ES2296339T3

ES2296339T3 - Medicamentos que regulan las lipoproteinas.

Info

Publication number: ES2296339T3
Application number: ES98936610T
Authority: ES
Inventors: Bernard Bihain; Lydie Bougueleret; Frances Yen-Potin
Original assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Serono Genetics Institute SA
Current assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Merck Biodevelopment SAS
Priority date: 1997-08-06
Filing date: 1998-08-06
Publication date: 2008-04-16
Anticipated expiration: 2018-08-06
Also published as: US6635431B1; WO1999007736A2; ES2210786T3; PT964870E; US6344441B1; US20080249009A1; US7291709B2; DE69838720D1; EP1375516A3; JP2005143508A; ATE256146T1; CY1107808T1; JP2001512746A; WO1999007737A2; WO1999007736A3; EP1903057A2; FR2767135A1; US7919091B2; DE69838720T2; DE69820419T2

Abstract

La invención se refiere a procedimientos y composiciones farmacéuticas útiles para modular los niveles de lipoproteínas (in vivo). La invención se deriva del descubrimiento de que la actividad del receptor estimulado por lipólisis (LSR) puede inhibirse o ampliarse por agentes exógenos, en particular polipéptidos.

Description

Medicamentos que regulan las lipoproteínas.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a medicamentos que son útiles para modular los niveles de lipoproteínas in vivo. Más particularmente, la invención se refiere a medicamentos que modifican la actividad del receptor estimulado por la lipólisis (LSR) y que se pueden utilizar para influir en el reparto de los lípidos de la dieta entre el hígado y los tejidos periféricos, incluido el tejido adiposo.

Antecedentes de la invención

La obesidad es un problema de salud pública que es grave y generalizado. Una tercera parte de la población en los países industrializados tiene un exceso de peso de, al menos, el 20% respecto al peso ideal. El fenómeno continúa empeorando, sobre todo en las regiones del mundo donde las economías se están modernizando. En los Estados Unidos, el número de personas obesas se ha incrementado desde el 25% de finales de los años setenta hasta el 33% de principios de los años noventa.

La obesidad aumenta considerablemente el riesgo de sufrir enfermedades cardiovasculares o metabólicas. Se estima que si toda la población tuviera un peso ideal, el riesgo de insuficiencia coronaria se reduciría en torno al 25% y el riesgo de insuficiencia cardíaca y de accidentes cerebrovasculares en torno al 35%. La insuficiencia coronaria, la enfermedad ateromatosa y la insuficiencia cardíaca son la vanguardia de las complicaciones cardiovasculares inducidas por la obesidad. Para un exceso de peso mayor del 30%, se duplica la incidencia de las enfermedades coronarias en los sujetos menores de 50 años. Los estudios llevados a cabo sobre otras enfermedades son igual de elocuentes. Para un exceso de peso del 20%, se duplica el riesgo de hipertensión arterial. Para un exceso de peso del 30%, se triplica el riesgo de cursar una diabetes de tipo 2. El de hiperlipidemias se multiplica por seis veces.

La lista de enfermedades que se inician por culpa de la obesidad es larga: hiperuricemia (11,4% en los sujetos obesos, frente al 3,4% en la población general), enfermedades digestivas, anomalías en las funciones hepáticas e incluso algunas neoplasias malignas.

Tanto si los cambios fisiológicos en la obesidad se caracterizan por un aumento del número de adipocitos como por un aumento de la cantidad de triglicéridos almacenados en cada adipocito, o por ambos, este exceso de peso es el resultado, principalmente, de un desequilibrio entre la cantidad de calorías consumidas y las calorías utilizadas por el cuerpo. Los estudios sobre las causas de este desequilibrio se han realizado en varias direcciones. Algunos se han centrado en estudiar el mecanismo de absorción de los alimentos y, por lo tanto, las moléculas que controlan el consumo de alimentos y la sensación de saciedad. Otros estudios han caracterizado las vías a través de las cuales el cuerpo utiliza sus calorías.

Los tratamientos para la obesidad que se han propuesto son de cuatro tipos. La restricción de alimentos es el utilizado con más frecuencia. A los individuos obesos se les recomienda cambiar sus hábitos de alimentación para consumir menos calorías. Este tipo de tratamiento es eficaz a corto plazo. Sin embargo, la tasa de recidiva es muy alta. También se propone el aumento del uso de las calorías mediante el ejercicio físico. Este tratamiento es ineficaz cuando se aplica sólo pero, sin embargo, mejora el adelgazamiento de los sujetos con una dieta hipocalórica. La intervención quirúrgica gastrointestinal, que reduce la absorción de las calorías ingeridas, es eficaz pero se ha abandonado virtualmente debido a los efectos secundarios que causa. El abordaje médico utiliza o bien la acción anorexígena de las moléculas implicadas del sistema nervioso central, o bien el efecto de las moléculas que aumentan el uso de energía al aumentar la producción de calor. Los prototipos de este tipo de moléculas son las hormonas tiroideas que desacoplan las fosforilaciones oxidativas de la cadena respiratoria mitocondrial. Los efectos secundarios y la toxicidad de este tipo de tratamiento hacen peligroso su uso. También se utiliza un enfoque que persigue reducir la absorción de los lípidos de la dieta secuestrándolos en la luz del tubo digestivo. Sin embargo, induce desequilibrios fisiológicos que son difíciles de tolerar: deficiencia en la absorción de las vitaminas liposolubles, flatulencia y esteatorrea. Cualquiera que sea el enfoque terapéutico concebido, todos los tratamientos de la obesidad se caracterizan por una tasa de recidiva muy alta.

Los mecanismos moleculares responsables de la obesidad en los hombres son complejos e implican factores genéticos y medioambientales. Debido a la baja eficacia de los tratamientos conocidos hasta ahora, urge definir los mecanismos genéticos que determinan la obesidad, para poder desarrollar fármacos mejor dirigidos.

Se han estudiado más de 20 genes como posibles candidatos, bien porque han intervenido en enfermedades en las que la obesidad es una de las manifestaciones clínicas, o bien porque son homólogos de los genes implicados en la obesidad en los modelos de animales. Situado en la región cromosómica 7q31, el gen OB es uno de los estudiados más ampliamente. Su producto, la leptina, está implicado en los mecanismos de la saciedad. La leptina es una proteína plasmática de 16 kDa producida por los adipocitos bajo la acción de varios estímulos. Los ratones obesos de tipo ob/ob muestran un gen de la leptina defectuoso; esta proteína es indetectable en el plasma de estos animales. La administración de la leptina obtenida por ingeniería genética a ratones ob/ob corrige su hiperfagia relativa y permite la normalización de su peso. Este efecto anorexígeno de la leptina pone en funcionamiento un receptor del sistema nervioso central, el receptor de ob, que pertenece a la familia de los receptores de citocinas de tipo 1. El receptor de ob es defectuoso en los ratones obesos de la cepa db/db. La administración de la leptina a estos ratones no tiene ningún efecto en el consumo de alimentos y no permite la reducción considerable de su peso. No se conocen de manera precisa los mecanismos mediante los cuales los receptores de ob transmiten la señal para la saciedad. Es posible que el neuropéptido Y esté implicado en su vía de señalización. Es importante especificar en esta etapa que los receptores de ob no son los únicos reguladores del apetito. El receptor 4 de la melanocortina también está implicado ya que los ratones que se han hecho deficientes para este receptor son obesos [Gura, Science, 275: 751 (1997)].

El descubrimiento de la leptina y la caracterización del receptor de la leptina en el sistema nervioso central han abierto una nueva ruta de búsqueda de medicamentos contra la obesidad. Sin embargo, este modelo resultó ser decepcionante con rapidez. De hecho, con una sola excepción [Montagne et al., Nature, 387: 903 (1997)], los genes que codifican la leptina o su receptor de ob han resultado ser normales en las personas obesas. Adicional y paradójicamente, las concentraciones en el plasma de la leptina, la hormona de la saciedad, son anormalmente elevadas en la mayoría de los seres humanos.

En relación con la presente invención, también se pueden citar los siguientes documentos:

- El documento de Mann et al. [Circulation, 94 (8), sup. I-698, 1996], que describe la proteína llamada ApoCIII y su propiedad de inhibir la unión de lipoproteínas ricas en triglicéridos al LSR;

- El documento de Troussard et al [Journal of Biological Chemistry, 270, (29), 17068-17071, 1995], que se refiere a un estudio que muestra que la proteína asociada al receptor (PAR) es capaz de ejercer un efecto inhibitorio importante sobre el LSR;

- El documento de solicitud de patente publicado con el número WO 99/04000 que describe el polipéptido llamado zsig37 y polipéptidos homólogos del mismo tales como el C1q citado por intervenir en la defensa del huésped frente a la infección;

- El documento de Ghebrehiwet et al. (Journal of Experimental Medecine, 179, 1809-1821, 1994) que describe análisis de unión que implican el C1q y su receptor; y

- El documento de solicitud de patente publicado con el número WO 96/39429 que se refiere al ADN que codifica Acrp30 y el uso del inhibidor o activador de Acrp30 para la regulación del balance energético de un mamífero o el uso de Acrp30 para modular la producción de insulina en un mamífero.

Claramente, hay una necesidad de nuevos medicamentos que sean útiles para reducir la masa corporal en los humanos. Tal composición farmacéutica ayudaría ventajosamente a controlar la obesidad y, por lo tanto, a aliviar muchas de las consecuencias cardiovasculares asociadas con esta enfermedad.

La presente invención describe un agente que influye en el reparto de los lípidos de la dieta entre el hígado y los tejidos periféricos para utilizarlo como un medicamento. Este agente se puede utilizar para tratar una enfermedad en la que se desea aumentar el reparto de los lípidos de la dieta hacia el hígado, reducir el consumo de alimentos en los individuos obesos, reducir la cantidad de ácidos grasos libres en los individuos obesos, disminuir la masa corporal de los individuos obesos o tratar una enfermedad relacionada con la obesidad seleccionada entre el grupo que consiste en ateroesclerosis relacionada con la obesidad, resistencia a la insulina relacionada con la obesidad, hipertensión relacionada con la obesidad, lesiones microangiopáticas de resultas de la diabetes de tipo II relacionada con la obesidad, lesiones oculares causadas por una microangiopatía en los individuos obesos con diabetes de tipo II y lesiones renales causadas por una microangiopatía en los individuos obesos con diabetes de tipo II. El agente que influye en el reparto de los lípidos de la dieta entre el hígado y los tejidos periféricos es uno cualquiera de: análogos de adipoQ, homólogos de adipoQ, derivados de adipoQ o fragmentos de cualquiera de los agentes anteriores, o incluye un antagonista del LSR o un agonista del LSR.

La invención se refiere a un compuesto que activa el LSR para la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir una enfermedad o un trastorno relacionado con la obesidad, en la que dicho compuesto comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos, en la que dicho compuesto tiene, al menos, una identidad del 80% con una de las secuencias de la SEQ ID n.º 7 a 10 y 14.

Otro aspecto más de la invención se refiere al uso de un compuesto de acuerdo con la presente invención en la fabricación de un medicamento para tratar una enfermedad en la que el reparto de los lípidos hacia el hígado es anormal. En una realización, se puede utilizar este medicamento para reducir el consumo de alimentos en los individuos obesos, reducir la cantidad de ácidos grasos libres en los individuos obesos, disminuir la masa corporal de los individuos obesos, o tratar o prevenir la enfermedad o el trastorno relacionado con la obesidad seleccionado entre el grupo que consiste en aterosclerosis relacionada con la obesidad, resistencia a la insulina relacionada con la obesidad, hipertensión relacionada con la obesidad, lesiones microangiopáticas de resultas de la diabetes tipo II relacionada con la obesidad, lesiones oculares causadas por una microangiopatía en los individuos obesos con diabetes de tipo II, y lesiones renales causadas por una microangiopatía en los individuos obesos con diabetes de tipo II. En una realización preferida, la invención se refiere al uso según la invención en la que dicho compuesto incluye un polipéptido que puede ser C1q, cerebelina o multimerina.

Otro aspecto más de la invención se refiere al uso de un compuesto según la invención para la fabricación de una composición farmacéutica que además comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para identificar un compuesto candidato que modula una actividad del receptor estimulado por la lipólisis que comprende:

a) poner en contacto dicho receptor estimulado por la lipólisis con una o más moléculas de prueba en presencia del compuesto que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de al menos el 80% con una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID n.º 7, SEQ ID n.º 8, SEQ ID n.º 9, SEQ ID n.º 10, SEQ ID n.º 11, SEQ ID n.º 12, SEQ ID n.º 13 y SEQ ID n.º 14; y

b) determinar si tales una o más moléculas de prueba modulan la interacción de dicho compuesto con dicho receptor estimulado por la lipólisis, en el que la modulación de dicha interacción identifica un compuesto dicho candidato.

En una realización preferida, el método para identificar un compuesto candidato de acuerdo con la presente invención se caracteriza por que una o más moléculas de prueba se seleccionan entre el grupo que consiste en péptidos, fármacos y pequeñas moléculas.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es un gráfico de rectas que muestra el efecto inhibidor de los anticuerpos dirigidos contra los péptidos sintéticos que representan las regiones aminoterminales y carboxiterminales de la proteína gC1q-R. La unión inducida con oleato de las ^{125}I-LDL a las membranas plasmáticas de los hepatocitos de rata se midió en presencia de concentraciones crecientes de anticuerpos dirigidos contra un péptido aminoterminal del gC1a-R (\blacksquare); anticuerpos dirigidos contra un péptido carboxiterminal del gC1q-R (O) o un anticuerpo de control negativo (\Box).

Las figuras 2A a 2C muestran gráficos de rectas que representan diferentes aspectos de la actividad del LSR. Los gráficos muestran los resultados para la unión (A), internacionalización (B) y degradación (C) de la LDL marcada, una lipoproteína de modelo, en presencia y en ausencia de oleato en concentraciones crecientes de C1q. Los valores en el eje vertical se presentan en ng de ^{125}I-LDL por mg de proteína celular que estaba unida, internalizada y degradada por placa en presencia (\blacksquare) o en ausencia (\Box) de oleato.

La figura 3 muestra un alineamiento de varias proteínas que son análogas a C1q. Los dominios globulares de las proteínas que pertenecen a la familia del complemento C1q se alinearon utilizando clustalW. Las diferentes secuencias alineadas son:

C1qa-117: secuencia de la proteína del complemento C1qA (referencia de SwissProt: P02745), desde el aminoácido en la posición 117 (SEQ ID n.º 7).

C1qb-122: secuencia de la proteína del complemento C1qB (referencia de SwissProt P02746), desde el aminoácido en la posición 122 (SEQ ID n.º 8).

C1qc-121: secuencia de la proteína del complemento C1qC (referencia de SwissProt P02747), desde el aminoácido en la posición 121 (SEQ ID n.º 9).

mul-1160: secuencia de la proteína traducida a partir de la secuencia nucleica para la multimerina (GenBank, número de acceso: U27109) desde el aminoácido 1160 (SEQ ID n.º 14).

cer-64: secuencia de la proteína traducida a partir de la secuencia nucleica para la cerebelina (GenBank, número de acceso: M58583) desde el aminoácido 64 (SEQ ID n.º 10).

apm1-115: secuencia de la proteína traducida a partir de la secuencia nucleica para la ApM1 (GenBank, número de acceso: D45371) desde el aminoácido 115 (SEQ ID n.º 11).

adQ-118: secuencia de la proteína a partir de la secuencia nucleica para la AdipoQ (GenBank, número de acceso: U49915) desde aminoácido 118 (SEQ ID n.º 12).

acrp-118: secuencia de la proteína traducida a partir de la secuencia nucleica para la acrp30 (GenBank, número de acceso: U37222) desde aminoácido 118 (SEQ ID n.º 13).

Las secuencias recuadradas muestran las dos porciones del alineamiento que corresponden a la firma C1q, correspondiendo la primera al consenso depositado en la base de datos Prosite (n.º PD0C00857): F-x(5)-[N/D]-x(4)-[F/Y/
W/L]-x(6)-F-x(5)-G-x-Y-x-F-x-[F/Y] (SEQ ID n.º 1), la segunda en el extremo COOH de las proteínas es: [S/T]-x-F-[S/T]-G-[F/Y]-L-[L/V]-[F/Y] (SEQ ID n.º 2). En estas secuencias, los corchetes ([]) encierran aminoácidos alternativos que pueden ocupar una posición y los números indican el número de iteraciones de un aminoácido inespecífico. Las flechas (V) por encima de los alineamientos marcan las posiciones de los restos de cisteína conservados en las tres formas de C1q pero no en las otras proteínas alineadas. Los símbolos (*) colocados bajo los alineamientos indican los aminoácidos conservados, los símbolos (.) indican las sustituciones conservativas de aminoácidos.

