CN104745596B

CN104745596B - 靶向肝癌细胞的细胞制备物

Info

Publication number: CN104745596B
Application number: CN201310575033.4A
Authority: CN
Inventors: 曹雪涛; 王春梅; 刘音; 温巧莲
Original assignee: Institute of Basic Medical Sciences of CAMS
Current assignee: Institute of Basic Medical Sciences of CAMS
Priority date: 2013-11-15
Filing date: 2013-11-15
Publication date: 2020-02-11
Anticipated expiration: 2033-11-15
Also published as: CN104745596A

Abstract

本发明涉及靶向肝癌细胞的细胞制备物及其制备方法。具体而言，本发明提供分离的多核苷酸，其包含编码一多肽的核苷酸序列，所述多肽包含识别乙型肝炎病毒表面抗原的结构域、间隔区、跨膜结构域和T细胞活化结构域。本发明还提供真核表达载体，其包含所述多核苷酸。本发明还提供制备包含靶向肝癌细胞的T细胞的细胞制备物的方法，其包含以下步骤：以本发明的真核表达载体转化分离的外周血单个核细胞。本发明还涉及本发明的细胞制备物在制备用于治疗肝癌的药物组合物中的应用。

Description

靶向肝癌细胞的细胞制备物

技术领域

本发明涉及免疫学领域，并具体涉及特异性识别肝癌细胞的细胞制备物、其制备方法及其用途。

背景技术

近年来，随着基因工程技术的发展，人们将抗体对抗原的高特异性和T细胞对靶细胞的细胞毒杀伤作用结合起来，构建了能够特异性识别抗原并活化T细胞的嵌合型抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)。CAR主要包括抗原特异性抗体单链可变区(scFv)、间隔序列(spacer)、跨膜区(TMDomain)和T细胞活化基序。根据T细胞活化基序的组成，CAR经历了三代的变革。最初第一代CAR仅含有1个胞内的信号分子(FcεRIγ或CD3ζ)，但人们用第一代CAR转染T细胞并不能有效地活化T细胞，反而引起T细胞的失能和凋亡。T细胞的完全活化需要CD3和CD28双信号刺激，但有些肿瘤细胞不表达或低表达共刺激分子如B7分子，人们发现在第一代CAR的基础上，在胞内区进一步加入共刺激信号分子(CD28活化区等)，可显著增强细胞因子(如IL-2、IFN-γ和颗粒酶)的分泌和抗肿瘤能力，这是第二代CAR，其中，共刺激信号分子还可以是41BB、ICOS、OX40等。在第二代CAR的基础上，发展出第三代CAR，其胞内区包含三种信号分子。CAR修饰的T淋巴细胞可通过scFv特异性识别肿瘤抗原或病毒，将T细胞活化信号传递到T细胞内，激活T细胞靶向杀伤肿瘤或病毒。

CAR修饰的T细胞(CAR-T)可用于治疗相关肿瘤，通过对患者自体的T细胞的修饰，使T细胞活化，分泌杀伤性物质，杀伤肿瘤。因此，CAR-T淋巴细胞具有很好的肿瘤靶向性，并且无主要组织相容性复合体(MHC)的限制。此外，CAR-T是对患者自体的T细胞进行改造，并且CAR的整个分子骨架是人源的，故能够避免机体对CAR-T细胞的排斥反应，使CAR-T细胞在体内可长时间存活。

目前对于肿瘤过继性细胞免疫治疗主要包括CIK细胞，DC-CIK细胞等，但由于CIK具有广谱杀伤作用，可对自身组织造成损伤，这限制了其在临床的应用。另外，制备DC-CIK的效率有待进一步提高，从外周血中获取CIK的数量有限，并且成本较高，大大限制了DC-CIK的临床应用性。

HBV感染与原发性肝癌发生密切相关，据统计约70%以上的肝癌患者HBsAg阳性。肝癌局部抗肿瘤免疫的效应细胞主要是CTL和辅助性T细胞，肝癌细胞可通过抗原递呈途径将HBsAg降解为肽段，呈递到CD8细胞表面，激活CD8淋巴细胞。但由于肿瘤细胞低表达MHC分子和共刺激分子，不能有效呈递抗原肽和活化CTL，因此，肝癌局部处于免疫低下状态，免疫系统不能有效清除肝癌细胞。

