CN105925543A - 一种包含ox40的慢病毒制备方法及应用 - Google Patents

一种包含ox40的慢病毒制备方法及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN105925543A
CN105925543A CN201610482297.9A CN201610482297A CN105925543A CN 105925543 A CN105925543 A CN 105925543A CN 201610482297 A CN201610482297 A CN 201610482297A CN 105925543 A CN105925543 A CN 105925543A
Authority
CN
China
Prior art keywords
plasmid
vsvg
pcr amplification
cell
slow virus
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201610482297.9A
Other languages
English (en)
Inventor
董坚
杨益
刘玉芝
何群
罗继薇
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wuhan Think Medical Technology Co Ltd
Original Assignee
Wuhan Think Medical Technology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wuhan Think Medical Technology Co Ltd filed Critical Wuhan Think Medical Technology Co Ltd
Priority to CN201610482297.9A priority Critical patent/CN105925543A/zh
Publication of CN105925543A publication Critical patent/CN105925543A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70575—NGF/TNF-superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15021—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/20011—Rhabdoviridae
    • C12N2760/20211—Vesiculovirus, e.g. vesicular stomatitis Indiana virus
    • C12N2760/20222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供了一种包含OX40的慢病毒制备方法及应用。通过所述慢病毒制备方法制备的慢病毒，可以不需要添加CD28，仅在转染前，于培养基中直接添加少量的CD3作为T细胞激活第一信号，减少Car‑T细胞制备的程序，降低成本及污染风险；通过重组VSVG，刺激T细胞进一步活化，增加病毒与细胞接触概率以有效提高感染效率。

Description

一种包含OX40的慢病毒制备方法及应用
技术领域
本发明属于医学生物技术领域，具体涉及一种包含OX40的慢病毒制备方法及应用。
背景技术
慢病毒(Lentivirus)载体是以HIV-1(人类免疫缺陷I型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。
慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。
如图1所示，慢病毒可作为CART淋巴细胞治疗中的外源基因的载体，将外源基因CAR导入到T淋巴细胞中，从而对T淋巴细胞进行基因组修饰，同时起到对T淋巴细胞活化的作用。嵌合抗原受体(CAR)基因修饰的T细胞是以能编码单链抗体-共刺激分子-免疫受体酪氨酸活化基序的嵌合分子的融合基因修饰T细胞而产生的一种基因修饰的T细胞，具有肿瘤抗原识别特异性强、亲和力高、非MHC限制性并且可在体内外大量扩增。
