ES2264207T3

ES2264207T3 - Homonologos proteinicos especificos de adipocitos.

Info

Publication number: ES2264207T3
Application number: ES98934630T
Authority: ES
Inventors: Paul O. Sheppard
Original assignee: Zymogenetics Inc
Current assignee: Zymogenetics Inc
Priority date: 1997-07-18
Filing date: 1998-07-17
Publication date: 2006-12-16
Anticipated expiration: 2018-07-17
Also published as: US20020156243A1; AU743745B2; DE69834643D1; NO20000215D0; EP1002075B1; EP1002075A1; AU8411398A; KR100385868B1; IL134011A0; DK1002075T3; NO20000215L; DE69834643T2; HUP0003762A2; CN1201003C; US6518403B2; ATE327328T1; JP2001510045A; WO1999004000A1; BR9810917A; CN1272883A

Abstract

La presente invención se refiere a moléculas de polipnucleótidos y polipéptidos que codifican el polipéptido zsig37, un miembro de la familia de proteínas que poseen un dominio de tipo colágeno y un dominio globular. Los polipéptidos, y los polinucleótidos que los codifican, están implicados en la dimerización u oligomerización y pueden usarse en el estudio de este proceso. La presente invención incluye también anticuerpos contra los polipéptidos zsig37.

Description

Homólogos proteínicos específicos de adipocitos.

Antecedentes de la invención

El equilibrio energético (que implica el metabolismo energético, el estado nutricional, el almacenamiento de lípidos, y similares) es un criterio importante para la salud. Esta homeostasis energética implica la toma de alimentos y el metabolismo de carbohidratos y lípidos para generar la energía necesaria para funciones voluntarias e involuntarias. El metabolismo de proteínas puede conducir a la generación de energía, pero preferiblemente conduce a la formación o reparación de músculos. Entre otras consecuencias, una falta de homeostasis energética conduce a sobre- o sub-formación de tejido adiposo.

La formación y el almacenamiento de grasa están modulados por insulina. Por ejemplo, la insulina estimula el transporte de glucosa a las células, donde se metaboliza en \alpha-glicerofosfato que se usa en la esterificación de ácidos grasos para permitir el almacenamiento de los mismos como triglicéridos. Además, los adipocitos (células de la grasa) expresan una proteína de transporte específica que potencia la transferencia de ácidos grasos hacia los adipocitos.

Los adipocitos también secretan varias proteínas que se cree que modulan el control homeostático de glucosa y el metabolismo de los lípidos. Estas proteínas secretadas por adipocitos adicionales incluyen adipsina, factores del complemento C3 y B, factor de necrosis tumoral \alpha, el producto génico ob, y Acrp30. También existe una evidencia que sugiere la existencia de una ruta secretora regulada por insulina en los adipocitos. Scherer y otros, J. Biol. Chem. 270(45): 26746-9, 1995. La sobre- o sub-secreción de estos restos, influida en parte por la sobre- o sub-formación de tejido adi-
poso, puede conducir a estados patológicos asociados directamente o indirectamente con la obesidad o la anorexia.

Acrp30 es un polipéptido de 247 aminoácidos que es expresado exclusivamente por los adipocitos. El polipéptido Acrp30 está compuesto por una secuencia de señal amino-terminal, una extensión de 27 aminoácidos de homología no conocida, 22 repeticiones de colágeno Gly-Xaa-Pro perfectas o Gly-Xaa-Xaa imperfectas y un dominio globular carboxi-terminal. Véanse Scherer y otros, según se describe anteriormente, y la Solicitud de Patente Internacional Nº WO96/39429. Acrp30, una proteína del suero humano abundante regulada por insulina, comparte similitud estructural, particularmente en el dominio globular carboxi-terminal, con el factor del complemento Clq y con una proteína del suero estival de ardillas listadas siberianas en hibernación (Hib27). La expresión de Acrp30 se induce más de 100 veces durante la diferenciación de los adipocitos. Acrp30 se sugiere para usar para modular el equilibrio energético y para identificar adipocitos en muestras de prueba.

Otra proteína secretada que parece estar producida exclusivamente en los adipocitos es apM1, descrita, por ejemplo, en Maeda y otros, Biochem. Biophys. Res. Comm. 221: 286-9, 1996. Un clon de 4517 pb tenía un marco de lectura abierto de 244 aminoácidos y una región no traducida 3' larga. La proteína incluía una secuencia de señal, una secuencia no colagenosa amino-terminal, 22 repeticiones de colágeno (Gly-XAA-Pro o Gly-Xaa-Xaa) y una región carboxi-terminal con homología para colágeno X, colágeno VIII y proteína del complemento Clq.

El factor del complemento Clq consiste en seis copias de tres polipéptidos relacionados (cadenas A, B y C), teniendo cada polipéptido aproximadamente 225 aminoácidos de largo con un dominio de colágeno amino-terminal cercano y una región globular carboxi-terminal. Seis regiones helicoidales triples están formadas por los dominios de colágeno de las seis cadenas A, las seis cadenas B y las seis cadenas C, formando una región central y seis tallos. Una porción de cabeza globular se forma mediante la asociación del dominio carboxi-terminal globular de una cadena A, una B y una C. Clq está compuesto por lo tanto por seis cabezas globulares conectadas a través de seis tallos similares a colágeno a una región fibrilar central. Sellar y otros, Biochem. J. 274: 481-90, 1991. Esta configuración se denomina a menudo un
ramo de flores. Acrp30 tiene una estructura de ramo similar formada a partir de un solo tipo de cadena polipeptídica.

Se buscan moléculas capaces de modular la homeostasis energética para el estudio de este fenómeno y para la prevención o el tratamiento de desequilibrios. Además, también se buscan moléculas capaces de modular rutas secretoras de adipocitos como moduladores indirectos de la homeostasis energética y como reactivos de investigación.

La presente invención proporciona tales polipéptidos para estos y otros usos que deben ser evidentes para los expertos en la especialidad a partir de las presentes enseñanzas.

Sumario de la invención

Dentro de un aspecto, la invención proporciona un polipéptido aislado que comprende los residuos de aminoácidos 26 a 281 del Nº ID SEC: 2.

También se describe un polipéptido aislado que comprende una secuencia de residuos de aminoácido que es al menos 75% idéntica en la secuencia de aminoácidos a los residuos 26-281 del Nº ID SEC: 2, en donde dicha secuencia comprende: repeticiones Gly-Xaa-Xaa o Gly-Xaa-Pro que forman un dominio de colágeno, en donde Xaa es cualquier aminoácido; y una porción globular carboxi-terminal. También se describe un polipéptido al menos 90% idéntico en la secuencia de aminoácidos con los residuos 26-281 del Nº ID SEC: 2. También se describe un polipéptido al menos 90% idéntico en la secuencia de aminoácidos a los residuos 22-281 del Nº ID SEC: 2. Dentro de una modalidad de la invención, el polipéptido comprende los residuos 1-281 del Nº ID SEC: 2. También se describe un polipéptido que comprende el Nº ID SEC: 44. Dentro de otra modalidad, el polipéptido está conectado covalentemente de forma amino-terminal o carboxi-terminal a un resto seleccionado del grupo que consiste en etiquetas de afinidad, toxinas, radionucleótidos, enzimas y fluoróforos. Dentro de una modalidad relacionada, se proporciona además un sitio de segmentación proteolítica entre dicha secuencia de residuos de aminoácido y dicha etiqueta de afinidad.

También se describe un polipéptido aislado seleccionado del grupo que consiste en: a) un polipéptido que tiene una secuencia de residuos de aminoácido que es 75% idéntica en la secuencia de aminoácidos al residuo de aminoácido 99 hasta el residuo de aminoácido 140 del Nº ID SEC: 2; b) un polipéptido que tiene una secuencia de residuos de aminoácido que es 75% idéntica en la secuencia de aminoácidos al residuo de aminoácido 140 ó 141 hasta el residuo de aminoácido 281 del Nº ID SEC: 2; y c) un polipéptido que tiene una secuencia de residuos de aminoácido que es 75% idéntica en la secuencia de aminoácidos al residuo de aminoácido 99 hasta el 281 del Nº ID SEC: 2.

Dentro de otro aspecto se proporciona una proteína de fusión que comprende una primera porción y una segunda porción enlazadas por un enlace peptídico, en donde la primera porción comprende un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (a) los residuos de aminoácido 26 a 281 del Nº ID SEC: 2, (b) los residuos de aminoácido 22 a 281 del Nº ID SEC: 2 y (c) los residuos de aminoácido 1 a 281 del Nº ID SEC: 2, y en donde la segunda porción comprende otro polipéptido.

También se describe una proteína de fusión que consiste esencialmente en una primera porción y una segunda porción enlazadas por un enlace peptídico, comprendiendo dicha primera porción un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en: a) un polipéptido que comprende una secuencia de residuos de aminoácido que es al menos 75% idéntica en la secuencia de aminoácidos al residuo de aminoácido 26 hasta el residuo de aminoácido 281 del Nº ID SEC: 2; b) un polipéptido que comprende una secuencia de residuos de aminoácido como la mostrada en el Nº ID SEC: 2 desde el residuo de aminoácido 1, 22 ó 26 hasta el residuo de aminoácido 281; c) un polipéptido que comprende una secuencia de residuos de aminoácido como la mostrada en el Nº ID SEC: 44 desde el residuo de aminoácido 1, 22 ó 26 hasta el residuo de aminoácido 281; d) una porción del polipéptido zsig37 como la mostrada en el Nº ID SEC: 2 o el Nº ID SEC: 44, que contiene el dominio similar a colágeno o una porción del dominio similar a colágeno capaz de dimerización u oligomerización; e) una porción del polipéptido zsig37 como la mostrada en el Nº ID SEC: 2 o el Nº ID SEC: 44, que contiene el dominio globularoide o una porción activa del dominio globularoide; o f) una porción del polipéptido zsig37 como la mostrada en el Nº ID SEC: 2 o el Nº ID SEC: 44 que incluye el dominio similar a colágeno y el dominio globular; y comprendiendo dicha segunda porción otro polipéptido. También se describe una proteína de fusión en la que la primera porción se selecciona del grupo que consiste en: a) un polipéptido que tiene la secuencia del residuo de aminoácido 99 hasta el residuo de aminoácido 140 del Nº ID SEC: 2 o el Nº ID SEC: 44; b) un polipéptido que tiene la secuencia del residuo de aminoácido 140 ó 141 hasta el residuo de aminoácido 281 del Nº ID SEC: 2 o el Nº ID SEC:
44; c) un polipéptido que tiene la secuencia del residuo de aminoácido 99 a 281 del Nº ID SEC: 2 o el Nº ID SEC: 44.

También se describe una proteína de fusión que comprende una secuencia de señal secretora que tiene la secuencia de aminoácidos de los residuos de aminoácido 1-21 ó 1-25 del Nº ID SEC: 2 o el Nº ID SEC: 44, en donde dicha secuencia de señal secretora está conectada operablemente a un polipéptido adicional.

Dentro de un aspecto adicional se proporciona un vector de expresión que comprende los siguientes elementos conectados operablemente:

: un promotor de la transcripción;

: un segmento de DNA que codifica un polipéptido que comprende los residuos de aminoácido 26 a 281 del Nº ID SEC: 2; y

: un terminador de la transcripción.

También se describe un vector de expresión que comprende los siguientes elementos conectados operablemente: un promotor de la transcripción; un segmento de DNA que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de residuos de aminoácido que es al menos 75% idéntica en la secuencia de aminoácidos a los residuos 26-281 del Nº ID SEC: 2, en donde dicha secuencia comprende: repeticiones Gly-Xaa-Xaa o Gly-Xaa-Pro que forman un dominio de colágeno, en donde Xaa es cualquier aminoácido; y una porción globular carboxi-teminal; y un terminador de la transcripción. También se describe un segmento de DNA que codifica un polipéptido que es al menos 90% idéntico en la secuencia de aminoácidos a los residuos 26-281 del Nº ID SEC: 2. También se describe un segmento de DNA que codifica un polipéptido que es al menos 90% idéntico en la secuencia de aminoácidos a los residuos 22-281 del Nº ID SEC: 2. Dentro de una modalidad de la invención, el segmento de DNA codifica un polipéptido que comprende los residuos 1-281 del Nº ID SEC: 2. Dentro de otra modalidad más, el segmento de DNA codifica un polipéptido conectado covalentemente de forma amino-terminal o carboxi-terminal una etiqueta de afinidad. Dentro de una modalidad adicional, el segmento de DNA codifica además una secuencia de señal secretora conectada operablemente a dicho polipéptido. También se describe una secuencia de señal secretora que comprende los residuos 1-21 ó 1-25 del Nº ID SEC: 2 o el Nº ID SEC: 44.

Dentro de otro aspecto se proporciona una célula cultivada en la que se ha introducido un vector de expresión que comprende los siguientes elementos conectados operablemente: un promotor de la transcripción; un segmento de DNA que codifica un polipéptido que comprende los residuos de aminoácido 26 a 281 del Nº ID SEC: 2; y un terminador de la transcripción, en donde la célula expresa el polipéptido codificado por el segmento de DNA.

También se describe una célula cultivada en la que se ha introducido un vector de expresión que comprende los siguientes elementos conectados operablemente: un promotor de la transcripción; un segmento de DNA que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de residuos de aminoácido que es al menos 75% idéntica en la secuencia de aminoácidos a los residuos 26-281 del Nº ID SEC: 2, en donde dicha secuencia comprende: repeticiones Gly-Xaa-Xaa o Gly-Xaa-Pro que forman un dominio de colágeno, en donde Xaa es cualquier aminoácido; y una porción globular carboxi-terminal; y un terminador de la transcripción, en donde dicha célula expresa dicho polipéptido codificado por dicho segmento de DNA.

Dentro de otro aspecto más se proporciona un método para producir un polipéptido, que comprende cultivar una célula en la que se ha introducido un vector de expresión que comprende los siguientes elementos conectados operablemente: un promotor de la transcripción; un segmento de DNA que codifica un polipéptido que comprende los residuos de aminoácido 26 a 281 del Nº ID SEC: 2; y un terminador de la transcripción; con lo que la célula expresa el polipéptido codificado por el segmento de DNA; y recuperar el polipéptido expresado.

También se describe un método para producir un polipéptido, que comprende: cultivar una célula en la que se ha introducido un vector de expresión que comprende los siguientes elementos conectados operablemente: un promotor de la transcripción; un segmento de DNA que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de residuos de aminoácido que es al menos 75% idéntica en la secuencia de aminoácidos a los residuos 26-281 del Nº ID SEC: 2, en donde dicha secuencia comprende: repeticiones Gly-Xaa-Xaa o Gly-Xaa-Pro que forman un dominio de colágeno, en donde Xaa es cualquier aminoácido; y una porción globular carboxi-terminal; y un terminador de la transcripción; con lo que dicha célula expresa dicho polipéptido codificado por dicho segmento de DNA; y recuperar dicho polipéptido expresado.

Dentro de otro aspecto se proporciona una composición farmacéutica que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y un polipéptido que comprende los residuos de aminoácido 26 a 281 del Nº ID SEC: 2.

También se describe una composición farmacéutica que comprende un polipéptido, comprendiendo dicho polipéptido una secuencia de residuos de aminoácido que es al menos 75% idéntica en la secuencia de aminoácidos a los residuos 26-281 del Nº ID SEC: 2, en donde dicha secuencia comprende: repeticiones Gly-Xaa-Xaa o Gly-Xaa-Pro que forman un dominio de colágeno, en donde Xaa es cualquier aminoácido; y una porción globular carboxi-terminal; en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Dentro de otro aspecto más se proporciona un anticuerpo que se une a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en los residuos de aminoácido 26 a 281 del Nº ID SEC: 2.

Otro aspecto proporciona un fragmento de anticuerpo que se une a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en los residuos de aminoácido 26 a 281 del Nº ID SEC: 2.

También se describe un anticuerpo que se une específicamente a un epítopo de un polipéptido que comprende una secuencia de residuos de aminoácido que es al menos 75% idéntica en la secuencia de aminoácidos a los residuos 26-281 del Nº ID SEC: 2, en donde dicha secuencia comprende: repeticiones Gly-Xaa-Xaa o Gly-Xaa-Pro que forman un dominio de colágeno, en donde Xaa es cualquier aminoácido; y una porción globular carboxi-terminal.

También se describe una proteína de unión que se une específicamente a un epítopo de un polipéptido que comprende una secuencia de residuos de aminoácido que es al menos 75% idéntica en la secuencia de aminoácidos a los residuos 26-281 del Nº ID SEC: 2, en donde dicha secuencia comprende: repeticiones Gly-Xaa-Xaa o Gly-Xaa-Pro que forman un dominio de colágeno, en donde Xaa es cualquier aminoácido; y una porción globular carboxi-terminal.

Dentro de otro aspecto se proporciona un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que comprende los residuos de aminoácido 26 a 281 del Nº ID SEC: 2.

Un aspecto relacionado proporciona un polinucleótido aislado que comprende los nucleótidos 246 a 1013 del Nº ID SEC: 1.

También se describe un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de residuos de aminoácido que es al menos 75% idéntica en la secuencia de aminoácidos a los residuos 26-281 del Nº ID SEC: 2, en donde dicha secuencia comprende: repeticiones Gly-Xaa-Xaa o Gly-Xaa-Pro que forman un dominio de colágeno, en donde Xaa es cualquier aminoácido; y una porción globular carboxi-terminal. También se describe un polipéptido al menos 90% idéntico en la secuencia de aminoácidos a los residuos 26-281 del Nº ID SEC: 2. También se describe un polipéptido al menos 90% idéntico en la secuencia de aminoácidos a los residuos 22-281 del Nº ID SEC: 2. Dentro de otra modalidad, el polipéptido comprende los residuos 1-281 del Nº ID SEC: 2. También se describe un polipéptido que comprende el Nº ID SEC: 44. Dentro de otra modalidad el polinucleótido es DNA.

También se describe un polinucleótido aislado seleccionado del grupo que consiste en: a) una secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 465 hasta el nucleótido 688 del Nº ID SEC: 1; b) una secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 688 hasta el nucleótido 1016 del Nº ID SEC: 1; c) una secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 691 hasta el nucleótido 1016 del Nº ID SEC: 1; d) una secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 465 hasta el nucleótido 1016 del Nº ID SEC: 1; e) una secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 364 hasta el nucleótido 490 del Nº ID SEC: 43; f) una secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 490 hasta el nucleótido 912 del Nº ID SEC: 43; g) una secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 364 hasta el nucleótido 912 del Nº ID SEC: 43; h) una secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 364 hasta el nucleótido 490 del Nº ID SEC: 43; i) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de residuos de aminoácido que es al menos 75% idéntica en la secuencia de aminoácidos al residuo de aminoácido 99, 140 ó 141 hasta el residuo de aminoácido 281 del Nº ID SEC: 2; j) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de residuos de aminoácido que es al menos 75% idéntica en la secuencia de aminoácidos al residuo de aminoácido 99 hasta el residuo de aminoácido 140 del Nº ID SEC: 2; k) secuencias de nucleótidos complementarias a a), b), c), d), e), f), g), h), i) o j), y l) secuencias de nucleótidos degeneradas de a), b), c), d), e), f), g), h), i), j) o k).

Dentro de otro aspecto se proporciona un polinucleótido aislado que codifica una proteína de fusión que comprende una primera porción y una segunda porción enlazadas por un enlace peptídico, en donde la primera porción comprende un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (a) los residuos de aminoácidos 26 a 281 del Nº ID SEC: 1, (b) los residuos de aminoácido 22 a 281 del Nº ID SEC: 2 y (c) los residuos de aminoácido 1 a 281 del Nº ID SEC: 2, y en donde la segunda porción comprende otro polipéptido.

También se describe un polinucleótido aislado que codifica una proteína de fusión que consiste esencialmente en una primera porción y una segunda porción enlazadas por un enlace peptídico, dicha primera porción se selecciona del grupo que consiste en: a) un polipéptido que comprende una secuencia de residuos de aminoácido que es al menos 75% idéntica en la secuencia de aminoácidos al residuo de aminoácido 26 hasta el residuo de aminoácido 281 del Nº ID SEC: 2; b) un polipéptido que comprende una secuencia de residuos de aminoácido como la mostrada en el Nº ID SEC: 2 desde el residuo de aminoácido 1, 22 ó 26 hasta el residuo de aminoácido 281; c) un polipéptido que comprende una secuencia de residuos de aminoácido como la mostrada en el Nº ID SEC: 44 desde el residuo de aminoácido 1, 22 ó 26 hasta el residuo de aminoácido 281; d) una porción del polipéptido zsig37 como la mostrada en el Nº ID SEC: 2 o el Nº ID SEC: 44, que contiene el dominio similar a colágeno o una porción del dominio similar a colágeno capaz de dimerización u oligomerización; e) una porción del polipéptido zsig37 como la mostrada en el Nº ID SEC: 2 o el Nº ID SEC: 44, que contiene el dominio globularoide o una porción activa del dominio globularoide; o f) una porción del polipéptido zsig37 como la mostrada en el Nº ID SEC: 2 o el Nº ID SEC: 44 que incluye el dominio similar a colágeno y el dominio globular; y comprendiendo dicha segunda porción otro
polipéptido.

También se describe un polipéptido aislado que codifica una proteína de fusión que comprende una secuencia de señal secretora que tiene la secuencia de aminoácidos de los residuos de aminoácido 1-21 ó 1-25 del Nº ID SEC: 2 o el Nº ID SEC: 44, en donde dicha secuencia de señal secretora está conectada operablemente a un polipéptido adicional.

También se describe una sonda o un cebador oligonucleotídicos que comprenden al menos 14 nucleótidos contiguos de un polinucleótido del Nº ID SEC: 23 o una secuencia complementaria al Nº ID SEC: 23.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 ilustra un alineamiento múltiple de y el polipéptido zsig37 de la presente invención y HUMUPST2_1 (Maeda y otros, Biochem. Biophys. Res. Comm. 221(2): 286-9, 1996); C1QA_HUMAN (Sellar y otros, Biochem. J. 274: 481-90, 1991, Reid, Biochem. J. 179: 367-71, 1979 y Reid y otros, Biochem. J. 203: 559-69, 1982); HP25_TAMAS (Takamatsu y otros, Mol. Cell. Biol. 13: 1516-21, 1993 y Kondo & Kondo, J. Biol. Chem. 267: 473-8, 1992); HP27_TAMAS (Takamatsu y otros y Kondo & Kondo referido anteriormente) y CERL_RAT (Wada & Ohtani, Brain Res. Mol. Brain Res. 9: 71-7, 1991).

La Figura 2 es una matriz que muestra el porcentaje de identidad de aminoácidos en una comparación de las seis proteínas mostradas en el alineamiento múltiple de la Fig. 1.

Descripción detallada de la invención

Antes de indicar la invención con detalle, puede ser útil para la comprensión de la misma definir los siguientes términos.

El término "etiqueta de afinidad" se usa aquí para indicar un segmento de péptido que puede estar empalmarse a un polipéptido para proporcionar la purificación o la detección del polipéptido o proporcionar sitios para el empalme del polipéptido a un substrato. En principio, cualquier péptido o proteína para los que está disponible un anticuerpo u otro agente de unión específico puede usarse como una etiqueta de afinidad. Etiquetas de afinidad incluyen una región de polihistidina, proteína A (Nilsson y otros, EMBO J. 4:1075, 1985; Nilsson y otros, Methods Enzymol. 198:3, 1991), glutationa S transferasa (Smith y Johnson, Gene 67:31, 1988), substancia P, péptido Flag™ (Hopp y otros, Biotechnology 6:1204-1210, 1988; disponible de Eastman Kodak Co., New Haven, CT), péptido de unión a estraptividina u otro epítopo o dominio de unión antigénico. Véase, en general, Ford y otros, Protein Expression and Purification 2: 95-107, 1991. DNAs que codifican etiquetas de afinidad están disponibles de suministradores comerciales (por ejemplo, Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).

El término "variante alélica" indica cualquiera de dos o más formas alternativas de un gen que ocupa el mismo locus cromosómico. La variación alélica surge naturalmente a través de mutación, y puede dar como resultado polimorfismo fenotípico dentro de poblaciones. Las mutaciones génicas pueden ser silenciosas (sin cambio en el polipéptido modificado) o pueden codificar polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos alterada. El término variante alélica también se usa aquí para indicar una proteína codificada por una variante alélica de un gen.

Los términos "amino-terminal" y "carboxilo-terminal" se usan aquí para indicar posiciones dentro de polipéptidos y proteínas. Cuando el contexto lo permite, estos términos se usan con referencia a una secuencia o porción particular de un polipéptido o una proteína para indicar proximidad o posición relativa. Por ejemplo, una cierta secuencia situada carboxilo-terminal a una secuencia de referencia dentro de una proteína está situada próxima al extremo carboxilo de la secuencia de referencia, pero no está necesariamente en el extremo carboxilo de la proteína completa.