发明内容

本发明提供分离的多核苷酸，其包含编码一多肽的核苷酸序列，所述多肽包含识别乙型肝炎病毒表面抗原的结构域、间隔区、跨膜结构域和T细胞活化结构域。

在本发明的优选实施方式中，所述识别乙型肝炎病毒表面抗原的结构域是乙型肝炎病毒表面抗原特异性抗体单链可变区。例如，所述单链可变区包含重链可变区、连接区和轻链可变区。

更加优选地，所述重链可变区包含如SEQ ID NO.47所示的氨基酸序列；连接区包含如SEQ ID NO.49所示的氨基酸序列；轻链可变区包含如SEQ ID NO.48所示的氨基酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述间隔区包含如SEQ ID NO.50所示的氨基酸序列。

在本发明的优选实施方式中，所述跨膜结构域为CD28的跨膜结构域。

在本发明的多核苷酸中，所述T细胞活化结构域包含至少一个T细胞活化基序。

优选地，所述T细胞活化结构域包含两个T细胞活化基序。

更优选地，所述T细胞活化结构域包含三个T细胞活化基序。

优选地，所述T细胞活化基序选自CD137、CD28和CD3ζ的活化基序。

本发明还提供真核表达载体，其包含上述本发明的多核苷酸。

本发明还提供制备包含靶向肝癌细胞的T细胞的细胞制备物的方法，其包含以下步骤：以上述本发明的真核表达载体转化分离的外周血单个核细胞。

在本发明的优选实施方式中，所述方法进一步包括从转化的外周血单个核细胞中分离CD8⁺T细胞。

在本发明的进一步优选实施方式中，所述方法进一步包括体外扩增所述细胞。

本发明还提供包含靶向肝癌细胞的T细胞的细胞制备物，其根据上述本发明的方法而制备。

本发明还提供靶向肝癌细胞的CD8⁺T细胞，所述CD8⁺T细胞包含上述本发明的多核苷酸，且所述CD8⁺T细胞能够表达由所述多核苷酸编码的多肽。

本发明还涉及上述本发明的细胞制备物和细胞在制备用于治疗肝癌的药物组合物中的应用。

附图说明

图1：HBsAg特异性抗体单链可变区的克隆和IMGT软件分析。

图中A是重链可变区VH和轻链可变区VL的PCR产物的电泳结果；B是根据VH和VL的PCR产物的测序结果翻译的氨基酸序列与已知的其它抗体的重链和轻链的氨基酸序列进行同源性比对的结果。

图2：编码HBsAg特异性嵌合型抗原受体的DNA的重组。

图中A是融合的DNA的组成结构示意图，B是构建完成的DNA的电泳图。

图3：HBsAg特异性嵌合型抗原受体的表达和定位。

图中A是对分离的膜蛋白进行Western blot分析的结果；B是表达CAR-Flag融合蛋白的293T细胞的共聚焦显微镜观察的结果。

图4：pLenti6.3_MCS-IRES2-EGFP慢病毒载体图谱。

图5：共聚焦显微镜观察HBsAg特异性嵌合型抗原受体慢病毒载体的表达和定位。

图6：HBsAg特异性嵌合型抗原受体慢病毒感染PBMC的效率以流式细胞仪检测的结果。

图7：ELISA检测HBsAg特异性嵌合型抗原受体慢病毒感染的PBMC与肝癌细胞系共培养后，分泌IFN-γ的结果，其中纵坐标轴为细胞培养上清中IFN-γ的浓度。

图中CAR组代表以HBsAg特异性嵌合型抗原受体慢病毒感染的PBMC，Negative组代表未改造的慢病毒感染的PBMC。

图8：HBsAg特异性嵌合型抗原受体慢病毒感染的PBMC对肝癌细胞增殖的影响。

图中E:T表示PBMC与HeP3B肝癌细胞的细胞数的比；CFSE Low(%)表示CFSE低标记的的细胞所占的比例；CAR表示HBsAg特异性嵌合型抗原受体慢病毒感染的PBMC组；Negative表示未改造的慢病毒感染的PBMC组。

