KR102433421B1 - Taz 단백질 또는 이의 변이체를 포함하는 제2형 당뇨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

TAZ 단백질 또는 이의 변이체를 포함하는 제2형 당뇨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 일 양상에 따르면, TAZ 단백질 또는 이의 변이체를 포함하는 약학적 조성물은 근육세포 내 IRS1의 발현을 증진시켜 인슐린 민감성을 높일 수 있으므로 제 2형 당뇨병의 예방, 개선, 또는 치료에 사용할 수 있다.

Description

TAZ 단백질 또는 이의 변이체를 포함하는 제2형 당뇨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for preventing or treating type 2 diabetes comprising TAZ protein or a variant thereof}

TAZ 단백질 또는 이의 변이체를 포함하는 제2형 당뇨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

TAZ (Transcriptional coactivator with PDZ-binding motif)는 14-3-3과 상호작용하는 세포 단백질로 동정된 바 있으며, TAZ는 또한 퍼옥시좀 증식자-활성화된 수용체-γ (PPARγ), 지방세포-특이적인 전사 인자와 상호작용을 수행하여, PPARγ 유도된 지방세포 분화의 저해를 야기한다. 또한, 중간엽 줄기세포에서 TAZ의 발현 수준은 조골세포 또는 지방세포로 세포 운명 결정에 대하여 중요한 역할을 하므로, TAZ는 중간엽 줄기세포 분화의 전사 조절자로 작용하는 것으로 인식되고 있다. 이 뿐만 아니라, TAZ는 갑상선 (thyroid) 전사 인자-1 (TTF-1/Nkx2.1), T-박스 전사 인자 (Tbx5), 페어드 박스 유전자 3 (Pax3), Gli-Similar 3 (Glis3) 및 Smad2/3-4 복합체를 포함하는 몇몇의 다른 전사인자와 상호작용을 하고, 그들의 전사 활성 및 세포 기능을 조절한다.

따라서, TAZ는 신장 및 폐 형성 (Park, K. S., 등(2004) J Biol Chem 279, 17384-17390;Kang, H. S., 등(2009) Mol Cell Biol 29, 2556-2569; Makita, R., 등 (2008) Am J Physiol Renal Physiol 294, F542-5535, 8, 12), 심장 및 팔다리 발생 (Murakami, M., Nakagawa, M., Olson, E. N., and Nakagawa, O. (2005) Proc Natl Acad Sci U S A 102, 18034-18039), 갑상선 분화 (Di Palma, T., 등 (2009) Exp Cell Res 315, 162-175), 배아 줄기세포 자가-재생 (Varelas, X., 등 (2008) Nat Cell Biol 10, 837-848), 및 내피-중간엽 전이 및 암세포의 침습 (Chan, S. W., 등 (2008) Cancer Res 68, 2592-2598;Lei, Q. Y., 등 (2008) Mol Cell Biol 28, 2426-2436)과 같은 생물학적 기능에 관여하는 것으로 알려져 있으나, 근육세포에 있어서 혈당 조절과 관련된 Wnt 신호전달 및 인슐린 민감성과 TAZ의 연관성에 대해서는 아직 알려진 바가 없다.

일 양상은 TAZ(Transcriptional coactivator with PDZ-binding motif) 단백질 또는 이의 변이체; 상기 단백질을 코딩하는 핵산분자; 및 상기 TAZ의 발현 또는 활성을 증가시키는 물질로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 제2형 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

다른 양상은 TAZ(Transcriptional coactivator with PDZ-binding motif) 단백질 또는 이의 변이체; 상기 단백질을 코딩하는 핵산분자; 및 상기 TAZ의 발현 또는 활성을 증가시키는 물질로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 제2형 당뇨병을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

일 양상은 TAZ(Transcriptional coactivator with PDZ-binding motif) 단백질 또는 이의 변이체; 상기 단백질을 코딩하는 핵산분자; 및 상기 TAZ의 발현 또는 활성을 증가시키는 물질로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 제2형 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 용어, "예방"은 일 양상에 따른 약학적 조성물을 개체에 투여하여 대사성 질환을 억제시키거나 지연시키는 모든 행위를 포함한다. 본 명세서에서 용어, "치료"는 일 양상에 따른 약학적 조성물을 개체에 투여하여 대사성 질환의 증세가 호전되도록 하거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미한다.

본 명세서에서 용어, "TAZ(Transcriptional coactivator with PDZ-binding motif)"는 14-3-3 단백질과 상호작용하는 세포 단백질로 동정된 바 있으며, WWTR1으로도 명명될 수 있다. TAZ는 또한 근육 세포 내 인슐린수용체물질(the insulin receptor substrate: IRS)1과 근육세포-특이적인 상호작용을 수행하여, 포도당 항상성 조절에 활용될 수 있다. 상기 TAZ는 단백질을 코딩하는 유전자의 서열은, 사람의 경우 GeneBank Accession No. NM_000116.5, NM_001303465.1, NM_181311.3, NM_181312.3, 또는 NM_181313.3, 마우스의 경우, NM_001173547.2, NM_001242615.2, NM_001242616.2, NM_001290738.1, 또는 NM_181516.6로부터 수득되는 서열일 수 있다. 상기 TAZ 단백질의 아미노산 서열은 GeneBank Accession No. NP_001161753, NP_001161753, NP_001335291.1, NP_000107.1, NP_001290394.1, NP_851828.1, NP_851829.1, 또는 NP_851830.1로부터 수득되는 아미노산 서열일 수 있다. 아울러, 상기 아미노산 서열은 예를 들어, 서열번호 1, 2 또는 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 상기 핵산 서열 또는 아미노산 서열과 일부 핵산 서열 또는 아미노산 서열이 일치하지 않더라도, 생물학적으로 동등한 활성을 갖는 핵산 서열 또는 아미노산 서열은 TAZ의 mRNA 또는 단백질로 간주될 수 있다.

상기 TAZ 단백질은 인간, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개 등의 포유 동물 유래의 모든 TAZ 단백질을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명에 사용 가능한 TAZ 단백질은 이들의 야생형(wild type)의 아미노산 서열을 갖는 단백질뿐만 아니라 TAZ 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 단백질의 변이체 (예컨대, 각 단백질의 아형(subtype)들)를 포함할 수 있다.

TAZ 단백질의 변이체란 TAZ 단백질의 천연 아미노산 서열의 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 천연 아미노산 서열과 상이한 서열을 가지면서 천연(wild-type) 단백질의 고유의 생물학적 기능을 유지하는 단백질을 의미한다. 상기 변이체는 천연 단백질과 동일한 생물학적 활성을 나타내는 기능적 등가물이거나 필요에 의해서 단백질의 물리 화학적 성질이 변형된 변이체일 수 있고, 물리, 화학적 환경에 대한 구조적 안정성이 증대되거나 생리학적 활성이 증대된 변이체일 수 있다.

상기 TAZ 단백질 또는 이의 변이체는 천연에서 분리되거나, 재조합적 또는 합성적으로 제조된(non-naturally occurring) 것 일 수 있다.

또한, 상기 TAZ 단백질을 코딩하는 핵산은 야생형 또는 상기한 바와 같은 변이체 형태의 TAZ 단백질을 코딩하는 염기서열로서, 하나 이상의 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있으며, 천연에서 분리되거나 화학적 합성법을 이용하여 제조할 수 있다. 상기 TAZ 단백질을 코딩하는 염기서열을 갖는 핵산은 단쇄 또는 이중쇄일 수 있으며, DNA 분자(게놈, cDNA) 또는 RNA (mRNA) 분자일 수 있다.

상기 TAZ의 변이체는 N- 말단이 절두된(truncated) C-말단 도메인을 포함할 수 있다. 상기 TAZ 단백질의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 예를 들어, 80번째, 예를 들어, 90번째, 예를 들어, 100번째, 예를 들어, 110번째, 예를 들어, 120번째, 예를 들어, 130번째, 예를 들어, 140번째, 예를 들어, 150번째, 예를 들어, 160번째, 예를 들어, 170번째, 예를 들어, 180번째, 예를 들어, 190번째, 예를 들어, 200번째 아미노산부터 C-말단까지의 영역일 수 있으나, 다른 단백질과 상호작용할 수 있는 WW 도메인을 포함하는 TAZ 단백질 변이체라면 이에 제한되지 않는다. 상기 TAZ의 변이체는 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 5로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 것일 수 있다. 마우스의 경우 상기 TAZ C-말단 도메인은 N-말단으로부터 124번째부터 C-말단까지의 영역일 수 있다.

아울러, 상기 TAZ의 변이체는 단백질 가수분해에 저항성을 가지는 변이체라면 제한되지 않으나, 예를 들어 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 단백질의 N 말단으로부터 58, 62, 306, 및 309번째 아미노산인 세린(Serine)이 알라닌(Alanine)으로 치환된 것일 수 있으며, 예를 들어 TAZ4SA일 수 있다.

상기 용어 "포도당 내성"은 생체 내 포도당 처리능력을 의미하는 것으로, 포도당이 대사되는 속도를 측정하는 것으로, 많은 양의 포도당을 복용한 후 시간 간격으로 혈당치를 측정하여 계산될 수 있으며, 용어 "당내성"또는 "내당능"과 혼용될 수 있다. 상기 용어 "인슐린 감수성"은 외래성 인슐린에 대한 생체의 감수성을 의미하는 것으로, 일정량의 인슐린을 투여하였을 때의 혈당 저하도로 계산될 수 있으며, 용어 "인슐린 저항성"또는 "인슐린 내성"과 혼용될 수 있다.

