CN105567679A

CN105567679A - 可分泌型trail蛋白构建物和表达载体

Info

Publication number: CN105567679A
Application number: CN201410531197.1A
Authority: CN
Inventors: 徐明恺; 周晋; 胡祥; 刘沐芸; 丁长才
Original assignee: Shenzhen Beike Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Shenzhen Beike Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2014-10-10
Filing date: 2014-10-10
Publication date: 2016-05-11
Anticipated expiration: 2034-10-10
Also published as: CN105567679B

Abstract

本发明提供了一种可分泌型TRAIL蛋白构建物和其表达载体。本发明还提供了生产TRAIL蛋白的方法。本发明的慢病毒表达载体可将表达的TRAIL蛋白分泌至宿主细胞外的培养液中，便于收集和纯化，以及更有效地在需要TRAIL蛋白的个体的体内发挥TRAIL蛋白的生理生化作用。

Description

可分泌型TRAIL蛋白构建物和表达载体

技术领域

本发明涉及基因重组和蛋白表达领域。本发明提供了一种可分泌型TRAIL蛋白构建物和其表达载体，具体的，提供了一种可表达分泌型TRAIL蛋白构建物和慢病毒表达载体。本发明的慢病毒表达载体可在宿主细胞中表达TRAIL蛋白分子，并可将表达的TRAIL蛋白分泌至宿主细胞外的培养液中，便于收集和纯化，以及更有效地在需要TRAIL蛋白的个体的体内发挥TRAIL蛋白的生理生化作用。

背景技术

癌症和恶性肿瘤已经成为严重威胁人类健康的最主要疾病之一，每年的发病率和死亡率都在逐渐攀升，世界各个国家的卫生组织，都对癌症和恶性肿瘤给予越来越多的关注。目前对于癌症和恶性肿瘤的治疗中，化疗、放疗和手术治疗依然是临床最常使用的主要手段。手术治疗受病灶部位限制，而化疗和放疗的副作用显著，不仅对肿瘤细胞产生抑制，也对正常细胞和组织产生严重杀伤作用，因此临床使用上受到严重限制。需要新的有效的低副作用的抗肿瘤制剂出现。

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TumorNecrosisFactor-RelatedApoptosis-InducingLigand,TRAIL)是肿瘤坏死因子超家族中的一员。参见WO97/33899和Wiley,S.R.等，Immunity3:673-682(1995)。TRAIL主要通过与细胞表面的死亡受体(DR4和DR5)结合，启动外源性凋亡途径，从而诱导肿瘤细胞产生凋亡。并且，该凋亡诱导活性主要是针对肿瘤细胞，而对正常细胞不产生杀伤作用，因此具有一定肿瘤特异性。获得TRAIL蛋白最经济的方式是基因工程表达纯化，目前多用的表达系统包括大肠杆菌原核表达系统和细胞真核表达系统。由于TRAIL蛋白是哺乳动物起源，因此真核细胞表达系统具有更好的兼容性。

真核细胞表达TRAIL蛋白过程中有两个问题需要解决。1.TRAIL的可分泌性：一般的真核细胞表达载体缺乏有效的分泌型信号肽序列，不能将表达的目的蛋白输送到细胞外培养基当中去，而是累积在细胞内部，一方面影响了目的蛋白的积累，另一方面也为后续分离纯化过程增加了困难。2.构建的基因工程细胞基因稳定性：普通真核细胞表达载体，将目的基因片段带入宿主细胞基因组中后，并不能稳定存在，目的基因随着宿主细胞传代分裂过程会逐渐丢失，因此需要不断的抗生素选择和单克隆细胞筛选。

本领域仍需要更好的在体内或体外表达TRAIL蛋白的表达载体。

发明内容

本发明提供了一种用于构建可分泌型TRAIL蛋白表达载体的核苷酸构建体。本发明还提供了可表达分泌型TRAIL蛋白的表达载体，该载体可稳定的转染哺乳动物宿主细胞，并可将表达的TRAIL蛋白分泌到宿主细胞外的细胞培养液中，便于后续的收集，分离和纯化。

