JP2008504821A - ベクター・パッケージング細胞系列 - Google Patents
ベクター・パッケージング細胞系列 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2008504821A JP2008504821A JP2007519457A JP2007519457A JP2008504821A JP 2008504821 A JP2008504821 A JP 2008504821A JP 2007519457 A JP2007519457 A JP 2007519457A JP 2007519457 A JP2007519457 A JP 2007519457A JP 2008504821 A JP2008504821 A JP 2008504821A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cell
- ligand
- cells
- viral
- membrane
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
- C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
- C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2740/15045—Special targeting system for viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
- C12N2740/15051—Methods of production or purification of viral material
- C12N2740/15052—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
- C12N2810/50—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein
- C12N2810/60—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses
- C12N2810/6072—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses negative strand RNA viruses
- C12N2810/6081—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses negative strand RNA viruses rhabdoviridae, e.g. VSV
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
- C12N2810/50—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein
- C12N2810/80—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from vertebrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
- C12N2810/50—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein
- C12N2810/80—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from vertebrates
- C12N2810/85—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from vertebrates mammalian
- C12N2810/855—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from vertebrates mammalian from receptors; from cell surface antigens; from cell surface determinants
Abstract
本発明は、標的細胞においてベクター形質転換を増大させる方法に関する。本発明は、標的細胞に結合し、そして活性化することを容易にする1以上の膜タンパク質を発現できるパッケージング細胞系列の組換え遺伝子操作を提供する。本発明は、1以上のかかる膜タンパク質をパッケージング細胞系列に組換え遺伝子操作することを提供する。かかる細胞系列の使用を介してウイルス粒子中にパッケージされるベクターは、これらのタンパク質を含む外被エンベロープを含むであろう。当該粒子は、標的細胞へ結合しそして標的化するために特に適しており、それらのベクターでの形質転換を促進する。当該標的細胞は、外来から供給された刺激分子の存在下で、パッケージされたベクターにより同時に活性化(刺激)されてもよい。
Description
本発明は、標的細胞のベクターによる形質導入を増加させる方法に関する。本発明は、標的細胞への結合及び標的細胞の活性化を促進する1以上の膜タンパク質を発現できるようにパッケージング細胞系列を組換え遺伝子操作することを提供する。或いは、本発明は、1以上のかかる膜タンパク質を内在的に発現する細胞を、パッケージング細胞系列へと組換え遺伝子操作することを提供する。かかる細胞系列を用いてウイルス粒子中にパッケージされたベクターは、これらのタンパク質を含む外被を含むであろう。当該粒子は、標的細胞に結合し、標的化して、ベクターを用いた形質導入を促進するために特に適していよう。外から供給された刺激分子の不存在下又は最小限の存在下において、標的細胞はパッケージされたベクターにより同時に活性化又は刺激されうる。
関連出願
本発明は、2004年7月1日に出願された米国仮特許出願第60/585,464号の優先権の利益を主張し、当該特許出願は完全に記載されているように本明細書に援用される。
本発明は、2004年7月1日に出願された米国仮特許出願第60/585,464号の優先権の利益を主張し、当該特許出願は完全に記載されているように本明細書に援用される。
レンチウイルス・ベクターは、古典的に、ニューロンなどの非分裂細胞を形質導入することがしられており、そして細胞分裂がない状態で標的細胞に遺伝子をデリバリーする当該ベクターの能力は、レンチウイルスに基づくベクターの重要な特徴及び利点の一つである(Naldiniら、1996-1; Naldiniら、1996-2)。しかしながら、細胞分裂している細胞を調和された様式で活性化に導くことは、細胞の全集合を高いレベルで同時に形質導入することを容易にする(Humeauら、2004; Parkら、2000)。第一のレンチウイルスベクターを用いたT細胞中への導入効率は、20〜40%の導入効率であり(Schroersら、2002; Costelloら、2000; Rangaら、1998; Mitsuasuら、2000)、cPPT/CTS配列を加えてプロウイルス配列の核転座の割合を増加させることにより、60〜75%ほどの高さに導入効率を有意に増加させた (Manganiniら、2002; Follenziら、2000; Cavalieriら、2003)。
従来の報告は、標的細胞を用いてベクターを濃縮して遺伝子導入の機会を増大させるスピノキュレーション(spinoculation)、或いは予め細胞を通常3日間刺激し、続いて1回又は複数回ベクターを加えることのいずれかに関する形質導入方法を用いた(Levineら、1997; Levineら、2000)。培養システムが密封されており、そして連続操作が難しい臨床設定においてこのような方法を使用することは難しい。最近開発された形質導入方法は、ベクター、細胞、並びにT細胞刺激分子CD3及びCD28を同時に加えて、細胞を分裂期に導くことに関する(Luら、2004; Hurneauら、2004)。CD3及びCD28への暴露は、ベクター添加前に細胞を予め刺激するために使用される場合、トランス遺伝子の発現を増加させることが以前に示された (Costelloら、2000)。この形質導入と培養開始法の組合せは、99%の最大形質導入効率をもたらし、かつこうしたレベルを達成するために必要とされる時間を3日に短縮した(Luら、2004)。これらの研究より、治療効果のために十分な形質導入効率を達成する際における細胞刺激の重要な役割が強調される。
形質導入に必要とされる培養時間の短縮はまた、形質導入される細胞の自然効力(natural potency)を維持する際の助けとなる。レンチウイルス・ベクターについての固有の性質は、当該ベクターがゲノム中への挿入のために細胞分裂を必要としないという点である。これは、休止期の細胞標的の遺伝子治療に対して助けとなる。当該標的は、マクロファージ、造血前駆細胞、及び循環しているナイーブTリンパ球を含み、これらは以下に詳細に提供される本発明により標的されうる。かかる標的は、治療において特に価値がある。なぜなら、これらは体内において長期間に渡り優れた効力を保持するからである。ex vivoにおいてサイトカイン又は他の刺激分子で過剰に刺激することは、in vivoでのその有効性の変化をもたらしうる(Mauriceら、2002; Scaresら、1998)。その結果、HIVに基づくベクターを用いる場合、休止期のT細胞においてG0からG1bへの移行の切り替えを誘導することは、本来のプロファイルを失うことをもたらす増殖を促進することなくベクター組込みを促進することができる(Dardalhonら、2000)。同様に、最小限の刺激は、造血幹細胞において、血液の再構成能力の喪失を誘導することなく有効な遺伝子導入を促進するであろう。
当該技術分野において最近開発された形質転換法は、従来方法を超える有意な改善を示すが、ex vivoでの細胞の活性化に外来共刺激分子を必要とすることは、体内に注射されてin vivoにおいて有効な形質導入を促進する遺伝子治療ベクターの開発に逆行するものである。治療計画として、in vivoにおいて治療分子及びベクターを共投与することをうまく提供する能力に関しては、不確かである。さらに、ex vivo遺伝子導入を適用する場合では、培地中の外来性共刺激分子についての要件は、さらなる品質制御及び安全性の問題を生じさせる。
上記文献の引例は、前述のいずれかが適切な従来技術であると認めることを意図するものではない。データーについての全ての記載又はこれらの文献の内容についての説明は、出願人が利用できる情報に基づいており、そしてデーター又はこれらの文献の内容の正確性を認めるものではない。
発明の要約
本発明は、改良されたパッケージング及びプロデューサー細胞系列、並びにレトロウイルス及びレンチウイルスによる形質導入及び標的化を改善するために当該細胞系列を含む組成物及び方法を提供する。いくつかの実施態様では、改良された結合性質及び刺激性質を有し、標的化される細胞において形質導入及び増殖を促進するレンチウイルス粒子を提供するレンチウイルス形質導入システムに関する。他の実施態様では、本発明は、単に高タイターのウイルス粒子及び/又は外来から供給された刺激因子で刺激することに頼ることなく、非分裂性の細胞に形質導入する方法を提供する。本発明はこうして、可溶性の刺激因子又はアクセサリー細胞により提供される因子を必要とすることなく、ex vivo又はin vitroにおいて使用される利点を有する。さらに、本発明は、ベクター又は「負荷量(payloads)」を有するウイルス粒子をデリバリーする直接注射液(direct injectable)としてin vivoで使用されてもよい。
本発明は、改良されたパッケージング及びプロデューサー細胞系列、並びにレトロウイルス及びレンチウイルスによる形質導入及び標的化を改善するために当該細胞系列を含む組成物及び方法を提供する。いくつかの実施態様では、改良された結合性質及び刺激性質を有し、標的化される細胞において形質導入及び増殖を促進するレンチウイルス粒子を提供するレンチウイルス形質導入システムに関する。他の実施態様では、本発明は、単に高タイターのウイルス粒子及び/又は外来から供給された刺激因子で刺激することに頼ることなく、非分裂性の細胞に形質導入する方法を提供する。本発明はこうして、可溶性の刺激因子又はアクセサリー細胞により提供される因子を必要とすることなく、ex vivo又はin vitroにおいて使用される利点を有する。さらに、本発明は、ベクター又は「負荷量(payloads)」を有するウイルス粒子をデリバリーする直接注射液(direct injectable)としてin vivoで使用されてもよい。
