JP2023133547A - 合成転写因子を用いる核リプログラミングのための方法 - Google Patents

Abstract

【課題】内在性細胞遺伝子の発現を調節することにより、哺乳動物体細胞をリプログラミングするための方法を提供すること。さらに、そのような方法により得られた細胞、ならびに幹細胞療法に適する疾患の処置のためのかかる細胞の使用のための治療方法、ならびにそのような使用のためのキットを提供すること。【解決手段】（ａ）哺乳動物体細胞を人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）へとリプログラムするのに十分な条件下で、かつそのための十分な時間をかけて、または（ｂ）該体細胞を哺乳動物体細胞集団（出発細胞）と実質的に異なる細胞型の標的細胞に分化させるのに十分な条件下で、かつそのための十分な時間をかけて、該哺乳動物体細胞集団（出発細胞）を合成転写因子と接触させる。【選択図】なし

Description

発明の分野
本発明は、人工多能性幹細胞(ｉＰＳＣ)を作製するための、哺乳動物体細胞の核リプログラミングの方法に関する。

発明の背景
細胞リプログラミングは核リプログラミングとも言われ、体細胞から幹細胞、例えばｉＰＳＣを産生するプロセスである。多数の正常および罹患細胞源からのｉＰＳＣの誘導は、幹細胞生物学に革命をもたらし、細胞療法および再生医療における最終的な使用のための幹細胞の産生を可能にした。

ｉＰＳＣは、多くの細胞型に分化することができ、胚性幹細胞（ＥＳＣ）を作製するために体外受精法からの廃棄胚を使用する必要性を排除し、関連する倫理的問題を最小限にすることができる。さらに、ＥＳＣは、同種異系細胞療法用途にしか使用できないが、ｉＰＳＣは、同種異系および自己細胞療法の両方に適用することができる。

山中および共同研究者らは、特定の転写因子の異所的発現が体細胞に分化多能性を誘導し得ることを明らかにした。これらの人工多能性幹細胞は自己再生し、多種多様な細胞型に分化することができる。それらは、ヒト疾患を成功裏にモデル化するために使用されており、創薬スクリーニングおよび細胞療法における使用に大きな可能性を有する。しかしながら、体細胞のｉＰＳＣへのリプログラミングの基本的メカニズムについてはまだ多くのことが理解されておらず、機構的な洞察が欠如しているとして、臨床応用の可能性について懸念がある。

体細胞を分化多能性に再プログラムするために使用されるリプログラミング因子（ＲＦ）としては、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ｃ－Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４、Ｌｉｎ２８、およびＮａｎｏｇが挙げられる。Ｏｃｔ３／４およびＳｏｘ２は、胚性幹（ＥＳ）細胞において分化多能性を維持する転写因子であり、一方、Ｋｌｆ４およびｃ－Ｍｙｃは、ｉＰＳＣ産生効率を高めると考えられる転写因子である。転写因子ｃ－Ｍｙｃは、Ｏｃｔ３／４およびＳｏｘ２がリプログラミングに必要な遺伝子にさらに効率的にアクセスできるようにするためにクロマチン構造を改変すると考えられており、一方、Ｋｌｆ４は、Ｏｃｔ３／４およびＳｏｘ２による特定の遺伝子の活性化を高める。Ｎａｎｏｇは、Ｏｃｔ３／４およびＳｏｘ２のように、ＥＳ細胞において分化多能性を維持する転写因子であり、一方、Ｌｉｎ２８は、分化中の特定のｍＲＮＡの翻訳または安定性に影響を及ぼすと考えられるｍＲＮＡ結合タンパク質である。バルプロ酸、クロマチン不安定化剤およびヒストンデアセチラーゼ阻害剤の同時投与と共に、Ｏｃｔ３／４およびＳｏｘ２のレトロウイルス発現が、線維芽細胞をｉＰＳＣへとリプログラムするのに十分であることも示されている。

ベクターのいくつかのクラスは、必要な遺伝子の組合せを過剰発現させると分化多能性を誘導することが示されている。最も初期のベクターは、ＤＮＡを組み込んだレトロウイルスおよび核リプログラミングのためのトランスポゾンに依拠していた。レトロウイルス媒介性リプログラミングは、かなり高いリプログラミング効率および高い成功率の利点を有するが、挿入変異誘発または発癌性リプログラミング因子の再発現のいずれかによって潜在的な腫瘍形成性について懸念を生じさせる。Ｃｒｅ－ＬｏｘＰ部位遺伝子送達またはＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンアプローチは、遺伝子送達後に宿主ゲノムから外来ＤＮＡを切り出すために使用されているが、残存する外来ＤＮＡの小さな挿入物を残すため、変異誘発の危険性は排除されない。

遺伝子改変の代替法として、ｍＲＮＡ、エピソームＤＮＡプラスミド、および細胞透過性タンパク質（ＣＰＰ）は、リプログラミングにおいて有効であることが示されている。ｍＲＮＡリプログラミングは、高いリプログラミング効率を有するが、この方法のロバスト性（再現性）は低い。

ＤＮＡベースのエピソーマルベクターでのリプログラミングは、ベクター組み込みの問題を軽減するために開発された。この方法では、体細胞を、リプログラミング因子をコードするエピソーマルベクターまたはエピソーマルベクターのセットでトランスフェクトする。しかしながら、このリプログラミング方法は、体細胞型に依存して変わりやすいｉＰＳＣコロニーの出現のためのリプログラミング効率および動態学（kinetics）をもたらす。

リプログラミング効率は、細胞リプログラミングプロセスが、無血清、エキソビボ（animal－free）、定義された細胞培養条件で実施されるとき、さらに低減する。臨床用途に最適化された条件（例えば、化学的に定義された動物成分を含まない細胞培養プロセスを利用する条件）において、十分な効率でおよび適時にｉＰＳＣを産生する能力が、ｉＰＳＣを治療用途に適用可能にするために必須である。

ほとんどのリプログラミング方法は、外来遺伝子の異所性発現に依存する。この異所性発現には、体細胞の内因性転写機構に主に影響を及ぼす一連の事象が含まれる。一旦、ｉＰＳＣが産生されると、ｉＰＳＣは、自己再生および分化多能性を維持するために内在性遺伝子の発現に依存すべきであるため、外来遺伝子の発現はもはや必要ではない。外来性のリプログラミング因子の永続的発現は、細胞の分化能を制限し得る。

従って、細胞増殖および分化多能性に関連する遺伝子のコード配列を人為的かつ構成的に発現させることなく、体細胞における細胞リプログラミングを誘導するための代替法が必要とされている。

発明の概要
本発明は、内在性細胞遺伝子の発現を調節することにより哺乳動物体細胞を再プログラミングする方法を提供する。体細胞の細胞リプログラミングは、胚性幹細胞関連遺伝子（例えば、ｏｃｔ３／４）の転写を活性化すること、ならびに／または体細胞特異的遺伝子および／または細胞死関連遺伝子の転写を抑制することによって誘導することができる。内因性転写機構は、合成転写因子（アクティベーターおよびサプレッサー）を用いて調節され得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲ（群生性等間隔短回文反復配列；clustered regularly interspaced palindromic repeat)、ＴＡＬＥ（転写アクティベーター様エフェクター）またはジンクフィンガー技術を、臨床および商業的用途に適する条件下で、より早く、より効率的な核リプログラミングを可能にするために、内在性細胞遺伝子の発現を調節するために使用することができる。

一例において、体細胞の核リプログラミングは、ＣＲＩＳＰＲに基づく技術を用いて達成される。

ＣＲＩＳＰＲシステムは、選択された細菌種において最初に同定され、原核生物の適応免疫系の一部を形成している。ウイルスまたはプラスミドＤＮＡの侵入によりＤＮＡの短い領域が捕捉され、ゲノムに組み込まれて、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から反復配列によって間隔をもって構成される、いわゆるＣＲＩＳＰＲアレイが形成される。ＣＲＩＳＰＲアレイへのこのＤＮＡの獲得の後に、転写およびＲＮＡプロセシングが続く。ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡプロセシングは、細菌種によって異なる様式で進行する。タイプＩＩシステム（細菌ストレプトコッカス・ピオゲネスにて記載）において、転写されたＲＮＡは、個々のＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を形成するＲＮアーゼＩＩＩによって切断される前に、トランス活性化型ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と対を形成している。

ｃｒＲＮＡはさらに、Ｃａｓ９ヌクレアーゼによる結合後にプロセシングされて、成熟ｃｒＲＮＡを産生する。その後、ｃｒＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体は、捕捉領域（プロトスペーサーと呼ばれる）に対する相補的配列を含むＤＮＡに結合する。次いで、Ｃａｓ９タンパク質は、部位特異的にＤＮＡの両方の鎖を切断して、二本鎖切断（ＤＳＢ）を形成する。これはＤＮＡベースのメモリーを提供し、結果として、反復曝露および／または感染の際にウイルスまたはプラスミドＤＮＡの迅速な分解をもたらす。天然のＣＲＩＳＰＲシステムは、幅広く報告されている（例えば、Barrangou and Marraffini, Molecular Cell 2014, 54:234－244を参照のこと）。

多数のグループが、遺伝子編集におけるＣＲＩＳＰＲシステムの可能性のある適用を特定している（Jinek et al., Science 2012, 337:816－821； Le Cong et al., Science 2013, 339:819－823； Mali et al., Science 2013, 339:823－826）。これは、ｔｒａｃｒＲＮＡに融合されたＣＲＩＳＰＲアレイからの個々のユニットの周囲に設計されたキメラＲＮＡに加えて、Ｃａｓ９タンパク質を利用することを伴う。これは、小さなガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と呼ばれる単一のＲＮＡ種を作り出し、そこでは、プロトスペーサー領域における配列の改変がＣａｓ９タンパク質を部位特異的に標的とすることができる。キメラＲＮＡと標的部位との間の塩基対形成相互作用の性質、ならびに標的外作用を予測および評価するために関連性の高いミスマッチに対するその耐性を理解するために、かなりの研究がなされている（例えば、Fu et al., Nature Biotechnology 2014, 32(3):279－284、および補足資料を参照のこと）。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集システムは、広範囲の生物および細胞株において、野生型Ｃａｓ９タンパク質とのＤＳＢ形成を誘導するため、またはＣａｓ９ｎ／Ｃａｓ９ Ｄ１０Ａと呼ばれる変異タンパク質を用いて単一のＤＮＡ鎖にニックを生じさせるために、成功裏に使用されている（例えば、Mali et al., Science 2013, 339:823－826； Sander and Joung, Nature Biotechnology 2014, 32(4):347－355を参照のこと）。ＤＳＢの形成は、遺伝子機能を破壊し得る小さな挿入および欠失（ｉｎｄｅｌ）の生成をもたらすが、Ｃａｓ９ｎ／Ｃａｓ９ Ｄ１０Ａニッカーゼは、内因性相同組換え機構を刺激しながら、ｉｎｄｅｌ生成を回避する（非相同末端結合機構によって修復される）。後者の機構は、ＤＮＡ領域を高精度でゲノムに挿入するために使用され得る。

メガヌクレアーゼ、転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）および組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）などの他の確立された遺伝子編集技術に対して、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は多くの利点を有し、特に速さと使用しやすさが特記される（例えば、Gaj et al., Trends in Biotechnology 2013, 31(7):397－405を参照のこと)。標的化は、タンパク質－ＤＮＡ相互作用というよりＲＮＡ－ＤＮＡ塩基の対形成相互作用によって達成されるという事実は、該システムを実験的に単純化し、かつハイスループットアプリケーションに適用可能にする。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムのさらなる発展型は、Ｃａｓ９タンパク質のヌクレアーゼ活性を完全に破壊し、それをＤＮＡ標的化機構として単独で用いることである。欠損したＣａｓ９変異体（ｄＣａｓ９）を、例えば転写を活性化または抑制するために、種々のタンパク質の機能的ドメインに融合することができる(Sander and Joung 2014)。このシステムの使い易さが遺伝子編集を容易にするのと同じように、ＣＲＩＳＰＲ－転写因子（ＣＲＩＳＰＲ－ＴＦ）の迅速な産生も可能にする。合成転写因子は、遺伝子機能の研究および異種転写単位の構築を含む多数の用途を有する。

ＣＲＩＳＰＲ－ＴＦを産生する最初の試みは、目的の遺伝子のプロモーター中の転写開始部位（ＴＳＳ）に近接する領域を標的とすることに加えて、ｄＣａｓ９の遺伝的融合を単一トランス活性化または抑制ドメインに利用した(Mali et al., Nature Biotechnology 2013, 31(9): 833－8)。これは転写を調節することに成功したが、遺伝子発現の大きな倍率変化には、各標的遺伝子に対する複数のｇＲＮＡの使用を必要とした。調節効率は、複数の異なる機能ドメインにｄＣａｓ９のデュアルＮ－およびＣ－末端融合を用いて、かつそれら自体が調節タンパク質に結合する改変ｇＲＮＡを用いることにより、増加し得る。例えば、Konermann et al., Nature 2015, 517: 583－588 (および補足資料)を参照のこと。後者の場合、調節は、３つの別個の成分；改変ｇＲＮＡ、ＲＮＡ結合機能ドメインタンパク質（例えば、ＭＳ２－ＶＰ６４）および融合していないｄＣａｓ９タンパク質を用いて達成される。

多重遺伝子調節もまた、ＣＲＩＳＰＲシステムを用いて実証されている。これにより、複雑な制御ネットワークの構築および遺伝子経路機能の包括的な調査が可能になる。ＣＲＩＳＰＲに基づくアプローチをその他の方法と技術的に区別するのは、特にこの側面である。いくつかの例では、ｉＰＳ細胞は、各々が、転写モジュレーターを種々の遺伝子に対して標的化する特定のｇＲＮＡ（複数可）と組み合わせて転写モジュレーター（アクティベーターまたはサプレッサー）を含む合成転写因子を用いて、特定の幹細胞関連遺伝子の活性化および他の遺伝子の同時抑制によって産生される。

いくつかの例では、幹細胞関連遺伝子は、特定のｇＲＮＡ（複数可）と組み合わせてｄＣａｓ９－ＶＰ６４などの合成転写アクティベーターを用いて活性化されて、所望の遺伝子を標的化する。内因性の遺伝子転写は、特定のｇＲＮＡ（複数可）と組み合わせてｄＣａｓ９－ＫＲＡＢなどの合成転写サプレッサーを用いて抑制されて、所望の遺伝子を標的化する。代替的な転写モジュレーターもまた、ＣＲＩＳＰＲ（例えば、Konermann et al., Nature 2015, 517: 583－588 (および補足資料)； Chavez (2015)) または他の合成転写因子（例えば、ＴＡＬＥＳ／ＺＦ）に基づいて用いることができる。

いくつかの例において、合成転写因子エレメントは、転写モジュレーター（単一のｄＣａｓ９融合体またはｄＣａｓ９および別個のモジュレーター（例えば、ＭＳ２－ＶＰ６４）のいずれか）およびｇＲＮＡをコードする発現ベクター（例えば、プラスミドベクター)をトランスフェクションするか、または成熟転写モジュレーターポリペプチド／タンパク質（複数可）および核酸分子（複数可）（ｇＲＮＡ）を用いて細胞を形質転換することにより、細胞に導入される。

転写調節は体細胞において人工的に誘導されるが、転写された遺伝子は、５’および３’ＵＴＲのような天然の調節エレメントを有し得る。同様に、合成転写因子エレメントをコードする発現ベクター（エピソームまたは他のもの）は、細胞分裂で希釈され、ｉＰＳＣがエピソーマルベクターまたはセンダイウイルスにより送達されるリプログラミング因子の異所性発現によって産生されるベクター不含有ｉＰＳＣに至る同様のプロセスによって細胞から除去されるべきである。

内因性遺伝子転写の直接的調節は、以下の利点の１つ以上を提供することができる：（１）体細胞トランスフェクションからｉＰＳＣコロニー出現までの時間の短縮（例えば、関連する内在性遺伝子の発現をより正確におよび／または厳密に制御する能力を介してリプログラミングを誘導する）;（２）新たに産生されたｉＰＳＣが、自己複製および分化多能性を維持するために、それらの内因性の転写機構に依存することを確実にする；（３）外来性の遺伝子サイレンシングおよび／またはクリアランスを確認する必要がない；（４）例えばサイレンシングおよび転写後調節などの、コード配列の異所性発現の“副作用”の可能性を最小化する（すなわち、配列がその天然ゲノム配列の外にある）；および、（５）リプログラミング効率の体細胞型に依存する変動を減少させる。

例えば、一時的にトランスフェクトされたプラスミドからの任意の過剰発現リプログラミング因子ではなく、より制御された方法で最初の内在性遺伝子をオンにする／上方制御することにより、本明細書に記載の発現系は天然の細胞プロセスにより近似する。