本发明提供了一种核苷酸分子，其包括如SEQIDNO：1所示序列中第7-930位的核苷酸序列。其中，SEQIDNO：1的第91-930位的核苷酸序列编码TRAIL蛋白。本发明的所述核苷酸分子为DNA构建体，具体的，为可分泌型TRAIL表达构建体，可用于插入到合适的载体中，形成表达可分泌型TRAIL蛋白的表达载体。在本发明的其中一个方面，本发明的核苷酸分子的核苷酸序列为如SEQIDNO：1的第7-930位所示。

氨基酸是由多核苷酸编码的。多核苷酸中的信使RNA链上决定一个氨基酸的相邻的三个碱基叫做一个“密码子”，亦称三联体密码。同一种氨基酸可以由几个不同的密码子来决定。本发明的核苷酸分子还包括其核酸序列中的对应SEQIDNO：1的第91-930位编码TRAIL蛋白的核酸序列与SEQIDNO：1的第91-930位不同，但符合氨基酸编码简并性，也可表达SEQIDNO：1的第91-930位编码的TRAIL蛋白的核苷酸分子。

本发明的核苷酸分子还包括其核酸序列中的对应SEQIDNO：1的第91-930位的核酸序列与SEQIDNO：1的第91-930位不同，但可编码与SEQIDNO：1的核苷酸序列中第91-930位编码的TRAIL蛋白具有相同或相似的活性的蛋白的核苷酸分子，所述具有相同或相似的活性的蛋白与SEQIDNO：1的核苷酸序列中第91-930位编码的TRAIL蛋白比较，在其氨基酸序列中可引入了一个或几个氨基酸的取代、缺失、插入、增加或倒位后所得的氨基酸序列，但保持和具有TRAIL蛋白的活性。

本发明还提供了一种含有上述本发明的核苷酸分子的载体。所述载体可为能够独立复制并具有选择标记的载体，如质粒、噬菌体和病毒等。根据载体的性质不同，可采用转染、转化、转导等方式，将重组DNA分子导入宿主细胞内，并使其大量繁殖。合适的基因工程宿主是本领域公知的，可以是大肠杆菌、酵母、昆虫细胞等。在本发明的其中一个方面，其中所述载体为病毒载体，其中所述核苷酸分子可表达地插入到所述病毒载体中。在本发明的其中一个方面，本发明的载体可转染哺乳动物宿主细胞和表达TRAIL蛋白，并且所述TRAIL蛋白可分泌到宿主细胞外。

在本发明的其中又一个方面，所述载体为慢病毒载体，其中所述的核苷酸分子可表达地克隆入慢病毒表达载体pLVTHM。

本发明还提供了转化细胞的方法，所述方法包括用前述本发明的核苷酸分子或载体来转化哺乳动物细胞。

本发明还提供了包含前述本发明的核苷酸分子或载体的哺乳动物细胞。

本发明还提供了用于生产TRAIL蛋白的方法，所述方法包括用前述本发明的核苷酸分子或载体来转化哺乳动物细胞，在所述哺乳动物细胞中表达TRAIL蛋白，所述TRAIL蛋白可分泌到宿主细胞外的培养液中。

本发明提供的可分泌型TRAIL表达构建体中，包括了高效的分泌信号肽序列和其它表达操控元件序列，可使位于其下游的TRAIL蛋白编码基因表达的TRAIL蛋白分子在表达后能够分泌到细胞外培养基中。特别是当本发明的表达构建体被克隆到慢病毒载体，例如慢病毒表达载体pLVTHM中，能够在哺乳动物细胞中高效和稳定地表达TRAIL蛋白分子。本发明提供的表达可分泌型TRAIL蛋白的慢病毒载体，利用慢病毒的特点将TRAIL蛋白表达基因稳定的整合在宿主细胞的基因组中，不易丢失。由此，本发明提供的表达可分泌型TRAIL蛋白的慢病毒载体和生产、分离、纯化TRAIL蛋白的方法，既方便了后续的纯化提取，省略了细胞破碎的过程；又避免表达的TRAIL蛋白在细胞内被胞内蛋白酶水解，因此可以显著提高蛋白表达效率。

