JP2004290196A - Ｆａｓ抗原を結合するリガンド - Google Patents

Abstract

【課題】Ｆａｓリガンド（Ｆａｓ−Ｌ）と称するタンパク質は、Ｆａｓ抗原として知られる細胞表面タンパク質に対して結合する。Ｆａｓ抗原に対して結合するヒトタンパク質を提供する。
【解決手段】特定のアミノ酸配列を含むマウスＦａｓ−Ｌポリペプチドをコードする単離ＤＮＡ、およびＦａｓ−Ｌポリペプチドを製造する場合に有用なＤＮＡ配列、発現ベクターならびに形質転換された宿主細胞を、Ｆａｓ−Ｌと免疫反応性の抗体と一緒に提供する。
【選択図】なし

Description

Ｆａｓ抗原を結合するリガンド。

発明の背景
アポトーシスとして知られるプログラム化された細胞死は、胚形成、変態、内分泌依存性組織委縮、正常組織代謝および免疫胸腺細胞の死で見られる（それらの抗原−受容体複合体によってまたはグルココルチコイドによって誘導される）（イトー（Ｉｔｏｈ）ら、Ｃｅｌｌ６６：２３３，１９９１年）。胸腺におけるＴ細胞の成熟の際に、自己抗原を認識するＴ細胞はアポトーシス過程によって破壊されるが、他は正に選択される。ある種の自己エピトープ（例えば、ある与えられた自己タンパク質の非能率的にプロセッシングされ且つ提示された抗原決定基）を認識する多くのＴ細胞はこの排除過程を免れた後に、自己免疫疾患においてある役割を果たしうるという可能性が示唆されている（ガモン（Ｇａｍｍｏｎ）ら、ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙＴｏｄａｙ １２：１９３，１９９１年）。

Ｆａｓとして知られる細胞表面抗原は、アポトーシスを媒介することが報告されており、しかも自己反応性Ｔ細胞のクローン欠失においてある役割を果たしていると考えられる（イトーら、Ｃｅｌｌ６６：２３３，１９９１年；ワタナベ（Ｗａｔａｎａｂｅ）−フクナガ（Ｆｕｋｕｎａｇａ）ら、Ｎａｔｕｒｅ３５６：３１４，１９９２年）。Ｆａｓは、活性Ｔ細胞、Ｂ細胞および好中球上に発現される４５ｋＤａ分子である（イトー、上記）。高濃度のＦａｓｍＲＮＡは、マウスの胸腺、肝、心臓、肺および卵巣において検出されている（ワタナベ−フクナガら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８：１２７４，１９９２年）。Ｆａｓに対する特異的単クローン性抗体の架橋は、種々の細胞系がアポトーシスを受けるように誘導すると報告されている（ヨネハラ（Ｙｏｎｅｈａｒａ）ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１６９：１７４７，１９８９年；トラウス（Ｔｒａｕｔｈ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４５：３０１，１９８９年）。しかしながら、ある種の条件下において、Ｆａｓに対する特異的単クローン性抗体の結合は、新たに単離されたＴ細胞に対して刺激性でありうる（オルダーソン（Ａｌｄｅｒｓｏｎ）ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７８：２２３１，１９９３年）。

ネズミおよびヒトＦａｓ抗原をコードするｃＤＮＡのクローニングは、ワタナベ−フクナガら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、上記）およびイトーら、上記によってそれぞれ報告されている。クローン化ｃＤＮＡによってコードされたアミノ酸配列は、ネズミおよびヒトＦａｓ抗原が、細胞表面受容体の神経成長因子受容体／腫瘍壊死因子受容体（ＮＧＦＲ／ＴＮＦＲ）系列のメンバーとの構造均一性を示す貫膜タンパク質であることを示す。
リンパ増殖（ｌｐｒ）突然変異として知られる常染色体劣性突然変異を有するマウスは、Ｆａｓ抗原遺伝子を欠き、そしてアポトーシスシグナルを伝達しうる正常な機能性Ｆａｓタンパク質を発現しない（ワタナベ−フクナガら、Ｎａｔｕｒｅ３５６：３１４，１９９２年）。ｌｐｒ突然変異を有するマウスは、リンパ節および脾臓におけるＣＤ４^-ＣＤ８^-胸腺細胞の蓄積、高γグロブリン血症、自己抗体生産、リウマチ様因子、関節炎並びに糸球体腎炎を特徴とするリンパ増殖性疾患を発症する（ワタナベ−フクナガら、Ｎａｔｕｒｅ）上記）。

ｌｐｒマウスで見られるのと区別がつかない臨床的症候群は、全身性リンパ増殖性疾患（ｇｌｄ）突然変異として知られる突然変異体遺伝子を有するマウスによって示される（ワタナベ−フクナガら、Ｎａｔｕｒｅ、上記）。ｇｌｄおよびｌｐｒ突然変異は、別々の染色体に地図で示される異なる遺伝子を包含する（セルディン（Ｓｅｌｄｉｎ）ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ１６７：６８８，１９８８年；ワトソン（Ｗａｔｓｏｎ）ら、ＭａｍｍａｌｉａｎＧｅｎｏｍｅ ２：１５８，１９９２年；ワタナベ−フクナガら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｇｅｎｅｔ．２９：３２５，１９９１年；およびワタナベ−フクナガら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、上記）。

Ｆａｓ抗原と相互作用する１個または複数の分子の存在および同一性の研究は、免疫系による自己寛容性の発生を更に洞察するためにおよび自己免疫疾患の病因学を研究する手段を提供するために望ましい。Ｆａｓを結合するラットタンパク質をコードしているｃＮＤＡはクローン化されている（スダ（Ｓｕｄａ）ら、Ｃｅｌｌ，７５：１１６９，１９９３年）。
ヒトＦａｓリガンドは、ヒト免疫系およびヒトに用いるための診断薬または治療薬の開発を含む研究などの用途に好ましいと考えられる。しかしながら、本発明より以前には、Ｆａｓ抗原に対して結合するヒトタンパク質が知られていなかった。

発明の概要
本発明は、新規のＦａｓリガンド（Ｆａｓ−Ｌ）タンパク質、並びに該Ｆａｓ−Ｌタンパク質をコードしている単離ＤＮＡ、該単離ＤＮＡを含む発現ベクターおよび該発現ベクターを有する宿主細胞を該Ｆａｓ−Ｌタンパク質の発現に適当な条件下で培養することによるＦａｓ−Ｌの製造法を提供する。

Ｆａｓ−Ｌは、Ｆａｓ（細胞表面タンパク質）として知られる抗原に対して結合するタンパク質である。具体的な実施態様において、Ｆａｓ−Ｌはヒトまたはネズミタンパク質である。Ｆａｓ−Ｌタンパク質に対して向けられた抗体またはそれらの免疫原性フラグメントもまた提供する。抗体の用途には、Ｆａｓに対するＦａｓ−Ｌの結合の阻止がある。したがって、このような結合によって媒介される生物学的活性を阻害することができる。

発明の詳細な説明
Ｆａｓとして知られる細胞表面抗原のリガンドとして作用しうる新規のヒトポリペプチドをコードしているＤＮＡを、本発明によって単離した。ネズミＦａｓ−ＬＤＮＡも同様に提供する。更に、Ｆａｓリガンド（Ｆａｓ−Ｌ）ＤＮＡを含む発現ベクター、並びに該発現ベクターを有する宿主細胞をＦａｓ−Ｌの発現に適当な条件下で培養し且つ発現されたＦａｓ−Ｌを回収することによる組換えＦａｓ−Ｌポリペプチドの製造法を提供する。実質的に均一の精製Ｆａｓ−Ｌタンパク質もまた本発明によって包含される。
本発明は、更に、ヒト若しくはネズミＦａｓ−Ｌまたは免疫原として作用してＦａｓ−Ｌ免疫原に対して特異的な抗体を生じることができるそれらの抗原性フラグメントを提供する。したがって、Ｆａｓ−Ｌに特異的な単クローン性抗体またはそれらの抗原性フラグメントを製造することができる。

本明細書中で開示された新規のタンパク質は、ＴＮＦ／ＮＧＦ受容体超系列のメンバーである細胞表面タンパク質Ｆａｓのリガンドである。Ｆａｓは、自己反応性Ｔ細胞のクローン欠失においてある役割を果たしていると考えられる。欠陥Ｆａｓ抗原の生産を引き起こす突然変異を有するマウスは、自己免疫症候群に冒されている。本発明のＦａｓリガンドの一つの用途は、自己免疫疾患の研究並びにＦａｓおよびＦａｓ−Ｌが自己寛容性の誘導において果たしうる役割の研究のための研究手段としてである。本発明のＦａｓ−Ｌポリペプチドはまた、Ｆａｓ若しくはＦａｓ−Ｌの欠失またはそれらの相互作用についてのインビトロ検定において用いることができる。
Ｆａｓ−Ｌタンパク質は、タンパク質精製試薬として用いることができる。固体支持体材料に結合したＦａｓ−Ｌは、アフィニティークロマトグラフィーによるＦａｓタンパク質の精製に有用である。Ｆａｓ−Ｌはまた、以下に更に詳細に記載されるＦａｓタンパク質の生物学的活性の監視において用いられる。

ヒトＦａｓ−ＬをコードしているｃＤＮＡの単離は、以下の実施例２に記載されている。このＦａｓ−ＬｃＤＮＡを有するクローニングベクターｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ^RＳＫによって形質転換された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）菌株ＤＨ５αは、１９９４年１月５日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ ＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に寄託され且つ受託番号６９５２７と指定された。寄託はブダペスト条約の条件に基いて行われた。
実施例２で単離されたヒトＦａｓ−Ｌ ＤＮＡのヌクレオチド配列を、配列番号：１で表わす。それによってコードされたアミノ酸配列を、配列番号：２で表わす。このヒトＦａｓ−Ｌタンパク質は、Ｎ末端細胞質ドメイン（アミノ酸１〜８０）、貫膜部分（アミノ酸８１〜１０５）および細胞外ドメイン（アミノ酸１０６〜２８１）を含む。細胞外ドメインは受容体結合部分を含む。

本明細書中で用いられる「Ｆａｓ−Ｌ」という用語は、膜結合タンパク質（細胞質ドメイン、貫膜部分および細胞外ドメイン）並びにＦａｓ結合性を保持する切断されたタンパク質を包含する。一つの実施態様において、可溶性Ｆａｓ−Ｌポリペプチドは、Ｆａｓ−Ｌタンパク質の細胞外ドメインの全部または一部分を含むが、細胞膜上に該ポリペプチドを保持させると考えられる貫膜部分を欠いている。好都合に、異種シグナルペプチドは、発現の際に可溶性Ｆａｓ−Ｌが分泌されるようにＮ末端に融合される。用いることができる。可溶性Ｆａｓ−Ｌポリペプチドは、Ｆａｓ抗原を結合する能力を保持している。可溶性Ｆａｓ−Ｌは、更に、可溶性Ｆａｓ−Ｌタンパク質が分泌されうるという条件ならば、貫膜部分の一部分または細胞質ドメイン若しくは他の配列の一部分を含んでいてよい。