상기 조성물은 근육 세포의 인슐린 감수성을 증가시키는 것일 수 있다. 상기 약학적 조성물은 포도당 내성을 억제시키고, 인슐린 민감성을 증진시켜 제 2형 당뇨병 질환의 예방 또는 치료 활성을 갖는 공지의 유효 성분을 더 포함할 수 있다. 상기 유효 성분은 공지의 천연 추출물, 천연물 기반 화합물, 합성 화합물 또는 이들의 조합일 수 있다.

상기 약학적 조성물은 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다. 담체, 부형제, 또는 희석제는 예를 들어, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알기네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 또는 광물유를 포함할 수 있다.

상기 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여 제형을 갖는 것일 수 있다. 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화될 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.

상기 약학적 조성물에 있어서, 경구 투여를 위한 고형 제제는 정제, 환제, 산제, 과립제, 또는 캡슐제일 수 있다. 상기 고형 제제는 부형제 또는 윤활제를 더 포함할 수 있다. 부형제는 예를 들면, 전분, 칼슘 카르보네이트(calcium carbonate), 수크로스, 락토스, 또는 젤라틴일 수 있다. 또한, 상기 윤활제는 마그네슘 스테아레이트, 또는 탈크일 수 있다. 상기 약학적 조성물에 있어서, 경구를 위한 액상 제제는 현탁제, 내용액제, 유제, 또는 시럽제일 수 있다. 상기 액상 제제는 물, 또는 리퀴드 파라핀을 포함할 수 있다. 상기 액상 제제는 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 또는 보존제를 포함할 수 있다. 상기 약학적 조성물에 있어서, 비경구 투여를 위한 제제는 크림, 로션, 연고, 액제, 패취, 향낭(sachet), 주사제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 또는 및 좌제일 수 있다.

상기 약학적 조성물은 TAZ(Transcriptional coactivator with PDZ-binding motif) 단백질 또는 이의 변이체; 상기 단백질을 코딩하는 핵산분자; 및 상기 TAZ의 발현 또는 활성을 증가시키는 물질로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 유효한 양으로 포함할 수 있다. 상기 유효한 양은 질환의 중증도, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 상기 약학적 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 상기 유효한 양은 상기 약학적 조성물 당 약 10 mg 내지 약 10 g, 약 100 mg 내지 약 8 g, 약 250 mg 내지 약 6 g, 약 약 500 mg 내지 약 4 g, 약 500 mg 내지 약 2 g, 또는 약 500 mg 내지 약 1 g일 수 있다. 상기 약학적 조성물은 경구, 경피, 피하, 직장, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 국소, 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여될 수 있다. 상기 약학적 조성물의 투여량은 예를 들어, 성인 기준으로 약 0.001 ㎎/kg 내지 약 100 ㎎/kg, 약 0.01 ㎎/kg 내지 약 10 ㎎/kg, 또는 약 0.1 ㎎/kg 내지 약 1 ㎎/kg의 범위 내이고, 1일 1회 내지 6회, 2 일 내지 3일에 1회, 또는 수일 1회 투여될 수 있다.

상기 제2형 당뇨병은 비만, 고지방 식이, 아디포넥틴(adiponectin) 감소 돌연변이, 또는 스타틴(statin) 약물에 의하여 유도될 수 있다.

또한 상기 스타틴은 예를 들면, 로바스타틴(lovastatin), 심바스타틴(simvastatin), 프라바스타틴(pravastatin), 플루바스타틴(fluvastatin), 아토르바스타틴(atorvastatin), 로수바스타틴(rosuvastatin), 이타바스타틴(itavastatin), 세리바스타틴(cerivastatin), 피타바스타틴(pitavastatin), 메바스타틴(mevastatin) 및 리바스타틴(rivastatin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 스타틴일 수 있다.

본 명세서에서 상기 TAZ의 발현 또는 활성을 증가시키는 물질이란 근육 세포에서 TAZ 단백질의 발현량을 증가시키거나 TAZ의 반응 활성 또는 반응 속도의 향상을 유도할 수 있는 물질을 의미하는 것으로, 그 종류가 특별히 제한되지 않으며, 펩타이드, 항체, 앱타머, 천연추출물 또는 화학물질일 수 있으며, 예를 들면, 상기 물질은 근육세포 특이적으로 TAZ의 발현 또는 활성을 증가시키는 프로모터의 치환에 의한 물질일 수 있다.

TAZ는 다양한 외부물질 투여 혹은 신호자극에 의해 발현 또는 활성이 증가될 수 있다. 그 예로 TAZ 활성은 radiation (UV, ionizing radiation 등), chemotherapeutic 약물, 외부 pathogens (rhinoviruses, N. gonorrhea, S. aureus, P. aeruginosa, C. parvum 등), 사이토카인, 산화적 스트레스 등에 의해 그 활성이 증가될 수 있다.

또한 본 발명의 조성물은 TAZ를 코딩하는 핵산분자를 벡터를 통하여 도입할 수 있는데, 본 발명에서 사용할 수 있는 벡터는 예컨대 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스(Retrovirus) 벡터, HIV(Human immunodeficiency virus) 벡터, MLV(Murineleukemia virus)벡터, ASLV(Avian sarcoma/leukosis) 벡터, SNV(Spleen necrosis virus)벡터, RSV(Rous sarcoma virus)벡터, MMTV(Mouse mammary tumor virus) 벡터, 아데노바이러스(Adenovirus) 벡터, 아데노 관련 바이러스(Adenoassociatedvirus) 벡터, 헤르페스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus) 벡터 및 에피조말 (episomal) 벡터로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 벡터일 수 있다.

본 발명에서 "벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 전달체를 의미할 수 있다.

본 발명의 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 인핸서 같은 발현 조절 요소 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한, 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함하고, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다. 벡터는 자가 복제하거나 숙주 DNA에 통합될 수 있다.

다른 양상은 TAZ(Transcriptional coactivator with PDZ-binding motif) 단백질 또는 이의 변이체; 상기 단백질을 코딩하는 핵산분자; 및 상기 TAZ의 발현 또는 활성을 증가시키는 물질로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 제2형 당뇨병을 치료하는 방법을 제공한다.

상기 방법은 근육 세포 내 IRS 1 의 발현을 증진시켜 인슐린 민감성을 증진시켜 제2형 당뇨병을 치료할 수 있다.

또 다른 양상은 근육 세포 TAZ의 발현 수준을 측정하는 단계; 상기 근육 세포에 제2형 당뇨병 예방 또는 치료용 시험 물질을 가하는 단계; 상기 시험물질이 처리된 근육 세포에서 TAZ 발현 수준을 측정하는 단계; 및 상기 시험물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 TAZ의 발현을 증가시킨 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 제2형 당뇨병 예방 또는 치료 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

구체적으로, 제2형 당뇨병 치료 시험 물질의 존재 및 부존재하에서 TAZ 단백질 발현의 증가 또는 감소를 비교하는 방법으로 제2형 당뇨병 치료제를 스크리닝하는데 유용하게 사용할 수 있다. 근육 세포의 TAZ 단백질의 발현 수준을 간접적으로 또는 직접적으로 증가시키는 물질은 본 발명에서 개시하고 있는 제2형 당뇨병의 치료제로서 선택할 수 있다.

즉, 제2형 당뇨병의 치료 시험 물질의 부존재시 및 존재시의 근육 세포에서 TAZ 단백질 발현 수준을 비교한 후, TAZ의 발현 수준을 증가시키는 물질을 제2형 당뇨병의 치료제로 예측할 수 있다.

본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.

일 양상에 따르면, TAZ 단백질 또는 이의 변이체를 포함하는 약학적 조성물은 근육세포 내 IRS1의 발현을 증진시켜 인슐린 민감성을 높일 수 있으므로 제 2형 당뇨병의 예방, 개선, 또는 치료에 사용할 수 있다.

