JP6059013B2 - 抗ｃｄ１００抗体およびこれを使用するための方法 - Google Patents

抗ｃｄ１００抗体およびこれを使用するための方法 Download PDF

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Description

発明の分野
本発明は、CD100中和抗体、例えば、ヒト化モノクローナル抗体、この抗体を使用する方法、ならびにCD100発現細胞に関連する状態および疾患を処置するための方法に関する。
発明の背景
CD100はセマフォリン4D(SEMA4D)としても知られ、セマフォリン遺伝子ファミリーに属する膜貫通タンパク質(例えば、SEQ ID NO:1(ヒト);SEQ ID NO:2(マウス))である。CD100はホモ二量体として細胞表面に発現するが、細胞が活性化するとタンパク質分解性の切断によって可溶型タンパク質である活性sCD100となり細胞表面から放出される。Suzuki et al., Nature Rev. Immunol. 3:159-167(2003); Kukutani et al., Nature Immunol. 9:17-23(2008)（非特許文献1および2）を参照されたい。
CD100は、活性化ヒトT細胞クローンに対する2種類のマウスモノクローナル抗体であるBD16およびBB18の作製によって初めて同定された(Herold et al., Int. Immunol. 7:1-8(1994)（非特許文献3）)。CD100は、免疫系において発現しているセマフォリンの最初の例である。CD100は、休止T細胞の表面では大量に発現し、休止B細胞、単球、およびプロフェッショナル抗原提示細胞、例えば、樹状細胞(DC)では弱く発現している。細胞が活性化すると、B細胞およびDCでのCD100表面発現のアップレギュレーションならびにsCD100の生成が刺激される。CD100は、その細胞質ドメインを介してシグナルを送る受容体として機能し、リガンドとしても機能すると考えられている(Hall et al., PNAS 93:11780-11785(1996)（非特許文献4）)。同定されたCD100受容体の1つがプレキシン-B1である。プレキシン-B1は非リンパ組織において発現しており、高親和性(1nM)のCD100受容体である(Tamagnone et al., Cell 99:71-80(1999)（非特許文献5）)。
CD100は、T細胞活性化およびB細胞活性化の重要なメディエーターである。CD100ノックアウト(CD100-/-)マウスはT依存性抗原に対する抗体応答が低く、T細胞初回抗原刺激が損なわれている。これらの機能は両方ともsCD100が投与されると回復する(Shi et al., Immunity 13:633-642(2000)（非特許文献6）)。
免疫細胞に対するCD100の証明された作用に加えて、CD100は、神経炎症疾患において見られる脱髄および軸索変性において直接的な役割も果たすようである。MSなどの炎症性脱髄疾患の発病には、免疫細胞が関与する炎症段階ならびに選択的な脱髄および神経変性の段階が含まれる。CD100は中枢神経系(CNS)オリゴデンドロサイトにおいて発現しており、軸索再生の阻害剤である。CD100発現は、脊髄病変の周辺部にあるオリゴデンドロサイトにおいてアップレギュレートしている(Moreau-Fauvarque et al., J. Neuroscience 23:9229-9239(2003)（非特許文献7）)。sCD100を発現している慢性活性化T細胞をヒト多能性神経前駆細胞またはラット脳に由来する初代オリゴデンドロサイトと共に培養すると、アポトーシスおよび突起伸長崩壊が誘導される(Giraudon et al., J. Immunol. 172:1246-1255(2004); Giraudon et al., NeuroMolecular Med. 7:207-216(2005)（非特許文献8および9）)。CD100によって誘導される神経前駆細胞アポトーシスは、抗CD100抗体であるBD16によって阻害することができる。
CD100ノックアウトマウスは、ヒト多発性硬化症(MS)のマウスモデルである実験的アレルギー性脳脊髄炎(EAE)の発症に対して耐性がある(Kumanogoh et al., J. Immulol. 169:1175-1181(2002)（非特許文献10）)。
他の多くの研究から、CD100はニューロンにおける成長円錐崩壊を誘導することが証明されており、神経炎症におけるCD100の機能関連性をさらに裏付けるものとして、HTLV-1関連脊髄症/熱帯性痙性不全対麻痺症(HAM/TSP)患者の脳脊髄液(CSF)におけるsCD100のレベルが非常に高いことが報告されている。従って、sCD100はオリゴデンドロサイトおよび神経前駆細胞の完全性に対して直接的な有害作用があり、CD100は、脱髄において病原的な役割を果たしている可能性がある。炎症応答および直接的な脱髄の重要なメディエーターとして、CD100中和分子、例えば、抗CD100抗体が、炎症疾患および脱髄疾患を処置するために当技術分野において必要とされている。
CD100は強力な血管形成促進分子でもある。CD100が結合することによってプレキシンB1が活性化すると、c-Metがトランス活性化し、腫瘍細胞の浸潤能力が促進され、インビトロおよびインビボ両方での血管形成が促進される。大きな腫瘍試料収集物におけるCD100の免疫組織化学分析から、頭頚部癌、前立腺癌、結腸癌、乳癌、および肺癌においてCD100過剰発現は非常に良く起こる事象であることが明らかになった。
CD100/プレキシンB1シグナル伝達はまた内皮細胞の遊走を誘導し、腫瘍細胞の遊走を促進することも示されている(Conrotto et al., Blood 105:4321-4329(2005); Giordano et al., Nature Cell Biology 4:720-724(2002)（非特許文献11および12）)。CD100によって誘導される内皮細胞遊走はCD100遮断抗体およびCD100ノックダウンによって阻止される。頭頚部扁平上皮癌(HNSCC)細胞におけるCD100発現をCD100ショートヘアピンRNA(shRNA)によってノックダウンした後に、ヌードマウスに移植すると、腫瘍血管分布および腫瘍成長が劇的に低減した(Basile et al., PNAS 103:9017-9022(2006)（非特許文献13）)。最近、報告から、腫瘍間質の炎症性浸潤と高い血管分類(vascular grade)との間には密接な相関関係があることが示されている。CD100は、腫瘍微小環境に存在する炎症細胞によって産生される。CD100が無い環境では、マウス乳癌細胞が腫瘍塊および転移を生じる能力はかなり低く、CD100の供給源は腫瘍関連マクロファージであった(Sierra et al., JEM 205: 1673-1685(2008)（非特許文献14）)。従って、CD100癌を処置するために、CD100中和分子、例えば、抗CD100抗体が当技術分野においてさらに必要とされている。
Suzuki et al., Nature Rev. Immunol. 3:159-167(2003) Kukutani et al., Nature Immunol. 9:17-23(2008) Herold et al., Int. Immunol. 7:1-8(1994) Hall et al., PNAS 93:11780-11785(1996) Tamagnone et al., Cell 99:71-80(1999) Shi et al., Immunity 13:633-642(2000) Moreau-Fauvarque et al., J. Neuroscience 23:9229-9239(2003) Giraudon et al., J. Immunol. 172:1246-1255(2004) Giraudon et al., NeuroMolecular Med. 7:207-216(2005) Kumanogoh et al., J. Immulol. 169:1175-1181(2002) Conrotto et al., Blood 105:4321-4329(2005) Giordano et al., Nature Cell Biology 4:720-724(2002) Basile et al., PNAS 103:9017-9022(2006) Sierra et al., JEM 205: 1673-1685(2008)
発明の簡単な概要
ある特定のタイプの自己免疫疾患、炎症疾患、癌、および浸潤性血管形成を含む、CD100に関連する疾患を処置するための組成物および方法が提供される。特に、CD100を中和するために抗CD100モノクローナル抗体が開発されている。マウスMAb67は、インビトロでCD100活性をブロックし、マウスモデルにおける実験的アレルギー性脳脊髄炎(EAE)、コラーゲン誘導性関節炎(CIA)、および癌の臨床徴候の重篤度を低減できることを示した。MAb2503は、ヒトCD100およびマウスCD100との親和性の改善を示し、MAb67と類似のCD100ブロッキング活性を証明したMAb67ヒト化バージョンである。
1つの態様において、本発明は、2503、67、または76からなる群より選択される参照モノクローナル抗体と同じCD100エピトープに特異的に結合する、単離された結合分子を提供する。
別の態様において、本発明は、CD100に特異的に結合し、2503、67、または76からなる群より選択される参照モノクローナル抗体がCD100に特異的に結合するのを競合阻害する、単離された結合分子を提供する。
別の態様において、本発明は、CD100に特異的に結合し、モノクローナル抗体2503、67、または76である、単離された抗体またはその抗原結合断片を提供する。
ある特定の態様において、CD100に特異的に結合する、本発明の単離された抗体またはその抗原結合断片は、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、またはSEQ ID NO:25と少なくとも90％同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域(VH)を含む。本発明の別の局面において、前記抗体またはその断片のVHは、20以下の保存的アミノ酸置換を除いてSEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、またはSEQ ID NO:25と同一であるアミノ酸配列を含む。本発明のさらに別の局面において、前記抗体またはその断片のVHは、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、またはSEQ ID NO:25のアミノ酸配列を含むか、これからなる。
ある特定の態様において、CD100に特異的に結合する、本発明の単離された抗体またはその抗原結合断片は、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、またはSEQ ID NO:29と少なくとも90％同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域(VL)を含む。本発明の別の局面において、前記抗体またはその断片のVLは、20以下の保存的アミノ酸置換を除いてSEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、またはSEQ ID NO:29と同一であるアミノ酸配列を含む。本発明のさらに別の局面において、前記抗体またはその断片のVLは、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、またはSEQ ID NO:29のアミノ酸配列を含むか、これからなる。
別の態様において、本発明は、CD100に特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合断片であって、前記抗体またはその断片のVHが、以下のCDR:2以下のアミノ酸置換を除いてSEQ ID NO:6と同一であるChothia-Kabat重鎖相補性決定領域-1(VH-CDR1)アミノ酸配列、4以下のアミノ酸置換を除いてSEQ ID NO:7と同一であるKabat重鎖相補性決定領域-2(VH-CDR2)アミノ酸配列、または2以下のアミノ酸置換を除いてSEQ ID NO:8と同一であるKabat重鎖相補性決定領域-3(VH-CDR3)アミノ酸配列の少なくとも1つを含む、単離された抗体またはその抗原結合断片を提供する。
別の態様において、本発明は、CD100に特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合断片であって、前記抗体またはその断片のVLが、以下のCDR:4以下のアミノ酸置換を除いてSEQ ID NO:14と同一であるKabat軽鎖相補性決定領域-1(VL-CDR1)アミノ酸配列、2以下のアミノ酸置換を除いてSEQ ID NO:15と同一であるKabat軽鎖相補性決定領域-2(VL-CDR2)アミノ酸配列、または2以下のアミノ酸置換を除いてSEQ ID NO:16と同一であるKabat軽鎖相補性決定領域-3(VL-CDR3)アミノ酸配列の少なくとも1つを含む、単離された抗体またはその抗原結合断片を提供する。
別の局面において、本発明の抗体またはその断片のVHは、前記VH-CDRの1つまたは複数において、4以下のアミノ酸置換を除いて、SEQ ID NO:6、7、および8をそれぞれ含むVH-CDR1、VH-CDR2、およびVH-CDR3アミノ酸配列を含む。さらなる局面において、VH-CDR1、VH-CDR2、およびVH-CDR3アミノ酸配列は、それぞれ、SEQ ID NO:6、7、および8である。
別の局面において、本発明の抗体またはその断片のVLは、前記VL-CDRの1つまたは複数において、4以下のアミノ酸置換を除いて、SEQ ID NO:14を含むVL-CDR1、SEQ ID NO:15を含むVL-CDR2、およびSEQ ID NO:16を含むVL-CDR3アミノ酸配列を含む。さらなる局面において、VL-CDR1、VL-CDR2、およびVL-CDR3アミノ酸配列は、それぞれ、SEQ ID NO:14、15、および16である。
別の態様において、本発明は、CD100に特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合断片であって、前記抗体またはその断片のVHが、以下のCDR:2以下のアミノ酸置換を除いてSEQ ID NO:26と同一であるKabat重鎖相補性決定領域-1(VH-CDR1)アミノ酸配列、4以下のアミノ酸置換を除いてSEQ ID NO:27と同一であるKabat重鎖相補性決定領域-2(VH-CDR2)アミノ酸配列、または2以下のアミノ酸置換を除いてSEQ ID NO:28と同一であるKabat重鎖相補性決定領域-3(VH-CDR3)アミノ酸配列の少なくとも1つを含む、単離された抗体またはその抗原結合断片を提供する。
別の態様において、本発明は、CD100に特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合断片であって、前記抗体またはその断片のVLが、以下のCDR:4以下のアミノ酸置換を除いてSEQ ID NO:30と同一であるKabat軽鎖相補性決定領域-1(VL-CDR1)アミノ酸配列、2以下のアミノ酸置換を除いてSEQ ID NO:31と同一であるKabat軽鎖相補性決定領域-2(VL-CDR2)アミノ酸配列、または2以下のアミノ酸置換を除いてSEQ ID NO:32と同一であるKabat軽鎖相補性決定領域-3(VL-CDR3)アミノ酸配列の少なくとも1つを含む、単離された抗体またはその抗原結合断片を提供する。
別の局面において、本発明の抗体またはその断片のVHは、前記VH-CDRの1つまたは複数において、4以下のアミノ酸置換を除いて、SEQ ID NO:26を含むVH-CDR1アミノ酸配列、SEQ ID NO:27を含むVH-CDR2アミノ酸配列、およびSEQ ID NO:28を含むVH-CDR3アミノ酸配列を含む。さらなる局面において、VH-CDR1、VH-CDR2、およびVH-CDR3アミノ酸配列は、それぞれ、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、およびSEQ ID NO:28である。
別の局面において、本発明の抗体またはその断片のVLは、前記VL-CDRの1つまたは複数において、4以下のアミノ酸置換を除いて、SEQ ID NO:30を含むVL-CDR1アミノ酸配列、SEQ ID NO:31を含むVL-CDR2アミノ酸配列、およびSEQ ID NO:32を含むVL-CDR3アミノ酸配列を含む。さらなる局面において、VL-CDR1、VL-CDR2、およびVL-CDR3アミノ酸配列は、それぞれ、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、およびSEQ ID NO:32である。
別の局面において、本発明の抗体またはその断片はヒトCD100およびマウスCD100に結合する。別の局面において、本発明の抗体またはその断片は、
Figure 0006059013
以下の解離定数(KD)を特徴とする親和性で、CD100ポリペプチドもしくはその断片またはCD100変種ポリペプチドに特異的に結合する。ある特定の局面において、CD100ポリペプチドもしくはその断片またはCD100変種ポリペプチドはヒトまたはマウスである。さらなる局面において、CD100ポリペプチドもしくはその断片またはCD100変種ポリペプチドはヒトであり、KDは約5×10-9M〜約6×10-9Mである。さらに別の局面において、CD100ポリペプチドもしくはその断片またはCD100変種ポリペプチドはマウスであり、KDは約1×10-9M〜約2×10-9Mである。
別の局面において、本発明の抗体またはその断片は、ヒト化されている、霊長類化されている、またはキメラである。
別の態様において、本発明は、本発明の抗体またはその断片および担体を含む、組成物を提供する。
別の態様において、本発明は、本発明の抗体VHポリペプチドまたはVLポリペプチドをコードする核酸を含む、単離されたポリヌクレオチドを提供する。別の局面において、本発明のポリヌクレオチドは、本発明の抗体またはその断片をコードする核酸を含むか、これからなる。さらに別の局面において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。別の局面において、本発明は、本発明のベクターを含む宿主細胞を提供する。別の局面において、本発明は、本発明の抗体を産生する方法を提供する。
別の態様において、本発明は、処置を必要とする動物において自己免疫疾患または炎症疾患を処置するための方法を提供する。前記方法は、本発明の単離された抗体またはその断片;ならびに薬学的に許容される担体を含む組成物を前記動物に投与する工程を含む。さらなる態様において、自己免疫疾患または炎症疾患は多発性硬化症または関節炎である。
別の態様において、本発明は、処置を必要とする動物において癌を処置するための方法を提供する。前記方法は、本発明の単離された抗体またはその断片;ならびに薬学的に許容される担体を含む組成物を前記動物に投与する工程を含む。
別の態様において、本発明は、癌の処置を必要とする動物において血管形成を阻害するための方法を提供する。前記方法は、本発明の単離された抗体またはその断片;ならびに薬学的に許容される担体を含む組成物を前記動物に投与する工程を含む。
さらなる局面において、本発明の抗体またはその断片は、CD100とCD100受容体との結合を阻害する。本発明のさらに別の局面において、CD100受容体はプレキシン-B1である。
[本発明1001]
2503または67からなる群より選択される参照モノクローナル抗体と同じCD100エピトープに特異的に結合する、単離された結合分子。
[本発明1002]
CD100に特異的に結合し、2503または67からなる群より選択される参照モノクローナル抗体がCD100に特異的に結合するのを競合阻害する、単離された結合分子。
[本発明1003]
抗体またはその抗原結合断片を含む、本発明1001または1002の結合分子。
[本発明1004]
CD100に特異的に結合し、モノクローナル抗体2503または67である、単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1005]
CD100に特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合断片であって、該抗体またはその断片の重鎖可変領域(VH)が、SEQ ID NO:9またはSEQ ID NO:10と少なくとも90％同一であるアミノ酸配列を含む、単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1006]
CD100に特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合断片であって、該抗体またはその断片の軽鎖可変領域(VL)が、SEQ ID NO:17またはSEQ ID NO:18と少なくとも90％同一であるアミノ酸配列を含む、単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1007]
CD100に特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合断片であって、該抗体またはその断片のVHが、20以下の保存的アミノ酸置換を除いてSEQ ID NO:9またはSEQ ID NO:10と同一であるアミノ酸配列を含む、単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1008]
CD100に特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合断片であって、該抗体またはその断片のVLが、20以下の保存的アミノ酸置換を除いてSEQ ID NO:17またはSEQ ID NO:18と同一であるアミノ酸配列を含む、単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1009]
前記抗体またはその断片のVHが、SEQ ID NO:9またはSEQ ID NO:10のアミノ酸配列を含む、本発明1005の抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1010]
前記抗体またはその断片のVLが、SEQ ID NO:17またはSEQ ID NO:18のアミノ酸配列を含む、本発明1006の抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1011]
CD100に特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合断片であって、該抗体またはその断片のVHおよびVLが、それぞれSEQ ID NO:9およびSEQ ID NO:10とまたはそれぞれSEQ ID NO:17およびSEQ ID NO:18と少なくとも90％同一であるアミノ酸配列を含む、単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1012]
CD100に特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合断片であって、該抗体またはその断片のVHおよびVLが、20以下の各保存的アミノ酸置換を除いて、それぞれSEQ ID NO:9およびSEQ ID NO:10とまたはそれぞれSEQ ID NO:17およびSEQ ID NO:18と同一であるアミノ酸配列を含む、単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1013]
前記抗体またはその断片のVHおよびVLが、それぞれSEQ ID NO:9およびSEQ ID NO:10とまたはそれぞれSEQ ID NO:17およびSEQ ID NO:18と同一であるアミノ酸配列を含む、本発明1011の単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1014]
CD100に特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合断片であって、該抗体またはその断片のVHが、2以下のアミノ酸置換を除いてSEQ ID NO:6と同一であるChothia-Kabat重鎖相補性決定領域-1(VH-CDR1)アミノ酸配列を含む、単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1015]
VH-CDR1アミノ酸配列がSEQ ID NO:6である、本発明1014の抗体またはその断片。
[本発明1016]
CD100に特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合断片であって、該抗体またはその断片のVHが、4以下のアミノ酸置換を除いてSEQ ID NO:7と同一であるKabat重鎖相補性決定領域-2(VH-CDR2)アミノ酸配列を含む、単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1017]
VH-CDR2アミノ酸配列がSEQ ID NO:7である、本発明1016の抗体またはその断片。
[本発明1018]
CD100に特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合断片であって、該抗体またはその断片のVHが、2以下のアミノ酸置換を除いてSEQ ID NO:8と同一であるKabat重鎖相補性決定領域-3(VH-CDR3)アミノ酸配列を含む、単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1019]
VH-CDR3アミノ酸配列がSEQ ID NO:8である、本発明1018の抗体またはその断片。
[本発明1020]
CD100に特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合断片であって、該抗体またはその断片のVLが、4以下のアミノ酸置換を除いてSEQ ID NO:14と同一であるKabat軽鎖相補性決定領域-1(VL-CDR1)アミノ酸配列を含む、単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1021]
VL-CDR1アミノ酸配列がSEQ ID NO:14である、本発明1020の抗体またはその断片。
[本発明1022]
CD100に特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合断片であって、該抗体またはその断片のVLが、2以下のアミノ酸置換を除いてSEQ ID NO:15と同一であるKabat軽鎖相補性決定領域-2(VL-CDR2)アミノ酸配列を含む、単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1023]
VL-CDR2アミノ酸配列がSEQ ID NO:15である、本発明1022の抗体またはその断片。
[本発明1024]
CD100に特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合断片であって、該抗体またはその断片のVLが、2以下のアミノ酸置換を除いてSEQ ID NO:16と同一であるKabat軽鎖相補性決定領域-3(VL-CDR3)アミノ酸配列を含む、単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1025]
VL-CDR3アミノ酸配列がSEQ ID NO:16である、本発明1024の抗体またはその断片。
[本発明1026]
CD100に特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合断片であって、該抗体またはその断片のVHが、VH-CDR1、VH-CDR2、およびVH-CDR3の1つまたは複数における4以下のアミノ酸置換を除いて、SEQ ID NO:6、7、および8をそれぞれ含むVH-CDR1、VH-CDR2、およびVH-CDR3アミノ酸配列を含む、単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1027]
VH-CDR1、VH-CDR2、およびVH-CDR3アミノ酸配列がそれぞれ、SEQ ID NO:6、7、および8である、本発明1026の単離された抗体。
[本発明1028]
CD100に特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合断片であって、該抗体またはその断片のVLが、VL-CDR1、VL-CDR2、およびVL-CDR3の1つまたは複数における4以下のアミノ酸置換を除いて、SEQ ID NO:14、15、および16をそれぞれ含むVL-CDR1、VL-CDR2、およびVL-CDR3アミノ酸配列を含む、単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1029]
VL-CDR1、VL-CDR2、およびVL-CDR3アミノ酸配列がそれぞれ、SEQ ID NO:14、15、および16である、本発明1028の単離された抗体。
[本発明1030]
VHフレームワーク領域が5以下のアミノ酸置換を有する、本発明1004、1006、1008、1011〜1013のいずれかの抗体またはその断片。
[本発明1031]
VLフレームワーク領域が5以下のアミノ酸置換を有する、本発明1005、1007、1009、および1010〜1013のいずれかの抗体またはその断片。
[本発明1032]
直線エピトープに結合する、本発明1003〜1031のいずれかの抗体またはその断片。
[本発明1033]
非直線立体構造のエピトープに結合する、本発明1003〜1031のいずれかの抗体またはその断片。
[本発明1034]
多重特異性である、本発明1003〜1033のいずれかの抗体またはその断片。
[本発明1035]
二重特異性である、本発明1034の抗体またはその断片。
[本発明1036]
Fab断片である、本発明1003〜1035のいずれかの抗体またはその断片。
[本発明1037]
F(ab) 2断片である、本発明1003〜1035のいずれかの抗体またはその断片。
[本発明1038]
Fv断片である、本発明1003〜1035のいずれかの抗体またはその断片。
[本発明1039]
単鎖抗体である、本発明1003〜1035のいずれかの抗体またはその断片。
[本発明1040]
多価であり、少なくとも2本の重鎖および少なくとも2本の軽鎖を含む、本発明1003〜1035のいずれかの抗体またはその断片。
[本発明1041]
ヒトκ定常領域およびヒトλ定常領域からなる群より選択される軽鎖定常領域を含む、本発明1003〜1035、1039、および1040のいずれかの抗体またはその断片。
[本発明1042]
重鎖定常領域またはその断片を含む、本発明1003〜1035および1039〜1041のいずれかの抗体またはその断片。
[本発明1043]
前記重鎖定常領域またはその断片が、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgE、またはIgDである、本発明1042の抗体またはその断片。
[本発明1044]
ヒトCD100およびマウスCD100に結合する、本発明1003〜1043のいずれかの抗体またはその断片。
[本発明1045]
Figure 0006059013
以下の解離定数(KD))を特徴とする親和性で、CD100ポリペプチドもしくはその断片またはCD100変種ポリペプチドに特異的に結合する、本発明1003〜1044のいずれかの抗体またはその断片。
[本発明1046]
前記CD100ポリペプチドもしくはその断片またはCD100変種ポリペプチドがヒトまたはマウスである、本発明1045の抗体またはその断片。
[本発明1047]
前記CD100ポリペプチドもしくはその断片またはCD100変種ポリペプチドがヒトであり、KDが約5×10-9M〜約6×10-9Mである、本発明1046の抗体またはその断片。
[本発明1048]
前記CD100ポリペプチドもしくはその断片またはCD100変種ポリペプチドがマウスであり、KDが約1×10-9M〜約2×10-9Mである、本発明1046の抗体またはその断片。
[本発明1049]
CD100とCD100受容体との結合を阻害する、本発明1003〜1048のいずれかの抗体またはその断片。
[本発明1050]
前記CD100受容体がプレキシン-B1である、本発明1049の抗体またはその断片。
[本発明1051]
ヒト化されている、霊長類化されている、またはキメラである、本発明1003〜1050のいずれかの抗体またはその断片。
[本発明1052]
ヒト化されている、本発明1051の抗体またはその断片。
[本発明1053]
前記抗体またはその断片に融合した異種ポリペプチドをさらに含む、本発明1003〜1052のいずれかの抗体またはその断片。
[本発明1054]
細胞傷害剤、治療剤、細胞増殖抑制剤、生物毒素、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生物学的応答調節剤、薬剤、リンホカイン、異種抗体またはその断片、検出可能な標識、ポリエチレングリコール(PEG)、および任意の該剤2つ以上の組み合わせからなる群より選択される剤と結合している、本発明1003〜1053のいずれかの抗体またはその断片。
[本発明1055]
前記細胞傷害剤が、放射性核種、生体毒素、酵素活性のある毒素、または任意の該細胞傷害剤の2つ以上の組み合わせからなる群より選択される、本発明1054の抗体またはその断片。
[本発明1056]
前記検出可能な標識が、酵素、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識、放射性標識、または任意の該検出可能な標識2つ以上の組み合わせからなる群より選択される、本発明1054の抗体またはその断片。
[本発明1057]
本発明1001〜1056のいずれかの抗体またはその断片および担体を含む、組成物。
[本発明1058]
前記担体が、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、本発明1057の組成物。
[本発明1059]
抗体VHポリペプチドをコードする核酸を含む、単離されたポリヌクレオチドであって、該VHポリペプチドのアミノ酸配列がSEQ ID NO:19またはSEQ ID NO:20と少なくとも90％同一であり、該VHポリペプチドを含む抗体またはその抗原結合断片がCD100に特異的に結合する、単離されたポリヌクレオチド。
[本発明1060]
前記VHポリペプチドのアミノ酸配列を変えることなく、該VHポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、発現上昇のために最適化されている、本発明1059のポリヌクレオチド。
[本発明1061]
前記最適化が、スプライスドナー部位およびスプライスアクセプター部位を同定および除去することを含む、本発明1060のポリヌクレオチド。
[本発明1062]
前記最適化が、前記ポリヌクレオチドを発現する細胞に対してコドン使用頻度を最適化することを含む、本発明1060のポリヌクレオチド。
[本発明1063]
前記核酸が、SEQ ID NO:19またはSEQ ID NO:20を含むヌクレオチド配列を含む、本発明1059〜1062のいずれかのポリヌクレオチド。
[本発明1064]
前記核酸が、SEQ ID NO:19またはSEQ ID NO:20からなるヌクレオチド配列を含む、本発明1063のポリヌクレオチド。
[本発明1065]
抗体VLポリペプチドをコードする核酸を含む、単離されたポリヌクレオチドであって、該VLポリペプチドのアミノ酸配列がSEQ ID NO:21またはSEQ ID NO:22と少なくとも90％同一であり、該VHポリペプチドを含む抗体またはその抗原結合断片がCD100に特異的に結合する、単離されたポリヌクレオチド。
[本発明1066]
前記VLポリペプチドのアミノ酸配列を変えることなく、該VLポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、発現上昇のために最適化されている、本発明1065のポリヌクレオチド。
[本発明1067]
前記最適化が、スプライスドナー部位およびスプライスアクセプター部位を同定および除去することを含む、本発明1066のポリヌクレオチド。
[本発明1068]
前記最適化が、ポリヌクレオチドを発現する細胞に対してコドン使用頻度を最適化することを含む、本発明1066のポリヌクレオチド。
[本発明1069]
前記核酸が、SEQ ID NO:21またはSEQ ID NO:22を含むヌクレオチド配列を含む、本発明1065〜1068のいずれかのポリヌクレオチド。
[本発明1070]
前記核酸が、SEQ ID NO:21またはSEQ ID NO:22からなるヌクレオチド配列を含む、本発明1069のポリヌクレオチド。
[本発明1071]
抗体VHポリペプチドをコードする核酸を含む、単離されたポリヌクレオチドであって、該VHポリペプチドのアミノ酸配列が、20以下の保存的アミノ酸置換を除いてSEQ ID NO:9またはSEQ ID NO:10と同一であり、該VHポリペプチドを含む抗体またはその抗原結合断片がCD100に特異的に結合する、単離されたポリヌクレオチド。
[本発明1072]
抗体VLポリペプチドをコードする核酸を含む、単離されたポリヌクレオチドであって、該VLポリペプチドのアミノ酸配列が、20以下の保存的アミノ酸置換を除いてSEQ ID NO:17またはSEQ ID NO:18と同一であり、該VLポリペプチドを含む抗体またはその抗原結合断片がCD100に特異的に結合する、単離されたポリヌクレオチド。
[本発明1073]
2以下のアミノ酸置換を除いてSEQ ID NO:6と同一であるVH-CDR1アミノ酸配列をコードする核酸を含む、単離されたポリヌクレオチドであって、該VH-CDR1を含む抗体またはその抗原結合断片がCD100に特異的に結合する、単離されたポリヌクレオチド。
[本発明1074]