方法１
ある側面において、本発明は、哺乳動物体細胞の核リプログラミング法を提供する。該方法には、（ａ）哺乳動物体細胞を人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）へとリプログラムするのに十分な条件下で、かつそのための十分な時間をかけて、または（ｂ）該体細胞を哺乳動物体細胞集団（出発細胞）と実質的に異なる細胞型の標的細胞に分化転換するのに十分な条件下で、かつそのための十分な時間をかけて、該哺乳動物体細胞集団（出発細胞）を合成転写因子と接触させることが含まれる。ある態様において、該方法は、リプログラムされた細胞を培養してｉＰＳＣのコロニーを形成することをさらに含む。

ある態様において、上記の方法は、インビトロ法である。他の例において、この方法は、インビボまたはエクスビボ法である。

ある態様において、転写調節のための各候補遺伝子の転写は、配列特異的ｇＲＮＡをＣＲＩＳＰＲに基づく合成転写因子と組み合わせることによって活性化または抑制され得る。ＣＲＩＳＰＲ調節は、所望の転写産物を達成するために、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）などの他の技術と組み合わせることができる。ある例において、ＥＳＣ関連遺伝子が活性化される。他の例において、アポトーシス誘導に関連する遺伝子が抑制される。さらに他の例では、上記の戦略が同時に使用され、すなわち、ＥＳＣ関連遺伝子が活性化されて、アポトーシス誘導に関連する遺伝子が抑制される。

上記方法のいくつかの態様において、合成転写因子は、（ａ）ＤＮＡ結合セグメントおよびポリペプチド結合セグメントを含む少なくとも１つのガイドＲＮＡ(ｇＲＮＡ)であって、ここで、該ＤＮＡ結合セグメントは、分化多能性因子遺伝子、例えば（ｉ）胚性幹細胞（ＥＳＣ）関連遺伝子、または（ｉｉ）アポトーシス誘導に関連する遺伝子のプロモーター領域に結合する；および、（ｂ）ガイドＲＮＡのポリペプチド結合セグメントに結合する、少なくとも１つの転写調節因子（例えば、ｄＣａｓ９－ＶＰ６４）、を含む。

他の態様において、合成転写因子は、ガイドＲＮＡを含まないが、標的遺伝子の調節ＤＮＡ配列に直接的に結合することができるＤＮＡ結合ドメイン、例えば（ｉ）胚性幹細胞（ＥＳＣ）関連遺伝子（例えば、ｏｃｔ３／４）のプロモーター領域、または（ｉｉ）アポトーシス誘導に関連する遺伝子（例えば、Ｐ５３）のプロモーター領域を組み込む。

いくつかの例において、上記の態様のいずれかによれば、活性化される内在性分化多能性因子遺伝子は、１つのリプログラミング因子遺伝子または少なくとも２つのリプログラミング因子遺伝子の組み合わせである。リプログラミング因子遺伝子の例としては、ＰＯＵ５Ｆ１(ｏｃｔ３／４)、ｓｏｘ２、ｋｌｆ４、ｃ－ｍｙｃ、ｌｉｎ２８、およびｎａｎｏｇが挙げられる。

上記の態様のいずれかによる他の例において、活性化される分化多能性因子遺伝子は、抗アポトーシス遺伝子、例えばｂｃｌ－２またはｂｃｌ－ｘである。いくつかの例において、活性化されるリプログラミング因子遺伝子は、ｏｃｔ３／４、ｓｏｘ－２、ｋｌｆ－４、ｃ－ｍｙｃ、ｌｉｎ２８およびｎａｎｏｇの少なくとも２つ、ならびに少なくとも１つの抗アポトーシス遺伝子（例えば、ｂｃｌ－２およびｂｃｌ－ｘ）である。

上記の態様のいずれかによるさらなる例において、細胞リプログラミングは、例えば、上記の遺伝子活性化のいずれか１つと組み合わせて、少なくとも１つの標的遺伝子の抑制を含む。いくつかの例において、抑制される分化多能性因子遺伝子は、Ｐ５３、ｐ２１、ｐ１９^Ａｒｆおよびｐ１６^{Ｉｎｋ４ａ}から選択される。

上記の態様のいずれかによる他の例において、抑制される分化多能性因子遺伝子は、細胞死および／または細胞周期停止を促進するシグナル伝達タンパク質をコードする遺伝子である。いくつかの例において、抑制される標的遺伝子は、ＲＯＣＫ、ＰＫＡ／ＰＫＧ／ＰＫＣファミリーキナーゼ、および抑制されるとｍＴＯＲ経路を阻害し得る他の遺伝子から選択される。

上記の態様のいずれかによる他の例では、抑制または活性化されている分化多能性因子遺伝子（複数可）は、合成転写因子（複数可）によって標的化されたとき、クロマチンが転写受容状態になるように、細胞のエピジェネティックな状態に影響を及ぼす。

本発明の方法において有用な別の分化多能性因子遺伝子は、ｇｌｉｓ１である。

いくつかの例では、少なくとも２つのリプログラミング因子遺伝子（例えば、ｏｃｔ３／４およびｓｏｘ２）の転写活性化を用いて再プログラミングを誘導する。他の例では、少なくとも３つのリプログラミング因子遺伝子（例えば、ｏｃｔ３／４、ｓｏｘ２およびｋｌｆ４）の活性化を用いて再プログラミングを誘導する。さらに他の例では、少なくとも４つのリプログラミング因子遺伝子（例えば、ｏｃｔ３／４、ｓｏｘ２、ｃ－ｍｙｃおよびｋｌｆ４）の活性化を用いて再プログラミングを誘導する。

方法１による他の例において、哺乳動物体細胞集団を、それぞれ異なる遺伝子を標的とする少なくとも２つの合成転写因子と接触させる。

方法２
他の側面では、本発明は、分化多能性因子の候補遺伝子を同定するためのインビトロスクリーニング法を提供する。

例えば、体細胞を、リプログラム因子遺伝子の少なくとも１つを欠くがｉＰＳＣ形成に必要なエピソーマルベクター混合物とともに、ＣＲＩＳＰＲに基づく転写アクティベーターおよび候補ｇＲＮＡのライブラリーを用いてトランスフェクトする。リプログラミング因子遺伝子の少なくとも１つを欠くエピソーム混合物のみで細胞をトランスフェクトすると、０％または非常に低いリプログラミング効率となるはずである。Ｃａｓ９ベースのアクティベーターおよびｇＲＮＡライブラリーの添加後の再プログラミングを達成することは、リプログラミングプロセスに関与する少なくとも１つの遺伝子が活性化され、その遺伝子の活性化が欠損したリプログラミング因子を補うことができることを示す。

例示的なスクリーニング方法は、（ａ）哺乳動物体細胞を人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）へとリプログラムするのに十分な時間および条件下で、哺乳動物体細胞集団を、（ｉ）ＤＮＡ結合セグメントおよびポリペプチド結合セグメントを含む少なくとも１つの候補ｇＲＮＡ；ならびに、（ｉｉ）候補ｇＲＮＡのポリペプチド結合セグメント（複数可）に結合する、合成転写モジュレーター（単一または複数のタンパク質からなる）と接触させて、それによって試験細胞の集団を形成させることを含む。一態様では、該方法は、（ｂ）該試験細胞を、例えばｉＰＳ細胞コロニーを形成するのに十分な時間および条件下で培養することをさらに含む。

方法２によるいくつかの態様において、再プログラミングの成功は、試験細胞集団の培養の際に１以上のｉＰＳＣコロニーの形成によって示される。他の態様において、少なくとも１つのｉＰＳＣコロニーの形成は、候補ｇＲＮＡ／転写アクティベーター複合体が、分化多能性因子遺伝子のプロモーター領域にハイブリダイズ（すなわち、結合）して、その後、その宿主細胞内で発現され、次いで、該宿主細胞の核リプログラミングに寄与することを示す。

方法２によるいくつかの態様では、体細胞集団を、種々の異なるＤＮＡ結合セグメントを表す候補ｇＲＮＡのライブラリーと接触させる。

方法１および２のいずれかの態様によるいくつかの例において、方法は、リプログラミング効率を測定することをさらに含む。

上記の態様のいずれかによるいくつかの例において、転写モジュレーターは、ＲＮＡ結合ドメインならびに転写活性化ドメイン（例えば、ＶＰ６４またはｐ６５）および転写抑制ドメイン（例えば、ＫＲＡＢ）から選択される機能的ドメインを含む。

いくつかの例では、ｄＣａｓ９ポリペプチドは、転写活性化ドメイン（例えば、ＶＰ６４またはｐ６５）に融合される。他の例において、ｄＣａｓ９ポリペプチドは、転写リプレッサードメイン（例えば、ＫＲＡＢ）に融合される。

上記の態様のいずれかによる他の例において、本方法は、哺乳動物体細胞集団を、合成転写因子成分をコードする少なくとも１つの発現ベクターと接触させることをさらに含む。従って、合成転写因子の成分（例えば、ｄＣａｓ９－ＶＰ６４およびｇＲＮＡ）を、好適な発現ベクター中にクローニングする。合成転写因子（複数可）をコードする少なくとも１つの発現ベクターで標的細胞をトランスフェクトすると、体細胞中で細胞リプログラミングが誘導され得る。

いくつかの例では、合成転写因子をコードする発現ベクターは、エピソーマルベクター（すなわち、プラスミドベクター）である。

一例において、合成転写因子の成分を単一の発現ベクターにクローニングする。例えば、哺乳動物体細胞集団を、少なくとも１つのガイドＲＮＡおよび少なくとも１つの転写モジュレーター（例えば、ｄＣａｓ９－ＶＰ６４）をコードする発現ベクターと接触させる。上記の態様のいずれかによる他の例において、本方法は、哺乳動物体細胞集団を、合成転写因子成分をコードする少なくとも２つの発現ベクターと接触させることをさらに含む。いくつかの例において、合成転写因子の成分を別々のベクターにクローニングする。例えば、哺乳動物体細胞集団を、少なくとも１つのガイドＲＮＡをコードする第１の発現ベクター、および少なくとも１つの転写モジュレーター（例えば、ｄＣａｓ９－ＶＰ６４）をコードする第２の発現ベクターと接触させる。

上記の態様のいずれかによるいくつかの例において、転写モジュレーターは、ポリペプチド／タンパク質（例えば、ｄＣａｓ９－ＶＰ６４ポリペプチド）として細胞に提供される。従って、この方法は、哺乳動物体細胞集団を、少なくとも１つの合成転写モジュレーターポリペプチドと接触させることを含む。体細胞へのポリペプチドの導入を誘発または促進するための方法は、当業者に知られている。

いくつかの態様において、転写モジュレーターポリペプチドは、ポリペプチド浸透ドメインを含む。ポリペプチド、ペプチド模倣体、および非ペプチド担体のような多数の浸透ドメインは、当技術分野で公知であり、本発明において使用され得る。例えば、透過性ポリペプチドは、ペネトラチンと呼ばれるショウジョウバエメラノガスター（Drosophila melanogaster）転写因子アンテナペディアの第３αヘリックスに由来し得る。

他の例では、ガイドＲＮＡは、単離された核酸分子として細胞に提供される。従って、本発明の方法は、哺乳動物体細胞集団を少なくとも１つの単離されたｇＲＮＡ（核酸）と接触させることを含み得る。

他の例では、上記の態様のいずれかによれば、合成転写因子がポリペプチド（例えば、ｄＣａｓ９－ＶＰ６４ポリペプチド）として体細胞に提供され、ガイドＲＮＡが核酸分子として細胞に提供される。従って、本発明の方法は、哺乳動物体細胞集団を少なくとも１つのｇＲＮＡ（核酸）、および少なくとも１つの転写モジュレーターポリペプチドと接触させることを含む。

いくつかの態様において、該体細胞集団を、少なくとも１つの外来性のリプログラミング因子とさらに接触させる。外来性のリプログラム因子は、外来性のリプログラミング因子をコードする発現ベクター（例えば、エピソーマルベクター）を用いて細胞に導入され得るか、またはポリペプチド、例えば組換えタンパク質として標的細胞に導入され得る。いくつかの態様において、リプログラミング因子は、細胞透過性タンパク質として提供される。さらなる態様において、外来性のリプログラミング因子は、リプログラミングタンパク質をコードする核酸として提供される。いくつかの例において、外来性のリプログラミング因子は、ｏｃｔ３／４、ｓｏｘ２、Ｋｌｆ－４、ｃ－Ｍｙｃ、ｌｉｎ２８、ｎａｎｏｇ、ＳＶ４０ ラージＴ－抗原、およびそれらの組合せから選択される。他の例において、外来性のリプログラミング因子は、ｓｏｘ２、Ｋｌｆ－４、ｃ－Ｍｙｃ、ＳＶ４０、ラージＴ抗原、およびそれらの組合せから選択される。他の例において、外来性リプログラミング因子は、ｓｏｘ２、ｌｉｎ２８、ｎａｎｏｇ、およびそれらの組合せから選択される。

他の態様において、体細胞のリプログラミングおよびｉＰＳ細胞の形成は、本明細書に記載の内在性遺伝子の活性化／抑制のみを用いて達成され、外来性のリプログラミング因子遺伝子を体細胞中に導入することを含まない。いくつかの例において、リプログラミング方法は、体細胞における少なくとも１つの遺伝子の発現を抑制することを含む。一般的には、この方法は、少なくとも２種、少なくとも３種、または少なくとも４種のリプログラミング因子遺伝子の発現を活性化することを含み、少なくとも１つの遺伝子、例えば細胞アポトーシスに関与する遺伝子（例えば、Ｐ５３、ｐ２１、またはＲＯＣＫ経路遺伝子）の発現を抑制することをさらに含む。

上記の態様のいずれかによるいくつかの例では、哺乳動物体細胞はヒト細胞である。上記の態様のいずれかによる他の例において、哺乳動物体細胞は、初代培養細胞（すなわち、哺乳動物対象から単離された細胞）である。初代培養細胞は、凍結保存する前に、限られた回数の継代（例えば、１継代または２継代）で培養することができる。さらに他の例において、哺乳動物体細胞は、血液細胞（例えば、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、臍帯血単核細胞）または線維芽細胞である。いくつかの例では、哺乳動物体細胞は、ヒト初代培養細胞である。他の例において、哺乳動物体細胞は、初代ヒトＰＢＭＣ、初代ヒト臍帯血単核細胞、または初代ヒト線維芽細胞である。他の例では、哺乳動物体細胞は、細胞株ではない。例えば、本明細書に記載の方法に従って再プログラムされる細胞は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞ではない。

本発明の他の側面は、本明細書に記載の方法のいずれかによって産生される誘導された人工多能性幹細胞の集団に関する。いくつかの態様において、人工多能性幹細胞はヒト細胞である。他の態様において、ｉＰＳＣは発現ベクターの成分を実質的に含まない。発現ベクター成分の欠如または存在は、何れかの技術的に認識された方法、例えばベクター特異的プライマー配列を利用するＰＣＲ法を用いて、決定され得る。

さらに他の側面では、本発明は、本発明のｉＰＳＣを薬学的に許容される担体と共に含む医薬組成物を提供する。

さらなる態様において、本発明は、患者において、疾患、例えば幹細胞療法に適した疾患を治療する方法を提供する。この方法は、治療的に有効量の本発明の医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む。

さらに他の側面において、本発明は、ヒト初代培養細胞集団、本発明の少なくとも１つの単離されたガイドＲＮＡ、および本発明の少なくとも１つの転写モジュレーターポリペプチド（例えば、ｄＣａｓ９－ＶＰ６４）を含む組成物を提供し、ここで、該転写モジュレーターは、ガイドＲＮＡに結合することができる。組成物は、外来性のリプログラミング因子をさらに含み得る。

