CN108778291B - 包含重组t细胞受体的组合物和文库以及使用重组t细胞受体的方法 - Google Patents

包含重组t细胞受体的组合物和文库以及使用重组t细胞受体的方法 Download PDF

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Abstract

提供了重组多核苷酸，包括编码具有来自作为本发明实施方式的新的AL、KQ、PP、19305CD8、BB、KB、ST、JD、19305DP、PB‑P、PB‑T和PB13.2T细胞受体(TCR)中任一种的氨基酸序列的TCR的α链和/或β链的表达载体。提供了包含多核苷酸的细胞，以及重组多核苷酸和表达载体的文库。提供了方法，该方法包括向个体给予表达新的重组TCR的经过修饰的人类T细胞。该方法用于预防和/或治疗被诊断患有癌症、怀疑患有癌症或具有癌症发展或复发风险的个体，其中所述癌症包括表达NY‑ESO‑1和/或其高度同源的LAGE‑1抗原的癌细胞。

Description

包含重组T细胞受体的组合物和文库以及使用重组T细胞受体 的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2016年1月6日提交的美国临时专利申请第62/275,600号的优先权，通过引用将其公开结合于此。
技术领域
本公开大体上涉及免疫疗法，更具体地涉及可以赋予T细胞直接肿瘤识别能力的重组T细胞受体。
背景技术
肿瘤抗原特异性T细胞通过采用特异性针对肿瘤抗原肽/HLA复合物的独特T细胞受体(TCR)α和β链复合物来识别并杀死癌细胞。极其多样化的TCRα/β序列单独地决定了肽特异性、HLA限制和识别强度。对具有肿瘤抗原特异性TCR的多克隆扩增的外周T细胞进行基因工程产生大量肿瘤抗原特异性T细胞，其可通过采用自体基因工程化的T细胞而用于癌症患者的过继性T细胞疗法。目前，在临床试验中仅测试了少数治疗性TCR基因产物，这明显限制了该强有力的治疗策略对于被其HLA类型及癌细胞中的抗原表达受限的患者的适用性。因此，对用于在涉及重组TCR的过继免疫疗法中使用的改进组合物和方法还存在持续的未被满足的需求。而本公开满足了这种需求。
发明内容
在一个方面，本公开提供了经过修饰的人类T细胞，其包含编码TCR的α链和/或β链的重组多核苷酸，其中TCR是本文所称为如下文进一步描述的AL、KQ、PP、19305CD8、BB、KB、ST、JD、19305DP、PB-P、PB-T或PB13.2的TCR之一。在另一个方面，本公开包括用于预防和/或治疗被诊断患有癌症、怀疑患有癌症或具有癌症发展或复发风险的个体的方法，其中所述癌症包括表达NY-ESO-1和/或其高度同源的LAGE-1抗原的癌细胞，该方法包括向所述个体给予表达本公开的重组TCR的经过修饰的人类T细胞。
在另一个方面，本公开包括编码TCR的表达载体，其中TCR包含具有如下文进一步描述的19305DP AL、KQ、PP、19305CD8、BB、KB、ST、JD、PB-P、PB-T或PB13.2的序列的α链和/或β链。
在另一个方面，本公开提供了包含多种表达载体的文库，其中所述表达载体编码选自如下文进一步描述的TCR(19305DP、AL、KQ、PP、19305CD8、BB、KB、ST、JD、PB-P、PB-T或PB13.2)的本文所描述的TCRα链和β链的组的至少一种α链和/或β链或其组合。在一个实施例中，文库可以进一步包含至少一种编码也在下文中进一步描述的TCR(JM、5B8、SB95)的α链、β链或其组合的表达载体。
在另一个方面，本公开提供了用于在将表达载体引入至被诊断个体的免疫细胞中使用的方法，该方法包括：从本公开的文库中选择表达载体，其中所述选择至少部分基于被诊断患有或怀疑患有NY-ESO-1/LAGE-1阳性癌症的个体的HLA类型，以及将所选择的表达载体分配给一方。
在另一个方面，本公开提供了一种方法，包括从本公开的表达载体文库中选择表达载体，并将表达载体引入至从诊断为患有NY-ESO-1/LAGE-1阳性癌症的个体获得的免疫细胞中，其中由表达载体编码的TCR的HLA类型与个体的HLA类型匹配，该方法可选地包括将包含表达载体的免疫细胞导入需要其的个体中。
在另一个方面，本公开提供了一种方法，包括测试来自个体的样品以确定该个体是否患有NY-ESO-1/LAGE-1阳性癌症，并且在确定所述个体患有NY-ESO-1/LAGE-1阳性癌症之后，至少部分地基于个体的HLA类型从本公开的文库中选择表达载体，并将表达载体引入至个体的免疫细胞中，该方法可选地进一步包括将包含表达载体的免疫细胞导入个体。
在另一个方面，本公开提供了用于在免疫疗法中使用的从本公开的文库中选择和/或检索TCR的基于计算机的方法。在一些实施方式中，本公开包括数据库，其包括TCR的核苷酸和/或氨基酸序列，或TCR的其它标记。在某些实施方式中，本公开包括一种系统，其包括被编程为使本公开文库的TCR与样品的HLA类型匹配的处理器。
附图说明
图1-1至1-4提供了本公开的载体的图示。
图1-1显示了用于产生表达TCR的骨架载体的质粒，其中(A)示出了经典的基于鼠干细胞病毒(MSCV)的逆转录病毒质粒；(B)示出了最近的逆转录病毒质粒。由于MSCV长末端重复序列(LTR)的强启动子活性和转基因表达在造血细胞中的体内稳定性，已经将鼠干细胞病毒(MSCV)衍生的载体广泛用于T细胞转导。由于3'-LTR在整合到宿主细胞(T细胞)期间被复制到5'-LTR并负责转基因转录，因此质粒中的3'-LTR对于表达非常重要。另一方面，5'-LTR负责转录以进行病毒生产。经典MSCV衍生载体(pMIG-II和pMIG-w)的示意图如图1-1所示。这两种载体在5'和3'位点均具有MSCV衍生的LTR、包装信号(Ψ)、多克隆位点(MCS)。转基因被克隆到多克隆位点(MCS)中，其后是内部核糖体进入位点(IRES)和绿色荧光蛋白基因(GFP)以有效检测经过转导的细胞。pMIG-w载体具有额外的土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WRE)，其增强转基因的表达。可以引入其它修饰，例如在商业逆转录病毒载体(pDON-5(Clontech))中存在的那些修饰。pDON-5源自鼠白血病病毒(MLV)载体，用CMV/MLV杂合LTR替换5'-LTR，以通过病毒包装细胞系中的较强CMV启动子活性来增强病毒生产。此外，可以引入来自人类延伸因子1α基因的部分内含子，以提供剪接受体位点(SA)，其与内源剪接供体位点(SD)一起诱导剪接并增强表达。
图1-2显示了将从5'-LTR至剪接受体位点的片段克隆至pMIG载体，其中(A)示出了通过PCR扩增连接限制酶位点；(B)示出了将PCR片段克隆至pMIG载体。为了产生能够产生在T细胞中诱导高水平转基因(TCR)表达的高滴度逆转录病毒的逆转录病毒载体，我们扩增了pDON-5质粒中从5'-LTR至含有剪接受体位点的内含子的DNA片段。将正向引物设计为在5'-LTR之前附加SgrAI限制酶识别位点，并将反向引物设计为在内含子之后附加NotI和SalI位点。用SgrAI和SalI处理经过PCR扩增的片段，并将该片段插入至pMIG-II质粒和pMIG-w质粒中，以将5'-LTR至GFP替换。
图1-3显示了引入填充物片段和PacI限制酶位点，其中(A)示出了通过PCR扩增连接限制酶位点；(B)示出了克隆填充物片段。描绘的质粒仅具有用于克隆的NotI和SalI识别位点。采用为已知6聚体序列的SalI不是优选的，由于这种较短的识别序列可能出现于转基因中。为了提供被认为不会存在于大多数与本公开相关的转基因中的其它限制酶识别位点，我们采用具有NotI限制性位点的正向引物和具有PacI-SalI位点的反向引物扩增了1.8kb DNA片段(填充物)。用NotI和SalI限制酶处理经过扩增的片段，并将该片段插入新的质粒中。
图1-4显示了将TCR表达盒克隆至载体，其中(A)示出了通过PCR扩增连接限制酶位点；(B)示出了克隆TCR表达盒。采用具有NotI限制性位点的正向引物和具有PacI限制酶位点的反向引物扩增TCR表达盒。用NotI和PacI限制酶处理经过扩增的表达盒并插入新的质粒中。
