JP4147220B2 - 動脈硬化症予防治療薬 - Google Patents
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Description
技術分野
本発明は、動脈硬化症予防治療薬に関する。
背景技術
動脈硬化は、動脈が弾力を失ってもろくなった状態をいい、当該動脈硬化は脳出血、脳梗塞、心筋梗塞、腎硬化症などの成人病の原因として重要である。動脈硬化の原因として高脂血症、血液中の細菌、ウイルス、過酸化脂質、活性酸素等が知られているが、未だ完全には解明されていない。いずれにしても動脈硬化の始まりは、動脈の内膜・内皮細胞の障害による肥厚であり、当該動脈内膜の肥厚を抑制する薬物の探索が希求されている。
従って、本発明の目的は、動脈硬化の予防治療に有効な医薬を提供することにある。
発明の開示
そこで本発明者は、インスリン抵抗性改善作用を有することが知られているアディポネクチンの薬理作用について研究してきたところ、アディポネクチン遺伝子を欠損したマウスでは動脈の内膜が顕著に肥厚しており、また粥状動脈硬化症発症モデルであるａｐｏＥ欠損マウスにアディポネクチン、特にアディポネクチンのＣ末端球状領域を過剰発現させると動脈硬化の発症が抑制されることから、アディポネクチン、そのＣ末端側球状領域又はその遺伝子が動脈硬化予防又は治療薬として有用であることを見出した。また、アディポネクチンの過剰発現は、血中の遊離脂肪酸、中性脂肪、総コレステロールなどに顕著な影響を与えず、スカベンジャー受容体Ａの発現を低下させていることから、アディポネクチンの動脈硬化防止作用は、スカベンジャー受容体Ａの発現を低下させて、マクロファージへの脂質の蓄積を抑制することによるものであることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明はアディポネクチンのＣ末端側球状領域、アディポネクチン又はそれらの遺伝子を有効成分とする動脈硬化症予防治療薬を提供するものである。
また、本発明は、アディポネクチンのＣ末端球状領域、アディポネクチン又はそれらの遺伝子を有効成分とするスカベンジャー受容体Ａ発現低下剤を提供するものである。
さらに本発明は、アディポネクチンのＣ末端側球状領域、アディポネクチン又はそれらの遺伝子の、動脈硬化症予防治療薬製造のための使用を提供するものである。
さらに、本発明が、アディポネクチンのＣ末端側球状領域、アディポネクチン又はそれらの遺伝子の、スカベンジャー受容体Ａ発現低下剤製造のための使用を提供するものである。
さらに本発明は、アディポネクチンのＣ末端側球状領域、アディポネクチン又はそれらの遺伝子の有効量を投与することを特徴とする動脈硬化症の処置方法を提供するものである。
さらに本発明は、アディポネクチンのＣ末端側球状領域、アディポネクチン又はそれらの遺伝子の有効量を投与することを特徴とする患者のスカベンジャー受容体Ａ発現低下方法を提供するものである。
発明を実施するための最良の形態
本発明に用いられるアディポネクチンは、既にクローニングされており［Ｍａｅｄａ，Ｋ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２２１，２８６−２９６（１９９６）、Ｎａｋａｎｏ，Ｙ．ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ）１２０，８０２−８１２（１９９６）］、既知の手段により入手できる。配列番号１及び２にヒトアディポネクチンの塩基酸配列及びアンミ酸配列を示す。アディポネクチンは、Ｎ末端側のコラーゲン様配列（ｃＡｄ）とＣ末端側の球状領域（ｇＡｄ；配列番号１中、アミノ酸番号１１４〜２３９又は１１１〜２４２）から構成されているが、Ｃ末端側の球状領域（ｇＡｄ）は、完全長アディポネクチンよりも強力な動脈硬化予防治療作用を有し、特に好ましい。また配列番号３及び４にマウスアディポネクチンの塩基酸配列及びアミノ酸配列を示す。マウスアディポネクチンのＮ末端側のコラーゲン様配列（ｃＡｄ）は４５〜１０９（アミノ酸番号）であり、Ｃ末端側の球状領域（ｇＡｄ）は１１０〜２４７（アミノ酸番号）である。また、本発明においては、配列番号１〜４に示すアミノ酸配列及びｇＡｄ領域を示すアミノ酸配列を有する蛋白質だけでなく、これらのアミノ酸配列の一又は複数のアミノ酸が置換、欠失又は付加したアミノ酸配列を有する蛋白質であってもアディポネクチンとしての作用を有するものであれば用いることができる。当該変異蛋白質としては、配列番号１〜４のアミノ酸配列又はｇＡｄ領域を示すアミノ酸配列と８０％以上、特に９０％以上の相同性を有するものが挙げられる。
本発明で用いられる遺伝子としては、配列番号１及び３に示されるアディポネクチンをコードする遺伝子及びｇＡｄをコードする遺伝子が挙げられる。また、これらの遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズし得る塩基配列を有する遺伝子も用いることができる。
アディポネクチン又はその一部のポリペプチド（ｇＡｄを含む）は、それが存在する細胞から分離することもできるが、アディポネクチンをコードする遺伝子がすでにクローニングされているので、ＤＮＡ組み換え技術、すなわち、当該遺伝子を用いて調製した発現ベクターを利用し、形質転換した細胞を用いて調製してもよい。
後記実施例に示すように、アディポネクチンを欠損させたマウスでは、血中の中性脂肪が高いが、コレステロールは野生型と差がない。また、アディポネクチンを欠損させたマウスは動脈硬化のモデルにおいて野生型に比べて２倍の内膜肥厚を示した。これに対し、粥状動脈硬化を自然に発症するモデルであるａｐｏＥ欠損マウスにｇＡｄを過剰発現させると、動脈硬化単面積が有意に低下し、動脈硬化発症が抑制される。ところが、ａｐｏＥ欠損マウスにｇＡｄを過剰発現させても、体重、血糖値、血中の遊離脂肪酸、中性脂肪、総コレステロールなどの一般の動脈硬化リスクファクターに顕著な影響を与えない。これに対し、ａｐｏＥ欠損マウスにｇＡｄを過剰発現させると動脈壁のスカベンジャー受容体Ａの発現が低下していた。ここで、スカベンジャー受容体Ａは、マクロファージが変性ＬＤＬを貪食する際、細胞表面で変性ＬＤＬを結合する受容体であり、動脈硬化発症の重要な受容体として知られている。