Las figuras 4A a 4C muestras gráficos de barras que representan diferentes aspectos de la actividad del LSR. Los gráficos muestran resultados para la unión (A); la captación o internacionalización (B); y la degradación (C) de ^{125}I-LDL por parte de los hepatocitos cultivados. Las barras huecas representan la diferencia entre los valores obtenidos después de la incubación con y sin oleato a 0,6 mM en ausencia de AdipoQ. Las barras rellenas muestran los mismos parámetros en las muestras incubadas con 25 ng de AdipoQ.

La figura 5 es un gráfico de rectas que muestra la respuesta lipémica posprandial en las ratas a las que se inyectó AdipoQ.

Las figuras 6A y 6B son gráficos de barras que representan los resultados obtenidos después de la infusión de AdipoQ en las ratas. Los gráficos muestran resultados para el adelgazamiento (A) y la concentración de triglicéridos en el plasma (B).

Las figuras 7A y 7B son gráficos de barras que representan el consumo de alimentos diario para los ratones ob/ob (A) y los ratones db/db (B) que eran o bien controles o a los que se les administró AdipoQ.

Visión general

En la presente memoria describimos composiciones y métodos que son útiles para modular la actividad del "receptor estimulado por la lipólisis" (LSR). Tal y como se detalla más adelante, la capacidad para modular la actividad del LSR proporciona una manera de intervenir en enfermedades que implican anomalías en el metabolismo de los lípidos. Más particularmente, hemos descubierto una familia de compuestos que se pueden incorporar en medicamentos que, al administrarse in vitro o in vivo, activan ventajosamente la actividad del LSR. Como consecuencia, los hepatocitos se unen a las lipoproteínas, las internalizan y las degradan de manera eficaz.

Cuando se utilizan de esta manera, los compuestos que mejoran la actividad del LSR, particularmente los que mejoran la actividad del receptor, pueden favorecer el adelgazamiento. A diferencia de los compuestos que activan el LSR, se pueden utilizar los agentes que inhiben la actividad del LSR para favorecer el almacenamiento de lípidos en el tejido adiposo porque se reducirá la degradación de las lipoproteínas en el hígado. Las composiciones y métodos de la invención son útiles para tratar enfermedades que incluyen: obesidad y anorexia, hiperlipidemias, ateroesclerosis, diabetes, hipertensión y, más generalmente, las distintas enfermedades asociadas con anomalías en el metabolismo de las citocinas.

Introducción

La presente invención describe métodos y composiciones que son útiles para regular la actividad de un receptor con varias subunidades llamado LSR. El LSR se expresa en la superficie de los hepatocitos y une las lipoproteínas en presencia de ácidos grasos libres. En ausencia de ácidos grasos libres, el LSR puede unir una citocina, preferiblemente una leptina. Cabe destacar que el LSR también es capaz de unirse al gC1q-R [Ghebrehiwet et al., J. Exp. Med. 179: 1809 (1994)] o a un receptor de tipo gC1q-R. Los expertos en la técnica comprenderán que gC1q-R es un receptor para C1q, una proteína que es un componente clave del sistema del complemento y que también se sabe que activa la fagocitosis por los macrófagos.

Brevemente, el LSR incluye, al menos, una subunidad \alpha y una subunidad \beta, preferiblemente, una subunidad \alpha y tres subunidades \beta. Ambas subunidades \alpha y \beta son los productos de la traducción de dos especies de ARNm que son resultado del ayuste alternativo de un ARN precursor común. Se cree que una subunidad \alpha' (\alpha prima), que es una proteína integral de la membrana como la subunidad \alpha y que está codificada por un tercer ARNm de ayuste alternativo, es un constituyente del LSR en alternativa a la subunidad \alpha. La inclusión además de una subunidad \gamma, que puede ser una proteína receptora gC1q-R o de tipo gC1q-R, con el LSR da lugar a la formación del "complejo LSR". Postulamos que el gC1q-R o la proteína de tipo gC1q-R sirve como una chaperona molecular que se asocia con el LSR.

Creemos que los agentes que modifican la estructura del complejo LSR al perturbar la interacción de la subunidad \gamma con el LSR activan de manera eficaz el LSR en ausencia de ácidos grasos libres. El efecto de esta perturbación se puede medir como el aumento de la unión, la internacionalización y la degradación de las lipoproteínas por los hepatocitos. Cuando los lípidos se degradan dentro de los hepatocitos, hay disponibles pocos lípidos para que se capten y almacenen en el tejido adiposo.

Definiciones

Tal y como se utiliza en la presente memoria, la terminología "LSR" y "receptor LSR" se refieren a la combinación de las subunidades \alpha o \alpha' y \beta que construyen un receptor expresado principalmente en la superficie de los hepatocitos y que se puede unir a las lipoproteínas y facilitar su internalización y su degradación en los hepatocitos.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, "complejo LSR" se refiere a un receptor LSR que además incluye una subunidad \gamma.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, se entiende que la terminología "polipéptido" designa una proteína o un péptido.

Se entenderá que "polipéptido equivalente" significará un polipéptido que tiene, al menos, una de las actividades de un polipéptido en cuestión. Así, por ejemplo, si un polipéptido en cuestión es capaz de inhibir la unión de una subunidad \gamma al LSR para formar un complejo LSR, entonces en este contexto un polipéptido equivalente será un polipéptido que es capaz de inhibir de manera similar la unión de la subunidad \gamma al LSR.

Se entenderá que "polipéptido homólogo" significará polipéptidos que muestran algunas modificaciones cuando se comparan con el polipéptido natural. Estas modificaciones incluyen una deleción, truncamiento, extensión, fusión quimérica y/o mutación, en particular, una mutación puntual. Entre los polipéptidos homólogos, se prefieren aquéllos en los que la secuencia de aminoácidos muestra, al menos, una homología del 80%, preferiblemente del 90%, con las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos según la invención.

Se entenderá que "polipéptido derivado" (o proteína derivada) significa todos los polipéptidos mutados que pueden existir, incluidas los truncamientos, deleciones y/o adiciones de restos de aminoácidos [incluidos los aminoácidos que se producen de forma natural, aminoácidos modificados y aminoácidos inusuales tales como los enumerados en la tabla 4 de WIPO Standard ST.25 (1998), y aminoácidos que no se producen de forma natural], sustituciones o mutaciones, en particular, mutaciones puntuales, independientemente de si se producen de forma natural o de si se producen de forma artificial. Se pueden crear derivados generados de forma artificial utilizando una serie de técnicas, incluida la mutagénesis de ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos, la síntesis química o la modificación química.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, la terminología "obesidad" y "relacionado con la obesidad" se utiliza para referirse a individuos que tiene una masa corporal que es mediblemente mayor que la ideal para su altura y esqueleto. Preferiblemente, esta terminología se refiere a los individuos con valores del índice de masa corporal mayores de 10, preferiblemente, con valores del índice de masa corporal mayores de 20 y, más preferiblemente, con valores del índice de masa corporal mayores de 35.

Se entiende que "fragmento de polipéptido" se refiere a un polipéptido o un péptido que comprende, al menos 5, al menos 7, al menos 10, al menos 15, al menos 30, o más de 30 aminoácidos consecutivos del polipéptido del que derivan. Se entenderá que se puede obtener un fragmento de polipéptido a partir del polipéptido de origen.

Se entenderá que fragmentos biológicamente activos de un polipéptido significa una porción de un polipéptido mayor, en el que dicha porción conserva una actividad característica del polipéptido mayor, y en el que la actividad se puede medir en cualquier sistema biológico. Por ejemplo, se considera que un fragmento de polipéptido es "biológicamente activo" si demuestra un cambio estadísticamente significativo de la actividad en cualquiera de los análisis descritos en los ejemplos 1, 2, 6, 7, 8, 9 ó 10. Así, por ejemplo, si una proteína modifica de forma característica la interacción entre la subunidad \gamma y el receptor LSR, entonces el fragmento biológicamente activo de esa proteína sería una porción de la proteína que conserva la capacidad para modificar dicha interacción.

Se entiende que un polinucleótido, una secuencia nucleica o un ácido nucleico significa una molécula de ADN y/o ARN natural o sintética aislada que puede incluir nucleótidos no naturales.

Se entiende que secuencias de polinucleótidos equivalentes significa secuencias de ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de acuerdo con la invención, teniendo en cuenta la degeneración del código genético, las secuencias de ADN complementario y las secuencias del ARN correspondiente, así como secuencias de ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos equivalentes.

Se entiende que secuencias nucleicas homólogas significa secuencias nucleicas que codifican los polipéptidos homólogos y/o las secuencias nucleicas que muestran un nivel de homología de al menos el 80%, preferiblemente el 90%. De acuerdo con la invención, la homología es sólo del tipo estadístico, quiere decir que las secuencias tienen un mínimo del 80%, preferiblemente el 90% de nucleótidos en común.

Se entenderá que alelo o variante alélica significa las secuencias mutadas naturales que corresponden a los polimorfismos presentes en los seres humanos y, en particular, a los polimorfismos que pueden llevar al brote y/o al desarrollo de la obesidad o de la anorexia. Estos polimorfismos también pueden conducir al brote y/o al desarrollo de riesgos o complicaciones asociadas con la obesidad, en particular, a nivel cardiovascular, y/o de enfermedades asociadas con anomalías en el metabolismo de las citocinas.

Se entiende que secuencias nucleicas mutadas significa las secuencias nucleicas que comprenden, al menos, una mutación puntual en comparación con la secuencia normal.

Mientras que las secuencias de acuerdo con la invención son, en general, secuencias de tipo salvaje, también son secuencias mutadas porque comprenden, al menos, una mutación puntual y, preferiblemente, al menos el 10% de las mutaciones en comparación con la secuencia de tipo salvaje.

Tal y como se cita en la presente invención, se pueden utilizar métodos y fármacos de la invención para tratar animales, entre ellos pájaros, peces o mamíferos. Se entiende que la categoría de mamíferos incluye mamíferos tales como ratones, ratas, conejos, mamíferos domésticos y seres humanos. Aunque los métodos del tratamiento se pueden aplicar a mamíferos no humanos, concebimos con claridad que también se pueden tratar los humanos utilizando los métodos y los medicamentos descritos en la presente memoria.

Compuestos moduladores de la actividad del LSR

Utilizando los métodos descritos en la presente memoria, se han identificado compuestos que modulan de manera selectiva la actividad del LSR in vivo e in vitro. Los compuestos identificados incluyen, por ejemplo, anticuerpos que tienen una especificidad de unión para la proteína gC1q-R, el C1q y la AdipoQ. Como se espera razonablemente que ApM1 represente el homólogo humano de la AdipoQ humana, tal y como se describe más adelante, se deduce que ApM1 será útil para modular la actividad del LSR y el metabolismo de las lipoproteínas en los humanos. Más generalmente, se espera que los homólogos del C1q sean útiles para modular la actividad del LSR y el metabolismo de las lipoproteínas. Sin embargo, estos compuestos no se limitan a ninguna estructura química en particular, ya que están definidos solamente por la cascada de análisis que permite, por primera vez, la identificación sistemática y racional de moduladores muy potentes y selectivos del LSR específico de los hepatocitos a nivel molecular.

Indicaciones

Mientras que no deseamos comprometernos con ninguna teoría de operación en particular, se cree que los compuestos identificados mediante los métodos descritos en la presente memoria se unen a la subunidad \gamma del complejo LSR, con lo cual el compuesto, o mejorará la actividad del LSR, o la inhibirá. Así, las composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto identificado mediante este procedimiento serán útiles para el tratamiento de enfermedades caracterizadas por concentraciones elevadas de triglicéridos en circulación o por una fuerte tendencia indeseable a depositar lípidos en el tejido adiposo. Alternativamente, los compuestos que inhiben la actividad del LSR serán útiles para favorecer el depósito de lípidos hacia el tejido adiposo y/o reducir la degradación de los lípidos de la dieta en el hígado.

Por lo tanto, en general, las enfermedades que se pueden tratar con los compuestos, composiciones, medicamentos y formulaciones farmacéuticas identificados mediante este procedimiento de la invención generalmente se refieren a enfermedades del metabolismo de los lípidos.

Formulaciones farmacéuticas y vías de administración

Los compuestos identificados se pueden administrar a un mamífero, incluido un paciente humano, solos o en composiciones farmacéuticas donde se mezclan con los vehículos o excipiente(s) adecuados a las dosis terapéuticamente eficaces para tratar o mejorar diferentes enfermedades asociadas con el metabolismo de los lípidos. Además, una dosis terapéuticamente eficaz se refiere a esa cantidad del compuesto suficiente para dar lugar a la mejora de los síntomas, tal y como se determinó mediante los métodos descritos en la presente invención. Así, una dosis terapéuticamente eficaz de AdipoQ o ApM1 será la dosis del compuesto que es adecuada para favorecer la reducción de la concentración de triglicéridos que sigue a una dieta rica en grasas y que favorecerá el adelgazamiento con el uso o la administración periódica continuada. Las técnicas para la formulación y la administración de los compuestos de la presente solicitud se pueden encontrar en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, última edición.

Vías de administración

Las vías adecuadas de administración incluyen la administración por vía oral, rectal, transmucosal o intestinal, la administración por vía parenteral, incluidas las inyecciones por vía intramuscular, subcutánea e intramedular, así como las inyecciones por vía intradural, intraventricular directa, intravenosa, intraperitoneal, intranasal o intraocular. Un método particularmente útil para administrar compuestos para favorecer el adelgazamiento conlleva el implante quirúrgico, por ejemplo en la cavidad abdominal del receptor, de un dispositivo para administrar el compuesto durante un largo
periodo de tiempo. En particular, se contemplan las formulaciones de liberación lenta de los fármacos de la invención.

Composición/formulación

Las composiciones farmacéuticas y los medicamentos a utilizar de acuerdo con la presente invención se pueden formular de una manera convencional utilizando uno o más vehículos fisiológicamente aceptables que comprenden excipientes y auxiliares. La formulación adecuada depende de la vía de administración elegida.

Algunos de los fármacos descritos en la presente invención incluirán un vehículo farmacéuticamente aceptable y, al menos, un polipéptido que es homólogo a la proteína Cq1 o un fragmento de la misma. Además de los fármacos que incluyen componentes proteicos homólogos a los homólogos de la proteína C1q, también contemplamos que los compuestos que no son proteicos que interaccionan con la subunidad \gamma del complejo LSR también encontrarán utilidad como moduladores de la actividad del LSR, tanto in vitro como in vivo. Incluidos entre los ejemplos de homólogos de la proteína C1q que encontrarán utilidad para modular la actividad del LSR y/o estimular una reducción de las lipoproteínas en el plasma y/o favorecer el adelgazamiento están las proteínas C1q (C1q A, C1q B y C1q C), AdipoQ, ApM1, acrp30, cerebelina y multimerina.

Para la inyección, los agentes de la invención se pueden formular en disoluciones acuosas, preferiblemente, en tampones fisiológicamente compatibles como la disolución de Hank, la disolución de Ringer o un tampón salino fisiológico tal como un tampón de fosfato o de bicarbonato. Para la administración por vía transmucosal, se utilizan en la formulación penetrantes adecuados para la barrera a atravesar. Tales penetrantes se conocen generalmente en la técnica.

Las composiciones farmacéuticas que se pueden utilizar por vía oral incluyen cápsulas de ajuste suave hechas de gelatina así como cápsulas blandas selladas hechas de gelatina y un plastificante, como el glicerol o el sorbitol. Las cápsulas de ajuste suave pueden contener los ingredientes activos en una mezcla con rellenos tales como lactosa, aglutinantes tales como almidones y/o lubricantes tales como talco o estearato de magnesio y, opcionalmente, estabilizantes. En las cápsulas blandas, los compuestos activos se pueden disolver o suspender en líquidos adecuados, tales como aceites grasos, parafina líquida o polietilenglicoles líquidos. Además, se pueden añadir estabilizantes. Todas las formulaciones para la administración por vía oral deben estar en dosis adecuadas para tal administración.

