CN106011174B - 一种通用型慢病毒载体及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种通用型慢病毒载体及其制备方法，涉及一种慢病毒载体及其其制备方法。本发明是要解决目前CAR‑T制备中过程中载体构建步骤烦琐、耗时过长，慢病毒载体无法通用，成本高的问题。该慢病毒载体以pCDH‑CMV‑MCS‑EF1‑Puro质粒为骨架，向质粒骨架的多克隆位点MCS处插入以下元件：CD8α Leader DNA序列、CD8α铰链区、CD28跨膜区‑胞内区、CD137胞内区和CD3ζ。方法：一、引物设计；二、外周血单个核细胞的获得、激活；三、mRNA的提取及RT反应；四、重组质粒制备；五、合成单链CD8α Leader DNA序列；六、将线性载体、目的基因片段及CD8α Leader片段连接，即得到通用型慢病毒载体。本发明用于制备慢病毒载体。

Description

一种通用型慢病毒载体及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种慢病毒载体及其其制备方法。
背景技术
T淋巴细胞是肿瘤细胞的天敌，在肿瘤免疫应答中起主要作用，对肿瘤细胞有极强的杀伤作用。但是，使用内源性T细胞进行肿瘤免疫治疗时，靶抗原需经过加工处理后才能和靶细胞表面的主要组织相容性复合物(main histocompatibility complex,MHC)作用，也就是存在我们常说的“MHC限制性”。然而，肿瘤免疫编辑的过程会使MHC在肿瘤细胞表面表达下降，破坏抗原加工过程，降低肽段免疫原性。这样长期形成的免疫逃逸机制，能使肿瘤细胞成功躲避T细胞攻击，肿瘤快速增殖。
过继性细胞免疫治疗(adoptive cellular immunotherapy,ACI)是目前较为有效的恶性肿瘤的治疗方法之一。随着技术的日趋成熟，已在多种实体瘤和血液肿瘤的临床治疗中取得较好疗效。其中，嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)T细胞技术是近年来发展非常迅速的一种细胞治疗技术。通过基因改造技术，效应T细胞的靶向性、杀伤活性和持久性均较常规应用的免疫细胞高，并可克服肿瘤局部免疫抑制微环境和打破宿主免疫耐受状态。
目前，大多数嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)由胞外抗原结合区(由来源于单克隆抗体的轻链(VL)和重链(VH)组成，中间由带韧性的铰链区连接形成单链抗体(single chain fragment variable,scFv)、跨膜区域和胞内信号转导区组成。CAR的信号域已从第一代的单一信号分子发展为包含CD28、4-1BB等共刺激分子的多信号结构域(第二、三代)，其可以提高T细胞的细胞毒性、增殖活性，维持T细胞应答，延长T细胞存活时间等；双特异性嵌合抗原受体(tan-CAR)有两种抗原识别区，它们连接在同一个信号转导受体上，可以同时作用于肿瘤微环境中的肿瘤细胞和元件，从而增强T细胞活性，增加亲和力。
慢病毒(Lentivirus)载体是以HIV-1(人类免疫缺陷I型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体。它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，可用于感染难转染的细胞，如原代细胞、神经元细胞、干细胞、不分化细胞、心肌细胞、血液细胞等，且可装载高达5kbDNA片段，使目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，形成稳定遗传物质，使得目的基因在细胞中可稳定长期表达。病毒载体颗粒通过包装元件和含病毒基因组质粒共转染包装细胞系，目前比较广泛采用的第三代包装系统--四质粒系统只含有HIV-1共9个基因中的3个，即gag、pol、rev。由于HIV-1基因组成分中60％被去除，因此父代病毒无法复制，是目前重组系数最低的一个慢病毒包装系统，至今未见重组报道。
目前，CAR-T研究及应用中广泛使用慢病毒作为CAR基因载体，大多数嵌合抗原受体(CAR)由胞外抗原结合区(scFv)、跨膜区域和胞内信号转导区组成，也有一些研究将胞外抗原结合区设计为具有双特异性的单链双特异性抗体(scBsAb)，且胞外抗原结合区前需加一条具有分泌功能的信号序列，以保证CAR基因所对应的蛋白序列能够具有分泌功能，由于不同种类的癌症具有不同肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen,TAA)和肿瘤特异性抗原(tumor specific antigen,TSA)，所以每种CAR需加入不同的抗体序列，每种肿瘤都进行CAR基因整体克隆成本相对较高，且载体构建时间会相对延长，因此构建出通用型载体是非常必要的。
发明内容