第一態様では、本発明は、標的細胞に結合し及び/又は当該細胞の細胞周期の移行を刺激する能力を有する分子をベクター・エンベロープ中にとり込むことにより、レンチウイルスの形質導入及び標的化を改善する方法を提供する。細胞周期の移行を刺激する能力は、形質導入を増加させることを示し、そして当該能力は、幾つかのin vitro及びex vivo形質導入プロトコルにおいて、CD3及びCD28リガンドの機能である。例えば、T細胞形質導入において使用される抗ヒトCD3/CD28結合ビーズは、当該分野の他のものにより使用された(Luら、2004及び Levineら、1997及び2000)。他のグループは、IL-2及びIL-7(Mauriceら、1999及びVerhoeyenら、2003)などの共刺激分子又は一本鎖抗CD-3抗体(Mauriceら、2002)を模倣する組換えエンベロープを含むレトロウイルスベクターを作成した。本発明は、レトロウイルスベクターのエンベロープ表面中に細胞表面タンパク質及び分子を取り込むことが、外来性共刺激分子を欠く中で形質導入効率を調節するであろうという認識に一部基づいている。
本発明は、選択した標的細胞に接着し、続いて形質導入、つまり遺伝子導入、をするために最適化されたエンベロープを含むレンチウイルス・ベクターを製造する新規の概念を提供する。これは、組換えエンベロープタンパク質を含むベクターを製造することにより達成されるものではなく(Verhoeyenら、2003; Mauriceら、1999及び2002)、関心の膜関連タンパク質をベクター表面上に発現するように遺伝子操作されたプロデューサー細胞系列を設計及び使用することにより達成される。当該細胞系列において産生されるベクターは、標的細胞に結合し、そして標的細胞を活性化し、そうしてかかる細胞中への遺伝子導入に最適化された能力を有する膜関連タンパク質を獲得する。かかるエンベロープタンパク質は、プロデューサー細胞又は他の細胞においてもともと存在するものであってもよく、そして非限定的な例としてCD49d、CD54、CD80、及びCD86を個々に又は2、3、又は4つ全ての組合せて含んでもよい。
本発明はこうして、共刺激するために外来分子を加える必要性を低下させるか又は取り除き、そして有利なことに、外来から提供された因子の非存在下で形質導入細胞を提供する。これは、形質導入細胞の見込まれる適用及び使用に拡張することができる。本発明はまた、ex vivo形質導入並びにin vivo遺伝子デリバリーのための単純化され、そして臨床的に適したアプローチをもたらす。本発明は、パッケージされた粒子で標的細胞を形質導入する間、合併症を低減するためにも使用されうる。
一の代表的な実施態様として、レンチウイルス・ベクターは、その天然の細胞宿主から出芽する天然HIVエンベロープをできるだけ模倣し、そしてウイルス・エンベロープタンパク質の点でのみ異なるエンベロープを含むように遺伝子操作されうる。非限定的にCD86及びCD43などのタンパク質を単独で又は組み合わせてこれらのベクター粒子内に含めることにより、当該粒子は、(CD86を介して)標的CD4T細胞の刺激のため、及び/又は(CD54を介した)細胞-ベクター相互作用を介してベクターの細胞への結合を増加させるために使用されうる。
こうして、in vivoにおいてもともと標的細胞に結合する細胞を使用することによって、ベクターのパッケージングを想定してもよい。例えば、T細胞は、リンパ組織において他のT細胞に結合し、そして活性化する分子を含む。その結果、T細胞又は関連するT細胞系列がパッケージング細胞として直接使用されてもよいし、又は改変された後に使用されてもよく、そして次にT細胞に結合することを意図されたベクターを生成するためにベクター生成細胞として使用されてもよい。別の例は、造血系前駆細胞を標的化及び形質導入することを意図されたベクターの産生/パッケージングのために、間葉系幹細胞(MSC)を使用することであろう。なぜなら、MSCはin vivoにおいてこれらの細胞のための支持マトリックスを提供するからである。
非改変細胞の使用の可能性に加えて、本発明は、当該細胞において少なくとも1の膜関連非ウイルスリガンドを発現するか又は発現できる第一核酸分子を含む、組換えレトロウイルスパッケージング細胞を提供する。内在性の膜関連非ウイルス性リガンドを増加させる核酸構築物を含む組換え細胞が本発明の実施において使用されてもよいが、当該リガンドは、幾つかの実施態様では非内在性である(又は当該細胞に対して異種性であるか、又はそうでなければ当該細胞内で通常発現されないもの)。非ウイルス性のリガンドは、天然の細胞表面分子であってもよく、そして標的細胞の細胞表面分子を結合する分子である。当該第一核酸分子は、当該細胞に一過的に導入されてもよく、又は前もって安定して当該細胞内に導入されてもよい。安定的に導入された分子は、本発明の実施態様に含まれる。
幾つかの実施態様では、当該少なくとも1の膜関連非ウイルス性リガンドは、当該細胞表面分子への結合を介して細胞-細胞接着の役割を果たし、及び/又は細胞の表面分子の結合後に作用して、当該細胞が細胞周期へと移行することを活性化又は刺激し、成長及び/又は増殖を導く。本発明の幾つかの実施態様において、当該細胞は、少なくとも2個のかかるリガンドを含み、例えばそのうちの一つは、細胞-細胞接着に役割を果たし、そしてもう一つは細胞周期の移行を活性化又は刺激する。本発明の他の実施態様では、当該細胞のCD3/TCR複合体が天然又は人工リガンドにより又は特異的な抗体(Ab)により結合される場合、当該リガンドは、T細胞表面分子を結合して、T細胞増殖を活性化する共刺激分子である。他の非限定的なリガンドは、造血細胞で見つかったリガンドである。
パッケージング細胞の組換え及びパッケージング特性は、当該細胞が少なくとも1の異種性核酸分子を含み、当該分子がレトロウイルスベクターのパッケージングに必要とされる1以上のウイルス因子を発現するか又は発現できるということを示唆しうる。1以上の因子は、トランスで機能して、ビリオン又はウイルス粒子中へのレトロウイルス核酸のパッケージングを許容する因子である。幾つかの実施態様では、当該因子は、1以上のウイルス構造タンパク質、例えば、マトリックス、キャプシド、又はヌクレオチドキャプシドタンパク質であり、及び/又は1以上のウイルス・アクセサリータンパク質である。当業者に認められるように、パッケージングされるベクターを有するパッケージング細胞は、トランスにおいて必要とされるパッケージング成分がパッケージング細胞由来の核酸配列とベクター由来の核酸配列との組合せにより発現されうるパッケージング・システムとして見なされうる。少なくとも1の異種核酸分子は、当該細胞に一過的に導入されるか、又は前もって安定的に細胞中へ導入されてもよい。安定的に導入された分子は、本発明の実施態様に含められる。
ウイルス因子(単数又は複数)は、レンチウイルス・ベクターのパッケージングを支援しうる。複数の因子(単数又は複数)のうちの任意の一つ又は組合せは、パッケージング細胞中の核酸配列によりコードされてもよく、そのようにコードされていない因子の全ては、当該ベクターの核酸配列によりコードされる。幾つかの実施態様では、因子は、ウイルス・エンベロープタンパク質及び他のトランス因子、例えばGAG又はPOLタンパク質、並びにレンチウイルスの場合様々なアクセサリータンパク質を含む。更なる実施態様では、本発明のパッケージング細胞は、レンチウイルス・ベクターをパッケージングできるウイルス・エンベロープタンパク質を発現するか、又は発現でき、関心の標的細胞に形質導入できる粒子を生成する。他の実施態様では、パッケージング細胞は、標的細胞の細胞表面分子に結合するウイルスリガンドを発現するか、又は発現できる。
本発明の一の代表的な実施態様では、ウイルス因子は、ウイルス又はベクター粒子と、標的細胞膜との融合を保つか又は仲介するタンパク質である。言い換えると、当該因子は、当該ウイルスリガンドを含む細胞膜と、標的細胞の細胞膜との融合を仲介するように機能する。非限的な例は、ネクチン-1、例えば野生型帯状疱疹ウイルス(HSV)-1エンベロープタンパク質を標的とし又は結合する因子を含む。ウイルス及び非ウイルス因子、例えばCD34+、CD33+、及び/又はCD14+細胞を標的とするか又は結合する因子、CD155/PVR又はCD112(ネクチン-2はCD34+細胞に存在する)を標的とするCD226(DNAM-1)タンパク質は、更なる非限定的な例である。
パッケージング細胞の組換え及びパッケージング特性は、パッケージされるベクター配列を欠くと、ウイルス粒子を生成しないと言うことを示唆しうる。ベクター配列は、かかる細胞中における第二核酸分子として見なされてもよく、そして長い末端反復(LTR)領域及び/又はレトロウイルスパッケージング又は二量化シグナルを有するレンチウイルス由来のベクターは、本発明を具体化したものである。
さらなる実施態様では、本発明の標的細胞は、非限定的に、抗原提示細胞(APC)、造血系細胞、肝細胞、リンパ球(T細胞及びB細胞、例えばリンパ節中心におけるT細胞及びB細胞を含む)、ニューロン、内皮細胞、腫瘍細胞、樹状細胞、線維芽細胞、及び非造血幹細胞を含む。
ベクター・エンベロープ中に取り込まれた後のパッケージング細胞の膜関連非ウイルスリガンドは、ビリオン粒子をかかる標的細胞に仕向けるために使用される。いくつかの実施態様においてリガンドは膜貫通タンパク質であるが、それらはパッケージング細胞膜の外表面上のタンパク質であってもよい。当該リガンドは、高等真核細胞のリガンド、それらに基づいた合成又はキメラ(融合)分子、一本鎖抗体又はその断片、或いは微生物用のタンパク質であってもよい。
本発明は、本明細書中で開示されるパッケージング細胞を含む組成物も提供する。かかる組成物は、パッケージング細胞とパッケージされるベクターとの組合せを含む。ベクターは、当該細胞に導入されうる。幾つかの実施態様では、本発明のベクターは、アクセサリータンパク質をコードする核酸を除いたベクター、例えば非限定的に、レンチウイルス・アクセサリータンパク質を発現できる機能配列を欠くレンチウイルスである。かかるタンパク質は、パッケージング細胞を介してトランスで提供されうる。他の組成物は、パッケージング細胞と適切な培地との組合せ、及び/又は当該細胞を増殖させるためのインキュベーション装置を含む。
第二態様では、本発明は、本発明のパッケージング細胞を生成する方法を提供する。かかる方法は、本明細書中に記載されるようにレトロウイルスのパッケージング及び/又は複製に必要とされるウイルス遺伝子産物を発現するか又は発現できる核酸分子を当該パッケージング細胞内に導入すること;並びに、本明細書に記載されるように少なくとも1の膜関連非ウイルスリガンドを発現するか又は発現できる核酸分子を当該パッケージング細胞内に導入することを含む。
第三態様では、本発明のウイルスベクター粒子を生成又はパッケージングする方法を提供する。かかる方法は、レトロウイルスベクターをコードするか又は含む核酸分子を、本明細書に記載される組換えパッケージング細胞中に導入することを含む。次に、本明細書に記載されるように、かかる細胞が少なくとも1の膜関連非ウイルスリガンドを含む粒子中に当該ベクターをパッケージする条件化において当該細胞を培養する。
第四態様では、本発明は、本明細書に記載されるようにウイルス・パッケージング因子をコードする核酸分子を導入することにより、組換えされるレトロウイルス・ベクターパッケージング細胞を提供する。当該細胞は、標的細胞又は組織の細胞表面分子に結合できる少なくとも1の膜関連リガンドを内在的に発現する細胞である。幾つかの実施態様では、当該細胞は、非接着性である(例えば、懸濁中で増殖されうる)か、及び/又はin vivoにおいて標的細胞又は組織と相互作用するか又は結合する細胞である。
非限定的な実施態様は、造血幹細胞を標的細胞として用いるベクターをパッケージする骨髄間質細胞を含む。或いは、当該細胞は、CD34+細胞の表面に結合するインテグリンタンパク質を発現する細胞であってもよい。他の実施態様では、パッケージング細胞は、SDF-1、VLA-4、VLA-5、又はLFA-1から選ばれるリガンドを発現することもあり、そしてパッケージされたベクターは、a)CD34+及びCD38-/CXCR4+、又はb)CD34+及びCD38low/CXCR4+である造血幹細胞に結合する。