图2。19305DP-TCR在多克隆激活的T细胞上的表达。用编码19305DP-TCR的逆转录病毒载体将来自外周血单核细胞的多克隆激活的T细胞转导两次，该19305DP-TCR的β链可变区是Vb8亚型。通过用抗-TCR Vb8抗体与抗-CD4和抗-CD8抗体一起染色来测量表达。
图3。19305DP-TCR转导的T细胞识别癌细胞。将19305DP-TCR转导的T细胞与NY-ESO-1+SK-MEL-37和NY-ESO1-SK-MEL-29黑素瘤细胞系在Golgi Stop存在下共培养6小时，并且通过细胞内IFN-g染色联合细胞表面CD8染色测量IFN-g产生。
图4小图A。用于表达TCR的逆转录病毒载体。LTR：长末端重复序列；ψ：包装信号；MCS：多克隆位点；IRES：内部核糖体进入位点；eGFP：增强的绿色荧光蛋白。图4小图B。TCR表达盒。(I)通过GSG(Gly-Ser-Gly)接头和P2A核糖体跳跃序列连接编码TCRβ链和α链的cDNA序列。(II)通过弗林蛋白酶识别位点(RAKR(Arg-Ala-Lys-Arg)(SEQ ID NO：59)、SGSG(Ser-Gly-Ser-Gly)(SEQ ID NO：60)接头、V5表位和P2A核糖体跳跃序列连接编码TCRβ链和α链的cDNA序列。
图5。CD4和CD8分子在HLA-A*02限制性T细胞克隆上的细胞表面表达。用抗-CD4和抗-CD8单克隆抗体将19305DP-TCR CD4/CD8双阳性T细胞克隆和AL CD8单阳性T细胞克隆染色，并通过流式细胞术分析。
图6。阻断抗体对癌症靶标识别的影响。在存在或不存在所示抗体下，将19305DP-TCRCD4/CD8双阳性T细胞克隆和JD CD8单阳性T细胞克隆与HLA-A*02+NY-ESO-1+黑素瘤细胞系MZ-MEL-9共培养。抗HLA I类抗体(aABC)抑制19305DP和JD的识别。虽然两种抗-CD8抗体显著抑制JD的识别，但19305DP的识别未被抑制，表明癌症靶标的识别是CD8-非依赖性的。*表示显著性(p<0.05)抑制。
图7。丙氨酸取代对NY-ESO-1肽识别的影响。用丙氨酸残基取代NY-ESO-1(157-170)肽(DP4肽SLLMWITQCFLPVF(SEQ ID NO：61)中的每个氨基酸残基。用丙氨酸取代的(1-14)或天然的DP4肽(DP4)脉冲或非脉冲(-)HLA-A*02阳性和NY-ESO-1阴性的癌细胞。通过测量上清液中的IFN-g来研究19305DP CD4/CD8双阳性T细胞克隆、ALCD8单阳性T细胞克隆和JD CD8单克隆阳性T细胞克隆的识别。对位置2、3、4、5、6和7处氨基酸的丙氨酸取代(LLMWIT-SEQ ID NO：62)显著降低了19305DP的识别，表明这些残基对T细胞识别很重要。计算机分析显示，除NY-ESO-1和LAGE-1外，没有已知的具有LLMWIT序列的蛋白质。
图8。19305DP-TCR-转导的T细胞的体内抗肿瘤活性。向NOD/Scid/IL-2Rg-链缺陷(NSG)小鼠皮下注射1×106HLA-A2+NY-ESO-1+A375细胞系。将外周血单核细胞(PBMC)多克隆激活，并通过逆转录病毒载体用19305DP-TCR、AL-TCR或不相关的TCR转导。在第11天，静脉内注射2.5×105个TCR转导的T细胞。在T细胞注射后每隔一天利用数字卡尺测量肿瘤体积。19305-TCR转导的T细胞显著抑制肿瘤生长(小图A)并延长存活期(小图B)。用19305DP-TCR转导的T细胞处理的6只小鼠中的5只在第40天是无肿瘤的，而注射有AL-TCR转导的T细胞的6只小鼠中有4只在此时间点是具有肿瘤的。
图9。用19305DP-TCR转导的CD8+和CD4+T细胞的体外CTL活性。采用生物素缀合的抗-CD4或抗-CD8抗体，然后采用抗生物素Dyna珠将PBMC中的CD4+或CD8+T细胞耗尽。将CD4耗尽和CD8耗尽的PBMC多克隆激活，并通过逆转录病毒载体用19305DP-TCR、AL-TCR或不相关的TCR转导。(小图A)在体内实验之前，用流式细胞术测定用TCR转导的CD8+T细胞(CD4耗尽的细胞)和CD4+T细胞(CD8耗尽的细胞)的纯度。(小图B)孵育4小时后，通过钙黄绿素-AM测定法测试用针对HLA-A2+NY-ESO-1+Mel624.38细胞系的指定TCR转导的CD8+或CD4+T细胞的细胞毒活性。(小图C)与用指定TCR转导的CD4+或CD8+T细胞共培养后的癌细胞凋亡细胞死亡。将HLA-A2+NY-ESO-1+A375细胞系(2.5×105)与5×105个T细胞共培养20小时。通过膜联蛋白-V和PI染色确定凋亡性细胞死亡。尽管通过短期细胞毒性测定(小图B)，与CD8+T细胞相比，19305DP-TCR转导的CD4+T细胞示出较弱的细胞毒活性，但CD4+T细胞诱导凋亡性细胞死亡(小图C)。在与AL-TCR转导的CD4+T细胞共培养时，未观察到癌细胞死亡。
图10。用19305DP-TCR转导的CD8+和CD4+T细胞的抗肿瘤活性。采用生物素缀合的抗-CD4或抗-CD8抗体，然后采用抗生物素Dyna珠将PBMC中的CD4+或CD8+T细胞耗尽。将CD4耗尽和CD8耗尽的PBMC多克隆激活，并通过逆转录病毒载体用19305DP-TCR、AL-TCR或不相关的TCR转导。向NOD/Scid/IL-2Rg-链缺陷(NSG)小鼠皮下注射1×106个HLA-A2+NY-ESO-1+A375细胞系。在第11天，静脉内注射0.6×105个TCR转导的CD8+T细胞(25％的全部PBMC)和1.9×105个TCR转导的CD4+T细胞(75％的全部PBMC)。在T细胞注射后每隔一天利用数字卡尺测量肿瘤体积。19305DP-TCR和AL-TCR转导的CD8+T细胞均控制肿瘤生长(左)，而仅19305DP-TCR转导的CD4+T细胞显示肿瘤消退(右)。
具体实施方式
除非本文另有定义，否则本公开中使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。
贯通本说明书中所给出的每个数值范围包括其上限值和下限值，以及落入其中的每个较窄的数值范围，如同这些较窄的数值范围全都在本文中明确写出一样。
本文描述的每种多核苷酸包括其互补序列及其反向互补序列，以及DNA序列的RNA等同物，其中DNA序列中的每个T被U替换。编码本文所述的氨基酸序列的所有多核苷酸序列都包括在本公开的范围内。
本公开提供了用于预防和/或治疗多种癌症的组合物和方法。通常，癌症是表达众所周知的NY-ESO-1/LAGE-1抗原的癌症。
本公开包括本文描述的重组TCR中的每一种，编码它们的多核苷酸，包含所述多核苷酸的表达载体，已引入所述多核苷酸的细胞(包括但不一定限于CD4+T细胞、CD8+T细胞、天然杀伤T细胞、γδT细胞、和祖细胞，如造血干细胞)。如在本公开中所使用的，“重组TCR”是指从被引入至细胞的多核苷酸表达的TCR，意味着在初始引入多核苷酸之前，TCR并不是由细胞中的染色体序列或其它多核苷酸编码的。
在一些实施方式中，将多核苷酸引入至其中的细胞是淋巴祖细胞、未成熟胸腺细胞(双阴性CD4-CD8-)、或双阳性胸腺细胞(CD4+CD8+)。在一些实施方式中，祖细胞包含标志物，如CD34、CD117(c-kit)和CD90(Thy-1)。本公开包括制备TCR的方法、修饰细胞以使其表达TCR的方法，经过修饰的细胞，以及将经过修饰的细胞用于抗癌途径的方法。还包括不同TCR的库。
在具体的实施方式中，本公开包括用于预防和/或治疗被诊断患有癌症、怀疑患有癌症或具有癌症发展或复发风险的个体的方法，其中所述癌症包括表达NY-ESO-1/LAGE-1抗原的癌细胞。在一个方面，该方法包括向所述个体给予包含编码本公开TCR的重组多核苷酸的经过修饰的人类细胞。经过修饰的人类细胞(如经过修饰的T细胞)相对于其未经修饰的T细胞对应物，其在抗癌能力方面得到增强。因此，在一些实施方式中，实践本公开的方法产生了治疗性反应，其可以包括但不一定限于减缓癌细胞和/或肿瘤的生长速率、减少肿瘤体积和/或降低肿瘤体积增长速率的增加、杀死癌细胞、延长已被诊断患有如本文更全面描述的癌症的个体的寿命、以及对癌症治疗领域的技术人员显而易见的其它参数。
