JP2002505850A - ポリペプチド及び同じものをコードしている核酸 - Google Patents

ポリペプチド及び同じものをコードしている核酸

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JP2002505850A JP2000523338A JP2000523338A JP2002505850A JP 2002505850 A JP2002505850 A JP 2002505850A JP 2000523338 A JP2000523338 A JP 2000523338A JP 2000523338 A JP2000523338 A JP 2000523338A JP 2002505850 A JP2002505850 A JP 2002505850A
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    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Abstract

(57)【要約】 本発明は新規のポリペプチドとそれらポリペプチドをコードしている核酸分子に向けられる。また、それらの核酸配列を含むベクターと宿主細胞、異種ポリペプチド配列に融合した本発明のポリペプチドを含むキメラポリペプチド分子、本発明のポリペプチドに結合する抗体及び本発明のポリペプチドの製造方法もここに提供される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は概して、新規のＤＮＡの同定及び単離、並びに当該ＤＮＡによりコー
ドされる新規のポリペプチドの組換え体製造に関する。
【０００２】
【従来の技術と発明が解決しようとする課題】
細胞外タンパク質は、多細胞生物の形成、分化、及び維持に重要な役割を演じ
ている。多くの個々の細胞の成り行き、たとえば増殖、移行、分化又は他の細胞
との相互作用は、典型的には他の細胞及び／又は隣接した環境からの情報によっ
て決定されている。この情報は分泌されるポリペプチド（例えば分裂促進因子、
生存因子（survival factors）、細胞毒性因子、分化因子、神経ペプチド、ホル
モン）により伝達されることが多いが、これは次に多様な細胞レセプター又は膜
結合性タンパク質により受容されて翻訳される。これら分泌されたポリペプチド
又は信号伝達分子は通常、細胞性の分泌経路を通って、細胞外環境の自身の活性
部位に到達する。
【０００３】 分泌されたタンパク質には種々の工業的適用性があるが、これには薬剤、診断
、バイオセンサー、及びバイオリアクターが含まれる。現在入手可能なタンパク
質薬剤の多く、例えば血栓溶解薬、インターフェロン、インターロイキン、エリ
スロポエチン、コロニー形成活性化因子、及び他の種々のサイトカインは、分泌
性のタンパク質である。これらのレセプターは膜タンパク質であるが、これは治
療剤又は診断薬としての可能性を有している。産業界及び学術界の双方ともに、
新規の天然の分泌性タンパク質を同定する努力を行っている。多くの研究におい
ては、哺乳動物の組換えＤＮＡライブラリーをスクリーニングして、新規の分泌
性タンパク質のコード配列を同定することに焦点をあてている。スクリーニング
の方法及び技術の例は、文献に記載されている（例えば、Kleinら, Proc.Natl.A
cad,Sci.,93:7108-7113(1996); 米国特許第5536637号を参照）。
【０００４】 膜に結合したタンパク質及びレセプターは、多細胞生物の形成、分化、及び維
持において重要な役割を演じている。多くの個々の細胞の成り行き、たとえば増
殖、移行、分化又は他の細胞との相互作用は、典型的には他の細胞及び／又は隣
接した環境からの情報によって決定されている。この情報は分泌されるポリペプ
チド（例えば分裂促進因子、生存因子（survival factors）、細胞毒性因子、分
化因子、神経ペプチド、ホルモン）により伝達されることが多いが、これは次に
多様な細胞レセプター又は膜結合性タンパク質により受容されて解釈される。こ
のような膜に結合したタンパク質及び細胞レセプターには、サイトカインレセプ
ター、レセプターキナーゼ、レセプターホスファターゼ、細胞-細胞相互作用に 関与するレセプター、及びセレクチンやインテグリン等の細胞付着分子が含まれ
るが、これらには限定されない。例えば、細胞の増殖及び分化を制御する信号の
変換は、一部には種々の細胞性タンパク質のリン酸化により制御されている。プ
ロテインチロシンキナーゼは、そのプロセスを触媒する酵素であるが、これはま
た増殖因子レセプターとしても作用する。実例には、線維芽細胞増殖因子レセプ
ター、及び神経増殖因子レセプターが含まれる。
【０００５】 膜に結合したタンパク質及びレセプター分子には、種々の工業的適用性があり
、これには薬剤及び診断薬が含まれる。レセプター免疫付着因子は例えば、レセ
プター−リガンド相互作用を阻止する治療薬として使用することができる。膜に
結合したタンパク質はまた、関連したレセプター／リガンド相互作用の潜在的な
ペプチド性又は小分子性の阻害剤のスクリーニングに使用することができる。産
業界及び学術界の双方ともに、新規の天然のレセプタータンパク質を同定する努
力をしている。これらの研究の多くは、哺乳動物の組換えＤＮＡライブラリーを
スクリーニングして新規のレセプタータンパク質のコード配列を同定することに
焦点を当てている。
【０００６】 本願では、新規の分泌性及びトランスメンブレンポリペプチド、並びに当該ポ
リペプチドをコードする新規の核酸の同定及び特徴付けを記載する。
【０００７】 １.ＰＲＯ２４１ 軟骨組織は、コラーゲン繊維のネットワークが密であり、プロテオグリカンが
高含量の大型の細胞外マトリックスを有する特殊な結合組織である。軟骨組織中
のプロテオグリカンの大部分は、アグリカン（aggrecan）であるが、これには多
くの硫酸コンドロイチン及び硫酸ケラチンの鎖が含まれていて、連結タンパク質
でヒアルロナン（hyaluronan）に結合することにより多分子凝集物を形成するが
、一方、軟骨組織にはまた、数多くの小分子量のプロテオグリカンが含まれてい
る。これらの小分子量プロテオグリカンのうちの一つは、ビグリカン（biglycan
）と呼ばれるタンパク質であるが、これは他の種々の軟骨組織（腱、強膜、皮膚
等が含まれる）の細胞外マトリックスに広く分布しているプロテオグリカンであ
る。ビグリカンは、ロイシン富反復配列と、二つの硫酸コンドロイチン／硫酸デ
ルマタン鎖であって、フィブロネクチンの細胞結合性領域に結合してそれへの細
胞付着を阻害する機能があることが知られている。ビグリカン等の小分子量プロ
テオグリカンが、軟骨組織の増殖及び／又は修復、並びに関節炎等の縮退性疾患
において重要な役割を演じていることが推論されている。このようにして、ビグ
リカンに対しての相同性を有する新規のポリペプチドを同定して特徴づけること
に興味が持たれている。
【０００８】 本願では、ビグリカンに対する相同性を有する新規のポリペプチドを同定及び
特徴付けすることを記載するが、ここではそのポリペプチドをＰＲＯ２４１ポリ
ペプチドと呼ぶ。
【０００９】 ２．ＰＲＯ２４３ （アフリカツメガエルの）コルディン（chordin）（Xchr）は、潜在的に背側 化（dorsalizing）活性を有しているシュペーマン編成原（Spermann organizer ）により分泌される可溶性因子である（Sasaiら、Cell 79:779-90(1994);Sasai ら、Nature 376:333-36(1995)）。その編成原により分泌される他の背側化因子 には、ノギン（noggin）（SmithとHarlan,Cell 70:829-840(1992) Lambら、Scie
nce 262:713-718(1993)）及びフォリスタチン（follistatin)（Hemmanti-Brivan
louら、Cell 77:283-295(1994)）がある。コルディンは、原始外胚葉を、神経対
非神経領域に細分化して、中胚葉の背側化により脊索形成及び筋形成を誘導する
。これは、腹側化性（ventralizing）ＢＭＰ−４シグナルのアンタゴニストとし
て機能することにより起こる。この阻害は、コルディンが細胞外空間においてＢ
ＭＰ−４に直接的に結合することにより介在されるが、それによってＢＭＰ−４
によるＢＭＰ−４レセプターの活性化を阻止する（Piccoloら、Develop.Biol.18
2:5-20(1996))。
【００１０】 ＢＭＰ−４は、胚の腹側から勾配がかかって発現しているが、一方、コルディ
ンは、ＢＭＰ−４のものとは相補的な勾配で発現している。コルディンはＢＭＰ
−４を拮抗して、ＢＭＰ−４勾配の低い側の末端を確立する。従って、コルディ
ンからのシグナル、及び他の編成原により誘導される因子の間の釣り合いと、Ｂ
ＭＰシグナルとの対比によって、外胚葉性胚葉が、その腹側−背側位置情報とと
もに提供される。コルディンはまた、中枢神経系の腹側−背側パターン形成にも
関与することがある（Sasaiら、Cell 79:779-90(1994)）。これは更に、前方神 経組織（前脳タイプ）を排他的に誘導し、これにより神経タイプを前方化（ante
riorizing）する（Sasaiら、Cell 79:779-90(1997)）。ニューロンの誘導とパタ
ーン形成において関与するので、コルディンは神経退行性疾患、及び神経損傷、
例えば外傷によるもの、又は化学療法後におけるものの治療に有益であるかもし
れない。
【００１１】 本願では、コルディンに相同性のある新規のポリペプチドの同定及び特徴付け
を記載するが、ここでは当該ポリペプチドをＰＲＯ２４３ポリペプチドと称す。
【００１２】 ３．ＰＲＯ２９９ 切痕（notch）タンパク質は、発生におけるシグナリングに関与する。このタ ンパク質は非対称な発生のポテンシャルに影響し、発生に関与する他のタンパク
質の発現の引き金となる（Robey,E.,Curr.Opin.Genet.Dev.,7(4):551(1997)，Si
mpson,P.,Curr.Opin.Genet.Dev.7(4):537(1997)，Blobel,CP.,Cell 90(4):589(1
997)，Nakayama, H.ら、Dev.Genet.,21(1):21(1997)，Nakayama H.ら、Dev.Gene
t.,21(1):21(1997)，Sullivan,S.A.ら、 Dev. Genet., 20(3):208 (1997)，及び
Hayashi, H.ら、Int.J.Dev.Biol.,40(6):1089(1996)を参照）。切痕のセラーテ （Serrate）介在性活性化が、ショウジョウバエの翅の成虫盤の背側区画におい て観察されている（Flemingら、Development,124(15):2973(1997)）。切痕は、 発生における役割、及びシグナリング能力の両方において興味深い。発生及び／
又はシグナリングにおいて役割を有する新規のポリペプチドもまた、興味深い。
【００１３】 本願では、切痕タンパク質に相同性のある新規のポリペプチドの同定及び特徴
付けを記載するが、ここではそのポリペプチドをＰＲＯ２９９ポリペプチドと称
す。
【００１４】 ４． ＰＲＯ３２３ ジペプチダーゼは、非常に多様な異なるジペプチドを開裂する酵素性タンパク
質であって、哺乳動物及び哺乳動物以外の生物において非常に重要な数多くの生
物学的プロセスに関与するものである。多様な異なる哺乳動物及び哺乳動物以外
の生物から、数多くの異なるジペプチダーゼが同定され、また特徴付けられてい
る。哺乳動物のジペプチダーゼは、数多くの生物学的プロセスにおいて重要な役
割を有するが、これには例えば、タンパク質の消化、活性化、不活化、又はジペ
プチドホルモン活性の調節、並びにタンパク質及び酵素の物理的特徴の変化が含
まれる。
【００１５】 ジペプチダーゼ酵素が有する重要な生理学的役割に鑑み、産業界及び学術界の
双方は、新規の天然のジペプチダーゼの相同物を同定する努力をしている。多く
の研究においては、哺乳動物の組換えＤＮＡライブラリーをスクリーニングして
、新規の分泌性且つ膜結合型のレセプタータンパク質のコード配列を同定するこ
とに焦点をあてている。スクリーニングの方法及び技術の例が、文献に記載され
ている（例えばKleinら、Proc.Natl.Acad.Sci.,93:7108-7113(1996) ; 米国特許
第5536637号を参照）。
【００１６】 本願では、種々のジペプチダーゼ酵素に相同性である新規のポリペプチドであ
るＰＲＯ３２３ポリペプチドの同定及び特徴付けを記載する。
【００１７】 ５．ＰＲＯ３２７ 下垂体前葉ホルモンプロラクチンは、数多くの成長ホルモン／プロラクチン／
胎盤性ラクトゲンの遺伝子ファミリーによりコードされている。哺乳動物におい
てはプロラクチンは主として、乳汁分泌及び乳腺の発達の原因となっている。プ
ロラクチンは、遺伝子転写及びｍＲＮＡの半減期の双方を増大することにより乳
タンパク質の遺伝子発現を刺激するように機能する。
【００１８】 プロラクチンタンパク質の生理学的影響は、プロラクチンが細胞表面のプロラ
クチンレセプターに結合する能力を通じて介在される。プロラクチンレセプター
は、種々の異なる細胞種において見られ、また約４００００の分子量を有し、ジ
スルフィド結合により、それ自身又は他のサブユニットとは明らかに結合してい
ない。プロラクチンレセプターのレベルは、研究対象の組織に応じて異なった制
御のされかたをしている。
【００１９】 細胞表面レセプター分子は、インビボで重要な生理学的役割を有するので、産
業界及び学術界はともに新規の天然の膜結合性レセプタータンパク質を同定する
ことに現在注力しているが、この中にはプロラクチンレセプターと相同性のある
配列を有すものが含まれる。これらの研究の多くは、哺乳動物の組換えＤＮＡラ
イブラリーをスクリーニングして、新規の膜結合性レセプタータンパク質のコー
ド配列を同定することに焦点をあてている。スクリーニングの方法及び技術の例
は、文献に記載されている（例えばKleinら、Proc.Natl.Acad.Sci.,93:7108-711
3(1996); 米国特許第5536637号を参照）。
【００２０】 本願では、プロラクチンレセプタータンパク質に高い相同性を示す新規のポリ
ペプチドであるＰＲＯ３２７ポリペプチドの同定及び特徴付けを記載する。
【００２１】 ６．ＰＲＯ２３３ 細胞の酸化還元状態が細胞の成り行きに関しての重要な決定要素であることが
研究報告されている。更に、反応性の酸素種が、細胞毒性であって炎症性疾患を
引き起こすが、これには組織の壊死、器官不全、アテローム性動脈硬化症、不妊
症、出生時欠損、早期老化、突然変異及び悪性腫瘍が含まれる。従って、酸化と
還元の制御は、数多くの理由により重要であるが、これには卒中、心臓発作、酸
化ストレス及び高血圧症を制御及び予防することが含まれる。
【００２２】 酸素のフリーラジカル及び抗酸化剤は、脳虚血及び再潅流後の中枢神経系にお
いて重要な役割を有することがわかっている。更に、心臓障害は、虚血及び再潅
流に関係付けられるが、これはフリーラジカルの作用により引き起こされること
が報告されている。この点において、還元酵素、特にはオキシドレダクターゼは
興味深いものである。更に、転写因子、ＮＦ−カッパＢ及びＡＰ−１は酸化還元
状態により制御され、ＡＩＤＳ、癌、アテローム性動脈硬化症、及び糖尿病合併
症の病原性に関与すると考えられている多様な遺伝子の発現に影響することが知
られている。この主題について更に記載している刊行物には、Kelseyら、Br.J.C
ancer,76(6):852-854(1997); FriedrichとWeiss, J.Theor.Biol.,187(4):529-54
0(1997); Pieulleら、J.Bacteriol.,179(18):5684-5692(1997)が含まれる。イン
ビボでの酸化還元反応の生理学的重要性に鑑み、酸化還元反応に関与する新規の
天然のタンパク質を同定する研究が現在進行中である。本願では、酸化還元酵素
に相同性である新規のポリペプチドであって、ＰＲＯ２３３ポリペプチドと本願
で称するものの同定及び特徴付けを記載する。
【００２３】 ７．ＰＲＯ３４４ 補体タンパク質は、血清タンパク質の大きな群を具備するが、その中のいくつ
かは酵素カスケードにおいて活性であり、炎症に関与するエフェクター分子を産
生する。この補体タンパク質は、炎症に関与する細胞の移行と機能を制御するこ
とにおいて生理学的に特に重要である。炎症及びインビボでの関連した機構の生
理学的重要性に鑑み、炎症に関与する新規の天然のタンパク質を同定する研究が
現在進行中である。本願では、補体タンパク質に相同性がある新規のポリペプチ
ドであって、本願でＰＲＯ３４４ポリペプチドと称するものの同定及び特徴付け
について記載する。
【００２４】 ８．ＰＲＯ３４７ システイン富タンパク質は一般には、複雑な三次元構造を有し、及び／又はジ
スルフィド架橋を形成することが可能な数多くのシステイン残基が存在すること
により多量体として存在するタンパク質である。
【００２５】 ９．ＰＲＯ３５４ インター-アルファ-トリプシンインヒビター（ＩＴＩ）は、多くの哺乳動物の
種において見られる、大型（Ｍｒがほぼ２４００００）の循環性プロテアーゼイ
ンヒビターである。この無傷のインヒビターは糖タンパク質であり、強力なグリ
コサミノグリカン結合により相互作用する３つのグリコシル化サブユニットから
なる。ＩＴＩの抗-トリプシン活性は、複合体の最小のサブユニット（即ち軽鎖 ）に位置するが、ここで軽鎖は現在、ビクニン（bikunin）として知られている 。成熟した軽鎖は、２１アミノ酸のＮ末端配列からなり、Ｓｅｒ-１０でグリコ シル化され、その後にタンデムなカニッツ（Kunitz）タイプの領域が二つあって
、そのうちの最初のものはＡｓｎ-４５でグリコシル化されていて、そのうちの 第二のものはトリプシン、キモトリプシン、及びプラスミンを阻害することがで
きる。ＩＴＩ複合体の残りの二つの鎖は、当該複合体の酵素的に活性な軽鎖と相
互作用するように機能する重鎖である。
【００２６】 産業界及び学術界はともに、新規の天然のタンパク質を同定する研究を行って
いる。多くの研究は、哺乳動物の組換えＤＮＡライブラリーをスクリーニングし
て、新規の分泌性、且つ膜結合型のレセプタータンパク質のコード配列を同定す
ることに焦点をあてている。スクリーニングの方法及び技術は、文献に記載され
いている（例えばKleinら、Proc.Natl.Acad.Sci.,93:7108-7113(1996);米国特許
第5536637号を参照）。本願では、ＩＴＩ重鎖に高い相同性を有する新規のポリ ペプチドであって、本願でＰＲＯ３５４ポリペプチドと称するものの同定及び特
徴付けを記載する。
【００２７】 １０．ＰＲＯ３５５ 細胞毒性又は制御性Ｔ細胞連結分子、又は「ＣＲＴＡＭ」タンパク質は、免疫
グロブリンスーパーファミリーと構造的に関連している。このＣＲＴＡＭタンパ
ク質は種々の免疫反応を介在することができるはずである。抗体は、概して高親
和性でＣＲＴＡＭに結合する（Zlotnik,A.,Faseb,106(6):A1037,Abr.216,1996年
6月）。Ｔ細胞抗原、及びインビボでの免疫プロセスの生理学的重要性に鑑み、 免疫反応に関与する新規の天然のタンパク質を同定する研究が現在進行中である
。Kennedyら、米国特許第5686257(1997)も参照。本願では、ＣＲＴＡＭに相同性
である新規のポリペプチドであって、本願ではＰＲＯ３５５ポリペプチドと称す
ものの同定及び特徴付けについて記載する。
【００２８】 １１．ＰＲＯ３５７ タンパク質-タンパク質相互作用には、レセプターと抗原との複合体、並びに シグナリング機構が含まれる。タンパク質-タンパク質相互作用の基礎となる構 造的及び機能的機構がよりわかるにつれて、タンパク質-タンパク質相互作用を より容易に操作してタンパク質-タンパク質相互作用の特定の結果を制御するこ とが容易になる。従って、タンパク質-タンパク質相互作用の基礎となる機構は 、科学的にいっても、医学的にいっても興味深い。
【００２９】 ロイシン富反復配列を含むタンパク質は全て、タンパク質-タンパク質相互作 用に関与すると考えられる。ロイシン富反復配列は、機能と細胞の位置とがとも
に多様である数多くのタンパク質中に存在する短い配列モチーフである。リボヌ
クレアーゼインヒビタータンパク質の結晶構造は、ロイシン富反復配列がベータ
-アルファ構造単位に対応することを示している。これらの単位は、一の表面が 溶媒に露出して、平行なベータシートを形成するようにして配列し、当該タンパ
ク質が異常な非球状形態を獲得する。これらの二つの特徴は、ロイシン富反復配
列のタンパク質結合性機能の原因となっていることが示されている。KobeとDeis
enhofer,Trends Biochem.Sci.,19(10):415-421(1994年10月)を参照。
【００３０】 組織編成機能を有し、個体発生中にコラーゲン繊維の方向付け及び配置を行う
ものであって、創傷治癒、組織修復、及び腫瘍間質形成等の病理学的プロセスに
関与するロイシン富プロテオグリカンについての研究が報告されている（Iozzo,
R.V.,Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.,32(2):141-174(1997)）。ロイシン富タンパ ク質が、創傷治癒や組織修復に関連するとした他の研究には、出血性疾患である
ベルナール-スリエ症候群に関連した複合体中のロイシン富モチーフ中に変異が あることが報告されているDe La Salle.C.ら、Vouv.Rev.Fr.Hematol.(ドイツ),3
7(4):215-222(1995)、血小板にはロイシン富反復配列があることが報告されてい
るChelemetson,K.J.,Thromb.Haemost.(ドイツ),74(1):111-116 (1995年7月)、形
質転換増殖因子βへのデコリン（decorin）の結合が、癌の治療、創傷治癒及び 傷跡に影響を与えることが報告されているLa Jolla Cancer Reseach Foundation
のRuoslahti, E.I.ら、WO9110727-Aがある。このグループのタンパク質の機能に
より関連付けられるものには、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）があるが、これ
は創傷治癒に有益であり、結合組織、皮膚、及び骨等の組織の再増殖に関する治
療に関係し、また、ヒト及び動物の体の成長を促進し、更には他の増殖関連プロ
セスを刺激するからである。ＩＧＦの酸不安定サブユニット（ＡＬＳ）は、ＩＧ
Ｆの半減期を増大し、またインビボでのＩＧＦ複合体の一部であることから興味
が持たれる。
【００３１】 ロイシン富反復配列を有することが報告されている別のタンパク質には、アル
ツハイマー病や、パーキンソン病等における神経障害等の神経退行性疾患の治療
や、癌の診断に有益であることが報告されているＳＬＩＴタンパク質がある（Ya
le University,Artavanistsakonas,S.とRothberg,J.M., WO9210518-A1を参照） 。膜糖タンパク質であってマウスの脳のグリア細胞内で特異的に発現し、ロイシ
ン富反復配列及び免疫グロブリン様領域を有しているＬＩＧ−１もまた興味が持
たれている（Suzukiら、J.Biol.Chem.(U.S.),271(37):22522(1996)）。ロイシン
富反復配列を有するタンパク質の生物学的機能について報告している他の研究に
は以下のものが含まれる：Tayar,N.ら、Mol.Cell Endocrinol.,(アイルランド),
125(1-2):65-70(1996年12月)（精線刺激ホルモンの関与）；Miura,Y.ら、日本臨
床 (日本),54(7):1784-1789 (1996年7月)（アポトーシスの関与）；Harris,P.C.
ら、J.Am.Soc.Nephrol.,6(4):1125-1113(Oct. 1995年10月)（腎臓疾患の関与） 。
【００３２】 従って、産業界及び学術界はともに、タンパク質-タンパク質相互作用をより 良く理解するために、ロイシン富反復配列を有する新規のタンパク質を同定する
研究を行っている。特に興味深いのは、ロイシン富反復配列を有し、例えばイン
スリン様増殖因子の酸不安定サブユニット等の、ロイシン富反復配列を有する既
知のタンパク質に相同的であるタンパク質である。多くの研究が、哺乳動物の組
換えＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行って、ロイシン富反復配列を有す
る新規の分泌性、且つ膜結合型のタンパク質のコード配列を同定することに焦点
をあてている。スクリーニングの方法及び技術は、文献に記載されている（例え
ばKleinら、Proc.Natl.Acad.Sci.,93:7108-7113(1996)；米国特許第5536637号を
参照）。
【００３３】 本願では、インスリン様増殖因子の酸不安定サブユニットと相同性が高い新規
のポリペプチドであって、本願ではＰＲＯ３５７ポリペプチドと称するものの同
定及び特徴付けを記載する。
【００３４】 １２．ＰＲＯ７１５ 哺乳動物における細胞数の制御は、一部には細胞増殖と細胞死との間のバラン
スにより決定されるものと考えられている。細胞死の一の形態は、時として壊死
性細胞死と呼ばれるものであって、ある種の外傷や細胞障害から生じる細胞の病
理学的形態により典型的に特徴付けられるものである。対照的に、別の「生理学
上の」細胞死の形態であって、通常は整然とした、又は制御された方法で進行す
るものがある。この整然とした、又は制御された形態の細胞死は「アポトーシス
」と呼ばれる（例えば、Barrら、Bio/Technology,12:487-493(1994)；Stellerら
、Science,267:1445-1449(1995)）。アポトーシス性の細胞死は、多くの生理学 的プロセスにおいて自然と起こるものであるが、これには胚の発生、免疫系にお
けるクローン選択が含まれる（Itohら、Cell,66:233-243(1991)）。アポトーシ ス性細胞死のレベルの低下は、癌、狼瘡、ヘルペスウイルス感染等の種々の病理
学的状態に関連している（Thompson,Science,267:1456-1462(1995)）。アポトー
シス性細胞死のレベルの増大は、ＡＩＤＳ、アルツハイマー病、パーキンソン病
、筋萎縮性側索萎縮症、多発性硬化症、色素性網膜炎、小脳退縮、再生不良性貧
血、心筋梗塞症、卒中、再潅流障害、及び毒素誘導性肝臓疾患等の種々の病理的
状態に関連する可能性がある（上記のThompsonを参照）。
【００３５】 アポトーシス性細胞死は、典型的には細胞における一以上の形態学的又は生化
学的変化を伴っているが、これには例えば、原形質の凝結、細胞質膜微小絨毛の
喪失、核の分割、染色体ＤＮＡの分解、又はミトコンドリア機能の喪失等がある
。種々の外来性及び内因性のシグナルが、このような形態学的及び生化学的細胞
変化を誘発、又は誘導すると考えられている（Raff,Nature,256:397-400(1992) ；Steller,上記; Sachsら、Blood,82:15(1993)）。例えば、これらは未成熟な胸
腺細胞のグルココルチコイドホルモン等のホルモン刺激により誘発される（Wata
nabe-Fukunagaら、Nature,356:314-317(1992)）。また、ｍｙｃ、ｒｅｌ、及び Ｅ１Ａ等の同定した癌遺伝子のいくつか、ｐ５３等の腫瘍抑制因子は、アポトー
シスの誘導にかかわることが報告されている。ある種の化学療法剤、及び放射線
のある形態のものは、同様にアポトーシス誘導活性があることが観察されている
（上記のThompson）。
【００３６】 種々の分子、例えば腫瘍壊死因子-α（"TNF-α"）、腫瘍壊死因子−β（"TNF-
β"又は"リンホトキシン-α"）、リンホトキシン-β（"LT-β"）、ＣＤ３０リガ
ンド、ＣＤ２７リガンド、ＣＤ４０リガンド、ＯＸ-４０リガンド、４-１ＢＢリ
ガンド、Ａｐｏ-１リガンド（Ｆａｓリガンド又はＣＤ９５リガンドとも呼ばれ る）、及びＡｐｏ-２リガンド（ＴＲＡＩＬとも呼ばれる）は、サイトカインの 腫瘍壊死因子（"TNF"）ファミリーのメンバーであることが同定された（Grussと
Dower,Blood,85:3378-3404(1995);Pittiら、J.Biol.Chem.,271:12687-12690(199
6); Wileyら、Immunity,3:673-682(1995);Browningら、Cell,72:847-856(1993);
Armitageら、Nature,357:80-82(1992)）。これらの分子の中では、ＴＮＦ-α、 ＴＮＦ-β、ＣＤ３０リガンド、４-ＩＢＢリガンド、Ａｐｏ-１リガンド、及び Ａｐｏ-２リガンド（ＴＲＡＩＬ）が、アポトーシス性細胞死に関与することが 報告されている。ＴＮＦ-αとＴＮＦ-βとはともに、感受性の腫瘍細胞において
アポトーシス性細胞死を誘導することが報告されている（Schmidら、Proc.Natl.
Acad.Sci.,83,1881(1986); Deltryら、Eur.J.Immunol.,17,:689(1987)）。Zheng
らは、ＴＮＦ-αがＣＤ８陽性Ｔ細胞の刺激後アポトーシスに関与することを報 告している（Zhengら、Nature,377,348-351(1995)）。ＣＤ３０リガンドが、胸 腺における自己反応性Ｔ細胞の削除に関与することが、他の研究者らにより報告
されている（Amakawaら、Cold Spring Habor Laboratory Symposium on Program
med Cell Death,Abst.No.10,(1995)）。
【００３７】 マウスのＦａｓ／Ａｐｏ-１レセプター又はリガンド遺伝子（それぞれlpr、gl
dと呼ばれる）における変異は、いくつかの自己免疫疾患に関連しているが、こ れはＡｐｏ-１リガンドが、末梢における自己反応性リンパ球のクローン的削除 において役割を演じている可能性を示している（Krammerら、Curr.Op.Immunol.,
6:279-289(1994); Nagataら、Science,267:1449-1456(1995)）。Ａｐｏ-１リガ ンドはまた、ＣＤ４陽性Ｔリンパ球及びＢリンパ球における刺激後のアポトーシ
スを誘導し、その機能がもはや必要とされない活性化リンパ球の除去に関与する
ことが報告されている（Krammerら、上記、Nagataら、上記）。Ａｐｏ-１レセプ
ターに特異的に結合する作動薬的マウスモノクローナル抗体は、細胞殺傷活性を
呈することが報告されているが、これはＴＮＦ-αにおけるものに匹敵するか又 は同等である（Yoneharaら、J.Exp.Med.,169:1747-1756 (1989)）。
【００３８】 このようなＴＮＦファミリーのサイトカインにより介在される種々の細胞性反
応の誘導は、その特定の細胞レセプターへの結合により開始されると考えられて
いる。約５５ｋＤａ（ＴＮＦＲ１）、及び約７５ｋＤａ（ＴＮＦＲ２）の、二つ
の別個のＴＮＦレセプターが同定されている（Hohmanら、J.Biol.Chem.264,1492
7-14934(1989); Brockhausら、Proc.Natl.Acad.Sci.,87:3127-3131(1990);EP 41
7563、1991年3月20日発行）。この両者のタイプのレセプターに対応するヒト及 びマウスのｃＤＮＡも同定・特徴付けされている（Loetscherら、Cell,61:351(1
990); Schallら、Cell,61:361(1990); Smithら、Science,248:1019-1023(1990);
Lewisら、Proc.Natl.Acad.Sci.,88:2830-2834(1991); Goodwinら、Mol.Cell.Bi
ol.,11:3020-3026(1991)）。これまでに同定されているＴＮＦファミリーのリガ
ンドは、リンホトキシン-α以外は、ＩＩ型のトランスメンブレンタンパク質で あり、そのＣ末端は細胞外にある。対照的に、これまでに同定されたＴＮＦレセ
プター（ＴＮＦＲ）における多くのレセプターは、Ｉ型のトランスメンブレンタ
ンパク質である。しかしながら、ＴＮＦリガンド及びそのレセプターファミリー
の双方においては、ファミリーメンバー間で同定された相同性は、主として細胞
外領域（"ＥＣＤ"）において見いだされている。ＴＮＦファミリーサイトカイン
のいくつかには、ＴＮＦ-α、Ａｐｏ-１リガンド、及びＣＤ４０リガンドが含ま
れるが、これらは細胞表面においてタンパク質的分解により開裂され、それぞれ
の場合に得られるタンパク質は、典型的には可溶性のサイトカインとして機能す
るホモ三量体分子を形成する。ＴＮＦレセプターファミリータンパク質はまた、
通常はタンパク分解的に開裂されて、同起源のサイトカインの阻害剤として機能
することが可能な、可溶性のレセプターＥＣＤを放出する。
【００３９】 最近になって、ＴＮＦＲファミリーの他のメンバーが同定された。このような
、ＴＮＦＲファミリーの新規に同定されたメンバーには、ＣＡＲ１、ＨＶＥＭ、
及びオステオプロテゲリン（osteoprotegerin；ＯＰＧ）が含まれる（Brojatsch
ら、Cell,87:845-855(1996); Montgomeryら、Cell,87:427-436(1996); Marsters
ら、J.Biol.Chem.,272:14029-14032(1997); Simonetら、Cell,89:309-319(1997)
）。他の既知のＴＮＦＲ様分子とは異なり、Simonetら（上記）は、ＯＰＧが疎 水性のトランスメンブレン-スパンニング配列を全く含まないことを報告してい る。
【００４０】 ＴＮＦファミリーのサイトカイン及びそのレセプターについてのレビューは、
上記のGrussとDowerを参照。
【００４１】 本明細書においては、腫瘍壊死因子ファミリーのメンバーのポリペプチドと相
同性を有する新規のポリペプチドであって、本願でＰＲＯ７１５ポリペプチドと
称すものについての同定及び特徴付けについて記載する。
【００４２】 １３．ＰＲＯ３５３ 補体タンパク質は、その一部が酵素的カスケードで作用して炎症に関与するエ
フェクター分子を産生する、一群の血清タンパク質から構成されている。補体タ
ンパク質は、炎症に関与する細胞の移行及び機能を制御することにおいて特に重
要である。インビボにおける炎症及び関連した機構の生理学的重要性に鑑み、炎
症に関与する新規の天然タンパク質を同定するために現在研究が進行中である。
本願では、補体タンパク質に相同性があり、本願でＰＲＯ３５３ポリペプチドと
称す新規の天然のタンパク質を同定、及び特徴付けする。
【００４３】 １４．ＰＲＯ３６１ ムチンは、発癌に関与することが示唆されている糖タンパク質のファミリーで
ある。ムチン及びムチン様タンパク質は、正常な細胞及び形質転換した細胞の双
方により分泌される。癌の医学的重要性に鑑み、癌を診断又は治療するために有
益となる新規の天然のタンパク質を同定する研究が現在進行中である。
【００４４】 キチナーゼタンパク質は、植物における病原性反応において関与が示唆されて
いるファミリーを構成する。キチナーゼタンパク質は、植物及び微生物により産
生され、植物の傷害に対する防御において役割を演じる可能性がある。植物の防
御機構の重要性に鑑み、植物における病原性関連反応の調節に有益となりうる新
規の天然のタンパク質を同定する研究が現在進行中である。本願では、ムチン及
びキチナーゼに相同性の新規のポリペプチドであって、本願においてＰＲＯ３６
１ポリペプチドと称したものについての同定及び特徴付けを記載する。
【００４５】 １５．ＰＲＯ３６５ ヒト２−１９タンパク質等のポリペプチドは、サイトカインとして機能するこ
とが可能である。サイトカインとは、免疫細胞の分化、増殖、又は機能を刺激若
しくは阻害する、低分子量タンパク質のことである。サイトカインは、細胞内メ
ッセンジャーとして作用することがよくあり、また多様な生理学的効果を有する
。免疫機構のインビボでの生理学的重要性に鑑み、免疫系への影響に関与する新
規の天然タンパク質を同定する研究が現在進行中である。本願においては、ヒト
２-１９タンパク質に相同性があり、本願でＰＲＯ３６５ポリペプチドと称す新 規のポリペプチドの同定及び特徴付けを記載する。
【００４６】
【課題を解決するための手段】
発明の要約 １．ＰＲＯ２４１ 本願においては、ビグリカンタンパク質に相同性である新規のポリペプチドを
コードするｃＤＮＡクローンが同定されているが、これは本願においてはＰＲＯ
２４１と呼ぶ。
【００４７】 一の態様において、本発明は、ＰＲＯ２４１ポリペプチドをコードするＤＮＡ
を具備する、単離された核酸分子を提供する。一の例においては、単離された核
散分子は、図２（配列番号：２）に示されるＰＲＯ２４１ポリペプチドのアミノ
酸残基１乃至３７９をコードしたＤＮＡを具備するか、又はそのようなコードし
た核酸配列に相補的であって、少なくとも中等度、そして適宜高度なストリンジ
ェンシー条件下で安定に結合したままであるものである。
【００４８】 別の態様において本発明は、単離されたＰＲＯ２４１ポリペプチドを提供する
。本発明は特に、単離された天然のＰＲＯ２４１ポリペプチド配列を提供するが
、一の態様においてこれは図２（配列番号：２）の残基１乃至３７９を具備する
アミノ酸配列を含んでいる。本発明の別の態様は、Ｎ末端のシグナルペプチドを
欠失したＰＲＯ２４１ポリペプチドに関するが、ここでＰＲＯ２４１ポリペプチ
ドは、全長ＰＲＯ２４１のアミノ酸配列（配列番号：２）のアミノ酸のほぼ１６
位乃至３７９位を具備している。
【００４９】 ２．ＰＲＯ２４３ 本願では、新規のポリペプチドであって、本願ではＰＲＯ２４３と称するもの
をコードしたｃＤＮＡ（ＤＮＡ35917-1207）が同定されている。
【００５０】 一の態様において本発明は、（ａ）図４（配列番号：７）に示されるアミノ酸
２４乃至９５４の配列を具備するＰＲＯ２４３ポリペプチドをコードしたＤＮＡ
分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の補足物、に少なくとも約８０％の配列相
同性を有する、単離された核酸分子を提供する。配列相同性は好ましくは、約８
５％であり、より好ましくは約９０％、最も好ましくは約９５％である。一の例
において、単離された核酸は、図４（配列番号：７）に示されるアミノ酸残基１
乃至９５４を有するポリペプチドと少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも
約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９
５％の配列相同性を有する。好ましくは、最高の相同性は、図４（配列番号：７
）の４つの保存されたシステインクラスター内（アミノ酸５１乃至１２５；アミ
ノ酸７０５乃至７６２；アミノ酸７８４乃至８４９；アミノ酸８９７乃至９３１
）で起こる。別の態様においては、単離された核散分子は、図４（配列番号：７
）のアミノ酸残基２４乃至９５４を有するＰＲＯ２４３ポリペプチドをコードす
るＤＮＡを具備するか、又はそのようなコード性核酸配列に相補的であって中等
度、そして適宜高度なストリンジェンシー条件下でそれに安定に結合したままの
ものである。別の例において本発明は、ＡＴＣＣ受託番号がＡＴＣＣ209508でＡ
ＴＣＣに寄託されたクローンＤＮＡ35917-1207、或いはＡＴＣＣ受託番号がＡＴ
ＣＣ209508で寄託されたクローンＤＮＡ35917-1207の全長タンパク質の核酸を提
供する。
【００５１】 更に別の態様において本発明は、単離されたＰＲＯ２４３ポリペプチドを提供
する。本発明は特に、単離された天然のＰＲＯ２４３ポリペプチドの配列を提供
するが、これはその一の態様において図４（配列番号７）の残基２４乃至９５４
を具備するアミノ酸配列を含んでいる。天然のシグナル配列（図４（配列番号：
７）のアミノ酸１乃至２３）を有するか、又は有さず、そして開始メチオニンを
有するか、又は有しない、天然のＰＲＯ２４３ポリペプチド配列が特に含まれる
。或いは本発明は、受託番号ＡＴＣＣ209508で寄託された核酸によりコードされ
るＰＲＯ２４３ポリペプチドを提供する。
【００５２】 ３．ＰＲＯ２９９ 本願では、新規のポリペプチドをコードするｃＤＮＡが同定されているが、本
願では当該ポリペプチドをＰＲＯ２９９と称す。
【００５３】 一の態様において本発明は、ＰＲＯ２９９ポリペプチドをコードするＤＮＡを
具備する、単離された核酸分子を提供する。一の例において、当該単離された核
酸は、図９（配列番号：１５）のアミノ酸残基１乃至７３７を有するＰＲＯ２９
９ポリペプチドをコードしたＤＮＡを具備するか、又はこれはそのようなコード
核酸配列に対して相補的であり、少なくとも中等度、そして適宜高度なストリン
ジェンシー条件下ではそれに安定に結合したままのものである。
【００５４】 別の態様において本発明は、単離されたＰＲＯ２９９ポリペプチドを提供する
。特に本発明は、単離された天然のＰＲＯ２９９ポリペプチド配列を提供するが
、一の態様においてこれは、図９（配列番号：１５）の残基１乃至７３７を具備
するアミノ酸配列を含む。本発明の別の態様は、ＰＲＯ２９９ポリペプチドの単
離された細胞外領域に関する。
【００５５】 ４．ＰＲＯ３２３ 本願では、ミクロソームジペプチドタンパク質に相同性を有する新規のポリペ
プチドをコードするｃＤＮＡクローンが同定されたが、本願では当該ポリペプチ
ドをＰＲＯ３２３と称す。
【００５６】 一の態様において本発明は、ＰＲＯ３２３ポリペプチドをコードするＤＮＡを
具備する、単離された核酸分子を提供する。一の例において当該単離された核散
分子は、図１３（配列番号：２４）のアミノ酸残基１乃至４３３を有するＰＲＯ
３２３ポリペプチドをコードしたＤＮＡを具備しているか、又はこれはそのよう
なコード核酸配列に対して相補的であって、少なくとも中等度、そして適宜高度
なストリンジェンシー条件下でそれに安定に結合したままのものである。
【００５７】 別の態様において本発明は、単離されたＰＲＯ３２３ポリペプチドを提供する
。特に本発明は、単離された天然のＰＲＯポリペプチド配列を提供するが、一の
態様においてこれは、図１３（配列番号：２４）の残基１乃至４３３を具備した
アミノ酸配列を含む。
【００５８】 ５．ＰＲＯ３２７ 本願では、プロラクチンレセプターに相同性である新規のポリペプチドをコー
ドするｃＤＮＡクローンが同定されたが、本願ではこれをＰＲＯ３２７と称す。
【００５９】 一の態様において本発明は、ＰＲＯ３２７ポリペプチドをコードするＤＮＡを
具備する、単離された核散分子が提供される。一の例において、当該単離された
核酸は、図１７（配列番号：３２）のアミノ酸残基１乃至４２２を有するＰＲＯ
３２７ポリペプチドをコードするＤＮＡを具備しているか、又はそのようなコー
ド核酸配列に対して相補的であって、少なくとも中等度、そして適宜高度なスト
リンジェンシー条件下でそれに安定に結合したままのものである。
【００６０】 別の態様において本発明は、ＰＲＯ３２７ポリペプチドを提供する。特に本発
明は、単離された天然のＰＲＯ３２７ポリペプチド配列を提供するが、一の態様
においてこれは、図１７（配列番号：３２）の残基１乃至４２２を具備するアミ
ノ酸配列を含む。
【００６１】 ６．ＰＲＯ２３３ 本願では、新規のポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンが同定されたが
、本願では当該ポリペプチドをＰＲＯ２３３と称す。
【００６２】 一の態様において本発明は、ＰＲＯ２３３ポリペプチドをコードするＤＮＡを
具備する、単離された核酸分子を提供する。一の例においては、当該単離された
核酸は、図１９（配列番号：３７）のアミノ酸残基１乃至３００を有するＰＲＯ
２３３ポリペプチドをコードするＤＮＡを具備するか、又はこれはそのようなコ
ード核酸配列に対して相補的であって、少なくとも中等度、そして適宜高度なス
トリンジェンシー条件下でそれに安定に結合したままのものである。
【００６３】 別の態様において、本発明は単離されたＰＲＯ２３３ポリペプチドを提供する
。特に本発明は、単離された天然のＰＲＯ２３３ポリペプチド配列を提供するが
、一の態様においてこれは、図１９（配列番号：３７）の残基１乃至３００を具
備するアミノ酸配列を含む。
【００６４】 ７．ＰＲＯ３４４ 本願では、新規のポリペプチドをコードするｃＤＮＡが同定されたが、本願で
は当該ポリペプチドをＰＲＯ３４４と称す。
【００６５】 一の態様において本発明は、ＰＲＯ３４４ポリペプチドをコードするＤＮＡを
具備する、単離された核酸分子を提供する。一の例においては、当該単離された
核酸は、図２１（配列番号：４２）のアミノ酸残基１乃至２４３を有するＰＲＯ
３４４ポリペプチドをコードするＤＮＡを具備するか、又はこれはそのようなコ
ード核酸配列に対して相補的であって、少なくとも中等度、そして適宜高度なス
トリンジェンシー条件下でそれに安定に結合したままのものである。
【００６６】 別の態様において、本発明は単離されたＰＲＯ３４４ポリペプチドを提供する
。特に本発明は、単離された天然のＰＲＯ３４４ポリペプチド配列を提供するが
、一の態様においてこれは、図２１（配列番号：４２）の残基１乃至２４３を具
備するアミノ酸配列を含む。
【００６７】 ８．ＰＲＯ３４７ 本願では、システイン富分泌タンパク質−３に相同性である新規のポリペプチ
ドをコードするｃＤＮＡが同定されたが、本願では当該ポリペプチドをＰＲＯ３
４７と称す。
【００６８】 一の態様において本発明は、ＰＲＯ３４７ポリペプチドをコードするＤＮＡを
具備する、単離された核酸分子を提供する。一の例においては、当該単離された
核酸は、図２３（配列番号：５０）のアミノ酸残基１乃至４５５を有するＰＲＯ
３４７ポリペプチドをコードするＤＮＡを具備するか、又はこれはそのようなコ
ード核酸配列に対して相補的であって、少なくとも中等度、そして適宜高度なス
トリンジェンシー条件下でそれに安定に結合したままのものである。
【００６９】 別の態様において、本発明は単離されたＰＲＯ３４７ポリペプチドを提供する
。特に本発明は、単離された天然のＰＲＯ３４７ポリペプチド配列を提供するが
、一の態様においてこれは、図２３（配列番号：５０）の残基１乃至４５５を具
備するアミノ酸配列を含む。
【００７０】 ９．ＰＲＯ３５４ 本願では、インター-アルファ-トリプシンインヒビター（ＩＴＩ）の重鎖に相
同性である新規のポリペプチドをコードするｃＤＮＡが同定されたが、本願では
当該ポリペプチドをＰＲＯ３５４と称す。
【００７１】 一の態様において本発明は、ＰＲＯ３５４ポリペプチドをコードするＤＮＡを
具備する、単離された核酸分子を提供する。一の例においては、当該単離された
核酸は、図２５（配列番号：５５）のアミノ酸残基１乃至６９４を有するＰＲＯ
３５４ポリペプチドをコードするＤＮＡを具備するか、又はこれはそのようなコ
ード核酸配列に対して相補的であって、少なくとも中等度、そして適宜高度なス
トリンジェンシー条件下でそれに安定に結合したままのものである。
【００７２】 別の態様において、本発明は単離されたＰＲＯ３５４ポリペプチドを提供する
。特に本発明は、単離された天然のＰＲＯ３５４ポリペプチド配列を提供するが
、一の態様においてこれは、図２５（配列番号：５５）の残基１乃至６９４を具
備するアミノ酸配列を含む。
【００７３】 １０．ＰＲＯ３５５ 本願では、新規のポリペプチドをコードするｃＤＮＡが同定されたが、本願で
は当該ポリペプチドをＰＲＯ３５５と称す。
【００７４】 一の態様において本発明は、ＰＲＯ３５５ポリペプチドをコードするＤＮＡを
具備する、単離された核酸分子を提供する。一の例においては、当該単離された
核酸は、図２７（配列番号：６１）のアミノ酸残基１乃至４４０を有するＰＲＯ
３５５ポリペプチドをコードするＤＮＡを具備するか、又はこれはそのようなコ
ード核酸配列に対して相補的であって、少なくとも中等度、そして適宜高度なス
トリンジェンシー条件下でそれに安定に結合したままのものである。
【００７５】 別の態様において、本発明は単離されたＰＲＯ３５５ポリペプチドを提供する
。特に本発明は、単離された天然のＰＲＯ３５５ポリペプチド配列を提供するが
、一の態様においてこれは、図２７（配列番号：６１）の残基１乃至４４０を具
備するアミノ酸配列を含む。
【００７６】 １１．ＰＲＯ３５７ 本願では、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）の酸不安定サブユニット（ＡＬＳ
）に相同性である新規のポリペプチドをコードするｃＤＮＡが同定されたが、本
願では当該ポリペプチドをＰＲＯ３５７と称す。
【００７７】 一の態様において本発明は、ＰＲＯ３５７ポリペプチドをコードするＤＮＡを
具備する、単離された核酸分子を提供する。一の例においては、当該単離された
核酸は、図２９（配列番号：６９）のアミノ酸残基１乃至５９８を有するＰＲＯ
３５７ポリペプチドをコードするＤＮＡを具備するか、又はこれはそのようなコ
ード核酸配列に対して相補的であって、少なくとも中等度、そして適宜高度なス
トリンジェンシー条件下でそれに安定に結合したままのものである。
【００７８】 別の態様において、本発明は単離されたＰＲＯ３５７ポリペプチドを提供する
。特に本発明は、単離された天然のＰＲＯ３５７ポリペプチド配列を提供するが
、一の態様においてこれは、図２９（配列番号：６９）の残基１乃至５９８を具
備するアミノ酸配列を含む。
【００７９】 １２．ＰＲＯ７１５ 本願では、腫瘍壊死因子ファミリーポリペプチドに相同性である新規のポリペ
プチドをコードするｃＤＮＡが同定されたが、本願では当該ポリペプチドをＰＲ
Ｏ７１５と称す。
【００８０】 一の態様において本発明は、ＰＲＯ７１５ポリペプチドをコードするＤＮＡを
具備する、単離された核酸分子を提供する。一の例においては、当該単離された
核酸は、図３１（配列番号：７６）のアミノ酸残基１乃至２５０を有するＰＲＯ
７１５ポリペプチドをコードするＤＮＡを具備するか、又はこれはそのようなコ
ード核酸配列に対して相補的であって、少なくとも中等度、そして適宜高度なス
トリンジェンシー条件下でそれに安定に結合したままのものである。
【００８１】 別の態様において、本発明は単離されたＰＲＯ７１５ポリペプチドを提供する
。特に本発明は、単離された天然のＰＲＯ７１５ポリペプチド配列を提供するが
、一の態様においてこれは、図３１（配列番号：７６）の残基１乃至２５０を具
備するアミノ酸配列を含む。
【００８２】 １３．ＰＲＯ３５３ 本願では、新規のポリペプチドをコードするｃＤＮＡが同定されたが、本願で
は当該ポリペプチドをＰＲＯ３５３と称す。
【００８３】 一の態様において本発明は、ＰＲＯ３５３ポリペプチドをコードするＤＮＡを
具備する、単離された核酸分子を提供する。一の例においては、当該単離された
核酸は、図３５（配列番号：８６）のアミノ酸残基１乃至２８１を有するＰＲＯ
３５３ポリペプチドをコードするＤＮＡを具備するか、又はこれはそのようなコ
ード核酸配列に対して相補的であって、少なくとも中等度、そして適宜高度なス
トリンジェンシー条件下でそれに安定に結合したままのものである。
【００８４】 別の態様において、本発明は単離されたＰＲＯ３５３ポリペプチドを提供する
。特に本発明は、単離された天然のＰＲＯ３５３ポリペプチド配列を提供するが
、一の態様においてこれは、図３５（配列番号：８６）の残基１乃至２８１を具
備するアミノ酸配列を含む。
【００８５】 １４．ＰＲＯ３６１ 本願では、新規のポリペプチドをコードするｃＤＮＡが同定されたが、本願で
は当該ポリペプチドをＰＲＯ３６１と称す。
【００８６】 一の態様において本発明は、ＰＲＯ３６１ポリペプチドをコードするＤＮＡを
具備する、単離された核酸分子を提供する。一の例においては、当該単離された
核酸は、図３７（配列番号：９１）のアミノ酸残基１乃至４３１を有するＰＲＯ
３６１ポリペプチドをコードするＤＮＡを具備するか、又はこれはそのようなコ
ード核酸配列に対して相補的であって、少なくとも中等度、そして適宜高度なス
トリンジェンシー条件下でそれに安定に結合したままのものである。当該単離さ
れた核酸配列は、１９９８年２月５日にＡＴＣＣ209621として寄託されたベクタ
ーのｃＤＮＡ挿入物を具備していてもよいが、これはＰＲＯ３６１をコードする
ヌクレオチド配列を含む。
【００８７】 別の態様において、本発明は単離されたＰＲＯ３６１ポリペプチドを提供する
。特に本発明は、単離された天然のＰＲＯ３６１ポリペプチド配列を提供するが
、一の態様においてこれは、図３７（配列番号：９１）の残基１乃至４３１を具
備するアミノ酸配列を含む。本発明の別の態様は、図３７（配列番号：９１）に
示されるアミノ酸配列のアミノ酸１乃至３７９を有するＰＲＯ３６１ポリペプチ
ドの、単離された細胞外領域に関する。ＰＲＯ３６１ポリペプチドは適宜、入手
するか、又は1998年2月5日にＡＴＣＣ209621として寄託されたベクター中のｃＤ
ＮＡ挿入物によりコードされるポリペプチドを発現することにより手に入れるこ
とができる。
【００８８】 １５．ＰＲＯ３６５ 本願では、新規のポリペプチドをコードするｃＤＮＡが同定されたが、本願で
は当該ポリペプチドをＰＲＯ３６５と称す。
【００８９】 一の態様において本発明は、ＰＲＯ３６５ポリペプチドをコードするＤＮＡを
具備する、単離された核酸分子を提供する。一の例においては、当該単離された
核酸は、図３９（配列番号：９９）のアミノ酸残基１乃至２３５を有するＰＲＯ
３６５ポリペプチドをコードするＤＮＡを具備するか、又はこれはそのようなコ
ード核酸配列に対して相補的であって、少なくとも中等度、そして適宜高度なス
トリンジェンシー条件下でそれに安定に結合したままのものである。別の例にお
いては、単利された核酸は、図３９（配列番号：９９）のアミノ酸残基２１乃至
２３５を有するＰＲＯポリペプチドをコードするＤＮＡを具備するか、又はその
ようなコード核酸配列に相補的であって、少なくとも中等度、そして適宜高度な
ストリンジェンシー条件下でそれに安定に結合したままのものである。
【００９０】 別の態様において、本発明は単離されたＰＲＯ３６５ポリペプチドを提供する
。特に本発明は、単離された天然のＰＲＯ３６５ポリペプチド配列を提供するが
、一の態様においてこれは、図３９（配列番号：９９）の残基１乃至２３５を具
備するアミノ酸配列を含む。本発明の別の態様は、図３９（配列番号：９９）の
アミノ酸２１乃至２３５を具備するアミノ酸配列に関する。
【００９１】 １６．別の態様 本発明の別の態様においては、上記又は下記の何れかのポリペプチをコードす
るＤＮＡを具備したベクターが提供される。そのような何れかのベクターを具備
した宿主細胞も提供される。例示としては、宿主細胞はＣＨＯ細胞、大腸菌（E.