发明详述

嵌合型抗原受体(CAR)又称人工T细胞受体、嵌合型T细胞受体、嵌合型免疫受体，是一种人工设计的受体，可以赋予免疫效应细胞某一种特异性。普遍来讲，这一技术被用于赋予T细胞特异性识别肿瘤表面抗原的特性。通过这种方法，可以产生大量的靶向杀伤肿瘤细胞。

HBsAg是HBV病毒的表面抗原，靶向HBsAg可清除病毒，阻止HBV相关性肝癌的生长和进程。本发明通过CAR赋予CD8⁺T细胞HBsAg单克隆抗体的特异性，使其具有较强的识别HBsAg、中和HBV和抗肝癌的能力。

CAR包括胞外区、跨膜结构域和胞内区。胞外区识别抗原的结构域和间隔区；跨膜区一般是穿越细胞膜的疏水性α螺旋(alpha helix)；胞内区包含由一种或几种T细胞活化基序组成的T细胞活化结构域。

在本发明具体实施方式中，识别抗原的结构域为识别乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的结构域。在优选的方案中，识别HBsAg的结构域选择HBsAg特异性抗体的单链可变区(scFv)。在进一步优选的实施例中scFv由序列如SEQ ID NO.47所示的HBsAg单克隆抗体重链可变区、序列如SEQ ID NO.49所示的连接区和序列如SEQ ID NO.48所示的HBsAg单克隆抗体轻链可变区组成。

间隔区连接识别抗原的结构域和跨膜结构域，这一区域的结构应该是易弯曲的，这样可以使识别抗原的结构域适应不同的方向，以促进抗原的识别。最简单的形式是免疫球蛋白IgG1的铰链区(hinge)。也可以是免疫球蛋白CH₂CH₃区或CD3的一部分。对大多数基于scFv的结构而言，IgG1的铰链区可以满足需要。不过最好的间隔区还需要依靠经验选择。在本发明的具体实施方式中，优选CD8铰链区(CD8hinge)作为间隔区。在优选的实施方式中，选择序列如SEQ ID NO.50所示的CD8铰链区。

跨膜结构域一般选择胞内区中最接近膜的元件的跨膜结构域。而不同的跨膜结构域会导致不同的稳定性。本发明的具体实施方式中，优选CD28跨膜结构域，其可以使CAR显著表达并且具有高稳定性。

胞内区起到活化T细胞的作用，而根据胞内区结构的不同，到目前为止，CAR被分为三代。第一代CAR的胞内区只有一个信号分子，通常为免疫球蛋白E的受体相关FcεRIγ或T细胞抗原受体信号的基础传导分子CD3ζ。这些信号可以激起T细胞的细胞毒作用，但是无法提供一个完全活化T细胞的信号，于是在第二代CAR的胞内区，添加了一个共刺激分子(例如41BB、ICOS、OX40等)。在此基础上，发展出了第三代CAR，其胞内区含有两个共刺激分子，即总共含有三个信号分子。本发明的优选实施方式中，选择CD28、CD137和CD3ζ构建第三代CAR。其中CD28包含跨膜结构域与活化基序的序列如SEQ ID NO.51所示，CD137的序列如SEQID NO.52所示，CD3ζ的序列如SEQ ID NO.53所示。

包含CAR的真核表达载体转化T细胞，即可产生CAR修饰的T细胞，修饰过的T细胞可以特异性识别某种抗原并被激活，从而产生杀伤作用。本发明优选的具体实施方式中，CAR被包装到慢病毒载体中，并以此慢病毒感染分离的人外周血单个核细胞(PBMC)，以修饰的PBMC抑制肿瘤细胞的生长。