作为和本申请最接近的现有技术，公开号为CN201510279570.3的专利公开了一种用于制备CART细胞的具有高效转染能力和生物学活性的慢病毒，将CD3和CD28的相关序列与VSVG重组后用于慢病毒的包装，将CD3的第一信号、CD28的第二信号，分别单独与VSVG重组来共同活化T细胞，同时在感染T细胞前不使用任何抗体激活T细胞，这种活化方式具有一定的风险性和不稳定性。
发明内容
为了解决现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种包含OX40的慢病毒制备方法及应用。通过所述慢病毒制备方法制备的慢病毒，可以不需要添加CD28，仅在转染前，于培养基中直接添加少量的CD3作为T细胞激活第一信号，减少Car-T细胞制备的程序，降低成本及污染风险；通过重组VSVG，刺激T细胞进一步活化，增加病毒与细胞接触概率以有效提高感染效率。
本发明所采用的技术方案为：
一种包含OX40的慢病毒制备方法，包括以下步骤：
A、慢病毒载体质粒881-3-SJ19的构建：
A1、对CD19CAR基因进行PCR扩增：以全基因合成CD19CAR基因为模板，进行PCR扩增，得到CD19CAR扩增产物；
A2、凝胶提纯CD19CAR扩增产物：使用凝胶提纯PCR扩增产物中CD19CAR的cDNA；
A3、用CD19CAR基因转染细胞：将步骤A2中得到的CD19CAR的cDNA、18-T Vector和Solution I混合均匀，在16℃下保存16小时；然后加入Trans5α感受态细胞中，依次在冰中保持30min，然后加热至42℃保持45s，再在冰中保持1min，然后加入SOC/LB培养基，在37℃振荡培养60分钟，培养后离心，弃部分上清液后，将剩余液体涂布在含有Amp的琼脂平板培养基上培养；
A4、提取含有CD19CAR基因的质粒：从琼脂平板培养基上挑取881-3-SJ19质粒；
B、VSVG质粒的改造：
B1、对OX40基因进行PCR扩增：以全基因合成OX40的基因片段为模板，进行PCR扩增，得到OX40扩增产物；
B2、对VSVG基因进行PCR扩增：以全基因合成VSVG的基因片段为模板，进行PCR扩增，得到VSVG扩增产物；
B3、获得OX40-VSVG重组基因片段：将所述OX40扩增产物和VSVG扩增产物进行酶切，并回收酶切产物进行连接反应，得到连接产物；
B4、用OX40-VSVG重组基因片段转染细胞：将步骤B3得到的连接产物加入TOP10感受态细胞中，混合均匀后依次在冰中保持30min，然后加热至42℃保持45s，再在冰中保持1min，然后加入SOC/LB培养基，在37℃振荡培养60分钟，培养后离心，弃部分上清液后，将剩余液体涂布在琼脂平板培养基上培养；
B5、改造VSVG质粒的提取：用碱裂解法或质粒抽提试剂盒提取改造的VSVG质粒，命名为OX40-VSVG质粒；
C、慢病毒的制备：
C1、配制BES溶液：将10ml 1.4M的NaCl、5ml 0.5M的BES、500μL 150mM的Na2HPO4和1100μL 1M的NaOH混合均匀、加双蒸水定容至50ml、调PH至6.95，过滤后保存，即为BES溶液；
C2、配制转染试剂：将步骤A4得到的881-3-SJ19质粒、NRF质粒、步骤B5得到的OX40-VSVG质粒、1M CaCl2和双蒸水，混合均匀后，逐滴加入步骤C1得到的BES溶液，滴加完毕后，静置30min；即得转染试剂；
C3、细胞转染和培养：复苏293T细胞并进行培养，当所述293T细胞密度达到培养皿底部70％时进行转染，用不含血清的DMEM培养基对所述293T细胞进行换液；换液后，逐滴加入步骤C2得到的转染试剂，混合均匀后，将所述293T细胞放入培养箱，静置2小时，静止后滴加胎牛血清，继续培养8小时，然后使用含10wt％胎牛血清的DMEM换液，继续培养48小时；
C4、病毒收集：步骤C3完成后，收集上清液，离心过滤后，即得病毒原液。
通过所述慢病毒制备方法制备的慢病毒，可以不需要添加CD28，仅在转染前，于培养基中直接添加少量的CD3作为T细胞激活第一信号，减少Car-T细胞制备的程序，降低成本及污染风险；通过重组VSVG，刺激T细胞进一步活化，增加病毒与细胞接触概率以有效提高感染效率。
根据本发明的一个实施例，凝胶提纯CD19CAR扩增产物的操作包括以下步骤：
1.在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶，切碎胶块。
2.称重胶块重量，计算胶块体积，以1mg＝1μL计算，向胶块中加入BufferGM(3个凝胶体积量)。
3.均匀混合后37℃水浴溶解，此时应间断振荡混合，使胶块充分溶解(约5-10分钟)。
