CN101492676A - 用脑膜细胞生成诱导的多能性干细胞的方法及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及使用脑膜细胞诱导重编程为诱导的多能性干细胞(iPS)的方法，所述方法包括：用包含多能性干细胞因子的cDNA导入脑膜细胞；在适宜上述被导入的脑膜细胞生长的培养条件下培养该细胞。本发明还涉及脑膜细胞被诱导重编程为iPS的用途，特别是所述脑膜细胞在被导入了多能性干细胞因子的cDNA后而被诱导重编程为iPS的用途。

Description

用脑膜细胞生成诱导的多能性干细胞的方法及其用途

一.发明背景

干细胞(stem cells)是人体及其各种组织细胞的初始来源，其最显著的生物学特征是既有自我更新和不断增殖的能力，又有多向分化的潜能。干细胞根据不同的来源分为成体干细胞(somaticstem cells)和胚胎干细胞(embryonic stem cells，ES细胞)。  成体干细胞包括骨髓间充质干细胞、胰腺干细胞、神经干细胞等成体组织中存在的。

1981年，ES细胞的分离和培养首先在小鼠中获得成功，是至今研究最广泛、最成熟的干细胞体系。随后，牛、羊等大动物的ES细胞分离和培养也相继获得成功。

hES细胞研究的应用前景主要是移植治疗，在组织工程学领域中以hES细胞作为种子细胞，可为临床上细胞、组织或器官的移植治疗提供大量的材料。通过控制hES细胞分化培养环境、转染能够促进ES细胞定向分化的关键分子基因等体外诱导分化策略，可获得特异性的组织细胞类型。这类细胞用于移植治疗，将给糖尿病、帕金森氏病、脊髓损伤、白血病、心肌损伤、肾衰竭、肝硬化等疾病的治疗带来新的希望。

一直以来，hES细胞研究面临着许多难题和争议，主要包括以下几个方面：(1)供体卵母细胞的来源困难，hES细胞建系效率低。此外，SCNT技术的不成熟必将需要进一步耗费更多的人类卵母细胞，故而其来源难以得到保证。(2)免疫排斥反应，除非采用SCNT技术，否则患者对hES细胞分化而来的各种细胞和组织仍然存在免疫排斥反应。(3)hES细胞具有成瘤性，移植到受体的体内后有发展为肿瘤的可能性，即使采用SCNT技术、给移植细胞设置自杀基因等应对措施，也不一定能够很好地解决这个问题(Reubinoff BE等人.Embryonic stem cell lines from human blastocysts：somatic differentiation in vitro。NatBiotechnol 2000；18：399-404；Richards M等人，Bongso A.Human feeders support prolongedundifferentiated growth of human inner cell masses and embryonic stem cells.Nat Biotechnol 2002；20：933-936；Burdon T等人，cell cycle

and pluripotency in embryonic stem cells.Trends Cell Biol 2002；12：432-438)。(4)体外保持hES风险(Nakagawa M，等人，N，Yamanaka S.Generation of induced pluripotentstem cells withoutMyc from mouse and human fibroblasts.Nat Biotechnol 2008；26：101-106)。同样，慢病毒转染技术可能也存在类似的风险。

为避开hES细胞和治疗性克隆研究的伦理学争论，需要找到一种替代途径，以便将人类的体细胞直接转化为多潜能干细胞，为患者提供“个性化”的自体干细胞。2003年，Gurdon研究小组发现，将已完全分化的小鼠胸腺细胞或成人外周血淋巴细胞的细胞核注入爪蟾卵母细胞后，哺乳动物细胞核的分化标志物丧失，而哺乳动物干细胞中最具特征性的标志物Oct4则呈高表达，提示哺乳动物细胞核可直接被两栖动物卵母细胞核泡所重构从而表达Oct4(Byrne JA等人，Nuclei of adult mammalian somatic cells aredirectly reprogrammed to oct-4 stem cell gene expression by amphibian oocytes.Curr Biol 2003；13：1206-1213)。

2006年，日本京都大学Yamanaka研究小组采用体外基因转染技术，从24个因子中筛选出Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4等4个转录因子，通过逆转录病毒将上述4个转录因子导入胚胎小鼠成纤维细胞或成年小鼠尾部皮肤成纤维细胞，在小鼠ES细胞的培养条件下获得了Fbx15+的多潜能干细胞系，该细胞系在细胞形态、生长特性、表面标志物、形成畸胎瘤等方面与小鼠ES细胞非常相似，而在基因表达谱、DNA甲基化方式及形成嵌合体动物方面却不同于小鼠ES细胞，故将其命名为诱导的多能性干细胞(iPS细胞)(Takahashi K，Yamanaka S.Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adultfibroblast cultures by defined factors.Cell 2006；126：663-676)。

2007-07，Yamanaka研究小组进一步用Nanog代替Fbx15进行筛选，得到了Nanog+的iPS细胞系，该iPS细胞不仅在细胞形态、生长特性、标志物表达、移植到小鼠皮下可形成包含3个胚层组织细胞结构的畸胎瘤等方面与小鼠ES细胞非常相似，而且在DNA甲基化方式、基因表达谱、染色质状态、形成嵌合体动物等方面也与小鼠ES细胞几乎完全相似。此外，研究还发现重新激活原癌基因c-Myc是嵌合体动物出现肿瘤形成的原因；而转染的上述4个基因在iPS细胞中并没有表达，表明这些基因只在诱导过程中起作用，iPS细胞保持多潜能性状态的原因是内源性转录因子Nanog基因的表达(Okita K，Ichisaka T等人，germline-competent induced pluripotent stem cells.Nature 2007；448：313-317)。同时独立发表的另一篇来自美国科学家的研究论文同样证实了上述4个转录因子足以使小鼠成纤维细胞在体外诱导重构成为类似小鼠ES细胞的iPS细胞(Wernig M等人，In vitro reprogramming of fibroblasts intoa pluripotent ES cell-like state.Nature 2007；448：318-324)。

新近报道了小鼠肝细胞和胃上皮细胞同样也可被重构成为iPS细胞，遗传学细胞谱系示踪分析显示，iPS细胞源自谱系定型的体细胞的直接重构，而未发现逆转录病毒整合到特定的基因位点与细胞核重构相关(Aoi T等人，Generation of Pluripotent Stem Cells from Adult Mouse Liver and Stomach Cells.Science 2008)。

还有研究者利用相同的技术，将上述同样的4个转录因子导入到人类皮肤成纤维细胞中，也成功获得了iPS细胞。原代人类成纤维细胞样滑膜细胞和源自新生儿成纤维细胞的细胞系同样也可被重构成为iPS细胞。这类iPS细胞在细胞形态、增殖能力、表面抗原标志、基因表达谱、多潜能干细胞特异性基因的表观遗传学状态、端粒酶活性等方面与hES细胞相似，并且在体外培养时和在小鼠体内畸胎瘤形成中均可分化为3个胚层的不同细胞类型(Takahashi K等人，Induction of pluripotent stem cells from adult humanfibroblasts by defined factors.Cell 2007；131：861-872)。与此同时，威斯康辛大学Thomson研究小组也报道了成功诱导胎儿成纤维细胞转化为具有hES细胞基本特征的人类iPS细胞，所不同的是他们使用慢病毒作为载体，并在14个候选基因中选择了Oct4、Sox2、Nanog、Lin28等4个基因进行转导(YuJ等人，Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.Science 2007；318：1917-1920)。

Park IH等人，Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors.Nature 2008；451：141-146利用来自胎儿、新生儿及成人的皮肤或肺部的原代成纤维细胞，其中包括来自1名健康男性皮肤活检得到的成纤维细胞，采用Yamanaka研究小组的策略也获得了相同的结果。他们还发现Oct4和Sox2在诱导重构为iPS细胞过程中是必需的，正是这两个转录因子维持了人类iPS细胞的多潜能性，而Klf4和c-Myc的作用是改变染色质的结构，从而有利于Oct4和Sox2的结合，以提高诱导的效率。此外，这项研究的重要意义在于将取自皮肤活检的成纤维细胞诱导为iPS细胞。上述研究表明，从活检人类皮肤组织中提取体细胞后进行诱导以制备患者特异性的干细胞是可行的，因而有望克服细胞移植治疗中存在的免疫排斥反应。鉴于导入c-Myc基因可使嵌合体小鼠的肿瘤发生率高达20％，可能会阻碍其未来的临床应用(Okita K，Ichisaka T，Yamanaka S.Generation of germline-competent inducedpluripotent stem cells.Nature 2007；448：313-317)。因此，Yamanaka研究小组新近报道，小鼠和人类皮肤成纤维细胞转染c-Myc以外的其余3个基因，在调整培养条件后也可得到iPS细胞。去除c-Myc基因尽管可使未来临床应用的安全性显著提高，但形成iPS细胞的效率却明显降低。虽然嵌合体小鼠在100d内没有肿瘤发生，但逆转录病毒的再激活仍有导致肿瘤发生的潜在风险(NakagawaM，等人，Generationof induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts.Nat Biotechnol2008；26：101-106)。同样，慢病毒转染技术可能也存在类似的风险。

二.发明内容

尽管已经证明了病毒转导一系列外源因子可以使得小鼠和人的成纤维细胞(例如MEF和MSF)以及神经干细胞的后生和转录状态重置成多能胚胎干细胞(ES细胞)的状态(Takahashi K，Yamanaka S.Cell，2006；126：663-676；Wernig M，Meissner A，Foreman R，等人，Nature.2007；448：318-324；Yu J，VodyanikMA，Smuga-Otto K等人Science.2007；318：1917-1920)，但是神经干细胞的培养条件要求极高，而MEF则是必须从胎鼠中获得，而且使用现有这些细胞诱导后产生的诱导的多能干细胞(induced pluripotentstem cell，iPS)产生嵌合小鼠的效率很低，产生的嵌合小鼠在一段时间后发生肿瘤的几率很大(Okita K，Ichisaka T，Yamanaka S.Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells.Nature2007；448：313-317)。

在本发明中，令人惊讶的发现，尽管与已经发现的并且能够被诱导为多能干细胞的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)和皮肤成纤维细胞(MSF)明显不同，小鼠脑膜细胞仍能被产生iPS细胞系，并且这种细胞系在形成嵌合小鼠中是高度有效的。其效率远大于已经发现的可以被诱导为iPS的神经干细胞、MEF等。而且形成的嵌合小鼠在经过很长时间后，仍然存活良好，极大的降低了发生肿瘤的潜在风险。