さらなる側面において、本発明は、本明細書中に記載の方法を実施するためのキットを提供する。

図１。ｉＰＳＣにおけるｈＯＣＴ４レベルと比較した、ＣＲＩＳＰＲベクターによるＨＥＫ２９３Ｔ細胞における内在性ｈＯＣＴ４の上方制御。相対的なｍＲＮＡ発現レベルを、トランスフェクションの４８時間後にｑＲＴ－ＰＣＲによって測定した。ｄＣａｓ９－ＶＰＲベクターおよび／またはｇＲＮＡによるトランスフェクションをベースラインとして用いた。データは、平均±標準偏差（ｓｔｄｖ）（ｎ＝３の独立したトランスフェクション）を表す。 図２。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における一過性およびエピソーマルＣＲＩＳＰＲベクターによる内在性ｈＯＣＴ４の上方制御。Ａ．免疫蛍光分析によって示される一過性ｄＣａｓ９－ｅＧＦＰおよびエピソーマルｐＣＥ－ｄＣａｓ９－ｅＧＦＰベクターによるトランスフェクション効率。Ｂ．相対的なｍＲＮＡ発現レベルを、トランスフェクションの４８時間後にｑＲＴ－ＰＣＲによって測定した。トランスフェクトされていないＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＯＣＴ４ ｍＲＮＡレベルをベースラインとして用いた。データは、平均±ｓｔｄｖ（ｎ＝２の独立したトランスフェクション）を表す。 図３．ＣＲＩＳＰＲによるＯＣＴ４の内因的活性化は、外来ＯＣＴ４が存在しない場合のリプログラミングを“レスキュー”することができる。ＣＲＩＳＰＲ技術を用いてＨＦＦおよびＰＢＭＮＣをリプログラミングすることによって産生されたｉＰＳＣコロニーを示す（Ａ）。ＨＦＦ－ｉＰＳＣおよびＰＢＭＮＣ－ｉＰＳＣコロニーの位相差画像を、コロニーピッキングの前に、それぞれ、ヌクレオフェクションの２０日および１６日後に採取した。リプログラミング効率は、ＨＦＦ－ｉＰＳＣの形態学またはＰＢＭＮＣ－ｉＰＳＣのアルカリホスファターゼ染色（Ｂ）のいずれかにより、ｉＰＳＣコロニーの数を数えることによって決定した。 図４．ＣＲＩＳＰＥＲ技術を用いた、ＨＦＦおよびＰＢＭＮＣのリプログラミングから得られたｉＰＳＣの特性化。Ａ．継代５および６でそれぞれ採取したＨＦＦ－ｉＰＳＣおよびＰＢＭＮＣ－ｉＰＳＣの位相差画像。ＨＦＦ－ｉＰＳＣおよびＰＢＭＮＣ－ｉＰＳＣにおける分化多能性マーカーの発現を、ＯＣＴ４、ＳＳＥＡ４、ＮＡＮＯＧおよびＴＲＡ－１－８１の免疫蛍光染色によって検出した。Ｂ．ＨＦＦ－ｉＰＳＣによって産生されたＥＢの位相差画像。ＥＢ内の細胞は、Ｐａｘ－６、ＳＭＡおよびＳｏｘ１７の免疫蛍光染色によって検出されるように、外胚葉、中胚葉および内胚葉系統の3つの胚葉を表す。

発明の詳細な説明
合成転写因子を用いて、例えば、内在性リプログラミング因子／分化多能性遺伝子を調節することによって、哺乳動物体細胞を核リプログラミングする方法が本明細書に記載されている。例示的な方法は、哺乳動物体細胞を人工多能性幹細胞に再プログラムする条件下で、かつそのために十分な時間をかけて、哺乳動物体細胞集団（出発体細胞）を１つの合成転写因子または合成転写因子のセットと接触させることを含む。あるいは、体細胞を出発体細胞とは実質的に異なる細胞型の標的細胞に分化転換させるのに十分な条件が選択される。例えば、血液細胞は、神経細胞に分化転換され得る。

本方法は、目的の特定の遺伝子を標的とするように設計された１以上の合成転写因子を含み得る。

ある態様において、合成転写因子は、別個のｇＲＮＡを含まないが、制御ＤＮＡ配列、例えば分化多能性因子遺伝子、例えば胚性幹細胞（ＥＳＣ）関連遺伝子、またはアポトーシス誘導に関連する遺伝子のプロモーター配列に直接的に結合することができるＤＮＡ結合ドメインを含む。

他の態様において、合成転写因子は、少なくとも１つの(ＤＮＡ結合)ガイドＲＮＡ分子および機能的または調節的ドメインを含むＲＮＡ結合ポリペプチドを含む。例えば、各合成転写因子は、（ａ）ＤＮＡ結合セグメントおよびポリペプチド結合セグメントを含む少なくとも１つのガイドＲＮＡを含み、ここで、該ＤＮＡ結合セグメントは配列特異的であり、例えば、分化多能性／リプログラミング因子遺伝子、例えば、胚性幹細胞（ＥＳＣ）関連遺伝子、またはアポトーシス誘導に関連する遺伝子のプロモーター領域に特異的に結合する。合成転写因子はさらに、ガイドＲＮＡのポリペプチド結合セグメントに結合する少なくとも１つの転写モジュレーター因子を含む。ガイドＲＮＡと合成転写因子との間の相互作用に基づき、機能的ドメイン（例えば、転写活性化ドメイン）を含む転写因子は、目的の特定の遺伝子、細胞ゲノム内のＤＮＡの位置（例えば、内在性リプログラミング因子遺伝子のプロモーター領域）に対して標的化される。次いで、調節遺伝子配列への転写モジュレーターの動員は、目的の内在性遺伝子の発現を調節し、例えば、分化多能性遺伝子の発現を駆動し、それにより、細胞のリログラミングに寄与する。複数の合成転写因子を用いて、複数の分化多能性因子遺伝子の発現を調節することができる。

ある態様において、本方法は、リプログラミングされた細胞を培養することをさらに含む。ある態様において、リプログラミングされた細胞は、発現ベクター成分を実質的に含まないｉＰＳＣを形成するのに十分な時間、または十分な細胞倍加数のために培養される。

従って、本明細書は、幹細胞療法による処置に適する疾患の処置のための細胞を用いる治療方法ならびにそのような使用のためのキットとともに、核リプログラミングの方法ならびにかかる方法により得られる細胞を記載する。

本発明は、特定の方法論、プロトコール、細胞株、動物種または属、および記載された試薬に限定されず、それ自体変化し得ることが理解されるべきである。本明細書で使用する用語は、特定の態様のみを説明するためのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図しないことも理解されるべきである。

定義
特許請求の範囲および／または明細書において用語“含む”と併せて使用されるとき、用語“１つの（a）”または“１つの（an）”の使用は、“１つ”を意味し得るが、“１以上”、“少なくとも１つ”、および“１または２以上”もまた意味する。

本明細書中、用語“約”は、値が、その値を決定するために用いられる方法／装置、または試験対象間に存在する変動についての誤差の固有の変動を含むことを示すために用いられる。一般的には、この用語は、状況に応じて、約１％または１％未満、約２％または２％未満、約３％または３％未満、約４％または４％未満、約５％または５％未満、約６％または６％未満、約７％または７％未満、約８％または８％未満、約９％または９％未満、約１０％または１０％未満、約１１％または１１％未満、約１２％または１２％未満、約１３％または１３％未満、約１４％または１４％未満、約１５％または１５％未満、約１６％または１６％未満、約１７％または１７％未満、約１８％または１８％未満、約１９％または１９％未満あるいは約２０％または２０％未満の変動性を有することを意味する。

特許請求の範囲における用語“または”の使用は、代替物のみを意味することを明示しない限り、または代替物が相互に排他的である場合を除いて、“および／または”を意味するために用いられるが、本明細書は代替物のみおよび“および／または”を意味する定義を支持する。

本明細書および特許請求の範囲で用いられる通り、用語“を包含する（comprising）”（ならびに、“含む（comprise）”および“含む（comprises）”などの任意の形態の包含)、用語“を有する（having）”（ならびに、“有する（have）”および“有する（has）”などの任意の形態の有する)、用語“を包含する（including）”（ならびに、“含む（includes）”および“含む（include）”などの任意の形態の含む）または用語“含有する（containing）”（ならびに、“含む（contains）”および“含む（contain）”などの任意の形態の含有)は、包括的または無制限であり、追加の、引用されていない要素または方法ステップを排除するものではない。本明細書に記載の態様は、本発明の方法または組成物に対して実施されてよく、その逆もまた想定される。さらに、本発明の組成物は、本発明の方法を達成するために用いられ得る。

“体細胞”とは、実験操作の不存在下では、通常、体の３つ全ての胚葉、すなわち外胚葉、中胚葉および内胚葉の細胞を生じることがないような、十分に分化した生物体の細胞を意味する。“体細胞”には、“複能性細胞（multipotent cell）”（すなわち、前駆細胞）が含まれるが、“分化多能性細胞”または“分化全能性細胞”は含まれない。例えば、体細胞は、ニューロンおよび神経前駆細胞の両方を含み、後者は、自然に中枢神経系の全てまたはいくつかの細胞型を生じるが、中胚葉または内胚葉系統の細胞を生じさせることはできない。

“複能性”とは、本明細書中、複数の細胞型を生じる可能性を有するが、分化多能性幹細胞よりも分化能が低い（分化能がより制限される）、複能性前駆細胞に関して言及される。例えば、分化多能性幹細胞は、いくつかのタイプの血球細胞を生じ得る造血細胞であるが、脳細胞または他のタイプの細胞を生じることはできない。

“分化多能性”とは、本明細書では、３つの胚葉のいずれかに分化する可能性を有する細胞／細胞型の特性を意味する：内胚葉（例えば、胃内膜、胃腸管、肺)、中胚葉（例えば、筋肉、骨、血液、尿生殖器）、または外肺葉（例えば、表皮組織および神経系)。

“分化多能性幹細胞”には、天然の分化多能性幹細胞および人工多能性幹細胞が含まれる。それらは、任意の胎児または成体細胞型を生じ得る。しかしながら、それらは、胎盤などの胚外組織に寄与する可能性がないため、一般的に、それらは単独では、胎児または成体に発展することはできない。

“人工多能性幹細胞”または（“ｉＰＳＣ”）は、多くの側面において、特定の幹細胞遺伝子および／またはタンパク質の発現、クロマチンのメチル化パターン、倍加時間、胚様体形成、奇形腫形成、生存可能なキメラ形成、ならびに効力および分化能などが、天然の分化多能性幹細胞、例えば胚性幹細胞に類似している。人工多能性細胞は、例えば、成体の胃、肝臓、皮膚細胞および血球細胞（例えば、臍帯血細胞）に由来し得る。ｉＰＳＣは、合成転写因子および／または特定の幹細胞関連遺伝子を非分化多能性細胞（例えば、体細胞）にトランスフェクションすることによって誘導され得る。特定の態様において、トランスフェクションは、レトロウイルスなどのウイルスベクター、例えば、非ウイルス性またはエピソーマルベクターを介して達成され得る。トランスフェクトされた遺伝子には、リプログラミング因子ｏｃｔ３／４（Ｐｏｕ５ｆ１）、Ｋｌｆ－４、ｃ－Ｍｙｃ、Ｓｏｘ－２、ｎａｎｏｇおよび ｌｉｎ２８が含まれるが、これらに限定されない。トランスフェクトされた細胞の亜集団は、分化多能性幹細胞と形態学的および生化学的に類似し始め得て、形態選択、倍加時間、またはレポーター遺伝子および抗生物質選択によって単離することができる。

用語“ペプチド”、“ポリペプチド”および“タンパク質”は、本明細書中互換的に用いられ、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を意味し、それには、コードされた、およびコードされていないアミノ酸、化学的または生化学的に改変または誘導体化されたアミノ酸、ならびに改変ペプチド骨格を有するポリペプチドが含まれる。

本明細書で用いる“結合する”または“相互作用”（例えば、ガイドＲＮＡのポリペプチド結合セグメントに結合する合成転写モジュレーターに関して）は、高分子化合物間（例えば、ＤＮＡとＲＮＡ間、またはポリペプチドとポリヌクレオチド間）の非共有相互作用を意味する。“結合”はまた、“と関連する（associated with）”または“相互作用する（interacting）”とも言われる。本明細書で用いる“結合する”は、結合パートナーが互いに結合することができることを意味する（例えば、必ずしも互いに結合する必要はない）。結合相互作用のいくつかの部分は配列特異的であり得るが、結合相互作用の全ての成分が配列特異的である必要はない（例えば、ＤＮＡ骨格中のリン酸基との接触など)。結合相互作用は、一般に、例えば、１ｍＭ未満、１００μＭ未満、１０μＭ未満、１μＭ未満、１００ｎＭ未満、１０ｎＭ未満の解離定数（Ｋｄ）により特徴付けられる。“親和性”は、結合の強さを意味し、結合親和性の増加はより低いＫｄと相関する。

本明細書で用いる“プロモーター”、“プロモーター配列”または“プロモーター領域”は、ＲＮＡポリメラーゼに結合することができ、下流のコード配列または非コード配列の転写開始に関与する、ＤＮＡ調節領域／配列を意味する。本明細書のいくつかの例において、プロモーター配列は、転写開始部位を含み、バックグラウンドより上で検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最小の塩基数またはエレメントを含むように上流に伸びる。ある態様において、プロモーター配列は、転写開始部位、ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合を担うタンパク質結合ドメインを含む。真核生物プロモーターは、“ＴＡＴＡ”ボックスおよび“ＣＡＴ”ボックスを含むことが多いが、必ずしも含むわけではない。誘導性プロモーターを含む種々のプロモーターを用いて、本発明の種々のベクターを駆動することができる。

“ベクター”または“発現ベクター”は、プラスミド、ファージ、ウイルス、またはコスミドなどのレプリコンであり、それに別のＤＮＡセグメント、すなわち“挿入物（insert）”を、細胞内で該結合されたＤＮＡセグメントの複製が起こるように、結合させることができる。“ベクター”には、エピソーマル（例えば、プラスミド）ベクターおよび非エピソーマルベクターが含まれる。本明細書のいくつかの態様において、ベクターはエピソーマルベクターであり、多数回の細胞継代後に、例えば非対称分配によって細胞集団から除去される／失われる。

“発現カセット”は、プロモーターに作動可能に連結されたＤＮＡコード配列を含む。“作動可能に連結された”とは、そのように記載された成分が意図された様式で機能することを可能にする関係にある並置を意味する。例えば、プロモーターは、該プロモーターがその転写または発現に影響を及ぼすとき、コード配列に作動可能に連結されている。

用語“組み換え発現ベクター”または“ＤＮＡ構築物”は、本明細書中互換的に用いられ、ベクターおよび少なくとも１つの挿入物を含むＤＮＡ分子を意味する。組換え発現ベクターは、通常、挿入物（複数可）を発現および／または増加させる目的で、または他の組換えヌクレオチド配列の構築のために作製される。挿入物（複数可）は、プロモーター配列に作動可能に連結されていても、されていなくてもよく、ＤＮＡ調節配列に作動可能に連結されていても、いなくてもよい。

用語“リプログラミング効率（efficiency of reprogrammingまたはreprogramming efficiency）”は、例えば、本発明の合成転写因子と接触したとき、細胞がｉＰＳ細胞コロニーを生じる能力を意味するために用いられ得る。分化多能性に対するリプログラミング効率の向上を示す体細胞は、対照と比較してｉＰＳＣを生じさせる能力が増強されることを示す。用語“リプログラミング効率”はまた、実質的に異なる体細胞型に再プログラムされる体細胞の能力、すなわち分化転換として知られるプロセスを意味し得る。本発明の方法を用いたリプログラミングの効率は、特定の体細胞の組合せ、合成転写因子またはリプログラミング因子を導入する方法、およびリプログラミング誘導後の培養方法によって変わる。本発明の方法は、“リプログラミング効率の測定”を含み得る。リプログラム効率の決定は、ｉＰＳＣコロニーの計数を含むことができ、またはリプログラミングされた細胞による以下の“主要な分化多能性マーカー”などの分化多能性マーカーの発現の測定を含み得る。

当業者によく知られている“主要な分化多能性マーカー”には、アルカリホスファターゼの発現に関与する遺伝子および／またはタンパク質、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、ｓｏｘ２、ｏｃｔ３／４、ｎａｎｏｇ、ＴＲＡ１６０、ＴＲＡ１８１、ＴＤＧＦ １、Ｄｎｍｔ３ｂ、ＦｏｘＤ３、ＧＤＦ３、Ｃｙｐ２６ａ１、ＴＥＲＴ、およびｚｆｐ４２が含まれるが、これらに限定されない。

“処置する”または“処置”は、本明細書中、疾患または障害、障害の症状、該障害に続発する疾患状態、または該障害の素因を治癒、軽減、緩和、予防または改善する目的で対象に薬物（例えば、本明細書に記載の医薬組成物）を投与することを意味する。“有効量”とは、処置対象において、本明細書に記載の医学的に望ましい結果を生じさせることができる薬物の量である。医学的に望ましい結果とは、客観的（すなわち、ある試験またはマーカーによって測定可能）または主観的（すなわち、対象が効果の指標を与えるか、または感じる)であり得る。