El término "par complemento/anticomplemento" indica restos no idénticos que forman un par estable asociado no covalentemente bajo condiciones apropiadas. Por ejemplo, la biotina y la avidina (o la estreptavidina) son miembros prototípicos de un par complemento/anticomplemento. Otros pares complemento/anticomplemento ejemplares incluyen pares receptor-ligando, pares anticuerpo/antígeno (o hapteno o epítopo), pares polinucleótido sentido/antisentido, y similares. Cuando es deseable la disociación subsiguiente del par complemento/anticomplemento, el par complemento/anticomplemento tiene preferiblemente una afinidad de unión de <10^{9} M^{-1}.

El término "complementos de una molécula polinucleotídica" es una molécula polinucleotídica que tiene una secuencia de bases complementaria y una orientación inversa en comparación con una secuencia de referencia. Por ejemplo la secuencia 5' ATGCACGGG 3' es complementaria a 5' CCCGTGCAT 3'.

El término "contiguo" indica un polinucleótido que tiene una extensión contigua de secuencia idéntica o complementaria a otro polinucleótido. Se dice que las secuencias contiguas se "solapan" una extensión dada de secuencia polinucleotídica en su totalidad o a lo largo de una extensión parcial del polinucleótido. Por ejemplo, contiguos representativos para la secuencia polinucleotídica 5'-ATGGCTTAGCTT-3' son 5'-TAGCTTgagtct-3' y 3'-gtcgacTACC
GA-5'.

El término "secuencia de nucleótidos degenerada" indica una secuencia de nucleótidos que incluye uno o más codones degenerados (en comparación con una molécula polinucleotídica de referencia que codifica un polipéptido). Los codones degenerados contienen diferentes tripletes de nucleótidos, pero codifican el mismo residuo de aminoácido (es decir, los tripletes GAU y GAC codifican cada uno Asp).

El término "vector de expresión" indica una molécula de DNA, lineal o circular, que comprende un segmento que codifica un polipéptido de interés conectado operablemente a segmentos adicionales que proporcionan su transcripción. Tales segmentos adicionales pueden incluir secuencias promotoras y terminadoras y opcionalmente pueden incluir uno o más orígenes de replicación, uno o más marcadores seleccionables, un potenciador, una señal de poliadenilación y similares. Los vectores de expresión se derivan generalmente de DNA plasmídico o viral, o pueden contener elementos de ambos.

El término "aislado", cuando se aplica a un polinucleótido, indica que el polinucleótido se ha retirado de su medio genético natural y está así libre de otras secuencias codificantes extrañas o no deseadas, y está en una forma adecuada para usar dentro de sistemas de producción de proteínas genéticamente manipuladas. Tales moléculas aisladas son las que se separan de su ambiente natural e incluyen clones de cDNA y genómicos. Las moléculas de DNA aisladas de la presente invención están libres de otros genes con los que están asociadas habitualmente, pero pueden incluir regiones no traducidas 5' y 3' presentes en la naturaleza que son promotores y terminadores. La identificación de regiones asociadas será evidente para un experto normal en la especialidad (véase, por ejemplo, Dynan y Tijan, Nature 316:774-78, 1985).

Un polipéptido o una proteína "aislado" es un polipéptido o una proteína que se encuentra en una condición distinta a la de su ambiente natural, tal como separado de sangre y tejido animal. En una forma preferida, el polipéptido aislado está substancialmente libre de otros polipéptidos, particularmente otros polipéptidos de origen animal. Se prefiere proporcionar los polipéptidos en una forma altamente purificada, es decir más de 95% puros, más preferiblemente más de 99% puros. Cuando se usa en este contexto, el término "aislado" no excluye la presencia del mismo polipéptido en formas físicas alternativas, tales como dímeros o formas alternativamente glicosiladas o derivadas.

El término "conectados operablemente", cuando se refiere a segmentos de DNA, indica que los segmentos están dispuestos de modo que funcionan de acuerdo con sus propósitos pretendidos, por ejemplo la transcripción se inicia en el promotor y avanza a través del segmento codificante hasta el terminador.

El término "ortólogo" indica un polipéptido o una proteína obtenido a partir de una especie que es el homólogo funcional de un polipéptido o una proteína procedente de una especie diferente. Las diferencias de secuencia entre ortólogos son el resultado de la especiación.

"Parálogos" son proteínas distintas pero estructuralmente relacionadas elaboradas por un organismo. Se cree que los parálogos surgen a través de duplicación génica. Por ejemplo, la \alpha-globina, la \beta-globina y la mioglobina son parálogos entre sí.

El término "polinucleótido" indica un polímero de una sola hebra o de doble hebra de bases desoxirribonucleotídicas o ribonucleotídicas leídas desde el extremo 5' hacia el 3'. Los polinucleótidos incluyen RNA y DNA, y pueden aislarse de fuentes naturales, sintetizarse in vitro o prepararse a partir de una combinación de moléculas naturales y sintéticas. Los tamaños de los polinucleótidos se expresan como pares de bases (abreviado "pb"), nucleótidos ("nt") o kilobases ("kb"). Cuando el contexto lo permite, los dos últimos términos pueden describir polinucleótidos que son de una sola hebra o de doble hebra. Cuando el término se aplica a moléculas de doble hebra, se usa para indicar longitud global y se entenderá que es equivalente al término "pares de bases". Será reconocido por los expertos en la especialidad que las dos hebras de un polinucleótido de doble hebra pueden diferir ligeramente en la longitud y que los extremos de las mismas pueden estar escalonados como resultado de la segmentación enzimática; así todos los nucleótidos dentro de una molécula polinucleotídica de doble hebra pueden no estar apareados. Tales extremos desapareados en general no superarán 20 nt de longitud.

Un "polipéptido" es un polímero de residuos de aminoácido enlazados por enlaces peptídicos, ya se produzcan naturalmente o sintéticamente. Los polipéptidos de menos de aproximadamente 10 residuos de aminoácido se denominan comúnmente "péptidos".

"Las sondas y/o los cebadores", según se usa aquí, pueden ser RNA o DNA. El DNA puede ser cDNA o DNA genómico. Las sondas y los cebadores polinucleotídicos son DNA o RNA de una sola hebra o de doble hebra, generalmente oligonucleótidos sintéticos, pero pueden generarse a partir de cDNA o secuencias genómicas clonados o sus complementos. Las sondas analíticas generalmente tendrán al menos 20 nucleótidos de longitud, aunque pueden usarse sondas algo más cortas (14-17 nucleótidos). Los cebadores de PCR tienen al menos 5 nucleótidos de longitud, preferiblemente 15 nt o más, más preferiblemente 20-30 nt. Pueden usarse polinucleótidos cortos cuando una pequeña región del gen se elige para el análisis. Para el análisis en bruto de genes, una sonda polinucleotídica puede comprender un exón entero o más. Las sondas pueden someterse a trazado para proporcionar una señal detectable, tal como con una enzima, biotina, un radionúclido, un fluoróforo, un quimioluminiscente, una partícula paramagnética y similares, que están disponibles comercialmente de muchas fuentes, tales como Molecular Probes, Inc., Eugene, OR y Amersham Corp., Arlington Heights, IL, usando técnicas que son bien conocidas en la especialidad.

El término "promotor" indica una porción de un gen que contiene secuencias de DNA que proporcionan la unión de RNA polimerasa y la iniciación de la transcripción. Las secuencias promotoras se encuentran comúnmente, pero no siempre, en las regiones no codificantes 5' de los genes.

El término "receptor" indica una proteína asociada a la célula que se une a una molécula bioactiva (es decir, un ligando) y media en el efecto del ligando sobre la célula. Los receptores unidos a la membrana se caracterizan por una estructura multidominial que comprende un dominio de unión a ligando extracelular y un dominio efector intracelular que típicamente está implicado en la transducción de la señal. La unión del ligando al receptor da como resultado un cambio de conformación en el receptor que provoca una interacción entre el dominio efector y otra molécula o moléculas de la célula. Esta interacción conduce a su vez a una alteración en el metabolismo de la célula. Episodios metabólicos que están conectados a interacciones receptor-ligando incluyen transcripción génica, fosforilación, desfosforilación, incremento en la producción de AMP cíclico, movilización de calcio celular, movilización de lípidos de la membrana, adhesión celular, hidrólisis de lípidos de inositol e hidrólisis de fosfolípidos. La mayoría de los receptores nucleares también exhibe una estructura multidominial, incluyendo un dominio transactivador aminoterminal, un dominio de unión a DNA y un dominio de unión al ligando. En general, los receptores pueden estar unidos a la membrana, ser citosólicos o nucleares; monómeros (por ejemplo, receptor de hormona estimulante del tiroides, receptor \beta-adrenérgico) o multímeros (por ejemplo, receptor de PDGF, receptor de hormona del crecimiento, receptor de IL-3, receptor de GM-CSF, receptor de G-CSF, receptor de eritropoyetina y receptor de IL-6).

El término "secuencia de señal secretora" indica una secuencia de DNA que codifica un polipéptido (un "péptido secretor") que, como un componente de un polipéptido mayor, dirige al polipéptido mayor a través de una ruta secretora de una célula en la que se sintetiza. El péptido mayor se segmenta comúnmente para retirar el péptido secretor durante el tránsito a través de la ruta secretora.

Un "receptor soluble" es un polipéptido receptor que no está unido a una membrana celular. Los receptores solubles son lo más comúnmente péptidos receptores que se unen a ligando que carecen de dominios de transmembrana y citoplásmicos. Los receptores solubles pueden comprender residuos de aminoácido adicionales, tales como etiquetas de afinidad que proporcionan la purificación del polipéptido o proporcionan sitios para el enlace del péptido a un substrato, o secuencias de regiones constantes de inmunoglobulina. Muchos receptores de la superficie celular tienen homólogos solubles presentes en la naturaleza que son producidos mediante proteolisis o traducidos a partir de mRNAs alternativamente reparados. Se dice que los polipéptido receptores están substancialmente libres de segmentos polipeptídicos de transmembrana e intracelulares cuando carecen de proteínas suficientes de estos segmentos para proporcionar anclaje a la membrana o transducción de señal, respectivamente.

El término "variante de reparación" se usa aquí para indicar formas alternativas de RNA transcrito a partir de un gen. La variación por reparación surge naturalmente a través del uso de sitios de reparación alternativos dentro de una molécula de RNA transcrita, o menos comúnmente entre moléculas de RNA transcritas separadamente, y puede dar como resultado varios mRNAs transcritos a partir del mismo gen. Las variantes de reparación pueden codificar polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos alterada. El término variante de reparación también se usa aquí para indicar una proteína codificada por una variante de reparación de un mRNA transcrito a partir de un gen.

Se entenderá que los pesos moleculares y las longitudes de los polímeros determinados mediante métodos analíticos imprecisos (por ejemplo, electroforesis en gel) serán valores aproximados. Cuando tal valor se exprese como "alrededor de" X o "aproximadamente" X, se entenderá que el valor de X indicado es exacto hasta \pm10%.

La presente invención se basa en parte en el descubrimiento de una nueva secuencia de DNA que codifica un polipéptido que tiene homología con una proteína relacionada con el complemento de adipocitos (Acrp30). Véase, por ejemplo, Scherer y otros, J. Biol. Chem. 270(45): 26746-9, 1995. El polipéptido Acrp30 se muestra en el Nº ID SEC: 3. Acrp30 parece estar muy relacionado con apM1 de ser humano (HUMUPST2_1 en las Figs. 1 y 2), con las diferencias más significativas observadas en la secuencia secretora.

La nueva secuencia de DNA codifica un polipéptido que tiene una secuencia de señal aminoterminal, una región N-terminal adyacente de ausencia de homología, un dominio de colágeno truncado compuesto por las repeticiones Gly-Xaa-Xaa o Gly-Xaa-Pro y una porción globular carboxi-terminal. La nueva secuencia polinucleotídica también contiene una región no traducida 3' larga. La estructura del polipéptido general indicada anteriormente es compartida por Acrp30 y HUMUPST2_1, excepto que el dominio similar a colágeno de cada una de estas proteínas es más largo que el de los polipéptidos zsig37. Además, la secuencia de DNA de HUMUPST2_1 se caracteriza por una región no traducida 3' larga. Por otra parte, Acrp30 y todas las secuencias alineadas en la Fig. 1, con la excepción de CERL_RAT, comparten un residuo de cisteína conservado en la posición 187 del polipéptido zsig37 según se muestra en la Fig. 1 y el Nº ID SEC: 2. Otras regiones de homología, encontradas en la porción globular carboxi-terminal en las proteínas alineadas, se identifican aquí como cebadores útiles para buscar otros miembros de la familia. Acrp30, por ejemplo, se identificaría en una búsqueda usando los cebadores. Además, los polipéptidos zsig37 de la presente invención incluyen un sitio de glicosilación conectado a N putativo en el aminoácido 93 (Asn) del Nº ID SEC: 2.

El análisis de la distribución tisular del mRNA correspondiente a este nuevo DNA usando una sonda de 30 bases (Nº ID SEC: 4) mostraba que la expresión era la más alta en corazón y placenta, con señales relativamente menos intensas en el riñón, el ovario, la glándula suprarrenal y el músculo esquelético y señales inferiores en una amplia variedad de otros tejidos presentes en la transferencia Northern. El polipéptido se ha denominado polipéptido zsig37.

Los nuevos polipéptidos zsig37 de la presente invención se identificaron inicialmente consultando una base de datos de EST con respecto a secuencias de señal secretoras, caracterizadas por un sitio de iniciación de metionina aguas arriba, una región hidrófoba de aproximadamente 13 aminoácidos y un sitio de segmentación, en un esfuerzo para seleccionar proteínas secretadas. Los polipéptidos correspondientes a ESTs que cumplen esos criterios de búsqueda se compararon con secuencias conocidas para identificar proteínas secretadas que tienen homología con ligandos conocidos. Se descubrió una sola secuencia de EST y se predijo que era una proteína secretada. El nuevo polipéptido codificado por el cDNA de longitud completa permite la identificación de una relación homóloga con proteína relacionada con el complemento de adipocitos Acrp30 (Nº ID SEC: 30) y proteína secretada por adipocitos apM1 (HUMUPST2_1 en las Figs. 1 y 2). También se identificó una homología algo más distante con la cadena A del componente del complemento C1Q, dos factores observados en el estado activo de marmotas siberianas en hibernación (HP25_TAMAS y HP27_TAMAS) y una proteína de cerebro de rata (CERL_RAT), según se muestra en las Figs. 1 y 2.

La secuencia completa del polipéptido zsig37 se obtuvo de un solo clon que se creía que la contenía, en donde el clon se obtuvo de una biblioteca de tejido tumoral de cerebro. Otras bibliotecas que podrían también investigarse con respecto a tales clones incluyen corazón, placenta, riñón, ovario, glándula suprarrenal, músculo esquelético, tejido adiposo y similares.

La secuencia de nucleótidos de la EST N-terminal se describe en el Nº ID SEC: 1 y su secuencia de aminoácidos deducida se describe en el Nº ID SEC: 2. Según se describe de forma general anteriormente, el polipéptido zsig37 incluye una secuencia de señal, que varía del aminoácido 1 (Met) hasta el residuo de aminoácido 21 (Gly). Una secuencia de señal alternativa varía del aminoácido 1 (Met) al aminoácido 25 (Ser). El polipéptido maduro varía por lo tanto desde el aminoácido 22 (Leu) o 26 (Arg) hasta el aminoácido 281 (Pro). Dentro del polipéptido maduro, se encuentra una región N-terminal de falta de homología conocida, que varía entre el residuo de aminoácido 22 (Leu) y 98 (Lys). Además, un dominio de colágeno truncado se encuentra entre el aminoácido 99 (Gly) y 140 (Arg). En el dominio de colágeno truncado, se observan 1 repetición Gly-Xaa-Pro perfecta y 13 Gly-Xaa-Xaa imperfectas. En contraste, Acrp30 contiene 22 repeticiones perfectas o imperfectas. El polipéptido zsig37 también incluye un dominio globular carboxi-terminal, que varía desde alrededor del aminoácido 141 (Cys) hasta el 281 (Pro). El polipéptido zsig37, HUMUPST2_1 y Acrp30 parecen ser homólogos dentro del dominio de colágeno y en el dominio globular, pero no en la porción N-terminal del polipéptido maduro.

También se describen fragmentos del polipéptido zsig37. Los fragmentos incluyen el dominio similar a colágeno de polipéptidos zsig37, que varía desde el aminoácido 99 (Gly) hasta el aminoácido 140 (Arg) del Nº ID SEC: 2, una porción del polipéptido zsig37 que contiene el dominio similar a colágeno o una porción del dominio similar a colágeno capaz de dimerización u oligomerización. Estos fragmentos son particularmente útiles en el estudio de la dimerización u oligomerización de colágeno o en la formación de proteínas de fusión como las descritas más a fondo posteriormente. También se describen polinucleótidos que codifican tales fragmentos, incluyendo el grupo que consiste en (a) moléculas polinucleotídicas que comprenden una secuencia de nucleótidos como la mostrada en la Nº ID SEC: 1 desde el nucleótido 1, 171, 234, 246 ó 465 hasta el nucleótido 589; (b) moléculas polinucleotídicas que codifican un fragmento de polipéptido zsig37 que son al menos 80% idénticas a la secuencia de aminoácidos del Nº ID SEC: 2 desde el residuo de aminoácido 99 (Gly) hasta el residuo de aminoácido 140 (Arg); (c) moléculas complementarias a (a) o (b); y (d) secuencias de nucleótidos degeneradas que codifican un fragmento de dominio similar a colágeno del polipéptido zsig37.

Otros fragmentos incluyen el dominio globular de polipéptidos zsig37, que varía desde el aminoácido 140 (Arg) o 141 (Cys) hasta 281 (Pro) del Nº ID SEC: 2, una porción del polipéptido zsig37 que contiene el dominio globularoide o una porción activa del dominio globularoide. Estos fragmentos son particularmente útiles en el estudio o la modulación del equilibrio energético o la neurotransmisión, particularmente la neurotransmisión relacionada con la dieta o el estrés. También puede estar presente actividad antimicrobiana en tales fragmentos. También se describen polinucleótidos que codifican tales fragmentos, incluyendo el grupo que consiste en (a) moléculas polinucleotídicas que comprenden una secuencia de nucleótidos como la mostrada en el Nº ID SEC: 1 desde el nucleótido 587 ó 590 hasta el nucleótido 1016; (b) moléculas polinucleotídicas que codifican un fragmento de polipéptido zsig37 que es al menos 80% idéntico con la secuencia de aminoácidos del Nº ID SEC: 2 desde el residuo de aminoácido 141 (Cys) hasta el residuo de aminoácido 281 (Pro); (c) moléculas complementarias a (a) o (b); y (d) secuencias de nucleótidos degeneradas que codifican un fragmento de dominio globular del polipéptido zsig37.

Otro fragmento del polipéptido zsig37 descrito aquí incluye tanto el dominio similar a colágeno como el dominio globular que varía desde el residuo de aminoácido 99 (Gly) hasta el 281 (Pro) del Nº ID SEC: 2. También se describen polinucleótidos que codifican tales fragmentos, incluyendo el grupo que consiste en (a) moléculas polinucleotídicas que comprenden una secuencia de nucleótidos como la mostrada en el Nº ID SEC: 1 desde el nucleótido 465 hasta el nucleótido 1016; (b) moléculas polinucleotídicas que codifican un fragmento del polipéptido zsig37 que es al menos aproximadamente 80% idéntico a la secuencia de aminoácidos del Nº ID SEC: 2 desde el residuo de aminoácido 99 (Gly) hasta el residuo de aminoácido 281 (Pro); (c) moléculas complementarias a (a) o (b); y (f) secuencias de nucleótidos degeneradas que codifican un fragmento de dominio similar a colágeno-dominio globular del polipéptido zsig37.

También se describen sondas degeneradas basadas en los polinucleótidos descritos anteriormente. También se describen sondas correspondientes a complementos de los polinucleótidos indicados anteriormente.

La presente invención también proporciona moléculas polinucleotídicas, incluyendo moléculas de DNA y RNA, que codifican los polipéptidos zsig37 descritos aquí. Los expertos en la especialidad reconocerán fácilmente que, en vista de la degeneración del código genético, es posible una variación de secuencia considerable entre estas moléculas polinucleotídicas. El Nº ID SEC: 3 es una secuencia de DNA degenerada que abarca todos los DNAs que codifican el polipéptido zsig37 del Nº ID SEC: 2. Los expertos en la especialidad reconocerán que la secuencia degenerada del Nº ID SEC: 23 también proporciona todas las secuencias de RNA que codifican el Nº ID SEC: 2 substituyendo T (timina) por U (uracilo). Así, la invención se refiere a polinucleótidos que codifican polipéptidos zsig37 que comprenden del nucleótido 1 hasta el nucleótido 842 del Nº ID SEC: 23 y sus equivalentes de RNA. La Tabla 1 indica lo códigos de una letra usados dentro del Nº ID SEC: 23 para indicar posiciones de nucleótidos degeneradas. Las "resoluciones" son los nucleótidos indicados por una letra del código. "Complemento" indica el código para el nucleótido o los nucleótidos complementarios. Por ejemplo, el código Y indica C (citosina) o T, y su complemento R indica A (adenina) o G (guanina), siendo A complementaria de T y siendo G complementaria de C.

TABLA 1

Nucleótido	Resolución	Complemento	Resolución
A	A	T	T
C	C	G	G
G	G	C	C
T	T	A	A
R	A\|G	Y	C\|T
Y	C\|T	R	A\|G
M	A\|C	K	G\|T
K	G\|T	M	A\|C
S	C\|G	S	C\|G
W	A\|T	W	A\|T
H	A\|C\|T	D	A\|G\|T
B	C\|G\|T	V	A\|C\|G
V	A\|C\|G	B	C\|G\|T
D	A\|G\|T	H	A\|C\|T
N	A\|C\|G\|T	N	A\|C\|G\|T

Los codones degenerados usados en el Nº ID SEC: 23 que abarcan todos los posibles codones posibles para un aminoácido dado se indican en la Tabla 2.

TABLA 2

Aminoácido	Código de	Codones	Codón
	una Letra		Degenerado
Cys	C	TGC TGT	TGY
Ser	S	AGC AGT TCA TCC TCG TCT	WSN
Thr	T	ACA ACC ACG ACT	ACN
Pro	P	CCA CCC CCG CCT	CCN
Ala	A	GCA GCC GCG GCT	GCN
Gly	G	GGA GGC GGG GGT	GGN
Asn	N	AA AAT	AAT
Asp	D	GAC GAT	GAY
Glu	E	GAA GAG	GAR
Gln	Q	CAA CAG	CAR
His	H	CAC CAT	CAY
Arg	R	AGA AGG CGA CGC CGG CGT	MGN
Lys	K	AAA AAG	AAR
Met	M	ATG	ATG
Ile	I	ATA ATC ATT	ATH
Leu	L	CTA CTC CTG CTT TTA TTG	YTN
Val	V	GTA GTC GTG GTT	GTN
Phe	F	TTC TTT	TTY
Tyr	Y	TAC TAT	TAY
Trp	W	TGG	TGG
Ter		TAA TAG TGA	TRR
Asn\|Asp	B		RAY
Glu\|Gln	Z		SAR
Any	X		NNN

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Un experto normal en la especialidad apreciará que se introduce alguna ambigüedad al determinar un codón degenerado, representativo de todos los codones posibles que codifican cada aminoácido. Por ejemplo, el codón degenerado para la serina (WSN) puede, en algunas circunstancias, codificar arginina (AGR), y el codón degenerado para arginina (MGN) puede, en algunas circunstancias, codificar serina (AGY). Existe una relación similar entre codones que codifican fenilalanina y leucina. Así, algunos polinucleótidos abarcados por la secuencia degenerada pueden codificar secuencias de aminoácidos variantes, pero un experto normal en la especialidad puede identificar fácilmente tales secuencias variantes mediante referencia a la secuencia de aminoácidos del Nº ID SEC: 2. Las secuencias variantes pueden probarse fácilmente con respecto a la funcionalidad según se describe aquí.

Un experto normal en la especialidad también apreciará que diferentes especies pueden exhibir "utilización de codones preferentes". En general, véanse Grantham y otros, Nuc. Acids Res. 8:1893-912, 1980; Haas y otros, Curr. Biol. 6:315-24, 1996; Wain-Hobson y otros, Gene 13:355-64, 1981; Grosjean y Fiers, Gene 18:199-209, 1982; Holm, Nuc. Acids Res. 14:3075-87, 1986; Ikemura, J. Mol. Biol. 158:573-97, 1982. Según se usa aquí, el término "utilización de codones preferentes" o "codones preferentes" es un término de la especialidad que se refiere a codones de traducción de proteínas que se usan lo más frecuentemente en células de una cierta especie, favoreciendo así a uno o unos pocos representantes de los posibles codones que codifican cada aminoácido (véase la Tabla 2). Por ejemplo, el aminoácido treonina (Thr) puede ser codificado por ACA, ACC, ACG o ACT, pero en las células de mamífero ACC es el codón más comúnmente usado; en otras especies, por ejemplo células de insecto, levadura, virus o bacterias, pueden ser preferentes codones de Thr diferentes. Codones preferentes para una especie particular pueden introducirse en los polinucleótidos de la presente invención mediante una variedad de métodos conocidos en la especialidad. La introducción de secuencias de codones preferentes en DNA recombinante, por ejemplo, puede potenciar la producción de la proteína haciendo la traducción de proteína más eficaz dentro de un tipo de célula o especie particular. Por lo tanto, la secuencia del codón degenerado descrita en el Nº ID SEC: 23 sirve como una plantilla para optimizar la expresión de polinucleótidos en diversos tipos de células y especies usados comúnmente en la especialidad y descritos aquí. Las secuencias que contienen codones preferentes pueden probarse y optimizarse con respecto a la expresión en diversas especies, y probarse con respecto a la funcionalidad según se describe aquí.