可溶性Ｆａｓ−Ｌは、所望のタンパク質を発現する完全な細胞を遠心分離などによって培地から分離し且つ所望のタンパク質の存在について培地（上澄み）を検定することによって同定する（そしてその非可溶性膜結合対応物と区別する）ことができる。培地は、以下の実施例に記載されたのと同様のまたは同一の手順を用いて検定されうる。培地中のＦａｓ−Ｌの存在は、タンパク質が細胞から分泌されたことを示し、したがって所望のタンパク質の可溶性の形である。可溶性Ｆａｓ−Ｌは、このタンパク質の天然に存在する形でありうる。可溶性形のＦａｓ−Ｌの使用は、いくつかの用途に好都合である。組換え宿主細胞からのタンパク質の精製は、可溶性タンパク質が細胞から分泌されるので容易である。更に、可溶性タンパク質は、概して、静脈内投与に更に適当である。

可溶性ポリペプチドを含む切断されたＦａｓ−Ｌは、多数の慣用的な技法のいずれによっても製造することができる。組換えタンパク質の場合、望ましいフラグメントをコードしているＤＮＡフラグメントは、発現ベクター中にサブクローン化されうる。或いは、望ましいＤＮＡ配列は、既知の技法を用いて化学的に合成することができる。ＤＮＡフラグメントは、更に、完全長さのクローン化ＤＮＡ配列の制限エンドヌクレアーゼ消化によって製造され且つアガロースゲル上の電気泳動によって単離することもできる。１個または複数の制限エンドヌクレアーゼ切断部位を有するリンカーを用いて、所望のＤＮＡフラグメントを発現ベクター中に挿入することができるし、またはそこに天然に存在する切断部位で該フラグメントを消化することができる。周知のポリメラーゼ連鎖反応手順を用いて、望ましいタンパク質フラグメントをコードしているＤＮＡ配列を単離してもよい。
もう一つのアプローチにおいては、酵素的処理（例えば、Ｂａｌ３１エキソヌクレアーゼを用いる）を用いてＤＮＡフラグメントから末端ヌクレオチドを削除して、特定の望ましい末端を有するフラグメントを得ることができる。商業的に入手可能なリンカーには、Ｂａｌ３１消化によって生じたブラント末端に対して連結することができるものがあり、それらは１個または複数の制限エンドヌクレアーゼ切断部位を有する。或いは、望ましい地点までのＤＮＡフラグメントのＮ−またはＣ末端を再構築するオリゴヌクレオチドを合成することができる。オリゴヌクレオチドは、所望のコーディング配列の上流に制限エンドヌクレアーゼ切断部位を有していてよいし且つ該コーディング配列のＮ末端に開始コドン（ＡＴＧ）を配置していてよい。

本発明のＦａｓ−Ｌ ＤＮＡとしては、ｃＤＮＡ、化学的に合成されたＤＮＡ、ＰＣＲによって単離されたＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよびそれらの組合せがある。ゲノムＦａｓ−ＬＤＮＡは、標準的な技法を用いて、本明細書中に開示されたＦａｓ−Ｌ ｃＤＮＡに対するハイブリッド形成によって単離することができる。Ｆａｓ−Ｌ ＤＮＡから転写されたＲＮＡもまた、本発明によって包含される。
本発明のいくつかの実施態様は、配列番号：１のヌクレオチド９３〜９３８（コーディング領域）または４０８〜９３８（細胞外ドメインをコードしている）から成る群より選択されるヌクレオチド配列を含む単離ＤＮＡを提供する。配列番号：２のタンパク質の生物学的活性フラグメントをコードしているＤＮＡもまた提供する。

更に、本明細書中において、組換え体および非組換え体両方の精製Ｆａｓ−Ｌポリペプチドを提供する。所望の生物学的活性を保持する天然Ｆａｓ−Ｌタンパク質の変異体および誘導体もまた本発明の範囲内である。Ｆａｓ−Ｌ変異体は、例えば、天然Ｆａｓ−Ｌポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の突然変異によって得ることができる。本明細書中で論及されるＦａｓ−Ｌ変異体とは、天然Ｆａｓ−Ｌと実質的に相同であるが、１種類または多数の欠失、挿入または置換のためにアミノ酸配列が天然Ｆａｓ−Ｌのそれとは異なるポリペプチドである。本発明のＦａｓ−ＬエンコーディングＤＮＡ配列は、天然Ｆａｓ−ＬＤＮＡ配列と比較した場合に１種類またはそれ以上のヌクレオチドの付加、欠失または置換を含むが、天然Ｆａｓ−Ｌタンパク質に対して本質的に生体同等物であるＦａｓ−Ｌタンパク質をコードする配列を包含する。

変異体アミノ酸またはＤＮＡ配列は、好ましくは、天然Ｆａｓ−Ｌ配列と少なくとも９０％同一である。天然および突然変異体配列間の相同度（同一性％）は、例えば、デバルー（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ）ら（Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１２：３８７，１９８４年）によって記載され且つウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆ ＷｉｓｃｏｎｓｉｎＧｅｎｅｔｉｃｓ ＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ）（ＵＷＧＣＧ）から入手可能なＧＡＰコンピュータープログラム、バージョン６．０を用いて二つの配列を比較することによって決定することができる。ＧＡＰプログラムは、スミス（Ｓｍｉｔｈ）およびウォーターマン（Ｗａｔｅｒｍａｎ）（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ２：４８２，１９８１年）によって修正された、ニードルマン（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ）およびヴンシュ（Ｗｕｎｓｃｈ）（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０年）の整列法を用いる。簡単にいうと、ＧＡＰプログラムは、類似した整列記号（すなわち、ヌクレオチドまたはアミノ酸）の数を二つの配列の短い方の記号の全数で割ったものとしての類似性を規定する。ＧＡＰプログラムに好ましい暗黙値パラメーターとしては、（１）ヌクレオチドに対するユナリー（ｕｎａｒｙ）比較マトリックス（同一に１および非同一に０の値を含む）並びにシュワルツ（Ｓｃｈｗａｒｔｚ）およびデイホフ（Ｄａｙｈｏｆｆ）監修、Ａｔｌａｓｏｆ ＰｒｏｔｅｉｎＳｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ナショナル・バイオメディカル・リサーチ・ファウンデーション（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ），３５３〜３５８頁，１９７９年に記載の、グリブスコフ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ）およびバージェス（Ｂｕｒｇｅｓｓ）、Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１４：６７４５，１９８６年の秤量比較マトリックス；（２）各ギャップに対する３．０のペナルティーおよび各ギャップの各記号に対する更に０．１０のペナルティー；並びに（３）最終ギャップに対するペナルティーなしがある。

天然アミノ酸配列の変更は、多数の既知の技法のいずれによっても達成されうる。突然変異は、天然配列のフラグメントに対する連結反応を可能にする制限部位に隣接された突然変異配列を有するオリゴヌクレオチドを合成することによって特定の遺伝子座に導入することができる。連結反応後、得られた再構築配列は、所望のアミノ酸挿入、置換または欠失を有する類似体をコードしている。
或いは、オリゴヌクレオチドに支配された部位特異的突然変異誘発法を用いて、必要な置換、欠失または挿入にしたがって変更された特定のコドンを有する変更された遺伝子を提供することができる。上記の変更を行う典型的な方法は、本明細書中に援用される、ワルダー（Ｗａｌｄｅｒ）ら（Ｇｅｎｅ４２：１３３，１９８６年）；バウアー（Ｂａｕｅｒ）ら、（Ｇｅｎｅ３７：７３，１９８５年）；クレイク（Ｃｒａｉｋ）（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９８５年１月，１２〜１９）；スミスら（ＧｅｎｅｔｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ，プレナム・プレス（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ），１９８１年）；並びに米国特許第４，５１８，５８４号明細書および同第４，７３７，４６２号明細書に開示されている。
変異体は、ある与えられたアミノ酸残基が、類似の物理化学的特性を有する残基によって置換されていることを意味する保守的置換配列を含んでいてよい。保守的置換の例としては、一つの脂肪族残基を別のものに、例えば、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ若しくはＡｌａの互いの置換、または一つの極性残基を別のものに、例えば、ＬｙｓとＡｒｇ；ＧｌｕとＡｓｐ；若しくはＧｌｎとＡｓｎとの間の置換がある。他のこのような保守的置換、例えば、類似の疎水性を有する残基全体の置換は周知である。

Ｆａｓ−Ｌは、更に、他の化学的残基、例えば、グリコシル基、脂質、リン酸、アセチル基等と共有結合または凝集結合を形成することによってＦａｓ−Ｌ誘導体を生成するように修飾されうる。Ｆａｓ−Ｌの共有結合誘導体は、化学的残基をＦａｓ−Ｌアミノ酸側鎖上の官能基に対してまたはＦａｓ−Ｌポリペプチド若しくはその細胞外ドメインのＮ末端若しくはＣ末端に結合することによって製造することができる。本発明の範囲内にある他のＦａｓ−Ｌ誘導体としては、例えば、Ｎ末端またはＣ末端融合のような組換え体培養での合成による、Ｆａｓ−Ｌまたはそのフラグメントと、他のタンパク質またはポリペプチドとの共有結合体または凝集結合体がある。例えば、結合体は、シグナルまたはリーダーポリペプチド配列（例えば、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）のα因子リーダー）をＦａｓ−ＬポリペプチドのＮ末端に含むことができる。シグナルまたはリーダーペプチドは、その合成の側から細胞膜または細胞壁の内側または外側に対する結合体の移動を共翻訳によってまたは翻訳後に支配する。

Ｆａｓ−Ｌポリペプチド融合は、Ｆａｓ−Ｌの精製および識別を容易にするように加えられたペプチドを含むことができる。このようなペプチドとしては、例えば、米国特許第５，０１１，９１２号明細書およびホップ（Ｈｏｐｐ）ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６：１２０４，１９８８年に記載のポリ−Ｈｉｓすなわち抗原識別ペプチドがある。この種のペプチドの一つは、ＦＬＡＧ^Rぺプチド、Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）（配列番号：３）であり、これは極めて抗原性であり、しかも発現された組換えタンパク質の速やかな検定および容易な精製を可能にする、特定の単クローン性抗体によって可逆的に結合されたエピトープを提供する。この配列はまた、Ａｓｐ−Ｌｙｓ対合直後の残基においてウシ粘膜エンテロキナーゼによって特異的に切断される。このペプチドのキャップ付き融合タンパク質は、更に、大腸菌における細胞内分解に対して耐性でありうる。４Ｅ１１と称するネズミハイブリドーマは、（米国特許第５，０１１，９１２号明細書に記載の）ある種の二価金属陽イオン存在下においてペプチドＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号：３）を結合する単クローン性抗体を生産し且つアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに受託番号HB９２５９として寄託された。Ｆｌａｇ^Rペプチドを結合する単クローン性抗体は、イーストマン・コダック・カンパニー、サイエンティフィック・イメージング・システムズ・ディビジョン（ＥａｓｔｍａｎＫｏｄａｋ Ｃｏ．，ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＩｍａｇｉｎｇ ＳｙｓｔｅｍｓＤｉｖｉｓｉｏｎ），ニューヘブン，コネチカット州から入手可能である。