在本发明的第一个方面中，本发明涉及将脑膜细胞诱导重编程为诱导的多能性干细胞的方法，所述方法包括：

(a)用包含多能性干细胞因子的cDNA导入脑膜细胞；

(b)在适宜上述被导入的脑膜细胞生长的培养条件下培养该细胞，以及任选地

(c)鉴定多能性干细胞克隆。

其中，所述多能性因子为对于干细胞多能性维持关键的因子，优选地，所述的多能性因子包括Oct4、Sox2(任选地，Sox1)、C-myc(任选地L-Myc或N-Myc)，以及Klf4(任选地，Klf5或Klf2)。最优选地，所述多能性因子包括Oct4、Sox2、C-myc以及Klf4。上述多能性因子可以是任何来源的，优选为小鼠的多能性因子以及其变体，如Sox2，NCBI登录号为NM_011443.3(小鼠包含基因2的SRY-框)(SEQ ID NO：1)；Oct4，NCBI登录号为NM_013633.2(小鼠POU结构域，5类，转录因子1(Pou5f1))(SEQ ID NO：2)；Klf4，NCBI登录号为NM_010637.2(小鼠Kruppel-样因子4(肠(gut)))(SEQ ID NO：3)；c-Myc，NCBI登录号为NM_010849.4(小鼠髓细胞瘤病癌基因(myelocytomatosis oncogene)(c-Myc))(SEQ ID NO：4)；Soxl，NCBI登录号为NM_009233.3，(小鼠包含基因1的SRY-框)(SEQ ID NO：5)；Klf2，NCBI登录号为NM_008452.2，(小鼠Kruppel-样因子2(肺))(SEQ ID NO：6)；Klf5，NCBI登录号为NM_009769.4，(小鼠Kruppel-样因子5)(SEQ ID NO：7)。C-Myc还可以被换为其突变体L-myc(登录号为NM_008506.2，小鼠v-myc髓细胞瘤病病毒爱基因同源物1v，肺癌来源的(禽类)((Mycl1)))(SEQ ID NO：8)；或者N-Myc(登录号为NM_008709.3，小鼠v-myc髓细胞瘤病病毒相关癌基因，神经母细胞瘤衍生的(禽类)(Mycn)(SEQ ID NO：10)。

在本发明的另一个方面中，本发明涉及脑膜细胞经诱导重编程产生的多能性干细胞的用途。特别是使用所述多能性干细胞来产生嵌合小鼠的用途。

在本发明的另外的方面中，本发明涉及脑膜细胞用于诱导重编程而产生多能性干细胞的用途。特别是通过将多能性干细胞因子的cDNA导入脑膜细胞后脑膜细胞被诱导重编程为多能性干细胞的用途。

在本发明的另一个方面中，本发明还涉及多能性干细胞因子cDNA通过被导入到脑膜细胞中来诱导脑膜细胞形成多能性干细胞的用途。

根据本发明所述，与现有技术公开的其它可以被诱导为iPS的细胞不同，脑膜细胞不仅可以诱导形成iPS，而且所产生的iPS产生嵌合小鼠的比例远大于现在已知的其它细胞；而且产生的这些嵌合小鼠存活状况良好，不会成瘤。这对于今后通过使用诱导的多能性细胞，而非直接从人体及动物体提取的胚胎干细胞，来利用组织再生医学治疗某些现有阶段难于治愈的疾病，尤其是与脑部相关的疾病，提供了更加有效且更加具有针对性的方案。

附图说明

图1.小鼠脑膜细胞(MENINGEAL)、小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)、皮肤成纤维细胞(MSF)、3株小鼠脑膜来源的iPS(iPS-C5、C8和C12)以及小鼠胚胎干细胞系CGR8进行的全基因表达谱比较。

图1.A iPS-C5、C8和C12分别与小鼠脑膜细胞的全基因表达谱比较。

图1.B iPS-C5、C8和C12分别与多能性干细胞CGR8的全基因表达谱比较。

图1.C小鼠脑膜细胞与MEF的全基因表达谱比较。

图1.D小鼠脑膜细胞与MSF的全基因表达谱比较。

图2.CGR8与iPS、脑膜细胞与MEF基因表达异同的示意图。

图3.利用逆转录病毒载体从新生小鼠的脑膜产生iPS细胞的示意图。第12天的克隆与小鼠ES细胞在形态学上没有可见的区别。

图4.从3株随机挑选的iPS克隆(iPS-C5、C6和C12)衍生的细胞所形成的ES样克隆，其碱性磷酸酶(AP)染色为阳性。其与多能性干细胞CGR8形成的克隆没有可见的区别。

图5.半定量RT-PCR证实这3株iPS克隆表达关键的胚胎干细胞(ES)标志物；使用CGR8小鼠ES细胞作为阳性对照，使用未感染的脑膜细胞和MEF作为阴性对照。

图6.使用SEQ NO ID：10作为探针，3株iPS细胞基因组中Southern印迹的结果，图中显示的条带数目表示基因组中整合的Klf4基因的拷贝数。使用ES细胞系作为对照。

图7.共聚焦免疫荧光显微摄影显示在挑选的iPS细胞中Nanog、Rex1和SSEA1的均匀表达(homogeneous)。横线指示放大倍数。空白区域的方框内显示在低倍放大下的DAPI染色。

图8.使用酸式硫酸盐测序分析Oct4和Nanog启动子的甲基化状态。空白区域表示未甲基化，填充区域表示甲基化的CpG二核苷酸。

图9.iPS-C5和iPS-C6胚状体(EB)分化第4天的相差照片

图10.iPS-C5和iPS-C6胚状体(EB)分化第9天的半定量RT-PCR结果，使用分析3胚层的标志物。使用培养在添加LIF的ES培养基中的iPS细胞作为对照。

图11.显示了使用本发明方法获得的iPS构建的嵌合鼠，其中非嵌合小鼠为纯白色，用星号标记；嵌合小鼠由于注射的iPS细胞来源于黑色的ICR小鼠，呈现黑色与白色相间分布的体色。

具体实施方案

1.定义和技术

除非另外指明，本发明的实践将使用分子生物学、微生物学、细胞生物学、免疫学和重组DNA的传统技术，其属于本领域技术范围。参见例如，Sambrook，Fritsch和Maniatis，分子克隆实验指南，第3版(2002)；CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(F.M.Ausubel等人编著(1987))；丛书METHODS INENZYMOLOGY(Academic Press，Inc.)：PCR 2：A PRACTICAL APPROACH(M.J.MacPherson，B.D.Hames和G.R.Taylor编著，(1995))，Harlow和Lane编著，(1988)ANTIBODIES，A LABORATORY MANUAL and ANIMALCELL CULTURE(R.I.Freshney编著，(1987))；W.French Anderson等人，HANDBOOK OF STEM CELLS，卷2。

本文中使用的一些术语具有下列定义的含义。

在说明书和权利要求书中使用的，单数型“一个”，和“这个”包括复数参考，除非上下文另有清楚的表述。例如，术语“(一个)细胞”包括复数的细胞，包括其混合物。

所有的数字标识，例如pH、温度、时间、浓度和分子量，包括范围，都是近似值，其以0.1的增量变动(+)或(-)。要了解，虽然不总是明确的叙述所有的数字标识之前都加上术语“约”。也要了解，虽然不总是明确的叙述，本文中描述的试剂仅仅是示例，其等价物是本领域已知的。

本文所述的“诱导的多能性干细胞(iPS细胞)”是这样的细胞，其在ES细胞培养条件下，与ES细胞在细胞形态、生长特性、表面标志物表达、移植到皮下可形成包含3个胚层组织细胞结构的畸胎瘤等方面与小鼠ES细胞非常相似，而且在DNA甲基化方式、基因表达谱、染色质状态、形成嵌合体动物等方面也与小鼠ES细胞几乎完全相似。

本文所述的脑膜细胞是来自哺乳动物的脑膜细胞，其来自神经脊(neural crest)，并且可以被分化成几种细胞系，包括成骨细胞和神经元细胞，既可以是体内的又可以是体外的(Gagan JR，Tholpady SS，Ogle RC.Birth Defects Res C Embryo Today.2007；81：297-304.)。脑膜细胞由两层组成，软脑脊膜(内部l)和硬膜(外部)，其包含脑并保护其不受伤害。

所述的脑膜细胞可以来源于任何动物(包括人)，优选是哺乳动物，更优选是小鼠。各种动物来源的脑膜细胞可以从动物中容易地分离，例如从新生小鼠中分离；或者从人脑部手术后的脑部废弃物中分离得到；原代脑膜细胞还可以是商业可购得的，例如从美国Sciencell公司方便地购得(人脑膜细胞，货号1405，上海麦莎公司代理)。特别地，使用在中国典型培养物保藏中心(武汉市武昌珞珈山)于2008年8月21日提交保藏的小鼠原代脑膜细胞(保藏编号为CCTCC NO：C200838；分类命名：小鼠脑膜细胞GIBH001)。

本文所述的术语“诱导重编程”是指将体细胞去分化为多能性干细胞的过程。优选地，通过将维持干细胞多能性所需的多能性因子cDNA导入体细胞可以诱导体细胞去分化成为多能性干细胞(Takahashi K，Yamanaka S.Cell.2006；126：663-676；Wernig M，Meissner A，Foreman R，等人，Nature.2007；448：318-324；Yu J，Vodyanik MA，Smuga-Otto K等人Science.2007；318：1917-1920)。其中，优选地，所述的多能性因子包括Oct4、Sox2(任选地，Sox1)、C-myc(任选地L-Myc或N-Myc)，以及Klf4(任选地，Klf5或Klf2)。最优选地，所述多能性因子为Oct4、Sox2、C-myc以及Klf4。具体地，所述多能性因子为Sox2，NCBI登录号为NM_011443.3(小鼠包含基因2的SRY-框)(SEQ ID NO：1)；Oct4，NCBI登录号为NM_013633.2(小鼠POU结构域，5类，转录因子1(Pou5f1))(SEQ ID NO：2)；Klf4，NCBI登录号为NM_010637.2(小鼠Kruppel-样因子4(肠(gut)))(SEQ ID NO：3)；c-Myc，NCBI登录号为NM_010849.4(小鼠髓细胞瘤病癌基因(myelocytomatosis oncogene)(c-Myc))(SEQ ID NO：4)；Sox1，NCBI登录号为NM_009233.3，(小鼠包含基因1的SRY-框)(SEQ ID NO：5)；Klf2，NCBI登录号为NM_008452.2，(小鼠Kruppel-样因子2(肺))(SEQ ID NO：6)；Klf5，NCBI登录号为NM_009769.4，(小鼠Kruppel-样因子5)(SEQ ID NO：7)。C-Myc还可以被换为其突变体L-myc(登录号为NM_008506.2，小鼠v-myc髓细胞瘤病病毒爱基因同源物1v，肺癌来源的(禽类)((Mycl1)))(SEQ ID NO：8)；或者N-Myc(登录号为NM_008709.3，小鼠v-myc髓细胞瘤病病毒相关癌基因，神经母细胞瘤衍生的(禽类)(Mycn)(SEQ ID NO：10)。

将所述多能性因子cDNA导入体细胞的方法可以是本领域技术人员熟知的多种技术，包括病毒感染、脂质体转染、电穿孔、粒子轰击等各种将DNA转入细胞的方法。优选地，使用包含cDNA的病毒载体进行转染，所述病毒载体包括慢病毒载体、逆转录病毒载体等多种病毒载体。优选地逆转录病毒载体(例如pMX载体)，如实施例中所述的。

本文所述的“适宜被导入多能性干细胞因子cDNA的脑膜细胞的生长条件”是本领域的常规干细胞培养条件，并且包括一些适宜各个具体细胞系，但是不影响细胞基本性质的修饰，培养方法以及培养条件参见W.French Anderson等人，HANDBOOK OF STEM CELLS，卷2。

本文所述的“嵌合小鼠”是通过本领域普通技术人员熟知的“嵌合鼠”技术实施的。是指将胚胎干细胞或通过本文技术获得的iPS注射入小鼠囊胚中，使得其与所注射入小鼠的囊胚中的胚胎细胞混合，共同在代孕母鼠中的子宫内生长发育，小鼠出生后全身上下的各个组织即由两种胚胎细胞共同混合组成，如马赛克拼图样，这样的小鼠被称为嵌合鼠(Evans M J，等人；The ability of EK cell to form chimerasafter selection of clones in G418 and some observation on the intergration of retroviral vectorproviral DNA into EK cells[M]；Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology；1985年；Xian MW，Wu BY，Hu XL，Shang KG，Wu HL，1996.Construction of chimeric mice of ES cells bymicroinjection method.Hereditas(北京)18(1)：7-10(中文))。使用iPS能否形成嵌合鼠是检验iPS是否与胚胎干细胞具有类似性质的最直接和最关键的证据。

实施例

下列实施例举例了发明人的标准实验室实践，用于示例本发明的模式，而不应将本发明理解为限定于这些实施例的范围。这些实施例。根据本文公开和本领域技术人员的普遍水平，技术人员将理解下列仅用于示例，可以在不超过本发明的范围内进行各种变动、修饰和改造。其中所涉及的技术，除非特别说明，均是本领域技术人员熟知的分子生物学、细胞生物学、生物化学等各个领域的常规技术。

实施例1.