附图说明

图1为本发明的可分泌型TRAIL蛋白构建体的一种实施方式的核苷酸序列；

图2为本发明的可分泌型TRAIL蛋白表达基因片段的琼脂糖凝胶电泳图；

图3经双酶切回收的慢病毒表达载体pLVTHM质粒片段的琼脂糖凝胶电泳图；

图4为HEK293细胞经慢病毒包装三质粒共转染48小时后的荧光显微照片图；

图5为慢病毒颗粒感染MSC细胞的荧光和白光显微照片图；

图6为检测TRAIL蛋白的ELISA标准曲线图；

图7为MTS法检测感染了慢病毒的MSC细胞上清液条件培养基对U87肿瘤细胞的生长抑制作用图。

具体实施方式

为了更好地理解和阐释本发明，下面将参照附图对本发明作进一步的详细描述。

实施例1

1、编码可分泌型TRAIL蛋白构建体的制备

合成具有SEQIDNO：1(如图1所示)的核苷酸序列的双链DNA分子。该DNA分子包含本发明的核苷酸分子，其核苷酸序列为如SEQIDNO：1所示序列中第7-930位的核苷酸序列。在合成的DNA分子中，其两端的六个核苷酸分别是额外增加的用于构建载体的限制性核酸内切酶ClaI和MluI的酶切位点。

2、双链DNA分子的双酶切和胶回收

合成的双链DNA分子经限制性核酸内切酶ClaI和MluI(NEB公司)充分消化。消化产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析，以Qiagene公司的胶回收试剂盒纯化约930bp片段。

图2为经双酶切回收的可分泌型TRAIL蛋白表达基因片段的琼脂糖凝胶电泳图。该基因片段约为930bp。图中右侧为目的DNA条带，左侧为使用的Invitrogen公司1KbPlusDNAladder分子量marker。

实施例2可分泌型TRAIL慢病毒表达载体pLVTHM-seTRAIL的构建

1、pLVTHM载体的双酶切

将pLVTHM载体质粒(Addgene，cat.no.为Plasmid12247)DNA经NEB公司的限制性核酸内切酶ClaI和MluI充分消化，消化产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳分析，以Qiagene公司的胶回收试剂盒纯化约7500bp的片段。

图3为经双酶切回收的慢病毒表达载体pLVTHM质粒DNA电泳图，基因片段约为11,000bp，右侧为目的DNA条带，左侧为使用的Invitrogen公司1KbPlusDNAladder分子量marker。

2、酶切产物的连接及转化

将实施例1经过酶切回收的约930bp小片段DNA和实施例第1步经同样酶切回收的约11,000bp大片段质粒DNA以5:1的摩尔比例混合，并以NEB公司的T4DNA连接酶16℃连接过夜，构建成表达载体pLVTHM-seTRAIL。连接产物转化E.coliDH5α感受态细胞(转化操作按F.奥斯伯，R.布伦特，R.E.金斯顿，D.D.穆尔，J.G.塞德曼，J.A.史密斯，K.斯特拉尔《精编分子生物学实验指南》美国纽约JohnWiley&Sons出版社1995年第三版P39-40)，以氨卞青霉素抗性筛选转化子。

3、表达载体pLVTHM-seTRAIL的验证

将挑选的阳性转化子扩培，提取质粒DNA(质粒DNA提取方法按J.萨姆布鲁克，E.F.费里奇，T.曼尼阿蒂斯《分子克隆实验指南》美国纽约冷泉港出版社2001年第三版P27-30)，并以Sanger双脱氧末端终止法进行DNA测序证实连接正确。

实施例3表达可分泌型TRAIL慢病毒颗粒的包装

1、表达质粒pLVTHM-seTRAIL和辅助质粒浓度和纯度的测定

采用第二代慢病毒包装系统，除表达质粒pLVTHM-seTRAIL外，还同时采用包装质粒pCMV-dR8.91；外壳蛋白质粒VSV-G(以上均购自Addgene)共同完成病毒颗粒的包装。首先以NanoDrop分光光度计分析各质粒DNA的纯度和浓度。

结果如下表.1所示：

表1各质粒DNA的浓度和纯度分析结果

2、共转染质粒配方(每15cm培养皿)：

*TEbuffer(10mMTirspH8.0,1mMEDTA)

#HBS(280mMNaCl,50mMHEPES,1.5mMNa₂HPO₄.H₂O,10mMKCl,12mMDextrose)