Para la administración por vía bucal, las composiciones pueden tomar la forma de comprimidos o pastillas formulados de la manera convencional.

Para la administración mediante inhalación, los compuestos a utilizar de acuerdo con la presente invención se administran convenientemente en forma de presentación en aerosol pulverizador de envases presurizados o un nebulizador, con el uso de un propulsor gaseoso adecuado, por ejemplo, dióxido de carbono. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosis se puede determinar proporcionando una válvula para administrar una cantidad medida. Las cápsulas y los cartuchos de, por ejemplo, gelatina, para utilizar en un inhalador o un insuflador, se pueden formular para contener una mezcla de polvo del compuesto y una base de polvo adecuado tal como lactosa o almidón.

Los compuestos se pueden formular para la administración parenteral mediante inyección, por ejemplo, mediante inyección intravenosa rápida o infusión continua. Las formulaciones para inyección se pueden presentar en forma de dosis unitarias, por ejemplo, en ampollas o en contenedores de muchas dosis, con un conservante añadido. Las composiciones pueden tomar tales formas como suspensiones, disoluciones o emulsiones en vehículos acuosos y pueden contener agentes de formulación tales como suspendedores, estabilizantes y/o dispersantes.

Las formulaciones farmacéuticas para la administración por vía parenteral incluyen disoluciones acuosas de los compuestos activos en la forma hidrosoluble. Las suspensiones acuosas pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, tales como carboximetil-celulosa de sodio, sorbitol o dextrano. Opcionalmente, la disolución también puede contener estabilizantes adecuados o agentes que aumentan la solubilidad de los compuestos para permitir la preparación de disoluciones muy concentradas.

Alternativamente, el ingrediente activo puede estar en forma de polvo o en una forma liofilizada para la constitución con un vehículo adecuado, tal como agua estéril sin pirógenos, antes de su uso.

Además de las formulaciones descritas anteriormente, los compuestos también se pueden formular como un preparado de liberación lenta. Tales formulaciones de efecto prolongado se pueden administrar mediante implante (por ejemplo, por vía subcutánea o intramuscular) o mediante inyección intramuscular. Así, por ejemplo, los compuestos se pueden formular con materiales poliméricos o hidrófobos adecuados (por ejemplo, como una emulsión en un aceite aceptable) o con resinas de intercambio iónico, o como derivados escasamente solubles, por ejemplo, como una sal escasamente soluble.

Adicionalmente, los compuestos se pueden administrar utilizando un sistema de liberación lenta, tal como matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el agente terapéutico. Se han establecido diferentes materiales de liberación lenta y los expertos en la técnica los conocen bien. Las cápsulas de liberación lenta pueden, según su naturaleza química, liberar los compuestos durante unas pocas semanas hasta aproximadamente 100 días.

Según la naturaleza química y la estabilidad biológica del reactivo terapéutico, se pueden emplear otras estrategias para la estabilización de la proteína.

Las composiciones farmacéuticas también pueden comprender vehículos o excipientes de fase sólida o en gel adecuados. Ejemplos de tales vehículos o excipientes incluyen, pero sin limitarse a ellos, carbonato, fosfato de calcio, diferentes azúcares, almidones, derivados de la celulosa, gelatina y polímeros tales como polietilenglicoles.

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Dosis eficaz

Las composiciones farmacéuticas adecuadas a utilizar en la presente invención incluyen composiciones en las que los ingredientes activos aparecen en una cantidad eficaz para lograr su propósito para el que se pensaron. Más específicamente, una cantidad terapéuticamente eficaz significa una cantidad eficaz para prevenir el desarrollo de los síntomas existentes en los sujetos a tratar o para aliviarlos. Los expertos en la técnica serán capaces de determinar las cantidades eficaces, especialmente a la luz de la descripción detallada proporcionada en la presente
memoria.

Para cualquier compuesto utilizado en el método de la invención, la dosis terapéuticamente eficaz se puede estimar inicialmente a partir de los análisis de cultivo de células. Por ejemplo, se puede formular una dosis en los modelos animales para conseguir un intervalo de concentración en circulación que incluye o abarca un punto o intervalo de concentración que se demostró que ejercía una mejora o la inhibición de la actividad del LSR en un sistema in vitro. Tal información se puede utilizar para determinar de manera más precisa las dosis útiles en los humanos.

Una dosis terapéuticamente eficaz se refiere a esa cantidad del compuesto que da lugar a una mejora de los síntomas de un paciente. La toxicidad y la eficacia terapéutica de tales compuestos se puede determinar mediante procedimientos farmacéuticos estándares en cultivos de células o en animales experimentales, por ejemplo, para determinar la DM_{50} (la dosis mortal para el 50% de la población de la prueba) y la DE_{50} (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50% de la población). La proporción de dosis entre los efectos tóxicos y los terapéuticos es el índice terapéutico y se puede expresar como la proporción entre la DM_{50} y la DE_{50}. Se prefieren los compuestos que muestran unos índices terapéuticos elevados.

Los datos obtenidos a partir de estos análisis de cultivo de células y estudios con animales se pueden utilizar para formular un intervalo de dosis de uso en los humanos. La dosis de tales compuestos se encuentra, preferiblemente, dentro de un intervalo de concentraciones en circulación que incluyen la DE_{50}, con poca o ninguna toxicidad. La dosis puede variar dentro de este intervalo según la forma farmacéutica empleada y la vía de administración utilizada. La formulación exacta, la vía de administración y la dosis la puede escoger cada médico según la enfermedad del paciente (véase, por ejemplo, Fingl et al., 1975, en The Pharmacological Basis of Therapeutics, cap. 1).

Se puede ajustar individualmente la cantidad y el intervalo de la dosis para proporcionar concentraciones del compuesto activo en el plasma que sean suficientes para mantener los efectos moduladores del LSR. Las dosis necesarias para conseguir el efecto modulador del LSR dependerán de las características individuales y de la vía de administración.

También se pueden determinar los intervalos de las dosis utilizando el valor para la concentración eficaz mínima. Los compuestos se deben administrar utilizando una posología que mantenga las concentraciones en el plasma por encima de la concentración eficaz mínima durante el 10-90% del tiempo, preferiblemente, entre el 30 y el 90% y, más preferiblemente, entre el 50 y el 90%. En los casos de administración local o captación selectiva, la concentración local eficaz del fármaco puede no referirse a la concentración en el plasma.

La cantidad de la composición administrada dependerá, por supuesto, del sujeto a tratar, del peso del sujeto, de la gravedad de la enfermedad, de la manera en que se administre y del criterio del médico que la prescriba.

Un intervalo de dosis preferida para la cantidad del homólogo polipeptídico de C1q, tal como AdipoQ o ApM1, que se puede administrar en una pauta diaria o regular para alcanzar los resultados deseados, incluida una reducción en la concentración de los triglicéridos y/o lipoproteínas en circulación en el plasma, oscila de 0,1 a 50 mg/kg de masa corporal. Un intervalo de dosis más preferido es de 0,2 a 25 mg/kg. Un intervalo de dosis aún más preferido es de 1,0 a 20 mg/kg, mientras que el intervalo más preferido es de 2,0 a 10 mg/kg. Por supuesto, estas dosis diarias se pueden administrar en pequeñas cantidades de forma periódica durante el transcurso de un día.

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Homologías de las proteínas

Se entiende que un polipéptido que tiene una nivel determinado de homología con una proteína o polipéptido objeto se puede identificar utilizando un alineamiento de secuencias y programas de comparación fácilmente disponibles, tales como blastp, fasta y/o ClustalW, y los métodos que serán familiares para los expertos en la técnica. Un método para identificar una proteína que es homóloga a una proteína objeto implica ejecutar un algoritmo de comparación de secuencias "blastp" estándar [Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)]. En este método, se puede utilizar una puntuación relativamente baja en el algoritmo blastp para aislar grandes cantidades de secuencias potencialmente homólogas de diferentes longitudes. Por ejemplo, una puntuación baja puede estar en el orden de entre unos 80 hasta unos 100 y puede dar lugar a dianas que tienen unos niveles de homología de aproximadamente el 20%.

Si se desean unos niveles de homología mayores, se pueden llevar a cabo más etapas. Por ejemplo, una vez que se ha identificado una primera serie de secuencias homólogas candidatas, se pueden seleccionar las secuencias que son más homólogas a la proteína objeto. En esta etapa, pueden variar dos parámetros. Primero, es posible "cortar" la proteína objeto en subsecuencias de interés y, luego, ejecutar las búsquedas de homología que afinan los resultados obtenidos en la etapa inicial. Por ejemplo, los fragmentos que están enumerados como SEQ ID n.º 7 a 14 o las secuencias consenso dentro de las dos regiones recuadradas mostradas en la figura 3 se podrían seleccionar como subsecuencias de interés que se podrían utilizar para ejecutar las búsquedas de homología. Segundo, se puede aumentar la puntuación utilizada al ejecutar el algoritmo blastp. Por ejemplo, al aumentar la puntuación hasta un nivel de 300, se pueden obtener con frecuencia unos niveles de homología de aproximadamente el 80%. Estos procedimientos se pueden realizar utilizando programas informáticos fácilmente accesibles tales como, por ejemplo, "blastp" o "fasta". [Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990); Pearson, W. R. Genomics 11: 635-650 (1991)].

Los expertos en la técnica se darán cuenta de que la puntuación citada más arriba que se puede introducir en el programa de comparación de secuencias se puede calcular basándose en el grado de homología que se desea. Las fórmulas dentro de los paquetes citados de algoritmos informáticos permiten esta posibilidad. En general, una puntuación creciente permite identificar alineamientos de proteínas cada vez más específicas caracterizados por unos niveles elevados de homología. Se pueden afinar adicionalmente los alineamientos candidatos utilizando alineamientos por parejas (fasta) o múltiples (ClustalW) [Higgings et al., Computer Applications in the Biosciences (CABIOS), 8: 189-191 (1992) y Thompson et al., Nucleic Acids Research, 22: 4673-4680 (1994)].

Una ilustración de la extensión de la homología entre las proteínas aparece en la tabla 1. Los resultados que aparecen en la tabla muestran diferentes niveles de homología entre la ApM1 y distintas proteínas completas o fragmentos de esas proteínas. Así, por ejemplo, la secuencia de toda la proteína Acrp30 mostró una homología del 81,8% con la proteína ApM1, mientras que el segmento de la Acrp30 identificado mediante la SEQ ID n.º 13 mostró una homología del 91,5% con la proteína ApM1.

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TABLA 1 Homologías entre ApM1 y distintas proteínas

1

Para identificar una proteína que tiene un nivel de homología determinado, tal como una homología de al menos el 25%, una homología de al menos el 50% o una homología de al menos el 80%, con otra proteína, tales como AdipoQ, ApM1 o C1q, se puede utilizar un análisis con blastp estándar en el que se instruye al programa para que recupere las proteínas que tienen una puntuación que corresponda al nivel de homología deseado. Por ejemplo, para identificar las proteínas que tienen un nivel de homología del 20 al 30%, se puede instruir al programa para que recupere las proteínas que tiene una puntuación entre aproximadamente 80 y aproximadamente 100. Para recuperar una proteína que tenga un nivel de homología del 80%, se puede instruir al programa para que incluya las proteínas que tienen una puntuación de aproximadamente 300. Se apreciará que se pueden computar estas puntuaciones sobre toda la longitud de la proteína objeto o sobre una parte de la proteína tales como las SEQ ID n.º 7 a 14. Se apreciará adicionalmente que se pueden obtener unos niveles de homología diferentes a los enumerados explícitamente en la presente memoria utilizando las instrucciones proporcionadas como parte del programa. Así, la siguiente descripción es adecuada para permitir al experto en la técnica identificar polipéptidos que son homólogos a una proteína objeto, tal como la proteína ApM1 humana, a diferentes niveles de homología. En algunos casos, se pueden utilizar los parámetros por omisión.

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El LSR con varias subunidades

El LSR específico de los hepatocitos es un receptor con varias subunidades que tiene una actividad dual. Cuando es activado por los ácidos grasos libres, el LSR permite la endocitosis de las lipoproteínas y, por lo tanto, es un componente en una vía metabólica para la eliminación de las lipoproteínas. Esta vía sirve principalmente, pero no de forma exclusiva, para favorecer la eliminación de las partículas con gran contenido de triglicéridos de origen intestinal [Mann et al., Biochemistry, 34: 10421 (1995)]. Esta actividad, que se expresa más particularmente en el hígado, depende de la presencia de ácidos grasos libres que se unen al receptor, induce un cambio reversible en la conformación de este complejo y le permite unir, con gran afinidad, varias clases de lipoproteínas tales como las que contienen apoproteína B o apoproteína E. En su otra función, y en ausencia de ácidos grasos libres, el LSR no une las lipoproteínas, pero es capaz de fijar una citocina, en particular, una leptina. Luego, el hepatocito internaliza la leptina unida al receptor, y la degrada.

Tal y como se describió anteriormente, las subunidades del LSR se pueden unir a gC1q-R, el receptor para C1q, uno de los componentes del complejo C1 de la vía convencional para la activación del complemento. Proteínas análogas a gC1q-R también se pueden unir en el sitio del LSR para la unión del gC1q-R. Se entiende que proteínas análogas a gC1q-R significa en particular las proteínas homólogas que muestran, preferiblemente, un nivel de homología de la secuencia de aminoácidos de al menos,el 80%, mostrando las proteínas, al menos, uno de los motivos de un sitio para la unión de la proteína gC1q-R en el receptor LSR y/o las proteínas capaces de interaccionar con el receptor LSR.

Otra característica del LSR se refiere al destino de las lipoproteínas o citocinas unidas. Más particularmente, es una característica del LSR que las lipoproteínas unidas o las citocinas unidas se incorporen en la célula y, luego, se degraden. Las lipoproteínas unidas pueden contener en particular apoproteína B o E.

Tal y como se describió detalladamente más abajo, la actividad del complejo LSR se puede modular mediante una familia de compuestos que incluye C1q o uno de sus compuestos análogos, como AdipoQ [Hu et al, J. Biol. Chem. 271: 10697 (1996)], ApM1 [Maeda et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 221: 286 (1996)] y cerebelina. En particular, el compuesto C1q o uno de sus compuestos análogos permite, en ausencia de ácidos grasos libres, mejorar la actividad del LSR y, por lo tanto, aumentar la cantidad de lipoproteínas unidas, internalizadas y degradadas por las células que expresan el receptor LSR.

La invención describe polipéptidos u otros compuestos que son capaces de modular, bien imitando, promocionando, inhibiendo o, de otro modo, alterando la interacción de la subunidad \gamma del complejo LSR con las subunidades \alpha o \alpha' y \beta del receptor LSR.

Estos polipéptidos se pueden obtener mediante la purificación o el aislamiento a partir de fuentes naturales o, alternativamente, se pueden obtener mediante recombinación genética o síntesis química. En el caso en el que los polipéptidos son polipéptidos sintéticos, pueden contener aminoácidos no naturales.

Se puede realizar una definición de la invención más completa describiendo primero la estructura del LSR y los métodos que se utilizaron para explicar sus propiedades farmacológicas.

Definición de la estructura y la función del LSR

Se identificaron las subunidades del LSR mediante procedimientos que utilizaron anticuerpos policlonales específicos del receptor. Estos anticuerpos se obtuvieron inmunizando conejos con especies de 240 kDa purificadas de gel que unen una sonda de LDL marcada en un análisis de transferencia de ligando [Mann et al., Biochemistry, 34: 10421 (1995)] realizado en presencia de oleato a 0,8 mM. En los procedimientos descritos en la presente memoria, se emplea el oleato como un ácido graso libre de modelo, que se utiliza para activar la actividad de unión a la lipoproteína del LSR. Los resultados de este análisis de transferencia del ligando además indicaron que las proteínas membranarias que tienen masas moleculares estimadas de 115 kDa y 90 kDa también unen LDL. En particular, los anticuerpos de conejo reconocieron las tres especies de unión a LDL en un procedimiento de inmunotransferencia e inhibieron la unión de las LDL a los LSR dispuestos sobre hepatocitos de rata en un análisis de unión de ligandos. Esto indicó que los anticuerpos policlonales generados contra las especies que unen LDL de 240 kDa eran útiles como reactivos específicos del LSR.