도 1은 TAZ에 의한 IRS1 발현 및 인슐린 신호전달 증진을 확인한 것으로, 8주 내지 10주령의 야생형 (WT) 및 근육특이적 TAZ-녹아웃 (mKO) 마우스에 인슐린을 복강내 주사하고 이의 결과를 확인한 결과(도 1A), 이의 리보솜 단백질 S6 키나아제, AS160, 인산화된 총 AKT의 비율을 평가한 결과(도 1B), 혈청-결핍 WT 및 TAZ- 녹아웃 (KO) 마우스 배아 섬유아세포 (MEF)를 1 nM 인슐린으로 처리하고 이의 용해물을 본석한 결과(도 1C), 혈청이 고갈된 대조군 (Con) 및 TAZ-녹다운된 (Ti) C2C12 근아세포를 1nM 인슐린으로 처리한 결과(도 1D), 및 WT 및 근육-특이적 TAZ-녹아웃 (mKO) 마우스, WT 및 TAZ-KO MEF, Con 및 TAZ-녹다운된 (Ti) C2C12 세포 유래의 골격 근육에서 Irs1 전사수준을 확인한 결과(도 1E)를 나타낸 것이다(*P<0.05; **P<0.005, 양측 스튜던트 t-검정(two tailed Student's t-test)).
도 2는 근육세포 내 포도당 항상성 과정에 있어서 TAZ의 역할을 확인한 것으로, 글루코스 섭취를 대조군 (Con) 및 TAZ-녹다운된 (Ti) C2C12 근관세포에서 분석한 결과(도 2A), 원형질 막 (PM) 및 사이토졸 (Cyt)으로 분별하고 Glut4 항체를 사용한 면역 블롯팅에 의해 분석을 수행한 결과(도 2B), 포도당 내성 시험을 위해, WT 및 근육-특이적 TAZ-녹아웃 (mKO) 마우스를 16 시간 동안 금식시키고, D- 포도당을 복강 내 주사 하였다. 지정된 시점에서 혈당을 측정한 결과(도 2C), 인슐린 내성 시험을 위해, WT 및 근육-특이적 TAZ-녹아웃 (mKO) 마우스를 4 시간 동안 금식시키고, 인슐린을 복강 내 투여하고, 이의 혈당 수준을 확인한 결과(도 2D), WT 및 근육-특이적 TAZ-녹아웃 (mKO) 마우스를 16 시간 동안 금식 시키거나 임의로 식이시키고, 혈청 인슐린 농도를 분석한 결과(도 2E)를 나타낸 도이다(* p < 0.05; ** p < 0.01, 양측 스튜던트 t-검정(two tailed Student's t-test)).
도 3은 8 주령 WT 및 근육-특이적 TAZ-녹아웃 (mKO) 마우스에 8주 동안 고지방식이 (HFD)를 하였다. 포도당 내성을 평가한 결과(도 3A), 8 주령 WT 및 근육-특이적 TAZ-녹아웃 (mKO) 마우스를 8 주 동안 HFD 조건에 노출시키고 인슐린 내성을 평가한 결과(도 3B), 8 주의 HFD 공급 동안 마우스의 체중을 측정한 결과(도 3C), HFD를 투여한 WT 및 근육-특이적 TAZ-녹아웃 (mKO) 마우스의 부고환 백색 지방 조직 (epididymal white adipose tissue: eWAT)을 헤마톡실린 및 에오신 (H & E) 염색을 통해 분석한 결과(도 3D), 상기 마우스의 간 샘플을 H & E 염색을 통해 분석한 결과(도 3E)를 나타낸 도이다(* p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.005, 양측 스튜던트 t-검정(two tailed Student's t-test)).
도 4는 TAZ가 결합하는 Irs1 조절 요소를 확인하기 위해, FLAG-TAZ (F-TAZ)-발현하는 C2C12 세포를 사용하여 염색질 면역침강 (ChIP) 시퀀싱을 한 결과(도 4A), ChIP- qPCR을 수행하여 TBE1 영역이 TAZ가 결합하는 부위인지 확인하는 실험을 수행한 결과(도 4B), c-Jun 및 Tead4가 Irs1 발현을 조절하고, 유사하게 c-Jun 및 Tead4가 TAZ/YAP 표적 유전자를 자극하는 것이 알려져 있으므로, si-RNA를 사용하여 c-Jun 및 Tead4를 모두 고갈시킨 경우 고갈이 Irs1의 발현이 조절되는지 확인한 결과(도 4C 및 4D), TBE1의 전사 조절 활성을 구체적으로 확인하기 위하여, TBE1을 둘러싸는 대략 500 bp의 DNA 요소를 클로닝하고 루시퍼라제 리포터 플라스미드에 삽입 하였고, 이를 확인한 결과(도 4E 및 4F)에 나타낸 도이다(***p<0.005, 양측 스튜던트 t-검정(two tailed Student's t-test)).
도 5는 ChIP 된 DNA를 프라이머 세트 플랭킹 TBE1 (n = 3)을 갖는 qRT-PCR로 c-Jun이 TBE1에 직접 모집되는지 확인하기 위해 ChIP 분석을 수행하였고 그 결과(도 5A), TAZ가 c-Jun과 물리적으로 상호 작용하는지 여부를 확인하기 위하여, 293T 세포를 F-TAZ- 및 c-Jun- 발현 플라스미드로 공동 형질 감염시켜 이를 면역블롯팅으로 분석을 수행한 결과(도 5B), 내인성 c-Jun 역시 TAZ와 상호 작용하는지 확인하기 위하여 C2C12 세포 용해물을 IgG 또는 c-Jun 항체로 면역 침전시키고, TAZ 및 c-Jun 항체를 사용하여 면역 복합체를 검출한 결과(도 5C), 야생형 (TBE-luc) 또는 돌연변이 c-Jun- 결합 부위 (TBE1m-luc)를 갖는 루시퍼라제 리포터 플라스미드를 c-Jun- 및 TAZ-발현 플라스미드와 함께 293T 세포에 형질 감염시켰다. 루시퍼라제 리포터 유전자 활성을 형질 감염 24 시간 후 분석한 결과(도 5D), TAZ의 특정 도메인을 변형시킨 경우, TAZ 신호전달 활성을 변화될 수 있는지 확인하기 위하여 야생형 (아미노산 1-395), N- 말단-삭제된 TAZ (아미노산 124-395 및 164-395) 및 WW 도메인 절단 TAZ 발현 플라스미드 (ΔWW)를 293T 세포에 c-Jun 발현 플라스미드와 함께 형질감염시켜 면역 블롯팅으로 이를 확인한 결과(도 5E), TAZ 돌연변이체의 전사 활성을 평가하기 위하여, TBE1-luc 리포터 플라스미드를 사용하였다. 293T 세포를 c-Jun 발현 플라스미드와 함께 TAZ 결실 돌연변이체와 함께 형질 감염시켜, 면역 블롯팅으로 이를 확인한 결과(도 5F)를 나타낸 도이다(*p<0.05; ***p<0.005, 양측 스튜던트 t-검정(two tailed Student's t-test)).
도 6은 W8주 내지 10 주령의 야생형 (WT) 및 TAZ- 녹아웃 (KO) 마우스 배아 섬유아세포(MEF)를 24 시간 동안 L 세포 유래의 Wnt3a-로 조절된 또는 대조군 배지로 처리하여 면역블롯팅으로 분석한 결과(도 6A), 상기 세포의 Irs1 발현을 qRT-PCR로 확인한 결과(도 6B), 대조군 (Con) 및 TAZ- 녹다운된 (Ti) C2C12 근관세포를 24 시간 동안 대조군 또는 Wnt3a- 조절된 배지로 처리하고, IRS1 및 TAZ의 수준을 면역 블롯팅으로 분석한 결과(도 6C), 이후 세포로부터의 총 RNA를 추출하고, qRT-PCR에 의해 Irs1 발현을 분석한 결과(도 6D), 생체 내 Wnt 신호 전달-유도 된 Irs1 발현에서 TAZ의 역할을 연구하기 위해 야생형, 근육-특이적 TAZ- 녹아웃 (TAZmKO), 근육-특이적 선종성 용종 대장균(APC)-녹아웃 (APCmKO), 및 근육-특이적 APC 및 TAZ 이중-녹아웃 (DbmKO) 마우스의 위장성 근육세포를 β- 카테닌 항체를 이용한 면역 블롯팅으로 분석한 결과(도 6E), 상기 마우스에서 Irs1 전사수준을 qRT-PCR로 분석한 결과를(도 6G), 상기 마우스의 포도당 내성 및 인슐린 민감성을 확인한 결과(도6G 및 6H)에 나타낸 도이다(*p<0.05; ***p<0.005, 양측 스튜던트 t-검정(two tailed Student's t-test)).
도 7은 스타틴에 의하여 유도된 TAZ 억제가 인슐린 민감성을 변화시킬 수 있는지 확인하기 위한 실험으로 면역 블롯팅으로 IRS1 및 TAZ 수준을 분석한 결과 (도 7A), RNA를 상기 위장 근육으로부터 분리하였고, IRS1 전사수준을 qRT-PCR로 분석한 결과(도 7B), 6주령의 마우스에 심바스타틴 또는 비히클을 3 주 동안 투여하고, 마우스를 16 시간 동안 금식시키고, 2g/kg 체중으로 D-글루코스를 복강 내 주사하고 혈청 내 포도당 수준을 측정한 결과(도 7C), 마우스에 심바스타틴 또는 비히클을 3 주 동안 투여하고, 마우스를 4 시간 동안 절식시킨 다음, 1.25 U/kg 체중으로 인슐린을 투여하여 혈청 포도당 수준을 분석한 결과(도 7D), C2C12 근관세포를 지정된 농도로 48 시간 동안 DMSO 또는 심바스타틴으로 처리하고, 이를 면역 블롯팅으로 분석한 결과(도 7E), 및 상기 세포를 수거하고, Irs1 발현을 qRT-PCR에 의해 분석한 결과(도 7F), 심바스타틴 대신 세리바스타틴으로 도 7E의 조건과 동일한 실험을 수행한 결과(각각 도 7G 및 7H)에 나타낸 것이다(*p<0.05; **p<0.01; ***p<0.005 양측 스튜던트 t-검정(two tailed Student's t-test)).
도 8은 인슐린 신호 전달에 대한 심바스타틴의 효과를 추가적으로 확인하기 위하여, 대조군 및 심바스타틴-처리 된 인슐린을 복강 내 주사하고 이를 면역 블롯팅으로 분석한 결과(도 8A), IRS1 및 TAZ 대 α-튜불린의 비를 분석, 총 AKT, AS160 및 리보솜 단백질 S6 키나아제에 대한 인산화된 비율을 측정한 결과(도 8B), C2C12 근관세포를 대조군, 야생형 TAZ 또는 단백질 분해성 분해 저항성 TAZ (TAZ4SA; TAZ S58, 62, 306, 309A) 레트로 바이러스 벡터로 형질 도입하고 10 μM 심바스타틴 또는 DMSO를 48 시간 동안 세포에 첨가하고, 수득된 세포에서 IRS1 및 TAZ 수준을 면역 블롯팅으로 분석한 결과(도 8C), 상기 세포에서의 Irs1 발현을 qRT-PCR에 의해 분석한 결과(도 8D) 및 포도당 흡수 수준을 대조군, 야생형 TAZ 및 TAZ4SA-과발현 C2C12 근관세포에서 분석한 결과(도 8E)에 나타낸 도이다(*p<0.05; **p<0.01; ***p<0.005, 양측 스튜던트 t-검정(two tailed Student's t-test)).