従って、アディポネクチン、ｇＡｄ又はこれらの遺伝子は、スカベンジャー受容体Ａ発現低下剤として、また動脈硬化症予防治療薬として有用である。また、ｇＡｄ又はその遺伝子はアディポネクチンよりも強力なスカベンジャー受容体発現低下作用及び動脈硬化予防治療作用を有し、特に有用である。
本発明の医薬をヒトを含む哺乳類に投与するには、前記有効成分に薬学的に許容される担体を加えて、種々の投与形態の医薬組成物とすることができる。かかる投与形態としては注射用製剤が好ましい。また薬学的に許容される担体としては、蒸留水、溶解補助剤、安定化剤、乳化剤、緩衝剤等が挙げられる。また、これら医薬の投与量は、疾患、性別、体重等により変化するが、アディポネクチン又はｇＡｄ量として０．１μｇ〜１０ｍｇ／日程度であろう。
実施例
次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。
Ａ．方法
（１）ノックアウトマウスの作成
アディポネクチンｃＤＮＡをプローブを用いて１２９／Ｓｖマウスゲノミックライブラリーをスクリーニングし、アディポネクチン遺伝子を含むクローンを複数クローニングした。翻訳開始点直下から翻訳終止点までをｎｅｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子で置換したターゲティングベクターを構築し、このターゲティングベクターをＥＳ細胞にトランスフェクションした。サザンブロッティングによりスクリーニングを行い、５クローンの相同組換え体を確認した。顕微注入法にてキメラマウスを作成し、ＢＩ／６との交配によりＦ１、さらにＦ２を作成した。
すなわち、アディポネクチン遺伝子の欠損マウスは、図１に示すような相同組換えによって作成した。マウスアディポネクチン遺伝子を欠損のため、アディポネクチンをコードしているエクソン２と３をｎｅｏ耐性遺伝子に置き換えたターゲティングベクターを作成した。独立した５つの相同句組換えを起こしたクローンがサザンブロットによって確認された（図２）。１２９／ＳｖをバックグランドにもつＥＳ細胞よりキメラマウスを作成し、ヘテロ欠損マウス作成のためＢＩ／６と交配した。その遺伝子型をサザンブロットにて確認した（図３）。
（２）インスリン負荷試験
負荷試験中のみ絶食をかけ、腹腔内にマウス体重１ｇあたり０．７ｍＵのヒトインスリンを投与した。採血は尾静脈から行い血糖値はグルテストエース（登録商標、三和化学研究所製）にて測定した。
（３）グルコース負荷試験
試験開始前に少なくとも１６時間以上絶食をかけた後、マウス体重１ｇあたり１．５ｍｇのグルコースを経口投与した。採血は眼底静脈より行い血糖値はグルテストエース（登録商標、三和化学研究所製）にて測定、インスリンはラットインスリンＲＩＡキット（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）を用いて測定した。
（４）血中脂質レベルの測定
血中の遊離脂肪酸、中性脂肪、総コレステロールは１６時間の絶食の後、それぞれＮＥＦＡＣ−ｔｅｓｔ，ＴＧＬ−ｔｙｐｅ，Ｔｃｈｏｌ Ｅ−ｔｙｐｅ（ワコー社製）を用いて測定した。
（５）血中レプチン、アディポネクチンの測定
血中のレプチン、アディポネクチンの測定は１６時間の絶食の後、それぞれＱｕｉｎｔｉｋｉｎｅ Ｍ ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ社製）、アディポネクチンＲＩＡキット（ＬＩＮＣＯ社製）を用いて測定した。
（６）カフによる血管内膜肥厚モデルの作製
大腿動脈に２．０ｍｍのポリエチレンチューブ（ＰＥ−５０）を留置し、２週間後に血管をホルマリンにて圧固定後、対側のカフを巻いていない対照血管とともに摘出した。摘出した血管に対して１０ｍｍの厚さで連続輪状切片を作製しそのうち１０切片をＨＥ染色し、血管内径、内膜の厚さ、中膜の厚さ、内膜中膜比を測定した。
（７）ｇＡｄ過発現マウスの作製
Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４８，１８２２−１８２９（１９９９）に従い、ヒトＳＡＰプロモータとマウスｇＡｄ ｃＤＮＡを有する融合遺伝子を作製した。精製Ｈｉｎｄ ＩＩＩ−ＸｈｏＩフラグメントをＣ５７ＢＬ６マウス（日本クレア製）の受精卵の前核にマイクロインジェクションした。トランスジェニックマウスがｇＡｄを過発現していることは、ｇＡｄのＢｇｌ ＩＩ／Ｈｉｎｃ ＩＩサイトに対してｇＡｄ ｃＤＮＡプローブを使ったテールＤＮＡのサザンブロッティングにより確認した。
（８）ｇＡｄを過剰発現するａｐｏＥ欠損マウスの作製
ｇＡｄを過剰発現するａｐｏＥ欠損マウスを交配し、ｇＡｄ過剰発現ａｐｏＥヘテロ欠損マウスを得、さらにａｐｏＥ欠損マウスと交配することにより、ｇＡｄを過剰発現するａｐｏＥ欠損マウスを作製した。
（９）血糖値、脂質レベルの測定
血糖値、血中の遊離脂肪酸、中性脂肪、総コレステロールは、飽食時にそれぞれグルテストエース（登録商標、三和化学研究所製）、ＮＥＦＡ Ｃ−ｔｅｓｔ、ＴＧＬ−ｔｙｐｅ、Ｔｃｈｏｌ Ｅ−ｔｙｐｅ（ワコー社製）を用いて測定した。
（１０）動脈硬化巣の大きさの評価
４ケ月齢のｇＡｄ過剰発現ａｐｏＥ欠損マウスとコントロールのａｐｏＥ欠損マウスから大動脈弓及び下行大動脈を摘出してホルマリン固定後、Ｓｕｄａｎ ＩＶにて染色し、動脈硬化巣の大きさを評価した。
（１１）コレステロールエステル蓄積量、スカベンジャー受容体Ａ発現量、マクロファージの集積の評価