本発明は、更に、関連した天然パターングリコシル化を伴うまたは伴わないＦａｓ−Ｌポリペプチドを包含する。酵母または哺乳動物発現系（例えば、ＣＯＳ−７細胞）において発現されたＦａｓ−Ｌは、発現系の選択に応じて、分子量およびグリコシル化パターンが天然Ｆａｓ−Ｌポリペプチドと同様でありうるしまたは有意に異なることがありうる。大腸菌などの細菌発現系におけるＦａｓ−Ｌポリペプチドの発現は、非グリコシル化分子を提供する。
アミノ酸残基若しくは配列の様々な付加若しくは置換、または生物学的活性若しくは結合に不必要な末端若しくは内部残基若しくは配列の欠失をコードするＤＮＡ構築物を製造することができる。例えば、Ｆａｓ−Ｌ細胞外ドメイン中のＮ−グリコシル化部位を修飾してグリコシル化を妨げ、同時に、酵母発現系を用いて均一の還元型炭水化物類似体を発現させることができる。真核性ポリペプチド中のＮ−グリコシル化部位は、アミノ酸トリプレットＡｓｎ−Ｘ−Ｙ（式中、Ｘは、Ｐｒｏ以外の任意のアミノ酸であり且つＹはＳｅｒまたはＴｈｒである）を特徴とする。このような部位は、ヒトＦａｓ−Ｌにおいて、配列番号：２のアミノ酸７６〜７８、１８４〜１８６、２５０〜２５２および２６０〜２６２で見られる。このトリプレットをコードしているヌクレオチド配列に対する適当な修飾は、Ａｓｎ側鎖における炭水化物残基の結合を妨げる置換、付加または欠失を引き起こす。タンパク質中のＮ−グリコシル化部位を失活させる既知の方法としては、米国特許第５，０７１，９７２号明細書および欧州特許第２７６，８４６号明細書に記載されたものがある。

もう一つの例において、生物学的活性に不可欠でないＣｙｓ残基をコードしている配列は、該Ｃｙｓ残基を欠失するようにまたは他のアミノ酸によって置換するように変更することができ、復元の際の誤った分子内ジスルフィド架橋の形成が防止される。他の変異体は、ＫＥＸ２プロテアーゼ活性が存在する酵母系における発現を促進するように、隣接した二塩基アミノ酸残基の修飾によって製造される。欧州特許第２１２，９１４号明細書は、タンパク質中のＫＥＸ２プロテアーゼプロセッシング部位を失活させるための部位特異的突然変異誘発の使用を開示している。ＫＥＸ２プロテアーゼプロセッシング部位は、Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ａｒｇ−ＬｙｓおよびＬｙｓ−Ａｒｇ対を変更するように残基を欠失させて、付加してまたは置換して、これらの隣接した塩基性残基が現れないようすることによって失活する。このようなＫＥＸ２プロテアーゼプロセッシング部位は、配列番号：２の残基３８〜３９、４３〜４４、７３〜７４および１４４〜１４５で見られる。Ｌｙｓ−Ｌｙｓ対合は、ＫＥＸ２切断にほとんど影響されず、Ａｒｇ−ＬｙｓまたはＬｙｓ−ＡｒｇのＬｙｓ−Ｌｙｓへの変換は、ＫＥＸ２部位を失活させるための保守的で且つ好ましい方法である。

天然に存在するＦａｓ−Ｌ変異体もまた本発明によって包含される。このような変異体の例は、ｍＲＮＡのオータナティブスプライシング事象によって（Ｆａｓ−Ｌは多エクソン遺伝子によってコードされているので）、またはＦａｓ結合性が保持されているＦａｓ−Ｌタンパク質のタンパク質分解切断によって、得られるタンパク質である。ｍＲＮＡのオータナティブスプライシングは、短縮型だが生物学的に活性のＦａｓ−Ｌタンパク質、例えば、天然に存在する可溶性形タンパク質などを生じることがある。タンパク質分解に起因する変異としては、例えば、Ｆａｓ−Ｌタンパク質からの１個またはそれ以上の末端アミノ酸のタンパク質分解除去による、異なる種類の宿主細胞での発現の際のＮ−またはＣ末端の相違がある。Ｎ−またはＣ末端において１〜５個のアミノ酸まで切断されているアミノ酸配列を有するＦａｓ−Ｌタンパク質は、本発明によって包含される。更に、タンパク質分解切断は、膜結合形タンパク質から可溶形Ｆａｓ−Ｌを放出することができる。
遺伝コードの縮重性のために、二つのＤＮＡ配列は異なっていることがあるがなお同一アミノ酸配列をコード化しうる。したがって、本発明は、天然ヒト若しくはネズミＦａｓ−ＬｃＤＮＡのコーディング領域またはそのフラグメントを含むＤＮＡ、並びに遺伝コードの結果として天然Ｆａｓ−ＬＤＮＡ配列に対して縮重性であるＤＮＡから選択される、生物学的活性Ｆａｓ−Ｌをコードしている単離ＤＮＡ配列を提供する。本発明の一つの実施態様は、配列番号：１のヌクレオチド配列のコーディング領域を含むＤＮＡ、並びにそれに対して縮重性のＤＮＡ配列を提供する。

Ｆａｓを結合する必要な能力を有する変異体は、任意の適当な検定によって同定することができる。Ｆａｓ−Ｌの生物学的活性は、例えば、Ｆａｓのリガンド結合ドメインに対する結合の競合（すなわち、競合的結合検定）によって決定することができる。
検定
Ｆａｓ−Ｌポリペプチドに対する競合的結合検定の一つの種類は、放射性標識された可溶性ヒトＦａｓ−Ｌ、および細胞表面Ｆａｓを発現する自然のままの細胞を用いる。自然のままの細胞の代わりに、融合タンパク質のＦｃ部分とのプロテインＡまたはプロテインＧ相互作用によって固相に結合した可溶性Ｆａｓ（例えば、Ｆａｓ／Ｆｃ融合タンパク質）を代用することができる。もう一つの種類の競合的結合検定は、Ｆａｓ／Ｆｃ融合タンパク質などの放射性標識された可溶性Ｆａｓ、およびＦａｓ−Ｌを発現する自然のままの細胞を用いる。或いは、可溶性Ｆａｓ−Ｌを固相に対して結合することができる。
競合的結合検定は、標準的な方法論を用いて行うことができる。定性結果は、競合的オートラジオグラフプレート結合検定によって得ることができるし、またはスキャッチャードプロットを用いて定量結果を生じてよい。

Ｆａｓを発現する自然のままの細胞を用いる競合的結合検定は、二つの方法によって行うことができる。第一の方法では、内因性細胞表面Ｆａｓを発現する細胞を懸濁液中でかまたは組織培養プレートに対する付着性によって増殖させる。
付着性細胞は、５ｍＭ ＥＤＴＡ処理を用いる３７℃で１０分間の処理によって除去することができる。第二の方法では、膜結合組換え体Ｆａｓを発現するトランスフェクションされた細胞を用いることができる。ＣＯＳ細胞または別の哺乳動物細胞を適当なベクター中のヒトＦａｓｃＤＮＡによってトランスフェクションして、細胞外部分を含む完全長さのＦａｓを発現させることができる。
或いは、可溶性Ｆａｓを、カラムクロマトグラフィー基質などの固相または同様の支持体に対して結合させることができる。固相に対する結合は、例えば、Ｆａｓ／Ｆｃ融合タンパク質を製造し、そしてそれをプロテインＡまたはプロテインＧ含有基質に対して結合することによって達成されうる。
Ｆａｓ−Ｌ（変異体を含む）の生物学的活性を測定するもう一つの手段は、上記の検定に類似した競合検定において共役した可溶性Ｆａｓ（例えば、¹²⁵Ｉ−Ｆａｓ／Ｆｃ）を用いることである。この場合、しかしながら、Ｆａｓ−Ｌを発現する自然のままの細胞または固体支持体に対して結合した可溶性Ｆａｓ−Ｌを用いて、推定上のＦａｓ−Ｌ変異体を含む試料によるＦａｓ−Ｌに対する共役した可溶性Ｆａｓの結合の競合を測定する。

オリゴマー
本発明は、二量体または三量体などのオリゴマーの形のＦａｓ−Ｌポリペプチドを包含する。オリゴマーは、別個のＦａｓ−Ｌポリペプチド上の残基間のジスルフィド結合によって生成されうる。本発明の一つの実施態様において、Ｆａｓ−Ｌ二量体は、抗体（ＩｇＧ１）のＦｃ部分に対してＦａｓ−Ｌを融合することによって生成される。「Ｆｃポリペプチド」という用語は、天然および突然変異タンパク質の形、並びに二量体化を促進するヒンジ領域を含む切断されたＦｃポリペプチドを包含する。Ｆｃポリペプチドは、好ましくは、（細胞外ドメインのみを含む）可溶性Ｆａｓ−Ｌに対して融合される。抗体に誘導されたポリペプチドの様々な部分（Ｆｃドメインを含む）に融合された異種ポリペプチドを含む融合タンパク質の製造は、例えば、本明細書によって援用されるアシュケナジ（Ａｓｈｋｅｎａｚｉ）ら（ＰＮＡＳＵＳＡ ８８：１０５３５，１９９１年）およびバーン（Ｂｙｒｎ）ら（Ｎａｔｕｒｅ３４４：６６７，１９９０年）に記載されている。
Ｆａｓ−Ｌ／Ｆｃ融合タンパク質をコードしている遺伝子融合は、適当な発現ベクター中に挿入される。Ｆａｓ−Ｌ／Ｆｃ融合タンパク質は抗体分子とほぼ同様に集合することが可能であり、その結果、鎖間ジスルフィド結合がＦｃポリペプチド間に形成され、二価Ｆａｓ−Ｌを生成する。他の実施態様において、Ｆａｓ−Ｌは、抗体重鎖または軽鎖の可変部の代わりに置換されうる。融合タンパク質を抗体の重鎖および軽鎖によって製造する場合、４個程度のＦａｓ−Ｌ細胞外部分によってＦａｓ−Ｌオリゴマーを生成することは可能である。或いは、２個の可溶性Ｆａｓ−Ｌポリペプチドと、米国特許第５，０７３，６２７号明細書（本明細書によって援用される）に記載されたようなペプチドリンカーとを結合することができる。
本発明は、ジスルフィド相互作用によって結合した、またはスペーサーアミノ酸結合基を含む若しくは含まない融合ポリマーとして発現されたＦａｓ−Ｌ細胞外ドメインまたはそれらのフラグメントのオリゴマーを提供する。例えば、二量体Ｆａｓ−Ｌ分子は、ＩｇＧＦｃ部分結合基によって結合されうる。