可以将实践本公开的实施方式的效果与任何合适的参考(如阳性对照或阴性对照)进行比较。在一些实施方式中，可以将效果与例如从表达具有已知作用的TCR的对照细胞、或表达对所讨论的特定抗原不具有特异性的TCR的对照细胞、或表达相对于HLA类型和/或T淋巴细胞类型不匹配的TCR的对照细胞所获得的参考值进行比较，或与在提供本公开的益处时对于本领域技术人员显而易见的任何其它合适的参考值进行比较。在一些实施方式中，合适的参考包括一个已知值或多个值范围。在一些实施方式中，参考包括统计值，如曲线下面积，或图表中的另一面积或绘图(plot)，和/或该参考通过重复测量而获得。
采用HLA-Ⅰ限制性TCR和HLA-II限制性TCR证明了本公开的各种非限制性实施方式。
HLA-I限制性TCR
在一个方面，本公开涵盖了对在HLA I类环境中被呈递的NY-ESO-1抗原具有特异性的多种新型TCR。下文将HLA-Ⅰ限制性TCR的ɑ链和β链以及编码它们的多核苷酸序列的具体实例进一步描述为“19305DP”、“AL”、“KQ”、“PP”、“19305CD8”、“BB”、“KB“、”ST“和”JD“。这些TCR对于由不同HLA I类类型呈递的NY-ESO-1/LAGE-1衍生肽具有特异性，包括HLA-A*02；B*27；B*35；Cw*03；和Cw*15。
HLA-II限制性TCR
在另一个方面，本公开涵盖对在HLA II类环境中被呈递的NY-ESO-1抗原具有特异性的多种新型TCR。下文将HLA-II限制性TCR的ɑ链和β链以及编码它们的多核苷酸序列的具体实例进一步描述为“PB-P”、“PB-T”和“PB13.2”。这些TCR对于由不同HLA II类类型呈递的NY-ESO-1/LAGE-1衍生肽具有特异性，包括HLA-DRB1*04和DRB1*07。在某些实施方式中，这些TCR赋予表达它们的T细胞直接识别肿瘤和/或癌细胞的能力，该肿瘤和/或癌细胞表达NY-ESO-1/LAGE-1抗原。
在某些方面，给予至个体的包含本公开重组TCR的细胞是同种异体的、同基因的或自体的细胞。因此，在一个实施方式中，从第一个体获得细胞，将该细胞修饰并给予至需要其的第二个体。在另一个实施方式中，在修饰细胞之前将它们从个体中取出，修饰细胞以表达重组TCR，然后将它们给予回至同一个体中。在某些实施方式中，根据本公开被修饰的细胞包含免疫细胞群，该免疫细胞群富集、包含特定免疫细胞类型或由特定免疫细胞类型组成。在某些方面，细胞是CD4+T细胞，或是CD8+T细胞。在一个方面，将本公开的一种或多种表达载体引入至其中的细胞包含免疫细胞的混合物，如CD4+细胞和CD8+T细胞，和/或可以包含外周血单核细胞(PBMC)。在一种方法中，将单独或一起编码19305DPTCR的一种或多种表达载体引入至免疫细胞的混合物中。在某些实施方式中，T细胞能够直接识别表达NY-ESO-1/LAGE-1抗原的癌细胞。在一些实施方式中，直接识别包括TCR与癌细胞表达的NY-ESO-1/LAGE-1抗原进行HLA II类限制性结合。
关于19305DP TCR，本公开证明了其表达和功能的某些特征。例如，图5-7提供了亲本19305DP克隆的特征。特别是，图5提供了CD4/CD8双阳性特征的证据。图6证明了CD8-非依赖性识别，表明TCR的高亲和力识别。图7证明了严格的NY-ESO-1/LAGE-1序列特异性，其支持与其它人类抗原无交叉反应性。图8-10显示出与AL-TCR相比，证明由19305DP-TCR转导的人类T细胞具有抗肿瘤作用的结果，该AL-TCR具有相同的HLA-A*02:01-限制性和NY-ESO-1特异性但来源于CD8单阳性T-细胞克隆。图8证明了同时含有由表达19305DP TCR或AL TCR的逆转录病毒载体转导的CD4+和CD8+T细胞的人类外周血单核细胞对表达NY-ESO-1和HLA-A*02:01的人类黑素瘤的体内生长抑制作用，证明19305DP-TCR转导的PBMC具有优异的抗肿瘤作用。图9证明了表达19305DP TCR和AL TCR的CD4+和CD8+T细胞的体外肿瘤杀伤能力，证明CD4+和CD8+T细胞在转导有19305DP-TCR时均有效杀死NY-ESO-1+HLA-A*02：01+癌症靶标，而在被转导有AL-TCR时只有CD8+T细胞杀死靶标。图10提供的数据证明了表达19305DPTCR和ALTCR的CD4+和CD8+T细胞具有体内肿瘤生长抑制作用，证明CD4+和CD8+T细胞在转导有19305DP-TCR时攻击NY-ESO-1+HLA-A*02:01+癌症靶标，而在被转导有AL-TCR时只有CD8+T细胞显示出肿瘤生长抑制作用。因此，在某些实施方式中，本公开涉及使用重组TCR和本公开的经过修饰的细胞(如修饰为表达19305DP TCR的细胞)转导CD4+T细胞或CD8+T细胞、或所谓的双阳性(“DP”)T细胞的能力。关于DP T细胞，本领域已知的是它们存在于胸腺的发育阶段。通过称为胸腺阳性选择的过程将CD4+/CD8+双阳性T细胞分化成CD4谱系或CD8谱系，并且认为CD4和CD8分化途径通常发展为相互排斥的命运。然而，已经在血液和外周淋巴组织中描述了成熟的CD4+/CD8+DP T细胞，并且已经在包括癌症在内的某些疾病中观察到它们-尽管频率较低。不希望受任何特定理论的约束，认为本公开首次描述了从DP T细胞获得的TCR，并且以重组方式产生这种TCR以证明其在过继免疫途径中的实用性，如本公开的实施例和附图所证明的。在某些实施方式中，本发明提供了表达TCR的细胞的混合物、或表达多于一种本文所述的TCR的细胞，该TCR对不同的癌症抗原具有特异性，因此提供了相对于TCR可被认为是多价的细胞群。
在某些实施例中，本发明提供的TCR能够识别NY-ESO-1；157-170，其是由氨基酸序列SLLMWITQCFLPVF(SEQ ID NO：63)组成的抗原，或者能够识别NY-ESO-1；95-106，其是由氨基酸序列PFATPMEAELAR(SEQ ID NO：64)组成的抗原。
在某些实施方式中，本发明提供的细胞是表达本公开TCR的工程化CD8+T细胞(其可以直接识别NY-ESO-1/LAGE-1+癌细胞)，以及经由TCR与和HLA II类分子结合的抗原相互作用而能够识别这些NY-ESO-1/LAGE-1抗原的CD4+T细胞，其中HLA II类分子由肿瘤细胞展示。
本发明包括编码本发明和本文公开的一种或多种TCR多肽的每一种多核苷酸序列，包括DNA序列和RNA序列，并包括包含这些序列和/或由这些序列组成的分离的和/或重组的多核苷酸。本发明还包括含有重组多核苷酸的细胞。该细胞可以是分离的细胞，在培养物中生长和/或扩增和/或保持的细胞，并且可以是原核或真核细胞。原核和真核细胞培养物可用于例如繁殖或扩增本发明的TCR表达载体。在一些实施方式中，细胞可以包含包装质粒，例如其提供用于将表达构建体的RNA拷贝转录和包装至重组病毒颗粒(如假病毒颗粒)中的一些或所有蛋白质。在一些实施方式中，将表达载体瞬时地或稳定地引入至细胞中。在一些实施方式中，将表达载体整合到用于其生产的细胞染色体中。在一些实施方式中，将编码TCR的多核苷酸整合到细胞的一个或多个染色体中，该TCR是通过表达载体(如病毒颗粒)引入至细胞中的。此类细胞可用于繁殖，或者它们可以是用于治疗和/或预防方法的细胞。真核细胞包括CD4+T细胞、CD8+T细胞、天然杀伤T细胞、γδT细胞及其祖细胞，其中已将本发明的TCR表达构建体引入至该细胞中。CD4+T细胞可以来自任何来源，包括但不限于人类受试者，其可能是或可能不是一旦被工程化就表达根据本公开的新的TCR的CD4+T细胞、CD8+T细胞或其组合的最终接受者。
用于本公开的实施方式的表达载体可以是任何合适的表达载体。在一些实施方式中，表达载体包括经过修饰的病毒多核苷酸，例如来自腺病毒、疱疹病毒或逆转录病毒，如慢病毒载体。表达载体不限于重组病毒，并且包括非病毒载体，如DNA质粒和体外转录的mRNA。