大動脈弁輪部の凍結連続輪状切片を作製し、そのうちの１０切片をＯｉｌ Ｒｅｄ Ｏ染色及び抗スカベンジャー受容体Ａ抗体、マクロファージ特異的マーカーである抗Ｍａｃ３抗体で免疫染色し、それぞれコレステロールエステル蓄積量、スカベンジャー受容体Ａ発現量、マクロファージの集積の評価を行った。
Ｂ．結果
（１）マウスアディポネクチン遺伝子欠損マウス
白色脂肪組織のノーザンブロットではヘテロ欠損型マウスではアディポネクチンの発現が約６０％減少し、ホモ欠損マウスではその発現が完全に消失していることが確認された（図４）。実際血中のアディポネクチン濃度を測定するとヘテロ欠損型マウスではその血中レベルが約６０％低下しホモ欠損マウスでは検出限界以下であった（図５）。なお血中レプチン濃度には差が認められなかった（図６）。
（２）マウスアディポネクチン遺伝子欠損マウスのインスリン抵抗性
６週の野生型（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）、ヘテロ欠損型（ａｄｉｐｏ ＋／−）、ホモ欠損型（ａｄｉｐｏ −／−）マウスの３群において体重差は認められなかった（図７）。６週の野生型とヘテロ型欠損マウスに対してインスリン感受性を調べる目的でインスリン負荷試験を行ったところ、外来性のインスリンに対する血糖値の降下の程度はヘテロ欠損型で有意に低く、ヘテロ欠損型マウスがインスリン抵抗性を有していることが明らかとなった（図８）。
次にグルコース負荷試験を行ったが、血糖値、インスリン値において野生型とヘテロ欠損型マウスにおいて差は認められなかった（図９）。しかし１０週間の高脂肪食を負荷したヘテロ欠損マウスでは野生型に比し体重は同じであったにもかかわらず糖負荷前後の血糖値が有意に上昇していた（図１０）。
次にはホモ欠損マウスの解析を行った。
６週の野生型とホモ欠損型マウスに対してインスリン負荷試験を行ったところ、外来性のインスリンに対する血糖値の降下の程度は野生型やヘテロ欠損型より有意に低く、インスリン抵抗性が野生型やヘテロ欠損型マウスに比し高いことが明らかとなった（図１１）。
次にグルコース負荷試験を行ったところ空腹時、負荷後ともに血糖値が野生型に比し高く、このことからホモ欠損型マウスはインスリン抵抗性に加え軽度の耐糖能障害も有していることが明らかとなった（図１２）。糖負荷前後のインスリン値は投与前と投与３０分後では違いはなかったが１５分値ではホモ欠損型マウスでは低い傾向にあった（図１２）。
（３）アディポネクチンホモ欠損型マウスでの血中中性脂肪
アディポネクチンの脂質代謝に対する影響を調べるために野生型、ヘテロ欠損型、ホモ欠損型マウスの血中遊離脂肪酸（ＦＦＡ）、中性脂肪（ＴＧ）、総コレステロール値（ＴＣ）を測定した（図１３，１４）。ヘテロ欠損型では３項目全てにおいて野生型との違いは認められなかった（図１３）が、ホモ欠損型では血中の中性脂肪値が野生型に比し有意に高値であった（図１４）。
（４）マウスアディポネクチンヘテロ欠損型マウスのカフ損傷モデルにおける内膜肥厚
アディポネクチンの動脈硬化に対する影響を見るためにカフ損傷に対する内膜肥厚の程度を野生型とヘテロ型欠損マウスにおいて比較した。両群においてカフ損傷後の血管の内径に差は認められなかった（図１５）。しかしカフ損傷２週間後においてヘテロ欠損型では野生型に比し内膜肥厚の程度が約１．８倍高かった（図１６）。しかし中膜の厚さに差は認められなかった（図１７）。野生型とヘテロ欠損型マウスにおいて内膜中膜比をとってみるとヘテロ欠損型では野生型に比し約２倍であった（図１８）。
（５）ｇＡｄを過剰発現するａｐｏＥ欠損マウスにおける動脈硬化発症の抑制
動脈硬化を自然に発症するモデルであるａｐｏＥ欠損マウスにｇＡｄを過剰発現させ、その動脈硬化発症が抑制されるかどうかを検討した。その結果を図１９及び図２０に示す。図１９中ａはａｐｏＥ欠損マウスの大動脈のＳｕｄａｎ ＩＶ染色結果であり、図１９中ｂはｇＡｄ過剰発現ａｐｏＥ欠損マウスの大動脈のＳｕｄａｎ ＩＶ染色結果である。ａとｂの対比から明らかなようにｇＡｄ過剰発現ａｐｏＥ欠損マウスでは動脈硬化巣が明確に減少している。また、動脈硬化巣の面積を対比したのが図２０である。図２０からもｇＡｄを過剰発現させると、Ｓｕｄａｎ ＩＶで染色される動脈硬化巣面積が大動脈弓（ｂ）、下行大動脈（ｃ）、両者を足して（ａ）比較検討した何れの場合でも、有意に低下しており、動脈硬化発症の抑制が認められた。
（６）ｇＡｄの過剰発現が普通食下のａｐｏＥ欠損マウスの動脈硬化リスクファクターに与える影響
普通食下におけるｇＡｄ過剰発現ａｐｏＥ欠損マウスの体重、血糖値、血中遊離脂肪酸、中性脂肪及び総コレステロール値の測定結果を表１に示す。
表１から明らかなように、普通食下のａｐｏＥ欠損ママウスにｇＡｄを過剰発現させても、体重、血糖値、血中の遊離脂肪酸、中性脂肪、総コレステロールなどの動脈硬化リスクファクターに顕著な影響を与えなかった。このことより、ｇＡｄは、血管壁やマクロファージに直接作用して、抗動脈硬化作用を発現している可能性が示唆された。
（７）ｇＡｄの動脈硬化発症抑制の作用機序
ｇＡｄの血管壁やマクロファージに対する直接作用のメカニズムを明らかにする目的で、大動脈弁輪部の凍結連続輪状切片を用いて、Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ染色及び抗スカベンジャー受容体Ａ抗体、マクロファージ特異的マーカーである抗Ｍａｃ３抗体で免疫染色を施行した。その結果、図２１に示すようにｇＡｄの過剰発現はマクロファージの集積には大きな影響を与えなかったが、スカベンジャー受容体Ａの発現を低下させて、マクロファージへの脂質の蓄積を抑制し、動脈硬化発症を低減させることが判明した。
産業上の利用可能性