本发明是要解决目前CAR-T制备中过程中载体构建步骤烦琐、耗时过长，慢病毒载体无法通用，成本高的问题，提供一种通用型慢病毒载体、其制备方法及应用。
本发明通用型慢病毒载体以pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro质粒为骨架，向质粒骨架的多克隆位点MCS处插入以下元件：CD8αLeader DNA序列、CD8α铰链区、CD28跨膜区-胞内区、CD137胞内区和CD3ζ；其中CD8αLeader DNA序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，CD8α铰链区如序列表中SEQ ID NO：2所示，CD28跨膜区-胞内区如序列表中SEQ ID NO：3所示，CD137胞内区如序列表中SEQ ID NO：4所示，CD3ζ如序列表中SEQ ID NO：5所示。
pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro质粒为购买得到，编号为CD510B-1。
本发明通用型慢病毒载体的制备方法，选择的基因为人CD8α引导链序列、CD8α铰链区、CD28跨膜区-胞内区、CD137胞内区及CD3ζ，具体构建步骤如下：
一、引物设计：
设计CD8α铰链区、CD28跨膜区-胞内区、CD137胞内区及CD3ζ的上游引物和下游引物，分别命名为：CD8αF/CD8αR、CD28F/CD28R、CD137F/CD137R、CD3ζF/CD3ζR。
引物具体要求为：
a.CD8α铰链区上游引物添加EcoR I酶切位点，CD3ζ下游添加Not I酶切位点；
b.CD8α铰链区下游引物与CD28跨膜区-胞内区上游引物应有一部分可以互补结合的重叠序列；
c.CD28跨膜区-胞内区下游引物与CD137胞内区上游引物应有一部分可以互补结合的重叠序列；
d.CD137胞内区下游引物与CD3ζ上游引物应有一部分可以互补结合的重叠序列。
引物序列如下：
CD8αF：5’-CCGGAATTCACCACGACGCCAGCGCCGC-3’
CD8αR：5’-ACCAGCACCCAAAAATCACAGGCGAAGTCCAGCCCCCT-3’
CD28F：5’-GACTTCGCCTGTGATTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGG-3’
CD28R：5’-CTTTCTGCCCCGTTTGGAGCGATAGGCTGCGAAGTCGC-3’
CD137F：5’-GCAGCCTATCGCTCCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCT-3’
CD137R：5’-GCTGAACTTCACTCTCAGTTCACATCCTCCTTCTTCTTC-3’
CD3ζF：5’-GGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAG-3’
CD3ζR：5’-ATTTGCGGCCGCTTAGCGAGGGGGCAGGGCCT-3’
二、外周血单个核细胞的获得、激活：
a.用肝素钠抗凝管采集成人外周血10ml，缓慢将其加入到事先分装好的Ficoll溶液中(体积比约为2∶1)，2000rpm离心20min；
b.移液管缓慢吸去上层血浆后，收取白膜层细胞PBMC，10ml生理盐水，1500rpm离心5min，重复洗涤一次并计数；
c.将PBMC用含10％FBS、1000IU/ml IL-2的RPMI1640培养基重悬并稀释至1×106/ml-1.5×106/ml，取2ml稀释液加入至事先用包被液包被好的6孔板中(所述包被液为0.5mlPBS，其中含有1μg/ml OKT3、2000U/mlIFN-γ和1000U/mlIL-1α)，刺激20-28h。
三、mRNA的提取及RT反应：
取步骤二激活后的PBMC 1500rpm离心5min后弃上清，用1ml预冷的Trizol冰上裂解细胞，抽提RNA，并进行反转录成cDNA。
四、以cDNA为模板，用引物CD8αF/CD8αR、CD28F/CD28R、CD137F/CD137R和CD3ζF/CD3ζR分别进行PCR扩增，获得CD8α铰链区、CD28跨膜区-胞内区、CD137胞内区及CD3ζ基因，胶回收纯化后依次进行重叠延伸PCR(overlap extension PCR)以获得含CD8α铰链区、CD28跨膜区-胞内区、CD137胞内区及CD3ζ基因的拼接基因序列，将得到的拼接基因进行纯化与PMD19-T simple载体进行连接，并将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经扩增后提取质粒进行基因测序，测序正确的质粒命名为CD8αHinge-CD28-CD137-CD3ζ-T simple，进行保存备用。