이하 실험예 및 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실험예 및 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실험예 1. 실험에 사용한 쥐의 제조

고려대학교 생명 동물 관리위원회의 승인을 받아, 고려대학교의 무균 시설에 마우스를 사육시켰다. 근육-특이적 TAZ- 녹아웃 마우스의 경우, Taz의 엑손 2 옆에 위치한 LoxP 부위를 함유하는 플랭킹된 대립 유전자를 활용하여 제조하였다. LoxP 부위는 네오마이신 선별 카세트의 상류에 위치하고, 네오마이신 선택 카세트를 EIIa-Cre 마우스와의 교차를 통한 부분 재조합에 의해 결실시켰다. Taz 플록스 된 대립 유전자를 갖는 마우스를 근육 크레아틴 키나아제 (MCK)-Cre 마우스와 교차시켰다. MCK-Cre 대립 유전자의 존재하에, Taz의 플록스된 엑손 2는 Cre- 매개 재조합에 의해 절단되었다. 근육-특이적 TAZ- 및 APC-더블 녹아웃 마우스를 생성하기 위해, APCfl / fl 마우스를 MCK-Cre : Taz^{fl / fl} 마우스와 교차시켰다. APC^{fl / fl} (C57BL / 6-Apctm1Tyj / J, # 009045), MCK-Cre (FVB-Tg (Ckmm-cre) 5Khn / J, # 006405) 및 EIIa-Cre (FVB / N-Tg (EIIa-cre) C5379Lmgd / J, # 003314) 마우스를 Jackson Laboratory에서 구입하였다. 고지방식이 조건의 경우, 8 주령 마우스에 8 주 동안 Research Diet (D12331)의 식이를 섭취시켰다.

실험예 2. 세포 배양

C2C12 세포 (ATCC)를 20 % 소 태아 혈청을 함유하는 DMEM에서 배양하였다. MEF를 마우스 배아로부터 수득하고 10 % 소 태아 혈청을 함유하는 DMEM에서 배양시켰다. 두 성장 배지 모두에 페니실린 및 스트렙토마이신이 보충되었다. 근원적 분화를 위해, C2C12 세포를 배양 플레이트에 시딩하고 24 시간 동안 유지시켰다. 세포가 컨플리언시에 도달하면, 배지를 2 % 말 혈청을 함유하는 DMEM으로 변경하여 분화를 촉진시켰다. 모든 세포를 5 % CO² 대기로 37 ℃에서 배양하였다.

실시예 1. 근육세포에서 TAZ의 대사기능의 확인

TAZ의 대사 기능을 이해하기 위해 근육 크레아틴 키나아제-Cre 마우스를 사용하여 근육-특이적 TAZ 녹아웃(TAZ-knockout: mKO) 마우스를 제조하였다. 근육과 같은 조직에서 주로 나타나는 인슐린-의존적 포도당의 이용과정은 인슐린 수용체 (IR)의 활성화와 IRS1/2, Akt 키나아제와 리보솜 S6 키나아제 (S6K) 및 160kDa (AS160)와 같은 기질의 순차적 활성이 필요한 것으로 알려져 있다. 특히, 인슐린 신호 전달에서 TAZ의 역할을 확인하기 위해, 8주 내지 10주령의 야생형 (WT) 및 근육-특이적 TAZ 녹아웃(mKO) 마우스에 인슐린을 복강내 주사하였고, 상기 근육 용해물을 면역 블롯팅으로 분석하였고, 이의 결과를 도 1A에 나타내었다. 이후, 리보솜 단백질 S6 키나아제, AS160, 인산화된 총 AKT의 비율을 평가하고 이를 도 1B에 나타내었다. 혈청-결핍 WT 및 TAZ- 녹아웃 (KO) 마우스 배아 섬유아세포 (MEF)를 1 nM 인슐린으로 처리하였다. 지정된 시점에서 면역 블롯팅에 의해 세포 용해물을 분석하였고, 이의 결과를 도 1C에 나타내었다. 혈청이 고갈된 대조군 (Con) 및 TAZ-녹다운된 (Ti) C2C12 근아세포를 1nM 인슐린으로 처리하였다. 지정된 시점에서 제조된 세포 용해물을 면역 블롯팅으로 분석하였고, 이의 결과를 도 1D에 나타내었다. Irs1 전사는 WT 및 TAZ- 녹아웃(mKO), WT 및 TAZ-KO MEF, Con 및 Ti C2C12 세포 유래의 골격 근육에서 qRT-PCR에 의해 분석하였고, 이의 결과를 도 1E 에 나타내었다.

도 1A 및 B에 나타낸 바와 같이, 근육-특이적 TAZ 녹아웃(mKO) 마우스는 WT 마우스보다 Akt 활성이 낮았고, 이 결과는 S6K 및 AS160의 인산화 감소를 통하여도 확인되었다. 도 1C 및 1D에 나타난 바와 같이 IRS1에서만 IR 단백질 수준의 변화 없이 근육-특이적 TAZ 녹아웃(mKO) 마우스에서 상당히 하향 조절되는 것을 확인할 수 있었다. 상기와 같은 IRS1 수준의 감소과 Akt 활성감소는 근육-특이적 TAZ 녹아웃(mKO) 마우스의 근육 조직에서만 나타나는 것이 확인되었으며, 아울러 도 1E에서는 Irs1 전사 수준이 근육-특이적 TAZ 녹아웃(mKO) 마우스, TAZ-녹아웃 (KO) 마우스 배아 섬유아세포(MEF) 및 TAZ- 녹다운된(Ti) C2C12 근육 모세포에서 감소된 것을 확인할 수 있었다.

실시예 2. 근육세포에서 TAZ에 의한 인슐린 신호전달 과정 및 인슐린 민감성 감소의 상승확인

근육세포 내 포도당 항상성 과정에 있어서 TAZ의 역할을 확인하기 위해, 2- 데옥시포도당 흡수를 시험관 내(in vitro)에서 C2C12 근아세포에서 정량화하였다.

글루코스 섭취를 대조군 (Con) 및 TAZ-녹다운된(Ti) C2C12 근관세포에서 분석하였고, 이의 결과를 도 2A 에 나타내었다. Con 및 TAZ-녹다운된(Ti) C2C12 근관세포를 100 nM 인슐린으로 처리하였다. 30 분 후, 원형질 막 (PM) 및 사이토졸 (Cyt)으로 분별하고 Glut4 항체를 사용한 면역 블롯팅에 의해 분석을 수행하고, 인슐린 수용체 β-서브 유닛 및 α-튜불린을 각각 PM 및 Cyt 로딩 대조군으로 사용 하였고, 이의 결과를 도 2B에 나타내었다. 포도당 내성 시험을 위해, WT 및 근육-특이적 TAZ 녹아웃(mKO) 마우스를 16 시간 동안 금식시키고, D- 포도당을 복강 내 주사 하였다. 지정된 시점에서 혈당을 측정하였고, 이의 결과를 도 2C에 나타내었다. 인슐린 내성 시험을 위해, WT 및 근육-특이적 TAZ 녹아웃(mKO) 마우스를 4 시간 동안 금식시키고, 인슐린을 복강 내 투여하였다. 지정된 시점에 혈당 수준을 측정하였고, 이의 결과를 도 2D에 나타내었다. WT 및 TAZ 녹아웃(mKO) 마우스를 16 시간 동안 금식시키거나 임의로 식이시키고, 혈청 인슐린 농도를 분석하였으며, 이의 결과를 도 2E 에 나타내었다.

도 2A에서 확인한 바와 같이, 포도당 흡수는 TAZ-녹다운된 세포(Ti)에서 유의하게 감소 하였다. Akt는 골격근에서 포도당 흡수를 촉진하기 위해 Glut4 원형질막 발현을 유도하는 것으로 알려져 있는데, 특히 도 2에서 확인한 바와 같이, 100nM의 인슐린을 가한 대조군과 TAZ-녹다운 C2C12 근관세포(Ti)에서는 30분 이후 플라즈마 멤브리인(PM)에 위치하는 Glut4 수준이 TAZ 녹다운 세포에서 감소하는 것에 확인되었고, 이는 결국 TAZ가 혈장막으로의 Glut4 전위를 통해 포도당 흡수를 유도할 수 있는 기능이 있는 것을 나타낸다. 또한 도 2C에서 포도당 주입한 경우 TAZ 녹아웃(mKO)에서 혈당 제거능이 감소되는 것을 확인되었으며, 이러한 인슐린-매개된 혈당의 감소는 근육-특이적 TAZ 녹아웃(mKO) 마우스에서 특히 현저하게 감소되는 것이 확인되었다. 또한 야생형과 근육-특이적 TAZ 녹아웃(mKO) 마우스를 금식시키거나 임의로 배식을 한 경우, 도 2E에서 확인할 수 있는 바와 같이, TAZ 녹아웃 마우스에서 혈청 인슐린 수준이 다소 상승한 것으로 나타나, TAZ 녹아웃으로 인해 나타나는 손상된 포도당 항상성은 인슐린 민감성 및 포도당 내성(glucose tolerance)의 손상에 의해 나타나는 것으로 확인되었다. 종합적으로 TAZ가 인슐린 민감성과 포도당 내성과 연관성이 높은 것을 확인하였다.