本発明によれば、動脈壁のスカベンジャー受容体Ａの発現を低下させて、マクロファージへの脂質の蓄積を抑制することにより、動脈硬化の発症及び進展を防止することにより、動脈硬化の実体像である血管内膜の肥厚を直接抑制できる動脈硬化症予防治療剤が提供できる。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図１は、アディポネクチン遺伝子欠損についてのジーンターゲティングの模式図を示す。上：マウスアディポネクチン遺伝子の制限酵素地図、中：アディポネクチン遺伝子ターゲティングベクター、下：予想されるターゲティングアリール。
図２は、ＳｐｅＩとＥｏＲＶによって消化されたＥＳ細胞由来のＤＮＡのサザンブロット結果を示す。１７ｋｂのバンドは野生型アリールを、１０．５ｋｂのバンドは変異アリールを示す。
図３は、ＳｐｅＩとＥｏＲＶによって消化された野生型（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）、ヘテロ欠損型（ａｄｉｐｏ ＋／−）、ホモ欠損型（ａｄｉｐｏ −／−）マウス由来のＤＮＡのサザンブロット結果を示す。１７ｋｂのバンドは野生型アリールを、１０．５ｋｂのバンドは変異アリールを示す。
図４は、野生型（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）、ヘテロ欠損型（ａｄｉｐｏ ＋／−）、ホモ欠損型（ａｄｉｐｏ −／−）マウスの白色脂肪組織のノーザンブロット結果を示す。
図５は、野生型（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）、ヘテロ欠損型（ａｄｉｐｏ ＋／−）、ホモ欠損型（ａｄｉｐｏ −／−）マウスの血中アディポネクチン濃度を示す。＊＊Ｐ＜０．０１。
図６は、野生型（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）、ヘテロ欠損型（ａｄｉｐｏ ＋／−）、ホモ欠損型（ａｄｉｐｏ −／−）マウスの血中レプチン濃度を示す。
図７は、野生型（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）、ヘテロ欠損型（ａｄｉｐｏ ＋／−）、ホモ欠損型（ａｄｉｐｏ −／−）マウスの６週における体重を示す。
図８は、野生型（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）、ヘテロ欠損型（ａｄｉｐｏ ＋／−）マウスの６週におけるインスリン負荷試験結果を示す。＊Ｐ＜０．０５。
図９は、野生型（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）、ヘテロ欠損型（ａｄｉｐｏ ＋／−）マウスの６週におけるグルコース負荷試験結果を示す。＊Ｐ＜０．０５。
図１０は、野生型（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）、ヘテロ欠損型（ａｄｉｐｏ ＋／−）マウスの高脂肪食負荷１０週におけるグリコース負荷試験結果を示す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
図１１は、野生型（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）、ホモ欠損型（ａｄｉｐｏ −／−）マウスの６週におけるインスリン負荷試験結果を示す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
図１２は、野生型（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）、ヘテロ欠損型（ａｄｉｐｏ ＋／−）マウスの６週におけるグルコース負荷試験結果を示す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
図１３は、野生型（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）、ヘテロ欠損型（ａｄｉｐｏ ＋／−）マウスの血中遊離脂肪酸（ＦＦＡ）、中性脂肪（ＴＧ）、総コレステロール値（ＴＣ）を示す。
図１４は、野生型（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）、ホモ欠損型（ａｄｉｐｏ −／−）マウスの血中遊離脂肪酸（ＦＦＡ）、中性脂肪（ＴＧ）、総コレステロール値（ＴＣ）を示す。
図１５は、野生型（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）、ヘテロ欠損型（ａｄｉｐｏ ＋／−）マウスのカフ損傷２週間後における血管の内径を示す。
図１６は、野生型（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）、ヘテロ欠損型（ａｄｉｐｏ ＋／−）マウスのカフ損傷２週間後における内膜肥厚の程度を示す。
図１７は、野生型（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）、ヘテロ欠損型（ａｄｉｐｏ ＋／−）マウスのカフ損傷２週間後における中膜肥厚の程度を示す。
図１８は、野生型（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）、ヘテロ欠損型（ａｄｉｐｏ ＋／−）マウスのカフ損傷２週間後における内膜中膜比を示す。
図１９は、ａｐｏＥ欠損マウス（ａｐｏＥ−／−：ａ）及びｇＡｄ過剰発現ａｐｏＥ欠損マウス（ｇＡｄＴｇ ａｐｏＥ−／−：ｂ）における動脈硬化巣を示す図である。
図２０は、ａｐｏＥ欠損マウス（ａｐｏＥ−／−）及びｇＡｄ過剰発現ａｐｏＥ欠損マウス（ｇＡｄＴｇ ａｐｏＥ−／−）における動脈硬化巣の面積〔大動脈弓（ｂ）及び下行大動脈（ｃ）及びそれらの合計（ａ）〕を示す図である。
図２１は、ａｐｏＥ欠損マウス（ａｐｏＥ−／−）及びｇＡｄ過剰発現ａｐｏＥ欠損マウス（ｇＡｄＴｇ ａｐｏＥ−／−）における動脈に対するＯｉｌ Ｒｅｄ Ｏ染色、抗Ｍａｃ３抗体との反応、抗スカベンジャー受容体Ａ抗体との反応を示す図である。
