CN110892070A - 用于转导和扩增淋巴细胞以及调节其活性的方法及组合物 - Google Patents

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Abstract

本公开提供用于以基因方式修饰淋巴细胞的方法及用于执行包括转导T细胞和/或NK细胞的过继性细胞疗法的方法。所述方法可包括抑制性RNA分子和/或可包括淋巴增生性组件的工程化信号传导多肽和/或嵌合抗原受体(CAR)，例如受微环境限制的生物CAR(MRB‑CAR)。本文中提供此类工程化信号传导多肽的额外组件，诸如驱动增生的那些组件及用于其的调节组件，以及复制缺陷型重组反转录病毒颗粒及包装细胞系以及其制造方法。提供用于调节经转导和/或经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞的许多组件及方法，例如，包括核糖开关、MRB‑CAR、识别域和/或pH调节剂的组件和方法。

Description

用于转导和扩增淋巴细胞以及调节其活性的方法及组合物
相关申请的交叉参考
本申请为：2017年3月19日提交的国际申请第PCT/US2017/023112号的部分继续申请；2017年7月8日提交的国际申请第PCT/US2017/041277号的部分继续申请；2017年3月19日提交的美国申请第15/462,855号的部分继续申请；以及2017年7月8日提交的美国申请第15/644,778号的部分继续申请；并主张以下申请的权益：2017年3月3日提交的美国临时申请第62/467,039号；2017年9月18日提交的美国临时申请第62/560,176号；2017年9月27日提交的美国临时申请第62/564,253号；以及2017年9月28日提交的美国临时申请第62/564,991号；国际申请第PCT/US2017/023112号主张2016年3月19日提交的美国临时申请第62/390,093号、2016年7月8日提交的美国临时申请第62/360,041号以及2017年3月3日提交的美国临时申请第62/467,039号的权益；国际申请第PCT/US2017/041277号主张2017年3月19日提交的国际申请第PCT/US2017/023112号、2017年3月19日提交的美国专利申请第15/462,855号、2016年7月8日提交的美国临时申请第62/360,041号以及2017年3月3日提交的美国临时申请第62/467,039号的权益；美国申请第15/462,855号主张2016年3月19日提交的美国临时申请第62/390,093号、2016年7月8日提交的美国临时申请第62/360,041号以及2017年3月3日提交的美国临时申请第62/467,039号的权益；且美国申请第15/644,778号为2017年3月19日提交的国际申请第PCT/US2017/023112号的部分继续申请及2017年3月19日提交的美国专利申请第15/462,855号的部分继续申请，且主张2016年7月8日提交的美国临时申请第62/360,041号及2017年3月3日提交的美国临时申请第62/467,039号的权益。这些申请以全文引用的方式并入本文中。
序列表
本申请在此以引用方式并入与本申请一起提交的电子序列表的材料。该电子序列表中的材料作为在2018年3月3日创建的标题为“F1_001_WO_03_Sequence_Listing_2018_03_03.txt”的文本(.txt)文件(其文件大小为526KB)提交，且以全文引用的方式并入本文中。
技术领域
本发明涉及免疫学领域，或更具体地，涉及T淋巴细胞或其他免疫细胞的基因修饰，以及制备复制缺陷型重组反转录病毒颗粒及控制其中基因表达的方法。
背景技术
从受试者(例如，患者)分离的淋巴细胞可在体外活化且经基因修饰以表达合成蛋白，这些合成蛋白能够基于所合并的基因程序而与其他细胞及环境重新定位结合。这种合成蛋白的一个实例为嵌合抗原受体(CAR)。目前使用的一种CAR为胞外识别域(例如，抗原结合域)、跨膜域及由复制缺陷型重组反转录病毒编码的一个或多个胞内信号传导域的融合。
尽管重组反转录病毒已在感染非分裂细胞上显示出功效，但静息CD4及CD8淋巴细胞对这些载体的基因转导不敏感。为了克服这些困难，通常在可出现带有CAR基因载体的基因修饰之前，使用刺激剂来在体外活化这些细胞。在刺激及转导之后，经基因修饰的细胞在体外扩增且随后再引入至淋巴消耗(lymphodeplete)的患者中。在体内抗原结合之后，CAR的胞内信号传导部分可在免疫细胞中启动活化相关的反应并释放细胞溶解分子以诱导肿瘤细胞死亡。
目前这些方法需要大量的操作及在T细胞再输注至患者中之前在体外制造增生性T细胞，以及淋巴消耗化学疗法以释放细胞因子及消耗竞争性受体以有助于T细胞移植。一旦引入至身体中，这些CAR疗法还不能控制体内传播速率，也不能安全地定向同样在肿瘤外表达的靶标。因此，现今CAR疗法一般由使用1×105个细胞/千克至1×108个细胞/千克的剂量离体扩增12天至28天的细胞输注，且定向靶标(例如，肿瘤靶标)，对于该CAR疗法离开肿瘤在靶标毒性上一般是可接受的。这些相对较长离体扩增时间产生细胞存活性及无菌性问题，以及包括可扩增性的挑战在内的样本一致问题。因此，亟需一种更安全、更有效的可扩增的T细胞或NK细胞疗法。
由于我们对驱动淋巴细胞的转导、增生和存活的过程的理解为涉及免疫过程的各种潜在商业用途的核心，因此需要经改进方法及组合物以供研究淋巴细胞。举例而言，其将有助于鉴别可用于更好的表征及理解淋巴细胞可如何经基因方式修饰的方法及组合物以及影响其存活及增生的因素。此外，其将有助于鉴别驱动淋巴细胞增生及存活的组合物。这些组合物可用于研究对这些过程的调节。除用于研究淋巴细胞的方法及组合物以外，需要经改进病毒包装细胞系及其制造及使用的方法。举例而言，这些细胞系及方法将适用于分析重组病毒(诸如重组反转录病毒颗粒)的不同组分，以及用于使用包装细胞系以供生产重组反转录病毒颗粒的方法。
发明内容
本文中提供帮助克服涉及用于转导和/或以基因方式修饰淋巴细胞(诸如T细胞和/或NK细胞)的方法、组合物及试剂盒的有效性及安全性问题。这些方法的某些实施例适用于用这些细胞进行过继性细胞疗法。因此，在一些方面，本文中提供用于以基因方式修饰和/或转导淋巴细胞(尤其T细胞和/或NK细胞)和/或用于调节经转导和/或经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞的方法、组合物及试剂盒。这些方法、组合物及试剂盒提供优于目前技术的改进的功效及安全性，尤其关于表达嵌合抗原受体(CAR)及在说明性实施例中微环境限制生物CAR的T细胞和/或NK细胞。利用本文提供的方法和/或使用该方法生产的经转导和/或经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞包括，在经由反转录病毒(例如，慢病毒)颗粒自反转录病毒(例如，慢病毒)基因组递送的说明性实施例中，为此类细胞及为利用此类细胞的方法(诸如研究方法、商业生产方法及过继性细胞疗法)提供经改进特征的功能性及功能性组合。举例而言，这些细胞可离体在较短时间内产生，及这些细胞具有可被更好调节的经改进的生长特性。
在一些方面，本文中提供用于调节CAR、mRNA、抑制性RNA的表达的调节组件，和/或在淋巴细胞(诸如B细胞、T细胞及NK细胞)中的淋巴增生性组件，例如嵌合淋巴增生性组件。此外，在一些方面，本文中提供表达各种功能组件且在其表面上携载各种功能组件的重组反转录病毒，以及用于生产这些重组反转录病毒的方法及包装细胞系。这些重组反转录病毒及用于生产其的方法及细胞克服了先前技术关于基因组数目及大小的限制，具有在递送至T细胞和/或NK细胞中时提供益处的不同功能组件。
在一些方面，提供用于转导和/或以基因方式修饰淋巴细胞(诸如T细胞和/或NK细胞)的方法，且在说明性实施例中，提供用于转导和/或以基因方式修饰静息T细胞和/或NK细胞的离体方法。这些方面中的一些方面可比先前方法快速得多地进行，可有助于更有效的研究、更有效的商业生产以及经改进的患者护理方法。此外，本文在一些实施例中提供了利用在本文中一些方面提供的重组反转录病毒以及药用试剂以提供经改进的安全性机制以帮助调节经转导和/或经基因方式修饰的淋巴细胞(诸如T细胞和/或NK细胞)的活性的方法。这些方法、组合物及试剂盒可在商业生产中及在用表达CAR的经转导和/或经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞的过继性细胞疗法中用作研究工具。
贯穿本专利申请，提供了关于本发明的方面及实施例的更多细节。章节及章节标题并不意欲限制方法、组合物及试剂盒或其中的功能组件的组合。
附图说明
图1显示包括包装细胞(100)及本公开的一个例示性、非限制性实施例的由包装细胞(100)产生的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒(200)的说明性组合物的示意图。在图1中，能够编码本发明的方面的各种载体(被称为重组多核苷酸(110))被包装至重组反转录病毒颗粒(200)中，该重组反转录病毒颗粒在其基因组中包括第一工程化信号传导多肽(其包括一个或多个淋巴增生性组件)且在一些实施例中包括第二工程化信号传导多肽(其为嵌合抗原受体或CAR)。复制缺陷型重组反转录病毒颗粒在其膜上表达：允许复制缺陷型重组反转录病毒颗粒与靶细胞结合并融合的假型组件(在一个非限制性实施例中，麻疹病毒凝血素(H)多肽及麻疹病毒融合(F)多肽、或其细胞质域缺失变体)(240)；能够结合并活化静息T细胞的活化组件(在非限制性实施例中，具有能够结合CD28的多肽及能够结合CD3的多肽的活化组件)(分别为210及220)；及膜结合细胞因子(在一个非限制性实施例中，IL-7 DAF融合多肽)(230)。标记为(250)、(260)、(270)、(280)及(290)的部分分别为Src-FLAG-Vpx、HIVgag基质、HIV gag衣壳、RNA及HIV pol。
图2显示包括由包装细胞(100)产生的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒(200)及由复制缺陷型重组反转录病毒颗粒(200)转染的静息T细胞(300)的说明性组合物的示意性图。复制缺陷型重组反转录病毒颗粒(200)的表面上的组件与静息T细胞的表面上的受体和/或配位体结合。在非限制性实施例中，假型组件可包括有助于复制缺陷型重组反转录病毒颗粒(200)与T细胞结合及融合的结合多肽及促融合多肽(在非限制性实施例中，麻疹病毒凝血素(H)多肽及麻疹病毒融合(F)多肽、或其细胞质域缺失变体)。在非限制性实施例中，复制缺陷型重组反转录病毒颗粒(200)在其表面上包括能够通过结合T细胞受体复合物及视情况存在的辅助受体(320)来活化静息T细胞的活化组件(在非限制性实施例中，具有能够结合CD28的多肽及能够结合CD3的多肽的活化组件)。此外，存在于复制缺陷型重组反转录病毒颗粒(200)的表面上的膜结合细胞因子(在非限制性实施例中，IL-7 DAF融合多肽)与静息T细胞的表面上的IL-7Rα(310)结合。与T细胞融合的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒(200)及编码包括淋巴增生性组件(在说明性实施例中，组成性活性IL-7Rα)(370)的第一工程化信号传导多肽的多核苷酸，在迁移至待并入至经活化T细胞的DNA中的细胞核之前在胞溶质中经反转录。不受理论限制，在一些非限制性实施例中，用病毒包装的Src-FLAG-Vpx(250)进入静息T细胞的胞溶质且促进SAMHD1(350)降解，从而导致可用于反转录的细胞质dNTP库增加。在一些实施例中，多核苷酸也可编码包括CAR(360)的第二工程化信号传导多肽。在一些实施例中，在化合物与调节其表达的控制组件(在非限制性实施例中，该控制组件为结合核苷类似物的核糖开关)结合时，表达淋巴增生性组件。在一些实施例中，CAR的表达也受控制组件调节。部分(330)为SLAM及CD46。部分(340)为CD3。
图3A至图3E显示用于转染包装细胞以产生本文描述的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的非限制性、例示性载体构建体的示意图。图3A显示含有编码融合至NFκB p65活化子域(p65 AD)的FRB域及融合至组成性表达的三个FKBP重复的ZFHD1 DNA结合域的多核苷酸序列的构建体。图3A中的构建体也包括HIV1 REV及作为在雷帕霉素诱导型ZFHD1/p65 AD启动子下的SrcFlagVpx融合的Vpx。图3B显示含有在ZFHD1/p65 AD启动子的控制下编码rtTA序列的多核苷酸的构建体。图3C显示含有编码侧接有loxP位点的嘌呤霉素抗性基因及侧接有lox2272位点的胞外MYC标记的多核苷酸的构建体。两个可选标记均在BiTRE启动子的控制下，该BiTRE启动子侧接有FRT位点。图3D显示含有编码侧接有在TRE启动子的控制下的loxP位点及在TRE启动子与RFP的5’loxP位点之间的单个FRT位点的RFP的多核苷酸的构建体。图3E显示含有编码侧接有在TRE启动子的控制下的loxP位点及在TRE启动子与GEP的5’loxP位点之间的单个FRT位点的GFP的多核苷酸的构建体。图3C至图3E中的构建体充当其他多核苷酸序列插入至包装细胞系的基因组中的着陆点。
图4A至图4C显示用于转染包装细胞以产生本文描述的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的非限制性、例示性载体构建体的示意图。图4A显示含有编码具有CD14 GPI锚连接位点的抗CD3(纯系UCHT1)scFvFc的三顺反子多核苷酸、能够使CD28与CD16B GPI锚连接位点结合的CD80胞外域(ECD)及融合至衰变加速因子(DAF)的IL-7(其中，转座子序列侧接多核苷酸区以用于整合至HEK293S基因组中)的构建体。图4B显示含有具有BiTRE启动子的多核苷酸及在一个方向上编码gag多肽及pol多肽的多核苷酸区以及在另一方向上编码麻疹病毒FΔx蛋白质及HΔy蛋白质的多核苷酸区的构建体。图4C显示含有编码CAR及在CD3Z启动子(其在HEK293S细胞中不具有活性)的控制下的淋巴增生性组件IL7Rα-insPPCL的多核苷酸序列的构建体，其中CAR及IL7Rα-insPPCL由编码T2A核糖体跳跃序列的多核苷酸序列隔开，且IL7Rα-insPPCL具有阿昔洛韦(acyclovir)核糖开关控制的核糖核酸酶。含CAR的构建体进一步包括cPPT/CTS、RRE序列及编码HIV-1 Psi(Ψ)的多核苷酸序列。待被整合至基因组中的含CAR的构建体上的整个多核苷酸序列侧接有FRT位点。
图5A至图5C显示作为选择性核糖开关对照的代表性核苷类似物的阿昔洛韦(图5A)、喷昔洛韦(图5B)及2’-脱氧鸟苷(图5C)的分子结构。
图6表示Mesoplasma florum I-A型脱氧鸟苷核糖开关调节区及相关基因产物。序列为M.florum L1基因组DNA(AE017263.1)nt624396至nt625670的反向互补序列(其与M.florum W37基因组DNA(CP006778.1)nt636277至nt637550相同)。结合用于初始筛选的适体序列的脱氧鸟苷以粗体及下划线指示。下游基因产物(Ib类(需氧)核糖核苷酸还原酶，β亚基)以大写字母指示。
图7表示用于定向进化策略的M.florum I-A型脱氧鸟苷核糖开关适体区。空椭圆内的核苷酸用于随机化。条纹椭圆内的核苷酸用于插入/缺失及随机化。
图8A及图8B表示M.florum I-A型脱氧鸟苷核糖开关适体筛选库。在图8A中，具有实线的盒内的核苷酸为用于随机化的序列区，且具有虚线的盒内的核苷酸为用于插入/缺失及随机化的序列区。图8B显示经由突变(随机核苷酸(“N”))及缺失/插入产生的可能序列。
图9表示合成为具有额外碱基对(添加其以允许PCR扩增)及T7启动子(添加其以用于在体外转录以用于文库筛选)的反向互补序列的M.florum I-A型脱氧鸟苷核糖开关适体寡聚文库。还显示对应T7启动子扩增引物及反向扩增引物。
图10表示枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)鸟苷xpt核糖开关调节区及相关基因产物。序列为枯草芽孢杆菌枯草亚种(B.subtilis subsp.subtilis)6051-HGW基因组DNA(CP003329.1)nt2319439至nt2320353的反向互补序列。结合用于初始筛选的适体序列的鸟苷以粗体及下划线指示。下游基因产物(黄嘌呤磷酸核糖转移酶xpt)以大写字母指示。
图11表示用于定向进化策略的枯草芽孢杆菌鸟苷xpt核糖开关适体区。空椭圆内的核苷酸用于随机化。条纹椭圆内的核苷酸用于插入/缺失及随机化。
图12A及图12B表示枯草芽孢杆菌鸟苷xpt核糖开关适体筛选文库。在图12A中，具有实线的盒内的核苷酸为用于随机化的序列区，且具有虚线的盒内的核苷酸为用于插入/缺失及随机化的序列区。图12B显示经由突变(随机核苷酸(“N”))及缺失/插入产生的可能序列。
图13表示合成为具有额外碱基对(添加其以允许PCR扩增)及T7启动子(添加其以用于在体外转录以用于文库筛选)的反向互补序列的枯草芽孢杆菌鸟苷xpt核糖开关适体寡聚文库。还显示对应T7启动子扩增引物及反向扩增引物。
图14显示选择文库构建。该文库为基于已知鸟苷-及脱氧鸟苷-结合RNA来构建(Pikovskaya,2013)。
图15显示氧化石墨烯(GrO)适体选择的示意图。在步骤(1)中，转录RNA且将其纯化。在步骤(2)中，洗提经纯化的RNA。在步骤(3)中，将适体与反向靶标(counter-target)及缓冲液一起培育。在步骤(4)中，用氧化石墨烯移除与反向靶标或缓冲液组分结合的序列。在步骤(5)中，离心分离上清液内的非特异性反应物种，接着将其丢弃。两次额外5分钟洗涤移除大部分的残余反向靶标结合序列及缓冲液结合序列。在步骤(6)中，将阿昔洛韦于1×选择缓冲液中的溶液添加至GrO结合文库以用于阳性选择，因此潜在适体序列将经由与阳性靶标相互作用而自GrO解吸附。在步骤(7)中，最终离心步骤将上清液中的靶标结合序列自仍吸附至GrO的非反应序列分离。在步骤(8)中，反转录所选择的序列，接着经由PCR扩增文库，接着对该文库进行转录以产生用于下一轮选择的文库。
图16显示氧化石墨烯平行评估的示意图。将经受平行评估的增浓文库分成四等份。接着，将文库样本添加至氧化石墨烯，且进行培育以将文库装载在氧化石墨烯上。使用两次5分钟洗涤以移除未结合材料。对于阳性(阿昔洛韦)及特殊靶标(喷昔洛韦)样本，各靶标分别在1×选择缓冲液中制备成1μM；反向靶标用10μM呈溶液形式的各反向靶标替换阳性靶标；阴性样本用等体积的不含核酸酶的水替换阳性靶标。接着，使样本与其各别氧化石墨烯制剂组合且进行培育。培育后，离心样本以回收其上清液，且文库回收利用NanoDrop-1000分光亮度计读数(Thermo Fisher Scientific；特拉华州威尔明顿)来测定。在变性PAGE上分析剩余文库样本。在用Gel-Star染色/去染色之后获取凝胶的影像。回收与所期望文库大小对应的带以用于后续轮的平行评估，其中阳性靶标阿昔洛韦替代阴性、反向及特殊靶标样本的预装载培育物的反向靶标。自第二平行评估回收的材料用于测序及分析。
图17显示针对阿昔洛韦的七种适体候选物。各适体的自由能在37℃及1M Na+下由Quikfold 3.0(Zuker 2003)计算。使用专有算法来鉴别序列。各序列中的下划线区为PCR引物退火区。
图18显示针对喷昔洛韦的七种适体候选物。各适体的自由能在37℃及1M Na+下由Quikfold 3.0(Zuker 2003)计算。使用专有算法来鉴别序列。各序列中的下划线区为PCR引物退火区。
图19A提供IL7Rα变体在PBMC中表达时测试淋巴增生性/存活活性的示意图。图19B提供显示在存在及不存在IL-2下的PBMC的存活百分比的条形图。
图20显示编码GFP、抗CD19嵌合抗原受体及eTAG(本文中称为F1-0-03)的慢病毒表达载体的示意图。
图21A及图21B分别显示在用所指示的慢病毒颗粒转导来自供体12M的新鲜分离且未刺激的PBMC14小时后的第3天、第6天、第9天、第13天、第17天的总CD3+群体中的CD3+GFP+细胞百分比(％)的直方图及CD3+GFP+群体的绝对细胞计数/槽的直方图。各棒表示重复的平均值+/-SD。
图22A及图22B分别显示在用所指示的慢病毒颗粒转导来自供体13F的新鲜分离且未刺激的PBMC 14小时后的第3天及第6天的总CD3+群体中的CD3+GFP+细胞(％)的直方图及CD3+GFP+群体的绝对细胞计数/槽的直方图。请注意，“A”显示使用VSV-G假型慢病毒颗粒(三次重复实验)的结果；“B”显示在向转导培养基添加OKT3 Ab(1μg/mL)的情况下使用VSV-G假型慢病毒颗粒(两次重复实验)的结果；“C”显示使用在其表面上表达GPI锚定UCHT1scFvFc的VSV-G假型慢病毒颗粒(三次重复实验)的结果；及“D”显示使用在其表面上表达GPI锚定UCHT1scFvFc及GPI锚定CD80或其功能性胞外片段的VSV-G假型慢病毒颗粒(两次重复实验)的结果。各棒表示两个重复或三个重复的平均值+/-SD，如图22A所示。
图23A及图23B分别显示在用所指示的慢病毒颗粒转导来自供体12M的新鲜分离且未刺激的PBMC持续所指示的暴露时间(2h至20h)后的第3天、第6天及第9天的总CD3+群体中的CD3+GFP+细胞百分比(％)的直方图及CD3+GFP+群体的绝对细胞计数/槽的直方图。转导是在如所指示的盘或振荡器摇瓶中进行。各棒表示两次重复用VSV-G假型化慢病毒颗粒(“VSV-G”)的平均值+/-SD；其他实验不具有重复。
图24A为慢病毒载体主链F1-0-02的示意图，其包括驱动GFP及eTag的表达的转基因表达盒以及合成EF-1α启动子与GFP的上游内含子A。图24B显示将miRNA插入至F1-0-02主链的EF1α内含子A中。“1”表示EF1α重叠；“2”表示5′臂；“3”表示miRNA1 5′茎；“4”表示环；“5”表示miRNA1 3′茎；“6”表示3′臂；“7”表示接头；“8”表示miRNA2 5′茎；“9”表示miRNA23′茎；“10”表示miRNA3 5′茎；“11”表示miRNA3 3′茎；“12”表示miRNA4 5′茎；及“13”表示miRNA4 3′茎。
图25为显示靶向处于EF-1α启动子内含子中的CD3ζ的miRNA能够阻断CD3复合物的表达的图。
图26为显示用含有复制缺陷型慢病毒颗粒的miR-TCRα转导的样本的ΔΔCt的直方图。ΔΔCt值表示相对于未经转导对照的各经转导样本中的经处理miR-TCRa miRNA的量。
图27A至图27C为显示在经pH调节药用试剂处理或不经其处理的情况下CHO-靶标1细胞的特异性溶解百分比的图。在图27A中，CHO-靶标1细胞最初是在pH 6.7下，且在由箭头所指示的时间处，分别用NaHCO3或不用NaHCO3来处理实验槽(实线)及对照细胞(虚线)。在图27B中，CHO-靶标1细胞最初是在pH 6.7下，且在由箭头所指示的时间处，分别用NaOH或不用NaOH来处理实验槽(实线)及对照细胞(虚线)。在图27C中，CHO-靶标1细胞最初是在pH 7.4下，且分别用HCl或不用HCl来处理实验槽(实线)及对照细胞(虚线)。
图28为显示在不存在(圆形)或存在(方形)阿昔洛韦的情况下F1A-795的热流通量相对于时间的图，如利用DSC所量测。
图29为显示在施用PBS或碳酸氢盐之前及之后的CHO异种移植肿瘤携带小鼠中的ProSense FAST探针中的RFU百分比的图。
图30为含有编码CAR及库1A、1.1A及1.1B的候选嵌合淋巴增生性组件(CLE)的多核苷酸序列的非限制性例示性转基因表达盒的示意图。
图31为含有编码库2B及2.1B的候选CLE的多核苷酸序列的非限制性例示性转基因表达盒的示意图。
图32为含有编码CAR及库3A、3B、3.1A及3.1B的候选CLE的多核苷酸序列的非限制性例示性转基因表达盒的示意图。
图33为含有编码库4B及4.1B的候选CLE的多核苷酸序列的非限制性例示性转基因表达盒的示意图。
图34分别显示在用所指示的慢病毒颗粒转导来自供体18的新鲜分离且未刺激的PBMC后第3天图34A活CD3+群体中的CD3+GFP+细胞百分比(％)的直方图及图34B每微升总的活群体的绝对细胞计数的直方图。各棒表示重复的平均值+/-SD。
图35为显示PBMC用编码个别CLE的慢病毒颗粒转导且在不存在外源性细胞因子的情况下培养35天的倍数扩增的图式。
图36为显示PBMC用编码抗CD19 CAR构建体及个别CLE的慢病毒颗粒转导且在供体匹配的PBMC的存在下但在不存在外源性细胞因子的情况下培养35天的倍数扩增的图式。
图37为显示所指示慢病毒颗粒在4小时中转导静息PBMC的效率的图式。如由FACS所测定，在不存在外源性细胞因子的情况下下，转导效率在6天后在培养物中经量测为CAR+PBMC％。各慢病毒颗粒编码CAR及CLE。用F1-1-228U及F1-3-219U转导的慢病毒颗粒在其表面上显示UCHT1scFvFc-GPI。
图38A及图38B为显示在静息PBMC用所指示慢病毒颗粒转导4小时且在不存在外源性细胞因子的情况下活体外培养6天后活细胞的总量的时间过程的图式。各慢病毒颗粒编码CAR及CLE。用F1-1-228U及F1-3-219U转导的慢病毒颗粒在其表面上显示UCHT1scFvFc-GPI。
图39A、图39B及图39C为显示来自给药有用所指示慢病毒颗粒转导4小时的人类PBMC且经静脉内注射而无需离体扩增PBMC的携带肿瘤的NSG小鼠的血液的每微克基因组DNA的慢病毒基因组的拷贝的时间过程的图式。各慢病毒颗粒编码CAR。F1-1-228、F1-1-228U、F1-3-219及F1-3-219U也编码CLE。用F1-1-228U及F1-3-219U转导的慢病毒颗粒在其表面上显示UCHT1scFvFc-GPI。
图40为显示给药有用所指示慢病毒颗粒转导4小时的人类PBMC且经静脉内注射而无需离体扩增PBMC的携带肿瘤的NSG小鼠的每200μl血液的CAR+细胞的数目的图式。在将小鼠安乐死的时候取样血液。各慢病毒颗粒编码CAR。F1-1-228、F1-1-228U、F1-3-219及F1-3-219U也编码CLE。用F1-1-228U及F1-3-219U转导的慢病毒颗粒在其表面上显示UCHT1scFvFc-GPI。
图41A为显示静脉内给药有用编码抗ROR2 MRB CAR及CLE的所指示慢病毒颗粒转导4小时的PBS或人类PBMC而无需离体扩增PBMC的NSG小鼠中的CHO-ROR2肿瘤的平均体积的图式。图41B为显示静脉内给药有用编码抗CD19 CAR及CLE的所指示慢病毒颗粒转导4小时的PBS或人类PBMC而无需离体扩增PBMC的NSG小鼠中的Raji肿瘤的平均体积的图式。用F1-1-228U及F1-3-219U转导的慢病毒颗粒在其表面上显示UCHT1scFvFc-GPI。
具体实施方式
定义
如本文中所使用，术语“嵌合抗原受体”或“CAR”或“CARs”指工程化受体，其将抗原特异性移植至细胞上，例如T细胞、NK细胞、巨噬细胞及干细胞。本发明的CAR包括至少一个抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域(TM)及胞内活化域(IAD)，且可包括柄(stalk)及一个或多个共刺激域(CSD)。在另一实施例中，CAR为对两种不同抗原或抗原决定基具有特异性的双特异性CAR。在ASTR与靶标抗原特异性结合之后，IAD活化胞内信号传导。举例而言，IAD可以以非MHC限制的方式将T细胞特异性及反应性重新定位于所选择的靶标，从而利用抗体的抗原结合特性。非MHC限制的抗原识别赋予表达CAR的T细胞不依赖于抗原处理而识别抗原的能力，因此绕过肿瘤逃逸的主要机制。此外，当在T细胞中表达时，CAR有利地不与内源性T细胞受体(TCR)α链及β链二聚化。
如本文中所使用，术语“微环境”意指与其他组织区域或身体区域具有恒定的或暂时的、物理的或化学的差异的组织或身体的任何部分或区域。举例而言，如本文中所使用的“肿瘤微环境”指肿瘤存在于其中的环境，该环境为肿瘤内的非细胞区域，且正好位于肿瘤组织外部的区域并不属于癌细胞自身的胞内隔室。肿瘤微环境可指代肿瘤环境的任何及所有条件，这些条件包括为恶化过程创建结构性和/或功能性环境以存活和/或扩增和/或扩散的条件。举例而言，肿瘤微环境可包括条件的更改，这些条件诸如(但不限于)：压力、温度、pH、离子强度、渗透压、重量渗透摩尔浓度、氧化应激、一种或多种溶质的浓度、电解质的浓度、葡萄糖的浓度、透明质酸的浓度、乳酸或乳酸盐的浓度、白蛋白的浓度、腺苷的水平、R-2-羟基戊二酸的水平、丙酮酸的浓度、氧气的浓度和/或氧化剂、还原剂或辅助因子的存在，以及熟练的技术人员将理解的其他条件。
如本文中交换地使用，术语“多核苷酸”及术语“核酸”指任何长度的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)的聚合形式。因此，此术语包括(但不限于)：单链、双链或多链的DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂交体，或包含嘌呤碱基及嘧啶碱基或其他天然、经化学方式或生物化学方式修饰的非天然或衍生的核苷酸碱基的聚合物。
如本文中所使用，术语“抗体”包括多克隆抗体及单克隆抗体，这些多克隆抗体及单克隆抗体包括完整的抗体及保留特异性结合抗原的抗体片段。抗体片段可为(但不限于)：片段抗原结合(Fab)片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、Fv片段、Fab’-SH片段、(Fab’)2Fv片段、Fd片段、重组IgG(rIgG)片段、单链抗体片段，包括单链可变片段(scFv)、二价scFv、三价scFv及单域抗体片段(例如，sdAb、sdFv、纳米抗体)。该术语包括免疫球蛋白的基因方式工程化和/或其他修饰形式，诸如：胞内抗体、肽抗体、嵌合抗体、单链抗体、全人类抗体、人类化抗体、包括抗体及非抗体蛋白质的抗原特异性靶向区的融合蛋白质、杂结合抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体、双功能抗体、三功能抗体及四功能抗体)、串联双-scFv及串联三-scFv。除非另外陈述，否则术语“抗体”应理解为包括其功能性抗体片段。该术语还包括完整或全长抗体，其包括任何类别或子类别的抗体，包括IgG及其子类别、IgM、IgE、IgA及IgD。
如本文中所使用，术语“抗体片段”包括完整抗体的一部分，例如，完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab’、F(ab’)2及Fv片段；双功能抗体；线性抗体(Zapata等人,Protein Eng.8(10):1057-1062(1995))；单链抗体分子；及由抗体片段形成的多特异性抗体。抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段(称为“Fab”片段，每一者具有单个抗原结合位点)及一残余“Fe”片段(一种反映容易结晶的能力的指示)。胃蛋白酶处理产生具有两个抗原结合位点且仍能够交联抗原的F(ab’)2片段。
如本文中可交换使用那样，术语“单链Fv”、“scFv”或“sFv”抗体片段包括抗体的VH域及VL域，其中这些域存在于单个多肽链中。在一些实施例中，Fv多肽进一步包括在VH域与VL域之间的可使sFv能够形成针对抗原结合的所需结构的多肽接头或间隔区。对于sFv的综述，参见Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg及Moore编,Springer-Verlag,纽约,第269至315页(1994)。
如本文中所使用，“天然存在”的VH域及VL域指已从宿主分离而不进一步分子进化以改变其在特殊条件下以scFv形式产生时的亲和性的VH域及VL域，诸如美国专利8709755B2及申请WO/2016/033331A1中所公开的那些。
如本文中所使用，术语“亲和性(affinity)”指两种试剂可逆结合的平衡常数，且被表达为解离常数(Kd)。亲和性可比抗体针对不相关氨基酸序列的亲和性高至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍、至少100倍或至少1000倍，或更高。抗体对于靶蛋白的亲和性可为(例如)约100纳摩尔(nM)至约0.1nM、约100nM至约1皮摩尔(pM)，或约100nM至约1飞摩尔(fM)或更高。如本文中所使用，术语“亲合力(avidity)”指两种或更多种试剂的复合物在稀释后对于解离的抗性。关于抗体和/或抗原结合片段，术语“免疫反应性”及“优先结合”在本文中互换地使用。
如本文中所使用，术语“结合(binding)”指归因于(例如)共价相互作用、静电相互作用、疏水相互作用及离子相互作用和/或氢键相互作用(包括诸如盐桥键及水桥键的相互作用)而在两个分子之间的直接缔合。非特异性结合应当是指亲和性低于约10-7M的结合，例如，亲和性低于10-6M、10-5M、10-4M等的结合。
如本文中所使用，提及“细胞表面表达系统(cell surface expression system)”或“细胞表面显示系统(cell surface display system)”是指蛋白质或其部分在细胞表面上的显示或表达。通常，生成表达与细胞表面蛋白质融合的感兴趣的蛋白质的细胞。举例而言，蛋白质表达为具有跨膜域的融合蛋白质。
如本文中所使用，术语“组件”包括多肽(包括多肽的融合体、多肽的区(region)及其功能性突变体或片段)及多核苷酸(包括微小RNA及shRNA，以及其功能性突变体或片段)。
如本文中所使用，术语“区(region)”为多肽或多核苷酸的任何区段。
如本文中所使用，“域(domain)”为具有功能性和/或结构性特性的多肽或多核苷酸的区。
如本文中所使用，术语“柄”或“柄域”指提供结构性柔性且与侧翼多肽区间隔的柔性(flexible)多肽连接区，且可由天然或合成的多肽组成。柄可衍生自免疫球蛋白(例如，IgGl)的铰链或铰链区，其一般被定义为自人类IgGl的Glu216拉伸至Pro230(Burton(1985)Molec.Immunol.,22:161-206)。可通过使第一个半胱氨酸与最后一个半胱氨酸在相同位置形成重链间二硫键(S-S)来将其他IgG同型的铰链区与IgG1序列进行比对。柄可为天然存在或非天然存在的，其包括(但不限于)经改变的铰链区，如美国专利第5,677,425号所公开。柄可包括衍生自任何类别或子类别的抗体的完整铰链区。柄也可包括衍生自CD8、CD28或在提供柔性且与侧翼区间隔上提供类似功能的其他受体的区。
如本文中所使用，术语“(经)分离”意味着材料从其原始环境(例如，当其为天然存在时，则为从天然环境)移除。举例而言，存在于活体动物中的天然存在的多核苷酸或多肽为未经分离的，但从天然系统中的共存材料的一些或全部分离的相同多核苷酸或多肽则为经分离的。此类多核苷酸可为载体的一部分，和/或此类多核苷酸或多肽可为组合物的一部分，且仍是经分离的，这是因为载体或组合物并非其天然环境的部分。
如本文中所使用，“多肽”为由肽键连接的单链氨基酸残基。多肽既不折叠成固定结构，也不具有任何翻译后修饰。“蛋白质”为折叠成固定结构的多肽。“多肽”及“蛋白质”在本文中互换地使用。
如本文中所使用，多肽可经“纯化”以移除多肽的天然环境的杂质组分，例如，将干扰多肽的诊断或治疗用途的材料，诸如，酶、激素及其他蛋白质或非蛋白质溶质。多肽可(1)纯化至按抗体重量计高于90％、高于95％或高于98％，如利用洛瑞法(Lowry method)测定，例如，高于99重量％，(2)借助于旋转杯序列分析仪纯化至足以获得N端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，或(3)利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)在还原条件或非还原条件下使用库马斯蓝或银染料纯化至均一性。
如本文中所使用，术语“免疫细胞”一般包括衍生自骨髓中产生的造血干细胞(HSC)的白血细胞(白血球)。“免疫细胞”包括(例如)淋巴细胞(T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞)及衍生自骨髓的细胞(嗜中性细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核球、巨噬细胞、树突状细胞)。
如本文中所使用，“T细胞”包括表达CD3的所有类型的免疫细胞，其包括辅助T细胞(CD4+细胞)、细胞毒性T细胞(CD8+细胞)、调节性T细胞(Treg)及γ-δT细胞。
如本文中所使用，“细胞毒性细胞”包括CD8+ T细胞、自然杀伤(NK)细胞、NK-T细胞、γδT细胞(一种CD4+细胞的子群)及嗜中性细胞(其为能够介导细胞毒性反应的细胞)。
如本文中所使用，术语“干细胞”一般包括分化多能或多潜能干细胞(pluripotent或multipotent stem cell)。“干细胞”包括(例如)胚胎干细胞(ES)、间充质干细胞(MSC)、诱导型分化多能性干细胞(iPS)及定型祖细胞(造血干细胞(HSC)、骨髓衍生细胞等)。
如本文中所使用，术语“治疗(treatment/treating)及类似者”指获得所需药理学和/或生理学效果。该效果就完全或部分地预防疾病或其症状而言可为预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或由疾病引起的不良影响而言可为治疗性的。如本文中所使用的“治疗”涵盖哺乳动物中的(例如，人类中的)疾病的任何治疗，且包括：(a)预防在易患疾病但尚未被诊断为患有其的个体中发生疾病；(b)抑制疾病，即遏止其发展；及(c)减轻疾病，即引起疾病消退。
如本文中互换地使用，术语“个体(individual)”、“受试者(subject)”、“宿主”及“患者”指哺乳动物，其包括(但不限于)人类、鼠类(例如，大鼠、小鼠)、兔类(例如，兔)、非人类灵长类、人类、犬、猫、有蹄类动物(例如，马、牛、绵羊、猪、山羊)等。
如本文中所使用，术语“治疗有效量”或“有效量”指在向哺乳动物或其他个体施用用于治疗疾病时足以影响疾病的此类治疗的试剂的量或两种试剂的组合量。“治疗有效量”将根据试剂、疾病及其严重程度以及待治疗的个体的年龄、体重等而变化。
如本文中所使用，术语“进化(evolution/evolving)”是指使用一种或多种突变方法以产生编码不同多肽的不同多核苷酸，该多肽自身为经改进的生物分子和/或有助于产生另一经改进的生物分子。“生理学”或“正常”或“正常生理学”条件为诸如(但不限于)以下的条件：压力、温度、pH、离子强度、渗透压、重量渗透摩尔浓度、氧化应激、一种或多种溶质的浓度、电解质的浓度、葡萄糖的浓度、透明质酸的浓度、乳酸或乳酸盐的浓度、白蛋白的浓度、腺苷的水平、R-2-羟基戊二酸的水平、丙酮酸的浓度、氧气的浓度和/或氧化剂、还原剂或辅助因子的存在，以及将被视为在施用部位处或在作用部位处的组织或器官处对于个体是在正常范围内的其他条件。
如本文中所使用，“以基因方式修饰的细胞”包括含有外源性核酸的细胞，无论是否将这些外源性核酸整合至细胞的基因组中。
如本文中所使用的“多肽”可包括蛋白质分子的部分或完整蛋白质分子以及任何翻译后或其他修饰。
如本文中所使用的假型组件可包括：“结合多肽”，其包括识别且结合靶标宿主细胞的一种或多种多肽(通常为糖蛋白)；及一种或多种“促融合多肽”，其介导反转录病毒与靶标宿主细胞膜融合，从而使反转录病毒基因组进入靶标宿主细胞。如本文中所使用的“结合多肽”也可被称为“T细胞和/或NK细胞结合多肽”或“靶标接合组件”，且“促融合多肽”也可被称为“促融合组件”。
“静息”淋巴细胞(诸如，静息T细胞)为细胞周期在并不表达活化标记(诸如Ki-67)的G0阶段中的淋巴细胞。静息淋巴细胞可包括从未接触特异性抗原的原生T细胞及已由与抗原的先前接触而更改的记忆T细胞。“静息”淋巴细胞也可被称为“静态”淋巴细胞。
如本文中所使用，“淋巴消耗(lymphodepletion)”涉及(例如通过施用淋巴消耗试剂)减少个体中的淋巴细胞的数目的方法。部分身体或全身分级辐射疗法还可导致淋巴消耗。淋巴消耗试剂可为能够在将其向哺乳动物施用时减少该哺乳动物中的功能性淋巴细胞的数目的化学化合物或组合物。此类试剂的一个实例为一种或多种化学治疗剂。此类试剂及剂量为已知的，且可视待治疗的个体而定由治疗医师来选择。淋巴消耗试剂的实例可包括(但不限于)氟达拉滨(fludarabine)、环磷酰胺、克拉屈滨(cladribine)、地尼白细胞介素(denileukin diftitox)或其组合。
RNA干扰(RNAi)为一种生物学过程，在其中RNA分子通过中和经靶标RNA分子来抑制基因表达或翻译。RNA靶标可为mRNA，或其可为对RNAi的功能性抑制敏感的任何其他RNA。如本文中所使用，“抑制性RNA分子”指其存在在细胞内产生RNAi且致使抑制性RNA分子靶向的转录物的表达降低的RNA分子。如本文中所使用的抑制性RNA分子具有能够形成RNA双螺旋的5’茎及3’茎。抑制性RNA分子可为(例如)miRNA(内源性或人工的)或shRNA、miRNA的前体(亦即Pri-miRNA或pre-miRNA)或shRNA、或作为经分离核酸直接转录或引入至细胞或个体的dsRNA。
如本文中所使用，“双链RNA”或“dsRNA”或“RNA双螺旋”是指由两条链组成的RNA分子。双链分子包括由杂交以形成双螺旋RNA结构的两条RNA链组成的那些，或其自身折叠以形成双螺旋结构的单链RNA。大多数但未必的是，双螺旋区中的所有碱基为碱基配对的。双螺旋区包含与靶标RNA互补的序列。与靶标RNA互补的序列为反义序列，且通常为18至29、19至29、19至21或25至28个核苷酸长，或在一些实施例中在低值端点(low end)上为18、19、20、21、22、23、24、25个与高值端点(high end)上为21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个之间，其中给定范围通常具有低于高值端点的低值端点。此类结构通常包括5’茎、环及由与各茎相邻的环(其并非双螺旋的部分)连接的3’茎。在某些实施例中，该环包含至少3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。在其他实施例中，该环包含2至40、3至40、3至21或19至21个核苷酸；或在一些实施例中，在低值端点为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个与高值端点为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35或40个之间，其中给定范围通常具有低于高值端点的低值端点。
如本文中所使用的术语“微小RNA侧翼序列”指包括微小RNA处理组件的核苷酸序列。微小RNA处理组件为有助于由前体微小RNA产生成熟微小RNA的最小核酸序列。这些组件通常位于侧接微小RNA茎环结构的40个核苷酸序列之内。在一些情况下，在侧接微小RNA茎环结构的长度在5与4,000个核苷酸之间的核苷酸序列的延伸内发现微小RNA处理组件。
术语“接头”在用于提及多重抑制性RNA分子时指加入两个抑制性RNA分子的连接构件。
如本文中所使用，除非将其明确地指出为可复制反转录病毒，否则“重组反转录病毒”指不可复制的或“复制缺陷型”反转录病毒。术语“重组反转录病毒”及“重组反转录病毒颗粒”在本文中互换地使用。此类反转录病毒/反转录病毒颗粒可为任何类型的反转录病毒颗粒，其包括(例如)γ反转录病毒及(在说明性实施例中)慢病毒。众所周知，此类反转录病毒颗粒(例如慢病毒颗粒)通常在包装细胞中通过用质粒(其包括诸如Gag、Pol及Rev的包装组分)及包膜或假型质粒(其编码假型组件)及转移的、基因组的或反转录病毒(例如慢病毒)表达载体(该表达载体通常为在其上编码基因或其他相关编码序列的质粒)转染这些包装细胞来形成。因此，反转录病毒(例如慢病毒)表达载体包括在转染至细胞中后促进表达及包装的序列(例如，侧接例如psi包装组件及靶标异源编码序列的5’LTR及3’LTR)。术语“慢病毒”及“慢病毒颗粒”在本文中互换地使用。
miRNA的“框架”由围绕miRNA的“5’微小RNA侧翼序列”和/或“3’微小RNA侧翼序列”及(在一些情况下)将miRNA中的茎环结构的茎隔开的环序列构成。在一些实施例中，“框架”衍自天然存在的miRNA，诸如，miR-155。术语“5’微小RNA侧翼序列”及“5’臂”在本文中互换地使用。术语“3’微小RNA侧翼序列”及“3’臂”在本文中互换地使用。
如本文中所使用，术语“miRNA前体”指可以酶促方式加工成miRNA的任何长度的RNA分子，诸如初级RNA转录物、pri-miRNA或pre-miRNA。
应理解，本发明及本文提供的方面及实施例并不限于所公开的特定实例，因此当然可能有变化。还应理解，本文中所使用的技术仅出于公开特定实例及实施例的目的，且并不旨在为限制性的，其为由于本发明的范畴将仅有随附申请专利范围所限定。
当提供值的范围时，应理解，在该范围的上限与下限之间的各中间值(除非上下文另外明确指示，否则为下限单位的十分之一)与该陈述范围中的任何其他值或中间值均涵盖在本发明内。这些较小范围的上限及下限可独立地包括在较小范围中，且也涵盖在本发明内，该陈述范围中的任何特异性排除的极限除外。当所陈述范围包括极限的一个或两个时，排除那些所包括的极限的一个或两个的范围也包括在本发明中。当针对范围给定重叠的多个低值及多个高值时，熟练的技术人员应认识到，所选择范围将包括低于高值的低值。本说明书中的所有标题均为易于阅读起见，且并非是限制性的。
除非另外定义，否则本文所使用的所有技术及科学术语均具有与本发明所属领域的一般技术人员所通常理解相同的含义。尽管类似于或等效于本文描述的那些的任何方法也可用于本发明的实践或测试，但现在描述较佳的方法及材料。本文所提及的所有公开案均以引用的方式并入本文中以公开及描述与所引用的公开案相关的方法和/或材料。
必须注意的是，除非上下文另外明确指示，否则如本文所使用及在随附申请专利范围中，单数形式包括复数个指示物。因此，例如，提及“嵌合抗原受体”包括复数个此类嵌合抗原受体及熟练此项技术人员已知的其等效物等。应进一步注意，申请专利范围可能被设计成排除任何视情况可选用的要素。因此，此陈述意欲充当使用与申请专利范围要素的引用相关的诸如“单独”、“仅”及类似者的排他性术语或使用“阴性”限制的前提基础。
应理解，为清楚起见在独立实施例的上下文中描述的本发明的某些特征也可以组合方式在单个实施例中提供。相反地，为简洁起见在单个实施例的上下文中描述的本发明的各种特征也可单独提供或以任何适合的子组合方式提供。属于本发明的实施例的所有组合均特异性地包涵在本发明中，且正如各组合及每一组合单独及清楚地公开一样公开于本文中。另外，各种实施例及其要素的所有子组合也均特异性地包涵在本发明中，且正如各子组合及每一此类子组合单独及清楚地公开一样公开于本文中。
实施方式
本发明通过提供用于以基因方式修饰淋巴细胞(例如NK细胞，且在说明性实施例中为T细胞)的经改进方法及组合物来克服现有技术挑战。举例而言，这些方法中的一些不包括预活化淋巴细胞，且这些方法中的一些在比先前方法更少的时间内进行。此外，提供具有许多用途(包括其在这些经改进方法中的用途)的组合物。这些组合物中的一些为以基因方式修饰的淋巴细胞，其具有经改进的增生及存活质量，包括在活体外培养时，例如在缺失生长因子的情况下。这些以基因方式修饰的淋巴细胞将具有例如以下的用途：作为研究工具，以更好的理解影响T细胞增生及存活的因素；及商业生产，例如可经采集及测试或用于商业产品的某些因子(诸如生长因子及免疫调节剂)的生产。
本文提供的一些实施例为用于执行过继性细胞疗法的方法，其包括离体需要少许时间(例如，24小时、12小时或8小时或更少)转导T细胞和/或NK细胞，且在一些实施例中不需要进行预先离体刺激。这些方法很好地适合于离体处理来自个体的血液的封闭系统，且可对于存在于与一些实施例相同的房间中的个体和/或在一些实施例中的个体在其血液或其经分离血细胞的其视线之内在进行该方法期间的所有时间内进行。更具体言的，本文中公开内容的方面及实施例通过提供用于转导静息T细胞和/或静息NK细胞的方法克服了与目前过继性细胞疗法相关的问题，这些方法通常利用有助于复制缺陷型重组反转录病毒颗粒与静息T细胞和/或静息NK细胞结合及融合的假型组件，以利用复制缺陷型重组反转录病毒颗粒有助于静息T细胞和/或静息NK细胞的基因修饰。此外，本文提供的方法通过在说明性实施例中利用嵌合抗原受体及一个或多个淋巴增生性组件克服了本领域的问题，这些淋巴增生性组件的表达是在控制组件的控制下，使得个体暴露于结合控制组件的化合物，或终止此类暴露促进体内经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞的扩增。
由于本文中详细公开的这些及其他改进，在一个方面中，本文中提供一种用于以基因方式修饰个体(诸如患有疾病或病症的患者)的静息T细胞和/或静息NK细胞的方法，其中收集来自个体的血液；静息T细胞和/或NK细胞通过使其与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触来以基因方式修饰；且通常在比现有技术方法中更短时间段(例如在24小时内及在一些非限制性实施例中为在12小时内)内且/或不进一步离体扩增经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞的群而将经基因方式修饰的细胞再引入至个体中，例如使得经基因方式修饰的静息T细胞和/或NK细胞并不经历多于4次离体细胞分裂。因此，本文提供的方法可在比目前CAR疗法短很多的时间内进行，从而提供个体可在离体步骤的整个时间内留在诊所中的方法。此有助于在封闭系统中进行离体步骤，此降低了污染及混合患者样本的机会且可更容易地由临床实验室进行。
因此，图1及图2提供用于本文提供的方法中的说明性组合物的示意性框图。图1提供包装细胞(100)及由此类包装细胞产生的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒(200)的框图。包装细胞(100)包括并入至其基因组(其包括表达反转录病毒蛋白质的重组转录组件)中的重组多核苷酸(110)及在可诱导启动子(其由结合配位体且有配位体活化的反式激活因子调节)的控制下的各种不同膜结合多肽。这些反式激活因子、可诱导启动子及配位体用于诱导依序表达及细胞膜结合多肽的积聚，这些细胞膜结合多肽将被并入至复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的膜以及为包装及组装复制缺陷型重组反转录病毒颗粒所必需的反转录病毒组分中。
由于如下文中详细论述的各种多核苷酸的依序诱导表达，产生图1中说明的说明性包装细胞(100)，且可将该包装细胞用于说明性方法以产生用于转染本文提供的静息T细胞和/或NK细胞(图2中的(300))的方法中的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒。在非限制性实施例中，包装细胞(100)在其基因组中包括编码可包装反转录病毒RNA基因组的核酸，该可包装反转录病毒RNA基因组包括为包装及组装复制缺陷型重组反转录病毒颗粒(作为非限制性说明性实施例，反转录病毒psi组件、反转录病毒gag多肽及反转录病毒pol多肽)所必需的反转录病毒基因组的组件中的至少一些。
与包装细胞的细胞膜结合或缔合的一些膜结合多肽将并入或缔合至复制缺陷型重组反转录病毒颗粒中，但并不由反转录病毒基因组编码。举例而言，包装细胞及尤其形成的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒可包括：反转录病毒Vpx多肽(250)，在非限制性实施例中其可表达为膜缔合的融合蛋白质，例如Src-Flag-Vpx多肽；可包括结合多肽及促融合多肽的假型组件(240)，在非限制性实施例中，其包括麻疹病毒凝血素(H)多肽及麻疹病毒融合(F)多肽、或其细胞质域缺失变体；视情况可选用的一个或多个活化组件(210,220)，在非限制性实施例中，其包括能够与CD3结合的膜结合多肽及能够与CD28结合的膜结合多肽；和/或视情况选用的膜结合细胞因子(230)，其的非限制性实施例为包括融合于DAF或其片段的IL-7的融合多肽。本文中提供这些膜结合多肽的各种其他特异性类型。
作为通过包装细胞依序表达转录组件的结果，产生复制缺陷型重组反转录病毒颗粒。变为复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的基因组的包装细胞的基因组内且通常被整合至其中的RNA反转录病毒基因组包括为反转录病毒产生、感染及整合至宿主细胞(其通常为静息T细胞和/或NK细胞)的基因组中所必需的反转录病毒组分(作为非限制性说明性实施例，反转录病毒Gag及Pol多核苷酸)。此外，反转录病毒基因组进一步包括编码本文提供的一个或通常两个工程化信号传导多肽的多核苷酸。工程化信号传导多肽中的一者通常编码至少一个淋巴增生性组件(在非限制性实施例中，组成性白细胞介素7受体突变)且其他工程化信号传导多肽通常编码嵌合抗原受体。
接着，复制缺陷型重组反转录病毒颗粒(200)用于以本文提供的方法来转导静息T细胞和/或静息NK细胞(300)。如图2所显示，在使静息T细胞和/或NK细胞(300)与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒(200)接触之后，复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的表面上的上文所论述的膜多肽与静息T细胞和/或NK细胞(300)的表面上的受体和/或配位体结合。举例而言，如上文所指示可包括与静息T细胞和/或静息NK细胞的表面上的分子结合的结合多肽及促融合多肽的假型组件有助于复制缺陷型重组反转录病毒颗粒(200)与T细胞和/或NK细胞膜的结合及融合。活化组件(210,220)通过接合T细胞受体复合物(一种在接触的时程中发生的过程或其后的培育物)来使静息T细胞和/或NK细胞(300)活化。此外，膜结合细胞因子(230)可存在于复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的表面上，且结合静息T细胞和/或NK细胞(300)的表面上的细胞因子受体(310)，从而进一步促进结合及活化。因此，不受理论限制，在本文提供的说明性实施例中，由于这些复制缺陷型重组反转录病毒颗粒(200)组分中的一者或多者，不需要利用尚未在复制缺陷型重组反转录病毒颗粒(200)中或上的组件的离体刺激或活化。此转而帮助缩减完成本文提供的这些说明性方法中的方法所需的离体时间。
在与T细胞和/或NK细胞(200)结合后，复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接着与T细胞和/或NK细胞(300)融合，且复制缺陷型重组反转录病毒颗粒中的多肽及核酸进入T细胞和/或NK细胞(300)。如上文所指示，复制缺陷型重组反转录病毒颗粒中的这些多肽中的一者为Vpx多肽(250)。Vpx多肽(250)与降解细胞质中的游离dNTP的SAMHD1限制因子(350)结合且诱导其降解。因此，细胞质中的游离dNTP的浓度随着Vpx降解SAMHD1而增加，且增加反转录活性，从而有助于反转录病毒基因组的反转录及整合至T细胞和/或NK细胞基因组中。
在将反转录病毒基因组整合至T细胞和/或NK细胞(200)中之后，T细胞和/或NK细胞基因组包括编码信号传导多肽(其编码淋巴增生性组件(370))的核酸及视情况选用的编码CAR(360)的信号传导多肽。淋巴增生性组件及视情况选用的CAR的表达是在控制组件的控制下。暴露于结合控制组件的化合物中(此可通过将该化合物施用转导其T细胞和/或NK细胞(300)的个体中来在体外或体内发生)通过表达淋巴增生性组件及视情况由于CAR的表达以及CAR与其靶细胞的结合来促进体外或体内中的T细胞和/或NK细胞(300)的增生。因此，本文中用复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转导的T细胞和/或NK细胞具有驱动增生和/或抑制细胞死亡(在说明性实施例中，此转而避免在将经转导T细胞和/或NK细胞返回个体中之前需要先前方法以使宿主淋巴消耗)的一个或多个信号。在说明性实施例中，此转而进一步降低在将经转导T细胞和/或NK细胞再引入至个体中之前处理所需天数。因此，在说明性实施例中，自个体采集血液至将血液再引入至个体所需时间不多于36小时、24小时、12小时，或在一些情况下甚至不多于8小时，此从根本上改变来自先前技术方法的CAR-T方法。此外，控制组件还提供本文提供的安全性机制中的一者。举例而言，停止施用化合物可下调或甚至终止淋巴增生性组件及视情况选用的CAR的表达，从而结束对于经转导T细胞和/或NK细胞及其子代的增生和/或存活信号。
用于转导和/或以基因方式修饰淋巴细胞的方法
在某些方面中，本文提供一种转导和/或以基因方式修饰淋巴细胞，通常是T细胞和/或NK细胞，且通常是静息T细胞和/或静息NK细胞的方法，其包括使淋巴细胞与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触，其中复制缺陷型重组反转录病毒颗粒通常包含在其表面上的假型组件，其中该接触(及在接触条件下的培育)有助于通过复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转导静息T细胞和/或NK细胞，由此产生经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞。这些假型组件通常能够结合静息T细胞和/或NK细胞且通常有助于其自身的膜融合或与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的其他蛋白质结合。
在一些实施例中，复制缺陷型重组反转录病毒颗粒可进一步包括活化组件，其可为本文提供的任何活化组件。在说明性实施例中，活化组件可为抗CD3，诸如抗CD3 scFv或抗CD3 scFvFc。在一些实施例中，该接触可进行1小时至24小时，例如1小时至12小时或1小时至6小时。在一些实施例中，该接触可进行少于24小时，例如少于12小时、少于8小时或少于4小时。包装细胞(且在说明性实施例中，包装细胞系，且在特定说明性实施例中，本文中的某些方面中提供的包装细胞)用于产生复制缺陷型重组反转录病毒颗粒。在这些方法的例示性实施例中，以基因方式修饰的T细胞或NK细胞能够在不存在由CAR识别的靶抗原的情况下及不存在细胞因子(诸如IL-2、IL-15或IL-7)的情况下离体培养至少7天、14天、21天、28天、35天、42天或60天中存活。在这些方法的例示性实施例中，经基因方式修饰的T细胞或NK细胞能够在小鼠中活体内移植和/或在小鼠中活体内富集至少7天、14天或28天。熟练的技术人员将认识到，这些小鼠可经处理或以其他方式经基因方式修饰，使得经基因方式修饰的T细胞或NK细胞之间的任何免疫学差异不会产生在小鼠中引发的针对由复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转导的淋巴细胞的任何组分的免疫反应。在一些实施例中，包装细胞系可为悬浮细胞系。在说明性实施例中，包装细胞系可在无血清培养基中生长。在一些实施例中，淋巴细胞可来自个体。在说明性实施例中，淋巴细胞可来自个体的血液。
用于转导和/或以基因方式修饰淋巴细胞(例如NK细胞，或在说明性实施例中，T细胞)的以上方面中的任一者的另外的实施例可包括复制缺陷型重组反转录病毒颗粒、淋巴增生性组件、CAR、假型组件、核糖开关、活化组件、膜结合细胞因子、miRNA和/或本文公开的其他组件的实施例中的任一者，且可与本文中的方法组合以用于使用包装细胞产生反转录病毒颗粒。在某些说明性实施例中，反转录病毒颗粒为慢病毒颗粒。用于转导T细胞和/或NK细胞的此方法可在活体外或离体进行。熟练的技术人员将认识到，用于转导和/或以基因方式修饰T细胞和/或NK细胞的本文提供的细节可适用于包括此步骤的任何方面，包括针对用于转导和/或以基因方式修饰淋巴细胞(诸如T细胞和/或NK细胞)的方法的方面。
因此，在一个方面中，本文中提供一种用于转导(和/或以基因方式修饰)淋巴细胞(一般来自经分离血液的静息T细胞和/或静息NK细胞)的方法，该方法包含：
A.自个体收集血液；
B.分离包含静息T细胞和/或静息NK细胞的周边血单核细胞(PBMC)；及
C.使受试者的静息T细胞和/或静息NK细胞与非复制型重组反转录病毒颗粒离体接触，其中非复制型重组反转录病毒颗粒包含在其表面上的能够结合静息T细胞和/或静息NK细胞且有助于非复制型重组反转录病毒颗粒与其的膜融合的假型组件，其中该接触有助于利用非复制型重组反转录病毒颗粒转导至少5％的静息T细胞和/或静息NK细胞，从而产生经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞，从而转导静息T细胞和/或NK细胞。
在包括转导T细胞和/或NK细胞的步骤的本文中的任何方法的一些实施例中，可使细胞在无需预先活化的情况下与反转录病毒颗粒接触。在包括转导T细胞和/或NK细胞的步骤的本文中的任何方法的一些实施例中，在转导之前，在黏着于单核球的基质上培育T细胞和/或NK细胞在一个实施例中多于4小时，或在另一实施例中多于6小时，或在又一实施例中多于8小时。在一个说明性实施例中，在转导之前，在黏着物基质上培育T细胞和/或NK细胞隔夜以移除单核球。在另一实施例中，该方法可包括，在转导之前在结合单核球的黏着物基质上培育T细胞和/或NK细胞不多于30分钟、1小时或2小时。在另一实施例中，在该转导步骤之前，T细胞和/或NK细胞不暴露于通过在黏着物基质上培育来移除单核球的步骤。在另一实施例中，在转导之前或在转导期间，T细胞和/或NK细胞并不与牛血清(诸如细胞培养牛血清，例如胎牛血清)一起培育或不暴露于其中。
因此，在另一方面中，本文中提供一种用于以基因方式修饰或转导个体的淋巴细胞(在说明性实施例中，T细胞和/或NK细胞，或T细胞和/或NK细胞群)的方法，该方法包括使一般个体的T细胞和/或NK细胞与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒离体接触，该复制缺陷型重组反转录病毒颗粒在其基因组中包含多核苷酸，该多核苷酸包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一种或多种核酸序列，其中该一种或多种核酸序列中的第一核酸序列编码针对一种或多种RNA靶目标两个或更多个抑制性RNA分子，且该一种或多种核酸序列中的第二核酸序列编码包含抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域及胞内活化域的嵌合抗原受体(CAR)，其中该接触有助于利用复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转导静息T细胞和/或NK细胞或静息T细胞和/或NK细胞中的至少一些，从而产生经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞。
在另一方面中，本文中提供一种用于以基因方式修饰或转导个体的淋巴细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)或其群的方法，该方法包括使个体的淋巴细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)或其群与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒离体接触，该复制缺陷型重组反转录病毒颗粒在其基因组中包含多核苷酸，该多核苷酸包含可操作地连接至在淋巴细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)中具有活性的启动子的一种或多种核酸序列，其中该一种或多种核酸序列中的第一核酸序列编码针对一种或多种RNA靶目标一种或多种(例如两个或更多个)抑制性RNA分子，且该一种或多种核酸序列中的第二核酸序列编码包含抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域及胞内活化域的嵌合抗原受体(CAR)，其中该接触有助于利用复制缺陷型重组反转录病毒颗粒基因修饰和/或转导淋巴细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)或淋巴细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)中的至少一些，从而产生经基因方式修饰和/或经转导的淋巴细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)。
在紧接着上文提供的方法的一些实施例中，将经基因方式修饰和/或经转导的淋巴细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)或其群引入至个体中。在一些实施例中，经基因方式修饰和/或经转导的淋巴细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)或其群在引入或再引入至个体中之前，离体进行4次或更少的细胞分裂。在一些实施例中，淋巴细胞为与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触1小时与12小时之间的静息T细胞和/或静息NK细胞。在一些实施例中，自个体收集血液的时间与将经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞再引入至个体中的时间之间不多于8小时。在一些实施例中，在收集血液之后及再引入血液之前的所有步骤均在封闭系统中进行，在整个处理期间人监测该封闭系统。
在紧接着上文所提供的包括多核苷酸的方法方面的任一者中，该多核苷酸包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一种或多种核酸序列，其中该一种或多种核酸序列中的第一核酸序列编码针对一种或多种RNA靶目标一种或多种(例如两个或更多个)抑制性RNA分子，且该一种或多种核酸序列中的第二核酸序列编码包含抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域及胞内活化域的嵌合抗原受体(CAR)，该多核苷酸可进一步包括编码不为抑制性RNA分子的至少一个淋巴增生性组件的第三核酸序列。在一些实施例中，淋巴增生性组件可为细胞因子或细胞因子受体多肽，或其包含信号传导域的片段。在一些实施例中，淋巴增生性组件为组成性活性。在某些实施例中，淋巴增生性组件可为IL-7受体或其片段。在说明性实施例中，淋巴增生性组件可为组成性活性IL-7受体或其组成性活性片段。
在紧接着上文提供的包括多核苷酸的方法方面中的任一者中，该多核苷酸包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一种或多种核酸序列，其中该一种或多种核酸序列中的第一核酸序列编码针对一个或多个RNA靶标的一个或多个(例如，两个或更多个)抑制性RNA分子，抑制性RNA分子在一些实施例中可包括与彼此部分或完全互补的5’链及3’链，其中该5’链及该3’链能够形成18至25个核苷酸RNA双螺旋。在一些实施例中，5’链长度可为18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸，且3’链长度可为18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸。在一些实施例中，5’链及3’链长度可相同或不同。在一些实施例中，RNA双螺旋可包括一个或多个错配。在替代实施例中，RNA双螺旋不具有错配。
在紧接着上文提供的包括多核苷酸的方法方面中的任一者中，该多核苷酸包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一种或多种核酸序列，其中该一种或多种核酸序列中的第一核酸序列编码针对一个或多个RNA靶标的一个或多个(例如，两个或更多个)抑制性RNA分子，抑制性RNA分子可为miRNA或shRNA。在一些实施例中，抑制性分子可为miRNA的前体，诸如Pri-miRNA或Pre-miRNA，或shRNA的前体。在一些实施例中，抑制性分子可为人工衍生的miRNA或shRNA。在其他实施例中，抑制性RNA分子可为经处理成siRNA的dsRNA(经转录或人工引入)或siRNA本身。在一些实施例中，抑制性RNA分子可为miRNA或shRNA，其具有在自然界中未发现的序列，或具有在自然界中未发现的至少一个功能片段，或具有在自然界中未发现的功能区段的组合。在说明性实施例中，抑制性RNA分子中的至少一者或全部为miR-155。
在紧接着上文提供的包括多核苷酸(包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一种或多种核酸序列)的方法方面中的任一者中，其中该一种或多种核酸序列中的第一核酸序列编码针对一个或多个RNA靶标的一个或多个(例如，两个或多个)抑制性RNA分子，在一些实施例中，抑制性RNA分子可自5’至3’定向包含：5’臂、5’茎、环、与该5’茎部分或完全互补的3’茎，及3’臂。在一些实施例中，该两个或更多个抑制性RNA分子中的至少一者具有此排列。在其他实施例中，所有该两个或更多个抑制性RNA分子皆具有此排列。在一些实施例中，5’茎长度可为18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸。在一些实施例中，3’茎长度可为18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸。在一些实施例中，环长度可为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸。在一些实施例中，5’臂、3’臂或两者均衍生自天然存在的miRNA。在一些实施例中，5’臂、3’臂或两者均衍生自天然存在的miRNA，该miRNA选自由以下组成的群：miR-155、miR-30、miR-17-92、miR-122及miR-21。在说明性实施例中，5’臂、3’臂或两者均衍生自miR-155。在一些实施例中，5’臂、3’臂或两者均衍生自小家鼠miR-155或智人miR-155。在一些实施例中，5’-臂具有SEQ ID NO:256中所阐述的序列或为其功能性变体，诸如与SEQ ID NO:256长度相同，或为SEQ ID NO:256的长度的95％、90％、85％、80％、75％，或50％，或为100个核苷酸或更少、95个核苷酸或更少、90个核苷酸或更少、85个核苷酸或更少、80个核苷酸或更少、75个核苷酸或更少、70个核苷酸或更少、45个核苷酸或更少、40个核苷酸或更少、35个核苷酸或更少、30个核苷酸或更少、或25个核苷酸或更少的序列；且与SEQ ID NO:256至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％一致。在一些实施例中，3’臂具有阐述于SEQ ID NO:260中的序列或其功能性变体，诸如与SEQ ID NO:260长度相同，或为SEQ ID NO:260的长度的95％、90％、85％、80％、75％，或50％，或为100个核苷酸或更少、95个核苷酸或更少、90个核苷酸或更少、85个核苷酸或更少、80个核苷酸或更少、75个核苷酸或更少、70个核苷酸或更少、65个核苷酸或更少、60个核苷酸或更少、55个核苷酸或更少、50个核苷酸或更少、45个核苷酸或更少、40个核苷酸或更少、35个核苷酸或更少、30个核苷酸或更少，或25个核苷酸或更少的序列；且与SEQID NO:260至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％一致。在一些实施例中，3’臂包含小家鼠BIC的核苷酸221至283。
在紧接着上文提供的包括多核苷酸(包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一种或多种核酸序列)的方法方面中的任一者中，其中该一种或多种核酸序列中的第一核酸序列编码针对一个或多个RNA靶标的两个或更多个抑制性RNA分子，在一些实施例中，该两个或更多个抑制性RNA分子可连续地位于第一核酸序列中。在一些实施例中，抑制性RNA分子可利用非功能性接头序列直接或间接地与彼此连接。在一些实施例中，接头序列长度可在5个与120个核苷酸之间，或长度在10个与40个核苷酸之间。
在紧接着上文提供的包括多核苷酸(包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一种或多种核酸序列)的方法方面中的任一者中，其中该一种或多种核酸序列中的第一核酸序列编码针对一个或多个RNA靶标的两个或更多个抑制性RNA分子，在一些实施例中，该第一核酸序列编码两个至四个抑制性RNA分子。在说明性实施例中，第一核酸序列中包括2个与10个之间、2个与8个之间、2个与6个之间、2个与5个之间、2个与4个之间、3个与5个之间或3个与6个之间的抑制性RNA分子。在一说明性实施例中，第一核酸序列中包括四个抑制性RNA分子。
在紧接着上文提供的包括多核苷酸(包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一种或多种核酸序列)的方法方面中的任一者中，其中该一种或多种核酸序列中的第一核酸序列编码针对一个或多个RNA靶标的一个或多个(例如两个或更多个)抑制性RNA分子，该一个或多个(例如两个或更多个)抑制性RNA分子可处于内含子中。在一些实施例中，内含子在启动子中。在说明性实施例中，内含子为EF-1α内含子A。在一些实施例中，内含子与启动子相邻且在启动子下游，在说明性实施例中，该内含子在用于产生复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的包装细胞中为无活性的。
在紧接着上文提供的包括多核苷酸(包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一种或多种核酸序列)的方法方面中的任一者中，其中该一种或多种核酸序列中的第一核酸序列编码针对一个或多个RNA靶标的两个或更多个抑制性RNA分子，在一些实施例中，该两个或更多个抑制性RNA分子可针对不同靶标。在一替代实施例中，两个或更多个抑制性RNA分子针对同一靶标。在一些实施例中，RNA靶标为自由T细胞表达的基因转录的mRNA，这些mRNA诸如(但不限于)：PD-1(防止失活)；CTLA4(防止失活)；TCRa(安全地防止自体免疫)；TCRb(安全-防止自体免疫)；CD3Z(安全-防止自体免疫)；SOCS1(防止失活)；SMAD2(防止失活)；miR-155靶标(促进活化)；IFNγ(减少CRS)；cCBL(延长信号传导)；TRAIL2(防止死亡)；PP2A(延长信号传导)；ABCG1(通过限制胆固醇的清除来增加胆固醇微含量)。在一些实施例中，RNA靶标为自编码T细胞受体(TCR)复合物的组分的基因转录的mRNA。在一些实施例中，两个或更多个抑制性RNA分子中的至少一者可减少T细胞受体(在说明性实施例中，T细胞的一个或多个内源性T细胞受体)的表达。在某些实施例中，RNA靶标可为自T细胞的内源性TCRα或TCRβ基因转录的mRNA，该T细胞的基因组包含编码一个或多个miRNA的第一核酸序列。在说明性实施例中，RNA靶标为自TCRα基因转录的mRNA。
在紧接着上文提供的包括多核苷酸(包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一种或多种核酸序列)的方法方面中的任一者中，其中该一种或多种核酸序列中的第一核酸序列编码针对一个或多个RNA靶标的一个或多个(例如两个或更多个)抑制性RNA分子，且该一种或多种核酸序列中的第二核酸序列编码包含抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域及胞内活化域的嵌合抗原受体(CAR)，在一些实施例中，CAR为受微环境限制的生物(MRB)-CAR。在其他实施例中，CAR的ASTR与肿瘤相关的抗原结合。在其他实施例中，CAR的ASTR为微环境受限的生物(MRB)-ASTR。
在紧接着上文提供的包括多核苷酸(包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一种或多种核酸序列)的方法方面中的任一者中，其中该一种或多种核酸序列中的第一核酸序列编码针对一个或多个RNA靶标的一个或多个(例如两个或更多个)抑制性RNA分子，且该一种或多种核酸序列中的第二核酸序列编码包含抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域及胞内活化域的嵌合抗原受体(CAR)，且在一些情况下，该一种或多种核酸序列中的第三核酸序列编码不为抑制性RNA分子的至少一个淋巴增生性组件，在一些实施例中，该第一核酸序列、该第二核酸序列及该第三核酸序列中的任一者或所有可操作地连接至核糖开关。在一些实施例中，核糖开关能够结合核苷类似物。在一些实施例中，核苷类似物为抗病毒药物。
在一些实施例中，提供方法以用于通过使细胞与本文中公开的反转录病毒颗粒及呈25ng/ml至200ng/ml、50ng/ml至150ng/ml、75ng/ml至125ng/ml或100ng/ml的可溶性抗CD3抗体接触来活化和/或以基因方式修饰且通常转导静息T细胞或NK细胞(在说明性实施例中，静息T细胞)。在说明性实施例中，这些方法在无需预先活化的情况下进行，且可进行例如8小时或更少，4小时或更少，或2小时与8小时之间、2小时与4小时之间，或2小时与3小时之间。
在某些方面中，本文提供用于对于个体进行过继性细胞疗法的方法，作为一说明性实施例，该方法可包括以下：
A.自个体收集血液；
B.分离包含静息T细胞和/或静息NK细胞的周边血单核细胞(PBMC)；
C.使个体的静息T细胞和/或静息NK细胞与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒离体接触，其中复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包含在其表面上的能够结合静息T细胞和/或NK细胞且有助于复制缺陷型重组反转录病毒颗粒与其的膜融合的假型组件，其中该接触有助于利用复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转导静息T细胞和/或NK细胞，从而产生经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞；及
D.在自个体采集血液的36小时、24小时、12小时或甚至8小时内，将经基因方式修饰的细胞再引入至个体中，从而在个体中进行过继性细胞疗法。
本文提供的一些方面中，具有类似步骤的方法被称为用于以基因方式修饰及扩增个体的淋巴细胞的方法。熟练的业内人士应理解，本文中的论述在其应用于进行过继性细胞疗法的方法及组合物时还应用于以基因方式修饰且扩增个体的淋巴细胞的方法。
通常，本发明的过继性细胞疗法利用自体性转移来进行，其中细胞经分离和/或以另外方式自接受细胞疗法的个体或自衍自此类个体的样本来制备。因此，在一些方面中，细胞为衍自需要治疗的个体(例如，患者)及在给与相同个体分离及处理之后的细胞。在本文公开的方法及组合物的一些实施例中，患有疾病或病症的个体进入使用已知方法(诸如静脉穿刺)抽取个体的血液的医疗机构中。在某些实施例中，自个体抽取的血液的体积在范围的低值端点为10ml、15ml、20ml、25ml、30ml、35ml、40ml、50ml、75ml或100ml与范围的高值端点为200ml、250ml、300ml、350ml、400ml、500ml、750ml、1000ml、2000ml或2500ml之间。在一些实施例中，自个体抽取10ml与400ml之间的血液。在一些实施例中，自个体抽取20ml与250ml之间的血液。在一些实施例中，血液在处理时为新鲜的。在本文所公开的实施例中的任一者中，新鲜血液可为自之前少于15分钟、30分钟、45分钟、60分钟、90分钟、120分钟、150分钟或180分钟的个体抽取的血液。在一些实施例中，以本文提供的方法处理血液而无需储存。
T细胞和/或NK细胞与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒之间的接触通常有助于利用复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转导T细胞和/或NK细胞。贯穿本发明中经转导T细胞和/或NK细胞包括离体经转导细胞的保持在离体转导期间被并入至细胞中的核酸或多核苷酸中的至少一些的子代。在引用“再引入”经转导细胞的本文中的方法中，应理解，此类细胞在其自个体的血液收集时通常并不处于经转导状态。本文公开的方面中的任一者中的受试者可为(例如)动物、哺乳动物及在说明性实施例中的人类。
不受理论限制，在非限制性说明性方法中，将编码淋巴增生性组件的多核苷酸(诸如IL7组成性活性突变体)(其可整合至T细胞和/或NK细胞的基因组中)离体递送至静息T细胞和/或NK细胞提供了具有用于体内扩增的驱动子的细胞而无需使宿主淋巴消耗。因此，在说明性实施例中，个体在进行接触的1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、14天、21天或28天内或1个月、2个月、3个月或6个月内，接触期间和/或在将经修饰的T细胞和/或NK细胞再引回至个体后的1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、14天、21天或28天内或1个月、2个月、3个月或6个月内并不暴露于淋巴消耗试剂中。此外，在非限制性实施例中，可进行本文提供的方法而不在其中复制缺陷型重组反转录病毒颗粒与个体的静息T细胞和/或NK细胞接触的步骤期间或在整个离体方法期间使个体暴露于淋巴消耗试剂中。
因此，活体内扩增个体中的经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞为本发明的一些实施例的特征。在说明性实施例中，这些方法为离体无传播的或基本上无传播的。
在本文的非限制性说明性实施例中，自个体抽取血液至离体转导T细胞和/或NK细胞后将血液再引入回至个体的此整个方法/过程可在以下时间段内发生：少于48小时、少于36小时、少于24小时、少于12小时、少于11小时、少于10小时、少于9小时、少于8小时、少于7小时、少于6小时、少于5小时、少于4小时、少于3小时、2小时或少于2小时。在其他实施例中，自个体抽取/收集血液至离体转导(在本文的非限制性说明性实施例中)T细胞和/或NK细胞后将血液再引入回至个体的此整个方法/过程在以下时间段内发生：1小时与12小时之间、或2小时与8小时之间、或1小时与3小时之间、或2小时与4小时之间、或2小时与6小时之间、或4小时与12小时之间、或4小时与24小时之间、或8小时与24小时之间、或8小时与36小时之间、或8小时与48小时之间、或12小时与24小时之间、或12小时与36小时之间、或12小时与48小时之间；或在以下时间段内发生：在范围的低值端点为15分钟、30分钟、60分钟、90分钟、120分钟、180分钟及240分钟与范围的高值端点为120分钟、180分钟、及240分钟、300分钟、360分钟、420分钟及480分钟之间。在其他实施例中，自个体抽取/收集血液至离体转导T细胞和/或NK细胞后将血液再引入回至个体的此整个方法/过程在以下时间段内发生：在范围的低值端点为1小时、2小时、3小时、4小时、6小时、8小时、10小时及12小时与范围的高值端点为8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、18小时、24小时、36小时或48小时之间。在一些实施例中，经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞是在发生接触的时间段后自复制缺陷型重组反转录病毒颗粒分离。
在本文中的任何方法(其包括血液收集的步骤及转导淋巴细胞(在说明性实施例中，T细胞和/或NK细胞，包括静息T细胞及NK细胞)的步骤)的一些实施例中，自血液收集至转导T细胞和/或NK细胞的方法并不包括通过在黏着物基质上培育在一个实施例中多于4小时、或在另一实施例中多于6小时或在又一实施例中多于8小时来移除单核球的步骤。在一个说明性实施例中，自血液收集至转导T细胞和/或NK细胞的方法并不包括在黏着物基质上隔夜培育以移除单核球。在另一实施例中，自血液收集至转导T细胞和/或NK细胞的方法包括通过在黏着物基质上培育不多于30分钟、1小时或2小时来移除单核球的步骤。在另一实施例中，自个体进行血液收集至转导淋巴细胞(在说明性实施例中，T细胞和/或NK细胞，包括静息T细胞和/或NK细胞)的方法不包括通过在黏着物基质上培育移除单核球的步骤。在另一实施例中，自个体进行血液收集至转导淋巴细胞(在说明性实施例中，T细胞和/或NK细胞，包括静息T细胞和/或NK细胞)的方法包括，该方法期间T细胞和/或NK细胞不与牛血清(诸如细胞培养牛血清，例如胎牛血清)一起培育或不暴露于其中。
在本文中的任何方法(其包括血液收集的步骤及转导淋巴细胞(在说明性实施例中，T细胞和/或NK细胞，包括静息T细胞及NK细胞)的步骤)的一些实施例中，自个体进行血液收集至再引入T细胞和/或NK细胞至个体中的方法并不包括通过在黏着物基质上培育在一个实施例中超过4小时、或在另一实施例中多于6小时或在又一实施例中多于8小时来移除单核球的步骤。在一个说明性实施例中，自个体进行血液收集至再引入T细胞和/或NK细胞至个体中的方法并不包括在黏着物基质上培育隔夜以移除单核球。在另一实施例中，自个体进行血液收集至再引入T细胞和/或NK细胞的方法包括通过在黏着物基质上培育不多于30分钟、1小时或2小时来移除单核球的步骤。在另一实施例中，自个体进行血液收集至再引入T细胞和/或NK细胞至个体中的方法并不包括通过在黏着物基质上培育隔夜来移除单核球的步骤。在另一实施例中，自个体进行血液收集至再引入T细胞和/或NK细胞至个体中的方法，在该方法期间T细胞和/或NK细胞并不与牛血清(诸如细胞培养牛血清，例如胎牛血清)一起培育或并不暴露于其中。
因为本文提供的用于过继性细胞疗法的方法，及用于在活体内扩增T细胞和/或NK细胞之前离体修饰静息这些T细胞和/或NK细胞的相关方法，可以显著短于先前方法的时间来进行，使得患者护理及安全性以及产品制造性的基本改进成为可能。因此，在负责批准在活体内进行用于治疗性目的时的此类方法的法规机构看来，此类方法预计是有利的。举例而言，在非限制性实施例中，在经修饰的T细胞和/或NK细胞再引入至患者中之前，在样本处理的整个时间，个体可留在与处理其血液或样本的机构的相同建筑(例如输注诊所)或房间中。在非限制性说明性实施例中，在自个体进行血液抽取/收集至离体转导T细胞和/或NK细胞后将血液再引入至个体的整个方法/过程中，个体保持在位置线内和/或其正被处理的血液或细胞的100、50、25或12英尺或臂的距离内。在其他非限制性说明性实施例中，在自个体进行血液抽取/收集至离体转导T细胞和/或NK细胞后将血液再引入至个体的整个方法/过程中和/或连续地，个体保持清醒和/或至少一个人可继续监测个体的正被处理的血液或细胞。因为本文提供的改进，用于过继性细胞疗法和/或转导静息T细胞和/或NK细胞的自个体进行血液抽取/收集至离体转导T细胞和/或NK细胞后将血液再引入至个体的整个方法/过程，可与人类的连续监测一起进行。在其他非限制性说明性实施例中，在自个体进行血液抽取/收集至离体转导T细胞和/或NK细胞后将血液再引入至个体的整个方法/过程的任何点处，均不会将血液细胞培育在无个人存在的房间中。在其他非限制性说明性实施例中，自个体进行血液抽取/收集至离体转导T细胞和/或NK细胞后将血液再引入至个体的整个方法/过程是紧挨着个体和/或在与个体相同的房间中和/或紧接着个体的床或椅子上进行。因此，可避免样本一致性混乱，以及避免超过数天或数周的长且昂贵的培育。本文提供的方法容易地适用于封闭及自动化血液处理系统的事实进一步证实此优点，其中将再引入至个体中的血液样本及其组分仅与单次、一次性使用的组分进行接触。
用于进行本文提供的过继性细胞疗法的方法一般包括1)转导淋巴细胞(诸如T细胞和/或NK细胞，其在说明性实施例中为静息T细胞和/或NK细胞)的方法，和/或包括2)用于以基因方式修饰淋巴细胞(诸如T细胞和/或NK细胞，其在说明性实施例中为静息T细胞和/或NK细胞)的方法，其两者(1及2)自身各自形成本发明的不同方面。此类方法可在具有或不具有在本文中经鉴别用于进行过继性细胞疗法的其他步骤的情况下来进行。在用于过继性细胞疗法的方法及本文中提供的包括离体转导静息T细胞和/或静息NK细胞的任何方法中，通常在将细胞与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触之前，自血细胞分离出嗜中性细胞/粒细胞。在一些实施例中，使用例如血球分离术和/或密度梯度离心法，自血液样本的其他组分分离出包括周边血淋巴细胞(PBL)(诸如T细胞和/或NK细胞)的周边血单核细胞(PBMC)。在一些实施例中，在PBMC和/或T细胞和/或NK细胞被处理、与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触、转导或转染之前，移除嗜中性细胞。关于待治疗的个体，细胞可为异体性和/或自体性的。
作为非限制性实施例，在本文中用于转导或以基因方式修饰的方法的一些实施例中，使用Sepax或Sepax 2细胞处理系统(BioSafe)分离PBMC。在一些实施例中，使用CliniMACS Prodigy细胞处理器(Miltenyi Biotec)分离PBMC。在一些实施例中，使用自动血球分离器，自个体采集血液，使血液穿过挑选出周边细胞类型(诸如，PBMC)的装置，且使剩余部分返回至个体中。密度梯度离心可在血球分离之后进行。在一些实施例中，使用去除白血球的过滤器器件分离PBMC。在一些实施例中，接着使用磁珠活化细胞分类术以根据细胞表型(亦即阳性选择)来纯化来自PBMC(诸如，PBL或其子集)的特异性细胞群。也可使用用于纯化的其他方法，诸如，基质黏着，其利用模拟T细胞在补充期间遭遇的环境的基质，从而使其黏着及迁移，或阴性选择，其中不需要的细胞利用抗体复合物(靶向不需要的细胞)来移除。在一些实施例中，红细胞花结术可用于纯化细胞。
在本文中的相关方面的任一者的一些说明性实施例中，PBL包括T细胞和/或NK细胞。在本文中的某些实施例期间，例如在修饰淋巴细胞的方法及进行过继性细胞疗法的方法中，与本发明的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触的T细胞和/或NK细胞主要为静息T细胞。在一些实施例中，T细胞和/或NK细胞包含95％与100％之间的静息细胞(Ki-67-)。在一些实施例中，与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触的T细胞和/或NK细胞包括在范围的低值端点为90％、91％、92％、93％、94％及95％静息细胞与范围的高值端点为96％、97％、98％、99％或100％静息细胞之间。在一些实施例中，T细胞和/或NK细胞包括原生细胞。
在本文公开的方法及组合物的一些实施例中，T细胞和/或NK细胞与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒离体接触以以基因方式修饰T细胞和/或NK细胞，以在再引入至个体中时在个体中引起靶向免疫反应。在接触时段期间，复制缺陷型重组反转录病毒颗粒识别T细胞和/或NK细胞且与T细胞和/或NK细胞结合，此时反转录病毒与宿主细胞膜开始融合。接着，经由转导程序，来自复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的基因材料进入T细胞和/或NK细胞，且并入至宿主细胞DNA中。慢病毒转导的方法为已知的。例示性方法描述于例如Wang等人(2012)J.Immunother.35(9):689-701，Cooper等人(2003)Blood.101:1637-1644，Verhoeyen等人(2009)Methods Mol Biol.506:97-114，及Cavalieri等人(2003)Blood.102(2):497-505中。
本文提供的方法中的许多方法包括转导T细胞和/或NK细胞。在此项技术中已知用于离体用复制缺陷型重组反转录病毒颗粒(诸如复制缺陷型重组慢病毒颗粒)转导T细胞和/或NK细胞的方法。在说明性实施例中，本文中提供的方法并不需要离体刺激或活化。因此，在本方法中可避免先前方法中的此常规步骤，但在转导期间可存在离体刺激性分子(诸如抗CD3和/或抗CD28珠粒)。然而，利用本文提供的说明性方法，不需要离体刺激。在某些例示性方法中，可使用在3重与10重感染(MOI)之间，且在一些实施例中，在5MOI与10MOI之间的单位的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒，例如慢病毒。
转导反应可在封闭系统(诸如如本文所论述的Sepax系统)中进行，其中转导反应可在该系统上装载的一次性袋子中进行。一旦从粒细胞(包括嗜中性细胞)分开、分离和/或纯化出自个体收集的血液样本的血细胞(诸如PBMC)，这些血液细胞可与本文公开的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒在袋子中接触，这些粒细胞在接触步骤(亦即转导反应)期间通常不存在。
复制缺陷型重组反转录病毒颗粒可再引入至含有经分离PBMC的袋中，从而接触PBMC。自个体收集血液的时间至将血细胞(诸如PBMC)添加至转导反应袋的时间可在30分钟与4小时之间、在30分钟与2小时之间，或在一些实施例中大约1小时。可将诸如培养基、人类血清白蛋白、人类AB+血清和/或源自个体的血清的添加物添加至转导反应混合物中。通常存在培养基，诸如此项技术中已知用于离体处理的那些(作为非限制性实施例，X-VIVO 15(Lonza))或CTS培养基(Thermo Fisher Scientific)。可将支持性细胞因子添加至转导反应混合物，诸如IL2、IL7或IL15，或HAS中发现的那些。
转导反应混合物可在23℃与39℃之间，且在一些实施例中在37℃下培育。在某些实施例中，转导反应可在37℃至39℃下进行以供较快速融合/转导。可将dGTP添加至转导反应。转导反应混合物可培育1至12小时，且在一些实施例中，在进行洗涤之前培育6至12小时，而无论这些细胞是否将在活体外、离体或引入至个体中进行研究。因此，在其中将细胞输注至个体中的某些实施例中，在转导后，在将经转导T细胞和/或NK细胞输注回至个体中之前，洗涤细胞以在输注回至个体中之前移除转导反应混合物。举例而言，在将经转导的细胞输注回个体之前，系统(诸如Sepax仪器)可用于例如用10ml至50ml的洗涤溶液来洗涤细胞。在一些实施例中，在PBMC和/或T细胞和/或NK细胞经处理、与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触、转导或转染之前，移除嗜中性细胞。
在用于进行过继性细胞疗法的一说明性实施例中，将血液自个体收集至血袋中，且将该血袋连接至细胞处理系统，诸如Sepax细胞处理系统。将使用细胞处理系统分离的PBMC收集至袋子中，使这些PBMC与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒在足以转导T细胞和/或NK细胞的条件下接触，并对其进行培育。在培育之后，将含有PBMC与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的混合物的袋子连接至细胞处理系统，且洗涤PBMC。将经洗涤的PBMC收集至袋子中，且再输注至个体中。在一些实施例中，自收集血液至再输注经转导T细胞和/或NK细胞的整个方法在1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、15小时、18小时或24小时内进行。在说明性实施例中，整个方法在12小时内进行。
在一些实施例中，复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的靶标细胞为PBL。在一些实施例中，靶细胞为T细胞和/或NK细胞。在一些实施例中，T细胞为辅助T细胞和/或杀伤T细胞。
在一些实施例中，本文提供的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒在其表面上具有假型组件，这些假型组件能够结合T细胞和/或NK细胞且有助于与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的膜融合。在其他实施例中，复制缺陷型重组反转录病毒颗粒在其表面上具有能够结合静息T细胞和/或NK细胞的活化组件。在又其他实施例中，复制缺陷型重组反转录病毒颗粒在其表面上具有膜结合细胞因子。在一些实施例中，复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包括多核苷酸，该多核苷酸具有编码一个或多个工程化信号传导多肽的一个或多个转录单元，这些工程化信号传导多肽中的一者或多者包括一个或多个淋巴增生性组件。在其他实施例中，当利用两种信号传导多肽时，一种包括至少一个淋巴增生性组件，且另一种通常为包括抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域及胞内活化域的嵌合抗原受体(CAR)。如本文所指示，通常与本文提供的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的表面缔合的活化组件能够接触静息T细胞和/或NK细胞足够时段，且由于该接触及在适当条件下活化静息T细胞和/或NK细胞。应理解，此活化在本文中的方法的接触步骤期间随时间推移而发生。此外，应理解，在其中在结合T细胞和/或NK细胞的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的表面上发现假型组件的一些实施例中，在本文中的方法中，活化可通过结合假型组件来诱导。活化组件在那些实施例中视情况存在。
本文中的其他部分中提供关于假型组件、活化组件、膜结合细胞因子、工程化信号传导多肽、淋巴增生性组件及CAR的其他描述。
在本文公开的方法及组合物的一些实施例中，自血液收集的总淋巴细胞的5％与90％之间经转导。在某些实施例中，经转导的淋巴细胞的百分比是在为5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％及60％的范围低值端点与为50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％及90％的范围高值端点之间。在一些实施例中，经转导的淋巴细胞的百分比为至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％或至少60％。
在本文公开的方法及组合物的一些实施例中，将经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞引回、再引入或再输注至个体中而无需额外离体操作，诸如刺激和/或活化T细胞和/或NK细胞。在现有技术方法中，离体操作用于刺激/活化T细胞和/或NK细胞，及用于在将经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞引入至个体中之前扩增经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞。在先前技术方法中，此通常花费数天或数周，且需要个体在初始血液抽取之后返回诊所以血液输注数天或数周。在本文公开的方法及组合物的一些实施例中，在T细胞和/或NK细胞与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触之前，T细胞和/或NK细胞并不通过暴露于抗CD3/抗CD28固体载体(诸如，涂布有抗CD3/抗CD28的珠粒)而离体进行刺激。因此，本文中提供一种离体无传播方法。在其他实施例中，经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞是指活体内(亦即在个体内)扩增或主要在活体内扩增，而并不离体扩增，或仅离体扩增较小数目的细胞分裂(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10轮的细胞分裂)。在一些实施例中，不添加额外培养基以允许细胞的另外扩增。在一些实施例中，在PBL与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触时，不发生PBL的细胞制造。在说明性实施例中，当PBL离体时不发生PBL的细胞制造。在过继性细胞疗法的先前方法中，个体在再输注经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞之前进行淋巴消耗。在一些实施例中，患者或个体在抽取血液之前并不进行淋巴消耗。在一些实施例中，患者或个体在再输注经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞之前并不进行淋巴消耗。
在本文公开的实施例中的任一者中，待再输注至个体中的T细胞和/或NK细胞的数目可在范围的低值端点为1×103、2.5×103、5×103、1×104、2.5×104、5×104、1×105、2.5×105、5×105、1×106、2.5×106、5×106及1×107个细胞/公斤与范围的高值端点为5×104、1×105、2.5×105、5×105、1×106、2.5×106、5×106、1×107、2.5×107、5×107及1×108个细胞/公斤之间。在说明性实施例中，待再输注至个体中的T细胞和/或NK细胞的数目可在范围的低值端点为1×104、2.5×104、5×104及1×105个细胞/公斤与范围的高值端点为2.5×104、5×104、1×105、2.5×105、5×105及1×106个细胞/公斤之间。在一些实施例中，待再输注至个体中的PBL的数目可少于范围的低值端点为5×105、1×106、2.5×106、5×106、1×107、2.5×107、5×107及1×108个细胞，与范围的高值端点为2.5×106、5×106、1×107、2.5×107、5×107、1×108、2.5×108、5×108及1×109个细胞。在一些实施例中，可用于再输注至70kg个体或患者中的T细胞和/或NK细胞的数目在7×105个细胞与2.5×108个细胞之间。在其他实施例中，可用于转导的T细胞和/或NK细胞的数目大约为7×106个加或减10％。
在本文公开的方法中，整个过继性细胞疗法程序(自抽取血液至再输注经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞)可有利地在比先前方法更短的时间中进行。在一些实施例中，整个过继性细胞疗法程序可在少于1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、15小时、18小时或24小时中进行。在说明性实施例中，整个过继性细胞疗法程序可在少于1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时或12小时中进行。在一些实施例中，整个过继性细胞疗法程序可在范围的低值端点为1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时或15小时与范围的高值端点为1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、15小时、18小时或24小时之间进行。
在本文中的一些实施例中，封闭系统用于处理PBMC，例如在包括以基因方式修饰PBMC、NK细胞且在说明性实施例中T细胞的方法中，例如通过转导PBMC或其子集。这些方法可用于以基因方式修饰待用于科学研究、商业生产或治疗方法的淋巴细胞。举例而言，这些方法可包括将周边血液单核细胞(PBMC)(包括NK细胞、T细胞或两者，且在一些实施例中，静息T细胞和/或静息NK细胞)自容器转移至封闭系统内的转导反应混合物中，其因此不需要环境暴露。该容器例如可为管、袋、注射器或其他容器。在一些实施例中，容器为用于研究设施的容器。在一些实施例中，容器为用于商业生产的容器。在其他实施例中，容器可为永夜血液收集过程的收集容器。本文中用于以基因方式修饰的方法通常涉及其中淋巴细胞与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触的接触步骤。在一些实施例中，该接触可在容器中(例如，在血袋内)进行。在其他实施例中，可将PBMC或其子部分自容器转移至封闭系统内的另一容器(例如自第一容器转移至第二容器)以供接触。第二容器可为封闭装置(诸如G-Rex装置)的细胞处理区室。在一些实施例中，在接触后，可将经基因方式修饰(例如，经转导)的细胞转移至封闭系统内的不同容器(亦即无需暴露于环境)。在此转移之前或之后，通常在封闭系统内洗涤细胞以基本上移除所有或所有反转录病毒颗粒。在一些实施例中，在接触之后将PBMC或其部分转移至其中接触(例如，转导)将经由洗涤细胞发生的容器中的此段落中所公开的过程在12小时内进行。在一些实施例中，其在范围的低值端点为1小时、2小时、3小时或4小时与范围的高值端点为4小时、8小时、10小时或12小时之间进行。
在本文提供的一些实施例中，自个体抽取血液样本、使T细胞和/或NK细胞与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触、和/或将经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞引入至个体中的步骤，发生在封闭系统中。封闭系统为一种对污染通常封闭或完全封闭的培养方法。由此，这是统或过程不会将细胞暴露于环境。本发明的一优势为，本文中提供用于在封闭系统中进行CAR疗法的方法。对于细胞处理程序中的安全性及调控的最高风险中的一者为经由频繁暴露于环境的污染的风险，如在传统开放式细胞培养系统中所发现的。为了缓和此风险，尤其在不存在抗生素时，已研发出致力于使用一次性(单次使用)设备的一些商业方法。然而，即使在无菌条件下使用，打开烧瓶以取样或添加额外生长培养基总是存在污染风险。为了克服此问题，本文中提供一种封闭系统方法，一种经设计且可经操作使得产物并不暴露于外部环境的方法。这是重要的，因为外部环境通常不系无菌的。经由无菌连接或焊接管进行材料转移。用于气体交换的空气经由透气膜或类似其他添加物经由0.2μm过滤器来进行以防止环境暴露。
在一些实施例中，封闭系统包括连接至个体的活体内循环系统的离体循环系统，使得抽取血液，且接着在被引回至个体之前循环至离体循环系统。在一些实施例中，离体循环系统包括与用于将细胞暴露于复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的系统或装置结合的用于分离PBL的系统或装置和/或用于分离T细胞和/或NK细胞的系统或装置。在一些实施例中，封闭系统并不允许T细胞和/或NK细胞暴露于空气。
此类封闭系统方法可利用可商购的器件来进行。举例而言，该方法可在适用于封闭系统T细胞制造的器件中进行。此类器件包括G-RexTM、WAVEBioreactorTM、OriGenPermaLifeTM袋及
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袋。
在本文公开的方法及组合物的一些实施例中，将个体内的经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞暴露于与其中存在的活体内控制组件结合的化合物，其中控制组件为由复制缺陷型重组反转录病毒颗粒引入的基因材料的一部分。在一些实施例中，控制组件可为核糖开关，且化合物可结合核糖开关的适体域。在一些实施例中，控制组件可为分子伴侣。在本文所公开的实施例中的任一者中，化合物可为核苷类似物。在一些实施例中，核苷类似物可为核苷类似抗病毒药物，其中抗病毒药物为一种由食品与药物管理局(Food and DrugAdministration)针对抗病毒治疗批准的化合物或一种美国抗病毒临床试验中的化合物。在说明性实施例中，化合物可为阿昔洛韦或喷昔洛韦。在一些实施例中，化合物可为泛昔洛韦(famciclovir)(喷昔洛韦的口服前体药物)或伐昔洛韦(valaciclovir)(阿昔洛韦的口服前体药物)。化合物与控制组件的结合影响经引入的基因材料的表达，且因此影响经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞的传播。
在一些实施例中，在自个体的血液分离PBL之前、同时和/或之后，且在T细胞和/或NK细胞与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触之前，将核苷类似抗病毒药物或前体药物(例如阿昔洛韦、伐昔洛韦、喷昔洛韦或泛昔洛韦)施用至个体。在一些实施例中，在自血液分离PBL之前或在T细胞和/或NK细胞与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触之前，在范围的低值端点为5分钟、10分钟、15分钟、30分钟及60分钟与范围的高值端点为1.5小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、8小时、12小时或24小时之间，将核苷类似抗病毒药物或前体药物施用至个体。在其他实施例中，在自血液分离PBL及在T细胞和/或NK细胞与本文所提供的方法中的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触之后，在范围的低值端点为1.5小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、8小时、12小时或24小时与范围的高值端点为1/2天、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、14天、21天或28天之间，将核苷类似抗病毒药物或前体药物施用至个体。在一些实施例中，在自血液分离PBL及在T细胞和/或NK细胞与本文所提供的方法中的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触之后的至少1.5小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、8小时、12小时或24小时，或至少2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、14天、21天或28天，将核苷类似抗病毒药物或前体药物施用至个体。在一些实施例中，在已将PBL再输注至个体之后的至少1天、2天、3天、4天、5天、7天、10天、14天、21天、28天、30天、60天、90天或120天，或5个月、6个月、9个月、12个月、24个月、36个月、48个月、60个月、72个月、84个月、96个月、120个月或无限期，将核苷类似抗病毒药物或前体药物施用至个体。在本文所公开的实施例中的任一者中，在PBL再输注之前和/或期间和/或已将PBL再输注之后，可施用核苷类似抗病毒药物或前体药物。
在一些实施例中，向个体每日施用与控制组件结合的化合物一次、两次、三次或四次。在一些实施例中，提供日剂量的化合物1周、2周、4周、3个月、6个月、1年，直至个体无病(诸如无癌症)或无限期地提供。在说明性实施例中，药物为与核苷类似物结合的核苷类似抗病毒药物，诸如核糖开关，如在本文中进一步详细公开。
用于递送药物的方法在此项技术中为已知的，该药物无论为小分子抑或生物制剂且可用于本文提供的方法。任何此类方法均可用于递送用于本发明的方法中的药物或候选化合物或抗体。举例而言，投药的常规路径包括非侵袭性经口(经由口)、局部(皮肤)、经黏膜(鼻、颊/舌下、阴道、眼及直肠)及吸入途径。许多蛋白质及肽药物(诸如单克隆抗体)必须通过注射或纳米针数组来递送。举例而言，许多免疫接种是基于蛋白质药物的递送，且通常通过注射来进行。
工程化信号传导多肽
在一些实施例中，用于接触T细胞和/或NK细胞的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒具有多核苷酸，该多核苷酸具有编码一种或多种工程化信号传导多肽的一个或多个转录单元。在一些实施例中，工程化信号传导多肽包括胞外域(例如，抗原特异性靶向区或ASTR)、视情况选用的柄及跨膜域的任何组合，与一个或多个胞内活化域、一个或多个调节域(诸如共刺激域)及一个或多个T细胞存活基元组合。在说明性实施例中，工程化信号传导多肽中的至少一者、两者或全部为嵌合抗原受体(CAR)或包括嵌合淋巴增生性组件(CLE)的淋巴增生性组件。在一些实施例中，当利用两个信号传导多肽时，一个编码淋巴增生性组件且另一个编码包括抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域及胞内活化域的嵌合抗原受体(CAR)。一般熟练此项技术的人员将能够针对本文公开的方法及组合物，将系统进行配置以利用类似或不类似的控制组件来将淋巴增生性组件及CAR放在不同的多核苷酸上。熟练的技术人员应认识到，工程化多肽也可称作重组多肽。
胞外域
在一些实施例中，工程化信号传导多肽包括胞外域，其为特异性结合对的成员。举例而言，在一些实施例中，胞外域可为细胞因子受体或其突变体或激素受体或其突变体的胞外域。此突变型胞外域在一些实施例中经报导在至少一些细胞类型中表达时为组成性活性的。在说明性实施例中，此胞外域及跨膜域不包括配位体结合区。据信，这些域在存在于工程化信号传导多肽中且表达于B细胞、T细胞和/或NK细胞中时不结合配位体。这些受体突变体中的突变可发生于胞外近膜区中。不受理论限制，本文提供的工程化信号传导多肽的至少一些胞外域(及一些胞外-跨膜域)中的突变通过使通常不在一起的活化链集合在一起而在不存在配位体的情况下负责工程化信号传导多肽的信号传导。关于包含胞外域中的突变的胞外域的另外的实施例可在例如本文中的淋巴增生性组件章节中找到。
在某些说明性实施例中，胞外域包含二聚基元。在一说明性实施例中，二聚基元包含亮氨酸拉链。在一些实施例中，亮氨酸拉链来自jun多肽，例如c-jun。关于包含二聚基元的胞外域的另外的实施例可在例如本文中的淋巴增生性组件章节中找到。
在某些实施例中，胞外域为抗原特异性靶向区(ASTR)，有时在本文中称为抗原结合域。特异性结合对包括(但不限于)抗原-抗体结合对；配位体-受体结合对；以及类似者。因此，适用于本发明的工程化信号传导多肽中的特异性结合对的成员包括ASTR，该ASTR为抗体、抗原、配位体、配位体的受体结合域、受体、受体的配位体结合域，以及亲和抗体。
适用于本发明的工程化信号传导多肽中的ASTR可为任何抗原结合多肽。在某些实施例中，ASTR为抗体，诸如全长抗体、单链抗体、Fab片段、Fab’片段、(Fab’)2片段、Fv片段，以及二价单链抗体或双功能抗体。
在一些实施例中，ASTR为单链Fv(scFv)。在一些实施例中，重链位于工程化信号传导多肽中的轻链的N端。在其他实施例中，轻链位于工程化信号传导多肽中的重链的N端。在所公开的实施例中的任一者中，重链及轻链可由的接头隔开，如本文中更详细论述。在所公开的实施例中的任一者中，重链或轻链可在工程化信号传导多肽的N端且通常为另一域(诸如信号序列或信号肽)的C端。
其他基于抗体的识别域(cAb VHH(骆驼抗体可变域)及人类化版本，IgNAR VH(鲨鱼抗体可变域)及人类化版本，sdAb VH(单一域抗体可变域)及“骆驼化”抗体可变域)适宜与工程化信号传导多肽一起使用且适用于使用本发明的工程化信号传导多肽的方法中。在一些情况下，也适宜使用基于T细胞(TCR)的识别域，诸如单链TCR(scTv，含有VαVβ的单链两域TCR)。
在一些实施例中，ASTR可为多特异性的，例如双特异性抗体。多特异性抗体具有针对至少两个不同位点的结合特异性。在某些实施例中，结合特异性中的一者是针对一种靶标抗原且另一者是针对另一种靶标抗原。在某些实施例中，双特异性抗体可结合至ta靶向抗原的两个不同的抗原决定基。双特异性抗体也可用于将细胞毒剂定位至表达靶标抗原的细胞中。双特异性抗体可制备为全长抗体或抗体片段。
适用于本发明的工程化信号传导多肽中的ASTR可具有多种抗原结合特异性。在一些情况下，抗原结合域对于由靶标细胞表达(由其合成)的抗原中存在的抗原决定基具有特异性。在一个实施例中，靶标细胞为癌细胞相关的抗原。癌细胞相关的抗原可为与以下相关的抗原：例如乳癌细胞、B细胞淋巴瘤、霍奇金(Hodgkin)淋巴瘤细胞、卵巢癌细胞、前列腺癌细胞、间皮瘤、肺癌细胞(例如，小细胞肺癌细胞)、非霍奇金B细胞淋巴瘤(B-NHL)细胞、卵巢癌细胞、前列腺癌细胞、间皮瘤细胞、肺癌细胞(例如，小细胞肺癌细胞)、黑色素瘤细胞、慢性淋巴细胞白血病细胞、急性淋巴细胞白血病细胞、神经母细胞瘤细胞、神经胶质瘤、神经胶母细胞瘤、神经管胚细胞瘤、结肠癌细胞等。癌细胞相关的抗原也可由非癌细胞表达。
工程化信号传导多肽的ASTR可结合的抗原的非限制性实施例包括例如CD19、CD20、CD38、CD30、ERBB2、CA125、MUC-1、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、CD44表面黏着分子、间皮素、癌胚抗原(CEA)、表皮生长因子受体(EGFR)、EGFRvIII、血管内皮生长因子受体-2(VEGFR2)、高分子量黑素瘤相关的抗原(HMW-MAA)、MAGE-Al、IL-13R-a2、GD2、Axl、Ror2，以及类似者。
在一些情况下，适用于工程化信号传导多肽中的特异性结合对的成员为受体的配位体的ASTR。配位体包括(但不限于)：激素(例如，红细胞生成素、生长激素、瘦素等)；细胞因子(例如，干扰素、白细胞介素、某些激素等)；生长因子(例如，调节蛋白；血管内皮生长因子(VEGF)；以及类似者)；整合素结合肽(例如，包含序列Arg-Gly-Asp的肽)；以及类似者。
当工程化信号传导多肽中的特异性结合对的成员为配位体时，可在特异性结合对的第二成员的存在下使工程化信号传导多肽活化，其中特异性结合对的第二成员为该配位体的受体。举例而言，当配位体为VEGF时，特异性结合对的第二成员可为包括可溶性VEGF受体的VEGF受体。
如上文所提及，在一些情况下，包括在工程化信号传导多肽中的特异性结合对的成员为ASTR，该ASTR为受体，例如配位体的受体、共受体等。该受体可为受体的配位体结合片段。合适受体包括(但不限于)：生长因子受体(例如，VEGF受体)；杀伤细胞凝集素样受体子家族K；成员1(NKG2D)多肽(MICA、MICB及ULB6的受体)；细胞因子受体(例如，IL-13受体；IL-2受体等)；CD27；自然细胞毒性受体(NCR)(例如，NKP30(NCR3/CD337)多肽(HLA-B相关的转录物3(BAT3)及B7-H6)的受体等)等。
在包括ASTR的本文提供的方面中的任一者的某些实施例中，可将ASTR定位于连接ASTR与表达与靶细胞上的靶向分子的中间蛋白质。中间蛋白质可经内源性地表达或外源性地引入，且可为天然地、经工程化或化学修饰的。在某些实施例中，ASTR可为抗标记ASTR，使得至少一个经标记中间物(通常抗标记共轭物)包括于由ASTR识别的标记与靶向分子(通常为表达于靶细胞上的蛋白质靶标)之间。因此，在这些实施例中，ASTR结合标记且标记共轭至针对靶细胞(诸如癌细胞)上的抗原的抗体。标记的非限制性实施例包括异硫氰酸荧光素(FITC)、链霉亲和素、生物素、组氨酸、二硝基苯酚、多甲藻素叶绿素蛋白复合物、绿色荧光蛋白、藻红蛋白(PE)、辣根过氧化酶、棕榈酰化、亚硝基化、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶以及麦芽糖结合蛋白。由此，ASTR包韩结合标记的分子。
柄
在一些实施例中，工程化信号传导多肽包括位于工程化信号传导多肽的部分中的柄，该部分位于细胞外部且插入在ASTR与跨膜域之间。在一些情况下，该柄与野生型CD8柄区(TTTPAPRPPTPAPTIASQP LSLRPEACRPAAGG AVHTRGLDFA(SEQ ID NO:79))具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性，与野生型CD28柄区(FCKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP(SEQ ID NO:80))具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性，或与野生型免疫球蛋白重链柄区具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性。在工程化信号传导多肽中，所用柄允许抗原特异性靶向区及通常整个工程化信号传导多肽保持与靶标抗原的结合增加。
柄区长度可为约4至约50个氨基酸，例如约4个氨基酸至约10个氨基酸、约10个氨基酸至约15个氨基酸、约15个氨基酸至约20个氨基酸、约20个氨基酸至约25个氨基酸、约25个氨基酸至约30个氨基酸、约30个氨基酸至约40个氨基酸，或约40个氨基酸至约50个氨基酸。
在一些情况下，工程化信号传导多肽的柄包括至少一个半胱氨酸。举例而言，在一些情况下，柄可包括序列Cys-Pro-Pro-Cys(SEQ ID NO:62)。若存在，第一工程化信号传导多肽的柄中的半胱氨酸可以能够与第二工程化信号传导多肽中的柄形成二硫键。
柄可包括此项技术中已知的免疫球蛋白铰链区氨基酸序列；参见例如Tan等人，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:162；及Huck等人(1986)Nucl.Acids Res.14:1779。作为非限制性实施例，免疫球蛋白铰链区可包括与以下氨基酸序列中的任一者的至少10个、15个、20个或全部氨基酸的一段具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的域：DKTHT(SEQ ID NO:63)；CPPC(SEQ ID NO:62)；CPEPKSCDTPPPCPR(SEQ ID NO:64)；(参见例如Glaser等人(2005)J.Biol.Chem.280:41494)；ELKTPLGDTTHT(SEQ ID NO:65)；KSCDKTHTCP(SEQ ID NO:66)；KCCVDCP(SEQ ID NO:67)；KYGPPCP(SEQ ID NO:68)；EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:69)(人类IgGl铰链)；ERKCCVECPPCP(SEQ ID NO:70)(人类IgG2铰链)；ELKTPLGDTTHTCPRCP(SEQ ID NO:71)(人类IgG3铰链)；SPNMVPHAHHAQ(SEQ ID NO:72)(人类IgG4铰链)；以及类似者。柄可包括具有人类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4铰链区的氨基酸序列的铰链区。柄与野生型(天然存在的)铰链区相比可包括一个或多个氨基酸取代和/或插入和/或缺失。举例而言，人类IgG 1铰链的His229可经Tyr取代，使得柄包括序列EPKSCDKTYTCPPCP(参见例如Yan等人(2012)J.Biol.Chem.287:5891)。柄可包括来源于人类CD8的氨基酸序列；例如，该柄可包括氨基酸序列：TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD(SEQ ID NO:73)，或其变体。
跨膜域
本发明的工程化信号传导多肽可包括用于插入至真核细胞膜中的跨膜域。跨膜域可插入在ASTR与共刺激域之间。跨膜域可插入在柄与共刺激域之间，使得嵌合抗原受体自胺基端(N端)至羧基端(C端)依次包括：ASTR、柄、跨膜域以及活化域。
提供将多肽插入至真核(例如，哺乳动物)细胞的细胞膜中的任何跨膜(TM)域适用于本文所公开的方面及实施例。适用于本文提供的方面或实施例中的任一者的TM域的非限制性实施例包括与以下TM域或经组合柄及TM域中的任一者的至少10个、15个、20个或全部氨基酸的一段具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的域：a)CD8αTM(SEQ ID NO:46)；b)CD8βTM(SEQ ID NO:47)；c)CD4柄(SEQ ID NO:48)；d)CD3Z TM(SEQ ID NO:49)；e)CD28 TM(SEQ ID NO:50)；f)CD134(OX40)TM(SEQ ID NO:51)；g)CD7 TM(SEQ ID NO:52)；h)CD8柄及TM(SEQ ID NO:75)；及i)CD28柄及TM(SEQ ID NO:76)。
作为非限制性实施例，本发明的一方面的跨膜域可与以下具有至少80％、90％或95％的序列一致性：SEQ ID NO:46跨膜域、CD8β跨膜域、CD4跨膜域、CD3ζ跨膜域、CD28跨膜域、CD134跨膜域，或CD7跨膜域。
胞内活化域
适用于本发明的工程化信号传导多肽中的胞内活化域在活化时通常诱导产生一种或多种细胞因子；增加细胞死亡；和/或增加CD8+ T细胞、CD4+ T细胞、NKT细胞、γδT细胞和/或嗜中性细胞的增生。活化域也可在本文中称为活化域。活化域可用于本文提供的CAR中或淋巴增生性组件中。
在一些实施例中，胞内活化域包括如下文所描述的至少一个(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个等)ITAM基元。在一些实施例中，胞内活化域可与如下文所描述的CD3Z、CD3D、CD3E、CD3G、CD79A、CD79B、DAP12、FCERlG、FCGR2A、FCGR2C、DAP10/CD28或ZAP70域具有至少80％、90％或95％的序列一致性。
适用于本发明的工程化信号传导多肽中的胞内活化域包括含有基于免疫酪氨酸的活化基元(ITAM)的胞内信号传导多肽。ITAM基元为YX1X2L/I，其中X1及X2独立地为任何氨基酸。在一些情况下，工程化信号传导多肽的胞内活化域包括1个、2个、3个、4个或5个ITAM基元。在一些情况下，ITAM基元在胞内活化域中重复两次，其中ITAM基元的第一个例与第二个例彼此由6个至8个氨基酸(例如，(YX1X2L/I)(X3)n(YX1X2L/I)，其中n为整数6至8，且6个至8个X3中的每一者可为任何氨基酸)分隔开。在一些情况下，工程化信号传导多肽的胞内活化域包括3个ITAM基元。
合适的胞内活化域可为含有ITAM基元的部分，该部分来源于含有ITAM基元的多肽。举例而言，合适的胞内活化域可为来自任何含有ITAM基元的蛋白质的含有ITAM基元的域。因此，合适的胞内活化域不需要含有其源自的整个蛋白质的整个序列。合适的含有ITAM基元的多肽的实例包括(但不限于)：CD3Z(CD3ζ)；CD3D(CD3δ)；CD3E(CD3ε)；CD3G(CD3γ)；CD79A(抗原受体复合物相关的蛋白质α链)；DAP12；以及FCERlG(Fcε受体Iγ链)。
在一些情况下，胞内活化域来源于T细胞表面糖蛋白CD3ζ链(也称为CD3Z、T细胞受体T3ζ链、CD247、CD3-ζ、CD3H、CD3Q、T3Z、TCRZ等)。举例而言，合适的胞内活化域可包括与以下序列中的至少10个、15个、20个或全部氨基酸的一段或与以下氨基酸序列(2个同种型)中的任一者的约100个氨基酸至约110个氨基酸(aa)、约110aa至约115aa、约115aa至约120aa、约120aa至约130aa、约130aa至约140aa、约140aa至约150aa或约150aa至约160aa一连续段具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的域：MKWKALFTAAILQAQLPITEAQSFGLLDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLRVKFSRSADAPAYQQGQNQL[YNELNLGRREEYDVL]DKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGL[YNELQKDKMAEAYSEI]GMKGERRRGKGHDGL[YQGLSTATKDTYDAL]HMQALPPR(SEQ ID NO:11)或MKWKALFTAAILQAQLPITEAQSFGLLDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLRVKFSRSADAPAYQQGQNQL[YNELNLGRREEYDVL]DKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGL[YNELQKDKMAEAYSEI]GMKGERRRGKGHDGL[YQGLSTATKDTYDAL]HMQALPPR(SEQ ID NO:12)，其中用括号将ITAM基元括起来。
同样，合适的胞内活化域多肽可包括全长CD3ζ氨基酸序列的含有ITAM基元的部分。因此，合适的胞内活化域可包括与以下序列中的至少10个、15个、20个或全部氨基酸的一段或与以下氨基酸序列中的任一者的约100个氨基酸至约110个氨基酸(aa)、约110aa至约115aa、约115aa至约120aa、约120aa至约130aa、约130aa至约140aa、约140aa至约150aa或约150aa至约160aa的一连续段具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的域：RVKFSRSADAPAYQQGQNQL[YNELNLGRREEYDVL]DKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGL[YNELQKDKMAEAYSEI]GMKGERRRGKGHDGL[YQGLSTATKDTYDAL]HMQALPPR(SEQ ID NO:13)；RVKFSRSADAPAYQQGQNQL[YNELNLGRREEYDVL]DKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGL[YNELQKDKMAEAYSEI]GMKGERRRGKGHDGL[YQGLSTATKDTYDAL]HMQALPPR(SEQ ID NO:81)；NQL[YNELNLGRREEYDVL]DKR(SEQ ID NO:14)；EGL[YNELQKDKMAEAYSEI]GMK(SEQ ID NO:15)；或DGL[YQGLSTATKDTYDAL]HMQ(SEQ ID NO:16)，其中用括号将ITAM基元括起来。
在一些情况下，胞内活化域来源于T细胞表面糖蛋白CD3δ链(也称为CD3D、CD3-δ、T3D、CD3抗原、δ子单元、CD3δ、CD3d抗原、δ多肽(TiT3复合物)、OKT3、δ链、T细胞受体T3δ链、T细胞表面糖蛋白CD3δ链等)。因此，合适的胞内活化域可包括与以下序列中的至少10个、15个、20个或全部氨基酸的一段或与以下氨基酸序列中的任一者的约100个氨基酸至约110个氨基酸(aa)、约110aa至约115aa、约115aa至约120aa、约120aa至约130aa、约130aa至约140aa、约140aa至约150aa或约150aa至约160aa的一连续段具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的域：MEHSTFLSGLVLATLLSQVSPFKIPIEELEDRVFVNCNTSITWVEGTVGTLLSDITRLDLGKRILDPRGIYRCNGTDIYKDKESTVQVHYRMCQSCVELDPATVAGIIVTDVIATLLLALGVFCFAGHETGRLSGAADTQALLRNDQV[YQPLRDRDDAQYSHL]GGNWARNK(SEQ ID NO:17)或MEHSTFLSGLVLATLLSQVSPFKIPIEELEDRVFVNCNTSITWVEGTVGTLLSDITRLDLGKRILDPRGIYRCNGTDIYKDKESTVQVHYRTADTQALLRNDQV[YQPLRDRDDAQYSHL]GGNWARNK(SEQ ID NO:18)，其中用括号将ITAM基元括起来。
同样，合适的胞内活化域多肽可包含全长CD3δ氨基酸序列的含有ITAM基元的部分。因此，合适的胞内活化域可包括与以下序列中的至少10个、15个、20个或全部氨基酸的一段具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的域：DQV[YQPLRDRDDAQYSHL]GGN(SEQ ID NO:19)，其中用括号将ITAM基元括起来。
在一些情况下，胞内活化域来源于T细胞表面糖蛋白CD3ε链(也称为CD3e、T细胞表面抗原T3/Leu-4ε链、T细胞表面糖蛋白CD3ε链、AI504783、CD3、CD3ε、T3e等)。因此，合适的胞内活化域可包括与以下序列中的至少10个、15个、20个或全部氨基酸的一段或与以下氨基酸序列的约100个氨基酸至约110个氨基酸(aa)、约110aa至约115aa、约115aa至约120aa、约120aa至约130aa、约130aa至约140aa、约140aa至约150aa或约150aa至约160aa的一连续段具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的域：MQSGTHWRVLGLCLLSVGVWGQDGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILTCPQYPGSEILWQHNDKNIGGDEDDKNIGSDEDHLSLKEFSELEQSGYYVCYPRGSKPEDANFYLYLRARVCENCMEMDMSVATIVIVDICITGGLLLLVYYWSKNRKAKAKPVTRGAGAGGRQRGQNKERPPPVPNPD[YEPIRKGQRDLYSGL]NQRRI(SEQID NO:20)，其中用括号将ITAM基元括起来。
同样，合适的胞内活化域多肽可包含全长CD3ε氨基酸序列的含有ITAM基元的部分。因此，合适的胞内活化域可包括与以下序列中的至少10个、15个、20个或全部氨基酸的一段具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的域：NPD[YEPIRKGQRDLYSGL]NQR(SEQ ID NO:21)，其中用括号将ITAM基元括起来。
在一些情况下，胞内活化域来源于T细胞表面糖蛋白CD3γ链(也称为CD3G、T细胞受体T3γ链、CD3-γ、T3G、γ多肽(TiT3复合物)等)。因此，合适的胞内活化域可包括与以下序列中的至少10个、15个、20个或全部氨基酸的一段或与以下氨基酸序列的约100个氨基酸至约110个氨基酸(aa)、约110aa至约115aa、约115aa至约120aa、约120aa至约130aa、约130aa至约140aa、约140aa至约150aa或约150aa至约160aa的一连续段具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的域：MEQGKGLAVLILAIILLQGTLAQSIKGNHLVKVYDYQEDGSVLLTCDAEAKNITWFKDGKMIGFLTEDKKKWNLGSNAKDPRGMYQCKGSQNKSKPLQVYYRMCQNCIELNAATISGFLFAEIVSIFVLAVGVYFIAGQDGVRQSRASDKQTLLPNDQL[YQPLKDREDDQYSHL]QGNQLRRN(SEQ ID NO:22)，其中用括号将ITAM基元括起来。
同样，合适的胞内活化域多肽可包含全长CD3γ氨基酸序列的含有ITAM基元的部分。因此，合适的胞内活化域可包括与以下序列中的至少10个、15个、20个或全部氨基酸的一段具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的域：DQL[YQPLKDREDDQYSHL]QGN(SEQ ID NO:23)，其中用括号将ITAM基元括起来。
在一些情况下，胞内活化域来源于CD79A(也称为B细胞抗原受体复合物相关的蛋白质α链；CD79a抗原(免疫球蛋白相关的α)；MB-1膜糖蛋白；Ig-α；膜结合的免疫球蛋白相关的蛋白质；表面IgM相关的蛋白质等)。因此，合适的胞内活化域可包括与以下序列中的至少10个、15个、20个或全部氨基酸的一段或与以下氨基酸序列中的任一者的约100个氨基酸至约110个氨基酸(aa)、约110aa至约115aa、约115aa至约120aa、约120aa至约130aa、约130aa至约140aa、约140aa至约150aa或约150aa至约160aa的一连续段具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的域：MPGGPGVLQALPATIFLLFLLSAVYLGPGCQALWMHKVPASLMVSLGEDAHFQCPHNSSNNANVTWWRVLHGNYTWPPEFLGPGEDPNGTLIIQNVNKSHGGIYVCRVQEGNESYQQSCGTYLRVRQPPPRPFLDMGEGTKNRIITAEGIILLFCAVVPGTLLLFRKRWQNEKLGLDAGDEYEDENL[YEGLNLDDCSMYEDI]SRGLQGTYQDVGSLNIGDVQLEKP(SEQ ID NO:24)或MPGGPGVLQALPATIFLLFLLSAVYLGPGCQALWMHKVPASLMVSLGEDAHFQCPHNSSNNANVTWWRVLHGNYTWPPEFLGPGEDPNEPPPRPFLDMGEGTKNRIITAEGIILLFCAVVPGTLLLFRKRWQNEKLGLDAGDEYEDENL[YEGLNLDDCSMYEDI]SRGLQGTYQDVGSLNIGDVQLEKP(SEQ ID NO:25)，其中用括号将ITAM基元括起来。
同样，合适的胞内活化域多肽可包含全长CD79A氨基酸序列的含有ITAM基元的部分。因此，合适的胞内活化域可包括与以下序列中的至少10个、15个、20个或全部氨基酸的一段具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的域：ENL[YEGLNLDDCSMYEDI]SRG(SEQ ID NO:26)，其中用括号将ITAM基元括起来。
在一些情况下，胞内活化域来源于DAP12(也称为TYROBP；TYRO蛋白质酪氨酸激酶接合蛋白质；KARAP；PLOSL；DNAX活化蛋白质12；KAR相关蛋白质；TYRO蛋白质酪氨酸激酶结合蛋白质；杀伤活化受体相关的蛋白质；杀伤活化受体相关的蛋白质等)。举例而言，合适的胞内活化域可包括与以下序列中的至少10个、15个、20个或全部氨基酸的一段或与以下氨基酸序列(4个同种型)中的任一者的约100个氨基酸至约110个氨基酸(aa)、约110aa至约115aa、约115aa至约120aa、约120aa至约130aa、约130aa至约140aa、约140aa至约150aa或约150aa至约160aa的一连续段具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的域：MGGLEPCSRLLLLPLLLAVSGLRPVQAQAQSDCSCSTVSPGVLAGIVMGDLVLTVLIALAVYFLGRLVPRGRGAAEAATRKQRITETESP[YQELQGQRSDVYSDL]NTQRPYYK(SEQ ID NO:27)、MGGLEPCSRLLLLPLLLAVSGLRPVQAQAQSDCSCSTVSPGVLAGIVMGDLVLTVLIALAVYFLGRLVPRGRGAAEATRKQRITETESP[YQELQGQRSDVYSDL]NTQ(SEQ ID NO:28)、MGGLEPCSRLLLLPLLLAVSDCSCSTVSPGVLAGIVMGDLVLTVLIALAVYFLGRLVPRGRGAAEAATRKQRITETESP[YQELQGQRSDVYSDL]NTQRPYYK(SEQ ID NO:29)或MGGLEPCSRLLLLPLLLAVSDCSCSTVSPGVLAGIVMGDLVLTVLIALAVYFLGRLVPRGRGAAEATRKQRITETESP[YQELQGQRSDVYSDL]NTQRPYYK(SEQ IDNO:30)，其中用括号将ITAM基元括起来。
同样，合适的胞内活化域多肽可包含全长DAP12氨基酸序列的含有ITAM基元的部分。因此，合适的胞内活化域可包括与以下序列中的至少10个、15个、20个或全部氨基酸的一段具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的域：ESP[YQELQGQRSDVYSDL]NTQ(SEQ ID NO:31)，其中用括号将ITAM基元括起来。
在一些情况下，胞内活化域来源于FCERlG(也称为FCRG；Fcε受体Iγ链；Fc受体γ链；fc-εRI-γ；fcRγ；fceRIγ；高亲和性免疫球蛋白ε受体子单元γ；免疫球蛋白E受体、高亲和性γ链等)。举例而言，合适的胞内活化域可包括与以下序列中的至少10个、15个、20个或全部氨基酸的一段或与以下氨基酸序列的约50个氨基酸至约60个氨基酸(aa)、约60aa至约70aa、约70aa至约80aa或约80aa至约88aa的一连续段具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的域：MIPAVVLLLLLLVEQAAALGEPQLCYILDAILFLYGIVLTLLYCRLKIQVRKAAITSYEKSDGV[YTGLSTRNQETYETL]KHEKPPQ(SEQID NO:32)，其中用括号将ITAM基元括起来。
同样，合适的胞内活化域多肽可包含全长FCER1G氨基酸序列的含有ITAM基元的部分。因此，合适的胞内活化域可包括与以下序列中的至少10个、15个、20个或全部氨基酸的一段具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的域：DGV[YTGLSTRNQETYETL]KHE(SEQ ID NO:33)，其中用括号将ITAM基元括起来。
适用于本发明的工程化信号传导多肽中的胞内活化域包括DAP10/CD28型信号传导链。DAP10信号传导链的一实例为氨基酸SEQ ID NO:34。在一些实施例中，合适的胞内活化域可包括与SEQ ID NO:34中的至少10个、15个、20个或全部氨基酸的一段具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的域。
CD28信号传导链的一实例为氨基酸SEQ ID NO:35。在一些实施例中，合适的胞内活化域可包括与SEQ ID NO:35中的至少10个、15个、20个或全部氨基酸的一段具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的域。
适用于本发明的工程化信号传导多肽中的胞内活化域包括ZAP70多肽，例如，合适的胞内活化域可包括与SEQ ID NO:36中的至少10个、15个、20个或全部氨基酸的一段或与以下氨基酸序列的约300个氨基酸至约400个氨基酸、约400个氨基酸至约500个氨基酸或约500个氨基酸至约619个氨基酸的一连续段具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的域。
调节域
调节域可改变工程化信号传导多肽中的胞内活化域的作用，包括增强或抑制活化域的下游作用或改变反应的性质。适用于本发明的工程化信号传导多肽中的调节域包括共刺激域。适合于工程化信号传导多肽中的包涵体的调节域的长度可为约30个氨基酸至约70个氨基酸(aa)，例如，调节域的长度可为约30aa至约35aa、约35aa至约40aa、约40aa至约45aa、约45aa至约50aa、约50aa至约55aa、约55aa至约60aa、约60aa至约65aa或约65aa至约70aa。在其他情况下，调节域的长度可为约70aa至约100aa、约100aa至约200aa，或大于200aa。
共刺激域通常增强和/或改变活化域的反应的性质。适用于本发明的工程化信号传导多肽中的共刺激域通常为衍生自受体的多肽。在一些实施例中，共刺激域同源二聚。个体共刺激域可为跨膜蛋白质的胞内部分(亦即，共刺激域可衍生自跨膜蛋白质)。合适的共刺激多肽的非限制性实施例包括(但不限于)4-lBB(CD137)、CD27、CD28、用于Lck结合(ICΔ)缺失的CD28、ICOS、OX40、BTLA、CD27、CD30、GITR及HVEM。举例而言，本发明的方面的共刺激域可与4-lBB(CD137)、CD27、CD28、用于Lck结合(ICΔ)缺失的CD28、ICOS、OX40、BTLA、CD27、CD30、GITR或HVEM的共刺激域具有至少80％、90％或95％序列一致性。举例而言，本发明的方面的共刺激域可与合适的共刺激多肽的非限制性实施例的共刺激域具有至少80％、90％或95％序列一致性，这些实例包括(但不限于)4-lBB(CD137)、CD27、CD28、用于Lck结合(ICΔ)缺失的CD28、ICOS、OX40、BTLA、CD27、CD30、GITR及HVEM。举例而言，本发明的方面的共刺激域可与4-lBB(CD137)、CD27、CD28、用于Lck结合(ICΔ)缺失的CD28、ICOS、OX40、BTLA、CD27、CD30、GITR或HVEM的共刺激域具有至少80％、90％或95％序列一致性。
适合于工程化信号传导多肽中的包涵体的共刺激域的长度可为约30个氨基酸至约70个氨基酸(aa)，例如，共刺激域的长度可为约30aa至约35aa、约35aa至约40aa、约40aa至约45aa、约45aa至约50aa、约50aa至约55aa、约55aa至约60aa、约60aa至约65aa或约65aa至约70aa。在其他情况下，共刺激域的长度可为约70aa至约100aa、约100aa至约200aa，或大于200aa。
在一些情况下，共刺激域衍生自跨膜蛋白质CD137(也称为TNFRSF9；CD137；4-lBB；CDwl37；ILA等)的胞内部分。举例而言，合适的共刺激域可包括与SEQ ID NO:1中的至少10个、15个、20个或全部氨基酸的一段具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的域。在这些实施例中的一些中，共刺激域的长度为约30aa至约35aa、约35aa至约40aa、约40aa至约45aa、约45aa至约50aa、约50aa至约55aa、约55aa至约60aa、约60aa至约65aa或约65aa至约70aa。
在一些情况下，共刺激域衍生自跨膜蛋白质CD28(也称为Tp44)的胞内部分。举例而言，合适的共刺激域可包括与SEQ ID NO:2中的至少10个、15个、20个或全部氨基酸的一段具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的域。在这些实施例中的一些中，共刺激域的长度为约30aa至约35aa、约35aa至约40aa、约40aa至约45aa、约45aa至约50aa、约50aa至约55aa、约55aa至约60aa、约60aa至约65aa或约65aa至约70aa。
在一些情况下，共刺激域衍生自为用于Lck结合(ICΔ)所缺失的跨膜蛋白质CD28的胞内部分。举例而言，合适的共刺激域可包括与SEQ ID NO:3中的至少10个、15个、20个或全部氨基酸的一段具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的域。在这些实施例中的一些中，共刺激域的长度为约30aa至约35aa、约35aa至约40aa、约40aa至约45aa、约45aa至约50aa、约50aa至约55aa、约55aa至约60aa、约60aa至约65aa或约65aa至约70aa。
在一些情况下，共刺激域衍生自跨膜蛋白质ICOS(也称为AILIM、CD278及CVIDl)的胞内部分。举例而言，合适的共刺激域可包括与SEQ ID NO:4中的至少10个、15个、20个或全部氨基酸的一段具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的域。在这些实施例中的一些中，共刺激域的长度为约30aa至约35aa、约35aa至约40aa、约40aa至约45aa、约45aa至约50aa、约50aa至约55aa、约55aa至约60aa、约60aa至约65aa或约65aa至约70aa。
在一些情况下，共刺激域衍生自跨膜蛋白质OX40(也称为TNFRSF4、RP5-902P8.3、ACT35、CD134、OX-40、TXGPlL)的胞内部分。举例而言，合适的共刺激域可包括与SEQ ID NO:5中的至少10个、15个、20个或全部氨基酸的一段具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的域。在这些实施例中的一些中，共刺激域的长度为约30aa至约35aa、约35aa至约40aa、约40aa至约45aa、约45aa至约50aa、约50aa至约55aa、约55aa至约60aa、约60aa至约65aa或约65aa至约70aa。
在一些情况下，共刺激域衍生自跨膜蛋白质CD27(也称为S152、T 14、TNFRSF7及Tp55)的细胞内部分。举例而言，合适的共刺激域可包括与SEQ ID NO:6中的至少10个、15个、20个或全部氨基酸的一段具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的域。在这些实施例中的一些中，共刺激域的长度为约30aa至约35aa、约35aa至约40aa、约40aa至约45aa、约45aa至约50aa。
在一些情况下，共刺激域衍生自跨膜蛋白质BTLA(也称为BTLAl及CD272)的胞内部分。举例而言，合适的共刺激域可包括与SEQ ID NO:7中的至少10个、15个、20个或全部氨基酸的一段具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的域。
在一些情况下，共刺激域衍生自跨膜蛋白质CD30(也称为TNFRSF8、DlS166E及Ki-1)的胞内部分。举例而言，合适的共刺激域可包括与SEQ ID NO:8中的约100个氨基酸至约110个氨基酸(aa)、约110aa至约115aa、约115aa至约120aa、约120aa至约130aa、约130aa至约140aa、约140aa至约150aa、约150aa至约160aa或约160aa至约185aa的一段具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的域。
在一些情况下，共刺激域衍生自跨膜蛋白质GITR(也称为TNFRSF18、RP5-902P8.2、AITR、CD357及GITR-D)的胞内部分。举例而言，合适的共刺激域可包括与SEQ ID NO:9中的至少10个、15个、20个或全部氨基酸的一段具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的域。在这些实施例中的一些中，共刺激域的长度为约30aa至约35aa、约35aa至约40aa、约40aa至约45aa、约45aa至约50aa、约50aa至约55aa、约55aa至约60aa、约60aa至约65aa或约65aa至约70aa。
在一些情况下，共刺激域衍生自跨膜蛋白质HVEM(也称为TNFRSF14、RP3-395M20.6、ATAR、
Figure BDA0002257374180000301
CD270、HVEA、HVEM、LIGHTR及TR2)的胞内部分。举例而言，合适的共刺激域可包括与SEQ ID NO:10中的至少10个、15个、20个或全部氨基酸的一段具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的域。在这些实施例中的一些中，第一多肽及第二多肽的共刺激域的长度为约30aa至约35aa、约35aa至约40aa、约40aa至约45aa、约45aa至约50aa、约50aa至约55aa、约55aa至约60aa、约60aa至约65aa或约65aa至约70aa。
接头
在一些情况下，工程化信号传导多肽包括在任何两个相邻域之间的接头。举例而言，接头可在跨膜域与第一刺激域之间。作为另一实例，ASTR可为抗体，且接头可在重链与轻链之间。作为另一实例，接头可在ASTR与跨膜域及共刺激域之间。作为另一实例，接头可在第二多肽的共刺激域与胞内活化域之间。作为另一实例，接头可在ASTR与胞内信号传导域之间。
接头肽可具有多种氨基酸序列中的任一者。蛋白质可通过通常具有柔性性质之间隔肽连接，但不排除其他化学键。接头可为长度在约1个与约100个氨基酸之间，或长度在约1个与约25个氨基酸之间的肽。这些接头可通过使用合成的编码接头的寡核苷酸偶合这些蛋白质来产生。可使用具有一定程度柔性的肽接头。连接肽可实际上具有任何氨基酸序列，考虑到合适的接头将具有产生通常柔性肽的序列。较小氨基酸(诸如甘氨酸及丙氨酸)的用途为用于创建柔性肽。此类序列的创建对于熟悉此项技术人员而言为常规的。
合适的接头可易于选择且可为合适的不同长度中的任一者，诸如1个氨基酸(例如Gly)至20个氨基酸、2个氨基酸至15个氨基酸、3个氨基酸至12个氨基酸，包括4个氨基酸至10个氨基酸、5个氨基酸至9个氨基酸、6个氨基酸至8个氨基酸、或7个氨基酸至8个氨基酸，且可为1个、2个、3个、4个、5个、6个或7个氨基酸。
例示性柔性接头包括甘氨酸聚合物(G)n、甘氨酸-丝氨酸聚合物(包括例如(GS)n、GSGGSn、GGGSn及GGGGSn，其中n为至少一的整数)，甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物，及此项技术中已知的其他柔性接头。甘氨酸及甘氨酸-丝氨酸聚合物引人感兴趣，这是由于这些氨基酸的两者均为相对非结构化的，且因此可作为组分之间的中性链。甘氨酸聚合物尤其令人感兴趣，这是由于甘氨酸比甚至丙氨酸具有显著更多的phi-psi空间，且比具有较长侧链的残基受到更少限制(参见Scheraga,Rev.Computational Chem.11173-142(1992))。例示性柔性接头包括(但不限于)GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:53)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:54)、GGGGSGGGSGGGGS(SEQ ID NO:55)、GGSG(SEQ ID NO:56)、GGSGG(SEQ ID NO:57)、GSGSG(SEQ IDNO:58)、GSGGG(SEQ ID NO:59)、GGGSG(SEQ ID NO:60)、GSSSG(SEQ ID NO:61)，以及类似者。一般熟练技术人员将认识到，将肽结合至上文所描述的任何组件的设计可包括为完全或部分柔性的接头，使得接头可包括柔性接头以及赋予较低柔性结构的一个或多个部分。
组合
在一些实施例中，通过复制缺陷型重组反转录病毒颗粒提供的多核苷酸具有编码一种或多种工程化信号传导多肽的某些组合的一个或多个转录单元。在本文所提供的一些方法及组合物中，在通过复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转录T细胞之后，经基因方式修饰的T细胞包括一种或多种工程化信号传导多肽的组合。将理解，称为“第一多肽”、“第二多肽”、“第三多肽”等是出于方便性，且“第一多肽”上的组件及“第二多肽”上的组件表示这些组件在不同多肽上，这些多肽称为第一或第二以通常在特异性多肽的其他组件或步骤中仅供参考及为了方便性。
在一些实施例中，第一工程化信号传导多肽包括能够结合抗原的胞外抗原结合域，及胞内信号传导域。在其他实施例中，第一工程化信号传导多肽还包括T细胞存活基元和/或跨膜域。在一些实施例中，第一工程化信号传导多肽不包括共刺激域，而在其他实施例中，第一工程化信号传导多肽的确包括共刺激域。
在一些实施例中，第二工程化信号传导多肽包括淋巴增生性基因产物及视情况的胞外抗原结合域。在一些实施例中，第二工程化信号传导多肽还包括以下中的一者或多者：T细胞存活基元、胞内信号传导域，及一个或多个共刺激域。在其他实施例中，当使用两种工程化信号传导多肽时，至少一者为CAR。
在一个实施例中，一种或多种工程化信号传导多肽在相同转录物下在T细胞特异性启动子或一般启动子下表达，其中在该转录物中，编码工程化信号传导多肽的核酸由编码一种或多种内部核糖体进入位点(IRE)或一种或多种蛋白酶裂解肽的核酸分隔开。
在某些实施例中，多核苷酸编码两种工程化信号传导多肽，其中第一工程化信号传导多肽包括能够结合第一抗原的第一胞外抗原结合域，及第一胞内信号传导域而非共刺激域，且第二工程化信号传导多肽包括能够结合VEGF的第二胞外抗原结合域，及第二胞内信号传导域，诸如共刺激分子的信号传导域。在某一实施例中，第一抗原为PSCA、PSMA或BCMA。在某一实施例中，第一胞外抗原结合域包含抗体或其片段(例如scFv)，例如对PSCA、PSMA或BCMA具有特异性的抗体或其片段。在某一实施例中，结合VEGF的第二胞外抗原结合域为VEGF的受体，亦即VEGFR。在某些实施例中，VEGFR为VEGFR1、VEGFR2或VEGFR3。在某一实施例中，VEGFR为VEGFR2。
在某些实施例中，多核苷酸编码两种工程化信号传导多肽，其中第一工程化信号传导多肽包括胞外肿瘤抗原结合域及CD3ζ信号传导域，且第二工程化信号传导多肽包括抗原结合域(其中该抗原为血管生成或血管原性因子)，及一个或多个共刺激分子信号传导域。血管生成因子可为例如VEGF。一个或多个共刺激分子信号传导基元可包含例如来自CD27、CD28、OX40、ICOS及4-1BB中的每一者的共刺激信号传导域。
在某些实施例中，多核苷酸编码两种工程化信号传导多肽，其中第一工程化信号传导多肽包括胞外肿瘤抗原结合域及CD3ζ信号传导域，第二多肽包含能够结合VEGF的抗原结合域的抗原结合域，及来自CD27、CD28、OX40、ICOS及4-1BB中的每一者的共刺激信号传导域。在另一实施例中，第一信号传导多肽或第二信号传导多肽还具有T细胞存活基元。在一些实施例中，T细胞存活基元为IL-7受体(IL-7R)的胞内信号传导域、IL-12受体的胞内信号传导域、IL-15受体的胞内信号传导域、IL-21受体的胞内信号传导域，或转变生长因子β(TGFβ)受体或TGFβ诱饵受体(TGF-β——显性-负型受体II(DNRII))的胞内信号传导域或衍生自其等。
在某些实施例中，多核苷酸编码两种工程化信号传导多肽，其中第一工程化信号传导多肽包括胞外肿瘤抗原结合域及CD3ζ信号传导域，且第二工程化信号传导多肽包含能够结合VEGF的抗原结合域、IL-7受体胞内T细胞存活基元、及来自CD27、CD28、OX40、ICOS及4-1BB中的每一者的共刺激信号传导域。
在一些实施例中，由多核苷酸编码超过两种信号传导多肽。在某些实施例中，仅工程化信号传导多肽中的一者包括结合至肿瘤相关的抗原或肿瘤特异性抗原的抗原结合域；这些工程化信号传导多肽中的剩余者的每一者包含结合至非肿瘤相关的抗原或非肿瘤特异性抗原的抗原结合域。在其他实施例中，工程化信号传导多肽中的两者或更多者包括结合至一种或多种肿瘤相关的抗原或肿瘤特异性抗原的抗原结合域，其中这些工程化信号传导多肽中的至少一者包含未结合至肿瘤相关的抗原或肿瘤特异性抗原的抗原结合域。
在一些实施例中，肿瘤相关的抗原或肿瘤特异性抗原为Her2、前列腺干细胞抗原(PSCA)、PSMA(前列腺特异性膜抗原)、B细胞成熟抗原(BCMA)α-胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、癌症抗原-125(CA-125)、CA19-9、钙视网膜蛋白、MUC-1、上皮膜蛋白(EMA)、上皮肿瘤抗原(ETA)、酪氨酸酶、黑素瘤相关的抗原(MAGE)、CD34、CD45、CD99、CD117、嗜铬粒蛋白、细胞角蛋白、结蛋白、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、大囊性疾病流体蛋白(GCDFP-15)、HMB-45抗原、蛋白黑色素A(T淋巴细胞识别的黑素瘤抗原；MART-1)、肌凝蛋白-D1、肌肉特异性肌动蛋白(MSA)、神经纤毛、神经元特异性烯醇酶(NSE)、胎盘碱性磷酸酶、突触泡蛋白、甲状腺球蛋白、甲状腺转录因子-1、丙酮酸激酶同工酶M2型(肿瘤M2-PK)、CD19、CD22、CD27、CD30、CD70、GD2(神经节苷脂G2)、EphA2、CSPG4、CD138、FAP(纤维母细胞活化蛋白)、CD171、κ整合素、λ整合素、5T4整合素、αvβ6整合素、整合素αvβ3(CD61)、泌乳激素K-Ras(V-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒致癌基因)、Ral-B、B7-H3、B7-H6、CAIX、CD20、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、EGFR、EGP2、EGP40、EpCAM、胚胎AchR、FRα、GD3、HLA-A1+MAGE1、HLA-A1+NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、刘易斯-Y(Lewis-Y)、Muc16、NCAM、NKG2D配位体、NY-ESO-1、PRAME、ROR1、存活素、TAG72、TEMs、VEGFR2、EGFRvIII(表皮生长因子变体III、精子蛋白17(Sp17)、间皮素、PAP(前列腺酸性磷酸酶)、前列腺卵白、TARP(T细胞受体γ替代读取框蛋白)、Trp-p8、STEAP1(前列腺1的六跨膜上皮抗原)、异常鼠蛋白或异常p53蛋白。
在一些实施例中，第一工程化信号传导多肽包括结合第一抗原的第一胞外抗原结合域，及第一胞内信号传导域；且第二工程化信号传导多肽包括结合第二抗原或结合第二抗原的受体的第二胞外抗原结合域，及第二胞内信号传导域，其中该第二工程化信号传导多肽不包含共刺激域。在某一实施例中，第一抗原结合域及第二抗原结合域独立地为受体的抗原结合部分或抗体的抗原结合部分。在某一实施例中，第二抗原结合域或第二抗原结合域中的一者或两者为scFv抗体片段。在某些实施例中，第一工程化信号传导多肽和/或第二工程化信号传导多肽额外包含跨膜域。在某一实施例中，第一工程化信号传导多肽或第二工程化信号传导多肽包含T细胞存活基元，例如本文所描述的T细胞存活基元中的任一者。
在另一实施例中，第一工程化信号传导多肽包括结合HER2的第一胞外抗原结合域，且第二工程化信号传导多肽包括结合MUC-1的第二胞外抗原结合域。
在另一实施例中，第二工程化信号传导多肽的第二胞外抗原结合域结合白细胞介素。
在另一实施例中，第二工程化信号传导多肽的第二胞外抗原结合域结合损伤相关的分子模式分子(DAMP；也称为警报素(alarmin))。在另一实施例中，DAMP为热休克蛋白质、染色质相关的蛋白质高迁移率组盒1(HMGB1)、S100A8(也称为MRP8或钙粒蛋白A)、S100A9(也称为MRP14或钙粒蛋白B)、血清淀粉样蛋白A(SAA)、脱氧核糖核酸、三磷酸腺苷、尿酸或硫酸肝素。
在某些实施例中，该第二抗原为抗体上的抗原，该抗体结合由肿瘤细胞呈递的抗原。
在一些实施例中，经由第二工程化信号传导多肽的信号转导活化为非抗原性的，但与低氧有关。在某些实施例中，低氧是通过低氧诱导因子-1α(HIF-1α)、HIF-1β、HIF-2α、HIF-2β、HIF-3α或HIF-3β的活化诱导的。
在一些实施例中，一种或多种工程化信号传导多肽的表达是由在本文中更详细地公开的控制组件调节的。
额外序列
工程化信号传导多肽(诸如CAR)可进一步包括一种或多种额外多肽域，其中此类域包括(但不限于)信号序列、抗原决定基标记、亲和域，及可例如通过抗体分析法或由于其为产生可检测信号的多肽而检测(可检测标记)其存在或活性的多肽。对于本文所提供的方面或实施例中的任一者的额外域的非限制性实施例包括与如下文所描述的以下序列中的任一者具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的域：信号序列、抗原决定基标记、亲和域或产生可检测信号的多肽。
适用于个体CAR(例如个体CAR的第一多肽)中的信号序列包括任何真核信号序列，其包括天然存在的信号序列、合成的(例如，人造的)信号序列等。在一些实施例中，举例而言，信号序列可为CD8信号序列MALPVTALLLPLALLLHAARP(SEQ ID NO:74)。
合适的抗原决定基标记包括(但不限于)凝血素(HA；例如YPYDVPDYA；SEQ ID NO:37)、FLAG(例如DYKDDDDK；SEQ ID NO:38)、c-myc(例如EQKLISEEDL；SEQ ID NO:39)以及类似者。
亲和域包括可与结合搭配物(例如在固体载体上固定的一者)相互作用的适用于识别或纯化的肽序列。编码多个连续的单一氨基酸(例如组氨酸)的DNA序列当与所表达蛋白质融合时，可用于通过高亲和力结合至树脂柱(诸如琼脂糖凝胶)的重组蛋白质的一步纯化。例示性亲和域包括His5(HHHHH；SEQ ID NO:40)、HisX6(HHHHHH；SEQ ID NO:41)、c-myc(EQKLISEEDL；SEQ ID NO:39)、Flag(DYKDDDDK；SEQ ID NO:38)、Strep标记(WSHPQFEK；SEQID NO:42)、凝血素(例如，HA标记(YPYDVPDYA；SEQ ID NO:37))、GST、硫氧还蛋白、纤维素结合域、RYIRS(SEQ ID NO:43)、Phe-His-His-Thr(SEQ ID NO:44)、甲壳素结合域、S肽、T7肽、SH2域、C端RNA标记、WEAAAREACCRECCARA(SEQ ID NO:45)、金属结合域，例如锌结合域或钙结合域，诸如来自钙结合蛋白质的那些例如钙调蛋白、肌钙蛋白C、钙调神经磷酸酶B、肌球蛋白轻链、恢复蛋白、S调节素、视锥蛋白、VILIP、神经钙蛋白、海马钙结合蛋白、聚集蛋白、钙牵蛋白(caltractin)、钙蛋白酶大亚基、S100蛋白，小白蛋白、钙结合蛋白D9K、钙结合蛋白D28K及钙视蛋白、内含肽、生物素、链霉亲和素、MyoD、Id、亮氨酸拉链序列以及麦芽糖结合蛋白。
合适的可检测信号产生蛋白质包括例如荧光蛋白质、催化产生可检测信号作为产物的反应的酶，以及类似者。
合适的荧光蛋白质包括(但不限于)绿色荧光蛋白质(GFP)或其变体、GFP的蓝色荧光变体(BFP)、GFP的青色荧光变体(CFP)、GFP的黄色荧光变体(YFP)、增强型GFP(EGFP)、增强型CFP(ECFP)、增强型YFP(EYFP)、GFPS65T、Emerald、Topaz(TYFP)、Venus、Citrine、mCitrine、GFPuv、不稳定的EGFP(dEGFP)、不稳定的ECFP(dECFP)、不稳定的EYFP(dEYFP)、mCFPm、Cerulean、T-Sapphire、CyPet，Ypet、mKO、HcRed、t-HcRed、DsRed、DsRed2、DsRed-单体、J-Red、二聚体2、t-二聚体2(12)、mRFP1、珊瑚、Renilla GFP、Monster GFP、paGFP、Kaede蛋白质及点燃蛋白质、藻胆蛋白及藻胆蛋白偶联物，包括B-藻红蛋白、R-藻红蛋白及别藻蓝蛋白。荧光蛋白质的其他实例包括mHoneydew、mBanana、mOrange、dTomato、tdTomato、mTangerine、mStrawberry、mCherry、mGrapel、mRaspberry、mGrape2、mPlum(Shaner等人(2005)Nat.Methods 2:905-909)，以及类似者。适宜使用来自Anthozoan物种的多种荧光及有色蛋白质中的任一者，如例如Matz等人(1999)Nature Biotechnol.17:969-973中所描述。
合适的酶包括(但不限于)辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶(GAL)、葡萄糖-6-磷酸去氢酶、β-N-乙酰胺基葡糖苷酶、β-葡糖苷酸酶、转化酶、黄嘌呤氧化酶、萤火虫荧光素酶、葡萄糖氧化酶(GO)，以及类似者。
识别域和/或消除域
本文所提供的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒中的任一者可包括编码识别域或消除域的核酸，该识别域或消除域作为编码本文所提供的工程化信号传导多肽中的任一者的核酸的部分或与其隔开。因此，本文所提供的工程化信号传导多肽中的任一者可包括识别域或消除域。举例而言，本文所公开的CAR中的任一者可包括识别域或消除域。此外，识别域或消除域可与本文所公开的淋巴增生性组件中的任一者一起表达，或甚至与其融合。识别域或消除域在T细胞和/或NK细胞上表达，但不在复制缺陷型重组反转录病毒颗粒上表达。
在一些实施例中，识别域或消除域可来源于单纯疱疹病毒衍生的酶胸苷激酶(HSV-tk)或诱导型半胱天冬酶9。在一些实施例中，识别域或消除域可包括经修饰之内源细胞表面分子，例如如美国专利8,802,374中所公开。经修饰之内源细胞表面分子可为任何细胞表面相关的受体、配位体、糖蛋白、细胞黏着分子、抗原、整合素或经修饰的分化簇(CD)。在一些实施例中，经修饰之内源细胞表面分子为经截短的酪氨酸激酶受体。在一个方面中，经截短酪氨酸激酶受体为表皮生长因子受体(EGFR)家族中的成员，例如ErbB1、ErbB2、ErbB3、ErbB4。在一些实施例中，识别域可为由抗体识别的多肽，该抗体识别EGFR成员的胞外域。在一些实施例中，识别域可为EGFR家族成员的至少20个连续氨基酸，或在例如EGFR家族成员的20个与50个连续氨基酸之间。举例而言，SEQ ID NO:78为由识别EGFR成员的胞外域的抗体结合且在适当条件下识别的例示性多肽。此类胞外EGFR抗原决定基有时在本文中称为eTag。在说明性实施例中，此类抗原决定基由可市购抗EGFR单克隆抗体识别。
也称为EGFR、ErbB1及HER1的表皮生长因子受体为胞外配位体的表皮生长因子家族的成员的细胞表面受体。EGFR活性的改变已涉及某些癌症。在一些实施例中，编码包括人类表皮生长因子受体(EGFR)的EGFR多肽的基因是由移除编码包括膜远程EGF结合域及细胞质信号传导尾的多肽但保留由抗EGFR抗体识别的胞外膜近端抗原决定基的核酸序列来构筑的。较佳地，抗体为已知可市购的抗EGFR单克隆抗体，诸如西妥昔单抗(cetuximab)、马妥珠单抗(matuzumab)、尼西珠单抗(necitumumab)或帕尼单抗(panitumumab)。
其他已显示，生物素标记的西妥昔单抗结合抗生物素微珠应用于免疫磁选择成功地丰富T细胞，该T细胞已用含有EGFRt的构建体自低至2％的群体慢病毒转导至大于90％的纯度，而对细胞制剂无可观测毒性。此外，其他已显示，此惰性EGFR分子的组成性表达不影响T细胞表型或如由协调表达的嵌合抗原受体(CAR)，CD19R引导的效应功能。此外，其他已显示，经由流式细胞术分析，EGFR成功地用作小鼠中的T细胞移植的体内的追踪标记物。此外，已通过
Figure BDA0002257374180000341
介导的抗体依赖型细胞毒性(ADCC)路径论证EGFR具有自杀基因潜力。本发明的发明者已使用慢病毒载体在PBMC中成功地表达eTag，且已发现暴露于西妥昔单抗的PBMC在活体外表达eTag，提供一种PBMC的有效的消除机制。因此，EGFR可用作具有免疫治疗潜力的转导性T细胞的非免疫基因选择工具、追踪标记物及自杀基因。EGFR核酸也可通过此项技术中熟知的方法来检测。
在本文所提供的一些实施例中，EGFR表达为还包括CAR的单一多肽的部分或表达为包括淋巴增生性组件的单一多肽的部分。在一些实施例中，可通过裂解信号和/或核糖体跳跃序列将编码EGFR识别域的氨基酸与编码嵌合抗原受体的氨基酸隔开。核糖体跳跃和/或裂解信号可为此项技术中已知的任何核糖体跳跃和/或裂解信号。不受理论限制，核糖体跳跃序列可为例如具有氨基酸序列GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQ ID NO:77)的T2A(也称为2A-1)。不受理论限制，裂解信号及核糖体跳跃序列的其他实例包括FMDV2A(F2A)、马A型鼻病毒2A(简称E2A)、猪捷申病毒1 2A(P2A)及扁刺蛾属(Thoseaasigna)病毒2A(T2A)。在一些实施例中，编码识别域的多核苷酸序列可与CAR或淋巴增生性组件在相同的转录物上，但通过内部核糖体进入位点与编码CAR或淋巴增生性组件的多核苷酸序列隔开。
在如本文中例示性列举的其他实施例中，识别域可表达为与淋巴增生性组件融合的融合多肽的部分。此类构建体与单独的多肽相比提供，尤其结合本文中提供的其他“空间节省”组件，在RNA基因组上占用更少的基因组空间的优势。在一个说明性实施例中，eTag表达为与IL7Rα突变体融合的融合多肽，如在本文中实验地论证。
嵌合抗原受体
在本发明的一些方面中，工程化信号传导多肽为嵌合抗原受体(CAR)或编码CAR的多核苷酸，为简单起见，其在本文称为“CAR”。本发明的CAR包括：a)至少一个抗原特异性靶向区(ASTR)；b)跨膜域；及c)胞内活化域。在说明性实施例中，CAR的抗原特异性靶向区为抗体针对靶标抗原的scFv部分。在说明性实施例中，胞内活化域来自CD3z。
本发明的CAR可存在于真核细胞(例如，哺乳动物细胞)的质膜中，其中合适的哺乳动物细胞包括(但不限于)细胞毒性细胞、T淋巴细胞、干细胞、干细胞的子代、祖细胞、祖细胞的子代及NK细胞、NK-T细胞及巨噬细胞。当存在于真核细胞的质膜中使，本发明的CAR在存在一个或多个靶标抗原(在某些条件下，结合ASTR)下经活化。靶标抗原为特异性结合对的第二成员。特异性结合对的靶标抗原可为可溶性(例如，未结合至细胞)因子；存在于诸如靶标细胞等细胞的表面上的因子；存在于实体表面上的因子；存在于脂质双层上的因子；以及类似者。当ASTR为抗体，且特异性结合对的第二成员为抗原时，抗原可为可溶性(例如，未结合至细胞)抗原；存在于诸如靶标细胞等细胞的表面上的抗原；存在于实体表面上的抗原；存在于脂质双层上的抗原；以及类似者。
在一些情况下，本发明的CAR在存在于真核细胞的质膜中时且由一种或多种靶标抗原活化时，使细胞中的至少一个核酸的表达增加。举例而言，在一些情况下，本发明的CAR在存在于真核细胞的质膜中时且由一种或多种靶标抗原活化时，与在不存在一种或多种靶标抗原下的核酸的转录水平相比，使细胞中的至少一个核酸的表达增加至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约75％、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约5倍、至少约10倍，或大于10倍。
作为一实例，本发明的CAR可包括含有基于免疫受体酪氨酸的活化基元(ITAM)的胞内信号传导多肽。
在一些情况下，本发明的CAR在存在于真核细胞的质膜中时且由一种或多种靶标抗原活化时，可使得细胞产生一种或多种细胞因子增加。举例而言，本发明的CAR在存在于真核细胞的质膜中时且由一种或多种靶标抗原活化时，与在不存在一种或多种靶标抗原下细胞所产生的细胞因子量相比，可使得细胞产生细胞因子增加至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约75％、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约5倍、至少约10倍，或大于10倍。其产量可增加的细胞因子包括(但不限于)干扰素γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-a)、IL-2、IL-15、IL-12、IL-4、IL-5、IL-10；趋化因子；生长因子；以及类似者。
在一些情况下，本发明的CAR在存在于真核细胞的质膜中时且由一种或多种靶标抗原活化时，可导致细胞中的核酸的转录增加及细胞产生细胞因子增加两者。
在一些情况下，本发明的CAR在存在于真核细胞的质膜中时且由一种或多种靶标抗原活化时，产生细胞朝向靶标细胞的细胞毒性活性，该靶标细胞在其细胞表面上表达抗原，该抗原与CAR的第一多肽的抗原结合域结合。举例而言，当真核细胞为细胞毒性细胞(例如，NK细胞或细胞毒性T淋巴细胞)时，本发明的CAR在存在于真核细胞的质膜中时且由一种或多种靶标抗原活化时，使细胞朝向靶标细胞的细胞毒性活性增加，该靶标细胞在其细胞表面上表达一种或多种靶标抗原。举例而言，当真核细胞为NK细胞或T淋巴细胞时，本发明的CAR在存在于真核细胞的质膜中时且由一种或多种靶标抗原活化时，与在不存在一种或多种靶标抗原下的细胞的细胞毒性活性相比，使得细胞的细胞毒性活性增加至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约75％、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约5倍、至少约10倍，或大于10倍。
在一些情况下，本发明的CAR在存在于真核细胞的质膜中时且由一种或多种靶标抗原活化时，可产生与其他CAR活化相关的事件，诸如增生及扩增(由于细胞分裂或抗凋亡反应增强)。
在一些情况下，本发明的CAR在存在于真核细胞的质膜中时且由一种或多种靶标抗原活化时，可产生与其他CAR活化相关的事件，诸如胞内信号传导调节、胞分化或细胞死亡。
在一些情况下，本发明的CAR受微环境限制。此特性通常为CAR的ASTR域的受微环境限制性质的结果。因此，本发明的CAR可具有较低结合亲和力或，在说明性实施例中，在微环境的条件下比在正常生理环境的条件下可具有针对一种或多种靶标抗原的更高结合亲和力。
淋巴增生性组件
尽管细胞连续增加，但周边T淋巴细胞数在整个成年期间维持非常稳定的水平，这是由于自胸腺移出及响应于抗原遭遇(antigen encounter)的增生，及由于在抗原清除之后去除抗原特异性效应的细胞的损耗(Marrak,P.等人.2000.Nat Immunol 1:107-111；Freitas,A.A.等人.2000.Annu Rev Immunol 18:83-111)。周边T细胞区室的尺寸由影响增生及存活两者的多个因素来调节。然而，在淋巴细胞减少的环境下，T淋巴细胞独立于同源抗原分裂，这是由于维持周边T细胞区室的尺寸的“急性恒定增生”机制。已通过活体内增生T细胞且将其等引入至淋巴消耗的个体中而在过继细胞疗法期间的个体或患者中建立淋巴细胞减少症的条件，从而导致经转移T细胞的植入及抗肿瘤功能增强。然而，个体的淋巴消耗是不希望的，这是由于其可引起严重的副作用，包括免疫紊乱及死亡。
研究已显示，淋巴消耗移除作为稳定细胞因子的细胞槽之内源性淋巴细胞，从而释放细胞因子以诱导过继转移的细胞的存活及增生。已知一些诸如IL-7及IL-15的细胞因子介导T细胞的抗原非依赖性增生且因此能够在非淋巴细胞减少的环境中诱发稳定增生。然而，这些细胞因子及其受体具有在稳态下防止淋巴增生性疾病的固有控制机制。
本文提供的许多方面包括淋巴增生性组件，或编码其的核酸，通常作为工程化信号传导多肽的部分。因此，在本发明的一些方面中，工程化信号传导多肽为淋巴增生性组件，诸如嵌合淋巴增生性组件(CLE)。通常，CLE含有胞外域、跨膜域及驱动增生的至少一个胞内信号传导域。CLE不包含ASTR及活化域两者。在本文的说明性实施例中，通常通过用复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转导静息T细胞和/或静息NK细胞而将一种或多种淋巴增生性组件引入至静息T细胞和/或静息NK细胞中，这些反转录病毒颗粒的基因组编码作为工程化信号传导多肽的部分的淋巴增生性组件。淋巴增生性组件可包括信号传导胞内域或可包括多于一个胞内域。在某些说明性实施例中，淋巴增生性组件包括两个胞内域。本文提供及实施例17及实施例18所论述的表7至表23提供使用本文中的实验方法鉴别的具有一个胞内域的CLE及具有两个胞内域的CLE，这些实验方法测试包括表6中所鉴别的胞外域及胞内域的不同组合的候选嵌合多肽。