细胞的制备和培养

分离新生C57BJ/L6小鼠的脑膜，用0.25％胰蛋白酶-EDTA(

)于37℃消化8-10分钟，然后用过火(fire-polished)移液器轻柔解离。将样品静置5分钟，沉淀组织碎片，将得到的细胞悬液以3.5×10⁵个细胞/ml的密度接种在100-mm培养皿中，所述培养皿用聚-D-赖氨酸(100μg/ml)预包被处理。用高葡萄糖DMEM培养基(4.5g/L的葡萄糖，HyClone公司)培养所得到的细胞，培养基中包含10％胎牛血清(HyClone公司)、2mM丙酮酸钠(Gibco公司)、2mM L-谷氨酰胺(Gibco公司)、青霉素(100U/ml)和链霉素(100μg/ml)。

将胚胎干细胞(ES)和诱导的多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPS细胞)培养在用丝裂霉素(10μg/ml)处理的MEF(小鼠胚胎成纤维细胞)上，并且培养在高葡萄糖DMEM(HyClone公司)中，所述高葡萄糖DMEM包含15％FBS(Gibco)，白血病抑制因子(LIF)、青霉素/链霉素、L-谷氨酰胺、β-巯基乙醇和非必需氨基酸(Gibco公司)。在纯化RNA或DNA之前，去除滋养层细胞，在0.2％明胶上传2代。

对于胚体的形成，通过胰蛋白酶消化收获iPS细胞，铺在非粘附的细菌培养皿上，并且在没有LIF的培养基中培养。

实施例2.

DNA微阵列

使用RNAeasy min试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)根据制造商的说明从细胞分离总RNA。以3毫克总RNA为模板，使用T7-Oligo(dT)启动子(Affymetrix，Santa Clara，CA)和Superscript II聚合酶(Ivitrogen公司)合成cDNA。使用体外转录系统(使用RNA Transcript Labeling Kit(Affymetrix))合成附有生物素标记的cRNA(按Affymetrix RNA Transcript Labeling Kit说明书)。

将片段化的生物素-cRNA与小鼠GeneChip430.2(Affymetrix)杂交。使用GeneArray Scanner 7G(Affymetrix)扫描芯片，根据制造商说明，使用默认参数用Robust Multi-chip Average(RMA)方法处理数据(CEL文件形式)，从中减去背景(以默认的内参探针为基准)，并使用软件ArrayAssist 5.5.1(Stratagene Corp.and Strand Life Sciences Pvt Ltd.)进行归一化。

图1.A-C是使用上述方法对脑膜细胞(MENINGEAL)、小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)、皮肤成纤维细胞(MSF)、3株小鼠脑膜来源的iPS(iPS-C5、C8和C12)以及小鼠胚胎干细胞系CGR8进行的全基因表达谱比较。

图1中每一个点均代表一种基因，X轴代表X轴所示细胞(如，图1.C的X轴对应MEF)中归一化的基因表达水平，Y轴代表Y轴所示细胞(如，图1.A的Y轴对应脑膜细胞)中归一化的基因表达水平。所有点相对于过X/Y轴交点的对角线越集中，说明两种细胞的基因表达谱相似度越高，也就提示两种细胞越相似。基于系统默认参数，图中红色的点代表在两种细胞中均存在高表达的基因；蓝色的点代表只在其中一种细胞中具有可检测的表达的基因。黄色的点代表在两种细胞中均无可检测的表达的基因。平行的线指示一种细胞中的基因表达相对于另一种细胞中的基因表达2、3、5和10倍的改变(高或低)。

以图1.C为例，箭头所示的点分别对应Sox2、Oct4和Nanog基因，其中，脑膜细胞中Sox2的表达量比MEF中的高10倍以上，而Oct4和Nanog在两种细胞中均没有可检测的表达。

从图1.A和B可见，3株诱导性多潜能干细胞(iPS-C6、C8和C12)与多能性干细胞系CGR8之间具有极高的相似度，而与原脑膜细胞具有较大的差异；另一方面，从图1.C和D可见，脑膜细胞与MEF、MSF的基因表达谱也显著不同。

图2的示意图具体显示了CGR8与iPS、脑膜细胞与MEF的基因表达异同。

由此可见，虽然以前认为脑膜细胞中大部分为成纤维细胞，但是经我们的基因芯片研究可以看出，其基因表达谱与成纤维细胞存在很大差异，在此不解释为对机制的任何限定，这种差异有可能是导致脑膜细胞来源的iPS与以前使用的MEF来源的iPS在后续细胞性质中差异的原因之一。

实施例3.

病毒载体感染脑膜细胞

根据实施例1所述的方法，在p6孔培养板中按每孔约4×10⁴个细胞接种小鼠的脑膜细胞，在37℃、5％CO2的常规培养条件下培养过夜，用收集的病毒上清液感染培养的脑膜细胞。所述病毒上清液是通过用包含小鼠Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的cDNA的反转录病毒pMX载体(Addgene公司)按常规方法转染Plat-E细胞(Lipofectamine 2000，Invitrogen公司)获得的(参见Sambrook，Fritsch和Maniatis，分子克隆实验指南，第3版(2002))。与编码GFP的载体的对照孵育表明接近了100％的转染效率(数据未显示)。

实施例4.

感染细胞的继续培养和克隆筛选

在感染后第2天，将感染后的脑膜细胞的培养基，替换为实施例1中所述的ES细胞培养用培养基，在37℃、5％CO2的常规培养条件下培养6天，每天更换一次培养基，用0.25％胰蛋白酶-EDTA(

)于37℃消化为单细胞悬液，将消化后的细胞按每培养皿约20000个细胞的密度接种到100mm培养皿中，所述培养皿按实施例1中描述的方法，预先用滋养层细胞包被。接种后的细胞在37℃、5％CO2的常规培养条件下培养6天，显微镜检可见ES样克隆(如图3所示)。

移去100mm培养皿中的大部分培养基，使用移液器用10μL枪头吸取生长紧密，边缘光滑的单个克隆，用0.25％胰蛋白酶-EDTA(

)于37℃消化为单细胞悬液，将消化后的细胞接种到24孔板的单个孔中，每个孔接种一个ES样克隆，所述24孔板按实施例1中描述的方法，预先用滋养层细胞包被。接种后的细胞在37℃、5％CO2的常规培养条件下培养。

通过上述方法，在第6天，将10⁵个细胞转移到10cm用小鼠成纤维细胞滋养层细胞包被的培养皿中(图3)。10⁵个转导的脑膜的1000个集落与4因子一起孵育后12天，这与以前介绍的使用成纤维细胞的情况类似(Takahashi K，Yamanaka S.Cell.2006；126：663-676；Qin D，Li W，Zhang J，et al.Cell research.2007.)。这些具有典型的ES集落的致密形态，并且在第16天，证明了80％为AP染色阳性(数据未显示)。来自不同培养皿的12个集落被选出进行进一步表征。其中的10个能够在滋养层细胞上维持增殖。我们的方法的总体效率为大约0.8％，与以前报道的用4个因子(不选择)的成纤维细胞诱导(约0.5％-0.8％)类似(Qin D，Li W，Zhang J，等人Cell research.2007；Meissner A，Wernig M，Jaenisch R.Nat Biotech.2007；25(10)：1177-81)，略低于使用神经干细胞在相似的培养条件下进行的实验(3.6％，Kim JB，ZaehresH，Wu G，等人Nature.2008)。在这10个脑膜-iPS集落中，选择了3个，用AP染色这些集落也是阳性的(图4)。

实施例5

半定量RT-PCR鉴定iPS中干细胞标志物的表达

使用Trizol(Takara公司)试剂，按照制造商说明提取总RNA。用M-MLV(Takara公司)试剂盒进行逆转录，并使用rTaq试剂盒(Takara公司)对于实施例2中选出的3个集落进行PCR。用Takara公司的基因组DNA提取试剂盒，根据制造商的说明提取基因组DNA，并且用rTaq酶进行RT-PCR。所有上述PCR条件均使用常规PCR条件(参见分子克隆实验指南，第3版)，按照制造商说明进行。

其中各标志物基因使用引物列表如表1所示。

表1，RT-PCR所用引物

SEQ ID NO：	引物名称(前：因子名称)F：正向；R反向	引物序列
			SEQ ID NO：11	pMX-F	GACGGCATCGCAGCTTGGATACAC
SEQ ID NO：12	pMX-R	TTATCGTCGACCACTGTGCTG
			SEQ ID NO：13	c-Myc-S1093	CAGAGGAGGAACGAGCTGAAGCGC
SEQ ID NO：14	Sox2-S768	GGTTACCTCTTCCTCCCACTCCAG
			SEQ ID NO：15	Klf4-S1236	GCGAACTCACACAGGCGAGAAACC
SEQ ID NO：16	Oct3/4-AS210	TGCGGGCGGACATGGGGAATCC

如图5所示，使用本申请的方法获得的iPS表达与多能性干细胞CGR8均表达相同的多能性因子，而这些因子在原始脑膜细胞中均没有可检测到的表达。

实施例6

Southern印迹

使用上述方法从小鼠iPS细胞系和R1 ES细胞中提取基因组DNA，取10μg基因组DNA用限制性酶消化过夜，根据制造商说明，酶切体系按常规方法配制，所述酶为EcoRI，BglII和NocI。

取10uL消化制备的基因组DNA片段样品，进行0.8％琼脂糖凝胶电泳。在碱变性后，将电泳分离的基因组DNA过夜转移到带阳性电荷的尼龙膜(Amersham公司)上，用紫外线辐射交联(条件)。然后，将上述尼龙膜在42℃，在DIG Easy Hyb缓冲液(Roche公司)中，与地高辛配基(DIG)-标记的DNA探针孵育过夜。洗涤(室温PBS洗涤15次)后，将碱性磷酸酶-缀合的抗-DIG抗体(1∶10,000，Roche公司)添加到膜上。在与CDP-star(Roche公司)一起孵育后，将膜暴露于X-射线膜。

图6显示了使用SEQ NO ID：10作为探针，在3株iPS细胞的基因组中的Southern印迹的结果，图中显示的条带数目表示基因组中整合的Klf4基因的拷贝数。这证明了转基因有多个拷贝整合。

实施例7

鉴定iPS基因组中病毒基因的插入

A.免疫荧光

室温下，将细胞在4％的多聚甲醛中固定30分钟后，用PBS洗涤，并且在室温下用含有5％FBS和0.1％的Triton-X100的PBS封闭20分钟。再用含有兔抗鼠Rex1、Nanog和鼠SSEA1单抗一抗(1∶50，Chemicon公司)的PBS(含有1％FBS)孵育1小时后，用PBS洗涤细胞。再与具有荧光素标记的合适二抗(Santa公司)孵育后，用PBS洗涤3次并且用80％的甘油封片。使用共聚焦显微镜(LEICA TCS AP2 AOBS)用于视觉观察。