4.当凝胶完全溶解后，观察溶胶液的颜色，如果溶胶液颜色由黄色变为橙色或粉色，向上述胶块溶解液中加入3M醋酸钠溶液(pH5.2)10μl，均匀混合至溶液恢复黄色。当分离小于400bp的DNA片段时，应在此溶液中再加入终浓度为20％的异丙醇。
5.将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。
6.将上述操作步骤4的溶液转移至Spin Column中，12,000rpm离心1分钟，弃滤液。
7.将700μl的Buffer WB加入Spin Column中，室温12,000rpm离心30秒钟，弃滤液。
8.再加入700μl的Buffer WB，将Spin Column安置于Collection Tube上，室温12,000rpm离心1分钟。
9.将Spin Column安置于新的1.5ml的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入30μl灭菌蒸馏水或Elution Buffer(加热至60℃使用时有利于提高洗脱效率。)室温静置1分钟。室温12000rpm离心1分钟洗脱DNA。
步骤A1中，所述PCR反应体系的总体积为50μL：包括0.25μL的Ex Taq酶、5μL的Ex Taq缓冲液、4μL的dNTP、2μL的模板和4μL引物，余量为灭菌水，所使用的dNTP的浓度为2.5mM，模板的浓度为100ng/μL，引物的浓度为10uM。
也就是说，所述dNTP、模板和引物，均为添加前的浓度。
步骤A1中，使用的PCR扩增程序为：进行25个循环，其中每个循环依次包括以下步骤：在98℃温度下预变性10s，在50℃温度下退火30s；在72℃温度下延伸2min；在完成25个循环之后，即完成PCR扩增程序。
步骤A4完成之后，还包括A5、酶切检测：依次进行酶切步骤和连接反应检测所述881-3-SJ19质粒的序列；使用的酶切体系为：2μL的881-3-SJ19质粒、1μL的缓冲液、0.5μL的XhoI酶和6.5μL的ddH2O；使用的连接体系为：2μL的慢病毒载体、1μL的缓冲液、0.5μL的XbaI酶和6.5μL的ddH2O。
步骤B1中，所述PCR反应体系的总体积为50μL：包括0.25μL的Ex Taq酶、5μL的Ex Taq缓冲液、4μL的dNTP、2μL的模板和4μL引物，余量为灭菌水，所使用的dNTP的浓度为2.5mM，模板的浓度为100ng/μL，引物的浓度为10uM。
步骤B1中，使用的PCR扩增程序为：进行25个循环，其中每个循环依次包括以下步骤：在98℃温度下预变性10s，在50℃温度下退火30s；在72℃温度下延伸2min；在完成25个循环之后，即完成PCR扩增程序。
步骤B2中，所述PCR反应体系的总体积为50μL：包括0.25μL的Ex Taq酶、5μL的Ex Taq缓冲液、4μL的dNTP、2μL的模板和4μL引物，余量为灭菌水，所使用的dNTP的浓度为2.5mM，模板的浓度为100ng/μL，引物的浓度为10uM。
步骤B2中，使用的PCR扩增程序为：进行25个循环，其中每个循环依次包括以下步骤：在98℃温度下预变性10s，在50℃温度下退火30s；在72℃温度下延伸2min；在完成25个循环之后，即完成PCR扩增程序。
步骤步骤C4完成之后，还包括C5、病毒效价检测：用病毒效价检测试剂盒检测病毒效价。
根据本发明的实施例，使用病毒效价检测试剂盒检测时，病毒效价的标准曲线如图2所示，病毒效价的检测结果如表2所示：
本发明还公开了，所述慢病毒制备方法制备得到的慢病毒在感染T细胞中的应用。
本发明的实施例2，公开了一例慢病毒感染T细胞及效果检测的实施例。从实施例能够看出，通过所述慢病毒制备方法制备的慢病毒，可以不需要添加CD28，仅在转染前，于培养基中直接添加少量的CD3作为T细胞激活第一信号，减少Car-T细胞制备的程序，降低成本及污染风险；通过重组VSVG，刺激T细胞进一步活化，增加病毒与细胞接触概率以有效提高感染效率。
为进一步明确本发明中的技术方案，做出以下说明，未进行着重说明的，均为行业通用术语，在此就不在赘述。
CD134(OX40)在T细胞增殖的后期及维持存活过程中发挥重要作用，通过影响其介导产生的细胞因子，进而影响CD4+T细胞的分化，而CD4+T细胞又能促进CD8+TCL的增殖和持续存在。同时，CD134能协同刺激T细胞的活化，促进B细胞类别转换和产生高效抗体。在众多的共刺激分子中，许多都可以阻止耐受的形成，而耐受一旦形成，只有CD134可以打破已建立的外周耐受。将CD134作为刺激T细胞活化的协同信号，结合慢病毒包装和T细胞活化方式的改进，重组到VSVG中，与靶向载体一同包装成慢病毒，在早期和长期活化T细胞方面有积极意义。携带OX40-VSVG的慢病毒可以与T淋巴细胞表面的CD134结合，加强慢病毒与T淋巴细胞的接触，有利于提高慢病毒感染效率。