五、在CD8α信号肽基因上游添加kozak序列以增加目的基因的表达量，同时在kozak序列前加入Nhe I酶切位点，在CD8α信号肽基因下游依次加入BamH I和EcoRI酶切位点，合成得到单链CD8αLeader DNA序列；
六、用限制性内切酶Nhe I和Not I对pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro载体进行双酶切，1％琼脂糖凝胶回收线性载体；
用限制性内切酶EcoRI和Not I对质粒CD8αHinge-CD28-CD137-CD3ζ-T simple进行双酶切，胶回收CD8αHinge-CD28-CD137-CD3ζ片段；
将步骤五合成的单链CD8αLeader DNA序列进行退火形成双链，退火条件为95℃5min、62℃10min，退火缓冲液为annealing buffer(10mM tris,50mM Nacl,1mM EDTA)，退火后进行纯化，得到CD8αLeader双链DNA序列，两端分别为含粘性末端的Nhe I和EcoRI的酶切位点。
七、将步骤六获得的pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro线性载体、CD8αHinge-CD28-CD137-CD3ζ片段及CD8αLeader片段利用T4DNA连接酶进行三段式连接，载体与片段的摩尔比为1:(3-10)，D8αHinge-CD28-CD137-CD3ζ片段与CD8αLeader片段的摩尔比为1:1，经鉴定正确后4℃保存备用，即得到用于表达嵌合抗原受体及双特异性嵌合抗原受体的通用型慢病毒载体。
本发明的有益效果：
本发明成功制备CD8α信号肽、CD8α铰链区、CD28跨膜区-胞内区、CD137胞内区及CD3ζ胞内区基因，并通过overlap PCR的方法将其进行拼接，拼接后的基因连入慢病毒表达载体。该载体加入这些嵌合抗原受体(CAR)所需元件后，针对不同肿瘤类型只需在此基础上克隆不同抗原的抗体序列并插入其中即可获得嵌合抗原受体(CAR)。
1.本发明是将设计好的基因插入到慢病毒表达载体中，利用293T细胞在辅助质粒的作用下，进行慢病毒颗粒的包装，基因插入后未影响载体的复制，且慢病毒依然可以正常包装。
2.本发明所包装的慢病毒在MOI值为300时可以成功感染T淋巴细胞，并且目的基因可以在T细胞中稳定的表达。
3.本发明所制备的通用性载体可以通过BamH I和EcoRI酶切位点及其相应的同尾酶进行多种单链抗体序列(ScFv)和双特异性抗体序列(BisFv)的连接，从而构建出多种特异性CAR及tan-CAR。
4、启动子为CMV启动子，是公认的启动真核基因表达的最有力量的启动子，被广泛应用于构建高效真核表达载体，用于基因工程、基因治疗和DNA免疫。
5、载体上引入的Puro抗性基因可以使感染的细胞具有嘌呤霉素抗性，而阴性细胞则可被嘌呤霉素杀死，从而实现了感染后阳性CAR-T细胞的筛选，此筛选方法快速、安全、利于应用。
6、载体本身所含有的5′LTR和3′LTR可以使目的基因整合到宿主细胞的基因组内，跟随宿主细胞的基因复制而进行复制，从而实现目的基因的稳定表达。
附图说明
图1为实施例1中制备好的最终质粒中目的基因PCR鉴定结果；
图2为实施例1中感染后的T细胞中目的基因表达情况检测。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式通用型慢病毒载体以pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro质粒为骨架，向质粒骨架的多克隆位点MCS处插入以下元件：CD8αLeader DNA序列、CD8α铰链区、CD28跨膜区-胞内区、CD137胞内区和CD3ζ；其中CD8αLeader DNA序列如序列表中SEQ IDNO：1所示，CD8α铰链区如序列表中SEQ ID NO：2所示，CD28跨膜区-胞内区如序列表中SEQID NO：3所示，CD137胞内区如序列表中SEQ ID NO：4所示，CD3ζ如序列表中SEQ ID NO：5所示。
本实施方式构建含信号序列、胞外铰链区、膜结合区和胞内信号转导区，胞内信号转导区含有CD3ζ序列和共刺激分子信号序列(costimulatory molecule,CM)序列，将它们同时连接到pCDH_Vector的MCS，构建出可以连接不同抗体序列，且具有分泌表达功能的通用型载体，方便了多种CAR及tan-CAR的研究及应用。
具体实施方式二：本实施方式通用型慢病毒载体的制备方法，具体步骤如下：
一、引物设计：
设计CD8α铰链区、CD28跨膜区-胞内区、CD137胞内区及CD3ζ的上游引物和下游引物，分别命名为：CD8αF/CD8αR、CD28F/CD28R、CD137F/CD137R、CD3ζF/CD3ζR；
二、外周血单个核细胞的获得、激活：
采集成人外周血，提取外周血单个核细胞，将外周血单个核细胞(PBMC)用含10％FBS和1000IU/ml IL-2的RPMI1640培养基重悬并稀释至1×106/ml-1.5×106/ml，取2ml稀释液加入至事先用包被液包被好的6孔板中，刺激20-28h。