El análisis electroforético de las proteínas que se inmunoprecipitaron utilizando los anticuerpos anti-LSR y, luego, se separaron en condiciones reductoras indicó que sólo un número muy pequeño de proteínas en particular fueron reconocidas por el reactivo del anticuerpo. Más particularmente, se encontraron proteínas de 68 kDa, 56 kDa y 35 kDa en el inmunoprecipitado. Esto demostró que el complejo LSR era un multímero compuesto de subunidades que tienen masas moleculares de 68 kDa (subunidad \alpha), 56 kDa (subunidad \beta) y 35 kDa (subunidad \gamma). Estas masas moleculares son estimaciones y se obtuvieron de la rata. Como se detalla más adelante, se cree que la subunidad \gamma corresponde a una proteína conocida previamente. La estructura de las subunidades \alpha y \beta se estableció mediante un procedimiento de clonación por expresión que utiliza anticuerpos anti-LSR policlonales como sonda.

De hecho, se cribó una genoteca de ADNc de hígado de rata en \lambdagt11 con los anticuerpos específicos anti-LSR para identificar los clones que expresan proteínas que corresponden a las subunidades del LSR. El análisis detallado de uno de los clones fágicos aislados utilizando un protocolo de PCR basado en la secuencia clonada identificada condujo a la identificación de tres especies de ARNm diferentes. El examen cuidadoso de las secuencias de estos ARNm, junto con la PCR posterior y los procedimientos de clonación, confirmó que las tres especies representaban variantes de ayuste alternativo de un sólo transcrito de precursor. Los tres ADNc completos tenían una longitud de 2097 pb, 2040 pb y 1893 pb. La masa molecular de las proteínas predichas codificadas por los marcos de lectura abiertos en las tres secuencias de ADNc eran 66 kDa, 64 kDa y 58 kDa, respectivamente.

Los procedimientos del método Northern que utilizan ARN aislado de tejidos diferentes de rata indicaron que el polinucleótido clonado se hibridaba a los transcritos expresados en hígado de rata como ARNm de 1,9 kb y 2,1 kb e indicaron, además, que esta expresión se limitaba sustancialmente al hígado.

Se utilizaron cinco técnicas diferentes para demostrar que las 2097 pb y las 1893 pb eran componentes esenciales del receptor LSR. Primero, se generaron anticuerpos policlonales contra dos péptidos sintéticos que tienen las secuencias que correspondían a los restos 169 a 186 y a los restos 556 a 570, respectivamente, codificadas por el ADNc de 2097 pb. Estas secuencias peptídicas eran comunes a todas las proteínas predichas codificadas por las tres variantes de ayuste de ARNm descritas más arriba. Se demostró que estos anticuerpos antipéptido, pero no los anticuerpos de control irrelevantes, inhibían la unión de las LDL al LSR presente en las membranas plasmáticas. Segundo, los procedimientos de análisis de inmunotransferencia y de transferencia de ligandos demostraron que las subunidades parcialmente purificadas \alpha y \beta: 1) se unen a los anticuerpos anti-LSR policlonales de conejo, 2) se unen a los anticuerpos antipéptido y 3) se unen a las LDL después de la incubación con oleatos. Tercero, la traducción in vitro y la marcación para producir proteínas sintéticas que corresponden a los polipéptidos codificados por los ADNc de 2097 pb y 1893 pb condujeron a productos que unen LDL en un análisis de ultracentrifugación en el que la unión del LDL produjo un complejo que tiene una densidad que era menor que la densidad de la proteína sola. En presencia de oleato, esta unión se mejoró el doble para la subunidad \alpha o el quíntuplo para la subunidad \beta. Cuarto, se encontró que las células de ovario de hámster chino (CHO por su nombre en inglés) transfectadas transitoriamente con un plásmido que contiene la subunidad \alpha del LSR mostraban un aumento de la unión de LDL después de incubaciones en presencia de oleato, mientras que la unión de LDL medida en ausencia de oleato no cambiaba. La cotransfección de los plásmidos que contienen la subunidad \beta del LSR junto con la subunidad \alpha del LSR aumentaba adicionalmente la unión de la LDL observada después de las incubaciones con oleato. Más importante aún, se observó un aumento en la degradación de la LDL después de la incubación con oleato sólo en las placas que contienen células cotransfectadas con las subunidades \alpha y \beta del LSR. Por lo tanto, la contransfección de ambas subunidades \alpha y \beta del LSR es una condición suficiente para aumentar la actividad del LSR en las células CHO. La afinidad de las distintas clases de lipoproteínas por el LSR en las células cotransfectadas con la subunidad \alpha y \beta era muy similar a la descrita originalmente para el LSR expresado en los hepatocitos de rata o en los fibroblastos humanos aislados de sujetos con hipercolesterolemia familiar [Bihain et al., Biochemistry, 31: 4628 (1992); Yen et al., Biochemistry, 33: 1172 (1994)].

Una quinta serie de indicios que demuestran que el gen identificado era responsable de la función del LSR y que este receptor participa en la eliminación de los triglicéridos de la dieta se obtuvo utilizando ratones genéticamente obesos. Se encontró que tanto los ratones ob/ob (que tienen un gen deficiente de leptina) como los ratones db/db (que tiene un defecto en el gen que codifica el receptor de la leptina) mostraban un aumento de la respuesta lipémica posprandial después de la alimentación forzada con la comida de prueba estándar descrita más arriba. El número medido de LSR disponibles en la membrana plasmática de los hepatocitos de estos ratones obesos era menor que el de los controles delgados. Además, el análisis por transferencia Northern reveló que la cantidad de ARNm del LSR había disminuido significativamente en los ratones obesos. El tratamiento de la obesidad de los ratones ob/ob mediante la administración diaria de leptina recombinante durante un periodo de treinta días condujo a una reducción de más del 30% de la masa corporal del animal, a una disminución masiva de la respuesta lipémica posprandial, a un aumento significativo en el número medido de LSR expresados en la superficie de los hepatocitos y a un aumento del número de ARNm del LSR.

Por lo tanto, partiendo de estos datos, se estableció que el gen del LSR identificado era responsable de la función de este receptor, que el LSR representa una etapa limitante del ritmo de eliminación de los triglicéridos de la dieta y que la expresión de este gen está desregulada en los ratones obesos. Es más, las subunidades de 56 y 68 kDa del LSR se unen sustancialmente a las LDL sólo después de la incubación con oleato. El análisis estequiométrico de los productos de inmunoprecipitación indicó que el complejo de unión a las LDL de 240 kDa que se observaba en el análisis de transferencia de ligandos representaba más probablemente un complejo multimérico formado por una sola subunidad \alpha y tres subunidades \beta. Se cree que el ADNc de 2040 pb descrito más arriba que representa el tercer producto de ayuste alternativo de ARN codifica una subunidad que puede sustituir a \alpha en el complejo multimérico. Esta última proteína se denomina \alpha' (alfa prima).

Mientras que las subunidades \alpha y \beta del LSR estaban codificadas por los ARNm de ayuste alternativo generados a partir de una sola molécula precursora, el procedimiento de clonación por expresión descrito más arriba no proporcionó más información sobre la identidad de la subunidad de 35 kDa que se había detectado junto con las proteínas de 68 kDa y 56 kDa en el inmunoprecipitado anti-LSR. De hecho, la subunidad \gamma del LSR se identificó mediante secuenciación directa de la proteína purificada.

Más en particular, se utilizó la secuenciación del extremo amino del material purificado por inmunoafinidad para establecer la identidad probable del componente final del complejo LSR. En este procedimiento, se utilizaron anticuerpos anti-LSR policlonales de conejo inmovilizados en una columna para capturar las proteínas membranarias de hígado de rata. Después de verificar la presencia de especies de 35 kDa en el eluido de la columna, se secuenció una muestra que contiene la proteína de 35 kDa utilizando un protocolo de degradación de Edman estándar. Los resultados de este procedimiento dieron una secuencia de polipéptido de 19 aminoácidos de largo que se utilizó para interrogar una base de datos de proteínas. Esta búsqueda reveló que la subunidad \gamma del receptor LSR incluía una secuencia polipeptídica que era idéntica a la que aparecía en gC1q-R [Ghebrehiwet et al., J. Exp. Med. 179: 1809 (1994)], un receptor conocido de la superficie celular que se une a las cabezas globulares del C1q. Como no se había establecido toda la secuencia de la proteína de 35 kDa purificada por inmunoafinidad, consideramos la posibilidad de que la subunidad \gamma del complejo LSR estuviera relacionada con la proteína gC1q-R, pero no fuera idéntica a ella.

El análisis de la secuencia de las proteínas de las subunidades \alpha y \beta del LSR reveló varias características estructurales interesantes. Por ejemplo, la presencia de varios sitios de fosforilación en el extremo amino de la proteína de la subunidad \alpha sugirió que el extremo amino de esta proteína estaba orientado hacia el interior de la célula y además sugirió un posible papel en la transducción de señales. La parte del extremo amino de la proteína de la subunidad \alpha también poseía una secuencia de aminoácidos hidrófoba que estaba separada por dos restos de prolina contiguos, una disposición que probablemente indujo una estructura en horquilla. Esta disposición de dos brazos hidrófobos probablemente constituye un posible dominio de unión de ácidos grasos del LSR .La subunidad \alpha también poseía una secuencia de aminoácidos hidrófobos coherente con un posible dominio transmembranario [Brendel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 89: 2002 (1992)] La proteína de la subunidad \beta no posee un dominio transmembranario y, probablemente, está ubicada fuera de la célula donde se une a través de puentes disulfuro a otros componentes del complejo LSR.

Composiciones y métodos para modular la actividad del LSR

Una característica estructural adicional de las proteínas de las subunidades \alpha y \beta estaba relacionada con la presencia de segmentos repetidos que eran ricos en restos serina y arginina. Esto era importante porque el receptor de la lamina y el "factor de ayuste 2" también tienen en común una secuencia repetida de restos de serina y arginina (RSRS), y se sabe también que estas proteínas se combinan con la proteína gC1q-R [Honoré et al., Gene, 134: 283 (1993)]. En vista de esta coincidencia de motivos estructurales relacionados e interacciones con gC1q-R, especulamos que los segmentos ricos en serina y arginina de las subunidades \alpha y \beta del LSR eran en cierto modo importantes para establecer el contacto con gC1q-R, o la proteína de tipo gC1q-R que era la subunidad \gamma del complejo LSR.

Tal y como se describe en el siguiente ejemplo, los anticuerpos policlonales dirigidos contra péptidos sintéticos derivados de la secuencia de aminoácidos primaria del gC1q-R se utilizaron para demostrar que esta proteína, o una proteína estrechamente relacionada con gC1q-R, era un componente del complejo LSR. En el procedimiento descrito más adelante, los anticuerpos antipéptido inhibieron la unión de la LDL marcada al LSR expresado en la superficie de los hepatocitos de rata. El uso del sustrato modelo de LDL en estos procedimientos proporcionó unos medios adecuados y muy sensibles para monitorizar aspectos del metabolismo de las lipoproteínas en los hepatocitos.

El ejemplo 1 describe los procedimientos utilizados para demostrar que la gC1q-R, o un homólogo estrechamente relacionado con esta proteína, era un constituyente del complejo LSR.

Ejemplo 1 El gC1q-R o una proteína de tipo gC1q-R es un componente del LSR de varias subunidades

Los anticuerpos policlonales de conejo dirigidos contra dos péptidos sintéticos que tienen secuencias ubicadas dentro de los extremos carboxilo y amino de la proteína gC1q-R se prepararon de acuerdo con los procedimientos de laboratorio estándares. El péptido sintético que representa la región del extremo amino de la proteína tenía la secuencia, LRCVPRVLGSSVAGY* (SEQ ID n.º 3) y correspondía a los restos 5 a 19 de la secuencia del polipéptido del gC1q-R. El péptido sintético del extremo carboxilo tenía la secuencia, C*YITFLEDLKSFVKSQ (SEQ ID n.º 4) y correspondía a los restos 268 a 282 del gC1q-R. Las posiciones de aminoácidos marcadas con "*" indican restos que difieren de la secuencia de la proteína de tipo salvaje para mejorar la antigenicidad del péptido. Los péptidos se unieron a un vehículo de hemocianina de lapa californiana (KLH por su nombre en inglés) antes de inyectarlos a los conejos. Estos procedimientos dieron lugar a dos muestras de suero, cada una con una especificidad de unión para una región diferente de la proteína gC1q-R. Además, se purificó la inmunoglobulina G (IgG) de estos sueros utilizando una columna con Proteína A (Pharmacia) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Cantidades crecientes de los anticuerpos antipéptido o un anticuerpo irrelevante de IgG se combinaron con ^{125}I-LDL en un análisis estándar para medir la unión inducida por el oleato de las LDL a las membranas plasmáticas de los hepatocitos de rata [Bihain et al., Biochemistry 31: 4628 (1992); Mann et al., J. Biol. Chem. 272: 31348 (1997)]. La unión inducida por el oleato se determinó como la diferencia entre incubaciones con y sin oleato a 0,5 mM. Se analizaron las mediciones numéricas en este experimento en forma de porcentaje de ^{125}I-LDL total unida a las membranas sin añadir anticuerpos.

Los resultados presentados en la figura 1 indicaron que los anticuerpos dirigidos contra cualquiera de dos regiones de la proteína gC1q-R inhibieron la actividad del LSR que se midió mediante la unión a LDL. La IgG de control negativo no inhibió la actividad del LSR en este análisis. Esto demostró que los efectos inhibidores observados en nuestros procedimientos eran los resultados de interacciones específicas anticuerpo-receptor. Estos resultados confirmaron que el gC1q-R, o una proteína estrechamente relacionada con el gC1q-R, era un componente del complejo LSR.

Los resultados anteriores aparentemente sugirieron que los agentes que unen la gC1q-R, o la subunidad \gamma del complejo LSR, tenían un efecto negativo o inhibidor sobre la actividad del LSR. Por lo tanto, teníamos identificados agentes que podían modular la actividad del LSR de un modo negativo.

A la vista de estos resultados, era interesante evaluar adicionalmente los efectos de los compuestos que se unen al gC1q-R, o que podrían alterar las interacciones entre la subunidad \gamma y el LSR. Dado que se conocía que la proteína del complemento C1q era un sustrato de unión para el gC1q-R, investigamos si C1q modularía la actividad del LSR del mismo modo que los anticuerpos antipéptido inhibieron la actividad del LSR en el ejemplo anterior. En particular, el experimento descrito en el ejemplo siguiente se realizó tanto en presencia como en ausencia de oleato, un ácido graso libre que hace accesible el sitio de unión a la lipoproteína en el LSR.

El ejemplo 2 describe los procedimientos utilizados para demostrar que se podría modular la actividad del LSR de una manera positiva. Inesperadamente, la intensificación de la actividad del LSR se produjo tanto en presencia como en ausencia de ácidos grasos libres.

Ejemplo 2 Regulación de la actividad del LSR mediante C1q y sus homólogos

Se incubaron cultivos primarios de hepatocitos de rata con 20 ng de leptina/pocillo utilizando placas de 6 pocillos durante 30 minutos a 37ºC para estimular la movilización de las proteínas del LSR hacia la superficie celular y para aumentar el número de receptores LSR expresados. Después se añadieron concentraciones crecientes de C1q (Sigma) y 20 \mug/ml de ^{125}I-LDL a los cultivos de células en paralelo en presencia o en ausencia de oleato a 0,5 mM. A continuación, se incubaron las mezclas 4 horas a 37ºC y se analizaron la unión, internalización y degradación de las LDL marcadas utilizando técnicas estándares [Bihain et al., Biochemistry, 31: 4628 (1992); Mann et al., J. Biol. Chem. 272: 31348 (1997)].

Los resultados presentados en las figuras 2A-C indicaron inesperadamente que el C1q mejoraba la actividad del LSR tanto en presencia como en ausencia de ácidos grasos libres. De hecho, fue sorprendente que la unión, internalización y degradación de la lipoproteína se produjera sin añadir oleato, ya que previamente se pensaba que estos aspectos de actividad del LSR requerían la presencia de ácidos grasos libres. También se observaron pequeños, pero significativos, aumentos en los tres parámetros medidos en presencia de oleato. La importancia de estos últimos aumentos fue menos considerable porque los valores de fondo medidos sin añadir C1q eran mayores en presencia de oleato en comparación con los valores medidos en ausencia de este ácido graso libre.

