CN104910278A - 一种用于制备cart细胞的具有高效转染能力和生物学活性的慢病毒 - Google Patents
一种用于制备cart细胞的具有高效转染能力和生物学活性的慢病毒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种用于制备CAR-T细胞的具有高效转染能力和生物学活性的慢病毒，该慢病毒可作为CAR-T淋巴细胞治疗中的外源基因的载体，可以更高的效率感染T淋巴细胞，将外源基因导入到T淋巴细胞中，从而对T淋巴细胞进行基因组修饰，而且在此过程中同时起到对T淋巴细胞活化的作用，极大的简化了肿瘤免疫治疗的过程。
Description
技术领域
本发明属于医学生物技术领域，具体地说，本发明涉及一种用于制备CART细胞的具有高效转染能力和生物学活性的慢病毒。
背景技术
癌症一直是困扰人类的巨大难题，世界卫生组织官方网站上指出，全球每年新发现肿瘤患者将每年1000万增加到1500万。2014年初发布的《2013中国肿瘤登记年报》显示，我国每年新发肿瘤病例约为312万例，平均每天8550人意味着每分钟就有6人就诊断为恶性肿瘤，这些数据都表明，癌症依然是威胁健康的一大杀手。
多年来，癌症治疗的方法主要是手术、化疗和放疗，对肿瘤患者的临床治疗有效率仍旧很低，据统计，同一种抗肿瘤药物的有效率仅为25％。针对同一种肿瘤，用同样的药、标准剂量的治疗方法，在不同病人身上所起的疗效及毒副作用却有很大的差异。造成这种结果的主要原因在于，肿瘤是一种多病因、异质性的疾病。过去十年来，依赖于患者个体生物标志物的肿瘤个性化治疗正在逐渐取代依据传统经验的治疗模式，并展现出优越的疗效和广阔的前景，如伊马替尼()和曲妥珠单抗()。
免疫疗法是继手术、化疗、放疗和靶向疗法后出现的一种新型疗法，被称为治疗癌症的“第五大疗法”。它是利用患者自身免疫系统的力量来抵抗癌症；癌症免疫疗法主要包括过继性细胞治疗、免疫调节剂、肿瘤疫苗以及免疫结合点阻断治疗等。虽然有关免疫治疗的研究早在30年前就已开展，最近两年《细胞》、《科学》、《自然》等国际顶级期刊刊出多项该领域的突破研究成果，制药巨头也不断推出此类型的重磅疗法。2014年12月6号-9号在旧金山举行的美国血液学会年会(ASH)上，癌症免疫疗法可谓是赚足了眼球，CAR-T疗法更是备受关注。
现有技术中的肿瘤免疫疗法的缺点如下：
1)操作繁琐。目前在CAR-T治疗过程中，T淋巴细胞的活化与T淋巴细胞的感染是两个分开的过程，需要先活化再感染。操作频繁，而繁琐的操作不仅仅是对人力资源的浪费，更重要的是，增加了对T淋巴细胞污染的机会，更加会影响T淋巴细胞的状态，而这些都会降低CART淋巴细胞的疗效，甚至会对CART淋巴细胞疗法引入安全隐患。
2)目前活化T淋巴细胞的方法主要是使用包被有抗体的磁珠与T淋巴细胞共培养，但该方法有着如下缺陷：
1.成本太高。包被抗体的磁珠制作繁琐。首先需要有表达纯化的抗体，其次需要将其偶联到磁珠。并且，整个操作过程均需要符合医疗级洁净程度。无论是自行制作，还是购买商业化的产品，成本均十分高昂。
2.操作繁琐。在培养过程中，需要先对抗体磁珠在医疗洁净程度下进行清洗操作，之后才能按照比例加入到T淋巴细胞中。除了对环境要求高导致的成本问题，整个操作过程也需要很多精力。
3.活化后需将磁珠彻底去除。由于磁珠对于人体免疫系统来说是异物，在CART淋巴细胞制备完成后，需要将其彻底去除。在去除过程中，需要用磁极对细胞进行处理，有可能对细胞造成一定的伤害，并且会损失部分CART淋巴细 胞。
当然，对于T淋巴细胞的活化，也有采用可溶性的抗体进行操作。可溶性抗体进行操作虽然没有活化后将磁珠去除的操作，但需要得到医疗级纯化的抗体，其成本也较高，操作也繁琐。
感染效率偏低。CAR表达序列导入应用到了多种载体，例如质粒、体外转录的mRNA、慢病毒或慢病毒载体等。其中质粒和mRNA作为载体，由于不能整合到基因组，所以不能在T淋巴细胞中稳定表达。相较于慢病毒，慢病毒能够感染未分裂期的细胞，而未分裂期T淋巴细胞的成功感染对于CART淋巴细胞的疗效具有促进作用。但是，目前常见的慢病毒对T淋巴细胞感染效率不高，并且感染效率与T淋巴细胞的激活方案也紧密关联。目前提高慢病毒感染效率的解决方案，包括对T淋巴细胞进行重复感染、感染时离心及加入例如Retronectin这样的促感染试剂，但这样的操作对细胞状态影响较大，会影响细胞后续的增殖扩增倍数，需要特殊的仪器支持，且操作繁琐。
现有的免疫治疗过程复杂、成本昂贵，因此本领域技术人员致力于开发能够简化治疗过程、降低治疗成本的技术方案。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于制备CART细胞的具有高效转染能力和生物学活性的慢病毒及其应用。
本发明的第一方面，提供了一种重组病毒包膜糖蛋白，所述蛋白具有式I所述结构：
N端’B-A C端’ (I)
其中，
元件A为衍生自野生型病毒包膜糖蛋白的蛋白元件；
元件B为辅助蛋白元件，并且所述辅助蛋白元件可特异性识别与T细胞活化相关的T细胞细胞膜表面蛋白；
“-”表示连接上述各元件的肽键或肽接头。
在另一优选例中，所述野生型病毒包膜糖蛋白选自：VSV、BaEv、RD114、MLV、和MV。
在另一优选例中，所述元件A为VSVG(水疱口炎病毒糖蛋白)。
在另一优选例中，所述元件A的氨基酸序列如SEQ ID NO.:2所示，优选地，所述元件A的编码多核苷酸序列如SEQ ID NO.:1所示。
在另一优选例中，所述与T细胞活化相关的T细胞细胞膜表面蛋白选自：CD3、CD28。
在另一优选例中，所述元件B选自：抗体(包括但不限于单克隆抗体、纳米抗体、单链抗体)、及其活性片段。
在另一优选例中，所述元件B选自下组：抗CD3的单链抗体、抗CD28的单链抗体。
在另一优选例中，所述元件B的序列如SEQ ID NO.:4、或SEQ ID NO.:6所示。
在另一优选例中，所述元件B的编码多核苷酸序列如SEQ ID NO.:3、或SEQ ID NO.:5所示。
在另一优选例中，所述重组病毒包膜糖蛋白选自下组：
(A)具有SEQ ID NO:17、19所示氨基酸序列的多肽；
(B)具有与SEQ ID NO:17、19所示氨基酸序列≥80％同源性(优选地，≥90％的同源性；等优选地≥95％的同源性；最优选地，≥97％的同源性，如98％以上，99％以上)的多肽，且所述多肽具有与(A)中多肽相似的活性；
(C)将(A)中任一所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且保留(A)中多肽活性的衍生多肽。
在另一优选例中，所述重组病毒包膜糖蛋白具有选自下组的一个或多个特性：
a)具有特异性识别与T细胞活化相关的T细胞细胞膜表面蛋白的活性；
b)具有促进T细胞活化的活性；
c)具有促进T细胞增殖的活性。
本发明的第二方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸编码本发明第一方面所述的重组病毒包膜糖蛋白。
本发明的第三方面，提供了一种载体，它含有本发明第二方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述载体为质粒。
在另一优选例中，所述载体为慢病毒载体、腺病毒载体、或腺相关病毒载体。
本发明的第四方面，提供了一种基因工程化的重组病毒，所述病毒具有本发明第一方面所述的重组病毒包膜糖蛋白。
在另一优选例中，所述病毒为慢病毒、腺病毒、或腺相关病毒。
在另一优选例中，所述病毒的基因组中具有外源的基因。
在另一优选例中，所述外源的基因表达CAR(嵌合抗原受体)。