本发明从产抗HBsAg的单克隆抗体的杂交瘤细胞CRL-8017中克隆到编码scFv中重链可变区和轻链可变区的DNA序列(序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2)，并从人的活化T细胞的cDNA中克隆了编码CD8hinge、CD28(包含跨膜结构域和T细胞活化基序)、CD137的T细胞活化基序和CD3ζ的DNA，其序列分别如SEQ ID NO.4-7所示，继而拼接构建了编码CAR的DNA(HBsAg-scFv+CD8+CD28+CD137+CD3ζ，序列如SEQ ID NO.54所示)，连接到慢病毒载体，并产生含有该DNA的慢病毒。以该慢病毒感染分离的PBMC，并检测修饰的PBMC抑制肝癌细胞的作用。

实施例

实施例1.抗HBsAg抗体的单链可变区(scFv)的嵌合型抗原受体的构建

以分泌抗HBsAg的单克隆抗体杂交瘤细胞CRL-8017细胞(ATCC购买)的总RNA反转录的cDNA为模板，克隆抗HBsAg抗体的单链可变区的重链(VH)和轻链(VL)。利用Primer5.0软件设计简并引物，其序列如表1所示。

表1

s=g/c,r=g/a,k=g/t,m=a/c,y=c/t,w=a/t,h=a/c/t,b=c/g/t,v=a/c/g,d=a/g/t,n=a/t/g/c.

利用Touchdown-PCR进行PCR扩增，反应体系和反应程序如下，其中表2是VH扩增体系；表3是VL扩增体系；表4是VH和VL扩增的反应程序。

表2

成分	体积(μL)
		cDNA	5
VH F primer(上游引物)	各1μL，共6μL
		VH R primer(下游引物)	各1μL，共3μL

ExTaq(Takara)	25
		dNTP(10mM)	1
加ddH2O至	50

表3

成分	体积(μL)
		cDNA	5
VL F primer(上游引物)	各1μL，共5μL
		VL R primer(下游引物)	各1μL，共2μL
ExTaq(Takara)	25
		dNTP(10mM)	1
加ddH2O至	50

表4

将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳(如图1A所示)，泳道从左至右依次是DNA MarkerDL2,000(从上至下条带大小分别为1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp)、VH的PCR产物和VL的PCR产物。以AXXGEN胶回收试剂盒(Axygen公司)进行胶回收纯化PCR产物，以T4连接酶连接到pMD-18T载体(T4连接酶和pMD-18T载体购自Takara公司)，连接反应体系如表5所示。

表5

成分	体积(μL)
		10×T4连接酶Buffer	1
PCR产物	3
		pMD-18T	2
T4连接酶	1
		补ddH2O至	10

以热激方法转化大肠杆菌并进行测序。VH序列如SEQ ID NO.1，其翻译的氨基酸序列如SEQ ID NO.47所示，VL序列如SEQ ID NO.2，其翻译的氨基酸序列如SEQ ID NO.48所示。对测序结果进行同源比较分析发现VH基因与其他抗体的重链呈较高同源性，VL基因与其他抗体的轻链有较高同源性，属于κ链。同时，IMGT软件分析还发现VH和VL基因编码的蛋白质的氨基酸序列具有抗体的基本骨架(包括FR和CDR区域)，提示其具有抗体的结构域和功能。如图1B所示，互相比较的两个序列中，在上面的是测序结果翻译成蛋白质序列，在下面的是小鼠的免疫球蛋白的重链和轻链可变区的蛋白质序列。

以人活化T细胞(来自于人外周血PBMC，经CD3免疫磁珠分选而来)的RNA反转录的cDNA为模板，PCR扩增编码CD8hinge区、CD28跨膜区和活化基序、CD137活化基序以及CD3活化基序CD3ζ的DNA，序列分别如SEQ ID NO.4-7所示，其编码的氨基酸序列分别如SEQ IDNO.50-53所示。其引物序列如表6所示，PCR体系如表7所示(其中Primer F表示上游引物，对应表6中的CD8a hinge-F、CD28TM-F、CD137-F和CD3-F；Primer R表示下游引物，对应表6中的CD8a hinge-R、CD28TM-R、CD137-R和CD3-R；上下游引物依次一一对应)，PCR程序如表8所示。

