JP2019205355A - 分子改変体アディポネクチン及び分子改変体アディポネクチンを含む医薬組成物 - Google Patents
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Abstract
【課題】三量体、六量体、12〜18量体等が混在せず、均一な製品として製造することができ、かつ、天然のアディポネクチンと同等以上の活性を有する分子改変体アディポネクチンの提供。【解決手段】マトリリンファミリータンパク質のコイルドコイルドメインのような三量体化ドメインと、アディポネクチンの球状領域とを含む融合タンパク質とすることにより、自然に会合し、均一な三量体を形成することができる分子改変体アディポネクチン。スタフィロコッカス属(ブドウ球菌属)のプロテインAのZZドメインを更に含み、前記プロテインAのZZドメインが前記マトリリンのコイルドコイル領域のN末端側に位置する、分子改変体アディポネクチン。【選択図】図1
Description
本発明は、分子改変体アディポネクチンに関する。より詳しくは、アディポネクチンのC末端側球状領域と、マトリリンのコイルドコイル領域とを含む、分子改変体アディポネクチンに関する。
高脂肪食や運動不足による肥満は、メタボリックシンドロームや糖尿病などの発症および増悪を促進するだけでなく、心血管疾患のリスクを高めることが知られている。特に、わが国では、心疾患及び脳血管疾患は、死因の約27%を占め、心血管病が三大死因の1つとなっている。心血管病は、食生活や生活習慣の変化による肥満及び運動不足に伴い、近年増加している。例えば、急性心筋梗塞の発症数は、わが国では年間約25万人と推定され、そのうち、約30%が死亡すると推定される。また、虚血性心疾患(狭心症及び心筋梗塞)の継続的な医療を受けている患者数は約90万人と推定される。虚血性心疾患の治療には、心臓カテーテル治療が可能であるが、発症から6時間以上経過したり、肥満症や糖尿病患者では、特に心筋梗塞の病巣縮小が見込まれない場合が多い。そのため、現在行われている心臓カテーテル治療に加え、補助的治療としての薬剤の開発が望まれている。
アディポネクチンは、1996年に発見された脂肪細胞に特異的に発現し分泌されるアディポカインの一種である。アディポネクチンは、他のホルモンと比較して、極めて多量に血漿中に存在する。アディポネクチンには、様々な機能があり、グルコースレベルの制御や、脂肪酸分解を含む代謝プロセスに加え、動脈硬化抑制、心保護作用、心筋梗塞の病巣縮小、傷ついた血管の修復、マクロファージの血管壁への接着、LDLの貪食抑制などに関与することが知られている。アディポネクチンの血中レベルの低下が、肥満にともなうメタボリックシンドローム、糖尿病、心血管疾患、がんなどの生活習慣病の発症および増悪の原因の一つである。アディポネクチンは、平滑筋増殖の抑制、動脈硬化症の治療に有効であると考えられている(特許文献1)。
アディポネクチンは、約30kDaのポリペプチドであり、健康なヒトの循環中では、2〜30mg/Lの範囲で存在する。アディポネクチンは、N末端のコラーゲンタンパク質に類似する領域(コラーゲン様ドメイン、cAd)、及びC末端側の球状領域(gAd)から構成される。そのうち、特にC末端側の球状領域(gAd)が、動脈硬化の予防及び治療に有用であることが知られている(特許文献2)。
血漿中のアディポネクチンは、三量体(低分子量トリマー)、六量体(中程度分子量ヘキサマー)、12〜18量体(高分子量多量体)等が混在した状態で存在している。アディポネクチン総量よりも、16量体又はそれ以上の高分子多量体レベルが、肥満、冠状動脈疾患等に相関が強いことが知られており、高分子多量体が最も生理活性が高いと考えられている(非特許文献1)。
アディポネクチンによるほとんどの心保護シグナルのメカニズムは、AMPKの活性化により媒介される。アディポネクチンは、抗炎症、抗酸化及び抗アポトーシス作用を有し、これらの作用により、虚血再灌流に対する保護効果がもたらされることが確認されている。低下しているアディポネクチンを補充することや、AMPKやPPARを活性化することは、肥満にともなうメタボリックシンドローム、糖尿病、心血管疾患、がんの治療法になることが示されている(非特許文献2〜4)。
Am.J.Cardiovasc Dis 2012;2(4): 253−366
Nature,503,493−499(2013)
Nature Medicine,11,1096−1103(2005)
Cardiovascular Res.74(2007)471−479
天然型のアディポネクチンは、コラーゲン様ドメインを介して三量体、六量体、12〜18量体等が混在した状態として存在する。そのため、天然型のアディポネクチンを用いた医薬品の製造の際には、多量体形成の制御ができず、均一なアディポネクチンを得ることが困難であるため、製造面での品質等の規格設定の点で問題があり扱いにくい。
本発明は、均一な製品として製造することができ、かつ、天然のアディポネクチンと同等以上の活性を有する分子改変体アディポネクチン、及び分子改変体アディポネクチンを含む医薬組成物を提供することを目的とする。
本願発明では、三量体化ドメインと、アディポネクチンの球状領域とを含む融合タンパク質とすることにより、分子改変体アディポネクチンを作成することとした。本発明の分子改変体アディポネクチンは、自然に会合し、均一な三量体を形成する。アディポネクチンは、12〜18量体等の多量体が活性を持つと考えられていたが、驚くべきことに、三量体を形成する本願発明の分子改変体アディポネクチンが、天然のアディポネクチンと同等又はそれを凌駕するほどの効果を有することが見出された。
そこで、本発明では、アディポネクチンのC末端側球状領域と、マトリリンのコイルドコイル領域とを含む、分子改変体アディポネクチンが提供される。この分子改変体アディポネクチンは、マトリリンのコイルドコイル領域により、効率的に三量体を形成することができる。
本発明の分子改変体アディポネクチンは、マトリリンのコイルドコイル領域がN末端側に位置し、アディポネクチン球状領域がC末端側に位置するものを用いることができる。
本発明の分子改変体アディポネクチンは、少なくとも1つのスタフィロコッカスのプロテインAのZZドメインをさらに含んでもよく、このプロテインAのZZドメインは、マトリリンのコイルドコイル領域のN末端側に位置してもよい。
分子改変体アディポネクチンに含まれるマトリリンには、マトリリン−2を使用することができる。
本発明の分子改変体アディポネクチンは、少なくとも1つのスタフィロコッカスのプロテインAのZZドメインをさらに含んでもよく、このプロテインAのZZドメインは、マトリリンのコイルドコイル領域のN末端側に位置してもよい。
分子改変体アディポネクチンに含まれるマトリリンには、マトリリン−2を使用することができる。
本発明の分子改変型アディポネクチンは、配列番号1のアミノ酸114〜244のアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号2のアミノ酸912〜952のアミノ酸配列からなるポリペプチド、及び、配列番号3のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むものを用いることができる。また、本発明の分子改変体アディポネクチンは、配列番号5、7、9及び11から選択されるアミノ酸配列を含むものを用いることができる。