在本发明中，VSVG的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
VSVG的结构图如图3所示；
OX40的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
OX40-VSVG的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；
OX40-VSVG的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；
OX40-VSVG的结构图如图4所示。
附图说明
图1为现有技术中T细胞活化过程的示意图；
图2是实施例中使用病毒效价检测试剂盒检测时，病毒效价的标准曲线图；
图3是VSVG的结构图；
图4是OX40-VSVG的结构图；
图5-图8是实施例2中感染效率的结果图；
图9是实施例2中CD69阳性表达率的结果图。
具体实施方式
下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。
在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
实施例1
一种包含OX40的慢病毒制备方法，包括以下步骤：
A、慢病毒载体质粒881-3-SJ19的构建：
A1、对CD19CAR基因进行PCR扩增：以全基因合成CD19CAR基因为模板，进行PCR扩增，得到CD19CAR扩增产物；
步骤A1中，所述PCR反应体系的总体积为50μL：包括0.25μL的Ex Taq酶、5μL的Ex Taq缓冲液、4μL的dNTP、2μL的模板和4μL引物，余量为灭菌水，所使用的dNTP的浓度为2.5mM，模板的浓度为100ng/μL，引物的浓度为10uM；
使用的PCR扩增程序为：进行25个循环，其中每个循环依次包括以下步骤：在98℃温度下预变性10s，在50℃温度下退火30s；在72℃温度下延伸2min；在完成25个循环之后，即完成PCR扩增程序。
A2、凝胶提纯CD19CAR扩增产物：使用凝胶提纯PCR扩增产物中CD19CAR的cDNA；
A3、用CD19CAR基因转染细胞：将步骤A2中得到的CD19CAR的cDNA、18-T Vector和Solution I混合均匀，在16℃下保存16小时；然后加入Trans5α感受态细胞中，依次在冰中保持30min，然后加热至42℃保持45s，再在冰中保持1min，然后加入SOC/LB培养基，在37℃振荡培养60分钟，培养后离心，弃部分上清液后，将剩余液体涂布在含有Amp的琼脂平板培养基上培养；
A4、提取含有CD19CAR基因的质粒：从琼脂平板培养基上挑取881-3-SJ19质粒；
A5、酶切检测：依次进行酶切步骤和连接反应检测所述881-3-SJ19质粒的序列；使用的酶切体系为：2μL的881-3-SJ19质粒、1μL的缓冲液、0.5μL的XhoI酶和6.5μL的ddH2O；使用的连接体系为：2μL的慢病毒载体、1μL的缓冲液、0.5μL的XbaI酶和6.5μL的ddH2O
其中，凝胶提纯CD19CAR扩增产物的操作包括以下步骤：
1.在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶，切碎胶块。
2.称重胶块重量，计算胶块体积，以1mg＝1μL计算，向胶块中加入BufferGM(3个凝胶体积量)。
3.均匀混合后37℃水浴溶解，此时应间断振荡混合，使胶块充分溶解(约5-10分钟)。
4.当凝胶完全溶解后，观察溶胶液的颜色，如果溶胶液颜色由黄色变为橙色或粉色，向上述胶块溶解液中加入3M醋酸钠溶液(pH5.2)10μl，均匀混合至溶液恢复黄色。当分离小于400bp的DNA片段时，应在此溶液中再加入终浓度为20％的异丙醇。
5.将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。
6.将上述操作步骤4的溶液转移至Spin Column中，12,000rpm离心1分钟，弃滤液。
7.将700μl的Buffer WB加入Spin Column中，室温12,000rpm离心30秒钟，弃滤液。