在另一优选例中，所述病毒具有至少两种本发明第一方面所述的重组病毒包膜糖蛋白(具有相同的元件A和不同的元件B)。
在另一优选例中，所述病毒的包膜糖蛋白中具有SEQ ID NO:17、和SEQ ID NO.:19所示的氨基酸序列的多肽。
本发明的第五方面，提供了一种宿主细胞，它含有本发明第三方面所述的载体或基因组中整合有本发明第二方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞(如CHO细胞、NS0细胞、或293细胞)。
本发明的第六方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒中包括本发明第一方面所述的重组病毒包膜糖蛋白、本发明第二方面所述的多核苷酸、本发明第三方面所述的载体、本发明第四方面所述的病毒、和/或本发明第五方面所述的宿主细胞。
在另一优选例中，所述试剂盒中包括编码权利要求1中所述重组病毒包膜糖蛋白的载体；和，野生型载体，所述野生型载体编码与所述重组病毒包膜糖蛋白相对应的野生型病毒包膜糖蛋白或其片段。
本发明的第七方面，提供了本发明第一方面所述的重组病毒包膜糖蛋白、本发明第二方面所述的多核苷酸、本发明第三方面所述的载体的用途，用于慢病毒、或腺病毒的包装。
本发明的第八方面，提供了一种重组病毒的包装方法，所述方法包括步骤：
(1)提供一包装细胞；
(2)配制转染体系，所述转染体系中包括表达权利要求1所述的重组病毒 包膜糖蛋白的载体；和
(3)转染包装细胞，进行病毒包装。
在另一优选例中，所述步骤(2)中，所述转染体系包括至少两种表达不同的重组病毒包膜糖蛋白的重组型载体；优选地，所述转染体系中还包括野生型载体，所述野生型载体编码与所述重组病毒包膜糖蛋白相对应的野生型病毒包膜糖蛋白或其片段。
在另一优选例中，所述重组型载体为αCD3-VSVG，和/或αCD28-VSVG；所述野生型载体为野生型载体H2。
在另一优选例中，所述步骤(2)所述转染体系中包括重组型载体αCD3-VSVG，和αCD28-VSVG；以及野生型载体H2；优选地，所述重组型载体与所述野生型载体的数量比为7：3-6。
在另一优选例中，所述重组型载体中αCD3-VSVG：αCD28-VSVG为1：1。
在另一优选例中，所述包装细胞为HEK-293T细胞。
本发明的第九方面，提供了本发明第四方面所述的重组病毒在制备CAR-T细胞中的用途。
本发明的第十方面，提供了一种制剂，所述制剂含有本发明第四方面所述的重组病毒和任选的赋形剂。
在另一优选例中，所述的制剂为药物制剂。
在另一优选例中，所述的赋形剂为药学上可接受的赋形剂。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了野生型H2质粒的结构图谱。
图2显示了经重组的αCD3–VSVG质粒的结构图谱。
图3显示了经重组的αCD28-VSVG质粒的结构图谱。
图4中A图显示了转染体系中不同类型H2质粒配比对病毒产量的影响，B图显示了成功表达的病毒颗粒的免疫印迹检测结果。
图5显示了本发明中经改造的慢病毒对T细胞的感染效率的检测结果。
图6显示了本发明中经改造的慢病毒对T细胞活化的影响。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究，获得一种新型的重组慢病毒设计方案，通过对其包膜进行修饰，该慢病毒可作为CAR-T淋巴细胞治疗中的外源基因的载体，可以更高的效率感染T淋巴细胞，将外源基因导入到T淋巴细胞中，从而对T淋巴细胞进行基因组修饰，而且在此过程中同时起到对T淋巴细胞活化的作用，极大的简化了肿瘤免疫治疗的过程。在此基础上，完成了本发明。
在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。
除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的 数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。
CAR-T淋巴细胞疗法
CAR-T(Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy)，即嵌合抗原受体T淋巴细胞免疫疗法。
嵌合抗原受体：人工设计的蛋白片段，包括胞外片段、跨膜区和胞内片段三部分组成。胞外片段可以对肿瘤细胞特定的膜蛋白进行识别，从而促进T淋巴细胞对肿瘤细胞的定位及杀伤。胞内段可以提供共刺激信号，增强细胞的杀伤能力，促进T淋巴细胞的存活。
CAR-T淋巴细胞治疗的原理在于经嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞，可以特异性地识别肿瘤特异的抗原，使效应T淋巴细胞的靶向性、杀伤性、持久性以及细胞因子的分泌均较常规应用的免疫细胞高。同时可克服肿瘤局部免疫抑制微环境并打破宿主免疫耐受状态，即表达CAR的T淋巴细胞以抗原依赖、非MHC限制的方式结合肿瘤抗原，启动并活化特异性杀伤肿瘤反应。
CAR-T淋巴细胞制备包括以下流程：
外周血单个核细胞(PBMC)/T淋巴细胞分离——T淋巴细胞活化——CAR表达序列导入——T淋巴细胞扩增。
CART疗法主要步骤如下：
1)T淋巴细胞分离。
通过采集全血或医院的单采血液系统，从外周血中将T淋巴细胞分离得到。
2)T淋巴细胞感染。
此步骤是对T淋巴细胞进行修饰的关键步骤。分离出的T淋巴细胞处于静息状态，首先需要对T淋巴细胞进行激活。之后，通过质粒、RNA或病毒作为载体，将嵌合抗原受体的表达片段转入细胞。嵌合抗原受体将在细胞内表达，并定位在T淋巴细胞膜上。感染后的T淋巴细胞(CAR-T)进行更进一步的扩增培养，达到一定数量后进行下一步实验。
3)T淋巴细胞回输。
通过质检的CAR-T通过静脉注射入患者体内。
4)疗效监控。
通过医院的监控系统对患者进行监控。
本发明的慢病毒主要应用于T淋巴细胞感染步骤。
病毒包膜糖蛋白
一些病毒(例如流感病毒和其他一些动物病毒)具有包裹在蛋白质衣壳外的一层包膜--病毒包膜，这层包膜主要来源于宿主细胞膜(磷脂层和膜蛋白)，但也包含有病毒自身的糖蛋白，本发明中的病毒包膜糖蛋白主要指此类病毒自身的糖蛋白。
病毒包膜的主要功能是帮助病毒进入宿主细胞。首先包膜表面上的糖蛋白识别并结合宿主表面受体，接着病毒包膜与宿主细胞膜结合，最后病毒衣壳和病毒基因组进入宿主，完成感染过程。
VSVG
在本发明中，术语VSVG指水疱性口炎病毒糖蛋白，在本发明的一个优选 的实施方式中，所述VSVG的氨基酸序列如下：
MKCLLYLAFLFIGVNCKFTIVFPHNQKGNWKNVPSNYHYCPSSSDLNWHNDLIGTALQVKMPKSHKAIQADGWMCHASKWVTTCDFRWYGPKYITHSIRSFTPSVEQCKESIEQTKQGTWLNPGFPPQSCGYATVTDAEAVIVQVTPHHVLVDEYTGEWVDSQFINGKCSNYICPTVHNSTTWHSDYKVKGLCDSNLISMDITFFSEDGELSSLGKEGTGFRSNYFAYETGGKACKMQYCKHWGVRLPSGVWFEMADKDLFAAARFPECPEGSSISAPSQTSVDVSLIQDVERILDYSLCQETWSKIRAGLPISPVDLSYLAPKNPGTGPAFTIINGTLKYFETRYIRVDIAAPILSRMVGMISGTTTERELWDDWAPYEDVEIGPNGVLRTSSGYKFPLYMIGHGMLDSDLHLSSKAQVFEHPHIQDAASQLPDDESLFFGDTGLSKNPIELVEGWFSSWKSSIASFFFIIGLIIGLFLVLRVGIHLCIKLKHTKKRQIYTDIEMNRLGK(SEQ ID NO.:2，下划线处为可选地信号肽)；