Los fragmentos de zsig37 pueden evaluarse con respecto a sus propiedades antimicrobianas de acuerdo con procedimientos conocidos en la especialidad. Véanse, por ejemplo, Barsum y otros, Eur. Respir. J. 8(5): 709-14, 1995; Sandovsky-Losica y otros, J. Med. Vet. Mycol (England) 28(4): 279-87, 1990; Mehentee y otros, J. Gen. Microbiol (England) 135 (Pt. 8): 2181-8, 1989; Segal y Savage, Journal of Medical and Veterinary Mycology 24: 477-479, 1986 y similares. Si se desea, el comportamiento del fragmento del polipéptido zsig37 a este respecto puede compararse con proteínas que se sabe que son funcionales a este respecto, tales como proteínas ricas en prolina, lisozima, histatinas, lactoperoxidasa o similares. Además, los fragmentos del polipéptido zsig37 pueden evaluarse en combinación con uno o más agentes antimicrobianos para identificar efectos sinérgicos. Un experto normal en la especialidad reconocerá que las propiedades antimicrobianas de polipéptidos zsig37, proteínas de fusión, agonistas, antagonistas y anticuerpos pueden evaluarse de forma similar.

Como neurotransmisores o moduladores de la neurotransmisión, fragmentos de polipéptido zsig37 así como polipéptidos zsig37, proteínas de fusión, agonistas, antagonistas o anticuerpos de la presente invención también pueden modular la concentración de ion calcio, la contracción muscular, la secreción de hormonas, la síntesis de DNA o el crecimiento celular, la renovación de fosfato de inositol, la liberación de araquidonato, la activación de fosfolipasa C, el vaciado gástrico, la activación de neutrófilos humanos o la capacidad de ADCC, la producción de anión superóxido y similares. La evaluación de estas propiedades puede efectuarse mediante métodos conocidos, tales como los indicados aquí.

El impacto del polipéptido zsig37, el fragmento, la fusión, el agonista o el antagonista sobre el nivel de calcio intracelular puede determinarse mediante métodos conocidos en la especialidad, tales como los descritos por Dobrzanski y otros, Regulatory Peptides 45: 341-52, 1993, y similares. El impacto del polipéptido zsig37, el fragmento, la fusión, el agonista o el antagonista sobre la contracción muscular puede determinarse mediante métodos conocidos en la especialidad, tales como los descritos por Smits & Lebebvre, J. Auton. Pharmacol. 14: 383-92, 1994, Belloli y otros, J. Vet. Pharmacol. Therap. 17: 379-83, 1994, Maggi y otros, Regulatory Peptides 53: 259-74, 1994, y similares. El impacto del polipéptido zsig37, el fragmento, la fusión, el agonista o el antagonista sobre la secreción de hormonas puede determinarse mediante métodos conocidos en la especialidad, tales como aquellos para la liberación de prolactina descritos por Henriksen y otros, J. of Receptor & Signal Transduction Research 15(1-4): 529-41, 1995, y similares. El impacto del polipéptido zsig37, el fragmento, la fusión, el agonista o el antagonista sobre la síntesis de DNA o el crecimiento celular puede determinarse mediante métodos conocidos en la especialidad, tales como los descritos por Dobrzanski y otros, Regulatory Peptides 45: 341-52, 1993, y similares. El impacto del polipéptido zsig37, el fragmento, la fusión, el agonista o el antagonista sobre la renovación de fosfato de inositol puede determinarse mediante métodos conocidos en la especialidad, tales como los descritos por Dobrzanski y otros, Regulatory Peptides 45: 341-52, 1993, y similares.

Además, el impacto del polipéptido zsig37, el fragmento, la fusión, el agonista o el antagonista sobre la liberación de araquidonato puede determinarse mediante métodos conocidos en la especialidad, tales como los descritos por Dobrzanski y otros, Regulatory Peptides 45: 341-52, 1993, y similares. El impacto del polipéptido zsig37, el fragmento, la fusión, el agonista o el antagonista sobre la activación de fosfolipasa C puede determinarse mediante métodos conocidos en la especialidad, tales como aquellos descritos por Dobrzanski y otros, Regulatory Peptides 45: 341-52, 1993, y similares. El impacto del polipéptido zsig37, el fragmento, la fusión, el agonista o el antagonista sobre el vaciado gástrico puede determinarse mediante métodos conocidos en la especialidad, tales como aquellos descritos por Varga y otros, Eur. J. Pharmacol. 286: 109-112, 1995, y similares. El impacto del polipéptido zsig37, el fragmento, la fusión, el agonista o el antagonista sobre la activación de neutrófilos humanos y la capacidad de ADCC puede determinarse mediante métodos conocidos en la especialidad, tales como los descritos por Wozniak y otros, Immunology 78: 629-34, 1993, y similares. El impacto del polipéptido zsig37, el fragmento, la fusión, el agonista o el antagonista sobre la producción de anión superóxido puede determinarse mediante métodos conocidos en la especialidad, tales como los descritos por Wozniak y otros, Immunology 78: 629-34, 1993, y similares.

La presente invención también proporciona proteínas de fusión de zsig37. También se describen proteínas de fusión que abarcan (1) un polipéptido seleccionado del grupo que comprende: (a) moléculas polipeptídicas que comprenden una secuencia de residuos de aminoácido como la mostrada en el Nº ID SEC: 2 desde el residuo de aminoácido 1 (Met), 22 (Leu) o 26 (Arg) hasta el residuo de aminoácido 281 (Pro); (b) moléculas polipeptídicas que varían desde el aminoácido 99 (Gly) hasta el aminoácido 140 (Arg) del Nº ID SEC: 2, una porción del polipéptido zsig37 que contiene el dominio similar a colágeno o una porción del dominio similar a colágeno capaz de dimerización u oligomerización; (c) moléculas polipeptídicas que varían desde el aminoácido 140 (Arg) o 141 (Cys) hasta el 281 (Pro) del Nº ID SEC: 2, una porción del polipéptido zsig37 que contiene el dominio globularoide o una porción activa del dominio globularoide; o (d) moléculas polipeptídicas que varían desde el aminoácido 99 (Gly) hasta el 281 (Pro), una porción del polipéptido zsig37 que incluye el dominio similar a colágeno y el dominio globular, y (2) otro polipéptido. El otro polipéptido puede ser un dominio globular alternativo adicional, un dominio similar a colágeno alternativo o adicional, un péptido de señal para facilitar la secreción de la proteína de fusión o similar. El dominio globular del complemento se une a IgG, así, el dominio globular del polipéptido zsig37, el fragmento o la fusión puede tener un papel
similar.

Los polipéptidos zsig37, que varían desde el aminoácido 1 (Met) hasta el aminoácido 281 (Pro); los polipéptidos zsig37 maduros alternativos, que varían desde el aminoácido 22 (Leu) o el aminoácido 26 (Arg) hasta el aminoácido 281 (Pro) o los fragmentos líderes de secreción alternativos de los mismos, fragmentos que varían desde el aminoácido 1 (Met) hasta el aminoácido 21 (Gly) o el aminoácido 25 (Ser), pueden usarse en el estudio de la secreción de proteínas desde células. En modalidades preferidas de este aspecto de la presente invención, los polipéptidos maduros se forman como proteínas de fusión con secuencias de señal secretoras putativas; plásmidos que tienen regiones reguladoras capaces de dirigir la expresión de la proteína de fusión se introducen en células de prueba; y se verifica la secreción de proteína madura. En otras modalidades preferidas de este aspecto de la presente invención, los fragmentos líderes de secreción alternativos se forman como proteínas de fusión con proteínas alternativas seleccionadas para la secreción; plásmidos que tienen regiones reguladoras capaces de dirigir la expresión de la proteína de fusión se introducen en células de prueba; y se verifica la secreción de la proteína. La verificación puede realizarse mediante técnicas conocidas en la especialidad, tales como HPLC y similares.

Los aminoácidos altamente conservados, particularmente aquellos en el dominio globular carboxi-terminal del polipéptido zsig37, pueden usarse como una herramienta para identificar nuevos miembros de la familia. Por ejemplo, la transcripción inversa-reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) puede usarse para amplificar secuencias que codifican los motivos conservados a partir de DNA obtenido de una variedad de fuentes tisulares. En particular, cebadores altamente degenerados diseñados a partir de secuencias conservadas son útiles para este propósito. En particular, los siguientes cebadores son útiles para este propósito:

1): Aminoácidos 269-274 del Nº ID SEC: 2 (correspondientes a los nucleótidos 975-992 del Nº ID SEC: 1);

2): Aminoácidos 191-196 del Nº ID SEC: 2 (correspondientes a los nucleótidos 741-758 del Nº ID SEC: 1);

3): Aminoácidos 163-168 del Nº ID SEC: 2 (correspondientes a los nucleótidos 657-674 del Nº ID SEC: 1);

4): Aminoácidos 173-178 del Nº ID SEC: 2 (correspondientes a los nucleótidos 687-704 del Nº ID SEC: 1); y

5): Aminoácidos 243-248 del Nº ID SEC: 2 (correspondientes a los nucleótidos 897-914 del Nº ID SEC: 1).

También se describen sondas degeneradas basadas en los polinucleótidos descritos anteriormente. También se abarcan sondas correspondientes a complementos de los polinucleótidos indicados anteriormente.

También se describen polinucleótidos aislados que se hibridarán a regiones de tamaño similar de los Nº ID SEC: 2, Nº ID SEC: 4, Nº ID SEC: 5, Nº ID SEC: 6, Nº ID SEC: 7, Nº ID SEC: 8, Nº ID SEC: 9, Nº ID SEC: 10, Nº ID SEC: 11, Nº ID SEC: 12, Nº ID SEC: 13, Nº ID SEC: 14, Nº ID SEC: 15, Nº ID SEC: 16, Nº ID SEC: 17, Nº ID SEC: 18, Nº ID SEC: 19, Nº ID SEC: 20 o una secuencia complementaria a las mismas, bajo condiciones restrictivas. En general, las condiciones restrictivas se seleccionan para ser aproximadamente 5ºC inferiores que el punto de fusión térmico (T_{m}) para la secuencia específica a una intensidad iónica y un pH definidos. El T_{m} es la temperatura (bajo intensidad iónica y pH definidos) a la que 50% de la secuencia diana se hibrida a una sonda perfectamente coincidente. Condiciones restrictivas típicas son aquellas en las que la concentración de sal es hasta aproximadamente 0,03 M a pH 7 y la temperatura es al menos aproximadamente 60ºC.

La presente invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende polipéptido zsig37 purificado en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Esta composición farmacéutica se usará para modular el equilibrio energético en mamíferos o para proteger las células endoteliales de una lesión.

Con respecto a modular el equilibrio energético, los polipéptido zsig37 modulan reacciones metabólicas celulares. Tales reacciones metabólicas incluyen adipogénesis, gluconeogénesis, glicogenolisis, lipogénesis, captación de glucosa, síntesis de proteínas, termogénesis, utilización de oxígeno y similares. El patrón de expresión del polipéptido zsig37 indica la expresión en tejidos de células endoteliales. Con respecto a la protección de células endoteliales, el polipéptido zsig37 puede usarse en la conservación de órganos, para crioconservación, para un pretratamiento quirúrgico para evitar la lesión debida a isquemia y/o inflamación o en procedimientos similares. La expresión del polipéptido zsig37 en el corazón sugiere que la proteína puede modular la liberación de acetilcolina y/o norepinefrina. Los polipéptidos zsig37 también encuentran uso como neurotransmisores o como moduladores de la neurotransmisión, según se indica por la expresión del polipéptido en tejidos asociados con el sistema nervioso simpático o parasimpático. A este respecto, los polipéptidos zsig37 pueden encontrar utilidad para modular la captación de nutrientes, según se demuestra, por ejemplo, por la captación de 2-desoxiglucosa en el cerebro o similares.

Entre otros métodos conocidos en la especialidad descritos aquí, el equilibrio energético de un mamífero puede evaluarse verificando una o más de las siguientes funciones metabólicas: adipogénesis, gluconeogénesis, glicogenolisis, lipogénesis, captación de glucosa, síntesis de proteínas, termogénesis, utilización de oxígeno o similares.

Estas funciones metabólicas se verifican mediante técnicas (ensayos o modelos animales) conocidas por un experto normal en la especialidad, como se indica más a fondo posteriormente. Por ejemplo, los efectos glucorreguladores de insulina son ejercidos predominantemente en el hígado, el músculo esquelético y el tejido adiposo. La insulina se une a su receptor celular en estos tres tejidos e inicia acciones específicas de los tejidos que dan como resultado, por ejemplo, la inhibición de la producción de glucosa y la estimulación de la utilización de glucosa. En el hígado, la insulina estimula la captación de glucosa e inhibe la gluconeogénesis y la glicogenolisis. En el músculo esquelético y el tejido adiposo, la insulina actúa para estimular la captación, el almacenamiento y la utilización de glucosa.

Existen métodos reconocidos en la especialidad para verificar todas las funciones metabólicas citadas anteriormente. Así, un experto normal en la especialidad puede evaluar polipéptidos zsig37, fragmentos, proteínas de fusión, anticuerpos, agonistas y antagonistas con respecto a funciones moduladoras metabólicas. Técnicas moduladoras ejemplares se indican posteriormente.

La adipogénesis, la gluconeogénesis y la glicogenolisis son componentes interrelacionados del equilibrio energético de mamíferos, que pueden evaluarse mediante técnicas conocidas usando, por ejemplo, ratones ob/ob o ratones db/db. Los ratones ob/ob son ratones endógamos que son homocigóticos para una mutación inactivante en el locus ob (obesidad). Tales ratones ob/ob son hiperfágicos e hipometabólicos, y se cree que son deficientes en la producción de proteína OB circulante. Los ratones db/db son ratones endógamos que son homocigóticos para una mutación inactivante en el locus db (diabetes). Los ratones db/db presentan un fenotipo similar al de ratones ob/ob, excepto que los ratones db/db también presentan un fenotipo diabético. Se cree que tales ratones db/db son resistentes a los efectos de proteína OB circulante. Además, se conocen en la especialidad diversos métodos in vitro para determinar estos parámetros.

La lipogénesis estimulada por insulina, por ejemplo, puede verificarse midiendo la incorporación de ^{14}C-acetato en triglicérido (Mackall y otros, J. Biol. Chem. 251:6462-6464, 1976) o la acumulación de triglicérido (Kletzien y otros, Mol. Pharmacol. 41:393-398, 1992).

La captación de glucosa puede evaluarse, por ejemplo, en un ensayo para el transporte de glucosa estimulado por insulina. Miotubos L6 diferenciados no transfectados (mantenidos en ausencia de G418) se ponen en DMEM que contiene 1 g/l de glucosa, BSA al 0,5 ó 1,0%, Hepes 20 mM y glutamina 2 mM. Después de dos a cinco horas de cultivo, el medio se reemplaza por DMEM libre de glucosa reciente que contiene 0,5 ó 1,0% de BSA, Hepes 20 mM, piruvato 1 mM y glutamina 2 mM. Se añaden las concentraciones apropiadas de insulina o IFG-1, o una serie de dilución de la substancia de prueba, y las células se incuban durante 20-30 minutos. Se añade desoxiglucosa sometida a trazado con ^{3}H o ^{14}C hasta una concentración final 1M, y las células se incuban durante aproximadamente 10-30 minutos. Las células se enjuagan a continuación rápidamente con tampón frío (por ejemplo, PBS), a continuación se someten a lisis con un agente de lisis adecuado (por ejemplo, SDS al 1% o NaOH 1 N). El lisado celular se evalúa a continuación contando en un contador de centelleo. La radiactividad asociada a las células se toma como una medida del transporte de glucosa después de substraer la unión no específica según se determina incubando células en presencia de citocolasina b, un inhibidor del transporte de glucosa. Otros métodos incluyen los descritos por, por ejemplo, Manchester y otros, Am. J. Physiol. 266 (Endocrinol. Metab. 29):E326-E333, 1994 (transporte de glucosa estimulado por insulina).

La síntesis de proteínas puede evaluarse, por ejemplo, comparando la precipitación de proteínas etiquetadas con ^{35}S-metionina después de la incubación de las células de prueba con ^{35}S-metionina y ^{35}S-metionina y un modulador putativo de la síntesis de proteína.

La termogénesis puede evaluarse según se describe por B. Stanley en The Biology of Neuropeptide Y and Related Peptides, W. Colmers y C. Wahlestedt (eds.), Humana Press, Ottawa, 1993, pp. 457-509; C. Billington y otros, Am. J. Physiol. 260:R321, 1991; N. Zarjevski y otros, Endocrinology 133:1753, 1993; C. Billington y otros, Am. J. Physiol. 266:R1765, 1994; Heller y otros, Am. J. Physiol. 252(4 Pt 2): R661-7, 1987; y Heller y otros, Am. J. Physiol. 245(3): R321-8, 1983. Además, la tasa metabólica, que puede medirse mediante una variedad de técnicas, es una medida indirecta de la termogénesis.

La utilización de oxígeno puede evaluarse según se describe por Heller y otros, Pflusers Arch 369(1): 55-9, 1977. Este método también implicaba un análisis de la temperatura hipotalámica y la producción térmica metabólica. La utilización de oxígeno y la termorregulación también se han evaluado en seres humanos según se describe por Haskell y otros, J. Appl. Physiol. 51(4): 948-54, 1981.

Entre otros métodos conocidos en la especialidad descritos, la protección de tejido de células endoteliales de mamífero puede evaluarse verificando la función del tejido endotelial. Por ejemplo, la función del corazón (aorta) puede evaluarse verificando la liberación de acetilcolina, la liberación de norepinefrina o parámetros similares. Estos parámetros se verifican mediante técnicas (ensayos o modelos animales) conocidas por un experto normal en la especialidad, como se indica más a fondo posteriormente.

La liberación de acetilcolina y norepinefrina puede verificarse mediante HPLC. Levy, Electrophysiology of the Sinoatrial and Atrioventricular Nodes, Alan R. Liss, Inc., 187-197, 1998, describen la medida de norepinefrina en efluentes del seno coronario. Además, puede marcarse eléctricamente el ritmo de los animales, con los resultados verificados según se describe por Elsner, European Heart Journal 16 (Suplemento N) 52-8, 1995 y Reiffel y Keuhnert, PACE 17 (Parte 1):349-65, 1994.

Entre los métodos conocidos en la especialidad o descritos aquí, las funciones de neurotransmisión pueden evaluarse verificando la captación de 2-desoxiglucosa en el cerebro. Este parámetro se verifica mediante técnicas (ensayos o modelos animales) conocidos para un experto normal en la especialidad, por ejemplo autorradiografía. Técnicas de verificación útiles son descritas, por ejemplo, Kilduff y otros, J. Neurosci. 10 2463-75, 1990, con técnicas relacionadas usadas para evaluar el "corazón en hibernación", según se describe en Gerber y otros, Circulation 94(4): 651-8, 1996 y Fallavollita y otros, Circulation 95(7): 1900-1909, 1997.

Además, los polipéptidos zsig37, los fragmentos, las fusiones, los agonistas o los antagonistas de los mismos pueden ser terapéuticamente útiles para aplicaciones antimicrobianas o moduladas por neurotransmisores. Por ejemplo, el componente del complemento C1q representa un papel en la defensa del huésped contra agentes infecciosos, tales como bacterias y virus. Se sabe que C1q exhibe varias funciones especializadas. Por ejemplo, C1q pone en marcha la cascada de un complemento a través de interacción con anticuerpo unido o proteína C-reactiva (CRP). Además, C1q interactúa directamente con ciertas bacterias, virus de RNA, micoplasma, cristales de ácido úrico, el componente lípido A de endotoxina bacteriana y membranas de ciertos orgánulos intracelulares. Se cree que la unión de C1q al receptor de C1q promueve la fagocitosis. C1q también parece mejorar el aspecto de formación de anticuerpos del sistema de defensa del huésped. Véase, por ejemplo, Johnston, Pediatr. Infect. Dis. J. 12(11): 933-41, 1993. Así, las moléculas similares a C1q solubles pueden ser útiles como agentes antimicrobianos, promoviendo la lisis o la fagocitosis de agentes infecciosos.

Los polipéptidos zsig37 de la presente invención también exhiben homología con restos que se cree que modulan la neurotransmisión. Según se muestra en la Fig. 1, los polipéptidos zsig37 son homólogos a las siguientes proteínas: HP25_TAMAS (Takamatsu y otros, Mol. Cell. Biol. 13: 1516-21, 1993 y Kondo & Kondo, J. Biol. Chem. 267: 473-8, 1992); HP27_TAMAS (Takamatsu y otros y Kondo & Kondo referido anteriormente) y CERL_RAT (Wada & Ohtani, Brain Res. Mol. Brain Res. 9: 71-7, 1991). HP25 y HP27 son polipéptidos encontrados en el suero activo (estival) de marmotas siberianas en hibernación. CERL está presente en el cerebelo de rata. Así, los polipéptidos zsig37, los fragmentos, las fusiones, los agonistas o los antagonistas pueden ser útiles para modular la neurotransmisión mediante, por ejemplo, la unión a neurotransmisores o receptores para los mismos.

El mapeo de híbridos de radiación es una técnica genética de células somáticas desarrollada para construir mapas contiguos de alta resolución de cromosomas de mamífero (Cox y otros, Science 250:245-250, 1990). El conocimiento parcial o total de una secuencia de un gen permite el diseño de cebadores de PCR adecuados para usar con paneles de mapeo de híbridos de radiación cromosómicos. Están disponibles paneles de mapeo de híbridos de radiación disponibles comercialmente que cubren todo el genoma humano, tales como the Stanford G3 RH Panel y the GeneBridge 4 RH Panel (Research Genetics, Inc., Huntsville, AL). Estos paneles permiten las localizaciones cromosómicas basadas en PCR rápidas y la ordenación de genes, sitios con secuencia etiquetada (STSs) y otros marcadores no polimórficos y polimóricos dentro una región de interés. Esto incluye establecer distancias físicas directamente proporcionales entre genes de interés nuevamente descubiertos y marcadores previamente mapeados. El conocimiento preciso de una posición de un gen puede ser útil de un número de modos incluyendo: 1) determinar si una secuencia es parte de un contiguo existente y obtener secuencias genéticas circundantes adicionales en diversas formas tales como clones YAC-,
BAC- o de cDNA, 2) proporcionar un posible gen candidato para una enfermedad hereditaria que muestra conexión a la misma región cromosómica, y 3) para organismos modélicos de referencia cruzada tales como ratón, que pueden ser beneficiosos para ayudar a determinar qué función podría tener un gen particular.

Los resultados mostraban que el gen que codifica el polipéptido zsig37 se mapeaba hasta el cromosoma 17 humano, región 17q25.2, mediante PCR usando the NIGMS Human/Rodent Somatic Cell Hybrid Mapping Panel Number 2 (National Institute of General Medical Sciences, Coriell Institute of Medical Research).

También se describen reactivos que encontrarán uso en aplicaciones diagnósticas. Por ejemplo, el gen zsig37, una sonda que comprende DNA o RNA de zsig37, o una subsecuencia del mismo, puede usarse para determinar si el gen zsig37 está presente en el cromosoma 17 o si se ha producido una mutación. Aberraciones cromosómicas detectables en el locus del gen zsig37 incluyen, pero no se limitan a, aneuploidía, cambios en el número de copias del gen, inserciones, deleciones, cambios en los sitios de restricción y transposiciones. Estas aberraciones pueden producirse dentro de la secuencia de codifcación, dentro de intrones o dentro de secuencias de flanqueo, incluyendo regiones promotoras y reguladoras aguas arriba, y pueden manifestarse como alteraciones físicas dentro de una secuencia de codificación o cambios en el nivel de expresión génica.