3、质粒共转染HEK293细胞株

A.转染前一日，将HEK293细胞接种于15cm细胞培养皿中，控制使接种日细胞密度达到80％左右；

B.各质粒组分，CaCl2溶液，TEbuffer充分混合在一个50ml的离心管中，并将以上混合物缓慢的加入另一个已经放置了HBS溶液的离心管中；

C.中速震荡混匀，并加入各细胞培养皿中，置于细胞培养箱培养；

D.转染后16小时，小心吸走培养基，并换液以含10％FBS的DMEM培养基；

E.继续培养48小时，以荧光显微镜观察细胞的荧光信号。

图4为HEK293细胞经慢病毒包装三质粒共转染48小时后的荧光显微照片。其中A为荧光显微镜下照片，B为同一视野下白光显微镜照片。

4、病毒颗粒收集

A.收集上述细胞培养上清液；

B.在4℃下，以5,000rpm离心20min，收集上清液；

C.上清液过0.22um的微孔滤膜，保留滤过液；

D.在4℃下，以9,000rpm离心过夜，获得病毒颗粒沉淀；

E.病毒颗粒以适量TBS溶液(800mgNaCl,20mgKCl,300mgTris碱，溶于100ml去离子水中，PH8.0)重悬成病毒颗粒储液，并保存于-80℃。

实施例4表达可分泌型TRAIL慢病毒滴度的测定

A.HEK293细胞接种于96孔板内，接种密度为4,000个细胞每孔，置于细胞培养箱培养过夜；

B.以含8ug/ml的polybrene的DMEM培养基(含10％FBS)，十倍梯度稀释制备的病毒储液；

C.小心吸走96孔板中的培养基，并以以上含有梯度稀释病毒颗粒的培养基，加入各孔，每个浓度处理组三个孔重复；

D.继续培养48小时，在荧光显微镜下观察具有绿色荧光信号的HEK293细胞，记录有荧光信号出现的最低稀释度(表2)，并以如下公式计算病毒颗粒储液的滴度：

滴度(TU/ul)＝1/10X10^(n-1)，其中n为梯度稀释系数。

表2滴度测定荧光信号检测结果(√表示有荧光，x表示无荧光)

由表2结果和上述公式计算

pLVTHM-seTRAIL慢病毒滴度为1X10⁶TU/ul

pLVTHM慢病毒滴度为1X10⁶TU/ul。

实施例5表达可分泌型TRAIL慢病毒对人间充质干细胞的感染

(1)培养良好的人间充质干细胞(MSC)细胞，以60％的细胞密度接种于细胞培养皿中，置于细胞培养箱培养过夜；

(2)小心吸走细胞培养皿中的培养基，以含8ug/ml的polybrene的α-MEM培养基(含10％FBS)，小心加入培养皿；

(3)每细胞培养皿中加入不同量的慢病毒储液，使MOI(病毒TU与靶细胞的数量的比值)分别为1，5，10和20，置于细胞培养箱继续培养24小时；

(4)小心吸走细胞培养皿中的培养基，以含10％FBS的α-MEM培养基小心加入各细胞培养皿，继续培养48小时；

(5)以荧光显微镜观察具有绿色荧光信号的MSC细胞，并收集细胞培养上清。

图5是慢病毒颗粒感染MSC细胞的荧光和白光显微照片。其中，(a)，(b)，(c)和(d)分别表示MOI为20,10,5和1；GFP为荧光下照片，Light为同一视野下白光照片，Merge为两个视野的整合照片。如图5所示，本发明的慢病毒颗粒能非常有效地感染MSC细胞。

实施例6检测感染慢病毒载体的MSC细胞表达和分泌TRAIL蛋白的能力

收集的细胞培养基上清液，以Abcam公司的TRAILHumanELISAKit试剂盒分析上清液中的TRAIL蛋白含量，精确按照试剂盒说明书操作，以试剂盒中提供的重组humanTRAIL做标准曲线，结果如图6所示，其中横坐标为450nm处吸光值，纵坐标为TRAIL蛋白标准品浓度(pg/ml)。

检测结果显示，感染可分泌型TRAIL慢病毒pLVTHM-seTRAIL的MSC培养基上清中，TRAIL蛋白浓度为：669.4pg/ml；感染对照空载慢病毒pLVTHM的MSC培养基上清中，TRAIL蛋白浓度为：30.1pg/ml。