coli）、又は酵母とすることができる。上記又は下記のポリペプチドを産生する
方法が提供されるが、これは更に、宿主細胞を所望ポリペプチドの発現に適した
条件下で培養し、細胞培養物より所望のポリペプチドを回収することを具備して
いる。
【００９２】 別の態様において本発明は、上記又は下記の何れかのポリペプチドであって異
種のポリペプチド又はアミノ酸配列に融合したものを具備したキメラ分子を提供
する。そのようなキメラ分子の例は、上記又は下記のいずれかのポリペプチドで
あって、エピトープ標識配列又は免疫グロブリンのＦｃ領域に融合したものであ
る。 別の態様において、本発明は、上記又は以下に記載したポリペプチドの何れか
に特異的に結合する抗体を提供する。任意に、該抗体はモノクローナル抗体であ
る。
【００９３】 別の態様において本発明は、ゲノム及びｃＤＮＡのヌクレオチド配列を単離す
るのに有益なオリゴヌクレオチドのプローブを提供するが、ここで、そのプロー
ブは上記又は下記の何れかのヌクレオチド配列に由来するものとすることができ
る。
【００９４】
【発明の実施の形態】 好適な実施態様の詳細な説明 Ｉ． 定義 ここで用い且つ数字の表記に直接続けられる場合に用語「ＰＲＯポリペプチド
」と「ＰＲＯ」は、各種のポリペプチドに関し、ここでの完全な表記（即ち、Ｐ
ＲＯ／数字）は、ここに記載した特有のポリペプチド配列に関する。ここで用い
る場合に用語「ＰＲＯ／数字ポリペプチド」及び「ＰＲＯ／数字」は、天然配列
ポリペプチドとポリペプチド変異体（ここで更に定義される）を包含する。ここ
に記載したＰＲＯポリペプチドは、ヒト組織タイプから或いは別な供給源からの
ような各種の供給源から単離され、又は組換え或いは合成方法によって製造され
得る。
【００９５】 「天然配列ＰＲＯポリペプチド」は、相当する天然から得られたＰＲＯポリペ
プチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。そのような天然配列Ｐ
ＲＯポリペプチドは、天然物から単離することができ、又は組換え或いは合成に
よって製造することができる。用語「天然配列ＰＲＯポリペプチド」は、特異的
ＰＲＯポリペプチドの自然発生端切り又は分泌形態（例えば、細胞外ドメイン配
列）、自然発生変異形（例えば、代替スプライス形）及びポリペプチドの自然発
生アレル変異体を特に包含する。本発明の各種の実施態様において、天然配列Ｐ
ＲＯ２４１ポリペプチドは、図２（配列番号：２）のアミノ酸１から３７９を含
む成熟又は全長天然配列ＰＲＯ２４１ポリペプチドであり、天然配列ＰＲＯ２４
３は、Ｎ末端シグナル配列（残基１乃至約２３）を持つ或いは無しの、及び位置
１で開始メチオニンを持つ或いは無しの、図４（配列番号：７）のアミノ酸２４
乃至９５４を含む成熟又は全長天然配列ポリペプチドであり、天然配列ＰＲＯ２
９９ポリペプチドは、図９（配列番号：１５）のアミノ酸１乃至７３７を含む成
熟或いは全長天然配列ＰＲＯ２９９ポリペプチドであるか、又は天然配列ＰＲＯ
２９９ポリペプチドは、全長ＰＲＯ２９９タンパク質の細胞外ドメインであり、
但し全長ＰＲＯ２９９タンパク質の予測トランスメンブレンドメインは、図８に
示したヌクレオチド２０２２で始まるヌクレオチドによってコードされ、天然配
列ＰＲＯ３２３ポリペプチドは、図１３（配列番号：２４）のアミノ酸１乃至４
３３を含む成熟或いは全長天然配列ＰＲＯ３２３ポリペプチドであり、天然配列
ＰＲＯ３２７ポリペプチドは、図１７（配列番号：３２）のアミノ酸１乃至４２
２を含む成熟或いは全長天然配列ＰＲＯ３２７ポリペプチドであり、天然配列Ｐ
ＲＯ２３３ポリペプチドは、図１９（配列番号：３７）のアミノ酸１乃至３００
を含む成熟或いは全長天然配列ＰＲＯ２３３ポリペプチドであり、天然配列ＰＲ
Ｏ３４４ポリペプチドは、図２１（配列番号：４２）のアミノ酸１乃至２４３を
含む成熟或いは全長天然配列ＰＲＯ３４４ポリペプチドであり、天然配列ＰＲＯ
３４７ポリペプチドは、図２３（配列番号：５０）のアミノ酸１乃至４５５を含
む成熟或いは全長天然配列ＰＲＯ３４７ポリペプチドであり、天然配列ＰＲＯ３
５４ポリペプチドは、図２５（配列番号：５５）のアミノ酸１乃至６９４を含む
成熟或いは全長天然配列ＰＲＯ３５４ポリペプチドであり、天然配列ＰＲＯ３５
５ポリペプチドは、図２７（配列番号：６１）のアミノ酸１乃至４４０を含む成
熟或いは全長天然配列ＰＲＯ３５５ポリペプチドであり、又は天然配列ＰＲＯ３
５５は、全長ＰＲＯ３５５タンパク質の細胞外ドメインであり、但し全長ＰＲＯ
３５５タンパク質の予測トランスメンブレンドメインは、図２６に示したヌクレ
オチド１１３８で始まるヌクレオチドによってコードされ、天然配列ＰＲＯ３５
７ポリペプチドは、図２９（配列番号：６９）のアミノ酸１乃至５９８を含む成
熟或いは全長天然配列ＰＲＯ３５７ポリペプチドであり、又は天然配列ＰＲＯ３
５７ポリペプチドは、全長ＰＲＯ３５７タンパク質の細胞外ドメインであり、但
し全長ＰＲＯ３５５タンパク質の予測トランスメンブレンドメインは、配列番号
：６８のヌクレオチド１５１８−１５７２、或いは配列番号：６８の１４９１−
１５７２によってコードされ、天然配列ＰＲＯ７１５ポリペプチドは、図３１（
配列番号：７６）のアミノ酸１乃至２５０を含む成熟或いは全長天然配列ＰＲＯ
７１５ポリペプチドであり、天然配列ＰＲＯ３５３ポリペプチドは、図３５（配
列番号：８６）のアミノ酸１乃至２８１を含む成熟或いは全長天然配列ＰＲＯ３
５３ポリペプチドであり、又は天然配列ＰＲＯ３５３ポリペプチドは、全長ＰＲ
Ｏ３５３タンパク質の細胞外ドメインであり、天然配列ＰＲＯ３６１ポリペプチ
ドは、図３７（配列番号：９１）のアミノ酸１乃至４３１を含む成熟或いは全長
天然配列ＰＲＯ３６１ポリペプチドであり、又は天然配列ＰＲＯ３６１ポリペプ
チドは、全長ＰＲＯ３６１タンパク質の細胞外ドメインであり、但し全長ＰＲＯ
３６１タンパク質の予測トランスメンブレンドメインは、図３６に示したヌクレ
オチド１３６３で始まるヌクレオチドによってコードされ、及び天然配列ＰＲＯ
３６５ポリペプチドは、図３９（配列番号：９９）のアミノ酸１乃至２３５を含
む成熟或いは全長天然配列ＰＲＯ３６５ポリペプチドである。
【００９６】 ＰＲＯポリペプチド「細胞外ドメイン」又は「ＥＣＤ」は、トランスメンブレ
ン及び細胞質ドメインの本質的にないＰＲＯポリペプチドの形態に関する。通例
、ＰＲＯポリペプチドＥＣＤは、そのようなトランスメンブレン及び／又は細胞
質ドメインの１％以内を有するであろうし、好ましくはそのようなドメインの０
．５％以内を有するであろう。本発明のＰＲＯポリペプチド用に同定した何れか
のドメインが疎水性ドメインのそのタイプを同定するために当該分野で通常利用
される基準に従って同定されることが理解されるであろう。トランスメンブレン
ドメインの正確な境界は、変化し得るが、しかし初めに同定したようなドメイン
のいずれか一方の末端で約５アミノ酸以下が最もありそうに思われる。
【００９７】 「ＰＲＯポリペプチド変異体」は、ここに記載した全長天然配列ＰＲＯポリペ
プチド配列と少なくとも約８０％アミノ酸配列同一性を有する上述の或いは後述
の活性ＰＲＯポリペプチドを意味する。そのようなＰＲＯポリペプチド変異体は
、例えば、１以上のアミノ酸残基がその全長天然アミノ酸配列のＰＲＯポリペプ
チドのＮ又はＣ末端で付加され、或いは欠失されるＰＲＯポリペプチドを含む。
通例、ＰＲＯポリペプチド変異体は、ここに記載した全長天然アミノ酸配列のア
ミノ酸配列と少なくとも約８０％アミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくと
も約８５％アミノ酸配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９０％アミノ
酸配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９５％アミノ酸配列同一性、最
も好ましくは少なくとも約９９％配列同一性を有するであろう。
【００９８】 ＰＲＯ２４３変異体に関して、語句「ＰＲＯ２４３変異体」は、（ａ）その天
然シグナル配列を持つ又は無しのＰＲＯ２４３ポリペプチドをコードしているＤ
ＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補体に対して少なくとも約８０％
アミノ酸配列同一性を有する後述した活性ＰＲＯ２４３を意味する。特有な実施
態様において、ＰＲＯ２４３変異体は、全長天然配列ＰＲＯ２４３についての図
４（配列番号：７）に示した推定アミノ酸配列を有するＰＲＯ２４３と少なくと
も約８０％アミノ酸配列相同性を有する。そのようなＰＲＯ２４３変異体は、例
えば、図４（配列番号：７）の配列のＮ或いはＣ末端で１以上のアミノ酸残基が
付加、又は欠失されるＰＲＯ２４３ポリペプチドを含む。好ましくは、核酸或い
はアミノ酸配列同一性は、少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９
０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％である。
【００９９】 ここで同定したＰＲＯポリペプチド配列に関して「パーセント（％）アミノ酸
配列同一性」は、必要であれば、最大パーセント配列同一性を達成するために、
その配列のアライニング及びギャップ導入後、特異的ＰＲＯポリペプチド配列中
のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして
定義され、且つ配列同一性の一部としていずれの保存的置換も考慮しない。パー
セントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアライメントは、例えば、Ｂ
ＬＡＳＴ，ＢＬＡＳＴ-２，ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ ）ソフトウェアのような公的に利用可能なコンピューターソフトウェアを用いて
、当業者の範囲内である各種の手法で達成することができる。好適なソフトウェ
アアライメントプログラムは、ＢＬＡＳＴである。当業者であれば、比較するべ
き配列の全長にわたり最大のアライメントを達成するために必要とされるいずれ
のアルゴリズムをも含む、アライメントを測定するための適切なパラメーターを
決定することができる。
【０１００】 ここで同定した、ＰＲＯ-コード核酸配列に関して「パーセント（％）核酸配 列同一性」は、必要であれば、最大パーセント配列同一性を達成するために、そ
の配列のアライニング及びギャップ導入後、興味あるＰＲＯ核酸配列中のヌクレ
オチドと同じである候補配列中のヌクレオチドのパーセンテージとして定義され
る。パーセント核酸配列同一性を決定する目的のためのアライメントは、例えば
、ＢＬＡＳＴ，ＢＬＡＳＴ-２，ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴ ＡＲ）ソフトウェアのような公的に利用可能なコンピューターソフトウェアを用
いて、当業者の範囲内である各種の手法で達成することができる。当業者であれ
ば、比較するべき配列の全長にわたり最大のアライメントを達成するために必要
とされるいずれのアルゴリズムをも含む、アライメントを測定するための適切な
パラメーターを決定することができる。
【０１０１】 ここに開示した各種ポリペプチドを記述するために用いる場合、「単離した」
とは、その天然環境の成分から同定及び分離及び／又は回収されているポリペプ
チドを意味する。その天然環境の不純成分は、そのペプチドの診断的又は治療的
な使用を典型的に妨害するであろう材料であり、酵素、ホルモン、及び他のタン
パク様又は非タンパク様溶質を含む。好適な実施態様において、該ポリペプチド
は、（１）スピニングカップ配列決定装置の使用によってＮ末端の少なくとも１
５残基或いは内部アミノ酸配列を得るために十分な度合まで、又は（２）クマシ
ーブルー又は、好ましくは銀染色を用いた非還元又は還元条件下でＳＤＳ-ＰＡ ＧＥによって均質となるまで、精製されるであろう。単離したポリペプチドは、
ＰＲＯポリペプチド天然環境の成分の少なくとも一つが存在しないであろうこと
から、組換え細胞内の原位置のポリペプチドを含む。通常、しかしながら、単離
したポリペプチドは、少なくとも一の精製工程によって作製されるだろう。
【０１０２】 「単離した」ＰＲＯポリペプチド-コード核酸分子は、ＰＲＯポリペプチド核 酸の天然供給源に普通に結合されることによって少なくとも一の不純核酸分子か
ら同定され且つ分離される核酸分子である。単離したＰＲＯポリペプチド核酸分
子は、天然で見出される形態又はセッティング以外のものである。単離したＰＲ
Ｏポリペプチド核酸分子は、従って、それが天然細胞に存在するような特異的Ｐ
ＲＯポリペプチド核酸分子と区別される。しかしながら、単離したＰＲＯポリペ
プチド核酸分子は、例えばその核酸分子が天然細胞のそれと異なる染色体配置中
にある場合、ＰＲＯポリペプチドを普通に発現する細胞中に含んだＰＲＯポリペ
プチド核酸分子を含む。
【０１０３】 用語「制御配列」は、特有な宿主生体中の操作可能に結合したコード配列の発
現のために必要なＤＮＡ配列に関する。原核生物のために好適な制御配列は、例
えば、プロモーター、任意にオペレーター配列、及びリボソーム結合部位を含む
。真核生物細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、及びエンハンサー
を用いることが知られる。
【０１０４】 核酸は、それが別の核酸配列との機能的関係に置かれる場合「操作可能に結合
(operably linked)」される。例えば、予備配列決定又は分泌リーダーのための ＤＮＡは、もしそれが該ポリペプチドの分泌に参与するプレタンパク質として発
現されるならば、ポリペプチド用のＤＮＡに操作可能に結合される；プロモータ
ーとエンハンサーは、もしそれが該配列の転写に影響を及ぼすならば、コード化
配列に操作可能に結合される；又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を促
進するように配置されるならば、コード配列に操作可能に結合される。一般に「
操作可能に結合」は、結合されるそのＤＮＡ配列が隣接され、且つ分泌リーダー
のケースにおいては隣接し且つリーディング相中にあることを意味する。しかし
ながら、エンハンサーは隣接されない。結合は、利便的な制限部位での結紮によ
って達成される。もしそのような部位が存在しないならば、合成オリゴヌクレオ
チドアダプター又はリンカーが通常の実施に従って使用される。
【０１０５】 用語「抗体」は、最も広い認識で用いられ、単純な抗-ＰＲＯポリペプチド、 モノクローナル抗体（アゴニスト、アンタゴニスト、及び中和抗体を含む）、及
びポリエピトピック特異性を持つ抗-ＰＲＯポリペプチド抗体組成物を明確にカ バーする。ここで用いた用語「モノクローナル抗体」は、実質上均一な抗体の集
団から得られた抗体、即ちその集団に含まれる個別の抗体が少量で存在し得る自
然発生変異の可能性を除いて同一であることに関する。
【０１０６】 ここで意図する「活性な」又は「活性」は、特異的な天然又は天然発生ＰＲＯ
ポリペプチドの生物学的及び／又は免疫学的活性を保持するＰＲＯポリペプチド
の形態に関する。ＰＲＯ２４３によって示された通り、好適な活性は、コルディ
ン(chordin)の活性に結合する及び影響を及ぼす、例えば阻止する又はその他の 調整をするための能力であり、その活性は、好ましくは脊索(notochord)の調節 と筋肉形成を含む。
【０１０７】 「治療」又は「治療する」は、治療的処置及び予防又は予防的手段の両方に関
する。治療の必要なそれらは、疾患に既にかかっている、同じくその疾患が予防
するべきものであるそれらの疾患を有する傾向にあるそれらを含む。
【０１０８】 治療の目的のための「哺乳動物」は、ヒト、家畜及び農業用動物、及び動物園
の、スポーツの又は愛玩用動物を含み、例えばヒツジ、イヌ、ウマ、ネコ、ウシ
などの、哺乳動物として分類される何れかの動物に関する。好ましくは、ここで
の哺乳動物はヒトである。
【０１０９】 ここで用いたような「担体」は、用いる用量と濃度でそれにさらされる細胞又
は哺乳動物に無毒である、薬学上許容される担体、賦形剤、又は安定化剤を含む
。しばしば生理学上許容される担体は、ｐＨ緩衝化水溶液である。生理学上許容
される担体の例は、リン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸のような緩衝液；アス
コルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０分子以下）ポリペプチド；血清
アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリンのようなタンパク質；ポリビニルピ
ロリドンのような親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アル
ギニン又はリシンのようなアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリ
ンを含むモノサッカリド、ジサッカリド、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡのような
キレート化剤；マンニトール又はソルビトールのような糖アルコール；ナトリウ
ムのような塩形成カウンターイオン；及び／又はTWEENTM、ポリエチレングリコ ール（ＰＥＧ）、およびPLURONICSTMのような非イオン性界面活性剤を含む。
【０１１０】 用語「アゴニスト」は、本発明の天然ＰＲＯポリペプチドのペプチド及び非- ペプチド類似物（天然ＰＲＯポリペプチドは、pro-ＰＲＯポリペプチド、pre-Ｐ
ＲＯポリペプチド、prepro-ＰＲＯポリペプチド、又は成熟ＰＲＯポリペプチド に関する）に関するとして及びそれが天然ＰＲＯポリペプチドの少なくとも１の
生物学的活性を保持するという条件で、そのようなＰＲＯポリペプチドに特異的
に結合する抗体に関して用いられる。好ましくは、本発明のアゴニストは、天然
ＰＲＯポリペプチドの少なくとも１の性質上の結合認識特性及びレセプター活性
化特性を保持する。
【０１１１】 用語「アンタゴニスト」は、本発明の天然ＰＲＯポリペプチドの生物学的活性
を阻害する分子に関し、ここでの天然ＰＲＯポリペプチドは、pro-ＰＲＯポリペ
プチド、pre-ＰＲＯポリペプチド、prepro-ＰＲＯポリペプチド、又は成熟ＰＲ Ｏポリペプチドに関する。好ましくは、ここでのアンタゴニストは、結合パート
ナーに対する本発明の天然ＰＲＯポリペプチドの結合を阻害する。ＰＲＯポリペ
プチド「アンタゴニスト」は、ＰＲＯアンタゴニストエフェクター機能を妨害す
る又は干渉する分子である（例えば、ＰＲＯポリペプチドによるＰＲＯポリペプ
チドレセプターの結合及び／又は活性化を妨害又は干渉する分子）。そのような
分子は、例えば、試験アンタゴニスト分子の存在及び不在において天然ＰＲＯポ
リペプチドの結合をモニタリングすることによってＰＲＯポリペプチドレセプタ
ー活性化を競合的に阻害するその能力によってスクリーンすることができる。本
発明のアンタゴニストはまた、ＰＲＯポリペプチド遺伝子に対するアンチセンス
ポリヌクレオチドも包含し、アンチセンスポリヌクレオチドがＰＲＯポリペプチ
ド遺伝子の転写又は翻訳を阻止し、それによってその発現と生物学的活性を阻害
する。
【０１１２】 「ストリンジェント条件」は、（１）洗浄のための低いイオン強度と高温を使
う、例えば５０℃で0.015Mの塩化ナトリウム／0.0015Mのクエン酸ナトリウム／0
.1%ドデシル硫酸ナトリウム；（２）ハイブリダイゼーションの間にホルムアミ ドのような変性剤を使う、例えば４２℃で、0.1%ウシ血清アルブミンとともに50
%(vol/vol)ホルムアミド／0.1%のFicoll／0.1%ポリビニルピロリドン／750mMの 塩化ナトリウム、75mMのクエン酸ナトリウムを伴う50mMのリン酸ナトリウム緩衝
液、pH6.5を用いることを意味する。別な実例は、0.2xSSCと0.1%のSDS中４２℃ での洗浄と共に、４２℃で50%ホルムアミド、5xSSC（0.75MのＮａＣｌ、0.075M クエン酸ナトリウム）、50mMのリン酸ナトリウム(pH6/8)、0.1%ピロリン酸ナト リウム、５ｘデンハード溶液、音波処理したサケ精子ＤＮＡ(50μg/ml)、0.1%Ｓ
ＤＳ、及び10%デキストラン硫酸の使用である。更に別な実例は、５５℃で10%デ
キストリン硫酸の緩衝液、2xSSC（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）と50%
ホルムアミドを用いたハイブリダイゼーション、続いて５５℃でＥＤＴＡ含有0.
1xSSCからなる高ストリンジェント洗浄である。
【０１１３】 「中等度にストリンジェントな条件」は、Sambrookら、上記、に記載され、且
つ上述したよりも、より劣る洗浄液とハイブリダイゼーション条件（例えば、温
度、イオン強度、及び％ＳＤＳ）の使用を含む。中等度にストリンジェントな条
件の実例は、20%ホルムアミド、5xSSC(150mMのＮａＣｌ、15mMのクエン酸三ナト
リウム)、50mMのリン酸ナトリウム(pH7.6)、５ｘデンハード溶液、10%デキスト ラン硫酸、及び20mg/mLの変性し切断したサケ精子ＤＮＡを含む溶液中３７℃で 一晩のインキュベーション、続いて約37-50℃で1xSSC中で該フィルターの洗浄、
のような条件である。熟達した研究者であれば、プローブ長などのようなファク
ターを調整するために必要な、温度、イオン強度などをどのように調節するかを
認識するであろう。
【０１１４】 「サザン分析」又は「サザンブロッティング」は、ＤＮＡ又はＤＮＡ含有組成
物の制限エンドヌクレアーゼ消化においてＤＮＡ配列の存在が、既知の標識した
オリゴヌクレオチド又はＤＮＡフラグメントへのハイブリダイゼーションによっ
て確認される方法である。サザン分析は、典型的に、アガロースゲル上でのＤＮ
Ａ消化物の電気泳動分離、電気泳動分離後のＤＮＡの変性、及びSambrookら、Mo
lecular Cloning: A Laboratory Manual(New York: Cold Spring Harbor Labora
tory Press, 1989)のセクション9.37-9.52に記載されたような、放射性標識した
、ビオチン化した、又は酵素標識したプローブによる、ニトロセルロース、ナイ
ロン又は分析用に好適な別の膜への該ＤＮＡの転移を含む。
【０１１５】 「ノーザン分析」又は「ノーザンブロッティング」は、オリゴヌクレオチド、
ＤＮＡフラグメント、ｃＤＮＡ又はそのフラグメント、又はＲＮＡフラグメント
のような既知のプローブにハイブリダイズするＲＮＡ配列を同定するために用い
る方法である。そのプローブは、32Ｐのような放射性同位体、又はビオチン化に
よって、又は酵素によって標識される。分析するべきＲＮＡは、アガロース又は
ポリアクリルアミドゲル上で普通に電気泳動的に分離され、ニトロセルロース、
ナイロン、又は他の適当な膜に転移し、さらにSambrookら、上記、のセクション
7.39-7.52中に記載されたそれらのような当該分野で周知の標準技術を用いて、 該プローブとハイブリダイズされる。
【０１１６】 ＩＩ．本発明の組成物と方法 １．全長ＰＲＯ２４１ポリペプチド 本発明は、ＰＲＯ２４１と本出願中で称したポリペプチドをコードしている新
たに同定及び単離したヌクレオチド配列を提供する。特に、本出願人は、後述す
る実施例で更に詳細に記載したように、ＰＲＯ２４１ポリペプチドをコードして
いるｃＤＮＡを同定及び単離している。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アライメ
ントコンピュータプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ２４１ポリペプチド
の部分が各種のビグリカンタンパク質と顕著な相同性を有することを知見した。
従って、本出願中に開示したＰＲＯ２４１ポリペプチドは、新たに同定されたビ
グリカン同族体ポリペプチドであり、且つビグリカンタンパク質の典型的な活性
を所有し得るということをここに確信した。
【０１１７】 ２．全長ＰＲＯ２４３ポリペプチド 本発明は、ＰＲＯ２４３と本出願中で称したポリペプチドをコードしている新
たに同定及び単離したヌクレオチド配列を提供する。特に、本出願人は、後述す
る実施例で更に詳細に記載したように、ＰＲＯ２４３ポリペプチドをコードして
いるｃＤＮＡを同定及び単離している。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アライメ
ントコンピュータプログラムを用いて、本出願人は、全長天然配列ＰＲＯ２４３
（図４及び配列番号：７に示した）が、アフリカツメガエル及びXenopusコルデ ィン(chordin)と５０％アミノ酸配列同一性を、及びラットコルディン(chordin)
と７７％相同性を有することを知見した。従って、本出願中に開示したＰＲＯ２
４３ポリペプチドは、コルディン(chordin)タンパク質ファミリーの新たに同定 されたメンバーであり、且つ脊索に影響を及ぼすとともに中胚葉の背方化(dorsa
lization)による筋肉形成の能力を所有し得るということをここに確信した。
【０１１８】 ３．全長ＰＲＯ２９９ポリペプチド 本発明は、ＰＲＯ２９９と本出願中で称したポリペプチドをコードしている新
たに同定及び単離したヌクレオチド配列を提供する。特に、本出願人は、後述す
る実施例で更に詳細に記載したように、ＰＲＯ２９９ポリペプチドをコードして
いるｃＤＮＡを同定及び単離している。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アライメ
ントコンピュータプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ２９９ポリペプチド
の各部が、切痕(notch)タンパク質と顕著な相同性を有することを知見した。従 って、本出願中に開示したＰＲＯ２９９ポリペプチドは、切痕タンパク質の新た
に同定されたメンバーであり、且つ切痕タンパク質ファミリーの典型的なシグナ
リング特性を所有し得るということをここに確信した。
【０１１９】 ４．全長ＰＲＯ３２３ポリペプチド 本発明は、ＰＲＯ３２３と本出願中で称したポリペプチドをコードしている新
たに同定及び単離したヌクレオチド配列を提供する。特に、本出願人は、後述す
る実施例で更に詳細に記載したように、ＰＲＯ３２３ポリペプチドをコードして
いるｃＤＮＡを同定及び単離している。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アライメ
ントコンピュータプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ３２３ポリペプチド
の各部が、各種のジペプチダーゼタンパク質と顕著な相同性を有することを知見
した。従って、本出願中に開示したＰＲＯ３２３ポリペプチドは、ジペプチダー
ゼ活性を有する新たに同定されたジペプチダーゼ同族体であるということをここ
に確信した。
【０１２０】 ５．全長ＰＲＯ３２７ポリペプチド 本発明は、ＰＲＯ３２７と本出願中で称したポリペプチドをコードしている新
たに同定及び単離したヌクレオチド配列を提供する。特に、本出願人は、後述す
る実施例で更に詳細に記載したように、ＰＲＯ３２７ポリペプチドをコードして
いるｃＤＮＡを同定及び単離している。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アライメ
ントコンピュータプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ３２７ポリペプチド
の部分が、各種のプロラクチンレセプタータンパク質と顕著な相同性を有するこ
とを知見した。従って、本出願中に開示したＰＲＯ３２７ポリペプチドは、新た
に同定されたプロラクチンレセプター同族体であり、且つプロラクチンレセプタ
ータンパク質の典型的な活性を有するということをここに確信した。
【０１２１】 ６．全長ＰＲＯ２３３ポリペプチド 本発明は、ＰＲＯ２３３と本出願中で称したポリペプチドをコードしている新
たに同定及び単離したヌクレオチド配列を提供する。特に、本出願人は、後述す
る実施例で更に詳細に記載したように、ＰＲＯ２３３ポリペプチドをコードして
いるｃＤＮＡを同定及び単離している。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アライメ
ントコンピュータプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ２３３ポリペプチド
の部分が、各種の還元酵素タンパク質と顕著な相同性を有することを知見した。
本出願人はまた、ＰＲＯ２３３をコードしているＤＮＡが、線虫(Caenorhabditi
s elegans)からのタンパク質と顕著な相同性を有することも見出した。従って、
本出願中に開示したＰＲＯ２３３ポリペプチドは、還元酵素ファミリーの新たに
同定されたメンバーであり、且つ還元酵素ファミリーの典型的な細胞の酸化還元
状態に影響を及ぼす能力を所有するということをここに確信した。
【０１２２】 ７．全長ＰＲＯ３４４ポリペプチド 本発明は、ＰＲＯ３４４と本出願中で称したポリペプチドをコードしている新
たに同定及び単離したヌクレオチド配列を提供する。特に、本出願人は、後述す
る実施例で更に詳細に記載したように、ＰＲＯ３４４ポリペプチドをコードして
いるｃＤＮＡを同定及び単離している。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アライメ
ントコンピュータプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ３４４ポリペプチド
の部分が、ヒトとマウスの補体タンパク質(complement proteins)と顕著な相同 性を有することを知見した。従って、本出願中に開示したＰＲＯ３４４ポリペプ
チドは、補体ファミリーの新たに同定されたメンバーであり、且つタンパク質の
補体ファミリーに典型的な炎症プロセスに影響を及ぼす能力を所有するというこ
とをここに確信した。
【０１２３】 ８．全長ＰＲＯ３４７ポリペプチド 本発明は、ＰＲＯ３４７と本出願中で称したポリペプチドをコードしている新
たに同定及び単離したヌクレオチド配列を提供する。特に、本出願人は、後述す
る実施例で更に詳細に記載したように、ＰＲＯ３４７ポリペプチドをコードして
いるｃＤＮＡを同定及び単離している。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アライメ
ントコンピュータプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ３４７ポリペプチド
の部分が、各種のシステイン-富分泌タンパク質(cysteine-rich secretory prot
eins)と顕著な相同性を有することを知見した。従って、本出願中に開示したＰ ＲＯ３４７ポリペプチドは、新たに同定されたシステイン-富分泌タンパク質で あり、且つシステイン-富分泌タンパク質ファミリーの典型的な活性を所有し得 るということをここに確信した。
【０１２４】 ９．全長ＰＲＯ３５４ポリペプチド 本発明は、ＰＲＯ３５４と本出願中で称したポリペプチドをコードしている新
たに同定及び単離したヌクレオチド配列を提供する。特に、本出願人は、後述す
る実施例で更に詳細に記載したように、ＰＲＯ３５４ポリペプチドをコードして
いるｃＤＮＡを同定及び単離している。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アライメ
ントコンピュータプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ３５４ポリペプチド
の部分が、インター-アルファ-トリプシンインヒビター重鎖タンパク質と顕著な
相同性を有することを知見した。従って、本出願中に開示したＰＲＯ３５４ポリ
ペプチドは、新たに同定されたインター-アルファ-トリプシンインヒビター重鎖
タンパク質ということをここに確信した。
【０１２５】 １０．全長ＰＲＯ３５５ポリペプチド 本発明は、ＰＲＯ３５５と本出願中で称したポリペプチドをコードしている新
たに同定及び単離したヌクレオチド配列を提供する。特に、本出願人は、後述す
る実施例で更に詳細に記載したように、ＰＲＯ３５５ポリペプチドをコードして
いるｃＤＮＡを同定及び単離している。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アライメ
ントコンピュータプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ３５５ポリペプチド
の各部が、ＣＲＴＡＭタンパク質と顕著な相同性を有することを知見した。本出
願人はまた、ＰＲＯ３５５ポリペプチドをコードしているＤＮＡが、胸腺細胞活
性化及び発育タンパク質、Ｈ２０Ａレセプター、Ｈ２０Ｂレセプター、ポリオウ
イルスレセプター及びオナガザル(Cercopithecus aethiops)ＡＧＭデルタ１タ ンパク質との相同性を有することも見出している。従って、本出願中に開示した
ＰＲＯ３５５ポリペプチドは、ＣＲＴＡＭタンパク質ファミリーの新たに同定さ
れたメンバーであるということをここに確信した。
【０１２６】 １１．全長ＰＲＯ３５７ポリペプチド 本発明は、ＰＲＯ３５７と本出願中で称したポリペプチドをコードしている新
たに同定及び単離したヌクレオチド配列を提供する。特に、本出願人は、後述す
る実施例で更に詳細に記載したように、ＰＲＯ３５７ポリペプチドをコードして
いるｃＤＮＡを同定及び単離している。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アライメ
ントコンピュータプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ３５７ポリペプチド
の各部が、インスリン様成長因子の酸不安定サブユニットと顕著な相同性を有す
ることを知見した。本出願人はまた、ＤＮＡ４４８０４-１２４８の非コード領 域が、ＷＯ９５／１４７７２中に記載されたヒト遺伝子サイン(human gene sign
ature)と整列(align)することも見出している。本出願人はさらに、ＤＮＡ４４ ８０４-１２４８の非コード領域が、DeuringとDoerfler,Gene,26:283-289(1983)
中に記載されたアデノウイルス型1/2一組換えウイルスＤＮＡと整列することを 見出している。コード領域相同性に基づいて、本出願中に開示したＰＲＯ３５７
ポリペプチドは、タンパク質のロイシン富繰り返しファミリー(leucine rich re
peat family)の新たに同定されたメンバーであり、且つ特に、インスリン様成長
因子の酸不安定サブユニットに関連付けられるということをここに確信した。そ
れだけでＰＲＯ３５７は、結合メカニズムに含まれ、且つ複合体の一部であろう
と思われる。
【０１２７】 １２．全長ＰＲＯ７１５ポリペプチド 本発明は、ＰＲＯ７１５と本出願中で称したポリペプチドをコードしている新
たに同定及び単離したヌクレオチド配列を提供する。特に、本出願人は、後述す
る実施例で更に詳細に記載したように、ＰＲＯ７１５ポリペプチドをコードして
いるｃＤＮＡを同定及び単離している。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アライメ
ントコンピュータプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ７１５ポリペプチド
の各部が、タンパク質の腫瘍壊死ファミリーの各種のメンバーと顕著な相同性を
有することを知見した。従って、本出願中に開示したＰＲＯ７１５ポリペプチド
は、タンパク質の腫瘍壊死因子の新たに同定されたメンバーであるということを
ここに確信した。
【０１２８】 １３．全長ＰＲＯ３５３ポリペプチド 本発明は、ＰＲＯ３５３と本出願中で称したポリペプチドをコードしている新
たに同定及び単離したヌクレオチド配列を提供する。特に、本出願人は、後述す
る実施例で更に詳細に記載したように、ＰＲＯ３５３ポリペプチドをコードして
いるｃＤＮＡを同定及び単離している。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アライメ
ントコンピュータプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ３５３ポリペプチド
の各部が、ヒトとマウスの補体タンパク質(complement proteins)と顕著な相同 性を有することを知見した。従って、本出願中に開示したＰＲＯ３５３ポリペプ
チドは、補体ファミリーの新たに同定されたメンバーであり、且つタンパク質の
補体ファミリーに典型的な炎症プロセスに影響を及ぼす能力を所有するというこ
とをここに確信した。
【０１２９】 １４．全長ＰＲＯ３６１ポリペプチド 本発明は、ＰＲＯ３６１と本出願中で称したポリペプチドをコードしている新
たに同定及び単離したヌクレオチド配列を提供する。特に、本出願人は、後述す
る実施例で更に詳細に記載したように、ＰＲＯ３６１ポリペプチドをコードして
いるｃＤＮＡを同定及び単離している。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アライメ
ントコンピュータプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ３６１ポリペプチド
の各部が、ムチンとキチナーゼタンパク質と顕著な相同性を有することを知見し
た。従って、本出願中に開示したＰＲＯ３６１ポリペプチドは、ムチン及び／又
はキチナーゼタンパク質の新たに同定されたメンバーであり、且つムチンとキチ
ナーゼタンパク質のそれぞれに典型的な癌、植物病原性又はレセプター機能と関
係付けできるということをここに確信した。
【０１３０】 １５．全長ＰＲＯ３６５ポリペプチド 本発明は、ＰＲＯ３６５と本出願中で称したポリペプチドをコードしている新
たに同定及び単離したヌクレオチド配列を提供する。特に、本出願人は、後述す
る実施例で更に詳細に記載したように、ＰＲＯ３６５ポリペプチドをコードして
いるｃＤＮＡを同定及び単離している。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アライメ
ントコンピュータプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ３６５ポリペプチド
の各部が、ヒト２−１９タンパク質と顕著な相同性を有することを知見した。従
って、本出願中に開示したＰＲＯ３６５ポリペプチドは、ヒト２−１９タンパク
質ファミリーの新たに同定されたメンバーであるということをここに確信した。
【０１３１】 １６．ＰＲＯポリペプチド変異体 ここに記載した全長天然配列ＰＲＯポリペプチドに加えて、ＰＲＯポリペプチ
ド変異体を調製できることが意図される。ＰＲＯポリペプチド変異体は、ＰＲＯ
ポリペプチドＤＮＡに変えられる適切なヌクレオチドを導入することによって、
或いは望まれるＰＲＯポリペプチドの合成によって調製することができる。当業
者であれば、アミノ酸変更が、グリコシル化部位の数或いは位置を変更すること
、又は膜固定(membrane anchoring)特性を変更することのような、ＰＲＯポリペ
プチドの後翻訳処理を変更し得ることを予期するであろう。
【０１３２】 天然全長配列ＰＲＯポリペプチドにおける又はここに記載したＰＲＯポリペプ
チドの各種ドメインにおける変異は、例えば米国特許第５３６４９３４号中に記
載された保存的及び非保存的変異のための何れかの技術とガイドラインとを用い
て行うことができる。変異は、天然配列ＰＲＯポリペプチドとの比較としてＰＲ
Ｏポリペプチドのアミノ酸配列における変化に帰結するＰＲＯポリペプチドをコ
ードしている１以上のコドンの置換、欠失又は挿入とし得る。任意に、変異は、
ＰＲＯポリペプチドの１以上のドメインにおいて少なくとも１のアミノ酸と何れ
かの他のアミノ酸との置換によるものである。望まれる活性に不利な影響を与え
ることなしに、アミノ酸残基が挿入され、置換され或いは欠失され得ることの測
定におけるガイダンスは、知られたタンパク質分子に相同なそれと該ＰＲＯポリ
ペプチドの配列とを比較すること及び高度に相同な領域で作られるアミノ酸配列
変化の数を最小にすることによって見出すことができる。アミノ酸置換は、セリ
ンによるロイシンの置換、即ち保存的アミノ酸置換のような、類似の構造及び／
又は化学特性を有する別なアミノ酸によって１のアミノ酸を置換することの結果
とすることができる。挿入又は欠失は、任意に、１乃至５アミノ酸の範囲内とし
て良い。許容される変異は、該配列中のアミノ酸の挿入、欠失又は置換を系統的
に行うこと及び後述の実施例中に記載したインビトロアッセイにおいて活性につ
いて得られた変異体を試験することによって測定し得る。
【０１３３】 特有な実施態様において、重要な保存的置換が、好適な置換体の表題の下に表
１中に示される。もしそのような置換が生物学的活性における変化に帰結するの
であれば、より現実的な変化、表１中に示した典型的な置換体、又はアミノ酸分
類に参照して更に後で記載したように導入され且つ生生成物がスクリーンされる
。
【０１３４】
【表１】
【０１３５】 ＰＲＯポリペプチドの機能或いは免疫学的同一性における実質上の改変は、（
ａ）その置換の領域中のポリペプチドバックボーンの構造、例えばシート或いは
ヘリックスの立体配座としての、（ｂ）標的部位での該分子の電荷又は疎水性、
又は（ｃ）側鎖の嵩、を維持することについてのその作用において有意に異なる
置換体を選択することによって達成される。自然発生残基は、共通の側鎖特性に
基づいてグループに分けられる： （１）疎水性：ノルロイシン，ｍｅｔ，ａｌａ，ｖａｌ，ｌｅｕ，ｉｌｅ； （２）中性親水性：ｃｙｓ，ｓｅｒ，ｔｈｒ； （３）酸性：ａｓｐ，ｇｌｕ； （４）塩基性：ａｓｎ，ｇｌｎ，ｈｉｓ，ｌｙｓ，ａｒｇ； （５）鎖の方位に影響する残基：ｇｌｙ，ｐｒｏ；及び （６）芳香族性：ｔｒｐ，ｔｙｒ，ｐｈｅ。
【０１３６】 非保存性置換は、別なクラスによってこれらのクラスの１のメンバーを交換す
ることを必要とするだろう。そのように置換した残基はまた、保存的置換部位に
、又は、より好ましくは、保持されている（非-保存的）部位にも導入し得る。
【０１３７】 該変異は、オリゴヌクレオチド介在（部位特異的）変異誘発、アラニンスキャ
ニング、及びＰＣＲ変異誘発のような当該分野で周知の方法を用いて作製できる
。部位特異的変異誘発[Carterら、Nucl. Acids Res.,13:4331(1986)；Zollerら 、Nucl. Acids Res.,10:6487(1987)]、カセット変異誘導[Wellsら、Gene,34:315
(1985)]、制限選択変異誘導[Wellsら、Philos.Trans.R.Soc.London SerA,317:41
5(1986)]、又は他の周知の技術は、望まれるＰＲＯポリペプチド変異体ＤＮＡを
製造するためのクローン化ＤＮＡで実行できる。
【０１３８】 スキャニングアミノ酸分析はまた、隣接配列に従って１以上のアミノ酸を同定
するために利用することができる。スキャニングアミノ酸の中で好適なものは、
相対的に小さい、中性アミノ酸である。そのようなアミノ酸は、アラニン、グリ
シン、セリン、及びシステインを含む。アラニンは、それがベータ炭素以外の側
鎖がなく、しかもその変異体の主鎖構造を変更する可能性が少ないため、このグ
ループの中で典型的に好ましいスキャニングアミノ酸である[CunninghamとWells
、Science,244:1081-1085(1989)]。アラニンはまた、それが最も普通のアミノ酸
であるため、典型的に好ましい。さらに、それは埋もれた及び露出した位置の両
方で頻繁に見出される[Creighton,The Proteins(W.H.Freeman & Co.,N.Y.);Chot
hia,J.Mol.Biol.,150:1(1976)]。もしアラニン置換が変異体の要求量を生じない
ならば、アイソテリックアミノ酸を使用することができる。
【０１３９】 １７．ＰＲＯポリペプチドの修飾 ＰＲＯポリペプチドの共有結合修飾物は、本発明の範囲内に含まれる。共有結
合修飾の一つのタイプは、選択した側鎖又はＮかＣ末端残基と反応することがで
きる有機誘導化剤によって、ＰＲＯポリペプチドの標的としたアミノ酸残基を反
応させることを含む。二官能剤による誘導体化は、例えば抗-ＰＲＯポリペプチ ド抗体を精製するための方法において使用するために水不溶性支持体マトリック
スに又は表面にＰＲＯポリペプチドを、及びその反対を架橋するために有用であ
る。普通に使用される架橋剤は、例えば、1,1-ビス(ジアゾアセチル)-2-フェニ ルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステル、例え ば4-アジドサリチル酸とのエステル、3,3'-ジチオビス(スクシンイミジルプロピ
オナート)のようなジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能イミドエステ ル、ビス-Ｎ-マレイミド-1,8-オクタンのような二官能マレイミド、及びメチル-