其编码多核苷酸序列如(SEQ ID NO.:1所示。
ScFv：
ScFv全称single-chain antibody fragment，即单链抗体片段。
在本发明的一个优选的实施方式中，术语αCD3-ScFv指鼠抗人CD3单链抗体片段，其较佳的氨基酸序列为：
EVKLVESGPELVKPGASMKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKNLEWMGLINPYKGVSTYNQKFKDKATLTVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGAGTSVTVSSTSGGGGSGGGGSGGGGSSRDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDIRNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSKFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPWTFAGGTKLELKRA，(SEQ ID NO.:4)；
其编码核苷酸序列为：
GAGGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGAGCTTCAATGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGGCTACACCATGAACTGGGTGAAGCAGAGTCATGGAAAGAACCTTGAGTGGATGGGACTTATTAATCCTTACAAAGGTGTTAGTACCTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTAACTGTAGACAAGTCATCCAGCACAGCCTACATGGAACTCCTCAGTCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATCGGGGTACTACGGTGATAGTGACTGGTACTTCGATGTCTGGGGCGCAGGAACCTCAGTCACTGTCTCCTCAACTAGTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTTCTAGAGACATCCAGATGACCCAGACCACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGAAATTATTTAAACTGGTATCAACAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAAGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAGGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTGGACGTTCGCTGGAGGCACCAAACTGGAACTGAAGCGCGCT，(SEQ ID NO.:3)。
在本发明的一个优选的实施方式中，术语αCD28-ScFv指鼠抗人CD28单链抗体片段，其较佳的氨基酸序列为：
QVKLQQSGPGLVTPSQSLSITCTVSGFSLSDYGVHWVRQSPGQGLEWLGVIWAGGGTNYNSALMSRKSISKDNSKSQVFLKMNSLQADDTAVYYCARDKGYSYYYSMDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVEYYVTSLMQWYQQKPGQPPKLLIFAASNVESGVPARFSGSGSGTNFSLNIHPVDEDDVAMYFCQQSRKVPYTFGGGTKLEIKR，(SEQ ID NO.:6)；
其编码核苷酸序列为：
CAGGTGAAACTGCAGCAGTCTGGACCTGGCCTGGTGACGCCCTCACAGAGCCTGTCCATCACTTGTACTGTCTCTGGGTTTTCATTAAGCGACTATGGTGTTCACTGGGTTCGCCAGTCTCCAGGACAGGGACTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGCTGGTGGAGGCACGAATTATAATTCGGCTCTCATGTCCAGAAAGAGCATCAGCAAAGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAGCTGATGACACAGCCGTGTATTACTGTGCCAGAGATAAGGGATACTCCTATTACTATTCTATGGACTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACTGTCTCCTCGGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGACATCGAGCTCACTCAGTCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGAGCCACCATCTCCTGCAGAGCCAGTGAGAGTGTTGAATATTATGTCACAAGTTTAATGCAGTGGTACCAGCAGAAGCCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTTTGCTGCATCCAACGTAGAATCTGGGGTCCCTGCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAAACTTCAGCCTCAACATCCATCCTGTGGACGAGGATGATGTTGCAATGTATTTCTGTCAGCAAAGTAGGAAGGTTCCTTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAA TAAAACGG，(SEQ ID NO.:5)。
重组病毒包膜糖蛋白
在本发明的一个优选的实施方式中，本发明人通过将αCD3-ScFv、αCD28-ScFv这两段单链抗体序列通过柔性肽序列分别与慢病毒包膜糖蛋白VSVG外端连接，并用这两个改造过的VSVG(分别标记为αCD3-VSVG(图2)、αCD28-VSVG(将图2的αCD3替换为αCD28))辅助质粒与野生型辅助质粒(图1)按比例进行慢病毒包装，从而得到表面表达αCD3-ScFv、αCD28-ScFv的慢病毒颗粒。融合蛋白N端具有信号肽MKCLLYLAFLFIGVNC(SEQ ID NO.:7)
携带αCD3-ScFv、αCD28-ScFv的慢病毒可以直接与T淋巴细胞表面的CD3及CD28相互作用，拉近了慢病毒与T淋巴细胞的接触距离和相互作用强度，从而提高了慢病毒对T淋巴细胞的感染效率。
携带αCD3-ScFv、αCD28-ScFv的慢病毒与T淋巴细胞表面的CD3和CD28受体相互作用后，细胞表面受体CD3和CD28向T淋巴细胞传递活化信号，T淋巴细胞在被感染的同时被活化。
在本发明优选地实施方式中，αCD3-VSVG融合蛋白(包括柔性肽片段)的氨基酸序列为：