图7中显示了三株iPS细胞所产生的ES样克隆的免疫荧光的结果，可见，多能性因子Nanog、SSEA1和Rex-1在三株iPS细胞中均有均匀的高表达。

B.亚硫酸氢盐基因组测序

根据制造商的说明，使用CpGenome修饰试剂盒(Chemicon公司)进行亚硫酸氢盐处理。处理过程中使用的Oct4和Nanog启动子的PCR引物见下表2。将上述PCR产物克隆到pMD18-T(Takara公司)载体中，随机选择克隆用于对每个基因测序，所述测序用M13正向和M13反向引物。启动子被封闭，基因不表达，证明了iPS中标志物的存在。

表2：PCR所用引物

SEQ IDNO：	引物名称(前：因子名称)F：正向；R反向	引物序列
			SEQ IDNO：17	mOct4U	GGTTTTTAGAGGATGGGTTGAGTG
SEQ IDNO：18	mOct4L	CGGATCCCTAAAACCAAATATCCAACCATA
			SEQ IDNO：19	mNanogU	AATGTTTATGGTGGATTTTGTAGGT
SEQ IDNO：20	mNanogL	CCCACACTCATATCAATATAATAAC

图8中显示iPS克隆中内源性Oct4和Nanog启动子区域没有或只有极低程度的甲基化，而MEF和未接受注射的脑膜细胞中，上述基因组区域均呈现高度甲基化。也就是说，经过诱导重编程的iPS细胞中，内源性多能性干细胞因子的表达被激活了。

实施例8

iPS多能性的鉴定

A.EB分化和各胚层标志物的鉴定

为了证明脑膜iPS的多能型，将脑膜-iPS克隆培养在没有LIF的不粘着培养皿上以形成胚状体(图9)

将使用实施例3-4的方法制备，并经过实施例5-7的方法鉴定筛选出来的3株iPS细胞按常规方法用0.25％胰酶消化，转入无菌的细菌培养皿中，在不加LIF的常规ES培养基中悬浮培养。培养第4天，可见3株iPS细胞均形成了紧密、光滑的胚状体(EB)(参见图9)。

根据实施例5例举的方法，提取上述iPS-C5和iPS-C6及其形成的EB(第9天)的总RNA，并逆转录为cDNA进行多能性干细胞因子和各胚层分化标志物的RT-PCR鉴定，使用表3中列出的RT-PCR引物。

表3：RT-PCR鉴定标志物所用的引物

SEQ ID NO：	引物名称(前：因子名称)F：正向；R反向	引物序列
			SEQ ID NO：21	Gata-6-F	GCAATGCATGCGGTCTAC
SEQ ID NO：22	Gata-6-R	CTCTTGGTAGCACCAGCTCA
			SEQ ID NO：23	Fgf-5-F	AAAGTCAATGGCTCCCACGAA
SEQ ID NO：24	Fgf-5-R	CTTCAGTCTGTACTTCACTGG
			SEQ ID NO：25	T-F	ATGCCAAAGAAAGAAACGAC
SEQ ID NO：26	T-R	AGAGGCTGTAGAACATGATT
			SEQ ID NO：27	Is11-F	AGCAAGAACGACTTCGTGATG
SEQ ID NO：28	Is11-R	GACTGAGAGGGTCTCCAGCTC
			SEQ ID NO：29	Bmp-2-F	GTTTGTGTTTGGCTTGACGC
SEQ ID NO：30	Bmp-2-R	AGACGTCCTCAGCGAATTTG
			SEQ ID NO：31	GAPDH-F	CATCACCATCTTCCAGGAGC
SEQ ID NO：32	GAPDH-R	ATGCCAGTGAGCTTCCCGTC

图10中显示RT-PCR的结果，可见使用本发明方法获得的iPS细胞具有分化为各胚层细胞的潜力。

B.构建嵌合鼠

注射用囊胚取自四周龄超排ICR母小鼠(黑色)，与同品系公鼠合笼，见栓3.5d(当日见栓为0.5d)时从子宫和输卵管中收集胚胎，移入上覆石蜡油的M 16培养液滴内，于37℃5％CO2孵箱内培养。

注射前3h将嵌合用iPS细胞更换新鲜培养液，胰酶消化后制成单细胞悬液备用。将适量iPS细胞悬液和囊胚期胚胎移入M2注射液滴内，在显微注射系统下，用持卵针固定囊胚，用注射针吸取iPS细胞，从远离内细胞团的滋养层部位进针，每个囊胚注射细胞10-12个。注射后囊胚腔消失，置于培养液中于孵箱中培养1-3h，待囊胚腔恢复后，移入见栓2.5d的假孕母鼠子宫中进行培育。

图11显示了使用本发明方法获得的iPS构建的嵌合鼠，其中非嵌合小鼠为纯白色，嵌合小鼠由于注射的iPS细胞来源于黑色的ICR小鼠，故呈现黑色与白色相间分布的体色。

代孕母鼠产生的小鼠及其中嵌合鼠数统计如下表

表3.

其中，C57 iPS-C系列表示使用本发明的方法获得的三株iPS细胞系，ICR iPS-C系列表示使用传统方法从MEF获得的三株iPS细胞系，从嵌合鼠数/出生的小鼠数可以看出，使用本发明的脑膜-iPS产生嵌合鼠的比例远高于用现有技术所列的各种细胞产生的iPS。表明使用本发明的方法构建的iPS细胞系在产生嵌合鼠，也就是说在更彻底的诱导重编程方面具有突出的、预料不到的效果。

截止至本申请递交日，本发明所产生的嵌合小鼠无一只成瘤，已经成功存活了100多天，也表明使用脑膜-iPS得到的嵌合鼠的成瘤性远低于现有技术所产生的各种iPS。

序列表

<110>中国科学院广州生物医药与健康研究院

<120>用脑膜细胞生成诱导的多能性干细胞的方法及其用途

<160>32

<170>PatentIn版本3.3

<210>1

<211>2457

<212>DNA

<213>小鼠(Mus musculus)

<220>

<221>小鼠包含基因2的SRY-框(Sox2)

<222>(1)..(2457)

<400>1

ctattaactt gttcaaaaaa gtatcaggag ttgtcaaggc agagaagaga gtgtttgcaa   60

aaagggaaaa gtactttgct gcctctttaa gactagggct gggagaaaga agaggagaga  120

gaaagaaagg agagaagttt ggagcccgag gcttaagcct ttccaaaaac taatcacaac  180

aatcgcggcg gcccgaggag gagagcgcct gttttttcat cccaattgca cttcgcccgt  240

ctcgagctcc gcttcccccc aactattctc cgccagatct ccgcgcaggg ccgtgcacgc  300

cgaggccccc gcccgcggcc cctgcatccc ggcccccgag cgcggccccc acagtcccgg  360

ccgggccgag ggttggcggc cgccggcggg ccgcgcccgc ccagcgcccg catgtataac  420

atgatggaga cggagctgaa gccgccgggc ccgcagcaag cttcgggggg cggcggcgga  480

ggaggcaacg ccacggcggc ggcgaccggc ggcaaccaga agaacagccc ggaccgcgtc  540

aagaggccca tgaacgcctt catggtatgg tcccgggggc agcggcgtaa gatggcccag  600

gagaacccca agatgcacaa ctcggagatc agcaagcgcc tgggcgcgga gtggaaactt  660

ttgtccgaga ccgagaagcg gccgttcatc gacgaggcca agcggctgcg cgctctgcac  720

atgaaggagc acccggatta taaataccgg ccgcggcgga aaaccaagac gctcatgaag    780

aaggataagt acacgcttcc cggaggcttg ctggcccccg gcgggaacag catggcgagc    840

ggggttgggg tgggcgccgg cctgggtgcg ggcgtgaacc agcgcatgga cagctacgcg    900

cacatgaacg gctggagcaa cggcagctac agcatgatgc aggagcagct gggctacccg    960

cagcacccgg gcctcaacgc tcacggcgcg gcacagatgc aaccgatgca ccgctacgac    1020

gtcagcgccc tgcagtacaa ctccatgacc agctcgcaga cctacatgaa cggctcgccc    1080

acctacagca tgtcctactc gcagcagggc acccccggta tggcgctggg ctccatgggc    1140

tctgtggtca agtccgaggc cagctccagc ccccccgtgg ttacctcttc ctcccactcc    1200

agggcgccct gccaggccgg ggacctccgg gacatgatca gcatgtacct ccccggcgcc    1260

gaggtgccgg agcccgctgc gcccagtaga ctgcacatgg cccagcacta ccagagcggc    1320

ccggtgcccg gcacggccat taacggcaca ctgcccctgt cgcacatgtg agggctggac    1380

tgcgaactgg agaaggggag agattttcaa agagatacaa gggaattggg aggggtgcaa    1440

aaagaggaga gtaggaaaaa tctgataatg ctcaaaagga aaaaaaatct ccgcagcgaa    1500

acgacagctg cggaaaaaaa ccaccaatcc catccaaatt aacgcaaaaa ccgtgatgcc    1560

gactagaaaa cttttatgag agatcttggg acttcttttt gggggactat ttttgtacag    1620

agaaaacctg agggcggcgg ggagggcggg ggaatcggac catgtataga tctggaggaa    1680

aaaaactacg caaaactttt ttttaaagtt ctagtggtac gttaggcgct tcgcagggag    1740

ttcgcaaaag tctttaccag taatatttag agctagactc cgggcgatga aaaaaaagtt    1800

ttaatatttg caagcaactt ttgtacagta tttatcgaga taaacatggc aatcaaatgt    1860

ccattgttta taagctgaga atttgccaat atttttcgag gaaagggttc ttgctgggtt    1920

ttgattctgc agcttaaatt taggaccgtt acaaacaagg aaggagttta ttcggatttg    1980

aacattttag ttttaaaatt gtacaaaagg aaaacatgag agcaagtact ggcaagaccg    2040

ttttcgtggt cttgtttaag gcaaacgttc tagattgtac taaattttta acttactgtt    2100

aaaggcaaaa aaaaaatgtc catgcaggtt gatatcgttg gtaatttata atagcttttg  2160

ttcaatccta ccctttcatt ttgttcacat aaaaaatatg gaattactgt gtttgaaata  2220

ttttcttatg gtttgtaata tttctgtaaa ttgtgatatt ttaaggtttt tccccccttt  2280

tattttccgt agttgtattt taaaagattc ggctctgtta ttggaatcag gctgccgaga  2340

atccatgtat atatttgaac taataccatc cttataacag ctacattttc aacttaagtt  2400

tttactccat tatgcacagt ttgagataaa taaatttttg aaatatggac actgaaa     2457

<210>2

<211>1346

<212>DNA

<213>小鼠

<220>

<221>小鼠POU结构域，5类，转录因子1(Pou5f1)(Oct4)

<222>(1)..(1346)