Los resultados descritos en el ejemplo anterior demostraron que la incubación de los hepatocitos de rata con C1q, una proteína capaz de unirse al gC1q-R y, por lo tanto, posiblemente capaz de desplazarla del complejo LSR, condujo a una activación espontánea del LSR en ausencia de ácidos grasos libres. Aunque no deseamos comprometernos con ninguna teoría particular que refuerce el mecanismo de la modulación de este receptor, ofrecemos lo siguiente como una posible explicación del fenómeno. Es posible que la proteína gC1q-R o, más en general, la subunidad \gamma, funcione como una proteína chaperona para el LSR. Además, es posible que la subunidad \gamma ejerza de algún modo un efecto inhibitorio sobre el LSR. Luego, se podría concebir que los agentes que perturban o alteran la unión de la subunidad \gamma al LSR se puedan utilizar para modular la actividad del LSR, que se puede medir in vitro como la unión, internalización y degradación de las LDL.

El caso ejemplar presentado más arriba sugirió que C1q servía como el agente perturbador de la unión de la subunidad \gamma al complejo LSR. Sin embargo, contemplamos que cualquier agente homólogo o análogo al C1q que sea capaz de unirse al gC1q-R, o a una proteína de tipo gC1q-R, también tendría el efecto de modular la actividad del receptor LSR.

El efecto del C1q descrito más arriba sobre la actividad del LSR nos llevó a investigar si las proteínas que comparten una homología estructural con C1q promoverían efectos similares sobre el LSR. Los alineamientos para algunos de estos homólogos se presentan en la figura 3, representando las regiones recuadradas regiones conservadas de homología estructural. Las proteínas murinas AdipoQ [Hu et al., J. Biol. Chem. 271: 10697 (1996)] y Acrp30 [Scherer et al., J. Biol. Chem. 270: 26746 (1995)] y la proteína humana ApM1 [Maeda et al., Biochem. Biphys. Res. Commun. 221: 286 (1996)] muestran claramente homologías notables. Estas tres proteínas, así como los componentes del complemento C1q (C1q A, B y C), son proteínas secretadas que tienen extremos amino que se parecen al colágeno (repetición de motivos Gly-X-Y) y extremos carboxilo que corresponden al dominio globular del C1q del complemento. Significativamente, estas tres proteínas se expresan preferiblemente en el tejido adiposo. Otros homólogos de la proteína muestran dominios globulares que se parecen al dominio del C1q. Más específicamente, la cerebelina y la multimerina (aislada en humanos) son dos proteínas que no tiene un dominio que se parece al
colágeno.

Resulta interesante que los restos de cisteína conservados en las posiciones 172, 179, 178 y 190, 196, 192, respectivamente en C1q A, C1q B y C1q C no estén conservados en los otros homólogos de C1q mostrados en el alineamiento. Estos restos cisteína están reemplazados en ApM1, AdipoQ y Acrp30 por un resto lisina y un resto aspartato. Los expertos en la técnica se darán cuenta de que los aminoácidos de lisina y aspartato pueden, en condiciones adecuadas, formar puentes salinos intercatenarios que pueden contribuir a la estructura de la proteína. Los aminoácidos en las posiciones correspondientes de la cerebelina y de la multimerina no permitirían la formación de puentes salinos. Por lo tanto, es posible caracterizar el dominio C1q de las proteínas producidas por los adipocitos gracias a la ausencia de cisteínas en la región correspondiente a los aminoácidos 170 a 200 de las moléculas de C1q y por el consenso en el dominio C1q.

Al considerar la relación estructural de los homólogos presentados en la figura 3, cabe destacar que la proteína ApM1, que está codificada por un ARNm caracterizado por expresarse intensamente en los adipocitos, muestra una identidad en el ácido nucleico del 79,7% y una identidad de aminoácidos del 80,6% con AdipoQ. Dado este nivel de relación entre las secuencias, la proteína ApM1 es casi seguramente el homólogo humano de la AdipoQ murina. Así, es razonable esperar que las actividades de la AdipoQ murina que se describen más abajo también caractericen la ApM1 en un sistema humano.

Dado que C1q tiene un amplio espectro de efectos biológicos, incluida la iniciación de la cascada del complemento, parecía poco probable que la activación muy especializada del LSR representara una función fisiológicamente significativa de esta proteína. En consecuencia, investigamos si los homólogos del C1q podían modular la actividad del LSR. Tal y como se indica en los ejemplos que siguen, actualmente hemos demostrado que la AdipoQ, una proteína plasmática abundante que tiene una función desconocida hasta la fecha, también intensifica la actividad del LSR.

La AdipoQ es un homólogo de C1q que se sabe que es secretada por los adipocitos con una cinética que se parece mucho a la cinética de la secreción de la adipsina. La adipsina es una hormona del sistema del complemento y se ha demostrado que corresponde al fragmento purificado del tercer componente del complemento, C3a-desArg [Baldo et al., J. Clin. Invest. 92: 1543 (1993)]. La adipsina estimula la síntesis de triglicéridos en los adipocitos y regula la lipemia posprandial [Sniderman et al., Proc. Nutr. Soc. 56: 703 (1997)]. Es más, se estimula la secreción de la AdipoQ y la adipsina en respuesta a la insulina.

Tal y como respaldan los resultados de los experimentos presentados más adelante, hemos probado que la AdipoQ puede estimular la actividad del LSR in vitro y que puede disminuir la masa corporal animal. Dado que la C1q y la AdipoQ comparten la homología estructural sin compartir también similitudes funcionales extensas, nuestra demostración de que AdipoQ activa la actividad del LSR establece la utilidad general de los homólogos de C1q como compuestos útiles para modificar la actividad del LSR.

El ejemplo 3 describe los métodos utilizados para preparar un vector de expresión que codifica la AdipoQ murina.

Ejemplo 3 Construcción de un vector de expresión que codifica la AdipoQ murina

Se utilizaron procedimientos de laboratorio estándares para aislar el ARN a partir de tejido adiposo que se había obtenido de ratones C57BL/6J. Se capturó el ARNm poli(A)* utilizando perlas magnéticas recubiertas con oligo-dT de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Dynal, Francia). El ARNm se retrotranscribió en ADNc utilizando la transcriptasa inversa SUPERSCRIPT y los reactivos que se adquirieron como un kit (Life Technologies, Francia). Se amplificó el ADNc que codifica la AdipoQ con un protocolo de PCR estándar utilizando los cebadores oligonucleotídicos que tienen las secuencias CTACATGGATCCAGTCATGCCGAAGAT (SEQ ID n.º 5), y CGACAACTC
GAGTCAGTTGGTATCATGG (SEQ ID n.º 6). Este procedimiento amplificó de manera selectiva secuencias de polinucleótidos cadena abajo de la posible secuencia señal localizada en el extremo 5' de la región codificante de AdipoQ. Se digirió el ADNc amplificado con las endonucleasas de restricción BamHI y Xhol y se ligaron los productos de la digestión en los correspondientes sitios del vector de expresión pTRC His B (Invitrogen, Francia). Este vector se ha construido para permitir la expresión de secuencias heterólogas cadena abajo de un dominio de polipéptido que incluye un motivo peptídico de hexahistidina, un sitio de escisión de la enterocinasa y un epítopo que es reconocido por un anticuerpo Anti-Xpress^{TM}. Después de la transformación de E. coli DH5-\alpha competentes, los clones bacterianos que albergan el polinucleótido que codifica la AdipoQ se seleccionaron cultivándolos en presencia de ampicilina. Se aisló el ADN plasmídico a partir de uno de los clones bacterianos y se determinó la secuencia del inserto del ADN heterólogo. Se encontró que la secuencia del inserto correspondía a las bases 57 a 762 de AdipoQ (n.º de acceso de GenBank U49915). La secuencia polinucleotídica clonada también correspondía a las bases 86 a 791 de la secuencia que codifica la Acrp30 (n.º de acceso de GenBank U37222), salvo para la posición del nucleótido 382. La secuencia del polinucleótido que codifica la Acrp30 tiene un resto adenosina en esta posición mientras que el polinucleótido de la AdipoQ tiene un resto guanina en la correspondiente posición. Esta sustitución nucleotídica conduce a un cambio de aminoácido de una metionina en Acrp30 a una valina en la AdipoQ.

Con la disponibilidad del vector de expresión arriba descrito, fue posible producir la proteína AdipoQ recombinante que se pudo utilizar para realizar experimentos in vitro e in vivo.

El ejemplo 4 describe los procedimientos que se utilizaron para preparar una forma recombinante de la proteína AdipoQ.

Ejemplo 4 Producción y purificación de la proteína AdipoQ recombinante

Las bacterias que contenían el vector de expresión de la AdipoQ se cultivaron a 37ºC en medio LB con selección con antibióticos hasta que la DO_{600} alcanzó 0,2. Luego, se indujo la producción de la proteína recombinante añadiéndole isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido a una concentración final de 1 mM. Se continuó con el cultivo bacteriano durante 16 horas más a 37ºC, y transcurrido dicho tiempo se recogieron por centrifugación las bacterias cultivadas. Se lisaron las bacterias de acuerdo con los procedimientos de laboratorio estándares utilizando lisozima en un tampón que incluía Tris-HCl (pH 7,4), NaCl, PMSF y desoxicolato de sodio. Se degradó el ADN en el lisado bruto por sonicación. Después de la centrifugación para retirar los residuos celulares, se aisló la proteína recombinante del sobrenadante limpio utilizando una columna PROBOND (Invitrogen, Francia). La resina cargada con níquel de la columna tiene afinidad por el motivo peptídico de hexahistidina descrito anteriormente de la proteína recombinante de fusión. Se consiguió la elución en presencia de imidazol. Después de la diálisis del eluido, se midió la concentración de la proteína mediante el método de Lowry estándar. Se comprobó la pureza de la proteína recombinante mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS. Se observó una sola banda de una masa molecular aparente de unos 33 kDa sobre el gel de proteínas. En particular, en este punto, la proteína recombinante conservaba el dominio proteico de hexahistidina.

A continuación, utilizamos un análisis in vitro para investigar si la AdipoQ recombinante, al igual que C1q, estimulaba la actividad del LSR. El uso del análisis in vitro nos permitió estudiar de manera particular diferentes aspectos de la actividad mediada por el LSR, incluida la unión, internalización y degradación de un sustrato de lipoproteína de modelo.

El ejemplo 5 describe los métodos que se utilizaron para probar que la AdipoQ estimulaba la actividad del LSR in vitro.

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Ejemplo 5 La AdipoQ recombinante estimula la actividad del LRS en los hepatocitos cultivados

Se prepararon cultivos primarios de hepatocitos de rata y se sembraron en placas de 6 pocillos a 900.000 células/pocillo. Después de 48 horas, se lavaron las células una vez con 2 ml/pocillo de una disolución salina tamponada con fosfato (PBS) y, luego, se incubaron durante 30 minutos a 37ºC con 20 ng/ml de leptina murina recombinante. A continuación, se incubaron adicionalmente las células durante 4 horas a 37ºC con 25 \mug/ml de AdipoQ recombinante y 20 \mug/ml de ^{125}I-LDL en presencia o en ausencia de oleato a 0,6 mM. Se determinaron la unión, internalización y degradación de la LDL marcada según los métodos estándares citados anteriormente.

Los resultados presentados en las figuras 4A-C muestran que la AdipoQ aumentó significativamente la cantidad de LDL que los hepatocitos habían unido, internalizado y degradado. De hecho, los resultados indicaron en particular que la degradación de las LDL mejoró de manera considerable al tratar los hepatocitos con AdipoQ. Cabe destacar que, en este contexto, el aumento de la actividad del LSR debido a la AdipoQ se midió en presencia de leptina. Estos resultados confirmaron que la AdipoQ era capaz de aumentar la actividad del LSR en los cultivos primarios de hepatocitos de rata.

Dado el hallazgo de que la AdipoQ mejoraba considerablemente la actividad del LSR in vitro, era interesante determinar si se repetiría el mismo patrón de actividad in vivo. Se probó esta posibilidad alimentando las ratas con una dieta rica en grasas, administrando AdipoQ recombinante a las ratas, midiendo los triglicéridos en el plasma y comparando los resultados con las mediciones tomadas en las ratas que no recibieron AdipoQ. Tal y como se describe más adelante, nuestros resultados indicaron que la administración con AdipoQ reducía considerablemente la concentración de los triglicéridos en el plasma después de una dieta de prueba rica en grasas.

El ejemplo 6 describe los procedimientos que se utilizaron para demostrar que la concentración de triglicéridos en el plasma después de una dieta rica en grasas disminuyó en los animales a los que se había inyectado AdipoQ.

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Ejemplo 6 La AdipoQ reduce los niveles de lípidos en sangre posprandial in vivo

Las ratas macho Sprague-Dawley que ayunaron durante una noche (400-450 g) se cebaron con una dieta de prueba rica en grasas (tiempo = 0) e, inmediatamente, se les administró mediante inyección por vía intravenosa en la vena femoral 300 \mul de PBS solo o que contenía 1 mg de la AdipoQ murina recombinante. La comida de prueba consistía en grasas al 60% (ácidos grasos saturados al 37%, monosaturados al 27% y poliinsaturados al 36%), proteínas al 20% y glúcidos al 20%, y proporcionó 56 kcal de energía/kg de masa corporal. Se administró una segunda inyección de AdipoQ 2 horas después de la comida de prueba. Se tomaron muestras de sangre a intervalos de 2 horas y se determinó la concentración de los triglicéridos mediante un análisis enzimático estándar utilizando reactivos que se habían adquirido como un kit (Boehringer Mannheim).

Los resultados presentados en la figura 5 demuestran que la AdipoQ disminuyó considerablemente la magnitud de la respuesta posprandial de los triglicéridos. Los valores cuantitativos presentados en la figura representan la media \pm desviación estándar (n = 3). Mientras que la concentración de triglicéridos en circulación continuó siendo sustancialmente constante en los animales a los que se administró AdipoQ, la concentración aumentó en los animales de control hasta alcanzar un máximo a unas 4 horas. Estos resultados in vivo fueron coherentes con la notable intensificación dependiente de AdipoQ de la actividad del LSR que habíamos observado in vitro.

El ejemplo 7 describe los procedimientos utilizados para demostrar que la administración de la AdipoQ promovió el adelgazamiento y redujo la concentración de los triglicéridos en el plasma de los animales normales. Esto fue verdad incluso cuando los animales se sometieron a una dieta rica en grasas. En particular, en este caso, la AdipoQ se administró mediante un protocolo de infusión lenta en vez de con una inyección.

Ejemplo 7 La administración de la AdipoQ mediante infusión estimula el adelgazamiento y la reducción de la concentración de los triglicéridos plasmáticos

Se introdujeron quirúrgicamente bombas osmóticas (Alzet) en las cavidades abdominales de 12 ratas macho Sprague-Dawley de 400-450 g. Las bombas contenían o bien 2 ml de PBS (pH 7,4) (control, n = 6) o bien 2 ml de AdipoQ recombinante de ratón (PBS a 5 mg/ml, n = 6). Las bombas utilizadas en este procedimiento se diseñaron para administrar 10 \mul/hora (50 \mug de AdipoQ/hora). Se pesaron los animales y, luego, se alojaron individualmente en jaulas metabólicas. Tres animales en cada grupo se sometieron o bien a una dieta de comida normal o bien a una dieta rica en grasas a voluntad (día 0). La dieta rica en grasas consistió en comida normal complementada con colesterol al 2% (p/v), grasa saturada al 10% (p/v) en forma de vegetalina, aceite de girasol al 10% (p/v) y sacarosa al 15% (p/v). En el día 3 se pesaron los animales y se tomaron muestras de sangre de la vena de la cola. Se midió la concentración de triglicéridos en el plasma utilizando un kit enzimático.

Los resultados presentados en las figuras 6A-B demuestran que la AdipoQ causó una reducción significativa de la concentración de triglicéridos en el plasma en los animales de prueba alimentados tanto con una dieta regular como con una dieta rica en grasas. Además, la administración de AdipoQ causó una reducción de la masa corporal que fue más pronunciada en los animales alimentados con la dieta rica en grasas.

El ejemplo 8 describe los procedimientos que definen otro efecto más de la AdipoQ in vivo. Más específicamente, los resultados presentados más adelante demuestran que los animales de prueba a los que se administró AdipoQ redujeron inesperadamente su consumo de alimentos.