発現系
本発明は、Ｆａｓ−Ｌの発現のための組換え体発現ベクターおよび該発現ベクターによって形質転換された宿主細胞を提供する。任意の適当な発現系を用いることができる。ベクターとしては、適当な転写または翻訳調節ヌクレオチド配列（例えば、哺乳動物、微生物、ウイルスまたは昆虫遺伝子に由来するもの）に対して機能的に結合したＦａｓ−ＬポリペプチドをコードするＤＮＡを含む。調節配列の例としては、転写プロモーター、オペレーター若しくはエンハンサー、ｍＲＮＡリボソーム結合部位、並びに転写および翻訳開始および終結を制御する適当な配列がある。ヌクレオチド配列は、該調節配列がＦａｓ−ＬＤＮＡ配列に機能的に関係している場合に機能的に結合される。例えば、プロモーターヌクレオチド配列は、該プロモーターヌクレオチド配列がＦａｓ−ＬＤＮＡ配列の転写を制御する場合、Ｆａｓ−Ｌ ＤＮＡ配列に対して機能的に結合される。複製起点によって通常与えられる所望の宿主細胞中で複製する能力、および形質転換細胞が同定される選択遺伝子は、更に、発現ベクター中に包含されうる。
更に、Ｆａｓ−Ｌ遺伝子に対して固有ではない適当なシグナルペプチドをコードする配列を、発現ベクター中に包含させることができる。例えば、シグナルペプチド（分泌リーダー）のＤＮＡ配列を枠中においてＦａｓ−Ｌ配列に対して融合させて、該シグナルペプチドを含む融合タンパク質としてＦａｓ−Ｌが最初に翻訳されるようにすることができる。所望の宿主細胞で機能的なシグナルペプチドは、Ｆａｓ−Ｌポリペプチドの細胞外分泌を促進する。シグナルペプチドは、細胞からのＦａｓ−Ｌの分泌の際にＦａｓ−Ｌポリペプチドから切断される。

Ｆａｓ−Ｌポリペプチドの発現に適当な宿主細胞としては、原核生物、酵母または高等真核細胞がある。細菌、真菌、酵母および哺乳動物細胞宿主と一緒に用いるのに適当なクローニングおよび発現ベクターは、例えば、ポーウェルズ（Ｐｏｕｗｅｌｓ）ら、ＣｌｏｎｉｎｇＶｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．エルセビア（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ），ニューヨーク（１９８５）に記載されている。無細胞翻訳系は、更に、本明細書中に開示されたＤＮＡ構築物に由来するＲＮＡを用いてＦａｓ−Ｌポリペプチドを製造するのに用いることができる。
原核生物としては、グラム陰性またはグラム陽性微生物、例えば、大腸菌またはバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｉ）がある。形質転換に適当な原核生物宿主細胞としては、例えば、大腸菌、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、並びにシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）およびブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）の属の範囲内の様々な他の種がある。大腸菌などの原核生物宿主細胞において、Ｆａｓ−Ｌポリペプチドは、原核生物宿主細胞における組換え体ポリペプチドの発現を促進するようにＮ末端メチオニン残基を含んでいてよい。Ｎ末端Ｍｅｔは、発現された組換え体Ｆａｓ−Ｌポリペプチドから切断されうる。
原核生物宿主細胞において用いるための発現ベクターは、概して、１種類またはそれ以上の表現型選択性マーカー遺伝子を含む。表現型選択性マーカー遺伝子は、例えば、抗生物質耐性を与えるまたは独立栄養要求性を与えるタンパク質をコードする遺伝子である。原核生物宿主細胞に有用な発現ベクターの例としては、商業的に入手可能なプラスミドに由来するもの、例えば、クローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）がある。ｐＢＲ３２２は、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性の遺伝子を含み、したがって、形質転換された細胞を識別するための簡単な手段を提供する。適当なプロモーターおよびＦａｓ−ＬＤＮＡ配列をｐＢＲ３２２ベクター中に挿入する。他の商業的に入手可能なベクターとしては、例えば、ｐＫＫ２２３−３（ファーマシア・ファイン・ケミカルズ（ＰｈａｒｍａｃｉａＦｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ），ウプサラ、スウェーデン）およびｐＧＥＭ１（プロメガ・バイオテク（ＰｒｏｍｅｇａＢｉｏｔｅｃ），マディソン，ＷＩ，ＵＳＡ）がある。

組換え原核生物宿主細胞発現ベクター用に一般的に用いられるプロモーター配列としては、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトースプロモーター系（チャン（Ｃｈａｎｇ）ら、Ｎａｔｕｒｅ２７５：６１５，１９７８年；およびゴデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ）ら、Ｎａｔｕｒｅ２８１：５４４，１９７９年）、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（ゴデルら、Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．８：４０５７，１９８０年；および欧州特許出願第ＥＰ−Ａ−３６７７６号明細書）およびｔａｃプロモーター（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ），４１２頁，１９８２年）がある。

特に有用な原核生物宿主細胞発現系は、ファージλＰ_LプロモーターおよびｃＩ８５７ｔｓ熱不安定性リプレッサー配列を用いる。λＰ_Lプロモーターの誘導体を包含するアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手可能なプラスミドベクターとしては、プラスミドｐＨＵＢ２（大腸菌菌株ＪＭＢ９（ＡＴＣＣ３７０９２）中に存在する）およびｐＰＬｃ２８（大腸菌ＲＲ１（ＡＴＣＣ５３０８２）中に存在する）がある。
或いは、Ｆａｓ−Ｌは、酵母宿主細胞において、好ましくはサッカロミセス属（例えば、Ｓ．セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））から発現されうる。他の属の酵母、例えば、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）またはクルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属もまた用いることができる。酵母ベクターは、しばしば、２μ酵母プラスミドからの複製起点配列、自律複製配列（ＡＲＳ）、プロモーター領域、ポリアデニル化のための配列、転写終結のための配列および選択性マーカー遺伝子を含む。酵母ベクターに適当なプロモーター配列としては、特に、メタロチオネイン、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ヒッツェマン（Ｈｉｔｚｅｍａｎ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：２０７３，１９８０年）または他の解糖酵素（ヘス（Ｈｅｓｓ）ら、Ｊ．Ａｄｖ．ＥｎｚｙｍｅＲｅｇ．７：１４９，１９６８年；およびホランド（Ｈｏｌｌａｎｄ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７：４９００，１９７８年）、例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼのプロモーターがある。酵母発現において用いるための他の適当なベクターおよびプロモーターは、ヒッツェマン、欧州特許出願第ＥＰＡ−７３，６５７号明細書で更に記載されている。他には、ラッセル（Ｒｕｓｓｅｌｌ）ら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：２６７４，１９８２年）およびバイアー（Ｂｅｉｅｒ）ら（Ｎａｔｕｒｅ３００：７２４，１９８２年）によって記載されたグルコース抑制性ＡＤＨ２プロモーターがある。酵母および大腸菌両方で複製可能なシャトルベクターは、大腸菌における選択および複製のためのｐＢＲ３２２からのＤＮＡ配列（Ａｍｐ^r遺伝子および複製起点）を上記酵母ベクター中に挿入することによって構築することができる。

酵母α因子リーダー配列は、Ｆａｓ−Ｌポリペプチドの分泌を支配するように用いることができる。α因子リーダー配列は、しばしば、プロモーター配列と構造遺伝子配列との間に挿入される。例えば、クルジャン（Ｋｕｒｊａｎ）ら、Ｃｅｌｌ３０：９３３，１９８２年およびビター（Ｂｉｔｔｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：５３３０，１９８４年を参照されたい。酵母宿主からの組換え体ポリペプチドの分泌を促進するのに適当な他のリーダー配列は、当業者に知られている。リーダー配列は、その３′末端付近に１個またはそれ以上の制限部位を含むように修飾されうる。これは、構造遺伝子に対するリーダー配列の融合を容易にする。
酵母形質転換プロトコルは当業者に知られている。この種の一つのプロトコルは、ヒンネル（Ｈｉｎｎｅｌ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７５：１９２９，１９７８年によって記載されている。ヒンネルらのプロトコルは、選択培地中のＴｒｐ⁺形質転換細胞を選択し、ここにおいて、選択培地は、酵母窒素塩基０．６７％、カザアミノ酸０．５％、グルコース２％、アデニン１０μｇ／ｍｌおよびウラシル２０μｇ／ｍｌから成る。
ＡＤＨ２プロモーター配列を含むベクターによって形質転換された酵母宿主細胞は、「豊富」培地で発現させるために増殖させることができる。豊富培地の例は、酵母エキス１％、ペプトン２％およびグルコース１％にアデニン８０μｇ／ｍｌおよびウラシル８０μｇ／ｍｌを補足したものである。ＡＤＨ２プロモーターの抑制解除は、培地からグルコースが消耗された場合に起こる。

哺乳動物または昆虫宿主細胞培養系もまた、組換え体Ｆａｓ−Ｌポリペプチドを発現するのに用いうる。昆虫細胞における異種タンパク質の生産のためのバキュロウイルス系は、ラコー（Ｌｕｃｋｏｗ）およびサマーズ（Ｓｕｍｍｅｒｓ）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６：４７（１９８８）によって論評されている。哺乳動物由来の樹立細胞系を用いてもよい。適当な哺乳動物宿主細胞系の例としては、サル腎細胞のＣＯＳ−７系（ＡＴＣＣＣＲＬ １６５１）（グルツマン（Ｇｌｕｚｍａｎ）ら、Ｃｅｌｌ２３：１７５，１９８１年）、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ １６３）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒーラ細胞およびＢＨＫ（ＡＴＣＣＣＲＬ １０）細胞系、並びにマクマーン（ＭｃＭａｈａｎ）ら（ＥＭＢＯＪ．１０：２８２１，１９９１年）によって記載のアフリカミドリザル腎細胞系ＣＶＩ（ＡＴＣＣＣＣＬ ７０）に由来するＣＶＩ／ＥＢＮＡ細胞系がある。

哺乳動物宿主細胞発現ベクターの転写および翻訳調節配列は、ウイルスゲノムから切取ることができる。一般的に用いられるプロモーター配列およびエンハンサー配列は、ポリオーマウイルス、アデノウイルス２、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）およびヒトサイトメガロウイルスに由来する。ＳＶ４０ウイルスゲノムに由来するＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０由来初期および後期プロモーター、エンハンサー、スプライスおよびポリアデニル化部位を用いて、哺乳動物宿主細胞における構造遺伝子配列の発現のための他の遺伝要素を提供することができる。ウイルス初期および後期プロモーターは、両方とも、ウイルス複製起点を更に含んでいてよいフラグメントとしてウイルスゲノムから容易に得られるので特に有用である（フィアス（Ｆｉｅｒｓ）ら、Ｎａｔｕｒｅ２７３：１１３，１９７８年）。より小さいまたはより大きいＳＶ４０フラグメントもまた、ＳＶ４０ウイルス複製起点に位置したＨｉｎｄＩＩＩ部位からＢｇｌＩ部位へと伸長した約２５０ｂｐ配列が包含されるという条件付きで用いることができる。

哺乳動物宿主細胞において用いるための典型的な発現ベクターは、オカヤマ（Ｏｋａｙａｍａ）およびベルク（Ｂｅｒｇ）（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２８０，１９８３年）によって開示されたように構築することができる。Ｃ１２７ネズミ乳房上皮細胞での哺乳動物ｃＤＮＡの安定な高レベル発現に有用な系は、実質的には、コスマン（Ｃｏｓｍａｎ）ら（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：９３５，１９８６年）によって記載のように構築することができる。コスマンら、Ｎａｔｕｒｅ３１２：７６８，１９８４年によって記載された有用な高発現ベクター、ＰＭＬＳＶＮ１／Ｎ４は、ＡＴＣＣ３９８９０として寄託された。更に別の有用な哺乳動物発現ベクターは、本明細書中に援用される欧州特許出願第ＥＰ−Ａ−０３６７５６６号明細書およびＰＣＴ出願第ＷＯ９１／１８９８２号明細書に記載されている。該ベクターはレトロウイルスに由来しうる。Ｆａｓ−Ｌの発現に対して、異種シグナル配列である天然シグナル配列を欠いたＩＩ型タンパク質、例えば、米国特許第４，９６５，１９５号明細書に記載のインターロイキン−７（ＩＬ−７）のシグナル配列、コスマンら、Ｎａｔｕｒｅ３１２：７６８（１９８４）に記載のインターロイキン−２受容体のシグナル配列；欧州特許第ＥＰ３６７，５６６号明細書に記載のインターロイキン−４受容体シグナルペプチド；米国特許第４，９６８，６０７号明細書に記載のＩ型インターロイキン−１受容体シグナルペプチド；および欧州特許第ＥＰ４６０，８４６号明細書に記載のＩＩ型インターロイキン−１受容体シグナルペプチドを加えることかできる。