本発明の別の実施態様として、上記分子改変体アディポネクチンの三量体が提供される。
また、本発明のさらに別の実施態様として、上記分子改変体アディポネクチンをコードする核酸が提供される。本発明の核酸として、配列番号4、6、8及び10から選択される核酸配列を含むものが好ましい。
またさらに、本発明の実施態様として、上記核酸を含むベクターが提供される。本発明のさらに別の実施態様として、上記核酸又は上記ベクターを含む、宿主細胞が提供される。
本発明のさらに別の態様として、分子改変体アディポネクチンの三量体と、製剤学的に許容される担体とを含む、医薬組成物が提供される。本発明の医薬組成物は、動脈硬化症の治療又は予防のため、糖尿病の治療又は予防のため、又は肥満の治療又は予防のために使用することができる。動脈硬化症には、狭心症、心筋梗塞又は脳梗塞が含まれる。
本発明によれば、多様な複数量体を形成する天然型アディポネクチンと比べて、均一な三量体を形成し、かつ、天然型アディポネクチンと同等又はそれを凌駕する生理学的活性を有する分子改変体アディポネクチンを提供することができる。例えば、天然型アディポネクチンの約3分の1の濃度の分子改変体アディポネクチンで、天然型アディポネクチンと同等の効果を奏することができる。
さらに、本発明の分子改変体アディポネクチンは、天然のアディポネクチンが媒介するシグナル伝達機構を活性化するため、アディポネクチンの欠乏により惹起される疾患、例えば、動脈硬化症のような心血管病、心不全、心臓肥大を含む心疾患、致死性不整脈、脳梗塞、肥満症、糖尿病、高血圧、高脂血症のようないわゆる生活習慣病及び悪性腫瘍(がん)などの、予防及び治療に有効である。
(分子改変体アディポネクチン)
本願発明の分子改変体アディポネクチンは、アディポネクチン球状領域及びマトリリンのコイルドコイル領域を含む融合タンパク質であり、好ましくは、N末端側にマトリリンのコイルドコイル領域、C末端側にアディポネクチン球状領域が融合したものである。アディポネクチン球状領域に、コイルドコイル領域を融合させることによって、三量体を極めて高効率に形成することができる。
本願発明の分子改変体アディポネクチンは、アディポネクチン球状領域及びマトリリンのコイルドコイル領域を含む融合タンパク質であり、好ましくは、N末端側にマトリリンのコイルドコイル領域、C末端側にアディポネクチン球状領域が融合したものである。アディポネクチン球状領域に、コイルドコイル領域を融合させることによって、三量体を極めて高効率に形成することができる。
また、分子改変体アディポネクチンは、スタフィロコッカスのプロテインAのIgG結合ドメインであるZZドメインをさらに含んでもよい。ZZドメインは、融合タンパク質である分子改変体アディポネクチンのN末端若しくはC末端、又は、N末端とC末端の両方に連結することができる。好ましくは、N末端にZドメインを連結する。Zドメインを連結することにより、一般的に、宿主細胞から発現される際に、可溶性画分でのタンパク質の発現が促進されることが知られている。本願の分子改変体アディポネクチンは、ZZドメインを含まなくともアディポネクチンと同等の生理活性、例えば、AMPK活性化効果、抗アポトーシス効果、抗炎症効果、心筋梗塞の病巣縮小効果等を奏するが、驚くべきことに、ZZドメインの導入により、可溶性画分での発現促進のみならず、より低濃度のタンパク質でも、天然のアディポネクチンと同等の生理活性を奏することが確認された。
本発明の分子改変体アディポネクチンは、例えば、配列番号1のアミノ酸114〜244のアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号2のアミノ酸912〜952のアミノ酸配列からなるポリペプチド、及び、配列番号3のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。また、本発明の分子改変体アディポネクチンは、例えば、配列番号5、7、9及び11のアミノ酸配列を含む。
本発明の分子改変体アディポネクチンは、通常の遺伝子工学的方法によって製造することができる。より詳細には、分子改変体アディポネクチンをコードする遺伝子を発現ベクターに組み込んで、これを適切な宿主細胞中に導入して発現させることにより、本願発明の分子改変体アディポネクチンを製造することができる。
(アディポネクチン)
本願発明の分子改変体アディポネクチンに含まれるアディポネクチンのC末端側の球状領域は、天然のアディポネクチンに由来することができる。天然のアディポネクチンは、既にアミノ酸配列が決定されており、公知の手段により入手することができる。本発明には、ヒトのアディポネクチンを使用するのが好ましく、例えば、配列番号1(図1)のアミノ酸配列を有するアディポネクチンを用いることができる。アディポネクチンは、上述のとおり、N末端のコラーゲンタンパク質に類似する領域(コラーゲン様ドメイン、cAd)、及びC末端側の球状領域(gAd)から構成される。アディポネクチンのC末端の球状領域のアミノ酸配列は、配列番号1のアミノ酸114〜244のアミノ酸配列からなるポリペプチドである。アディポネクチンの活性を有する限り、配列番号1のアミノ酸114〜244のアミノ酸配列からなるポリペプチドに限らず、これらのアミノ酸配列の1個又は複数のアミノ酸が置換、欠失又は付加したアミノ酸配列を有する変異体ポリペプチドを用いることができる。このような変異体ポリペプチドとして、配列番号1のアミノ酸114〜244のアミノ酸配列に対し、アミノ酸の保存的置換を有するものが挙げられる。変異体ポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸114〜244のアミノ酸配列に80%以上、85%以上、90%以上、95%以上又は98%以上の相同性を有するものが例示できる。
本願発明の分子改変体アディポネクチンに含まれるアディポネクチンのC末端側の球状領域は、天然のアディポネクチンに由来することができる。天然のアディポネクチンは、既にアミノ酸配列が決定されており、公知の手段により入手することができる。本発明には、ヒトのアディポネクチンを使用するのが好ましく、例えば、配列番号1(図1)のアミノ酸配列を有するアディポネクチンを用いることができる。アディポネクチンは、上述のとおり、N末端のコラーゲンタンパク質に類似する領域(コラーゲン様ドメイン、cAd)、及びC末端側の球状領域(gAd)から構成される。アディポネクチンのC末端の球状領域のアミノ酸配列は、配列番号1のアミノ酸114〜244のアミノ酸配列からなるポリペプチドである。アディポネクチンの活性を有する限り、配列番号1のアミノ酸114〜244のアミノ酸配列からなるポリペプチドに限らず、これらのアミノ酸配列の1個又は複数のアミノ酸が置換、欠失又は付加したアミノ酸配列を有する変異体ポリペプチドを用いることができる。このような変異体ポリペプチドとして、配列番号1のアミノ酸114〜244のアミノ酸配列に対し、アミノ酸の保存的置換を有するものが挙げられる。変異体ポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸114〜244のアミノ酸配列に80%以上、85%以上、90%以上、95%以上又は98%以上の相同性を有するものが例示できる。
(三量体化ドメイン)