关于由上述多核苷酸/表达载体编码的多肽，在某些方面，本发明提供功能性TCR和编码它们的表达载体，其中功能性TCR包含TCRα链和TCRβ链，其中这两条链彼此以物理结合方式呈现(例如，在复合物中)并且彼此非共价连接，或者其中这两条链是不同的多肽但彼此共价连接，例如通过二硫键、或非肽键的其它共价键。其它合适的键可以包括，例如，取代或未取代的聚亚烷基二醇，及以例如共聚物形式的乙二醇和丙二醇的组合。在其它实施方式中，构成TCRα链和TCRβ链的两种多肽都可以包含在单一多肽中，如融合蛋白。在某些实施方式中，融合蛋白包含TCRα链氨基酸序列和TCRβ链氨基酸序列，二者是从相同的开放阅读框(ORF)、或不同的ORF、或包含产生非连续翻译的信号的ORF翻译出的。在一个实施方式中，ORF包含位于TCRα链和TCRβ链之间的P2A介导的翻译跳跃位点。用于制备含有P2A的蛋白质的构建体(也称为2A肽连接的多顺反子载体)是本领域已知的。(参见，例如，GeneTransfer：Delivery and Expression of DNA and RNA，实验室手册，(2007)，Friedman等人，国际标准书号(ISBN)978-087969765-5。简言之，2A肽序列，在包含在编码区之间时，允许通过在2A肽序列中发生的新的切割事件在单个载体内以化学计量地产生离散的蛋白质产物。2A肽序列通常是包含18-22个氨基酸的短序列并且可以包含不同的氨基末端。因此，在一个实施方式中，本发明的融合蛋白包含P2A氨基酸序列。在一些实施方式中，本发明的融合蛋白可以包含TCRα链和TCRβ链之间的接头序列。在某些实施方式中，接头序列可以包含GSG(Gly-Ser-Gly)接头或SGSG(Ser-Gly-Ser-Gly)(SEQ ID NO：59)接头。在某些实施方式中，TCRα链和TCRβ链通过包含弗林蛋白酶识别位点，如RAKR(Arg-Ala-Lys-Arg)(SEQ IDNO：60)位点的氨基酸序列彼此连接。
在一个实施方式中，编码TCR的表达构建体还可以编码另外的多核苷酸。另外的多核苷酸可以是能够鉴定TCR表达细胞的多核苷酸，例如通过编码可检测的标记，如荧光蛋白或发光蛋白。另外的多核苷酸可以是编码允许选择性消除TCR表达细胞的元件(如胸苷激酶基因)的多核苷酸。在一些实施方式中，另外的多核苷酸可以是其促进对内源编码的TCR的表达的抑制的多核苷酸。在一个实施方式中，编码TCR的表达构建体还编码可以促进一种或多种内源性TCR的RNAi介导下调的多核苷酸。例如，参见Okamoto S等人.(2009)CancerResearch，69：9003-9011，和Okamoto S等人.(2012).Molecular Therapy-Nucleic Acids，1，e63。在一个实施方式中，编码TCR的表达构建体可以编码靶向内源性编码的TCR的shRNA或siRNA。在可替换的实施方式中，可以采用编码用于在下调内源性TCR产生中使用的多核苷酸的第二种不同的表达构建体。
在某些方法中，可以从表达构建体表达不同的TCR链，使得β链相对于α链是N末端取向的，因此本发明的TCR也可以包含这种链取向或其它取向。在可替换的实施方式中，可以从引入至相同细胞的不同表达载体表达TCRα链蛋白和TCRβ链蛋白。在某些实施方式中，可以将编码TCR的mRNA用作表达载体的替代物。
关于工程化的CD4+T细胞、CD8+T细胞及其组合的用途，该方法通常包括向需要其的个体给予有效量的包含CD4+T细胞的组合物(通常静脉内或腹膜内注射1010个细胞)。在多种实施方式中，需要其的个体是患有癌症、怀疑患有癌症或具有发展为癌症风险的个体，该癌症被表征为表达NY-ESO-1/LAGE-1的恶性细胞。如本领域众所周知的，NY-ESO-1/LAGE-1是由多种癌细胞和肿瘤类型表达的。在特定非限制性的实施例中，此类癌症包括膀胱癌、脑癌、乳腺癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、骨髓瘤、前列腺癌、肉瘤和黑素瘤。具体的实施方式包括但不限于脂肪肉瘤和肝内胆管癌。个体可以患有早期或晚期形式的任何这些癌症，或者可以从任何这些癌症中缓解。在一个实施方式中，给予本发明组合物的个体具有任何表达NY-ESO-1的癌症类型复发的风险。在某些实施方式中，个体患有肿瘤、怀疑患有肿瘤或具有肿瘤发展或复发的风险，该肿瘤包含表达含有由NY-ESO-1:157-170和/或NY-ESO-1:95-106定义的氨基酸序列的蛋白质的细胞。在一些实施方式中，本公开包括对长度在15个至24个氨基酸残基之间的NY-ESO-1的肽片段具有特异性的重组TCR，其中该肽与HLA-II以复合物存在。在一些实施方式中，本公开包括对与HLA-Ⅰ或HLA-II复合的肽具有特异性的重组TCR，其中该肽包含NY-ESO-1:157-170和/或NY-ESO-1:95-106的氨基酸序列或由其组成。
下面给出的核苷酸和氨基酸序列代表用于证明本发明的那些。如上所述，本发明包括编码本文描述的TCR构建体的氨基酸序列的任一和所有多核苷酸序列。此外，考虑了TCR中氨基酸序列的变化，只要它们没有不利地影响TCR的功能。在多种实施方式中，与本文呈现的序列相比，包含一个或多个氨基酸变化的TCR将包含保守氨基酸取代或其它取代、添加或缺失，只要表达本发明重组TCR的细胞可以直接且特异性地识别表达NY-ESO-1/LAGE-1的肿瘤细胞，其中该识别依赖于NY-ESO-1/LAGE-1的表达和由肿瘤细胞以HLA II类限制性方式从其加工的肽的呈递。在一些实施方式中，本发明的TCR包含在抗原呈递细胞不参与下促进对肿瘤细胞上肿瘤抗原直接识别的任何氨基酸序列。在一些实施方式中，本公开提供的TCR的氨基酸序列与作为本公开一部分的序列表中提供的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％的相似性。在多种实施方式中，本发明的任何TCR可具有如本文所定义的其同源表位的Koff值，其与相同表位的天然存在的TCR的由TCR所显示的同源表位的Koff基本相同。在一些实施方式中，TCR氨基酸序列可以包含其恒定区的变化。在这方面，本领域已知通常TCR的恒定区基本上不促进抗原识别。例如，可以用鼠序列替换TCR的人类恒定区的一部分，并保留TCR的功能。(参见，例如，GoffSL等人(2010)Cancer Immunology，Immunotherapy，59：1551-1560)。因此，考虑了对本文公开的TCR序列的各种修饰，并且可以包括但不限于以下变化：改善特定链配对、或促进与CD3复合物的T细胞信号传导蛋白的更强结合、或抑制内源性TCR和引入的TCR之间的二聚体形成。在一些实施方式中，氨基酸变化可以存在于CDR区，如CDR3区，包括但不一定限于CDR3序列中的一个、两个、三个或更多个氨基酸的取代。在一些实施方式中，氨基酸变化对TCR的功能无影响。成熟TCR蛋白的前端是称为信号肽或前导肽的氨基酸序列，该氨基酸序列引导新合成的TCR蛋白至分泌途径。在细胞表面表达之前，信号肽被从成熟TCR蛋白中除去。因此，用其它天然序列或人工序列替换信号肽并不会改变成熟TCR的功能。因此，考虑了对本文公开的信号肽序列的各种修饰，包括但不限于删除或改变信号肽中的部分或所有的氨基酸，或用其它氨基酸和/或多肽序列替换全部或部分的氨基酸，考虑到本公开的益处，其实例对于本领域技术人员是显而易见的。在某些方面，本公开包括编码来自TCRα链、β链或其组合的一个或多个TCR高变区或互补决定区(CDR)的表达载体和其它多核苷酸。在某些实施方式中，仅编码一个CDR、或仅编码两个CDR、或仅编码三个CDR、或仅编码来自TCRα链和β链的某些CDR的组合，并且本公开涵盖了TCR CDR区段的所有组合、以及编码来自本文描述的TCRα链和β链的TCRCDR区段的多核苷酸。本领域技术人员将能够识别本文呈现的每种TCR氨基酸序列的TCRCDR区段。
文库
本公开包括编码TCR的多种表达载体，即包含编码不同TCR的多种不同表达载体的文库，其中该文库的至少一个成员编码本公开TCR的新的ɑ-链和/或新的β-链。因此，该文库的至少一个成员可选自编码HLA-Ⅰ限制性TCR(本文称为AL、KQ、PP、19305CD8、BB、KB、ST、JD和19305DP)中的至少一种的ɑ链和/或β链的表达载体，并且该文库的至少一个成员可选自编码本文描述的新的HLA-II限制性TCR(本文称为PB-P、PB-T、PB13.2)的至少一种的ɑ链和/或β链的表达载体。编码这些HLA-Ⅰ限制性TCR和HLA-II限制性TCR的不同表达载体的组合包括在本公开中。
在一个非限制性实例中，本公开的文库包含编码本文描述为19305DP的TCR的表达载体，其是HLA-A*02限制性TCR，并且在CD4+和CD8+T细胞中均有功能。该TCR最初是从CD4+CD8+双阳性的独特肿瘤抗原特异性T细胞获得的，并且认为首次描述了这种TCR。AL、KQ、PP、19305CD8、BB、KB、ST和JD TCR基因最初是从CD8+单阳性T细胞获得的，并且PB-P、PB-T和PB13.2是来自CD4+单阳性T细胞的。