本発明は、動脈硬化症予防治療薬に関する。
背景技術
動脈硬化は、動脈が弾力を失ってもろくなった状態をいい、当該動脈硬化は脳出血、脳梗塞、心筋梗塞、腎硬化症などの成人病の原因として重要である。動脈硬化の原因として高脂血症、血液中の細菌、ウイルス、過酸化脂質、活性酸素等が知られているが、未だ完全には解明されていない。いずれにしても動脈硬化の始まりは、動脈の内膜・内皮細胞の障害による肥厚であり、当該動脈内膜の肥厚を抑制する薬物の探索が希求されている。
従って、本発明の目的は、動脈硬化の予防治療に有効な医薬を提供することにある。
発明の開示
そこで本発明者は、インスリン抵抗性改善作用を有することが知られているアディポネクチンの薬理作用について研究してきたところ、アディポネクチン遺伝子を欠損したマウスでは動脈の内膜が顕著に肥厚しており、また粥状動脈硬化症発症モデルであるａｐｏＥ欠損マウスにアディポネクチン、特にアディポネクチンのＣ末端球状領域を過剰発現させると動脈硬化の発症が抑制されることから、アディポネクチン、そのＣ末端側球状領域又はその遺伝子が動脈硬化予防又は治療薬として有用であることを見出した。また、アディポネクチンの過剰発現は、血中の遊離脂肪酸、中性脂肪、総コレステロールなどに顕著な影響を与えず、スカベンジャー受容体Ａの発現を低下させていることから、アディポネクチンの動脈硬化防止作用は、スカベンジャー受容体Ａの発現を低下させて、マクロファージへの脂質の蓄積を抑制することによるものであることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明はアディポネクチンのＣ末端側球状領域、アディポネクチン又はそれらの遺伝子を有効成分とする動脈硬化症予防治療薬を提供するものである。
また、本発明は、アディポネクチンのＣ末端球状領域、アディポネクチン又はそれらの遺伝子を有効成分とするスカベンジャー受容体Ａ発現低下剤を提供するものである。
さらに本発明は、アディポネクチンのＣ末端側球状領域、アディポネクチン又はそれらの遺伝子の、動脈硬化症予防治療薬製造のための使用を提供するものである。
さらに、本発明が、アディポネクチンのＣ末端側球状領域、アディポネクチン又はそれらの遺伝子の、スカベンジャー受容体Ａ発現低下剤製造のための使用を提供するものである。
さらに本発明は、アディポネクチンのＣ末端側球状領域、アディポネクチン又はそれらの遺伝子の有効量を投与することを特徴とする動脈硬化症の処置方法を提供するものである。
さらに本発明は、アディポネクチンのＣ末端側球状領域、アディポネクチン又はそれらの遺伝子の有効量を投与することを特徴とする患者のスカベンジャー受容体Ａ発現低下方法を提供するものである。
発明を実施するための最良の形態
本発明に用いられるアディポネクチンは、既にクローニングされており［Ｍａｅｄａ，Ｋ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２２１，２８６−２９６（１９９６）、Ｎａｋａｎｏ，Ｙ．ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ）１２０，８０２−８１２（１９９６）］、既知の手段により入手できる。配列番号１及び２にヒトアディポネクチンの塩基酸配列及びアンミ酸配列を示す。アディポネクチンは、Ｎ末端側のコラーゲン様配列（ｃＡｄ）とＣ末端側の球状領域（ｇＡｄ；配列番号１中、アミノ酸番号１１４〜２３９又は１１１〜２４２）から構成されているが、Ｃ末端側の球状領域（ｇＡｄ）は、完全長アディポネクチンよりも強力な動脈硬化予防治療作用を有し、特に好ましい。また配列番号３及び４にマウスアディポネクチンの塩基酸配列及びアミノ酸配列を示す。マウスアディポネクチンのＮ末端側のコラーゲン様配列（ｃＡｄ）は４５〜１０９（アミノ酸番号）であり、Ｃ末端側の球状領域（ｇＡｄ）は１１０〜２４７（アミノ酸番号）である。また、本発明においては、配列番号１〜４に示すアミノ酸配列及びｇＡｄ領域を示すアミノ酸配列を有する蛋白質だけでなく、これらのアミノ酸配列の一又は複数のアミノ酸が置換、欠失又は付加したアミノ酸配列を有する蛋白質であってもアディポネクチンとしての作用を有するものであれば用いることができる。当該変異蛋白質としては、配列番号１〜４のアミノ酸配列又はｇＡｄ領域を示すアミノ酸配列と８０％以上、特に９０％以上の相同性を有するものが挙げられる。
本発明で用いられる遺伝子としては、配列番号１及び３に示されるアディポネクチンをコードする遺伝子及びｇＡｄをコードする遺伝子が挙げられる。また、これらの遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズし得る塩基配列を有する遺伝子も用いることができる。
アディポネクチン又はその一部のポリペプチド（ｇＡｄを含む）は、それが存在する細胞から分離することもできるが、アディポネクチンをコードする遺伝子がすでにクローニングされているので、ＤＮＡ組み換え技術、すなわち、当該遺伝子を用いて調製した発現ベクターを利用し、形質転換した細胞を用いて調製してもよい。
後記実施例に示すように、アディポネクチンを欠損させたマウスでは、血中の中性脂肪が高いが、コレステロールは野生型と差がない。また、アディポネクチンを欠損させたマウスは動脈硬化のモデルにおいて野生型に比べて２倍の内膜肥厚を示した。これに対し、粥状動脈硬化を自然に発症するモデルであるａｐｏＥ欠損マウスにｇＡｄを過剰発現させると、動脈硬化単面積が有意に低下し、動脈硬化発症が抑制される。ところが、ａｐｏＥ欠損マウスにｇＡｄを過剰発現させても、体重、血糖値、血中の遊離脂肪酸、中性脂肪、総コレステロールなどの一般の動脈硬化リスクファクターに顕著な影響を与えない。これに対し、ａｐｏＥ欠損マウスにｇＡｄを過剰発現させると動脈壁のスカベンジャー受容体Ａの発現が低下していた。ここで、スカベンジャー受容体Ａは、マクロファージが変性ＬＤＬを貪食する際、細胞表面で変性ＬＤＬを結合する受容体であり、動脈硬化発症の重要な受容体として知られている。