3-[(p-アジドフェニル)ジチオ]プロピオイミダートのような剤を含む。
【０１４０】 他の修飾は、グルタミニルとアスパラギニル残基をそれぞれ相当するグルタミ
ルとアスパルチル残基への脱アミド化、プロリンとリシンのヒドロキシル化、セ
リル又はトレオニル残基の水酸基のリン酸化、リシン、アルギニン、及びヒスチ
ジン側鎖のα-アミノ基のメチル化[T.E.Creighton,Proteins: Structure and Mo
lecular Properties,W.H.Freeman & Co.,San Francisco,pp.79-86(1983)]、Ｎ末
端アミンのアセチル化、及び何れかのＣ末端カルボキシル基のアミド化を含む。
【０１４１】 本発明の範囲内に含まれるＰＲＯポリペプチドの共有結合修飾の別なタイプは
、該ポリペプチドの天然グリコシル化パターンを変えることを含む。「天然グリ
コシル化パターンを変える」とは、天然配列ＰＲＯポリペプチド中で見出される
１以上の炭水化物部分を欠失すること、及び／又は天然配列ＰＲＯポリペプチド
中に存在しない１以上のグリコシル化部位を加えること、及び／又はグリコシル
化部位に付着した糖残基の比率及び／又は組成を変えることを意味すると、ここ
での目的のために意図される
【０１４２】 ＰＲＯポリペプチドへのグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列を変えるこ
とによって達成し得る。その変更は、例えば、天然配列ＰＲＯポリペプチドへの
１以上のセリン又はトレオニン残基の付加、又はそれによる置換によって作製し
得る（Ｏ-結合したグリコシル化部位の場合）。該ＰＲＯポリペプチドのアミノ 酸配列は、特にコドンが望まれるアミノ酸に翻訳されるであろうようにそれが生
成されるよう、予備選択した塩基で該ＰＲＯポリペプチドをコードしているＤＮ
Ａを変異することによって、ＤＮＡレベルでの変更を通して任意に変更し得る。
【０１４３】 ＰＲＯポリペプチドポリペプチド上の炭水化物部分の数を増加するための別の
手段は、ポリペプチドへのグリコシドの化学的又は酵素的カップリングによるも
のである。そのような方法は、当該分野において、例えば、1987年9月11日公開 のＷＯ８７／０５３３０中に、及びAplinとWriston,CRC Crit.Rev.Biochem.,259
-306頁(1981)中に記載されている。
【０１４４】 ＰＲＯポリペプチド上にある炭水化物部分の除去は、化学的又は酵素的に、又
はグリコシル化のための標識として利用されるアミノ酸残基をコードしているコ
ドンの突然変異的置換によって達成し得る。化学的な脱グリコシル化は、当該分
野で周知であるとともに、例えば、Hakimuddinら、Arch.Biochem.Biophys.,259:
52(1987)によって、及びEdgeら、Anal.Biochem.,118:131(1981)によって記載さ れる。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的な切断は、Thotakuraら、Meth. E
nzymol.,138:350(1987)により記載されたようなエンド-及びエキソ-グリコシダ ーゼの使用によって達成することができる。
【０１４５】 本発明のＰＲＯポリペプチドの共有結合修飾の別なタイプは、米国特許第４６
４０８３５；４４９６６８９：４３０１１４４；４６７０４１７；４７９１１９
２又は４１７９３３７号中に記載される手法において、例えばポリエチレングリ
コール、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンのような各種の
非タンパク様ポリマーの一つにＰＲＯポリペプチドを結合することを含む。
【０１４６】 本発明のＰＲＯポリペプチドはまた、別な、非相同ポリペプチド又はアミノ酸
配列に融合したＰＲＯポリペプチドを含むキメラ分子を形成する手法においても
修飾され得る。一つの実施態様において、そのようなキメラ分子は、ＰＲＯポリ
ペプチドと、抗-標識抗体(anti-tag antibody)が選択的に結合できるエピトープ
を提供する標識ポリペプチドとの融合体を含む。該エピトープ標識は一般に、Ｐ
ＲＯポリペプチドのアミノ又はカルボキシ末端に配される。そのようなエピトー
プ-標識形(epitope-tagged forms)の存在は、該標識ポリペプチドに対する抗体 を用いて検出することができる。また、エピトープ標識の提供は、エピトープ標
識に結合する抗-標識抗体又は別なタイプのアフィニティーマトリックスを用い るアフィニティー精製によって容易に精製されるＰＲＯポリペプチドを可能にす
る。代わりの実施態様において、該キメラ分子は、ＰＲＯポリペプチドと、免疫
グロブリンとの又は免疫グロブリンの特有な領域との融合を含み得る。キメラ分
子の二価の形態のために、そのような融合はＩｇＧ分子のＦｃ領域までとするこ
とができる。
【０１４７】 各種の標識ポリペプチドとそのそれぞれの抗体は、当該分野で良く知られる。
実例は、ポリヒスチジン（ポリ-his）又はポリヒスチジングリシン(ポリ-his-gl
y)標識；ｆｌｕ ＨＡ標識ポリペプチドとその抗体１２ＣＡ５[Fieldら、Mol.Cel
l.Biol.,8:2159-2165(1988)]；ｃ-ｍｙｃ標識とそれの８Ｆ９，３Ｃ７，６Ｅ１ ０，Ｇ４，Ｂ７，及び９Ｅ１０抗体[Evanら、Molecular and Cellular Biology,
5:3610-3616(1985)]；及び単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）標識 及びその抗体[Paborskyら、Protein Engineering,3(6):547-553(1990)]を含む。
他の標識ポリペプチドは、Ｆｌａｇ-ペプチド[Hoppら、BioTechnology,6:1204-1
210(1988)]；ＫＴ３エピトープペプチド[Martinら、Science,255:192-194(1992)
]；α-チューブリンエピトープペプチド[Skinnerら、J.Biol.Chem.,266:15163-1
5166(1991)]；及びＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチド標識[Lutz-Freyermuthら 、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:6393-6397(1990)]を含む。
【０１４８】 １８．ＰＲＯポリペプチドの調製 以下の記載は、ＰＲＯポリペプチド核酸を含むベクターによって形質転換した
又はトランスフェクションした細胞を培養することによるＰＲＯポリペプチドの
調製に本質的に関する。勿論、それはＰＲＯポリペプチドを製造するために利用
し得る、当該分野で周知の方法で代替することが意図される。例えば、ＰＲＯポ
リペプチド配列、又はその一部は、固相技術を用いて直接ペプチド合成によって
製造して良い[例えば、Stewartら、Solid-Phase Peptide Synthesis,W.H.Freema
n Co.,San Francisco,CA,(1969); Merrifield,J.Am.Chem.Soc.,85:2149-2154(19
63)を参照]。インビトロタンパク質合成は、手動技術を用いて又は自動によって
実施して良い。自動化合成は、例えば、製造者の指示に従ってApplied Biosyste
msペプチドシンセサイザー(Foster City,CA)を用いて達成し得る。ＰＲＯポリペ
プチドの各部は、別々に化学合成し、全長ＰＲＯポリペプチドを製造するための
化学的又は酵素的方法を用いて結合して良い。
【０１４９】 Ａ．ＰＲＯポリペプチドをコードしているＤＮＡの単離 ＰＲＯポリペプチドをコードしているＤＮＡは、ＰＲＯポリペプチドｍＲＮＡ
を持つとともに、それを検出可能なレベルで発現すると思われる組織から調製し
たｃＤＮＡライブラリーから得られる。従って、ヒトＰＲＯポリペプチドＤＮＡ
は、実施例中に記載したようなヒト組織から調製したｃＤＮＡライブラリーから
利便的に得ることができる。ＰＲＯポリペプチド-コード化遺伝子は、ゲノムラ イブラリーから、或いはオリゴヌクレオチド合成によって得ることもできる。
【０１５０】 ライブラリーは、興味ある遺伝子又はそれによってコードしたタンパク質を同
定するために設計したプローブ（ＰＲＯポリペプチドに対する抗体又は少なくと
も約２０−８０塩基のオリゴヌクレオチドのような）によってスクリーンするこ
とができる。その選択したプローブによるｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーのス
クリーニングは、Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual(New Yo
rk:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中に記載されるような標準手法
を用いて処理し得る。望まれるＰＲＯポリペプチドをコードしている遺伝子を単
離するための代替手段は、ＰＣＲ方法論を使用することである[Sambrookら、上 記；Dieffenbachら、PCR Primer:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Lab
oratory Press,1995)]。
【０１５１】 後述の実施例は、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための技術を記
載する。プローブとして選択したオリゴヌクレオチド配列は、擬陽性が最少化さ
れるように十分な長さにすると共に十分に明白なものにすべきである。そのオリ
ゴヌクレオチドは、それがスクリーンするべきライブラリー中のＤＮＡへのハイ
ブリダイゼーションを検出できるように好ましくは標識される。標識化(labelin
g)の方法は、当該分野で周知であり、32Ｐ-標識したＡＴＰのような放射性標識 、ビオチン化、又は酵素標識を含む。中等度ストリンジェンシー及び高度なスト
リンジェンシーを含むハイブリダイゼーション条件は、Sambrookら、上記、中に
提供される。
【０１５２】 そのようなライブラリースクリーニング法で同定される配列は、寄託された及
びＧｅｎＢａｎｋのような公共のデータベース又は他のプライベートな配列デー
タベースで利用可能な他の周知の配列と比較し且つアライメントすることができ
る。その分子の定められた領域内の又は全長配列にわたる配列同一性（アミノ酸
又はヌクレオチドレベルでの何れか一方）は、相同性を測定するため各種アルゴ
リズムを利用する、ＢＬＡＳＴ，ＡＬＩＧＮ，ＤＮＡｓｔａｒ，及びＩＮＨＥＲ
ＩＴのようなコンピューターソフトウェアプログラムを用いた配列アラインメン
トを経て決定することができる。
【０１５３】 タンパク質コード配列を有する核酸は、初めてここに記載した推定アミノ酸配
列を用いて、もし必要なら、プレカーサーを検出する及びｃＤＮＡに逆転写され
ていないｍＲＮＡの中間体を加工するために、Sambrookら、上記、中に記載した
ような通常のプライマー伸長法を用いて、選択したｃＤＮＡ又はゲノムライブラ
リーをスクリーニングすることによって得ることができる。
【０１５４】 Ｂ．宿主細胞の選択と形質転換 宿主細胞は、ＰＲＯポリペプチド作製用にここに記載した発現又はクローニン
グベクターによって形質転換され、そしてプロモーターの誘導、形質転換体の選
択、又は望まれる配列をコードしている遺伝子の増幅のために適切なように修正
した通常の栄養培地中で培養される。培地、温度、ｐＨなどのような培養条件は
、過度の実験なしに熟達した研究者であれば選択することができる。一般に、細
胞培養の生産性を最大化するための原理、プロトコール、及び実践技術は、Mamm
alian Cell Biotechnology: A Practical Approach,M.Butler,ed.(IRL Press,19
91)及びSambrookら、上記、中に見出すことができる。
【０１５５】 トランスフェクションの方法は、例えば、ＣａＰＯ4とエレクトロポレーショ ンのように、当業者に周知である。使用される宿主細胞に基づいて、形質転換は
、そのような細胞に対して適切な標準技術を用いて実行される。Sambrookら、上
記、に記載される塩化カルシウムを用いるカルシウム処理、又はエレクトロポレ
ーションは、一般に原核生物又は本質的に細胞壁バリアを含む他の細胞用に使用
される。アグロバクテリウム・チュメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens
)による感染は、Shawら、Gene,23:315(1983)と1989年6月29日に公開されたＷＯ ８９／０５８５９によって記載されるようなある種の植物細胞の形質転換のため
に使用される。そのような細胞壁を持たない哺乳動物細胞のためには、Grahamと
van der Eb,Virology,52:456-457(1978)のリン酸カルシウム沈殿法が利用できる
。哺乳動物細胞宿主系形質転換の一般態様は、米国特許第４３９９２１６号中に
記載されている。酵母における形質転換は典型的に、Van Solingenら、J.Bact.,
130:946(1977)とHsiaoら、Proc.Natl.Acad.Sci.(USA),76:3829(1979)の方法に従
って行われる。しかしながら、核ミクロ注入、エレクトロポレーション、完全な
細胞と細菌のプロトプラスト融合、ポリカチオン、例えばポリブレン又はポリオ
ルニチン、のような細胞にＤＮＡを導入するための他の方法も使用し得る。哺乳
動物細胞を形質転換するための各種の技術については、Keownら、Methods in En
zymology,185:527-537(1990)とMansourら、Nature,336:348-352(1988)を参照。
【０１５６】 ここでのベクターにおいてＤＮＡをクローニング又は発現するために好適な宿
主細胞は、原核生物、酵母、又は高等な真核生物を含む。適当な原核生物は、真
性細菌属に制限されることなく、グラム陰性又はグラム陽性生物、例えば大腸菌
のようなエシェリキア属を含む。大腸菌Ｋ１２株ＭＭ２９４(ATCC 31446)；大腸
菌Ｘ１７７６(ATCC 31537)；大腸菌Ｗ３１１０株(ATCC 27325)；及びＫ５ ７７ ２(ATCC 53635)のような各種の大腸菌株が公的に利用可能である。他の好適な原
核生物宿主細胞は、例えば大腸菌のようなエシェリキア属、エンテロバクター属
、エルウイニア属、クレブシエラ属、プロテウス属、サルモネラ属、例えばネズ
ミチフス菌、セラティア属、例えば霊菌、及びシゲラ属のような腸内細菌科、同
じくＢ．スブチリス、Ｂ．リケニホルミス（例えば、Ｂ．リケニホルミス４１Ｐ
は1989年4月12日に公開されたＤＤ２６６７１０中に開示される）のようなバチ ルス属、緑膿菌のようなシュードモナス属、及びストレプトマイセス属を含む。
大腸菌Ｋ１２株ＭＭ２９４(ATCC 31446)；大腸菌Ｘ１７７６(ATCC 31537)；大腸
菌Ｗ３１１０株(ATCC 27325)；及びＫ５ ７７２(ATCC 53635)のような各種の大 腸菌株が公的に利用可能である。これらの例示は、制限のためではなく説明のた
めである。Ｗ３１１０株は、それが組み換えＤＮＡ製品発酵のために普通の宿主
株であるために特に好ましい宿主又は親の一つである。好ましくは、該宿主細胞
は、最少量の蛋白分解酵素を分泌する。例えば、Ｗ３１１０株は、完全な遺伝子
型tonAを有する大腸菌Ｗ３１１０株１Ａ２；完全な遺伝子型tonA ptr3を有する 大腸菌Ｗ３１１０株９Ｅ４；完全な遺伝子型tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169
degP ompT kanrを有する大腸菌Ｗ３１１０株２７Ｃ７(ATCC 55244)；完全な遺 伝子型tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT rbs7 ilvG kanrを有する
大腸菌Ｗ３１１０株３７Ｄ６；非カナマイシン耐性degT欠失変異を持つ３７Ｄ６
株である大腸菌Ｗ３１１０株４０Ｂ４；及び1990年8月7日発行の米国特許第４９
４６７８３号中に開示される変異ペリプラズミックプロテアーゼを有する大腸菌
株を含むそのような宿主の実例とともに、該宿主に内因性のタンパク質をコード
している遺伝子中の遺伝的変異をもたらすように修正し得る。或いは、クローニ
ングのインビトロ法、例えばＰＣＲ又は他の核酸ポリメラーゼ反応が好適である
。
【０１５７】 原核生物に加えて、糸状真菌又は酵母のような真核微生物が、ＰＲＯポリペプ
チドをコードしている核酸を含むベクターのための適当なクローニング又は発現
宿主である。サッカロミセス・セレビシエは、普通に用いられる下等な真核宿主
微生物である。しかしながら、多数の他の属、種、及び株が普通に利用でき且つ
ここで有用である、例えばシゾサッカロミセス・ポンベ(BeachとNurse, Nature,
290: 140(1981); 1985年5月2日公開のＥＰ１３９３８３)；クリベロマイセス宿
主(米国特許第４９４３５２９号；Fleerら、Bio/Technology, 9:968-975(1991))
例えばＫ．ラクチス(MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourtら、J. Bacteriol
., 737(1983))、Ｋ．フラジリス(ATCC 12424)、Ｋ．ブルガリクス(ATCC 16045) 、Ｋ．ウイッケラミイ(ATCC 24178)、Ｋ．ワルチ(ATCC 56500)、Ｋ．ドロソフィ
ラルム(ATCC 36906; Van den Bergら、Bio/Technology, 8:135(1990)、Ｋ．サー
モトレランス及びＫ．マキシアヌス；ヤロウィア(EP402226)；ピシア・パストリ
ス(EP183070；Sreekrishnaら、J. Basic Microbiol., 28:265-278(1988))；カン
ジダ属；トリコデルマ・リーシア(EP244,234)；ニューロスポラ・クラシア(Case
ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 5259-5263(1979))；シュヴァニオミセス
属、例えばシュヴァニオミセス・オクシデンタリス(1990年10月31日公開のEP394
538)；及び糸状真菌、例えば、ニューロスポラ属、ペニシリウム属、トリポクラ
ディウム属(1991年1月10日公開のWO91/00357)のような、及びアスペルギルス属 宿主、Ａ．ニドランス(Ballanceら、Biochem. Biophys. Res. Commun., 112: 28
4-289(1983); Tilburnら、Gene, 26:205-221(1983); Yeltonら、Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA, 81:1470-1474(1984))及びＡ．ニガー KellyとHynes, EMBO J., 4
:475-479(1985)。メチロトロピック酵母がここでは好適であり、制限されること
なしに、ハンセヌラ属、カンジダ属、クロエケラ属、ピシア属、サッカロミセス
属、トルロプシス属及びロドトルラ属からなる属から選択されるメタノールで増
殖可能な酵母を含む。酵母のこのクラスの例示である特有の種のリストは、C.An
thony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269(1982)中に見出される。
【０１５８】 グリコシル化ＰＲＯポリペプチドの発現用に好適な宿主細胞は、多細胞生体か
ら得られる。無脊椎動物細胞の実例は、ショウジョウバエＳ２とスポドプテラＳ
ｆ９のような昆虫細胞、同じく植物細胞を含む。有用な哺乳動物宿主細胞系の実
例は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）とＣＯＳ細胞を含む。より特有な
例は、ＳＶ４０によって形質転換したサル腎臓ＣＶ１系(ＣＯＳ-７,ATCC CRL 16
51)；ヒト胚腎臓系(２９３又は懸濁培養での増殖用にサブクローンした２９３細
胞、Grahamら、J.Gen Virol.,36:59(1977))；チャイニーズハムスター卵巣細胞/
-ＤＨＦＲ(ＣＨＯ、UrlaubとChasin,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216(1980))；
マウスセルトーリ細胞(ＴＭ４，Mather,Biol.Reprod.,23:243-251(1980))；ヒト
肺細胞(Ｗ１３８，ATCC CCL 75)；ヒト肝臓細胞(Hep G2, HB 8065)；及びマウス
乳癌(MMT 060562, ATCC CCL51)を含む。適切な宿主細胞の選択は、当業者の範囲
内と思われる。
【０１５９】 Ｃ．複製可能ベクターの選択と使用 ＰＲＯポリペプチドをコードしている核酸（例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮ
Ａ）は、クローニングのため（そのＤＮＡの増幅）又は発現のために複製可能ベ
クターに挿入し得る。各種のベクターが、公的に利用可能である。該ベクターは
、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、又はファージの形態とし得る
。その適切な核酸配列は、各種の手法によって該ベクター内に挿入し得る。一般
に、ＤＮＡは、当該分野で周知の技術を用いて適当な制限エンドヌクレアーゼ部
位に挿入される。ベクター構成要素は、一般に、制限されることなしに、１以上
のシグナル配列、複製の起点、１以上のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プ
ロモーター、及び転写終止配列を含む。これらの１以上の構成要素を含む適当な
ベクターの構築は、熟達した研究者に周知である標準的な結紮技術を利用する。
【０１６０】 興味あるＰＲＯポリペプチドは、直接的にのみならず、シグナル配列又は成熟
タンパク質又はポリペプチドのＮ末端で特異的切断部位を有する他のポリペプチ
ドとし得る非相同ポリペプチドとの融合ポリペプチドとして組み換えによって製
造し得る。一般に、該シグナル配列は、ベクターの構成要素として良く、又はそ
れはベクターに挿入されるＰＲＯポリペプチド-コード化ＤＮＡの一部とし得る 。該シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐ
、又は心臓-安定エンテロトキシンIIリーダーのような原核生物のシグナル配列 とし得る。酵母分泌用のシグナル配列は、例えば、酵母インベルターゼリーダー
、アルファ因子リーダー(サッカロミセスとクリベロミセスα因子リーダーを含 む、後者は米国特許第５０１０１８２号中に記載される)、又は酸性ホスファタ ーゼリーダー、Ｃ．アルビカンスグルコアミラーゼリーダー(1990年4月4日公開 のEP362179)、又は1990年11月15日公開のＷＯ９０／１３６４６に記載されたシ グナルとして良い。哺乳動物細胞発現において、哺乳動物シグナル配列は、同じ
又は関連する種の分泌されたポリペプチドからのシグナル配列のようなタンパク
質の直接分泌、同じくウイルス分泌リーダーに使用し得る。
【０１６１】 発現及びクローニングベクターの両方は、選択した宿主細胞の１以上の中でそ
のベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。そのような配列は、各種の細菌
、酵母、及びウイルスについて良く知られている。プラスミドｐＢＲ３２２から
の複製の起点は、大部分のグラム陰性細菌用に好適であり、２μプラスミド起点
は、酵母用に好適であり、且つ各種のウイルス起点(ＳＶ４０、ポリオーマ、ア デノウイルス、ＶＳＶ、又はＢＰＶ)は、哺乳動物細胞中のクローニングベクタ ーに有用である。
【０１６２】 発現及びクローニングベクターは、典型的に選択遺伝子、選択可能マーカーと
も言われる、を含むであろう。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質又は他の
毒素、例えばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、又はテトラサイ
クリンに対する耐性を与える、（ｂ）補充栄養要求性欠如、又は（ｃ）例えばバ
チルス属のＤ-アラニンラセマーゼをコードしている遺伝子のような、複合培地 から利用可能でない臨界栄養源の供給、のタンパク質をコードする。
【０１６３】 哺乳動物細胞用の適当な選択マーカーの実例は、ＤＨＦＲ又はチミジンキナー
ゼのような、ＰＲＯポリペプチド-コード核酸を取り込むための感応細胞の同定 を可能にするそれらである。野生型ＤＨＦＲが用いられる場合に適当な宿主細胞
は、Urlaubら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216(1980)によって記載されるよう
に製造され且つ増殖された、ＤＨＦＲ活性が不足したＣＨＯ細胞系である。酵母
において使用するために適当な選択遺伝子は、酵母プラスミドＹＲｐ７に存在す
るｔｒｐ１遺伝子である[Stinchcombら、Nature,282:39(1979)；Kingsmanら、Ge
ne, 7:141(1979)；Tschemperら、Gene,10:157(1980)]。該ｔｒｐ１遺伝子は、ト
リプトファン中で増殖する能力を欠いた酵母の変異株、例えば、ATCC No.44076 又はPEP4-1用の選択マーカーを提供する[Jones,Genetics,85:12(1977)]。
【０１６４】 発現及びクローニングベクターは、ｍＲＮＡ合成を導くためのＰＲＯポリペプ
チドコード核酸配列に操作可能に結合したプロモーターを通例は含む。各種の可
能性のある宿主細胞によって認識されるプロモーターは周知である。原核生物宿
主で使用するために好適なプロモーターは、β-ラクタマーゼとラクトースプロ モーター系[Changら、Nature,275:615(1978)；Goeddelら、Nature,281:544(1979
)]、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系[Goeddel, N
ucleic Acids Res.,8:4057(1980); EP36776]、及びｔａｃプロモーターのような
ハイブリッドプロモーター[deBoerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80:21-25(1983)
]を含む。細菌系において使用するためのプロモーターは、ＰＲＯポリペプチド をコードしているＤＮＡに操作可能に結合したShine-Dalgarno(S.D.)配列をも含
むであろう。
【０１６５】 酵母宿主で使用するために適当なプロモーター配列の実例は、３-ホスホグリ セラートキナーゼ[Hitzemanら、J.Biol.Chem.,255:2073(1980)]又はエノラーゼ 、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン 酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-6-リン酸イソメ ラーゼ、3-ホスホグリセラートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースホス
フェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼの
ような他の解糖酵素[Hessら、J.Adv.Enzyme Reg.,7:149(1968);Holland,Biochem
istry,17:4900(1978)]を含む。
【０１６６】 増殖状態によって制御される転写の更なる効果を有する誘導可能なプロモータ
ーである、他の酵素プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシト
クロムＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関係する分解酵素、メタロチオネイ
ン、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトースとガラク トース利用のための応答可能な酵素のプロモーター領域である。酵母発現におけ
る使用のための適当なベクターとプロモーターは、ＥＰ７３６５７中に更に記載
される。
【０１６７】 哺乳動物宿主細胞中のベクターからのＰＲＯポリペプチド転写は、例えばポリ
オーマウイルス、鶏痘ウイルス(1989年7月5日公開のＵＫ２２１１５０４)、アデ
ノウイルス(アデノウイルス２のような)、ウシパピローマウイルス、鳥類肉腫ウ
イルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス及びシミア
ンウイルス４０(SV40)のようなウイルスのゲノムから；非相同哺乳動物プロモー
ター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター；及び宿主
細胞系と和合されるそのようなプロモーターを提供する、熱ショックプロモータ
ー、から得られたプロモーターによって制御される。
【０１６８】 より高等な真核生物によるＰＲＯポリペプチドをコードしているＤＮＡの転写
は、ベクターへのエンハンサー配列の挿入によって増加し得る。エンハンサーは
、通常約１０から３００ｂｐまでのＤＮＡのシス-作用要素であり、その転写を 増加するプロモーターに作用する。多くのエンハンサー配列が哺乳動物から現在
知られている（グロブリン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトタンパク質 、及びインスリン）。典型的に、しかしながら、それは真核生物細胞ウイルスか
らのエンハンサーが使用されるだろう。実例は、複製起点の後の側上のＳＶ４０
エンハンサー（ｂｐ１００−２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーター
エンハンサー、複製起点の後方上のポリオーマエンハンサー、及びアデノウイル
スエンハンサーを含む。該エンハンサーは、ＰＲＯポリペプチドコード配列の位
置５’又は３’でベクター内にスプライスされるが、しかし好ましくは該プロモ
ーターから部位５’に配される。
【０１６９】 真核生物細胞（酵母、カビ、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物か
らの有核細胞）において使用される発現は、転写の終止のため及びｍＲＮＡを安
定化するために必要な配列をも含むであろう。そのような配列は普通、真核生物
又はウイルスＤＮＡｓ又はｃＤＮＡｓの５’及び時折３’非翻訳領域から利用可
能である。これらの領域は、ＰＲＯポリペプチドをコードしているｍＲＮＡの非
翻訳部分中のポリアデニル化フラグメントとして転写したヌクレオチドセグメン
トを含む。
【０１７０】 組換え脊椎動物細胞培養におけるＰＲＯポリペプチドの合成への適合のために
好適な更に他の方法、ベクター、及び宿主細胞は、Gethingら、Nature,293:620-
625(1981); Manteiら、Nature,281:40-46(1979); EP117060;とEP117058中に記載
される。
【０１７１】 Ｄ．遺伝子増幅／発現の検出 遺伝子増幅／発現は、直接試料で、例えば、ここに提供した配列に基づいて、
適切に標識したプローブを用いて、通常のサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写を
定量するためのノーザンブロット法[Thomas, Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:5201-
5205(1980)]、ドットブロッティング（ＤＮＡ分析）、又はin situハイブリダイ
ゼーションで測定し得る。あるいは、抗体は、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖、及
びＤＮＡ-ＲＮＡハイブリッド二本鎖又はＤＮＡ-タンパク質二本鎖を含む特異的
二本鎖を認識できるそれを利用し得る。その結果抗体は、標識されて良く、且つ
該アッセイは、その二本鎖がその表面上に二本鎖の形成において、該二本鎖に結
合した抗体の存在が検出できるように表面に結合される場合、実行し得る。
【０１７２】 あるいは遺伝子発現は、細胞の免疫組織学的染色又は組織切片のような免疫学
的方法及び遺伝子生成物の発現を直接定量するため、細胞培養又は体液のアッセ
イによって測定し得る。流体試料の免疫組織学的染色のために有用な抗体は、モ
ノクローナル又はポリクローナルのいずれかとして良く、また何れの哺乳動物に
おいても作製し得る。利便的に、該抗体は、天然配列ＰＲＯポリペプチドに対し
て、又はここに提供したＤＮＡ配列に基づく合成ペプチドに対して又はＰＲＯポ
リペプチドＤＮＡと特異的抗体エピトープをコードしているものと融合した外因
性配列に対して製造し得る。
【０１７３】 Ｅ．ポリペプチドの精製 ＰＲＯポリペプチドの形成物は、培地又は宿主細胞溶解物から回収し得る。も
し膜に結合しているならば、それは適当な洗剤溶液(例えばTriton-X100)を用い て又は酵素的な切断によってその膜から離すことができる。ＰＲＯポリペプチド
の発現において用いた細胞は、凍結-融解サイクル、音波処理、機械的粉砕、又 は細胞溶解剤のような各種の物理的化学的手段によって破砕することができる。
【０１７４】 それは組換え細胞タンパク質又はポリペプチドからＰＲＯポリペプチドを精製
するために望まれるであろう。以下の手法は、好適な精製手法の例示である：イ
オン交換カラムでの分画によって；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカでの
又はＤＥＡＥのようなカチオン交換樹脂でのクロマトグラフィー；クロマトフォ
ーカシング；ＳＤＳ-ＰＡＧＥ；硫安沈殿；例えばSEPHADEXTMG-75を用いたゲル 濾過；ＩｇＧのような不純物を除去するためのプロテインＡSEPHAROSETMカラム ；及びＰＲＯポリペプチドのエピトープ-標識化形を結合する金属キレート化カ ラム。タンパク質精製の各種の方法を用いて良く、さらにそのような方法は当該
分野で周知であり、且つ、例えば、Deutscher,Methods in Enzymology,182(1990
);及びScopes, Protein Purification: Principles and Practice (Springer-Ve
rlag: New York,1982)中に記載される。選択した精製工程は、例えば使用した生
生成物の及び生産した特有のＰＲＯポリペプチドの本質に基づくであろう。
【０１７５】 １９．ＰＲＯポリペプチドの使用 本発明のＰＲＯポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列（又はその相
補体）は、染色体及び遺伝子マッピングにおいて、及びアンチセンスＲＮＡとＤ
ＮＡの生成においてハイブリダイゼーションプローブとしての使用を含む、当該
分野及び分子生物学の分野における各種の適用を有する。ＰＲＯポリペプチド- コード核酸は、ここに記載した組換え技術によってＰＲＯポリペプチドの製造用
にも有用であろう。
【０１７６】 全長天然配列ＰＲＯポリペプチド-コード核酸又はその一部は、全長ＰＲＯポ リペプチド遺伝子を単離するための、或いはＰＲＯポリペプチド核酸配列と同一
の望まれる配列を有する、更に他の遺伝子（例えば、ＰＲＯポリペプチドの天然
発生変異体又は他の種からのＰＲＯポリペプチド）を単離するためのｃＤＮＡラ
イブラリー用のハイブリダイゼーションプローブとして使用し得る。任意に、該
プローブの長さは、約２０乃至約５０塩基とされるであろう。該ハイブリダイゼ
ーションプローブは、ここに開示した何れかのＤＮＡ分子のヌクレオチド配列か
ら、或いは天然配列ＰＲＯポリペプチドコード化ＤＮＡのプロモーター、エンハ
ンサー要素及びイントロンを含むゲノム配列から得ることができる。例えば、ス
クリーニング法は、約４０塩基の選択したプローブを合成するための周知のＤＮ
Ａ配列を用いてＰＲＯポリペプチド遺伝子のコード化領域を単離することを含む
であろう。ハイブリダイゼーションプローブは、32Ｐ又は35Ｓのような放射性ヌ
クレオチド、又はアビジン／ビオチン結合系に結合したアルカリホスファターゼ
のような酵素標識を含む、各種の標識によって標識し得る。本発明のＰＲＯポリ
ペプチド遺伝子のそれに相補な配列を有する標識化プローブは、プローブをハイ
ブリダイズするそのようなライブラリーのメンバーを決定するためヒトｃＤＮＡ
、ゲノムＤＮＡ、又はｍＲＮＡのライブラリーをスクリーンするために使用する
ことができる。ハイブリダイゼーション技術は、後述の実施例中に更に詳細に記
載される。
【０１７７】 本出願中に開示したＥＳＴｓは、ここに開示した方法を用いて、プローブと同
様に利用し得る。
【０１７８】 該プローブはまた、密接に関係したＰＲＯポリペプチド配列の同定のための配
列のプールを生成するためのＰＣＲ技術においても利用し得る。
【０１７９】 ＰＲＯポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列はまた、ＰＲＯポリペ
プチドをコードするその遺伝子のマッピングのため及び遺伝的疾患を持つ個人の
遺伝的分析のためのハイブリダイゼーションプローブを構築するためにも使用で
きる。ここに提供されたヌクレオチド配列は、in situハイブリダイゼーション 、周知の染色体マーカーに対する結合分析、及びライブラリーによるハイブリダ
イゼーションスクリーニングのような周知技術を用い、染色体及び染色体の特有
の領域にマッピングし得る。
【０１８０】 ＰＲＯポリペプチド用のコード配列が別なタンパク質に結合するタンパク質を
コードする場合に、該ＰＲＯポリペプチドは、そのリガンドを同定するためのア
ッセイにおいて使用することができる。同様に、レセプター／リガンド結合相互
作用のインヒビターを同定することができる。そのような結合相互作用に含まれ
たタンパク質はまた、ペプチド又は小分子インヒビター又は結合相互作用のアゴ
ニストをスクリーンするために使用することもできる。スクリーニングアッセイ
は、天然ＰＲＯポリペプチド又はＰＲＯポリペプチド用レセプターの生物学的活
性を模倣するリード化合物を見出すために設計することができる。そのようなス
クリーニングアッセイは、小分子薬剤候補を同定するために特に好適なそれらを
作る、化合物ライブラリーの高スループットスクリーニングに服しやすいアッセ
イを含むであろう。意図される小分子は、合成有機又は無機化合物を含む。該ア
ッセイは、タンパク質-タンパク質結合アッセイ、生化学スクリーニングアッセ イ、免疫アッセイ及び当該分野において十分に特徴付けされる細胞ベースのアッ
セイを含む、各種の方式において実行することができる。
【０１８１】 ＰＲＯポリペプチド又は何れかのその修正された形態をコードしている核酸は
、治療的に有効な試薬の開発又はスクリーニングにおいて、その結果有用である
トランスジェニック動物又は「ノックアウト」動物の何れか一方を生産するため
にも使用できる。トランスジェニック動物（例えばマウス又はラット）は、出生
前の、例えば胎児段階で、トランスジーンがその動物に、又はその動物の親に導
入された、トランスジーンを含む細胞を有する動物である。トランスジーンは、
開発するトランスジェニック動物からの細胞のゲノム内に導入されるＤＮＡであ
る。一つの実施態様において、ＰＲＯポリペプチドをコードしているｃＤＮＡは
、ＰＲＯポリペプチドをコードしているＤＮＡを発現する細胞を含むトランスジ
ェニック動物を生成するために用いた確立した技術及びゲノムの配列に従いＰＲ
ＯポリペプチドをコードしているゲノムＤＮＡをクローンするため使用すること
ができる。トランスジェニック動物、特にマウス又はラットのような動物を作製
するための方法は、当該分野において通常的になされており、例えば米国特許第
４７３６８６６と４８７０００９号中に記載される。典型的に、個々の細胞は、
組織特異的エンハンサーによるＰＲＯポリペプチドトランスジーン組み込みのた
めの標的とされるであろう。胎児段階でその動物の生殖細胞系に導入したＰＲＯ
ポリペプチドをコードしているトランスジーンのコピーを含むトランスジェニッ
ク動物は、ＰＲＯポリペプチドをコードしているＤＮＡの増加した発現の作用を
実験するために用いることができる。そのような動物は、例えば、それの過剰発
現と関連した病的状態からの保護を与えることを通して試薬のためのテスター動
物として使用することができる。本発明のこの態様に従い、動物はその試薬で治
療され、その病的状態の可能性のある治療的な介入を示すであろう、該トランス
ジーンを持つ治療しない動物と比べて、病的状態の発生が減じられる。
【０１８２】 あるいは、「ノックアウト」動物は、該ポリペプチドをコードしている内因性
遺伝子と、該動物の胚細胞に導入した同じポリペプチドをコードしている変更し
たゲノムＤＮＡとの間の相同組換えの結果として、興味あるＰＲＯポリペプチド
をコードしている欠陥のある又は変更された遺伝子を有するものを構築すること
ができる。例えば、ＰＲＯポリペプチドをコードしているｃＤＮＡは、確立され
た技術に従い、ＰＲＯポリペプチドをコードしているゲノムＤＮＡをクローンす
るために用いることができる。ＰＲＯポリペプチドをコードしているゲノムＤＮ
Ａの一部は、欠失されるか、或いはモニター組込みに用いることができる選択可
能なマーカーをコードしている遺伝子のような、別な遺伝子と置換することがで
きる。典型的に、変更していない隣接ＤＮＡの数キロ塩基（５’と３’での両方
）は、ベクター中に含まれる[例えば、相同組換えベクターの記載についてのTho
masとCapecchi,Cell,51:503(1987)を参照]。該ベクターは、胚の幹細胞系内に導
入され（例えばエレクトロポレーションで）、内因性ＤＮＡで相同的に組み換え
られている導入されたＤＮＡで細胞が選択される[例えば、Liら、Cell,69:915(1
992)を参照]。選択した細胞は、次いで凝集キメラを形成するために動物（例え ばマウス又はラット）の芽細胞に注入される[例えば、Bradley,Teratocarcinoma
s and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach,E.J.Robertson,ed.(IRL,O
xford,1987),113-152頁中を参照]。キメラの胚は、適当な偽妊娠メス里親動物に
移植することができ、その胚は「ノックアウト」動物が生成するまで成長させる
。それの生殖細胞における相同的に組換えたＤＮＡを持った子孫は、標準的な技
術によって同定することができ、相同的に組み換えたＤＮＡを含むその動物の全
ての全ての細胞が動物繁殖に使用できる。ノックアウト動物は、例えば、ある種
の病的状態に対して防御するその能力によって及びＰＲＯポリペプチドの不在の
ための病的状態のその進行によって特徴付けできる。
【０１８３】 ＰＲＯポリペプチドのインビトロ投与が利用される場合、正常な用量は、投薬
のルートに基づいて、約１０ｎｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ動物体重又は１日
当たりまで、好ましくは約１μｇ／ｋｇ／日乃至１０ｍｇ／ｋｇ／日に変更し得
る。特有な用量とデリバリーの方法のためのガイダンスは、文献中に提供されて
いる；例えば米国特許第４６５７７６０；５２０６３４４；又は５２２５２１２
号を参照。異なる処方は、一つの器官又は組織を標的化する投与が、例えば別の
器官又は組織のそれとは異なる手法でデリバリーを必要とするであろう異なる治
療用化合物と異なる疾患のために有効となるであろう。
【０１８４】 ＰＲＯポリペプチドの徐放性投与がＰＲＯポリペプチドの必要とされる何れか
の疾患或いは疾病の治療に好適な放出特性を持つ処方に望まれる場合、ＰＲＯポ
リペプチドのミクロカプセル化が企図される。遅延した放出用の組換えタンパク
質のミクロカプセル化は、ヒト成長ホルモン（ｒｈＧＨ）、インターフェロン- （ｒｈＩＦＮ-）、インターロイキン-２、及びＭＮｒｇｐ１２０で成功裏に行わ
れている。Johnsonら、Nat.Med.,2:795-799(1996);Yasuda,Biomed.Ther.,27:122
1-1223(1993);Horaら、Bio/Technology,8:755-758(1990);Cleland,"Design and
Production of Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycoli
de Microsphere Systems,"in Vaccine Design:The Subunit and Adjuvant Appro
ach,Powell and Newman,eds,(Plenum Press:New York,1995)439-462頁；ＷＯ９ ７／０３６９２，ＷＯ９６／４００７２，ＷＯ９６／０７３９９；及び米国特許
第５６５４０１０号。