在某些方面，除了本文描述的至少一种新的TCR/表达载体之外，本公开提供的文库还可以包括编码HLA II类限制性TCR的表达载体，该TCR选自下文描述为HLA DPB1*04限制性的“JM”、“5B8”和DRB1*01限制性“SB95”的TCR。公开号为WO/2014/160030的PCT/US14/25673描述了这些构建体，通过引用将其中对TCR、编码TCR的表达载体及制备和使用TCR和表达载体的方法的描述并入本文。JM、5B8和SB95 TCR是从NY-ESO-1阳性个体获得的，并且这些TCR授予T细胞(包括CD4+T细胞)直接识别NY-ESO-1+癌细胞的能力，如下文进一步描述的，其包括但不一定限于PB-P、PB-T和PB13.2。因此，这些TCR赋予T细胞直接识别表达NY-ESO-1/LAGE-1抗原的癌细胞的能力，其中直接识别癌细胞包括TCR与由癌细胞表达的NY-ESO-1/LAGE-1抗原进行人类白细胞抗原HLA II类限制性结合。
在多种实施方式中，本公开的表达载体文库编码多种TCR。在某些方面，表达载体不包含任何噬菌体DNA或噬菌粒DNA，和/或TCR多肽均不包含任何噬菌体蛋白或噬菌粒蛋白。在一些实施方式中，TCR不包含任何噬菌体蛋白或噬菌粒蛋白，因此不是例如TCR噬菌体展示文库的组分。
在某些实施例中，本公开的TCR表达载体文库中的表达载体编码多个TCR，使得表达TCR的细胞可以对具有不同HLA I类类型、HLA II类类型和/或其组合的多样性患者起作用。
在某些实施方式中，由本公开的表达载体文库编码的HLA I类限制性TCR能够对具有HLA I类类型的患者起作用，该HLA I类类型选自HLA-A、HLA-B、HLA-C和其组合所包含的等位基因。在某些实施方式中，在提交本申请或专利时，该文库足够多样化以适合用于对至少50％的美国高加索人群进行癌症治疗。在某些方面，本公开的文库适合用于基于HLA-I类(A*02/B*35/C*04)限制性TCR和HLA II类(DR*01/DR*04/DR*07/DP*04)限制性TCR的癌症治疗，在不期望受任何特定理论束缚下认为在提交本申请或专利时，该HLA-I类限制性TCR包括美国高加索人群中67％的HLA类型，并且在不期望受任何特定理论束缚下认为在提交本申请或专利时，该HLA II类限制性TCR包括美国高加索人群中87％的HLA类型。在某些实施方式中，在提交本申请或专利时，本公开的TCR文库包含对美国高加索人群中10种最常出现的HLA类型具有特异性的TCR，因此可以适合用于对至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的人群进行癌症治疗。在某些实施方式中，本公开提供了限制于多个NY-ESO-1指定TCR(其受限于表1中列出的HLA类型)的TCR文库。在一些实施方式中，文库包含受限于表1中下划线的HLA类型中的一种或组合的TCR。在某些方面，本公开包括编码不同TCR的2至3,000种不同表达载体的文库。
在某些实施方式中，本公开的TCR表达载体文库中的表达载体编码一系列的TCR，使得表达TCR的细胞可以对具有HLA II类类型的多样性患者起作用，该HLA II类类型选自HLA-DP、-DM、-DOA、-DOB、-DQ、-DR和其组合包含的等位基因。
在一些实施方式中，本公开的表达载体文库包含至少两种编码至少两种不同TCR的表达载体，其中的至少一种选自19305DP、AL、KQ、PP、19305CD8、BB、KB、ST、JD、PB-P、PB-T和PB13.2。在一个实施方式中，本公开的表达载体文库包含编码19305DP的α链、β链或α链和β链两者的表达载体。
在某些实施方式中，本公开包括不同表达载体的文库。在一个实施例中，每种表达载体可以被包含作为分离的DNA制剂，或者可以保持在例如细胞培养物中。可以将这些组合物单独地保存在例如密封的容器中，如玻璃小瓶或塑料小瓶，Eppendorf管等，并且可以保持在降低的温度，如零摄氏度或更低的温度。每个单独的容器或保存容器的位置可以包括容器中的表达载体的标记。这样的标记可以包括但不限于人类或机器可感知的材料，如印刷标签、条形码、QR码等，或用于确定表达载体的成分/位置的任何其它标记，并且该标记可以用于检索用于在本公开方法中使用的TCR。在某些方面，本公开包括多个包含不同TCR的不同容器，其中每个容器是被索引的，并且其中容器的标记记录在数据库中。数据库可以被数字化且可以被调整以使其与软件集成。在某些方面，本公开提供了用于从本公开的文库中选择TCR的基于计算机的方法，该方法包括使用处理器以将个体或样本的输入HLA类型或其它HLA信息与和所述HLA类型相容的文库中的TCR进行匹配。在某些实现方式中，本公开可以排除包括信号、载波或瞬时信号的基于计算机的方法。
在一个方面，本公开包括一种系统，其包括TCR文库以及包含TCR的核苷酸和/或序列和/或HLA类型的标记的数据库，该数据库与处理器通信，其中处理器被编程为选择和/或指定与样品的HLA类型匹配的文库中的合适TCR。该系统还可以包括用于检索包含匹配的TCR的容器的装置，包括但不一定是可以例如指向合适的TCR的标记，并且可以从文库选择和/或检索所指示的TCR的自动化装置。在另一个方面，本公开提供了一种计算机可读介质，包括填充有关于本公开的TCR文库信息的数据库。在一个实施方式中，本公开包括计算机可读介质，其包括用于计算机从本公开的TCR文库中选择TCR的一组指令，其中TCR与样品的HLA类型匹配。
在一个方面，本公开包括接收诊断患有NY-ESO-1/LAGE-1阳性癌症的个体的HLA类型的指示，基于HLA类型从本公开的文库中选择表达载体，和将表达载体分配给一方，本公开用于在将表达载体引入至被诊断个体的免疫细胞中使用。分配表达载体可以包括采用任何合适的方法转运表达载体。
在一个方面，本公开包括从本公开的文库中选择表达载体，并将表达载体引入至从诊断患有NY-ESO-/LAGE-11阳性癌症的个体获得的免疫细胞中，其中由表达载体编码的TCR的HLA类型与个体的HLA类型匹配。在一些实施方式中，本公开还包括将免疫细胞导入需要其的个体中，所述个体可以是被诊断患有NY-ESO-1/LAGE-1阳性癌症的个体，或者可以是具有与被诊断个体HLA类型相同的HLA类型的个体。
在一个方面，本公开包括测试来自个体的样品以确定个体是否患有NY-ESO-1/LAGE-1阳性癌症，并且在确定所述个体患有NY-ESO-1/LAGE-1阳性癌症之后，基于个体的HLA类型从本公开文库中选择表达载体，以及将表达载体引入至个体的免疫细胞中。
以下实施例旨在说明而非限制本发明。
实施例1
在具体和说明性的实施方式中，编码本发明TCR的多核苷酸序列，以及由多核苷酸编码的TCR α链和TCR β链的氨基酸序列如下。图1-4示出了证明TCR克隆和使用的代表性和非限制性实施例。
HLA-A*02-限制性NY-ESO-1157-165-特异性T-细胞克隆“AL”
1.核苷酸序列
TCR α链
Figure GDA0002463803860000141
Figure GDA0002463803860000151
TCR β链
Figure GDA0002463803860000152
2.AL的氨基酸序列(从起始密码子-编码性甲硫氨酸开始至终止密码子-编码终止(*)结束)
TCR α链
Figure GDA0002463803860000161
TCR β链
Figure GDA0002463803860000162
HLA-B*35-限制性NY-ESO-194-102-特异性T-细胞克隆“KQ”
1.核苷酸序列
TCR α链
Figure GDA0002463803860000163
Figure GDA0002463803860000171
TCR β链
Figure GDA0002463803860000172
2.KQ的氨基酸序列(从起始密码子-编码性甲硫氨酸开始至终止密码子-编码终止(*)结束)
TCR α链
Figure GDA0002463803860000173
TCR β链
Figure GDA0002463803860000181
HLA-B*35-限制性NY-ESO-194-104-特异性T-细胞克隆“PP”
1.核苷酸序列
TCR α链
Figure GDA0002463803860000182
TCR β链
Figure GDA0002463803860000183