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Ejemplo 8 La administración de AdipoQ favorece la reducción del consumo de alimentos en los ratones genéticamente obesos

A los ratones obob y db/db alojados en jaulas metabólicas se les inyectó diariamente durante 5 días en la vena de la cola o bien PBS sólo o bien AdipoQ murina recombinante (100 \mug) dispersada en un vehículo de PBS. Se monitorizó la cantidad de comida consumida diariamente por cada animal durante el periodo del experimento.

Los resultados presentados en las figuras 7A-B demuestran que la media del consumo de alimentos al día de los ratones obesos disminuyó considerablemente después de la administración de AdipoQ. Los datos del gráfico reflejan la media del consumo de alimentos y la desviación estándar para 4 ratones por cada grupo, salvo para el grupo de control de db/db (n = 3) en el que murió un animal antes del fin del experimento. Significativamente, se observó una reducción dependiente de la AdipoQ en el consumo de comida para los grupos de ratones ob/ob y db/db. Esto estableció que la AdipoQ era útil para controlar el consumo de comida en ausencia de leptina (ratones ob/ob) y que la AdipoQ podía solucionar la resistencia a la leptina que es característica de los ratones db/db.

El ejemplo 9 describe un método que se puede utilizar para reducir los triglicéridos en el plasma y la masa corporal en los humanos. Aunque este caso ejemplar describe un tratamiento de los humanos obesos, se entiende que a los humanos no obesos también se les puede administrar el medicamento descrito más adelante. Para los propósitos de procedimientos descritos en los siguientes dos ejemplos, se recluta una población de individuos con un índice de masa corporal >35 y se les realizan pruebas para diabetes (concentración de glucosa en el plasma en ayunas >120 mg/dl) e hipertrigliceridemia o "HTG" (concentración de triglicéridos en ayunas >150 mg/dl). A continuación, se constituyen cuatro grupos de sujetos obesos. Estos grupos incluyen: 1) sujetos con obesidad y sin diabetes o HTG, 2) sujetos con diabetes pero sin HTG, 3) sujetos con HTG pero sin diabetes y 4) sujetos con diabetes y con HTG.

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Ejemplo 9 Administración de un medicamento que incluye AdipoQ

Primero, se identifica una población de individuos humanos obesos y luego se separa en dos grupos aleatorios. El grupo de control recibe una inyección por vía intravenosa diaria de un placebo durante un periodo de una semana, dos semanas, un mes o más de un mes. El placebo comprende un volumen a 1,0 ml de PBS estéril. Los individuos en el grupo del tratamiento reciben una inyección por vía intravenosa dos veces al día de un fármaco que comprende 1,0 ml de PBS estéril que contiene AdipoQ recombinante a un nivel de dosis que corresponde a AdipoQ a 2,5 mg/kg de masa corporal. La AdipoQ recombinante se produce según los procedimientos de buena fabricación (PBF) en un sistema de expresión procariótico esencialmente de acuerdo con los procedimientos descritos en los ejemplos 3 y 4. Los individuos de ambos grupos siguen una dieta rica en grasas, y durante el procedimiento se monitorizan regularmente la concentración de triglicéridos en el suero y la masa corporal.

Al final del periodo de tratamiento, está claro que los individuos a los que se les administró el fármaco que incluía la AdipoQ muestran una reducción significativa de la concentración de triglicéridos en el plasma respecto al grupo de control. Además, hay pruebas de que estos individuos han experimentado una reducción de peso medible.

El ejemplo 10 describe cómo se puede utilizar ApM1 para estimular la reducción de la cantidad de triglicéridos en el plasma y la masa corporal.

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Ejemplo 10 La administración de ApM1 reduce los triglicéridos en el plasma y la masa corporal

Primero, se identifica una población de individuos humanos obesos y, luego, se separan en dos grupos aleatorios. El grupo de control recibe una inyección por vía intravenosa diaria de un placebo durante un periodo de tiempo de una semana, dos semanas, un mes o más de un mes. El placebo comprende un volumen de 1,0 ml de PBS estéril. Los individuos en el grupo de tratamiento reciben una inyección por vía intravenosa dos veces al día de un fármaco que comprende 1,0 ml de PBS estéril que contiene ApM1 humana a un nivel de dosis que corresponde a 2,5 mg de ApM1/kg de masa corporal. La ApM1 humana es un material recombinante producido según los estándares de los PBF. Para este propósito, se utiliza un sistema de expresión procariótico esencialmente de acuerdo con los procedimientos descritos en los ejemplos 3 y 4, salvo que el ADNc de la ApM1 humana se sustituye por el ADNc de la AdipoQ murina descrita en estos ejemplos. Los individuos de ambos grupos siguen una dieta rica en grasas. Se monitorizan la concentración de triglicéridos en la sangre y la masa corporal para ambos grupos de individuos.

Al final del periodo de tratamiento, los individuos en el grupo al que se le administró el fármaco que incluía la ApM1 muestran una reducción significativa de la concentración de los triglicéridos en el plasma respecto al grupo de control. Además, estos individuos han experimentado una reducción medible de la masa corporal.

La presente invención describe la preparación de un medicamento para alterar el reparto de los lípidos de la dieta entre los tejidos adiposos y el hígado en un individuo. Por ejemplo, los fármacos pueden aumentar o disminuir el nivel de lipólisis que se produce en el hígado. En particular, los medicamentos pueden aumentar o disminuir el nivel de lipólisis que se produce en el hígado al aumentar o disminuir la actividad del LSR.

Se pueden utilizar tales medicamentos en procedimientos para reducir la cantidad de lípidos de la dieta que se almacenan en el tejido adiposo o en procedimientos para aumentar la cantidad de lípidos de la dieta que se almacenan en el tejido adiposo según la naturaleza de la enfermedad a tratar. En particular, tales medicamentos aumentan o reducen las actividades de compuestos (entre ellos, AdipoQ, ApM1, C1q, cualquiera de los compuestos descritos anteriormente análogos a C1q, compuestos que tienen al menos la secuencia de consenso SEQ ID n.º 1 y, opcionalmente, la SEQ ID n.º 2, y compuestos que comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de al menos el 80% con una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID n.º 7 a 14) que aumentan la cantidad de los lípidos de la dieta repartidos hacia el hígado.

Se pueden utilizar medicamentos que aumentan la actividad de estos compuestos en un individuo para reducir el consumo de alimentos en los individuos obesos, para reducir los niveles de ácidos grasos libres en los individuos obesos, para reducir la masa corporal de los individuos obesos o para tratar diversas enfermedades relacionadas con la obesidad. Tales enfermedades relacionadas con la obesidad incluyen aterosclerosis (que puede aparecer de resultas de una gran cantidad de ácidos grasos libres y de restos de quilomicrones en el plasma), resistencia a la insulina relacionada con la obesidad que es resultado de la aparición de ácidos grasos en el plasma o ácidos grasos producidos por una lipólisis extracelular [Walker, M., Metabolism 44: 18-20 (1995); Lonnroth, P., Intern. Med. Suppl. 735: 23-29 (1991); Hannes, M.M et al., Int. J. Obes. 14: 831-841 (1990), hipertensión relacionada con la obesidad que es resultado de ácidos grasos en el plasma o ácidos grasos producidos por una lipólisis extracelular [Goodfriend y Eagan, J. Med. 344: 1649-1654 (1996)], lesiones microangiopáticas que son el resultado de una diabetes de tipo II relacionada con la obesidad, y lesiones oculares y renales causadas por una microangiopatía en los sujetos obesos con una diabetes de tipo II.

Los medicamentos que reducen la actividad de los compuestos que aumentan el reparto de los lípidos en la dieta hacia el hígado (entre ellos, AdipoQ, ApM1, C1q, cualquiera de los compuestos descritos anteriormente análogo a C1q, compuestos que tienen al menos la secuencia consenso SEQ ID n.º 1 y, opcionalmente, la SEQ ID n.º 2, y compuestos que comprenden una secuencia de aminoácidos que tienen una homología de al menos el 80% con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID n.º 7 a 14) se pueden utilizar para tratar enfermedades tales como la caquexia en los sujetos con un síndrome neoplásico o para-neoplásico o trastornos de alimentación.

Se pueden utilizar diversas técnicas para aumentar la actividad de los compuestos que aumentan el reparto de los lípidos de la dieta hacia el hígado. En particular, se puede aumentar la actividad de estos compuestos administrando estos compuestos (entre ellos, AdipoQ, ApM1, C1q, cualquiera de los compuestos descritos anteriormente análogo a C1q, o compuestos que tienen al menos la secuencia consenso SEQ ID n.º 1 y, opcionalmente, la SEQ ID n.º 2, y compuestos que comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de al menos el 80% con una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID n.º 7 a 14) al individuo en cualquiera de las formulaciones farmacéuticamente aceptables descritas anteriormente. También se han proporcionado más arriba las vías de administración de estos compuestos así como las dosis adecuadas de estos agentes.

En otro método, los genes (o partes de los mismos) que codifican compuestos que aumentan el reparto de los lípidos de la dieta hacia el hígado (entre ellos, AdipoQ, ApM1, C1q, cualquiera de los compuestos descritos anteriormente análogo a C1q, compuestos que tienen al menos la secuencia consenso SEQ ID n.º 1 y, opcionalmente, la SEQ ID n.º 2, y compuestos que comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de al menos el 80% con una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID n.º 7 a 14) se pueden mutagenizar para crear proteínas o péptidos derivados que tengan una mayor capacidad para aumentar el reparto de los lípidos de la dieta hacia el hígado que las proteínas de tipo salvaje. Los expertos en la técnica conocen numerosos procedimientos de mutagénesis, incluidas la mutagénesis específica de sitio y la mutagénesis química aleatoria. Por ejemplo, se puede utilizar cualquiera de los procedimientos de mutagénesis descritos en Ausebel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1998).

Las proteínas o los péptidos codificados por los genes mutagenizados se introducen en vectores de expresión, se aíslan utilizando técnicas familiares para los expertos en la técnica y se verifican para determinar si tienen una mayor actividad que las proteínas de tipo salvaje utilizando los procedimientos descritos más adelante.

Alternativamente, en vez de preparar derivados utilizando los procedimientos de mutagénesis descritos anteriormente, se pueden utilizar técnicas de química combinatoria que permiten generar una gran cantidad de péptidos derivados in vitro.

Las proteínas o los péptidos derivados que tienen aumentada la actividad respecto a los de tipo salvaje se pueden identificar comparando su actividad con la actividad de las proteínas o los péptidos de tipo salvaje en el análisis con hepatocitos de rata del ejemplo 5. Luego, esas proteínas o péptidos derivados que tienen mayor actividad respecto a las proteínas de tipo salvaje se pueden analizar adicionalmente en el análisis de respuesta lipémica posprandial del ejemplo 6, el análisis de triglicéridos en el plasma del ejemplo 7, el análisis del consumo de alimentos del ejemplo 8 o el análisis de adelgazamiento del ejemplo 7.

Esas proteínas o péptidos derivados que tienen mayor actividad respecto a las proteínas de tipo salvaje se pueden utilizar en medicamentos para aumentar el reparto de los lípidos de la dieta hacia el hígado. En tales medicamentos, la proteína o el péptido derivado se puede administrar al individuo en un vehículo farmacéuticamente aceptable tal como los descritos anteriormente. La proteína o el péptido derivado se puede administrar mediante cualquiera de las vías y con cualquiera de las dosis descritas anteriormente.

Además, tal y como se discutió anteriormente, se pueden obtener moléculas pequeñas, fármacos y otros compuestos que aumentan la actividad de un compuesto que aumenta el reparto de los lípidos de la dieta hacia el hígado utilizando diferentes métodos sintéticos familiares para los expertos en la técnica, incluidas las técnicas basadas en la química combinatoria. Se pueden evaluar pequeñas moléculas, fármacos u otros compuestos candidatos determinando su capacidad para aumentar la actividad de un compuesto que aumenta el reparto de los lípidos de la dieta hacia el hígado en el análisis con hepatocitos de rata del ejemplo 5. Esos compuestos que aumentan la actividad de un compuesto que aumenta el reparto de los lípidos de la dieta hacia el hígado en el análisis con hepatocitos de rata se pueden evaluar adicionalmente en el análisis de respuesta lipémica posprandial del ejemplo 6, el análisis de triglicéridos en el plasma del ejemplo 7, el análisis del consumo de alimentos del ejemplo 8 o el análisis de adelgazamiento del
ejemplo 7.

Tal y como se describió anteriormente, la presente invención también describe medicamentos para reducir la actividad de los compuestos que aumentan el reparto de los lípidos de la dieta hacia el hígado. Se pueden utilizar tales medicamentos para tratar enfermedades como las descritas anteriormente en las que es deseable reducir el reparto de los lípidos de la dieta hacia el hígado (es decir, para aumentar el reparto de los lípidos de la dieta hacia el tejido adiposo). La actividad de los compuestos que aumentan el reparto de los lípidos de la dieta hacia el hígado (entre ellos, AdipoQ, ApM1, C1q, cualquiera de los compuestos descritos anteriormente análogos a C1q, o compuestos que tienen al menos la secuencia consenso SEQ ID n.º 1 y, opcionalmente, la SEQ ID n.º 2, y compuestos que comprenden una secuencia de aminoácidos que tienen una homología de al menos el 80% con una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID n.º 7 a 14) se puede reducir utilizando una serie de métodos, incluidos los métodos descritos más adelante.

También se puede aumentar el reparto de los lípidos de la dieta hacia el hígado preparando un anticuerpo que se une a la subunidad \gamma, el receptor de C1q (gC1q-R) o una proteína relacionado con éste así como fragmentos de estas proteínas. Tales anticuerpos pueden modular la interacción entre el LSR y la subunidad \gamma, el receptor de C1q (gC1q-R) o una proteína relacionada con éste de una manera que aumenta el reparto de los lípidos de la dieta hacia el hígado. Los anticuerpos pueden ser cualquiera de los anticuerpos descritos más adelante.

En un procedimiento para reducir la actividad de un compuesto que aumenta el reparto de los lípidos de la dieta hacia el hígado, se administra a un individuo un anticuerpo que inhibe la actividad del compuesto. El anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal.

Los anticuerpos policlonales capaces de unirse específicamente a un compuesto que aumenta el reparto de los lípidos de la dieta hacia el hígado se pueden obtener utilizando el compuesto (o un fragmento del mismo) como inmunógeno en los procedimientos descritos en el ejemplo 1 anterior. Alternativamente, se pueden generar anticuerpos policlonales contra la subunidad \gamma, el receptor de C1q (gC1q-R) o una proteína relacionada con éste, así como fragmentos de estas proteínas.

Los anticuerpos monoclonales contra los compuestos que aumentan el reparto de los lípidos de la dieta hacia el hígado se pueden preparar a partir de hibridomas murinos de acuerdo con el método clásico de Kohler, G, and Milstein, C, Nature, 256: 495 (1975) o los métodos derivados del mismo. Brevemente, se inocula repetidamente un ratón con unos pocos microgramos del compuesto o un fragmento del mismo (tales como AdipoQ1, ApM1, C1q, cualquiera de los compuestos descritos anteriormente análogos a C1q, o compuestos que tienen al menos la secuencia consenso SEQ ID n.º 1 y, opcionalmente, la SEQ ID n.º 2, y compuestos que comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de al menos el 80% con una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID n.º 7 a 14) durante un periodo de unas pocas semanas. Alternativamente, se pueden generar anticuerpos monoclonales contra la
subunidad \gamma, el receptor de C1q (gC1q-R) o una proteína relacionada con éste, así como fragmentos de estas proteínas.

Luego, se sacrifica el ratón y se aíslan las células que producen el anticuerpo a partir del bazo. Se fusionan los esplenocitos por medio de polietilenglicol con células de mieloma de ratón, y se destruye el exceso de células no fusionadas cultivando el sistema en medios selectivos que comprenden aminopterina (medios HAT). Se diluyen las células fusionadas con éxito y las alícuotas de la dilución se colocan en los pocillos de una placa de microtitulación donde se continúa el crecimiento del cultivo. Se identifican los clones productores de anticuerpos detectando el anticuerpo en el líquido sobrenadante de los pocillos mediante procedimientos de inmunoanálisis, tales como ELISA, como originalmente describieron Engwall, E., Meth. Enzymol. 70: 419 (1980), y los métodos derivados del mismo. Se pueden expandir los clones positivos seleccionados y recoger el producto de los anticuerpos monoclonales para su utilización. Los procedimientos detallados para la producción de anticuerpos monoclonales se describen en Davis, L. et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier, Nueva York, apartado 21-2.