本発明は、本明細書に記載されるベクターを場合により伴ってこのようなパッケージング細胞を含む組成物、このような細胞を製造する方法、並びに本明細書に開示されるようにベクターをパッケージするためにこうした細胞を使用する方法を提供する。
第五態様では、本発明は、本発明の細胞、組成物、及び方法により生成されるベクター含有ウイルス粒子を提供する。こうした粒子は、本明細書に記載されるようにリガンド及びパッケージング細胞由来の他の分子を含む外皮を有するであろう。
定義
本明細書に使用される「組換え」という用語は、タンパク質又は核酸などの生物生成物を生産するために遺伝子工学及び/又は分子生物学的技術を用いることを指す。発現される組換え核酸分子の場合、当該用語は、通常自然界において見られない配列を含む非天然分子を指す。このような分子は、もちろん、天然物又は合成物である生体分子を発現するために使用されうる。組換え細胞の場合、当該用語は、内在しないタンパク質を発現するか又は発現できる細胞、又は内在タンパク質を内在しえないレベルで発現するか、又は発現できる細胞を指す。
本明細書に使用される「組換え」という用語は、タンパク質又は核酸などの生物生成物を生産するために遺伝子工学及び/又は分子生物学的技術を用いることを指す。発現される組換え核酸分子の場合、当該用語は、通常自然界において見られない配列を含む非天然分子を指す。このような分子は、もちろん、天然物又は合成物である生体分子を発現するために使用されうる。組換え細胞の場合、当該用語は、内在しないタンパク質を発現するか又は発現できる細胞、又は内在タンパク質を内在しえないレベルで発現するか、又は発現できる細胞を指す。
「ウイルス粒子」又は「ベクター粒子」又は「ビリオン」という用語、又はそのバリエーションは、通常、本明細書に記載されるウイルス又はベクター核酸を封入するか又は含む巨大分子複合体を指す。こうした粒子は、通常、プロデューサー及びパッケージング細胞、並びに本発明の方法により生成される際に獲得される脂質二重膜中に入れられている。
本発明は、レトロウイルスパッケージング細胞及びそれらを含むベクターパッケージングシステムを与える。当該細胞及びシステムは、様々な標的細胞を導入するために使用されうるパッケージされたベクター粒子を製造するために使用されてもよい。
本明細書に記載されるように、本発明を実施する複数の様式が存在する。非限定的な様式は、使用される細胞タイプ、パッケージされるベクターのタイプ、発現されるリガンドのタイプ、リガンドを発現するために使用される構築物及び方法、及びパッケージされたベクターにより標的化される細胞型を含む。もちろん、当業者に理解されることであるが、パッケージング細胞は、ベクターのパッケージングに必要とされる1以上のウイルス因子を発現するか又は発現できる少なくとも1の異種核酸分子を含む。1以上の因子は、トランスで機能して、ウイルス核酸ベクターをビリオン又はウイルス粒子中にパッケージングすることを許容する。
こうして一の様式において、本発明は、パッケージング細胞内で、標的細胞の細胞表面分子に結合する少なくとも1の膜関連非ウイルスリガンドを発現することができる第一核酸分子を含む組換えレトロウイルスパッケージング細胞を提供する。いくつの実施態様では、当該細胞は、ウイルス因子を発現するか又はベクター配列を発現するか若しくはベクター配列である第二核酸分子が存在しない状態では、ウイルス粒子を生成しない。別の様式では、本発明は、標的細胞又は組織の細胞表面分子に結合できる少なくとも1の膜関連リガンドを内在的に発現するレトロウイルス・ベクター・パッケージング細胞を提供する。
本発明は、様々な細胞で実施されうる。実施態様は、哺乳動物細胞を含むが、レトロウイルス及びレンチウイルス・ベクターのパッケージングを支援する他の真核細胞のタイプが使用されてもよい。細胞型は、懸濁細胞、及び非限定的にCOS、TE671、HT1080、Mv-1-Lu、及びヒト293細胞系列などの細胞を含む。上記細胞の誘導体又は天然細胞が使用されてもよい。
更なる実施態様では、パッケージング細胞は、トランスにおいてベクター・パッケージングに必須である1以上のウイルスタンパク質を発現する。幾つかの実施態様では、レトロウイルスパッケージング細胞は以下の:
i) 標的細胞の細胞表面分子を結合し、そして場合により当該ウイルスリガンドを含む細胞膜と当該標的細胞との結合又は融合を媒介し、及び/又はGpからG1bへの細胞周期の移行を刺激するように機能するウイルス又は非ウイルス・リガンドを発現できる異種核酸分子
ii) CD226(DNAM-1)、野生型単純疱疹ウイルス(HSV)-1エンベロープタンパク質、又は他のウイルエンベロープタンパク質を発現できる異種核酸分子
を含む。
i) 標的細胞の細胞表面分子を結合し、そして場合により当該ウイルスリガンドを含む細胞膜と当該標的細胞との結合又は融合を媒介し、及び/又はGpからG1bへの細胞周期の移行を刺激するように機能するウイルス又は非ウイルス・リガンドを発現できる異種核酸分子
ii) CD226(DNAM-1)、野生型単純疱疹ウイルス(HSV)-1エンベロープタンパク質、又は他のウイルエンベロープタンパク質を発現できる異種核酸分子
を含む。
レトロウイルスパッケージング細胞がii)を含む場合、標的細胞は、造血幹細胞;CD34+、CD33+、CD14+であり、ネクチン1又はネクチン様タンパク質を発現する細胞;T細胞;樹状細胞、又はリンパ節の中心におけるB細胞;又は線維芽細胞である。他の実施態様では、本発明のパッケージング細胞は、in vivoで標的細胞又は組織と相互作用する細胞に由来する。
トランス作用タンパク質の非限定的な例は、構造タンパク質、エンベロープ(env)タンパク質、アクセサリータンパク質、標的細胞膜との融合を促進するタンパク質、及び任意のレトロウイルス又はレンチウイルス、例えば非限定的に、モロニー・マウス白血病ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、RD114、BaEV、GALV、SSAV、FeLV-B、両種性マウス白血病ウイルス(MLV-A)、ヒト免疫不全ウイルス、トリ白血病ウイルス、及びNZBウイルス、のGag及び/又はPolタンパク質を含む。GAG及び/又はPOLタンパク質は改変、合成、又はキメラ(GAG/POL)構築物であってもよい。
エンベロープタンパク質の例は、非限定的に、両種性エンベロープ、同種性エンベロープ、又は異種性エンベロープを含み、又は両種性及び同種性部分を含むエンベロープであってもよい。当該タンパク質はまた、上記レトロウイルス及びレンチウイルスのいずれかのタンパク質であってもよい。或いは、エンベロープタンパク質は、改変、合成、又はキメラエンベロープ構築物であってもよいし、或いは水疱性口内炎ウイルス及びHVJウイルスなどの非レトロウイルスから得てもよい。具体的な非限定的な例は、モロニー・マウス白血病ウイルス(MMLV)、ラウス肉腫ウイルス、及びネコ内在性ウイルスRD114のエンベロープ;テナガザル白血病ウイルス(GALV)エンベロープ;ヒヒ内在性ウイルス(BaEV)エンベロープ;サル肉腫随伴ウイルス(SSAV);両種性マウス白血病ウイルス(MLV-A)エンベロープ;ヒト免疫不全ウイルスエンベロープ;トリ白血病ウイルスエンベロープ;内在性異種性NZBウイルスエンベロープ;及びパラミクソウイルスファミリーのエンベロープ、例えば非限定的にHVJウイルスエンベロープなどを含む。
パッケージされるベクターのタイプは、任意のウイルスに基づくベクターを含む。レトロウイルス、例えばトリ細網内皮症ウイルス(アヒル感染性貧血性ウイルス、脾臓壊死ウイルス、Twiehaus株網膜内皮症ウイルス、C型レトロウイルス、網膜内皮症ウイルスHungary-2(REV-H-2))、及びネコ白血病ウイルス(FeLV))由来のベクターは、非限定的な一例である。レトロウイルスゲノムは、ベクターとして使用するために改変された(Cone & Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci.. USA. 81:6349-6353, (1984))。本発明ベクターとして使用されうるレトロウイルス又はレトロウイルス科ファミリーは、レンチウイルス、例えばヒト免疫不全ウイルス(HIV-1及びHIV-2)、ネコ免疫不全ウイルス、サル免疫不全ウイルス(SIV)、マエディ/ビスナウイルス、ヤギ関節炎/脳炎ウイルス、ウマ感染性貧血ウイルス (EIAV)、及びウシ免疫不全ウイルス(BIV);トリC型レトロウイルス、例えばトリ白血病ウイルス(ALV);HTLV-BLVレトロウイルス、例えばウシ白血病ウイルス(BLV)、ヒトT細胞白血球ウイルス(HTLV)、及びサルT細胞白血球ウイルス;哺乳動物B型レトロウイルス、例えばマウス乳癌ウイルス (MMTV); 哺乳類C型レトロウイルス、例えばマウス白血病ウイルス(MLV)、ネコ肉腫ウイルス(FeSV)、マウス肉腫ウイルス、ギボンザル白血病ウイルス、ギニアブタC型ウイルス、ブタC型ウイルス、ウーリー・サル肉腫ウイルス、及び毒ヘビレトロウイルス;スプマウイルス(泡沫状ウイルス群)、例えばヒトスプマウイルス(HSRV)、ネコ合胞体形成ウイルス(FeSFV)、ヒト泡沫状ウイルス、サル泡沫状ウイルス、及びウシ合胞体ウイルス;及びD型レトロウイルス、例えばメイソン-ファイザー・サル・ウイルス(MPMV)、リスザル・レトロウイルス、及びラングール・サル・ウイルスを含む。
「ベクター」又は「プラスミド」という用語は、異なる細胞環境又は遺伝環境間で、核酸配列の受け渡しを可能にする核酸分子を指す。非制限的なベクターは、その中に、自己複製及び発現核酸配列を可能にする配列を含む。ベクターは、使用される細胞システムに適した選別マーカーを場合により含んでもよい。本発明の実施において使用するためのベクターの一のタイプは、染色体外での複製を可能にする核酸であるエピソームとして維持される。本発明を実施する際に使用するためのベクターの一のタイプは、エピソームとして維持され、当該エピソームは、細胞外複製を可能にする核酸である。別のタイプは、ベクターが導入された細胞のゲノム内に安定して組み込まれるベクターである。
本発明のベクターは、パッケージング細胞及び/又はベクターを標的細胞にデリバリーした後に標的細胞において発現される「ペイロード」をコードする遺伝物質である。ベクターが粒子内にパッケージされる事実は、「ペイロード」、又は当該「ペイロード」をコードする遺伝物質の発現の際に生成される生物生成物が、標的細胞へのデリバリーのためにパッケージ粒子内に取り込まれることを許容する。本発明の1の「ペイロード」は、ベクター・ゲノムによりコードされる治療物質である。もちろんポリペプチド又は核酸(例えば、RNA)である「ペイロード」は、パッケージング細胞内で発現されてもよいし、そして標的細胞内で発現されることに加えて、又は発現されることに代えてパッケージ粒子内に物理的に存在してもよい。幾つかの実施態様では、「ペイロード」は、使用されるパッケージング細胞にとって毒性ではないか、又は最小限の毒性しか有さない。
治療物質をコードする遺伝物質の非制限的な例は、腫瘍壊死因子(TNF)遺伝子、例えばTNF-α;インターフェロン、例えばインターフェロン-α、インターフェロン-β、及びインターフェロン-ガンマをコードする遺伝子;インターロイキン、例えば、IL-1、IL-1β、及びインターロイキン2〜14をコードする遺伝子:GM-CSFをコードする遺伝子;アデノシン・デアミナーゼ(ADA)をコードする遺伝子;細胞増殖因子、例えばリンパ球の増殖因子であるリンフォカインをコードする遺伝子;上皮成長因子及びケラチノサイト成長因子(KGF)をコードする遺伝子;可溶性CD4をコードする遺伝子;第八因子;第九因子;シトクロームb;グルコセレブロシダーゼ;T細胞受容体;LDL受容体、ApoE、ApoC、ApoAI、及びコレステロール輸送及び代謝に関与する他の遺伝子;アルファ-1アンチトリプシン(α1AT)遺伝子;インスリン遺伝子;ヒポキサンチン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ遺伝子;CFTR遺伝子;陰性選別マーカー、又は「自殺」遺伝子、例えばウイルス・チミジン・キナーゼ遺伝子、例えば単純疱疹ウイルス・チミジン・キナーゼ遺伝子、サイトメガロウイルス・ウイルス・チミジン・キナーゼ遺伝子、及び水痘帯状疱疹ウイルス・チミジン・キナーゼ遺伝子;抗体の抗原結合性ドメインのFc受容体、ウイルス複製を阻害するアンチセンス配列、例えばB型肝炎又は非A型非B型肝炎ウイルスの複製を阻害するアンチセンス配列;c−mybオリゴヌクレオチド・アンチセンス;及び抗酸化物質、例えば非限定的に、マンガン・スーパーオキシドジスムターゼ(Mn-SOD)、カタラーゼ、銅-亜鉛-スーパーオキシドジスムターゼ(CuZn-SOD)、細胞外スーパーオキシドジスムターゼ(EC-SOD)、及びグルタチオン還元酵素をコードする遺伝子;多剤耐性(MDR)遺伝子;リボザイムをコードするポリヌクレオチド;アンチセンス・ポリヌクレオチド;アンジオテンシン変換酵素の競合的阻害剤、血管平滑筋カルシウムチャネルの競合的阻害剤、アドレナリン受容体の競合的阻害剤として作用する分泌性ペプチドをコードする遺伝子をコードするポリヌクレオチド、及び中枢神経系においてアミロイド・プラークを破壊する酵素をコードするポリヌクレオチドを含む。