前記VH-CDR1アミノ酸配列がSEQ ID NO:6である、本発明1073のポリヌクレオチドまたはその断片。
[本発明1075]
4以下のアミノ酸置換を除いてSEQ ID NO:7と同一であるVH-CDR2アミノ酸配列をコードする核酸を含む、単離されたポリヌクレオチドであって、該VH-CDR2を含む抗体またはその抗原結合断片がCD100に特異的に結合する、単離されたポリヌクレオチド。
[本発明1076]
前記VH-CDR2アミノ酸配列がSEQ ID NO:7である、本発明1075のポリヌクレオチドまたはその断片。
[本発明1077]
2以下のアミノ酸置換を除いてSEQ ID NO:8と同一であるVH-CDR3アミノ酸配列をコードする核酸を含む、単離されたポリヌクレオチドであって、該VH-CDR3を含む抗体またはその抗原結合断片がCD100に特異的に結合する、単離されたポリヌクレオチド。
[本発明1078]
前記VH-CDR3アミノ酸配列がSEQ ID NO:8である、本発明1077のポリヌクレオチドまたはその断片。
[本発明1079]
4以下のアミノ酸置換を除いてSEQ ID NO:14と同一であるVL-CDR1アミノ酸配列をコードする核酸を含む、単離されたポリヌクレオチドであって、該VL-CDR1を含む抗体またはその抗原結合断片がCD100に特異的に結合する、単離されたポリヌクレオチド。
[本発明1080]
前記VL-CDR1アミノ酸配列がSEQ ID NO:14である、本発明1079のポリヌクレオチドまたはその断片。
[本発明1081]
2以下のアミノ酸置換を除いてSEQ ID NO:15と同一であるVL-CDR2アミノ酸配列をコードする核酸を含む、単離されたポリヌクレオチドであって、該VL-CDR2を含む抗体またはその抗原結合断片がCD100に特異的に結合する、単離されたポリヌクレオチド。
[本発明1082]
前記VL-CDR2アミノ酸配列がSEQ ID NO:15である、本発明1081のポリヌクレオチドまたはその断片。
[本発明1083]
2以下のアミノ酸置換を除いてSEQ ID NO:16と同一であるVL-CDR3アミノ酸配列をコードする核酸を含む、単離されたポリヌクレオチドであって、該VL-CDR3を含む抗体またはその抗原結合断片がCD100に特異的に結合する、単離されたポリヌクレオチド。
[本発明1084]
前記VL-CDR3アミノ酸配列がSEQ ID NO:16である、本発明1083のポリヌクレオチドまたはその断片。
[本発明1085]
抗体VHポリペプチドをコードする核酸を含む、単離されたポリヌクレオチドであって、該VHポリペプチドが、SEQ ID NO:6、7、および8をそれぞれ含むVH-CDR1、VH-CDR2、およびVH-CDR3アミノ酸配列を含み、抗体またはその抗原結合断片がCD100に特異的に結合する、単離されたポリヌクレオチド。
[本発明1086]
抗体VLポリペプチドをコードする核酸を含む、単離されたポリヌクレオチドであって、該VLポリペプチドが、SEQ ID NO:14、15、および16をそれぞれ含むVL-CDR1、VL-CDR2、およびSVL-CDR3アミノ酸配列を含み、抗体またはその抗原結合断片がCD100に特異的に結合する、単離されたポリヌクレオチド。
[本発明1087]
前記抗体VHポリペプチドと融合したシグナルペプチドをコードする核酸をさらに含む、本発明1059〜1064、1071、1073〜1078、および1085のいずれかのポリヌクレオチド。
[本発明1088]
前記抗体VLポリペプチドと融合したシグナルペプチドをコードする核酸をさらに含む、本発明1065〜1069、1072、1079〜1084、および1086のいずれかのポリヌクレオチド。
[本発明1089]
前記抗体VHポリペプチドと融合した重鎖定常領域CH1ドメインをコードする核酸をさらに含む、本発明1059〜1064、1071〜1078、1085、および1087のいずれかのポリヌクレオチド。
[本発明1090]
前記抗体VHポリペプチドと融合した重鎖定常領域CH2ドメインをコードする核酸をさらに含む、本発明1059〜1064、1071〜1078、1085、1087、および1089のいずれかのポリヌクレオチド。
[本発明1091]
前記VHポリペプチドと融合した重鎖定常領域CH3ドメインをコードする核酸をさらに含む、本発明1059〜1064、1071〜1078、1085、1087、1089、および1090のいずれかのポリヌクレオチド。
[本発明1092]
前記VHポリペプチドと融合した重鎖ヒンジ領域をコードする核酸をさらに含む、本発明1059〜1064、1071〜1078、1085、1087、および1089〜1091のいずれかのポリヌクレオチド。
[本発明1093]
前記重鎖定常領域が、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgE、またはIgDである、本発明1091または1092のポリヌクレオチド。
[本発明1094]
前記VLポリペプチドと融合した軽鎖定常領域ドメインをコードする核酸をさらに含む、本発明1065〜1070、1072、1079〜1084、1086および1088のいずれかのポリヌクレオチド。
[本発明1095]
前記軽鎖定常領域がヒトκである、本発明1094のポリヌクレオチド。
[本発明1096]
前記抗体またはその抗原結合断片がヒトCD100およびマウスCD100に特異的に結合する、本発明1059〜1095のいずれかのポリヌクレオチド。
[本発明1097]
本発明1059〜1096のいずれかのポリヌクレオチドを含む、ベクター。
[本発明1098]
前記ポリヌクレオチドがプロモーターと機能的に結合している、本発明1097のベクター。
[本発明1099]
本発明1097または1098のベクターを含む、宿主細胞。
[本発明1100]
CD100に特異的に結合する抗体またはその断片を産生する方法であって、本発明1099の宿主細胞を培養する工程、および該抗体またはその断片を回収する工程を含む、方法。
[本発明1101]
本発明1100の方法によって産生された、単離されたポリペプチド。
[本発明1102]
本発明1059〜1096のいずれかのポリヌクレオチドによってコードされる、単離されたポリペプチド。
[本発明1103]
本発明1101または1102のポリペプチドを含む、単離された抗体またはその断片。
[本発明1104]
単離されたVHコードポリヌクレオチドおよび単離されたVLコードポリヌクレオチドを含む組成物であって、該VHコードポリヌクレオチドおよび該VLコードポリヌクレオチドは、それぞれSEQ ID NO:9およびSEQ ID NO:17とまたはそれぞれSEQ ID NO:10およびSEQ ID NO:18と少なくとも90％同一であるアミノ酸配列をコードする核酸を含み、該VHコードポリヌクレオチドおよび該VLコードポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはその断片がCD100に特異的に結合する、組成物。
[本発明1105]
前記VHコードポリヌクレオチドおよびVLコードポリヌクレオチドが、それぞれSEQ ID NO:9およびSEQ ID NO:17からまたはそれぞれSEQ ID NO:10およびSEQ ID NO:18からなるアミノ酸配列をコードする核酸を含む、本発明1104の組成物。
[本発明1106]
単離されたVHコードポリヌクレオチドおよび単離されたVLコードポリヌクレオチドを含む組成物であって、該VHコードポリヌクレオチドおよび該VLコードポリヌクレオチドは、20未満の保存的アミノ酸置換を除いてそれぞれSEQ ID NO:9およびSEQ ID NO:17とまたはそれぞれSEQ ID NO:10およびSEQ ID NO:18と同一であるアミノ酸配列をコードする核酸を含み、該VHコードポリヌクレオチドおよび該VLコードポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはその断片がCD100に特異的に結合する、組成物。
[本発明1107]
前記VHアミノ酸配列およびVLアミノ酸配列が、それぞれSEQ ID NO:9およびSEQ ID NO:17、またはそれぞれSEQ ID NO:10およびSEQ ID NO:18である、本発明1106の組成物。
[本発明1108]
単離されたVHコードポリヌクレオチドおよび単離されたVLコードポリヌクレオチドを含む組成物であって、該VHコードポリヌクレオチドが、それぞれSEQ ID NO:6、7、および8からなるVH-CDR1、VH-CDR2、およびVH-CDR3アミノ酸配列を含むVHポリペプチドをコードし、該VLコードポリヌクレオチドが、それぞれSEQ ID NO:14、15、および16からなるVL-CDR1、VL-CDR2、およびVL-CDR3アミノ酸配列を含むVLポリペプチドをコードし、該VHコードポリヌクレオチドおよび該VLコードポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはその断片がCD100に特異的に結合する、組成物。
[本発明1109]
前記VHコードポリヌクレオチドが、抗体VHポリペプチドと融合したシグナルペプチドをコードする核酸をさらに含む、本発明1104〜1108のいずれかの組成物。
[本発明1110]
前記VLコードポリヌクレオチドが、抗体VLポリペプチドと融合したシグナルペプチドをコードする核酸をさらに含む、本発明1104〜1108のいずれかの組成物。
[本発明1111]
前記VHコードポリヌクレオチドが、前記VHポリペプチドと融合した重鎖定常領域CH1ドメインをコードする核酸をさらに含む、本発明1104〜1110のいずれかの組成物。
[本発明1112]
前記VHコードポリヌクレオチドが、前記VHポリペプチドと融合した重鎖定常領域CH2ドメインをコードする核酸をさらに含む、本発明1104〜1111のいずれかの組成物。
[本発明1113]
前記VHコードポリヌクレオチドが、前記VHポリペプチドと融合した重鎖定常領域CH3ドメインをコードする核酸をさらに含む、本発明1104〜1112のいずれかの組成物。
[本発明1114]
前記VHコードポリヌクレオチドが、前記VHポリペプチドと融合した重鎖ヒンジ領域をコードする核酸をさらに含む、本発明1104〜1113のいずれかの組成物。
[本発明1115]
前記重鎖定常領域が、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgE、またはIgDである、本発明1113または1114の組成物。
[本発明1116]
前記VLコードポリヌクレオチドが、VLポリペプチドと融合した軽鎖定常領域ドメインをコードする核酸をさらに含む、本発明1104〜1115のいずれかの組成物。
[本発明1117]
前記軽鎖定常領域がヒトκである、本発明1116の組成物。
[本発明1118]
前記VHコードポリヌクレオチドおよび前記VLコードポリヌクレオチドが1つのベクターに含まれる、本発明1104〜1117のいずれかの組成物。
[本発明1119]
前記VHコードポリヌクレオチドが第1のベクターに含まれ、前記VLコードポリヌクレオチドが、該第1のベクターと同一でない第2のベクターに含まれる、本発明1104〜1117のいずれかの組成物。
[本発明1120]
前記VHコードポリヌクレオチドが第1のプロモーターと機能的に結合し、前記VLコードポリヌクレオチドが第2のプロモーターと機能的に結合している、本発明1118または1119の組成物。
[本発明1121]
第1のプロモーターおよび第2のプロモーターが同一プロモーターのコピーである、本発明1120の組成物。
[本発明1122]
第1のプロモーターおよび第2のプロモーターが同一でない、本発明1120の組成物。
[本発明1123]
第1のベクターおよび第2のベクターが単一の宿主細胞の中に含まれる、本発明1118〜1122のいずれかの組成物。
[本発明1124]
第1のベクターおよび第2のベクターが別々の宿主細胞の中に含まれる、本発明1118〜1122のいずれかの組成物。
[本発明1125]
前記抗体またはその抗原結合断片がヒトCD100およびマウスCD100に特異的に結合する、本発明1104〜1124のいずれかの組成物。
[本発明1126]
本発明1118のベクター。
[本発明1127]
本発明1119の第1のベクター。
[本発明1128]
本発明1119の第2のベクター。
[本発明1129]
前記VHコードポリヌクレオチドおよび前記VLコードポリヌクレオチドがインフレームで融合し、これらと機能的に結合している単一のプロモーターから同時転写され、同時翻訳されて、単鎖抗体またはその抗原結合断片となる、本発明1126のベクター。
[本発明1130]
前記VHコードポリヌクレオチドおよび前記VLコードポリヌクレオチドが、これらと機能的に連結している単一のプロモーターから同時転写されるが、別々に翻訳される、本発明1126のベクター。
[本発明1131]
前記VHコードポリヌクレオチドと前記VLコードポリヌクレオチドの間に配置されたIRES配列をさらに含む、本発明1126のベクター。
[本発明1132]
VHをコードする前記ポリヌクレオチドおよびVLをコードする前記ポリヌクレオチドが別々に転写され、それぞれが別々のプロモーターと機能的に結合している、本発明1126のベクター。
[本発明1133]
CD100に特異的に結合する抗体またはその断片を産生する方法であって、本発明1121の宿主細胞を培養する工程、および該抗体またはその断片を回収する工程を含む、方法。
[本発明1134]
CD100に特異的に結合する抗体またはその断片を産生する方法であって、本発明1123の別々の宿主細胞を同時培養する工程、および該抗体またはその断片を回収する工程を含む、方法。
[本発明1135]
CD100に特異的に結合する抗体またはその断片を産生する方法であって、本発明1124の別々の宿主細胞を別々に培養する工程、VHコードポリペプチドおよびVLコードポリペプチドを組み合わせる工程、ならびに該抗体またはその断片を回収する工程を含む、方法。
[本発明1136]
本発明1126もしくは1129〜1132のいずれかのベクター、本発明1127の第1のベクター、または本発明1128の第2のベクターを含む、宿主細胞。
[本発明1137]
CD100に特異的に結合する抗体またはその断片を産生する方法であって、本発明1136の宿主細胞を培養する工程、および該抗体またはその断片を回収する工程を含む、方法。
[本発明1138]
本発明1137の方法によって産生された、CD100に特異的に結合する抗体またはその断片。
[本発明1139]
動物においてCD100を中和するための方法であって、
(a)本発明1003〜1056、1103、および1138のいずれかの単離された抗体またはその断片;ならびに
(b)薬学的に許容される担体
を含む組成物を、該動物に投与する工程
を含む、方法。
[本発明1140]
処置を必要とする動物において自己免疫疾患または炎症疾患を処置するための方法であって、
(a)本発明1003〜1056、1103、および1138のいずれかの単離された抗体またはその断片;ならびに
(b)薬学的に許容される担体
を含む組成物を、該動物に投与する工程
を含む、方法。
[本発明1141]
前記自己免疫疾患または炎症疾患が多発性硬化症である、本発明1140の方法。
[本発明1142]
前記自己免疫疾患または炎症疾患が関節炎である、本発明1140の方法。
[本発明1143]
前記自己免疫疾患または該炎症疾患が関節リウマチである、本発明1142の方法。
[本発明1144]
処置を必要とする動物において癌を処置するための方法であって、
(a)本発明1003〜1056、1103、および1138のいずれかの単離された抗体またはその断片;ならびに
(b)薬学的に許容される担体
を含む組成物を、該動物に投与する工程
を含む、方法。
[本発明1145]
癌の処置を必要とする動物において血管形成を阻害するための方法であって、
(a)本発明1003〜1056、1103、および1138のいずれかの単離された抗体またはその断片;ならびに
(b)薬学的に許容される担体
を含む組成物を、該動物に投与する工程
を含む、方法。
[本発明1146]
前記抗体またはその断片がCD100とCD100受容体との結合を阻害する、本発明1139〜1145のいずれかの方法。
[本発明1147]
前記CD100受容体がプレキシン-B1である、本発明1146の方法。
[本発明1148]
前記動物が哺乳動物である、本発明1139〜1147のいずれかの方法。
[本発明1149]
前記哺乳動物がヒトである、本発明1148の方法。
CD100ブロッキングアッセイの図。CD100-Hisは、プレキシンB1を発現する安定細胞株(293/プレキシン)の細胞表面にあるプレキシンB1と結合を示した。プレキシンB1と結合したCD100-Hisは、ビオチン結合抗Hisタグ特異的モノクローナル抗体およびストレプトアビジン-APCを用いて検出される。CD100-HisとプレキシンB1との結合をブロックすることができる抗CD100 MAbは、フローサイトメトリーによって測定した時に、293/プレキシン細胞に関連する蛍光を低下させる。 図1に記載のCD100ブロッキングアッセイにおいて試験した、ウサギ抗His+ストレプトアビジン-APC(Rb抗his+sAPC)、マウスCD100(muCD100のみ)、マウスCD100+0.625μg/ml MAb(MAb67、MAb76、およびmIgGアイソタイプ)、ならびにマウスCD100+0.156μg/ml MAb(MAb67、MAb76、およびmIgGアイソタイプ)のフローサイトメトリー結果を示した。モノクローナル抗体67および76は、マウスCD100とプレキシンB1受容体との結合をブロックする。 アイソタイプ対照と比較してMAb67(67-2)および76(76-1)の吸光度が上昇したことから分かるように、モノクローナル抗体67および76は、マウスCD100を介して、293/プレキシンB細胞がフィブロネクチンコーティングプレートから剥離するのをブロックする。 臨床スコアの低下から分かるように、マウスIgG対照による処置と比較して、30mg/kg抗CD100 MAb76(1X/週もしくは2X/週)またはMAb67(1X/週もしくは2X/週)による処置によって、SJLマウスにおける再発寛解型EAEは軽減する(4A)。さらに、これらの結果を、それぞれのMAb処置について21日目と試験最終日の間の群平均スコア(Group Mean Score)(GMS)のパーセント低下を比較することによって図示した(4B)。 臨床スコアの低下から分かるように、マウスIgG対照による処置と比較して、30mg/kg抗CD100 MAb76(1X/週)またはMAb67(1X/週)による処置によって、SJLマウスにおける再発寛解型EAEは軽減する(5A)。さらに、これらの結果を、両方のMAb処置について18日目と試験最終日の間の群平均スコア(GMS)のパーセント低下を比較することによって図示した(5B)。 臨床スコアの低下から分かるように、マウスIgG対照による処置と比較して、免疫化の7日後に開始した30mg/kg抗CD100 MAb67処置(1X/週)によって、SJLマウスにおける再発寛解型EAEは軽減する。 MAb2503、MAb67、またはIgG対照の競合的結合による、ビオチン化67とヒトCD100との結合をブロックするパーセント(％)を示したELISA結果(7A)、またはビオチン化67とマウスCD100との結合をブロックするパーセント(％)を示したELISA結果(7B)。 図1に記載のCD100ブロッキングアッセイにおいて試験されたストレプトアビジン-APC(sAPCのみ)、ヒトCD100(huCD100)、1.0μgアイソタイプ、および1.0μg MAb(67または2503)のフローサイトメトリー結果を示す。MAb67およびMAb2503は、ヒトCD100とプレキシンB1受容体との結合をブロックする。 図1に記載のCD100ブロッキングアッセイにおいて試験されたストレプトアビジン-APC(sAPCのみ)、マーモセットCD100(marmCD100)、1.0μgアイソタイプ、および1.0μg MAb(67または2503)のフローサイトメトリー結果を示す。MAb67およびMAb2503は、マーモセットCD100とプレキシンB1受容体との結合をブロックする。 図1に記載のCD100ブロッキングアッセイにおいて試験されたストレプトアビジン-APC(sAPCのみ)、マウスCD100(muCD100)、1.0μgアイソタイプ、および1.0μg MAb(67または2503)のフローサイトメトリー結果を示す。MAb67およびMAb2503は、マウスCD100とプレキシンB1受容体との結合をブロックする。 MAb67、MAb2503、およびIgG対照によるCD100中和による、CD100によって引き起こされる吸光度の低下のブロッキングを示す。抗CD100 MAb67およびMAb2503は、ヒトCD100(9A)およびマーモセットCD100(9B)によって誘導される、フィブロネクチンコーティングプレートからの293/プレキシン細胞の剥離をブロックする。 50,000個のCT26結腸腫瘍細胞をマウス脚筋肉に注射した後の野生型Balb/cマウスおよびCD100-/-マウスの腫瘍体積(mm3)の変化を示した。 50,000個のCT26腫瘍細胞をマウス脚筋肉に注射した後の、1mg MAb67または1mg対照マウスIgGで処置した野生型Balb/cマウス、およびCD100-/-マウス(「KO」)の、平均脚体積(mean leg volume)(mm3)の変化を示した。 コラーゲン誘導性関節炎(CIA)の大まかな処置戦略を示す模式図。 CIAモデルにおける関節炎疾患発症の低減を、600μg MAb67で処置した群について示した。処置を20日目で開始した時の、600μg MAb67で処置したマウスにおける関節炎指数(Arthritic Index)(AI)を、600μgの負の対照(IgG1)および600μgの正の対照エタネルセプト(Enbrel(登録商標))で処置したマウスにおけるAIと比較した(13A)。処置を20日目で開始した時の、またはAIが>3になった時に処置を開始した時の、MAb67処置の関節炎指数(AI)結果を、負の対照(IgG1)および正の対照エタネルセプト(Embrel(登録商標))による処置と比較した(13B)。 ミョウバン(水酸化アルミニウム-水酸化マグネシウム)で沈澱させた(4-ヒドロキシ-3-ニトロフェニル)アセチル結合ニワトリガンマグロブリン(「NP-CGG」)で免疫化したBalb/cマウスにおいて、600μg MAb67処置によって、一次免疫後(14A)および二次免疫後(14B)に脾臓(SP)およびリンパ節(LN)における胚中心(GC)B細胞(「B220+CD38lowPNA+」)の数が減少した。NP-CGGで免疫化した、およびNP-CGGで免疫化しなかったCD100-/-マウスおよびBalb/cマウスの結果も示した。 50,000個のCT26結腸腫瘍細胞をマウス脚筋肉に注射した後の、野生型Balb/cマウスの腫瘍体積(mm3)の変化を示した。1mg MAb67を1日目から開始して毎週注射したマウスの結果を、IgG対照を注射したマウスと比較して示した。腫瘍成長遅延のエンドポイントまで試験を行った。 50,000個のBCA34線維芽細胞腫瘍細胞をマウス腹部領域にs.c.注射した後の、野生型Balb/cマウスおよびCD100-/-マウス(「SEMA4D-/-」)の腫瘍体積(mm3)の変化を示した(16A)。50,000個のBCA34線維芽細胞腫瘍細胞をマウス脚筋肉に注射した後の、1mg MAb67または1mg対照マウスIgGで処置した野生型Balb/cマウスの平均大腿体積(mm3)の変化を示した(16B)。 マウス脚筋肉に50,000個のEMT6マウス乳癌腫瘍細胞を注射した後の、野生型Balb/cマウスおよびCD100-/-マウス(「SEMA4D-/-」)の腫瘍体積(mm3)の変化を示した。 マウス側腹部筋肉に2個のHN12頭頚部腫瘍/マウスをs.c.注射した後の、無胸腺ヌードマウスの腫瘍体積(mm3)の変化を示した。移植後1日目から開始して毎週、1mgのMAb2503を注射したマウスの結果を、IgG4対照を注射したマウスと比較して示した。 マウス脚筋肉に2個のHN6 HIF1a mODD頭頚部腫瘍をs.c.注射した後の、無胸腺ヌードマウスの腫瘍体積(mm3)の変化を示した。移植後1日目から開始して毎週、1mgのMAb2503を注射したマウスの結果を、IgG4対照を注射したマウスと比較して示した(19A)。IgG4対照処置マウスおよびMAb2503処置マウスからの代表的な腫瘍の写真を示した(19B)。 ラットにおけるMAb2503単回静脈内注射飽和分析からのパーセント飽和結果。Sprague-Dawleyラットに、0mg/kg、0.01mg/kg、0.1mg/kg、1.0mg/kg、10mg/kg、および100mg/kgの用量のMAb2503単回静脈内注射を投与した。雄ラット(20A)および雌ラット(20B)におけるMAb2503によって飽和した細胞標的(SEMA4D)のパーセントを求めるために、フローサイトメトリーに基づく飽和アッセイを溶解全血に対して様々な時点で行った。 カニクイザルにおけるMAb2503単回静脈内注射飽和分析からのパーセント飽和結果。カニクイザルに、0mg/kg、0.01mg/kg、0.1mg/kg、1.0mg/kg、10mg/kg、および100mg/kgの用量のMAb2503単回静脈内注射を投与した。MAb2503によって飽和した細胞標的(SEMA4D)のパーセントを求めるために、フローサイトメトリーに基づく飽和アッセイを溶解全血に対して様々な時点で行った(雄データおよび雌データを組み合わせた)。
発明の詳細な説明
I.定義
「1つの(a)」または「1つの(an)」実体という用語は、この実体の1つまたは複数を指していることに留意すべきである。例えば、「1つの抗CD100抗体」は、1つまたは複数の抗CD100抗体であることが理解される。従って、「1つの(a)」(または「1つの(an)」)、「1つまたは複数の」、および「少なくとも1つの」という用語は本明細書において同義に用いられることがある。
本明細書で使用する「腫瘍」という用語は、悪性でも良性でも全ての新生細胞の成長および増殖、ならびに全ての癌細胞および癌組織ならびに前癌細胞および前癌組織を指す。
「浸潤性血管形成」とは、悪性腫瘍および非悪性腫瘍を含む病理学的状態を支えるための血管の形成ならびに黄斑変性における新血管の異常形成を指す。
「癌」および「癌の」という用語は、典型的に無秩序な細胞増殖を特徴とする哺乳動物における生理学的状態を指すか、またはこれについて述べている。癌の例には、癌腫、リンパ腫、および白血病が含まれるが、これに限定されない。
本明細書で使用する「ポリペプチド」という用語は、単数の「ポリペプチド」ならびに複数の「ポリペプチド」を含むことが意図され、アミド結合(ペプチド結合とも知られる)によって直線的に連結した単量体(アミノ酸)からなる分子を指す。「ポリペプチド」という用語は2つ以上のアミノ酸からなる任意の鎖を指し、特定の長さの産物を指さない。従って、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、または2つ以上のアミノ酸からなる鎖を指すために用いられる他の任意の用語は「ポリペプチド」の定義の中に含まれ、「ポリペプチド」という用語はこれらの用語の代わりに用いられてもよく、これらの用語と同義に用いられてもよい。「ポリペプチド」という用語はまた、ポリペプチドの発現後修飾の産物を指すことも意図される。発現後修飾にはグリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護基/ブロック基による誘導体化、タンパク質切断、または非天然アミノ酸による修飾が含まれるが、それに限定されるわけではない。ポリペプチドは天然の生物学的供給源に由来してもよく、組換え技術によって産生されてもよいが、必ずしも、指定された核酸配列から翻訳されるとは限らない。ポリペプチドは化学合成を含む任意のやり方で作製することができる。
本発明のポリペプチドは、約3以上、5以上、10以上、20以上、25以上、50以上、75以上、100以上、200以上、500以上、1,000以上、または2,000以上アミノ酸のサイズでもよい。ポリペプチドは、規定された三次元構造を有してもよいが、必ずしも、このような構造を有するとは限らない。規定の三次元構造を有するポリペプチドは折り畳まれていると言われ、規定の三次元構造を有さず、多くの異なる立体構造をとることができるポリペプチドは折り畳まれていないと言われる。本明細書で使用する糖タンパク質という用語は、アミノ酸残基、例えば、セリン残基またはアスパラギン残基の酸素含有側鎖または窒素含有側鎖を介してタンパク質に取り付けられた少なくとも1つの炭水化物部分と結合しているタンパク質を指す。
「単離された」ポリペプチドまたはその断片、変種、もしくは誘導体とは、天然の環境にはないポリペプチドを意味する。特定のレベルの精製は必要とされない。例えば、単離されたポリペプチドは、その自然または天然の環境から取り出されていてもよい。組換えにより産生され、宿主細胞内で発現されたポリペプチドおよびタンパク質は、本発明の目的で単離されているとみなされ、同様に、任意の適切な技法によって分離されている、分画されている、または部分的もしくは実質的に精製されている自然のポリペプチドまたは組換えポリペプチドも単離されているとみなされる。
本発明のポリペプチドとして、前述のポリペプチドの断片、誘導体、類似体、または変種、およびその任意の組み合わせも含まれる。「断片」、「変種」、「誘導体」、および「類似体」という用語は本発明の抗CD100抗体または抗体ポリペプチドを指す時には、本発明の対応する抗体または抗体ポリペプチドの抗原結合特性の少なくとも一部を保持している任意のポリペプチドを含む。本発明のポリペプチドの断片には、本明細書の他の場所で議論される特定の抗体断片に加えてタンパク質分解断片ならびに欠失断片が含まれる。本発明の抗CD100抗体および抗体ポリペプチドの変種には前記の断片が含まれ、アミノ酸置換、欠失、または挿入のためにアミノ酸配列が変化しているポリペプチドも含まれる。変種は天然のものでもよく、非天然のものでもよい。非天然変種は、当技術分野において公知の変異誘発法を用いて生成されてもよい。変種ポリペプチドは保存的もしくは非保存的なアミノ酸置換、欠失、または付加を含んでもよい。変種ポリペプチドはまた本明細書において「ポリペプチド類似体」と呼ばれることもある。本明細書で使用する、抗CD100抗体または抗体ポリペプチドの「誘導体」は、官能基側鎖の反応によって1つまたは複数の残基が化学的に誘導体化された本ポリペプチドを指す。20種類の標準アミノ酸の中の1種類または複数の種類の天然アミノ酸誘導体を含有するペプチドも「誘導体」として含まれる。例えば、プロリンの代わりに4-ヒドロキシプロリンが用いられてもよく、リジンの代わりに5-ヒドロキシリジンが用いられてもよく、ヒスチジンの代わりに3-メチルヒスチジンが用いられてもよく、セリンの代わりにホモセリンが用いられてもよく、リジンの代わりにオルニチンが用いられてもよい。本発明の抗CD100抗体および抗体ポリペプチドの誘導体は、本発明の参照抗体または抗体ポリペプチドでは見られないさらなる特徴を示すように変えられているポリペプチドを含んでもよい。
「ポリヌクレオチド」という用語は単数の核酸ならびに複数の核酸を含むことが意図され、単離された核酸分子または構築物、例えば、メッセンジャーRNA(mRNA)またはプラスミドDNA(pDNA)を指す。ポリヌクレオチドは、従来のホスホジエステル結合または従来にはない結合(例えば、アミド結合、例えば、ペプチド核酸(PNA)において見られる結合)を含んでもよい。「核酸」という用語は、ポリヌクレオチドに存在する任意の1つまたは複数の核酸セグメント、例えば、DNA断片またはRNA断片を指す。「単離された」核酸またはポリヌクレオチドとは、自然環境から取り出されている核酸分子、DNAまたはRNAを意味する。例えば、ベクターの中に含まれる、抗CD100結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片をコードする組換えポリヌクレオチドは、本発明の目的では単離されているとみなされる。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例には、異種宿主細胞の中で維持されている組換えポリヌクレオチド、または溶解状態にある(部分的もしくは実質的に)精製されたポリヌクレオチドが含まれる。単離されたRNA分子には、本発明のポリヌクレオチドのインビボRNA転写物またはインビトロRNA転写物が含まれる。さらに、本発明の単離されたポリヌクレオチドまたは核酸には、合成により生成されたこのような分子が含まれる。さらに、ポリヌクレオチドまたは核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位、または転写ターミネーターなどの調節エレメントでもよく、これを含んでもよい。
本明細書で使用する「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸部分である。「停止コドン」(TAG、TGA、またはTAA)はアミノ酸に翻訳されないが、コード領域の一部とみなされることがある。だが、隣接配列、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロンはどれもコード領域の一部でない。本発明の2つ以上のコード領域が1つのポリヌクレオチド構築物の中に存在してもよく、例えば、1つのベクターにあってもよく、別々のポリヌクレオチド構築物に、例えば、別々の(異なる)ベクターにあってもよい。さらに、どのベクターもコード領域を1つしか含んでいなくてもよく、2つ以上のコード領域を含んでもよい。例えば、免疫グロブリン重鎖可変領域をコードするベクターおよび免疫グロブリン軽鎖可変領域をコードするベクターが別々にあってもよい。さらに、本発明のベクター、ポリヌクレオチド、または核酸は、抗CD100抗体またはその断片、変種、もしくは誘導体をコードする核酸と融合した状態で、または融合していない状態で異種コード領域をコードしてもよい。異種コード領域には、分泌シグナルペプチドまたは異種機能ドメインなどの特殊なエレメントまたはモチーフが含まれるが、それに限定されるわけではない。
ある特定の態様において、ポリヌクレオチドまたは核酸はDNAである。DNAの場合、ポリペプチドをコードする核酸を含むポリヌクレオチドは、通常、1つまたは複数のコード領域と機能的に結合しているプロモーターおよび/または他の転写制御エレメントもしくは翻訳制御エレメントを含んでもよい。機能的に結合しているとは、遺伝子産物、例えば、ポリペプチドが調節配列の影響または制御を受けて発現されるように、遺伝子産物のコード領域が1つまたは複数の調節配列と結合している時である。2つのDNA断片(例えば、ポリペプチドコード領域およびこれらと結合しているプロモーター)は、プロモーター機能の誘導によって望ましい遺伝子産物をコードするmRNAが転写されれば、および2つのDNA断片間の結合の性質が、発現調節配列が遺伝子産物の発現を誘導する能力を妨げず、DNAテンプレートが転写される能力を妨げないのであれば「機能的に結合している」。従って、プロモーター領域はポリペプチドコード核酸を転写することができれば、ポリペプチドコード核酸と機能的に結合しているだろう。プロモーターは、所定の細胞においてのみDNAを実質的に転写する細胞特異的プロモーターでもよい。細胞特異的転写を誘導するために、プロモーターのほかに他の転写制御エレメント、例えば、エンハンサー、オペレーター、リプレッサー、および転写終結シグナルがポリヌクレオチドと機能的に結合していてもよい。適切なプロモーターおよび他の転写制御領域が本明細書において開示される。
様々な転写制御領域が当業者に公知である。これらには、脊椎動物細胞において機能する転写制御領域が含まれるが、それに限定されるわけではない。脊椎動物細胞において機能する転写制御領域には、サイトメガロウイルスに由来するプロモーターおよびエンハンサーセグメント(最初期プロモーターとイントロン-A)、シミアンウイルス40(初期プロモーター)、ならびにレトロウイルス(例えば、ラウス肉腫ウイルス)などがあるが、これに限定されない。他の転写制御領域には、脊椎動物遺伝子、例えば、アクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン、およびウサギβ-グロビンに由来する転写制御領域、ならびに真核細胞において遺伝子発現を制御することができる他の配列が含まれる。さらなる適切な転写制御領域には、組織特異的プロモーターおよびエンハンサーならびにリンホカイン誘導性プロモーター(例えば、インターフェロンまたはインターロイキンによって誘導されるプロモーター)が含まれる。
同様に、様々な翻訳制御エレメントが当業者に公知である。これらには、リボソーム結合部位、翻訳開始コドンおよび翻訳終結コドン、ならびにピコルナウイルスに由来するエレメント(特に、配列内リボソーム進入部位すなわちIRES、CITE配列とも呼ばれる)が含まれるが、これに限定されない。
他の態様において、本発明のポリヌクレオチドは、RNA、例えば、メッセンジャーRNA(mRNA)の形をしたRNAである。
本発明のポリヌクレオチドおよび核酸コード領域は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を誘導する分泌ペプチドまたはシグナルペプチドをコードする、さらなるコード領域と結合してもよい。シグナル仮説によれば、哺乳動物細胞によって分泌されたタンパク質にはシグナルペプチド配列または分泌リーダー配列があり、粗面小胞体を通る成長タンパク質鎖の輸送が開始したらシグナルペプチド配列または分泌リーダー配列は成熟タンパク質から切断される。当業者であれば、脊椎動物細胞によって分泌されたポリペプチドは、一般的に、ポリペプチドのN末端にシグナルペプチドが融合しており、シグナルペプチドは完全なまたは「完全長」のポリペプチドから切断されて、分泌型型または「成熟」型のポリペプチドとなることを知っている。ある特定の態様において、天然シグナルペプチド、例えば、免疫グロブリン重鎖シグナルペプチドもしくは軽鎖シグナルペプチド、または機能的に結合しているポリペプチドの分泌を誘導する能力を保持している、その配列の機能誘導体が用いられる。または、異種哺乳動物シグナルペプチドまたはその機能誘導体が用いられてもよい。例えば、野生型リーダー配列は、ヒト組織プラスミノゲンアクチベーター(TPA)またはマウスβ-グルクロニダーゼのリーダー配列と置換されてもよい。