精製Ｆａｓ−Ｌタンパク質
本発明は、精製ヒトおよびネズミＦａｓ−Ｌタンパク質を提供し、これは、上記の組換え体発現系によって製造することができるしまたは天然に存在する細胞から精製することができる。所望の精製度は、目的とされるタンパク質の使用に依る。比較的高い精製度は、例えば、タンパク質をインビボ投与する場合に望ましい。好都合に、Ｆａｓ−Ｌポリペプチドは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による分析の際に他のタンパク質に対応するタンパク質バンドが検出されないように精製される。Ｆａｓ−Ｌタンパク質に対応する多重バンドを、上記で論及したように、示差的グリコシル化、示差的翻訳後プロセッシング等に基いてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより可視化しうることは、適切な分野の業者によって理解される。Ｆａｓ−Ｌタンパク質標品は、別のタンパク質（非Ｆａｓ−Ｌ）に対応するバンドが見られない限りにおいて精製されていると考えられる。最も好ましくは、Ｆａｓ−Ｌは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析において単一タンパク質バンドによって示されるように実質的に均一になるまで精製される。タンパク質バンドは、銀染色によってまたは（タンパク質が放射性標識されている場合）オートラジオグラフィーによって可視化されうる。
一つの実施態様において、Ｆａｓ−Ｌタンパク質は、Ｎ末端アミノ酸配列ＭＱＱＰＦＮＹＰＹＰＱＩ（配列番号：２のアミノ酸１〜１２）を特徴とするヒトタンパク質である。このようなタンパク質は、５′末端配列ＡＴＧＣＡＧＣＡＧＣＣＣＴＴＣＡＡＴＴＡＣＣＣＡＴＡＴＣＣＣＣＡＧＡＴＣ（配列番号：１のヌクレオチド９３〜１２８）を特徴とするＤＮＡによってコードされている。

Ｆａｓ−Ｌタンパク質を製造する一つの方法は、Ｆａｓ−ＬをコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターによって形質転換された宿主細胞を、Ｆａｓ−Ｌが発現されるような条件下において培養することを含む。次に、用いられた発現系に応じて、Ｆａｓ−Ｌタンパク質を培地または細胞抽出物から回収する。当業者が認めるように、組換え体Ｆａｓ−Ｌを精製する手順は、用いられた宿主細胞の種類およびＦａｓ−Ｌが培地中に分泌されているか否かなどの因子によって変化する。
例えば、組換え体タンパク質を分泌する発現系を用いる場合、最初に、商業的に入手可能なタンパク質濃縮フィルター、例えば、アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）またはミリポア・ペリコン（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＰｅｌｌｉｃｏｎ）限外濾過装置を用いて培地を濃縮してよい。濃縮工程後、濃縮物をゲル濾過媒質などの精製基質に対して加えることができる。或いは、陰イオン交換樹脂、例えば、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）側基を有する基質または支持体を用いることができる。基質は、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロース、またはタンパク質精製において一般的に用いられる他の種類でありうる。或いは、陽イオン交換工程を用いることができる。適当な陽イオン交換体としては、スルホプロピルまたはカルボキシメチル基を含む各種不溶性基質がある。スルホプロピル基が好ましい。最後に、疎水性逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）媒質（例えば、メチルまたは他の脂肪族側基を有するシリカゲル）を用いる１回またはそれ以上のＲＰ−ＨＰＬＣ工程を用いてＦａｓ−Ｌを更に精製することができる。前述の精製工程のいくつかまたは全部を様々な組合せで用いて、実質的に均一の組換え体タンパク質を提供することができる。
更に、Ｆａｓのリガンド結合ドメインを含むアフィニティーカラムを用いて、発現されたＦａｓ−Ｌポリペプチドをアフィニティー精製することが可能である。Ｆａｓ−Ｌポリペプチドは、高塩溶離緩衝液中のアフィニティーカラムから除去された後、用いるための低塩緩衝液中に透析する。或いは、アフィニティーカラムは、Ｆａｓ−Ｌを結合する抗体を含むことができる。実施例３は、本発明のＦａｓ−Ｌタンパク質を用いて、Ｆａｓ−Ｌに対して向けられた単クローン性抗体生じる手順を記載する。
細菌培養において製造された組換え体タンパク質は、最初の宿主細胞の破壊、遠心分離、不溶性ポリペプチドの場合は細胞ペレットからまたは可溶性ポリペプチドの場合は上澄み液からの抽出、続いて、１回またはそれ以上の濃縮、塩析、イオン交換、アフィニティー精製またはサイズ排除クロマトグラフィー工程によって単離することができる。最終的に、ＲＰ−ＨＰＬＣを最終精製工程に用いることができる。微生物細胞は、凍結融解サイクル、音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を含む任意の好都合な方法によって破壊することができる。
好ましくは、形質転換された酵母宿主細胞を用いて、Ｆａｓ−Ｌを分泌ポリペプチドとして発現させる。これは精製を簡単にする。酵母宿主細胞発酵から分泌された組換え体ポリペプチドは、ウルダル（Ｕｒｄａｌ）ら（Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．２９６：１７１，１９８４年）によって開示されたのと類似の方法によって精製することができる。ウルダルらは、分離用ＨＰＬＣカラム上の組換え体ヒトＩＬ−２の精製のために二つの逐次的逆相ＨＰＬＣ工程を記載している。

抗体
本明細書中で開示されたＦａｓ−Ｌポリペプチドと免疫反応性である抗体を提供する。多クローン性および単クローン性抗体は、慣用的な技法によって製造することができる。例えば、ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ，ケネット（Ｋｅｎｎｅｔ）ら（監修），プレナム・プレス，ニューヨーク（１９８０）；およびＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ハーロウ（Ｈａｒｌｏｗ）およびランド（Ｌａｎｄ）（監修），コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス，コールド・スプリング・ハーバー，ニューヨーク（１９８８）を参照されたい。Ｆａｓ−Ｌと免疫反応性である単クローン性抗体の生産は、以下の実施例３で更に例証する。
本発明のＦａｓ−Ｌタンパク質またはそれらの抗原性フラグメントを免疫原として用いて、Ｆａｓ−Ｌ免疫原に対して特異的な多クローン性または単クローン性抗体を生じることができる。一つの実施態様において、可溶性Ｆａｓ−Ｌポリペプチドは免疫原である。細胞表面上で組換え体Ｆａｓ−Ｌを発現する細胞もまた免疫原として用いることができる。更に別の代用物として、Ｆａｓ−Ｌポリペプチドを含む融合タンパク質（例えば、Ｆａｓ−Ｌの細胞外ドメインおよび抗体Ｆｃ部分ポリペプチドを含む融合タンパク質）が免疫原である。

慣用的な技法によって製造しうるこのような抗体の抗原結合フラグメントもまた本発明によって包含される。このようなフラグメントの例としては、制限されないが、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）およびＦ（ａｂ'）₂フラグメントがある。遺伝子工学技術によって製造された抗体フラグメントおよび誘導体も更に提供される。
本発明の単クローン性抗体としては、キメラ抗体、例えば、ネズミ単クローン性抗体のヒト化型がある。このようなヒト化抗体は、既知の技法によって製造することができ、しかも抗体をヒトに対して投与する場合に減少した免疫原性の利点を与える。一つの実施態様において、ヒト化単クローン性抗体抗体は、ネズミ抗体の可変部（またはちょうどその抗原結合部位）およびヒト抗体に由来する不変部を含む。或いは、ヒト化抗体フラグメントは、ネズミ単クローン性抗体の抗原結合部位およびヒト抗体に由来する（抗原結合部位を欠いた）可変部フラグメントを含んでいてよい。キメラおよび更に工学処理された単クローン性抗体の製造法としては、リーチマン（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ）ら（Ｎａｔｕｒｅ３３２：３２３，１９８８年）、リュー（Ｌｉｕ）ら（ＰＮＡＳ８４：３４３９，１９８７年）、ラリック（Ｌａｒｒｉｃｋ）ら（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ７：９３４，１９８９年）、並びにウィンター（Ｗｉｎｔｅｒ）およびハリス（Ｈａｒｒｉｓ）（ＴＩＰＳ１４：１３９，１９９３年５月）に記載されたものがある。
本発明の一つの実施態様は、細胞表面Ｆａｓ抗原に対するＦａｓ−Ｌの結合を阻止する単クローン性抗体に関する。単クローン性抗体は、Ｆａｓ抗原を有する細胞に対するＦａｓ−Ｌの結合を阻止する能力についての慣用的な検定においてスクリーニングすることができる。

Ｆａｓ−Ｌの性質および用途並びにＦａｓ−Ｌを結合する抗体
Ｆａｓ抗原は、アポトーシスを媒介することが報告されており、しかも自己反応性Ｔ細胞のクローン欠失においてある役割を果たしていると考えられる。（イトーら、Ｃｅｌｌ６６：２３３，１９９１年；ワタナベ−フクナガら、Ｎａｔｕｒｅ３５６：３１４，１９９２年）。ｌｐｒ突然変異を有するマウスは、アポトーシスシグナルを伝達することができる機能性Ｆａｓタンパク質を生産しない（ワタナベ−フクナガら、Ｎａｔｕｒｅ，上記）。これらのマウスは、リンパ節および脾臓におけるＣＤ４^-ＣＤ８^-胸腺細胞の蓄積、高γグロブリン血症、自己抗体生産、リウマチ様因子、関節炎並びに糸球体腎炎を特徴とするリンパ増殖性疾患を発症する（ワタナベ−フクナガら、Ｎａｔｕｒｅ、上記）。オルダーソンら（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７８：２２３１，１９９３年）は、ある種の形質転換された細胞系でのアポトーシスの誘導におけるある役割に加えて、Ｆａｓタンパク質は、正常Ｔ細胞の活性化および増殖において重要な役割を果たしうることを報告している。
したがって、本発明のＦａｓ−Ｌおよび抗Ｆａｓ−Ｌ抗体を用いる研究は、免疫系による自己寛容性の発現および自己免疫疾患の病因学を更に洞察させることができる。ＦａｓとＦａｓ−Ｌとの相互作用およびシグナル伝達の機序を研究することができる。抗体は、ＦａｓとＦａｓ−Ｌとの相互作用を阻止するのに用いることができる。Ｆａｓ−Ｌおよびそれと反応性の抗体は、Ｆａｓに対するＦａｓ−Ｌの結合によって媒介される生物学的作用を促進するまたは阻害するのにそれぞれ用いることができる。したがって、Ｆａｓ−Ｌおよび抗体を用いて、インビトロまたはインビボでのこのような生物学的作用を調節することができる。