在一些说明性实施例中，淋巴增生性组件可为或可包含细胞因子，或在另外的说明性实施例中，细胞因子受体，或包括其信号传导域的片段，其活化STAT3路径、STAT4路径，或甚至在另外的说明性实施例中，Jak/STAT5路径。由此，在非限制性实施例中，淋巴增生性组件可为细胞因子受体或包括其信号传导域的活性片段，诸如白细胞介素受体，或包括活化STAT5的其信号传导域的活性片段。因此，淋巴增生性组件为促进增生且视情况存活(抗凋亡)并视情况提供增强淋巴细胞的分化状态、增生潜能或对细胞死亡的抗性的共刺激信号的多肽。在说明性实施例中，淋巴增生性组件为诱导T细胞和/或NK细胞的增生的多肽。说明性淋巴增生性组件通过活化STAT5诱导增生。因此，此淋巴增生性组件的片段在说明性实施例中保留通过活化STAT5诱导T细胞和/或NK细胞的增生的能力。
在说明性实施例中，当存在于经基因方式修饰的PBMC、淋巴细胞或经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞中时，淋巴增生性组件能够促进淋巴细胞增生/扩增且在细胞至细胞因子(诸如IL-15、IL-7，且在说明性实施例中，IL-2)及在培养6天、7天、14天、21天或35天期间通过细胞表达的CAR的ASTR的靶标的暴露的缺失下视情况离体或活体外存活于培养物中。
在本文所呈现的方法及组合物中的一些中，淋巴增生性组件用于促进经基因方式修饰的T细胞活体内的增生或扩增而不必使个体淋巴消耗。由此，可进行本文所提供的方法(包括通常通过转导此类T细胞和/或NK细胞而将淋巴增生性组件插入至个体的静息T细胞和/或NK细胞中)的非限制性说明实施例，而不在进行该方法之前、期间和/或之后使个体淋巴消耗，或不在进行此方法之前自个体收集血液之前、期间和/或之后使个体淋巴消耗，或不离体以基因方式修饰来自个体的T细胞和/或NK细胞之前、期间和/或之后，和/或在将这些经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞再引入至个体中之前、期间和/或之后使个体淋巴消耗。促进T细胞活体内的增生的因子包括细胞因子及其受体，其中受体通常包括配位体结合域及信号传导域。在一些实施例中，用于本文所公开的方法及组合物中的淋巴增生性组件为细胞因子和/或细胞因子受体。细胞因子可为白细胞介素，且细胞因子受体可为白细胞介素受体。淋巴增生性组件可为细胞因子的功能性片段和/或细胞因子受体的功能性片段(诸如其信号传导域)，其中该片段能够例如通过活化STAT5来促进T细胞的增生。
在一些实例中，本文中的方法及组合物中的细胞因子淋巴增生性组件包括以下中的一者或多者：白细胞介素-7(IL-7)或其受体(IL-7R)，或其信号传导域；白细胞介素-12(IL-12)或其受体(IL-12R)，或其信号传导域；白细胞介素-23(IL-23)或其由IL-12Rβ1及IL-23R组成的受体，或其信号传导域；白细胞介素-27(IL-27)或其受体(IL-27R)，或其信号传导域；白细胞介素-15(IL-15)或其受体(IL-15R)，或其信号传导域；白细胞介素-21(IL-21)或其受体(IL-21R)，或其信号传导域；或转变生长因子β(TGFβ)或其受体(TGFβR)或其信号传导域；或TGFβ诱饵受体(TGF-β——显性-负型受体II(DNRII))。在一些实施例中，淋巴增生性组件为IL-12R或TGFβ诱饵受体(TGF-β-显性负型受体II(DNRII))。
IL-7结合至IL-7受体(一种由IL-7Rα及常见的γ链组成的杂二聚体)。结合产生对于胸腺内的T细胞发育及周边内的存活至关重要的信号级联。已知IL-7与IL-7受体的结合使Jak/STAT5路径活化。
IL-12涉及原生T细胞分化成Th1细胞(Hsieh CS等人.1993.Science.260(5107):547-9)且称为T细胞刺激因子。IL-12结合至IL-12受体(其为由IL-12R-β1及IL-12R-β2形成的杂二聚体受体)。IL12可通过活化STAT4而起作用，但经显示同样活化T细胞中的STAT5(Ahn,H.等人.1998.J.Immun.161:5893-5900)。IL-12家族由细胞因子IL-12、IL-23及IL-27组成。IL-23的受体由IL-12Rβ1及IL-23R组成。IL-27为由两种不同基因(Epstein-Barr病毒诱导的基因3(EBI3)及IL-27p28)组成的杂二聚体细胞因子。IL-27与IL-27受体相互作用。
IL-15为结构及功能上类似于IL-2的T细胞及NK细胞刺激因子。两种细胞因子均诱导T细胞的增生；且认为其共享功能是由使用IL-2/IL-15Rβ及常见γ链的两种受体产生的。IL-15的信号传导路径通过与IL-15Rα受体结合，且随后向其细胞表面上带有IL-15Rβγc复合物的周围细胞呈递来开始。在结合IL-15β后，子单元即活化詹纳斯激酶1(Janus kinase1；Jak1)及γc子单元詹纳斯激酶3(Jak3)，该γc子单元詹纳斯激酶3导致STAT3及STAT5的磷酸化及活化。
IL-21在经活化的人类CD4+T细胞及NK T细胞中表达，且IL-21表达在T辅助细胞的Th2及Th17子集中经上调。IL-21受体(IL-21R)在T细胞、B细胞及NK细胞的表面上表达且在结构上类似于如同IL-2R或IL-15的其他I型细胞因子的受体。IL-21R需要与常见γ链(γc)二聚合以便结合IL-21。当结合至IL-21时，IL-21受体经由Jak/STAT路径起作用，从而活化STAT1、STAT3及STAT5。
TGFβ诱饵受体(TGF-β—显性-负型受体II(DNRII))通过与天然受体竞争TGFβ结合来阻断TGFβ信号传导。TGFβ-DNRII为激酶失活的截短形式的RII，其含有RII的胞外TGFβ结合域及跨膜域。TGFβ-DNRII结合配位体但并不使RI磷酸化及活化，此从而减少或消除Smad磷酸化。
已在患有B细胞及T细胞急性淋巴母细胞白血病(B-ALL及T-ALL)的个体中鉴别出IL-7Rα的功能性增加的突变(Zenatti PP等人.2011.Nat Genet 43:932-939；Snochat,C.等人.2011.J Exp Med 208:901-908；McElroy,C.A.等人.2012.PNAS 109(7):2503-2508)。突变包括在IL-7RαTMD的N端区中的插入及缺失，其中几乎所有的序列均含有额外的Cys残基，及S165至C165突变。半胱氨酸导致受体的组成性活化。所有T群组中的突变中的一些使JAK1活化。这些功能性增加的IL-7R突变体可在本文所提供的方面中的任一者中用作淋巴增生性组件中的一者。
因此，在一些实施例中，淋巴增生性组件为经突变的IL-7受体。在其他实施例中，经突变的IL-7受体为组成性活性的，从而在不存在细胞因子配位体的情况下使JAK-STAT5路径活化。在又其他实施例中，经突变的IL-7受体包含在237与254之间的位置处的1个至10个氨基酸插入，该插入包括半胱氨酸残基，该半胱氨酸残基包括组成性活化STAT5路径的能力。在一些实施例中，经突变的IL-7受体为IL-7Rα-insPPCL(由SEQ ID NO:82表示)。此外，在本文提供的一些嵌合淋巴增生性组件(CLE)实施例中，域中的一个或多个(但并非所有)来自IL-7Rα-insPPCL。
在一些实施例中，淋巴增生性组件为嵌合细胞因子受体，诸如但不限于连接至其受体的细胞因子，该受体通常组成性活化与对应经活化野生型细胞因子受体(诸如STAT3、STAT4，以及在说明性实施例中，STAT5)相同的STAT路径。在一些实施例中，嵌合细胞因子受体为白细胞介素或其片段，该白细胞介素或其片段经由接头连接至或共价连接至其同源受体。在一些实施例中，嵌合细胞因子受体为连接至IL-7Rα的IL-7。在其他实施例中，嵌合细胞因子受体为连接至IL-7Rα域的IL-7，诸如IL-7Rα的胞外域和/或IL-7Rα的跨膜域。在一些实施例中，淋巴增生性组件为未连接至细胞因子的细胞因子受体，且实际上在一些实施例中，本文所提供的淋巴增生性组件为未连接至细胞因子的组成性活性的细胞因子受体。这些嵌合IL-7受体在表达时通常组成性活化STAT5。
在本文提供的包括淋巴增生性组件的方法及组合物中的任一者的说明性实施例中，其中淋巴增生性组件为细胞因子或细胞因子受体多肽或其包含信号传导域的片段，淋巴增生性组件可包含经由接头共价连接至其同源白细胞介素受体多肽的部分。通常，同源白细胞介素受体的此部分包括能够结合白细胞介素细胞因子的胞外域及跨膜域的功能性部分。在一些实施例中，胞内域为同源白细胞介素受体的胞内部分。在一些实施例中，胞内域为能够促进淋巴细胞增生的不同细胞因子受体的胞内部分。在一些实施例中，淋巴增生性组件为经由接头共价连接至其全长同源白细胞介素受体多肽的白细胞介素多肽。
在一些实施例中，淋巴增生性组件可包括细胞因子受体或包括其信号传导域的片段。在一些实施例中，细胞因子受体可为CD40、CRLF2、CSF2RA、CSF2RB、CSF3R、EPOR、GHR、IFNAR1、IFNAR2、IFNGR1、IFNGR2、IFNLR1、IL1R1、IL1RAP、IL1RL1、IL1RL2、IL2RA、IL2RG、IL2RB、IL3RA、IL4R、IL5RA、IL6R、IL6ST、IL7RA、IL9R、IL10RA、IL10RB、IL12RB1、IL13RA2、IL15RA、IL17RA、IL17RB、IL17RC、IL17RE、IL18R1、IL18RAP、IL20RA、IL20RB、IL21R、IL22RA1、IL23R、IL27R、IL31RA、LEPR、LIFR、MPL、OSMR、PRLR、TNFRSF4、TNFRSF8、TNFRSF9、TNFRSF14或TNFRSF18。在实施例17及实施例18中测试包括以上所列的细胞因子受体的功能性胞内域的嵌合细胞因子受体的例示性实施例以确认包括这些功能性胞内域的嵌合细胞因子受体可起淋巴增生性组件的作用。
在某些说明性实施例中，淋巴增生性组件包含细胞因子受体或包括活化Jak/STAT5路径的信号传导域的其片段。举例而言，此淋巴增生性组件可包括IL21R、IL27R、IL31RA、LIFR及OSMR的胞内域。如实施例17及实施例18的实验及表7至表17中所显示，在候选嵌合多肽中发现包括这些基因的胞内域的嵌合淋巴增生性组件，这些候选嵌合多肽在不存在诸如IL-2的外源性细胞因子的情况下培养的PBMC中诱导最高程度的增生。
在一些实施例中，淋巴增生性组件可包含为白细胞介素或白细胞介素受体且为在实施例17及18(表7至17)中的库1A、1.1A、2B、2.1B、3A、3.1A、3B、3.1B、4B和/或4.1B中识别的最优构建体的部分的胞内域。在一些实施例中，淋巴增生性组件可包含为细胞因子受体且为在实施例17及18(表7至17)中的库1A、1.1A、2B、2.1B、3A、3.1A、3B、3.1B、4B和/或4.1B中识别的最优构建体的部分的胞内域。在一些实施例中，淋巴增生性组件可包含包括至少一个ITAM基元且为在实施例17及18(表7至17)中的库1A、1.1A、2B、2.1B、3A、3.1A、3B、3.1B、4B和/或4.1B中识别的最优构建体的部分的胞内域。
在说明性实施例中，淋巴增生性组件可包含来自IL7R、IL12RB1、IL15RA或IL27RA的胞内域，其存在于如实施例17及18(表19至23)中详述的在初始筛选及重复筛选中显示尤其值得注意的富集(亦即，引起最高程度的增生)的构建体中。
在说明性实施例中，淋巴增生性组件可包含来自以下细胞因子受体的胞内域：CD27、CD40、CRLF2、CSF2RA、CSF3R、EPOR、FCER1G、FCGR2A、FCGR2C、GHR、IFNAR1、IFNAR2、IFNGR2、IL1R1、IL1RL1、IL2RA、IL2RG、IL3RA、IL5RA、IL6R、IL7R、IL9R、IL10RB、IL11RA、IL12RB1、IL13RA1、IL13RA2、IL15RA、IL17RB、IL18R1、IL18RAP、IL20RB、IL22RA1、IL27RA、IL31RA、LEPR、MPL、OSMR、PRLR、TNFRSF4、TNFRSF8、TNFRSF9、TNFRSF14或TNFRSF18，其存在于如实施例17及18(表19至23)中详述的在初始筛选及重复筛选中显示尤其值得注意的富集(亦即，引起最高程度的增生)的构建体中。
在说明性实施例中，淋巴增生性组件可包含来自CD3D、CD3E、CD3G、CD79A、CD79B、FCER1G、FCGR2A或FCGR2C的胞内域，其包括至少一个ITAM基元且存在于如实施例17及18(表19至23)中详述的在初始筛选及重复筛选中显示尤其值得注意的富集(亦即，引起最高程度的增生)的构建体中。
在一些实施例中，此段落中的淋巴增生性组件(其在实施例17及18中显示在具有仅单一胞内域的构建体中具有活性)可为具有两个或更多个胞内域，或在说明性实施例中具有单一胞内域(亦即，该淋巴增生性组件不包含两个或更多个胞内域)的淋巴增生性组件的胞内域。在说明性实施例中，淋巴增生性组件中的胞内域包含来自以下的域：CD40、CRLF2、CSF2RA、CSF3R、EPOR、FCGR2A、IFNAR2、IFNGR2、IL1R1、IL3RA、IL7R、IL10RB、IL11RA、IL12RB1、IL13RA2、IL18RAP、IL31RA、MPL、MYD88、TNFRSF14或TNFRSF18，其存在于如在作为单一胞内信号传导域的实施例18(表22及23)中详述的在初始筛选及重复筛选中显示尤其值得注意的富集(亦即，引起最高程度的增生)的构建体中。在说明性实施例中，淋巴增生性组件中的胞内域包含来自IL7R或IL12RB1的域，其存在于如实施例18(表22及23)中详述的在初始筛选及重复筛选中显示尤其值得注意的富集(亦即，引起最高程度的增生)的构建体中。在一些实施例中，具有单一胞内域的淋巴增生性组件中的胞内域可为细胞因子受体。在说明性实施例中，具有单一胞内域的淋巴增生性组件中的细胞因子受体包含来自以下的域：CD40、CRLF2、CSF2RA、CSF3R、EPOR、FCGR2A、IFNAR2、IFNGR2、IL1R1、IL3RA、IL7R、IL10RB、IL11RA、IL12RB1、IL13RA2、IL18RAP、IL31RA、MPL、TNFRSF14或TNFRSF18，其存在于如实施例18(表22及23)中详述的在初始筛选及重复筛选中显示尤其值得注意的富集(亦即，引起最高程度的增生)的构建体中。在一些实施例中，淋巴增生性组件中的胞内域可包括至少一个ITAM基元。在说明性实施例中，包括至少一个ITAM基元的淋巴增生性组件中的胞内域包含来自FCGR2A的域，其存在于如实施例18(表22)中详述的在初始筛选及重复筛选中显示尤其值得注意的富集(亦即，引起最高程度的增生)的构建体中。
在说明性实施例中，淋巴增生性组件可包含来自CD27、CD28、OX40(也称为TNFRSF4)、GITR(也称为TNFRSF18)或HVEM(也称为TNFRSF14)的共刺激域，其存在于如实施例17及18(表19至23)中详述的在初始筛选及重复筛选中显示尤其值得注意的富集(亦即，引起最高程度的增生)的构建体中。
在一些实施例中，淋巴增生性组件可为以下构建体中的一者：M024-S190-S047、M025-S050-S197、M036-S170-S047、M012-S045-S048、M049-S194-S064、M025-S190-S050、M025-S190-S05、E013-T041-S186-S051、E013-T028-S186-S051、E014-T015-S186-S051、E011-T016-S186-S050、E011-T073-S186-S050或E013-T011-S186-S211，其全部如实施例21(图35及36)中所示在转导之后刺激静息淋巴细胞的增生。在某些实施例中，淋巴增生性组件包含来自CSF3R、IL3RA、ICOS、CRLF、CSF2RA、LIFR或CD40的胞外域；来自MyD88、CD40或MPL的第一胞内域，和/或来自CD27或MyD88的第二胞内域。
在一些实施例中，淋巴增生性组件可为构建体E013-T041-S186-S051，其如实施例22(图38A及图38B)中所显示及分析在用显示UCHT1scFvFc-GPI的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒之后刺激静息淋巴细胞的增生。在其他实施例中，淋巴增生性组件为IL7-IL7RA-IL2RB，如实施例22中所示出且分析。
如实施例17中详述，对于库1A及1.1A，具有来自细胞因子受体CD27、IL1RL1、IL6R、IL31RA、TNFRSF4或TNFRSF18的域的构建体在库1A及1.1A(表19)中皆显示尤其值得注意的富集(亦即，引起最高程度的增生)。
如实施例17中详述，对于库2B及2.1B，具有来自细胞因子受体CD40、FCER1G、FCGR2C、IFNGR2、GHR、IL10RB、IL11RA、IL13RA2、IL17RB、IL22RA1、TNFRSF14或TNFRSF9的域的构建体在库2B及2.1B(表20)中皆显示尤其值得注意的富集(亦即，引起最高程度的增生)。
如实施例18中详述，对于库3A及3.1A，具有来自细胞因子受体CD27、CD40、CSF2RA、FCGR2A、MPL、OSMR、TNFRSF4或TNFRSF18的域的构建体在库3A及3.1A(表21)中皆显示尤其值得注意的富集(亦即，引起最高程度的增生)。
如实施例18中详述，对于库3B及3.1B，具有来自细胞因子受体CD27、CD40、CRLF2、CSF2RA、CSF3R、EPOR、FCER1G、FCGR2A、FCGR2C、IFNAR1、IFNAR2、IFNGR2、IL1RL1、IL2RG、IL3RA、IL5RA、IL6R、IL7R、IL9R、IL10RB、IL11RA、IL12RB1、IL13RA1、IL13RA2、IL15RA、IL18RAP、IL20RB、IL27RA、IL31RA、LEPR、MPL、OSMR、PRLR、TNFRSF4、TNFRSF8、TNFRSF9、TNFRSF14或TNFRSF18的域的构建体在库3B及3.1B(表22)中皆显示尤其值得注意的富集(亦即，引起最高程度的增生)。
如实施例18中详述，对于库4B及4.1B，具有来自细胞因子受体CD27、CD40、CRLF2、CSF2RA、CSF3R、EPOR、FCGR2A、FCGR2C、IFNAR2、IFNGR2、IL1R1、IL2RA、IL3RA、IL2RG、IL6R、IL7R、IL10RB、IL11RA、IL31RA、IL13RA1、IL13RA2、IL18R1、MPL、OSMR、TNFRSF4、TNFRSF9或TNFRSF18的域的构建体在库4B及4.1B(表23)中皆显示尤其值得注意的富集(亦即，引起最高程度的增生)。
在某些说明性实施例中，淋巴增生性组件包含CD40、MPL及IL2Rb的胞内域，其在本文中的实施例中经证实以促进PBMC增生。
在一些实施例中，淋巴增生性组件可不为细胞因子受体。在一些实施例中，除细胞因子受体以外的淋巴增生性组件可包括来自以下的胞内信号传导域：CD2、CD3D、CD3G、CD3Z、CD4、CD8RA、CD8RB、CD28、CD79A、CD79B、FCER1G、FCGR2A、FCGR2C或ICOS。在实施例17及实施例18及其中引用的表中提供包括这些所叙述基因的嵌合淋巴增生性组件的例示性实施例。
在一些实施例中，CLE不为连接至IL-2/IL-15受体的IL-15。
在本文所公开的方法及组合物的一些中，淋巴增生性组件的表达是通过化合物与控制组件(如本文其他地方所论述)的结合来诱导且甚至可依赖于该结合，该控制组件在非限制性实施例中为核糖开关。在一些实施例中，淋巴增生性组件由在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子表达。对于本文所提供的方法及组合物，熟练技术人员将认识到，启已知动子在T细胞和/或NK细胞中具有活性且可用于表达第一工程化信号传导多肽或第二工程化信号传导多肽，或其任何组分。在说明性实施例中，此启动子在包装细胞系(诸如本文所公开的包装株)中为无活性的。在一些实施例中，启动子为EF1α启动子或鼠干细胞病毒(MSCV)启动子(Jones等人,Human Gene Therapy(2009)20:630-40)。在说明性实施例中，启动子为T细胞特异性CD3ζ启动子。
在一些实施例中，淋巴增生性组件受微环境限制。举例而言，淋巴增生性组件可为在异常条件相对于生理条件下差异性结合其各别细胞因子的突变受体。举例而言，可使用在肿瘤环境下比在正常生理环境下可更强烈地结合IL7的IL-7R。
在一些实施例中，淋巴增生性组件融合至识别域或消除域。在本文中更详细地公开此类识别域或消除域。此融合提供了，尤其在使用经截短或其他突变的淋巴增生性组件时，在反转录病毒基因组中需要更少的多核苷酸的优势。此在本文所提供的说明性实施例中为重要的，这是由于其有助于允许编码功能性组件的更多核酸包括于反转录病毒基因组中且由于其添加了机制，若不再需要其的增生或其的增生对有机体有害，则可通过该机制杀灭表达淋巴增生性组件的细胞。
在一些实施例中，淋巴增生性组件(包括CLE)包含如上文所公开的胞内活化域。在一些说明性实施例中，淋巴增生性组件为包含胞内活化域的CLE，该胞内活化域包含含ITAM域。由此，CLE可包含胞内活化域，该胞内活化域与本文所提供的CD3Z、CD3D、CD3E、CD3G、CD79A、CD79B、DAP12、FCERlG、FCGR2A、FCGR2C、DAP10/CD28或ZAP70域具有至少80％、90％、95％、98％或100％序列一致性。在某些说明性实施例中，胞内活化域为来自以下的含ITAM域：CD3D、CD3G、CD3Z、CD79A、CD79B、FCER1G、FCGR2A或FCGR2C。包含胞内活化域的CLE在证实于本文中的实施例17及实施例18及相关表18至表23中，其在不存在外源性细胞因子(诸如外源性IL-2)的情况下在培养物中离体促进PBMC的增生时为有效的。在一些实施例中，本文提供包含来自以下的胞内域的CLE：CD3D、CD3G、CD3Z、CD79A、FCER1G。
在一些实施例中，淋巴增生性组件的一个或多个域融合至CAR的共刺激域和/或胞内活化域。如本文所公开的嵌合淋巴增生性组件不为嵌合抗原受体(CAR)，这是由于其不包含ASTR。然而，在一些实施例中，淋巴增生性组件的一个或多个胞内域可为与CAR相同的多肽的部分或可融合或视情况功能性地连接至CAR的一些组分。举例而言，淋巴增生性组件可融合至抗原特异性靶向区(ASTR)且通过将ASTR结合至其抗原进行活化。在又其他实施例中，工程化信号传导多肽可包括ASTR、胞内活化域(诸如CD3ζ信号传导域)、共刺激域及淋巴增生性域。关于共刺激域、胞内活化域、ASTR及其他CAR域的其他细节公开于本文中的其他地方中。
在本文的说明性实施例中，通常通过用复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转导静息T细胞和/或静息NK细胞而将T细胞和/或NK细胞存活组件引入至静息T细胞和/或静息NK细胞中，该复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的基因组编码作为工程化信号传导多肽的部分的T细胞和/或NK细胞存活组件。在一些实施例中，淋巴增生性组件也为T细胞和/或NK细胞存活组件。如上文所论述，淋巴增生性组件中的一些不仅促进增生，而且其同样促进细胞存活。在一些实施例中，T细胞和/或NK细胞存活基元不为淋巴增生性组件。在一些实施例中，T细胞和/或NK细胞存活基元可为CD28 T细胞存活基元或CD137细胞存活基元。这些T细胞存活基元可在包括ASTR(诸如scFv)的工程化信号传导多肽中找到。在一说明性实施例中，T细胞存活基元为经由CD8a跨膜域或CD28跨膜域连接至scFv的CD28 T细胞存活基元或CD137基元。在某些实施例中，该胞内信号传导域包含多肽序列，该多肽序列包含基于免疫受体酪氨酸的活化基元(ITAM)。在某一实施例中，该多肽序列为CD3ζ信号传导域。
在一些实施例中，淋巴增生性组件不为多肽，相反包含抑制性RNA。在一些实施例中，根据本文中的任何方面的过程的方法、用途、组合物及产物包括包含抑制性RNA的淋巴增生性组件及为工程化信号传导多肽的淋巴增生性组件。在淋巴增生性组件为抑制性RNA的实施例中，该抑制性RNA可为通常通过利用使SOCS路径中的负调节子降解或下调而增强STAT5的活化来刺激STAT5路径的miRNA。在一些实施例中，miRNA是指编码影响增生的蛋白质的mRNA，诸如但不限于ABCG1、SOCS1、TGFbR2、SMAD2、cCBL及PD1。在说明性实施例中，如本文所例示，此抑制性RNA(例如miRNA)可定位于包装细胞和/或复制缺陷型重组反转录病毒颗粒基因组和/或反转录病毒载体中之内含子中，且通常通过在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子驱动来表达。不受理论的限制，认为转录单元中之内含子的包涵体导致转录物的更高表达和/或稳定性。由此，将miRNA置放于反转录病毒基因组之内含子中的能力增加了本发明的教示，该教示克服了先前技术中试图使最大活性达到反转录病毒(诸如慢病毒基因组)的大小限制的挑战。在一些实施例中，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个miRNA(在说明性实施例中，2个与5个之间的(例如4个)miRNA(其中的一者或多者各自结合编码ABCG1、SOCS1、TGFbR2、SMAD2、cCBL及PD1中的一者或多者的核酸))可包括于重组反转录病毒基因组中且使用本文所提供的方法传递至靶标细胞，例如T细胞和/或NK细胞。实际上，如本文所提供，1个、2个、3个或4个miRNA可传递于单个内含子(诸如EF1a内含子)中。
ABCG1为对胸腺细胞及周边淋巴细胞增生进行负调节的ATP结合卡匣转运蛋白(Armstrong等人.2010.J Immunol 184(1):173-183)。
SOCS1为抑制Jak/Stat路径(诸如STAT5)的细胞因子信号转导的负调节子的SOCS(细胞因子信号传导的抑制因子)家族的成员。SOCS1也称为JAB(Janus激酶结合蛋白质)、SSI-1(Stat诱导的Stat抑制剂-1)及TIP3(Tec相互作用蛋白质)。
TGFbR2为丝氨酸/苏氨酸蛋白质激酶家族的成员，该丝氨酸/苏氨酸蛋白质激酶家族结合TGF-β，从而形成使蛋白质磷酸化的复合物，随后进入细胞核且调节与增生相关的基因的转录。
SMAD2介导转变生长因子(TGF)-β的信号且调节多个细胞过程，诸如细胞增生、凋亡及分化。
cCBL为通过使ZAP-70去磷酸化且失活且经由TCR之内化来抑制TCR信号传导的E3泛素连接酶。
PD1(CD279)为在T细胞及ProB细胞上表达的细胞表面受体。PD-1结合两种配位体，PD-L1及PD-L2。经由PD-1进行信号传导起防止细胞活化的作用。
在一些实施例中，本文中的淋巴增生性组件为包含表18的基因中的任一者胞内区的多肽。在一些实施例中，淋巴增生性组件包含或为在表18的嵌合多肽中所鉴别的胞内域。在这些实施例中，淋巴增生性组件可为多肽，该多肽为嵌合多肽(参加下文CLE)，或不为CLE，但包含或为在表18的P3(第一胞内域)位置中所鉴别的基因的胞内域。表18鉴别在第7天与第二胞内域不存在于构建体上只最后一天之间促进PBMC的增生的CLE构建体。在此实施例的一些子实施例中，在具有或不具有包含二聚基元的胞外域的情况下，淋巴增生性组件为包括跨膜域及胞内域的组合的嵌合多肽(亦即CLE，参见下文)。
在一些实施例中，淋巴增生性组件包含MPL或为MPL或其变体或片段，包括在具有或不具有MPL的跨膜域和/或胞外域的情况下包括至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的MPL的胞内域，和/或在具有或不具有MPL的跨膜域和/或胞外域的情况下与MPL的胞内域具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的变体或片段，其中变体和/或片段保留促进PBMC(且在一些实施例中，T细胞)的细胞增生的能力。在一些实施例中，包括于本文中的组合物及方法中的MPL片段具有和/或保留JAK-2结合域。在一些实施例中，包括于本文中的MPL片段具有或保留活化STAT的能力。MPL的全胞内域为SEQ ID NO:491(表7至表18中的部分S186)。MPL为促血小板生成素的受体。诸如促血小板生成素及EPO的若干细胞因子在文献及本文中称作激素或细胞因子。
在一些实施例中(其提供本发明的单独方面)，本文提供为嵌合淋巴增生性组件(CLE)的嵌合多肽以及经分离多核苷酸及编码其的核酸序列。例示性CLE说明于图30至图33中。本文中的CLE促进T细胞和/或NK细胞的增生且可视情况还促进T细胞和/或NK细胞的存活。一些CLE促进增生且视情况还促进其他类型的PBMC(例如B细胞)的存活。包括编码CLE及CAR的核酸序列的本文所提供的实施例在本文中称作出于设计方便的CLE CAR多核苷酸实施例。在一些实施例中，CLE可包括跨膜域及第一胞内域。此外，在说明性实施例中，如图30至图33所显示，CLE包括胞外域和/或第二胞内域(且在另外的实施例中，第三胞内域、第四胞内域等等)。本文中的嵌合多肽为嵌合的，这是由于至少一个域来自与其他域中的至少一者不同的多肽且此嵌合体在无人类干预的情况不能自然地在有机体中找到。一些CLE包括受体的配位体且一些CLE不包括受体的配位。
不受理论限制，这些CLE经设计以组成性方式(亦即，不需要用于活化的配位体结合)促进B细胞、NK细胞和/或T细胞的增生及视情况细胞存活。CLE中无一者可在自然中找到，且许多CLE具有通常不在B细胞、T细胞和/或NK细胞中活体内表达的组分，和/或一些候选CLE不通常已知用于特异性地促进B细胞、T细胞和/或NK细胞的细胞增生和/或细胞存活信号传导。举例而言，MPL通常不在B细胞、T细胞和/或NK细胞中表达。出人意料地，如实施例17及实施例18中所阐述通过筛选大量候选嵌合多肽所鉴别的新CLE促进PBMC细胞增生。这些CLE有助于满足鉴别刺激B细胞、T细胞和/或NK细胞的增生以及视情况存活的机制的长期需求，诸如对重要的临床相关技术而言将为有益的，诸如以基因方式工程化以表达所定义TCR的CAR-T及T细胞。由此，据信一些CLE将向T细胞和/或NK细胞提供活体内扩增且无需使宿主淋巴消耗的能力。
本文所提供的嵌合淋巴增生性组件及经分离多核苷酸及编码其的核酸可包括于包括淋巴增生性组件的本文所提供的任何方面中。举例而言，第一工程化信号传导多肽可为或可包括本文所提供的方面中的CLE，该CLE包括编码由控制组件调节的第一工程化信号传导多肽的一个或多个转录单元。此外，提供本发明的单独方面，其特异性地包括CLE。举例而言，这些方面包括经分离嵌合淋巴增生性多肽、经分离多核苷酸及编码其的核酸，以及载体，这些载体包括质粒、病毒及反转录病毒载体(包括这些核酸序列或经分离多核苷酸)。这些方面进一步包括用于用经分离多核苷酸及包含其的载体转导或转染PBMC(诸如B细胞，或特定而言T细胞及NK细胞)的方法。这些细胞可为经分离未更改的细胞，或其可为经修饰的细胞，诸如经基因方式修饰诸如以表达所定义TCR或CAR-T细胞的细胞。
在一些实施例中，CLE包括来自相同部分(在说明性实施例中，相同受体)的胞外部分及跨膜部分两者，其中的一者在说明性实施例中为突变体，因此形成胞外域及跨膜域。这些域可来自细胞因子受体或其突变体，或激素受体或其突变体，在一些实施例中，当在至少一些细胞类型中表达时，其经报导为组成性活性的。在说明性实施例中，此胞外域及跨膜域不包括配位体结合区。据信，这些域在存在于CLE中并表达于B细胞、T细胞和/或NK细胞中时不结合配位体。这些受体突变体中的突变可发生于跨膜区中或胞外近膜区中。不受理论限制，本文提供的CLE的至少一些胞外-跨膜域中的突变通过使通常不在一起的活化链集合在一起或通过改变经连接跨膜域和/或胞内域的确认而在不存在配位体的情况下负责CLE的信号传导。
本文所提供的利用受体突变体的这些跨膜域的一个方面为包含一种或多种核酸序列的经分离多核苷酸，其中：
该一种或多种核酸序列的第一核酸序列编码在胺基至羧基取向中包含以下的嵌合多肽，
(a)来自细胞因子受体或激素受体的胞外域及跨膜域，其中胞外域及跨膜域中的至少一者包含在细胞因子受体的组成性活性突变体上发现的突变，且其中胞外序列不结合细胞因子受体的配位体；及
(b)选自具有表7至表11中所鉴别的经选择多肽的第一胞内域且视情况第二胞内域的基因的胞内域的第一胞内域，其中该嵌合多肽促进B细胞、T细胞和/或NK的细胞增生。
这些实施例中的此胞外域及跨膜域的胞外区通常足够长以形成接头，在说明性实施例中，跨膜域与另一功能性肽区之间的柔性接头，诸如间隙域，其在一些实施例中连接至胞外区的胺基端。因此，胞外区在存在以形成胞外域及跨膜域时长度可在1个氨基酸与1000个氨基酸之间，且通常在4个氨基酸与400个氨基酸之间，在4个氨基酸与200个氨基酸之间，在4个氨基酸与100个氨基酸之间，在4个氨基酸与50个氨基酸之间，在4个氨基酸与25个氨基酸之间或在4个氨基酸与20个氨基酸之间。在一个实施例中，胞外区为针对本发明的此方面的胞外域及跨膜域的GGGS。
如以下更详细论述，无论作为包括胞外域及跨膜域的实施例的部分(作为例如如实施例17的库1A、1.1A、1.1B、2B及2.1B所显示的一个部分)或作为包括胞外二聚基元的实施例的部分(如例18的库3A、3B、3.1A、3.1B、4B及4.1B所显示)，跨膜域通常至少足够长以穿过质膜。因此，跨膜域或胞外域及跨膜域的跨膜区可在10个氨基酸与250个氨基酸之间，且更通常长度为至少15个氨基酸，且可例如在15个氨基酸与100个氨基酸之间，15个氨基酸与75个氨基酸之间、在15个氨基酸与50个氨基酸之间，在15个氨基酸与40个氨基酸之间或在15个氨基酸与30个氨基酸之间。
包括这些域(在说明性实施例中，胞外域)的实施例的CLE的例示性胞外域及跨膜域通常少于来自经报导为组成性的突变体受体的膜近端胞外域连同跨膜域的30个氨基酸，其不需要用于活化相关胞内域的配位体结合。在说明性实施例中，这些胞外域及跨膜域包括IL7RA Ins PPCL、CRLF2 F232C、CSF2RB V449E、CSF3R T640N、EPOR L251C I252C、GHRE260C I270C、IL27RA F523C以及MPL S505N。此胞外域及跨膜域的另外的非限制性实施例在表6中提供且在实施例17及对应表中例示出。在一些实施例中，胞外域及跨膜域不包含在序列中与IL7RA或其突变体的胞外域和/或跨膜域的部分相同的多于10、20、25、30或50个组成性氨基酸。在一些实施例中，胞外域及跨膜域不为IL7RA Ins PPCL。在一些实施例中，胞外域及跨膜域不包含在序列中与IL15R的胞外域和/或跨膜域的部分相同的多于10、20、25、30或50个组成性氨基酸。
在实施例18中提供额外例示性跨膜域。说明性实施例中的这些跨膜域来自类型I跨膜蛋白。
因此，本文在一个方面提供包含一种或多种核酸序列的经分离多核苷酸，其中：
该一种或多种核酸序列的第一核酸序列编码在胺基至羧基取向中包含以下的嵌合多肽，
a)来自类型I跨膜蛋白的跨膜域；及
b)选自具有表12至表17中所鉴别的经选择多肽的第一胞内域的基因的胞内域的第一胞内域，其中该嵌合多肽促进B细胞、T细胞和/或NK细胞的细胞增生。
在说明性实施例中，该嵌合多肽促进PBMC(例如B细胞和/或NK细胞，和/或在说明性实施例中，T细胞)的细胞增生。如实施例18所显示，这些嵌合多肽能够在培养期间(例如在添加IL-2至表达编码嵌合多肽的核酸的PBMC(例如B细胞、T细胞或NK细胞)的培养培养基的缺失下)在PBMC至外源性细胞因子(诸如IL-2、IL-15或IL-7)的暴露的缺失下促进PBMC的细胞增生。如实施例18所说明，对于这些实施例，可在转导PBMC期间，但不在后续培养中添加IL-2。举例而言，本文公开的嵌合多肽为淋巴增生性组件，这是由于其能够促进PBMC(且在说明性实施例中，T细胞)的细胞增生及视情况细胞存活，且无需在视情况用编码嵌合淋巴增生性组件的核酸转导PBMC后，在培养第1天、第2天、第3天、第4天、第5天或第7天后的培养PBMC(亦即，T细胞)期间添加IL-2实施例21提供可用于鉴别且分析淋巴增生性组件的方法的另一实例。此分析可包括例如量测此淋巴增生性组件的相关淋巴增生性活性，例如通过分析由与不表达这些淋巴增生性组件的对照淋巴细胞相比表达这些淋巴增生性组件的经基因方式修饰的淋巴细胞所提供的富集幅度。
在此方面的一个实施例中，第一核酸序列进一步编码胞外域，且在说明性实施例中，胞外域包含二聚基元。在此方面的说明性实施例中，胞外域包含亮氨酸拉链。在一些实施例中，亮氨酸拉链来自jun多肽，例如c-jun。在某些实施例中，c-jun多肽为ECD-11的c-jun多肽区。
在其中跨膜域为类型I跨膜蛋白的这些方面中的任一者的实施例中，跨膜域可为类型I生长因子受体、激素受体、T细胞受体或TNF家族受体。在其中嵌合多肽包含胞外域且其中胞外域包含二聚基元的方面及实施例中的任一者的一实施例中，跨膜域可为类型I细胞因子受体、激素受体、T细胞受体或TNF家族受体。
例示性跨膜域包括用于实施例18中的任何跨膜域。在一些实施例中，跨膜域来自CD4、CD8RB、CD40、CRLF2、CSF2RA、CSF3R、EPOR、FCGR2C、GHR、ICOS、IFNAR1、IFNGR1、IFNGR2、IL1R1、IL1RAP、IL2RG、IL3RA、IL5RA、IL6ST、IL7RA、IL10RB、IL11RA、IL13RA2、IL17RA、IL17RB、IL17RC、IL17RE、IL18R1、IL18RAP、IL20RA、IL22RA1、IL31RA、LEPR、PRLR及TNFRSF8或在这些突变体存在于实施例18中所提供的构建体中时已知促进某些细胞类型中的信号传导活性的其突变体。在一些实施例中，跨膜域来自CD40、ICOS、FCGR2C、PRLR、IL3RA或IL6ST。在一些实施例中，跨膜域为针对表12至表17中的任何一者或多者的构建体中的这些基因所提供的特定跨膜域或来自那些表之前50个、25个或10个所列构建体中的构建体中的任一者的跨膜域。在说明性实施例中，跨膜域来自CD40或ICOS(作为非限制性实施例，针对这些基因的跨膜域在表6中提供)或保留跨膜的能力的其片段，和/或已知促进某些细胞类型中的组成性信号传导活性的其突变体。
来自此方面的例示性跨膜域显示为表12至表17中的P2。对于库3A，当本文中发现的候选嵌合多肽组件的跨膜域位置(P2)处时，来自CD40、CD8B、CRLF2、CSF2RA、GCGR2C、ICOS、IFNAR1、IFNGR1、IL10RB、IL18R1、IL18RAP、IL3RA、LEPR及PRLR的跨膜域(P2)或当这些突变体存在于实施例18中所提供的构建体中时已知促进某些细胞类型中的组成性信号传导活性的其突变体，在以组合方式考虑具有来源于该基因的跨膜域的所有构建体的数据时，在第7天与最后一天之间促进PBMC的增生。在实施例17及实施例18中提供的筛选中，用含有库的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转导细胞且接着馈入PBMC或不馈入PBMC，如实施例17及实施例18中所论述。在库数字后用“A”鉴别其中细胞馈入PBMC的筛选，例如库1A，在库数字后用“B”鉴别其中细胞不馈入PBMC的筛选，例如库1.1B。此外，以相同方式进行鉴别为含有“.1”的库(例如，库1.1A)的筛选以筛选不具有“.1”的对应库，例如，库1.1A为库1A的重复筛选。对于库3B，来自CD40、ICOS、CSF2RA、IL18R1、IL3RA及TNFRSF14的跨膜域或当这些突变体存在于实施例18中所提供的构建体中时已知促进某些细胞类型中的组成性信号传导活性的其突变体最能够促进细胞增生。对于库4B，来自IL3RA、CSFR2RA、IL18R1、CD8B、CD40、ICOS的跨膜域或当这些突变体存在于实施例18中所提供的构建体中时已知促进某些细胞类型中的组成性信号传导活性的其突变体最能够促进细胞增生。在说明性实施例中，本文提供的CLE中的跨膜域为来自CD40及ICOS的跨膜域。跨膜域或存在于针对库3A、3B、3.1A、3.1B、4B及4.1B促进细胞增生的构建体中的其部分和/或突变体的实例在实施例18中所提供的表中提供。
在本文中的任何方面的一些实施例中，嵌合多肽包含除CSF2RB的跨膜域突变体V449E以外的在显示于表12至表17中的构建体中的任一者中所鉴别的跨膜域。
在一些实施例中，胞外域及跨膜域为病毒蛋白LMP1或其突变体和/或片段。LMP1为已知在靶向脂质筏时或在融合至CD40时独立于配位体活化细胞信号传导的多跨跨膜蛋白(Kaykas等人,EMBO J.20:2641(2001))。LMP1的片段通常足够长以跨越质膜且活化所连接胞内域。举例而言，LMP1可在15个氨基酸与386个氨基酸之间、15个氨基酸与200个氨基酸之间、15个氨基酸与150个氨基酸之间、15个氨基酸与100个氨基酸之间、18个氨基酸与50个氨基酸之间、18个氨基酸与30个氨基酸之间、20个氨基酸与200个氨基酸之间、20个氨基酸与150个氨基酸之间、20个氨基酸与50个氨基酸之间、20个氨基酸与30个氨基酸之间、20个氨基酸与100个氨基酸之间、20个氨基酸与40个氨基酸之间或20个氨基酸与25个氨基酸之间。LMP1的突变体和/或片段在包括于本文提供的CLE中时保留其活化胞内域的能力。此外，若存在，胞外域包括至少1个，但通常至少4个氨基酸且其通常连接至另一个功能性多肽，诸如间隙域，例如eTag。
在本文提供的CLE的其他实施例中，胞外域包括二聚部分。文中所公开的许多不同二聚部分可用于这些实施例中。在说明性实施例中，二聚部分能够同源二聚。不受理论限制，二聚部分可对经由跨膜域连接至其的胞内域提供活化功能。此活化可在例如二聚部分的二聚之后提供，其可使得改变经由跨膜域连接至其的胞内域的定向，或其可使得胞内域接近。具有二聚部分的胞外域还可充当将识别标记连接至表达CLE的细胞的功能。在一些实施例中，二聚剂可位于胞内而非胞外。在一些实施例中，可使用多于一个或多个二聚域。
其中胞外域具有二聚基元的实施例的胞外域足够长以形成二聚物，诸如亮氨酸拉链二聚物。由此，包括二聚部分的胞外域可为15个氨基酸至100个氨基酸、20个氨基酸至50个氨基酸、30个氨基酸至45个氨基酸或35个氨基酸至40个氨基酸，在说明性实施例中为表6中所提供的c-Jun胞外域的c-Jun部分。包括二聚部分的多肽的胞外域可不保留其他功能性。举例而言，对于亮氨酸拉链二聚物，这些亮氨酸拉链能够形成二聚物，这是由于其保留沿着α隔开7个残基的亮氨酸的基元。然而，本文提供的CLE的某些实施例的亮氨酸拉链部分可或可不保留其的DNA结合功能。
此类型的一个例示性胞外域为来自Jun部分(诸如c-Jun)的亮氨酸拉链域。举例而言，胞外域可为出现于NM_002228_3(表6)中的c-Jun的变体。此胞外域用于实施例18中所论述的构建体中。
1个丙氨酸与4个丙氨酸之间的间隔子可包括于具有二聚部分的胞外域与跨膜域之间的CLE中。不受理论限制，据信，丙氨酸间隔子通过改变胞内域的定向来影响经由跨膜域连接至亮氨酸拉链胞外区的胞内域的信号传导。
本文提供的CLE的第一胞内域及第二胞内域为已知在至少一些细胞类型中的基因的胞内信号传导域，以促进增生、存活(抗凋亡)和/或提供增强分化状态、增生潜能或对细胞死亡的抗性的共刺激信号。由此，这些胞内域可为来自淋巴增生性组件的胞内域及本文提供的共刺激域。已知候选嵌合多肽的胞内域中的一些可活化JAK1/JAK2信号传导及STAT5。出现于第一胞内域中的基因及其胞内域与第二胞内域相同，除若第一胞内域及第二胞内域相同，则至少一个且通常跨膜域及胞外域两者不来自相同基因以外。
例示性胞内域包括来自表7至表11中所列的构建体的那些。来自经经验上判定为在实施例17的实验中为活性的这些基因的例示性胞内域提供于实施例17中所提供的表的第一胞内域(P3)及第二胞内域(P4)位置中且如以下此章节中进一步列举。在针对实施例17筛选的热门中所鉴别的说明性胞内域包括CD40、CSF2RA、IFNAR1、IL1RAP、IL4R、IL6ST、IL11RA、IL12RB2、IL17RA、IL17RD、IL17RE、IL18R1、IL21R、IL23R、MPL及MyD88。在针对实施例18筛选的热门中所鉴别的说明性胞内域包括CD40、LEPR、MyD88、IFNAR2、MPL、IL18R1、IL13RA2、IL10RB、IL23R或CSF2RA。在某些说明性实施例中，第一胞内域为MPL、LEPR、MyD88或IFNAR2。对于这些某些说明性实施例，非限制性例示性第二胞内域(P4)域为连接至提供于表12至表17中的对应MPL、LEPR、MyD88、IFNAR2、CD40、CD79B或CD27第一胞内域(P3)的基因的那些，在一些非限制实施例中包括这些表中所提供的那些基因的第一胞内域和/或第二胞内域。对于这些某些说明性实施例，其他非限制例示性第二胞内域(P4)域为连接至实施例18中所提供的表中的对应MPL、LEPR、MYD88、IFNAR2、CD40、CD79B或CD27第一胞内域，包括(作为非限制性实施例)这些表中所提供的那些基因的第一胞内域和/或第二胞内域。在一些实施例中，嵌合淋巴增生性组件可为实施例17及实施例18的表19至表23中的多肽中的任一者。
在某些说明性实施例中，第二胞内域来自CD3D、CD3G、CD27、CD40、CD79A、CD79B、FCER1G、FCGRA2、ICOS、TNFRSF4及TNFRSF8，或当这些突变体存在于实施例18中所提供的构建体中时已知促进某些细胞类型中的信号传导活性的其突变体。在某些说明性实施例中，第二胞内域来自CD40、CD79B、TNFRSF4、TNFRSF9、TNFRSF14、FCGRA2、CD3G或CD27，在说明性实施例中包括CD40、CD79B及CD27的胞内域。对于这些某些说明性实施例，非限制性例示性第一胞内域(P3)为连接至CD40、CD79B、TNFRSF4、TNFRSF9、TNFRSF14、FCGRA2、CD3G或CD27的基因的那些，在说明性实施例中包括表12至表17中的CD40、CD79B或CD27的胞内域，包括(作为非限制性实施例)这些表中所提供的那些基因的第一胞内域和/或第二胞内域。对于这些某些说明性实施例，其他非限制性例示性第一胞内(P3)域为连接至CD40、CD79B、TNFRSF4、TNFRSF9、TNFRSF14、FCGRA2、CD3G或CD27的基因的那些，在说明性实施例中包括作为实施例18中所提供的P3的这些基因的表中的CD40、CD79B及CD27第二胞内域的胞内域，包括(作为非限制性实施例)这些表中所提供的那些基因的第一胞内域和/或第二胞内域。
关于促进细胞存活及增生的构建体内的实施例17及实施例18中所鉴别的以上基因的例示性胞内域的详细信息(包括序列信息)在表6中提供。可包括于本文提供的CLE实施例中的胞内域包括所述基因的胞内域的突变体和/或片段，其限制条件为这些突变体和/或片段保留促进增生、存活(抗凋亡)和/或提供增强分化状态、增生潜能或对细胞死亡的抗性的共刺激信号的能力。由此，胞内域可例如在10个氨基酸与1000个氨基酸之间、10个氨基酸与750个氨基酸之间、10个氨基酸与500个氨基酸之间、10个氨基酸与250个氨基酸之间以及10个氨基酸与100个氨基酸之间。
在一些实施例中，CLE的所有域不为IL-7受体或其突变体，和/或具有IL-7受体的至少10个、15个、20个或25个连续氨基酸的其片段，或不为IL-15受体或其突变体，和/或具有IL-15受体的至少10个、15个、20个或25个连续氨基酸的其片段。在一些实施例中，CLE不包含CD40及MyD88的第一胞内域及第二胞内域的组合。
在说明性实施例中，CLE包括识别域和/或消除域。关于识别域和/或消除域的细节在本文中的其他章节中提供。本文提供的识别域和/或消除域中的任一者可为CLE的部分。通常，识别域连接至胞外域的N端。不受理论限制，在一些实施例中，胞外域包括提供接头(在说明性实施例中，柔性接头)的功能，从而将识别域连接至表达CLE的细胞。
在说明性实施例中，如图30及图32所说明，本文提供的CLE与可根据本文提供的CAR实施例中的任一者设计或此项技术中另外已知的CAR共表达。
本文提供的一些实施例为经分离多核苷酸及编码本文提供的CLE中的任一者的核酸序列，如图30至图33中所例示。这些经分离多核苷酸可包括此项技术中已知的任何组件，以用于提供转录物(诸如编码CLE的转录物)的表达。举例而言，经分离多核苷酸可包括在B细胞、T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子组件。对于这些实施例而言为合适的这些启动子在此项技术中为已知的，其中的一些在本发明的其他章节中鉴别。举例而言，熟练的技术人员将如实施例17及实施例18中更详细论述所理解，如何涉及经分离多核苷酸及含有其的载体，以用于表达本文提供的CLE实施例中的任一者。举例而言，在一些实施例中，在编码CLE或位于相同转录单元上的CLE上游的CAR的胺基端氨酸的ATG起始位点上游的10个核苷酸内提供Kozak序列。因此，在包含编码本文提供的CLE的核酸的多核苷酸实施例中，多核苷酸可进一步包含Kozak相关序列、WPRE组件及多个终止序列中的一者或多者，例如二重终止序列或三重终止序列。
此外，包括编码本文提供的CLE的核酸序列的多核苷酸通常还包含信号序列以直接表达质膜。例示性信号序列在本文中于其他章节中提供。可在转录物上提供组件，使得CAR及CLE两者自相同转录物表达。此构建体在比这些组件自不同转录物表达时需要更少的核酸方面为有利的，其为使得这些构建体存在于载体(诸如反转录病毒基因组)中的重要特征，例如用于转染或转导B细胞T细胞和/或NK细胞。
众多嵌合多肽候选物经涉及且鉴别为本文中的实施例17及实施例18中的淋巴增生性组件。对于库1A(其包括编码嵌合多肽及CAR的构建体)，172个顶部候选嵌合多肽经鉴别(参见表7)，在不存在IL-2的情况下培养时，在第7天与最后一天之间促进PBMC增生。对于库2B(其包括编码嵌合多肽但不包括CAR的构建体)，167个顶部候选嵌合多肽经鉴别(参见表8)，在不存在IL-2的情况下培养时，在第7天与最后一天之间促进PBMC增生。某些说明性CLE以及多核苷酸以及编码其的核酸序列，以及包括这些中的任一者的方法包括在表7至表11中所提供的构建体上的来自具有经匹配域的基因(例如，跨膜基因及第一胞内基因及视情况第二胞内基因)的胞内域以及(在非限制性实施例中)在这些表上提供的特定经匹配域，其中的一些阐述于本文中的例示性实施例章节中。在说明性实施例中，可使用在具有相同P1至P2、P3及P4域(例如，库1A及1.1A)的首次筛选及重复筛选中具有尤其值得注意的富集度的构建体上的来自具有经匹配域的CLE(例如，跨膜基因及第一胞内基因及视情况第二胞内基因)的胞内域，如表7至表11中所显示。对于库1A及1.1A，构建体M001-S116-S044、M024-S192-S045、M001-S047-S102、M048-S195-S043、M012-S216-S211及M030-S170-S194在两次筛选中具有尤其值得注意的富集度。
在表19中提供关于在对库1A及库1.1A两者的筛选中的具有尤其值得注意的富集度的构建体中的第一及第二胞内域的其他信息，包括第一及第二胞内域来源的基因，第一和/或第二胞内域是否为细胞因子受体，且第一和/或第二胞内域是否具有至少一个ITAM基元。如实施例17中所显示，具有来自IL6R、MYD88、CD27、MYD88、TNFRSF18或IL31RA的胞内域的构建体(当存在于第一胞内域(P3)时)及具有来自CD8B、IL1RL1、CD8A、TNFRSF4或MYD88的胞内域的构建体(当存在于第二胞内域(P4)时)，在库1A及1.1A两者中显示尤其值得注意的富集度(表19)。具有来自细胞因子受体IL6R、CD27、TNFRSF18或IL31RA的结构域的构建体存在于第一胞内域(P3)时，且具有来自细胞因子受体IL1RL1或TNFRSF4的结构域的构建体存在于第二胞内域(P4)时，在库1A及1.1A两者中显示尤其值得注意的富集度(表19)。
对于库2B及2.1B，构建体M007-S049-S051、M007-S050-S039、M012-S050-S043、M012-S161-S213、M030-S142-S049、M001-S145-S130、M018-S085-S039、M018-S075-S053、M012-S135-S074及M007-S214-S077在两个筛选中具有尤其值得注意的富集度。出于重复筛选的目的，具有尤其值得注意的富集度的构建体为具有log2((在最后一天的标准化计数数据+1)/(在第7天的标准化计数数据+1))值大于2的那些构建体。
在表20中提供关于在对库2B及库2.1B两者的筛选中的具有尤其值得注意的富集度的构建体中的第一及第二胞内域的其他信息，包括第一及第二胞内域来源的基因，第一和/或第二胞内域是否为细胞因子受体，且第一和/或第二胞内域是否具有至少一个ITAM基元。具有来自CD28、CD40、IL22RA1、IL13RA2、IL17RB、IFNGR2、FCGR2C、IL11RA或TNFRSF14的胞内域的构建体存在于第一胞内域(P3)时，且具有来自CD40、CD3G、CD8A、TNFRSF9、CD28、IL10RB、CD79B、FCER1G或GHR的胞内域的构建体存在于第二胞内域(P4)时，在库2B及2.1B两者中显示尤其值得注意的富集度(表20)。具有来自细胞因子受体CD40、IL22RA1、IL13RA2、IL17RB、IFNGR2、FCGR2C、IL11RA或TNFRSF14的结构域的构建体存在于第一胞内域(P3)时，且具有来自细胞因子受体TNFRSF9、IL10RB、FCER1G、GHR或CD40的结构域的构建体存在于第二胞内域(P4)时，在库2B及2.1B两者中显示尤其值得注意的富集度(表20)。具有含有FCGR2C的ITAM基元的结构域的构建体存在于第一胞内域(P3)时，且具有含有CD3G、CD79B或FCER1G的ITAM基元的结构域的构建体存在于第二胞内域(P4)时，在库2B及2.1B两者中显示尤其值得注意的富集度(表20)。
在一初始中期分析中，对于库3A(其包括编码嵌合多肽及CAR的构建体)，126个顶部候选嵌合多肽经鉴别(参见表12)，在不存在IL-2的情况下培养时，如实施例18中所阐述在用未经转导的PBMC刺激的经转导PBMC的第7天与最后一天之间促进PBMC增生。对于库3B(其包括编码嵌合多肽及CAR的构建体)的初始中期分析，127个顶部候选嵌合多肽经鉴别(参见表13)，在不存在IL-2的情况下培养时，如实施例18中所阐述在未用未经转导的PBMC刺激的经转导PBMC的第7天与最后一天之间促进PBMC增生。对于库4B(其包括编码嵌合多肽而非CAR的构建体)，154个顶部候选嵌合多肽经鉴别(参见表16)，在不存在IL-2的情况下培养时，如实施例18中所阐述在未用未经转导的PBMC刺激的经转导PBMC的第7天与最后一天之间促进PBMC增生。
在进一步解码之后(其提供深度解码)，在库3A及3B中，其包括编码嵌合多肽及CAR及补充有(库3A)或未补充有(库3B)新鲜经转导PBMC的经转导PBMC的构建体，在第21天对于库3A鉴别到134个顶部候选物，在第35天对于库3A鉴别到124个顶部候选物，且第21天对于库3B鉴别到131个顶部候选物(分别参见表12及表13)在不存在IL-2(亦即，在初始转导后的培养期间不将IL-2添加至培养培养基)、IL-7或任何其他外源性细胞因子的情况下培养时，在第7天与最后一天之间促进PBMC增生。
某些说明性CLE以及多核苷酸以及编码其的核酸序列以及包括这些中的任一的方法包括在表12至表17中所提供的构建体上的来自具有经匹配域的基因(例如，跨膜基因及第一胞内基因及视情况第二胞内基因)的胞内域以及(在非限制性实施例中)在这些表上提供的特定经匹配域，其中的一些阐述于本文中的例示性实施例章节中。在例示性CLE实施例中设想，来自第一胞内域或第二胞内域位置的在实施例17及实施例18中所提供的数据中所鉴别的胞内域可互换地作为第一胞内域或第二胞内域。在说明性实施例中，可使用在具有相同P1、P2、P3及P4域(例如，库3A及3.1A)的首次筛选及重复筛选中具有尤其值得注意的富集度的构建体上的来自具有经匹配域的基因(例如，跨膜基因及第一胞内基因及视情况第二胞内基因)的胞内域。对于库3A及3.1A，构建体E008/E013-T041-S186-S050、E006/E011-T077-S186-S211、E007/E012-T021-S186-S051、E009/E014-T041-S186-S053、E007/E012-T073-S186-S053、E006/E011-T017-S186-S051、E006/E011-T031-S186-S211、E006/E011-T011-S186-S050、E006/E011-T011-S186-S047、E007/E012-T001-S186-S050、E006/E011-T041-S186-S051、E008/E013-T028-S186-S076、E009/E014-T029-S199-S053、E009/E014-T062-S186-S216、E007/E012-T006-S058-S051、E009/E014-T076-S186-S211及E007/E012-T001-S186-S047在两个筛选中均具有尤其值得注意的富集度，其中通过此处的斜杠间隔开的P1部分包括如表6、12及14中所示的库3A及3.1A的不同标签。出于重复筛选的目的，具有尤其值得注意的富集度的构建体为具有log2((在最后一天的标准化计数数据+1)/(在第7天的标准化计数数据+1))值大于2的那些构建体。
在表21中提供关于在对库3A及库3.1A两者的筛选中的具有尤其值得注意的富集度的构建体中的第一及第二胞内域的其他信息，包括第一及第二胞内域来源的基因，第一和/或第二胞内域是否为细胞因子受体，且第一和/或第二胞内域是否具有至少一个ITAM基元。具有来自MPL、OSMR或CSF2RA的胞内域的构建体存在于第一胞内域(P3)时，且具有来自CD40、TNFRSF4、CD79B、CD27、FCGR2A或TNFRSF18的胞内域的构建体存在于第二胞内域(P4)时，在库3A及3.1A两者中显示尤其值得注意的富集度(表21)。具有来自细胞因子受体MPL、OSMR或CSF2RA的结构域的构建体存在于第一胞内域(P3)时，且具有来自细胞因子受体CD40、TNFRSF4、CD27、FCGR2A或TNFRSF18的结构域的构建体存在于第二胞内域(P4)时，在库3A及3.1A两者中显示尤其值得注意的富集度(表21)。具有含有MPL或OSMR的ITAM基元的结构域的构建体存在于第二胞内域(P4)时，在库3A及3.1A两者中显示尤其值得注意的富集度(表21)。
对于3B及3.1B，构建体E007/E012-T017-S186-S051、E007/E012-T073-S186-S053、E008/E013-T028-S186-S047、E006/E011-T011-S186-S047、E007/E012-T082-S176-S214、E006/E011-T046-S186-S052、E008/E013-T029-S186-S052、E009/E014-T011-S186-S053、E008/E013-T032-S186-S039、E007/E012-T034-S186-S051、E007/E012-T041-S192-S213、E006/E011-T014-S069-S213、E006/E011-T022-S186-S053、E006/E011-T023-S115-S075、E006/E011-T029-S106-S213、E006/E011-T032-S155-S080、E006/E011-T041-S186-S216、E006/E011-T057-S135-S080、E006/E011-T072-S191-X002、E006/E011-T077-S186-S216、E006/E011-T080-S141-S080、E007/E012-T001-X001-S214、E007/E012-T007-S059-S211、E007/E012-T016-S186-S052、E007/E012-T031-S186-S053、E007/E012-T044-S102-S052、E007/E012-T044-S142-X002、E007/E012-T055-S069-S053、E007/E012-T063-S176-S216、E007/E012-T065-S157-S075、E008/E013-T008-S085-X002、E008/E013-T011-S085-S048、E008/E013-T021-S109-X002、E008/E013-T021-S168-S211、E008/E013-T032-S064-S214、E008/E013-T037-S170-S215、E008/E013-T038-S176-S048、E008/E013-T039-S137-S216、E008/E013-T041-S141-S053、E008/E013-T045-S177-S048、E008/E013-T048-S109-S074、E008/E013-T073-S199-S075、E009/E014-T001-S157-S074、E009/E014-T005-S196-S049、E009/E014-T011-S130-X002、E009/E014-T013-S155-X002、E009/E014-T017-S186-S076、E009/E014-T021-S142-S080、E009/E014-T023-S082-S076、E009/E014-T038-S196-S037、E009/E014-T055-S186-S052、E009/E014-T060-S175-S053、E009/E014-T070-S085-S212、E008/E013-T026-S054-S213、E009/E014-T007-S120-S053、E007/E012-T045-S186-S211、E008/E013-T073-S186-X002、E008/E013-T074-S186-X002、E007/E012-T055-S186-S053、E008/E013-T036-S186-S053、E007/E012-T017-S058-S053、E008/E013-T030-S189-S080、E006/E011-T029-S081-S047、E009/E014-T044-S194-S050、E006/E011-T028-S121-X002、E008/E013-T028-S186-S053、E009/E014-T078-S142-S213、E009/E014-T041-S186-S051、E008/E013-T006-S186-S050、E006/E011-T028-S186-S075、E006/E011-T040-S120-S038、E007/E012-T044-S115-S211、E009/E014-T039-S176-S075、E007/E012-T028-S186-S050、E008/E013-T031-S202-S050、E007/E012-T072-S192-S053、E006/E011-T065-X001-S051、E007/E012-T030-S062-X002、E007/E012-T073-S186-X002、E009/E014-T056-S186-S053、E008/E013-T046-S137-X002、E006/E011-T016-S136-S076、E007/E012-T032-S142-S037、E007/E012-T065-S120-S215、E009/E014-T077-S186-S047、E009/E014-T001-S126-S051、E006/E011-T030-S121-S039、E008/E013-T006-S176-S213、E009/E014-T032-S130-S215、E008/E013-T041-S186-S039、E009/E014-T021-S186-S047、E008/E013-T026-S137-S214、E007/E012-T029-S116-S075、E008/E013-T026-S106-S049以及E007/E012-T032-S168-S075在两次筛选中具有尤其值得注意的富集度，其中由此处的斜线隔开的P1部分包括库3B及3.1B的不同标记，如表6、表13及表15中所显示。出于重复筛选的目的，具有尤其值得注意的富集度的构建体为具有log2((在最后一天的标准化计数数据+1)/(在第7天的标准化计数数据+1))值大于2的那些构建体。
在表22中提供关于在对库3B及库3.1B两者的筛选中的具有尤其值得注意的富集度的构建体中的第一及第二胞内域的其他信息，包括第一及第二胞内域来源的基因，第一和/或第二胞内域是否为细胞因子受体，且第一和/或第二胞内域是否具有至少一个ITAM基元。具有来自MPL、LEPR、MYD88、EPOR、IL5RA、IL2RG、IL18RAP、IL11RA、IL13RA1、CSF2RA、IL1RL1、IL13RA2、IL20RB、IFNGR2、IL3RA、IL27RA、CSF3R、IL31RA、IL12RB1、OSMR、IL10RB、IFNAR2、CRLF2、IL7R、IFNAR1、PRLR、IL9R、IL6R或IL15RA的胞内域的构建体存在于第一胞内域(P3)时，且具有来自CD40、CD79B、CD27、TNFRSF14、CD79A、CD3G、TNFRSF9、FCGR2C、ICOS、TNFRSF18、TNFRSF4、CD28、FCER1G、FCGR2A、CD3D、TNFRSF8或CD3E的胞内域的构建体存在于第二胞内域(P4)时，在库3B及3.1B两者中显示尤其值得注意的富集度(表22)。具有来自MPL、LEPR、EPOR、IL5RA、IL2RG、IL18RAP、IL11RA、IL13RA1、CSF2RA、IL1RL1、IL13RA2、IL20RB、IFNGR2、IL3RA、IL27RA、CSF3R、IL31RA、IL12RB1、OSMR、IL10RB、IFNAR2、CRLF2、IL7R、IFNAR1、PRLR、IL9R、IL6R或IL15RA的胞内域的构建体存在于第一胞内域(P3)时，且具有来自CD40、CD27、TNFRSF14、TNFRSF9、FCGR2C、TNFRSF18、TNFRSF4、FCER1G、FCGR2A或TNFRSF8的胞内域的构建体存在于第二胞内域(P4)时，在库3B及3.1B两者中显示尤其值得注意的富集度(表22)。具有含有CD79B、CD79A、CD3G、FCGR2C、FCER1G、FCGR2A、CD3D或CD3E的ITAM基元的结构域的构建体存在于第二胞内域(P4)时，在库3B及3.1B两者中显示尤其值得注意的富集度(表22)。
对于库4B及4.1B，构建体E007/E012-T078-S154-S047、E008/E013-T062-S186-X002、E008/E013-T055-S186-S050、E009/E014-T057-S186-S050、E007/E012-T077-S054-S053、E007/E012-T034-S135-S211、E009/E014-T071-X001-S216、E009/E014-T011-S141-S037、E008/E013-T041-S186-S037、E006/E011-T038-S106-S039、E006/E011-T011-S121-X002、E007/E012-T007-S085-S215、E006/E011-T041-S186-S050、E007/E012-T008-S064-S051、E006/E011-T041-S186-S047、E008/E013-T045-S186-S051、E008/E013-T003-S104-S216、E006/E011-T019-S186-S053、E008/E013-T071-S064-S080、E006/E011-T021-S054-X002、E006/E011-T003-S135-X002、E009/E014-T020-S199-S213、E008/E013-T027-S121-S211、E009/E014-T032-S195-X002、E009/E014-T050-S171-X002、E008/E013-T069-S083-X002、E008/E013-T026-S116-S038、E009/E014-T072-S195-X002、E007/E012-T047-S058-S211、E008/E013-T046-S142-S080、E006/E011-T065-S186-S076、E006/E011-T062-S069-X002、E007/E012-T047-S098-X002、E009/E014-T069-S099-S048、E008/E013-T039-S141-S050、E006/E011-T052-S130-S052、E008/E013-T041-S186-X002、E007/E012-T019-S120-X002、E008/E013-T045-S186-S053、E006/E011-T003-S170-S039、E007/E012-T047-S058-S051、E007/E012-T069-S109-X002、E009/E014-T019-S130-S075以及E006/E011-T047-S054-S053在两次筛选中具有尤其值得注意的富集度，其中由此处的斜线隔开的P1部分包括库4B及4.1B的不同标记，如表6、表16及表17中所显示。出于重复筛选的目的，具有尤其值得注意的富集度的构建体为具有log2((在最后一天的标准化计数数据+1)/(在第7天的标准化计数数据+1))值大于2的那些构建体。在表23中提供关于在对库4B及库4.1B两者的筛选中的具有尤其值得注意的富集度的构建体中的第一及第二胞内域的其他信息，包括第一及第二胞内域来源的基因，第一和/或第二胞内域是否为细胞因子受体，且第一和/或第二胞内域是否具有至少一个ITAM基元。具有来自IL18R1、MPL、CRLF2、IL11RA、IL13RA1、IL2RG、IL7R、IFNGR2、CSF3R、IL2RA、OSMR、MYD88、IL31RA、IFNAR2、IL6R、CSF2RA、IL13RA2、EPOR、IL1R1、IL10RB或IL3RA的胞内域的构建体存在于第一胞内域(P3)时，且具有来自CD27、CD40、CD79B、TNFRSF4、TNFRSF18、CD3D、CD3G、CD27、ICOS、TNFRSF9、CD3E、FCGR2A、CD28、CD79A或FCGR2C的胞内域的构建体存在于第二胞内域(P4)时，在库4B及4.1B两者中显示尤其值得注意的富集度(表23)。具有来自IL18R1、MPL、CRLF2、IL11RA、IL13RA1、IL2RG、IL7R、IFNGR2、CSF3R、IL2RA、OSMR、IL31RA、IFNAR2、IL6R、CSF2RA、IL13RA2、EPOR、IL1R1、IL10RB或IL3RA的胞内域的构建体存在于第一胞内域(P3)时，且具有来自CD27、CD40、TNFRSF4、TNFRSF18、TNFRSF9、FCGR2A或FCGR2C的胞内域的构建体存在于第二胞内域(P4)时，在库4B及4.1B两者中显示尤其值得注意的富集度(表23)。具有含有CD79B、CD3D、CD3G、CD3E、FCGR2A、CD79A或FCGR2C的ITAM基元的结构域的构建体存在于第二胞内域(P4)时，在库4B及4.1B两者中显示尤其值得注意的富集度(表23)。
在说明性实施例中，CLE包含来自表19至表23的构建体中的任一者中的胞内域。在一些说明性实施例中，CLE包含来自仅具有单个胞内域(其他P3或P4为接头或终止)的表19至表23的构建体中的任一者中的胞内域。
关于本文提供的各种例示性CLE域的信息可在表6中找到。举例而言，表7中所鉴别的第一CLE为M008-S212-S075。对于此CLE，胞外域及跨膜域(P1-2)为M008，第一胞内域(P3)为S212，且第二胞内域(P4)为S075。当考虑编码其的核酸时，例如M008，关于这些域及模块的鉴别的详细信息可在表6中找到。表6论述M008为ECDTM-8且更特定而言此为具有PPCL拆入的白细胞介素7受体α(IL7RA)突变体且构建体包括eTag。
对于库1A，当出现于候选嵌合多肽的第一胞内域位置(P3)处时，来自CD3D、CD3E、CD8A、CD27、CD40、CD79B、IFNAR1、IL2RA、IL3RA、IL13RA2、TNFRSF8及TNFRSF9的胞内域或具有信号传导活性的其突变体，在以组合方式考虑具有来源于该基因的第一胞内域(P3)的所有构建体的数据时，在第7天与最后一天之间促进PBMC的增生。因此，本文提供的CLE的例示性实施例具有来自CD3D、CD3E、CD8A、CD27、CD40、CD79B、IFNAR1、IL2RA、IL3RA、IL13RA2、TNFRSF8及TNFRSF9的胞内域，包括作为第二胞内域(或在说明性实施例中，第一胞内域)保留信号传导活性的其突变体。
对于库1A，当出现于候选嵌合多肽的第二胞内域位置(P4)处时，来自CD3D、CD3G、CD8A、CD8B、CD27、CD40、CD79B、CRLF2、FCGR2C、ICOS、IL2RA、IL13RA1、IL13RA2、IL15RA、TNFRSF9及TNFRSF18的胞内域或已知具有信号传导活性的其突变体，在以组合方式考虑具有来源于该基因的第二胞内域(P4)的所有构建体的数据时，在第7天与最后一天之间促进PBMC的增生。存在于促进细胞增生的构建体中的第二胞内域或其部分和/或突变体的实例提供于实施例17中的表中。因此，本文提供的CLE的例示性实施例具有来自CD3D、CD3G、CD8A、CD8B、CD27、CD40、CD79B、CRLF2、FCGR2C、ICOS、IL2RA、IL13RA1、IL13RA2、IL15RA、TNFRSF9及TNFRSF18的胞内域，包括作为第一胞内域(或在说明性实施例中，第二胞内域)保留信号传导活性的其突变体。
对于库3A，当出现于本文中的候选嵌合多肽组件的第一胞内域(P3)处时，来自CSF2RA、IFNAR1、IL1RAP、IL4R、IL6ST、IL11RA、IL12RB2、IL17RA、IL17RD、IL17RE、IL18R1、IL21R、IL23R、MPL及MyD88的第一胞内(P3)域或当这些突变体存在于实施例18中所提供的构建体中时已知促进某些细胞类型中的信号传导活性的其突变体，在以组合方式考虑具有来源于该基因的第一胞内域的所有构建体的数据时，在第7天与最后一天之间或第7天与第21天之间促进PBMC的增生。此结论基于混合培养的PBMC细胞群体中的构建体的序列计数的富集，使得当针对一个基因将所有构建体的结果组合时，对于库3A，以表上指示的最后一天的标准化计数加一与第7天的标准化计数加一之间的比率的以2为底的对数计算的富集度为至少2。对于库3B，当以此方式进行分析时，来自CSF2RB、IL4R及MPL的第一胞内域或当这些突变体存在于实施例18中所提供的构建体中时已知促进某些细胞类型中的信号传导活性的其突变体为最佳进行者。在表12及表15中提供了存在于针对库3A、3B、3.1A及3.1B促进细胞增生的构建体中的第一胞内域或其部分和/或突变体的实例。
对于库3A，当出现于本文中的候选嵌合多肽组件的第二胞内域(P4)处时，来自CD3D、CD3G、CD27、CD40、CD79A、CD79B、FCER1G、FCGRA2、ICOS、TNFRSF4及TNFRSF8的第二胞内(P4)域或当这些突变体存在于实施例18中所提供的构建体中时已知促进某些细胞类型中的信号传导活性的其突变体，在以组合方式考虑具有来源于该基因的第二胞内域的所有构建体的数据时，在表上所指示的第7天与第21天之间或第7天与最后一天之间促进PBMC的增生。此结论基于混合培养的PBMC细胞群体中的构建体的序列计数的富集，使得当针对一个基因将所有构建体的结果组合时，对于库3A，以表上指示的最后一天的标准化计数加一与第7天的标准化计数加一之间的比率的以2为底的对数计算的富集度为至少2。在表12及表17中提供了存在于针对库3A及3B促进细胞增生的构建体中的第二胞内域或其部分和/或突变体的实例。
在一初始中期解码分析后，对于库3A，当出现于本文中的候选嵌合多肽组件的第一胞内域(P3)处时，来自IL17RD、IL17RE、IL1RAP、IL23R及MPL的第一胞内(P3)域或已知促进某些细胞类型中的信号传导活性的其突变体，在以组合方式考虑具有来源于该基因的第一胞内域的所有构建体的数据时，在第7天与第21天之间促进PBMC的增生。对于库3B，当以此方式进行分析时，来自IL21R、MPL或OSMR的第一胞内域或已知促进某些细胞类型中的信号传导活性的其突变体为最佳进行者。在实施例18中的表中提供了存在于针对库3A及3B促进细胞增生的构建体中的第一胞内域或其部分和/或突变体的实例。因此，本文提供的CLE的例示性实施例具有来自IL17RD、IL17RE、IL1RAP、IL23R及MPL F9的胞内域，包括作为第二胞内域(或在说明性实施例中，第一胞内域)保留信号传导活性的其突变体。
在一初始解码分析后，对于库3A，当出现于本文中的候选嵌合多肽组件的第二胞内域(P4)处时，来自CD27、CD3G、CD40及CE79B的第二胞内(P4)域或已知促进某些细胞类型中的信号传导活性的其突变体，在以组合方式考虑具有来源于该基因的第二胞内域的所有构建体的数据时，在表上所指示的第7天与最后一天之间促进PBMC的增生。对于库3B，当以此方式进行分析时，来自CD40的第二胞内域或已知促进某些细胞类型中的信号传导活性的其突变体为最佳进行者。因此，本文提供的CLE的例示性实施例具有来自CD27、CD3G、CD40及CE79B的胞内域，包括作为第一胞内域(或在说明性实施例中，第二胞内域)保留信号传导活性的其突变体。
如表12至表17所显示，当出现于本文中的候选嵌合多肽的第一胞内域(P3)处时，来自MPL、LEPR、MYD88、IFNAR2的第一胞内(P3)域或在一些情况中保留信号传导活性的其突变体，在考虑最频繁出现在顶部候选构建体中的第一胞内域时，在第7天与实验结束之间促进PBMC的增生。存在于针对库3A、3B、3.1A、3.1B、4B及4.1B促进细胞增生的构建体中的第一胞内域或其部分和/或突变体的实例提供于实施例18中的表中。因此，本文提供的CLE的例示性实施例具有来自MPL、LEPR、MYD88、IFNAR2的胞内域，包括作为第二胞内域(或在说明性实施例中，第一胞内域)保留信号传导活性的其突变体。
如表12至表17所显示，当出现于本文中的候选嵌合多肽的第二胞内域(P4)处时，来自CD40、CD79B、CD27的第二胞内(P4)域或在一些情况中保留信号传导活性的其突变体，在考虑最频繁出现在顶部候选构建体中的第一胞内域时，在第7天与表上所指示的最后一天之间促进PBMC的增生。存在于针对库3A、3B、3.1A、3.1B、4B及4.1B促进细胞增生的构建体中的第一胞内域或其部分和/或突变体的实例提供于实施例18中的表中。因此，本文提供的CLE的例示性实施例具有来自CD40、CD79B、CD27的胞内域，包括作为第一胞内域(或在说明性实施例中，第二胞内域)保留信号传导活性的其突变体。
在经分离多肽中的任一者的值得注意的实施例或包含编码促进PBMC、B细胞、T细胞和/或NK细胞(亦即，CLE)的细胞增生的嵌合多肽的第一核酸序列及编码包含抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域及胞内活化域的嵌合抗原受体(CAR)的第二核酸序列的本文提供的载体方面及实施例中，第一核酸序列及第二核酸序列可由核糖体跳跃序列隔开。在一些实施例中，核糖体跳跃序列为F2A、E2A、P2A或T2A。
如本文公开，淋巴增生性组件(如在本文中与CLE一起例示)在一些说明性实施例中可包括二聚基元，以有助于增强和/或调节其活性，例如以影响细胞中的信号，诸如影响蛋白质活性或基因表达的信号。此二聚基元通常为其部分或整个胞外域。在一些实施例中，二聚部分可连接至本文中的CLE的胞外域的识别及间隙序列。实际上，在一些实施例中，淋巴增生性组件可包括来自一种蛋白质的整个淋巴增生性组件，除胞外域包括二聚部分以外。
在包括二聚剂及多核苷酸及编码其的核酸的淋巴增生性组件及CLE的一些实施例中，二聚基元可包括来自作为同源二聚物天然地存在的跨膜同源二聚多肽的氨基酸序列。举例而言，二聚基元可为亮氨酸拉链多肽，例如Jun，如本文中实施例18所例示。在一些实施例中，这些跨膜同源二聚多肽可包括早期活化抗原CD69(CD69)、转移受体蛋白1(CD71)、B细胞分化抗原(CD72)、T细胞表面蛋白触觉(CD96)、内皮因子(Cd105)、杀伤细胞凝集素样受体子族B成员1(Cd161)、P-选凝素糖蛋白配位体1(Cd162)、谷胺酰基胺基肽酶(Cd249)、肿瘤坏死因子受体超家族成员16(CD271)、钙黏蛋白-1(上皮钙黏蛋白)(Cd324)或其活性片段。在一些实施例中，二聚基元可包括来自在配位体(在本文中也称为二聚物或二聚剂)结合后二聚的跨膜蛋白的氨基酸序列。在一些实施例中，二聚基元及二聚物可包括(其中二聚物在二聚物结合对后的圆括号里)：FKBP及FKBP(雷帕霉素(rapamycin))；GyrB及GyrB(香豆霉素(coumermycin))；DHFR及DHFR(甲胺喋呤(methotrexate))；或DmrB及DmrB(AP20187)。如上文所提及，雷帕霉素可用作二聚物。替代地，可使用雷帕霉素衍生物或类似物(参见例如WO96/41865、WO 99/36553、WO 01/14387；及Ye等人(1999)Science 283:88-91)。举例而言，类似物、同源物、衍生物及结构上与雷帕霉素相关的其他化合物(“雷帕霉素类似物”)除此的外包括具有一个或多个与雷帕霉素相关的以下修饰的雷帕霉素的变体：在C7、C42和/或C29处去甲基化、消除或替换甲氧基；在C13、C43和/或C28处消除、衍生或替换羟基；在C14、C24和/或C30处还原、消除或衍生酮；用5员脯胺酰基环替换6员甲基呱啶环；且对环己基环进行替代取代或用经取代环戊基环替换环己基环。额外信息呈现于例如美国专利第5,525,610号、第5,310,903号、第5,362,718号及第5,527,907号中。描述了C-28羟基的选择性差向异构(参见例如WO 01/14387)。适用作雷帕霉素的替代物的额外合成二聚剂包括描述于美国专利公开案第2012/0130076号中的那些。如以上所提及，香豆霉素可用作二聚剂。替代地，可使用香豆霉素类似物(参见例如Farrar等人(1996)Nature 383:178-181；及美国专利第6,916,846号)。如以上所提及，在一些情况中，二聚剂为甲胺喋呤，例如无细胞毒性、同源双功能性甲胺喋呤二聚物(参见例如美国专利第8,236,925号)。
在一些实施例中，当存在于真核细胞的质膜中时，包括二聚基元的淋巴增生性组件(在一说明性实施例中，CLE)可在不存在二聚剂的情况下为活性的。举例而言，包括含亮氨酸拉链的二聚基元或包括来自跨膜同源二聚多肽的二聚基元的淋巴增生性组件可在不存在二聚剂的情况下为活性的，这些跨膜同源二聚多肽包括CD69、CD71、CD72、CD96、Cd105、Cd161、Cd162、Cd249、CD271、Cd324、其活性突变体和/或其活性片段。在一些实施例中，当存在于真核细胞的质膜中时，包括二聚基元的淋巴增生性组件可在二聚剂的存在下为活性的。举例而言，包括来自FKBP、GyrB、DHFR或DmrB的二聚基元的淋巴增生性组件可分别在个别二聚剂或其类似物(例如，雷帕霉素、香豆霉素、甲胺喋呤及AP20187)的存在下为活性的。
在包括淋巴增生性组件(例如，CLE)(其包括用于二聚包含二聚基元的多肽的二聚物)的方法实施例中，可使用能够产生所需效果的便利手段向宿主(个体)施用二聚物。因此，可将二聚物并入至多种调配物种以供施用。更特定而言，可通过与合适医药学上可接受的载剂或稀释剂组合将二聚物调配为医药组合物，且可调配为呈固体、半固体、液体或气态形式的制剂，诸如锭剂、胶囊、粉剂、颗粒剂、药膏、溶液、栓剂、注射剂、吸入剂及气雾剂。
熟练的技术人员将容易理解，剂量水平可根据特定二聚物、症状的严重程度及个体对副作用的敏感性而变化。可利用多种手段通过熟练此项技术人员来容易地确定给定化合物的较佳剂量。
使用适用于药物递送的任何可用方法及途径向受试者施用二聚物，包括活体内剂离体方法以及全身性及局部施用途径。
在其中CLE的胞外域包含二聚基元的任何方面或实施例中，二聚基元可选自由以下组成的群：含亮氨酸拉链基元的多肽、CD69、CD71、CD72、CD96、Cd105、Cd161、Cd162、Cd249、CD271及Cd324，以及其保留二聚能力的突变体和/或活性片段。在其中CLE的胞外域包含二聚基元的方面或实施例中的任一者中，二聚基元可需要二聚剂，且二聚基元及相关二聚剂可选自由以下组成的群：FKBP及雷帕霉素或其类似物、GyrB及香豆霉素或其类似物、DHFR及甲胺喋呤或其类似物或DmrB及AP20187或其类似物，以及保留二聚能力的所述二聚蛋白的突变体和/或活性片段。
在其中CLE的胞外域包含二聚基元的任何方面或实施例的说明性实施例中，胞外域可包含亮氨酸拉链基元。在一些实施例中，亮氨酸拉链基元来自jun多肽，例如c-jun。在某些实施例中，c-jun多肽为ECD-11的c-jun多肽区。
在包括淋巴增生性组件的本文所提供的方面或实施例中的任一者中，淋巴增生性组件可为包含膜靶向区、二聚(多聚)域、第一胞内域及视情况选用的第二胞内域及另外视情况选用的第三胞内域及视情况选用的第四胞内域的多肽，其中第一胞内域及视情况选用的第二胞内域、第三胞内域及第四胞内域来自具有表7至表17中所鉴别的胞内域的任何基因，或选自表7至表17中所鉴别的第一胞内域及第二胞内域中的任一者，且其中该内部二聚和/或多聚淋巴增生性组件促进PBMC(且在说明性实施例中，B细胞、T细胞和/或NK细胞)的细胞增生。此多肽可在本文中称作内部二聚和/或多聚淋巴增生性组件。在某些实施例中，可将接头添加在域中的任一者之间。在某些实施例中，第一胞内域及第二胞内域不为MyD88及CD40。在一些实施例中，胞内域为MPL或保留促进PBMC细胞增生的能力的其胞内片段。在一些实施例中，胞内域不为MPL或保留促进PBMC细胞增生的能力的其胞内片段。在一些实施例中，胞内域不为MyD88或保留促进PBMC细胞增生的能力的其胞内片段。
说明性实施例中的此内部二聚和/或多聚多肽淋巴增生性组件的二聚域位于膜靶向区与第一胞内域之间。在某些实施例中，二聚(或多聚)域包含多聚或二聚配位体结合位点，诸如FKBP区，例如FKBP12。在一些实施例中，多肽可包含胞外域，诸如本文提供的胞外域中的任一者，例如在实施例17的表7至表11中或在实施例18的表12至表17中，其具有或不具有识别域及间隙域。在某些实施例中，膜靶向区选自由豆蔻酰化区、棕榈酰化区、异戊二烯化区及受体的跨膜序列组成的群。在某些实施例中，膜靶向区为豆蔻酰化区。内部二聚和/或多聚淋巴增生性组件通常经由膜靶向区连接至质膜，例如连接至具有N端肉豆蔻酸盐的膜。在说明性实施例中，FKBP区结合FK506。
一个实施例中之内部二聚和/或多聚淋巴增生性组件为使用脂质可渗透二聚免疫抑制剂药物FK506的类似物的系统的整体部分，其损失其正常生物活性，同时获得交联以基因方式融合至FK506结合蛋白FKBP12的分子的能力。通过将一个或多个FKBP及豆蔻酰化序列融合至靶受体的胞质信号传导域，可以二聚物药物依赖型但配位体及胞外域独立型方式刺激信号传导。此为系统提供时间控制、使用单体药物类似物的可逆性，且增强特异性。第三代AP20187/AP1903二聚物药物对于其结合域FKBP12的高亲和力允许活体内特异性活化重组受体，且无需经由内源性FKBP12诱导非特异性副作用。也可使用与二聚物药物结合的具有氨基酸取代及缺失的FKBP12变体(诸如FKBP12V36)。另外，合成配位体对蛋白酶分解具有抗性，使得其在活体内活化受体时比大多数所递送蛋白剂更有效。
假型组件
本文所提供的方法及组合物中的多者包括假型组件。具有异源包膜糖蛋白的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的假型化通常改变病毒的向性且有助于宿主细胞的转导。如本文所使用的假型组件可包括：“结合多肽”，其包括识别且结合靶标宿主细胞的一种或多种多肽(通常糖蛋白)；及一种或多种“促融合多肽”，其介导反转录病毒与靶标宿主细胞膜融合，从而使反转录病毒基因组进入靶标宿主细胞。在本文所提供的一些实施例中，假型组件提供为多肽/蛋白质，或提供为编码多肽/蛋白质的核酸序列。
在一些实施例中，假型组件为猫内源性病毒(RD114)包膜蛋白质、双嗜性包膜蛋白质、嗜亲性包膜蛋白质、疱疹性口腔病毒包膜蛋白质(VSV-G)，和/或副黏液麻疹包膜蛋白质H及F。
在一些实施例中，假型组件包括结合多肽及来源于不同蛋白质的融合多肽。举例而言，本文所公开的方法及组合物中的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒可通过麻疹病毒(MV)的融合(F)多肽及凝血素(H)多肽来假型化，作为非限制性实施例，MV的临床野生型菌株，及包括埃德蒙斯顿菌株(Edmonston strain；MV-Edm)或其片段的疫苗菌株。不受理论限制，认为凝血素(H)及融合(F)多肽两者均可在进入宿主细胞中发挥作用，其中该H蛋白质在靶标细胞上将MV与受体CD46、SLAM及Nectin-4结合，且F介导反转录病毒及宿主细胞膜的融合。在一说明性实施例中，尤其在靶标细胞为T细胞和/或NK细胞时，结合多肽为麻疹病毒H多肽，且融合多肽为麻疹病毒F多肽。
在一些研究中，经截短F及H多肽假型化的慢病毒颗粒在效价及转导效率上显著增大(Funke等人.2008.Molecular Therapy.16(8):1427-1436)、(Frecha等人.2008.Blood.112(13):4843-4852)。在F胞质尾区被30个残基(也称为MV(Ed)-FΔ30(SEQID NO:105))截短时获得最高效价。针对H变体，在缺失18个或19个残基(MV(Ed)-HΔ18(SEQID NO:106)或(MV(Ed)-HΔ19))时出现最佳截短，但具有24个残基的截短的变体在缺失残基经丙氨酸置换下及未置换下(MV(Ed)-HΔ24(SEQ ID NO:235)及MV(Ed)-HΔ24+A)也产生最佳效价。
在一些实施例中，包括针对转导T细胞和/或NK细胞的那些，本文公开的方法及组合物中的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒经麻疹病毒融合(F)多肽及凝血素(H)多肽的突变或变异版本(在说明性实施例中，麻疹病毒F及H多肽的胞质域缺失变体)假型化。在一些实施例中，经突变F及H多肽为“经截短H”或“经截短F”多肽，其的胞质部分已经截短，亦即，氨基酸残基(或编码蛋白质的对应核酸分子的编码核酸)已经缺失。“HΔY”及“FΔX”分别表示此类经截短H及F多肽，其中“Y”是指已自胺基端缺失的1个至34个残基，且“X”是指已自胞质域的羧基端缺失的1个至35个残基。在另一实施例中，“经截短F多肽”为FΔ24或FΔ30和/或“经截短H蛋白质”选自由以下组成的群：HΔ14、HΔ15、HΔ16、HΔ17、HΔ18、HΔ19、HΔ20、HΔ21+A、HΔ24及HΔ24+4A，更佳地HΔ18或HΔ24。在一说明性实施例中，经截短F多肽为MV(Ed)-FΔ30，且经截短H多肽为MV(Ed)-HΔ18。
在一些实施例中，融合多肽包括表达为一种多肽的多种组件。在一些实施例中，结合多肽及融合多肽自相同的转录物但自单独的核糖体结合位点翻译；在其他实施例中，结合多肽及融合多肽由裂解肽位点(其不受理论限制，在翻译之后裂解，如文献中常见)或核糖体跳跃序列隔开。在一些实施例中，结合多肽及融合多肽自分离的核糖体结合位点的翻译产生比结合多肽更高量的融合多肽。在一些实施例中，融合多肽与结合多肽的比率为至少2:1、至少3:1、至少4:1、至少5:1、至少6:1、至少7:1或至少8:1。在一些实施例中，融合多肽与结合多肽的比率在1.5:1、2:1或3:1的范围的低值端点与3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或10:1的范围的高值端点之间。
活化组件
本发明的方法及组合物方面中的多者包括活化组件(在本文中也称作T细胞活化组件)，或编码活化组件的核酸。与慢病毒(LV)转导进入静息T细胞中相关的限制归因于一系列进入前及进入后障壁以及细胞限制因子(Strebel等人2009.BMC Medicine 7:48)。一个限制为包膜假型化LV颗粒不能识别潜在受体并介导与细胞膜融合。然而，在某些条件下，静息T细胞经基于HIV-1的慢病毒载体的转导最可能在T细胞受体(TCR)CD3复合物及CD28共刺激后(Korin及Zack.1998.Journal of Virology.72:3161-8，Maurice等人.2002.Blood99:2342-50)，以及经由暴露于细胞因子(Cavalieri等人2003)。
免疫系统的细胞(诸如T淋巴细胞)经由受体或受体复合物识别特异性抗原并与其相互作用，在识别或与此类抗原相互作用时，使得细胞在体内活化并扩增。此受体的实例为抗原特异性T淋巴细胞受体复合物(TCR/CD3)。T细胞受体(TCR)在T淋巴细胞的表面上表达。一种组分(CD3)负责在TCR由配位体占据之后的胞内信号传导。针对抗原CD3复合物(TCR/CD3)的T淋巴细胞受体识别通过主要组织兼容性复合物(MHC)的蛋白质呈递至其的抗原性肽。MHC及肽的复合物在抗原呈现细胞及其他T淋巴细胞标靶的表面上表达。TCR/CD3复合物的刺激导致T淋巴细胞的活化及随后的抗原特异性免疫反应。TCR/CD3复合物在免疫系统的效应功能及调节上发挥重要作用。因此，本文提供的活化组件通过与T细胞受体相关复合物的一种或多种组分结合，例如通过与CD3结合来活化T细胞。在一些情况中，活化组件可单独活化。在其他情况中，活化需要经由TCR受体复合物活化，以便进一步活化细胞。
T淋巴细胞还需要第二、共刺激信号以变得完全活性。在无此信号下，T淋巴细胞对结合至TCR的抗原无反应，或变得无变应性。此共刺激信号例如由CD28、在产生抗原细胞上与CD80及CD86相互作用的T淋巴细胞蛋白质提供。如本文所使用，CD80的功能性胞外片段保留其与CD28相互作用的能力。ICOS(诱导性共刺激剂)(另一种T淋巴细胞蛋白质)在结合至ICOS配位体时提供共刺激信号。
T细胞受体(TCR)CD3复合物的活化及经CD28的共刺激可通过离体暴露于用抗CD3及抗CD28涂布的固体表面(例如，珠粒)上来发生。在本文所公开的方法及组合物中的一些实施例中，静息T细胞通过暴露于用抗CD3及抗CD28离体涂布的固体表面上来活化。在其他实施例中，静息T细胞或NK细胞(说明性实施例中，T细胞)通过暴露于可溶性抗CD3抗体(例如，呈50ng/ml至150ng/ml，或75ng/ml至125ng/ml，或100ng/ml)来活化。在此实施例中，其可为用于以基因方式修饰或转导(在说明性实施例中无需预先活化)的方法的部分，可进行此活化和/或接触例如8小时或更少、4小时或更少，或2小时与8小时之间、2小时与4小时之间，或2小时与3小时之间。
在本文所提供的方法及组合物的某些说明性实施例中，能够结合CD3和/或CD28的多肽在本文所公开的方法及组合物中的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的表面上呈现为“活化组件”，其亦为本发明的方面。结合CD3和/或CD28的多肽称为“活化组件”，这是由于其活化静息T细胞的能力。
在一些实施例中，活化组件为能够结合CD3的多肽。在一些实施例中，能够结合CD3的多肽为抗CD3抗体，或其保留结合至CD3的能力的片段。在说明性实施例中，抗CD3抗体或其片段为单链抗CD3抗体，诸如但不限于抗CD3scFv。在另一说明性实施例中，能够结合至CD3的多肽为抗CD3scFvFc。
大量抗人类CD3单克隆抗体及其抗体片段为可用的，且可用于本发明，包括(但不限于)UCHT1、OKT-3、HIT3A、TRX4、X35-3、VIT3、BMA030(BW264/56)、CLB-T3/3、CRIS7、YTH12.5、F111409、CLB-T3.4.2、TR-66、WT31、WT32、SPv-T3b、11D8、XIII-141、XIII46、XIII-87、12F6、T3/RW2-8C8、T3/RW24B6、OKT3D、M-T301、SMC2及F101.01。
在一些实施例中，活化组件为能够结合至CD28的多肽。在一些实施例中，能够结合至CD28的多肽为抗CD28抗体，或其保留结合至CD28的能力的片段。在其他实施例中，能够结合至CD28的多肽为CD80、CD86，或其能够结合CD28且诱导CD28介导的Akt的活化的片段，诸如CD80的外部片段。在本文中的一些方面中，CD80的外部片段表示通常存在于保留结合至CD28的能力的CD80的标准细胞位置中的细胞外部的片段。在说明性实施例中，抗CD28抗体或其片段为单链抗CD28抗体，诸如但不限于抗CD28scFv。在另一说明性实施例中，能够结合至CD28的多肽为CD80，或CD80的片段，诸如CD80的外部片段。
抗CD28抗体在此项技术中为已知的且可包括作为非限制性实施例的单克隆抗体9.3、IgG2a抗体(Dr.Jeffery Ledbetter,Bristol Myers Squibb Corporation,Seattle,Wash.)、单克隆抗体KOLT-2(IgG1抗体)、15E8(IgG1抗体)、248.23.2(IgM抗体)及EX5.3D10(IgG2a抗体)。
在一说明性实施例中，活化组件包括两种多肽，能够结合至CD3的多肽及能够结合至CD28的多肽。
在某些实施例中，能够结合至CD3或CD28的多肽为抗体(单链单克隆抗体)或抗体片段(例如单链抗体片段)。因此，抗体片段可为例如单链片段可变区(scFv)、抗体的抗体结合(Fab)片段、单链抗原结合片段(scFab)、无半胱氨酸的单链抗原结合片段(scFabΔC)、片段可变区(Fv)、对抗原的相邻抗原决定基具有特异性的结构(CRAb)或单域抗体(VH或VL)。
在本文所公开的实施例中的任一者中，活化组件或编码其的核酸可包括二聚或更高级多聚基元。二聚或多聚基元在此项技术中已知且熟练的技术人员将理解如何将其并入至多肽中以供有效二聚或多聚。举例而言，在一些实施例中，包括二聚基元的活化组件可为能够与CD3和/或CD28结合的一个或多个多肽。在一些实施例中，能够与CD3结合的多肽为抗CD3抗体或保留与CD3结合的能力的其片段。在说明性实施例中，抗CD3抗体或其片段为单链抗CD3抗体，诸如(但不限于)抗CD3 scFv。在另一说明性实施例中，能够与CD3结合的多肽为抗CD3scFvFc，其在一些实施例中被视为具有二聚基元但不具有任何额外二聚基元的抗CD3，这是由于已知抗CD3scFvFc构建体能够在不需要单独二聚基元的情况下二聚。
在一些实施例中，二聚或多聚基元或编码其的核酸序列可为来自作为同源二聚物或多聚物天然地存在的跨膜多肽的氨基酸序列。在一些实施例中，二聚或多聚基元或编码其的核酸序列可为来自天然蛋白质或经工程化蛋白质的片段的氨基酸序列。在一个实施例中，同源二聚多肽为含亮氨酸拉链基元的多肽(亮氨酸拉链多肽)。举例而言，亮氨酸拉链来源于c-JUN，其的非限制性实施例经公开与本文中的嵌合淋巴增生性组件(CLE)有关。
在一些实施例中，这些跨膜同源二聚多肽可包括早期活化抗原CD69(CD69)、转移受体蛋白1(CD71)、B细胞分化抗原(CD72)、T细胞表面蛋白触觉(CD96)、内皮因子(Cd105)、杀伤细胞凝集素样受体子族B成员1(Cd161)、P-选凝素糖蛋白配位体1(Cd162)、谷胺酰基胺基肽酶(Cd249)、肿瘤坏死因子受体超家族成员16(CD271)、钙黏蛋白-1(上皮钙黏蛋白)(Cd324)或其活性片段。在一些实施例中，二聚基元及编码其的核酸可包括来自在配位体(在本文中也称为二聚物或二聚剂)结合后二聚的跨膜蛋白的氨基酸序列。在一些实施例中，二聚基元及二聚物可包括(其中二聚物在二聚物结合对后的圆括号里)：FKBP及FKBP(雷帕霉素)；GyrB及GyrB(香豆霉素)；DHFR及DHFR(甲胺喋呤)；或DmrB及DmrB(AP20187)。如上文所提及，雷帕霉素可用作二聚物。替代地，可使用雷帕霉素衍生物或类似物(参见例如WO96/41865、WO 99/36553、WO 01/14387；及Ye等人(1999)Science 283:88-91)。举例而言，类似物、同源物、衍生物及结构上与雷帕霉素相关的其他化合物(“雷帕霉素类似物”)除此的外包括具有一个或多个与雷帕霉素相关的以下修饰的雷帕霉素的变体：在C7、C42和/或C29处去甲基化、消除或替换甲氧基；在C13、C43和/或C28处消除、衍生或替换羟基；在C14、C24和/或C30处还原、消除或衍生酮；用5员脯胺酰基环替换6员甲基呱啶环；且对环己基环进行替代取代或用经取代环戊基环替换环己基环。额外信息呈现于例如美国专利第5,525,610号、第5,310,903号、第5,362,718号及第5,527,907号中。描述了C-28羟基的选择性差向异构(参见例如WO 01/14387)。适用作雷帕霉素的替代物的额外合成二聚剂包括描述于美国专利公开案第2012/0130076号中的那些。如以上所提及，香豆霉素可用作二聚剂。替代地，可使用香豆霉素类似物(参见例如Farrar等人(1996)Nature 383:178-181；及美国专利第6,916,846号)。如以上所提及，在一些情况中，二聚剂为甲胺喋呤，例如无细胞毒性、同源双功能性甲胺喋呤二聚物(参见例如美国专利第8,236,925号)。
在一些实施例中，当存在于复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的表面上时，包括二聚基元的活化组件可在不存在二聚剂的情况下为活性的。举例而言，包括来自跨膜同源二聚多肽的二聚基元的活化组件可在不存在二聚剂的情况下为活性的，这些跨膜同源二聚多肽包括CD69、CD71、CD72、CD96、Cd105、Cd161、Cd162、Cd249、CD271、Cd324、其活性突变体和/或其活性片段。在一些实施例中，活化组件可为抗CD3单链片段且包括选自由以下组成的群的二聚基元：CD69、CD71、CD72、CD96、Cd105、Cd161、Cd162、Cd249、CD271、Cd324、其活性突变体和/或其活性片段。
在一些实施例中，当存在于复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的表面上时，包括二聚基元的活化组件可在二聚剂的存在下为活性的。举例而言，包括来自FKBP、GyrB、DHFR或DmrB的二聚基元的活化组件可分别在个别二聚剂或其类似物(例如，雷帕霉素、香豆霉素、甲胺喋呤及AP20187)的存在下为活性的。在一些实施例中，活化组件可为针对抗CD3或抗CD28的单链抗体片段或结合CD3或CD28的另一分子，且二聚基元及二聚剂可选自由以下组成的群：FKBP及雷帕霉素或其类似物、GyrB及香豆霉素或其类似物、DHFR及甲胺蝶呤或其类似物，或DmrB及AP20187或其类似物。
在一些实施例中，活化组件与异源信号序列和/或异源膜黏附序列融合，其中的两者帮助将活化组件引导至膜上。异源信号序列将活化组件靶向内质网，其中异源膜黏附序列共价连接至一种或多种脂肪酸(也称为翻译后脂质修饰)使得与异源膜黏附序列融合的活化组件锚定在质膜的脂质筏中。在一些实施例中，翻译后脂质修饰可经由豆蔻酰化、棕榈酰化或GPI锚定来发生。豆蔻酰化为对应于14-碳饱和脂肪酸(肉豆蔻酸)与真核或病毒蛋白质的N端甘氨酸的共价连接的翻译后蛋白质修饰。棕榈酰化为对应于C16酰基链与半胱氨酸，且较少地与蛋白质的丝氨酸及苏氨酸残基的共价连接的翻译后蛋白质修饰。GPI锚定是指在翻译后修饰期间糖基磷脂酰肌醇或GPI与蛋白质C端的连接。
在一些实施例中，异源膜连接序列为GPI锚定连接序列。异源GPI锚定连接序列可来源于任何已知的经GPI锚定的蛋白质(评论于Ferguson MAJ,Kinoshita T,HartGW.Glycosylphosphatidylinositol Anchors.In:Varki A,Cummings RD,Esko JD等人编.Essentials of Glycobiology.第2版.Cold Spring Harbor(NY):Cold Spring HarborLaboratory Press；2009.第11章)。在一些实施例中，异源GPI锚定连接序列为来自CD14、CD16、CD48、CD55(DAF)、CD59、CD80及CD87的GPI锚定连接序列。在一些实施例中，异源GPI锚定连接序列来源于CD16。在说明性实施例中，异源GPI锚定连接序列来源于Fc受体FcγRIIIb(CD16b)或衰变加速因子(DAF)，另外称为补体衰变加速因子或CD55。
在一些实施例中，活化组件中的一者或两者包括帮助将活化组件引导至细胞膜的表达的异源信号序列。可使用在包装细胞系中具有活性的任何信号序列。在一些实施例中，信号序列为DAF信号序列。在说明性实施例中，活化组件与在其N端的DAF循环序列及在其C端的GPI锚定连接序列融合。
在一说明性实施例中，活化组件包括与来源于CD14的GPI锚定连接序列融合的抗-CD3 scFvFc，及与来源于CD16b的GPI锚定连接序列融合的CD80；且两者表达于本文所提供的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的表面上。在一些实施例中，抗CD3 scFvFc与其N端的DAF信号序列及其C端的来源于CD14的GPI锚定连接序列融合，且CD80与其N端的DAF信号序列及其C端的来源于CD16b的GPI锚定连接序列融合；且两者皆表达于本文所提供的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的表面上。在一些实施例中，DAF信号序列包括DAF蛋白质的氨基酸残基1-30。
膜结合的细胞因子
本文所提供的方法及组合物方面中的一些实施例包括膜结合细胞因子，或编码膜结合细胞因子的多核苷酸。细胞因子通常但不总为分泌性蛋白质。天然分泌的细胞因子可经工程化为膜结合的融合蛋白质。膜结合细胞因子融合多肽包括在本文所公开的方法及组合物中，且也为本发明的方面。在一些实施例中，复制缺陷型重组反转录病毒颗粒具有在其表面上的能够结合T细胞和/或NK细胞且促进其增生及/存活的膜结合细胞因子融合多肽。通常地，将膜结合多肽并入至复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的膜中，且在细胞通过复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转导时，反转录病毒及宿主细胞膜的融合产生结合至经转导细胞的膜的多肽。
在一些实施例中，细胞因子融合多肽包括IL-7、IL-15或其活化片段。膜结合细胞因子融合多肽通常为与异源信号序列和/或异源膜连接序列融合的细胞因子。在一些实施例中，异源膜连接序列为GPI锚定连接序列。异源GPI锚定连接序列可来源于任何已知的经GPI锚定的蛋白质(评论于Ferguson MAJ,Kinoshita T,HartGW.Glycosylphosphatidylinositol Anchors.In:Varki A,Cummings RD,Esko JD等人编.Essentials of Glycobiology.第2版.Cold Spring Harbor(NY):Cold Spring HarborLaboratory Press；2009.第11章)。在一些实施例中，异源GPI锚定连接序列为来自CD14、CD16、CD48、CD55(DAF)、CD59、CD80及CD87的GPI锚定连接序列。在一些实施例中，异源GPI锚定连接序列来源于CD16。在一些实施例中，异源GPI锚定连接序列来源于Fc受体FcγRIIIb(CD16b)。在一些实施例中，GPI锚定为DAF的GPI锚定。
在说明性实施例中，膜结合细胞因子为与DAF融合的细胞因子的融合多肽。已知DAF积聚在并入至自包装细胞萌芽的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的膜中的脂质筏中。因此，不受理论限制，认为DAF融合蛋白质较佳靶向包装细胞的膜的部分，该包装细胞将变成重组反转录病毒膜的部分。
在非限制说明性实施例中，细胞因子融合多肽为IL-7，或其与DAF融合的活性片段。在一特定非限制说明性实施例中，融合细胞因子多肽依次包括：DAF信号序列(DAF的残基1-31)、无其信号序列的IL-7，及DAF的残基36-525。
核糖开关控制组件
核糖开关
本文所提供的组合物及方法中的一些包括一种或多种核糖开关或包括一种或多种核糖开关的多核苷酸，其本身形成本发明的不同方面。核糖开关为调节基因表达的细菌中的常见特征，且为实现对生物功能的RNA控制的手段。核糖开关为可存在于mRNA的5’非翻译区中的多核苷酸且经由结合小分子配位体而允许对基因表达的调节控制，该小分子配位体诱导或抑制核糖开关活性。通常地，核糖开关控制涉及产生小分子配位体的基因产物，由此形成反馈环。核糖开关通常以顺式方式作用，尽管核糖开关已经鉴别以反式方式作用。天然核糖开关由两个域组成：经由三维折叠RNA结构结合配位体的适体域及基于不存在或存在配位体诱导或抑制核糖开关的活性的功能切换域。因此，核糖开关存在两种配位体敏感构形，表示开状态及关状态(Garst等人，2011)。功能切换域可通过调节以下来影响多核苷酸的表达：内部核糖体进入位点、反转录病毒基因构建体中易得到之前mRNA剪接供体、前mRNA剪接、翻译、转录终止、转录物降解、miRNA表达，或shRNA表达(Dambach及Winkler2009)。适体域及功能切换域可用作模块化组件，允许合成RNA器件控制基因表达，作为自筛选随机RNA库所识别的天然适体、突变/经进化的天然适体，或全合成适体(McKeague等人2016)。
嘌呤核糖开关家族表示发现超过500个序列的最大家族的一者(Mandal等人2003；US20080269258及WO2006055351)。嘌呤核糖开关与中间环/接合组件(J1-2、L2、J2-3、L3、J3-1)共享由三个保守螺旋组件/茎结构(P1、P2、P3)组成的类似结构。由于序列改变，核糖开关的嘌呤家族的适体域在其与不同嘌呤化合物(诸如腺嘌呤、鸟嘌呤、腺苷、鸟苷、脱氧腺苷、脱氧鸟苷(图5))的亲和力/调节上自然不同(Kim等人2007)。
在一个方面中，本文提供用于调节靶多核苷酸的表达的经分离多核苷酸，包括：编码可操作连接至启动子及核糖开关的靶多核苷酸的多核苷酸，其中该核糖开关包括：a)能够结合核苷类似物抗病毒药物且相对于核苷类似物抗病毒药物与鸟嘌呤或2’-脱氧鸟苷结合减少的适体域；及b)能够调节靶多核苷酸的表达的功能切换域，其中核苷类似物与适体域的结合诱导或抑制功能切换域的表达调节活性，从而调节靶基因的表达。在一些实施例中，靶多核苷酸可为多肽编码区、miRNA或shRNA。在一非限制性实施例中，核糖开关可操作连接至具有活体内活性(例如在治疗疾病时有效)的编码多肽、miRNA或shRNA的核酸。举例而言，在此非限制性实施例中，核糖开关可操作连接至编码嵌合抗原受体的核酸。在本文所提供的非限制说明性实施例中，靶多核苷酸编码包括在本发明的多种其他方面中的一种或多种工程化信号传导多肽。在这些非限制说明性实施例中，核糖开关及编码一种或多种工程化信号传导多肽的靶多核苷酸可出现于包装细胞的基因组中、复制缺陷型重组反转录病毒颗粒中、T细胞和/或NK细胞中。
在一些实施例中，适体域可在30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个及70个核苷酸的长度范围的低值端点与35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个及100个核苷酸的长度范围的高值端点之间，例如长度在45个与80个核苷酸之间，长度在45个与60个核苷酸之间或长度在45个与58个核苷酸之间。在说明性实施例中，核苷类似抗病毒药物可为医药配位体阿昔洛韦(acyclovir)(也称为阿昔洛韦及非球蛋白)或喷昔洛韦(penciclovir)(图5)。在一些实施例中，适体域对核苷类似抗病毒药物的结合亲和力可比对核苷或核苷酸的结合亲和力大(例如)至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍。
在一些实施例中，控制组件(例如核糖开关)可操作连接至靶基因且可控制靶基因活体内和/或活体外表达，促进活体内经截短T细胞的扩增。在一些实施例中，扩增取决于控制组件的存在。然而，在其他实施例中，经截短T细胞的扩增可通过其他因素(诸如个体中的白细胞介素的存在)及重组T细胞上的CAR的ASTR与其配位体的结合来至少部分驱动。
在一些实施例中，在PBL自血液分离之前、期间和/或之后且在T细胞和/或NK细胞与诱导控制组件的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触之前将核苷类似抗病毒药物(例如阿昔洛韦或喷昔洛韦)施用个体，该控制组件在说明性非限制性实施例中为结合至核苷类似抗病毒药物且调节一种或多种靶多核苷酸的表达的核糖开关。一种或多种靶多核苷酸可编码一种或多种多肽，这些多肽在非限制说明性实施例中为一种或多种工程化信号传导多肽，其中的至少一者编码至少一种淋巴增生性组件。在一些实施例中，在PBL自血液分离之前或在T细胞和/或NK细胞与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触之前，在5分钟、10分钟、15分钟、30分钟与60分钟的范围的低值端点与1.5小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、8小时、12小时、24小时、48小时或72小时的范围的高值端点之间将核苷类似抗病毒药物(例如阿昔洛韦及喷昔洛韦)施用个体。在一些实施例中，在PBL自血液分离之后或在T细胞和/或NK细胞与本文所提供的方法中的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触之后，在1.5小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、8小时、12小时或24小时的范围的低值端点与1/2天、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、14天、21天或28天的范围的高值端点之间将核苷类似抗病毒药物(例如阿昔洛韦及喷昔洛韦)施用个体。在一些实施例中，在PBL自血液分离之后或在T细胞和/或NK细胞与本文所提供的方法中的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触之后的至少1.5小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、8小时、12小时或24小时，或至少2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、14天、21天或28天将核苷类似抗病毒药物(例如阿昔洛韦及喷昔洛韦)施用个体。在一些实施例中，在PBL已再融合至个体之后的至少1天、2天、3天、4天、5天、7天、10天、14天、21天、28天、30天、60天、90天或120天，或5个月、6个月、9个月、12个月、24个月、36个月、48个月、60个月、72个月、84个月、96个月、120个月或无限期将核苷类似抗病毒药物(例如阿昔洛韦及喷昔洛韦)施用个体。在本文所公开的实施例中的任一者中，可在PBL的再融合之前和/或期间和/或PBL已再融合之后施用核苷类似抗病毒药物。在一些实施例中，施用核苷类似抗病毒药物直至个体不再经历靶多核苷酸相关的疾病症状，或不再罹患该疾病。
在一些实施例中，相对于阿昔洛韦或替代地另一抗病毒剂，适体域可优先结合喷昔洛韦，使得可利用伴随的抗病毒疗法而不影响核糖开关。在一些实施例中，适体域可结合喷昔洛韦，且结合亲和力比该适体域结合阿昔洛韦或另一抗病毒剂大(例如)至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍。在一些实施例中，相对于喷昔洛韦或替代地另一抗病毒剂，适体域可优先结合阿昔洛韦，使得可利用伴随的抗病毒疗法而不影响核糖开关。在一些实施例中，适体域可结合阿昔洛韦，且结合亲和力比该适体域结合喷昔洛韦或另一抗病毒剂大(例如)至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍。在一些实施例中，可向个体给予喷昔洛韦(泛昔洛韦)及阿昔洛韦(伐昔洛韦)的口服前药。
在一些实施例中，经分离多核苷酸的适体域可与序列SEQ ID NO:87至SEQ ID NO:93中的任一者共享至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性或与其一致，且保留结合阿昔洛韦的能力及相对于核苷类似抗病毒药物结合鸟嘌呤或2′-脱氧鸟苷的减小的能力，且其中该适体域在被阿昔洛韦结合时仍保留诱导或抑制功能切换域的表达调节活性的能力。在一些实施例中，经分离多核苷酸的适体域可与SEQ ID NO:94至SEQ ID NO:100的适体域共享至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性或与其一致，且保留结合喷昔洛韦的能力及相对于核苷类似抗病毒药物结合鸟嘌呤或2′-脱氧鸟苷的减小的能力，且其中该适体域在被喷昔洛韦结合时仍保留诱导或抑制功能切换域的表达调节活性的能力。在一些实施例中，经分离多核苷酸的区或核糖开关的区可与序列SEQ ID NO:87至SEQ ID NO:100中的任一者共享至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性或与其一致。
在一些实施例中，含有经分离多核苷酸的适体域的区的DNA序列可与序列SEQ IDNO:108至SEQ ID NO:221中的任一者共享至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性或与其一致。在一些实施例中，经分离多核苷酸的区可与序列SEQ ID NO:108至SEQ ID NO:221中的任一者共享至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性或与其一致。
在一些实施例中，含有经分离多核苷酸的适体域的区的DNA序列可与SEQ ID NO:108共享至少80％、85％、90％、91.84％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性或与其一致。在一些实施例中，含有经分离多核苷酸的适体域的区的DNA序列可与SEQ ID NO:147共享至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.83％、96％、97％、98％或99％序列一致性或与其一致。在一些实施例中，含有经分离多核苷酸的适体域的区的DNA序列可与SEQ ID NO:164共享至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、93.88％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性或与其一致。在一些实施例中，含有经分离多核苷酸的适体域的区的DNA序列可与SEQ ID NO:183共享至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.83％、96％、97％、98％或99％序列一致性或与其一致。在一些实施例中，含有经分离多核苷酸的适体域的区的DNA序列可与SEQ ID NO:198共享至少80％、85％、90％、91％、91.84％、92％、93％、94％、95％、95.83％、96％、97％、98％或99％序列一致性或与其一致。
一些实施例中，经分离多核苷酸的区可包括共有序列SEQ ID NO:222至SEQ IDNO:226中的任一者。在一些实施例中，经分离多核苷酸的区可与序列SEQ ID NO:222至SEQID NO:226中的任一者共享至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.83％、96％、97％、98％或99％序列一致性或与其一致。
在本文所公开的实施例中的任一者中，经分离多核苷酸可保留结合阿昔洛韦和/或喷昔洛韦的能力。在本文所公开的实施例中的任一者中，经分离多核苷酸可为序列SEQID NO:87至SEQ ID NO:100或SEQ ID NO:108至SEQ ID NO:221中的任一者的反向补体。在本文所公开的实施例中的任一者中，经分离多核苷酸可为DNA序列SEQ ID NO:108至SEQ IDNO:221或与SEQ ID NO:108至SEQ ID NO:221互补的DNA序列的转录物或RNA版本。在本文所公开的实施例中的任一者中，经分离多核苷酸可为RNA序列SEQ ID NO:87至SEQ ID NO:100中的任一者的反向转录物或DNA版本或与RNA序列SEQ ID NO:87至SEQ ID NO:100中的任一者的反向转录物互补的DNA链。
在本文提供的一些实施例中，核糖开关支架可用于突变分析或分子进化。针对突变分析或分子进化所选择的核糖开关可来自任何已知的组织，例如细菌。在一些实施例中，来自Mesoplasma florum的I-A类脱氧鸟苷核糖开关可用于分子进化。在一些实施例中，衍生的适体域可与来自Mesoplasma florum的I-A类脱氧鸟苷核糖开关的适体域至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％或95％一致(SEQ ID NO:237)。在其他实施例中，可使用来自枯草芽孢杆菌的xpt核糖开关。在一些实施例中，衍生的适体域可与来自枯草芽孢杆菌的xpt核糖开关的适体域至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％或95％一致(SEQ IDNO:243)。
适体域可用作分子组件且与功能切换域中的任一者组合以影响RNA转录。在本文公开的实施例中的任一者中，核糖开关可通过调节以下活性中的任一者来影响RNA转录：内部核糖体进入位点(IRES)、前mRNA剪接供体可及性、前mRNA剪接、翻译、转录终止、转录降解、miRNA表达，或shRNA表达。在一些实施例中，功能转换域可控制抗IRES与IRES的结合(参见例如Ogawa，RNA(2011),17:478-488，其公开内容以全文引用的方式并入本文中)。在本文公开的实施例中的任一者中，小分子配位体的存在或不存在可使得核糖开关影响RNA转录。在一些实施例中，核糖开关可包括核糖核酸酶。具有核糖核酸酶的核糖开关可在存在小分子配位体的情况下抑制或增强对靶多核苷酸的转录降解。在一些实施例中，核糖核酸酶可为手枪类核糖核酸酶，锤头类核糖核酸酶、扭曲类核糖核酸酶、斧头类核糖核酸酶，或HDV(丁型肝炎病毒)核糖核酸酶。
在本文公开的实施例中的任一者中，核糖开关可定位于相对于靶多核苷酸的不同位置中，如通常对于核糖开关已知。在一些实施例中，核糖开关可调节前mRNA剪接供体可及性或前mRNA剪接且定位于靶多核苷酸之前。在一些实施例中，核糖开关可调节poly(A)尾部之内含物且定位于靶多核苷酸之后。在一些实施例中，核糖开关可调节抗IRES且可定位于IRES的上游。在非限制性说明性实施例中，本文提供的核糖开关可定位于相对于编码本文提供的一个或多个工程化信号传导多肽的核酸的这些位置中的任一者中。
在包括多核苷酸(包括核糖开关)的本文公开的实施例中的任一者中，该多核苷酸可进一步包括Kozak类型序列、WPRE组件及二重终止密码子或三重终止密码子中的一者或多者，其中二重终止密码子或三重终止密码子的一个或多个终止密码子定义自一个或多个转录单元的至少一者的读取终止。在某些实施例中，多核苷酸包括选自以下的Kozak类型序列：CCACCAUG(G)(SEQ ID NO:515)、CCGCCAT/UG(G)(SEQ ID NO:516)、GCCGCCGCCAT/UG(G)(SEQ ID NO:517)或GCCGCCGCCAT/UG。在某些实施例中，与第一核酸序列的起始密码子有关的-3及+4核苷酸两者包括G。在其他实施例中，其可与包括Kozak类型序列之前述实施例和/或包括三重终止密码子的以下实施例组合，多核苷酸包括WPRE组件。在一些实施例中，WPRE组件位于一个或多个转录单元的终止密码子的3’及多核苷酸的3’LTR的5’处。在另一实施例中，其可与前述实施例(亦即，其中多核苷酸包括Kozak类型序列的实施例和/或其中多核苷酸包括WPRE的实施例)组合，一个或多个转录单元经二重终止密码子或三重终止密码子的一个或多个终止密码子终止。
在一些实施例中，核糖开关可在高于37.5℃、38℃、38.5℃、39℃、39.5℃，或40℃的温度下不稳定，从而使得核糖开关不再对配位体具有反应性。在一些实施例中，分子进化可用以选择在高于37.5℃、38℃、38.5℃、39℃、39.5℃，或40℃的温度下不稳定的核糖开关。
在一些实施例中，靶多核苷酸可编码miRNA、shRNA，和/或多肽，其中靶多核苷酸可操作地连接至启动子。在一些实施例中，靶多核苷酸可编码淋巴增生性组件。在一些实施例中，靶多核苷酸可为miRNA或shRNA。在一些实施例中，miRNA或shRNA可增强STAT5路径或抑制SOCS路径。在一些实施例中，miRNA或shRNA可靶向SOCS1、SMAD2、TGFb，或PD-1的转录物。在一些实施例中，miRNA为miR-115。在一些实施例中，靶多核苷酸编码多肽且该多肽可包括包括抗原特异性靶向区的CAR、跨膜域，及胞内活化域。
在另一方面中，本文提供用于调节靶多核苷酸的表达的经分离多核苷酸，包括：编码可操作连接至启动子及核糖开关的靶多核苷酸的多核苷酸，其中该核糖开关包括：a)能够结合核苷类似抗病毒药物的适体域，且结合亲和力比适体域结合鸟嘌呤或2’-脱氧鸟苷的亲和力大至少两倍；及b)能够调节靶多核苷酸的表达的功能切换域，其中核苷类似物与适体域的结合诱导或抑制功能切换域的表达调节活性。在一些实施例中，适体域可结合核苷类似抗病毒药物，且结合亲和力比该适体域结合鸟嘌呤或2’-脱氧鸟苷的亲和力大(例如)至少3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍。在一些实施例中，适体域可在范围的低值端点长度为30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个及70个核苷酸与在范围的高值端点长度为35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个及100个核苷酸之间，例如长度在45个与80个核苷酸之间或长度在45个与58个核苷酸之间。在说明性实施例中，核苷类似抗病毒药物可为医药配位体阿昔洛韦(也称为阿昔洛韦及非球蛋白)或喷昔洛韦(penciclovir)。在一些实施例中，适体域可具有比对核苷或核苷酸的结合亲和力大(例如)至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍的对核苷类似抗病毒药物的结合亲和力。在一些实施例中，核苷类似物与适体域的结合可诱导核糖开关中的活性。
在一些实施例中，适体域可对于喷昔洛韦具有特异性且对阿昔洛韦或替代地另一抗病毒剂缺乏反应性，使得可利用伴随抗病毒治疗而不影响核糖开关。在一些实施例中，适体域可结合喷昔洛韦，且结合亲和力比该适体结合阿昔洛韦或另一抗病毒剂大(例如)至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍。在一些实施例中，适体域可对于阿昔洛韦具有特异性且对喷昔洛韦或替代地另一抗病毒剂缺乏反应性，使得可利用伴随抗病毒治疗而不影响核糖开关。在一些实施例中，适体域可结合阿昔洛韦，且结合亲和力比该适体结合喷昔洛韦或另一抗病毒剂大(例如)至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍。在一些实施例中，可向个体给予喷昔洛韦(泛昔洛韦)及阿昔洛韦(伐昔洛韦)的口服前药。在一些实施例中，衍生的适体结构域可与来自Mesoplasma florum的I-A类脱氧鸟苷核糖开关的适体结构域至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％一致。在一些实施例中，衍生的适体域可与来自枯草芽孢杆菌的xpt核糖开关的适体结构域至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％一致。在本文公开的实施例中的任一者中，核糖开关可通过调节以下活性中的任一者来影响RNA转录：内部核糖体进入位点、反转录病毒基因构建体中之前mRNA剪接供体可及性、前mRNA剪接、翻译、转录终止、转录降解、miRNA表达，或shRNA表达。在一些实施例中，功能切换域可控制抗IRES与IRES的结合。在本文公开的实施例中的任一者中，小分子配位体的存在或不存在可使得核糖开关影响RNA转录。在一些实施例中，核糖开关可包括核糖核酸酶。具有核糖核酸酶的核糖开关可在存在小分子配位体的情况下抑制或增强对相关基因的转录降解。在一些实施例中，核糖核酸酶可为手枪类核糖核酸酶、锤头类核糖核酸酶、扭曲类核糖核酸酶、斧头类核糖核酸酶，或HDV(丁型肝炎病毒)核糖核酸酶。在一些实施例中，核糖开关可在高于37.5℃、38℃、38.5℃、39℃、39.5℃，或40℃的温度下不稳定，从而使得核糖开关不再对配位体具有反应性。在一些实施例中，分子进化可用以选择在高于37.5℃、38℃、38.5℃、39℃、39.5℃，或40℃的温度下不稳定的核糖开关。在一些实施例中，靶多核苷酸可编码miRNA、shRNA，和/或多肽，其中靶多核苷酸可操作地连接至启动子。在一些实施例中，靶多核苷酸可编码淋巴增生性组件。在一些实施例中，靶多核苷酸可为miRNA，且视情况，miRNA可刺激STAT5路径或抑制SOCS路径。在一些实施例中，miRNA可靶向SOCS1、SHP、SMAD2、TGFb，或PD-1的转录物。在这些实施例中，miRNA为miR-115。在一些实施例中，靶多核苷酸编码多肽且该多肽可包括包括抗原特异性靶向区的CAR、跨膜域，及胞内活化域。CAR的其他实施例公开于本文的其他处。
在一些实施例中，适体的进化可经由使用SELEX(配位体指数富集的系统进化)方法自随机化天然嘌呤或鸟嘌呤适体库进行适体选择来进行，该方法包括(但不限于)在选择过程及筛选中采用氧化石墨烯的那些方法。在其他实施例中，诸如易错PCR的随机突变方法可用以进化适体构建体或核糖开关构建体，其中该适体通过在活体外或在哺乳动物细胞内筛选来并入本文所描述的核糖开关活性中的任一者的内容中。在其他实施例中，核苷酸的随机库可用于核糖开关的进化中。在本文所公开的实施例中的任一者中，可通过在活体外或在哺乳动物细胞内筛选此类库来识别核糖开关。
在一些实施例中，进化或衍生的适体域可增强对天然配位体的类似物的结合且减弱对天然配位体的结合。在一些实施例中，适体域可经配置以增强对天然配位体的类似物的结合且减弱对天然配位体的结合。在一些实施例中，适体域可衍生自嘌呤核糖开关家族。在一些实施例中，天然配位体可为核苷或核苷酸且类似物可为核苷类似物或核苷酸类似物。在一些实施例中，核苷类似物为抗病毒药物。在说明性实施例中，适体域可衍生自2’-脱氧鸟苷及鸟嘌呤核糖开关骨架且衍生的适体域可显示相对于野生型核糖开关的对2’-脱氧鸟苷及鸟嘌呤的降低的结合。
在一些实施例中，核糖开关可调节反转录病毒基因构建体中的前mRNA剪接供体可及性，其中该反转录病毒构建体在一般启动子或T细胞特异性启动子下自反向链驱使CAR基因或其他相关基因。在其他实施例中，核糖开关可调节反转录病毒基因构建体中的IRES，其中该反转录病毒构建体驱使CAR基因或其他相关基因的翻译。在其他实施例中，核糖开关可控制RNA、miRNA的转录终止或基因转录，或可控制转录的翻译。在其他实施例中，可将核苷类似物核糖开关与核糖核酸酶整合以在核苷类似物的存在下抑制或增强CAR基因或其他相关基因的转录降解。
在一些实施例中，用于调节靶多核苷酸的表达的经分离多核苷酸为分子克隆载体，该靶多核苷酸包括编码可操作地连接至启动子的靶多核苷酸的多核苷酸及结合核苷类似抗病毒药物的核糖开关。分子克隆载体可为此项技术中已知的任何类型的分子克隆载体。作为非限制性实施例，载体可为质粒、病毒、复制缺陷型病毒颗粒、反转录病毒、或复制缺陷型重组反转录病毒颗粒，其中的任一者可为表达载体。此表达载体可编码在上文所提供的靶多核苷酸中的任一者。一个或多个限制和/或多个克隆位点可包括于分子克隆载体5’或3’至本文所提供的核糖开关上，从而使得该核糖开关可操作地连接至插入至该限制和/或多个克隆位点中的靶多核苷酸。
分子伴侣
在一个方面中，本文中提供一种用于以基因方式修饰及扩增个体的淋巴细胞的方法，其包含：
A.使个体的静息T细胞和/或NK细胞(通常不需要先前离体刺激)与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒离体接触，该复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包含：
i.在其表面上的假型组件，该假型组件能够与T细胞和/或NK细胞结合且有助于复制缺陷型重组反转录病毒颗粒至其上的膜融合；及
ii.多核苷酸，其包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中活化的启动子的一个或多个转录单元，其中该一个或多个转录单元编码由控制组件调节的第一工程化信号传导多肽，其中该第一工程化信号传导多肽包含至少一个淋巴增生性组件和/或嵌合抗原受体，
其中该接触有助于利用复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转导静息T细胞和/或NK细胞中的至少一些，从而产生经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞；
B.将经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞引入至个体中；及
C.使经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞活体内暴露于充当控制组件的化合物以影响第一工程化信号传导多肽的表达且促进淋巴细胞在活体内的扩增，从而基因方式修饰且扩增个体的淋巴细胞。
在说明性实施例中，在无需离体刺激的情况下进行转导。在说明性实施例中，该化合物为分子伴侣，诸如小分子分子伴侣。在说明性实施例中，分子伴侣与淋巴增生性组件和/或CAR组分的结合增强淋巴增生性组件和/或CAR的增生活性。可在收集血液之前、在接触期间和/或在将T细胞和/或NK细胞引入至个体中之后将分子伴侣施用至个体。此方面的一些实施例包括自个体收集血液。在这些实施例中，引入为将在再引入之前经收集且经基因方式修饰的细胞再引入。说明性实施例中，整个过程为比先前技术方法更短的过程，如对于本文的其他方面而言。举例而言，整个过程可在少于48小时、少于24小时，或少于12小时内完成。在其他实施例中，整个过程可在范围的低值端点为2小时、4小时、6小时，或8小时内完成，且在范围的高值端点为12小时、24小时、36小时或48小时内完成。
因此，在本文所提供的方法及组合物的一些实施例中，控制组件为分子伴侣。如与本文中具有其他活体内控制组件(诸如通常结合化合物以影响本文中的第一或第二工程化信号传导多肽的淋巴增生性组件或其他组分的核糖开关)的其他实施例相比，分子伴侣为作为控制组件的化合物，且因此通过结合至本文中的第一或第二工程化信号传导多肽的淋巴增生性组件或其他组分来直接影响其活性。在包括施用分子伴侣的本文的方法的此类实施例的说明性实施例中，淋巴增生性组件、膜结合细胞因子，和/或CAR组分可为较低活性或非活性的淋巴增生性组件、膜结合细胞因子，和/或CAR组分，其由分子伴侣结合以增加其活性。因此，由分子伴侣结合的靶标通常为靶向多肽。在一些实施例中，如所指示，多肽可为第一工程化信号传导多肽和/或第二工程化信号传导多肽，或其多肽组分，其活性通过结合至分子伴侣受影响，其在说明性实施例中为小分子分子伴侣。在一些实施例中，多肽可包括活性经调节的淋巴增生性组件，在说明性实施例中其活性经分子伴侣(较佳地为小分子分子伴侣)上调。本文所提供的方法中的分子伴侣可为结合至突变淋巴增生性组件和/或非活性CAR组分，由此使其活化的化合物。
在其他实施例中，淋巴增生性组件或其他信号传导域已经突变以仅在存在小分子合成伴侣的情况下允许输送至质膜。在其他实施例中，伴侣作为增强剂促进淋巴增生性组件或其他信号传导域或蛋白质的稳定性及半衰期。
将理解，本发明的方面及实施例包括本文详细提供的相同步骤及组合物中的多者。因此，将理解，贯穿本说明书的关于这些共同组件的教示适用于将分子伴侣用作控制组件的方面及实施例，除本文提供的其他体内控制组件(诸如核糖开关)的外或替代地，该分子伴侣通常直接结合淋巴增生性组件或其他靶分子，该分子伴侣通常利用结合核糖开关的分子，诸如药物。
在一些实施例中，分子伴侣为可调节靶向物的子细胞定位的化合物，例如将诸如淋巴增生性组件和/或CAR的组分的靶向蛋白质自内质网恰当地折叠且输送至质膜或其表面上的半衰期。在其他实施例中，分子伴侣可促进功能失调靶向物的功能构造，因此充当增强剂。充当天然突变蛋白质的伴侣或增强剂的分子的实例包括鲁玛卡托(lumacaftor)及依伐卡托(ivacaftor)。这些蛋白质对诸如G551D或F508del的突变CFTR氯通道变体起作用。依伐卡托增强G551D或F508del突变离子通道的活性，而鲁玛卡托促进突变体氯通道的稳定化及依伐卡托之后续增强。此类伴随依赖性蛋白质可由天然功能性蛋白质产生且仅在存在分子伴侣的情况下筛选功能活性。因此，此类蛋白质仅在伴侣存在时具有活性。可针对特异性伴侣活性进行筛选的此类分子的实例包括对正常人类蛋白质显示无活性的小分子抗病毒剂或抗感染剂。因此，在一个实施例中，用于本文的方法中的分子伴侣为对正常人类蛋白质显示无活性的小分子抗病毒化合物或抗感染化合物。
在一些实施例中，可暴露经基因方式修饰的淋巴细胞且/或可向个体施用分子伴侣。在一些实施例中，在将PBL自血液分离之前、期间和/或之后及在使T细胞和/或NK细胞与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触之前将化合物施用个体。在此类实施例中，复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包括较低活性或非活性的淋巴增生性组件和/或结合至分子伴侣化合物且由该分子伴侣化合物调节的CAR组分。
对于本文所提供的用于修饰及扩增淋巴细胞的实施例中的任一者(其可为过继性细胞疗法方法的一部分)，可在PBL自血液分离之前或在使T细胞和/或NK细胞与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触之前，化合物可在范围的低值端点为5分钟、10分钟、15分钟、30分钟及60分钟与在范围的高值端点为1.5小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、8小时、12小时，或24小时之间施用个体。在一些实施例中，在PBL自血液分离之后或在T细胞和/或NK细胞与本文所提供的方法中的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触之后，化合物在范围的低值端点为1.5小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、8小时、12小时或24小时与在范围的高值端点为1/2天、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、14天、21天或28天之间施用个体。在一些实施例中，在PBL自血液分离之后或在T细胞和/或NK细胞与本文所提供的方法中的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触之后的至少1.5小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、8小时、12小时或24小时，或至少2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、14天、21天或28天将化合物施用个体。在一些实施例中，在PBL已再融合至个体之后的至少1天、2天、3天、4天、5天、7天、10天、14天、21天、28天、30天、60天、90天或120天，或5个月、6个月、9个月、12个月、24个月、36个月、48个月、60个月、72个月、84个月、96个月、120个月或无限期将化合物施用个体。在本文所公开的实施例中的任一者中，可在PBL的再融合之前和/或期间和/或PBL已再融合之后施用化合物。
对于本文所提供的实施例中的任一者，分子伴侣不在化合物所结合的控制组件中，该化合物调节和/或活化这些控制组件。分子伴侣为作为控制组件且调节淋巴增生性组件和/或CAR的功能性组分的活性的化合物，较佳地小分子化合物。
制造重组反转录病毒颗粒的包装细胞系/方法
本发明提供产生复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的哺乳动物包装细胞及包装细胞系。产生复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的这些细胞系在本文中也称作包装细胞系。本文的实施例7中提供此方法的一非限制性实施例。包装细胞系的细胞可为黏着细胞或悬浮细胞。在说明性实施例中，包装细胞系可为悬浮细胞系，亦即在生长期间不黏着至表面的细胞系。这些细胞可在化学上定义的培养基和/或无血清培养基中生长。在一些实施例中，包装细胞系可为来源于黏着细胞系的悬浮细胞系，例如HEK293可在根据此项技术中已知的方法产生适应悬浮的HEK293细胞系的条件下生长。包装细胞系通常在化学上定义的培养基中生长。在一些实施例中，包装细胞系培养基可包括血清。在一些实施例中，包装细胞系培养基可包括血清替代物，如此项技术中已知。在说明性实施例中，包装细胞系培养基可为无血清培养基。此培养基可为按照美国食品及药物管理局(US Food and DrugAdministration；FDA)的现行药品优良制造实践(Current Good ManufacturingPractice；CGMP)条例制造的化学上定义的无血清调配物。包装细胞系培养基可为无异源的及完整的。在一些实施例中，包装细胞系培养基由管理机构清除以用于离体细胞处理，诸如FDA 510(k)清除装置。在本文中(其中陈述培养基包括基底培养基与包括培养基补充物的目录编号诸如A1048501或A1048503的培养基补充物的组合物)应理解，所述组合物意在表示培养基与所添加补充物的组合物。通常，培养基及补充物的制造提供关于所添加补充物的量的说明。
因此，在一个方面中，本文提供一种制造复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的方法，其包括：A.在含悬浮液的无血清培养基中培养包装细胞，其中该包装细胞包含编码复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的可包装RNA基因组、REV蛋白质、gag多肽、pol多肽及假型组件的核酸序列；及B.自无血清培养基采集复制缺陷型重组反转录病毒颗粒。在另一方面中，本文提供一种用复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转导淋巴细胞的方法，其包含：A.在含悬浮液的无血清培养基中培养包装细胞，其中该包装细胞包含编码复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的可包装RNA基因组、REV蛋白质、gag多肽、pol多肽及假型组件的核酸序列；B.自无血清培养基采集复制缺陷型重组反转录病毒颗粒；及C.使淋巴细胞与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触，其中进行该接触少于24小时、20小时、18小时、12小时、8小时、4小时或2小时(或在范围的低值端点为1小时、2小时、3小时或4小时与范围的高值端点为4小时、6小时、8小时、12小时、18小时、20小时或24小时之间)，由此转导淋巴细胞。
在另一个方面中，本文提供反转录病毒包装系统，其包括：哺乳动物细胞，其包括：a)第一反式激活因子，其由组成性启动子表达且能够结合第一配位体及第一可诱导启动子以在存在与不存在第一配位体的情况下影响可操作地连接至其的核酸序列的表达；b)第二反式激活因子，其能够结合第二配位体及第二可诱导启动子，且在存在与不存在第二配位体的情况下影响可操作地连接至其的核酸序列的表达；及c)反转录病毒颗粒的可包装RNA基因组，其中该第一反式激活因子调节该第二反式激活因子的表达，且其中该第二反式激活因子调节包含于病毒包装中的反转录病毒多肽的表达，该反转录病毒多肽为诸如gag多肽、pol多肽和/或假型组件及视情况可选的将并入复制缺陷型重组反转录病毒颗粒中或并入复制缺陷型重组反转录病毒颗粒上且被认为对包装细胞系具有毒性的其他多肽，例如HEK-293。在某些方面中，第二反式激活因子自身对于包装细胞系具有细胞毒性。假型组件通常能够结合至靶细胞的细胞膜且有助于其融合，如本文所详细论述。因此，不受理论限制，系统提供积聚无法抑制或无法实质上抑制或被认为无法抑制哺乳动物细胞的增生或存活的某些多肽/蛋白质(例如非毒性蛋白质)的能力，同时培养哺乳动物细胞种群持续数天或无限期，且控制期望用于反转录病毒产物但对哺乳动物细胞的存活和/或增生具有抑制性或可具有抑制性或已经报道具有抑制性的多肽(例如毒性多肽)的诱导，直至接近将产生并采集复制缺陷型重组反转录病毒颗粒时的较晚时间。可包装RNA基因组通常由可操作地连接至启动子(出于方便起见有时在本文中称为第三启动子)的多核苷酸编码，其中该第三启动子通常可由第一反式激活因子抑或第二反式激活因子诱导。在说明性实施例中，可包装RNA基因组由可操作地连接至第三启动子的多核苷酸编码，其中该第三启动子由第二反式激活因子诱导。因此，可包装RNA基因组可在接近将采集复制缺陷型重组反转录病毒颗粒时的较晚时间点处产生。
熟练此项技术人员将理解，许多不同的反式激活因子、配位体，及可诱导启动子可用于反转录病毒包装系统中。此类可诱导启动子可分离且来源于许多生物，例如真核生物及原核生物。对用于第二生物中的来源于第一生物的可诱导启动子(例如第一原核生物及第二真核生物、第一真核生物及第二原核生物，等)的修饰为此项技术中已知的。此类可诱导启动子，及基于此类可诱导启动子但也包括其他控制蛋白质的系统包括(但不限于)醇调节的启动子(例如醇脱氢酶I(alcA)基因启动子、对醇反式激活因子蛋白质具有反应性的启动子(AlcR)等)、四环素调节的启动子(例如包括TetActivators、TetON、TetOFF等的启动子系统)、类固醇调节的启动子(例如大鼠糖皮质激素受体启动子系统、人类雌性激素受体启动子系统、类视黄素启动子系统、甲状腺启动子系统、蜕皮激素启动子系统、米非司酮启动子系统等)、金属调节的启动子(例如金属硫蛋白启动子系统等)、相关病原调节的启动子(例如水杨酸调节的启动子、乙烯调节的启动子、苯并噻二唑调节的启动子等)、温度调节的启动子(例如热休克可诱导启动子(例如HSP-70、HSP-90、大豆热休克启动子等))、光调节的启动子、合成可诱导启动子，及类似者。在一些实施例中，可使用米非司酮调节的系统。在一些实施例中，可使用具有自动调节反馈环路的米非司酮可诱导系统。在一些实施例中，GAL4调节融合蛋白质由也含有转座子端重复位点及lox位点及FRT位点的一个构建体表达。在一些实施例中，GAL4调节融合蛋白质控制反向tet反式激活因子(rtTA)及BiTRE的表达。在一些实施例中，具有lox位点及FRT位点的另一构建体含有GAL4上游活化序列(UAS)及驱动如mCherry的报道子的E1b TATA盒启动子。在一些实施例中，GAL4调节融合蛋白在控制GAL4调节融合蛋白的表达的启动子及控制靶多核苷酸的表达的启动子两者上结合GAL4上游活化序列(UAS)。在一些实施方案中，米非司酮、多西环素及嘌呤霉素将用于包装细胞系的诱导及选择。
在一些实施例中，反式激活因子中的任一者或两者可以分成两个或更多个多肽。在一些实施例中，该两个或更多个多肽可包括DNA结合域及能够刺激单独多肽上的转录的活化域。此“活化域”不与“活化组件”混淆，诸如结合CD3的多肽，其能够活化T细胞和/或NK细胞，且在与此T细胞和/或NK细胞接触时通常将其活化，如本文所详细论述。分离的多肽可进一步包括具有能够通过添加配位体而二聚的多肽的融合物。在一些实施例中，活化域可为p65活化域或其功能片段。在本文的包装系统的说明性实施例中，DNA结合域可为来自ZFHD1的DNA结合域或其功能片段。在一些实施例中，一个多肽可为具有FKBP或其功能突变体和/或其片段或多个FKBP的融合物，且另一多肽可为具有mTOR的FRB域或其功能突变体和/或其片段的融合物，且配位体可为雷帕霉素或功能性雷帕类似物。在一些实施例中，FRB含有突变体K2095P、T2098L和/或W2101F。在一些实施例中，分离的多肽可为FKBP或其功能片段，及CalcineurinA或其功能片段，且二聚剂可为FK506。在一些实施例中，分离的多肽可为FKBP或其功能片段，及CyP-Fas或其功能片段，且二聚剂可为FKCsA。在一些实施例中，分离的多肽可为GAI或其功能片段，及GID1或其功能片段，且二聚剂可为赤霉素。在一些实施例中，分离的多肽可为Snap-tag及HaloTag或其功能片段且二聚剂可为HaXS。在一些实施例中，分离的多肽可包括相同的多肽。举例而言，DNA结合域及活化结构域可表达为具有FKBP或GyrB的融合蛋白，且二聚剂可分别为FK1012或香豆霉素。在一些实施例中，可诱导启动子可为DNA结合域通常结合的DNA序列。在一些实施例中，可诱导启动子可不同于DNA结合域通常结合的DNA序列。在一些实施例中，反式激活因子可为rtTA，配位体可为四环素或多西环素，且可诱导启动子可为TRE。在说明性实施例中，第一反式激活因子为融合至FRB的p65活化域及融合至三个FKBP多肽的ZFHD1 DNA结合域，且第一配位体为雷帕霉素。在其他说明性实施例中，第二反式激活因子可为rtTA，第二配位体可为四环素或多西环素，且可诱导启动子可为TRE。
在一些实施例中，第一反式激活因子可调节组件的表达以控制含有共有序列的转录物的核输出，诸如HIV Rev，且该共有序列可为Rev反应组件。在说明性实施例中，靶细胞为T细胞。
在一些实施例中，假型组件为反转录病毒包膜多肽。假型组件通常包括用于将靶细胞与病毒膜结合并促进靶细胞与病毒膜的膜融合的结合多肽及融合多肽，如本文更详细地论述。在一些实施例中，假型组件为猫内源性病毒(RD114)包膜蛋白质、肿瘤反转录病毒双嗜性包膜蛋白质、肿瘤反转录嗜亲性包膜蛋白质和/或水泡性口炎病毒包膜蛋白质(VSV-G)。在说明性实施例中，假型组件包括结合多肽及衍生自不同蛋白质的融合多肽，如本文进一步详细论述。举例而言，在说明性实施例中，尤其在靶细胞为T细胞和/或NK细胞时，结合多肽为麻疹病毒的凝血素(H)多肽(例如麻疹病毒的埃德蒙斯顿菌株(Edmonston strain))或其细胞质域缺失变体，且其他融合多肽为麻疹病毒的融合(F)多肽(例如麻疹病毒的埃德蒙斯顿菌株)或其细胞质域缺失变体。在一些实施例中，融合多肽可包括表达为一个多肽的多个组件。在一些实施例中，结合多肽及融合多肽可翻译自同一转录物，但翻译自不同核糖体结合位点，或在翻译后使用肽裂解信号或核糖体跳过序列来裂解多肽，如本文其他处所公开，以产生结合多肽及融合多肽。在一些实施例中，当结合多肽为麻疹病毒H多肽或其细胞质域缺失，且融合多肽为麻疹病毒F多肽或其细胞质域缺失时，F多肽及H多肽自分离的核糖体结合位点的翻译产生比H多肽更高量的F多肽。在一些实施例中，F多肽(或其细胞质域缺失)与H多肽(或其细胞质域缺失)的比率为至少2:1、至少3:1、至少4:1、至少5:1、至少6:1、至少7:1，或至少8:1。
在一些实施例中，第一反式激活因子可调节能够结合并活化靶细胞(诸如T细胞或NK细胞)的活化组件的表达。可表达本文所公开的任何活化组件。举例而言，在这些实施例中，活化组件可包括：a.)能够结合并活化CD3的膜结合多肽；和/或b.)能够结合并活化CD28的膜结合多肽。在一些实施例中，能够结合至且活化CD3的膜结合多肽可为抗CD3抗体。在其他实施例中，抗CD3抗体可为抗CD3 scFvFc。在一些实施例中，能够结合并活化CD28的膜结合多肽为CD80、CD86或其功能片段，诸如CD80的细胞外域。
在一些实施例中，第二反式激活因子可调节可包装RNA基因组的表达，该可包装RNA基因组可包括编码一种或多种靶标多肽的RNA，作为非限制性实施例包括本文公开的工程化信号传导多肽中的任一者和/或一种或多种(例如两种或更多种)抑制性RNA分子。应注意，可预见反转录病毒包装系统方面及制备复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的方法方面不限于制备用于转导T细胞和/或NK细胞的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒，而也适用于可通过复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转导的任何细胞类型。在一些说明性实施例中，可包装RNA基因组经设计以表达一种或多种靶标多肽，作为非限制性实施例包括本文所公开的工程化信号传导多肽中的任一者和/或一种或多种(例如两种或更多种)与诸如gag及pol的反转录病毒组分相反定向(例如，在相反链上且在相反方向上编码)的抑制性RNA分子。举例而言，可包装RNA基因组包括5’至3’：5’长末端重复或其活性截短片段；编码反转录病毒顺式作用RNA包装组件的核酸序列；编码第一靶标多肽及视情况存在的第二靶标多肽的核酸序列，靶标多肽为诸如但不限于呈相反定向的工程化信号传导多肽，其可相对于5’长末端重复及顺式作用RNA包装组件以此相反方向驱动启动子，该启动子在一些实施例中仅出于方便起见称为“第四”启动子(且有时在本文中称为在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子)，其在诸如T细胞和/或NK细胞的靶细胞中具有活性，但在说明性实施例中，在包装细胞中不具有活性，或在包装细胞中仅具有诱导性或最小活性；及3’长末端重复或其活性截短片段。在一些实施例中，可包装RNA基因组可包括中枢聚嘌呤区域(cPPT)/中枢终止序列(CTS)组件。在一些实施例中，反转录病毒顺式作用RNA包装组件可为HIV Psi。在一些实施例中，反转录病毒顺式作用RNA包装组件可为Rev反应组件。在例示性实施例中，由与5’长末端重复相反定向的启动子驱动的工程化信号传导多肽为本文所公开的一种或多种工程化信号传导多肽，且可视情况表达如本文更详细公开的一种或多种抑制性RNA分子。
应理解，诸如第一启动子、第二启动子、第三启动子、第四启动子等的启动子编号仅出于方便起见。除非明确地叙述其他启动子，否则称为“第四”启动子的启动子不应被视为暗示存在任何其他启动子，诸如第一启动子、第二启动子或第三启动子。应注意，这些启动子中的每一者能够驱动转录物以适当细胞类型表达，且此类转录物形成转录单元。
在一些实施例中，工程化信号传导多肽可包括第一淋巴增生性组件。适合的淋巴增生性组件公开于本文中的其他部分中。作为非限制性实施例，淋巴增生性组件可表达为具有识别域的融合物，诸如eTag，如本文所公开。在一些实施例中，可包装RNA基因组可进一步包括编码第二工程化多肽的核酸序列，包括编码本文所提供的任何CAR实施例的嵌合抗原受体。举例而言，第二工程化多肽可包括第一抗原特异性靶向区、第一跨膜域，及第一胞内活化域。抗原特异性靶向区、跨膜域及胞内活化域的实例公开于本文其他处。在靶细胞为T细胞的一些实施例中，在靶细胞中具有活性的启动子在T细胞中具有活性，如本文其他处所公开。
在一些实施例中，工程化信号传导多肽可包括CAR，且核酸序列可编码本文所提供的任何CAR实施例。举例而言，工程化多肽可包括第一抗原特异性靶向区、第一跨膜域及第一胞内活化域。抗原特异性靶向区、跨膜域及胞内活化域的实例公开于本文其他处。在一些实施例中，可包装RNA基因组可进一步包括编码第二工程化多肽的核酸序列。在一些实施例中，第二工程化多肽可为淋巴增生性组件。在其中靶细胞为T细胞或NK细胞的一些实施例中，在靶细胞中具有活性的启动子在T细胞或NK细胞中具有活性，如本文其他处所公开。
在一些实施例中，可包装RNA基因组可进一步包括核糖开关，如本文其它部分所论述。在一些实施例中，编码工程化信号传导多肽的核酸序列可呈反向定向。在其他实施例中，可包装RNA基因组可进一步包括核糖开关，且视情况该核糖开关可呈反向定向。在本文所公开的实施例中的任一者中，包括这些组件中的任一者的多核苷酸可包括引物结合位点。在说明性实施例中，转录阻断剂或polyA序列可置放于基因附近以防止或减少未经调节的转录。在本文所公开的实施例中的任一者中，编码Vpx的核酸序列可位于第二转录单元上或视情况存在的第三转录单元上，或位于可操作地连接至第一可诱导启动子的额外转录单元上。
在本文中的另一方面中提供一种包含复制缺陷型反转录病毒颗粒的可包装RNA基因组的哺乳动物包装细胞系，其中该可包装RNA基因组包含：
a.5’长末端重复或其活化片段；
b.编码反转录病毒顺式作用RNA包装组件的核酸序列；
c.多核苷酸，其包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一种或多种核酸序列，其中一种或多种核酸中的第一核酸序列编码针对一种或多种RNA靶标的一种或多种(例如两种或更多种)抑制性RNA分子，且一种或多种核酸中的第二核酸序列编码嵌合抗原受体(CAR)，该嵌合抗原受体包含抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域及胞内活化域；及
d.3’长末端重复或其活化片段。
以上方面中的抑制性RNA分子可包括在本公开的其它部分中所提供的抑制性RNA分子中的任一者，作为非限制性实施例，shRNA或miRNA。
在哺乳动物包装细胞系方面的一些实施例中，(c)的多核苷酸可与编码反转录病毒顺式作用RNA包装组件(b)、5’长末端重复(a)和/或3’长末端重复(d)的核酸序列呈相反定向。
在哺乳动物包装细胞系方面的一些实施例中，可包装RNA基因组的表达通过在哺乳动物包装细胞系中具有活性的诱导型启动子驱动。
在说明性实施例中，在驱动上文紧接着提供的这些方面中的可诱导RNA及CAR的表达的T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子，在包装细胞系中不具有活性或仅具有最小活性或可诱导活性。在说明性实施例中，在T细胞和/或NK细胞中具有活性的此启动子位于编码一(例如两种)或多种可诱导RNA及CAR及3’LTR的核酸之间的可包装RNA基因组上。
在涉及编码针对一种或多种RNA靶向物的一种或多种抑制性RNA分子的可包装细胞或细胞系的方面中的任一者中，至少一种抑制性RNA分子及在一些实施例中，所有抑制性RNA分子可包括彼此部分地或完全互补的5’链及3’链，其中该5’链及该3’链能够形成18个至25个核苷酸RNA双螺旋体。在一些实施例中，5’链长度可为18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸，且3’链长度可为18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸。在一些实施例中，5’链及3’链长度可相同或不同。在一些实施例中，RNA双螺旋可包括一个或多个错配。在替代实施例中，RNA双螺旋不具有错配。
在上文针对本文的编码针对一种或多种RNA靶向物的抑制性RNA分子的可包装细胞或细胞系所提供的方面中的任一者中，抑制性RNA分子可为miRNA或shRNA。在一些实施例中，抑制性分子可为miRNA之前体，诸如Pri-miRNA或Pre-miRNA，或shRNA之前体。在一些实施例中，一种或多种抑制性RNA分子可为人工衍生的miRNA或shRNA。在其他实施例中，抑制性RNA分子可为经处理成siRNA的dsRNA(经转录或人工引入)或siRNA本身。在一些实施例中，抑制性RNA分子可为miRNA或shRNA，其具有在自然界中未发现的序列，或具有在自然界中未发现的至少一个功能区段，或具有在自然界中未发现的功能区段的组合。在说明性实施例中，抑制性RNA分子中的至少一者或全部为miR-155。
在上文针对本文的编码针对一种或多种RNA靶向物的抑制性RNA分子的可包装细胞或细胞系所提供的方面中的任一者中，该一种或多种抑制性RNA分子在一些实施例中可包含自5’至3’定向：5’臂、5’茎、环、与该5’茎部分或完全互补的3’茎，及3’臂。在一些实施例中，两种或更多种抑制性RNA分子中的至少一者具有此排列。在其他实施例中，两个或更多个抑制性RNA分子的全部均具有此排列。在一些实施例中，5’茎长度可为18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸。在一些实施例中，3’茎长度可为18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸。在一些实施例中，环长度可为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸。在一些实施例中，5’臂、3’臂或两者均衍生自天然存在的miRNA。在一些实施例中，5’臂、3’臂或两者均衍生自天然存在的miRNA，该miRNA选自以下组成的群：miR-155、miR-30、miR-17-92、miR-122及miR-21。在说明性实施例中，5’臂、3’臂或两者均衍生自miR-155。在一些实施例中，5’臂、3’臂或两者均衍生自小家鼠miR-155或智人miR-155。在一些实施例中，5’臂具有SEQ IDNO:256中所阐述的序列或为其功能变体，诸如与SEQ ID NO:256长度相同，或为SEQ ID NO:256的长度的95％、90％、85％、80％、75％，或50％，或为100个核苷酸或更少、95个核苷酸或更少、90个核苷酸或更少、85个核苷酸或更少、80个核苷酸或更少、75个核苷酸或更少、70个核苷酸或更少、65个核苷酸或更少、60个核苷酸或更少、55个核苷酸或更少、50个核苷酸或更少、45个核苷酸或更少、40个核苷酸或更少、35个核苷酸或更少、30个核苷酸或更少，或25个核苷酸或更少；且与SEQ ID NO:256至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％一致的序列。在一些实施例中，3’臂具有SEQ ID NO:260中所阐述的序列或为其功能变体，例如与SEQ ID NO:260相同的长度，或为SEQ ID NO:206的长度的95％、90％、85％、80％、75％，或50％，或为100个核苷酸或更少、95个核苷酸或更少、90个核苷酸或更少、85个核苷酸或更少、80个核苷酸或更少、75个核苷酸或更少、70个核苷酸或更少、65个核苷酸或更少、60个核苷酸或更少、55个核苷酸或更少、50个核苷酸或更少、45个核苷酸或更少、40个核苷酸或更少、35个核苷酸或更少、30个核苷酸或更少，或25个核苷酸或更少；且与SEQ ID NO:260至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％一致的序列。在一些实施例中，3’臂包含小家鼠BIC的核苷酸221至283。
在另一方面中，本文提供用于制备复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的方法，其包括：培养包装细胞群以积聚第一反式激活因子，其中这些包装细胞包括由组成性启动子表达的第一反式激活因子，其中该第一反式激活因子能够结合第一配位体及第一可诱导启动子，以在存在与不存在第一配位体的情况下影响可操作地连接至其上的核酸序列的表达，且其中第二反式激活因子的表达由第一反式激活因子调节；在第一配位体的存在下培育包括积聚的第一反式激活因子的包装细胞群以积聚第二反式激活因子，其中第二反式激活因子能够结合第二配位体及第二可诱导启动子，以在存在与不存在第二配位体的情况下影响可操作地连接到其上的核酸序列的表达；且在第二配位体的存在下培育包括积聚的第二反式激活因子的包装细胞群，从而诱导涉及病毒包装的反转录病毒多肽的表达，诸如gag多肽、pol多肽和/或假型组件，及视情况存在的被认为抑制哺乳动物细胞增生或存活的其他多肽，其将并入复制缺陷型重组反转录病毒中或并入其上，从而制得复制缺陷型重组反转录病毒颗粒。在说明性实施例中，可包装RNA基因组由可操作地连接至启动子(出于方便起见有时称作“第三”启动子)的多核苷酸编码，其中该第三启动子具有组成性活性或可由第一反式激活因子或在说明性实施例中由第二反式激活因子诱导，从而制得复制缺陷型重组反转录病毒颗粒。假型组件通常能够结合靶细胞的细胞膜且促进靶细胞膜与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒膜的融合。假型组件可为此项技术中已知的任何包膜蛋白质。在一些实施例中，包膜蛋白质可为水泡性口炎病毒包膜蛋白质(VSV-G)、猫内源性病毒(RD114)包膜蛋白质、肿瘤反转录病毒双嗜性包膜蛋白质和/或肿瘤反转录嗜亲性包膜蛋白质。熟练此项技术这将理解，多种不同反式激活因子、配位体，及可诱导启动子可用于制备复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的方法中。适合的反式激活因子、配位体，及可诱导启动子公开于本文中其他处，包括上文中。熟练的业内人士将进一步理解，与本文提供的反转录病毒包装系统方面相关的上述教示也适用于制备复制缺陷型重组反转录病毒颗粒方面的方法，且反之亦然。
在一些实施例中，第一反式激活因子可调节组件的表达以控制含有共有序列的转录物的核输出，诸如HIV Rev，且共有序列可为Rev反应组件(RRE)。在说明性实施例中，靶细胞通常为T细胞。在一些实施例中，HIV RRE及编码HIV Rev的多核苷酸区域可分别由HIV-2RRE及编码HIV-2Rev的多核苷酸区域替代。在一些实施例中，HIV RRE及编码HIV Rev的多核苷酸区域可分别由SIV RRE及编码SIV Rev的多核苷酸区域替代。在一些实施例中，HIVRRE及编码HIV Rev的多核苷酸区域可分别由RemRE及编码β反转录病毒Rem的多核苷酸区域替代。在一些实施例中，HIV RRE及编码HIV Rev的多核苷酸区域可分别由δ反转录病毒RexRRE及编码δ反转录病毒Rex的多核苷酸区域替代。在一些实施例中，不需要Rev类蛋白质且PRE可由诸如组成性转运组件(CTE)的顺式作用RNA组件替代。
在一些实施例中，假型组件为病毒包膜蛋白质。假型化分析组件通常包括用于将病毒与靶细胞膜结合并促进病毒与靶细胞膜的膜融合的结合多肽及融合多肽。在一些实施例中，假型组件可为猫内源性病毒(RD114)包膜蛋白质、肿瘤反转录病毒双嗜性包膜蛋白质、肿瘤反转录嗜亲性包膜蛋白质和/或水泡性口炎病毒包膜蛋白质(VSV-G)。在说明性实施例中，假型组件包括结合多肽及衍生自不同蛋白质的融合多肽，如本文进一步详细论述。举例而言，在一说明性实施例中，尤其在靶细胞为T细胞和/或NK细胞时，结合多肽可为麻疹病毒H多肽的细胞质域缺失变体且融合多肽可为麻疹病毒F多肽的细胞质域缺失变体。在一些实施例中，融合多肽可包括表达为一个多肽的多个组件。在一些实施例中，结合多肽及融合多肽可翻译自同一转录物且翻译自不同核糖体结合位点，或可在翻译后使用肽裂解信号或核糖体跳过序列来裂解多肽，如本文其他处所公开，以产生结合多肽及融合多肽。在一些实施例中，结合多肽及融合多肽自分离的核糖体结合位点的翻译产生比结合多肽更高量的融合多肽。在一些实施例中，融合多肽与结合多肽的比率为至少2:1、至少3:1、至少4:1、至少5:1、至少6:1、至少7:1，或至少8:1。
在一些实施例中，第一反式激活因子可调节能够结合并活化诸如T细胞的靶细胞的活化组件的表达。在这些实施例中，活化组件可包括：a.)能够结合并活化CD3的膜结合多肽；和/或b.)能够结合并活化CD28的膜结合多肽。在一些实施例中，能够结合并活化CD28的膜结合多肽为CD80、CD86或其功能片段。在一些实施例中，复制缺陷型重组反转录病毒颗粒可包括反转录病毒膜上的活化组件及核衣壳内的反转录病毒RNA，从而制得复制缺陷型重组反转录病毒颗粒。
在一些实施例中，第二反式激活因子可调节包括自5’至3’的RNA的表达：5’长末端重复或其活性截短片段；编码反转录病毒顺式作用RNA包装组件的核酸序列；编码第一靶标多肽及视情况存在的第二靶标多肽(作为非限制性实施例，一或两种工程化信号传导多肽)的核酸序列；在靶细胞中具有活性的启动子；及3’长末端重复或其活性截短片段。在一些实施例中，RNA可包括cPPT/CTS组件。在一些实施例中，RNA可包括引物结合位点。在一些实施例中，反转录病毒顺式作用RNA包装组件可为HIV Psi。在一些实施例中，反转录病毒顺式作用RNA包装组件可为Rev反应组件。在本文公开的实施例中的任一者中，RNA上的反转录病毒组分(包括RRE及Psi)可位于任何位置，如熟练此项技术人员将理解。在说明性实施例中，工程化信号传导多肽为本文所公开的工程化信号传导多肽中的一者或多者。
在一些实施例中，工程化信号传导多肽可包括第一淋巴增生性组件。适合的淋巴增生性组件公开于本文中的其他部分中。在一些说明性实施例中，淋巴增生性组件为融合至识别域的IL-7受体突变体，诸如eTag。在一些实施例中，可包装RNA基因组可进一步包括编码第二工程化多肽的核酸序列，包括编码本文所提供的任何CAR实施例的嵌合抗原受体。举例而言，第二工程化多肽可包括第一抗原特异性靶向区、第一跨膜域，及第一胞内活化域。抗原特异性靶向区、跨膜域及胞内活化域的实例公开于本文其他处。在靶细胞为T细胞的一些实施例中，在靶细胞中具有活性的启动子在T细胞中具有活性，如本文其他处所公开。
在一些实施例中，可包装RNA基因组可进一步包括核糖开关，如本文其它部分所论述。在一些实施例中，编码工程化信号传导多肽的核酸序列可呈反向定向。在其他实施例中，可包装RNA基因组可进一步包括核糖开关，且视情况该核糖开关可呈反向定向。在本文所公开的实施例中的任一者中，包括这些组件中的任一者的多核苷酸可包括引物结合位点。在说明性实施例中，转录阻断剂或polyA序列可置放于基因附近以防止或减少未经调节的转录。在本文所公开的实施例中的任一者中，编码Vpx的核酸序列可位于第二转录单元上或视情况存在的第三转录单元上，或位于可操作地连接至第一可诱导启动子的额外转录单元上。
在用于制备复制缺陷型重组反转录病毒颗粒方面的包装系统或方法的一些实施例中，编码的RNA可以包括内含子，其可例如转录自用于表达靶标多肽的相同启动子。在某些说明性实施例中，此类内含子可编码1种、2种、3种，或4种miRNA。在用于制备复制缺陷型重组反转录病毒颗粒方面的包装系统或方法的这些及其他实施例中，可包装RNA基因组大小为11,000KB或更小，且在一些实例中为10,000KB或更小。
在一些实施例中，第一反式激活因子可影响一种或多种非毒性多肽的表达。在一些实施例中，第二反式激活因子可影响一种或多种毒性多肽的表达。举例而言，第一反式激活因子可诱导除了将转运至包装细胞的细胞膜的多肽的外的反转录病毒蛋白质Rev及Vpx的表达，且第二反式激活因子可诱导反转录病毒蛋白质GAG、POL、MV(Ed)-FΔ30以及MV(Ed)-HΔ18或MV(Ed)-HΔ24的表达以及慢病毒基因组的表达。在一些实施例中，第一反式激活因子可影响一种或多种毒性多肽的表达且/或第二反式激活因子可影响一种或多种非毒性多肽的表达。
在另一方面中，本文提供哺乳动物包装细胞，其包括：a)哺乳动物包装细胞的基因组中的第一转录单元，其包括编码第一反式激活因子的核酸序列，其中该第一转录单元可操作地连接至组成性启动子，且其中该反式激活因子能够结合第一可诱导启动子且在存在与不存在第一配位体的情况下影响可操作地连接至其上的核酸序列的表达，且其中该第一反式激活因子能够结合该第一配位体；b)哺乳动物包装细胞的基因组中的第二转录单元及视情况存在的第三转录单元，其包括编码反转录病毒REV蛋白质的核酸序列及编码第二反式激活因子的核酸序列，该第二反式激活因子能够结合第二可诱导启动子且在存在与不存在第二配位体的情况下影响可操作地连接至其上的核酸序列的表达，其中该第二反式激活因子能够结合该第二配位体，且其中该第二转录单元及视情况存在的第三转录单元可操作地连接至该第一可诱导启动子；c)哺乳动物包装细胞的基因组中的第四转录单元及视情况存在的第五转录单元，其包括编码反转录病毒gag多肽及反转录病毒pol多肽的核酸序列，以及能够结合并促进靶细胞膜与反转录病毒膜的融合的结合多肽和融合多肽，其中该第四转录单元及视情况存在的第五转录单元可操作地连接至该第二可诱导启动子；以及d)哺乳动物包装细胞的基因组中的第六转录单元，其自5’至3’包括5’LTR或其活性截短片段、编码反转录病毒顺式作用RNA包装组件的核酸序列、cPPT/CTS组件、编码工程化信号传导多肽的核酸序列的反向互补、内含子、在靶细胞中具有活性的启动子，以及3’LTR或其活性截短片段，其中该第六转录单元可操作地连接至该第二可诱导启动子。
在另一方面中，本文提供用于制备复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的方法，其包括：1.)培养包装细胞群以积聚第一反式激活因子，其中这些包装细胞包括：a)哺乳动物包装细胞的基因组中的第一转录单元，其包括编码第一反式激活因子的核酸序列，其中该第一转录单元可操作地连接至组成性启动子，且其中该反式激活因子能够结合第一可诱导启动子且在存在与不存在第一配位体的情况下影响可操作地连接至其上的核酸序列的表达，且其中该第一反式激活因子能够结合该第一配位体；b)哺乳动物包装细胞的基因组中的第二转录单元及视情况存在的第三转录单元，其包括编码反转录病毒REV蛋白质的核酸序列及编码第二反式激活因子的核酸序列，该第二反式激活因子能够结合第二可诱导启动子且在存在与不存在第二配位体的情况下影响可操作地连接至其上的核酸序列的表达，其中该第二反式激活因子能够结合该第二配位体，且其中该第二转录单元及视情况存在的第三转录单元可操作地连接至该第一可诱导启动子；c)哺乳动物包装细胞的基因组中的第四转录单元及视情况存在的第五转录单元，其包括编码反转录病毒gag多肽及反转录病毒pol多肽的核酸序列，以及能够结合并促进反转录病毒膜与靶细胞膜的融合的结合多肽和融合多肽，其中该第四转录单元及视情况存在的第五转录单元可操作地连接至该第二可诱导型启动子；以及d)哺乳动物包装细胞的基因组中的第六转录单元，其自5’至3’包括5’LTR或其活性截短片段、引物结合位点(PBS)、编码反转录病毒顺式作用RNA包装组件的核酸序列、cPPT/CTS组件、编码工程化信号传导多肽的核酸序列的反向互补、内含子、在靶细胞中具有活性的靶细胞启动子，以及3’LTR或其活性截短片段，其中该第五转录单元可操作地连接至该第二可诱导启动子；及2)在该第一配位体的存在下培育包括该第一反式激活因子的包装细胞群以积聚该第二反式激活因子及反转录病毒REV蛋白质；及3)在该第二配位体的存在下培育包括该第二反式激活因子及反转录病毒REV蛋白质的包装细胞群，从而诱导反转录病毒gag多肽、反转录病毒pol多肽、结合多肽、融合多肽及反转录病毒RNA(自5’至3’包括5’LTR或其活化片段的反转录病毒RNA、PBS、反转录病毒顺式作用RNA包装组件、编码工程化信号传导多肽的核酸序列的反向互补、靶细胞启动子，以及3’LTR或其活性截短片段)的表达，其中复制缺陷型重组反转录病毒颗粒由包装细胞形成并释放，且其中该复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包括反转录病毒膜上的结合多肽和/或融合多肽以及核衣壳内的反转录病毒RNA，从而制得复制缺陷型重组反转录病毒颗粒。
在本文所提供的一方面中，反转录病毒包装系统可包括哺乳动物细胞，其包括：1.)第一反式激活因子，其由组成性启动子表达且能够结合第一配位体及第一可诱导启动子来在存在与不存在第一配位体的情况下影响可操作地连接至其上的核酸序列的表达；2.)第二反式激活因子，其能够结合第二配位体及第二可诱导启动子，且在存在与不存在第二配位体的情况下影响可操作地连接至其上的核酸序列的表达；及3.)反转录颗粒的可包装RNA基因组，其中该第一反式激活因子调节该第二反式激活因子、HIV REV、IL7 GPI DAF及活化组件的表达，且其中该第二反式激活因子调节gag多肽、pol多肽、反转录病毒顺式作用RNA包装组件，及一种或多种包膜多肽的表达。在说明性实施例中，第一反式激活因子可为融合至p65活化域的FRB域及融合至ZFHD1 DNA结合域的一个或多个FKBP域，第一配位体可为雷帕霉素，且第一可诱导启动子可为一个或多个ZFHD1结合位点。在说明性实施例中，第二反式激活因子可为rtTA蛋白质，第二配位体可为四环素或多西环素，且第二可诱导启动子可为TRE启动子或双向TRE启动子。在说明性实施例中，反转录病毒顺式作用RNA包装组件可为HIV Psi。在说明性实施例中，一种或多种包膜蛋白质包括麻疹病毒的F多肽及H多肽的细胞质域缺失变体。在说明性实施例中，转录阻断剂或polyA序列可置放于基因附近以防止或减少未经调节的转录。在一些实施例中，可使用具有核糖开关的雷帕霉素-多西环素可诱导慢病毒基因组(SEQ ID NO:83)。在一些实施例中，可使用雷帕霉素-多西环素可诱导GAG POL ENV(SEQ ID NO:84)。在一些实施例中，可使用雷帕霉素可诱导TET活化子(SEQ IDNO:85)。在一些实施例中，可使用雷帕霉素诱导子可诱导REV srcVpx(SEQ ID NO:86)。
本发明的一些方面包括细胞或为细胞，在说明性实施例中为用作包装细胞以制备复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的哺乳动物细胞，诸如用于转导T细胞和/或NK细胞的慢病毒颗粒。可选择广泛多种细胞中的任一者来在体外产生病毒或病毒颗粒，诸如根据本发明的复位向重组反转录病毒颗粒。通常使用真核细胞，尤其哺乳动物细胞，包括人类细胞，猿类细胞，犬类细胞，猫类细胞，马类细胞及啮齿动物细胞。在说明性实施例中，细胞为人类细胞。在其他说明性实施例中，细胞无限地增生，且因此永生。可有利地用于本发明的细胞的实例包括NIH 3T3细胞、COS细胞、Madin-Darby犬肾细胞、人类胚胎293T细胞及衍生自此类细胞的任何细胞，诸如gpnlslacZ
Figure BDA0002257374180000701
细胞，其衍生自293T细胞。可使用高度可转染细胞，诸如人胚胎肾293T细胞。“高度可转染”是指细胞的至少约50％、较佳地至少约70％、最佳地至少约80％可表达引入的DNA的基因。
适合的哺乳动物细胞包括原代细胞及永生化细胞系。适合的哺乳动物细胞系包括人类细胞系、非人类灵长类细胞系、啮齿动物(例如小鼠、大鼠)细胞系，及类似者。适合的哺乳动物细胞系包括(但不限于)HeLa细胞(例如美国模式培养物保藏所(ATCC)第CCL-2号)、CHO细胞(例如ATCC第CRL9618号、第CCL61号、第CRL9096号)、293细胞(例如ATCC第CRL-1573号)、Vero细胞、NIH 3T3细胞(例如ATCC第CRL-1658号)、Huh-7细胞、BHK细胞(例如ATCC第CCLlO号)、PC12细胞(ATCC第CRL1721号)、COS细胞、COS-7细胞(ATCC第CRL1651号)、RATl细胞、小鼠L细胞(ATCC第CCLI.3号)、人类胚胎肾(HEK)细胞(ATCC第CRL1573号)、HLHepG2细胞、Hut-78、Jurkat、HL-60、NK细胞系(例如NKL、NK92及YTS)，及类似者。
在本文所公开的实施例中的任一者中，制备复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的方法可包括使哺乳动物包装细胞生长至50％、60％、70％、80％、90％或95％汇合，或生长至25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的峰值细胞密度，且接着分裂或稀释细胞。在一些实施例中，可使用搅拌槽反应器来使细胞生长。在一些实施例中，可使用熟练的业内人士将理解的方法将细胞分裂至少约1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:12、1:15，或1:20。在一些实施例中，可将细胞稀释至25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的峰值细胞密度。在一些实施例中，在分裂或稀释细胞之后，可在添加第一配位体之前使细胞生长持续1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、10小时，或16小时，或1天、2天、3天、4天、5天、6天，或7天。在一些实施例中，在存在第一配位体的情况下使细胞生长持续1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、21天，或28天，在说明性实施例中，该第一配位体可为雷帕霉素或雷帕类似物。在一些实施例中，可添加第二配位体且使细胞生长持续1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、21天，或28天，在说明性实施例中，该第二配位体可为四环素或多西环素。培养条件将取决于所用的细胞及配位体，且方法为此项技术中已知的。用于培养且诱导HEK293S细胞的条件的特定实例显示于实施例8中。