本明細書で言及する“幹細胞療法による処置が可能な疾患”は、ｉＰＳＣのような幹細胞の投与によって処置され得る全ての手技、病状、障害、疾患および／または病気を意味する。そのような疾患には、骨髄、皮膚、心臓および角膜移植、移植片対宿主疾患、肝臓および腎不全、肺傷害、リウマチ性関節炎、自己免疫疾患、例えばクローン病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症、狼瘡および糖尿病；同種移植片拒絶反応の予防、神経学的障害および心血管医学；ならびに急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、バーキットリンパ腫、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、若年性骨髄単球性白血病（ＪＭＭＬ）、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、リンパ腫肉芽腫症、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、骨髄不全症候群、巨核球性血小板減少症、自己免疫好中球減少症（重度）、先天性難赤血球性貧血、周期性好中球減少症、ダイヤモンド・ブラックファン貧血、エバン症候群、ファンコニ貧血、グランツマン病、若年性皮膚筋炎、コストマン症候群、赤血球糸無形成症、シュワッハマン症候群、重症再生不良性貧血、先天性鉄芽球性貧血橈骨欠損を伴う血小板減少症（ＴＡＲ症候群）、先天性異型症候群、血液疾患、鎌状赤血球貧血（ヘモグロビンＳＳ）、ＨｂＳＣ疾患、鎌状赤血球ベータサラセミア、α－サラセミアメジャー（胎児水腫)、β－サラセミアメジャー（クーリー貧血症）、β－中間型サラセミア、Ｅ－βｏ型 サラセミア、Ｅ－β＋型サラセミア、代謝障害、副腎白質ジストロフィー・ゴーシェ病（小児）、異染性白質ジストロフィー、クラッベ病（グロボイド細胞白質ジストロフィー)、ガンサー病、ヘルマンスキー・プドラック症候群、ハーラー症候群、ハーラー・シェイー症候群、ハンター症候群、サンフィリポ症候群、マロトー・ラミー症候群、ムコ多糖症ＩＩ型、ＩＩＩ型、αマンノース症、ニーマンピック症候群Ａ型およびＢ型、サンドホッフ症候群、テイサックス病、バタン病（遺伝性ニューロンセロイドリポフスチノーシス)、レッシュニーハン病、免疫不全症、毛細血管拡張性運動失調症、慢性肉芽腫症、ディジョージ症候群、ＩＫＫ γ欠損症、免疫調節障害・多発性内分泌異常、Ｘ連鎖性低リン酸血症、ＩＩ型、ミエロカチヘキシスＸ連鎖免疫不全症、重症複合免疫不全症、アデノシンデアミナーゼ欠損症、ウィスコット・アルドリッチ症候群、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症、Ｘ連鎖リンパ球増殖性疾患、オムン症候群、網状異形成、胸腺異形成、白血球接着欠損症、他の骨化石症、ランゲルハンス細胞組織球症、血球貪食症候群、急性および慢性腎疾患、アルツハイマー病、老化防止、関節炎、喘息、心筋幹細胞療法、脳梗塞（脳卒中）、脳性麻痺（脳卒中）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、鬱血性心不全、真性糖尿病（Ｉ型およびＩＩ型)、線維筋痛症、免疫不全、虚血性心疾患、狼瘡、多発性硬化症、心筋梗塞、骨関節症、骨粗鬆症、パーキンソン病、末梢動脈疾患、リウマチ性関節炎、外科手術における幹細胞療法、外傷性脳損傷および神経学的疾患が含まれるが、これらに限定されない。

本明細書で用いる“患者”は、幹細胞療法を適用可能な疾患、例えば心血管疾患と診断されたか、またはそれに罹患していると予期されるか、またはそれを発症する疑いのある哺乳動物対象を意味する。患者の例としては、幹細胞療法が有益であり得るヒト、サル、イヌ、ブタ、ウシ、ネコ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、げっ歯動物および他の哺乳動物であり得る。

“投与する”は、本明細書中、例えば注射により、患者に本発明のｉＰＳＣを提供することを意味する。限定ではなく例として、投与は、静脈内（ｉ.ｖ.）投与、皮下（ｓ.ｃ.）投与、皮内（ｉ.ｄ.）投与、腹腔内（ｉ.ｐ.）投与、または筋肉内（ｉ.ｍ.）投与により行われ得る。１つまたは複数のかかる投与法を用いることができる。非経腸投与は、例えば、ボーラス注射または経時徐灌流によって行うことができる。あるいは、または同時に、投与は、経口経路によるものであってよい。加えて、投与は、細胞のボーラスまたはペレットの外科的沈着、または細胞が装填された医療器、例えばステントの位置決めによっても行われ得る。好ましくは、本発明の組成物は、疾患の部位に、例えば病変部（例えば、血管狭窄／閉塞、壊死性組織または壊疽性感染部位)またはその周辺（例えば、約または少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０ミリメートルの距離）に投与される。

“それを必要とする患者”は、本明細書中、幹細胞療法に適する疾患と診断されたか、または疾患を有すると疑われる患者を意味する。

分化多能性因子および分化多能性因子遺伝子
本明細書で用いる用語“分化多能性因子遺伝子”または“リプログラミング因子遺伝子”は、分化多能性因子ポリペプチド（そのプロモーター領域を含む）をコードする内在性細胞遺伝子を意味する。分化多能性因子遺伝子の発現の活性化または抑制は、体細胞の核リプログラミング、例えば分化複能性または分化多能性に寄与する。“分化多能性因子遺伝子”は、本発明の方法において有用な標的遺伝子を含む。分化多能性因子遺伝子の例としては、ＥＳＣ関連遺伝子、例えばリプログラミング因子遺伝子（一般的に、本明細書に記載の方法において活性化される)、およびアポトーシスの開始に関与する遺伝子（一般的に、本明細書に記載の方法において抑制される)などが挙げられる。

本明細書で用いる“分化多能性因子”または“リプログラミング因子”は、上記の“分化多能性因子遺伝子”または“リプログラミング因子遺伝子”の対応する遺伝子産物を意味する。

用語“分化多能性因子の候補遺伝子”とは、哺乳動物体細胞の核リプログラミングに関与する可能性のある遺伝子を意味し、これは、候補ガイドＲＮＡ（例えば、候補ガイドＲＮＡのライブラリー）を利用して本発明のインビトロスクリーニング法を用いて同定される。そのような遺伝子の発現の活性化または抑制は、結果として、ｉＰＳＣの形成、例えば、本明細書に概説されるような適切なリプログラミング方法を実施したとき、少なくとも１つのｉＰＳＣコロニーの形成をもたらす。ｉＰＳＣの形成は、候補ガイドＲＮＡが候補遺伝子のプロモーター領域にハイブリダイズし、転写モジュレーターを該候補遺伝子の調節領域に標的化させたことを示し得る。次いで、候補遺伝子の発現が調節され、それにより宿主細胞のリプログラミングに寄与する可能性がある。“分化多能性因子の候補遺伝子”の同定は、候補ガイドＲＮＡのＤＮＡ結合配列を内在性遺伝子配列とマッチングさせることをさらに含み得る。リプログラミングにおける候補遺伝子の関与は、同定されたＤＮＡ結合セグメントを有する追加の候補ｇＲＮＡを本明細書に記載の１以上の転写モジュレーターと組み合わせて用いて哺乳動物体細胞のリプログラミングを繰り返すことによって、さらに検証することができる。

リプログラミング因子遺伝子の例としては、ＰＯＵ５Ｆ１（ｏｃｔ３／４）、ｓｏｘ２、ｋｌｆ４、ｃ－ｍｙｃ、ｌｉｎ２８およびｎａｎｏｇが挙げられる。いくつかの例において、活性化されるリプログラミング因子遺伝子は、ｏｃｔ３／４、ｓｏｘ－２、ｋｌｆ－４、ｃ－ｍｙｃ、ｌｉｎ２８およびｎａｎｏｇのうち少なくとも２つである。いくつかの例において、活性化されるリプログラミング因子遺伝子は、ｏｃｔ３／４、ｓｏｘ２、ｌｉｎ２８およびｎａｎｏｇのうち少なくとも２つである。さらに他の例において、活性化されるリプログラミング因子遺伝子は、ｏｃｔ３／４、ｓｏｘ２、ｃ－ｍｙｃおよびｋｌｆ４のうち少なくとも２つである。他の例において、活性化されるリプログラミング因子遺伝子は、ｏｃｔ３／４、ｓｏｘ２、ｌｉｎ２８およびｎａｎｏｇのうち少なくとも３つである。さらに他の例において、活性化されるリプログラミング因子遺伝子は、ｏｃｔ３／４、ｓｏｘ２、ｃ－ｍｙｃおよびｋｌｆ４のうち少なくとも３つである。いくつかの例において、活性化されるリプログラミング因子遺伝子は、ｏｃｔ３／４、ｓｏｘ２、ｌｉｎ２８およびｎａｎｏｇである。さらに他の例において、活性化されるリプログラミング因子遺伝子は、ｏｃｔ３／４、ｓｏｘ－２、ｃ－ｍｙｃおよびｋｌｆ４である。

上記の態様のいずれかによる他の例において、活性化される遺伝子は、抗アポトーシス遺伝子、例えばｂｃｌ－２またはｂｃｌ－ｘである。いくつかの例において、活性化されるリプログラミング因子遺伝子は、ｏｃｔ３／４、ｓｏｘ－２、ｋｌｆ－４、ｃ－ｍｙｃ、ｌｉｎ２８およびｎａｎｏｇのうち少なくとも２つ、ならびに少なくとも１つの抗アポトーシス遺伝子（例えば、ｂｃｌ－２およびｂｃｌ－ｘのうち少なくとも１つ）である。他の例において、活性化されるリプログラミング因子遺伝子は、ｏｃｔ３／４、ｓｏｘ２、ｌｉｎ２８およびｎａｎｏｇのうち少なくとも２つ、ならびに少なくとも１つの抗アポトーシス遺伝子（例えば、ｂｃｌ－２およびｂｃｌ－ｘのうち少なくとも１つ）である。さらに他の例において、活性化されるリプログラミング因子遺伝子は、ｏｃｔ３／４、ｓｏｘ２、ｃ－ｍｙｃおよびｋｌｆ４のうち少なくとも２つ、ならびに少なくとも１つの抗アポトーシス遺伝子（例えば、ｂｃｌ－２およびｂｃｌ－ｘのうち少なくとも１つ）である。いくつかの例において、活性化されるリプログラミング因子遺伝子は、ｏｃｔ３／４、ｓｏｘ－２、ｌｉｎ２８およびｎａｎｏｇのうち少なくとも３つ、ならびに少なくとも１つの抗アポトーシス遺伝子（例えば、ｂｃｌ－２およびｂｃｌ－ｘのうち少なくとも１つ）である。さらに他の例において、活性化されるリプログラミング因子遺伝子は、ｏｃｔ３／４、ｓｏｘ２、ｃ－ｍｙｃおよびｋｌｆ４のうち少なくとも３つ、ならびに少なくとも１つの抗アポトーシス遺伝子（例えば、ｂｃｌ－２およびｂｃｌ－ｘのうち少なくとも１つ）である。いくつかの例において、活性化されるリプログラミング因子遺伝子は、ｏｃｔ３／４、ｓｏｘ２、ｌｉｎ２８およびｎａｎｏｇ、ならびに少なくとも１つの抗アポトーシス遺伝子（例えば、ｂｃｌ－２およびｂｃｌ－ｘのうち少なくとも１つ）である。さらに他の例において、活性化されるリプログラミング因子遺伝子は、ｏｃｔ３／４、ｓｏｘ－２、ｃ－ｍｙｃおよびｋｌｆ４、ならびに少なくとも１つの抗アポトーシス遺伝子（例えば、ｂｃｌ－２およびｂｃｌ－ｘのうち少なくとも１つ）である。

細胞のリプログラミングは、従来から、転写因子（例えば、ｏｃｔ３／４、ｓｏｘ２、ｋｌｆ４、ｎａｎｏｇ、ｃ－Ｍｙｃおよびｌｉｎ２８)の組合せ、ならびにアポトーシスリプレッサーとして機能するタンパク質をコードする遺伝子を用いて達成される。これらの遺伝子の例としては、ＳＶ－４０ラージＴ抗原および腫瘍リプレッサータンパク質であるｐ５３のドミナントネガティブ体である。これらのアポトーシス抑制のための遺伝子はヒト細胞ゲノム中に内在しないため、ＣＲＩＰＲ法において、細胞リプログラミングの過程で活性化され得るアポトーシス経路を抑制すべきである。

従って、上記態様のいずれかによるさらなる例において、細胞リプログラミングは、少なくとも１つの標的遺伝子の抑制を、例えば、上記の遺伝子活性化のいずれか１つと組み合わせて含む。いくつかの例において、抑制される標的遺伝子は、アポトーシス促進遺伝子または細胞周期阻害剤である。例としては、ｐ５３およびその標的遺伝子ｐ２１（細胞周期阻害剤）が挙げられる。他の細胞周期阻害剤を抑制することは、細胞リプログラミング法によって誘発されるアポトーシス経路を妨げ得る。候補物質としては、ｐ１９^Ａｒｆ （ｐ５３を安定化する）およびｐ１６^{Ｉｎｋ４ａ} （ｐＲｂがサイクリンＤによってリン酸化されないようにし、それにより細胞周期停止を誘導する）が挙げられる。Ｉｎｋ４／Ａｒｆ遺伝子座は、ｉＰＳＣにおいてエピジェネティックにサイレンシングされるが、体細胞において上方制御されており、リプログラミングに対するエピジェネティックバリアとしてのＩｎｋ４ａ／Ａｒｆ遺伝子座の重要な役割が示唆される（H. Li. M. Collado, A. Villasante et al., “The Ink4/Arf locus is a barrier for iPS cell reprogramming,” Nature 2009, 460(7259): 1136－1139)。従って、いくつかの例において、抑制される標的遺伝子は、ｐ５３、ｐ２１、ｐ１９^Ａｒｆおよびｐ１６^{Ｉｎｋ４ａ}から選択される。

上記の態様のいずれかによる他の例において、抑制される分化多能性因子遺伝子は、細胞死および／または細胞周期停止を促進するシグナル伝達タンパク質をコードする遺伝子である。例としては、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ（ＲＯＣＫ）およびセリン－スレオニンキナーゼのＡＧＣ（ＰＫＡ／ＰＫＧ／ＰＫＣ）ファミリーに属するキナーゼ類が挙げられる。ＲＯＣＫは、主に、細胞骨格に作用することにより細胞の形状および運動を調節することに関与している。ＲＯＣＫ阻害は、分散誘導性アポトーシスを防止することによって、単細胞としての分化多能性幹細胞の生存を促進することが示されている。さらに、ＲＯＣＫを抑制することは、ｍＴＯＲ経路を阻害する可能性がある。ラパマイシンによるｍＴＯＲ経路の阻害は、例えば、リプログラミング効率を著しく高める（T. Chen, L. Shen, J. Yu et al., “Rapamycin and other longevity promoting compounds enhance the generation of mouse induced pluripotent stem cells,” Aging Cell 2011, 10(5):908－911)。従って、いくつかの例において、抑制される分化多能性因子遺伝子は、ＲＯＣＫ、ＰＫＡ／ＰＫＧ／ＰＫＣファミリーキナーゼおよびその抑制がｍＴＯＲ経路を阻害し得る他の遺伝子から選択される。

本発明の方法において有用な別の分化多能性因子遺伝子は、ｇｌｉｓ１である。

目的のリプログラミング因子には、体細胞が異なる体細胞に再プログラムされる分化転換に有用な因子もまた含まれる。ある体細胞を別の実質的に異なる体細胞型への分化転換する目的のために、異なるセットのリプログラミング因子の使用が見いだされる。例えば、線維芽細胞を心筋細胞に分化転換させるために、細胞透過性ペプチドＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃおよびＴｂｘ５を用いることができる（Leda et al., Cell 2010, 142(3): 375－386、引用により本明細書中に包含させる）。

本明細書に記載のいくつかの態様において、哺乳動物体細胞を外来性のリプログラミング因子と接触させる。外来性のリプログラミング因子は、単離されたポリペプチドの組成物として、すなわち生物学的に活性な無細胞形態で、またはそれをコードする外来核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）として（それは、細胞に送達されるか、または発現されることにより、体細胞を、例えば、分化複能性または分化多能性にリプログラミングするために再プログラムするか、またはそれに寄与する）、細胞に提供される。いくつかの態様において、リプログラミング因子は、挿入されることなく、すなわち、レシピエント細胞のゲノムへの外来ＤＮＡの挿入をもたらさない形態で該レシピエント体細胞に提供され得る。

生物学的活性は、特異的ＤＮＡ結合アッセイによって決定することができるか、または細胞性転写を変化させる際の因子の有効性を決定することによって。本発明の組成物は、１以上の生物学的に活性なリプログラミング因子を提供することができる。組成物は、少なくとも約５０ μｇ／ｍｌの可溶性リプログラミング因子、少なくとも約１００ μｇ／ｍｌ；少なくとも約１５０ μｇ／ｍｌ、少なくとも約２００ μｇ／ｍｌ、少なくとも約２５０ μｇ／ｍｌ、少なくとも約３００ μｇ／ｍｌ、または少なくとも約５００ μｇ／ｍｌの可溶性リプログラミング因子を含み得る。

ｋｌｆ４ポリペプチドは、ヒトｋｌｆ４のアミノ酸配列、すなわち、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００４２２６（配列番号１）およびＮＭ＿００４２３５（配列番号２）で見いだされ得るクルッペル様転写因子の配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドである。ｋｌｆ４ポリペプチド、例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００４２３５（配列番号２）の配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９５％、９７％、９９％または１００％同一であるポリペプチドおよびそれらをコードする核酸は、本発明におけるリプログラミング因子としての用途が見出される。