Los anticuerpos que son capaces de inhibir la actividad de los compuestos que aumentan el reparto de los lípidos de la dieta hacia el hígado (entre ellos, AdipoQ, ApM1, C1q, cualquiera de los compuestos descritos anteriormente análogos a C1q, compuestos que tienen al menos la secuencia consenso SEQ ID n.º 1 y, opcionalmente, la SEQ ID n.º 2, y compuestos que comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene una homología al menos del 80% con una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID n.º 7 a 14) se pueden identificar poniendo en contacto el compuesto con cantidades crecientes de los anticuerpos monoclonales o policlonales antes de llevar a cabo, o mientras se lleva a cabo, el análisis descrito en el ejemplo 5 con el compuesto. A los anticuerpos que reducen la unión, internalización, y/o degradación en el análisis con hepatocitos de rata se les puede verificar la actividad in vivo administrando cantidades crecientes de los anticuerpos a los ratones y determinando la capacidad de los anticuerpos para inhibir la reducción mediada por el compuesto en la respuesta posprandial de los triglicéridos en el análisis descrito en el ejemplo 6 anterior, la capacidad de los anticuerpos para inhibir la reducción mediada por el compuesto de los triglicéridos en el plasma en el análisis descrito en el ejemplo 7 anterior, la capacidad de los anticuerpos para inhibir la reducción mediada por el compuesto del consumo de alimentos en los ratones obesos en el análisis descrito en el ejemplo 8 anterior o la capacidad de los anticuerpos para inhibir el adelgazamiento mediado por el compuesto en el análisis descrito en el ejemplo 7.

También se puede reducir el reparto de los lípidos de la dieta hacia el hígado preparando un anticuerpo que se una a la subunidad \gamma, el receptor de C1q (gC1q-R) o una proteína relacionada con éste, así como fragmentos de estas proteínas. Tales anticuerpos pueden modular la interacción entre AdipoQ, ApM1 o proteínas análogas y la subunidad \gamma, el receptor de C1q (gC1q-R) o una proteína relacionada con éste, de una manera que reduce el reparto de los lípidos de la dieta hacia el hígado. Los anticuerpos pueden ser cualquiera de los anticuerpos descritos anteriormente.

Alternativamente, también se puede reducir el reparto de los lípidos de la dieta hacia el hígado utilizando fragmentos de anticuerpos que conservan la capacidad de unirse específicamente a AdipoQ, ApM1, C1q, cualquiera de los compuestos descritos anteriormente análogos a C1q, compuestos que tienen al menos la secuencia consenso SEQ ID n.º 1 y, opcionalmente, la SEQ ID n.º 2, compuestos que comprenden una secuencia de aminoácidos que tienen una homología de al menos el 80% con una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID n.º 7 a 14, la subunidad \gamma, el receptor de C1q (gC1q-R) o una proteína relacionada con éste. Por ejemplo, los fragmentos pueden ser fragmentos Fab, que se pueden preparar utilizando los métodos familiares para los expertos en la técnica.

Alternativamente, los anticuerpos pueden comprender anticuerpos humanizados o anticuerpos monocatenarios. Una serie de métodos para fabricar anticuerpos humanizados o anticuerpos monocatenarios son familiares para los expertos en la técnica, incluidas las técnicas descritas en las patentes de los EE.UU. n.º 5.705.154, 5.565.332 y 5.608.039.

A continuación, esos anticuerpos que inhiben los efectos mediados por los compuestos en uno o más de los análisis descritos anteriormente se pueden utilizar en medicamentos para reducir la actividad de los compuestos que aumentan el reparto de los lípidos de la dieta hacia el hígado. Los anticuerpos se pueden administrar a los individuos en un vehículo farmacéuticamente aceptable tales como los descritos anteriormente.

Alternativamente, se puede reducir la actividad de un compuesto que aumenta el reparto de los lípidos de la dieta hacia el hígado utilizando derivados del compuesto que inhiben su actividad. Por ejemplo, se pueden preparar derivados de los compuestos que aumentan el reparto de los lípidos de la dieta hacia el hígado (tales como derivados de AdipoQ, ApM1, C1q, cualquiera de los compuestos descritos anteriormente análogo a C1q o compuestos que tienen al menos la secuencia consenso SEQ ID n.º 1 y, opcionalmente, la SEQ ID n.º 2, compuestos que comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de al menos el 80% con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID n.º 7 a 14) utilizando los procedimientos de mutagénesis o de química combinatoria descritos anteriormente en conexión con la preparación de derivados que tienen más actividad respecto a los de tipo salvaje.

Las proteínas o péptidos derivados producidos con los procedimientos anteriores se pueden utilizar en fármacos para reducir la actividad de los compuestos que aumentan el reparto de los lípidos de la dieta hacia el hígado. Tales proteínas o péptidos mutantes pueden reducir la actividad de un compuesto que aumenta el reparto de los lípidos de la dieta hacia el hígado (entre ellos, AdipoQ, ApM1, C1q, cualquiera de los compuestos descritos anteriormente análogo a C1q, o compuestos que tienen al menos la secuencia consenso SEQ ID n.º 1 y, opcionalmente, la SEQ ID n.º 2, y compuestos que comprenden una secuencia de aminoácidos que tienen una homología de al menos el 80% con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID n.º 7 a 14) a través de una serie de mecanismos, entre ellos, actuar como antagonistas para la unión de las proteínas de tipo salvaje a sus ligandos. Por ejemplo, los antagonistas pueden tener una menor actividad y, por lo tanto, reducir la actividad del compuesto compitiendo con él.

Se pueden determinar las proteínas o los péptidos derivados que son capaces de inhibir la actividad de la proteína de tipo salvaje determinando su capacidad para bloquear la actividad de las proteínas de tipo salvaje en análisis tales como el análisis con hepatocitos de rata del ejemplo 5, el análisis de la respuesta lipémica posprandial del ejemplo 6, el análisis de los triglicéridos en el plasma del ejemplo 7, el análisis del consumo de alimentos del ejemplo 8 o el análisis del adelgazamiento del ejemplo 7. Alternativamente, se pueden evaluar las proteínas o péptidos derivados determinando su capacidad para aumentar el consumo de alimentos o causar un aumento de peso cuando se administran en los análisis de los ejemplos 7 y 8.

Esas proteínas o péptidos derivados que inhiben la actividad de las proteínas de tipo salvaje se pueden utilizar en medicamentos para reducir la actividad de un compuesto que aumenta el reparto de los lípidos de la dieta hacia el hígado. En tales medicamentos, se puede administrar la proteína o péptido derivado al individuo en un vehículo farmacéuticamente aceptable tales como los descritos anteriormente. Se puede administrar la proteína o el péptido derivado a través de cualquiera de las vías y en cualquiera de las dosis descritas anteriormente.

Además, tal y como se discutió anteriormente, se pueden obtener moléculas pequeñas, fármacos u otros compuestos que reducen la actividad de un compuesto que aumenta el reparto de los lípidos de la dieta hacia el hígado utilizando una serie de métodos sintéticos familiares para los expertos en la técnica, incluidas las técnicas basadas en la química combinatoria. Se pueden evaluar moléculas pequeñas, fármacos y otros compuestos candidatos determinando su capacidad para inhibir la actividad de un compuesto que aumenta el reparto de los lípidos de la dieta hacia el hígado en el análisis con hepatocitos de rata del ejemplo 5. Esos compuestos que inhiben la actividad de un compuesto que aumenta el reparto de los lípidos de la dieta hacia el hígado en el análisis con hepatocitos de rata se pueden evaluar adicionalmente en el análisis de la respuesta lipémica posprandial del ejemplo 6, en el análisis de los triglicéridos en el plasma
del ejemplo 7, el análisis del consumo de alimentos del ejemplo 8 o en el análisis del adelgazamiento del ejemplo 8.

Así, la presente invención describe un agente que aumenta la actividad de un compuesto que aumenta el reparto de los lípidos de la dieta hacia el hígado para utilizarlo como un medicamento. En particular, se puede utilizar el agente para tratar una enfermedad seleccionada entre el grupo que consiste en obesidad, aterosclerosis relacionada con la obesidad, resistencia a la insulina relacionada con la obesidad, hipertensión relacionada con la obesidad, lesiones microangiopáticas relacionadas con la obesidad, lesiones oculares relacionadas con la obesidad, lesiones renales relacionadas con la obesidad y otras enfermedades en las que se desea aumentar el reparto de los lípidos de la dieta hacia el hígado. En particular, se pueden tratar las enfermedades anteriores administrando una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto que aumenta el reparto de los lípidos de la dieta hacia el hígado en un vehículo farmacéuticamente aceptable a un individuo que padece las enfermedades anteriores. En algunas realizaciones, se puede administrar el medicamento a un individuo que se ha determinado que tiene menos del nivel normal de actividad de un compuesto que aumenta el reparto de los lípidos de la dieta hacia el hígado. En particular, el medicamento puede comprender AdipoQ, ApM1, C1q, cualquiera de los compuestos descritos anteriormente análogo a C1q, o compuestos que tienen al menos la secuencia consenso SEQ ID n.º 1 y, opcionalmente, la SEQ ID n.º 2 o compuestos que comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de al menos el 80% con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID n.º 7 a 14. Alternativamente, el medicamento puede comprender un derivado de los compuestos anteriores que muestra más actividad que el compuesto de tipo salvaje o un ácido nucleico que aumenta el nivel de expresión de los compuestos anteriores en el individuo.

En otro aspecto, la presente invención describe un agente que inhibe la actividad de un compuesto que aumenta el reparto de los lípidos de la dieta hacia el hígado para utilizarlo como un medicamento. Se puede utilizar el medicamento para tratar una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en caquexia en los sujetos con síndrome neoplásico o para-neoplásico, trastornos de la alimentación y otras enfermedades en las que se desee reducir el reparto de los lípidos de la dieta hacia el hígado. En particular, se pueden tratar las enfermedades anteriores administrando una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente que inhibe la actividad de un compuesto que aumenta el reparto de los lípidos de la dieta hacia el hígado en un vehículo farmacéuticamente aceptable a un individuo que padece las enfermedades anteriores. En algunas realizaciones, se puede administrar el medicamento a un individuo que se ha determinado que tiene más actividad que el nivel normal de actividad de un compuesto que aumenta el reparto de los lípidos de la dieta hacia el hígado. En particular, el medicamento puede comprender un agente que inhibe la actividad de AdipoQ, ApM1, C1q, cualquiera de los compuestos descritos anteriormente análogo a C1q, un compuesto que tiene al menos la secuencia consenso SEQ ID n.º 1 y, opcionalmente, la SEQ ID n.º 2, o un compuesto que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de al menos el 80% con una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID n.º 7 a 14. Por ejemplo, el medicamento puede comprender un anticuerpo que inhibe la actividad de AdipoQ, ApM1, C1q, cualquiera de los compuestos descritos anteriormente análogo a C1q, un compuesto que tiene al menos la secuencia consenso SEQ ID n.º 1 y, opcionalmente, la SEQ ID n.º 2, o un compuesto que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de al menos el 80% con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID n.º 7 a 14. El medicamento también puede comprender un derivado de AdipoQ, ApM1, C1q, cualquiera de los compuestos descritos anteriormente análogo a C1q, un compuesto que tiene al menos la secuencia consenso SEQ ID n.º 1 y, opcionalmente, la SEQ ID n.º 2, y compuestos que comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de al menos el 80% con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID n.º 7 a 14. Alternativamente, el medicamento puede comprender un ácido nucleico, tal como un ácido nucleico antisentido o un ácido nucleico que forma una triple hélice, que altera la expresión o disminuye el nivel de expresión de AdipoQ, ApM1, C1q, cualquiera de los compuestos descritos anteriormente análogo a C1q, un compuesto que tiene al menos la secuencia consenso SEQ ID n.º 1 y, opcionalmente, la SEQ ID n.º 2, o un compuesto que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de al menos el 80% con una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID n.º 7 a 14 en el individuo.

Los individuos obesos expresan niveles más bajos que los normales de AdipoQ o de compuestos relacionados con AdipoQ. [Hu et al., J. Biol. Chem. 271: 10697-10703 (1996)]. Los individuos obesos que tienen una actividad reducida de la AdipoQ, ApM1 o de compuestos análogos en el plasma, en líquidos corporales o en tejidos corporales pueden correr el riesgo de desarrollar una serie de enfermedades asociadas con el reparto de unos niveles de los lípidos de la dieta hacia el hígado más bajos que los normales (es decir, el reparto de unos niveles mayores de los lípidos de la dieta hacia los tejidos adiposos que los normales). En particular, tales individuos pueden padecer aterosclerosis relacionada con la obesidad, resistencia a la insulina relacionada con la obesidad, hipertensión relacionada con la obesidad, lesiones microangiopáticas relacionadas con la obesidad, lesiones oculares relacionadas con la obesidad y lesiones renales relacionadas con la obesidad.

En otro aspecto, la presente invención describe métodos para identificar moléculas que se unen a la subunidad \gamma. Tal y como se expuso anteriormente, la subunidad \gamma puede ser el receptor de C1q (gC1q-R) o una proteína relacionada con éste. En consecuencia, tal y como se utiliza más adelante, la terminología "subunidad \gamma" se referirá al gC1q-R o a la proteína relacionada que constituye la subunidad \gamma del complejo LSR.

Las moléculas que se unen a la subunidad \gamma se pueden utilizar en los medicamentos y los métodos de la presente invención para aumentar o reducir el reparto de los lípidos de la dieta hacia el hígado. Por ejemplo, tales moléculas pueden actuar como agonistas o antagonistas para estimular o reducir la actividad del LSR.

Se dispone de numerosos métodos para identificar los ligandos de la subunidad \gamma. Uno de tales métodos se describe en la patente de los EE. UU. n.º 5.270.170, cuya descripción se incorpora en la presente memoria mediante referencia. Brevemente, en este método, se construye una genoteca de péptidos al azar. La genoteca de péptidos aleatorios comprende una gran cantidad de vectores que codifican fusiones entre los péptidos a los que se les ensayará la actividad de unión a la subunidad \gamma y una proteína de unión al ADN, tal como el represor lac codificado por el gen lacl. Los vectores en la genoteca de péptidos aleatorios también contienen sitios de unión para la proteína de unión al ADN, tales como el sitio lacO en el caso en el que la proteína de unión al ADN sea el represor lac. Se introduce la genoteca de péptidos aleatoria en una célula hospedadora, donde se expresa la proteína de fusión. Luego, se lisan las células hospedadoras bajo condiciones que permiten que la parte de la proteína de unión al ADN de fusión se una a los sitios de unión del ADN en el vector.

Los vectores que tienen las proteínas de fusión unidas a ellos se ponen en contacto con la subunidad \gamma inmovilizada, o un fragmento inmovilizado de la subunidad \gamma en las condiciones que permiten que los péptidos se unan específicamente. Por ejemplo, se puede inmovilizar una subunidad \gamma o un fragmento de la misma fijándola a una superficie tal como una placa de plástico o una partícula. En particular, el fragmento inmovilizado de la subunidad \gamma puede comprender el sitio de unión a C1q, AdipoQ o ApM1.

Los vectores que codifican los péptidos al azar capaces de unirse a la subunidad \gamma, o a un fragmento de la misma, o al sitio de unión de C1q, AdipoQ o ApM1 de la misma se retendrán específicamente en la superficie mediante la interacción entre el péptido y la subunidad \gamma, un fragmento de la subunidad \gamma, o el sitio de unión a C1q, AdipoQ o ApM1 de la misma.