En general, estos métodos diagnósticos comprenden las etapas de (a) obtener una muestra genética de un paciente; (b) incubar la muestra genética con una sonda o un cebador polinucleotídicos según se describe anteriormente, bajo condiciones en las que el polinucleótido se hibridará a una secuencia polinucleotídica complementaria, para producir un primer producto de reacción; y (c) comparar el primer producto de reacción con un producto de reacción de control. Una diferencia entre el primer producto de reacción y el producto de reacción de control es indicativa de una anormalidad genética en el paciente. Muestras genéticas para usar dentro de la presente invención incluyen DNA, cDNA y RNA genómicos. La sonda o el cebador polinucleótido puede ser RNA o DNA, y comprenderá una porción del Nº ID SEC: 1, el complemento del Nº ID SEC: 1 o un equivalente de RNA del mismo. Métodos de ensayo adecuados a este respecto incluyen técnicas genéticas moleculares conocidas por los expertos en la especialidad, tales como análisis de polimorfismo de la longitud de fragmentos de restricción (RFLP), análisis de repetición en tándem corta (STR) empleando técnicas de PCR, reacción en cadena de ligación (Barany, PCR Methods and Applications 1:5-16, 1991), ensayos de protección de ribonucleasas y otras técnicas de análisis de conexión genética conocidas en la especialidad (Sambrook y otros, ibid.; Ausubel y otros, ibid.; Marian, Chest 108:255-65, 1995). Los ensayos de protección de ribonucleasas (véase, por ejemplo, Ausubel y otros, ibid, c. 4) comprenden la hibridación de una sonda de RNA a una muestra de RNA de un paciente, después de lo cual el producto de reacción (híbrido de RNA-RNA) se expone a RNasa. Las regiones hibridadas del RNA se ibid.protegen de la digestión. Dentro de los ensayos de PCR, una muestra genética de un paciente se incuba con un par de cebadores polinucleotídicos y la región entre los cebadores se amplifica y se recupera. Los cambios en el tamaño o la cantidad de producto recuperado son indicativos de mutaciones en el paciente. Otra técnica basada en PCR que puede emplearse es el análisis de polimorfismo conformacional de una sola hebra (SSCP) (Hayashi, PCR Methods and Applications 1:34-8, 1991).

Un estado asociado con 17q25.2 es la enfermedad de almacenamiento de glicógeno II. Así, el polipéptido zsig37 puede ser útil en el estudio, la prevención o el tratamiento, por ejemplo, la terapia génica, de este estado. Si un mamífero tiene un gen zsig37 mutado o carece de él, el gen zsig37 puede introducirse en las células del mamífero. En una modalidad, un gen que codifica un polipéptido zsig37 se introduce in vivo en un vector viral. Tales vectores incluyen un virus de DNA atenuado o defectuoso, tal como, pero no limitado a, virus de herpes simple (HSV), papilomarivus, virus de Espstein Barr (EBV), adenovirus, virus adenoasociado (AAV) y similares. Se prefieren los virus defectuosos, que carecen totalmente o casi totalmente de genes virales. Un virus defectuoso no es infeccioso después de la introducción en una célula. El uso de vectores virales defectuosos permite la administración a las células en un área localizada específica, sin preocuparse de que el vector pueda infectar otras células. Ejemplos de vectores particulares incluyen, pero no se limitan a, un vector de virus de herpes 1 (HSV1) defectuoso (Kaplitt y otros, Molec. Cell. Neurosci, 2:320-330(1991)), un vector de adenovirus atenuado, tal como el vector descrito por Stratford-Perricaudet y otros, J. Clin. Invest. 90: 626-630 (1992), y un vector de virus adenoasociado defectuoso (Samulski y otros, J. Virol., 61:3096-3101 (1987); Samulski y otros, J. Virol., 63:3822-3828 (1989)).

El gen puede introducirse en un vector retroviral, por ejemplo, según se describe en Anderson y otros, Patente de EE.UU. Nº 5.399.346; Mann y otros, Cell, 33:153 (1983); Temin y otros, Patente de EE.UU. Nº 4.650.764; Temin y otros, Patente de EE.UU Nº 4.980.289; Markowitz y otros, J. Virol. 62:1120 (1988); Temin y otros, Patente de EE.UU Nº 5.124.263; Publicación de Patente Internacional Nº WO 95/07358, publicada el 16 de Marzo de 1995 por Dougherty y otros y Blood, 82:845 (1993).

Alternativamente, el vector puede introducirse mediante lipofección in vivo usando liposomas. Pueden usarse lípidos catiónicos sintéticos para preparar liposomas para la transfección in vivo de un gen que codifica un marcador (Felgner y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:7413-7417 (1987); véase Mackey y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:8027-8031 (1988)). El uso de lipofección para introducir genes exógenos en órganos específicos in vivo tiene ciertas ventajas prácticas. La orientación ("targeting") molecular de liposomas a células específicas representa un área beneficiosa. Está claro que dirigir la transfección a células particulares representa un área beneficiosa. Está claro que dirigir la transfección a tipos de células particulares sería particularmente ventajoso en un tejido con heterogeneidad celular, tal como el páncreas, el hígado, el riñón y el cerebro. Los lípidos pueden acoplarse químicamente a otras moléculas con propósitos de orientación. Los péptidos, por ejemplo hormonas o neurotransmisores, y las proteínas, tales como anticuerpos, o las moléculas no peptídicas, orientados, podrían acoplarse a liposomas química-
mente.

Es posible retirar las células del cuerpo e introducir el vector como un plásmido de DNA desnudo y a continuación reimplantar las células transformadas en el cuerpo. Un vector de DNA desnudo para terapia génica puede introducirse en las células huésped deseadas mediante métodos conocidos en la especialidad, por ejemplo, transfección, electroporación, microinyección, transducción, fusión celular, DEAE-dextrano, precipitación con fosfato cálcico, uso de una pistola génica o uso de un transportador de vectores de DNA. Véanse, por ejemplo, Wu y otros, J. Biol. Chem. 267:963-967 (1992); Wu y otros, J. Biol. Chem. 263:14621-14624 (1988) y Johnston y Tang, Methods in Cell Biology 43: 353-65 (1994).

También se describen composiciones de polinucleótido antisentido que son complementarias a un segmento de los polinucleótidos indicados en el Nº ID SEC: 1. Tales oligonucleótidos antisentido sintéticos se diseñan para unirse a mRNA que codifica polipéptidos zsig37 e inhibir la traducción de tal mRNA. Tales oligonucleótidos antisentido son útiles para inhibir la expresión de genes que codifican polipéptidos zsig37 en cultivo celular o en un sujeto.

Los polipéptidos zsig37 pueden usarse en el análisis de la eficacia energética de un mamífero. Polipéptidos zsig37 encontrados en muestras de suero o tejido pueden ser indicativos de una capacidad de los mamíferos para almacenar alimentos, tendiendo los mamíferos más altamente eficaces a la obesidad. Más específicamente, se describen métodos para detectar polipéptido zsig37, que comprenden:

exponer una muestra que contiene posiblemente polipéptido zsig37 a un anticuerpo empalmado a un soporte sólido, en donde dicho anticuerpo se une a un epítopo de un polipéptido zsig37;

lavar dichos anticuerpo-polipéptido inmovilizados para retirar contaminantes no unidos;

exponer los anticuerpo-polipéptido inmovilizados a un segundo anticuerpo dirigido a un segundo epítopo de un polipéptido zsig37, en donde el segundo anticuerpo está asociado a un trazador detectable; y

detectar el trazador detectable. La concentración de polipéptido zsig37 en la muestra de prueba parece ser indicativa de la eficacia energética de un mamífero. Esta información puede ayudar al análisis nutricional de un mamífero. Potencialmente, esta información puede ser útil para identificar y/u orientar hacia tejido deficiente en energía.

La invención también se refiere a anticuerpos que se unen específicamente a los polipéptidos zsig37 descritos anteriormente. Tales anticuerpos son útiles para, entre otros usos que se describen aquí, la preparación de anticuerpos anti-idiotípicos. También se describen métodos para identificar agonistas o antagonistas de los polipéptidos zsig37 descritos anteriormente, agonistas o antagonistas que pueden tener propiedades valiosas según se analiza adicionalmente aquí. También se describe un método para identificar agonistas de polipéptidos zsig37, que comprende proporcionar células sensibles a los mismos, cultivar las células en presencia de un compuesto de prueba y comparar las respuestas celulares con la célula cultivada en presencia del polipéptido zsig37, y seleccionar los compuestos de prueba para los que la respuesta celular es del mismo tipo.

También se describe un método para identificar antagonistas de polipéptidos zsig37, que comprende proporcionar células sensibles a un polipéptido zsig37, cultivar una primera porción de las células en presencia de polipéptido zsig37, cultivar una segunda porción de las células en presencia del polipéptido zsig37 y un compuesto de prueba, y detectar una disminución en una respuesta celular de la segunda porción de las células en comparación con la primera porción de las células. Además de esos ensayos descritos aquí, pueden probarse muestras con respecto a la inhibición de la actividad de zsig37 dentro de una variedad de ensayos diseñados para medir la unión a un receptor o la estimulación/inhibición de respuestas celulares dependientes de zsig37. Por ejemplo, líneas celulares sensibles a zsig37 pueden transfectarse con un constructo génico informador que es sensible a una ruta celular estimulada por zsig37. Los constructos génicos informadores de este tipo son conocidos en la especialidad y generalmente comprenderán un elemento de respuesta a DNA de zsig37 conectado operablemente a un gen que codifica una proteína ensayable, tal como luciferasa. Elementos de respuesta a DNA pueden incluir, pero no se limitan a, elementos de respuesta a AMP cíclico (CRE), elementos de respuesta a hormonas (HRE), elementos de respuesta a insulina (IRE) (Nasrin y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:5273-7, 1990) y elementos de respuesta a suero (SRE) (Shaw y otros, Cell 56: 563-72, 1989). Los elementos de respuesta a AMP cíclico se revisan en Roestler y otros, J. Biol. Chem. 263 (19):9063-6, 1988 y Habener, Molec. Endocrinol. 4 (8): 1087-94, 1990. Los elementos de respuesta a hormonas se revisan en Beato, Cell 56:335-44; 1989. Compuestos, soluciones, mezclas o extractos candidatos se prueban con respecto a la capacidad para inhibir la actividad de zsig37 sobre las células diana según se evidencia por una disminución en la estimulación con zsig37 de la expresión del gen informador. Ensayos de este tipo detectarán compuestos que bloquean directamente la unión de zsig37 a receptores de la superficie celular, así como compuestos que bloquean procesos de la ruta celular subsiguientes a la unión receptor-ligando. Alternativamente, compuestos u otras muestras pueden probarse con respecto al bloqueo directo de la unión de zsig37 a receptor usando zsig37 etiquetado con un trazador detectable (por ejemplo, ^{125}I, biotina, peroxidasa de rábano picante, FITC y similares). Dentro de ensayos de este tipo, la capacidad de una muestra de prueba para inhibir la unión de zsig37 sometido a trazado al receptor es indicativa de la actividad inhibidora, que puede confirmarse a través de ensayos secundarios. Los receptores usados dentro de ensayos de unión pueden ser receptores celulares o receptores inmovilizados
aislados.

También se describe un método para estudiar insulina. Tales métodos comprenden incubar adipocitos en un medio de cultivo que comprende polipéptido zsig37, anticuerpo monoclonal, agonista o antagonista del mismo \pm insulina y observar cambios en la secreción o diferenciación de proteínas de adipocitos.

Los agentes protectores antimicrobianos pueden ser de acción directa o de acción indirecta. Tales agentes que operan a través de mecanismos de acción y asociación a la membrana o formación de poros se enlazan directamente al microbio atacante. Los agentes antimicrobianos también pueden actuar a través de un mecanismo enzimático, descomponiendo substancias protectoras microbianas o su pared/membrana celular. Los agentes antimicrobianos, capaces de inhibir la proliferación o la acción de microorganismos o de romper la integridad de los microorganismos mediante cualquier mecanismo fijado anteriormente, son útiles en métodos para prevenir la contaminación en cultivo celular por microbios susceptibles a esa actividad animicrobiana. Tales técnicas implican cultivar células en presencia de una actividad eficaz de dicho polipéptido zsig37 o un agonista o antagonista del mismo.

Además, los polipéptidos zsig37 o los agonistas de los mismos pueden usarse como reactivos de cultivo celular en estudios in vitro de infección por microorganismos exógenos, tal como infección bacteriana, viral o fúngica. Tales restos también pueden usarse en modelos animales in vivo de infección.

También se describen métodos para estudiar el metabolismo celular de mamíferos. Tales métodos comprenden incubar células que han de estudiarse, por ejemplo células endoteliales vasculares humanas, \pm polipéptido zsig37, anticuerpo monoclonal, agonista o antagonista del mismo, y observar cambios en la adipogénesis, gluconeogénesis, glicogenolisis, lipogénesis, captación de glucosa o similares.

También se describe un método para estudiar la dimerización u oligomerización. Tales métodos comprenden incubar polipéptidos zsig37 o fragmentos o proteínas de fusión de los mismos que contienen un dominio similar a colágeno solo o en combinación con otros polipéptidos que tienen dominios similares a colágeno y observar las asociaciones formadas entre los dominios similares a colágeno. Tales asociaciones se indican mediante HPLC, dicroismo circular o similares.

Según se apunta previamente, los polinucleótidos aislados de la presente invención incluyen DNA y RNA. Métodos para aislar DNA y RNA son bien conocidos en la especialidad. Generalmente se prefiere aislar RNA de tumor cerebral, corazón, placenta, tejido adiposo y similares, aunque el DNA también puede prepararse usando RNA de otros tejidos o aislarse como DNA genómico. El RNA total puede prepararse usando extracción con HCl de guanidina seguida por aislamiento y centrifugación en un gradiente de CsCl (Chirgwin y otros, Biochemistry 18:52-94, 1979). Se prepara RNA de Poli (A)^{+} a partir de RNA total usando el método de Aviv y Leder (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:1408-1412, 1972). Se prepara DNA complementario (cDNA) a partir de RNA de poli (A)^{+} usando métodos conocidos. A continuación, polinucleótidos que codifican polipéptidos zsig37 se identifican y aíslan mediante, por ejemplo, hibridación o PCR.

También se describen polipéptidos y polinucleótidos homólogos de otras especies (ortólogos o parálogos). Estas especies incluyen, pero no se limitan a, mamíferos, aves, anfibios, reptiles, peces, insectos y otras especies de vertebrados o invertebrados. De particular interés son polipéptidos zsig37 procedentes de otras especies de mamífero, incluyendo proteínas de múrido, de rata, porcinas, ovinas, bovinas, caninas, felinas, equinas y de otros primates. Ortólogos de las proteínas humanas pueden clonarse usando información y composiciones proporcionadas por la presente invención en combinación con técnicas de clonación convencionales. Por ejemplo, un cDNA puede clonarse usando mRNA obtenido de un tejido o tipo celular que expresa la proteína. Fuentes adecuadas de mRNA pueden identificarse sondeando transferencias Northern con sondas diseñadas a partir de las secuencias descritas aquí. Se prepara a continuación una biblioteca a partir de mRNA de un tejido o línea celular positivos. Un cDNA que codifica polipéptido zsig37 puede aislarse a continuación mediante una variedad de métodos, tales como sondeando con un cDNA humano completo o parcial o con uno o más grupos de sondas degeneradas basadas en las secuencias descritas. Un cDNA también puede clonarse usando la reacción en cadena de la polimerasa, o PCR (Mullis, Patente de EE.UU. 4.683.202), usando cebadores diseñados a partir de las secuencias descritas aquí. Dentro de un método adicional, la biblioteca de cDNA puede usarse para transformar o transfectar células huésped, y la expresión del cDNA de interés puede detectarse con un anticuerpo para el polipéptido zsig37. Técnicas similares también pueden aplicarse al aislamiento de clones genómicos. También pueden identificarse ortólogos rastreando bases de datos de EST específicas de la especie usando las secuencias proporcionadas aquí. Una EST que codifica un ortólogo de zsig37 de múrido se encontró rastreando una base de datos de EST de ratón según se describe con más detalle posteriormente. El ortólogo de ratón (Nº ID SEC: 43) tiene 77% de identidad con la secuencia humana al nivel de nucleótidos y 77% de identidad al nivel de
aminoácidos.

Los expertos en la especialidad reconocerán que las secuencias descritas en el Nº ID SEC: 1 y el Nº ID SEC: 2 representan un solo alelo de DNA y proteína de zsig37 humano y que se espera que ocurra variación alélica y reparación alternativa. Las variantes alélicas de esta secuencia pueden clonarse sondeando bibliotecas de cDNA o genómicas a partir de diferentes individuos de acuerdo con procedimientos estándar. Variantes alélicas de la secuencia de DNA mostrada en el Nº ID SEC: 1, incluyendo las que contienen mutaciones silenciosas y aquellas en las que las mutaciones dan como resultado cambios en la secuencia de aminoácidos, se describen aquí, como también proteínas que son variantes alélicas del Nº ID SEC: 2. También se describen cDNAs generados a partir de mRNAs alternativamente reparados, que contienen las propiedades del polipéptido zsig37, como también polipéptidos codificados por tales cDNAs y mRNAs. Las variantes alélicas y las variantes de reparación de estas secuencias pueden clonarse sondeando bibliotecas de cDNA o genómicas de diferentes individuos o tejidos de acuerdo con procedimientos estándar conocidos en la especialidad.

También se describen polipéptidos zsig37 aislados que son substancialmente homólogos a los polipéptidos del Nº ID SEC: 2 y sus homólogos/ortólogos de especie. El término "substancialmente homólogos" se usa aquí para indicar polipéptidos que tienen 50%, preferiblemente 60%, más preferiblemente al menos 80%, de identidad de secuencia con las secuencias mostradas en el Nº ID SEC: 2 o sus ortólogos o parálogos. Tales polipéptidos serán más preferiblemente al menos 90% idénticos y lo más preferiblemente 95% o más idénticos al Nº ID SEC: 2 o sus ortólogos o parálogos. El porcentaje de identidad de secuencia se determina mediante métodos convencionales. Véanse, por ejemplo, Altschul y otros, Bull. Math. Bio. 48: 603-616, 1986 y Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919, 1992. Brevemente, dos secuencias de aminoácidos se alinean para optimizar las mutaciones de alineamiento usando una penalización por apertura de huecos de 10, una penalización por extensión de huecos de 1 y la matriz de puntuación "blosum 62" de Henikoff y Henikoff (ibid.) según se muestra en la Tabla 3 (los aminoácidos están indicados por los códigos de una letra estándar). El porcentaje de identidad se calcula a continuación
como:

\vskip1.000000\baselineskip

\dotable{\tabskip\tabcolsep\hfil#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 Número total de coincidencias idénticas\+\+\cr 
---------------------------------------------------------------------------------------------------
\+ x \+ 100\cr  [longitud de la secuencia más larga más el número de
huecos introducido\+\+\cr  en la secuencia más larga para alinear
las dos
secuencias]\+\+\cr}

1

\newpage

La identidad de secuencia de moléculas polinucleotídicas se determina mediante métodos similares usando una relación como la descrita anteriormente.

Proteínas y polipéptidos substancialmente homólogos se caracterizan por tener una o más substituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos. Estos cambios son preferiblemente de naturaleza secundaria, esto es substituciones de aminoácidos conservativas (véase la Tabla 4) y otras substituciones que no afectan significativamente al plegamiento o la actividad de la proteína o el polipéptido; deleciones pequeñas, típicamente de 1 a alrededor de 30 aminoácidos; y extensiones amino- o carboxilo-terminales pequeñas, tales como un residuo de metionina amino-terminal, un péptico conector pequeño de hasta aproximadamente 20-25 residuos o una etiqueta de afinidad. Los polipéptidos que comprenden etiquetas de afinidad pueden comprender además un sitio de segmentación proteolítica entre el polipéptido zsig37 y la etiqueta de afinidad. Tales sitios preferidos incluyen sitios de segmentación de trombina y sitios de segmentación de factor Xa.

TABLA 4 Substituciones de aminoácidos conservativas

Básicos:	arginina
	lisina
	histidina
Ácidos:	ácido glutámico
	ácido aspártico
Polares:	glutamina
	asparagina
Hidrófobos:	leucina
	isoleucina
	valina
Aromáticos:	fenilalanina
	triptófano
	tirosina
Pequeños:	glicina
	alanina
	serina
	treonina
	metionina

Las proteínas de la presente invención también pueden comprender residuos de aminoácido no presentes en la naturaleza. Aminoácidos no presentes en la naturaleza incluyen, sin limitación, trans-3-metilprolina, 2,4-metanoprolina, cis-4-hidroxiprolina, trans-4-hidroxiprolina, N-metilglicina, alo-treonina, metiltreonina, hidroxietilcisteína, hidroxietilhomocisteína, nitroglutamina, homoglutamina, ácido pipecólico, ácido tiazolidincarboxílico, deshidroprolina, 3- y 4-metilprolina, 3,3-dimetilprolina, terc-leucina, norvalina, 2-azafenilalanina, 3-azafenilalanina, 4-azafenilalanina y 4-fluorofenilalanina. Se conocen en la especialidad varios métodos para incorporar en proteínas residuos de aminoácido no presentes en la naturaleza. Por ejemplo, puede emplearse un sistema in vitro en el que se suprimen mutaciones sin sentido usando tRNAs supresores químicamente aminoacilados. Métodos para sintetizar aminoácidos y aminoacilar tRNA son conocidos en la especialidad. La transcripción y la traducción de plásmidos que contienen mutaciones sin sentido se lleva a cabo en un sistema libre de células que comprende un extracto de E. coli S30 y enzimas y otros reactivos disponibles comercialmente. Las proteínas se purifican mediante cromatografía. Véanse, por ejemplo, Robertson y otros, J. Am. Chem. Soc. 113:2722, 1991; Ellman y otros, Methods Enzymol. 202:301, 1991; Chung y otros, Science 259:806-9, 1993 y Chung y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10145-9, 1993). En un segundo método, se lleva a cabo la traducción en Xenopus oocytes mediante microinyección de mRNA mutado y RNAs supresores químicamente aminoacilados (Turcatti y otros, J. Biol. Chem. 271:19991-8, 1996). Dentro de un tercer método, células de E. coli se cultivan en ausencia de un aminoácido natural que ha de reemplazarse (por ejemplo, fenilalanina) y en presencia del aminoácido o aminoácidos no presentes en la naturaleza (por ejemplo, 2-azafenilalanina, 3-azafenilalanina, 4-azafenilalanina o 4-fluorofenilalanina). El aminoácido no presente en la naturaleza se incorpora en la proteína en lugar de su homólogo natural. Véase Koide y otros, Biochem. 33:7470-6, 1994. Los residuos de aminoácido presentes en la naturaleza pueden convertirse en especies no presentes en la naturaleza mediante modificación química in vitro. La modificación química puede combinarse con mutagénesis dirigida al sitio para expandir adicionalmente la gama de las substituciones (Wynn y Richards, Protein Sci. 2:395-403, 1993).

Los residuos de aminoácido de zsig37 pueden substituirse por un número limitado de aminoácidos no conservativos, aminoácidos que no son codificados por el código genético, aminoácidos no presentes en la naturaleza y aminoácidos no naturales.

Los aminoácidos esenciales en los polipéptidos de la presente invención pueden identificarse de acuerdo con procedimientos conocidos en la especialidad, tales como mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis por exploración de alanina ((Cunningham y Wells, Science 244: 1081-5, 1989; Bass y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4498-502, 1991). En la última técnica, se introducen mutaciones de alanina simples en cada residuo de la molécula y las moléculas mutantes resultantes se prueban con respecto a la actividad biológica (por ejemplo, la capacidad para modular el equilibrio energético) según se describe posteriormente, para identificar residuos de aminoácido que son críticos para la actividad de la molécula. Véase, además, Hilton y otros, J. Biol. Chem. 271:4699-708, 1996. Los sitios de ligando-receptor u otra ineteracción biológica también pueden determinarse mediante análisis físico de la estructura, según se determina mediante técnicas tales como resonancia magnética nuclear, cristalografía, difracción de electrones o trazado por fotoafinidad, junto con mutación de aminoácidos del sitio de contacto putativos. Véanse, por ejemplo, de Vos y otros, Science 255:306-12, 1992; Smith y otros, J. Mol. Biol. 224:899-904, 1992; Wlodaver y otros, FEBS Lett. 309:59-64, 1992. Las identidades de los aminoácidos esenciales también pueden inferirse a partir del análisis de homologías con polipéptidos relacionados.

Múltiples substituciones de aminoácidos pueden realizarse y probarse usando métodos conocidos de mutagénesis y rastreo, tales como los descritos por Reidharr-Olson y Sauer (Science 241:53-7, 1988) o Bowie y Sauer (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2152-6, 1989). Brevemente, estos autores describen métodos para aleatorizar simultáneamente dos o más posiciones en un polipéptido, seleccionar un polipéptido funcional y a continuación someter a secuenciación los polipéptidos mutagenizados para determinar el espectro de substituciones permisibles en cada posición. Otros métodos que pueden usarse incluyen presentación en fagos (por ejemplo, Lowman y otros, Biochem. 30:10832-7, 1991; Ladner y otros, Patente de EE.UU. Nº 5.223.409; Huse, Publicación WIPO WO 92/06204) y mutagénesis dirigida a una región (Derbyshire y otros, Gene 46:145, 1986; Ner y otros, DNA 7:127, 1988).

Variantes del DNA y las secuencias polipeptídicas de zsig37 descritos pueden generarse a través de barajado de DNA según se describe por Stemmer, Nature 370:389-91, 1994, Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-51, 1994 y la Publicación WIPO WO 97/20078. Brevemente, DNAs variantes se generan mediante recombinación homóloga in vitro mediante fragmentación aleatoria de un DNA parental seguido por reensamblaje usando PCR, dando como resultado mutaciones puntuales introducidas aleatoriamente. Esta técnica puede modificarse usando una familia de DNAs parentales, tales como variantes alélicas o DNAs de diferentes especies, para introducir variabilidad adicional en el procedimiento. La selección o el rastreo con respecto a la actividad deseada, seguido por iteraciones adicionales de mutagénesis y ensayo, proporciona una "evolución" rápida de las secuencias seleccionando mutaciones deseables mientras se seleccionan simultáneamente frente a cambios perjudiciales.