本発明のＦａｓ−Ｌ ＤＮＡおよびタンパク質は、自己免疫疾患の病因学を解明する場合の探求手段として有用である。このような疾患としては、制限されないが、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、免疫芽細胞性リンパ節症（ＩＢＬ）、血管免疫芽細胞性リンパ節症（ＡＩＬ）、リンパ肉芽腫症Ｘ（ＬｇＸ）、慢性関節リウマチ、糖尿病、多発性硬化症およびアレルギーがある。対宿主性移植片病を治療する場合のＦａｓ−Ｌの使用もまた探求されうる。
Ｆａｓ−Ｌは、Ｆａｓ抗原を有する細胞においてアポトーシスを誘導するのに用いることができる。したがって、Ｆａｓ−Ｌは、アポトーシスが起こる機序の研究において有用な探求試薬である。
本発明のＦａｓ−Ｌは、Ｆａｓ−Ｌによって（直接的にまたは間接的に）媒介される疾患の治療法を開発する場合に用いることができる。或いは、治療的有効量の精製Ｆａｓ−Ｌタンパク質を、不完全なすなわち不十分な量のＦａｓ−Ｌによって引き起こされた疾患に冒された患者に対して投与することができる。更に代わるものとして、Ｆａｓ−ＬＤＮＡ配列を、このような疾患の治療に対する遺伝子療法の開発に用いることができる。
本発明は、精製Ｆａｓ−Ｌおよび生理学的に許容しうる担体、希釈剤または賦形剤を含む薬剤組成物を提供する。このような担体、賦形剤および希釈剤は、用いられる用量および濃度において受容者に対して無毒性である。このような組成物は、緩衝剤；酸化防止剤、例えばアスコルビン酸；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質；アミノ酸；グルコース、スクロースまたはデキストリンを含めた炭水化物；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；グルタチオン；並びに薬剤組成物中で一般的に用いられる他の安定化剤および賦形剤を含んでいてよい。中性緩衝食塩水または同種血清アルブミンと混合された食塩水は、典型的で適当な希釈剤である。組成物は、希釈剤として適当な賦形剤溶液（例えば、スクロース）を用いて凍結乾燥物として配合することができる。適当な担体およびそれらの配合物の更に別の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ′ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１６版，１９８０年，マック・パブリシング・カンパニー（Ｍａｃｋ ＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ）に記載されている。適当な投与量および投与回数は、当然ながら、治療されている症状の性状および苛酷さ、所望の反応、患者の体格および状態等の因子に依る。

治療的使用には、本発明の精製タンパク質を患者、好ましくはヒトに対してその症状に適切な方法での処置のために投与する。したがって、例えば、薬剤組成物は、ボーラス注射、連続注入、植込み錠からの徐放または他の適当な技法によって投与することができる。
薬剤組成物中で用いられるＦａｓ−Ｌタンパク質は、好ましくは、Ｆａｓ−Ｌタンパク質が天然または内因性由来の他のタンパク質を実質的に含まないように、望ましくは、製造工程の残留タンパク質混入物含量が約１質量％未満であるように精製される。このような組成物は、しかしながら、安定化剤、担体、賦形剤または共治療薬として加えられた他のタンパク質を含むことがある。Ｆａｓ−Ｌタンパク質は、好ましくは、実質的に均一になるまで精製される、すなわち、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析された場合に単一タンパク質バンドとして検出される。

本発明のＦａｓ−Ｌポリペプチドは、更に、Ｆａｓ若しくはＦａｓ−Ｌまたはそれらの相互作用の検出のためのインビトロ検定において用いることができる。
本発明のＦａｓ−Ｌは、Ｆａｓを発現する細胞を検出する結合検定において用いることができる。例えば、Ｆａｓ−Ｌ若しくは細胞外ドメインまたはそのフラグメントを、¹²⁵Ｉなどの検出可能な残基に対して結合することができる。¹²⁵Ｉによる放射性標識は、高比活性に標識された機能性¹²⁵Ｉ−Ｆａｓ−Ｌ分子を生じるいくつかの標準的な方法論のいずれによっても達成されうる。或いは、別の検出可能な残基、例えば、比色または蛍光分析反応を触媒しうる酵素、ビオチンまたはアビジンを用いることができる。Ｆａｓ発現について検査される細胞は、標識Ｆａｓ−Ｌと接触させることができる。インキュベーション後、結合していない標識Ｆａｓ−Ｌを除去し、そして検出可能な残基を用いて結合を測定する。

本明細書中で開示されたＦａｓリガンドタンパク質はまた、Ｆａｓ−Ｌに対する結合親和性によってＦａｓタンパク質の生物学的活性を測定するのに用いることができる。例証するために、異なる温度で貯蔵されたまたは異なる細胞種で生産されたＦａｓタンパク質の生物学的活性を測定する結合親和性実験においてＦａｓ−Ｌを用いることができる。したがって、Ｆａｓタンパク質の生物学的活性は、例えば、研究実験においてそれを用いる前に確認することができる。
Ｆａｓ−Ｌタンパク質は、「品質保証」実験の実施者が、例えば、異なる条件下においてＦａｓタンパク質の保存寿命および安定性を監視するのに用いることができる試薬として用いられる。Ｆａｓリガンドは、Ｆａｓタンパク質の修飾（例えば、化学的修飾、切断、突然変異等）後に生物学的活性が保持されているかどうかを確認するのに用いることができる。修飾されたＦａｓタンパク質のＦａｓ−Ｌに対する結合親和性を、非修飾Ｆａｓタンパク質のそれと比較して、Ｆａｓの生物学的活性に対する修飾の何等かの悪影響を検出する。
Ｆａｓリガンドの別の用途は、タンパク質精製法における試薬としてである。
Ｆａｓ−ＬまたはＦａｓ−Ｌ／Ｆｃ融合タンパク質を慣用的な技法によって固体支持体基質に対して結合させ且つ用いて、アフィニティークロマトグラフィーによってＦａｓを精製することができる。本発明の抗体は、例えば、Ｆａｓ−Ｌの生物学的活性を阻害する作用を研究するのに、インビトロまたはインビボでＦａｓ−Ｌの存在を検出するのに、そしてＦａｓ−Ｌを精製するアフィニティークロマトグラフィーにおいて用いることができる。本発明の抗体もまた、Ｆａｓ抗原含有細胞のＦａｓ−Ｌに媒介されたアポトーシスの阻害が望まれる場合に用いられる。細胞上のＦａｓ抗原に対する内因性Ｆａｓ−Ｌの結合を阻止する抗体（好ましくは、単クローン性抗体）をこの目的に用いる。一つの実施態様において、抗体は細胞表面Ｆａｓ−Ｌに対して結合し、そして標的細胞上のＦａｓ抗原に対する細胞表面Ｆａｓ−Ｌの結合を阻害する。

本発明の一つの実施態様は、Ｆａｓ−ＬおよびＦａｓの相互作用によって媒介された疾患を治療する方法であって、Ｆａｓに対するＦａｓ−Ｌの結合を阻害する治療的有効量の抗体および適当な希釈剤または担体を含む組成物を、該疾患に冒された患者に対して投与することを含む上記方法に関する。好ましくは、抗体は単クローン性抗体である。本発明のＦａｓ−Ｌ特異的抗体による治療的処置が有益でありうる疾患としては、制限されないが、ＳＬＥ、慢性関節リウマチ、ライム病、特発性ＣＤ４⁺Ｔリンパ球減少症、およびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染作用がある。
活性ヒトＴ細胞は、活性化誘導細胞死（ＡＣＩＤ）と称される過程である、ＣＤ３／Ｔ細胞受容体複合体によって引き起こされるプログラム化された細胞死（アポトーシス）が起こるように誘導される。ＡＩＣＤは、ＨＩＶ感染者から単離されたばかりのＴ細胞において見られたが、ＨＩＶ非感染者には見られなかった（グロークス（Ｇｒｏｕｘ）ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７５：３３１，１９９２年；マイアード（Ｍｅｙａａｒｄ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５７：２１７，１９９２年）。したがって、アポトーシスは、ＨＩＶ感染者におけるＣＤ４⁺Ｔ細胞の減少およびＡＩＤＳへの進行においてある役割を果たしているかもしれない。
ＨＩＶ感染でのＴ細胞減少においてＦａｓ−Ｌがある役割を果たすためには、二つの判定基準を満たす必要がある。第一に、Ｆａｓ−Ｌが発現される必要があり、したがって、Ｔ細胞は抗原に対する暴露によって活性化される必要がある。
第二に、Ｔ細胞は「感作」されて、Ｆａｓに媒介されたアポトーシスに対して感受性になる必要がある。ＨＩＶ⁺患者において、Ｔ細胞のこのような感作は、ＧＰ−１２０／抗ＧＰ−１２０複合体によるＣＤ４の架橋から生じることがある。
このような複合体は、インビトロでＡＩＣＤが起こるように正常ＣＤ４⁺Ｔ細胞を感作することおよびヒトＣＤ４トランスジーンを発現するマウスにおいてＴ細胞にアポトーシスを起こさせることが分かっている（ワン（Ｗａｎｇ）ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２４：１５５３，１９９４年）。更に、ＣＤ４⁺Ｔ細胞は、ＣＤ４に対する抗体によって処置されたマウスにおいてアポトーシス細胞死を起こすが、この現象は、Ｆａｓ欠乏ＬＰＲマウスでは起こらない（ワンら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２４：１５４９，１９９４年）。活性化された正常ヒトＴ細胞（例えば、ＰＬ−１細胞）においておよびＨＩＶ⁺患者から単離されたばかりのＴ細胞において見られるＡＩＣＤは、定性的に同一である。したがって、Ｆａｓ−ＬとＦａｓとの相互作用を阻害する抗体を用いるＨＩＶ感染患者に対する治療的介入は可能でありうる。
治療的使用には、本発明の精製抗体を、ヒトなどの患者に対してその症状に適切な方法での処置のために投与する。Ｆａｓ−Ｌを結合する抗体および適当な希釈剤または担体を含む組成物を本明細書中において提供する。適当な組成物の希釈剤、担体および他の成分は上記に記載の通りである。一つの実施態様において、薬剤組成物は、細胞表面Ｆａｓ抗原に対するＦａｓ−Ｌの結合を阻害する治療的有効量の単クローン性抗体および適当な希釈剤または担体を含む。