以下の:組織プラスミノゲンアクチベータ(tPA);尿プラスミノーゲン活性化因子(ウロキナーゼ);ヒルジン;フェニルアラニン水酸化酵素遺伝子;ニューロンNO合成酵素;内皮NO合成酵素;血管作動性ペプチド;血管新生ペプチド;抗-血管由来ペプチド;ドーパミン遺伝子;ジストロフィン遺伝子;β-グロビン遺伝子;α-グロビン遺伝子;HbA遺伝子;プロトオンコジーン、例えばras、src、及びbcl遺伝子;腫瘍抑制遺伝、例えば、p53及びRb;LDL受容体;乳癌、子宮癌、胃癌、上皮癌の治療用のヘレグリン-αタンパク質遺伝子;及びT細胞抗原受容体のβ-鎖内に含まれるエピトープに特異的なモノクローナル抗体をコードする遺伝物質が使用されてもよい。しかしながら、本発明の範囲が特定の治療物質に限定されるべきでないということが理解され様。
本発明の幾つかの実施態様では、血友病の治療において有用な凝血因子(例えば第八因子又は第九因子)をコードする遺伝子でありうるか、又は当該遺伝子は、別の治療効果を有する1以上の生成物をコードすることもある。適切な遺伝子の例は、TNF、インターロイキン(インターロイキン12)、インターフェロン(α、β、及びγ-インターフェロン)、T細胞受容体タンパク質、及び抗体に結合するFc受容体などのサイトカインをコードするものを含む。
本発明のベクターは、非限定的にHIV及びヘルペス感染などのウイルス感染などの感染性疾患、癌、アデノシン・デアミナーゼ欠損症、鎌状赤血球貧血症、サラセミア、血友病、糖尿病、α-抗トリプシン欠損症、アルツハイマー病などの脳障害、並びに成長障害及び心臓疾患などの他の疾患であって、コレステロール代謝の変化及び免疫系の欠陥により引き起こされるものを含む様々な疾患の治療に有用である。
別の実施態様では、本発明のベクターは、陰性選別マーカー、例えば、ウイルス・チミジン・キナーゼ、例えば単純疱疹ウイルス・チミジン・キナーゼ(TK)遺伝子を含んでも良い。かかるベクターは、in vivo又はex vivoにおいて、ヒト患者の癌細胞(特に腫瘍細胞)に投与されうる。当該ベクターは、次に腫瘍細胞に形質導入させる。ベクターが腫瘍細胞に形質導入させた後に、患者は、相互作用剤(interaction agent)、例えばガンシクロビル又はアシクロビルを投与される。これの薬剤は、複製をしている細胞(つまり、癌又は腫瘍細胞)であって、陰性選別マーカーをコードするベクターで形質導入された細胞の全てを殺すために、陰性選別マーカーにより発現されるタンパク質と相互作用する。
本発明のベクターは、関心の標的細胞を結合し、そして当該細胞に感染するように設計される。いくつかの実施態様では、標的細胞は、抗原提示細胞(APC)、造血細胞系列、幹細胞、造血幹細胞、リンパ球、ニューロン、内皮細胞、又は腫瘍細胞である。標的が造血幹細胞である場合、パッケージング細胞は場合により骨髄間質細胞である。造血幹細胞標的は、CD34+及びCD38-/CXCR4+、或いはCD34+及びCD381ow/CXCR4+であってもよい。他の幹細胞は、骨髄間質細胞又は肝臓などの胎児組織から単離されたCD34+細胞、CD34+ヒト胚性前駆幹細胞(hESC)、造血系の、又は上記の他の起源のCD133+幹細胞、又はサイド・ポピュレーション(SP)表現系を示す細胞を含む。リガンドは、場合によりSDF-1、VLA-4、VLA-5、又はLFA-1である。本発明は、インテグリンをリガンドとして使用することにより、CD34+細胞を標的することを含む。
本発明はまた、標的細胞の表面分子に結合し、そしてウイルス粒子の標的細胞への形質導入を促進する、様々な天然又は人工膜関連リガンドを用いて実施されうる。かかるリガンドは、当該リガンドを含む細胞膜と、標的細胞の細胞膜との融合を媒介するように機能しうる。実施態様は、細胞-細胞接着の役割を有するか、又は標的細胞上の刺激活性(細胞周期又は細胞増殖又は細胞成長への進行又は移行を誘導する)を有すると知られている任意のリガンドを含む。CD3/TCR複合体が天然リガンド又は特異的抗体(Ab)により結合される間、T細胞増殖において相乗的作用を有すると知られている共刺激分子が含まれる。こうして、T細胞表面分子に結合してT細胞増殖を活性化させる共刺激分子は、T細胞のCD3/TCR複合体が天然又は人工リガンドにより、又は特異的Abにより結合される場合、本発明を実施する際に使用されても良い。いくつかの実施態様において、パッケージング細胞は、少なくとも2個のかかるリガンド、例えば、非限定的に、細胞-細胞接着を促進するリガンド、及び標的細胞の刺激を促進するリガンドを発現する。別の実施態様では、膜関連非ウイルスリガンドは、造血細胞のリガンド又は膜貫通タンパク質である。
膜関連リガンドの他の非限定的な例は、キメラ、ヒト化、モノクローナル、一本鎖形態を含む抗体及びその断片であって、本明細書に記載されるように膜関連リガンドとして機能するものである。非限定的な例は、LFA-1、CD18、CD11b、CD11c、CD11d、又はCD43に結合する抗体又は抗体断片を含む。さらなる非限定的な例は、本明細書に記載されるようにリガンドとして機能する微生物成分である。LFA-1、CD18、CD11b、CD11c、CD11d、又はCD43に結合する微生物タンパク質は、非限定的な例を示す。
具体的な例、及びリガンドの非限定的な例は、CD28;CD28BP(Lazeticら、J. Biol. Chem., 277(41):38660-38668 (2002));B7-H1、B7-H2(ICOS-L、B7RP-1、GL50として知られている)、B7-H3、B7-H4、及び他の関連するB7分子;PD-1結合分子、例えばPD-L2及びPD-L1;OX40リガンド(CD154)(OX40/CD134に結合する);4-1BBリガンド(4-1BB/CD137に結合する);(CD11aとCD18との複合体である)LFA-1結合分子、例えばICAM-1/CD54、ICAM-2/CD102、ICAM-3/CD50、ICAM-4/LW、又はICAM-5/テレンセファリン;LFA-1、CD11a、CD18、CD11b、CD11c、CD11d、又はCD43に結合する抗体又は微生物分子;CD2(LFA-2)のリガンド、例えばCD15、CD48、CD58、又はCD59についてのリガンド;CD5についてのリガンド、例えばCD72;及びCD58(LFA-3)についてのリガンド、例えばCD2を含む。もちろん、かかるリガンドの任意の組合せは、本発明の実施において使用されても良い。
他の代表的及び非限定的な例は、標的T細胞及び他の細胞、例えばB細胞(例えばCD40を介して)、CD34発現造血前駆細胞(例えばCD62Lを介して)、及びレトロウイルス及び/又はレンチウイルスの感染/複製に感受性のある他の細胞の表面に結合するリガンドを含む。リガンドとして使用する細胞表面分子のさらなる例は、LFA-3(CD58とも呼ばれる);FasL(Fasリガンド); CD70;B7-H1(PD-L1とも呼ばれる);B7-H2;B7-H3(B7RP-2とも呼ばれる);B7-H4;CD2;CD3、又はCD3/TCR複合体;CD11a;CD26;CD27;CD28;CD30L;CD32;CD38;CD40L(CD154とも呼ばれる);CD45;CD49;CD50(ICAM-3とも呼ばれる);CD54(ICAM-1とも呼ばれる);CD80(B7.1とも呼ばれる);CD86(B7.2とも呼ばれる);CD100;CD122;CD137L(4-1BBリガンドとも呼ばれる);CD153;CTLA-4(CD152とも呼ばれる);ICOS;OX40L(CD134とも呼ばれる);PD-1;PD-L2(B7-DCとも呼ばれる);SLAM(CD150とも呼ばれる);TIM-1;TIM-2;TIM-3;TIM-4;及び2B4(CD244とも呼ばれる)を含む。幾つかのリガンドは、場合によりMHCクラスIIと共発現してもよい。もちろん、かかるリガンドの任意の組合せは、本発明を実施する際に使用されてもよい。
本発明において使用するリガンド又はウイルス因子をコードする核酸は、既知の配列のPCR増幅を含む適切な又は都合のよい既知の方法のいずれかにより獲得されるか又は製造されてもよい。
リガンド分子の一のタイプは、B7-1(B8として以前から知られており、そしてCD80としても知られている)及びB7-2(CD86としても知られている)などの刺激又は共刺激分子であって、CD28に結合する分子である。B7-1及びB7-2は、免疫グロブリン・スーパーファミリーの一員である関連ホモダイマー糖タンパク質である。他の刺激又は共刺激分子は、抗-CD28抗体又はその機能性部分であり、CD28に結合するFab部分を含む。幾つかの実施態様では、パッケージング細胞は、CD54ではなくCD86をリガンドとして発現する。
他のタイプのリガンドは、細胞-細胞接着分子である。これらは、様々なICAM分子を含み、これらは、細胞内接着分子(ICAM)ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、白血球機能関連抗原(LFA)LFA-1及びLFA-3を含む。ICAM関連メンバーは、全て、T細胞インテグリン、LFA-1に結合する。樹状細胞、マクロファージ、及びB細胞を含むAPC上に発現されることに加えて、ICAM-1及びICAM-2は、内皮細胞上で発現され、それにより、細胞接着を媒介し、そして本発明のパッケージされたベクターを用いた形質導入を可能にする。ICAM-3は、白血球上でのみ発現し、そうして本発明のリガンドとの結合について標的化される。いくつかの実施態様では、パッケージング細胞は、ICAM-1(CD54)、ICAM2、又はICAM-3をリガンドとして発現せず、CD86をリガンドとして発現する。
ICAM-1、-2、及び-3の間の相互作用は、LFA-3(CD58)及びLFA-2(CD2)と、LFA-1(CD11a及びCD18)との間の第二結合相互作用と相乗的であることが観察された。こうして、これらのICAM分子は、CD58、CD11a、及びCD18、或いはCD2と共発現されて、CD58、CD11a及びCD18、或いはCD2に結合する表面分子で細胞の標的化を許容する。いくつかの実施態様では、LFA-1、LFA-2、又はLFA-3は、CD86と共発現しない。
ICAM-1、-2、及び-3との間の相互作用は、LFA-3(CD58)及びLFA-2(CD2)とLFA-1(CD11a及びCD18)との間の第二結合相互作用と相乗的であると観察された。これらのICAM分子は、こうして、CD58、CD11a及びCD18、又はCD2と共発現して、CD58、CD11a及びCD18、又はCD2に結合する表面分子を用いて細胞を標的化することを許容する。
本発明は、生存分子をリガンドとして使用して実施されうる。生存分子は、細胞死の刺激から誘導にわたる細胞応答において役割を果たす分子である。生存分子は、細胞の表面に晒されるタンパク質であってもよいし、又は他の細胞表面巨大分子、例えば炭水化物又は脂質などであってもよい。かかる細胞表面分子はまた、細胞表面上の受容体とも呼ばれる。本発明を実施する際に使用するための生存分子は、Fasリガンドを含む。
他の分子は、TNF受容体、TNF、及びCD70、II型膜貫通タンパク質であって、CD27に結合するTNFファミリーのメンバーであるタンパク質を含む。CD27は休止中のT及びB細胞上に発現される一方、CD70は活性型T及びB細胞上において発現される。CD70のその受容体、CD27への結合は、T細胞共刺激を誘導し、そして当該相互作用は、非刺激T細胞プールからのT細胞のリクルートに重要でありうる。他のある条件下では、TNFによるTNF受容体の活性化は、同様の応答をもたらす。