本発明の分子改変体アディポネクチンは、アディポネクチンのC末端側球状領域のN末端側に、多量体化ドメインが連結されている。多量体化ドメインは、多量体化ドメインと結合したポリペプチドが多量体化するのを促進する。多量体化ドメインは、好ましくは、三量体化ドメインであり、一般にコイルドコイルドメインを有する。このような三量体ドメインの例として、イソロイシンジッパー、マトリリン(matrilin)ファミリータンパク質、GCN4等のコイルドコイルドメインを例示することができる。特に好ましいのは、マトリリンファミリータンパク質のコイルドコイルドメインである。マトリリンファミリータンパク質は、分泌性細胞外マトリクスタンパク質であり、マトリリン−1からマトリリン−4により構成される。本明細書中では、マトリリン−1からマトリリン−4からなるマトリリンファミリータンパク質を、単にマトリリンとも称する。
本発明の分子改変体アディポネクチンは、アディポネクチンのC末端側球状領域のN末端側に、多量体化ドメインが連結されている。多量体化ドメインは、多量体化ドメインと結合したポリペプチドが多量体化するのを促進する。多量体化ドメインは、好ましくは、三量体化ドメインであり、一般にコイルドコイルドメインを有する。このような三量体ドメインの例として、イソロイシンジッパー、マトリリン(matrilin)ファミリータンパク質、GCN4等のコイルドコイルドメインを例示することができる。特に好ましいのは、マトリリンファミリータンパク質のコイルドコイルドメインである。マトリリンファミリータンパク質は、分泌性細胞外マトリクスタンパク質であり、マトリリン−1からマトリリン−4により構成される。本明細書中では、マトリリン−1からマトリリン−4からなるマトリリンファミリータンパク質を、単にマトリリンとも称する。
マトリリン−1は、非関節性軟骨の細胞外マトリクスの成分であり、主に軟骨細胞から分泌される。マトリリン−2は、マトリクス会合に関与する分泌性タンパク質である。マトリリン−3は、軟骨性組織で発現される分泌性タンパク質である。マトリリン−4は、胎児性腎臓、胚及び胎盤で発現され、軟骨の細胞外マトリクスに対して重要な分泌性タンパク質である。このうち、特に、本発明には、ヒトのマトリリンを使用するのが好ましく、特に、ヒトのマトリリン−2のコイルドコイルドメインが、三量体化ドメインとして好適に使用される。マトリリン−2のアミノ酸配列は、配列番号2(図1)で表され、コイルドコイルドメインは、配列番号2のアミノ酸912〜952のアミノ酸配列からなるポリペプチドである。三量体形成活性を有し、かつ、分子改変体アディポネクチンの活性を損なわない限り、配列番号2のアミノ酸912〜952のアミノ酸配列からなるポリペプチドに限らず、これらのアミノ酸配列の1個又は複数のアミノ酸が置換、欠失又は付加したアミノ酸配列を有する変異体ポリペプチドを用いることができる。このような変異体ポリペプチドとして、配列番号2のアミノ酸912〜952のアミノ酸配列に対し、アミノ酸の保存的置換を有するものが挙げられる。変異体ポリペプチドは、配列番号2のアミノ酸912〜952のアミノ酸配列に80%以上、85%以上、90%以上、95%以上又は98%以上の相同性を有するものが例示できる。
アディポネクチンの球状領域を三量体化ドメインと融合することにより、生じた融合タンパク質が三量体を形成する。天然のアディポネクチンが、三量体、六量体、それらが組み合わさった多量体からなる混合物であるのに対し、本願の分子改変体アディポネクチンは、発現されたポリペプチドの少なくとも約60%、さらに好都合には少なくとも約70%、最も望ましくは少なくとも約75%が三量体として存在する。
(ZZドメイン)
本発明の分子改変体アディポネクチンは、さらに、スタフィロコッカスのプロテインAのZドメインを含んでもよい。Zドメインは、スタフィロコッカスのプロテインAに由来する、抗体のFc領域に結合するドメインである。Zドメインは、フォールディングされていない又は誤ったフォールディングをされたタンパク質を可溶化するために一般的に用いられる(例えば、Biochemistry 1994,33,4207−4211参照)。2つのZドメインをタンデムに並べた、ZZドメインとして使用することが好ましい。ZZドメインは、配列番号3(図1)に記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを使用することができる。ZZドメインをコードするヌクレオチド配列として、例えば、pEZZ18(GEヘルスケア・ジャパン株式会社)など市販のベクターを利用することができる。タンパク質の可溶化を促進し、分子改変体アディポネクチンの活性を損なわない限り、配列番号3のアミノ酸配列からなるポリペプチドに限らず、これらのアミノ酸配列の1個又は複数のアミノ酸が置換、欠失又は付加したアミノ酸配列を有する変異体ポリペプチドを用いることができる。このような変異体ポリペプチドとして、配列番号3のアミノ酸配列に対し、アミノ酸の保存的置換を有するものが挙げられる。また、変異体のポリペプチドは、配列番号3のアミノ酸114〜244のアミノ酸配列に80%以上、85%以上、90%以上、95%以上又は98%以上の相同性を有するものが例示できる。
本発明の分子改変体アディポネクチンは、さらに、スタフィロコッカスのプロテインAのZドメインを含んでもよい。Zドメインは、スタフィロコッカスのプロテインAに由来する、抗体のFc領域に結合するドメインである。Zドメインは、フォールディングされていない又は誤ったフォールディングをされたタンパク質を可溶化するために一般的に用いられる(例えば、Biochemistry 1994,33,4207−4211参照)。2つのZドメインをタンデムに並べた、ZZドメインとして使用することが好ましい。ZZドメインは、配列番号3(図1)に記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを使用することができる。ZZドメインをコードするヌクレオチド配列として、例えば、pEZZ18(GEヘルスケア・ジャパン株式会社)など市販のベクターを利用することができる。タンパク質の可溶化を促進し、分子改変体アディポネクチンの活性を損なわない限り、配列番号3のアミノ酸配列からなるポリペプチドに限らず、これらのアミノ酸配列の1個又は複数のアミノ酸が置換、欠失又は付加したアミノ酸配列を有する変異体ポリペプチドを用いることができる。このような変異体ポリペプチドとして、配列番号3のアミノ酸配列に対し、アミノ酸の保存的置換を有するものが挙げられる。また、変異体のポリペプチドは、配列番号3のアミノ酸114〜244のアミノ酸配列に80%以上、85%以上、90%以上、95%以上又は98%以上の相同性を有するものが例示できる。
(精製用タグ)
分子改変体アディポネクチンは、精製を容易にするために、精製用のタグを含んでもよい。精製用タグとしては、当業者に広く知られており、特に限定されないが、例えば、Hisタグ、GSTタグ、MBPタグ、Strep(II)タグ等を使用することができる。精製後にタグを含む領域は必ずしも切断される必要はないが、タグを含む領域を切断する場合には、プロテアーゼ等の認識部位を精製用タグの隣接部に導入して、当該プロテアーゼにより切断してもよい。
分子改変体アディポネクチンは、精製を容易にするために、精製用のタグを含んでもよい。精製用タグとしては、当業者に広く知られており、特に限定されないが、例えば、Hisタグ、GSTタグ、MBPタグ、Strep(II)タグ等を使用することができる。精製後にタグを含む領域は必ずしも切断される必要はないが、タグを含む領域を切断する場合には、プロテアーゼ等の認識部位を精製用タグの隣接部に導入して、当該プロテアーゼにより切断してもよい。