従って、アディポネクチン、ｇＡｄ又はこれらの遺伝子は、スカベンジャー受容体Ａ発現低下剤として、また動脈硬化症予防治療薬として有用である。また、ｇＡｄ又はその遺伝子はアディポネクチンよりも強力なスカベンジャー受容体発現低下作用及び動脈硬化予防治療作用を有し、特に有用である。
本発明の医薬をヒトを含む哺乳類に投与するには、前記有効成分に薬学的に許容される担体を加えて、種々の投与形態の医薬組成物とすることができる。かかる投与形態としては注射用製剤が好ましい。また薬学的に許容される担体としては、蒸留水、溶解補助剤、安定化剤、乳化剤、緩衝剤等が挙げられる。また、これら医薬の投与量は、疾患、性別、体重等により変化するが、アディポネクチン又はｇＡｄ量として０．１μｇ〜１０ｍｇ／日程度であろう。
実施例
次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。
Ａ．方法
（１）ノックアウトマウスの作成
アディポネクチンｃＤＮＡをプローブを用いて１２９／Ｓｖマウスゲノミックライブラリーをスクリーニングし、アディポネクチン遺伝子を含むクローンを複数クローニングした。翻訳開始点直下から翻訳終止点までをｎｅｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子で置換したターゲティングベクターを構築し、このターゲティングベクターをＥＳ細胞にトランスフェクションした。サザンブロッティングによりスクリーニングを行い、５クローンの相同組換え体を確認した。顕微注入法にてキメラマウスを作成し、ＢＩ／６との交配によりＦ１、さらにＦ２を作成した。
すなわち、アディポネクチン遺伝子の欠損マウスは、図１に示すような相同組換えによって作成した。マウスアディポネクチン遺伝子を欠損のため、アディポネクチンをコードしているエクソン２と３をｎｅｏ耐性遺伝子に置き換えたターゲティングベクターを作成した。独立した５つの相同句組換えを起こしたクローンがサザンブロットによって確認された（図２）。１２９／ＳｖをバックグランドにもつＥＳ細胞よりキメラマウスを作成し、ヘテロ欠損マウス作成のためＢＩ／６と交配した。その遺伝子型をサザンブロットにて確認した（図３）。
（２）インスリン負荷試験
負荷試験中のみ絶食をかけ、腹腔内にマウス体重１ｇあたり０．７ｍＵのヒトインスリンを投与した。採血は尾静脈から行い血糖値はグルテストエース（登録商標、三和化学研究所製）にて測定した。
（３）グルコース負荷試験
試験開始前に少なくとも１６時間以上絶食をかけた後、マウス体重１ｇあたり１．５ｍｇのグルコースを経口投与した。採血は眼底静脈より行い血糖値はグルテストエース（登録商標、三和化学研究所製）にて測定、インスリンはラットインスリンＲＩＡキット（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）を用いて測定した。
（４）血中脂質レベルの測定
血中の遊離脂肪酸、中性脂肪、総コレステロールは１６時間の絶食の後、それぞれＮＥＦＡＣ−ｔｅｓｔ，ＴＧＬ−ｔｙｐｅ，Ｔｃｈｏｌ Ｅ−ｔｙｐｅ（ワコー社製）を用いて測定した。
（５）血中レプチン、アディポネクチンの測定
血中のレプチン、アディポネクチンの測定は１６時間の絶食の後、それぞれＱｕｉｎｔｉｋｉｎｅ Ｍ ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ社製）、アディポネクチンＲＩＡキット（ＬＩＮＣＯ社製）を用いて測定した。
（６）カフによる血管内膜肥厚モデルの作製
大腿動脈に２．０ｍｍのポリエチレンチューブ（ＰＥ−５０）を留置し、２週間後に血管をホルマリンにて圧固定後、対側のカフを巻いていない対照血管とともに摘出した。摘出した血管に対して１０ｍｍの厚さで連続輪状切片を作製しそのうち１０切片をＨＥ染色し、血管内径、内膜の厚さ、中膜の厚さ、内膜中膜比を測定した。
（７）ｇＡｄ過発現マウスの作製
Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４８，１８２２−１８２９（１９９９）に従い、ヒトＳＡＰプロモータとマウスｇＡｄ ｃＤＮＡを有する融合遺伝子を作製した。精製Ｈｉｎｄ ＩＩＩ−ＸｈｏＩフラグメントをＣ５７ＢＬ６マウス（日本クレア製）の受精卵の前核にマイクロインジェクションした。トランスジェニックマウスがｇＡｄを過発現していることは、ｇＡｄのＢｇｌ ＩＩ／Ｈｉｎｃ ＩＩサイトに対してｇＡｄ ｃＤＮＡプローブを使ったテールＤＮＡのサザンブロッティングにより確認した。
（８）ｇＡｄを過剰発現するａｐｏＥ欠損マウスの作製
ｇＡｄを過剰発現するａｐｏＥ欠損マウスを交配し、ｇＡｄ過剰発現ａｐｏＥヘテロ欠損マウスを得、さらにａｐｏＥ欠損マウスと交配することにより、ｇＡｄを過剰発現するａｐｏＥ欠損マウスを作製した。
（９）血糖値、脂質レベルの測定
血糖値、血中の遊離脂肪酸、中性脂肪、総コレステロールは、飽食時にそれぞれグルテストエース（登録商標、三和化学研究所製）、ＮＥＦＡ Ｃ−ｔｅｓｔ、ＴＧＬ−ｔｙｐｅ、Ｔｃｈｏｌ Ｅ−ｔｙｐｅ（ワコー社製）を用いて測定した。
（１０）動脈硬化巣の大きさの評価
４ケ月齢のｇＡｄ過剰発現ａｐｏＥ欠損マウスとコントロールのａｐｏＥ欠損マウスから大動脈弓及び下行大動脈を摘出してホルマリン固定後、Ｓｕｄａｎ ＩＶにて染色し、動脈硬化巣の大きさを評価した。
（１１）コレステロールエステル蓄積量、スカベンジャー受容体Ａ発現量、マクロファージの集積の評価
大動脈弁輪部の凍結連続輪状切片を作製し、そのうちの１０切片をＯｉｌ Ｒｅｄ Ｏ染色及び抗スカベンジャー受容体Ａ抗体、マクロファージ特異的マーカーである抗Ｍａｃ３抗体で免疫染色し、それぞれコレステロールエステル蓄積量、スカベンジャー受容体Ａ発現量、マクロファージの集積の評価を行った。
Ｂ．結果