如本文所公开，复制缺陷型重组反转录病毒颗粒为用于基因递送的常用工具(Miller，Nature(1992)357:455-460)。复制缺陷型重组反转录病毒颗粒将未经排列的核酸序列递送至广泛范围的啮齿动物、灵长类动物及人类体细胞中的能力使得复制缺陷型重组反转录病毒颗粒较适用于将基因转移至细胞。在一些实施例中，复制缺陷型重组反转录病毒颗粒可衍生自α反转录病毒属，β反转录病毒属，γ反转录病毒属，δ反转录病毒属，ε反转录病毒属，慢病毒属或泡沫病毒属。存在许多种适用于本文中所公开的方法的反转录病毒。举例而言，可使用鼠白血病病毒(MLV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、马感染性贫血病毒(EIAV)、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、劳斯肉瘤病毒(RSV)、富士纳肉瘤病毒(FuSV)、莫罗尼鼠白血病病毒(Mo-MLV)、FBR鼠骨肉瘤病毒(FBR MSV)、莫罗尼鼠肉瘤病毒(Mo-MSV)、艾贝森鼠白血病病毒(Abelson murine leukemia virus)(A-MLV)、禽骨髓细胞病变病毒-29(MC29)及禽红细胞增生病毒(AEV)。反转录病毒的详细列表可见于Coffin等人的(“Retroviruses”，1977，Cold Spring Harbor Laboratory Press版：J M Coffin,S MHughes,H E Varmus，第758至763页)。可在此项技术中找到关于一些反转录病毒的基因组结构的细节。举例而言，可自NCBI Genbank(亦即Genome Accession第AF033819号)中找到关于HIV的细节。
在说明性实施例中，复制缺陷型重组反转录病毒颗粒可衍生自慢病毒属。在一些实施例中，复制缺陷型重组反转录病毒颗粒可衍生HIV、SIV或FIV。在其他说明性实施例中，复制缺陷型重组反转录病毒颗粒可衍生自慢病毒属中的人类免疫缺陷病毒(HIV)。慢病毒为复杂的反转录病毒，除常见的反转录病毒基因gag、pol及env外，还含有具有调节或结构功能的其他基因。较高复杂性使得慢病毒能够在潜伏感染过程中调节其生命周期。典型的慢病毒为人类免疫缺陷病毒(HIV)，AIDS的病原体。在体内，HIV可感染极少分裂的终末分化的细胞，诸如淋巴细胞及巨噬细胞。
在说明性实施例中，本文提供的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒含有Vpx多肽。Vpx多肽可在其基因组中整合Vpx编码核酸后在包装细胞系中表达，例如作为并入至反转录病毒膜中的细胞膜结合蛋白质(Durand等人，J.Virol.(2013)87:234-242)。可通过病毒蛋白酶的处理顺序构建反转录病毒膜结合Vpx，使得游离Vpx一旦并入病毒颗粒中即被释放。具有此功能的Vpx融合物的此实例为Src-Flag-Vpx，其包括c-Src之前11个氨基酸的膜靶向域(MGSSKSKPKDP)(SEQ ID NO:227)，随后为病毒蛋白酶裂解域KARVLAEA(SEQ ID NO:228)，随后为Flag-tagged Vpx。
不受理论的限制，Vpx多肽通过降解限制因子SAMHD1来刺激反转录过程的效率，而有助于静息细胞的转导。因此，认为在本文提供的方法中，其中Vpx存在于用以转导T细胞和/或NK细胞的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒中，Vpx在通过含有Vpx的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转导细胞之后经释放至静息T细胞或静息NK细胞的细胞质中。Vpx接着降解SAMHD1，其使得游离dNTP增加，此进而刺激反转录病毒基因组的反转录。
在一些实施例中，本文提供的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包含和/或含有Vpu多肽。Vpu多肽可在其基因组中整合Vpu编码核酸后自质粒或包装细胞系表达为例如被并入反转录病毒膜中的病毒膜蛋白。由Vpu与针对人类中的表达优化的其序列密码子形成的重组可经构筑及表达，使得可将游离Vpu并入至病毒颗粒中。Vpu为出现于HIV-1及一些HIV-1相关的猿猴免疫缺陷病毒(SIV)分离物(诸如SIVcpz、SIVgsn及SIVmon)中但并非HIV-2或大多数SIV分离物中的辅助蛋白。Vpu蛋白参与CD4的下调及束缚蛋白的拮抗以供颗粒释放。更重要地，Vpu与病毒孔蛋白且特定而言来自流感病毒A(IAV)的病毒孔蛋白M2共享结构相似性，由此，Vpu经显示形成阳离子选择性离子信道且在多种模型中渗透膜。已显示，IAV-M2有助于酸化颗粒且因此有利于自用于进入之内体途径早期释放，从而减少尽头传输产物的量。
本文的实施例20表明，通过反转录病毒颗粒转导静息PBMC由反转录病毒颗粒中的Vpu的存在来加强。不受理论限制，Vpu多肽通过加速慢病毒假型的酸化辅助静息细胞的转导，从而允许更多衣壳更快的到达胞质。酸化病毒内部导致削弱病毒结构蛋白之间的静电相互作用，且因此有助于分解衣壳及核糖核酸蛋白(RNP)复合物。因此，据信在本文提供的方法中(其中Vpu存在于用于转导T细胞和/或NK细胞的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒膜中)，在通过含有Vpu的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转导细胞后，Vpu加速慢病毒颗粒在内体途径中的酸化，且有利于将衣壳释放至静息T细胞和/或NK细胞的胞质中。因此，在一些实施例中，其中包括Vpu多肽，其包含或为Vpu的片段，该Vpu片段保留促进静息PBMC(且在一些实施例中，静息T细胞)的转导的能力。该片段可包含与野生型Vpu具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％一致性的75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的Vpu的片段。在一些实施例中，Vpu多肽包括保留促进慢病毒颗粒在内体途径中的酸化的能力的Vpu片段。
反转录病毒基因组大小
在本文提供的方法及组合物中，重组反转录病毒基因组(在非限制性说明性实施例中为慢病毒基因组)对可包装至病毒颗粒中的多核苷酸的数量具有限制。在本文提供的一些实施例中，由多核苷酸编码区编码的多肽可为保留功能活性的截短或其它缺失，使得多核苷酸编码区由比野生型多肽的多核苷酸编码区更少的核苷酸编码。在一些实施例中，由多核苷酸编码区编码的多肽可为可由一个启动子表达的融合多肽。在一些实施例中，融合多肽可具有裂解信号以由一个融合多肽及一个启动子产生两个或更多个功能性多肽。此外，在初始离体转导之后不需要的一些功能不包括于反转录病毒基因组中，而经由包装细胞膜存在于复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的表面上。这些不同策略在本文用于使包装于复制缺陷型重组反转录病毒颗粒内的功能性组件最大化。
在一些实施例中，待包装的重组反转录病毒基因组可在范围的低值端点为1,000个、2,000个、3,000个、4,000个、5,000个、6,000个、7,000个及8,000个核苷酸与范围的高值端点为2,000个、3,000个、4,000个、5,000个、6,000个、7,000个、8,000个、9,000个、10,000个及11,000个核苷酸之间。待包装的反转录病毒基因组包括编码如本文所详细公开的第一及第二工程信号传导多肽的一个或多个多核苷酸区。在一些实施例中，待包装的反转录病毒基因组可少于5,000个、6,000个、7,000个、8,000个、9,000个、10,000个，或11,000个核苷酸。本文其他处所讨论的可包装的功能包括用于反转录病毒装配及包装所需的反转录病毒序列，诸如反转录病毒rev、gag及pol编码区，以及5’LTR及3’LTR或其活性截短片段，编码反转录病毒顺式作用RNA包装组件的核酸序列及cPPT/CTS组件。此外，在说明性实施例中，本文中的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒可包括以下中的任何一者或多者或全部(在一些实施例中呈这些反转录病毒功能区的相反取向)：编码第一及第二工程信号传导多肽的一个或多个多核苷酸区，其中的至少一者包括至少一个淋巴组织增生组件且可进一步包括ASTR；可包括嵌合抗原受体的第二工程化信号多肽；通常调节第一和/或第二工程化信号传导多肽表达的控制组件，诸如核糖开关；识别域、内含子、在靶细胞中具有活性的启动子，诸如T细胞，2A裂解信号和/或IRES。
重组反转录病毒颗粒
重组反转录病毒颗粒公开于本文提供的方法及组合物中，例如用以转导T细胞和/或NK细胞以制备经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞。重组反转录病毒颗粒自身为本发明的方面。通常，包括于本文提供的方面中的重组反转录病毒颗粒为复制缺陷型的，表示重组反转录病毒颗粒在其离开包装细胞时即无法复制。在说明性实施例中，重组反转录病毒颗粒为慢病毒颗粒。
在一些方面中，本文提供一种复制缺陷型重组反转录病毒颗粒以用于转导细胞，通常淋巴细胞且在说明性实施例中T细胞和/或NK细胞。复制缺陷型重组反转录病毒颗粒可包括本文其他处论述的假型组件中的任一者。在一些实施例中，复制缺陷型重组反转录病毒颗粒可包括本文其他处论述的活化组件中的任一者。在一个方面中，本文提供包括多核苷酸的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒，该多核苷酸包括：A.可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一个或多个转录单元，其中该一个或多个转录单元编码嵌合抗原受体(CAR)；及B.在其表面上的假型组件及T细胞活化组件，其中该T细胞活化组件不由复制缺陷型重组反转录病毒颗粒中的多核苷酸编码。在一些实施例中，T细胞活化组件可为本文其他处论述的活化组件中的任一者。在说明性实施例中，T细胞活化组件可为抗CD3scFvFc。在另一方面中，本文提供一种复制缺陷型重组反转录病毒颗粒，其包括多核苷酸，该多核苷酸包括可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一个或多个转录单元，其中该一个或多个转录单元编码包括嵌合抗原受体(CAR)的第一多肽及包括淋巴增生性组件的第二多肽。在一些实施例中，淋巴增生性组件可为嵌合淋巴增生性组件。在说明性实施例中，淋巴增生性组件不包含连接至IL-7受体α链或其片段的IL-7。在一些实施例中，淋巴增生性组件不包含连接至IL-2/IL-15受体β链的IL-15。
在一些方面中，本文提供一种复制缺陷型重组反转录病毒颗粒，其包含多核苷酸，该多核苷酸包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一个或多个转录单元，其中该一个或多个转录单元编码包含嵌合抗原受体(CAR)的第一多肽及包含嵌合淋巴增生性组件(例如组成性活性嵌合淋巴增生性组件)的第二多肽。在说明性实施例中，嵌合淋巴增生性组件不包含连接至其同源受体或连接至其同源受体的片段的细胞因子。
在一些方面中，本文提供一种重组反转录病毒颗粒，其包括(i)假型组件，其能够结合T细胞和/或NK细胞并促进重组反转录病毒颗粒的膜融合；(ii)多核苷酸，其具有可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一个或多个转录单元，其中该一个或多个转录单元编码具有嵌合抗原受体(包括抗原特异性靶向区、跨膜域及胞内活化域)的第一工程化信号传导多肽，以及包含至少一种淋巴组织增生性组件的第二工程化信号传导多肽；其中该第一工程化信号传导多肽和/或该第二工程化信号传导多肽的表达由体内控制组件调节；及(iii)在其表面上的活化组件，其中该活化组件能够结合至T细胞和/或NK细胞，且不由重组反转录病毒颗粒中的多核苷酸编码。在一些实施例中，在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子在包装细胞系中不具有活性，或仅以可诱导的方式在包装细胞系中具有活性。在本文公开的实施例中的任一者中，第一及第二工程化信号传导多肽中的一者可具有嵌合抗原受体且另一工程化信号传导多肽可具有至少一种淋巴增生性组件。
贯穿本发明提供包括于复制缺陷型重组反转录病毒颗粒中的各种组件及组件的组合，诸如假型组件、活化组件及膜结合细胞因子，以及包括于复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的基因组中的核酸序列，诸如但不限于编码CAR的核酸；编码淋巴增生性组件的核酸；编码控制组件(诸如核糖开关)的核酸；启动子，尤其在T细胞中具有组成型活性或可诱导的启动子；及编码抑制性RNA分子的核酸。此外，本文提供的各种方面(诸如制备重组反转录病毒颗粒的方法、进行过继细胞治疗的方法，以及转导T细胞的方法)产生和/或包括复制缺陷型重组反转录病毒颗粒。此类方法中产生和/或包括的复制缺陷型重组反转录病毒自身形成作为本发明的独立方面的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒组合物，这些组合物可呈分离形式。此类组合物可呈干燥(例如冻干)形式，或者可呈此项技术已知的适合的溶液或培养基形式以用于储存且使用反转录病毒颗粒。
因此，作为非限制性实施例，在另一方面中，本文提供一种在其基因组中具有多核苷酸的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒，该多核苷酸具有可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一种或多种核酸序列，在一些情况下，该核酸序列包括编码针对一种或多种RNA靶标的一种或多种(例如两种或更多种)抑制性RNA分子的第一核酸序列及编码嵌合抗原受体或CAR的第二核酸序列，如本文所描述。在其他实施例中，存在编码本文先前所描述的不为抑制性RNA分子的至少一种淋巴增生性组件的第三核酸序列。在某些实施例中，多核苷酸包括如本文所提及的一个或多个核糖开关，这些核糖开关可操作地连接至第一核酸序列、第二核酸序列和/或第三核酸序列(若存在)。在此构建体中，一种或多种抑制性RNA、CAR和/或不为抑制性RNA的一种或多种淋巴增生性组件的表达由核糖开关控制。在一些实施例中，两种至10种抑制性RNA分子由第一核酸序列编码。在其他实施例中，两种至六种抑制性RNA分子由第一核酸序列编码。在说明性实施例中，4种抑制性RNA分子由第一核酸序列编码。在一些实施例中，第一核酸序列编码一种或多种抑制性RNA分子且位于内含子内。在某些实施例中，内含子包括启动子的全部或部分。启动子可为Pol I、Pol II，或Pol III启动子。在一些说明性实施例中，启动子为Pol II启动子。在一些实施例中，内含子邻近在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子且位于该启动子的下游。在一些实施例中，内含子为EF1-α内含子A。
本文的重组反转录病毒颗粒实施例包括其中反转录病毒颗粒包含基因组的那些，该基因组包括编码一种或多种抑制性RNA分子的一种或多种核酸。编码可包括于反转录病毒颗粒的基因组中的抑制性RNA分子的此类核酸的各种替代实施例(包括此类核酸与编码除抑制性RNA分子的外的CAR或淋巴增生性组件的其他核酸的组合)包括于例如本文提供的抑制性RNA部分以及包括于组合这些实施例的各种其他段落中。此外，此类复制缺陷型重组反转录病毒的各种替代物可通过在本文中所公开的包装细胞系方面内公开的例示性核酸识别。熟练的业内人士将认识到，包括编码一种或多种(例如两种或更多种)抑制性RNA分子的基因组的重组反转录病毒颗粒的此部分的公开内容可与本文其他部分所提供的编码抑制性RNA分子的此类核酸的各种替代物组合。此外，熟练的业内人士将认识到，编码一种或多种抑制性RNA分子的此类核酸可与本文所提供的各种其他功能性核酸组件组合，例如本文中侧重于抑制性RNA分子及编码这些分子的核酸的部分所公开。此外，在本文其他部分中提供的特异性抑制性RNA分子的各种实施例可用于本发明的重组反转录病毒颗粒方面中。
诸如慢病毒载体的重组反转录病毒载体的必需元素为是此项技术中已知的。这些元素包括于包装细胞系部分中，及在实施例部分中所提供的用于制备重组反转录病毒颗粒的细节中。举例而言，慢病毒颗粒通常包括包装组件REV、GAG及POL，其可经由一种或多种包装质粒递送至包装细胞系；假型分型组件，本文提供的各种实施例，其可经由假型化质粒递送至包装细胞系；及基因组，其由经由转移质粒递送至宿主细胞的多核苷酸产生。此多核苷酸通常包括病毒LTR及psi包装信号。5’LTR可为与异源启动子融合的嵌合5’LTR，其包括不依赖于Tat反式活化的5’'LTR。转移质粒可自失活，例如通过移除3’LTR的U3区。在一些非限制性实施例中，对于包括反转录颗粒的本文提供的任何组合物或方法方面及实施例，将包括(但不限于)Src-FLAG-Vpu的Vpu(诸如包含Vpu的多肽(本文中有时称为“Vpu多肽”))包装于反转录病毒颗粒内。在一些非限制性实施例中，将Vpx(诸如Src-FLAG-Vpx)包装于反转录病毒颗粒内。不受理论限制，在转导T细胞后，Vpx进入细胞的胞液且促进SAMHD1的降解，从而使得可用于反向转录胞质dNTP库增加。在一些非限制性实施例中，对于包括本文提供的反转录颗粒的任何组合物或方法方面及实施例，将Vpu及Vpx包装于反转录病毒颗粒内。
包括于本发明的各种方面中的反转录病毒颗粒(例如慢病毒颗粒)在说明性实施例中为非复制型，尤其出于对于包括将用此类反转录病毒颗粒转导的细胞引入个体的实施例的安全原因。当复制缺陷型反转录病毒颗粒用于转导细胞时，反转录病毒颗粒并非由转导的细胞产生。对反转录病毒基因组的修饰为此项技术中已知的，以确保包括该基因组的反转录病毒颗粒为复制缺陷型的。然而，应理解，在一些实施例中，针对本文所提供的方面中的任一者，可使用复制胜任型重组反转录病毒颗粒。
熟练的业内人士将认识到，可使用不同类型的载体(诸如表达载体)将本文所论述的功能组件递送至包装细胞和/或至T细胞。本发明的说明性方面利用反转录病毒载体，及(在一些特定说明性实施例中)慢病毒载体。其他适合的表达载体可用于实现本文的某些实施例。此类表达载体包括(但不限于)病毒载体(例如基于以下的病毒载体：痘苗病毒；脊髓灰质炎病毒；腺病毒(参见例如Li等人，Invest Opthalmol Vis Sci 35:2543 2549,1994；Borras等人，Gene Ther 6:515 524,1999；Li及Davidson，PNAS 92:7700 7704,1995；Sakamoto等人，H Gene Ther 5:1088 1097,1999；WO 94/12649,WO 93/03769；WO 93/19191；WO 94/28938；WO 95/11984and WO 95/00655)；腺相关病毒(参见例如Ali等人，HumGene Ther 9:81 86,1998，Flannery等人，PNAS 94:6916 6921,1997；Bennett等人，InvestOpthalmol Vis Sci 38:2857 2863,1997；Jomary等人，Gene Ther 4:683 690,1997，Rolling等人，Hum Gene Ther 10:641 648,1999；Ali等人，Hum Mol Genet 5:591594,1996；WO 93/09239中的Srivastava，Samulski等人，J.Vir.(1989)63:3822-3828；Mendelson等人，Virol.(1988)166:154-165；及Flotte等人，PNAS(1993)90:10613-10617)；SV40；单纯疱疹病毒；或反转录病毒载体(例如，小鼠白血病病毒、脾坏死病毒及衍生自诸如罗斯肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus)、哈维肉瘤病毒(Harvey Sarcoma Virus)、禽白血病病毒、人类免疫缺陷病毒、骨髓增生性肉瘤病毒及乳腺肿瘤病毒的反转录病毒的载体)，例如γ反转录病毒；或人类免疫缺陷病毒(参见例如Miyoshi等人，PNAS 94:1031923,1997；Takahashi等人，J Virol 73:7812 7816,1999)；及类似者。
在说明性实施例中，反转录病毒颗粒为慢病毒颗粒。此类反转录病毒颗粒通常包括位于病毒包膜内的衣壳内的反转录病毒基因组。
在一些实施例中，利用含DNA的病毒颗粒代替重组反转录病毒颗粒。此类病毒颗粒可为腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、巨细胞病毒、痘病毒、牛痘病毒、流感病毒、水泡性口炎病毒(VSV)，或辛德毕斯病毒(Sindbis virus)。熟练的业内人士将理解如何修改本文公开的用于不同病毒及反转录病毒或反转录病毒颗粒的方法。在使用包括DNA基因组的病毒颗粒时，熟练的业内人士将理解，这些基因组中可包括功能单元以诱导将病毒颗粒的全部或部分DNA基因组整合至用此类病毒转导的T细胞的基因组中。
在一些实施例中，HIV RRE及编码HIV Rev的多核苷酸区可由N端RGG盒RNA结合基元及编码ICP27的多核苷酸区替代。在一些实施例中，编码HIV Rev的多核苷酸区可由编码腺病毒E1B 55-kDa及E4 Orf6的一个或多个多核苷酸区替代。
在一个方面中，本发明提供容器(诸如商业容器或包装)或包含其的试剂盒，包含根据本文提供的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒方面中的任一者的经分离复制缺陷型重组反转录病毒颗粒。此外，在另一方面中，本文提供容器(诸如商业容器或包装)或包含其的试剂盒，包含根据本文提供的包装细胞和/或包装细胞系方面中的任一者的经分离包装细胞，在说明性实施例中，来自包装细胞系的经分离包装细胞。在一些实施例中，试剂盒包括额外容器，该额外容器包括额外试剂，诸如用于本文提供的方法中的缓冲液或试剂。此外，在某些方面中，本文提供任何方面中的本文提供的任何复制缺陷型重组反转录病毒颗粒在制造用于以基因方式修饰根据本文提供的任何方面的T细胞或NK的试剂盒中的用途。此外，在某些方面中，本文提供任何方面中的本文提供的任何包装细胞和/或包装细胞系在制造用于产生根据本文提供的任何方面的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒中的用途。
在一个方面中，本文提供含有复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的商用容器及使用来治疗个体的肿瘤生长的说明书，其中该复制缺陷型重组反转录病毒颗粒在其基因组中包含多核苷酸，该多核苷酸包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一种或多种核酸序列。在一些实施例中，一种或多种核酸序列中的一核酸序列可编码嵌合抗原受体(CAR)，该嵌合抗原受体包含抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域及胞内活化域。在一些实施例中，一种或多种核酸序列中的一核酸序列可编码针对一个或多个RNA靶标的一个或多个抑制性RNA分子。
含有重组反转录病毒颗粒的容器可为用于储存重组反转录病毒颗粒的管、小瓶，孔板，或其他容器。试剂盒可包括两个或更多个容器，其中第二或其他容器可包括例如用于转导T细胞和/或NK细胞的溶液或培养基，和/或第二或其他容器可包括pH调节药用试剂。这些容器中的任一者可具有工业强度及等级。包括试剂盒及编码抑制性RNA分子的核酸的此类方面中的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒可为本文所提供的此类复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的实施例中的任一者，其包括本文所提供的抑制性RNA的实施例中的任一者。
在另一方面中，本文提供一种复制缺陷型重组反转录病毒颗粒在制造用于以基因方式修饰T细胞和/或NK细胞的试剂盒中的用途，其中试剂盒的用途包括：使T细胞或NK细胞与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒离体接触，其中该复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包括表面上的假型组件及表面上的T细胞活化组件，其中该接触有助于通过复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转导T细胞或NK细胞，由此产生经基因方式修饰的T细胞或NK细胞。在一些实施例中，T细胞或NK细胞可来自个体。在一些实施例中，T细胞活化组件可经膜结合。在一些实施例中，该接触可进行范围的低值端点为1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时或8小时与范围的高值端点为4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、10小时、12小时、15小时、18小时、21小时及24小时之间，例如1小时与12小时之间。用于制造试剂盒的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒可包括本文其他处论述的方面、实施例或子实施例中的任一者。
经基因方式修饰的T细胞及NK细胞
在本文的方法及组合物的实施例中，产生本身为本发明的单独方面的经基因方式修饰的淋巴细胞。此类经基因方式修饰的淋巴细胞可为经转导的淋巴细胞。在一个方面中，本文提供经基因方式修饰的T细胞或NK细胞，其中T细胞或NK细胞经经基因方式修饰以表达第一工程化信号传导多肽。在一些实施例中，第一工程化信号传导多肽可为淋巴增生性组件或包括抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域及胞内活化域的CAR。在一些实施例中，T细胞或NK细胞可进一步包括可为CAR或淋巴增生性组件的第二工程化信号传导多肽。在一些实施例中，淋巴增生性组件可为嵌合淋巴增生性组件。在一些实施例中，T细胞或NK细胞可进一步包括表面上的假型组件。在一些实施例中，T细胞或NK细胞可进一步包括表面上的活化组件。经基因方式修饰的T细胞或NK细胞的CAR、淋巴增生性组件、假型组件及活化组件可包括本文公开的方面、实施例或子实施例中的任一者。在说明性实施例中，活化组件可为抗CD3scFvFc。
本文提供的一些方面包括根据方法通过转导静息T细胞和/或静息NK细胞制成的经基因方式修饰的T细胞或NK细胞，该方法包含使静息T细胞和/或静息NK细胞与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒离体接触，其中该复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包含在其表面上的假型组件及在其表面上的膜结合T细胞活化组件，其中该接触有助于通过复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转导静息T细胞和/或NK细胞，由此产生经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞，且其中该接触进行范围的低值端点为1小时、2小时、3小时、4小时或6小时与范围的高值端点为4小时、6小时、8小时、10小时、12小时、18小时、20小时或24小时之间，例如1小时与12小时之间。
在一些实施例中，经基因方式修饰的淋巴细胞为已经基因方式修饰以表达包含至少一种淋巴增生性组件的第一工程化信号传导多肽和/或包含嵌合抗原受体的第二工程化信号传导多肽的淋巴细胞，诸如T细胞或NK细胞，该嵌合抗原受体包括抗原特异性靶向区(ASTR)，跨膜域及胞内活化域。在本文方面中的任一者的一些实施例中，NK细胞为NKT细胞。NKT细胞为表达CD3且通常共表达αβT细胞受体且还表达通常与NK细胞相关的多种分子标记物(NK1.1或CD56)的子组。
本发明的经基因方式修饰的淋巴细胞具有已通过重组DNA方法引入至淋巴细胞中的异源核酸序列。举例而言，在用于转导本文所提供的淋巴细胞的方法期间将说明性实施例中的异源序列插入至淋巴细胞中。在淋巴细胞内发现异源核酸，且在一些实施例中经整合或未整合至经基因方式修饰的淋巴细胞的基因组中。
在说明性实施例中，将异源核酸整合至经基因方式修饰的淋巴细胞的基因组中。在说明性实施例中，使用利用重组反转录病毒颗粒的本文所提供的用于转导淋巴细胞的方法来产生此类淋巴细胞。此类重组反转录病毒颗粒可包括编码嵌合抗原受体的多核苷酸，该嵌合抗原受体通常包括至少一个抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域及胞内活化域。在本发明的其他部分中，本文提供复制缺陷型重组反转录病毒颗粒及在复制缺陷型反转录病毒颗粒的基因组中编码的多核苷酸的各种实施例，该复制缺陷型反转录病毒颗粒可用以产生本身形成本发明的另一方面的经基因方式修饰的淋巴细胞。
本发明的经基因方式修饰的淋巴细胞可在体外分离。举例而言，此类淋巴细胞可出现于如本文所提供的用于离体转导的培养基及其他溶液中。淋巴细胞可以未经基因方式修饰的形式存在于以本文所提供的方法自个体收集的血液中，接着在转导方法期间经基因方式修饰。经基因方式修饰的淋巴细胞可在其经基因方式修饰之后在其经引入或再引入至个体之后出现于个体内部。经基因方式修饰的淋巴细胞可为静息T细胞或静息NK细胞，或经基因方式修饰的T细胞或NK细胞可以主动分裂，尤其在其表达在如本文所公开的转导之后经插入至T细胞或NK细胞中的核酸中所提供的功能组件中的一些之后。
在一个方面中，本文提供经转导和/或经基因方式修饰的T细胞或NK细胞，其包含重组多核苷酸，该重组多核苷酸在其基因组中包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一个或多个转录单元，这些转录单元表达本发明的方面及实施例中的任一者中提供的功能组件中的一者或多者。举例而言，一个或多个转录元可表达CAR，其可包括本文所提供的CAR组件中的任一者，诸如ASTR(作为非限制性实施例，为MBR-ASTR)、跨膜域及胞内信号传导域，且可以进一步包括作为非限制性实施例的调节域。此外，本文提供在经转导和/或经基因方式修饰的T细胞或NK细胞内表达的一个或多个功能组件、淋巴增生性组件中的一者或多者，例如组成性活性IL-7受体突变体或不为抑制性RNA分子(例如miRNA或shRNA)的其他淋巴增生性组件、识别域和/或消除域。
在一个方面中，本文提供经基因方式修饰的T细胞或NK细胞，其包含：
a.针对一种或多种RNA靶标的一种或多种(例如两种或更多种)抑制性RNA分子；及
b.嵌合抗原受体(CAR)，其包含抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域及胞内活化域，
和/或编码针对一种或多种RNA靶标的抑制性RNA分子及CAR的核酸，其中该一种(例如两种)或更多种抑制性RNA分子及CAR或编码其的核酸编码由T细胞和/或NK细胞的基因修饰的核酸序列编码或为T细胞和/或NK细胞的基因修饰的核酸序列。
经基因方式修饰的T细胞或NK细胞可为经基因方式修饰的T细胞群和/或NK细胞群，其包括针对一种或多种RNA靶标的一种(例如两种)或更多种抑制性RNA分子；及CAR。
在紧接以上T细胞或NK细胞包含一种或多种(例如两种或更多种)抑制性RNA分子及CAR或编码其的核酸的方面的一些实施例中，针对可包括作为CAR的一部分或可与淋巴增生性组件一起表达或用以控制淋巴增生性组件的组件，可包括本文所提供的具体实施例中的任一者。
在紧接以上T细胞或NK细胞包含一种或多种(例如两种或更多种)抑制性RNA分子及CAR或编码其的核酸的方面的一些实施例中，CAR为微环境限制性生物(MRB)-CAR和/或经基因方式修饰的T细胞或NK细胞可进一步包括不为抑制性RNA分子的至少一种淋巴增生性组件和/或编码淋巴增生性组件的核酸。在此类实施例中，淋巴增生性组件由对T细胞和/或NK细胞的基因修饰的核酸序列编码。在此类实施例中，可使用和/或编码本文所公开的淋巴增生性组件中的任一者。举例而言，至少一种淋巴增生性组件可为组成性活性的IL-7受体。
在紧接以上T细胞或NK细胞包含一种或多种(例如两种或更多种)抑制性RNA分子及CAR或编码其的核酸的方面的一些实施例中，该抑制性RNA分子为miRNA或shRNA的前体。在此方面的一些实施例中，该一种(例如两种)或更多种抑制性RNA分子为多顺反子的。在此方面的一些实施例中，该一种(例如两种)或更多种抑制性RNA分子针对相同的或(在说明性实施例中)不同的RNA靶标。在此方面的一些实施例中，该一种(例如两种)或更多种抑制性RNA分子中的大部分或全部降低了内源性TCR的表达。
在紧接以上T细胞或NK细胞包含一种或多种(例如两种或更多种)抑制性RNA分子及CAR或编码其的核酸的方面的一些实施例中，该RNA靶标为自选自由以下组成的群的基因转录的mRNA：PD-1、CTLA4、TCRα、TCRβ、CD3ζ、SOCS、SMAD2、miR-155靶标、IFNγ、cCBL、TRAIL2、PP2A，及ABCG1。在此方面的一些实施例中，该一种(例如两种)或更多种抑制性RNA分子中的至少一者为miR-155。
在紧接以上T细胞或NK细胞包含一种或多种(例如两种或更多种)抑制性RNA分子及CAR或编码其的核酸的方面的一些实施例中，CAR的ASTR为MRB ASTR和/或CAR的ASTR结合至与肿瘤相关的抗原。此外，在以上方面的一些实施例中，第一核酸序列可操作地连接至核糖开关，该核糖开关例如能够结合核苷类似物，且在说明性实施例中为抗病毒药物，例如阿昔洛韦。
在本文公开的方法及组合物中，工程化信号传导多肽的表达由控制组件调节，且在一些实施例中，该控制组件为包含核糖开关的多核苷酸。在某些实施例中，核糖开关能够结合核苷类似物，且当核苷类似物存在时，表达工程化信号传导多肽中的一者或两者。
本文所公开的经基因方式修饰的淋巴细胞也可在其表面上具有多肽，这些多肽在本文所提供的转导方法期间为复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的融合的残留物。此类多肽可包括活化组件、假型组件和/或包括细胞因子的一种或多种融合多肽。
在一个方面中，本文提供表达针对一种或多种RNA靶标一种或多种(例如两种或更多种)抑制性RNA分子及嵌合抗原受体或CAR的经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞，如本文所公开。在一些实施例中，经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞进一步表达本文所公开的不为抑制性RNA分子的至少一种淋巴增生性组件。在某些实施例中，经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞还表达控制一种或多种抑制性RNA分子、CAR和/或不为抑制性RNA分子的至少一种淋巴增生性组件的表达的一种或多种核糖开关。在一些实施例中，经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞表达两种至10种抑制性RNA分子。在其他实施例中，经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞表达两种至六种抑制性RNA分子。在说明性实施例中，经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞表达四种抑制性RNA分子。
核酸
本发明提供编码本发明的多肽的核酸。在一些实施例中，核酸将为DNA，包括例如重组性表达载体。在一些实施例中，核酸将为RNA，例如体内合成的RNA。
在一些情况下，核酸提供例如在哺乳动物细胞中产生本发明的多肽。在其他情况下，个体核酸提供编码本发明的多肽的核酸的扩增。
编码本发明的多肽的核苷酸序列可操作地连接至转录控制组件，例如启动子及增强子等。
适合的启动子及增强子组件为此项技术中已知的。为在细菌细胞中表达，适合的启动子包括(但不限于)lacl、lacZ、T3、T7、gpt、λP及trc。为在真核细胞中表达，适合的启动子包括(但不限于)轻链和/或重链免疫球蛋白基因启动子及增强子组件；巨细胞病毒立即早期启动子；单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子；早期及晚期SV40启动子；反转录病毒的长末端重复中存在的启动子；小鼠金属硫蛋白-I启动子；及此项技术中已知的各种组织特异性启动子。
适合的可逆启动子(包括可逆诱导型启动子)为此项技术中已知的。此类可逆启动子可分离且衍生自许多生物体，例如真核生物及原核生物。对用于第二生物中的衍生自第一生物(例如第一原核生物及第二真核生物、第一真核生物及第二原核生物，等)的可逆启动子的修饰为此项技术中已知的。此类可逆启动子，及基于此类可逆启动子但也包含其他控制蛋白质的系统包括(但不限于)醇调节启动子(例如醇去氢酶I(alcA)基因启动子、对醇反式激活因子蛋白质具有反应性的启动子(AlcR)等)、四环素调节的启动子(例如包括TetActivators、TetON、TetOFF等的启动子系统)、类固醇调节的启动子(例如大鼠糖皮质激素受体启动子系统、人类雌性激素受体启动子系统、类视黄素启动子系统、甲状腺启动子系统、蜕皮激素启动子系统、米非司酮启动子系统等)、金属调节的启动子(例如金属硫蛋白启动子系统等)、相关病原调节的启动子(例如水杨酸调节的启动子、乙烯调节的启动子、苯并噻二唑调节的启动子等)、温度调节在启动子(例如热休克可诱导启动子(例如HSP-70、HSP-90、大豆热休克启动子等))、光调节的启动子、合成可诱导启动子，及类似者。
在一些情况下，含有适合的启动子的基因座或构建体或转基因经由对可诱导系统的诱导来进行不可逆转换。用于诱导不可逆转换的适合的系统为此项技术中公知的，例如，不可逆转换的诱导可利用Cre-lox介导的重组(参见例如Fuhrmann-Benzakein等人，PNAS(2000)28:e99，其公开内容以引用的方式并入本文)。此项技术中已知的重组酶、内切核酸酶、连接酶、重组位点等的任何适合的组合可用于产生不可逆转换的启动子。本文其他处描述的用于进行位点特异性重组的方法、机制及要求用于产生不可逆转换的启动子且为此项技术中所熟知的，参见例如Grindley等人(2006)Annual Review of Biochemistry,567-605及Tropp(2012)Molecular Biology(Jones&Bartlett Publishers,马萨诸塞州萨德伯里)，其公开内容以引用的方式并入本文中。
在一些情况下，启动子为CD8细胞特异性启动子、CD4细胞特异性启动子、嗜中性粒细胞特异性启动子或NK特异性启动子。举例而言，可使用CD4基因启动子，参见例如Salmon等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:7739及Marodon等人(2003)Blood 101:3416。作为另一实例，可使用CD8基因启动子。NK细胞特异性表达可通过使用Neri(第46页)启动子来实现；参见例如Eckelhart等人(2011)Blood 117:1565。
在一些实施例中，例如，为在酵母细胞中表达，适合的启动子为组成性启动子，诸如ADH1启动子、PGK1启动子、ENO启动子、PYK1启动子及类似者；或为可调节启动子，诸如GALI启动子、GAL10启动子、ADH2启动子、PH05启动子、CUP1启动子、GAL7启动子、MET25启动子、MET3启动子、CYC1启动子、HIS3启动子、ADH1启动子、PGK启动子、GAPDH启动子、ADC1启动子、TRP1启动子、URA3启动子、LEU2启动子、ENO启动子、TP1启动子及AOX1(例如用于毕赤酵母中)。对合适的载体及启动子的选择在熟练此项技术人员的水平之内。
用于原核宿主细胞中的适合的启动子包括(但不限于)噬菌体T7RNA聚合酶启动子、trp启动子、lac操作子启动子、杂合启动子(例如lac/tac杂合启动子、tac/trc杂合启动子、trp/lac启动子、T7/lac启动子)；trc启动子；tac启动子及类似者；araBAD启动子；经体内调节的启动子，诸如ssaG启动子或相关启动子(参见例如美国专利公开案第20040131637号)、pagC启动子(Pulkkinen及Miller,J.Bacterial.,1991:173(1):86-93；Alpuche-Aranda等人,PNAS,1992；89(21):10079-83)、nirB启动子(Harborne等人(1992)Mal.Micro.6:2805-2813)，及类似者(参见例如Dunstan等人(1999)Infect.Immun.67:5133-5141；McKelvie等人(2004)Vaccine 22:3243-3255；及Chatfield等人(1992)Biotechnol.10:888-892)；σ70启动子，例如共有σ70启动子(参见例如Genome Accession第AX798980号、第AX798961号及第AX798183号)；固定相启动子，例如dps启动子、spv启动子及类似者；衍生自致病岛SPI-2的启动子(参见例如WO96/17951)；actA启动子(参见例如Shetron-Rama等人(2002)Infect.Immun.70:1087-1096)；rpsM启动子(参见例如Valdivia及Falkow(1996).Mal.Microbial.22:367)；tet启动子(参见例如Hillen,W.及Wissmann,A.(1989)In Saenger,W.及Heinemann,U.(编)，Topics in Molecular and StructuralBiology,Protein-Nucleic Acid Interaction.Macmillan，London，UK，第10卷，第143至162页)；SP6启动子(参见例如Melton等人(1984)Nucl.Acids Res.12:7035)；及类似者。用于诸如大肠杆菌的原核生物的适合的强启动子包括(但不限于)Trc、Tac、T5、T7及Pλ。用于细菌宿主细胞的操作子的非限制性实施例包括乳糖启动子操作子(当与乳糖接触时，Laci抑制蛋白改变构象，从而防止Laci抑制蛋白与操作子结合)、色氨酸启动子操作子(当与色氨酸复合时，TrpR抑制蛋白具有结合操作子的构象；在不存在色氨酸的情况下，TrpR抑制蛋白具有不结合操作子的构象)及tac启动子操作子(参见例如deBoer等人(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80:21-25)。
编码本发明的多肽的核苷酸序列可存在于表达载体和/或克隆载体中。编码两个单独多肽的核苷酸序列可在相同或不同的载体中克隆。表达载体可包括选择性标记、复制源及提供载体的复制和/或维持的其他部件。适合的表达载体包括例如质粒、病毒载体，及类似者。
大量适合的载体及启动子为熟练此项技术人员已知；许多在商业上可用于产生个体重组构建体。借助于实例提供以下细菌载体：pBs、phagescript、PsiXl74、pBluescriptSK、pBs KS、pNH8a、pNH16a、pNH18a、pNH46a(Stratagene,La Jolla,CA，USA)；pTrc99A、pKK223-3、pKK233-3、pDR540，及pRIT5(Pharmacia,Uppsala，Sweden)。借助于实例提供以下真核生物载体：pWLneo、pSV2cat、pOG44、PXRl、pSG(Stratagene)pSVK3、pBPV、pMSG，及pSVL(Pharmacia)。
表达载体通常具有位于启动子序列附近的方便限制位点，以提供编码异源蛋白质的核酸序列的插入。可存在在表达宿主中操作的可选择标记。
如上所述，在一些实施例中，编码本发明的多肽的核酸在一些实施例中将为RNA，例如体外合成的RNA。体外合成RNA的方法为此项技术中已知的；可使用任何已知的方法来合成包括编码本发明的多肽的核苷酸序列的RNA。将RNA引入至宿主细胞中的方法为此项技术中已知的。参见例如Zhao等人(2010)Cancer Res.15:9053。将包括编码本发明的多肽的核苷酸序列的RNA引入至宿主细胞中可在体外或离体或体内进行。举例而言，可通过包含编码本发明的多肽的核苷酸序列的RNA对宿主细胞(例如，NK细胞、细胞毒性T淋巴细胞等)进行体外或离体电穿孔。
包括多核苷酸、核酸序列和/或转录单元和/或包括其的载体的各种方面及实施例进一步包括Kozak类型序列、土拨鼠肝炎病毒转录后调节组件(WPRE)及二重终止密码子或三重终止密码子中的一者或多者，其中二重终止密码子或三重终止密码子的一个或多个终止密码子定义自一个或多个转录单元的至少一者的读取终止。在某些实施例中，多核苷酸、核酸序列和/或转录单元和/或包括其的载体进一步包括在一个或多个转录单元中的至少一者的起始密码子上游的10个核苷内具有5’核苷酸的Kozak类型序列。在一个实施例中，Kozak类型序列为或包括CCACCAT/UG(G)(SEQ ID NO:515)、CCGCCAT/UG(G)(SEQ ID NO:516)、GCCGCCGCCAT/UG(G)(SEQ ID NO:517)或GCCGCCACCAT/UG(G)(SEQ ID NO:515)(其中圆括号中的核苷酸表示视情况选用的核苷酸及指示该位置处的不同可能的核苷酸的由斜线隔开的核苷酸，例如视核酸是否为DNA或RNA而定)。在包括AU/TG起始密码子的这些实施例中，可将A视为位置0。在某些说明性实施例中，-3及+4处的核苷酸相同，例如-3及+4可为G。在另一实施例中，Kozak类型序列包括ATG上游的第3位置中的A或G，其中ATG为起始密码子。在另一实施例中，Kozak类型序列包括AUG上游的第3位置中的A或G，其中AUG为起始密码子。在一说明性实施例中，Kozak类型序列为(GCC)GCCRCCATG，其中R为嘌呤(A或G)。在一说明性实施例中，Kozak类型序列为GCCGCCACCAUG(SEQ ID NO:518)。在另一实施例中，其可与包括Kozak类型序列的前述实施例和/或包括三重密码子的以下实施例组合，多核苷酸包括WPRE组件。WPRE表征于技术(参见例如(Higashimoto等人,Gene Ther.2007；14:1298))中且例示于本文的实施例17及实施例18中。在一些实施例中，WPRE组件位于一个或多个转录单元的终止密码子的3’及多核苷酸的3’LTR的5’处。在另一实施例中，其可与前述实施例(亦即，其中多核苷酸包括Kozak类型序列的实施例和/或其中多核苷酸包括WPRE的实施例)中的一者或两者组合，一个或多个转录单元经二重终止密码子或三重终止密码子的一个或多个终止密码子终止，其中二重终止密码子包括第一读取框中的第一终止密码子及第二读取框中的第二终止密码子或具有第二终止密码子的框中的第一终止密码子，且其中三重终止密码子包括第一读取框中的第一终止密码子、第二读取框中的第二终止密码子及第三读取框中的第三终止密码子或具有第二终止密码子或第三终止密码子的框中的第一终止密码子。
本文的三重终止密码子包括三个终止密码子，一个在各读取框中，在彼此的10个核苷酸内，且较佳具有重叠序列，或在相同读取框中的三个终止密码子，较佳在连续密码子处。二重终止密码子表示两个终止密码子，各自在不同读取框中，在彼此的10个核苷酸内，且较佳具有重叠序列，或在相同读取框中的两个终止密码子，较佳在连续密码子处。
在本文公开的方法及组合物中的一些中，使用不利用复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的方法进行DNA至PBMC、B细胞、T细胞和/或NK细胞中的引入及视情况DNA至宿主细胞基因组中的并入。举例而言，可利用其他病毒载体，诸如来源于腺病毒、腺病毒相关病毒或1型单纯疱疹病毒的那些，作为非限制实施例。
在一些实施例中，本文提供的方法可包括用非病毒载体转染和/或转导靶细胞。在利用非病毒载体转染靶细胞的本文公开的实施例中的一者中，可使用包括电穿孔、核转染、脂质体调配物、脂质、树状体、阳离子聚合物(诸如聚(乙烯亚胺)(PEI)及聚(l-赖氨酸)(PLL))、纳米颗粒、细胞穿透肽、显微注射和/或未整合慢病毒载体的方法将非病毒载体(包括裸DNA)引入至靶细胞(诸如PBMC、B细胞、T细胞和/或NK细胞)中。在一些实施例中，可将DNA引入至具有脂质体及鱼精蛋白的复合物中的靶细胞(诸如PBMC、B细胞、T细胞和/或NK细胞)中。可用于本文提供的方法的实施例中的用于离体转染和/或转导T细胞和/或NK细胞的其他方法在此项技术中已知(参见例如Morgan及Boyerinas,Biomedicines.2016年4月20日；4(2).pii:E9，其以全文引用的方式并入本文中)。
在本文提供的方法的一些实施例中，可通过将靶DNA共转染、共核转染或共电穿孔为在所关注基因的5’及3’末端含有转座子ITR片段的质粒或将转座酶载体系统共转染、共核转染或共电穿孔为DNA或mRNA或蛋白质或位点特异性丝氨酸重组酶(诸如将所关注基因整合至人类基因组中的假attP位点的phiC31)而使用基于转座子的载体系统将DNA整合至基因组中，在此情况下，DNA载体可含有34bp至40bp attB位点，其为重组酶的识别序列(Bhaskar Thyagarajan等人.Site-Specific Genomic Integration in Mammalian CellsMediated by Phage
Figure BDA0002257374180000801
Integrase,Mol Cell Biol.2001年6月；21(12):3926–3934)且经重组酶共转染。对于T细胞和/或NK细胞，可用于本文提供的某些方法中的基于转座子的系统利用呈DNA、mRNA或蛋白质形式的Sleeping Beauty DNA载体系统(参见例如美国专利第6,489,458号及美国专利申请第15/434,595号，其以全文引用的方式并入本文中)、PiggyBac DNA载体系统(参见例如Manuri等人,Hum Gene Ther.2010年4月；21(4):427-37，其以全文引用的方式并入本文中)或Tol2转座子系统(参见例如Tsukahara等人,GeneTher.2015年2月；22(2):209–215，其以全文引用的方式并入本文中)。在一些实施例中，基于转座子的载体系统的转座子和/或转座酶在引入至T细胞和/或NK细胞中之前可经产生作为微环DNA载体(参见例如Hudecek等人,Recent Results Cancer Res.2016；209:37-50及Monjezi等人,Leukemia.2017年1月；31(1):186-194，其以全文引用的方式并入本文中)。也可通过添加与靶位点的整合5’及3’同源的50bp至1000bp同源臂使用CRISPR或TALEN介导的整合将CAR或淋巴增生性组件整合至基因组中的所定义及特异性位点中(Jae Seong Lee等人.Scientific Reports 5,文章编号：8572(2015)，由CRISPR/Cas9及同源定向的DNA修复路径介导的CHO细胞中的位点特异性整合)。CRISPR或TALEN提供特异性及基因靶向的裂解且构建体将经由同源介导末端接合整合(Yao X等人.Cell Res.2017年6月；27(6):801-814.doi:10.1038/cr.2017.76.2017年5月19日电子版)。CRISPR或TALEN可经靶质粒转染为DNA、mRNA或蛋白质。
包装细胞
本发明提供包装细胞及为包装细胞系的哺乳动物细胞系，其产生以基因方式修饰靶标哺乳动物细胞及其的哺乳动物细胞系的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒。在说明性实施例中，包装细胞包含核酸序列，其编码复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的可包装RNA基因组、REV蛋白、gag多肽、pol多肽及假型组件。
适合的哺乳动物细胞包括原代细胞及永生化细胞系。适合的哺乳动物细胞系包括人类细胞系、非人类灵长类细胞系、啮齿动物(例如小鼠、大鼠)细胞系，及类似者。适合的哺乳动物细胞系包括(但不限于)HeLa细胞(例如，美国模式培养物保藏所(ATCC)第CCL-2号)、CHO细胞(例如ATCC第CRL9618号、第CCL61号、第CRL9096号)、HEK293细胞(例如，ATCC第CRL-1573号)、适应悬浮的HEK293细胞、Vero细胞、NIH 3T3细胞(例如，ATCC第CRL-1658号)、Huh-7细胞、BHK细胞(例如，ATCC第CCLlO号)、PC12细胞(ATCC第CRL1721号)、COS细胞、COS-7细胞(ATCC第CRL1651号)、RATl细胞、小鼠L细胞(ATCC第CCLI.3号)、人类胚胎肾(HEK)细胞(ATCC第CRL1573号)、HLHepG2细胞、Hut-78、Jurkat、HL-60、NK细胞系(例如，NKL、NK92及YTS)，及类似者。
在一些情况下，细胞并非永生化细胞系，而是自受试者获得的细胞或离体细胞(例如，原代细胞)。举例而言，在一些情况下，细胞为自受试者获得的免疫细胞。作为另一实例，细胞为自受试者获得的干细胞或祖细胞。在包括B细胞、T细胞或NK细胞的本文提供的实施例及方面中的任一者中，细胞可为自体细胞或其可为异体细胞(在本文中也称为异源细胞)。在一些实施例中，异源细胞可为以基因方式工程化的异源细胞。异体细胞(诸如异源T细胞)及用于以基因方式工程化异体细胞的方法在此项技术中已知。在一些实施例中，异体细胞可为永生化细胞。在其中异体细胞为T细胞的一些实施例中，T细胞经基因方式工程化，使得其T细胞受体链中的至少一者不起作用或其至少部分缺失。在一些实施例中，异体细胞可经修饰，使得其缺失所有或部分B2微小球蛋白。在其中异体细胞用于本文的方法中的一些实施例中，淋巴增生性组件和/或CLE可起作用以减少为实践本发明所必需的细胞数且可有助于自个体的T细胞、B细胞或NK细胞的细胞制造。
活化免疫细胞的方法
本发明提供体外、体内或离体活化免疫细胞(在说明性实施例中，淋巴细胞)的方法。该方法通常涉及使免疫细胞(体外、体内或离体)与活化组件或与一种或多种靶标抗原接触，其中该免疫细胞经基因方式修饰以产生本发明的微环境受限的CAR。在一种或多种靶标抗原的存在下，微环境受限的CAR活化免疫细胞，由此产生经活化免疫细胞。免疫细胞包括例如细胞毒性T淋巴细胞、NK细胞、CD4+ T细胞、T调节(Treg)细胞，γδT细胞、NK-T细胞、嗜中性粒细胞等。在其他实施例中，使T细胞与T细胞活化剂接触，活化T细胞。这些方法提供于本文中且论述于本文的活化组件章节中。
将经基因方式修饰的免疫细胞(例如T淋巴细胞、NK细胞)与一种或多种靶标抗原接触可使由免疫细胞产生的细胞因子与在不存在一种或多种靶标抗原时由免疫细胞所产生的细胞因子的量相比增加至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约75％、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约5倍、至少约10倍，或大于10倍。产量可增加的细胞因子包括但不限于IL-2及IFN-γ。
将经基因方式修饰的免疫细胞(例如细胞毒性T淋巴细胞)与AAR接触可使细胞毒性细胞的细胞毒性活性与在不存在一种或多种靶标抗原时细胞毒性细胞的细胞毒性活性相比增加至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约75％、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约5倍、至少约10倍，或大于10倍。
将经基因方式修饰的免疫细胞(例如细胞毒性T淋巴细胞)与一种或多种靶标抗原接触可使细胞毒性细胞的细胞毒性活性与在不存在一种或多种靶标抗原时细胞毒性细胞的细胞毒性活性相比增加至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约75％、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约5倍、至少约10倍，或大于10倍。
在其他实施例中，例如，取决于宿主免疫细胞，使经基因方式修饰的宿主细胞与抗原接触可增加或减少细胞增生、细胞存活、细胞死亡，及类似者。
用于制备微环境受限的抗原特异性靶向区的方法
在一些实施例中，CAR的抗原结合域(本文中也称作“抗原特异性靶区”或“ASTR”)组成性地结合其同源抗原。在其他实施例中，ASTR可受微环境限制，较佳地或仅在某些异常条件下结合其同源抗原，例如存在于肿瘤微环境中的那些，如本文更详细地公开。较佳地或仅在肿瘤微环境的异常条件下结合的微环境受限的ASTR可减少靶向肿瘤外效应，这是因为在正常生理条件下与抗原结合减少，在一些情况下减少至低于通过免疫测定检测的位准。在某些方面中，本文所提供的CAR包括特异性结合靶蛋白的微环境受限的ASTR，其中该ASTR为包括重链可变区域及轻链可变区域的scFv片段。
本文所公开的方面的某些说明性实施例，例如本文所公开的方法、细胞、细胞系、复制缺陷型重组反转录病毒颗粒、多核苷酸或载体，包括CAR，该CAR包括微环境受限的抗原特异性靶向区。
因此，在一个方面中，本文提供用于结合靶标抗原的嵌合抗原受体，其包括：
a)微环境受限的抗原特异性靶向区，与正常生理环境相比在异常条件下其呈现出与靶标抗原的结合增加，其中该抗原特异性靶向区结合至该靶标；
b)跨膜域；及
c)胞内活化域。
在另一方面中，本文提供用于结合靶标抗原的嵌合抗原受体，其包括：
a)至少一个微环境受限的抗原特异性靶向区，其通过淘选多肽库且在与正常生理条件相比的异常条件下在靶标抗原结合测定中活性增加而经选择；
b)跨膜域；及
c)胞内活化域。
在本文公开的任何方面的一些实施例中，嵌合抗原受体中的任一者可为微环境受限的，使得与正常生理条件相比在异常状态下其表达出增加的结合活性。在本文公开的任何方面的一些说明性实施例中，自初始多肽库识别微环境受限的ASTR，而无需在筛选/进化之前突变/进化库的成员和/或无需在视情况存在的重复轮次筛选期间或之间突变。例示性跨膜域及胞内活化域可为本文针对CAR所公开的那些中的任一者。
在一个方面中，本文提供一种用于选择微环境受限的ASTR的方法，其包含通过以下步骤淘选多肽显示库：
a.使多肽显示库的多肽在正常生理条件下进行靶标抗原结合测定，且在异常条件下进行靶标抗原结合测定；及
b.选择在与生理条件相比的异常条件下显示出靶标抗原结合活性增加的多肽，从而选择微环境受限的抗原特异性靶区。
在另一方面中，本文提供一种用于分离微环境受限的ASTR的方法，其包括通过以下步骤淘选多肽显示库：
在异常条件下使多肽库与结合至固体载体的靶标抗原接触，其中表达与结合靶标抗原的多肽的纯系仍经由靶标抗原结合至固体载体；
在生理条件下使固体载体与结合多肽一起培育；及
收集在生理条件下自固体载体溶离的纯系，从而分离微环境受限的抗原特异性靶向区。
在本文公开的任何方面的一些说明性实施例中，自初始多肽库筛选识别微环境受限的抗原特异性靶向区，而无需在筛选之前突变/进化库的成员和/或无需在视情况存在的重复轮次筛选或淘选期间或之间突变/进化。
正常生理条件可包括针对个体而言被认为在给药位点或在作用位点的组织或器官处的正常范围内的温度、pH、渗透压、重量渗透摩尔浓度、氧化应力及电解质浓度的那些。异常条件为偏离正常可接受范围的条件。在一个方面中，微环境受限的抗原特异性靶向区(即多肽)在正常条件下实际上无活性，但在除正常条件以外在与正常条件相同或更好的位准下具有活性。举例而言，在一个方面中，微环境受限的抗原特异性靶向区在体温下实际上无活性，但在更低温度下具有活性。在另一方面中，在正常条件下使微环境受限的抗原特异性靶向区可逆地或不可逆地失活。在另一方面中，微环境受限的抗原特异性靶向区为治疗性蛋白质。在另一方面中，将微环境受限的抗原特异性靶向区用作药物或治疗剂。在又一方面中，微环境受限的抗原特异性靶向区在高度充氧的血液中(诸如在通过肺之后或在肾脏中发现的较低pH环境中)或多或少具有活性。
在一些实施例中，进行单轮选择以获得微环境受限的抗原特异性靶向区。在某些实施例中，在识别在异常条件下结合抗原并且在生理条件下不结合的游离多肽或表达具有这些性质的测试多肽的细胞或通过在初始或上一轮中具有此类性质的测试多肽涂覆的噬菌体之后重复筛选或淘选方法。在一些方法中，收集的噬菌体用于感染也可通过辅助噬菌体感染的细胞，以便扩增收集的噬菌体。在测试细胞表面上的多肽的其他方法中，可使收集的细胞生长以通过扩增编码多肽的细胞中的多核苷酸来“扩增”由细胞表达的多肽。在一些实施例中，通过生长表达所识别的多肽的细胞来完成扩增，而无需进行处理以在各轮之间突变编码所识别的多肽的多核苷酸。因此，通过扩增含有编码这些收集的多肽的多核苷酸的细胞来富集前一轮中收集的多肽。
淘选或筛选方法可进行单次，或重复1次至1000次。在说明性实施例中，淘选重复1次至20次或2次至10次或2次至5次。
在其他方法中，在各轮淘选之间使用一轮或多轮突变/进化来进行针对相关抗原(即靶标抗原)的微环境受限的ASTR。在一个方法中，例如通过产生多肽或蛋白质库并筛选该多肽或蛋白质库得到具有对靶标抗原的所要结合亲和力的多肽或蛋白质来识别野生型蛋白质。在野生型蛋白质为抗体的一些实施例中，可通过产生及筛选多株或单克隆抗体库(包括噬菌体显示抗体库，例如噬菌体显示人源化抗体库)发现野生型抗体。
可通过使野生型蛋白质或编码野生型蛋白质的核酸序列进行突变诱发处理以产生突变多肽群来产生进化的ASTR，这些突变多肽可经筛选以识别在肿瘤环境和/或体外肿瘤替代测定条件中具有与正常生理环境相比增加的活性(例如与靶标抗原的结合亲和力增强)的ASTR。此类方法的实例提供于WO2016033331(“CONDITIONALLY ACTIVE CHIMERICANTIGEN RECEPTORS FOR MODIFIED T CELLS”)或美国专利第8709755号中，这些专利的全部内容以引用的方式并入本文中。产生微环境受限的抗体的此方法在本文中以全文引用的方式并入本文中。
在其他实施例中，可通过在异常条件及生理条件下筛选初始多肽库且自初始多肽库识别在异常条件下及生理条件下优先地或专有地结合的测试多肽，来识别微环境受限的抗原特异性多肽(即靶向区，例如抗体)。在一些实例中，在初始多肽库筛选中，自初始多肽库识别的经识别且分离的微环境受限的抗原特异性多肽(即靶向区，例如抗体)在异常条件下及生理条件下优先地或专有地结合其同源抗原。在此类情况中，不进行突变/进化的轮次。因此，进行说明性实施例中的方法而无需在筛选轮次(例如，淘选轮次)之间使编码经分离微环境限制性抗原特异性靶向区的多肽突变，或在异常条件及生理条件下仅针对单个结合测定进行以分离且识别微环境受限的抗原特异性多肽(即靶向区，例如抗体)。该方法可通过在筛选和/或淘选轮次之间培养、高保真扩增和/或稀释编码抗原特异性靶向区的多核苷酸或包括其的宿主生物体来进行而无需任何突变/进化。此外，该方法可在无需重复筛选和/或淘选的情况下进行，且可在微环境受限的抗原特异性多肽(即靶向区，例如抗体)经分离之后进行而无需使编码经分离的微环境受限的抗原特异性靶向区的多核苷酸突变/进化。
用于本文所提供的用以检测多肽与同源结合配偶体的结合的方法的测定包括基于细胞的测定，且尤其使用细胞表面显示系统(诸如哺乳动物细胞表面显示系统)进行的测定。在例示性方法中，可将编码多肽或变异多肽库(包括经修饰的多肽库)的核酸引入至适于在细胞(诸如哺乳动物细胞)中表达的载体中。接着通过载体转染细胞，且由这些细胞表达一种或多种多肽。可使含有表面表达多肽的细胞库与含有可溶性或表面结合的同源结合配偶体的溶液接触。可使用可检测对细胞的表面的结合的任何测定法来检测结合活性。也可通过评估多肽的功能活性或多肽来评估活性。熟练的业内人士已知的任何基于细胞的测定均被考虑用于本文所提供的方法，包括细胞增生测定、细胞死亡测定、流式细胞术、细胞分离技术、荧光活化细胞分选(FACS)、相位显微镜、荧光显微镜、受体结合测定、细胞信号传导测定、免疫细胞化学及报道子基因测定。在一些实例中，测定为荧光活化细胞分选(FACS)测定。
多肽或蛋白质可由哺乳动物细胞表达为分泌的可溶性分子、细胞表面分子或胞内抗体。在例示性方法中，可在大部分或全部细胞显示锚定于细胞表面上的蛋白质库的成员的条件下通过蛋白质库来转染细胞。视情况，可使用表达系统，其中大多数哺乳动物细胞转染体在其基因组中仅具有一个质粒。因此，大多数(即，至少约70％或约80％或约90％)的转染子表达一种多肽中的一种或多种分子。此可通过例如分离且培养受试者转染子且对表达的序列进行扩增及测序以确定其是否具有单个序列来验证。
在本文所提供的方法的一些实例中，多肽为显示于哺乳动物细胞表面上的抗体。本文所描述的任何抗体可在哺乳动物细胞的表面上表达，包括全长二价功能性抗体，诸如IgG抗体。抗体可为片段，例如Fab片段或scFv片段。抗体可以包括Fc区，诸如scFv-Fc或包含两个重链及两个轻链的全长抗体。熟练的业内人士可选择适合的抗体片段。举例而言，在哺乳动物细胞中制备的ScFv-Fcs及全长抗体可具有优于scFv’s或Fab片段的若干优点。
可用于本文所提供的结合测定中的固体载体包括能够与多肽的结合配偶体(例如配位体，受体或抗原)附着的任何载体。为促进高通量筛选，通常将同源结合配偶体附着至固体载体。在本文所提供的方法中用作固体载体的载体的实例包括(但不限于)玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、直链淀粉、天然纤维素及改质纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂及磁性固体载体，诸如包括磁铁矿的固体载体。固体载体可为此项技术中已知的一种或多种珠粒或颗粒、微球、管或板的表面、过滤膜，及其他固体载体。例示性固体载体系统包括(但不限于)由例如玻璃、硅、金属、尼龙、纤维素、塑料或复合材料(包括多孔板或膜)构成的平坦表面；或可呈珠粒的形式，诸如硅胶、受控孔玻璃、磁性或纤维素珠粒。此外，此类方法可适用于悬浮液或以柱的形式使用。在一些实施例中，通过生物淘选具有永生化靶标抗原的噬菌体显示或酵母表面显示(Colby等人，“Engineering Antibody Affinity by YeastSurface Display”,Meth.Enzym.388,26(2004))的抗体(例如人源化抗体)库来识别及分离微环境受限的抗原特异性多肽(亦即靶向区域，例如抗原)。举例而言，可使用本文中的噬菌体显示或酵母表面显示方法来淘选天然人源化抗体库或合成的人源化抗体库。在一些实施例中，初始噬菌体显示过程可将噬菌体纯系转移至哺乳动物载体并用于哺乳动物细胞表面筛选方法(参见例如Yoon等人,BMC Biotechnology 12:62；1472-6750(2012))。在实施例2中提供用于进行噬菌体显示以分离微环境受限抗原特异性靶区的例示性方法。
使用本文提供的方法识别的微环境受限的ASTR可为抗体、抗原、配位体、配位体的受体结合域、受体、受体的配位体结合域或亲和体。在微环境受限的ASTR为抗体的实施例中，其可为全长抗体、单链抗体、Fab片段、Fab’片段、(Fab’)2片段、Fv片段，及二价单链抗体或双功能抗体。其中该抗原特异性靶向区包含来自抗体的重链及轻链。在一些实施例中，微环境受限的ASTR为单链可变片段。此类单链可变片段可具有由接头隔开的重链及轻链，其中该接头长度在6个至100个氨基酸之间。在一些实施例中，重链位于嵌合抗原受体上的轻链的N端。在其他实施例中，轻链位于重链的N端。微环境受限的ASTR可为双特异性ASTR。
使用本文提供的方法识别的微环境受限的ASTR通常为多肽，且更具体而言为多肽抗体，且在说明性实施例中为单链抗体。这些多肽可在异常条件及正常条件下以更高或更低亲和力结合至同源抗原，但在说明性实施例中在异常条件下以比正常条件下更高的亲和力结合。在一些实施例中，这些多肽在异常条件下可以与生理(即正常)条件相比高10％、20％、25％、50％、75％、90％、95％或99％的亲和力来结合至其同源抗原。在一些实施例中，使用本文提供的方法识别的ASTR在正常生理条件下不结合至同源抗原达到其使用阴性对照(诸如阴性对照抗体)获得的背景位准以上的任何可检测位准。
通过本文提供的方法分离的编码微环境受限的ASTR的核苷酸序列可通过对表达微环境受限的抗原特异性靶向的收集细胞的核苷酸进行测序来测定。接着可通过产生编码包含微环境受限的抗原特异性靶向区(MRB-ASTR)、跨膜域及胞内活化域的多肽的多核苷酸来将此核苷酸序列信息用于制备微环境受限的生物嵌合抗原受体(MRB-CAR)。微环境受限的抗原特异性靶向区可经克隆至CAR构建体表达系统中，其可用以在其基因组中产生包括CAR的重组慢病毒，且接着重组慢病毒可用于转导T细胞来在与生理条件相比的肿瘤选择性环境中测试表达靶细胞杀伤的CAR介导的肿瘤抗原。
条件性活性的条件
在本文提供的方法中，在两组不同条件下筛选或测试一种或多种多肽(例如单链抗体)的活性，该两组条件模拟两种不同生理环境中的一个或多个条件，诸如病态微环境及非病态微环境的正常生理条件。通常，这些条件为可在体外模拟或复制的条件。一组条件可包括用以模拟与疾病相关的微环境的一个或多个条件。疾病可改变细胞内平衡及细胞外平衡。举例而言，病变微环境可模拟肿瘤微环境或癌症微环境中的一个或多个条件。通常，两组条件下的活性差异可产生分子的条件性活性。因此，与第二组条件(例如正常环境或非疾病环境中的模拟条件)相比，在第一组条件(例如模拟肿瘤微环境中的条件)下显示更高活性的分子经识别为微环境受限的候选分子。
可选择两组条件以改变在两种生理环境中不同的一个或多个参数，诸如本文所描述或熟练此项技术人员已知的，包括但不限于化学条件、生物条件，或身体状况。可在两组条件之间变化的参数可包括选自以下的一个或多个条件：压力、温度、pH、离子强度、渗透压、重量渗透摩尔浓度、氧化应力、浊度，暴露域光(包括UV、红外线或可见光)、一种或多种溶质(诸如电解质)的浓度、葡萄糖浓度、透明质酸浓度、乳酸或乳酸盐浓度、白蛋白浓度、腺苷含量、R-2-羟基戊二酸含量、丙酮酸浓度、氧浓度和/或氧化剂、还原剂或辅助因子的存在。通过改变校准溶液中的电解质及缓冲体系，可将诸如pH、缓冲能力、离子环境、温度、葡萄糖浓度及离子强度的生理条件调节至待模拟的生物环境的那些生理条件。通过本文所描述的一个或多个条件，可将模拟正常生理环境的该组条件选择为与模拟病变微环境(诸如肿瘤微环境)的该组条件不同。
举例而言，如以下所论述，与非肿瘤微环境相比，肿瘤微环境的各种参数不同，包括但不限于氧浓度、压力、辅助因子的存在、pH、透明质酸浓度、乳酸浓度、白蛋白浓度、腺苷含量、R-2-羟基戊二酸含量及丙酮酸浓度。与在非肿瘤环境或正常环境中存在的条件相比，这些参数中的任一者可在体外复制以模拟存在于肿瘤或癌症环境中的一种或多种条件。可模拟的正常生理条件包括在身体的任何位置处的健康或非疾病组织(诸如胃肠道、皮肤、脉管系统、血液及细胞外基质)中发现的环境。通常，在本文的分析中，生理条件可通过选择用于评估蛋白质活性的缓冲液来在体外进行模拟。举例而言，可通过用以评估测定中的活性的测定缓冲液中的差异来模拟病变微环境(诸如肿瘤微环境)及非病变环境的任何一个或多个条件。因此，在本文中用以识别微环境受限的多肽的方法中，使测定缓冲液的一种或多种组分或一种或多种特征改变或在用以在第一条件下测试活性的第一测定中与用以在第二个条件下测试活性的第二测定中不同。举例而言，如本文所论述，肿瘤微环境的各种参数与非肿瘤环境相比不同，包括但不限于氧、压力、辅助因子的存在、pH、透明质酸浓度(诸如提高或降低的透明质酸浓度)、乳酸盐浓度(诸如提高或降低的乳酸盐浓度)、白蛋白浓度(诸如提高或降低的白蛋白浓度)、腺苷含量(诸如提高或降低的腺苷含量)、R-2-羟基戊二酸含量(诸如提高或降低的R-2-羟基戊二酸含量)及丙酮酸盐浓度(包括提高或降低的丙酮酸浓度)。更具体而言，肿瘤微环境中的条件可包括与非肿瘤微环境相比较低的pH、较高浓度的透明质酸、较高浓度的乳酸盐及丙酮酸盐、较高浓度的白蛋白、增加的腺苷含量，增加的R-2-羟基戊二酸含量、低氧、较低浓度的葡萄糖及略微较高的温度。举例而言，微环境限受限的ASTR在正常体温下实际上无活性，但在肿瘤微环境中在较高温度下具有活性。在又一方面中，微环境受限的抗体在正常氧合血液中具有较低活性，但在存在于肿瘤中的较少氧合环境下具有较高活性。在又一方面中，微环境受限的抗体在正常生理pH 7.2至7.8中具有较低活性，但在肿瘤微环境中存在的酸性pH 5.8至7.0或6.0至6.8下具有较高活性。举例而言，微环境受限的抗体在6.7的pH下比在pH 7.4下具有更高活性。在熟练此项技术人员已知的肿瘤微环境中存在也可用作本发明的条件的其他条件，在这些条件下条件活性ASTR具有不同的结合亲和力。模拟这些体内肿瘤条件的体外测定条件在本文中称作体外肿瘤替代测定条件。
可通过选择特定测定缓冲液来在体外模拟这些条件中的任一者或多者。仿真病变微环境的测定缓冲液的组合物可选择为与模拟正常环境的测定缓冲液的组合物相同，除本文已知或描述的在病变微环境中改变的一个或多个条件的外。此外，在筛选或识别一种或多种多肽在两组不同条件下的活性时，通常仅在测定中变化的条件与模拟体内微环境的缓冲条件相关。测定的其他条件(诸如时间、温度及培育条件)对于两组条件可相同。通常，在模拟病变微环境的该组条件及模拟正常微环境的条件中使用相同的碱性缓冲液，但缓冲组合物的设计可在诸如以下的一个或多个参数上不同，诸如pH、氧、压力、辅助因子的存在、pH、透明质酸浓度(诸如提高或降低的透明质酸浓度)、乳酸盐浓度(诸如提高或降低的乳酸浓度)、白蛋白浓度(诸如提高或降低的透明质酸浓度)和/或丙酮酸浓度(包括提高或降低的丙酮酸浓度)。在模拟病变微环境的条件及模拟正常微环境的条件下，可使用熟练此项技术人员已知的任何碱性缓冲液。
产生微环境受限的细胞的方法
本发明提供一种产生微环境受限的细胞的方法。该方法大体上包括通过表达载体(例如质粒或反转录病毒载体)或包括编码本发明的微环境受限的CAR的核苷酸序列的RNA(例如体外转录的RNA)来以基因方式修饰哺乳动物细胞。经基因方式修饰的细胞在一种或多种靶标抗原的存在下受微环境限制。基因修饰可在体内、体外或离体进行。细胞可为免疫细胞(例如T淋巴细胞、T辅助细胞或NK细胞)、干细胞、祖细胞等。
在一些情况下，离体进行基因修饰。举例而言，自受试者获得T淋巴细胞、干细胞、T辅助细胞或NK细胞；且将自受试者获得的细胞进行基因方式修饰以表达本发明的CAR。经基因方式修饰的细胞在一种或多种靶标抗原的存在下可受微环境限制。在一些情况下，经基因方式修饰的细胞经离体活化。在其他情况下，将经基因方式修饰的细胞引入受试者(例如自其获得细胞的受试者)；且经基因方式修饰的细胞在体内活化。举例而言，当一个或多个靶标抗原存在于受试者的细胞表面上时，不需要施用抗原。经基因方式修饰的细胞与存在于受试者的细胞表面上的抗原接触，且将经基因方式修饰的细胞活化。举例而言，当经基因方式修饰的细胞为T淋巴细胞时，经基因方式修饰的细胞可对于在CAR结合的其表面上表达一种或多种靶标抗原的细胞展现细胞毒性。
用于通过改变pH来调节MRB CAR表达T细胞和/或NK细胞活性的方法
在某些方面中，本文提供通过在微环境(包括靶向组织内或一个或多个非靶向(例如健康/正常)组织内的靶细胞)内产生pH变化或偏移，通过调节MRB-CAR与这些靶细胞上的同源抗原的结合来调节表达MRB CAR的T细胞和/或NK细胞与靶细胞的结合及产生靶细胞的裂解/杀伤的方法。此类方法通常包括在微环境中使诸如哺乳动物细胞(例如人细胞)的靶细胞与表达MRB CAR的T细胞和/或NK细胞接触，且接着通过降低或更通常地提高pH来改变微环境的pH。微环境可为靶标微环境，例如肿瘤或脱靶微环境，其中脱靶结合可产生副作用。在一些实施例中，此类方法可提供短暂降低的对肿瘤微环境敏感的CAR-T靶向结合。
因此，在一个方面中，本文提供用于调节微环境受限的表达生物嵌合抗原受体(MRB-CAR)的T细胞或NK细胞与表达个体中的MRB-CAR的同源抗原的细胞的结合的方法，该方法包括以下：
a.将包含编码MRB-CAR的核酸的T细胞和/或NK细胞引入至个体中，其中在引入之后(且视情况和/或在其期间)，包含编码MRB-CAR的核酸的T细胞和/或NK细胞表达MRB-CAR且结合至在个体中表达同源抗原的细胞；及
b.将医药试剂以充足量施用至个体以增加血液pH和/或组织的pH和/或微环境的pH，其中该给药在引入之前、期间或之后进行，且其中血液、组织和/或微环境的增加的pH介导表达MRB-CAR的T细胞和/或NK细胞与表达具有增加pH的血液、组织或微环境中的同源抗原的细胞的结合。
在包括施用本发明的pH调节药用试剂的步骤的方面中，pH的变化/偏移可通过将靶向或非靶向细胞/组织暴露于pH调节药用试剂来实现，例如通过向个体施用pH调节药用试剂。本文提供pH调节药用试剂的非限制性实施例。在某些方面中，本文提供在用于调节MRB-CAR与其同源抗原结合或用于调节MRB CAR表达的T细胞和/或NK细胞与表达其同源抗原的细胞结合或用于减少或减轻个体中靶向肿瘤外毒性的方法中使用的药用试剂。在某些实施例中，此类方面关于治疗肿瘤生长、癌症、增生或细胞增生性疾病。
在其他方面中，本文提供pH调节药用试剂的用途，其用于制备用于控制经基因方式工程化的T细胞和/或NK细胞与个体中的靶标哺乳动物细胞在活体内的结合的药物或试剂盒中。在其他方面中，本文提供一种试剂盒，其包括含有复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的容器及其用于进行治疗肿瘤生长的方法的说明书，其中该说明书指示通过调节pH来控制T细胞和/或NK细胞与靶标哺乳动物细胞的结合的方法。此类方法可为本文此部分提供的用于通过改变pH来调节表达MRB CAR的T细胞和/或NK细胞结合和/或活性的方法中的任一者。含有重组反转录病毒颗粒的容器可为用于储存重组反转录病毒颗粒和/或pH调节药用试剂的管、小瓶，孔板，或其他容器。这些容器中的任一者可具有工业强度及等级。在某些实施例中，该试剂盒可包括两个或更多个容器。一个容器(container/vessel)可包括重组反转录病毒颗粒且另一容器可包括pH调节药用试剂。在此类方法中，药用试剂以足够的量经递送/施用以提高血液pH和/或组织pH和/或微环境pH以调节表达MRB-CAR的经修饰/重组T细胞和/或NK细胞的MRB-CAR与具有增加的pH的血液和/或组织中的同源抗原的结合。本文提供用于以足够量施用pH调节药用试剂且持续足够时间的非限制性例示性细节。
在将MRB-CAR引入至个体中之后，无论相对于组织靶向或脱靶的靶细胞，均可与诸如pH调节药用试剂的pH调节剂接触。因此，本文提供的用于调节表达MRB CAR的T细胞的结合和/或细胞毒性活性(例如用于减轻靶向肿瘤外活性和/或用于抑制诸如肿瘤细胞增生的靶细胞增生)的例示性方面可包括以下步骤：
a.将包含编码MRB-CAR的核酸的T细胞和/或NK细胞引入至个体中，其中在引入之后，包含编码MRB-CAR的核酸的T细胞和/或NK细胞表达MRB-CAR，且视情况结合至在个体中表达同源抗原的细胞；及
b.以足够量将药用试剂施用至个体以提高血液pH和/或组织pH和/或微环境pH以调节表达MRB CAR的T细胞和/或NK细胞与表达具有增加的pH的血液、组织或微环境中的MRBCAR的同源抗原的细胞的结合。将理解，取决于用以将编码MRB-CAR的核酸引入至T细胞和/或NK细胞中的具体方法，T细胞和/或NK细胞可或可不在其经引入至个体中之前表达MRB-CAR。然而，在引入至个体中之后的一些时间点下，例如，2小时、4小时、8小时、12小时、1天、2天、4天和/或7天或更长时间，包括编码MRB-CAR的核酸的T细胞和/或NK细胞表达MRB-CAR。接着此类细胞通常结合至表达MRB-CAR的同源抗原的靶细胞。
本文提供的用于以基因方式修饰及视情况扩增个体的淋巴细胞的方法可用于将编码MRB-CAR的核酸序列引入至个体的T细胞和/或NK细胞的基因组中以产生能够表达MRBCAR的T细胞和/或NK细胞，且接着将能够表达MRB CAR的T细胞和/或NK细胞引入至个体中，其中在引入之后，T细胞和/或NK细胞表达MRB CAR，以便使MRB-CAR与靶细胞/组织接触。本发明提供如何进行这些方法以及用于修饰及扩增淋巴细胞的各种替代方案的细节，其中的任一者可用于本发明的方面，包括改变pH以调节表达MRB CAR的T细胞和/或NK细胞与表达MRB-CAR的同源抗原的靶细胞的结合。
用于以基因方式修饰及扩增淋巴细胞的此类方法通常涉及使T细胞和/或NK细胞(在说明性实施例中可为静息细胞)与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触以转导这些T细胞和/或NK细胞。此类接触通常在自个体移除淋巴细胞之后离体进行。接着将T细胞和/或NK细胞引入/再引入至通常已移除其的个体中。复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包括具有编码MRB-CAR的多核苷酸的基因组。关于此类复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的许多替代实施例及其他细节提供在本文其他部分中，且可用于本文提供的方法中，该方法以取决于pH的方式通过调节表达由MRB-CAR识别的同源靶标多肽的细胞的微环境中的pH来调节MRB-CAR的结合及产生其的裂解/杀伤。
包括此类组合物的特定说明性方面可包括用于调节本文中其他部分提供的表达MRB CAR的T细胞的结合、细胞杀伤活性和/或存活的其他组件。在包括pH的变化的方法以及本文提供的其他实施例中可与MRB CAR表达组合的此类控制组件包括核糖开关及消除域，因此，本文提供的此类方法及组合物的组合形成一种强大的多方面途径来确保在将表达CAR的T细胞(包括表达MRB CAR的T细胞)施用个体之后的个体的安全性。
用于通过表达MRB CAR的T细胞和/或NK细胞调节靶细胞的结合的此类方法可用以例如通过增加个体内的血液和/或非肿瘤组织的pH来降低靶向肿瘤外毒性。举例而言，在个体内的“正常”组织pH变得瞬间降低的情况下，可以正常组织的pH增加同时肿瘤的pH保持较低且仍处于表达MRB-CAR的T细胞和/或NK细胞结合靶标肿瘤细胞的pH下的方式来递送pH调节剂。在这些实施例中，可以较低浓度或以靶向方式将pH调节剂递送至正常组织。
在一些实施例中，此可完成同时使肿瘤微环境内的pH保持足够低以使MRB-CAR T细胞和/或NK细胞与肿瘤内的其同源靶标表达细胞结合。在本文所提供的方法的说明性方面中，组织的pH保持在表达MRB CAR的T细胞和/或NK细胞与其靶标结合一段时间的pH下，该时间足以使表达MRB CAR的T细胞和/或NK细胞接触且结合表达其同源抗原的细胞(例如2小时、4小时、8小时、12小时或24小时，或2天、4天、7天、14天、28天或30天，或1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、12个月、24个月，或更长时间)，且接着使pH偏移/改变，例如通过使组织的pH提高至一程度以影响表达MRB CAR的T细胞和/或NK细胞与靶细胞的结合。
因此，在一个方面中，本文提供一种经由药物改变血管及组织pH来瞬时降低肿瘤微环境敏感性CAR-T细胞靶结合的方法。在不同条件下具有不同结合性的肿瘤微环境敏感性CAR-T细胞的靶结合部分也称为微环境受限生物学、微环境受限、微环境受控或条件活性，且可指示整个CAR或其任何靶结合域，例如ASTR、scFv或scFvFc。CAR-T细胞中的这些微环境受控的ASTR提供额外位准的保护以避免靶向肿瘤外毒性，需要肿瘤局部环境条件实现T细胞接合。尽管对于一些单克隆抗体疗法具有吸引力，但过继性细胞疗法可产生对其CAR-T靶标瞬时容许的局部环境。举例而言，在具有低pH的组织中活化的CAR-T细胞可进一步降低微环境的pH，取决于CAR构建体中存在的细胞质域。在其他情况下，与过继性细胞治疗相关的细胞因子释放综合征及其他病状可导致血液的碳酸氢盐缓冲能力损失，从而引起乳酸性酸中毒。已确立通过静脉内输注施用的过继性细胞疗法产生暂时性肺压迫。对于一些细胞疗法，输注速率需要持续监测溶解氧(Fischer等人Stem Cells Dev.2009年6月；18(5):683–691)。肺压迫程度取决于细胞大小、活化状态、细胞剂量及输注速率。Cruz等人(Cytotherapy.2010年10月；12(6):743–749)报道来自超过300个T细胞输注的不良发现，低剂量及缓慢输注可减少肺压迫。然而，通过某些高效CAR-T细胞，甚至以低含量存在于肺内皮上的靶标，诸如Her2(Morgan等人Mol Ther.2010年4月；18(4):843–851)，可产生不可控制的立即毒性，且由于输注后肺中的初始高CAR-T细胞浓度以及这些组织中T细胞靶标的存在而使得患者急剧恶化。在其他情况下，T细胞靶标在诸如胆管的其他目标组织中的存可能产生不可控制的靶向肿瘤外毒性(Lamers Mol Ther.2013年4月；21(4):904-12)且在可使用诸如类固醇的其他试剂或细胞消除抗原决定基之前产生严重器官毒性。尽管静脉及动脉血浆对酸中毒具有强缓冲能力，但呼吸性酸中毒、休克、代谢性酸中毒及缺血性酸中毒的条件可发生于通过过继性细胞疗法治疗的癌症患者中。
在本文提供的一些方面中，MRB-CAR在个体中的结合可通过向个体施用药用试剂来调节，以提高或降低血液、组织和/或微环境的pH。在一些方面中，可通过向个体施用药用试剂以提高或降低血液pH和/或组织的pH和/或微环境的pH来在个体中减轻靶向肿瘤外毒性。在一些方面中，T细胞和/或NK细胞与靶标哺乳动物细胞的结合可通过引入药剂以提高或降低血液pH和/或组织的pH和/或微环境的pH来控制。在一些方面中，可通过向个体施用pH调节药用试剂来控制个体活体内的经基因工程化的T细胞和/或NK细胞与靶标哺乳动物细胞的结合。在说明性实施例中，药用试剂可提高血液pH和/或组织的pH和/或微环境的pH。在一些实施例中，微环境可为活体内微环境。在说明性实施例中，微环境可为肿瘤微环境。在一些实施例中，微环境可包括靶标哺乳动物细胞，其中靶标哺乳动物细胞在其表面上表达靶标抗原。在一些实施例中，向个体施用药用试剂可将血液、组织和/或微环境的pH自小于5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8或6.9的pH增加至至少6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5或7.6的pH，其中血液、组织和/或微环境的pH在施用药用试剂之前低于施用药用试剂之后。在一些实施例中，向个体施用药用试剂可将血液、组织和/或微环境的pH自高于6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5或7.6的pH降低至低于5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9或7.0的pH，其中血液、组织和/或微环境的pH在施用药用试剂之前高于施用药用试剂之后。在一些实施例中，向个体施用药用试剂可在个体的血液、组织和/或微环境中产生pH偏移。在一些实施例中，pH偏移可为在任一方向上的至少0.1pH单位、0.2pH单位、0.3pH单位、0.4pH单位、0.5pH单位、0.6pH单位、0.7pH单位、0.8pH单位、0.9pH单位、1.0pH单位、1.1pH单位、1.2pH单位、1.3pH单位、1.4pH单位、1.5pH单位、1.6pH单位、1.7pH单位或1.8pH单位，即在施用药用试剂之后的pH相对于施用药用试剂之前的pH提高或降低。在说明性实施例中，pH偏移为pH增加。
本发明的MRB-CAR可在一个pH下而非不同pH下减少与其同源抗原的结合。在针对MRB-CAR的差异性结合的说明性pH值未曾提供于广泛方面中的说明性实施例中及替代地对于代替用于此类方面的那些值的其他实施例中，MRB-CAR可在较高pH下而非较低pH下减少结合。举例而言，MRB-CAR可在高于7.0、7.1、7.2、7.3、7.4或7.5的pH下而非低于6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9或7.0的pH下减少与其同源抗原的结合。在其他实施例中，MRB-CAR可在较高pH下而非较低pH下减少结合。举例而言，MRB-CAR可在低于6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9或7.0的pH下而非高于7.0、7.1、7.2、7.3、7.4或7.5的pH下减少与其同源抗原的结合。在一些说明性实施例中，相比于在pH 7.4至7.6下，MRB-CAR在6.5至6.7的pH下展现增加的结合。在其他说明性实施例中，相比于在7.4的pH下，MRB-CAR在6.7的pH下展现增加的结合。在其他实施例中，相比于在血液的pH下，MRB-CAR在肿瘤的pH下展现增加的结合。在一些实施例中，MRB-CAR可包括抗原特异性靶向区、柄及胞内活化域。在一些实施例中，MRB-CAR也可包括共刺激域。在一些实施例中，MRB-CAR可与肿瘤相关的抗原结合。
在包括调节血液、组织或微环境的pH的方法中，可将微环境的pH自低于7.0的pH增加至高于7.0的pH。举例而言，pH可自低于6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9或7.0的pH增加至高于7.0、7.1、7.2、7.3或7.4的pH。在一些实施例中，MRB-CAR可在引入药用试剂之前在增加的pH下而非微环境的pH下与同源抗原结合。在某些实施例中，pH可自低于7.0增加7.1至8.0的pH、或至7.1至7.8的pH、或至7.2至7.8的pH、或至7.2至7.6的pH、或至7.3至7.6的pH、或至7.4至7.8的pH、或至7.4至7.6的pH。视施用的药用试剂的类型及剂量而定，此pH的增加可发生少于1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、12小时或24小时，或多于1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、12小时或24小时。在某些实施例中，施用药用试剂，使得pH在靶标组织(诸如肿瘤)中，及例如在靶标组织(例如，肿瘤)微环境的至少一个表面中，在靶标组织(例如，肿瘤)微环境的至少一部分中以及在说明性实施例中在整个靶标组织(例如，肿瘤)微环境中保持高于7.0、7.1、7.2、7.3、7.4或7.5；或在7.0、7.1、7.2、7.3的范围的低值端点与7.4、7.5、7.6、7.7或7.8的范围的高值端点之间。微环境可为活体内微环境，诸如肿瘤、组织、非肿瘤组织、正常组织或经历瞬时pH偏移的组织。举例而言，通常经历短暂pH变化的组织包括厌氧条件中的肌肉组织或经历锻炼的肌肉组织或已发炎组织或正经历发炎的组织。在包括靶标哺乳动物细胞的一些实施例中，靶标哺乳动物细胞可为肿瘤细胞或非肿瘤细胞或正常细胞。
在一些方面中，提供用于瞬时提高血管pH以降低微环境受控的MRB-CAR对其抗原的亲和力的方法。血液pH的0.4U偏移可使形成MRB-CAR的一部分的某些scFv对其同源抗原的亲和力降低超过10倍。在一些实施例中，可经由各种药用试剂的IV或口服施用途径来实现治疗性pH控制。举例而言，在一些实施例中，可通过碳酸氢盐或碳酸氢钠来实现结合亲和力的失活。在其它实施例中，可使用三羟甲基胺基甲烷(也称为缓血酸胺(tromethamine/trometamol)及THAM)和/或CarbicarbTM(碳酸氢钠和碳酸钠的等摩尔高渗溶液)可以足以减轻靶向肿瘤外毒性的量来提高血液中的pH。在又其他实施例中，可使用小分子质子泵抑制剂以足以减轻靶向肿瘤外毒性的量来提高血液pH和/或组织pH。可用于包括调节pH的方法中的质子泵抑制剂包括(但不限于)埃索美拉唑(esomeprazole)(Nexium)、埃索美拉唑及萘普生(naproxen)(Vimovo)、兰索拉唑(lansoprazole)(Prevacid)、奥美拉唑(omeprazole)(Prilosec及Zegerid)及雷贝拉唑(rabeprazole)(Aciphex)。质子泵抑制剂的施用可在更长的时间内有效地用于调节抗原结合域与其同源抗原的结合亲和力持续在数天，数周，数月或数年。在其他实施例中，抗原结合域对其同源抗原的亲和力可通过控制转运体及泵的转录、翻译、膜表达及稳定性来改变血液pH和/或组织pH来调节。经改变表达可调节pH的此类转运体及泵的实例包括(但不限于)质子泵、钠质子交换家族(NHE)、碳酸盐转运体家族(BCT)及单羧酸转运体家族的成员。
在某些实施例中，在输注患者的表达微环境受限生物ASTR(例如scFv或scFvFcs)的CAR-T细胞之前或同时施用pH调节药用试剂，诸如碳酸氢盐、THAM或CaricarbTM。此类治疗将减轻另外与CAR-T细胞输注的暂时性肺压迫相关的实时细胞毒性。因此，在某些方面中，本文提供通过向个体施用足以提高血液pH和/或组织pH和/或微环境pH的量的药用试剂；且同时或随后(例如之后1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、12小时或24小时，或1天、2天、3天、4天或7天)将表达MRB CAR的T细胞或NK细胞引入至个体中来减少对个体的正常、健康组织造成的细胞毒性的方法。在某些实施例中，在此类引入之后的目标时间(例如之后1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、12小时或24小时，或1天、2天、3天、4天或7天)，持续在一段时间内或无限期终止施用药用试剂，以便改变个体的血液、组织或微环境的pH并调节表达MRBCAR的T细胞的结合/活性。
可以使用各种有效的给药方案来施用能够调节pH的药用试剂(例如提高个体的血液pH值和/或组织pH和/或微环境pH)，如熟练的业内人士将理解。在本文中，给药可指示给予个体药用试剂，包括经由IV将药用试剂注射至个体中，或向个体或服用药用试剂的个体提供口服剂量的药用试剂。药用试剂可施用至个体或患者持续各种时间长度，例如至少1天、2天、3天、4天、5天或6天；1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周或11周；3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、12个月、15个月或18个月；或2年、2.5年、3年、3.5年、4年、4.5年或5年或无限期。在一些实施例中，药用试剂可为碳酸氢盐、碳酸氢钠(NaHCO3)或碳酸氢钠及碳酸钠的溶液，且肠胃外或IV剂量可为：0.2×个体体重(kg)×个体的碱缺失；所需HCO3(mEq)＝0.5×重量(kg)×[24-血清HCO3(mEq/L)]；或2mEq/kg至5mEq/kgIV输注持续4小时至8小时。在一些实施例中，可取决于酸中毒的严重程度使用碳酸氢盐、碳酸氢钠及碳酸氢钠溶液的标准给药方案。举例而言，可经由IV以1公升/小时至1.5公升/小时的速率来施用稀释于1L的含5％右旋糖的水中的50mEq至150mEq碳酸氢盐。在其他非限制性实施例中，可经由IV以1公升/小时至1.5公升/小时的速率来施用稀释于1L的含5％右旋糖的水中的90mEq至180mEq碳酸氢盐。在其中药用试剂为碳酸氢盐或碳酸氢钠(NaHCO3)的一些实施例中，肠内或口服剂量可为例如给予个体的325mg至2000mg碳酸氢钠1次/天至4次/天。
在一些实施例中，药用试剂可为三羟甲基胺基甲烷(也称为缓血酸胺(tromethamine/trometamol)和THAM)，且胃肠外或IV剂量可估计为：所需缓血酸胺溶液(0.3M的mL)＝体重(kg)×碱缺失(毫克当量/公升)×1.1。在一些实施例中，可自借助于Siggaard-Andersen列线图测定的mEq/L的细胞外液的缓冲液碱缺失(以mEq/L为单位)来估计三羟甲基胺基甲烷的IV剂量。在一些实施例中，初始剂量可为通过缓慢IV输注至多1000mL来注射的500ml(150mEq)三羟甲基胺基甲烷，其中最大剂量为500mg/kg(227mg/lb)持续不少于一小时的时间。
在一些实施例中，药用试剂可为小分子质子泵抑制剂，且可施用持续延长的治疗长度。举例而言，可施用小分子质子泵抑制剂持续至少1天、2天、3天、4天、5天或6天；1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周或11周；3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、12个月、15个月或18个月；或2年、2.5年、3年、3.5年、4年、4.5年或5年或无限期。在一些实施例中，质子泵抑制剂可为埃索美拉唑(Nexium)，且可每天一次或两次经口施用20mg或40mg埃索美拉唑。在一些实施例中，质子泵抑制剂可为埃索美拉唑(Nexium)与萘普生(Vimovo)的组合，且可每天一次或两次经口施用20mg埃索美拉唑与375mg至500mg萘普生。在一些实施例中，质子泵抑制剂可为兰索拉唑(Prevacid)，且可每天一次或两次经口施用15mg、30mg或60mg兰索拉唑。在一些实施例中，可通过IV每天一次历经30分钟注射30mg兰索拉唑来施用兰索拉唑并持续至多7天。接着个体可切换至口服兰索拉唑并继续治疗。在一些实施例中，质子泵抑制剂可为奥美拉唑(Prilosec及Zegerid)，且可每天一次或两次经口施用10mg、20mg或40mg奥美拉唑。在一些实施例中，质子泵抑制剂可为雷贝拉唑(Aciphex)，且可每天一次或两次经口施用20mg或60mg雷贝拉唑或可每天一次经口施用100mg雷贝拉唑。在本文所公开的实施例中的任一者中，药用试剂可彼此组合使用。
在本文所公开的实施例中的任一者中，可在施用药用试剂之前、期间或之后量测个体的血液、组织和/或微环境的pH。在一些实施例中，向个体施用或继续施用药用试剂以提供或降低pH的决定可基于个体的血液、组织和/或微环境的pH量测值。用于量测个体的血液pH和/或血液的碳酸氢盐含量的方法为此项技术中熟知的。在一些实施例中，可使用正电子发射断层摄影法(PET)、磁共振光谱(MRS)、磁共振成像(MRI)及光学成像来量测微环境中的体内pH，例如肿瘤中(关于测量肿瘤pH的细节，参见：Zhang X,Lin Y,Gillies RJ.TumorpH and its measurement.J Nucl Med.2010年8月；51(8):1167-70)。
在另一方面中，本文提供一种减轻个体的靶向肿瘤外毒性的方法，其包括以下：
a.将编码微环境受限的生物嵌合抗原受体(MRB-CAR)的多核苷酸引入至个体的T细胞或NK细胞中以产生能够表达MRB-CAR的T细胞和/或NK细胞；
b.将能够表达MRB-CAR的T细胞和/或NK细胞引入至个体中，其中T细胞和/或NK细胞在个体中表达MRB-CAR；及
c.将药用试剂以充足量施用至个体以增加血液pH和/或组织的pH和/或微环境的pH以介导MRB-CAR与其具有增加的pH的血液、组织和/或微环境中的同源抗原的结合，由此减轻个体中的靶向肿瘤毒性。
在引入步骤中，T细胞或NK细胞能够表达MRB-CAR，这是因为其经基因方式修饰以含有编码MRB-CAR的核酸。此基因修饰可为在通过转染或转导而引入T细胞或NK细胞内的载体上存在MRB-CAR编码序列。在说明性实施例中，编码MRB-CAR的核酸经整合至T细胞或NK细胞的基因组中。
设想此项技术中已知的用于将多核苷酸引入T细胞和/或NK细胞的各种方法可与本文提供的方法一起用于包括使用诸如pH调节药用试剂来改变pH以影响MRB-CAR T细胞或NK细胞与细胞上的其同源抗原结合的方面(在本文中有时称为“pH切换方面”)。通常，载体(在说明性实施例中为表达载体)用于递送多核苷酸。此类载体可包括此项技术中已知的用于向T细胞和/或NK细胞递送核酸的各种载体。本发明的说明性方面利用反转录病毒载体及反转录病毒颗粒，及(在一些特别说明性实施例中)慢病毒载体及(在说明性实施例中)重组慢病毒颗粒。
其他适合的表达载体可用于本文提供的pH切换方面。此类表达载体包括(但不限于)病毒载体(例如基于以下的病毒载体：痘苗病毒；脊髓灰质炎病毒；腺病毒(参见例如Li等人,Invest Opthalmol Vis Sci 35:2543 2549,1994；Borras等人,Gene Ther 6:515524,1999；Li及Davidson,PNAS 92:7700 7704,1995；Sakamoto等人,H Gene Ther 5:10881097,1999；WO 94/12649、WO 93/03769、WO 93/19191、WO 94/28938、WO 95/11984及WO 95/00655)；腺相关病毒(参见例如Ali等人,Hum Gene Ther 9:81 86,1998，Flannery等人,PNAS 94:6916 6921,1997；Bennett等人,Invest Opthalmol Vis Sci 38:2857 2863,1997；Jomary等人,Gene Ther 4:683 690,1997，Rolling等人,Hum Gene Ther 10:641648,1999；Ali等人,Hum Mol Genet 5:591594,1996；WO 93/09239中的Srivastava，Samulski等人,J.Vi(1989)63:3822-3828；Mendelson等人,Virol.(1988)166:154-165；及Flotte等人，PNAS(1993)1 90:10613-10617)；SV40；单纯疱疹病毒；或反转录病毒载体(例如，小鼠白血病病毒、脾坏死病毒及衍生自诸如罗斯肉瘤病毒、哈维肉瘤病毒、禽白血病病毒、人类免疫缺陷病毒、骨髓增生性肉瘤病毒及乳腺肿瘤病毒的反转录病毒的载体)，例如γ反转录病毒；或人类免疫缺陷病毒(参见例如Miyoshi等人,PNAS 94:10319 23,1997；Takahashi等人,J Virol 73:7812 7816,1999)；及类似者。
在一些实施例中，利用含DNA的病毒颗粒代替重组反转录病毒颗粒。此类病毒颗粒可为腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、巨细胞病毒、痘病毒、牛痘病毒、流感病毒、水泡性口炎病毒(VSV)，或辛德毕斯病毒。熟练的业内人士将理解如何修改本文公开的用于不同病毒及反转录病毒或反转录病毒颗粒的方法。在使用包括DNA基因组的病毒颗粒时，熟练的业内人士将理解，这些基因组中可包括功能单元以诱导将病毒颗粒的全部或部分DNA基因组整合至用此类病毒转导的T细胞和/或NK细胞的基因组中。替代地，功能性DNA可经递送至在细胞中表达但不整合至T细胞和/或NK细胞的基因组中的T细胞和/或NK细胞。
在说明性实施例中，在本发明的pH切换方面中使用的载体为重组反转录病毒颗粒，且在某些实施例中为重组慢病毒颗粒。此类反转录病毒颗粒通常包括位于病毒包膜内的衣壳内的反转录病毒基因组。在本文的各个部分中的本发明提供重组反转录病毒颗粒的各种实施例，其公开可包含于重组反转录病毒颗粒的表面上或在重组反转录病毒颗粒的基因组内和/或中的组件。这些重组反转录病毒颗粒实施例中的任一者可用于本文所提供的pH切换方面中。
抑制性RNA分子
在某些实施例中，本文提供的本发明的方法包括抑制在T细胞和/或NK细胞中表达的一种或多种内源基因的表达。本文提供的方法说明制备重组反转录病毒颗粒的能力，这些重组反转录病毒颗粒表达一种或多种(且在说明性实施例中，两种或更多种)抑制性RNA分子，诸如可用于此类方法的miRNA或shRNA。事实上，本文提供的方法说明此类抑制性RNA分子可在包括例如Ef1a内含子的内含子内经编码。此利用本方法教示以使可包括于可包装反转录病毒基因组中的功能组件最大化，以克服先前教示的缺点，且使此类重组反转录病毒颗粒在过继性T细胞疗法中的有效性最大化。
在一些实施例中，抑制性RNA分子包括与彼此部分或完全互补的5’链及3’链(在一些实例中，有义链及反义链)，使得该两个链能够在细胞环境内形成18至25个核苷酸的RNA双螺旋。5’链长度可为18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸，且3’链长度可为18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸。5’链及3’链可为相同或不同的长度，且RNA双螺旋可包括一个或多个错配。替代地，RNA双螺旋不具有错配。
包括于本文所提供的组合物及方法中的抑制性RNA分子在某些说明性实施例中不存在于和/或不天然表达在其插入其基因组的T细胞中。在一些实施例中，抑制性RNA分子为miRNA或shRNA。在一些实施例中，当在本文或优先权申请中提及编码siRNA的核酸，尤其在核酸为基因组的一部分的上下文中，将理解，此类核酸能够在由DICER处理的细胞中形成诸如miRNA或shRNA的siRNA前体，以形成通常与RISK复合物相互作用或成为RISK复合物的一部分的双链RNA。在一些实施例中，本发明的一实施例中的抑制性分子可为miRNA的前体(诸如Pri-miRNA或Pre-miRNA)，或shRNA的前体。在一些实施例中，miRNA或shRNA为人工衍生的(亦即人工miRNA或siRNA)。在其他实施例中，抑制性RNA分子为经处理成siRNA的dsRNA(经转录或人工引入)或siRNA本身。在一些实施例中，miRNA或shRNA具有在自然界中未发现的序列，或具有在自然界中未发现的至少一个功能区段，或具有在自然界中未发现的功能区段的组合。
在一些实施例中，抑制性RNA分子以一连串或多重排列方式置于第一核酸分子中，使得多个miRNA序列同时自单个多顺反子miRNA转录物表达。在一些实施例中，抑制性RNA分子可利用非功能性接头序列直接或间接地与彼此连接。在一些实施例中，接头序列长度可在5个核苷酸与120个核苷酸之间，且在一些实施例中可在10个核苷酸与40个核苷酸之间，作为非限制性实施例。在说明性实施例中，编码一种或多种(例如两种或更多种)抑制性RNA的第一核酸序列及编码CAR(例如MRB-CAR)的第二核酸序列可操作地连接至具有组成型活性或可在T细胞或NK细胞中诱导的启动子。因此，这些抑制性RNA分子(例如miRNA)以及CAR以多顺反子的方式表达。另外，功能性序列可自同一转录物表达。举例而言，本文所提供的并非抑制性RNA分子的淋巴增生性组件中的任一者可自与CAR及一种或多种(例如两种或更多种)抑制性RNA分子相同的转录物表达。
在一些实施例中，抑制性RNA分子为天然存在的miRNA，诸如但不限于miR-155。替代地，可产生人造miRNA，其中能够形成杂交/互补的茎结构且针对靶标RNA的序列置于包括用于微小RNA处理的微小RNA侧翼序列及环的miRNA框架中，且可视情况衍生自与茎序列之间的侧翼序列相同的天然存在的miRNA。因此，在一些实施例中，抑制性RNA分子自5’至3’定向包括：5’微小RNA侧翼序列、5’茎、环、与该5’茎部分或完全互补的3’茎，及3’微小RNA侧翼序列。在一些实施例中，5’茎(本文中也称为5’臂)长度可为18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸。在一些实施例中，3’茎(本文中也称为3’臂)长度可为18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸。在一些实施例中，环的长度为3至40、10至40、20至40或20至30个核苷酸，且在说明性实施例中，环的长度可为18、19、20、21或22个核苷酸。在一些实施例中，一个茎比另一茎长两个核苷酸。较长茎可为5’茎或3’茎。
在一些实施例中，5’微小RNA侧翼序列、3’微小RNA侧翼序列或两者均衍生自天然存在的miRNA，诸如但不限于miR-155、miR-30、miR-17-92、miR-122及miR-21。在某些实施例中，5’微小RNA侧翼序列、3’微小RNA侧翼序列或两者均衍生自miR-155，例如来自小家鼠或智人的miR-155。将合成的miRNA茎环插入至miR-155框架(亦即5’微小RNA侧翼序列、3’微小RNA侧翼序列及miRNA 5’茎与3’茎之间的环)为此项技术中的一般技术人员已知的(Chung，K.等人2006.Nucleic Acids Research.34(7):e53；US7,387,896)。SIBR(合成抑制性BIC衍生的RNA)序列(Chung等人.2006，同前文献)例如具有由小家鼠BIC非编码mRNA(Genbank IDAY096003.1)的核苷酸134至161(SEQ ID NO:256)组成的5’微小RNA侧翼序列及由小家鼠BIC非编码mRNA(Genbank ID AY096003.1)的核苷酸223至283组成的3’微小RNA侧翼序列。在一项研究中，SIBR序列经修饰(eSIBR)以增强miRNA的表达(Fowler，D.K.等人.2015.Nucleic acids Research 44(5):e48)。在本发明的一些实施例中，miRNA可置于SIBR或eSIBR miR-155框架中。在本文的说明性实施例中，miRNA置于miR-155框架中，其包括由SEQ ID NO:256显示的miR-155的5’微小RNA侧翼序列，由SEQ ID NO:260显示的3’微小RNA侧翼序列(小家鼠BIC非编码mRNA的核苷酸221至265)；及经修饰的miR-155环(SEQ IDNO:258)。因此，在一些实施例中，miR-155的5’微小RNA侧翼序列为SEQ ID NO:256或其功能性变体，诸如与SEQ ID NO:256相同的长度，或为SEQ ID NO:256的长度的95％、90％、85％、80％、75％或50％或长度为100个核苷酸或更少、95个核苷酸或更少、90个核苷酸或更少、85个核苷酸或更少、80个核苷酸或更少、75个核苷酸或更少、70个核苷酸或更少、65个核苷酸或更少、60个核苷酸或更少、55个核苷酸或更少、50个核苷酸或更少、45个核苷酸或更少、40个核苷酸或更少、35个核苷酸或更少、30个核苷酸或更少，或25个核苷酸或更少；且与SEQID NO:256至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％一致的序列。在一些实施例中，miR-155的3’微小RNA侧翼序列为SEQ ID NO:260或其功能性变体，例如与SEQ ID NO:260相同的长度，或为SEQ ID NO:260的长度的95％、90％、85％、80％、75％，或50％或长度为100个核苷酸或更少、95个核苷酸或更少、90个核苷酸或更少、85个核苷酸或更少、80个核苷酸或更少、75个核苷酸或更少、70个核苷酸或更少、65个核苷酸或更少、60个核苷酸或更少、55个核苷酸或更少、50个核苷酸或更少、45个核苷酸或更少、40个核苷酸或更少、35个核苷酸或更少、30个核苷酸或更少，或25个核苷酸或更少；且与SEQ ID NO:260至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％一致的序列。然而，作用以在插入其中的miRNA的细胞内提供适当处理以形成能够抑制其结合的靶标mRNA的表达的成熟miRNA的任何已知的微小RNA框架涵盖于本发明中。
在一些实施例中，由复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的多核苷酸中的核酸序列编码的抑制性RNA分子中的至少一者、至少两者、至少三者，或至少四者具有呈5’至3’取向的以下排列：5’微小RNA侧翼序列、5’茎、环、与该5’茎部分或完全互补的3’茎，及3’微小RNA侧翼序列。在一些实施例中，所有抑制性RNA分子具有呈5’至3’取向的以下排列：5’微小RNA侧翼序列、5’茎、环、与该5’茎部分或完全互补的3’茎，及3’微小RNA侧翼序列。如本文所公开，抑制性RNA分子可由一个或多个接头序列分隔开，其在一些实施例中没有除在这些抑制性RNA分子之间作为间隔子的外的功能。
在一些实施例中，当包括两个或更多个抑制性RNA分子(在一些实例中，包括1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个抑制性RNA分子)时，这些抑制性RNA分子针对相同或不同的RNA靶标(诸如自相关基因转录的mRNA)。在说明性实施例中，第一核酸序列中包括2个与10个之间、2个与8个之间、2个与6个之间、2个与5个之间、3个与5个之间或3个与6个之间的抑制性RNA分子。在一说明性实施例中，第一核酸序列中包括四个抑制性RNA分子。
在一些实施例中，RNA靶标为自由T细胞表达的基因转录的mRNA，这些mRNA诸如(但不限于)：PD-1(防止失活)；CTLA4(防止失活)；TCRa(安全地防止自体免疫)；TCRb(安全-防止自体免疫)；CD3Z(安全-防止自体免疫)；SOCS1(防止失活)；SMAD2(防止失活)；miR-155靶标(促进活化)；IFNγ(减少CRS)；cCBL(延长信号传导)；TRAIL2(防止死亡)；PP2A(延长信号传导)；ABCG1(通过限制胆固醇的清除来增加胆固醇微含量)。在说明性实施例中，在本文提供的方法中插入至T细胞至基因组中的miRNA针对靶标，使得T细胞的增生经诱导且/或增强且/或凋亡经抑制。
在一些实施例中，RNA靶标包括编码T细胞受体(TCR)复合物的组份的mRNA。此类组分可包括用于产生和/或形成T细胞受体复合物的组分和/或用于T细胞受体复合物的恰当功能的组分。因此，在一个实施例中，两种或更多种抑制性RNA分子中的至少一者使得TCR复合物(在说明性实施例中，T细胞的一种或多种内源性TCR复合物)的形成和/或功能降低。T细胞受体复合物包括TCRa、TCRb、CD3d、CD3e、CD3g及CD3z。已知这些组分具有复杂的相互依赖性，使得任何一个子单元的表达的降低将导致复合物的表达及功能降低。因此，在一个实施例中，RNA靶标为表达与经转导T细胞内源性的TCRa、TCRb、CD3d、CD3e、CD3g及CD3z中的一者或多者的mRNA。在某些实施例中，RNA靶标为自T细胞的内源性TCRα或TCRβ基因转录的mRNA，该T细胞的基因组包含编码一个或多个miRNA的第一核酸序列。在说明性实施例中，RNA靶标为自TCRα基因转录的mRNA。在某些实施例中，可将针对自具有相似预期效用的靶基因转录的mRNA的抑制性RNA分子组合。在其他实施例中，可将针对自具有互补效用的靶基因转录的靶标mRNA的抑制性RNA分子组合。在一些实施例中，两种或更多种抑制性RNA分子针对自靶基因CD3Z、PD1、SOCS1和/或IFNγ转录的mRNA。
在本文提供的一些实施例中，两种或更多种抑制性RNA分子可在单个内含子中递送，诸如但不限于EF1-αa内含子A。可用于携带本发明的miRNA的内含子序列包括在T细胞内处理的任何内含子。如本文所示，此类排列的一个优势在于，此有助于以本文提供的方法使miRNA序列包括于用于将此类序列递送至T细胞的反转录病毒基因组的大小内的能力最大化。当第一核酸序列的内含子包括用以以多顺反子方式表达内含子、CAR序列及本文所提供的其他功能性序列的启动子序列的全部或部分(诸如并非抑制性RNA分子的淋巴增生性组件)时，此尤其为真。内含子的序列要求为此项技术中已知的。在一些实施例中，此类内含子处理可操作地连接至核糖开关，诸如本文所公开的任何核糖开关。因此，核糖开关可提供用于控制第一核酸序列上的一个或多个miRNA序列的表达的调节组件。因此，本文所提供的说明性实施例为针对内源性T细胞受体子单元的miRNA的组合，其中miRNA的表达由核糖开关调节，该核糖开关可为本文所论述的核糖开关中的任一者。
在一些实施例中，抑制性RNA分子可提供于可包括于相同或不同转录单元上的多个核酸序列上。举例而言，第一核酸序列可编码一种或多种抑制性RNA分子，且自第一启动子表达，且第二核酸序列可编码一种或多种抑制性RNA分子且自第二启动子表达。在说明性实施例中，两种或更多种抑制性RNA分子位于自单个启动子表达的第一核酸序列上。用于表达此类miRNA的启动子通常为在用以表达反转录病毒颗粒的包装细胞中无活性的启动子，该反转录病毒颗粒将其基因组中的miRNA递送至靶标T细胞，但此类启动子在T细胞内为组成性活性或呈可诱导的方式的活性。启动子可为Pol I、Pol II，或Pol III启动子。在一些说明性实施例中，启动子为Pol II启动子。
特征及商业生产方法
本发明提供多种方法及组合物，可使用作为研究试剂以用于科学实验及商业生产。此科学实验可包括用于使用以基因方式修饰(例如转导)本文提供的淋巴细胞的方法表征淋巴细胞(诸如NK细胞，且在说明性实施例中，T细胞)的方法。这些方法例如可用于研究淋巴细胞的活化及通过其活化使得这些细胞可转导的详述分子机制。此外，本文提供将用于例如作为研究工具以更好理解影响T细胞增生及存活的因素的经基因方式修饰的淋巴细胞。这些经基因方式修饰的淋巴细胞(诸如NK细胞，且在说明性实施例中，T细胞)可此外用于商业生产，例如用于产生可经采集或测试或用于产生商业产物的某些因子，诸如生长因子及免疫调节剂。
淋巴细胞的科学实验和/或特征可包括用于分析或比较淋巴细胞的本文提供的方面、实施例或子实施例中的任一者。在一些实施例中，可用包括多核苷酸的本文提供的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转导T细胞和/或NK细胞。在一些实施例中，转导T细胞和/或NK细胞可包括多核苷酸，这些多核苷酸包括编码本发明的多肽的多核苷酸，例如CAR、淋巴增生性组件和/或活化组件。在一些实施例中，多核苷酸可包括如本文其他处论述的抑制性RNA分子。在一些实施例中，淋巴增生性组件可为嵌合淋巴增生性组件。
治疗方法
本发明提供使用CAR的各种治疗方法。本发明的CAR在存在与T淋巴细胞或NK细胞中时，可介导对靶细胞的细胞毒性。本发明的CAR结合靶细胞上存在的抗原，从而通过经基因方式修饰以产生CAR的T淋巴细胞或NK细胞介导靶细胞的杀伤。CAR的ASTR结合存在于靶细胞的表面上的抗原。
本发明提供杀伤或抑制靶细胞的生长的方法，该方法包括使经基因方式修饰以产生个体CAR的细胞毒性免疫效应细胞(例如，细胞毒性T细胞或NK细胞)接触，使得T淋巴细胞或NK细胞识别存在于靶细胞的表面上的抗原，且介导对靶细胞的杀伤。
本发明提供治疗患有疾病或病症的受试者中的疾病或病症的方法，该方法包括：a.将包括编码CAR的多核苷酸序列的表达载体引入至自个体获得的周边血细胞中以产生经基因工程化的细胞毒性细胞；及b.向个体施用该经基因工程化的细胞毒性细胞。
在包括向个体(尤其患有或疑似患有癌症的个体)施用经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞的本文提供的方法中，这些方法可进一步包括将有效剂量的免疫核查点抑制剂递送至个体。此核查点抑制剂递送可在施用经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞之前、之后或同时发生。免疫核查点抑制剂为已知的且各种化合物经批准且在临床研究中。在提及一些免疫核查点抑制剂的情况下，核查点分子(其中的许多者为核查点抑制剂化合物的靶标)包括以下：
CD27.此分子支持原生T细胞的抗原特异性扩增且对产生T细胞记忆而言为必不可少的。Celldex Therapeutics正在研究CDX-1127，其为激动抗CD27单纯系抗体。
CD28.此分子组成性地表达于几乎所有人类CD4+ T细胞上及所有CD8 T细胞的约一半上。CD28为TGN1412『超激动剂』的靶标。
CD40.此分子(出现于包括抗原呈现细胞的各种免疫系统细胞上)具有CD40L，另外称为CD154，且作为其配位体瞬时表达于经活化CD4+ T细胞的表面上。抗CD40激动剂单纯系抗体授权给Roche。
CD122.已知此分子(其为白细胞介素-2受体β子单元)增加CD8+效应T细胞的增生。Nektar Therapeutics已研发NKTR-214，其为经CD122偏压的免疫刺激性细胞因子。
CD137.当此分子(也称为4-1BB)由CD137配位体结合时，结果为T-细胞增生。Pieris Pharmaceuticals已研发对CD137及HER2具有双特异性的工程化脂质运载蛋白。
OX40.此分子(也称为CD134)具有作为其配位体的OX40L或CD252。如同CD27，OX40促进效应子及记忆T细胞的扩增，然而，其还抑止T调节细胞的分化及活性，且以其调节细胞因子产量的能力而闻名。AstraZeneca具有三种靶向OX40的研发药物：MEDI0562为人类化OX40激动剂、MEDI6469、鼠类OX4激动剂；及MEDI6383(OX40激动剂)。
GITR为糖皮质激素诱导的TNFR家族相关基因的缩写，其促进T细胞扩增，包括Treg扩增。TG Therapeutics正在研究抗GITR抗体。
ICOS.此分子为可诱导T细胞共刺激因子的缩写，且也称为CD278，其表达于经活化T细胞上。Jounce Therapeutics正在研发ICOS激动剂。
A2AR.在癌症疗法中将腺苷A2A受体视为重要的核查点，这是因为引起A2a受体的活化的免疫微环境中的腺苷为负免疫反馈环且肿瘤微环境具有相对较高浓度的腺苷。
B7-H3(也称为CD276)最初理解为共刺激分子但现今视为共抑制的。MacroGenics正在研究MGA271，其为靶向B7-H3的经Fc优化的单纯系抗体。
B7-H4(也称为VTCN1)由肿瘤细胞及肿瘤相关巨噬细胞表达且在肿瘤逃逸中起作用。
BTLA.此分子为B及T淋巴细胞弱化子的缩写且也称为CD272，其具有作为其配位体的HVEM(疱疹病毒进入介体)。
CTLA-4为细胞因子T淋巴细胞相关蛋白4的缩写且也称为CD152，其为Bristol-Myers Squibb的化合物伊匹单抗(Yervoy)的靶标。
IDO为吲哚胺2,3-加双氧酶的缩写，其为具有免疫抑制性特性的色氨酸分解酶。另一重要的分子为TDO，色氨酸2,3-加双氧酶。IDO.Newlink Genetics及Incyte已鉴别IDO路径抑制剂。
KIR为杀灭细胞免疫球蛋白样受体的缩写，其为自然杀灭细胞上的MHC类别I分子的受体。Bristol-Myers Squibb已研发丽瑞鲁单抗(Lirilumab)，其为KIR的单纯系抗体。
LAG3，其为淋巴细胞活化基因-3的缩小，起作用以通过作用于Treg抑止免疫应答，且CD8+ T细胞具有直接影响。Bristol-Myers Squibb已研发称为BMS-986016的抗LAG3单纯系抗体。
PD-1为程序化死亡1(PD-1)受体的缩写，其具有两个配位体PD-L1及PD-L2。此核查点为Merck&Co.的黑素瘤药物默沙东(Keytrud)的靶标。
TIM-3为T细胞免疫球蛋白域及白结构域3的缩写，其表达于经活化人类CD4+ T细胞上且调节Th1 and Th17细胞因子。
VISTA(蛋白质)为T细胞活化的V域Ig抑制因子的缩写，VISTA起始表达于造血细胞上。
适用于治疗的个体
各种个体适用于通过本发明的方法及组合物治疗。适合的个体包括患有疾病或病症、经诊断患有疾病或病症、处于患有疾病或病症的风险、曾患有疾病或病症且处于疾病或病症复发的风险、已通过用于该疾病或病症的药物治疗且未能对此治疗作出反应、或已通过用于该疾病或病症的药物治疗但在对此治疗的初步反应之后复发的任何个体，例如人或非人类动物。
适用于通过免疫调节方法治疗的个体包括具有自身免疫疾病的受试者；为器官或组织移植接受者及类似者的受试者；免疫缺陷的受试者；及感染病原体的受试者。
例示性实施例
此例示性实施例章节提供本文中提供的例示性方面及实施例且贯穿此说明书进一步论述。出于简洁及方便起见，所有所公开方面及实施例及所公开方面及实施例的所有可能的组合不列于此章节中。应理解，所提供的实施例为针对许多方面的特定实施例，如此整个公开内容所论述。意欲鉴于本文的完整公开内容，以下所述或此完整公开内容中的任何个别实施例可与以下所述或此完整公开内容中的任何方面组合，其中其为可添加至方面的额外元素或因为其为针对已呈现于方面中的元素的更窄元素。此组合在此详细描述的其他章节中论述了更多的规范。
在一个方面中，本文提供包括多核苷酸的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒，该多核苷酸包括：
A.可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一个或多个转录单元，其中该一个或多个转录单元编码包含嵌合抗原受体(CAR)；及
B.在其表面上的假型组件及活化组件(例如，NK细胞活化组件，或在说明性实施例中，T细胞活化组件)，其中该活化组件不由复制缺陷型重组反转录病毒颗粒中的多核苷酸编码。
在另一方面中，本文提供一种复制缺陷型重组反转录病毒颗粒，其包括多核苷酸，该多核苷酸包括可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一个或多个转录单元，其中该一个或多个转录单元编码包括嵌合抗原受体(CAR)的第一多肽及包括淋巴增生性组件的第二多肽。在此章节中及此公开内容中，本文提供诸如(但不限于)淋巴增生性组件、活化组件、假型组件、控制组件、CAR及其他组件的这些颗粒的各种实施例。
在另一方面中，本文提供包含多核苷酸的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒，该多核苷酸包括可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一个或多个转录单元，其中该一个或多个转录单元编码包含嵌合抗原受体(CAR)的第一多肽及包含嵌合淋巴增生性组件(例如组成性活性嵌合淋巴增生性组件)的第二多肽。在说明性实施例中，嵌合淋巴增生性组件不包含连接至其同源受体或连接至其同源受体的片段的细胞因子。在此章节中及此公开内容中，本文提供诸如(但不限于)淋巴增生性组件、活化组件、假型组件、控制组件、CAR及其他组件的这些颗粒的各种实施例。
在另一方面中，本文提供一种复制缺陷型重组反转录病毒颗粒，其包含：
A.多核苷酸，其包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一个或多个转录单元，其中该一个或多个转录单元编码嵌合抗原受体(CAR)；及
B.在其表面上的假型组件及T细胞活化组件，其中该T细胞活化组件不由该复制缺陷型重组反转录病毒颗粒中的多核苷酸编码，且其中该T细胞活化组件为抗CD3 scFvFc抗体。在此章节中及此公开内容中，本文提供诸如(但不限于)淋巴增生性组件、活化组件、假型组件、控制组件、CAR及其他组件的这些颗粒的各种实施例。
在另一方面中，本文提供一种复制缺陷型重组反转录病毒颗粒，其包含：
A.一个或多个假型组件，其能够与T细胞和/或NK细胞结合且有助于复制缺陷型重组反转录病毒颗粒与其的膜融合；
B.多核苷酸，其包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一个或多个转录单元，其中该一个或多个转录单元编码包含嵌合抗原受体(包含抗原特异性靶向区、跨膜域及胞内活化域)的第一工程化信号传导多肽及包含至少一个淋巴增生性组件的第二工程化信号传导多肽；其中第一工程化信号传导多肽和/或第二工程化信号传导多肽的表达由控制组件来调节；及
C.在其表面上的活化组件，其中该活化组件能够与T细胞和/或NK细胞结合且不由复制缺陷型重组反转录病毒颗粒中的多核苷酸编码。在此章节中及此公开内容中，本文提供诸如(但不限于)淋巴增生性组件、活化组件、假型组件、控制组件、CAR及其他组件的这些颗粒的各种实施例。
在一些方面中，本文提供通过用本文提供的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒中的任一者离体转导静息T细胞和/或静息NK细胞制成的经基因方式修饰的淋巴细胞(诸如T细胞或NK细胞)，其中该接触有助于通过复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转导静息T细胞和/或NK细胞，由此产生经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞。在一些实施例中，复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包含在其表面上的假型组件及在其表面上的膜结合T细胞活化组件。在此章节中及此公开内容中，本文提供诸如(但不限于)接触时间、淋巴增生性组件、活化组件、假型组件、控制组件及其他组件的此细胞的各种实施例。
在另一方面中，本文提供任何复制缺陷型重组反转录病毒颗粒在制造用于以基因方式修饰T细胞和/或NK细胞的试剂盒中的用途，其中试剂盒的用途包括本文提供的方法方面及实施例中的任一者的步骤。举例而言，在另一方面中，本文提供一种复制缺陷型重组反转录病毒颗粒在制造用于以基因方式修饰T细胞或NK细胞的试剂盒中的用途，其中试剂盒的用途包括：使T细胞或NK细胞与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒离体接触，其中该复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包括在表面上的假型组件及通常在表面上的T细胞活化组件，其中该接触有助于通过复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转导T细胞或NK细胞，由此产生经基因方式修饰的T细胞或NK细胞。在一些实施例中，T细胞活化组件可经膜结合。在说明性实施例中，T细胞活化组件经由T细胞受体相关受体复合物活化T细胞。在一些实施例中，该接触可进行范围的低值端点为1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时或8小时与范围的高值端点为4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、10小时、12小时、15小时、18小时、21小时及24小时之间，例如1小时与12小时之间或1小时与5小时之间。在此用途方面及本文的其他用途方面中，用于制造试剂盒的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒可包括本文提供的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒方面及实施例中的任一者。本文提供诸如(但不限于)其他接触时间、淋巴增生性组件、活化组件、假型组件、经转染/经基因方式修饰的细胞百分比、控制组件及其他组件的这些方法的各种其他实施例。
在另一方面中，本文提供转导和/或以基因方式修饰的淋巴细胞，通常T细胞和/或NK细胞，且通常静息T细胞和/或静息NK细胞，其包括使淋巴细胞与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触，其中该复制缺陷型重组反转录病毒颗粒通常包含在其表面上的假型组件，其中该接触(其也可被视为在接触条件下培育)有助于通过复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转导静息T细胞和/或NK细胞，由此产生经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞。假型组件通常能够结合静息T细胞和/或NK细胞且通常有助于其自身的膜融合或与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的其他蛋白质结合。在方法的一些实施例中，复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包含活化组件，诸如经由T细胞受体相关复合物活化T细胞的T细胞活化组件。此活化组件可为抗CD3抗体，例如抗CD3 scFv或抗CD3 scFvFc。本文提供各种例示性及说明性接触时间。本文提供诸如(但不限于)接触时间、淋巴增生性组件、活化组件、假型组件、经转染/经基因方式修饰的细胞百分比、控制组件及其他组件的这些方法的各种其他实施例。
在另一方面中，本文提供用于以基因方式修饰和/或转导淋巴细胞的方法，该方法包含使淋巴细胞与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒离体接触，其中该复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包含在其表面上的假型组件及在其表面上的膜结合T细胞活化组件，其中该接触有助于通过复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转导淋巴细胞，由此产生经基因方式修饰的淋巴细胞。在一些实施例中，膜结合T细胞活化组件为抗CD3抗体，例如抗CD3 scFv或抗CD3scFvFc。本文提供诸如(但不限于)接触时间、淋巴增生性组件、活化组件、假型组件、经转染/经基因方式修饰的细胞百分比、控制组件及其他组件的这些方法的各种其他实施例。
在另一方面中，本文提供转导个体的静息淋巴细胞的方法，该方法包含使静息T细胞和/或静息NK细胞与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒离体接触，其中该复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包含在其表面上的假型组件，该假型组件能够结合静息T细胞和/或静息NK细胞且有助于复制缺陷型重组反转录病毒颗粒与其的膜融合，其中该接触有助于通过复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转导静息T细胞和/或NK细胞，由此产生经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞。在此方面的说明性实施例中，至少10％、20％或25％的静息T细胞和/或NK细胞或10％与70％之间、10％与50％之间或20％与50％之间的T细胞和/或NK细胞经转导作为方法的结果。本文提供诸如(但不限于)接触时间、淋巴增生性组件、活化组件、假型组件、经转染/经基因方式修饰的细胞百分比、控制组件及其他组件的这些方法的各种其他实施例。
在另一方面中，本文提供用于转导来自经分离学院的静息T细胞和/或静息NK细胞的方法，其包含：
A.自个体收集血液；
B.分离包含静息T细胞和/或静息NK细胞的周边血液单核细胞(PBMC)；
C.使个体的静息T细胞和/或静息NK细胞与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒离体接触，其中该复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包含在其表面上的假型组件，该假型组件能够结合静息T细胞和/或静息NK细胞且有助于复制缺陷型重组反转录病毒颗粒与其的膜结合，其中该接触有助于通过复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转导至少5％的静息T细胞和/或NK细胞，由此产生经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞，由此转导静息T细胞和/或NK细胞。本文提供诸如(但不限于)接触时间、淋巴增生性组件、活化组件、假型组件、经转染/经基因方式修饰的细胞百分比、控制组件及其他组件的这些方法的各种其他实施例。
通常，包装细胞系用于产生本文其他处所论述的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒。在一些实施例中，包装细胞系可为悬浮细胞系。在说明性实施例中，包装细胞系可在无血清培养基中生长。在一些实施例中，淋巴细胞可来自个体。在说明性实施例中，淋巴细胞可来自个体的血液。本文提供诸如(但不限于)接触时间、淋巴增生性组件、活化组件、假型组件、经转染/经基因方式修饰的细胞百分比、控制组件及其他组件的这些方法的各种其他实施例。
在另一方面中，本文提供用复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转导淋巴细胞的方法，其包含：
A.用包含复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的组分的一组载体转染包装细胞，其中该包装细胞在含悬浮液的无血清培养基中生长；
B.自无血清培养基采集该复制缺陷型重组反转录病毒颗粒；及
C.使淋巴细胞与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触。本文提供诸如(但不限于)接触时间、淋巴增生性组件、活化组件、假型组件、经转染/经基因方式修饰的细胞百分比、控制组件及其他组件的这些方法的各种实施例。
在另一方面中，本文提供一种用复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转导淋巴细胞的方法，其包含：
A.将包装细胞培养培养在无血清培养基中的悬浮液中，其中该包装细胞包含编码该复制缺陷型反转录病毒颗粒的可包装RNA基因组、REV蛋白质、gag多肽、pol多肽及假型组件的核酸序列；
B.自无血清培养基采集该复制缺陷型重组反转录病毒颗粒；及
C.使该淋巴细胞与该复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触，其中该接触进行少于12小时，由此转导该淋巴细胞。本文提供诸如(但不限于)其他接触时间、淋巴增生性组件、活化组件、假型组件、经转染/经基因方式修饰的细胞百分比、控制组件及其他组件的这些方法的各种其他实施例。
除非不与方面相容或已陈述于方面中，在说明性实施例中，包装细胞为永生化细胞，其包含编码可包装RNA基因组的稳定地整合至其中的DNA核酸。在一些实施例中，gag多肽及pol多肽自一个或多个可诱导启动子表达，其中该方法进一步包含：在培养期间，添加反式活化因子以诱导gag多肽及pol多肽自一个或多个可诱导启动子的表达。本文提供诸如(但不限于)接触时间、淋巴增生性组件、活化组件、控制组件及其他组件的这些方法的各种实施例。
除非不与方面相容或已陈述于方面中，在用于以基因方式修饰和/或转导淋巴细胞(T淋巴细胞)，用于以基因方式修饰及扩增淋巴细胞(例如T淋巴细胞)或进行本文中的细胞疗法或类似方法的的方法方面中的任一者的说明性实施例中，该接触可实行15分钟、30分钟或45分钟或范围的地段在于1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时或8小时与范围的高值端点在于2小时、4小时、6小时、8小时、10小时、12小时、18小时、24小时、36小时、48小时及72小时之间。举例而言，在说明性实施例中，该接触实行2小时与24小时之间、2小时与20小时之间、2小时与6小时之间、1小时与20小时之间、1小时与12小时之间、1小时与4小时之间、4小时与12小时之间或4小时与8小时之间。在一些实施例中，除非陈述或另外陈述于本文提供的广泛方面中，否则在方法、产生产物的制程或其的用途中的任一者中，使PBMC、NK细胞(且在说明性实施例中，T细胞)与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触可进行1小时与24小时之间，例如1小时与12小时之间、1小时与6小时之间。在一些实施例中，该接触可进行少于24小时，例如少于12小时、少于8小时或少于4小时。在说明性实施例中，该接触进行1小时与14小时之间、1小时与12小时之间、1小时与6小时之间、1小时与4小时之间或2小时与14小时之间。可在不预先活化的情况下进行这些方法。
除非不与方面相容或已陈述于方面中，用于转导和/或以基因方式修饰淋巴细胞(例如NK细胞或在说明性实施例中，T细胞)的以上方法、用途或方法方面的产物中的任一者的另外的实施例可包括本文中其他处公开的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒、淋巴增生性组件、CAR、假型组件、核糖开关、活化组件、膜结合细胞因子、miRNA和/或其他组件的实施例中的任一者。在某些说明性实施例中，反转录病毒颗粒为慢病毒颗粒。
除非不与方面兼容或已陈述于方面中，在本文提供的方法、试剂盒、用途或组合物(例如，多核苷酸、包装细胞或复制缺陷型重组反转录病毒颗粒)中，复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包含或进一步包含在其表面上的活化组件，其能够活化T细胞和/或NK细胞。通常，诸如T细胞活化组件的活化组件不由复制缺陷型重组反转录病毒颗粒中的多核苷酸编码。
除非不与方面相容或已陈述于方面中，在叙述T细胞和/或NK细胞或静息T细胞和/或静息NK细胞的本文提供的方法、试剂盒、用途或组合物(例如，多核苷酸、包装细胞或复制缺陷型重组反转录病毒颗粒)中，在某些说明性实施例中，该细胞为T细胞。
除非不与方面相容或已陈述于方面中，通常，本文提供的方法、试剂盒、用途或组合物(例如，多核苷酸、包装细胞或复制缺陷型重组反转录病毒颗粒)中的任一者中的重组反转录病毒颗粒为复制缺陷型的，亦即不可复制。在说明性实施例中，反转录病毒为慢病毒，诸如复制或复制缺陷型HIV慢病毒。在说明性实施例中，反转录病毒为慢病毒，诸如复制缺陷型或复制缺陷型HIV慢病毒颗粒。因此，在文提供的方法、试剂盒、用途或组合物(例如，多核苷酸、包装细胞或复制缺陷型重组反转录病毒颗粒)中的任一者中的说明性实施例中，若未叙述或另外叙述，复制缺陷型重组反转录病毒颗粒为慢病毒颗粒和/或经基因方式修饰的细胞为经基因方式修饰的T细胞。
除非不与方面兼容或已陈述于方面中，在本文提供的方面中的任一者的说明性实施例中，淋巴细胞可为T细胞和/或NK细胞。在另外的实施例中，T细胞和/或NK细胞可为静息T细胞和/或静息NK细胞。
除非不与方面相容或已陈述于方面中，在用于转导、以基因方式修饰及扩增淋巴细胞或用于进行本文的适应性细胞疗法或类似疗法的方法方面中的任一者的说明性实施例中，10％与75％之间、或10％与70％之间、或10％与60％之间、或10％与50％之间、或10％与25％之间、或20％与75％之间、或20％与50％之间，或至少10％、20％或25％的静息T细胞经转导或0％与75％之间的NK细胞经转导。在其他方面中，5％与80％之间、或10％与80％之间、或10％与70％之间、或10％与60％之间、或10％与50％之间、或10％与25％之间、或10％与20％之间、或20％与50％之间的静息NK细胞经转导。
除非不与方面相容或已陈述于方面中，在用于以基因方式修饰及扩增淋巴细胞或用于进行本文的适应性细胞疗法的或类似疗法或本文提供的任何组合物的方法方面中的任一者的说明性实施例中，该第二工程化信号传导多肽的表达由控制组件来调节。
除非不与方面相容或已陈述于方面中，在包括经基因方式修饰的T细胞或NK细胞或复制缺陷型重组反转录病毒颗粒本文的方法、用途、制程产物或组合物中的任一者中，此经基因方式修饰的T细胞或NK细胞或复制缺陷型重组反转录病毒颗粒可包括多核苷酸，其包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一个或多个转录单元，其中该一个或多个转录单元编码包含嵌合抗原受体(CAR)的第一多肽和/或包含T细胞淋巴增生性组件的二多肽。在一些实施例中，CAR和/或淋巴增生性组件的表达受控制组件或针对每一者的不同控制组件控制。在一些实施例中，CAR和/或淋巴增生性组件可表达于相同多肽上，且在说明性实施例中，CAR和/或淋巴增生性组件表达为独立的多肽。在一些实施例中，CAR为MRB CAR。在一些实施例中，嵌合淋巴增生性组件为组成性活性的，例如组成性活性嵌合细胞因子受体。在此实施例中，组成性活性嵌合细胞因子受体可受控制组件控制。
除非与一个方面不相容或在一个方面中已陈述，否则在本文包括多核苷酸的方面中的任一者中，该多核苷酸包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一个或多个转录单元，其中该一个或多个转录单元编码包含嵌合抗原受体(CAR)的第一多肽和/或包含T细胞淋巴增生性组件的第二多肽，该多核苷酸可进一步包含Kozak相关序列、WPRE组件及多重终止序列(诸如双重终止密码子或三重终止密码子)中的一者或多者，其中双重终止密码子或三重终止密码子中的一个或多个终止密码子限定自该一个或多个转录单元中的至少一者中读取的终止。在某些实施例中，多核苷酸包含选自以下的Kozak类型序列：CCACCAT/UG(G)、CCGCCAT/UG(G)、GCCGCCGCCAT/UG(G)，或GCCGCCACCAT/U(G)。在某些实施例中，相对于第一核酸序列的起始密码子的-3及+4核苷酸皆包含G。在可与包含Kozak类型序列的前述实施例和/或包括三重终止密码子的以下实施例组合的另一实施例中，多核苷酸包含WPRE组件。在一些实施例中，WPRE组件位于一个或多个转录单元的终止密码子的3’及多核苷酸的3’LTR的5’处。在可与前述实施例(亦即，其中多核苷酸包含Kozak类型序列的实施例和/或其中多核苷酸包含WPRE的实施例)中的任一者或两者组合的另一实施例中，一个或多个转录单元经双重终止密码子或三重终止密码子中的一个或多个终止密码子终止。
除非与一个方面不相容或在一个方面中已陈述，否则在本文中提供的包括淋巴增生性组件的方法、用途及组合物中的任一者的说明性实施例中，该淋巴增生性组件可为嵌合淋巴增生性组件。在本文中的包括嵌合淋巴增生性组件的实施例中的任一者中，该嵌合淋巴增生性组件可为嵌合细胞因子受体。在本文中的包括嵌合淋巴增生性组件的实施例中的任一者中，该嵌合淋巴增生性组件可为连接至IL-7受体α的IL-7，或不连接至IL-7受体α的IL-7。在一些实施例中，嵌合细胞因子受体包含连接至IL-7受体α的IL-7，或其保留促进T细胞和/或NK细胞的增生的能力的片段，且其中该嵌合细胞因子受体为组成性活性。在一些实施例中，嵌合细胞因子受体包含共价连接至能够结合IL-7的IL-7受体的功能性胞外片段、IL-7受体跨膜域及IL-7受体信号传导域的IL-7。
除非与一个方面不相容或在一个方面中已陈述，否则在本文中的包括嵌合淋巴增生性组件的方面或实施例中的任一者中，该嵌合淋巴增生性组件可不为嵌合细胞因子受体。在本文中提供的包括淋巴增生性组件的方法及组合物中的任一者的说明性实施例中，嵌合淋巴增生性组件可为嵌合细胞因子受体。在本文中提供的包括嵌合细胞因子受体的方法及组合物中的任一者的说明性实施例中，该嵌合细胞因子受体包含IL-7受体的胞内信号传导域、IL-12受体的胞内信号传导域、IL-15/IL-2受体的胞内信号传导域(诸如IL-15/IL-2β受体)、IL-21受体的胞内信号传导域、IL-23受体的胞内信号传导域、IL-27受体的胞内信号传导域、转化生长因子β(TGFβ)诱饵受体的胞内信号传导域或CD28。在一些实施例中，嵌合细胞因子受体包含与IL-7受体融合的IL-7。
除非与一个方面不相容或在一个方面中已陈述，否则在本文中提供的包括淋巴增生性组件的方法及组合物中的任一者的说明性实施例中，该淋巴增生性组件可包含T细胞存活基元。T细胞存活基元可包含IL-7受体、IL-15受体或CD28的全部或功能性片段。在其他实施例中，淋巴增生性组件可包括细胞因子或细胞因子受体多肽，或其包含信号传导域的片段。举例而言，淋巴增生性组件可包含白细胞介素多肽且该淋巴增生性组件可进一步包含经由接头共价连接的其同源白细胞介素受体多肽的部分。通常，同源白细胞介素受体的此部分包括能够结合白细胞介素细胞因子的胞外域及跨膜域的功能性部分。在一些实施例中，胞内域为同源白细胞介素受体的胞内部分。在一些实施例中，胞内域为能够促进淋巴细胞增生且视情况在不存在将淋巴细胞暴露至外源性细胞因子且在不存在针对CAR的ASTR的靶标的情况下在培养物中离体或活体外存活6天、7天、14天、21天或35天或更长的不同白细胞介素受体的胞内部分，这些外源性细胞因子为诸如IL-15、IL-7及在说明性实施例中IL-2，该CAR在培养期间由淋巴细胞表达。
除非与一个方面不相容或在一个方面中已陈述，否则在一些实施例中，淋巴增生性组件为经由接头共价连接至其全长同源白细胞介素受体多肽的白细胞介素多肽。替代地，淋巴增生性组件可为IL-7受体的胞内信号传导域、IL-12受体的胞内信号传导域、IL-23受体的胞内信号传导域、IL-27受体的胞内信号传导域、IL-15受体的胞内信号传导域、IL-21受体的胞内信号传导域，或转化生长因子β(TGFβ)诱饵受体的胞内信号传导域。
除非与一个方面不相容或在一个方面中已陈述，否则在一些说明性实施例中，淋巴增生性组件为组成性活性。此外，淋巴增生性组件可包括突变IL-7受体或其片段，其可进一步包括组成性活性突变IL-7受体或其组成性活性片段。在一些实施例中，淋巴增生性组件或嵌合细胞因子受体包含IL7 InsPPCL突变体。除非与一个方面不兼容或在一个方面中已陈述，否则在包括淋巴增生性组件的方面中的任一者中，该淋巴增生性组件可为本文中的淋巴增生性组件部分中列举的任一CLE。举例而言，在说明性实施例中，CLE包含来自特别称为尤其值得注意的基因基因和/或相对于本文中的实例的最优构建体(Top Constructs)的域。
在某些说明性实施例中，淋巴增生性组件包含细胞因子受体或包括活化Jak/STAT5路径的信号传导域的其片段。举例而言，此淋巴增生性组件可包括IL21R、IL27R、IL31RA、LIFR及OSMR的胞内域。如实施例17及实施例18的实验及表7至表17中所显示，在候选嵌合多肽中发现包括这些基因的胞内域的嵌合淋巴增生性组件，这些候选嵌合多肽在不存在诸如IL-2的外源性细胞因子的情况下培养的PBMC中诱导最高程度的增生。
在一些实施例中，淋巴增生性组件可包含为白细胞介素或白细胞介素受体且为在实施例17及18(表7至17)中的库1A、1.1A、2B、2.1B、3A、3.1A、3B、3.1B、4B和/或4.1B中识别的最优构建体的部分的胞内域。在一些实施例中，淋巴增生性组件可包含为细胞因子受体且为在实施例17及18(表7至17)中的库1A、1.1A、2B、2.1B、3A、3.1A、3B、3.1B、4B和/或4.1B中识别的最优构建体的部分的胞内域。在一些实施例中，淋巴增生性组件可包含包括至少一个ITAM基元且为在实施例17及18(表7至17)中的库1A、1.1A、2B、2.1B、3A、3.1A、3B、3.1B、4B和/或4.1B中识别的最优构建体的部分的胞内域。
在说明性实施例中，淋巴增生性组件可包含来自IL7R、IL12RB1、IL15RA或IL27RA的胞内域，其存在于如实施例17及18(表19至23)中详述的在初始筛选及重复筛选中显示尤其值得注意的富集(亦即，引起最高程度的增生)的构建体中。
在说明性实施例中，淋巴增生性组件可包含来自以下细胞因子受体的胞内域：CD27、CD40、CRLF2、CSF2RA、CSF3R、EPOR、FCER1G、FCGR2A、FCGR2C、GHR、IFNAR1、IFNAR2、IFNGR2、IL1R1、IL1RL1、IL2RA、IL2RG、IL3RA、IL5RA、IL6R、IL7R、IL9R、IL10RB、IL11RA、IL12RB1、IL13RA1、IL13RA2、IL15RA、IL17RB、IL18R1、IL18RAP、IL20RB、IL22RA1、IL27RA、IL31RA、LEPR、MPL、OSMR、PRLR、TNFRSF4、TNFRSF8、TNFRSF9、TNFRSF14或TNFRSF18，其存在于如实施例17及18(表19至23)中详述的在初始筛选及重复筛选中显示尤其值得注意的富集(亦即，引起最高程度的增生)的构建体中。
在说明性实施例中，淋巴增生性组件可包含来自CD3D、CD3E、CD3G、CD79A、CD79B、FCER1G、FCGR2A或FCGR2C的胞内域，其包括至少一个ITAM基元且存在于如实施例17及18(表19至23)中详述的在初始筛选及重复筛选中显示尤其值得注意的富集(亦即，引起最高程度的增生)的构建体中。
在一些实施例中，此段落中的淋巴增生性组件(其在实施例17及18中显示在具有仅单一胞内域的构建体中具有活性)可为具有两个或更多个胞内域，或在说明性实施例中具有单一胞内域(亦即，该淋巴增生性组件不包含两个或更多个胞内域)的淋巴增生性组件的胞内域。在说明性实施例中，淋巴增生性组件中的胞内域包含来自以下的域：CD40、CRLF2、CSF2RA、CSF3R、EPOR、FCGR2A、IFNAR2、IFNGR2、IL1R1、IL3RA、IL7R、IL10RB、IL11RA、IL12RB1、IL13RA2、IL18RAP、IL31RA、MPL、MYD88、TNFRSF14或TNFRSF18，其存在于如在作为单一胞内信号传导域的实施例18(表22及23)中详述的在初始筛选及重复筛选中显示尤其值得注意的富集(亦即，引起最高程度的增生)的构建体中。在说明性实施例中，淋巴增生性组件中的胞内域包含来自IL7R或IL12RB1的域，其存在于如实施例18(表22及23)中详述的在初始筛选及重复筛选中显示尤其值得注意的富集(亦即，引起最高程度的增生)的构建体中。在一些实施例中，具有单一胞内域的淋巴增生性组件中的胞内域可为细胞因子受体。在说明性实施例中，具有单一胞内域的淋巴增生性组件中的细胞因子受体包含来自以下的域：CD40、CRLF2、CSF2RA、CSF3R、EPOR、FCGR2A、IFNAR2、IFNGR2、IL1R1、IL3RA、IL7R、IL10RB、IL11RA、IL12RB1、IL13RA2、IL18RAP、IL31RA、MPL、TNFRSF14或TNFRSF18，其存在于如实施例18(表22及23)中详述的在初始筛选及重复筛选中显示尤其值得注意的富集(亦即，引起最高程度的增生)的构建体中。在一些实施例中，淋巴增生性组件中的胞内域可包括至少一个ITAM基元。在说明性实施例中，包括至少一个ITAM基元的淋巴增生性组件中的胞内域包含来自FCGR2A的域，其存在于如实施例18(表22)中详述的在初始筛选及重复筛选中显示尤其值得注意的富集(亦即，引起最高程度的增生)的构建体中。
在说明性实施例中，淋巴增生性组件可包含来自CD27、CD28、OX40(也称为TNFRSF4)、GITR(也称为TNFRSF18)或HVEM(也称为TNFRSF14)的共刺激域，其存在于如实施例17及18(表19至23)中详述的在初始筛选及重复筛选中显示尤其值得注意的富集(亦即，引起最高程度的增生)的构建体中。
在一些实施例中，淋巴增生性组件可为以下构建体中的一者：M024-S190-S047、M025-S050-S197、M036-S170-S047、M012-S045-S048、M049-S194-S064、M025-S190-S050、M025-S190-S05、E013-T041-S186-S051、E013-T028-S186-S051、E014-T015-S186-S051、E011-T016-S186-S050、E011-T073-S186-S050或E013-T011-S186-S211，其全部如实施例21(图35及36)中所示在转导之后刺激静息淋巴细胞的增生。在某些实施例中，淋巴增生性组件包含来自CSF3R、IL3RA、ICOS、CRLF、CSF2RA、LIFR或CD40的胞外域；来自MyD88、CD40或MPL的第一胞内域，和/或来自CD27或MyD88的第二胞内域。
在一些实施例中，淋巴增生性组件可为构建体E013-T041-S186-S051，其如实施例22(图38A及38B)中示出且分析在用显示UCHT1scFvFc-GPI的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转导之后刺激静息淋巴细胞的增生。在其他实施例中，淋巴增生性组件为IL7-IL7RA-IL2RB，如实施例22中所示出且分析。
如实施例17中详述，对于库1A及1.1A，具有来自细胞因子受体CD27、IL1RL1、IL6R、IL31RA、TNFRSF4或TNFRSF18的域的构建体在库1A及1.1A(表19)中皆显示尤其值得注意的富集(亦即，引起最高程度的增生)。
如实施例17中详述，对于库2B及2.1B，具有来自细胞因子受体CD40、FCER1G、FCGR2C、IFNGR2、GHR、IL10RB、IL11RA、IL13RA2、IL17RB、IL22RA1、TNFRSF14或TNFRSF9的域的构建体在库2B及2.1B(表20)中皆显示尤其值得注意的富集(亦即，引起最高程度的增生)。
如实施例18中详述，对于库3A及3.1A，具有来自细胞因子受体CD27、CD40、CSF2RA、FCGR2A、MPL、OSMR、TNFRSF4或TNFRSF18的域的构建体在库3A及3.1A(表21)中皆显示尤其值得注意的富集(亦即，引起最高程度的增生)。
如实施例18中详述，对于库3B及3.1B，具有来自细胞因子受体CD27、CD40、CRLF2、CSF2RA、CSF3R、EPOR、FCER1G、FCGR2A、FCGR2C、IFNAR1、IFNAR2、IFNGR2、IL1RL1、IL2RG、IL3RA、IL5RA、IL6R、IL7R、IL9R、IL10RB、IL11RA、IL12RB1、IL13RA1、IL13RA2、IL15RA、IL18RAP、IL20RB、IL27RA、IL31RA、LEPR、MPL、OSMR、PRLR、TNFRSF4、TNFRSF8、TNFRSF9、TNFRSF14或TNFRSF18的域的构建体在库3B及3.1B(表22)中皆显示尤其值得注意的富集(亦即，引起最高程度的增生)。
如实施例18中详述，对于库4B及4.1B，具有来自细胞因子受体CD27、CD40、CRLF2、CSF2RA、CSF3R、EPOR、FCGR2A、FCGR2C、IFNAR2、IFNGR2、IL1R1、IL2RA、IL3RA、IL2RG、IL6R、IL7R、IL10RB、IL11RA、IL31RA、IL13RA1、IL13RA2、IL18R1、MPL、OSMR、TNFRSF4、TNFRSF9或TNFRSF18的域的构建体在库4B及4.1B(表23)中皆显示尤其值得注意的富集(亦即，引起最高程度的增生)。
除非与一个方面不相容或在一个方面中已陈述，否则在本文所公开的包括淋巴增生性组件的方面及实施例中的任一者中，诸如方法、用途、组合物及过程方面的产物，在说明性实施例中，经基因方式修饰的PBMC、淋巴细胞或经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞能够促进淋巴细胞增生/扩增且视情况在不存在将这些细胞暴露至细胞因子(诸如IL-15、IL-7及在说明性实施例中IL-2)及针对在培养期间由这些细胞表达的CAR的ASTR的靶目标情况下在培养物中离体或活体外存活至少6天、7天、14天、21天或35天或更长。在本文中公开的包括CAR及淋巴增生性组件的实施例的任一者中，经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞可能够植入小鼠体内而不暴露至由该CAR识别的靶标。
除非与一个方面不相容或在一个方面中已陈述，否则在本文提供的包括复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的方法及组合物中的任一者的说明性实施例中，这些复制缺陷型重组反转录病毒颗粒可包含在其表面上的活化组件。在说明性实施例中，活化组件经由T细胞受体相关的复合物活化T细胞。在一些情况下，活化组件可仅活化T细胞。在其他情况下，活化组件需要经由TCR受体复合物的活化以进一步活化T细胞。因此，在一些实施例中，活化组件包含：
A.能够与CD3结合的膜结合多肽；和/或
B.能够与CD28结合的膜结合多肽。
此外，能够与CD3结合的膜结合多肽为能够与融合至异源GPI锚定连接序列的CD3结合的多肽，且能够与CD28结合的膜结合多肽可为能够与融合至异源GPI锚定连接序列的CD28结合的多肽。在一些实施例中，能够与CD28结合的膜结合多肽为CD80、CD86或能够诱导对Akt(诸如CD80的胞外域)的经CD28介导的活化的其功能性片段。
除非与一个方面不相容或在一个方面中已陈述，否则在本文提供的为复制缺陷型重组反转录病毒颗粒或包括复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的方法及组合物中的任一者的说明性实施例中，活化组件可为能够结合CD3的膜结合多肽，诸如抗CD3 scFv或抗CD3scFvFc。在本文提供的包括复制缺陷型重组反转录病毒颗粒及抗CD3的方法及组合物中的任一者的说明性实施例，抗CD3可为与异源GPI锚定连接序列融合的抗CD3 scFvFc。在本文提供的包括复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的方法及组合物中的任一者的说明性实施例中，能够结合CD3的膜结合多肽可为与CD14 GPI锚定连接序列结合的抗CD3 scFv，且能够结合CD28的膜结合多肽可为与CD16B GPI锚定连接序列结合的CD80或其胞外域。在本文提供的包括复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的方法及组合物中的任一者的说明性实施例中，复制缺陷型重组反转录病毒颗粒可在其表面上包含结合CD14 GPI锚定连接序列的抗CD3scFv，或结合CD16B GPI锚定连接序列的CD80或其胞外域，及IL-7的融合多肽或其活化片段，及，及包含GPI锚定连接序列的DAF。在本文提供的包括复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的方法及组合物中的任一者的说明性实施例中，IL-7或其活化片段，及DAF融合体、抗CD3scFV及CD80及其胞外域各包含DAF信号序列。
除非另外陈述，或在广泛方面中已陈述，否则在本文提供的包括复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的方法及组合物中的任一者的说明性实施例中，这些复制缺陷型重组反转录病毒颗粒可在其表面上包含膜结合细胞因子。膜结合细胞因子可为IL-7、IL-15或其活化片段。在其他实施例中，膜结合细胞因子为IL-7的的融合多肽或其活化片段及DAF。举例而言，融合多肽可包含DAF信号序列(SEQ ID NO:286的核苷酸1至34)，无其信号序列(SEQ IDNO:286的核苷酸35至186)的IL-7及包括其GPI锚定连接序列(SEQ ID NO:286的核苷酸187至532)的DAF片段。
除非与一个方面不相容或在一个方面中已陈述，否则在本文提供的方法及组合物方面中的任一者的说明性实施例中，假型组件可包含一种或多种异源包膜蛋白质。在其他实例中，假型组件可包括由T细胞识别的一种或多种病毒多肽。一个或多个假型组件可包含麻疹病毒F多肽、麻疹病毒H多肽和/或其片段。该一个或多个假型组件可为麻疹病毒F多肽和/或麻疹病毒H多肽的细胞质域缺失变体。
除非与一个方面不相容或在一个方面中已陈述，否则在本文提供的包括控制组件的方法及组合物中的任一者的说明性实施例中，该控制组件为可调节淋巴增生性组件的控制组件，其中淋巴增生性组件在促进T细胞和/或NK细胞的增生中在不存在化合物的情况下无活性或具有较低活性，且其中该化合物为结合淋巴增生性组件且诱导淋巴增生性组件的活性的分子伴侣。
除非与一个方面不相容或在一个方面中已陈述，否则在本文提供的包括控制组件的方法及组合物中的任一者的说明性实施例中，控制组件可为包含核糖开关的多核苷酸。核糖开关可能够结合核苷类似物且结合控制组件的化合物为核苷类似物。核苷类似物可为抗病毒剂。抗病毒剂可为阿昔洛韦或喷昔洛韦。
除非与一个方面不相容或在一个方面中已陈述，否则在本文提供的包括工程化信号传导多肽(其包括ASTR)的方法及组合物中的任一者的说明性实施例中，这些工程化信号重叠多肽中的一者或两者的ASTR可结合肿瘤相关的抗原。在一些说明性实施例中，第二工程化多肽的抗原特异性靶向区为微环境受限的抗原特异性靶向区。
除非与一个方面不相容或在一个方面中已陈述，否则在本文提供的包括一个或多个复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的方法及组合物中的任一者的说明性实施例中，若在最广泛方面中未明确地叙述，则复制缺陷型重组反转录病毒颗粒可编码经生物验证的单克隆抗体的识别域。在一些实施例中，识别域在与嵌合抗原受体相同的转录物上表达，且其中通过核糖体跳跃和/或裂解信号将识别域与嵌合抗原受体分离。核糖体跳跃和/或裂解信号可为2A-1。识别域可包括由识别EGFR的抗体识别的多肽或其抗原决定基。识别域可为由EGFR抗体识别且在经转导的T细胞和/或NK细胞的表面上表达为本文提供的另一控制机制的EGFR突变体。在相关实施例中，识别域可包括由识别EGFR的抗体识别的多肽或其抗原决定基。
除非与方面、方法、用途、过程产物中的任一者不相容或在一个方面中已陈述，否则该方法可进一步包括自个体收集血液。该方法可进一步包括在离体接触个体的静息T细胞和/或静息NK细胞之后，将经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞再引入该个体。在某些实施例中，接触的静息T细胞和/或静息NK细胞来自个体的血液，且其中经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞的扩增在个体体内发生。在某些实施例中，在收集血液与再引入经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞之间的步骤在不超过24小时、18小时、12小时、8小时、6小时或4小时内进行。其他时间提供于本文中。在某些实施例中，个体在进行接触的7天内、在接触期间，和/或在将经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞再引入至个体后的7天内并不暴露于淋巴消耗剂。[684]在一个方面中，本文提供一种转导和/或以基因方式修饰个体的淋巴细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)，在说明性实施例中静息淋巴细胞(静息T细胞和/或NK细胞)的方法，该方法包含使个体的静息T细胞和/或静息NK细胞离体与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触，其中复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包含在其表面上的假型组件及在其表面上的能够结合静息T细胞和/或静息NK细胞且有助于复制缺陷型重组反转录病毒颗粒与其融合的膜结合抗CD3 scFvFc抗体，其中该接触有助于利用复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转导静息T细胞和/或NK细胞，由此产生经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞。
在一个方面中，本文提供一种转导和/或以基因方式修饰来自分离血液的静息T细胞和/或静息NK细胞的方法，该方法包含：自个体收集血液；分离包含静息T细胞和/或静息NK细胞的周边血单核细胞(PBMC)；以及使个体的静息T细胞和/或静息NK细胞离体与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触有效时间，其中复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包含在其表面上的假型组件及在其表面上的膜结合抗CD3scFvFc抗体，从而产生经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞，由此转导静息T细胞和/或NK细胞。
在本文中的转导和/或以基因方式修饰包括膜结合抗CD3 scFvFc抗体的T淋巴细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)的方面中，假型组件在某些实施例中为疱疹性口腔病毒包膜蛋白质(VSV-G)。在一些实施例中，复制缺陷型重组反转录病毒颗粒进一步包含能够与CD28结合的膜结合多肽，其可包括例如CD80、CD86的胞外域，或其保留与CD28结合的能力的功能性片段。在一些实施例中，抗CD3 scFvFc抗体与异源性GPI锚定连接序列融合。在一些实施例中，抗CD3 scFvFc抗体不由复制缺陷型重组反转录病毒颗粒中的多核苷酸编码。
在本文中的转导和/或以基因方式修饰包括膜结合抗CD3 scFvFc抗体的T淋巴细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)的方面中，重组反转录病毒颗粒可进一步包括多核苷酸，该多核苷酸包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一个或多个转录单元，其中该一个或多个转录单元编码嵌合抗原受体。在一些实施例中，能够与CD3结合的膜结合多肽不由复制缺陷型重组反转录病毒颗粒中的多核苷酸编码。在一些实施例中，抗CD3 scFvFc抗体不由复制缺陷型重组反转录病毒颗粒中的多核苷酸编码。
在另一方面中，本文提供一种转导和/或以基因方式修饰个体的静息淋巴细胞的方法，该方法包含使个体的静息T细胞和/或静息NK细胞离体与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触，其中复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包含在其表面上的假型组件及在其表面上的能够与CD3结合的膜结合多肽，而非在其表面上的能够与CD28结合且活化CD28的膜结合多肽，其中该接触有助于利用复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转导静息T细胞和/或NK细胞，由此产生经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞。
在另一方面中，本文提供一种转导和/或以基因方式修饰来自分离血液的静息T细胞和/或静息NK细胞的方法，该方法包含：自个体收集血液；分离包含静息T细胞和/或静息NK细胞的周边血单核细胞(PBMC)；以及使个体的静息T细胞和/或静息NK细胞离体与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触有效时间，其中复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包含在其表面上的假型组件及在其表面上的能够与CD3结合的膜结合多肽，而非在其表面上的能够与CD28结合且活化CD28的膜结合多肽，由此产生经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞，由此转导静息T细胞和/或NK细胞。
在本文中的转导和/或以基因方式修饰静息T淋巴细胞的方面中，该静息T淋巴细胞包括在其表面上的假型组件及在其表面上的能够与CD3结合的膜结合多肽，而非在其表面上的能够与CD28结合且活化CD28的膜结合多肽，假型组件可为例如疱疹性口腔病毒包膜蛋白质(VSV-G)。在说明性实施例中，能够与CD3结合的膜结合多肽为抗CD3 scFvFc抗体，其在一些实施例中与异源性GPI锚定连接序列融合。在此方面的一些实施例中，接触进行至少2小时、或2小时与24小时之间，或2小时与6小时之间。在一些实施例中，可检测标记由复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的基因组编码，且在转导之后在T细胞和/或NK细胞中检测到。在一些实施例中，能够与CD3结合的膜结合多肽不由复制缺陷型重组反转录病毒颗粒中的多核苷酸编码。在一些实施例中，可检测标记由复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的基因组编码，且在转导之后在T细胞和/或NK细胞中检测到。
在另一方面中，本文提供一种复制缺陷型重组反转录病毒颗粒，其包含：一个或多个假型组件；多核苷酸，其包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一个或多个转录单元，其中该一个或多个转录单元编码嵌合抗原受体；及在其表面上的假型组件以及在其表面上的活化组件，其中该活化组件能够与T细胞和/或NK细胞结合且不由复制缺陷型重组反转录病毒颗粒中的多核苷酸编码，且其中该活化组件为抗CD3 scFvFc抗体。
在另一方面中，本文提供一种复制缺陷型重组反转录病毒颗粒，其包含：一个或多个假型组件，其能够与T细胞和/或NK细胞结合且有助于与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒至其上的膜融合；
多核苷酸，其包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一个或多个转录单元，其中该一个或多个转录单元编码嵌合抗原受体；及在其表面上的假型组件以及在其表面上的活化组件，其中该活化组件能够与T细胞和/或NK细胞结合且不由复制缺陷型重组反转录病毒颗粒中的多核苷酸编码，且其中该活化组件为能够在其表面上与CD3结合的膜结合多肽，但不为能够在其表面上与CD28结合且活化CD28的膜结合多肽。
在本文中的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒方面的一些实施例中，该重组反转录病毒颗粒进一步包含多核苷酸，该多核苷酸包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一个或多个转录单元，其中该一个或多个转录单元编码嵌合抗原受体。在这些方面中的一些实施例中，能够与CD3结合的膜结合多肽不由复制缺陷型重组反转录病毒颗粒中的多核苷酸编码。在这些方面中的一些实施例中，抗CD3 scFvFc抗体不由复制缺陷型重组反转录病毒颗粒中的多核苷酸编码。
在本文中的方面及实施例中的任一者中，诸如包括多肽或编码其的核酸的那些包括例如存在于复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的表面上的活化组件，该活化组件可进一步包括例如具有能够与CD28或在说明性实施例中与CD3结合的多肽的融合多肽、可在不存在二聚剂的情况下有活性的二聚基元。在一些实施例中，活化组件可为抗CD3单链抗体且二聚基元可选自由以下组成的群：CD69、CD71、CD72、CD96、Cd105、Cd161、Cd162、Cd249、CD271及Cd324，以及其保留二聚能力的突变体和/或活性片段。
在本文中的方面及实施例中的任一者中，诸如包括多肽或编码其的核酸的那些包括例如存在于复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的表面上的活化组件，该活化组件可进一步包括例如具有能够与CD28或在说明性实施例中与CD3结合的多肽的融合多肽、可在不存在二聚剂的情况下有活性的二聚基元。在一些实施例中，活化组件可为抗CD3单链抗体且二聚基元可选自由以下组成的群：FKBP及雷帕霉素或其类似物、GyrB及香豆霉素或其类似物、DHFR及甲胺蝶呤或其类似物，或DmrB及AP20187或其类似物，以及保留二聚能力的所述二聚蛋白质的突变体和/或活性片段。
在本文中的方面及实施例中的任一者中，诸如包括多肽或编码其的核酸的那些包括例如存在于复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的表面上的活化组件，该活化组件可进一步包括抗CD3-scFvFc-GPI部分(UCHT1)及视情况的VSV-G。
在以上方面的一个实施例中，该多核苷酸进一步包含Kozak类型序列、WPRE组件及双重终止密码子或三重终止密码子中的一者或多者，其中双重终止密码子或三重终止密码子中的一个或多个终止密码子限定自一个或多个转录单元中的至少一者中读取的终止。在某些实施例中，多核苷酸包含选自以下的Kozak类型序列：CCACCAT/UG(G)、CCGCCAT/UG(G)、GCCGCCGCCAT/UG(G)，或GCCGCCACCAT/U(G)。在某些实施例中，相对于第一核酸序列的起始密码子的-3及+4核苷酸皆包含G。在可与包含Kozak类型序列的前述实施例和/或包括三重终止密码子的以下实施例组合的另一实施例中，多核苷酸包含WPRE组件。在一些实施例中，WPRE组件位于一个或多个转录单元的终止密码子的3’及多核苷酸的3’LTR的5’处。在可与前述实施例(亦即，多核苷酸包含Kozak类型序列的实施例和/或其中多核苷酸包含WPRE的实施例)中的任一者或两者组合的另一实施例中，一个或多个转录单元经双重终止密码子或三重终止密码子中的一个或多个终止密码子终止。
在本文提供的包括ASTR的方面中的任一者的一些实施例中，ASTR可为抗tagASTR。此方法可进一步包括例如与靶分子(诸如靶细胞上的靶蛋白)结合的经tag结合的抗体。
在本文提供的包括B细胞、T细胞或NK细胞的实施例及方面中的任一者中，细胞可为同种异体细胞，或其可不为同种异体细胞。
在本文所公开的方面及实施例中的任一者中，将DNA转导成PBMC、B细胞、T细胞和/或NK细胞及视情况将DNA并入宿主细胞基因组中可使用不利用复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的方法来进行。举例而言，可利用其他病毒载体，诸如来源于腺病毒、腺病毒相关病毒或1型单纯疱疹病毒的那些，作为非限制实施例。在其他实施例中，这些方面及实施例可包括用非病毒载体转染和/或转导靶细胞。在本文所公开的利用非病毒载体转染靶细胞的这些实施例中的任一者中，可使用包括以下的方法将包括裸DNA的非病毒载体引入至靶细胞(诸如PBMC、B细胞、T细胞和/或NK细胞)中：电穿孔、核转染、脂质体制剂、脂质、树枝状聚合物、诸如聚(乙烯亚胺)(PEI)和聚(l-离氨酸)(PLL)的阳离子聚合物、纳米颗粒、细胞穿透肽、显微注射和/或非整合慢病毒载体。在本文提供的方法及组合物的一些实施例中，可使用基于转座子的载体系统通过共转染、共核转染或共电穿孔靶DNA将DNA整合至基因组中，该靶DNA作为在感兴趣基因及转座酶载体系统的5’及3’末端含有转座子ITR片段的质粒。这些方法中使用的转座酶或其他酶(例如CRISPR或TALEN)可与靶质粒共转染为DNA、mRNA或蛋白质。
在另一方面中，本文一种提供复制缺陷型重组反转录病毒颗粒，每一者包含：
A.在其表面上的假型组件，该假型组件能够与T细胞和/或NK细胞结合且有助于复制缺陷型重组反转录病毒颗粒与其的膜融合的，其中该假型组件包含麻疹病毒F多肽和/或麻疹病毒H多肽的细胞质域缺失变体；
B.多核苷酸，其包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一个或多个转录单元，其中该一个或多个转录单元编码包含嵌合抗原受体(其包含抗原特异性靶向区、跨膜域及胞内活化域)的第一工程化信号传导多肽及包含组成性活性IL-7受体突变体的第二工程化信号传导多肽；其中IL-7受体突变体的表达由结合核苷类似抗病毒药物的核糖开关调节；及
C.能够与CD3结合的多肽及能够与CD28结合的多肽，其中这些多肽在复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的表面上表达；能够与T细胞和/或NK细胞结合；且不由复制缺陷型重组反转录病毒颗粒中的多核苷酸编码。在此方面的说明性实施例中，核苷类似抗病毒药物与核糖开关的结合增加IL-7受体突变体的表达。
在一个方面中，本文提供一种以基因方式修饰且扩增个体的淋巴细胞的方法，该方法包含：