【０１８５】 これらのタンパク質の徐放性処方は、その生物和合性及び広範な生物分解特性
のため、ポリ-乳酸-共グリコール酸（ＰＬＧＡ）を用いて開発された。ＰＬＧＡ
、乳酸及びグリコール酸の分解生成物は、ヒトの体内で迅速に分解できる。その
上、このポリマーの分解は、その分子量と組成に基づいて、数ヶ月から数年まで
調節することができる。Lewis,"Controlled release of bioactive agents from
lactide/glycolide polymer,"in:M.ChasinとR.Langer(Eds.),Biodegradable Po
lymers as Drug Delivery Systems(Marcel Dekker:New York,1990)1-41頁。
【０１８６】 例えば、８５ｋｇの最大体重を持った哺乳動物においてほぼ８０g/kg/日の用 量を提供することができる処方のためには、最も多い用量は、１日当たりＰＲＯ
ポリペプチドのほぼ６．８ｍｇとされるであろう。この用量レベルを達成するた
めに、最も低いと思われる最初のバースト（＜２０％）とともに最大と思われる
負荷タンパク質(15-20%w/wＰＲＯポリペプチド）を含む徐放性処方が必要である
。１−２週間ミクロ粒子からのＰＲＯポリペプチドの継続（ゼロ-オーダー）放 出もまた望まれる。加えて、放出すべき被包化タンパク質は、望まれる放出期間
にわたりその形状及び安定性を維持すべきである。
【０１８７】 内因性ビグリカンタンパク質のそれに放出される生物学的活性を所有する本発
明のＰＲＯ２４１ポリペプチドは、治療目的のインビボ及びインビトロの両方で
利用し得る。当業者であれば、そのような目的のために本発明のＰＲＯ２４１ポ
リペプチドをどのように利用するかを十分に承知しているであろう。
【０１８８】 コルディン(chordin)（ＣＨＤ）は、示差的な顔の特徴(低い前毛髪線、眉毛叢
生症、前傾の外鼻孔、上顎前突症、長い人中、こい口(carp mouth))、出生前又 は出生後の成長遅延、精神遅延及び、しばしば、しかし常時ではない上肢奇形に
よって特徴付けられるコルネリア・ド・ランゲ症候群として知られる異形症候群
のための候補遺伝子である。また、ＣＤＬが血小板減少症との関連において存在
するレアケースもある。ＣＤＬの遺伝子は、3q26.3(OMIM#122470)への結合によ ってマップされている。初期アフリカツメガエル(early Xenopus)パターン化に おけるＸｃｈｄ（アフリカツメガエルコルディン(Xenopus chordin)）包含及び 神経系統発育は、興味のある候補遺伝子中にＣＨＤを作る。ＣＨＤは、染色体３
上の適切な領域にマップされる。それはＴＨＰＯに非常に密接し、ＴＨＰＯとＣ
ＨＤの両方を包含する欠失は、血小板減少症と発育異形症のレアケースに帰結で
きる。全成人組織の大部分がＣＨＤ発現に対して陰性である顕現したＣＤのin s
itu分析において、僅かに陽性のシグナルが、長い骨の発育と推定上の成長にお いてＣＨＤを関連させる大腿骨頭と寛骨臼（股関節）との間に形成される発育中
の滑膜性の連結の割線において観測された。そのような機能は、もし混乱したな
らば、成長遅延をもたらすことができる。
【０１８９】 ｃＤＮＡから予測したヒトＣＨＤアミノ酸配列は、Ｘｃｈｄに５０％同一性（
及び６６％保存された）である。４システイン-富ドメイン中の全ての４０シス テインが保存される。これらのシステイン富ドメインは、トロンボスポンジン、
プロコラーゲン及びフォン・ビルブラント因子中で観測されたそれらに類似して
いる。Bornstein,P.FASEB J 6:3290-3299(1992);Hunt,L.& Barker,W.Biochem.Bi
ophys.Res.Commun.144:876-882(1987)。
【０１９０】 ヒトＣＨＤ座（ゲノムＰＲＯ２４３）は、ゲノムＤＮＡの９．６ｋｂ中に２３
エキソンを含む。ＣｐＧ島は、５’及びエキソン１のほぼ１００ｂｐ５’で始ま
る５′で配置され、且つ該遺伝子の第１のイントロン内に第１のエキソンと末端
を通して延長される。ＴＨＰＯとＣＨＤ配座は、その転写開始部位を分離するほ
ぼ２．２ｋｂの頭−頭(head-to-head)形態で構成される。タンパク質レベルで、
ＰＲＯ２４３は、アフリカツメガエルコルディン(Xchd)に５１％同一性である。
１のアミノ末端と３のカルボキシ末端システイン-富クラスター中の４０システ インの全てが保存される。
【０１９１】 ＰＲＯ２４３は、残基１乃至約２３でシグナル配列を有する９５４アミノ酸ポ
リペプチドである。４のシステインクラスター：（１）残基約５１乃至約１２５
；（２）残基約７０５乃至約７６１；（３）残基約７８４乃至約８４９；及び（
４）残基約８９７乃至約９３１、がある。残基約３１５乃至約３９６で潜在ロイ
シンジッパーと、残基２１７，３５１，３６５と４３４でＮ-グリコシル化部位 がある。
【０１９２】 ＰＲＯ２９９ポリペプチドと切痕タンパク質に相同性を有するその部分は、イ
ンビボでの治療目的のために、同じく各種の他の適用のために有用となり得る。
新規の切痕タンパク質と関連した分子の同定は、発育に作用するそれらのような
多数のヒトの疾患に関連付けできる。かくして、新規切痕タンパク質と切痕様分
子の同定は、そのようなタンパク質が、各種の異なるヒトの疾患のための潜在的
な治療として奉仕し得るそれにおいて特に重要である。そのようなポリペプチド
はまた、バイオテクノロジーと医学リサーチ同じく各種の工業的な適用において
重要な役割を演じ得る。結果として、ＰＲＯ２９９のような新規の分子において
特有な科学的及び医学的な興味がある。
【０１９３】 １以上の内因性ジペプチダーゼタンパク質のそれに関連した生物学的活性を所
有する本発明のＰＲＯ３２３ポリペプチドは、治療的目的のためにインビボとイ
ンビトロの両方で利用し得る。当業者であれば、そのような目的のために本発明
のＰＲＯ３２３ポリペプチドをどのように利用するか十分に承知しているだろう
。
【０１９４】 内因性プロラクチンレセプタータンパク質のそれに関連した生物学的活性を所
有する本発明のＰＲＯ３２７ポリペプチドは、治療的目的のためにインビボとイ
ンビトロの両方で利用し得る。当業者であれば、そのような目的のために本発明
のＰＲＯ３２７ポリペプチドをどのように利用するか十分に承知しているだろう
。プロラクチンに結合する能力を所有するＰＲＯ３２７ポリペプチドは、プロラ
クチンアンタゴニストとしてインビボとインビトロの両方で機能し得る。
【０１９５】 ＰＲＯ２３３ポリペプチドと還元酵素に相同性を有するその部分はまた、イン
ビボでの治療目的のために、同じく各種の他の適用のために有用となり得る。新
規の還元酵素タンパク質と関連した分子の同定は、炎症性疾患、器官不全、アテ
ローム性動脈硬化症、心臓損傷、不妊症、出生時欠損、成熟前老化、ＡＩＤＳ、
癌、糖尿病合併症及び一般の変異のような多数のヒトの疾患に関連付けできる。
多数の疾患プロセスにおいて重要な役割を演じるように思える酸素フリーラジカ
ルと抗酸化剤を与える新規還元酵素タンパク質と還元酵素様分子の同定は、その
ようなタンパク質が、各種の異なるヒトの疾患のための潜在的な治療として奉仕
し得るそれにおいて特に重要である。そのようなポリペプチドはまた、バイオテ
クノロジーと医学リサーチ同じく各種の工業的な適用において重要な役割を演じ
得る。結果として、ＰＲＯ２３３のような新規の分子において特有な科学的及び
医学的な興味がある。
【０１９６】 ＰＲＯ３４４ポリペプチドと補体(complement)タンパク質に相同性を有するそ
の部分はまた、インビボでの治療目的のために、同じく各種の他の適用のために
有用となり得る。新規補体タンパク質と関連分子の同定は、免疫系の細胞の炎症
応答に作用するような多数のヒトの疾患に関連付けされる。かくして、新規補体
タンパク質と補体様分子の同定は、そのようなタンパク質が、各種の異なるヒト
の疾患のための潜在的な治療として奉仕し得るそれにおいて特に重要である。そ
のようなポリペプチドはまた、バイオテクノロジーと医学リサーチ同じく各種の
工業的な適用において重要な役割を演じ得る。結果として、ＰＲＯ３４４のよう
な新規の分子において特有な科学的及び医学的な興味がある。
【０１９７】 システイン-富分泌タンパク質のそれに関連した生物学的活性を所有する本発 明のＰＲＯ３４７ポリペプチドは、治療的目的のためにインビボとインビトロの
両方で利用し得る。当業者であれば、そのような目的のために本発明のＰＲＯ３
４７ポリペプチドをどのように利用するか十分に承知しているだろう。
【０１９８】 インター-アルファ-トリプシンインヒビタータンパク質の重鎖のそれに関連し
た生物学的活性を所有する本発明のＰＲＯ３５４ポリペプチドは、治療的目的の
ためにインビボとインビトロの両方で利用し得る。当業者であれば、そのような
目的のために本発明のＰＲＯ３５４ポリペプチドをどのように利用するか十分に
承知しているだろう。
【０１９９】 ＰＲＯ３５５ポリペプチドとＣＲＴＡＭに相同性を有するその部分はまた、イ
ンビボでの治療目的のために、同じく各種の他の適用のために有用となり得る。
Ｔ細胞に関連付けられる新規分子の同定は、一般に免疫系に含まれる病状のよう
な多数のヒトの疾患に関連付けられる。多数の疾患プロセスにおいて重要な役割
を演じるＣＲＴＡＭタンパク質結合抗体を与える、新規ＣＲＴＡＭタンパク質と
ＣＲＴＡＭ様分子の同定は、そのようなタンパク質が、各種の異なるヒトの疾患
のための潜在的な治療として奉仕し得るそれにおいて特に重要である。そのよう
なポリペプチドはまた、バイオテクノロジーと医学リサーチ同じく各種の工業的
な適用において重要な役割を演じ得る。結果として、ＰＲＯ３５５のような新規
の分子において特有な科学的及び医学的な興味がある。
【０２００】 ＰＲＯ３５７は、ＡＬＳに関してその活性を測定するためにＡＬＳとの競合結
合アッセイにおいて使用することができる。その上、ＰＲＯ３５７は、より長い
インビボでの半減期を有するものに複合化し得るポリペプチドを延長するかを測
定するためのアッセイにおいて使用することができる。ＰＲＯ３５７は、又それ
が相同性を有するカルボキシペプチダーゼとのアッセイにおいて同様に使用する
ことができる。その結果は、それ相応に適用することができる。
【０２０１】 タンパク質の腫瘍壊死因子ファミリーのそれに関連した生物学的活性を所有す
る本発明のＰＲＯ７１５ポリペプチドは、治療的目的のためにインビボとインビ
トロの両方で利用し得る。当業者であれば、そのような目的のために本発明のＰ
ＲＯ７１５ポリペプチドをどのように利用するか十分に承知しているだろう。Ｐ
ＲＯ７１５ポリペプチドは、それに特異的なレセプターに結合し、それによって
そのようなレセプターを活性化することが予期される。本発明のＰＲＯ７１５ポ
リペプチドの変異体は、その特異的レセプター活性のアゴニスト或いはアンタゴ
ニストとして機能し得る。
【０２０２】 ＰＲＯ３５３ポリペプチドと補体(complement)タンパク質に相同性を有するそ
の部分はまた、インビボでの治療目的のために、同じく各種の他の適用のために
有用となり得る。新規補体タンパク質と関連分子の同定は、免疫系の細胞の炎症
応答に作用するような多数のヒトの疾患に関連付けされる。かくして、新規補体
タンパク質と補体様分子の同定は、そのようなタンパク質が、各種の異なるヒト
の疾患のための潜在的な治療として奉仕し得るそれにおいて特に重要である。そ
のようなポリペプチドはまた、バイオテクノロジーと医学リサーチ同じく各種の
工業的な適用において重要な役割を演じ得る。結果として、ＰＲＯ３５３のよう
な新規の分子において特有な科学的及び医学的な興味がある。
【０２０３】 ＰＲＯ３６１ポリペプチドと、ムチン及びキチナーゼタンパク質に相同性を有
するその部分はまた、インビボでの治療目的のために、同じく各種の他の適用の
ために有用となり得る。新規ムチン及びキチナーゼタンパク質と関連分子の同定
は、癌或いは細胞表面分子又はレセプターに含まれるそれらのような多数のヒト
の疾患に関連付けされる。かくして、新規ムチン及びキチナーゼタンパク質の同
定は、そのようなタンパク質が、各種の異なるヒトの疾患のための潜在的な治療
として奉仕し得るそれにおいて特に重要である。そのようなポリペプチドはまた
、バイオテクノロジーと医学リサーチ同じく各種の工業的な適用において重要な
役割を演じ得る。結果として、ＰＲＯ３６１のような新規の分子において特有な
科学的及び医学的な興味がある。
【０２０４】 ＰＲＯ３６５ポリペプチドと、ヒト２−１９タンパク質に相同性を有するその
部分はまた、インビボでの治療目的のために、同じく各種の他の適用のために有
用となり得る。新規ヒト２−１９タンパク質と関連分子の同定は、免疫系の細胞
の結合或いは活性を調節するような多数のヒト疾患に関連付けられる。かくして
、新規ヒト２−１９タンパク質とヒト２−１９タンパク質様分子の同定は、その
ようなタンパク質が、各種の異なるヒトの疾患のための潜在的な治療として奉仕
し得るそれにおいて特に重要である。そのようなポリペプチドはまた、バイオテ
クノロジーと医学リサーチ同じく各種の工業的な適用において重要な役割を演じ
得る。結果として、ＰＲＯ３６５のような新規の分子において特有な科学的及び
医学的な興味がある。
【０２０５】 ２０．抗-ＰＲＯポリペプチド抗体 本発明は、さらに抗-ＰＲＯポリペプチド抗体を提供する。典型的な抗体は、 ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異的、及びヘテロ接合抗体を
含む。
【０２０６】 Ａ．ポリクローナル抗体 本発明の抗-ＰＲＯポリペプチド抗体は、ポリクローナル抗体を含み得る。ポ リクローナル抗体の製造方法は、熟達した研究者に周知である。ポリクローナル
抗体は、例えば、免疫化剤の、及び望まれるなら、アジュバントとともに１回以
上の注射によって哺乳動物中に生じさせることができる。典型的に、該免疫化剤
及び／又はアジュバントは、多重皮下又は腹腔内注射によって該哺乳動物に注射
されるであろう。該免疫化剤は、ＰＲＯポリペプチド又はその融合タンパク質を
含み得る。それは、免疫化される哺乳動物において免疫原であることが知られた
タンパク質に対する免疫化剤を接合するために有用となり得る。そのような免疫
原性タンパク質の実例は、制限されることなしに、キーホールリンペットヘモシ
アニン、血清アルブミン、ウシチログロブリン、及びダイズトリプシンインヒビ
ターを含む。利用し得るアジュバントの実例は、フロイント完全アジュバントと
ＭＰＬ-ＴＤＭアジュバント（モノホスホリルリピドＡ、合成トレハロースジコ リノマイコラート）を含む。該免疫化プロトコールは、過度の実験なしに当業者
によって選択され得る。
【０２０７】 Ｂ．モノクローナル抗体 抗-ＰＲＯポリペプチド抗体は、それに代えてモノクローナル抗体とし得る。 モノクローナル抗体は、KohlerとMilstein,Nature,256:495(1975)によって記載 されたそれらのようなハイブリドーマ法を用いて作製し得る。ハイブリドーマ法
において、マウス、ハムスター、又は他の適当な宿主動物が、免疫化剤に特異的
に結合するであろう抗体を生成する又は精製することができるリンパ球を引き出
すための免疫化剤によって典型的に免疫化される。あるいは、該リンパ球はイン
ビトロで免疫化し得る。
【０２０８】 該免疫化剤は、興味あるＰＲＯポリペプチド又はその融合タンパク質を典型的
に含むであろう。一般に、もしヒト起源の細胞が望まれるなら末梢血液リンパ球
("ＰＢＬｓ")が使用され、或いは非ヒト哺乳動物源が望まれるなら脾臓細胞又は
リンパ節細胞が用いられる。該リンパ球は、次いでハイブリドーマ細胞を形成す
るために、ＰＥＧのような適当な融合化剤を用いて、不朽化細胞系に融合される
[Goding,Monoclonal Antibodies: Principles and Practice,Academic Press,(1
986)59-103頁]。不朽化細胞系は、哺乳類細胞、特に齧歯類の骨髄腫細胞、ウシ 、及びヒト起源が通例形質転換される。通例、ラット又はマウス骨髄腫細胞系が
利用される。該ハイブリドーマ細胞は、融合していない不朽化細胞の増殖又は生
存を阻害する１以上の物質を好ましくは含む適当な培養培地中で培養し得る。例
えば、もしその親細胞が酵素ヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシルトラン
スフェラーゼ(ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ)を欠くならば、そのハイブリドーマ用の
培養培地は、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を阻害する物質、ヒポキサンチン、アミ
ノプテリン、及びチミジンを典型的に含むであろう(「ＨＡＴ培地」)。
【０２０９】 好ましい不朽化細胞系は、十分に融合する、選択した抗体生産細胞によって抗
体の安定な抗レベル発現を支持する、且つそのようなＨＡＴ培地のような培地に
感受性であるそれらである。より好ましい不朽化細胞系は、例えば、Salk Insit
ute Cell Distribution Center,San Diego,California,及びAmerican Type Cult
ure Collection,Rockville,Marylandから得ることができるネズミ骨髄腫系であ る。ヒト骨髄腫及びマウス-ヒトヘテロ骨髄腫細胞系はまた、ヒトモノクローナ ル抗体の生産のために記載されている[Kozbor, J.Immunol.,133:3001(1984);Bro
deurら、Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications (Marc
el Dekker,Inc.,New York,(1987)51-63頁]。
【０２１０】 ハイブリドーマが培養される培養培地は、次いで興味あるＰＲＯポリペプチド
に対するモノクローナル抗体の存在について測定することができる。好ましくは
、該ハイブリドーマ細胞によって製造されたモノクローナル抗体の結合特異性は
、免疫沈降によって又はラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)又は酵素免疫吸着測定法
(ＥＬＩＳＡ)のようなインビトロ結合アッセイによって測定される。そのような
技術と測定法は、当該分野で周知である。該モノクローナル抗体の結合親和性は
、例えば、MunsonとPollard,Anal.Biochem.,107:220(1980)のスキャッチャード 分析によって測定することができる。
【０２１１】 望まれるハイブリドーマが同定された後、そのクローンは、制限希釈法と標準
法による増殖によってサブクローンし得る[Goding,上記]。この目的のための適 当な培養培地は、例えば、Dulbecco's修正イーグル培地とＲＰＭＩ-１６４０培 地を含む。あるいは、該ハイブリドーマ細胞は、哺乳動物中の腹水としてインビ
ボで増殖し得る。
【０２１２】 サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ
-Sepharose、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、
又はアフィニティークロマトグラフィーのような通常の免疫グロブリン精製法に
よって培地又は腹水液から単離又は精製し得る。
【０２１３】 モノクローナル抗体はまた、米国特許第４８１６５６７号中に記載されるそれ
らのような組換えＤＮＡ法によっても作製し得る。本発明のモノクローナル抗体
をコードしているＤＮＡは、通常の手法（例えば、ネズミ抗体の重鎖及び軽鎖を
コードしている遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用い
ることによって）を用いて容易に単離及び配列決定することができる。本発明の
ハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの好ましい供給源として利用される。
一度単離した該ＤＮＡは、発現ベクターの中に組み込むことができ、次いで組換
え宿主細胞においてモノクローナル抗体の合成を得るため、他の免疫グロブリン
タンパク質を生産しない類人猿ＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨ
Ｏ）細胞、または骨髄腫細胞のような宿主細胞内にトランスフェクトされる。そ
のＤＮＡはまた、例えば相同ネズミ配列[米国特許第４８１６５６７号；Morriso
nら、上記]の代わりにヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード化配列で置換する
ことにより、又は非免疫グロブリンポリペプチドのコード化配列の全部又は一部
を免疫グロブリンコード化配列に共有結合接続することによって修正され得る。
そのような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインを置
換することができ、又はキメラ二価抗体を創造するように本発明の抗体の１の抗
原結合部位の可変領域と置換することができる。
【０２１４】 該抗体は、一価抗体とし得る。一価抗体を製造するための方法は、当該分野で
周知である。例えば、一つの方法は、免疫グロブリン軽鎖と修正した重鎖との組
換え発現を含む。該重鎖は、重鎖架橋化を防ぐため、Ｆｃ領域中の何れかのポイ
ントで一般に端切りされる。あるいは、関係のあるシステイン残基は、他のアミ
ノ酸残基で置換され又は架橋を防ぐために欠失される。
【０２１５】 インビトロでの方法はまた、一価抗体を調製するためにも適当である。そのフ
ラグメント、特にＦａｂフラグメントを生産するための抗体の消化は、当該分野
において知られたルーチンの技術を用いて達成することができる。
【０２１６】 Ｃ．ヒト化抗体 本発明の抗-ＰＲＯポリペプチド抗体は、ヒト化抗体又はヒト抗体をさらに含 む。非ヒト(例えばネズミ)抗体のヒト化形は、キメラ免疫グロブリン、免疫グロ
ブリン鎖、又は非-ヒト免疫グロブリンから得られる最小配列を含むそのフラグ メント(Fv,Fab,Fab',F(ab')2、又は抗体の他の抗原結合配列のような)である。 ヒト化抗体は、レセプターの相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、望まれる
特異性、親和性、及び用量を有する、マウス、ラット、又はウサギのような非- ヒト種(ドナー抗体)のＣＤＲからの残基によって置換されるヒト免疫グロブリン
（レセプター抗体）を含む。いずれかの場合、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレー
ムワーク残基は、相当する非ヒト残基と置換される。ヒト化抗体はまた、該レセ
プター抗体中にも、或いは移入したＣＤＲ又はフレームワーク配列中にも見出さ
れない残基を含み得る。一般に、該ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリンのそれ
に相当するＣＤＲ領域の全て又は実質上全て、及びＦＲ領域の全て又は実質上全
てがヒト免疫グロブリン共通配列のそれである可変領域の少なくとも１，及び典
型的には２の実質上全てを含むであろう。ヒト化抗体は、好ましくは免疫グロブ
リン定常領域(Fc)、典型的にはヒト免疫グロブリンのそれの少なくとも部分をも
含むであろう[Jonesら、Nature,321:522-525(1986)；Riechmannら、Nature,332:
323-329(1988)；及びPresta, Curr.Op.Struct.Biol.,2:593-596(1992)]。
【０２１７】 非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当該分野において周知である。一般に
、ヒト化抗体は、ヒトでない供給源からそれに導入した１以上のアミノ酸残基を
有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、「移入」可変領域から典型
的に取られる「移入」残基として関係する。ヒト化は、ヒト抗体の相当する配列
で齧歯類ＣＤＲｓ又はＣＤＲ配列を置換することによって、Winterと共同研究者
の方法[Jonesら、Nature 321,522-525(1986);Riechmannら、Nature,332,323-327
(1988);Verhoeyenら、Science 239,1534-1536(1988)]に従い本質的に実行される
。従って、そのような「ヒト化した」抗体は、キメラ抗体であり（米国特許第４
８１６５６７号）、完全なヒト可変領域よりも実質上劣るものが非ヒト種からの
相当する配列により置換されている。実際、ヒト化した抗体は幾つかのＣＤＲ残
基と可能性のある幾つかのＦＲ残基が齧歯類中の類似部位からの残基によって置
換されたヒト抗体である。
【０２１８】 ヒト化抗体はまた、ファージディスプレーライブラリーを含む、当該分野で周
知の各種の技術を用いて製造することもできる[HoogenboomとWinter,J.Mol.Biol
.,227:381(1991)；Marksら、J.Mol.Biol.,222:581(1991)]。Coleら及びBoerner らの技術はまた、ヒトモノクローナル抗体の調製のためにも利用可能である(Col
eら、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,p.77(1985)及び
Boernerら、J.Immunol.,147(1):86-95(1991)]。
【０２１９】 Ｄ．二重特異性抗体 二重特異性抗体は、少なくとも２の異なる抗原に特異的結合性を有する、好ま
しくはヒト又はヒト化したモノクローナル抗体である。本ケースにおいて、特異
的結合性の一つは、ＰＲＯポリペプチドのためのものであり、他方は、何れかの
他の抗原のためのものであり、好ましくは細胞表面タンパク質又はレセプター又
はレセプターサブユニットのためのものである。
【０２２０】 二重特異性抗体の製造方法は、当該分野で周知である。従来、二重特異性抗体
の組み換え体生産は、二つの重鎖が異なる特異性を有する場合、二つの免疫グロ
ブリン重鎖／軽鎖ペアの共発現に基づいている[MilsteinとCuello, Nature 305,
537-539(1983)]。免疫グロブリン重鎖と軽鎖の取り合わせがランダムであるため
に、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、一つのみが正しい二重特異性
構造を有する１０の異なる抗体分子の可能性のある混合物が生産される。正しい
分子の精製は、アフィニティークロマトグラフィー工程によって通例は達成され
る。類似の手法は、1993年5月13日公開のＷＯ９３／０８８２９中に、及びTraun
eckerら、EMBO J.,10:3655-3659(1991)中に開示される。
【０２２１】 望まれる結合特異性を持つ抗体可変ドメイン(抗体-抗原結合部位)は、免疫グ ロブリン定常ドメイン配列に融合することができる。その融合は、好ましくはヒ
ンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖定常
ドメインを伴う。その融合体の少なくとも一つにおいて存在する軽鎖結合のため
に必要な部位を含む第１の重鎖定常領域(ＣＨ１)を有することが好ましい。免疫
グロブリン重鎖融合体、及びもし望むなら、免疫グロブリン軽鎖、をコードして
いるＤＮＡは、別個の発現ベクターに挿入され、且つ適当な宿主生物に共トラン
スフェクトされる。二重特異性抗体を生成するための更なる詳細のために、例え
ば、Sureshら、Methods in Enzymology,121:210(1986)を参照。
【０２２２】 Ｅ．ヘテロ接合抗体 ヘテロ接合抗体もまた、本発明の範囲内である。ヘテロ接合抗体は、共有結合
した二つの抗体から構成される。そのような抗体は、例えば、希望しない細胞に
免疫系細胞を標的化する[米国特許第４６７６９８０号]、及びＨＩＶ感染の治療
のために提案されている[ＷＯ９１／００３６０；ＷＯ９２／２００３７３；Ｅ Ｐ０３０８９]。該抗体は、架橋剤が含まれるそれらを含む、合成タンパク質化 学において周知の方法を用いてインビトロで製造し得る。例えば、イムノトキシ
ンは、ジスルフィド交換反応を用いて又はチオエーテル結合を形成することによ
って構築し得る。この目的のための好適な試薬の実例は、イミノチオラートとメ
チル-4-メルカプトブチルイミダート及び米国特許第４６７６９８０号中に記載 されるそれらを含む。
【０２２３】 ２１．抗-ＰＲＯポリペプチド抗体の使用 本発明の抗-ＰＲＯポリペプチド抗体は、各種の有用性を有する。例えば、抗-
ＰＲＯポリペプチド抗体は、例えば特有の細胞、組織、又は血清におけるその発
現を検出するための、ＰＲＯポリペプチド用の診断アッセイにおいて使用し得る
。競合結合アッセイ、直接又は間接サンドウィッチアッセイ及び異種又は同種相
で実施される免疫沈降アッセイ[Zola,Monoclonal Antibodies: A Manual of Tec
hniques,CRC Press,Inc.(1987)147-158頁]のような当該分野で周知の各種診断ア
ッセイ技術が使用し得る。診断アッセイにおいて使用した抗体は、検出可能な部
分で標識することができる。該検出可能な部分は、直接又は間接的のいずれか一
方で、検出可能なシグナルをもたらすことができるべきである。例えば、検出可
能な部分は、3Ｈ，14Ｃ，32Ｐ，35Ｓ，又は125Ｉのような放射性同位体、イソチ
オシアン酸フルオレセイン、ローダミン、又はルシフェリンのような蛍光又は化
学発光化合物、又はアルカリホスファターゼ、ベータ-ガラクトシダーゼ又はホ ースラディッシュペルオキシダーゼのような酵素とし得る。該検出可能部分への
抗体の接合のための当該分野で周知のいずれかの方法は、Hunterら、Nature,144
:945(1962);Davidら、Biochemistry,13:1014(1974);Painら、J.Immunol.Meth.,4
0:219(1981);及びNygren,J.Histochem.and Cytochem.,30:407(1982)によって記 載されたそれらの方法を含み、利用し得る。
【０２２４】 抗-ＰＲＯポリペプチド抗体はまた、組換え細胞培養又は天然供給源からのＰ ＲＯポリペプチドのアフィニティー精製に有用である。この方法において、ＰＲ
Ｏポリペプチドに対する抗体は、当該分野で周知の方法を用いて、Sephadex樹脂
又は濾紙のような適当な支持体上に固定化される。固定化した抗体は、次いで精
製するべきＰＲＯポリペプチドを含む試料に接触させ、その後該支持体は、ＰＲ
Ｏポリペプチド以外の試料中の実質上全ての材料を除去するであろう適当な溶媒
で洗浄される。最後に、該支持体は、該抗体からＰＲＯポリペプチドを放出する
であろう別の適当な溶媒で洗浄される。
【０２２５】 コルディン(chordin)（ＣＨＤ）は、示差的な顔の特徴(低い前毛髪線、眉毛叢
生症、前傾の外鼻孔、上顎前突症、長い人中、こい口(carp mouth))、出生前又 は出生後の成長遅延、精神遅延及び、しばしば、しかし常時ではない上肢奇形に
よって特徴付けられるコルネリア・ド・ランゲ症候群として知られる異形症候群
のための候補遺伝子である。また、ＣＤＬが血小板減少症との関連において存在
するレアケースもある。ＣＤＬの遺伝子は、3q26.3(OMIM#122470)への結合によ ってマップされている。初期アフリカツメガエル(early Xenopus)パターン化に おけるＸｃｈｄ（アフリカツメガエルコルディン(Xenopus chordin)）包含及び 神経系統発育は、興味のある候補遺伝子中にＣＨＤを作る。ＣＨＤは、染色体３
上の適切な領域にマップされる。それはＴＨＰＯに非常に密接し、ＴＨＰＯとＣ
ＨＤの両方を包含する欠失は、血小板減少症と発育異形症のレアケースに帰結で
きる。全成人組織の大部分がＣＨＤ発現に対して陰性である顕現したＣＤのin s
itu分析において、僅かに陽性のシグナルが、長い骨の発育と推定上の成長にお いてＣＨＤを関連させる大腿骨頭と寛骨臼（股関節）との間に形成される発育中
の滑膜性の連結の割線において観測された。そのような機能は、もし混乱したな
らば、成長遅延をもたらすことができる。
【０２２６】 ｃＤＮＡから予測したヒトＣＨＤアミノ酸配列は、Ｘｃｈｄに５０％同一性（
及び６６％保存された）である。４システイン-富ドメイン中の全ての４０シス テインが保存される。これらのシステイン富ドメインは、トロンボスポンジン、
プロコラーゲン及びフォン・ビルブラント因子中で観測されたそれらに類似して
いる。Bornstein,P.FASEB J 6:3290-3299(1992);Hunt,L.& Barker,W.Biochem.Bi
ophys.Res.Commun.144:876-882(1987)。
【０２２７】 ＰＲＯ２４３コルディン(chordin)に対する抗体は、ＰＲＯ２４３の過剰発現 によって特徴付けされる条件でポリペプチドを結合するものを作ることができる
。
【０２２８】 以下の実施例は、説明の目的のためにのみ提供され、且ついずれの手法も本発
明の範囲を制限することを意図していない。
【０２２９】 本明細書中に引用した全ての特許と参考文献は、それらの全体が参照によりこ
こに組み込まれる。
【０２３０】
【実施例】
本実施例に関する商業的に利用できる試薬は、特に示さない限り、製造元の指
示書に従って用いた。以下の実施例、および明細書を通して、ＡＴＣＣ受託番号
によって同定される細胞源は、Ａｍｅｉｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， Ｍａｒｙｌａｎｄである。
【０２３１】 実施例１：新規なポリペプチドおよびこれらをコードするｃＤＮＡを同定する
ための細胞外ドメイン相同性スクリーニング ＥＳＴデータベースを検索するために、公的Ｓｗｉｓ−Ｐｒｏｔデータベース
からの約９５０個の既知分泌タンパク質から、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）配列（
もしもあるならば、分泌シグナル配列を含む）を用いた。ＥＳＴデータベースは
、公的データベース（例えば、Ｄａｔｈｏｆｆ、Ｇｅｎｅｂａｎｋ）と私的デー
タベース（例えば、ＬＩＦＥＳＥＱTM、Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉ
ｃａｌｓ．Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ．ＣＡ）を含む。ＥＣＤタンパク質配列をＥＳＴ
配列の６フレーム翻訳と比較するため、コンピュータープログラムＢＬＡＳＴも
しくはＢＬＡＳＴ２（ＡｌｔｓｃｈｕｌとＧｉｓｈ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２６６：４６０−４８０（１９９６））を用いて検索を行
った。既知のタンパク質をコードしていない７０（いくつかの事例においては、
９０）以上のＢｌａｓｔスコアーとのそれらの比較を、プログラム「ｐｈａｒｐ
」［Ｐｈｉｌ Ｇｒｅｅｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏ
ｎ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ；（ｈｔｔｐ：／／ｂｏｚｅｍａｎ．ｍｂｔ．ｗａｓ
ｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄｕ／ｐｈｒａｐ．ｄｏｃｓ／ｐｈｒａｐ．ｈｔｍｌ］を用
いてまとめ、コンセンサスＤＮＡ配列に集めた。
【０２３２】 この細胞外ドメイン相同性スクリーニングを用い、コンセンサスＤＮＡ配列を
、ｐｈｒａｐを用い、その他の同定されているＥＳＴ配列に対応してまとめた。
さらに、上記ＥＳＴ配列の供給源を用い、得られたコンセンサス配列をできる限
り伸長させるために、しばしば（いつもではないが）ＢＬＡＳＴとｐｈｒａｐの
反復サイクルを用いて、該コンセンサス配列を伸長した。
【０２３３】 次いで、上記のように得られたコンセンサス配列に基づいて、オリゴヌクレオ
チドを合成し、ＰＣＲによって興味ある配列を含むｃＤＮＡライブラリーを同定
するため、およびＰＲＯポリペプチドをコードする全長配列のクローンを単離す
るためのプローブとして用いるために使用した。前進（．ｆ）と逆進（．ｒ）Ｐ
ＣＲプライマーは、一般的に、２０から３０ヌクレオチドまでの範囲とし、しば
しば、長さ約１００−１０００ｂｐのＰＣＲ生成物を与えるように設計される。
いくつかの事例において、コンセンサス配列が約１−１．５ｋｂよりも大きい時
に、付加的なオリゴヌクレオチドが合成される。全長クローンのためのいくつか
のライブラリーをスクリーニングするために、ライブラリーからＤＮＡを、Ａｕ
ｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｂｉｏｌｏｇｙに従って、ＰＣＲプライマー対を用い、ＰＣＲ増幅によって
スクリーニングした。次いで、興味ある遺伝子をコードするクローンを、オリゴ
ヌクレオチドプローブもしくはプライマー対の一つを用いて単離するために、陽
性のライブラリーを用いた。
【０２３４】 ｃＤＮＡクローンを単離するために用いたｃＤＮＡライブラリーは、Ｉｎｖｉ
ｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡなどから商業的に利用できる試薬を用
いた標準的な方法によって構築した。ｃＤＮＡは、ＮｏｔＩ部位を含むオリゴｄ
Ｔプライマーで合成し、ＳａｌＩヘミキナーゼアダプターに平滑端で連結し、Ｎ
ｏｔＩ部位で切断し、ゲル電気泳動により適切にサイズ分画し、好適なクローニ
ングベクター［例えば、ｐＲＫＢもしくはｐＲＫＤ；ｐＲＫ５Ｂは、ＳｆｉＩ部
位を含まないｐＲＫ５Ｄの前駆体である；Ｈｏｌｍｅｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２
５３：１２７８−１２８０（１９９１）参照］に、特有のＸｈｏＩおよびＮｏｔ
Ｉ部位で、定められた方向でクローニングした。
【０２３５】 実施例２：アミラーゼスクリーニングによるｃＤＮＡクローンの単離 １．オリゴｄＴプライマーで合成されたｃＤＮＡライブラリーの調製 ｍＲＮＡは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡからの試薬と
プロトコール（Ｆａｓｔ Ｔｒａｃｋ２）を用い、興味のあるヒト組織から単離
した。このＲＮＡは、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓ
ｂｕｒｇ，ＭＤ（Ｓｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ）
の試薬とプロトコールを用い、ベクターｐＲＫ５Ｄ中、オリゴｄＴプライマーで
合成したｃＤＮＡライブラリーを作製するために用いた。この操作で、二本鎖ｃ
ＤＮＡは、１０００ｂｐよりも大きなサイズとなり、ＳａｌＩ／ＮｏｔＩリンカ
ー化ｃＤＮＡを、ＸｈｏＩ／ＮｏｔＩで切断したベクターにクローニングした。
ｐＲＫ５Ｄは、ＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ ｃＤＮＡクローニング部位に先立つＳｆｉ
Ｉ制限酵素部位が続くｓｐ６転写開始部位を有するクローニングベクターである
。
【０２３６】 ２．ランダムプライマーで合成されたｃＤＮＡライブラリーの調製 第２のｃＤＮＡライブラリーは、第１のｃＤＮＡクローンの５’末端を優先的
に発現させるために産出した。Ｓｐ６ ＲＮＡは、第１のライブラリー（上記）
から産出し、このＲＮＡを、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ （Ｓｕｐｅ
ｒ Ｓｃｒｉｐｔ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ、上記）からの試薬とプロト
コールを用い、ベクターｐＳＳＴ−ＡＭＹ．０中、ランダムプライマーで合成し
たｃＤＮＡライブラリーを産出するために用いた。この操作で、二本鎖ｃＤＮＡ
は、５００−１０００ｂｐのサイズとなり、ＮｏｔＩアダプターに平滑端で連結
し、ＳｆｉＩで切断し、ＳｆｉＩ／ＮｏｔＩで切断したベクターにクローニング
した。ｐＳＳＴ−ＡＭＹ．０は、ｃＤＮＡクローニング部位に先立つ酵母アルコ
ールデヒドロゲナーゼプロモーターと、クローニングサイトの後であって、酵母
アルコールデヒドロゲナーゼターミネーターが続くマウスアミラーゼ配列（分泌
シグナルを有さない成熟配列）を有するクローニングベクターである。このよう
にアミラーゼ配列とフレーム内で融合したベクター中にクローニングされたｃＤ
ＮＡは、適切にトランスフェクションした酵母コロニーからアミラーゼを分泌す
るようになる。
【０２３７】 ３．形質転換と検出 上記段落２に記載したライブラリーからのＤＮＡは、電気受容能のあるＤＨ１
０８細菌（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、２０ｍｌ）を加えるために、
氷上で冷却した。次いで、細菌とベクターの混合物を、製造元によって推奨され
る方法によってエレクトロポレーションした。続いて、ＳＯＣ培地（Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１ｍｌ）を加え、混合物を３７℃で３０分間インキ
ュベーションした。次いで、形質転換体を、アンピシリンを含有する標準的な１
５０ｍｍＬＢプレート２０枚に播き、１６時間（３７℃）インキュベーションし
た。陽性コロニーを、プレートからこすり取り、ＣｓＣｌ−密度勾配などの標準
的なプロトコールを用い、細菌ペレットからＤＮＡを単離した。次いで、精製し
たＤＮＡを用いて、以下の酵母のプロトコールを行った。
【０２３８】 酵母の方法は３種類に分けられる：（１）プラスミド／ｃＤＮＡ結合ベクター
による酵母の形質転換；（２）アミラーゼを分泌している酵母クローンの検出と
単離；および（３）酵母コロニーからの直接的な挿入物のＰＣＲ増幅、および配
列決定と、更なる分析のためのＤＮＡの精製。
【０２３９】 用いられた酵母株は、ＨＤ５６−５Ａ（ＡＴＣＣ−９０７８５）であった。こ
の株は、以下の遺伝子型を有する：ＭＡＴアルファ、ｕｒａ３−５２、ｌｅｕ２
−３、ｌｅｕ２−１１２、ｈｉｓ３−１１、ｈｉｓ３−１５、ＭＡＬ+、ＳＵＣ+ 、ＧＡＬ+。好ましくは、翻訳後経路を欠失している酵母変異株を用いることが できる。そのような変異株は、ｓｅｃ７１、ｓｅｃ７２、ｓｅｃ６２において、
転座欠失アレルを有しており、端切りしたｓｅｃ７１が最も好ましい。もしくは
、これらの遺伝子の正常な作用を阻害するアンタゴニスト（アンチセンスヌクレ
オチドおよび／またはリガンドを含む）、この翻訳後経路に関連するその他のタ
ンパク質（例えば、ＳＥＣ６１ｐ、ＳＥＣ７２ｐ、ＳＥＣ６２ｐ、ＳＥＣ６３ｐ
、ＴＤＪ１ｐ、もしくはＳＳＡ１ｐ−４ｐ）、もしくはこれらのタンパク質の混
合体も、アミラーゼ発現酵母と組み合わせて好適に用いられる。
【０２４０】 形質転換は、Ｇｉｅｔｚら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，２０：１４２５
（１９９２）によって略述されたプロトコールに基づいて行った。次いで、形質
転換細胞を、寒天からＹＥＰＤ混合培地（１００ｍｌ）に播種し、３０℃で一晩
培養した。ＹＥＰＤ培地は、Ｋａｉｓｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓ
ｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ｐ．２０７（１９９４）に記載
されたように調製した。次いで、一晩培養物を、新鮮なＹＥＰＤ培地（５００ｍ
ｌ）で、約２ｘ１０6細胞／ｍｌ（約ＯＤ600＝０．１）に希釈し、１ｘ１０7細 胞／ｍｌ（約ＯＤ600＝０．４−０．５）となるまで再度培養した。
【０２４１】 次いで、細胞を回収し、ＳｏｒｖａｌＧＳ３ローターで、５０００ｒｐｍ、５
分間で、ＧＳ３ローターボトルに移し、上清を除去し、次いで、滅菌水に再度懸
濁し、再び５０ｍｌファルコンチューブ中、Ｂｅｃｋｍａｎ ＧＳ−６ＫＲ遠心
分離機３５００ｒｐｍで遠心分離することにより、形質転換用に調製した。上清
を除去し、続けて細胞をＬｉＡｃ／ＴＥ（１０ｍｌ、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ
、１ｍ ＭＥＤＴＡ ｐＨ７．５、１００ｍＭのＬｉ2ＯＯＣＣＨ3）で洗浄し、
ＬｉＡｃ／ＴＥ（２．５ｍｌ）中に再度懸濁した。
【０２４２】 形質転換は、調製した細胞（１００μｌ）に、新たに変性させた一本鎖サケ精
子ＤＮＡ（Ｌｏｆｓｔｒａｎｄ Ｌａｂｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）
と形質転換させるＤＮＡ（１μｇ、容量＜１０μｌ）とを、マイクロ遠心分離チ
ューブ内で混合することによって行った。混合液を、渦動撹拌により簡単に混合
し、次いで、４０％ＰＥＧ／ＴＥ（６００μｌポリエチレングリコール−４００
０、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、１００ｍＭＬｉ2ＯＯＣＣ Ｈ3ｐＨ７．５）を添加した。この混合液を、穏やかに混合し、３０分間凝集さ せながら３０℃でインキュベーションした。この細胞を、次いで、４２℃で１５