本発明の「結合分子」または「抗原結合分子」は、その最も広い意味で、抗原決定基に特異的に結合する分子を指す。1つの態様において、結合分子は、CD100、例えば、約150kDaの膜貫通CD100ポリペプチドまたは約120kDaの可溶性CD100ポリペプチド(通常、sCD100と呼ばれる)に特異的に結合する。別の態様において、本発明の結合分子は抗体またはその抗原結合断片である。別の態様において、本発明の結合分子は、抗体分子の少なくとも1つの重鎖CDRまたは軽鎖CDRを含む。別の態様において、本発明の結合分子は、1種類または複数の種類の抗体分子に由来する少なくとも2つのCDRを含む。別の態様において、本発明の結合分子は、1種類または複数の種類の抗体分子に由来する少なくとも3つのCDRを含む。別の態様において、本発明の結合分子は、1種類または複数の種類の抗体分子に由来する少なくとも4つのCDRを含む。別の態様において、本発明の結合分子は、1種類または複数の種類の抗体分子に由来する少なくとも5つのCDRを含む。別の態様において、本発明の結合分子は、1種類または複数の種類の抗体分子に由来する少なくとも6つのCDRを含む。
本発明は、ある特定の抗CD100抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体に関する。具体的に天然抗体などのフルサイズ抗体について言及している場合を除いて、「抗CD100抗体」という用語は、フルサイズ抗体ならびにこのような抗体、例えば、天然抗体もしくは免疫グロブリン分子の抗原結合断片、変種、類似体、もしくは誘導体、または抗体分子と同様に抗原に結合する操作された抗体分子もしくは断片を含む。
本明細書で使用する「ヒト」抗体または「完全ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、ヒト免疫グロブリンライブラリーから単離された抗体、または下記のように、例えば、Kucherlapatiらによる米国特許第5,939,598号に記載のように1種類もしくは複数の種類のヒト免疫グロブリンの遺伝子が導入されているが、内因性免疫グロブリンを発現しない動物から単離された抗体を含む。「ヒト」抗体または「完全ヒト」抗体はまた少なくとも重鎖可変ドメインを含むか、または少なくとも重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含み、可変ドメインはヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列を有する。
「ヒト」抗体または「完全ヒト」抗体はまた、本明細書に記載の抗体分子(例えば、VH領域および/もしくはVL領域)の変種(誘導体を含む)を含むか、これらから本質的になるか、またはこれらからなり、抗体またはその断片がCD100ポリペプチドまたはその断片もしくは変種に免疫特異的に結合する、前記の「ヒト」抗体または「完全ヒト」抗体を含む。アミノ酸を置換する部位特異的変異誘発およびPCRを介した変異誘発を含むが、これに限定されない、当業者に公知の標準的な技法を用いて、ヒト抗CD100抗体をコードするヌクレオチド配列に変異を導入することができる。好ましくは、変種(誘導体を含む)は、参照のVH領域、VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VL領域、VLCDR1、VLCDR2、またはVLCDR3を基準として、50アミノ酸未満の置換、40アミノ酸未満の置換(subsitution)、30アミノ酸未満の置換、25未満のアミノ酸未満の置換、20アミノ酸未満の置換、15アミノ酸未満の置換、10アミノ酸未満の置換、5アミノ酸未満の置換、4アミノ酸未満の置換、3アミノ酸未満の置換、または2アミノ酸未満の置換をコードする。
ある特定の態様において、アミノ酸置換は、以下でさらに議論される保存的アミノ酸置換である。または、変異は、例えば、飽和変異誘発によって、コード配列の全てまたは一部に沿って無作為に導入されてもよく、活性を保持している変異体を同定するために、結果として得られた変異体は生物学的活性(例えば、CD100ポリペプチド、例えば、ヒトCD100、マウスCD100、またはヒトCD100およびマウスCD100の両方に結合する能力)についてスクリーニングされてもよい。「ヒト」抗体または「完全ヒト」抗体のこのような変種(またはその誘導体)はまた、「最適化された」または「抗原結合に最適化された」ヒト抗体または完全ヒト抗体と呼ばれることもあり、抗原に対する親和性が改善した抗体を含む。
「抗体」および「免疫グロブリン」という用語は本明細書において同義に用いられる。抗体または免疫グロブリンは少なくとも重鎖可変ドメインを含み、通常、少なくとも重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む。脊椎動物系における免疫グロブリン基本構造はかなりよく理解されている。例えば、Harlow et al.(1988) Antibodies: A Laboratory Manual(2nd ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press)を参照されたい。
以下でさらに詳細に議論するように、「免疫グロブリン」という用語は、生化学的に区別することができる様々な広範囲のクラスのポリペプチドを含む。当業者であれば、重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロン(γ、μ、α、δ、ε)と分類され、これらの中にはいくつかのサブクラス(例えば、γ1〜γ4)があると理解するだろう。抗体の「クラス」を、それぞれ、IgG、IgM、IgA、IgG、またはIgEと決めるのは、この鎖がどういったものであるかということである。免疫グロブリンサブクラス(アイソタイプ)、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1などははっきり特徴付けられており、機能の専門化を付与することが知られている。本開示を考慮すれば、これらのクラスおよびアイソタイプのそれぞれの改変バージョンは当業者であれば容易に認めることができ、従って、本発明の範囲内である。明らかに、全ての免疫グロブリンクラスが本発明の範囲内であり、以下の考察は、概して、免疫グロブリン分子のIgGクラスに関するものであろう。IgGについて、標準的な免疫グロブリン分子は、分子量が約23,000ダルトンの2本の同一の軽鎖ポリペプチド、および分子量が53,000〜70,000の2本の同一の重鎖ポリペプチドを含む。4本の鎖は、典型的には、「Y」立体配置をとってジスルフィド結合しており、軽鎖は、「Y」の口元から始まり可変領域まで延びて重鎖の添え木となる。
軽鎖はカッパまたはラムダ(κ、λ)と分類される。それぞれの重鎖クラスはκ軽鎖またはλ軽鎖と結合することができる。一般的に、軽鎖および重鎖は互いに共有結合しており、免疫グロブリンがハイブリドーマ、B細胞、または遺伝子操作された宿主細胞によって産生された時には、2本の重鎖の「テール」部分はジスルフィド共有結合または非共有結合によって互いに結合している。重鎖のアミノ酸配列は、Y立体配置の二またに分かれた末端にあるN末端から、各鎖の底部にあるC末端まで延びている。
軽鎖および重鎖は両方とも構造および機能に相同性のある領域に分けられる。機能上、「定常」および「可変」という用語が用いられる。これに関して、軽鎖部分の可変ドメイン(VLまたはVK)および重鎖部分の可変ドメイン(VH)が抗原認識および特異性を決定することが理解されるだろう。逆に、軽鎖の定常ドメイン(CL)および重鎖の定常ドメイン(CH1、CH2、またはCH3)は、分泌、経胎盤移動性、Fc受容体結合、補体結合などの重要な生物学的特性を付与する。きまりによって、定常領域ドメインの番号は、抗体の抗原結合部位またはアミノ末端から離れるにつれて大きくなる。N末端部分は可変領域であり、C末端部分には定常領域がある。CH3およびCLドメインは、実際には、それぞれ、重鎖および軽鎖のカルボキシ末端を構成する。
前記のように、可変領域があると、抗体は抗原にあるエピトープを選択的に認識し、抗原にあるエピトープに特異的に結合することが可能になる。すなわち、抗体のVLドメインおよびVHドメインまたはこれらの可変ドメインの中にある相補性決定領域(CDR)のサブセットが一緒になって、三次元抗原結合部位を規定する可変領域を形成する。この四次抗体構造は、Yの各アームの末端に存在する抗原結合部位を形成する。さらに具体的には、抗原結合部位は、VH鎖およびVL鎖のそれぞれにある3つのCDRによって規定される。場合によっては、例えば、ラクダ科の種に由来する、またはラクダ科の免疫グロブリンに基づいて操作された、ある特定の免疫グロブリン分子では、完全な免疫グロブリン分子は重鎖のみからなり、軽鎖が無いことがある。例えば、Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448(1993)を参照されたい。
天然抗体において、それぞれの抗原結合ドメインに存在する6つの「相補性決定領域」すなわち「CDR」は、抗体が水環境内で三次元立体配置をとる時に抗原結合ドメインを形成するように特異的に配置される短く隣接しないアミノ酸配列である。抗原結合ドメインにある残りのアミノ酸は「フレームワーク」領域と呼ばれ、分子内の変化がより少ない。フレームワーク領域は主にβシート立体構造をとり、CDRは、βシート構造をつなぐループを形成し、場合によってはβシート構造の一部を形成する。従って、フレームワーク領域は、非共有結合性の鎖間相互作用によってCDRを正しい方向に配置する足場を形成するように働く。配置されたCDRによって形成される抗原結合ドメインは、免疫反応性抗原上のエピトープに相補的な表面を規定する。この相補的な表面は、抗体とそのコグネイトエピトープとの非共有結合を促進する。CDRを構成するアミノ酸およびフレームワーク領域を構成するアミノ酸はそれぞれ正確に定められているので(以下を参照されたい)、当業者であれば、所定の重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインについてCDRを構成するアミノ酸およびフレームワーク領域を構成するアミノ酸を容易に特定することができる。
当技術分野において用いられる、および/または受け入れられている用語の2つ以上の定義がある場合、本明細書で使用する用語の定義は、はっきりと反対のことが述べられている場合を除いて、このような全ての意味を含むことが意図される。具体例は、「相補性決定領域」(「CDR」)という用語が、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドの可変領域の中に見られる隣接しない抗原結合部位について述べるために用いられることである。この特定の領域は、参照により本明細書に組み入れられる、Kabat et al.(1983) U.S. Dept. of Health and Human Services, 「Sequences of Proteins of Immunological Interest」およびChothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917(1987)によって説明されており、ここでは、これらの定義は、互いに比較した時にアミノ酸残基の重複またはサブセットを含む。それにもかかわらず、抗体またはその変種のCDRを言うために一方の定義を用いても、本明細書において定義および使用されたような用語の範囲の中にあると意図される。前記で引用された各参考文献によって定義されたようなCDRを含む適切なアミノ酸残基を、比較として以下の表1に示した。ある特定のCDRを含む正確な残基番号は、CDRの配列およびサイズに応じて異なる。当業者であれば、抗体の可変領域アミノ酸配列があれば、どの残基が特定のCDRを構成するか日常的に確かめることができる。
（表１）CDRの定義1
Figure 0006059013
1表1における全てのCDR定義のナンバリングは、Kabat et al.(以下を参照されたい)によって示されたナンバリング法によるものである。
Kabatらはまた、どの抗体にも適用可能な可変ドメイン配列のナンバリングシステムを定めた。当業者であれば、配列そのものの他にどの実験データにも頼ることなく、この「Kabatナンバリング」システムを任意の可変ドメイン配列に明確に割り当てることができる。本明細書で使用する「Kabatナンバリング」は、Kabat et al.(1983) U.S. Dept. of Health and Human Services, 「Sequence of Proteins of Immunological Interest」に記載のナンバリングシステムを指す。他で特定しない限り、本発明の抗CD100抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体における特定のアミノ酸残基位置の番号についての言及は、Kabatナンバリングシステムに準じたものである。
本発明の抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、霊長類化抗体、またはキメラ抗体、単鎖抗体、エピトープ結合断片、例えば、Fab、Fab'およびF(ab')2、Fd、Fv、単鎖Fv(scFv)、ジスルフィド結合Fvs(sdFv)、VLドメインまたはVHドメインを含む断片、Fab発現ライブラリーによって産生された断片、ならびに抗イディオタイプ(抗Id)抗体(例えば、本明細書において開示された抗CD100抗体に対する抗Id抗体を含む)が含まれるが、これに限定されない。ScFv分子は当技術分野において公知であり、例えば、米国特許第5,892,019号に記載されている。本発明の免疫グロブリンまたは抗体分子は、免疫グロブリン分子の任意のタイプ(例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、およびIgY)、クラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2など)、またはサブクラスのものでよい。
本明細書で使用する「重鎖部分」という用語は、免疫グロブリン重鎖に由来するアミノ酸配列を含む。重鎖部分を含むポリペプチドは、CH1ドメイン、ヒンジ(例えば、上部ヒンジ領域、中央ヒンジ領域、および/または下部ヒンジ領域)ドメイン、CH2ドメイン、CH3ドメイン、またはその変種もしくは断片の少なくとも1つを含む。例えば、本発明において使用するための結合ポリペプチドは、CH1ドメインを含むポリペプチド鎖;CH1ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部、およびCH2ドメインを含むポリペプチド鎖;CH1ドメインおよびCH3ドメインを含むポリペプチド鎖;CH1ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部、およびCH3ドメインを含むポリペプチド鎖、またはCH1ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部、CH2ドメイン、およびCH3ドメインを含むポリペプチド鎖を含んでもよい。別の態様において、本発明のポリペプチドは、CH3ドメインを含むポリペプチド鎖を含む。さらに、本発明において使用するための結合ポリペプチドは、CH2ドメインの少なくとも一部(例えば、CH2ドメインの全てまたは一部)を欠いてもよい。前記で示したように、これらのドメイン(例えば、重鎖部分)は、アミノ酸配列の点で天然免疫グロブリン分子と異なるように改変されてもよいことが当業者に理解されるだろう。
本明細書において開示された、ある特定の抗CD100抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体において、多量体の1本のポリペプチド鎖の重鎖部分は、多量体の第2のポリペプチド鎖にある重鎖部分と同一である。または、本発明の重鎖部分含有単量体は同一でない。例えば、それぞれの単量体は、異なる標的結合部位、例えば、二重特異性抗体を形成する異なる標的結合部位を含んでもよい。
本明細書において開示された診断方法および処置方法において使用するための結合分子の重鎖部分は異なる免疫グロブリン分子に由来してもよい。例えば、ポリペプチドの重鎖部分は、IgG1分子に由来するCH1ドメインおよびIgG3分子に由来するヒンジ領域を含んでもよい。別の例では、重鎖部分は、一部がIgG1分子に由来し、一部がIgG3分子に由来するヒンジ領域を含んでもよい。別の例では、重鎖部分は、一部がIgG1分子に由来し、一部がIgG4分子に由来するキメラヒンジを含んでもよい。
本明細書で使用する「軽鎖部分」という用語は、免疫グロブリン軽鎖、例えば、κ軽鎖またはλ軽鎖に由来するアミノ酸配列を含む。好ましくは、軽鎖部分は、VLドメインまたはCLドメインの少なくとも1つを含む。
本明細書において開示された抗CD100抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体は、これらが認識または特異的に結合する、抗原、例えば、本明細書において開示された標的ポリペプチド(例えば、CD100)のエピトープまたは部分によって説明または特定されてもよい。抗体の抗原結合ドメインと特異的に相互作用する標的ポリペプチド部分が「エピトープ」または「抗原決定基」である。標的ポリペプチドは1個のエピトープを含んでもよく、典型的には少なくとも2個のエピトープを含み、抗原のサイズ、立体構造、およびタイプに応じて任意の数のエピトープを含むことができる。さらに、標的ポリペプチドにある「エピトープ」は非ポリペプチドエレメントでもよく、非ポリペプチドエレメントを含んでもよく、例えば、エピトープは炭水化物側鎖を含んでもよいことに留意すべきである。
抗体に対するペプチドエピトープまたはポリペプチドエピトープの最小サイズは約4〜5個のアミノ酸と考えられている。ペプチドエピトープまたはポリペプチドエピトープは、好ましくは少なくとも7個、より好ましくは少なくとも9個、最も好ましくは少なくとも約15〜約30個のアミノ酸を含有する。CDRは三次構造の形で抗原性のペプチドまたはポリペプチドを認識することができるので、エピトープを構成するアミノ酸は連続している必要はなく、場合によっては、同じペプチド鎖にさえなくてもよい。本発明の抗CD100抗体によって認識されるペプチドエピトープまたはポリペプチドエピトープは、CD100の少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、より好ましくは少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも15個、少なくとも20個、少なくとも25、または約15〜約30個の連続したまたは非連続のアミノ酸の配列を含有してもよい。
「特異的に結合する」とは、一般的に、抗体がその抗原結合ドメインを介してエピトープに結合することを意味し、結合が、抗原結合ドメインとエピトープとのある程度の相補性を必要とすることを意味する。この定義によれば、抗体は、ランダムな関連しないエピトープに結合するより容易に抗体の抗原結合ドメインを介してエピトープに結合する時に、エピトープに「特異的に結合する」と言われる。「特異性」という用語は、ある特定の抗体がある特定のエピトープに結合する相対親和性を評価するために本明細書において用いられる。例えば、抗体「A」は、ある特定のエピトープに対して抗体「B」より高い特異性を有すると考えられてもよく、抗体「A」は、関連エピトープ「D」より高い親和性でエピトープ「C」に結合すると言われてもよい。
「優先的に結合する」とは、関連した、類似の、相同の、または似ているエピトープにより容易に、抗体がエピトープに特異的に結合することを意味する。従って、ある特定のエピトープに「優先的に結合する」抗体は関連エピトープと交差反応することがあっても、このエピトープに結合する可能性が関連エピトープより高いだろう。
非限定的な例として、抗体は、第2のエピトープに対する抗体の解離定数(KD)より低いKDで第1のエピトープに結合すれば、第1のエピトープに優先的に結合するとみなすことができる。別の非限定的な例では、抗体は、第2のエピトープに対する抗体のKDより少なくとも1桁低い親和性で第1のエピトープに結合すれば、第1のエピトープに優先的に結合するとみなすことができる。別の非限定的な例では、抗体は、第2のエピトープに対する抗体のKDより少なくとも2桁低い親和性で第1のエピトープに結合すれば、第1のエピトープに優先的に結合するとみなすことができる。
別の非限定的な例では、抗体は、第2のエピトープに対する抗体のオフレートk(off)より低いオフレート(k(off))で第1のエピトープに結合すれば、第1のエピトープに優先的に結合するとみなすことができる。別の非限定的な例では、抗体は、第2のエピトープに対する抗体のk(off)より少なくとも1桁低い親和性で第1のエピトープに結合すれば、第1のエピトープに優先的に結合するとみなすことができる。別の非限定的な例では、抗体は、第2のエピトープに対する抗体のk(off)より少なくとも2桁低い親和性で第1のエピトープに結合すれば、第1のエピトープに優先的に結合するとみなすことができる。本明細書において開示された抗体または抗原結合断片、変種、もしくは誘導体は、5X10-2sec-1、10-2sec-1、5X10-3sec-1、もしくは10-3sec-1より低いオフレート(k(off))またはこれに等しいオフレート(k(off))で、本明細書において開示された標的ポリペプチド(例えば、CD100、例えば、ヒトCD100、マウスCD100、もしくはヒトCD100およびマウスCD100の両方)またはその断片もしくは変種に結合すると言うことができる。より好ましくは、本発明の抗体は、5X10-4sec-1、10-4sec-1、5X10-5sec-1、または10-5sec-1、5X10-6sec-1、10-6sec-1、5X10-7sec-1、もしくは10-7sec-1より低いオフレート(k(off)またはこれに等しいオフレート(k(off))で、本明細書において開示された標的ポリペプチド(例えば、CD100、例えば、ヒトCD100、マウスCD100、もしくはヒトCD100およびマウスCD100の両方)またはその断片もしくは変種に結合すると言うことができる。
本明細書において開示された抗体または抗原結合断片、変種、もしくは誘導体は、103M-1sec-1、5X103M-1sec-1、104M-1sec-1、もしくは5X104M-1sec-1より大きなオンレート(k(on)またはこれに等しいオンレート(k(on))で、本明細書において開示された標的ポリペプチド(例えば、CD100、例えば、ヒトCD100、マウスCD100、もしくはヒトCD100およびマウスCD100の両方)またはその断片もしくは変種に結合すると言うことができる。より好ましくは、本発明の抗体は、105M-1sec-1、5X105M-1sec-1、106M-1sec-1、または5X106M-1sec-1、もしくは107M-1sec-1より大きなオンレート(k(on)またはこれに等しいオンレート(k(on))で、本明細書において開示された標的ポリペプチド(例えば、CD100、例えば、ヒトCD100、マウスCD100、もしくはヒトCD100およびマウスCD100の両方)またはその断片もしくは変種に結合すると言うことができる。
抗体は、参照抗体とある特定のエピトープとの結合をある程度までブロックする範囲で、ある特定のエピトープに優先的に結合するのであれば、参照抗体とある特定のエピトープとの結合を競合阻害すると言われる。競合阻害は、当技術分野において公知の任意の方法、例えば、競合ELISAアッセイによって確かめることができる。抗体は、参照抗体とある特定のエピトープとの結合を、少なくとも90％、少なくとも80％、少なくとも70％、少なくとも60％、または少なくとも50％まで競合阻害すると言うことができる。
本明細書で使用する「親和性」という用語は、個々のエピトープと免疫グロブリン分子のCDRとの結合の強度の尺度を指す。例えば、Harlow et al. (1988) Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed.)27-28頁を参照されたい。本明細書で使用する「アビディティ」という用語は、免疫グロブリン集団と抗原との複合体の全安定性、すなわち、免疫グロブリン混合物と抗原との機能的な結合強度を指す。例えば、Harlowの29-34頁を参照されたい。アビディティは、集団内にある個々の免疫グロブリン分子と特定のエピトープとの親和性と関連し、免疫グロブリンおよび抗原の給合価とも関連している。例えば、二価モノクローナル抗体と、ポリマーなどの高反復エピトープ構造を有する抗原との相互作用は高アビディティの相互作用であるだろう。
本発明の抗CD100抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体はまた交差反応性によって説明または特定されることがある。本明細書で使用する「交差反応性」という用語は、ある抗原に特異的な抗体が第2の抗原と反応する能力を指す。これは、2種類の抗原性物質間の関連性を示す尺度である。従って、抗体は、その形成を誘導したエピトープ以外のエピトープに結合するのであれば交差反応性である。交差反応性エピトープは、一般的に、誘導エピトープと同じ相補的な構造特徴の多くを含み、場合によってはオリジナルより良好に実際に適合することがある。
例えば、ある特定の抗体は、参照エピトープと関連するが同一でないエピトープ、例えば、(当技術分野において公知の、および本明細書に記載の方法を用いて計算された時に)少なくとも95％、少なくとも90％、少なくとも85％、少なくとも80％、少なくとも75％、少なくとも70％、少なくとも65％、少なくとも60％、少なくとも55％、および少なくとも50％の同一性を有するエピトープに結合する点で、ある程度の交差反応性を有する。抗体は、参照エピトープと(当技術分野において公知の、および本明細書に記載の方法を用いて計算された時に)95％未満の、90％未満の、85％未満の、80％未満の、75％未満の、70％未満の、65％未満の、60％未満の、55％未満の、および50％未満の同一性を有するエピトープに結合しないのであれば、交差反応性がほとんど無いか、または全く無いと言うことができる。抗体は、ある特定のエピトープの他の類似体、オルソログ、またはホモログに結合しないのであれば、このエピトープに対して「高度に特異的」だと考えられ得る。
本発明の抗CD100結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片、変種もしくは誘導体はまた、本発明のポリペプチド、例えば、CD100、例えば、ヒトCD100、マウスCD100、またはヒトCD100およびマウスCD100の両方との結合親和性によって説明または特定されることがある。好ましい結合親和性には、解離定数すなわちKdが
Figure 0006059013
未満の結合親和性が含まれる。ある特定の態様において、本発明の抗CD100結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片は、約5×10-9〜約6×10-9のKdでヒトCD100に結合する。別の態様において、本発明の抗CD100結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片は、約1×10-9〜約2×10-9のKdでマウスCD100に結合する。
本発明の抗CD100抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体は「多重特異性」、例えば、二重特異性、三重特異性でもよく、さらに大きな多重特異性でもよい。これは、1種類または複数の種類の抗原(例えば、タンパク質)に存在する2種類のエピトープを同時に認識する、またはこれらに結合することを意味する。従って、抗CD100抗体が「単一特異性」か「多重特異性」、例えば、「二重特異性」かどうかは、結合ポリペプチドが反応する異なるエピトープの数を指している。多重特異性抗体は、本明細書に記載の標的ポリペプチドの異なるエピトープに対して特異性があってもよく、標的ポリペプチドならびに異種エピトープ、例えば、異種ポリペプチドまたは固体支持体材料に対して特異性があってもよい。
本明細書で使用する「結合価(valency)」という用語は、結合ポリペプチドまたはCD100結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片に存在する潜在的な結合ドメイン、例えば、抗原結合ドメインの数を指す。それぞれの結合ドメインは1つのエピトープに特異的に結合する。結合ポリペプチドまたはCD100結合分子が複数の結合ドメインを含む時には、それぞれの結合ドメインは同じエピトープに特異的に結合してもよく、2つの結合ドメインがある抗体については「二価単一特異性」と呼ばれ、異なるエピトープに特異的に結合してもよく、2つのドメインを有する抗体については「二価二重特異性」と呼ばれる。抗体またはその抗原結合断片はまた二重特異性であり、かつそれぞれの特異性について二価でもよい(「二重特異性四価抗体」と呼ばれる)。別の態様において、四価ミニボディまたはドメイン欠失抗体を作製することができる。
二重特異性二価抗体およびこれを作る方法は、例えば、米国特許第5,731,168号;同第5,807,706号;同第5,821,333号;ならびに米国特許出願公開第2003/020734号および同第2002/0155537号に記載されている。これらの全ての開示が参照により本明細書に組み入れられる。二重特異性四価抗体およびこれを作る方法は、例えば、WO02/096948およびWO00/44788に記載されている。これらの両方の開示が参照により本明細書に組み入れられる。概略については、PCT公報であるWO93/17715;WO92/08802;WO91/00360;WO92/05793; Tutt et al., J. Immunol. 147:60-69(1991);米国特許第4,474,893号;同第4,714,681号;同第4,925,648号;同第5,573,920号;同第5,601,819号;Kostelny et al., J. Immunol 148: 1547-1553(1992)を参照されたい
前記で示したように、様々な免疫グロブリンクラスの定常領域のサブユニット構造および三次元立体配置が周知である。本明細書で使用する「VHドメイン」という用語は免疫グロブリン重鎖のアミノ末端可変ドメインを含み、「CH1ドメイン」という用語は免疫グロブリン重鎖の最初の(最もアミノ末端側にある)定常領域ドメインを含む。CH1ドメインはVHドメインに隣接しており、免疫グロブリン重鎖分子のヒンジ領域のアミノ末端側にある。
本明細書で使用する「CH2ドメイン」という用語は、例えば、従来の番号付けの手法を用いて抗体の約残基244〜残基360(残基244〜360、Kabatナンバリングシステム;および残基231〜340、EUナンバリングシステム;Kabat EA et al.を参照されたい)に及ぶ重鎖分子部分を含む。CH2ドメインは、別のドメインと接近して対になっていない点で独特である。もっと正確に言うと、インタクトな自然IgG分子の2つのCH2ドメインの間に2本のN結合型の分枝した炭水化物鎖が配置されている。CH3ドメインはCH2ドメインからIgG分子のC末端に及んでおり、約108個の残基を含むことも詳細に記録が残されている。
本明細書で使用する「ヒンジ領域」という用語は、CH1ドメインとCH2ドメインをつなぐ重鎖分子部分を含む。このヒンジ領域は約25個の残基を含み、可動性がある。従って、2つのN末端抗原結合領域は独立して動くことができる。ヒンジ領域は、3つの特異なドメイン:上部ヒンジ領域、中央ヒンジ領域、および下部ヒンジ領域にさらに分けることができる(Roux et al., J. Immunol. 161:4083(1998))。
本明細書で使用する「ジスルフィド結合」という用語は、2個の硫黄原子間で形成された共有結合を含む。アミノ酸システインは、ジスルフィド結合を形成するか、もう1つのチオール基と架橋することができるチオール基を構成する。ほとんどの天然IgG分子において、CH1領域およびCL領域はジスルフィド結合によって連結され、2本の重鎖は、Kabatナンバリングシステムを用いた場合、239および242に対応する位置(位置226または229、EUナンバリングシステム)にある2個のジスルフィド結合によって連結されている。
本明細書で使用する「キメラ抗体」という用語は、免疫反応性領域または免疫反応性部位が第1の種から得られているか、または由来し、定常領域が第2の種から得られている(インタクトでもよく、部分的なものでもよく、本発明に従って改変されてもよい)任意の抗体を意味すると考えられる。好ましい態様において、標的結合領域または標的結合部位は非ヒト供給源に由来し(例えば、マウスまたは霊長類)、定常領域はヒト(例えば、本明細書に記載のモノクローナル抗体(MAb)2368)である。
本明細書で使用する「操作された抗体」とは、重鎖もしくは軽鎖またはその両方における可変ドメインが、既知の特異性の抗体に由来する1つまたは複数のCDRの少なくとも部分的置換によって変えられ、必要に応じて、部分的なフレームワーク領域置換および配列変化によって変えられている抗体を指す。CDRは、フレームワーク領域が得られた抗体と同じクラスさらにはサブクラスの抗体に由来してもよいが、CDRは、異なるクラスの抗体から、好ましくは、異なる種に由来する抗体から得られると想定される。既知の特異性の非ヒト抗体に由来する1つまたは複数の「ドナー」CDRがヒト重鎖フレームワーク領域または軽鎖フレームワーク領域に移植されている操作された抗体は、本明細書において「ヒト化抗体」と呼ばれる。ある可変ドメインの抗原結合能力を別の可変ドメインに移すために、CDRの全てを、ドナー可変ドメインに由来する完全なCDRと交換することは必要でない場合がある。逆に、標的結合部位の活性を維持するのに必要な残基を移すことだけ必要な場合がある。
さらに、ヒト化抗体の重鎖もしくは軽鎖またはその両方における可変ドメインの中にあるフレームワーク領域がヒト由来残基しか含まない場合があることが認められており、この場合、ヒト化抗体のこれらのフレームワーク領域は「完全ヒトフレームワーク領域」と呼ばれる(例えば、MAb2503)。または、必要に応じて、正しい結合を維持するために、またはCD100抗原との結合を増強するために、ヒト化抗体の重鎖もしくは軽鎖またはその両方における可変ドメインのヒトフレームワーク領域の対応する位置の中にある、ドナー可変ドメインのフレームワーク領域の1つまたは複数の残基が操作されてもよい。従って、このように操作されているヒトフレームワーク領域は、ヒトフレームワーク残基およびドナーフレームワーク残基の混合物を含み、本明細書において「部分的ヒトフレームワーク領域」と呼ばれる。
例えば、抗CD100 抗体のヒト化は、本質的に、Winterおよび共同研究者(Jones et al., Nature 321:522-525(1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327(1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536(1988))の方法に従って、ヒト抗CD100抗体の対応する配列を、げっ歯類または変異体げっ歯類CDRまたはCDR配列で置換することによって行うことができる。参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,225,539号;同第5,585,089号;同第5,693,761号;同第5,693,762号;同第5,859,205号も参照されたい。結果として生じたヒト化抗CD100抗体は、ヒト化抗体の重鎖および/または軽鎖の可変ドメインの完全ヒトフレームワーク領域の中に少なくとも1つのげっ歯類CDRまたは変異体げっ歯類CDRを含むだろう。場合によっては、ヒト化抗CD100抗体の1つまたは複数の可変ドメインのフレームワーク領域の中にある残基は、対応する非ヒト(例えば、げっ歯類)残基によって交換される(例えば、米国特許第5,585,089号;同第5,693,761号;同第5,693,762号;および同第6,180,370号を参照されたい)。この場合、結果として生じたヒト化抗CD100抗体は、重鎖および/または軽鎖の可変ドメインの中に部分的ヒトフレームワーク領域を含むだろう。
さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体に見られない残基を含んでもよい。これらな改変は、抗体の性能をさらに改良するために(例えば、望ましい親和性を得るために)加えられる。一般的に、ヒト化抗体は、少なくとも1つの、および典型的に2つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ここで、CDRの全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのCDRに対応し、フレームワーク領域の全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のフレームワーク領域である。ヒト化抗体はまた、任意で、免疫グロブリン定常領域(Fc)の少なくとも一部、典型的には、ヒト免疫グロブリンの定常領域(Fc)の少なくとも一部も含む。さらなる詳細については、参照により本明細書に組み入れられる、Jones et al., Nature 331:522-525(1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329(1988);およびPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596(1992)を参照されたい。従って、このような「ヒト化」抗体は、インタクトなヒト可変ドメインより実質的に小さい配列が非ヒト種に由来する対応配列によって置換されている抗体を含んでもよい。実際には、ヒト化抗体は、典型的に、一部のCDR残基、場合によっては一部のフレームワーク残基が、げっ歯類抗体の類似部位に由来する残基によって置換されているヒト抗体である。例えば、米国特許第5,225,539号;第5,585,089号;第5,693,761号;第5,693,762号;第5,859,205号を参照されたい。ヒト化抗体および所定の抗原に対する親和性が改善したヒト化抗体を産生するための技法が開示されている、米国特許第6,180,370号および国際公開公報第01/27160号も参照されたい。