Alternativamente, se pueden identificar moléculas capaces de unirse a la subunidad \gamma utilizando sistemas de doble híbrido tales como el Matchmaker Two Hybrid System 2 (n.º del catálogo K1604-1, Clontech). Tal y como se describe en el manual que acompaña al Matchmaker Two-Hybrid System 2 (n.º de catálogo K1604-1, Clontech), los ácidos nucleicos que codifican la subunidad \gamma, un fragmento de los mismos, o un fragmento que comprende el sitio de unión a C1q, AdipoQ o ApM1 se introducen en un vector de expresión de tal forma que se encuentran en fase con el ADN que codifica el dominio de unión al ADN del activador transcripcional de la levadura GAL4. Los ácidos nucleicos en una genoteca que codifican proteínas o péptidos que pueden interaccionar con la subunidad \gamma, un fragmento de la subunidad \gamma, o el sitio de unión a C1q, AdipoQ o ApM1 se introducen en un segundo vector de expresión de tal forma que se encuentran en fase con el ADN que codifica el dominio de activación de GAL4. Se transforman los dos plásmidos de expresión en la levadura y la levadura se siembra en placas con medio de selección que selecciona la expresión de los marcadores de selección de cada uno de los vectores de expresión así como la expresión dependiente de GAL4 del gen HIS3. Los transformantes capaces de crecer en un medio que carece de histidina se criban por la expresión de lacZ dependiente de GAL4. Las células que son positivas tanto en la selección por histidina como en el análisis del lacZ contienen plásmidos que codifican proteínas o péptidos que interaccionan con la subunidad \gamma, un fragmento de la misma, o el sitio de unión a C1q, AdipoQ o ApM1.

Alternativamente, para estudiar la interacción de la subunidad \gamma, se puede utilizar un fragmento de la misma o un fragmento que comprende el sitio de unión a C1q, AdipoQ o ApM1 de la misma con fármacos o moléculas pequeñas, tales como las moléculas generadas a través de métodos de química combinatoria, el método de microdiálisis acoplado a HPLC descrito por Wang et al., Chromatographia, 44, 205-208 (1997) o el método de electroforesis capilar de afinidad descrito por Busch et al., J. Chromatogr. 777: 311-328 (1997), cuyas descripciones se incorporan en la presente memoria mediante referencia.

En otros métodos, se pueden identificar proteínas, péptidos, fármacos, moléculas pequeñas u otros compuestos que interaccionan con la subunidad \gamma, un fragmento de la misma o un fragmento que comprende el sitio de unión a C1q, AdipoQ o ApM1 de la misma utilizando análisis tales como el siguiente. Se marca la molécula cuya unión se va a comprobar con un marcador detectable, tal como una etiqueta fluorescente, radioactiva o enzimática y se pone en contacto con la subunidad \gamma inmovilizada, un fragmento de la misma o un fragmento que comprende el sitio de unión a C1q, AdipoQ o ApM1 de la misma en las condiciones que permiten que se produzca la unión específica. Después de retirar las moléculas unidas inespecíficamente, se detectan las moléculas unidas utilizando los medios
adecuados.

Alternativamente, se pueden identificar proteínas, péptidos, fármacos, moléculas pequeñas u otros compuestos que se unen a la subunidad \gamma, un fragmento de la misma o un fragmento que comprende el sitio de unión a C1q, AdipoQ o ApM1 de la misma utilizando experimentos de competición. En tales análisis, se inmoviliza la subunidad \gamma, un fragmento de la misma o un fragmento que comprende el sitio de unión a C1q, AdipoQ o ApM1 de la misma a una superficie, tal como una placa de plástico. Cantidades crecientes de las proteínas, péptidos, fármacos, moléculas pequeñas u otros compuestos se ponen en contacto con la subunidad \gamma, un fragmento de la misma o un fragmento que comprende el sitio de unión a C1q, AdipoQ o ApM1 de la misma inmovilizados en presencia de un ligando de la subunidad \gamma conocido y con una marcación detectable, tales como AdipoQ, C1q, cualquiera de los compuestos descritos anteriormente análogo a C1q, un compuesto que tiene al menos la secuencia consenso de la SEQ ID n.º 1 y, opcionalmente, la SEQ ID n.º 2, o un compuesto que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una homología al menos del 80% con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID n.º 7 a 14. Por ejemplo, se puede detectar el ligando de la subunidad \gamma marcado con una etiqueta fluorescente, radioactiva o enzimática. La capacidad de la molécula de prueba para unirse a la subunidad \gamma, un fragmento de la misma o un fragmento que comprende el sitio de unión a C1q, AdipoQ o ApM1 de la misma se determina midiendo la cantidad del ligando conocido detectado mediante marcación unido en presencia de la molécula de prueba. Una reducción en la cantidad del ligando conocido unido a la subunidad \gamma, un fragmento de la misma o un fragmento que comprende el sitio de unión a C1q, AdipoQ o ApM1 de la misma cuando la molécula a probar está presente indica que la molécula de prueba es capaz de unirse a la subunidad \gamma, un fragmento de la misma o un fragmento que comprende el sitio de unión a C1q, AdipoQ o ApM1 de la misma. Se puede utilizar este método para identificar los compuestos que se unen a la subunidad \gamma y que, por lo tanto, representan posibles agonistas o antagonistas de la actividad del LSR que se pueden explotar en los medicamentos descritos anteriormente.

También se pueden detectar proteínas, péptidos, fármacos, pequeñas moléculas u otros compuestos que interaccionan con la subunidad \gamma, un fragmento de la misma o un fragmento que comprende el sitio de unión a C1q, AdipoQ o ApM1 de la misma utilizando un biosensor óptico como se describe en Edwards y Leatherbarrow, Analytical Biochemistry, 246, 1-6, (1997). La principal ventaja de este método es que permite determinar la tasa de asociación entre la subunidad \gamma y las otras moléculas con las que interacciona. Así, es posible seleccionar específicamente las moléculas interaccionantes con una tasa de asociación elevada o baja. Normalmente, se une una molécula de diana a la superficie del sensor (a través de una matriz de carboximetil-dextrano) y se pone en contacto una muestra de las moléculas de prueba con las moléculas de diana. La unión de una molécula de prueba con la molécula de diana provoca un cambio en el índice de refracción y/o el grosor. Este cambio se detecta con el biosensor siempre que se produzca en el campo evanescente (que se extiende a unos cientos de nanómetros desde la superficie del sensor). En estos análisis de detección, la molécula diana puede ser la subunidad \gamma, un fragmento de la misma o un fragmento que comprende el sitio de unión a C1q, AdipoQ o ApM1 de la misma, y la muestra a probar puede ser una colección de proteínas extraídas de tejidos o células, un conjunto de proteínas expresadas, colecciones de péptidos y/o sustancias químicas combinatorios, péptidos mostrados en fagos, fármacos, moléculas pequeñas u otros compuestos. Los tejidos o las células de los que se extraen las proteínas a probar proceden de cualquier especie.

Las proteínas u otras moléculas que interaccionan con la subunidad \gamma, un fragmento de la misma o un fragmento que comprende el sitio de unión a C1q, AdipoQ o ApM1 de la misma también se pueden encontrar utilizando columnas de afinidad que contienen la subunidad \gamma, un fragmento de la misma o un fragmento que comprende el sitio de unión a C1q, AdipoQ o ApM1 de la misma. La subunidad \gamma, un fragmento de la misma o un fragmento que contiene el sitio de unión a C1q, AdipoQ o ApM1 de la misma se pueden fijar a la columna utilizando las técnicas convencionales, entre ellas, la unión química a una matriz de columna adecuada tal como agarosa, Affi Gel u otras matrices familiares para los expertos en la técnica. En algunas versiones de este método, la columna de afinidad contiene proteínas quiméricas en las que la subunidad \gamma, un fragmento de la misma o un fragmento que comprende el sitio de unión a C1q, AdipoQ o ApM1 de la misma se fusiona a la glutation S transferasa. Una mezcla de proteínas celulares o un conjunto de proteínas expresadas tal y como se describe anteriormente se aplica a la columna de afinidad. Luego, proteínas, péptidos, fármacos, moléculas pequeñas u otras moléculas que interaccionan con la subunidad \gamma, un fragmento de la misma o un fragmento que comprende el sitio de unión a C1q, AdipoQ o ApM1 de la misma unidos a la columna se pueden aislar y analizar en un gel de electroforesis bidimensional tal y como se describe en Ramunsen et al., Electrophoresis, 18, 588-598 (1997). Alternativamente, se pueden purificar las proteínas u otras moléculas retenidas en la columna de afinidad mediante métodos basados en la electroforesis y secuenciarlas. Se puede utilizar el mismo método para aislar anticuerpos, detectar productos mostrados en fagos o cribar anticuerpos humanos mostrados en fagos.

Los compuestos identificados utilizando los métodos anteriores se pueden cribar para determinar si actúan como agonistas o antagonistas de la actividad del LSR de la siguiente forma. Los compuestos que son agonistas aumentarán la actividad del LSR en uno o más análisis seleccionados entre el grupo que consiste en el análisis con hepatocitos de rata del ejemplo 5, el análisis de la respuesta lipémica posprandial del ejemplo 6, el análisis de los triglicéridos en el plasma del ejemplo 7, el análisis del consumo de alimentos del ejemplo 8 o el análisis de la masa corporal del ejemplo 7. Tales compuestos son útiles en los medicamentos explicados anteriormente para tratar enfermedades en las que se desea aumentar el reparto de los lípidos de la dieta hacia el hígado.

Alternativamente, los compuestos que son antagonistas de la actividad del LSR inhibirán la actividad de la AdipoQ en uno o más análisis seleccionados entre el grupo que consiste en el análisis con hepatocitos de rata del ejemplo 5, el análisis de la respuesta lipémica posprandial del ejemplo 6, el análisis de los triglicéridos en el plasma del ejemplo 7, el análisis del consumo de alimentos del ejemplo 8 o el análisis de la masa corporal del ejemplo 7. Tales compuestos son útiles en los medicamentos explicados anteriormente para tratar enfermedades en las que se desea reducir el reparto de los lípidos de la dieta hacia el hígado.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i): SOLICITANTE:

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(A): NOMBRE: Genset SA

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(B): DIRECCIÓN: 24, RUE ROYALE

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(C): CIUDAD: París

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(E): PAÍS: Francia

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(F):: CÓDIGO POSTAL (ZIP): 75008

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(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Fármacos que regulan las lipoproteínas

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(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 14

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(v): FORMULARIO LEGIBLE POR ORDENADOR:

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(A): TIPO DE MEDIO: Disquete

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(B): ORDENADOR: IBM PC compatible

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(C): SISTEMA OPERATIVO: Win95

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(D): SOFTWARE: Word

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(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA ID N.º 1

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 31 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

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(C): NÚMERO DE CADENAS: monocatenario

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

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(vi): FUENTE ORIGINAL:

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(A): ORGANISMO: Homo sapiens

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID N.º 1:

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100

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID N.º 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID N.º 2:

\vskip1.000000\baselineskip

101

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID N.º 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 15 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID n.º 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Arg Cys Val Pro Arg Val Leu Gly Ser Ser Val Ala Gly Tyr}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID N.º 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 16 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID N.º 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Tyr Ile Thr Phe Leu Glu Asp Leu Lys Ser Phe Val Lys Ser Gln}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID N.º 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: idéntica a 58..73 en el n.º de acceso de GenBank U49915

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 12..27

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID N.º 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTACATGGAT CCAGTCATGC CGAAGAT

\hfill

27

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID N.º 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 28 pares de base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE. idéntica a 745..762 en el n.º de acceso de GenBank: U49915

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: complementa 11..28

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID N.º 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGACAACTCG AGTCAGTTGG TATCATGG

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID N.º 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 129 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: fragmento 117-245 del n.º de acceso de SwissProt P02745

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: caja de consenso correspondiente a la SEQ ID n.º 1

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 17-47

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: caja de consenso correspondiente a la SEQ ID n.º 2

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 118-126

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID n.º 7

2

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID N.º 8

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 130 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE DEL ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: fragmento 122-251 del n.º de acceso de Swissprot P02745

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: caja de consenso correspondiente a la SEQ ID n.º 1

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 19-49

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: caja de consenso correspondiente a la SEQ ID n.º 2

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 117-125

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID N.º 8:

\vskip1.000000\baselineskip

4

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID N.º 9

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 124 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: fragmento 121-244 del n.º de acceso de Swissprot P02745

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: caja de consenso correspondiente a la SEQ ID n.º 1

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 19-49

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: caja de consenso correspondiente a la SEQ ID n.º 2

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 114-122

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID n.º 9:

\vskip1.000000\baselineskip

5

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID n.º 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 130 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: fragmento 64-193 de la traducción del n.º de acceso de GenBank M58583

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: caja de consenso correspondiente a la SEQ ID n.º 1

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 23-53

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: caja de consenso correspondiente a la SEQ ID n.º 2

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 120-128

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID N.º 10

\vskip1.000000\baselineskip

7

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID N.º 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 130 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: fragmento 115-244 de la traducción del n.º de acceso del GenBank D45371

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: caja de consenso correspondiente a la SEQ ID n.º 1

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 18-48

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: caja de consenso correspondiente a la SEQ ID n.º 2

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 118-126

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID N.º 11:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

9

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID N.º 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 130 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Mus musculus

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: fragmento 118-247 de la traducción del n.º de acceso de GenBank U49915

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: caja de consenso correspondiente a la SEQ ID n.º 1

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 18-48

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: caja de consenso que corresponde a la SEQ ID n.º 2

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 118-126

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID N.º 12

\vskip1.000000\baselineskip

11

12

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID N.º 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 130 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO:Mus musculus

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: fragmento 118-267 de la traducción del n.º de acceso del GenBank U37222

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: caja de consenso correspondiente a la SEQ ID n.º 1

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 18-48

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: caja de consenso correspondiente a la SEQ ID n.º 2

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 118-126

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID N.º 13:

13

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID N.º 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 126 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: fragmento 1161-1286 de la traducción del n.º de referencia de GenBank U27109

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: caja de consenso correspondiente a la SEQ ID N.º 1

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 17-47

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: caja de consenso correspondiente a la SEQ ID n.º 2

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 116-124

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID N.º 14:

\vskip1.000000\baselineskip

14

15

Claims

1. Utilización de un compuesto que activa el receptor estimulado por la lipólisis, que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 80% con una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID n.º 7, SEQ ID n.º 8, SEQ ID n.º 9, SEQ ID n.º 10 y SEQ ID n.º 14 para la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir una enfermedad o trastorno relacionado con la obesidad.

2. La utilización de la reivindicación 1, en la que dicha secuencia de aminoácidos consiste en una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID n.º 7, SEQ ID n.º 8, SEQ ID n.º 9, SEQ ID n.º 10 y SEQ ID n.º 14.

3. La utilización de las reivindicaciones 1 y 2 para la fabricación de una composición farmacéutica, comprendiendo dicha composición farmacéutica además un vehículo farmacéuticamente aceptable.

4. La utilización de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dicha enfermedad o trastorno relacionada con la obesidad se selecciona entre el grupo que consiste en aterosclerosis relacionada con la obesidad, resistencia a la insulina relacionada con la obesidad, hipertensión relacionada con la obesidad, lesiones microangiopáticas de resultas de una diabetes de tipo 2 relacionada con la obesidad, lesiones oculares causadas por una microangiopatía en los sujetos obesos con diabetes de tipo 2 y lesiones renales causadas por microangiopatía en sujetos obesos con diabetes de tipo 2.

5. La utilización de las reivindicaciones 1 a 3, para la fabricación de un medicamento para tratar una enfermedad en la que el reparto de los lípidos hacia el hígado es anormal.

6. La utilización de las reivindicaciones 1 a 3, para la fabricación de un medicamento para reducir el consumo de alimentos en los individuos obesos, reducir los niveles de ácidos grasos en los individuos obesos, o reducir la masa corporal de los individuos obesos.

7. La utilización de las reivindicaciones 1 a 6, en la que el compuesto mencionado comprende un polipéptido seleccionado entre el grupo que consiste en C1q, cerebelina y multimerina para la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir una enfermedad o trastorno relacionada con la obesidad .

8. Un método para identificar un compuesto candidato para modular una actividad del receptor estimulado por la lipólisis que comprende:

a) poner en contacto dicho receptor estimulado por la lipólisis con una o más moléculas de prueba en presencia de un compuesto que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 80% con una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID n.º 7, SEQ ID n.º 8, SEQ ID n.º 9, SEQ ID n.º 10, SEQ ID n.º 11, SEQ ID n.º 12, SEQ ID n.º 13 y SEQ ID n.º 14; y

b) determinar si dicha una o más moléculas de prueba modulan la interacción de dicho compuesto con dicho receptor estimulado por la lipólisis, en el que la modulación de dicha interacción identifica un compuesto nombrado candidato.

9. El método de la reivindicación 8, en el que dicha una o más moléculas de prueba se seleccionan entre el grupo que consiste en péptidos, fármacos y moléculas pequeñas.