他の非制限的な細胞表面結合性の分子は、FLT-3リガンド、TPO、及びKitリガンド受容体に対する抗体又はリガンドであり、これらは、受容体を発現する細胞、例えば造血幹細胞を、ベクターによる形質導入についてより受容性にする。さらなる非制限的な細胞表面結合分子は、GM-CSF及びIL-4受容体に対する抗体又はリガンドであり、これらは、樹状細胞又はその前駆細胞、例えば単球、CD34陽性幹細胞、又は樹状細胞系列における分化始原細胞などを、ベクターによる形質導入についてより受容性とする。他の細胞表面結合性分子は、別の細胞表面に結合する細胞表面上に見られる分子を含む。
細胞表面結合分子のさらなる実施態様は、ポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質、及びイオンを含み、それら全ては場合により他の物質と複合体形成している。幾つかの実施態様では、当該分子は、血液細胞の表面上に見られる因子、例えば、
に結合する。小文字(例えば「a」又は「b」)は、複数の遺伝子産物から構成されるか、又は構造的に関連するタンパク質のファミリーに属する複合体化したCD分子を指す。「w」という表記法は、未だ十分に確認されていない推定のCD分子を指す。CD分子のより完全なリストは、http:// at mpr.nci.niri.gov/prow/に見出される。もちろん、かかるリガンドの任意の組合せを、本発明を実施する際に使用してもよい。
様々な構築物及び方法は、本発明のリガンド及びウイルス因子を発現するために使用されうる。非制限的な構築物は、使用されるパッケージング細胞においてリガンドの発現を制御する安定なプロモーターを含む構築物である。当該構築物は、本明細書に記載されるリガンド及びウイルス因子をコードする核酸配列に、作動可能なように結合される誘導性及び構成的プロモーターを含む。
本発明は、本明細書に記載されるウイルス因子及びリガンドを発現できる実質的に純粋な形態のプラスミド発現ベクターを使用して実施される。当該リガンド及びウイルス因子をコードする配列は、対応する組換えタンパク質を生成するために使用される。かかる配列の発現を仕向けることができるヘルパー・ベクターは、「発現ベクター」又は「発現プラスミド」と呼ばれてもよい。
発現ベクターは、宿主において挿入された配列の転写を促進する(当該配列に作動可能なように結合する)制御領域においてプロモーター配列を含む。当該配列は、本発明のリガンド又は「ペイロード」をコードしてもよい。ベクターは、構成的にある配列を発現する細胞に対する選択圧を制限するために、誘導性プロモーターを含んでもよい。発現ベクターはまた、複製起源並びに典型的に形質転換された細胞の表現系についての選択を可能にする特異的遺伝子を含む。作動可能なように結合されたという用語は、機能エレメント、例えば制御領域内の応答エレメント、と本明細書に記載されるコード配列及びプロモーターとの結合をもたらすために、核酸配列を共有結合されることを指す。
本発明において使用するためのベクターは、真核細胞に適合するベクターでありうる。真核細胞発現ベクターは、当該技術分野において知られており、そして本発明のウイルス因子及びリガンドをコードする配列を発現するためのプロモーターを含む。これらの発現ベクターは、成熟mRNAを生成するための任意のスプライシング・シグナル並びに正確かつ十分なポリアデニル化に必要とされる区別される配列エレメントを含んでもよい。これらは、場合により、コードされた遺伝子の発現レベルを増加させるために、ウイルスレプリコンを含む。高レベルの発現は、誘導性プロモーター、例えば非限定的に、メタロチオニンIIAプロモーター及び熱ショックプロモーターを用いて達成されてもよい。
本発明は、組換えレトロウイルスパッケージング細胞を産生する方法も提供する。当該方法は、1)レトロウイルスの複製及び/又はパッケージングに必須であるウイルス遺伝子産物を当該パッケージング細胞内に発現できる核酸分子、及び2)標的細胞の細胞表面分子に結合する少なくとも1の膜関連非ウイルスリガンドを、当該パッケージング細胞内に発現できる少なくとも1の核酸分子を、細胞中に導入することを含む。さらなる方法は、1)レトロウイルスのパッケージング及び/又は複製に必須であるウイルス遺伝子産物を当該パッケージング細胞内に発現できる核酸分子、及び2)標的細胞の細胞表面分子に結合する少なくとも1の膜関連非ウイルスリガンドを、当該パッケージング細胞内に発現増加できる少なくとも1の核酸分子を、細胞内に誘導することを含む。
幾つかの実施態様において、本発明は、組換えリガンド及びウイルス因子の長期間に渡り高収率の産生をもたらす安定的なトランスフェクションをさらに提供する。安定的なトランスフェクションは、遺伝物質が次に起こる細胞複製及び細胞分裂の細胞周期の進行に渡り失われることがないように、遺伝物質を細胞ゲノムに組み込むことを指す。或いは、細胞は一過的にトランスフェクションされ、その結果、当該物質は次に生じる細胞複製及び細胞分裂の細胞周期の間、細胞から失われることもある。
パッケージング細胞は、適切な発現制御エレメント(例えば、プロモーター及びエンハンサー配列、転写終結因子、ポリアデニル化部位など)、及び場合により選択マーカーにより制御されるcDNAで形質転換されうる。当該選択マーカーは、選別への抵抗性を与え、そして細胞が安定してプラスミドを細胞の染色体に組み込むこと及び細胞系列に行き渡ったクローンを形成するように増殖することを許容する。
本発明は、同じベクター内に存在し、そして一つの又は別々の(場合により複数の)制御エレメント、例えばプロモーターの制御下で存在するリガンド及び/又はウイルス因子をコードする1を超える配列の存在も考慮に入れる。こうして、本発明のウイルス因子タンパク質及び/又は組換えリガンドをパッケージング細胞内で産生するためのヘルパー・ベクター構築物の全ての可能な組合せが考慮される。
パッケージされたベクターにより標的される細胞型(つまり標的細胞)は、非限定的に、初代細胞、例えば、有核血液細胞の全ての形態を含む血液細胞;肝細胞;内皮細胞;リンパ球;及び悪性及び良性腫瘍細胞を含む腫瘍細胞を含む。こうした細胞への投与のために、パッケージされたベクターは、ヒトなどの動物に、ex vivo又はin vivo技術を介して投与されてもよい。
さらに、本発明は、ウイルスベクターを生成又はパッケージングする方法を提供する。本方法は、1)本発明のパッケージング細胞中に、レトロウイルス・ベクターをコードするか又は含む核酸分子を導入し、そして2)パッケージング細胞の1以上の膜関連非ウイルスリガンドを含む粒子内に当該ベクターをパッケージする条件下で、当該細胞を培養することを含む。当該リガンドは、本明細書に記載されるとおりであり、そして標的細胞の細胞表面分子に結合することもある。幾つかの実施態様では、レトロウイルス・ベクターをコードするか又は含む核酸分子は、パッケージング細胞内に導入される「第二」核酸である。
本発明を一般的に記載したが、例示により提供され、そして他に記載がない限り本発明を限定するものとして意図されない以下の実施例を参照して、同じものはより容易に理解されよう。
実施例1:レンチウイルス・ベクターの膜にとり込まれたCD54により媒介される形質導入の増加
VRX494は、cppt/CTS配列、HIVエンベロープ遺伝子に狙いを定めた937塩基アンチセンス・ペイロード、及び更なる実施態様において取り除かれうるGFP-マーカー遺伝子を含むHIVに基づく最小のレンチウイルス・ベクターである。後者二つの核酸配列は、両方ともLTRプロモーターの制御下で発現される。VRX494を、論文に示された方法(Luら、2004)に従って、一のヘルパー・プラスミドの存在下で293FT細胞を一過的にトランスフェクションすることにより産生して、Gタンパク質偽型ウイルス粒子をもたらした。パッケージング細胞の細胞表面上におけるCD54の発現が、ベクター膜エンベロープ上での発現をもたらし、そうして形質転換を高めるかを試験するために、CD54発現構築物(VRX588)を作成した。VRX494を、VRX588の存在下又は不存在下のいずれかで産生して、ウイルス粒子エンベロープ膜表面においてCD54を含むか又は含まないベクターをもたらした。ベクター含有上清を、様々な間隔で回収し、貯蔵し、そして遠心した。ベクターペレットを、緩衝液中で再構成し、そして次に論文に発表された方法(Luら、2004)に従ってHeLa-tat細胞上で滴定した。
VRX494は、cppt/CTS配列、HIVエンベロープ遺伝子に狙いを定めた937塩基アンチセンス・ペイロード、及び更なる実施態様において取り除かれうるGFP-マーカー遺伝子を含むHIVに基づく最小のレンチウイルス・ベクターである。後者二つの核酸配列は、両方ともLTRプロモーターの制御下で発現される。VRX494を、論文に示された方法(Luら、2004)に従って、一のヘルパー・プラスミドの存在下で293FT細胞を一過的にトランスフェクションすることにより産生して、Gタンパク質偽型ウイルス粒子をもたらした。パッケージング細胞の細胞表面上におけるCD54の発現が、ベクター膜エンベロープ上での発現をもたらし、そうして形質転換を高めるかを試験するために、CD54発現構築物(VRX588)を作成した。VRX494を、VRX588の存在下又は不存在下のいずれかで産生して、ウイルス粒子エンベロープ膜表面においてCD54を含むか又は含まないベクターをもたらした。ベクター含有上清を、様々な間隔で回収し、貯蔵し、そして遠心した。ベクターペレットを、緩衝液中で再構成し、そして次に論文に発表された方法(Luら、2004)に従ってHeLa-tat細胞上で滴定した。
CD4+Tリンパ球をMACS陽性選別によりヒトPBMCから単離した。精製された細胞を、T細胞培地中で一晩1ウェルあたり1×106の濃度で、1セルあたり3ビーズの割合でCD3/CD28刺激ビーズの存在下で培養した。これにより、CD11a/CD18(LFA-1)構造が影響を受けて、ベクター粒子上のCD54(ICAM-1)による結合に対しより受容性になった。形質導入は、レトロネクチンの存在下又は不存在下で、20のMOIで三回行った。培養物を、5%CO2中で37℃で3日間、ベクターの存在下でインキュベーションした。使用されなかったベクターを洗い流し、そして細胞を次に1mlあたり0.5×106細胞で再び蒔いた。ある体積の培養培地を適切な容器に移すことにより細胞を最大7日間維持した。7日目に培養物を回収し、PBSで2回洗浄し、計数し、そしてSOPに従ってTaqManPCRを用いて、細胞あたりの平均ベクター・コピー数を決定するために106細胞/バイアルで乾燥ペレット化した。
形質導入を高める能力について知られている化合物であるレトロネクチンの存在下では、CD54の存在は、CD54なしの対照に比べて標的初代CD4Tリンパ球において約7倍にコピー数を増大させた。レトロネクチンの非存在下では、CD54は、標的コピー数をCD54なしの対照の10倍に高めた。形質導入の同等のレベルは、レトロネクチンの存在下又は不存在下において、CD54陽性ベクターにより形質導入された細胞について達成された(図1)。このことは、CD54の存在が主要な効果を有する一方、レトロネクチンが形質転換に関して比較的小さいプラスの効果しか有さないということを示唆する。
実施例2:ベクター膜上に発現されたCD86と共にパッケージされたレンチウイルス・ベクターを用いた形質導入後における細胞刺激及び増殖の増加
293細胞は、当該タンパク質をコードする発現構築物を用いて、細胞にトランスフェクションさせることにより、CD54、CD86、又はその両方を含むように改変された。幾つかの点について、フリーサイトメトリーによる評価により、トランスフェクションされた細胞を試験して、細胞表面上に正しくタンパク質が発現しているかを確認した。細胞を、抗CD54-PE又は抗CD86-PEで染色し、そして生存率についてヨウ化プロピジウムで染色した。イソ型対照である抗-マウスIgG1−PE及び抗-マウスIgG2aをベースライン染色を検出するために使用した。
293細胞は、当該タンパク質をコードする発現構築物を用いて、細胞にトランスフェクションさせることにより、CD54、CD86、又はその両方を含むように改変された。幾つかの点について、フリーサイトメトリーによる評価により、トランスフェクションされた細胞を試験して、細胞表面上に正しくタンパク質が発現しているかを確認した。細胞を、抗CD54-PE又は抗CD86-PEで染色し、そして生存率についてヨウ化プロピジウムで染色した。イソ型対照である抗-マウスIgG1−PE及び抗-マウスIgG2aをベースライン染色を検出するために使用した。