실시예 3. TAZ에 의한 포도당 내성 효과확인

상기 실험예를 통해 제조한 8 주령 WT 및 근육-특이적 TAZ 녹아웃(mKO) 마우스에 8주 동안 고지방식이 (HFD)를 하였다. 포도당 내성을 평가하기 위해, 마우스를 16 시간 동안 기아 상태로 만들고, 복강 내 주사를 통해 D-글루코스를 주입하였다. 일정 시점에서 혈당 수준을 측정하였고, 이를 도 3A에 나타내었다. 또한 8 주령 WT 및 근육-특이적 TAZ 녹아웃(mKO) 마우스를 8 주 동안 HFD 조건에 노출시키고 인슐린 내성을 평가하였다. 4 시간의 금식 후, 마우스에 인슐린을 복강 내 투여하였다. 일정 시점에서 혈당 수준을 측정하였고, 이를 도 3B에 나타내었다. 8 주의 HFD 공급 동안, 마우스의 체중을 매주 측정하였고, 이를 도 3C에 나타내었다. 또한 상기와 같이 HFD를 투여한 WT 및 근육-특이적 TAZ 녹아웃(mKO) 마우스를 안락사시키고, 부고환 백색 지방 조직 (epididymal white adipose tissue: eWAT)을 HFD 공급 WT 및 mKO 마우스로부터 단리하고, 고정시키고, 탈수시키고, 파라핀으로 고정시켰다. 그 후, eWAT를 헤마톡실린 및 에오신 (H & E) 염색을 통해 절단하고 분석하여 WT 및 근육-특이적 TAZ 녹아웃(mKO) 마우스 사이의 표현형 차이를 확인하였고 이를 도 3D에 나타내었다. 지방 세포 크기는 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 측정되었다(스케일 바 = 100 μm). 간을 HFD 공급 야생형 및 근육-특이적 TAZ 녹아웃(mKO) 마우스로부터 해부하고 고정시키고, 탈수시키고, 파라핀으로 고정시켰다. 파라핀 고정 조직의 절편 후, 간 샘플을 H & E 염색을 통해 분석하였다. 간에서 지질을 염색하기 위해, 단리된 간을 OCT 화합물에 매립하고, 냉동시키고, 크라이오톰을 사용하여 절편화하였다. 간에서 지질을 시각화하기 위해 샘플을 오일-레드-O 염색법으로 염색하였고, 이를 도 3E에 나타내었다(스케일 바 = 100 μm). 스튜던트 t-테스트를 사용하여 통계 분석을 수행하였다.

도 3A및 3B에서 확인한 바와 같이, WT와 근육-특이적 TAZ 녹아웃(mKO) 마우스의 대사장애가 있는지 확인하였으나, 표현형을 확인한 결과 인슐린 감수성의 차이를 제외하고는 대사 장애가 검출되지 않았고, 간 및 지방 조직에서 표현형 차이는 존재하지 않음을 확인하였다. 그러나 고지방 식이를 투여한 경우 몇 가지 표현형의 차이가 확인되었는데, 근육-특이적 TAZ 녹아웃(mKO) 마우스는 감소된 인슐린 감수성과 혈청 내 포도당 제거가 효과적으로 일어나지 않음을 확인할 수 있었다. 또한 도 3C및 도 3D에서 확인한 바와 같이 지방 세포 크기가 증가함에 따라 근육-특이적 TAZ 녹아웃(mKO) 마우스의 체중이 증가되는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 3E에서 확인한 바와 같이, 근육-특이적 TAZ 녹아웃(mKO) 마우스는 간 섹션에서 증가된 양의 지질 방울이 확인되어 지방간 표현형이 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 이러한 결과를 통해 TAZ가 근육에서 인슐린 신호 전달 및 항상성 유지에 중요한 조절자로 기능할 수 있으며, 이는 TAZ와 인슐린 감수성 및 포도당 내성이 강력하게 연관되어 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 4. 근육세포에서 TAZ의 신호전달 과정의 확인

TAZ가 결합하는 Irs1 조절 요소를 확인하기 위해, FLAG-TAZ (F-TAZ)-발현하는 C2C12 세포를 사용하여 염색질 면역침강 (ChIP) 시퀀싱을 수행하였다. 도 4A에 염색질 면역침강 (ChIP) 시퀀싱을 수행한 결과를 나타내었으며, 도 4A를 통해 TAZ-결합 DNA 요소 중에서, 1 차 표적 요소 (TAZ 결합 요소 # 1; TBE1)는 H3Kme1과 관련된 ChIP 서열 분석 데이터를 포함하여 ChIP 서열 분석의 피크 점수 및 NCBI 시퀀스 리드 아카이브에서 얻은 H3Kme1, H3Kme3 및 H3K27ac 정보를 포함하는 게놈 영역 측면에서 Irs1의 염색질 변형 상태를 고려하여 선택하였다.

아울러, ChIP- qPCR을 수행하여 TBE1 영역이 TAZ가 결합하는 부위인지 확인하는 실험을 수행하였고 이를 도 4B에 나타내었다. ChIP은 대조군과 F-TAZ 과발현시킨 C2C12세포로 확인하였다. 도 4B에서 확인한 바와 같이, 전사 활성 영역은 TBE1과 중첩되고, TAZ가 전사 활성 Irs1 cis-조절 요소와 연관성이 있는 것을 확인할 수 있었으며, 이와 같은 TBE1에 대한 TAZ 결합은 ChIP-PCR을 통해 확인할 수 있었다.

아울러, c-Jun 및 Tead4가 Irs1 발현을 조절하고, 유사하게 c-Jun 및 Tead4가 TAZ/YAP 표적 유전자를 자극하는 것이 알려져 있으므로, si-RNA를 사용하여 c-Jun 및 Tead4를 모두 고갈시킨 경우, 상기 인자의 고갈이 Irs1의 발현을 조절할 수 있는지를 실험해보았으며, 이를 도 4C및 도 4D에 나타내었다. 도 4C및 도 4D에서 확인할 수 있는 바와 같이, c-Jun 및 Tead4가 고갈되는 경우 Irs1도 상당히 하향 조절되는 것을 확인할 수 있었다. TBE1의 전사 조절 활성을 구체적으로 확인하기 위하여, TBE1을 둘러싸는 대략 500 bp의 DNA 요소를 클로닝하고 루시퍼라제 리포터 플라스미드에 삽입 하였고, 이를 확인한 결과를 도 4E 및 4F에 나타내었다. 도 4E에서 확인할 수 있는 바와 같이, 리포터 유전자 활성은 TAZ 및 c-Jun 또는 Tead4의 존재 하에 유도되며, TAZ와 c-Jun 및 Tead4이 모두 존재하는 경우 시너지 효과가 발생하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 3F에서 확인한 바와 같이, 리포터 플라스미드는 TAZ- 넉다운 세포에 도입되었을 때, 그 리포터 유전자 활성이 WT보다 현저하게 감소되었다. 따라서, TAZ는 공동-자극자(costimulator)인 c-Jun 및 Tead4를 매개로 한 Irs1 전사를 유도할 수 있음을 확인하였다.

실시예 5. 근육세포에서의 TAZ의 결합 도메인의 확인

8주 내지 10 주령의 마우스 위장 근육 게놈 DNA를 초음파 처리하여 절단하고, 염색질 단편을 c-Jun 항체로 면역 침전시켰다. ChIP 된 DNA를 프라이머 세트 플랭킹 TBE1 (n = 3)을 갖는 qRT-PCR로 c-Jun이 TBE1에 직접 모집되는지 확인하기 위해 ChIP 분석을 수행하였고 그 결과를 도 5A에 나타내었다. 도 5A에서 확인한 바와 같이, TBE1영역은 c-Jun에 의해 점유되는 것이 확인되었으며, 특히 c-Jun에는 TAZ WW 도메인 27과 상호 작용할 수 있는 Pro-Pro-X-Tyr 모티프가 포함되어 있는 것이 알려져 있다.

TAZ가 c-Jun과 물리적으로 상호 작용하는지 여부를 확인하기 위하여, 293T 세포를 F-TAZ- 및 c-Jun- 발현 플라스미드로 공동 형질 감염시켰다. 항 -FLAG 항체로 면역 침전시킨 후, 용리된 샘플을 TAZ 및 c-Jun 항체로 면역 블롯팅하여 분석을 수행하였으며, 이를 도 5B 에 나타내었다. 도 5B 에서 확인한 바와 같이, 이소성 발현된 TAZ 및 c-Jun은 서로 상호 작용하였다.

아울러, 내인성 c-Jun 역시 TAZ와 상호 작용하는지 확인하기 위하여 C2C12 세포 용해물을 IgG 또는 c-Jun 항체로 면역 침전시키고, TAZ 및 c-Jun 항체를 사용하여 면역 복합체를 검출하였고, 결과를 도 5C에 나타내었다. 도 5 C에서 확인한 바와 같이, TAZ 및 c-Jun은 내인적으로 상호작용 하였다.

TBE 1 영역을 변형시키는 경우, TAZ 신호전달 활성을 변화시킬 수 있는지 확인하기 위하여 TBE1-luc에서 c-Jun- 결합 부위를 돌연변이 시켰다. c-Jun- 결합 부위는 부위-지정 돌연변이 유발에 의해 생성되었다. 야생형 (TBE-luc) 또는 돌연변이 c-Jun- 결합 부위 (TBE1m-luc)를 갖는 루시퍼라제 리포터 플라스미드를 c-Jun- 및 TAZ-발현 플라스미드와 함께 293T 세포에 형질 감염시켰다. 루시퍼라제 리포터 유전자 활성을 형질 감염 24 시간 후 분석하였고, 이 결과를 도 5D에 나타내었다. 도 5D 에서 확인한 바와 같이, TBE1-luc돌연변이체(TBE1m-luc)는 TAZ 및 c-Jun의 존재 하에 리포터 플라스미드의 활성이 확연하게 낮아지는 것이 확인되었다.