本明細書で使用する「連結した」、「融合した」、または「融合」という用語は同義に用いられる。これらの用語は、化学的結合または組換え手段を含むどんな手段でも、2つ以上の要素または成分を一緒に結び付けることを指す。「インフレーム融合」は、2つ以上のポリヌクレオチドオープンリーディングフレーム(ORF)を結び付けて、元のORFの正しい翻訳読み枠を維持するように、連続したさらに長いORFを形成することを指す。従って、組換え融合タンパク質は、元のORFによってコードされるポリペプチドに対応する2つ以上のセグメントを含有する1つのタンパク質である(これらのセグメントは、通常、天然では、このようにつながっていない)。従って、読み枠は融合セグメント全体を通して連続しているが、セグメントは、例えば、インフレームリンカー配列によって物理的または空間的に分離されてもよい。例えば、免疫グロブリン可変領域のCDRをコードするポリヌクレオチドはインフレームで融合しているが、「融合した」CDRが連続したポリペプチドの一部として同時翻訳される限り、少なくとも1つの免疫グロブリンフレームワーク領域またはさらなるCDR領域をコードするポリヌクレオチドによって分離されてもよい。
ポリペプチドの文脈において、「直線配列」または「配列」は、配列内で互いに隣接する残基がポリペプチドの一次構造において連続している、アミノ末端からカルボキシル末端方向へのポリペプチド内のアミノ酸の順序である。
本明細書で使用する「発現」という用語は、遺伝子が、生化学的因子、例えば、ポリペプチドを産生するプロセスを指す。このプロセスは、遺伝子ノックダウンならびに一過的発現および安定発現を含むが、それに限定されるわけではない、細胞内での遺伝子の機能的存在の現れを含む。「発現」は、遺伝子からメッセンジャーRNA(mRNA)への転写、およびこのようなmRNAからポリペプチドへの翻訳を含むが、それに限定されるわけではない。望ましい最終産物が生化学的因子であれば、発現は、この生化学的因子および任意の前駆体の生成を含む。遺伝子発現によって遺伝子産物が産生される。本明細書で使用する、遺伝子産物は、核酸、例えば、遺伝子の転写によって生成されるメッセンジャーRNAでもよく、転写物から翻訳されたポリペプチドでもよい。さらに、本明細書に記載の遺伝子産物は、転写後修飾、例えば、ポリアデニル化が加えられた核酸、または翻訳後修飾、例えば、メチル化、グリコシル化、脂質の付加、他のタンパク質サブユニットとの結合、タンパク質切断などが加えられたポリペプチドを含む。
本明細書で使用する「処置する」または「処置」という用語は、治療的処置および予防的処置または防止的処置の両方を指す。予防的処置もしくは防止的処置では、望ましくない生理学的変化または生理学的障害、例えば、多発性硬化症、関節炎、または癌の進行を阻止および/または遅らせる(弱める)ことを目的とする。有益なまたは望ましい臨床結果には、検出可能でも検出不可能でも、症状の軽減、疾患の程度の低下、疾患の安定した(すなわち、悪化していない)状態、疾患進行の遅延または減速、疾患状態の回復または寛解、および軽快(部分的または全面的)が含まれるが、これに限定されない。「処置」はまた、処置を受けていない場合の期待生存率と比較して生存期間を延ばすことも意味する。処置を必要とする人には、状態または障害に既に罹患している人、ならびに状態もしくは障害に罹患しやすい人、または状態もしくは障害を予防しようとする人が含まれる。
「被験体」または「個体」または「動物」または「患者」または「哺乳動物」とは、診断、予後、または療法が所望される任意の被験体、特に、哺乳動物被験体を意味する。哺乳動物被験体には、ヒト、家畜(domestic animal)、家畜(farm animal)、および動物園、スポーツ、またはペットの動物、例えば、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、乳牛などが含まれる。
本明細書で使用する「抗CD100抗体の投与から利益を得る被験体」および「処置を必要とする動物」という句は、例えば、抗CD100ポリペプチドの検出のために(例えば、診断法のために)および/または抗CD100抗体を用いた疾患の処置、すなわち寛解もしくは予防のために使用された抗CD100抗体の投与から利益を得る被験体、例えば、哺乳動物被験体を含む。本明細書においてさらに詳述するように、抗CD100抗体は非結合体の形で用いられてもよく、例えば、薬物、プロドラッグ、または同位体と結合されてもよい。
II.標的ポリペプチドの説明
本明細書で使用する「CD100」および「CD100ポリペプチド」という用語は同義に用いられる。ある特定の態様において、CD100は細胞表面に発現するか、または細胞によって分泌される。別の態様において、CD100は膜結合型である。別の態様において、CD100は、可溶型、例えば、sCD100である。別の態様において、CD100は、フルサイズCD100もしくはその断片またはCD100変種ポリペプチドを含んでもよく、CD100断片またはCD100変種ポリペプチドはフルサイズCD100の機能特性の一部または全てを保持している。
フルサイズのヒトCD100タンパク質は、2本の150kDaポリペプチド鎖からなるホモ二量体膜貫通タンパク質である。CD100は細胞表面受容体のセマフォリンファミリーに属し、SEMA4Dとも呼ばれる。ヒトおよびマウスSema4D/CD100はいずれもタンパク分解によって膜貫通型から切断されて、120kDa可溶型となる。このことは、2種類のSema4Dアイソフォームが存在することを示している(Kumanogoh et al., J. Cell Science 116(7):3464(2003))。セマフォリンは可溶型タンパク質および膜結合型タンパク質からなり、これらは、最初に、ニューロンとその適切な標的との正確な接続の確立において重要な役割を果たす軸索ガイダンス因子と定義された。CD100は、構造上、クラスIVセマフォリンとみなされており、アミノ末端シグナル配列に続いて17個の保存システイン残基を含有する特徴的な「Sema」ドメイン、Ig様ドメイン、リジンリッチ配列、疎水性膜貫通領域、および細胞質テールからなる。
CD100のそれぞれのポリペプチド鎖は、約13アミノ酸のシグナル配列に続いて、約512アミノ酸のセマフォリンドメイン、約65アミノ酸の免疫グロブリン様(Ig様)ドメイン、104アミノ酸のリジンリッチ配列、約19アミノ酸の疎水性膜貫通領域、および110アミノ酸の細胞質テールを含む。細胞質テールにあるコンセンサスチロシンリン酸化部位は、CD100とチロシンキナーゼとの予測された結合を裏付けている(Schlossman, et al., Eds.(1995) Leucocyte Typing V(Oxford University Press, Oxford)。
2つのタイプのCD100受容体が同定されている。受容体の1つがプレキシン-B1であり、非リンパ組織において発現し、高親和性(1nM)のCD100受容体であると示されている(Tamagnone et al., Cell 99:71-80(1999))。CD100によるプレキシンB1シグナル伝達刺激はニューロンの成長円錐崩壊を誘導し、オリゴデンドロサイトの突起伸長崩壊およびアポトーシスを誘導することが示されている(Giraudon et al., J. Immunol. 172:1246-1255(2004); Giraudon et al., NeuroMolecular Med. 7:207-216(2005))。CD100と結合した後に、プレキシンB1シグナル伝達はR-Rasの不活性化を媒介して、インテグリンを介した細胞外マトリクスとの接着を減少させ、Rhoを活性化して、細胞骨格の再編成による細胞崩壊を引き起こす。Kruger et al., Nature Rev. Mol. Cell Biol 6:789-800(2005); Pasterkamp, TRENDS in Cell Biology 15:61-64(2005))を参照されたい。
リンパ組織において、CD72は低親和性(300nM)CD100受容体として用いられる(Kumanogoh et al., Immunity 13:621-631(2000))。B細胞およびAPCはCD72を発現し、抗CD72抗体は、CD40誘導性B細胞応答の増強およびCD23のB細胞シェディングなどのsCD100と同じ作用の多くを有する。CD72は、多くの抑制性受容体と結合することができるチロシンホスファターゼSHP-1を補充することによってB細胞応答の負の制御因子として作用すると考えられている。CD100とCD72が相互作用するとSHP-1が解離し、この負の活性化シグナルが失われる。CD100は、インビトロでT細胞の刺激ならびにB細胞の凝集および生存を促進することが示されている。CD100発現細胞またはsCD100を添加すると、インビトロではCD40誘導性のB細胞増殖および免疫グロブリン産生が増強し、インビボでは抗体応答が促進する(Ishida et al., Inter. Immunol 15:1027-1034(2003); Kumanogoh and H. Kukutani, Trends in Immunol. 22:670-676(2001))。sCD100によって、補助刺激分子のアップレギュレーションおよびIL-12分泌の増大を含む、CD40誘導性のDC成熟が増強する。さらに、sCD100は免疫細胞遊走を阻害することができ、これは、抗CD100マウス遮断抗体を添加することによって逆転することができる(Elhabazi et al., J. Immunol. 166:4341-4347(2001); Delaire et al., J. Immunol. 166:4348-4354(2001))。
Sema4Dは、脾臓、胸腺、およびリンパ節を含むリンパ系器官において、ならびに脳、心臓、および腎臓などの非リンパ系器官において高レベルで発現している。リンパ系器官において、Sema4Dは休止T細胞において大量に発現しているが、休止B細胞および樹状細胞(DC)などの抗原提示細胞(APC)では弱く発現している。
細胞が活性化すると、CD100の表面発現ならびに可溶性CD100(sCD100)の生成が増大する。CD100の発現パターンは、CD100が免疫系において重要な生理学的役割ならびに病理学的役割を果たしていることを示唆している。CD100は、B細胞の活性化、凝集、および生存を促進する;CD40誘導性の増殖および抗体産生を増強する;T細胞依存性抗原に対する抗体応答を増強する;T細胞増殖を増大させる;樹状細胞成熟およびT細胞刺激能を増強することが示されており、脱髄および軸索変性に直接関与している(Shi et al., Immunity 13:633-642(2000); Kumanogoh et al., J Immunol 169:1175-1181(2002);およびWatanabe et al., J Immunol 167:4321-4328(2001))。
CD100ノックアウト(CD100-/-)マウスから、CD100は体液性免疫および細胞性免疫応答の両方で重要な役割を果たしているというさらなる証拠が得られている。CD100-/-マウスでは非リンパ組織の異常は知られていない。CD100-/-マウスに由来する樹状細胞(DC)は同種刺激(allostimulatory)能力が低く、補助刺激分子発現に欠陥があり、これはsCD100を添加することによってレスキューすることができる。CD100欠損マウス(CD100-/-)は、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質ペプチドによって誘導される実験的自己免疫脳脊髄炎を発症しない。なぜなら、CD100の非存在下ではミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質特異的T細胞は発生しないからである(Kumanogoh et al., J Immunol 169:1175-1181(2002))。多量の可溶性CD100が、自己免疫になりやすいMRL/lprマウス(SLEなどの全身自己免疫疾患のモデル)の血清中にも検出されるが、正常マウスでは検出されない。さらに、sCD100のレベルは自己抗体のレベルと相関関係があり、年齢と共に増加する(Wang et al., Blood 97:3498-3504(2001))。可溶性CD100はまた脱髄疾患患者の脳脊髄液および血清において蓄積することが示されており、sCD100はヒト多能性神経前駆細胞(Dev細胞)のアポトーシスを誘導し、インビトロでは突起伸長を阻害し、ラットオリゴデンドロサイトのアポトーシスを誘導する(Giraudon et al., J Immunol 172(2): 1246-1255(2004))。このアポトーシスは抗CD100 MAbによってブロックされた。
III.抗CD100抗体
CD100に結合する抗体が当技術分野において述べられている。例えば、米国特許出願公開第2008/0219971A1号、国際特許出願WO93/14125、およびHerold et al., Int. Immunol.7(1):1-8(1995)を参照されたい。これらはそれぞれその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
本発明の抗体は、CD100に結合する抗CD100抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体、例えば、MAb2503、MAb67、およびMAb76を含む。ある特定の態様において、抗CD100抗体は、ヒトCD100、マウスCD100、またはヒトCD100およびマウスCD100の両方に結合する。他の態様において、抗CD100抗体はCD100とその受容体、例えば、プレキシン-Bとの結合をブロックする。
1つの態様において、本発明は、モノクローナル抗体2503、67、または76と同じCD100エピトープに特異的に結合する、単離された結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片を提供する。別の態様において、本発明は、CD100に特異的に結合し、モノクローナル抗体2503、67、または76が、CD100、例えば、ヒトCD100、マウスCD100、またはヒトCD100およびマウスCD100の両方に特異的に結合するのを競合阻害する、単離された結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片を提供する。
ある特定の態様において、本発明の結合分子は、参照抗CD100抗体分子のアミノ酸配列と少なくとも約80％、約85％、約88％、約89％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、または約95％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。さらなる態様において、結合分子は、参照抗体と少なくとも約96％、約97％、約98％、約99％、または100％の配列同一性を有する。
別の態様において、本発明は、免疫グロブリン重鎖可変ドメイン(VHドメイン)を含む、免疫グロブリン重鎖可変ドメイン(VHドメイン)から本質的になる、または免疫グロブリン重鎖可変ドメイン(VHドメイン)からなる、単離された抗体またはその抗原結合断片を提供する。ここで、VHドメインのCDRの少なくとも1つは、SEQ ID NO:9またはSEQ ID NO:10のCDR1、CDR2、またはCDR3と少なくとも約80％、約85％、約90％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％、または同一であるアミノ酸配列を有する。
別の態様において、本発明は、免疫グロブリン重鎖可変ドメイン(VHドメイン)を含む、免疫グロブリン重鎖可変ドメイン(VHドメイン)から本質的になる、または免疫グロブリン重鎖可変ドメイン(VHドメイン)からなる、単離された抗体またはその抗原結合断片を提供する。ここで、VHドメインのCDRの少なくとも1つは、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、またはSEQ ID NO:8と少なくとも約80％、約85％、約90％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％、または同一であるアミノ酸配列を有する。
別の態様において、本発明は、免疫グロブリン重鎖可変ドメイン(VHドメイン)を含む、免疫グロブリン重鎖可変ドメイン(VHドメイン)から本質的になる、または免疫グロブリン重鎖可変ドメイン(VHドメイン)からなる、単離された抗体またはその抗原結合断片を提供する。ここで、VHドメインのCDRの少なくとも1つは、1個、2個、3個、4個、または5個の保存的アミノ酸置換を除いてSEQ ID NO:6、 SEQ ID NO:7、またはSEQ ID NO:8と同一であるアミノ酸配列を有する。
別の態様において、本発明は、SEQ ID NO:9またはSEQ ID NO:10と少なくとも約80％、約85％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％、または100％同一であるアミノ酸配列を有するVHドメインを含む、これから本質的になる、またはこれからなる、単離された抗体またはその抗原結合断片を提供する。ここで、抗CD100抗体は、CD100に特異的または優先的に結合する、コードされたVHドメインを含む。
別の態様において、本発明は、免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン(VLドメイン)を含む、免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン(VLドメイン)から本質的になる、または免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン(VLドメイン)からなる、単離された抗体またはその抗原結合断片を提供する。ここで、VLドメインのCDRの少なくとも1つは、SEQ ID NO:17またはSEQ ID NO:18のCDR1、CDR2、またはCDR3と少なくとも約80％、約85％、約90％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％、または同一であるアミノ酸配列を有する。
別の態様において、本発明は、免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン(VLドメイン)を含む、免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン(VLドメイン)から本質的になる、または免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン(VLドメイン)からなる、単離された抗体またはその抗原結合断片を提供する。ここで、VLドメインのCDRの少なくとも1つは、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、またはSEQ ID NO:16と少なくとも約80％、約85％、約90％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％、または同一であるアミノ酸配列を有する。
別の態様において、本発明は、免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン(VLドメイン)を含む、免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン(VLドメイン)から本質的になる、または免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン(VLドメイン)からなる、単離された抗体またはその抗原結合断片を提供する。ここで、VLドメインのCDRの少なくとも1つは、1個、2個、3個、4個、または5個の保存的アミノ酸置換を除いてSEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、またはSEQ ID NO:16と同一であるアミノ酸配列を有する。
さらなる態様において、本発明は、SEQ ID NO:17またはSEQ ID NO:18と少なくとも約80％、約85％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％、または100％同一であるアミノ酸配列を有するVLドメインを含む、これから本質的になる、またはこれからなる、単離された抗体またはその抗原結合断片を含む。ここで、抗CD100抗体は、CD100に特異的または優先的に結合する、コードされたVLドメインを含む。
本発明の方法において、本発明の抗CD100抗体の生物学的に活性のある適切な変種を使用することができる。このような変種は、親抗CD100抗体の望ましい結合特性を保持している。抗体変種を作製する方法は一般的に当技術分野において利用可能である。
変異誘発およびヌクレオチド配列変化を加える方法は当技術分野において周知である。例えば、Walker and Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York); Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492 (1985); Kunkel et al., Methods Enzymol. 154:367-382 (1987); Sambrook et al.(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, N.Y.);米国特許第4,873,192号;およびこれらの中で引用された参考文献を参照されたい。これらは参照により本明細書に組み入れられる。関心対象のポリペプチドの生物学的活性に影響を及ぼさない適切なアミノ酸置換に関するガイダンスは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Dayhoff et al. (1978) in Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D. C), pp. 345-352のモデルの中に見つけることができる。Dayhoff et al.のモデルでは、適切な保存的アミノ酸置換を確かめるためにポイントアクセプティッドミューテーション(Point Accepted Mutation)(PAM)アミノ酸類似性マトリクス（PAM250マトリクス）を用いる。保存的置換、例えば、あるアミノ酸から類似の特性を有する別のアミノ酸への交換が好ましいことがある。Dayhoff et al.のモデルのPAM250マトリクスによって開示される保存的アミノ酸置換の例には、
Figure 0006059013
が含まれるが、これに限定されない。
抗CD100結合分子、例えば、関心対象の抗体またはその抗原結合断片、ポリペプチドの変種の構築の際に、変種が望ましい特性を有し続けるように、例えば、CD100、例えば、ヒトCD100、マウスCD100、またはヒトCD100およびマウスCD100の両方、例えば、細胞表面に発現しているCD100または細胞によって分泌されたCD100に特異的に結合することができ、かつ本明細書に記載のようにCD100ブロッキング活性を有するように、改変が加えられる。明らかに、変種ポリペプチドをコードするDNAにおいてなされるどの変異も配列を読み枠から外してはならず、好ましくは、mRNA二次構造を生じ得る相補領域を作り出さない。EP特許出願公開第75,444号を参照されたい。
抗CD100結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片の結合特異性を測定する方法には、標準的な競合的結合アッセイ、T細胞またはB細胞による免疫グロブリン分泌をモニタリングするアッセイ、T細胞増殖アッセイ、アポトーシスアッセイ、ELISAアッセイなどが含まれるが、これに限定されない。例えば、WO93/14125; Shi et al., Immunity 13:633-642(2000); Kumanogoh et al., J Immunol 169:1175-1181(2002); Watanabe et al., J Immunol 167:4321-4328(2001); Wang et al., Blood 97:3498-3504(2001);およびGiraudon et al., J Immunol 172(2):1246-1255(2004)に開示されている、このようなアッセイを参照されたい。これらは全て参照により本明細書に組み入れられる。
本明細書において開示された定常領域、CDR、VHドメイン、またはVLドメインを含む、任意の特定のポリペプチドが、別のポリペプチドと少なくとも約65％、約70％、約75％、約80％、約85％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％、さらには約100％同一かどうかについて本明細書で論じている場合には、BESTFITプログラム(Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wis. 53711)などがあるが、これに限定されない当技術分野において公知の方法およびコンピュータプログラム/ソフトウェアを用いて、％同一性を求めることができる。BESTFITでは、2つの配列間の最も良い相同性セグメントを見つけるためにSmith and Waterman(1981) Adv. Appl. Math. 2:482-489の局所相同性アルゴリズムを用いる。特定の配列が、例えば、本発明の参照配列と95％同一かどうか確かめるためにBESTFITまたは他の任意の配列アラインメントプログラムを使用した場合、パラメータは、もちろん、参照ポリペプチド配列の完全長にわたって同一性パーセントが計算され、参照配列におけるアミノ酸総数の5％までの相同性ギャップが許容されるように設定される。
本発明の目的のために、パーセント配列同一性は、Smith-Waterman相同性検索アルゴリズムを使用し、アフィンギャップ(affine gap)検索とギャップオープンペナルティ12およびギャップ延長ペナルティ2、BLOSUMマトリクス62を用いて求めることができる。Smith-Waterman相同性検索アルゴリズムは、Smith and Waterman(1981) Adv. Appl. Math. 2:482-489において開示されている。変種は、例えば、参照抗CD100抗体(例えば、MAb2503、67または76)と、1〜15アミノ酸残基と少ないアミノ酸残基分だけ、6〜10アミノ酸残基などの1〜10アミノ酸残基、5アミノ酸残基、4アミノ酸残基、3アミノ酸残基、2アミノ酸残基、さらには1アミノ酸残基と少ないアミノ酸残基分だけ異なってもよい。
CD100に特異的に結合することができ、望ましいCD100ブロッキング活性を保持することができるポリペプチドの正確な化学構造は多くの要因によって決まる。この分子にイオン化可能なアミノ基およびカルボキシル基が存在する時には、特定のポリペプチドは酸性塩もしくは塩基性塩の形または中性型として得ることができる。生物学的活性を保持しているこのような調製物は全て適切な環境条件に置かれた時に、本明細書で使用する抗CD100抗体の定義の中に含まれる。さらに、ポリペプチドの一次アミノ酸配列は、糖部分を用いた誘導体化(グリコシル化)、または脂質基、リン酸基、アセチル基などの他の補足分子によって増強されてもよい。ポリペプチドの一次アミノ酸配列はまた糖類との結合によって増強されてもよい。このような増強のある特定の局面は、産生宿主の翻訳後プロセシング系を介して達成される。他のこのような改変がインビトロで導入されてもよい。どの事象においても、抗CD100抗体の望ましい特性が破壊されていない限り、このような改変は、本明細書において用いられる抗CD100抗体の定義の中に含まれる。このような改変は、様々なアッセイにおいて、ポリペプチドの活性を増やすまたは減らすことによって定量的または定性的に活性に影響を及ぼし得ると予想される。さらに、鎖の中の個々のアミノ酸残基が酸化、還元、または他の誘導体化によって改変されてもよく、活性を保持している断片を得るようにポリペプチドが切断されてもよい。望ましい特性(例えば、CD100に対する結合特異性、結合親和性、およびCD100ブロッキング活性)を破壊しないこのような変化は、本明細書で使用する関心対象の抗CD100抗体の定義からポリペプチド配列を排除しない。
当技術分野では、ポリペプチド変種の調製および使用に関する、内容のあるガイダンスを提供している。抗CD100結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片、変種の調製の際に、当業者であれば、自然タンパク質のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列に対するどの改変が、本発明の方法において用いられる薬学的組成物の治療活性成分として使用するのに適した変種をもたらすか容易に決定することができる。
抗CD100抗体の定常領域は、多くのやり方でエフェクター機能を変えるように変異することができる。例えば、米国特許第6,737,056B1および米国特許出願公開第2004/0132101A1号を参照されたい。これらは、Fc受容体との抗体結合を最適化するFc変異を開示している。
ある特定の抗CD100抗体において、Fc部分は、当技術分野において公知の技法を用いてエフェクター機能を弱めるように変異することができる。例えば、(点変異または他の手段によって)定常領域ドメインが欠失または不活性化すると、改変された循環抗体のFc受容体結合が低下し、それによって、腫瘍局在化が増大し得る。他の場合では、本発明と一致する、定常領域の改変は補体結合を緩和し、従って、血清半減期を短くし、結合した細胞毒の非特異的結合を弱めるかもしれない。定常領域のさらに他の改変を用いて、ジスルフィド結合またはオリゴ糖部分を改変することができる。ジスルフィド結合またはオリゴ糖部分が改変すると、抗原特異性または抗体可動性が増大することにより局在化が増大する。改変の結果として生じた生理学的プロファイル、バイオアベイラビリティ、および他の生化学的作用、例えば、腫瘍局在化、生体内分布、および血清半減期は、過度の実験なく、周知の免疫学的技法を用いて容易に測定および定量することができる。
本発明の抗CD100抗体はまた、改変された誘導体、例えば、共有結合によって抗体とそのコグネイトエピトープとの特異的な結合が妨げられないように、任意のタイプの分子を抗体に共有結合することによって改変された誘導体を含む。例えば、限定されるわけではないが、抗体誘導体は、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、公知の保護基/ブロック基による誘導体化、タンパク質切断、細胞リガンドまたは他のタンパク質との連結などによって改変されている抗体を含む。特異的な化学切断、アセチル化、ホルミル化などを含むが、これに限定されない公知の技法によって、非常に多くの化学修飾のうちどれでも行うことができる。さらに、誘導体は1つまたは複数の非古典的アミノ酸を含有してもよい。
「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が、電荷が似ている側鎖を有するアミノ酸残基と交換される置換である。電荷が似ている側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当技術分野において定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖を有するアミノ酸(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、無電荷極性側鎖を有するアミノ酸(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖を有するアミノ酸(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、β分枝側鎖を有するアミノ酸(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)、および芳香族側鎖を有するアミノ酸(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)が含まれる。または、変異は、例えば、飽和変異誘発によってコード配列の全てまたは一部に沿ってランダムに導入することができ、活性(例えば、抗CD100ポリペプチドに結合する能力)を保持している変異体を特定するために、結果として得られた変異体の生物学的活性をスクリーニングすることができる。
例えば、抗体分子のフレームワーク領域にのみ、または抗体分子のCDR領域にのみ変異を導入することが可能である。導入される変異はサイレントまたは中立のミスセンス変異でもよく、すなわち、抗体の抗原結合能に影響を及ぼさなくてもよく、ほとんど影響を及ぼさなくてもよい。これらのタイプの変異は、コドン使用頻度を最適化するのに、またはハイブリドーマの抗体産生を改善するのに有用であり得る。または、中立でないミスセンス変異は、抗体の抗原結合能を変えることがある。最もサイレントかつ中立のミスセンス変異の位置はフレームワーク領域にある可能性が高いのに対して、最も中立でないミスセンス変異の位置はCDRにある可能性が高いが、これは絶対条件でない。当業者であれば、抗原結合活性の変化なし、または結合活性の変化あり(例えば、抗原結合活性の改善もしくは抗体特異性の変化)などの望ましい特性を有する変異体分子を設計および試験することができるだろう。変異誘発後に、コードされるタンパク質は日常的に発現させることができ、コードされるタンパク質の機能活性および/または生物学的活性(例えば、CD100ポリペプチドの少なくとも1つのエピトープに免疫特異的に結合する能力)は、本明細書に記載の技法を用いて、または当技術分野において公知の技法を日常的に変更することによって確かめることができる。
ある特定の態様において、本発明の抗CD100抗体は、少なくとも1つの最適化された相補性決定領域(CDR)を含む。「最適化されたCDR」とは、CDRが、最適化されたCDRを含む抗CD100抗体に付与される持続性のもしくは改善された結合親和性および/または抗CD100活性に基づいて改変および最適化されていることを意味する。「抗CD100活性」または「CD100ブロッキング活性」は、CD100に関連した以下の活性:B細胞の活性化、凝集、および生存;CD40誘導性の増殖および抗体産生;T細胞依存性抗原に対する抗体応答;T細胞もしくは他の免疫細胞の増殖;樹状細胞の成熟;脱髄および軸索変性;多能性神経前駆細胞および/もしくはオリゴデンドロサイトのアポトーシス;内皮細胞遊走の誘導;自発性単球遊走の阻害;細胞表面プレキシンB1との結合;または可溶性CD100もしくはCD100+細胞表面に発現しているCD100に関連した他の任意の活性の1つまたは複数を調節する活性を含んでもよい。抗CD100活性はまた、ある特定のタイプのリンパ腫、自己免疫疾患、中枢神経系(CNS)炎症疾患および末梢神経系(PNS)炎症疾患を含む炎症疾患、移植片拒絶、ならびに浸潤性血管形成を含むが、これに限定されない、CD100発現に関連した疾患の発生率または重篤度の低下に起因し得る。マウス抗CD100 MAb BD16およびBB18に基づく最適化抗体の例は、米国特許出願公開第2008/0219971A1号、国際特許出願WO93/14125、およびHerold et al., Int. Immunol. 7(1):1-8(1995)に記載された。これらはそれぞれその全体が、参照により本明細書に組み入れられる。これらの改変は、抗CD100抗体がCD100抗原に対する特異性を保持し、結合親和性および/または抗CD100活性が改善するような、CDRの中のアミノ酸残基の交換を含んでもよい。
IV.抗CD100抗体をコードするポリヌクレオチド
本発明はまた、本発明の抗CD100抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体をコードする核酸分子を提供する。
1つの態様において、本発明は、免疫グロブリン重鎖可変ドメイン(VHドメイン)をコードする核酸を含む、これから本質的になる、またはこれからなる、単離されたポリヌクレオチドを提供する。ここで、VHドメインのCDRの少なくとも1つは、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、またはSEQ ID NO:5からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列と少なくとも約80％、約85％、約90％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％、または同一であるアミノ酸配列を有する。
他の態様において、本発明は、免疫グロブリンVHドメインをコードする核酸を含む、これから本質的になる、またはこれからなる、単離されたポリヌクレオチドを提供する。ここで、VHドメインのCDRの少なくとも1つは、(a)SEQ ID NO:6に示したアミノ酸配列を含むCDR1;(b)SEQ ID NO:7に示したアミノ酸配列を含むCDR2;および(c)SEQ ID NO:8に示したアミノ酸配列を含むCDR3からなる群より選択される。
さらなる態様において、本発明は、SEQ ID NO:9またはSEQ ID NO:10を含む参照VHドメインポリペプチド配列と少なくとも約80％、約85％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％、または100％同一であるアミノ酸配列を有する、VHドメインをコードする核酸を含む、これから本質的になる、またはこれからなる、単離されたポリヌクレオチドを含む。ここで、コードされるVHドメインを含む抗CD100抗体はCD100に特異的または優先的に結合する。