表6

CD8a hinge-F	SEQ ID NO.23	ATGTACTTCAGCCACTTCGTGC
			CD8a hinge-R	SEQ ID NO.24	TGACAGGAGAAGGACCCCAC
CD28TM-F	SEQ ID NO.25	TGCAAAATTGAAGTTATGTATCCTC
			CD28TM-R	SEQ ID NO.26	GGAGCGATAGGCTGCGAA
CD137-F	SEQ ID NO.27	CCACCCGCCTCCTCCGAG
			CD137-R	SEQ ID NO.28	TTCCGACCTCGGTGAAGGGAG
CD3-F	SEQ ID NO.29	AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGA
			CD3-R	SEQ ID NO.30	GCGAGGGGGCAGGGCCTG
VH–EcoRI-F	SEQ ID NO.31	<u>GAATTC</u>ATGTACTTCAGCCACTTCGTGC
			VH-Linker-R	SEQ ID NO.32	TGAACCGCCTCCACCTGAAGAGACTCTGAGAG
Linker-VL-F	SEQ ID NO.33	CT GGC GGT GGC GGA TCGCGATATTCTACTGACTC
			CD8ahinge-VL-R	SEQ ID NO.34	GAAGTGGCTGAAGTACATCCGTTCCAGCTC
CD8ahinge-F	SEQ ID NO.35	GCCACCATGTACTTCAGCCACTTCGTGC
			CD8ahinge-CD28TM-R	SEQ ID NO.36	GAGGATACATAACTTCAATTTTGCACCCCCTCGTGTGCACTGC
CD28TM-CD8ahinge-F	SEQ ID NO.37	GCAGTGCACACGAGGGGGTGCAAAATTGAAGTTATGTATCCTC
			CD28TM-CD3-R	SEQ ID NO.38	TCTGCGCTCCTGCTGAACTTCACTCTGGAGCGATAGGCTGCGAA
CD3-CD28TM-4F	SEQ ID NO.39	TTCGCAGCCTATCGCTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGA
			CD3-BamHI-R	SEQ ID NO.40	TGTA<u>GGATCC</u>GCGAGGGGGCAGGGCCTG
CD8ahinge-CD137-R	SEQ ID NO.41	CTCGGAGGAGGCGGGTGGTGACAGGAGAAGGACCCCAC
			CD137-CD8a hinge-F	SEQ ID NO.42	GTGGGGTCCTTCTCCTGTCACCACCCGCCTCCTCCGAG

CD137-CD3-R	SEQ ID NO.43	TCTGCGCTCCTGCTGAACTTCACTCTTTCCGACCTCGGTGAAGG
			CD3-CD137-F	SEQ ID NO.44	CCTTCACCGAGGTCGGAAAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGA
CD28TM-CD137-R	SEQ ID NO.45	CTCAGTGTGAAGATGGACGCCGGAGCGATAGGCTGCGAA
			CD137-CD28TM-F	SEQ ID NO.46	TTCGCAGCCTATCGCTCCGGCGTCCATCTTCACACTGAG

下划线部分为酶切位点。

表7

成分	体积(μL)
		10×Buffer	5
MgSO<sub>4</sub>(50mM)	2
		dNTP(10mM)	1
Taq HiFi(5U/μL,Invitrogen)	0.2
		Primer F(10uM)	1
Primer R(10uM)	1
		T细胞cDNA	1
加ddH<sub>2</sub>O至	50

表8

琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，并用AXGGEN胶回收试剂盒回收目的片段。以如表5的体系将所得片段连接到pMD-18T载体，以热激方法转化大肠杆菌并进行测序，保留测序结果正确的克隆。

依次以编码VH、VL、CD8hinge、CD28、CD137和CD3ζ的DNA的测序正确的克隆为模板(每个体系加2μL模板)，利用表6中设计的融合引物进行分段扩增，得到A到F段的DNA。扩增体系(除模板外)如表9-14所示，反应程序如表15所示。