A.使个体的静息T细胞和/或NK细胞离体在不需要进行预先离体刺激的情况下与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触，该复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包括：
i.在其表面上的假型组件，该假型组件能够与T细胞和/或NK细胞结合且有助于复制缺陷型重组反转录病毒颗粒与其的膜融合；及
ii.多核苷酸，其包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一个或多个转录单元，其中该一个或多个转录单元编码由控制组件调节的第一工程化信号传导多肽，其中该第一工程化信号传导多肽包含至少一个淋巴增生性组件，
其中该接触有助于利用复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转导静息T细胞和/或NK细胞中的至少一些，由此产生能经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞；
B.将经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞引入至个体中；及
C.使经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞活体内暴露于结合控制组件的化合物，以影响第一工程化信号传导多肽的表达且活体内促进和/或强化淋巴细胞的扩增、移植和/或持久性，由此以基因方式修饰及扩增个体的淋巴细胞。在说明性实施例中，在无需活体外刺激的情况下进行转导。
在以上方面及用于以基因方式修饰及扩增淋巴细胞或用于进行本文的细胞治疗的方法方面中的任一者中，若在最广泛的方面中未叙述，则在某些实施例中，多核苷酸进一步包含编码包含第一嵌合抗原受体的第二工程化信号传导多肽的转录单元，该第一嵌合抗原受体包含抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域及胞内活化域。
在另一方面中，本文提供用于对个体进行过继性细胞疗法的方法，该方法包含：
A.自个体收集血液；
B.使来自个体的血液的静息T细胞和/或NK细胞离体与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触，其中该复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包含
i.在其表面上的假型组件，该假型组件能够与T细胞和/或NK细胞结合且有助于复制缺陷型重组反转录病毒颗粒至其上的膜融合；及
ii.多核苷酸，其包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一个或多个转录单元，其中该一个或多个转录单元编码包含至少一个淋巴增生性组件(其表达由控制组件调节)的第一工程化信号传导多肽，及包含包含抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域及胞内活化域的嵌合抗原受体的第二工程化信号传导多肽，
其中该接触产生变为经基因方式修饰的静息T细胞和/或NK细胞中的至少一些；及
C.将经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞再引入至个体中，其中经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞的扩增、移植和/或持久性出现于个体体内，且其中在收集血液与再引入经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞之间的方法在不超过24小时内进行，从而对个体进行过继性细胞疗法。
本文的另一方面提供用于对个体进行过继性细胞疗法的方法，该方法包含：
A.自个体收集血液；
B.分离包含静息T细胞和/或静息NK细胞的周边血单核细胞(PBMC)；
C.使个体的静息T细胞和/或静息NK细胞离体与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触，其中复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包含在其表面上的能够结合静息T细胞和/或NK细胞且有助于复制缺陷型重组反转录病毒颗粒至其上的膜融合的假型组件，其中该接触有助于利用复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转导静息T细胞和/或NK细胞，从而产生经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞；及
D.在自个体收集血液的24小时内，将经基因方式修饰的细胞再引入至个体中，从而在个体中进行过继性细胞疗法。
在用于以基因方式修饰且扩增淋巴细胞或用于进行本文的过继性细胞疗法或类似方法的方法方面中的任一者的说明性实施例中，若在最广泛方面中未明确地叙述，则该方法可进一步包含将经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞在体内暴露于结合控制组件的化合物，以影响第一工程化信号传导多肽及视情况存在的第二工程化信号传导多肽的表达，且促进体内淋巴细胞的扩增、移植和/或持久性。
在用于以基因方式修饰且扩增淋巴细胞或用于进行本文的过继性细胞疗法或类似方法的方法方面中的任一者的说明性实施例中，若在最广泛方面中未明确地叙述，则经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞在经引入或再引入至个体之前离体经历8次、7次、6次、5次、4次、3次或更少的细胞分裂。
在用于以基因方式修饰且扩增淋巴细胞或用于进行本文的过继性细胞疗法或类似方法的方法方面中的任一者的说明性实施例中，若在最广泛方面中未明确地叙述，则经基因发生修饰的T细胞和/或NK细胞在体内的扩增、移植和/或持久性取决于结合控制组件的化合物的存在或不存在，且在说明性实施例中取决于结合控制组件的化合物的存在。
在用于以基因方式修饰且扩增淋巴细胞或用于进行本文的过继性细胞疗法或类似方法的方法方面中的任一者的说明性实施例中，若在最广泛方面中未明确地叙述，则个体在进行接触的7天、14天或21天内或在接触期间，和/或在将经修饰的T细胞和/或NK细胞引入至个体中之后7天、14天或21天内未暴露于淋巴消耗剂。在其他实施例中，个体在接触期间未暴露于淋巴消耗剂。
在用于以基因方式修饰且扩增淋巴细胞或用于进行本文的过继性细胞疗法或类似方法的方法方面中的任一者的说明性实施例中，若在最广泛方面中未明确地叙述，则静息T细胞和/或静息NK细胞与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触15分钟与12小时之间。
在用于以基因方式修饰及扩增淋巴细胞或用于进行本文的过继性细胞疗法或类似方法的方法方面中的任一者的说明性实施例中，若在最广泛方面中未明确地叙述，则该方法进一步包括在接触之后自T细胞和/或NK细胞分离复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的步骤。在包括引入或再引入的方法中，分离是在引入之前进行。在用于以基因方式修饰且扩增淋巴细胞或用于进行本文的过继性细胞疗法或类似方法的方法方面中的任一者的说明性实施例中，若在最广泛方面中未明确地叙述，则该暴露步骤包括在接触之前或期间，和/或在已将经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞引入至个体中之后向个体施用一定剂量的化合物。
在用于以基因方式修饰且扩增淋巴细胞或用于进行本文的过继性细胞疗法或类似方法的方法方面中的任一者的说明性实施例中，若在最广泛方面中未明确地叙述，则该方法包含在使T细胞和/或NK细胞离体与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触之前自个体收集包含T细胞和/或NK细胞的血液，且其中该引入为再引入。举例而言，自个体抽取20ml与250ml之间的血液。
在用于以基因方式修饰且扩增淋巴细胞或用于进行本文的过继性细胞疗法或类似方法的方法方面中的任一者的说明性实施例中，若在最广泛方面中未明确地叙述，则在自个体收集血液的时间与将经修饰的T细胞和/或NK细胞再引入至个体中的时间之间不超过8小时、12小时、24小时或48小时。
在用于以基因方式修饰且扩增淋巴细胞或用于进行本文的过继性细胞疗法或类似方法的方法方面中的任一者的说明性实施例中，若在最广泛方面中未明确地叙述，则在自个体收集血液的时间与将经修饰的T细胞和/或NK细胞再引入至个体中的时间之间的范围为在低值端点为4小时或8小时与高值端点为12小时、24小时、36小时或48小时之间。
在本文提供的包括向个体(尤其在个体患有或疑似患有癌症时)施用经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞的方面及实施例中，方法可进一步包括向个体递送有效量的免疫检查点抑制剂。
在用于以基因方式修饰且扩增淋巴细胞或用于进行本文的过继性细胞疗法或类似方法的方法方面中的任一者的说明性实施例中，若在最广泛方面中未明确地叙述，则在收集血液之后且在再引入血液之前的所有步骤都在一个封闭的系统中进行，在该系统中一人在整个处理过程中监控该封闭系统。在另一实施例中，在收集血液之后及在再引入血液之前，在与个体保持在同一房间中的封闭系统中进行。
在本文中提供的包括一个或多个转录单元或一个或多个工程化信号传导多肽的方法及组合物中的任一者的说明性实施例中，若在最广泛方面中未明确地叙述，则这些转录单元中的一者或这些工程化信号传导多肽中的一者可编码或包含或进一步包含抗原特异性靶向区(ASTR)及将该ASTR连接至淋巴增生性组件的跨膜域。此工程化信号传导多肽的ASTR能够与第一肿瘤抗原结合，且在存在时，第二工程化信号传导多肽的ASTR能够与第二肿瘤抗原结合。在说明性实施例中，第一工程化信号传导多肽和/或第二工程化信号传导多肽进一步包含共刺激域。此外，第一工程化信号传导多肽和/或第二工程化信号传导多肽进一步包含柄。此外，第一工程化信号传导多肽进一步包含胞内活化域。第一工程化信号传导多肽和/或第二工程化信号传导多肽上的胞内活化域可来源于CD3ζ。在本文中提供的包括淋巴增生性组件的方法及组合物中的任一者的说明性实施例中，该淋巴增生性组件可包含MPL或可为MPL或其变体和/或片段，包括包括MPL的胞内域的至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，具有或不具有MPL的跨膜域和/或胞外域；和/或与MPL的胞内域具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性，具有或不具有MPL的跨膜域和/或胞外域的变体和/或片段，其中该变体和/或片段保留促进PBMC(在一些实施例中T细胞)的细胞增生的能力。
在本文中提供的包括淋巴增生性组件的方法或组合物的任一者中，该淋巴增生性组件可包括刺激STAT5路径或抑制SOCS路径的抑制性RNA分子，诸如miRNA或shRNA。举例而言，抑制性RNA分子可结合编码选自由以下组成的群的蛋白质的核酸：ABCG1、SOCS、TGFbR2、SMAD2、cCBL及PD1。在本文提供的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒或转导细胞中的任一者或包括其的方法的说明性实施例中，此类复制缺陷型重组反转录病毒颗粒或转导细胞可编码两种或更多种抑制性RNA分子，诸如内含子中的miRNA或shRNA，在一些实施例中为1种、2种、3种或4种抑制性RNA分子，其结合编码以下目标内源性T细胞表达的基因中的一者或多者的核酸：PD-1、CTLA4、TCRα、TCRβ、CD3ζ、SOCS、SMAD2、miR-155、IFNγ、cCBL、TRAIL2、PP2A或ABCG1。举例而言，在一个实施例中，靶向以下中的任一者的miRNA的组合可包括在复制缺陷型重组反转录病毒颗粒或转导细胞的基因组中：TCRα、CD3ζ、IFNγ，及PD-1；且在另一实施例中为SOCS 1、IFNγ、TCRα及CD3ζ。
在本文提供的方法及组合物中的任一者的说明性实施例中，复制缺陷型重组反转录病毒颗粒、哺乳动物细胞和/或包装细胞可包含Vpu多肽。Vpu多肽可为例如融合多肽，且在一些实例中，尤其在包装细胞中，为膜结合Vpu多肽。在本文提供的方法及组合物中的任一者的说明性实施例中，复制缺陷型重组反转录病毒颗粒、哺乳动物细胞和/或包装细胞可包含Vpu多肽及Vpx多肽两者。
在本文提供的方法及组合物中的任一者的说明性实施例中，复制缺陷型重组反转录病毒颗粒、哺乳动物细胞和/或包装细胞可包含Vpx多肽。Vpx多肽可为例如融合多肽，且在一些实例中，尤其在包装细胞中，为膜结合Vpx多肽。
在本文所提供的方法或组合物中的任一者中，一个或多个假型组件可包括疱疹性口腔病毒包膜蛋白质(VSV-G)、猫类内源性病毒(RD114)包膜蛋白、致癌反转录病毒双嗜性包膜蛋白或致癌反转录病毒亲嗜性包膜蛋白或其功能性片段。
在一个方面中，本文提供经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞，其中该T细胞和/或NK细胞已经基因方式修饰以表达包含淋巴增生性组件的第一工程化信号传导多肽及包含CAR的第二工程化信号传导多肽，该CAR包括抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域及胞内活化域。
在另一方面中，本文提供经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞，其包含：在该T细胞或NK细胞的表面上的假型组件及在该T细胞或NK细胞的表面上的活化组件，其中该T细胞或NK细胞已经基因方式修饰以表达包含淋巴增生性组件的第一工程化信号传导多肽及包含嵌合抗原受体的第二工程化信号传导多肽，该嵌合抗原受体包括抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域及胞内活化域。
在另一方面中，本文提供经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞，其包含：
A.第一工程化信号传导多肽，其包含至少一个淋巴增生性组件；及
B.第二工程化信号传导多肽，其包含嵌合抗原受体，该嵌合抗原受体包含抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域及胞内活化域。
在一些实施例中，经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞能够在不存在IL-2的情况下离体存活于培养物中。在一些实施例中，经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞包含嵌合细胞因子受体。在一些实施例中，经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞不包含嵌合细胞因子受体。
在本文提供的包括哺乳动物包装细胞的方法(包括复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包装系统方面，或用于制备复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的方法)中的任一者中，例如，可包装RNA基因组由可操作地连接至启动子的多核苷酸编码，其中该启动子具有组成性活性或可由第一反式激活因子或第二反式激活因子诱导。可包装RNA基因组可由可操作地连接至启动子的多核苷酸编码，其中该启动子可由第二反式激活因子诱导。本文中用于驱动第一和/或第二工程化信号传导多肽的表达的启动子通常在靶细胞(例如淋巴细胞、PBL、T细胞和/或NK细胞)中具有活性，但在说明性实施例中，在包装细胞系中不具有活性。第二反式激活因子可调节能够结合并活化靶细胞的活化组件的表达。在本文提供的包括哺乳动物包装细胞的方法(包括复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包装系统方面，或用于制备复制缺陷型重组反转录病毒颗粒(例如，一些实施例中的可包装RNA基因组)的方法)中的任一者中，可包装RNA基因组的表达可由第二反式激活因子调节。
此外，可包装RNA基因组自5’至3’包含：
1.)5’长末端重复或其活化片段；
2.)核酸序列，其编码反转录病毒顺式作用RNA包装组件；
3.)编码第一靶标多肽的核酸序列和/或编码一种或多种(例如两种或更多种)抑制性RNA分子的核酸序列；
4.)在靶细胞中具有活性的启动子；及
5.)3’长末端重复或其活化片段。
在一些实施例中，编码第一靶标多肽的核酸序列与编码用于包装及组装的反转录病毒组分的RNA及5’LTR呈相反定向。
在本文提供的包括哺乳动物包装细胞的方法(包括复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包装系统方面，或用于制备复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的方法)中的任一者中，例如第一靶标多肽包含第一工程信号传导多肽且其中该第一工程化信号传导多肽包含至少一个淋巴增生性组件。可包装RNA基因组可进一步包含编码第二靶标多肽的核酸序列。第二靶标多肽可包含包括嵌合抗原受体的第二工程化信号传导多肽，该嵌合抗原受体包含：
1.)第一抗原特异性靶向区；
2.)第一跨膜域；及
3.)第一胞内活化域。
在本文提供的包括哺乳动物包装细胞的方法(包括复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包装系统方面，或用于制备复制缺陷型重组反转录病毒颗粒(例如哺乳动物细胞)的方法)中的任一者中，例如包装细胞可包括例如在第二转录单元或视情况存在的第三转录单元上或在可操作地连接至第一可诱导启动子的其他转录单元上编码Vpu多肽的核酸序列。在本文提供的包括哺乳动物包装细胞的方法(包括复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包装系统方面，或用于制备复制缺陷型重组反转录病毒颗粒(例如哺乳动物细胞)的方法)中的任一者中，例如，包装细胞可包括例如在第二转录单元或视情况存在的第三转录单元上或在可操作地连接至第一可诱导启动子的其他转录单元上编码Vpx多肽及Vpu多肽两者的核酸序列。可为包装细胞的哺乳动物细胞可为293细胞。
在本文提供的包括哺乳动物包装细胞的方法(包括复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包装系统方面，或用于制备复制缺陷型重组反转录病毒颗粒(例如哺乳动物细胞)的方法)中的任一者中，例如包装细胞可包括例如在第二转录单元或视情况存在的第三转录单元上或在可操作地连接至第一可诱导启动子的其他转录单元上编码Vpx的核酸序列。可为包装细胞的哺乳动物细胞可为293细胞。
在本文提供的包括哺乳动物包装细胞的方法(包括复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包装系统方面，或用于制备复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的方法)中的任一者中，第一配位体可为雷帕霉素，且第二配位体可为四环素或阿霉素，或第一配体可为四环素或阿霉素且第二配体可为雷帕霉素。
在一些方面中，本文提供已通过本文提供的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒中的任一者转导的细胞。该细胞可为例如淋巴细胞，诸如T细胞或NK细胞。在说明性实施例中，该细胞为人类细胞。
在一个方面中，本文提供用于扩增个体中经修饰的T细胞和/或NK细胞的方法，该方法包含：
A.使自该个体获得的经分离静息T细胞和/或静息NK细胞与本文所公开的实施例中的任一者的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触；
B.将经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞引入至个体中；及
C.向该个体提供有效量的阿昔洛韦、阿昔洛韦前药、喷昔洛韦或喷昔洛韦前药，其中该经修饰的T细胞和/或NK细胞在施用阿昔洛韦、阿昔洛韦前药、喷昔洛韦或喷昔洛韦前药后在该个体中增生，从而扩增个体中的经修饰的T细胞和/或NK细胞。
在另一方面中，本文提供用于停止个体中经修饰的T细胞和/或NK细胞的扩增、移植和/或持久性的方法，该方法包含：
A.使自该个体获得的经分离静息T细胞和/或NK细胞与本文所公开的实施例中的任一者的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触；
B.将经修饰的T细胞和/或NK细胞引入至个体中；
C.向该个体施用有效量的阿昔洛韦、阿昔洛韦前药、喷昔洛韦或喷昔洛韦前药以扩增个体中经修饰的T细胞和/或NK细胞，其中该经修饰的T细胞和/或NK细胞在施用阿昔洛韦、阿昔洛韦前药、喷昔洛韦、喷昔洛韦前药后在该个体中增生，从而扩增个体中的经修饰PBL；及
D.停止施用阿昔洛韦、阿昔洛韦前药、喷昔洛韦或喷昔洛韦前药，其中该经修饰的T细胞和/或NK细胞在停止施用阿昔洛韦、阿昔洛韦前药、喷昔洛韦或喷昔洛韦前药后在该个体中停止增生，从而控制个体中的经修饰的T细胞和/或NK细胞的扩增、移植和/或持久性。
在另一方面中，本文中提供一种治疗个体中的癌症的方法，该方法包含：
A.使自该个体获得的经分离静息T细胞和/或NK细胞与根据本文所公开的实施例中的任一者的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触；
B.将经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞引入至个体中；及
C.向该个体施用有效量的阿昔洛韦、阿昔洛韦前药、喷昔洛韦或喷昔洛韦前药以扩增个体中的经修饰T细胞和/或NK细胞，其中该经修饰T细胞和/或NK细胞在施用阿昔洛韦、阿昔洛韦前药、喷昔洛韦、喷昔洛韦前药后在该个体中增生，且其中该经修饰T细胞和/或NK细胞中的嵌合抗原受体结合个体中的癌细胞，从而治疗个体中的癌症。
在另一方面中，本文中提供一种经转导T细胞和/或NK细胞，其包含重组多核苷酸，该重组多核苷酸包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一个或多个转录单元，其中该一个或多个转录单元编码由控制组件调节的第一工程化信号传导多肽，其中该第一工程化信号传导多肽包含组成性活性IL-7受体突变体，且其中该控制组件能够活体内与化合物结合，和/或经设计和/或经配置与化合物结合。
在另一方面中，本文中提供一种反转录病毒包装系统，其包含：
哺乳动物细胞，其包含：
A.第一反式激活因子，其由组成性启动子表达且能够结合第一配位体及第一可诱导启动子以供在第一配位体的存在对比缺失下影响可操作地连接至其的核酸序列的表达；
B.第二反式激活因子，其能够结合第二配位体及第二可诱导启动子，且在第二配位体的存在对比缺失下影响可操作地连接至其的核酸序列的表达；及
C.针对反转录病毒颗粒的可包装RNA基因组，
其中该第一反式激活因子调节该第二反式激活因子及反转录病毒REV蛋白质的表达，其中该第二反式激活因子调节gag多肽、pol多肽及能够与靶细胞结合且有助于与其膜融合的一个或多个假型组件的表达，且其中反转录病毒蛋白质衍生自反转录病毒。此方面的实施例可包括针对其他方面中的所述实施例在本文中提供的实施例中的任一者。
在另一方面中，本文提供一种用于制造复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的方法，其包含：
A.培养包装细胞的群体以积聚第一反式激活因子，其中包装细胞包含由第一组成性启动子表达的第一反式激活因子，其中第一反式激活因子能够结合第一配位体及第一可诱导启动子以供在第一配位体的存在下对比于缺失下影响可操作地连接至其的核酸序列的表达，且其中由第一反式激活因子调节第二反式激活因子及反转录病毒REV蛋白质的表达；
B.在第一配位体的存在下培育包含经积聚第一反式激活因子的包装细胞的群体以积聚第二反式激活因子及反转录病毒REV蛋白质，其中第二反式激活因子能够结合第二配位体及第二可诱导启动子以供在第二配位体的存在下对比于缺失下影响可操作地连接至其的核酸序列的表达；及
C.在第二配位体的存在下培育包含经积聚第二反式激活因子及反转录病毒REV蛋白质的包装细胞的群体，从而诱导gag多肽、pol多肽及一个或多个假型组件的表达，从而制造复制缺陷型重组反转录病毒颗粒，
其中可包装RNA基因组是由可操作地连接至第三启动子的多核苷酸编码，其中该第三启动子是组成性活性的或可由第一反式激活因子或第二反式激活因子诱导，且其中一个或多个假型组件能够与靶标细胞结合和/或有助于膜与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒融合。
在本文所提供的反转录病毒包装系统及用于制造复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的方法的一些实施例中，哺乳动物细胞进一步包含能够与靶细胞(通常为淋巴细胞，诸如NK细胞或在说明性实施例中为T细胞)结合且活化靶细胞的活化组件，且第一反式激活因子调节活化组件的表达。活化组件在复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的表面上且其中该活化组件可包括：能够与CD3结合的膜结合多肽；和/或能够与CD28结合的膜结合多肽。能够与CD3结合的膜结合多肽为能够与融合至异源GPI锚定连接序列的CD3结合的多肽，且能够与CD28结合的膜结合多肽为能够与融合至异源GPI锚定连接序列的CD28结合的多肽。能够与CD28结合的膜结合多肽在一些实施例中包含CD80、CD86或能够诱导经CD28介导的Akt的活化的其功能性片段(诸如CD80的胞外域)。在其他实施例中，能够结合CD3的膜结合多肽为与CD14 GPI锚定连接序列结合的抗CD3 scFv或抗CD3 scFvFc，且其中能够与CD28结合的膜结合多肽为CD80，或与CD16B GPI锚定连接序列结合的其胞外片段。
在本文所提供的反转录病毒包装系统及用于制造复制缺陷型重组反转录病毒颗粒方面的方法的一些实施例中，哺乳动物细胞进一步包含膜结合细胞因子，且第一反式激活因子调节膜结合细胞因子的表达。膜结合细胞因子可为例如IL-7、IL-15或其活化片段。实施例中的膜结合细胞因子可为IL-7或其活化片段及DAF的融合多肽。举例而言，融合多肽可包含DAF信号序列及不具有其信号序列的IL-7，接着为DAF的残基36至525。
在本文所提供的反转录病毒包装系统及用于制造复制缺陷型重组反转录病毒颗粒方面的方法的一些实施例中，哺乳动物细胞包含与其膜相关联的：活化组件，其包含与CD14 GPI锚定连接序列结合的抗CD3scFV或抗CD3 scFvFc，或与CD16B GPI锚定连接序列结合的CD80或其胞外片段；及膜结合细胞因子，其包含IL-7或其活化片段及包含GPI锚定连接序列的DAF的融合多肽，且其中第一反式激活因子调节活化组件及膜结合细胞因子中的每一者的表达。在一些实施例中，IL-7或其活化片段及DAF融合、抗CD3scFV或抗CD3 scFvFc及CD80或其胞外片段各自包含DAF信号序列。
在本文所提供的反转录病毒包装系统及用于制造复制缺陷型重组反转录病毒颗粒方面的方法的一些实施例中，哺乳动物细胞进一步包含Vpu多肽。在本文所提供的反转录病毒包装系统及用于制造复制缺陷型重组反转录病毒颗粒方面的方法的一些实施例中，哺乳动物细胞进一步包含Vpu多肽及Vpx多肽。在本文所提供的反转录病毒包装系统及用于制造复制缺陷型重组反转录病毒颗粒方面的方法的一些实施例中，哺乳动物细胞进一步包含Vpx多肽。在这些或其他实施例中，一个或多个假型组件包含由T细胞识别的一个或多个病毒多肽。一个或多个假型组件可包含麻疹病毒F多肽、麻疹病毒H多肽和/或其片段。在某些说明性实施例中，一个或多个假型组件为麻疹病毒F多肽和/或麻疹病毒H多肽的细胞质域缺失变体。
在本文所提供的反转录病毒包装系统及用于制造复制缺陷型重组反转录病毒颗粒方面的方法的一些实施例中，可包装RNA基因组由可操作地连接至第三启动子的多核苷酸编码，其中该第三启动子是组成性活性的或可由第一反式激活因子或第二反式激活因子诱导。在说明性实施例中，可包装RNA基因组由可操作地连接至第三启动子的多核苷酸编码，其中该第三启动子可由第二反式激活因子诱导。
在本文所提供的反转录病毒包装系统及用于制造复制缺陷型重组反转录病毒颗粒方面的方法的一些实施例中，可包装RNA基因组进一步自5’至3’包含：
a)5’长末端重复或其活化片段；
b)核酸序列，其编码反转录病毒顺式作用RNA包装组件；
c)核酸序列，其编码第一靶标多肽及视情况选用的第二靶标多肽；
d)第四启动子，其可操作地连接至第一靶标多肽及视情况选用的第二靶标多肽，其中该第四启动子在靶细胞中具有活性但在包装细胞系中为无活性的；及
e)3’长末端重复或其活化片段。
在包括紧接着上文构建体的本文所提供的反转录病毒包装系统及用于制造复制缺陷型重组反转录病毒颗粒方面的方法的一些实施例中，第三启动子促进与由第四启动子促进的转录及表达相反的方向上的转录或表达。
在本文所提供的反转录病毒包装系统及用于制造复制缺陷型重组反转录病毒颗粒方面的方法的一些实施例中，可包装RNA基因组编码在本发明中公开的任何实施例的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒，其中第一靶标多肽及第二靶标多肽分别为第一工程化信号传导多肽及第二工程化信号传导多肽。在一些实施中，例如，可包装RNA基因组进一步包含可操作地连接至核酸的控制组件，该核酸编码第一工程化信号传导多肽或第二工程化信号传导多肽。控制组件在说明性实施例中为核糖开关。核糖开关在说明性实施例中能够结合化合物且结合控制组件的化合物为核苷类似物，且该核苷类似物可为抗病毒药物，例如阿昔洛韦或喷昔洛韦。
在本文所提供的反转录病毒包装系统及用于制造复制缺陷型重组反转录病毒颗粒方面的方法的一些实施例中，可包装RNA基因组进一步包含内含子，该内含子包含编码抑制性RNA分子(诸如miRNA或shRNA)的多核苷酸。内含子可邻近于第四启动子或在第四启动子的下游。
在本文所提供的反转录病毒包装系统及用于制造复制缺陷型重组反转录病毒颗粒方面的方法的一些实施例中，靶标细胞可为T细胞和/或NK细胞。
在本文所提供的反转录病毒包装系统及用于制造复制缺陷型重组反转录病毒颗粒方面的方法的一些实施例中，一个或多个假型组件包含疱疹口腔炎病毒包膜蛋白(VSV-G)、猫类内源性病毒(RD114)包膜蛋白、致癌反转录病毒双嗜性包膜蛋白或致癌反转录病毒亲嗜性包膜蛋白或其功能性片段。
在本文所提供的反转录病毒包装系统及用于制造复制缺陷型重组反转录病毒颗粒方面的方法的一些实施例中，可包装RNA基因组大小为11,000KB或更小，或10,000KB或更小。在本文所提供的反转录病毒包装系统及用于制造复制缺陷型重组反转录病毒颗粒方面的方法的一些实施例中，第一靶标多肽包含第一工程化信号传导多肽且其中该第一工程化信号传导多肽包含至少一个淋巴增生性组件，且第二靶标多肽包含包括CAR的第二工程化信号传导多肽。
在一个方面中，本文中提供一种用于调节多核苷酸靶标多核苷酸的表达的经分离多核苷酸，其包含：
多核苷酸，其编码可操作地连接至启动子及核糖开关的多核苷酸靶标多核苷酸，其中该核糖开关包含：
a.)适体域，其能够结合核苷类似物抗病毒药物且相对于核苷类似物抗病毒药物减少与鸟嘌呤或2’-脱氧鸟苷的结合；
b.)功能切换域，其能够调节多核苷酸靶标多核苷酸的表达，其中由适体域结合的核苷类似物诱导或抑制功能切换域的表达调节活性，从而调节多核苷酸靶标多核苷酸的表达。
在包括控制组件的本文所提供的这些方法及组合物中的任一者的说明性实施例中可为包含核糖开关的多核苷酸。核糖开关可能够结合核苷类似物且结合控制组件的化合物为核苷类似物。核苷类似物可为抗病毒剂。抗病毒剂可为阿昔洛韦或喷昔洛韦。核糖开关可较佳地经由喷昔洛韦结合阿昔洛韦或较佳地经由阿昔洛韦结合喷昔洛韦。核糖开关可在高于37℃、37.5℃、38℃、38.5℃或39℃(例如，高于39℃)的温度下减少与核苷类似物抗病毒药物的结合。核糖开关可在长度为35、40、45及50个核苷酸的范围的低值端点与长度为60、65、70、75、80、85、90、95及100个核苷酸的范围的高值端点之间，例如在长度为45与80个核苷酸之间。在包括核糖开关的本文所提供的这些方法及组合物中的任一者的说明性实施例中，由核糖开关调节的多核苷酸靶标多核苷酸可包括编码miRNA、shRNA和/或多肽的区域。多核苷酸靶标多核苷酸可编码淋巴增生性组件。多核苷酸靶标多核苷酸可可操作地连接至启动子。多核苷酸靶标多核苷酸可包括编码多肽的区域，且该多肽可包括嵌合抗原受体，该嵌合抗原受体包含抗原特异性靶向区、跨膜域及胞内活化域。在包括核糖开关的本文所提供的这些方法及组合物中的任一者的说明性实施例中，功能切换域可调节内部核糖体进入位点、病毒基因构建体中的pre-mRNA剪接供体可及性、翻译、转录终止、转录降解、miRNA表达或shRNA表达，从而调节多核苷酸靶标多核苷酸的表达。核糖开关可包括核糖核酸酶。在本文所提供的包括核糖开关的方法及组合物中的任一者的说明性实施例中，经分离多核苷酸可为分子克隆载体或表达载体。在本文所提供的包括核糖开关的方法及组合物中的任一者的说明性实施例中，可将经分离多核苷酸整合至反转录病毒基因组中或至哺乳动物染色体或其片段中。在本文中的包含核糖开关的方面及实施例中的任一者的说明性实施例中，核糖开关调节前mRNA剪接。举例而言，核糖开关可包含通常在本文中的多核苷酸和/或转录单元上的两个外显子之间的分支点序列。因此，核苷类似抗病毒化合物或药物与核糖开关的结合调节外显子剪接。此类实施例可包括多核苷酸，该多核苷酸包含第一外显子、第二外显子及在第一外显子与第二外显子之间的核糖开关，其中该核糖开关包含分支点序列，且其中核苷类似抗病毒化合物或药物(例如阿昔洛韦)与核糖开关的结合调节第一及第二外显子的外显子剪接。在本文中的包含核糖开关的方面及实施例中的任一者的说明性实施例中，核糖公开可通过调节前mRNA反式剪接来控制基因表达。在此类实施例中，核糖开关位于反式剪接内含子内。举例而言，一个方面可包括多核苷酸，该多核苷酸包含第一外显子、第二外显子及在第一外显子与第二外显子之间的核糖开关，其中该核糖开关包含分支点序列，且其中阿昔洛韦与核糖开关的结合调节第一及第二外显子的外显子剪接。
本文中提供的另一方面为一种用于以基因方式修饰及扩增个体的淋巴细胞的方法，其包含：
A.自个体收集血液；
B.使来自个体的血液的T细胞和/或NK细胞与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒活体外接触，该复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包含：
i.在其表面上的假型组件，该假型组件能够与T细胞和/或NK细胞结合且有助于与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒膜融合，其中该假型组件包含麻疹病毒F多肽和/或麻疹病毒H多肽的细胞质域缺失变体；
ii.能够与CD3结合的多肽及能够与CD28结合的多肽，其中这些多肽在复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的表面上表达且能够与T细胞和/或NK细胞结合，且另外其中这些多肽并不由复制缺陷型重组反转录病毒颗粒中的多核苷酸编码；及
iii.多核苷酸，其包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一个或多个转录单元，
其中一个或多个转录单元编码包含组成性活性IL-7受体突变体的第一工程化信号传导多肽及包含嵌合抗原受体的第二工程化信号传导多肽，该嵌合抗原受体包含抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域及胞内活化域。
其中IL-7受体突变体的表达由结合核苷类似物抗病毒药物的核糖开关调节，其中核苷类似物抗病毒药物与核糖开关的结合增加IL-7受体突变体的表达，且
其中该接触使得静息T细胞和/或NK细胞中的至少一些变为经基因方式修饰；
C.将经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞再引入至个体中；及
D.将经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞活体内暴露于核苷类似物抗病毒药物以促进T细胞和/或NK细胞的扩增，其中收集血液与再引入经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞之间的方法在不多于24小时内进行和/或不需要进行预先活体外刺激，从而以基因方式修饰且扩增个体的淋巴细胞。
在此方法方面的说明性实施例中，反转录病毒颗粒为慢病毒颗粒。在另一说明性实施例中，复制缺陷型重组反转录病毒颗粒以基因方式修饰T细胞。在另一说明性实施例中，能够与CD3结合的多肽及能够与CD28结合的多肽各自与异源性GPI锚定连接序列融合。在一些情况下，能够与CD3结合的多肽可为抗CD3 scFvFc或抗CD3 scFv，且能够与CD28结合的多肽可为CD80。抗CD3 scFvFc或抗CD3 scFv及CD80可各自进一步与DAF信号序列融合。在另一说明性实施例中，复制缺陷型重组反转录病毒颗粒在其表面上进一步包含融合多肽，该融合多肽包含共价连接至DAF的细胞因子。在一些情况下，细胞因子可为IL-7或IL-15，且融合多肽可包含DAF信号序列、不具有其信号序列的IL-7及包含GPI锚定连接序列的DAF的片段。
在紧接着上文的此方法方面的另一说明性实施例中，核糖开关进一步以通过核糖开关与核苷类似物抗病毒药物的结合调节的方式来控制嵌合抗原受体的表达，该核苷类似物抗病毒药物在一些情况下为阿昔洛韦和/或喷昔洛韦。在另一实施例中，组成性活性IL-7可经miRNA或shRNA或编码miRNA或shRNA的核酸替换，且可存在IL-7。在一些情况下，miRNA或shRNA可由内含子内的核酸编码。
本文中提供的另一方面为复制缺陷型重组反转录病毒颗粒，其包含：
A.在其表面上的假型组件，该假型组件能够与T细胞和/或NK细胞结合且有助于与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒膜融合，其中该假型组件包含麻疹病毒F多肽和/或麻疹病毒H多肽的细胞质域缺失变体；
B.多核苷酸，其包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一个或多个转录单元，其中该一个或多个转录单元编码包含嵌合抗原受体(包含抗原特异性靶向区、跨膜域及胞内活化域)的第一工程化信号传导多肽及包含组成性IL-7受体突变体的第二工程化信号传导多肽；其中IL-7受体突变体的表达由结合核苷类似物抗病毒药物的核糖开关调节，其中核苷类似物抗病毒药物与核糖开关的结合增加IL-7受体突变体的表达；及
C.能够与CD3结合的多肽及能够与CD28结合的多肽，其中这些多肽在复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的表面上表达；能够与T细胞和/或NK细胞结合；且不由复制缺陷型重组反转录病毒颗粒中的多核苷酸编码。
在任一复制缺陷型重组反转录病毒颗粒方面的说明性实施例中，该反转录病毒颗粒为慢病毒颗粒。在该方法的其他说明性实施例中，能够与CD3结合的多肽及能够与CD28结合的多肽各自与异源性GPI锚定连接序列融合。在一些情况下，能够与CD3结合的多肽可为抗CD3 scFvFc或抗CD3 scFv，且能够与CD28结合的多肽可为CD80。抗CD3 scFvFc或抗CD3scFv及CD80可各自进一步与DAF信号序列融合。在另一说明性实施例中，复制缺陷型重组反转录病毒颗粒在其表面上进一步包含融合多肽，该融合多肽包含共价连接至DAF的细胞因子。在一些情况下，细胞因子可为IL-7或IL-15，且融合多肽可包含DAF信号序列、不具有其信号序列的IL-7及包含GPI锚定连接序列的DAF的片段。
在本文中的任一复制缺陷型重组反转录病毒颗粒方面的另一说明性实施例中，核糖开关进一步以通过核糖开关与核苷类似抗病毒药物的结合调节的方式来控制嵌合抗原受体的表达，该核苷类似抗病毒药物在一些情况下为阿昔洛韦和/或喷昔洛韦。在另一实施例中，组成性活性IL-7可经miRNA或shRNA或编码miRNA或shRNA的核酸替换，且可存在IL-7。miRNA或shRNA可由内含子内的核酸编码。
本文中提供的另一方面为一种用于制造复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的方法，其包含：
A.培养包装细胞的群体以积聚第一反式激活因子，其中包装细胞包含由组成性启动子表达的第一反式激活因子，其中第一反式激活因子能够结合第一配位体及第一可诱导启动子以供在第一配位体的存在下对比于缺失下影响可操作地连接至其的核酸序列的表达，且其中由第一反式激活因子调节第二反式激活因子及反转录病毒REV蛋白质的表达；
B.在第一配位体的存在下培育包含经积聚第一反式激活因子的包装细胞的群体以积聚第二反式激活因子及反转录病毒REV蛋白质及通常在其表面上的活化组件，该活化组件包含能够与CD3结合的多肽及包含能够与CD28结合的多肽，其中第二反式激活因子能够结合第二配位体及第二可诱导启动子以供在第二配位体的存在下对比于缺失下影响可操作地连接至其的核酸序列的表达；及
C.在第二配位体的存在下培育包含经积聚第二反式激活因子及反转录病毒REV蛋白质的包装细胞的群体，从而诱导gag多肽、pol多肽、能够与T细胞和/或NK细胞结合且有助于与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒膜融合的假型组件的表达，其中该假型组件包含麻疹病毒F多肽和/或麻疹病毒H多肽的细胞质域缺失变体，
其中可包装RNA基因组由可操作地连接至第三启动子的多核苷酸编码，且其中该启动子可由第二反式激活因子诱导，
其中可包装RNA基因组自5’至3’包含：
i.5’长末端重复或其活化片段；
ii.核酸序列，其编码反转录病毒顺式作用RNA包装组件；
iii.核酸序列，其编码由裂解信号隔开的包含嵌合抗原受体的第一工程化信号传导多肽及包含组成性活性IL-7受体突变体的第二工程化信号传导多肽；
iv.第四启动子，其在T细胞和/或NK细胞中具有活性；及
v.3’长末端重复或其活化片段，且
其中可包装RNA基因组进一步包含结合核苷类似物抗病毒药物的核糖开关，其中核糖开关与核苷类似物抗病毒药物的结合增加IL-7受体突变体的表达，
从而制造复制缺陷型重组反转录病毒颗粒。
在该方法的一说明性实施例中，核糖开关进一步以通过结合核糖开关与核苷类似物抗病毒药物的结合调节的方式来控制嵌合抗原受体的表达。在另一说明性实施例中，核苷类似物抗病毒药物为阿昔洛韦和/或喷昔洛韦。在另一说明性实施例中，可包装RNA基因组进一步包含识别域，其中该识别域包含由识别EGFR或其抗原决定基的抗体识别的多肽。在另一说明性实施例中，第一配位体为雷帕霉素，且第二配位体为四环素或阿霉素；或第一配位体为四环素或阿霉素，且第二配位体为雷帕霉素。在另一说明性实施例中，包装细胞进一步包含在第二或视情况选用的第三转录单元上或可操作地连接至第一可诱导启动子的其他转录单元上编码Vpu的核酸序列。在另一说明性实施例中，包装细胞进一步包含在第二或视情况选用的第三转录单元上或可操作地连接至第一可诱导启动子的其他转录单元上编码Vpu多肽及Vpx多肽的核酸序列。在另一说明性实施例中，包装细胞进一步包含在第二或视情况选用的第三转录单元上或可操作地连接至第一可诱导启动子的其他转录单元上编码Vpx的核酸序列。在另一说明性实施例中，能够与CD3结合的多肽及能够与CD28结合的多肽各自与异源性GPI锚定连接序列融合。在一些情况下，能够与CD3结合的多肽可为抗CD3scFvFc或抗CD3 scFv，且能够与CD28结合的多肽可为CD80。抗CD3 scFvFc或抗CD3 scFv及CD80可各自进一步与DAF信号序列融合。在另一说明性实施例中，还包括包含共价连接至DAF的细胞因子的融合多肽的表达。在一些情况下，细胞因子可为IL-7或IL-15，且融合多肽可包含DAF信号序列、不具有其信号序列的IL-7及包含GPI锚定连接序列的DAF的片段。在另一说明性实施例中，核糖开关进一步以通过核糖开关与核苷类似物抗病毒药物的结合调节的方式来控制嵌合抗原受体的表达，该核苷类似物抗病毒药物在一些情况下为阿昔洛韦和/或喷昔洛韦。在另一实施例中，组成性活性IL-7可经miRNA或shRNA或编码miRNA或shRNA的核酸替换，且可存在IL-7。miRNA或shRNA可由内含子内的核酸编码。在一说明性实施例中，反转录病毒颗粒为慢病毒颗粒。
本文中的另一方面中提供一种以基因方式修饰的淋巴细胞，其包含：
A.第一工程化信号传导多肽，其包含组成性活性IL-7受体突变体；及
B.第二工程化信号传导多肽，其包含嵌合抗原受体，该嵌合抗原受体包含抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域及胞内活化域。
在以上经基因方式修饰的淋巴细胞的说明性实施例中，经基因方式修饰的淋巴细胞为T细胞和/或NK细胞。在某些实施例中，淋巴细胞为T细胞。在另一说明性实施例中，该第一工程化信号传导多肽和/或该第二工程化信号传导多肽的表达由结合核苷类似物抗病毒药物的核糖开关调节，其中核苷类似物抗病毒药物与核糖开关的结合增加IL-7受体突变体的表达。在另一实施例中，经基因方式修饰的淋巴细胞表达至少一种(例如，两种)抑制性RNA分子，诸如miRNA或shRNA。抑制性RNA分子可进一步由内含子内的核酸编码。
本文中的另一方面提供一种以基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞，其包含：
a.第一工程化信号传导多肽，其包含至少一个淋巴增生性组件；及
b.第二工程化信号传导多肽，其包含嵌合抗原受体，该嵌合抗原受体包含抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域及胞内活化域。
在经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞方面的说明性实施例中，淋巴增生性组件是组成性活性的，且在一些情况下为组成性活性突变的IL-7受体或其片段。在另一说明性实施例中，第一工程化信号传导多肽和/或第二工程化信号传导多肽的表达由控制组件调节。在一些情况下，控制组件为包含核糖开关的多核苷酸。在一些情况下，核糖开关能够结合核苷类似物且当核苷类似物存在时，表达第一工程化信号传导多肽和/或第二工程化信号传导多肽。在其他说明性实施例中，经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞在其表面上具有活化组件、假型组件和/或膜结合细胞因子。在一些情况下，活化组件包含能够与CD3结合的膜结合多肽；和/或能够与CD28结合的膜结合多肽。在某些实施例中，活化组件包含与异源性GPI锚定连接序列融合的抗CD3 scFV或抗CD3 scFvFc和/或与异源性GPI锚定连接序列融合的CD80。在一说明性实施例中，假型组件包含麻疹病毒F多肽、麻疹病毒H多肽，和/或麻疹病毒F多肽和/或麻疹病毒H多肽的细胞质域缺失变体。在其他实施例中，膜结合细胞因子为包含IL-7或融合至DAF或包含GPI锚定连接序列的其片段的融合多肽。
在一个方面中，本文中提供一种用于以基因方式修饰及扩增个体的淋巴细胞的方法，其包含：
A.使个体的静息T细胞和/或NK细胞活体外在通常不需要进行预先活体外刺激的情况下与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触，这些复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包含：
i.在其表面上的假型组件，该假型组件能够与T细胞和/或NK细胞结合且有助于与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒膜融合；及
ii.多核苷酸，其包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一个或多个转录单元，其中该一个或多个转录单元：编码由控制组件调节的第一工程化信号传导多肽，其中该第一工程化信号传导多肽包含至少一个淋巴增生性组件；且视情况编码由控制组件视情况调节的第二工程化信号传导多肽，其中第二工程化信号传导多肽包含胞内活化域及视情况选用的CAR的其他组分，
其中该接触有助于利用复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转导静息T细胞和/或NK细胞中的至少一些，从而产生经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞；
B.将经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞引入至个体中；及
将经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞活体内暴露于充当控制组件的化合物以影响第一工程化信号传导多肽的表达且活体内促进淋巴细胞的扩增、移植和/或持久性，从而以基因方式修饰及扩增个体的淋巴细胞。
在说明性实施例中，在无需活体外刺激的情况下进行转导。在说明性实施例中，化合物为分子伴侣，诸如小分子伴侣。在说明性实施例中，分子伴侣与淋巴增生性组件的结合增加淋巴增生性组件的增生活性。可在收集血液之前、在接触期间和/或在将T细胞和/或NK细胞引入至个体中之后将分子伴侣施用至个体。关于其中该化合物作为控制组件的这一方面，应当理解，此化合物通常能够与淋巴增生性组件和/或CAR的组分结合，且在进行该方法期间与此淋巴增生性组件或CAR组分结合。与包括用复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转染T细胞和/或NK细胞的本文所提供的方法相关的其他实施例及教示应用于此方面，还包括分子伴侣实施例。
在另一方面中，本文中提供一种用于选择受微环境限制的抗原特异性靶向区的方法，该方法包含通过以下淘选多肽显示库：
a.使多肽显示库的多肽在正常生理条件下经受结合分析及在异常条件下的结合分析；及
b.选择在与生理条件相比的异常条件下展现结合活性的增加的多肽，从而选择受微环境限制的抗原特异性靶向区。
在另一方面中，本文中提供一种用于分离受微环境限制的抗原特异性靶向区的方法，其包含：
通过以下淘选多肽库：
a)在异常条件下使多肽库与结合至固体载体的靶标抗原接触，其中表达与结合靶标抗原的多肽的纯系仍经由靶标抗原结合至固体载体；
b)在生理条件下将固体载体与结合多肽一起培育；及
c)收集在生理条件下自固体载体溶离的纯系，从而分离微环境受限的抗原特异性靶向区。
在另一方面中，本文中提供一种用于结合靶标抗原的嵌合抗原受体，该嵌合抗原受体包含：
a)至少一个受微环境限制的抗原特异性靶向区，其通过淘选多肽库选择，且与正常生理条件下相比在异常条件下结合分析的活性增加；
b)跨膜域；及
c)胞内活化域。
在另一方面中，本文中提供一种用于结合靶标抗原的嵌合抗原受体，该嵌合抗原受体包含：
a)受微环境限制的抗原特异性靶向区，其与正常生理环境下相比，在异常条件下展现与靶标抗原的结合的增加，其中抗原特异性靶向区与靶标结合；
b)跨膜域；及
c)胞内活化域。
在包括受微环境限制的抗原特异性靶向区(ASTR)的本文所提供的这些方法及组合物中的任一者的说明性实施例中，与正常条件下相比，ASTR在异常条件下的分析中对靶标抗原可增加至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的结合亲和力。异常条件可为低氧、酸性pH、较高浓度的乳酸、较高浓度的透明质酸、较高浓度的白蛋白、较高浓度的腺苷、较高浓度的R-2-羟基戊二酸、较高浓度的PAD酶、较高压力、较高氧化反应及较低养分可用性。如相比于在7.4的pH下，受微环境限制的ASTR在6.7的pH下可展现抗原结合的增加。受微环境限制的ASTR可展现在与对应生理条件相关的肿瘤环境和/或活体内肿瘤环境分析条件中的抗原结合的增加。靶标可为4-1BB、ST4、腺癌抗原、α-胎蛋白、AXL、BAFF、B-淋巴瘤细胞、C242抗原、CA-125、碳酸酐酶-9(CA-IX)、C-MET、CCR4、CD 152、CD 19、CD20、CD200、CD22、CD221、CD23(IgE受体)、CD28、CD30(TNFRSF8)、CD33、CD4、CD40、CD44 v6、CD51、CD52、CD56、CD74、CD80、CEA、CNT0888、CTLA-4、DRS、EGFR、EpCAM、CD3、FAP、纤连蛋白外域-B、叶酸受体1、GD2、GD3神经节苷脂、糖蛋白75、GPNMB、HER2/neu、HGF、人类分散因子受体激酶、IGF-1受体、IGF-I、IgG1、Ll-CAM、IL-13、IL-6、类胰岛素生长因子I受体、整合素nSP1、整合素nvP3、MORAb-009、MS4A1、MUC1、黏蛋白CanAg、N葡萄糖代神经氨酸、NPC-1C、PDGF-R a、PDL192、磷脂酰丝氨酸、前列腺癌细胞、RANKL、RON、ROR1、ROR2 SCH900105、SDC1、SLAMF7、TAG-72、腱生蛋白C、TGFβ2、TGF-P、TRAIL-R1、TRAIL-R2、肿瘤抗原CTAA16.88、VEGF-A、VEGFR-1、VEGFR2及波形蛋白。ASTR可为抗体、抗原、配位体、配位体的受体结合域、受体、受体的配位体结合域或亲和体。ASTR可为全长抗体、单链抗体、Fab片段、Fab’片段、(Fab’)2片段、Fv片段以及二价单链抗体或双功能抗体。ASTR可包括来自抗体的重链及轻链。抗体可为单链可变片段。在一些实施例中，重链及轻链可由接头隔开，其中该接头长度在6与100个氨基酸之间。在一些实施例中，重链可定位于嵌合抗原受体上的轻链的N端，且在一些实施例中轻链可定位于嵌合抗原受体上的重链的N端。
在包括多肽显示库的本文所提供的这些方法中的任一者的说明性实施例中，多肽显示库可为噬菌体显示库或酵母显示库。多肽显示库可为抗体显示库。抗体显示库可为人类或人类化抗体显示库。抗体显示库可为原生库。这些方法可包括用所收集噬菌体感染细菌细胞以产生精制噬菌体显示库，且重复接触、培育及收集1至1000个循环，使用由前述循环产生的精制噬菌体显示库。
在包括分离或选择受微环境限制的ASTR的本文所提供的这些方法中的任一者的说明性实施例中，该方法可包括测定编码受微环境限制的抗原特异性靶向区的多核苷酸的核酸序列，从而测定受微环境限制的ASTR的多肽序列。这些方法可包括通过产生编码多肽的多核苷酸来制造受微环境限制的生物嵌合抗原受体，该多肽包含受微环境限制的ASTR、跨膜域及胞内活化域。该库可为单链抗体库。
用于分离受微环境限制的ASTR的方法可包括重复淘选1至1000次之间。可进行用于分离受微环境限制的ASTR的方法，而无需在淘选的轮次之间突变编码受微环境限制的抗原特异性靶向区的多核苷酸。用于分离受微环境限制的ASTR的方法可在淘选的轮次之间通过培养、高保真扩增和/或稀释编码抗原特异性靶向区的多核苷酸或包括其的宿主生物体来进行。这些方法可包括在重复之前，诱变处理经选择和/或经分离受微环境限制的抗原特异性靶向区。这些方法可包括在经由长久读取DNA测序的淘选的一个或多个轮次之后测定经选择和/或经分离受微环境限制的抗原特异性靶向区和/或编码其的多核苷酸的序列。这些方法可包括在经分离受微环境限制的ASTR的扩增之前及之后测测序列。可进行用于分离经分离受微环境限制的ASTR的方法，而无需在不需要重复淘选。可进行用于分离经分离受微环境限制的ASTR的方法，而无需在分离受微环境限制的ASTR之后，突变编码经分离受微环境限制的ASTR的多核苷酸。
在包括具有受微环境限制的ASTR的嵌合抗原受体的本文所提供的这些组合物中的任一者的说明性实施例中，受微环境限制的ASTR可通过淘选抗体库来鉴别。在一些实施例中，受微环境限制的ASTR通过淘选噬菌体显示库或酵母显示库来鉴别。在一些实施例中，嵌合抗原受体包含双特异性ASTR。
在另一方面中本文中提供一种经转导T细胞和/或NK细胞，其包含重组多核苷酸，该重组多核苷酸包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一个或多个转录单元，其中该一个或多个转录单元编码由控制组件调节的第一工程化信号传导多肽，其中该第一工程化信号传导多肽包含组成性活性IL-7受体突变体，且其中控制组件能够活体外或活体内与化合物结合，或经配置以活体内结合化合物。
在另一方面中本文中提供一种复制缺陷型重组反转录病毒颗粒，其包含重组多核苷酸，该重组多核苷酸包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一个或多个转录单元，其中该一个或多个转录单元编码由控制组件(其可为活体内控制组件)调节的第一工程化信号传导多肽，其中该第一工程化信号传导多肽包含组成性IL-7受体突变体，且其中控制组件能够活体内与化合物结合，或经配置以活体内结合化合物。
在另一方面中本文中提供一种转导T细胞和/或NK细胞的方法，该方法包含：使T细胞和/或NK细胞与包含重组多核苷酸的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触，该重组多核苷酸包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一个或多个转录单元，其中该一个或多个转录单元编码由控制组件调节的第一工程化信号传导多肽，其中该第一工程化信号传导多肽包含组成性IL-7受体突变体，且其中活体内控制组件能够在转导条件下活体内或活体外与化合物结合，从而转导T细胞和/或NK细胞。
在前述段落提供的经转导T细胞和/或NK细胞方面、复制缺陷型重组反转录病毒颗粒方面、及方法方面的说明性实施例中，重组多核苷酸进一步包含编码包含第一嵌合抗原受体的第二工程化信号传导多肽的转录单元，该第一嵌合抗原受体包含抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域及胞内活化域。在其他说明性实施例中，淋巴增生性组件包含经突变IL-7受体或其片段。在其他说明性实施例中，控制组件为包含核糖开关的多核苷酸。在一些情况下，核糖开关能够结合核苷类似物且结合控制组件的化合物为核苷类似物。在一些情况下，核苷类似物为抗病毒剂，诸如阿昔洛韦或喷昔洛韦。在某些实施例中，抗病毒剂为阿昔洛韦。在其他说明性实施例中，组成性活性IL-7受体突变体与EGFR或其抗原决定基融合。在其他说明性实施例中，组成性活性IL-7受体突变体包含eTag。在其他说明性实施例中，组成性活性IL-7受体突变体包含PPCL插入。在其他说明性实施例中，组成性活性IL-7受体突变体包含等效于野生型人类IL-8受体中的位置243的位置处的PPCL插入。在其他说明性实施例中，经转导T细胞和/或NK细胞为经转导T细胞。
在另一方面中，本文中提供一种用于调节表达受微环境限制的生物嵌合抗原受体(MRB-CAR)的T细胞和/或NK细胞与表达个体中的MRB-CAR的同源抗原的细胞结合的方法，该方法包括：
a.将包括编码MRB-CAR的核酸的T细胞和/或NK细胞引入至个体中，其中在引入后，包括编码MRB-CAR的核酸的T细胞和/或NK细胞表达MRB-CAR且与表达个体中的同源抗原的细胞结合；及
b.向个体施用呈充足量的药用试剂以增加血液pH和/或组织的pH和/或微环境的pH，其中该施用在引入之前、期间或之后进行，且其中血液、组织和/或微环境的增加的pH调节表达MRB-CAR的T细胞和/或NK细胞与表达具有增加的pH的血液、组织或微环境中的同源抗原的细胞的结合。
在另一方面中，本文中提供一种用于靶向减轻个体中的肿瘤毒性的方法，其包括：
a.将编码受微环境限制的生物嵌合抗原受体(MRB-CAR)的核酸引入至个体的T细胞和/或NK细胞中以产生包括编码MRB-CAR的核酸的T细胞和/或NK细胞；
b.将包括编码MRB-CAR的核酸的T细胞和/或NK细胞引入至个体中，其中在引入之后，包括编码MRB-CAR的核酸的T细胞和/或NK细胞表达MRB-CAR且与表达个体中的同源抗原的细胞结合；及
c.向个体施用呈充足量的药用试剂以增加血液pH和/或组织的pH和/或微环境的pH以调节MRB-CAR与具有增加的pH的血液、组织和/或微环境中的其同源抗原的结合，从而靶向减轻个体中的肿瘤毒性。
在一些实施例中，核酸可为载体。在说明性实施例中，载体为反转录病毒颗粒。
在另一方面中，本文中提供一种用于控制T细胞和/或NK细胞与靶标哺乳动物细胞的结合的方法，其包括：
a.使靶标哺乳动物细胞与微环境中的T细胞和/或NK细胞接触，其中靶标哺乳动物细胞表达同源抗原，且如相比于在pH 7.4下，T细胞和/或NK细胞表达在pH 6.7下有差异地与同源抗原结合的受微环境限制的生物嵌合抗原受体(MRB-CAR)；及
b.通过将药用试剂以充足量引入微环境来增加微环境的pH，从而控制T细胞和/或NK细胞与靶标哺乳动物细胞的结合。
在另一方面中，本文中提供一种用于控制表达受微环境限制的生物嵌合抗原受体(MRB-CAR)的T细胞和/或NK细胞与个体中的靶标哺乳动物细胞在活体内的结合的方法，该方法包括经由增加个体内的微环境的pH的有效给药方案向个体施用pH调节药用试剂，其中个体包括表达MRB-CAR的T细胞和/或NK细胞，其中如相比于在pH 7.4下，MRB-CAR在pH 6.7下有差异地与其同源抗原结合，其中微环境包括靶标哺乳动物细胞，其中靶标哺乳动物细胞在其表面上表达同源抗原，且其中T细胞和/或NK细胞在增加微环境的pH之前相比于之后有差异地与靶标哺乳动物细胞结合，从而控制T细胞和/或NK细胞与个体中的靶标哺乳动物细胞在活体内的结合。
在本文提供的包括药用试剂及MRB-CAR的方面中的任一者中，MRB-CAR可在一个pH下而非不同pH下减少与其同源抗原的结合。在针对MRB-CAR的差异性结合的说明性pH值未曾提供于广泛方面中的说明性实施例中及替代地对于代替用于这些方面的那些值的其他实施例，MRB-CAR可在较高pH下而非较低pH下减少结合。举例而言，MRB-CAR可在高于7.0、7.1、7.2、7.3、7.4或7.5的pH下而非低于6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9或7.0的pH下减少与其同源抗原的结合。在其他实施例中，MRB-CAR可在较高pH下而非较低pH下减少结合。举例而言，MRB-CAR可在低于6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9或7.0的pH下而非高于7.0、7.1、7.2、7.3、7.4或7.5的pH下减少与其同源抗原的结合。在一些说明性实施例中，相比于在pH 7.4至7.6下，MRB-CAR在6.5至6.7的pH下展现增加的结合。在其他说明性实施例中，相比于在7.4的pH下，MRB-CAR在6.7的pH下展现增加的结合。在其他实施例中，相比于在血液的pH下，MRB-CAR在肿瘤的pH下展现增加的结合。在一些实施例中，MRB-CAR可包括抗原特异性靶向区、柄及胞内活化域。在一些实施例中，MRB-CAR也可包括共刺激域。在一些实施例中，MRB-CAR可与肿瘤相关的抗原结合。
在本文提供的包括药用试剂及MRB-CAR的方面中的任一者中，微环境的pH可自低于7.0的pH增加至高于7.0的pH。举例而言，pH可自低于6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9或7.0的pH增加至高于7.0、7.1、7.2、7.3或7.4的pH。在一些实施例中，MRB-CAR可在引入药用试剂之前在增加的pH下而非微环境的pH下与同源抗原结合。在某些实施例中，pH可自低于7.0增加7.1至8.0的pH、或至7.1至7.8的pH、或至7.2至7.8的pH、或至7.2至7.6的pH、或至7.3至7.6的pH、或至7.4至7.8的pH、或至7.4至7.6的pH。视施用的药用试剂的类型及剂量而定，此pH的增加可发生少于1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、12小时或24小时，或多于1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、12小时或24小时。在某些实施例中，施用药用试剂，使得pH在靶标组织(诸如肿瘤)中，及例如在靶标组织(例如，肿瘤)微环境的至少一个表面中，在靶标组织(例如，肿瘤)微环境的至少一部分中以及在说明性实施例中在整个靶标组织(例如，肿瘤)微环境中保持高于7.0、7.1、7.2、7.3、7.4或7.5；或在7.0、7.1、7.2、7.3的范围的低值端点与7.4、7.5、7.6、7.7或7.8的范围的高值端点之间。
在本文提供的包括药用试剂及MRB-CAR的方面中的任一者中，微环境可为活体内微环境，诸如肿瘤、组织、非肿瘤组织、正常组织或已经历pH短暂变化的组织。举例而言，通常经历pH短暂变化的组织包括厌氧条件下的肌肉组织或经历锻炼的肌肉组织或已发炎组织或正经历发炎的组织。在包括靶标哺乳动物细胞的一些实施例中，靶标哺乳动物细胞可为肿瘤细胞或非肿瘤细胞或正常细胞。
在本文提供的包括药用试剂及MRB-CAR的方面中的任一者中，药用试剂可为碳酸氢钠、参(羟甲基)胺基甲烷、碳酸氢钠及碳酸钠的等摩尔高渗溶液或质子泵抑制剂，这些质子泵抑制剂，诸如艾美拉唑(esomeprazole)、艾美拉唑及萘普生(naproxen)、兰索拉唑(lansoprazole)、奥美拉唑(omeprazole)及雷贝拉唑(rabeprazole)。
编码本发明的MRB-CAR的核酸可经由各种手段引入至T细胞和/或NK细胞中。在本文提供的包括药用试剂及MRB-CAR的方面中的任一者中，一个或多个引入步骤可通过以下来进行：
a.使个体的静息T细胞和/或NK细胞活体外在不需要进行预先活体外刺激的情况下与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触，该复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包括：
i.在其表面上的一个或多个假型组件，该假型组件能够与T细胞和/或NK细胞结合且有助于与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒膜融合；及
ii.多核苷酸，其包括可操作地连接至在编码MRB-CAR的T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的转录单元，
其中该接触有助于利用复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转导静息T细胞和/或NK细胞中的至少一些，从而产生能够表达MRB-CAR的T细胞和/或NK细胞，通常是因为其现今包括多核苷酸，该多核苷酸包括在编码MRB-CAR的T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的转录单元；及
b.将能够表达MRB-CAR的T细胞和/或NK细胞引入至个体中。
在一些实施例中，T细胞和/或NK细胞可在引入之前活体外经历2、3、4、5、6、7、8、9或10次或更少细胞分裂。在一些实施例中，静息T细胞和/或静息NK细胞可与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11或12小时的范围的低值端点与6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时或24小时的范围的高值端点之间，其中对于给定范围，较低值低于较高值。在一些实施例中，静息T细胞和/或静息NK细胞可来自自个体收集的血液。在说明性实施例中，在自个体收集血液的时间与将能够表达MRB-CAR的T细胞和/或静息NK细胞引入至个体中的时间之间可不多于12小时、15小时、16小时、18小时、21小时、24小时、30小时、36小时、42小时或48小时。在一些实施例中，收集血液之后及引入能够表达MRB-CAR的T细胞和/或静息NK细胞之前的所有步骤在封闭系统中进行。
在本文提供的包括方法(包括MRB-CAR及药用试剂)中的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的任何实施例中，包括可操作地连接至在编码MRB-CAR的T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的转录单元的多核苷酸由T细胞和/或NK细胞吸收，使得此类细胞能够表达MRB-CAR。在说明性实施例中T细胞和/或NK细胞将多核苷酸整合至其基因组中。
在本文提供的包括方法(包括MRB-CAR及药用试剂)中的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的任何实施例中，复制缺陷型重组反转录病毒颗粒可进一步包括在其表面上的活化组件，诸如能够活化静息T细胞和/或静息NK细胞的活化组件。在一些实施例中，活化组件可包括在本发明中提供的任何活化组件。在说明性实施例中，活化组件可包括能够与CD3结合的膜结合多肽和/或能够与CD28结合的膜结合多肽。在包括方法(包括MRB-CAR及药用试剂)中的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的表面上的活化组件的紧接着上文提供的实施例中的任一者中，膜结合多肽中的一个或多个可与异源性GPI锚定连接序列融合。在一些实施例中，能够与CD3结合的膜结合多肽和/或能够与CD28结合的膜结合多肽可为分别结合CD3或CD28的scFv或scFvFc。在说明性实施例中，能够与CD3结合的膜结合多肽可为结合CD3的scFv或scFvFc。在一些实施例中，能够与CD28结合的膜结合多肽可为CD80、CD86的胞外域或能够诱导CD28介导的Akt的活化的其功能性片段。
在本文提供的包括方法(包括MRB-CAR及药用试剂)中的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的任何实施例中，编码MRB-CAR的多核苷酸可可操作地连接至核糖开关。在一些实施例中，核糖开关可以能够结合核苷类似物。在一些实施例中，核苷类似物可为抗病毒药物，诸如阿昔洛韦或喷昔洛韦。
在本文提供的包括方法(包括MRB-CAR及药用试剂)中的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的任何实施例中，复制缺陷型重组反转录病毒颗粒可在其表面上包括生物批准的单克隆抗体的识别域。举例而言，识别域可包括由识别EGFR或其抗原决定基的抗体所识别的多肽。
在本文提供的包括方法(包括MRB-CAR及药用试剂)中的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的任何实施例中，一个或多个假型组件可包括麻疹病毒F多肽、麻疹病毒H多肽和/或保留与静息T细胞和/或静息NK细胞结合的能力的其片段。在一些实施例中，一个或多个假型组件可包括VSV-G多肽。在一些实施例中，复制缺陷型重组反转录病毒颗粒可在其表面上包括IL-7或其活化片段及包括GPI锚定连接序列的DAF的融合多肽。
在本文提供的包括方法(包括MRB-CAR及药用试剂)中的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的任何实施例中，复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的基因组可编码一种或多种抑制性RNA分子，例如两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、或六种或更多种抑制性RNA分子。在一些实施例中，抑制性RNA分子可针对不同RNA靶标。在一些实施例中，抑制性RNA分子可位于内含子内。在一些实施例中，抑制性RNA分子能够形成形成18至25个核苷酸RNA双螺旋的5’茎及3’茎。在一些实施例中，抑制性RNA分子中的至少一者自5’至3’取向可包括：5’微小RNA侧翼序列、5’茎、环、3’茎及3’微小RNA侧翼序列，其中5’茎或3’茎能够与RNA靶标结合。在另一实施例中，5’茎长度可为18至25个核苷酸，其中该3’茎长度为18至25个核苷酸，其中该环长度为3至40个核苷酸。在一些实施例中，5’微小RNA侧翼序列及3’微小RNA侧翼序列中的一者或多者衍生自天然存在的miRNA，诸如mIR-155。
在另一方面中，本文中提供一种pH调节药用试剂以供在用于控制T细胞和/或NK细胞与个体中的靶标哺乳动物细胞在活体内的结合的方法中使用，该方法包括经由增加个体内的微环境的pH的有效给药方案向个体施用pH调节药用试剂，其中个体包括T细胞和/或NK细胞，其中如相比于在pH 7.4下，T细胞和/或NK细胞表达在pH 6.7下有差异地与其同源抗原结合的受微环境限制的生物嵌合抗原受体(MRB-CAR)，其中T细胞和/或NK细胞表达MRB-CAR，其中微环境包括靶标哺乳动物细胞，其中靶标哺乳动物细胞其表面上的表达同源抗原，且其中T细胞和/或NK细胞在通过施用pH调节药用试剂增加微环境的pH之前相比于之后有差异地与靶标哺乳动物细胞结合，从而控制T细胞和/或NK细胞与个体中的靶标哺乳动物细胞在活体内的结合
在另一方面中，本文中提供一种药用试剂以供在用于调节表达受微环境限制的生物嵌合抗原受体(MRB-CAR)的T细胞和/或NK细胞与表达个体中的MRB-CAR的同源抗原的细胞的结合的方法中使用，以供治疗肿瘤生长，其中该方法包括：
a.将能够表达MRB-CAR的T细胞和/或NK细胞引入至个体中，其中MRB-CAR与表达个体中的同源抗原的细胞结合，其中在引入之后，包括编码MRB-CAR的核酸的T细胞和/或NK细胞表达MRB-CAR且与表达个体中的同源抗原的细胞结合；及
b.向个体施用呈有效量的药用试剂以增加血液pH和/或组织pH和/或微环境pH以调节表达MRB-CAR的T细胞和/或NK细胞与表达具有增加的pH的血液、组织或微环境中的同源抗原的细胞的结合。
在另一方面中，本文中提供一种药用试剂以供在用于靶向减轻个体中的肿瘤毒性的方法中使用，其中该方法包括：
a.将编码受微环境限制的生物嵌合抗原受体(MRB-CAR)的核酸引入至个体的T细胞和/或NK细胞中，以产生能够表达MRB-CAR的T细胞和/或NK细胞；
b.将能够表达MRB-CAR的T细胞和/或NK细胞引入至个体中，其中在引入之后，包括编码MRB-CAR的核酸的T细胞和/或NK细胞表达MRB-CAR且与表达个体中的同源抗原的细胞结合；及
c.向个体施用呈充足量的药用试剂以增加血液pH和/或组织pH和/或微环境pH以调节MRB-CAR与具有增加的pH的血液、组织和/或微环境中的其同源抗原的结合，从而靶向减轻个体中的肿瘤毒性。
在另一方面中，本文中提供一种药用试剂以供在用于控制表达受微环境限制的生物嵌合抗原受体(MRB-CAR)的T细胞和/或NK细胞与靶标哺乳动物细胞的结合的方法中使用，以供治疗肿瘤生长，其中该方法包括：
a.使靶标哺乳动物细胞与表达微环境中的MRB-CAR的T细胞和/或NK细胞接触，其中靶标哺乳动物细胞表达同源抗原，且如相比于在pH 7.4下，T细胞和/或NK细胞表达在pH6.7下有差异地与同源抗原结合的MRB-CAR；及
b.通过将呈充足量的药用试剂引入至微环境来增加微环境的pH，从而控制表达MRB-CAR的T细胞和/或NK细胞与靶标哺乳动物细胞的结合。
在另一方面中，本文中提供一种药用试剂以供在用于控制表达受微环境限制的生物嵌合抗原受体(MRB-CAR)的T细胞和/或NK细胞与个体中的靶标哺乳动物细胞在活体内的结合的方法中使用，以供治疗肿瘤生长，其中该药用试剂为pH调节药用试剂，且其中该方法包括经由增加个体内的微环境的pH的有效给药方案向个体施用pH调节药用试剂，其中个体包括表达MRB-CAR的T细胞和/或NK细胞，其中如相比于在pH 7.4下，MRB-CAR在pH 6.7下有差异地与其同源抗原结合，其中微环境包括靶标哺乳动物细胞，其中靶标哺乳动物细胞在其表面上表达同源抗原，且其中T细胞和/或NK细胞在增加微环境的pH之前相比于之后有差异地与靶标哺乳动物细胞结合。
在另一方面中，本文中提供一种pH调节药用试剂以供在用于控制表达受微环境限制的生物嵌合抗原受体(MRB-CAR)的T细胞和/或NK细胞与个体中的靶标哺乳动物细胞在活体内的结合的方法中使用，以供治疗肿瘤生长，其中该方法包括经由增加个体内的微环境的pH的有效给药方案向个体施用pH调节药用试剂，其中个体包括表达MRB-CAR的T细胞和/或NK细胞，其中如相比于在pH 7.4下，MRB-CAR在pH 6.7下有差异地与其同源抗原结合，其中微环境包括靶标哺乳动物细胞，其中靶标哺乳动物细胞在其表面上表达同源抗原，且其中T细胞和/或NK细胞在通过施用pH调节药用试剂增加微环境的pH之前相比于之后有差异地与靶标哺乳动物细胞结合。
在另一方面中，本文中提供一种pH调节药用试剂以供用于制造用于控制表达受微环境限制的生物嵌合抗原受体(MRB-CAR)的T细胞和/或NK细胞与个体中的靶标哺乳动物细胞在活体内的结合的药剂，其中经由增加个体内的微环境的pH的有效给药方案向个体施用pH调节药用试剂，其中个体包括表达MRB-CAR的T细胞和/或NK细胞，其中如相比于在pH 7.4下，MRB-CAR在pH 6.7下有差异地与其同源抗原结合，其中微环境包括靶标哺乳动物细胞，其中靶标哺乳动物细胞在其表面上表达同源抗原，且其中T细胞和/或NK细胞在通过施用pH调节药用试剂增加微环境的pH之前相比于之后有差异地与靶标哺乳动物细胞结合。
在本文提供的包括用于方法中的pH调节药用试剂或药用试剂及MRB-CAR或包括pH调节药用试剂及MRB-CAR的用途的方面中的任一者中，MRB-CAR可在一个pH下而非不同pH下减少与其同源抗原的结合。在针对MRB-CAR的差异性结合的说明性pH值未曾提供于广泛方面中的说明性实施例中及替代地对于代替用于这些方面的那些值的其他实施例，MRB-CAR可在较高pH下而非较低pH下减少结合。举例而言，MRB-CAR可在高于7.0、7.1、7.2、7.3、7.4或7.5的pH下而非低于6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9或7.0的pH下减少与其同源抗原的结合。在其他实施例中，MRB-CAR可在较高pH下而非较低pH下减少结合。举例而言，MRB-CAR可在低于6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9或7.0的pH下而非高于7.0、7.1、7.2、7.3、7.4或7.5的pH下减少与其同源抗原的结合。在一些说明性实施例中，相比于在pH 7.4至7.6下，MRB-CAR在6.5至6.7的pH下展现增加的结合。在其他说明性实施例中，相比于在7.4的pH下，MRB-CAR在6.7的pH下展现增加的结合。在其他实施例中，相比于在血液的pH下，MRB-CAR在肿瘤的pH下展现增加的结合。在一些实施例中，MRB-CAR可包括抗原特异性靶向区、柄及胞内活化域。在一些实施例中，MRB-CAR还可包括共刺激域。在一些实施例中，MRB-CAR可与肿瘤相关的抗原结合。
在本文提供的包括用于方法中的pH调节药用试剂或药用试剂及MRB-CAR或包括pH调节药用试剂及MRB-CAR的用途的方面中的任一者中，微环境的pH可自低于7.0的pH增加至高于7.0的pH。举例而言，pH可自低于6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9或7.0的pH增加至高于7.0、7.1、7.2、7.3或7.4的pH。在一些实施例中，MRB-CAR可在引入药用试剂之前在增加的pH下而非微环境的pH下与同源抗原结合。在某些实施例中，pH可自低于7.0增加7.1至8.0的pH、或至7.1至7.8的pH、或至7.2至7.8的pH、或至7.2至7.6的pH、或至7.3至7.6的pH、或至7.4至7.8的pH、或至7.4至7.6的pH。视施用的药用试剂的类型及剂量而定，此pH的增加可发生少于1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、12小时或24小时，或多于1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、12小时或24小时。在某些实施例中，施用药用试剂，使得pH在靶标组织(诸如肿瘤)中，及例如在靶标组织(例如，肿瘤)微环境的至少一个表面中，在靶标组织(例如，肿瘤)微环境的至少一部分中以及在说明性实施例中在整个靶标组织(例如，肿瘤)微环境中保持高于7.0、7.1、7.2、7.3、7.4或7.5；或在7.0、7.1、7.2、7.3的范围的低值端点与7.4、7.5、7.6、7.7或7.8的范围的高值端点之间。
在本文提供的包括用于方法中的pH调节药用试剂或药用试剂及MRB-CAR或包括pH调节药用试剂及MRB-CAR的用途的方面中的任一者中，微环境可为活体内微环境，诸如肿瘤、组织、非肿瘤组织、正常组织或已经历pH短暂变化的组织。举例而言，通常经历pH短暂变化的组织包括厌氧条件下的肌肉组织或经历锻炼的肌肉组织或已发炎组织或正经历发炎的组织。在包括靶标哺乳动物细胞的一些实施例中，靶标哺乳动物细胞可为肿瘤细胞或非肿瘤细胞或正常细胞。
在本文提供的包括用于方法中的pH调节药用试剂或药用试剂及MRB-CAR或包括pH调节药用试剂及MRB-CAR的用途的方面中的任一者中，药用试剂可为碳酸氢钠、参(羟甲基)胺基甲烷、碳酸氢钠及碳酸钠的等摩尔高渗溶液或质子泵抑制剂，这些质子泵抑制剂诸如艾美拉唑、艾美拉唑及萘普生、兰索拉唑、奥美拉唑及雷贝拉唑。
在本文提供的包括用于方法中的pH调节药用试剂或药用试剂及MRB-CAR或包括pH调节药用试剂及MRB-CAR的用途的方面中的任一者中，药用试剂可在用于治疗癌症、肿瘤、肿瘤生长或细胞增生性病症的方法中使用。
在另一方面中，本文中提供一种含有容器(含有复制缺陷型重组反转录病毒颗粒)及用于治疗肿瘤生长的其使用说明书的试剂盒，其中这些说明书指导用于控制T细胞和/或NK细胞与靶标哺乳动物细胞的结合的方法，在该方法中包括：
a.用在其基因组中包括在与pH 7.4相比的pH 6.7下有差异地与同源抗原结合的受微环境限制的嵌合抗原受体(MRB-CAR)的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒来转导T细胞和/或NK细胞，以产生能够表达MRB-CAR的T细胞和/或NK细胞；
b.将能够表达MRB-CAR的T细胞和/或NK细胞引入至个体中，其中在引入之后，包括编码MRB-CAR的核酸的T细胞和/或NK细胞表达MRB-CAR且与表达个体中的同源抗原的细胞结合；
c.使靶标哺乳动物细胞与微环境中的表达MRB-CAR的T细胞和/或NK细胞接触，其中靶标哺乳动物细胞表达MRB-CAR的同源抗原，且T细胞和/或NK细胞表达MRB-CAR；及
d.通过引入呈充足量的pH调节药用试剂至微环境来增加微环境的pH，从而影响靶标哺乳动物细胞与T细胞和/或NK细胞的结合。
在一些实施例中，试剂盒可进一步包括pH调节药用试剂。
在试剂盒的一些实施例中，MRB-CAR可在一个pH下而非不同pH下减少与其同源抗原的结合。在针对MRB-CAR的差异性结合的说明性pH值未曾提供于广泛方面中的说明性实施例中及替代地对于代替用于这些方面的那些值的其他实施例，MRB-CAR可在较高pH下而非较低pH下减少结合。举例而言，MRB-CAR可在高于7.0、7.1、7.2、7.3、7.4或7.5的pH下而非低于6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9或7.0的pH下减少与其同源抗原的结合。在其他实施例中，MRB-CAR可在较高pH下而非较低pH下减少结合。举例而言，MRB-CAR可在低于6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9或7.0的pH下而非高于7.0、7.1、7.2、7.3、7.4或7.5的pH下减少与其同源抗原的结合。在一些说明性实施例中，相比于在pH 7.4至7.6下，MRB-CAR在6.5至6.7的pH下展现增加的结合。在其他说明性实施例中，相比于在7.4的pH下，MRB-CAR在6.7的pH下展现增加的结合。在其他实施例中，相比于在血液的pH下，MRB-CAR在肿瘤的pH下展现增加的结合。在一些实施例中，MRB-CAR可包括抗原特异性靶向区、柄及胞内活化域。在一些实施例中，MRB-CAR还可包括共刺激域。在一些实施例中，MRB-CAR可与肿瘤相关的抗原结合。
在试剂盒的一些实施例中，微环境的pH可自低于7.0的pH增加至高于7.0的pH。举例而言，pH可自低于6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9或7.0的pH增加至高于7.0、7.1、7.2、7.3或7.4的pH。在一些实施例中，MRB-CAR可在引入药用试剂之前在增加的pH下而非微环境的pH下与同源抗原结合。在某些实施例中，pH可自低于7.0增加7.1至8.0的pH、或至7.1至7.8的pH、或至7.2至7.8的pH、或至7.2至7.6的pH、或至7.3至7.6的pH、或至7.4至7.8的pH、或至7.4至7.6的pH。视施用的药用试剂的类型及剂量而定，此pH的增加可发生少于1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、12小时或24小时，或多于1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、12小时或24小时。在某些实施例中，施用药用试剂，使得pH在靶标组织(诸如肿瘤)中，及例如在靶标组织(例如，肿瘤)微环境的至少一个表面中，在靶标组织(例如，肿瘤)微环境的至少一部分中以及在说明性实施例中在整个靶标组织(例如，肿瘤)微环境中保持高于7.0、7.1、7.2、7.3、7.4或7.5；或在7.0、7.1、7.2、7.3的范围的低值端点与7.4、7.5、7.6、7.7或7.8的范围的高值端点之间。在一些实施例中，微环境可为活体内微环境，诸如肿瘤、组织、非肿瘤组织、正常组织或已经历pH短暂变化的组织。举例而言，通常经历pH短暂变化的组织包括厌氧条件中的肌肉组织或经历锻炼的肌肉组织或已发炎组织或正经历发炎的组织。在包括靶标哺乳动物细胞的一些实施例中，靶标哺乳动物细胞可为肿瘤细胞或非肿瘤细胞或正常细胞。
在试剂盒的一些实施例中，药用试剂可为碳酸氢钠、参(羟甲基)胺基甲烷、碳酸氢钠及碳酸钠的等摩尔高渗溶液或质子泵抑制剂，这些质子泵抑制剂诸如艾美拉唑、艾美拉唑及萘普生、兰索拉唑、奥美拉唑及雷贝拉唑。
在一个方面中，本文中提供一种在其基因组中包含多核苷酸的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒，该多核苷酸包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一种或多种核酸序列，其中：
a.一种或多种核酸序列的第一核酸序列编码针对一个或多个RNA靶标的一个或多个(例如，两个或更多个)抑制性RNA分子，及
b.该一种或多种核酸序列的第二核酸序列编码嵌合抗原受体(CAR)，该嵌合抗原受体包含抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域及胞内活化域。
在本文中的另一方面中提供一种包含复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的可包装RNA基因组的哺乳动物包装细胞系，其中该可包装RNA基因组包含：
a.5’长末端重复或其活化片段；
b.核酸序列，其编码反转录病毒顺式作用RNA包装组件；
c.多核苷酸，其包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一种或多种核酸序列，其中一种或多种核酸的第一核酸序列编码针对一个或多个RNA靶标的一个或多个(例如，两个或更多个)抑制性RNA分子，且一种或多种核酸序列的第二核酸序列编码嵌合抗原受体(CAR)，该嵌合抗原受体包含抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域及胞内活化域；及
d.3’长末端重复或其活化片段。
在哺乳动物包装细胞系方面的一些实施例中，(c)的多核苷酸可在与编码反转录病毒顺式作用RNA包装组件(b)、5’长末端重复(a)和/或3’长末端重复(d)的核酸序列呈相反定向。
在哺乳动物包装细胞系方面的一些实施例中，可包装RNA基因组的表达通过在哺乳动物包装细胞系中具有活性的可诱导启动子驱动。
在哺乳动物包装细胞系方面的一些实施例中，反转录病毒顺式作用RNA包装组件可包含中央聚嘌呤段(cPPT)/中央终止序列、HIV Psi或其组合。
本文中的另一方面提供一种反转录病毒载体，其包含针对复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的可包装RNA基因组，其中该可包装RNA基因组包含：
a.5’长末端重复或其活化片段；
b.核酸序列，其编码反转录病毒顺式作用RNA包装组件；
c.多核苷酸，其包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一种或多种核酸序列，其中一种或多种核酸的第一核酸序列编码针对一个或多个RNA靶标的一个或多个(例如，两个或更多个)抑制性RNA分子，且一种或多种核酸序列的第二核酸序列编码嵌合抗原受体(CAR)，该嵌合抗原受体包含抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域及胞内活化域；及
d.3’长末端重复或其活化片段。
在反转录病毒载体方面的一些实施例中，(c)的多核苷酸可在与编码反转录病毒顺式作用RNA包装组件的核酸序列(b)、5’长末端重复(a)和/或3’长末端重复(d)相反的取向中。
在反转录病毒载体方面的一些实施例中，可包装RNA基因组的表达是由在哺乳动物包装细胞系中具有活性的可诱导启动子驱动。
在反转录病毒载体方面的一些实施例中，反转录病毒顺式作用RNA包装组件可包含中央聚嘌呤段(cPPT)/中央终止序列、HIV Psi或其组合。反转录病毒载体可视情况包括抗生素抗性基因和/或可检测标记。
在另一方面中，本文提供一种用于以基因方式修饰或转导个体的淋巴细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)或其群的方法，该方法包含使个体的淋巴细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)或其群活体外与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触，该复制缺陷型重组反转录病毒颗粒在其基因组中包含多核苷酸，该多核苷酸包含可操作地连接至在淋巴细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)中具有活性的启动子的一种或多种核酸序列，其中该一种或多种核酸序列的第一核酸序列编码针对一个或多个RNA靶标的一个或多个(例如，两个或更多个)抑制性RNA分子，且该一种或多种核酸序列的第二核酸序列编码嵌合抗原受体(CAR)，该嵌合抗原受体包含抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域及胞内活化域，其中该接触有助于利用复制缺陷型重组反转录病毒颗粒基因修饰和/或转导淋巴细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)或淋巴细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)中的至少一些，从而产生经基因方式修饰和/或转导的淋巴细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)。
在紧接着上文提供的方法的一些实施例中，将经基因方式修饰和/或转导的淋巴细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)或其群引入至个体中。在一些实施例中，经基因方式修饰和/或转导的淋巴细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)或其群体在被引入或再次引入至个体中之前活体外经历4次或更少细胞分裂。在一些实施例中，淋巴细胞为与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触1小时与12小时之间的静息T细胞和/或静息NK细胞。在一些实施例中，自个体收集血液的时间与将经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞再引入至个体中的时间之间不超过8小时。在一些实施例中，在收集血液之后及再引入血液之前的所有步骤均在封闭系统中进行，在整个处理期间人监测该封闭系统。
在另一方面中，本文中提供一种经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞，其包含：
a.针对一个或多个RNA靶标一个或多个(例如，两个或更多个)抑制性RNA分子；及
b.嵌合抗原受体(CAR)，其包含抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域及胞内活化域，其中该一个或多个(例如，两个或更多个)抑制性RNA分子及CAR由T细胞和/或NK细胞的基因修饰的核酸序列编码。
在经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞方面的一些实施例中，经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞还包含不为抑制性RNA分子的至少一个淋巴增生性组件，其中该淋巴增生性组件由T细胞和/或NK细胞的基因修饰的核酸编码。在一些实施例中，抑制性RNA分子、CAR和/或至少一个淋巴增生性组件以多顺反子物质表达。在说明性实施例中，抑制性RNA分子由单个多顺反子转录物表达。
在另一方面中本文提供一种复制缺陷型重组反转录病毒颗粒以供在用于以基因方式修饰个体的淋巴细胞的方法中使用，以供治疗肿瘤生长，其中复制缺陷型重组反转录病毒颗粒在其基因组中包含多核苷酸，该多核苷酸包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一种或多种核酸序列，其中一种或多种核酸序列的第一核酸序列编码针对一个或多个RNA靶标的一个或多个(例如，两个或更多个)抑制性RNA分子，且一种或多种核酸序列的第二核酸序列编码嵌合抗原受体(CAR)，该嵌合抗原受体包含抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域及胞内活化域，其中该方法包含活体外接触个体的T细胞和/或NK细胞，且该接触有助于利用复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转导静息T细胞和/或NK细胞中的至少一些，从而产生经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞。
在紧接着上文提供的用于以基因方式修饰个体方面的淋巴细胞的方法中，在一些实施例中，将药用试剂用于该方法中，其进一步包括将经基因方式工程化的T细胞和/或NK细胞引入至个体中。
在另一方面中本文提供一种复制缺陷型重组反转录病毒颗粒以供在用于以基因方式修饰个体的T细胞和/或NK细胞的方法中使用，以供治疗肿瘤生长，其中该方法包含：
a.使个体的T细胞和/或NK细胞活体外与在其基因组中包含多核苷酸的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触，该多核苷酸包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一种或多种核酸序列，其中一种或多种核酸序列的第一核酸序列编码针对一个或多个RNA靶标的一个或多个(例如，两个或更多个)抑制性RNA分子，且一种或多种核酸序列的第二核酸序列编码嵌合抗原受体(CAR)，该嵌合抗原受体包含抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域及胞内活化域，其中该接触有助于利用复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转导静息T细胞和/或NK细胞中的至少一些，从而产生经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞；及
b.将经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞引入至个体中，从而以基因方式修饰个体的T细胞和/或NK细胞。
在紧接着上文提供的方面中，在一些实施例中，T细胞和/或NK细胞的群体在接触步骤中接触，且在引入步骤中引入至个体中。
在另一方面中本文提供复制缺陷型重组反转录病毒颗粒在制造用于以基因方式修饰个体的T细胞和/或NK细胞的试剂盒中的用途，其中该试剂盒的用途包含：
1.使个体的T细胞和/或NK细胞活体外与在其基因组中包含多核苷酸的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触，该多核苷酸包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一种或多种核酸序列，其中一种或多种核酸序列的第一核酸序列编码针对一个或多个靶标的一个或多个(例如，两个或更多个)抑制性RNA分子，且一种或多种核酸序列的第二核酸序列编码嵌合抗原受体(CAR)，该嵌合抗原受体包含抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域及胞内活化域，其中该接触有助于利用复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转导静息T细胞和/或NK细胞中的至少一些，从而产生经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞；及
2.将经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞引入至个体中，从而以基因方式修饰个体的T细胞和/或NK细胞。
在另一方面中本文提供复制缺陷型重组反转录病毒颗粒在制造用于以基因方式修饰个体的T细胞和/或NK细胞的药剂中的用途，其中该药剂的用途包含：
A)使个体的T细胞和/或NK细胞活体外与在其基因组中包含多核苷酸的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触，该多核苷酸包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一种或多种核酸序列，其中一种或多种核酸序列的第一核酸序列编码针对一个或多个靶标的一个或多个(例如，两个或更多个)抑制性RNA分子，且一种或多种核酸序列的第二核酸序列编码嵌合抗原受体(CAR)，该嵌合抗原受体包含抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域及胞内活化域，其中该接触有助于利用复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转导静息T细胞和/或NK细胞中的至少一些，从而产生经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞；及
B)将经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞引入至个体中，从而以基因方式修饰个体的T细胞和/或NK细胞。
在另一方面中本文提供一种含有复制缺陷型重组反转录病毒颗粒及用以以治疗个体中的肿瘤生长的其使用说明书的商用容器，其中复制缺陷型重组反转录病毒颗粒在其基因组中包含多核苷酸，该多核苷酸包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一种或多种核酸序列，其中一种或多种核酸序列的第一核酸序列编码针对一个或多个RNA靶标的一个或多个(例如，两个或更多个)抑制性RNA分子，且一种或多种核酸序列的第二核酸序列编码嵌合抗原受体(CAR)，该嵌合抗原受体包含抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域及胞内活化域。
在一些实施例中，在商用容器的方面中，该说明书指导使用者活体外接触个体的T细胞和/或NK细胞，以有助于利用复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转导个体的至少一个静息T细胞和/或NK细胞，从而产生经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞。
在本文提供的包括多核苷酸(包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一种或多种核酸序列)的方面中的任一者中，其中一种或多种核酸序列的第一核酸序列编码针对一个或多个RNA靶标的一个或多个(例如，两个或更多个)抑制性RNA分子，且一种或多种核酸序列的第二核酸序列编码嵌合抗原受体(CAR)，该嵌合抗原受体包含抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域及胞内活化域，该多核苷酸可进一步包括第三核酸序列，该第三核酸序列编码不为抑制性RNA分子的至少一个淋巴增生性组件。在一些实施例中，淋巴增生性组件可为细胞因子或细胞因子受体多肽，或其包含信号传导域的片段。在一些实施例中，淋巴增生性组件为组成性活性。在某些实施例中，淋巴增生性组件可为IL-7受体或其片段。在说明性实施例中，淋巴增生性组件可为组成性活性IL-7受体或其组成性活性片段。
在本文提供的包括多核苷酸(包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一种或多种核酸序列)的方面中的任一者中，其中一种或多种核酸序列的第一核酸序列编码针对一个或多个RNA靶标的一个或多个(例如，两个或更多个)抑制性RNA分子，抑制性RNA分子在一些实施例中可包括与彼此部分或完全互补的5’链及3’链，其中该5’链及该3’链能够形成18至25个核苷酸RNA双螺旋。在一些实施例中，5’链长度可为18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸，且3’链长度可为18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸。在一些实施例中，5’链及3’链长度可相同或不同。在一些实施例中，RNA双螺旋可包括一个或多个错配。在替代实施例中，RNA双螺旋不具有错配。
在本文提供的包括多核苷酸(包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一种或多种核酸序列)的方面中的任一者中，其中一种或多种核酸序列的第一核酸序列编码针对一个或多个RNA靶标的一个或多个(例如，两个或更多个)抑制性RNA分子，抑制性RNA分子可为miRNA或shRNA。在一些实施例中，抑制性分子可为miRNA的前体，诸如Pri-miRNA或前miRNA，或shRNA的前体。在一些实施例中，抑制性分子可为人工衍生的miRNA或shRNA。在其他实施例中，抑制性RNA分子可为经处理成siRNA的dsRNA(经转录或人工引入)或siRNA本身。在一些实施例中，抑制性RNA分子可为miRNA或shRNA，其具有在自然界中未发现的序列，或具有在自然界中未发现的至少一个功能性区段，或具有在自然界中未发现的功能性区段的组合。在说明性实施例中，抑制性RNA分子中的至少一者或全部为miR-155。
在本文提供的包括多核苷酸(包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一种或多种核酸序列)的方面中的任一者中，其中一种或多种核酸序列的第一核酸序列编码针对一个或多个RNA靶标的一个或多个(例如，两个或更多个)抑制性RNA分子，在一些实施例中，抑制性RNA分子可自5’至3’取向包含：5’臂、5’茎、环、与该5’茎部分或完全互补的3’茎，及3’臂。在一些实施例中，两个或更多个抑制性RNA分子中的至少一者具有此排列。在其他实施例中，两个或更多个抑制性RNA分子的全部均具有此排列。在一些实施例中，5’茎长度可为18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸。在一些实施例中，3’茎长度可为18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸。在一些实施例中，环长度可为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸。在一些实施例中，5’臂、3’臂或两者均衍生自天然存在的miRNA。在一些实施例中，5’臂、3’臂或两者均衍生自天然存在的miRNA，该天然存在的miRNA选自以下组成的群：miR-155、miR-30、miR-17-92、miR-122及miR-21。在说明性实施例中，5’臂、3’臂或两者衍生自miR-155。在一些实施例中，5’臂、3’臂或两者衍生自小家鼠(Musmusculus)miR-155或智人(Homo sapiens)miR-155。在一些实施例中，5’臂具有阐述于SEQID NO:256中的序列或为其功能性变体，诸如长度与SEQ ID NO:256相同，或SEQ ID NO:256长度的95％、90％、85％、80％、75％或50％或为100个核苷酸或更少、95个核苷酸或更少、90个核苷酸或更少、85个核苷酸或更少、80个核苷酸或更少、75个核苷酸或更少、70个核苷酸或更少、65个核苷酸或更少、60个核苷酸或更少、55个核苷酸或更少、50个核苷酸或更少、45个核苷酸或更少、40个核苷酸或更少、35个核苷酸或更少、30个核苷酸或更少或25个核苷酸或更少的序列；且至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％与SEQ IDNO:256一致。在一些实施例中，3’臂具有阐述于SEQ ID NO:260中的序列或为其功能性变体，诸如长度与SEQ ID NO:260相同，或SEQ ID NO:260长度的95％、90％、85％、80％、75％或50％或为100个核苷酸或更少、95个核苷酸或更少、90个核苷酸或更少、85个核苷酸或更少、80个核苷酸或更少、75个核苷酸或更少、70个核苷酸或更少、65个核苷酸或更少、60个核苷酸或更少、55个核苷酸或更少、50个核苷酸或更少、45个核苷酸或更少、40个核苷酸或更少、35个核苷酸或更少、30个核苷酸或更少或25个核苷酸或更少的序列；且至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％与SEQ ID NO:260一致。在一些实施例中，3’臂包含小家鼠BIC的核苷酸221至283。
在本文提供的包括多核苷酸(包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一种或多种核酸序列)的方面中的任一者中，其中一种或多种核酸序列的第一核酸序列编码针对一个或多个RNA靶标的两个或更多个抑制性RNA分子，在一些实施例中，两个或更多个抑制性RNA分子可连续地定位于第一核酸序列中。在一些实施例中，抑制性RNA分子可利用非功能性接头序列直接地或间接地与彼此邻接。在一些实施例中，接头序列长度可在5个与120个核苷酸之间，或长度在10个与40个核苷酸之间。
在本文提供的包括多核苷酸(包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一种或多种核酸序列)的方面中的任一者中，其中一种或多种核酸序列的第一核酸序列编码针对一个或多个RNA靶标的两个或更多个抑制性RNA分子，在一些实施例中，第一核酸序列编码两个至四个抑制性RNA分子。在说明性实施例中，第一核酸序列中包括2个与10个之间、2个与8个之间、2个与6个之间、2个与5个之间、2个与4个之间、3个与5个之间或3个与6个之间的抑制性RNA分子。在一说明性实施例中，第一核酸序列中包括四个抑制性RNA分子。
在本文提供的包括多核苷酸(包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一种或多种核酸序列)的方面中的任一者中，其中一种或多种核酸序列的第一核酸序列编码针对一个或多个RNA靶标的一个或多个(例如，两个或更多个)抑制性RNA分子，该一个或多个(例如，两个或更多个)抑制性RNA分子可在内含子中。在一些实施例中，内含子在启动子中。在说明性实施例中，内含子为EF-1α内含子A。在一些实施例中，内含子邻近启动子且在启动子的下游，在说明性实施例中，该内含子在用于产生复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的包装细胞中为无活性的。
在本文提供的包括多核苷酸(包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一种或多种核酸序列)的方面中的任一者中，其中一种或多种核酸序列的第一核酸序列编码针对一个或多个RNA靶标的两个或更多个抑制性RNA分子，在一些实施例中，该两个或更多个抑制性RNA分子可针对不同靶标。在一替代实施例中，两个或更多个抑制性RNA分子针对同一靶标。在一些实施例中，RNA靶标为自由T细胞表达的基因转录的mRNA，这些mRNA诸如(但不限于)：PD-1(防止失活)；CTLA4(防止失活)；TCRa(安全地防止自体免疫)；TCRb(安全-防止自体免疫)；CD3Z(安全-防止自体免疫)；SOCS1(防止失活)；SMAD2(防止失活)；miR-155靶标(促进活化)；IFNγ(减少CRS)；cCBL(延长信号传导)；TRAIL2(防止死亡)；PP2A(延长信号传导)；ABCG1(通过限制胆固醇的清除来增加胆固醇微含量)。在一些实施例中，RNA靶标为自编码T细胞受体(TCR)复合物的组分的基因转录的mRNA。在一些实施例中，两个或更多个抑制性RNA分子中的至少一者可减少T细胞受体(在说明性实施例中，T细胞的一个或多个内源性T细胞受体)的表达。在某些实施例中，RNA靶标可为自T细胞的内源性TCRα或TCRβ基因转录的mRNA，该T细胞的基因组包含编码一个或多个miRNA的第一核酸序列。在说明性实施例中，RNA靶标为自TCRα基因转录的mRNA。
在本文提供的包括多核苷酸(包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一种或多种核酸序列)的方面中的任一者中，其中一种或多种核酸序列的第一核酸序列编码针对一个或多个RNA靶标的一个或多个(例如，两个或更多个)抑制性RNA分子，且一种或多种核酸序列的第二核酸序列编码嵌合抗原受体(CAR)，该嵌合抗原受体包含抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域及胞内活化域，在一些实施例中，CAR为受微环境限制的生物(MRB)-CAR。在其他实施例中，CAR的ASTR与肿瘤相关的抗原结合。在其他实施例中，CAR的ASTR为微环境受限的生物(MRB)-ASTR。
在本文提供的包括多核苷酸(包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一种或多种核酸序列)的方面中的任一者中，其中一种或多种核酸序列的第一核酸序列编码针对一个或多个RNA靶标的一个或多个(例如，两个或更多个)抑制性RNA分子，且一种或多种核酸序列的第二核酸序列编码嵌合抗原受体(CAR)，该嵌合抗原受体包含抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域及胞内活化域，且在一些情况下，编码至少一个淋巴增生性组件的一种或多种核酸序列的第三核酸序列不为抑制性RNA分子，在一些实施例中，第一核酸序列、第二核酸序列及第三核酸序列中的任一者或全部可操作地连接至核糖开关。在一些实施例中，核糖开关能够结合核苷类似物。在一些实施例中，核苷类似物为抗病毒药物。
在本文提供的包括复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的方面中的任一者中，在一些实施例中，复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包含在其表面上的假型组件，该假型组件能够与T细胞和/或NK细胞结合且有助于与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒膜融合。在一些实施例中，假型组件可为麻疹病毒F多肽、麻疹病毒H多肽、VSV-G多肽，或保留与静息T细胞和/或静息NK细胞结合的能力的任何其片段。在说明性实施例中，假型组件为VSV-G。
在本文提供的包括复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的方面中的任一者中，在一些实施例中，复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包含在其表面上的活化组件，该活化组件包含能够与CD3结合的膜结合多肽，和/或能够与CD28结合的膜结合多肽。在一些实施例中，能够与CD3结合的膜结合多肽与异源性GPI锚定连接序列融合，和/或能够与CD28结合的膜结合多肽与异源性GPI锚定连接序列融合。在一些实施例中，能够与CD3结合的膜结合多肽为抗CD3 scFV或抗CD3 scFvFc。在说明性实施例中，能够与CD3结合的膜结合多肽为抗CD3scFvFc。在说明性实施例中，能够与CD28结合的膜结合多肽为CD80，或与CD16B GPI锚定连接序列结合的其胞外细胞域。
在本文提供的包括复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的方面中的任一者中，在一些实施例中，复制缺陷型重组反转录病毒颗粒在其表面上包含核酸，该核酸编码由经生物验证的单克隆抗体识别的域。
在下文提供的包括促进PBMC(例如B细胞、T细胞和/或NK细胞)的细胞增生的嵌合多肽的方面中，嵌合多肽可在本文中称为嵌合淋巴增生性组件(CLE)。在下文中提供的包括编码CLE及CAR的核酸序列的实施例在本文中称为CLE CAR多核苷酸实施例。
在本文中提供的包括淋巴增生性组件的方面及实施例中的任一者的实施例及子实施例(包括在本节上述段落中的那些)中，淋巴增生性组件可为本文中提供的嵌合淋巴增生性组件中的任一者，包括在本节的下文中。在本文中的包括CAR的方面及实施例中的任一者的其他实施例及子实施例中，淋巴增生性组件在说明性实施例中为由本文所提供的CLECAR多核苷酸(及相关多肽)实施例中的核酸编码的嵌合淋巴增生性组件中的任一者，例如在本节的下文中所阐述。
在一个方面中，本文提供包含一种或多种核酸序列的经分离的多核苷酸，其中：
该一种或多种核酸序列的第一核酸序列编码在胺基至羧基取向中包含以下的嵌合多肽，
a)来自细胞因子受体或激素受体的胞外域及跨膜域，其中胞外域及跨膜域中的至少一者包含
a在细胞因子受体的组成性活性突变体上发现的突变，且其中胞外序列不结合细胞因子受体的配位体，或
b来自LMP1的胞外域及跨膜域；及
b)第一胞内域，其选自具有在表7-10中识别的所选多肽的第一胞内域的基因的胞内域，其中该嵌合多肽促进B细胞、T细胞和/或NK细胞的细胞增生。
在紧接着上文段落中的方面的一个实施例中，第一核酸序列进一步编码第二胞内域，其中该第二胞内域可在第一胞内域的上游(亦即5’)处，或在说明性实施例中第二胞内域在第一胞内域的下游处。在此实施例的子实施例中，第一胞内域及第二胞内域组合包含所选择多肽的第一胞内域及第二胞内域组合。因此，为了清楚起见，在非限制例示性实施例中，所选择的多肽为M008-S212-S075。在此实施例中，嵌合多肽的第一胞内域包含或即为TNFRSF8转录变体1(NM_001243_4)(S212)且第二多肽包含或即为FCGR2C(NM_201563_5)(S075)。
在此方面的一个实施例中，嵌合多肽包含所选择多肽的跨膜域、第一胞内域及第二胞内域。在此方面的一个实施例中，嵌合多肽包含所选择多肽的胞外域及跨膜域、第一胞内域及第二胞内域。因此，为了清楚起见，在非限制例示性实施例中，所选择的多肽为M008-S212-S075。在此实施例中，嵌合多肽的胞外域及跨膜域包含或即为Myc LMP1(NC_007605_1)(M008)，嵌合多肽的第一胞内域包含或即为TNFRSF8转录变体1(NM_001243_4)(S212)，且嵌合多肽的第二胞内域包含或即为FCGR2C(NM_201563_5)(S075)。在一相关子实施例中，嵌合多肽包含所选择多肽的胞外及跨膜域、第一胞内域及第二胞内域，除了胞外域及跨膜域视情况包含识别域或消除域，或不包含识别域或消除域。在一相关子实施例中，嵌合多肽包含所选择多肽的胞外域及跨膜域、第一胞内域及第二胞内域，除了胞外域及跨膜域以外包含所选择多肽的识别或消除域，或另一清除标签。在上述段落中提供的方面的另一实施例中，第一胞内域及第二胞内域组合包含所选择多肽的第一胞内域及在表7-10中的任何候选多肽的第二胞内域中识别的任何基因的任何胞内域。
在此方面的另一实施例中，多核苷酸进一步包含编码嵌合抗原受体(CAR)的第二核酸序列，该嵌合抗原受体包含抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域及胞内活化域。在此方面的一子实施例中，第一胞内域及第二胞内域组合为所选择多肽的第一胞内域及第二胞内域组合，且所选择多肽经识别在表7-10中。在此实施例的另一子实施例中，嵌合多肽包含所选择多肽的胞外域及跨膜域、第一胞内域及第二胞内域，且所选择多肽识别在表7-10中。在一相关子实施例中，嵌合多肽包含所选择多肽的胞外域及跨膜域、第一胞内域及第二胞内域，除了胞外域及跨膜域视情况包含识别或消除域，且其中该识别或消除域为所选择多肽的胞外域的识别或消除域，或其他识别或消除域，且其中所选择多肽经识别在表7-10中。
在另一方面中，本文提供包含一种或多种核酸序列的经分离多核苷酸，其中：
该一种或多种核酸序列的第一核酸序列编码在胺基至羧基取向中包含以下的嵌合多肽，
a)来自细胞因子受体或激素的胞外域及跨膜域，其中胞外域及跨膜域中的至少一者包含
c在细胞因子受体的组成性活性突变体上发现的突变，且其中胞外序列不结合细胞因子受体的配位体，或
d来自LMP1的胞外域及跨膜域；及
b)第一胞内域，其选自CD3D、CD3E、CD8A、CD27、CD40、CD79B、IFNAR1、IL2RA、IL3RA、IL13RA2、TNFRSF8、TNFRSF9、IL31RA或MyD88的胞内域，其中该嵌合多肽促进PBMC，在说明性实施例中B细胞、T细胞和/或NK细胞的细胞增生。
在紧接着上文段落中的方面的一个实施例中，第一核酸序列进一步编码第二胞内域，其中该第二胞内域可在第一胞内域的上游(亦即5’)处，或在说明性实施例中第二胞内域在第一胞内域的下游处。在此实施例的一子实施例中，第二胞内域来自在实施例17的任一表中识别为在第35天对比第7天产生高于0、1或2的富集的所选择多肽中的第二胞内域的基因，其中该第一胞内域来自所选择多肽的第一胞内域的基因。在此子实施例或实施例的另一子实施例中，第一胞内域及第二胞内域组合为来自在实施例17的任一表中识别为在第35天对比第7天产生高于0、1或2的富集的所选择多肽的第一胞内域及第二胞内域。在此段落中的实施例或子实施例的另一实施例中，第一胞内域来自表7-10中所选择多肽的所选择第一胞内域的第一基因且第二胞内域来自所选择多肽的所选择第二胞内域的第二基因。在此段落中的实施例或子实施例的另一实施例中，第一胞内域来自表7-10中的所选择多肽且第二胞内域来自标7-10中的所选择多肽。
在其中第一核酸序列进一步编码第二胞内域的紧接着上文实施例的另一子实施例中，第二胞内域选自在实施例17中的任一表中识别为针对相应的第一胞内域在第35天对比第7天产生高于0、1或2的富集的第二胞内域。在这些实施例的子实施例中，第一胞内域选自CD27、CD40或CD79B的胞内域。在此实施例的其他子实施例中，第一胞内域选自在实施例17的任一表中识别为在第35天对比第7天产生高于0、1或2的富集的CD3D、CD3E、CD8A、CD27、CD40、CD79B、IFNAR1、IL2RA、IL3RA、IL13RA2、TNFRSF8、TNFRSF9、IL31RA或MyD88的胞内域。在此段落中的实施例或子实施例的另一实施例中，第一胞内域来自表7-10中所选择的嵌合多肽的第一基因且第二胞内域来自表7-10中所选择的嵌合多肽的第二基因。在此段落中的实施例或子实施例的另一实施例中，第一胞内域来自表7-10中所选择嵌合多肽的第一基因且第二胞内域来自CD3D、CD3G、CD8A、CD8B、CD27、CD40、CD79B、CRLF2、FCGR2C、ICOS、IL2RA、IL13RA1、IL13RA2、IL15RA、TNFRSF9及TNFRSF18的胞内域。在此段落中的实施例或子实施例的另一实施例中，第一胞内域来自在表7-10中识别的所选择多肽且第二胞内域来自在表7-10中识别的所选择多肽。在一相关子实施例中，嵌合多肽包含所选择多肽的胞外域及跨膜域、第一胞内域及第二胞内域，除了胞外域及跨膜域视情况包含清除标签，或不包含清除标签，且其中所选择多肽识别在表7-10中。在一相关子实施例中，嵌合多肽包含所选择多肽的胞外域及跨膜域、第一胞内域及第二胞内域，除了胞外域及跨膜域包含所选择多肽的识别或消除域，或其他识别或消除域，且其中所选择多肽识别在表7-10中。
在此方面的另一实施例中，第一胞内域选择CD3D、CD3E、CD8A、CD27、CD40、CD79B、IFNAR1、IL2RA、IL3RA、IL13RA2、TNFRSF8或TNFRSF9的胞内域，多核苷酸进一步包含编码嵌合抗原受体(CAR)的第二核酸序列，该嵌合抗原受体包含抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域及胞内活化域。在此方面的一子实施例中，第一胞内域来自所选择多肽的第一胞内域的基因且第二胞内域来自所选择多肽的第二胞内域的基因，且所选择多肽经识别在表7-10中。在此方面的一子实施例中，第一胞内域及第二胞内域组合为所选择多肽的第一胞内域及第二胞内域组合，且所选择多肽经识别在表7-10中。在此实施例的一子实施例中，嵌合多肽包含所选择多肽的胞外域及跨膜域、第一胞内域及第二胞内域，且所选择多肽经识别在表7-10中。在一相关子实施例中，嵌合多肽包含所选择多肽的胞外及跨膜域、第一胞内域及第二胞内域，除了胞外域及跨膜域视情况包含识别或消除域，且其中该识别或消除域为所选择多肽的胞外域的识别或消除域，或其他识别或消除域，且其中所选择多肽经识别在表7-10中。
在另一方面中，本文提供包含一种或多种核酸序列的经分离多核苷酸，其中：
该一种或多种核酸序列的第一核酸序列编码在胺基至羧基取向中包含以下的嵌合多肽，
(a)来自细胞因子受体或激素的胞外域及跨膜域，其中胞外域及跨膜域中的至少一者包含
i.在细胞因子受体的组成性活性突变体上发现的突变，且其中胞外序列不结合细胞因子受体的配位体，或
ii.来自LMP1的胞外域及跨膜域；及
(b)第一胞内域，其选自CD3D、CD3G、CD8A、CD8B、CD27、CD40、CD79B、CRLF2、FCGR2C、ICOS、IL2RA、IL13RA1、IL13RA2、IL15RA、TNFRSF9及TNFRSF18的胞内域，其中该嵌合多肽促进PBMC，且在说明性实施例中B细胞、T细胞和/或NK细胞的细胞增生。
在实施例17中，在紧接着上述方面中所述的胞内域识别为值得注意的第二胞内域。然而应当理解，在一些实施例中，识别为值得注意的第二胞内域的胞内域为这些实施例的嵌合多肽的第一胞内域。
在另一方面中，本文提供包含一种或多种核酸序列的经分离多核苷酸，其中：
该一种或多种核酸序列的第一核酸序列编码在胺基至羧基取向中包含以下的嵌合多肽，
a)来自细胞因子受体或激素的胞外域及跨膜域，其中胞外域及跨膜域中的至少一者包含
a.在细胞因子受体的组成性活性突变体上发现的突变，且其中胞外序列不结合细胞因子受体的配位体，或
b.来自LMP1的胞外域及跨膜域；及
b)第一胞内域，其选自CD3D、CD3E、CD8A、CD27、CD40、CD79B、IFNAR1、IL2RA、IL3RA、IL13RA2、TNFRSF8、TNFRSF9、IL31RA或MyD88的胞内域，
其中该嵌合多肽促进PBMC，且在说明性实施例中B细胞、T细胞和/或NK细胞的细胞增生，且其中胞外域及跨膜域选自IL7RA Ins PPCL、LMP1、CRLF2 F232C、CSF2RB V449E、CSF3R T640N、EPOR L251C I252C、GHR E260C I270C、IL27RA F523C及MPL S505N的胞外域及跨膜域。
在上述关于编码嵌合多肽的多核苷酸的方面中的任一者的某些实施例中，其中该嵌合多肽促进PBMC，且在说明性实施例中B细胞、T细胞和/或NK细胞的细胞增生，胞外域及跨膜域选自CSF3R T640N及MPL S505N。在说明性实施例中，胞外域及跨膜域来自CSF3RT640N且在某些实施例中，分离的多核苷酸不包含CAR。在某些子实施例中，胞外域及跨膜域为表6中所提供的CSF3R T640N，但识别域及消除域为可选的。在某些实施例中，第一胞内域及第二胞内域来自本文中的包括所述胞内域及胞外域及所述第一胞内域的实施例17及表中所提供的多肽中的任一者。在其他子实施例中，胞外域及胞内域来自MPL S505N，且在某些实施例中，表6中提供的MPL S505N的除识别域及消除域以外的胞外域及跨膜域为可选的。
在另一方面中，本文提供包含一种或多种核酸序列的经分离多核苷酸，其中：
该一种或多种核酸序列的第一核酸序列编码在胺基至羧基取向中包含以下的嵌合多肽，
a)来自I型跨膜蛋白的跨膜域；及
b)第一胞内域，其选自具有在表11-16中识别的所选择多肽的第一胞内域的基因的胞内域，其中该嵌合多肽促进B细胞、T细胞和/或NK细胞的细胞增生
且在说明性实施例中B细胞、T细胞和/或NK细胞的细胞增生。
其中该嵌合多肽促进PBMC，且在说明性实施例中B细胞、T细胞和/或NK细胞的细胞增生。如附加实施例18中所示，此类嵌合多肽能够在培养期间在PBMC不暴露于IL-2的情况下，例如在不添加IL-2至表达编码嵌合多肽的核酸的PBMC培养培养基(例如B细胞、T细胞和/或NK细胞)中的情况下促进PBMC的细胞增生。
在紧接着上文段落中的方面的一个实施例及在下文本节中的此方面的任何实施例中，第一胞内域为具有表11-16中的第一胞内域的基因的胞内域，且在其他说明性实施例中，第一50、25或10构建体中的一者列于表11-16中，且在其他说明性实施例中，第一50、25或10构建体中的一者列于表11-16中的六个表中的两者、三者、四者或五者中，或全部表中。在一个实施例中，第一胞内域为在表17中识别的胞内域。表17识别在第7天与第21天或第35天之间促进PBMC的增生的构建体，其中第二胞内域不存在于该构建体中。在此实施例的一些实施例中，嵌合多肽包含跨膜域及胞内域的组合，具有或不具有包含表17的二聚基元的胞外域。
在紧接着上文段落中的方面的一个实施例及在下文本节中的此方面的任何实施例中，第一核酸序列进一步编码胞外域，且在说明性实施例中，该胞外域包含二聚基元。在其中CLE的胞外域包含二聚基元的任何方面或实施例中，二聚基元可选自由以下组成的群：含亮氨酸拉链基元的多肽、CD69、CD71、CD72、CD96、Cd105、Cd161、Cd162、Cd249、CD271及Cd324，以及其保留二聚能力的突变体和/或活性片段。在其中CLE的胞外域包含二聚基元的方面或实施例中的任一者中，二聚基元可需要二聚剂，且二聚基元及相关二聚剂可选自由以下组成的群：FKBP及雷帕霉素或其类似物、GyrB及香豆霉素或其类似物、DHFR及甲胺喋呤或其类似物或DmrB及AP20187或其类似物，以及保留二聚能力的所述二聚蛋白的突变体和/或活性片段。
在其中CLE的胞外域包含二聚基元的任何方面或实施例的说明性实施例中，胞外域可包含亮氨酸拉链基元。在一些实施例中，亮氨酸拉链基元来自jun多肽，例如c-jun。在某些实施例中，c-jun多肽为ECD-11的c-jun多肽区。[867]在此方面的一个实施例中，第一核酸序列进一步编码第二胞内域，其中该第二胞内域可在第一胞内域的上游(亦即5’)处，或在说明性实施例中第二胞内域在第一胞内域的下游处。在此实施例的子实施例中，第一胞内域及第二胞内域组合包含所选择多肽的第一胞内域及在表11-16中的任何候选多肽的第二胞内域中识别的任何基因的任何胞内域，且在表11-16中的说明性实施例中，及在其他实施例中，第一50、25或10构建体的一者列于表11-16中，且在其他说明性实施例中，第一50、25或10构建体的一者列于表11-16中的表的两者、三者、四者或五者，或全部表中。在此实施例的子实施例中，第一胞内域及第二胞内域组合包含所选择多肽的第一胞内域及第二胞内域。
在此方面的一个实施例中，嵌合多肽包含所选择多肽的跨膜域、第一胞内域及第二胞内域。在此方面的一个实施例中，嵌合多肽包含所选择多肽的胞外及跨膜域、第一胞内域及第二胞内域，其中该胞外域视情况包含识别域或消除域。
在一相关子实施例中，嵌合多肽包含所选择多肽的胞外及跨膜域、第一胞内域及第二胞内域，除了胞外域及跨膜域视情况包含识别域或消除域，或不包含识别域或消除域。在一相关子实施例中，嵌合多肽包含所选择多肽的胞外及跨膜域、第一胞内域及第二胞内域，除了胞外域及跨膜域视情况包含所选择多肽的识别域或消除域，或另一识别域或消除域。
在此方面的另一实施例中，多核苷酸进一步包含编码嵌合抗原受体(CAR)的第二核酸序列，该嵌合抗原受体包含抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域及胞内活化域。在此方面的子实施例中，第一胞内域及第二胞内域组合为所选择多肽的第一胞内域及第二胞内域组合，且所选择多肽识别在表11-16中，且在其他实施例中，第一50、25或10构建体中的一者列于表11-16中，且在其他实施例中，第一50、25或10构建体中的一者列于表11-16中的表中的两者、三者、四者或五者，或全部表中。在此实施例的另一实施例中，嵌合多肽包含所选择多肽的胞外域及跨膜域、第一胞内域及第二胞内域，且所选择多肽识别在表11-16中，或在说明性实施例中，第一50、25或10构建体中的一者列于表11-16中，在其他实施例中，第一50、25或10构建体中的一者列于表11-16中的表的两者、三者、四者或五者，或全部表中。在一相关子实施例中，嵌合多肽包含所选择多肽的胞外域及跨膜域、第一胞内域及第二胞内域，除了胞外域及跨膜域视情况包含识别域或消除域，且其中该识别域或消除域为所选择多肽的胞外域的识别域或消除域，或另一识别域或消除域，且其中所选择多肽识别在表11-16中。
在另一方面中，本文提供包含一种或多种核酸序列的经分离多核苷酸，其中：
该一种或多种核酸序列的第一核酸序列编码在胺基至羧基取向中包含以下的嵌合多肽，
a)来自I型跨膜蛋白的跨膜域；及
b)第一胞内域，其选自LEPR、MYD88、IFNAR2、MPL、IL18R1、IL13RA2、IL10RB、IL23R或CSF2RA的胞内域，
其中该嵌合多肽促进PBMC，且在说明实施例中，B细胞、T细胞和/或NK细胞的细胞增生。
在紧接着上文段落中的方面的一个实施例及在下文本节中的此方面的任何实施例中，第一核酸序列进一步编码胞外域，且在说明性实施例中，该胞外域包含二聚基元。在此方面的说明性实施例中，胞外域包含亮氨酸拉链。在一些实施例中，亮氨酸拉链来自jun多肽，例如c-jun。在某些实施例中，c-jun多肽为ECD-11的c-jun多肽区。
在其中第一胞内域选自LEPR、MYD88、IFNAR2、MPL、IL18R1、IL13RA2、IL10RB、IL23R或CSF2RA的胞内域的此方面的另一实施例中，第一核酸序列进一步编码第二胞内域，其中第二胞内域可在第一胞内域的上游(即5’)处，或在说明性实施例中，第二胞内域在第一胞内域的下游处。在此实施例的一子实施例中，第二胞内域来自在实施例18的任一表中识别为在第21天对比第7天产生高于0、1或2的富集的所选择多肽中的第二胞内域的基因，其中该第一胞内域来自所选择多肽的第一胞内域的基因。在此子实施例或实施例的另一子实施例中，第一胞内域及第二胞内域组合为来自在实施例18的任一表中识别为在第21天对比第7天产生高于0、1或2的富集的所选择多肽的第一胞内域及第二胞内域。在此段落中的实施例或子实施例的另一实施例中，第一胞内域来自表11-16中所选择多肽的所选择第一胞内域的第一基因且第二胞内域来自所选择多肽的所选择第二胞内域的第二基因。在此段落中的实施例或子实施例的另一实施例中，第一胞内域来自表11-16中所选择多肽且第二胞内域来自所选择多肽。在此方面的另一实施例或本文中的任何实施例中，多核苷酸进一步包含编码嵌合抗原受体(CAR)的第二核酸序列，该嵌合抗原受体包含抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域及胞内活化域。
在此方面的一个实施例或紧接着前述段落中的包含第二胞内域的实施例及子实施例的一个子实施例或其他子实施例中，第一胞内域为LEPR、MYD88、IFNAR2及MPL的胞内域。在另一实施例中，第一胞内域为LEPR、IFNAR2及MPL的胞内域。在另一实施例中，第一胞内域不是MyD88。在另一实施例中，第一胞内域不是MyD88且第二胞内域不是CD40。在此段落中的此实施例的子实施例中，多核苷酸进一步包含编码嵌合抗原受体(CAR)的第二核酸序列，该嵌合抗原受体包含抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域及胞内活化域。
在本发明的此方面的一个实施例中，MPL为第一胞内域且第二胞内域来自在表11-16中识别的所选择多肽中的第二胞内域的基因。在此实施例的其他子实施例中，第一胞内域及第二胞内域组合包含来自在表11-16中识别的所选择嵌合多肽的第一胞内域及第二胞内域。在这些实施例的一些子实施例中，第一胞内域及第二胞内域的取向是相反的以使得第二域的羧基端残基与第一域或与第二域与第一域之间的间隔区结合。
在本发明的此方面的一个实施例中，LEPR为第一胞内域且第二胞内域来自在表11-16中识别的所选择多肽中的第二胞内域的基因。在此实施例的其他子实施例中，第一胞内域及第二胞内域组合包含来自在表11-16中识别的所选择嵌合多肽的第一胞内域及第二胞内域。在这些实施例的一些子实施例中，第一胞内域及第二胞内域的取向是相反的以使得第二域的羧基端残基与第一域或与第二域与第一域之间的间隔区结合。
在本发明的此方面的一个实施例中，IFNAR2为第一胞内域且第二胞内域来自在表11-16中识别的所选择多肽中的第二胞内域的基因。在此实施例的其他子实施例中，第一胞内域及第二胞内域组合包含来自在表11-16中识别的所选择嵌合多肽的第一胞内域及第二胞内域。在这些实施例的一些子实施例中，第一胞内域及第二胞内域的取向是相反的以使得第二域的羧基端残基与第一域或第二域与第一域之间的间隔区结合。
在本发明的此方面的一个实施例中，MPL为第一胞内域且第二胞内域来自在表11-16中识别的所选择多肽中的第二胞内域的基因。在此实施例的其他子实施例中，第一胞内域及第二胞内域组合包含来自在表11-16中识别的所选择嵌合多肽的第一胞内域及第二胞内域。在这些实施例的一些子实施例中，第一胞内域及第二胞内域的取向是相反的以使得第二域的羧基端残基与第一域或第二域与第一域之间的间隔区结合。
在上文其中第一胞内域选自LEPR、MYD88、IFNAR2、IL17RD、IL17RE、IL1RAP、IL23R及MPL的胞内域的经分离多核苷酸方面的一些实施例中，跨膜域选自CD40、CD8B、CRLF2、CSF2RA、GCGR2C、ICOS、IFNAR1、IFNGR1、IL10RB、IL18R1、IL18RAP、IL3RA及PRLR的跨膜域。在一些说明性实施例中，跨膜域为CD40或ICOS的跨膜域。在一些子实施例中，第一胞内域来自LEPR、MYD88、IFNAR2及MPL。举例而言，在一些实施例中，跨膜域为来自CD40的跨膜域且第一胞内域为来自MPL的胞内域。
在上文其中第一胞内域选自LEPR、MYD88、IFNAR2、IL17RD、IL17RE、IL1RAP、IL23R及MPL的胞内域的经分离多核苷酸方面的一些实施例中，第二胞内域来自CD40、CD79B或CD27。在一些子实施例中，第一胞内域来自LEPR、MYD88、IFNAR2及MPL。举例而言，在一些实施例中，第一胞内域为MPL且第二胞内域为CD40。在此段落中的所有实施例中，第一胞内域及第二胞内域在多肽上的顺序可相反。
在另一方面中，本文提供包含一种或多种核酸序列的经分离多核苷酸，其中：
该一种或多种核酸序列的第一核酸序列编码在胺基至羧基取向中包含以下的嵌合多肽，
a)来自I型跨膜蛋白的跨膜域；及
b)第一胞内域，其选自具有在表11-16中识别的所选择多肽的第一胞内域的基因的胞内域，其中该嵌合多肽促进B细胞、T细胞和/或NK细胞的细胞增生
其中该嵌合多肽促进PBMC，且在说明实施例中，B细胞、T细胞和/或NK细胞的细胞增生。在一些实施例中，NK细胞为NKT细胞。
在紧接着上文段落中的方面的一个实施例及在下文本节中的此方面的任何实施例中，第一核酸序列进一步编码胞外域，且在说明性实施例中，该胞外域包含二聚基元。在其中CLE的胞外域包含二聚基元的任何方面或实施例中，二聚基元可选自由以下组成的群：含亮氨酸拉链基元的多肽、CD69、CD71、CD72、CD96、Cd105、Cd161、Cd162、Cd249、CD271及Cd324，以及其保留二聚能力的突变体和/或活性片段。在本文中的CLE的胞外域包含二聚基元的任何方面或实施例中，二聚基元可需要二聚剂，且二聚基元及相关二聚剂可选自由以下组成的群：FKBP及雷帕霉素或其类似物、GyrB及香豆霉素或其类似物、DHFR及甲胺蝶呤或其类似物，或DmrB及AP20187或其类似物，以及保留二聚能力的所述二聚蛋白质的突变体和/或活性片段。
在本文中的CLE的胞外域包含二聚基元的任何方面或实施例的说明性实施例中，胞外域可包含亮氨酸拉链基元。在一些实施例中，亮氨酸拉链基元来自jun多肽，例如c-jun。在某些实施例中，c-jun多肽为ECD-11的c-jun多肽区。
在此方面的一个实施例中，第一核酸序列进一步编码第二胞内域，其中该第二胞内域可在第一胞内域的上游(亦即5’)处，或在说明性实施例中第二胞内域在第一胞内域的下游处。在此实施例的子实施例中，第一胞内域及第二胞内域组合包含所选择多肽的第一胞内域及在表11-16中的任何候选多肽的第二胞内域中识别的任何基因的任何胞内域。在此实施例的子实施例中，第一胞内域及第二胞内域组合包含所选择多肽的第一胞内域及第二胞内域。
在此方面的一个实施例中，嵌合多肽包含所选择多肽的跨膜域、第一胞内域及第二胞内域。在此方面的一个实施例中，嵌合多肽包含所选择多肽的胞外及跨膜域、第一胞内域及第二胞内域，其中该胞外域视情况包含识别域或消除域。
在一相关子实施例中，嵌合多肽包含所选择多肽的胞外及跨膜域、第一胞内域及第二胞内域，除了胞外域及跨膜域视情况包含识别域或消除域，或不包含识别域或消除域。在一相关子实施例中，嵌合多肽包含所选择多肽的胞外及跨膜域、第一胞内域及第二胞内域，除了胞外域及跨膜域视情况包含所选择多肽的识别域或消除域，或另一识别域或消除域。
在此方面的另一实施例中，多核苷酸进一步包含编码嵌合抗原受体(CAR)的第二核酸序列，该嵌合抗原受体包含抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域及胞内活化域。在此方面的子实施例中，第一胞内域及第二胞内域组合为所选择多肽的第一胞内域及第二胞内域组合，且所选择多肽识别在表11-16中。在此实施例的另一实施例中，嵌合多肽包含所选择多肽的胞外域及跨膜域、第一胞内域及第二胞内域，且所选择多肽识别在表11-16中。在一相关子实施例中，嵌合多肽包含所选择多肽的胞外域及跨膜域、第一胞内域及第二胞内域，除了胞外域及跨膜域视情况包含识别域或消除域，且其中该识别域或消除域为所选择多肽的胞外域的识别域或消除域，或另一识别域或消除域，且其中所选择多肽识别在表11-16中。
在另一方面中，本文提供包含一种或多种核酸序列的经分离多核苷酸，其中：
该一种或多种核酸序列的第一核酸序列编码在胺基至羧基取向中包含以下的嵌合多肽，
c)来自I型跨膜蛋白的跨膜域；及
d)第一胞内域，其选自LEPR、MYD88、IFNAR2、IL17RD、IL17RE、IL1RAP、IL23R及MPL的胞内域，
其中该嵌合多肽促进PBMC，且在说明实施例中，B细胞、T细胞和/或NK细胞的细胞增生。
在紧接着上文段落中的方面的一个实施例及在下文本节中的此方面的任何实施例中，第一核酸序列进一步编码胞外域，且在说明性实施例中，该胞外域包含二聚基元。在此方面的说明性实施例中，胞外域包含亮氨酸拉链。在一些实施例中，亮氨酸拉链来自jun多肽，例如c-jun。在某些实施例中，c-jun多肽为ECD-11的c-jun多肽区。
在其中第一胞内域选自LEPR、MYD88、IFNAR2、IL17RD、IL17RE、IL1RAP、IL23R及MPL的胞内域的此方面的另一实施例中，第一核酸序列进一步编码第二胞内域，其中第二胞内域可在第一胞内域的上游(即5’)处，或在说明性实施例中，第二胞内域在第一胞内域的下游处。在此实施例的一子实施例中，第二胞内域来自在实施例18的任一表中识别为在第21天对比第7天产生高于0、1或2的富集的所选择多肽中的第二胞内域的基因，其中该第一胞内域来自所选择多肽的第一胞内域的基因。在此子实施例或实施例的另一子实施例中，第一胞内域及第二胞内域组合为来自在实施例18的任一表中识别为在第21天对比第7天产生高于0、1或2的富集的所选择多肽的第一胞内域及第二胞内域。在此段落中的实施例或子实施例的另一实施例中，第一胞内域来自表11-16中所选择多肽的所选择第一胞内域的第一基因且第二胞内域来自所选择多肽的所选择第二胞内域的第二基因。在此段落中的实施例或子实施例的另一实施例中，第一胞内域来自表11-16中所选择多肽且第二胞内域来自所选择多肽。在此方面的另一实施例或本文中的任何实施例中，多核苷酸进一步包含编码嵌合抗原受体(CAR)的第二核酸序列，该嵌合抗原受体包含抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域及胞内活化域。
在本文中包括嵌合多肽的方法或经分离多核苷酸实施例中的任一者的某些实施例中，其中该嵌合多肽促进PBMC，且在说明性实施例中，B细胞、T细胞和/或NK细胞的细胞增生，第一和/或第二胞内域(在说明性实施例中第一胞内域)为来自LEPR、MYD88、IFNAR2、MPL、IL18R1、IL13RA2、IL10RB、IL23R或CSF2RA的胞内域。在一些实施例中，第一胞内域来自MPL。在例示性子实施例中，嵌合多肽包含包含本文中所提供的二聚基元的胞外域。
在本文中包括嵌合多肽的方法或经分离多核苷酸实施例中的任一者的某些实施例中，其中该嵌合多肽促进PBMC，且在说明性实施例中，B细胞、T细胞和/或NK细胞的细胞增生，跨膜域来自CD40、ICOS、FCGR2C、PRLR、IL3RA或IL6ST。在一些实施例中，跨膜域来自CD40或ICOS。在例示性子实施例中，嵌合多肽包含包含本文中所提供的二聚基元的胞外域。
在本文中包括嵌合多肽的方法或经分离多核苷酸实施例中的任一者的某些实施例中，其中该嵌合多肽促进PBMC，且在说明性实施例中，B细胞、T细胞和/或NK细胞的细胞增生，第一和/或第二胞内域(在说明性实施例中第一胞内域)为来自CD40、CD79B、TNFRSF4、TNFRSF9、TNFRSF14、FCGRA2、CD3G或CD27的胞内域。在一些说明性实施例中，第二胞内域来自CD40、CD79B或CD27。在例示性子实施例中，嵌合多肽包含包含本文中所提供的二聚基元的胞外域。
在本文中包括嵌合多肽的方法或经分离多核苷酸实施例中的任一者的某些实施例中，其中该嵌合多肽促进PBMC，且在说明性实施例中，B细胞、T细胞和/或NK细胞的细胞增生，第一和/或第二胞内域为表11-16中的嵌合多肽中的任一者的胞内域(P3或P4组件)。在一些实施例中，嵌合多肽包含表11-16中的嵌合多肽中的任一者的任一P2、P3及P4组合。
在其中跨膜域为I型跨膜蛋白的方面及实施例中的任一者的实施例中，跨膜域可为I型细胞因子受体、激素受体、T细胞受体或TNF家族受体。在其中嵌合多肽包含跨膜域且其中跨膜域包含二聚基元的方面及实施例中的任一者的实施例中，跨膜域可为I型细胞因子受体、激素受体、T细胞受体或TNF家族受体。在此段落中的这些实施例中的任一者的说明性实施例中，第一胞内域选自LEPR、MYD88、IFNAR2、IL17RD、IL17RE、IL1RAP、IL23R及MPL的胞内域。
在作为关于包含编码嵌合多肽的核酸序列的多核苷酸的方面及实施例中的任一者的实施例中，该嵌合多肽包含胞外域，该胞外域可包含胞外域的羧基端的20个氨基酸内(且在说明性实施例中，在胞外域的羧基端处)的1、2、3或4个氨基酸间隔子以使得间隔子将胞外域及跨膜域间隔开。在一些实施例中，1、2、3或4个氨基酸间隔子包含丙氨酸残基，且在一些情况下，仅丙氨酸残基。在包含该间隔子的实施例的说明性子实施例中，胞外域包含二聚基元，例如亮氨酸拉链基元。
应理解，本文所提供的包含促进PBMC、B细胞、T细胞和/或NK细胞的细胞增生的嵌合多肽的方面及实施例的第一胞内域及第二胞内域可包括所述基因的突变体和/或片段，其限制条件为该嵌合多肽保留其促进PBMC、B细胞、T细胞和/或NK细胞的细胞增生的能力。这些突变体和/或片段通常保留信号传导活性以使得嵌合多肽保留其促进存活及增生活性。应理解，第一胞内域及第二胞内域可为相反的以便用于本文中所提供的包含促进PBMC、B细胞、T细胞和/或NK细胞的细胞增生的嵌合多肽的任一方面及实施例中。因此，在这些实施例应当理解，第一胞内域为第二胞内域且反之亦然。
在本文提供的包含多核苷酸的方面及实施例中的任一者中，该多核苷酸包括编码促进PBMC、B细胞、T细胞和/或NK细胞的细胞增生的嵌合多肽的核酸序列，该核酸序列可进一步编码识别域或消除域。在一些实施例中，识别域或消除域为生物学批准的单克隆抗体的识别域。在一些实施例中，识别域或消除域包含由识别EGFR的抗体识别的多肽，或其抗原决定基。在一些实施例中，识别域或消除域包含由识别MYC的抗体识别的多肽，或其抗原决定基。
在本文提供的包含多核苷酸的方面及实施例中的任一者中，该多核苷酸包括编码促进PBMC、B细胞、T细胞和/或NK细胞的细胞增生的嵌合多肽的核酸序列，该核酸序列和/或第二核酸序列可操作地连接至在B细胞、T细胞和/或NK细胞中具有活性的第一启动子。在一些说明性实施例中，第一启动子在T细胞和/或NK细胞中为活性的。
在本文提供的具有编码促进PBMC、B细胞、T细胞和/或NK细胞的细胞增生的嵌合多肽的核酸序列的经分离多核苷酸方面及实施例中的任一者的实施例中，针对包含第二胞内域的多核苷酸实施例，接头可存在于跨膜域与第一胞内域之间和/或在第一胞内域与第二胞内域之间。在一些实施例中，针对包含胞外域的实施例，在1与4个丙氨酸之间的接头存在于胞外域与跨膜域之间。
在本文提供的包含编码促进PBMC、B细胞、T细胞和/或NK细胞的细胞增生的嵌合多肽的第一核酸序列及编码嵌合抗原受体(CAR)的第二核酸序列的经分离多核苷酸或载体方面及实施例中的任一者的实施例中，该嵌合抗原受体包含抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域及胞内活化域，该第一核酸序列及第二核酸序列可通过核糖体跳跃序列间隔开。在一些实施例中，核糖体跳跃序列为F2A、E2A、P2A或T2A。
在本文提供的编码促进PBMC、B细胞、T细胞和/或NK细胞的细胞增生的嵌合多肽的经分离多核苷酸方面及实施例中的任一者的实施例中，该多核苷酸进一步包含Kozak类型序列、WPRE组件及双重终止密码子或三重终止密码子中的一者或多者，其中双重终止密码子或三重终止密码子中的一个或多个终止密码子限定自一个或多个转录单元中的至少一者中读取的终止。在某些实施例中，多核苷酸进一步包含选自以下的Kozak类型序列：CCACCAUG(G)、CCGCCAT/UG(G)、GCCGCCGCCAT/UG(G)或GCCGCCGCCAT/UG。在某些实施例中，相对于第一核酸序列的起始密码子的-3及+4核苷酸皆包含G。在可与包含Kozak类型序列的前述实施例和/或包括三重终止密码子的以下实施例组合的另一实施例中，多核苷酸包含WPRE组件。在一些实施例中，WPRE组件位于一个或多个转录单元的终止密码子的3’及多核苷酸的3’LTR的5’处。在可与前述实施例(亦即，多核苷酸包含Kozak类型序列的实施例和/或其中多核苷酸包含WPRE的实施例)中的任一者或两者组合的另一实施例中，一个或多个转录单元经双重终止密码子或三重终止密码子中的一个或多个终止密码子终止。
在一个方面中，本文提供包含以下的核酸载体
本文提供的编码促进PBMC、B细胞、T细胞和/或NK细胞的细胞增生的嵌合多肽的经分离多核苷酸方面及实施例中的任一者的实施例，
a.复制源；
b.抗生素抗性基因；和/或
c.一种或多种病毒和/或反转录病毒序列，其选自反转录病毒长端重复序列(LTR)或其活性片段、反转录病毒顺式作用RNA包装组件，和/或反转录病毒中心多嘌呤段/中心终止序列(CTS)组件。
在此方面的某些实施例中，载体为质粒。在其他实施例中，载体为复制缺陷型病毒载体，例如复制缺陷型反转录病毒载体或颗粒。在这些实施例中，复制缺陷型反转录载体或颗粒颗包含5’反转录病毒LTR或其活性片段、反转录病毒顺式作用RNA包装组件，及3’反转录病毒LTR或其活性片段，其中5’反转录病毒LTR及3’反转录病毒LTR侧接经分离的多核苷酸。在一些实施例中，该经分离的多核苷酸与编码反转录病毒顺式作用RNA包装组件、5’长端重复序列和/或3’长端重复序列的核酸序列呈相反定向。
在一些方面中，本文提供包含反转录病毒基因组且进一步包含包膜及衣壳的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒，该反转录病毒基因组包含本文中的包含经分离多核苷酸的方面及实施例中的任一者，该经分离多核苷酸包含编码促进PBMC、B细胞、T细胞和/或NK细胞的细胞增生的嵌合多肽的第一核酸序列。反转录病毒颗粒可额外包含本公开案中所阐述的反转录病毒组件中的任一者。在一个实施例中，反转录病毒基因组进一步包含编码嵌合抗原受体(CAR)的第二核酸序列，该嵌合抗原受体包含抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域及胞内活化域。在一些实施例中，第一核酸序列及第二核酸序列可通过核糖体跳跃序列间隔开。在一些实施例中，核糖体跳跃序列为F2A、E2A、P2A或T2A。在这些实施例中，第一核酸序列及第二核酸序列通常在相同的转录单元上。
在另一实施例中，本文提供一种哺乳动物细胞，其中该哺乳动物细胞(例如人类细胞)为包含经分离多核苷酸的B细胞、T细胞或NK细胞，根据本文中的包含经分离多核苷酸的方面及实施例中的任一者，该经分离多核苷酸视情况可整合至该细胞的基因组中，该经分离多核苷酸包含编码促进PBMC、B细胞、T细胞和/或NK细胞的细胞增生的嵌合多肽的第一核酸序列。在一个实施例中，哺乳动物细胞中的经分离多核苷酸进一步包含编码嵌合抗原受体(CAR)的第二核酸序列，该嵌合抗原受体包含抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域及胞内活化域。在一些实施例中，第一核酸序列及第二核酸序列可通过核糖体跳跃序列间隔开。在一些实施例中，核糖体跳跃序列为F2A、E2A、P2A或T2A。在这些实施例中，第一核酸序列及第二核酸序列通常在相同的转录单元上。在一些实施例中，细胞为T细胞或NK细胞，且在某些说明性实施例中，细胞为人类T细胞。
在另一方面中，本文提供根据本文中的包含经分离多核苷酸的方面及实施例中的任一者的包含经分离多核苷酸的包装组件，该经分离多核苷酸可整合至细胞的基因组中，包含编码促进PBMC、B细胞、T细胞和/或NK细胞的细胞增生的嵌合多肽的第一核酸序列。在一些实施例中，该细胞中的经分离多核苷酸进一步包含编码嵌合抗原受体(CAR)的第二核酸序列，该嵌合抗原受体包含抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域及胞内活化域。在一些实施例中，第一核酸序列及第二核酸序列可通过核糖体跳跃序列间隔开。在一些实施例中，核糖体跳跃序列为F2A、E2A、P2A或T2A。在这些实施例中，第一核酸序列及第二核酸序列通常在相同的转录单元上。在一些实施例中，细胞为本文提供用于产生反转录病毒颗粒的细胞。
在一个方面中，本文提供一种促进PBMC(例如，B细胞、T细胞和/或NK细胞)的细胞增生的方法，该方法包含用编码淋巴增生性组件(且在说明性实施例中，根据本文所提供的实施例中的任一者的嵌合多肽)的载体转导和/或以基因方式修饰细胞，其中该嵌合多肽促进PBMC增生。该方法可包括培养细胞至少7天、14天、21天、28天、35天、42天或60天。通常地，此培养例如在一些实施例中在用可诱导IL-2的培养基转导之后在存在IL-2的情况下进行。
在一个方面中，本文提供一种转染、转导和/或以基因方式修饰B细胞、T细胞和/或NK细胞(在一些非限制性实施例中，可为同种异体细胞、自体细胞或非同种异体细胞)的方法，该方法包含使该细胞与根据本文中的包含经分离多核苷酸的方面及实施例中的任一者的经分离多核苷酸接触，该经分离多核苷酸包含编码促进PBMC、B细胞、T细胞和/或NK细胞的细胞增生的嵌合多肽的第一核酸序列(CLE方面及实施例)。在此方法方面中的一些实施例中，该细胞为T细胞且经分离多核苷酸进一步包含编码嵌合抗原受体(CAR)的第二核酸序列，该嵌合抗原受体包含抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域及胞内活化域。换言的，用于转染、转导和/或以基因方式修饰B细胞、T细胞和/或NK细胞的方法可包括使该细胞与根据本文中的CLE或CLE CAR实施例中的任一者的经分离多核苷酸接触。在一些实施例中，第一核酸序列及第二核酸序列可通过核糖体跳跃序列间隔开。在一些实施例中，核糖体跳跃序列为F2A、E2A、P2A或T2A。在这些实施例中，第一核酸序列及第二核酸序列通常在相同的转录单元上。在一些实施例中，细胞为T细胞或NK细胞，且在某些说明性实施例中，细胞为人类T细胞。该接触在用于转染、转导和/或以基因方式修饰细胞的有效条件下进行。在一些实施例中，在接触时的经分离多核苷酸在根据本文中所提供的载体方面及实施例中的任一者的载体内。在一些实施例中，经分离多核苷酸在接触时在非复制型反转录病毒颗粒中。
在本文方面中的任一者的一些实施例中，NK细胞为NKT细胞。
以下非限制性实施例仅借助于说明例示性实施例而提供，且绝不限制本发明的范畴及精神。此外，应理解，本文所公开或主张的任何发明涵盖本文所描述的任何一个或多个特征的所有变体、组合及排列。任何一个或多个特征可明确地自权利要求排除，即使未在本文中明确地阐述特定排除。还应理解，除非一般熟练此项技术人员将理解，否则根据本文公开的特定方法或本领域中已知的其他方法，用于方法中的试剂的公开内容意欲与(及为其提供支持)涉及试剂的用途的方法同义。另外，除非一般熟练此项技术人员将理解，否则说明书和/或权利要求公开一种方法，本文所公开的试剂中的任何一者或多者可用于该方法。
实施例
实施例1.特异性响应于核苷类似物抗病毒药物的核糖开关的产生。
此实施例提供一种基于结合鸟苷及脱氧鸟苷的天然结构性核糖开关来筛选库的方法。这些核糖开关为用作架构以发展偏差库(biased library)以供选择与配位体核苷类似物特异性结合的适体。以前，等温滴定热量测定法已用于显示这些天然核糖开关与其天然配位体结合。额外测试显示，脱氧鸟苷开关也微弱地与核苷类似物(阿昔洛韦及喷昔洛韦)相互作用，从而导致将此序列重新设计为新的库。核糖开关的单链区用于特异性回应于所选择的阿昔洛韦或喷昔洛韦的突变及变体序列。
材料
自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)订购选择组分：鸟嘌呤、鸟苷、脱氧鸟苷、阿昔洛韦及喷昔洛韦。阿昔洛韦为初始靶标，而喷昔洛韦为在稍后轮次中使用的特别关注的分析物，且鸟嘌呤、鸟苷及脱氧鸟苷用作反向靶标。待用作分配培养基的氧化石墨烯(GrO)购自Angstron Materials(俄亥俄州代顿))。HEPES(pH 7.3)及MgCl2购自Amersco LLC.(俄亥俄州Solon)。KCl购自Teknova(加州Hollister)。在5×(1×为50mM HEPES，100mM KCl，20mMMgCl2，pH 7.3)下制备选择缓冲液。在无核酸酶的水中重建构靶标、反向靶标及寡核苷酸以供初步分析及适体筛选。制备所有靶标的等份且储存在-20℃下以最大化保质期。
适体库的产生
利用IBA GmbH(德国哥廷根)合成呈图14中的序列的反向互补物的初始适体库模板。在图14中，盒中的核苷酸为已知序列中的单链，其中在合成期间引入“突变”以使与原始靶标的类似物的更佳结合。对于用实线勾勒出的盒内的核苷酸，允许取代突变；对于用虚线勾勒出的盒内的核苷酸，允许取代突变以及插入或缺失。利用IDT(爱荷华州Coralville)合成呈单链DNA的引物。将T7引物(SEQ ID NO:240)与库模板序列组合以供利用Titanium TaqDNA聚合酶(Clontech；加州山景城)进行引物扩增。使用Ampliscribe T7高产率转录试剂盒(Epicentre；威斯康星州麦迪逊)转录经引物扩增的材料，且接着在用于选择之前在具有8M脲素的10％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)上进行纯化。在选择期间，使用SuperScriptIV反转录酶(Invitrogen；加州卡尔斯巴德)使用反向引物(SEQ ID NO:241)来反转录库且使用Titanium Taq DNA聚合酶(Clontech；加州山景城)对该库进行扩增。具有SEQ ID NO:248的适体具有-3至-1的J2-3环变化及～2.25×1010的多样性。具有SEQ ID NO:250的适体具有0(天然)至+5的J2-3环变化及～9.38×1014的多样性。两种寡核苷酸(SEQ ID NO:249及SEQ ID NO:250)以1:4160的比率混合以在经组合库池中产生等摩尔多样性，具有～9.38×1013的总多样性。
库筛选
使用氧化石墨烯-指数富集的配位体的系统进化(GO-SELEX)方法(图15)(Park等人，2012)，利用使氧化石墨烯针对单链核酸的高亲和力的π-π相互作用(Zeng等人，2015)来进行库筛选。目标是选择不与1×选择缓冲液或不与反向靶标(鸟嘌呤、鸟苷及脱氧鸟苷)相互作用但与阳性靶标阿昔洛韦结合的序列。
对于每个轮次，首先在1×选择缓冲液中对给定量的库进行复性(在90℃下变性5分钟，在4℃下5分钟，接着在室温下)。接着将反向靶标添加至经复性的库中且在37℃下培育30分钟。此的例外为轮次1及轮次2，其中仅短暂地(<1分钟)包括反向靶标以帮助将库装载至GrO上。在使库与反向靶标及缓冲液组分相互作用之后，历经在37℃下培育10分钟的时程将未结合库装载至GrO上(质量等于轮次开始时库的质量的100倍)。接着以7,000×g离心溶液以沉降GrO。移除含有与反向靶标和/或缓冲液结合的序列的上清液。沉降物接着用200μL 1×选择缓冲液洗涤，以7,000×g离心且在每次洗涤后移除上清液。接着添加阳性含靶标溶液且允许在37℃下至多60分钟的表1中指示的条件下自GrO溶离库，基本上允许靶标针对库结合与氧化石墨烯竞争。与靶标更强有力地结合的序列将自氧化石墨烯解吸附且在培育末期保持与靶标结合。最终离心步骤自保持与氧化石墨烯结合的无响应库分离位于上清液中的经释放材料。
在阳性选择之后，经回收RNA使用具有8M脲素的10％变性PAGE来进行纯化，接着使用分光亮度计读数(表1)来定量，用SuperScript IV反转录且使用PCR用Titanium Taq DNA聚合酶进行扩增。将扩增产物转录为RNA以供选择的下一轮次。
历经选择的时程实施三级严格性(表1)。选择之前两个轮次并不包括针对反向靶标的筛选以最大化装载至GrO上的库。另外，阳性培育中使用大量过量的阿昔洛韦以最大化库回收率，如此为低严格性设计。在实现库回收之后引入反向靶标培育物，作为中等严格性条件。同样在这些三个轮次期间降低阿昔洛韦与库的比率以增加针对靶标结合的库竞争。一旦实现大于10％的回收率，则实施高严格性选择的最终轮次。使保持高及阳性靶标/库比率的反向靶标/库比率为1:1，同时减少阳性培育时间，以选择更快结合序列。一旦库回收率在高严格性条件的两个轮次之后显示为保持超过10％，则进行平行评估。
Figure BDA0002257374180001401
表1.选择及评估条件用于选择及培育的各轮次的条件，具有作为针对各轮次的经回收样本与输入库之间的比率的回收率。历经选择的时程监测库富集。*反向靶标用于装载，而非扩增培育。
Figure BDA0002257374180001402
用经汇集的反向靶标进行预装载培育。
Figure BDA0002257374180001403
用阳性靶标阿昔洛韦进行预装载培育。进行这是用于最小化交叉反应物种的回收率。以下缩写用于此表中：“X-靶标”为反向靶标；“(+)靶标”为阿昔洛韦或喷昔洛韦；“(+)培育时间(分钟)”为“库：(+)靶标”溶液于GrO上培育的时间。G0为代0等；R1为轮次1等。对于平行评估(平行1及平行2)，用以下进行培育：(-)为仅1×选择缓冲液，(×)为含反向靶标的1×选择缓冲液，(+)为含阿昔洛韦的1×选择缓冲液，及(P)为含喷昔洛韦的1×选择缓冲液。
对于两个平行评估，将待评估的库分为四个相等量以用于如上制备及复性(图16)。对于各条件，将50皮摩尔的库与1×选择缓冲液组合，复性(90℃下5分钟，4℃下5分钟)，且接着在37℃下与200μL的10μM含经合并反向靶标的1×选择缓冲液一起培育30分钟。接着将这些样本装载至氧化石墨烯的量相当于样本中的库的质量的100倍的氧化石墨烯上，并在37℃下培育10分钟，且接着如前述用200μL的1×选择缓冲液洗涤两次。接着在37℃下将经装载氧化石墨烯样本与含200μL的合适评估条件(仅1×选择缓冲液，10μM经汇集反向靶标，1μM喷昔洛韦，1μM阿昔洛韦(第一平行评估)，或0.5μM阿昔洛韦(第二平行评估)；在表1中，这些条件分别显示为：(-)、(X)、(P)、(+)及(+))的1×选择缓冲液一起平行培育30分钟。最终离心步骤自无回应的经氧化石墨烯结合的库分离经解吸附回应库。响应库使用分光亮度计读数来定量(表1)，使用具有8M的10％变性PAGE脲素来鉴别，且准备用于第二平行评估。此后续评估对于阳性样本的预装载培育继续使用反向靶标，但对于各其他样本的预培育利用阳性靶标阿昔洛韦。进行这是用于最小化给定样本中的交叉反应序列的表示(亦即，响应于阳性样本中的反向靶标，回应于阴性反向靶标或喷昔洛韦样本中的阿昔洛韦)。自第二平行评估回收的材料使用分光亮度计读数来定量(表1)，使用具有8M脲素的10％变性PAGE来鉴别，且利用反转录及PCR来准备以供测序以产生双链DNA。
测序
初始库经受大于10个轮次的基于GrO的选择及平行评估(表1)。GO-SELEX方法经设计以经由多个轮次的选择来富集与感兴趣的给定靶标结合的序列并移除与非靶标化合物或缓冲液组分结合的序列。作为结果，期望待测序的群体含有潜在适体候选物的多个拷贝。
实施Illumina MiSeq系统(加州圣地亚哥)以在平行评估之后使用单端读取技术测序适体库。深度测序与后续数据分析减少传统SELEX所需的大量筛选轮次，此可由于筛选方法引入误差及偏差(Schütze等人，2011)。测序以下五个样本：回应于阿昔洛韦的最后一代库，回应于反向靶标的最后一代库，响应于1×选择缓冲液(阴性条件)的最后一代库，响应于阿昔洛韦的倒数第二代库，及响应于感兴趣的额外靶标(喷昔洛韦)的最后一代库。根据这些数据集，以95％同源性(考虑到突变、缺失及插入的序列相似性)构建序列家族以用于适体候选物鉴别。存在来自回应于阿昔洛韦的库的1,711,535个原始序列(124,600个唯一序列)及来自回应于喷昔洛韦的库的2,074,832个原始序列(110,149个唯一序列)。
适体候选物选择
序列家族构建主要聚焦于序列相似性。这表示计入阳性靶标群体中的序列的频率，但强调的是相似序列之间的变化程度，其中95％同源性为最小要求(在整个序列中100％匹配对于加入家族并不是必需的，可错配、插入或缺失至多2个碱基)。因此，期望具有最多成员的家族高度作为适体候选物。在构建家族之后，考虑到家族在某一给定群体中的相对存在—频繁出现在阴性及反向靶标群体中的家族被视为较弱的候选物，这是因为其显示在与缓冲液或反向靶标组分结合时的一定程度的非特异性相互作用。另外，显示高富集率(亦即，最终阳性群体与倒数第二阳性群体之间的较大比率)的家族提高其候选资格，这是因为富集率已与候选物相对于剩余群体的结合亲和力相关(Levay等人，2015；Wang等人，2014)。在这些条件下，若干候选物家族似乎为针对结合阿昔洛韦(表2)及喷昔洛韦的强有力候选物。
Figure BDA0002257374180001411
Figure BDA0002257374180001421
Figure BDA0002257374180001431
Figure BDA0002257374180001441
Figure BDA0002257374180001451
表2.用于结合阿昔洛韦及喷昔洛韦的候选物。DNA序列对应于结合RNA核糖开关的阿昔洛韦的非茎区。在筛选时鉴别到七个家族：582、769、795、935、946、961及996，其中在各家族中具有在1个与39个之间的序列。将家族中各序列的一致性％与各家族(582-1、769-1、795-1、935-1、946-1、961-1及996-1)内的最常见的序列进行比较。也将家族中各序列的一致性％与野生型序列进行比较。
阳性靶标阿昔洛韦产生对应于582-1(SEQ ID NO:108)、769-1(SEQ ID NO:147)、795-1(SEQ ID NO:164)、935-1(SEQ ID NO:183)、946-1(SEQ ID NO:198)、961-1(SEQ IDNO:220)及996-1(SEQ ID NO:221)的七个强有力候选物(SEQ ID NO:87至SEQ ID NO:93；包括茎区的RNA序列)，各自命名为F1A(图17)。这些序列为各家族中最常见的序列(各家族的所有成员的DNA序列为：582(SEQ ID NO:108至SEQ ID NO:146)；769(SEQ ID NO:147至SEQID NO:163)；795(SEQ ID NO:164至SEQ ID NO:182)；935(SEQ ID NO:183至SEQ ID NO:197)；946(SEQ ID NO:198至SEQ ID NO:219)；961(SEQ ID NO:220)；及996(SEQ ID NO:221))。共有序列显示各家族的各核苷酸位置处的所有可能的取代或间隙(SEQ ID NO:222至SEQ ID NO:226)。由于目标为基于为与脱氧鸟苷结合所已知的RNA来鉴别来自库的适体，所以强有力候选物需要在反向靶标群体中具有最小的存在。候选物F1A-795、F1A-935及F1A-946非常符合此标准，这是因为未在反向靶标群体中检测到这些候选物。就此而言，将F1A-996及F1A-961视为下一最佳候选物，即使其在反向靶标群体中显示较小程度。另外，候选物应最低程度地出现于阴性群体中，这是因为那些序列自GrO解吸附而无阿昔洛韦的影响且可表示假阳性。F1A-935及F1A-946在此标准下非常好的理想地表达，这是因为未在阴性群体中发现其等。候选物F1A-769在阴性群体中被最小程度地检测到，其中候选物F1A-961、F1A-795及F1A-996表达的较不佳。富集率为需考虑的最终条件，其中F1A-935、F1A-946及F1A-769充分地表达。包括候选物F1A-582，这是因为其展现最大富集率，尽管其在其他标准下表达并不良好。剩余候选物相对于这些四个并不表达良好，但展现可接受特性。
额外靶标喷昔洛韦产生七个强有力候选物(SEQ ID NO:94至SEQ ID NO:100)，各自命名为F1P(图18)。如前，目标为基于为与脱氧鸟苷结合所已知的RNA来鉴别来自库的适体，偏离经富集的库以供在轮次10之后与阿昔洛韦结合。强有力候选物需要在阿昔洛韦及反向靶标群体两者中具有最小存在以最小化交叉反应性。候选物F1P-923符合第一个标准，候选物F1P-710符合第二个标准，且候选物F1P-584在一定程度上符合两个标准。候选物F1P-584还显示喷昔洛韦优于阴性条件的适中偏好，以及相对于针对阿昔洛韦之前代的响应的适中富集。剩余候选物显示喷昔洛韦优于阿昔洛韦的最小偏好或喷昔洛韦优于反向靶标(分别为F1P-837及F1P-932；F1P-991及F1P-718)的最小偏好。这些四个候选物显示喷昔洛韦优于最小化假阳性的机会的阴性条件的一些偏好，但在候选物不显示喷昔洛韦优于其类似物的选择性时，此标准是不显著的。富集率为需考虑的最终条件，其中F1P-923、F1P-932及F1P-584充分地表达。
进行所选择适体的定性的PAGE评估。经个别合成及转录的适体在生理Mg++(0.5mM)下经受氧化石墨烯(GrO)选择，且用阿昔洛韦(+)或反向靶标(x)溶离。各样本的经特异性溶离的适体碎片经受PAGE以供分析。
将100皮摩尔的各适体候选物(每次实验/泳道)再悬浮于1×经修改的选择缓冲液(50mM HEPES，100mM KCl，0.5mM MgCl2，pH 7.3)中且复性(90℃下5分钟，接着4℃下5分钟)，接着在37℃下与200皮摩尔(每一)的经汇集反向靶标或靶标一起培育30分钟。最终库浓度为0.5μM，靶标/反向靶标浓度为1μM(培育体积为200μl)。
在靶标/反向靶标培育之后，添加250μg的GrO(Angstron Materials(俄亥俄州代顿))以吸附未结合的候选物(在37℃下培育10分钟)。
以7,000×g离心样本5分钟。回收上清液，使用具有40mM EDTA的2×甲酰胺变性，且在具有8M脲素的10％变性PAGE上电泳(供货商：American Bioanalytical；目录号#AB13021-01000.AB13022-01000)。电泳缓冲液为1×TBE(供货商：Amresco/VWR；目录号#0658-20L，使用DI水稀释)。DNA梯为20/100 DNA梯(IDT)。凝胶用凝胶星型(Lonza，50535)染色且在蓝光透射仪上成像。
候选物F1A-769、F1A-795、F1A-946及F1A-996似乎在此定性PAGE评估(自GrO用阿昔洛韦靶标的适体的良好溶离及用反向靶标的相对较低或最小溶离)中展现选择性阳性反应。
结论
在反复筛选及平行评估的十二个轮次之后鉴别针对阿昔洛韦的强有力候选物；在筛选及平行评估的两个轮次之后鉴别针对喷昔洛韦的合理候选物。
实施例2.条件性scFv’s的分离
移除潜在剪接位点库，且肿瘤抗原特异性scFv’s是利用重叠寡聚合成来合成且将其克隆至含有阿昔洛韦响应性组件及灵长类CD3ζ启动子的CAR穿梭式构建体中。作为初始原型，利用具有CD8-α信号肽、柄及跨膜域的EPCAM或ERBB2scFv的抗ECD。使用如美国专利第8,709,755号及PCT公开案第WO/2016/033331A1号中所描述的方法或通过在许可及非许可条件下自人类噬菌体库直接选择来产生受实体肿瘤微环境限制的CAR产物。简言之，在以下肿瘤许可条件下淘选来自Creative Biolabs(Shirley，纽约)的人类VH×VL库：100μg/ml透明质酸，100kDa碎片(Lifecore Biomedical，明尼苏达州查斯卡)，20mg/ml重组HAS(Cyagen，加州圣克拉拉)，含200ng/ml重组人类VEGF的25mM碳酸氢钠缓冲液，2μM腺苷，10mM乳酸钠pH 6.7，接着用与生物素标记的人类IgG结合的链霉抗生素磁珠(ThermoFisher，加州卡尔斯巴德)清除。与在37℃下结合珠粒的EPCAM及ERBB2的生物素标记的靶标受体ECD的结合在允许条件下，接着为在允许条件下的连续洗涤来进行。用生理条件(1μg/ml透明质酸，20mg/ml HAS，25mM碳酸氢盐，1mM乳酸钠pH 7.2)，接着用酸性溶离液溶离封闭性变体且用1M Tris快速中和来释放噬菌体。扩增噬菌体且使用长读取测序(PacBio，加州门洛帕克)分裂基因组DNA以供VH×VL链的深度序列分析。可重复淘选以供富集。排除在经由对靶标富集的噬菌体培养过程期间显示读数的较佳扩增的VH×VL序列以供进一步分析。与在肿瘤许可条件下富集但在生理条件下释放的靶标选择性结合的噬菌体经选择以供进一步表征为克隆至CAR构建体表达系统中，慢病毒的世代且转导至T细胞中以供测试表达CAR介导的肿瘤抗原的靶标细胞在肿瘤选择性环境中相比于生理条件下的杀伤。
实施例3.使用受微环境限制的scFv’s产生MRB-CAR。
获得受微环境限制的ASTR，其通过利用如申请WO/2016/033331A1中所描述的进化使VH及VL序列进行针对低pH微环境的低选择性来制得。在相比于正常组织MRB-CAR的微环境下，在肿瘤微环境的降低的pH下具有增加的活性的用于结合两种同源肿瘤抗原(靶标1或靶标2)中的任一者的嵌合抗原受体(CAR)通过将受微环境限制的单链抗体的重链及轻链与其他CAR域一起并入慢病毒表达载体中以产生一系列候选MRB-CAR来制得。这些MRB-CAR包括分子的各种组合。MRB-CAR自胺基至羧基末端在位置1至位置9中包括：CD8信号肽(sp)(P1)(SEQ ID NO:74)；受微环境限制的抗靶标1ASTR或抗靶标2ASTR(P2至P4)；在T2A及T2B的情况下来自CD8的柄及跨膜(TM)域(SEQ ID NO:75)(P5)及来自CD137的共刺激域(P6)(SEQ IDNO:1)或在T1A的情况下来自CD28的柄及跨膜(TM)域(SEQ ID NO:76)(P5)及来自ICΔ的共刺激域(SEQ ID NO:3)(P6)；来自CD3Z的活化域(SEQ ID NO:13)(P7)；2A-1核糖体跳跃序列(SEQ ID NO:77)(P8)；及例示性eTAG(SEQ ID NO:78)(P9)。
用重组慢病毒颗粒转导淘选T细胞(AllCells，Alameda，CA)以表达该系列的候选MRB-CAR，且通过使用FACS测定表达eTag的细胞的百分比来计算经转导细胞的百分比。用编码候选MRB-CAR的重组慢病毒颗粒成功地转导淘选T细胞。
利用xCELLigence系统(ACEA)在7.4的pH(正常组织)或6.7的pH(肿瘤微环境的降低的pH)下分析候选MRB-CAR针对表达靶标1或靶标2(分别为CHO-靶标1及CHO-靶标2)的靶标细胞的细胞毒性活性。简言之，在实验前一天将表达靶标1或靶标2的靶标细胞以20,000个细胞/孔接种至具有肿瘤条件或正常培养基的96-孔E-盘中。使效应细胞在含有100IU/mL的IL-2的人类T细胞培养基中静息两天且以3:1、1:1及0.3:1的效应细胞/靶标细胞比率(E/T)添加至含有靶标细胞的实验孔中。
在添加效应细胞之后每5分钟进行阻抗读取持续大约40小时且阻抗报告为细胞指数(CI)。如下计算特异性细胞溶解的百分比：((CI靶标+经对照病毒转导的效应T细胞)-(CI靶标+用针对靶标1或靶标2的CAR转导的效应T细胞))/(CI靶标+经对照病毒转导的效应T细胞)×100。
结果
许多候选MRB-CAR在6.7的pH下比在7.4的pH下对靶标细胞具有更高细胞毒性活性。在6.7的pH下比在7.4的pH下在裂解靶标细胞处更有效的例示性MRB-CAR包括MRB-CART1A、MRB-CAR T2A及MRB-CAR T2B。MRB-CAR T1A的ASTR自5’至3’包含由接头1(SEQ ID NO:283)隔开的靶标1MRB VH(SEQ ID NO:281)及靶标1MRB VL(SEQ ID NO:282)。MRB-CAR T2A的ASTR自5’至3’包含由接头2(SEQ ID NO:291)隔开的靶标2MRB VH(SEQ ID NO:289)及靶标2MRB VL(SEQ ID NO:290)。除交换VH及VL的位置以外，MRB-CAR T2B的ASTR与MRB-CART2A的ASTR相同。
实施例4.配位体可诱导的核糖开关的构建。
将脱氧鸟苷核糖开关适体及鸟苷核糖开关适体(Pikovskaya，2014；Kim，2007)或其他嘌呤核糖开关适体合成为寡核苷酸。在一个实例中，针对进化选择来自Mesoplasmaflorum的脱氧鸟苷IA核糖开关(在图6及图7中加下划线且呈粗体)以产生阿昔洛韦回应性核糖开关。在另一实例中，针对进化选择来自枯草芽孢杆菌的鸟苷xpt核糖开关(在图10及图11中加下划线且呈粗体)以产生阿昔洛韦回应性核糖开关。对于这些两个实例中的每一者，在P2、P3、J1-2及J2-3区段(图7及图11)中用替代核苷酸在经靶标序列位置处产生随机RNA库。各区段在各经靶标序列位置处允许3个替代核酸，或替代地在各经靶标序列位置处在+1位点中允许4个核苷酸的碱基缺失及插入以供如图8A至图8B及图9(M.florum IA)与图12A至图12B及图13(B.subtilis xpt)中所指示的饱和诱变。引物扩增及试剂制备是在RNA转录之后。所得RNA库在鸟嘌呤、鸟苷及脱氧鸟苷的存在下对氧化石墨烯进行阴性选择，接着为用阿昔洛韦及喷昔洛韦进行阳性选择。在阴性及阳性选择过程中，使用人类细胞生理镁水平(0.5mM至1.2mM)且温度保持在37℃下。对经回收适体进行反转录且扩增PCR，接着进行转录且随后筛选至少8个连续轮次的选择。在平行方法中，在40℃下用额外阴性筛选来筛选适体。通过NextGen测序及分析来检查所得阳性池。合成个别适体且利用在35℃至40℃下呈人类细胞生理镁水平的等温热量测定法来检查亲和力。之后进行阳性阿昔洛韦及喷昔洛韦特异性适体的选择，将适体与核糖核酸酶锤头型及枪式核糖核酸酶整合在一起。将阳性阿昔洛韦选择性适体与枪式核糖核酸酶组合以鉴别经阿昔洛韦调节的核糖核酸酶。(Harris KA RNA.2015 Nov；21(11):1852-8.doi:10.1261/rna)。变体在存在阿昔洛韦下及不存在喷昔洛韦下经受基于凝胶移位的PAGE纯化。另外，将环鸟苷选择性核糖开关立即置放于环中的3′以剪接CAR/IL-7构建体的受体上游。在不存在阿昔洛韦下，剪接位点位置在核糖开关复合物中结合，但在存在阿昔洛韦下变得可接近，从而产生功能性CAR转录物。
实施例5.活体内传播域的构建。
利用重叠寡核苷酸合成(DNA2.0，Newark，California)来合成来自T细胞淋巴母细胞白血病(243InsPPCL(SEQ ID NO:82)；246InsKCH(SEQ ID NO:101)；241InsFSCGP(SEQ IDNO:102)；244InsCHL(SEQ ID NO:103)；及244InsPPVCSVT(SEQ ID NO:104)；全部均来自Shochat等人2011,J.Exp.Med.Vol.208No.5 901-908)的一系列组成性活性IL7受体(IL7R)跨膜突变体。将经合成组成性活性IL7R跨膜突变体立即插入至在2A核糖体跳跃序列后面的组成性表达慢病毒载体主链中，接着为抗CD19 CD3ζ表达盒，该表达盒包括CD8A柄(SEQ IDNO:79)及前导肽(SEQ ID NO:74)。HEK293包装细胞用IL7R跨膜突变体慢病毒载体及慢病毒包装构建体来转染，进行生长，并使用本领域中已知的方法采集病毒上清液。经CD3/CD28刺激的T细胞用病毒上清液来转导且在IL2缺陷型AIM V、CTS OpTmizer T细胞扩增SFM或X-VIVO 15培养基中生长4周，每周一次补充来自相同供体的冷冻PBMC。所得经扩增的表达IL7R变体的经转导T细胞利用FACS分选来克隆且通过测序RT-PCR产物来鉴别IL7R构建体的序列。选择243InsPPCL变体(PPCL)(SEQ ID NO:82)以供进一步进化以产生条件性活性CAR。
实施例6.用于CAR-T活化及传播的辅助组分的筛选。