分間、熱刺激し、この反応チューブを、マイクロ遠心分離機で、１２０００ｒｐ
ｍ、５−１０秒間遠心し、デカンテーションし、ＴＥ（５００μｌ、１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ ｐＨ７．５）で再度懸濁し、続けて再度遠
心分離した。次いで、細胞をＴＥ（１ｍｌ）中に希釈し、予め１５０ｍｍ培養プ
レート（ＶＷＲ）に調製した選択培地上に、２０μｌずつ分注した。
【０２４３】 もしくは、多数の小さな反応の代わりに、形質転換を、単一、大規模の反応で
、試薬量もそれに応じて増やして行った。
【０２４４】 用いた選択培地は、Ｋａｉｓｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇ
ｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ｐ．２０８−２１０（１９９４）によ
って記載されたように調製されたウラシル欠失合成完全デキストロース（ＳＣＤ
−Ｕｒａ）寒天とした。形質転換体は、３０℃で２−３日間培養した。
【０２４５】 アミラーゼを分泌しているコロニーの検出は、選択増殖培地中に赤色澱粉を含
ませることによって行った。澱粉を、Ｂｉｅｌｙら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ
．，１７２：１７６−１７９（１９８８）によって記載された手順に従って、赤
色染料（Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｒｅｄ−１２０、Ｓｉｇｍａ）と結合させた。結合
させた澱粉を、ＳＣＤ−Ｕｒａ寒天プレート中、最終濃度０．１５％（ｗ／ｖ）
で取り込ませ、リン酸カリウムでｐＨ７．０に緩衝化した（最終濃度５０−１０
０ｍＭ）。
【０２４６】 十分に単離、同定できる単一コロニーを得るために、陽性コロニーを拾い、新
鮮な選択培地（１５０ｍｍプレート上）に塗布した。アミラーゼの分泌が陽性で
ある十分に単離された単一コロニーは、緩衝化したＳＣＤ−Ｕｒａ寒天への赤色
澱粉の直接的な取り込みによって検出した。陽性コロニーは、直接目視可能な陽
性コロニー周囲の透明な輪を生じさせる澱粉分解能によって決定した。
【０２４７】 ４．ＰＣＲ増幅によるＤＮＡの単離 陽性コロニーを単離する時、その部位を楊枝で拾い上げ、９６ウェルプレート
中の滅菌水（３０μｌ）に希釈した。この時、陽性コロニーを、続く分析用に凍
結保存するか、直ちに増幅する。分注した細胞（５μｌ）を、２５μｌ容量：０
．５μｌのＫｌｅｎｔａｑ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）；
４．０μｌ１０ｍＭｄＮＴＰ'ｓ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ−Ｃｅｔｕｓ）； ２．５μｌＫｌｅｎｔａｑ緩衝液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃ
Ａ）；０．２５μｌ前進オリゴ１；０．２５μｌ逆進オリゴ；１２．５μｌ滅菌
水を含む、でのＰＣＲ反応の鋳型として用いた。前進オリゴヌクレオチド１の配
列は： ５’−ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＴＡＡＡＴＡＧＡＣＣＴＧＣＡ ＡＴＴＡＴＴＡＡＴＣＴ −３’（配列番号：１６）。 逆進オリゴヌクレオチド２び配列は： ５’−ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＣＣＴＧＣＡＣＡＣＣＴＧＣ ＡＡＡＴＣＣＡＴＴ −３’（配列番号：１７）。
【０２４８】 次いで、ＰＣＲを以下のように行った： ａ． 変性 ９２℃、５分 ｂ． ３サイクル： 変性 ９２℃、３０秒 アニーリング ５９℃、３０秒 伸長 ７２℃、６０秒 ｃ． ３サイクル： 変性 ９２℃、３０秒 アニーリング ５７℃、３０秒 伸長 ７２℃、６０秒 ｄ． ２５サイクル： 変性 ９２℃、３０秒 アニーリング ５５℃、３０秒 伸長 ７２℃、６０秒 ｅ． 保持 ４℃
【０２４９】 オリゴヌクレオチドの下線部位は、ＡＤＨプロモーター領域とアミラーゼ領域
に各々アニーリングし、挿入が無い場合は、ベクターｐＳＳＴ−ＡＭＹ．０から
３０７ｂｐ領域を増幅した。典型的には、これらのオリゴヌクレオチドの５’末
端の最初の１８ヌクレオチドに、配列決定用プライマーのアニーリング部位を含
ませた。このように、空ベクターからのＰＣＲ反応の生成物は、３４３ｂｐであ
った。一方、シグナル配列を融合させたｃＤＮＡは、かなり長いヌクレオチド配
列となった。
【０２５０】 ＰＣＲに続けて、分注した反応生成物（５μｌ）を、上記Ｓａｍｂｒｏｏｋら
に記載されたように、Ｔｒｉｓ−Ｂｏｒａｔｅ−ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）緩衝系を用
いた１％アガロースゲルのアガロースゲル電気泳動によって調べた。４００ｂｐ
よりも大きい単一で強いＰＣＲ生成物が得られたクローンを、９６Ｑｉａｑｕｉ
ｃｋ ＰＣＲ ｃｌｅａｎ−ｕｐ ｃｏｌｕｍ （Ｑｉａｇｅｎ社、Ｃｈａｔｓ
ｗｏｒｔｈ，ＣＡ）で精製した後、さらにＤＮＡ配列決定によって分析した。
【０２５１】 実施例３：ヒトＰＲＯ２４１をコードしているｃＤＮＡの単離 コンセンサスＤＮＡ配列は、上記実施例１に記載した他のＥＳＴ配列に対応し
てまとめた。このコンセンサス配列を、ここにＤＮＡ３０８７６と称する。ＤＮ
Ａ３０８７６のコンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲによる興味ある配列を
含むｃＤＮＡライブラリーの同定、および２）ＰＲＯ２４１をコードする全長配
列のクローンを単離するためのプローブとしての使用、のために、オリゴヌクレ
オチドを合成した。
【０２５２】 ＰＣＲプライマー（前進および逆進）を合成した： 前進ＰＣＲプライマー ５’−ＧＧＡＡＡＴＧＡＧＴＧＣＡＡＡＣＣＣＴＣ−３
’ （配列番号：３） 逆進ＰＣＲプライマー ５’−ＴＣＣＣＡＡＧＣＴＧＡＡＣＡＣＴＣＡＴＴＣＴ
ＧＣ−３’ （配列番号：４） さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを、以下のヌ
クレオチド配列を有するコンセンサスＤＮＡ３０８７６配列から構築した。 ハイブリダイゼーションプローブ ５’−ＧＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＴＣＣＡＴＡＴＣＡＧＡＡＴＴＧＣＡＧＡＡＧ
ＣＡＡＡＡＣＴＧＡＣＣＴＣＡＧＴＴ−３’（配列番号：５）
【０２５３】 全長クローンの供給源としてのいくつかのライブラリーをスクリーニングする
ために、ライブラリーからＤＮＡを、上記同定されたＰＣＲプライマー対を用い
たＰＣＲ増幅によって、スクリーニングした。次いで、陽性のライブラリーを、
オリゴヌクレオチドプローブおよび該ＰＣＲプライマーの一つを用いて、ＰＲＯ
２４１をコードするクローンを単離するために用いた。ｃＤＮＡライブラリーを
構築するためのＲＮＡを、ヒト胎児腎臓組織（ＬＩＢ２９）から単離した。
【０２５４】 上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列から、ＰＲＯ２４１の全長ＤＮＡ
配列［ここに、ＵＮＱ２１５（ＤＮＡ３４３９２−１１７０）と称する］（配列
番号：１）と、ＰＲＯ２４１のタンパク質配列を得た。
【０２５５】 ＵＮＱ２１５（ＤＮＡ３４３９２−１１７０）の全ヌクレオチド配列を図１に
示す（配列番号：１）。クローンＵＮＱ２１５（ＤＮＡ３４３９２−１１７０）
は、ヌクレオチド部位２３４−２３６に見かけ上の翻訳開始部位と、ヌクレオチ
ド部位１３７１−１３７３に終止コドンでの終止を有する単一のオープンリーデ
ィングフレームを含む（図１）。推定されるポリペプチドプレカーサーは３７９
アミノ酸長（図２）である。図２に示した全長のＰＲＯ２４１タンパク質は、推
定上、約４３３０２ダルトンの分子量と、約７．３０のｐＩを有する。クローン
ＵＮＱ２１５（ＤＮＡ３４３９２−１１７０）は、ＡＴＣＣに寄託し、ＡＴＣＣ
寄託番号ＡＴＣＣ ２０９５２６が付与されている。
【０２５６】 全長ＰＲＯ２４１ポリペプチドアミノ酸配列の分析により、様々なビグリカン
プロテオグリカンタンパク質と有意な相同性を有することが提示されており、こ
れによってＰＲＯ２４１が新規のビグリカン相同ポリペプチドであることが示さ
れている。
【０２５７】 実施例４： 染色体ウォーキングによるヒトＰＲＯ２４３をコードするｃＤＮ
Ａクローンの単離 概論： ヒトトロンボポエチン（ＴＨＰＯ）は、２つのドメインからなる３
５２アミノ酸のグリコシル化されたホルモンである。エリスロポエチンと５０％
の類似性を共有するＮ末端ドメインは、生物活性を発現する。Ｃ末端領域は、分
泌に必要とされる。トロンボポエチン（ＴＨＰＯ）遺伝子は、ヒト染色体３ｑ２
７−ｑ２８に位置し、ここで、この遺伝子の６つのエキソンは、染色体ＤＮＡ７
キロ塩基対に及ぶ（Ｇｕｒｎｅｙら、Ｂｌｏｏｄ ８５：９８１−９８８（１９
９５））。ＴＨＰＯに近接して位置するＴＨＰＯ相同体をコードする遺伝子が存
在するかを調べるために、この領域の染色体ＤＮＡフラグメントを同定し、配列
決定した。ＴＨＰＯ遺伝子座を包囲している３つのＰ１クローンと１つのＰＡＣ
クローン（Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ；カタロ
グ番号、Ｐ１−２５３５とＰＡＣ−６３５９）を単離し、１４０ｋｂ領域を、定
序ショットガン方法（orderd shotgun strategy）（Ｃｈｅｎら、Ｇｅｎｏｍｉ ｃｓ １７：６５１−６５６（１９９３））を用い、ＰＣＲに基づくギャップ充
填方法（gap filling approach）と組み合わせて配列決定した。分析により、該
領域は、ＴＨＰＯに非常に隣接して位置する４つの付加遺伝子：腫瘍壊死因子−
受容体１型付随タンパク２（ＴＲＡＰ２）、伸長開始因子γ（ｅｌｆ４ｇ）、塩
素チャネル２（ＣＬＣＮ２）およびＲＮＡポリメラーゼＩＩサブユニットｈＲＰ
Ｂ１７、と共に遺伝子が豊富であることが明らかとなった。その領域でＴＨＰＯ
相同体が見い出されなかったものの、４つの新規な遺伝子が、コンピューター補
助遺伝子検出器（ＧＲＡＩＬ）［Ｘｕら、Ｇｅｎ．Ｅｎｇｉｎ．１６：２４１−
２５３（１９９４）］、ＣｐＧ島の存在［Ｃｒｏｓｓ，Ｓ．とＢｉｒｄ，Ａ．、
Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．と Ｄｅｖｅｌ．５：１０９−３１４（１９ ９５）］、および既知の遺伝子との相同性（ＷＵ−ＢＬＡＳＴ２．０によって検
出）（ＡｌｔｓｃｈｕｌとＧｉｓｈ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６
：４６０−４８０（１９９６）（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄ
ｕ／ｂｌａｓｔ／ＲＥＡＤＭＥ．ｈｔｍｌ）によって推測されている。
【０２５８】 Ｐ１クローンとＰＡＣクローン： ＴＨＰＯ染色体配列［Ａ．Ｌ．Ｇｕｒｒｎ
ｅｙら、Ｂｌｏｏｄ ８５：９８１−８８（１９９５）］から設計されたＰＣＲ
プライマーでスクリーニングされた染色体Ｐ１ライブラリー（Ｇｅｎｏｍｅ Ｓ
ｙｓｔｅｍｓ社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ：カタログ番号：Ｐ１−２５３５）
から最初のヒトＰ１クローンを単離した。ＰＣＲプライマーは、このＰ１クロー
ンから得られた末端配列から設計し、次いで、重複するクローンを同定するため
、ＰＩとＰＡＣライブラリー（Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、カタログ番号
：Ｐ１−２５３５＆ＰＡＣ−６５３９）をスクリーニングするために用いた。
【０２５９】 定序ショットガン方法： 定序ショットガン方法（ＯＳＳ）（Ｃｈｅｎら、Ｇ
ｅｎｏｍｉｃｓ１７：６５１−６５６（１９９３））は、段階的アプローチによ
る、巨大な染色体ＤＮＡクローンの位置決定や配列決定を含む。Ｐ１クローンま
たはＰＡＣクローンは、音波処理し、断片をラムダベクター（λＢｌｕｅｓｔａ
ｒ）（Ｎｏｖａｇｅｎ社、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ；カタログ番号６９２４２−３
）にサブクローニングした。該ラムダサブクローン挿入物は、長距離ＰＣＲ（Ｂ
ａｒｎｅｓ，Ｗ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：２２１
６−２２２０（１９９４））によって単離し、末端を配列決定した。本来のクロ
ーンの部分的な地図を作製するために、ラムダ−末端配列を重複させた。重複す
る末端配列を含むラムダクローンを同定し、プラスミドベクター（ｐＵＣ９もし
くはｐＵＣ１８）にサブクローニングした挿入物とプラスミドサブクローンの末
端を配列決定し、隣接している配列を産出するために、まとめた。この直接的な
配列決定法により、興味のある領域を読み取り、まとめるために要求される重複
が最小になる。
【０２６０】 ＴＨＰＯ遺伝子座をより良好に定め、ヘマトポエチンファミリーに関連するそ
の他の遺伝子を検索するため、４つの染色体クローンを、ヒトＰＩとＰＡＣライ
ブラリー（Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、カタログ番号：Ｐ１−２５３５と
ＰＡＣ−６５３９）のＰＣＲスクリーニングによってこの領域から単離した。染
色体フラグメントのサイズは以下の通りである：Ｐ１．ｔは４０ｋｂ；Ｐ１．ｇ
は７０ｋｂ；Ｐ１．ｕは７０ｋｂ；およびＰＡＣ．ｚは２００ｋｂ。これらの４
つの染色体クローン間の関係を図５に図示する。２００ｋｂ染色体ＤＮＡ領域の
約８０％を、定序ショットガン方法（ＯＳＳ）（Ｃｈｅｎら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ
１７：６５１−６５６（１９９３））によって配列決定し、Ａｕｔｏ Ａｓｓｅ
ｍｂｌｅｒTM（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍ
ｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ、カタログ番号９０３２２７）を用い、コ
ンティグにまとめた。これらのコンティグの予備的な順序は、手動分析によって
決定した。４６コンティグがあり、ギャップ充填を用いた。表２にギャップの数
とサイズを要約した。
【０２６１】 表２ １４０ｋｂ領域におけるギャップの要約 ギャップのサイズ 数 ＜５０ｂｐ １３ ５０−１５０ｂｐ ７ １５０−３００ｂｐ ７ ３００−１０００ｂｐ １０ １０００−５０００ｂｐ ７ ＞５０００ｂｐ ２（１５０００ｂｐ）
【０２６２】 ＤＮＡ配列決定： ＡＢＩ ＤＹＥ−ｐｒｉｍｅｒTM ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（
ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ；カタ
ログ番号４０２１１２）を、ラムダとプラスミドサブクローンの末端を配列決定
するために用いた。ＡＢＩ ＤＹＥ−ｔｅｒｍｉｎａｔｅｒTM ｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ
；カタログ番号４０３０４４）を、各々のＰＣＲプライマーを用いたＰＣＲ生成
物の配列決定に用いた。配列は、ＡＢＩ３７７機器でまとめた。１ｋｂよりも大
きなＰＣＲ生成物のために、ウォーキングプライマーを用いた。コンティグ配列
を、Ａｕｔｏ ＡｓｓｅｍｂｌｅｒTM（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔ
ｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ、カタログ番号９０３２２７）における
ＯＯＳ方法によって産出し、ギャップ充填配列を記録したファイルを、Ｓｅｑｕ
ｅｎｃｈｅｒTM（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ社、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）に、重
複と編集のために組み込ませた。
【０２６３】 ＰＣＲに基づくギャップ充填方法：プライマーは、各コンティグの５’−と３
’−末端配列に基づき、反復と低い精度の配列領域を除くように設計した。全て
のプライマーは、１９−２４ｍｅｒで、５０−７０％のＧ／Ｃ含有量となるよう
に設計した。オリゴを標準的な方法で合成し、ゲル−精製した。
【０２６４】 コンティグの方向と順序が未知なので、プライマーの過変異を増幅反応におい
て用いた。２つのＰＣＲキットを用いた：第１に、ＸＬ ＰＣＲキット（Ｐｅｒ
ｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ；カタログ番号Ｎ８０８０２０５）
、伸長時間約１０分；および第２に、もしＸＬ ＰＣＲキットでスメアーが生じ
る（smeared）もしくは多重生成物が観察されたならば、Ｔａｑ Ｐｏｌｙｍｅ ｒａｓｅ ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ社、Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ；カタログ
番号：２０１２２３）を、高ストリンジェント条件下で用いた。成功した各反応
から主なＰＣＲ生成物を、０．９％低融点アガロースゲルから抽出し、Ｇｅｎｅ
ｃｌｅａｎ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキットで、配列決定の前に精製
した。
【０２６５】 分析： コード化領域の同定と特徴付けを以下のように行った：最初に、反復
する配列を、反復エレメントのライブラリーに対するＦａｓｔＡフォーマットで
、ＤＮＡ配列をスクリーニングし、マスクされた疑わしい配列に戻るＲｅｐｅａ
ｔＭａｓｋｅｒ（Ａ．Ｆ．Ａ Ｓｍｉｔ ＆ Ｐ．Ｇｒｅｅｎ， ｈｔｔｐ：／
／ｆｔｐ．ｇｅｎｏｍｅ．ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄｕ／ＲＭ／ＲＭ ｄｅ
ｔａｉｌｓ．ｈｅｍｌ）を用いてマスクした。マスクされていない反復は、ＷＵ
ＢＬＡＳＴ［Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ ＆ Ｇｉｓｈ， Ｗ．， Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：４６０−４８０（１９９６）］を用い、ＧｅｎＢ
ａｎｋデーターベースと配列を比較することによって同定し、手動でマスクした
。
【０２６６】 次に、ＷＵＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムを用いた、染色体領域とＧｅｎｅｎ
ｔｅｃｈのタンパク質データベースとの比較によって、既知遺伝子を明らかにし
、次いで、他で大きく異なる配列間で局所的に同定された領域を見出すために、
Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｃｈ（ＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍ
ｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０）アルゴリズムを用い、各遺
伝子の染色体およびｃＤＮＡ配列を整列することによって注釈付けた。この方法
により、この領域における５つの既知遺伝子、ＴＨＰＯ、ＴＲＡＰ２、ｅｌＦ４
ｇ、ＣＬＣＮ２およびｈＲＰＢ１７の全てのエキソンを検出した（表３）。
【０２６７】 表３ 分析された１４０ｋｂ領域に局在する既知遺伝子の要約 既知遺伝子 遺伝子座 真核生物翻訳開始因子４γ ３ｑ２７−ｑｔｅｒ トロンボポエチン ３ｑ２６−ｑ２７ 塩素チャネル２ ３ｑ２６−ｑｔｅｒ ＴＮＦレセプター付随タンパク２ 予めマップされていない
ＲＮＡポリメラーゼＩＩサブユニットｈＲＰＢ１７ 予めマップされていない
【０２６８】 最後に、新規な転写単位を多くの方法を用いて推測した。ＣｐＧ島（Ｓ．Ｃｒ
ｏｓｓ ＆ Ｂｉｒｄ，Ａ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．５：
１０９−３１４（１９９５））はプロモーター領域を定めるために用い、ＧＣ富
、６または８−ｍｅｒパリンドローム配列を認識する酵素によって切断されるク
ラスター部位として同定した。ＣｐＧ島には、通常、遺伝子のプロモーター領域
が付随している。ＧｅｎＢａｎｋに対して、短い染色体領域（１０−２０ｋｂ）
のＷＵＢＬＡＳＴ２．０分析により、ＥＳＴとの一致を明らかにした。個別のＥ
ＳＴ配列（もしくは、可能ならば、それらの配列のクロマトグラムのファイル）
を検索し、理論上のｃＤＮＡ配列（ここにＤＮＡ３４４１５として称される）を
提供するため、シークエンサーにまとめた。ＧＲＡＩＬ２（ＡｐｏＣｏｍ社、Ｋ
ｎｏｘｖｉｌｌｅ，ＴＮ，ＤＥＣαに対する指揮系統）は、新規なエキソンを推
測するために用いた。この領域における５つの既知遺伝子は、ＧＲＡＩＬアルゴ
リズムの成功裏の内部対照として機能した。
【０２６９】 単離： Ｃｈｏｒｄｉｎ ｃＤＮＡクローンは、オリゴｄＴプライマーで合成
されたヒト胎児肺ライブラリーから単離した。ヒト胎児肺ポリＡ+ ＲＮＡを、 Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（カタログ番号６５２８−１、ロット番号４３７７７）から購
入し、５ｍｇを、ｐＫＲ５Ｂ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ， ＬＩＢ２６）のｃＤＮＡ
ライブラリーを構築するために用いた。３’−プライマー（ｐＧＡＣＴＡＧＴＴ
ＣＴＡＧＡＴＣＧＣＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ
）（配列番号：８）と、５’−リンカー（ｐＣＧＧＡＣＧＣＧＴＧＧＧＧＣＣＴ
ＧＣＧＣＡＣＣＣＡＧＣＴ）（配列番号：９）を、ＳａｌＩとＮｏｔＩ制限酵素
部位を導入するように設計した。提示された染色体遺伝子のエキソンを手動で「
スプライシング」して導き出された推定上のヒトコルディンｃＤＮＡ配列（ＤＮ
Ａ３４４１５）から設計したオリゴヌクレオチドプローブで、クローンをスクリ
ーニングした。配列決定する前にｃＤＮＡクローンの同一性を確認するため、Ｐ
ＣＲプライマーの側腹に位置するプローブを用いた。
【０２７０】 オリゴヌクレオチドプローブのスクリーニングを以下のように行った： ＯＬＩ５６４０ ３４４１５．ｐ１ ５’−ＧＣＣＧＣＴＣＣＣＣＧＡＡＣＧＧ
ＧＣＡＧＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＣＡＧＡＡ−３’（配列番号：１０）と ＯＬＩ５６４０ ３４４１５．ｐ２ ５’−ＧＧＣＧＣＡＣＡＧＣＡＣＧＣＡＧ
ＣＧＣＡＴＣＡＣＣＣＣＧＡＡＴＧＧＣＴＣ−３’（配列番号：１１）；と、用
いた側腹に位置するプローブは以下のものであった： ＯＬＩ５６３９ ３４４１５． ｆ１ ５’−ＧＴＧＣＴＧＣＣＣＡＴＣＣＧＴ
ＴＣＴＧＡＧＡＡＧＧＡ−３’（配列番号：１２）と、 ＯＬＩ５６４３ ３４４１５．ｒ ５’−ＧＣＡＧＧＧＴＧＣＴＣＡＡＡＣＡＧ
ＧＡＣＡＣ−３’（配列番号：１３）。
【０２７１】 実施例５：ＰＲＯ２４３のノーザンブロットおよびｉｎ ｓｉｔｕ ＲＮＡハ
イブリダイゼーション分析 ヒト組織におけるＰＲＯ２４３ ｍＲＮＡの発現を、ノーザンブロットによっ
て試験した。ヒト胎児および成人組織から得られたヒトポリＡ+ＲＮＡブロット （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ；カタログ番号７７６０−１と
７７５６−１）を、全長ＰＲＯ２４３ ｃＤＮＡに基づいた32Ｐ−標識ｃＤＮＡ
フラグメントプローブとハイブリダイズさせた。ブロットは、プローブと共に、
ハイブリダイゼーション緩衝液（５ｘＳＳＰＥ；２ｘデンハート溶液；１００ｍ
ｇ／ｍｌ変性切断サケ精子ＤＮＡ；５０％ホルムアミド；２％ＳＤＳ）中、６０
時間、４２℃でインキュベーションした。ブロットを、２ｘＳＳＣで複数回；０
．０５％ＳＤＳで室温１時間洗浄し、続けて、高ストリンジェントな洗浄を、３
０分間、０．１ｘＳＳＣ；０．１％ＳＤＳ中、５０℃で行い、オートラジオグラ
フィーに供した。ブロットを一晩露光させた後、フォスフォイメージャ（ｐｈｏ
ｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ）分析機（Ｆｕｊｉ）によって現像した。
【０２７２】 図６に示すように、ＰＲＯ２４３ ｍＲＮＡ転写生成物を検出した。発現パタ
ーンの分析により、予想される４．０ｋｂ転写物の強いシグナルが、成熟および
胎児の肝臓において、および、非常に弱いシグナルが成熟腎臓において示された
。胎児の脳、肺および腎臓は陰性であり、成熟心臓、脳、肺および脾臓は陰性で
あった。より小さな転写生成物が、胎盤（２．０ｋｂ）、成熟骨格筋（１．８ｋ
ｂ）および胎児肝臓（２．０ｋｂ）において観察された。
【０２７３】 ＰＲＯ２４３の成人組織のＩｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより、陽
性シグナルが、大腿骨頭と寛骨臼との間に形成される発育中の滑膜性連結の割線
において得られた。他の全組織は陰性であった。ヒト胎児の顔、頭、四肢とマウ
ス胚子のさらなる切片標本についても試験した。ヒト胎児組織における発現は、
発育している四肢および骨膜傍の間葉における顔骨に隣接して観察された。発現
は高く特異的であり、しばしば血管新生している領域に隣接していた。また、発
現は、発育時の一時的に胎児脳の後頭葉に観察されるが、脳においてそれ以外で
は観察されなかった。さらに、発現は、発育中の内耳の神経節において認められ
た。マウスの組織において、ヒトプローブにより、発現を認めることはできなか
った（図７参照）。
【０２７４】 Ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、最適化されたプロトコールで、Ｐ
ＣＲ産出33Ｐ標識リボプローブ［ＬｕとＧｉｌｌｅｔｔ，Ｃｅｌｌ Ｖｉｓｉｏ
ｎ １：１６９−１７６（１９９４）］を用いて行った。ホルマリン固定、パラ
フィン包埋したヒト胎児および成人組織を薄切し、脱パラフィン化し、プロテア
ーゼＫ（２０ｇ／ｍｌ）で１５分間、３７℃で除タンパクし、さらに、ＬｕとＧ
ｉｌｌｅｔｔ（１９９４）によって記載されたように、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリ
ダイゼーション用に処理した。［33Ｐ］−ＵＴＰ標識アンチセンスリボプローブ
をＰＣＲ生成物から産出し、５５℃で一晩ハイブリダイズさせた。スライドを、
Ｋｏｄａｋ ＮＴＢ２ ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｃｋ感光紙に浸し、４週間露光
させた。
【０２７５】 実施例６：ヒトＰＲＯ２９９をコードするｃＤＮＡクローンの単離 ここでＤＮＡ２８８４７として称するｃＤＮＡ配列（図１０；配列番号：１８
）を、上記実施例２に記載したように単離した。さらなる分析後、ＤＮＡ２８８
４７の３’端切り型が見出され、これをここにＤＮＡ３５８７７（図１１；配列
番号：１９）と称する。ＤＮＡ３５８７７配列に基づいて、オリゴヌクレオチド
を、１）ＰＣＲによって、興味のある配列を含むｃＤＮＡライブラリーを同定す
るため、および２）ＰＲＯ２９９をコードする全長の配列のクローンを単離する
ためのプローブとして使用するため、合成した。前進および逆進ＰＣＲプライマ
ーは、一般的に、２０から３０ヌクレオチドの範囲であり、しばしば、長さ約１
００−１０００ｂｐのＰＣＲ生成物を得るように設計する。プローブの配列は、
典型的には、長さ４０−５５ｂｐである。いくつかの事例において、コンセンサ
ス配列が約１−１．５ｋｂｐよりも大きくなる時、付加的オリゴヌクレオチドを
合成する。全長のクローンのための複数個のライブラリーをスクリーニングする
ために、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙに従って、ＰＣＲプライマー対を用い、ライブ
ラリーからＤＮＡをＰＣＲ増幅によってスクリーニングした。次いで、オリゴヌ
クレオチドプローブと該プライマー対の一つを用い、興味のある遺伝子をコード
するクローンを単離するために、陽性のライブラリーを用いた。
【０２７６】 前進と逆進ＰＣＲプライマーを合成した： 前進ＰＣＲプライマー（３５８７７．ｆ１） ５’−ＣＴＣＴＧＧＡＡＧＧＴＣ
ＡＣＧＧＣＣＡＣＡＧＧ−３’（配列番号：２０） 逆進ＰＣＲプライマー（３５８７７．ｒ１） ５’−ＣＴＣＡＧＴＴＣＧＧＴＴ
ＧＧＣＡＡＡＧＣＴＣＴＣ−３’（配列番号：２１） さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを、以下のヌ
クレオチド配列を有するＤＮＡ３５８７７配列から構築した。 ハイブリダイゼーションプローブ（３５８７７．ｐ１） ５’−ＣＡＧＴＧＣＴＣＣＣＴＣＡＴＡＧＡＴＧＧＡＣＧＡＡＡＧＴＧＴＧＡＣ
ＣＣＣＣＣＴＴＴＣＡＧＧＣＧＡＧＡＧＣＴＴＴＧＣＣＡＡＣＣＧＡＡＣＴＧＡ
−３’（配列番号：２２）
【０２７７】 全長クローンの供給源として複数個のライブラリーをスクリーニングするため
に、ライブラリーからＤＮＡを、上記同定されたＰＣＲプライマー対の一つを用
い、ＰＣＲ増幅によってスクリーニングした。次いで、オリゴヌクレオチドプロ
ーブを用い、ＰＲＯ２９９配列をコードするクローンを単離するために、陽性ラ
イブラリーを用いた。
【０２７８】 ｃＤＮＡライブラリーを構築するためのＲＮＡを、ヒト胎児脳組織から単離し
た。ｃＤＮＡクローンを単離するために用いたｃＤＮＡライブラリーを、例えば
、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡなどから商業的に利用でき
る試薬を用いた標準的な方法により構築した。ｃＤＮＡは、ＮｏｔＩ部位を含む
オリゴｄＴプライマーで合成し、ＳａｌＩヘミキナーゼアダプターに平滑端で連
結し、ＮｏｔＩで切断し、ゲル電気泳動でおおよそのサイズに分画し、定められ
た方向で適切なクローニングベクター［例えば、ｐＲＫＢもしくはｐＲＫＤ；ｐ
ＲＫ５ＢはＳｆｉＩ部位を含まないｐＲＫ５Ｄの前駆体である；Ｈｏｌｍｅｓら
、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５３：１２７８−１２８０（１９９１）参照］に、特有の
ＸｈｏＩとＮｏｔＩ部位で、クローニングした。
【０２７９】 上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列決定により、ＰＲＯ２９９の全長
のＤＮＡ配列［ここにＵＮＱ２６２（ＤＮＡ３９９７６−１２１５）と称する］
を得て、ＰＲＯ２９９のタンパク質配列を推定した。
【０２８０】 ＵＮＱ２６２（ＤＮＡ３９９７６−１２１５）の全ヌクレオチド配列を図８に
示す（配列番号：１４）。クローンＵＮＱ２６２（ＤＮＡ３９９７６−１２１５
）は、ヌクレオチド部位１１１−１１３に見かけ上の翻訳開始部位と、ヌクレオ
チド部位２３２２−２３２４に終止コドンでの終止を有する単一のオープンリー
ディングフレームを含む（図８）。この推定されるポリペプチドプレカーサーは
、７３７アミノ酸長である（図９）。クローンＵＮＱ２６２（ＤＮＡ３９９７６
−１２１５）によってコードされるポリペプチド配列の重要な領域が同定され、
以下のものを含む：アミノ酸１−２８に相当する単一ペプチド、アミノ酸６３８
−６６２に相当する推定トランスメンブレン領域、アミノ酸８０−１０６、１２
１−２０３、３３６−３６０、３７８−４１５、４１６−４４１、４５４−４９
０、４９１−５２８、５２９−５４８、５６７−６０４および６０５−６２２に
相当する１０個のＥＧＦの反復、アミノ酸１０−１２０，２０４−２０７，２０
８−２２２，２２３−２８５，２８６−３０４，３６１−３７４，３７５−３７
７，４４２−４５３，５４９−５６３，および５６４−５６６に相当する、潜在
的な１０個のＮ−グリコシル化部位。クローンＵＮＱ２６２（ＤＮＡ３９９７６
−１２１５）が、ＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号がＡＴＣＣ２０９５２
４と付与されている。
【０２８１】 全長のＰＲＯ２９９ポリペプチドのアミノ酸配列の分析から、それの一部が、
切痕タンパク質(notch protein)と有意な相同性を有することが提示され、それ によって、ＰＲＯ２９９が新規な切痕タンパク相同体であり、典型的な切痕タン
パク質の活性を有することが示唆されている。
【０２８２】 実施例７： ヒトＰＲＯ３２３をコードするｃＤＮＡクローンの単離 コンセンサスＤＮＡ配列を、上記実施例１に記載されたように、他のＥＳＴ配
列に対応してまとめた。このコンセンサス配列を、ここに、ＤＮＡ３０８７５と
称する。ＤＮＡ３０８７５コンセンサス配列に基づいて、オリゴヌクレオチドを
、１）ＰＣＲによって、興味のある配列を含むｃＤＮＡライブラリーを同定する
ため、および２）ＰＲＯ３２３の全長をコードする配列のクローンを単離するた
めのプローブとして使用するため、合成した。
【０２８３】 ＰＣＲプライマー（２個の前進と１個の逆進）を合成した： 前進ＰＣＲプライマー１ ５’−ＡＧＴＴＣＴＧＧＴＣＡＧＣＣＴＡＴＧＴＧＣ
Ｃ−３’（配列番号：２５） 前進ＰＣＲプライマー２ ５’−ＣＧＴＧＡＴＧＧＴＧＴＣＴＴＴＧＴＣＣＡＴ
ＧＧＧ−３’（配列番号：２６） 逆進ＰＣＲプライマー ５’−ＣＴＣＣＡＣＣＡＡＴＣＣＣＧＡＴＧＡＡＣＴＴ
ＧＧ−３’（配列番号：２７） さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを、以下のヌ
クレオチド配列を有するコンセンサスＤＮＡ３０８７５配列から構築した。 ハイブリダイゼーションプローブ ５’−ＧＡＧＣＡＧＡＴＴＧＡＣＣＴＣＡＴＡＣＧＣＣＧＣＡＴＧＴＧＴＧＣＣ
ＴＣＣＴＡＴＴＣＴＧＡＧＣＴＧＧＡ−３’（配列番号：１１）
【０２８４】 全長クローンの供給源としての複数個のライブラリーをスクリーニングするた
め、ライブラリーからＤＮＡを、上記同定されたＰＣＲプライマー対を用いたＰ
ＣＲ増幅によってスクリーニングした。次いで、ＰＲＯ３２３遺伝子をコードす
るクローンを、オリゴヌクレオチドプローブと該ＰＣＲプライマー対の一つを用
いて単離するため、陽性ライブラリーを用いた。ｃＤＮＡライブラリーの構築の
ためのＲＮＡを、ヒト胎児肝組織（ＬＩＢ６）から単離した。
【０２８５】 上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列決定によって、ＰＲＯ３２３［こ
こに、ＵＮＱ２８４（ＤＮＡ３５５９５−１２２８）と称する］（配列番号：２
３）が得られ、ＰＲＯ３２３のタンパク質配列が推定された。
【０２８６】 ＵＮＱ２８４（ＤＮＡ３５５９５−１２２８）の全ヌクレオチド配列を図１２
（配列番号：２３）に示す。クローンＵＮＱ２８４（ＤＮＡ３５５９５−１２２
８）は、ヌクレオチド部位１１０−１１２に見かけ上の翻訳開始部位と、ヌクレ
オチド部位１４０９−１４１１に終止コドンでの終止を有する単一のオープンリ
ーディングフレームを含む（図１２）。推測されるポリペプチドプレカーサーは
、４３３アミノ酸長である（図１３）。図１３に示された全長ＰＲＯ３２３タン
パク質は、分子量約４７７８７ダルトンで、ＰＩ約６．１１であると推測される
。クローンＵＮＱ２８４（ＤＮＡ３５５９５−１２２８）は、ＡＴＣＣに寄託し
ており、ＡＴＣＣ寄託番号２０９５２８が付与される。
【０２８７】 全長ＰＲＯ３２３ポリペプチドのアミノ酸配列の分析により、それの一部が、
様々なジペプチダーゼタンパク質と有意な相同性を有することが示され、それに
よって、ＰＲＯ３２３が、新規なジペプチダーゼタンパク質であることが示唆さ
れている。
【０２８８】 実施例８： ヒトＰＲＯ３２７をコードするｃＤＮＡクローンの単離 発現配列標識（expressed sequence tag）（ＥＳＴ）ＤＮＡデータベース（Ｌ
ＩＦＥＳＥＱTM，Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｐａｌｏ
Ａｌｔｏ，ＣＡ）を検索し、様々なＥＳＴ配列が、ヒトプロラクチン受容体タン
パク質とのある程度の相同性を示すことを確認した。これらのＥＳＴ配列を、ｐ
ｈｒａｐを用いて整列し、コンセンサス配列を得た。次いで、上記ＥＳＴ配列の
供給源を用いて、コンセンサス配列をできるかぎり伸長するため、このコンセン
サスＤＮＡ配列を、ＢＬＡＳとｐｈｒａｐの反復サイクルを用いて伸長した。伸
長し、まとめた配列を、ここにＤＮＡ３８１１０と称する。上記検索は、コンピ
ュータープログラムＢＬＡＳＴもしくはＢＬＡＳＴ２を用いて行った（Ａｌｔｓ
ｈｕｌら、Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２６６：４６０−４８
０（１９９６））。既知のタンパク質をコードしないＢＬＡＳＴスコアー７０（
もしくは、いくつかの事例において９０）以上となるこれらの比較結果を、グル
ープ化し、プログラム「ｐｈａｒｐ」（Ｐｈｉｌ Ｇｒｅｅｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓ
ｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｓｅａｔｔｌｅ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ
；ｈｔｔｐ：／／ｂｏｚｅｍａｎ．ｍｂｔ．ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄｕ／ｐ
ｈｒａｐ．ｄｏｃｓ／ｐｈｒａｐ．ｈｔｍｌ）により、コンセンサスＤＮＡ配列
にまとめた。
【０２８９】 上記のように得られたＤＮＡ３８１１０コンセンサス配列に基づいて、オリゴ
ヌクレオチドを、１）興味のある配列を含むｃＤＮＡライブラリーを、ＰＣＲに
よって同定するため、および２）ＰＲＯ３２７をコードする全長の配列のクロー
ンを単離するためのプローブとしての使用のため、合成した。
【０２９０】 ＰＣＲプライマー（前進と逆進）を以下のように合成した： 前進プライマー ５’−ＣＣＣＧＣＣＣＧＡＣＧＴＧＣＡＣＧＴＧＡＧＣＣ−３
’（配列番号：３３） 逆進プライマー ５’−ＴＧＡＧＣＣＡＧＣＣＣＡＧＧＡＡＣＴＧＣＴＴＧ−３
’（配列番号：３４） さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを、以下のヌ
クレオチド配列を有するコンセンサスＤＮＡ３８１１０コンセンサス配列から構
築した。 ハイブリダイゼーションプローブ ５’−ＣＡＡＧＴＧＣＧＣＴＧＣＡＡＣＣＣＣＴＴＴＧＧＣＡＴＣＴＡＴＧＧＣ
ＴＣＣＡＡＧＡＡＡＧＣＣＧＧＧＡＴ−３’（配列番号：３５）
【０２９１】 全長クローンの供給源としての複数個のライブラリーをスクリーニングするた
めに、ライブラリーからＤＮＡを、上記ＰＣＲプライマー対を用いたＰＣＲ増幅
によってスクリーニングした。次いで、陽性ライブラリーを、オリゴヌクレオチ
ドプローブと上記ＰＣＲプライマーの一つを用い、ＰＲＯ３２７遺伝子をコード
するクローンを単離するために用いた。ｃＤＮＡライブラリーの構築のためのＲ
ＮＡを、ヒト胎児肺組織（ＬＩＢ２６）から単離した。
【０２９２】 上記単離したクローンのＤＮＡ配列決定により、ＰＲＯ３２７の全長ＤＮＡ配
列［ここに、ＵＮＱ２８８（ＤＮＡ３８１１３−１２３０）として称する］（配
列番号：１６）を得て、ＰＲＯ３２７のタンパク質配列を推定した。
【０２９３】 ＵＮＱ２８８（ＤＮＡ３８１１３−１２３０）の全ヌクレオチド配列を、図１
６（配列番号：３１）に示す。クローンＵＮＱ２８８（ＤＮＡ３８１１３−１２
３０）は、ヌクレオチド部位１１９−１２１に見かけ上の翻訳開始部位と、ヌク
レオチド部位１３８５−１３８７に終止コドンでの終止を有する単一のオープン
リーディングフレームを含む（図１６）。推測されるポリペプチドプレカーサー
は、４２２アミノ酸長である（図１７）。図１７に示された全長ＰＲＯ３２７タ
ンパク質は、分子量約４６３０２ダルトンで、ＰＩ約９．４２であると推測され
る。クローンＵＮＱ２８８（ＤＮＡ３８１１３−１２３０）は、ＡＴＣＣに寄託
しており、ＡＴＣＣ寄託番号２０９５３０が付与されている。
【０２９４】 全長ＰＲＯ３２７ポリペプチドのアミノ酸配列の分析により、それの一部が、
ヒトプロラクチン受容体タンパク質と有意な相同性を有することが提示され、そ
れによって、ＰＲＯ３２７が、新規なプロラクチン結合タンパク質であることが
示唆されている。
【０２９５】 実施例９： ヒトＰＲＯ２３３をコードするｃＤＮＡクローンの単離 コンセンサスＤＮＡ配列を、上記実施例１に記載されたように、他のＥＳＴ配
列と対応してまとめた。このコンセンサス配列を、ここに、ＤＮＡ３０９４５と
称する。ＤＮＡ３０９４５コンセンサス配列に基づいて、オリゴヌクレオチドを
、１）ＰＣＲによって、興味のある配列を含むｃＤＮＡライブラリーを同定する
ため、および２）ＰＲＯ２３３の全長をコードする配列のクローンを単離するた
めのプローブとして使用するため、合成した。
【０２９６】 ＰＣＲプライマーを以下のように合成した： 前進ＰＣＲプライマー１ ５’−ＧＧＴＧＡＡＧＧＣＡＧＡＡＡＴＴＧＧＡＧＡ
ＴＧ−３’（配列番号：３８） 逆進ＰＣＲプライマー ５’−ＡＴＣＣＣＡＴＧＣＡＴＣＡＧＣＣＴＧＴＴＴＡ
ＣＣ−３’（配列番号：３９） さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを、以下のヌ
クレオチド配列を有するコンセンサスＤＮＡ３０９４５配列から構築した。 ハイブリダイゼーションプローブ ５’−ＧＣＴＧＧＴＧＴＡＧＴＣＴＡＴＡＣＡＴＣＡＧＡＴＴＴＧＴＴＴＧＣＴ
ＡＣＡＣＡＡＧＡＴＣＣＴＣＡＧ−３’（配列番号：４０）
【０２９７】 全長クローンの供給源としての複数個のライブラリーをスクリーニングするた
めに、ライブラリーからＤＮＡを、上記同定されたＰＣＲプライマー対を用いた
ＰＣＲ増幅によってスクリーニングした。次いで、ＰＲＯ２３３遺伝子をコード
するクローンをオリゴヌクレオチドプローブを用いて単離するために、陽性ライ
ブラリーを用いた。ｃＤＮＡライブラリーの構築のためのＲＮＡを、ヒト胎児脳
組織から単離した。
【０２９８】 上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列決定によって、ＰＲＯ２３３［こ
こに、ＵＮＱ２０７（ＤＮＡ３４４３６−１２３８）と称する］（配列番号：３
６）が得られ、ＰＲＯ２３３のタンパク質配列が推定された。
【０２９９】 ＵＮＱ２０７（ＤＮＡ３４４３６−１２３８）の全ヌクレオチド配列を図１８
（配列番号：３６）に示す。クローンＵＮＱ２０７（ＤＮＡ３４４３６−１２３
８）は、ヌクレオチド部位１０１−１０３に見かけ上の翻訳開始部位と、ヌクレ
オチド部位１００１−１００３に終止コドンでの終止を有する単一のオープンリ
ーディングフレームを含む（図１８）。推測されるポリペプチドプレカーサーは
、３００アミノ酸長である（図１９）。図１９に示された全長ＰＲＯ２３３タン
パク質は、分子量約３２９６４ダルトンで、ＰＩ約９．５２であると推測される
。さらに、単一ペプチドと推定上の酸化還元酵素活性部位を含む興味のある領域
を、図１９に示す。クローンＵＮＱ２０７（ＤＮＡ３４４３６−１２３８）は、
ＡＴＣＣに寄託しており、ＡＴＣＣ寄託番号２０９５２３が付与されている。
【０３００】 全長ＰＲＯ２３３ポリペプチドのアミノ酸配列の分析により、それの一部が、
様々な還元酵素タンパク質と有意な相同性を有することが提示され、それによっ
て、ＰＲＯ２３３が、新規な還元酵素タンパク質であることが示唆されている。
【０３０１】 実施例１０： ヒトＰＲＯ３４４をコードするｃＤＮＡクローンの単離 コンセンサスＤＮＡ配列を、上記実施例１に記載されたように、他のＥＳＴ配
列に対応してまとめた。このコンセンサス配列を、ここに、ＤＮＡ３４３９８と
称する。ＤＮＡ３４３９８コンセンサス配列に基づいて、オリゴヌクレオチドを
、１）ＰＣＲによって、興味のある配列を含むｃＤＮＡライブラリーを同定する
ため、および２）ＰＲＯ３４４の全長をコードする配列のクローンを単離するた
めのプローブとして使用するため、合成した。
【０３０２】 ＤＮＡ３４３９８コンセンサス配列に基づいて、前進と逆進ＰＣＲプライマー
を合成した： 前進ＰＣＲプライマー（３４３９８．ｆ１） ５’−ＴＡＣＡＧＧＣＣＣＡＧＴ
ＣＡＧＧＡＣＣＡＧＧＧＧ−３’（配列番号：４３） 前進ＰＣＲプライマー（３４３９８．ｆ２） ５’−ＡＧＣＣＡＧＣＣＴＣＧＣ
ＴＣＴＣＧＧ−３’（配列番号：４４） 前進ＰＣＲプライマー（３４３９８．ｆ３） ５’−ＧＴＣＴＧＣＧＡＴＣＡＧ