表9、A段扩增体系

成分	体积(μL)
		10×Buffer	5
MgSO<sub>4</sub>(50mM)	2
		dNTP(10mM)	1
Taq HiFi(5U/μL,Invitrogen)	0.2
		VH-EcoRI-F(10uM)	1

VH-Linker-R(10uM)	1
		加ddH<sub>2</sub>O至	50

表10、B段扩增体系

成分	体积(μL)
		10×Buffer	5
MgSO<sub>4</sub>(50mM)	2
		dNTP(10mM)	1
Taq HiFi(5U/μL,Invitrogen)	0.2
		Linker-VL-F(10uM)	1
CD8ahinge-VL-R(10uM)	1
		加ddH<sub>2</sub>O至	50

表11、C段扩增体系

成分	体积(μL)
		10×Buffer	5
MgSO<sub>4</sub>(50mM)	2
		dNTP(10mM)	1
Taq HiFi(5U/μL,Invitrogen)	0.2
		CD8ahinge-F(10uM)	1
CD8ahinge-CD28TM-R(10uM)	1
		加ddH<sub>2</sub>O至	50

表12、D段扩增体系

成分	体积(μL)
		10×Buffer	5
MgSO<sub>4</sub>(50mM)	2
		dNTP(10mM)	1
Taq HiFi(5U/μL,Invitrogen)	0.2
		CD28TM-CD8ahinge-F(10uM)	1
CD28TM-CD137-R(10uM)	1
		加ddH<sub>2</sub>O至	50

表13、E段扩增体系

成分	体积(μL)
		10×Buffer	5
MgSO<sub>4</sub>(50mM)	2
		dNTP(10mM)	1
Taq HiFi(5U/μL,Invitrogen)	0.2
		CD137-CD28TM-F-F(10uM)	1
CD137-CD3-R(10uM)	1

加ddH<sub>2</sub>O至

50

表14、F段扩增体系

成分	体积(μL)
		10×Buffer	5
MgSO<sub>4</sub>(50mM)	2
		dNTP(10mM)	1
Taq HiFi(5U/μL,Invitrogen)	0.2
		CD3-CD137-F(10uM)	1
CD3-BamHI-R(10uM)	1
		加ddH<sub>2</sub>O至	50

表15

琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，并用AXGGEN胶回收试剂盒回收目的片段。

以A、B、C、D、E和F段PCR产物为模板，对目的DNA的全长进行PCR拼接，程序如表16所示，其全长DNA的结构如图2A所示，图中各组成部分从左到右的排列顺序与各组成部分在DNA正义链上5’-3’方向的排列顺序相同，其中VH编码HBsAg特异性抗体重链可变区，其序列如SEQ ID NO.1所示；VL编码HBsAg特异性抗体轻链可变区，其序列如SEQ ID NO.2所示；linker为HBsAg特异性抗体重链可变区和轻链可变区的连接区，其序列如SEQ ID NO.3所示，与VH、VL共同组成HBsAg特异性抗体单链可变区；CD8hinge编码CD8分子的铰链部分，作为CAR中的spacer，其序列如SEQ ID NO.4所示；CD28编码CD28分子的跨膜区和T细胞活化基序，其序列如SEQ ID NO.5所示；CD137编码CD137分子的T细胞活化基序，其序列如SEQ IDNO.6所示；CD3zeta编码CD3分子的T细胞活化基序，其序列如SEQ ID NO.7所示。所得CAR全长DNA序列如SEQ ID NO.54所示。

表16

成分	体积(μL)
		10×Buffer	5
MgSO<sub>4</sub>(50mM)	2
		dNTP(10mM)	1
Taq HiFi(5U/μL,Invitrogen)	0.2
		VH-EcoRI-F(10uM)	1
CD3-R-BamHI-R(10uM)	1
		A段PCR产物	1
B段PCR产物	1
		C段PCR产物	1
D段PCR产物	1
		E段PCR产物	1
F段PCR产物	1
		加ddH<sub>2</sub>O至	50

琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，结果如图2B所示，左侧泳道为DNAMarker DL2000(从上到下条带大小分别为2000bp、1000bp、750bp、500bp)，右侧泳道条带为构建的带有酶切位点的编码CAR的DNA，并用AXGGEN胶回收试剂盒回收目的片段。