アディポネクチン球状領域とマトリリンのコイルドコイル領域との間には、任意のリンカーが含まれていてもよい。リンカーは、特に限定されないが、マトリリンのコイルドコイル領域や、アディポネクチン球状領域の隣接する領域に由来するものを用いることができる。
(核酸)
本願発明で使用できる核酸は、アディポネクチンのC末端側球状領域と、マトリリンのコイルドコイル領域とをそれぞれコードする核酸配列を含む。このような核酸配列として、例えば、配列番号1のアミノ酸114〜244のアミノ酸配列からなるポリペプチド、及び配列番号2のアミノ酸912〜952のアミノ酸配列をそれぞれコードする核酸配列を含むものが例示できる。さらに、スタフィロコッカスのプロテインAのZZドメインをコードする核酸配列を含ませてもよい。プロテインAのZZドメインをコードする核酸として、pEZZ18(GEヘルスケア・ジャパン株式会社)など市販のベクターに由来するものを使用してもよい。また、プロテインAのZZドメインをコードする核酸には、例えば、配列番号3のアミノ酸配列からなるZZドメインをコードする核酸配列を使用することができる。
本願発明で使用できる核酸は、アディポネクチンのC末端側球状領域と、マトリリンのコイルドコイル領域とをそれぞれコードする核酸配列を含む。このような核酸配列として、例えば、配列番号1のアミノ酸114〜244のアミノ酸配列からなるポリペプチド、及び配列番号2のアミノ酸912〜952のアミノ酸配列をそれぞれコードする核酸配列を含むものが例示できる。さらに、スタフィロコッカスのプロテインAのZZドメインをコードする核酸配列を含ませてもよい。プロテインAのZZドメインをコードする核酸として、pEZZ18(GEヘルスケア・ジャパン株式会社)など市販のベクターに由来するものを使用してもよい。また、プロテインAのZZドメインをコードする核酸には、例えば、配列番号3のアミノ酸配列からなるZZドメインをコードする核酸配列を使用することができる。
さらに、本願発明で使用できる核酸に、精製を容易にするために上述の精製用のタグをコードする核酸配列を含ませてもよい。また、任意のリンカー配列をコードする核酸配列を含ませてもよい。本願発明で使用できる核酸は、上述の分子改変体アディポネクチンのアミノ酸配列をコードするものであれば、その配列は特に限定されない。例えば、配列番号4、6、8及び10の核酸配列、又は、配列番号5、7、9及び11のアミノ酸配列をコードする核酸配列を用いることができる。
(ベクター)
発現ベクターは、プラスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター、人工染色体ベクター等を用いることができ、例えば、pET−24a−dのようなpET系、pUC系、pBI系、pSMA計、pBluscript系、λgt11、λZAP、pUB110、pTP5、YEp13、YCp50、バキュロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス等の任意のベクターを、宿主細胞に合わせて使用することができ、特に限定されない。発現ベクターには、プロモーター、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリアデニル化部位、ターミネーター、選択マーカー、複製起点等を含ませたものを用いることができる。
発現ベクターは、プラスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター、人工染色体ベクター等を用いることができ、例えば、pET−24a−dのようなpET系、pUC系、pBI系、pSMA計、pBluscript系、λgt11、λZAP、pUB110、pTP5、YEp13、YCp50、バキュロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス等の任意のベクターを、宿主細胞に合わせて使用することができ、特に限定されない。発現ベクターには、プロモーター、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリアデニル化部位、ターミネーター、選択マーカー、複製起点等を含ませたものを用いることができる。
宿主は、原核生物及び真核生物のいずれをも用いることが可能である。原核生物宿主には、大腸菌、枯草菌等を用いることができ、真核生物宿主には、酵母菌、哺乳動物細胞、昆虫細胞等を用いることができる。
発現ベクターを導入する方法としては、任意の公知の方法、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法などを用いることができる。分子改変体アディポネクチンは、宿主細胞の培地から公知の方法で回収し、精製することにより、得ることができる。発現された分子改変体アディポネクチンは、三量体化ドメインにより、三量体を形成し、細胞内に蓄積又は細胞外に分泌される。回収及び精製には、一般的な方法により行うことができ、例えば、アフィニティクロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなど、各種のクロマトグラフィーを用いることができる。また、三量体を形成しているかどうかは、非加熱および非還元の条件でSDS−PAGE解析およびウェスタンブロット解析等により、容易に確認することができる。
(医薬組成物)
本発明の医薬組成物は、本発明の分子改変体アディポネクチンを有効成分とし、さらに薬学的に許容される担体を加えて、種々の投与形態の医薬組成物とすることができる。また、本発明の分子改変体アディポネクチンをコードする核酸を含む遺伝子治療用ベクターを有効成分として、さらに薬学的に許容される担体を加えて種々の投与形態の医薬組成物とすることができる。医薬組成物の投与形態として、経口投与及び非経口投与が可能である。非経口投与の場合には、静脈内、動脈内、皮下、筋肉内及び腹腔内への投与など、種々の形態が可能である。
本発明の医薬組成物は、本発明の分子改変体アディポネクチンを有効成分とし、さらに薬学的に許容される担体を加えて、種々の投与形態の医薬組成物とすることができる。また、本発明の分子改変体アディポネクチンをコードする核酸を含む遺伝子治療用ベクターを有効成分として、さらに薬学的に許容される担体を加えて種々の投与形態の医薬組成物とすることができる。医薬組成物の投与形態として、経口投与及び非経口投与が可能である。非経口投与の場合には、静脈内、動脈内、皮下、筋肉内及び腹腔内への投与など、種々の形態が可能である。
経口投与用の医薬組成物としては、例えば、錠剤、カプセル、顆粒、細粒、シロップ、腸溶剤、徐放性カプセル等を例示することができる。経口投与用の医薬組成物には、乳糖、結晶セルロース、デンプンなどの賦形剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ステアリン酸カルシウムなどの滑沢剤のような担体を用いることができる。さらに、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、セラセフフェート、ヒプロメロースフタル酸エステル等のコーティング剤によりコートしてもよい。また、カプセルの場合には、腸溶性コーティング剤等により、腸溶性カプセルとすることもできる。