<400>2

aaccgtccct aggtgagccg tctttccacc aggcccccgg ctcggggtgc ccaccttccc   60

catggctgga cacctggctt cagacttcgc cttctcaccc ccaccaggtg ggggtgatgg  120

gtcagcaggg ctggagccgg gctgggtgga tcctcgaacc tggctaagct tccaagggcc  180

tccaggtggg cctggaatcg gaccaggctc agaggtattg gggatctccc catgtccgcc  240

cgcatacgag ttctgcggag ggatggcata ctgtggacct caggttggac tgggcctagt  300

cccccaagtt ggcgtggaga ctttgcagcc tgagggccag gcaggagcac gagtggaaag  360

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ggggctcacc ctgggcgttc tctttggaaa ggtgttcagc cagaccacca tctgtcgctt  600

cgaggccttg cagctcagcc ttaagaacat gtgtaagctg cggcccctgc tggagaagtg   660

ggtggaggaa gccgacaaca atgagaacct tcaggagata tgcaaatcgg agaccctggt   720

gcaggcccgg aagagaaagc gaactagcat tgagaaccgt gtgaggtgga gtctggagac   780

catgtttctg aagtgcccga agccctccct acagcagatc actcacatcg ccaatcagct   840

tgggctagag aaggatgtgg ttcgagtatg gttctgtaac cggcgccaga agggcaaaag   900

atcaagtatt gagtattccc aacgagaaga gtatgaggct acagggacac ctttcccagg   960

gggggctgta tcctttcctc tgcccccagg tccccacttt ggcaccccag gctatggaag  1020

cccccacttc accacactct actcagtccc ttttcctgag ggcgaggcct ttccctctgt  1080

tcccgtcact gctctgggct ctcccatgca ttcaaactga ggcaccagcc ctccctgggg  1140

atgctgtgag ccaaggcaag ggaggtagac aagagaacct ggagctttgg ggttaaattc  1200

ttttactgag gagggattaa aagcacaaca ggggtggggg gtgggatggg gaaagaagct  1260

cagtgatgct gttgatcagg agcctggcct gtctgtcact catcattttg ttcttaaata  1320

aagactggga cacacagtag atagct                                       1346

<210>3

<211>2905

<212>DNA

<213>小鼠

<220>

<221>小鼠Kruppel-样因子4(肠(gut))(Klf4)

<222>(1)..(2905)

<400>3

gccaagagag cgagcgcggc tccgggcgcg cggggagcag aggcggtggc gggcggcggg   60

ggcacccgga gccgccgagt gcccctcccc gcccctccag ccccccaccc aggaacccgc  120

ccgtgacccg cgcccatggc cgcgcgcacc cggtacagtc cccaggactc cgcaccccgc  180

gccaccgtcc agctcgcagt tccgcgccac cgcggccatt ctcacctggc ggcgccgccc  240

gccaccgccc ggaccacagc ccccgcgccg ccgacagcca cagtggccgc gacaacggtg     300

ggggacactg ctgagtccaa gagcgtgcag cctggccatc ggacctactt atctgccttg     360

ctgattgtct atttttataa gagtttacaa cttttctaag aatttttgta tacaaaggaa     420

ctttttttaa agacatcgcc ggtttatatt gaatccaaag aagaaggatc tcgggcaatc     480

tgggggtttt ggtttgaggt tttgtttcta aagtttttaa tcttcgttga ctttggggct     540

caggtacccc tctctcttct tcggactccg gaggaccttc tgggccccca cattaatgag     600

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ctacagcggt ggcccgccgc gcatgtgccc caagattaag caagaggcgg tcccgtcctg    1440

cacggtcagc cggtccctag aggcccattt gagcgctgga ccccagctca gcaacggcca    1500

ccggcccaac acacacgact tccccctggg gcggcagctc cccaccagga ctacccctac    1560

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acaagtcccc tctctccatt atcaagagct catgccaccg ggttcctgcc tgccagagga    1740

gcccaagcca aagaggggaa gaaggtcgtg gccccggaaa agaacagcca cccacacttg    1800

tgactatgca ggctgtggca aaacctatac caagagttct catctcaagg cacacctgcg    1860

aactcacaca ggcgagaaac cttaccactg tgactgggac ggctgtgggt ggaaattcgc    1920

ccgctccgat gaactgacca ggcactaccg caaacacaca gggcaccggc cctttcagtg    1980

ccagaagtgt gacagggcct tttccaggtc ggaccacctt gccttacaca tgaagaggca    2040

cttttaaatc ccacgtagtg gatgtgaccc acactgccag gagagagagt tcagtatttt    2100

tttttctaac ctttcacact gtcttcccac gaggggagga gcccagctgg caagcgctac    2160

aatcatggtc aagttcccag caagtcagct tgtgaatgga taatcaggag aaaggaagag    2220

tccaagagac aaaacagaaa tactaaaaac aaacaaacaa aaaaacaaac aaaaaaacca    2280

agaaaaaaaa atcacagaac agatggggtc tgatactgga tggatcttct atcattccaa    2340

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ttgaattgtg tttcgatgat gcaatacaca cgtaaagatc accttgtatg ctctttgcct    2520

tcttaaaaaa aaaaagccat tattgtgtcg gaggaagagg aagcgattca ggtacagaac    2580

atgttctaac agcctaaatg atggtgcttg gtgagttgtg gtcctaaagg taccaaacgg    2640

gggagccaaa gttctccaac tgctgcatac ttttgacaag gaaaatctag ttttgtcttc    2700

cgatctacat tgatgaccta agccaggtaa ataagcctgg tttatttctg taacattttt    2760

atgcagacag tctgttatgc actgtggttt cagatgtgca ataatttgta caatggttta    2820

ttcccaagta tgcctttaag cagaacaaat gtgtttttct atatagttcc ttgccttaat    2880

aaatatgtaa tataaattta accca                                          2905

<210>4

<211>2399

<212>DNA

<213>小鼠

<220>

<221>小鼠髓细胞瘤病癌基因(myelocytomatosis oncogene)  (c-Myc)

<222>(1)..(2399)

<400>4

cccgcccacc cgccctttat attccggggg tctgcgcggc cgaggacccc tgggctgcgc   60

tgctctcagc tgccgggtcc gactcgcctc actcagctcc cctcctgcct cctgaagggc  120

agggcttcgc cgacgcttgg cgggaaaaag aagggagggg agggatcctg agtcgcagta  180

taaaagaagc ttttcgggcg tttttttctg actcgctgta gtaattccag cgagagacag  240

agggagtgag cggacggttg gaagagccgt gtgtgcagag ccgcgctccg gggcgaccta  300

agaaggcagc tctggagtga gaggggcttt gcctccgagc ctgccgccca ctctccccaa  360

ccctgcgact gacccaacat cagcggccgc aaccctcgcc gccgctggga aactttgccc  420

attgcagcgg gcagacactt ctcactggaa cttacaatct gcgagccagg acaggactcc  480

ccaggctccg gggagggaat ttttgtctat ttggggacag tgttctctgc ctctgcccgc  540

gatcagctct cctgaaaaga gctcctcgag ctgtttgaag gctggatttc ctttgggcgt  600

tggaaacccc gcagacagcc acgacgatgc ccctcaacgt gaacttcacc aacaggaact  660

atgacctcga ctacgactcc gtacagccct atttcatctg cgacgaggaa gagaatttct  720

atcaccagca acagcagagc gagctgcagc cgcccgcgcc cagtgaggat atctggaaga  780

aattcgagct gcttcccacc ccgcccctgt ccccgagccg ccgctccggg ctctgctctc  840

catcctatgt tgcggtcgct acgtccttct ccccaaggga agacgatgac ggcggcggtg  900

gcaacttctc caccgccgat cagctggaga tgatgaccga gttacttgga ggagacatgg  960

tgaaccagag cttcatctgc gatcctgacg acgagacctt catcaagaac atcatcatcc    1020

aggactgtat gtggagcggt ttctcagccg ctgccaagct ggtctcggag aagctggcct    1080

cctaccaggc tgcgcgcaaa gacagcacca gcctgagccc cgcccgcggg cacagcgtct    1140

gctccacctc cagcctgtac ctgcaggacc tcaccgccgc cgcgtccgag tgcattgacc    1200

cctcagtggt ctttccctac ccgctcaacg acagcagctc gcccaaatcc tgtacctcgt    1260

ccgattccac ggccttctct ccttcctcgg actcgctgct gtcctccgag tcctccccac    1320

gggccagccc tgagccccta gtgctgcatg aggagacacc gcccaccacc agcagcgact    1380

ctgaagaaga gcaagaagat gaggaagaaa ttgatgtggt gtctgtggag aagaggcaaa    1440

cccctgccaa gaggtcggag tcgggctcat ctccatcccg aggccacagc aaacctccgc    1500

acagcccact ggtcctcaag aggtgccacg tctccactca ccagcacaac tacgccgcac    1560

ccccctccac aaggaaggac tatccagctg ccaagagggc caagttggac agtggcaggg    1620

tcctgaagca gatcagcaac aaccgcaagt gctccagccc caggtcctca gacacggagg    1680

aaaacgacaa gaggcggaca cacaacgtct tggaacgtca gaggaggaac gagctgaagc    1740

gcagcttttt tgccctgcgt gaccagatcc ctgaattgga aaacaacgaa aaggccccca    1800

aggtagtgat cctcaaaaaa gccaccgcct acatcctgtc cattcaagca gacgagcaca    1860

agctcacctc tgaaaaggac ttattgagga aacgacgaga acagttgaaa cacaaactcg    1920

aacagcttcg aaactctggt gcataaactg acctaactcg aggaggagct ggaatctctc    1980

gtgagagtaa ggagaacggt tccttctgac agaactgatg cgctggaatt aaaatgcatg    2040

ctcaaagcct aacctcacaa ccttggctgg ggctttggga ctgtaagctt cagccataat    2100

tttaactgcc tcaaacttaa atagtataaa agaacttttt tttatgcttc ccatcttttt    2160

tctttttcct tttaacagat ttgtatttaa ttgttttttt aaaaaaatct taaaatctat    2220

ccaattttcc catgtaaata gggccttgaa atgtaaataa ctttaataaa acgtttataa    2280

cagttacaaa agattttaag acatgtacca taattttttt tatttaaaga cattttcatt    2340

tttaaagttg atttttttct attgttttta gaaaaaaata aaataattgg aaaaaatac  2399

<210>5

<211>4037

<212>DNA

<213>小鼠

<220>

<221>小鼠包含基因1的SRY-框(Sox1)

<222>(1)..(4037)