三、mRNA的提取及RT反应：
提取步骤二激活后的PBMC的RNA，并进行反转录成cDNA；
四、以cDNA为模板，用引物CD8αF/CD8αR、CD28F/CD28R、CD137F/CD137R和CD3ζF/CD3ζR分别进行PCR扩增，获得CD8α铰链区、CD28跨膜区-胞内区、CD137胞内区及CD3ζ基因，胶回收纯化后依次进行重叠延伸PCR以获得含CD8α铰链区、CD28跨膜区-胞内区、CD137胞内区及CD3ζ基因的拼接基因序列，将得到的拼接基因进行纯化与PMD19-T simple载体进行连接，并将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经扩增后提取质粒进行基因测序，测序正确的质粒命名为CD8αHinge-CD28-CD137-CD3ζ-Tsimple，进行保存备用；
五、在CD8α信号肽基因上游添加kozak序列以增加目的基因的表达量，同时在kozak序列前加入Nhe I酶切位点，在CD8α信号肽基因下游依次加入BamH I和EcoRI酶切位点，合成得到单链CD8αLeader DNA序列；
六、用限制性内切酶Nhe I和Not I对pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro载体进行双酶切，1％琼脂糖凝胶回收线性载体；
用限制性内切酶EcoR I和Not I对质粒CD8αHinge-CD28-CD137-CD3ζ-T simple进行双酶切，胶回收CD8αHinge-CD28-CD137-CD3ζ片段；
将步骤五合成的单链CD8αLeader DNA序列进行退火形成双链，退火后进行纯化，得到CD8αLeader双链DNA序列；
七、将步骤六获得的pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro线性载体、CD8αHinge-CD28-CD137-CD3ζ片段及CD8αLeader片段利用T4DNA连接酶进行三段式连接，经鉴定正确后4℃保存备用，即得到用于表达嵌合抗原受体及双特异性嵌合抗原受体的通用型慢病毒载体。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二不同的是：步骤一中引物CD8αF序列为：5’-CCGGAATTCACCACGACGCCAGCGCCGC-3’，引物CD8αF序列为：5’-ACCAGCACCCAAAAATCACAGGCGAAGTCCAGCCCCCT-3’。其它与具体实施方式二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式二或三不同的是：步骤一中引物CD28F序列为：5’-GACTTCGCCTGTGATTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGG-3’；引物CD28R序列为：5’-CTTTCTGCCCCGTTTGGAGCGATAGGCTGCGAAGTCGC-3’。其它与具体实施方式二或三相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式二至四之一不同的是：步骤一中引物CD137F序列为：5’-GCAGCCTATCGCTCCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCT-3’；引物CD137R序列为：5’-GCTGAACTTCACTCTCAGTTCACATCCTCCTTCTTCTTC-3’。其它与具体实施方式二至四之一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式二至五之一不同的是：步骤一中引物CD3ζF序列为：5’-GGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAG-3’；引物CD3ζR序列为：5’-ATTTGCGGCCGCTTAGCGAGGGGGCAGGGCCT-3’。其它与具体实施方式二至五之一相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式二至六之一不同的是：步骤二所述包被液为含有1μg/ml OKT3、2000U/mlIFN-γ和1000U/mlIL-1α的PBS缓冲液。其它与具体实施方式二至六之一相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式二至七之一不同的是：步骤二所述提取外周血单个核细胞的方法具体为：
a.将10ml成人外周血加入到事先分装好的Ficoll溶液中，2000rpm离心20min；其中外周血与Ficoll溶液的体积比为2：1；