静脈内、動脈内、皮下、筋肉内及び腹腔内投与用の薬剤には、例えば、蒸留水、安定化剤、乳化剤、緩衝剤等の担体を含ませることができる。当業者は、保存安定性等を考慮して担体を選択することができる。本願発明の医薬組成物は、例えば、分子改変体アディポネクチンを0.01〜0.05μg/日の投与量で投与可能であるが、この投与量は投与ルート、性別、年齢、体重、疾患の状態等により変更可能である。
本願発明の分子改変体アディポネクチンを含む医薬組成物は、アディポネクチンがアディポネクチン受容体に結合することにより活性化されるAMPKを活性化するため、天然のアディポネクチンにより治療及び予防効果が見込まれる疾患に対して、同様の高い治療及び予防効果が期待できる。例えば、本願発明の分子改変体アディポネクチンを含む医薬組成物は、動脈硬化症のような心血管病、心不全、心臓肥大を含む心疾患、致死性不整脈、脳梗塞、肥満症、糖尿病、高血圧、高脂血症のようないわゆる生活習慣病及び悪性腫瘍(がん)などに対して、予防及び治療効果を奏する。
予防及び治療とは、疾患の発症の予防及び疾患の治療のみならず、当該疾患に伴う症状の予防及び治療、当該疾患の再発の抑制をも包含する概念である。治療には、根治治療のみならず、処置前と比べて症状が改善する場合をも含む。
予防及び治療とは、疾患の発症の予防及び疾患の治療のみならず、当該疾患に伴う症状の予防及び治療、当該疾患の再発の抑制をも包含する概念である。治療には、根治治療のみならず、処置前と比べて症状が改善する場合をも含む。
以下に実施例に基づいて本発明を説明するが、下記の実施例は本発明を説明するためのものであり、本発明を限定するためのものではない。
<実施例1:hMat2cc−gAd発現大腸菌株の作製>
ヒトのアディポネクチン(配列番号1)の球状領域(114残基から244残基まで)のアミノ末端にヒトのマトリリン2(配列番号2)のコイルドコイル領域(912残基から952残基まで)を連結したポリペプチド(以下、hMat2cc−gAd)(配列番号5)(図2)を大腸菌で発現させるため、このポリペプチドをコードするDNA配列(配列番号4)(図2)を設計し、発現ベクターにクローニングするための5’末端へのNdeI認識配列および3’末端へのXhoI認識配列を付加したDNAを人工合成した。この合成DNAをプラスミドpET−24a(+)(メルク株式会社)のT7プロモーターの下流に挿入し、得られたプラスミドを大腸菌BL21(DE3)株(メルク株式会社)に導入してhMat2cc−gAd発現大腸菌株を得た。
ヒトのアディポネクチン(配列番号1)の球状領域(114残基から244残基まで)のアミノ末端にヒトのマトリリン2(配列番号2)のコイルドコイル領域(912残基から952残基まで)を連結したポリペプチド(以下、hMat2cc−gAd)(配列番号5)(図2)を大腸菌で発現させるため、このポリペプチドをコードするDNA配列(配列番号4)(図2)を設計し、発現ベクターにクローニングするための5’末端へのNdeI認識配列および3’末端へのXhoI認識配列を付加したDNAを人工合成した。この合成DNAをプラスミドpET−24a(+)(メルク株式会社)のT7プロモーターの下流に挿入し、得られたプラスミドを大腸菌BL21(DE3)株(メルク株式会社)に導入してhMat2cc−gAd発現大腸菌株を得た。
<実施例2:ZZ−hMat2cc−gAd発現大腸菌株の作製>
hMat2cc−gAd(配列番号5)のアミノ末端に黄色ブドウ球菌のプロテインAに由来するZZ領域(配列番号3)を連結したポリペプチド(以下、ZZ−hMat2cc−gAd)(配列番号7)(図3)を大腸菌で発現させるため、このポリペプチドをコードするDNA配列(配列番号6)(図3)を設計し、発現ベクターにクローニングするための5’末端へのNcoI認識配列および3’末端へのXhoI認識配列を付加したDNAを人工合成した。この合成DNAをプラスミドpET−24d(+)(メルク株式会社)のT7プロモーターの下流に挿入し、得られたプラスミドを大腸菌BL21(DE3)株(メルク株式会社)に導入してZZ−hMat2cc−gAd発現大腸菌株を得た。
hMat2cc−gAd(配列番号5)のアミノ末端に黄色ブドウ球菌のプロテインAに由来するZZ領域(配列番号3)を連結したポリペプチド(以下、ZZ−hMat2cc−gAd)(配列番号7)(図3)を大腸菌で発現させるため、このポリペプチドをコードするDNA配列(配列番号6)(図3)を設計し、発現ベクターにクローニングするための5’末端へのNcoI認識配列および3’末端へのXhoI認識配列を付加したDNAを人工合成した。この合成DNAをプラスミドpET−24d(+)(メルク株式会社)のT7プロモーターの下流に挿入し、得られたプラスミドを大腸菌BL21(DE3)株(メルク株式会社)に導入してZZ−hMat2cc−gAd発現大腸菌株を得た。
<実施例3:hMat2cc−gAd−ZZ発現大腸菌株の作製>
hMat2cc−gAd(配列番号5)のカルボキシル末端にZZ領域(配列番号3)を連結したポリペプチド(以下、hMat2cc−gAd−ZZ)(配列番号9)(図4)を大腸菌で発現させるため、このポリペプチドをコードするDNA配列(配列番号8)(図4)を設計し、発現ベクターにクローニングするための5’端へのNcoI認識配列および3’末端へのXhoI認識配列を付加したDNAを人工合成した。この合成DNAをプラスミドpET−24d(+)(メルク株式会社)のT7プロモーターの下流に挿入し、得られたプラスミドを大腸菌BL21(DE3)株(メルク株式会社)に導入してhMat2cc−gAd−ZZ発現大腸菌株を得た。
hMat2cc−gAd(配列番号5)のカルボキシル末端にZZ領域(配列番号3)を連結したポリペプチド(以下、hMat2cc−gAd−ZZ)(配列番号9)(図4)を大腸菌で発現させるため、このポリペプチドをコードするDNA配列(配列番号8)(図4)を設計し、発現ベクターにクローニングするための5’端へのNcoI認識配列および3’末端へのXhoI認識配列を付加したDNAを人工合成した。この合成DNAをプラスミドpET−24d(+)(メルク株式会社)のT7プロモーターの下流に挿入し、得られたプラスミドを大腸菌BL21(DE3)株(メルク株式会社)に導入してhMat2cc−gAd−ZZ発現大腸菌株を得た。
<実施例4:ZZ−hMat2cc−gAd−ZZ発現大腸菌株の作製>
hMat2cc−gAd(配列番号5)のアミノ末端およびカルボキシル末端の両方にZZ領域(配列番号3)を連結したポリペプチド(以下、ZZ−hMat2cc−gAd−ZZ)(配列番号11)(図6)を大腸菌で発現させるため、このポリペプチドをコードするDNA配列(配列番号10)(図5)を設計し、発現ベクターにクローニングするための5’末端へのNcoI認識配列および3’末端へのXhoI認識配列を付加したDNAを人工合成した。この合成DNAをプラスミドpET−24d(+)(メルク株式会社)のT7プロモーターの下流に挿入し、得られたプラスミドを大腸菌BL21(DE3)株(メルク株式会社)に導入してZZ−hMat2cc−gAd−ZZ発現大腸菌株を得た。