MKCLLYLAFLFIGVNCHHHHHHEVKLVESGPELVKPGASMKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKNLEWMGLINPYKGVSTYNQKFKDKATLTVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGAGTSVTVSSTSGGGGSGGGGSGGGGSSRDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDIRNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSKFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPWTFAGGTKLELKRAGGGSGGGSSGGGSKFTIVFPHNQKGNWKNVPSNYHYCPSSSDLNWHNDLIGTALQVKMPKSHKAIQADGWMCHASKWVTTCDFRWYGPKYITHSIRSFTPSVEQCKESIEQTKQGTWLNPGFPPQSCGYATVTDAEAVIVQVTPHHVLVDEYTGEWVDSQFINGKCSNYICPTVHNSTTWHSDYKVKGLCDSNLISMDITFFSEDGELSSLGKEGTGFRSNYFAYETGGKACKMQYCKHWGVRLPSGVWFEMADKDLFAAARFPECPEGSSISAPSQTSVDVSLIQDVERILDYSLCQETWSKIRAGLPISPVDLSYLAPKNPGTGPAFTIINGTLKYFETRYIRVDIAAPILSRMVGMISGTTTERELWDDWAPYEDVEIGPNGVLRTSSGYKFPLYMIGHGMLDSDLHLSSKAQVFEHPHIQDAASQLPDDESLFFGDTGLSKNPIELVEGWFSSWKSSIASFFFIIGLIIGLFLVLRVGIHLCIKLKHTKKRQIYTDIEMNRLGK(SEQ ID NO.:17)，
其编码多核苷酸序列为：
atgaagtgccttttgtacttagcctttttattcattggggtgaattgccatcatcatcatcatcatgaggtgaagctggtggagtctggacctgagctggtgaagcctggagcttcaatgaagatatcctgcaaggcttctggttactcattcactggctacaccatgaactgggtgaagcagagtcatggaaagaaccttgagtggatgggacttattaatccttacaaaggtgttagtacctacaaccagaagttcaaggacaaggccacattaactgtagacaagtcatccagcacagcctacatggaactcctcagtctgacatctgaggactctgcagtctattactgtgcaagatcggggtactacggtgatagtgactggtacttcgatgtctggggcgcaggaacctcagtcactgtctcctcaactagtggtggtggtggttctggtggtggtggttctggtggtggtggttcttctagagacatccagatgacccagaccacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatcagttgcagggcaagtcaggacattagaaattatttaaactggtatcaacagaaaccagatggaactgttaaactcctgatctactacacatcaagattacactcaggagtcccatcaaagttcagtggcagtgggtctggaacagattattctctcaccattagcaacctggagcaagaggatattgccacttacttttgccaacagggtaatacgcttccgtggacgttcgctggaggcaccaaactggaactgaagcgcgctggaggcggttcaggaggtggctcgagcggaggcggttcaaagttcaccatagtttttccacacaaccaaaaaggaaactggaaaaatgttccttctaattaccattattgcccgtcaagctcagatttaaattggcataatgacttaataggcacagccttacaagtcaaaatgcccaagagtcacaaggctattcaagcagacggttggatgtgtcatgcttccaaatgggtcactacttgtgatttccgctggtatggaccgaagtatataacacattccatccgatccttcactccatctgtagaacaatgcaaggaaagcattgaacaaacgaaacaaggaacttggctgaatccaggcttccctcctcaaagttgtggatatgcaactgtgacggatgccgaagcagtgattgtccaggtgactcctcaccatgtgctggttgatgaatacacaggagaatgggttgattcacagttcatcaacggaaaatgcagcaattacatatgccccactgtccataactctacaacctggcattctgactataaggtcaaagggctatgtgattctaacctcatttccatggacatcaccttcttctcagaggacggagagctatcatccctgggaaaggagggcacagggttcagaagtaactactttgcttatgaaactggaggcaaggcctgcaaaatgcaatactgcaagcattggggagtcagactcccatcaggtgtctggttcgagatggctgataaggatctctttgctgcagccagattccctgaatgcccagaagggtcaagtatctctgctccatctcagacctcagtggatgtaagtctaatt caggacgttgagaggatcttggattattccctctgccaagaaacctggagcaaaatcagagcgggtcttccaatctctccagtggatctcagctatcttgctcctaaaaacccaggaaccggtcctgctttcaccataatcaatggtaccctaaaatactttgagaccagatacatcagagtcgatattgctgctccaatcctctcaagaatggtcggaatgatcagtggaactaccacagaaagggaactgtgggatgactgggcaccatatgaagacgtggaaattggacccaatggagttctgaggaccagttcaggatataagtttcctttatacatgattggacatggtatgttggactccgatcttcatcttagctcaaaggctcaggtgttcgaacatcctcacattcaagacgctgcttcgcaacttcctgatgatgagagtttattttttggtgatactgggctatccaaaaatccaatcgagcttgtagaaggttggttcagtagttggaaaagctctattgcctcttttttctttatcatagggttaatcattggactattcttggttctccgagttggtatccatctttgcattaaattaaagcacaccaagaaaagacagatttatacagacatagagatgaaccgacttggaaagtaa(SEQ ID NO.:16)。
在本发明优选地实施方式中，αCD28-VSVG融合蛋白(包括柔性肽片段)的氨基酸序列为：