8.再加入700μl的BufferWB，将Spin Column安置于Collection Tube上，室温12,000rpm离心1分钟。
9.将Spin Column安置于新的1.5ml的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入30μl灭菌蒸馏水或Elution Buffer(加热至60℃使用时有利于提高洗脱效率。)室温静置1分钟。室温12000rpm离心1分钟洗脱DNA。
其中，Buffer GM使用量见表1
表1：Buffer GM使用量表
凝胶浓度 Buffer GM使用量
1.0％ 3个凝胶体积量
1.0％—1.5％ 4个凝胶体积量
1.5％—2.0％ 5个凝胶体积量
B、VSVG质粒的改造：
B1、对OX40基因进行PCR扩增：以全基因合成OX40的基因片段为模板，进行PCR扩增，得到OX40扩增产物；
步骤B1中，所述PCR反应体系的总体积为50μL：包括0.25μL的Ex Taq酶、5μL的Ex Taq缓冲液、4μL的dNTP、2μL的模板和4μL引物，余量为灭菌水，所使用的dNTP的浓度为2.5mM，模板的浓度为100ng/μL，引物的浓度为10uM。
使用的PCR扩增程序为：进行25个循环，其中每个循环依次包括以下步骤：在98℃温度下预变性10s，在50℃温度下退火30s；在72℃温度下延伸2min；在完成25个循环之后，即完成PCR扩增程序。
B2、对VSVG基因进行PCR扩增：以全基因合成VSVG的基因片段为模板，进行PCR扩增，得到VSVG扩增产物；
所述PCR反应体系的总体积为50μL：包括0.25μL的Ex Taq酶、5μL的Ex Taq缓冲液、4μL的dNTP、2μL的模板和4μL引物，余量为灭菌水，所使用的dNTP的浓度为2.5mM，模板的浓度为100ng/μL，引物的浓度为10uM。
使用的PCR扩增程序为：进行25个循环，其中每个循环依次包括以下步骤：在98℃温度下预变性10s，在50℃温度下退火30s；在72℃温度下延伸2min；在完成25个循环之后，即完成PCR扩增程序。
B3、获得OX40-VSVG重组基因片段：将所述OX40扩增产物和VSVG扩增产物进行酶切，并回收酶切产物进行连接反应，得到连接产物；
B4、用OX40-VSVG重组基因片段转染细胞：将步骤B3得到的连接产物加入TOP10感受态细胞中，混合均匀后依次在冰中保持30min，然后加热至42℃保持45s，再在冰中保持1min，然后加入SOC/LB培养基，在37℃振荡培养60分钟，培养后离心，弃部分上清液后，将剩余液体涂布在琼脂平板培养基上培养；
B5、改造VSVG质粒的提取：用碱裂解法或质粒抽提试剂盒提取改造的VSVG质粒，命名为OX40-VSVG质粒；
C、慢病毒的制备：
C1、配制BES溶液：将10ml 1.4M的NaCl、5ml 0.5M的BES、500μL 150mM的Na2HPO4和1100μL 1M的NaOH混合均匀、加双蒸水定容至50ml、调PH至6.95，过滤后保存，即为BES溶液；
C2、配制转染试剂：将步骤A4得到的881-3-SJ19质粒、NRF质粒、步骤B5得到的OX40-VSVG质粒、1M CaCl2和双蒸水，混合均匀后，逐滴加入步骤C1得到的BES溶液，滴加完毕后，静置30min；即得转染试剂；
C3、细胞转染和培养：提前两周复苏293T细胞，在10cm培养皿内进行培养，每日观察细胞；待细胞铺满2层左右，将1盘细胞消化传代至10盘，每日观察，至细胞密度达皿底70％左右时可进行转染。转染前，用8ml不含血清的DMEM培养基换液；换液后，逐滴加入步骤C2得到的转染试剂，缓缓吹打混匀以上转染试剂，每盘细胞取1ml该试剂，逐滴均匀地加入到已换液的293T细胞中。将培养皿前后方向、左右方向各轻轻晃动数十次混匀，将细胞放入培养箱，静置2小时。每盘细胞补加1ml胎牛血清，逐滴均匀地加入后，将培养皿前后方向、左右方向各轻轻晃动数十次混匀，将细胞放入培养箱。约8h后，每盘细胞用10ml含10％胎牛血清的DMEM换液，将培养箱的CO2浓度调整为3％；
C4、病毒收集：步骤C3完成后，收集上清(共100ml)，1200rpm离心5min，0.22um(PES)滤膜过滤上清，即为病毒原液。
C5、病毒效价检测：用病毒效价检测试剂盒检测病毒效价，检测结果约为108/ml，病毒效价的标准曲线如图2所示，病毒效价的检测结果如表2所示：
表2：病毒效价的检测结果表
样品名 OD值 检测效价(IFU/ml) 实际效价