hMat2cc−gAd(配列番号5)のアミノ末端およびカルボキシル末端の両方にZZ領域(配列番号3)を連結したポリペプチド(以下、ZZ−hMat2cc−gAd−ZZ)(配列番号11)(図6)を大腸菌で発現させるため、このポリペプチドをコードするDNA配列(配列番号10)(図5)を設計し、発現ベクターにクローニングするための5’末端へのNcoI認識配列および3’末端へのXhoI認識配列を付加したDNAを人工合成した。この合成DNAをプラスミドpET−24d(+)(メルク株式会社)のT7プロモーターの下流に挿入し、得られたプラスミドを大腸菌BL21(DE3)株(メルク株式会社)に導入してZZ−hMat2cc−gAd−ZZ発現大腸菌株を得た。
<実施例5:hMat2cc−gAdの調製と性状解析>
hMat2cc−gAd発現大腸菌株について、カナマイシンとイソプロピル−β−チオガラクトピラノシドを含む2xYT培地を用いて培養し、遠心分離で回収した菌体を20mMのTris−HCl(pH7.5)を含む緩衝液に再懸濁して超音波破砕を行った。得られた細胞破砕物を遠心分離によって可溶性画分と不溶性画分に分離し、可溶性画分をHiTrap Q FFカラム(GEヘルスケア・ジャパン株式会社)とHiTrap TALON crudeカラム(GEヘルスケア・ジャパン株式会社)によって連続的に精製した。この精製物について、BCA Protein Assay Kit(Thermo Scientific)を用いてタンパク質濃度測定を行った。また、非加熱および非還元の条件でSDS−PAGE解析およびウェスタンブロット解析を行い、hMat2cc−gAdが3量体を形成していること、および高純度であることを確認した。
hMat2cc−gAd発現大腸菌株について、カナマイシンとイソプロピル−β−チオガラクトピラノシドを含む2xYT培地を用いて培養し、遠心分離で回収した菌体を20mMのTris−HCl(pH7.5)を含む緩衝液に再懸濁して超音波破砕を行った。得られた細胞破砕物を遠心分離によって可溶性画分と不溶性画分に分離し、可溶性画分をHiTrap Q FFカラム(GEヘルスケア・ジャパン株式会社)とHiTrap TALON crudeカラム(GEヘルスケア・ジャパン株式会社)によって連続的に精製した。この精製物について、BCA Protein Assay Kit(Thermo Scientific)を用いてタンパク質濃度測定を行った。また、非加熱および非還元の条件でSDS−PAGE解析およびウェスタンブロット解析を行い、hMat2cc−gAdが3量体を形成していること、および高純度であることを確認した。
<実施例6:ZZ融合型hMat2cc−gAdの調製と性状解析>
ZZ−hMat2cc−gAd発現大腸菌株、hMat2cc−gAd−ZZ発現大腸菌株およびZZ−hMat2cc−gAd−ZZ発現大腸菌株のそれぞれについて、カナマイシンとイソプロピル−β−チオガラクトピラノシドを含む2xYT培地を用いて培養し、遠心分離で回収した菌体を20mMのTris−HCl(pH7.5)を含む緩衝液に再懸濁して超音波破砕を行った。得られた細胞破砕物を遠心分離によって可溶性画分と不溶性画分に分離し、可溶性画分をHiTrap TALON crudeカラム(GE Healthcare)とHiLoad 16/60 Superdex 200 pg(GE Healthcare)カラムによって連続的に精製した。この精製物について、BCA Protein Assay Kit(Thermo Scientific)を用いてタンパク質濃度測定を行った。また、非加熱および非還元の条件でSDS−PAGE解析およびウェスタンブロット解析を行い、3種類のZZ融合型hMat2cc−gAdが3量体を形成していること、および高純度であることを確認した。
ZZ−hMat2cc−gAd発現大腸菌株、hMat2cc−gAd−ZZ発現大腸菌株およびZZ−hMat2cc−gAd−ZZ発現大腸菌株のそれぞれについて、カナマイシンとイソプロピル−β−チオガラクトピラノシドを含む2xYT培地を用いて培養し、遠心分離で回収した菌体を20mMのTris−HCl(pH7.5)を含む緩衝液に再懸濁して超音波破砕を行った。得られた細胞破砕物を遠心分離によって可溶性画分と不溶性画分に分離し、可溶性画分をHiTrap TALON crudeカラム(GE Healthcare)とHiLoad 16/60 Superdex 200 pg(GE Healthcare)カラムによって連続的に精製した。この精製物について、BCA Protein Assay Kit(Thermo Scientific)を用いてタンパク質濃度測定を行った。また、非加熱および非還元の条件でSDS−PAGE解析およびウェスタンブロット解析を行い、3種類のZZ融合型hMat2cc−gAdが3量体を形成していること、および高純度であることを確認した。
<実施例7:ラット心筋細胞を用いたhMat2cc−gAdによるAMPK及びAkt活性作用の検討>
ラットの心筋細胞を用いて、分子改変体アディポネクチンhMat2cc−gAdにより心保護シグナルが活性化されることを確認した。
ラットの心筋細胞を用いて、分子改変体アディポネクチンhMat2cc−gAdにより心保護シグナルが活性化されることを確認した。
ラットの心筋細胞をDMEM中で培養し、10μg/mlのhMat2cc−gAdにより18時間処理した。心筋細胞を溶解バッファー中にてホモジナイズし、30μg量のタンパク質を、10%ポリアクリルアミドゲルを用いて、変性条件下のSDS−PAGEにより分離した。電気泳動後、分離したタンパク質を膜に転写させ、ウェスタンブロット解析を行った。具体的には、一次抗体を1:1,000の割合で希釈し、HRPをコンジュゲートした二次抗体を1:15,000の割合で希釈して用いた。検出は、ECL−PLUSウエスタンブロッティング検出キット(Amersham Pharmacia Biotec製)を用いた。用いた一次抗体は、p−AMPK(リン酸化AMPK)、p−Akt(リン酸化Akt)に対する抗体である(Cell Signaling Technology社)。抗チューブリン抗体(Oncogene社)は、タンパク量の内部標準としてチューブリン量を測定するために用いた。ここで、AMPKは、アディポネクチンシグナル伝達機構における中心的なメディエーターであり、アディポネクチン受容体が活性化されることにより、リン酸化されるタンパク質である。AMPKがリン酸化され、活性化されると、心肥大抑制、糖尿病性心筋症抑制、心筋梗塞抑制に働く心保護シグナルが活性化され(Am.J.Cardiovasc Dis 2012; 2(4): 253−366)、また、糖取り込みや、脂肪酸の燃焼を引き起こすシグナルが活性化されることが知られている(Nature Medicine 2002: Vol.8,1288−1295)。リン酸化されたAMPK(p−AMPK)は、さらにその下流のAktをリン酸化する。結果を図7に示す。図中左は、P−AMPK、P−Aktであり、右は、念のために、P−AMPKについて再度ウエスタンブロッティングを行った結果である。+はhMat2cc−gAdにより処理したものであり、−は未処理のものである。
hMat2cc−gAdにより処理したものは、p−AMPK及びp−Akt量がコントロールに比較して高まっており、分子改変体アディポネクチンにより、アディポネクチンシグナルが活性化していることが確認された。
<実施例8:ラット心筋細胞を用いたZZ−hMat2cc−gAd、hMat2cc−gAd−ZZ及びZZ−hMat2cc−gAd−ZZによるAMPK及びAkt活性作用の検討>
ラットの心筋細胞を用いて、実施例7と同様に、他の分子改変体アディポネクチンでも心保護シグナルが活性化されることを確認した。