<400>5

gtcactcgcc agcgcgccat gcaaatcacc gccgccgccg gttcccattg gccgcggcgc   60

gctcatttaa tggcagcccg ggcccggcgt atggctgctg ggccccccgc gccaccggcc  120

ccgcgtgcgc ctccgctccg agcgcacggc ctcgggcagg cagcggacag cttgtcctgg  180

gcacagcggc acagctctct ggctctctgc tcgcgttggc actcccactg ctgtccctaa  240

ccccctccct ggctgcaccg cgatcgcccc ctccgaaccc ccctccgagt ccccctcagc  300

gcctggctcc ccccaggcac ctgggaccag cacatgccca gcgcacgcgg cgcaccgcct  360

tgctagaagt tgcggtccca gagttggaag ccgccaagga agccagcaca ggaacggaga  420

cttcgagccg acaagaggag gcagcgaacc ctgcgtcggg cccaggggca ccgcttcaga  480

cccagaaagt ggagcctcaa cttggccacg actgcacctg tttgcacagt tcagccctga  540

gtgaccggac ggcagcaatc aacctggcca tcggcctctt tggcaagtgg tttgtgcacc  600

gggagaaact ttccacctgc gagctggacc cgcgctaagt gcgtgtgctt ttgcctcttt  660

tttgttgttg ttgttgttgt ggcctccacc caaccccctt ctctccgcta ggcacccacc  720

gcacacacac cccccccccc agtctctctg ggctgatcct ctctccaccc acccaccccc  780

acccggccgt ctatgctcca ggccctctct ttgcggtacc ggtgaacccg ctagccgccc  840

agatgtacag catgatgatg gagaccgacc tgcactcgcc cggcggcgcc caggcgccca  900

cgaacctctc gggcccggcc ggggcgggcg ggggcggcgg tgggggcggg ggcggcggcg     960

gcggcggggg caccaaggcc aaccaggatc gggtcaagcg gcccatgaac gccttcatgg    1020

tgtggtcccg cggacagcgg cgcaagatgg cccaggaaaa ccccaagatg cacaactcgg    1080

agatcagcaa gcgcctcggg gccgagtgga aggtcatgtc cgaggccgag aagcggccgt    1140

tcatcgacga ggccaagaga ctgcgcgcgc tgcacatgaa ggaacacccg gattacaagt    1200

accggccgcg ccgcaagacc aagacgctgc tcaagaagga caagtactcg ctggccggcg    1260

ggctgctagc ggccggcgcg ggtggcggcg gcgcggccgt ggccatgggt gtgggcgtgg    1320

gcgtcggggc ggcggcggtg ggccagcgct tggagagccc aggcggcgcg gcgggaggag    1380

gctacgcgca tgtcaacggc tgggctaacg gcgcctaccc cggctcggtg gccgcggcgg    1440

ctgcggccgc ggccatgatg caggaggcac agctggccta cgggcagcac ccaggcgcgg    1500

gcggcgcgca cccgcacgca cacccggcgc acccgcaccc gcaccatccg cacgcgcatc    1560

ctcacaaccc gcagcccatg caccgctacg acatgggcgc gctgcagtac agccccatct    1620

ccaactctca gggctacatg agcgcgtcgc cttcgggcta cggcggcatc ccttacggcg    1680

ccgcggccgc cgccgccgcc gctgcgggcg gcgcgcacca gaactcggcg gtggcggcag    1740

cggcagccgc ggcagccgcg tcgtcggggg ccctgggcgc cctcggatct ctggtcaagt    1800

cggagccgag cggcagtccg ccggccccgg ctcactcacg ggcaccgtgt cccggggacc    1860

tgcgcgagat gatcagcatg tacctgcccg ccggcgaggg tggcgacccg gcggcggcag    1920

cggctgcggc ggcccaaagc cggctgcact cgctgccaca gcactaccag ggcgcgggcg    1980

cgggcgtcaa cggcacggtg cccctgacgc acatctagcg ccgcggggac gccggggaca    2040

ctgcggctta aggccggcgc cccggcgacg aagagcgagg cctgcgcccc agcctccaga    2100

gcccgacttt gtaccgaggt ccccgcgctc tcgataaaag gccgctctgg agagccgagc    2160

gccaggtgac atctgccccc atcaccttcc ccaggactcc gaggcgctga caccagactg    2220

gcctcttaga ctgaactttg gtgttttcat gagacctttt gtacagtatt tatcgtccgc    2280

agaggaggca cacagcgttt tctcggcttc ggaggacaaa agacaaaaac ccagcgaggc    2340

gatgccaact tttgtatgac tgccggctct gtaacttttt ccggggttta cttcccgcca    2400

gctcttctgc ctgaggccga gtgacggacc tcgagccctt ctcacttgtt ataaatctaa    2460

gtaaggcaga tccaaacatt tacaagtttt ttgtagttgt taccgctctt ttgggttggt    2520

tggttaattt ataccgcaat cccctctcag acggtggagt tatattctgg gttttgtaaa    2580

tctctgtatc cgagcatttc caattttttg ttttgttttg tattatttct tgtaaatgcg    2640

ttgtgacatt tttattttag gcgttgcgat acggggggaa gaggagtcgg atgttgtaca    2700

tagcctgcaa gtctttcatc taaaagcaaa aaacaaagag agataccccc aaaatgcatc    2760

aaatttgaat caatacattt aagagagaaa agcccgtttc cctgtgaaat cgaaacgtgc    2820

taattttata tgcatgtttt atgagttcaa aatacaatta gcaatctgtt ggaggagaaa    2880

ttatctgcag ggcccaagag taaggaaatc ccaccaagcg gagtgcagcg tttccgtgac    2940

tttattcggt ggggaaagag aaatcttaaa ctccatagat tattttgtag agttcaagtt    3000

gacacagaag ggaagtaatt acaaaatgct tcctaatggt ttagcgtttt aactgccatg    3060

gccctggctt attttttttt gcatttcttt cctgtggttc tgccttttgc atactgtagc    3120

agttttgagg cagctgggtc tcagaaggag gatgggttgt gctcagtggt gggacaaggc    3180

caaggatagg gacaacagcc accgccaaga cagcgtgcct ttgatttctc tgtaattgga    3240

attgtaagtg aaattatctt cctgtgcttc aaggaagcaa tcctgaccca gacctcacca    3300

ccacagagtc tctcacccag gtcttatccc atcccctccc gattcctctc tgggaaaatc    3360

caacataatt ctaccgattt tcttacacac acacacacac acacacacac acacactctc    3420

tcctgtgtga accgggatgc agattgccag ggaatgtaaa cacagaatgc tgtgtttatc    3480

attcctgacc agatcttgag gttgtttgat gctttaaata tttttaatta tattttttct    3540

aggtgtttat tggtatattg caggtccccc ccccctggaa tttaaagttc cctgtaaaac    3600

tttgtcttca agtaatctga cagcattaaa tattgcattt aaaagttata ctgtagcaaa  3660

tatgttttaa aattaatcat gacattagaa tgaaattcta tttttgaagg aaattttctt  3720

taagtccaga tggggaatga tactattttc agcatccttt cccctgattt tttcccaatt  3780

tcttttcttg gaatgaatat ggactagcca ttcaaaagtg gacttaatct agcaattcag  3840

taagaccaga gctcaaccta cattggagaa tatctttcag tataaatgct aatattacaa  3900

gtgacacgtg tgattttttt taaagtcatt taatgatttt gcttaaaccc ctcattcctt  3960

aaagtgattg caagagattc aagaatgacg cccactgctt tctgatgagg taataaaaga  4020

acacccctcc ctttttc                                                 4037

<210>6

<211>1816

<212>DNA

<213>小鼠

<220>

<221>小鼠Kruppel-样因子2(肺)(Klf2)

<222>(1)..(1816)

<400>6

acacacagtc cctgccatgg cgctcagcga gcctatcttg ccgtcctttg ccactttcgc     60

cagcccgtgc gagcgcggcc tccaggagcg ctggccgcga aatgaacccg aggcgggcgg    120

cacggatgag gacctaaaca acgtgttgga cttcatcctc tccatgggat tggacggtct    180

gggcgccgaa aatcctcccg agcccccgcc gcagcccccg ccgcctgcct tctactaccc    240

ggagccgggt gctccgccgc cctacagcat ccccgcggcc agcctgggaa cagagctgct    300

gcgccccgac ctggacccgc ctcaggggcc ggctctgcac ggccgcttcc tcctcgcgcc    360

tcccgggcgg ctagtgaagg ccgagccccc cgaggtggac ggcggcggct acggctgcgc    420

tccgggcctg gcccacggac cgcgcgggct gaagctcgag ggcgccccag gagcgacagg    480

tgcatgcatg cggggtcccg ccggccgccc cccgccgccc ccggacacgc cgccgctcag    540

ccccgacggc cccctgcgca tcccggcgtc cggtccccgc aacccgttcc cgccgccctt     600

cggtcccggc cccagcttcg gcggtcccgg ccccgcgttg cactacgggc ctcccgcgcc     660

tggcgccttc ggtcttttcg aggacgcggc ggcagcggcg gcggcgctgg gcttggctcc     720

acctgccacg cgcggtctcc tcacgccgcc ctcgtccccg ctggagctgc tggaggccaa     780

gcccaaacgc ggccgccgct cctggccccg caagcgcgcc gccacacata cttgcagcta     840

caccaactgc ggcaagacct acaccaagag ctcgcaccta aaggcgcatc tgcgtacaca     900

cacaggtgag aagccttatc attgcaactg ggaaggatgc ggctggaagt tcgcgcgctc     960

tgacgagctt acccgccact accgaaagca cacaggtcac agaccctttc agtgccactt    1020

gtgcgaccgg gccttctcca ggtccgacca cctggccttg cacatgaagc gacacatgta    1080

gcctgggtcg actcggctag cccatgcgcg actgtggcag gttccacgcg cggggcacgg    1140

tccccttgca aacagactgc tatttattgg accttaggac agagccggac aagtgtggcc    1200

acaggaaaat gactctgcca ccagttctgg cccccacagt gactgaaggc cccaggaaag    1260

aagacaggag tctgtgaaga atgttttcaa aatggtgcaa taattgactt atttccctcg    1320

ggtccccact agaggatcga ggctagatgc cttgtgagaa atgcctttga gtttactgtc    1380

cccaacgttt ttataatatt gtatataaga ctatgaccga ttgtatttct ataagggaga    1440

cgatggcatc tctgccgcct gcttcgtttt tatacgactt ttttttaatt aaagttttgg    1500

atctttggag gaatcacggt agtggtgtgg ctggggatag ggtaggtcct gaggggacag    1560

ggagcagtca gtgcctgtgg ccaaggtcac cagctgcagc ccccagctgc caaggcctgt    1620

gggttcgcta taaatgtaaa catggtgttt taggattgag cacaggttat ttttaagtct    1680

gctactttga gccataattt gccccacccc caccccctgt atcccaagtg ggaaaagcct    1740

tggctccact gatgtggctg accattcctt tttttagaaa gaaaaataga aaagaaaatt    1800

aaaaaccttt tcctgg                                                    1816

<210>7

<211>1728

<212>DNA

<213>小鼠

<220>

<221>小鼠Kruppel-样因子5(Klf5)

<222>(1)..(1728)