病毒原液(稀释103倍) 1.577 939.164 9.392*105
病毒原液(稀释104倍) 0.292 107.512 1.075*106
病毒浓缩液(稀释105倍) 1.667 997.412 9.974*107
病毒浓缩液(稀释106倍) 0.284 102.335 1.023*108
实施例2
慢病毒感染T细胞及效果检测
1、机采获取约1×107个单核淋巴细胞；Ficoll分离出单个核细胞，加含IL-2(1000U/ml)的vivo15培养基进行培养，加少量CD3抗体刺激(100ug/ml)。感染前将细胞浓度调整为1×106/ml，取体积1ml，6孔板内培养；按MOI＝5来计算病毒量，加入病毒浓缩液前，加入1ml完全培养液悬浮，0.22um过滤。加入病毒后，轻轻混匀，放入培养箱培养3天后，洗去病毒继续培养。
2、感染效率检测
收集5×105细胞；用buffer(PBS+2％BSA)洗三次；细胞重悬于200μL的buffer，加1ug的protein L-biotin，4℃45min；用buffer洗一次；细胞重悬于200μL的buffer，加10μL的SA-PE(5ug/ml)，同时加2μLCD3–APC，避光，4℃25min；用buffer洗一次，用buffer悬浮至200μL；流式检测PE及APC荧光。VSVG重组后，感染效率由35％提高至89％，增加50％以上，结果如图5-图8所示。
3、活化效率检测
收集2×105细胞；用buffer(PBS+2％BSA)洗三次；细胞重悬于200μL的buffer，加2ug的CD69-FITC，4℃避光孵育30min；用buffer洗一次，用buffer悬浮至200μL；流式检测荧光。活化效率约为55％，可见改造后的慢病毒可以有效激活T细胞，结果如图9所示。
最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种包含OX40的慢病毒制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、慢病毒载体质粒881-3-SJ19的构建：
A1、对CD19CAR基因进行PCR扩增：以全基因合成CD19CAR基因为模板，进行PCR扩增，得到CD19CAR扩增产物；
A2、凝胶提纯CD19CAR扩增产物：使用凝胶提纯PCR扩增产物中CD19CAR的cDNA；
A3、用CD19CAR基因转染细胞：将步骤A2中得到的CD19CAR的cDNA、18-T Vector和Solution I混合均匀，在16℃下保存16小时；然后加入Trans5α感受态细胞中，依次在冰中保持30min，然后加热至42℃保持45s，再在冰中保持1min，然后加入SOC/LB培养基，在37℃振荡培养60分钟，培养后离心，弃部分上清液后，将剩余液体涂布在含有Amp的琼脂平板培养基上培养；
A4、提取含有CD19CAR基因的质粒：从琼脂平板培养基上挑取881-3-SJ19质粒；
B、VSVG质粒的改造：
B1、对OX40基因进行PCR扩增：以全基因合成OX40的基因片段为模板，进行PCR扩增，得到OX40扩增产物；
B2、对VSVG基因进行PCR扩增：以全基因合成VSVG的基因片段为模板，进行PCR扩增，得到VSVG扩增产物；
B3、获得OX40-VSVG重组基因片段：将所述OX40扩增产物和VSVG扩增产物进行酶切，并回收酶切产物进行连接反应，得到连接产物；
B4、用OX40-VSVG重组基因片段转染细胞：将步骤B3得到的连接产物加入TOP10感受态细胞中，混合均匀后依次在冰中保持30min，然后加热至42℃保持45s，再在冰中保持1min，然后加入SOC/LB培养基，在37℃振荡培养60分钟，培养后离心，弃部分上清液后，将剩余液体涂布在琼脂平板培养基上培养；
B5、改造VSVG质粒的提取：用碱裂解法或质粒抽提试剂盒提取改造的VSVG质粒，命名为OX40-VSVG质粒；
C、慢病毒的制备：
C1、配制BES溶液：将10ml 1.4M的NaCl、5ml 0.5M的BES、500μL 150mM的Na 2HPO4和1100μL 1M的NaOH混合均匀、加双蒸水定容至50ml、调PH至6.95，过滤后保存，即为BES溶液；
C2、配制转染试剂：将步骤A4得到的881-3-SJ19质粒、NRF质粒、步骤B5得到的OX40-VSVG质粒、1M CaCl2和双蒸水，混合均匀后，逐滴加入步骤C1得到的BES溶液，滴加完毕后，静置30min；即得转染试剂；