ｃ－Ｍｙｃポリペプチドは、ヒトｃ－Ｍｙｃ、すなわち、骨髄球腫ウイルス癌遺伝子相同体のアミノ酸配列（その配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００２４５８（配列番号３）およびＮＭ＿００２４６７（配列番号４）に見いだされ得る）と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドである。ｃ－Ｍｙｃポリペプチド、例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２４６７（配列番号４）の配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９５％、９７％、９９％または１００％同一であるポリペプチドおよびそれらをコードする核酸は、本発明におけるリプログラミング因子としての用途が見出される。

Ｎａｎｏｇポリペプチドは、ヒトＮａｎｏｇ、すなわちＮａｎｏｇホメオボックスのアミノ酸配列（その配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０７９１４１（配列番号５）およびＮＭ＿０２４８６５（配列番号６）に見いだされ得る）と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドである。Ｎａｎｏｇポリペプチド、例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０２４８６５（配列番号６）の配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９５％、９７％、９９％または１００％同一であるポリペプチドおよびそれらをコードする核酸は、本発明におけるリプログラミング因子としての用途が見出される。

Ｌｉｎ－２８ポリペプチドは、ヒトＬｉｎ－２８、すなわち、線虫のＬｉｎ－２８相同体のアミノ酸配列（その配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０７８９５０（配列番号７）およびＮＭ＿０２４６７４（配列番号８）に見いだされ得る）と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドである。Ｌｉｎ－２８ポリペプチド、例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０２４６７４（配列番号８）の配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９５％、９７％、９９％または１００％同一であるポリペプチドおよびそれらをコードする核酸は、本発明のリプログラミング因子としての用途が見出される。

Ｏｃｔ３／４ポリペプチドは、Homo sapiens POU class 5 homeobox 1 (POU5F1)としても公知のヒトＯｃｔ３／４のアミノ酸配列（その配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００２６９２（配列番号９）およびＮＭ＿００２７０１（配列番号１０）に見いだされ得る）と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドである。Ｏｃｔ３／４ポリペプチド、例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２７０１（配列番号１０）の配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９５％、９７％、９９％または１００％同一であるポリペプチドおよびそれらをコードする核酸は、本発明のリプログラミング因子としての用途が見出される。

Ｓｏｘ２ポリペプチドは、ヒトＳｏｘ２、すなわち、性決定領域Ｙボックス２タンパク質のアミノ酸配列（その配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００３０９７（配列番号１１）およびＮＭ＿００３１０６（配列番号１２）に見いだされ得る）と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドである。Ｓｏｘ２ポリペプチド、例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００３１０６（配列番号１２）の配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９５％、９７％、９９％または１００％同一であるポリペプチドおよびそれらをコードする核酸は、本発明のリプログラミング因子としての用途が見出される。

本発明の方法はまた、哺乳動物体細胞を、転写を改変または調節することができる小分子またはリプログラミングエンハンサーと接触させることを含み得る。いくつかの例において、該小分子またはリプログラミングエンハンサーは、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤である。ｓｉＲＮＡ、バルプロ酸、ヒドロキサム酸、トリコスタチンＡ、スベロイルアニリドヒドロキサム酸、ＢＩＸ－０１２９４およびＢａｙＫ８６４４を含むが、これに限定されない小分子が、細胞のリプログラミングに有用であると記載されている（例えば、Shi et al., Cell Stem Cell 2008； 3(5):568－574 および、Huangfu et al., Nature Biotechnology 2008、26:795－797を参照のこと、各々、引用により本明細書中に包含させる）。本発明の方法において有用な他のリプログラミングエンハンサーとしては、アルミニウム含有塩（例えば、水酸化アルミニウム）およびＴＧＦ－β阻害剤（例えば、Ａ８３－０１）が挙げられる。

合成転写因子
一般的に、用語“転写因子”とは、ＤＮＡに（ＤＮＡ結合ドメインを介して）結合し、機能的（活性化またはリプレッサー）ドメインを介して遺伝子発現を調節する能力を有する複合体を意味する。本明細書の記載と関連して、ＤＮＡ結合ドメインは、（ＤＮＡ結合）ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と組み合わせて用いされる、ＲＮＡ結合ドメイン（例えば、ｄＣＡＳ９）で置換され得る。本発明の合成転写因子の例としては、ｇＲＮＡおよびｄＣａｓ９－ＶＰ６４が挙げられ、ここで、ｄＣａｓ９は例示的ＲＮＡ結合ドメインであり、ＶＰ６４は例示的トランス活性化ドメインである。本発明の合成転写因子の別の例としては、ｇＲＮＡ（少なくとも１つのＭＳ２結合ループを含む）；ｄＣａｓ９；および、ＭＳ２－ＶＰ６４が挙げられ、ここで、ＭＳ２は例示的ＲＮＡ結合ドメインであり、ＶＰ６４は例示的トランス活性化ドメインである。

従って、本発明の合成転写因子は、（ａ）ＤＮＡ結合セグメントおよびポリペプチド結合セグメントを含む少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、ならびに（ｂ）少なくとも１つの、ＲＮＡ結合ドメイン（ｇＲＮＡのポリペプチド結合セグメントに結合することができる）および少なくとも１つの機能的ドメイン（例えば、転写活性化ドメイン）を含むポリペプチドである転写モジュレーターを含む。ｇＲＮＡと転写モジュレーターとの間の相互作用に基づき、転写モジュレーターは、細胞ゲノム内の特定のＤＮＡ位置（例えば、内在性分化多能性因子遺伝子のプロモーター領域）に標的化される。その後、転写モジュレーターの動員は、内在性遺伝子の発現を調節し、例えば、分化多能性因子遺伝子の発現を駆動し、それにより細胞のリプログラミングに寄与する。

細胞のゲノム内の複数の遺伝子座で遺伝子発現を調節するために、細胞を合成転写因子のカクテルと接触させることができる。例えば、カクテルは、各々が異なるＤＮＡ結合セグメントを有するが、それぞれが同じポリペプチド結合セグメントを有する、多数のガイドＲＮＡを含み得る。この場合、同じ転写モジュレーターを用いて、複数の遺伝子を調節することができる。他の例において、合成転写因子のカクテルは、異なるポリペプチド結合セグメントを有する少なくとも２つのガイドＲＮＡを含んでいてよく、その場合、異なるＲＮＡ結合ドメインを有する少なくとも２つの異なる転写モジュレーターが用いられる。

ガイドＲＮＡ
転写モジュレーターに結合し、転写モジュレーターを標的ＤＮＡ内の特定の位置（すなわち、内在性分化多能性因子遺伝子のプロモーター領域）に標的化するＲＮＡ分子は、本明細書中、“ガイドＲＮＡ”または“ｇＲＮＡ”と呼ばれ、また“ＤＮＡ標的化ＲＮＡ”と呼ぶこともできる。ガイドＲＮＡは、少なくとも２つのヌクレオチドセグメント：少なくとも１つの“ＤＮＡ結合セグメント”および少なくとも１つの“ポリペプチド結合セグメント”を含む。“セグメント”とは、分子の一部、セクション、または領域、例えば、ＲＮＡ分子のヌクレオチドの連続したストレッチを意味する。他に特にこれと異なる記載がない限り“セグメント”の定義は、特定の塩基対数に限定されない。

ガイドＲＮＡは、少なくとも２つのポリペプチド結合セグメントを含み得る。いくつかの態様において、ガイドＲＮＡの第１のポリペプチド結合セグメントは、第１の転写モジュレーター（例えば、ｄＣａｓ９－ＶＰ６４）またはｄＣａｓ９単独に結合するように設計され、そして第２のポリペプチド結合セグメントは、第２の転写モジュレーターを動員するように設計される。例えば、ガイドＲＮＡの第１のポリペプチド結合セグメントは、合成ｄＣａｓ９ベースの転写制御因子（例えば、ｄＣａｓ９－ＶＰ６４）に結合し、一方、ガイドＲＮＡの１以上のＭＳ２誘導（recruiting）ポリペプチド結合セグメント（例えば、テトラループおよび／またはステムルー２ドメインに融合される）は、１以上のＭＳ２ベースの転写モジュレーター（例えば、ＭＳ２－ＶＰ６４）に結合する。例えば、Konermann et al., Nature 2015, 517: 583－588 (および補足資料)を参照のこと（その開示内容全体を引用により本明細書中に包含させる）。いくつかの例において、体細胞をｄＣａｓ９、ＭＳ２ベースの転写制御因子ならびにｄＣａｓ９およびＭＳ２の両方に結合するガイドＲＮＡと接触させる。

ｇＲＮＡのポリペプチド結合セグメントは、２以上の核酸分子の領域を含み得る。ある例において、ガイドＲＮＡのポリペプチド結合セグメントは、相補性領域に沿ってハイブリダイズした２つの別個の分子を含む。例えば、相補性領域に沿ってハイブリダイズした２つの別個の分子を含む。２つの別個の分子を含むガイドＲＮＡのポリペプチド結合セグメントは、（ｉ）１００塩基対長の第１ＲＮＡ分子の３０塩基対および５０塩基対長の第２ＲＮＡ分子の１５塩基対を含み得る。

ガイドＲＮＡは、単離されたＲＮＡ分子として標的細胞に導入され得るか、またはガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを含む発現ベクターを用いて細胞に導入され得る。

ガイドＲＮＡのＤＮＡ結合セグメント
ガイドＲＮＡの“ＤＮＡ結合セグメント”（または、“ＤＮＡ標的化配列”）は、標的ＤＮＡ内の特定の配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。本明細書に記載のある態様において、標的ＤＮＡは、内在性リプログラミング因子遺伝子または他の分化多能性因子遺伝子のプロモーター領域である。例えば、ガイドＲＮＡのＤＮＡ結合セグメントは、内在性ｏｃｔ３／４遺伝子、内在性ｓｏｘ－２遺伝子、内在性ｋｌｆ４遺伝子、または内在性ｃ－ｍｙｃ遺伝子のプロモーター領域内の配列に相補的である。他の例において、ＤＮＡ結合セグメントは、ヌクレオチド配列のライブラリーに由来し、分化多能性因子の候補遺伝子のプロモーター領域に結合し得る。

ガイドＲＮＡのポリペプチド結合セグメント
本発明のガイドＲＮＡは、１以上のポリペプチド結合配列／セグメントを含む。ガイドＲＮＡのポリペプチド結合セグメント（または、“タンパク質結合配列”）は、本発明の転写モジュレーターのＲＮＡ結合ドメイン（例えば、修飾Ｃａｓ９ポリペプチドドメインまたはＭＳ２ポリペプチドドメイン）と相互作用する。かかるポリペプチド結合セグメントまたは配列は、当業者によく知られており、例えば米国特許出願公開第２０１４／００６８７９７号、同第２０１４／０２７３０３７号、同第２０１４／０２７３２２６号、同第２０１４／０２９５５５６号、同第２０１４／０２９５５５７号、同第２０１４／０３４９４０５号、同第２０１５／００４５５４６号、同第２０１５／００７１８９８号、同第２０１５／００７１８９９号および同第２０１５／００７１９０６号（これらの開示内容は、引用により本明細書中に包含させる）に記載されている。

いくつかの例において、ガイドＲＮＡは、少なくとも１つのｄＣａｓ９結合セグメントを含む。伝統的なＣＲＩＳＰＲシステムを用いるとき、ｄＣａｓ９は、ガイドＲＮＡとのＤＮＡ結合複合体が効率的にＤＮＡに結合する前に、該複合体を形成する必要がある。従って、いくつかの例において、合成転写因子は、少なくとも１つのｄＣａｓ９ベースの転写モジュレーター（例えば、トランス活性化ドメインまたはリプレッサードメインに融合したｄＣａｓ９）を含む。しかしながら、Ｃａｓ９結合に依存しないガイドＲＮＡを設計することができる。

他の例において、ガイドＲＮＡは、少なくとも２つのポリペプチド結合セグメント：ｄＣａｓ９結合セグメントである第１のポリペプチド結合セグメント、およびｄＣａｓ９（例えば、ＭＳ２）以外のポリペプチドに結合する第２のポリペプチド結合セグメントを含む。この場合、ｄＣａｓ９は、それ自体で（転写活性化またはリプレッサードメインに融合することなく）細胞に提供され得る。

いくつかの例において、ガイドＲＮＡのポリペプチド結合セグメントは、例えば、ガイドＲＮＡのテトラループおよび／またはステムループ２ドメインに融合され得る、ＭＳ２結合セグメントである。そのような結合ドメインは、当業者によく知られている。例えば、Konermann et al., Nature 2015, 517: 583－588 （および補足資料）を参照のこと（その開示内容全体は、引用により本明細書中に包含される）。

転写モジュレーター
本発明の転写モジュレーターは、少なくとも１つのＲＮＡ結合ドメイン（ガイドＲＮＡのポリペプチド結合セグメントに結合することができる）および少なくとも１つの機能的ドメイン（例えば、転写活性化ドメインまたはリプレッサードメイン）を含む。転写モジュレーターのＲＮＡ結合ドメインとガイドＲＮＡとの相互作用に基づき、転写モジュレーターは、目的の特定の遺伝子、細胞ゲノム内のＤＮＡ位置（例えば、内在性リプログラミング因子遺伝子のプロモーター領域）に標的化される。目的の内在性遺伝子への転写モジュレーターの動員は、標的遺伝子の発現を調節し、それによって細胞リプログラミングに寄与する。そのような調節は、外来リプログラミング因子遺伝子の発現に代わり得る。例えば、外来ｏｃｔ３／４を、例えばポリペプチドをコードする発現ベクターにより細胞に導入する代わりに、内在性ｏｃｔ３／４遺伝子を細胞内で直接的に活性化させる。

転写モジュレーターのＲＮＡ結合ドメイン（ＢＤ）
ＲＮＡ結合ドメインまたはＲＮＡ結合ポリペプチドは、当業者によく知られており、例えば、米国特許出願公開第２０１４／００６８７９７号、同第２０１４／０２７３０３７号、同第２０１４／０２７３２２６号、同第２０１４／０２９５５５６号、同第２０１４／０２９５５５７号、同第２０１４／０３４９４０５号、同第２０１５／００４５５４６号、同第２０１５／００７１８９８号、同第２０１５／００７１８９９号および同第２０１５／００７１９０６号に記載されている（その開示内容全体は、引用により本明細書中に包含される）。本発明のいくつかの態様において、ＲＮＡ結合ドメインは、酵素的に不活性なＣａｓ９ポリペプチド（ｄＣａｓ９）を含む。いくつかの例において、転写モジュレーターのＲＮＡ結合ドメインがｄＣａｓ９（例えば、ＭＳ２)ではない場合、例えば、ｄＣａｓ９が、ガイドＲＮＡとのＤＮＡ結合複合体を形成するために必要とされるため、細胞にｄＣａｓ９がさらに提供される。あるいは、細胞を、少なくとも２つの転写モジュレーターであって、そのうち少なくとも１つがｄＣａｓ９ベースである転写モジュレーターと接触させる。いくつかの例において、転写モジュレーターのＲＮＡ結合ドメインは、ＭＳ２ポリペプチドを含む。

転写モジュレーターのＲＮＡ結合ドメインは、一般的に、少なくとも１つの機能的ドメイン、例えば、ＶＰ６４、ｐ６５またはＨＳＦ１などのトランス活性化ドメインに融合される。いくつかの例において、ｄＣａｓ９またはＭＳ２などのＲＮＡ結合ドメインは、１つの機能的ドメインに正確に融合される。例えば、本発明の転写モジュレーターは、ｄＣａｓ９－ＶＰ６４またはｄＣａｓ９と組み合わせたＭＳ２－ｐ６５なる一般構造を有し得る。他の例において、ｄＣａｓ９またはＭＳ２などの単一のＲＮＡ結合ドメインは、複数の機能的ドメインに融合している（機能的ドメインはそれぞれ独立して選択される）。転写モジュレーターが少なくとも２つの機能的ドメインを含むとき、機能的ドメインは、直線的にＲＮＡ結合ドメインに結合され得る。例えば、本発明の転写モジュレーターは、ＭＳ２－ｐ６５－ＨＳＦ１なる一般構造を有し得る。

転写モジュレーターの機能的ドメイン（ＦＤ）
本発明の転写モジュレーターは、少なくとも１つの機能的ドメインを含む。機能的ドメインは、ＤＮＡからメッセンジャーＲＮＡへの遺伝情報の転写速度を制御することができるドメインであり得る。機能的ドメインは、この機能を単独で、あるいはＲＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡからＲＮＡへの遺伝情報の転写を行う酵素）の動員を促進するか（アクティベーターとして）、または阻止することにより（リプレッサーとして）、複合体において他のタンパク質と共に実行することができる。通常、ＤＮＡ結合転写因子の一部であるこのような転写活性化ドメインは、当業者によく知られている。本発明のいくつかの態様において、機能的ドメインは、ＶＰ６４、ｐ６５およびＨＳＦ－１（ヒトヒートショック因子１）（遺伝子発現のアクティベーター）またはＫＲＡＢ（遺伝子発現の抑制因子）の活性化ドメインから選択される。