将上述PCR产物、pcDNA^TM3.1/flag(invitrogen公司)用EcoRI和BamHI各自进行双酶切，酶切体系如表17所示。

表17

成分	体积(μL)
		10×Buffer Tango	3
PCR产物/PMD-18T	1ug
		限制性内切酶EcoRI	0.5
限制性内切酶BamHI	0.5
		补ddH<sub>2</sub>O至	30

37℃酶切4-5小时后，电泳分离酶切片段，切胶回收目的片段。

T4DNA ligase连接上述酶切后的PCR产物及目的载体，连接体系表18所示。

表18

成分	体积(μL)
		10×T4连接酶Buffer	1

PCR-酶切产物	3
		载体P酶切产物	2
T4连接酶	1
		补ddH<sub>2</sub>0至	10

以热激方法将连接产物转化大肠杆菌，并进行测序，保存测序正确的克隆。

实施例2.嵌合型抗原受体表达模式检测

因构建的嵌合型抗原受体是重组子，首先需明确其是否膜定位。将实施例1中测序正确的克隆，即CAR真核表达质粒(CAR-Flag)转入293T细胞：293T细胞接种于6孔细胞培养板，37℃，5%CO₂细胞培养箱常规培养过夜；2μg CAR-Flag质粒溶于100μL的50nM NaCl溶液中，5-10μL JetPEI转染试剂(Polyplus公司)溶于100μL的50nM NaCl，5分钟后，将两者混合，室温作用15分钟，随即将混合物加入待转染的细胞中，转染细胞48小时。利用Focus^TMGlobal Fraction Kit(G-Biosciencesiosciences公司)进行分离膜蛋白，蛋白样品定量采用BCA法。取50μg蛋白行SDS-PAGE电泳。用抗Flag、GAPDH的抗体(Cell SignalingTechnology，货号依次为#8146、#2118，来源依次为鼠源、兔源)进行Western Blot检测(二抗为Santacruz HRP抗鼠，sc-2748和Santacruz HRP抗兔，sc-2749)。以Syngene BioImaging Systems(Frederick,MD)检测Western Blot结果，如图3A所示，特异性标记Flag和内参GAPDH都显示有杂交条带，表明膜蛋白中含有嵌合型抗原受体。

将293T细胞平铺于载玻片，18-24小时后，利用前述方法以JetPEI(Polyplus公司)转染试剂瞬时转染CAR-Flag表达质粒，36-48小时后，利用anti-CD3的抗体(CellSignaling Technology，#4443兔源，1:100)和荧光二抗(Alex488，Invitrogen，1:200)进行免疫间接标记，以Leica TCS SP5激光共聚焦显微镜进行检测，结果如图3B所示，荧光信号只出现在细胞膜位置，表明嵌合型抗原受体表达在膜上。

实施例3.嵌合型抗原受体慢病毒载体的构建和表达模式检测

以CAR-Flag的真核表达质粒作为模板，以引物F:5’-gacacggatccgccgccaccatgcaggtccaactgcagcagtctggggctgaac-3’(SEQ ID NO.56)和R:5’-gtgtcggcgcgcctcagcgagggggcagggcctgcatgtgaag-3’(SEQ ID NO.57)，进行PCR扩增，其中下划线标注的分别为BamHI和AscI的酶切位点。扩增产物经电泳纯化回收，以如表4的体系将所得片段连接到pMD-18T载体，以热激方法转化大肠杆菌并进行测序，保留测序结果正确的克隆。将测序正确的克隆委托Invitrogen公司构建到穿梭表达质粒pLenti6.3_MCS-IRES2-EGFP(结构如图4所示)的多克隆位点中，得到载体CAR-pLenti6.3_MCS-IRES2-EGFP(CAR-PL)，并包装含有CAR-PL的慢病毒载体。