MKCLLYLAFLFIGVNCHHHHHHQVKLQQSGPGLVTPSQSLSITCTVSGFSLSDYGVHWVRQSPGQGLEWLGVIWAGGGTNYNSALMSRKSISKDNSKSQVFLKMNSLQADDTAVYYCARDKGYSYYYSMDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVEYYVTSLMQWYQQKPGQPPKLLIFAASNVESGVPARFSGSGSGTNFSLNIHPVDEDDVAMYFCQQSRKVPYTFGGGTKLEIKRGGGSGGGSSGGGSKFTIVFPHNQKGNWKNVPSNYHYCPSSSDLNWHNDLIGTALQVKMPKSHKAIQADGWMCHASKWVTTCDFRWYGPKYITHSIRSFTPSVEQCKESIEQTKQGTWLNPGFPPQSCGYATVTDAEAVIVQVTPHHVLVDEYTGEWVDSQFINGKCSNYICPTVHNSTTWHSDYKVKGLCDSNLISMDITFFSEDGELSSLGKEGTGFRSNYFAYETGGKACKMQYCKHWGVRLPSGVWFEMADKDLFAAARFPECPEGSSISAPSQTSVDVSLIQDVERILDYSLCQETWSKIRAGLPISPVDLSYLAPKNPGTGPAFTIINGTLKYFETRYIRVDIAAPILSRMVGMISGTTTERELWDDWAPYEDVEIGPNGVLRTSSGYKFPLYMIGHGMLDSDLHLSSKAQVFEHPHIQDAASQLPDDESLFFGDTGLSKNPIELVEGWFSSWKSSIASFFFIIGLIIGLFLVLRVGIHLCIKLKHTKKRQIYTDIEMNRLGK(SEQ ID NO.:19)，
其编码多核苷酸序列为：
atgaagtgccttttgtacttagcctttttattcattggggtgaattgccatcatcatcatcatcatcaggtgaaactgcagcagtctggacctggcctggtgacgccctcacagagcctgtccatcacttgtactgtctctgggttttcattaagcgactatggtgttcactgggttcgccagtctccaggacagggactggagtggctgggagtaatatgggctggtggaggcacgaattataattcggctctcatgtccagaaagagcatcagcaaagacaactccaagagccaagttttcttaaaaatgaacagtctgcaagctgatgacacagccgtgtattactgtgccagagataagggatactcctattactattctatggactactggggccaagggaccacggtcactgtctcctcgggtggtggtggttctggtggtggtggttctggtggtggtggttctgacatcgagctcactcagtctccagcttctttggctgtgtctctagggcagagagccaccatctcctgcagagccagtgagagtgttgaatattatgtcacaagtttaatgcagtggtaccagcagaagccaggacagccacccaaactcctcatctttgctgcatccaacgtagaatctggggtccctgccaggtttagtggcagtgggtctgggacaaacttcagcctcaacatccatcctgtggacgaggatgatgttgcaatgtatttctgtcagcaaagtaggaaggttccttacacgttcggaggggggaccaagctggaaataaaacggggaggcggttcaggaggtggctcgagcggaggcggttcaaagttcaccatagtttttccacacaaccaaaaaggaaactggaaaaatgttccttctaattaccattattgcccgtcaagctcagatttaaattggcataatgacttaataggcacagccttacaagtcaaaatgcccaagagtcacaaggctattcaagcagacggttggatgtgtcatgcttccaaatgggtcactacttgtgatttccgctggtatggaccgaagtatataacacattccatccgatccttcactccatctgtagaacaatgcaaggaaagcattgaacaaacgaaacaaggaacttggctgaatccaggcttccctcctcaaagttgtggatatgcaactgtgacggatgccgaagcagtgattgtccaggtgactcctcaccatgtgctggttgatgaatacacaggagaatgggttgattcacagttcatcaacggaaaatgcagcaattacatatgccccactgtccataactctacaacctggcattctgactataaggtcaaagggctatgtgattctaacctcatttccatggacatcaccttcttctcagaggacggagagctatcatccctgggaaaggagggcacagggttcagaagtaactactttgcttatgaaactggaggcaaggcctgcaaaatgcaatactgcaagcattggggagtcagactcccatcaggtgtctggttcgagatggctgataaggatctctttgctgcagccagattccctgaatgcccagaagggtcaagtatctctgctccatctcagacctcagtggatgtaagtctaattcaggacgttgagaggatcttggattattccctctgccaagaaacctggagcaaaatcagagcgggtcttccaatctctccagtggatctcagctatcttgctcctaaaaacccaggaaccggtcctgctttcaccataatcaatggtaccctaaaatactttgagaccagatacatcagagtcgatattgctgctccaatcctctcaagaatggtcggaatgatcagtggaactaccacagaaagggaactgtgggatgactgggcaccatatgaagacgtggaaattggacccaatggagttctgaggaccagttcaggatataagtttcctttatacatgattggacatggtatgttggactccgatcttcatcttagctcaaaggctcaggtgttcgaacatcctcacattcaagacgctgcttcgcaacttcctgatgatgagagtttattttttggtgatactgggctatcca aaaatccaatcgagcttgtagaaggttggttcagtagttggaaaagctctattgcctcttttttctttatcatagggttaatcattggactattcttggttctccgagttggtatccatctttgcattaaattaaagcacaccaagaaaagacagatttatacagacatagagatgaaccgacttggaaagtaa(SEQ ID NO.:18)。
在本发明的其它实施方式中，除了慢病毒表面的VSVG可以融合表达αCD3-ScFv和αCD28-ScFv，慢病毒表面的其他膜蛋白(包括但不限于BaEv(猴内源性逆转录病毒)、RD114、MLV(鼠白血病病毒)、MV(人麻疹病毒)的env)也可以融合表达αCD3-ScFv和αCD28-ScFv，并达到类似的效果。
在本发明的其它实施方式中，除了慢病毒，慢病毒、腺病毒等其他病毒的膜蛋白也可以表达αCD3-ScFv和αCD28-ScFv序列，并达到类似的效果。