いくつかの態様において、機能的ドメイン（例えば、転写活性化ドメインまたはリプレッサードメイン）は、ＲＮＡ結合ドメインのアミノ末端またはカルボキシ末端に融合される。いくつかの例において、ＲＮＡ結合ドメインはｄＣａｓ９であり、機能的ドメイン（例えば、転写活性化ドメイン）は、ｄＣａｓ９ポリペプチドのＣ末端またはＮ末端に融合される。他の例において、機能的ドメイン（例えば、転写活性化ドメイン）は、ＲＮＡ結合ドメインの内部アミノ酸残基に融合される。他の例において、ＲＮＡ結合ドメインは、機能的ドメインの内部アミノ酸残基に融合される。

いくつかの例において、本発明の方法は、単一遺伝子の発現を調節するために少なくとも２つの転写モジュレーターを利用する。そのような組み合わせの一例は、ｄＣａｓ９とＭＳ２の両方に結合し得るｇＲＮＡと組み合わせたｄＣａｓ９－ＶＰ６４およびＭＳ２－ｐ６５－ＨＳＦ１である。例えば、上記のKonermannらの文献を参照のこと。

転写モジュレーターの組み合わせ例としては、
１．ｄＣａｓ９－［（ＦＤ^１）_ｍ－ＦＤ］_ｎ；
２．ｄＣａｓ９と組み合わせたＢＤ^１－［（ＦＤ^１）_ｍ－（ＦＤ）］_ｎ；および、
３．ｄＣａｓ９－［（ＦＤ^１）_ｍ－（ＦＤ）］_ｎと組み合わせたＢＤ^１－［（ＦＤ^１）_ｍ－（ＦＤ）］_ｎ
が挙げられ、
ここで、式中、ＢＤ^１は、ｄＣａｓ９以外のＲＮＡ結合ドメインであり、ＦＤ^１およびＦＤは、独立して選択された機能的ドメイン（それらは、同じでも、異なっていてもよい）、ｍは、０および１から独立して選択される整数であり、そしてｎは、１から１０より独立して選択される整数である。上記の態様の一例において、整数ｎは、１から５から独立して選択される（例えば、１または２である）。別の例において、ｎはそれぞれ１である。上記の態様における別の例において、ｍは０である。

リプログラミング
体細胞に合成転写因子（ガイドＲＮＡおよび転写モジュレーターを含む）を導入する方法は、精製ＲＮＡまたはポリペプチド；または、該ポリペプチドをコードする核酸を細胞に提供することを含む。

標的哺乳動物細胞に外来遺伝子を導入するのに有用な多くのベクターが利用可能である。ベクターは、例えばプラスミドとして、またはサイトメガロウイルス、アデノウイルスなどのウイルス由来ベクターとして、エピソーム的に維持されてもよい。合成転写因子の発現ベクターは、一般的に、所望の遺伝子の発現を駆動する、すなわち、転写活性化するのに好適なプロモーターを含む。これには、偏在的（ubiquitously）に作用するプロモーター、例えばＣＭＶベータ作用プロモーター、または誘導性プロモーター、例えば、特に細胞集団において活性であるか、またはテトラサイクリンなどの薬物の存在に応答するプロモーターが含まれる。転写活性化により、転写が、標的細胞の基底レベルを超えて、少なくとも、または約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１００倍または１０００倍増加することが意図される。

例えば、ヒトｉＰＳＣを調製するために、出発体細胞（例えば、ヒトＰＢＭＮＣ）を培養し、所定のベクターの組合せによるヌクレオフェクションによりトランスフェクションして、リプログラミングを誘導する。いくつかの例において、ベクター（複数可）は、エピソーマルプラスミドである。

例えば、凍結保存された出発細胞は、遠心分離によって集められ、組織培養プレート上に播種され（例えば、６ウェルプレート；２～４×１０^６細胞／ｍｌ）、そして適切な条件下、例えば、加湿された３７℃の酸素正常状態のインキュベーター（例えば、２０．９％ Ｏ_２；５％ ＣＯ_２）中で増殖させた。

特定の増殖期間（例えば、約３日)後、細胞を細胞を遠心分離によって回収し、適切な増殖培地（例えば、すべての添加物を含むＰＢＭＣ培地）に懸濁し、計数し得る。その後、細胞を組織培養プレート上に播種し（例えば、６ウェルプレート、０．５～１×１０^６細胞／ｍｌ）、適切な条件下、例えば、加湿された３７℃の酸素正常状態のインキュベーター（例えば、２０．９％ Ｏ_２；５％ ＣＯ_２）中で増殖させた。

適当な増殖期間（例えば、約６日)後、細胞を、適切な条件（例えば、LONZA 4D Nucleofector^（商標））下で、リプログラミングプラスミドを含む適切な培地（例えば、１００μｌのLonza P3 Nucleofector^（商標）溶液）中でヌクレオフェクションに供し得る。

ヌクレオフェクションの後、体細胞を、フィーダー層細胞を含む従来の培養培地中で維持することができるか、またはフィーダー層の非存在下で、すなわち、分化多能性に誘導されるもの以外の体細胞を欠いて、培養することができる。フィーダー層を含まない培養物は、タンパク質コーティングされた表面、例えばマトリゲルなどを利用してもよい。体細胞は、懸濁液中で維持されてもよいか、またはマイクロキャリアに結合されてもよい。

例えば、ヌクレオフェクション後、細胞を、適切な培地（例えば、全ての添加物を含むＰＢＭＣ培地）を用いて希釈し、リプログラミングをサポートする適切な培地（例えば、６ウェルプレート、Lonza L7 hPSC Matrix^（商標）、全ての添加物、必要に応じてLonza episomal Enhancer A^（商標）などのリプログラミングエンハンサーを含むＰＢＭＣ培地）中で適当な組織培養プレートに移し得る。その後、適当な時間（例えば、約２日間）、３７℃（３％ Ｏ_２；５％ ＣＯ_２）の低酸素加湿インキュベーター中で、適切な条件下で、細胞を増殖させ、それにより細胞のリプログラミングを可能にする。

適切な増殖期間（例えば、ヌクレオフェクションの約２日）後に、ｉＰＳＣ増殖およびコロニー形成をサポートする適当な培養培地（例えば、添加物を含むLonza L7 hPSC Culture Medium^（商標）)を、ヌクレオフェクトした細胞に添加する。その後（例えば、ヌクレオフェクションの約４日後）、培地を、ｉＰＳＣ増殖およびコロニー形成をサポートする適当な培養培地（例えば、添加物を含むLonza L7 hPSC Culture Medium^（商標））に置き換える。次いで、細胞を、適当な時間（例えば、約１４日間）、３７℃（３％ Ｏ_２；５％ ＣＯ_２）の低酸素加湿インキュベーター中で、適切な条件下で、増殖させ得る。

ｉＰＳＣコロニーが継代培養するのに十分な大きさになるまで、必要に応じて培地を交換することができる。最初のｉＰＳＣコロニーを、適切な培地（例えば、添加物を含むL7 hPSC Culture Medium^（商標）)を用いて別個のウェル（例えば、L7 hPSC Matrix^（商標）)に手動で継代し、適当な条件下、例えば、加湿した３７℃のインキュベーター中、正常酸素状態(２０．９％ Ｏ_２； ５％ ＣＯ_２）で、インキュベートしてよい。ｉＰＳＣのその後の継代（例えば、Ｐ３およびそれ以降の継代）には、適当な継代溶液（例えば、Lonza L13 hPSC Passaging Solution^（商標））を用いてもよい。

いくつかの態様において、体細胞集団を外来性のリプログラミング因子とさらに接触する。出発体細胞集団を、細胞を多能性へとリプログラムするのに十分な組合せおよび量で、上記で定義したようなリプログラミング因子と接触させる。リプログラミング因子は、体細胞に個別に、またはリプログラミング因子の単一の組成物として、すなわち、予め混合された組成物として、提供され得る。リプログラミング因子は、対象細胞に異なる時間に同時にまたは連続して添加されてよい。リプログラミング因子の用量は、細胞の性質、因子、培養条件などによって変わり得る。いくつかの態様において、用量は、各因子について約１ｎＭから約１μＭ、より一般的には、約１０ｎＭから約５００ｎＭ、または約１００から２００ｎＭであり得る。

いくつかの態様において、リプログラミング因子ポリペプチドは、ポリペプチド透過性ドメインに融合したリプログラミング因子のポリペプチド配列を含み得る。ポリペプチド、ペプチド模倣体および非ペプチド担体などの多数の透過性ドメインは、当技術分野で公知であり、本発明において使用され得る。例えば、透過性ポリペプチドは、ペネトラチンと呼ばれるショウジョウバエメラノガスター転写因子アンテナペディアの第３αヘリックスに由来し得る。

リプログラミング効率は、コロニー数（例えば、形態またはアルカリホスファターゼ染色）により決定することができる。

ｉＰＳＣは、ｈＥＳＣ様の形態を有し、大きな核－細胞質比、明確な境界および明瞭な核を有する平坦なコロニーとして成長する。さらに、ｉＰＳＣは、アルカリホスファターゼ、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、ｓｏｘ２、ｏｃｔ３／４、ｎａｎｏｇ、ＴＲＡ１６０、ＴＲＡ１８１、ＴＤＧＦ １、Ｄｎｍｔ３ｂ、ＦｏｘＤ３、ＧＤＦ３、Ｃｙｐ２６ａ１、ＴＥＲＴおよびｚｆｐ４２を含むが、これらに限定されない、当業者によく知られている１種以上の主要な多様性マーカーを発現し得る。さらに、ｉＰＳＣは、奇形腫（テラトーマ）を形成し得る。さらに、それらは、生体内の外胚葉、中胚葉、または内胚葉組織を形成するか、またはそれに寄与し得る。

遺伝子は、様々な目的のために体細胞またはそれに由来するｉＰＳＣに導入され得て、例えば、機能欠失型の遺伝子を置き換えて、マーカー遺伝子などを提供し得る。あるいは、アンチセンスｍＲＮＡまたはリボザイムを発現するベクターを導入することにより、望ましくない遺伝子の発現を阻止することができる。遺伝子療法の他の方法は、正常な前駆細胞が、利点を有し、選択圧、例えば多剤耐性遺伝子（ＭＤＲ）、またはｂｃｌ－２などの抗アポトーシス遺伝子を受けることを可能にする、薬剤耐性遺伝子の導入である。標的細胞に核酸を導入するために、上記の、例えばエレクトロポレーション、カルシウム沈降ＤＮＡ法、融合、トランスフェクション、リポフェクション、感染などの当技術分野で公知の様々な技術を用いることができる。ＤＮＡが導入される特定の様式は、本発明の実施に重要ではない。

ある側面において、本発明は、本明細書に記載の方法によって作製されるｉＰＳ細胞を提供する。

使用方法
上記の方法により作製されたｉＰＳＣは、レシピエントにおいて分化中の細胞または分化した細胞を再構成（reconstituting）または補充（supplementing）するために用いられ得る。誘導された細胞は、様々な系列の細胞型に分化することができる。分化した細胞の例としては、外胚葉（例えば、ニューロンおよび線維芽細胞）、中胚葉（例えば、心筋細胞）、または内胚葉（例えば、膵臓細胞）系統からの分化細胞が挙げられる。分化細胞は、膵臓β細胞、神経幹細胞、ニューロン（例えば、ドーパミン作動性ニューロン)、乏突起膠細胞、乏突起膠細胞前駆細胞、肝細胞、肝幹細胞、星状細胞、筋細胞、造血細胞または心筋細胞の１以上であり得る。

誘導された細胞をより特殊化した細胞種に分化させるための多くの方法がある。誘導された細胞を分化させる方法は、幹細胞、特にＥＳ細胞、ＭＳＣ、ＭＡＰＣ、ＭＩＡＭＩ、造血幹細胞（ＨＳＣ）を分化させるために用いられるものと同様の方法であり得る。ある場合において、分化は、エクスビボで起こる。ある場合において、分化は、インビボで起こる。

誘導された細胞、または誘導された細胞から分化した細胞は、疾患（例えば、遺伝子疾患）を処置するための療法として用いられ得る。いくつかの側面において、本発明は、患者における幹細胞療法に適する疾患を処置する方法を提供する。例示的な方法は、本明細書に記載のｉＰＳ細胞および薬学的に許容される担体を含む治療的有効量の医薬組成物をそれを必要とする患者に投与することを含む。

療法は、疾患の原因を処置することに指向してもよい。あるいは、療法は、疾患または病状の作用を処置することであってもよい。誘導された細胞は、対象の損傷部位に、またはそれに近接して移入され得る。または、細胞は、該細胞を損傷部位に移動させるか、または帰巣（home）させるのを可能にする方法で対象に導入され得る。移入された細胞は、ダメージを受けた細胞または損傷細胞を有利に置き換え、対象の全体的な状態の改善を可能にし得る。いくつかの例では、移入された細胞は、組織の再生または修復を刺激し得る。

移入された細胞は、誘導細胞から分化した細胞であってもよい。移入された細胞はまた、誘導された細胞から分化した複能性幹細胞であってもよい。いくつかの場合、移入された細胞は、分化していない誘導された細胞であってもよい。

対象への処置の投与回数は様々であり得る。誘導された細胞および／または分化した細胞を対象に導入することは、単発事象（one－time event）であり得るが、特定の状況では、かかる処置は、限定された期間の間に改善を導き、進行中の一連の反復治療を必要とすることがある。他の状況では、細胞の複数回の投与が、効果が観察される前に必要とされ得る。正確なプロトコールは、疾患または病状、疾患の段階および処置される個々の対象のパラメーターによって変わる。

細胞は、以下の経路：非経腸、静脈内、動脈内、筋肉内、皮下、経皮、気管内、腹腔内または脊髄液のいずれかの経路を介して対象に導入され得る。

ｉＰＳＣは、生理的に許容される媒体中で投与され得る。それらは、単独で、または例えば、それらが移植されている組織におけるそれらの増殖および／または組織化を支持する適切な基質またはマトリックスと共に提供され得る。通常、少なくとも１ｘ１０^５個の細胞、好ましくは１ｘ１０^６個以上が投与される。細胞は、注射、カテーテルなどによって導入することができる。細胞は、液体窒素温度で凍結し、解凍時に使用できるよう長期間貯蔵することができる。凍結した場合、細胞は通常、１０％ ＤＭＳＯ、５０％ ＦＣＳ、４０％ ＲＰＭＩ １６４０培地中に保存される。解凍後、細胞は、前駆細胞の増殖および分化に関連する増殖因子および／または間質細胞の使用によって増大され得る。

実施例１
ヒトＰＯＵ５Ｆ１／ＯＣＴ４遺伝子転写の内因性活性化によるリプログラミングレスキュー（ＣＲＩＳＰＲベースのリプログラミング）
ベクター配列
ｄＣａｓ９、ｄＣａｓ９－ＶＰ６４およびガイドＲＮＡ構築物のＤＮＡ配列を、Mali, P.らの“CAS9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering”, Nat Biotechnol 2013, 31(9): 833－8（その開示内容全体を引用により本明細書中に包含させる）に記載の通りに調製した。ＭＳ２結合ループおよびＭＳ２転写調節因子融合タンパク質（例えば、ＭＳ２－ＶＰ６４）を含むｇＲＮＡのさらなる配列を、Konermannらの、Nature 2015、517: 583－588 （および補足資料）（その開示内容全体を引用により本明細書中に包含させる）に記載の通りに調製した。GeneARTにより配列を合成し、エピソーマルクローニングベクターにクローニングした。これらのベクターを、以下の実験に直接用いた。

ヒトＰＯＵ５Ｆ１／ＯＣＴ４転写活性化のためのｇＲＮＡの選択
ヒト末梢血単核細胞（ｈＰＢＭＣ）を６日間培養し、その後、ｄＣａｓ９およびｇＲＮＡをコードするベクターの種々の組み合わせをトランスフェクトした（以下の表１を参照のこと）。トランスフェクションは、Lonza 4D Nucleofector^（商標）（program EO－115）およびLonza P3 Primary Cell 4D－Nucleofector^（商標）キットを用いて、各プラスミドの組み合わせを１０^６個の細胞にヌクレオフェクションすることにより達成した。細胞を完全ＨＰＧＭに播種し、さらに４８時間培養した。細胞ペレットを回収し、全ＲＮＡを精製して、ヒトＰＯＵ５Ｆ１／ＯＣＴ４ ｍＲＮＡの内在性レベルを検出するために、ｑｔ－ＰＣＲを実施した。

ヒトＰＢＭＣのフィーダー非依存性リプログラミング
ｈＰＢＭＮＣをヌクレオフェクトして、下記のプロトコールおよび以下のベクターの組み合わせを用いてリプログラミングを誘導した：（ａ）以下をコードする５ベクター：１．Ｏｃｔ４；２．Ｓｏｘ－２およびｋｌｆ４；３．ｌｉｎ２８およびｃ－Ｍｙｃ；４．Ｐ５３ＤＤ；５．ＥＢＮＡ－１陽性対照（“Ｏｋｉｔａ ｓｅｔ”）；（ｂ）Ｏｃｔ４をコードするベクターなしのＯｋｉｔａ ｓｅｔ；および、（ｃ）Ｏｃｔ４をコードするベクターを有さないＯｋｉｔａ ｓｅｔと、Ｏｃｔ４転写を誘導することが見出されたＣａｓ－９－ＶＰ６４およびｇＲＮＡをコードする上記のベクター。