（１）マウスアディポネクチン遺伝子欠損マウス
白色脂肪組織のノーザンブロットではヘテロ欠損型マウスではアディポネクチンの発現が約６０％減少し、ホモ欠損マウスではその発現が完全に消失していることが確認された（図４）。実際血中のアディポネクチン濃度を測定するとヘテロ欠損型マウスではその血中レベルが約６０％低下しホモ欠損マウスでは検出限界以下であった（図５）。なお血中レプチン濃度には差が認められなかった（図６）。
（２）マウスアディポネクチン遺伝子欠損マウスのインスリン抵抗性
６週の野生型（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）、ヘテロ欠損型（ａｄｉｐｏ ＋／−）、ホモ欠損型（ａｄｉｐｏ −／−）マウスの３群において体重差は認められなかった（図７）。６週の野生型とヘテロ型欠損マウスに対してインスリン感受性を調べる目的でインスリン負荷試験を行ったところ、外来性のインスリンに対する血糖値の降下の程度はヘテロ欠損型で有意に低く、ヘテロ欠損型マウスがインスリン抵抗性を有していることが明らかとなった（図８）。
次にグルコース負荷試験を行ったが、血糖値、インスリン値において野生型とヘテロ欠損型マウスにおいて差は認められなかった（図９）。しかし１０週間の高脂肪食を負荷したヘテロ欠損マウスでは野生型に比し体重は同じであったにもかかわらず糖負荷前後の血糖値が有意に上昇していた（図１０）。
次にはホモ欠損マウスの解析を行った。
６週の野生型とホモ欠損型マウスに対してインスリン負荷試験を行ったところ、外来性のインスリンに対する血糖値の降下の程度は野生型やヘテロ欠損型より有意に低く、インスリン抵抗性が野生型やヘテロ欠損型マウスに比し高いことが明らかとなった（図１１）。
次にグルコース負荷試験を行ったところ空腹時、負荷後ともに血糖値が野生型に比し高く、このことからホモ欠損型マウスはインスリン抵抗性に加え軽度の耐糖能障害も有していることが明らかとなった（図１２）。糖負荷前後のインスリン値は投与前と投与３０分後では違いはなかったが１５分値ではホモ欠損型マウスでは低い傾向にあった（図１２）。
（３）アディポネクチンホモ欠損型マウスでの血中中性脂肪
アディポネクチンの脂質代謝に対する影響を調べるために野生型、ヘテロ欠損型、ホモ欠損型マウスの血中遊離脂肪酸（ＦＦＡ）、中性脂肪（ＴＧ）、総コレステロール値（ＴＣ）を測定した（図１３，１４）。ヘテロ欠損型では３項目全てにおいて野生型との違いは認められなかった（図１３）が、ホモ欠損型では血中の中性脂肪値が野生型に比し有意に高値であった（図１４）。
（４）マウスアディポネクチンヘテロ欠損型マウスのカフ損傷モデルにおける内膜肥厚
アディポネクチンの動脈硬化に対する影響を見るためにカフ損傷に対する内膜肥厚の程度を野生型とヘテロ型欠損マウスにおいて比較した。両群においてカフ損傷後の血管の内径に差は認められなかった（図１５）。しかしカフ損傷２週間後においてヘテロ欠損型では野生型に比し内膜肥厚の程度が約１．８倍高かった（図１６）。しかし中膜の厚さに差は認められなかった（図１７）。野生型とヘテロ欠損型マウスにおいて内膜中膜比をとってみるとヘテロ欠損型では野生型に比し約２倍であった（図１８）。
（５）ｇＡｄを過剰発現するａｐｏＥ欠損マウスにおける動脈硬化発症の抑制
動脈硬化を自然に発症するモデルであるａｐｏＥ欠損マウスにｇＡｄを過剰発現させ、その動脈硬化発症が抑制されるかどうかを検討した。その結果を図１９及び図２０に示す。図１９中ａはａｐｏＥ欠損マウスの大動脈のＳｕｄａｎ ＩＶ染色結果であり、図１９中ｂはｇＡｄ過剰発現ａｐｏＥ欠損マウスの大動脈のＳｕｄａｎ ＩＶ染色結果である。ａとｂの対比から明らかなようにｇＡｄ過剰発現ａｐｏＥ欠損マウスでは動脈硬化巣が明確に減少している。また、動脈硬化巣の面積を対比したのが図２０である。図２０からもｇＡｄを過剰発現させると、Ｓｕｄａｎ ＩＶで染色される動脈硬化巣面積が大動脈弓（ｂ）、下行大動脈（ｃ）、両者を足して（ａ）比較検討した何れの場合でも、有意に低下しており、動脈硬化発症の抑制が認められた。
（６）ｇＡｄの過剰発現が普通食下のａｐｏＥ欠損マウスの動脈硬化リスクファクターに与える影響
普通食下におけるｇＡｄ過剰発現ａｐｏＥ欠損マウスの体重、血糖値、血中遊離脂肪酸、中性脂肪及び総コレステロール値の測定結果を表１に示す。
（７）ｇＡｄの動脈硬化発症抑制の作用機序
ｇＡｄの血管壁やマクロファージに対する直接作用のメカニズムを明らかにする目的で、大動脈弁輪部の凍結連続輪状切片を用いて、Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ染色及び抗スカベンジャー受容体Ａ抗体、マクロファージ特異的マーカーである抗Ｍａｃ３抗体で免疫染色を施行した。その結果、図２１に示すようにｇＡｄの過剰発現はマクロファージの集積には大きな影響を与えなかったが、スカベンジャー受容体Ａの発現を低下させて、マクロファージへの脂質の蓄積を抑制し、動脈硬化発症を低減させることが判明した。
産業上の利用可能性
本発明によれば、動脈壁のスカベンジャー受容体Ａの発現を低下させて、マクロファージへの脂質の蓄積を抑制することにより、動脈硬化の発症及び進展を防止することにより、動脈硬化の実体像である血管内膜の肥厚を直接抑制できる動脈硬化症予防治療剤が提供できる。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図１は、アディポネクチン遺伝子欠損についてのジーンターゲティングの模式図を示す。上：マウスアディポネクチン遺伝子の制限酵素地図、中：アディポネクチン遺伝子ターゲティングベクター、下：予想されるターゲティングアリール。
図２は、ＳｐｅＩとＥｏＲＶによって消化されたＥＳ細胞由来のＤＮＡのサザンブロット結果を示す。１７ｋｂのバンドは野生型アリールを、１０．５ｋｂのバンドは変異アリールを示す。