实施例7感染慢病毒载体的MSC细胞所分泌的TRAIL蛋白的活性检测

(1)收集的培养了感染有病毒颗粒的MSC的细胞培养上清液，1，000rpm离心10分钟，除去残存细胞，吸取上清液，做为条件培养基；

(2)以含10％FBS的α-MEM培养基以2倍浓度梯度逐次稀释该条件培养基，设置1，0.5,0.25，和0.125浓度；

(3)以含10％FBS的α-MEM培养基培养的人胶质瘤细胞系U87细胞，以3,000细胞每孔的密度接种于96孔板中，置于细胞培养箱培养过夜；

(4)小心干净的吸走每孔中的培养基上清液；

(5)每孔中分别加入200ul梯度稀释的各浓度条件培养基，同时设置空白对照孔(加入含10％FBS的α-MEM培养基)，继续培养72小时；

(6)每孔加入预置的MTS溶液(promega)20ul，继续培养3小时；

(7)以ThermoScientificMulitiskan微孔板读板仪，在490nm测量波长，690nm参比波长下，测量各孔吸光度值；

(8)以如下计算抑瘤率：抑瘤率(％)＝(空白孔吸光值-条件培养基处理孔吸光值)/空白孔吸光值x100。

图7为MTS法检测感染了慢病毒的MSC细胞上清液条件培养基对U87肿瘤细胞的生长抑制作用结果的图。其中，TRAIL表示可分泌型TRAIL慢病毒处理组，empty表示对照空载慢病毒处理组。

由图7结果可知，本发明构建的可表达分泌型TRAIL蛋白的慢病毒载体感染MSC细胞后，MSC可表达大量具有生物活性的TRAIL蛋白，并分泌到细胞培养基中。

本发明的发明人出乎意料地发现本发明构建的可分泌型TRAIL表达构建体中，包括了高效的分泌信号肽序列，可使克隆于其下游的TRAIL蛋白编码基因表达的TRAIL蛋白分子能够分泌到细胞外培养基中，特别是当本发明的表达构建体被克隆到慢病毒载体，例如慢病毒表达载体pLVTHM中，能够在哺乳动物细胞中高效低表达TRAIL蛋白分子。发明人在实验室实验中发现，本发明提供的表达可分泌型TRAIL蛋白的慢病毒载体与克隆到其它类型的载体比较，在转染动物细胞后，能够在培养细胞的培养液中获得更高和明显更稳定的TRAIL蛋白。本发明提供的表达可分泌型TRAIL蛋白的慢病毒载体，利用慢病毒的特点将TRAIL蛋白表达基因稳定的整合在宿主细胞的基因组中，不易丢失。由此，本发明提供的表达可分泌型TRAIL蛋白的慢病毒载体和生产、分离、纯化TRAIL蛋白的方法，既方便了后续的纯化提取，省略了细胞破碎的过程；又避免表达的TRAIL蛋白在细胞内被胞内蛋白酶水解，因此可以显著提高蛋白表达效率。

除非另外指出，本发明的实践将使用生物技术、有机化学、无机化学等的常规技术，显然除在上述说明和实施例中所特别描述之外，还可以别的方式实现本发明。其它在本发明范围内的方面与改进将对本发明所属领域的技术人员显而易见。根据本发明的教导，许多改变和变化是可行的，因此其在本发明的范围之内。本文所提到的所有专利、专利申请与科技论文均据此通过引用结合到本文。

Claims

1.一种核苷酸分子，其具有如SEQIDNO：1所示序列中第7-930位的核苷酸序列。

2.一种含有如权利要求1所述的核苷酸分子的载体。

3.权利要求2的载体，其中所述载体为病毒载体，其中如权利要求1所述的核苷酸分子可表达地插入到所述病毒载体中。

4.权利要求3的载体，其可转染哺乳动物宿主细胞和表达TRAIL蛋白，并且所述TRAIL蛋白可分泌到宿主细胞外。

5.权利要求2-4中任一项的载体，其为慢病毒载体，其中如权利要求1所述的核苷酸分子可表达地克隆入慢病毒表达载体pLVTHM。

6.转化细胞的方法，所述方法包括用权利要求1的核苷酸分子或权利要求2-5中任一项的载体来转化哺乳动物细胞。

7.包含权利要求1的核苷酸分子或权利要求2-5中任一项的载体的哺乳动物细胞。

8.用于生产TRAIL蛋白的方法，所述方法包括用权利要求1的核苷酸分子或权利要求2-5中任一项的载体来转化哺乳动物细胞，在所述哺乳动物细胞中表达TRAIL蛋白，所述TRAIL蛋白可分泌到宿主细胞外的培养液中。