Los métodos de mutagénesis que se describen anteriormente pueden combinarse con métodos de rastreo automatizados de alto rendimiento para detectar actividad de polipéptidos mutagenizados clonados en células huésped. Las moléculas de DNA mutagenizadas que codifican polipéptidos activos (por ejemplo, capacidad para modular el equilibrio energético) pueden recuperarse de las células huésped y someterse a secuenciación rápidamente usando equipos modernos. Estos métodos permiten la determinación rápida de la importancia de residuos de aminoácido individuales en un polipéptido de interés y pueden aplicarse a polipéptidos de estructura desconocida.

Usando los métodos analizados anteriormente, un experto normal en la especialidad puede identificar y/o preparar una variedad de polipéptidos que son substancialmente homólogos a los residuos 22 a 281 del Nº ID SEC: 1 o variantes alélicas de los mismos y retener las propiedades moduladoras del equilibrio energético u otras de la proteína silvestre. Tales polipéptidos pueden incluir aminoácidos adicionales, tales como repeticiones de colágeno adicionales del tipo Gly-Xaa-Pro o Gly-Xaa-Xaa. Tales polipéptidos también pueden incluir segmentos polipeptídicos adicionales como los descritos en general anteriormente.

Los polipéptidos de la presente invención, incluyendo proteínas de longitud completa, fragmentos de las mismas y proteínas de fusión, pueden producirse en células huésped genéticamente manipuladas de acuerdo con técnicas convencionales. Células huésped adecuadas son aquellos tipos de células que pueden transformarse o transfectarse con DNA exógeno y crecer en cultivo, e incluyen bacterias, células fúngicas y células eucarióticas superiores cultivadas. Se prefieren las células eucarióticas, particularmente células cultivadas de organismos multicelulares. Técnicas para manipular moléculas de DNA clonadas e introducir DNA exógeno en una variedad de células huésped son descritas por Sambrook y otros, Molecular Clowning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 y Ausubel y otros, (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987.

En general, una secuencia de DNA que codifica un polipéptido zsig37 de la presente invención está conectada operablemente a otros elementos genéticos requeridos para su expresión, que incluyen generalmente un promotor y un terminador de la transcripción dentro de un vector de expresión. El vector también contendrá comúnmente uno o más marcadores seleccionables y uno o más orígenes de replicación, aunque los expertos en la especialidad reconocerán que dentro de ciertos sistemas pueden proporcionarse marcadores seleccionables en vectores separados, y la replicación del DNA exógeno puede proporcionarse mediante integración en el genoma de la célula huésped. La selección de promotores, terminadores, marcadores seleccionables, vectores y otros elementos es un asunto de diseño habitual dentro del nivel de experiencia normal en la especialidad. Muchos de tales elementos se describen en la literatura y están disponibles a través de suministradores comerciales.

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Para dirigir un polipéptido zsig37 a la ruta secretora de una célula huésped, una secuencia de señal secretora (también conocida como una secuencia líder, una secuencia de señal, una preprosecuencia o una presecuencia) se proporciona en el vector de expresión. La secuencia de señal secretora puede ser la del polipéptido zsig37 o puede derivarse de otra proteína secretada (por ejemplo, t-PA) o sintetizarse de novo. La secuencia de señal secretora está enlazada a la secuencia de DNA del polipéptido zsig37 en el marco de lectura correcto. Las secuencias de señal secretoras están situadas comúnmente 5' con respecto a la secuencia de DNA que codifica el polipéptido de interés, aunque ciertas secuencias de señal pueden estar situadas en cualquier parte de la secuencia de DNA de interés (véanse, por ejemplo, Welch y otros, Patente de EE.UU. Nº 5.037.743; Holland y otros, Patente de EE.UU. Nº 5.143.830). A la inversa, la porción de la secuencia de señal del polipéptido zsig37 (aminoácidos 1-21 ó 1-25 del Nº ID SEC: 2) puede emplearse para dirigir la secreción de una proteína alternativa mediante métodos análogos.

La secuencia de señal secretora contenida en los polipéptidos de la presente invención puede usarse para dirigir otros polipéptidos a la ruta secretora. La presente invención proporciona tales polipéptidos de fusión. Puede elaborarse un polipéptido de fusión de señal en el que una secuencia de señal secretora derivada de los residuos de aminoácido 1-22 ó 1-25 del Nº ID SEC: 2 se conecta operablemente a otro polipéptido usando métodos conocidos en la especialidad y descritos aquí. La secuencia de señal secretora contenida en los polipéptidos de fusión de la presente invención está preferiblemente fusionada aminoterminalmente a un péptido adicional para dirigir el péptido adicional hacia la ruta secretora. Tales constructos tienen numerosas aplicaciones conocidas en la especialidad. Por ejemplo, estos nuevos constructos de fusión de secuencia de señal secretora pueden dirigir la secreción de un componente activo de una proteína normalmente no secretada, tal como un receptor. Tales fusiones pueden usarse in vivo o in vitro para dirigir los péptidos a través de la ruta secretora.

Las células de mamífero cultivadas también son huéspedes adecuados dentro de la presente invención. Métodos para introducir DNA exógeno en células huésped de mamífero incluyen transfección mediada por fosfato cálcico (Wigler y otros, Cell 14:725, 1978; Corsaro y Pearson, Somatic Cell Genetics 7:603, 1981: Graham y Van der Eb, Virology 52:456, 1973), electroporación (Neumann y otros, EMBO J. 1:841-845, 1982), transfección mediada por DEAE-dextrano (Ausubel y otros, eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987), transfección mediada por liposomas (Hawley-Nelson y otros, Focus 15:73, 1993; Ciccarone y otros, Focus 15:80, 1993) y vectores virales (A. Miller y G. Rosman, BioTechniques 7:980-90, 1989; Q. Wang y M. Finer, Nature Med. 2:714-16, 1996). La producción de polipéptidos recombinantes en células de mamífero cultivadas es descrita, por ejemplo, por Levinson y otros, Patente de EE.UU. Nº 4.713.339; Hagen y otros, Patente de EE.UU. Nº 4.784.950; Palmiter y otros, Patente de EE.UU. Nº 4.579.821 y Ringold, Patente de EE.UU. Nº 4.656.134. Células de mamífero cultivadas preferidas incluyen las líneas celulares (ATCC NºCRL 1650), COS-7 (ATCC Nº CRL 1651), BHK 570 (ATCC Nº CRL 10314), 293 (ATCC Nº CRL 1573; Graham y otros, J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977) y de ovario de hámster chino (por ejemplo, CHO-K1; ATCC Nº CCL 61). Líneas celulares adecuadas adicionales son conocidas en la especialidad y están disponibles a partir de depósitos públicos tales como the American Type Culture Collection, Rockville, Maryland. En general, se prefieren promotores de la transcripción fuertes, tales como promotores procedentes de SV-40 o citomegalovirus. Véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. Nº 4.956.288). Otros promotores adecuados incluyen los de genes de metalotioneína (Patentes de EE.UU. Nº 4.579.821 y 4.601.978) y el promotor tardío principal de adenovirus.

La selección de fármacos se usa generalmente para seleccionar células de mamífero cultivadas en las que se ha insertado DNA extraño. Tales células se denominan comúnmente (transfectantes). Las células que se han cultivado en presencia del agente selectivo y son capaces de pasar el gen de interés a su progenie se denominan "transfectantes estables". Un marcador seleccionable preferido es un gen que codifica resistencia al antibiótico neomicina. La selección se lleva a cabo en presencia de un fármaco de tipo neomicina, tal como G-418 o similares. También pueden usarse sistemas de deleción para incrementar el nivel de expresión del gen de interés, un procedimiento denominado "amplificación". La amplificación se lleva a cabo cultivando transfectantes en presencia de un bajo nivel del agente selectivo y a continuación incrementando la cantidad de agente selectivo para seleccionar células que producen altos niveles de los productos de los genes introducidos. Un marcador seleccionable amplificable preferido es la dihidrofolato reductasa, que confiere resistencia a metotrexato. También pueden usarse otros genes de resistencia a fármacos (por ejemplo, resistencia a higromicina, resistencia a múltiples fármacos, puromicina acetiltransferasa). Marcadores alternativos que introducen un fenotipo alterado, tal como proteína fluorescente verde, o proteínas de la superficie celular, tales como CD4, CD8, MHC Clase I, fosfatasa alcalina placentaria, pueden usarse para clasificar células transfectadas a partir de células no transfectadas mediante medios tales como clasificación por FACS o tecnología de separación con cuentas magnéticas.

Otras células eucarióticas superiores también pueden usarse como huéspedes, incluyendo células de planta, células de insecto y células de ave. El uso de Agrobacterium rhizogenes como un vector para expresar genes en células de planta ha sido revisado por Sinkar y otros, J. Biosci.(Bangalore) 11:47-58, 1987. La transformación de células de insecto y la producción de polipéptidos extraños en las mismas es descrita por Guarino y otros, Patente de EE.UU. Nº 5.162.222 y publicación WIPO WO 94/06463. Las células de insecto pueden infectarse con baculovirus recombinante, comúnmente derivado de virus de poliedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV). Véanse, King y Possee, The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide, Londres, Chapman & Hall; O'Reilly y otros, Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, Nueva York, Oxford University Press., 1994 y Richardson, C. D., Ed., Baculovirus Expression Protocols. Methods in Molecular Biology, Totowa, NJ, Humana Press, 1995. Un segundo método para elaborar baculovirus de zsig37 recombinante utiliza un sistema basado en transposones descrito por Luckow (Luckow y otros, J. Virol. 67:4566-79, 1993). Este sistema, que utiliza vectores de transferencia, es vendido en el estuche Bac-to-Bac™ (Life Technologies, Rockville, MD). Este sistema utiliza un vector de transferencia, pFastBacl™ (Life Technologies) que contiene un transposón Tn7 para mover el DNA que codifica el polipéptido zsig37 a un genoma de baculovirus mantenido en E. coli como un plásmido grande denominado un "bácmido". Véanse, Hill-Perkins y Possee, J. Gen. Virol. 71:971-6, 1990; Bonning y otros, J. Gen. Virol. 75:1551-6, 1994 y Chazenbalk y Rapoport, J. Biol. Chem. 270:1543-9, 1995. Además, los vectores de transferencia pueden incluir una fusión en el marco con DNA que codifica una etiqueta epitópica en el extremo C o N del polipéptido zsig37 expresado, por ejemplo una etiqueta epitópica Glu-Glu (Grussenmeyer y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. 82:7952-4, 1985). Usando una técnica conocida en la especialidad, un vector de transferencia que contiene zsig37 se transforma en E. coli, y se rastrea con respecto a bácmidos que contienen un gen lacZ interrumpido indicativo de baculovirus recombinante. El DNA bacmídico que contiene el genoma de baculovirus recombinante se aísla, usando técnicas comunes, y se usa para transfectar células de Spodoptera frugiperda, por ejemplo células Sf9. Se produce subsiguientemente virus recombinante que expresa zsig37. Se elaboran reservas virales recombinantes mediante métodos usados comúnmente en la especialidad.

El virus recombinante se usa para infectar células huésped, típicamente una línea celular derivada del cogollero del maíz, Spodoptera frugiperda. Véase, en general, Glick y Pasternak, Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA, ASM Press, Washington, D.C., 1994. Otra línea celular adecuada es la línea celular High FiveO™ (Invitrogen) derivada de Trichoplusia ni (Patente de EE.UU. Nº 5.300.435). Se usan medios libres de suero disponibles comercialmente para hacer crecer y mantener las células. Medios adecuados son Sf900 II™ (Life Technologies) o ESF 921™ (Expression Systems) para las células Sf9; y Ex-cellO405™ (JRH Biosciences, Lenexa, KS) o Express FiveO™ (Life Technologies) para las células de T. ni. Las células se hacen crecer desde una densidad de inoculación de aproximadamente 2-5 x 10^{5} células hasta una densidad de 1-2 x 10^{6} células, momento en el cual se añade una reserva viral recombinante a una multiplicidad de infección (MOI) de 0,1 a 10, más típicamente cerca de 3. Procedimientos usados se describen generalmente en manuales de laboratorio disponibles (King y Possee, ibid.; O'Reilly y otros, ibid.; Richardson, ibid.). La purificación subsiguiente del polipéptido zsig37 a partir del sobrenadante puede alcanzarse usando métodos descritos aquí.

Células fúngicas, incluyendo células de levadura, también pueden usarse dentro de la presente invención. Especies de levadura de particular interés a este respecto incluyen Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris y Pichia methanolica. Métodos para transformar células de S. cerevisiae con DNA exógeno y producir polipéptidos recombinantes son descritos, por ejemplo, por Kawasaki, Patente de EE.UU. Nº 4.599.311; Kawasaki y otros, Patente de EE.UU. Nº 4.931.373; Brake, Patente de EE.UU. Nº 4.870.008; Welch y otros, Patente de EE.UU. Nº 5.037.743 y Murray y otros, Patente de EE.UU. Nº 4.845.075. Las células transformadas se seleccionan mediante el fenotipo determinado por el marcador seleccionable, comúnmente resistencia a fármacos o la capacidad para crecer en ausencia de un nutriente particular (por ejemplo, leucina). Un sistema vectorial preferido para usar en Saccharomyces cerevisiae es el sistema vectorial POT1 descrito por Kawasaki y otros (Patente de EE.UU. Nº 4.931.373), que permite que se seleccionen células transformadas mediante crecimiento en medios que contienen glucosa. Promotores y terminadores adecuados para usar en levadura incluyen los de genes de enzimas glicolíticas (véanse, por ejemplo, Kawasaki, Patente de EE.UU. Nº 4.599.311; Kingsman y otros, Patente de EE.UU. Nº 4.615.974 y Bitter, Patente de EE.UU. Nº 4.977.092) y genes de alcohol deshidrogenasa. Véanse, además, las Patentes de EE.UU. Nº 4.990.446; 5.063.154; 5.139.936 y 4.661.454. Sistemas de transformación para otras levaduras, incluyendo Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyvercmyces fragilis, Ustilago maydis, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia guillermondii y Candida maltosa, se conocen en la especialidad. Véase, por ejemplo, Gleeson y otros, J. Gen. Microbiol. 132:3459-65, 1986 y Cregg, Patente de EE.UU. Nº 4.882.279. Pueden utilizarse células de Aspergillus de acuerdo con los métodos de McKnight y otros, Patente de EE.UU. Nº 4.935.349. Métodos para transformar Acremonium chrysogenum son descritos por Sumino y otros, Patente de EE.UU. Nº 5.162.228. Métodos para transformar Neurospora son descritos por Lambowitz, Patente de EE.UU. Nº 4.486.533.

El uso de Pichia methanolica como huésped para la producción de proteínas recombinantes se describe en las publicaciones WIPO WO 97/17450, WO 97/17451, WO 98/02536 y WO 98/02565. Moléculas de DNA para usar en la transformación de P. methanolica se prepararán comúnmente como plásmidos circulares de doble hebra, que preferiblemente se linealizan antes de la transformación. Para la producción de polipéptidos en P. methanolica, se prefiere que el promotor y el terminador del plásmido sean de un gen de P. methanolica, tal como un gen de utilización de alcohol (AUG1 o AUG2) de P. methanolica. Otros promotores útiles incluyen los de los genes de dihidroxiacetona sintasa (DHAS), formiato deshidrogenasa (FMD) y catalasa (CAT). Para facilitar la integración del DNA en el cromosoma del huésped, se prefiere tener todo el segmento de expresión del plásmido flanqueado en ambos extremos por secuencias de DNA del huésped. Un marcador seleccionable preferido para usar en Pichia methanolica es el gen de ADE2 de P. methanolica, que codifica fosforribosil-5-aminoimidazol carboxilasa (AIRC; EC 4.1.1.21), que permite que células huésped ade2 crezcan en ausencia de adenina. Para procedimientos industriales a gran escala en los que es deseable minimizar el uso de metanol, se prefiere usar células huésped en las que se supriman ambos genes de utilización de metanol (AUG1 y AUG2). Para la producción de proteínas secretadas, se prefieren células huésped deficientes en genes de proteasas vacuolares (PEP4 y PRB1). Se usa electroporación para facilitar la introducción de un plásmido que contiene DNA que codifica un polipéptido de interés en células de P. methanolica. Se prefiere transformar células de P. methanolica mediante electroporación usando un campo eléctrico pulsatorio exponencialmente decadente que tiene una intensidad de campo de 2,5 a 4,5 kV/cm, preferiblemente alrededor de 3,75 kV/cm, y una constante de tiempo (\tau) de 1 a 40 milisegundos, lo más preferiblemente alrededor de 20 milisegundos.

Células huésped procarióticas, incluyendo cepas de las bacterias Escherichia coli, Bacillus y otros géneros, también son células huésped útiles dentro de la presente invención. Técnicas para transformar estos huéspedes y expresar secuencias de DNA extrañas clonadas en los mismos son bien conocidas en la especialidad (véase, por ejemplo Sambrook y otros, ibid.). Cuando se expresa un polipéptido zsig37 en bacterias tales como E. coli, el polipéptido puede retenerse en el citoplasma, típicamente como gránulos insolubles, o puede dirigirse al espacio periplasmático mediante una secuencia de secreción bacteriana. En el primer caso, las células se someten a lisis y los gránulos se recuperan y se desnaturalizan usando, por ejemplo, isotiocianato de guanidina o urea. El polipéptido desnaturalizado puede a continuación replegarse y dimerizarse diluyendo el desnaturalizante, tal como mediante diálisis frente a una solución de urea y una combinación de glutationa reducida y oxidada, seguido por diálisis contra una solución salina tamponada. En el último caso, el polipéptido puede recuperarse del espacio periplásmico en una forma soluble y funcional rompiendo las células (mediante, por ejemplo, sonicación o choque osmótico) para liberar el contenido del espacio periplásmico y recuperar la proteína, obviando de ese modo la necesidad de desnaturalización y replegamiento.

Células huésped transformadas o transfectadas se cultivan de acuerdo con procedimientos convencionales en un medio de cultivo que contiene nutrientes y otros componentes requeridos para el crecimiento de las células huésped elegidas. Una variedad de medios adecuados, incluyendo medios definidos y medios complejos, es conocida en la especialidad e incluye generalmente una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, aminoácidos esenciales, vitaminas y minerales. Los medios también pueden contener componentes tales como factores de crecimiento o suero, según se requiera. El medio de crecimiento se seleccionará generalmente de células que contienen el DNA exógenamente añadido mediante, por ejemplo, selección de fármacos o deficiencia en un nutriente esencial que es suplementado por el marcador seleccionable soportado en el vector de expresión o cotransfectado en la célula huésped.

Polipéptidos zsig37 recombinantes (o polipéptidos zsig37 quiméricos) expresados pueden purificarse usando fraccionación y/o métodos y medios de purificación convencionales. La precipitación con sulfato amónico y la extracción con ácidos o caótropos pueden usarse para la fraccionación de muestras. Etapas de purificación ejemplares pueden incluir hidroxiapatito, exclusión por tamaños, FPLC y cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa. Medios cromatográficos adecuados incluyen dextranos derivados, agarosa, celulosa, poliacrilamida, sílices especializadas y similares. Se prefieren derivados de PEI, DEAE, QAE y Q. Medios cromatográficos ejemplares incluyen los medios derivados con grupos fenilo, butilo u octilo, tales como Phenyl-Sepharose FF (Pharmacia), Toyopearl butyl 650 (Toso Haas, Montgomeryville, PA), Octyl-Sepharose (Pharmacia) y similares; o resinas poliacrílicas, tales como Amberchrom CG 71 (Toso Haas) y similares. Soportes sólidos adecuados incluyen cuentas de vidrio, resinas basadas en sílice, resinas celulósicas, cuentas de agarosa, cuentas de agarosa reticuladas, cuentas de poliestireno, resinas de poliacrilamida reticuladas y similares, que son insolubles bajo las condiciones en las que han de usarse. Estos soportes pueden modificarse con grupos reactivos que permiten el empalme de proteínas por grupos amino, grupos carboxilo, grupos sulfhidrilo, grupos hidroxilo y/o restos de carbohidrato. Ejemplos de químicas de acoplamiento incluyen activación con bromuro de cianógeno, activación con N-hidroxisuccinimida, activación con epóxido, activación con sulfhidrilo, activación con hidrazida y derivados carboxílicos y amínicos para químicas de acoplamiento de carbodiimidas. Estos y otros medios sólidos son bien conocidos y ampliamente usados en la especialidad y están disponibles de suministradores comerciales. Métodos para unir polipéptidos receptores a medios de soporte son bien conocidos en la especialidad. La selección de un método particular es un asunto de diseño habitual y está determinada en parte por las propiedades del soporte elegido. Véase, por ejemplo, Affinity Chromatography: Principles & Methods, Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Suecia, 1988.

Los polipéptidos de la presente invención pueden aislarse mediante explotación de sus propiedades estructurales o de unión. Por ejemplo, puede usarse cromatografía de adsorción de iones metálicos inmovilizados (IMAC) para purificar proteínas ricas en histidina o proteínas que tienen una etiqueta de His. Brevemente, un gel se carga en primer lugar con iones metálicos divalentes para formar un quelato (E. Sulkowski, Trends in Biochem. 3:1-7, 1985). Las proteínas ricas en histidina serán absorbidas en esta matriz con diferentes afinidades, dependiendo del ion metálico usado, y se eluirán mediante elución competitiva, disminuyendo el pH o el uso de agentes quelantes fuertes. Otros métodos de purificación incluyen purificación de proteínas glicosiladas mediante cromatografía de afinidad con lectina y cromatografía de intercambio iónico (Methods in Enzymol., Vol. 182, "Guide to Protein Purification", M. Deutscher, (ed.), Acad. Press, San Diego, 1990, pp. 529-39). Dentro de modalidades preferidas adicionales de la invención, una fusión del polipéptido de interés y un rótulo de afinidad (por ejemplo, proteína de unión a maltosa, FLAG, Glu-Glu, un dominio de inmunoglobulina) puede construirse para facilitar la purificación según se analiza con mayor detalle en las secciones de Ejemplos posteriores.

Pueden usarse ventajosamente procedimientos de replegamiento (y, opcionalmente, reoxidación) de proteínas. Se prefiere purificar la proteína hasta >80% de pureza, más preferiblemente hasta >90% de pureza, aún más preferiblemente hasta >95% de pureza y de forma particularmente preferible es un estado farmacéuticamente puro, esto es mayor que 99,9% puro con respecto a macromoléculas contaminantes, particularmente otras proteínas y ácidos nucleicos, y está libre de agentes infecciosos y pirogénicos. Preferiblemente, una proteína purificada está substancialmente libre de otras proteínas, particularmente otras proteínas de origen animal.

Polipéptidos zsig37 o fragmentos de los mismos también pueden prepararse a través de síntesis química. Tales polipéptidos zsig37 pueden ser monómeros o multímeros; estar glicosilados o no glicosilados; pegilados o no pegilados; y pueden o no incluir un residuo del aminoácido metionina inicial.

Un polipéptido que se une a ligando, tal como un polipéptido que se une a polipéptido zsig37, también puede usarse para la purificación del ligando. El polipéptido está inmovilizado sobre un soporte sólido, tal como cuentas de agarosa, agarosa reticulada, vidrio, resinas celulósicas, resinas basadas en sílice, poliestireno, poliacrilamida reticulada o materiales similares que son estables bajo las condiciones de uso. Métodos para conectar polipéptidos a soportes sólidos son conocidos en la especialidad, e incluyen química de aminas, activación con bromuro de cianógeno, activación con N-hidroxisuccinimida, activación con epóxido, activación con sulfhidrilo y activación con hidrazida. El medio resultante generalmente se configurará en la forma de una columna y fluidos que contienen ligandos se hacen pasar a través de la columna una o más veces para permitir que el ligando se una al polipéptido que se une a ligandos. El ligando se eluye a continuación usando cambios en la concentración de sal, agentes caotrópicos (HCl de guanidina) o pH para romper la unión ligando-receptor.

Un sistema de ensayo que usa un receptor que se une a ligando (o un anticuerpo, un miembro de un par complemento/anticomplemento) o un fragmento de unión del mismo y un instrumento biosensor disponible comercialmente BIAcore™, Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ) puede emplearse ventajosamente. Tal receptor, anticuerpo, miembro de un par complemento/anticomplemento o fragmento está inmovilizado sobre la superficie de un "chip" receptor. El uso de ese instrumento es descrito por Karlsson, J. Immunol. Methods 145:229-40, 1991 y Cunningham y Wells, J. Mol. Biol. 234:554-63, 1993. Un receptor, anticuerpo, miembro o fragmento se enlaza covalentemente, usando química de amina o sulfhidrilo, a fibras de dextrano que están enlazadas a película de oro dentro de la celdilla de flujo. Una muestra de prueba se hace pasar a través de la celdilla. Si un ligando, epítopo o miembro opuesto del par complemento/anticomplemento está presente en la muestra, se unirá al receptor, anticuerpo o miembro inmovilizado, respectivamente, provocando un cambio en el índice de refracción del medio, que se detecta como un cambio en la resonancia de plasmones superficiales de la película de oro. Este sistema permite la determinación de velocidades de marcha y paro, a partir de las cuales puede calcularse la afinidad de unión, y la averiguación de la estequiometría de unión.