ラットの心筋細胞を用いて、実施例7と同様に、他の分子改変体アディポネクチンでも心保護シグナルが活性化されることを確認した。
ZZ−hMat2cc−gAd、hMat2cc−gAd−ZZ及びZZ−hMat2cc−gAd−ZZにより、実施例7と同様にラットの心筋細胞を処理した。心筋細胞を溶解バッファー中にてホモジナイズし、30μg量のタンパク質を、10%ポリアクリルアミドゲルを用いて、変性条件下のSDS−PAGEにより分離した。電気泳動後、分離したタンパク質を膜に転写させ、ウェスタンブロット解析を行った。具体的には、一次抗体を1:1,000の割合で希釈し、HRPをコンジュゲートした二次抗体を1:15,000の割合で希釈し用いた。検出は、ECL−PLUSウエスタンブロッティング検出キット(Amersham Pharmacia Biotec製)を用いた。用いた一次抗体は、p−AMPK(リン酸化AMPK)、T−AMPK(全AMPK)、p−Akt(リン酸化Akt)、T−Akt(全Akt)に対する抗体である。抗チューブリン抗体(Oncogene社)は、タンパク質の内部標準としてチューブリン量を測定するために用いた。結果を図8に示す。右と左の写真は、念のために2回のウェスタンブロットを行ったものである。
分子改変体アディポネクチンは全て、p−AMPK及びp−Akt量がコントロールに比較して高まっており、分子改変体アディポネクチンにより、アディポネクチンシグナルが活性化していることが確認された。特に、ZZ−hMat2cc−gAdにおいて、AMPK及びAktの活性化が顕著であった。
<実施例9:ラット線維芽細胞を用いたZZ−hMat2cc−gAd、hMat2cc−gAd−ZZ及びZZ−hMat2cc−gAd−ZZによるAMPK及びAkt活性の検討>
ラット線維芽細胞でも、他の種の分子改変体アディポネクチンによりアディポネクチンシグナルが活性化されることを確認した。
ラット線維芽細胞でも、他の種の分子改変体アディポネクチンによりアディポネクチンシグナルが活性化されることを確認した。
ラット線維芽細胞を、10μm/mlの濃度のZZ−hMat2cc−gAd、hMat2cc−gAd−ZZ又はZZ−hMat2cc−gAd−ZZの分子改変体アディポネクチンにより18時間処理した。実施例8同様に、ウエスタンブロッティングによりp−AMPK(リン酸化AMPK)(Cell Signaling Technology社)、T−AMPK(全AMPK)(Cell Signaling Technology社)、p−Akt(リン酸化Akt)、T−Akt(全Akt)を検出した。結果を図9に示す。線維芽細胞でも、分子改変体アディポネクチンにより、アディポネクチンシグナルが活性化していることが確認された。特に、ZZ−hMat2cc−gAdにおいて、AMPK及びAktの活性化が顕著であった。
<実施例10:ラット心筋細胞を用いたhMat2cc−gAdによる抗アポトーシス効果の検討>
ラット心筋細胞が、hMat2cc−gAdにより、低酸素状態により引き起こされるアポトーシスが抑制されることを確認した。
ラット心筋細胞が、hMat2cc−gAdにより、低酸素状態により引き起こされるアポトーシスが抑制されることを確認した。
ラット心筋細胞を、無血清培地中にて酸素正常状態で48時間又は低酸素状態(<1%のO2及び5%のCO2、37℃)で12時間処理し、その後10μm/mlのhMat2cc−gAdの存在下又は非存在下の酸素条件下(<21%のO2及び5%のCO2、37℃)に24時間静置した。通常の方法に従い、TUNEL染色(緑)を行い、アポトーシスを起こした細胞を染色した。DAPI染色(青)により全ての死細胞を染色した。
TUNEL染色及びDAPI染色の結果の代表的な写真を図10の上段に示し、定量的に解析したTUNEL陽性のアポトーシスによる死細胞の割合を下段のグラフに示す。低酸素状態におけるTUNEL陽性細胞の割合、すなわち、アポトーシスによる死細胞の割合が、hMat2cc−gAd処理によりコントロールと比べて有意に減少し、hMat2cc−gAdが抗アポトーシス作用を奏することが示された。
<実施例11:ラット心筋細胞を用いたZZ−hMat2cc−gAd、hMat2cc−gAd−ZZ及びZZ−hMat2cc−gAd−ZZによる抗アポトーシス効果の検討>
ラット心筋細胞が、他の種の分子改変体アディポネクチンによっても、低酸素状態により引き起こされるアポトーシスが抑制されることを確認した。
ラット心筋細胞が、他の種の分子改変体アディポネクチンによっても、低酸素状態により引き起こされるアポトーシスが抑制されることを確認した。
実施例10同様に、ラット心筋細胞をZZ−hMat2cc−gAd、hMat2cc−gAd−ZZ又はZZ−hMat2cc−gAd−ZZにより処理して、アポトーシスによる死細胞の割合を計測した。
TUNEL染色の結果の代表的な写真を図11の上段に示し、定量的に解析したTUNEL陽性のアポトーシスによる死細胞の割合を下段のグラフに示す。低酸素状態におけるTUNEL陽性細胞の割合、すなわち、アポトーシスによる死細胞の割合が、他の種の分子改変体アディポネクチンによってもコントロールと比べて有意に減少し、他の種の分子改変体アディポネクチンが抗アポトーシス作用を奏することが示された。
<実施例12:ラット心筋細胞を用いたhMat2cc−gAdによる抗炎症効果(TNFα及びIL−1βのmRNA発現量の抑制)の検討>
心筋細胞の炎症が、hMat2cc−gAdにより抑制されることを確認した。心筋細胞は、リポポリサッカライド(LPS)による刺激を受けると、TNFα及びIL−1βを産生し、炎症を生じる。TNFα及びIL−1βのmRNA量に基づき、hMat2cc−gAdが炎症を抑制することを確認した。
心筋細胞の炎症が、hMat2cc−gAdにより抑制されることを確認した。心筋細胞は、リポポリサッカライド(LPS)による刺激を受けると、TNFα及びIL−1βを産生し、炎症を生じる。TNFα及びIL−1βのmRNA量に基づき、hMat2cc−gAdが炎症を抑制することを確認した。
ラット新生児心筋細胞(NRVM)を24ウェルの培養皿に250μl/ウェル(2.5×105細胞/ウェル)の濃度で播種した。10μm/mlの濃度のhMat2cc−gAdにより1時間処理した後、100ng/mlのLPSにより6時間処理して炎症性サイトカインであるTNFα及びIL−1βの発現を誘導した。RT−PCRにより、TNFα及びIL−1βのmRNA量を測定した。コントロールには、分子改変体アディポネクチンの代わりにPBSを使用した。結果を図12に示す。
hMat2cc−gAdにより、TNFα及びIL−1βのmRNA発現量がコントロールに比べて減少しており、炎症が抑制されたことが確認された。
このように、分子改変体アディポネクチンを用いた場合、10μg/mlの濃度で抗炎症効果が確認された。
一方で、天然のアディポネクチンでは、LPS刺激によるTNF−α産生を測定した場合、10μg/mlの濃度ではTNFα産生を抑制しなかったが、30μg/mlの濃度で抑制することが確認されている(Nature Medicine,11,1096−1103(2005))。これらのことから、本願発明の分子改変体アディポネクチンは、天然のアディポネクチンの約3分の1の濃度でも同等の効果を奏することが示された。
このように、分子改変体アディポネクチンを用いた場合、10μg/mlの濃度で抗炎症効果が確認された。