刺激及び増殖の評価について、ヒト・アフェレーシス生成物から単離され、続いて(Miltenyi装置を用いた)CD4+濃縮によりCD4T細胞について精製された凍結CD4+T細胞を、5%ヒトAB血清、50μg/mlゲンタマイシン、100U/mlのIL-2、及び1.6mg/mlのN-アセチルシステイン(NAC)を含むX-vivoにおける15の培地中で培養した。細胞を、次の3個の条件:添加なし、5mg/mlの濃度での抗CD3抗体(クローンOKT-3)、又は1セルあたり3ビーズの濃度の抗CD3/CD28マイクロビーズのうちの1つの条件において、1×106細胞/mlの濃度で蒔いた。これらの3種の条件について、ベクターなし、対照ベクター、又はその膜にCD54、CD86、又はこれらの両タンパク質を一緒に含む対照ベクターを試験した。
1日目及び2日目において、全てのウェル内の細胞を、ゆっくり再懸濁して、全ての凝集を破壊した。3日目において、細胞を2回洗浄し、そして計数し、そしてZ2Coulter Counterを用いて大きさを計測した。7日目において、細胞を計数し、そして再び大きさを計測し、そして緑色蛍光タンパク質(GFP)の発現について分析した。GFPは、使用したレンチウイルス・ベクターにより発現される遺伝子のマーカーである。この時点で、活性化マーカーであるCD25及びCD69の発現を、抗-CD25-PE又は抗-CD69-PE、及びヨウ化プロピジウムを使用し、ベースライン染色についてIgGK1-PEイソ型対照を用いて、試験した。
2セットの実験を行った。最初の実験は、上で記載される293細胞において産生されたベクターを使用した。2回目の実験は、細胞系列を前もって樹立することなく、単純な一過的コトランスフェクション技術を用いて、細胞内で産生されたベクターを使用した。これらの実験の増殖結果をそれぞれ図2及び3に示す。可溶性抗-CD3抗体と組み合わせて、CD86-表面発現レンチウイルス・ベクターで処理された細胞は、通常(未改変)ベクターで処理した細胞を超える有意に高い増殖を示した。CD54は、細胞増殖を高めるか又は遅延させる役割を果たすようには見えなかった。293F細胞系列を用いて、又は一過的トランスフェクションを介して産生されるベクターで処理された細胞間で観察される有意差は存在しなかった。
CD86及びCD54を発現する293細胞の共培養は、CD54のみを発現する293細胞に比べて、CD4+T細胞上での活性化マーカーCD25及びCD69の発現を高めた(図4及び5に示される)。これらの結果は、CD86発現細胞に晒された細胞における改善された増殖が細胞活性化の結果であるという発見を支持した。
最後に、ベクターの表面上にCD86を発現することは、293F細胞系列により又は上で記載されるように一過的トランスフェクションにより産生されるベクターについて、7日目でGFP発現レベルを高めた。CD86と組み合わせたCD54がベクター挿入の細胞あたりのコピー数を改善することが前に示されたが、この実験において、CD54は、CD86のみに比べた場合、ベクターで誘導された細胞の全体の割合へ寄与しないように思える。CD86のみの存在は、10%未満から約30%まで、形質導入割合を増大させた。
これらのデーターを合わせると、ベクター粒子の表面に刺激リガンドをとり込むことが、細胞刺激及び増殖を高めることができるということが明らかに示される。
本明細書に引用される参考文献、例えば特許、特許出願、及び公開は、本明細書中で具体的に援用されているかどうかに関わらず、その全てを本明細書中に援用する。
本発明を十分に記載してきたが、本発明の本質及び範囲から逸脱せず、そして過度の実験を必要とすることなく、本発明と同一物が、同等のパラメーター、濃度、及び条件の広い範囲内で行われうるということが、当業者により認められよう。
本発明が、その具体的実施態様に関して記載された一方、さらなる改変が可能であることが理解されよう。本出願は、本発明が属する技術分野における既知又は慣用事項になる場合、並びに本明細書に記載された本質的特徴に適用される場合、一般的に本発明の原理に従い、そして本開示からのかかる逸脱を含む本発明の任意の変化、使用、又は適用に及ぶことが意図される。
Claims (49)
- 標的細胞の細胞表面分子に結合し、そして当該細胞の細胞周期の移行を活性化又は刺激する少なくとも1の膜関連非ウイルスリガンドを、パッケージング細胞内で発現することができる第一核酸分子を含む、組換えレトロウイルス・パッケージング細胞。
- 前記パッケージング細胞が、レトロウイルス構造タンパク質又はアクセサリータンパク質を発現する、請求項1に記載の細胞。
- パッケージされるレトロウイルス・ベクターをさらに含む、請求項1又は2に記載の細胞。
- 標的細胞の細胞表面分子に結合する少なくとも1の膜関連非ウイルスリガンドを、パッケージング細胞において発現することができる第一核酸分子を含む組換えレトロウイルス・パッケージング細胞であって、第二核酸分子の非存在下でウイルス粒子を産生しない、前記細胞。
- 前記レトロウイルス・パッケージング細胞が以下の:
i) 標的細胞の細胞表面分子に結合し、そして場合によりウイルスリガンドを含む細胞膜と当該標的細胞との融合を媒介するように機能する当該ウイルスリガンドを発現できる異種核酸分子
ii)CD49d、CD54、CD84、CD86、又はそれらの組合せを発現できる異種核酸分子
を含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の細胞。 - 前記標的細胞が、抗原提示細胞(APC)、造血細胞系列の細胞、幹細胞、造血幹細胞、リンパ球、ニューロン、内皮細胞、又は腫瘍細胞である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記少なくとも1の膜関連非ウイルスリガンドが、以下の:
i) T細胞のCD3/TCR複合体が、天然若しくは人工リガンド又は特異的Abにより結合されるとき、当該T細胞表面分子に結合してT細胞の増殖を活性化する、共刺激分子
ii)当該細胞表面分子への結合を介して、細胞-細胞接着の役割を果たす分子
である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の細胞。 - 前記少なくとも1の膜関連非ウイルスリガンドが、前記細胞表面分子を結合した後に、前記標的細胞を活性化して増殖させる、請求項1〜6のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記少なくとも1の膜関連非ウイルスリガンドが、2個のかかるリガンドを含む、請求項1〜6に記載のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記膜関連非ウイルスリガンドが、造血細胞のリガンドである、請求項1〜6のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記膜関連非ウイルスリガンドが、膜貫通タンパク質である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記膜関連非ウイルスリガンドが、CD28、CD28BP、CD40、CD62L、CD80(B7-1)、CD86(B7-2)、又はFasリガンド(FasL)、CD70、LFA-3(CD58)、B7-H1(PD-L1)、B7-H2、B7-H3(B7RP-2)、B7-H4、CD2、CD3、CD3/TCR複合体、CD11a、CD26、CD27、CD28、CD30L、CD32、CD38、CD40L(CD154)、CD45、CD49、CD50(ICAM-3)、CD54(ICAM-1)、CD100、CD122、CD137L(4-1BBリガンド)、CD153、CTLA-4(CD152)、ICOS、OX40L(CD134)、PD-1、PD-L2(B7-DC)、SLAM(CD150)、TIM-1、TIM-2、TIM-3、TIM-4、2B4(CD244)、又はそれらの組合せである、請求項1〜6のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記膜関連非ウイルスリガンドが、B7-H1、B7-H2(ICOS-L、B7RP-1、及びGL50としても知られている)、B7-H3、及びB7-H4などのB7関連分子である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記膜関連非ウイルスリガンドが、LFA-1、又はCD11aとCD18の複合体、例えば、ICAM-1(CD54)、ICAM-2(CD102)、ICAM-3(CD50)、ICAM-4(LW)、及びICAM-5(テレンセファリン)に結合する、請求項1〜6のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記膜関連非ウイルスリガンドは、PD-L2又はPD-L1などのPD-1リガンド;OX40(CD134)に結合するOX40リガンド;4-1BB(CD137)に結合する4-1BBリガンド;LFA-2(CD2)に結合する、CD15、CD48、CD58、又はCD59などのリガンド;CD5に結合する、CD72などのリガンド;又はLFA-3(CD58)に結合する、CD2などのリガンドである、請求項1〜6のいずれか一項に記載される細胞。
- 前記膜関連非ウイルスリガンドが、LFA-1、CD18、CD11b、CD11c、CD11d、及びCD43に結合する抗体又は抗体断片である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記膜関連非ウイルスリガンドが、LFA-1、CD18、CD11b、CD11c、CD11d、及びCD43に結合する微生物タンパク質である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記標的細胞が造血幹細胞である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記標的細胞がCD34+、CD33+、CD14+であり、又はネクチン1を発現する、請求項1〜6のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記標的細胞がT細胞である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記標的細胞が樹状細胞又はリンパ節中心におけるB細胞である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記標的細胞が線維芽細胞である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の細胞。
- 組換えレトロウイルス・パッケージング細胞を産生する方法であって、当該方法が以下の:
レトロウイルスのパッケージング及び/又は複製に必要とされるウイルス遺伝子産物を、当該パッケージング細胞内で発現できる核酸分子、
標的細胞の細胞表面分子に結合する少なくとも1の膜関連非ウイルスリガンドを、当該パッケージング細胞内で発現できる少なくとも1の核酸分子
を細胞内に導入する、を含む、前記方法。 - ウイルスベクターをパッケージングする方法であって、当該方法が以下の:
レトロウイルス・ベクターをコードするか又は含む第二核酸分子を、請求項1、2、4、又は5のいずれか一項に記載の組換え細胞中に導入し、そして
上記細胞が標的細胞の細胞表面分子に結合する膜関連非ウイルスリガンドを含む粒子中に上記ベクターをパッケージする条件下で、当該細胞を培養する
を含む、前記方法。 - 前記ウイルス遺伝子産物が、標的細胞の細胞表面分子に結合し、そして場合により前記ウイルスリガンドを含む細胞膜と当該標的細胞との融合を媒介するように機能する、請求項23又は24に記載の方法。
- 前記標的細胞が、抗原提示細胞、造血細胞系列の細胞、幹細胞、造血幹細胞、リンパ球、ニューロン、内皮細胞、又は腫瘍細胞である、請求項23〜25のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも1の膜関連非ウイルスリガンドが、以下の:
i) T細胞のCD3/TCR複合体が、天然若しくは人工のリガンドにより結合されるか、又は特異的抗体により結合される場合、T細胞表面分子に結合してT細胞増殖を活性化する共刺激分子、及び/又は
ii) 当該細胞表面分子への結合を介して、細胞-細胞接着の役割を果たす分子
である、請求項23〜26のいずれか一項に記載の方法。 - 前記少なくとも1の膜関連非ウイルスリガンドが、前記細胞表面分子に結合後に、前記標的細胞を活性化して増殖させる、請求項23〜26のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも1の膜関連非ウイルスリガンドが、2のかかるリガンドを含む、請求項23〜26のいずれか一項に記載の方法。
- 前記膜関連非ウイルスリガンドが、造血細胞のリガンドである、請求項23〜26のいずれか一項に記載の方法。
- 前記膜関連非ウイルスリガンドが、膜貫通タンパク質である、請求項23〜26のいずれか一項に記載の方法。
- 前記膜関連非ウイルスリガンドが、CD28、CD28BP、CD40、CD62L、CD80(B7-1)、CD86(B7-2)、又はFasリガンド(FasL)、CD70、LFA-3(CD58)、B7-H1(PD-L1)、B7-H2、B7-H3(B7RP-2)、B7-H4、CD2、CD3、CD3/TCR複合体、CD11a、CD26、CD27、CD28、CD30L、CD32、CD38、CD40L(CD154)、CD45、CD49、CD50(ICAM-3)、CD54(ICAM-1)、CD100、CD122、CD137L(4-1BBリガンド)、CD153、CTLA-4(CD152)、ICOS、OX40L(CD134)、PD-1、PD-L2(B7-DC)、SLAM(CD150)、TIM-1、TIM-2、TIM-3、TIM-4、2B4(CD244)、又はそれらの組合せである、請求項23〜26のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ウイルス遺伝子産物が、ポリオウイルス受容体CD155、野生型単純疱疹ウイルス(HSV)-1エンベロープタンパク質、又は他のウイルス・エンベロープタンパク質である、請求項23〜26のいずれか一項に記載の方法。
- 前記膜関連非ウイルスリガンドが、B7-H1、B7-H2(ICOS-L、B7RP-1、及びGL50としても知られている)、B7-H3、及びB7-H4などのB7関連分子である、請求項23〜26のいずれか一項に記載の方法。
- 前記膜関連非ウイルスリガンドが、LFA-1、又はICAM-1(CD54)、ICAM-2(CD102)、ICAM-3(CD50)、ICAM-4(LW)、及びICAM-5(テレンセファリン)などのCD11aとCD18との複合体に結合する、請求項23〜26のいずれか一項に記載の方法。
- 前記膜関連非ウイルスリガンドが、PD-L2又はPD-L1などのPD-1リガンドであり;OX40(CD134)に結合するOX40リガンド;4-1BB(CD137)に結合する4-1BBリガンド;LFA-2(CD2)に結合する、CD15、CD48、CD58、又はCD59などのリガンド;CD5に結合する、CD72などのリガンド;又はLFA-3(CD58)に結合する、CD2などのリガンドである、請求項23〜26のいずれか一項に記載の方法。
- 前記膜関連非ウイルスリガンドが、LFA-1、CD18、CD11b、CD11c、CD11d、及びCD43に結合する抗体又は抗体断片である、請求項23〜26のいずれか一項に記載の方法。
- 前記膜関連非ウイルスリガンドが、LFA-1、CD18、CD11b、CD11c、CD11d、及びCD43に結合する微生物タンパク質である、請求項23〜26のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的細胞が造血幹細胞である、請求項23〜26のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的細胞が、CD34+、CD33+、CD14+であるか、又はネクチン1を発現する、請求項23〜26のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的細胞がT細胞である、請求項23〜26のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的細胞が、樹状細胞又はリンパ節中心のB細胞である、請求項23〜26のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的細胞が線維芽細胞である、請求項23〜26のいずれか一項に記載の方法。
- 標的細胞又は組織の細胞表面分子に結合できる少なくとも1の膜関連リガンドを内在的に発現する細胞を含む、レトロウイルスベクターパッケージング細胞。
- 前記細胞が、in vivoにおいて標的細胞又は組織と相互作用する、請求項44に記載のパッケージング細胞。
- 前記細胞が骨髄間質細胞であり、前記標的細胞が造血幹細胞である、請求項45に記載のパッケージング細胞。
- 前記リガンドがインテグリンであり、そして前記標的細胞がCD34+細胞である、請求項44又は45に記載のパッケージング細胞。
- 前記リガンドがSDF-1 VLA-4、VLA-5、又はLFA-1であり、そして前記造血幹細胞がCD34+及びCD38-/CXCR4+、又はCD34+、及びCD38lo/CXCR4+である、請求項47に記載のパッケージング細胞。
- 前記細胞が、レトロウイルス・パッケージング細胞であり、それにより、標的細胞の細胞表面分子に結合し、そして場合により当該ウイルスリガンドを含む細胞膜と、当該標的細胞との融合を媒介するように機能する、ウイルスリガンドを発現できる異種核酸分子を含む、請求項44に記載の細胞。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US58546404P | 2004-07-01 | 2004-07-01 | |
PCT/US2005/023416 WO2006007539A1 (en) | 2004-07-01 | 2005-06-30 | Vector packaging cell line |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2008504821A true JP2008504821A (ja) | 2008-02-21 |
Family
ID=34973063
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2007519457A Pending JP2008504821A (ja) | 2004-07-01 | 2005-06-30 | ベクター・パッケージング細胞系列 |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20060003452A1 (ja) |
EP (1) | EP1769078A1 (ja) |
JP (1) | JP2008504821A (ja) |
CN (1) | CN101072880A (ja) |
AU (1) | AU2005262329A1 (ja) |
CA (1) | CA2572467A1 (ja) |
WO (1) | WO2006007539A1 (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2018506983A (ja) * | 2015-03-02 | 2018-03-15 | ユーシーエル ビジネス ピーエルシー | レトロウイルスおよびレンチウイルスベクター |
JP2021510522A (ja) * | 2018-01-11 | 2021-04-30 | カメレオン バイオサイエンシーズ, インコーポレイテッド | 免疫回避性ベクターおよび遺伝子療法のための使用 |
Families Citing this family (25)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
PL2397156T3 (pl) | 2005-06-08 | 2017-07-31 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Sposoby i kompozycje do leczenia uporczywych infekcji i nowotworu poprzez hamowanie ścieżki zaprogramowanej śmierci komórki 1 (PD-1) |
NZ629273A (en) * | 2006-12-27 | 2015-02-27 | Harvard College | Compositions and methods for the treatment of infections and tumors |
JP2011517409A (ja) * | 2008-03-28 | 2011-06-09 | バイレクシス コーポレイション | レンチウイルスベースの免疫原性ベクター |
CA2744449C (en) | 2008-11-28 | 2019-01-29 | Emory University | Methods for the treatment of infections and tumors |
SG196798A1 (en) | 2008-12-09 | 2014-02-13 | Genentech Inc | Anti-pd-l1 antibodies and their use to enhance t-cell function |
JPWO2010101249A1 (ja) | 2009-03-06 | 2012-09-10 | 国立大学法人三重大学 | T細胞の機能増強方法 |
US9273283B2 (en) * | 2009-10-29 | 2016-03-01 | The Trustees Of Dartmouth College | Method of producing T cell receptor-deficient T cells expressing a chimeric receptor |
CA2845536A1 (en) | 2011-08-15 | 2013-02-21 | Amplimmune, Inc. | Anti-b7-h4 antibodies and their uses |
US10494440B2 (en) * | 2012-05-11 | 2019-12-03 | Vaccinex, Inc. | Use of semaphorin-4D binding molecules to promote neurogenesis following stroke |
JP2016505843A (ja) | 2012-12-19 | 2016-02-25 | アンプリミューン, インコーポレイテッド | B7−h4特異的抗体、並びにその組成物及び使用方法 |
RS64664B1 (sr) | 2013-02-15 | 2023-11-30 | Bioverativ Therapeutics Inc | Gen optimizovanog faktora viii |
KR20160075676A (ko) | 2013-10-24 | 2016-06-29 | 오스페달레 산 라파엘 에스.알.엘. | 방법 |
JP7372728B2 (ja) * | 2014-10-31 | 2023-11-01 | ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア | 改変t細胞に関する方法および組成物 |
CN104673897B (zh) * | 2015-01-26 | 2017-09-29 | 江苏先声药业有限公司 | 一种测定pd‑1通路抑制剂之生物学活性的方法 |
RU2018106515A (ru) | 2015-07-21 | 2019-08-21 | Зе Чилдрен'С Медикал Сентер Корпорейшн | Pd-l1-экспрессирующие гемопоэтические стволовые клетки и применения |
JP7217630B2 (ja) | 2016-02-01 | 2023-02-03 | バイオベラティブ セラピューティクス インコーポレイテッド | 最適化第viii因子遺伝子 |