Los polipéptidos que se unen a ligando también pueden usarse dentro de otros sistemas de ensayo conocidos en la especialidad. Tales sistemas incluyen el análisis de Scatchard para la determinación de la afinidad de unión (véase Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51: 660-72, 1949) y ensayos calorimétricos ((Cunningham y otros, Science 253:545-48, 1991; Cunningham y otros, Science 245:821-25, 1991).

Los polipéptidos zsig37 también pueden usarse para preparar anticuerpos que se unen específicamente a epítopos de polipéptidos zsig37, péptidos o polipéptidos. Métodos para preparar anticuerpos policlonales y monoclonales son bien conocidos en la especialidad (véanse, por ejemplo, Sambrook y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbor, NY, 1989 y Hurrell, J. G. R., Ed., Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, CRC Press, Inc., Boca Ratón, FL, 1982).

Como será evidente para un experto normal en la especialidad, los anticuerpos policlonales pueden generarse a partir de la inoculación de una variedad de animales de sangre caliente, tales como caballos, vacas, cabras, ovejas, perros, pollos, conejos, ratones, hámsteres, cobayas y ratas, así como animales transgénicos tales como ovejas, vacas, cabras o cerdos transgénicos. Los anticuerpos también pueden expresarse en levaduras y hongos en formas modificadas así como en células de mamífero o insecto. El polipéptido zsig37 o un fragmento del mismo sirve como un antígeno (inmunógeno) para inocular a un animal o provocar una respuesta inmunitaria. Antígenos adecuados incluirán el polipéptido zsig37 codificado por el Nº ID SEC: 2 desde el residuo de aminoácido 22-281 del Nº ID SEC: 2, desde el residuo de aminoácido 26-281 del Nº ID SEC: 2 o un fragmento del residuo de aminoácido 9-281 continuo del mismo. La inmunogenicidad de un polipéptido zsig37 puede incrementarse a través del uso de un adyuvante, tal como alumbre (hidróxido de aluminio) o adyuvante completo o incompleto de Freund. Polipéptidos útiles para la inmunización también incluyen polipéptidos de fusión, tales como fusiones de zsig37 o una porción del mismo con un polipéptido de inmunoglobulina o con una etiqueta de afinidad. El inmunógeno polipeptídico también puede ser una molécula de longitud completa o una porción de la misma. Si la porción de polipéptido es "similar a un hapteno", tal porción puede estar ventajosamente enlazada o conectada a un portador macromolecular (tal como hemocianina de lapa de ojo de cerradura (KLH), albúmina de suero bovino (BSA) o toxoide del tétanos) para la inmunización.

Según se usa aquí, el término "anticuerpos" incluye anticuerpos policlonales, anticuerpos policlonales purificados por afinidad, anticuerpos monoclonales y fragmentos que se unen a antígeno, tales como fragmentos proteolíticos F(ab')_{2} y Fab. También se incluyen anticuerpos intactos o fragmentos manipulados genéticamente, tales como anticuerpos quiméricos, fragmentos Fv, anticuerpos monocatenarios y similares, así como péptidos y polipéptidos que se unen a antígeno. Los anticuerpos no humanos pueden humanizarse injertando solo CDRs no humanas en regiones estructurales y constantes humanas, o incorporando los dominios variables no humanos enteros (opcionalmente "cubriéndolos" con una superficie humanoide mediante substitución de residuos expuestos, en donde el resultado es un anticuerpo "chapeado"). En algunos casos, los anticuerpos humanizados pueden retener residuos no humanos dentro de los dominios estructurales de la región variable humana para potenciar características de unión apropiadas. A través de anticuerpos humanizados, la semivida biológica puede incrementarse y el potencial para reacciones inmunitarias adversas durante la administración a seres humanos se reduce. Técnicas alternativas para generar o seleccionar anticuerpos útiles aquí incluyen la exposición in vitro de linfocitos a proteína o péptido zsig37, y la selección de bibliotecas de presentación de anticuerpos en vectores fágicos o similares (por ejemplo, a través del uso de proteína o péptido zsig37 inmovilizado o etiquetado).

Se define que los anticuerpos se unen específicamente si: 1) exhiben un nivel umbral de actividad de unión y/o 2) no reaccionan cruzadamente de forma significativa con moléculas polipeptídicas relacionadas. En primer lugar, los presentes anticuerpos se unen específicamente si se unen a un polipéptido, péptido o epítopo zsig37 con una afinidad de unión (K_{a}) de 10^{6} mol^{-1} o más, preferiblemente 10^{7} mol^{-1} o más, más preferiblemente 10^{8} mol^{-1} o más y lo más preferiblemente 10^{9} mol^{-1} o más. La afinidad de unión de un anticuerpo puede ser determinada fácilmente por un experto normal en la especialidad, por ejemplo, mediante análisis de Scatchard (Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51: 660-672, 1949).

En segundo lugar, los anticuerpos se unen específicamente si no reaccionan cruzadamente de forma significativa con polipéptidos afines. Los anticuerpos no reaccionan cruzadamente de forma significativa con moléculas polipeptídicas afines, por ejemplo, si detectan polipéptido zsig37 pero no polipéptidos relacionados conocidos usando un análisis de transferencia Western estándar (Ausubel y otros, ibid.). Ejemplos de polipéptidos relacionados conocidos incluyen otros miembros de una familia de proteínas tales como Acrp30 (Nº ID SEC: 3), el polipéptido mostrado en el alineamiento de la Fig. 1 y similares. También podrían incluir, si se desea, ortólogos y polipéptidos zsig37 humanos mutantes. Por otra parte, los anticuerpos pueden "rastrearse frente a" polipéptidos relacionados conocidos para aislar una población que se une específicamente a los polipéptidos de la invención. Por ejemplo, anticuerpos producidos para polipéptidos zsig37 humanos son adsorbidos en polipéptidos relacionados adheridos a una matriz insoluble; los anticuerpos específicos para polipéptidos zsig37 humanos fluirán a través de la matriz bajo las condiciones tamponadoras apropiadas. Tal rastreo permite el aislamiento de anticuerpos policlonales y monoclonales no reactivos cruzadamente con polipéptidos estrechamente relacionados (Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988; Current Protocols in Immunology, Cooligan y otros (eds.), National Institutes of Health, John Wiley and Sons, Inc., 1995). El rastreo y el aislamiento de anticuerpos específicos es bien conocido en la especialidad (véanse, Fundamental Immunology, Paul (eds.), Raven Press, 1993; Getzoff y otros, Adv. in Immunol. 43: 1-98, 1988; Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Goding, J.W. (eds.), Academic Press Ltd., 1996; Benjamin y otros, Ann. Rev. Immunol. 2: 67-101, 1984). Ejemplos representativos de tales ensayos incluyen: inmunoelectroforesis simultánea, radioinmunoensayo, radioinmunoprecipitación, ensayo de inmunoabsorción con enzimas ligadas (ELISA), ensayo de transferencia por gotas o transferencia Western, ensayo de inhibición o competición y ensayo tipo sándwich.

Genes que codifican polipéptidos que tienen dominios de unión a polipéptidos zsig37 potenciales, "proteínas de unión", pueden obtenerse rastreando bibliotecas de péptidos aleatorias o dirigidas presentadas sobre un fago (presentación en fagos) o sobre bacterias, tales como E. coli. Secuencias de nucleótidos que codifican los polipéptidos pueden obtenerse de un número de modos, tales como a través de mutagénesis aleatoria y síntesis de polinucleótidos aleatoria. Alternativamente, también pueden producirse bibliotecas de presentación en fagos restringidas. Estas bibliotecas de presentación de péptidos pueden usarse para rastrear con respecto a péptidos que interactúan con una diana conocida que puede ser una proteína o un polipéptido, tal como un ligando o receptor, una macromolécula biológica o sintética o substancias orgánicas o inorgánicas. Técnicas para crear y rastrear tales bibliotecas de presentación de péptidos son conocidas en la especialidad (Ladner y otros, Patente de EE.UU. Nº 5.223.409; Ladner y otros, Patente de EE.UU. Nº 4.946.778; Ladner y otros, Patente de EE.UU. Nº 5.403.484 y Ladner y otros, Patente de EE.UU. Nº 5.571.698) y bibliotecas de presentación de péptidos y estuches para rastrear tales bibliotecas están disponibles comercialmente, por ejemplo, de Clontech (Palo Alto, CA), Invitrogen Inc. (San Diego, CA), New England Biolabs, Inc. (Beverly, MA) y Pharmacia LKB Biotechnology Inc. (Piscataway, NJ). Las bibliotecas de presentación de péptidos pueden rastrearse usando las secuencias zsig37 descritas aquí para identificar proteínas que se unen a zsig37. Estas "proteínas de unión" que interactúan con polipéptidos zsig37 pueden usarse esencialmente como un anticuerpo, para etiquetar células; para aislar polipéptidos homólogos mediante purificación por afinidad; directamente o indirectamente conjugadas a fármacos, toxinas, radionúclidos y similares. Estas proteínas de unión también pueden usarse en métodos analíticos tales como para rastrear bibliotecas de expresión y neutralizar la actividad. Las proteínas de unión también pueden usarse para ensayos diagnósticos para determinar niveles circulantes de polipéptidos; para detectar o cuantificar polipéptidos solubles como marcador de una patología o enfermedad subyacente. Para incrementar la semivida de estas proteínas de unión, pueden conjugarse. Sus propiedades biológicas pueden modificarse mediante dimerización o multimerización para usar como agonistas o antagonistas. Los péptidos de unión pueden rastrearse frente a polipéptidos relacionados conocidos según se describe anteriormente.

Los anticuerpos y las proteínas de unión para zsig37 pueden usarse para someter a trazado a células que expresan zsig37; para aislar zsig37 mediante purificación por afinidad; para ensayos diagnósticos para determinar niveles circulantes de polipéptidos zsig37; para detectar o cuantificar zsig37 soluble como marcador de una patología o enfermedad subyacente; en métodos analíticos que emplean FACS; para rastrear bibliotecas de expresión; para generar anticuerpos antiidiotípicos; y como anticuerpos neutralizadores o como antagonistas para bloquear la actividad de modulación del equilibrio energético de polipéptidos zsig37 o una actividad similar in vitro e in vivo. Rótulos o etiquetas directos adecuados incluyen radionúclidos, enzimas, substratos, cofactores, inhibidores, marcadores fluorescentes, marcadores quimioluminiscentes, partículas magnéticas y similares; etiquetas o trazadores indirectos pueden hacer uso de biotina-avidina u otros pares de complemento/anticomplemento como productos intermedios. Por otra parte, anticuerpos para zsig37 o fragmentos del mismo pueden usarse in vitro para detectar zsig37 desnaturalizado o fragmentos del mismo en ensayos, por ejemplo, transferencia Western u otros ensayos conocidos en la especialidad.

Los anticuerpos o las proteínas de unión también pueden conjugarse directamente o indirectamente a fármacos, toxinas, radionúclidos y similares, y estos conjugados usarse para aplicaciones diagnósticas o terapéuticas in vivo. Por ejemplo, los polipéptidos o anticuerpos de la presente invención pueden usarse para identificar o tratar tejidos u órganos que expresan una molécula anticomplementaria correspondiente (receptor o antígeno, respectivamente, por ejemplo). Más específicamente, los polipéptidos zsig37 o los anticuerpos anti-zsig37, o los fragmentos o porciones bioactivos de los mismos, pueden acoplarse a moléculas detectables o citotóxicas y aportarse a un mamífero que tiene células, tejidos u órganos que expresan la molécula anticomplementaria.

Moléculas detectables adecuadas pueden empalmarse directamente o indirectamente al polipéptido o anticuerpo, e incluyen radionúclidos, enzimas, substratos, cofactores, inhibidores, marcadores fluorescentes, marcadores quimioluminiscentes, partículas magnéticas y similares. Moléculas citotóxicas adecuadas pueden empalmarse directamente o indirectamente al polipéptido o anticuerpo, e incluyen toxinas bacterianas o de planta (por ejemplo, toxina de la difteria, exotoxina de Pseudomonas, ricina, abrina y similares), así como radionúclidos terapéuticos, tales como yodo-131, renio-188 o itrio-90 (empalmados directamente al polipéptido o anticuerpo o empalmados indirectamente por medio de un resto quelante, por ejemplo). Los polipéptidos o anticuerpos también pueden conjugarse a fármacos citotóxicos, tales como adriamicina. Para el empalme indirecto de una molécula detectable o citotóxica, la molécula detectable o citotóxica puede conjugase con un miembro de un par complementario/anticomplementario, en el que el otro miembro está unido a la porción de polipéptido o anticuerpo. Para estos propósitos, biotina/estreptavidina es un par complementario/anticomplementario ejemplar.

Proteínas de fusión de polipéptido-toxina o proteínas de fusión de anticuerpo-toxina pueden usarse para la inhibición o extirpación de células o tejidos elegidos como diana (por ejemplo, para tratar células o tejidos cancerosos). Alternativamente, si el polipéptido tiene múltiples dominios funcionales (es decir, un dominio de activación o un dominio de unión a ligando, más un dominio de orientación), una proteína de fusión que incluya solo el dominio de orientación puede ser adecuada para dirigir una molécula detectable, una molécula citotóxica o una molécula complementaria a un tipo de célula o tejido de interés. En casos en los que la única proteína de fusión del dominio incluye una molécula complementaria, la molécula anticomplementaria puede estar conjugada a una molécula detectable o citotóxica. Tales proteínas de fusión de dominio-molécula complementaria representan así un vehículo de orientación genérico para el aporte específico para células/tejidos de conjugados de moléculas detectables/citotóxicas anticomplementarios genéricos. Los conjugados de polipéptido o anticuerpo bioactivo descritos aquí pueden aportarse intravenosamente, intraarterialmente, intraductalmente con DMSO, intramuscularmente, subcutáneamente, intraperitonealmente, también mediante métodos transdérmicos, mediante electrotransferencia, oralmente o a través de un
inhalante.

Los polinucleótidos que codifican polipéptidos zsig37 son útiles dentro de aplicaciones de terapia génica en las que se desea incrementar e inhibir la actividad de zsig37. Si un mamífero tiene un gen zsig37 mutado o ausente, el gen zsig37 puede introducirse en las células del mamífero. En una modalidad, un gen que codifica un polipéptido zsig37 se introduce in vivo en un vector viral. Tales vectores incluyen un virus de DNA atenuado o defectuoso, tal como, pero no limitado a, virus de herpes simple (HSV), papilomarivus, virus de Epstein Barr (EBV), adenovirus, virus adenoasociado (AAV) y similares. Se prefieren virus defectuosos, que carecen totalmente o casi totalmente de genes virales. Un virus defectuoso no es infeccioso después de la introducción en una célula. El uso de vectores virales defectuosos permite la administración a células en un área localizada específica, sin preocuparse de que el vector pueda infectar otras células. Ejemplos de vectores particulares incluyen, pero no se limitan a, un vector de virus de herpes 1 (HSV1) defectuoso (Kaplitt y otros, Molec. Cell. Neurosci, 2:320-30, 1991), un vector de adenovirus atenuado, tal como el vector descrito por Stratford-Perricaudet y otros, J. Clin. Invest. 90: 626-30, 1992, y un vector de virus adenoasociado defectuoso (Samulski y otros, J. Virol., 61:3096-101, 1987; Samulski y otros, J. Virol., 63:3822-8, 1989)).

Un gen zsig37 puede introducirse en un vector retroviral, por ejemplo, según se describe en Anderson y otros, Patente de EE.UU. Nº 5.399.346; Mann y otros, Cell, 33:153, 1983; Temin y otros, Patente de EE.UU. Nº 4.650.764; Temin y otros, Patente de EE.UU Nº 4.980.289; Markowitz y otros, J. Virol. 62:1120, 1988; Temin y otros, Patente de EE.UU Nº 5.124.263; Publicación WIPO WO 95/07358 y Kuo y otros, Blood 82:845, 1993. Alternativamente, el vector puede introducirse mediante lipofección in vivo usando liposomas. Pueden usarse lípidos catiónicos sintéticos para preparar liposomas para la transfección in vivo de un gen que codifica un marcador (Felgner y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:7413-7, 1987; Mackey y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8027-31, 1988). El uso de lipofección para introducir genes exógenos en órganos específicos in vivo tiene ciertas ventajas prácticas. La orientación de liposomas hacia células específicas representa un área beneficiosa. Más particularmente, dirigir la transfección a células particulares representa un área beneficiosa. Por ejemplo, dirigir la transfección a tipos de células particulares sería particularmente ventajoso en un tejido con heterogeneidad celular, tal como el páncreas, el hígado, el riñón y el cerebro. Los lípidos pueden acoplarse químicamente a otras moléculas con el propósito de orientación. Los péptidos (por ejemplo, hormonas o neurotransmisores), las proteínas tales como anticuerpos, o las moléculas no peptídicas, orientados, pueden acoplarse a liposomas químicamente.

Es posible retirar las células diana del cuerpo, para introducir el vector como un plásmido de DNA desnudo; y a continuación reimplantar las células transformadas en el cuerpo. Vectores de DNA desnudos para terapia génica pueden introducirse en las células huésped deseadas mediante métodos conocidos en la especialidad, por ejemplo, transfección, electroporación, microinyección, transducción, fusión celular, DEAE-dextrano, precipitación con fosfato cálcico, uso de una pistola génica o uso de un transportador vectorial de DNA. Véanse, por ejemplo, Wu y otros, J. Biol. Chem. 267:963-7, 1992; Wu y otros, J. Biol. Chem. 263:14621-4, 1988.

Puede usarse metodología antisentido para inhibir la transcripción de un gen zsig37, tal como para inhibir la proliferación celular in vivo. Polinucleótidos que son complementarios de un segmento de un polipéptido que codifica zsig37 (por ejemplo, un polinucleótido como el indicado en el Nº ID SEC: 1) se diseñan para unirse a mRNA que codifica zsig37 y para inhibir la traducción de tal mRNA. Tales polinucleótidos antisentido se usan para inhibir la expresión de genes que codifican polipéptidos zsig37 en cultivos celulares o en un sujeto.

También pueden generarse ratones transgénicos, manipulados para expresar el gen zsig37, y ratones que exhiben ausencia completa de función del gen zsig37, denominados "ratones knockout" (Snouwaert y otros, Science 257:1083, 1992), (Lowell y otros, Nature 366:740-42, 1993). Estos ratones pueden emplearse para estudiar el gen zsig37 y la proteína codificada por el mismo en un sistema in vivo.

Para el uso farmacéutico, las proteínas de la presente invención se formulan para el aporte parenteral, particularmente intravenoso o subcutáneo, de acuerdo con métodos convencionales. La administración intravenosa se da mediante inyección en bolo o infusión a lo largo de un período típico de una a varias horas. En general, las formulaciones farmacéuticas incluirán una proteína zsig37 en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina, solución salina tamponada, dextrosa al 5% en agua o similares. Las formulaciones pueden incluir además uno o más excipientes, conservantes, solubilizantes, agentes tamponadores, albúmina para prevenir la pérdida de proteína en las superficies de los viales, etc. Métodos de formulación son bien conocidos en la especialidad y se describen, por ejemplo, en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton PA, 19ª ed., 1995. Las dosis terapéuticas serán determinadas generalmente por el médico de acuerdo con patrones aceptados, teniendo en cuenta la naturaleza y la gravedad del estado que ha de tratarse, las características del paciente, etc. La determinación de la dosis está dentro del nivel de experiencia normal en la especialidad.

La invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos no limitativos.

Ejemplo 1 Extensión de la Secuencia de EST

Los nuevos polinucleótidos que codifican polipéptidos zsig37 de la presente invención se identificaron inicialmente seleccionando una EST de una base de datos de EST, prediciendo una secuencia proteínica basada en el mismo, y buscando bases de datos de secuencias conocidas para la proteína secretada que es la más homóloga con la proteína predicha basada en la EST. ESTs que potencialmente codifican proteínas que tienen homología biológicamente interesante con proteínas secretadas conocidas se identificaron para un estudio adicional. Una secuencia de EST simple se descubrió y se predijo que era homóloga con proteína específica para adipocitos. Véase, por ejemplo, Scherer y otros, J. Biol. Chem. 270(45): 26746-9, 1995. Para identificar el cDNA correspondiente, se usó para la secuenciación un clon que se consdieraba que era probable que contuviera toda la secuencia de codificación. Usando un estuche Invitrogen S.N.A.P.™ Miniprep (Invitrogen, Corp., San Diego, CA), de acuerdo con las instrucciones del fabricante, se preparó un cultivo nocturno en LB + 50 \mug/ml de ampicilina. La plantilla se sometió a secuenciación en un secuenciador de DNA ABIPRISM™ modelo 377 (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT.) usando the ABI PRISM™ Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Perkin-Elmer Corp.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los oligonucleótidos ZC695 (Nº ID SEC: 5), ZC694 (Nº ID SEC: 6) hasta los promotores SP6 y T7 en el vector que contiene el clon se usaron como cebadores de secuenciación. Los oligonucleótidos ZC13210 (Nº ID SEC: 7), ZC13588 (Nº ID SEC: 8), ZC13532 (Nº ID SEC: 9), ZC13641 (Nº ID SEC: 10), ZC13586 (Nº ID SEC: 11), ZC13651 (Nº ID SEC: 12), ZC13622 (Nº ID SEC: 13), ZC13625 (Nº ID SEC: 14), ZC13650 (Nº ID SEC: 15), ZC13589 (Nº ID SEC: 16), ZC13624 (Nº ID SEC: 17), ZC13531 (Nº ID SEC: 18), ZC13587 (Nº ID SEC: 19) y ZC13623 (Nº ID SEC: 20) se usaron para completar la secuencia a partir del clon. Se llevaron a cabo reacciones de secuenciación en un Hybaid OmniGene Temperature Cycling System (National Labnet Co., Woodbridge, NY). Se usó para el análisis de datos software de análisis de secuencia SEQUENCHER™ 3.0 (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI). La secuencia de 2769 pb resultante se describe en el Nº ID SEC: 1. La comparación de la secuencia de EST derivada originalmente con la secuencia representada en el Nº ID SEC: 1 mostraba que existía una ambigüedad de pares de bases (un residuo de "N" desconocido) y no había interacciones de pares de bases que dieran como resultado la identificación de leucina en la resolución de la ambigüedad y desplazamientos del marco cero entre las secuencias de aminoácidos deducidas.

Ejemplo 2 Distribución en Tejidos

Se realizaron Northerns usando Human Multiple Tissue Blots de Clontech (Palo Alto, CA). Una sonda de DNA de 30 bases (ZC12447; Nº ID SEC: 4) hasta el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos de la proteína madura mostrada en el Nº ID SEC: 1 se trazó radiactivamente con ^{32}P usando polinucleótido quinasa de T4 y tampón de reacción directa (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD) de acuerdo con las especificaciones del fabricante. La sonda se purificó usando una columna de arrastre NUCTRAP (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA). Se usó solución EXPRESSHYB (Clontech, Palo Alto, CA) para la prehibridación y como una solución de hibridación para las transferencias Northern. La hibridación tuvo lugar durante la noche a 50ºC y las transferencias se lavaron a continuación en 2 x SSC y SDS al 0,1% a TA, seguido por un lavado en 1 x SSC y SDS al 0,1% a 68ºC (aproximadamente 5ºC menos que el punto de fusión). Un tamaño del transcrito se observó en aproximadamente 2,8 kb. La intensidad de señal era la más alta para el corazón y la placenta, con señales relativamente menos intensas en el riñón, el ovario, la glándula suprarrenal y el músculo esquelético y señales más bajas en una amplia variedad de otros tejidos presentes en la transferencia Northern.

Se realizó un análisis de transferencia Northern adicional usando una transferencia Northern de tejido intestinal. La transferencia se preparó usando mRNA de línea celular de adenocarcinoma colorrectal humano SW480 (Clontech, Palo Alto, CA), tejido de intestino delgado humano (Clontech), tejido de estómago humano (Clontech), línea celular de músculo liso intestinal humano (Hism; ATCC Nº CRL-1692; American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD), línea celular de colon humano normal (FHC; ATCC Nº CRL-1831; American Type Culture Collection) y línea celular de intestino delgado humano fetal normal (FHs74 Int.; ATCC Nº CCL241; American Type Culture Collection).

Los RNAs totales se aislaron de Hism, FHC y FHs74 Int. mediante el método del guanidinio ácido (Cheomczynski y otros, Anal. Biochem. 162:156-9, 1987). Los RNAs de poliA^{+} se seleccionaron eluyendo RNA total a través de una columna que retiene RNAs de poliA^{+} (Aviv y otros, Proc. Nat. Acad. Sci. 69:1408-12, 1972). Se separaron 2 \mug de RNA de poliA^{+} de cada muestra en un gel de agarosa al 1,5% en formaldehído 2,2 M y tampón de fosfato. Los RNAs se transfirieron a membrana Nytran (Schleicher y Schuell, Keene, NH) en 20 x SSC durante la noche. La transferencia se trató en el UV Stratalinker 2400 (Stratagene, La Jolla, CA) a 0,12 Julios. La transferencia se horneó a 80ºC durante una hora.

cDNA de longitud completa (mostrado en el Nº ID SEC: 1) se amplificó mediante PCR y se radiotrazó con ^{32}P dCTP usando un Rediprime pellet kit (Amersham, Arlington Heights, IL) de acuerdo con las especificaciones del fabricante. La transferencia se hibridó en EXPRESSHYB (Clontech) a 56ºC durante la noche. La transferencia se lavó a temperatura ambiente en 2 x SSC y SDS al 0,1%, a continuación en 2 x SSC y SDS al 0,1% a 65ºC y finalmente a 65ºC en 0,1 x SSC y SDS al 0,1%. Los resultados mostraban que zsig37 se hibridaba a todos los tejidos excepto a la línea celular del músculo liso intestinal humano HISM.