TAZ의 특정 도메인을 변형시킨 경우, TAZ 신호전달 활성을 변화될 수 있는지 확인하기 위하여 야생형 (아미노산 1-395), N- 말단-삭제된 TAZ (아미노산 124-395 및 164-395) 및 WW 도메인 절단 TAZ 발현 플라스미드 (ΔWW)를 293T 세포에 c-Jun 발현 플라스미드와 함께 형질감염 시켰다. 세포 용해물을 FLAG 항체로 형질 감염한지 24 시간 후에 면역 침전시키고, 용리된 샘플을 TAZ 및 c-Jun 항체를 사용한 면역 블롯팅으로 분석하고, 그 결과를 도 5E 에 나타내었다. 도 5 E에서 나타난 바와 같이, WW 도메인이 결여된 TAZ 돌연변이체 구조물 (TAZΔWW 및 TAZ164-395)은 c-Jun과 상호 작용하지 않았으나, WW 도메인 함유 구조물 (TAZwt 및 TAZ124-395)은 c-Jun과 상호작용 하는 것을 확인할 수 있었다.

TAZ 돌연변이체의 전사 활성을 평가하기 위하여, TBE1-luc 리포터 플라스미드를 사용하였다. 293T 세포를 c-Jun 발현 플라스미드와 함께 TAZ 결실 돌연변이체와 함께 형질 감염시켰다. 레닐라(Renilla) 루시퍼라제 플라스미드를 형질 감염에 사용하였다. 세포를 용해시키고, 형질 감염 후 24 시간 후의 루시퍼라제 활성을 측정하였고, 그 결과를 도 5F에 나타내었다. 도 5F에서 확인한 바와 같이, c-Jun- 매개 리포터 유전자 활성은 WW 도메인을 함유하는 TAZ 단백질에 의해 증가되는 것을 확인하였다. 따라서, WW 도메인을 포함하는 TAZ 단백질이 포도당 내성 또는 인슐린 민감성과 관련성이 높은 것을 확인할 수 있었으며, 또한 상기 도메인을 포함하는 TAZ124-395 돌연변이체 역시 같은 효과를 나타내어 TAZ와 c-Jun의 상호 작용으로 인한 Irs1 전사가 유도되어 인슐린 민감성을 높일 수 있는 가능성을 확인하였다.

실시예 6. 근육세포에서 TAZ의 신호전달에 관여하는 인자의 확인

인슐린 신호 전달체계의 손상은 포도당 대사과정을 손상시켜 당뇨병을 유도하는 것으로 알려져 있으므로, TAZ가 Wnt 신호전달 과정의 매개자로서, Wnt 신호전달로 유도된 Irs1 의 발현에 영향을 미치는지 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 8주 내지 10 주령의 야생형 (WT) 및 TAZ- 녹아웃 (KO) 마우스 배아 섬유아세포(MEF)를 24 시간 동안 L 세포 유래의 Wnt3a-로 조절된 또는 대조군 배지로 처리하였다. 세포 용해물을 면역 블롯팅으로 분석하였고, 이를 도 6A에 나타내었다. 상기 세포의 Irs1 발현을 qRT-PCR로 확인하였고, 이를 분석한 결과를 도 6B에 나타내었다. 이후, 대조군 (Con) 및 TAZ- 녹다운된 (Ti) C2C12 근관세포를 24 시간 동안 대조군 또는 Wnt3a- 조절된 배지로 처리하고, IRS1 및 TAZ의 수준을 면역 블롯팅으로 분석하고, 이를 도 6C에 나타내었다. 이후, 세포로부터의 총 RNA를 추출하고, qRT-PCR에 의해 Irs1 발현을 분석하였으며, 이의 결과를 도 6D에 나타내었다.

생체 내 Wnt 신호 전달-유도 된 Irs1 발현에서 TAZ의 역할을 연구하기 위해, Wnt 신호 전달의 음성 조절자로 선종성 용종 대장균(APC)에 대한 대립 유전자를 보유하는 마우스를 근육-특이적 TAZ 녹아웃(mKO) 마우스와 교차시켜 근육-특이적 TAZ 및 APC 이중 녹아웃된 마우스를 제조하였다. 야생형, 근육-특이적 TAZ- 녹아웃 (TAZmKO), 근육-특이적 선종성 용종 대장균(APC)-녹아웃 (APCmKO), 및 근육-특이적 APC 및 TAZ 이중-녹아웃 (DbmKO) 마우스의 위장성 근육세포를 β- 카테닌 항체를 이용한 면역 블롯팅으로 분석하였고, 그 결과를 도 6E에 나타내었다. 야생형, 근육-특이적 TAZ- 녹아웃 (TAZmKO), 근육-특이적 선종성 용종 대장균(APC)-녹아웃 (APCmKO), 및 근육-특이적 APC 및 TAZ 이중-녹아웃 (DbmKO) 마우스의 Irs1 전사수준을 qRT-PCR로 분석하였고, 이를 도 6G에 나타내었다. 야생형, 근육-특이적 TAZ- 녹아웃 (TAZmKO), 근육-특이적 선종성 용종 대장균(APC)-녹아웃 (APCmKO), 및 근육-특이적 APC 및 TAZ 이중-녹아웃 (DbmKO) 마우스의 포도당 내성 및 인슐린 민감성을 확인한 결과를 도6G 및 6H 에 나타내었다. 스튜던트 t- 테스트를 사용하여 통계 분석을 수행하였다.

도 6A 및 6B에서 확인한 바와 같이, Wnt3a로 24 시간 배양한 후, 야생형 MEF는 상당한 Irs1 발현의 유도가 확인되었다. 상기와 같은Irs1 발현의 유도는 TAZ-KO MEF에서 발생하지 않았으므로, Wnt3a- 매개 IRS1 유도는 TAZ에 의하여 나타나는 것을 확인하였다. 도 6C및 6D에서 확인한 바와 같이, C2C12 근관세포에서도 마찬가지로 Wnt3a-유도된 Irs1 발현이 TAZ- 녹다운 C2C12 근관세포에서는 관찰되지 않는 것을 확인하였다. 도 6E및 6F에서 한 바와 같이, 위장관 근육에서 IRS1의 발현 수준은 근육-특이적 선종성 용종 대장균(APC)-녹아웃 (APCmKO) 마우스가 야생형보다 다소높은 것을 확인하였으나, 근육-특이적 APC 및 TAZ 이중-녹아웃 (DbmKO) 마우스에서는 현저하게 IRS1의 발현 수준이 낮은 것을 확인하였다. 따라서, 이러한 결과를 통해서 TAZ가 Wnt 신호전달에 의하여 유도되는 IRS1의 발현을 유도하는 것을 확인할 수 있었다. 도 6G 및 6H에서 확인한 바와 같이, APCmKO 마우스는 유의할 정도의 혈당 제거 활성을 나타내었지만, 이와 같은 활성은 DbmKO 마우스에서는 감소되는 것으로 나타났고, 또한 APCmKO 마우스는 인슐린 민감성이 유의하게 증가한 것으로 나타난 반면, DbmKO 마우스는 상기와 같은 민감성이 다소 낮아지는 것으로 나타나, Wnt 신호 전달-유도 된 인슐린 감수성이 TAZ에 의해 조절될 수 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 7. 스타틴 약물과 TAZ 발현 수준에 의한 인슐린 민감성 확인

스타틴 약물은 TAZ를 핵 내에 위치시켜 의한 TAZ수준을 변화시키므로, 스타틴에 의하여 유도된 TAZ 억제가 인슐린 민감성을 변화시킬 수 있는지 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 6 주령 마우스에 심바스타틴 또는 비히클을 3 주 동안 투여하였다. 마우스를 안락사시키고, 위장 근육을 분리하고, 면역 블롯팅으로 IRS1 및 TAZ 수준을 분석하였고, 이를 도 7A에 나타내었다. RNA를 상기 위장 근육으로부터 분리하였고, IRS1 전사수준을 qRT-PCR로 분석하였고, Gapdh 발현으로 정규화하여 도 7B에 나타내었다. 6주령의 마우스에 심바스타틴 또는 비히클을 3 주 동안 투여하고, 마우스를 16 시간 동안 금식시키고, 2g/kg 체중으로 D-글루코스를 복강 내 주사하였다. 지정된 시점에서 글루코 미터를 사용하여 혈청 포도당 수준을 측정하였다. 각 마우스에 대한 곡선 아래 면적을 계산하고 비히클 조건에 대한 배수 변화(n = 8)로 나타낸 결과를 도 7C에 나타내었다. 6 주령 마우스에 심바스타틴 또는 비히클을 3 주 동안 투여하였다. 마우스를 4 시간 동안 절식시킨 다음, 1.25 U/kg 체중으로 인슐린을 투여하였다. 지정된 시점에서 혈청 포도당 수준을 분석하였다. 각 마우스에 대한 곡선 아래 면적을 계산하고 비히클 상태에 대한 면적 변화 (n = 8)를 나타낸 결과를 도 7D에 나타내었다. C2C12 근관세포를 지정된 농도로 48 시간 동안 DMSO 또는 심바스타틴으로 처리하고, 세포 용해물을 면역 블롯팅으로 분석하였고, 이를 도 7E에 나타내었다. 상기 세포를 수거하고, Irs1 발현을 qRT-PCR에 의해 분석하고 Gapdh 발현 (n = 3)으로 정규화한 결과를 도 7F에 나타내었다. 심바스타틴 대신 세리바스타틴으로 도 7E의 조건과 동일한 실험을 수행하였으며, 심바스타틴 대신 세리바스타틴으로 도 7F와 동일한 동일한 실험을 수행하였으며, 상기 결과를 각각 도 7G 및 7H에 나타내었다.