リプログラミング効率は、コロニー数（形態またはアルカリホスファターゼ染色による）およびコロニー品質（形態による）によって決定した。

以下の手順および上記のエピソーマルプラスミドを用いて、ヒトＰＢＭＣをリプログラミングすることによって、ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を作製した。

材料：ｈＰＢＭＣ（Lonzaカタログ番号CC－2702、(５０ｘ１０^６ 細胞／バイアル)；Lonza L7 hPSC Culture Medium^（商標）および添加因子（Supplement）キット；Lonza L13 hPSC Passaging Solution^（商標）；Lonza L7 hPSC Matrix^（商標）；Lonza 4D Nucleofector^（商標）；Lonza P3 Primary Cell 4D－Nucleofector^（商標）キット；Lonza Episomal Reprogramming Kit^（商標） (Episomal Reprogramming Plasmid Mix^（商標）；Episomal Enhancer A^（商標）)；６ウェルおよび１２ウェル組織培養処理プレート；ＰＢＭＣ基礎培地；HPGM^（商標）；抗生物質を含まないPoietics^（商標）造血前駆細胞増殖培地；PBMC培地サプリメント（表２参照）。

ｈＰＢＭＣをＰＢＭＣ基礎培地中で遠心した（２００×ｇで１５分間）。培地を除去し、細胞ペレットを全てのサプリメントを含むＰＢＭＣ培地１０ｍｌに分散させた。細胞を計数し、６ウェルの組織培養処理プレートに２～４×１０^６ 細胞／ｍｌで播種した。プレートを加湿式３７℃インキュベーターに入れ、正常酸素条件（２０．９％ Ｏ_２； ５％ ＣＯ_２）下に保った。

３日目に、細胞を、ＰＢＭＣ基礎培地を用いて１５ｍｌの遠心管に移し、２００ ｘ ｇで５分間遠心した。培地を除去し、細胞ペレットを、全てのサプリメントを含むＰＢＭＣ培地１０ｍｌに懸濁させた。細胞を計数し、６ウェルプレートに０．５～１×１０^６ 細胞／ｍｌで播種した。プレートを、正常酸素条件（２０．９％ Ｏ_２； ５％ ＣＯ_２）下加湿式３７℃インキュベーターに入れた。

６日目に、全てのサプリメントを含む２ｍｌのＰＢＭＣ培地を、６ウェルプレート（L7 hPSC Matrix^（商標）で予め処理した）の各ウェルに添加した。６μｌのEpisomal Enhancer A^（商標）を各ウェルに添加した。プレートを、３７℃にて、低酸素加湿インキュベーター（３％ Ｏ_２； ５％ ＣＯ_２）で１時間、予め平衡化させた。ＰＢＭＣ基礎培地中、１ ｘ １０^６個の細胞を、１５ｍＬチューブに移し、２００×ｇで５分間遠心した。上清を除去し、細胞をヌクレオフェクション試薬（１００μｌのP3 Nucleofector^（商標） 溶液を、３μｇのEpisomal Reprogramming Plasmid Mix^（商標）を含むチューブに分注した）に懸濁させた。

細胞をNucleocuvette^（商標）に移し、ヌクレオフェクションした（4D Nucleofector^（商標））。約５００μｌのＰＢＭＣ培地（全てのサプリメントを含む）をキュベットに添加し、細胞を平衡化した６ウェルプレートに直接移した。プレートを、３７℃にて、低酸素加湿インキュベーター（３％ Ｏ_２； ５％ ＣＯ_２）中に２日間、置いた。

８日目に、２ｍｌのL7 hPSC Culture Medium^（商標）（全てのサプリメントを含む）を、ヌクレオフェクションした細胞を有する各ウェルに添加した。コロニーが継代培養するのに十分な大きさになるまで、細胞をL7 hPSC Culture Medium^（商標）中、低酸素条件下で培養した。

ｉＰＳＣコロニーの継代
１２ウェルプレートを、L7 hPSC Matrix^（商標）で予め処理し、出発コロニーを、全てのサプリメントを含むL7 hPSC Culture Medium^（商標）を用いて別個のウェルに播種した。プレートを、正常酸素条件下、加湿した３７℃のインキュベーター（２０．９％ Ｏ_２； ５％ ＣＯ_２）中でインキュベートした。Ｐ３およびそれ以降の継代では、L13 hPSC Passaging Solution^（商標）を用いた。

実施例２
ヒトＯＣＴ４遺伝子転写の内在性活性化によるリプログラミングレスキュー（ＣＲＩＳＰＲベースのリプログラミング）
ベクター配列
ｄＣａｓ９タンパク質のＣ末端に融合したＶＰ６４－ｐ６５－Ｒｔａ活性化ドメインからなるｄＣａｓ９－ＶＰＲおよびガイドＲＮＡ構築物のＤＮＡ配列を、Mali, P1らの(Mali, P. et al. “CAS9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering”, Nat Biotechnol 2013, 31(9): 833－8)およびChavez, Aらの(Chavez, A. et al, “Highly efficient Cas9－mediated transcriptional programming”, Nat Methods. 2015 Apr；12(4):326－8）に記載の通りに調製した。GeneARTにより配列を合成し、標準クローニングベクターにクローニングした。これらのベクターを、以下の実験で直接用いた。

ヒトＯＣＴ４転写活性化のためのｇＲＮＡ組合せの決定
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、一過性のＣａｓ９－ＶＰＲおよびｇＲＮＡをコードするベクター（表１参照）の様々な組合せでトランスフェクトした。Lipofectamine 2000^{（登録商標）}試薬を用いてプラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に同時トランスフェクションした。トランスフェクションの４８時間後に細胞ペレットを回収した。全ＲＮＡを精製し、内因性レベルのｈＯＣＴ４ ｍＲＮＡを検出するためにｑＲＴ－ＰＣＲを実施した。

高レベルのｈＯＣＴ４ ｍＲＮＡが、２つのｇＲＮＡ（１８＋２０）または７つのｇＲＮＡ（１５－２１）（それぞれ、約３６０倍および約１３８０倍、図１参照）で同時トランスフェクションされたｄＣａｓ９－ＶＰＲにより産生された。対照ｉＰＳＣ細胞における内在性レベルのヒトＰＯＵ５Ｆ１／ＯＣＴ４ ｍＲＮＡは、ベースラインより約５９００倍高かった。より高いレベルのｈＯＣＴ４ ｍＲＮＡが７つのｇＲＮＡ（１５－２１）を用いて検出されたが、プラスミドの大きなサイズは、将来のリプログラミング実験におけるトランスフェクションの効率に影響を与える可能性がある。従って、リプログラミング実験のためにエピソームＣＲＩＳＰＲベクターを産生するために、２つのｇＲＮＡ（１８＋２０）の組合せを用いる決定がなされた。

内在性ヒトＰＯＵ５Ｆ１／ＯＣＴ４遺伝子転写の活性化のためのエピソームＣＲＩＳＰＲベクターの作製
ｈＯＣＴ４転写活性化のためのエピソームＣＲＩＳＰＲベクターを、ｄＣａｓ９－ＶＰＲおよびGeneArtによって合成されたｇＲＮＡ（１８＋２０）をｐＣＥエピソーマルベクターにクローニングすることにより作製した（ｐＣＥ－ｄＣａｓ９－ＶＰＲ－ＯＣＴ４）。さらに、ｄＣａｓ９－ｅＧＦＰ融合タンパク質を発現するベクターを、トランスフェクション対照として作製した（ｐＣＥ－ｄＣａｓ９－ｅＧＦＰ）。エピソーマルベクター ｐＣＥ－ｄＣａｓ９－ＶＰＲ－ＯＣＴ４の機能を、免疫蛍光分析およびｑＲＴ－ＰＣＲを用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞において確認した。同様のトランスフェクション効率が、一過性のｄＣａｓ９－ｅＧＦＰおよびエピソームｐＣＥ－ｄＣａｓ９－ｅＧＦＰベクターを用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞において達成された（図２Ａ）。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるｈＯＣＴ４の同様の活性化が、エピソームおよび一過性のＣＲＩＳＰＲ－ｈＯＣＴ４ベクターで達成された（図２Ｂ）。エピソームｄＣａｓ９－ｅＧＦＰおよびｐＣＥ－ｄＣａｓ９－ｅＧＦＰベクターを、以下の実験に直接用いた。

内在性ヒトＯＣＴ４遺伝子転写のＣＲＩＳＰＲ介在性活性化によるリプログラミングレスキュー
ヒト細胞リプログラミングにおいて外来ＯＣＴ４を置換するためにＣＲＩＳＰＲ技術を用い得ることを実証するために、２種のヒト体細胞、ヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）および末梢血単核細胞（ＰＢＭＮＣ）を、ｄｈＯＣＴ４活性化のためのＣａｓ９－ＶＰＲおよびｇＲＮＡをコードするエピソーマルベクター（ｐＣＥ－ｄＣａｓ９－ＶＰＲ－ＯＣＴ４）を、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８およびＬ－ＭＹＣ（ｐＣＥ－ｈＯＣＴ３／４を含む、または含まないＯＫＩＴＡ ｓｅｔ）をコードするエピソーマルＯＫＩＴＡベクター (ｏｒｉＰ／ＥＢＮＡ－１を含むベクター； Okita et al., Stem Cells 31: 458－466 (2013)； Okita et al., Nature Methods 8:409－412 (2011))と共に用いて再プログラムした。ＣＲＩＳＰＲ介在性リプログラミングの陽性対照として、体細胞にＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８およびＬ－ＭＹＣ（完全ＯＫＩＴＡ ｓｅｔ）をコードするエピソーマルＯＫＩＴＡベクターをトランスフェクトした。トランスフェクションは、Lonza 4D Nucleofector^（商標） (program EO－115)およびLonza P3 Primary Cell 4D－Nucleofector^（商標） キットを用いて、各プラスミド組合せ（表２参照）で体細胞をヌクレオフェクションすることによって行った。

上記のトランスフェクション手順を用いて、ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を、ＨＦＦおよびＰＢＭＮＣの両方をリプログラミングすることにより作製した。リプログラミング効率を、コロニー数によって決定した（図３Ａ参照）。一般的に、より高いリプログラミング効率が、ＨＦＦと比較して、ＰＢＭＮＣにおいて達成された。ｐＣＥ－ｄＣａｓ９－ＶＰＲ－ＯＣＴ４ （ＣＲＩＳＰＲ－ＯＣＴ４）ベクター を用いたリプログラミングは、完全なOkita setを用いたリプログラミングと比較して、ＨＦＦおよびＰＢＭＮＣともに低かった(それぞれ、約４倍および約２．５倍、図３Ｂ参照)。これらの結果は、ＣＲＩＳＰＲによるＯＣＴ４の内因性活性化が、外来ＯＣＴ４の不存在下でのリプログラミングを‘レスキュー’し得ることを示している。

ＣＲＩＳＰＲ技術を用いてＨＦＦおよびＰＢＭＮＣをリプログラミングすることにより作製されたｉＰＳＣコロニー遺伝子を手動で採取し、５から６継代にわたって増殖させた。その後、これらのｉＰＳＣクローンを、細胞形態、分化多能性マーカーの発現および多能性分化能に基づいて特徴づけた。ＨＦＦおよびＰＢＭＮＣ由来のｉＰＳＣクローン（それぞれ、ＨＦＦ－ｉＰＳＣおよびＰＢＭＮＣ－ｉＰＳＣ）は、ｈＥＳＣ様の形態を示し、大きな核－細胞質比、明確な境界および明瞭な核を有する平坦なコロニーとして成長した（図４Ａ参照）。ＨＦＦ－ｉＰＳＣおよびＰＢＭＮＣ－ｉＰＳＣは、ＯＣＴ４、ＳＳＥＡ４、ＮＡＮＯＧおよびＴＲＡ－１－８１などの多能性マーカーを発現した（図４Ａ参照）。ＨＦＦ－ｉＰＳＣの例に示す通り、ＣＲＩＳＰＲ介在性のリプログラミングによって産生されたｉＰＳＣは、胚体（ＥＢ）用のものであり、Ｐａｘ－６、ＳＭＡおよびＳｏｘ１７の発現によって示されるような外胚葉、中胚葉および内胚葉の３つの胚葉の細胞に分化する（図４Ｂ参照）。

他にこれと異なる記載がない限り、本明細書で用いられる全ての技術的および科学的用語ならびに略語は、本発明の技術分野における当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されたものと類似または等価な組成物、方法、キットおよび情報を伝達するための手段はいずれも本発明の実施に使用できるが、好ましい組成物、方法、キットおよび情報伝達手段は、本明細書に記載されている。

本明細書に引用された全ての文献は、法律で認められる限りにおいて、引用により本明細書中に包含される。これらの文献の考察は、単に著者らの記述を概説することを意図している。いかなる文献（または文献の一部）も関連する先行技術であるとは認めない。本願出願人らは、引用された文献の正確性および妥当性を争う権利を留保する。