ＧＴＣＴＧＧ−３’（配列番号：４５） 逆進ＰＣＲプライマー（３４３９８．ｒ１） ５’−ＧＡＡＡＧＡＧＧＣＡＡＴ
ＧＧＡＴＴＣＧＣ−３’（配列番号：４６） 逆進ＰＣＲプライマー（３４３９８．ｒ２） ５’−ＧＡＣＴＴＡＣＡＣＴＴＧ
ＣＣＡＧＣＡＣＡＧＣＡＣ−３’（配列番号：４７） さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを、以下のヌ
クレオチド配列を有するＤＮＡ３４３９８コンセンサス配列から構築した。 ハイブリダイゼーションプローブ ５’−ＧＧＡＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＣＴＧＧＡＧＧＧＴＣＣＧＧＡＧＴＡＧＣＧ
ＡＧＣＧＣＣＣＣＧＡＡＧ−３’（配列番号：４８）
【０３０３】 全長クローンの供給源としての複数個のライブラリーをスクリーニングするた
めに、ライブラリーからＤＮＡを、上記同定されたＰＣＲプライマー対を用いた
ＰＣＲ増幅によってスクリーニングした。次いで、オリゴヌクレオチドプローブ
と該ＰＣＲプライマーの一つを用いて、ＰＲＯ３４４遺伝子をコードするクロー
ンを単離するために、陽性ライブラリーを用いた。ｃＤＮＡライブラリーの構築
のためのＲＮＡを、ヒト胎児腎組織から単離した。
【０３０４】 上記のように単離されたクローンのＤＮＡ配列決定によって、ＰＲＯ３４４の
全長のＤＮＡ配列［ここに、ＵＮＱ３０３（ＤＮＡ４０５９２−１２４２）と称
する］（配列番号：４１）を得て、ＰＲＯ３４４のタンパク質配列を推定した。
【０３０５】 ＵＮＱ３０３（ＤＮＡ４０５９２−１２４２）の全ヌクレオチド配列を図２０
（配列番号：４１）に示す。クローンＵＮＱ３０３（ＤＮＡ４０５９２−１２４
２）は、ヌクレオチド部位２２７−２２９に見かけ上の翻訳開始部位と、ヌクレ
オチド部位９５６−９５８に終止コドンでの終止を有する単一のオープンリーデ
ィングフレームを含む（図２０）。推測ポリペプチドプレカーサーは、２４３ア
ミノ酸長である（図２１）。ＰＲＯ３４４のヌクレオチド１から７２９によって
コードされたアミノ酸配列の重要な領域は、図２１に示されているように、単一
ペプチド、成熟タンパク質の開始、および潜在的な２個のＮ−ミリストイル化部
位を含む。クローンＵＮＱ３０３（ＤＮＡ４０５９２−１２４２）は、ＡＴＣＣ
に寄託しており、ＡＴＣＣ寄託番号ＡＴＣＣ２０９４９２が付与されている。
【０３０６】 全長ＰＲＯ３４４ポリペプチドのアミノ酸配列の分析により、それらの一部が
、様々なヒトおよび齧歯動物の補体タンパク質と有意な相同性を有することが提
示され、それによって、ＰＲＯ３４４が、新規な補体タンパク質であることが示
唆されている。
【０３０７】 実施例１１： ヒトＰＲＯ３４７をコードするｃＤＮＡクローンの単離 コンセンサスＤＮＡ配列を、上記実施例１に記載されたように、他のＥＳＴ配
列に対応してまとめた。このコンセンサス配列を、ここに、ＤＮＡ３９４９９と
称する。ＤＮＡ３９４９９コンセンサス配列に基づいて、オリゴヌクレオチドが
、１）ＰＣＲによって、興味のある配列を含むｃＤＮＡライブラリーを同定する
ため、および２）ＰＲＯ３４７の全長をコードする配列のクローンを単離するた
めのプローブとして使用するため、合成した。
【０３０８】 ＰＣＲプライマー（前進と逆進）を以下のように合成した： 前進ＰＣＲプライマー ５’−ＡＧＧＡＡＣＴＴＣＴＧＧＡＴＣＧＧＧＣＴＣＡ
ＣＣ−３’（配列番号：５１） 逆進ＰＣＲプライマー ５’−ＧＧＧＴＣＴＧＧＧＣＣＡＧＧＴＧＧＡＡＧＡＧ
ＡＧ−３’（配列番号：５２） さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを、以下のヌ
クレオチド配列を有するコンセンサスＤＮＡ３９４９９配列から構築した。 ハイブリダイゼーションプローブ ５’−ＧＣＣＡＡＧＧＡＣＴＣＣＴＴＣＣＧＣＴＧＧＧＣＣＡＣＡＧＧＧＧＡＧ
ＣＡＣＣＡＧＧＣＣＴＴＣ−３’（配列番号：５３）
【０３０９】 全長クローンの供給源としての複数個のライブラリーをスクリーニングするた
めに、ライブラリーからＤＮＡを、上記同定したＰＣＲプライマー対を用いたＰ
ＣＲ増幅によってスクリーニングした。次いで、オリゴヌクレオチドプローブと
該ＰＣＲプライマーの一つを用いて、ＰＲＯ３４７遺伝子をコードするクローン
を単離するために、陽性ライブラリーを用いた。ｃＤＮＡライブラリーの構築の
ためのＲＮＡを、ヒト胎児腎組織（ＬＩＢ２２８）から単離した。
【０３１０】 上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列決定によって、ＰＲＯ３４７の全
長のＤＮＡ配列［ここに、ＵＮＱ３０６（ＤＮＡ４４１７６−１２４４）と称す
る］（配列番号：４９）を得て、ＰＲＯ３４７のタンパク質配列を推定した。
【０３１１】 ＵＮＱ３０６（ＤＮＡ４４１７６−１２４４）の全ヌクレオチド配列を図２２
（配列番号：４９）に示す。クローンＵＮＱ３０６（ＤＮＡ４４１７６−１２４
４）は、ヌクレオチド部位１２３−１２５に見かけ上の翻訳開始部位と、ヌクレ
オチド部位１４８８−１４９０に終止コドンでの終止を有する単一のオープンリ
ーディングフレームを含む（図２２）。推測されるポリペプチドプレカーサーは
、４５５アミノ酸長である（図２３）。図２３に示された全長ＰＲＯ３４７タン
パク質は、分子量約５０４７８ダルトンで、ＰＩ約８．４４であると推測される
。クローンＵＮＱ３０６（ＤＮＡ４４１７６−１２４４）は、ＡＴＣＣに寄託し
ており、ＡＴＣＣ寄託番号２０９５３２が付与されている。
【０３１２】 全長ＰＲＯ３４７ポリペプチドのアミノ酸配列の分析により、それの一部が、
様々なシステインに富む分泌タンパク質と有意な相同性を有することが提示され
、それによって、ＰＲＯ３４７が、新規なシステインに富む分泌タンパク質であ
ることが示唆されている。
【０３１３】 実施例１２： ヒトＰＲＯ３５４をコードするｃＤＮＡクローンの単離 発現配列標識（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇ）（ＥＳＴ
）ＤＮＡデータベース（ＬＩＦＥＳＥＱTM， Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅ
ｕｔｉｃａｌｓ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）を検索し、インター-アルフ ァ-トリプシンインヒビター重鎖と、およびお互いに、ある程度の相同性を有す る様々なＥＳＴ配列を同定した。次いで、相同のＥＳＴ配列を整列し、コンセン
サス配列を得た。次いで、公的ＥＳＴデータベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ）
と私的ＥＳＴ ＤＮＡデータベース（ＬＩＦＥＳＥＱTM，Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａ
ｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）の両方から得られた相
同ＥＳＴ配列を用い、コンセンサス配列をできるかぎり伸長するために、ＢＬＡ
Ｓとｐｈｒａｐの反復サイクルを用い、得られたコンセンサスＤＮＡ配列を伸長
した。伸長し、まとめた配列を、ここにＤＮＡ３９６３３と称する。上記検索を
、コンピュータープログラムＢＬＡＳＴもしくはＢＬＡＳＴ２を用いて実行した
（Ａｌｔｓｈｕｌら、Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２６６：４
６０−４８０（１９９６））。既知のタンパク質をコードしないＢＬＡＳＴスコ
アー７０（もしくは、いくつかの事例において９０）以上となるこれらの比較結
果を、プログラム「ｐｈａｒｐ」（Ｐｈｉｌ Ｇｒｅｅｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔ
ｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｓｅａｔｔｌｅ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ；
ｈｔｔｐ：／／ｂｏｚｅｍａｎ．ｍｂｔ．ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄｕ／ｐｈ
ｒａｐ．ｄｏｃｓ／ｐｈｒａｐ．ｈｔｍｌ）を用い、グループ化し、コンセンサ
スＤＮＡ配列にまとめた。
【０３１４】 ＤＮＡ３９６３３コンセンサス配列に基づいて、オリゴヌクレオチドを、１）
興味のある配列を含むｃＤＮＡライブラリーを、ＰＣＲによって同定するため、
および２）ＰＲＯ３５４をコードする全長配列のクローンを単離するためのプロ
ーブとしての使用のため、合成した。前進と逆進ＰＣＲプライマーは、一般的に
、２０から３０ヌクレオチドの範囲であり、しばしば、長さ約１００−１０００
ｂｐのＰＣＲ生成物を与えるように設計する。プローブの配列は、典型的には、
長さ４０−５５ｂｐである。いくつかの事例において、コンセンサス配列が約１
−１．５ｋｂを超える時、付加的なオリゴヌクレオチドを合成する。全長クロー
ンのためのいくつかのライブラリーをスクリーニングするために、ライブラリー
からＤＮＡを、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙに従って、ＰＣＲプライマー対を用い、
ＰＣＲ増幅によってスクリーニングした。次いで、オリゴヌクレオチドプローブ
もしくはプライマー対の一つを用い、興味のある遺伝子をコードするクローンを
単離するために、陽性のライブラリーを用いた。
【０３１５】 ＰＣＲプライマー（前進と逆進）を以下のように合成した： 前進プライマー１（３９６３３．ｆ１） ５’−ＧＴＧＧＧＡＡＣＣＡＡＡＣＴ
ＣＣＧＧＣＡＧＡＣＣ−３’（配列番号：５６） 前進プライマー２（３９６３３．ｆ２） ５’−ＣＡＣＡＴＣＧＡＧＣＧＴＣＴ
ＣＴＧＧ−３’（配列番号：５７） 逆進プライマー（３９６３３．ｒ１） ５’−ＡＧＣＣＧＣＴＣＣＴＴＣＴＣＣ
ＧＧＴＴＣＡＴＣＧ−３’（配列番号：５８） さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを、以下のヌ
クレオチド配列を有するコンセンサスＤＮＡ３９６３３配列から構築した。 ハイブリダイゼーションプローブ ５’−ＴＧＧＡＡＧＧＡＣＣＡＣＴＴＧＡＴＡＴＣＡＧＴＣＡＣＴＣＣＡＧＡＣ
ＡＧＣＡＴＣＡＧＧＧＡＴＧＧＧ−３’（配列番号：５９）
【０３１６】 全長クローンの供給源としての複数個のライブラリーをスクリーニングするた
めに、ライブラリーからＤＮＡを、上記ＰＣＲプライマー対を用いたＰＣＲ増幅
によってスクリーニングした。次いで、オリゴヌクレオチドプローブと上記ＰＣ
Ｒプライマーの一つを用いて、ＰＲＯ３５４遺伝子をコードするクローンを単離
するために、陽性のライブラリーを用いた。
【０３１７】 ｃＤＮＡライブラリーの構築のためのＲＮＡを、ヒト胎児腎組織（ＬＩＢ２２
７）から単離した。ｃＤＮＡクローンを単離するために用いたｃＤＮＡライブラ
リーを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡなどから商業的に利
用できる試薬を用いた標準的な方法によって構築した。ｃＤＮＡを、ＮｏｔＩ部
位を含むオリゴｄＴプライマーで合成し、ＳａｌＩヘミキナーゼアダプターに平
滑端で連結し、ＮｏｔＩ部位で切断し、適切にゲル電気泳動によりサイズ分画し
、好適なクローニングベクター［例えば、ｐＲＫＢもしくはｐＲＫＤ；ｐＲＫ５
Ｂは、ＳｆｉＩ部位を含まないｐＲＫ５Ｄの前駆体である；Ｈｏｌｍｅｓら、Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ，２５３：１２７８−１２８０（１９９１）参照］に、特有のＸｈ
ｏＩおよびＮｏｔＩ部位で、定められた方向でクローニングした。
【０３１８】 上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列により、ＰＲＯ３５４の全長のＤ
ＮＡ配列［ここに、ＵＮＱ３１１（ＤＮＡ４４１９２−１２４６）として称する
］（配列番号：５４）を得て、ＰＲＯ３５４のタンパク質配列を推定した。
【０３１９】 ＵＮＱ３１１（ＤＮＡ４４１９２−１２４６）の全ヌクレオチド配列を図２４
（配列番号：５４）に示す。クローンＵＮＱ３１１（ＤＮＡ４４１９２−１２４
６）は、ヌクレオチド部位７２−７４に見かけ上の翻訳開始部位と、ヌクレオチ
ド部位２１５４−２１５６に終止コドンでの終止とを有する単一のオープンリー
ディングフレームを含む（図２４）。推測されるポリペプチドプレカーサーは、
６９４アミノ酸長である（図２５）。図２５に示した全長ＰＲＯ３５４タンパク
質は、分子量約７７４００ダルトンで、ＰＩ約９．５４であると推測される。ク
ローンＵＮＱ３１１（ＤＮＡ４４１９２−１２４６）は、ＡＴＣＣに寄託してお
り、ＡＴＣＣ寄託番号ＡＴＣＣ２０９５３１が付与されている。
【０３２０】 全長ＰＲＯ３５４ポリペプチドのアミノ酸配列の分析により、それの一部が、
インター-アルファ-トリプシンインヒビター重鎖タンパク質と有意な相同性を有
することが提示され、それによって、ＰＲＯ３５４が、新規なインター-アルフ ァ-トリプシンインヒビター重鎖タンパク相同体であることが示唆されている。
【０３２１】 実施例１３： ヒトＰＲＯ３５５をコードするｃＤＮＡクローンの単離 コンセンサスＤＮＡ配列を、上記実施例１に記載されたように、ＢＬＡＳＴと
ｐｈｒａｐを用いて、他のＥＳＴ配列に対応してまとめた。このコンセンサス配
列を、ここに、ＤＮＡ３５７０２と称する。ＤＮＡ３５７０２コンセンサス配列
に基づいて、オリゴヌクレオチドを、１）ＰＣＲによって、興味ある配列を含む
ｃＤＮＡライブラリーを同定するため、および２）ＰＲＯ３５５の全長をコード
する配列のクローンを単離するためのプローブとして使用するため、合成した。
【０３２２】 前進と逆進のＰＣＲプライマーを以下のように合成した： 前進ＰＣＲプライマー（．ｆ１） ５’−ＧＧＣＴＴＣＴＧＣＴＧＴＴＧＣＴＣ
ＴＴＣＴＣＣＧ−３’（配列番号：６２） 前進ＰＣＲプライマー（．ｆ２） ５’−ＧＴＡＣＡＣＴＧＴＧＡＣＣＡＧＴＣ
ＡＧＣ−３’（配列番号：６３） 前進ＰＣＲプライマー（．ｆ３） ５’−ＡＴＣＡＴＣＡＣＡＧＡＴＴＣＣＣＧ
ＡＧＣ−３’（配列番号：６４） 逆進ＰＣＲプライマー（．ｒ１） ５’−ＴＴＣＡＡＴＣＴＣＣＴＣＡＣＣＴＴ
ＣＣＡＣＣＧＣ−３’（配列番号：６５） 逆進ＰＣＲプライマー（．ｒ２） ５’−ＡＴＡＧＣＴＧＴＧＴＣＴＧＣＧＴＣ
ＴＧＣＴＧＣＧ−３’（配列番号：６６） さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを、以下のヌ
クレオチド配列を有するコンセンサスＤＮＡ３５７０２配列から構築した。 ハイブリダイゼーションプローブ ５’−ＣＧＣＧＧＣＡＣＴＧＡＴＣＣＣＣＡＣＡＧＧＴＧＡＴＧＧＧＣＡＧＡＡ
ＴＣＴＧＴＴＴＡＣＧＡＡＡＧＡＣＧ−３’（配列番号：６７）
【０３２３】 全長のクローンの供給源としての複数個のライブラリーをスクリーニングする
ために、ライブラリーからＤＮＡを、上記同定されたＰＣＲプライマー対の一つ
を用いたＰＣＲ増幅によってスクリーニングした。次いで、陽性ライブラリーを
、オリゴヌクレオチドプローブを用いて、ＰＲＯ３５５遺伝子をコードするクロ
ーンを単離するために用いた。ｃＤＮＡライブラリーの構築のためのＲＮＡを、
ヒト胎児肝組織から単離した。
【０３２４】 上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列決定によって、ＰＲＯ３５５の全
長のＤＮＡ配列［ここに、ＵＮＱ３１２（ＤＮＡ３９５１８−１２４７）と称す
る］（配列番号：６０）を得て、ＰＲＯ３５５のタンパク質配列を推定した。
【０３２５】 ＵＮＱ３１２（ＤＮＡ３９５１８−１２４７）の全ヌクレオチド配列を図２６
（配列番号：６０）に示す。クローンＵＮＱ３１２（ＤＮＡ３９５１８−１２４
７）は、ヌクレオチド部位２２−２４に見かけ上の翻訳開始部位と、ヌクレオチ
ド部位１３４２−１３４４に終止コドンでの終止を有する単一のオープンリーデ
ィングフレームを含む（図２６）。推測されるポリペプチドプレカーサーは、４
４０アミノ酸長である（図２７）。図２７に示された全長ＰＲＯ３５５タンパク
質は、分子量約４８２４０ダルトンで、ＰＩ約４．９３であると推測される。さ
らに、単一ペプチド、細胞外ドメインにおけるＩｇ反復、潜在的なＮ−グリコシ
ル化部位、および潜在的なトランスメンブランドメインを含む興味ある領域が、
図２７に示されている。クローンＵＮＱ３１２（ＤＮＡ３９５１８−１２４７）
は、ＡＴＣＣに寄託しており、ＡＴＣＣ寄託番号ＡＴＣＣ２０９５２９が付与さ
れている。
【０３２６】 全長ＰＲＯ３５５ポリペプチドのアミノ酸配列の分析により、それの一部が、
ＣＲＴＡＭタンパク質と有意な相同性を有することが提示され、それによって、
ＰＲＯ３５５が、ＣＲＴＡＭタンパク質であることが示唆されている。
【０３２７】 実施例１４： ヒトＰＲＯ３５７をコードするｃＤＮＡクローンの単離 Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ
によるｓｅｑｕｅｎｃｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｔａｇクローン番号「２４５
２９７２」を、データベース検索を始めるために用いた。Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ
公的タンパク質データベースからの約９５０個の既知分泌タンパク質から、細胞
外ドメイン（ＥＣＤ）配列（もしあるならば、分泌シグナルを含む）を、Ｉｎｃ
ｙｔｅ ＥＳＴクローン番号「２４５２９７２」の一部と重複した発現配列標識
（ＥＳＴ）データベースを検索するために用いた。ＥＳＴデータベースは、公的
ＥＳＴデータベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ）と、私的ＥＳＴ ＤＮＡデータ
ベース（ＬＩＦＥＳＥＱTM，Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，
Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を含む。上記検索を、コンピュータープログラムＢ
ＬＡＳＴもしくはＢＬＡＳＴ２を用い［Ａｌｔｓｈｕｌら、Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２６６：４６０−４８０（１９９６）］、ＥＣＤタン
パク質配列をＥＳＴ配列の６フレーム翻訳と比較して実行した。既知のタンパク
質をコードしないＢＬＡＳＴスコアー７０（もしくは、いくつかの事例において
９０）以上となるこれらの比較結果を、プログラム「ｐｈａｒｐ」（Ｐｈｉｌ
Ｇｒｅｅｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｓｅａｔｔ
ｌｅ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ；ｈｔｔｐ：／／ｂｏｚｅｍａｎ．ｍｂｔ．ｗａｓ
ｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄｕ／ｐｈｒａｐ．ｄｏｃｓ／ｐｈｒａｐ．ｈｔｍｌ）を用
い、グループ化し、コンセンサスＤＮＡ配列にまとめた。
【０３２８】 次いで、コンセンサスＤＮＡ配列を、ｐｈｒａｐを用い、他のＥＳＴ配列に対
応してまとめた。このコンセンサス配列を、ここではＤＮＡ３７１６２と称する
。この事例において、上記ＥＳＴ配列の供給源を用い、コンセンサス配列をでき
るかぎり伸長させるために、コンセンサスＤＮＡ配列を、ＢＬＡＳとｐｈｒａｐ
の反復サイクルを用いて伸長した。
【０３２９】 ＤＮＡ３７１６２コンセンサス配列に基づいて、オリゴヌクレオチドを、１）
興味のある配列を含むｃＤＮＡライブラリーを、ＰＣＲによって同定するため、
および２）ＰＲＯ３５７をコードする全長配列のクローンを単離するためのプロ
ーブとしての使用のため、合成した。前進と逆進ＰＣＲプライマーは、一般的に
、２０から３０ヌクレオチドの範囲であり、しばしば、長さ約１００−１０００
ｂｐのＰＣＲ生成物を得るために設計される。プローブの配列は、典型的には、
長さ４０−５５ｂｐである。いくつかの事例において、コンセンサス配列が約１
−１．５ｋｂを超える時、付加的なオリゴヌクレオチドを合成する。全長のクロ
ーンのためのいくつかのライブラリーをスクリーニングするために、ライブラリ
ーからＤＮＡを、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｅ Ｐｒｏｒｏｃｏｌｓ ｉ
ｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙに従って、ＰＣＲプライマー対を用い
たＰＣＲ増幅によってスクリーニングした。次いで、陽性のライブラリーを、オ
リゴヌクレオチドプローブとプライマー対の一つを用い、興味のある遺伝子をコ
ードするクローンを単離するために用いた。
【０３３０】 ＰＣＲプライマーを以下のように合成した： 前進プライマー１ ５’−ＣＣＣＴＣＣＡＣＴＧＣＣＣＣＡＣＣＧＡＣＴ−３’
（配列番号：７０）； 逆進プライマー１ ５’−ＣＧＧＴＴＣＴＧＧＧＧＡＣＧＴＴＡＧＧＧＣＴＣＧ
−３’（配列番号：７１）；および 前進プライマー２ ５’−ＣＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＣＣＡＣＣＴＧＣＣＴＣＡＡ
Ｔ−３’（配列番号：７２）。 さらに、２つの合成オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを、以
下のヌクレオチド配列を有するコンセンサスＤＮＡ３７１６２配列から構築した
。 ハイブリダイゼーションプローブ１； ５’−ＡＧＧＡＣＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＣＣＡＣＣＴＧＣＣＴＣＡＡＴＧＧＧＧ
ＧＣＡＣＡＴＧＣＣＡＣＣ−３’（配列番号：７３）；および ハイブリダイゼーションプローブ２ ５’−ＡＣＧＣＡＡＡＧＣＣＣＴＡＣＡＴＣＴＡＡＧＣＣＡＧＡＧＡＧＡＧＡＣ
ＡＧＧＧＣＡＧＣＴＧＧＧ−３’（配列番号：７４）。
【０３３１】 全長クローンの供給源としての複数個のライブラリーをスクリーニングするた
めに、ライブラリーからＤＮＡを、上記ＰＣＲプライマー対を用いたＰＣＲ増幅
によってスクリーニングした。次いで、オリゴヌクレオチドプローブとＰＣＲプ
ライマーの一つを用い、ＰＲＯ３５７遺伝子をコードするクローンを単離するた
め、陽性のライブラリーを用いた。
【０３３２】 ｃＤＮＡライブラリーを構築するためのＲＮＡを、ヒト胎児肝組織から単離し
た。ｃＤＮＡクローンを単離するために用いたｃＤＮＡライブラリーを、Ｉｎｖ
ｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡなどから商業的に利用できる試薬を
用いた標準的な方法によって構築した。ｃＤＮＡを、ＮｏｔＩ部位を含むオリゴ
ｄＴプライマーで合成し、ＳａｌＩヘミキナーゼアダプターに平滑端で連結し、
ＮｏｔＩで切断し、ゲル電気泳動により適切にサイズ分画し、好適なクローニン
グベクター［例えば、ｐＲＫＢもしくはｐＲＫＤ；ｐＲＫ５Ｂは、ＳｆｉＩ部位
を含まないｐＲＫ５Ｄの前駆体である；Ｈｏｌｍｅｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５
３：１２７８−１２８０（１９９１）参照］に、特有のＸｈｏＩおよびＮｏｔＩ
部位で、定められた方向でクローニングした。
【０３３３】 上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列決定により、ＰＲＯ３５７の全長
のＤＮＡ配列［ここに、ＵＮＱ３１４（ＤＮＡ４４８０４−１２４８）としてす
る］（配列番号：６８）を得て、ＰＲＯ３５７のタンパク質配列を推定した。
【０３３４】 ＵＮＱ３１４（ＤＮＡ４４８０４−１２４８）の全ヌクレオチド配列を図２８
（配列番号：６８）に示す。クローンＵＮＱ３１４（ＤＮＡ４４８０４−１２４
８）は、ヌクレオチド部位１３７−１３９に見かけ上の翻訳開始部位と、ヌクレ
オチド部位１９３１−１９３３に終止コドンでの終止を有する単一のオープンリ
ーディングフレームを含む（図２８）。推測されるポリペプチドプレカーサーは
、５９８アミノ酸長である（図２９）。クローンＵＮＱ３１４（ＤＮＡ４４８０
４−１２４８）は、ＡＴＣＣに寄託しており、ＡＴＣＣ寄託番号ＡＴＣＣ２０９
５２７が付与されている。
【０３３５】 さらなる分析により、図２９に示すような様々な特性が示されている。図２９
には、配列番号：６８のヌクレオチド１３７から１９３０まで得られたアミノ酸
配列（配列番号：６９）を示す。分子量が６３０３０ダルトン；ｐＩが７．２４
；およびＮＴ（Ｓ／Ｔ）が３である。推定されるトランスメンブレンドメインは
、図２９においてアミノ酸５０６から５２４までに示される。もしくは、トラン
スメンブレン領域はアミノ酸４９７の「Ｇ」で始まる。潜在的なＮ−グリコシル
化部位は、図２９の下線部位である。ＥＧＦ様ドメインのシステインパターンサ
インが、アミノ酸３５５から３６６までに見られる。また、この領域は、ラット
における乳脂乳球タンパク質、切痕、もしくは肝細胞増殖因子変換酵素において
も認められる。また、このシグナルペプチドは、図２９のアミノ酸１−２２にも
ある。ＡＬＳとの相同の最初と、細胞外ドメインにおける他のロイシン反復に富
むタンパク質が、アミノ酸部位２４から始まる。
【０３３６】 これゆえ、全長ＰＲＯ３５７のアミノ酸配列の分析から、それの一部が、ＡＬ
Ｓとの有意な相同性を有することが提示され、これによって、ＰＲＯ３５７がＡ
ＬＳに関する新規のロイシン富反復タンパク質であることが示唆される。
【０３３７】 実施例１５： ヒトＰＲＯ７１５をコードするｃＤＮＡクローンの単離 私的ＥＳＴ ＤＮＡデータベース（ＬＩＦＥＳＥＱTM，Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａ
ｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を、ヒトＴＮＦ−αの
相同性を有するポリペプチドをコードするＥＳＴ配列について検索した。この検
索により、Ｉｎｃｙｔｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｔａｇ Ｎ
ｏ．２０９９８５５を同定した。
【０３３８】 次いで、コンセンサスＤＮＡ配列を、ｓｅｑｅｘｔと「ｐｈｒａｐ」（Ｐｈｉ
ｌ Ｇｒｅｅｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｓｅａ
ｔｔｌｅ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ； ｈｔｔｐ：／／ｂｏｚｅｍａｎ．ｍｂｔ．
ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄｕ／ｐｈｒａｐ．ｄｏｃｓ／ｐｈｒａｐ．ｈｔｍｌ
）を用い、その他のＥＳＴ配列に対応してまとめた。このコンセンサス配列を、
ここにＤＮＡ５２０９２と称する。この構成に同定された様々なＥＳＴクローン
の定序に基づいて、Ｍｅｒｃｋ／Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｍ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ＥＳＴセット（ＥＳＴクローン番号．７２５８８７、受託番号．ＡＡ２９２３
５８）から単一のＥＳＴクローンを得て、その挿入物を配列決定した。次いで、
全長ＤＮＡ５２７２２−１２２９配列を、ＥＳＴクローン番号．７２５８８７か
らの挿入ＤＮＡの配列決定によって得た。
【０３３９】 ＵＮＱ３８３（ＤＮＡ５２７２２−１２２９）の全ヌクレオチド配列を、図３
０（配列番号：７５）において示す。クローンＵＮＱ３８３（ＤＮＡ５２７２２
−１２２９）は、ヌクレオチド部位１１４−１１６に見かけ上の翻訳開始部位を
含み、ヌクレオチド部位８６４−８６６に終止コドンでの終止を有する単一のオ
ープンリ−ディングフレームを含む。推定されるポリペプチドは、２５０アミノ
酸長（図３１）である。図３１に示される全長のＰＲＯ７１５は、分子量約２７
４３３ダルトン、ｐＩ約９．８５であると推定される。
【０３４０】 全長ＰＲＯ７１５ポリペプチドのアミノ酸配列の分析より、タンパク質の腫瘍
壊死因子ファミリーの一員と有意な相同性を有すことが提示され、それによって
、ＰＲＯ７１５が、新規な腫瘍壊死因子タンパク質であることが示されている。
【０３４１】 実施例１６： ヒトＰＲＯ３５３をコードするｃＤＮＡクローンの単離 コンセンサスＤＮＡ配列を、上記実施例１に記載されたように、ｐｈｒａｐを
用い、他のＥＳＴ配列に対応してまとめた。このコンセンサス配列を、ここに、
ＤＮＡ３６３６３と称する。上記ＥＳＴ配列の供給源を用い、コンセンサス配列
をできる限り伸長させるため、ＢＬＡＳＴおよびｐｈｒａｐの反復サイクルを用
い、該コンセンサスＤＮＡ配列を伸長した。ＤＮＡ３６３６３コンセンサス配列
に基づいて、オリゴヌクレオチドを、１）ＰＣＲによって、興味のある配列を含
むｃＤＮＡライブラリーを同定するため、および２）ＰＲＯ３５３の全長をコー
ドする配列のクローンを単離するためのプローブとして使用するため、合成した
。
【０３４２】 ＤＮＡ３６３６３コンセンサス配列に基づいて、前進と逆進のＰＣＲプライマ
ーを以下のように合成した： 前進ＰＣＲプライマー（３６３６３．ｆ１） ５’−ＴＡＣＡＧＧＣＣＣＡＧＴ
ＣＡＧＧＡＣＣＡＧＧＧＧ−３’（配列番号：８７） 逆進ＰＣＲプライマー（３６３６３．ｒ１） ５’−ＣＴＧＡＡＧＡＡＧＴＡＧ
ＡＧＧＣＣＧＧＧＣＡＣＧ−３’（配列番号：８８） さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを、以下のヌ
クレオチド配列を有するコンセンサスＤＮＡ３６３６３配列から構築した。 ハイブリダイゼーションプローブ ３６３６３．ｐ１ ５’−ＣＣＣＧＧＴＧＣＴＴＧＣＧＣＴＧＣＴＧＴＧＡＣＣＣＣＧＧＴＡＣＣＴ
ＣＣＡＴＧＴＡＣＣＣＧＧ−３’（配列番号：８９）
【０３４３】 全長クローンの供給源としての複数個のライブラリーをスクリーニングするた
め、ライブラリーからＤＮＡを、上記同定されたＰＣＲプライマー対の一つを用
いたＰＣＲ増幅によってスクリーニングした。次いで、オリゴヌクレオチドプロ
ーブとＰＣＲプライマー対の一つを用いて、ＰＲＯ３５５遺伝子をコードするク
ローンを単離するため、陽性ライブラリーを用いた。ｃＤＮＡライブラリーの構
築のためのＲＮＡを、ヒト胎児腎組織から単離した。
【０３４４】 上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列決定によって、ＰＲＯ３５３の全
長のＤＮＡ配列［ここに、ＵＮＱ３１０（ＤＮＡ４１２３４−１２４２）と称す
る］（配列番号：８５）を得て、ＰＲＯ３５３のタンパク質配列を推定した。
【０３４５】 ＵＮＱ３１０（ＤＮＡ４１２３４−１２４２）の全ヌクレオチド配列を図３４
（配列番号：８５）に示す。クローンＵＮＱ３１０（ＤＮＡ４１２３４−１２４
２）は、ヌクレオチド部位３０５−３０７に見かけ上の翻訳開始部位と、ヌクレ
オチド部位１１４８−１１５０に終止コドンでの終止を有する単一のオープンリ
ーディングフレームを含む（図３４）。推測されるポリペプチドプレカーサーは
、２８１アミノ酸長である（図３５）。ＰＲＯ３５３によってコードされるアミ
ノ酸配列の重要な領域には、アミノ酸１−２６に相当する単一ペプチド、アミノ
酸部位２７に成熟タンパクの開始、アミノ酸９３−９８に相当する潜在的なＮ−
グリコシル化部位、および、アミノ酸９９−２８１に相当する、３０ｋｄの脂肪
細胞補体−関連タンパク質前駆体と相同性を有する領域を含む。クローンＵＮＱ
３１０（ＤＮＡ４１２３４−１２４２）は、ＡＴＣＣに寄託しており、ＡＴＣＣ
寄託番号ＡＴＣＣ２０９６１８が付与されている。
【０３４６】 全長ＰＲＯ３５３ポリペプチドのアミノ酸配列の分析により、それらの一部が
、ヒトおよび齧歯動物の補体タンパク質と有意な相同性を有することが示され、
それによって、ＰＲＯ３５５が、新規な補体タンパク質であることが示唆されて
いる。
【０３４７】 実施例１７： ヒトＰＲＯ３６１をコードするｃＤＮＡクローンの単離 コンセンサスＤＮＡ配列を、上記実施例１に記載されたように、ｐｈｒａｐを
用い、他のＥＳＴ配列に対応してまとめた。このコンセンサス配列を、ここに、
ＤＮＡ４０６５４と称する。ＤＮＡ４０６５４コンセンサス配列に基づいて、オ
リゴヌクレオチドを、１）ＰＣＲによって、興味のある配列を含むｃＤＮＡライ
ブラリーを同定するため、および２）ＰＲＯ３６１の全長をコードする配列のク
ローンを単離するためのプローブとして使用するため、合成した。
【０３４８】 前進と逆進のＰＣＲプライマーを以下のように合成した： 前進ＰＣＲプライマー（．ｆ１） ５’−ＡＧＧＧＡＧＧＡＴＴＡＴＣＣＴＴＧ
ＡＣＣＴＴＴＧＡＡＧＡＣＣ−３’（配列番号：９２） 前進ＰＣＲプライマー（．ｆ２） ５’−ＧＡＡＧＣＡＡＧＴＧＣＣＣＡＧＣＴ
Ｃ−３’（配列番号：９３） 前進ＰＣＲプライマー（．ｆ３） ５’−ＣＧＧＧＴＣＣＣＴＧＣＴＣＴＴＴＧ
Ｇ−３’（配列番号：９４） 逆進ＰＣＲプライマー（．ｒ１） ５’−ＣＡＣＣＧＴＡＧＣＴＧＧＧＡＧＣＧ
ＣＡＣＴＣＡＣ−３’（配列番号：９５） 逆進ＰＣＲプライマー（．ｒ２） ５’−ＡＧＴＧＴＡＡＧＴＣＡＡＧＣＴＣＣ
Ｃ−３’（配列番号：９６） さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを、以下のヌ
クレオチド配列を有するコンセンサスＤＮＡ４０６５４配列から構築した。 ハイブリダイゼーションプローブ ５’−ＧＣＴＴＣＣＴＧＡＣＡＣＴＡＡＧＧＣＴＧＴＣＴＧＣＴＡＧＴＣＡＧＡ
ＡＴＴＧＣＣＴＣＡＡＡＡＡＧＡＧ−３’（配列番号：９７）
【０３４９】 全長のクローンの供給源としての複数個のライブラリーをスクリーニングする
ために、ライブラリーからＤＮＡを、上記同定されたＰＣＲプライマー対の一つ
を用いたＰＣＲ増幅によってスクリーニングした。次いで、オリゴヌクレオチド
プローブを用い、ＰＲＯ３６１遺伝子をコードするクローンを単離するため、陽
性ライブラリーを用いた。ｃＤＮＡライブラリーの構築のためのＲＮＡを、ヒト
胎児腎組織から単離した。
【０３５０】 上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列決定によって、ＰＲＯ３５３の全
長のＤＮＡ配列［ここに、ＵＮＱ３１６（ＤＮＡ４５１４０−１２５０）と称す
る］（配列番号：９０）を得て、ＰＲＯ３５３のタンパク質配列を推定した。
【０３５１】 ＵＮＱ３１６（ＤＮＡ４５４１０−１２５０）の全ヌクレオチド配列を図３６
（配列番号：９０）に示す。クローンＵＮＱ３１６（ＤＮＡ４５４１０−１２５
０）は、ヌクレオチド部位２２６−２２８に見かけ上の翻訳開始部位と、ヌクレ
オチド部位１５１９−１５２１に終止コドンでの終止を有する単一のオープンリ
ーディングフレームを含む（図３６）。推測されるポリペプチドプレカーサーは
、４３１アミノ酸長である（図３７）。図３７に示されている全長のＰＲＯ３６
１タンパク質は、分子量約４６８１０ダルトン、ｐＩ約６．４５であると推定さ
れる。さらに、トランスメンブレンドメイン（アミノ酸３８０−４０９）とアル
ギナーゼファミリーのタンパク質に典型的な配列（アミノ酸３−１４と３９−５
７）を含む興味のある領域を、図３７に示す。クローンＵＮＱ３１６（ＤＮＡ４
５４１０−１２５０）は、ＡＴＣＣに寄託しており、ＡＴＣＣ寄託番号ＡＴＣＣ
２０９６２１が付与されている。
【０３５２】 全長ＰＲＯ３６１ポリペプチドのアミノ酸配列の分析により、それの一部が、
ムチンおよび／もしくはキチナーゼタンパク質と有意な相同性を有することが示
され、それによって、ＰＲＯ３５５が、新規なムチンおよび／もしくはキチナー
ゼタンパク質であることが示唆されている。
【０３５３】 実施例１８： ヒトＰＲＯ３６５をコードするｃＤＮＡクローンの単離 コンセンサスＤＮＡ配列を、上記実施例１に記載したように、ｐｈｒａｐを用
い、他のＥＳＴ配列に対応してまとめた。このコンセンサス配列を、ここに、Ｄ
ＮＡ３５６１３と称する。ＤＮＡ３５６１３コンセンサス配列に基づいて、オリ
ゴヌクレオチドを、１）ＰＣＲによって、興味のある配列を含むｃＤＮＡライブ
ラリーを同定するため、および２）ＰＲＯ３６５の全長をコードする配列のクロ
ーンを単離するためのプローブとして使用するため、合成した。
【０３５４】 前進と逆進のＰＣＲプライマーを以下のように合成した： 前進ＰＣＲプライマー（．ｆ１−３５６１３） ５’−ＡＡＴＧＴＧＡＣＣＡＣ
ＴＧＧＡＣＴＣＣＣ−３’（配列番号：１００） 前進ＰＣＲプライマー（．ｆ２−３５６１３） ５’−ＡＧＧＣＴＴＧＧＡＡＣ
ＴＣＣＣＴＴＣ−３’（配列番号：１０１） 逆進ＰＣＲプライマー（．ｒ１−３５６１３） ５’−ＡＡＧＡＴＴＣＴＴＧＡ
ＧＣＧＡＴＴＣＣＡＧＣＴＧ−３’（配列番号：１０２） さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを、以下のヌ
クレオチド配列を有するコンセンサスＤＮＡ３５６１３配列から構築した。 ハイブリダイゼーションプローブ ５’−ＡＡＴＣＣＣＴＧＣＴＣＴＴＣＡＴＧＧＴＧＡＣＣＴＡＴＧＡＣＧＡＣＧ
ＧＡＡＧＣＡＣＡＡＧＡＣＴＧ−３’（配列番号：１０３）
【０３５５】 全長のクローンの供給源としての複数個のライブラリーをスクリーニングする
ため、ライブラリーからＤＮＡを、上記同定したＰＣＲプライマー対の一つを用
いたＰＣＲ増幅によってスクリーニングした。次いで、オリゴヌクレオチドプロ
ーブを用いて、ＰＲＯ３６５遺伝子をコードするクローンを単離するために、陽
性ライブラリーを用いた。ｃＤＮＡライブラリーの構築のためのＲＮＡを、ヒト
胎児腎組織から単離した。
【０３５６】 上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列決定によって、ＰＲＯ３６５の全
長のＤＮＡ配列［ここに、ＵＮＱ３２０（ＤＮＡ４６７７７−１２５３）と称す
る］（配列番号：９８）を得て、ＰＲＯ３６５のタンパク質配列を推定した。
【０３５７】 ＵＮＱ３２０（ＤＮＡ４６７７７−１２５３）の全ヌクレオチド配列を図３８
（配列番号：９８）に示す。クローンＵＮＱ３２０（ＤＮＡ４６７７７−１２５
３）は、ヌクレオチド部位１５−１７に見かけ上の翻訳開始部位を有し、ヌクレ
オチド部位７２０−７２２に終止コドンでの終止を有する単一のオープンリーデ
ィングフレームを含む（図３８）。推測されるポリペプチドプレカーサーは、２
３５アミノ酸長である（図３９）。クローンＵＮＱ３２０（ＤＮＡ４６７７７−
１２５３）によってコードされるポリペプチド配列の重要な領域が、同定され、
図３９に示す以下のものを含む：アミノ酸１−２０に相当する単一ペプチド、ア
ミノ酸２１に相当する成熟タンパクの開始、多数の潜在的なＮ−グリコシル化部
位。クローンＵＮＱ３２０（ＤＮＡ４６７７７−１２５３）は、ＡＴＣＣに寄託
しており、ＡＴＣＣ寄託番号ＡＴＣＣ２０９６１９が付与されている。
【０３５８】 全長ＰＲＯ３６５ポリペプチドのアミノ酸配列の分析により、それの一部が、
ヒト２−１９タンパク質と有意な相同性を有することが示され、それによって、
ＰＲＯ３６５が、新規なヒト２−１９タンパク相同体であることが示唆されてい
る。
【０３５９】 実施例１９：ＰＲＯポリペプチドをコードする核酸のハイブリダイゼーション
プローブとしての使用 以下の方法は、ハイブリダイゼーションプローブとして、ＰＲＯポリペプチド
をコードする核酸配列の使用について記載する。 ここに開示された興味のあるＰＲＯポリペプチドのコード化配列を含むＤＮＡ
を、ヒト組織ｃＤＮＡライブラリーもしくはヒト組織染色体ライブラリーにおい
て、相同ＤＮＡ（例えば、ＰＲＯポリペプチドの天然の変種をコードするものな
ど）をスクリーニングするためのプローブとして、もしくはプローブを調製する
ための塩基として用いることができる。
【０３６０】 どちらかのライブラリーＤＮＡを含むフィルターのハイブリダイゼーションお
よび洗浄は、以下の高ストリンジェント条件下で行う。放射性同位元素標識化Ｐ
ＲＯポリペプチドをコードする核酸由来のプローブのフィルターへのハイブリダ
イゼーションを、５０％ホルムアミド溶液、５ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、０．
１％ピロリン酸ナトリウム、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８、２ｘデン
ハート溶液、および１０％デキストラン硫酸中、４２℃で２０時間行う。フィル
ターの洗浄は、０．１ｘＳＳＣと０．１％ＳＤＳの水溶液中、４２℃で行う。
【０３６１】 次いで、全長の天然ＰＲＯポリペプチド配列をコードするＤＮＡと同一の所望
の配列を有するＤＮＡを、当該分野において公知の標準的な方法を用いて同定す
ることができる。
【０３６２】 実施例２０： 大腸菌におけるＰＲＯポリペプチドの発現 本実施例では、大腸菌における組み換え発現による所望のＰＲＯポリペプチド
のグリコシル化されていない型の調製について説明する。
【０３６３】 所望のＰＲＯポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を、最初に、選択したＰＣ
Ｒプライマーを用いて増幅する。該プライマーは、選択された発現ベクター上の
制限酵素部位に相当する制限酵素部位を含まなければならない。様々な発現ベク
ターが用いられ得る。好適なベクターの例は、アンピシリンおよびテトラサイク
リン耐性遺伝子を含むｐＢＲ３２２［大腸菌由来；Ｂｏｌｉｖａｒら、Ｇｅｎｅ
、２：９５（１９９７）参照］である。ベクターは、制限酵素で消化し、脱リン
酸化する。次いで、ＰＣＲで増幅した配列を、ベクター内に結紮させる。ベクタ
ーは、好ましくは、抗生物質耐性遺伝子、ｔｒｐプロモーター、ポリｈｉｓリー
ダー（最初の６ＳＴＩＩコドン、ポリｈｉｓ配列およびエンテロキナーゼ切断部
位を含む）、特異的ＰＲＯポリペプチドコード化領域、ラムダ転写終結因子、ａ
ｒｇＵ遺伝子をコードする配列を含む。
【０３６４】 次いで、結紮混合物を、上記Ｓａｍｂｒｏｏｋらに記載された方法を用いて、
選択された大腸菌株を形質転換するために用いた。形質転換体は、ＬＢプレート
上での増殖能によって同定し、次いで、抗生物質耐性コロニーを選択する。プラ
スミドＤＮＡを単離し、制限酵素分析およびＤＮＡ配列決定によって確認するこ
とができる。
【０３６５】 選択したクローンを、抗生物質を補充したＬＢ培地などの液体培養培地中で一
晩培養することができる。続いて、一晩培養物を、大規模培養に播種するために
用いる。次いで、発現プロモータが始動する所望の光学密度まで、細胞を培養す
る。
【０３６６】 さらに数時間培養後、細胞を遠心分離によって回収することができる。遠心分
離によって得られた細胞ペレットを、当該分野において公知の様々な試薬を用い
て可溶化し、次いで、可溶化ＰＲＯポリペプチドを、該タンパク質との強固な結
合を許容する条件下で金属錯体カラムを用い、精製することができる。
【０３６７】 ＰＲＯ２４１は、以下の操作により、ポリ−Ｈｉｓ標識化形態で、大腸菌に発
現させることができた。ＰＲＯ２４１をコードするＤＮＡは、最初に、選択した
ＰＣＲプライマーを用いて増幅した。該プライマーは、選択された発現ベクター
上の制限酵素部位に相当する制限酵素や、効果的かつ確かな翻訳の開始、金属錯
体カラム上での速やかな精製、およびエンテロキナーゼのタンパク分解除去を提
供するその他の有用な配列を含む。ＰＣＲ増幅、ポリ−Ｈｉｓ標識化配列を、次
いで、発現ベクターに結紮し、株５２（Ｗ３１１０ｆｕｈＡ（ｔｏｎＡ） ｌｏ
ｎ ｇａｌＥ ｒｐｏＨｉｓ（ｈｔｐＲｔｓ） ｃＩｐＰ（ｌａｃＩｑ）に基づ
く大腸菌宿主を形質転換させるために用いた。最初に、形質転換体を、５０ｍｇ
／ｍｌカルベニシリンを含むＬＢ培地中、３０℃で、Ｏ．Ｄ．６００が３−５に
なるまで、振とう培養した。次いで、培養物を、ＣＲＡＰ培地［１１０ｍＭ Ｍ
ＰＯＳ、ｐＨ７．３、０．５５％（ｗ／ｖ）グルコースおよび７ｍＭ ＭｇＳＯ 4 と同様に、３．５７ｇ （ＮＨ4）2ＳＯ4、０．７１ｇクエン酸ナトリウム・２
水和物、１．０７ｇＫＣｌ、５．３６ｇ Ｄｉｆｃｏ酵母エキス、５．３６ｇ
Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ ｈｙｃａｓｅ ＳＦを５００ｍＬ水に混合することによっ
て調製した］中、５０−１００倍に希釈し、おおよそ２０−３０時間、３０℃で
振とう培養した。試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって発現を確かめるために
除去し、大量の培養物を遠心分離して細胞ペレットとした。細胞ペレットは、精
製および再生まで凍結させた。
【０３６８】 ０．５から１Ｌ培養物から得られた大腸菌ペースト（６−１０ｇペレト）を、
７Ｍグアニジン、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８緩衝液中、１０容量（ｗ／ｖ）に