US11111505B2 (en) | 2016-03-19 | 2021-09-07 | Exuma Biotech, Corp. | Methods and compositions for transducing lymphocytes and regulating the activity thereof |
US11325948B2 (en) | 2016-03-19 | 2022-05-10 | Exuma Biotech Corp. | Methods and compositions for genetically modifying lymphocytes to express polypeptides comprising the intracellular domain of MPL |
GB201614093D0 (en) | 2016-08-17 | 2016-09-28 | Autolus Ltd | Vector |
CN110892070A (zh) * | 2017-03-03 | 2020-03-17 | F1肿瘤医学公司 | 用于转导和扩增淋巴细胞以及调节其活性的方法及组合物 |
WO2019060708A1 (en) | 2017-09-22 | 2019-03-28 | The Children's Medical Center Corporation | TREATMENT OF TYPE 1 DIABETES AND AUTOIMMUNE DISEASES OR DISORDERS |
CN109781975B (zh) * | 2017-11-14 | 2022-05-06 | 河南乾坤科技有限公司 | 富集循环稀有细胞的试剂及方法 |
CN110093351B (zh) * | 2018-01-29 | 2023-06-23 | 华南生物医药研究院 | 可分离的核酸、多肽、重组载体、重组细胞及应用 |
US20200199626A1 (en) * | 2018-12-06 | 2020-06-25 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Use of lentiviral vectors expressing factor ix |
WO2020191378A1 (en) * | 2019-03-21 | 2020-09-24 | Allogene Therapeutics, Inc. | METHODS FOR ENHANCING TCRαβ+ CELL DEPLETION EFFICIENCY |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH06500923A (ja) * | 1990-09-21 | 1994-01-27 | カイロン コーポレイション | パッケージング細胞 |
JP2002514388A (ja) * | 1998-04-29 | 2002-05-21 | ユニバーシティー・オブ・サウザーン・カリフォルニア | 修飾エンベロープエスコート蛋白質を含むレトロウイルスベクター |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0633943A4 (en) * | 1992-04-03 | 1997-05-02 | Alexander T Young | GENTHERAPY USING TARGETED VIRAL VECTORS. |
JPH08504091A (ja) * | 1992-09-22 | 1996-05-07 | メディカル・リサーチ・カウンシル | 外部表面に非ウィルス性ポリペプチドを提示する組換えウィルス |
JP2002531583A (ja) * | 1998-12-11 | 2002-09-24 | バイオミラ,インコーポレイテッド | Muc−1アンタゴニストおよび免疫疾患の治療方法。 |
US6627442B1 (en) * | 2000-08-31 | 2003-09-30 | Virxsys Corporation | Methods for stable transduction of cells with hiv-derived viral vectors |
DE60125926T2 (de) * | 2001-07-27 | 2007-10-25 | Frankgen Biotechnologie Ag | Methode zum Auffinden von Proteinen mit einer Signalsequenz |
US7090837B2 (en) * | 2003-01-21 | 2006-08-15 | The Salk Institute For Biological Studies | Compositions and methods for tissue specific targeting of lentivirus vectors |
-
2005
- 2005-06-30 US US11/172,147 patent/US20060003452A1/en not_active Abandoned
- 2005-06-30 JP JP2007519457A patent/JP2008504821A/ja active Pending
- 2005-06-30 CA CA002572467A patent/CA2572467A1/en not_active Abandoned
- 2005-06-30 AU AU2005262329A patent/AU2005262329A1/en not_active Abandoned
- 2005-06-30 WO PCT/US2005/023416 patent/WO2006007539A1/en active Application Filing
- 2005-06-30 EP EP05768137A patent/EP1769078A1/en not_active Withdrawn
- 2005-06-30 CN CNA2005800226238A patent/CN101072880A/zh active Pending
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH06500923A (ja) * | 1990-09-21 | 1994-01-27 | カイロン コーポレイション | パッケージング細胞 |
JP2002514388A (ja) * | 1998-04-29 | 2002-05-21 | ユニバーシティー・オブ・サウザーン・カリフォルニア | 修飾エンベロープエスコート蛋白質を含むレトロウイルスベクター |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
JPN5007011482, GENE, 1996, Vol.175, No.1, P.121−125 * |
JPN5007011483, THE JOURNAL OF GENE MEDICINE, 200402, Vol.6, SUPPL.1, P.S83−S94 * |
JPN5007011484, BLOOD, 2002, Vol.99, No.7, P.2342−2350 * |
JPN6010016820, PLoS Biology, 200408, Vol.2, Issue8, P.1045 * |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2018506983A (ja) * | 2015-03-02 | 2018-03-15 | ユーシーエル ビジネス ピーエルシー | レトロウイルスおよびレンチウイルスベクター |
JP2020092722A (ja) * | 2015-03-02 | 2020-06-18 | ユーシーエル ビジネス リミテッド | レトロウイルスおよびレンチウイルスベクター |
JP2021510522A (ja) * | 2018-01-11 | 2021-04-30 | カメレオン バイオサイエンシーズ, インコーポレイテッド | 免疫回避性ベクターおよび遺伝子療法のための使用 |
JP7406253B2 (ja) | 2018-01-11 | 2023-12-27 | カメレオン バイオサイエンシーズ, インコーポレイテッド | 免疫回避性ベクターおよび遺伝子療法のための使用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2006007539A1 (en) | 2006-01-19 |
CA2572467A1 (en) | 2006-01-19 |
AU2005262329A1 (en) | 2006-01-19 |
EP1769078A1 (en) | 2007-04-04 |
US20060003452A1 (en) | 2006-01-05 |
CN101072880A (zh) | 2007-11-14 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2008504821A (ja) | ベクター・パッケージング細胞系列 | |
JP7412885B2 (ja) | 細胞の異なる亜型の活性を選択的にモジュレートするための方法 | |
JP6695347B2 (ja) | レトロウイルスおよびレンチウイルスベクター | |
AU2016206868B2 (en) | Modified hepatitis post-transcriptional regulatory elements | |
JP2020156494A (ja) | 養子t細胞療法のためのセントラルメモリーt細胞 | |
JP2006345852A (ja) | 抗体複合体 | |
US9670459B2 (en) | Production method for cell populations | |
CA2612355A1 (en) | Antibody complexes | |
IL296606A (en) | Buffers for stabilizing lentiviral preparations | |
JP2021520853A (ja) | ウイルスベクター及びパッケージング細胞株 | |
US20220241328A1 (en) | Use of cd8-targeted viral vectors | |
WO2022109162A1 (en) | Vector system for delivery of multiple polynucleotides and uses thereof | |
JP7262465B2 (ja) | Nk細胞形質導入のための方法 | |
WO2023115039A2 (en) | Modified paramyxoviridae fusion glycoproteins | |
Mühlebach et al. | Transduction efficiency of MLV but not of HIV-1 vectors is pseudotype dependent on human primary T lymphocytes | |
CA3219487A1 (en) | Lipid particles containing a truncated baboon endogenous retrovirus (baev) envelope glycoprotein and related methods and uses | |
US11957715B2 (en) | Method for NK cell transduction | |
US20240132841A1 (en) | Large scale car-t immune cell manufacturing method utilizing lentiviral vector transfection | |
WO2023150518A1 (en) | Cd3-targeted lentiviral vectors and uses thereof |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20100330 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20100907 |