도 7A에서 확인한 바와 같이, 심바스타틴-처리된 마우스에서 TAZ 및 IRS1의 수준이 감소하였고, 도 7B에서 확인할 수 있는 바와 같이, 심바스타틴은 IRS1의 수준을 감소시켰다. 도 7C에서 확인할 수 있는 바와 같이, in vivo 에서 심바스타틴은 대조군 대비 인슐린 민감성을 감소시켜 혈액 내 포도당 제거능을 현저하게 저해시켰다. 또한 도 7D에서 확인한 바와 같이, 인슐린-매개 혈액 내 포도당 수준의 감소는 심바스타틴-처리된 마우스에서 억제되었으며, 스타틴-매개된 TAZ 및 IRS1 수준의 감소는 도 7E및 7F에서 확인한 바와 같이, C2C12 근관세포에서도 현저하게 나타났다. 또한 도 7G 및 7H 에서 확인한 바와 같이, 세리바스타틴을 처리한 경우에도 유사한 결과가 나타나, 스타틴 약물에 의하여 인슐린 민감성이 유의하게 낮아지는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 8. 스타틴 약물로 인한 인슐린 민감성 감소에 저항성을 가진 TAZ 돌연변이체 활성 확인

인슐린 신호 전달에 대한 심바스타틴의 효과를 추가적으로 확인하기 위하여, 대조군 및 심바스타틴-처리 된 마우스에 인슐린을 주입하고, 인슐린 신호 전달 조절 경로를 분석하였다. 비히클 또는 심바스타틴을 3주동안 투여한 6주령 마우스에 인슐린을 복강 내 주사하였다. 15분 후, 근육 용해물을 면역 블롯팅으로 분석하였고, 이를 도 8A에 나타내었다. 상기 기재된 바와 같이 분석 방법으로, 3 개의 독립적인 실험을 평가하여 IRS1 및 TAZ 대 α-튜불린의 비를 분석하였고, 총 AKT, AS160 및 리보솜 단백질 S6 키나아제에 대한 인산화된 비율을 측정하였고 이의 결과를 도 8B 에 나타내었다. C2C12 근관세포를 대조군, 야생형 TAZ 또는 단백질 분해성 분해 저항성 TAZ (TAZ4SA; TAZ S58, 62, 306, 309A) 레트로 바이러스 벡터로 형질 도입하여 안정한 세포주를 확립하였다. 이어서, 10 μM 심바스타틴 또는 DMSO를 48 시간 동안 세포에 첨가하고, 수득된 세포에서 IRS1 및 TAZ 수준을 면역 블롯팅으로 분석하였고, 이를 8C에 나타내었다. 상기 세포에서의 Irs1 발현을 qRT-PCR에 의해 분석한 결과를 도 8D에 나타내었다. 포도당 흡수 수준을 대조군, 야생형 TAZ 및 TAZ4SA-과발현 C2C12 근관세포에서 분석하였고, 그 결과를 도 8E에 나타내었다.

도 8A 및 8B에 나타난 바와 같이, 심바스타틴-처리된 마우스는 대조군 마우스보다 낮은 Akt 활성을 나타났고, 이는 AS160 및 S6K의 인산화 감소에 의해 확인되었다. 상기와 같은 결과를 통하여 심바스타틴-처리된 마우스에서 포도당 내성 및 인슐린 감수성이 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 심바스타틴-매개된 Irs1 발현의 하향 조절 억제가 TAZ에 의해 조절되는지 여부를 확인하기 위해, WT TAZ 또는 단백질 분해 저항성 TAZ (TAZ4SA)를 C2C12 근관세포에서 안정적으로 발현시키고, Irs1 발현을 분석하였다. 도 8C 및 8D에 나타난 바와 같이, 야생형 TAZ는 심바스타틴의 존재 하에서 분해되어 Irs1 발현이 감소되는 것이 확인되었다. 반면, TAZ4SA-과발현 세포에서는 Irs1 발현 또는 전사의 감소는 나타나지 않는 것이 확인되었다. 또한, 도 8E에서 확인한 바와 같이, 심바스타틴 처리 후 TAZ4SA- 과발현 세포에서는 포도당 흡수가 감소되지 않았다. 이에, 종합적으로 스타틴 약물 매개에 의한 인슐린 감수성 감소는 IRS1 수준 및 AKT 활성 감소에 의한 것이고, 이에 따른 TAZ 고갈은 인슐린 감수성 감소의 원인인 되는 것을 확인하였다. 따라서, TAZ4SA-과발현된 TAZ 돌연변이체는 스타틴 약물에 의한 인슐린 감수성 감소에 영향을 받지 않을 수 있는 것을 확인할 수 있었다.