b.移液管吸去上层血浆后，收取白膜层细胞PBMC，10ml生理盐水，1500rpm离心5min，重复洗涤一次并计数。其它与具体实施方式二至七之一相同。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式二至八之一不同的是：步骤六所述退火条件为95℃5min、62℃10min，退火缓冲液为annealing buffer(10mM tris,50mMNacl,1mM EDTA)。其它与具体实施方式二至八之一相同。
具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式二至九之一不同的是：步骤七中载体与片段的摩尔比为1:(3-10)，所述片段为CD8αHinge-CD28-CD137-CD3ζ片段和CD8αLeader片段的混合物，其中D8αHinge-CD28-CD137-CD3ζ片段与CD8αLeader片段的摩尔比为1:1。其它与具体实施方式二至九之一相同。
为验证本发明的有益效果，进行以下试验：
实施例1：
本实施例通用型慢病毒载体的制备方法，选择的基因为人CD8α引导链序列、CD8α铰链区、CD28跨膜区-胞内区、CD137胞内区及CD3ζ，具体构建步骤如下：
一、引物设计：
设计CD8α铰链区、CD28跨膜区-胞内区、CD137胞内区及CD3ζ的上游引物和下游引物，分别命名为：CD8αF/CD8αR、CD28F/CD28R、CD137F/CD137R、CD3ζF/CD3ζR。
引物具体要求为：
a.CD8α铰链区上游引物添加EcoR I酶切位点，CD3ζ下游添加Not I酶切位点；
b.CD8α铰链区下游引物与CD28跨膜区-胞内区上游引物应有一部分可以互补结合的重叠序列；
c.CD28跨膜区-胞内区下游引物与CD137胞内区上游引物应有一部分可以互补结合的重叠序列；
d.CD137胞内区下游引物与CD3ζ上游引物应有一部分可以互补结合的重叠序列。
引物序列如下：
CD8αF：5’-CCGGAATTCACCACGACGCCAGCGCCGC-3’
CD8αR：5’-ACCAGCACCCAAAAATCACAGGCGAAGTCCAGCCCCCT-3’
CD28F：5’-GACTTCGCCTGTGATTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGG-3’
CD28R：5’-CTTTCTGCCCCGTTTGGAGCGATAGGCTGCGAAGTCGC-3’
CD137F：5’-GCAGCCTATCGCTCCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCT-3’
CD137R：5’-GCTGAACTTCACTCTCAGTTCACATCCTCCTTCTTCTTC-3’
CD3ζF：5’-GGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAG-3’
CD3ζR：5’-ATTTGCGGCCGCTTAGCGAGGGGGCAGGGCCT-3’
二、外周血单个核细胞的获得、激活：
a.用肝素钠抗凝管采集成人外周血10ml，缓慢将其加入到事先分装好的Ficoll溶液中(体积比为2：1)，2000rpm离心20min；
b.移液管缓慢吸去上层血浆后，收取白膜层细胞PBMC，10ml生理盐水，1500rpm离心5min，重复洗涤一次并计数；
c.将PBMC用含10％FBS、1000IU/ml IL-2的RPMI1640培养基重悬并稀释至1×106/ml-1.5×106/ml，取2ml稀释液加入至事先用包被液包被好的6孔板中(所述包被液为0.5mlPBS，其中含有1μg/ml OKT3、2000U/mlIFN-γ和1000U/mlIL-1α)，刺激20-28h。
三、mRNA的提取及RT反应：
取步骤二激活后的PBMC 1500rpm离心5min后弃上清，用1ml预冷的Trizol冰上裂解细胞，抽提RNA，并进行反转录成cDNA。
四、以cDNA为模板，用引物CD8αF/CD8αR、CD28F/CD28R、CD137F/CD137R和CD3ζF/CD3ζR分别进行PCR扩增，获得CD8α铰链区、CD28跨膜区-胞内区、CD137胞内区及CD3ζ基因，胶回收纯化后依次进行重叠延伸PCR(overlap extension PCR)以获得含CD8α铰链区、CD28跨膜区-胞内区、CD137胞内区及CD3ζ基因的拼接基因序列，将得到的拼接基因进行纯化与PMD19-T simple载体进行连接，并将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经扩增后提取质粒进行基因测序，测序正确的质粒命名为CD8αHinge-CD28-CD137-CD3ζ-T simple，进行保存备用。
1、利用CD8αF/CD8αR、CD28F/CD28R、CD137F/CD137R、CD3ζF/CD3ζR引物，以PBMCscDNA为模板，分别PCR扩增CD8α铰链区、CD28跨膜区-胞内区、CD137胞内区及CD3ζ胞内区基因，其PCR扩增体系为：