図３は、ＳｐｅＩとＥｏＲＶによって消化された野生型（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）、ヘテロ欠損型（ａｄｉｐｏ ＋／−）、ホモ欠損型（ａｄｉｐｏ −／−）マウス由来のＤＮＡのサザンブロット結果を示す。１７ｋｂのバンドは野生型アリールを、１０．５ｋｂのバンドは変異アリールを示す。
図４は、野生型（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）、ヘテロ欠損型（ａｄｉｐｏ ＋／−）、ホモ欠損型（ａｄｉｐｏ −／−）マウスの白色脂肪組織のノーザンブロット結果を示す。
図５は、野生型（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）、ヘテロ欠損型（ａｄｉｐｏ ＋／−）、ホモ欠損型（ａｄｉｐｏ −／−）マウスの血中アディポネクチン濃度を示す。＊＊Ｐ＜０．０１。
図６は、野生型（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）、ヘテロ欠損型（ａｄｉｐｏ ＋／−）、ホモ欠損型（ａｄｉｐｏ −／−）マウスの血中レプチン濃度を示す。
図７は、野生型（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）、ヘテロ欠損型（ａｄｉｐｏ ＋／−）、ホモ欠損型（ａｄｉｐｏ −／−）マウスの６週における体重を示す。
図８は、野生型（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）、ヘテロ欠損型（ａｄｉｐｏ ＋／−）マウスの６週におけるインスリン負荷試験結果を示す。＊Ｐ＜０．０５。
図９は、野生型（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）、ヘテロ欠損型（ａｄｉｐｏ ＋／−）マウスの６週におけるグルコース負荷試験結果を示す。＊Ｐ＜０．０５。
図１０は、野生型（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）、ヘテロ欠損型（ａｄｉｐｏ ＋／−）マウスの高脂肪食負荷１０週におけるグリコース負荷試験結果を示す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
図１１は、野生型（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）、ホモ欠損型（ａｄｉｐｏ −／−）マウスの６週におけるインスリン負荷試験結果を示す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
図１２は、野生型（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）、ヘテロ欠損型（ａｄｉｐｏ ＋／−）マウスの６週におけるグルコース負荷試験結果を示す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
図１３は、野生型（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）、ヘテロ欠損型（ａｄｉｐｏ ＋／−）マウスの血中遊離脂肪酸（ＦＦＡ）、中性脂肪（ＴＧ）、総コレステロール値（ＴＣ）を示す。
図１４は、野生型（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）、ホモ欠損型（ａｄｉｐｏ −／−）マウスの血中遊離脂肪酸（ＦＦＡ）、中性脂肪（ＴＧ）、総コレステロール値（ＴＣ）を示す。
図１５は、野生型（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）、ヘテロ欠損型（ａｄｉｐｏ ＋／−）マウスのカフ損傷２週間後における血管の内径を示す。
図１６は、野生型（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）、ヘテロ欠損型（ａｄｉｐｏ ＋／−）マウスのカフ損傷２週間後における内膜肥厚の程度を示す。
図１７は、野生型（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）、ヘテロ欠損型（ａｄｉｐｏ ＋／−）マウスのカフ損傷２週間後における中膜肥厚の程度を示す。
図１８は、野生型（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）、ヘテロ欠損型（ａｄｉｐｏ ＋／−）マウスのカフ損傷２週間後における内膜中膜比を示す。
図１９は、ａｐｏＥ欠損マウス（ａｐｏＥ−／−：ａ）及びｇＡｄ過剰発現ａｐｏＥ欠損マウス（ｇＡｄＴｇ ａｐｏＥ−／−：ｂ）における動脈硬化巣を示す図である。
図２０は、ａｐｏＥ欠損マウス（ａｐｏＥ−／−）及びｇＡｄ過剰発現ａｐｏＥ欠損マウス（ｇＡｄＴｇ ａｐｏＥ−／−）における動脈硬化巣の面積〔大動脈弓（ｂ）及び下行大動脈（ｃ）及びそれらの合計（ａ）〕を示す図である。
図２１は、ａｐｏＥ欠損マウス（ａｐｏＥ−／−）及びｇＡｄ過剰発現ａｐｏＥ欠損マウス（ｇＡｄＴｇ ａｐｏＥ−／−）における動脈に対するＯｉｌ Ｒｅｄ Ｏ染色、抗Ｍａｃ３抗体との反応、抗スカベンジャー受容体Ａ抗体との反応を示す図である。
Claims (3)
- アディポネクチンのＣ末端側球状領域又はその遺伝子を有効成分とする動脈硬化症予防治療薬。
- さらに薬学的に許容される担体を含有するものである請求項１記載の動脈硬化症予防治療薬。
- アディポネクチンのＣ末端側球状領域又はその遺伝子を有効成分とするスカベンジャー受容体Ａ発現低下剤。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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