在本发明一个较佳地实施方式中，αCD3-VSVG、αCD28-VSVG及野生型的辅助质粒(H2)以一定比例共同包装慢病毒。然而在其它的实施方式中，也可将αCD3-VSVG与野生型辅助质粒、αCD28-VSVG及野生型辅助质粒分别混合包装慢病毒，得到的慢病毒混合起来使用，可以达到类似的效果。
在本发明的其它的实施方式中，不采用本专利所述的αCD3-ScFv及αCD28-ScFv的序列，而采用其他具有与αCD3-ScFv、αCD28-ScFv具有相同功能(与CD3和CD28相互作用的并引起T细胞的激活反应)的其他片段，也能够达到本发明的效果。
在本发明中，“融合蛋白”、“重组蛋白”、“本发明蛋白”、“本发明融合蛋白”可互换使用，指具有式I所述结构，即含有包括衍生自野生型病毒包膜糖蛋白的蛋白元件；和可特异性识别与T细胞活化相关的T细胞细胞膜表面蛋白融合而成的多肽。代表性的例子包括αCD28-VSVG融合蛋白、和αCD28-VSVG融合蛋白。此外，应理解，所述术语还包括融合蛋白的活性片段和衍生物。本发明中所述融合蛋白可以为分离的。
如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的蛋白质片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码多肽的功能。
如本文所用，术语“引物”指的是在与模板配对，在DNA聚合酶的作用下能以其为起点进行合成与模板互补的DNA链的寡聚核苷酸的总称。引物可以是天然的RNA、DNA，也可以是任何形式的天然核苷酸。引物甚至可以是非天然的核苷酸如LNA或ZNA等。引物“大致上”(或“基本上”)与模板上一条链上的一个特殊的序列互补。引物必须与模板上的一条链充分互补才能开始延伸，但引物的序列不必与模板的序列完全互补。比如，在一个3'端与模板互补的引物的5'端加上一段与模板不互补的序列，这样的引物仍大致上与模板互补。只要有足够长的引物能与模板充分的结合，非完全互补的引物也可以与模板形成引物-模板复合物，从而进行扩增。
本发明融合蛋白或其元件(如VSVG)的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据已公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或融合蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述蛋白质的方法。
通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸序列可用来表达或生产重组蛋白。一般来说有以下步骤：
(1)用本发明的编码本发明蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
(2)在合适的培养基中培养的宿主细胞；
(3)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明蛋白的编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、NS0、COS7、或293细胞的动物细胞等。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用RbCl。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
应理解，所述术语还包括本发明融合蛋白的衍生物，指本发明融合蛋白在经过1-3个氨基酸添加或替换、1-2个氨基酸缺失并仍具有肿瘤抑制活性的多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
表1
| 最初的残基 | 代表性的取代 | 优选的取代 |
| Ala(A) | Val；Leu；Ile | Val |
| Arg(R) | Lys；Gln；Asn | Lys |
| Asn(N) | Gln；His；Lys；Arg | Gln |
| Asp(D) | Glu | Glu |
| Cys(C) | Ser | Ser |
| Gln(Q) | Asn | Asn |
| Glu(E) | Asp | Asp |
| Gly(G) | Pro；Ala | Ala |
| His(H) | Asn；Gln；Lys；Arg | Arg |
| Ile(I) | Leu；Val；Met；Ala；Phe | Leu |
| Leu(L) | Ile；Val；Met；Ala；Phe | Ile |
| Lys(K) | Arg；Gln；Asn | Arg |
| Met(M) | Leu；Phe；Ile | Leu |
| Phe(F) | Leu；Val；Ile；Ala；Tyr | Leu |
| Pro(P) | Ala | Ala |
| Ser(S) | Thr | Thr |
| Thr(T) | Ser | Ser |
| Trp(W) | Tyr；Phe | Tyr |
| Tyr(Y) | Trp；Phe；Thr；Ser | Phe |
| Val(V) | Ile；Leu；Met；Phe；Ala | Leu |
一旦鉴定获得了相关的肽序列，就可以用重组法来大批量地获得相关肽序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到相关肽(融合蛋白)。
此外，还可用化学方法直接合成相关肽序列。
肽接头
本发明提供了一种融合蛋白，它可任选地含有肽接头。肽接头大小和复杂性可能会影响蛋白的活性。通常，肽接头应当具有足够的长度和柔韧性，以保证连接的两个蛋白在空间上有足够的自由度以发挥其功能。同时避免肽接头中形成α螺旋或β折叠等对融合蛋白的稳定性的影响。
连接肽的长度一般为0-20个氨基酸，较佳地1-15个氨基酸。为了保证效果，本发明使用的连接肽为13个氨基酸。
本发明通过对慢病毒的改造，实现此慢病毒可以高效率感染T淋巴细胞，并且在感染T淋巴细胞的同时起到T淋巴细胞活化的功能。从而起到以下作用：
1)提高生产效率，增加产品安全性。将现有CART淋巴细胞制备过程中的T淋巴细胞活化和感染两个分开进行的流程合并为一步流程，可以减少操作时间，提高生产效率，减少CART淋巴细胞与外部环境的接触机会，增加CART淋巴细胞的安全性。
2)节省成本，增加产品安全性。由于仅需要加入慢病毒就可以起到活化与感染的功能，省略掉了活化过程中需要加入的磁珠或其他促进活化的试剂，因 此极大的节省了成本。同时减少了加入试剂及对细胞进行操作的次数，从而增加了CART淋巴细胞的安全性。另外，由于感染效率较高，无需再加入促进感染效率的试剂，也无需进行离心，从而无需提供离心相关的仪器，节省成本，增加产品安全性。
3)提高生产效率，增加产品安全性。由于不需要加入磁珠进行T淋巴细胞的活化，也就不需要对磁珠进行分离，因此减少了操作步骤，提高了生产效率。减少磁珠的引入也可增加产品的安全性。
下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
实施例1：构建重组慢病毒载体
重组慢病毒载体αCD3-VSVG、αCD28-VSVG的示意图参考图前已述。
重组慢病毒载体的构建是基于携带有VSVG基因的病毒包装辅助质粒H2(购自Addgene，即pVSV-G)进行的。
αCD3-VSVG重组慢病毒载体的构建：
a)获得αCD3基因片段：