PCR扩增条件为：95℃5min，95℃45sec，60℃30ecs，72℃30sec，35个循环，72℃7min。
2、Over-lap PCR将CD8α铰链区基因与CD28跨膜区-胞内区基因融合：
将PCR反应获得的CD8α铰链区基因与CD28跨膜区-胞内区基因片段进行2％的琼脂糖凝胶分析并纯化回收后进行基因融合，体系如下：
混匀后进行PCR扩增。循环参数为：95℃7min，95℃45sec，60℃30ecs，72℃45sec，15个循环，72℃7min。扩增结束后，将PCR产物进行1.5％的琼脂糖凝胶分析并纯化回收后与CD137胞内区基因融合。
3、CD8α铰链区-CD28跨膜区-胞内区基因与CD137胞内区基因融合具体参数及反应条件同步骤2。
4、CD8α铰链区-CD28跨膜区-胞内区-CD137胞内区基因与CD3ζ胞内区基因融合具体参数及反应条件同步骤2。
五、在CD8α信号肽基因上游添加kozak序列以增加目的基因的表达量，同时在kozak序列前加入Nhe I酶切位点，在CD8α信号肽基因下游依次加入BamH I和EcoR I酶切位点，合成得到单链CD8αLeader DNA序列；
六、用限制性内切酶Nhe I和Not I对pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro载体进行双酶切，1％琼脂糖凝胶回收线性载体；
用限制性内切酶EcoR I和Not I对质粒CD8αHinge-CD28-CD137-CD3ζ-T simple进行双酶切，胶回收CD8αHinge-CD28-CD137-CD3ζ片段；
将步骤五合成的单链CD8αLeader DNA序列进行退火形成双链，退火条件为95℃5min、62℃10min，退火缓冲液为annealing buffer(10mM tris,50mM Nacl,1mM EDTA)，退火后进行纯化，得到CD8αLeader双链DNA序列，两端分别为含粘性末端的Nhe I和EcoR I的酶切位点。
七、将步骤六获得的pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro线性载体、CD8αHinge-CD28-CD137-CD3ζ片段及CD8αLeader片段利用T4DNA连接酶进行三段式连接，载体与两个片段的摩尔比为1:6，D8αHinge-CD28-CD137-CD3ζ片段与CD8αLeader片段的摩尔比为1:1，经鉴定正确后4℃保存备用，即得到用于表达嵌合抗原受体及双特异性嵌合抗原受体的通用型慢病毒载体。
八、慢病毒的包装及T淋巴细胞的感染
将密度为1×105cells/ml 2ml的293T细胞接种于6孔板，18-24h后用脂质体进行转染，转染后48h收获慢病毒，具体步骤为：a.约235ul Opti-MEM稀释2.7ug pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro-目的基因+1.76ug pMDL(Gal/Pol)+0.95ug pVSVG+0.68ug pREV至250ul；b.235ul Opti-MEM稀释15ul lipofectamine2000；c.5min后，将a、b步溶液混合，室温静止30min；d.从6孔板中吸出1ml培养基，然后滴加入500ul质粒和脂质体混合物，6-10h后，移除含有DNA-脂质体复合物的培养基，代之以正常培养液DMED+10％FBS(从此刻开始算时间)，48h后收级含有慢病毒的培养上清；
慢病毒浓缩及滴度测定：a.用0.45μm滤器过滤上清液于过滤杯中，将过滤杯插到滤过液收集管中，4000×g离心10-15min，将病毒浓缩液移出，分装后，-80℃保存；b.取其中一支进行病毒生物学滴度测定。具体操作为：将慢病毒依次10倍稀释后加入到事先准备的293T细胞中，感染48h后加入5μg/ml的puromycin，继续培养2天，通过计算感染后的活细胞数量来判断滴度数值。
T淋巴细胞的感染及目的基因的表达：a.取10ml-20ml外周血，用Ficol分离PBMC，将PBMC以1-2×106/ml的密度接种于T75培养瓶中，第0天加入2000IU/mL的IFN-r刺激，第1天加入400ng/ml anti-CD3及4000IU/mL IL-2使T细胞激活；b.激活培养2-3天后离心收集T细胞，PBS洗涤两次后用500-1000IU/mL IL-2培养基稀释到5*105/ml，接种于6孔板，每孔2ml；c.向T细胞中加入慢病毒，(MOI值为300)，用封口膜封好6孔板边缘，900g离心1h后，37℃5％CO2培养感染4小时，置换新鲜培液并继续37℃培养；d.收获未感染的T细胞及感染后培养48h、14d的T细胞，提取RNA进行表达情况检测。
图1为制备好的最终质粒中目的基因PCR鉴定结果；