1つの態様において、本発明は、免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン(VLドメイン)をコードする核酸を含む、これから本質的になる、またはこれからなる、単離されたポリヌクレオチドを提供する。ここで、VLドメインのCDRの少なくとも1つは、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、およびSEQ ID NO:13からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列と少なくとも約80％、約85％、約90％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％、または同一であるアミノ酸配列を有する。
他の態様において、本発明は、免疫グロブリンVLドメインをコードする核酸を含む、これから本質的になる、またはこれからなる、単離されたポリヌクレオチドを提供する。ここで、VLドメインのCDRの少なくとも1つは、(a)SEQ ID NO:14に示したアミノ酸配列を含むCDR1;(b)SEQ ID NO:15に示したアミノ酸配列を含むCDR2;および(c)SEQ ID NO:16に示したアミノ酸配列を含むCDR3からなる群より選択される。
さらなる態様において、本発明は、SEQ ID NO:17またはSEQ ID NO:18を含む参照VLドメインポリペプチド配列と少なくとも約80％、約85％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％、または100％同一であるアミノ酸配列を有するVLドメインをコードする核酸を含む、これから本質的になる、またはこれからなる、単離されたポリヌクレオチドを含む。ここで、コードされるVLドメインを含む抗CD100抗体はCD100に特異的または優先的に結合する。
前記のポリヌクレオチドはいずれも、例えば、コードされるポリペプチドの分泌を誘導するシグナルペプチド、本明細書に記載の抗体定常領域、または本明細書に記載の他の異種ポリペプチドをコードする、さらなる核酸をさらに含んでもよい。また、本明細書の他の場所においてさらに詳細に議論するように、本発明は、前記のポリヌクレオチドの1つまたは複数を含む組成物を含む。
1つの態様において、本発明は、本明細書に記載のVHドメインをコードする第1のポリヌクレオチド、および本明細書に記載のVLドメインをコードする第2のポリヌクレオチドを含む組成物を含む。具体的には、SEQ ID NO:19もしくはSEQ ID NO:20に示したVHドメインコードポリヌクレオチド、ならびにVLドメインコードポリヌクレオチド、例えば、SEQ ID NO:21もしくはSEQ ID NO:22に示したVLドメインコードポリヌクレオチドを含むか、またはこれらから本質的になるか、またはこれらからなる組成物。
本発明はまた、他の場所に記載の本発明のポリヌクレオチドの断片を含む。さらに、本明細書に記載の融合ポリポリペプチド(polypolypeptide)、Fab断片、および他の誘導体をコードするポリヌクレオチドも本発明によって意図される。
ポリヌクレオチドは、当技術分野において公知の任意の方法によって生成または製造することができる。例えば、抗体のヌクレオチド配列が既知であれば、(例えば、Kutmeier et al., Bio Techniques 17:242(1994)に記載のように)化学合成されたオリゴヌクレオチドから、抗体をコードするポリヌクレオチドを構築することができる。これは、簡単に述べると、抗体をコードする配列の一部を含有する重複オリゴヌクレオチドを合成する工程、これらのオリゴヌクレオチドをアニールおよび連結する工程、次いで、連結されたオリゴヌクレオチドをPCRによって増幅する工程を含む。
または、本発明の抗CD100抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドは適切な供給源に由来する核酸から作製することができる。特定の抗体をコードする核酸を含有するクローンを利用できないが、抗体分子の配列が既知であれば、抗体をコードする核酸は化学合成されてもよく、適切な供給源(例えば、抗体cDNAライブラリー、あるいは抗体もしくは他の抗CD100抗体を発現する任意の組織もしくは細胞、例えば、抗体を発現するように選択されたハイブリドーマ細胞から作製したcDNAライブラリー、または抗体もしくは他の抗CD100抗体を発現する任意の組織もしくは細胞、例えば、抗体を発現するように選択されたハイブリドーマ細胞から単離した核酸、好ましくは、ポリA+RNA)から、配列の3'末端および5'末端にハイブリダイズ可能な合成プライマーを用いたPCR増幅によって、または、例えば、抗体もしくは他の抗CD100抗体をコードするcDNAライブラリーからcDNAクローンを同定するために特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを用いたクローニングによって得られてもよい。次いで、PCRによって生成された増幅核酸は、当技術分野において周知の任意の方法を用いて、複製可能なクローニングベクターにクローニングすることができる。
抗CD100抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列が決定されたら、異なるアミノ酸配列を有する抗体を作製するように、例えば、アミノ酸置換、欠失、および/または挿入を作り出すように、ヌクレオチド配列を操作する当技術分野において周知の方法、例えば、組換えDNA法、部位特異的変異誘発、PCRなどを用いて、そのヌクレオチド配列を操作することができる(例えば、Sambrook et al.(1990) Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd ed.; Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y.およびAusubel et al., eds. (1998) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, NY)に記載の技法を参照されたい。これらは両方ともその全体が参照により本明細書に組み入れられる)。
抗CD100結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドは、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドからなってよい。ポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドは非改変RNAまたは非改変DNAでもよく、改変RNAまたは改変DNAでもよい。例えば、抗CD100抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドは、一本鎖DNAおよび二本鎖DNA、一本鎖領域および二本鎖領域の混合物であるDNA、一本鎖RNAおよび二本鎖RNA、ならびに一本鎖領域および二本鎖領域の混合物であるRNA、一本鎖、より典型的には二本鎖、または一本鎖領域および二本鎖領域の混合物でもよいDNAおよびRNAを含むハイブリッド分子からなってもよい。さらに、抗CD100結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドは、RNAもしくはDNAまたはRNAおよびDNAの両方を含む三重鎖領域からなってもよい。抗CD100結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドはまた、1つまたは複数の修飾塩基、または安定になるように改変された、もしくは他の理由で改変されたDNA骨格もしくはRNA骨格を含有してもよい。「修飾」塩基には、例えば、トリチル化塩基およびイノシンなどの珍しい塩基が含まれる。DNAおよびRNAに様々な改変を加えることができる。従って、「ポリヌクレオチド」は、化学的、酵素的、または代謝的に改変された型を包含する。
免疫グロブリン(例えば、免疫グロブリン重鎖部分または軽鎖部分)に由来するポリペプチドの非天然変種をコードする単離されたポリヌクレオチドは、1つまたは複数のアミノ酸置換、付加、または欠失がコードタンパク質に導入されるように、免疫グロブリンのヌクレオチド配列に1つまたは複数のヌクレオチド置換、付加、または欠失を導入することによって作り出すことができる。部位特異的変異誘発およびPCRを介した変異誘発などの標準的な技法によって変異を導入することができる。好ましくは、保存的アミノ酸置換は1つまたは複数の非必須アミノ酸残基においてなされる。
V.融合タンパク質および抗体結合体
本明細書の他の場所においてさらに詳細に議論するように、抗CD100結合分子、例えば、本発明の抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体は、さらに、N末端またはC末端において異種ポリペプチドと組換えにより融合されてもよく、ポリペプチドまたは他の組成物と化学的に結合されてもよい(共有結合および非共有結合による結合を含む)。例えば、抗CD100抗体は、検出アッセイにおける標識として有用な分子およびエフェクター分子、例えば、異種ポリペプチド、薬物、放射性核種、または毒素と組換えにより融合されてもよく、結合されてもよい。例えば、PCT国際公開公報第92/08495号;同第91/14438号;同第89/12624号;米国特許第5,314,995号;およびEP396,387を参照されたい。
本発明の抗CD100抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体は、改変された誘導体、すなわち、共有結合によって抗体と抗CD100との結合が妨げられないように、任意のタイプの分子を抗体に共有結合することによって改変された誘導体を含んでもよい。例えば、限定されるわけではないが、抗体誘導体は、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、公知の保護基/ブロック基による誘導体化、タンパク質切断、細胞リガンドまたは他のタンパク質との連結などによって改変されている抗体を含む。特異的な化学切断、アセチル化、ホルミル化などを含むが、これに限定されない公知の技法によって、非常に多くの化学修飾のうちどれでも行うことができる。さらに、誘導体は1つまたは複数の非古典的アミノ酸を含有してもよい。
抗CD100結合分子、例えば、本発明の抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体は、ペプチド結合または改変されたペプチド結合、すなわち、ペプチドアイソスターによって互いにつながったアミノ酸からなってもよく、遺伝子によってコードされる20種類のアミノ酸以外のアミノ酸を含有してもよい。例えば、抗CD100抗体は、翻訳後プロセシングなどの天然プロセスによって改変されてもよく、当技術分野において周知の化学修飾法によって改変されてもよい。このような改変は、基本的な教科書およびさらに詳しい研究書ならびに膨大な研究論文において詳細に説明されている。ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、およびアミノ末端またはカルボキシル末端を含む抗CD100結合分子のどの場所にでも、または炭水化物などの部分に改変を加えることができる。ある特定の抗CD100結合分子の中のいくつかの部位において同程度または様々な程度で、同じタイプの改変が存在してもよいことが理解されるだろう。または、ある特定の抗CD100結合分子は多くのタイプの改変を含有してもよい。抗CD100結合分子は分枝していてもよく、例えば、ユビキチン結合の結果として分枝していてもよく、分枝して、または分枝することなく環状になっていてもよい。環状、分枝、および分枝環状の抗CD100結合分子は翻訳後天然プロセスから得られてもよく、合成法によって作製されてもよい。改変には、アセチル化、アシル化、ADP-リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトール(phosphotidylinositol)の共有結合、架橋結合、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γ-カルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、タンパク質へのトランスファーRNAを介したアミノ酸付加、例えば、アルギニル化、およびユビキチン結合が含まれる。(例えば、Proteins--Structure and Molecular Properties, T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, NY; 2nd ed.(1993); Johnson, ed.(1983) Posttranslational Covalent Modification of Proteins (Academic Press, NY), pgs. 1-12; Seifter et al., Meth. Enzymol. 182:626-646 (1990); Rattan et al., Ann. NY Acad. Sci. 663:48-62(1992)を参照されたい)。
本発明はまた、抗CD100抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体および異種ポリペプチドを含む、融合タンパク質も提供する。抗体と融合する異種ポリペプチドは機能に有用なものでもよく、または抗CD100ポリペプチド発現細胞を標的化するのに有用である。
1つの態様において、本発明の融合タンパク質は、本発明の抗体のVHドメインのいずれか1つもしくは複数のアミノ酸配列または本発明の抗体のVLドメインのいずれか1つもしくは複数のアミノ酸配列、あるいはその断片または変種、および異種ポリペプチド配列を有するポリペプチドを含むか、これから本質的になるか、またはこれからなる。
別の態様において、本明細書において開示された診断方法および処置方法において使用するための融合タンパク質は、抗CD100抗体、またはその断片、変種、もしくは誘導体のVHドメインのCDRのいずれか1つ、2つ、または3つのアミノ酸配列、あるいは抗CD100抗体、またはその断片、変種、もしくは誘導体のVLドメインのCDRのいずれか1つ、2つ、または3つのアミノ酸配列、および異種ポリペプチド配列を有するポリペプチドを含むか、これから本質的になるか、またはこれからなる。1つの態様において、融合タンパク質は、本発明の抗CD100抗体の少なくとも1つのVHドメインのアミノ酸配列、および本発明の抗CD100抗体またはその断片、誘導体、もしくは変種の少なくとも1つのVLドメインのアミノ酸配列、ならびに異種ポリペプチド配列を有するポリペプチドを含む。好ましくは、融合タンパク質のVHドメインおよびVLドメインは、CD100の少なくとも1つのエピトープに特異的に結合する単一供給源の抗体(またはscFvもしくはFab断片)に対応する。さらに別の態様において、本明細書において開示された診断方法および処置方法において使用するための融合タンパク質は、抗CD100抗体のVHドメインのCDRのいずれか1つ、2つ、3つ以上のアミノ酸配列、および抗CD100抗体またはその断片もしくは変種のVLドメインのCDRのいずれか1つ、2つ、3つ以上のアミノ酸配列、ならびに異種ポリペプチド配列を有するポリペプチドを含む。好ましくは、VHドメインまたはVLドメインの2つ、3つ、4つ、5つ、6つ以上のCDRは本発明の単一供給源の抗体(またはscFvもしくはFab断片)に対応する。これらの融合タンパク質をコードする核酸分子も本発明に含まれる。
文献において報告された例示的な融合タンパク質には、T細胞受容体(Gascoigne et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:2936-2940 (1987));CD4(Capon et al., Nature 337:525-531(1989); Traunecker et al., Nature 339:68-70(1989); Zettmeissl et al., DNA Cell Biol. USA 9:347-353(1990);およびByrn et al., Nature 344:661-670(1990));L-セレクチン(ホーミング受容体)(Watson et al., J. Cell. Biol. 110:2221-2229(1990);およびWatson et al., Nature 349:164-167(1991));CD44(Aruffo et al., Cell 61:1303-1313(1990));CD28およびB7(Linsley et al., J. Exp. Med. 173:721-730(1991));CTLA-4(Lisley et al., J. Exp. Med. 174:561-569(1991));CD22(Stamenkovic et al., Cell 66:1133-1144(1991));TNF受容体(Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10535-10539(1991); Lesslauer et al., Eur. J. Immunol. 27:2883-2886(1991);およびPeppel et al., J. Exp. Med. 174:1483-1489(1991));ならびにIgE受容体a(Ridgway and Gorman, J. Cell. Biol. Vol. 115, Abstract No. 1448(1991))の融合が含まれる。
本明細書の他の場所において議論するように、ポリペプチドのインビボ半減期を延ばすために、または当技術分野において公知の方法を用いてイムノアッセイにおいて使用するために、抗CD100結合分子、例えば、本発明の抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体は異種ポリペプチドと融合されてもよい。例えば、1つの態様において、本発明の抗CD100抗体のインビボ半減期を延ばすために、PEGを本発明の抗CD100抗体と結合することができる。Leong et al., Cytokine 16:106(2001); Adv. in Drug Deliv. Rev. 54:531(2002);またはWeir et al., Biochem. Soc. Transactions 30:512(2002)を参照されたい。
さらに、抗CD100結合分子、例えば、本発明の抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体の精製または検出を容易にするために、抗CD100結合分子、例えば、本発明の抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体を、ペプチドなどのマーカー配列と融合することができる。好ましい態様において、マーカーアミノ酸配列は、ヘキサヒスチジンペプチド、例えば、特に、pQEベクター(QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, Calif., 91311)の中に入れて提供されているタグである。マーカーアミノ酸配列の多くは市販されている。Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824(1989)に記載のように、例えば、ヘキサヒスチジンを用いると融合タンパク質が便利に精製される。精製に有用な他のペプチドタグには、インフルエンザ血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに対応する「HA」タグ(Wilson et al., Cell 37:767(1984))および「flag」タグが含まれるが、これに限定されない。
融合タンパク質は当技術分野において周知の方法を用いて調製することができる(例えば、米国特許第5,116,964号および同第5,225,538号を参照されたい)。融合がなされる正確な部位は、融合タンパク質の分泌または結合特性を最適化するように経験的に選択することができる。次いで、発現のために、融合タンパク質をコードするDNAを宿主細胞に導入する。
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抗CD100結合分子、例えば、本発明の抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体は非結合型で用いられてもよく、様々な分子、例えば、分子の治療特性を改善する分子、標的検出を容易にする分子、または患者のイメージングもしくは療法のための分子の少なくとも1つと結合されてもよい。精製前もしくは精製後、または精製が行われている時に、抗CD100結合分子、例えば、本発明の抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体を標識または結合することができる。
特に、本発明の抗CD100抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体は、治療剤、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生物学的応答調節剤、薬剤、またはPEGと結合されてもよい。
当業者であれば、結合しようとする選択された剤に応じて様々な技法を用いて結合体を組み立てることができると理解するだろう。例えば、ビオチンとの結合体は、例えば、結合ポリペプチドと、ビオチンN-ヒドロキシスクシンイミドエステルなどのビオチン活性化エステルとの反応によって調製される。同様に、蛍光マーカーとの結合体は、カップリング剤、例えば、本明細書において列挙したカップリング剤の存在下で、またはイソチオシアネート、好ましくは、フルオレセイン-イソチオシアネートとの反応によって調製することができる。本発明の抗CD100抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体の結合体も同様に調製される。
さらに、本発明は、診断剤または治療剤と結合した、抗CD100結合分子、例えば、本発明の抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体を含む。抗CD100抗体は、その抗原結合断片、変種、および誘導体を含めて、臨床試験法の一部として、例えば、所定の処置法および/または予防法の効力を確かめる臨床試験法の一部として、例えば、疾患の発症または進行をモニタリングするために診断に使用することができる。例えば、検出は、抗CD100抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体と検出可能な物質とをカップリングすることによって容易にすることができる。検出可能な物質の例には、様々な酵素、補欠分子団、蛍光材料、発光材料、生物発光材料、放射性材料、様々な陽電子放射型断層撮影法を用いる陽電子放射金属、および非放射性の常磁性金属イオンが含まれる。本発明による診断剤として使用するために抗体と結合することができる金属イオンについては、例えば、米国特許第4,741,900号を参照されたい。適切な酵素の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが含まれる。適切な補欠分子団複合体の例には、ストレプトアビジン/ビオチンおよびアビジン/ビオチンが含まれる。適切な蛍光材料の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル、またはフィコエリトリンが含まれる。発光材料の一例にはルミノールが含まれる。生物発光材料の例には、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが含まれる。適切な放射性材料の例には、125I、131I、111In、90Y、または99Tcが含まれる。
抗CD100結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体は、細胞毒、治療剤、または放射性金属イオンなどの治療部分と結合されてもよい。細胞毒または細胞傷害剤には、細胞に有害な任意の剤が含まれる。
抗CD100結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体はまた、化学発光化合物とカップリングすることによって検出可能に標識することもできる。次に、化学発光によって標識された抗CD100結合分子の存在は、化学反応中に生じた発光の存在を検出することによって決定される。特に有用な化学発光標識化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、テロマティック(theromatic)アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、およびシュウ酸エステルである。
抗CD100抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体を検出可能に標識することができる手法の1つは、これらと酵素を連結し、酵素イムノアッセイ(EIA)において連結産物を使用することによる手法である(Voller, A., 「The Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)」 Microbiological Associates Quarterly Publication, Walkersville, Md.; Diagnostic Horizons 2:1-7(1978); Voller et al., J. Clin. Pathol. 31:507-520(1978); Butler, Meth. Enzymol. 73:482-523(1981); Maggio, ed. (1980) Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, Fla.; Ishikawa et al., eds. (1981) Enzyme Immunoassay(Kgaku Shoin, Tokyo)。酵素は抗CD100抗体に結合しており、例えば、分光光度法、蛍光測定法、または視覚的手段によって検出可能な化学部分を生じるように、適切な基質、好ましくは、発色基質と反応する。抗体を検出可能に標識するのに使用することができる酵素には、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、δ-5-ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α-グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、およびアセチルコリンエステラーゼが含まれるが、これに限定されない。さらに、検出は、酵素の発色基質を用いる比色法によって達成することができる。検出はまた、同じように調製された標準と比較して基質の酵素反応の程度を視覚的に比較することによって達成することもできる。
検出はまた、様々な他のイムノアッセイのいずれを用いても達成することができる。例えば、抗CD100結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体を放射標識することによって、ラジオイムノアッセイ(RIA)を用いて結合分子を検出することができる(例えば、参照により本明細書に組み入れられる、Weintraub(March, 1986) Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques(The Endocrine Society)を参照されたい)。放射性同位体は、ガンマカウンター、シンチレーションカウンター、またはオートラジオグラフィーを含むが、これに限定されない手段によって検出することができる。
抗CD100結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体はまた、152Euなどの蛍光放出金属またはランタニド系列の他の蛍光放出金属を用いて検出可能に標識することもできる。これらの金属は、ジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)またはエチレンジアミン四酢酸(EDTA)などの金属キレート基を用いて結合分子に取り付けることができる。
様々な部分と、抗体(例えば、抗CD100抗体)またはその抗原結合断片、 変種、もしくは誘導体を結合するための技法は周知である。例えば、Amon et al. (1985) 「Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy」, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, ed. Reisfeld et al. (Alan R. Liss, Inc.), pp. 243-56; Hellstrom et al. (1987) 「Antibodies for Drug Delivery」, in Controlled Drug Delivery, ed. Robinson et al. (2nd ed.; Marcel Dekker, Inc.), pp. 623-53); Thorpe (1985) 「Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in Cancer Therapy: A Review」, in Monoclonal Antibodies '84: Biological and Clinical Applications, ed. Pinchera et al., pp. 475-506; 「Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy」 in Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy, ed. Baldwin et al., Academic Press, pp. 303-16 (1985);およびThorpe et al. (1982) 「The Preparation and Cytotoxic Properties of Antibody-Toxin Conjugates」, Immunol. Rev. 62:119-58を参照されたい。
VI.抗体ポリペプチドの発現
抗体の軽鎖および重鎖をコードするDNA配列は、周知の方法に従って逆転写酵素およびDNAポリメラーゼを用いて同時にまたは別々に作製することができる。PCRは、コンセンサス定常領域プライマーによって開始されてもよく、公開された重鎖および軽鎖のDNA配列およびアミノ酸配列に基づく、さらに特異性のあるプライマーによって開始されてもよい。前記で議論したように、抗体軽鎖および重鎖をコードするDNAクローンを単離するために、PCRも使用することができる。この場合、コンセンサスプライマーまたはさらに大きな相同プローブ、例えば、マウス定常領域プローブによってライブラリーをスクリーニングすることができる。
DNA、典型的には、プラスミドDNAを、当技術分野において公知の技法を用いて細胞から単離し、例えば、組換えDNA法に関する前述の参考文献に詳述された標準的な周知の技法に従って制限地図を作製し、配列決定することができる。もちろん、DNAは、単離プロセスまたは後の分析の間のどの時点であっても本発明に従って合成DNAでもよい。
本発明の抗CD100抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体を得るために、単離された遺伝物質を操作した後に、抗CD100抗体をコードするポリヌクレオチドは、典型的には、望ましい量の抗CD100抗体を産生するのに使用することができる宿主細胞に導入するために発現ベクターに挿入される。
本明細書に記載の標的分子、例えば、CD100に結合する、抗体またはその断片、誘導体、もしくは類似体、例えば、抗体の重鎖または軽鎖の組換え発現は、抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築を必要とする。本発明の抗体分子または抗体の重鎖もしくは軽鎖またはその一部(好ましくは、重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインを含有する部分)をコードするポリヌクレオチドが得られたら、当技術分野において周知の技法を用いた組換えDNA技術によって、抗体分子を産生するためのベクターを作製することができる。従って、抗体をコードするヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドを発現させることによってタンパク質を調製する方法が本明細書に記載されている。当業者に周知の方法を用いて、抗体コード配列ならびに適切な転写制御シグナルおよび翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、例えば、インビトロ組換えDNA法、合成法、およびインビボ遺伝子組換えが含まれる。従って、本発明は、プロモーターと機能的に連結された、本発明の抗体分子またはその重鎖もしくは軽鎖または重鎖可変ドメインもしくは軽鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む複製可能なベクターを提供する。このようなベクターは、抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含んでもよく(例えば、PCT国際公開公報第86/05807号;PCT国際公開公報第89/01036号;および米国特許第5,122,464号を参照されたい)、重鎖全体または軽鎖全体を発現させるために、抗体の可変ドメインをこのようなベクターにクローニングすることができる。
「ベクター」または「発現ベクター」という用語は、望ましい遺伝子を宿主細胞に導入し、宿主細胞において発現させるためのビヒクルとして本発明に従って用いられるベクターを意味するために本明細書において用いられる。当業者に公知のように、このようなベクターは、プラスミド、ファージ、ウイルス、およびレトロウイルスからなる群より容易に選択することができる。一般的に、本発明と適合するベクターは、選択マーカー、望ましい遺伝子のクローニングを容易にする適切な制限部位、ならびに真核細胞または原核細胞において進入および/または複製する能力を含む。
本発明の目的では、非常に多くの発現ベクター系を使用することができる。例えば、あるクラスのベクターでは、ウシパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス(RSV、MMTV、もしくはMOMLV)、またはSV40ウイルスなどの動物ウイルスに由来するDNAエレメントが用いられる。他のベクターでは、ポリシストロニック系と内部リボソーム結合部位が用いられる。さらに、トランスフェクトされた宿主細胞の選択を可能にする1種類または複数の種類のマーカーを導入することによって、DNAを細胞染色体に組み込んでいる細胞を選択することができる。マーカーは、栄養要求性宿主に対する原栄養性、殺生物剤耐性(例えば、抗生物質)、または銅などの重金属耐性を提供してもよい。選択マーカー遺伝子は、発現させようとするDNA配列と直接連結されてもよく、同時形質転換によって同じ細胞に導入されてもよい。最適なmRNA合成のために、さらなるエレメントも必要とされることがある。これらのエレメントは、シグナル配列、スプライスシグナル、ならびに転写プロモーター、エンハンサー、および終結シグナルを含んでもよい。
特に好ましい態様において、クローニングされた可変領域遺伝子は、前記のように合成された重鎖定常領域遺伝子および軽鎖定常領域遺伝子(好ましくは、ヒト)と共に発現ベクターに導入される。もちろん、真核細胞において発現を誘発することができる任意の発現ベクターを本発明において使用することができる。適切なベクターの例には、プラスミドpcDNA3、pHCMV/Zeo、pCR3.1、pEF1/His、pIND/GS、pRc/HCMV2、pSV40/Zeo2、pTRACER-HCMV、pUB6/V5-His、pVAX1、およびpZeoSV2(Invitrogen, San Diego, Calif.から入手可能)、ならびにプラスミドpCI(Promega, Madison, Wis.から入手可能)が含まれるが、これに限定されない。一般的に、多数の形質転換細胞から、適切に高いレベルの免疫グロブリン重鎖および軽鎖を発現する形質転換細胞をスクリーニングすることは、例えば、ロボットシステムによって行うことができる日常的な実験法である。
さらに一般的には、抗CD100抗体の単量体サブユニットをコードするベクターまたはDNA配列が調製されたら、発現ベクターを適切な宿主細胞に導入することができる。宿主細胞へのプラスミドの導入は当業者に周知の様々な技法によって達成することができる。これらには、トランスフェクション(電気泳動およびエレクトロポレーションを含む)、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈殿、エンベロープのあるDNAとの細胞融合、マイクロインジェクション、ならびにインタクトなウイルスの感染が含まれるが、これに限定されない。Ridgway (1988)「Mammalian Expression Vectors」in Vectors, ed. Rodriguez and Denhardt (Butterworths, Boston, Mass.), Chapter 24.2, pp. 470-472を参照されたい。典型的に、宿主へのプラスミドの導入はエレクトロポレーションによるものである。発現構築物を有する宿主細胞を軽鎖および重鎖の産生に適切な条件下で増殖させ、重鎖タンパク質および/または軽鎖タンパク質の合成についてアッセイする。例示的なアッセイ法には、酵素結合免疫測定法(ELISA)、ラジオイムノアッセイ(RIA)、または蛍光活性化セルソーター分析(FACS)、免疫組織化学などが含まれる。