Ejemplo 3 Mapeo Cromosómico del Gen Zsig37

El gen zsig37 se mapeó hasta el cromosoma humano 17, región 17q25.2, mediante PCR usando the NIGMS Human/Rodent Somatic Cell Hybrid Mapping Panel Number 2 (National Institute of General Medical Sciences, Coriell Institute of Medical Research). El panel consistía en DNA aislado de 24 híbridos de células somáticas de ser humano/roedor que retenían cada uno un cromosoma humano específico y los DNAs parentales. Para el mapeo del gen zsig37, se establecieron reacciones de 20 \mul en una placa de microvaloración de 96 pocillos (Stratagene, La Jolla, CA) y se usaron en un ciclador térmico "RoboCycler Gradient 96" (Stratagene). Cada una de las 27 reacciones de PCR consistía en 2 \mul de 10 x tampón de reacción de PCR KlenTaq (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA), 1,6 \mul de mezcla de dNTPs (2,5 mM cada uno, PERKIN-ELMER, Foster City, CA), 1 \mul de cebador de sentido (Nº ID SEC: 21), 1 \mul de cebador antisentido (Nº ID SEC: 22), 2 \mul de RediLoad (Research Genetics, Inc.), 0,4 \mul de 50X Advantage KlenTaq Polymerase Mix (Clontech Laboratories, Inc.), 25 ng de DNA procedente de un clon híbrido individual o un control y ddH_{2}O para un volumen total de 20 \mul. Las reacciones se cubrieron con una cantidad igual de aceite mineral y se sellaron. Las condiciones del ciclador de PCR eran como sigue: una desnaturalización inicial de 1 ciclo de 5 minutos a 95ºC, 35 ciclos de una desnaturalización de 1 minuto a 95ºC, 1 minuto de reasociación a 60ºC y 1,5 minutos de extensión a 72ºC, seguido por una extensión final de 1 ciclo de 7 minutos a 72ºC. Las reacciones se separaron mediante electroforesis sobre un gel de agarosa NuSieve GTG al 3% (FMC Bioproducts, Rockland, ME).

Ejemplo 4 Creación de vectores de expresión de mamífero zsig37NEE/pZP9 y zsig37CEE/tZP9

Se prepararon dos vectores de expresión para el polipéptido zsig37, zSIG37NEE/pZP9 y zSIG37CEE/pZP9, en donde los constructos se diseñaron para expresar un polipéptido zsig37 que tenía una etiqueta Glu-Glu C- o N-terminal.

Zsig37NEE/pZP9

Se creó un fragmento de DNA de zsig-37 generado por PCR de 800 pb usando ZC15040 (Nº ID SEC: 24) y ZC15033 (Nº ID SEC: 25) como cebadores de PCR y la plantilla descrita en el Ejemplo 1 anteriormente. La reacción de PCR se incubó a 94ºC durante 3 minutos y a continuación se puso en marcha durante 5 ciclos de 94ºC durante 30 segundos, 30ºC durante 20 segundos y 72ºC durante 1 minuto, seguido por 25 ciclos a 94ºC durante 30 segundos, 64ºC durante 20 segundos y 72ºC durante 1 minuto. Siguió una extensión de 5 minutos a 72ºC. Se hizo que el producto PCR resultante recorriera continuación un gel de agarosa con TBE al 0,9% con 1 x tampón de TBE. Una banda del tamaño predicho se cortó y el DNA se purificó del gel con una resina Qiaex II® (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El DNA se digirió con las enzimas de restricción Bam HI y Xba I, seguido por extracción y precipitación.

El fragmento de DNA de zsig37 digerido por restricción cortado se subclonó en el plásmido NEE/pZP9 que se había cortado con las enzimas de restricción Bam HI y Xba I. El vector de expresión zsig37NEE/pZP9 incorpora el líder de TPA y empalma a una etiqueta Glu-Glu (Nº ID SEC: 26) al extremo N de la secuencia polinucleotídica que codifica el polipéptido zsig37. El plásmido NEE/pZP9 (depositado en the American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, ATCC Nº 98668) es un vector de expresión de mamífero que contiene un casete de expresión que tiene el promotor de metalotioneína 1 de ratón, un péptido líder de TPA seguido por la secuencia que codifica la etiqueta Glu-Glu (Nº ID SEC: 26), múltiples sitios de restricción para la inserción de secuencias de codificación y un terminador de hormona del crecimiento humana. El plásmido también contiene un origen de replicación de E. coli, una unidad de expresión de marcador seleccionable de mamífero que tiene un promotor de SV40, un potenciador y un origen de replicación, un gen DHFR y el terminador de SV40.

zsig376CEE/pZP9

Se creó un fragmento de DNA de zsig37 generado por PCR de 866 pb de acuerdo con el procedimiento indicado anteriormente usando ZC15721 (Nº ID SEC: 27) y ZC15035 (Nº ID SEC: 28) como cebadores de PCR. El fragmento de PCR purificado se digirió con las enzimas de restricción Eco RI y Bam HI, se purificó con gel usando una resina Qiaex II según se describe anteriormente.

El DNA de zsig37 cortado y digerido por restricción se subclonó en el plásmido CEE/pZP9 que se había cortado con Eco RI y Bam HI. El vector de expresión zsig37CEE/pZP9 usa el péptido de señal zsig37 natural y el epítopo Glu-Glu (Nº ID SEC: 26) está enlazado en el extremo C como un adyuvante de la purificación. El plásmido CEE/pZP9 (depositado en the American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, ATCC Nº 98668) es un vector de expresión de mamífero que contiene un casete de expresión que tiene el promotor de metalotioneína 1 de ratón, múltiples sitios de restricción para la inserción de secuencias de codificación, una secuencia que codifica la etiqueta Glu-Glu (Nº ID SEC: 26), un codón de parada y un terminador de hormona del crecimiento humana. El plásmido también tiene un origen de replicación de E. coli, una unidad de expresión de marcador seleccionable de mamífero que tiene un promotor de SV40, un potenciador y un origen de replicación, un gen DHFR y el terminador de SV40.

Para los constructos etiquetados en N y C, aproximadamente 30 ng de los insertos digeridos por restricción y 50 ng de los vectores correspondientes se ligaron a temperatura ambiente durante 4 horas. Un microlitro de cada reacción de ligación se sometió a electroforesis independientemente en células del complemento DH10B (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD) de acuerdo con la dirección del fabricante y se cultivó en placa sobre placas LB que contenían 50 mg/ml de ampicilina, y se incubó durante la noche.

Las colonias se rastrearon mediante PCR según se describe anteriormente. Para rastreos de zsig37NEE/pZP9 y zsig37CEE/pZP9 los cebadores eran ZC13006 (Nº ID SEC: 29) y ZC13007 (Nº ID SEC: 20). La reacción de PCR se incubó a 94ºC durante 2,5 minutos y a continuación se puso en marcha durante 25 ciclos de 94ºC durante 10 minutos, 58ºC durante 20 segundos y 72ºC durante 1 minuto. Siguió una extensión de 5 minutos a 72ºC. La secuencia del inserto de clones positivos, 1013 pb para zsig37NEE y un fragmento de 950 pb para zsig37CEE, se verificó mediante análisis de secuencias. Se realizó una preparación de plásmidos a gran escala usando un QIAGEN® Maxi prep kit (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Ejemplo 5 Transfección y Expresión de Polipéptidos zsig37NEE y CEE

Células BHK 570 (Nº ATCC CRL-10314) se cultivaron en placas en platos de cultivo tisular de 10 cm y se dejaron crecer hasta aproximadamente 50 a 70% de confluencia durante la noche a 37ºC, CO_{2} al 5%, en medio de DMEM/FBS (DMEM, Gibco/BRL High Glucose, (Gibco BRL, Gaithersburg, MD), suero bovino fetal al 5% (Hyclone, Logan, UT), L-glutamina 2 \muM (JRH Biosciences, Lenexa, KS), piruvato sódico 1 \muM (Gibco BRL)). Las células se transfectaron a continuación con el plásmido zsig37NEE/pZP9 (etiqueta Glu-Glu N-terminal) o zsig37CEE/pZP9 (etiqueta Glu-Glu C-terminal), usando Lipofectamine™ (Gibco BRL), en formulación de medio libre de suero (SF) (DMEM, Gibco/BRL High Glucose, (Gibco BRL, Gaithersburg, MD), L-glutamina 2 mM, piruvato sódico 2 mM, 10 \mug/ml de transferrina, 5 \mug/ml de insulina, 10 \mug/ml de fetuína y 2 ng/ml de selenio). Dieciséis microgramos de zsig37NEE/pZP9 y 16 \mug de zsig37CEE/pZP9 se diluyeron separadamente en tubos de 15 ml hasta un volumen final total de 640 ml de medio SF. En tubos separados, 35 \mul de Lipofectamine™ (Gibco BRL) se mezclaron con 605 \mul de medio SF. La mezcla de Lipofectamine™ se añadió a la mezcla de DNA y se dejó incubar aproximadamente 30 minutos a temperatura ambiente. Se añadieron 5 mililitros de medio SF a la mezcla de DNA:Lipofectamine™. Las células se enjuagaron una vez con 5 ml de medio SF, se aspiraron y se añadió la mezcla de DNA:Lipofectamine™. Las células se incubaron a 37ºC durante 5 horas y a continuación se añadieron a la placa 6,4 ml de DMEM/FBS al 10%, medio PSN al 1%. La placa se incubó a 37ºC durante la noche y la mezcla de DNA:Lipofectamine™ se reemplazó por medio de FBS/DMEM reciente al día siguiente. El día 2 después de la transfección, las células se dividieron en el medio de selección (ESTEP Nº 1 con MTX 1 \muM) en placas de 150 mm a 1:50, 1:100 y 1:200. Las placas se realimentaron el día 5 después de la transfección con medio de selección reciente.

Rastreo de colonias

Aproximadamente 10-12 días después de la transfección, un plato de cultivo de 150 mm de colonias resistentes a metotrexato se eligió de cada transfección, el medio se aspiró, las placas se lavaron con 10 ml de medio ESTEP 2 libre de suero (668,7 g/50 l de DMEM (Gibco), 5,5 g/50 l de sal sódica de ácido pirúvico al 96% (Mallinckrodt), 185,0 g/50 l de NaHCO_{3} (Mallinkrodt), 5,0 mg/ml, 25 ml/50 l de insulina, 10,0 mg/ml y 25 ml/50 l de transferrina). El medio de lavado se aspiró y se reemplazó por 5 ml de ESTE 2 libre de suero. Malla de Teflon estéril (Spectrum Medical Industries, Los Ángeles, CA) preembebida en ESTPE 2 libre de suero se puso a continuación sobre las células. Un filtro de nitrocelulosa estéril preembebido en ESTEP 2 libre de suero se puso a continuación sobre la malla. Las marcas de orientación sobre la nitrocelulosa se transfirieron al plato de cultivo. Las placas se incubaron a continuación durante 5-6 horas en un incubador con CO_{2} al 5% a 37ºC. Después de la incubación, el filtro se retiró y el medio se aspiró y se reemplazó por DMEM/FBS al 5%, 1 x medio PSN (Gibco BRL). El filtro se puso a continuación en una bolsa sellable que contenía 50 ml de tampón (Tris 25 mM, glicina 25 mM, \beta-mercaptoetanol 5 mM) y se incubó en un baño de agua a 65ºC durante 10 minutos. Los filtros se bloquearon en leche en polvo desnatada al 10%/tampón Western A (Western A: Tris 50 mM, pH 7,4, EDTA 5 mM, NP-40 al 0,05%, NaCl 150 mM y gelatina al 0,25%) durante 15 minutos a temperatura ambiente en un agitador giratorio. El filtro se incubó a continuación con un conjugado de anticuerpo anti-Glu-Glu-HRP a una dilución 1:1000 en leche en polvo desnatada al 2,5%/tampón Western A (Western A: Tris 50 mM, pH 7,4, EDTA 5 mM, NP-40 al 0,05%, NaCl 150 mM y gelatina al 0,25%) durante la noche a 4ºC en un agitador giratorio. El filtro se lavó a continuación tres veces a temperatura ambiente en BPS más Tween 20 al 0,1%, 5-15 minutos por lavado. El filtro se reveló con reactivo ECL (Amersham Corp., Arlington Heights, IL) de acuerdo con las directrices del fabricante y se expuso a película (Hyperfilm ECL, Amersham) durante aproximadamente 5 minutos.

La película se alineó con la placa que contenía las colonias. Usando la película como guía, se seleccionaron colonias adecuadas. Discos de colonización de 3 mm estériles (PGC Scientific Corp., Frederick, MD) se embebieron en tripsina y se pusieron sobre las colonias. Veinte colonias para cada constructo se transfirieron a 200 \mul de medio de selección en una placa de 96 pocillos. Una serie de siete diluciones de dos veces se llevó a cabo para cada colonia. Las células se hicieron crecer durante una semana a 37ºC, momento en el cual los pocillos que recibían la dilución más baja de células que están ahora a la densidad óptima se seleccionaban, se tripsinizaban y se transferían a una placa de 12 pocillos que contenía medio de selección. El plato de cultivo de 150 mm también se tripsinizó y el resto de las células se reunieron y se sometieron a análisis Western y prueba con micoplasmas. La fracción reunida se congeló para el almacenamiento.

Los clones se expandieron directamente a partir de la placa de 12 pocillos en dos matraces T-75. Un matraz se mantuvo para continuar el crecimiento celular, el segundo matraz se hizo crecer en ESTP 2 libre de suero que se recogió para análisis de transferencia Western. Se seleccionaron clones de cada uno de los constructos de expresión, basándose en análisis de transferencia Western, se reunieron y se transfirieron a un cultivo a gran escala.

Ejemplo 6 Expresión de zsig37CEE en Mamíferos a Gran Escala

Un matraz T-162, que contenía células confluentes que expresan zsig37CEE y uno que contenía zsig37NEE obtenidos del procedimiento de expresión descrito anteriormente se expandieron en cuatro matraces T-162 cada uno. Uno de los cuatro matraces resultantes se usó para congelar cuatro crioviales y los otros tres matraces se usaron para generar una fábrica de células Nunc.

Las células procedentes de los tres matraces T-162 de zsig37CEE y zsig37NEE se usaron para sembrar independientemente dos fábricas de células Nunc (10 capas, disponibles comercialmente de VWR). Brevemente, las células procedentes de los matraces T-162 descritos anteriormente se separaron usando tripsina, se reunieron y se añadieron a 1,5 litros de medio ESTEP1 (668,7 g/50 l de DMEM (Gibco), 5,5 g/50 l de ácido pirúvico, sal sódica al 96% (Mallinckrodt), 185,0 g/50 l de NaHCO_{3} (Mallinckrodt), 5,0 mg/ml y 25 ml/50 l de insulina (JRH Biosciences), 10,0 mg/ml y 25 ml/50 l de transferrina (JRH Biosciences), 2,5 l/50 l de suero bovino fetal (caracterizado) (Hyclone), MTX 1 \muM, con el pH ajustado hasta 7,05 +/- 0,05) precalentado hasta 37ºC. El medio que contenía las células se vertió a continuación en las fábricas de células Nunc a través de un embudo. Las fábricas de células se pusieron en una incubadora de 37ºC/CO_{2} al 5,0%.

A 80-100% de confluencia, se realizó una prueba de contaminación visual (cambio en el color de rojo fenol) sobre el contenido de las fábricas de células Nunc. Puesto que no se observaba contaminación, el sobrenadante de las fábricas confluentes se vertió en un pequeño recipiente de recogida, se muestreó y se descartó. Las células adherentes se lavaron a continuación una vez con 400 ml de PBS. Para separar las células de las fábricas, se añadieron 100 ml de tripsina a cada una y se retiraron y las células se incubaron a continuación durante de 5 a 10 minutos en la tripsina residual. Las células se recogieron después de dos lavados de 200 ml con medio ESTP1. A cada una de diez botellas que contenían medio ESTEP1 (1,5 litros cada una, a 37ºC) se añadieron 40 ml de células recogidas. Una botella de 1,5 litros se usó a continuación para rellenar una fábrica de Nunc. Cada fábrica de células se puso en una incubadora de 37ºC/CO_{2} al 5,0%.

A una confluencia de 80-90%, se realizó una prueba de contaminación visual (cambio de color de rojo fenol) sobre las fábricas de células Nunc. Puesto que no se observaba contaminación, el sobrenadante de las fábricas confluentes se vertió en un pequeño recipiente de recogida, se muestreó y se descartó. Las células se lavaron a continuación una vez con 400 ml de PBS. Se añadieron a cada fábrica de células Nunc 1,5 litros de medio ESTEP2 (668,7 g/50 l de DMEM (Gibco), 5,5 g/50 l de sal sódica de ácido pirúvico al 96% (Mallinckrodt), 185,0 g/50 l de NaHCO_{3} (Mallinkrodt), 5,0 mg/ml, 25 ml/50 l de insulina, 10,0 mg/ml y 25 ml/50 l de transferrina). Las fábricas de células se incubaron a 37ºC/CO_{2} al 5,0%.

En aproximadamente 48 horas se realizó una prueba de contaminación visual (cambio de color de rojo fenol) sobre las fábricas de células Nunc. El sobrenadante de cada fábrica se vertió en pequeños recipientes de recogida. Se vertió medio libre de suero reciente (1,5 litros) en cada fábrica de células Nunc y las fábricas se incubaron a 37ºC/CO_{2} al 5,0%. Un ml de recogida de sobrenadante para cada constructo se transfirió a un portaobjetos de microscopio y se sometió a análisis microscópico con respecto a la contaminación. El contenido de los pequeños recipientes de recogida para cada constructo se reunió y se filtró inmediatamente. Se realizó a continuación una segunda recogida, substancialmente como se describe anteriormente, a las 48 horas, y las fábricas de células se descartaron a continuación. Un aparato de tren filtrante montado asépticamente se usó para la filtración aséptica del sobrenadante de recogida (medio acondicionado). El montaje era como sigue: el tubo estaba atado con alambre a un filtro OptiCap (Millipore Corp., Bedford, MA) y un filtro Supercap 50 (Gelman Sciences, Ann Arbor, MI). El filtro Supercap 50 también estaba empalmado a un recipiente tapado estéril situado en una tolva; el tubo situado aguas arriba del filtro Millipore Opti-cap se insertó en una bomba peristáltica y el extremo libre del tubo se puso en el recipiente de recogida grande. La bomba peristáltica se puso en marcha entre 200 y 300 rpm, hasta que todo el medio acondicionado pasaba a través del filtro final de 0,22 \mum hacia un recipiente de recolección estéril. El filtrado se puso en una cámara fría a 4ºC pendiente de purificación. El medio se concentró 10 veces con un concentrador de separación de 5 kDA Millipore (Millipore, Bedford, MA) de acuerdo con la directriz del fabricante y se sometió a análisis de transferencia Western usando un anticuerpo de etiquetaje anti-FLAG (Kodak).

Zsig37CEE:
5 Matraces T-162 =	0,12 mg/l, 38 kDa;
1 Fábrica, FBS =	0,12 mg/l, 38 kDa;
10 Fábricas, FBS =	0,12 mg/l, 38 kDa;
10 Fábricas (Nº 1), SF =	1,2 mg/l, 38 kDa; y
10 Fábricas (Nº 2), SF =	3,56 mg/l, 38 kDa.

Zsig37NEE:
5 Matraces T-162 =	0,137 mg/l, 35 kDa;
1 Fábrica, FBS =	0,137 mg/l, 35 kDa;
10 Fábricas, FBS =	0,137 mg/l, 35 kDa;
10 Fábricas (Nº 1), SF =	1,37 mg/l, 35 kDa; y
10 Fábricas (Nº 2), SF =	4,11 mg/l, 35 kDa.

Ejemplo 7 Purificación de zsig37 NEE y zsig37 CEE

A no ser que se apunte otra cosa, todas las operaciones se llevaron a cabo a 4ºC. El siguiente procedimiento se usó para purificar zsig37 que contenía etiquetas Glu-Glu (EE) N-terminales o C-terminales. Un total de 25 litros de medio acondicionado de células de riñón de hámster recién nacido (BHK) se filtró estérilmente secuencialmente a través de un filtro de cápsula Millipore (Bedford, MA) OptiCap capsule 0,2 mM de cuatro pulgadas (10,2 cm) y un Gelman (Ann Arbor, MI) Supercap 50 0,2 mM. El material se concentró a continuación hasta 1,3 litros usando un concentrador de flujo tangencial Millipore ProFlux A30 equipado con una membrana Amicon (Bedford, MA) S10Y3 de 3000 kDa de separación. El material concentrado se filtró estérilmente de nuevo con el filtro Gelman según se describe anteriormente. Una mezcla de inhibidores de proteasa se añadió al medio acondicionado concentrado hasta concentraciones finales de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA, Sigma Chemical Co. St. Louis, MO) 2,5 mM, leupeptina (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN) 0,001 mM, pepstatina (Boehringer-Mannheim) 0,001 mM y Pefabloc (Boehringer-Mannheim) 0,4 mM. Una muestra de 25,0 ml de Sepharose anti-EE, preparada como se describe posteriormente, se añadió a la muestra para la adsorción de la partida y la mezcla se agitó suavemente en un aparato de cultivo rotatorio Wheaton (Millville, NJ) durante 18,0 h a 4ºC.

La mezcla se vertió a continuación en una Econo-Column (Bio-Rad, Laboratories, Hercules, CA) de 5,0 x 20,0 cm y el gel se lavó con 30 volúmenes de columna de solución salina tamponada con fosfato (PBS). La fracción pasante no retenida se descartó. Una vez que la absorbancia del efluente a 280 nM era menor que 0,05, el flujo a través de la columna se redujo hasta cero y el gel de Sepharose anti-EE se lavó discontinuamente con 2,0 volúmenes de columna de PBS que contenía 0,4 ng/ml de péptido EE (AnaSpec, San José, CA). El péptido usado tiene la secuencia Glu-Tyr-Met-Pro-Val-Asp, Nº ID SEC: 31). Después de 1,0 h a 4ºC, el flujo se reanudó y la proteína eluida se recogió. Esta fracción se denomina la elución de péptido. El gel de Sepharose anti-EE se lavó a continuación con 2,0 volúmenes de columna de glicina 0,1 M, pH 2,5, y el lavado de glicina se recogió separadamente. El pH de la fracción eluida con glicina se ajustó hasta 7,0 mediante la adición de un pequeño volumen de 10 x PBS y se almacenó a 4ºC para el análisis futuro, si era necesario.

La elución del péptido se concentró hasta 5,0 ml usando un concentrador de membrana de una separación de peso molecular 15.000 (Millipore, Bedford, MA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La elución de péptido concentrada se separó del péptido libre mediante cromatografía en una columna Sephadex G-50 (Pharmacia, Piscataway, NJ) de 1,5 x 50 cm equilibrada en PBS a un caudal de 1,0 ml/minuto usando una BioCad Sprint HPLC (PerSeptive BioSystems, Framingham, MA). Se recogieron fracciones de 2 ml y se verificó la absorbancia a 280 nM. Se recogió el primer pico de material que absorbe a 280 nM y que se eluye cerca del volumen de huecos de la columna. Esta fracción era zsig37 NEE o zsig37 CEE puro. El material puro se concentró como se describe anteriormente, se analizó mediante SDS-PAGE y se sometió a transferencia Western con anticuerpos anti-EE, y se tomaron muestras para el análisis de aminoácidos y la secuenciación N-terminal. El resto de la muestra se dividió en partes alícuotas y se almacenó a -80ºC de acuerdo con los procedimientos estándar de los presentes inventores.

La electroforesis de zsig37 NEE sobre geles de SDS-PAGE en ausencia de agentes reductores mostraba una banda principal teñida con azul de Coomassie de un peso molecular aparente de 39.000 y varios componentes secundarios de pesos moleculares entre 60.000 y 116.000. Todas las bandas mostraban reactividad cruzada con anticuerpos anti-EE en las transferencias Western. En presencia de agente reductor, la única banda observada era la proteína de 39.000 kDa y su intensidad de tinción con azul de Coomassie se incrementaba. Esta banda también mostraba reactividad cruzada con el anticuerpo anti-EE en las transferencias Western.