图2为感染后的T细胞中目的基因表达情况检测。其中M为Maker，1为未感染的T细胞，2为感染后48h的T细胞，3为感染后14d的T细胞。
图2中可见，未感染的T细胞不能表达目的基因，感染48h后可以表达目的基因，说明感染成功；感染14d后还可以检测到目的基因的表达，说明基因可以整合到T细胞基因组，能够稳定表达。
本方法成功制备CD8α信号肽、CD8α铰链区、CD28跨膜区-胞内区、CD137胞内区及CD3ζ胞内区基因，并通过overlap PCR的方法将其进行拼接，拼接后的基因连入慢病毒表达载体。该载体加入这些嵌合抗原受体(CAR)所需元件后，针对不同肿瘤类型只需在此基础上克隆不同抗原的抗体序列并插入其中即可获得嵌合抗原受体。构建出可以连接不同抗体序列，且具有分泌表达功能的通用型载体，方便了多种CAR及tan-CAR的研究及应用。

Claims (9)

1.一种通用型慢病毒载体的制备方法，其特征在于该方法
具体步骤如下：
一、引物设计：
设计CD8α铰链区、CD28跨膜区-胞内区、CD137胞内区及CD3ζ的上游引物和下游引物，分别命名为：CD8αF/CD8αR、CD28F/CD28R、CD137F/CD137R、CD3ζF/CD3ζR；
二、外周血单个核细胞的获得、激活：
采集成人外周血，提取外周血单个核细胞，将外周血单个核细胞用含10％FBS和1000IU/ml IL-2的RPMI1640培养基重悬并稀释至1×106/ml-1.5×106/ml，取2ml稀释液加入至事先用包被液包被好的6孔板中，刺激20-28h。
三、mRNA的提取及RT反应：
提取步骤二激活后的PBMC的RNA，并进行反转录成cDNA；
四、以cDNA为模板，用引物CD8αF/CD8αR、CD28F/CD28R、CD137F/CD137R和CD3ζF/CD3ζR分别进行PCR扩增，获得CD8α铰链区、CD28跨膜区-胞内区、CD137胞内区及CD3ζ基因，胶回收纯化后依次进行重叠延伸PCR以获得含CD8α铰链区、CD28跨膜区-胞内区、CD137胞内区及CD3ζ基因的拼接基因序列，将得到的拼接基因进行纯化与PMD19-T simple载体进行连接，并将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经扩增后提取质粒进行基因测序，测序正确的质粒命名为CD8αHinge-CD28-CD137-CD3ζ-T simple，进行保存备用；
五、在CD8α信号肽基因上游添加kozak序列以增加目的基因的表达量，同时在kozak序列前加入Nhe I酶切位点，在CD8α信号肽基因下游依次加入BamH I和EcoR I酶切位点，合成得到单链CD8αLeader DNA序列；
六、用限制性内切酶Nhe I和Not I对pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro载体进行双酶切，1％琼脂糖凝胶回收线性载体；
用限制性内切酶EcoR I和Not I对质粒CD8αHinge-CD28-CD137-CD3ζ-T simple进行双酶切，胶回收CD8αHinge-CD28-CD137-CD3ζ片段；
将步骤五合成的单链CD8αLeader DNA序列进行退火形成双链，退火后进行纯化，得到CD8αLeader双链DNA序列；
七、将步骤六获得的pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro线性载体、CD8αHinge-CD28-CD137-CD3ζ片段及CD8αLeader片段利用T4 DNA连接酶进行三段式连接，经鉴定正确后4℃保存备用，即得到用于表达嵌合抗原受体及双特异性嵌合抗原受体的通用型慢病毒载体。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤一中引物CD8αF序列为：5’-CCGGAATTCACCACGACGCCAGCGCCGC-3’，引物CD8αF序列为：5’-ACCAGCACCCAAAAATCACAGGCGAAGTCCAGCCCCCT-3’。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤一中引物CD28F序列为：5’-GACTTCGCCTGTGATTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGG-3’；引物CD28R序列为：5’-CTTTCTGCCCCGTTTGGAGCGATAGGCTGCGAAGTCGC-3’。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤一中引物CD137F序列为：5’-GCAGCCTATCGCTCCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCT-3’；引物CD137R序列为：5’-GCTGAACTTCACTCTCAGTTCACATCCTCCTTCTTCTTC-3’。