<400>7

cgcggggcag gtacgcgctc tcttaggttg ctggtggagc ttgggggtgg cgggagcggg   60

ttccggcgag agggtgagcg agcgctgggg cggggcggga gaaagtggct gcccgaggac  120

ctcggcggtg acgcgtggcc gagcccagga gccccgatct ccgtgcccgc cttcgtgagc  180

gtctggctgc cggcccaggg gtcccccgcc gcggcccccc gccgagtccg ccgtcccgtg  240

ccagcccgag cgaggtggga tcgcgatcgc tccgtgtccc gctcccgtaa tccccagacc  300

gtccatgccc acgcgggtgc tgaccatgag cgcccgcctg ggaccactgc cccagccgcc  360

ggccgcgcag gacgagcccg tgttcgcgca gctcaagccg gtgctgggcg ctgcgaaccc  420

ggcccgcgac gcggcgctct tctccggaga cgatctgaaa cacgcgcacc accacccgcc  480

tgcgccgccg ccagccgctg gcccgcgact gccctcggag gagctggtcc agacaagatg  540

tgaaatggag aagtatctga cccctcagct ccctccagtt ccgataattt cagagcataa  600

aaagtataga cgagacagtg cctcagtggt agaccagttc ttcactgaca ctgaaggcat  660

accttacagc atcaacatga acgtcttcct ccctgacatc actcacctga gaactggcct  720

ctacaaatcc cagagaccat gcgtaacaca gatcaagaca gaacctgtta ccattttcag  780

ccaccagagc gagtcgacgg cccctcctcc tcctccggcc cccacccagg ctctccccga  840

gttcactagt atcttcagct cccaccagac cacagcgcca ccacaggagg tgaacaatat  900

cttcatcaaa caagaacttc ctataccaga tcttcatctc tctgtccctt cccagcaggg  960

ccacctgtac cagctgttga atacaccgga tctagacatg cccagttcga caaaccagac  1020

ggcagtaatg gacaccctta atgtttctat ggcaggcctt aacccacacc cctctgctgt  1080

tccacagacg tcaatgaaac agttccaggg catgccccct tgcacgtaca ccatgccaag  1140

tcagtttctt ccacagcagg ccacctactt tcccccgtca ccaccaagct cagagcctgg  1200

aagtcccgat agacaagctg agatgctgca gaatctcacc ccacctccgt cctatgccgc  1260

tacaattgct tccaaactgg cgattcacaa cccaaattta cctgccactc tgccagttaa  1320

ttcgccaact ctcccacctg tcagatacaa cagaaggagt aacccggatc tggagaagcg  1380

acgtatccac ttctgcgatt ataatggttg cacaaaagtt tatacaaagt cgtctcactt  1440

aaaagctcac ctgaggactc atacgggcga gaagccctac aagtgcacct gggagggctg  1500

cgactggagg tttgcccggt cggatgagct gacccgccac tacaggaagc acacgggcgc  1560

caagccgttc cagtgcatgg tgtgccaacg cagcttctcc cgctccgacc acctcgcgct  1620

gcacatgaag cgccaccaga actgagcgag cgagcgctgc gcccacccgc ctgacgcctt  1680

gcagtccgct ctgccatcct ttaaaccgca gacctaactt cataaaaa               1728

<210>8

<211>3518

<212>DNA

<213>禽类

<220>

<221>小鼠v-myc髓细胞瘤病病毒爱基因同源物1v，

     肺癌来源的(禽类)(L-Myc)

<222>(1)..(3518)

<400>8

cccgagccgg cggggagccg ctccgctcca ggtggcgggc ggcgggagcg aggtgaggct     60

gcgggtggcc cgggcagggg tccccagggg actggcgggc tgcaaggctg cagactgcct    120

tcgagacagc gcgcccccgc ccggccctgc tgtgcccccg gagctgagct ccgggcggtg    180

ctggcaaagt ttgctttgaa ctcgctcccc tcagcctggt cggcccgttg cgagctgccc    240

tgagcgagct gaccccaggc caggcttccc aggagcaggg accagggcgc gggctgcaag     300

ctggtgggcc tggggagaga ccagagcccc gcagccagct gcagcgaggg actcggagcc     360

gcctcttccc tcggcgggca ccgcagtcag ctcgtctccc ccttccctcc cgcagggagc     420

ggacatggac ttcgactcgt atcagcacta tttctacgac tatgactgcg gagaggattt     480

ctaccgctcc acggcgccca gcgaggacat ctggaagaaa ttcgagctgg tgccgtcgcc     540

ccccacgtcg ccgccctggg gctccggtcc cggcgccgtg gacccagcct ctgggattaa     600

tcccggggag ccgtggcctg gagggggtgc cggggacgag gcggaatctc ggggccattc     660

gaaagcctgg ggcaggaatt atgcttccat cattcgccgt gactgcatgt ggagcggctt     720

ctccgcccga gaacggctgg agagagtggt gagcgacagg ctggccccag gcgcgccccg     780

ggggaacccg cccaaagcgc ccgctacccc ggacggcact cctagtctgg aagccagtaa     840

cccggcgccc gccacccaat gtcagctggg cgagcccaag actcaggcct gctccgggtc     900

cgagagcccc agcgattctg aaggtgaaga gattgacgtg gtgaccgtgg agaagaggcg     960

atctctggac atccgaaagc cagtcaccat cacggtgcga gcagaccccc tggacccctg    1020

catgaagcac ttccatatct ctatccacca acagcagcat aactatgctg cccgttttcc    1080

tccagaaagt tgctctcaag agggggatcc tgagccaggt ccccaggaag aggctccgga    1140

gatagaagct cccaaggaga aagaggagga ggaagaggaa gaggaggaag aagagattgt    1200

gagcccccca cctgtcggaa gtgaggctcc ccagtcctgc caccccaaac ctgtcagttc    1260

tgacactgag gacgtgacca agaggaagaa ccataacttc ttggaacgaa aaaggaggaa    1320

tgacctccgc tcccggttcc tagccctgcg ggaccaggtt cccaccctgg ccagctgctc    1380

taaggccccc aaagtcgtga tcctcagcaa ggcgttagaa tacttgcagg ctttggtggg    1440

ggctgaaaag aaaatggcta cagagaaaag gcagctccgg tgtcggcaac agcaactgca    1500

aaagagaatc gcgtacctca gtggctacta accgaccaga acgcctgact tcttggtctc    1560

acagacacaa gcttattgtt taacctctct ctccctttta gtaatttgca cattttggtt    1620

acagcggggg gggcagtctg gacagtagat cccagaatgc attgcagccg gtgtgcgcac    1680

acaataaggg cttgcattct tggtaacctc gaaacccaat tctccctctt ccccgaccga    1740

ctcatgggaa tgctgtcctt ctctggcgcc tttggcttct cagcaggcag ctactgagga    1800

gatttggggt ctgcttagct cactagctcc tgacgaaagg ctgacagatg ctatgcaaca    1860

ggtggtggac gttgttgggg ctgcagccta cgtgaaatct cacactgtgc tggggcttca    1920

ggctaggaaa ggatgctgct ctcactgctg tctctgggga tgatctgagg acagctgggc    1980

ctggatactg tcccccaggc tccgttttcc aggaggcaag cgagctgtcc cgggcgaaga    2040

caagctcgca gacttgatca gcatggagca ttacctcacc gtcagacact ttacagtagc    2100

tgtggagtgg aaacctttaa gatagatttg gatggtaggc cacacccttc cctgcacgct    2160

caatgctatg actttgagaa agggcttggc ctctatgtag agtctttgtc tcagagttct    2220

ctgggccttc tcagagaggg acctttctat cctcacaagg gacctttttg tttcttcctg    2280

cctttgttat gcaatggcca ccacagcacc ctttcacacc gaccagaaat atttccccag    2340

gacataggga aatgggtcac agcccaggac ctggggaagc cttggcatcc ccactcatga    2400

ccaacggtcc ttgcccaggt tttctgcagg gctatttgag gcccagcttg gaaccttttc    2460

tcgaggcaga tagttacaag gtgcctctga aggacaagcc ctatcgcttc ctctttccca    2520

cctgcctctc tgtcagatct tgactctgtc tacaatctgc tggaacagtg caaacctgtc    2580

cttctcgagc aactttgctg gctctgcagc caccatcctg attctctgcc ggcctgagtc    2640

acatcctttc ccctggaatc tgggccttac agagagattc agaggggcac cgcttgcatt    2700

cacctgatgc ccccagaagg taaacttact tcctggtggg ttgtcagtgt acctctagga    2760

acgctactca gccaacaagg agagtttgct ccagctgtgt tctgcaactc cctgtggaat    2820

caaagtacag ccctctatcc tgggaaagtc accaagctag cagccgtcac gtgagcatct    2880

ttcaggagat cctaagcttt gcctgaaaga agagccagcc tttccagaac tctacccagg    2940

aaagcagatc tgttcctgct ggccctgggc ttggaagtag gggtacagtg tgggggacag  3000

acagtaagta acaacatgtg gctctcaaaa accagctacc acttccaaat tggctcccaa  3060

ctgtgatggc ctccaattac ttcctggcct caagtcctag aggaagcttc ggaagttgct  3120

gttgtacctg ttggggcagg acttctaggc accaagggac tcctggaact atcttgggag  3180

gacaagtggt gaacaggcta aagtctcatc tgaatggctt gtgttttata agctgctgcg  3240

gggttgtatg ctgtgggcgt cttttgtttt tgtttttgct ttttttttta atactgtatt  3300

tttgtatgct tttttgcaaa gtggtgttaa ctgtttttgt ataagaaaaa caaaaaacaa  3360

aaaccctcct gttgcaaggg tctggtttat tttgaaaggt gcatttacct gaaattttgt  3420

atttagttgt aatcattaat tgcttgattt taaactgttg ccttctggga catcttctaa  3480

taaaaagatt tctcaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa                          3518

<210>9

<211>2596

<212>DNA

<213>禽类

<220>

<221>小鼠v-myc髓细胞瘤病病毒相关癌基因，神经母细胞瘤衍生的(禽类)(N-Myc)

<222>(1)..(2596)