将293T细胞平铺于载玻片，18-24小时后，利用实施例2中的方法以JetPEI(Polyplus)转染试剂将CAR-PL表达质粒瞬时转染至293T细胞，36-48小时后，固定，打孔，利用anti-CD3的抗体(Cell Signaling Technology，#4443兔源，1:100)和荧光二抗(Alex488，Invitrogen，1:200)进行免疫间接标记，以Leica TCS SP5激光共聚焦显微镜进行检测。如图5所示，以共聚焦显微镜观察经HBsAg特异性嵌合型抗原受体慢病毒载体瞬时转染的293T细胞，其结果显示，荧光信号在细胞膜的位置上，这也就说明构建在慢病毒载体上的嵌合型抗原受体的表达是膜定位的。

实施例4.CAR修饰的PBMC的功能检测

(1)CAR慢病毒感染PBMC的效率检测

在肝癌局部抗肿瘤免疫细胞主要包括CD8⁺和CD4⁺T淋巴细胞，我们利用Ficoll-Hypaque(IAE-1)分离液从健康人外周血中分离单个核细胞(PBMC)，实施例3中所得到的的CAR慢病毒(CAR-PL)感染(MOI：5)，48小时后，以FACSCalibur流式细胞仪(BectonDickinson公司)依据细胞中的GFP信号进行检测(如图4所示，载体中有编码GFP的基因)，结果如图6所示，右侧的峰为有GFP信号的细胞，其所占的比例，也就是感染效率为48.2%。

(2)分泌IFN-γ杀伤性物质

进一步对CAR慢病毒感染的PBMC进行功能检测。将CAR慢病毒和对照病毒(不含有CAR的病毒)感染的PBMC分别与对数生长期的Hep3B(分泌HBV病毒颗粒)和HepG2(不分泌HBV病毒颗粒)的肝癌细胞系(Hep3B和HepG2均来自上海中科院细胞所，细胞数的比为PBMC:肝癌细胞=5:1，细胞悬液总体积100μL)在37℃和5%CO₂的条件下共培养48小时，以PeproTech900-K27试剂盒对培养基中IFN-γ的含量进行ELISA检测。结果如图7所示，发现CAR慢病毒感染的PBMC与HepG2共培养，PBMC分泌IFN-γ非常少(57.12pg/mL)，与Hep3B肝癌细胞共培养的PBMC细胞可分泌大量IFN-γ(701.23pg/mL)，而对照病毒感染的PBMC与肝癌细胞共培养，分泌的IFN-γ的量都不高且很接近(与Hep3B共培养为101.1pg/mL；与HepG2共培养为102pg/mL)。说明CAR修饰的PBMC细胞中的CD8⁺T细胞被充分活化，并可释放杀伤性细胞因子(图7)。由图中可见HBsAg特异性嵌合型抗原受体慢病毒感染的PBMC在与分泌HBV病毒颗粒的肝癌细胞HeP3B共培养时，无论是相对于与不分泌HBV病毒颗粒的HePG2共培养还是相对于与同种细胞共培养的未改造慢病毒感染的PBMC，其IFN-γ的分泌都有明显的提高。

实施例5.抑制肝癌细胞的增殖

将Hep3B细胞用CFSE(Fluka公司)以0.25μmol/5*10⁷细胞的剂量标记10分钟，无血清培养基洗三次，完全培养基培养过夜，分别与CAR慢病毒和对照病毒感染48小时的PBMC(感染方法同实施例4)共培养48小时(细胞数比，PBMC:Hep3B为10:1、25:1和50:1)，以FACSCalibur流式细胞仪通过CFSE信号检测肝癌细胞的增殖情况。结果如图8所示，两组分别设不加入PBMC的空白对照；当PBMC:Hep3B为10:1、25:1和50:1时，CAR慢病毒感染的PBMC与对照病毒感染的PBMC相比，非常显著的抑制了肝癌细胞的增殖，P<0.01，P值分别为0.0007524、0.000642102和0.00040432。而从图中可以看出，加入对照病毒感染的PBMC与空白对照相比，肝癌细胞的增殖基本一致。这表明CAR慢病毒感染的PBMC被活化后，可以显著的抑制分泌HBV病毒颗粒的肝癌细胞Hep3B的增殖。