Figure GDA0002463803860000191
2.PP的氨基酸序列(从起始密码子-编码性甲硫氨酸开始至终止密码子-编码终止(*)结束)
TCR α链
Figure GDA0002463803860000192
TCR β链
Figure GDA0002463803860000193
HLA-B*27-限制性NY-ESO-l51-70-特异性T-细胞克隆“19305CD8”
1.核苷酸序列
TCR α链
Figure GDA0002463803860000201
TCR β链
Figure GDA0002463803860000202
Figure GDA0002463803860000211
2.19305CD8的氨基酸序列(从起始密码子-编码性甲硫氨酸开始至终止密码子-编码终止(*)结束)
TCR α链
Figure GDA0002463803860000212
TCR β链
Figure GDA0002463803860000213
HLA-Cw*15-限制性NY-ESO-1127-135-特异性T-细胞克隆“BB”
1.核苷酸序列
TCR α链
＞BBA-2
Figure GDA0002463803860000214
Figure GDA0002463803860000221
TCR β链
Figure GDA0002463803860000222
2.BB的氨基酸序列(从起始密码子-编码性甲硫氨酸开始至终止密码子-编码终止(*)结束)
TCR α链
Figure GDA0002463803860000223
Figure GDA0002463803860000231
TCR β链
Figure GDA0002463803860000232
HLA-Cw*03-限制性NY-ESO-192-100-特异性T-细胞克隆“KB”
1.核苷酸序列
TCR α链
Figure GDA0002463803860000233
TCR β链
Figure GDA0002463803860000241
2.KB的氨基酸序列(从起始密码子-编码性甲硫氨酸开始至终止密码子-编码终止(*)结束)
TCR α链
Figure GDA0002463803860000242
TCR β链
Figure GDA0002463803860000243
Figure GDA0002463803860000251
HLA-Cw*03-限制性NY-ESO-196-104-特异性T-细胞克隆“ST”
1.核苷酸序列
TCR α链
Figure GDA0002463803860000252
TCR β链
Figure GDA0002463803860000253
Figure GDA0002463803860000261
2.ST的氨基酸序列(从起始密码子-编码性甲硫氨酸开始至终止密码子-编码终止(*)结束)
TCR α链
Figure GDA0002463803860000262
TCR β链
Figure GDA0002463803860000263
HLA-A*02-限制性NY-ESO-1157-165-特异性T-细胞克隆“19305DP”
1.核苷酸序列
TCR α链
Figure GDA0002463803860000264
Figure GDA0002463803860000271
TCR β链
Figure GDA0002463803860000272
2.19305DP的氨基酸序列(从起始密码子-编码性甲硫氨酸开始至终止密码子-编码终止(*)结束)
TCR α链
Figure GDA0002463803860000281
TCR β链
Figure GDA0002463803860000282
HLA-A*02-限制性NY-ESO-1157-165-特异性T-细胞克隆“JD”
1.核苷酸序列
TCR α链
Figure GDA0002463803860000283
Figure GDA0002463803860000291
TCR β链
Figure GDA0002463803860000292
2.JD的氨基酸序列(从起始密码子-编码性甲硫氨酸开始至终止密码子-编码终止(*)结束)
TCR α链
Figure GDA0002463803860000293
TCR β链
Figure GDA0002463803860000301
HLA-DRB1*07-限制性NY-ESO-1(139-160)-特异性T-细胞克隆“PB-P”
1.核苷酸序列
TCR α-链
Figure GDA0002463803860000302
TCR β-链
Figure GDA0002463803860000303
Figure GDA0002463803860000311
2.PB-P的氨基酸序列(从起始密码子-编码性甲硫氨酸开始至终止密码子-编码终止(*)结束)
TCR α-链
Figure GDA0002463803860000312
TCR β-链
Figure GDA0002463803860000313
HLA-DRB1*04-限制性NY-ESO-1(111-143)-特异性T-细胞克隆“PB-T”
1.核苷酸序列
TCR α-链
Figure GDA0002463803860000321
TCR β-链
Figure GDA0002463803860000322
Figure GDA0002463803860000331
2.PB-T的氨基酸序列(从起始密码子-编码性甲硫氨酸开始至终止密码子-编码终止(*)结束)
TCR α-链
Figure GDA0002463803860000332
TCR β-链
Figure GDA0002463803860000333
HLA-DRB1*07-限制性NY-ESO-1(139-160)-特异性T-细胞克隆“PB13.2”
1.核苷酸序列
TCR α-链
Figure GDA0002463803860000334
Figure GDA0002463803860000341
TCR β-链
Figure GDA0002463803860000342
2.PB13.2的氨基酸序列(从起始密码子-编码性甲硫氨酸开始至终止密码子-编码终止(*)结束)
TCR α-链
Figure GDA0002463803860000351
TCR β-链
Figure GDA0002463803860000352
结合本实施例的前述序列，该实施例提供了产生表达NY-ESO-1特异性TCR的逆转录病毒载体的非限制性证明(图1)。这些附图的说明如下：
图1-1。由于MSCV长末端重复序列(LTR)的强启动子活性和转基因表达在造血细胞中的体内稳定性，已经将鼠干细胞病毒(MSCV)衍生的载体广泛用于T细胞转导。由于3′-LTR在整合到宿主细胞(如T细胞)期间被复制到5′-LTR并负责转基因转录，因此质粒中的3′-LTR对于表达非常重要。另一方面，5′-LTR负责转录以进行病毒生产。经典MSCV衍生载体(pMIG-II和pMIG-w)的示意图如图1所示。这两种载体在5′和3′位点均具有MSCV衍生的LTR、包装信号(Ψ)、多克隆位点(MCS)。转基因被克隆到MCS中，其后是内部核糖体进入位点(IRES)和绿色荧光蛋白基因(GFP)以有效检测经过转导的细胞。pMIG-w载体具有额外的土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WRE)，其增强转基因的表达。在最近的逆转录病毒载体中，引入了如在商业逆转录病毒载体pDON-5(Clontech)中发现的其它修饰。pDON-5源自鼠白血病病毒(MLV)载体，用CMV/MLV杂合LTR替换5′-LTR，以通过病毒包装细胞系中的较强CMV启动子活性来增强病毒生产。此外，引入来自人类延伸因子1α基因的部分内含子，以提供剪接受体位点(SA)，其与内源剪接供体位点(SD)一起诱导剪接并增强表达。
图1-2。为了产生能够产生在T细胞中诱导高水平转基因(TCR)表达的高滴度逆转录病毒的逆转录病毒载体，我们扩增了pDON-5质粒中从5′-LTR至含有剪接受体位点的内含子的DNA片段。将正向引物设计为在5′-LTR之前附加SgrAI限制酶识别位点，并将反向引物设计为在内含子之后附加NotI和SalI位点。用SgrAI和SalI处理经过PCR扩增的片段，并将该片段插入至pMIG-II质粒和pMIG-w质粒中，以将5'-LTR至GFP替换。