<400>9

agtgacagtc atctgtctgg acgcgctggg tggatgcggg gggctcctgg gaactgggtt   60

ggagccgaac gagcgctagc caggcgtaag cgcgcacaca ctgcagccgc cggaggacaa  120

ccccctcccg ccgccgctcc ctcagcccac ccggagaccc cagccccgag tcgcctccgg  180

atccccggca gtctgcggga gagttggagg ttggcgcgac tctgctgctc tccacgggaa  240

ggaagcactc ccccatatta aaaagagcgg agatattaaa agagaggcga acccatgccc  300

agctgcaccg cgtccaccat gccggggatg atctgcaaga acccagacct cgagtttgac  360

tcactgcagc cctgcttcta cccggacgaa gatgacttct acttcggcgg tcccgactcg     420

accccaccgg gggaggacat ctggaagaag tttgagctgc tgcccacgcc cccgttgtcg     480

cccagccgcg ccttcccaga gcacagcccg gagccttcga attgggctac ggagatgctg     540

ctgccggagg ccgacctgtg gggcaacccg gccgaggagg atgcgttcgg tctcgggggc     600

ctgggtggcc tcactcctaa tccggtcatc cttcaggact gcatgtggag cggcttctct     660

gcccgcgaga agctagagcg cgcagtgaac gaaaaactac agcacggcca cgggcccccg     720

ggcgtcagct cagcctgctc ggctcccgga gtgggtgcca gcagccccgg gggccgtgcc     780

cttggtgggt cgtcgagtgc tagccacacc ggggccaccc tgcctaccga cctctcccac     840

ccggctgccg aatgtgtgga ccccgccgtg gtcttcccct tcccggtgaa caagcgagag     900

tcggcgtcgg tgcccgctgc ccccactagc gccccggcga ccagcgctgc ggtcactagt     960

gtgtctgttc cagctactgc cccggtggct gctcctgctc gtgcaggcgg ccgtcctgcc    1020

agcagtgggg aggccaaggc cctcagcacc tccggagagg ataccttgag cgactcagat    1080

gatgaggatg acgaggagga agatgaagag gaggaaatcg atgtggtcac cgtagagaag    1140

agacgttcct cctctaacaa caaggcggta accactttca cgatcactgt gcgtcccaag    1200

acctccgctc tgggcctggg gcgagcacag cctggcgagc tgatcctcaa gcgctgtgtt    1260

cccatccatc agcagcacaa ctatgctgca ccctcaccct acgtggagag cgaggacgcg    1320

cccccgcaga aaaagatcaa gagcgaggct tctccacgcc ccctcaaaag tgttgttcca    1380

gcaaaagcga agagcctgag cccccgaaac tcagactcgg aggacagcga gcgccgccgc    1440

aaccacaaca tcctggagcg tcaacgccgg aacgacctgc gctccagctt cctgacgctc    1500

agggaccatg tgcctgagct ggtgaagaac gagaaggccg ccaaggtggt catcttgaaa    1560

aaggccaccg agtacgtgca cgccctacag gccaacgagc accagctcct gctggaaaag    1620

gagaaactgc aggcgaggca gcagcagttg ctaaagaaga tcgaacacgc tcggacttgc    1680

taaacgtttc ccacacggac agtcactgcc actttgcaca ttttgatttt tttttttttt    1740

taaacaaaca ttgtgttgac attaagaatg ttggtttact ttcaaattgg tcccctgtcg  1800

agtctggatc tgggtagggg gcaggacacg gggttctgcc atgaccttgg aaaaaaaact  1860

gacttatggg atgctgggtg gcttgttttc ctcctccata tcacctggtg acagccgtgg  1920

aagttcggga cactaaggag cttcaggagg ctgtgaagtc accttgttcc ggtccaagat  1980

tccaaacaga gtcattcctt ctttttacaa tggtgcttaa gttccagcaa atgccacaga  2040

agggggggtt gccatttgat gcccctggga acacttgtgt aaataccatt gatacacccg  2100

ccttttgtat acgtcctggg taatgagagg tggctcttgc ggccagtatt agactggaag  2160

ttcacaccta agtactgtaa gaatacctca atgtttgagg ggcatgtttt gtatacaaat  2220

atattgttaa tctgttatgt actgtactaa ttcctacacg gcctgtatac tttagtatga  2280

cgctgataca taactaaatt tgatacttat attttcgtat gaaaatgagt tgtggaagtt  2340

ttgagtagat attactttat cactttttga actaagaaac ttttgtaaag aaattttact  2400

atatatatat attccttttt ttcctagcct gtttcttcct tgtttactgt atttgttcat  2460

gtttggtgca tagaactggg taaaatggca aagttctgtg tttaatttct tcaaaatgta  2520

tatatttagt gctgcacctt agagcacttt gaaatacctc atgtttatga aaataaatag  2580

caattaaatg atgcaa                                                  2596

<210>10

<211>1425

<212>DNA

<213>人造

<220>

<223>探针序列

<220>

<221>Klf4探针序列

<222>(1)..(1425)

<400>10

atggctgtca gcgacgctct gctcccgtcc ttctccacgt tcgcgtccgg cccggcggga      60

agggagaaga cactgcgtcc agcaggtgcc ccgactaacc gttggcgtga ggaactctct     120

cacatgaagc gacttccccc acttcccggc cgcccctacg acctggcggc gacggtggcc     180

acagacctgg agagtggcgg agctggtgca gcttgcagca gtaacaaccc ggccctccta     240

gcccggaggg agaccgagga gttcaacgac ctcctggacc tagactttat cctttccaac     300

tcgctaaccc accaggaatc ggtggccgcc accgtgacca cctcggcgtc agcttcatcc     360

tcgtcttccc cggcgagcag cggccctgcc agcgcgccct ccacctgcag cttcagctat     420

ccgatccggg ccgggggtga cccgggcgtg gctgccagaa acacaggtgg agggctcctc     480

tacagccgag aatctgcgcc acctcccacg gcccccttca acctggggga catcaatgac     540

gtgagcccct cgggcggctt cgtggctgag ctcctgcggc cggagttgga cccagtatac     600

attccgccac agcagcctca gccgccaggt ggggggctga tgggcaagtt tgtgctgaag     660

gcgtctctga ccacccctgg cagcgagtac agcagccctt cggtcatcag tgttagcaaa     720

ggaagcccag acggcagcca ccccgtggta gtggcgccct acagcggtgg cccgccgcgc     780

atgtgcccca agattaagca agaggcggtc ccgtcctgca cggtcagccg gtccctagag     840

gcccatttga gcgctggacc ccagctcagc aacggccacc ggcccaacac acacgacttc     900

cccctggggc ggcagctccc caccaggact acccctacac tgagtcccga ggaactgctg     960

aacagcaggg actgtcaccc tggcctgcct cttcccccag gattccatcc ccatccgggg    1020

gccaactacc ctcctttcct gccagaccag atgcagtcac aagtcccctc tctccattat    1080

caagagctca tgccaccggg ttcctgcctg ccagaggagc ccaagccaaa gaggggaaga    1140

aggtcgtggc cccggaaaag aacagccacc cacacttgtg actatgcagg ctgtggcaaa    1200

acctatacca agagttctca tctcaaggca cacctgcgaa ctcacacagg cgagaaacct    1260

taccactgtg actgggacgg ctgtgggtgg aaattcgccc gctccgatga actgaccagg    1320

cactaccgca aacacacagg gcaccggccc tttcagtgcc agaagtgtga cagggccttt  1380

tccaggtcgg accaccttgc cttacacatg aagaggcact tttaa                  1425

<210>11

<211>24

<212>DNA

<213>人造

<220>

<223>引物

<400>11

gacggcatcg cagcttggat acac                                         24

<210>12

<211>21

<212>DNA

<213>人造

<220>

<223>引物

<400>12

ttatcgtcga ccactgtgct g                                            21

<210>13

<211>24

<212>DNA

<213>人造

<220>

<223>引物

<400>13

cagaggagga acgagctgaa gcgc                                         24

<210>14

<211>24

<212>DNA

<213>人造

<220>

<223>引物

<400>14

ggttacctct tcctcccact ccag    24

<210>15

<211>24

<212>DNA

<213>人造

<220>

<223>引物

<400>15

gcgaactcac acaggcgaga aacc    24

<210>16

<211>22

<212>DNA

<213>人造

<220>

<223>引物

<400>16

tgcgggcgga catggggaat cc      22

<210>17

<211>24

<212>DNA

<213>人造

<220>

<223>引物

<400>17

ggtttttaga ggatgggttg agtg    24

<210>18

<211>30

<212>DNA

<213>人造

<220>

<223>引物

<400>18

cggatcccta aaaccaaata tccaaccata    30

<210>19

<211>25

<212>DNA

<213>人造

<220>

<223>引物

<400>19

aatgtttatg gtggattttg taggt         25

<210>20

<211>25

<212>DNA

<213>人造

<220>

<223>引物

<400>20

cccacactca tatcaatata ataac         25

<210>21

<211>18

<212>DNA

<213>人造

<220>

<223>引物

<400>21

gcaatgcatg cggtctac                 18

<210>22

<211>20

<212>DNA

<213>人造

<220>

<223>引物

<400>22

ctcttggtag caccagctca      20

<210>23

<211>21

<212>DNA

<213>人造

<220>

<223>引物

<400>23

aaagtcaatg gctcccacga a    21

<210>24

<211>21

<212>DNA

<213>人造

<220>

<223>引物

<400>24

cttcagtctg tacttcactg g    21

<210>25

<211>20

<212>DNA

<213>人造

<220>

<223>引物

<400>25

atgccaaaga aagaaacgac      20

<210>26

<211>20

<212>DNA

<213>人造

<220>

<223>引物

<400>26

agaggctgta gaacatgatt      20

<210>27

<211>21

<212>DNA

<213>人造

<220>

<223>引物

<400>27

agcaagaacg acttcgtgat g    21

<210>28

<211>21

<212>DNA

<213>人造

<220>

<223>引物

<400>28

gactgagagg gtctccagct c    21

<210>29

<211>20

<212>DNA

<213>人造

<220>

<223>引物

<400>29

gtttgtgttt ggcttgacgc    20

<210>30

<211>20

<212>DNA

<213>人造

<220>

<223>引物

<400>30

agacgtcctc agcgaatttg    20

<210>31

<211>20

<212>DNA

<213>人造

<220>

<223>引物

<400>31

catcaccatc ttccaggagc    20

<210>32

<211>20

<212>DNA

<213>人造

<220>

<223>引物

<400>32

atgccagtga gcttcccgtc    20

Claims (28)

1.将脑膜细胞诱导重编程为诱导的多能性干细胞的方法，所述方法包括：

用包含多能性干细胞因子的cDNA导入脑膜细胞；

在适宜上述被导入的脑膜细胞生长的培养条件下培养该细胞。

2.如权利要求1的诱导重编程方法，所述方法还包括：

c)鉴定多能性干细胞克隆。

3.如权利要求1或2所述的诱导重编程方法，其中所述导入cDNA的方法为用包含所述cDNA的病毒载体感染脑膜细胞。

4.如权利要求1或2的诱导重编程方法，所述多能性干细胞因子包括Sox2、Oct4以及Klf4。

5.如权利要求4的诱导重编程方法，所述多能性干细胞因子还包括C-myc。

6.如权利要求4的诱导重编程方法，其中所述Sox2还可以是Sox1，Klf4还可以是Klf5或Klf2。

7.如权利要求5的诱导重编程方法，其中所述C-myc还可以是L-Myc或N-Myc。

8.如权利要求4-7中任一项所述的方法，其中所述Sox2为SEQ ID NO：1；Oct4为SEQ ID NO：2；Klf4为SEQ ID NO：3；c-Myc为SEQ ID NO：4；Sox1为SEQ ID NO：5；Klf2为SEQ ID NO：6；Klf5为SEQID NO：7；L-myc为SEQ ID NO：8；N-Myc为SEQ ID NO：10。

9.如权利要求1-8中任一项的诱导重编程方法，所述病毒载体为逆转录病毒载体。

10.如权利要求9的诱导重编程方法，所述逆转录病毒载体为pMX。

11.如权利要求1-10中任一项的诱导重编程方法，所述脑膜细胞来源于哺乳动物。

12.如权利要求11所述的诱导重编程方法，所述哺乳动物为小鼠。

13.如权利要求12所述的诱导重编程方法，所述脑膜细胞优选为保藏在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO：C200835的小鼠脑膜细胞。

14.通过权利要求12中方法产生的多能性干细胞用于产生嵌合小鼠的用途。

15.脑膜细胞用于经诱导重编程而产生多能性干细胞的用途。

16.如权利要求15中的脑膜细胞的用途，所述诱导脑膜细胞重编程的过程包括将包含多能性干细胞因子的cDNA导入脑膜细胞。

17.如权利要求16中的脑膜细胞的用途，其中所述多能性干细胞因子包括Sox2、Oct4以及Klf4。

18.如权利要求17中的脑膜细胞的用途，其中所述多能性干细胞因子还包括C-myc。

19.如权利要求17或18中的脑膜细胞的用途，其中所述Sox2还可以是Sox1，Klf4还可以是Klf5或Klf2。

20.如权利要求18中的脑膜细胞的用途，其中所述C-myc还可以是L-Myc或N-Myc。

21.如权利要求16-20中任一项的用途，其中所述导入为使用包含所述多能性因子cDNA的病毒载体感染脑膜细胞。

22.如权利要求15-21中任一项的脑膜细胞的用途，所述脑膜细胞来源于哺乳动物。

23.如权利要求22中脑膜细胞的用途，所述脑膜细胞来源于小鼠。

24.多能性干细胞因子用于诱导脑膜细胞重编程为多能性干细胞的用途。

25.如权利要求24所述的多能性干细胞因子的用途，其中所述诱导脑膜细胞重编程的过程包括将多能性干细胞因子的cDNA导入脑膜细胞。

26.如权利要求24所述的多能性干细胞因子的用途，其中所述导入为使用包含所述多能性因子cDNA的病毒载体感染脑膜细胞。

27.如权利要求24-26任一项所述的多能性干细胞因子的用途，所述多能性干细胞因子选自Sox2、Sox1、Oct4、C-myc、L-Myc、N-Myc、Klf5、klf2、Klf4和其组合。

28.如权利要求24-27中任一项所述的多能性干细胞因子的用途，其中所述脑膜细胞来源于小鼠。

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