懸濁させた。固形の亜硫酸ナトリウム塩と液体の四チオン酸塩を、最終濃度が各
々０．１Ｍおよび０．０２Ｍとなるまで添加し、溶液を４℃で一晩攪拌させた。
このステップにより、全システイン残基が亜硫酸化により保護された変性タンパ
ク質となる。溶液を、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｉｆｕｇｅで３０分
間、４００００回転で遠心分離した。上清を、金属錯体カラム緩衝液（６Ｍグア
ニジン、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４）の３−５容量で希釈し、０．２２ミ
クロンフィルターに濾過して透明化した。垂下する透明化した抽出物を、金属錯
体カラム緩衝液で平衡化した５ｍｌ Ｑｉａｇｅｎ Ｎｉ−ＮＴＡ金属錯体カラ
ム上に、負荷した。カラムを、５０ｍＭイミダゾール（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，
Ｕｔｒｏｌ ｇｒａｄｅ）、ｐＨ７．４を含む付加用緩衝液で洗浄した。タン
パク質を、２５０ｍＭイミダゾールを含む緩衝液で溶出した。所望のタンパク質
を含む画分を採取し、４℃で保存した。タンパク濃度は、アミノ酸配列に基づい
て算出した吸光係数を用い、２８０ｎｍにおける吸光度によって評価した。
【０３６９】 タンパク質は、新鮮に調製した再生緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．６
、０．３ＭＮａＣｌ、２．５Ｍ尿素、５ｍＭシステイン、２０ｍＭグリシンおよ
び１ｍＭＥＤＴＡからなる）中、試料をゆっくりと希釈させることにより、再生
させた。再生容量は、最終タンパク質濃度が、５０から１００マイクログラム／
ｍｌの間となるように選択した。再生溶液は、緩やかに、４℃で１２−３６時間
攪拌した。ＴＦＡを最終濃度０．４％（ｐＨがおおよそ３）となるまで添加する
ことによって、再生反応を終了させた。タンパク質をさらに精製する前に、溶液
を０．２２ミクロンフィルターで濾過し、アセトニトリルが２−１０％の最終濃
度となるように添加した。再生したタンパク質を、０．１％ＴＦＡの泳動用緩衝
液を用いたＰｏｒｏｓ Ｒ１／Ｈ逆相カラム上、約１０から８０％までのアセト
ニトリル濃度勾配で、クロマトグラフィーにかけた。Ａ２８０吸光を有する分画
溶液を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分析し、再生相同タンパク質を含む分
画を採取した。一般的に、適切に再生した大部分のタンパク質は、最も凝縮して
、逆相樹脂との相互作用から疎水性内部がシールされているため、アセトニトリ
ルの最低濃度で溶出される。凝集している種は、たいてい、高いアセトニトリル
濃度で溶出される。逆相の過程で、所望の型からミスフォールディングされた型
を排除することに加えて、試料からエンドトキシンをも除去する。
【０３７０】 所望の折畳されたＰＲＯ２４１タンパク質を含む分画を採取し、アセトニトリ
ルを、溶液に導かれる緩やかな窒素の流れを用いて除去する。透析によって、も
しくは、フォーミュレーション緩衝液で平衡化したＧ２５Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ（
Ｐｈａｒｍａｃｉａ）樹脂を用いたゲル濾過によって、０．１４Ｍ塩化ナトリウ
ムと、４％マンニトールを含む２０ｍＭＨｅｐｅｓ、ｐＨ６．８中、タンパク質
を形成し、滅菌濾過した。
【０３７１】 実施例２１： 哺乳動物細胞におけるＰＲＯポリペプチドの発現 本実施例では、哺乳動物細胞での組み換え発現による所望のＰＲＯポリペプチ
ドのグリコシル化された型の調製について説明する。
【０３７２】 ベクター、ｐＲＫ５（１９８９年３月１５日に出版されたＥＰ３０７２４７参
照）が、発現ベクターとして用いられる。任意で、ＰＲＯポリペプチドをコード
するＤＮＡを、上記Ｓａｍｂｒｏｏｋらに記載された結紮方法を用い、ＰＲＯポ
リペプチドＤＮＡの挿入を許容する選択された制限酵素でｐＲＫ５に結紮する。
得られたベクターを、ｐＲＫ５−ＰＲＯポリペプチドと称する。
【０３７３】 一つの実施態様において、選択された宿主細胞は、２９３細胞である。ヒト２
９３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １５７３）は、組織培養プレートで、胎児ウシ血
清と、任意で栄養成分および／もしくは抗生物質で補充したＤＭＥＭなどの培地
中で、集密になるまで増殖させる。約１０μｇのｐＲＫ５−ＰＲＯポリペプチド
ＤＮＡを、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子をコードするＤＮＡ［Ｔｈｉｍｍａｐｐａｙａら
、Ｃｅｌｌ、３１：５４３（１９８２）］１μｇと混合し、５００μｌの、０．
１ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１ｍＭＥＤＴＡ、０．２２７ＭＣａＣｌ2に溶解 する。この混合物に、５００μのｌ５０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３５）、２８
０ｍＭＮａＣｌ、１．５ｍＭＮａＰＯ4を添加、滴下し、沈殿物を２５℃、１０ 分間かけて形成させる。この沈殿物を懸濁し、２９３細胞に添加し、３７℃で約
４時間静置する。培養培地を、吸引除去し、ＰＢＳ中２０％グリセリン２ｍｌを
３０秒間添加する。次いで、２９３細胞を無血清培地で洗浄し、新鮮な培地を添
加し、細胞を約５日間インキュベーションする。
【０３７４】 トランスフェクション後、おおよそ２４時間で、培養培地を除去し、培養培地
（のみ）もしくは２００μＣｉ／ｍｌ35Ｓ−システインおよび２００μＣｉ／ｍ
ｌ35Ｓ−メチオニンを含む培養培地に置換する。１２時間のインキュベーション
後、馴化培地を回収し、スピンフィルター上で濃縮し、１５％ＳＤＳゲルにかけ
る。工程にかけたゲルを、乾燥させ、ＰＲＯポリペプチドの存在が確認できるの
に必要な時間だけ、フィルムに露光する。形質転換細胞を含む培養物を、さらに
インキュベーション（無血清培地中）し、その培地を選択されたバイオアッセイ
で試験した。
【０３７５】 代替技術において、ＰＲＯポリペプチドを、Ｓｏｍｐａｒｙｒａｃら、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１２：７５７５（１９８１）によって記載
されたようにデキストラン硫酸法を用い、一過的に２９３細胞に導入させる。２
９３細胞は、スピナーフラスコ中で最大密度まで培養し、７００μｇのｐＲＫ５
−ＰＲＯポリペプチドＤＮＡを添加する。最初に細胞を、遠心分離によって、ス
ピナーフラスコから濃縮し、ＰＢＳで洗浄する。ＤＮＡ−デキストラン沈殿物を
、細胞ペレット上で４時間インキュベーションする。細胞を、２０％グリセリン
で９０秒間処理し、組織培養培地で洗浄し、組織培養培地、５μｇ／ｍｌウシイ
ンスリン、および０．１μｇ／ｍｌウシトランスフェリンを含むスピナーフラス
コに再度導入する。約４日後、細胞と破片を除去するために、馴化培地を遠心分
離し、濾過する。次いで、発現ＰＲＯポリペプチドを含む試料を、透析および／
もしくはカラムクロマトグラフィーなどのあらゆる選択される方法によって、濃
縮、および精製する。
【０３７６】 他の実施態様において、ＰＲＯポリペプチドは、ＣＨＯ細胞において発現させ
ることができる。ＣａＰＯ4もしくはＤＥＡＥ−デキストランなどの公知の試薬 を用いて、ｐＲＫ５−ＰＲＯポリペプチドは、ＣＨＯ細胞にトランスフェクショ
ンすることができる。上記のように、細胞培養物をインキュベーションし、培地
を培養培地（のみ）もしくは、35Ｓ−メチオニンなどの放射性ラベルを含む培地
と置換する。ＰＲＯポリペプチドの存在を決定した後、培養培地を無血清培地に
置換する。好ましくは、培養物は、約６日間インキュベーションし、次いで、馴
化培地を回収する。次いで、発現ＰＲＯポリペプチドを含む培地は、選択される
いずれかの方法によって濃縮、精製することができる。
【０３７７】 また、エピトープ標識化ＰＲＯポリペプチドは、宿主ＣＨＯ細胞に発現させる
ことができる。ＰＲＯポリペプチドは、ｐＲＫ５ベクターからサブクローニング
する。サブクローン挿入物は、バキュロウィルス発現ベクター中、ポリ−ｈｉｓ
標識などの選択されたエピトープ標識とフレーム内で融合するために、ＰＣＲを
行うことができる。次いで、ポリ−ｈｉｓ標識化ＰＲＯポリペプチド挿入物は、
安定株の選択のためのＤＨＦＲなどの選択マーカを含むＳＶ４０駆動ベクター内
にサブクローニングすることができる。最後に、ＣＨＯ細胞は、（上記のように
）ＳＶ４０駆動ベクターでトランスフェクションさせることができる。発現を確
認するために、上記のように標識することができる。次いで、発現したポリ−Ｈ
ｉｓ標識化ＰＲＯポリペプチドを含む培養培地を、Ｎｉ2+−錯体アフィニティー
クロマトグラフィーなど、選択されるあらゆる方法によって、濃縮、精製するこ
とができる。
【０３７８】 ＰＲＯ２４１を、一過的および安定発現方法の両方によって、ＣＨＯ細胞にう
まく発現させることができた。さらに、ＰＲＯ２４３、ＰＲＯ３２３およびＰＲ
Ｏ２３３を、ＣＨＯ細胞に一過的に発現させることができた。
【０３７９】 ＣＨＯ細胞における安定発現は、以下の方法を用いて行った。タンパク質は、
各タンパク質の可溶型（例えば、細胞外ドメイン）のコード配列が、ヒンジ、Ｃ
Ｈ２およびＣＨ２ドメインを含むＩｇＧ１定常領域配列に融合させたＩｇＧ構造
物（免疫接合体）、および／もしくはポリ−ｈｉｓ標識化形態となるように発現
させた。
【０３８０】 ＰＣＲの増幅に次いで、各ＤＮＡを、Ａｕｓｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒ
ｏｔｏｃｏｌｓ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｕｎｉｔ３．
１６， Ｊｏｈｎ ＷｉｌｅｙとＳｏｎｓ（１９９７）において記載されている
ような標準的な技術を用いて、ＣＨＯ発現ベクターにサブクローニングした。ｃ
ＤＮＡの便利な往復を許容するように、興味のあるＤＮＡの５’および３’と適
合する制限酵素部位５’を有するように、ＣＨＯ発現ベクターを構築する。ＣＨ
Ｏ細胞における発現に用いたベクターは、例えば、Ｌｕｃａｓら、Ｎｕｃｌ．
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４：９（１７７４−１７７９（１９９６）に記載された
ものであり、興味のあるｃＤＮＡとジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）の発現を
駆動するためにＳＶ４０初期プロモーター／エンハンサーを用いる。ＤＨＦＲの
発現により、トランスフェクションに続いて、プラスミドの安定維持株を選定す
ることができる。
【０３８１】 所望のプラスミドＤＮＡ１２μｇは、商業的に利用できるトランスフェクショ
ン試薬Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（Ｑｕｉａｇｅｎ）、ＤｏｓｐｅｒもしくはＦｕｇｅ
ｎｅ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用い、約１０００万個のＣ
ＨＯ細胞内に導入させた。細胞を培養し、上記Ｌｕｃａｓらにおいて記載した。
おおよそ３ｘ１０7個の細胞を、さらなる増殖と下記の産生のために、アンプル 中で凍結させる。
【０３８２】 プラスミドＤＮＡを含むアンプルを、水槽中に置いて融解させ、渦動攪拌で混
合した。内容物を、１０ｍＬの培地を含む遠心分離用チューブにピペットで移し
、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を吸引除去し、細胞を１０ｍＬの
選択培地（０．２μｍフィルターで濾過した５％胎児ウシ血清を含むＰＳ２０を
０．２μｍフィルターで濾過したもの）に再度懸濁した。次いで、細胞を、９０
ｍＬ選択培地を含む１００ｍＬスピナーに分注した。１−２日後、細胞を、１５
０ｍＬ選択増殖培地で満たした２５０ｍＬスピナーに移し、３７℃でインキュベ
ーションした。さらに２−３日後、２５０ｍＬ、５００ｍＬ、および２０００ｍ
Ｌスピナーに、３ｘ１０5細胞／ｍＬを播種した。細胞培地を、遠心分離によっ て新鮮な培地に交換し、産生用培地に再度懸濁した。好適なあらゆるＣＨＯ培地
を用いることができるが、１９９２年６月１６日に発行された米国特許第５１２
２４６９号に記載されている産生培地を、実際には用いた。３Ｌ産生スピナーに
、０．２ｘ１０6細胞／ｍＬで播種した。０日目、細胞数、ｐＨを測定した。１ 日目、スピナーから標本を取り、濾過空気の散布を開始した。２日目、スピナー
から標本を取り、温度を３３℃に上げ、３０ｍＬの５００ｇ／Ｌグルコースと、
０．６ｍＬの１０％消泡剤（例えば、３５％ポリジメチルシロキサン乳剤 、Ｄ
ｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ，３６５ 医薬用グレードエマルジョン）を加えた。産生
時にｐＨを必要な限り、約７．２に保った。１０日目後、もしくは、生存率が７
０％以下に落ち込む前に、細胞培養物を、遠心分離と０．２２μｍフィルター濾
過により、回収した。濾過物は、４℃で保存、もしくは直ちに精製用のカラムに
かけた。
【０３８３】 ポリ−ｈｉｓ標識化構築物用に、タンパク質を、Ｎｉ−ＮＴＡカラム（Ｑｉａ
ｇｅ）を用いて精製した。精製前に、イミダゾールを、馴化培地に５ｍＭ濃度と
なるように添加した。馴化培地を、０．３ＭＮａＣｌと５ｍＭイミダゾールを含
む２０ｍＭＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、緩衝液で平衡化させた６ｍｌＮｉ−ＮＴＡ
カラムに、流速４−５ｍｌ／ｍｉｎ、４℃でポンプ注入した。負荷後、カラムを
さらに平衡化用緩衝液で洗浄し、０．２５Ｍイミダゾールを含む平衡化用緩衝液
でタンパク質を溶出した。続けて、高純度に精製したタンパク質を、１０ｍＭＨ
ｅｐｅｓ、０．１４ＭＮａＣｌおよび４％マンニトール、ｐＨ６．８を含む保存
用緩衝液中、２５ｍｌ Ｇ２５ Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で
脱塩し、−８０℃で保存した。
【０３８４】 免疫接合体（Ｆｃ含有）構造物を、以下のように馴化培地から精製した。該馴
化培地を、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．８で平衡化した５ｍｌプ
ロテインＡカラム上にポンプ注入した。注入後、１００ｍＭクエン酸、ｐＨ３．
５での溶出の前に、カラムを平衡化用緩衝液で十分に洗浄した。２７５μｌの１
Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ９中に、１ｍｌ画分を採取して、溶出したタンパク質
を直ちに中和した。続けて、高純度に精製したタンパク質を、ポリ−Ｈｉｓ標識
化タンパク質用に、保存用緩衝液中、上記の様に脱塩した。同一性を、ＳＤＳポ
リアクリルアミドゲルおよびエドマン分解によるＮ末端アミノ酸配列決定によっ
て評価した。
【０３８５】 ＰＲＯ２４１、ＰＲＯ２４３、ＰＲＯ２９９、ＰＲＯ３２３、ＰＲＯ３２７、
ＰＲＯ２３３、ＰＲＯ３４４、ＰＲＯ３４７、ＰＲＯ３５４、ＰＲＯ３５５、Ｐ
ＲＯ３５７、ＰＲＯ３５３、ＰＲＯ３６１、およびＰＲＯ３６５も、また、ＣＯ
Ｓ細胞において、一過的にうまく発現させることができた。
【０３８６】 実施例２２：酵母におけるＰＲＯポリペプチドの発現 以下の方法は、酵母における所望のＰＲＯポリペプチドの組み換え発現につい
て記載したものである。
【０３８７】 最初に、酵母発現ベクターを、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターからＰＲＯ
ポリペプチドの細胞内産生もしくは分泌のために構築する。所望のＰＲＯポリペ
プチド、選択されたシグナルペプチド、およびプロモータをコードするＤＮＡを
、ＰＲＯポリペプチドの細胞内発現を導くために選択したプラスミドの適切な制
限酵素部位に挿入する。分泌の場合には、ＰＲＯポリペプチドをコードするＤＮ
Ａを、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモータ、酵母α因子分泌シグナル／リーダー配
列、および（必要ならば）ＰＲＯポリペプチド発現用リンカー配列をコードする
ＤＮＡと共に、選択したプラスミドにクローニングする。
【０３８８】 次いで、例えば、酵母株ＡＢ１１０のような酵母細胞を、上記発現プラスミド
と共に形質転換し、選択した培養液中で培養することができる。形質転換した酵
母の上清を、１０％トリクロロ酢酸で沈殿させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ク
マシーブルー染色によるゲル染色により分析する。
【０３８９】 続けて、酵母細胞を遠心分離により、培養液から除去し、次いで、選択したカ
ートリッジフィルターを用いて培地を濃縮することにより、組み換えＰＲＯポリ
ペプチドを、単離精製することができる。ＰＲＯポリペプチドを含む濃縮物は、
さらに、選択したカラムクロマトグラフィー樹脂を用いて精製する。
【０３９０】 実施例２３： バキュロウィルス−感染昆虫細胞におけるＰＲＯポリペプチド
の発現 以下の方法は、バキュロウィルス−感染昆虫細胞におけるＰＲＯポリペプチド
の組み換え発現について記載する。
【０３９１】 選択したＰＲＯポリペプチドを、バキュロウィルス発現ベクターに含まれるエ
ピトープ標識の上流に融合させる。そのようなエピトープ標識は、ポリ−ｈｉｓ
標識およびイムノグロブリン標識（例えば、ＩｇＧのＦｃ領域）を含む。ｐＶＬ
１３９３（Ｎｏｖａｇｅｎ）のような商業的に利用できるプラスミドを含み、様
々なプラスミドが用いられる。簡単には、ＰＲＯポリペプチドもしくはＰＲＯポ
リペプチドの所望の部分（例えば、トランスメンブランタンパク質の細胞外ドメ
インをコードする配列など）を、５’および３’領域に相補するプライマーを用
いたＰＣＲによって増幅する。５’プライマーは、両端に（選択された）制限酵
素部位を組み込ませることができる。次いで、生成物を、前記の選択した制限酵
素で消化し、発現ベクター中にサブクローニングする。
【０３９２】 組み換えバキュロウィルスは、リポフェクチン（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬから商業
的に利用できる）を用い、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperd
a）（Ｓｆ９）細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１７１１）に、上記プラスミドとＢａｃ ｕｌｏＧｏｌｄTMウィルスＤＮＡ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を、共−トランスフ
ェクションさせることによって産出される。２８℃で４−５日間インキュベーシ
ョン後、遊離されたウィルスを回収し、さらなる増幅に用いる。ウィルス感染と
タンパク質発現を、Ｏ’Ｒｅｉｌｌｅｙら、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｅｘｐｒ
ｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｏ
ｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９４）によって記載され
たように行う。
【０３９３】 次いで、発現したポリ−ｈｉｓ標識化ＰＲＯポリポペプチドを、例えば、以下
のようにＮｉ2+−錯体アフィニティークロマトグラフィーによって精製すること
ができる。抽出物を、Ｒｕｐｅｒｔら、Ｎａｔｕｒｅ，３６２：１７５−１７９
（１９９３）によって記載されたように、組み換えウィルス感染Ｓｆ９細胞から
調製する。簡単には、Ｓｆ９細胞を洗浄し、音波処理用緩衝液（２５ｍＬ Ｈｅ
ｐｅｓ，ｐＨ７．９；１２．５ｍＭ ＭｇＣｌ2；０．１ｍＭ ＥＤＴＡ；１０ ％グリセリン；０．１％ ＮＰ−４０；０．４Ｍ ＫＣｌ）に懸濁し、氷上で２
０秒間、２回、音波処理する。音波処理物を遠心分離によって透明化し、上清を
ローディング緩衝液（５０ｍＭリン酸塩、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセ
リン、ｐＨ７．８）で５０倍に希釈し、０．４５μｍフィルターで濾過する。Ｎ
ｉ2+−ＮＴＡアガロースカラム（Ｑｉａｇｅｎから商業的に利用できる）を、基
底容量５ｍＬで調製し、２５ｍＬの水で洗浄し、２５ｍＬのローディング緩衝液
で平衡化する。濾過した細胞抽出物を、０．５ｍＬ／分でカロムにかける。ロー
ディング緩衝液でＡ280のベースラインになるまでカラムを洗浄し、そこで分画 の採取を始める。次に、カラムを二次洗浄用緩衝液（５０ｍＭリン酸塩；３００
ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセリン、ｐＨ６．０）で洗浄し、非特異的に結合し
たタンパク質を溶出する。再度Ａ280ベースラインに到達後、カラムを、二次洗 浄用緩衝液中、０から５００ｍＭイミダゾール濃度勾配で展開する。１ｍＬ画分
を採取し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと銀染色、もしくはＮｉ2+−ＮＴＡ−アルカリフォ
スファターゼ複合体（Ｑｉａｇｅｎ）を用いたウェスタンブロットにより分析す
る。溶出したＨｉｓ10−標識化ＰＲＯポリペプチドを含む画分を収集し、ローデ
ィング緩衝液に対して透析する。
【０３９４】 もしくは、ＩｇＧ標識化（もしくはＦｃ標識化）ＰＲＯポリペプチドの精製を
、例えば、プロテインＡもしくはプロテインＧカラムクロマトグラフィーを含む
、公知のクロマトグラフィー技術を用いて行うことができる。
【０３９５】 ＰＲＯ２４１、ＰＲＯ３２７およびＰＲＯ３４４を、バキュロウィスル感染Ｓ
ｆ９昆虫細胞に発現させることができる。実際には、発現を、０．５−２Ｌスケ
ールで実行させたが、それはより大きな（例えば、８Ｌ）調製用に容易にスケー
ルアップすることができる。タンパク質は、細胞外領域が、ヒンジ、ＣＨ２およ
びＣＨ３ドメインを含むＩｇＧ１定常領域配列に融合したＩｇＧ構造物（免疫接
合体）として、および／もしくはポリ−Ｈｉｓ標識化形態として発現した。
【０３９６】 バキュロウィスル感染Ｓｇ９細胞における発現のために、ＰＣＲ増幅に次いで
、各コード化配列をバキュロウイスル発現ベクター（ＩｇＧ融合体にはｐｂ．Ｐ
Ｈ．ＩｇＧ、ポリ−Ｈｉｓ標識化タンパク質にはｐｂ．ＰＨ．Ｈｉｓ．ｃ）にサ
ブクローニングし、リポフェクチン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を用いて、１０５ス
ポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）（Ｓｆ９）細胞（ＡＴＣ Ｃ ＣＲＬ１７１１）に、上記ベクターとＢａｃｕｌｏＧｏｌｄTMウィルスＤＮ
Ａ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を、共−トランスフェクションした。ｐｂ．ＰＨ．
ＩｇＧおよびｐｂ．ＰＨ．Ｈｉｓは、商業的に利用できるバキュロウィルス発現
ベクターｐＶＬ１３９３（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）に、ＨｉｓもしくはＦｃ標識
配列を含むように修飾したポリリンカー領域を有する修飾体である。細胞は、１
０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を補充したＨｉｎｋ’ｓ ＴＮＭ−ＦＨ培地で培
養した。細胞を、２８℃で５日間インキュベーションした。上清を回収し、続け
て、１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を補充したＨｉｎｋ’ｓ ＴＮＭ−ＦＨ培
地中で、おおよそ感染多重度（ＭＯＩ）１０で、Ｓｆ９細胞を感染させることに
より、第１のウィルス増幅のために用いた。細胞を、２８℃で３日間インキュベ
ーションした。上清を回収し、バキュロウィルス発現ベクターにおける構築物の
発現を、ヒスチジン標識化タンパク質に対するＮｉ−ＮＴＡビーズ（ＱＩＡＧＥ
Ｎ）もしくはＩｇＧ標識化タンパク質に対するプロテイン−ＡセファロースＣＬ
−４Ｂビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）２５ｍＬに、上清１ｍＬをバッチ結合し、
次いで、クマシーブルー染色によりタンパク質標準の既知濃度との比較を行うＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって測定した。
【０３９７】 第１のウィルス増幅上清を、ＥＳＦ−９２１培地（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓ
ｙｓｔｅｍｓ ＬＬＣ）中、約ＭＯＩ０．１で培養したＳｆ９細胞のスピナー培
養物（５００ｍＬ）を感染するために用いた。細胞を、２８℃で３日間インキュ
ベーションした。上清を回収し、濾過した。バッチ結合と、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分
析を、必要に応じて、スピナー培養の発現が確認されるまで繰り返した。
【０３９８】 形質転換細胞からの馴化培地（０．５から３Ｌ）を、細胞を除去するための遠
心分離によって回収し、０．２２ミクロンフィルターで濾過した。ポリ−Ｈｉｓ
標識化構築物の場合、タンパク質をＮｉ−ＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を用い
て精製した。精製前に、イミダゾールを馴化培地に濃度５ｍＭとなるように添加
した。馴化培地は、０．３Ｍ ＮａＣｌおよび５ｍＭイミダゾールを含む２０ｍ
Ｍ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４緩衝液で平衡化した６ｍｌ Ｎｉ−ＮＴＡカラムに
、流速４−５ｍｌ／分、４℃でポンプ注入した。注入後、カラムをさらなる平衡
化緩衝液で洗浄し、タンパク質を、０．２５Ｍイミダゾールを含む平衡化緩衝液
で溶出した。続いて、高純度に精製したタンパク質を、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、
０．１４Ｍ ＮａＣｌ、４％マンニトール、ｐＨ６．８を含む保存用緩衝液中、
２５ｍｌ Ｇ２５ Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムで脱塩、
−８０℃で保存した。
【０３９９】 タンパク質の免疫接合体（Ｆｃ含有）構築物を、馴化培地から、以下のように
精製した。馴化培地を、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．８で平衡化
されている５ｍｌプロテインＡカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にポンプ注入した
。注入後、カラムを、１００ｍＭクエン酸、ｐＨ３．５での溶出の前に、平衡化
緩衝液で十分に洗浄した。溶出したタンパク質を、２７５ｍＬの１Ｍ Ｔｒｉｓ
緩衝液、ｐＨ９を含むチューブ中に、１ｍＬ画分を採取することによって、直ち
に中和した。続いて、高純度に精製したタンパク質を、ポリ−Ｈｉｓ標識化タン
パク質用に、保存用緩衝液中、上記のように脱塩した。タンパク質の同一性を、
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル（ＰＥＧ）電気泳動およびエドマン分解によるＮ
末端アミノ酸配列決定によって確認した。
【０４００】 ＰＲＯ２４３、ＰＲＯ３２３、ＰＲＯ３４４およびＰＲＯ３５５は、バキュロ
ウィルス感染Ｈｉ５昆虫細胞に発現させることができる。実際には、発現を０．
５−２Ｌスケールで行ったが、容易に、より大きな（例えば、８Ｌ）調製用にス
ケールアップすることができる。
【０４０１】 バキュロウィルス感染Ｈｉ５昆虫細胞での発現のために、ＰＲＯポリペプチド
をコードするＤＮＡは、例えば、Ｐｆｕ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）などの好適な
システムで増幅させる、もしくはバキュロウィルス発現ベクターに含まれるエピ
トープ標識の上流（５’−）に融合させることができる。そのようなエピトープ
標識は、ポリ−Ｈｉｓ標識およびイムノグロブリン標識（例えば、ＩｇＧのＦｃ
領域のような）を含む。ｐＶＬ１３９３（Ｎｏｖａｇｅｎ）のような商業的に利
用できるプラスミドを含み、様々なプラスミドが用いられる。簡単には、ＰＲＯ
ポリペプチドもしくはＰＲＯポリペプチドの所望の部分（例えば、トランスメン
ブレンタンパク質の細胞外ドメインをコードする配列など）を、５’および３’
領域に相補するプライマーを用いたＰＣＲによって増幅する。５’プライマーは
、両端に（選択された）制限酵素部位を組み込み得る。次いで、生成物を上記選
択した制限酵素で消化し、発現ベクターにサブクローニングする。例えば、ｐＶ
Ｌ１３９３誘導体は、ＮＡＭＥ配列の下流（３’−）に、ヒトＩｇＧのＦｃ領域
（ｐｂ．ＰＨ．ＩｇＧ）もしくは８ヒスチジン標識（ｐｂ．ＰＨ．Ｈｉｓ）を含
む。
【０４０２】 Ｈｉ５細胞は、２７℃で、ＣＯ2とペニシリン／ストレプトマイシン（ｐｅｎ ／ｓｔｒｅｐ）を加えない条件下で、５０％集密まで培養した。各１５０ｍＭプ
レートに、ＰＲＯポリペプチドを含むｐＩＥに基づくベクター３０μｇを、１ｍ
ｌ Ｅｘ−Ｃｅｌｌ培地［培地：Ｅｘ−Ｃｅｌｌ４０１＋１／１００ Ｌ−Ｇｌ
ｕ ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ＃１４４０１−７８Ｐ（注解；この培地は
光感受性である）］を混合し、各チューブで、１００μｌＣｅｌｌ Ｆｅｃｔｉ
ｎ［ＣｅｌｌＦＥＣＴＩＮ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ＃１０３６２−０１０）（混合の
ために渦動撹拌したもの）］を、１ｍｌのＥｘ−Ｃｅｌｌ培地と混合した。２つ
の溶液を、混合し、室温で１５分間インキュベーションした。８ｍｌのＥｘ−Ｃ
ｅｌｌ培地を２ｍｌ ＤＮＡ／ＣｅｌｌＦＥＣＴＩＮ混合物に添加し、これを一
度Ｅｘ−Ｃｅｌｌ培地で洗浄しているＨｉ５細胞に重層した。次いで、プレート
を、暗所で、室温、１時間インキュベーションした。次いで、ＤＮＡ／Ｃｅｌｌ
ＦＥＣＴＩＮ混合物を吸引し、過剰量のＣｅｌｌＦＥＣＴＩＮを除去するために
、細胞を、一度洗浄した。３０ｍｌの新鮮なＥｘ−Ｃｅｌｌ培地を添加し、細胞
を２８℃で３日間インキュベートした。上清を回収し、バキュロウィルス発現ベ
クターにおけるＰＲＯポリペプチドの発現を、ヒスチジン標識化タンパク質に対
するＮｉ−ＮＴＡビーズ（ＱＩＡＧＥＮ）もしくはＩｇＧ標識化タンパク質に対
するプロテインＡ−セファロースＣＬ−４Ｂビーズ２５ｍＬに、上清１ｍＬをバ
ッチ結合し、次いで、クマシーブルー染色によりタンパク質標準の既知濃度との
比較を行うＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって測定した。
【０４０３】 形質転換細胞から馴化培地（０．５から３Ｌ）を、細胞を除去するための遠心
分離によって回収し、０．２２ミクロンフィルターで濾過した。ポリ−Ｈｉｓ標
識化構築物として、ＰＲＯポリペプチドを含むタンパク質を、Ｎｉ−ＮＴＡカラ
ム（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。精製前に、イミダゾールを、濃度５ｍＭ
になるまで、馴化培地に添加した。馴化培地を、０．３Ｍ ＮａＣｌおよび５ｍ
Ｍイミダゾールを含む２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４緩衝液で、平衡化した
６ｍｌ Ｎｉ−ＮＴＡカラムに、流速４−５ｍｌ／分、４℃でポンプ注入した。
注入後、カラムをさらなる平衡化緩衝液で洗浄し、０．２５Ｍイミダゾールを含
む平衡化緩衝液で、タンパク質を溶出した。続いて、高純度に精製したタンパク
質を、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、０．１４Ｍ ＮａＣｌおよび４％マンニトール、
ｐＨ６．８を含む保存用緩衝液中、２５ｍｌ Ｇ２５ Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ）カラムで脱塩し、−８０℃で保存した。
【０４０４】 タンパク質の免疫接合体（Ｆｃ含有）は、馴化培地から、以下のように精製し
た。馴化培地を、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．８で平衡化した５
ｍｌプロテインＡカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上にポンプ注入した。注入後、
カラムを、１００ｍＭクエン酸、ｐＨ３．５で溶出する前に、平衡化緩衝液で十
分に洗浄した。２７５ｍＬの１ＭＴｒｉｓ緩衝液、ｐＨ９を含むチューブ中に、
１ｍＬ画分を採取することによって、溶出タンパク質を直ちに中和した。続けて
、高純度に精製したタンパク質を、上記のようにポリ−Ｈｉｓ標識化タンパク質
用に、保存用緩衝液中で脱塩した。タンパク質の同一性を、ＳＤＳポリアクリル
アミドゲル（ＰＥＧ）およびエドマン分解によるＮ末端アミノ酸配列決定、およ
び所望もしくは必要に応じてその他の分析方法によって確認した。
【０４０５】 実施例２４：ＰＲＯポリペプチドに結合する抗体の調製 この実施例では、ＰＲＯポリペプチドと特異的に結合し得るモノクローナル抗
体の調製について説明する。
【０４０６】 モノクローナル抗体の作製技術は、当該分野において公知であり、例えば、上
記Ｇｏｄｉｎｇ，に記載されている。用いられる免疫原は、精製されたＰＲＯポ
リペプチド、ＰＲＯポリペプチドを含む融合タンパク質、および細胞表面に組み
換えＰＲＯポリペプチドを発現している細胞を含む。免疫原の選択は、過度な実
験を行わずに、当該分野の技術者がなし得るものである。
【０４０７】 ＰＲＯポリペプチド免疫原をフロイント完全アジュバントで乳化し、１−１０
０μｇ量を、皮下もしくは腹腔内注射して、Ｂａｌｂ／ｃなどのマウスを免疫化
した。もしくは、免疫原は、ＭＰＩ−ＴＤＭアジュバント（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕ
ｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）に乳化し
、動物の後足に注入した。次いで、１０から１２日後に、所定のアジュバントに
乳化させた追加免疫原を、免疫化されたマウスに追加注射した。それから数週間
後、再び、マウスに追加免疫原を注射した。抗ＰＲＯポリペプチド抗体を検出す
るためのＥＬＩＳＡアッセイ用に、血清試料を、定期的にマウスから、後眼窩採
血によって採取することができる。
【０４０８】 適切な抗体力価が検出された後、抗体に「陽性」の動物に、ＰＲＯポリペプチ
ドの最後の静脈注射を行うことができる。３から４日後、このマウスを屠殺して
、脾臓細胞を採取した。次いで、脾臓細胞を、例えば、ＡＴＣＣ、Ｎｏ．ＣＲＬ
１５９７から利用できるＰ３Ｘ６３ＡｇＵ．１などの選択された齧歯類の骨髄腫
細胞株に、（３５％ポリエチレングリコールを用いて）融合した。ハイブリドー
マ細胞を融合により産出し、次いで、非融合細胞、骨髄腫ハイブリッド、脾臓細
胞ハイブリッドの増殖を阻害するために、ＨＡＴ（ヒポキサチン、アミノプテリ
ン、チミジン）培地を含む９６ウェル組織培養プレートに平板培養させることが
できる。
【０４０９】 ハイブリドーマ細胞は、ＰＲＯポリペプチドに対する反応性についてＥＬＩＳ
Ａでスクリーニングした。ＰＲＯポリペプチドに対する所望のモノクローナル抗
体を分泌する「陽性」ハイブリドーマ細胞の確定は、当該分野における技術範囲
内である。
【０４１０】 陽性ハイブリドーマ細胞は、抗ＰＲＯポリペプチドモノクローナル抗体を含む
腹水を産生させるために、同系のＢａｌｂ／ｃマウスの腹腔内に注入させること
ができる。あるいは、このハイブリドーマ細胞は、組織培養フラスコもしくはロ
ーラーボトルで生育させることもできる。腹水中に産生されたモノクローナル抗
体の精製は、硫安沈殿、次いでゲル濾過クロマトグラフィーを用いて行うことが
できる。あるいは、プロテインＡもしくはプロテインＧに対する抗体の結合に基
づいたアフィニティークロマトグラフィーを用いることができる。
【０４１１】 実施例２５：キメラＰＲＯポリペプチド ＰＲＯポリペプチドを、タンパク精製を容易にするために付加された１以上の
付加ポリペプチドドメインを有するキメラタンパク質として発現させることがで
きる。そのような精製を容易にするドメインは、限定されないが、固相化された
金属上での精製ができるヒスチジン−トリプトファンモジュール、固相化された
イムノグロブリン上での精製ができるプロテインＡドメイン、およびＦＬＡＧＳ TM 伸長／アフィニティー精製システム（Ｉｍｍｕｎｅｘ Ｃｏｒｐ．，Ｓｅａｔ
ｔｌｅ Ｗａｓｈ）において利用されるドメインなどの金属錯体ペプチドを含む
。精製用ドメインとＰＲＯポリペプチド配列との間に、Ｆａｃｔｏｒ ＸＡもし
くはエンテロキナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などの切断できるリンカー配列
を含むことは、ＰＲＯポリペプチドをコードするＤＮＡの発現を促進するのに有
用である。
【０４１２】 実施例２６： 特異抗体を用いたＰＲＯポリペプチドの精製 天然もしくはＰＲＯポリペプチドを、当該分野のタンパク精製において標準的
な様々な技術により精製することができる。例えば、前駆ＰＲＯポリペプチド、
成熟ＰＲＯポリペプチドもしくは前ＰＲＯポリペプチドを、興味あるＰＲＯポリ
ペプチドに対する特異抗体を用いたイムノアフィニティークロマトグラフィーに
よって精製する。一般に、イムノアフィニティーカラムは、抗ＰＲＯポリペプチ
ド抗体の活性クロマトグラフィー樹脂との共有結合によって構築される。
【０４１３】 ポリクローナルイムノグロブリンは、免疫された血清から、硫安沈殿もしくは
固相化プロテインＡ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ，Ｐｉｓｃａｔｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）における精製のどちらかによって調製した
。同様に、モノクローナル抗体は、マウス腹水液から、硫安沈殿もしくは固相化
プロテインＡ上でのクロマトグラフィーによって調製した。部分的に精製された
イムノグロブリンは、ＣｎＢｒ−活性化ＳＥＰＨＡＲＯＳＥTM（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）などのクロマトグラフィー樹脂に
共有結合した。抗体を樹脂に結合させて樹脂を保護し、修飾した樹脂を製造元の
指示書に従って洗浄した。
【０４１４】 そのようなイムノアフィニティーカラムは、ＰＲＯポリペプチドを含む細胞か
ら画分を可溶型で調製することによって、ＰＲＯポリペプチドの精製時に使用し
得る。この調製物は、全細胞もしくは界面活性剤の添加によって遠心分離して得
られた細胞画分の可溶化、もしくは当該分野において公知の他の方法によって得
ることができる。もしくは、シグナル配列を含む可溶性ＰＲＯポリペプチドを、
細胞が生育している培地中に、有用量で分泌させることができる。
【０４１５】 可溶性ＰＲＯポリペプチド含有調製物は、イムノアフィニティーカラムに通し
、カラムは、ＰＲＯポリペプチドの好ましい吸光度となるような条件下（例えば
、界面活性剤含有高イオン強度緩衝液）で洗浄した。次いで、カラムは、抗体／
ＰＲＯポリペプチド結合体が分離する条件下（例えば、約ｐＨ２−３などの低い
ｐＨ緩衝液、または尿素もしくはチオシアネートイオンなどの高濃度のカオトロ
ープ）で溶出させ、ＰＲＯポリペプチドを回収した。
【０４１６】 実施例２７：薬剤スクリーニング 本発明は、様々な薬剤スクリーニング技術において、ＰＲＯポリペプチドもし
くはそれに結合するフラグメントを用いた化合物のスクリーニングに一部有用で
ある。そのような試験において用いられるＰＲＯポリペプチドもしくはフラグメ
ントは、溶液中に遊離、固形支持物に付着、細胞表面上に産出、もしくは細胞内
に局在させることができる。薬剤スクリーニングの一つの方法として、ＰＲＯポ
リペプチドもしくはフラグメントを発現する組み換え核酸で安定的に形質転換し
た真核生物もしくは原核生物の宿主細胞を用いる。そのような形質転換細胞に対
して、競合的結合アッセイにおいて、薬剤をスクリーニングする。そのような細
胞は、生存もしくは固定された形態のどちらかで、標準的な結合アッセイに用い
ることができる。例えば、ＰＲＯポリペプチドもしくはフラグメントと試薬との
複合体形成を測定することができる。もしくは、試薬によって引き起こされる、
ＰＲＯポリペプチドと標的細胞もしくは標的受容体との複合体形成の減少を測定
することができる。
【０４１７】 このように、本発明は、ＰＲＯポリペプチド−付随疾患もしくは障害に影響を
及ぼし得る薬剤もしくはその他の試薬のスクリーニング方法を提供するものであ
る。これらの方法は、ＰＲＯポリペプチドもしくはそのフラグメントと、そのよ
うな試薬との接触、および当該分野において公知の方法によって行う（Ｉ）試薬
とＰＲＯポリペプチドもしくはフラグメントとの複合体の存在、もしくは（ｉｉ
）ＰＲＯポリペプチドもしくはフラグメントと細胞との複合体の存在のアッセイ
を含む。そのような競的合結合アッセイにおいて、典型的には、ＰＲＯポリペプ
チドもしくはフラグメントを標識する。適切にインキュベーション後、遊離ＰＲ
Ｏポリペプチドもしくはフラグメントを、結合型から分離し、遊離もしくは複合
化していない標識量を、ＰＲＯポリペプチドと結合する、もしくはＰＲＯポリペ
プチド／細胞複合化を妨げる試薬特有の性能の指標とする。
【０４１８】 薬剤スクリーニングの他の技術は、ポリペプチドに対して好適な結合親和性を
有する化合物の高スループットスクリーニングを提供し、１９８４年、９月１３
日に公開されたＷＯ ８４／０３５６４に詳細に記載されている。簡単に述べる
と、様々な小さいペプチド試験化合物を大量に、固形支持物上、例えばプラスチ
ックピンなどの表面に合成させる。ＰＲＯポリペプチドに適用する時は、ペプチ
ド試験化合物を、ＰＲＯポリペプチドと反応させ、洗浄する。結合したＰＲＯポ
リペプチドを、当該分野において公知の方法で検出する。また、精製したＰＲＯ
ポリペプチドを、前記薬剤スクリーニング技術における使用のために、直接プレ
ート上に被覆させることができる。さらに、ペプチドを捕捉し、固形支持物上に
固相化するために、非中和抗体を使用することもできる。
【０４１９】 また、本発明は、中和抗体が、ＰＲＯポリペプチド、もしくはそのフラグメン
トに結合する試験化合物と競合して、特異的にＰＲＯポリペプチドと結合し得る
競合的薬剤スクリーニングアッセイの使用を意図する。この様式において、抗体
は、ＰＲＯポリペプチドと、１以上の抗原決定基を共有するペプチドの存在を検
出するために使用することができる。
【０４２０】 実施例２８：合理的薬剤設計 合理的薬剤設計の目的は、生物学的に活性な興味あるポリペプチド（すなわち
、ＰＲＯポリペプチド）もしくはそれらと相互作用する低分子（例えば、アゴニ
スト、アンタゴニスト、もしくはインヒビター）の構造類似体を産出することで
ある。これらの例は、ＰＲＯポリペプチドのより活性もしくは安定な形状、また
はｉｎ ｖｉｖｏでのＰＲＯポリペプチドの機能を増強する、もしくは阻害する
薬剤を作るために用いることができる（Ｈｏｄｇｓｏｎ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ，９：１９−２１（１９９１）参照）。
【０４２１】 一つの方法において、ＰＲＯポリペプチドもしくはＰＲＯポリペプチド−イン
ヒビター複合体の３次元構造を、ｘ線結晶学、コンピューターモデリング、もし
くはより典型的に、該２つの方法の組み合わせによって確定する。構造を解明し
、分子の活性部位を決定するために、ＰＲＯポリペプチドの形状と電荷を確定し
なければならない。頻繁でないが、ＰＲＯポリペプチドの構造に関する有用な情
報を、相同タンパク質の構造に基づくモデリングによって得ることができる。両
方の事例において、関連する構造の情報が、類似するＰＲＯポリペプチド様分子
の設計もしくは効果的なインヒビターの同定に用いられる。合理的薬剤設計の有
用な実施例は、ＢｒａｘｔｏｎとＷｅｌｌｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１
：７７９６−７８０１（１９８２）によって示されているように、活性もしくは
安定性が向上した、もしくはＡｔｈａｕｄａら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１３
：７４２−７４６（１９９３）によって示されているように、天然ペプチドのイ
ンヒビター、アゴニスト、もしくはアンタゴニストとして作用する分子を含む。