発現ベクターを従来法によって宿主細胞に導入し、次いで、トランスフェクトされた細胞を従来法によって培養して、本明細書に記載の方法において使用するための抗体を産生する。従って、本発明は、異種プロモーターと機能的に連結された、本発明の抗体またはその重鎖もしくは軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含有する宿主細胞を含む。二本鎖抗体の発現に好ましい態様では、下記で詳述するように、免疫グロブリン分子全体を発現させるために、重鎖および軽鎖を両方ともコードするベクターを宿主細胞において同時発現させることができる。
本明細書で使用する「宿主細胞」とは、組換えDNA法を用いて構築され、少なくとも1種類の異種遺伝子をコードするベクターを有する細胞を指す。組換え宿主から抗体を単離するためのプロセスの説明において、「細胞」および「細胞培養物」という用語は、特に断りのない限り、抗体の供給源を指すために同義に用いられる。言い換えると、「細胞」からのポリペプチドの回収は、遠心沈殿した全細胞からの回収を意味してもよく、培地および懸濁細胞の両方を含有する細胞培養物からの回収を意味してもよい。
本明細書に記載の方法において使用するための抗体分子を発現させるために、様々な宿主発現ベクター系を利用することができる。このような宿主発現系は、関心対象のコード配列が産生され、その後に精製されるビヒクルであるが、適切なヌクレオチドコード配列によって形質転換またはトランスフェクトされた時に本発明の抗体分子をインサイチューで発現することができる細胞でもある。これらには、微生物、例えば、抗体コード配列を含有する、組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNA、またはコスミドDNA発現ベクターによって形質転換された細菌(例えば、大腸菌(E.coli)、枯草菌(B.subtilis));抗体コード配列を含有する組換え酵母発現ベクターによって形質転換された酵母(例えば、サッカロマイセス属(Saccharomyces)、ピチア属(Pichia));抗体コード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター(例えば、バキュロウイルス)に感染した昆虫細胞系;抗体コード配列を含有する、組換えウイルス発現ベクター(例えば、カリフラワーモザイクウイルス、CaMV;タバコモザイクウイルス、TMV)に感染した、もしくは組換えプラスミド発現ベクター(例えば、Tiプラスミド)によって形質転換された植物細胞系;または哺乳動物細胞ゲノムに由来するプロモーター(例えば、メタロチオネインプロモーター)もしくは哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター(例えば、アデノウイルス後期プロモーター;ワクシニアウイルス7.5Kプロモーター)を含有する組換え発現構築物を有する哺乳動物細胞系(例えば、COS、CHO、BLK、293、3T3細胞)が含まれるが、これに限定されない。特に、組換え抗体分子全体を発現させるために、好ましくは、細菌細胞、例えば、大腸菌、より好ましくは、真核細胞が組換え抗体分子のために用いられる。例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)などの哺乳動物細胞と、ヒトサイトメガロウイルスに由来する主要中間初期(major intermediate early)遺伝子プロモーターエレメントなどのベクターが有効な抗体発現系である(Foecking et al., Gene 45:101(1986); Cockett et al., Bio/Technology 8:2(1990))。
タンパク質発現に用いられる宿主細胞株は哺乳動物に由来することが多い。当業者であれば、発現しようとする望ましい遺伝子産物に最も適した特定の宿主細胞株を優先的に決定する能力があると信じられている。例示的な宿主細胞株には、CHO(チャイニーズハムスター卵巣)、DG44およびDUXB11(チャイニーズハムスター卵巣株、DHFRマイナス)、HELA(ヒト子宮頸癌)、CVI(サル腎臓株)、COS(SV40T抗原を含むCVI誘導体)、VERY、BHK(ベビーハムスター腎臓)、MDCK、293、WI38、R1610(チャイニーズハムスター線維芽細胞)、BALBC/3T3(マウス線維芽細胞)、HAK(ハムスター腎臓株)、SP2/0(マウス骨髄腫)、P3.times.63-Ag3.653(マウス骨髄腫)、BFA-1c1BPT(ウシ内皮細胞)、RAJI(ヒトリンパ球)、および293(ヒト腎臓)が含まれるが、これに限定されない。宿主細胞株は、典型的には、商業サービス、American Tissue Culture Collection、または公表された文献から入手することができる。
さらに、挿入された配列の発現を調節する、またはある決まったやり方で遺伝子産物を修飾およびプロセシングする宿主細胞株を選択することができる。タンパク質産物のこのような修飾(例えば、グリコシル化)およびプロセシング(例えば、切断)はタンパク質の機能に重要な場合がある。宿主細胞ごとに、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後プロセシングおよび修飾のための特徴的かつ特異的な機構がある。発現された外来タンパク質の正しい修飾およびプロセシングを確実にするように、適切な細胞株または宿主系を選択することができる。このために、一次転写物の正しいプロセシング、グリコシル化、および遺伝子産物のリン酸化のための細胞機構を有する真核宿主細胞を使用することができる。
組換えタンパク質を長期間、高収率で産生するために、安定発現が好ましい。例えば、抗体分子を安定発現する細胞株を操作してもよい。ウイルス複製起点を含有する発現ベクターを使用するのではなく、適切な発現制御エレメント(例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など)および選択マーカーによって制御されたDNAによって、宿主細胞を形質転換することができる。外来DNAを導入した後に、操作された細胞を強化倍地(enriched media)中で1〜2日間、増殖させてもよく、次いで、選択培地に移す。組換えプラスミド中の選択マーカーは選択耐性を付与し、細胞がプラスミドを細胞染色体に安定に組み込み、増殖してフォーカス(foci)を形成し、次に、フォーカスがクローン化し、細胞株まで発達するのを可能にする。この方法は、抗体分子を安定発現する細胞株を操作するのに有利に使用することができる。
単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子(Wigler et al., Cell 11:223(1977))、ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子(Szybalska and Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:202(1992))、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子(Lowy et al., Cell 22:817(1980))を含むが、これに限定されない多数の選択系を使用することができる。これらの遺伝子は、それぞれ、tk-細胞、hgprt-細胞、またはaprt-細胞において使用することができる。また、代謝拮抗剤耐性を、以下の遺伝子:メトトレキセート耐性を付与する、dhfr(Wigler et al., Natl. Acad. Sci. USA 77:357(1980); O'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527 (1981)); ミコフェノール酸耐性を付与する、gpt(Mulligan and Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072(1981)); アミノグリコシド G-418耐性を付与する、neo(Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu and Wu, Biotherapy 3:87-95(1991); Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596 (1993); Mulligan, Science 260:926-932(1993)およびMorgan and Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217 (1993); TIB TECH 11(5): 155-215 (May, 1993));ならびにハイグロマイシン耐性を付与する、hygro(Santerre et al., Gene 30:147(1984))の選択の基礎として使用することができる。使用することができる、当技術分野において一般に知られている組換えDNA技術の方法は、Ausubel et al. (1993) Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley & Sons, NY); Kriegler (1990)「Gene Transfer and Expression」 in A Laboratory Manual(Stockton Press, NY); Dracopoli et al.(eds)(1994) Current Protocols in Human Genetics (John Wiley & Sons, NY) Chapters 12 and 13; Colberre-Garapin et al.(1981) J. Mol. Biol. 150:1に記載されている。これらはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
抗体分子の発現レベルはベクター増幅によって高めることができる(総説については、Bebbington and Hentschel(1987)「The Use of Vectors Based on Gene Amplification for the Expression of Cloned Genes in Mammalian Cells in DNA Cloning」(Academic Press, NY) Vol. 3を参照されたい)。抗体を発現するベクター系の中にあるマーカーが増幅可能な場合、宿主細胞の培養物に存在する阻害剤のレベルが上昇することによってマーカー遺伝子のコピー数が増加するであろう。増幅領域は抗体遺伝子と関連しているので、抗体の産生も増加するだろう(Crouse et al., Mol. Cell. Biol. 3:257(1983))。
インビトロで産生されたら、スケールアップによって多量の望ましいポリペプチドを得ることができる。組織培養条件下で哺乳動物細胞を培養するための技法は当技術分野において公知であり、均一な懸濁培養、例えば、エアリフト型リアクターもしくは連続スターラーリアクターにおける懸濁培養、または固定化細胞培養もしくは捕捉細胞培養(entrapped cell culture)、例えば、中空糸の中、マイクロカプセルの中、アガロースミクロビーズ上、もしくはセラミックカートリッジ上での固定化細胞培養もしくは捕捉細胞培養を含む。必要に応じておよび/または所望に応じて、例えば、合成ヒンジ領域ポリペプチドを優先的に生合成した後に、または本明細書に記載のHICクロマトグラフィー段階の前もしくは後に、従来通りのクロマトグラフィー法、例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、DEAE-セルロース上でのクロマトグラフィー、または(イムノ)アフィニティクロマトグラフィーによってポリペプチド溶液を精製することができる。
本発明の抗CD100抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体をコードする遺伝子はまた、昆虫細胞、細菌細胞もしくは酵母細胞、または植物細胞などの非哺乳動物細胞において発現させることもできる。核酸を容易に取り込む細菌には、腸内細菌科(enterobacteriaceae)のメンバー、例えば、大腸菌またはサルモネラ属(Salmonella)の株;バチルス科(Bacillaceae)、例えば、枯草菌;肺炎球菌(Pneumococcus);連鎖球菌(Streptococcus)、およびインフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)が含まれる。さらに、細菌において発現させた時に、異種ポリペプチドは典型的に封入体の一部になることが理解されるだろう。異種ポリペプチドを単離し、精製し、次いで、機能分子に組み立てなければならない。四価型抗体が望ましいのであれば、サブユニットは四価抗体に自己集合する(WO02/096948A2)。
細菌系では、発現させる抗体分子に意図された用途に応じて、多くの発現ベクターを有利に選択することができる。例えば、抗体分子の薬学的組成物を作製するために、多量のこのようなタンパク質を産生しようとする時に、容易に精製される高レベルの融合タンパク質産物の発現を誘導するベクターが望ましい場合がある。このようなベクターには、以下が含まれるが、これに限定されない：融合タンパク質が産生されるように、抗体コード配列が個々にベクターに入れられてlacZコード領域とインフレームに連結することができる、大腸菌発現ベクターpUR278(Ruther et al., EMBO J. 2:1791(1983));pINベクター(Inouye and Inouye, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109(1985); Van Heeke and Schuster, J. Biol. Chem. 24:5503-5509(1989))など。グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現するために、pGEXベクターも使用することもできる。一般的に、このような融合タンパク質は可溶性であり、マトリクスグルタチオン-アガロースビーズに吸着および結合させた後に、遊離グルタチオンの存在下で溶出することによって溶解細胞から容易に精製することができる。pGEXベクターは、クローニングされた標的遺伝子産物をGST部分から放出できるようにトロンビンまたは第Xa因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計されている。
原核生物に加えて、真核生物微生物も使用することができる。サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)すなわち一般的なパン酵母が真核生物微生物の中で最も一般的に用いられるが、多くの他の株、例えば、ピチア・パストリス(Pichia pastoris)がよく用いられる。
サッカロマイセス属における発現のために、例えば、プラスミドYRp7(Stinchcomb et al., Nature 282:39(1979); Kingsman et al., Gene 7:141(1979); Tschemper et al., Gene 10:157(1980))が一般的に用いられる。このプラスミドは、トリプトファン中での増殖能が無い変異酵母株、例えば、ATCC No. 44076またはPEP4-1(Jones, Genetics 85:12(1977))に選択マーカーを提供するTRP1遺伝子を既に含有している。次いで、酵母宿主細胞ゲノムの特徴としてtrp1損傷が存在すれば、トリプトファンの非存在下での増殖によって形質転換を検出するのに有効な環境となる。
昆虫系では、典型的に、オートグラファ核多角体ウイルス(AcNPV)が外来遺伝子を発現するベクターとして用いられる。このウイルスはヨトウガ(Spodoptera frugiperda)細胞において増殖する。抗体コード配列を個々にウイルスの非必須領域(例えば、ポリヘドリン遺伝子)に入れてクローニングし、AcNPVプロモーター(例えば、ポリヘドリンプロモーター)の制御下に置くことができる。
本発明の抗体分子が組換えにより発現されたら、当技術分野において公知の任意の免疫グロブリン分子精製法によって、例えば、クロマトグラフィー(例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、特に、プロテインA後の特異的抗原に対するアフィニティクロマトグラフィー、およびサイジング(sizing)カラムクロマトグラフィー)、遠心分離、溶解度差(differential solubility)、またはタンパク質精製のための他の任意の標準的な技法によって精製することができる。または、本発明の抗体の親和性を高める好ましい方法が米国特許出願公開第20020123057A1号に開示される。
VII. 治療用抗CD100抗体を用いた処置方法
本発明の方法は、CD100発現細胞から分泌された可溶性CD100またはCD100発現細胞上で発現した可溶性CD100に関連した疾患を有する患者を処置するための、抗CD100結合分子、例えば、抗原結合断片、変種、および誘導体を含めた抗体の使用に関する。「CD100発現細胞」とは、CD100抗原を発現する正常細胞および悪性細胞を意味する。細胞においてCD100発現を検出するための方法は当技術分野において周知であり、PCR法、免疫組織化学、フローサイトメトリー、ウエスタンブロット、ELISAなどを含むが、これに限定されない。
以下の議論は、本発明の抗CD100抗体を用いた様々な疾患および障害の診断方法および処置について言及しているが、本明細書に記載の方法は、本発明の抗CD100抗体の望ましい特性を保持している、例えば、CD100、例えば、ヒトCD100、マウスCD100、ヒトCD100およびマウスCD100に特異的に結合し、CD100中和活性を有することができる、これらの抗CD100抗体の抗原結合断片、変種、および誘導体にも適用可能である。
1つの態様において、処置には、患者への抗CD100結合分子、例えば、本発明の抗体もしくはその抗原結合断片の適用もしくは投与、または患者から単離された組織または細胞株への抗CD100結合分子の投与が含まれる。ここで、患者は、疾患、疾患の症状、または疾患の素因を有する。別の態様において、処置はまた、患者への抗CD100結合分子、例えば、本発明の抗体もしくはその抗原結合断片を含む薬学的組成物の適用もしくは投与、または疾患、疾患の症状、もしくは疾患の素因を有する患者から単離された組織または細胞株への抗CD100結合分子を含む薬学的組成物の適用もしくは投与を含むことが意図される。
抗CD100結合分子、例えば、本発明の抗体またはその結合断片は、様々な悪性腫瘍および非悪性腫瘍の処置に有用である。「抗腫瘍活性」とは、悪性CD100発現細胞の増殖または蓄積の速度が遅くなること、従って、既存の腫瘍の成長速度が遅くなること、もしくは療法の間に生じる腫瘍の成長速度が遅くなること、および/または既存の新生(腫瘍)細胞もしくは新たに形成した新生細胞が破壊されること、従って、療法中の腫瘍の全体サイズが小さくなることを意味する。例えば、少なくとも1種類の抗CD100抗体による療法によって、ヒトにおけるCD100発現細胞に関連した疾患状態の処置に関して有益な生理学的応答、例えば、血管形成の低下が引き起こされる。
1つの態様において、本発明は、医薬として使用するための、特に、癌の処置もしくは予防において使用するための、または前癌状態もしくは前癌病変において使用するための、抗CD100結合分子、例えば、本発明による抗体またはその結合断片に関する。ある特定の態様において、抗CD100結合分子、例えば、本発明の抗体またはその結合断片は、CD100を過剰発現している癌の処置に用いられる。ある特定の態様において、抗CD100結合分子、例えば、本発明の抗体またはその結合断片は、CD100を過剰発現している頭頚部癌または結腸癌の処置に用いられる。
さらに、抗CD100結合分子、例えば、本発明の抗体またはその結合断片はまた、腫瘍発症および黄斑変性を含む、新血管の形成に依存した病理学的状態を処置するために血管形成を阻害するのに使用することもできる。血管形成は複雑な多段階の形態形成事象であり、この間に、内皮細胞は血管リモデリングの主要な決定因子によって刺激され、細胞間接触および細胞とマトリクスの接触を劇的に改変し、成熟した血管樹(vascular tree)に再編成されるように方向性をもって移動する(Bussolino et al., Trends Biochem Sci. 22:251-256(1997); Risau, Nature 386:671-674(1997); Jain, Nat. Med. 9:685-693 (2003))。新血管の形成は胚発生間の重要な段階であるが、成人では、生理学的状態および病理学的状態、例えば、網膜症、関節リウマチ、虚血、特に、腫瘍成長および転移でも起こる(Carmeliet, Nat. Med. 9:653-660(2003))。この新血管の病理学的形成は、本明細書において「浸潤性血管形成」と呼ばれる。Basile et al., PNAS 103(24):9017-9022(2006))は、CD100がHNSCC細胞から脱落すると内皮細胞遊走を刺激し、内皮細胞遊走はCD100遮断抗体およびCD100ノックダウンによって阻止されることを証明した。CD100過剰発現は、前立腺癌、結腸癌、乳癌、および肺癌においても認められた。このことは、CD100の発現が、多種多様な癌腫が血管形成を促進し得る頻繁に用いられる戦略であることを示唆している。
本発明の方法によれば、少なくとも1種類の抗CD100結合分子、例えば、本明細書の他の場所で定義された抗体またはその抗原結合断片は、悪性ヒト細胞に関して正の治療応答を促進するのに用いられる。癌処置に関する「正の治療応答」とは、これらの結合分子、例えば、抗体もしくはその断片の抗腫瘍活性に関連した疾患の改善、および/または疾患に関連した症状の改善を意味する。すなわち、抗増殖作用、さらなる腫瘍成長の阻止、腫瘍サイズの縮小、腫瘍脈管構造の減少、癌細胞数の減少、および/または疾患に関連した1つもしくは複数の症状の低減を観察することができる。従って、例えば、疾患の改善は完全寛解と特徴付けられることがある。「完全寛解」とは、以前は異常であったX線撮影試験、骨髄、および脳脊髄液(CSF)を基準として臨床的に検出可能な疾患が存在しないことを意味する。このような応答は、本発明の方法による処置後、少なくとも1ヶ月間、持続しなければならない。または、疾患の改善は部分応答と分類されることがある。「部分応答」とは、新たな病変の非存在下で、全ての測定可能な腫瘍量(すなわち、被験体に存在する腫瘍細胞の数)が少なくとも約50％減少し、少なくとも1ヶ月間、持続することを意味する。このような応答は、測定可能な腫瘍にのみ適用することができる。
腫瘍応答は、生物発光イメージング、例えば、ルシフェラーゼイメージング、骨スキャンイメージング、および骨髄吸引(BMA)を含む腫瘍生検サンプリングなどのスクリーニング法を用いて腫瘍形態(すなわち、全部の腫瘍量、腫瘍細胞数など)の変化について評価することができる。これらの正の治療応答に加えて、抗CD100結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片による療法を受けている被験体は、疾患に関連した症状の改善の有益な効果を経験するかもしれない。例えば、被験体は、いわゆる、B症状、例えば、寝汗、発熱、体重減少、および/またはじんま疹の軽減を経験するかもしれない。
抗CD100結合分子、例えば、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片はまた、CD100発現細胞に関連した炎症疾患および免疫系の欠陥または障害の処置において使用することもできる。炎症疾患は炎症および組織破壊またはその組み合わせを特徴とする。「抗炎症活性」とは炎症の低減または予防を意味する。「炎症疾患」は、免疫応答の開始事象または標的が、例えば、同種抗原、異種抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、未知の抗原、またはアレルゲンを含む非自己抗原を含む、免疫を介した任意の炎症プロセスを含む。1つの態様において、炎症疾患は、末梢神経系または中枢神経系の炎症障害である。別の態様において、炎症疾患は関節の炎症障害である。
さらに、本発明の目的のために「炎症疾患」という用語は「自己免疫疾患」を含む。本明細書で使用する「自己免疫」という用語は、一般的に、「自己」抗原が関与する、免疫を介した炎症プロセスを含むと理解される。自己免疫疾患において、自己抗原は宿主免疫応答を誘発する。自己免疫疾患は、正常状態の自己寛容からの逸脱である、自己抗原(self antigen)(自己抗原(autoantigen))に対する不適切な免疫応答に起因することがある。一般的に、細胞傷害性分子または免疫複合体として働く抗体(特に、IgG抗体であるが、IgG抗体だけではない)は様々な自己免疫疾患の主要なメディエーターであり、自己免疫疾患の多くは衰弱性または命に関わるものであり得る。
1つの態様において、多発性硬化症(MS)を処置するために、抗CD100結合分子、例えば、本発明の抗体または抗原結合断片が用いられる。MSは散在性硬化症または散在性脳脊髄炎(encephalomyelitis disseminata)とも知られ、中枢神経系を免疫系が攻撃して、脱髄する自己免疫状態である。多発性硬化症という名前は、神経系において形成する瘢痕(硬化、斑または病変とも呼ばれる)を指す。MS病変は、一般的に、小脳の脳室に近い白質領域、脳幹、大脳基底核および脊髄、ならびに視神経が関与する。MSは、髄鞘の作製および維持を担っている細胞であるオリゴデンドロサイトを破壊する。MSはミエリンを薄くするか、またはミエリンを完全に消失させ、疾患が進行するにつれて軸策を切断する。
神経学的症状はMSによって異なることがあり、この疾患は身体障害および認知障害まで進行することが多い。MSはいくつかの型をとり、新たな症状が別個の発病として現れるか(再発型)、時が経つにつれてゆっくりと蓄積する(進行型)。発病の間に、症状が完全に消失することがあるが、特に、疾患が進行するにつれて永続的な神経学的損傷が生じることが多い。
本発明の抗CD100モノクローナル抗体、例えば、MAb2503、MAb67、またはMAb76を用いたCD100中和は、数種類の機構を介してMSの重篤度を下げるのに使用することができる。例えば、抗CD100モノクローナル抗体は、CD100による免疫成熟および活性化をブロックして、CNS抗原に対する二次免疫応答を低減することによって再発速度を遅らせることができる。抗CD100モノクローナル抗体は、CNSにあるオリゴデンドロサイトのアポトーシス媒介における可溶性CD100の作用をブロックして、脱髄を低減することによって疾患重篤度を小さくすることができる。
1つの態様において、関節炎を処置するために、抗CD100結合分子、例えば、本発明の抗体または抗原結合断片が用いられる。関節炎は関節の炎症疾患であり、関節を免疫系が攻撃する自己免疫状態によって引き起こされることがある。ある特定の態様において、関節炎は、変形性関節症、痛風関節炎、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、反応性関節炎、関節リウマチ、若年発症関節リウマチ、感染性関節炎、炎症性関節炎、敗血症性関節炎、変形性関節症、破壊性関節炎、およびライム関節炎からなる群より選択される。1つの態様において、関節炎は関節リウマチ(RA)である。
本発明は、本発明の抗CD100結合分子、例えば、MAb2503、MAb67、またはMAb76を被験体に投与することによって関節炎を処置または予防する方法を含む。本発明の方法は、関節炎、例えば、関節リウマチに関連する、疼痛、腫脹、またはこわばりを低減することができる。本発明はまた、関節の働き、機能、および健康状態を改善するための方法に関する。本発明のある態様において、処置は、関節炎重篤度スコアの減少、関節炎重篤度/曲線下面積の減少、関節炎に関連した組織病理学パラメータ(炎症、パンヌス、軟骨損傷、および骨損傷)の減少、血清中アラキドン酸濃度の低下、または抗コラーゲン抗体の減少をもたらす。ある特定の態様において、有益なまたは望ましい臨床結果には、関節炎に関連した症状の軽減;関節炎の予防;関節炎の発症の遅延;集団内での関節炎の発生率の低下;関節炎に関連した状態の程度の低下;関節炎に関連した状態、障害、もしくは疾患の状況の安定化(すなわち、悪化を食い止める);関節炎に関連した状態、障害、もしくは疾患の発症の遅延、または関節炎に関連した状態、障害、もしくは疾患の進行の減速;検出可能でも検出不可能でも、状態、障害、もしくは疾患状態の回復、関節炎に関連した状態、障害、もしくは疾患の軽快(部分的もしくは全面的);あるいは関節炎に関連した状態、障害、もしくは疾患の向上もしくは改善が含まれるが、これに限定されない。
本発明の方法は、関節炎を有する個体または関節炎を発症するリスクのある個体に投与することができる。従って、ある態様において、本発明は、正常関節、ボーダーラインの関節炎関節、または関節炎のひどい関節を有する被験体を処置する方法であって、本明細書に記載のように、本発明の抗CD100分子、例えば、MAb2503、MAb67、またはMAb76を被験体に投与する工程を含む、方法に関する。ある態様において、本発明の方法は、被験体の余命のために慢性関節炎を処置するのに使用することができる。
本発明の方法によれば、自己免疫疾患および/または炎症疾患の処置または予防に関する正の治療応答を促進するために、少なくとも1種類の抗CD100結合分子、例えば、本明細書の他の場所で定義された抗体またはその抗原結合断片が用いられる。自己免疫疾患および/または炎症疾患に関する「正の治療応答」とは、これらの抗体の抗炎症活性、抗血管新生活性、抗アポトーシス活性に関連した疾患の改善、および/または疾患に関連した症状の改善を意味する。すなわち、CD100発現細胞のさらなる増殖の阻止である抗増殖作用、炎症性サイトカイン、接着分子、プロテアーゼ、(CD100を有する細胞がB細胞である場合)免疫グロブリン、その組み合わせなどの分泌低下を含むが、これに限定されない炎症応答の低減、抗炎症タンパク質の産生の増大、自己反応性細胞の数の減少、免疫寛容の増大、自己反応性細胞の生存の阻害、アポトーシスの低減、内皮細胞遊走の低減、自発性単球遊走の増大、sCD100またはCD100発現細胞の刺激によって媒介される1つまたは複数の症状の低減および/または減少を観察することができる。このような正の治療応答は投与経路に限定されず、ドナー、ドナー組織(例えば、臓器灌流)、宿主、その任意の組み合わせなどへの投与を含んでもよい。
臨床応答は、スクリーニング法、例えば、核磁気共鳴画像法(MRI)スキャン、X線画像法、コンピュータ断層撮影(CT)スキャン、フローサイトメトリーまたは蛍光活性化セルソーター(FACS)分析、組織学、肉眼所見、およびELISA、RIA、クロマトグラフィーなどによって検出可能な変化を含むが、これに限定されない血液化学を用いて評価することができる。これらの正の治療応答に加えて、抗CD100結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片を用いた療法を受けている被験体は、疾患に関連した症状の改善の有益な効果を経験するかもしれない。
抗CD100結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片を、外科手術または外科的処置(例えば、脾摘出術、肝切除術、リンパ節切除術、白血球除去法、骨髄移植など);放射線療法;化学療法を含むが、これに限定されない少なくとも1種類の他の癌療法と組み合わせて、任意で、自己由来骨髄移植または他の癌療法と組み合わせて使用することができる。ここで、さらなる癌療法は、抗CD100結合分子、例えば、抗体もしくはその抗原結合断片を用いた療法の前、または抗CD100結合分子、例えば、抗体もしくはその抗原結合断片を用いた療法の間、または抗CD100結合分子、例えば、抗体もしくはその抗原結合断片を用いた療法の後に投与される。従って、併用療法が、抗CD100結合分子、例えば、本発明の抗体またはその抗原結合断片の投与と、化学療法、放射線療法、他の抗癌抗体療法、低分子に基づく癌療法、またはワクチン/免疫療法に基づく癌療法のように別の治療剤の投与を含む場合、本発明の方法は、別々の製剤もしくは単一の薬学的製剤を用いた同時投与、またはどちらかの順序での連続投与を含む。
抗CD100結合分子、例えば、本発明の抗体またはその結合断片を、自己免疫および炎症疾患の処置に有用なことが知られている、または自己免疫および炎症疾患の処置のために用いられたことのある、もしくは現在用いられている任意の剤または剤の組み合わせを含む自己免疫および炎症疾患の任意の公知の療法と組み合わせて使用することができる。従って、この併用療法が、抗CD100結合分子と別の治療剤の投与を含む場合、本発明の方法は、別々の製剤または単一の薬学的製剤を用いた同時投与、およびどちらかの順序での連続投与を含む。本発明のある態様において、本明細書に記載の抗CD100抗体は免疫抑制薬または抗炎症薬と組み合わせて投与される。ここで、抗体および治療剤はどちらかの順序で連続して投与されてもよく、同時に(すなわち、同時的にまたは同じ時間枠内で)投与されてもよい。
他のある態様において、関節リウマチを処置および/または予防するために、抗CD100結合分子、例えば、本発明の抗体またはその抗原結合断片を単独で、または免疫抑制薬と組み合わせて使用することができる。従って、関節リウマチを処置するために本発明の抗CD100抗体が用いられる、ある態様では、抗体を適切な免疫抑制薬と組み合わせて使用することができる。前記で議論したように、処置の有効性は任意の手段を用いて評価することができ、American College of Rheumatologyの基準、European League of Rheumatismの基準、または他の任意の基準によって定義された臨床応答によって測定された有効性を含むが、これに限定されない。例えば、Felson et al., Arthritis. Rheum. 38:721-35(1995)およびvan Gestel et al., Arthritis Rheum. 39:34-40(1996)を参照されたい。
さらに他の態様では、多発性硬化症を処置および/または予防するために、本発明の抗CD100抗体を単独で、または免疫抑制薬と組み合わせて使用することができる。従って、多発性硬化症を処置するために本発明の抗CD100抗体が用いられる、ある態様では、抗体を適切な免疫抑制薬と組み合わせて使用することができる。
本発明のさらなる態様は、臨床検査法の一部としての、組織におけるタンパク質レベルの診断モニタリングのための、例えば、所定の処置レジメンの効力を確かめるための、抗CD100結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片の使用である。例えば、検出は、抗体と検出可能な物質をカップリングすることによって容易にすることができる。検出可能な物質の例には、様々な酵素、補欠分子団、蛍光材料、発光材料、生物発光材料、および放射性材料が含まれる。適切な酵素の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが含まれる。適切な補欠分子団複合体の例には、ストレプトアビジン/ビオチンおよびアビジン/ビオチンが含まれる。適切な蛍光材料の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル、またはフィコエリトリンが含まれる。発光材料の一例にはルミノールが含まれる。生物発光材料の例には、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが含まれる。適切な放射性材料の例には、125I、131I、35S、および3Hが含まれる。
VIII.薬学的組成物および投与方法
抗CD100結合分子、例えば、本発明の抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体を調製する方法、およびこれらを必要とする被験体に投与する方法は当業者に周知であるか、当業者によって容易に決定される。抗CD100結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体の投与経路は、例えば、経口経路、吸入による非経口経路、または局所経路でもよい。本明細書で使用する非経口という用語は、例えば、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、皮下投与、直腸投与、または腟投与を含む。これらの全ての形の投与がはっきりと本発明の範囲内と意図されるが、投与の形の一例は注射用溶液、特に、静脈内または動脈内の注射用または点滴用の溶液であろう。通常、注射に適切な薬学的組成物は、緩衝液(例えば、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、またはクエン酸緩衝液)、界面活性剤(例えば、ポリソルベート)、任意で、安定剤(例えば、ヒトアルブミン)などを含んでもよい。しかしながら、本明細書における開示と適合した他の方法では、抗CD100結合分子、例えば、本発明の抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体を有害細胞集団の部位に直接送達し、それによって、治療剤への罹患組織の曝露を高めることができる。
本明細書において議論したように、CD100発現細胞を介した疾患、例えば、ある特定のタイプの癌、自己免疫疾患、中枢神経系(CNS)炎症疾患および末梢神経系(PNS)炎症疾患を含む炎症疾患、ならびに浸潤性血管形成をインビボで処置するために、抗CD100結合分子、例えば、本発明の抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体は薬学的に有効な量で投与することができる。これに関して、開示された本発明の結合分子は、投与を容易にし、活性物質の安定性を促進するように処方されることが理解されるだろう。好ましくは、本発明による薬学的組成物は、薬学的に許容される、無毒で、無菌の担体、例えば、生理食塩水、無毒の緩衝液、防腐剤などを含む。本発明の用途のために、結合された、または結合されていない、抗CD100結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体の薬学的に有効な量とは、標的と効果的に結合し、利益を得るのに十分な量、例えば、疾患もしくは障害の症状を寛解するのに十分な量、または物質もしくは細胞を検出するのに十分な量を意味するとみなされるものとする。