C3、细胞转染和培养：复苏293T细胞并进行培养，当所述293T细胞密度达到培养皿底部70％时进行转染，用不含血清的DMEM培养基对所述293T细胞进行换液；换液后，逐滴加入步骤C2得到的转染试剂，混合均匀后，将所述293T细胞放入培养箱，静置2小时，静止后滴加胎牛血清，继续培养8小时，然后使用含10wt％胎牛血清的DMEM换液，继续培养48小时；
C4、病毒收集：步骤C3完成后，收集上清液，离心过滤后，即得病毒原液。
2.根据权利要求1所述的慢病毒制备方法，其特征在于，步骤A1中，所述PCR反应体系的总体积为50μL：包括0.25μL的Ex Taq酶、5μL的Ex Taq缓冲液、4μL的dNTP、2μL的模板和4μL引物，余量为灭菌水，所使用的dNTP的浓度为2.5mM，模板的浓度为100ng/μL，引物的浓度为10uM。
3.根据权利要求1所述的慢病毒制备方法，其特征在于，步骤A1中，使用的PCR扩增程序为：进行25个循环，其中每个循环依次包括以下步骤：在98℃温度下预变性10s，在50℃温度下退火30s；在72℃温度下延伸2min；在完成25个循环之后，即完成PCR扩增程序。
4.根据权利要求1所述的慢病毒制备方法，其特征在于，步骤A4完成之后，还包括A5、酶切检测：依次进行酶切步骤和连接反应检测所述881-3-SJ19质粒的序列；使用的酶切体系为：2μL的881-3-SJ19质粒、1μL的缓冲液、0.5μL的XhoI酶和6.5μL的ddH2O；使用的连接体系为：2μL的慢病毒载体、1μL的缓冲液、0.5μL的XbaI酶和6.5μL的ddH2O。
5.根据权利要求1所述的慢病毒制备方法，其特征在于，步骤B1中，所述PCR反应体系的总体积为50μL：包括0.25μL的Ex Taq酶、5μL的Ex Taq缓冲液、4μL的dNTP、2μL的模板和4μL引物，余量为灭菌水，所使用的dNTP的浓度为2.5mM，模板的浓度为100ng/μL，引物的浓度为10uM。
6.根据权利要求1所述的慢病毒制备方法，其特征在于，步骤B1中，使用的PCR扩增程序为：进行25个循环，其中每个循环依次包括以下步骤：在98℃温度下预变性10s，在50℃温度下退火30s；在72℃温度下延伸2min；在完成25个循环之后，即完成PCR扩增程序。
7.根据权利要求1所述的慢病毒制备方法，其特征在于，步骤B2中，所述PCR反应体系的总体积为50μL：包括0.25μL的Ex Taq酶、5μL的Ex Taq缓冲液、4μL的dNTP、2μL的模板和4μL引物，余量为灭菌水，所使用的dNTP的浓度为2.5mM，模板的浓度为100ng/μL，引物的浓度为10uM。
8.根据权利要求1所述的慢病毒制备方法，其特征在于，步骤B2中，使用的PCR扩增程序为：进行25个循环，其中每个循环依次包括以下步骤：在98℃温度下预变性10s，在50℃温度下退火30s；在72℃温度下延伸2min；在完成25个循环之后，即完成PCR扩增程序。
9.根据权利要求1所述的慢病毒制备方法，其特征在于，步骤步骤C4完成之后，还包括C5、病毒效价检测：用病毒效价检测试剂盒检测病毒效价。
10.权利要求1-9任一所述慢病毒制备方法制备得到的慢病毒在感染T细胞中的应用。
CN201610482297.9A 2016-06-27 2016-06-27 一种包含ox40的慢病毒制备方法及应用 Pending CN105925543A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610482297.9A CN105925543A (zh) 2016-06-27 2016-06-27 一种包含ox40的慢病毒制备方法及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610482297.9A CN105925543A (zh) 2016-06-27 2016-06-27 一种包含ox40的慢病毒制备方法及应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105925543A true CN105925543A (zh) 2016-09-07

Family

ID=56829149