全基因合成信号肽-6His-αCD3-柔性肽片段(信号肽核苷酸序列信息为SEQ ID NO.:8，6Hi s核苷酸序列信息为SEQ ID NO.:9，αCD3核苷酸序列信息为SEQ ID NO.:3，柔性肽核苷酸序列信息为SEQ ID NO.:10)，以全基因合成质粒为模板，设计αCD3基因引物，正向引物1(5'
TTCCTCGACGGATCCCTCGAGCGCCACCATGAAGTGCCTTTTGTACTTAGCCTTTTTATTCAT TGG 3'，SEQ ID NO.:11)和反向引物2(5'GGTTGTGTGGAAAAACTATGGTGAAC 3'，SEQ ID NO.:12)，PCR扩增，PCR条件为：98℃变性3分钟；98℃变性10秒，60℃退火10秒，72℃延伸1分钟，30个循环；72℃8分钟；由此获得αCD3基因片段。
b)获得VSVG基因片段：
以病毒包装辅助质粒H2(参照质粒图1，SEQ ID NO.:1)为模板，设计VSVG基因引物，正向引物3(5'GTTCACCATAGTTTTTCCACACAACC 3'，SEQ ID NO.:13)和反向引物4(5'TCCTCGACGGATCCCTCGAGTTACTTTCCAAGTCGGTTCATCTC 3'，SEQ ID NO.:14)，PCR扩增，PCR条件为：98℃变性3分钟；98℃变性10秒，60℃退火10秒，72℃延伸1分钟30秒，30个循环；72℃8分钟；由此获得VSVG基因片段。
c)获得信号肽-6His-αCD3-柔性肽-VSVG重组基因片段：
以步骤a、b获得的基因片段为模板，正向引物1(5'TTCCTCGACGGATCCCTCGAGCGCCACCATGAAGTGCCTTTTGTACTTAGCCTTTTTATTCATTGG3'，SEQ ID NO.:11)和反向引物4(5'TCCTCGACGGATCCCTCGAGTTACTTTCCAAGTCGGTTCATCTC 3'，SEQ ID NO.:14)，Overlap PCR扩增，PCR条件为：98℃变性3分钟；98℃变性10秒，60℃退火10秒，72℃延伸2分钟20秒，30个循环；72℃8分钟；由此获得信号肽-6His-αCD3-柔性肽-VSVG重组基因片段。
d)病毒包装辅助质粒H2的处理：
用XhoI酶切H2质粒，获得4.8Kb和1676bp两个片段，凝胶回收纯化4.8Kb 的载体片段。
e)In-Fusion(重组酶法)构建αCD3-VSVG重组慢病毒载体
将步骤c获得重组基因片段与步骤d获得的酶切载体做In-Fusion同源重组，获得αCD3-VSVG重组慢病毒载体，其In-Fusion同源重组体系(购自苏州神洲基因有限公司)和条件如下：
In-Fusion Enzyme：1μl
In-Fusion Buffer：2μl
重组基因片段：300ng
酶切载体片段：100ng
双蒸水：总体积补到10μl
37℃30分钟。
αCD28-VSVG重组慢病毒载体构建：
f)获得αCD28基因片段：
全基因合成信号肽-6His-αCD28-柔性肽片段(信号肽核苷酸序列信息为SEQ.ID.NO.1，6His核苷酸序列信息为SEQ.ID.NO.2，αCD28核苷酸序列信息为SEQ.ID.NO.5，柔性肽核苷酸序列信息为SEQ.ID.NO.3)，以全基因合成质粒为模板，设计αCD28基因引物，正向引物1(5'TTCCTCGACGGATCCCTCGAGCGCCACCATGAAGTGCCTTTTGTACTTAGCCTTTTTATTC3'，SEQ ID NO.:15)和反向引物2(5'GGTTGTGTGGAAAAACTATGGTGAAC 3'，SEQ ID NO.:12)，PCR扩增，PCR条件为：98℃变性3分钟；98℃变性10秒，60℃退火10秒，72℃延伸1分钟，30个循环；72℃8分钟；由此获得αCD28基因片段。
g)获得VSVG基因片段：
以病毒包装辅助质粒H2(参照质粒图谱Fig C，VSVG基因SEQ.ID.NO.6)为模板，设计VSVG基因引物，正向引物3(5'GTTCACCATAGTTTTTCCACACAACC3',SEQ ID NO.:13)和反向引物4(5'TCCTCGACGGATCCCTCGAGTTACTTTCCAAGTCGGTTCATCTC 3'，SEQ ID NO.:14)，PCR扩增，PCR条件为：98℃变性3分钟；98℃变性10秒，60℃退火10秒，72℃延伸1分钟30秒，30个循环；72℃8分钟；由此获得VSVG基因片段。
h)获得信号肽-6His-αCD28-柔性肽-VSVG重组基因片段：
以步骤a、b获得的基因片段为模板，正向引物1(5'TTCCTCGACGGATCCCTCGAGCGCCACCATGAAGTGCCTTTTGTACTTAGCCTTTTTATTC3'，SEQ ID NO.:15)和反向引物4(5'TCCTCGACGGATCCCTCGAGTTACTTTCCAAGTCGGTTCATCTC 3'，SEQ ID NO.:14)，Overlap PCR扩增，PCR条件为：98℃变性3分钟；98℃变性10秒，60℃退火10秒，72℃延伸2分钟20秒，30个循环；72℃8分钟；由此获得信号肽-6His-αCD28-柔性肽-VSVG重组基因片段。
i)病毒包装辅助质粒H2的处理：
用XhoI酶切H2质粒，获得4.8Kb和1676bp两个片段，凝胶回收纯化4.8Kb的载体片段。
j)In-Fusion构建αCD28-VSVG重组慢病毒载体
将步骤c获得重组基因片段与步骤d获得的酶切载体做In-Fusion同源重组，获得αCD28-VSVG重组慢病毒载体，其In-Fusion同源重组体系(购自苏州神洲基因有限公司)和条件如下：
In-Fusion Enzyme：1μl
In-Fusion Buffer：2μl
重组基因片段：300ng
酶切载体片段：100ng
双蒸水：总体积补到10μl
37℃30分钟。
k)转化
取数只TOP10(100μl)感受态置于冰上，待其融化后加入步骤e、j同源重组产物，冰浴30分钟，42℃热激90秒，继续冰浴2-3分钟；加入无抗生素的LB培养基500μl，37℃220rpm培养1小时；5000rpm离心1分钟，超净工作台中弃去450μl上清液，将剩余培养基与菌体吹匀，涂布在相应抗性的LB固体培养基上；37℃过夜培养。
l)阳性克隆鉴定
通过菌落PCR的方法鉴定阳性克隆并送测序，比对分析结果后最终确定带有正确序列的克隆。
m)质粒抽提
使用碱裂解法或购买质粒抽提试剂盒提取重组的慢病毒质粒αCD3-VSVG、αCD28-VSVG，测定浓度后，-20℃冰箱保存。
本发明所用的基因序列说明如下：
信号肽核苷酸序列SEQ ID NO.:8：
atgaagtgccttttgtacttagcctttttattcattggggtgaattgc
6His核苷酸序列SEQ ID NO.:9：CATCATCATCATCATCAT
柔性肽核苷酸序列SEQ ID NO.:10：
GGAGGCGGTTCAGGAGGTGGCTCGAGCGGAGGCGGTTCA
H2质粒带有CMV启动子，该启动子可在真核细胞中大量启动下游基因表达，无组织特异性。在CMV启动子与VSVG之间还有β-Globin序列，在VSVG下游也有一段β-Globin序列，该序列的存在在一定程度上可增强VSVG基因在真核细胞中的转录水平。
实施例2：重组慢病毒包装及初步验证
1.按照24h传代周期供应HEK-293T细胞(购自ATCC公司)，转染前换液，每盘细胞用电动移液器更换5ml含2％FBS的DMEM培养基。