本発明において用いられる薬学的組成物は、例えば、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン、緩衝物質、例えば、リン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩または電解質、例えば、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイドシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースベースの物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ろう、ポリエチレン-ポリオキシプロピレン-ブロックポリマー、ポリエチレングリコール、および羊毛脂を含む、薬学的に許容される担体を含む。
非経口投与用の調製物には、無菌の水溶液または非水溶液、懸濁液、およびエマルジョンが含まれる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えば、オリーブ油、および注射用有機エステル、例えば、オレイン酸エチルである。水性担体には、例えば、食塩水および緩衝化培地を含む、水、アルコール溶液/水溶液、エマルジョン、または懸濁液が含まれる。本発明において、薬学的に許容される担体には、0.01〜0.1M、好ましくは0.05Mのリン酸緩衝液または0.8％食塩水が含まれるが、これに限定されない。他の一般的な非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンガー液デキストロース(Ringer's dextrose)、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンガー液、または不揮発性油が含まれる。静脈内ビヒクルには、体液補充薬および栄養分補充薬、電解質補充薬、例えば、リンガー液デキストロースをベースとするものなどが含まれる。防腐剤および他の添加剤、例えば、殺菌剤、抗酸化物質、キレート剤、および希ガスなども存在してよい。
さらに具体的には、注射使用に適した薬学的組成物には、滅菌した水溶液(水溶性の場合)または分散液、および滅菌した注射液または分散液を即時調製するための滅菌散剤が含まれる。このような場合、組成物は滅菌されていなければならず、容易な注射可能性が存在する程度まで液状であるべきである。これは製造および保存の条件下で安定でなければならず、好ましくは、細菌および菌類などの微生物の汚染作用を防ぐように保存されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど)、ならびにその適切な混合物を含有する溶媒または分散媒でもよい。例えば、レシチンなどのコーティングを使用することによって、分散液の場合では必要とされる粒径を維持することによって、および界面活性剤を使用することによって適切な流動性を維持することができる。本明細書において開示された治療方法において使用するのに適した製剤は、Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co.) 16th ed.(1980)に記載されている。
微生物の活動は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって阻止することができる。多くの場合、等張性の剤、例えば、糖、多価アルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを組成物に含めることが好ましい。注射用組成物の長期吸収は、吸収遅延剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物に含めることによって可能になる。
どのような場合でも、必要とされる量の活性化合物(例えば、抗CD100抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体それ自体、または他の活性物質との組み合わせ)を単独で、または必要に応じて本明細書において列挙された成分の1つまたは組み合わせと適切な溶媒に溶解して組み込み、その後に濾過滅菌することによって、滅菌注射液を調製することができる。一般的に、分散液は、活性化合物を、基本分散媒および前記で列挙された成分に由来する必要とされる他の成分を含有する無菌ビヒクルに組込むことによって調製される。滅菌注射液を調製するための滅菌散剤の場合、好ましい調製方法は真空乾燥および凍結乾燥である。真空乾燥および凍結乾燥によって、活性成分と任意のさらなる望ましい成分の予め濾過滅菌された溶液から、活性成分と任意のさらなる望ましい成分の散剤が得られる。注射用の調製物は加工され、アンプル、バック、瓶、注射器、またはバイアルなどの容器に入れられ、当技術分野において公知の方法に従って無菌条件下で密封される。さらに、調製物は、キット、例えば、米国特許出願第09/259,337号に記載のキットの形で包装および販売されてもよい。このような製造品には、好ましくは、関連した組成物が、疾患もしくは障害に罹患している、または疾患もしくは障害の素因のある被験体の処置に有用なことを示すラベルまたは添付文書があるだろう。
非経口製剤は単一ボーラス量でもよく、注入でもよく、または負荷ボーラス量の後に維持量が続いてもよい。これらの組成物は、特定の決まった間隔で、または変化する間隔で、例えば、1日に1回、または「必要に応じて」投与されてもよい。
本発明において用いられるある特定の薬学的組成物は、例えば、カプセル、錠剤、水性懸濁液、または溶液を含む許容可能な剤形にして経口投与することができる。ある特定の薬学的組成物はまた鼻用エアゾール剤または吸入によって投与することもできる。このような組成物は、ベンジルアルコールもしくは他の適切な防腐剤、バイオアベイラビリティを高める吸収促進剤、および/または他の従来の可溶化剤もしくは分散剤を用いて食塩水に溶解した溶液として調製されてもよい。
担体材料と組み合わせて1つの剤形を生成することができる、抗CD100結合分子、例えば、抗体またはその断片、変種、または誘導体の量は、処置される宿主および特定の投与方法に応じて異なるだろう。組成物は、単回投与、複数回の投与として、または注入中に所定の期間にわたって投与することができる。望ましい最適の応答(例えば、治療応答または予防応答)が得られるように、投与計画も調整することができる。
本開示の範囲に合わせて、上述の処置方法に従って、治療効果を生じるのに十分な量の本発明の抗CD100抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体をヒトまたは他の動物に投与することができる。本発明の抗CD100抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体は、公知の技法に従って、本発明の抗体と従来の薬学的に許容される担体または希釈剤とを組み合わせることによって調製された従来の剤形にして、このようなヒトまたは他の動物に投与することができる。薬学的に許容される担体または希釈剤の形および特徴は、組み合わされる活性成分の量、投与経路、および他の周知の変数によって決まることが当業者に認識されるだろう。さらに、当業者であれば、抗CD100結合分子、例えば、本発明の抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体の1つまたは複数の種を含むカクテルが特に有効であると判明することがあることを理解するだろう。
「治療に有効な用量または量」または「有効量」とは、投与された時に、処置しようとする疾患を有する患者の処置に関して正の治療応答をもたらす、抗CD100結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片の量を意味する。
CD100発現細胞を介した疾患、例えば、ある特定のタイプの癌、例えば、頭頚部癌、前立腺癌、結腸癌、乳癌、および肺癌;自己免疫疾患、例えば、関節炎、多発性硬化症、中枢神経系(CNS)炎症疾患および末梢神経系(PNS)炎症疾患を含む炎症疾患;ならびに浸潤性血管形成を処置するための、本発明の組成物の治療に有効な用量は、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトであるか動物であるか、投与される他の薬物療法、および処置が予防であるか処置であるかを含めて多くの異なる要因に左右される。通常、患者はヒトであるが、トランスジェニック哺乳動物を含む非ヒト哺乳動物も処置することができる。安全性および効力を最適化するたけに、当業者に公知の日常的な方法を用いて処置投与量を滴定することができる。
投与しようとする少なくとも1種類の抗CD100結合分子、例えば、抗体またはその結合断片の量は、本発明の開示があれば過度の実験なく当業者によって容易に求められる。投与方法、ならびに少なくとも1種類の抗CD100結合分子、例えば、抗体、その抗原結合断片、変種、または誘導体のそれぞれの量に影響を及ぼす要因には、疾患の重篤度、病歴、ならびに療法を受けている個体の年齢、身長、体重、健康状態、および身体状態が含まれるが、これに限定されない。同様に、投与しようとする抗CD100結合分子、例えば、抗体またはその断片、変種、もしくは誘導体の量は、投与方法、および被験体がこの剤の単回投与または複数回投与を受けるかどうかに左右されるだろう。
本発明はまた、例えば、関節炎、多発性硬化症、CNS炎症疾患およびPNS炎症疾患、または癌を含む、自己免疫疾患および/または炎症疾患を処置するための医薬の製造における、抗CD100結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体の使用も提供する。
本発明はまた、自己免疫疾患および/もしくは炎症疾患を処置するために被験体を処置するための、または癌を処置するための医薬の製造における、抗CD100結合分子、例えば、本発明の抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体の使用も提供する。ここで、医薬は、少なくとも1種類の他の療法によって前処置されている被験体において用いられる。「前処置された」または「前処置」とは、被験体が、抗CD100結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体を含む医薬を受ける前に、1種類または複数の種類の他の療法を受けている(例えば、少なくとも1種類の他の癌療法によって処置されている)ことを意味する。「前処置された」または「前処置」とは、被験体が、抗CD100結合分子、例えば、本明細書において開示されたモノクローナル抗体2503またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体を含む医薬を用いた処置が開始する前、2年以内に、18ヶ月以内に、1年以内に、6ヶ月以内に、2ヶ月以内に、6週間以内に、1ヶ月以内に、4週間以内に、3週間以内に、2週間以内に、1週間以内に、6日以内に、5日以内に、4日以内に、3日以内に、2日以内に、さらには1日以内に、少なくとも1種類の他の療法によって処置されていることを含む。被験体が、以前の療法を用いた前処置に対するレスポンダーであったことは必要でない。従って、抗CD100結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体を含む医薬が与えられる被験体は、以前の療法を用いた前処置、または前処置が複数の種類の療法を含んでいた場合、以前の療法の1つもしくは複数に応答していてもよく、以前の療法を用いた前処置に、または前処置が複数の種類の療法を含んでいた場合、以前の療法の1つもしくは複数に応答していなくてもよい(例えば、癌は難治性であった)。抗CD100結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体を含む医薬を受ける前に、被験体が前処置を受けていてもよい他の癌療法の例には、外科手術;放射線療法;化学療法、任意で、自己由来骨髄移植と組み合わせた化学療法。この場合、適切な化学療法剤には、本明細書において前記で列挙された化学療法剤が含まれるが、これに限定されない;他の抗癌モノクローナル抗体療法;本明細書において前記で列挙された低分子を含むが、これに限定されない、低分子に基づく癌療法;ワクチン/免疫療法に基づく癌療法;ステロイド療法;他の癌療法;またはその任意の組み合わせが含まれるが、これに限定されない。
IX.診断
さらに、本発明は、例えば、関節炎、多発性硬化症、中枢神経系(CNS)炎症疾患および末梢神経系(PNS)炎症疾患、ならびに浸潤性血管形成を含む、ある特定のタイプの癌、自己免疫疾患、炎症疾患などのCD100発現細胞を介した疾患の診断中に有用な診断方法を提供する。この方法は、個体に由来する組織もしくは他の細胞または体液におけるCD100タンパク質または転写物の発現レベルを測定する工程、および測定された発現レベルと正常組織または体液における標準的なCD100発現レベルを比較する工程であって、標準と比較した発現レベルの増大が障害を示す工程を含む。
当業者に公知の古典的な免疫組織学的方法を用いて生物学的試料中のCD100タンパク質レベルをアッセイするために、本発明の抗CD100抗体ならびにその抗原結合断片、変種、および誘導体を使用することができる(例えば、Jalkanen, et al., J. Cell. Biol. 101:976-985(1985); Jalkanen et al., J. Cell Biol. 105:3087-3096(1987)を参照されたい)。CD100タンパク質発現を検出するのに有用な他の抗体に基づく方法には、イムノアッセイ、例えば、酵素結合免疫測定法(ELISA)、免疫沈降、またはウェスタンブロッティングが含まれる。適切なアッセイは、本明細書の他の場所においてさらに詳しく説明されている。
「CD100ポリペプチドの発現レベルをアッセイする」とは、直接的に(例えば、絶対的なタンパク質レベルを決定もしくは評価することによって)、または相対的に(例えば、第2の生物学的試料中の疾患関連ポリペプチドレベルと比較することによって)、第1の生物学的試料中のCD100ポリペプチドのレベルを定性的または定量的に測定または評価することを意味する。好ましくは、第1の生物学的試料におけるCD100ポリペプチド発現レベルを測定または評価し、障害を有さない個体から得られた第2の生物学的試料から取られた標準、または障害を有さない個体の集団からのレベルを平均することによって求められた標準である標準的なCD100ポリペプチドレベルと比較する。当技術分野において理解されるように、「標準的な」CD100ポリペプチドレベルが分かったら、これを、比較のための標準として繰り返し使用することができる。
「生物学的試料」とは、CD100を潜在的に発現する個体、細胞株、組織培養物、または他の細胞供給源から得られた任意の生物学的試料を意味する。哺乳動物から組織生検材料および体液を得るための方法は当技術分野において周知である。
X.イムノアッセイ
本発明の抗CD100抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体の免疫特異的結合は、当技術分野において公知の任意の方法によってアッセイすることができる。使用することができるイムノアッセイには、いくつか例を挙げてみると、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ELISA(酵素結合免疫測定法)、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射線測定法、蛍光イムノアッセイ、プロテインAイムノアッセイなどの技法を用いた競合アッセイ系および非競合的アッセイ系が含まれるが、これに限定されない。このようなアッセイは日常的であり、当技術分野において周知である(例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Ausubel et al., eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley & Sons, Inc., NY), Vol. 1を参照されたい)。例示的なイムノアッセイを以下で簡単に説明する(が、限定を目的としない)。
免疫沈降プロトコールは、一般的に、溶解緩衝液、例えば、タンパク質ホスファターゼおよび/またはプロテアーゼインヒビター(例えば、EDTA、PMSF、アプロチニン、バナジン酸ナトリウム)を添加したRIPA緩衝液(1％NP-40またはTritonX-100、1％デオキシコール酸ナトリウム、0.1％SDS、0.15M NaCl、0.01 Mリン酸ナトリウム,pH7.2、1％Trasylol)に溶解して細胞集団を溶解する工程、関心対象の抗体を細胞溶解産物に添加する工程、ある期間にわたって(例えば、1〜4時間)4℃でインキュベートする工程、プロテインAおよび/またはプロテインGセファロースビーズを細胞溶解産物に添加する工程、約1時間以上、4℃でインキュベートする工程、ならびにビーズを溶解緩衝液で洗浄する工程、ビーズをSDS/試料緩衝液に再懸濁する工程を含む。関心対象の抗体が特定の抗原を免疫沈降する能力は、例えば、ウエスタンブロット分析によって評価することができる。当業者であれば、抗体と抗原との結合を増大させ、バックグラウンドを減らすために改変することができるパラメータ(例えば、セファロースビーズを用いて細胞溶解産物を前もって清澄化する工程)について精通しているであろう。免疫沈降プロトコールに関するさらなる考察については、例えば、Ausubel et al., eds,(1994) Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley & Sons, Inc., NY) Vol. 1, 10.16.1を参照されたい。
一般的に、ウエスタンブロット分析は、タンパク質試料の調製、ポリアクリルアミドゲル(例えば、抗原の分子量に応じて8％〜20％SDS-PAGE)におけるタンパク質試料の電気泳動、ポリアクリルアミドゲルから膜、例えば、ニトロセルロース、PVDF、またはナイロンへのタンパク質試料の転写、ブロッキング溶液(例えば、3％BSAまたは脱脂乳を含むPBS)による膜のブロッキング、洗浄緩衝液(例えば、PBS-Tween20)による膜の洗浄、ブロッキング緩衝液で希釈した一次抗体(関心対象の抗体)による膜のブロッキング、洗浄緩衝液による膜の洗浄、ブロッキング緩衝液で希釈した、酵素基質(例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼもしくはアルカリホスファターゼ)または放射性分子(例えば、32Pまたは125I)と結合した二次抗体(一次抗体、例えば、抗ヒト抗体を認識する)による膜のブロッキング、洗浄緩衝液による膜の洗浄、および抗原の存在の検出を含む。当業者であれば、検出されるシグナルを増大させ、バックグラウンドノイズを低減するように改変することができるパラメータについて精通しているであろう。ウエスタンブロットプロトコールに関するさらなる議論については、例えば、Ausubel et al., eds,(1994) Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley & Sons, Inc., NY) Vol. 1、10.8.1を参照されたい。
ELISAは、抗原を調製する工程、96ウェルマイクロタイタープレートのウェルを抗原によってコーティングする工程、酵素基質(例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ)などの検出可能な化合物と結合した関心対象の抗体をウェルに添加する工程、ある期間にわたってインキュベートする工程、および抗原の存在を検出する工程を含む。ELISAでは、関心対象の抗体は、検出可能な化合物と結合する必要はない。代わりに、検出可能な化合物と結合した第2の抗体(関心対象の抗体を認識する)をウェルに添加することができる。さらに、ウェルを抗原によってコーティングする代わりに、抗体をウェルにコーティングすることができる。この場合、コーティングされたウェルに関心対象の抗原を添加した後に、検出可能な化合物と結合した第2の抗体を添加することができる。当業者であれば、検出されるシグナルを増大さるように改変することができるパラメータならびに当技術分野において公知のELISAの他のバリエーションについて精通しているであろう。ELISAに関するさらなる議論については、例えば、Ausubel et al., eds,(1994) Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley & Sons, Inc., NY) Vol. 1 at 11.2.1.を参照されたい。
抗体と抗原との結合親和性および抗体-抗原相互作用のオフレートは競合的結合アッセイによって求めることができる。競合的結合アッセイの一例は、漸増量の非標識抗原の存在下での標識抗原(例えば、3Hまたは123I)と関心対象の抗体とのインキュベーション、および標識抗原に結合した抗体の検出を含むラジオイムノアッセイである。特定の抗原に対する関心対象の抗体の親和性および結合オフレートは、スキャッチャードプロット分析によるデータから求めることができる。第2の抗体との競合もラジオイムノアッセイを用いて求めることができる。この場合、漸増量の非標識の第2の抗体の存在下で、標識化合物(例えば、3Hまたは125I)と結合した関心対象の抗体と抗原をインキュベートする。
さらに、本発明の抗CD100抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体は、CD100タンパク質またはその保存された変種もしくはペプチド断片のインサイチュー検出のために、免疫蛍光法、免疫電子顕微鏡、または非免疫学的アッセイのように組織学的に使用することができる。インサイチュー検出は、患者から組織学的標本を取り出し、組織学的標本に標識抗CD100抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体を適用することによって、好ましくは、生物学的試料の上に標識抗体(または断片)を載せることによって達成することができる。このような手順を使用することによって、CD100タンパク質または保存された変種もしくはペプチド断片の存在を確かめるだけでなく、調べられた組織におけるCD100タンパク質または保存された変種もしくはペプチド断片の分布を確かめることもできる。本発明を用いると、当業者であれば、このようなインサイチュー検出を実現するために、多種多様な組織学的方法(例えば、染色法)のうちどれであっても改変できることを容易に理解するであろう。
CD100遺伝子産物またはその保存された変種もしくはペプチド断片についてのイムノアッセイおよび非イムノアッセイは、典型的には、CD100またはその保存された変種もしくはペプチド断片に結合することができる検出可能に標識された抗体の存在下で、試料、例えば、生物学的液体、組織抽出物、新鮮に収集された細胞、または細胞培養においてインキュベートされた細胞の溶解産物をインキュベートする工程、および当技術分野において周知の多数の技法によって、結合した抗体を検出する工程を含む。
生物学的試料を、固相支持体または担体、例えば、ニトロセルロース、または細胞、細胞粒子、もしくは可溶性タンパク質を固定化することができる他の固体支持体と接触させ、この上に固定化することができる。次いで、支持体を適切な緩衝液で洗浄した後に、検出可能に標識された、抗CD100抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体によって処理する。次いで、結合しなかった抗体を除去するために、固相支持体を緩衝液で再洗浄することができる。任意で、その後に抗体を標識する。次いで、固体支持体上に結合している標識の量を従来手段によって検出することができる。
「固相支持体または担体」とは、抗原または抗体を結合することができる任意の支持体を意味する。周知の支持体または担体には、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然セルロースおよび修飾セルロース、ポリアクリルアミド、斑れい岩、および磁鉄鉱が含まれる。担体の性質はある程度、可溶性があってもよく、本発明の目的のために不溶性でもよい。支持体材料は、つながっている分子が抗原または抗体に結合することができる限り、実質的に任意の可能性のある構造形態を有することができる。従って、支持体の形態はビーズのように球状でもよく、試験管の内面または棒の外面のようにのように円筒形でもよい。または、表面は、シート、試験紙などのように平らでもよい。好ましい支持体はポリスチレンビーズを含む。当業者であれば、結合抗体または抗原に適した他の多くの担体を知っているか、日常的な実験を用いることによって同じものを突き止めることができるだろう。
ある特定のロットの抗CD100抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体の結合活性は周知の方法に従って求めることができる。当業者であれば、日常的な実験を用いることによって、それぞれの測定について機能しかつ最適なアッセイ条件を決めることができるだろう。
抗体-抗原相互作用の親和性を測定するのに利用可能な様々な方法があるが、速度定数を求める方法は比較的少ない。これらの方法のほとんどは標識抗体または抗原のいずれかに依存している。標識抗体または抗原があると日常的な測定は必ず複雑になり、測定された量に不確実性が導入される。
BIACORE(登録商標)において行われるような表面プラズモン共鳴 (SPR)には、抗体-抗原相互作用の親和性を測定する従来方法より優れた多くの利点がある。すなわち、(i)抗体も抗原も標識する必要がない;(ii)抗体は予め精製される必要はなく、細胞培養上清を直接使用することができる;(iii)異なるモノクローナル抗体相互作用の迅速な半定量比較を可能にするリアルタイム測定が可能であり、多くの評価目的に十分である;(iv)生体分子に特異的な表面を再生することができ、その結果、一連の異なるモノクローナル抗体を同一条件下で容易に比較できる;(v)分析法は完全に自動化され、ユーザーの介入なく大規模な一連の測定を行うことができる。BIAapplications Handbook, バージョンAB(1998年増刷)、BIACORE(登録商標)コード番号BR-1001-86; BIAtechnology Handbook, バージョンAB(1998年増刷)、BIACORE(登録商標)コード番号BR-1001-84。SPRに基づく結合試験では、結合ペアの一方のメンバーがセンサー表面に固定化されることが必要である。固定化された結合パートナーはリガンドと呼ばれる。溶解状態にある結合パートナーは分析物と呼ばれる。場合によっては、リガンドは、捕捉分子と呼ばれる別の固定化分子との結合を介して表面に間接的に取り付けられる。SPR応答は、分析物が結合または解離した時の検出表面での質量濃度変化を反映している。
SPRに基づいて、リアルタイムBIACORE(登録商標)測定は、相互作用が起こる時に直接、相互作用をモニタリングする。この技法はキネティックパラメータの決定に適している。比較親和性ランキング(Comparative affinity ranking)は簡単に行うことができ、センサーグラムデータからキネティック定数および親和定数を得ることができる。
分析物が不連続のパルスとなってリガンド表面に注入された時に、結果として生じたセンサーグラムは3つの本質的な相:(i)試料注入中の分析物とリガンドとの会合;(ii)試料注入中の平衡または定常状態。ここでは、分析物の結合速度は複合体からの解離とバランスがとれている;(iii)緩衝液が流れている間の表面からの分析物の解離に分けることができる。
会合相および解離相から、分析物-リガンド相互作用のキネティック(kaおよびkd、複合体形成の速度および解離の速度、kd/ka=KD)に関する情報が得られる。平衡相から、分析物-リガンド相互作用の親和性(KD)に関する情報が得られる。
BIAevaluationソフトウェアは、数値積分とグローバルフィッティングアルゴリズムの両方を用いた曲線フィッティングのための総合的な機能(comprehensive facility)を提供する。適切なデータ解析により、簡単なBIACORE(登録商標)調査から相互作用の別々の速度定数および親和定数を得ることができる。この技法によって測定可能な親和性の範囲はmMからpMまで非常に広い。
エピトープ特異性はモノクローナル抗体の重要な特徴である。BIACORE(登録商標)によるエピトープマッピングは、ラジオイムノアッセイ、ELISA、または他の表面吸着法を用いた従来法とは対照的に標識も精製抗体も必要とせず、数種類の一続きのモノクローナル抗体を用いた多部位特異性試験を可能にする。さらに、多数の解析を自動処理することができる。
ペアワイズ結合実験は、2種類のMAbが同じ抗原に同時に結合する能力を試験する。別々のエピトープに対するMAbは独立して結合するが、同一のエピトープまたは密接に関連するエピトープに対するMAbは互いの結合を妨害する。BIACORE(登録商標)を用いたこれらの結合実験は実施が簡単である。
例えば、捕捉分子を用いて第1のMabに結合させた後に、連続して抗原および第2のMAbを添加することができる。センサーグラムから、(1)どれくらいの抗原が第1のMabに結合するか、(2)表面に取り付けられた抗原に第2のMAbがどの程度まで結合するか、(3)第2のMAbが結合しなければ、ペアワイズ試験の順序を逆にすると結果が変わるかどうかが明らかになるであろう。
ペプチド阻害は、エピトープマッピングに用いられる別の技法である。この方法はペアワイズ抗体結合試験を補うことができ、抗原の一次配列が既知の場合に機能エピトープと構造特徴を関連づけることができる。様々なMAbと固定化抗原との結合を阻害するかどうか、ペプチドまたは抗原断片を試験する。ある特定のMAbの結合を妨害するペプチドは、このMAbにより定義されたエピトープと構造的に関連すると想定される。
本発明の実施では、特に定めのない限り、当業者の範囲内にある細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えDNA、および免疫学の従来法を用いる。このような技法は文献において十分に説明されている。例えば、
Figure 0006059013
を参照されたい。
抗体工学の一般的な原理は、Borrebaeck, ed. (1995) Antibody Engineering (2nd ed.; Oxford Univ. Press) に示されている。タンパク質工学の一般的な原理は、Rickwood et al., eds. (1995) Protein Engineering, A Practical Approach (IRL Press at Oxford Univ. Press, Oxford, Eng.)に示されている。抗体および抗体-ハプテン結合の一般的な原理は、Nisonoff (1984) Molecular Immunology (2nd ed.; Sinauer Associates, Sunderland, Mass.);およびSteward (1984) Antibodies, Their Structure and Function (Chapman and Hall, New York, N.Y.)に示されている。さらに、一般的に、Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York; Stites et al., eds. (1994) Basic and Clinical Immunology (8th ed; Appleton & Lange, Norwalk, Conn.)およびMishell and Shiigi (eds) (1980) Selected Methods in Cellular Immunology (W.H. Freeman and Co., NY)のように、当技術分野において公知であり、具体的に述べられていない免疫学における標準的な方法に従う。
免疫学の一般的な原理を示している標準的な参考文献には、
Figure 0006059013
が含まれる。
前記で引用された全ての参考文献ならびに本明細書において引用された全ての参考文献はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
以下の実施例は例示として提供され、限定として提供されない。
実施例1
CD100に特異的な抗体の選択および特徴付け
ヒトCD100、サルCD100、およびマウスCD100を認識するマウス抗CD100抗体を、下記の方法を用いて作製した。
「ライン1」細胞株は、BALB/cマウスにおける自然発症肺腫瘍から得られた。本発明者らは、BALB/cマウスへの、外来cDNAでトランスフェクトされたライン1生細胞の注射は免疫応答を誘導する有効な手段であると以前に示した(未発表データ)。ライン1細胞株を、完全長ヒトCD100 cDNA(SEQ ID NO:23)をコードする発現プラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞株から、ヒトCD100を発現する安定株を単離した(ライン1.CD100)。CD100欠損マウス(BALB/cバックグラウンド、Kumanogoh et al., J. Immunol. 169:1175-1181(2002)を参照されたい)を、完全フロイントアジュバント(CFA)で乳化した精製マウスCD100-His(精製用C末端6Xhisタグを有するマウスCD100細胞外ドメイン)を用いた免疫化によって初回刺激した。この免疫化の1週間後に、マウスに、200,000個のライン1.CD100生細胞を筋肉内(i.m.)注射した。ライン1.CD100注射の19日後に、マウスを屠殺し、脾臓を収集し、ハイブリドーマを作製する標準的な手順に従ってP3X63Ag8.653融合パートナー(ATCC#CRL-1580)と融合した。ハイブリドーマクローンを、ヒトCD100およびマウスCD100に結合するかどうかELISAによってスクリーニングした。特に、ハイブリドーマ技術を用いて、MAb67に特異的なハイブリドーマ細胞株を調製した
Figure 0006059013
。マウスCD100特異的抗体の大きなパネルを作製した。これらの抗体の大部分も高親和性でヒトCD100に結合した。2つのハイブリドーマ、クローン67-2および76-1は、マウスCD100およびヒトCD100に対して高親和性を示すモノクローナル抗体(それぞれ、MAb67およびMAb76と呼ぶ)を産生した(表2を参照されたい)。
（表２）マウス抗CD100 MAbの親和性測定
Figure 0006059013
*親和性はBIACORE(登録商標)表面プラズモン共鳴技術を用いて測定した。
抗体クロスブロッキングELISAから、MAb67およびMAb76はCD100上にある別個のエピトープを認識することが証明された。さらに、MAb67およびMAb 76は、独立して得られたマウス抗ヒトCD100抗体BD16(US2008/0219971A1に記載)が認識するエピトープとは異なるエピトープを認識する。従って、2つの独立したマウス抗CD100抗体であるMAb76(SEQ ID NO:25-40を参照されたい)ならびにMAb67(SEQ ID NO:3-8; 10; 11-16; 18; 20および22を参照されたい)が作製された。
実施例2
MAb67およびMAb 76はインビトロでマウスCD100およびヒトCD100の活性をブロックする
CD100特異的抗体を、蛍光ブロッキングアッセイにおいてCD100結合を阻害する能力についてスクリーニングした。CD100特異的抗体がCD100とプレキシンB1との結合をブロックするかどうか試験するために使用した方法の図を図1に示した。ヒト293細胞を、CD100受容体:プレキシンB1をコードするcDNAによってトランスフェクトした。プレキシンB1を発現する安定細胞株を選択した(293/プレキシン)。細胞表面にあるプレキシンB1に結合したCD100-Hisを、ビオチン結合Hisタグ特異的モノクローナル抗体およびストレプトアビジン-APCを用いたフローサイトメトリーによって検出した。試験した抗CD100 MAbがCD100とプレキシンB1との結合をブロックできた時には、表面に検出されるCD100-Hisは少なくなり、結果として蛍光が少なくなる。
40ナノグラム(ng)のヒトCD100-HisまたはマウスCD100-His(C末端Hisタグ)を単独で、または様々な濃度の抗CD100 MAbと4℃で一晩インキュベートした。翌朝、(1)CD100のみ、または(2)抗CD100 MAb(67または76)とプレインキュベートしたCD100を293/プレキシン細胞と組み合わせ、氷上で30分間インキュベートした。プレキシンB1を介して細胞に結合しているCD100は、ビオチン化ポリクローナルウサギ抗His MAbの後にストレプトアビジン-APCを用いて検出した。細胞をフローサイトメトリーによって分析した。結果から、CD100の中和によって蛍光が少なくなることが分かった。特に、CD100とMAb67またはMAb76をプレインキュベートすることによって、CD100のみと比較して蛍光が弱くなった(図2)。抗CD100 MAb67または76の濃度を0.156μg/mlから0.625μg/mlに増やすと、さらに蛍光が弱くなった。同様にヒトCD100がブロックされることも観察された(データ示さず)。従って、これらの結果から、MAb67およびMAb76は、ヒトCD100とプレキシンB1との結合およびマウスCD100とプレキシンB1との結合をブロックできたことが分かった。
CD100/プレキシンB1シグナル伝達は、アクチンフィラメントの再編成を誘導することによって細胞外マトリクスからの剥離および細胞崩壊を誘導することが示されている(Kruger et al., Nature Reviews Molecular Cell Biology 6:789-800(2005)を参照されたい)。細胞外マトリクスと結合させた後に細胞剥離を確かめる異種アッセイを用いて、フィブロネクチンコーティングプレートからの293/プレキシン細胞のCD100誘導性剥離を抗CD100抗体がブロックできるかどうか確かめた。