<110> Ewha University - Industry Collaboration Foundation Korea University Research and Business Foundation <120> Pharmaceutical composition for preventing or treating type 2 diabetes comprising TAZ protein or a variant thereof <130> PN131443 <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 452 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Met His Asn Ser Thr Ala Pro Leu Ser Ala Arg Leu Phe Pro Lys Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Leu Gln Thr Leu Phe Met Gly Gln Ser Gly Ser Arg Gly 20 25 30 Gly Cys Ala Arg Leu Arg Leu Leu Cys Arg Leu Leu Ala Gln Trp Glu 35 40 45 Arg Pro Arg Pro Val Pro Gly Ile Lys Met Asn Pro Ser Ser Val Pro 50 55 60 His Pro Leu Pro Pro Pro Gly Gln Gln Val Ile His Val Thr Gln Asp 65 70 75 80 Leu Asp Thr Asp Leu Glu Ala Leu Phe Asn Ser Val Met Asn Pro Lys 85 90 95 Pro Ser Ser Trp Arg Lys Lys Ile Leu Pro Glu Ser Phe Phe Lys Glu 100 105 110 Pro Asp Ser Gly Ser His Ser Arg Gln Ser Ser Thr Asp Ser Ser Gly 115 120 125 Gly His Pro Gly Pro Arg Leu Ala Gly Gly Ala Gln His Val Arg Ser 130 135 140 His Ser Ser Pro Ala Ser Leu Gln Leu Gly Thr Gly Ala Gly Ala Ala 145 150 155 160 Gly Gly Pro Ala Gln Gln His Ala His Leu Arg Gln Gln Ser Tyr Asp 165 170 175 Val Thr Asp Glu Leu Pro Leu Pro Pro Gly Trp Glu Met Thr Phe Thr 180 185 190 Ala Thr Gly Gln Arg Tyr Phe Leu Asn His Ile Glu Lys Ile Thr Thr 195 200 205 Trp Gln Asp Pro Arg Lys Val Met Asn Gln Pro Leu Asn His Val Asn 210 215 220 Leu His Pro Ser Ile Thr Ser Thr Ser Val Pro Gln Arg Ser Met Ala 225 230 235 240 Val Ser Gln Pro Asn Leu Ala Met Asn His Gln His Gln Gln Val Val 245 250 255 Ala Thr Ser Leu Ser Pro Gln Asn His Pro Thr Gln Asn Gln Pro Thr 260 265 270 Gly Leu Met Ser Val Pro Asn Ala Leu Thr Thr Gln Gln Gln Gln Gln 275 280 285 Gln Lys Leu Arg Leu Gln Arg Ile Gln Met Glu Arg Glu Arg Ile Arg 290 295 300 Met Arg Gln Glu Glu Leu Met Arg Gln Glu Ala Ala Leu Cys Arg Gln 305 310 315 320 Leu Pro Met Glu Thr Glu Thr Met Ala Pro Val Asn Thr Pro Ala Met 325 330 335 Ser Thr Asp Met Arg Ser Val Thr Asn Ser Ser Ser Asp Pro Phe Leu 340 345 350 Asn Gly Gly Pro Tyr His Ser Arg Glu Gln Ser Thr Asp Ser Gly Leu 355 360 365 Gly Leu Gly Cys Tyr Ser Val Pro Thr Thr Pro Glu Asp Phe Leu Ser 370 375 380 Asn Met Asp Glu Met Asp Thr Gly Glu Asn Ser Gly Gln Thr Pro Met 385 390 395 400 Thr Val Asn Pro Gln Gln Thr Arg Phe Pro Asp Phe Leu Asp Cys Leu 405 410 415 Pro Gly Thr Asn Val Asp Leu Gly Thr Leu Glu Ser Glu Asp Leu Ile 420 425 430 Pro Leu Phe Asn Asp Val Glu Ser Ala Leu Asn Lys Ser Glu Pro Phe 435 440 445 Leu Thr Trp Leu 450 <210> 2 <211> 395 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Met Asn Pro Ser Ser Val Pro His Pro Leu Pro Pro Pro Gly Gln Gln 1 5 10 15 Val Ile His Val Thr Gln Asp Leu Asp Thr Asp Leu Glu Ala Leu Phe 20 25 30 Asn Ser Val Met Asn Pro Lys Pro Ser Ser Trp Arg Lys Lys Ile Leu 35 40 45 Pro Glu Ser Phe Phe Lys Glu Pro Asp Ser Gly Ser His Ser Arg Gln 50 55 60 Ser Ser Thr Asp Ser Ser Gly Gly His Pro Gly Pro Arg Leu Ala Gly 65 70 75 80 Gly Ala Gln His Val Arg Ser His Ser Ser Pro Ala Ser Leu Gln Leu 85 90 95 Gly Thr Gly Ala Gly Ala Ala Gly Gly Pro Ala Gln Gln His Ala His 100 105 110 Leu Arg Gln Gln Ser Tyr Asp Val Thr Asp Glu Leu Pro Leu Pro Pro 115 120 125 Gly Trp Glu Met Thr Phe Thr Ala Thr Gly Gln Arg Tyr Phe Leu Asn 130 135 140 His Ile Glu Lys Ile Thr Thr Trp Gln Asp Pro Arg Lys Val Met Asn 145 150 155 160 Gln Pro Leu Asn His Val Asn Leu His Pro Ser Ile Thr Ser Thr Ser 165 170 175 Val Pro Gln Arg Ser Met Ala Val Ser Gln Pro Asn Leu Ala Met Asn 180 185 190 His Gln His Gln Gln Val Val Ala Thr Ser Leu Ser Pro Gln Asn His 195 200 205 Pro Thr Gln Asn Gln Pro Thr Gly Leu Met Ser Val Pro Asn Ala Leu 210 215 220 Thr Thr Gln Gln Gln Gln Gln Gln Lys Leu Arg Leu Gln Arg Ile Gln 225 230 235 240 Met Glu Arg Glu Arg Ile Arg Met Arg Gln Glu Glu Leu Met Arg Gln 245 250 255 Glu Ala Ala Leu Cys Arg Gln Leu Pro Met Glu Thr Glu Thr Met Ala 260 265 270 Pro Val Asn Thr Pro Ala Met Ser Thr Asp Met Arg Ser Val Thr Asn 275 280 285 Ser Ser Ser Asp Pro Phe Leu Asn Gly Gly Pro Tyr His Ser Arg Glu 290 295 300 Gln Ser Thr Asp Ser Gly Leu Gly Leu Gly Cys Tyr Ser Val Pro Thr 305 310 315 320 Thr Pro Glu Asp Phe Leu Ser Asn Met Asp Glu Met Asp Thr Gly Glu 325 330 335 Asn Ser Gly Gln Thr Pro Met Thr Val Asn Pro Gln Gln Thr Arg Phe 340 345 350 Pro Asp Phe Leu Asp Cys Leu Pro Gly Thr Asn Val Asp Leu Gly Thr 355 360 365 Leu Glu Ser Glu Asp Leu Ile Pro Leu Phe Asn Asp Val Glu Ser Ala 370 375 380 Leu Asn Lys Ser Glu Pro Phe Leu Thr Trp Leu 385 390 395 <210> 3 <211> 272 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 3 Leu Pro Leu Pro Pro Gly Trp Glu Met Thr Phe Thr Ala Thr Gly Gln 1 5 10 15 Arg Tyr Phe Leu Asn His Ile Glu Lys Ile Thr Thr Trp Gln Asp Pro 20 25 30 Arg Lys Val Met Asn Gln Pro Leu Asn His Val Asn Leu His Pro Ser 35 40 45 Ile Thr Ser Thr Ser Val Pro Gln Arg Ser Met Ala Val Ser Gln Pro 50 55 60 Asn Leu Ala Met Asn His Gln His Gln Gln Val Val Ala Thr Ser Leu 65 70 75 80 Ser Pro Gln Asn His Pro Thr Gln Asn Gln Pro Thr Gly Leu Met Ser 85 90 95 Val Pro Asn Ala Leu Thr Thr Gln Gln Gln Gln Gln Gln Lys Leu Arg 100 105 110 Leu Gln Arg Ile Gln Met Glu Arg Glu Arg Ile Arg Met Arg Gln Glu 115 120 125 Glu Leu Met Arg Gln Glu Ala Ala Leu Cys Arg Gln Leu Pro Met Glu 130 135 140 Thr Glu Thr Met Ala Pro Val Asn Thr Pro Ala Met Ser Thr Asp Met 145 150 155 160 Arg Ser Val Thr Asn Ser Ser Ser Asp Pro Phe Leu Asn Gly Gly Pro 165 170 175 Tyr His Ser Arg Glu Gln Ser Thr Asp Ser Gly Leu Gly Leu Gly Cys 180 185 190 Tyr Ser Val Pro Thr Thr Pro Glu Asp Phe Leu Ser Asn Met Asp Glu 195 200 205 Met Asp Thr Gly Glu Asn Ser Gly Gln Thr Pro Met Thr Val Asn Pro 210 215 220 Gln Gln Thr Arg Phe Pro Asp Phe Leu Asp Cys Leu Pro Gly Thr Asn 225 230 235 240 Val Asp Leu Gly Thr Leu Glu Ser Glu Asp Leu Ile Pro Leu Phe Asn 245 250 255 Asp Val Glu Ser Ala Leu Asn Lys Ser Glu Pro Phe Leu Thr Trp Leu 260 265 270 <210> 4 <211> 400 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Asn Pro Ala Ser Ala Pro Pro Pro Leu Pro Pro Pro Gly Gln Gln 1 5 10 15 Val Ile His Val Thr Gln Asp Leu Asp Thr Asp Leu Glu Ala Leu Phe 20 25 30 Asn Ser Val Met Asn Pro Lys Pro Ser Ser Trp Arg Lys Lys Ile Leu 35 40 45 Pro Glu Ser Phe Phe Lys Glu Pro Asp Ser Gly Ser His Ser Arg Gln 50 55 60 Ser Ser Thr Asp Ser Ser Gly Gly His Pro Gly Pro Arg Leu Ala Gly 65 70 75 80 Gly Ala Gln His Val Arg Ser His Ser Ser Pro Ala Ser Leu Gln Leu 85 90 95 Gly Thr Gly Ala Gly Ala Ala Gly Ser Pro Ala Gln Gln His Ala His 100 105 110 Leu Arg Gln Gln Ser Tyr Asp Val Thr Asp Glu Leu Pro Leu Pro Pro 115 120 125 Gly Trp Glu Met Thr Phe Thr Ala Thr Gly Gln Arg Tyr Phe Leu Asn 130 135 140 His Ile Glu Lys Ile Thr Thr Trp Gln Asp Pro Arg Lys Ala Met Asn 145 150 155 160 Gln Pro Leu Asn His Met Asn Leu His Pro Ala Val Ser Ser Thr Pro 165 170 175 Val Pro Gln Arg Ser Met Ala Val Ser Gln Pro Asn Leu Val Met Asn 180 185 190 His Gln His Gln Gln Gln Met Ala Pro Ser Thr Leu Ser Gln Gln Asn 195 200 205 His Pro Thr Gln Asn Pro Pro Ala Gly Leu Met Ser Met Pro Asn Ala 210 215 220 Leu Thr Thr Gln Gln Gln Gln Gln Gln Lys Leu Arg Leu Gln Arg Ile 225 230 235 240 Gln Met Glu Arg Glu Arg Ile Arg Met Arg Gln Glu Glu Leu Met Arg 245 250 255 Gln Glu Ala Ala Leu Cys Arg Gln Leu Pro Met Glu Ala Glu Thr Leu 260 265 270 Ala Pro Val Gln Ala Ala Val Asn Pro Pro Thr Met Thr Pro Asp Met 275 280 285 Arg Ser Ile Thr Asn Asn Ser Ser Asp Pro Phe Leu Asn Gly Gly Pro 290 295 300 Tyr His Ser Arg Glu Gln Ser Thr Asp Ser Gly Leu Gly Leu Gly Cys 305 310 315 320 Tyr Ser Val Pro Thr Thr Pro Glu Asp Phe Leu Ser Asn Val Asp Glu 325 330 335 Met Asp Thr Gly Glu Asn Ala Gly Gln Thr Pro Met Asn Ile Asn Pro 340 345 350 Gln Gln Thr Arg Phe Pro Asp Phe Leu Asp Cys Leu Pro Gly Thr Asn 355 360 365 Val Asp Leu Gly Thr Leu Glu Ser Glu Asp Leu Ile Pro Leu Phe Asn 370 375 380 Asp Val Glu Ser Ala Leu Asn Lys Ser Glu Pro Phe Leu Thr Trp Leu 385 390 395 400 <210> 5 <211> 34 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Leu Pro Leu Pro Pro Gly Trp Glu Met Thr Phe Thr Ala Thr Gly Gln 1 5 10 15 Arg Tyr Phe Leu Asn His Ile Glu Lys Ile Thr Thr Trp Gln Asp Pro 20 25 30 Arg Lys

Claims (6)

1. TAZ(Transcriptional coactivator with PDZ-binding motif) 단백질의 변이체; 및
   상기 TAZ 단백질의 변이체를 코딩하는 핵산분자로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 제2형 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,
   상기 TAZ 단백질의 변이체는 서열번호 2, 3, 또는 5로 이루어진 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 포함하는 것; 또는 서열번호 2의 아미노산 서열으로 이루어진 폴리펩티드의 N 말단으로부터 58, 62, 306, 및 309번째 아미노산인 세린(Serine)이 알라닌(Alanine)으로 치환된 것이고,
   상기 조성물은 근육 세포의 인슐린 감수성(insulin sensitivity)을 증가시키는 것인, 조성물.
2. 청구항 1에 있어서, 상기 제2형 당뇨병은 비만, 고지방 식이, 아디포넥틴(adiponectin) 감소 돌연변이, 및 스타틴(statin) 약물로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상으로 유도되는 것인 조성물.
3. 삭제
4. 삭제
5. 청구항 2에 있어서, 상기 스타틴 약물은 로바스타틴(lovastatin), 심바스타틴(simvastatin), 프라바스타틴(pravastatin), 플루바스타틴(fluvastatin), 아토르바스타틴(atorvastatin), 로수바스타틴(rosuvastatin), 이타바스타틴(itavastatin), 세리바스타틴(cerivastatin), 피타바스타틴(pitavastatin), 메바스타틴(mevastatin) 및 리바스타틴(rivastatin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 조성물.
6. TAZ(Transcriptional coactivator with PDZ-binding motif) 단백질의 변이체; 및
   상기 TAZ 단백질의 변이체를 코딩하는 핵산분자로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 제2형 당뇨병을 치료하는 방법으로서,
   상기 TAZ 단백질의 변이체는 서열번호 2, 3, 또는 5로 이루어진 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 포함하는 것; 또는 서열번호 2의 아미노산 서열으로 이루어진 폴리펩티드의 N 말단으로부터 58, 62, 306, 및 309번째 아미노산인 세린(Serine)이 알라닌(Alanine)으로 치환된 것이고,
   상기 TAZ 단백질의 변이체는 근육 세포의 인슐린 감수성(insulin sensitivity)을 증가시키는 것인, 방법.

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