图1-3。图1-3中描绘的质粒仅具有用于克隆的NotI和SalI识别位点。采用识别特定6聚体核苷酸序列的SalI不是优选的，因为它可能出现足够频繁而存在于转基因中，从而导致其裂解。为了提供被认为不太可能出现在大多数TCR转基因中的其它限制酶识别位点，我们采用具有NotI限制性位点的正向引物和具有PacI-SalI位点的反向引物扩增了1.8kbDNA片段(填充物)。用NotI和SalI限制酶处理经过扩增的片段，并将该片段插入新的质粒中。
图1-4。采用具有NotI限制性位点的正向引物和具有PacI限制酶位点的反向引物扩增所描绘的TCR表达盒。用NotI和PacI限制酶处理经过扩增的表达盒并将其插入至新的质粒中。
将19305DP-TCR基因转导至多克隆激活的T细胞中(图2)。在低剂量IL-2、IL-7和IL-12的存在下，采用植物血凝素(PHA，从Remel获得)将来自健康个体的T细胞预活化2天。将逆转录病毒颗粒包被在非组织培养板上，该非组织培养板是预涂有纤维连接蛋白(从Clontech获得)并用牛血清白蛋白(来自Sigma的BSA)封闭的。通过在逆转录病毒包被的板中培养，用逆转录病毒感染活化的T细胞。24小时后重复进行病毒感染。感染的总次数为2次。在IL-2和IL-7存在下扩增被感染的细胞。从PHA活化T细胞起5天均包含IL-12。感染后，超过95％的TCR基因转导的T细胞通过用TCR Vβ亚型特异性抗体染色表达经过转导的TCR。
19305DP-TCR-转导的T细胞的抗肿瘤功能(图3和8-10)。将TCR基因转导的T细胞与HLA-A*02+NY-ESO-1+黑素瘤细胞系(SK-MEL-37)或HLA-A*02+NY-ESO-1-黑素瘤细胞系(SK-MEL-29)在Golgi Stop(BD Biosciences)存在下共培养6小时。用荧光染料缀合的抗-CD4和抗-CD8抗体将细胞染色，并使用BD Cytofix/Cytoperm试剂盒(BD Biosciences)固定和透化。通过荧光染料缀合的抗IFN-γ抗体将细胞内IFN-γ染色。TCR基因转导的CD4+和CD8+T细胞都是仅在将它们与NY-ESO-1+SK-MEL-37共培养时才产生IFN-γ，而对于SK-MEL-29不会如此。未转导的CD4+和CD8+T细胞对于SK-MEL-37或SK-MEL-29不产生IFN-γ(图3)。在图8中，用1百万SK-MEL-37接种免疫缺陷型NOD/SCID/IL-2Rγ-链缺陷型(NSG)小鼠。在第9天确认肿瘤生长后，注射1千万个19305DP-TCR基因转导的T细胞。将对照荷瘤小鼠注射不相关的TCR转导的T细胞。用19305DP-TCR转导的T细胞处理的小鼠显示出肿瘤生长显著延迟，并且大多数小鼠最终排斥肿瘤异种移植物。在接受不相关的TCR转导的T细胞的对照小鼠中肿瘤持续生长。
实施例2
该实施例提供了可以与实施例1中描述的任何一种TCR序列一起包含在本公开的文库中的其它TCR序列的描述。这些TCR赋予CD4+T细胞直接识别NY-ESO-1/LAGE-1阳性癌细胞的能力。
“JM”HLA-DPB1*0401/0402-限制性NY-ESO-l157-170-特异性肿瘤
识别CD4+T细胞克隆
(a)TCR α链和β链的cDNA核苷酸序列
TCR α链
Figure GDA0002463803860000381
TCR β链
Figure GDA0002463803860000382
AAAGGATTTCTGA(SEQ ID NO：48)
(b)JM的TCR α链和β链的氨基酸序列(TCR可变区以斜体表示，CDR3区以黑体表示)
TCR α链
Figure GDA0002463803860000391
TCR β链
Figure GDA0002463803860000392
“5B8”HLA-DPB1*0401/0402-限制性NY-ESO-1157-170-特异性肿瘤识别CD4+T细胞克隆
(a)TCR α链和β链的cDNA核苷酸序列
TCR α链
Figure GDA0002463803860000393
Figure GDA0002463803860000401
TCR β链
Figure GDA0002463803860000402
(b)5B8的TCR α链和β链的氨基酸序列(TCR可变区以斜体表示，CDR3区以黑体表示)
TCR α链
Figure GDA0002463803860000403
Figure GDA0002463803860000411
TCR β链
Figure GDA0002463803860000412
“SB95”HLA-DRB1*0101-限制性NY-ESO-195-106-特异性肿瘤识别CD4+T细胞克隆
(a)TCR α链和β链的cDNA核苷酸序列
TCR α链
Figure GDA0002463803860000413
TCR β链
Figure GDA0002463803860000414
Figure GDA0002463803860000421
(b)SB95的TCR α链和β链的氨基酸序列(TCR可变区以斜体表示，CDR3区以黑体表示)
TCR α链
Figure GDA0002463803860000422
TCR β链
Figure GDA0002463803860000423
图4提供了可用于表达该实施例的任何TCR的表达载体的非限制性实例。对于图4：(A)用于表达TCR的逆转录病毒载体。LTR：长末端重复序列；ψ：包装信号；MCS：多克隆位点；IRES：内部核糖体进入位点；eGFP：增强的绿色荧光蛋白。(B)TCR表达盒。(I)通过GSG(Gly-Ser-Gly)接头和P2A核糖体跳跃序列连接编码TCR β链和α链的cDNA序列。(II)通过弗林蛋白酶识别位点(RAKR(Arg-Ala-Lys-Arg))、SGSG(Ser-Gly-Ser-Gly)接头、V5表位和P2A核糖体跳跃序列连接编码TCR β链和α链的cDNA序列。
如PCT PCT/US14/25673中所描述的，该实施例的TCR能够促进直接识别癌细胞并诱导它们凋亡。此外，发现表达本实施例TCR的CD4+T细胞通过在不存在抗原呈递细胞下直接识别癌细胞而有效增强肿瘤抗原特异性CD8+T细胞的细胞毒活性。另外，用表达该实施例的重组TCR的CD4+T细胞共刺激的CD8+T细胞增殖活跃并且使中枢记忆T细胞标志物上调，并且表达这些TCR的CD4+T细胞显示出显著的体内抗肿瘤活性以抑制免疫缺陷小鼠中的人类癌细胞生长，并且这些CD4+T细胞与肿瘤抗原特异性CD8+T细胞共同抑制体内肿瘤生长。
美国不同种族群体的HLA等位基因频率。(表1示出了欧洲裔美国人中最常见的10种类型)。HLA-A、B、C、DR和DQ数据的获得和修改来自国家骨髓供体
Figure GDA0002463803860000431
(NMDP)/Be The
Figure GDA0002463803860000432
网站：bioinformatics.bethematchclinical.org/。HLA-DP的数据获得自等位基因频率网络数据库：www.allelefrequencies.net/contact.asp。
在一个实施方式中，本公开的文库包含多个由下表1中的下划线/黑体的HLA类型限制的NY-ESO-1特异性TCR。
表1
Figure GDA0002463803860000433
Figure GDA0002463803860000441
Figure GDA0002463803860000451
尽管已经参考特定实施方式具体示出且描述了本公开，但是本领域技术人员应该理解，在不脱离如本文所公开的本公开的精神和范围的情况下，其中可以在形式和细节上进行各种改变。
Figure IDA0001806395090000011
Figure IDA0001806395090000021
Figure IDA0001806395090000031
Figure IDA0001806395090000041
Figure IDA0001806395090000051
Figure IDA0001806395090000061
Figure IDA0001806395090000071
Figure IDA0001806395090000081
Figure IDA0001806395090000091
Figure IDA0001806395090000101