細胞剥離アッセイのために、293/プレキシン細胞(通常、懸濁細胞株として増殖させる)を、フィブロネクチンでコーティングされた96ウェルプレートに40,000細胞/ウェルの密度でプレートし、一晩、接着させた。2(2)μg/mlのマウスCD100-His(C末端Hisタグ)を単独で、または様々な濃度の抗CD100 MAb(67または76)と4℃で6時間インキュベートした。次いで、CD100試料を室温まで上げた後に、293/プレキシン細胞に添加した。細胞を、CD100または抗体とプレインキュベートしたCD100によって37℃で30分間、処理し、PBSで2回洗浄し、クリスタルバイオレットによって15分間、染色した。次いで、細胞をPBSで2回洗浄し、乾燥させた。文書化のためにスキャナーで画像を取り込んだ。次いで、33％氷酢酸100μlを用いてクリスタルバイオレットをRTで15分間、可溶化し、ピペットで吸い取って新しいプレートに入れた。吸光度を570nmで読み取った。CD100があるとプレートに接着している細胞の数が少なくなり、従って、吸光度が下がるのに対して、CD100が中和されると吸光度が上がる。
図3に示したように、MAb67およびMAb76は両方とも、アイソタイプ対照と比較してマウスCD100を介した細胞剥離をブロックし、吸光度を上げることができた。同様に、両MAbともヒトCD100を介した細胞剥離をブロックすることができた(データ示さず)。
MAb67および76はCD100と細胞表面プレキシンB1との結合、およびフィブロネクチンコーティングプレートからの293/プレキシン細胞の誘導剥離をブロックした。前記のインビトロ機能アッセイの結果から、MAb67およびMAb76はインビトロでマウスCD100およびヒトCD100の機能をブロックできたことが分かった。
実施例3
マウス疾患モデルにおける抗CD100モノクローナル抗体の評価
抗CD100中和モノクローナル抗体(76および67)をSJL EAE動物モデルにおいてインビボで試験した。再発性実験的自己免疫脳脊髄炎(R-EAE)は、中枢神経系内での炎症および脱髄を特徴とする、CD4+T細胞を介した疾患である。SJLマウスにおいて、R-EAEは、プロテオリピドタンパク質のペプチドエピトープ(PLP139-151)(HSLGKWLGHPDKF;SEQ ID NO:24)で免疫化することによって誘導することができる。このモデルは、中等度から重篤な急性麻痺期に続いて、寛解、その後の再発を特徴とする。表3に示したスケールを用いて、疾患の重篤度をスコア化した。
（表３）EAE臨床徴候の評価
Figure 0006059013
SJLマウスを、100μgのPLP139-151を含むCFAで免疫化した。百日咳毒素を0日目に投与し、48時間後に再投与した。マウスを、30mg/kg MAb76、MAb67、またはアイソタイプ対照抗体を用いて、0日目から週2回、または7日目から週1回、処置した。EAE臨床徴候のスコア化は、EAE誘導後、10日目から開始した。
図4Aに示したように、MAb76またはMAb67による処置によって、マウスIgG対照と比較してSJLマウスにおけるEAEの重篤度が低減した。MAb76およびMAb67について、1X/週および2x/週それぞれの21日目と試験最終日の間の群平均スコア(GMS)のパーセント低下を図4Bに示した。図4Bに示したように、MAb76(1X/週)のGMSパーセント阻害は35〜40％であった。MAb67(1X/週)のGMSパーセント阻害は65〜70％であった。MAb76(2X/週)のGMSパーセント阻害は40〜50％であった。MAb67(2X/週)のGMSパーセント阻害は45〜50％であった。これらの結果から、MAb67およびMAb76は両方ともSJLマウスの再発寛解型EAEを弱めたことが分かる。
30mg/kg用量のMAb76を使用し、1X/週で投与して、SJL EAE試験を繰り返した。結果から、MAb76は、マウスIgGと比較してSJLマウスのEAEの重篤度を低減できたことがさらに証明された(データ示さず)。21日目と試験最終日の間の群平均スコア(GMS)のパーセント低下は50〜60％であった。さらに、30mg/kgのMAb76またはMAb67を使用し、1X/週で投与して、SJL EAE試験を繰り返した。MAb67またはMAb76で処置すると、18日目と試験最終日の間のGMSパーセント低下は30〜40％であった。図5Aおよび5Bの結果は、MAb76およびMAb67がSJLマウスのEAE重篤度を低減できたことをさらに証明している。
30mg/kgのMAb67を使用し、1X/週で投与して、SJL EAE試験を繰り返した。この場合、処置を免疫化後7日目に開始した。7日目に開始したMAb67による処置から、12日目と試験最終日の間のGMSパーセント低下は約50％であった。結果を図6に示した。
これらのインビボ試験からの結果は、様々なマウスEAE実験におけるMAb76またはMAb67を用いたCD100中和によってEAEの臨床徴候が低下したことを証明している。これらの実験において、MAb76およびMAb67の結果は互いに似ていた。
これらの結果から、MAb76およびMAb67はインビトロでCD100活性をブロックする能力を有し、重要なことに、マウスEAEモデルでの様々な投薬実験においてEAEの重篤度を低減する能力を有することが証明された。
実施例4
キメラ抗CD100モノクローナル抗体およびヒト化抗CD100モノクローナル抗体の調製
前記のマウスモノクローナル抗体クローン67は、インビトロではヒトCD100およびマウスCD100を中和する能力を有し、インビボではマウスモデルのEAEを寛解させることが示されている。
クローン67ハイブリドーマから可変重鎖(VH)遺伝子および可変軽鎖(VK)遺伝子をクローニングし、これらの配列を決定した。MAb67 VH遺伝子およびVK遺伝子のアミノ酸配列を以下に示した。CDR1領域、CDR2領域、およびCDR3領域には下線を引いた。
Figure 0006059013
ヒトγ4重鎖定常領域コード配列を含有する哺乳動物発現ベクターに入れてMAb67 VH遺伝子をクローニングして、完全長キメラ重鎖を作り出した。ヒトκ定常領域コード配列を有する哺乳動物発現ベクターに入れてMAb67 VKをクローニングして、完全長キメラ軽鎖を作り出した。キメラ抗体を作るために、キメラ重鎖およびキメラ軽鎖を含有する発現ベクターをCHO-S細胞にコトランスフェクトした。産生されたモノクローナル抗体を細胞から分泌させ、3〜6日の発現期間の後に収集した。結果として生じたMAbをプロテインAクロマトグラフィーを用いて精製し、特徴付けた。結果として生じたキメラMAb(MAb2368)は、フローサイトメトリーおよびELISAによってCD100に特異的であることが証明され、CD100との結合においてマウスMAb67と競合できることが示された。まとめると、これらのデータは、67MAbをコードする正しいVH遺伝子およびVK遺伝子が単離されたことを証明している。
MAb67可変CDR領域を用いて、ヒト化モノクローナル抗体を作り出した。ヒト化VH遺伝子およびVK遺伝子をそれぞれ、ヒトγ4を含有するベクターおよびヒトκ定常ドメインを含有するベクターに入れてクローニングした。ヒト化VHおよびヒト化VKが対になることによって、IgG4/κ MAb2503が作り出された。ヒト化MAb67 VH(H2160)およびVK(L553)のアミノ酸配列を下記に示した。CDR1領域、CDR2領域、およびCDR3領域には下線を引いた。
Figure 0006059013
MAb2503抗体のVH領域をコードするポリヌクレオチド(ヒトγを有するヒト免疫グロブリン遺伝子;H2160)およびVK領域をコードするポリヌクレオチド(ヒトκを有するヒト免疫グロブリン遺伝子;L553)をpCMV-Script(Stratagene)ベクターに入れてクローニングし、2009年5月7日にAmerican Type Culture Collection(「ATCC」)に寄託し、それぞれ、ATCC寄託番号PTA-10004およびPTA-10005が付けられた。ATCCは、10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, USAにある。ATCC寄託は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約の条項によりなされた。
実施例5
ヒト化抗CD100モノクローナル抗体2503の特徴付け
MAb2503の特異性をELISAおよびフローサイトメトリーによって特徴付けた。MAb2503を、MAb67とのエピトープ競合アッセイおよびBIACORE(登録商標)表面プラズモン共鳴技術を用いた親和性決定アッセイにおいて試験した。
MAb2503およびMAb67のエピトープ特異性を競合ELISAによって確かめた。ELISAプロトコールのために、ELISAプレートをCD100-Fcでコーティングした。マウス67MAbまたはヒト化2503MAbを滴定した。抗体をCD100に結合させ、結合しなかった抗体を洗い流した。ビオチン化MAb67を添加した。抗体をCD100に結合させ、結合しなかった抗体を洗い流した。CD100に結合したビオチン化MAb67をストレプトアビジン-HRPを用いて検出した。MAb2503またはMAb67がビオチン化67とヒトCD100との結合をブロックする能力(図7Aに示した)およびビオチン化67とマウスCD100との結合をブロックする能力(図7Bに示した)をELlSAによって分析した。
抗CD100 MAbの結合親和性を、BIACORE(登録商標)表面プラズモン共鳴技術を用いて確かめた。MAb2503は、CD100(ヒト、マウス、およびマーモセット)ならびにCD100発現細胞株にのみ結合することが示された。このことから、MAb2503はCD100に特異的であることが分かった。MAb2503は、MAb67と比較してヒトCD100およびマウスCD100に対して高親和性を示した。MAb2503およびMAb67の親和性の特徴をまとめたものを以下の表4に示した。
（表４）ヒトCD100、マーモセットCD100、およびマウスCD100に対する抗CD100 MAbの親和性
Figure 0006059013
*親和性はBIACORE(登録商標)表面プラズモン共鳴技術を用いて測定した
これらのアッセイから、MAb2503はCD100に特異的であり、マウスMAb67と同じエピトープに結合することが分かる。MAb2503はマウスCD100およびヒトCD100の両方に結合することが示された。従って、MAb2503の利点は、マウスおよびヒトでも安全性および効力について試験できることである。さらに、MAb2305はヒトCD100、サルCD100、およびマウスCD100に結合することが示された。
実施例6
MAb2503はインビトロでマウスCD100およびヒトCD100の活性をブロックする
(1)フローサイトメトリーブロッキングアッセイおよび(2)細胞剥離アッセイを含む、実施例2において前述したアッセイを用いて、MAb2503がCD100機能をブロックできるかどうか試験した。
CD100特異的抗体であるMAb67およびMAb2503を、蛍光ブロッキングアッセイにおいてCD100とプレキシンB1との結合を阻害する能力についてスクリーニングした。CD100特異的抗体がCD100とプレキシンB1との結合をブロックするかどうか試験するために使用した方法を図1に示した(実施例2)。CD100とMAb67またはMAb2503をプレインキュベーションすると、CD100のみと比較して蛍光が弱くなった。MAb2503は、インビトロでヒトCD100(図8Aを参照されたい)、マーモセットCD100(図8Bを参照されたい)、およびマウスCD100(図8Cを参照されたい)の結合をブロックすることができた。従って、これらの結果から、MAb67およびMAb2503は両方ともヒトCD100、サルCD100、およびマウスCD100とプレキシンB1との結合をブロックできたことが分かった。
ヒトCD100およびサルCD100を介した、フィブロネクチンコーティングプレートからの293/プレキシン細胞の剥離を抗CD100 MAbがブロックする能力を、実施例2に記載の細胞剥離アッセイを用いて確かめた。CD100があると、プレートに接着している細胞の数が少なくなり、従って、吸光度が下がる。図9Aおよび9Bにそれぞれ示したように、ヒトCD100およびマーモセットCD100がMAb2503またはMAb67によって中和されると吸光度が上がった。このアッセイにおいてMAb2503およびMAb67はマウスCD100も中和した(データ示さず)。
MAb2503は、ヒトCD100、マウスCD100、およびサルCD100と細胞表面プレキシンB1との結合をブロックし、フィブロネクチンコーティングプレートからの293/プレキシン細胞の剥離を誘導した。従って、これらの結果から、MAb2503はヒトCD100、マウスCD100、およびサルCD100を機能的に中和できたことが分かる。
実施例7
抗CD100抗体はインビボで血管形成を阻害する
CD100は強力な血管形成促進分子であり、CD100が結合することによってプレキシンB1が活性化すると、c-Metがトランス活性化し、腫瘍細胞の浸潤能力が促進され、血管形成が促進される。
インビボでの腫瘍成長に及ぼすCD100非存在の影響を証明するために、CT26腫瘍細胞を野生型Balb/cまたはCD100-/-マウスの脚筋肉に注射し、結果として生じた腫瘍成長を測定した。図10に示したように、この試験では、CD100-/-マウスにおける腫瘍体積は野生型Balb/cマウスと比較して少なかった。これらの結果から、マウス結腸癌細胞株(CT26)は、CD100の無い環境において増殖が遅いことが証明された。
次に、野生型Balb/cマウスにおけるCT26腫瘍細胞増殖をMAb67が低減する能力を試験した。CT26腫瘍細胞を野生型Balb/c(n=48)マウスまたはCD100-/-(n=9)マウスの脚筋肉に注射した。注射後に、野生型マウスを、それぞれ24匹のマウスからなる2つの群に分けた。一方の群は、1日目から開始して、1mg MAb67をi.p.注射することによって処置し、他方の群は、1mgマウスIgGをi.p.注射することによって処置した。7日ごとに処置を繰り返した。マウスの腫瘍成長を分析した。図11に示したように、MAb67で処置すると、マウスIgG対照群と比較してBalb/cマウスにおけるCT26腫瘍成長は低減した。
従って、これらの結果から、MAb67の構造特徴および機能特徴を有する抗体はインビボで腫瘍成長を低減したことが分かる。
実施例8
抗CD100抗体はインビボでコラーゲン誘導性関節炎を阻害する
コラーゲン誘導性関節炎(CIA)マウスモデルにおいてMAb67が関節炎を低減する能力を試験した。コラーゲン誘導性関節炎(CIA)モデルは、疾患原因に取り組み、治療RA標的を確認するために広く用いられている関節リウマチ(RA)の前臨床動物炎症モデルである(Brand et al., Nat. Protoc. 2(5): 1269-75(2007))。一般的なCIA手順を図12に示した(この一般的な手順に対する全ての変更を下記で説明する)。簡単に述べると、0日目に、コラーゲンおよび完全フロイントアジュバント(CFA)を含有するエマルジョンを尾の皮内に注射することによって、関節炎を誘導した。その後に、20日目から週2回、皮下(s.c.)注射または腹腔内(i.p.)注射することによって、対照および試験処置を投与した。調査1の試験群を以下の表5において説明する。
（表５）コラーゲン誘導性関節炎(CIA)調査1試験群
Figure 0006059013
表6に示したスケールを用いて、疾患重篤度をスコア化した。それぞれのマウス脚をスコア化した(関節炎の巨視的徴候を週3回評価した)。個々の脚スコアを足すことによって、関節炎指数(Arthritic Index)(AI)を計算した(最大AI=16)。典型的に、CIAモデルでは関節炎の最初の徴候は免疫化の21〜28日後に現われる。
（表６）CIAスコア化法
Figure 0006059013
調査1の結果は、600μg MAb67で処置した群のCIAモデルにおける関節炎疾患発症の低減を示した。処置を20日目で開始した場合の、600μg MAb67で処置したマウスの関節炎指数(AI)を600μg負の対照(IgG1)および600μg正の対照(エタネルセプト)で処置したマウスのAIと比較した。結果を図13Aに示した。これらの結果から、MAb67は、CIAモデルにおける関節炎疾患発症の低減がエタネルセプトと同程度であるか、エタネルセプトより良好であったことが分かる。
第2の調査(調査2)は、処置を遅らせた、すなわち関節炎指数が>3になった時に開始した場合の、MAb67および正の対照による処置を含んだ。調査2の試験群を以下の表7に示した。
（表７）コラーゲン誘導性関節炎(CIA)調査2試験群
Figure 0006059013
調査2のために、MAb67を用いた処置(処置を20日目に開始したか、AIが>3になった時に開始した)のAI結果を、負の対照(IgG1)および正の対照(エタネルセプト;AIが>3の時に処置を開始した)と比較した。結果を図13Bに示した。これらの結果から、処置を20日目で開始したか、AI>3まで遅らせた時に、MAb67は、CIAモデルにおける関節炎疾患発症の低減がエタネルセプトと同程度であるか、エタネルセプトより良好であったことが分かる。従って、MAb67はCIAモデルにおいてAIが>3になってから投与された時に、関節炎疾患発症を阻止し、関節炎疾患を処置することが示された。
実施例9
抗CD100抗体はインビボでの一次B細胞応答および記憶B細胞応答をブロックする
Balb/cおよびCD100-/-マウスを、ミョウバン(水酸化アルミニウム-水酸化マグネシウム)で沈澱させた(4-ヒドロキシ-3-ニトロフェニル)アセチル結合ニワトリガンマグロブリン(「NP-CGG」)で免疫化し、その後に、対照IgG1(Balb/cおよびCD100-/-)またはMAb67(Balb/cのみ)によって処置した。試験群を以下の表8に示した。
（表８）一次B細胞応答および記憶B細胞応答の試験群
Figure 0006059013
マウスを前記の表8に記載のように-7日目から処置し、0日目にNP-CGGで免疫化した。1群あたり3匹のマウスを10日目に安楽死させ、脾臓およびリンパ節を胚中心(GC)B細胞(「B220+CD38lowPNA+」)について分析した。それぞれの脾臓を別々に分析し、3匹全てのマウスからのリンパ節を分析のために1つの試料にした。表8に示したように、残りのマウスの処置を続けた。21日目に、マウスを、同じNP-CGGを含むミョウバンを用いて追加免疫した。31日目に、残りのマウスを安楽死させ、脾臓およびリンパ節を胚中心(GC)B細胞(「B220+CD38lowPNA+」)について分析した。それぞれの脾臓を別々に分析し、3匹全てのマウスからのリンパ節を分析のために1つの試料にした。図14Aおよび14Bの結果から、600μg MAb67による処置によって、一次免疫(14A)および二次免疫(14B)それぞれの後に、脾臓(SP)およびリンパ節(LN)にあるGC B細胞の数が減少したことが分かる。従って、MAb67は、インビボで一次B細胞応答および記憶B細胞応答をブロックすることが示された。
実施例10
抗CD100抗体はインビボで腫瘍成長を遅らせる
MAb67による腫瘍成長の低減を、CT26およびBCA34マウス異種移植片腫瘍モデルにおいて試験した。これらの試験のために、腫瘍細胞をBalb/cマウスの脚に筋肉内注射した。1mgのMAb67抗体または負の対照(IgG)を0.2ml体積に溶解したものを、移植の1日後から週1回、腹腔内(i.p.)注射することによって、マウスを処置した。腫瘍体積(mm3)および/または大腿体積(mm3)の変化を測定して、腫瘍成長速度を求めた。負の対照マウスの腫瘍成長速度と比較したMAb67処置マウスの腫瘍成長速度を用いて、腫瘍成長遅延(TGD)を計算した。
CD100の無い環境においてBCA34腫瘍細胞およびEMT6腫瘍細胞が成長する能力も試験した。これらの試験のために、腫瘍細胞をBalb/cおよびCD100-/-(SEMA4D-/-)マウスの脚に注射し、腫瘍成長を測定した。
CT26結腸腫瘍細胞
CT26腫瘍細胞はマウス結腸腫瘍に由来し、非常に低レベルのCD100を発現する。50,000個のCT26結腸腫瘍細胞を野生型Balb/cマウス(20匹マウス/処置群)にs.c.注射した。腫瘍体積(mm3)の変化を、移植の1日後から開始して毎週、1mg MAb67で処置したマウスにおいて測定し、IgG対照を注射したマウスと比較した。結果(ある期間にわたる平均腫瘍体積)を図15に示した。MAb67処置マウスのTGDは17％(p=0.0317)であった。これらの結果から、MAb67処置マウスにおいてCT26腫瘍成長は遅くなったことが分かる。
BCA34線維芽細胞腫瘍細胞
BCA34腫瘍細胞は低レベルのCD100を発現する。最初に、50,000個のBCA34腫瘍細胞を、野生型Balb/cマウスまたはCD100-/-(「SEMA4D-/-」)マウスの腹部領域にs.c.注射した。これらのマウスにおいて腫瘍体積(mm3)の変化を測定し、結果を図16Aに示した。これらの結果から、BCA34腫瘍細胞は、CD100の無い環境において増殖が遅いことが分かる。
別の実験では、50,000個のBCA34腫瘍細胞を野生型Balb/cマウス(21匹マウス/処置群)の脚筋肉に注射した。腫瘍体積(mm3)の変化を、移植の1日後から開始して毎週、1mg MAb67で処置したマウスにおいて測定し、IgG対照を注射したマウスと比較した。結果(ある期間にわたる平均大腿体積)を図16Bに示した。MAb67処置マウスのTGDは18％(p=0.009)であった。これらの結果から、BCA34腫瘍成長はMAb67処置マウスにおいて低下したことが分かる。
EMT6乳癌腫瘍細胞
EMT6腫瘍細胞はマウス乳癌腫瘍に由来し、中レベルのCD100を発現する。50,000個のEMT6腫瘍細胞を野生型Balb/cマウスまたはCD100-/-(「SEMA4D-/-」)マウスの脚筋肉に注射した。これらのマウスにおける腫瘍体積(mm3)の変化を測定し、結果を図17に示した。野生型Balb/cマウスおよびCD100-/-マウス(「SEMA4D-/-」)について腫瘍体積(mm3)の変化を示した。これらの結果から、EMT6腫瘍細胞は、CD100の無い環境において増殖が遅いことが分かった。
実施例11
抗CD100抗体はインビボでのヒト腫瘍成長を遅らせる
MAb2503による腫瘍成長の低減を、HN12およびHN6 HIF1a mODDヒト異種移植片腫瘍モデルにおいて試験した。HN12およびHN6 HIF1a mODDはヒト頭頚部腫瘍に由来し、両異種移植片とも高レベルのHIF1aおよびCD100を発現する。HN6 HIF-1a mODD異種移植片モデルは、Sun et al., J Biol Chem 284(46):32066-74(2009)に記載されている。これらの実験のために、2個の腫瘍/マウスを無胸腺ヌードマウス(10匹マウス/処置群)にs.c.注射した。移植の1日後に、0.2ml体積に溶解した1mgのMAb2503抗体または負の対照(IgG4)を週1回、i.p.注射することによって、マウスを処置した。腫瘍体積(mm3)の変化を測定した。負の対照マウスの成長速度と比較した、MAb2503処置HN6 HIF-1a mODDマウスの腫瘍成長速度を用いて、腫瘍成長遅延(TGD)を計算した。
この実験のエンドポイントはTGDであった。HN12およびHN6 HIF-1a mODD異種移植片モデルにおけるMAb2503処置の腫瘍成長結果を、それぞれ、図18および19Aに示した。MAb2503で処置したHN6 HIF-1a mODD異種移植片マウスのTGDは13％(p=0.0008)であった。さらに、IgG4対照およびMAb2505で処置したHN6 HIF-1a mODD異種移植片マウスに由来する代表的な腫瘍の写真を図19Bに示した。これらの結果から、MAb2503処置によってインビボでヒト頭頚部腫瘍成長が低減したことが分かる。
実施例12
高力価のMAb2503を発現させるためのCHO-S安定細胞株
高力価のMAb2503を発現させるためにCHO-S安定細胞株を得た。ヒト化抗CD100モノクローナル抗体2503の重鎖および軽鎖の相補DNA(cDNA)を使用して、いくつかのチャイニーズハムスター卵巣(CHO-S)発現細胞株を作製した。これは、GPEx(商標)技術(Catalent Pharma Solutions, Madison, Wisconsin)およびCHO-S前駆細胞を用いて構築した(Bleck et al.,「An Alternative Method for the Rapid Generation of Stable, High-Expressing Mammalian Cell Lines」, BioProcessing Journal(September/October 2005)を参照されたい)。
単一細胞クローニングの後に、培養状態での増殖および抗体産生に基づいて1個の発現クローンを選択し、バイアルに入れた発現細胞からなるリサーチバンク(research bank)を作製した。このクローンによって産生された発現抗体の効力および特異性を、インビトロおよびインビボ機能アッセイ(例えば、フローブロッキングおよび剥離アッセイ)を用いて特徴付けた。その後に、選択されたCHO発現クローンに由来する細胞を培養状態で増殖させ、第2の(ペアレンタルシードストック(Parental Seed Stock))バンクを調製し、凍結した。その後に、ペアレンタルシードストックに由来する1個のバイアルからの細胞を培養状態で増殖させ、マスター細胞バンク(MCB)のcGMP作製のために使用した。
実施例13
ラットおよびカニクイザルにおける抗CD100抗体の投与量およびPK試験
ラットおよびカニクイザルにおいてMAb2503の単回静脈内注射飽和分析を行った。
ラット試験:36匹のSprague-Dawleyラット(3匹/性別/群)に、0.01〜100mg/kgのMAb2503の単回静脈内注射を投与した。MAb2503によって飽和した細胞標的(SEMA4D)のパーセントを求めるために、フローサイトメトリーに基づく飽和アッセイを溶解全血に対して様々な時点で行った。血清中に検出されたMAbの量との良好なデータ相関があった。これは、飽和が血清中の遊離薬物の量に依存し、血清中に約1〜5μg/mlの遊離薬物が検出された時に細胞が飽和したことを示唆している。雄ラットおよび雌ラットにおける0mg/kg、0.01mg/kg、0.1mg/kg、1.0mg/kg、10mg/kg、および100mg/kgのMAb2503用量でのパーセントSEMA4D飽和を、それぞれ、図2OAおよび図2OBに示した。
霊長類試験:28匹のカニクイザル(2/性別/群;4/性別/対照群)に、0.01〜100mg/kgのMAb2503の単回静脈内注射を投与した。MAb2503によって飽和した細胞標的(SEMA4D)のパーセントを求めるために、フローサイトメトリーに基づく飽和アッセイを溶解全血に対して様々な時点で行った。血清中に検出されたMAbの量との良好なデータ相関があった。これは、飽和が血清中の遊離薬物の量に依存し、血清中に約1〜5μg/mlの遊離薬物が検出された時に細胞が飽和したことを示唆している。雄ラットおよび雌ラットにおける0mg/kg、0.01mg/kg、0.1mg/kg、1.0mg/kg、10mg/kg、および100mg/kgのMAb2503用量でのパーセントSEMA4D飽和(組み合わせ)を図21に示した。ラットおよび霊長類の飽和結果は非常に似ていた。
ラットおよび霊長類における0.01mg/kg、0.1mg/kg、1.0mg/kg、10mg/kg、または100mg/kg MAb2503の単回静脈内注射についての生物学的半減期(時間(日数))、注射後ゼロ時での血漿中抗体濃度(C0)、ゼロ時から時間tまでの血漿中濃度曲線下面積(AUC0-1)を含む薬物動態学的(PK)結果を表9に示した。
（表９）ラットおよび霊長類(カニクイザル)における2503抗体のPK値
Figure 0006059013
MAb2503排出相半減期はラットとカニクイザルとで似ていることが見出され、用量依存的に約6時間〜約10日であった。飽和およびPK結果は両方とも用量依存的であるように見え、ラットとカニクイザルとで非常に似たプロファイルを示唆している。さらに、ラットまたはカニクイザルにおいて0.01〜100mg/kgの用量でMAb2503の有意な毒性は観察されなかった。
特定の態様の前述の説明は、本発明の一般的な内容を十分に明らかにしているので、他の人は、当技術分野の範囲内の知識を適用することによって、本発明の一般的な概念から逸脱することなく、過度の実験なく、このような特定の態様を容易に変更することができる、および/または様々な用途に適合させることができる。従って、このような適合および変更は、本明細書において提示された開示およびガイダンスに基づいて、開示された態様の均等物の意味および範囲の中にあることが意図される。開示およびガイダンスを考慮して本明細書の用語または語句が当業者により解釈されるように、本明細書における語句または用語は説明を目的とし、限定を目的としないと理解すべきである
本発明の範囲および目的は、前記の例示的な態様のいずれによっても限定されてはならず、添付の特許請求の範囲およびその均等物によってのみ定義すべきである。

Claims (14)

  1. マウス、ヒト、およびサルのCD100に特異的に結合し、かつ、それらを中和する、重鎖可変領域ポリペプチド（VH）および軽鎖可変領域ポリペプチド（VL）を含む単離された抗体またはその抗原結合断片であって、
    （a）該VHはSEQ ID NO:6、7、および8をそれぞれ含むVH-CDR1、VH-CDR2、およびVH-CDR3アミノ酸配列を含み、並びに、該VLはSEQ ID NO:14、15、および16をそれぞれ含むVL-CDR1、VL-CDR2、およびVL-CDR3アミノ酸配列を含む；
    （b）該VHは、SEQ ID NO:6、7、および8をそれぞれ含むVH-CDR1、VH-CDR2、およびVH-CDR3アミノ酸配列を有するアミノ酸配列であって、SEQ ID NO:9またはSEQ ID NO:10と少なくとも90％同一であるアミノ酸配列を含み、並びに、該VLは、SEQ ID NO:14、15、および16をそれぞれ含むVL-CDR1、VL-CDR2、およびVL-CDR3アミノ酸配列を有するアミノ酸配列であって、SEQ ID NO:17またはSEQ ID NO:18と少なくとも90％同一であるアミノ酸配列を含む；または
    （c）該VHはATCC PTA-10004として寄託されたポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を含み、および、該VLはATCC PTA-10005として寄託されたポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を含む、
    前記単離された抗体またはその抗原結合断片。
  2. 前記抗体またはその抗原結合断片のVHが、SEQ ID NO:9またはSEQ ID NO:10のアミノ酸配列を含み、かつ、前記抗体またはその抗原結合断片のVLが、SEQ ID NO:17またはSEQ ID NO:18のアミノ酸配列を含む、請求項1記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
  3. 前記抗体またはその断片に融合した異種ポリペプチドをさらに含む、請求項1または2記載の抗体もしくはその抗原結合断片。
  4. 単鎖抗体、Fab断片、F(ab) 2断片、およびFv断片からなる群より選択される、請求項1から3のいずれか一項記載の抗体またはその抗原結合断片。
  5. CD100とCD100受容体との結合を阻害する、請求項1から4のいずれか一項記載の抗体またはその抗原結合断片。
  6. ヒト化されている、霊長類化されている、またはキメラである、請求項1から5のいずれか一項記載の抗体またはその抗原結合断片。
  7. 細胞傷害剤、治療剤、細胞増殖抑制剤、生物毒素、プロドラッグ、酵素、ウイルス、脂質、生物学的応答調節剤、薬剤、リンホカイン、異種抗体またはその断片、検出可能な標識、ポリエチレングリコール(PEG)、および任意の該剤2つ以上の組み合わせからなる群より選択される剤と結合している、請求項1から6のいずれか一項記載の抗体またはその抗原結合断片。
  8. 請求項1から7のいずれか一項記載の抗体またはその抗原結合断片と担体とを含む、組成物。
  9. （a）抗体VHポリペプチドをコードする核酸であって、該VHポリペプチドが、SEQ ID NO:6、7、および8をそれぞれ含むVH-CDR1、VH-CDR2、およびVH-CDR3アミノ酸配列を含み、該VHポリペプチドおよびSEQ ID NO:17またはSEQ ID NO:18のアミノ酸配列を含むVLポリペプチドを含む抗体またはその抗原結合断片がマウス、ヒト、およびサルのCD100に特異的に結合し、かつ、それらを中和する、核酸；
    （b）抗体VHポリペプチドをコードする核酸であって、該VHポリペプチドのアミノ酸配列がSEQ ID NO:6、7、および8をそれぞれ含むVH-CDR1、VH-CDR2、およびVH-CDR3アミノ酸配列を含み、かつ、SEQ ID NO:9またはSEQ ID NO:10と少なくとも90％同一であり、該VHポリペプチドおよびSEQ ID NO:17またはSEQ ID NO:18のアミノ酸配列を含むVLポリペプチドを含む抗体またはその抗原結合断片がマウス、ヒト、およびサルのCD100に特異的に結合し、かつ、それらを中和する、核酸；
    （c）スプライスドナー部位およびスプライスアクセプター部位を除去することこと、前記ポリヌクレオチドを発現する細胞に対してコドン使用頻度を最適化すること、または両方によって、VHポリペプチドのアミノ酸配列を変えることなく、発現上昇のために最適化されている(a)または(b)のVHポリペプチドをコードする核酸；
    （d）抗体VHポリペプチドをコードする、SEQ ID NO:19またはSEQ ID NO:20を含む核酸であって、該VHポリペプチドおよびSEQ ID NO:17またはSEQ ID NO:18のアミノ酸配列を含むVLポリペプチドを含む抗体またはその抗原結合断片がマウス、ヒト、およびサルのCD100に特異的に結合し、かつ、それらを中和する、核酸；
    （e）抗体VLポリペプチドをコードする核酸であって、該VLポリペプチドが、SEQ ID NO:14、15、および16をそれぞれ含むVL-CDR1、VL-CDR2、およびVL-CDR3アミノ酸配列を含み、該VLポリペプチドおよびSEQ ID NO:9またはSEQ ID NO:10のアミノ酸配列を含むVHポリペプチドを含む抗体またはその抗原結合断片がマウス、ヒト、およびサルのCD100に特異的に結合し、かつ、それらを中和する、核酸；
    （f）抗体VLポリペプチドをコードする核酸であって、該VLポリペプチドのアミノ酸配列がSEQ ID NO:14、15、および16をそれぞれ含むVL-CDR1、VL-CDR2、およびVL-CDR3アミノ酸配列を含み、かつ、SEQ ID NO:17またはSEQ ID NO:18と少なくとも90％同一であり、該VLポリペプチドおよびSEQ ID NO:9またはSEQ ID NO:10のアミノ酸配列を含むVHポリペプチドを含む抗体またはその抗原結合断片がマウス、ヒト、およびサルのCD100に特異的に結合し、かつ、それらを中和する、核酸；
    （g）スプライスドナー部位およびスプライスアクセプター部位を除去することこと、前記ポリヌクレオチドを発現する細胞に対してコドン使用頻度を最適化すること、または両方によって、VLポリペプチドのアミノ酸配列を変えることなく、発現上昇のために最適化されている(e)または(f)のVLポリペプチドをコードする核酸；または
    （h）抗体VLポリペプチドをコードする、SEQ ID NO:21またはSEQ ID NO:22を含む核酸であって、該VLポリペプチドおよびSEQ ID NO:9またはSEQ ID NO:10のアミノ酸配列を含むVHポリペプチドを含む抗体またはその抗原結合断片がマウス、ヒト、およびサルのCD100に特異的に結合し、かつ、それらを中和する、核酸
    を含む、単離されたポリヌクレオチド。
  10. 単離されたVHコードポリヌクレオチドおよび単離されたVLコードポリヌクレオチドを含む組成物であって、該VHコードポリヌクレオチドが、それぞれSEQ ID NO:6、7、および8からなるVH-CDR1、VH-CDR2、およびVH-CDR3アミノ酸配列を含むVHポリペプチドをコードし、該VLコードポリヌクレオチドが、それぞれSEQ ID NO:14、15、および16からなるVL-CDR1、VL-CDR2、およびVL-CDR3アミノ酸配列を含むVLポリペプチドをコードし、該VHポリペプチドおよびVLポリペプチドを含む抗体またはその抗原結合断片がマウス、ヒト、およびサルのCD100に特異的に結合し、かつ、それらを中和する、組成物。
  11. 前記VHコードポリヌクレオチドおよび前記VLコードポリヌクレオチドが、1つのベクターまたは別々のベクターに含まれる、請求項10記載の組成物。
  12. CD100に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を産生する方法であって、請求項9記載のポリヌクレオチドまたは請求項11記載の組成物を含む宿主細胞を培養する工程、および該抗体またはその断片を回収する工程を含む、方法。
  13. （a）動物においてCD100を中和するための、
    （b）処置を必要とする動物において自己免疫疾患もしくは炎症疾患を処置するための、
    （c）処置を必要とする動物において癌を処置するための、または
    （d）癌の処置を必要とする動物において血管形成を阻害するための、請求項1から7のいずれか一項記載の単離された抗体もしくはその抗原結合断片、または請求項8記載の組成物を含む、薬学的組成物。
  14. 前記自己免疫疾患または炎症疾患が、多発性硬化症または関節炎からなる群より選択される、請求項13記載の薬学的組成物。
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