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610482297.9A Pending CN105925543A (zh) 2016-06-27 2016-06-27 一种包含ox40的慢病毒制备方法及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105925543A (zh)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104910278A (zh) * 2015-05-27 2015-09-16 上海吉凯基因科技有限公司 一种用于制备cart细胞的具有高效转染能力和生物学活性的慢病毒

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104910278A (zh) * 2015-05-27 2015-09-16 上海吉凯基因科技有限公司 一种用于制备cart细胞的具有高效转染能力和生物学活性的慢病毒

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
王鹏鹏等: "CD8+ T细胞激活和免疫记忆形成的分子调节机制", 《中华微生物学和免疫学杂志》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107630006B (zh) 一种制备tcr与hla双基因敲除的t细胞的方法
Kast et al. Cooperation between cytotoxic and helper T lymphocytes in protection against lethal Sendai virus infection. Protection by T cells is MHC-restricted and MHC-regulated; a model for MHC-disease associations.
CN106801056A (zh) 一种sgRNA及其构建的慢病毒载体和应用
CN108531457A (zh) 一种Cas9/RNP敲除T细胞PD-1和LAG3基因及制备CAR-T细胞的方法
CN110616189B (zh) 通用型靶向cd19抗原嵌合受体t细胞的制备及其应用
CN105777911A (zh) 抗bcma嵌合抗原受体、编码基因、重组表达载体及其构建方法和应用
CN104910278B (zh) 一种用于制备cart细胞的具有高效转染能力和生物学活性的慢病毒
CN105950664B (zh) 一种靶向cd123的复制缺陷性重组慢病毒car-t转基因载体及其构建方法和应用
CN105949316B (zh) 抗EGFRvIII嵌合抗原受体、编码基因、重组表达载体及其构建方法和应用
CN108409840A (zh) 抗cd123单链抗体及其组合的嵌合抗原受体和应用
CN105949317A (zh) 抗cd20嵌合抗原受体、编码基因、重组表达载体及其构建方法和应用
CN105949318A (zh) 抗her2嵌合抗原受体、编码基因、重组表达载体及其构建方法和应用
CN109097402A (zh) 一种重组载体CAR-CD244-antiCD19的制备方法
CN105924533A (zh) Ror1特异性嵌合抗原受体及其应用
CN105820255A (zh) 抗cd33嵌合抗原受体、编码基因、重组表达载体及其构建方法和应用
CN114230658B (zh) 新型冠状病毒特异性t细胞受体和其用途
CN108300693A (zh) 一种自然杀伤细胞体外扩增方法
CN105950663B (zh) 一种靶向cd30的复制缺陷性重组慢病毒car-t转基因载体及其构建方法和应用
CN105349562B (zh) 表达猪细小病毒vp2蛋白的重组载体、重组菌及其应用
CN105925544A (zh) 一种包含4-1bb的慢病毒制备方法及应用
CN106279432A (zh) 一种vc‑car分子及在清除hiv‑1感染细胞中的应用
CN104892770B (zh) 一种对t细胞和造血干细胞具有高效感染和促增殖能力的慢病毒载体
CN109913501A (zh) 一种靶向cd152的复制缺陷性重组慢病毒car-t转基因载体及构建方法
CN105950662A (zh) 一种靶向cd22的复制缺陷性重组慢病毒car-t转基因载体及其构建方法和应用
CN107794269A (zh) 促进基因编辑t细胞活化及扩增的生物膜、制法及应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20160907

RJ01 Rejection of invention patent application after publication