一方で、天然のアディポネクチンでは、LPS刺激によるTNF−α産生を測定した場合、10μg/mlの濃度ではTNFα産生を抑制しなかったが、30μg/mlの濃度で抑制することが確認されている(Nature Medicine,11,1096−1103(2005))。これらのことから、本願発明の分子改変体アディポネクチンは、天然のアディポネクチンの約3分の1の濃度でも同等の効果を奏することが示された。
<実施例13:ラット心筋細胞を用いた抗炎症効果(TNF抑制)の検討>
心筋細胞の炎症が、他の種の分子改変体アディポネクチンによっても抑制されることを確認した。
心筋細胞の炎症が、他の種の分子改変体アディポネクチンによっても抑制されることを確認した。
ラット新生児心筋細胞(NRVM)を24ウェルの培養皿に250μl/ウェル(2.5×105細胞/ウェル)の濃度で播種した。10μm/mlの濃度のZZ−hMat2cc−gAd、hMat2cc−gAd−ZZ又はZZ−hMat2cc−gAd−ZZにより1時間処理した後、100ng/mlのLPSにより6時間処理して炎症を誘導した。RT−PCRにより、TNFαのmRNA量を測定した。コントロールには、分子改変体アディポネクチンの代わりにPBSを使用した。結果を図13に示す。
ZZ−hMat2cc−gAd、hMat2cc−gAd−ZZ又はZZ−hMat2cc−gAd−ZZにより、TNFα発現量がコントロールに比べて減少しており、炎症が抑制されたことが確認された。
<実施例14:分子改変体アディポネクチン処理による虚血再灌流障害後の梗塞サイズの影響>
分子改変体アディポネクチンhMat2cc−gAdにより、虚血再灌流障害後の梗塞サイズが、野生型無処理マウスと比較して減少することを確認した。
分子改変体アディポネクチンhMat2cc−gAdにより、虚血再灌流障害後の梗塞サイズが、野生型無処理マウスと比較して減少することを確認した。
1.0μg/gの分子改変体アディポネクチンhMat2cc−gAdを複数のC57BL/6系統マウスの頚動脈内に投与した。コントロールのマウスには、PBSを投与した。
投与から30分後にLAD血管結紮を30分行い、続いて48時間再灌流した。LAD動脈を再縫合後、1mlの1.0%エバンスブルー(Sigma Chemilal Co.)を頸静脈から注入し、非梗塞組織を染色した。その後、心臓を取り出し、PBSにより洗浄後、横断面の切片を作成し、23℃にて5分間、1.0mlの1.5%の2,3,5−トリフェリニルテトラゾリンクロライド(Sigma Chemilal Co.)により染色し、梗塞領域を染色した。
図14中の写真は、虚血領域(AAR)を示すエバンスブルーと、梗塞領域(IA)を示す2,3,5−トリフェリニルテトラゾリンクロライドにより染色した後の心臓組織の写真を示す。青色の部分は、虚血の影響を受けていない、健康な心筋を表し、白色領域は、死んだ組織を表す。さらに、イメージJソフトウエアを用いて、コンピューター面積測定を行い、左室領域(LV)、虚血領域(AAR)、梗塞領域(IA)の面積を決定した。左室領域(LV)に対する虚血領域(AAR)の割合(AAR/LV)、虚血領域(AAR)に対する梗塞領域(IA)の割合(IA/AAR)、及び左室領域(LV)に対する梗塞領域(IA)の割合(IA/LV)を図14のグラフに示す。コントロールと比較して、hMat2cc−gAdを投与した群は、IA/AAR及びIA/LVが減少した。よって、hMat2cc−gAdが心筋梗塞縮小に有効であることが示された。
<実施例15:分子改変体アディポネクチン処理による虚血再灌流障害後の梗塞サイズの影響>
他の分子改変体アディポネクチンによっても、虚血再灌流障害後の梗塞サイズが減少することを確認した。
他の分子改変体アディポネクチンによっても、虚血再灌流障害後の梗塞サイズが減少することを確認した。
1.0μg/gのZZ−hMat2cc−gAd又はZZ−hMat2cc−gAd−ZZを、実施例14同様に投与した。コントロールのマウスには、PBSを投与した。
実施例14同様に、虚血再灌流障害の後、エバンスブルー染色及び2,3,5−トリフェリニルテトラゾリンクロライド染色を行い、虚血領域(AAR)、梗塞領域(IA)及び左室領域(LV)の面積を測定してグラフ化した。結果を図15に示す。コントロールと比較して、分子改変体アディポネクチンを投与した群は、IA/AAR及びIA/LVが減少した。よって、ZZ−hMat2cc−gAd又はZZ−hMat2cc−gAd−ZZが心筋梗塞縮小に有効であることが示された。
実施例14同様に、虚血再灌流障害の後、エバンスブルー染色及び2,3,5−トリフェリニルテトラゾリンクロライド染色を行い、虚血領域(AAR)、梗塞領域(IA)及び左室領域(LV)の面積を測定してグラフ化した。結果を図15に示す。コントロールと比較して、分子改変体アディポネクチンを投与した群は、IA/AAR及びIA/LVが減少した。よって、ZZ−hMat2cc−gAd又はZZ−hMat2cc−gAd−ZZが心筋梗塞縮小に有効であることが示された。
Claims (15)
- アディポネクチンのC末端側球状領域と、マトリリンのコイルドコイル領域とを含む、分子改変体アディポネクチン。
- マトリリンのコイルドコイル領域がN末端側に位置し、アディポネクチン球状領域がC末端側に位置する、請求項1に記載の分子改変体アディポネクチン。
- 少なくとも1つのスタフィロコッカスのプロテインAのZZドメインをさらに含む、請求項1又は2に記載の分子改変体アディポネクチン。
- プロテインAのZZドメインが、マトリリンのコイルドコイル領域のN末端側に位置する、請求項3に記載の分子改変体アディポネクチン。
- マトリリンがマトリリン−2である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の分子改変体アディポネクチン。
- 配列番号1のアミノ酸114〜244のアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号2のアミノ酸912〜952のアミノ酸配列からなるポリペプチド、及び、配列番号3のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む、請求項3又は4に記載のアディポネクチン。
- 配列番号5、7、9及び11から選択されるアミノ酸配列を含む請求項6に記載の分子改変体アディポネクチン。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載の分子改変体アディポネクチンの三量体。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載の分子改変体アディポネクチンをコードする核酸。
- 配列番号4、6、8及び10から選択される核酸配列を含む、請求項9に記載の核酸。
- 請求項9又は10に記載の核酸を含む、ベクター。
- 請求項9又は10に記載の核酸又は請求項11に記載のベクターを含む、宿主細胞。
- 薬学的有効量の請求項8に記載の改変型アディポネクチンの三量体と、製剤学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
- 動脈硬化症の治療又は予防のための請求項13に記載の医薬組成物。
- 動脈硬化症が、狭心症、心筋梗塞又は脳梗塞である、請求項14に記載の医薬組成物。
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