一系列蛋白编码的域(ABCG1、SOCS1、SMAD2、TGFBR2、cCBL及PD1)及miRNA序列经构建以供并入至CD3-启动子驱动的CAR盒(cassette)的反向链上的合成内含子中。含有CD3-启动子驱动的CAR盒(cassette)及蛋白编码的域或miRNA序列的各构建体包括用于深度测序的唯一条形码且使用Gibson组装来组装，接着转型，及在大肠杆菌(E.coli.)中进行库扩增。制备病毒原液且用于在AIM V、CTS OpTmizer T细胞扩增SFM或不具有IL2的X-VIVO 15培养基中转导经CD3/CD28刺激的T细胞且使其在连续取样DNA的情况下在培养物中生长4周以供用于密码鉴别的扩增及深度测序。库还经受PACBio全长测序以测定库多样性且解码条形码组分。针对CAR CD3ζ域的协同活性测试miRNA序列及蛋白编码的域。
实施例7.将反转录病毒包装及转导系统工程化为靶向静息T细胞以供选择T细胞整合及由PBMC表达。
尽管可能利用瞬态转染产生高效价慢病毒载体，但此方法带有产生复制缺陷型重组反转录病毒(RCR)的风险且对于临床应用不可扩增。在此，通过将编码可诱导启动子的多个构建体及其调节剂同步引入至HEK293悬浮适应性细胞(HEK293S)中以稳定地产生病毒组分、CAR基因及其调节组分来产生稳定的反转录病毒包装细胞系。两个不同的可诱导系统可用于暂时控制基因的表达。一个系统是基于两种转录因子的雷帕霉素-或雷帕霉素类似物诱导的二聚合。一个转录因子由与ZFHD1 DNA结合域融合的FKPB蛋白质的三个拷贝组成且其他转录因子由与p65活化域融合的FRB蛋白质组成。雷帕霉素或雷帕霉素类似物将转录因子二聚合以形成ZFHD1/p65 AD且可在12xZFHD1结合位点处活化基因转录。
如图3A至图3E中所显示的一系列载体是通过侧接转座子序列产生以用于整合至HEK293S基因组中。一旦整合至细胞的基因组中，这些序列充当调节组分及lox位点和/或FRT位点(在此被称为着陆点)以供随后使用Cre和/或flp重组酶进行整合。初始5个构建体含有编码嘌呤霉素抗性、GFP、RFP及经由N端PLss(牛促乳素信号肽)靶向细胞膜且经由衍生自血小板的生长因子受体(PDGFR)C端跨膜锚定域锚定至细胞膜的胞外MYC标记的多核苷酸序列。初始5个构建体也可包括组成性最小CMV启动子及最小IL-2启动子、经雷帕霉素调节的基于ZFHD1的启动子、四环素响应性组件(TRE)启动子或双向TRE(BiTRE)启动子。图3A中的构建体含有编码与NFκB p65活化子域(p65 AD)融合的FRB域及与组成性表达的三个FKBP重复融合的ZFHD1 DNA结合域的多核苷酸序列。图3A中的构建体也包括在雷帕霉素可诱导的ZFHD1/p65 AD启动子下的HIV1 REV及HSV VP65域SrcFlagVpx。图3B中的构建体包括编码在ZFHD1/p65 AD启动子的控制下的rtTA序列的多核苷酸。图3C中的构建体包括编码侧接有loxP位点的嘌呤霉素抗性基因及侧接有lox2272位点的胞外MYC标记的多核苷酸。这些可选标记的两者均在BiTRE启动子的控制下，该BiTRE启动子侧接有FRT位点。图3D中的构建体包括编码在TRE启动子的控制下侧接有loxP位点的GFP的多核苷酸。图3D中的构建体还包括在TRE启动子与GFP的5’loxP位点之间的单个FRT位点。图3E中的构建体包括编码在ZFHD1/p65AD启动子的控制下侧接有loxP位点的RFP的多核苷酸。图3E中的构建体还包括在ZFHD1/p65AD启动子与RFP的5’loxP位点之间的单个FRT位点。图3C至图3E中的构建体充当其他多核苷酸序列的着陆点以插入至包装细胞系的基因组中。待插入的多核苷酸序列可侧接有lox位点且使用Cre重组酶及loxP位点插入至基因组中。此导致编码嘌呤霉素抗性、胞外MYC标记、GFP及RFP的基因组区的插入及同步移除。替代地，多核苷酸序列可侧接有FRT位点，且使用flp重组酶及FRT位点来插入至基因组中，接着使用Cre重组酶移除编码嘌呤霉素抗性、胞外MYC标记、GFP及RFP的多核苷酸序列。
为用整合至基因组中的着陆点产生包装细胞系，用等摩尔浓度的5种质粒(图3A至图3E)加5μg的经活体外转录的piggybac转座酶mRNA或5μg的具有用于在PEI的存在下以2:1或3:1的PEI比DNA(w/w)的比率表达piggybac转座酶的启动子的质粒或2μg至5μg piggybac转座酶蛋白使用阳离子肽混合物来共转染HEK293S细胞。在100nm雷帕霉素及1μg/mL多西环素的存在下用嘌呤霉素选择经转染细胞2至5天，接着荧光活化的细胞分选以收集表达GFP及RFP的细胞。经分选细胞在不存在嘌呤霉素、雷帕霉素及多西环素下生长5天，且移除表达GFP及RFP的细胞，也用myc珠粒移除myc阳性细胞。接着筛选来自经阴性分选的细胞的个别纯系以供利用雷帕霉素及多西环素以及所克隆的单个细胞诱导GFP及RFP。采集来自纯系的DNA且经测序以用于整合分析。对在存在雷帕霉素及多西环素下具有GFP及RFP的强有力诱导表达，在不存在雷帕霉素及多西环素下具有受限背景表达呈阳性的纯系进行扩增并进行堆积。
接着用含有三顺反子多核苷酸的构建体转染具有来自整合至基因组中的图3A至图3E的构建体的HEK293S细胞，该三顺反子多核苷酸编码DAF信号序列/抗CD3 scFvFc(UCHT1)/CD14 GPI锚定连接位点(SEQ ID NO:287)、能够结合CD28/CD16B GPI锚定连接位点(SEQ ID NO:286)的DAF信号序列/CD80胞外域及DAF信号序列/IL-7/DAF(SEQ ID NO:286)及侧接用于整合至HEK293S基因组中的多核苷酸区的转座子序列(图4)。在转染之后，细胞在不存在雷帕霉素及多西环素下扩增2天且选择为组成性红色的纯系。接着用用于表达Cre重组酶的构建体瞬时转染阳性纯系以移除剩余基因组DNA及RFP编码区。同时转染含有具有BiTRE启动子的多核苷酸、及在一个方向上编码gag多肽及pol多肽的多核苷酸区以及在另一方向上编码麻疹病毒F蛋白质及H蛋白质的多核苷酸区的另一构建体(图4B)。Cre重组酶将构建体整合至基因组中以产生显示于图4B中的经整合序列。针对在多西环素及雷帕霉素的存在下的蛋白表达评估所得纯系且通过用于基因组整合的深度测序进行分析。保留剩余TRE回应性GFP位点以用于慢病毒基因组插入。
实施例8.慢病毒载体及反转录病毒包装的产生。
用用于表达Flp重组酶的构建体(图4C)及含有多核苷酸序列的构建体转染实施例7中产生的反转录病毒包装稳定细胞系，该多核苷酸序列编码CAR及在CD3Z启动子(其在HEK293S细胞中无活性)的控制下的淋巴增生性组件IL7Rα-insPPCL，其中CAR及IL7Rα-insPPCL由编码T2A核糖体跳跃序列的多核苷酸序列隔开，且IL7Rα-insPPCL具有阿昔洛韦核糖开关控制的核糖核酸酶。含CAR的构建体进一步包括cPPT/CTS及RRE序列以及编码HIV-1Psi的多核苷酸序列。待被整合至基因组中的含CAR的构建体上的整个多核苷酸序列侧接有FRT位点。含CAR的构建体的成功整合造成因此通过用用于表达Cre重组酶的构建体瞬时转染而移除的GFP的组成性表达。HEK293S株在无血清培养基中生长。在经搅拌槽反应器中生长至峰值细胞密度之后，将细胞稀释至70％峰值细胞密度且用100nM雷帕霉素处理2天以诱导早期基因REV、Vpx及aCD3 scFv CD16B GPI、aCD28 scFv CD16B GPI及IL-7 SD GPIDAF的表达，接着在培养基中添加1μg/mL多西环素以诱导如Gag Pol、MV(Ed)-FΔ30、MV(Ed)-HΔ18及包括治疗性靶标的慢病毒基因组的结构化组件的表达。病毒产量的水平由包装序列的qPCR及p24 ELISA来检查。通过细胞的深度过滤及使用TFF盒的浓缩/渗滤，接着快速冷冻以供装入小瓶来采集病毒。
实施例9.周边血单核细胞(PBMC)分离、转导及表达
以下实施例说明在活体内扩增之前用于活体外处理PBMC的封闭系统的用途。作为一实施例，用酸性柠檬酸盐葡萄糖溶液(ACD)作为抗凝剂自个体抽取30ml至200ml的人类血液至血液收集袋中。替代地，将血液抽取至采血管、注射器或等效物中且转移至空血液收集袋或IV袋中。根据制造商的说明书，在Sepax2细胞处理系统(BioSafe)上使用纯细胞试剂盒(目录号#CS-900.2，Omniamed)处理全部血液。将周边血单核细胞(PBMC)收集至培养袋中，或替代地注射器中。无菌地等份采集以用于细胞计数以测定存活细胞的数目。在具有呈至多200ml最终体积的10IU/ml至300IU/ml IL-2(目录号#202-IL-010，R&D Systems)的X-VIVO 15(目录号#08-879H，Lonza)或CTS OpTmizer细胞扩增SFM(目录号#A1048501，ThermoFisher Scientific)培养基中将呈0.1×106至1.0×106个存活细胞/毫升的最终浓度的PBMC转移至G-Rex100MCS透气细胞培养系统器件(Wilson Wolf)。除IL-2以外，可将CTS免疫细胞SR(目录号#A2596101，Thermo Fisher Scientific)添加至培养基。根据制造商的说明书，封闭G-Rex透气细胞培养系统器件可预涂布有Retronectin(目录号#CH-296，Takara)或类似衍生自纤连蛋白的等效物。
将自周边血液分离的PBMC装载至PALL PBMC过滤器上，经由过滤器用10ml AIM V(Thermo Fisher Scientific)或X-VIVO 15培养基洗涤一次，接着在37℃下以5毫升/小时用10ml至60ml慢病毒原液(如实施例8中所制备)灌注。接着再次用含有重组人类DNase(Pulmozyme，Genentech)的AIM V、CTS OpTmizer T细胞扩增SFM或X-VIVO 15培养基洗涤PBMC，接着用无DNase的林格氏乳酸盐(Lactated Ringers)(目录号#L7500，Braun)洗涤。接着经由过滤器将PBMC反灌注至注射器中。接着经由静脉内输注将细胞(细胞的靶标水平为5×105至1×106个细胞/公斤)再输注至个体中。
根据反转录病毒基因组内含有的核糖开关，将各别核苷类似物抗病毒药物或核苷类似物抗病毒前药(阿昔洛韦、伐昔洛韦、喷昔洛韦及泛昔洛韦)给予个体。可经口每天三次将任何治疗有效剂量(诸如500mg核苷类似物抗病毒药物或前药)给予个体。用核苷类似物抗病毒药物或前药治疗较佳地在再输注之前(诸如2小时前)开始，且也可在再输注的时或再输注一些时间后开始。治疗可继续至少1、2、3、4、5、7、10、14、21、28、30、60、90、120天或5、6、9、12、24、36或48个月或更长。治疗可包括每天一次、两次、三次或四次施用核苷类似物抗病毒药物或前药。在再输注及治疗开始后，经由使用qPCR以定量病毒基因组的量在再输注后第2天、第5天、第7天、第11天、第13天、第18天、第28天及第56天血液计数来测定经感染细胞的数目。经历发热或细胞因子释放综合症的个体可使核苷类似物抗病毒药物或前药的剂量或频率减少或停止。若经感染T细胞未能在第18天扩增10,000至100,000倍，则可增加核苷类似物抗病毒药物或前药的剂量或频率。可经由FDG PET成像及连续CT扫描来量测个体的临床反应。可在经延长缓解期后或在过量T细胞传播超出总周边T细胞计量的30％的情形下减少或停止核苷类似物抗病毒药物或前药的口服剂量
实施例10.增加血管或组织pH的治疗性干预。
为减少抗原结合域与其同源抗原的结合，将NaHCO3作为IV丸剂或通过IV输注来施用。标准剂量为1mg/kg的体重作为初始剂量，接着每10分钟0.5mg/kg。50毫升丸剂的NaHCO3将增加血清pH大约0.1的pH单位。若pH为7.0，则其需要四个50mEq安瓿的NaHCO3以将pH校正为7.40。
实施例11.测试PBMC中的IL-7受体淋巴增生性/存活组件的活性。
为测试IL-7Rα变体的其介导T细胞的细胞因子非依赖性存活的能力，用酸性柠檬酸盐(ACD)作为抗凝剂将三十毫升人类血液抽取至采血管中。遵循制造商的说明书使用用Ficoll-PacqueTM(General Electric)的密度梯度离心来处理全部血液，以获得周边血单核细胞(PBMC)。将PBMC的等份与X-VivoTM 15培养基(Lonza)一起无菌地转移至12孔组织培养盘的孔，至含50万存活细胞/毫升的1mL最终体积中的最终浓度。还将重组人类白细胞介素-2(IL-2)(Novoprotein)添加至浓度为100IU/ml的一些样本。在50ng/ml的浓度下添加活化抗CD3 Ab(OKT3，Novoprotein)，以活化PBMC以供病毒转导。在37℃及5％二氧化碳下在标准湿润组织培养培育箱中培育盘隔夜。在培育隔夜之后，在5重感染(MOI)下将含有所要测试构建体(图19A)的慢病毒颗粒制剂添加至个别孔。在37℃及5％二氧化碳下在标准湿润组织培养培育箱中培育盘隔夜。在培育隔夜之后，收集12孔盘的孔中的每一者的内含物且离心以获得丸粒。用D-PBS+2％人类血清白蛋白(HSA)洗涤样本一次，将其再悬浮于X-Vivo15TM培养基中，且转移至
Figure BDA0002257374180001511
6-孔透气细胞培养器件(Wilson Wolf)的孔。添加额外X-VivoTM15培养基以使各孔的最终体积达至30ml。将构建体中的每一者的匹配对照样本转移至
Figure BDA0002257374180001512
6-孔透气细胞培养器件(Wilson Wolf)的孔且添加额外培养基以用针对一些对照样本的100IU/ml IL-2使最终体积达至30ml。在37℃及5％二氧化碳下在标准湿润组织培养培育箱中培育
Figure BDA0002257374180001513
器件7天。在培养期间每2至3天将新鲜IL-2添加至含有IL-2的对照样本。不具有IL-2的经匹配测试样本不进行补充。移除样本以供在扩增期间(Countess，ThermoFisher)在第7天追踪细胞数目及存活率。
图19A提供所测试的IL7Rα构建体的示意图。将这些构建体插入至重组慢病毒基因组中。复制缺陷型重组反转录病毒颗粒用于转导PBMC。图19A显示野生型IL7Rα(SEQ ID NO:229)的示意图，其由信号序列(SS)、胞外域(ECD)、跨膜(TM)域及胞内域(ICD)组成。“1”指示纤连蛋白III型域的位点；“2”指示WSXWS基元的位点；“3”指示Box 1位点；“4”指示蛋白激酶C(PKC)磷酸化位点的位点；及“5”指示Box 2位点。
变体“A”为在位置243处具有InsPPCL(Shochat等人2011,J.Exp.Med.Vol.208No.5901-908)但不具有S185C突变的IL-7Rα，其在具有GFP多肽、GSG接头及与其N端融合的P2A核糖体跳跃序列的转录物上表达。变体“B”为具有GFP多肽、GSG接头及与其N端融合的P2A核糖体跳跃序列以及信号序列与胞外域之间的Myc标记的IL-7RαInsPPCL。变体“C”类似于变体“B”，除其胞内域在位置292处截短以外。变体“D”类似于变体“A”，除其胞内域在位置292处截短以外。变体“E”为在其N端处截短使得信号序列及大部分胞外域(残基1至残基228)不存在的IL-7RαInsPPCL变体；变体“E”自胺基端依次还具有GFP多肽、GSG接头、P2A核糖体跳跃序列及与N端融合的eTag。氨基酸残基的编号基于IL7Rα(NCBI GI第002176.2号)。使用Trypan Blue排除法针对在存在或不存在IL-2下的存活率测试含有变体中的每一者的T细胞。
如图19B中所显示，PBMC需要IL-2以供活体外存活。如图19B中所说明，未转染PBMC在转导后第7天在存在IL-2下具有约80％存活率且在不存在IL-2下具有0％存活率。具有IL-7RαInsPPCL(图19A中的IL-7Rα变体A及B)的全长版本的PBMC在转导后第7天在不存在IL-2下具有大于20％的存活率，从而指示组成性活性IL-7RαInsPPCL受体的表达在这些细胞中具有存活活性。此外，相比于野生型IL-7受体，表达具有经截短胞内域(ICD)的IL-7RαInsPPCL(图19A中的IL-7Rα变体C及D)变体的T细胞在转导后第7天具有增加的存活率。最后，如图19B中显示的N端IL-7受体突变体(图19A中的IL-7Rα变体E)在这些细胞中具有存活活性。因此，此实施例说明，当在PBMC中表达时IL-7受体具有存活活性。
实施例12.通过用VSV-G假型化且在其表面上表达抗CD3 scFvFc的反转录病毒颗粒转导新鲜经分离及未经刺激的人类T细胞的效率。
重组慢病毒颗粒通过用编码gag/pol及rev的单独的慢病毒包装质粒及编码VSV-G的假型化质粒瞬时转染293T细胞(Lenti-XTM 293T，Clontech)来生产。用包装质粒共转染编码GFP、抗CD19嵌合抗原受体及在此称为F1-0-03(图20)的eTAG的第三代慢病毒表达载体(在3’LTR中含有缺失导致自身失活)。细胞通过在FreestyleTM 293 Expression Medium(ThermoFisher Scientific公司)中连续生长来适应悬浮培养。以1×106个细胞/毫升(30mL)在125mL Erlenmeyer烧瓶中接种悬浮液中的细胞，并立即使用溶解于弱酸中的聚乙烯亚胺(PEI)(Polysciences)转染。
对于30mL细胞将质粒DNA稀释于1.5ml GibcoTM Opti-MEMTM培养基中。为获得用VSV-G假型化的慢病毒颗粒，所使用的总DNA(每mL培养体积中1μg)为具有以下穆尔比的4种质粒的混合物：2×基因组质粒(F1-0-03)、1×含Rev的质粒、1×含VSV-G的质粒及1×含gag/pol的质粒。为获得用VSV-G假型化且在其表面上表达抗CD3-scFvFc-GPI的慢病毒颗粒，所使用的总DNA(每mL培养体积中1μg)为具有以下穆尔比的5种质粒的混合物：2×基因组质粒(F1-0-03)、1×含Rev的质粒、1×含VSV-G的质粒、1×含抗CD3-scFvFc-GPI的质粒及1×含gag/pol的质粒。为获得用VSV-G假型化且在其表面上表达抗CD3-scFvFc-GPI及CD80-GPI的慢病毒颗粒，所使用的总DNA(每mL培养体积中1μg)为具有以下穆尔比的6种质粒的混合物：2×基因组质粒(F1-0-03)、1×含Rev的质粒、1×含VSV-G的质粒、1×含抗CD3-scFvFc的质粒、1×含CD80的质粒及1×含gag/pol的质粒。单独地，在1.5ml GibcoTM Opti-MEMTM中稀释PEI至每mL培养体积中2μg(与DNA的比为2:1比率)。在5分钟室温培育之后，将两种溶液彻底地混合在一起，且在室温下培育20分钟。将最终体积(3ml)添加至细胞。接着伴随125rpm的旋转及具有8％CO2、在37℃下培育细胞72小时。含有抗CD3-scFvFc-GPI的质粒包括衍生自OKT3或UCHT1的scFv及GPI锚定连接序列。UCHT1scFvFc-GPI载体编码包括人类Igκ信号肽(NCBI GI第CAA45494.1号的氨基酸1至氨基酸22)的肽(SEQ ID NO:278)，该人类Igκ信号肽与UCHT1 scFv(NCBI GI第CAH69219.1号的氨基酸21至氨基酸264)融合，与具有位置115处的A取代为T的人类IgG1 Fc(NCBI GI第AEV43323.1号的氨基酸1至氨基酸231)融合，该人类IgG1 Fc与人类DAF GPI锚定连接序列(NCBI GI第NP_000565号的氨基酸345至氨基酸381)融合。OKT3scFvFc-GPI载体编码包括人类Igκ信号肽(NCBI GI第CAA45494.1号的氨基酸1至氨基酸22)的肽(SEQ ID NO:279)，该人类Igκ信号肽与OKT3 scFv(SEQ ID NO:285)融合，该OKT3 scFv与人类IgG1 Fc(NCBI GI第AEV43323.1号的氨基酸1至氨基酸231)融合，该人类IgG1 Fc与人类DAF GPI锚定连接序列(NCBI GI第NP_000565号的氨基酸345至氨基酸381)融合。CD80-GPI载体编码包括人类CD80信号肽及与人类CD16b GPI锚定连接序列(NCBI GI第NP_000561号的氨基酸196至氨基酸233)融合的胞外域(NCBI GI第NP_005182号的氨基酸1至氨基酸242)的肽(SEQ ID NO:280)。
在72小时后，采集上清液且通过以1,200g离心10分钟来澄清。将经澄清上清液倒入新试管中。在4℃下，通过以3,300g隔夜离心来沉淀慢病毒颗粒。舍弃上清液，且将慢病毒颗粒丸粒再悬浮于1:100的初始体积的X-VivoTM 15培养基(Lonza)中。利用连续稀释及在转导72小时后的293T及Jurkat细胞中利用流式细胞术分析GFP表达来滴定慢病毒颗粒。
将周边血单核细胞(PBMC)首先自供体12F及供体12M的ACD(酸性柠檬酸盐)试管中的新鲜血液或自供体13F的血块黄层分离，利用加州圣地亚哥血库(San Diego BloodBank,CA)收集并分配。根据制造商的说明书，进行基于SepMateTM 50(StemcellTM)的Ficoll-Paque
Figure BDA0002257374180001521
(GE Healthcare Life Sciences)上的PBMC的梯度密度分离。根据各SepMateTM试管将稀释于PBS-2％HIFCS(热灭活胎牛血清)中的30mL的血液或血块黄层分层。在室温下以1,200g离心20分钟之后，收集PBMC层，经汇集且用45mL的PBS-2％HIFCS洗涤三次，并在室温下以400g离心10分钟。接着在室温下在10mL的RBC裂解缓冲液(Alfa Aesar)中培育丸粒10分钟，且用45mL的PBS-2％HIFCS洗涤额外两次，并在室温下以400g离心10分钟。在以下转导及培养培养基中进行最终洗涤：供体13F的X-VivoTM 15或供体12F及供体12M的RPMI-1640+10％HIFCS。不采取额外步骤以移除单核细胞。在分离之后，新鲜及未经刺激PBMC经再悬浮在各别培养基中达到1×106/mL的最终浓度，且用先前公开的慢病毒颗粒转导这些PBMC(两个重复或三个重复)。使传导在37℃、5％CO2下在供体13F的X-VivoTM 15培养基中或在供体12F及供体12M的RPMI-1640+10％HIFCS中进行14小时传导通常在1毫升/孔的12孔盘形式中在MOI 1下进行。对于动力学实验，0.5×106PBMC/mL是在7mL最终溶液、在MOI1下，伴随125rpm的旋转及具有8％CO2，在37℃下在125mL振荡烧瓶中培育2小时至20小时来转导。在与慢病毒一起培育所选择时间后，用供体13F的X-VivoTM 15培养基或供体12F及供体12M的PBS+2％HIFCS洗涤三次，且最终在37℃，5％CO2下在供体13F的X-VivoTM 15培养基或供体12F及供体12M的RPMI-1640+10％HIFCS中在1×106/mL的细胞密度下培育。在转导后第3天开始，并且从此开始每隔2-3天，将培养基体积加倍且用IL-2补充至最终浓度100U/mL。在转导后的不同天(第3天至第17天)收集样本，以利用GFP表达水平评估所产生的各类型的慢病毒的转导效率。
在转导后的不同天，对于具有或不具有呈1μg/ml的OKT3抗体(Biolegend)下用VSV-G假型化的慢病毒颗粒，VSV-G假型化且在其表面上表达抗CD3 scFvFc-GPI的慢病毒颗粒，或用VSV-G假型化且在其表面上表达抗CD3 scFvFc-GPI及CD80-GPI的慢病毒颗粒，收集100μL的细胞且利用流式细胞术对于CD3+细胞群体中的GFP的表达进行分析。
图21A及图21B分别显示在用所指示慢病毒颗粒转导自供体12M的新鲜经分离及未经刺激PBMC 14小时后第3天、第6天、第9天、第13天及第17天的总CD3+群体中的CD3+GFP+细胞的百分比(％)的直方图及CD3+GFP+群体的每孔绝对细胞数量的直方图。各棒表示重复的平均值+/-SD。图21A及图21B显示，用VSV-G假型化慢病毒颗粒且在慢病毒颗粒的表面上表达抗CD3-scFvFc有效地转导新鲜经分离及未经刺激的PBMC。衍生自OKT3或UCHT1的抗CD3scFv’s在呈scFvFc-GPI的形式时是有效的。
图22A及图22B分别显示在用所指示慢病毒颗粒转导自供体13F的新鲜经分离及未经刺激PBMC 14小时后第3天及第6天的总CD3+群体中的CD3+GFP+细胞的百分比(％)的直方图及CD3+GFP+群体的每孔绝对细胞数量的直方图。请注意，“A”为使用经VSV-G假型化的慢病毒颗粒的结果(三个重复实验)；“B”为在向转导培养基添加OKT3 Ab(1μg/mL)的情况下使用经VSV-G假型化的慢病毒颗粒的结果(两个重复实验)；“C”为使用在其表面上表达经GPI锚定的UCHT1scFvFc的经VSV-G假型化的慢病毒颗粒的结果(三个重复实验)；及“D”为使用在其表面上表达经GPI锚定的UCHT1scFvFc及经GPI锚定的CD80的经VSV-G假型化的慢病毒颗粒的结果(两个个重复实验)。各棒表示两个重复或三个重复的平均值+/-SD，如图22A所指示。图22A及图22B显示，当进行转导14小时时，用VSV-G假型化慢病毒且在其表面上表达抗CD3-scFvFc-GPI及CD80-GPI也有效地转导新鲜经分离及未经刺激的PBM。
图23A及图23B分别显示在用所指示慢病毒颗粒转导自供体12M的新鲜经分离及未经刺激PBMC持续暴露的所指示时间(2小时至20小时)(亦即，细胞与慢病毒颗粒在转导反应混合物中的接触)后第3天、第6天及第9天的总CD3+群体中的CD3+GFP+细胞的百分比(％)的直方图及CD3+GFP+群体的每孔绝对细胞数量的直方图。转导是在如所指示的盘或振荡器烧瓶中进行。各棒表示用VSV-G(“[VSV-G]”)假型化的慢病毒颗粒的两个重复的平均值+/-SD；其他实验不具有重复。图23A及图23B显示，可用用VSV-G假型化及在其表面上表达抗CD3scFvFc及CD80的慢病毒颗粒在少至2小时内有效地转导新鲜经分离及未经刺激的PMBC。
值得注意的是，随后的试验使用仅使用Rev、VSV-G、gag/pol及F1-0-03(而非编码抗CD3或CD80的载体)在存在可溶性抗CD3抗体(100ng/ml)下转导新鲜分离的静息PBMC 2.5小时所产生的慢病毒颗粒来进行。转导使用3种不同的可溶性抗CD3抗体纯系来实现。针对CD3抗体纯系HIT3A、OKT3及UCHT1，在第6天通过CD3+GFP+细胞量测的转导效率分别为4.31％、3.27％及0.52％。在不存在可溶性抗体下的背景转导效率为0.06％。
实施例13.插入至EF-1α启动子内含子中的miRNA的功能性。
设计四个单独
Figure BDA0002257374180001531
基因片段，各自含有包括miR-155 5’侧接序列或“5’臂”(SEQ ID NO:256)及miR-155 3’侧接序列或“3’臂”(SEQ ID NO:260)的miR-155框架。对于各
Figure BDA0002257374180001532
靶向CD3zeta mRNA转录物的唯一miRNA片段用于替换miR-155茎-环前体。各
Figure BDA0002257374180001537
含有经设计以有助于将全部四个
Figure BDA0002257374180001533
作为单链组装至EF-1α启动子内含子中的40bp重叠序列。使用用于进行
Figure BDA0002257374180001534
组装ultra的商用试剂盒(NEBuilder，New EnglandBiolabs，Inc.)来组装
Figure BDA0002257374180001535
含有miRNA(在序列SEQ ID NO:255中)的合成EF-1α启动子及内含子A为驱动慢病毒载体主链中所含有的GFP及eTag的表达的转殖基因表达盒(cassette)的部分(具有由西妥昔单抗识别的GFP及例示性eTag的慢病毒载体主链在此称为F1-0-02；图24A及24B)。在表3中指示的SEQ ID NO:255中的各
Figure BDA0002257374180001536
及其各别组分的核苷酸位置为图24B中的各“特征”的位置。将四个miRNA适当组装至慢病毒载体主链中是通过对经修饰的EF-1α启动子及内含子区进行全面测序来确认的。
Figure BDA0002257374180001541
表3.SEQ ID NO:255中的特征的核苷酸位置
在其基因中含有编码针对CD3zeta的四个miRNA的核酸的复制缺陷型慢病毒颗粒通过将以下四个质粒瞬时共转染至悬浮HEK293细胞中来产生：含有编码经修饰以包括靶向CD3zeta mRNA转录物的四个miRNA的F1-0-02的核酸的质粒，编码VSV-G的质粒，编码REV的质粒及编码GAG-POL的质粒。在48小时后采集慢病毒颗粒上清液且经PEG沉淀24小时。离心上清液，且将成丸粒慢病毒颗粒再悬浮于不具有IL-2的完全PBMC生长培养基中。利用Jurkat细胞的48小时转导来计算慢病毒颗粒效价。
对于转导，在第0天融解PBMC且与100U/mL的hrIL-2一起培育24小时。在第1天，经由经CD3/CD28结合的珠粒活化PBMC。在第2天，在10MOI下用含有具有编码miRNA的核酸序列的基因组的慢病毒颗粒转导经活化PBMC。扩增细胞直至第11天，其中每两天添加新鲜hrIL-2。在第7天、第9天及第11天，采集1百万个细胞以供FACS分析。
针对CD3 Epsilon表面表达，使用经PE结合的OKT-3抗体(Biolegend)染色细胞。表达水平是利用GFP阳性群体(经转导细胞)中的PE的平均荧光强度来测定。在衍生自F1-0-02的反转录慢病毒颗粒与衍生自F1-0-02的反转录慢病毒颗粒之间比较经转导细胞的表达水平，其中将编码连续定位的CD3z miRNA核酸序列插入至EF-1α启动子及内含子A中。
结果显示于图25中。此数据显示，靶向由EF-1α启动子内含子A内的核酸序列编码的CD3zeta的连续miRNA在基因敲除CD3复合物的表达时有效。
实施例14.插入至EF-1α启动子内含子中的连续抑制性RNA的位置独立性
克隆
四个表达miRNA的慢病毒载体构建体经设计以测试在包含连续的4个miRNA前体的结构中的个别miRNA前体的处理。表4显示个别构建体的名称及各构建体中的miR-TCRα的位置。
构建体 位置1 位置2 位置3 位置4
TCRa-P1 miR-TCRa miR-155 miR-PD-1 miR-CTLA-4
TCRa-P2 miR-155 miR-TCRa miR-PD-1 miR-CTLA-4
TCRa-P3 miR-155 miR-PD-1 miR-TCRa miR-CTLA-4
TCRa-P4 miR-155 miR-CTLA-4 miR-PD-1 miR-TCRa
表4.含有多顺反子miRNA的构建体
各miRNA含有用于实施例13中的miR-155框架，亦即，miR-155 5′臂(SEQ ID NO:256)、miR-155 3′臂(SEQ ID NO:260)、环(SEQ ID NO:258)及如表5中所显示的茎序列的特异性次序。类型II组装方法用于达成将四个miRNA片段组装至慢病毒载体构建体(F1-0-02；提供于实施例13中且显示于图24A中)的EF-1α内含子内的其合适位置中。
Figure BDA0002257374180001551
Figure BDA0002257374180001561
其中：
SEQ ID NO:267＝TCRαmiRNA茎1；ATATGTACTTGGCTGGACAGC
SEQ ID NO:268＝TCRαmiRNA茎2；GCTGTCCACAAGTACATAT
SEQ ID NO:269＝接头1；CACATTGGTGCCGGATGAAGCTCTTATGTTGCCGGTCAT
SEQ ID NO:270＝mir-155茎1；CTGTTAATGCTAATCGTGATA
SEQ ID NO:271＝mir-155茎2；TATCACGATTATTAACAG
SEQ ID NO:272＝接头2；GTTGCCGGAGTCTTGGCAGCGAGAGATCACTATCAACTAA
SEQ ID NO:273＝PD-1miRNA茎1；TACCAGTTTAGCACGAAGCTC
SEQ ID NO:274＝PD-1miRNA茎2；GAGCTTCGCTAAACTGGTA
SEQ ID NO:275＝接头3；GTGTTAATTGTCCATGTAGCGAGGCATCCTTATGGCGTGG
SEQ ID NO:276＝CTLA-4miRNA茎1；TGCCGCTGAAATCCAAGGCAA
SEQ ID NO:277＝CTLA-4miRNA茎2；TTGCCTTGTTTCAGCGGCA
表5：miRNA构建体中的序列
慢病毒颗粒产生
四个构建体及对照F1-0-02(其不包括编码miRNA的核酸序列)用于在293T细胞的30mL悬浮培养物中产生慢病毒颗粒。采集慢病毒颗粒且利用PEG沉淀浓缩。功能性慢病毒颗粒效价通过在多次稀释(1:1000、1:10000、1:100000)下转导Jurkat细胞，在37℃下培育慢病毒颗粒及细胞2天，用FACS缓冲液洗涤细胞2×及利用流式细胞术分析GFP来获得。关于慢病毒颗粒产生的其他细节在本文实施例13中提供。
转导
对于转导，融解PBMC且在含有100U/mL hrIL-2的完全培养基中回收隔夜。经由暴露于经CD3/CD28结合的珠粒24小时来活化1×105PBMC。在MOI 10下用四个miRNA构建体中的每一者或用对照反转录病毒颗粒F1-0-02在两个重复孔中转导细胞。每3天用100U/mLhrIL-2供应细胞且扩增这些细胞直至第10天。
FACS
采集细胞以供FACS分析，该FACS分析确认用复制缺陷型慢病毒载体转导的细胞。结果显示，在实验中将大约等量的含有miRNA的病毒递送至各孔。
细胞-对-ct miRNA RT-qPCR及分析
RT-qPCR分析经设计以检测表达及将miRNA前体加工为经成熟加工的miR。通过首先将所有miR-TCRa ct值归一化为RNU48内部对照以产生ΔCt值来进行分析。接着，自未经转导的对照的ΔCt减去各经转导样本的ΔCt值以产生ΔΔCt。此值表示各经转导样本相对于未经转导的对照中的经加工miR-TCRa miRNA的量。
如图26中所显示，RT-qPCR分析成功地检测到用含有miR-TCRα的复制缺陷型慢病毒颗粒转导的样本中的经加工miR-TCRα。此外，结果清晰地指示，在所测试的四个位置中的任一者处的miRNA TCRα加工中无显著影响。
实施例15.受微环境限制的生物的表达CAR的T细胞的细胞毒性活性可通过改变pH来控制。
以下实施例说明，表达MRB-CAR的经转导T细胞(也称为效应细胞)的细胞毒性活性可如何通过改变微环境的pH来调节。在此实施例中，编码能够结合同源抗原靶标1(抗靶标1)的MRB-CAR的核酸为用于产生复制缺陷型重组慢病毒颗粒。用慢病毒颗粒转导淘选T细胞，且在改变培养基的pH之前及之后使用实时细胞分析(RTCA)来比较效应细胞的细胞毒性活性。
复制缺陷型重组慢病毒颗粒的产生
测试编码T1B的核酸(实施例3中的来自候选MRB-CAR的系列的抗靶标1MRB-CAR)。复制缺陷型重组慢病毒颗粒是通过用慢病毒表达载体及核酸瞬时转染Lenti-X 293T细胞(Clontech，加州山景城)来产生，这些核酸包括编码MRB-CAR或对照物C1(含有GMCFsp及eTAG(SEQ ID NO:284))的区段，但不包括抗靶标1MRB-CAR。细胞通过在Freestyle293Expression Medium(ThermoFisher Scientific，马萨诸塞州沃尔瑟姆)中连续生长来适应悬浮培养。使用溶解于弱酸中的PEI(Polysciences，Warminster，PA)转染悬浮液中的细胞。细胞(30mL)在125mL Erlenmeyer烧瓶中生长至1×106个细胞/毫升。
对于30mL细胞将总DNA稀释于1.5ml Optimem培养基中。总DNA(每mL培养体积中1μg)为具有以下摩尔比的4种质粒的混合物：包括慢病毒包装组件、LTR及编码T1B的核酸的2×基因组质粒，1×编码Rev的质粒，1×编码VSVg的质粒及1×编码Gagpol的质粒。单独地，在1.5ml Optimem中稀释PEI至每mL培养体积中2μg(与DNA的2:1比率)。在5分钟室温培育之后，将两种溶液充分混合在一起，且在室温下培育20分钟。将最终体积(3ml)添加至细胞。接着伴随120rpm的旋转及具有5％至8％CO2、在37℃下培育细胞72小时。
在72小时后，通过以1,000g离心10分钟来采集上清液。将上清液倒入新鲜试管且添加PEG溶液(PEG-IT，System Biosciences)中的1/4上清液体积。通过在4℃下培育隔夜来沉淀复制缺陷型重组慢病毒颗粒，接着在4℃下以1,500g离心20分钟。移除上清液，且将细胞再悬浮于1:100体积的X-VIVO 15培养基中。利用Jurkat细胞中的eTAG表达滴定病毒。
T细胞转导/扩增
自AllCells获得淘选T细胞。如上论述制造抗靶标1 MRB-CAR复制缺陷型重组慢病毒颗粒。在慢病毒转导前两天，融解细胞且在X-VIVO 15培养基(Lonza，Basel，Switzerland)中与5％人类血清(Valley Biomedical Inc.，Winchester，VA)及10mM N-乙酰基L-半胱氨酸(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)一起培养。添加重组人类IL-2(R&DSystems，明尼苏达州明尼阿波利斯)达到100IU/mL的最终浓度。在慢病毒转导前二十四小时，将初级人类T细胞以0.5×106个细胞/孔接种至12-孔盘中且在1:3细胞:珠粒比率下使用Dynabeads人类T-活化子CD3/CD28(ThermoFisher Scientific)来活化。在转导当天，在5MOI下将慢病毒颗粒溶液添加至孔。使经传导淘选T细胞在X-VIVO 15培养基中维持～106个/mL持续3天，接着用100IU/mL IL-2转移至具有30毫升/孔的X-VIVO 15培养基的6-孔G-Rex盘中。在进行实验之前培养细胞至少10天，且每隔一天添加IL-2。
pH变化细胞毒性分析
通过添加NaHCO3或NaOH改变pH之前及之后的经转导T细胞的细胞毒性活性是使用xCELLigence系统来量测。简言之，在实验前一天，用含有40mM HEPES及40mM PIPES(pH6.7)的X-VIVO 15培养基将靶标细胞(用在细胞表面上表达靶标1的构建体稳定地转染的CHO细胞(CHO-靶标1细胞))以10,000个细胞/孔接种至96-孔E-盘(ACEA；加州圣地亚哥)中。融解先前用含有编码如上论述产生的T1B或C1(分别为T1BVP及C1VP)的核酸的慢病毒颗粒转导的经冷冻保存的效应细胞且在含有100IU/mL的IL-2(R&D Systems，明尼苏达州明尼阿波利斯)的X-VIVO 15培养基中培养两天。在实验当天，洗涤用T1BVP或C1VP转导的细胞且将其再悬浮于含有40mM HEPES及40mM PIPES(pH 6.7)的X-VIVO 15培养基中，且接着以1:1的效应细胞/靶标细胞比率(E/T)添加至实验孔中。
每5分钟获取在xCELLigence系统(ACEA)上量测的阻抗读数且报告为细胞指数(CI)以定量细胞汇合度作为细胞增生/细胞裂解的量测。添加效应细胞后大约3小时，将8μl的7.5％NaHCO3或14μl的0.5M NaOH添加至具有含有40mM HEPES及40mM PIPES(pH 6.7)的X-VIVO 15培养基的孔中以将pH自6.7增加至7.4。在添加效应细胞后继续阻抗读数大约20小时。如下计算特异性细胞溶解的百分比：((CI靶标+经C1VP转导的效应T细胞)-(CI靶标+经T1BVP转导的效应T细胞))/(CI靶标+经C1VP转导的效应T细胞)×100。
对RTCA杀伤分析的HCl切换
通过添加HCl改变pH之前及之后的经转导T细胞的细胞毒性活性是使用xCELLigence系统来量测。简言之，在实验前一天，用含有40mM HEPES及40mM PIPES(pH7.4)的X-VIVO 15培养基将CHO-靶标1细胞以10,000个细胞/孔接种至96-孔E-盘。融解先前用C1VP或T1BVP转导的经冷冻保存的效应细胞且在含有100IU/mL的IL-2的X-VIVO 15培养基中培养两天。在实验当天，洗涤用T1BVP或C1VP转导的细胞且将其再悬浮于含有40mMHEPES及40mM PIPES(pH 7.4)的X-VIVO 15培养基中，且接着以1:1的效应细胞/靶标细胞比率(E/T)添加至实验孔中。
每5分钟获取阻抗读数且报告为细胞指数(CI)。添加效应细胞后大约3小时，将8μl的1M HCl添加至具有含有40mM HEPES及40mM PIPES(pH 7.4)的X-VIVO 15培养基的孔中以将pH自7.4切换至6.7。在添加效应细胞后继续阻抗读数大约20小时。如下计算特异性细胞溶解的百分比：((CI靶标+C经1VP转导的效应T细胞)-(CI靶标+经T1BVP转导的效应T细胞))/(CI靶标C1VP)×100。
结果
在pH 6.7及pH 7.4下比较能够在降低的pH下结合具有增加的活性的同源抗原靶标1的MRB-CAR的细胞毒性活性。用编码抗靶标1MRB-CAR的慢病毒颗粒转导的T细胞是用于杀伤表达靶标1的CHO细胞，且接着增加pH以测定细胞毒性活性是否可由pH变化抑制。如图27A及图27B中所显示，添加NaHCO3或NaOH至活性CAR-T细胞的微环境以增加培养基的pH抑制了表达MRB-CAR的T细胞的细胞毒性活性。这些结果显示，表达活性MRB-CAR的T细胞可杀伤表达靶标的细胞，且接着此杀伤活性可通过增加微环境的pH来抑制。
也测定了待利用pH变化活化的表达MRB-CAR的T细胞的细胞毒性活性的能力。如图27C中所显示，表达抗靶标1MRB-CAR的T细胞的对于CHO-靶标1细胞的细胞毒性活性在7.4的pH较低且该活性是通过添加HCl以降低微环境的pH来增加。此外，这些结果显示，表达MRB-CAR的T细胞的细胞毒性活性可由微环境内的pH的变化(通过在增加pH后降低细胞毒性活性及在减少pH后增加细胞毒性活性两者)来调节在此非限制实施例中，pH自pH 6.7增加且自pH 7.4减少。
实施例16.碳酸氢盐施用可增加小鼠中的微环境的pH。
以下实施例显示，活体内肿瘤微环境的pH可通过施用药用试剂来调节。在此实施例中，药用试剂为碳酸氢钠，且肿瘤微环境为小鼠中的CHO异种移植肿瘤。该实施例包括量测活体内及活体外两者的肿瘤微环境的pH的两种方法。
大多数实体肿瘤的胞外微环境是酸性的，通常具有在6.5与6.9之间的pH。相反，正常组织pH系碱性的，通常具有在7.2与7.5之间的pH。然而，直接地量测肿瘤微环境的活体内pH可能为困难的。幸运的是，组织蛋白酶的相关蛋白酶活性在较低pH下较高且在较高pH下较低。因此，肿瘤内组织蛋白酶活性的量测可充当肿瘤微环境的pH的替代量测。为量测组织蛋白酶B、组织蛋白酶L、组织蛋白酶S、组织蛋白酶K、组织蛋白酶V及组织蛋白酶D的活体内活性，使用近红外ProSense 750 FAST探针(PerkinElmer)。为进一步确认利用碳酸氢钠的施用的肿瘤微环境中的pH的调节，用酚红处理所切除肿瘤并注意颜色。酚红为经历pH有关的颜色转换的pH指示剂。酚红的钠盐广泛用于细胞培养培养基中以鉴别pH值。酚红的溶液在6.4或更低的pH下呈黄色颜色，或在约pH 7.0下呈橙色颜色，在约pH 7.4下呈红色颜色及在高于pH 7.8下紫色颜色。
根据研究所动物看护与使用委员会(Institutional Animal Care and UseCommittee)批准的方案来处理小鼠。皮下(sc)中国仓鼠卵巢(CHO)肿瘤异种移植建立于12周龄至14周龄雌性B-NSG小鼠(NOD-PrkdcscidIl2rgtm1/Bcgen(北京百奥赛图基因生物技术有限公司))的后腿中。简言之，在DPBS(ThermoFisher)中洗涤经培养CHO细胞(ATCC，弗吉尼亚州马纳萨斯)，经计数，并再悬浮于冷DPBS中且在冰上在1.5×106个细胞/200微升的浓度下与合适体积的Matrigel ECM(Corning；最终浓度5mg/mL)混合。
动物用于在注射之前移除毛发(Nair)的情况下使用标准经批准的麻醉的注射。将含200μl的细胞悬浮液的ECM皮下注射至小鼠的后腿中。一旦肿瘤可触，使用侧径计2次/周量测肿瘤。使用以下方程式计算肿瘤体积：(最长直径*最短直径2)/2。当平均肿瘤体积达到200mm3时，将小鼠随机地分配至各别处理组。
在施用碳酸氢盐前两天，将B-NSG小鼠的饮用水自酸性改变为常规pH的经高压灭菌纯化的水。在随后一天，经由100μl尾部静脉注射(4nmol ProSense 750FAST探针/100μlPBS)将750 ProSense FAST探针施用至6个携带有CHO-异种移植肿瘤的小鼠。使单独一组的携带有CHO-异种移植肿瘤的小鼠未经处理。在随后一天，施用碳酸氢钠且使用CaliperIVIS Lumina XR对用ProSense 750 FAST探针处理的小鼠进行成像。简言之，使用含3％O22L/min异氟烷的O2载气以2L/min麻醉小鼠，且接着置放向成像期间经麻醉小鼠供应1.5％异氟烷的鼻锥。图像采集由5秒的近红外探针(745/810nm激励/发射波长)的暴露组成。将荧光图像覆盖在小鼠的正常光图像上。在施用PBS(对照)或碳酸氢钠之前获取时间0(处理前)图像。接着经由腹膜内注射(ip)向小鼠施用1毫升/小鼠PBS(对照，ThermoFisher)或1毫升/小鼠1M碳酸氢钠(Shanghai Experiment Reagent Co.,LTD)。接着在施用PBS或碳酸氢盐后30min对小鼠进行成像。调整所收集荧光图像以具有相同的最小值、最大值及临限值。在此研究中将光子计数定义为相对荧光单位(RFU)。通过将各小鼠中的来自30min时间点的光子计数归一化为处理前时间点(时间0；100％)来计算RFU。由于时间0处理前值处的各小鼠中的荧光值之间的可变性，不同时间点处的所观测荧光强度值仅针对个别小鼠归一化而不针对处理前值。
在实验的单独臂中，未接受NIR组织蛋白酶探针的6只小鼠在腹膜内施用PBS或碳酸氢钠后1.5小时利用颈椎脱位来安乐死。自各小鼠切除CHO异种移植肿瘤。用解剖刀将异种移植肿瘤分成两半且置放于皮式培养皿(petri dish)上。接着使用解剖刀重复地切割/分割肿瘤组织半部。将水或0.05％酚红溶液(50mg酚红/100ml水)分别逐滴添加至各肿瘤半部。注意颜色，且在移除肿瘤异种移植样本后，即获取经处理肿瘤异种移植及留在皮式培养皿上的酚红溶液的图像。
结果
图29显示来自在施用PBS(对照；n＝3)或碳酸氢盐(n＝3)之前及之后携带CHO-异种移植肿瘤的小鼠中的成像肿瘤内组织蛋白酶活性的RFU结果(具有SEM的平均值)。这些结果表明，碳酸氢钠施用可增加活体内肿瘤微环境的pH，如由在腹膜内碳酸氢钠施用后观测到的降低的组织蛋白酶活性所证明。
使用自相对于经PBS处理的小鼠(n＝3)的经碳酸氢钠处理的小鼠(n＝3)切除的肿瘤组织观测到酚红指示剂自黄色/橙色变为红色的颜色改变。这些结果表明，在腹膜内施用后，碳酸氢钠施用增加活体内肿瘤微环境的pH，如由酚红指示剂自黄色/橙色变为红色的颜色改变所证明。
实施例17.候选嵌合多肽淋巴增生性组件的识别
在此实施例中，候选(推定)嵌合淋巴增生性组件的两个嵌合多肽库(库1及库2)经组装至来自胞外-跨膜阻断序列库、胞内阻断序列库及根据图30及图31中所提供的编码嵌合多肽的构建体的条形码库的病毒载体中。库转导的PBMC的增生随时间进行：以一周间隔自PBMC提取基因组DNA且扩增条形码区以用于DNA测序以估计在这些混合的含有测试候选嵌合淋巴增生性组件中的每一者的PBMC培养物中的细胞数目。因此，筛选测试候选嵌合淋巴增生性组件在不存在IL-2或任何其他外源性细胞因子下促进PBMC细胞增生的能力。
在此研究中制备且分析两个库：库1(其用于识别为库1A、1.1A及1.1B的筛选中)的构建体在候选嵌合多肽的5’末端处侧接有CAR，而库2(其用于识别为库2B及2.1B的筛选中)的构建体不包括CAR(图30及图31)。图30提供含有多核苷酸序列的非限制性例示性转基因表达盒的示意图，该多核苷酸序列编码由慢病毒载体主链中的EF-1α启动子及Kozak类型序列(GCCGCCACC(SEQ ID NO:519))驱动的库1的CAR及候选嵌合淋巴增生性组件。CAR经FLAG标记且含有针对CD19的ASTR、CD8的茎及跨膜部分，及来自CD3z的胞内活化域。库1的各候选淋巴增生性组件包括3个模块：一个胞外/跨膜模块(P1-2)及2个胞内模块(P3及P4)。P1-2模块还编码识别和/或消除域(TAG)。三重终止序列(TAATAGTGA(SEQ ID NO:520))自DNA条形码(P5)中分离P4。WPRE
(GTCCTTTCCATGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCTG(SEQ ID NO:521))存在于最后一个终止密码子(开始于最后一个终止密码子的最后一个核苷酸之后的4bp)与3’LTR(其开始于WPRE的最后一个核苷酸之后的83个核苷酸)之间。
库1的CAR及P1-2通过编码T2A核糖体跳跃序列的多核苷酸序列间隔开。
图31提供含有多核苷酸序列的非限制性例示性转基因表达盒的示意图，该多核苷酸序列编码由慢病毒载体主链中的EF-1α启动子及Kozak类型序列(GCCGCCACC(SEQ ID NO:519))驱动的库2的候选CLE。库2的各候选淋巴增生性组件包括3个模块：一个胞外/跨膜模块(P1-2)及2个胞内模块(P3及P4)。P1-2模块还编码识别和/或消除域(TAG)。三重终止序列(TAATAGTGA(SEQ ID NO:520))自DNA条形码(P5)中分离P4。WPRE
(GTCCTTTCCATGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCTG(SEQ ID NO:521))存在于最后一个终止密码子(开始于最后一个终止密码子的最后一个核苷酸之后的4bp)与3’LTR(其开始于WPRE的最后一个核苷酸之后的83个核苷酸)之间。
两个库的经组装候选嵌合多肽部分遵循具有3个位置(1个胞外/跨膜模块(P1-2)及2个胞内模块(P3及P4)，其中的一者可为提前终止信号)的完全相同的设计。包括由各域中的每一者之间的核酸序列编码的GGS接头作为构建体组件产物。编码Myc或eTAG识别和/或消除域(在表6中称为“eTAG”或“Myc Tag”)的完整或变体形式的核酸经插入各截短细胞因子受体(或选择LMP1构建体)的胞外域的5’作为P1-2模块的部分，以使得所编码的候选嵌合多肽在具有胞外域的框中包括识别和/或消除域。信号序列插入在库1中的编码CAR序列的5’端处及在库2的编码识别和/或消除域序列的5’端处。也为增强型Kozak类型序列的Kozak类型序列(GCCGCCACC(SEQ ID NO:519))插入在ATG起始密码子之前的10个核苷酸内，该起始密码子在库1中的信号序列编码序列的5’端处及在库2中的编码识别和/或消除域序列(或选择LMP1构建体)的5’端处。第4个模块含有由～10,000×～10,000个子条形码的随机PCR组件产生的随机条形码(～1亿个组合)。库1构建体的CAR的写码序列编码信号序列、FLAG标签、抗CD19 ASTR scFv、CD8a茎、CD8a跨膜域及CD3ζ胞内活化域。CAR(仅库1)及CLE(库1及库2)的表达由EF1α启动子驱动。在库1的构建体中，T2A位点位于CAR与嵌合多肽编码序列之间。在库1及2中，三重终止密码子存在于P4的3’末端处。
病毒载体的合成
库组件的个别部分经设计且合成为具有兼容性IIs型酶(AarI)突出端及在各部分的5’及3’末端上编码甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸序列的连接体的DNA嵌段。随后将这些部分各别选殖至通用质粒载体中。各部分的组件完成为一个管组件，其中将0.04pmol的部分、0.04pmol条形码混合物及0.04pmol质粒载体主链添加至10ul反应物中，接着添加1单位AarI酶、10单位T4 DNA连接酶及1X连接酶缓冲液(50mM Tris-HCl、10mM MgCl2、1mM ATP、10mM DTT)以获得最佳连接酶活性。使用如下的热循环进行分解及连接循环：在37℃下2min及16℃下5min；在50℃下培育5min以最终分解；在80℃下培育10min以使AarI失活，以及最终保持在4℃下的55个循环。随后组装的载体通过习知的乙醇沉淀来纯化。将得到的纯化载体电穿孔(Electro Micropulser，Bio-rad)至Top10电感受态细胞(Thermo FisherScientific)中且直接回收在含有康微素抗生素的液体培养物中以用于选择及扩增。在37℃下培育培养物10至12小时并且随后收集，且使用ZymoPURE-EndoZeroTM质粒Gigaprep试剂盒纯化质粒。
慢病毒颗粒生产
重组慢病毒颗粒是通过用编码gag/pol及rev的单独的慢病毒包装质粒及编码VSV-G的假型化质粒瞬时转染293T细胞(Lenti-XTM 293T，Clontech)来产生。编码具有或不具有共表达嵌合抗原受体的候选嵌合多肽的合成病毒载体用包装质粒共转染。细胞通过在FreestyleTM 293Expression Medium(ThermoFisher Scientific公司)中连续生长来适应悬浮培养。以1×106个细胞/毫升(200mL)在1L Erlenmeyer烧瓶中接种悬浮液中的细胞，并立即使用溶解于弱酸中的聚乙烯亚胺(PEI)(Polysciences)转染。
对于200mL细胞将质粒DNA稀释于10ml GibcoTM Opti-MEMTM培养基中。为获得用VSV-G假型化的慢病毒颗粒，所使用的总DNA(每mL培养体积中1μg)为具有以下穆尔比的4种质粒的混合物：2×组合病毒载体、1×含Rev的质粒、1×含VSV-G的质粒及1×含gag/pol的质粒。单独地，将PEI在10ml GibcoTM Opti-MEMTM中稀释至每mL培养体积中2μg(与DNA的比为2:1比率)。在5分钟室温培育之后，将两种溶液彻底地混合在一起，且在室温下培育20分钟。将最终体积(20ml)添加至细胞中。接着伴随125rpm的旋转及具有8％CO2、在37℃下培育细胞48小时。
在48小时后，采集上清液且通过以1,000g离心10分钟来澄清。随后使病毒上清液经由低蛋白结合的Millex-HV 0.45μm PVDF过滤器(Millipore，目录编号SLHVR25LS)来过滤。将澄清上清液倒入新试管中，使1体积的Lenti-X PEG(Takara，4×)与3体积的澄清上清液混合，并且在4℃下培育隔夜。随后通过以1,500g且在4℃下离心90分钟来沉淀慢病毒颗粒。舍弃上清液，且将慢病毒颗粒丸粒再悬浮于1:100的初始体积的不具有IL-2的完全PBMC生长培养基中。使用来自Takara(#632200)的p24检定ELISA试剂盒来滴定慢病毒颗粒。
PBMC的转导及培养
将来自健康供体的全部人类血液(101ml)收集至200ml含有CDP抗凝剂(Nanger；S-200)的血袋中。遵循制造商的说明书及试剂盒CS900.2(BioSafe；1008)使用Sepax 2S-100器件(Biosafe；14000)使用用Ficoll-PacqueTM(General Electric)的密度梯度离心来处理血液，以获得周边血单核细胞(PBMC)。活PBMC的产量为7.3×107个细胞。将1.5×107个PBMC各自添加至两个G-Rex 100M细胞培养器件(Wilson Wolf，81100S)中以在最终体积30ml的完全OpTmizerTM CTSTM T细胞扩增SFM(根据制造商的说明书的补充有26ml OpTmizerTMCTSTM T细胞扩增补充液(Thermo Fisher，A10484-02)、25ml CTSTM免疫细胞SR(ThermoFisher，A2596101)及10ml CTSTM GlutaMAXTM-I补充液(Thermo Fisher，A1286001)的OpTmizerTM CTSTM T细胞扩增基础培养基1L(Thermo Fisher，A10221))中达到最终浓度0.5×106个活细胞/毫升。还将浓度为100IU/ml的重组人类白细胞介素-2(IL-2)(Novoprotein)以及浓度为50ng/ml的活化抗CD3 Ab(OKT3，Novoprotein)一起添加以活化PBMC用于病毒转导。将G-Rex器件在37℃及5％CO2下在标准湿润组织培养箱中培育隔夜。在隔夜培育之后，在5重感染(MOI)下将含有所要测试编码嵌合多肽的构建体(库1或库2)的慢病毒颗粒制剂添加至个别G-Rex器件中。将G-Rex器件(库1及库2)在37℃及5％CO2下在标准湿润组织培养箱中培育隔夜。在隔夜培育之后，添加额外的完全OpTmizerTM CTSTM T细胞扩增SFM以使各G-Rex器件的最终体积达到500ml。在此或以下细胞培养步骤中不添加额外的IL-2或其他外源性细胞因子。自PBMC分离后，将
Figure BDA0002257374180001611
器件在37℃及5％CO2下在标准湿润组织培养箱中培育7天。在第7天，通过离心自用库1或库2转导的两个G-Rex器件中收集细胞并将这些细胞再悬浮于新鲜的不具有IL-2的完全OpTmizerTM CTSTM T细胞扩增SFM中。将1.25×107个库1细胞及2.54×107的库2细胞置放在含有500ml不具有IL-2的完全OpTmizerTM CTSTM T细胞扩增SFM的新G-Rex 100M器件上。将一小瓶解冻的第0天冷冻供体匹配的PBMC(1.46×107个PBMC)添加至含有用库1转导的细胞的G-Rex器件中以提供对CD19ASTR的CD19+B细胞活化。在这些筛选中，用库数目之后的A指定用PBMC供养的细胞，例如使用用库1转导且用PBMC供养的细胞进行的筛选在本文称为库1A。库2不接受第0天PBMC。在这些筛选中，用库数目之后的B指定不用PBMC供养的细胞，例如使用用库2转导且不用PBMC供养的细胞进行的筛选在本文称为库2B。将G-Rex器件在37℃及5％CO2下在标准湿润组织培养箱中培育隔夜。在第14天，通过离心自两个G-Rex器件(库1A及库2B)中收集细胞并将这些细胞再悬浮于新鲜的不具有IL-2的完全OpTmizerTM CTSTM T细胞扩增SFM中。将这些细胞各自置放在含有30ml不具有IL-2的完全OpTmizerTM CTSTM T细胞扩增SFM的6孔G-rex盘(Wilson-Wolf；80240M)的个别孔中。将一小瓶解冻的第0天冷冻供体匹配的PBMC添加至含有库1A细胞的孔中以提供对CD19 ASTR的CD19+B细胞活化。将G-Rex器件在37℃及5％CO2下在标准湿润组织培养箱中培育隔夜。在第21天，自6孔G-rex盘的各孔收集细胞，并且重复在第14天进行的处理。在转导后的不同天(第7天、第21天、第28天和/或第35天)收集样本(1×105至～4-5×106个细胞)，且根据试剂盒方案使用GenEluteTM哺乳动物基因组DNA微量制剂纯化基因组DNA。在一些情况下，使用用Ficoll-PacqueTM(General Electric)的密度梯度离心来纯化样本以在基因组DNA提取之前移除死亡细胞。使用Illumina HiSeq对纯化的基因组DNA进行测序，产生配对末端150bp读数。通常，从每个索引的fastq文文件中提取一千万个读数的子集，并使用barcode_reader进行分析处理，该barcode_reader为一个自定义的R脚本，用于基于恒定区域的存在提取条形码序列。还将纯化的基因组DNA在PacBio测序系统上测序以获得更长读取长度以将条形码与构建体相关联。重复这些筛选且将这些库指定为1.1A、1.1B及2.1B，其中A及B指示如上文所论述的细胞是否用PBMC供养。
资料分析
一旦获得所有时间点的HiSeq数据后，就基于条形码ID合并条形码计数表。使用下式将计数标准化为“每百万计数”：1×106*原始计数/总和(样本中所有条形码的原始计数)，其称为流行率值。舍弃具有每时间点0.33cpm或更少的平均流行率的条形码。通过SMRT测序(Pacific Biosciences)在选择时间点获得的全长构建体-条形码关联性用于识别感兴趣的组件。过滤掉不具有3个部分的非胜任型构建体或具有超过一个构筑细胞的模糊构建体。各组件的富集值以(最终时间点的标准化计数+1)/(最初时间点的标准化计数+1)计算。候选嵌合多肽基因经识别为富集度高于各库特异性阈值的构建体。
结果
嵌合多肽候选物经指示具有3个测试域，其包括一胞外及跨膜域(P1-2)、第一胞内域(P3)及第二胞内域(P4)(图30及图31)。此外，构建体包括DNA条形码以帮助使用下一代测序来分析且识别构建体。另外，如表6中所示的最多构建体包括在具有胞外域及跨膜域的框中编码识别和/或消除域的核酸序列。然而，编码LMP1的胞外或跨膜片段的那些构建体的识别和/或消除域在含有此类识别和/或消除域的那些构建体的细胞内。库1构建体编码嵌合多肽候选物的上游的CAR。基于20个不同的胞外-跨膜域、106个可能的P3域及107个可能的P4域设计总共226,840个可能的概念化组合，其中一个为终止密码子。在病毒载体组装、慢病毒颗粒产生、PBMC的转导及培养7天后，并非所有概念化构建体均检测到。对于库1A，在转导PBMC及培养7天之后，存在57,815个构建体。对于库2B，在转导PBMC及培养7天之后，存在69,578个构建体。关于分析的候选物的详细信息以及详细结果提供在表7至11中。关于各候选部分的详细信息提供在表6中。表7-11的标题如下：BlockSequence为在各构建体中使用的来自表6的P1-P2、P3及P4域的密码；Norm_D7为在第7天的标准化计数；Enrich_DXX为在第XX天对比第7天的富集度，其中XX为表中指示的当天，例如Enrich_D21为第21天对比第7天的富集度且Enrich_D35为第35天对比第7天的富集度。构建体的资料紧接着该构建体的右行显示。两个构建体的资料显示于各列中。举例而言，在表7中识别的第一候选物为M008-S212-S075。对于此候选物，胞外及跨膜域(P1-2)为M008，第一胞内域(P3)为S212，且第二胞内域(P4)为S075。关于这些模块的身份标识的详细信息(例如M008)可在表6中找到。表6公开M008为LMP1且该构建体包括Myc标签。候选域的氨基酸序列提供于表6中。为清楚说明，表6中的GenBank标识符提供编码多肽域的核酸序列。在一些情况下，核酸序列经修饰以辅助克隆，或用于密码子优化，但编码与GenBank序列相同的多肽。在一些情况下，如由表6中提供的氨基酸序列显而易见，使用由GenBank序列编码的多肽的部分。
候选胞外及跨膜域选自已知的突变受体，诸如已经报导在至少一些细胞类型中表达时为组成性活性的细胞因子或激素受体。配位体结合域不包括在候选胞外及跨膜域中。此类受体突变体中的突变发生在跨膜区或近膜区中。例示性候选胞外及跨膜域包括IL7RAIns PPCL、LMP1、CRLF2 F232C、CSF2RB V449E、CSF3R T640N、EPOR L251C I252C、GHR E260CI270C、IL27RA F523C及MPL S505N。候选胞外及跨膜域包括野生型病毒蛋白LMP1，其为一种已知在靶向脂质筏时或在与CD40融合时活化与配位体无关的细胞信号传导的多重跨膜蛋白(Kaykas等人.EMBO J.20:2641(2001))。
选择占据候选嵌合多肽的第一及第二胞内域的潜在多肽的身份标识为一致的。这些候选胞内域为已知在至少一些细胞类型中促进增生、存活(抗细胞凋亡)和/或提供共刺激信号的基因的胞内信号传导域，该共刺激信号增强分化状态、增生潜能或对细胞死亡的抗性。已知候选嵌合多肽的胞内域中的一些可活化JAK1/JAK2信号传导及STAT5。来自表6中所列出的基因中的一些的胞内域包括在库中。来自这些基因的例示性胞内域提供在表7至11的P3及P4位置。关于这些P3及P4域的详细信息提供在表6中。
对于包括编码嵌合多肽及CAR的构建体的库1A，当在不存在IL-2下培养时识别到在第7天与表上指示的最后一天之间促进PBMC增生至最大程度(及也可能存活)的172个最优候选嵌合多肽(参见表7，其中富集度以Log2(表中所指示的最后一天的标准化计数+1)–log2(第7天的标准化计数+1)计算)。值得注意的是，实施例17及18的此筛选实验或全部筛选实验为竞争性实验。因此，阴性结果并不意味构建体在不存在诸如IL-2的生长因子下不促进T细胞的增生。其仅意味相对于所测试的其他构建体，其在增生方面表达优于其他构建体。
对于库1A，对于在P1-2位置测试的每个胞外及跨膜突变体域，一些嵌合多肽构建体在第7天与表上所指示的最后一天之间促进细胞增生。当将自相同位置P1-2突变体推导的所有构建体的全部结果组合时，所有测试的胞外及跨膜域在第7天与表上所指示的最后一天之间产生大于1的细胞富集度(即促进细胞增生)。存在于促进细胞增生的构建体中的胞外和/或跨膜域或其部分和/或突变体的实例提供于表7中。在称为库1.1A的重复筛选中存在于促进细胞增生的构建体中的胞外和/或跨膜域或其部分和/或突变体的实例提供于表9中。在称为库1.1B(其包括用库1转导不用PBMC供养的细胞)的重复筛选中存在于促进细胞增生的构建体中的胞外和/或跨膜域或其部分和/或突变体的实例提供于表10中。
对于库1A，已知具有信号传导活性的来自CD3D、CD3E、CD8A、CD27、CD40、CD79B、IFNAR1、IL2RA、IL3RA、IL13RA2、TNFRSF8及TNFRSF9的胞内域或其突变体(若此类突变体存在于这些表中提供的构建体中)在发现处于候选嵌合多肽的第一胞内域位置(P3)时在第7天与表上所指示的最后一天之间促进PBMC增生，此时以组合方式考虑具有来自彼基因的第一细胞内域(P3)的所有构建体的数据。此结论基于混合培养的PBMC细胞群体中的构建体的序列计数的富集，当将一个基因的所有构建体的结果组合时，使得对于库1A，在表中指示的最后一天存在的此结构域计数比第7天多至少3倍。存在于促进最高程度的细胞增生的构建体中的第一胞内域或其部分和/或突变体的实例提供于表7中。在称为库1.1A的重复筛选中存在于促进最高程度的细胞增生的构建体中的第一胞内域或其部分和/或突变体的实例提供于表9中。在称为库1.1B(其包括用库1转导不用PBMC供养的细胞)的重复筛选中存在于促进细胞增生的构建体中的第一胞内域或其部分和/或突变体的实例提供于表10中。
对于库1A，已知具有信号传导活性的来自CD3D、CD3G、CD8A、CD8B、CD27、CD40、CD79B、CRLF2、FCGR2C、ICOS、IL2RA、IL13RA1、IL13RA2、IL15RA、TNFRSF9及TNFRSF18的胞内域或其突变体(若此类突变体存在于这些表中)在发现处于候选嵌合多肽的第二胞内域位置(P4)时在第7天与表上所指示的最后一天之间促进PBMC增生，此时以组合方式考虑具有来自彼基因的第二细胞内域(P4)的所有构建体的数据。此结论基于混合培养的PBMC细胞群体中的构建体的序列计数的富集，当将一个基因的所有构建体的结果组合时，使得对于库1A，在第35天存在的此结构域计数比第7天多至少2.9倍。存在于促进最高程度的细胞增生的构建体中的第二胞内域或其部分和/或突变体的实例提供于表7中。在称为库1.1A的重复筛选中存在于促进细胞增生的构建体中的第二胞内域或其部分和/或突变体的实例提供于表9中。在称为库1.1B(其包括用库1转导不用PBMC供养的细胞)的重复筛选中存在于促进细胞增生的构建体中的第二胞内域或其部分和/或突变体的实例提供于表10中。
特定言的，对于库1A，在具有MPL S505N(MPL原癌基因，具有丝氨酸505突变成天冬酰胺的血小板生成素受体)作为P1-P2模块的5,996个构建体中，165个为阳性的，其定义为对于库1A具有富集度大于二的构建体。在具有CD3D(CD3d分子)作为P3模块的436个构建体中，24个为阳性的。在具有CD3E(CD3e分子)作为P3模块的528个构建体中，17个为阳性的。在具有CD8A(CD8a分子)作为P3模块的261个构建体中，14个为阳性的。在具有CD40(CD40分子)作为P3模块的1,022个构建体中，50个为阳性的。在具有IL3RA(白细胞介素3受体次单元α)作为P3模块的568个构建体中，26个为阳性的。在具有CD79B(CD79b分子)作为P3模块的556个构建体中，27个为阳性的。在具有IFNAR1(干扰素α及β受体次单元1)作为P3模块的131个构建体中，7个为阳性的。在具有IL13RA2(白细胞介素13受体次单元α2)作为P3模块的519个构建体中，33个为阳性的。在具有IL2RA(白细胞介素2受体子单元α)作为P3模块的571个构建体中，28个为阳性的。在具有CD27(CD27分子)作为P3模块的618个构建体中，30个为阳性的。在具有TNFRSF8(TNF受体超家族成员8)作为P3模块的573个构建体中，15个为阳性的。在具有TNFRSF9(TNF受体超家族成员9)作为P3模块的573个构建体中，25个为阳性的。在具有IL13RA2(白细胞介素13受体次单元α2)作为P4模块的360个构建体中，25个为阳性的。在具有IL2RA(白细胞介素2受体次单元α)作为P4模块的490个构建体中，28个为阳性的。在具有IL15RA(白细胞介素15受体次单元α)作为P4模块的489个构建体中，22个为阳性的。在具有CD8A(CD8a分子)作为P4模块的590个构建体中，25个为阳性的。在具有IL13RA1(白细胞介素13受体次单元α1)作为P4模块的619个构建体中，25个为阳性的。在具有CD3G(CD3g分子)作为P4模块的637个构建体中，30个为阳性的。在具有CD3D(CD3d分子)作为P4模块的618个构建体中，37个为阳性的。在具有CD27(CD27分子)作为P4模块的673个构建体中，29个为阳性的。在具有CD79B(CD79b分子)作为P4模块的654个构建体中，33个为阳性的。在具有TNFRSF9(TNF受体超家族成员9)作为P4模块的728个构建体中，30个为阳性的。在具有CD40(CD40分子)作为P4模块的1,169个构建体中，53个为阳性的。在具有TNFRSF18(TNF受体超家族成员18)作为P4模块的1,324个构建体中，54个为阳性的。在具有CD8B作为P4模块的1,739个构建体中，73个为阳性的。在具有CRLF2作为P4模块的286个构建体中，8个为阳性的。在具有FCGR2C作为P4模块的725个构建体中，29个为阳性的。在具有ICOS作为P4模块的602个构建体中，24个为阳性的。
对于库1A及1.1A，构建体M001-S116-S044、M024-S192-S045、M001-S047-S102、M048-S195-S043、M012-S216-S211及M030-S170-S194在两次筛选中具有尤其值得注意的富集度。出于重复筛选的目的，具有尤其值得注意的富集度的构建体为具有log2((在最后一天的标准化计数数据+1)/(在第7天的标准化计数数据+1))值大于2的那些构建体。
关于在对库1A及库1.1A两者的筛选中的具有尤其值得注意的富集度的构建体中的第一及第二胞内域的其他信息提供于表19中，包括第一及第二胞内域来源的基因，第一和/或第二胞内域是否为细胞因子受体，且第一和/或第二胞内域是否具有至少一个ITAM基元。具有来自IL6R、MYD88、CD27、MYD88、TNFRSF18或IL31RA的胞内域的构建体存在于第一胞内域(P3)时，且具有来自CD8B、IL1RL1、CD8A、TNFRSF4或MYD88的胞内域的构建体存在于第二胞内域(P4)时，在库1A及1.1A两者中显示尤其值得注意的富集度(表19)。具有来自细胞因子受体IL6R、CD27、TNFRSF18或IL31RA的结构域的构建体存在于第一胞内域(P3)时，且具有来自细胞因子受体IL1RL1或TNFRSF4的结构域的构建体存在于第二胞内域(P4)时，在库1A及1.1A两者中显示尤其值得注意的富集度(表19)。
在包括编码嵌合多肽且不编码CAR的构建体的库2B中，当在不存在IL-2下培养时识别到在第7天与表上指示的最后一天之间促进PBMC增生的167个最优候选物(参见表8，其中富集度以Log2(表上所指示的最后一天的标准化计数+1)–log2(第7天的标准化计数+1)计算)。值得注意的是，一般富集度小于针对库1A构建体(包括CAR)发现的彼富集度。
对于库2B，在P1-2位置中的CSF3R T640N在第7天与表上所指示的最后一天之间促进细胞增生比其他所测试的胞外及跨膜(P1-2)域更佳，当将来自胞外及跨膜域的所有构建体的所有结果组合时，产生大于2.5的富集因子。存在于促进最高程度的细胞增生的构建体中的胞外及/跨膜域或其部分和/或突变体的实例提供于表8中。存在于在称为库2.1B的重复筛选中促进最高程度的细胞增生的构建体中的胞外和/或跨膜域或其部分和/或突变体的实例提供于表11中。
对于库2B，已知具有信号传导活性的来自CD8A、CD40、IFNAR1、IL31RA及MyD88的胞内域或其突变体(若此类突变体存在于这些表中所提供的构建体中)在发现处于候选嵌合多肽的第一胞内域位置(P3)时在第7天与表上所指示的最后一天之间促进PBMC增生，此时以组合方式考虑具有来自彼基因的第一细胞内域(P3)的所有构建体的数据。此结论基于混合培养的PBMC细胞群体中的构建体的序列计数的富集，当将一个基因的所有构建体的结果组合时，使得对于库2B，在第28天存在的此结构域计数比第7天多至少2倍。存在于促进最大程度的细胞增生的构建体中的第一胞内域或其部分和/或突变体的实例提供于表8中。存在于在称为库2.1B的重复筛选中促进最高程度的细胞增生的构建体中的第一胞内域或其部分和/或突变体的实例提供于表11中。
对于库2B，已知具有信号传导活性的来自CD27的胞内域或其突变体(若此类突变体存在于这些表中所提供的构建体中)在发现处于嵌合多肽候选物的第二胞内域位置(P4)时在第7天与表上所指示的最后一天之间促进PBMC增生，此时以组合方式考虑具有来自彼基因的第二细胞内域(P4)的所有构建体的数据。此结论基于混合培养的PBMC细胞群体中的构建体的序列计数的富集，当将一个基因的所有构建体的结果组合时，使得对于库2B，在第28天存在的此结构域计数比第7天多至少11倍。存在于促进最大程度的细胞增生的构建体中的第二胞内域或其部分和/或突变体的实例提供于表8中。存在于在称为库2.1B的重复筛选中促进最大程度的细胞增生的构建体中的第二胞内域或其部分和/或突变体的实例提供于表11中。
特定言的，对于库2B，在具有CSF3R T640N(具有苏氨酸640突变成天冬酰胺的群落刺激因子3受体)作为库2B的P1/P2模块的6,909个构建体中，59个为阳性的，其定义为对于库2B具有大于二的富集度的构建体。在具有IFNAR1(干扰素α及β受体次单元1)作为库2B的P3模块的184个构建体中，3个为阳性的。在具有CD40(CD40分子)作为库2B的P3模块的1,258个构建体中，17个为阳性的。在具有CD27(CD27分子)作为库2B的P4模块的851个构建体中，11个为阳性的。在具有CD8A作为库2B的P3模块的418个构建体中，10个为阳性的。在具有IL31RA作为库2B的P3模块的1,385个构建体中，12个为阳性的。在具有MyD88作为库2B的P3模块的5,757个构建体中，56个为阳性的。
对于库2B及2.1B，构建体M007-S049-S051、M007-S050-S039、M012-S050-S043、M012-S161-S213、M030-S142-S049、M001-S145-S130、M018-S085-S039、M018-S075-S053、M012-S135-S074及M007-S214-S077在两个筛选中具有尤其值得注意的富集度。出于重复筛选的目的，具有尤其值得注意的富集度的构建体为具有log2((在最后一天的标准化计数数据+1)/(在第7天的标准化计数数据+1))值大于2的那些构建体。
关于在对库2B及库2.1B两者的筛选中的具有尤其值得注意的富集度的构建体中的第一及第二胞内域的其他信息提供于表20中，包括第一及第二胞内域来源的基因，第一和/或第二胞内域是否为细胞因子受体，且第一和/或第二胞内域是否具有至少一个ITAM基元。具有来自CD28、CD40、IL22RA1、IL13RA2、IL17RB、IFNGR2、FCGR2C、IL11RA或TNFRSF14的胞内域的构建体存在于第一胞内域(P3)时，且具有来自CD40、CD3G、CD8A、TNFRSF9、CD28、IL10RB、CD79B、FCER1G或GHR的胞内域的构建体存在于第二胞内域(P4)时，在库2B及2.1B两者中显示尤其值得注意的富集度(表20)。具有来自细胞因子受体CD40、IL22RA1、IL13RA2、IL17RB、IFNGR2、FCGR2C、IL11RA或TNFRSF14的结构域的构建体存在于第一胞内域(P3)时，且具有来自细胞因子受体TNFRSF9、IL10RB、FCER1G、GHR或CD40的结构域的构建体存在于第二胞内域(P4)时，在库2B及2.1B两者中显示尤其值得注意的富集度(表20)。具有含有FCGR2C的ITAM基元的结构域的构建体存在于第一胞内域(P3)时，且具有含有CD3G、CD79B或FCER1G的ITAM基元的结构域的构建体存在于第二胞内域(P4)时，在库2B及2.1B两者中显示尤其值得注意的富集度(表20)。
实施例18.候选嵌合多肽淋巴增生性组件的识别。
在此实施例中，候选(推定)嵌合淋巴增生性组件的两个嵌合多肽库(库3及库4)经组装至来自胞外-跨膜阻断序列库、胞内阻断序列库及根据图32及图33中所提供的编码嵌合多肽的构建体的条形码库的病毒载体中。库转导的PBMC的增生随时间进行：以一周间隔自PBMC提取基因组DNA且扩增条形码区以用于DNA测序以估计在这些混合的含有测试候选嵌合多肽中的每一者的PBMC培养物中的细胞数目。因此，筛选测试候选嵌合多肽在不存在外源性添加的IL-2或任何其他外源性细胞因子下促进PBMC细胞增生的能力。
在此研究中制备且分析两个库：库3(其用于识别为库3A、3B、3.1A及3.1B的筛选中)在嵌合多肽的5’末端处侧接有CAR，而库4(其用于识别为库4B及4.1B的筛选中)不包括CAR。图32提供含有多核苷酸序列的非限制性例示性转基因表达盒的示意图，该多核苷酸序列编码由慢病毒载体主链中的EF-1α启动子及Kozak类型序列(GCCGCCACC(SEQ ID NO:519))驱动的库3的CAR及候选CLE。CAR经FLAG标记且含有针对CD19的ASTR、CD8的茎及跨膜部分，及来自CD3z的胞内活化域。库3的各候选淋巴增生性组件包括4个模块：胞外模块(P1)、跨膜模块(P2)及2个胞内模块(P3及P4)。P1模块还编码Myc识别和/或消除域。三重终止序列(TAATAGTGA(SEQ ID NO:520))自DNA条形码(P5)中分离P4。WPRE
(GTCCTTTCCATGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCTG(SEQ ID NO:521))存在于最后一个终止密码子(开始于最后一个终止密码子的最后一个核苷酸之后的4bp)与3’LTR(其开始于WPRE的最后一个核苷酸之后的83个核苷酸)之间。
库3的CAR及P1通过编码T2A核糖体跳跃序列的多核苷酸序列间隔开。
图33提供含有多核苷酸序列的非限制性例示性转基因表达盒的示意图，该多核苷酸序列编码由慢病毒载体主链中的EF-1α启动子及Kozak类型序列(GCCGCCACC(SEQ ID NO:519))驱动的库4的候选CLE。库4的各候选淋巴增生性组件包括4个模块：胞外模块(P1)、跨膜模块(P2)及2个胞内模块(P3及P4)。P1模块还编码Myc识别和/或消除域。三重终止序列(TAATAGTGA(SEQ ID NO:520))自DNA条形码(P5)中分离P4。WPRE
(GTCCTTTCCATGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCTG(SEQ ID NO:521))存在于最后一个终止密码子(开始于最后一个终止密码子的最后一个核苷酸之后的4bp)与3’LTR(其开始于WPRE的最后一个核苷酸之后的83个核苷酸)之间。
两个库的经组装候选嵌合多肽部分遵循具有4个位置(1个胞外模块(P1)、1个跨膜模块(P2)及2个胞内模块(P3及P4)，其中的一者可为提前终止信号)的完全相同的设计(图32及33)。编码Myc标签或eTAG识别和/或消除域(在表6中称为“eTAG”或“Myc Tag”)的完整或变体形式的核酸经插入在库3中的编码CAR序列的5’端处及在库4中的P1中的c-Jun结构域的5’端处。信号序列插入在库3中的编码CAR序列的5’端处及在库4的编码识别和/或消除域序列的5’端处。除P1及P2结构域如本实施例稍后更详细阐述的外，库的通用设计及构建(包括条形码)如本文实施例17中所公开。此外，清除域在如表6中所指示的一些构建体上，且在存在时为eTag变体或Myc标签。
病毒载体的合成及慢病毒生产
如实施例17中所公开合成载体并且产生各库的慢病毒颗粒。
PBMC的转导及培养
对于库3A，将来自健康供体的全部人类血液(89.1ml)收集至200ml含有CDP抗凝剂(Nanger；S-200)的血袋中。遵循制造商的说明书及试剂盒CS900.2(BioSafe；1008)使用Sepax 2S-100器件(Biosafe；14000)使用用Ficoll-PacqueTM(General Electric)的密度梯度离心来处理血液，以获得周边血单核细胞(PBMC)。活PBMC的产量为8.4×107个细胞。将十小瓶每瓶5×106个PBMC的细胞冷冻以稍后用于供养含有CD19-CAR的库3A样本的CD19+B细胞。将3×107个PBMC添加至一个G-Rex 100M细胞培养器件(Wilson Wolf，81100S)中以在最终体积60ml的完全OpTmizerTM CTSTM T细胞扩增SFM(根据制造商的说明书的补充有26mlOpTmizerTM CTSTM T细胞扩增补充液(Thermo Fisher，A10484-02)、25ml CTSTM免疫细胞SR(Thermo Fisher，A2596101)及10ml CTSTM GlutaMAXTM-I补充液(Thermo Fisher，A1286001)的OpTmizerTM CTSTM T细胞扩增基础培养基1L(Thermo Fisher，A10221))中达到最终浓度0.5×106个活细胞/毫升。还将浓度为100IU/ml的重组人类白细胞介素-2(IL-2)(Novoprotein)以及浓度为50ng/ml的活化抗CD3 Ab(OKT3，Novoprotein)一起添加以活化PBMC用于病毒转导。将G-Rex器件在37℃及5％CO2下在标准湿润组织培养箱中培育隔夜。在隔夜培育之后，在5重感染(MOI)下将含有所要测试编码嵌合多肽的构建体(库3)的慢病毒颗粒制剂添加至G-Rex器件中。将G-Rex器件在37℃及5％CO2下在标准湿润组织培养箱中培育隔夜。在隔夜培育之后，添加额外的完全OpTmizerTM CTSTM T细胞扩增SFM以使最终体积达到500ml。在此或以下细胞培养步骤中不添加额外的IL-2或其他外源性细胞因子。自PBMC分离后，将
Figure BDA0002257374180001671
器件在37℃及5％CO2下在标准湿润组织培养箱中培育7天。在第7天，通过离心自用库3转导的G-Rex器件中收集细胞并将这些细胞再悬浮于新鲜的不具有IL-2的完全OpTmizerTM CTSTM T细胞扩增SFM中。将5×107个库3细胞置放在含有500ml不具有IL-2的完全OpTmizerTM CTSTM T细胞扩增SFM的新G-Rex 100M器件上且标记为库3A。将1.1×108个库3细胞置放在含有500ml不具有IL-2的完全OpTmizerTM CTSTM T细胞扩增SFM的新G-Rex100M器件上且标记为库3B。在这些筛选中，用库数目之后的A指定用PBMC喂供养的细胞，例如使用用库3转导且用PBMC供养的细胞进行的筛选在本文称为库3A。将一小瓶解冻的第0天冷冻供体匹配的PBMC(2×107个PBMC)添加至含有用库3A转导的细胞的G-Rex器件中以提供对CD19 ASTR的CD19+B细胞活化。库3B不接受第0天PBMC。在这些筛选中，用库数目之后的B指定不用PBMC喂供养的细胞。举例而言，使用用库3转导且不用PBMC供养的细胞进行的筛选在本文中称为库3B。将G-Rex器件在37℃及5％CO2下在标准湿润组织培养箱中培育。在第14天，通过离心自两个G-Rex器件(库3A、库3B)中收集细胞并将这些细胞再悬浮于新鲜的不具有IL-2的完全OpTmizerTM CTSTM T细胞扩增SFM中。将这些细胞各自置放在含有30ml不具有IL-2的完全OpTmizerTM CTSTM T细胞扩增SFM的6孔G-Rex盘(Wilson-Wolf；80240M)的个别孔中。将一小瓶解冻的第0天冷冻供体匹配的PBMC(5×106个PBMC)添加至含有库3A G-Rex中以提供对CD19 ASTR的CD19+B细胞活化。
将G-Rex器件在37℃及5％CO2下在标准湿润组织培养箱中培育。在第21天、第28天、第35天及第42天重复此过程，除了在第21天将两小瓶冷冻第0天PBMC添加至库3A，在第28天、第35天及第42天添加一瓶。库3B在过去21天不培养。重复这些筛选，除了P1部分上的Myc标签用eTag替换(如表6、14及15中所显示)并且指定为库3.1A及3.1B，其中该A及B指示如上文所论述的细胞是否用PBMC供养。
制备库3A的细胞以在第49天通过流式细胞术(400g，5分钟)分析。通过离心收集细胞并且根据制造商的说明在Ficoll(Ficoll-Paque Premium(GE,cat#17-5442-02))上分层。将1.7x 106个细胞再悬浮于450μl FACs染色缓冲液(554656，BD)中。将再悬浮的细胞等分至9个eppendorf管中，每个管含有50μl或1.8×105个细胞。将2.5μl人类Fc嵌段(564220，BD)添加至各管中并且在室温下培育10分钟。将以下抗体配方添加至50μl样本中以染色CD3、CD4、CD8、CD56、CD19、FLAG Tag(CAR+)：2.5μl抗CD3-BV421抗体(纯系OKT3,317344，Biolegend)、2.5μl抗CD8-BV510抗体(纯系RPA-T8(301048，Biolegend))、2.5μl抗CD4-PE-Cy7抗体(纯系OKT4(317412，Biolegend))、2.5μl抗CD56-BV785(362550，Biolegend)及0.5μl PE抗FLAG Tag(抗DYKDDDDK，Clone L5,637310，Biolegend)用于5种颜色染色样本。添加2.5μl BB515 CD19抗体(纯系HIB19,564456,BD)及0.5ul PE抗FLAG Tag抗体用于2种颜色染色样本。还使用上述抗体及体积制备单染色CD3、CD4、CD8、CD56或FLAG Tag的样本。添加2.5μl BV421 IgG(小鼠IgG2a，400259，Biolegend)、2.5μl PE/CY5 IgG(小鼠IgG2b，400317，Biolegend)、2.5μl BV510 IgG(小鼠IgG1，400171，Biolegend)、2.5μl BV785 IgG(小鼠IgG1，400169，Biolegend)及10μl PE IgG(小鼠IgG1，555749，BD)用于IgG对照染色样本。不添加抗体以用于未染色对照。将样本在冰上培育30分钟。将这些样本离心(400g，5分钟)并且移除上清液。用0.5ml FACS染色缓冲液洗涤这些样本两次。将经染色的细胞集结粒再悬浮于125μl FACS染色缓冲液中且随后通过添加125ul BD固定缓冲液(554655BD)来固定。在4℃下用固定缓冲液培育这些样本15分钟。用500μl FACS染色缓冲液洗涤这些样本两次并且用0.4ml FACS染色缓冲液再悬浮。在Novocyte流式细胞测仪(ACEA Biosciences)进行样本的FAC分析并且基于正向散射及侧向散射使用淋巴细胞门分析。
对于库4B，将来自健康供体的全部人类血液(70ml)收集至200ml含有CDP抗凝剂(Nanger；S-200)的血袋中。遵循制造商的说明书及试剂盒CS900.2(BioSafe；1008)使用Sepax 2S-100器件(Biosafe；14000)使用用Ficoll-PacqueTM(General Electric)的密度梯度离心来处理血液，以获得周边血单核细胞(PBMC)。活PBMC的产量为4.9×107个细胞。将4.9×107个PBMC添加至一个G-Rex 100M细胞培养器件(Wilson Wolf，81100S)中以在最终体积98ml的完全OpTmizerTM CTSTM T细胞扩增SFM中达到最终浓度0.5×106个活细胞/毫升。还将浓度为100IU/ml的重组人类白细胞介素-2(IL-2)(Novoprotein)以及浓度为50ng/ml的活化抗CD3 Ab(OKT3，Novoprotein)一起添加以活化PBMC用于病毒转导。将G-Rex器件在37℃及5％CO2下在标准湿润组织培养箱中培育隔夜。在隔夜培育之后，在5重感染(MOI)下将含有所要测试编码嵌合多肽的构建体(库4)的慢病毒颗粒制剂添加至G-Rex器件中。将G-Rex器件在37℃及5％CO2下在标准湿润组织培养箱中培育隔夜。在隔夜培育之后，添加额外的完全OpTmizerTM CTSTM T细胞扩增SFM以使最终体积达到500ml。在此或以下细胞培养步骤中不添加额外的IL-2。自PBMC分离后，将
Figure BDA0002257374180001681
器件在37℃及5％CO2下在标准湿润组织培养箱中培育7天。在第7天，通过离心自用库4转导的G-Rex器件中收集细胞并将这些细胞再悬浮于新鲜的不具有IL-2的完全OpTmizerTM CTSTM T细胞扩增SFM中。将1.63×108个库4细胞置放在含有500ml不具有IL-2的完全OpTmizerTM CTSTM T细胞扩增SFM的新G-Rex 100M器件上且标记为库4。库4不接受第0天PBMC。因此，在这些筛选中，用库数目之后的B指定库，例如使用用库4转导且不用PBMC供养的细胞进行的筛选在本文称为库4B。将G-Rex器件在37℃及5％CO2下在标准湿润组织培养箱中培育。在第14天，通过离心自G-Rex器件(库4)中收集细胞并将这些细胞再悬浮于新鲜的不具有IL-2的完全OpTmizerTM CTSTM T细胞扩增SFM中。将这些细胞各自置放在含有30ml不具有IL-2的完全OpTmizerTM CTSTM T细胞扩增SFM的6孔G-rex盘(Wilson-Wolf；80240M)的个别孔中。将G-Rex器件在37℃及5％CO2下在标准湿润组织培养箱中培育。库4样本在过去21天培养。重复这些筛选，除了P1部分上的Myc标签用eTag替换(如表6及16中所显示)并且指定为库4.1B，其中该B指示如上文所论述的细胞不用PBMC供养。
在转导后的不同天(第7天及第21天)收集样本(7×104至～4-8×106个细胞)，且根据试剂盒方案使用GenEluteTM哺乳动物基因组DNA微量制剂纯化基因组DNA。在一些情况下，使用用Ficoll-PacqueTM(General Electric)的密度梯度离心来纯化样本以在基因组DNA提取之前移除死亡细胞。使用Illumina HiSeq对纯化的基因组DNA进行测序，产生配对末端150bp读数。通常，从每个索引的fastq文文件中提取一千万个读数的子集，并使用barcode_reader进行分析处理，该barcode_reader为一个自定义的R脚本，用于基于恒定区域的存在提取条形码序列。还将纯化的基因组DNA在PacBio测序系统上测序以将条形码与构建体相关联。
资料分析
除时间点不同以外，如实施例17中所公开进行数据分析。
结果
在此实验中，嵌合多肽候选物经设计具有4个测试域，其包括胞外域(P1)、跨膜域(P2)、第一胞内域(P3)及第二胞内域(P4)(图32及图33)。如实施例17中所解释，构建体包括DNA条形码以帮助使用下一代测序来分析且识别构建体。另外，所有构建体包括在具有胞外域的框中编码识别和/或消除域的核酸序列。库3而非库4中的构建体编码嵌合多肽候选物上游的CAR，其在结构上与库1(实施例17)中所使用的CAR一致。
用于库3及库4的胞外域为包括已知为二聚基元的亮氨酸拉链基元(NM_002228_3)的c-Jun变体(参见例如Chinenov及Kerppola,Oncogene.2001年4月30日；20(19):2438-52)。具有0与4个丙氨酸残基之间之间隔区包括在c-Jun胞外域与跨膜域之间的候选嵌合多肽。不受理论限制，据信丙氨酸间隔区可通过改变连接的跨膜域和/或胞内域的方向来影响经由跨膜域与亮氨酸胞外区连接的胞内域的信号传导。
候选跨膜域选自已知的野生型及突变体I型受体的单跨膜域，诸如已经报导在至少一些细胞类型中表达时为组成性活性的细胞因子、激素、共刺激或活化受体。选自库3及库4的此类受体突变体中的突变发生在跨膜区中。库3A、3B、3.1A、3.1B、4B及4.1B的例示性跨膜域可识别在表12至17中。表12至17的标题如下：BlockSequence为各构建体中使用的来自表6的P1、P2、P3及P4域的密码；Norm_D7为在第7天的标准化计数；Enrich_DXX为第XX天对比第7天的富集度，其中XX为表中所指示的天数，例如Enrich_D21为第21天对比第7天的富集度且Enrich_D35为第35天对比第7天的富集度。构建体的资料紧接着该构建体的右行显示。两个构建体的资料显示于各列中。举例而言，在表12中识别的第一构建体为E013-T047-S158-S080，其阐述为P1-P2-P3-P4。在彼构建体中，跨膜域(P2)为T047，其为IL7RA InsPPCL(白细胞介素7受体)的跨膜域，如表6中所提供，以及此结构域的氨基酸序列包括在此构建体中。实施例17中包括的相同的第一胞内域(P3)及第二胞内域(P4)包括在此实施例中的库中，但P3部分中的一者为间隔区(参见下文)。
基于Jun亮氨酸拉链胞外域及将其与82个不同的跨膜域、81个潜在的P3域间隔开的0-4个苏氨酸间隔区(其中的一者为23个氨基酸间隔区)、及21个潜在的P4域(其中一个为终止密码子)设计总共5个可能的概念化组合。在病毒载体组装、慢病毒颗粒产生、PBMC的转导及培养7天后，并非所有概念化构建体均检测到。对于库3A及库3B，在转导PBMC及培养7天之后，存在68,951个构建体。对于库4B，在转导PBMC及培养7天之后，存在50,652个构建体。可自表6及12至17中确定关于分析的候选物的详细信息。构建体的写码系统与实施例17所解释的相同，如前述段落中所阐述。
对于库3A、3B、3.1A、3.1B、4B及4.1B，在第7天与表上指示的最后一天之间识别到促进PBMC细胞增生的构建体。在CLE的特定模块中的某些多肽在库3A、3B及4中的最优命中者之间。这些CLE促进增生至最大程度。举例而言，在P2位置含有CD40或ICOS；在P3位置含有MPL、MyD88、LEPR或IFNAR2；和/或在P4位置含有CD40、CD79B或CD27的例示性构建体为3个库3A、3B及4B中的至少2个中之前5个最常见的嵌合多肽(参见表12、13及16)。显然，MPL为对于所有3个库而言在P3大间隔处的最常见嵌合多肽。注意来自P3(MP、MyD88、LEPR及IFNAR2)的最优命中者不包括在这些构建体的P4位置中。
在包括编码嵌合多肽及CAR的构建体以及补充有(库3A)或不具有(库3B)新鲜未转导PBMC的转导PBMC的库3A及库3B中，当在不存在IL-2下培养时分别识别到在第7天与表上指示的最后一天之间促进PBMC增生的126个及127个最优候选物(参见表12及13)。表12及13的最优候选物清单通过将基于初始中期资料分析的在第21天之前100个最流行候选物与基于初始中期数据分析在第21天与第7天之间之前100个最富集的候选构建体组合来产生。初始中期数据通过译码经编码库的部分来产生，以使得对于库3A已解码前100个构建体中的66个及前1000个构建体中的538个；且对于库3B已解码前100个构建体中的77个，及前1000个构建体中的464个。
对于库3A，当以组合方式考虑具有来自彼基因的跨膜域的所有构建体的数据时(数据未示出)，来自CD40、CD8B、CRLF2、CSF2RA、FCGR2C、ICOS、IFNAR1、IFNGR1、IL10RB、IL18R1、IL18RAP、IL3RA、LEPR及PRLR的跨膜域(P2)或其突变体已知在某些细胞类型中促进信号传导活性(若此类突变体存在于这些表中所提供的构建体中)、在第7天与第21天之间促进PBMC的增生。此结论基于混合培养的PBMC细胞群体中的构建体的序列计数的富集，当将一个基因的所有构建体的结果组合时，使得对于库3A，以第21天的标准化计数加一与第7天的标准化计数加一之间的比率的以2为底的对数计算的富集度为至少2。对于库3B，来自CD40、ICOS、CSF2RA、IL18R1、IL3RA及TNFRSF14的跨膜域在以此方式分析时为表达最佳的。对于第35天及第21天的库3A及3B，存在于促进细胞增生的构建体中的跨膜域或其部分和/或突变体的实例分别提供于表12及13中。存在于称为库3.1A及3.1B的重复筛选中的促进细胞增生的构建体中的跨膜域或其部分和/或突变体的实例提供于表14及15中。
对于库3A，当在第7天与第21天之间在本文的候选嵌合多肽组件的第一胞内域位置(P3)处发现促进PBMC增生时，当以组合方式考虑具有来自彼基因的第一细胞内域的所有构建体的数据时(数据未示出)，来自IL17RD、IL17RE、IL1RAP、IL23R及MPL的第一胞内域(P3)或其突变体已知在某些细胞类型中促进信号传导活性(若此类突变体存在于这些表中所提供的构建体中)。此结论基于混合培养的PBMC细胞群体中的构建体的序列计数的富集，当将一个基因的所有构建体的结果组合时，使得对于库3A，以第21天的标准化计数加一与第7天的标准化计数加一之间的比率的以2为底的对数计算的富集度为至少2。对于库3B，已知在某些细胞类型中促进信号传导活性的来自IL21R、MPL及IL2RB的第一胞内域或其突变体(若此类突变体存在于这些表中)在以此方式分析时为表达最佳的。对于第35天及第21天的库3A及3B，存在于促进最大程度的细胞增生的构建体中的第一胞内域或其部分和/或突变体的实例分别提供于表12及13中。存在于称为库3.1A及3.1B的重复筛选中的促进细胞增生的构建体中的第一胞内域或其部分和/或突变体的实例提供于表14及15中。
对于库3A，当在第7天与第21天之间在本文的候选嵌合多肽组件的第二胞内域位置(P4)处发现促进PBMC增生时，当以组合方式考虑具有来自彼基因的第二细胞内域的所有构建体的数据时(数据未示出)，来自CD27、CD3G、CD40及CD79B的第二胞内域(P4)或其突变体已知在某些细胞类型中促进信号传导活性(若此类突变体存在于这些表中)。此结论基于混合培养的PBMC细胞群体中的构建体的序列计数的富集，当将一个基因的所有构建体的结果组合时，使得对于库3A，以第21天的标准化计数加一与第7天的标准化计数加一之间的比率的以2为底的对数计算的富集度为至少2。对于库3B，已知在某些细胞类型中促进信号传导活性的来自CD40的第二胞内域或其突变体(若此类突变体存在于这些表中)在以此方式分析时为表达最佳的。对于第35天及第21天的库3A及3B，存在于促进最大程度的细胞增生的构建体中的第二胞内域或其部分和/或突变体的实例分别提供于表12及13中。存在于称为库3.1A及3.1B的重复筛选中的促进最大程度的细胞增生的构建体中的第二胞内域或其部分和/或突变体的实例提供于表14及15中。
关于特定基因，在具有CD8B(CD8b分子)作为P2部分的798个构建体中，111个阳性的，其定义为对于第21天的库3A或3B具有富集度大于二(log2)的构建体。在具有CD40(CD40分子)作为P2部分的1,032个构建体中，159个阳性的。在具有CRLF2(细胞因子受体类似因子2)作为P2部分的1,339个构建体中，175个阳性的。在具有CSF2RA(群落刺激因子2受体α次单元)作为P2部分的593个构建体中，108个阳性的。在具有FCGR2C(IgG受体IIc的Fc片段(基因/假基因))作为P2部分的714个构建体中，88个阳性的。在具有ICOS(可诱导T细胞共刺激剂)作为P2部分的788个构建体中，108个阳性的。在具有IFNAR1(干扰素α及β受体次单元1)作为P2模块的882个构建体中，106个为阳性的。在具有IFNGR1(干扰素γ受体1)作为P2模块的806个构建体中，104个为阳性的。在具有IL3RA(白细胞介素3受体次单元α)作为P2模块的938个构建体中，132个为阳性的。在具有IL10RB(白细胞介素10受体次单元α)作为P2模块的746个构建体中，99个为阳性的。在具有IL18R1(白细胞介素18受体1)作为P2模块的814个构建体中，131个为阳性的。在具有IL18RAP(白细胞介素18受体辅助蛋白)作为P2模块的552个构建体中，83个为阳性的。在具有LEPR(瘦素受体)作为P2模块的1,390个构建体中，184个为阳性的。在具有PRLR(催乳素受体)作为P2模块的795个构建体中，123个为阳性的。
在具有IL1RAP(白细胞介素1受体辅助蛋白)作为P3部分的1,259个构建体中，158个阳性的，其定义为对于第21天的库3A或3B具有富集度大于二的构建体。在具有IL17RD(白细胞介素17受体D)作为P3部分的200个构建体中，31个阳性的。在具有IL17RE(白细胞介素17受体E)作为P3模块的11个构建体中，3个为阳性的。在具有IL23R(白细胞介素23受体)作为P3模块的538个构建体中，86个为阳性的。在具有MPL(MPL原癌基因，血小板生成素受体)作为P3模块的1,531个构建体中，509个为阳性的。
在具有CD3G(CD3g分子)作为P4部分的3,124个构建体中，458个阳性的，其定义为对于第21天的库3A或3B具有富集度大于二的构建体。在具有CD27(CD27分子)作为P4部分的3,293个构建体中，443个阳性的。在具有CD40(CD40分子)作为P4模块的5,163个构建体中，724个为阳性的。在具有CD79B(CD79b分子)作为P4模块的4,486个构建体中，663个为阳性的。值得注意的是，对于任何构建体而言，由于这是一种竞争性测定法，“阴性”表示构建体在促进增生方面不参与竞争，而非构建体不能够促进增生。
对于库3A及3.1A，构建体E008/E013-T041-S186-S050、E006/E011-T077-S186-S211、E007/E012-T021-S186-S051、E009/E014-T041-S186-S053、E007/E012-T073-S186-S053、E006/E011-T017-S186-S051、E006/E011-T031-S186-S211、E006/E011-T011-S186-S050、E006/E011-T011-S186-S047、E007/E012-T001-S186-S050、E006/E011-T041-S186-S051、E008/E013-T028-S186-S076、E009/E014-T029-S199-S053、E009/E014-T062-S186-S216、E007/E012-T006-S058-S051、E009/E014-T076-S186-S211及E007/E012-T001-S186-S047在两个筛选中均具有尤其值得注意的富集度，其中通过此处的斜杠间隔开的P1部分包括如表6、12及14中所示的库3A及3.1A的不同标签。出于重复筛选的目的，具有尤其值得注意的富集度的构建体为具有log2((在最后一天的标准化计数数据+1)/(在第7天的标准化计数数据+1))值大于2的那些构建体。
关于在对库3A及库3.1A两者的筛选中的具有尤其值得注意的富集度的构建体中的第一及第二胞内域的其他信息提供于表21中，包括第一及第二胞内域来源的基因，第一和/或第二胞内域是否为细胞因子受体，且第一和/或第二胞内域是否具有至少一个ITAM基元。具有来自MPL、OSMR或CSF2RA的胞内域的构建体存在于第一胞内域(P3)时，且具有来自CD40、TNFRSF4、CD79B、CD27、FCGR2A或TNFRSF18的胞内域的构建体存在于第二胞内域(P4)时，在库3A及3.1A两者中显示尤其值得注意的富集度(表21)。具有来自细胞因子受体MPL、OSMR或CSF2RA的结构域的构建体存在于第一胞内域(P3)时，且具有来自细胞因子受体CD40、TNFRSF4、CD27、FCGR2A或TNFRSF18的结构域的构建体存在于第二胞内域(P4)时，在库3A及3.1A两者中显示尤其值得注意的富集度(表21)。具有含有MPL或OSMR的ITAM基元的结构域的构建体存在于第二胞内域(P4)时，在库3A及3.1A两者中显示尤其值得注意的富集度(表21)。
对于库3B及3.1B，构建体E007/E012-T017-S186-S051、E007/E012-T073-S186-S053、E008/E013-T028-S186-S047、E006/E011-T011-S186-S047、E007/E012-T082-S176-S214、E006/E011-T046-S186-S052、E008/E013-T029-S186-S052、E009/E014-T011-S186-S053、E008/E013-T032-S186-S039、E007/E012-T034-S186-S051、E007/E012-T041-S192-S213、E006/E011-T014-S069-S213、E006/E011-T022-S186-S053、E006/E011-T023-S115-S075、E006/E011-T029-S106-S213、E006/E011-T032-S155-S080、E006/E011-T041-S186-S216、E006/E011-T057-S135-S080、E006/E011-T072-S191-X002、E006/E011-T077-S186-S216、E006/E011-T080-S141-S080、E007/E012-T001-X001-S214、E007/E012-T007-S059-S211、E007/E012-T016-S186-S052、E007/E012-T031-S186-S053、E007/E012-T044-S102-S052、E007/E012-T044-S142-X002、E007/E012-T055-S069-S053、E007/E012-T063-S176-S216、E007/E012-T065-S157-S075、E008/E013-T008-S085-X002、E008/E013-T011-S085-S048、E008/E013-T021-S109-X002、E008/E013-T021-S168-S211、E008/E013-T032-S064-S214、E008/E013-T037-S170-S215、E008/E013-T038-S176-S048、E008/E013-T039-S137-S216、E008/E013-T041-S141-S053、E008/E013-T045-S177-S048、E008/E013-T048-S109-S074、E008/E013-T073-S199-S075、E009/E014-T001-S157-S074、E009/E014-T005-S196-S049、E009/E014-T011-S130-X002、E009/E014-T013-S155-X002、E009/E014-T017-S186-S076、E009/E014-T021-S142-S080、E009/E014-T023-S082-S076、E009/E014-T038-S196-S037、E009/E014-T055-S186-S052、E009/E014-T060-S175-S053、E009/E014-T070-S085-S212、E008/E013-T026-S054-S213、E009/E014-T007-S120-S053、E007/E012-T045-S186-S211、E008/E013-T073-S186-X002、E008/E013-T074-S186-X002、E007/E012-T055-S186-S053、E008/E013-T036-S186-S053、E007/E012-T017-S058-S053、E008/E013-T030-S189-S080、E006/E011-T029-S081-S047、E009/E014-T044-S194-S050、E006/E011-T028-S121-X002、E008/E013-T028-S186-S053、E009/E014-T078-S142-S213、E009/E014-T041-S186-S051、E008/E013-T006-S186-S050、E006/E011-T028-S186-S075、E006/E011-T040-S120-S038、E007/E012-T044-S115-S211、E009/E014-T039-S176-S075、E007/E012-T028-S186-S050、E008/E013-T031-S202-S050、E007/E012-T072-S192-S053、E006/E011-T065-X001-S051、E007/E012-T030-S062-X002、E007/E012-T073-S186-X002、E009/E014-T056-S186-S053、E008/E013-T046-S137-X002、E006/E011-T016-S136-S076、E007/E012-T032-S142-S037、E007/E012-T065-S120-S215、E009/E014-T077-S186-S047、E009/E014-T001-S126-S051、E006/E011-T030-S121-S039、E008/E013-T006-S176-S213、E009/E014-T032-S130-S215、E008/E013-T041-S186-S039、E009/E014-T021-S186-S047、E008/E013-T026-S137-S214、E007/E012-T029-S116-S075、E008/E013-T026-S106-S049及E007/E012-T032-S168-S075在两个筛选中均具有尤其值得注意的富集度，其中通过此处的斜杠间隔开的P1部分包括如表6、13及15中所示的库3B及3.1B的不同标签。出于重复筛选的目的，具有尤其值得注意的富集度的构建体为具有log2((在最后一天的标准化计数数据+1)/(在第7天的标准化计数数据+1))值大于2的那些构建体。
关于在对库3B及库3.1B两者的筛选中的具有尤其值得注意的富集度的构建体中的第一及第二胞内域的其他信息提供于表22中，包括第一及第二胞内域来源的基因，第一和/或第二胞内域是否为细胞因子受体，且第一和/或第二胞内域是否具有至少一个ITAM基元。具有来自MPL、LEPR、MYD88、EPOR、IL5RA、IL2RG、IL18RAP、IL11RA、IL13RA1、CSF2RA、IL1RL1、IL13RA2、IL20RB、IFNGR2、IL3RA、IL27RA、CSF3R、IL31RA、IL12RB1、OSMR、IL10RB、IFNAR2、CRLF2、IL7R、IFNAR1、PRLR、IL9R、IL6R或IL15RA的胞内域的构建体存在于第一胞内域(P3)时，且具有来自CD40、CD79B、CD27、TNFRSF14、CD79A、CD3G、TNFRSF9、FCGR2C、ICOS、TNFRSF18、TNFRSF4、CD28、FCER1G、FCGR2A、CD3D、TNFRSF8或CD3E的胞内域的构建体存在于第二胞内域(P4)时，在库3B及3.1B两者中显示尤其值得注意的富集度(表22)。具有来自MPL、LEPR、EPOR、IL5RA、IL2RG、IL18RAP、IL11RA、IL13RA1、CSF2RA、IL1RL1、IL13RA2、IL20RB、IFNGR2、IL3RA、IL27RA、CSF3R、IL31RA、IL12RB1、OSMR、IL10RB、IFNAR2、CRLF2、IL7R、IFNAR1、PRLR、IL9R、IL6R或IL15RA的胞内域的构建体存在于第一胞内域(P3)时，且具有来自CD40、CD27、TNFRSF14、TNFRSF9、FCGR2C、TNFRSF18、TNFRSF4、FCER1G、FCGR2A或TNFRSF8的胞内域的构建体存在于第二胞内域(P4)时，在库3B及3.1B两者中显示尤其值得注意的富集度(表22)。具有含有CD79B、CD79A、CD3G、FCGR2C、FCER1G、FCGR2A、CD3D或CD3E的ITAM基元的结构域的构建体存在于第二胞内域(P4)时，在库3B及3.1B两者中显示尤其值得注意的富集度(表22)。
FACs分析显示第49天库3A扩增细胞主要为CD3+、CD8+、CD56+及FLAG-Tag+。下文紧接的表格显示对指定标记及标记组合染色呈阳性的淋巴细胞百分比。此数据显示自此库筛选中识别的驱动程序主要为扩增CD3+T细胞组分。
Figure BDA0002257374180001721
对于在包括编码嵌合多肽而无CAR的构建体以及未补充有新鲜未转导PBMC的转导PBMC的库4B，当在不存在IL-2下培养时识别到在第7天与表上指示的最后一天之间促进最大程度的PBMC增生的154个最优候选物(参见表16)。
对于库4B，当在第7天与表上指示的最后一天之间在本文的候选嵌合多肽组件的跨膜域位置(P2)处发现促进PBMC的细胞增生时，当以组合方式考虑具有来自彼基因的跨膜域的所有构建体的数据时，来自CD40、CD8B、CSF2RA、IL18R1及IL3RA的跨膜域(P2)或其突变体已知在某些细胞类型中促进组成性信号传导活性(若此类突变体存在于这些表中所提供的构建体中)。此结论基于混合培养的PBMC细胞群体中的构建体的序列计数的富集，使得当针对一个基因将所有构建体的结果组合时，对于库4B，以表上指示的最后一天的标准化计数加一与第7天的标准化计数加一之间的比率的以2为底的对数计算的富集度为至少2。存在于库4B中促进细胞增生的构建体中的跨膜域或其部分和/或突变体的实例提供于表16中。存在于在称为库4.1B的重复筛选中促进细胞增生的构建体中的跨膜域或其部分和/或突变体的实例提供于表17中。
对于库4B，当在第7天与表上指示的最后一天之间在本文的候选嵌合多肽组件的第一胞内域位置(P3)处发现促进PBMC的细胞增生时，当以组合方式考虑具有来自彼基因的第一细胞内域的所有构建体的数据时，来自CRLF2、CSF2RA、IFNGR2、IL4R、MPL及OSMR的第一胞内域(P3)或其突变体已知在某些细胞类型中促进信号传导活性(若此类突变体存在于这些表中所提供的构建体中)。此结论基于混合培养的PBMC细胞群体中的构建体的序列计数的富集，当将一个基因的所有构建体的结果组合时，使得对于库4B，以表上指示的最后一天的标准化计数加一与第7天的标准化计数加一之间的比率的以2为底的对数计算的富集度为大于0。存在于库4B中促进细胞增生的构建体中的第一胞内域域或其部分和/或突变体的实例提供于表16中。存在于在称为库4.1B的重复筛选中促进细胞增生的构建体中的第一胞内域域或其部分和/或突变体的实例提供于表17中。
对于库4，当在第7天与表上指示的最后一天之间在本文的候选嵌合多肽组件的第二胞内域位置(P4)处发现促进PBMC的增生时，当以组合方式考虑具有来自彼基因的第二细胞内域的所有构建体的数据时，来自CD27、CD40及CD79B的第二胞内域(P4)或其突变体已知在某些细胞类型中促进信号传导活性(若此类突变体存在于这些表中所提供的构建体中)。此结论基于混合培养的PBMC细胞群体中的构建体的序列计数的富集，当将一个基因的所有构建体的结果组合时，使得对于库4B，在最后一天存在的此结构域计数比第7天多。存在于库4B中促进细胞增生的构建体中的第二胞内域域或其部分和/或突变体的实例提供于表16中。存在于在称为库4.1B的重复筛选中促进细胞增生的构建体中的第二胞内域域或其部分和/或突变体的实例提供于表17中。
对于库4B及4.1B，构建体E007/E012-T078-S154-S047、E008/E013-T062-S186-X002、E008/E013-T055-S186-S050、E009/E014-T057-S186-S050、E007/E012-T077-S054-S053、E007/E012-T034-S135-S211、E009/E014-T071-X001-S216、E009/E014-T011-S141-S037、E008/E013-T041-S186-S037、E006/E011-T038-S106-S039、E006/E011-T011-S121-X002、E007/E012-T007-S085-S215、E006/E011-T041-S186-S050、E007/E012-T008-S064-S051、E006/E011-T041-S186-S047、E008/E013-T045-S186-S051、E008/E013-T003-S104-S216、E006/E011-T019-S186-S053、E008/E013-T071-S064-S080、E006/E011-T021-S054-X002、E006/E011-T003-S135-X002、E009/E014-T020-S199-S213、E008/E013-T027-S121-S211、E009/E014-T032-S195-X002、E009/E014-T050-S171-X002、E008/E013-T069-S083-X002、E008/E013-T026-S116-S038、E009/E014-T072-S195-X002、E007/E012-T047-S058-S211、E008/E013-T046-S142-S080、E006/E011-T065-S186-S076、E006/E011-T062-S069-X002、E007/E012-T047-S098-X002、E009/E014-T069-S099-S048、E008/E013-T039-S141-S050、E006/E011-T052-S130-S052、E008/E013-T041-S186-X002、E007/E012-T019-S120-X002、E008/E013-T045-S186-S053、E006/E011-T003-S170-S039、E007/E012-T047-S058-S051、E007/E012-T069-S109-X002、E009/E014-T019-S130-S075及E006/E011-T047-S054-S053在两个筛选中均具有尤其值得注意的富集度，其中通过此处的斜杠间隔开的P1部分包括如表6、16及17中所示的库34B及4.1B的不同标签。出于重复筛选的目的，具有尤其值得注意的富集度的构建体为具有log2((在最后一天的标准化计数数据+1)/(在第7天的标准化计数数据+1))值大于2的那些构建体。
在表23中提供关于在对库4B及库4.1B两者的筛选中的具有尤其值得注意的富集度的构建体中的第一及第二胞内域的其他信息，包括第一及第二胞内域来源的基因，第一和/或第二胞内域是否为细胞因子受体，且第一和/或第二胞内域是否具有至少一个ITAM基元。具有来自IL18R1、MPL、CRLF2、IL11RA、IL13RA1、IL2RG、IL7R、IFNGR2、CSF3R、IL2RA、OSMR、MYD88、IL31RA、IFNAR2、IL6R、CSF2RA、IL13RA2、EPOR、IL1R1、IL10RB或IL3RA的胞内域的构建体存在于第一胞内域(P3)时，且具有来自CD27、CD40、CD79B、TNFRSF4、TNFRSF18、CD3D、CD3G、CD27、ICOS、TNFRSF9、CD3E、FCGR2A、CD28、CD79A或FCGR2C的胞内域的构建体存在于第二胞内域(P4)时，在库4B及4.1B两者中显示尤其值得注意的富集度(表23)。具有来自IL18R1、MPL、CRLF2、IL11RA、IL13RA1、IL2RG、IL7R、IFNGR2、CSF3R、IL2RA、OSMR、IL31RA、IFNAR2、IL6R、CSF2RA、IL13RA2、EPOR、IL1R1、IL10RB或IL3RA的胞内域的构建体存在于第一胞内域(P3)时，且具有来自CD27、CD40、TNFRSF4、TNFRSF18、TNFRSF9、FCGR2A或FCGR2C的胞内域的构建体存在于第二胞内域(P4)时，在库4B及4.1B两者中显示尤其值得注意的富集度(表23)。具有含有CD79B、CD3D、CD3G、CD3E、FCGR2A、CD79A或FCGR2C的ITAM基元的结构域的构建体存在于第二胞内域(P4)时，在库4B及4.1B两者中显示尤其值得注意的富集度(表23)。
对于库4B，在具有CD8B(CD8b分子)作为P2部分的572个构建体中，21个为阳性的，其定义为对于库4B具有富集度大于二的构建体。在具有CD40(CD40分子)作为P2模块的897个构建体中，50个为阳性的。在具有CSF2RA(群落刺激因子2受体α次单元)作为P2模块的551个构建体中，25个为阳性的。在具有IL3RA(白细胞介素3受体次单元α)作为P2模块的732个构建体中，47个为阳性的。在具有IL18R1(白细胞介素18受体1)作为P2模块的738个构建体中，44个为阳性的。在具有MPL(MPL原癌基因，血小板生成素受体)作为P3模块的1,683个构建体中，305个为阳性的。
在第21天对库3A的初始中期分析中，前100个命中者中的66个及前1000个命中者中的538个已经解码。进一步译码提供深度译码及对库3A之前100个命中者中的99个及前1000个命中者中的992个的识别且在第35天收集资料并且在第21天更新分析。在第21天对库3B的初始分析中，前100个命中者中的77个及前1000个命中者中的464个已经在初始中期分析中解码。进一步译码提供深度译码及对库3B之前100个命中者中的100个及前1000个命中者中的708个的识别。库3A及3B的最优构建体以及库3A的第35天数据及库3B的第21天资料分别显示与表12及13中。
在包括编码嵌合多肽及CAR的构建体以及补充有(库3A)或不具有(库3B)新鲜未转导PBMC的转导PBMC的库3A及库3B中，当在不存在IL-2(亦即，在初始转导之后的培养期间，不将IL-2不添加到培养培养基中)下培养时识别到在第7天与表上指示的最后一天之间促进最大程度的PBMC增生的针对第35天的库3A的124个最优候选物，并且识别到针对第21天的库3B的131个最优候选物(分别参见表12及13)。表12(第35天的库3A)及13(第21天的库3B)的最优候选清单是通过在深度解码之后将在第21天(库3B)或第21或35天(库3A)之前100个最流行候选物与第21天与第7天之间(库3B)或第21天与第7天之间或第35天与第7天之间(库3A)之前100个最富集候选构建体组合来产生。
从使用深度译码所得结果的最优命中者表中来看，CLE的特定模块中的某些多肽是在库3A及库3B中的至少一者及第21天及第35天(库3A)或第21天(库3B)的时间点中的至少一者的最优命中者当中。举例而言，含有以下的例示性构建体是在前5个最常见嵌合多肽当中(参见表12及表13)：在P2位置中，CD40(特定言的例如具有密码T011的跨膜域)、ICOS(特定言的例如具有密码T028的跨膜域)、FCGR2C(特定言的例如具有密码T024的跨膜域)、PRLR(特定言的例如具有密码T077的跨膜域)、IL3RA(特定言的例如具有密码T041的跨膜域)、IL6ST(特定言的例如具有密码T045的跨膜域)；在P2位置中，IL18R1(特定言的例如具有密码T062的跨膜域)；在P3位置中，MPL(特定言的例如具有密码S186的胞内域)、IL18R1(特定言的例如具有密码S154的胞内域)、IL13RA2(特定言的例如具有密码S142的胞内域)、IL10RB(特定言的例如具有密码S130的胞内域)、LEPR(特定言的例如具有密码S176的胞内域)、IFNAR2(特定言的例如具有密码S083的胞内域)、IL23R(特定言的例如具有密码S165的胞内域)、MyD88(特定言的例如具有密码S194的胞内域，及CSF2RA(特定言的例如具有密码S058的胞内域)；和/或在P4位置中，CD40(特定言的例如具有密码S050或S051的胞内域)、CD79B(特定言的例如具有密码S053的胞内域)、TNFRSF4(特定言的例如具有密码S211的胞内域)、TNFRSF9(特定言的例如具有密码S213的胞内域)、TNFRSF14(特定言的例如具有密码S214的胞内域)、FCGRA2(特定言的例如具有密码S076的胞内域)、CD3G(特定言的例如具有密码S039的胞内域)或CD27(特定言的例如具有密码S047的胞内域)。显然，MPL为对于两个库3A及3B而言在P3大间隔处的最常见嵌合多肽。注意来自P3的最优命中者不包括在库3A或3B中的这些构建体的P4位置中。
以下额外观测结果值得注意：P2_CD40、P2_ICOS、P3_MPL、P4_CD40及P4_CD79B在表12及13中的每一者中显示为最优命中者中的最常见部分。P4_CD27在表12及13中显示为最常见部分。CSF2RB在前123个最富集中出现4次且在P2处重复最多，但突变V449E并不出现在这些最优命中者中(表12)。因此，在本文的一些实施例中，嵌合多肽包含在表12及13中所示的任何构建体中识别的跨膜域，除CSF2RB的跨膜域突变V449E以外。八个MyD88变体在库3A前123个中的P3位置处出现至少一次(表12)。在库中测试的CD40的两个变体在库3A之前123个列表中的P4位置处出现至少一次(表12)。在P3处的MPL与在P4处的CD40的组合显示在库3A之前123个构建体清单中的26个构建体中(表12)。
为对基因进行基因分析，对于库3A，已知在某些细胞类型中促进信号传导活性的来自CD4、CD8B、CD40、CRLF2、CSF2RA、CSF3R、EPOR、FCGR2C、GHR、ICOS、IFNAR1、IFNGR1、IFNGR2、IL1R1、IL1RAP、IL2RG、IL3RA、IL5RA、IL6ST、IL7RA、IL10RB、IL11RA、IL13RA2、IL17RA、IL17RB、IL17RC、IL17RE、IL18R1、IL18RAP、IL20RA、IL22RA1、IL31RA、LEPR、PRLR及TNFRSF8的跨膜域(P2)或其突变体(若此类突变体存在于这些表中所提供的构建体中)在第7天与表示所指示的最后一天之间促进PBMC的增生，此时以组合方式考虑具有来自彼基因的跨膜域的所有构建体的数据时(表12)。此结论基于混合培养的PBMC细胞群体中的构建体的序列计数的富集，使得当针对一个基因将所有构建体的结果组合时，对于库3A，以表上指示的最后一天的标准化计数加一与第7天的标准化计数加一之间的比率的以2为底的对数计算的富集度为至少2。对于库3B(表13)，已知在某些细胞类型中促进信号传导活性的来自CD40、ICOS及IL18R1的跨膜域或其突变体(若此类突变体存在于这些表中)在以此方式分析时为表达最佳的。对于库3A及库3B，在表12及表13中提供了存在于促进最大程度的细胞增生的构建体中的跨膜域或其部分和/或突变体的实例。在表14及15中提供了存在于称为库3.1A及库3.1B的重复筛选中的促进细胞增生的构建体中的跨膜域或其部分和/或突变体的实例。
对于库3A，已知在某些细胞类型中促进信号传导活性的来自CSF2RA、IFNAR1、IL1RAP、IL4R、IL6ST、IL11RA、IL12RB2、IL17RA、IL17RD、IL17RE、IL18R1、IL21R、IL23R、MPL及MyD88的第一胞内域(P3)或其突变体(若此类突变体存在于这些表中所提供的构建体中)在发现处于本文的候选嵌合多肽组件的第一胞内域位置(P3)时在第7天与表上指示的最后一天之间促进PBMC的细胞增生，此时以组合方式考虑具有来自彼基因的第一细胞内域的所有构建体的数据。此结论基于混合培养的PBMC细胞群体中的构建体的序列计数的富集，使得当针对一个基因将所有构建体的结果组合时，对于库3A，以表上指示的最后一天的标准化计数加一与第7天的标准化计数加一之间的比率的以2为底的对数计算的富集度为至少2。对于库3B，已知在某些细胞类型中促进信号传导活性的来自CSF2RB、IL4R及MPL的第一胞内域或其突变体(若此类突变体存在于这些表中)在以此方式分析时为表达最佳的。在表12及表13中提供了对于库3A及库3B，存在于促进最大程度的细胞增生的构建体中的第一胞内域或其部分和/或突变体的实例。在表14及表15提供了存在于称为库3.1A及库3.1B的重复筛选中的促进细胞增生的构建体中的第一胞内域或其部分和/或突变体的实例。
对于库3A，已知在某些细胞类型中促进信号传导活性的来自CD3D、CD3G、CD27、CD40、CD79A、CD79B、FCER1G、FCGRA2、ICOS、TNFRSF4及TNFRSF8的第二胞内域(P4)或其突变体(若此类突变体存在于这些表中所提供的构建体中)在发现处于本文的候选嵌合多肽组件的第二胞内域位置(P4)时在第7天与第21或第7天与表上指示的最后一天之间促进PBMC的增生，此时以组合方式考虑具有来自彼基因的第二细胞内域的所有构建体的数据。此结论基于混合培养的PBMC细胞群体中的构建体的序列计数的富集，使得当针对一个基因将所有构建体的结果组合时，对于库3A，以表上指示的最后一天的标准化计数加一与第7天的标准化计数加一之间的比率的以2为底的对数计算的富集度为至少2。对于库3B，已知在某些细胞类型中促进信号传导活性的来自CD40的第二胞内域或其突变体(若此类突变体存在于这些表中)尽管未获得2倍log2富集度，但在以此方式分析时为表达最佳的。对于库3A及库3B，在表12及表13中提供了存在于促进最大程度的细胞增生的构建体中的第二胞内域或其部分和/或突变体的实例。在表14及表15中提供了存在于称为库3.1A及库3.1B的重复筛选中的促进细胞增生的构建体中的第二胞内域或其部分和/或突变体的实例。
实施例19.利用差示扫描量热法(DSC)在阿昔洛韦的不存在及存在下的F1A-795的热变性
在此实施例中，核苷类似物抗病毒药物与核糖开关(SEQ ID NO:87)的适体域的结合通过在核苷类似物抗病毒药物阿昔洛韦的缺失相比于存在下比较适体域的热变性来证实。
适体制备
利用IDT(Coralville，IA)将T7引物(SEQ ID NO:246)以及所鉴别候选序列的模板(反向互补物)合成为单链DNA。通过组合组分至1μM模板、2μM T7引物、200μM dNTP、1×Titanium Taq DNA聚合酶及1×Titanium Taq缓冲液(Clontech Laboratories；加州山景城)，接着在95℃下加热3分钟，在55℃下加热1分钟及在68℃下加热2分钟(无循环)来使候选物经引物扩增。42皮摩尔的双链DNA是用于根据标准试剂盒指示(1×反应缓冲液，7.5mM各NTP，10mM DTT，1×RiboGuard RNase抑制剂，1×Ampliscribe T7酶溶液)用AmpliscribeT7高产率转录试剂盒(Lucigen；威斯康星州米德尔顿)进行十二次20-μl反应。在42℃下培育反应物隔夜，接着通过添加1μl DNase I终止且在37℃下培育15分钟。在具有8M脲素的10％变性PAGE上纯化转录产物。冻干至少10纳摩尔的各候选物，且在结合评估当天将其再悬浮于1×结合缓冲液(50mM HEPES，100mM KCl，0.5mM MgCl2，pH 7.3)中。
简言之，DSC是用于分析在不存在阿昔洛韦的情况下的F1A-795(7.2μM)及在存在阿昔洛韦(29.4μM)的情况下的F1A-795(2.77μM)。所有分析均在1×结合缓冲液中进行且所使用的所有水均经DEPC处理。将所有分析物首先再悬浮于经DEPC处理的水中，接着在1×结合缓冲液中稀释至其最终所列浓度。在装载DSC(GE Healthcare MicroCal VP-DSC)之前，在25℃下对样本进行脱气10分钟。以每分钟1℃的速率自10℃至115℃扫描不具有阿昔洛韦的样本。以每分钟1℃的速率自10℃至105℃扫描具有阿昔洛韦的样本。
结果
如由DSC量测，在不存在阿昔洛韦的情况下的F1A-795的热变性具有中心在约60℃下的转换(图28)。此转换表明，适体域在不存在阿昔洛韦的情况下结构化。在不存在阿昔洛韦的情况下，F1A-795具有中心在约75℃下的转换(图28)。此稳定效果指示，核苷类似物抗病毒药物阿昔洛韦与适体域F1A-795结合。因此，此实验确认，F1A-795由阿昔洛韦结合。
实施例20.通过含有VSV-G的假型组件及膜结合活化组件及并且视情况含有Vpu蛋白质的反转录病毒颗粒对新鲜经分离且未经刺激的人类T细胞的转导效率
重组慢病毒颗粒是通过用编码gag/pol及rev的单独的慢病毒包装质粒及编码VSV-G的假型化质粒瞬时转染293T细胞(Lenti-XTM 293T，Clontech)来产生。编码GFP、抗CD19嵌合抗原受体及在本文称为F1-0-03的eTAG(图20)的第三代慢病毒表达载体用包装质粒共转染。细胞通过在FreestyleTM 293Expression Medium(ThermoFisher Scientific公司)中连续生长来适应悬浮培养。以1×106个细胞/毫升(30mL)在125L Erlenmeyer烧瓶中接种悬浮液中的细胞，并立即使用溶解于弱酸中的聚乙烯亚胺(PEI)(Polysciences)转染。
对于30mL细胞将质粒DNA稀释于1.5ml GibcoTM Opti-MEMTM培养基中。为获得用VSV-G假型化的慢病毒颗粒，所使用的总DNA(每mL培养体积中1μg)为具有以下穆尔比的4种质粒的混合物：2×基因组质粒(F1-0-03)、1×含Rev的质粒、1×含VSV-G的质粒及1×含gag/pol的质粒。为获得用VSV-G假型化且在其表面呈现抗CD3-scFvFc-GPI的慢病毒颗粒，所使用的总DNA(每mL培养体积中1μg)为具有以下穆尔比的5种质粒的混合物：2×基因组质粒(F1-0-03)、1×含Rev的质粒、1×含VSV-G的质粒、1×含抗CD3-scFvFc-GPI的质粒及1×含gag/pol的质粒。为获得用VSV-G假型化且呈现抗CD3-scFvFc-GPI并且含有辅助蛋白Vpu的慢病毒颗粒，所使用的总DNA(每mL培养体积中1μg)为具有以下穆尔比的6种质粒的混合物：2×基因组质粒(F1-0-03)、1×含Rev的质粒、1×含VSV-G的质粒、1×含抗CD3-scFvFc-GPI的质粒、1×含Vpu-CH的质粒及1×含gag/pol的质粒。单独地，将PEI在1.5ml GibcoTMOpti-MEMTM中稀释至每mL培养体积中2μg(与DNA的比为2:1比率)。在5分钟室温培育之后，将两种溶液彻底地混合在一起，且在室温下培育20分钟。将最终体积(3ml)添加至细胞中。接着伴随125rpm下及具有8％CO2、在37℃下培育细胞72小时。含有抗CD3-scFvFc-GPI的质粒包括来源于UCHT1的scFv及来源于DAF(CD55)的GPI锚定连接序列。UCHT1scFvFc-GPI载体编码包括与人类Igκ信号肽(NCBI GI No.CAA45494.1的氨基酸1-22)的肽(SEQ ID NO:278)，该人类Igκ信号肽与UCHT1 scFv(NCBI GI No.CAH69219.1的氨基酸21-264)融合、与人类IgG1 Fc(NCBI GI No.AEV43323.1的氨基酸1-231)、与人类DAF GPI锚定连接序列(NCBI GINo.NP_000565的氨基酸345-381)融合。含有Vpu-CH的质粒编码包括来自HIV-1M CH167-CC分离体(氨基酸1-84，GeneBank：AGF30946.1)的Vpu序列的肽(MFDFIARVDYRVGVVALVVALIIAIIVWSIVYIEYRKLLKQRKIDWLIKRIRERAEDSGNESDGEIEELSTMVDMEHLRLLDDL*)。
在72小时之后，采集上清液并且通过以1,200g离心10分钟来澄清。将经澄清上清液倒入新试管中。在4℃下，通过以3,300g隔夜离心来沉淀慢病毒颗粒。舍弃上清液，且将慢病毒颗粒集结粒再悬浮于1:100的初始体积的X-VivoTM 15培养基(Lonza)中。通过连续稀释及在转导72小时后的293T及Jurkat细胞中通过流式细胞术分析GFP表达来滴定慢病毒颗粒。
将周边血单核细胞(PBMC)自血块黄层分离，利用加州圣地亚哥血库收集并分配。根据制造商的说明书，进行基于SepMateTM 50(StemcellTM)的Ficoll-Paque
Figure BDA0002257374180001771
(GEHealthcare Life Sciences)上的PBMC的梯度密度分离。根据各SepMateTM试管将稀释于X-VivoTM 15培养基中的30mL的血块黄层分层。在室温下以1,200g离心20分钟之后，收集PBMC层，经汇集且用45mL的X-VivoTM 15培养基洗涤三次，并在室温下以400g离心10min。接着在室温下在10mL的RBC裂解缓冲液(Alfa Aesar)中培育丸粒10分钟，且用45mL的X-VivoTM 15培养基洗涤额外两次，并在室温下以400g离心10min。不采取额外步骤以移除单核细胞。在分离之后，将新鲜及未经刺激的PBMC再悬浮于X-VivoTM 15中达到1×106/mL的最终浓度，且用先前公开的慢病毒颗粒转导这些PBMC(两个重复)。使传导在37℃、5％CO2下在X-VivoTM15培养基中进行3天。传导通常在1毫升/孔的12孔盘形式中在针对[VSV-g]pp的MOI 10下及在针对[VSV-G+UCHT1]pp及[VSV-G+UCHT1+Vpu-CH]pp的MOI 1进行(两个重复)。在转导3天之后，收集样本并通过FACS分析CD3+群体中的绝对细胞计数及GFP表达量。
图34A及图34B分别显示在用所指示慢病毒颗粒转导新鲜经分离及未经刺激PBMC之后3天的总CD3+群体中的CD3+GFP+细胞的百分比(％)的直方图(图34A)及或CD3+群体的每孔绝对细胞数量的直方图(图34B)。各棒表示重复的平均值+/-SD。图34A显示，将抗CD3-scFvFc-GPI部分(UCHT1)添加至VSV-G假型化慢病毒颗粒中与单独的[VSV-G]pp相比产生对新鲜经分离及未经刺激PBMC的更高转导效率。图34A还示出，Vpu-CH的添加可进一步提高双假型化载体[VSV-G+UCHT1]pp的转导效率。图34B显示，UCHT1与仅VSV-G相比以每微升绝对细胞计数增强细胞刺激。Vpu及UCHT1的添加与仅VSV-G相比以绝对细胞计数类似地增强细胞刺激。
实施例21.个别淋巴增生性组件的特征化
在此实施例中，在实施例17及实施例18中描述的库筛选中识别的选择嵌合淋巴增生性组件(CLE)经单独地评估。为进一步分析在库2B筛选中识别的CLE，活化的PBMC用编码单独的CLE的慢病毒颗粒隔夜转导并且在不存在外源性细胞因子下培养。为进一步分析在库3A筛选中识别的CLE，活化的PBMC用编码在5’末端侧接有抗CD19 CAR的CLE的慢病毒颗粒隔夜转导，并且在存在每7天将供体匹配的CD19+B细胞添加至培养物中，但不存在外源性细胞因子的情况下培养。将细胞培养至多35天以评估CLE促进PBMC增生的能力。此实施例进一步提供表征任何个别推定的淋巴增生性组件的方法并且进一步证实若干高度活跃CLE的身份。
重组反转录病毒颗粒是在293T细胞(Lenti-XTM 293T，Clontech)中产生，该293T细胞适应在FreestyleTM 293 Expression Medium(ThermoFisher Scientific公司)无血清化学成分界定的培养基中悬浮培养。如实施例20中所解释，使用具有基因组质粒及3种编码gag/pol、rev的慢病毒包装质粒及编码的假型化质粒的PEI转染这些细胞。在实施例17及实施例18中描述的库筛选中识别的所选择CLE是自其部分(P1-2、P3及P4或P1、P2、P3及P4)各别再生的并且经插入至与其首先经识别的库相同的转基因表达盒中。所选择CLE中的每一者的模块部分显示于图35及36中并且基因名称及氨基酸序列显示于表6中。图31及32分别显示库2及库3的卡匣。用含有经由库筛选识别的构建体的慢病毒颗粒转导的细胞被称为“DL”紧接着库编号。举例而言，用含有来自库2的构建体的慢病毒颗粒转导的细胞称为DL2。因此，具有前缀“DL2”及“DL3”的CLE分别在图31及图32中所示的卡匣中构建的。类似地，“DC1-5”及“DC1-6”包含插入至如图30中所示的库1所使用的转基因表达盒中的CLE。DC1-5的嵌合淋巴增生性组件自胺基端至羧基端编码：人类IL-7(SEQ ID NO:511)、柔性接头(SEQID NO:53)及为不具有其信号肽的全长IL-7Rα的人类IL-7Rα(SEQ ID NO:229)的残基21-458。DC1-6的CLE自胺基端至羧基端编码：IL-7(SEQ ID NO:511)、柔性接头(SEQ ID NO:53)、IL-7Rα(CD127)(SEQ ID NO:513)的胞外及跨膜部分，及IL-2Rβ(CD122)(SEQ ID NO:514)的胞内域。先前已描述嵌合蛋白IL-7–IL-7Rα及IL-7–IL-7Rα–IL-2Rβ(Hunter等人.Molecular Immunology 56(2013):1-11)。IL-7“DC2-5”及“DC2-6”包含插入至如图31中所示的库2所使用的转基因表达盒中的CLE。DC2-5及DC2-6中的CLE分别为与DC1-5及DC1-6相同的CLE。包括未经转导的PBMC(NT)、用编码eTag而非CLE(F1-0-01)的载体转导的PBMC及用编码抗CD19 CAR及eTag而非CLE(F1-3-23)的载体转导的PBMC作为阴性对照。
此实施例中使用的来自库2B的构建体为DL2-1(M024-S190-S047)、DL2-2(M025-S050-S197)、DL2-3(M036-S170-S047)、DL2-4(M012-S045-S048)、DL2-5(M049-S194-S064)、DL2-6(M025-S190-S050)及DL2-7(M025-S190-S051)。
此实施例中使用的来自库3A的构建体为DL3A-1(E013-T047-S158-S080)、DL3A-2(E011-T024-S194-S039)、DL3A-3(E014-T040-S135-S076)、DL3A-4(E013-T041-S186-S051)、DL3A-5(E013-T064-S058-S212)、DL3A-6(E013-T028-S186-S051)、DL3A-7(E014-T015-S186-S051)、DL3A-8(E011-T016-S186-S050)、DL3A-9(E011-T073-S186-S050)及DL3A-10(E013-T011-S186-S211)。
在第0天，根据制造商的说明书，通过用Ficoll-Paque
Figure BDA0002257374180001781
(GE HealthcareLife Sciences)密度梯度离心接着裂解红细胞来自血块黄层(加州圣地亚哥血库)富集PBMC。将1.5×106个PBMC在补充有100IU/ml(IL-2)及50ng/ml抗CD3抗体(317326，Biolegend)的3ml完全OpTmizerTM CTSTM T细胞扩增SFM中接种在G-Rex 6孔盘(WilsonWolf，80240M)的各孔中以活化PBMC用于病毒转导。在37℃及5％CO2下转导隔夜之后，在MOI为5下将上文所描述的编码构建体的慢病毒颗粒直接添加至经活化PBMC中并且在37℃及5％CO2下培育隔夜。第二天，用完全OpTmizerTM CTSTM T细胞扩增SFM使各孔中的培养基体积达到30ml并且将盘放回培养箱中。在此或以下细胞培养步骤中不添加IL-2、IL-7或其他外源性细胞因子。在第7天收集各孔的细胞以测定细胞数目、存活百分比及经转导细胞百分比，其通过FACS分析定义为FLAG-Tag+或E-Tag+细胞的百分比。随后将这些细胞离心，再悬浮于新鲜的完全OpTmizerTM CTSTM T细胞扩增SFM中，并且将各样本的0.5×106个细胞在30ml完全OpTmizerTM CTSTM T细胞扩增SFM中再接种至G-Rex 6孔盘的孔中。先前将含有0.5×106个CD19+B细胞的冷藏第0天供体匹配的PBMC(如在第0天由FACS测定)添加至“DL3A-”培养物中以提供对CD19 ASTR的CD19+B细胞活化。在第35天采集细胞之前，在第14天、第20天及第28天重复此过程。
结果
将用编码CLE的慢病毒颗粒转导的PBMC在不存在外源性细胞因子下培养35天。增生表示为倍数扩增，其通过细胞总数除以该时间点接种的细胞数来计算。用图35中所示的各单独选择的CLE转导的PBMC比阴性对照增生更多，该阴性对照包括未经转导PBMC及用编码eTag而非CLE的载体转导的PBMC(图35)。此外，以下CLE在第14天、第21天、第28天及第35天呈现大于23的倍数扩增，而对于这些时间点，阴性对照的倍数扩增几乎为0：DL2-7、DC2-6、DL2-6、DL2-2、DL2-1及DC2-5。用编码抗CD19 CAR及不同CLE(图36中所示)的构建体转导并且在存在每7天添加新鲜的供体匹配的PBMC，但不存在外源性细胞因子的情况下培养的PBMC比阴性对照增生更多，该阴性对照包括未经转导PBMC及用编码抗CD19 CAR及eTag而非CLE的载体转导的PBMC。图36中所示的所有CLE在第35天呈现大于23的倍数扩增，而阴性对照的倍数扩增在第35天几乎为0。用含有编码DL3A-1(E013-T047-S158-S080)、DL3A-2(E011-T024-S194-S039)、DL3A-3(E014-T040-S135-S076)及DL3A-5(E013-T064-S058-S212)的多核苷酸的慢病毒颗粒转导的PBMC的增生与阴性对照相当并且未显示于图36中。
实施例22.对本文提供的各种说明性方法(包括经基因方式修饰的淋巴细胞的体内扩增)的概念性证明
此实施例提供用于离体转导PBMC(包括T细胞)并且活体内扩增这些经转导PBMC(包括T细胞)的例示性方法。此类方法包括用表达某些说明性嵌合淋巴增生性组件的说明性重组慢病毒颗粒进行的说明性4小时转导方法。此外，此类方法提供用于用复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转导PBMC(其在说明性实施例中通常为T细胞)4小时的额外例示性方法，其中该复制缺陷型重组反转录病毒颗粒通过在无血清化学成分界定的培养基中的悬浮液中用编码复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的各种组分的载体转染包装细胞来产生。
材料及方法
重组反转录病毒颗粒在293T细胞(Lenti-XTM 293T，Clontech)中产生，293T细胞适应在FreestyleTM 293 Expression Medium(ThermoFisher Scientific公司)无血清化学成分界定的培养基中悬浮培养。如实施例20中所解释使用具有3种基因组质粒(详述于下文)及3种编码gag/pol、rev的单独的包装质粒及编码VSV-G的假型化质粒中的1种的PEI瞬时转染细胞。为产生也显示膜结合活化组件的慢病毒颗粒，如实施例20中所描述共转染编码能够与CD3(UCHT1scFvFc-GPI)结合的膜结合多肽的第四包装质粒。基因组质粒为在3’LTR中含有导致自身失活的缺失的第三代慢病毒表达载体，其中该质粒编码以下：
(1)抗ROR2 MRB-CAR:T2A:eTag(F1-1-27)：该基因组质粒与图20中所示的彼基因组质粒一致，不同的处在于编码抗CD19 CAR的序列经具有识别人类ROR2、CD8茎及跨膜序列(SEQ ID NO:75)、CD137(SEQ ID NO:1)及CD3z(SEQ ID NO:13)的scFv的MRB-ASTR替代。编码此构建体的重组慢病毒颗粒称为F1-1-27
(2)Flag-抗ROR2 MRB-CAR:T2A:CLE(F1-1-228及F1-1-228U)：该基因组质粒与图20中所示的彼基因组质粒一致，不同的处在于编码抗CD19的序列经与上述(1)中所描述的抗ROR2 MRB-CAR共价连接的Flag标签替代，并且GMCSFR ss:eTag经CLE替代。该CLE为包含胞外二聚模块(P1)、跨膜模块(P2)及2个胞内模块(P3及P4)的I型跨膜蛋白质。在位置P1-P2-P3-P4中的基因为MycTag 2A Jun–IL13RA–MPL–CD40。这些模块的密码为E013-T041-S186-S051(参见表6)。该CLE首先在库3A、3B及4B中识别并且在库3A中的第7天与第35天之间为第6个最富集的CLE。编码此构建体的重组反转录病毒颗粒称为F1-1-228并且编码此构建体并且显示UCHT1scFvFc-GPI的重组反转录病毒颗粒称为F1-1-228U；或
(3)Flag-抗CD19 CAR:T2A:CLE(F1-3-219及F1-3-219U)：该基因组质粒与图20中所示的抗人类CD19 CAR一致，不同的处在于Flag标签插入在CD8ss与CAR之间，并且编码GMCSFRss:eTag的序列经CLE替代。该CLE为I型跨膜蛋白质，其包含经由柔性接头共价连接至其同源白细胞介素受体的胞外及跨膜模块域并且共价连接至不同细胞因子受体的胞内域的白细胞介素多肽。特定言的，自胺基端至羧基端，该质粒编码：IL-7(SEQ ID NO:511)、柔性接头(SEQ ID NO:53)、IL-7Rα(CD127)(SEQ ID NO:513)的胞外及跨膜部分，及IL-2Rβ(CD122)(SEQ ID NO:514)的胞内域。编码此构建体的重组反转录病毒颗粒称为F1-3-219并且编码此构建体并且显示UCHT1scFvFc-GPI的重组反转录病毒颗粒称为F1-3-219U。
PBMC分离，在离体刺激之后对PBMC的隔夜转导，接着对经工程化淋巴细胞的15天离体扩增
在第0天，根据制造商的说明使用CS-900.2试剂盒(BioSafe；1008)在Sepax 2 S-100器件(Biosafe；14000)上通过密度梯度离心使用Ficoll-PacqueTM(General Electric)自知情同意的健康志愿者的ACD周边血中分离PBMC。将3.0×107个活PBMC接种在1L G-Rex(Wilson-Wolf)上并且使用补充有100IU/ml IL-2(Novoprotein，GMP-CD66)、10ng/ml IL-7(Novoprotein，GMP-CD47)及50ng/ml抗CD3抗体(OKT3，Novoprotein)的完全OpTmizerTMCTSTM T细胞扩增SFM使体积达到60ml以活化这些PBMC(其包括T细胞及NK细胞)用于病毒转导。在37℃及5％CO2下培育隔夜之后，在MOI为5(440ul)下将编码抗ROR2 MRB-CAR、F1-1-27的慢病毒颗粒直接添加至经活化PBMC中并且在37℃及5％CO2下培育隔夜。在隔夜培育之后，通过使用补充有NAC(Sigma)的完全OpTmizerTM CTSTM T细胞扩增SFM使G-Rex中的培养基总体积达到100ml来供养细胞以使最终浓度增加10mM以及100IU/ml重组人类IL-2及10ng/ml重组人类IL-7。在每48小时添加100IU/ml重组人类IL-2及10ng/ml重组人类IL-7溶液下在37℃及5％CO2下将G-Rex器件在标准湿润组织培养箱中培育。在采集之前，细胞在第15天时扩增。将这些经转导细胞在冷冻培养基(70％RPMI 1640、20％热失活FBS、10％DMSO)中洗涤并且以5.0×107个细胞/毫升的1ml等分试样冷藏保存以稍后使用。在用于下文实施例中的实验A组之前两天，将8小瓶(4.0×108)这些冷藏保存的经F1-1-27转导的PBMC解冻并且在含有377ml补充有100IU/ml的IL-2(Novoprotein)、10ng/ml IL-7(Novoprotein)及充足的NAC的完全OpTmizerTM CTSTM T细胞扩增SFM(根据制造商的说明书补充有26mlOpTmizerTM CTSTM T细胞扩增补充液(Thermo Fisher，A10484-02)、25ml CTSTM免疫细胞SR(Thermo Fisher，A2596101)及10ml CTSTMGlutaMAXTM-I补充液(Thermo Fisher，A1286001)的OpTmizerTM CTSTM T细胞扩增基础培养基1L(Thermo Fisher，A10221))的G-Rex100M中静置2天以使最终浓度增加10mM。
在无需事先离体刺激并且无需离体细胞扩增下的PBMC分离及静息淋巴细胞的有利快速转导
将知情同意的2个健康志愿者的全部人类血液收集至含有1.5ml柠檬酸葡萄糖溶液A抗凝剂的多个100mm Vacutainer管(Becton Dickenson；364606)中(ACD周边血)。对于各志愿者，将来自Vacutainer管的血液汇集(185.2ml用于B组，182.5ml用于C组)并且分配至2个标准500ml血液收集袋中经由转导进行PBMC富集的以下步骤在封闭系统中进行。
在Sepax 2S-100器件(Biosafe；14000)上使用CS-900.2试剂盒(BioSafe；1008)使用用Ficoll-PaqueTM(General Electric)的密度梯度离心对来自各志愿者的2个血袋中的血液依次处理，根据制造商的说明书使用2次洗涤循环，以每次运行获得45ml经分离PBMC。用于Sepax 2处理中的洗涤溶液为标准生理盐水(Chenixin Pharm)+2％人类血清白蛋白(HSA)(Sichuan Yuanda Shuyang Pharmaceutical)。最终的细胞再悬浮溶液为45ml完全OpTmizerTM CTSTM T细胞扩增SFM(补充有26ml OpTmizerTM CTSTM T细胞扩增补充液(ThermoFisher，A10484-02)、25ml CTSTM免疫细胞SR(Thermo Fisher，A2596101)及10ml CTSTMGlutaMAXTM-I补充液(Thermo Fisher，A1286001)的OpTmizerTM CTSTM T细胞扩增基础培养基1L(Thermo Fisher，A10221-03))。Sepax 2机器上的每一处理步骤大约为1小时及12分钟。自2个处理轮次获得的经富集PBMC分别汇集用于B组及C组，并且对这些细胞计数。
将5.5×107个新鲜富集的活PBMC接种至用于B组的4个标准血液收集袋中的每一个中，并且使用完全OpTmizerTM CTSTM T细胞扩增SFM使体积达到55ml以使得细胞密度为1.0×106/ml。将1.12×108个新鲜富集的活PBMC接种至用于C组的2个标准血液收集袋中的每一个中，并且使用完全OpTmizerTM CTSTM T细胞扩增SFM使体积达到110ml以使得细胞密度为1.0×106/ml。不添加抗CD3、抗CD28、IL-2、IL-7或其他外源性细胞因子以在转导之前离体活化或以其他方式刺激淋巴细胞。如下在MOI为1下将慢病毒颗粒直接添加至血液收集袋中的未刺激PBMC中：将0.779ml的F1-1-228添加至一袋B组PBMC中并且将3.11ml的F1-1-228U添加至另一袋B组PBMC中；将0.362ml的F1-3-219添加至一袋C组PBMC中并且将3.52ml的F1-3-219U添加至另一袋C组PBMC中。温和地按摩转导反应混合物以混合内容物，随后在37℃及5％CO2下在标准湿润组织培养箱中在血液收集袋中培育四(4)小时。随后将来自各袋的PBMC翻译至50ml Conical管中(从而在此概念验证试验中自封闭系统移除细胞)并在再悬浮于5ml DPBS+2％HAS中之前在DPBS+2％HAS中洗涤3次并计数。下表显示该过程中的每一步骤的持续时间及经历的总时间。在这些PBMC用于此实施例中的试验中之前不对其进行其他处理。
Figure BDA0002257374180001801
表24.在血液解冻及汇集之后各步骤的经历时间。
通过上述方法转导PBMC的体外转导效率及细胞因子非依赖性存活/增生[1086]将诱导T细胞及NK细胞的2.0x 106个PBMC一式两份或一式三份接种至各样本的6孔组织培养盘的各孔中。将这些盘离心并且将各样本再悬浮于2ml完全OpTmizerTM CTSTM T细胞扩增SFM中。不添加细胞因子。在37℃及5％CO2下在标准湿润组织培养箱中培养这些盘6天。在第3天将各孔的细胞悬浮液的一半(1ml)移除并且在第6天移除剩余细胞以测定细胞数目、存活百分比及转导细胞百分比，其通过FACS分析定义为FLAG-Tag+细胞的百分比。将第6天的总细胞计数加倍以解释在第3天移除细胞的一半。
通过上述方法转导致效应PBMC的体内增生/存活及靶向杀死肿瘤
选择使用NSG或NOD Scid Gamma小鼠的异种移植模型来探测用F1-1-27、F1-1-228、F1-1-228U、F1-3-219及F1-3-219U转导的人类PBMC在体内存活、增生及杀死同源抗原表达肿瘤的能力。NSG为缺乏成熟T细胞、NK细胞及B细胞的小鼠品种且为迄今为止描述的最免疫缺乏的小鼠品系之一。通常对免疫系统的这些细胞组分进行移除以致使人类PBMC能够在宿主物先天性、体液性或适应性免疫反应的情况下移植。由于不存在小鼠细胞外共同γ链，所以通常仅在人类中进行辐射或淋巴耗尽化学疗法之后才能实现稳定细胞因子的浓度，此使得经接受性转移的人类细胞能够接受此类细胞因子。同时，这些动物还可用于移植肿瘤异种移植靶标以检测CAR杀死靶向表达肿瘤的功效。尽管异种反应性T细胞受体抗原在效应细胞产物中的存在最终会引起移植物抗宿主病，但这些模型能够对动物药理学及急性耐受性进行短期评估。
表达内源性人类CD19的Raji细胞(ATCC,弗吉尼亚州马纳萨斯)及经转染以稳定表达人类ROR2(CHO-ROR2)的CHO细胞(ATCC,弗吉尼亚州马纳萨斯)用于提供抗原来刺激CAR效应细胞并且产生一致的目标肿瘤以测定CAR效应细胞杀死同源抗原表达肿瘤的功效。Raji细胞及转基因CHO变体在与Matrigel人造基底组合皮下施用至NSG小鼠中之后快速生长并伴有散播性恶性肿瘤。
根据中国科学院生化与细胞所实验动物管理委员会(Institutional AnimalCare and Use Committee)批准的方案处理小鼠。皮下(sc)肿瘤异种移植物在雌性NOD-PrkdcscidIl2rgtm1/Begen(B-NSG)小鼠(北京百奥赛图基因生物技术有限公司)之后腹侧建立。简言之，培养的Raji细胞及培养的CHO-ROR2细胞单独地在DPBS(Thermo Fisher)中洗涤，计数，再悬浮于冷DPBS中并且与浓度为0.5×106个细胞/200微升的适当体积的Matrigel ECM(Corning；最终浓度5mg/mL)在冰上混合。在注射之前使用标准批准的麻醉及脱毛(Nair)来制备动物以供注射。分别将Raji及CHO-ROR2细胞的200μl的含细胞悬浮液的ECM皮下注射至9周龄或10周龄小鼠的后侧面。
在肿瘤接种后5天，如下通过尾部静脉注射来静脉内(IV)给药携带有平均77mm3体积的CHO-ROR2肿瘤的小鼠：A组中的NSG小鼠接受含用F1-1-27慢病毒颗粒转导的1×107个PBMC的200μl DPBS(n＝4)，或仅200μl DPBS(n＝2)；B组中的NSG小鼠接受含用F1-1-228慢病毒颗粒转导的0.85×107个PBMC的200μl DPBS(n＝2)、含用F1-1-228U慢病毒颗粒转导的0.85×107个PBMC的200μl DPBS(n＝2)或仅200μl DPBS(n＝2)。类似地，在肿瘤接种后5天，通过尾部静脉注射仅200μl DPBS(n＝4)或用含F1-3-219慢病毒颗粒的200μl DPBS(n＝3)或含F1-3-219U慢病毒颗粒的200μl DPBS(n＝3)转导的1×107个PBMC来静脉内(IV)给药携带有Raji肿瘤的C组中的小鼠(平均76mm3体积)。应注意，使用在离体活化之前且不进行离体细胞扩增的情况下对静息淋巴细胞的有利快速转导的方案来转导具有F1-1-228、F1-1-228U、F1-3-219及F1-3-219U的PBMC用于给药这些小鼠。自全部人类血液收集至用经转导的PBMC IV给药小鼠所经历的总时间对于F1-1-228及F1-1-228U为14.5小时，且对于F1-3-219及F1-3-219U为11.5小时。
使用测径规一周2次量测肿瘤并且使用以下等式计算肿瘤体积：(最长直径×最短直径2)/2。在第7天、第14天及第21天自各小鼠收集大约100μl血液以供FACS及qPCR分析。当小鼠被安乐死时，还收集血液、脾脏及肿瘤，其与来自肿瘤负荷的尸检指针一致。
流式细胞术
对于自体外培养物收获的细胞-将细胞离心并再悬浮于0.5ml FACS染色缓冲液(554656，BD)中。将2.5μl人类Fc嵌段(BD，564220)添加至各样本中并且在室温下培育10分钟。在冰上用0.5μl抗FLAG Tag PE((抗DYKDDDDK)637310，Biolegend))及0.5μl Live/DeadFixable Green Dead细胞染色剂(L34970，Thermo Fisher)对细胞染色30min。将细胞用FACS缓冲液洗涤两次，固定在FACS缓冲液及BD Cytofix(554655，BD)的1:1混合物中，用Novocyte(ACEA)处理，并且使用基于正向及侧向散射以及活死染色的活阀门用NovoExpress软件(ACEA)分析所得数据。量测经转导的淋巴细胞作为FLAG Tag+细胞。
对于自血液获得的细胞—新鲜收集的血液中的红血球使用裂解缓冲液(555899，BD)来裂解并且将剩余细胞再悬浮于100μl的FACS染色缓冲液中。将2.5μl人类Fc嵌段(BD，564220)添加至各样本中并且在室温下培育10分钟。在冰上用生物素化的西妥昔单抗对细胞染色30min经染色的细胞用FACS缓冲液洗涤并且用5μl抗人类CD45-PE-Cy7及0.5μl抗小鼠CD45-FITC进一步染色。将0.4μl SA-PE添加至来自这些组的经用F1-1-27、F1-1-228、F1-1-228U及PBS对照转导的细胞给药的小鼠的样本中。将1μl抗FLAG Tag PE((抗DYKDDDDK)637310，Biolegend)添加至来自此组的经用F1-3-219及F1-3-219U以及PBS对照转导的细胞给药的小鼠的样本中。在冰上培育细胞30min，在FACS缓冲液中洗涤两次，并且再悬浮于具有1μl 7-AAD(420404，Biolegend)的100μl FACS染色缓冲液中。新鲜染色的样本用Novocyte(ACEA)处理，并且使用基于正向及侧向散射的活阀门、基于7-AAD、人类CD45+的活阀门用NovoExpress软件(ACEA)分析所得数据并且检测FLAG或eTag的表达。
qPCR
通过生物分析qPCR来评估自血液样本分离的基因组DNA(gDNA)的经转导淋巴细胞的存在。使用QIAamp DNA Blood Mini试剂盒(Qiagen 51106)自50μl血液样本分离基因组DNA并且使用QIAamp DNA Micro试剂盒(56304)进一步清洗该DNA。使用对于慢病毒的5’LTR具有特异性的引物及探针组对分离的基因组DNA进行TaqMan测定(Thermo Fisher)以检测经转导的细胞。
结果
在此实验中使用经VSV-G假型化并且编码CAR及淋巴增生性组件的慢病毒颗粒。慢病毒颗粒F1-1-228及F1-1-228U编码MRB-CAR至ROR2并且慢病毒颗粒F1-2-219及F1-3-219U编码CAR至CD19。慢病毒颗粒F1-1-228U及F1-3-219U还在其表面上呈现UCHT1scFvFc-GPI。通过用Ficoll-PaqueTM密度梯度离心自人类血液分离PBMC。在细胞离体活化之前，将新鲜PBMC在标准血袋中用慢病毒颗粒转导。在4小时转导之后，将细胞洗涤并且用于以下实验中。熟练的技术人员将理解，自血液收集至洗涤细胞的整个过程可在封闭系统中进行。作为对照，将PBMC活化隔夜，用编码CAR而不编码淋巴增生性组件或UCHT1scFvFc-GPI的慢病毒颗粒转导，并且离体扩增15天(F1-1-27)。
将经转导的PBMC在不存在细胞因子下体外培养。图37显示在第6天的转导效率。UCHT1scFvFc-GPI增加F1-1-228及F1-3-219的转导效率。静息PBMC在暴露于F1-1-228U或F1-3-219U 4小时时的转导效率分别为34％及73％。图38显示在第3天与第6天之间的这些培养物中的活细胞总数。用F1-1-228U或F1-3-219U转导的静息PBMC在不存在外源性细胞因子下在第3天与第6天之间存活且甚至增生，而用F1-1-228或F1-3-219转导的PBMC却未存活且甚至增生。这些结果证实，呈现活化组件并且编码淋巴增生性组件的慢病毒颗粒可在4小时内转导静息PBMC，并且这些经转导的PBMC在不存在外源性细胞因子下培养6天时可体外增生且存活。
携带ROR2或CD19肿瘤的免疫缺乏小鼠经静脉内给予分别表达CAR至ROR2或CD19的1×107个PBMC。随着时间检测经转导PBMC在体内存活且增生的能力。图39A-C显示作为经转导细胞的读数的通过qPCR的每微克基因组DNA的慢病毒拷贝。图39A显示对于F1-1-27的每微克基因组DNA的慢病毒拷贝，其不编码淋巴增生性组件，自第7天的平均数884降低至低于第21天的定量下限(LLOQ)。图39B显示对于F1-1-228U的慢病毒拷贝低于第7天及第14天的LLOQ，但第21天增加大于LLOQ并且在第25天增加至平均数1,939。图39C显示当小鼠被安乐死时，对于F1-3-219U的慢病毒拷贝自低于第7天的LLOQ增加至第14天的20,430。在对照样本F1-1-228及F1-3-219中的慢病毒拷贝仍低于LLOQ。图40显示在小鼠被安乐死时(最后时间点显示于图39中)如通过对CAR构建体的eTag或FLAG-Tag的FACS分析所测定的每200ul血液的经转导细胞数目。每200ul来自用F1-1-228U(5,857)及F1-3-219U(121,324)转导的细胞给药的小鼠的血液中检测到显著数目的CAR+细胞。用F1-1-228或F1-3-219U转导的淋巴细胞杀死在体内表达其目标抗原的肿瘤(图41A及B)。在两种情况下，淋巴细胞以延迟方式减小肿瘤体积。不受理论限制，但此延迟与注射细胞扩增的需求一致，其花费如qPCR所观测的时间。后来的时间点不能在此实验中研究，这是由于携带ROR2肿瘤的小鼠达到了对于肿瘤负荷的安乐死指针，并且携带Raji肿瘤的小鼠产生了由小鼠中大量经转导及扩增的淋巴细胞引起的移植物抗宿主病。这些数据一起显示，呈现活化组件并且编码淋巴增生性组件的反转录病毒颗粒可在4小时内转导静息PBMC，并且这些转导的PMBC可体内增生并存活。在此实验中测试的两种淋巴增生性组件MycTag 2A Jun-IL13Ra-MPL-CD40及IL-7-IL-7Rα-IL-2Rβ呈现促进体内存活且增生的能力。此外，以此方式转导的表达MRB-CAR(F1-1-228U)或传统CAR(F1-3-219U)的这些淋巴细胞能够体内识别并且杀死肿瘤细胞。
所公开的实施例、实例及实验不意欲限制本发明的范畴或表示以下实验为进行的全部或唯一的实验。已努力确保关于所使用的数字(例如，量、温度等)的准确度，但应计入一些实验性误差及偏差。应理解，可在不改变实验意欲说明的基本方面的情况下对如所描述的方法进行变化。
熟习此项技术人员可在本发明的范畴及精神下设计许多修改及其他实施例。实际上，可在不改变本发明的基本方面的情况下由熟练的技术人员对所描述的材料、方法、图式、实验、实例及实施例进行变化。所公开实施例中的任一者可结合其他所公开的实施例来使用。
在一些情况下，参考特定实施例描述一些概念。然而，一般熟练此项技术人员理解，可在不背离如以下申请专利范围所阐述的发明内容的范畴的情况下进行各种修改及改变。因此，说明书及图式应视为呈说明性意义而非限制性意义，且所有这些修改意欲包括在本发明的范畴内。
表6.部分P1-P2、P1、P2、P3及P4的密码、名称、细胞因子受体、ITAM基元及氨基酸序列
Figure BDA0002257374180001831
Figure BDA0002257374180001841
Figure BDA0002257374180001851
Figure BDA0002257374180001861
Figure BDA0002257374180001871
Figure BDA0002257374180001881
Figure BDA0002257374180001891
Figure BDA0002257374180001901
Figure BDA0002257374180001911
Figure BDA0002257374180001921
Figure BDA0002257374180001931
Figure BDA0002257374180001941
Figure BDA0002257374180001951
Figure BDA0002257374180001961
Figure BDA0002257374180001971
Figure BDA0002257374180001981
表7.文库1A最优构建体。
Figure BDA0002257374180001982
Figure BDA0002257374180001991
Figure BDA0002257374180002001
表8.文库2B最优构建体。
Figure BDA0002257374180002002
Figure BDA0002257374180002011
表9.文库1.1A最优构建体。
嵌段序列 Norm_D7 富集_D42 嵌段序列 Norm_D7 富集_D42
M007-S120-S214 0.00 16.52 M030-S054-S169 0.97 10.42
M001-S117-S105 2.25 15.48 M012-S117-S142 4.31 10.40
M024-S062-S137 0.77 14.07 M042-S038-S053 1.54 10.24
M012-S117-S194 4.25 14.05 M001-S186-S084 3.02 10.17
M012-S117-S126 0.00 13.58 M024-S130-S171 0.00 10.05
M001-S117-S169 0.84 13.18 M042-S190-S042 3.41 9.93
M012-S062-S046 2.45 12.77 M036-S143-S194 0.39 9.92
M012-S117-S058 2.96 12.75 M030-S168-S137 7.34 9.81
M048-S054-S076 5.15 12.73 M012-S062-S136 1.29 9.77
M036-S080-S195 3.09 12.44 M030-S084-S143 7.53 9.60
M042-S120-S199 3.09 12.29 M012-S054-S169 2.70 9.51
M030-S080-S197 0.00 12.21 M012-S062-S170 14.22 9.34
M001-S155-S048 1.29 11.96 M030-S062-S143 0.45 9.34
M012-S171-S074 1.09 11.86 M030-S154-S194 3.09 9.28
M030-S117-S049 5.21 11.74 M012-S064-S063 3.35 9.25
M030-S170-S080 6.18 11.63 M030-S170-S194 7.27 9.19
M030-S136-S101 4.38 11.59 M030-S170-S168 3.67 9.14
M024-S130-S063 8.30 11.51 M012-S106-S169 1.35 9.10
M024-S211-S154 4.83 11.45 M001-S117-S052 2.64 9.10
M012-S062-S138 0.90 11.06 M030-S198-S169 1.03 9.04
M030-S102-S191 1.42 10.86 M030-S214-S050 2.32 9.02
M036-S197-S076 0.00 10.82 M036-S199-S038 1.61 9.01
M030-S190-S047 0.00 10.75 M018-S044-S177 4.38 8.85
M012-S062-S169 11.00 10.59 M001-S190-S042 0.00 8.79
M012-S037-S157 0.90 10.52 M036-S175-S059 10.04 8.78
表10.文库1.1B最优构建体。
嵌段序列 Norm_D7 富集_D28 嵌段序列 Norm_D7 富集_D28
M001-S126-S170 2.57 7.68 M042-S141-S120 0.84 6.17
M012-S106-S169 1.35 7.65 M042-S130-S177 0.84 6.17
M007-S194-S100 0.00 7.19 M036-S176-S116 0.58 6.16
M036-S101-S183 0.00 7.11 M007-S109-S212 0.64 6.14
M024-S135-S098 0.00 7.08 M010-S195-S100 0.84 6.10
M024-S038-S098 0.00 7.04 M012-S168-S175 0.00 6.07
M007-S109-S135 0.00 7.02 M018-S102-S117 0.00 6.01
M024-S191-S038 0.00 6.94 M018-S211-S083 0.00 6.00
M012-S064-S116 0.00 6.93 M018-S192-S058 0.00 6.00
M009-S100-S074 0.00 6.84 M042-S143-S168 0.00 5.95
M001-S120-S039 0.00 6.84 M012-S186-S120 0.00 5.95
M018-S154-S085 0.00 6.83 M030-S087-S052 0.00 5.95
M030-S104-S048 0.00 6.79 M008-S186-S085 0.00 5.94
M030-S168-S121 0.00 6.78 M042-S202-S050 0.00 5.93
M042-S120-S171 1.16 6.75 M001-S171-S214 0.00 5.91
M036-S176-S195 0.90 6.62 M001-S138-S037 0.00 5.91
M010-S171-S169 0.00 6.53 M012-S143-S176 0.00 5.91
M030-S175-S120 1.48 6.52 M042-S186-S050 0.00 5.91
M048-S051-S115 0.84 6.52 M012-S192-S076 3.09 5.91
M024-S047-S080 0.00 6.50 M048-S098-S074 0.00 5.90
M009-S199-S141 0.77 6.39 M042-S186-S215 0.00 5.90
M018-S136-S183 0.39 6.34 M048-S050-S211 0.00 5.90
M036-S062-S212 1.03 6.30 M010-S074-S169 1.35 5.88
M012-S211-S137 0.71 6.21 M008-S212-S099 3.22 5.88
M010-S064-S171 0.71 6.19 M001-S074-S197 0.00 5.88
表11.文库2.1B最优构建体。
嵌段序列 Norm_D7 富集_D28 嵌段序列 Norm_D7 富集_D28
M042-S186-S044 0.78 8.65 M010-S177-S215 1.63 5.85
M048-S100-S045 0.98 8.51 M024-S193-S193 0.33 5.83
M001-S186-S170 2.21 8.24 M012-S049-S192 0.20 5.80
M024-S039-S052 6.24 7.53 M048-S130-S170 0.39 5.80
M001-S214-S058 0.26 7.27 M018-S175-S171 1.56 5.80
M042-S080-S074 2.02 7.04 M030-S051-S080 2.28 5.79
M030-S170-S115 2.60 6.96 M012-S121-S072 0.13 5.76
M009-S083-S138 1.04 6.44 M009-S183-S161 1.50 5.75
M042-S154-S075 2.73 6.44 M007-S077-S059 0.33 5.75
M030-S214-S143 4.49 6.33 M018-S058-S062 1.76 5.73
M012-S213-S211 1.63 6.23 M008-S170-S168 0.33 5.73
M036-S212-S214 0.78 6.17 M018-S050-S043 0.33 5.73
M030-S036-S106 2.86 6.05 M012-S215-S126 1.17 5.69
M001-S169-S083 1.30 6.04 M024-S083-S047 3.58 5.68
M007-S105-S064 0.13 5.95 M048-S052-S084 0.52 5.68
M009-S039-S183 1.56 5.95 M042-S052-S130 1.56 5.67
M009-S074-S050 1.63 5.94 M036-S064-S047 1.95 5.65
M012-S076-S051 1.43 5.94 M008-S148-S137 0.52 5.65
M010-S072-S186 1.30 5.92 M036-S198-S135 0.52 5.64
M008-S142-S075 0.13 5.91 M018-S043-S051 1.11 5.64
M001-S175-S168 0.33 5.87 M042-S105-S104 0.46 5.62
M036-S170-S175 0.13 5.87 M030-S074-S082 0.39 5.61
M018-S194-S116 1.43 5.87 M036-S083-S130 0.52 5.59
M042-S115-S121 0.33 5.85 M001-S137-S157 0.46 5.58
M018-S043-S086 0.00 5.85 M008-S083-S104 0.72 5.57
表12.文库3A最优构建体。
Figure BDA0002257374180002021
Figure BDA0002257374180002031
Figure BDA0002257374180002041
表13.文库3B最优构建体。
Figure BDA0002257374180002042
Figure BDA0002257374180002051
表14.文库3.1A最优构建体。
嵌段序列 Norm_D7 富集_D35 嵌段序列 Norm_D7 富集_D35
E006-T074-S194-S211 0.00 15.37 E007-T065-S106-S053 1.23 11.32
E010-T073-S186-S211 3.27 14.82 E008-T001-S190-S053 0.00 11.30
E009-T049-S106-S037 0.00 13.34 E007-T032-S138-S052 0.00 11.24
E009-T073-S190-S215 2.10 13.00 E010-T044-S190-S080 2.28 11.20
E009-T009-S165-S052 0.80 12.98 E009-T044-S129-S053 1.23 11.18
E009-T066-S168-S053 2.10 12.85 E008-T073-S186-S080 0.00 11.17
E010-T024-S197-S214 0.00 12.59 E007-T020-S082-S211 0.00 11.16
E009-T072-S186-S039 0.00 12.42 E007-T006-S195-S052 0.00 11.11
E009-T038-S105-S050 0.00 12.38 E008-T027-S190-S050 1.61 11.08
E006-T057-S105-S039 0.00 12.38 E007-T056-S143-S050 0.68 10.99
E007-T017-S197-S047 1.79 12.25 E010-T042-S177-S049 1.85 10.96