Figure IDA0001806395090000111
Figure IDA0001806395090000121
Figure IDA0001806395090000131
Figure IDA0001806395090000141
Figure IDA0001806395090000151
Figure IDA0001806395090000161
Figure IDA0001806395090000171
Figure IDA0001806395090000181
Figure IDA0001806395090000191
Figure IDA0001806395090000201
Figure IDA0001806395090000211
Figure IDA0001806395090000221
Figure IDA0001806395090000231
Figure IDA0001806395090000241
Figure IDA0001806395090000251
Figure IDA0001806395090000261
Figure IDA0001806395090000271
Figure IDA0001806395090000281
Figure IDA0001806395090000291
Figure IDA0001806395090000301
Figure IDA0001806395090000311
Figure IDA0001806395090000321
Figure IDA0001806395090000331
Figure IDA0001806395090000341
Figure IDA0001806395090000351
Figure IDA0001806395090000361
Figure IDA0001806395090000371
Figure IDA0001806395090000381
Figure IDA0001806395090000391
Figure IDA0001806395090000401
Figure IDA0001806395090000411
Figure IDA0001806395090000421
Figure IDA0001806395090000431
Figure IDA0001806395090000441
Figure IDA0001806395090000451
Figure IDA0001806395090000461
Figure IDA0001806395090000471
Figure IDA0001806395090000481
Figure IDA0001806395090000491
Figure IDA0001806395090000501
Figure IDA0001806395090000511
Figure IDA0001806395090000521
Figure IDA0001806395090000531
Figure IDA0001806395090000541
Figure IDA0001806395090000551
Figure IDA0001806395090000561
Figure IDA0001806395090000571
Figure IDA0001806395090000581
Figure IDA0001806395090000591
Figure IDA0001806395090000601
Figure IDA0001806395090000611
Figure IDA0001806395090000621
Figure IDA0001806395090000631
Figure IDA0001806395090000641
Figure IDA0001806395090000651

Claims (14)

1.一种重组多核苷酸，所述重组多核苷酸编码TCR 19305DP的T细胞受体(TCR)的α链和β链，其中所述α链包含SEQ ID NO：1的序列，并且所述β链包含SEQ ID NO：2的序列。
2.根据权利要求1所述的重组多核苷酸，其中所述重组多核苷酸存在于表达载体中。
3.根据权利要求2所述的重组多核苷酸，其中所述表达载体存在于细胞中。
4.根据权利要求3所述的重组多核苷酸，其中所述表达载体存在于为CD4+T细胞或CD8+T细胞的细胞中。
5.根据权利要求4所述的重组多核苷酸，其中所述表达载体编码包含SEQ ID NO：1的序列的所述19305DPα链和包含SEQ ID NO：2的序列的所述19305DPβ链。
6.权利要求1至5中任一项所述的重组多核苷酸在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗被诊断患有癌症、怀疑患有癌症或具有癌症发展或复发的风险的个体，其中所述癌症包含表达NY-ESO-1/LAGE-1抗原的癌细胞，其中向所述个体给予包含权利要求2所述的表达载体的经过修饰的人类T细胞。
7.根据权利要求6所述的用途，其中所述癌细胞选自膀胱癌细胞、脑癌细胞、乳腺癌细胞、胃癌细胞、食道癌细胞、头颈癌细胞、肝胆癌细胞、肾癌细胞、卵巢癌细胞、非小细胞肺癌细胞、骨髓瘤、前列腺癌细胞、肉瘤细胞、睾丸癌细胞、黑素瘤细胞或其组合。
8.根据权利要求6或权利要求7所述的用途，包括在所述给予之前从所述个体取出T细胞，并通过将所述表达载体引入至所述T细胞来修饰所述T细胞。
9.根据权利要求8所述的用途，其中所述表达载体编码包含SEQ ID NO：1的序列的所述19305DPα链和包含SEQ ID NO：2的序列的所述19305DPβ链。
10.根据权利要求8所述的用途，其中存在所述表达载体的所述经过修饰的T细胞包括CD4+T细胞、CD8+T细胞或其组合。
11.一种文库，包含多个编码权利要求1至5中任一项所述的T细胞受体TCR 19305DP的α链和β链的重组多核苷酸。
12.根据权利要求11所述的文库，其中所述重组多核苷酸存在于表达载体中。
13.根据权利要求12所述的文库，其中所述重组多核苷酸编码包含SEQ ID NO：1的序列的所述19305DPα链和包含SEQ ID NO：2的序列的所述19305DPβ链。
14.根据权利要求13所述的文库，其进一步包含至少一种另外的重组多核苷酸，所述另外的重组多核苷酸编码来自AL、KQ、PP、BB、KB、ST、JD、PB-P、PB-T、PB13.2、19305CD8、JM、5B8和SB95 TCR的至少一种TCRα链和/或至少一种TCRβ链，
对于AL，包含SEQ ID NO：5的序列的α链和/或包含SEQ ID NO：6的序列的β链；
对于KQ，包含SEQ ID NO：9的序列的α链和/或包含SEQ ID NO：10的序列的β链；
对于PP，包含SEQ ID NO：13的序列的α链和/或包含SEQ ID NO：14的序列的β链；
对于BB，包含SEQ ID NO：17的序列的α链和/或包含SEQ ID NO：18的序列的β链；
对于KB，包含SEQ ID NO：21的序列的α链和/或包含SEQ ID NO：22的序列的β链；
对于ST，包含SEQ ID NO：25的序列的α链和/或包含SEQ ID NO：26的序列的β链；
对于JD，包含SEQ ID NO：29的序列的α链和/或包含SEQ ID NO：30的序列的β链；
对于PB-P，包含SEQ ID NO：33的序列的α链和/或包含SEQ ID NO：34的序列的β链；
对于PB-T，包含SEQ ID NO：37的序列的α链和/或包含SEQ ID NO：38的序列的β链；
对于PB13.2，包含SEQ ID NO：41的序列的α链和/或包含SEQ ID NO：42的序列的β链；
对于19305CD8，包含SEQ ID NO：45的序列的α链和/或包含SEQ ID NO：46的序列的β链；
对于JM，包含SEQ ID NO：49的序列的α链和/或包含SEQ ID NO：50的序列的β链；
对于5B8，包含SEQ ID NO：53的序列的α链和/或包含SEQ ID NO：54的序列的β链；和
对于SB95，包含SEQ ID NO：57的序列的α链和/或包含SEQ ID NO：58的序列的β链。
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