2.依次加入HBW缓冲液、质粒H1(购自Addgene公司，12μg/盘，盘指10cm细胞培养皿下同)、重组H2质粒(10μg/盘)、载体质粒(包含外源基因的慢病毒载体，购自Addgene公司，24μg/盘)、CaCl2(50μl/盘)，最后在旋涡震荡器上边震荡边逐滴加入2×HBS(500μl/盘)，转染体系为1ml/盘。其中载体质粒为表达EIF1α启动的EGFP的载体，重组H2为αCD3-VSVG、αCD28-VSVG与野生型H2的混合。其中αCD3-VSVG和αCD28-VSVG以1:1的比例加入，与野生型的H2以不同比例搭配，见图4中的图A。
3.小心吹打转染体系，混匀后取1000μl逐滴加入293T细胞，操作保持稳定使转染体系均匀分布于10cm平皿。
4.保持平皿水平，并使平皿内液体前后左右分别各晃动十次，混匀过程要充分，但不能有液体溅出或流到平皿壁外，然后置于37℃，5％CO2培养箱中培养。转染后8小时，弃去上清液，用电动移液器更换含DMEM培养基。
5.转染结束后28～30小时之间开始第一次收集上清，补齐10ml DMEM培养基。在转染结束后48～50小时开始第二次收集上清。超速离心，重悬于100ul DMEM以备后用。
αCD3-VSVG和αCD28-VSVG以1:1的比例加入，与野生型的H2以不同比 例搭配及对应慢病毒颗粒产量(严格使用clontech的Lenti-X p24Rapid titer kit进行检测)见图4。可见，当αCD3/αCD28-VSVG占所用H2总量为30％时，慢病毒产量最高。采用这一组的条件所得病毒颗粒进行免疫印迹(Western blot)的方法检验，可见scfv标记的VSVG正常表达。
实施例3：重组慢转录病毒感染T淋巴细胞
感染实验按照本领域技术人员已知的常规方法进行。简述感染步骤如下：
1.外周血单核淋巴细胞(PBMC)的获得，通过血液单采系统获得>1x107的细胞。
2.使用完全培养基(TexMACS培养基+5％的自体血清)调整部分细胞悬液使其终浓度为0.7×106/ml，并加入白介素2(IL-2)，青霉素(penicillin)和链霉素(streptomycin)及牛血清白蛋白(BSA)，令其终浓度分别为600IU/ml，100U/ml，100μg/ml和0.2％。
3.将重悬好的细胞轻轻混匀，取出0.4ml的细胞悬液(总细胞量0.28×106)转移至1.5mL离心管中。
4.加入所需要的病毒，按照MOI为10来计算添加的病毒量。
5.将加入的病毒与细胞悬液轻轻混匀，再将细胞与病毒混合液转移至24-孔板中。
6.将细胞板置于32℃预热的板式离心机1000g离心30分钟。
7.然后然后放于37℃，5％CO2的培养箱培养。
8.8-12小时后，向感染过病毒的PBMC细胞补加1mL的完全培养基(TexMACS培养基+5％的自体血清+600IU/ml的白介素2(IL-2)，100U/ml的青霉素(penicillin)，100g/ml的链霉素(streptomycin)及0.2％牛血清白蛋白(BSA)。
9.在细胞培养过程中每隔一天用完全培养基将细胞进行换液，维持细胞的密度在维持细胞密度维持在0.5-2x 106/ml。
10.将胞放于37℃，5％CO2的培养箱培养中培养4天后进行效果测。
实施例4：重组慢病毒的效果检测
1.感染效率检测
1.1经细胞计数后收集1x 106个细胞，400g离心5min。
1.2弃去培养基，加入500ul流式洗液(PBS，PH7.2，+2％BSA，0.22m滤膜过滤)，洗涤一次。
1.3去除流式洗液将细胞沉淀用手指轻轻弹散。
1.4加入FACS洗液，4℃400g 5min离心，弃上清；
1.5加入400ul FACS洗液将细胞重悬，再转移到400ul细胞悬液到96-孔板中，准备上机检测，检测结果见图5。
感染成功的慢病毒会表达绿色荧光，可经流式检测得到。由此图可见，野生型VSVG包被的慢病毒感染效率约为44％，明显弱于经改造的VSVG(感染效率81％)。由此可知，经改造的慢病毒可以明显提高对T淋巴细胞的感染效率。
2.感染后激活的CD69活化阳性T细胞检测
CD69是T淋巴细胞被激活后细胞表面出现的激活标志物。通过检测CD69阳性的T细胞的数量，可以得知活化的效果。
2.1经细胞计数后收集1x 106个细胞，400g离心5min。
2.2弃去培养基，加入500ul流式洗液(PBS，PH7.2，+2％BSA，0.22m滤膜过滤)，洗涤一次。
2.3去除流式洗液将细胞沉用手指淀轻轻弹散。
2.4加入10ul CD69-APC抗体，4℃避光染色20min,中间混匀一次；
2.5加入FACS洗液，4℃400g 5min离心，弃上清；
2.6加入400ul FACS洗液将细胞重悬，再转移到400ul细胞悬液到96-孔板中，准备上机检测，检测结果见图6。
由图中可见，改造后的慢病毒可以明显起到激活T细胞的作用，CD69阳性细胞率高达50％以上。而且能够有效的促进细胞增殖。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
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Claims (10)
1.一种重组病毒包膜糖蛋白，其特征在于，所述蛋白具有式I所述结构：
N端’ B-A C端’ (I)
其中，
元件A为衍生自野生型病毒包膜糖蛋白的蛋白元件；
元件B为辅助蛋白元件，并且所述辅助蛋白元件可特异性识别与T细胞活化相关的T细胞细胞膜表面蛋白；
“-”表示连接上述各元件的肽键或肽接头；
优选地，所述野生型病毒包膜糖蛋白选自：VSV、BaEv、RD114、MLV、和MV；
更优选地，所述与T细胞活化相关的T细胞细胞膜表面蛋白选自：CD3、和CD28。
最优选地，所述重组病毒包膜糖蛋白选自下组：
(A)具有SEQ ID NO:17、19所示氨基酸序列的多肽；
(B)具有与SEQ ID NO:17、19所示氨基酸序列≥80％同源性(优选地，≥
90％的同源性；等优选地≥95％的同源性；最优选地，≥97％的同源性，
如98％以上，99％以上)的多肽，且所述多肽具有与(A)中多肽相似的活
性；
(C)将(A)中任一所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添
加而形成的，且保留(A)中多肽活性的衍生多肽。
2.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸编码权利要求1所述的重组病毒包膜糖蛋白。
3.一种载体，其特征在于，它含有权利要求2所述的多核苷酸。
4.一种基因工程化的重组病毒，其特征在于，所述病毒具有权利要求1所述的重组病毒包膜糖蛋白。
5.一种宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求3所述的载体或基因组中整合有权利要求2所述的多核苷酸。
6.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括权利要求1所述的重组病毒包膜糖蛋白、权利要求2所述的多核苷酸、权利要求3中所述的载体、权利要求4所述的病毒、和/或权利要求5所述的宿主细胞。
7.权利要求1所述的重组病毒包膜糖蛋白、权利要求2所述多核苷酸、权利要求3所述的载体的用途，用于慢病毒、或腺病毒的包装。
8.一种重组病毒的包装方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
(1)提供一包装细胞；
(2)配制转染体系，所述转染体系中包括表达权利要求1所述的重组病毒包膜糖蛋白的载体；和
(3)转染包装细胞，进行病毒包装。
9.权利要求4所述的重组病毒的用途，其特征在于，用于制备生产CAR-T细胞的试剂。
10.一种制剂，其特征在于，所述制剂含有权利要求4所述的重组病毒和任选的赋形剂。
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