核酸フラグメント
本発明は、更に、本明細書中で示されたＦａｓ−Ｌヌクレオチド配列のフラグメントを提供する。一つの実施態様において、このようなフラグメントは、実施例１で単離された（そしてＡＴＣＣ６９５２７として寄託された）ヒトＦａｓ−ＬｃＤＮＡの少なくとも１４個の連続したヌクレオチドを含む。このようなフラグメントは、配列番号：１のＤＮＡ配列のコーディング領域の少なくとも１４個のヌクレオチドを含むことができる。本明細書中において、該フラグメントのＤＮＡおよびＲＮＡ相補体を、一本鎖および二本鎖両方の形のＦａｓ−ＬＤＮＡと一緒に提供する。
このようなＦａｓ−Ｌ核酸フラグメントの用途には、プローブとしての使用がある。一つの例として、Ｆａｓ−Ｌの細胞外ドメインに対応するプローブを用いることができる。該プローブは、インビトロ検定で並びにノーザンおよびサザンブロットのような方法でＦａｓ−Ｌ核酸の存在を検出する場合に用いられる。Ｆａｓ−Ｌを発現する細胞種も同定することができる。このような方法は周知であり、そして当業者は、具体的な目的の用途に応じて、適当な長さのプローブを選択することができる。
Ｆａｓ−Ｌ核酸の他の有用なフラグメントは、標的Ｆａｓ−Ｌ ｍＲＮＡ（センス）またはＦａｓ−Ｌ ＤＮＡ（アンチセンス）配列に対して結合することができる一本鎖核酸配列（ＲＮＡかまたはＤＮＡ）を含むアンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドである。アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドは、本発明により、Ｆａｓ−ＬｃＤＮＡのコーディング領域のフラグメントを含む。このようなフラグメントは、概して、少なくとも１４個のヌクレオチド、好ましくは約１４〜約３０個のヌクレオチドを含む。ある与えられたタンパク質のｃＤＮＡ配列に基いてアンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドを生成する方法は、例えば、スタイン（Ｓｔｅｉｎ）およびコーエン（Ｃｏｈｅｎ）、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．４８：２６５９，１９８８年およびファン・デア・クロル（ｖａｎｄｅｒ Ｋｒｏｌ）ら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ６：９５８，１９８８年に記載されている。

標的核酸配列に対するアンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドの結合は、二重らせんの促進された分解、転写若しくは翻訳の未成熟終結を含むいくつかの手段の一つによってまたは他の手段によって翻訳（ＲＮＡ）または転写（ＤＮＡ）を阻止する二重らせんの形成を引き起こす。したがって、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて、Ｆａｓ−Ｌタンパク質の発現を阻止することができる。アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドは、修飾された糖−ホスホジエステル主鎖（または他の糖結合、例えば、ＷＯ９１／０６６２９号明細書に記載のもの）を有するオリゴヌクレオチドを更に含み、そしてここにおいて該糖結合は内因性ヌクレアーゼに対して耐性である。耐性の糖結合を有するこのようなオリゴヌクレオチドはインビボで安定である（すなわち、酵素分解に耐えられる）が、標的ヌクレオチド配列に対して結合することができるように配列特異性を保持している。センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドの他の例としては、ＷＯ９０／１０４４８号明細書に記載のような有機部分、並びにポリ（Ｌ−リシン）などの標的核酸配列に対するオリゴヌクレオチドの親和性を増加させるようなその他の部分に対して共有結合しているオリゴヌクレオチドがある。また更に、エリプティシンなどの挿入剤およびアルキル化剤または金属錯体をセンスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドに対して結合して、標的ヌクレオチド配列に対するアンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドの結合特異性を変更することができる。アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、ＣａｐＯ₄に媒介されたＤＮＡトランスフェクション、エレクトロポレーション、またはエプスタイン・バールウイルスなどの他の遺伝子転移ベクターを含む任意の遺伝子転移法によって、標的核酸配列を含む細胞中に導入することができる。好ましくは、アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドを、適当なレトロウイルスベクター中にアンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドを挿入することにより、標的核酸配列を含む細胞中に導入した後、該挿入された配列を含むレトロウイルスベクターと該細胞とをインビボでかまたはエクスビボ（ｅｘｖｉｖｏ）で接触させる。適当なレトロウイルスベクターとしては、制限されないが、ネズミレトロウイルスＭ−ＭｕＬＶ、Ｎ２（Ｍ−ＭｕＬＶに由来するレトロウイルス）、またはＤＣＴ５Ａ、ＤＣＴ５ＢおよびＤＣＴ５Ｃと称する二重コピーベクターがある（ＰＣＴ出願ＷＯ９０／１３６４１号明細書を参照されたい）。或いは、他のプロモーター配列を用いてオリゴヌクレオチドを発現させることができる。

センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドもまた、ＷＯ９１／０４７５３号明細書に記載のように、リガンド結合分子との結合体の生成により、標的ヌクレオチド配列を含む細胞中に導入することができる。適当なリガンド結合分子としては、制限されないが、細胞表面受容体、成長因子、他のサイトカイン、または細胞表面受容体に対して結合する他のリガンドがある。好ましくは、リガンド結合分子の結合は、リガンド結合分子の対応する分子または受容体に対して結合するその能力をほとんど妨げないし、或いはセンス若しくはアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその結合型の細胞中への侵入を阻止しない。
或いは、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＷＯ９０／１０４４８号明細書に記載のように、オリゴヌクレオチド−脂質複合体の生成により、標的核酸配列を含む細胞中に導入することができる。センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド−脂質複合体は、好ましくは、内因性リパーゼによって細胞中で分離する。

以下の実施例は、具体的な実施態様を例証するために与えられ、発明の範囲を制限するためではない。
実施例１：ネズミ(マウス）Ｆａｓ−Ｌ ＤＮＡの単離
ネズミＦａｓ−Ｌ ＤＮＡの１８０ｂｐフラグメントを、以下のようにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって単離した。ＰＣＲでの鋳型は、ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ，シグマ・ケミカル・カンパニー（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．））によって１８時間剌激されたネズミ末梢血リンパ球（ＰＢＬ）に由来するＲＮＡから製造されたｃＤＮＡであった。
５′および３′プライマーは、スダ（Ｓｕｄａ）ら（Ｃｅｌｌ，７５：１１６９，１９９３年）のラットＦａｓ−ＬＤＮＡ配列に基くオリゴヌクレオチドであった。該プライマーは、Ｆａｓ−ＬＤＮＡの３′末端付近の１８０ｂｐフラグメントを規定する。ＰＣＲは慣用法によって行われた。例えば、サイキ（Ｓａｉｋｉ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２３９：４８７（１９８８）；ＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＤＮＡ Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ，ウー（Ｗｕ）ら監修、アカデミック・プレス・インコーポレーテッド（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．），サン・ディエゴ（１９８９），１８９〜１９６頁；およびＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，イニス（Ｉｎｎｉｓ）ら監修，アカデミック・プレス・インコーポレーテッド（１９９０）を参照されたい。
ＰＣＲによって単離され且つ増幅された１８０ｂｐネズミＦａｓ−Ｌ ＤＮＡフラグメントは、配列番号：４で示されたネズミＦａｓ−Ｌ ＤＮＡ配列のヌクレオチド６４３〜８２２を含んでいた。このＤＮＡフラグメントをプローブとして用いるために³²Ｐによって標識した。ランダムプライムドＤＮＡ標識付けキット（アマーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、アーリントン・ハイツ，イリノイ州）を用いてプローブに放射性標識を付けた。

完全長さのネズミＦａｓ−Ｌ ＤＮＡを以下のように単離した。ＳＣ９と称するネズミハイブリドーマ細胞系を、Ｔ細胞ハイブリドーマ細胞系ＢＷ５１４７と、リンチ（Ｌｙｎｃｈ）．Ｄ．およびＲ．ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：３１，１９９４年）によって記載された∝Ｂ１０．５ＣＴＬ系との融合によって生成した。∝Ｂ１０．５ＣＴＬ細胞を、融合の前にＰＭＡおよびイオノマイシンによって刺激した（ＰＭＡ５００ｎｇ／ｍｌおよびイオノマイシン３μｇ／ｍｌ中において37℃で２時間培養した）。ＳＣ９ハイブリドーマ細胞系をＦａｓ−Ｌ発現について選択した。簡単にいうと、融合から得られた細胞のＦａｓ−Ｌ発現について、可溶性Ｆａｓ／Ｆｃ融合タンパク質に対する結合の検定を含めて検定した。ＳＣ９を、Ｆａｓ／Ｆｃに対する細胞結合に基いて、蛍光活性細胞選別（ＦＡＣＳ）によって単離した。
ＳＣ９細胞を上記のようにＰＭＡおよびイオノマイシンによって刺激し、そしてＲＮＡをそこから抽出した。ｃＤＮＡを慣用的な技法によってＲＮＡから製造し、そしてファージベクターλｇｔ１０中に挿入し且つ包括させた（ギガパク（Ｇｉｇａｐａｋ）^Rストラタジーン・クローニング・システムズ（ＳｔｒａｔａｇｅｎｅＣｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ），ラホヤ，ＣＡ）。得られたｃＤＮＡライブラリーを、プローブとして上記で製造された１８０ｂｐネズミＦａｓ−ＬＤＮＡフラグメントを用いてスクリーニングした。
正のクローンを単離し、そしてｃＤＮＡインサートのヌクレオチド配列を決定した。このネズミＦａｓ−Ｌヌクレオチド配列を配列番号：４で示し、そしてそれによってコードされたアミノ酸配列を配列番号：５で示す。タンパク質は細胞質ドメイン（アミノ酸１〜７８）、貫膜部分（アミノ酸７９〜１０３）および細胞外ドメイン（アミノ酸１０４〜２７９）を含む。

実施例２：ヒトＦａｓ−Ｌ ＤＮＡの単離
ヒトＦａｓ−Ｌ ｃＤＮＡを、刺激されたヒト末梢血リンパ球に由来するｃＤＮＡライブラリーから単離した。手順は以下の通りであった。
末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を正常なヒト志願者から入手し、そしてＯＫＴ３（抗ＣＤ３抗体）１０ｎｇ／ｍｌおよびヒトＩＬ−２１０ｎｇ／ｍｌによって６日間処理した。ＰＢＬ細胞を洗浄し且つイオノマイシン（カルビオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ））５００ｎｇ／ｍｌおよびＰＭＡ１０ｎｇ／ｍｌによって４時間刺激した。メッセンジャーＲＮＡを、剌激されたＰＢＬ細胞から単離した。
ｍＲＮＡ鋳型で合成されたｃＤＮＡを、製造者の指示にしたがって、λｇｔ１０ファージベクター（ギガパク^Rストラタジーン・クローニング・システムズ、ラホヤ，ＣＡ）中に包括させた。次に、組換え体ファージを大腸菌菌株ＫＷ２５１上でプレーティングし且つ標準的なプラークハイブリッド形成技術を用いてスクリーニングした。

