效率高于不使用氢氧化铝进行所述方法的效率。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，就至少一个关键多潜能标记物的表达来看，所述核重编程效率高1至5倍。
12.如权利要求10所述的方法，其特征在于，就产生的经诱导的多潜能干细胞的量来看，所述核重编程效率高1至5倍。
13.用于权利要求1所述的方法的试剂盒，其中所述试剂盒包含(a)氢氧化铝和(b)重编程因子的混合物。
14.一种用于体内给予的治疗组合物，所述组合物包含氢氧化铝和一种或多种细胞穿透肽、和/或编码这类肽的核酸，用于治疗性调节细胞和/或组织表型。
15.如权利要求14所述的治疗组合物在制备用于治疗有需要的患者的药物中的用途。
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