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤一中引物CD3ζF序列为：5’-GGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAG-3’；引物CD3ζR序列为：5’-ATTTGCGGCCGCTTAGCGAGGGGGCAGGGCCT-3’。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤二所述包被液为含有1μg/mlOKT3、2000U/mlIFN-γ和1000U/mlIL-1α的PBS缓冲液。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤二所述提取外周血单个核细胞的方法具体为：
a.将10ml成人外周血加入到事先分装好的Ficoll溶液中，2000rpm离心20min；其中外周血与Ficoll溶液的体积比为2：1；
b.移液管吸去上层血浆后，收取白膜层细胞PBMC，10ml生理盐水，1500rpm离心5min，重复洗涤一次并计数。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤六所述退火条件为95℃5min、62℃10min，退火缓冲液为annealing buffer。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤七中载体与片段的摩尔比为1:(3-10)，所述片段为CD8αHinge-CD28-CD137-CD3ζ片段和CD8αLeader片段的混合物，其中D8αHinge-CD28-CD137-CD3ζ片段与CD8αLeader片段的摩尔比为1:1。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN109609533B (zh) * 2017-12-27 2020-07-10 赛德特生物科技开发有限公司 基于人源化cd276抗体的car慢病毒表达载体构建及其应用
CN109207501A (zh) * 2018-09-25 2019-01-15 深圳市菲鹏生物治疗股份有限公司 表达通用型嵌合抗原受体的序列的构建方法
CN110734930A (zh) * 2019-06-20 2020-01-31 武汉百翼生物科技有限公司 一种重组慢病毒载体、重组慢病毒
CN113046393B (zh) * 2021-04-22 2021-11-16 广州金泰生物科技有限公司 一种重组慢病毒载体、2019-nCoV假病毒及其制备和应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104910278A (zh) * 2015-05-27 2015-09-16 上海吉凯基因科技有限公司 一种用于制备cart细胞的具有高效转染能力和生物学活性的慢病毒

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
UY35468A (es) * 2013-03-16 2014-10-31 Novartis Ag Tratamiento de cáncer utilizando un receptor quimérico de antígeno anti-cd19
CN104788573B (zh) * 2015-05-08 2018-10-16 中国医学科学院血液病医院（血液学研究所） 嵌合抗原受体hCD19scFv-CD8α-CD28-CD3ζ及其用途

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104910278A (zh) * 2015-05-27 2015-09-16 上海吉凯基因科技有限公司 一种用于制备cart细胞的具有高效转染能力和生物学活性的慢病毒

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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Highly efficient gene transfer using a retroviral vector into murine T cells for preclinical chimeric antigen receptor-expressing T cell therapy;Hotaka Kusabuka;《Biochemical and Biophysical Research Communications》;20160422;第473卷(第1期);73-79 *

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