実施例１で製造された³²Ｐ標識１８０ｂｐネズミＦａｓ−Ｌプローブを、組換えＤＮＡに対して３７℃で一晩中ハイブリッド形成した。ハイブリッド形成の後、６ＸＳＳＣによって室温で２回洗浄した後、２ＸＳＳＣ／０．１％ＳＤＳによって５５℃で２回洗浄した。正の（ハイブリッド形成）プラークをオートラジオグラフィーによって可視化した。
正のプラーク２個を精製し、そしてインサートをＰＣＲによって増幅させた。
クローニング部位（ｃＤＮＡが挿入されたλｇｔ１０のＥｃｏＲＩ部位）に隣接するオリゴヌクレオチドをＰＣＲのためのプライマーとして用いた。両方の正のプラークからの組換え体ファージのｃＤＮＡインサートの長さは約２．０ｋｂであった。一つのクローンからのＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩによって消化し、そして（ｃＤＮＡインサートを含む）所望のフラグメントをＥｃｏＲＩ消化クローニングベクターｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ^RＳＫ（ストラタジーン・クローニング・システムズ，ラホヤ，ＣＡ）中に連結させた。得られた組換えベクター（ヒトＦａｓ−Ｌ／ｐＢＳと称する）を含む大腸菌菌株ＤＨ５α細胞は、１９９４年１月５日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託され且つ受託番号ＡＴＣＣ６９５２７と指定された。寄託はブダペスト条約の条件に基いて行われた。
このヒトＦａｓ−Ｌ ＤＮＡのＤＮＡ配列を配列番号：１で表わす。単離されたＤＮＡによってコードされたアミノ酸配列を配列番号：２で表わす。このヒトＦａｓ−Ｌタンパク質は、Ｎ末端細胞質ドメイン（アミノ酸１〜８０）、貫膜部分（アミノ酸８１〜１０５）および細胞外ドメイン（アミノ酸１０６〜２８１）を含む。当業者に理解されるように、貫膜部分は、疎水性ドメインの種類を識別するための慣用的な判定基準によって識別される。貫膜部分の正確な境界は、上記に示されたものとは僅かに（おそらく両末端の５個までのアミノ酸）異なることがある。タンパク質中のこのような疎水性部分を識別するのに有用なコンピュータープログラムが入手可能である。

ヒトＦａｓ−Ｌ コーディング領域ＤＮＡ配列（配列番号：１のヌクレオチド９３〜９３８）は、スダら（Ｃｅｌｌ，７５：１１６９，１９９３年）で示されたラットＦａｓ−Ｌコーディング領域ＤＮＡ配列と８２．８９％一致する。配列番号：２のヒトＦａｓ−Ｌアミノ酸配列は、ラットＦａｓ−Ｌのそれと７７．９８％一致する。ヒトとラットとの間の相同度は、本明細書中で開示されたヒトＦａｓ−ＬｃＤＮＡが単離される前には知られても断定されてもいなかった。
ヒトＦａｓ−Ｌ ｃＤＮＡは、ＳａｌＩおよびＮｏｔＩによる消化によってｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ^RＳＫから切断された。所望のフラグメントを単離し、そしてＳａｌＩおよびＮｏｔＩによって消化された哺乳動物発現ベクターｐＤＣ４０９中に連結した。
ｐＤＣ４０９はｐＤＣ４０６と称する発現ベクターに由来するが、ｍｃｓを除くＢｇｌＩＩ部位を欠失した結果としてｍｃｓＢｇｌＩＩ部位が独特であるという点でｐＤＣ４０６とは異なる。２個のＰｍｅ１部位および１個のＳｒｆ１部位をｍｃｓに対して加え、そして３個の停止コドン（ＴＡＧ）を、三つの読み枠全部で機能するようにｍｃｓの下流に配置した。Ｔ７プライマー／プロモーターを加えて、ＤＮＡ配列順序決定工程を促進した。
プラスミドｐＤＣ４０６は、マクマーンら（ＥＭＢＯＪ．１０：２８２１，１９９１年）によっておよびＰＣＴ出願ＷＯ９１／１８９８２（本明細書によって援用される）で記載されており、哺乳動物細胞で用いるための発現ベクターであるが、大腸菌細胞においても複製可能である。

ｐＤＣ４０６は、ＳＶ４０、エプスタイン・バールウイルスおよびｐＢＲ３２２に由来する複製起点を含み、ダウアー（Ｄｏｗｅｒ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４２：４３１４（１９８９）によって記載されたＨＡＶ−ＥＯの誘導体である。ｐＤＣ４０６は、ＨＡＶ−ＥＯ中のアデノウイルス２の３部分リーダー配列中に存在するイントロンの欠失によってＨＡＶ−ＥＯとは異なる。多クローニング部位（多数の制限エンドヌクレアーゼ開裂部位を含む）中に挿入されたＤＮＡは、ＨＩＶおよびアデノウイルスに由来する調節要素を用いて転写され且つ翻訳される。ベクターは、アンピシリン耐性を与える遺伝子を含む。
組換えベクター（ヒトＦａｓ−Ｌ ＤＮＡを含むｐＤＣ４０９）を、サル腎細胞系ＣＶ−１／ＥＢＮＡ−１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １０４７８）中にトランスフェクションさせた。ＣＶ−１／ＥＢＮＡ細胞系は、マクマーンら、上記によって記載されたように、ヒトＣＭＶ中間体−初期エンハンサー／プロモーターに由来するエプスタイン・バールウイルス核抗原−１（ＥＢＮＡ−１）を構成的に発現するＥＢＮＡ−１をコードしている遺伝子によるＣＶ−１細胞系（ＡＴＣＣＣＣＬ ７０）のトランスフェクションによって誘導された。ＥＢＮＡ−１遺伝子は、ＥＢＶ複製起点を有するｐＤＣ４０９などの発現ベクターのエピソーム複製を可能にする。
組換えベクターによって形質転換されたＣＶ１−ＥＢＮＡ−１細胞をローラーボトル中で培養して、Ｆａｓ−Ｌタンパク質の発現を可能にした。他の適当な哺乳動物発現ベクターをｐＤＣ４０９の代わりに置換えてよい。

実施例３
この実施例は、Ｆａｓ−Ｌに対する単クローン性抗体の製造を例証する。Ｆａｓ−Ｌを、ＣＯＳ−７またはＣＶＩ−ＥＢＮＡ細胞などの哺乳動物宿主細胞中で発現させ、そして本明細書中に記載のＦａｓ／Ｆｃアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製する。Ｆａｓ−Ｌは、本明細書中に記載のヒト若しくはネズミＦａｓ−Ｌであってよいし、またはそれらの免疫原性フラグメント、例えば、それらの細胞外ドメインであってよい。
精製Ｆａｓ−Ｌは、慣用的な技法、例えば、米国特許第４，４１１，９９３号明細書に記載された技法を用いて、Ｆａｓ−Ｌに対する単クローン性抗体を生成するのに用いることができる。簡単にいうと、完全フロイントアジュバント中に乳化したＦａｓ−Ｌを免疫原として用いてマウスを免疫感作し且つ１０〜１００μｇの量を皮下または腹腔内に注射した。１０〜１２日後、免疫感作された被験動物を、不完全フロイントアジュバント中に乳化した追加のＦａｓ−Ｌによって追加免疫する。引続き、毎週〜隔週免疫感作スケジュールでマウスに定期的に追加免疫する。血清試料は、Ｆａｓ−Ｌ抗体についてのドットプロット検定またはエリザ（ＥＬＩＳＡ）（酵素結合イムノソルベント検定法）によって試験するために、後眼窩出血または尾先端切断によって定期的に得られた。
適当な抗体力価の検出後、陽性の動物に食塩水中のＦａｓ−Ｌの最後の静脈内注射を１回行う。３〜４日後、被験動物を屠殺し、脾臓細胞を採取し、そして脾臓細胞をネズミ骨髄腫細胞系（例えば、ＮＳ１またはＡｇ８．６５３）に対して融合させる。融合は、ハイブリドーマ細胞を生成し、それを多数の微量滴定プレート中のＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン）選択培地中でプレーティングして、非融合細胞、骨髄腫ハイブリッドおよび脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害する。
ハイブリドーマ細胞の精製Ｆａｓ−Ｌに対する反応性を、エングバル（Ｅｎｇｖａｌｌ）ら、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ．８：８７１，１９７１年および米国特許第４，７０３，００４号明細書で開示された技法の適応により、エリザによってスクリーニングした。正のハイブリドーマ細胞を、同系ＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔内注射して、高濃度の抗Ｆａｓ−Ｌ単クローン性抗体を含む腹水を生じることができる。或いは、ハイブリドーマ細胞をフラスコまたはローラーボトル中において種々の技法によってインビトロ増殖させることができる。マウス腹水中で生産された単クローン性抗体は、硫酸アンモニウム沈降に続いてゲル排除クロマトグラフィーによって精製することができる。或いは、プロテインＡまたはプロテインＧに対する抗体の結合に基くアフィニティークロマトグラフィーもまた、Ｆａｓ−Ｌに対する結合に基くアフィニティークロマトグラフィーの場合と同様に用いることができる。

配列表および配列表の配列番号1の配列の一部を示す図である。 配列表の配列番号１の配列の一部を示す図である。 配列表の配列番号１の配列の一部および配列番号２の配列の一部を示す図である。 配列表の配列番号２の配列の一部を示す図である。 配列表の配列番号３の配列および配列番号４の一部を示す図である。 配列表の配列番号４の配列の一部を示す図である。 配列表の配列番号４の配列の一部および配列番号５の配列の一部を示す図である。 配列表の配列番号５の配列の一部を示す図である。

Claims (15)

1. 配列番号：５の残基１〜２７９のアミノ酸配列を含むマウスＦａｓ−Ｌポリペプチドをコードする単離ＤＮＡ。
2. 前記ＤＮＡが、配列番号：４の残基３１〜８６７のヌクレオチド配列を含む請求項1に記載の単離ＤＮＡ。
3. 配列番号：５の残基１０４〜２７９のアミノ酸配列を含む可溶性マウスＦａｓ−Ｌポリペプチドをコードする単離ＤＮＡ。
4. 前記ＤＮＡが、配列番号：４の残基３４０〜８６７のヌクレオチド配列を含む請求項３に記載の単離ＤＮＡ。
5. 請求項１〜４のいずれかに記載のＤＮＡを含む発現ベクター。
6. 請求項５に記載のベクターによって形質転換された宿主細胞を培養し、培養物からＦａｓ−Ｌポリペプチドを回収するマウスＦａｓ−Ｌポリペプチドを製造する方法。
7. 配列番号５の残基１〜２７９のアミノ酸配列を含む精製されたマウスＦａｓ−Ｌポリペプチド。
8. 配列番号５の残基１０４〜２７９のアミノ酸配列を含む可溶性マウスＦａｓ−Ｌポリペプチド。
9. 請求項７または８に記載のポリペプチドを含むＦａｓ−Ｌポリペプチドのオリゴマー。
10. 請求項７または８に記載のポリペプチドの二量体または三量体である請求項９に記載のオリゴマー。
11. Ｆａｓ−Ｌと抗体のＦｃ領域とを融合して作られる、または、スペーサーアミノ酸結合基の存在下、または不存在下に、融合タンパク質として発現される、２以上のＦａｓ−Ｌポリペプチドのシステイン残基間のジスルフィド結合によって形成される請求項９または１０に記載のオリゴマー。
12. ラットＦａｓ−Ｌポリペプチドおよび配列番号：２の残基１５２〜２８１のアミノ酸配列からなるヒトＦａｓ−Ｌポリペプチドと免疫反応する抗体を除く、請求項７または８に記載のＦａｓ−Ｌポリペプチドと免疫反応性の抗体。
13. 前記抗体が単クローン性抗体である請求項１２に記載の抗体。
14. 配列番号：４のコーディンク領域の少なくとも１４個のヌクレオチドを含む単離核酸分子またはそのＤＮＡ若しくはＲＮＡ相補体。
15. 請求項７または８に記載のＦａｓ−ＬポリペプチドまたはそれをコードするＤＮＡをＦａｓ−Ｌによって直接または間接に媒介される疾患の診断治療薬または治療の開発に用いる方法。

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