E010-T045-S138-S074 0.00 12.20 E008-T034-S064-S039 0.00 10.95
E008-T024-S197-S039 0.00 12.16 E007-T040-S054-S052 1.85 10.83
E006-T077-S202-S053 0.00 12.09 E010-T019-S054-S051 1.48 10.80
E009-T032-S105-S048 1.85 12.05 E007-T058-S086-S052 1.48 10.78
E008-T056-S197-S050 0.00 12.02 E009-T019-S192-S214 0.86 10.69
E006-T008-S170-S075 1.36 12.01 E010-T066-S192-S037 1.91 10.67
E010-T017-S084-S052 0.00 11.96 E006-T048-S194-S074 0.00 10.57
E009-T032-S129-S047 0.00 11.69 E006-T078-S102-S075 1.05 10.55
E010-T053-S194-S211 1.30 11.69 E010-T017-S197-S053 1.17 10.55
E008-T010-S064-S037 0.00 11.68 E010-T041-S169-S074 0.00 10.50
E009-T060-S175-S053 0.00 11.50 E006-T038-S192-S053 1.79 10.47
E008-T073-S169-X002 0.00 11.39 E007-T032-S129-S212 0.49 10.46
E009-T071-S186-S211 4.08 11.38 E007-T035-S189-S051 4.08 10.45
E006-T077-S069-S050 4.94 11.35 E006-T006-S116-S214 0.00 10.44
表15.文库3.1B最优构建体。
Figure BDA0002257374180002052
Figure BDA0002257374180002061
表16.文库4B最优构建体。
Figure BDA0002257374180002062
Figure BDA0002257374180002071
表17.文库4.1B最优构建体。
Figure BDA0002257374180002072
Figure BDA0002257374180002081
表18.Lib3 P4终止。
Figure BDA0002257374180002082
Figure BDA0002257374180002091
Figure BDA0002257374180002101
Figure BDA0002257374180002111
Figure BDA0002257374180002121
Figure BDA0002257374180002131
Figure BDA0002257374180002141
Figure BDA0002257374180002151
Figure BDA0002257374180002161
Figure BDA0002257374180002171
Figure BDA0002257374180002181
Figure BDA0002257374180002191
Figure BDA0002257374180002201
Figure BDA0002257374180002211
Figure BDA0002257374180002221
Figure BDA0002257374180002231
Figure BDA0002257374180002241
Figure BDA0002257374180002251
Figure BDA0002257374180002261
Figure BDA0002257374180002271
Figure BDA0002257374180002281
Figure BDA0002257374180002291
Figure BDA0002257374180002301
Figure BDA0002257374180002311
Figure BDA0002257374180002321
Figure BDA0002257374180002331
Figure BDA0002257374180002341
Figure BDA0002257374180002351
Figure BDA0002257374180002361
Figure BDA0002257374180002371
Figure BDA0002257374180002381
Figure BDA0002257374180002391
Figure BDA0002257374180002401
Figure BDA0002257374180002411
Figure BDA0002257374180002421
Figure BDA0002257374180002431
Figure BDA0002257374180002441
Figure BDA0002257374180002451
表19.文库1A及1.1A中具有特别值得注意的富集度的构建体。
Figure BDA0002257374180002452
表20.文库2B及2.1B中具有特别值得注意的富集度的构建体。
Figure BDA0002257374180002453
表21.文库3A及3.1A中具有特别值得注意的富集度的构建体。
Figure BDA0002257374180002454
Figure BDA0002257374180002461
表22.文库3B及3.1B中具有特别值得注意的富集度的构建体。
Figure BDA0002257374180002462
Figure BDA0002257374180002471
Figure BDA0002257374180002481
表23.文库4B及4.1B中具有特别值得注意的富集度的构建体。
Figure BDA0002257374180002482
Figure BDA0002257374180002491
序列表
<110> F1肿瘤医学公司
<120> 用于转导和扩增淋巴细胞以及调节其活性的方法及组合物
<130> F1.001.WO.03
<150> 62/467,039
<151> 2017-03-03
<150> PCT/US2017/023112
<151> 2017-03-19
<150> 62/560,176
<151> 2017-09-18
<150> 62/564,253
<151> 2017-09-27
<150> 62/564,991
<151> 2017-09-28
<150> 15/462,855
<151> 2017-03-19
<150> 15/644,778
<151> 2017-07-08
<150> PCT/US2017/041277
<151> 2017-07-08
<160> 521
<170> PatentIn 版本号 3.5
<210> 1
<211> 42
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 2
<211> 41
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 3
<211> 41
<212> PRT
<213> 智人
<400> 3
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Ala Tyr Ala Ala
20 25 30
Ala Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 4
<211> 35
<212> PRT
<213> 智人
<400> 4
Thr Lys Lys Lys Tyr Ser Ser Ser Val His Asp Pro Asn Gly Glu Tyr
1 5 10 15
Met Phe Met Arg Ala Val Asn Thr Ala Lys Lys Ser Arg Leu Thr Asp
20 25 30
Val Thr Leu
35
<210> 5
<211> 37
<212> PRT
<213> 智人
<400> 5
Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser
20 25 30
Thr Leu Ala Lys Ile
35
<210> 6
<211> 49
<212> PRT
<213> 智人
<400> 6
His Gln Arg Arg Lys Tyr Arg Ser Asn Lys Gly Glu Ser Pro Val Glu
1 5 10 15
Pro Ala Glu Pro Cys Arg Tyr Ser Cys Pro Arg Glu Glu Glu Gly Ser
20 25 30
Thr Ile Pro Ile Gln Glu Asp Tyr Arg Lys Pro Glu Pro Ala Cys Ser
35 40 45
Pro
<210> 7
<211> 114
<212> PRT
<213> 智人
<400> 7
Cys Cys Leu Arg Arg His Gln Gly Lys Gln Asn Glu Leu Ser Asp Thr
1 5 10 15
Ala Gly Arg Glu Ile Asn Leu Val Asp Ala His Leu Lys Ser Glu Gln
20 25 30
Thr Glu Ala Ser Thr Arg Gln Asn Ser Gln Val Leu Leu Ser Glu Thr
35 40 45
Gly Ile Tyr Asp Asn Asp Pro Asp Leu Cys Phe Arg Met Gln Glu Gly
50 55 60
Ser Glu Val Tyr Ser Asn Pro Cys Leu Glu Glu Asn Lys Pro Gly Ile
65 70 75 80
Val Tyr Ala Ser Leu Asn His Ser Val Ile Gly Pro Asn Ser Arg Leu
85 90 95
Ala Arg Asn Val Lys Glu Ala Pro Thr Glu Tyr Ala Ser Ile Cys Val
100 105 110
Arg Ser
<210> 8
<211> 187
<212> PRT
<213> 智人
<400> 8
Arg Arg Ala Cys Arg Lys Arg Ile Arg Gln Lys Leu His Leu Cys Tyr
1 5 10 15
Pro Val Gln Thr Ser Gln Pro Lys Leu Glu Leu Val Asp Ser Arg Pro
20 25 30
Arg Arg Ser Ser Thr Gln Leu Arg Ser Gly Ala Ser Val Thr Glu Pro
35 40 45
Val Ala Glu Glu Arg Gly Leu Met Ser Gln Pro Leu Met Glu Thr Cys
50 55 60
His Ser Val Gly Ala Ala Tyr Leu Glu Ser Leu Pro Leu Gln Asp Ala
65 70 75 80
Ser Pro Ala Gly Gly Pro Ser Ser Pro Arg Asp Leu Pro Glu Pro Arg
85 90 95
Val Ser Thr Glu His Thr Asn Asn Lys Ile Glu Lys Ile Tyr Ile Met
100 105 110
Lys Ala Asp Thr Val Ile Val Gly Thr Val Lys Ala Glu Leu Pro Glu
115 120 125
Gly Arg Gly Leu Ala Gly Pro Ala Glu Pro Glu Leu Glu Glu Glu Leu
130 135 140
Glu Ala Asp His Thr Pro His Tyr Pro Glu Gln Glu Thr Glu Pro Pro
145 150 155 160
Leu Gly Ser Cys Ser Asp Val Met Leu Ser Val Glu Glu Glu Gly Lys
165 170 175
Glu Asp Pro Leu Pro Thr Ala Ala Ser Gly Lys
180 185
<210> 9
<211> 54
<212> PRT
<213> 智人
<400> 9
His Ile Trp Gln Leu Arg Ser Gln Cys Met Trp Pro Arg Glu Thr Gln
1 5 10 15
Leu Leu Leu Glu Val Pro Pro Ser Thr Glu Asp Ala Arg Ser Cys Gln
20 25 30
Phe Pro Glu Glu Glu Arg Gly Glu Arg Ser Ala Glu Glu Lys Gly Arg
35 40 45
Leu Gly Asp Leu Trp Val
50
<210> 10
<211> 60
<212> PRT
<213> 智人
<400> 10
Cys Val Lys Arg Arg Lys Pro Arg Gly Asp Val Val Lys Val Ile Val
1 5 10 15
Ser Val Gln Arg Lys Arg Gln Glu Ala Glu Gly Glu Ala Thr Val Ile
20 25 30
Glu Ala Leu Gln Ala Pro Pro Asp Val Thr Thr Val Ala Val Glu Glu
35 40 45
Thr Ile Pro Ser Phe Thr Gly Arg Ser Pro Asn His
50 55 60
<210> 11
<211> 163
<212> PRT
<213> 智人
<400> 11
Met Lys Trp Lys Ala Leu Phe Thr Ala Ala Ile Leu Gln Ala Gln Leu
1 5 10 15
Pro Ile Thr Glu Ala Gln Ser Phe Gly Leu Leu Asp Pro Lys Leu Cys
20 25 30
Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile Leu Thr Ala
35 40 45
Leu Phe Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr
50 55 60
Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg
65 70 75 80
Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met
85 90 95
Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu
100 105 110
Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys
115 120 125
Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu
130 135 140
Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu
145 150 155 160
Pro Pro Arg
<210> 12
<211> 164
<212> PRT
<213> 智人
<400> 12
Met Lys Trp Lys Ala Leu Phe Thr Ala Ala Ile Leu Gln Ala Gln Leu
1 5 10 15
Pro Ile Thr Glu Ala Gln Ser Phe Gly Leu Leu Asp Pro Lys Leu Cys
20 25 30
Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile Leu Thr Ala
35 40 45
Leu Phe Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr
50 55 60
Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg
65 70 75 80
Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met
85 90 95
Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn
100 105 110
Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
115 120 125
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
130 135 140
Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala
145 150 155 160
Leu Pro Pro Arg
<210> 13
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人
<400> 13
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 14
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人
<400> 14
Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp
1 5 10 15
Val Leu Asp Lys Arg
20
<210> 15
<211> 22
<212> PRT
<213> 智人
<400> 15
Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr
1 5 10 15
Ser Glu Ile Gly Met Lys
20
<210> 16
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人
<400> 16
Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp
1 5 10 15
Ala Leu His Met Gln
20
<210> 17
<211> 171
<212> PRT
<213> 智人
<400> 17
Met Glu His Ser Thr Phe Leu Ser Gly Leu Val Leu Ala Thr Leu Leu
1 5 10 15
Ser Gln Val Ser Pro Phe Lys Ile Pro Ile Glu Glu Leu Glu Asp Arg
20 25 30
Val Phe Val Asn Cys Asn Thr Ser Ile Thr Trp Val Glu Gly Thr Val
35 40 45
Gly Thr Leu Leu Ser Asp Ile Thr Arg Leu Asp Leu Gly Lys Arg Ile
50 55 60
Leu Asp Pro Arg Gly Ile Tyr Arg Cys Asn Gly Thr Asp Ile Tyr Lys
65 70 75 80
Asp Lys Glu Ser Thr Val Gln Val His Tyr Arg Met Cys Gln Ser Cys
85 90 95
Val Glu Leu Asp Pro Ala Thr Val Ala Gly Ile Ile Val Thr Asp Val
100 105 110
Ile Ala Thr Leu Leu Leu Ala Leu Gly Val Phe Cys Phe Ala Gly His
115 120 125
Glu Thr Gly Arg Leu Ser Gly Ala Ala Asp Thr Gln Ala Leu Leu Arg
130 135 140
Asn Asp Gln Val Tyr Gln Pro Leu Arg Asp Arg Asp Asp Ala Gln Tyr
145 150 155 160
Ser His Leu Gly Gly Asn Trp Ala Arg Asn Lys
165 170
<210> 18
<211> 127
<212> PRT
<213> 智人
<400> 18
Met Glu His Ser Thr Phe Leu Ser Gly Leu Val Leu Ala Thr Leu Leu
1 5 10 15
Ser Gln Val Ser Pro Phe Lys Ile Pro Ile Glu Glu Leu Glu Asp Arg
20 25 30
Val Phe Val Asn Cys Asn Thr Ser Ile Thr Trp Val Glu Gly Thr Val
35 40 45
Gly Thr Leu Leu Ser Asp Ile Thr Arg Leu Asp Leu Gly Lys Arg Ile
50 55 60
Leu Asp Pro Arg Gly Ile Tyr Arg Cys Asn Gly Thr Asp Ile Tyr Lys
65 70 75 80
Asp Lys Glu Ser Thr Val Gln Val His Tyr Arg Thr Ala Asp Thr Gln
85 90 95
Ala Leu Leu Arg Asn Asp Gln Val Tyr Gln Pro Leu Arg Asp Arg Asp
100 105 110
Asp Ala Gln Tyr Ser His Leu Gly Gly Asn Trp Ala Arg Asn Lys
115 120 125
<210> 19
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人
<400> 19
Asp Gln Val Tyr Gln Pro Leu Arg Asp Arg Asp Asp Ala Gln Tyr Ser
1 5 10 15
His Leu Gly Gly Asn
20
<210> 20
<211> 206
<212> PRT
<213> 智人
<400> 20
Met Gln Ser Gly Thr His Trp Arg Val Leu Gly Leu Cys Leu Leu Ser
1 5 10 15
Val Gly Val Trp Gly Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr
20 25 30
Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr
35 40 45
Cys Pro Gln Tyr Pro Gly Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys
50 55 60
Asn Ile Gly Gly Asp Glu Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp
65 70 75 80
His Leu Ser Leu Lys Glu Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr
85 90 95
Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu
100 105 110
Tyr Leu Arg Ala Arg Val Cys Glu Asn Cys Met Glu Met Asp Met Ser
115 120 125
Val Ala Thr Ile Val Ile Val Asp Ile Cys Ile Thr Gly Gly Leu Leu
130 135 140
Leu Leu Val Tyr Tyr Trp Ser Lys Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys Pro
145 150 155 160
Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala Gly Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn Lys
165 170 175
Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro Asn Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg Lys
180 185 190
Gly Gln Arg Asp Leu Tyr Ser Gly Leu Asn Gln Arg Arg Ile
195 200 205
<210> 21
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人
<400> 21
Asn Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg Lys Gly Gln Arg Asp Leu Tyr Ser
1 5 10 15
Gly Leu Asn Gln Arg
20
<210> 22
<211> 182
<212> PRT
<213> 智人
<400> 22
Met Glu Gln Gly Lys Gly Leu Ala Val Leu Ile Leu Ala Ile Ile Leu
1 5 10 15
Leu Gln Gly Thr Leu Ala Gln Ser Ile Lys Gly Asn His Leu Val Lys
20 25 30
Val Tyr Asp Tyr Gln Glu Asp Gly Ser Val Leu Leu Thr Cys Asp Ala
35 40 45
Glu Ala Lys Asn Ile Thr Trp Phe Lys Asp Gly Lys Met Ile Gly Phe
50 55 60
Leu Thr Glu Asp Lys Lys Lys Trp Asn Leu Gly Ser Asn Ala Lys Asp
65 70 75 80
Pro Arg Gly Met Tyr Gln Cys Lys Gly Ser Gln Asn Lys Ser Lys Pro
85 90 95
Leu Gln Val Tyr Tyr Arg Met Cys Gln Asn Cys Ile Glu Leu Asn Ala
100 105 110
Ala Thr Ile Ser Gly Phe Leu Phe Ala Glu Ile Val Ser Ile Phe Val
115 120 125
Leu Ala Val Gly Val Tyr Phe Ile Ala Gly Gln Asp Gly Val Arg Gln
130 135 140
Ser Arg Ala Ser Asp Lys Gln Thr Leu Leu Pro Asn Asp Gln Leu Tyr
145 150 155 160
Gln Pro Leu Lys Asp Arg Glu Asp Asp Gln Tyr Ser His Leu Gln Gly
165 170 175
Asn Gln Leu Arg Arg Asn
180
<210> 23
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人
<400> 23
Asp Gln Leu Tyr Gln Pro Leu Lys Asp Arg Glu Asp Asp Gln Tyr Ser
1 5 10 15
His Leu Gln Gly Asn
20
<210> 24
<211> 226
<212> PRT
<213> 智人
<400> 24
Met Pro Gly Gly Pro Gly Val Leu Gln Ala Leu Pro Ala Thr Ile Phe
1 5 10 15
Leu Leu Phe Leu Leu Ser Ala Val Tyr Leu Gly Pro Gly Cys Gln Ala
20 25 30
Leu Trp Met His Lys Val Pro Ala Ser Leu Met Val Ser Leu Gly Glu
35 40 45
Asp Ala His Phe Gln Cys Pro His Asn Ser Ser Asn Asn Ala Asn Val
50 55 60
Thr Trp Trp Arg Val Leu His Gly Asn Tyr Thr Trp Pro Pro Glu Phe
65 70 75 80
Leu Gly Pro Gly Glu Asp Pro Asn Gly Thr Leu Ile Ile Gln Asn Val
85 90 95
Asn Lys Ser His Gly Gly Ile Tyr Val Cys Arg Val Gln Glu Gly Asn
100 105 110
Glu Ser Tyr Gln Gln Ser Cys Gly Thr Tyr Leu Arg Val Arg Gln Pro
115 120 125
Pro Pro Arg Pro Phe Leu Asp Met Gly Glu Gly Thr Lys Asn Arg Ile
130 135 140
Ile Thr Ala Glu Gly Ile Ile Leu Leu Phe Cys Ala Val Val Pro Gly
145 150 155 160
Thr Leu Leu Leu Phe Arg Lys Arg Trp Gln Asn Glu Lys Leu Gly Leu
165 170 175
Asp Ala Gly Asp Glu Tyr Glu Asp Glu Asn Leu Tyr Glu Gly Leu Asn
180 185 190
Leu Asp Asp Cys Ser Met Tyr Glu Asp Ile Ser Arg Gly Leu Gln Gly
195 200 205
Thr Tyr Gln Asp Val Gly Ser Leu Asn Ile Gly Asp Val Gln Leu Glu
210 215 220
Lys Pro
225
<210> 25
<211> 188
<212> PRT
<213> 智人
<400> 25
Met Pro Gly Gly Pro Gly Val Leu Gln Ala Leu Pro Ala Thr Ile Phe
1 5 10 15
Leu Leu Phe Leu Leu Ser Ala Val Tyr Leu Gly Pro Gly Cys Gln Ala
20 25 30
Leu Trp Met His Lys Val Pro Ala Ser Leu Met Val Ser Leu Gly Glu
35 40 45
Asp Ala His Phe Gln Cys Pro His Asn Ser Ser Asn Asn Ala Asn Val
50 55 60
Thr Trp Trp Arg Val Leu His Gly Asn Tyr Thr Trp Pro Pro Glu Phe
65 70 75 80
Leu Gly Pro Gly Glu Asp Pro Asn Glu Pro Pro Pro Arg Pro Phe Leu
85 90 95
Asp Met Gly Glu Gly Thr Lys Asn Arg Ile Ile Thr Ala Glu Gly Ile
100 105 110
Ile Leu Leu Phe Cys Ala Val Val Pro Gly Thr Leu Leu Leu Phe Arg
115 120 125
Lys Arg Trp Gln Asn Glu Lys Leu Gly Leu Asp Ala Gly Asp Glu Tyr
130 135 140
Glu Asp Glu Asn Leu Tyr Glu Gly Leu Asn Leu Asp Asp Cys Ser Met
145 150 155 160
Tyr Glu Asp Ile Ser Arg Gly Leu Gln Gly Thr Tyr Gln Asp Val Gly
165 170 175
Ser Leu Asn Ile Gly Asp Val Gln Leu Glu Lys Pro
180 185
<210> 26
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人
<400> 26
Glu Asn Leu Tyr Glu Gly Leu Asn Leu Asp Asp Cys Ser Met Tyr Glu
1 5 10 15
Asp Ile Ser Arg Gly
20
<210> 27
<211> 113
<212> PRT
<213> 智人
<400> 27
Met Gly Gly Leu Glu Pro Cys Ser Arg Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu
1 5 10 15
Leu Ala Val Ser Gly Leu Arg Pro Val Gln Ala Gln Ala Gln Ser Asp
20 25 30
Cys Ser Cys Ser Thr Val Ser Pro Gly Val Leu Ala Gly Ile Val Met
35 40 45
Gly Asp Leu Val Leu Thr Val Leu Ile Ala Leu Ala Val Tyr Phe Leu
50 55 60
Gly Arg Leu Val Pro Arg Gly Arg Gly Ala Ala Glu Ala Ala Thr Arg
65 70 75 80
Lys Gln Arg Ile Thr Glu Thr Glu Ser Pro Tyr Gln Glu Leu Gln Gly
85 90 95
Gln Arg Ser Asp Val Tyr Ser Asp Leu Asn Thr Gln Arg Pro Tyr Tyr
100 105 110
Lys
<210> 28
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 28
Met Gly Gly Leu Glu Pro Cys Ser Arg Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu
1 5 10 15
Leu Ala Val Ser Gly Leu Arg Pro Val Gln Ala Gln Ala Gln Ser Asp
20 25 30
Cys Ser Cys Ser Thr Val Ser Pro Gly Val Leu Ala Gly Ile Val Met
35 40 45
Gly Asp Leu Val Leu Thr Val Leu Ile Ala Leu Ala Val Tyr Phe Leu
50 55 60
Gly Arg Leu Val Pro Arg Gly Arg Gly Ala Ala Glu Ala Thr Arg Lys
65 70 75 80
Gln Arg Ile Thr Glu Thr Glu Ser Pro Tyr Gln Glu Leu Gln Gly Gln
85 90 95
Arg Ser Asp Val Tyr Ser Asp Leu Asn Thr Gln
100 105
<210> 29
<211> 102
<212> PRT
<213> 智人
<400> 29
Met Gly Gly Leu Glu Pro Cys Ser Arg Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu
1 5 10 15
Leu Ala Val Ser Asp Cys Ser Cys Ser Thr Val Ser Pro Gly Val Leu
20 25 30
Ala Gly Ile Val Met Gly Asp Leu Val Leu Thr Val Leu Ile Ala Leu
35 40 45
Ala Val Tyr Phe Leu Gly Arg Leu Val Pro Arg Gly Arg Gly Ala Ala
50 55 60
Glu Ala Ala Thr Arg Lys Gln Arg Ile Thr Glu Thr Glu Ser Pro Tyr
65 70 75 80
Gln Glu Leu Gln Gly Gln Arg Ser Asp Val Tyr Ser Asp Leu Asn Thr
85 90 95
Gln Arg Pro Tyr Tyr Lys
100
<210> 30
<211> 101
<212> PRT
<213> 智人
<400> 30
Met Gly Gly Leu Glu Pro Cys Ser Arg Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu
1 5 10 15
Leu Ala Val Ser Asp Cys Ser Cys Ser Thr Val Ser Pro Gly Val Leu
20 25 30
Ala Gly Ile Val Met Gly Asp Leu Val Leu Thr Val Leu Ile Ala Leu
35 40 45
Ala Val Tyr Phe Leu Gly Arg Leu Val Pro Arg Gly Arg Gly Ala Ala
50 55 60
Glu Ala Thr Arg Lys Gln Arg Ile Thr Glu Thr Glu Ser Pro Tyr Gln
65 70 75 80
Glu Leu Gln Gly Gln Arg Ser Asp Val Tyr Ser Asp Leu Asn Thr Gln
85 90 95
Arg Pro Tyr Tyr Lys
100
<210> 31
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人
<400> 31
Glu Ser Pro Tyr Gln Glu Leu Gln Gly Gln Arg Ser Asp Val Tyr Ser
1 5 10 15
Asp Leu Asn Thr Gln
20
<210> 32
<211> 86
<212> PRT
<213> 智人
<400> 32
Met Ile Pro Ala Val Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu Val Glu Gln Ala
1 5 10 15
Ala Ala Leu Gly Glu Pro Gln Leu Cys Tyr Ile Leu Asp Ala Ile Leu
20 25 30
Phe Leu Tyr Gly Ile Val Leu Thr Leu Leu Tyr Cys Arg Leu Lys Ile
35 40 45
Gln Val Arg Lys Ala Ala Ile Thr Ser Tyr Glu Lys Ser Asp Gly Val
50 55 60
Tyr Thr Gly Leu Ser Thr Arg Asn Gln Glu Thr Tyr Glu Thr Leu Lys
65 70 75 80
His Glu Lys Pro Pro Gln
85
<210> 33
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人
<400> 33
Asp Gly Val Tyr Thr Gly Leu Ser Thr Arg Asn Gln Glu Thr Tyr Glu
1 5 10 15
Thr Leu Lys His Glu
20
<210> 34
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人
<400> 34
Arg Pro Arg Arg Ser Pro Ala Gln Asp Gly Lys Val Tyr Ile Asn Met
1 5 10 15
Pro Gly Arg Gly
20
<210> 35
<211> 68
<212> PRT
<213> 智人
<400> 35
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser
20 25 30
Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly
35 40 45
Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala
50 55 60
Ala Tyr Arg Ser
65
<210> 36
<211> 619
<212> PRT
<213> 智人
<400> 36
Met Pro Asp Pro Ala Ala His Leu Pro Phe Phe Tyr Gly Ser Ile Ser
1 5 10 15
Arg Ala Glu Ala Glu Glu His Leu Lys Leu Ala Gly Met Ala Asp Gly
20 25 30
Leu Phe Leu Leu Arg Gln Cys Leu Arg Ser Leu Gly Gly Tyr Val Leu
35 40 45
Ser Leu Val His Asp Val Arg Phe His His Phe Pro Ile Glu Arg Gln
50 55 60
Leu Asn Gly Thr Tyr Ala Ile Ala Gly Gly Lys Ala His Cys Gly Pro
65 70 75 80
Ala Glu Leu Cys Glu Phe Tyr Ser Arg Asp Pro Asp Gly Leu Pro Cys
85 90 95
Asn Leu Arg Lys Pro Cys Asn Arg Pro Ser Gly Leu Glu Pro Gln Pro
100 105 110
Gly Val Phe Asp Cys Leu Arg Asp Ala Met Val Arg Asp Tyr Val Arg
115 120 125
Gln Thr Trp Lys Leu Glu Gly Glu Ala Leu Glu Gln Ala Ile Ile Ser
130 135 140
Gln Ala Pro Gln Val Glu Lys Leu Ile Ala Thr Thr Ala His Glu Arg
145 150 155 160
Met Pro Trp Tyr His Ser Ser Leu Thr Arg Glu Glu Ala Glu Arg Lys
165 170 175
Leu Tyr Ser Gly Ala Gln Thr Asp Gly Lys Phe Leu Leu Arg Pro Arg
180 185 190
Lys Glu Gln Gly Thr Tyr Ala Leu Ser Leu Ile Tyr Gly Lys Thr Val
195 200 205
Tyr His Tyr Leu Ile Ser Gln Asp Lys Ala Gly Lys Tyr Cys Ile Pro
210 215 220
Glu Gly Thr Lys Phe Asp Thr Leu Trp Gln Leu Val Glu Tyr Leu Lys
225 230 235 240
Leu Lys Ala Asp Gly Leu Ile Tyr Cys Leu Lys Glu Ala Cys Pro Asn
245 250 255
Ser Ser Ala Ser Asn Ala Ser Gly Ala Ala Ala Pro Thr Leu Pro Ala
260 265 270
His Pro Ser Thr Leu Thr His Pro Gln Arg Arg Ile Asp Thr Leu Asn
275 280 285
Ser Asp Gly Tyr Thr Pro Glu Pro Ala Arg Ile Thr Ser Pro Asp Lys
290 295 300
Pro Arg Pro Met Pro Met Asp Thr Ser Val Tyr Glu Ser Pro Tyr Ser
305 310 315 320
Asp Pro Glu Glu Leu Lys Asp Lys Lys Leu Phe Leu Lys Arg Asp Asn
325 330 335
Leu Leu Ile Ala Asp Ile Glu Leu Gly Cys Gly Asn Phe Gly Ser Val
340 345 350
Arg Gln Gly Val Tyr Arg Met Arg Lys Lys Gln Ile Asp Val Ala Ile
355 360 365
Lys Val Leu Lys Gln Gly Thr Glu Lys Ala Asp Thr Glu Glu Met Met
370 375 380
Arg Glu Ala Gln Ile Met His Gln Leu Asp Asn Pro Tyr Ile Val Arg
385 390 395 400
Leu Ile Gly Val Cys Gln Ala Glu Ala Leu Met Leu Val Met Glu Met
405 410 415
Ala Gly Gly Gly Pro Leu His Lys Phe Leu Val Gly Lys Arg Glu Glu
420 425 430
Ile Pro Val Ser Asn Val Ala Glu Leu Leu His Gln Val Ser Met Gly
435 440 445
Met Lys Tyr Leu Glu Glu Lys Asn Phe Val His Arg Asp Leu Ala Ala
450 455 460
Arg Asn Val Leu Leu Val Asn Arg His Tyr Ala Lys Ile Ser Asp Phe
465 470 475 480
Gly Leu Ser Lys Ala Leu Gly Ala Asp Asp Ser Tyr Tyr Thr Ala Arg
485 490 495
Ser Ala Gly Lys Trp Pro Leu Lys Trp Tyr Ala Pro Glu Cys Ile Asn
500 505 510
Phe Arg Lys Phe Ser Ser Arg Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr
515 520 525
Met Trp Glu Ala Leu Ser Tyr Gly Gln Lys Pro Tyr Lys Lys Met Lys
530 535 540
Gly Pro Glu Val Met Ala Phe Ile Glu Gln Gly Lys Arg Met Glu Cys
545 550 555 560
Pro Pro Glu Cys Pro Pro Glu Leu Tyr Ala Leu Met Ser Asp Cys Trp
565 570 575
Ile Tyr Lys Trp Glu Asp Arg Pro Asp Phe Leu Thr Val Glu Gln Arg
580 585 590
Met Arg Ala Cys Tyr Tyr Ser Leu Ala Ser Lys Val Glu Gly Pro Pro
595 600 605
Gly Ser Thr Gln Lys Ala Glu Ala Ala Cys Ala
610 615
<210> 37
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成HA表位
<400> 37
Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
1 5
<210> 38
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成FLAG表位
<400> 38
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 39
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成c-myc表位
<400> 39
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
1 5 10
<210> 40
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成His5 Affinity
<400> 40
His His His His His
1 5
<210> 41
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成HisX6 Affinity
<400> 41
His His His His His His
1 5
<210> 42
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成Strep标签Affinity
<400> 42
Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
1 5
<210> 43
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成HisX6 Affinity
<400> 43
Arg Tyr Ile Arg Ser
1 5
<210> 44
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成Affinity
<400> 44
Phe His His Thr
1
<210> 45
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成Affinity
<400> 45
Trp Glu Ala Ala Ala Arg Glu Ala Cys Cys Arg Glu Cys Cys Ala Arg
1 5 10 15
Ala
<210> 46
<211> 24
<212> PRT
<213> 智人
<400> 46
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
20
<210> 47
<211> 23
<212> PRT
<213> 智人
<400> 47
Leu Gly Leu Leu Val Ala Gly Val Leu Val Leu Leu Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Val Ala Ile His Leu Cys Cys
20
<210> 48
<211> 25
<212> PRT
<213> 智人
<400> 48
Ala Leu Ile Val Leu Gly Gly Val Ala Gly Leu Leu Leu Phe Ile Gly
1 5 10 15
Leu Gly Ile Phe Phe Cys Val Arg Cys
20 25
<210> 49
<211> 23
<212> PRT
<213> 智人
<400> 49
Leu Cys Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile Leu
1 5 10 15
Thr Ala Leu Phe Leu Arg Val
20
<210> 50
<211> 27
<212> PRT
<213> 智人
<400> 50
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 51
<211> 26
<212> PRT
<213> 智人
<400> 51
Val Ala Ala Ile Leu Gly Leu Gly Leu Val Leu Gly Leu Leu Gly Pro
1 5 10 15
Leu Ala Ile Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu
20 25
<210> 52
<211> 24
<212> PRT
<213> 智人
<400> 52
Ala Leu Pro Ala Ala Leu Ala Val Ile Ser Phe Leu Leu Gly Leu Gly
1 5 10 15
Leu Gly Val Ala Cys Val Leu Ala
20
<210> 53
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成接头1
<400> 53
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 54
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成接头2
<400> 54
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25 30
<210> 55
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成接头3
<400> 55
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 56
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成接头4
<400> 56
Gly Gly Ser Gly
1
<210> 57
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成接头5
<400> 57
Gly Gly Ser Gly Gly
1 5
<210> 58
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成接头6
<400> 58
Gly Ser Gly Ser Gly
1 5
<210> 59
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成接头7
<400> 59
Gly Ser Gly Gly Gly
1 5
<210> 60
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成接头8
<400> 60
Gly Gly Gly Ser Gly
1 5
<210> 61
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成接头9
<400> 61
Gly Ser Ser Ser Gly
1 5
<210> 62
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成铰链1
<400> 62
Cys Pro Pro Cys
1
<210> 63
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成铰链2
<400> 63
Asp Lys Thr His Thr
1 5
<210> 64
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成铰链3
<400> 64
Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg
1 5 10 15
<210> 65
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成铰链4
<400> 65
Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr
1 5 10
<210> 66
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成铰链5
<400> 66
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
1 5 10
<210> 67
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成铰链6
<400> 67
Lys Cys Cys Val Asp Cys Pro
1 5
<210> 68
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成铰链7
<400> 68
Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro
1 5
<210> 69
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成铰链8
<400> 69
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
<210> 70
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成铰链9
<400> 70
Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 71
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成铰链10
<400> 71
Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys
1 5 10 15
Pro
<210> 72
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成铰链11
<400> 72
Ser Pro Asn Met Val Pro His Ala His His Ala Gln
1 5 10
<210> 73
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成铰链12
<400> 73
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
<210> 74
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人
<400> 74
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 75
<211> 69
<212> PRT
<213> 智人
<400> 75
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile
35 40 45
Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val
50 55 60
Ile Thr Leu Tyr Cys
65
<210> 76
<211> 66
<212> PRT
<213> 智人
<400> 76
Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn
1 5 10 15
Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu
20 25 30
Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly
35 40 45
Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe
50 55 60
Trp Val
65
<210> 77
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成2A-1切割信号
<400> 77
Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu
1 5 10 15
Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 78
<211> 357
<212> PRT
<213> 智人
<400> 78
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly
20 25 30
Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe
35 40 45
Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala
50 55 60
Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu
65 70 75 80
Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile
85 90 95
Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu
100 105 110
Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala
115 120 125
Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu
130 135 140
Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr
145 150 155 160
Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys
165 170 175
Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly
180 185 190
Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu
195 200 205
Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys
210 215 220
Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu
225 230 235 240
Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met
245 250 255
Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala
260 265 270
His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val
275 280 285
Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His
290 295 300
Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro
305 310 315 320
Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala
325 330 335
Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly
340 345 350
Ile Gly Leu Phe Met
355
<210> 79
<211> 45
<212> PRT
<213> 智人
<400> 79
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
<210> 80
<211> 39
<212> PRT
<213> 智人
<400> 80
Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn
1 5 10 15
Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu
20 25 30
Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro
35
<210> 81
<211> 113
<212> PRT
<213> 智人
<400> 81
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
50 55 60
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
65 70 75 80
Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
85 90 95
Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
100 105 110
Arg
<210> 82
<211> 463
<212> PRT
<213> 智人
<400> 82
Met Thr Ile Leu Gly Thr Thr Phe Gly Met Val Phe Ser Leu Leu Gln
1 5 10 15
Val Val Ser Gly Glu Ser Gly Tyr Ala Gln Asn Gly Asp Leu Glu Asp
20 25 30
Ala Glu Leu Asp Asp Tyr Ser Phe Ser Cys Tyr Ser Gln Leu Glu Val
35 40 45
Asn Gly Ser Gln His Ser Leu Thr Cys Ala Phe Glu Asp Pro Asp Val
50 55 60
Asn Thr Thr Asn Leu Glu Phe Glu Ile Cys Gly Ala Leu Val Glu Val
65 70 75 80
Lys Cys Leu Asn Phe Arg Lys Leu Gln Glu Ile Tyr Phe Ile Glu Thr
85 90 95
Lys Lys Phe Leu Leu Ile Gly Lys Ser Asn Ile Cys Val Lys Val Gly
100 105 110
Glu Lys Ser Leu Thr Cys Lys Lys Ile Asp Leu Thr Thr Ile Val Lys
115 120 125
Pro Glu Ala Pro Phe Asp Leu Ser Val Ile Tyr Arg Glu Gly Ala Asn
130 135 140
Asp Phe Val Val Thr Phe Asn Thr Ser His Leu Gln Lys Lys Tyr Val
145 150 155 160
Lys Val Leu Met His Asp Val Ala Tyr Arg Gln Glu Lys Asp Glu Asn
165 170 175
Lys Trp Thr His Val Asn Leu Ser Ser Thr Lys Leu Thr Leu Leu Gln
180 185 190
Arg Lys Leu Gln Pro Ala Ala Met Tyr Glu Ile Lys Val Arg Ser Ile
195 200 205
Pro Asp His Tyr Phe Lys Gly Phe Trp Ser Glu Trp Ser Pro Ser Tyr
210 215 220
Tyr Phe Arg Thr Pro Glu Ile Asn Asn Ser Ser Gly Glu Met Asp Pro
225 230 235 240
Ile Leu Leu Pro Pro Cys Leu Thr Ile Ser Ile Leu Ser Phe Phe Ser
245 250 255
Val Ala Leu Leu Val Ile Leu Ala Cys Val Leu Trp Lys Lys Arg Ile
260 265 270
Lys Pro Ile Val Trp Pro Ser Leu Pro Asp His Lys Lys Thr Leu Glu
275 280 285
His Leu Cys Lys Lys Pro Arg Lys Asn Leu Asn Val Ser Phe Asn Pro
290 295 300
Glu Ser Phe Leu Asp Cys Gln Ile His Arg Val Asp Asp Ile Gln Ala
305 310 315 320
Arg Asp Glu Val Glu Gly Phe Leu Gln Asp Thr Phe Pro Gln Gln Leu
325 330 335
Glu Glu Ser Glu Lys Gln Arg Leu Gly Gly Asp Val Gln Ser Pro Asn
340 345 350
Cys Pro Ser Glu Asp Val Val Val Thr Pro Glu Ser Phe Gly Arg Asp
355 360 365
Ser Ser Leu Thr Cys Leu Ala Gly Asn Val Ser Ala Cys Asp Ala Pro
370 375 380
Ile Leu Ser Ser Ser Arg Ser Leu Asp Cys Arg Glu Ser Gly Lys Asn
385 390 395 400
Gly Pro His Val Tyr Gln Asp Leu Leu Leu Ser Leu Gly Thr Thr Asn
405 410 415
Ser Thr Leu Pro Pro Pro Phe Ser Leu Gln Ser Gly Ile Leu Thr Leu
420 425 430
Asn Pro Val Ala Gln Gly Gln Pro Ile Leu Thr Ser Leu Gly Ser Asn
435 440 445
Gln Glu Glu Ala Tyr Val Thr Met Ser Ser Phe Tyr Gln Asn Gln
450 455 460
<210> 83
<211> 13673
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有核糖开关的合成Dox-雷帕霉素诱导型慢病毒基因组
<400> 83
gatatctata acaagaaaat atatatataa taagttatca cgtaagtaga acatgaaata 60
acaatataat tatcgtatga gttaaatctt aaaagtcacg taaaagataa tcatgcgtca 120
ttttgactca cgcggtcgtt atagttcaaa atcagtgaca cttaccgcat tgacaagcac 180
gcctcacggg agctccaagc ggcgactgag atgtcctaaa tgcacagcga cggattcgcg 240
ctatttagaa agagagagca atatttcaag aatgcatgcg tcaattttac gcagactatc 300
tttctagggt taagacggat cgggagatct cccgatcccc tatggtgcac tctcagtaca 360
atctgctctg atgccgcata gttaagccag tatctgctcc ctgcttgtgt gttggaggtc 420
gctgagtagt gcgcgagcaa aatttaagct acaacaaggc aaggcttgac cgacaattgc 480
atgaagaatc tgcttagggt taggcgtttt gcgctgcttc gcgatgtacg ggccagatat 540
acgcgttgac attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg gtcattagtt 600
catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc gcctggctga 660
ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca 720
atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc ccacttggca 780
gtacatcaag tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg 840
cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc 900
tacgtattag tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacat caatgggcgt 960
ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt caatgggagt 1020
ttgttttgga accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaacaactc cgccccattg 1080
acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata taagcagagc tctccctatc 1140
agtgatagag atctccctat cagtgataga gatcgtcgac gagctcgttt agtgaaccgt 1200
cagatcgcct ggagacgccc tcgaagccgc ggtgcgggtg ccagggcgtg ccctgggtct 1260
ctctggttag accagatctg agcctgggag ctctctggct aactagggaa cccactgctt 1320
aagcctcaat aaagcttgcc ttgagtgctt caagtagtgt gtgcccgtct gttgtgtgac 1380
tctggtaact agagatccct cagacccttt tagtcagtgt ggaaaatctc tagcagtggc 1440
gcccgaacag ggacttgaaa gcgaaaggga aaccagagga gctctctcga cgcaggactc 1500
ggcttgctga agcgcgcacg gcaagaggcg aggggcggcg actggtgagt acgccaaaaa 1560
ttttgactag cggaggctag aaggagagag atgggtgcga gagcgtcagt attaagcggg 1620
ggagaattag atcgcgatgg gaaaaaattc ggttaaggcc agggggaaag aaaaaatata 1680
aattaaaaca tatagtatgg gcaagcaggg agctagaacg attcgcagtt aatcctggcc 1740
tgttagaaac atcagaaggc tgtagacaaa tactgggaca gctacaacca tcccttcaga 1800
caggatcaga agaacttaga tcattatata atacagtagc aaccctctat tgtgtgcatc 1860
aaaggataga gataaaagac accaaggaag ctttagacaa gatagaggaa gagcaaaaca 1920
aaagtaagac caccgcacag caagcggccg ctgatcttca gacctggagg aggagatatg 1980
agggacaatt ggagaagtga attatataaa tataaagtag taaaaattga accattagga 2040
gtagcaccca ccaaggcaaa gagaagagtg gtgcagagag aaaaaagagc agtgggaata 2100
ggagctttgt tccttgggtt cttgggagca gcaggaagca ctatgggcgc agcgtcaatg 2160
acgctgacgg tacaggccag acaattattg tctggtatag tgcagcagca gaacaatttg 2220
ctgagggcta ttgaggcgca acagcatctg ttgcaactca cagtctgggg catcaagcag 2280
ctccaggcaa gaatcctggc tgtggaaaga tacctaaagg atcaacagct cctggggatt 2340
tggggttgct ctggaaaact catttgcacc actgctgtgc cttggaatgc tagttggagt 2400
aataaatctc tggaacagat ttggaatcac acgacctgga tggagtggga cagagaaatt 2460
aacaattaca caagcttaat acactcctta attgaagaat cgcaaaacca gcaagaaaag 2520
aatgaacaag aattattgga attagataaa tgggcaagtt tgtggaattg gtttaacata 2580
acaaattggc tgtggtatat aaaattattc ataatgatag taggaggctt ggtaggttta 2640
agaatagttt ttgctgtact ttctatagtg aatagagtta ggcagggata ttcaccatta 2700
tcgtttcaga cccacctccc aaccccgagg ggacccgaca ggcccgaagg aatagaagaa 2760
gaaggtggag agagagacag agacagatcc attcgattag tgaacggatc tcgacggtat 2820
cgattagact gtagcccagg aatatggcag ctagattgta cacatttaga aggaaaagtt 2880
atcttggtag cagttcatgt agccagtgga tatatagaag cagaagtaat tccagcagag 2940
acagggcaag aaacagcata cttcctctta aaattagcag gaagatggcc agtaaaaaca 3000
gtacatacag acaatggcag caatttcacc agtactacag ttaaggccgc ctgttggtgg 3060
gcggggatca agcaggaatt tggcattccc tacaatcccc aaagtcaagg agtaatagaa 3120
tctatgaata aagaattaaa gaaaattata ggacaggtaa gagatcaggc tgaacatctt 3180
aagacagcag tacaaatggc agtattcatc cacaatttta aaagaaaagg ggggattggg 3240
gggtacagtg caggggaaag aatagtagac ataatagcaa cagacataca aactaaagaa 3300
ttacaaaaac aaattacaaa aattcaaaat tttcgggttt attacaggga cagcagagat 3360
ccagtttggc tgcattgatc acgtgagggg ctctagactc tagacacaca aaaaaccaac 3420
acacagatct aatgaaaata aagatctttt attgagaaac ttatacaggg tagcataatg 3480
ggctactgac cccgccttca aacctatttg gagactataa gtgaaaatta tcactggttt 3540
tggtagaagc tggacatggt gacatatgct tcttcttgat ttgatcccag ggaagtaaga 3600
atgggctgac cctgagcaac tgggttcaat gtcaggattc cagattggag agaaaatgga 3660
gggggcagcg tgctgtttgt agtcccaagg ctaagcagga ggtcctggta cacatgaggc 3720
ccattcttgc cactctccct gcagtctagg gacctggaag aggagagaat aggggcgtca 3780
catgcactga cattcccagc caggcatgtg agggatgaat ctcttccaaa gctttctgga 3840
gtgacgacta catcctcaga tgggcagttg gggctctgca catcccctcc aagcctctgc 3900
ttctcagatt cttctagttg ctgaggaaac gtatcttgca gaaaaccttc cacttcatct 3960
ctagcttgaa tgtcatccac cctatgaatc tggcagtcca ggaaactttc aggattgaaa 4020
ctcacattta aattttttct tggtttctta caaagatgtt ccagagtctt cttatgatcg 4080
gggagactgg gccatacgat aggcttaatc ctttttttcc ataacacaca ggccaagatg 4140
accaacagag cgacagagaa aaaactcaaa atgctgatgg tcaggcatgg tggtagtaag 4200
ataggatcca tctcccctga gctattattg atctctggag ttctgaagta ataacttgga 4260
ctccattcac tccagaagcc tttaaaatag tgatcaggga tggatcgaac tttaatctca 4320
tacattgctg ccggttggag ctttctctgc aggagtgtca gctttgtgct ggataaattc 4380
acatgcgtcc atttgttttc atccttttcc tggcggtaag ctacatcatg cattaaaact 4440
tttacatact tcttttgcaa gtgtgatgta ttaaatgtca ccacaaagtc attggctcct 4500
tcccgataga tgacactcag gtcaaaagga gcctcaggtt taactatagt ggttaggtct 4560
atttttttgc aggttagact cttttctcca accttcacac atatattgct ctttccaatc 4620
agtaagaatt tctttgtctc gatgaaatat atctcttgta gtttcctgaa attcaggcac 4680
tttacctcca cgagggcccc acatatttca aattccagat tggtggtgtt gacatctggg 4740
tcctcaaaag cacatgtcag tgaatgctgc gatccattca cttccaactg gctatagcat 4800
gagaatgagt agtcatccag ttctgcatct tccaagtctc cattttgagc atagccactt 4860
tctccagaaa cgacttgaag taaagaaaaa accatgccaa aagttgtacc tagaattgtc 4920
attgggccgg gattttcctc cacgtccccg catgttagta gacttcccct gccctcgccg 4980
gagcgagggg gcagggcctg catgtgaagg gcgtcgtagg tgtccttggt ggctgtactg 5040
agaccctggt aaaggccatc gtgccccttg cccctccggc gctcgccttt catcccaatc 5100
tcactgtagg cctccgccat cttatctttc tgcagttcat tgtacaggcc ttcctgaggg 5160
ttcttccttc tcggctttcc ccccatctca gggtcccggc cacgtctctt gtccaaaaca 5220
tcgtactcct ctcttcgtcc tagattgagc tcgttataga gctggttctg gccctgcttg 5280
tacgcggggg cgtctgcgct cctgctgaac ttcactctca gttcacatcc tccttcttct 5340
tcttctggaa atcggcagct acagccatct tcctcttgag tagtttgtac tggtctcata 5400
aatggttgtt tgaatatata caggagtttc tttctgcccc gtttgcagta aagggtgata 5460
accagtgaca ggagaaggac cccacaagtc ccggccaagg gcgcccagat gtagatatca 5520
caggcgaagt ccagccccct cgtgtgcact gcgccccccg ccgctggccg gcacgcctct 5580
gggcgcaggg acaggggctg cgacgcgatg gtgggcgccg gtgttggtgg tcgcggcgct 5640
ggcgtcgtgg ttgaggagac ggtgactgag gttccttggc cccagtagtc catagcatag 5700
ctaccaccgt agtaataatg tttggcacag tagtaaatgg ctgtgtcatc agtttgcaga 5760
ctgttcattt ttaagaaaac ttggctcttg gagttgtcct tgatgatggt cagtctggat 5820
ttgagagctg aattatagta tgtggtttca ctaccccata ttactcccag ccactccaga 5880
ccctttcgtg gaggctggcg aatccagctt acaccatagt cgggtaatga gacccctgag 5940
acagtgcatg tgacggacag gctctgtgag ggcgccacca ggccaggtcc tgactcctgc 6000
agtttcacct cagatccgcc gccacccgac ccaccaccgc ccgagccacc gccacctgtg 6060
atctccagct tggtcccccc tccgaacgtg tacggaagcg tattaccctg ttggcgaagt 6120
aggtggcaat atcttcttgc tccaggttgc taattgtcag agaataatct gttccagacc 6180
cactgccact gaaccttgat gggactcctg agtgtaatct tgatgtatgg tagatcagga 6240
gtttaacagt tccatctggt ttctgctgat accaatttaa atatttacta atgtcctgac 6300
ttgccctgca actgatggtg actctgtctc ccagagaggc agacagggag gatgtagtct 6360
gtgtcatctg gatgtccggc ctggcggcgt ggagcagcaa ggccagcggc aggagcaagg 6420
cggtcactgg taaggccatg gatcctctag atcacgacac ctgaaatgga agaaaaaaac 6480
tttgaaccac tgtctgaggc ttgagaatga accaagatcc aaactcaaaa agggcaaatt 6540
ccaaggagaa ttacatcaag tgccaagctg gcctaacttc agtctccacc cactcagtgt 6600
ggggaaactc catcgcataa aacccctccc cccaacctaa agacgacgta ctccaaaagc 6660
tcgagaacta atcgaggtgc ctggacggcg cccggtactc agtggagtca catgaagcga 6720
cggctgagga cggaaaggcc cttttccttt gtgtgggaga aacttataca gggtagcata 6780
atgggctact gaccccgcct tcaaacctat ttggagacta taagtgaaaa tgactcaccc 6840
gcccgctctc ccggcacctt catcttgtcc tttccctcag aaagaggctg ggaggcagag 6900
gctgaggcag cggtggccgg gacggttagg agaaaaggag tctctgctgg ttttattctg 6960
cagctacctc cccaggaagt ggaggactgt ggggcctttg agaagcacct gccgacaggg 7020
ccaagaaatt cgcactcccc ctttcggttc acaggcagga agccctggag gtttgagggt 7080
ttggggtgtg tgtatgtatc tgtctgtctg aattttgctt tttctctcat ttgaccattg 7140
ttttaatgct ccttttttta aaaaaaataa ttcttatcta attcctatct tgattggtaa 7200
agtccatctc taggcaaata caagttctcg atggaaaaca ataagtaatg taaaatacag 7260
catagcaaaa ctttaacctc caaatcaagc ctctacttga atccttttct gagggatgaa 7320
taaggcatag gcatcagggg ctgttgccaa tgtgcattag ctgtttgcag cctcaccttc 7380
tttcatggag tttaagatat agtgtatttt cccaaggttt gaactagctc ttcatttctt 7440
tatgttttaa atgcactgac ctcccacatt ccctttttag taaaatattc agaaataatt 7500
taaatacatc attgcaatga aaataaatgt tttttattag gcagaatcca gatgctcaag 7560
gcccttcata atatccccca gtttagtagt tggacttagg gaacaaagga acctttaata 7620
gaaattggac agcaagaaag cgagcttagt gatacttgtg atcctctaga tcacgacacc 7680
tgaaatggaa gaaaaaaact gcaccttcat cttgtccttt ccctcagaaa gaggctggga 7740
ggcagaggct gaggcagcgg tggccgggac ggttaggaga aaaggagtct ctgctggttt 7800
tattctgcag ctacctcccc aggaagtgga ggactgtggg gcctttgaga agcacctgcc 7860
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tgagggtttg gggtgtgtgt atgtatctgt ctgtctgaat tttgcttttt ctctcatttg 7980
accattgttt taatgctcct ttttttaaaa aaaataattc ttatctaatt cctatcttga 8040
ttggtaaagt ccatctctag gcaaatacaa gttctcgatg gaaaacaata agtaatgtaa 8100
aatacagcat agcaaaactt taacctccaa atcaagcctc tacttgaatc cttttctgag 8160
ggatgaataa ggcataggca tcaggggctg ttgccaatgt gcattagctg tttgcagcct 8220
caccttcttt catggagttt aagatatagt gtattttccc aaggtttgaa ctagctcttc 8280
atttctttat gttttaaatg cactgacctc ccacattccc tttttagtaa aatattcaga 8340
aataatttaa atacatcatt gcaatgaaaa taaatgtttt ttattaggca gaatccagat 8400
gctcaaggcc cttcataata tcccccagtt tagtagttgg acttagggaa caaaggaacc 8460
tttaatagaa attggacagc aagaaagcga gcttagtgat acttgtaaaa agagacgcgt 8520
ctctaaaagt cctttccatg gctgctcgcc tgtgttgcca cctggattct gcgcgggacg 8580
tccttctgct acgtcccttc ggccctcaat ccagcggacc ttccttcccg cggcctgctg 8640
ccggctctgc ggcctcttcc gcgtcttcgc cttcgccctc agacgagtcg gatctccctt 8700
tgggccgcct ccccgcctgg aattcgagct cggtaccttt aagaccaatg acttacaagg 8760
cagctgtaga tcttagccac tttttaaaag aaaagggggg actggaaggg ctaattcact 8820
cccaacgaag acaagatctg ctttttgctt gtactgggtc tctctggtta gaccagatct 8880
gagcctggga gctctctggc taactaggga acccactgct taagcctcaa taaagcttgc 8940
cttgagtgct tcaagtagtg tgtgcccgtc tgttgtgtga ctctggtaac tagagatccc 9000
tcagaccctt ttagtcagtg tggaaaatct ctagcagtag tagttcatgt catcttatta 9060
ttcagtattt ataacttgca aagaaatgaa tatcagagag tgagaggaac ttgtttattg 9120
cagcttataa tggttacaaa taaagcaata gcatcacaaa tttcacaaat aaagcatttt 9180
tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa tgtatcttat catgtctggc 9240
tctagctatc ccgcccctaa ctccgcccat cccgccccta actccgccca gttccgccca 9300
ttctccgccc catggctgac taattttttt tatttatgca gaggccgagg ccgcctcggc 9360
ctctgagcta ttccagaagt agtgaggagg cttttttgga ggcctaggga cgtatggcca 9420
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aatgggcaca aattttctgt cagtggagag ggtgaaggtg atgcaacata cggaaaactt 9600
acccttaaat ttatttgcac tactggaaaa ctacctgttc catggccaac acttgtcact 9660
actttctctt atggtgttca atgcttttca agatacccag atcatatgaa acggcatgac 9720
tttttcaaga gtgccatgcc cgaaggttat gtacaggaaa gaactatatt tttcaaagat 9780
gacgggaact acaagacacg tgctgaagtc aagtttgaag gtgataccct tgttaataga 9840
atcgagttaa aaggtattga ttttaaagaa gatggaaaca ttcttggaca caaattggaa 9900
tacaactata actcacacaa tgtatacatc atggcagaca aacaaaagaa tggaatcaaa 9960
gttaacttca aaattagaca caacattgaa gatggaagcg ttcaactagc agaccattat 10020
caacaaaata ctccaattgg cgatggccct gtccttttac cagacaacca ttacctgtcc 10080
acacaatctg ccctttcgaa agatcccaac gaaaagagag accacatggt ccttcttgag 10140
tttgtaacag ctgctgggat tacacatggc atggatgaac tatacaaata ggacctccat 10200
agaagacacc gggaccgatc caataacttc gtatagcata cattatacga agttatgcct 10260
ccggactcta gcgtttaaac ttaagcttgg gaagttccta ttccgaagtt cctattctct 10320
agaaagtata ggaacttcta ccgagctcgg atccactagt ccagtgtggt ggaattctgc 10380
agatatccag cacagtggcg gccgctcgag tctagagggc ccgtttaaac ccgctgatca 10440
gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc cgtgccttcc 10500
ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga aattgcatcg 10560
cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg tggggcagga cagcaagggg 10620
gaggattggg aagacaatag caggcatgct ggggatgcgg tgggctctat ggcttctgag 10680
gcggaaagtt aaccctagaa agataatcat attgtgacgt acgttaaaga taatcatgcg 10740
taaaattgac gcatgtgttt tatcggtctg tatatcgagg tttatttatt aatttgaata 10800
gatattaagt tttattatat ttacacttac atactaataa taaattcaac aaacaattta 10860
tttatgttta tttatttatt aaaaaaaaac aaaaactcaa aatttcttct ataaagtaac 10920
aaaaaccagc tggggctcga agttcctata ctttctagag aataggaact tctatagtga 10980
gtcgaataag ggcgacacaa aatttattct aaatgcataa taaatactga taacatctta 11040
tagtttgtat tatattttgt attatcgttg acatgtataa ttttgatatc aaaaactgat 11100
tttcccttta ttattttcga gatttatttt cttaattctc tttaacaaac tagaaatatt 11160
gtatatacaa aaaatcataa ataatagatg aatagtttaa ttataggtgt tcatcaatcg 11220
aaaaagcaac gtatcttatt taaagtgcgt tgcttttttc tcatttataa ggttaaataa 11280
ttctcatata tcaagcaaag tgacaggcgc ccttaaatat tctgacaaat gctctttccc 11340
taaactcccc ccataaaaaa acccgccgaa gcgggttttt acgttatttg cggattaacg 11400
attactcgtt atcagaaccg cccagggggc ccgagcttaa gactggccgt cgttttacaa 11460
cacagaaaga gtttgtagaa acgcaaaaag gccatccgtc aggggccttc tgcttagttt 11520
gatgcctggc agttccctac tctcgccttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc 11580
ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac 11640
agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa 11700
ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca 11760
caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc 11820
gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata 11880
cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta 11940
tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca 12000
gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga 12060
cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg 12120
tgctacagag ttcttgaagt ggtgggctaa ctacggctac actagaagaa cagtatttgg 12180
tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg 12240
caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag 12300
aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa 12360
cgacgcgcgc gtaactcacg ttaagggatt ttggtcatga gcttgcgccg tcccgtcaag 12420
tcagcgtaat gctctgcttt tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat 12480
tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa 12540
actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc 12600
gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga 12660
aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagtttatgc atttctttcc 12720
agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac 12780
cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga ggcgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac 12840
aattacaaac aggaatcgag tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat 12900
tttcacctga atcaggatat tcttctaata cctggaacgc tgtttttccg gggatcgcag 12960
tggtgagtaa ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagtggca 13020
taaattccgt cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac 13080
ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaag cgatagattg 13140
tcgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca 13200
tgttggaatt taatcgcggc ctcgacgttt cccgttgaat atggctcata ttcttccttt 13260
ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat 13320
gtatttagaa aaataaacaa ataggggtca gtgttacaac caattaacca attctgaaca 13380
ttatcgcgag cccatttata cctgaatatg gctcataaca ccccttgttt gcctggcggc 13440
agtagcgcgg tggtcccacc tgaccccatg ccgaactcag aagtgaaacg ccgtagcgcc 13500
gatggtagtg tggggactcc ccatgcgaga gtagggaact gccaggcatc aaataaaacg 13560
aaaggctcag tcgaaagact gggcctttcg cccgggctaa ttagggggtg tcgcccttat 13620
tcgactctat agtgaagttc ctattctcta gaaagtatag gaacttctga agt 13673
<210> 84
<211> 15025
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成Dox-雷帕霉素诱导型GAG POL ENV
<400> 84
gatatctata acaagaaaat atatatataa taagttatca cgtaagtaga acatgaaata 60
acaatataat tatcgtatga gttaaatctt aaaagtcacg taaaagataa tcatgcgtca 120
ttttgactca cgcggtcgtt atagttcaaa atcagtgaca cttaccgcat tgacaagcac 180
gcctcacggg agctccaagc ggcgactgag atgtcctaaa tgcacagcga cggattcgcg 240
ctatttagaa agagagagca atatttcaag aatgcatgcg tcaattttac gcagactatc 300
tttctagggt taagacggat cgggagatct cccgatcccc tatggtgcac tctcagtaca 360
atctgctctg atgccgcata gttaagccag tatctgctcc ctgcttgtgt gttggaggtc 420
gctgagtagt gcgcgagcaa aatttaagct acaacaaggc aaggcttgac cgacaattgc 480
atgaagaatc tgcttagggt taggcgtttt gaagttccta tactttctag agaataggaa 540
cttcggaata ggaacttcgg atgcaatttc ctcattttat taggaaagga cagtgggagt 600
ggcaccttcc agggtcaagg aaggcacggg ggaggggcaa acaacagatg gctggcaact 660
agaaggcaca gcgttagtga tacttgtggg ccagggcatt agccacacca gccaccactt 720
tctgataggc agcctgcact ggtggggtga attccgcgga agcttgtgta attgttaatt 780
tctctgtccc actccatcca ggtcgtgtga ttccaaatct gttccagaga tttattactc 840
caactagcat tccaaggcac agcagtggtg caaatgagtt ttccagagca accccaaatc 900
cccaggagct gttgatcctt taggtatctt tccacagcca ggattcttgc ctggagctgc 960
ttgatgcccc agactgtgag ttgcaacaga tgctgttgcg cctcaatagc cctcagcaaa 1020
ttgttctgct gctgcactat accagacaat aattgtctgg cctgtaccgt cagcgtcatt 1080
gacgctgcgc ccatagtgct tcctgctgct cccaagaacc caaggaacaa agctcctgcg 1140
gccgctccgg aattccatgt gttaatcctc atcctgtcta cttgccacac aatcatcacc 1200
tgccatctgt tttccataat ccctgatgat ctttgctttt cttcttggca ctacttttat 1260
gtcactatta tcttgtatta ctactgcccc ttcacctttc cagaggagct ttgctggtcc 1320
tttccaaact ggatctctgc tgtccctgta ataaacccga aaattttgaa tttttgtaat 1380
ttgtttttgt aattctttag tttgtatgtc tgttgctatt atgtctacta ttctttcccc 1440
tgcactgtac cccccaatcc ccccttttct tttaaaattg tggatgaata ctgccatttg 1500
tactgctgtc ttaagatgtt cagcctgatc tcttacctgt cctataattt tctttaattc 1560
tttattcata gattctatta ctccttgact ttggggattg tagggaatgc caaattcctg 1620
cttgatcccc gcccaccaac aggcggcctt aactgtagta ctggtgaaat tgctgccatt 1680
gtctgtatgt actgttttta ctggccatct tcctgctaat tttaagagga agtatgctgt 1740
ttcttgccct gtctctgctg gaattacttc tgcttctata tatccactgg ctacatgaac 1800
tgctaccaag ataacttttc cttctaaatg tgtacaatct agctgccata ttcctgggct 1860
acagtctact tgtccatgca tggcttcccc ttttagctga catttatcac agctggctac 1920
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gtgatatttc tcatgttctt cttgggcctt atctattcca tctaaaaata gtactttcct 2040
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ttccttttgt atgggtaatt taaatttagg agtctttccc catattacta tgctttctgt 2580
ggctattttt tgtactgcct ctgttaattg tttcacatca ttagtgtggg cacccttcat 2640
tcttgcatac tttcctgttt tcagattttt aaatggctct tgataaattt gatatgtcca 2700
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tgtggtaaat ccccacctca acagatgttg tctcagttcc tctatttttg ttctatgctg 3120
ccctatttct aagtcagatc ctacatacaa atcatccatg tattgataga tgactatgtc 3180
tggattttgt tttctaaaag gctctaagat ttttgtcatg ctacactgga atattgctgg 3240
tgatcctttc catccctgtg gaagcacatt gtactgatat ctaatccctg gtgtctcatt 3300
gtttatacta ggtatggtaa atgcagtata cttcctgaag tctttatcta agggaactga 3360
aaaatatgca tcgcccacat ccagtactgt tactgatttt ttctgtttta accctgcagg 3420
atgtggtatt cctaattgaa cttcccagaa atcttgagtt ctcttattaa gttctctgaa 3480
atctactaat tttctccatt tagtactgtc ttttttcttt atggcaaata ctggagtatt 3540
gtatggattt tcaggcccaa tttttgaaat ttttccttcc ttttccattt ctgtacaaat 3600
ttctactaat gcttttattt tttcttctgt caatggccat tgtttaactt ttgggccatc 3660
cattcctggc tttaatttta ctggtacagt ctcaatagga ctaatgggaa aatttaaagt 3720
gcagccaatc tgagtcaaca gatttcttcc aattatgttg acaggtgtag gtcctactaa 3780
tactgtacct atagctttat gtccgcagat ttctatgagt atctgatcat actgtcttac 3840
tttgataaaa cctccaattc cccctatcat ttttggtttc catcttcctg gcaaattcat 3900
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tatctttatt gtgacgaggg gtcgctgcca aagagtgatc tgagggaagc taaaggatac 4020
agttccttgt ctatcggctc ctgcttctga gagggagttg ttgtctcttc cccaaacctg 4080
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cccttgtggg aaggccagat cttccctaaa aaattagcct gtctctcagt acaatctttc 4200
atttggtgtc cttcctttcc acatttccaa cagccctttt tcctaggggc cctgcaattt 4260
ttggctatgt gcccttcttt gccacaattg aaacacttaa cagtctttct ttggttccta 4320
aaattgcctt tctgtatcat tatggtagct ggatttgtta cttggctcat tgcttcagcc 4380
aaaactcttg ctttatggcc gggtcccccc actccctgac atgctgtcat catttcttct 4440
agtgtcgctc ctggtcccaa tgcttttaaa atagtcttac aatctgggtt cgcattttgg 4500
accaacaagg tttctgtcat ccaatttttt acctcttgtg aagcttgctc ggctcttaga 4560
gttttataga atcggtctac atagtctcta aagggttcct ttggtccttg tcttatgtcc 4620
agaatgctgg tagggctata cattcttact attttattta atcccaggat tatccatctt 4680
ttatagattt ctcctactgg gataggtgga ttatgtgtca tccatcctat ttgttcctga 4740
agggtactag tagttcctgc tatgtcactt ccccttggtt ctctcatctg gcctggtgca 4800
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gccttctctt ctactacttt tacccatgca tttaaagttc taggtgatat ggcctgatgt 5040
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gctactgtat tatataatga tctaagttct tctgatcctg tctgaaggga tggttgtagc 5280
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cgttctagct ccctgcttgc ccatactata tgttttaatt tatatttttt ctttccccct 5400
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gcacccatgg cggcggcaga tctcgaattc agatctcacg tgctttgcca aagtgatggg 5520
ccagcacaca gaccagcacg ttgcccagga gctgtgggag gaagataaga ggtatgaaca 5580
tgattagcaa aagggcctag cttggactca gaataatcca gccttatccc aaccataaaa 5640
taaaagcaga atggtagctg gattgtagct gctattagca atatgaaacc tcttacatca 5700
gttacaattt atatgcagaa atatttatat gcagaaatat tgctattgcc ttaacccaga 5760
aattatcact gttattcttt agaatggtgc aaagaggcat gatacattgt atcattattg 5820
ccctgaaaga aagagattag ggaaagtatt agaaataaga taaacaaaaa agtatattaa 5880
aagaagaaag cattttttaa aattacaaat gcaaaattac cctgatttgg tcaatatgtg 5940
taccctgtta cttctcccct tcctatgaca tgaacttaac catagaaaag aaggggaaag 6000
aaaacatcaa gggtcccata gactcaccct gaagttctca ggatccgagc tcggtaccac 6060
atgtaagctt cgaggggagg ctggatcggt cccggtgtct tctatggagg tcaaaacagc 6120
gtggatggcg tctccaggcg atctgacggt tcactaaacg ctgcttcgcg atgtacgggc 6180
cagatatacg cgttgcgatc tgacggttca ctaaacgagc tctgcttata taggcctccc 6240
accgtacacg ccacctcgac atactcgagt ttactcccta tcagtgatag agaacgtatg 6300
aagagtttac tccctatcag tgatagagaa cgtatgcaga ctttactccc tatcagtgat 6360
agagaacgta taaggagttt actccctatc agtgatagag aacgtatgac cagtttactc 6420
cctatcagtg atagagaacg tatctacagt ttactcccta tcagtgatag agaacgtata 6480
tccagtttac tccctatcag tgatagagaa cgtataagct ttaggcgtgt acggtgggcg 6540
cctataaaag cagagctcgt ttagtgaacc gtcagatcgc ctggagcaat tccacaacac 6600
ttttgtctta taccaacttt ccgtaccact tcctaccctc gtaaatcgtc gacgagctcg 6660
tttagtgaac cgtcagatcg cctggagacg ccctcgaagc cgcggtgcgg gtgccagggc 6720
gtgcccttgg gctccatgtc catcatgggt ctcaaggtga acgtctctgc catattcatg 6780
gcagtactgt taactctcca aacacccacc ggtcaaatcc attggggcaa tctctctaag 6840
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tcattagtca taaaattaat gcccaatata actctcctca ataactgcac gagggtagag 6960
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gcaatgaccc agaatataag accggttcag agtgtagctt caagtaggag acacaagaga 7080
tttgcgggag tagtcctggc aggtgcggcc ctaggcgttg ccacagctgc tcagataaca 7140
gccggcattg cacttcacca gtccatgctg aactctcaag ccatcgacaa tctgagagcg 7200
agcctggaaa ctactaatca ggcaattgag gcaatcagac aagcagggca ggagatgata 7260
ttggctgttc agggtgtcca agactacatc aataatgagc tgataccgtc tatgaaccaa 7320
ctatcttgtg atttaatcgg ccagaagctc gggctcaaat tgctcagata ctatacagaa 7380
atcctgtcat tatttggccc cagcttacgg gaccccatat ctgcggagat atctatccag 7440
gctttgagct atgcgcttgg aggagacatc aataaggtgt tagaaaagct cggatacagt 7500
ggaggtgatt tactgggcat cttagagagc agaggaataa aggcccggat aactcacgtc 7560
gacacagagt cctacttcat tgtcctcagt atagcctatc cgacgctgtc cgagattaag 7620
ggggtgattg tccaccggct agagggggtc tcgtacaaca taggctctca agagtggtat 7680
accactgtgc ccaagtatgt tgcaacccaa gggtacctta tctcgaattt tgatgagtca 7740
tcgtgtactt tcatgccaga ggggactgtg tgcagccaaa atgccttgta cccgatgagt 7800
cctctgctcc aagaatgcct ccgggggtcc accaagtcct gtgctcgtac actcgtatcc 7860
gggtcttttg ggaaccggtt cattttatca caagggaacc taatagccaa ttgtgcatca 7920
atcctttgca agtgttacac aacaggaacg atcattaatc aagaccctga caagatccta 7980
acatacattg ctgccgatca ctgcccggta gtcgaggtga acggcgtgac catccaagtc 8040
gggagcagga ggtatccaga cgctgtgtac ttgcacagaa ttgacctcgg tcctcccata 8100
tcattggaga ggttggacgt agggacaaat ctggggaatg caattgctaa gttggaggat 8160
gccaaggaat tgttggagtc atcggaccag atattgagga gtatgaaagg tttatcgagc 8220
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ttaatatgtt gctgcagggg gcgttgaccc ctctccctcc ccccccccta acgttactgg 8340
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gccgtctttt ggcaatgtga gggcccggaa acctggccct gtcttcttga cgagcattcc 8460
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tatgggatct gatctggggc ctcggtacac atgctttaca tgtgtttagt cgaggttaaa 8820
aaaacgtcta ggccccccga accacgggga cgtggttttc ctttgaaaaa cacgatgata 8880
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gaccttatgt tttgctggct gttctgtttg tcatgtttct gagcttgatc gggttgctag 9000
ccattgcagg cattagactt catcgggcag ccatctacac cgcagagatc cataaaagcc 9060
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gtgcagatgt ggctgctgaa gagctcatga atgcattggt gaactcaact ctactggaga 9360
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tcagaggtca attctcaaac atgtcgctgt ccctgttaga cttgtattta ggtcgaggtt 9480
acaatgtgtc atctatagtc actatgacat cccagggaat gtatggggga acttacctag 9540
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acagaggtgt tatcgctgac aaycaagcaa aatgggctgt cccgacaaca cgaacagatg 9960
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ctgttgatct gagtctgaca gttgagctta aaatcaaaat tgcttcggga ttcgggccat 10140
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tgactatccc rccaatgaag aacctagcct taggtgtaat caacacattg gagtggatac 10260
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aggcgctgaa gctgaagggc ggcggccact acctggtgga gttcaagtca atctacatgg 11460
ccaagaagcc cgtgaagctg cccggctact actacgtgga ctccaagctg gacatcacct 11520
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tgttccagta ggacctccat agaagacacc gggaccgatc caataacttc gtatagcata 11640
cattatacga agttatgcct ccggactcta gcgtttaaac ttaagcttgg taccgagctc 11700
ggatccacta gtccagtgtg gtggaattct gcagatatcc agcacagtgg cggccgctcg 11760
agtctagagg gcccgtttaa acccgctgat cagcctcgac tgtgccttct agttgccagc 11820
catctgttgt ttgcccctcc cccgtgcctt ccttgaccct ggaaggtgcc actcccactg 11880
tcctttccta ataaaatgag gaaattgcat cgcattgtct gagtaggtgt cattctattc 11940
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ctggggatgc ggtgggctct atggcttctg aggcggaaag ttaaccctag aaagataatc 12060
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tgtatatcga ggtttattta ttaatttgaa tagatattaa gttttattat atttacactt 12180
acatactaat aataaattca acaaacaatt tatttatgtt tatttattta ttaaaaaaaa 12240
acaaaaactc aaaatttctt ctataaagta acaaaaacca gctggggctc gaagttccta 12300
tactttctag agaataggaa cttctatagt gagtcgaata agggcgacac aaaatttatt 12360
ctaaatgcat aataaatact gataacatct tatagtttgt attatatttt gtattatcgt 12420
tgacatgtat aattttgata tcaaaaactg attttccctt tattattttc gagatttatt 12480
ttcttaattc tctttaacaa actagaaata ttgtatatac aaaaaatcat aaataataga 12540
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gttgcttttt tctcatttat aaggttaaat aattctcata tatcaagcaa agtgacaggc 12660
gcccttaaat attctgacaa atgctctttc cctaaactcc ccccataaaa aaacccgccg 12720
aagcgggttt ttacgttatt tgcggattaa cgattactcg ttatcagaac cgcccagggg 12780
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aggccatccg tcaggggcct tctgcttagt ttgatgcctg gcagttccct actctcgcct 12900
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ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg 13140
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tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc 13260
gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc 13320
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tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt 13440
aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtgggct 13500
aactacggct acactagaag aacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc 13560
ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt 13620
ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg 13680
atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgacgcgc gcgtaactca cgttaaggga 13740
ttttggtcat gagcttgcgc cgtcccgtca agtcagcgta atgctctgct tttagaaaaa 13800
ctcatcgagc atcaaatgaa actgcaattt attcatatca ggattatcaa taccatattt 13860
ttgaaaaagc cgtttctgta atgaaggaga aaactcaccg aggcagttcc ataggatggc 13920
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cccctcgtca aaaataaggt tatcaagtga gaaatcacca tgagtgacga ctgaatccgg 14040
tgagaatggc aaaagtttat gcatttcttt ccagacttgt tcaacaggcc agccattacg 14100
ctcgtcatca aaatcactcg catcaaccaa accgttattc attcgtgatt gcgcctgagc 14160
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gcgcaggaac actgccagcg catcaacaat attttcacct gaatcaggat attcttctaa 14280
tacctggaac gctgtttttc cggggatcgc agtggtgagt aaccatgcat catcaggagt 14340
acggataaaa tgcttgatgg tcggaagtgg cataaattcc gtcagccagt ttagtctgac 14400
catctcatct gtaacatcat tggcaacgct acctttgcca tgtttcagaa acaactctgg 14460
cgcatcgggc ttcccataca agcgatagat tgtcgcacct gattgcccga cattatcgcg 14520
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ttcccgttga atatggctca tattcttcct ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg 14640
ttattgtctc atgagcggat acatatttga atgtatttag aaaaataaac aaataggggt 14700
cagtgttaca accaattaac caattctgaa cattatcgcg agcccattta tacctgaata 14760
tggctcataa caccccttgt ttgcctggcg gcagtagcgc ggtggtccca cctgacccca 14820
tgccgaactc agaagtgaaa cgccgtagcg ccgatggtag tgtggggact ccccatgcga 14880
gagtagggaa ctgccaggca tcaaataaaa cgaaaggctc agtcgaaaga ctgggccttt 14940
cgcccgggct aattaggggg tgtcgccctt attcgactct atagtgaagt tcctattctc 15000
tagaaagtat aggaacttct gaagt 15025
<210> 85
<211> 6584
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成雷帕霉素诱导型TET活化因子
<400> 85
gatatctata acaagaaaat atatatataa taagttatca cgtaagtaga acatgaaata 60
acaatataat tatcgtatga gttaaatctt aaaagtcacg taaaagataa tcatgcgtca 120
ttttgactca cgcggtcgtt atagttcaaa atcagtgaca cttaccgcat tgacaagcac 180
gcctcacggg agctccaagc ggcgactgag atgtcctaaa tgcacagcga cggattcgcg 240
ctatttagaa agagagagca atatttcaag aatgcatgcg tcaattttac gcagactatc 300
tttctagggt taagacggat cgggagatct cccgatcccc tatggtgcac tctcagtaca 360
atctgctctg atgccgcata gttaagccag tatctgctcc ctgcttgtgt gttggaggtc 420
gctgagtagt gcgcgagcaa aatttaagct acaacaaggc aaggcttgac cgacaattgc 480
atgaagaatc tgcttagggt taggcgtttt gcgctgcttc gcgatgtacg ggccagatat 540
acgcgttctc catagaagac accgaataaa atatctttat tttcattaca tctgtgtgtt 600
ggttttttgt gtgaatcgat agtactaaca tacgctctcc atcaaaacaa aacgaaacaa 660
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accgatccaa taacttcgta tagcatacat tatacgaagt tatgcctccg gactctagcg 780
ttttagttat tactagcgct accggactca gatctcgagc tcaagcttcg aattctgcag 840
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gccgaccgac gcccttgacg attttgactt agacatgctc ccagccgatg cccttgacga 2040
ctttgacctt gatatgctgc ctgctgacgc tcttgacgat tttgaccttg acatgctccc 2100
cgggtaagtc cctccccccc ccctaacgtt actggccgaa gccgcttgga ataaggccgg 2160
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cggaaacctg gccctgtctt cttgacgagc attcctaggg gtctttcccc tctcgccaaa 2280
ggaatgcaag gtctgttgaa tgtcgtgaag gaagcagttc ctctggaagc ttcttgaaga 2340
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cacgttgtga gttggatagt tgtggaaaga gtcaaatggc tctcctcaag cgtattcaac 2520
aaggggctga aggatgccca gaaggtaccc cattgtatgg gatctgatct ggggcctcgg 2580
tgcacatgct ttacatgtgt ttagtcgagg ttaaaaaacg tctaggcccc ccgaaccacg 2640
gggacgtggt tttcctttga aaaacacgat gataaatgga tagcactgag aacgtcatca 2700
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gcggcggcca ctacctggtg gagttcaagt caatctacat ggccaagaag cccgtgaagc 3240
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ccgtggtgga gcagtacgag cgcgccgagg cccgccacca cctgttccag tagctcgact 3360
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gaaggtgcca ctcccactgt cctttcctaa taaaatgagg aaattgcatc gcattgtctg 3480
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taaccctaga aagataatca tattgtgacg tacgttaaag ataatcatgc gtaaaattga 3660
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atttatttat taaaaaaaaa caaaaactca aaatttcttc tataaagtaa caaaaaccag 3840
ctggggctcg aagttcctat actttctaga gaataggaac ttctatagtg agtcgaataa 3900
gggcgacaca aaatttattc taaatgcata ataaatactg ataacatctt atagtttgta 3960
ttatattttg tattatcgtt gacatgtata attttgatat caaaaactga ttttcccttt 4020
attattttcg agatttattt tcttaattct ctttaacaaa ctagaaatat tgtatataca 4080
aaaaatcata aataatagat gaatagttta attataggtg ttcatcaatc gaaaaagcaa 4140
cgtatcttat ttaaagtgcg ttgctttttt ctcatttata aggttaaata attctcatat 4200
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gggcggcacu uauacagggu agcauaaugg gcuacuugac gccuucaccu auuuguagac 60
uauaaguguc gcgcg 75
<210> 90
<211> 76
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成进化适体
<400> 90
gggcggcacu uauacagcgu agcauaaugg gcugcagacg ccgucaaacc uauuugcaga 60
cuauaagugu cgcgcg 76
<210> 91
<211> 74
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成进化适体
<400> 91
gggcggcacu uauacaccgu agcauaaugg gcuacugccg ccgucgaccu uuuggagacu 60
auaagugucg cgcg 74
<210> 92
<211> 75
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成进化适体
<400> 92
gggcggcacu uauacagguc agcauaaugu gcuagugcgc cuucaaaccu auuuagagac 60
uauaaguguc gcgcg 75
<210> 93
<211> 76
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成进化适体
<400> 93
gggcggcacu uauacagcuu agcguaaugg cuacugacgc cguccaaacc uauuuacaga 60
cuauaagugu cgcgcg 76
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成进化适体
<400> 94
gggcggcacu uauacagggg agcauaaugg gcuacugacg ccuuuaaacc uauuugagga 60
cuauaagugu cgcgcg 76
<210> 95
<211> 74
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成进化适体
<400> 95
gggcggcacu uauacaugga agcauaaugg gcugccgacg gcccuuaacc uuuggagacu 60
auaagugucg cgcg 74
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<220>
<223> 合成进化适体
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gggcggcacu uauacagauu agcauaaugg gcuacugacc ccgccggcaa accuauuuga 60
agacuauaag ugucgcgcg 79
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<220>
<223> 合成进化适体
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uauaaguguc gcgcg 75
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<220>
<223> 合成进化适体
<400> 98
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cuauaagugu cgcgcg 76
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成进化适体
<400> 99
gggcggcacu uauacagagu agcauaaugg gcuacagacg ccgucaaacc uauuuaccga 60
cuauaagugu cgcgcg 76
<210> 100
<211> 75
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成进化适体
<400> 100
gggcggcacu uauacagggu gcauaauggg cuagugacgc cuucaaaccu auuuguagac 60
uauaaguguc gcgcg 75
<210> 101
<211> 461
<212> PRT
<213> 智人
<400> 101
Met Thr Ile Leu Gly Thr Thr Phe Gly Met Val Phe Ser Leu Leu Gln
1 5 10 15
Val Val Ser Gly Glu Ser Gly Tyr Ala Gln Asn Gly Asp Leu Glu Asp
20 25 30
Ala Glu Leu Asp Asp Tyr Ser Phe Ser Cys Tyr Ser Gln Leu Glu Val
35 40 45
Asn Gly Ser Gln His Ser Leu Thr Cys Ala Phe Glu Asp Pro Asp Val
50 55 60
Asn Thr Thr Asn Leu Glu Phe Glu Ile Cys Gly Ala Leu Val Glu Val
65 70 75 80
Lys Cys Leu Asn Phe Arg Lys Leu Gln Glu Ile Tyr Phe Ile Glu Thr
85 90 95
Lys Lys Phe Leu Leu Ile Gly Lys Ser Asn Ile Cys Val Lys Val Gly
100 105 110
Glu Lys Ser Leu Thr Cys Lys Lys Ile Asp Leu Thr Thr Ile Val Lys
115 120 125
Pro Glu Ala Pro Phe Asp Leu Ser Val Ile Tyr Arg Glu Gly Ala Asn
130 135 140
Asp Phe Val Val Thr Phe Asn Thr Ser His Leu Gln Lys Lys Tyr Val
145 150 155 160
Lys Val Leu Met His Asp Val Ala Tyr Arg Gln Glu Lys Asp Glu Asn
165 170 175
Lys Trp Thr His Val Asn Leu Ser Ser Thr Lys Leu Thr Leu Leu Gln
180 185 190
Arg Lys Leu Gln Pro Ala Ala Met Tyr Glu Ile Lys Val Arg Ser Ile
195 200 205
Pro Asp His Tyr Phe Lys Gly Phe Trp Ser Glu Trp Ser Pro Ser Tyr
210 215 220
Tyr Phe Arg Thr Pro Glu Ile Asn Asn Ser Ser Gly Glu Met Asp Pro
225 230 235 240
Ile Leu Leu Thr Ile Ser Lys Cys His Leu Ser Phe Phe Ser Val Ala
245 250 255
Leu Leu Val Ile Leu Ala Cys Val Leu Trp Lys Lys Arg Ile Lys Pro
260 265 270
Ile Val Trp Pro Ser Leu Pro Asp His Lys Lys Thr Leu Glu His Leu
275 280 285
Cys Lys Lys Pro Arg Lys Asn Leu Asn Val Ser Phe Asn Pro Glu Ser
290 295 300
Phe Leu Asp Cys Gln Ile His Arg Val Asp Asp Ile Gln Ala Arg Asp
305 310 315 320
Glu Val Glu Gly Phe Leu Gln Asp Thr Phe Pro Gln Gln Leu Glu Glu
325 330 335
Ser Glu Lys Gln Arg Leu Gly Gly Asp Val Gln Ser Pro Asn Cys Pro
340 345 350
Ser Glu Asp Val Val Val Thr Pro Glu Ser Phe Gly Arg Asp Ser Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Ala Gly Asn Val Ser Ala Cys Asp Ala Pro Ile Leu
370 375 380
Ser Ser Ser Arg Ser Leu Asp Cys Arg Glu Ser Gly Lys Asn Gly Pro
385 390 395 400
His Val Tyr Gln Asp Leu Leu Leu Ser Leu Gly Thr Thr Asn Ser Thr
405 410 415
Leu Pro Pro Pro Phe Ser Leu Gln Ser Gly Ile Leu Thr Leu Asn Pro
420 425 430
Val Ala Gln Gly Gln Pro Ile Leu Thr Ser Leu Gly Ser Asn Gln Glu
435 440 445
Glu Ala Tyr Val Thr Met Ser Ser Phe Tyr Gln Asn Gln
450 455 460
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<211> 463
<212> PRT
<213> 智人
<400> 102
Met Thr Ile Leu Gly Thr Thr Phe Gly Met Val Phe Ser Leu Leu Gln
1 5 10 15
Val Val Ser Gly Glu Ser Gly Tyr Ala Gln Asn Gly Asp Leu Glu Asp
20 25 30
Ala Glu Leu Asp Asp Tyr Ser Phe Ser Cys Tyr Ser Gln Leu Glu Val
35 40 45
Asn Gly Ser Gln His Ser Leu Thr Cys Ala Phe Glu Asp Pro Asp Val
50 55 60
Asn Thr Thr Asn Leu Glu Phe Glu Ile Cys Gly Ala Leu Val Glu Val
65 70 75 80
Lys Cys Leu Asn Phe Arg Lys Leu Gln Glu Ile Tyr Phe Ile Glu Thr
85 90 95
Lys Lys Phe Leu Leu Ile Gly Lys Ser Asn Ile Cys Val Lys Val Gly
100 105 110
Glu Lys Ser Leu Thr Cys Lys Lys Ile Asp Leu Thr Thr Ile Val Lys
115 120 125
Pro Glu Ala Pro Phe Asp Leu Ser Val Ile Tyr Arg Glu Gly Ala Asn
130 135 140
Asp Phe Val Val Thr Phe Asn Thr Ser His Leu Gln Lys Lys Tyr Val
145 150 155 160
Lys Val Leu Met His Asp Val Ala Tyr Arg Gln Glu Lys Asp Glu Asn
165 170 175
Lys Trp Thr His Val Asn Leu Ser Ser Thr Lys Leu Thr Leu Leu Gln
180 185 190
Arg Lys Leu Gln Pro Ala Ala Met Tyr Glu Ile Lys Val Arg Ser Ile
195 200 205
Pro Asp His Tyr Phe Lys Gly Phe Trp Ser Glu Trp Ser Pro Ser Tyr
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Tyr Phe Arg Thr Pro Glu Ile Asn Asn Ser Ser Gly Glu Met Asp Pro
225 230 235 240
Ile Phe Ser Cys Gly Pro Leu Thr Ile Ser Ile Leu Ser Phe Phe Ser
245 250 255
Val Ala Leu Leu Val Ile Leu Ala Cys Val Leu Trp Lys Lys Arg Ile
260 265 270
Lys Pro Ile Val Trp Pro Ser Leu Pro Asp His Lys Lys Thr Leu Glu
275 280 285
His Leu Cys Lys Lys Pro Arg Lys Asn Leu Asn Val Ser Phe Asn Pro
290 295 300
Glu Ser Phe Leu Asp Cys Gln Ile His Arg Val Asp Asp Ile Gln Ala
305 310 315 320
Arg Asp Glu Val Glu Gly Phe Leu Gln Asp Thr Phe Pro Gln Gln Leu
325 330 335
Glu Glu Ser Glu Lys Gln Arg Leu Gly Gly Asp Val Gln Ser Pro Asn
340 345 350
Cys Pro Ser Glu Asp Val Val Val Thr Pro Glu Ser Phe Gly Arg Asp
355 360 365
Ser Ser Leu Thr Cys Leu Ala Gly Asn Val Ser Ala Cys Asp Ala Pro
370 375 380
Ile Leu Ser Ser Ser Arg Ser Leu Asp Cys Arg Glu Ser Gly Lys Asn
385 390 395 400
Gly Pro His Val Tyr Gln Asp Leu Leu Leu Ser Leu Gly Thr Thr Asn
405 410 415
Ser Thr Leu Pro Pro Pro Phe Ser Leu Gln Ser Gly Ile Leu Thr Leu
420 425 430
Asn Pro Val Ala Gln Gly Gln Pro Ile Leu Thr Ser Leu Gly Ser Asn
435 440 445
Gln Glu Glu Ala Tyr Val Thr Met Ser Ser Phe Tyr Gln Asn Gln
450 455 460
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<211> 462
<212> PRT
<213> 智人
<400> 103
Met Thr Ile Leu Gly Thr Thr Phe Gly Met Val Phe Ser Leu Leu Gln
1 5 10 15
Val Val Ser Gly Glu Ser Gly Tyr Ala Gln Asn Gly Asp Leu Glu Asp
20 25 30
Ala Glu Leu Asp Asp Tyr Ser Phe Ser Cys Tyr Ser Gln Leu Glu Val
35 40 45
Asn Gly Ser Gln His Ser Leu Thr Cys Ala Phe Glu Asp Pro Asp Val
50 55 60
Asn Thr Thr Asn Leu Glu Phe Glu Ile Cys Gly Ala Leu Val Glu Val
65 70 75 80
Lys Cys Leu Asn Phe Arg Lys Leu Gln Glu Ile Tyr Phe Ile Glu Thr
85 90 95
Lys Lys Phe Leu Leu Ile Gly Lys Ser Asn Ile Cys Val Lys Val Gly
100 105 110
Glu Lys Ser Leu Thr Cys Lys Lys Ile Asp Leu Thr Thr Ile Val Lys
115 120 125
Pro Glu Ala Pro Phe Asp Leu Ser Val Ile Tyr Arg Glu Gly Ala Asn
130 135 140
Asp Phe Val Val Thr Phe Asn Thr Ser His Leu Gln Lys Lys Tyr Val
145 150 155 160
Lys Val Leu Met His Asp Val Ala Tyr Arg Gln Glu Lys Asp Glu Asn
165 170 175
Lys Trp Thr His Val Asn Leu Ser Ser Thr Lys Leu Thr Leu Leu Gln
180 185 190
Arg Lys Leu Gln Pro Ala Ala Met Tyr Glu Ile Lys Val Arg Ser Ile
195 200 205
Pro Asp His Tyr Phe Lys Gly Phe Trp Ser Glu Trp Ser Pro Ser Tyr
210 215 220
Tyr Phe Arg Thr Pro Glu Ile Asn Asn Ser Ser Gly Glu Met Asp Pro
225 230 235 240
Ile Leu Leu Thr Cys His Leu Ile Ser Ile Leu Ser Phe Phe Ser Val
245 250 255
Ala Leu Leu Val Ile Leu Ala Cys Val Leu Trp Lys Lys Arg Ile Lys
260 265 270
Pro Ile Val Trp Pro Ser Leu Pro Asp His Lys Lys Thr Leu Glu His
275 280 285
Leu Cys Lys Lys Pro Arg Lys Asn Leu Asn Val Ser Phe Asn Pro Glu
290 295 300
Ser Phe Leu Asp Cys Gln Ile His Arg Val Asp Asp Ile Gln Ala Arg
305 310 315 320
Asp Glu Val Glu Gly Phe Leu Gln Asp Thr Phe Pro Gln Gln Leu Glu
325 330 335
Glu Ser Glu Lys Gln Arg Leu Gly Gly Asp Val Gln Ser Pro Asn Cys
340 345 350
Pro Ser Glu Asp Val Val Val Thr Pro Glu Ser Phe Gly Arg Asp Ser
355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Ala Gly Asn Val Ser Ala Cys Asp Ala Pro Ile
370 375 380
Leu Ser Ser Ser Arg Ser Leu Asp Cys Arg Glu Ser Gly Lys Asn Gly
385 390 395 400
Pro His Val Tyr Gln Asp Leu Leu Leu Ser Leu Gly Thr Thr Asn Ser
405 410 415
Thr Leu Pro Pro Pro Phe Ser Leu Gln Ser Gly Ile Leu Thr Leu Asn
420 425 430
Pro Val Ala Gln Gly Gln Pro Ile Leu Thr Ser Leu Gly Ser Asn Gln
435 440 445
Glu Glu Ala Tyr Val Thr Met Ser Ser Phe Tyr Gln Asn Gln
450 455 460
<210> 104
<211> 466
<212> PRT
<213> 智人
<400> 104
Met Thr Ile Leu Gly Thr Thr Phe Gly Met Val Phe Ser Leu Leu Gln
1 5 10 15
Val Val Ser Gly Glu Ser Gly Tyr Ala Gln Asn Gly Asp Leu Glu Asp
20 25 30
Ala Glu Leu Asp Asp Tyr Ser Phe Ser Cys Tyr Ser Gln Leu Glu Val
35 40 45
Asn Gly Ser Gln His Ser Leu Thr Cys Ala Phe Glu Asp Pro Asp Val
50 55 60
Asn Thr Thr Asn Leu Glu Phe Glu Ile Cys Gly Ala Leu Val Glu Val
65 70 75 80
Lys Cys Leu Asn Phe Arg Lys Leu Gln Glu Ile Tyr Phe Ile Glu Thr
85 90 95
Lys Lys Phe Leu Leu Ile Gly Lys Ser Asn Ile Cys Val Lys Val Gly
100 105 110
Glu Lys Ser Leu Thr Cys Lys Lys Ile Asp Leu Thr Thr Ile Val Lys
115 120 125
Pro Glu Ala Pro Phe Asp Leu Ser Val Ile Tyr Arg Glu Gly Ala Asn
130 135 140
Asp Phe Val Val Thr Phe Asn Thr Ser His Leu Gln Lys Lys Tyr Val
145 150 155 160
Lys Val Leu Met His Asp Val Ala Tyr Arg Gln Glu Lys Asp Glu Asn
165 170 175
Lys Trp Thr His Val Asn Leu Ser Ser Thr Lys Leu Thr Leu Leu Gln
180 185 190
Arg Lys Leu Gln Pro Ala Ala Met Tyr Glu Ile Lys Val Arg Ser Ile
195 200 205
Pro Asp His Tyr Phe Lys Gly Phe Trp Ser Glu Trp Ser Pro Ser Tyr
210 215 220
Tyr Phe Arg Thr Pro Glu Ile Asn Asn Ser Ser Gly Glu Met Asp Pro
225 230 235 240
Ile Leu Leu Thr Pro Pro Val Cys Ser Val Thr Ile Ser Ile Leu Ser
245 250 255
Phe Phe Ser Val Ala Leu Leu Val Ile Leu Ala Cys Val Leu Trp Lys
260 265 270
Lys Arg Ile Lys Pro Ile Val Trp Pro Ser Leu Pro Asp His Lys Lys
275 280 285
Thr Leu Glu His Leu Cys Lys Lys Pro Arg Lys Asn Leu Asn Val Ser
290 295 300
Phe Asn Pro Glu Ser Phe Leu Asp Cys Gln Ile His Arg Val Asp Asp
305 310 315 320
Ile Gln Ala Arg Asp Glu Val Glu Gly Phe Leu Gln Asp Thr Phe Pro
325 330 335
Gln Gln Leu Glu Glu Ser Glu Lys Gln Arg Leu Gly Gly Asp Val Gln
340 345 350
Ser Pro Asn Cys Pro Ser Glu Asp Val Val Val Thr Pro Glu Ser Phe
355 360 365
Gly Arg Asp Ser Ser Leu Thr Cys Leu Ala Gly Asn Val Ser Ala Cys
370 375 380
Asp Ala Pro Ile Leu Ser Ser Ser Arg Ser Leu Asp Cys Arg Glu Ser
385 390 395 400
Gly Lys Asn Gly Pro His Val Tyr Gln Asp Leu Leu Leu Ser Leu Gly
405 410 415
Thr Thr Asn Ser Thr Leu Pro Pro Pro Phe Ser Leu Gln Ser Gly Ile
420 425 430
Leu Thr Leu Asn Pro Val Ala Gln Gly Gln Pro Ile Leu Thr Ser Leu
435 440 445
Gly Ser Asn Gln Glu Glu Ala Tyr Val Thr Met Ser Ser Phe Tyr Gln
450 455 460
Asn Gln
465
<210> 105
<211> 523
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成Fc-Δ-30
<400> 105
Met Ser Ile Met Gly Leu Lys Val Asn Val Ser Ala Ile Phe Met Ala
1 5 10 15
Val Leu Leu Thr Leu Gln Thr Pro Thr Gly Gln Ile His Trp Gly Asn
20 25 30
Leu Ser Lys Ile Gly Val Val Gly Ile Gly Ser Ala Ser Tyr Lys Val
35 40 45
Met Thr Arg Ser Ser His Gln Ser Leu Val Ile Lys Leu Met Pro Asn
50 55 60
Ile Thr Leu Leu Asn Asn Cys Thr Arg Val Glu Ile Ala Glu Tyr Arg
65 70 75 80
Arg Leu Leu Arg Thr Val Leu Glu Pro Ile Arg Asp Ala Leu Asn Ala
85 90 95
Met Thr Gln Asn Ile Arg Pro Val Gln Ser Val Ala Ser Ser Arg Arg
100 105 110
His Lys Arg Phe Ala Gly Val Val Leu Ala Gly Ala Ala Leu Gly Val
115 120 125
Ala Thr Ala Ala Gln Ile Thr Ala Gly Ile Ala Leu His Gln Ser Met
130 135 140
Leu Asn Ser Gln Ala Ile Asp Asn Leu Arg Ala Ser Leu Glu Thr Thr
145 150 155 160
Asn Gln Ala Ile Glu Ala Ile Arg Gln Ala Gly Gln Glu Met Ile Leu
165 170 175
Ala Val Gln Gly Val Gln Asp Tyr Ile Asn Asn Glu Leu Ile Pro Ser
180 185 190
Met Asn Gln Leu Ser Cys Asp Leu Ile Gly Gln Lys Leu Gly Leu Lys
195 200 205
Leu Leu Arg Tyr Tyr Thr Glu Ile Leu Ser Leu Phe Gly Pro Ser Leu
210 215 220
Arg Asp Pro Ile Ser Ala Glu Ile Ser Ile Gln Ala Leu Ser Tyr Ala
225 230 235 240
Leu Gly Gly Asp Ile Asn Lys Val Leu Glu Lys Leu Gly Tyr Ser Gly
245 250 255
Gly Asp Leu Leu Gly Ile Leu Glu Ser Arg Gly Ile Lys Ala Arg Ile
260 265 270
Thr His Val Asp Thr Glu Ser Tyr Phe Ile Val Leu Ser Ile Ala Tyr
275 280 285
Pro Thr Leu Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Leu Glu Gly
290 295 300
Val Ser Tyr Asn Ile Gly Ser Gln Glu Trp Tyr Thr Thr Val Pro Lys
305 310 315 320
Tyr Val Ala Thr Gln Gly Tyr Leu Ile Ser Asn Phe Asp Glu Ser Ser
325 330 335
Cys Thr Phe Met Pro Glu Gly Thr Val Cys Ser Gln Asn Ala Leu Tyr
340 345 350
Pro Met Ser Pro Leu Leu Gln Glu Cys Leu Arg Gly Ser Thr Lys Ser
355 360 365
Cys Ala Arg Thr Leu Val Ser Gly Ser Phe Gly Asn Arg Phe Ile Leu
370 375 380
Ser Gln Gly Asn Leu Ile Ala Asn Cys Ala Ser Ile Leu Cys Lys Cys
385 390 395 400
Tyr Thr Thr Gly Thr Ile Ile Asn Gln Asp Pro Asp Lys Ile Leu Thr
405 410 415
Tyr Ile Ala Ala Asp His Cys Pro Val Val Glu Val Asn Gly Val Thr
420 425 430
Ile Gln Val Gly Ser Arg Arg Tyr Pro Asp Ala Val Tyr Leu His Arg
435 440 445
Ile Asp Leu Gly Pro Pro Ile Ser Leu Glu Arg Leu Asp Val Gly Thr
450 455 460
Asn Leu Gly Asn Ala Ile Ala Lys Leu Glu Asp Ala Lys Glu Leu Leu
465 470 475 480
Glu Ser Ser Asp Gln Ile Leu Arg Ser Met Lys Gly Leu Ser Ser Thr
485 490 495
Ser Ile Val Tyr Ile Leu Ile Ala Val Cys Leu Gly Gly Leu Ile Gly
500 505 510
Ile Pro Ala Leu Ile Cys Cys Cys Arg Gly Arg
515 520
<210> 106
<211> 599
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成Hc-Δ-18
<400> 106
Met Gly Ser Arg Ile Val Ile Asn Arg Glu His Leu Met Ile Asp Arg
1 5 10 15
Pro Tyr Val Leu Leu Ala Val Leu Phe Val Met Ser Leu Ser Leu Ile
20 25 30
Gly Leu Leu Ala Ile Ala Gly Ile Arg Leu His Arg Ala Ala Ile Tyr
35 40 45
Thr Ala Glu Ile His Lys Ser Leu Ser Thr Asn Leu Asp Val Thr Asn
50 55 60
Ser Ile Glu His Gln Val Lys Asp Val Leu Thr Pro Leu Phe Lys Ile
65 70 75 80
Ile Gly Asp Glu Val Gly Leu Arg Thr Pro Gln Arg Phe Thr Asp Leu
85 90 95