Para zsig37 CEE, la electroforesis sobre geles de SDS-PAGE en ausencia de agentes reductores mostraba una banda principal teñida con azul de Coomassie de peso molecular aparente 39.000 y varios componentes secundarios de pesos entre 60.000 y 116.000. En las transferencias Western, solo las bandas de pesos moleculares aparentes 150.000, 116.000 y 60.000 mostraban reactividad cruzada con el anticuerpo anti-EE. En presencia de agentes reductores, solo se observaba la banda teñida con azul de Coomassie a 39.000 kDa y este material mostraba reactividad cruzada con el anticuerpo anti-EE en las transferencias Western. Bajo estas condiciones, también se observaba una pequeña cantidad de material reactivo cruzadamente a 150.000 kDa.

Preparación de Sepharose anti-EE

Un volumen de lecho de 100 ml de proteína G-Sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ) se lavó tres veces con 100 ml de PBS que contenía azida sódica al 0,02% usando una unidad de filtración de 0,45 micras Nalgene de 500 ml. El gel se lavó con 6,0 volúmenes de trietanolamina 200 mM, pH 8,2 (TEA, Sigma, St. Louis, MO) y se añadió un volumen igual de solución de anticuerpo EE que contenía 900 mg de anticuerpo. Después de una incubación nocturna a 4ºC, el anticuerpo no unido se retiró lavando la resina con 5 volúmenes de TEA 200 mM según se describe anteriormente. La resina se resuspendió en 2 volúmenes de TEA, se transfirió a un recipiente adecuado y se añadió dimetilpimilimidato-2HCl (Pierce, Rockford, IL), disuelto en TEA, hasta una concentración final de 36 mg/ml de gel. El gel se hizo oscilar a temperatura ambiente durante 45 minutos y el líquido se retiró usando la unidad filtrante según se describe anteriormente. Los sitios no específicos en el gel se bloquearon a continuación incubando durante 10 minutos a temperatura ambiente con 5 volúmenes de etanolamina 20 mM en TEA 200 mM. El gel se lavó con 5 volúmenes de PBS que contenía azida sódica al 0,02% y se almacenó en esta solución a 4ºC.

Ejemplo 8 Ensayos de Adhesión y Proliferación

La capacidad de zsig37 para estimular la adhesión y la extensión de células TF-1 se ensayó como sigue. Se preparó una serie de diluciones a partir de zsig37 etiquetado con Glu-Glu C-terminal, de 10 a 0,0625 \mug/ml, en PBS o tampón de revestimiento de ELISA (NaCO_{3} 0,1 M) y cada una se cultivó en placa en una placa de 96 pocillos (Costar, Pleasanton, CA) a 100 \mul/pocillo. Las placas se incubaron a 37ºC, CO_{2} al 5%, durante 2 horas. Las placas se lavaron a continuación 3 veces con RPMI/FBS al 10% (RPMI 1640, L-glutamina 2 mM, 110 \mug/ml de piruvato sódico, PSN y suero bovino fetal inactivado térmicamente al 10%) y se dejaron bloquear durante 15 minutos.

Células TF-1 (derivadas de células de leucemia mieloide aguda) se resuspendieron en RMPI/FBS al 10% y se cultivaron en placas a 10.00 células/pocillo en las placas de 96 pocillos revestidas con zsig37CEE a un volumen final de 120 \mul/pocillo. La placa se incubó a 37ºC bajo CO_{2} al 5% durante 2 horas. Las placas se lavaron a continuación 3 veces con PBS y se añadieron 200 \mul/pocillo de medio de crecimiento (RPMI/FBS al 10%, 5 ng/ml de GM-CSF). Las células se inspeccionaron microscópicamente antes y después del lavado.

También se usó un ensayo de incorporación de colorante para medir cuantitativamente el número de células adherentes basándose en un cambio colorimétrico y un incremento en la señal fluorescente. Se añadió Alamar Blue™ (AccuMed, Chicago, IL) a las placas de 96 pocillos y las células se incubaron a 37ºC bajo CO_{2} al 5% durante la noche. Las placas se exploraron a continuación usando un fluorómetro con una longitud de onda de excitación de 544 nm y una longitud de onda de emisión de 590 nm. Había más células adherentes sobre las placas revestidas con zsig37CEE-PBS que sobre las placas revestidas con zsig37CEE-NaCO_{3} 0,1 M. La adición de zsig37 soluble no bloqueaba la adhesión de células al zsig37 unido.

Se realizó un segundo ensayo usando TF-1, DA-1 (una línea celular dependiente de IL-3 derivada del nódulo linfático de un ratón con un linfoma de células B mediante crecimiento externo en medio IL-3 (proporcionado por el Dr. Kenneth Kaushansky, University of Washington, Seattle, WA)), pre-B (células de médula ósea de ratón p53-/-, dependientes de IL-7, B220+, bajas en Thy1, Sca-1+) y líneas celulares A7BaF-3 según se describe anteriormente a 5.000 células/pocillo. Las células BHK también se cultivaron en placa a 500 células/pocillo. El zsig37 potenciaba el crecimiento de células A7-BaF-3 e inhibía ligeramente el crecimiento de células DA-1.

Ejemplo 9 Secuencia Ortóloga de Ratón

Los nuevos polinucleótidos que codifican polipéptidos zsig37 humanos de la presente invención se usaron para rastrear una base de datos de EST de ratón con respecto a secuencias de ratón homólogas. Se descubrió una sola secuencia de EST y se predijo con respecto a la secuencia de zsig37 humano. Para identificar el cDNA correspondiente, un clon que se consideraba probable que contuviera toda la secuencia de codificación se usó para la secuenciación. Usando un Invitrogen S.N.A.P.™ Miniprep kit (Invitrogen Corp.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, se preparó un cultivo nocturno de 5 ml en LB + 50 \mug/ml de ampicilina. La plantilla se sometió a secuenciación en un secuenciador de DNA ABIPRISM™ modelo 377 (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT.) usando el ABI PRISM™ Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Perkin-Elmer Corp.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los oligonucleótidos ZC694 (Nº ID SEC: 6), ZC6768 (SEQ IDNO: 32), ZC18297 (SEQ IDNO: 33), ZC18298 (Nº ID SEC: 34), ZC18402 (Nº ID SEC: 35), ZC18403 (Nº ID SEC: 36), ZC18456 (Nº ID SEC: 37), ZC18457 (Nº ID SEC: 38), ZC18560 (Nº ID SEC: 39), ZC18561 (Nº ID SEC: 40), ZC18687 (Nº ID SEC: 41) y ZC18688 (Nº ID SEC: 42) se usaron para completar la secuencia a partir del clon. Las reacciones de secuenciación se llevaron a cabo en un Hybaid OmniGene Temperature Cycling System (National Labnet Co., Woodbridge, NY). Se usó software para el análisis de secuencias SEQUENCHER™ 3.1 (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI) para el análisis de datos. La secuencia de 2559 pb resultante se describe en el Nº ID SEC: 43 y la secuencia de aminoácidos deducida en el Nº ID SEC: 44. El alineamiento con la secuencia de nucleótidos de zsig37 humano (Nº ID SEC: 1) muestra 77% de identidad a nivel de nucleótidos. La secuencia de aminoácidos putativa (Nº ID SEC: 44) tiene 77% de identidad con la secuencia del polipéptido humano (Nº ID SEC: 2).

Ejemplo 10 Ensayos Basados en Células

Se analizaron polipéptidos zsig37 en un ensayo in vitro de alto rendimiento para identificar substancias que activan selectivamente respuestas celulares en líneas celulares de osteoblastos inmortalizados. Una línea celular de osteoblastos maduros derivada de ratones p53-/- (deficientes), CCC4, que se transfecta con un plásmido que contiene un elemento de respuesta a suero (SRE) inducible que conduce a la expresión de luciferasa se usó en el ensayo. Estas células también expresan receptores de PTH, PDGF y bFGF endógenos. La estimulación del SRE y así la expresión de luciferasa en las células CCC4 indica que es probable que la entidad química estimule la mitogénesis en osteoblastos.

Líneas CCC4 se tripsinizaron y se ajustaron hasta 5 x 10^{4} células/ml en medio de cultivo en placa (alfa-MEM, suero bovino fetal inactivado térmicamente al 1%, piruvato Na 1 mM y L-glutamato 2 mM) y se cultivaron en placas (200 \mul/pocillo) en placas de microvaloración blancas opacas Dynatech Microlite (Dynatech, Chantilly, VA) y se incubaron durante la noche a 37ºC, CO_{2} al 5%. El medio de crecimiento se aspiró a continuación y se reemplazó por 50 \mul/pocillo de medio de ensayo (F-12 HAM, albúmina de suero bovino al 0,5%, HEPES 20 mM, piruvato Na 1 mM y L-glutamato 2 mM). Se realizaron diluciones en serie de zsig37 en medio de ensayo (concentración de ensayo final 0,29-1000 ng/ml) y se añadieron a los pocillos. Las muestras de zsig37 se ensayaron por triplicado. También se usaron controles de suero (negativos) y bFGF (positivos). La concentración final de bFGF era 3 ng/ml. Los controles se ensayaron por cuadruplicado. Las placas se incubaron durante 4 horas a 37ºC, CO_{2} al 5%. El medio de ensayo se aspiró a continuación y las placas se enjuagaron una vez con PBS. Se añadieron a continuación a cada pocillo 25 \mul de tampón de lisis (Luciferase Assay Reagent, E1501, Promega Corp., Madison, WI). Las placas se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente. Se añadieron 50 microlitros/pocillo de substrato de luciferasa (Luciferase Assay Reagent, E150-1, Promega Corp.) y la actividad de luciferasa se detectó usando un LUMINOSKAN™ de Labsystems a 2 segundos/pocillo después de un retraso de 1 segundo. La señal basal (no inducida) media se substrajo de todas las lecturas que se expresan en la Tabla 5 como un porcentaje de la inducción máxima producida por 3 ng/ml
de bFGF.

El zsig37 estimula la expresión de luciferasa en este ensayo indicando que estimulan los osteoblastos. El zsig37 estimula en un máximo de 73 a 75% a 1000 ng/ml.

Se realizó un ensayo de mimético de factor de crecimiento homólogo para determinar si el zsig37 está actuando como un mimético de factor de crecimiento, particularmente ligandos de receptor de tirosina quinasa PDGF, bFGF y EGF (negativo a insulina-R). Se usó en el ensayo una línea celular clonal derivada de ratones Swiss 3T·, Swiss 3T3, que se transfecta con un plásmido que contiene un elemento de respuesta a suero (SRE) inducible que conduce la expresión de luciferasa. Estas células también expresan receptores de PMA, EGF y bFGF endógenos. La estimulación del SRE y así la expresión de luciferasa en las células Swiss 3T3 indican que es probable que la entidad química imite la actividad de los factores de crecimiento PDGF, bFGF y EGF.

Células Swiss 3T3 se tripsinizaron y se ajustaron hasta 5 x 10^{4} células/ml en medio de cultivo en placa, se cultivaron en placa y se incubaron como se describe anteriormente. El medio de crecimiento se activó a continuación y se reemplazó por 50 \mug/pocillo de medio de ensayo (F-12 HAM, albúmina de suero bovino al 0,5%, HEPES 20 mM). Se realizaron diluciones en serie de zsig37 en medio de ensayo (concentración de ensayo final 0,29-1000 ng/ml) y se añadieron a los pocillos. Las muestras de zsig37 se ensayaron por triplicado. También se usaron un control de suero (negativo) y bFGF (positivo) para promover la proliferación celular. La concentración final de bFGF era 3 ng/ml. Los controles se ensayaron por cuadruplicado. Las placas se incubaron durante 5 horas a 37ºC, CO_{2} al 5%. El medio de ensayo se activó a continuación y las placas se enjuagaron una vez con PBS. Se añadieron a continuación a cada pocillo 25 \mul de tampón de lisis (Luciferase Assay Reagent, E1501, Promega Corp., Madison, WI). Las placas se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente. Se añadieron 40 microlitros/pocillo de substrato de luciferasa (Luciferase Assay Reagent, E150-1, Promega Corp.) y la actividad de luciferasa se detectó usando un LUMINOSKAN™ de Labsystems a 2 segundos/pocillo después de un retraso de 1 segundo. La señal basal (no inducida) media se substrajo de todas las lecturas que se expresan como un porcentaje de la inducción máxima producida por 3 ng/ml de bFGF. Un tratamiento de cinco horas de esta línea celular con bFGF, DDGF, EGF o PMA conduce a una inducción de 25-50 veces de la expresión de luciferasa por SRE.

El zsig37 no parece estimular la expresión de luciferasa en este ensayo. El zsig37 se estimula en un máximo de 0,2 a 0,1% a 1000 ng/ml.

Ejemplo 11 Administración In Vivo de zsig37 a través de Aporte Adenoviral

Se pesaron 24 ratones C57B16/J macho y 24 hembra de aproximadamente 12 semanas de edad (Jackson Labs, Bar Harbor, ME), se midió la temperatura corporal y la toma de alimento se verificó diariamente durante 4 días antes de la inyección (días -4 a -1). El día 0, los ratones se dividieron en tres grupos y recibían 0,1 ml de virus (1,8 x 10^{11} partículas de virus vacías de AdV/0,1 ml o 5 x 10^{11} partículas de virus Adv-zsig37-CEE/0,1 ml) mediante inyección intravenosa en la vena de la cola, o sin inyección. La inyección debe dar como resultado la infección del hígado del huésped y la expresión de gen aportado viralmente debe comenzar en 24 horas y continuar durante de 1 a 4 semanas. Se probaron tres grupos de ratones. Grupo 1, no tratado, n=8 de cada uno de machos y hembras. Grupo 2, vacío de AdV (virus vacío), n=8 de cada uno de machos y hembras. Grupo 3, AdV-zsig37 CEE, n=8 de cada uno de machos y hembras.

Las temperaturas corporales, los pesos de los animales y el peso de alimento ingerido se verificaron durante el estudio de tres semanas. No se encontró diferencia entre los grupos.

El día 21 los ratones hembra se sometieron a eutanasia y se sacrificaron mediante dislocación cervical, y el día 22 los machos. Los animales se exsanguinaron y los tejidos se recogieron para la necropsia.

El panel de la química sérica estándar se realizó en el momento del sacrificio. Los parámetros hepáticos, renales y metabólicos estaban todos dentro de intervalos normales. Sin embargo, existía una diferencia entre el grupo de tratamiento de zsig37 y el grupo tratado con virus vacío. Los animales con zsig37 tenían un índice lipémico medio superior que los controles con virus vacío. La diferencia no era significativa, sin embargo, se justificaba una investigación adicional. Se ensayaron los ácidos grasos libres totales en el suero restante de cada animal. Se observó una diferencia estadísticamente significativa en los niveles de ácidos grasos libres en suero entre ratones macho (p=0,0379) que recibían virus vacío y los que recibían virus que codifica zsig37; los ratones con zsig37 tenían niveles superiores. También se observó una diferencia, aunque no estadísticamente significativa, en las hembras (p=0,3357). El hígado, el bazo, el riñón, el timo, el corazón y el cerebro se pesaron después de la extirpación. No se encontró diferencia entre los grupos de tratamiento. Los análisis histopatológicos de estos tejidos y la médula ósea no revelaban diferencia entre los grupos de tratamiento.

Para confirmar los resultados anteriores se realizó un segundo rastreo como el anterior con las siguientes modificaciones. Se probaron tres grupos: a) sin tratar y en ayunas, b) sin AdV y en ayunas, c) AdV-zsig37-CEE y en ayunas, que contenía 20 C57B16/J, 10 de cada uno de machos y hembras. Los ratones se mantuvieron en ayunas durante la noche y se recogieron 100 \mul de suero para establecer un nivel basal para los siguientes parámetros: glucosa en ayunas, TP, fosfatasa alcalina, colesterol, triglicéridos, ácidos grasos libres e insulina. Los pesos corporales se tomaron tres veces a la semana. El día 0, los ratones fueron inyectados en la vena lateral de la cola con 0,1 ml de la solución de virus apropiada. Se recogió sangre el día 17 después de un ayuno nocturno. Después de 3 semanas los ratones fueron sacrificados y se recogió toda la sangre. Una porción de la sangre se mezcló con EDTA para examinar CBC's y el resto se volvió a ensayar y se rastreó según se describe anteriormente. Los órganos se recogieron y el cadáver se conservó para la histopatología.

<110> ZymoGenetics. Inc.

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<120> HOMÓLOGOS DE PROTEÍNAS ESPECIFICAS DE ADIPOCITOS

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<130> 97-30PC

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<150> 60/053.154

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<151> 1997-07-18

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<160> 44

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<170> FastSEQ para Windows Versión 3.0

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<210> 1

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<211> 2769

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<212> DNA

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<213> Homo sapien

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<220>

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<221> CDS

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<222> (171)...(1013)

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<400> 1

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2

3

4

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<210> 2

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<211> 281

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

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<400> 2

5

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<210> 3

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<211> 247

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<212> PRT

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<213> Homo sapien

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<400> 3

6

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<210> 4

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<211> 30

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido ZC12447

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<400> 4

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\hskip-.1em\dddseqskip

atggggcacg cgactcagga ccaggccaga

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30

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<210> 5

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<211> 19

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido ZC695

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<400> 5

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gatttaggtg acactatag

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19

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<210> 6

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<211> 20

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido ZC694

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<400> 6

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taatacgact cactataggg

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20

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<210> 7

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<211> 20

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido ZC13210

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<400> 7

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aagcaccggg aagcagggag

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20

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<210> 8

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<211> 20

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido ZC13588

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<400> 8

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cgggcacgta gcagtagaac

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20

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<210> 9

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<211> 20

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido ZC13532

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<400> 9

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gagagggctg aagaacaaca

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20

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<210> 10

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<211> 20

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido ZC13641

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<400> 10

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aaggtggcga gaggaaagga

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20

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<210> 11

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<211> 20

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<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido ZC13586

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgttcaccgg caagttctac

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido ZC13651

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctttgtcctc cacggtttac

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido ZC13622

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tttcctctcg ccaccttcca

\hfill

20

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido ZC13625

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cttcggctgc ttctaaccaa c

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido ZC13650

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtaaaccgtg gaggacaaag

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido ZC13859

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gctgccaacc aacacaacca c

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido ZC13624

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcaggattag tcaaaacc

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido ZC13531

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aacatggggt gaggtggaga

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido ZC13587

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcctcgtggg ctaagcatca

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido ZC13623

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atctccagga accccatagc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido ZC14444

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tctccaggaa ccccatag

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido ZC14445

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcaggattag tcaaaacc

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 843

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Polipéptido zsig37 que codifica la secuencia de nucleótidos degenerada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido ZC15040

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

actcattcta gactagggct cggt

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido ZC15033

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atgaatggat ccctggtcct gagt

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido de la etiqueta de afinidad Glu-Glu

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Glu Tyr Met Pro Met Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido ZC15721

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctgtaggaat tcatgggctc ccgt

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido ZC15035

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

attcatggat ccgggctcgg tggc

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido ZC13006

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggctgtcctc taagcgtcac

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido ZC13007

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aggggtcaca gggatgcca

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> péptido Glu-Glu

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Tyr Met Pro Val Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido ZC6768

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcaattaacc ctcactaaag ggaac

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido ZC18297

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcctgaaagg cgagaaaggt g

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido ZC18298

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttccctgagt ctgagctagg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido ZC18402

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tccagagtga ctggggaagt g

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido ZC18403

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agtgacgagt tcgacaccta c

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido ZC18456

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgtgttccca ttcctggaca c

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido ZC18457

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tccttccagc tggctggaaa g

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido ZC18560

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agaatgcagg gataggtcag

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Oligonucleótido ZC18561

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<400> 40

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\hskip-.1em\dddseqskip

tcagaggatc ctgacagcag

\hfill

20

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

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<211> 21

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido ZC18687

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<400> 41

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\hskip-.1em\dddseqskip

tggacacgtg agagggactt c

\hfill

21

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<210> 42

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<211> 20

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido ZC18688

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

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\hskip-.1em\dddseqskip

agcagtagaa cttcccagtg

\hfill

20

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

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<211> 2559

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<212> DNA

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<213> Mus musculus

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<220>

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<221> CDS

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<222> (70)...(912)

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<223> ortólogo de ratón

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<400> 43

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9

10

11

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<210> 44

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<211> 281

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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<400> 44

12

13

Claims

1. Un polipéptido aislado que comprende los residuos de aminoácido 26 a 281 del Nº ID SEC: 2.

2. El polipéptido aislado de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el polipéptido comprende los residuos de aminoácido 22 a 281 del Nº ID SEC: 2.

3. El polipéptido aislado de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el polipéptido comprende el Nº ID SEC: 2.

4. El polipéptido aislado de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en la secuencia de aminoácidos del Nº ID SEC: 2.

5. Una proteína de fusión que comprende una primera porción y una segunda porción enlazadas por un enlace peptídico, en la que la primera porción comprende un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (a) los residuos de aminoácido 26 a 281 del Nº ID SEC: 2, (b) los residuos de aminoácido 22 a 281 del Nº ID SEC: 2 y (c) los residuos de aminoácido 1 a 281 del Nº ID SEC: 2, y en la que la segunda porción comprende otro polipéptido.

6. La proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la segunda proteína es una etiqueta de afinidad.

7. La proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 5, en la que la segunda proteína es un polipéptido de inmunoglobulina.

8. Un oligómero polipeptídico que comprende al menos dos polipéptidos de acuerdo con la reivindicación 1.

9. Una composición farmacéutica que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y un polipéptido que comprende los residuos de aminoácido 26 a 281 del Nº ID SEC: 2.

10. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 9, en la que el polipéptido comprende los residuos de aminoácido 22 a 281 del Nº ID SEC: 2.

11. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 9, en la que el polipéptido comprende el Nº ID SEC: 2.

12. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 9, en la que el polipéptido consiste en el Nº ID SEC: 2.

13. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 9, en donde la composición farmacéutica comprende un complejo de al menos dos de los polipéptidos.

14. Un vector de expresión que comprende los siguientes elementos conectados operablemente:

un promotor de la transcripción;

un segmento de DNA que codifica un polipéptido que comprende los residuos de aminoácido 26 a 281 del Nº ID SEC: 2; y

un terminador de la transcripción.

15. El vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 14, en el que el polipéptido codificado comprende los residuos de aminoácido 22 a 281 del Nº ID SEC: 2.

16. El vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 14, en el que el polipéptido está conectado covalentemente de forma aminoterminal o carboxiterminal a una etiqueta de afinidad.

17. El vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 14, en el que el segmento de DNA codifica además una secuencia de señal secretora conectada operablemente al polipéptido.

18. Una célula cultivada en la que se ha introducido un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 14, en donde la célula expresa el polipéptido codificado por el segmento de DNA.

19. Un método para producir un polipéptido, que comprende:

cultivar una célula en la que se ha introducido un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 14;

con lo que la célula expresa el polipéptido codificado por el segmento de DNA; y

recuperar el polipéptido expresado.

20. Un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que comprende los residuos de aminoácido 26 a 281 del Nº ID SEC: 2.

21. El polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 20, en el que el polipéptido codificado comprende los residuos de aminoácido 22 a 281 del Nº ID SEC: 2.

22. El polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 20, en el que el polipéptido codificado es el Nº ID SEC: 2.

23. Un polinucleótido aislado que comprende los nucleótidos 246 a 1013 del Nº ID SEC: 1.

24. El polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 23, en donde el polinucleótido comprende los nucleótidos 246 a 1016 del Nº ID SEC: 1.

25. El polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 23, en donde el polinucleótido comprende los nucleótidos 171 a 1013 del Nº ID SEC: 1.

26. El polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 23, en donde el polinucleótido comprende los nucleótidos 171 a 1016 del Nº ID SEC: 1.

27. Un polinucleótido aislado que codifica una proteína de fusión que comprende una primera porción y una segunda porción enlazadas por un enlace peptídico, en el que la primera porción comprende un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (a) los residuos de aminoácido 26 a 281 del Nº ID SEC: 2, (b) los residuos de aminoácido 22 a 281 del Nº ID SEC: 2 y (c) los residuos de aminoácido 1 a 281 del Nº ID SEC: 2, y en el que la segunda porción comprende otro polipéptido.

28. Un anticuerpo que se une a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en los residuos de aminoácido 26 a 281 del Nº ID SEC: 2.

29. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 28, en donde el anticuerpo se une a los residuos de aminoácido 22 a 281 del Nº ID SEC: 2.

30. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 28, en donde el anticuerpo se une al Nº ID SEC: 2.

31. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 28, en donde el anticuerpo es un anticuerpo policlonal.

32. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 28, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

33. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 28, en donde el anticuerpo es un anticuerpo quimérico.

34. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 28, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monocatenario.

35. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 28, en donde el anticuerpo es un anticuerpo humanizado.

36. Un fragmento de anticuerpo que se une a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en los residuos de aminoácido 26 a 281 del Nº ID SEC: 2.

37. El fragmento de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 36, en donde el fragmento de anticuerpo se une a los residuos de aminoácido 22 a 281 del Nº ID SEC: 2.

38. El fragmento de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 36, en donde el fragmento de anticuerpo se une al Nº ID SEC: 2.

39. El fragmento de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 36, en donde el fragmento de anticuerpo es un fragmento F(ab)'_{2}.

40. El fragmento de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 36, en donde el fragmento de anticuerpo es un fragmento Fab.

41. El fragmento de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 36, en donde el fragmento de anticuerpo es un fragmento Fv.