さらなる側面において、本発明は、本明細書中に記載の方法を実施するためのキットを提供する。
本発明のさらなる態様を、以下に記載する：
［項１］
哺乳動物体細胞の核リプログラミングの方法であって、
哺乳動物体細胞を人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）へとリプログラムするのに十分な条件下で、かつそのための十分な時間をかけて、哺乳動物体細胞集団を分化多能性因子遺伝子の発現を活性化する合成転写因子と接触させること
を含む、方法。
［項２］
哺乳動物体細胞の核リプログラミングの方法であって、
哺乳動物体細胞を該哺乳動物体細胞とは細胞型が異なる標的細胞に分化転換するのに十分な条件下で、かつそのための十分な時間をかけて、哺乳動物体細胞集団を分化多能性因子遺伝子の発現を活性化する合成転写因子と接触させること
を含む、方法。
［項３］
該哺乳動物体細胞がヒト細胞である、項１または２に記載の方法。
［項４］
該哺乳動物体細胞が線維芽細胞である、項３に記載の方法。
［項５］
該哺乳動物体細胞が初代血球細胞である、項３に記載の方法。
［項６］
該血球細胞が、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）または臍帯血単核細胞である、項５に記載の方法。
［項７］
合成転写因子が、
（ａ）ＤＮＡ結合セグメントおよびポリペプチド結合セグメントを含む少なくとも１つのガイドＲＮＡであって、ここで該ＤＮＡ結合セグメントが、分化多能性因子遺伝子のプロモーター領域に結合している、ガイドＲＮＡ；および、
（ｂ）該ガイドＲＮＡの該ポリペプチド結合セグメントに結合する、少なくとも１つの転写モジュレーター
を含む、項１から６のいずれか一項に記載の方法。
［項８］
該分化多能性因子遺伝子が、ｏｃｔ３／４、ｓｏｘ２、ｋｌｆ４、ｃ－ｍｙｃ、ｌｉｎ２８、ｎａｎｏｇ、ｇｌｉｓ－１、ｂｃｌ２およびｂｃｌｘからなる群より選択される、項７に記載の方法。
［項９］
該分化多能性因子遺伝子が、ｏｃｔ３／４、ｓｏｘ２、ｋｌｆ４、ｃ－ｍｙｃ、ｌｉｎ２８およびｎａｎｏｇからなる群より選択される、項８に記載の方法。
［項１０］
該分化多能性因子遺伝子がｏｃｔ３／４である、項９に記載の方法。
［項１１］
該転写モジュレーターが、酵素的に不活性なＣａｓ９ポリペプチド（ｄＣａｓ９）を含む、項７から１０のいずれか一項に記載の方法。
［項１２］
該ｄＣａｓ９が、転写活性化ドメインに融合している、項１１に記載の方法。
［項１３］
転写活性化ドメインが、ＶＰ６４またはｐ６５である、項１２に記載の方法。
［項１４］
哺乳動物体細胞の集団を、第２の分化多能性因子遺伝子の発現を抑制する第２の合成転写因子と接触させることをさらに含む、項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
［項１５］
発現抑制される第２の分化多能性因子遺伝子が、Ｐ１９Ａｒｆ、Ｐ１６Ｉｎｋ４ａ、ＲＯＣＫ、ＰＫＡ／ＰＫＧ／ＰＫＣファミリーキナーゼ遺伝子、および発現抑制されたときｍＴＯＲ経路を阻害する遺伝子から選択される、項１４に記載の方法。
［項１６］
該第２の合成転写因子が、転写抑制ドメインに融合されたｄＣａｓ９を含む第２の転写モジュレーターを含む、項１４または１５に記載の方法。
［項１７］
転写抑制ドメインがＫＲＡＢである、項１６に記載の方法。
［項１８］
該哺乳動物体細胞の集団を、該合成転写因子をコードする少なくとも１つの発現ベクターと接触させる、項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
［項１９］
該発現ベクターが、非ウイルス性のエピソーマルベクターである、項１８に記載の方法。
［項２０］
該哺乳動物体細胞の集団を、該ガイドＲＮＡおよび該転写モジュレーターの両方をコードする発現ベクターと接触させる、項１８または１９に記載の方法。
［項２１］
該哺乳動物体細胞の集団を、該ガイドＲＮＡをコードする第１の発現ベクターおよび該転写モジュレーターをコードする第２の発現ベクターと接触させる、項１８または１９に記載の方法。
［項２２］
該哺乳動物体細胞の集団を、転写モジュレーターポリペプチドと接触させる、項７から１７のいずれか一項に記載の方法。
［項２３］
該哺乳動物体細胞の集団を、転写モジュレーターポリペプチドと接触させ、さらに単離されたｇＲＮＡ核酸と接触させる、項２２に記載の方法。
［項２４］
該哺乳動物体細胞の集団を、それぞれ異なる遺伝子を標的とする少なくとも３つの合成転写因子と接触させる、項１から２３のいずれか一項に記載の方法。
［項２５］
該哺乳動物体細胞の集団を、
（ｉ）転写活性化ドメインに融合されたｄＣａｓ９；
（ｉｉ）哺乳動物のｏｃｔ３／４遺伝子のプロモーター領域の少なくとも一部に相補的なＤＮＡ結合セグメントを含む、ｇＲＮＡ；
（ｉｉｉ）哺乳動物のｓｏｘ２遺伝子のプロモーター領域の少なくとも一部に相補的なＤＮＡ結合セグメントを含む、ｇＲＮＡ；および、
（ｉｖ）哺乳動物のｋｌｆ４遺伝子のプロモーター領域の少なくとも一部に相補的なＤＮＡ結合セグメントを含む、ｇＲＮＡ
と接触させる、項２４に記載の方法。
［項２６］
該哺乳動物体細胞の集団を、４つの異なる分化多能性因子遺伝子の発現を活性化する少なくとも４つの合成転写因子と接触させる、項１から２５のいずれか一項に記載の方法。
［項２７］
該ｉＰＳＣまたは該標的細胞を培養することをさらに含む、項１から２６のいずれか一項に記載の方法。
［項２８］
哺乳動物体細胞の初代培養細胞の核リプログラミングの方法であって、
哺乳動物体細胞の初代培養細胞を人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）へとリプログラムするのに十分な条件下で、かつそのための十分な時間をかけて、哺乳動物体細胞の初代培養細胞の集団を、
（ａ）（ｉ）分化多能性因子遺伝子のプロモーター領域の一部に相補的なＤＮＡ結合セグメント、および（ｉｉ）ポリペプチド結合セグメントを含む、少なくとも１つのガイドＲＮＡ；および、
（ｂ）（ｉ）該ガイドＲＮＡの該ポリペプチド結合セグメントに結合することができるｄＣａｓ９；および（ｉｉ）転写活性化ドメインおよびリプレッサードメインから選択される機能的ドメインを含む、少なくとも１つの転写モジュレーターと、
接触させることを含む、方法。
［項２９］
該転写活性化ドメインが、ＶＰ６４またはｐ６５である、項２８に記載の方法。
［項３０］
該分化多能性因子遺伝子が、ｏｃｔ３／４、ｓｏｘ２、ｃ－ｍｙｃ、ｋｌｆ４、ｎａｎｏｇおよびｌｉｎ２８から選択される、項２８に記載の方法。
［項３１］
哺乳動物体細胞の初代培養細胞が、ヒトの初代培養細胞である、項２８に記載の方法。
［項３２］
該哺乳動物体細胞の集団を少なくとも１つの外来性のリプログラミング因子と接触させることをさらに含む、項１から３１のいずれか一項に記載の方法。
［項３３］
該外来性のリプログラミング因子が、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８、Ｎａｎｏｇ、およびＳＶ４０ラージＴ－抗原、ならびにそれらの組合せから選択される、項３２に記載の方法。
［項３４］
該哺乳動物体細胞の集団を該外来性のリプログラミング因子をコードする発現ベクターと接触させる工程、または該哺乳動物体細胞の集団を細胞浸透性の外来性のリプログラミング因子ポリペプチドと接触させる工程を含む、項３２または３３に記載の方法。
［項３５］
項１から３４のいずれか一項に記載の方法により産生される、ｉＰＳＣの集団。
［項３６］
発現ベクターの成分を実質的に含まない、項３５に記載のｉＰＳＣの集団。
［項３７］
項３５に記載のｉＰＳＣおよび薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
［項３８］
治療的有効量の項３７に記載の医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、該患者における幹細胞療法に適している疾患の処置法。
［項３９］
哺乳動物体細胞の初代培養細胞の集団、少なくとも１つのガイドＲＮＡ、および該ガイドＲＮＡに結合する少なくとも１つの転写モジュレーターを含む、組成物。
［項４０］
項１から３４のいずれか一項に記載の方法を実施するためのキット。
［項４１］
分化多能性因子の候補遺伝子を識別するためのスクリーニング方法であって、
（ａ）哺乳動物体細胞を人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）へとリプログラムするのに十分な条件下で、かつそのための十分な時間をかけて、該哺乳動物体細胞の集団を、（ｉ）分化多能性因子の候補遺伝子のプロモーター領域の一部に相補的なＤＮＡ結合セグメント；および、ポリペプチド結合セグメントを含む少なくとも１つの候補ガイドＲＮＡ；および、
（ｉｉ）該候補ＲＮＡの該ポリペプチド結合セグメントに結合する、少なくとも１つの転写モジュレーターと接触させて、それにより試験細胞の集団を形成する工程；ならびに、
（ｂ）該試験細胞を培養する工程、
を含み、ここで、該分化多能性因子の候補遺伝子が、ｏｃｔ３／４、ｓｏｘ２、ｋｌｆ４、ｃ－ｍｙｃ、ｌｉｎ２８およびｎａｎｏｇから選択されるものではない、方法。
［項４２］
該試験細胞が、培養により、ｉＰＳＣの１以上のコロニーを形成する、項４１に記載の方法。
［項４３］
リプログラミング効率を測定することをさらに含む、項４１に記載の方法。
［項４４］
該哺乳動物体細胞の集団を候補ｇＲＮＡのライブラリーと接触させ、ここで、該ライブラリー内の各候補ｇＲＮＡが、実質的に、異なるＤＮＡ結合セグメントを含む、項４１に記載の方法。
［項４５］
該哺乳動物体細胞の集団を、該合成転写因子をコードする少なくとも１つの発現ベクターと接触させることを含む、項４１から４４のいずれか一項に記載の方法。
［項４６］
該哺乳動物体細胞の集団を少なくとも１つの外来性のリプログラミング因子と接触させることをさらに含む、項４１から４５のいずれか一項に記載の方法。

Claims (46)

1. 哺乳動物体細胞の核リプログラミングの方法であって、
   哺乳動物体細胞を人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）へとリプログラムするのに十分な条件下で、かつそのための十分な時間をかけて、哺乳動物体細胞集団を分化多能性因子遺伝子の発現を活性化する合成転写因子と接触させること
   を含む、方法。
2. 哺乳動物体細胞の核リプログラミングの方法であって、
   哺乳動物体細胞を該哺乳動物体細胞とは細胞型が異なる標的細胞に分化転換するのに十分な条件下で、かつそのための十分な時間をかけて、哺乳動物体細胞集団を分化多能性因子遺伝子の発現を活性化する合成転写因子と接触させること
   を含む、方法。
3. 該哺乳動物体細胞がヒト細胞である、請求項１または２に記載の方法。
4. 該哺乳動物体細胞が線維芽細胞である、請求項３に記載の方法。
5. 該哺乳動物体細胞が初代血球細胞である、請求項３に記載の方法。
6. 該血球細胞が、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）または臍帯血単核細胞である、請求項５に記載の方法。
7. 合成転写因子が、
   （ａ）ＤＮＡ結合セグメントおよびポリペプチド結合セグメントを含む少なくとも１つのガイドＲＮＡであって、ここで該ＤＮＡ結合セグメントが、分化多能性因子遺伝子のプロモーター領域に結合している、ガイドＲＮＡ；および、
   （ｂ）該ガイドＲＮＡの該ポリペプチド結合セグメントに結合する、少なくとも１つの転写モジュレーター
   を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
8. 該分化多能性因子遺伝子が、ｏｃｔ３／４、ｓｏｘ２、ｋｌｆ４、ｃ－ｍｙｃ、ｌｉｎ２８、ｎａｎｏｇ、ｇｌｉｓ－１、ｂｃｌ２およびｂｃｌｘからなる群より選択される、請求項７に記載の方法。
9. 該分化多能性因子遺伝子が、ｏｃｔ３／４、ｓｏｘ２、ｋｌｆ４、ｃ－ｍｙｃ、ｌｉｎ２８およびｎａｎｏｇからなる群より選択される、請求項８に記載の方法。
10. 該分化多能性因子遺伝子がｏｃｔ３／４である、請求項９に記載の方法。
11. 該転写モジュレーターが、酵素的に不活性なＣａｓ９ポリペプチド（ｄＣａｓ９）を含む、請求項７から１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 該ｄＣａｓ９が、転写活性化ドメインに融合している、請求項１１に記載の方法。
13. 転写活性化ドメインが、ＶＰ６４またはｐ６５である、請求項１２に記載の方法。
14. 哺乳動物体細胞の集団を、第２の分化多能性因子遺伝子の発現を抑制する第２の合成転写因子と接触させることをさらに含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 発現抑制される第２の分化多能性因子遺伝子が、Ｐ１９^Ａｒｆ、Ｐ１６^{Ｉｎｋ４ａ}、ＲＯＣＫ、ＰＫＡ／ＰＫＧ／ＰＫＣファミリーキナーゼ遺伝子、および発現抑制されたときｍＴＯＲ経路を阻害する遺伝子から選択される、請求項１４に記載の方法。
16. 該第２の合成転写因子が、転写抑制ドメインに融合されたｄＣａｓ９を含む第２の転写モジュレーターを含む、請求項１４または１５に記載の方法。
17. 転写抑制ドメインがＫＲＡＢである、請求項１６に記載の方法。
18. 該哺乳動物体細胞の集団を、該合成転写因子をコードする少なくとも１つの発現ベクターと接触させる、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
19. 該発現ベクターが、非ウイルス性のエピソーマルベクターである、請求項１８に記載の方法。
20. 該哺乳動物体細胞の集団を、該ガイドＲＮＡおよび該転写モジュレーターの両方をコードする発現ベクターと接触させる、請求項１８または１９に記載の方法。
21. 該哺乳動物体細胞の集団を、該ガイドＲＮＡをコードする第１の発現ベクターおよび該転写モジュレーターをコードする第２の発現ベクターと接触させる、請求項１８または１９に記載の方法。
22. 該哺乳動物体細胞の集団を、転写モジュレーターポリペプチドと接触させる、請求項７から１７のいずれか一項に記載の方法。
23. 該哺乳動物体細胞の集団を、転写モジュレーターポリペプチドと接触させ、さらに単離されたｇＲＮＡ核酸と接触させる、請求項２２に記載の方法。
24. 該哺乳動物体細胞の集団を、それぞれ異なる遺伝子を標的とする少なくとも３つの合成転写因子と接触させる、請求項１から２３のいずれか一項に記載の方法。
25. 該哺乳動物体細胞の集団を、
    （ｉ）転写活性化ドメインに融合されたｄＣａｓ９；
    （ｉｉ）哺乳動物のｏｃｔ３／４遺伝子のプロモーター領域の少なくとも一部に相補的なＤＮＡ結合セグメントを含む、ｇＲＮＡ；
    （ｉｉｉ）哺乳動物のｓｏｘ２遺伝子のプロモーター領域の少なくとも一部に相補的なＤＮＡ結合セグメントを含む、ｇＲＮＡ；および、
    （ｉｖ）哺乳動物のｋｌｆ４遺伝子のプロモーター領域の少なくとも一部に相補的なＤＮＡ結合セグメントを含む、ｇＲＮＡ
    と接触させる、請求項２４に記載の方法。
26. 該哺乳動物体細胞の集団を、４つの異なる分化多能性因子遺伝子の発現を活性化する少なくとも４つの合成転写因子と接触させる、請求項１から２５のいずれか一項に記載の方法。
27. 該ｉＰＳＣまたは該標的細胞を培養することをさらに含む、請求項１から２６のいずれか一項に記載の方法。
28. 哺乳動物体細胞の初代培養細胞の核リプログラミングの方法であって、
    哺乳動物体細胞の初代培養細胞を人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）へとリプログラムするのに十分な条件下で、かつそのための十分な時間をかけて、哺乳動物体細胞の初代培養細胞の集団を、
    （ａ）（ｉ）分化多能性因子遺伝子のプロモーター領域の一部に相補的なＤＮＡ結合セグメント、および（ｉｉ）ポリペプチド結合セグメントを含む、少なくとも１つのガイドＲＮＡ；および、
    （ｂ）（ｉ）該ガイドＲＮＡの該ポリペプチド結合セグメントに結合することができるｄＣａｓ９；および（ｉｉ）転写活性化ドメインおよびリプレッサードメインから選択される機能的ドメインを含む、少なくとも１つの転写モジュレーターと、
    接触させることを含む、方法。
29. 該転写活性化ドメインが、ＶＰ６４またはｐ６５である、請求項２８に記載の方法。
30. 該分化多能性因子遺伝子が、ｏｃｔ３／４、ｓｏｘ２、ｃ－ｍｙｃ、ｋｌｆ４、ｎａｎｏｇおよびｌｉｎ２８から選択される、請求項２８に記載の方法。
31. 哺乳動物体細胞の初代培養細胞が、ヒトの初代培養細胞である、請求項２８に記載の方法。
32. 該哺乳動物体細胞の集団を少なくとも１つの外来性のリプログラミング因子と接触させることをさらに含む、請求項１から３１のいずれか一項に記載の方法。
33. 該外来性のリプログラミング因子が、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８、Ｎａｎｏｇ、およびＳＶ４０ラージＴ－抗原、ならびにそれらの組合せから選択される、請求項３２に記載の方法。
34. 該哺乳動物体細胞の集団を該外来性のリプログラミング因子をコードする発現ベクターと接触させる工程、または該哺乳動物体細胞の集団を細胞浸透性の外来性のリプログラミング因子ポリペプチドと接触させる工程を含む、請求項３２または３３に記載の方法。
35. 請求項１から３４のいずれか一項に記載の方法により産生される、ｉＰＳＣの集団。
36. 発現ベクターの成分を実質的に含まない、請求項３５に記載のｉＰＳＣの集団。
37. 請求項３５に記載のｉＰＳＣおよび薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
38. 治療的有効量の請求項３７に記載の医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、該患者における幹細胞療法に適している疾患の処置法。
39. 哺乳動物体細胞の初代培養細胞の集団、少なくとも１つのガイドＲＮＡ、および該ガイドＲＮＡに結合する少なくとも１つの転写モジュレーターを含む、組成物。
40. 請求項１から３４のいずれか一項に記載の方法を実施するためのキット。
41. 分化多能性因子の候補遺伝子を識別するためのスクリーニング方法であって、
    （ａ）哺乳動物体細胞を人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）へとリプログラムするのに十分な条件下で、かつそのための十分な時間をかけて、該哺乳動物体細胞の集団を、（ｉ）分化多能性因子の候補遺伝子のプロモーター領域の一部に相補的なＤＮＡ結合セグメント；および、ポリペプチド結合セグメントを含む少なくとも１つの候補ガイドＲＮＡ；および、
    （ｉｉ）該候補ＲＮＡの該ポリペプチド結合セグメントに結合する、少なくとも１つの転写モジュレーターと接触させて、それにより試験細胞の集団を形成する工程；ならびに、
    （ｂ）該試験細胞を培養する工程、
    を含み、ここで、該分化多能性因子の候補遺伝子が、ｏｃｔ３／４、ｓｏｘ２、ｋｌｆ４、ｃ－ｍｙｃ、ｌｉｎ２８およびｎａｎｏｇから選択されるものではない、方法。
42. 該試験細胞が、培養により、ｉＰＳＣの１以上のコロニーを形成する、請求項４１に記載の方法。
43. リプログラミング効率を測定することをさらに含む、請求項４１に記載の方法。
44. 該哺乳動物体細胞の集団を候補ｇＲＮＡのライブラリーと接触させ、ここで、該ライブラリー内の各候補ｇＲＮＡが、実質的に、異なるＤＮＡ結合セグメントを含む、請求項４１に記載の方法。
45. 該哺乳動物体細胞の集団を、該合成転写因子をコードする少なくとも１つの発現ベクターと接触させることを含む、請求項４１から４４のいずれか一項に記載の方法。
46. 該哺乳動物体細胞の集団を少なくとも１つの外来性のリプログラミング因子と接触させることをさらに含む、請求項４１から４５のいずれか一項に記載の方法。