【０４２２】 また、上記のように選択した機能的アッセイによって、標的特異抗体を単離し
、その結晶構造を解明することができる。この方法は、おおむね、続く薬剤設計
の基礎となるファーマコアー（ｐｈａｒｍａｃｏｒｅ）を産出する。機能的、薬
学的に活性な抗体に対する抗イディオタイプ抗体（ａｎｒｉ−ｉｄｓ）を産出す
ることによって、タンパク質結晶学を完全に迂回することができる。鏡像の鏡像
なので、抗イディオタイプ抗体の結合部位が、本来の受容体の類似体であると予
想される。次いで、化学的もしくは生物学的に産出したペプチドの貯蔵物から、
ペプチドを同定および単離するために、抗イディオタイプ抗体を用いることがで
きる。次いで、単離したペプチドを、ファーマコアーとして作用させる。
【０４２３】 本発明によって、Ｘ線結晶学のような分析的な研究を行うのに、十分量のＰＲ
Ｏポリペプチドを利用することができるようになる。さらに、ここに提供される
ＰＲＯポリペプチドアミノ酸配列についての情報は、Ｘ線構造学に代わる、もし
くは加えて、コンピューターモデリング技術を用いるための手引きを提供するも
のである。
【０４２４】 実施例２９： ＰＲＯ２４１の軟骨からのプロテオグリカンの遊離を刺激する
性能 ＰＲＯ２４１の軟骨組織からのプロテオグリカンの遊離を刺激する性能を、以
下のように測定した。
【０４２５】 生後４−６ヶ月のブタの中手指節関節を、無菌的に切開し、関節軟骨を、注意
深く下層の骨を除去しながら、手で切り取った。軟骨を細かく刻み、９５％空気
、５％ＣＯ2の湿潤環境下、０．１％ＢＳＡと１００Ｕ／ｍｌペニシリンと、１ ００μｇストレプトマイシンを含む無血清（ＳＦ）培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２ １
：１）中、２４時間大量培養した。３回洗浄後、約１００ｍｇの関節を、マイク
ロ遠心チューブに分注し、上記無血清培地中、さらに２４時間インキュベーショ
ンした。次いで、ＰＲＯ２４１ポリペプチドを、単独もしくは１８ｎｇ／ｍｌの
インターロイキン−１α（公知の軟骨組織からのプロテオグリカン遊離刺激因子
）と組み合わせて、１％添加した。次いで、上清を回収し、１，９−ジメチルー
メチレンブルー（ＤＭＢ）比色定量アッセイ（ＦａｒｎｄａｌｅとＢｕｔｔｌｅ
、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ ８８３：１７３−１７７（
１９８５））を用いて、プロテオグリカン量をアッセイした。このアッセイにお
ける陽性結果は、測定したポリペプチドが、例えば、スポーツ関連関節損傷、関
節軟骨欠損、変形性関節症、もしくは慢性関節リウマチの治療において用いられ
得ることを示す。
【０４２６】 ＰＲＯ２４１ポリペプチドを上記アッセイで測定すると、ポリペプチドは、単
独およびインターロイキン−１αと共に刺激後、および処置後２４時間と７２時
間で、軟骨組織からのプロテオグリカンの遊離を顕著に刺激し、このことから、
ＰＲＯ２４１ポリペプチドが、軟骨組織からのプロテオグリカンの遊離を刺激す
るために有用であることが示された。
【０４２７】 実施例３０：Ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、細胞もしくは組織調製物内の核酸
配列の検出と局在測定に強力かつ用途の広い技術である。例えば、遺伝子の発現
部位の同定、転写の組織分布の分析、ウィルス感染の同定と局在測定、特異的ｍ
ＲＮＡ合成の変化の追跡および染色体マップ作製を促進するのに有用である。
【０４２８】 Ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、ＬｕとＧｉｌｌｅｔｔ、Ｃｅｌｌ
Ｖｉｓｉｏｎ １：１６９−１７６（１９９４）による以下の最適化された方
法で、ＰＣＲ−産生33Ｐ−標識化リボプローブを用い行った。簡単には、ホルマ
リン固定し、パラフィン包埋したヒト組織を、薄切し、脱パラフィン化し、プロ
テアーゼＫ（２０ｇ／ｍｌ）で１５分間、３７℃で除蛋白し、さらに上記Ｌｕお
よびＧｉｌｌｅｔｔによって記載されたように、Ｉｎ Ｓｉｔｕハイブリダイゼ
ーションのためにさらに処理を行った。（33Ｐ）ＵＴＰ−標識化アンチセンスリ
ボプローブを、ＰＣＲ生成物から産生し、５５℃で一晩ハイブリダイズさせた。
このスライドを、Ｋｏｄａｋ ＮＴＢ２核飛跡感光乳剤に浸し、４週間露光させ
た。
【０４２９】 33Ｐ−リボプローブの合成 ６．０μｌ（１２５ｍＣｉ）の33Ｐ−ＵＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ ＢＦ １０
０２， ＳＡ＜２０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を、急速真空乾燥させた。乾燥した33 Ｐ−ＵＴＰを含む各チューブに、下記成分を添加した： ２．０μｌ ５ｘ転写緩衝液 １．０μｌ ＤＴＴ（１００ｍＭ） ２．０μｌ ＮＴＰ 混合物（２．５ｍＭ：１０μｌ：各１０ｍＭＧＴＰ、Ｃ
ＴＰ＆ＡＴＰ＋１０μｌ 水） １．０μｌ ＵＴＰ（５０μＭ） １．０μｌ Ｒｎａｓｉｎ １．０μｌ 鋳型ＤＮＡ（１μｇ） １．０μｌ 水 １．０μｌ ＲＮＡポリメラーゼ（通常、ＰＣＲ生成物Ｔ３＝ＡＳ、Ｔ７＝
Ｓ）
【０４３０】 該チューブを、３７℃で１時間インキュベーションした。１．０μｌ ＲＱ１
ＤＮアーゼを添加し、３７℃で１５分間インキュベーションした。９０μｌＴＥ
（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ７．６ ／１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０）を添
加し、その混合液を、ＤＥ８１紙上にピペットで移した。残った溶液をＭｉｃｒ
ｏｃｏｎ−５０限外濾過ユニットに負荷し、プログラム１０（６分）を用いて遠
心分離した。濾過ユニットを、第２のチューブに入れ、プログラム２（３分）を
用いて遠心分離した。最終の回収遠心分離後、１００μｌＴＥを添加した。次い
で、１μｌの最終生成物を、ＤＥ８１紙上にピペットで移し、６ｍｌのＢｉｏｆ
ｌｏｕｒ ＩＩでカウントした。
【０４３１】 プローブを、ＴＢＥ／尿素ゲル上で泳動した。３μｌのローディング緩衝液に
、１−３μｌのプローブもしくは５μｌのＲＮＡ Ｍｒｋ ＩＩＩを添加した。
９５℃のヒートブロック上で３分間加熱後、直ちにゲルを氷上に置いた。ゲルの
ウェルを平らにし、試料をかけ、１８０−２５０ボルトで４５分間泳動した。ゲ
ルをサランラップで包み、−７０℃のフリーザー中、１時間から一晩、増感紙を
用いてＸＡＲフィルムに露光した。
【０４３２】 33Ｐ−ハイブリダイゼーション Ａ．凍結切片の調製 スライドを、フリーザーから取り出し、アルミニウムトレイ上に置き、室温で
５分間解凍させた。トレイを、凝結を低減させるために、５５℃のインキュベー
ター内に５分間置いた。スライドを、ドラフト内の氷上の４％パラホルムアルデ
ヒド中で、１０分間固定し、０．５ｘＳＳＣで５分間、室温で洗浄した（２５ｍ
ｌ ２０ｘＳＳＣ＋９７５ｍｌＳＱ Ｈ2Ｏ）。０．５μｇ／ｍｌプロテアーゼ Ｋ（１０ｍｇ／ｍｌ保存液１２．５μｌを、予め暖められたＲＮアーゼ−不含Ｒ
Ｎアーゼ緩衝液２５０ｍｌで希釈したもの）中で、１０分間、３７℃で除蛋白後
、切片を、室温で１０分間、０．５ｘＳＳＣで洗浄した。切片を、７０％、９５
％、および１００％エタノール中で、各２分間ずつ脱水させた。
【０４３３】 Ｂ．パラフィン包埋切片の前処理 スライドを、脱パラフィン化し、ＳＱＨ2Ｏ中に置き、２ｘＳＳＣで、室温、 各５分間ずつ、２回洗浄した。切片を、ヒト胚芽組織の場合は、２０μｇ／ｍｌ
プロテアーゼＫ（１０ｍｇ／ｍｌ保存液５００μｌをＲＮアーゼ−不含ＲＮアー
ゼ緩衝液２５０ｍｌに希釈；３７℃、１５分）で、もしくはホルマリン組織切片
の場合は、８ｘプロテアーゼＫ（１００μｌをＲｎアーゼ緩衝液２５０ｍｌに希
釈、３７℃、３０分）で除蛋白した。続けて０．５ｘＳＳＣでの洗浄、脱水を、
上記のように行った。
【０４３４】 Ｃ．プレハイブリダイゼーション Ｂｏｘ緩衝液（４ｘＳＳＣ、５０％ホルムアミド）で飽和させた濾紙を配列し
たプラスチック箱に、スライドを配置した。組織を、５０μｌのハイブリダイゼ
ーション緩衝液（３．７５ｇ デキストラン硫酸＋６ｍｌＳＱＨ2Ｏ）で覆い、 渦動攪拌し、フタを緩めた状態で、マイクロ波で２分間加熱した。氷上で冷却し
た後、ホルムアミド１８．７５ｍｌ、２０ｘＳＳＣ３．７５ｍｌ、およびＳＱＨ 2 Ｏ９ｍｌを加え、組織を十分に渦動攪拌し、４２℃で１−４時間インキュベー ションした。
【０４３５】 Ｄ．ハイブリダイゼーション １スライド当たり、プローブ１．０ｘ１０6ｃｐｍおよびｔＲＮＡ（５０ｍｇ ／ｍｌ保存液）１．０μｌを、９５℃で３分間加熱した。スライドを氷上で冷却
し、ハイブリダイゼーション緩衝液４８μｌを１スライド当たり加えた。渦動攪
拌後、33Ｐ混合液５０μｌを、スライド上のプレハイブリダイゼーション５０μ
ｌに添加した。該スライドを、５５℃で一晩インキュベーションした。
【０４３６】 Ｅ．洗浄 洗浄を、２ｘＳＳＣ、ＥＤＴＡを用い、２ｘ１０分間、室温で行い（２０ｘＳ
ＳＣ＋０．２５Ｍ ＥＤＴＡ１６ｍｌ、Ｖf＝４Ｌ）、次いで、ＲＮアーゼＡ処 理を、３７℃で３０分間行った（１０ｍｇ／ｍｌ保存液５００μｌをＲｎアーゼ
緩衝液２５０ｍｌで希釈＝２０μｇ／ｍｌ）。スライドを、２ｘ１０分間、２ｘ
ＳＳＣ、ＥＤＴＡで、室温で洗浄した。ストリンジェントな洗浄条件は、以下の
ようにした：５５℃で２時間、０．１ｘＳＳＣ、ＥＤＴＡ（２０ｘＳＳＣ２０ｍ
ｌ＋ＥＤＴＡ１６ｍｌ、Ｖf＝４Ｌ）。
【０４３７】 Ｆ．オリゴヌクレオチド Ｉｎ ｓｉｔｕ分析を、ここに示した様々なＤＮＡ配列で行った。これらの
分析に用いたオリゴヌクレオチドは、以下の通りである。 （１）ＤＮＡ４４８０４−１２４８（ＰＲＯ３５７） ｐｌ：５’−ＧＧＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＧＣ
ＣＣＧＣＡＡＣＣＣＣＴＴＣＡＡＣＴＧ−３’（配列番号：１０４） ｐ２：５’−ＣＴＡＴＧＡＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡＣＣＧ
ＣＡＧＣＴＧＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＴＡ−３’（配列番号：１０５） （２）ＤＮＡ５２７２２−１２２９（ＰＲＯ７１５） ｐｌ：５’−ＧＧＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＣ
ＣＣＣＧＣＣＡＣＣＴＣＣＴ−３’（配列番号：１０６） ｐ２：５’−ＣＴＡＴＧＡＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡＣＴＣ
ＧＡＧＡＣＡＣＣＡＣＣＴＧＡＣＣＣＡ−３’（配列番号：１０７） ｐ３：５’−ＧＧＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＣＡ
ＡＧＧＡＡＧＧＣＡＧＧＡＧＡＣＴＣＴ−３’（配列番号：１０８） ｐ４：５’−ＣＴＡＴＧＡＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡＣＴＡ
ＧＧＧＧＧＴＧＧＧＡＡＴＧＡＡＡＡＧ−３’（配列番号：１０９） （３）ＤＮＡ３８１１３−１２３０（ＰＲＯ３２７） ｐｌ：５’−ＧＧＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＣＣ
ＣＣＴＧＡＧＣＴＣＴＣＣＣＧＴＧＴＡ−３’（配列番号：１１０） ｐ２：５’−ＣＴＡＴＧＡＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡＡＧＧ
ＣＴＣＧＣＣＡＣＴＧＧＴＣＧＴＡＧＡ−３’（配列番号：１１１） （４）ＤＮＡ３５９１７−１２０７（ＰＲＯ２４３） ｐｌ：５’−ＧＧＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＡＡＧ
ＧＡＧＣＣＧＧＧＡＣＣＣＡＧＧＡＧＡ−３’（配列番号：１１２） ｐ２：５’−ＣＴＡＴＧＡＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡＧＧＧ
ＧＧＣＣＣＴＴＧＧＴＧＣＴＧＡＧＴ−３’（配列番号：１１３）
【０４３８】 Ｇ．結果 Ｉｎ Ｓｉｔｕ分析を、ここに開示した様々なＤＮＡ配列で行った。これらの
分析結果は以下のようである。 （１）ＤＮＡ４４８０４−１２４８（ＰＲＯ３５７） 胎児組織における骨形成部位と悪性骨肉腫細胞において、低から中程度の発現
。胎盤および腱においてかろうじて検出できるシグナル。他の全組織は陰性。 試験した胎児の組織（Ｅ１２−Ｅ１６）は以下を含む：肝臓、腎臓、副腎、肺
、心臓、大脈管、食道、胃、脾臓、性腺、脳、脊髄および体壁。 試験した成人の組織：肝臓、腎臓、胃、脾臓、副腎、膵臓、肺、結腸腫瘍、腎
細胞腫瘍および骨肉腫。アセトアミノフェン誘導肝障害、肝硬変。 試験したチンパンジーの組織は以下を含む：甲状腺、上皮小体、リンパ節、神
経、舌、胸腺、副腎、胃粘膜および唾液腺。 アカゲザル：大脳と小脳。
【０４３９】 （２）ＤＮＡ５２７２２−１２２９（ＰＲＯ７１５） 総合すると、高いシグナルが多くの組織に亘って認められた−中でも高いシグ
ナルが、胎盤、骨芽細胞、損傷した腎尿細管、損傷した肝臓、結腸直腸肝臓転移
および胆嚢で認められた。 試験した胎児の組織（Ｅ１２−Ｅ１６）は以下を含む：胎盤、臍帯、肝臓、腎
臓、副腎、甲状腺、肺、心臓、大脈管、食道、胃、小腸、脾臓、胸腺、膵臓、脳
、眼、脊髄、体壁、骨盤および下肢。 試験した成人の組織：肝臓、腎臓、副腎、心筋層、大動脈、肺、皮膚、軟骨肉
腫、眼、胃、結腸、結腸腫瘍、前立腺、膀胱粘膜および胆嚢。アセトアミノフェ
ン誘導肝障害、肝硬変。 試験したアカゲザル：大脳皮質（ｒｍ）、海馬（ｒｍ） 試験したチンパンジー：甲状腺、上皮小体、リンパ節、神経、舌、胸腺、副腎
、胃粘膜および唾液腺。
【０４４０】 （３）ＤＮＡ３８１１３−１２３０（ＰＲＯ３２７） 高レベルの発現が、発育中のマウスとヒトの胎児の肺で観察された。正常の成
人の肺（気管支上皮を含む）は、陰性であった。ヒト胎児気管の粘膜下組織で発
現しており、筋肉細胞でかろうじて発現していた。また、ヒト胎盤において組織
発生が不確かである非栄養膜細胞においても発現が認められた。マウスにおいて
は、発育中の鼻および発育中の舌において観察された。他の全ての組織は陰性で
あった。推定される機能：気管支発育においての確かな機能。 試験した胎児の組織（Ｅ１２−Ｅ１６）は以下を含む：胎盤、臍帯、肝臓、腎
臓、副腎、甲状腺、肺、心臓、大脈管、食道、胃、小腸、脾臓、胸腺、膵臓、脳
、眼、脊髄、骨盤および下肢。 試験した成体の組織は以下を含む：肝臓、腎臓、副腎、心筋層、大動脈、脾臓
、リンパ節、膵臓、肺、皮膚、大脳（ｒｍ）、海馬（ｒｍ）、陰茎、眼、膀胱、
胃、胃粘膜、結腸、結腸腫瘍、甲状腺（チンパンジー）、上皮小体（チンパンジ
ー）、卵巣（チンパンジー）および軟骨肉腫。 （４）ＤＮＡ３５９１７−１２０７（ＰＲＯ２４３） コルネリア・ド・ランゲ症候群（Ｃｏｒｎｅｌｉａ ｄｅ Ｌａｎｇｅ ｓｙ
ｎｄｒｏｍｅ）（ＣｄＬＳ）は、先天性の症候群である。それは、生まれた時か
ら出現することを意味する。ＣｄＬＳは、身体、知能および言語の発育遅延を引
き起こす疾患である。ＣｄＬＳを有する小児の大多数は、軽度から重度におよぶ
精神遅延の程度で、精神的に遅延している。報告されたＩＱは、３０から８５で
ある。ＩＱの平均値は５３である。頭と顔の特徴は、小さい頭、しばしば中央で
つながっている薄い両眉、長い睫毛、短い上唇、薄い下唇、低位置の耳と高い弓
なりの口蓋もしくは口蓋破裂を含む。他の特徴は、言葉遅延（最も軽度な傷害に
おいても）、遅延した発育と低い身長、低い泣き声、小さい手足、内側に曲がっ
た５本の指、猿線、および多毛を含む。診断は、これらの特徴の組み合わせの出
現によって決まる。これらの特徴の多くが、様々な程度で出現する。いくつかの
事例において、これらの特徴は、出現しないかもしれないし、とても軽度である
ため、熟達した遺伝学者もしくはこの症候群に習熟したその他の者によって観察
された時のみ認識されるかもしれない。ＣｄＬＳについて多くのことが知られて
いるが、最近の報告では、より多くの研究されるべきことがあることが報告され
ている。
【０４４１】 この研究において、ヒト胎児の顔、頭、四肢およびマウス胎芽が試験された。
マウス組織においては、全く発現が認められなかった。発現は、アンチセンスプ
ローブでのみ認められた。
【０４４２】 発現は、発育中の四肢および骨膜傍の間葉細胞における顔骨に隣接して観察さ
れた。発現は、高特異的であり、しばしば、血管新生している領域に隣接してい
た。分布は、コルネリア・ド・ランゲ症候群において観察された骨格異常と一致
している。また、発現は、発育時の一時的に胎児脳の後頭葉においても観察され
たが、その他には観察されなかった。さらに、発現は、発育中の内耳の神経節に
おいて認められた；この発見の有意性は明らかではない。
【０４４３】 これらのデータは、機能的な情報を提供するものではないが、分布は、この症
候群に最も重篤な影響を与えることが知られている部位に一致する。
【０４４４】 さらに、わずかな発現が、大腿骨頭と寛骨臼との間（股関節）に形成されてい
る発育中の滑膜性連結における割線に観察された。この発現パターンが、その他
の連結形成部位において観察されるのであれば、コルネリア・ド・ランゲ症候群
に観察される顔と四肢の異常を説明できる。
【０４４５】 実施例３１： アフリカツメガエル卵母細胞におけるＰＲＯ２４３ ｍＲＮＡ
の活性 ＰＲＯ２４３をコードするヒトｃｈｏｒｄｉｎクローン（ＤＮＡ３５９１７−
１２０７）が、アフリカツメガエルコルディン(chordin)とショウジョウバエｓ ｏｇ遺伝子によって推測されるように、機能し、作用することを証明するために
、ＤＮＡ３５９１７−１２０７から超らせん状のプラスミドＤＮＡをＱｉａｇｅ
ｎによって調製し、アフリカツメガエルの胚芽に注入するために用いた。アフリ
カツメガエルのコルディンｍＲＮＡの腹側の植物極割球へのマイクロインジェク
ションにより、第２（２倍）軸を誘導し（Ｓａｓａｉら、Ｃｅｌｌ ７９：７７
９−７９０（１９９４））と、ショウジョウバエｓｏｇも、アフリカツメガエル
胚芽の側腹位に異所的に発現する時に、第２軸を誘導する（Ｈｏｌｌｅｙら、Ｎ
ａｔｕｒｅ ３７６：２４９−２５３（１９９５）と、Ｓｃｈｍｉｄｔら、Ｄｅ
ｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２１：４３１９−４３２８（１９９５））。アフリカツ
メガエル卵母細胞において機能するｓｏｇの性能は、背腹軸 パターン形成に含
まれる過程が、進化時に保存されていることを示している。
【０４４６】 方法 カエル胚芽の操作： 成熟雌のカエルを、使用３日前に、受胎している雌馬の血清２０００Ｉ．Ｕ．
を、および注入前夜にヒトの絨毛性のゴナドトロピン８００Ｉ．Ｕ．をブースト
（boost）した。翌朝、新鮮な卵母細胞を、雌のカエルから搾取し、卵母細胞を 、雄のカエルから切開して取り出しミンチ状にした精巣と混合することにより、
インビトロでの卵母細胞の受精を行った。ＮｉｅｕｗｋｏｏｐとＦａｂｅｒ、Ｎ
ｏｒｍａｌ Ｔａｂｌｅ ｏｆ Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ，Ｎ．−Ｈ．Ｐ
社監修（Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９６７）に従って、胚芽の発育を維持し、段階
づけた。
【０４４７】 受精した卵を、２％システイン（ｐＨ７．８）で１０分間脱ゼリー化させ、滅
菌水で１回洗浄し、５％Ｆｉｃｏｌｌを含む０．１ｘＭＢＳに移した。受精した
卵を、インジェクショントレー上、５％Ｆｉｃｏｌｌを含む０．１ｘＭＢＳ中に
配列した。２細胞期に発育したアフリカツメガエル胚芽に、野生型ｃｈｏｒｄｉ
ｎ（ＤＮＡ３５９１７−１２０７）を含むｐＲＫ５を２００ｐｇ、もしくは対照
として挿入物を含まないｐＲＫ５を２００ｐｇ注入した。注入した胚芽を、５０
ｍｇ／ｍｌゲンタマイシンを含む０．１ｘＭＢＳに移した後、Ｎｉｅｕｋｗｋｏ
ｏｐｋｉ３７−３８に到達するまで、トレー上でさらに６時間保持した。
【０４４８】 結果： ヒトｃｈｏｒｄｉｎ ｃＤＮＡを単一の割球に注入したところ、おたまじゃく
しの側腹になった。おたまじゃくしの側腹は、尾が短くねじれ、セメント腺が拡
張して見える。ヒトｃｈｏｒｄｉｎのアフリカツメガエルにおける側腹剤として
機能する性能は、ＤＮＡ３５９１７−１２０７によってコードされたタンパク質
が、カエルにおける背腹パターン形成に機能、かつ影響を及ぼすことを示し、そ
して、腹側パターン形成において含まれる過程が、進化時に保存されていて、作
用機構がヒト、ハエおよびカエルの間で共通に保存されていることが提示するも
のである。
【０４４９】 材料の寄託 以下の材料は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃ
ｔｉｏｎ，１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，
ＭＤ，ＵＳＡ（ＡＴＣＣ）に寄託されている： 材料 ＡＴＣＣ寄託番号 寄託日 ＤＮＡ３４３９２−１１７０ ＡＴＣＣ２０９５２６ 1997年12月10日 ＤＮＡ３５９１７−１２０７ ＡＴＣＣ２０９５０８ 1997年12月 3日 ＤＮＡ３９９７６−１２１５ ＡＴＣＣ２０９５２４ 1997年12月10日 ＤＮＡ３５５９５−１２２８ ＡＴＣＣ２０９５２８ 1997年12月10日 ＤＮＡ３８１１３−１２３０ ＡＴＣＣ２０９５３０ 1997年12月10日 ＤＮＡ３４４３６−１２３８ ＡＴＣＣ２０９５２３ 1997年12月10日 ＤＮＡ４０５９２−１２４２ ＡＴＣＣ２０９４９２ 1997年11月21日 ＤＮＡ４４１７６−１２４４ ＡＴＣＣ２０９５３２ 1997年12月10日 ＤＮＡ４４１９２−１２４６ ＡＴＣＣ２０９５３１ 1997年12月10日 ＤＮＡ３９５１８−１２４７ ＡＴＣＣ２０９５２９ 1997年12月10日 ＤＮＡ４４８０４−１２４８ ＡＴＣＣ２０９５２７ 1997年12月10日 ＤＮＡ５２７２２−１２２９ ＡＴＣＣ２０９５７０ 1998年 1月 7日 ＤＮＡ４１２３４−１２４２ ＡＴＣＣ２０９６１８ 1998年 2月 5日 ＤＮＡ４５４１０−１２５０ ＡＴＣＣ２０９６２１ 1998年 2月 5日 ＤＮＡ４６７７７−１２５３ ＡＴＣＣ２０９６１９ 1998年 2月 5日
【０４５０】 これらの寄託物は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペス
ト条約の規定およびそれに基づく規則の下で行われた（ブダペスト条約）。これ
は、寄託日から３０年間、寄託物の生存可能な培養物の維持を保証する。寄託物
はブダペスト条約の下でＡＴＣＣにより入手可能であり、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社
とＡＴＣＣとの間の合意を得ることを条件として、直接関係する米国特許の発行
、もしくは米国またはその他の国の早い方の特許出願の公開に基づいて、公衆に
寄託物の培養物の子孫の永久的かつ無制限の利用可能性を保証し、そして、その
子孫の入手を、米国特許法第１２２条およびそれに準ずる長官規則（特に８８６
ＯＧ６３８に関して米国特許法施行規則§１．１４を含む）に従って付与される
米国特許商標庁長官によって定められた者に保証する。
【０４５１】 本願の譲受人は、寄託物の培養物が適切な条件下で培養された場合に死滅また
は損なわれた場合には、この材料を速やかに同一物で置き換えることに同意した
。寄託材料の利用可能性は、その国の特許法に従って政府の権力の下に付与され
た権利に違反して本発明を実施するライセンスとして解釈されない。
【０４５２】 上記明細書は、当業者が本発明を十分に実施できるものと解する。寄託された
実施態様は、本発明の一部の態様の単なる例示に過ぎないこと、並びに、機能的
に均等なあらゆる構成物が本発明の範囲に含まれることから、本発明は、寄託さ
れた構築物により、範囲が制限されるものではない。ここに言う材料の寄託は、
上記記述が、その最良の形態を含めた本発明のあらゆる態様の実施を可能にする
のに不適切であることの承認、あるいは、それが示す特定の例示に請求の範囲を
限定すると解釈されるとの承認を構成するものではない。実際に、ここに記載ま
たは示されたものに加えて、本発明の種々の変更が、上記記載から当業者にとっ
て明白になり、添付された請求の範囲内に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、天然配列ＰＲＯ２４１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配
列番号：１）を示し、配列番号：１は、「ＵＮＱ２１５」及び／又は「ＤＮＡ３
４３９２-１１７０」とここで称したクローンである。
【図２】 図２は、図１に示した配列番号：１のコード配列から得られたア
ミノ酸配列（配列番号：２）を示す。また図２中には、推定シグナルペプチド、
潜在ロイシンジッパー領域及び潜在Ｎ-グリコシル化部位の位置も提供される。
【図３】 図３は、天然配列ＰＲＯ２４３ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配
列番号：６）を示し、配列番号：６は、「ＵＮＱ２１７」及び／又は「ＤＮＡ３
５９１７-１２０７」とここで称したクローンである。
【図４】 図４は、図３中に示した配列番号：６のコード配列から得られた
アミノ酸配列（配列番号：７）を示す。
【図５】 図５は、ヒト染色体３ｑ２７-ｑ２８のＴＨＰＯ領域中のゲノム クローンの形成を示す。
【図６】 図６は、ヒト成人及び胎児組織の発現を示す。６Ａは、ヒトコル
ディン(chordin)（ＰＲＯ２４３）プローブにハイブリダイズした成人及び胎児 組織のノーザンブロットである。下方パネルはアクチン対照を示す。６Ｂは、示
される保存システインブロックをコードしているコドンの位置とともにヒトコル
ディン（ＰＲＯ２４３）ｃＤＮＡの図である。用いたプローブの範囲は、実線に
よって示される。
【図７】 図７は、大腿骨頭と寛骨臼との間に形成される発育途上の滑膜性
の連結の割線において陽性シグナルを与える成人組織のＰＲＯ２４３in situハ イブリダイゼーションを示す。
【図８】 図８は、天然配列ＰＲＯ２９９ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配
列番号：１４）を示し、配列番号：１４は「ＵＮＱ２６２」及び／又は「ＤＮＡ
３９９７６-１２１５」とここで称したクローンである。
【図９】 図９は、図８に示した配列番号：１４のコード配列から得られた
アミノ酸配列（配列番号：１５）を示す。
【図１０】 図１０は、ＤＮＡ２８８４７（配列番号：１８）とここで称し
たヌクレオチド配列を示す。
【図１１】 図１１は、ＤＮＡ３５８７７（配列番号：１９）とここで称し
たヌクレオチド配列を示す。
【図１２】 図１２は、天然配列ＰＲＯ３２３ｃＤＮＡのヌクレオチド配列
（配列番号：２３）を示し、配列番号：２３は、「ＵＮＱ２８４」及び／又は「
ＤＮＡ３５５９５-１２２８」とここで称したクローンである。
【図１３】 図１３は、図１２に示した配列番号：２３のコード配列から得
られたアミノ酸配列（配列番号：２４）を示す。
【図１４】 図１４は、ＰＲＯ３２３-融合ポリペプチドとＩｇＧ定常ドメ インの部分との間のキメラ融合タンパク質のヌクレオチド配列（ヌクレオチド７
９−１４１６）を含む一本鎖ヌクレオチド配列（配列番号：２９）を示し、該キ
メラ融合タンパク質は「ＰＲＯ４５４」とここで称した。ＰＲＯ３２３／ＩｇＧ
融合タンパク質（ＰＲＯ４５４）をコードしている一本鎖ヌクレオチド配列（配
列番号：２９）は、「ＤＮＡ３５８７２」とここで称した。
【図１５】 図１５は、図１４に示したヌクレオチド配列のヌクレオチド７
９−１４１６から得られたアミノ酸配列（配列番号：３０）を示す。ＰＲＯ３２
３-誘導配列とＩｇＧ-誘導配列との間のＰＲＯ４５４アミノ酸配列における連結
は、該図中のアミノ酸４１５−４１６の間と思われる。
【図１６】 図１６は、天然配列ＰＲＯ３２７ｃＤＮＡのヌクレオチド配列
（配列番号：３１）を示し、配列番号：３１は、「ＵＮＱ３２７」及び／又は「
ＤＮＡ３８１１３-１２３０」とここで称したクローンである。
【図１７】 図１７は、図１６に示した配列番号：３１のコード配列から得
られたアミノ酸配列（配列番号：３２）を示す。
【図１８】 図１８は、天然配列ＰＲＯ２３３ｃＤＮＡのヌクレオチド配列
（配列番号：３６）を示し、配列番号：３６は「ＵＮＱ２０７」及び／又は「Ｄ
ＮＡ３４４３６-１２３８」とここで称したクローンである。
【図１９】 図１９は、図１８に示した配列番号：３６のコード配列から得
られたアミノ酸配列（配列番号：３７）を示す。
【図２０】 図２０は、天然配列ＰＲＯ３４４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列
（配列番号：４１）を示し、配列番号：４１は、「ＵＮＱ３０３」及び／又は「
ＤＮＡ４０５９２-１２４２」とここで称したクローンである。
【図２１】 図２１は、図２０に示した配列番号：４１のコード配列から得
られたアミノ酸配列（配列番号：４２）を示す。
【図２２】 図２２は、天然配列ＰＲＯ３４７ｃＤＮＡのヌクレオチド配列
（配列番号：４９）を示し、配列番号：４９は、「ＵＮＱ３０６」及び／又は「
ＤＮＡ４４１７６-１２４４」とここで称したクローンである。
【図２３】 図２３は、図２２に示した配列番号：４９のコード配列から得
られたアミノ酸配列（配列番号：５０）を示す。
【図２４】 図２４は、天然配列ＰＲＯ３５４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列
（配列番号：５４）を示し、配列番号：５４は、「ＵＮＱ３１１」及び／又は「
ＤＮＡ４４１９２-１２４６」とここで称したクローンである。
【図２５】 図２５は、図２４に示した配列番号：５４のコード配列から得
られたアミノ酸配列（配列番号：５５）を示す。
【図２６】 図２６は、天然配列ＰＲＯ３５５ｃＤＮＡのヌクレオチド配列
（配列番号：６０）を示し、配列番号：６０は、「ＵＮＱ３１２」及び／又は「
ＤＮＡ３９５１８-１２４７」とここで称したクローンである。
【図２７】 図２７は、図２６に示した配列番号：６０のコード配列から得
られたアミノ酸配列（配列番号：６１）を示す。
【図２８】 図２８は、天然配列ＰＲＯ３５７ｃＤＮＡのヌクレオチド配列
（配列番号：６８）を示し、配列番号：６８は、「ＵＮＱ３１４」及び／又は「
ＤＮＡ４４８０４-１２４８」とここで称したクローンである。
【図２９】 図２９は、図２８に示した配列番号：６８のコード配列から得
られたアミノ酸配列（配列番号：６９）を示す。
【図３０】 図３０は、天然配列ＰＲＯ７１５ｃＤＮＡのヌクレオチド配列
（配列番号：７５）を示し、配列番号：７５は、「ＵＮＱ３８３」及び／又は「
ＤＮＡ５２７２２-１２２９」とここで称したクローンである。
【図３１】 図３１は、図３０に示した配列番号：７５のコード配列から得
られたアミノ酸配列（配列番号：７６）を示す。
【図３２】 図３２は、ヒト腫瘍壊死因子-α（ＴＮＦＡ＿ヒト）（配列番 号：７７）と、ＤＮＡ５２７２２-１２２９のヌクレオチド１１４−８６３から 得られたアミノ酸配列（配列番号：７６）との比較を示す。同じアミノ酸は箱で
囲んだ。
【図３３】 図３３は、ＤＮＡ５２７２２-１２２９のヌクレオチド１１４ −８６３から得られたアミノ酸配列（配列番号：７６）とタンパク質の腫瘍壊死
ファミリーの各種のメンバーの配列（配列番号：７８−８４）との比較を示す。
同じアミノ酸は箱で囲った。
【図３４】 図３４は、天然配列ＰＲＯ３５３ｃＤＮＡのヌクレオチド配列
（配列番号：８５）を示し、配列番号：８５は、「ＵＮＱ３１０」及び／又は「
ＤＮＡ４１２３４-１２４２」とここで称したクローンである。
【図３５】 図３５は、図３４に示した配列番号：８５のコード配列から得
られたアミノ酸配列（配列番号：８６）を示す。
【図３６】 図３６は、天然配列ＰＲＯ３６１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列
（配列番号：９０）を示し、配列番号：９０は、「ＵＮＱ３１６」及び／又は「
ＤＮＡ４５４１０-１２５１」とここで称したクローンである。
【図３７】 図３７は、図３６に示した配列番号：９０のコード配列から得
られたアミノ酸配列（配列番号：９１）を示す。
【図３８】 図３８は、天然配列ＰＲＯ３６５ｃＤＮＡのヌクレオチド配列
（配列番号：９８）を示し、配列番号：９８は、「ＵＮＱ３２０」及び／又は「
ＤＮＡ４６７７７-１２５３」とここで称したクローンである。
【図３９】 図３９は、図３８に示した配列番号：９８のコード配列から得
られたアミノ酸配列（配列番号：９９）を示す。
【手続補正書】
【提出日】平成１２年６月２１日（２０００．６．２１）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２８３
【補正方法】変更
【補正内容】
【０２８３】 ＰＣＲプライマー（２個の前進と１個の逆進）を合成した： 前進ＰＣＲプライマー１ ５’−ＡＧＴＴＣＴＧＧＴＣＡＧＣＣＴＡＴＧＴＧＣ
Ｃ−３’（配列番号：２５） 前進ＰＣＲプライマー２ ５’−ＣＧＴＧＡＴＧＧＴＧＴＣＴＴＴＧＴＣＣＡＴ
ＧＧＧ−３’（配列番号：２６） 逆進ＰＣＲプライマー ５’−ＣＴＣＣＡＣＣＡＡＴＣＣＣＧＡＴＧＡＡＣＴＴ
ＧＧ−３’（配列番号：２７） さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを、以下のヌ
クレオチド配列を有するコンセンサスＤＮＡ３０８７５配列から構築した。 ハイブリダイゼーションプローブ ５’−ＧＡＧＣＡＧＡＴＴＧＡＣＣＴＣＡＴＡＣＧＣＣＧＣＡＴＧＴＧＴＧＣＣ
ＴＣＣＴＡＴＴＣＴＧＡＧＣＴＧＧＡ−３’（配列番号：２８）
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｑ 1/68 5/00 Ｂ (31)優先権主張番号 ６０／０６９，３３５ (32)優先日 平成９年12月11日(1997．12．11) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／０６９，２７８ (32)優先日 平成９年12月11日(1997．12．11) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／０６９，４２５ (32)優先日 平成９年12月12日(1997．12．12) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／０６９，６９６ (32)優先日 平成９年12月16日(1997．12．16) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／０６９，６９４ (32)優先日 平成９年12月16日(1997．12．16) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／０６９，７０２ (32)優先日 平成９年12月16日(1997．12．16) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／０６９，８７０ (32)優先日 平成９年12月17日(1997．12．17) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／０６９，８７３ (32)優先日 平成９年12月17日(1997．12．17) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／０６８，０１７ (32)優先日 平成９年12月18日(1997．12．18) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／０７０，４４０ (32)優先日 平成10年１月５日(1998．1．5) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／０７４，０８６ (32)優先日 平成10年２月９日(1998．2．9) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／０７４，０９２ (32)優先日 平成10年２月９日(1998．2．9) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／０７５，９４５ (32)優先日 平成10年２月25日(1998．2．25) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ， ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，Ｌ Ｕ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ， ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，Ｕ Ｇ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (71)出願人 460 Ｐｏｉｎｔ Ｓａｎ Ｂｒｕｎｏ Ｂｌｖｄ．，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａ ｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ 94080 ＵＳＡ (72)発明者 オードレイ・ゴッダード アメリカ合衆国・カリフォルニア・ 94131・サン・フランシスコ・コンゴ・ス トリート・110 (72)発明者 オースティン・エル・ガーニー アメリカ合衆国・カリフォルニア・ 94002・ベルモント・ワン・デビー・レー ン（番地なし) (72)発明者 ジーン・ユアン アメリカ合衆国・カリフォルニア・ 94403・サン・マテオ・ウエスト・サーテ ィーセヴンス・アヴェニュー・176 (72)発明者 ケヴィン・ピー・ベイカー アメリカ合衆国・メリーランド・20878・ ダーンスタウン・インディアン・ラン・ド ライブ・14006 (72)発明者 ジャン・チェン アメリカ合衆国・ニュー・ジャージー・ 08540・プリンストン・ヨーク・ドライ ブ・121 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA01 BA14 BA63 CA01 CA07 DA02 DA06 DA12 HA01 HA11 HA15 4B063 QA18 QQ79 QQ96 QR48 QS33 QS36 QX02 4B064 AG01 CA02 CA06 CA10 CA19 CC24 DA01 DA13 4B065 AA26X AA72X AA91X AA93Y AB01 AC15 BA02 CA24 CA25 CA44 CA46 4H045 AA10 AA11 BA10 BA41 CA40 EA20 EA50 FA74

Claims (18)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 図２（配列番号：２）、図４（配列番号：７）、図９（配列
    番号：１５）、図１１（配列番号：１９）、図１３（配列番号：２４）、図１５
    （配列番号：３０）、図１７（配列番号：３２）、図１９（配列番号：３７）、
    図２１（配列番号：４２）、図２３（配列番号：５０）、図２５（配列番号：５
    ５）、図２７（配列番号：６１）、図２９（配列番号：６９）、図３１（配列番
    号：７６）、図３５（配列番号：８６）、図３７（配列番号：９１）、及び図３
    ９（配列番号：９９）に示したアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸
    配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に少なくとも８０％配列
    同一性を有している単離した核酸。
  2. 【請求項２】 上記ヌクレオチド配列が、図１（配列番号：１）、図３（配
    列番号：６）、図８（配列番号：１４）、図１０（配列番号：１８）、図１２（
    配列番号：２３）、図１４（配列番号：２９）、図１６（配列番号：３１）、図
    １８（配列番号：３６）、図２０（配列番号：４１）、図２２（配列番号：４９
    ）、図２４（配列番号：５４）、図２６（配列番号：６０）、図２８（配列番号
    ：６８）、図３０（配列番号：７５）、図３４（配列番号：８５）、図３６（配
    列番号：９０）、及び図３８（配列番号：９８）に示した配列、又はその相補体
    からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む請求項１記載の核酸。
  3. 【請求項３】 上記ヌクレオチド配列が、図１（配列番号：１）、図３（配
    列番号：６）、図８（配列番号：１４）、図１０（配列番号：１８）、図１２（
    配列番号：２３）、図１４（配列番号：２９）、図１６（配列番号：３１）、図
    １８（配列番号：３６）、図２０（配列番号：４１）、図２２（配列番号：４９
    ）、図２４（配列番号：５４）、図２６（配列番号：６０）、図２８（配列番号
    ：６８）、図３０（配列番号：７５）、図３４（配列番号：８５）、図３６（配
    列番号：９０）、及び図３８（配列番号：９８）に示した配列の全長コード配列
    、又はその相補体からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む請求項１記
    載の核酸。
  4. 【請求項４】 受託番号ＡＴＣＣ２０９５２６、ＡＴＣＣ２０９５０８、Ａ
    ＴＣＣ２０９５２４、ＡＴＣＣ２０９５２８、ＡＴＣＣ２０９５３０、ＡＴＣＣ
    ２０９５２３、ＡＴＣＣ２０９４９２、ＡＴＣＣ２０９５３２、ＡＴＣＣ２０９
    ５３１、ＡＴＣＣ２０９５２９、ＡＴＣＣ２０９５２７、ＡＴＣＣ２０９５７０
    、ＡＴＣＣ２０９６１８、ＡＴＣＣ２０９６２１又はＡＴＣＣ２０９６１９の下
    に寄託したＤＮＡの全長コード配列を含む単離した核酸。
  5. 【請求項５】 請求項１記載の核酸を含むベクター。
  6. 【請求項６】 該ベクターで形質転換した宿主細胞により認識される制御配
    列に操作可能に結合した請求項５記載のベクター。
  7. 【請求項７】 請求項５記載のベクターを含む宿主細胞。
  8. 【請求項８】 上記細胞がＣＨＯ細胞である請求項７記載の宿主細胞。
  9. 【請求項９】 上記細胞が大腸菌である請求項７記載の宿主細胞。
  10. 【請求項１０】 上記細胞が酵母細胞である請求項７記載の宿主細胞。
  11. 【請求項１１】 ＰＲＯポリペプチドの製造方法であり、上記ＰＲＯポリペ
    プチドの発現のために好適な条件下で請求項７記載の宿主細胞を培養すること及
    びその細胞培養物からＰＲＯポリペプチドを回収することを含む方法。
  12. 【請求項１２】 図２（配列番号：２）、図４（配列番号：７）、図９（配
    列番号：１５）、図１１（配列番号：１９）、図１３（配列番号：２４）、図１
    ５（配列番号：３０）、図１７（配列番号：３２）、図１９（配列番号：３７）
    、図２１（配列番号：４２）、図２３（配列番号：５０）、図２５（配列番号：
    ５５）、図２７（配列番号：６１）、図２９（配列番号：６９）、図３１（配列
    番号：７６）、図３５（配列番号：８６）、図３７（配列番号：９１）、及び図
    ３９（配列番号：９９）に示したアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ
    酸配列に少なくとも８０％配列同一性を有している単離した天然配列ＰＲＯポリ
    ペプチド。
  13. 【請求項１３】 受託番号ＡＴＣＣ２０９５２６、ＡＴＣＣ２０９５０８、
    ＡＴＣＣ２０９５２４、ＡＴＣＣ２０９５２８、ＡＴＣＣ２０９５３０、ＡＴＣ
    Ｃ２０９５２３、ＡＴＣＣ２０９４９２、ＡＴＣＣ２０９５３２、ＡＴＣＣ２０
    ９５３１、ＡＴＣＣ２０９５２９、ＡＴＣＣ２０９５２７、ＡＴＣＣ２０９５７
    ０、ＡＴＣＣ２０９６１８、ＡＴＣＣ２０９６２１又はＡＴＣＣ２０９６１９の
    下に寄託したヌクレオチドによってコードされたアミノ酸配列に少なくとも８０
    ％配列同一性を有する単離したＰＲＯポリペプチド。
  14. 【請求項１４】 異種アミノ酸配列に融合した請求項１２記載のポリペプチ
    ドを含むキメラ分子。
  15. 【請求項１５】 上記異種アミノ酸配列が、エピトープ標識配列である請求
    項１４記載のキメラ分子。
  16. 【請求項１６】 上記異種アミノ酸配列が、免疫グロブリンのＦｃ領域であ
    る請求項１４記載のキメラ分子。
  17. 【請求項１７】 請求項１２記載のＰＲＯポリペプチドに特異的に結合する
    抗体。
  18. 【請求項１８】 上記抗体がモノクローナル抗体である請求項１７記載の抗
    体。
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