Val Lys Phe Ile Ser Asp Lys Ile Lys Phe Leu Asn Pro Asp Arg Glu
100 105 110
Tyr Asp Phe Arg Asp Leu Thr Trp Cys Ile Asn Pro Pro Glu Arg Ile
115 120 125
Lys Leu Asp Tyr Asp Gln Tyr Cys Ala Asp Val Ala Ala Glu Glu Leu
130 135 140
Met Asn Ala Leu Val Asn Ser Thr Leu Leu Glu Thr Arg Thr Thr Asn
145 150 155 160
Gln Phe Leu Ala Val Ser Lys Gly Asn Cys Ser Gly Pro Thr Thr Ile
165 170 175
Arg Gly Gln Phe Ser Asn Met Ser Leu Ser Leu Leu Asp Leu Tyr Leu
180 185 190
Ser Arg Gly Tyr Asn Val Ser Ser Ile Val Thr Met Thr Ser Gln Gly
195 200 205
Met Tyr Gly Gly Thr Tyr Leu Val Glu Lys Pro Asn Leu Ser Ser Lys
210 215 220
Arg Ser Glu Leu Ser Gln Leu Ser Met Tyr Arg Val Phe Glu Val Gly
225 230 235 240
Val Ile Arg Asn Pro Gly Leu Gly Ala Pro Val Phe His Met Thr Asn
245 250 255
Tyr Leu Glu Gln Pro Val Ser Asn Asp Leu Ser Asn Cys Met Val Ala
260 265 270
Leu Gly Glu Leu Lys Leu Ala Ala Leu Cys His Gly Glu Asp Ser Ile
275 280 285
Thr Ile Pro Tyr Gln Gly Ser Gly Lys Gly Val Ser Phe Gln Leu Val
290 295 300
Lys Leu Gly Val Trp Lys Ser Pro Thr Asp Met Gln Ser Trp Val Pro
305 310 315 320
Leu Ser Thr Asp Asp Pro Val Ile Asp Arg Leu Tyr Leu Ser Ser His
325 330 335
Arg Gly Val Ile Ala Asp Asn Gln Ala Lys Trp Ala Val Pro Thr Thr
340 345 350
Arg Thr Asp Asp Lys Leu Arg Met Glu Thr Cys Phe Gln Gln Ala Cys
355 360 365
Lys Gly Lys Ile Gln Ala Leu Cys Glu Asn Pro Glu Trp Ala Pro Leu
370 375 380
Lys Asp Asn Arg Ile Pro Ser Tyr Gly Val Leu Ser Val Asp Leu Ser
385 390 395 400
Leu Thr Val Glu Leu Lys Ile Lys Ile Ala Ser Gly Phe Gly Pro Leu
405 410 415
Ile Thr His Gly Ser Gly Met Asp Leu Tyr Lys Ser Asn His Asn Asn
420 425 430
Val Tyr Trp Leu Thr Ile Pro Pro Met Lys Asn Leu Ala Leu Gly Val
435 440 445
Ile Asn Thr Leu Glu Trp Ile Pro Arg Phe Lys Val Ser Pro Asn Leu
450 455 460
Phe Thr Val Pro Ile Lys Glu Ala Gly Glu Asp Cys His Ala Pro Thr
465 470 475 480
Tyr Leu Pro Ala Glu Val Asp Gly Asp Val Lys Leu Ser Ser Asn Leu
485 490 495
Val Ile Leu Pro Gly Gln Asp Leu Gln Tyr Val Leu Ala Thr Tyr Asp
500 505 510
Thr Ser Arg Val Glu His Ala Val Val Tyr Tyr Val Tyr Ser Pro Gly
515 520 525
Arg Ser Phe Ser Tyr Phe Tyr Pro Phe Arg Leu Pro Ile Lys Gly Val
530 535 540
Pro Ile Glu Leu Gln Val Glu Cys Phe Thr Trp Asp Gln Lys Leu Trp
545 550 555 560
Cys Arg His Phe Cys Val Leu Ala Asp Ser Glu Ser Gly Gly His Ile
565 570 575
Thr His Ser Gly Met Val Gly Met Gly Val Ser Cys Thr Val Thr Arg
580 585 590
Glu Asp Gly Thr Asn Arg Arg
595
<210> 107
<211> 529
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DAFss-IL7-DAF融合
<400> 107
Met Thr Val Ala Arg Pro Ser Val Pro Ala Ala Leu Pro Leu Leu Gly
1 5 10 15
Glu Leu Pro Arg Leu Leu Leu Leu Val Leu Leu Cys Leu Pro Ala Asp
20 25 30
Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu Met
35 40 45
Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser Asn
50 55 60
Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp Ala
65 70 75 80
Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg Gln
85 90 95
Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu Lys
100 105 110
Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val Lys
115 120 125
Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser Leu
130 135 140
Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu Cys
145 150 155 160
Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile
165 170 175
Leu Met Gly Thr Lys Glu His Cys Gly Leu Pro Pro Asp Val Pro Asn
180 185 190
Ala Gln Pro Ala Leu Glu Gly Arg Thr Ser Phe Pro Glu Asp Thr Val
195 200 205
Ile Thr Tyr Lys Cys Glu Glu Ser Phe Val Lys Ile Pro Gly Glu Lys
210 215 220
Asp Ser Val Ile Cys Leu Lys Gly Ser Gln Trp Ser Asp Ile Glu Glu
225 230 235 240
Phe Cys Asn Arg Ser Cys Glu Val Pro Thr Arg Leu Asn Ser Ala Ser
245 250 255
Leu Lys Gln Pro Tyr Ile Thr Gln Asn Tyr Phe Pro Val Gly Thr Val
260 265 270
Val Glu Tyr Glu Cys Arg Pro Gly Tyr Arg Arg Glu Pro Ser Leu Ser
275 280 285
Pro Lys Leu Thr Cys Leu Gln Asn Leu Lys Trp Ser Thr Ala Val Glu
290 295 300
Phe Cys Lys Lys Lys Ser Cys Pro Asn Pro Gly Glu Ile Arg Asn Gly
305 310 315 320
Gln Ile Asp Val Pro Gly Gly Ile Leu Phe Gly Ala Thr Ile Ser Phe
325 330 335
Ser Cys Asn Thr Gly Tyr Lys Leu Phe Gly Ser Thr Ser Ser Phe Cys
340 345 350
Leu Ile Ser Gly Ser Ser Val Gln Trp Ser Asp Pro Leu Pro Glu Cys
355 360 365
Arg Glu Ile Tyr Cys Pro Ala Pro Pro Gln Ile Asp Asn Gly Ile Ile
370 375 380
Gln Gly Glu Arg Asp His Tyr Gly Tyr Arg Gln Ser Val Thr Tyr Ala
385 390 395 400
Cys Asn Lys Gly Phe Thr Met Ile Gly Glu His Ser Ile Tyr Cys Thr
405 410 415
Val Asn Asn Asp Glu Gly Glu Trp Ser Gly Pro Pro Pro Glu Cys Arg
420 425 430
Gly Lys Ser Leu Thr Ser Lys Val Pro Pro Thr Val Gln Lys Pro Thr
435 440 445
Thr Val Asn Val Pro Thr Thr Glu Val Ser Pro Thr Ser Gln Lys Thr
450 455 460
Thr Thr Lys Thr Thr Thr Pro Asn Ala Gln Ala Thr Arg Ser Thr Pro
465 470 475 480
Val Ser Arg Thr Thr Lys His Phe His Glu Thr Thr Pro Asn Lys Gly
485 490 495
Ser Gly Thr Thr Ser Gly Thr Thr Arg Leu Leu Ser Gly His Thr Cys
500 505 510
Phe Thr Leu Thr Gly Leu Leu Gly Thr Leu Val Thr Met Gly Leu Leu
515 520 525
Thr
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<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成582-1
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acagcttagc gtaatggcta ctgacgccgt ccaaacctat ttacagact 49
<210> 109
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成582-2
<400> 109
acagcttagg ataatggcta ctgacgccgt ccaaacctat ttacagact 49
<210> 110
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成582-3
<400> 110
acagcttagc ataatggcta ctgacgccgt ccaaacctat tcacagact 49
<210> 111
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成582-4
<400> 111
acagcttagc ataatggcta ctgacgccgt ccaaacctat tgacagact 49
<210> 112
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成582-5
<400> 112
acagcatagc ataatggcta ctgacgccgt ccaaacctat ttacagact 49
<210> 113
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 113
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<211> 48
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<213> 人工序列
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acagcttagc ttaatggcta ctgacgccgt ccaaacctat ttacagact 49
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acagcttagc ataatggata ctgacgccgt ccaaacctat ttacagact 49
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acagcttagc attgtggcta ctgacgccgt ccaaacctat ttacagact 49
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<212> DNA
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<212> DNA
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<400> 128
acagcttacc ttaatggcta ctgacgccgt ccaaacctat ttacagact 49
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<212> DNA
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<212> DNA
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acagcttagc ataatggcta ctgacgccgt ccaaactcat ttacagact 49
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<212> DNA
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acagcgtagc atagtggcta ctgacgccgt ccaaacctat ttacagact 49
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<212> DNA
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acagcttagt gtaatggcta ctgacgctgt ccaaacctat ttacagact 49
<210> 143
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<212> DNA
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acagcttagc ataatggcta ctgacggcgt tcaaacctat ttacagact 49
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<211> 49
<212> DNA
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acaggttagc ataatggcta ctgacgccgt ccaaacctat ttatagact 49
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<212> DNA
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acagcttagc ataatggcta ctgacgccgt ccaaacctat tgtcgact 48
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<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
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acagcttagc ataatggcta ctgacgccgt ccaaacctat ttacgact 48
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<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
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acaggtcagc ataatgtgct agtgcgccct caaacctatt tagagact 48
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acaggttagc ataatgtgct attgcgcctt caaacctatt tagagact 48
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<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
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acaggtcagc ataatgtgct agtgcgcatt caaacctatt tagagact 48
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<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
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acaggttagc ataatgtgct agtgcgcctt caaacctatt ttgagact 48
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<211> 48
<212> DNA
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<400> 152
acaggttatc ataatgtgct agtgcgcctt caaacctatt tagagact 48
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<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
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acaggttagc atgatgtgct agtgcgcctt caaacctatt tagagact 48
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<212> DNA
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<212> DNA
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acaggtcagc aaaatgtgca agtgcgcctt caaacctatt tagagact 48
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<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
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acaggtcagc ataatgtgct agtgcgcctt caaacctatc tggagact 48
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<211> 48
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<400> 157
acagcttagc ataatgtgct agtgcgcctt caaacctatt tagagact 48
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<211> 48
<212> DNA
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<400> 158
acaggtcagc ataatgtgct agtgcgcctt caaacctatt tacagact 48
<210> 159
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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acaggtcagc ataatgtgct agtgcgcctt caaacatatt tagagact 48
<210> 160
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
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<400> 160
acagggtagc ataatgtgct agtgcgcctt caaacctatt tagagact 48
<210> 161
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成769-15
<400> 161
acaggttagc ataatgtgct agtgcgccct caaacctatt tagagact 48
<210> 162
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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acaggttagc ataatgtgcc agtgcgcctt caaacctatt tagagact 48
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<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 163
acaggtcagc ataatgggct agtgcgcctt caaacctatt tagagact 48
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<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
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acagcgaagc ataatggcta ctgacgccct caaaccctat ttacagact 49
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<211> 49
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acagcgaagc ataatggctt ctgacgccct caaaccctat ttgcagact 49
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<211> 49
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acagccaagc atactggcta ctgacgccct caaaccctat ttgcagact 49
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acagcgaagc ataatggcta ctgacgcccg caaaccctat ttgcagact 49
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acagcgaagc ataatggcta ctgacggcct caaaccctat ttgcagact 49
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<211> 49
<212> DNA
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<211> 49
<212> DNA
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<223> 合成795-8
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acagcgaagc ataatggcta ctgacgcctt caaaccctat ttgcagact 49
<210> 172
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成795-9
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acagcgaagc ataatggcta cagacgccct caaaacctat ttgcagact 49
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<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成795-10
<400> 173
acagcgaagc ataatggcta ctgacgccct caaaccctat ttgagact 48
<210> 174
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成795-11
<400> 174
acagcgaagc ataatggcta ctgacgccct caaaccctat tgtcgact 48
<210> 175
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成795-12
<400> 175
acagccaagc ataatggcta ctgacgccct caaaccctat ttgcagact 49
<210> 176
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成795-13
<400> 176
acagcgaagc ataatggcta ctgacgccct caaaccctat ttggcgact 49
<210> 177
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成795-14
<400> 177
acagcgaagc ataatgtcta ctgacgccct caaaccctat ttgcagact 49
<210> 178
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成795-15
<400> 178
acagcgaagc ataatggcta ctgacgccgt caaaccctat ttgtagact 49
<210> 179
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成795-16
<400> 179
acagcgaagc ataatggcta ctgacgccct caaaccttat ttgcagact 49
<210> 180
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成795-17
<400> 180
acaggtagca taatggctac tgacgccctc aaaccctatt tgcagact 48
<210> 181
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成795-18
<400> 181
acagcgaagc ataatggcta ctgacgccct caaaccctat ttctagact 49
<210> 182
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成795-19
<400> 182
acagcgaagc ataatggcta ctgacgccct caaaccctat ttgtagact 49
<210> 183
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成935-1
<400> 183
acagggtagc ataatgggct acttgacgcc ttcacctatt tgtagact 48
<210> 184
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成935-2
<400> 184
acagggtagc ataatgggct acttgacgcc ttcacctatt tgagact 47
<210> 185
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成935-3
<400> 185
acagggtagc ataatgggct actttacgcc ttcacctatt tgtagact 48
<210> 186
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成935-4
<400> 186
acagggtagc ataatgggct acttgacgcc ttcacctatt tctagact 48
<210> 187
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成935-5
<400> 187
acagggtagc ataatgggct acttgacgcc ttcacctatt tggagact 48
<210> 188
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成935-6
<400> 188
acagggtagc atagtgggct acttgacgcc ttcacctatt tgtagact 48
<210> 189
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成935-7
<400> 189
acagggtagc atgatgggct acttgacgcc ttcacctatt tgtagact 48
<210> 190
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成935-8
<400> 190
acagggtagc ataatgggct acttgacgcc ttcacctatt agtagact 48
<210> 191
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成935-9
<400> 191
acagggtagc ataatgggct atttgacgcc ttcacctatt tgtagact 48
<210> 192
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成935-10
<400> 192
acagggtagc ataatgggct acttgccgcc ttcacctatt tgtagact 48
<210> 193
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成935-11
<400> 193
acagtgtagc ataattggct acttgacgcc ttcacctatt tgtagact 48
<210> 194
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成935-12
<400> 194
acagggtagc ataatgggct acttgacgct ttcacctttt tgtagact 48
<210> 195
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成935-13
<400> 195
acagggtagc ataaggggct acttgacgcc ttcacctatt tgtagact 48
<210> 196
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成935-14
<400> 196
acagggtagc ataatggact acttgacgcc tccacctatt tgtagact 48
<210> 197
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成935-15
<400> 197
acagggtagc ataatgggct acttgtcgcc ttcacctatt tgtagact 48
<210> 198
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成946-1
<400> 198
acagcgtagc ataatgggct gcagacgccg tcaaacctat ttgcagact 49
<210> 199
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成946-2
<400> 199
acagcgtagc ataatgggct gcagacgcag tcaaacctat ttgcagact 49
<210> 200
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成946-3
<400> 200
acatgtagca taatgggcta ctgacgccgt caaacctatt tgcagact 48
<210> 201
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成946-4
<400> 201
acagcgtagc atagtgggct gcagacgccg tcaaacctat ttgcagact 49
<210> 202
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成946-5
<400> 202
acagtgtagc ataatgggct gcagacgcct tcaaacctat ttggagact 49
<210> 203
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成946-6
<400> 203
acagtgtagc ataatgggct gctgacgccg tcaaacctat ttgaagact 49
<210> 204
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成946-7
<400> 204
acagcgtagc ataatgggct acaggcgccg tcaaacctat ttgcagact 49
<210> 205
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成946-8
<400> 205
acagcgtagc ataatgggct actggcgccg tcaaacctat ttgcagact 49
<210> 206
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成946-9
<400> 206
acagcgtagc ataatgggct gcagacgccg tcaaacctat ttgagact 48
<210> 207
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成946-10
<400> 207
acaggtagca taatgggctg cagacgccgt caaacctatt tgcagact 48
<210> 208
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成946-11
<400> 208
acaggtagca taatgggctg ctgacgccgt caaacctatt tacagact 48
<210> 209
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成946-12
<400> 209
acagcgtagc atattgggct gcagacgccg tcaaacctat ttgcagact 49
<210> 210
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成946-13
<400> 210
acagcgtagc ataatgggct gcagacgcct tcaaacctat ttggagact 49
<210> 211
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成946-14
<400> 211
acagtgtagc ataatgggct gcagacgccg tcaaacctat ttgagact 48
<210> 212
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成946-15
<400> 212
acagcgtagc ataatgggct gctgacgccg tcaaacctat ttggagact 49
<210> 213
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成946-16
<400> 213
acagcgtagc ataatgggct gcagacgccg tcaaacctat ttacagact 49
<210> 214
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成946-17
<400> 214
acagcgtagc ataatgggct gctgacgccg tcaaacctat ttgcagact 49
<210> 215
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成946-18
<400> 215
acagggtagc ataatgggct gcagacgccg tcaaacctat ttggagact 49
<210> 216
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成946-19
<400> 216
acagcgtagc ataatgggct acagacgccg tcaaacctat ttgcagact 49
<210> 217
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成946-20
<400> 217
acagcgtcgc ataatgggct gcagacgccg tcaaatctat ttgcagact 49
<210> 218
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成946-21
<400> 218
acagcgtagc ataatgggct tcagacgccg tcaaacctat ttgcagact 49
<210> 219
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成946-22
<400> 219
acatgtagca taatgggctg cagacgccgt caaacctatt tggagact 48
<210> 220
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成961-1
<400> 220
acaccgtagc ataatgggct actgccgccg tcgacctttt ggagact 47
<210> 221
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成996-1
<400> 221
acagggtagc ataatggctt aggacgcctt caaacctatc aagact 46
<210> 222
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成582家族共有
<220>
<221> 未归类特征
<222> (5)..(5)
<223> 5位的n可以是C，G或无核苷酸
<220>
<221> 未归类特征
<222> (6)..(6)
<223> 6位的n可以是A，C，G，T或无核苷酸
<220>
<221> 未归类特征
<222> (45)..(45)
<223> 45位的n可以是A或无核苷酸
<400> 222
acagnntasb dtwvdksmta cygrsgsbgy yywaamyhat kbhbngact 49
<210> 223
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成769家族共有
<400> 223
acagskyakc awratgkgch aktgcgcmyt caaacmtaty tdsagact 48
<210> 224
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成795家族共有
<220>
<221> 未归类特征
<222> (5)..(5)
<223> 5位的n可以是C或没有核苷酸
<220>
<221> 未归类特征
<222> (40)..(40)
<223> 位置40处的n可以是T或没有核苷酸
<220>
<221> 未归类特征
<222> (44)..(44)
<223> 位置44处的n可以是C，G，T或无核苷酸
<400> 224
acagnswrgc atamtgkctw cwgacgscbk caaamcytan ttvnmgact 49
<210> 225
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成935家族共有
<220>
<221> 未归类特征
<222> (43)..(43)
<223> 43位的n可以是G，T或无核苷酸
<400> 225
acagkgtcgc atrrkkgrct ayttkhcgcy tycacctwtt wsnagact 48
<210> 226
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成946家族共有
<220>
<221> 未归类特征
<222> (4)..(4)
<223> 4位的n可以是G或没有核苷酸
<220>
<221> 未归类特征
<222> (5)..(5)
<223> 5位的n可以是C，G，T或无核苷酸
<220>
<221> 未归类特征
<222> (44)..(44)
<223> 位置44处的n可以是A，C，G或无核苷酸
<400> 226
acanngtmgc atadtgggct dcwgrcgcmk tcaaayctat ttrnagact 49
<210> 227
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Src-Flag-Vpx的合成膜靶向结构域
<400> 227
Met Gly Ser Ser Lys Ser Lys Pro Lys Asp Pro
1 5 10
<210> 228
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成病毒蛋白酶切割结构域
<400> 228
Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala
1 5
<210> 229
<211> 458
<212> PRT
<213> 智人
<400> 229
Met Thr Ile Leu Gly Thr Thr Phe Gly Met Val Phe Ser Leu Leu Gln
1 5 10 15
Val Val Ser Gly Glu Ser Gly Tyr Ala Gln Asn Gly Asp Leu Glu Asp
20 25 30
Ala Glu Leu Asp Asp Tyr Ser Phe Ser Cys Tyr Ser Gln Leu Glu Val
35 40 45
Asn Gly Ser Gln His Ser Leu Thr Cys Ala Phe Glu Asp Pro Asp Val
50 55 60
Asn Ile Thr Asn Leu Glu Phe Glu Ile Cys Gly Ala Leu Val Glu Val
65 70 75 80
Lys Cys Leu Asn Phe Arg Lys Leu Gln Glu Ile Tyr Phe Ile Glu Thr
85 90 95
Lys Lys Phe Leu Leu Ile Gly Lys Ser Asn Ile Cys Val Lys Val Gly
100 105 110
Glu Lys Ser Leu Thr Cys Lys Lys Ile Asp Leu Thr Thr Ile Val Lys
115 120 125
Pro Glu Ala Pro Phe Asp Leu Ser Val Val Tyr Arg Glu Gly Ala Asn
130 135 140
Asp Phe Val Val Thr Phe Asn Thr Ser His Leu Gln Lys Lys Tyr Val
145 150 155 160
Lys Val Leu Met His Asp Val Ala Tyr Arg Gln Glu Lys Asp Glu Asn
165 170 175
Lys Trp Thr His Val Asn Leu Ser Ser Thr Lys Leu Thr Leu Leu Gln
180 185 190
Arg Lys Leu Gln Pro Ala Ala Met Tyr Glu Ile Lys Val Arg Ser Ile
195 200 205
Pro Asp His Tyr Phe Lys Gly Phe Trp Ser Glu Trp Ser Pro Ser Tyr
210 215 220
Tyr Phe Arg Thr Pro Glu Ile Asn Asn Ser Ser Gly Glu Met Asp Pro
225 230 235 240
Ile Leu Leu Thr Ile Ser Ile Leu Ser Phe Phe Ser Val Ala Leu Leu
245 250 255
Val Ile Leu Ala Cys Val Leu Trp Lys Lys Arg Ile Lys Pro Ile Val
260 265 270
Trp Pro Ser Leu Pro Asp His Lys Lys Thr Leu Glu His Leu Cys Lys
275 280 285
Lys Pro Arg Lys Asn Leu Asn Val Ser Phe Asn Pro Glu Ser Phe Leu
290 295 300
Asp Cys Gln Ile His Arg Val Asp Asp Ile Gln Ala Arg Asp Glu Val
305 310 315 320
Glu Gly Phe Leu Gln Asp Thr Phe Pro Gln Gln Leu Glu Glu Ser Glu
325 330 335
Lys Gln Arg Leu Gly Gly Asp Val Gln Ser Pro Asn Cys Pro Ser Glu
340 345 350
Asp Val Val Ile Thr Pro Glu Ser Phe Gly Arg Asp Ser Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Ala Gly Asn Val Ser Ala Cys Asp Ala Pro Ile Leu Ser Ser
370 375 380
Ser Arg Ser Leu Asp Cys Arg Glu Ser Gly Lys Asn Gly Pro His Val
385 390 395 400
Tyr Gln Asp Leu Leu Leu Ser Leu Gly Thr Thr Asn Ser Thr Leu Pro
405 410 415
Pro Pro Phe Ser Leu Gln Ser Gly Ile Leu Thr Leu Asn Pro Val Ala
420 425 430
Gln Gly Gln Pro Ile Leu Thr Ser Leu Gly Ser Asn Gln Glu Glu Ala
435 440 445
Tyr Val Thr Met Ser Ser Phe Tyr Gln Asn
450 455
<210> 230
<211> 723
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成GFP-接头-P2A-IL7Ra IncPPCL密码子(P2A除外)以及剪切优化
<400> 230
Met Ser Gly Gly Glu Glu Leu Phe Ala Gly Ile Val Pro Val Leu Ile
1 5 10 15
Glu Leu Asp Gly Asp Val His Gly His Lys Phe Ser Val Arg Gly Glu
20 25 30
Gly Glu Gly Asp Ala Asp Tyr Gly Lys Leu Glu Ile Lys Phe Ile Cys
35 40 45
Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu
50 55 60
Cys Tyr Gly Ile Gln Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Glu His Met Lys Met
65 70 75 80
Asn Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Ile Gln Glu Arg
85 90 95
Thr Ile Gln Phe Gln Asp Asp Gly Lys Tyr Lys Thr Arg Gly Glu Val
100 105 110
Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Lys
115 120 125
Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Ser
130 135 140
Phe Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Arg Pro Asp Lys Ala Asn Asn Gly
145 150 155 160
Leu Glu Ala Asn Phe Lys Thr Arg His Asn Ile Glu Gly Gly Gly Val
165 170 175
Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Thr Asn Val Pro Leu Gly Asp Gly Pro
180 185 190
Val Leu Ile Pro Ile Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Thr Lys Ile Ser
195 200 205
Lys Asp Arg Asn Glu Ala Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Ser Phe
210 215 220
Ser Ala Cys Cys His Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Arg Gly Ser
225 230 235 240
Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu
245 250 255
Asn Pro Gly Pro Met Thr Ile Leu Gly Thr Thr Phe Gly Met Val Phe
260 265 270
Ser Leu Leu Gln Val Val Ser Gly Glu Ser Gly Tyr Ala Gln Asn Gly
275 280 285
Asp Leu Glu Asp Ala Glu Leu Asp Asp Tyr Ser Phe Ser Cys Tyr Ser
290 295 300
Gln Leu Glu Val Asn Gly Ser Gln His Ser Leu Thr Cys Ala Phe Glu
305 310 315 320
Asp Pro Asp Val Asn Ile Thr Asn Leu Glu Phe Glu Ile Cys Gly Ala
325 330 335
Leu Val Glu Val Lys Cys Leu Asn Phe Arg Lys Leu Gln Glu Ile Tyr
340 345 350
Phe Ile Glu Thr Lys Lys Phe Leu Leu Ile Gly Lys Ser Asn Ile Cys
355 360 365
Val Lys Val Gly Glu Lys Ser Leu Thr Cys Lys Lys Ile Asp Leu Thr
370 375 380
Thr Ile Val Lys Pro Glu Ala Pro Phe Asp Leu Ser Val Val Tyr Arg
385 390 395 400
Glu Gly Ala Asn Asp Phe Val Val Thr Phe Asn Thr Ser His Leu Gln
405 410 415
Lys Lys Tyr Val Lys Val Leu Met His Asp Val Ala Tyr Arg Gln Glu
420 425 430
Lys Asp Glu Asn Lys Trp Thr His Val Asn Leu Ser Ser Thr Lys Leu
435 440 445
Thr Leu Leu Gln Arg Lys Leu Gln Pro Ala Ala Met Tyr Glu Ile Lys
450 455 460
Val Arg Ser Ile Pro Asp His Tyr Phe Lys Gly Phe Trp Ser Glu Trp
465 470 475 480
Ser Pro Ser Tyr Tyr Phe Arg Thr Pro Glu Ile Asn Asn Ser Ser Gly
485 490 495
Glu Met Asp Pro Ile Leu Leu Pro Pro Cys Leu Thr Ile Ser Ile Leu
500 505 510
Ser Phe Phe Ser Val Ala Leu Leu Val Ile Leu Ala Cys Val Leu Trp
515 520 525
Lys Lys Arg Ile Lys Pro Ile Val Trp Pro Ser Leu Pro Asp His Lys
530 535 540
Lys Thr Leu Glu His Leu Cys Lys Lys Pro Arg Lys Asn Leu Asn Val
545 550 555 560
Ser Phe Asn Pro Glu Ser Phe Leu Asp Cys Gln Ile His Arg Val Asp
565 570 575
Asp Ile Gln Ala Arg Asp Glu Val Glu Gly Phe Leu Gln Asp Thr Phe
580 585 590
Pro Gln Gln Leu Glu Glu Ser Glu Lys Gln Arg Leu Gly Gly Asp Val
595 600 605
Gln Ser Pro Asn Cys Pro Ser Glu Asp Val Val Ile Thr Pro Glu Ser
610 615 620
Phe Gly Arg Asp Ser Ser Leu Thr Cys Leu Ala Gly Asn Val Ser Ala
625 630 635 640
Cys Asp Ala Pro Ile Leu Ser Ser Ser Arg Ser Leu Asp Cys Arg Glu
645 650 655
Ser Gly Lys Asn Gly Pro His Val Tyr Gln Asp Leu Leu Leu Ser Leu
660 665 670
Gly Thr Thr Asn Ser Thr Leu Pro Pro Pro Phe Ser Leu Gln Ser Gly
675 680 685
Ile Leu Thr Leu Asn Pro Val Ala Gln Gly Gln Pro Ile Leu Thr Ser
690 695 700
Leu Gly Ser Asn Gln Glu Glu Ala Tyr Val Thr Met Ser Ser Phe Tyr
705 710 715 720
Gln Asn Gln
<210> 231
<211> 733
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成GFP-接头-P2A-Myc标签-IL7Ra IncPPCL内含子(P2A除外)和剪切优化
<400> 231
Met Ser Gly Gly Glu Glu Leu Phe Ala Gly Ile Val Pro Val Leu Ile
1 5 10 15
Glu Leu Asp Gly Asp Val His Gly His Lys Phe Ser Val Arg Gly Glu
20 25 30
Gly Glu Gly Asp Ala Asp Tyr Gly Lys Leu Glu Ile Lys Phe Ile Cys
35 40 45
Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu
50 55 60
Cys Tyr Gly Ile Gln Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Glu His Met Lys Met
65 70 75 80
Asn Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Ile Gln Glu Arg
85 90 95
Thr Ile Gln Phe Gln Asp Asp Gly Lys Tyr Lys Thr Arg Gly Glu Val
100 105 110
Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Lys
115 120 125
Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Ser
130 135 140
Phe Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Arg Pro Asp Lys Ala Asn Asn Gly
145 150 155 160
Leu Glu Ala Asn Phe Lys Thr Arg His Asn Ile Glu Gly Gly Gly Val
165 170 175
Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Thr Asn Val Pro Leu Gly Asp Gly Pro
180 185 190
Val Leu Ile Pro Ile Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Thr Lys Ile Ser
195 200 205
Lys Asp Arg Asn Glu Ala Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Ser Phe
210 215 220
Ser Ala Cys Cys His Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Arg Gly Ser
225 230 235 240
Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu
245 250 255
Asn Pro Gly Pro Met Thr Ile Leu Gly Thr Thr Phe Gly Met Val Phe
260 265 270
Ser Leu Leu Gln Val Val Ser Gly Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu
275 280 285
Asp Leu Glu Ser Gly Tyr Ala Gln Asn Gly Asp Leu Glu Asp Ala Glu
290 295 300
Leu Asp Asp Tyr Ser Phe Ser Cys Tyr Ser Gln Leu Glu Val Asn Gly
305 310 315 320
Ser Gln His Ser Leu Thr Cys Ala Phe Glu Asp Pro Asp Val Asn Ile
325 330 335
Thr Asn Leu Glu Phe Glu Ile Cys Gly Ala Leu Val Glu Val Lys Cys
340 345 350
Leu Asn Phe Arg Lys Leu Gln Glu Ile Tyr Phe Ile Glu Thr Lys Lys
355 360 365
Phe Leu Leu Ile Gly Lys Ser Asn Ile Cys Val Lys Val Gly Glu Lys
370 375 380
Ser Leu Thr Cys Lys Lys Ile Asp Leu Thr Thr Ile Val Lys Pro Glu
385 390 395 400
Ala Pro Phe Asp Leu Ser Val Val Tyr Arg Glu Gly Ala Asn Asp Phe
405 410 415
Val Val Thr Phe Asn Thr Ser His Leu Gln Lys Lys Tyr Val Lys Val
420 425 430
Leu Met His Asp Val Ala Tyr Arg Gln Glu Lys Asp Glu Asn Lys Trp
435 440 445
Thr His Val Asn Leu Ser Ser Thr Lys Leu Thr Leu Leu Gln Arg Lys
450 455 460
Leu Gln Pro Ala Ala Met Tyr Glu Ile Lys Val Arg Ser Ile Pro Asp
465 470 475 480
His Tyr Phe Lys Gly Phe Trp Ser Glu Trp Ser Pro Ser Tyr Tyr Phe
485 490 495
Arg Thr Pro Glu Ile Asn Asn Ser Ser Gly Glu Met Asp Pro Ile Leu
500 505 510
Leu Pro Pro Cys Leu Thr Ile Ser Ile Leu Ser Phe Phe Ser Val Ala
515 520 525
Leu Leu Val Ile Leu Ala Cys Val Leu Trp Lys Lys Arg Ile Lys Pro
530 535 540
Ile Val Trp Pro Ser Leu Pro Asp His Lys Lys Thr Leu Glu His Leu
545 550 555 560
Cys Lys Lys Pro Arg Lys Asn Leu Asn Val Ser Phe Asn Pro Glu Ser
565 570 575
Phe Leu Asp Cys Gln Ile His Arg Val Asp Asp Ile Gln Ala Arg Asp
580 585 590
Glu Val Glu Gly Phe Leu Gln Asp Thr Phe Pro Gln Gln Leu Glu Glu
595 600 605
Ser Glu Lys Gln Arg Leu Gly Gly Asp Val Gln Ser Pro Asn Cys Pro
610 615 620
Ser Glu Asp Val Val Ile Thr Pro Glu Ser Phe Gly Arg Asp Ser Ser
625 630 635 640
Leu Thr Cys Leu Ala Gly Asn Val Ser Ala Cys Asp Ala Pro Ile Leu
645 650 655
Ser Ser Ser Arg Ser Leu Asp Cys Arg Glu Ser Gly Lys Asn Gly Pro
660 665 670
His Val Tyr Gln Asp Leu Leu Leu Ser Leu Gly Thr Thr Asn Ser Thr
675 680 685
Leu Pro Pro Pro Phe Ser Leu Gln Ser Gly Ile Leu Thr Leu Asn Pro
690 695 700
Val Ala Gln Gly Gln Pro Ile Leu Thr Ser Leu Gly Ser Asn Gln Glu
705 710 715 720
Glu Ala Tyr Val Thr Met Ser Ser Phe Tyr Gln Asn Gln
725 730
<210> 232
<211> 572
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成GFP-接头-P2A-IL7RaSP-Myc标签-IL7RaIncPPCL C末端截短密码子(P2A除外)和剪切
<400> 232
Met Ser Gly Gly Glu Glu Leu Phe Ala Gly Ile Val Pro Val Leu Ile
1 5 10 15
Glu Leu Asp Gly Asp Val His Gly His Lys Phe Ser Val Arg Gly Glu
20 25 30
Gly Glu Gly Asp Ala Asp Tyr Gly Lys Leu Glu Ile Lys Phe Ile Cys
35 40 45
Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu
50 55 60
Cys Tyr Gly Ile Gln Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Glu His Met Lys Met
65 70 75 80
Asn Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Ile Gln Glu Arg
85 90 95
Thr Ile Gln Phe Gln Asp Asp Gly Lys Tyr Lys Thr Arg Gly Glu Val
100 105 110
Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Lys
115 120 125
Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Ser
130 135 140
Phe Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Arg Pro Asp Lys Ala Asn Asn Gly
145 150 155 160
Leu Glu Ala Asn Phe Lys Thr Arg His Asn Ile Glu Gly Gly Gly Val
165 170 175
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180 185 190
Val Leu Ile Pro Ile Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Thr Lys Ile Ser
195 200 205
Lys Asp Arg Asn Glu Ala Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Ser Phe
210 215 220
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225 230 235 240
Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu
245 250 255
Asn Pro Gly Pro Met Thr Ile Leu Gly Thr Thr Phe Gly Met Val Phe
260 265 270
Ser Leu Leu Gln Val Val Ser Gly Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu
275 280 285
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290 295 300
Leu Asp Asp Tyr Ser Phe Ser Cys Tyr Ser Gln Leu Glu Val Asn Gly
305 310 315 320
Ser Gln His Ser Leu Thr Cys Ala Phe Glu Asp Pro Asp Val Asn Ile
325 330 335
Thr Asn Leu Glu Phe Glu Ile Cys Gly Ala Leu Val Glu Val Lys Cys
340 345 350
Leu Asn Phe Arg Lys Leu Gln Glu Ile Tyr Phe Ile Glu Thr Lys Lys
355 360 365
Phe Leu Leu Ile Gly Lys Ser Asn Ile Cys Val Lys Val Gly Glu Lys
370 375 380
Ser Leu Thr Cys Lys Lys Ile Asp Leu Thr Thr Ile Val Lys Pro Glu
385 390 395 400
Ala Pro Phe Asp Leu Ser Val Val Tyr Arg Glu Gly Ala Asn Asp Phe
405 410 415
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420 425 430
Leu Met His Asp Val Ala Tyr Arg Gln Glu Lys Asp Glu Asn Lys Trp
435 440 445
Thr His Val Asn Leu Ser Ser Thr Lys Leu Thr Leu Leu Gln Arg Lys
450 455 460
Leu Gln Pro Ala Ala Met Tyr Glu Ile Lys Val Arg Ser Ile Pro Asp
465 470 475 480
His Tyr Phe Lys Gly Phe Trp Ser Glu Trp Ser Pro Ser Tyr Tyr Phe
485 490 495
Arg Thr Pro Glu Ile Asn Asn Ser Ser Gly Glu Met Asp Pro Ile Leu
500 505 510
Leu Pro Pro Cys Leu Thr Ile Ser Ile Leu Ser Phe Phe Ser Val Ala
515 520 525
Leu Leu Val Ile Leu Ala Cys Val Leu Trp Lys Lys Arg Ile Lys Pro
530 535 540
Ile Val Trp Pro Ser Leu Pro Asp His Lys Lys Thr Leu Glu His Leu
545 550 555 560
Cys Lys Lys Pro Arg Lys Val Ser Val Phe Gly Ala
565 570
<210> 233
<211> 562
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成GFP-接头-P2A-IL7RaSP-IL7RaIncPPCL C末端截短密码子(P2A除外)和剪切优化
<400> 233
Met Ser Gly Gly Glu Glu Leu Phe Ala Gly Ile Val Pro Val Leu Ile
1 5 10 15
Glu Leu Asp Gly Asp Val His Gly His Lys Phe Ser Val Arg Gly Glu
20 25 30
Gly Glu Gly Asp Ala Asp Tyr Gly Lys Leu Glu Ile Lys Phe Ile Cys
35 40 45
Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu
50 55 60
Cys Tyr Gly Ile Gln Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Glu His Met Lys Met
65 70 75 80
Asn Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Ile Gln Glu Arg
85 90 95
Thr Ile Gln Phe Gln Asp Asp Gly Lys Tyr Lys Thr Arg Gly Glu Val
100 105 110
Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Lys
115 120 125
Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Ser
130 135 140
Phe Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Arg Pro Asp Lys Ala Asn Asn Gly
145 150 155 160
Leu Glu Ala Asn Phe Lys Thr Arg His Asn Ile Glu Gly Gly Gly Val
165 170 175
Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Thr Asn Val Pro Leu Gly Asp Gly Pro
180 185 190
Val Leu Ile Pro Ile Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Thr Lys Ile Ser
195 200 205
Lys Asp Arg Asn Glu Ala Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Ser Phe
210 215 220
Ser Ala Cys Cys His Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Arg Gly Ser
225 230 235 240
Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu
245 250 255
Asn Pro Gly Pro Met Thr Ile Leu Gly Thr Thr Phe Gly Met Val Phe
260 265 270
Ser Leu Leu Gln Val Val Ser Gly Glu Ser Gly Tyr Ala Gln Asn Gly
275 280 285
Asp Leu Glu Asp Ala Glu Leu Asp Asp Tyr Ser Phe Ser Cys Tyr Ser
290 295 300
Gln Leu Glu Val Asn Gly Ser Gln His Ser Leu Thr Cys Ala Phe Glu
305 310 315 320
Asp Pro Asp Val Asn Ile Thr Asn Leu Glu Phe Glu Ile Cys Gly Ala
325 330 335
Leu Val Glu Val Lys Cys Leu Asn Phe Arg Lys Leu Gln Glu Ile Tyr
340 345 350
Phe Ile Glu Thr Lys Lys Phe Leu Leu Ile Gly Lys Ser Asn Ile Cys
355 360 365
Val Lys Val Gly Glu Lys Ser Leu Thr Cys Lys Lys Ile Asp Leu Thr
370 375 380
Thr Ile Val Lys Pro Glu Ala Pro Phe Asp Leu Ser Val Val Tyr Arg
385 390 395 400
Glu Gly Ala Asn Asp Phe Val Val Thr Phe Asn Thr Ser His Leu Gln
405 410 415
Lys Lys Tyr Val Lys Val Leu Met His Asp Val Ala Tyr Arg Gln Glu
420 425 430
Lys Asp Glu Asn Lys Trp Thr His Val Asn Leu Ser Ser Thr Lys Leu
435 440 445
Thr Leu Leu Gln Arg Lys Leu Gln Pro Ala Ala Met Tyr Glu Ile Lys
450 455 460
Val Arg Ser Ile Pro Asp His Tyr Phe Lys Gly Phe Trp Ser Glu Trp
465 470 475 480
Ser Pro Ser Tyr Tyr Phe Arg Thr Pro Glu Ile Asn Asn Ser Ser Gly
485 490 495
Glu Met Asp Pro Ile Leu Leu Pro Pro Cys Leu Thr Ile Ser Ile Leu
500 505 510
Ser Phe Phe Ser Val Ala Leu Leu Val Ile Leu Ala Cys Val Leu Trp
515 520 525
Lys Lys Arg Ile Lys Pro Ile Val Trp Pro Ser Leu Pro Asp His Lys
530 535 540
Lys Thr Leu Glu His Leu Cys Lys Lys Pro Arg Lys Val Ser Val Phe
545 550 555 560
Gly Ala
<210> 234
<211> 824
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成GFP-接头-P2A-eTag-IL7RaIncPPCL N末端删除密码子(P2A除外)和剪切优化
<400> 234
Met Ser Gly Gly Glu Glu Leu Phe Ala Gly Ile Val Pro Val Leu Ile
1 5 10 15
Glu Leu Asp Gly Asp Val His Gly His Lys Phe Ser Val Arg Gly Glu
20 25 30
Gly Glu Gly Asp Ala Asp Tyr Gly Lys Leu Glu Ile Lys Phe Ile Cys
35 40 45
Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu
50 55 60
Cys Tyr Gly Ile Gln Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Glu His Met Lys Met
65 70 75 80
Asn Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Ile Gln Glu Arg
85 90 95
Thr Ile Gln Phe Gln Asp Asp Gly Lys Tyr Lys Thr Arg Gly Glu Val
100 105 110
Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Lys
115 120 125
Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Ser
130 135 140
Phe Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Arg Pro Asp Lys Ala Asn Asn Gly
145 150 155 160
Leu Glu Ala Asn Phe Lys Thr Arg His Asn Ile Glu Gly Gly Gly Val
165 170 175
Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Thr Asn Val Pro Leu Gly Asp Gly Pro
180 185 190
Val Leu Ile Pro Ile Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Thr Lys Ile Ser
195 200 205
Lys Asp Arg Asn Glu Ala Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Ser Phe
210 215 220
Ser Ala Cys Cys His Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Arg Gly Ser
225 230 235 240
Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu
245 250 255
Asn Pro Gly Pro Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu
260 265 270
Leu Pro His Pro Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys Asn Gly
275 280 285
Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn
290 295 300
Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile
305 310 315 320
Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu
325 330 335
Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly
340 345 350
Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala
355 360 365
Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln
370 375 380
Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg
385 390 395 400
Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys
405 410 415
Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr
420 425 430
Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys
435 440 445
Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys
450 455 460
Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg
465 470 475 480
Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg
485 490 495
Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu
500 505 510
Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys
515 520 525
Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys
530 535 540
Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala
545 550 555 560
Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly
565 570 575
Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Glu Ile
580 585 590
Asn Asn Ser Ser Gly Glu Met Asp Pro Ile Leu Leu Pro Pro Cys Leu
595 600 605
Thr Ile Ser Ile Leu Ser Phe Phe Ser Val Ala Leu Leu Val Ile Leu
610 615 620
Ala Cys Val Leu Trp Lys Lys Arg Ile Lys Pro Ile Val Trp Pro Ser
625 630 635 640
Leu Pro Asp His Lys Lys Thr Leu Glu His Leu Cys Lys Lys Pro Arg
645 650 655
Lys Asn Leu Asn Val Ser Phe Asn Pro Glu Ser Phe Leu Asp Cys Gln
660 665 670
Ile His Arg Val Asp Asp Ile Gln Ala Arg Asp Glu Val Glu Gly Phe
675 680 685
Leu Gln Asp Thr Phe Pro Gln Gln Leu Glu Glu Ser Glu Lys Gln Arg
690 695 700
Leu Gly Gly Asp Val Gln Ser Pro Asn Cys Pro Ser Glu Asp Val Val
705 710 715 720
Ile Thr Pro Glu Ser Phe Gly Arg Asp Ser Ser Leu Thr Cys Leu Ala
725 730 735
Gly Asn Val Ser Ala Cys Asp Ala Pro Ile Leu Ser Ser Ser Arg Ser
740 745 750
Leu Asp Cys Arg Glu Ser Gly Lys Asn Gly Pro His Val Tyr Gln Asp
755 760 765
Leu Leu Leu Ser Leu Gly Thr Thr Asn Ser Thr Leu Pro Pro Pro Phe
770 775 780
Ser Leu Gln Ser Gly Ile Leu Thr Leu Asn Pro Val Ala Gln Gly Gln
785 790 795 800
Pro Ile Leu Thr Ser Leu Gly Ser Asn Gln Glu Glu Ala Tyr Val Thr
805 810 815
Met Ser Ser Phe Tyr Gln Asn Gln
820
<210> 235
<211> 593
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成MV(ed)-HD24
<400> 235
Met Asn Arg Glu His Leu Met Ile Asp Arg Pro Tyr Val Leu Leu Ala
1 5 10 15
Val Leu Phe Val Met Ser Leu Ser Leu Ile Gly Leu Leu Ala Ile Ala
20 25 30
Gly Ile Arg Leu His Arg Ala Ala Ile Tyr Thr Ala Glu Ile His Lys
35 40 45
Ser Leu Ser Thr Asn Leu Asp Val Thr Asn Ser Ile Glu His Gln Val
50 55 60
Lys Asp Val Leu Thr Pro Leu Phe Lys Ile Ile Gly Asp Glu Val Gly
65 70 75 80
Leu Arg Thr Pro Gln Arg Phe Thr Asp Leu Val Lys Phe Ile Ser Asp
85 90 95
Lys Ile Lys Phe Leu Asn Pro Asp Arg Glu Tyr Asp Phe Arg Asp Leu
100 105 110
Thr Trp Cys Ile Asn Pro Pro Glu Arg Ile Lys Leu Asp Tyr Asp Gln
115 120 125
Tyr Cys Ala Asp Val Ala Ala Glu Glu Leu Met Asn Ala Leu Val Asn
130 135 140
Ser Thr Leu Leu Glu Thr Arg Thr Thr Asn Gln Phe Leu Ala Val Ser
145 150 155 160
Lys Gly Asn Cys Ser Gly Pro Thr Thr Ile Arg Gly Gln Phe Ser Asn
165 170 175
Met Ser Leu Ser Leu Leu Asp Leu Tyr Leu Ser Arg Gly Tyr Asn Val
180 185 190
Ser Ser Ile Val Thr Met Thr Ser Gln Gly Met Tyr Gly Gly Thr Tyr
195 200 205
Leu Val Glu Lys Pro Asn Leu Ser Ser Lys Arg Ser Glu Leu Ser Gln
210 215 220
Leu Ser Met Tyr Arg Val Phe Glu Val Gly Val Ile Arg Asn Pro Gly
225 230 235 240
Leu Gly Ala Pro Val Phe His Met Thr Asn Tyr Leu Glu Gln Pro Val
245 250 255
Ser Asn Asp Leu Ser Asn Cys Met Val Ala Leu Gly Glu Leu Lys Leu
260 265 270
Ala Ala Leu Cys His Gly Glu Asp Ser Ile Thr Ile Pro Tyr Gln Gly
275 280 285
Ser Gly Lys Gly Val Ser Phe Gln Leu Val Lys Leu Gly Val Trp Lys
290 295 300
Ser Pro Thr Asp Met Gln Ser Trp Val Pro Leu Ser Thr Asp Asp Pro
305 310 315 320
Val Ile Asp Arg Leu Tyr Leu Ser Ser His Arg Gly Val Ile Ala Asp
325 330 335
Asn Gln Ala Lys Trp Ala Val Pro Thr Thr Arg Thr Asp Asp Lys Leu
340 345 350
Arg Met Glu Thr Cys Phe Gln Gln Ala Cys Lys Gly Lys Ile Gln Ala
355 360 365
Leu Cys Glu Asn Pro Glu Trp Ala Pro Leu Lys Asp Asn Arg Ile Pro
370 375 380
Ser Tyr Gly Val Leu Ser Val Asp Leu Ser Leu Thr Val Glu Leu Lys
385 390 395 400
Ile Lys Ile Ala Ser Gly Phe Gly Pro Leu Ile Thr His Gly Ser Gly
405 410 415
Met Asp Leu Tyr Lys Ser Asn His Asn Asn Val Tyr Trp Leu Thr Ile
420 425 430
Pro Pro Met Lys Asn Leu Ala Leu Gly Val Ile Asn Thr Leu Glu Trp
435 440 445
Ile Pro Arg Phe Lys Val Ser Pro Asn Leu Phe Thr Val Pro Ile Lys
450 455 460
Glu Ala Gly Glu Asp Cys His Ala Pro Thr Tyr Leu Pro Ala Glu Val
465 470 475 480
Asp Gly Asp Val Lys Leu Ser Ser Asn Leu Val Ile Leu Pro Gly Gln
485 490 495
Asp Leu Gln Tyr Val Leu Ala Thr Tyr Asp Thr Ser Arg Val Glu His
500 505 510
Ala Val Val Tyr Tyr Val Tyr Ser Pro Gly Arg Ser Phe Ser Tyr Phe
515 520 525
Tyr Pro Phe Arg Leu Pro Ile Lys Gly Val Pro Ile Glu Leu Gln Val
530 535 540
Glu Cys Phe Thr Trp Asp Gln Lys Leu Trp Cys Arg His Phe Cys Val
545 550 555 560
Leu Ala Asp Ser Glu Ser Gly Gly His Ile Thr His Ser Gly Met Val
565 570 575
Gly Met Gly Val Ser Cys Thr Val Thr Arg Glu Asp Gly Thr Asn Arg
580 585 590
Arg
<210> 236
<211> 1275
<212> DNA
<213> 花中间原体
<400> 236
aaaaaaaata aaatcaatag caaatattaa gatttttaag aaataaaaaa ttaatattaa 60
tttacaactg aatataaaag aaacttatac agggtagcat aatgggctac tgaccccgcc 120
ttcaaaccta tttggagact ataagtgaaa aaccactctt taattattaa agtttctttt 180
tatgtccaaa agacaagaag aaactttttt atttagttga atttataata agagaaaaag 240
aaaggatatt atatggcaaa aataaaaaac caatattaca acgagtctgt ttcgccaatt 300
gaatatgcgc aacaaggatt taaaggaaaa atgcgttcag taaactgaaa cgtagtaaat 360
gatgaaaaag atttagaggt atgaaataga attacacaaa acttctgatt gcctgaaaaa 420
attccagttt caaatgattt aacttcatga agaactttga caccagaatg acaagaatta 480
attacaagaa cttttacagg attaacattg ttagatacaa ttcaagctac tgttggtgat 540
gtggctcaag ttcctaactc attaactgac catgaacaag taatttacac aaactttgca 600
tttatggttg cagttcacgc tagatcatat ggttcaatct tttcaacttt atgttcaagt 660
gaacaaattg aagaggctca tgaatgagtt atcaatacag aaacattaca agaaagagct 720
aaagcattaa ttccttatta tgtgaatgat gaccctttaa agtcaaaagt tgcagctgct 780
ttaatgccag gcttcttatt atatggaggc ttctatttac cattttacct atcagctaga 840
ggtaaattac caaacacttc agatattatt agattaatat taagagataa agttatacat 900
aactactata gtggttataa atatcaaaag aaagttgcta aactttctcc agaaaaacaa 960
gctgaaatga aagaatttgt ttttaaatta ttatatgaat taatagattt agaaaaagct 1020
tatttgaaag aattgtatga ggattttgga ttagctgatg atgctattag atttagtgtt 1080
tacaacgcag gtaaattttt acaaaattta ggttatgatt caccgtttac agaagaagaa 1140
acaagaattg agccagaaat attcacacaa ttatcagcta gagctgatga aaaccatgat 1200
ttcttttcag ggaatggctc atcatatatt atgggagttt cagaagaaac tgaagatgac 1260
gattgggagt tttaa 1275
<210> 237
<211> 64
<212> RNA
<213> 花中间原体
<400> 237
acuuauacag gguagcauaa ugggcuacug accccgccuu caaaccuauu uggagacuau 60
aagu 64
<210> 238
<211> 69
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成脱氧鸟苷核糖开关适体突变
<220>
<221> 未归类特征
<222> (10)..(13)
<223> 位置10-13处的n可以是A，C，G或T
<220>
<221> 未归类特征
<222> (27)..(29)
<223> 位置27-29处的n可以是A，C，G或T
<220>
<221> 未归类特征
<222> (31)..(32)
<223> 位置31-32处的n可以是A，C，G或T
<220>
<221> 未归类特征
<222> (33)..(40)
<223> 33-40位的n可以是A，C，G，T或无核苷酸
<220>
<221> 未归类特征
<222> (44)..(46)
<223> 位置44-46处的n可以是A，C，G或T
<220>
<221> 未归类特征
<222> (57)..(59)
<223> 位置57-59处的n可以是A，C，G或T
<400> 238
acuuauacan nnnagcauaa ugggcunnng nnnnnnnnnn gccnnnaaac cuauuunnng 60
acuauaagu 69
<210> 239
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于筛选的合成寡核苷酸文库
<220>
<221> 未归类特征
<222> (19)..(21)
<223> 位置19-21处的n可以是A，C，G或T
<220>
<221> 未归类特征
<222> (32)..(34)
<223> 位置32-34处的n可以是A，C，G或T
<220>
<221> 未归类特征
<222> (38)..(39)
<223> 位置38-39处的n可以是A，C，G或T
<220>
<221> 未归类特征
<222> (40)..(47)
<223> 位置40-47处的n可以是A，C，G，T或无核苷酸
<220>
<221> 未归类特征
<222> (49)..(51)
<223> 位置49-51处的n可以是A，C，G或T
<220>
<221> 未归类特征
<222> (65)..(68)
<223> 位置65-68处的n可以是A，C，G或T
<400> 239
cgcgcgacac ttatagtcnn naaataggtt tnnnggcnnn nnnnnnncnn nagcccatta 60
tgctnnnntg tataagtgcc gccc 84
<210> 240
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成T7启动子扩增引物
<400> 240
taatacgact cactataggg cggcacttat aca 33
<210> 241
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成反向扩增引物
<400> 241
cgcgcgacac ttatagtc 18
<210> 242
<211> 915
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌
<400> 242
tcaaaagcct ggcggcgcgg tcgtcagact cttttatatc gaatcccctt gaaatacgaa 60
tgatatctaa aaaaacaaaa ttaaagttcg ggaattttta ttttcagcct atgcaagaga 120
ttagaatctt gatataattt attacaatat aataggaaca ctcatataat cgcgtggata 180
tggcacgcaa gtttctaccg ggcaccgtaa atgtccgact atgggtgagc aatggaaccg 240
cacgtgtacg gttttttgtg atatcagcat tgcttgctct ttatttgagc gggcaatgct 300
ttttttattc tcataacgga ggtagacagg atggaagcac tgaaacggaa aatagaggaa 360
gaaggcgtcg tattatctga tcaggtattg aaagtggatt cttttttgaa tcaccaaatt 420
gatccgctgc ttatgcagag aattggtgat gaatttgcgt ctaggtttgc aaaagacggt 480
attaccaaaa ttgtgacaat cgaatcatca ggtatcgctc ccgctgtaat gacgggcttg 540
aagctgggtg tgccagttgt cttcgcgaga aagcataaat cgttaacact caccgacaac 600
ttgctgacag cgtctgttta ttcctttacg aagcaaacag aaagccaaat cgcagtgtct 660
gggacccacc tgtcggatca ggatcatgtg ctgattatcg atgatttttt ggcaaatgga 720
caggcagcgc acgggcttgt gtcgattgtg aagcaagcgg gagcttctat tgcgggaatc 780
ggcattgtta ttgaaaagtc atttcagccg ggaagagatg aacttgtaaa actgggctac 840
cgagtggaat ctttggcaag aattcagtct ttagaagaag gaaaagtgtc cttcgtacag 900
gaggttcatt catga 915
<210> 243
<211> 69
<212> RNA
<213> 枯草芽孢杆菌
<400> 243
cacucauaua aucgcgugga uauggcacgc aaguuucuac cgggcaccgu aaauguccga 60
cuaugggug 69
<210> 244
<211> 74
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成鸟苷xpt核糖开关适体突变
<220>
<221> 未归类特征
<222> (11)..(14)
<223> 位置11-14处的n可以是A，C，G或T
<220>
<221> 未归类特征
<222> (30)..(35)
<223> 位置30-35处的n可以是A，C，G或T
<220>
<221> 未归类特征
<222> (36)..(43)
<223> 位置36-43处的n可以是A，C，G，T或无核苷酸
<220>
<221> 未归类特征
<222> (47)..(49)
<223> 位置47-49处的n可以是A，C，G或T
<220>
<221> 未归类特征
<222> (61)..(63)
<223> 位置61-63处的n可以是A，C，G或T
<400> 244
cacucauaua nnnncgugga uauggcacgn nngnnnnnnn nnnaccnnnu accguaaaug 60
nnngacuaug ggug 74
<210> 245
<211> 89
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于筛选的合成寡核苷酸文库
<220>
<221> 未归类特征
<222> (20)..(22)
<223> 位置20-22处的n可以是A，C，G或T
<220>
<221> 未归类特征
<222> (34)..(36)
<223> 位置34-36处的n可以是A，C，G或T
<220>
<221> 未归类特征
<222> (40)..(41)
<223> 位置40-41处的n可以是A，C，G或T
<220>
<221> 未归类特征
<222> (42)..(49)
<223> 位置42-49处的n可以是A，C，G，T或无核苷酸
<220>
<221> 未归类特征
<222> (51)..(53)
<223> 位置51-53处的n可以是A，C，G或T
<220>
<221> 未归类特征
<222> (69)..(72)
<223> 位置69-72处的n可以是A，C，G或T
<400> 245
cgcgcgacca cccatagtcn nncatttacg gtgnnnggtn nnnnnnnnnc nnncgtgcca 60
tatccacgnn nntatatgag tggccgccc 89
<210> 246
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成T7启动子扩增引物
<400> 246
taatacgact cactataggg cggccactca tata 34
<210> 247
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成反向扩增引物
<400> 247
cgcgcgacca cccatagtc 19
<210> 248
<211> 152
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸1转录RNA
<400> 248
gggcggcacu uauacagggu agcauaaugg gcuacugacg ccuucaaacc uauuuggaga 60
cuauaagugu cgcgcggggc ggcacuuaua caggguagca uaaugggcua cugacgccuu 120
caaaccuauu uggagacuau aagugucgcg cg 152
<210> 249
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸1合成模板
<400> 249
cgcgcgacac ttatagtctc caaataggtt tgaaggcgtc agtagcccat tatgctaccc 60
tgtataagtg ccgccc 76
<210> 250
<211> 79
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸2转录RNA
<400> 250
gggcggcacu uauacagggu agcauaaugg gcuacugacc ccgccuucaa accuauuugg 60
agacuauaag ugucgcgcg 79
<210> 251
<211> 79
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸2合成模板
<400> 251
cgcgcgacac ttatagtctc caaataggtt tgaaggcggg gtcagtagcc cattatgcta 60
ccctgtataa gtgccgccc 79
<210> 252
<211> 560
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DAFss-aCD3scFv(UCHT1)IgG1 Fc-CD14GPI
<400> 252
Met Thr Val Ala Arg Pro Ser Val Pro Ala Ala Leu Pro Leu Leu Gly
1 5 10 15
Glu Leu Pro Arg Leu Leu Leu Leu Val Leu Leu Cys Leu Pro Asp Ile
20 25 30
Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg
35 40 45
Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr Leu Asn
50 55 60
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr
65 70 75 80
Thr Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly
85 90 95
Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp
100 105 110
Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr Phe
115 120 125
Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly
145 150 155 160
Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala
165 170 175
Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala
180 185 190
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly
195 200 205
Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val
210 215 220
Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala
225 230 235 240
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp
245 250 255
Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
260 265 270
Ser Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
275 280 285
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
290 295 300
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
305 310 315 320
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
325 330 335
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
340 345 350
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
355 360 365
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
370 375 380
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
385 390 395 400
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
405 410 415
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
420 425 430
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
435 440 445
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
450 455 460
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
465 470 475 480
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
485 490 495
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Val Asp Asn Leu Thr Leu Asp
500 505 510
Gly Asn Pro Phe Leu Val Pro Gly Thr Ala Leu Pro His Glu Gly Ser
515 520 525
Met Asn Ser Gly Val Val Pro Ala Cys Ala Arg Ser Thr Leu Ser Val
530 535 540
Gly Val Ser Gly Thr Leu Val Leu Leu Gln Gly Ala Arg Gly Phe Ala
545 550 555 560
<210> 253
<211> 276
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DAFss-CD80ECD-CD16GPI
<400> 253
Met Thr Val Ala Arg Pro Ser Val Pro Ala Ala Leu Pro Leu Leu Gly
1 5 10 15
Glu Leu Pro Arg Leu Leu Leu Leu Val Leu Leu Cys Leu Pro Val Ile
20 25 30
His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys Gly His
35 40 45
Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp Gln Lys
50 55 60
Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp Met Asn Ile Trp
65 70 75 80
Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr Asn Asn Leu Ser
85 90 95
Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr Glu Cys
100 105 110
Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg Glu His Leu Ala
115 120 125
Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr Pro Ser Ile Ser
130 135 140
Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile Ile Cys Ser Thr
145 150 155 160
Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu Ser Trp Leu Glu Asn Gly Glu
165 170 175
Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp Pro Glu Thr Glu
180 185 190
Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met Thr Thr Asn His
195 200 205
Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg Val Asn Gln Thr
210 215 220
Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro Asp Asn Val Ser
225 230 235 240
Thr Ile Ser Ser Phe Ser Pro Pro Gly Tyr Gln Val Ser Phe Cys Leu
245 250 255
Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly Leu Tyr Phe Ser Val
260 265 270
Lys Thr Asn Ile
275
<210> 254
<211> 533
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DAFss-IL7-DAF
<400> 254
Met Ala Thr Thr Met Thr Val Ala Arg Pro Ser Val Pro Ala Ala Leu
1 5 10 15
Pro Leu Leu Gly Glu Leu Pro Arg Leu Leu Leu Leu Val Leu Leu Cys
20 25 30
Leu Pro Ala Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu
35 40 45
Ser Val Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu
50 55 60
Ile Gly Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His
65 70 75 80
Ile Cys Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg
85 90 95
Lys Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu
100 105 110
His Leu Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr
115 120 125
Gly Gln Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro
130 135 140
Thr Lys Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu
145 150 155 160
Asn Asp Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys
165 170 175
Trp Asn Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His Cys Gly Leu Pro Pro
180 185 190
Asp Val Pro Asn Ala Gln Pro Ala Leu Glu Gly Arg Thr Ser Phe Pro
195 200 205
Glu Asp Thr Val Ile Thr Tyr Lys Cys Glu Glu Ser Phe Val Lys Ile
210 215 220
Pro Gly Glu Lys Asp Ser Val Ile Cys Leu Lys Gly Ser Gln Trp Ser
225 230 235 240
Asp Ile Glu Glu Phe Cys Asn Arg Ser Cys Glu Val Pro Thr Arg Leu
245 250 255
Asn Ser Ala Ser Leu Lys Gln Pro Tyr Ile Thr Gln Asn Tyr Phe Pro
260 265 270
Val Gly Thr Val Val Glu Tyr Glu Cys Arg Pro Gly Tyr Arg Arg Glu
275 280 285
Pro Ser Leu Ser Pro Lys Leu Thr Cys Leu Gln Asn Leu Lys Trp Ser
290 295 300
Thr Ala Val Glu Phe Cys Lys Lys Lys Ser Cys Pro Asn Pro Gly Glu
305 310 315 320
Ile Arg Asn Gly Gln Ile Asp Val Pro Gly Gly Ile Leu Phe Gly Ala
325 330 335
Thr Ile Ser Phe Ser Cys Asn Thr Gly Tyr Lys Leu Phe Gly Ser Thr
340 345 350
Ser Ser Phe Cys Leu Ile Ser Gly Ser Ser Val Gln Trp Ser Asp Pro
355 360 365
Leu Pro Glu Cys Arg Glu Ile Tyr Cys Pro Ala Pro Pro Gln Ile Asp
370 375 380
Asn Gly Ile Ile Gln Gly Glu Arg Asp His Tyr Gly Tyr Arg Gln Ser
385 390 395 400
Val Thr Tyr Ala Cys Asn Lys Gly Phe Thr Met Ile Gly Glu His Ser
405 410 415
Ile Tyr Cys Thr Val Asn Asn Asp Glu Gly Glu Trp Ser Gly Pro Pro
420 425 430
Pro Glu Cys Arg Gly Lys Ser Leu Thr Ser Lys Val Pro Pro Thr Val
435 440 445
Gln Lys Pro Thr Thr Val Asn Val Pro Thr Thr Glu Val Ser Pro Thr
450 455 460
Ser Gln Lys Thr Thr Thr Lys Thr Thr Thr Pro Asn Ala Gln Ala Thr
465 470 475 480
Arg Ser Thr Pro Val Ser Arg Thr Thr Lys His Phe His Glu Thr Thr
485 490 495
Pro Asn Lys Gly Ser Gly Thr Thr Ser Gly Thr Thr Arg Leu Leu Ser
500 505 510
Gly His Thr Cys Phe Thr Leu Thr Gly Leu Leu Gly Thr Leu Val Thr
515 520 525
Met Gly Leu Leu Thr
530
<210> 255
<211> 1823
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有miRs的合成EF-1a启动子
<400> 255
ggctccggtg cccgtcagtg ggcagagcgc acatcgccca cagtccccga gaagttgggg 60
ggaggggtcg gcaattgaac cggtgcctag agaaggtggc gcggggtaaa ctgggaaagt 120
gatgtcgtgt actggctccg cctttttccc gagggtgggg gagaaccgta tataagtgca 180
gtagtcgccg tgaacgttct ttttcgcaac gggtttgccg ccagaacaca ggtaagtgcc 240
gtgtgtggtt cccgcgggcc tggcctcttt acgggttatg gcccttgcgt gccttgaatt 300
acttccacct ggctgcagta cgtgattctt gatcccgagc ttcgggttgg aagtgggtgg 360
gagagttcga ggccttgcgc ttaaggagcc ccttcgcctc gtgcttgagt tgaggcctgg 420
cctgggcgct ggggccgccg cgtgcgaatc tggtggcacc ttcgcgcctg tctcgctgct 480
ttcgataagt ctctagccat ttaaaatttt tgatgacctg ctgcgacgct ttttttctgg 540
caagatagtc ttgtaaatgc gggccaagat ctgcacactg gtatttcggt ttttggggcc 600
gcgggcggcg acggggcccg tgcgtcccag cgcacatgtt cggcgaggcg gggcctgcga 660
gcgcggccac cgagaatcgg acgggggtag tctcaagctg gccggcctgc tctggtgcct 720
ggcctcgcgc cgccgtgtat cgccccgccc tgggcggcaa ggctggcccg gtcggcacca 780
gttgcgtgag cggaaagatg gccgcttccc ggccctgctg cagggagctc aaaatggagg 840
acgcggcgct cgggagagcg ggcgggtgag tcacccacac aaaggaaaag ggcctttccg 900
tcctcagccg tcgcttcatg tgactccact gagtaccggg cgccgtccag gcacctcgat 960
tagttcctgg aggcttgctg aaggctgtat gctgacatgg tacagttcaa tggtggtttt 1020
ggccactgac tgaccaccat tgctgtacca tgtcaggaca caaggcctgt tactagcact 1080
cacatggaac aaatggccca cattggtgcc ggatgaagct cttatgttgc acggtcatct 1140
ggaggcttgc tgaaggctgt atgctgtcag tctgttcatc ttctggcgtt ttggccactg 1200
actgacgcca gaaggaacag actgacagga cacaaggcct gttactagca ctcacatgga 1260
acaaatggcc gttgccggag tcttggcagc gagagatcac tatcaactaa ctggaggctt 1320
gctgaaggct gtatgctgaa gcgtgaagtg aatcaacggg ttttggccac tgactgaccc 1380
gttgatactt cacgcttcag gacacaaggc ctgttactag cactcacatg gaacaaatgg 1440
ccgtgttaat tgtccatgta gcgaggcatc cttatggcgt ggctggaggc ttgctgaagg 1500
ctgtatgctg gcagtatcct agtacattga cgttttggcc actgactgac gtcaatgtta 1560
ggatactgcc aggacacaag gcctgttact agcactcaca tggaacaaat ggccgctttt 1620
ggagtacgtc gtctttaggt tggggggagg ggttttatgc gatggagttt ccccacactg 1680
agtgggtgga gactgaagtt aggccagctt ggcacttgat gtaattctcc ttggaatttg 1740
ccctttttga gtttggatct tggttcattc tcaagcctca gacagtggtt caaagttttt 1800
ttcttccatt tcaggtgtcg tga 1823
<210> 256
<211> 28
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 256
ctggaggctt gctgaaggct gtatgctg 28
<210> 257
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码MiRNA茎的合成DNA
<400> 257
acatggtaca gttcaatggt g 21
<210> 258
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码环的合成DNA
<400> 258
gttttggcca ctgactgac 19
<210> 259
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码茎的合成DNA
<400> 259
caccattgct gtaccatgt 19
<210> 260
<211> 45
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 260
caggacacaa ggcctgttac tagcactcac atggaacaaa tggcc 45
<210> 261
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码MiRNA茎的合成DNA
<400> 261
tcagtctgtt catcttctgg c 21
<210> 262
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码MiRNA茎的合成DNA
<400> 262
gccagaagga acagactga 19
<210> 263
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码MiRNA茎的合成DNA
<400> 263
aagcgtgaag tgaatcaacg g 21
<210> 264
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码MiRNA茎的合成DNA
<400> 264
ccgttgatac ttcacgctt 19
<210> 265
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码MiRNA茎的合成DNA
<400> 265
gcagtatcct agtacattga c 21
<210> 266
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码MiRNA茎的合成DNA
<400> 266
gtcaatgtta ggatactgc 19
<210> 267
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码MiRNA茎的合成DNA
<400> 267
atatgtactt ggctggacag c 21
<210> 268
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码MiRNA茎的合成DNA
<400> 268
gctgtccaca agtacatat 19
<210> 269
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码接头的合成DNA
<400> 269
cacattggtg ccggatgaag ctcttatgtt gccggtcat 39
<210> 270
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码MiRNA茎的合成DNA
<400> 270
ctgttaatgc taatcgtgat a 21
<210> 271
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码MiRNA茎的合成DNA
<400> 271
tatcacgatt attaacag 18
<210> 272
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码接头的合成DNA
<400> 272
gttgccggag tcttggcagc gagagatcac tatcaactaa 40
<210> 273
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码MiRNA茎的合成DNA
<400> 273
taccagttta gcacgaagct c 21
<210> 274
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码MiRNA茎的合成DNA
<400> 274
gagcttcgct aaactggta 19
<210> 275
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码接头的合成DNA
<400> 275
gtgttaattg tccatgtagc gaggcatcct tatggcgtgg 40
<210> 276
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码MiRNA茎的合成DNA
<400> 276
tgccgctgaa atccaaggca a 21
<210> 277
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码MiRNA茎的合成DNA
<400> 277
ttgccttgtt tcagcggca 19
<210> 278
<211> 534
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成UCHT1scFvFc-GPI
<400> 278
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Ser Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser
20 25 30
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser
35 40 45
Gln Asp Ile Arg Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
50 55 60
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val
65 70 75 80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr
85 90 95
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
100 105 110
Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
115 120 125
Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
145 150 155 160
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
165 170 175
Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
180 185 190
Ala Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
195 200 205
Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
210 215 220
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
225 230 235 240
Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp
245 250 255
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp
260 265 270
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
275 280 285
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
290 295 300
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
305 310 315 320
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
325 330 335
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
340 345 350
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
355 360 365
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Thr Pro Ile Glu
370 375 380
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
385 390 395 400
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
405 410 415
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
420 425 430
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
435 440 445
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
450 455 460
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
465 470 475 480
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
485 490 495
Gly Pro Asn Lys Gly Ser Gly Thr Thr Ser Gly Thr Thr Arg Leu Leu
500 505 510
Ser Gly His Thr Cys Phe Thr Leu Thr Gly Leu Leu Gly Thr Leu Val
515 520 525
Thr Met Gly Leu Leu Thr
530
<210> 279
<211> 530
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成OKT3scFvFc-GPI
<400> 279
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Ser Gly Ala Arg Cys Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile
20 25 30
Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser
35 40 45
Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser
50 55 60
Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro
65 70 75 80
Ala His Phe Arg Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile
85 90 95
Ser Gly Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp
100 105 110
Ser Ser Asn Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
130 135 140
Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser
145 150 155 160
Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr
165 170 175
Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly
180 185 190
Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
195 200 205
Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met
210 215 220
Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
225 230 235 240
Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
245 250 255
Thr Leu Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
260 265 270
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
275 280 285
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
290 295 300
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
305 310 315 320
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
325 330 335
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
340 345 350
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
355 360 365
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
370 375 380
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
385 390 395 400
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
405 410 415
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
420 425 430
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
435 440 445
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
450 455 460
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
465 470 475 480
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Pro Asn Lys
485 490 495
Gly Ser Gly Thr Thr Ser Gly Thr Thr Arg Leu Leu Ser Gly His Thr
500 505 510
Cys Phe Thr Leu Thr Gly Leu Leu Gly Thr Leu Val Thr Met Gly Leu
515 520 525
Leu Thr
530
<210> 280
<211> 280
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成hCD80-CD16 GPI
<400> 280
Met Gly His Thr Arg Arg Gln Gly Thr Ser Pro Ser Lys Cys Pro Tyr
1 5 10 15
Leu Asn Phe Phe Gln Leu Leu Val Leu Ala Gly Leu Ser His Phe Cys
20 25 30
Ser Gly Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu
35 40 45
Ser Cys Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile
50 55 60
Tyr Trp Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp
65 70 75 80
Met Asn Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr
85 90 95
Asn Asn Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly
100 105 110
Thr Tyr Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg
115 120 125
Glu His Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr
130 135 140
Pro Ser Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile
145 150 155 160
Ile Cys Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu Ser Trp Leu
165 170 175
Glu Asn Gly Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp
180 185 190
Pro Glu Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met
195 200 205
Thr Thr Asn His Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg
210 215 220
Val Asn Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro
225 230 235 240
Asp Asn Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Ser Pro Pro Gly Tyr Gln Val
245 250 255
Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly Leu
260 265 270
Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile
275 280
<210> 281
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成靶标1 MRB VH
<400> 281
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Ser Phe Trp Gly Ala
20 25 30
Thr Met Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Leu Ile Lys Pro Ser Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala His Gly His Tyr Glu Ser Tyr Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 282
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成靶标 1 MRB VL
<400> 282
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Val Ser Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Gln Asp Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Glu His Phe Ser Pro Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 283
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成接头1
<400> 283
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 284
<211> 357
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 含GMCSF多肽α链信号序列（氨基酸1-22）和eTAG（氨基酸23-357）的合成C1对照多肽
<400> 284
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly
20 25 30
Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe
35 40 45
Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala
50 55 60
Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu
65 70 75 80
Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile
85 90 95
Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu
100 105 110
Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala
115 120 125
Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu
130 135 140
Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr
145 150 155 160
Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys
165 170 175
Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly
180 185 190
Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu
195 200 205
Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys
210 215 220
Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu
225 230 235 240
Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met
245 250 255
Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala
260 265 270
His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val
275 280 285
Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His
290 295 300
Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro
305 310 315 320
Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala
325 330 335
Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly
340 345 350
Ile Gly Leu Phe Met
355
<210> 285
<211> 240
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成OKT3 ScFv
<400> 285
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala His Phe Arg Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr
85 90 95
Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn Gly Gly Gly Gly Ser Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser
115 120 125
Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys
130 135 140
Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Lys Gln
145 150 155 160
Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg
165 170 175
Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr
180 185 190
Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr
195 200 205
Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His
210 215 220
Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
225 230 235 240
<210> 286
<211> 532
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DAFss-IL7-DAF融合
<400> 286
Met Thr Val Ala Arg Pro Ser Val Pro Ala Ala Leu Pro Leu Leu Gly
1 5 10 15
Glu Leu Pro Arg Leu Leu Leu Leu Val Leu Leu Cys Leu Pro Ala Val
20 25 30
Trp Gly Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser
35 40 45
Val Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile
50 55 60
Gly Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile
65 70 75 80
Cys Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys
85 90 95
Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His
100 105 110
Leu Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly
115 120 125
Gln Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr
130 135 140
Lys Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn
145 150 155 160
Asp Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp
165 170 175
Asn Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His Cys Gly Leu Pro Pro Asp
180 185 190
Val Pro Asn Ala Gln Pro Ala Leu Glu Gly Arg Thr Ser Phe Pro Glu
195 200 205
Asp Thr Val Ile Thr Tyr Lys Cys Glu Glu Ser Phe Val Lys Ile Pro
210 215 220
Gly Glu Lys Asp Ser Val Ile Cys Leu Lys Gly Ser Gln Trp Ser Asp
225 230 235 240
Ile Glu Glu Phe Cys Asn Arg Ser Cys Glu Val Pro Thr Arg Leu Asn
245 250 255
Ser Ala Ser Leu Lys Gln Pro Tyr Ile Thr Gln Asn Tyr Phe Pro Val
260 265 270
Gly Thr Val Val Glu Tyr Glu Cys Arg Pro Gly Tyr Arg Arg Glu Pro
275 280 285
Ser Leu Ser Pro Lys Leu Thr Cys Leu Gln Asn Leu Lys Trp Ser Thr
290 295 300
Ala Val Glu Phe Cys Lys Lys Lys Ser Cys Pro Asn Pro Gly Glu Ile
305 310 315 320
Arg Asn Gly Gln Ile Asp Val Pro Gly Gly Ile Leu Phe Gly Ala Thr
325 330 335
Ile Ser Phe Ser Cys Asn Thr Gly Tyr Lys Leu Phe Gly Ser Thr Ser
340 345 350
Ser Phe Cys Leu Ile Ser Gly Ser Ser Val Gln Trp Ser Asp Pro Leu
355 360 365
Pro Glu Cys Arg Glu Ile Tyr Cys Pro Ala Pro Pro Gln Ile Asp Asn
370 375 380
Gly Ile Ile Gln Gly Glu Arg Asp His Tyr Gly Tyr Arg Gln Ser Val
385 390 395 400
Thr Tyr Ala Cys Asn Lys Gly Phe Thr Met Ile Gly Glu His Ser Ile
405 410 415
Tyr Cys Thr Val Asn Asn Asp Glu Gly Glu Trp Ser Gly Pro Pro Pro
420 425 430
Glu Cys Arg Gly Lys Ser Leu Thr Ser Lys Val Pro Pro Thr Val Gln
435 440 445
Lys Pro Thr Thr Val Asn Val Pro Thr Thr Glu Val Ser Pro Thr Ser
450 455 460
Gln Lys Thr Thr Thr Lys Thr Thr Thr Pro Asn Ala Gln Ala Thr Arg
465 470 475 480
Ser Thr Pro Val Ser Arg Thr Thr Lys His Phe His Glu Thr Thr Pro
485 490 495
Asn Lys Gly Ser Gly Thr Thr Ser Gly Thr Thr Arg Leu Leu Ser Gly
500 505 510
His Thr Cys Phe Thr Leu Thr Gly Leu Leu Gly Thr Leu Val Thr Met
515 520 525
Gly Leu Leu Thr
530
<210> 287
<211> 564
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DAFss-aCD3scFv(UCHT1)IgG1 Fc-CD14GPI
<400> 287
Met Thr Val Ala Arg Pro Ser Val Pro Ala Ala Leu Pro Leu Leu Gly
1 5 10 15
Glu Leu Pro Arg Leu Leu Leu Leu Val Leu Leu Cys Leu Pro Ala Val
20 25 30
Trp Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
35 40 45
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg
50 55 60
Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
65 70 75 80
Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
85 90 95
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
100 105 110
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu
115 120 125
Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu
145 150 155 160
Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu
165 170 175
Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp
180 185 190
Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Leu Ile Asn
195 200 205
Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe
210 215 220
Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn
225 230 235 240
Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly
245 250 255
Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr
260 265 270
Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
275 280 285
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
290 295 300
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
305 310 315 320
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
325 330 335
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
340 345 350
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
355 360 365
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
370 375 380
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
385 390 395 400
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
405 410 415
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
420 425 430
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
435 440 445
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
450 455 460
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
465 470 475 480
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
485 490 495
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Val Asp Asn
500 505 510
Leu Thr Leu Asp Gly Asn Pro Phe Leu Val Pro Gly Thr Ala Leu Pro
515 520 525
His Glu Gly Ser Met Asn Ser Gly Val Val Pro Ala Cys Ala Arg Ser
530 535 540
Thr Leu Ser Val Gly Val Ser Gly Thr Leu Val Leu Leu Gln Gly Ala
545 550 555 560
Arg Gly Phe Ala
<210> 288
<211> 280
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DAFss-CD80ECD-CD16GPI
<400> 288
Met Thr Val Ala Arg Pro Ser Val Pro Ala Ala Leu Pro Leu Leu Gly
1 5 10 15
Glu Leu Pro Arg Leu Leu Leu Leu Val Leu Leu Cys Leu Pro Ala Val
20 25 30
Trp Gly Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu
35 40 45
Ser Cys Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile
50 55 60
Tyr Trp Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp
65 70 75 80
Met Asn Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr
85 90 95
Asn Asn Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly
100 105 110
Thr Tyr Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg
115 120 125
Glu His Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr
130 135 140
Pro Ser Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile
145 150 155 160
Ile Cys Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu Ser Trp Leu
165 170 175
Glu Asn Gly Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp
180 185 190
Pro Glu Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met
195 200 205
Thr Thr Asn His Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg
210 215 220
Val Asn Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro
225 230 235 240
Asp Asn Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Ser Pro Pro Gly Tyr Gln Val
245 250 255
Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly Leu
260 265 270
Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile
275 280
<210> 289
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成靶标2 MRB VH
<400> 289
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Thr Gly
20 25 30
Glu Tyr Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Arg Gly Gln Arg Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Tyr Ile Thr Tyr Asp Gly Ser Lys Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asn Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Phe Glu Gly Val Trp Tyr Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 290
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成靶标2 MRB VL
<400> 290
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Arg Tyr
20 25 30
Gly Asn Ser Phe Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Thr Tyr Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 291
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成接头2
<400> 291
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25 30
<210> 292
<211> 368
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽M001
<400> 292
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly
20 25 30
Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe
35 40 45
Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala
50 55 60
Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu
65 70 75 80
Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile
85 90 95
Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu
100 105 110
Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala
115 120 125
Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu
130 135 140
Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr
145 150 155 160
Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys
165 170 175
Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly
180 185 190
Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu
195 200 205
Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys
210 215 220
Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu
225 230 235 240
Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met
245 250 255
Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala
260 265 270
His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val
275 280 285
Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His
290 295 300
Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro
305 310 315 320
Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Glu Ile Asn Asn Ser Ser
325 330 335
Gly Glu Met Asp Pro Ile Leu Leu Pro Pro Cys Leu Thr Ile Ser Ile
340 345 350
Leu Ser Phe Phe Ser Val Ala Leu Leu Val Ile Leu Ala Cys Val Leu
355 360 365
<210> 293
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽M002
<400> 293
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly
20 25 30
Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe
35 40 45
Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala
50 55 60
Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu
65 70 75 80
Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile
85 90 95
Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu
100 105 110
Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala
115 120 125
Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu
130 135 140
Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr
145 150 155 160
Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys
165 170 175
Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly
180 185 190
Gln Pro Glu Ile Asn Asn Ser Ser Gly Glu Met Asp Pro Ile Leu Leu
195 200 205
Pro Pro Cys Leu Thr Ile Ser Ile Leu Ser Phe Phe Ser Val Ala Leu
210 215 220
Leu Val Ile Leu Ala Cys Val Leu
225 230
<210> 294
<211> 194
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽M007
<400> 294
Met Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Glu His Asp Leu Glu
1 5 10 15
Arg Gly Pro Pro Gly Pro Arg Arg Pro Pro Arg Gly Pro Pro Leu Ser
20 25 30
Ser Ser Leu Gly Leu Ala Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Leu Leu Phe
35 40 45
Trp Leu Tyr Ile Val Met Ser Asp Trp Thr Gly Gly Ala Leu Leu Val
50 55 60
Leu Tyr Ser Phe Ala Leu Met Leu Ile Ile Ile Ile Leu Ile Ile Phe
65 70 75 80
Ile Phe Arg Arg Asp Leu Leu Cys Pro Leu Gly Ala Leu Cys Ile Leu
85 90 95
Leu Leu Met Ile Thr Leu Leu Leu Ile Ala Leu Trp Asn Leu His Gly
100 105 110
Gln Ala Leu Phe Leu Gly Ile Val Leu Phe Ile Phe Gly Cys Leu Leu
115 120 125
Val Leu Gly Ile Trp Ile Tyr Leu Leu Glu Met Leu Trp Arg Leu Gly
130 135 140
Ala Thr Ile Trp Gln Leu Leu Ala Phe Phe Leu Ala Phe Phe Leu Asp
145 150 155 160
Leu Ile Leu Leu Ile Ile Ala Leu Tyr Leu Gln Gln Asn Trp Trp Thr
165 170 175
Leu Leu Val Asp Leu Leu Trp Leu Leu Leu Phe Leu Ala Ile Leu Ile
180 185 190
Trp Met
<210> 295
<211> 174
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽M008
<400> 295
Met Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Ser Ser Ser Leu Gly
1 5 10 15
Leu Ala Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Leu Leu Phe Trp Leu Tyr Ile
20 25 30
Val Met Ser Asp Trp Thr Gly Gly Ala Leu Leu Val Leu Tyr Ser Phe
35 40 45
Ala Leu Met Leu Ile Ile Ile Ile Leu Ile Ile Phe Ile Phe Arg Arg
50 55 60
Asp Leu Leu Cys Pro Leu Gly Ala Leu Cys Ile Leu Leu Leu Met Ile
65 70 75 80
Thr Leu Leu Leu Ile Ala Leu Trp Asn Leu His Gly Gln Ala Leu Phe
85 90 95
Leu Gly Ile Val Leu Phe Ile Phe Gly Cys Leu Leu Val Leu Gly Ile
100 105 110
Trp Ile Tyr Leu Leu Glu Met Leu Trp Arg Leu Gly Ala Thr Ile Trp
115 120 125
Gln Leu Leu Ala Phe Phe Leu Ala Phe Phe Leu Asp Leu Ile Leu Leu
130 135 140
Ile Ile Ala Leu Tyr Leu Gln Gln Asn Trp Trp Thr Leu Leu Val Asp
145 150 155 160
Leu Leu Trp Leu Leu Leu Phe Leu Ala Ile Leu Ile Trp Met
165 170
<210> 296
<211> 184
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽M009
<400> 296
Met Glu His Asp Leu Glu Arg Gly Pro Pro Gly Pro Arg Arg Pro Pro
1 5 10 15
Arg Gly Pro Pro Leu Ser Ser Ser Leu Gly Leu Ala Leu Leu Leu Leu
20 25 30
Leu Leu Ala Leu Leu Phe Trp Leu Tyr Ile Val Met Ser Asp Trp Thr
35 40 45
Gly Gly Ala Leu Leu Val Leu Tyr Ser Phe Ala Leu Met Leu Ile Ile
50 55 60
Ile Ile Leu Ile Ile Phe Ile Phe Arg Arg Asp Leu Leu Cys Pro Leu
65 70 75 80
Gly Ala Leu Cys Ile Leu Leu Leu Met Ile Thr Leu Leu Leu Ile Ala
85 90 95
Leu Trp Asn Leu His Gly Gln Ala Leu Phe Leu Gly Ile Val Leu Phe
100 105 110
Ile Phe Gly Cys Leu Leu Val Leu Gly Ile Trp Ile Tyr Leu Leu Glu
115 120 125
Met Leu Trp Arg Leu Gly Ala Thr Ile Trp Gln Leu Leu Ala Phe Phe
130 135 140
Leu Ala Phe Phe Leu Asp Leu Ile Leu Leu Ile Ile Ala Leu Tyr Leu
145 150 155 160
Gln Gln Asn Trp Trp Thr Leu Leu Val Asp Leu Leu Trp Leu Leu Leu
165 170 175
Phe Leu Ala Ile Leu Ile Trp Met
180
<210> 297
<211> 162
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽M010
<400> 297
Met Ser Leu Gly Leu Ala Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Leu Leu Phe
1 5 10 15
Trp Leu Tyr Ile Val Met Ser Asp Trp Thr Gly Gly Ala Leu Leu Val
20 25 30
Leu Tyr Ser Phe Ala Leu Met Leu Ile Ile Ile Ile Leu Ile Ile Phe
35 40 45
Ile Phe Arg Arg Asp Leu Leu Cys Pro Leu Gly Ala Leu Cys Ile Leu
50 55 60
Leu Leu Met Ile Thr Leu Leu Leu Ile Ala Leu Trp Asn Leu His Gly
65 70 75 80
Gln Ala Leu Phe Leu Gly Ile Val Leu Phe Ile Phe Gly Cys Leu Leu
85 90 95
Val Leu Gly Ile Trp Ile Tyr Leu Leu Glu Met Leu Trp Arg Leu Gly
100 105 110
Ala Thr Ile Trp Gln Leu Leu Ala Phe Phe Leu Ala Phe Phe Leu Asp
115 120 125
Leu Ile Leu Leu Ile Ile Ala Leu Tyr Leu Gln Gln Asn Trp Trp Thr
130 135 140
Leu Leu Val Asp Leu Leu Trp Leu Leu Leu Phe Leu Ala Ile Leu Ile
145 150 155 160
Trp Met
<210> 298
<211> 363
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽M012
<400> 298
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly
20 25 30
Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe
35 40 45
Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala
50 55 60
Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu
65 70 75 80
Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile
85 90 95
Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu
100 105 110
Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala
115 120 125
Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu
130 135 140
Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr
145 150 155 160
Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys
165 170 175
Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly
180 185 190
Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu
195 200 205
Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys
210 215 220
Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu
225 230 235 240
Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met
245 250 255
Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala
260 265 270
His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val
275 280 285
Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His
290 295 300
Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro
305 310 315 320
Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Ala Glu Thr Pro Thr Pro Pro
325 330 335
Lys Pro Lys Leu Ser Lys Cys Ile Leu Ile Ser Ser Leu Ala Ile Leu
340 345 350
Leu Met Val Ser Leu Leu Leu Leu Ser Leu Trp
355 360
<210> 299
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽M013
<400> 299
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly
20 25 30
Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe
35 40 45
Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala
50 55 60
Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu
65 70 75 80
Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile
85 90 95
Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu
100 105 110
Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala
115 120 125
Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu
130 135 140
Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr
145 150 155 160
Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys
165 170 175
Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly
180 185 190
Gln Ala Glu Thr Pro Thr Pro Pro Lys Pro Lys Leu Ser Lys Cys Ile
195 200 205
Leu Ile Ser Ser Leu Ala Ile Leu Leu Met Val Ser Leu Leu Leu Leu
210 215 220
Ser Leu Trp
225
<210> 300
<211> 354
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽M018
<400> 300
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly
20 25 30
Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe
35 40 45
Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala
50 55 60
Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu
65 70 75 80
Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile
85 90 95
Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu
100 105 110
Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala
115 120 125
Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu
130 135 140
Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr
145 150 155 160
Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys
165 170 175
Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly
180 185 190
Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu
195 200 205
Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys
210 215 220
Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu
225 230 235 240
Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met
245 250 255
Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala
260 265 270
His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val
275 280 285
Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His
290 295 300
Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro
305 310 315 320
Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Thr Glu Ser Val Leu Pro Met
325 330 335
Trp Val Leu Ala Leu Ile Glu Ile Phe Leu Thr Ile Ala Val Leu Leu
340 345 350
Ala Leu
<210> 301
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽M019
<400> 301
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly
20 25 30
Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe
35 40 45
Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala
50 55 60
Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu
65 70 75 80
Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile
85 90 95
Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu
100 105 110
Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala
115 120 125
Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu
130 135 140
Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr
145 150 155 160
Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys
165 170 175
Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly
180 185 190
Gln Thr Glu Ser Val Leu Pro Met Trp Val Leu Ala Leu Ile Glu Ile
195 200 205
Phe Leu Thr Ile Ala Val Leu Leu Ala Leu
210 215
<210> 302
<211> 360
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽M024
<400> 302
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly
20 25 30
Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe
35 40 45
Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala
50 55 60
Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu
65 70 75 80
Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile
85 90 95
Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu
100 105 110
Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala
115 120 125
Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu
130 135 140
Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr
145 150 155 160
Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys
165 170 175
Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly
180 185 190
Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu
195 200 205
Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys
210 215 220
Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu
225 230 235 240
Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met
245 250 255
Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala
260 265 270
His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val
275 280 285
Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His
290 295 300
Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro
305 310 315 320
Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Thr Pro Glu Gly Ser Glu Leu
325 330 335
His Ile Ile Leu Gly Leu Phe Gly Leu Leu Leu Leu Leu Asn Cys Leu
340 345 350
Cys Gly Thr Ala Trp Leu Cys Cys
355 360
<210> 303
<211> 224
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽M025
<400> 303
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly
20 25 30
Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe
35 40 45
Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala
50 55 60
Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu
65 70 75 80
Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile
85 90 95
Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu
100 105 110
Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala
115 120 125
Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu
130 135 140
Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr
145 150 155 160
Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys
165 170 175
Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly
180 185 190
Gln Thr Pro Glu Gly Ser Glu Leu His Ile Ile Leu Gly Leu Phe Gly
195 200 205
Leu Leu Leu Leu Leu Asn Cys Leu Cys Gly Thr Ala Trp Leu Cys Cys
210 215 220
<210> 304
<211> 359
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽M030
<400> 304
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly
20 25 30
Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe
35 40 45
Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala
50 55 60
Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu
65 70 75 80
Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile
85 90 95
Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu
100 105 110
Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala
115 120 125
Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu
130 135 140
Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr
145 150 155 160
Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys
165 170 175
Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly
180 185 190
Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu
195 200 205
Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys
210 215 220
Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu
225 230 235 240
Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met
245 250 255
Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala
260 265 270
His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val
275 280 285
Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His
290 295 300
Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro
305 310 315 320
Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Thr Pro Ser Asp Leu Asp Pro
325 330 335
Cys Cys Leu Thr Leu Ser Leu Ile Leu Val Val Ile Leu Val Leu Leu
340 345 350
Thr Val Leu Ala Leu Leu Ser
355
<210> 305
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽M031
<400> 305
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Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe
35 40 45
Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala
50 55 60
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Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile
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Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly
180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
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<213> 人工序列
<220>
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100 105 110
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260 265 270
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<220>
<223> 合成多肽M037
<400> 307
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽M043
<400> 309
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<220>
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275 280 285
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<211> 223
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽M049
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽E006
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽E007
<400> 313
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<213> 人工序列
<220>
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355 360 365
Ala Ala
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽E009
<400> 315
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65 70 75 80
Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile
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100 105 110
Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala
115 120 125
Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu
130 135 140
Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr
145 150 155 160
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165 170 175
Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly
180 185 190
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195 200 205
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225 230 235 240
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245 250 255
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<210> 316
<211> 372
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽E010
<400> 316
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly
20 25 30
Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe
35 40 45
Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala
50 55 60
Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu
65 70 75 80
Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile
85 90 95
Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu
100 105 110
Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala
115 120 125
Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu
130 135 140
Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr
145 150 155 160
Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys
165 170 175
Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly
180 185 190
Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu
195 200 205
Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys
210 215 220
Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu
225 230 235 240
Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met
245 250 255
Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala
260 265 270
His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val
275 280 285
Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His
290 295 300
Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro
305 310 315 320
Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Leu Glu Arg Ile Ala Arg Leu
325 330 335
Glu Glu Lys Val Lys Thr Leu Lys Ala Gln Asn Ser Glu Leu Ala Ser
340 345 350
Thr Ala Asn Met Leu Arg Glu Gln Val Ala Gln Leu Lys Gln Lys Val
355 360 365
Ala Ala Ala Ala
370
<210> 317
<211> 69
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽E011
<400> 317
Met Thr Ile Leu Gly Thr Thr Phe Gly Met Val Phe Ser Leu Leu Gln
1 5 10 15
Val Val Ser Gly Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Leu Glu
20 25 30
Arg Ile Ala Arg Leu Glu Glu Lys Val Lys Thr Leu Lys Ala Gln Asn
35 40 45
Ser Glu Leu Ala Ser Thr Ala Asn Met Leu Arg Glu Gln Val Ala Gln
50 55 60
Leu Lys Gln Lys Val
65
<210> 318
<211> 70
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽E012
<400> 318
Met Thr Ile Leu Gly Thr Thr Phe Gly Met Val Phe Ser Leu Leu Gln
1 5 10 15
Val Val Ser Gly Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Leu Glu
20 25 30
Arg Ile Ala Arg Leu Glu Glu Lys Val Lys Thr Leu Lys Ala Gln Asn
35 40 45
Ser Glu Leu Ala Ser Thr Ala Asn Met Leu Arg Glu Gln Val Ala Gln
50 55 60
Leu Lys Gln Lys Val Ala
65 70
<210> 319
<211> 71
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽E013
<400> 319
Met Thr Ile Leu Gly Thr Thr Phe Gly Met Val Phe Ser Leu Leu Gln
1 5 10 15
Val Val Ser Gly Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Leu Glu
20 25 30
Arg Ile Ala Arg Leu Glu Glu Lys Val Lys Thr Leu Lys Ala Gln Asn
35 40 45
Ser Glu Leu Ala Ser Thr Ala Asn Met Leu Arg Glu Gln Val Ala Gln
50 55 60
Leu Lys Gln Lys Val Ala Ala
65 70
<210> 320
<211> 72
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽E014
<400> 320
Met Thr Ile Leu Gly Thr Thr Phe Gly Met Val Phe Ser Leu Leu Gln
1 5 10 15
Val Val Ser Gly Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Leu Glu
20 25 30
Arg Ile Ala Arg Leu Glu Glu Lys Val Lys Thr Leu Lys Ala Gln Asn
35 40 45
Ser Glu Leu Ala Ser Thr Ala Asn Met Leu Arg Glu Gln Val Ala Gln
50 55 60
Leu Lys Gln Lys Val Ala Ala Ala
65 70
<210> 321
<211> 73
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽E015
<400> 321
Met Thr Ile Leu Gly Thr Thr Phe Gly Met Val Phe Ser Leu Leu Gln
1 5 10 15
Val Val Ser Gly Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Leu Glu
20 25 30
Arg Ile Ala Arg Leu Glu Glu Lys Val Lys Thr Leu Lys Ala Gln Asn
35 40 45
Ser Glu Leu Ala Ser Thr Ala Asn Met Leu Arg Glu Gln Val Ala Gln
50 55 60
Leu Lys Gln Lys Val Ala Ala Ala Ala
65 70
<210> 322
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽T001
<400> 322
Leu Ile Ile Gly Ile Cys Gly Gly Gly Ser Leu Leu Met Val Phe Val
1 5 10 15
Ala Leu Leu Val Phe Tyr Ile
20
<210> 323
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽T002
<400> 323
Gly Ile Ile Val Thr Asp Val Ile Ala Thr Leu Leu Leu Ala Leu Gly
1 5 10 15
Val Phe Cys Phe Ala
20
<210> 324
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽T003
<400> 324
Val Met Ser Val Ala Thr Ile Val Ile Val Asp Ile Cys Ile Thr Gly
1 5 10 15
Gly Leu Leu Leu Leu Val Tyr Tyr Trp Ser
20 25
<210> 325
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽T004
<400> 325
Gly Phe Leu Phe Ala Glu Ile Val Ser Ile Phe Val Leu Ala Val Gly
1 5 10 15
Val Tyr Phe Ile Ala
20
<210> 326
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽T005
<400> 326
Leu Cys Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile Leu
1 5 10 15
Thr Ala Leu Phe Leu
20
<210> 327
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽T006
<400> 327
Met Ala Leu Ile Val Leu Gly Gly Val Ala Gly Leu Leu Leu Phe Ile
1 5 10 15
Gly Leu Gly Ile Phe Phe
20
<210> 328
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽T007
<400> 328
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr
20
<210> 329
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽T008
<400> 329
Leu Gly Leu Leu Val Ala Gly Val Leu Val Leu Leu Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Val Ala Ile His Leu Cys Cys
20
<210> 330
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽T009
<400> 330
Ile Leu Val Ile Phe Ser Gly Met Phe Leu Val Phe Thr Leu Ala Gly
1 5 10 15
Ala Leu Phe Leu His
20
<210> 331
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽T010
<400> 331
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 332
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽T011
<400> 332
Ala Leu Val Val Ile Pro Ile Ile Phe Gly Ile Leu Phe Ala Ile Leu
1 5 10 15
Leu Val Leu Val Phe Ile
20
<210> 333
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽T012
<400> 333
Ile Ile Thr Ala Glu Gly Ile Ile Leu Leu Phe Cys Ala Val Val Pro
1 5 10 15
Gly Thr Leu Leu Leu Phe
20
<210> 334
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽T013
<400> 334
Gly Ile Ile Met Ile Gln Thr Leu Leu Ile Ile Leu Phe Ile Ile Val
1 5 10 15
Pro Ile Phe Leu Leu Leu
20
<210> 335
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽T014
<400> 335
Phe Ile Leu Ile Ser Ser Leu Ala Ile Leu Leu Met Val Ser Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Ser Leu Trp
20
<210> 336
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽T015
<400> 336
Cys Ile Leu Ile Ser Ser Leu Ala Ile Leu Leu Met Val Ser Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Ser Leu Trp
20
<210> 337
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽T016
<400> 337
Asn Leu Gly Ser Val Tyr Ile Tyr Val Leu Leu Ile Val Gly Thr Leu
1 5 10 15
Val Cys Gly Ile Val Leu Gly Phe Leu Phe
20 25
<210> 338
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽T017
<400> 338
Met Trp Val Leu Ala Leu Ile Val Ile Phe Leu Thr Ile Ala Val Leu
1 5 10 15
Leu Ala Leu
<210> 339
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽T018
<400> 339
Met Trp Val Leu Ala Leu Ile Glu Ile Phe Leu Thr Ile Ala Val Leu
1 5 10 15
Leu Ala Leu
<210> 340
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽T019
<400> 340
Ile Ile Leu Gly Leu Phe Gly Leu Leu Leu Leu Leu Thr Cys Leu Cys
1 5 10 15
Gly Thr Ala Trp Leu Cys Cys
20
<210> 341
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽T020
<400> 341
Ile Ile Leu Gly Leu Phe Gly Leu Leu Leu Leu Leu Asn Cys Leu Cys
1 5 10 15
Gly Thr Ala Trp Leu Cys Cys
20
<210> 342
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽T021
<400> 342
Leu Ile Leu Thr Leu Ser Leu Ile Leu Val Val Ile Leu Val Leu Leu
1 5 10 15
Thr Val Leu Ala Leu Leu Ser
20
<210> 343
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽T022
<400> 343
Cys Cys Leu Thr Leu Ser Leu Ile Leu Val Val Ile Leu Val Leu Leu
1 5 10 15
Thr Val Leu Ala Leu Leu Ser
20
<210> 344
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽T023
<400> 344
Leu Cys Tyr Ile Leu Asp Ala Ile Leu Phe Leu Tyr Gly Ile Val Leu
1 5 10 15
Thr Leu Leu Tyr Cys
20
<210> 345
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽T024
<400> 345
Ile Ile Val Ala Val Val Thr Gly Ile Ala Val Ala Ala Ile Val Ala
1 5 10 15
Ala Val Val Ala Leu Ile Tyr
20
<210> 346
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽T025
<400> 346
Ile Ile Val Ala Val Val Ile Ala Thr Ala Val Ala Ala Ile Val Ala
1 5 10 15
Ala Val Val Ala Leu Ile Tyr
20
<210> 347
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽T026
<400> 347
Phe Pro Trp Leu Leu Ile Ile Ile Phe Gly Ile Phe Gly Leu Thr Val
1 5 10 15
Met Leu Phe Val Phe Leu Phe Ser
20
<210> 348
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽T027
<400> 348
Phe Pro Trp Leu Leu Cys Ile Ile Phe Gly Ile Phe Gly Leu Thr Val
1 5 10 15
Met Leu Phe Val Phe Leu Phe Ser
20
<210> 349
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽T028
<400> 349
Phe Trp Leu Pro Ile Gly Cys Ala Ala Phe Val Val Val Cys Ile Leu
1 5 10 15
Gly Cys Ile Leu Ile
20
<210> 350
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽T029
<400> 350
Ile Trp Leu Ile Val Gly Ile Cys Ile Ala Leu Phe Ala Leu Pro Phe
1 5 10 15
Val Ile Tyr Ala Ala
20
<210> 351
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽T030
<400> 351
Ile Gly Gly Ile Ile Thr Val Phe Leu Ile Ala Leu Val Leu Thr Ser
1 5 10 15
Thr Ile Val Thr Leu
20
<210> 352
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽T031
<400> 352
Ser Leu Trp Ile Pro Val Val Ala Ala Leu Leu Leu Phe Leu Val Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Phe Ile
20
<210> 353
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽T032
<400> 353
Val Ile Leu Ile Ser Val Gly Thr Phe Ser Leu Leu Ser Val Leu Ala
1 5 10 15
Gly Ala Cys Phe Phe
20
<210> 354
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽T033
<400> 354
Phe Leu Val Leu Pro Ser Leu Leu Ile Leu Leu Leu Val Ile Ala Ala
1 5 10 15
Gly Gly Val Ile Trp
20
<210> 355
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽T034
<400> 355
His Met Ile Gly Ile Cys Val Thr Leu Thr Val Ile Ile Val Cys Ser
1 5 10 15
Val Phe Ile Tyr Lys Ile Phe
20
<210> 356
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽T035
<400> 356
Val Leu Leu Val Val Ile Leu Ile Val Val Tyr His Val Tyr Trp Leu
1 5 10 15
Glu Met Val Leu Phe
20
<210> 357
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽T036
<400> 357
Ile Tyr Cys Ile Ile Ala Val Cys Ser Val Phe Leu Met Leu Ile Asn
1 5 10 15
Val Leu Val Ile Ile
20
<210> 358
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽T037
<400> 358
Ala Tyr Leu Ile Gly Gly Leu Ile Ala Leu Val Ala Val Ala Val Ser
1 5 10 15
Val Val Tyr Ile Tyr
20
<210> 359
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽T038
<400> 359
Val Ala Val Ala Gly Cys Val Phe Leu Leu Ile Ser Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Gly Leu
<210> 360
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽T039
<400> 360
Ile Pro Trp Leu Gly His Leu Leu Val Gly Leu Ser Gly Ala Phe Gly
1 5 10 15
Phe Ile Ile Leu Val Tyr Leu Leu Ile
20 25
<210> 361
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽T040
<400> 361
Val Val Ile Ser Val Gly Ser Met Gly Leu Ile Ile Ser Leu Leu Cys
1 5 10 15
Val Tyr Phe Trp Leu
20
<210> 362
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽T041
<400> 362
Thr Ser Leu Leu Ile Ala Leu Gly Thr Leu Leu Ala Leu Val Cys Val
1 5 10 15
Phe Val Ile Cys
20
<210> 363
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽T042
<400> 363
Leu Leu Leu Gly Val Ser Val Ser Cys Ile Val Ile Leu Ala Val Cys
1 5 10 15
Leu Leu Cys Tyr Val Ser Ile Thr
20
<210> 364
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽T043
<400> 364
Phe Val Ile Val Ile Met Ala Thr Ile Cys Phe Ile Leu Leu Ile Leu
1 5 10 15
Ser Leu Ile Cys
20
<210> 365
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽T044
<400> 365
Thr Phe Leu Val Ala Gly Gly Ser Leu Ala Phe Gly Thr Leu Leu Cys
1 5 10 15
Ile Ala Ile Val Leu
20
<210> 366
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽T045
<400> 366
Ala Ile Val Val Pro Val Cys Leu Ala Phe Leu Leu Thr Thr Leu Leu
1 5 10 15
Gly Val Leu Phe Cys Phe
20
<210> 367
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽T046
<400> 367
Ile Leu Leu Thr Ile Ser Ile Leu Ser Phe Phe Ser Val Ala Leu Leu
1 5 10 15
Val Ile Leu Ala Cys Val Leu
20
<210> 368
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽T047
<400> 368
Ile Leu Leu Pro Pro Cys Leu Thr Ile Ser Ile Leu Ser Phe Phe Ser
1 5 10 15
Val Ala Leu Leu Val Ile Leu Ala Cys Val Leu
20 25
<210> 369
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽T048
<400> 369
Gly Asn Thr Leu Val Ala Val Ser Ile Phe Leu Leu Leu Thr Gly Pro
1 5 10 15
Thr Tyr Leu Leu Phe
20
<210> 370
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽T049
<400> 370
Val Ile Ile Phe Phe Ala Phe Val Leu Leu Leu Ser Gly Ala Leu Ala
1 5 10 15
Tyr Cys Leu Ala Leu
20
<210> 371
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽T050
<400> 371
Trp Met Val Ala Val Ile Leu Met Ala Ser Val Phe Met Val Cys Leu
1 5 10 15
Ala Leu Leu Gly Cys Phe
20
<210> 372
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽T051
<400> 372
Ser Leu Gly Ile Leu Ser Phe Leu Gly Leu Val Ala Gly Ala Leu Ala
1 5 10 15
Leu Gly Leu Trp Leu
20
<210> 373
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽T052
<400> 373
Trp Leu Ile Phe Phe Ala Ser Leu Gly Ser Phe Leu Ser Ile Leu Leu
1 5 10 15
Val Gly Val Leu Gly Tyr Leu Gly Leu
20 25
<210> 374
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽T053
<400> 374
Trp Met Ala Phe Val Ala Pro Ser Ile Cys Ile Ala Ile Ile Met Val
1 5 10 15
Gly Ile Phe Ser Thr
20
<210> 375
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽T054
<400> 375
Leu Tyr Ile Thr Met Leu Leu Ile Val Pro Val Ile Val Ala Gly Ala
1 5 10 15
Ile Ile Val Leu Leu Leu Tyr Leu
20
<210> 376
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽T055
<400> 376
Phe Trp Leu Pro Phe Gly Phe Ile Leu Ile Leu Val Ile Phe Val Thr
1 5 10 15
Gly Leu Leu Leu
20
<210> 377
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽T056
<400> 377
Val Ala Ile Ser Thr Ser Thr Val Leu Leu Cys Gly Leu Ser Ala Val
1 5 10 15
Ser Leu Leu Ala Cys Tyr Leu
20
<210> 378
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽T057
<400> 378
Val Tyr Trp Phe Ile Thr Gly Ile Ser Ile Leu Leu Val Gly Ser Val
1 5 10 15
Ile Leu Leu Ile Val
20
<210> 379
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽T058
<400> 379
Leu Leu Leu Leu Ser Leu Leu Val Ala Thr Trp Val Leu Val Ala Gly
1 5 10 15
Ile Tyr Leu Met Trp
20
<210> 380
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽T059
<400> 380
Trp Ala Leu Val Trp Leu Ala Cys Leu Leu Phe Ala Ala Ala Leu Ser
1 5 10 15
Leu Ile Leu Leu Leu
20
<210> 381
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽T060
<400> 381
Ala Val Ala Ile Thr Val Pro Leu Val Val Ile Ser Ala Phe Ala Thr
1 5 10 15
Leu Phe Thr Val Met
20
<210> 382
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽T061
<400> 382
Leu Gly Leu Leu Ile Leu Ala Leu Leu Ala Leu Leu Thr Leu Leu Gly
1 5 10 15
Val Val Leu Ala Leu
20
<210> 383
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽T062
<400> 383
Gly Met Ile Ile Ala Val Leu Ile Leu Val Ala Val Val Cys Leu Val
1 5 10 15
Thr Val Cys Val Ile
20
<210> 384
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽T063
<400> 384
Gly Val Val Leu Leu Tyr Ile Leu Leu Gly Thr Ile Gly Thr Leu Val
1 5 10 15
Ala Val Leu Ala Ala
20
<210> 385
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽T064
<400> 385
Ile Ile Phe Trp Tyr Val Leu Pro Ile Ser Ile Thr Val Phe Leu Phe
1 5 10 15
Ser Val Met Gly Tyr
20
<210> 386
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽T065
<400> 386
Val Leu Ala Leu Phe Ala Phe Val Gly Phe Met Leu Ile Leu Val Val
1 5 10 15
Val Pro Leu Phe Val
20
<210> 387
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽T066
<400> 387
Gly Trp Asn Pro His Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Val Ile Val Phe
1 5 10 15
Ile Pro Ala Phe Trp
20
<210> 388
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽T067
<400> 388
Tyr Ser Phe Ser Gly Ala Phe Leu Phe Ser Met Gly Phe Leu Val Ala
1 5 10 15
Val Leu Cys Tyr Leu
20
<210> 389
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽T068
<400> 389
Leu Leu Leu Gly Met Ile Val Phe Ala Val Met Leu Ser Ile Leu Ser
1 5 10 15
Leu Ile Gly Ile Phe
20
<210> 390
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽T069
<400> 390
Val Leu Pro Gly Ile Leu Phe Leu Trp Gly Leu Phe Leu Leu Gly Cys
1 5 10 15
Gly Leu Ser Leu Ala
20
<210> 391
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽T070
<400> 391
Val Leu Pro Gly Ile Leu Cys Leu Trp Gly Leu Phe Leu Leu Gly Cys
1 5 10 15
Gly Leu Ser Leu Ala
20
<210> 392
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽T071
<400> 392
Ile Ile Leu Ile Thr Ser Leu Ile Gly Gly Gly Leu Leu Ile Leu Ile
1 5 10 15
Ile Leu Thr Val Ala Tyr Gly Leu
20
<210> 393
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽T072
<400> 393
Ala Gly Leu Tyr Val Ile Val Pro Val Ile Ile Ser Ser Ser Ile Leu
1 5 10 15
Leu Leu Gly Thr Leu Leu Ile
20
<210> 394
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽T073
<400> 394
Val Gly Leu Ile Ile Ala Ile Leu Ile Pro Val Ala Val Ala Val Ile
1 5 10 15
Val Gly Val Val Thr Ser Ile Leu Cys
20 25
<210> 395
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽T074
<400> 395
Ile Ser Leu Val Thr Ala Leu His Leu Val Leu Gly Leu Ser Ala Val
1 5 10 15
Leu Gly Leu Leu Leu Leu
20
<210> 396
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽T075
<400> 396
Ile Ser Leu Val Thr Ala Leu His Leu Val Leu Gly Leu Asn Ala Val
1 5 10 15
Leu Gly Leu Leu Leu Leu
20
<210> 397
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽T076
<400> 397
Leu Ile His Ile Leu Leu Pro Met Val Phe Cys Val Leu Leu Ile Met
1 5 10 15
Val Met Cys Tyr Leu
20
<210> 398
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽T077
<400> 398
Thr Thr Val Trp Ile Ser Val Ala Val Leu Ser Ala Val Ile Cys Leu
1 5 10 15
Ile Ile Val Trp Ala Val Ala Leu
20
<210> 399
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽T078
<400> 399
Val Ala Ala Ile Leu Gly Leu Gly Leu Val Leu Gly Leu Leu Gly Pro
1 5 10 15
Leu Ala Ile Leu Leu
20
<210> 400
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽T079
<400> 400
Pro Val Leu Asp Ala Gly Pro Val Leu Phe Trp Val Ile Leu Val Leu
1 5 10 15
Val Val Val Val Gly Ser Ser Ala Phe Leu Leu Cys
20 25
<210> 401
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽T080
<400> 401
Ile Ile Ser Phe Phe Leu Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu
1 5 10 15
Leu Phe Phe Leu Thr Leu Arg Phe Ser Val Val
20 25
<210> 402
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽T081
<400> 402
Trp Trp Phe Leu Ser Gly Ser Leu Val Ile Val Ile Val Cys Ser Thr
1 5 10 15
Val Gly Leu Ile Ile
20
<210> 403
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽T082
<400> 403
Leu Gly Trp Leu Thr Val Val Leu Leu Ala Val Ala Ala Cys Val Leu
1 5 10 15
Leu Leu Thr Ser Ala
20
<210> 404
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S036
<400> 404
Thr Lys Arg Lys Lys Gln Arg Ser Arg Arg Asn Asp Glu Glu Leu Glu
1 5 10 15
Thr Arg Ala His Arg Val Ala Thr Glu Glu Arg Gly Arg Lys Pro His
20 25 30
Gln Ile Pro Ala Ser Thr Pro Gln Asn Pro Ala Thr Ser Gln His Pro
35 40 45
Pro Pro Pro Pro Gly His Arg Ser Gln Ala Pro Ser His Arg Pro Pro
50 55 60
Pro Pro Gly His Arg Val Gln His Gln Pro Gln Lys Arg Pro Pro Ala
65 70 75 80
Pro Ser Gly Thr Gln Val His Gln Gln Lys Gly Pro Pro Leu Pro Arg
85 90 95
Pro Arg Val Gln Pro Lys Pro Pro His Gly Ala Ala Glu Asn Ser Leu
100 105 110
Ser Pro Ser Ser Asn
115
<210> 405
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S037
<400> 405
Gly His Glu Thr Gly Arg Leu Ser Gly Ala Ala Asp Thr Gln Ala Leu
1 5 10 15
Leu Arg Asn Asp Gln Val Tyr Gln Pro Leu Arg Asp Arg Asp Asp Ala
20 25 30
Gln Tyr Ser His Leu Gly Gly Asn Trp Ala Arg Asn Lys
35 40 45
<210> 406
<211> 55
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S038
<400> 406
Lys Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala
1 5 10 15
Gly Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro
20 25 30
Asn Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg Lys Gly Gln Arg Asp Leu Tyr Ser
35 40 45
Gly Leu Asn Gln Arg Arg Ile
50 55
<210> 407
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S039
<400> 407
Gly Gln Asp Gly Val Arg Gln Ser Arg Ala Ser Asp Lys Gln Thr Leu
1 5 10 15
Leu Pro Asn Asp Gln Leu Tyr Gln Pro Leu Lys Asp Arg Glu Asp Asp
20 25 30
Gln Tyr Ser His Leu Gln Gly Asn Gln Leu Arg Arg Asn
35 40 45
<210> 408
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S042
<400> 408
Cys Val Arg Cys Arg His Arg Arg Arg Gln Ala Glu Arg Met Ser Gln
1 5 10 15
Ile Lys Arg Leu Leu Ser Glu Lys Lys Thr Cys Gln Cys Pro His Arg
20 25 30
Phe Gln Lys Thr Cys Ser Pro Ile
35 40
<210> 409
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S043
<400> 409
Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn Arg Arg Arg Val Cys Lys Cys Pro Arg
1 5 10 15
Pro Val Val Lys Ser Gly Asp Lys Pro Ser Leu Ser Ala Arg Tyr Val
20 25 30
<210> 410
<211> 48
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S044
<400> 410
Arg Arg Arg Arg Ala Arg Leu Arg Phe Met Lys Gln Pro Gln Gly Glu
1 5 10 15
Gly Ile Ser Gly Thr Phe Val Pro Gln Cys Leu His Gly Tyr Tyr Ser
20 25 30
Asn Thr Thr Thr Ser Gln Lys Leu Leu Asn Pro Trp Ile Leu Lys Thr
35 40 45
<210> 411
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S045
<400> 411
Arg Arg Arg Arg Ala Arg Leu Arg Phe Met Lys Gln Leu Arg Leu His
1 5 10 15
Pro Leu Glu Lys Cys Ser Arg Met Asp Tyr
20 25
<210> 412
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S046
<400> 412
Arg Arg Arg Arg Ala Arg Leu Arg Phe Met Lys Gln Phe Tyr Lys
1 5 10 15
<210> 413
<211> 48
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S047
<400> 413
Gln Arg Arg Lys Tyr Arg Ser Asn Lys Gly Glu Ser Pro Val Glu Pro
1 5 10 15
Ala Glu Pro Cys Arg Tyr Ser Cys Pro Arg Glu Glu Glu Gly Ser Thr
20 25 30
Ile Pro Ile Gln Glu Asp Tyr Arg Lys Pro Glu Pro Ala Cys Ser Pro
35 40 45
<210> 414
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S048
<400> 414
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Ala Tyr Ala Ala
20 25 30
Ala Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 415
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S049
<400> 415
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 416
<211> 62
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S050
<400> 416
Lys Lys Val Ala Lys Lys Pro Thr Asn Lys Ala Pro His Pro Lys Gln
1 5 10 15
Glu Pro Gln Glu Ile Asn Phe Pro Asp Asp Leu Pro Gly Ser Asn Thr
20 25 30
Ala Ala Pro Val Gln Glu Thr Leu His Gly Cys Gln Pro Val Thr Gln
35 40 45
Glu Asp Gly Lys Glu Ser Arg Ile Ser Val Gln Glu Arg Gln
50 55 60
<210> 417
<211> 66
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S051
<400> 417
Ser Glu Ser Ser Glu Lys Val Ala Lys Lys Pro Thr Asn Lys Ala Pro
1 5 10 15
His Pro Lys Gln Glu Pro Gln Glu Ile Asn Phe Pro Asp Asp Leu Pro
20 25 30
Gly Ser Asn Thr Ala Ala Pro Val Gln Glu Thr Leu His Gly Cys Gln
35 40 45
Pro Val Thr Gln Glu Asp Gly Lys Glu Ser Arg Ile Ser Val Gln Glu
50 55 60
Arg Gln
65
<210> 418
<211> 61
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S052
<400> 418
Arg Lys Arg Trp Gln Asn Glu Lys Leu Gly Leu Asp Ala Gly Asp Glu
1 5 10 15
Tyr Glu Asp Glu Asn Leu Tyr Glu Gly Leu Asn Leu Asp Asp Cys Ser
20 25 30
Met Tyr Glu Asp Ile Ser Arg Gly Leu Gln Gly Thr Tyr Gln Asp Val
35 40 45
Gly Ser Leu Asn Ile Gly Asp Val Gln Leu Glu Lys Pro
50 55 60
<210> 419
<211> 49
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S053
<400> 419
Leu Asp Lys Asp Asp Ser Lys Ala Gly Met Glu Glu Asp His Thr Tyr
1 5 10 15
Glu Gly Leu Asp Ile Asp Gln Thr Ala Thr Tyr Glu Asp Ile Val Thr
20 25 30
Leu Arg Thr Gly Glu Val Lys Trp Ser Val Gly Glu His Pro Gly Gln
35 40 45
Glu
<210> 420
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S054
<400> 420
Lys Leu Trp Arg Val Lys Lys Phe Leu Ile Pro Ser Val Pro Asp Pro
1 5 10 15
Lys Ser Ile Phe Pro Gly Leu Phe Glu Ile His Gln Gly Asn Phe Gln
20 25 30
Glu Trp Ile Thr Asp Thr Gln Asn Val Ala His Leu His Lys Met Ala
35 40 45
Gly Ala Glu Gln Glu Ser Gly Pro Glu Glu Pro Leu Val Val Gln Leu
50 55 60
Ala Lys Thr Glu Ala Glu Ser Pro Arg Met Leu Asp Pro Gln Thr Glu
65 70 75 80
Glu Lys Glu Ala Ser Gly Gly Ser Leu Gln Leu Pro His Gln Pro Leu
85 90 95
Gln Gly Gly Asp Val Val Thr Ile Gly Gly Phe Thr Phe Val Met Asn
100 105 110
Asp Arg Ser Tyr Val Ala Leu
115
<210> 421
<211> 437
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S057
<400> 421
Arg Phe Cys Gly Ile Tyr Gly Tyr Arg Leu Arg Arg Lys Trp Glu Glu
1 5 10 15
Lys Ile Pro Asn Pro Ser Lys Ser His Leu Phe Gln Asn Gly Ser Ala
20 25 30
Glu Leu Trp Pro Pro Gly Ser Met Ser Ala Phe Thr Ser Gly Ser Pro
35 40 45
Pro His Gln Gly Pro Trp Gly Ser Arg Phe Pro Glu Leu Glu Gly Val
50 55 60
Phe Pro Val Gly Phe Gly Asp Ser Glu Val Ser Pro Leu Thr Ile Glu
65 70 75 80
Asp Pro Lys His Val Cys Asp Pro Pro Ser Gly Pro Asp Thr Thr Pro
85 90 95
Ala Ala Ser Asp Leu Pro Thr Glu Gln Pro Pro Ser Pro Gln Pro Gly
100 105 110
Pro Pro Ala Ala Ser His Thr Pro Glu Lys Gln Ala Ser Ser Phe Asp
115 120 125
Phe Asn Gly Pro Tyr Leu Gly Pro Pro His Ser Arg Ser Leu Pro Asp
130 135 140
Ile Leu Gly Gln Pro Glu Pro Pro Gln Glu Gly Gly Ser Gln Lys Ser
145 150 155 160
Pro Pro Pro Gly Ser Leu Glu Tyr Leu Cys Leu Pro Ala Gly Gly Gln
165 170 175
Val Gln Leu Val Pro Leu Ala Gln Ala Met Gly Pro Gly Gln Ala Val
180 185 190
Glu Val Glu Arg Arg Pro Ser Gln Gly Ala Ala Gly Ser Pro Ser Leu
195 200 205
Glu Ser Gly Gly Gly Pro Ala Pro Pro Ala Leu Gly Pro Arg Val Gly
210 215 220
Gly Gln Asp Gln Lys Asp Ser Pro Val Ala Ile Pro Met Ser Ser Gly
225 230 235 240
Asp Thr Glu Asp Pro Gly Val Ala Ser Gly Tyr Val Ser Ser Ala Asp
245 250 255
Leu Val Phe Thr Pro Asn Ser Gly Ala Ser Ser Val Ser Leu Val Pro
260 265 270
Ser Leu Gly Leu Pro Ser Asp Gln Thr Pro Ser Leu Cys Pro Gly Leu
275 280 285
Ala Ser Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Val Lys Ser Gly Phe Glu
290 295 300
Gly Tyr Val Glu Leu Pro Pro Ile Glu Gly Arg Ser Pro Arg Ser Pro
305 310 315 320
Arg Asn Asn Pro Val Pro Pro Glu Ala Lys Ser Pro Val Leu Asn Pro
325 330 335
Gly Glu Arg Pro Ala Asp Val Ser Pro Thr Ser Pro Gln Pro Glu Gly
340 345 350
Leu Leu Val Leu Gln Gln Val Gly Asp Tyr Cys Phe Leu Pro Gly Leu
355 360 365
Gly Pro Gly Pro Leu Ser Leu Arg Ser Lys Pro Ser Ser Pro Gly Pro
370 375 380
Gly Pro Glu Ile Lys Asn Leu Asp Gln Ala Phe Gln Val Lys Lys Pro
385 390 395 400
Pro Gly Gln Ala Val Pro Gln Val Pro Val Ile Gln Leu Phe Lys Ala
405 410 415
Leu Lys Gln Gln Asp Tyr Leu Ser Leu Pro Pro Trp Glu Val Asn Lys
420 425 430
Pro Gly Glu Val Cys
435
<210> 422
<211> 54
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S058
<400> 422
Lys Arg Phe Leu Arg Ile Gln Arg Leu Phe Pro Pro Val Pro Gln Ile
1 5 10 15
Lys Asp Lys Leu Asn Asp Asn His Glu Val Glu Asp Glu Ile Ile Trp
20 25 30
Glu Glu Phe Thr Pro Glu Glu Gly Lys Gly Tyr Arg Glu Glu Val Leu
35 40 45
Thr Val Lys Glu Ile Thr
50
<210> 423
<211> 64
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S059
<400> 423
Lys Arg Phe Leu Arg Ile Gln Arg Leu Phe Pro Pro Val Pro Gln Ile
1 5 10 15
Lys Asp Lys Leu Asn Asp Asn His Glu Val Glu Asp Glu Met Gly Pro
20 25 30
Gln Arg His His Arg Cys Gly Trp Asn Leu Tyr Pro Thr Pro Gly Pro
35 40 45
Ser Pro Gly Ser Gly Ser Ser Pro Arg Leu Gly Ser Glu Ser Ser Leu
50 55 60
<210> 424
<211> 186
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S062
<400> 424
Ser Pro Asn Arg Lys Asn Pro Leu Trp Pro Ser Val Pro Asp Pro Ala
1 5 10 15
His Ser Ser Leu Gly Ser Trp Val Pro Thr Ile Met Glu Glu Asp Ala
20 25 30
Phe Gln Leu Pro Gly Leu Gly Thr Pro Pro Ile Thr Lys Leu Thr Val
35 40 45
Leu Glu Glu Asp Glu Lys Lys Pro Val Pro Trp Glu Ser His Asn Ser
50 55 60
Ser Glu Thr Cys Gly Leu Pro Thr Leu Val Gln Thr Tyr Val Leu Gln
65 70 75 80
Gly Asp Pro Arg Ala Val Ser Thr Gln Pro Gln Ser Gln Ser Gly Thr
85 90 95
Ser Asp Gln Val Leu Tyr Gly Gln Leu Leu Gly Ser Pro Thr Ser Pro
100 105 110
Gly Pro Gly His Tyr Leu Arg Cys Asp Ser Thr Gln Pro Leu Leu Ala
115 120 125
Gly Leu Thr Pro Ser Pro Lys Ser Tyr Glu Asn Leu Trp Phe Gln Ala
130 135 140
Ser Pro Leu Gly Thr Leu Val Thr Pro Ala Pro Ser Gln Glu Asp Asp
145 150 155 160
Cys Val Phe Gly Pro Leu Leu Asn Phe Pro Leu Leu Gln Gly Ile Arg
165 170 175
Val His Gly Met Glu Ala Leu Gly Ser Phe
180 185
<210> 425
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S063
<400> 425
Ser Pro Asn Arg Lys Asn Pro Leu Trp Pro Ser Val Pro Asp Pro Ala
1 5 10 15
His Ser Ser Leu Gly Ser Trp Val Pro Thr Ile Met Glu Glu Leu Pro
20 25 30
Gly Pro Arg Gln Gly Gln Trp Leu Gly Gln Thr Ser Glu Met Ser Arg
35 40 45
Ala Leu Thr Pro His Pro Cys Val Gln Asp Ala Phe Gln Leu Pro Gly
50 55 60
Leu Gly Thr Pro Pro Ile Thr Lys Leu Thr Val Leu Glu Glu Asp Glu
65 70 75 80
Lys Lys Pro Val Pro Trp Glu Ser His Asn Ser Ser Glu Thr Cys Gly
85 90 95
Leu Pro Thr Leu Val Gln Thr Tyr Val Leu Gln Gly Asp Pro Arg Ala
100 105 110
Val Ser Thr Gln Pro Gln Ser Gln Ser Gly Thr Ser Asp Gln Val Leu
115 120 125
Tyr Gly Gln Leu Leu Gly Ser Pro Thr Ser Pro Gly Pro Gly His Tyr
130 135 140
Leu Arg Cys Asp Ser Thr Gln Pro Leu Leu Ala Gly Leu Thr Pro Ser
145 150 155 160
Pro Lys Ser Tyr Glu Asn Leu Trp Phe Gln Ala Ser Pro Leu Gly Thr
165 170 175
Leu Val Thr Pro Ala Pro Ser Gln Glu Asp Asp Cys Val Phe Gly Pro
180 185 190
Leu Leu Asn Phe Pro Leu Leu Gln Gly Ile Arg Val His Gly Met Glu
195 200 205
Ala Leu Gly Ser Phe
210
<210> 426
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S064
<400> 426
Ser Pro Asn Arg Lys Asn Pro Leu Trp Pro Ser Val Pro Asp Pro Ala
1 5 10 15
His Ser Ser Leu Gly Ser Trp Val Pro Thr Ile Met Glu Glu Asp Ala
20 25 30
Phe Gln Leu Pro Gly Leu Gly Thr Pro Pro Ile Thr Lys Leu Thr Val
35 40 45
Leu Glu Glu Asp Glu Lys Lys Pro Val Pro Trp Glu Ser His Asn Ser
50 55 60
Ser Glu Thr Cys Gly Leu Pro Thr Leu Val Gln Thr Tyr Val Leu Gln
65 70 75 80
Gly Asp Pro Arg Ala Val Ser Thr Gln Pro Gln Ser Gln Ser Gly Thr
85 90 95
Ser Asp Gln Ala Gly Pro Pro Arg Arg Ser Ala Tyr Phe Lys Asp Gln
100 105 110
Ile Met Leu His Pro Ala Pro Pro Asn Gly Leu Leu Cys Leu Phe Pro
115 120 125
Ile Thr Ser Val Leu
130
<210> 427
<211> 235
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S069
<400> 427
His Arg Arg Ala Leu Lys Gln Lys Ile Trp Pro Gly Ile Pro Ser Pro
1 5 10 15
Glu Ser Glu Phe Glu Gly Leu Phe Thr Thr His Lys Gly Asn Phe Gln
20 25 30
Leu Trp Leu Tyr Gln Asn Asp Gly Cys Leu Trp Trp Ser Pro Cys Thr
35 40 45
Pro Phe Thr Glu Asp Pro Pro Ala Ser Leu Glu Val Leu Ser Glu Arg
50 55 60
Cys Trp Gly Thr Met Gln Ala Val Glu Pro Gly Thr Asp Asp Glu Gly
65 70 75 80
Pro Leu Leu Glu Pro Val Gly Ser Glu His Ala Gln Asp Thr Tyr Leu
85 90 95
Val Leu Asp Lys Trp Leu Leu Pro Arg Asn Pro Pro Ser Glu Asp Leu
100 105 110
Pro Gly Pro Gly Gly Ser Val Asp Ile Val Ala Met Asp Glu Gly Ser
115 120 125
Glu Ala Ser Ser Cys Ser Ser Ala Leu Ala Ser Lys Pro Ser Pro Glu
130 135 140
Gly Ala Ser Ala Ala Ser Phe Glu Tyr Thr Ile Leu Asp Pro Ser Ser
145 150 155 160
Gln Leu Leu Arg Pro Trp Thr Leu Cys Pro Glu Leu Pro Pro Thr Pro
165 170 175
Pro His Leu Lys Tyr Leu Tyr Leu Val Val Ser Asp Ser Gly Ile Ser
180 185 190
Thr Asp Tyr Ser Ser Gly Asp Ser Gln Gly Ala Gln Gly Gly Leu Ser
195 200 205
Asp Gly Pro Tyr Ser Asn Pro Tyr Glu Asn Ser Leu Ile Pro Ala Ala
210 215 220
Glu Pro Leu Pro Pro Ser Tyr Val Ala Cys Ser
225 230 235
<210> 428
<211> 235
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S072
<400> 428
His Arg Arg Ala Leu Lys Gln Lys Ile Trp Pro Gly Ile Pro Ser Pro
1 5 10 15
Glu Ser Glu Phe Glu Gly Leu Phe Thr Thr His Lys Gly Asn Phe Gln
20 25 30
Leu Trp Leu Tyr Gln Asn Asp Gly Cys Leu Trp Trp Ser Pro Cys Thr
35 40 45
Pro Phe Thr Glu Asp Pro Pro Ala Ser Leu Glu Val Leu Ser Glu Arg
50 55 60
Cys Trp Gly Thr Met Gln Ala Val Glu Pro Gly Thr Asp Asp Glu Gly
65 70 75 80
Pro Leu Leu Glu Pro Val Gly Ser Glu His Ala Gln Asp Thr Tyr Leu
85 90 95
Val Leu Asp Lys Trp Leu Leu Pro Arg Asn Pro Pro Ser Glu Asp Leu
100 105 110
Pro Gly Pro Gly Gly Ser Val Asp Ile Val Ala Met Asp Glu Gly Ser
115 120 125
Glu Ala Ser Ser Cys Ser Ser Ala Leu Ala Ser Lys Pro Ser Pro Glu
130 135 140
Gly Ala Ser Ala Ala Ser Phe Glu Tyr Thr Ile Leu Asp Pro Ser Ser
145 150 155 160
Gln Leu Leu Arg Pro Trp Thr Leu Cys Pro Glu Leu Pro Pro Thr Pro
165 170 175
Pro His Leu Lys Phe Leu Phe Leu Val Val Ser Asp Ser Gly Ile Ser
180 185 190
Thr Asp Tyr Ser Ser Gly Asp Ser Gln Gly Ala Gln Gly Gly Leu Ser
195 200 205
Asp Gly Pro Tyr Ser Asn Pro Tyr Glu Asn Ser Leu Ile Pro Ala Ala
210 215 220
Glu Pro Leu Pro Pro Ser Tyr Val Ala Cys Ser
225 230 235
<210> 429
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S074
<400> 429
Arg Leu Lys Ile Gln Val Arg Lys Ala Ala Ile Thr Ser Tyr Glu Lys
1 5 10 15
Ser Asp Gly Val Tyr Thr Gly Leu Ser Thr Arg Asn Gln Glu Thr Tyr
20 25 30
Glu Thr Leu Lys His Glu Lys Pro Pro Gln
35 40
<210> 430
<211> 77
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S075
<400> 430
Cys Arg Lys Lys Arg Ile Ser Ala Asn Ser Thr Asp Pro Val Lys Ala
1 5 10 15
Ala Gln Phe Glu Pro Pro Gly Arg Gln Met Ile Ala Ile Arg Lys Arg
20 25 30
Gln Pro Glu Glu Thr Asn Asn Asp Tyr Glu Thr Ala Asp Gly Gly Tyr
35 40 45
Met Thr Leu Asn Pro Arg Ala Pro Thr Asp Asp Asp Lys Asn Ile Tyr
50 55 60
Leu Thr Leu Pro Pro Asn Asp His Val Asn Ser Asn Asn
65 70 75
<210> 431
<211> 77
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S076
<400> 431
Cys Arg Lys Lys Arg Ile Ser Ala Asn Ser Thr Asp Pro Val Lys Ala
1 5 10 15
Ala Gln Phe Glu Pro Pro Gly Arg Gln Met Ile Ala Ile Arg Lys Arg
20 25 30
Gln Leu Glu Glu Thr Asn Asn Asp Tyr Glu Thr Ala Asp Gly Gly Tyr
35 40 45
Met Thr Leu Asn Pro Arg Ala Pro Thr Asp Asp Asp Lys Asn Ile Tyr
50 55 60
Leu Thr Leu Pro Pro Asn Asp His Val Asn Ser Asn Asn
65 70 75
<210> 432
<211> 350
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S077
<400> 432
Lys Gln Gln Arg Ile Lys Met Leu Ile Leu Pro Pro Val Pro Val Pro
1 5 10 15
Lys Ile Lys Gly Ile Asp Pro Asp Leu Leu Lys Glu Gly Lys Leu Glu
20 25 30
Glu Val Asn Thr Ile Leu Ala Ile His Asp Ser Tyr Lys Pro Glu Phe
35 40 45
His Ser Asp Asp Ser Trp Val Glu Phe Ile Glu Leu Asp Ile Asp Glu
50 55 60
Pro Asp Glu Lys Thr Glu Glu Ser Asp Thr Asp Arg Leu Leu Ser Ser
65 70 75 80
Asp His Glu Lys Ser His Ser Asn Leu Gly Val Lys Asp Gly Asp Ser
85 90 95
Gly Arg Thr Ser Cys Cys Glu Pro Asp Ile Leu Glu Thr Asp Phe Asn
100 105 110
Ala Asn Asp Ile His Glu Gly Thr Ser Glu Val Ala Gln Pro Gln Arg
115 120 125
Leu Lys Gly Glu Ala Asp Leu Leu Cys Leu Asp Gln Lys Asn Gln Asn
130 135 140
Asn Ser Pro Tyr His Asp Ala Cys Pro Ala Thr Gln Gln Pro Ser Val
145 150 155 160
Ile Gln Ala Glu Lys Asn Lys Pro Gln Pro Leu Pro Thr Glu Gly Ala
165 170 175
Glu Ser Thr His Gln Ala Ala His Ile Gln Leu Ser Asn Pro Ser Ser
180 185 190
Leu Ser Asn Ile Asp Phe Tyr Ala Gln Val Ser Asp Ile Thr Pro Ala
195 200 205
Gly Ser Val Val Leu Ser Pro Gly Gln Lys Asn Lys Ala Gly Met Ser
210 215 220
Gln Cys Asp Met His Pro Glu Met Val Ser Leu Cys Gln Glu Asn Phe
225 230 235 240
Leu Met Asp Asn Ala Tyr Phe Cys Glu Ala Asp Ala Lys Lys Cys Ile
245 250 255
Pro Val Ala Pro His Ile Lys Val Glu Ser His Ile Gln Pro Ser Leu
260 265 270
Asn Gln Glu Asp Ile Tyr Ile Thr Thr Glu Ser Leu Thr Thr Ala Ala
275 280 285
Gly Arg Pro Gly Thr Gly Glu His Val Pro Gly Ser Glu Met Pro Val
290 295 300
Pro Asp Tyr Thr Ser Ile His Ile Val Gln Ser Pro Gln Gly Leu Ile
305 310 315 320
Leu Asn Ala Thr Ala Leu Pro Leu Pro Asp Lys Glu Phe Leu Ser Ser
325 330 335
Cys Gly Tyr Val Ser Thr Asp Gln Leu Asn Lys Ile Met Pro
340 345 350
<210> 433
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S080
<400> 433
Cys Trp Leu Thr Lys Lys Lys Tyr Ser Ser Ser Val His Asp Pro Asn
1 5 10 15
Gly Glu Tyr Met Phe Met Arg Ala Val Asn Thr Ala Lys Lys Ser Arg
20 25 30
Leu Thr Asp Val Thr Leu
35
<210> 434
<211> 100
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S081
<400> 434
Lys Val Phe Leu Arg Cys Ile Asn Tyr Val Phe Phe Pro Ser Leu Lys
1 5 10 15
Pro Ser Ser Ser Ile Asp Glu Tyr Phe Ser Glu Gln Pro Leu Lys Asn
20 25 30
Leu Leu Leu Ser Thr Ser Glu Glu Gln Ile Glu Lys Cys Phe Ile Ile
35 40 45
Glu Asn Ile Ser Thr Ile Ala Thr Val Glu Glu Thr Asn Gln Thr Asp
50 55 60
Glu Asp His Lys Lys Tyr Ser Ser Gln Thr Ser Gln Asp Ser Gly Asn
65 70 75 80
Tyr Ser Asn Glu Asp Glu Ser Glu Ser Lys Thr Ser Glu Glu Leu Gln
85 90 95
Gln Asp Phe Val
100
<210> 435
<211> 251
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S082
<400> 435
Lys Trp Ile Gly Tyr Ile Cys Leu Arg Asn Ser Leu Pro Lys Val Leu
1 5 10 15
Asn Phe His Asn Phe Leu Ala Trp Pro Phe Pro Asn Leu Pro Pro Leu
20 25 30
Glu Ala Met Asp Met Val Glu Val Ile Tyr Ile Asn Arg Lys Lys Lys
35 40 45
Val Trp Asp Tyr Asn Tyr Asp Asp Glu Ser Asp Ser Asp Thr Glu Ala
50 55 60
Ala Pro Arg Thr Ser Gly Gly Gly Tyr Thr Met His Gly Leu Thr Val
65 70 75 80
Arg Pro Leu Gly Gln Ala Ser Ala Thr Ser Thr Glu Ser Gln Leu Ile
85 90 95
Asp Pro Glu Ser Glu Glu Glu Pro Asp Leu Pro Glu Val Asp Val Glu
100 105 110
Leu Pro Thr Met Pro Lys Asp Ser Pro Gln Gln Leu Glu Leu Leu Ser
115 120 125
Gly Pro Cys Glu Arg Arg Lys Ser Pro Leu Gln Asp Pro Phe Pro Glu
130 135 140
Glu Asp Tyr Ser Ser Thr Glu Gly Ser Gly Gly Arg Ile Thr Phe Asn
145 150 155 160
Val Asp Leu Asn Ser Val Phe Leu Arg Val Leu Asp Asp Glu Asp Ser
165 170 175
Asp Asp Leu Glu Ala Pro Leu Met Leu Ser Ser His Leu Glu Glu Met
180 185 190
Val Asp Pro Glu Asp Pro Asp Asn Val Gln Ser Asn His Leu Leu Ala
195 200 205
Ser Gly Glu Gly Thr Gln Pro Thr Phe Pro Ser Pro Ser Ser Glu Gly
210 215 220
Leu Trp Ser Glu Asp Ala Pro Ser Asp Gln Ser Asp Thr Ser Glu Ser
225 230 235 240
Asp Val Asp Leu Gly Asp Gly Tyr Ile Met Arg
245 250
<210> 436
<211> 67
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S083
<400> 436
Lys Trp Ile Gly Tyr Ile Cys Leu Arg Asn Ser Leu Pro Lys Val Leu
1 5 10 15
Arg Gln Gly Leu Ala Lys Gly Trp Asn Ala Val Ala Ile His Arg Cys
20 25 30
Ser His Asn Ala Leu Gln Ser Glu Thr Pro Glu Leu Lys Gln Ser Ser
35 40 45
Cys Leu Ser Phe Pro Ser Ser Trp Asp Tyr Lys Arg Ala Ser Leu Cys
50 55 60
Pro Ser Asp
65
<210> 437
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S084
<400> 437
Cys Phe Tyr Ile Lys Lys Ile Asn Pro Leu Lys Glu Lys Ser Ile Ile
1 5 10 15
Leu Pro Lys Ser Leu Ile Ser Val Val Arg Ser Ala Thr Leu Glu Thr
20 25 30
Lys Pro Glu Ser Lys Tyr Val Ser Leu Ile Thr Ser Tyr Gln Pro Phe
35 40 45
Ser Leu Glu Lys Glu Val Val Cys Glu Glu Pro Leu Ser Pro Ala Thr
50 55 60
Val Pro Gly Met His Thr Glu Asp Asn Pro Gly Lys Val Glu His Thr
65 70 75 80
Glu Glu Leu Ser Ser Ile Thr Glu Val Val Thr Thr Glu Glu Asn Ile
85 90 95
Pro Asp Val Val Pro Gly Ser His Leu Thr Pro Ile Glu Arg Glu Ser
100 105 110
Ser Ser Pro Leu Ser Ser Asn Gln Ser Glu Pro Gly Ser Ile Ala Leu
115 120 125
Asn Ser Tyr His Ser Arg Asn Cys Ser Glu Ser Asp His Ser Arg Asn
130 135 140
Gly Phe Asp Thr Asp Ser Ser Cys Leu Glu Ser His Ser Ser Leu Ser
145 150 155 160
Asp Ser Glu Phe Pro Pro Asn Asn Lys Gly Glu Ile Lys Thr Glu Gly
165 170 175
Gln Glu Leu Ile Thr Val Ile Lys Ala Pro Thr Ser Phe Gly Tyr Asp
180 185 190
Lys Pro His Val Leu Val Asp Leu Leu Val Asp Asp Ser Gly Lys Glu
195 200 205
Ser Leu Ile Gly Tyr Arg Pro Thr Glu Asp Ser Lys Glu Phe Ser
210 215 220
<210> 438
<211> 69
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S085
<400> 438
Leu Val Leu Lys Tyr Arg Gly Leu Ile Lys Tyr Trp Phe His Thr Pro
1 5 10 15
Pro Ser Ile Pro Leu Gln Ile Glu Glu Tyr Leu Lys Asp Pro Thr Gln
20 25 30
Pro Ile Leu Glu Ala Leu Asp Lys Asp Ser Ser Pro Lys Asp Asp Val
35 40 45
Trp Asp Ser Val Ser Ile Ile Ser Phe Pro Glu Lys Glu Gln Glu Asp
50 55 60
Val Leu Gln Thr Leu
65
<210> 439
<211> 271
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S086
<400> 439
Lys Thr Leu Met Gly Asn Pro Trp Phe Gln Arg Ala Lys Met Pro Arg
1 5 10 15
Ala Leu Asp Phe Ser Gly His Thr His Pro Val Ala Thr Phe Gln Pro
20 25 30
Ser Arg Pro Glu Ser Val Asn Asp Leu Phe Leu Cys Pro Gln Lys Glu
35 40 45
Leu Thr Arg Gly Val Arg Pro Thr Pro Arg Val Arg Ala Pro Ala Thr
50 55 60
Gln Gln Thr Arg Trp Lys Lys Asp Leu Ala Glu Asp Glu Glu Glu Glu
65 70 75 80
Asp Glu Glu Asp Thr Glu Asp Gly Val Ser Phe Gln Pro Tyr Ile Glu
85 90 95
Pro Pro Ser Phe Leu Gly Gln Glu His Gln Ala Pro Gly His Ser Glu
100 105 110
Ala Gly Gly Val Asp Ser Gly Arg Pro Arg Ala Pro Leu Val Pro Ser
115 120 125
Glu Gly Ser Ser Ala Trp Asp Ser Ser Asp Arg Ser Trp Ala Ser Thr
130 135 140
Val Asp Ser Ser Trp Asp Arg Ala Gly Ser Ser Gly Tyr Leu Ala Glu
145 150 155 160
Lys Gly Pro Gly Gln Gly Pro Gly Gly Asp Gly His Gln Glu Ser Leu
165 170 175
Pro Pro Pro Glu Phe Ser Lys Asp Ser Gly Phe Leu Glu Glu Leu Pro
180 185 190
Glu Asp Asn Leu Ser Ser Trp Ala Thr Trp Gly Thr Leu Pro Pro Glu
195 200 205
Pro Asn Leu Val Pro Gly Gly Pro Pro Val Ser Leu Gln Thr Leu Thr
210 215 220
Phe Cys Trp Glu Ser Ser Pro Glu Glu Glu Glu Glu Ala Arg Glu Ser
225 230 235 240
Glu Ile Glu Asp Ser Asp Ala Gly Ser Trp Gly Ala Glu Ser Thr Gln
245 250 255
Arg Thr Glu Asp Arg Gly Arg Thr Leu Gly His Tyr Met Ala Arg
260 265 270
<210> 440
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S087
<400> 440
Lys Thr Leu Met Gly Asn Pro Trp Phe Gln Arg Ala Lys Met Pro Arg
1 5 10 15
Ala Leu Glu Leu Thr Arg Gly Val Arg Pro Thr Pro Arg Val Arg Ala
20 25 30
Pro Ala Thr Gln Gln Thr Arg Trp Lys Lys Asp Leu Ala Glu Asp Glu
35 40 45
Glu Glu Glu Asp Glu Glu Asp Thr Glu Asp Gly Val Ser Phe Gln Pro
50 55 60
Tyr Ile Glu Pro Pro Ser Phe Leu Gly Gln Glu His Gln Ala Pro Gly
65 70 75 80
His Ser Glu Ala Gly Gly Val Asp Ser Gly Arg Pro Arg Ala Pro Leu
85 90 95
Val Pro Ser Glu Gly Ser Ser Ala Trp Asp Ser Ser Asp Arg Ser Trp
100 105 110
Ala Ser Thr Val Asp Ser Ser Trp Asp Arg Ala Gly Ser Ser Gly Tyr
115 120 125
Leu Ala Glu Lys Gly Pro Gly Gln Gly Pro Gly Gly Asp Gly His Gln
130 135 140
Glu Ser Leu Pro Pro Pro Glu Phe Ser Lys Asp Ser Gly Phe Leu Glu
145 150 155 160
Glu Leu Pro Glu Asp Asn Leu Ser Ser Trp Ala Thr Trp Gly Thr Leu
165 170 175
Pro Pro Glu Pro Asn Leu Val Pro Gly Gly Pro Pro Val Ser Leu Gln
180 185 190
Thr Leu Thr Phe Cys Trp Glu Ser Ser Pro Glu Glu Glu Glu Glu Ala
195 200 205
Arg Glu Ser Glu Ile Glu Asp Ser Asp Ala Gly Ser Trp Gly Ala Glu
210 215 220
Ser Thr Gln Arg Thr Glu Asp Arg Gly Arg Thr Leu Gly His Tyr Met
225 230 235 240
Ala Arg
<210> 441
<211> 179
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S098
<400> 441
Lys Ile Asp Ile Val Leu Trp Tyr Arg Asp Ser Cys Tyr Asp Phe Leu
1 5 10 15
Pro Ile Lys Val Leu Pro Glu Val Leu Glu Lys Gln Cys Gly Tyr Lys
20 25 30
Leu Phe Ile Tyr Gly Arg Asp Asp Tyr Val Gly Glu Asp Ile Val Glu
35 40 45
Val Ile Asn Glu Asn Val Lys Lys Ser Arg Arg Leu Ile Ile Ile Leu
50 55 60
Val Arg Glu Thr Ser Gly Phe Ser Trp Leu Gly Gly Ser Ser Glu Glu
65 70 75 80
Gln Ile Ala Met Tyr Asn Ala Leu Val Gln Asp Gly Ile Lys Val Val
85 90 95
Leu Leu Glu Leu Glu Lys Ile Gln Asp Tyr Glu Lys Met Pro Glu Ser
100 105 110
Ile Lys Phe Ile Lys Gln Lys His Gly Ala Ile Arg Trp Ser Gly Asp
115 120 125
Phe Thr Gln Gly Pro Gln Ser Ala Lys Thr Arg Phe Trp Lys Asn Val
130 135 140
Arg Tyr His Met Pro Val Gln Arg Arg Ser Pro Ser Ser Lys His Gln
145 150 155 160
Leu Leu Ser Pro Ala Thr Lys Glu Lys Leu Gln Arg Glu Ala His Val
165 170 175
Pro Leu Gly
<210> 442
<211> 210
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S099
<400> 442
Lys Ile Asp Ile Val Leu Trp Tyr Arg Asp Ser Cys Tyr Asp Phe Leu
1 5 10 15
Pro Ile Lys Ala Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Asp Ala Tyr Ile Leu Tyr
20 25 30
Pro Lys Thr Val Gly Glu Gly Ser Thr Ser Asp Cys Asp Ile Phe Val
35 40 45
Phe Lys Val Leu Pro Glu Val Leu Glu Lys Gln Cys Gly Tyr Lys Leu
50 55 60
Phe Ile Tyr Gly Arg Asp Asp Tyr Val Gly Glu Asp Ile Val Glu Val
65 70 75 80
Ile Asn Glu Asn Val Lys Lys Ser Arg Arg Leu Ile Ile Ile Leu Val
85 90 95
Arg Glu Thr Ser Gly Phe Ser Trp Leu Gly Gly Ser Ser Glu Glu Gln
100 105 110
Ile Ala Met Tyr Asn Ala Leu Val Gln Asp Gly Ile Lys Val Val Leu
115 120 125
Leu Glu Leu Glu Lys Ile Gln Asp Tyr Glu Lys Met Pro Glu Ser Ile
130 135 140
Lys Phe Ile Lys Gln Lys His Gly Ala Ile Arg Trp Ser Gly Asp Phe
145 150 155 160
Thr Gln Gly Pro Gln Ser Ala Lys Thr Arg Phe Trp Lys Asn Val Arg
165 170 175
Tyr His Met Pro Val Gln Arg Arg Ser Pro Ser Ser Lys His Gln Leu
180 185 190
Leu Ser Pro Ala Thr Lys Glu Lys Leu Gln Arg Glu Ala His Val Pro
195 200 205
Leu Gly
210
<210> 443
<211> 182
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S100
<400> 443
Tyr Arg Ala His Phe Gly Thr Asp Glu Thr Ile Leu Asp Gly Lys Glu
1 5 10 15
Tyr Asp Ile Tyr Val Ser Tyr Ala Arg Asn Ala Glu Glu Glu Glu Phe
20 25 30
Val Leu Leu Thr Leu Arg Gly Val Leu Glu Asn Glu Phe Gly Tyr Lys
35 40 45
Leu Cys Ile Phe Asp Arg Asp Ser Leu Pro Gly Gly Ile Val Thr Asp
50 55 60
Glu Thr Leu Ser Phe Ile Gln Lys Ser Arg Arg Leu Leu Val Val Leu
65 70 75 80
Ser Pro Asn Tyr Val Leu Gln Gly Thr Gln Ala Leu Leu Glu Leu Lys
85 90 95
Ala Gly Leu Glu Asn Met Ala Ser Arg Gly Asn Ile Asn Val Ile Leu
100 105 110
Val Gln Tyr Lys Ala Val Lys Glu Thr Lys Val Lys Glu Leu Lys Arg
115 120 125
Ala Lys Thr Val Leu Thr Val Ile Lys Trp Lys Gly Glu Lys Ser Lys
130 135 140
Tyr Pro Gln Gly Arg Phe Trp Lys Gln Leu Gln Val Ala Met Pro Val
145 150 155 160
Lys Lys Ser Pro Arg Arg Ser Ser Ser Asp Glu Gln Gly Leu Ser Tyr
165 170 175
Ser Ser Leu Lys Asn Val
180
<210> 444
<211> 299
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S101
<400> 444
Tyr Arg Ala His Phe Gly Thr Asp Glu Thr Ile Leu Asp Gly Lys Glu
1 5 10 15
Tyr Asp Ile Tyr Val Ser Tyr Ala Arg Asn Ala Glu Glu Glu Glu Phe
20 25 30
Val Leu Leu Thr Leu Arg Gly Val Leu Glu Asn Glu Phe Gly Tyr Lys
35 40 45
Leu Cys Ile Phe Asp Arg Asp Ser Leu Pro Gly Gly Asn Thr Val Glu
50 55 60
Ala Val Phe Asp Phe Ile Gln Arg Ser Arg Arg Met Ile Val Val Leu
65 70 75 80
Ser Pro Asp Tyr Val Thr Glu Lys Ser Ile Ser Met Leu Glu Phe Lys
85 90 95
Leu Gly Val Met Cys Gln Asn Ser Ile Ala Thr Lys Leu Ile Val Val
100 105 110
Glu Tyr Arg Pro Leu Glu His Pro His Pro Gly Ile Leu Gln Leu Lys
115 120 125
Glu Ser Val Ser Phe Val Ser Trp Lys Gly Glu Lys Ser Lys His Ser
130 135 140
Gly Ser Lys Phe Trp Lys Ala Leu Arg Leu Ala Leu Pro Leu Arg Ser
145 150 155 160
Leu Ser Ala Ser Ser Gly Trp Asn Glu Ser Cys Ser Ser Gln Ser Asp
165 170 175
Ile Ser Leu Asp His Val Gln Arg Arg Arg Ser Arg Leu Lys Glu Pro
180 185 190
Pro Glu Leu Gln Ser Ser Glu Arg Ala Ala Gly Ser Pro Pro Ala Pro
195 200 205
Gly Thr Met Ser Lys His Arg Gly Lys Ser Ser Ala Thr Cys Arg Cys
210 215 220
Cys Val Thr Tyr Cys Glu Gly Glu Asn His Leu Arg Asn Lys Ser Arg
225 230 235 240
Ala Glu Ile His Asn Gln Pro Gln Trp Glu Thr His Leu Cys Lys Pro
245 250 255
Val Pro Gln Glu Ser Glu Thr Gln Trp Ile Gln Asn Gly Thr Arg Leu
260 265 270
Glu Pro Pro Ala Pro Gln Ile Ser Ala Leu Ala Leu His His Phe Thr
275 280 285
Asp Leu Ser Asn Asn Asn Asp Phe Tyr Ile Leu
290 295
<210> 445
<211> 207
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S102
<400> 445
Leu Lys Met Phe Trp Ile Glu Ala Thr Leu Leu Trp Arg Asp Ile Ala
1 5 10 15
Lys Pro Tyr Lys Thr Arg Asn Asp Gly Lys Leu Tyr Asp Ala Tyr Val
20 25 30
Val Tyr Pro Arg Asn Tyr Lys Ser Ser Thr Asp Gly Ala Ser Arg Val
35 40 45
Glu His Phe Val His Gln Ile Leu Pro Asp Val Leu Glu Asn Lys Cys
50 55 60
Gly Tyr Thr Leu Cys Ile Tyr Gly Arg Asp Met Leu Pro Gly Glu Asp
65 70 75 80
Val Val Thr Ala Val Glu Thr Asn Ile Arg Lys Ser Arg Arg His Ile
85 90 95
Phe Ile Leu Thr Pro Gln Ile Thr His Asn Lys Glu Phe Ala Tyr Glu
100 105 110
Gln Glu Val Ala Leu His Cys Ala Leu Ile Gln Asn Asp Ala Lys Val
115 120 125
Ile Leu Ile Glu Met Glu Ala Leu Ser Glu Leu Asp Met Leu Gln Ala
130 135 140
Glu Ala Leu Gln Asp Ser Leu Gln His Leu Met Lys Val Gln Gly Thr
145 150 155 160
Ile Lys Trp Arg Glu Asp His Ile Ala Asn Lys Arg Ser Leu Asn Ser
165 170 175
Lys Phe Trp Lys His Val Arg Tyr Gln Met Pro Val Pro Ser Lys Ile
180 185 190
Pro Arg Lys Ala Ser Ser Leu Thr Pro Leu Ala Ala Gln Lys Gln
195 200 205
<210> 446
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S103
<400> 446
Asn Ile Phe Lys Ile Asp Ile Val Leu Trp Tyr Arg Ser Ala Phe His
1 5 10 15
Ser Thr Glu Thr Ile Val Asp Gly Lys Leu Tyr Asp Ala Tyr Val Leu
20 25 30
Tyr Pro Lys Pro His Lys Glu Ser Gln Arg His Ala Val Asp Ala Leu
35 40 45
Val Leu Asn Ile Leu Pro Glu Val Leu Glu Arg Gln Cys Gly Tyr Lys
50 55 60
Leu Phe Ile Phe Gly Arg Asp Glu Phe Pro Gly Gln Ala Val Ala Asn
65 70 75 80
Val Ile Asp Glu Asn Val Lys Leu Cys Arg Arg Leu Ile Val Ile Val
85 90 95
Val Pro Glu Ser Leu Gly Phe Gly Leu Leu Lys Asn Leu Ser Glu Glu
100 105 110
Gln Ile Ala Val Tyr Ser Ala Leu Ile Gln Asp Gly Met Lys Val Ile
115 120 125
Leu Ile Glu Leu Glu Lys Ile Glu Asp Tyr Thr Val Met Pro Glu Ser
130 135 140
Ile Gln Tyr Ile Lys Gln Lys His Gly Ala Ile Arg Trp His Gly Asp
145 150 155 160
Phe Thr Glu Gln Ser Gln Cys Met Lys Thr Lys Phe Trp Lys Thr Val
165 170 175
Arg Tyr His Met Pro Pro Arg Arg Cys Arg Pro Phe Pro Pro Val Gln
180 185 190
Leu Leu Gln His Thr Pro Cys Tyr Arg Thr Ala Gly Pro Glu Leu Gly
195 200 205
Ser Arg Arg Lys Lys Cys Thr Leu Thr Thr Gly
210 215
<210> 447
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S104
<400> 447
Thr Trp Gln Arg Arg Gln Arg Lys Ser Arg Arg Thr Ile
1 5 10
<210> 448
<211> 286
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S105
<400> 448
Asn Cys Arg Asn Thr Gly Pro Trp Leu Lys Lys Val Leu Lys Cys Asn
1 5 10 15
Thr Pro Asp Pro Ser Lys Phe Phe Ser Gln Leu Ser Ser Glu His Gly
20 25 30
Gly Asp Val Gln Lys Trp Leu Ser Ser Pro Phe Pro Ser Ser Ser Phe
35 40 45
Ser Pro Gly Gly Leu Ala Pro Glu Ile Ser Pro Leu Glu Val Leu Glu
50 55 60
Arg Asp Lys Val Thr Gln Leu Leu Leu Gln Gln Asp Lys Val Pro Glu
65 70 75 80
Pro Ala Ser Leu Ser Ser Asn His Ser Leu Thr Ser Cys Phe Thr Asn
85 90 95
Gln Gly Tyr Phe Phe Phe His Leu Pro Asp Ala Leu Glu Ile Glu Ala
100 105 110
Cys Gln Val Tyr Phe Thr Tyr Asp Pro Tyr Ser Glu Glu Asp Pro Asp
115 120 125
Glu Gly Val Ala Gly Ala Pro Thr Gly Ser Ser Pro Gln Pro Leu Gln
130 135 140
Pro Leu Ser Gly Glu Asp Asp Ala Tyr Cys Thr Phe Pro Ser Arg Asp
145 150 155 160
Asp Leu Leu Leu Phe Ser Pro Ser Leu Leu Gly Gly Pro Ser Pro Pro
165 170 175
Ser Thr Ala Pro Gly Gly Ser Gly Ala Gly Glu Glu Arg Met Pro Pro
180 185 190
Ser Leu Gln Glu Arg Val Pro Arg Asp Trp Asp Pro Gln Pro Leu Gly
195 200 205
Pro Pro Thr Pro Gly Val Pro Asp Leu Val Asp Phe Gln Pro Pro Pro
210 215 220
Glu Leu Val Leu Arg Glu Ala Gly Glu Glu Val Pro Asp Ala Gly Pro
225 230 235 240
Arg Glu Gly Val Ser Phe Pro Trp Ser Arg Pro Pro Gly Gln Gly Glu
245 250 255
Phe Arg Ala Leu Asn Ala Arg Leu Pro Leu Asn Thr Asp Ala Tyr Leu
260 265 270
Ser Leu Gln Glu Leu Gln Gly Gln Asp Pro Thr His Leu Val
275 280 285
<210> 449
<211> 86
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S106
<400> 449
Glu Arg Thr Met Pro Arg Ile Pro Thr Leu Lys Asn Leu Glu Asp Leu
1 5 10 15
Val Thr Glu Tyr His Gly Asn Phe Ser Ala Trp Ser Gly Val Ser Lys
20 25 30
Gly Leu Ala Glu Ser Leu Gln Pro Asp Tyr Ser Glu Arg Leu Cys Leu
35 40 45
Val Ser Glu Ile Pro Pro Lys Gly Gly Ala Leu Gly Glu Gly Pro Gly
50 55 60
Ala Ser Pro Cys Asn Gln His Ser Pro Tyr Trp Ala Pro Pro Cys Tyr
65 70 75 80
Thr Leu Lys Pro Glu Thr
85
<210> 450
<211> 53
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S109
<400> 450
Arg Arg Tyr Leu Val Met Gln Arg Leu Phe Pro Arg Ile Pro His Met
1 5 10 15
Lys Asp Pro Ile Gly Asp Ser Phe Gln Asn Asp Lys Leu Val Val Trp
20 25 30
Glu Ala Gly Lys Ala Gly Leu Glu Glu Cys Leu Val Thr Glu Val Gln
35 40 45
Val Val Gln Lys Thr
50
<210> 451
<211> 569
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S110
<400> 451
Lys Ile Lys Lys Glu Trp Trp Asp Gln Ile Pro Asn Pro Ala Arg Ser
1 5 10 15
Arg Leu Val Ala Ile Ile Ile Gln Asp Ala Gln Gly Ser Gln Trp Glu
20 25 30
Lys Arg Ser Arg Gly Gln Glu Pro Ala Lys Cys Pro His Trp Lys Asn
35 40 45
Cys Leu Thr Lys Leu Leu Pro Cys Phe Leu Glu His Asn Met Lys Arg
50 55 60
Asp Glu Asp Pro His Lys Ala Ala Lys Glu Met Pro Phe Gln Gly Ser
65 70 75 80
Gly Lys Ser Ala Trp Cys Pro Val Glu Ile Ser Lys Thr Val Leu Trp
85 90 95
Pro Glu Ser Ile Ser Val Val Arg Cys Val Glu Leu Phe Glu Ala Pro
100 105 110
Val Glu Cys Glu Glu Glu Glu Glu Val Glu Glu Glu Lys Gly Ser Phe
115 120 125
Cys Ala Ser Pro Glu Ser Ser Arg Asp Asp Phe Gln Glu Gly Arg Glu
130 135 140
Gly Ile Val Ala Arg Leu Thr Glu Ser Leu Phe Leu Asp Leu Leu Gly
145 150 155 160
Glu Glu Asn Gly Gly Phe Cys Gln Gln Asp Met Gly Glu Ser Cys Leu
165 170 175
Leu Pro Pro Ser Gly Ser Thr Ser Ala His Met Pro Trp Asp Glu Phe
180 185 190
Pro Ser Ala Gly Pro Lys Glu Ala Pro Pro Trp Gly Lys Glu Gln Pro
195 200 205
Leu His Leu Glu Pro Ser Pro Pro Ala Ser Pro Thr Gln Ser Pro Asp
210 215 220
Asn Leu Thr Cys Thr Glu Thr Pro Leu Val Ile Ala Gly Asn Pro Ala
225 230 235 240
Tyr Arg Ser Phe Ser Asn Ser Leu Ser Gln Ser Pro Cys Pro Arg Glu
245 250 255
Leu Gly Pro Asp Pro Leu Leu Ala Arg His Leu Glu Glu Val Glu Pro
260 265 270
Glu Met Pro Cys Val Pro Gln Leu Ser Glu Pro Thr Thr Val Pro Gln
275 280 285
Pro Glu Pro Glu Thr Trp Glu Gln Ile Leu Arg Arg Asn Val Leu Gln
290 295 300
His Gly Ala Ala Ala Ala Pro Val Ser Ala Pro Thr Ser Gly Tyr Gln
305 310 315 320
Glu Phe Val His Ala Val Glu Gln Gly Gly Thr Gln Ala Ser Ala Val
325 330 335
Val Gly Leu Gly Pro Pro Gly Glu Ala Gly Tyr Lys Ala Phe Ser Ser
340 345 350
Leu Leu Ala Ser Ser Ala Val Ser Pro Glu Lys Cys Gly Phe Gly Ala
355 360 365
Ser Ser Gly Glu Glu Gly Tyr Lys Pro Phe Gln Asp Leu Ile Pro Gly
370 375 380
Cys Pro Gly Asp Pro Ala Pro Val Pro Val Pro Leu Phe Thr Phe Gly
385 390 395 400
Leu Asp Arg Glu Pro Pro Arg Ser Pro Gln Ser Ser His Leu Pro Ser
405 410 415
Ser Ser Pro Glu His Leu Gly Leu Glu Pro Gly Glu Lys Val Glu Asp
420 425 430
Met Pro Lys Pro Pro Leu Pro Gln Glu Gln Ala Thr Asp Pro Leu Val
435 440 445
Asp Ser Leu Gly Ser Gly Ile Val Tyr Ser Ala Leu Thr Cys His Leu
450 455 460
Cys Gly His Leu Lys Gln Cys His Gly Gln Glu Asp Gly Gly Gln Thr
465 470 475 480
Pro Val Met Ala Ser Pro Cys Cys Gly Cys Cys Cys Gly Asp Arg Ser
485 490 495
Ser Pro Pro Thr Thr Pro Leu Arg Ala Pro Asp Pro Ser Pro Gly Gly
500 505 510
Val Pro Leu Glu Ala Ser Leu Cys Pro Ala Ser Leu Ala Pro Ser Gly
515 520 525
Ile Ser Glu Lys Ser Lys Ser Ser Ser Ser Phe His Pro Ala Pro Gly
530 535 540
Asn Ala Gln Ser Ser Ser Gln Thr Pro Lys Ile Val Asn Phe Val Ser
545 550 555 560
Val Gly Pro Thr Tyr Met Arg Val Ser
565
<210> 452
<211> 569
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S113
<400> 452
Lys Ile Lys Lys Glu Trp Trp Asp Gln Ile Pro Asn Pro Ala Arg Ser
1 5 10 15
Arg Leu Val Ala Ile Ile Ile Gln Asp Ala Gln Gly Ser Gln Trp Glu
20 25 30
Lys Arg Ser Arg Gly Gln Glu Pro Ala Lys Cys Pro His Trp Lys Asn
35 40 45
Cys Leu Thr Lys Leu Leu Pro Cys Phe Leu Glu His Asn Met Lys Arg
50 55 60
Asp Glu Asp Pro His Lys Ala Ala Lys Glu Met Pro Phe Gln Gly Ser
65 70 75 80
Gly Lys Ser Ala Trp Cys Pro Val Glu Ile Ser Lys Thr Val Leu Trp
85 90 95
Pro Glu Ser Ile Ser Val Val Arg Cys Val Glu Leu Phe Glu Ala Pro
100 105 110
Val Glu Cys Glu Glu Glu Glu Glu Val Glu Glu Glu Lys Gly Ser Phe
115 120 125
Cys Ala Ser Pro Glu Ser Ser Arg Asp Asp Phe Gln Glu Gly Arg Glu
130 135 140
Gly Ile Val Ala Arg Leu Thr Glu Ser Leu Phe Leu Asp Leu Leu Gly
145 150 155 160
Glu Glu Asn Gly Gly Phe Cys Gln Gln Asp Met Gly Glu Ser Cys Leu
165 170 175
Leu Pro Pro Ser Gly Ser Thr Ser Ala His Met Pro Trp Asp Glu Phe
180 185 190
Pro Ser Ala Gly Pro Lys Glu Ala Pro Pro Trp Gly Lys Glu Gln Pro
195 200 205
Leu His Leu Glu Pro Ser Pro Pro Ala Ser Pro Thr Gln Ser Pro Asp
210 215 220
Asn Leu Thr Cys Thr Glu Thr Pro Leu Val Ile Ala Gly Asn Pro Ala
225 230 235 240
Tyr Arg Ser Phe Ser Asn Ser Leu Ser Gln Ser Pro Cys Pro Arg Glu
245 250 255
Leu Gly Pro Asp Pro Leu Leu Ala Arg His Leu Glu Glu Val Glu Pro
260 265 270
Glu Met Pro Cys Val Pro Gln Leu Ser Glu Pro Thr Thr Val Pro Gln
275 280 285
Pro Glu Pro Glu Thr Trp Glu Gln Ile Leu Arg Arg Asn Val Leu Gln
290 295 300
His Gly Ala Ala Ala Ala Pro Val Ser Ala Pro Thr Ser Gly Tyr Gln
305 310 315 320
Glu Phe Val His Ala Val Glu Gln Gly Gly Thr Gln Ala Ser Ala Val
325 330 335
Val Gly Leu Gly Pro Pro Gly Glu Ala Gly Tyr Lys Ala Phe Ser Ser
340 345 350
Leu Leu Ala Ser Ser Ala Val Ser Pro Glu Lys Cys Gly Phe Gly Ala
355 360 365
Ser Ser Gly Glu Glu Gly Tyr Lys Pro Phe Gln Asp Leu Ile Pro Gly
370 375 380
Cys Pro Gly Asp Pro Ala Pro Val Pro Val Pro Leu Phe Thr Phe Gly
385 390 395 400
Leu Asp Arg Glu Pro Pro Arg Ser Pro Gln Ser Ser His Leu Pro Ser
405 410 415
Ser Ser Pro Glu His Leu Gly Leu Glu Pro Gly Glu Lys Val Glu Asp
420 425 430
Met Pro Lys Pro Pro Leu Pro Gln Glu Gln Ala Thr Asp Pro Leu Val
435 440 445
Asp Ser Leu Gly Ser Gly Ile Val Phe Ser Ala Leu Thr Cys His Leu
450 455 460
Cys Gly His Leu Lys Gln Cys His Gly Gln Glu Asp Gly Gly Gln Thr
465 470 475 480
Pro Val Met Ala Ser Pro Cys Cys Gly Cys Cys Cys Gly Asp Arg Ser
485 490 495
Ser Pro Pro Thr Thr Pro Leu Arg Ala Pro Asp Pro Ser Pro Gly Gly
500 505 510
Val Pro Leu Glu Ala Ser Leu Cys Pro Ala Ser Leu Ala Pro Ser Gly
515 520 525
Ile Ser Glu Lys Ser Lys Ser Ser Ser Ser Phe His Pro Ala Pro Gly
530 535 540
Asn Ala Gln Ser Ser Ser Gln Thr Pro Lys Ile Val Asn Phe Val Ser
545 550 555 560
Val Gly Pro Thr Tyr Met Arg Val Ser
565
<210> 453
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S115
<400> 453
Lys Ile Cys His Leu Trp Ile Lys Leu Phe Pro Pro Ile Pro Ala Pro
1 5 10 15
Lys Ser Asn Ile Lys Asp Leu Phe Val Thr Thr Asn Tyr Glu Lys Ala
20 25 30
Gly Ser Ser Glu Thr Glu Ile Glu Val Ile Cys Tyr Ile Glu Lys Pro
35 40 45
Gly Val Glu Thr Leu Glu Asp Ser Val Phe
50 55
<210> 454
<211> 82
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S116
<400> 454
Arg Phe Lys Lys Thr Trp Lys Leu Arg Ala Leu Lys Glu Gly Lys Thr
1 5 10 15
Ser Met His Pro Pro Tyr Ser Leu Gly Gln Leu Val Pro Glu Arg Pro
20 25 30
Arg Pro Thr Pro Val Leu Val Pro Leu Ile Ser Pro Pro Val Ser Pro
35 40 45
Ser Ser Leu Gly Ser Asp Asn Thr Ser Ser His Asn Arg Pro Asp Ala
50 55 60
Arg Asp Pro Arg Ser Pro Tyr Asp Ile Ser Asn Thr Asp Tyr Phe Phe
65 70 75 80
Pro Arg
<210> 455
<211> 277
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S117
<400> 455
Asn Lys Arg Asp Leu Ile Lys Lys His Ile Trp Pro Asn Val Pro Asp
1 5 10 15
Pro Ser Lys Ser His Ile Ala Gln Trp Ser Pro His Thr Pro Pro Arg
20 25 30
His Asn Phe Asn Ser Lys Asp Gln Met Tyr Ser Asp Gly Asn Phe Thr
35 40 45
Asp Val Ser Val Val Glu Ile Glu Ala Asn Asp Lys Lys Pro Phe Pro
50 55 60
Glu Asp Leu Lys Ser Leu Asp Leu Phe Lys Lys Glu Lys Ile Asn Thr
65 70 75 80
Glu Gly His Ser Ser Gly Ile Gly Gly Ser Ser Cys Met Ser Ser Ser
85 90 95
Arg Pro Ser Ile Ser Ser Ser Asp Glu Asn Glu Ser Ser Gln Asn Thr
100 105 110
Ser Ser Thr Val Gln Tyr Ser Thr Val Val His Ser Gly Tyr Arg His
115 120 125
Gln Val Pro Ser Val Gln Val Phe Ser Arg Ser Glu Ser Thr Gln Pro
130 135 140
Leu Leu Asp Ser Glu Glu Arg Pro Glu Asp Leu Gln Leu Val Asp His
145 150 155 160
Val Asp Gly Gly Asp Gly Ile Leu Pro Arg Gln Gln Tyr Phe Lys Gln
165 170 175
Asn Cys Ser Gln His Glu Ser Ser Pro Asp Ile Ser His Phe Glu Arg
180 185 190
Ser Lys Gln Val Ser Ser Val Asn Glu Glu Asp Phe Val Arg Leu Lys
195 200 205
Gln Gln Ile Ser Asp His Ile Ser Gln Ser Cys Gly Ser Gly Gln Met
210 215 220
Lys Met Phe Gln Glu Val Ser Ala Ala Asp Ala Phe Gly Pro Gly Thr
225 230 235 240
Glu Gly Gln Val Glu Arg Phe Glu Thr Val Gly Met Glu Ala Ala Thr
245 250 255
Asp Glu Gly Met Pro Lys Ser Tyr Leu Pro Gln Thr Val Arg Gln Gly
260 265 270
Gly Tyr Met Pro Gln
275
<210> 456
<211> 196
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S120
<400> 456
Trp Lys Lys Arg Ile Lys Pro Ile Val Trp Pro Ser Leu Pro Asp His
1 5 10 15
Lys Lys Thr Leu Glu His Leu Cys Lys Lys Pro Arg Lys Asn Leu Asn
20 25 30
Val Ser Phe Asn Pro Glu Ser Phe Leu Asp Cys Gln Ile His Arg Val
35 40 45
Asp Asp Ile Gln Ala Arg Asp Glu Val Glu Gly Phe Leu Gln Asp Thr
50 55 60
Phe Pro Gln Gln Leu Glu Glu Ser Glu Lys Gln Arg Leu Gly Gly Asp
65 70 75 80
Val Gln Ser Pro Asn Cys Pro Ser Glu Asp Val Val Ile Thr Pro Glu
85 90 95
Ser Phe Gly Arg Asp Ser Ser Leu Thr Cys Leu Ala Gly Asn Val Ser
100 105 110
Ala Cys Asp Ala Pro Ile Leu Ser Ser Ser Arg Ser Leu Asp Cys Arg
115 120 125
Glu Ser Gly Lys Asn Gly Pro His Val Tyr Gln Asp Leu Leu Leu Ser
130 135 140
Leu Gly Thr Thr Asn Ser Thr Leu Pro Pro Pro Phe Ser Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Ile Leu Thr Leu Asn Pro Val Ala Gln Gly Gln Pro Ile Leu Thr
165 170 175
Ser Leu Gly Ser Asn Gln Glu Glu Ala Tyr Val Thr Met Ser Ser Phe
180 185 190
Tyr Gln Asn Gln
195
<210> 457
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S121
<400> 457
Trp Lys Lys Arg Ile Lys Pro Ile Val Trp Pro Ser Leu Pro Asp His
1 5 10 15
Lys Lys Thr Leu Glu His Leu Cys Lys Lys Pro Arg Lys Val Ser Val
20 25 30
Phe Gly Ala
35
<210> 458
<211> 230
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S126
<400> 458
Lys Leu Ser Pro Arg Val Lys Arg Ile Phe Tyr Gln Asn Val Pro Ser
1 5 10 15
Pro Ala Met Phe Phe Gln Pro Leu Tyr Ser Val His Asn Gly Asn Phe
20 25 30
Gln Thr Trp Met Gly Ala His Gly Ala Gly Val Leu Leu Ser Gln Asp
35 40 45
Cys Ala Gly Thr Pro Gln Gly Ala Leu Glu Pro Cys Val Gln Glu Ala
50 55 60
Thr Ala Leu Leu Thr Cys Gly Pro Ala Arg Pro Trp Lys Ser Val Ala
65 70 75 80
Leu Glu Glu Glu Gln Glu Gly Pro Gly Thr Arg Leu Pro Gly Asn Leu
85 90 95
Ser Ser Glu Asp Val Leu Pro Ala Gly Cys Thr Glu Trp Arg Val Gln
100 105 110
Thr Leu Ala Tyr Leu Pro Gln Glu Asp Trp Ala Pro Thr Ser Leu Thr
115 120 125
Arg Pro Ala Pro Pro Asp Ser Glu Gly Ser Arg Ser Ser Ser Ser Ser
130 135 140
Ser Ser Ser Asn Asn Asn Asn Tyr Cys Ala Leu Gly Cys Tyr Gly Gly
145 150 155 160
Trp His Leu Ser Ala Leu Pro Gly Asn Thr Gln Ser Ser Gly Pro Ile
165 170 175
Pro Ala Leu Ala Cys Gly Leu Ser Cys Asp His Gln Gly Leu Glu Thr
180 185 190
Gln Gln Gly Val Ala Trp Val Leu Ala Gly His Cys Gln Arg Pro Gly
195 200 205
Leu His Glu Asp Leu Gln Gly Met Leu Leu Pro Ser Val Leu Ser Lys
210 215 220
Ala Arg Ser Trp Thr Phe
225 230
<210> 459
<211> 322
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S129
<400> 459
Gln Leu Tyr Val Arg Arg Arg Lys Lys Leu Pro Ser Val Leu Leu Phe
1 5 10 15
Lys Lys Pro Ser Pro Phe Ile Phe Ile Ser Gln Arg Pro Ser Pro Glu
20 25 30
Thr Gln Asp Thr Ile His Pro Leu Asp Glu Glu Ala Phe Leu Lys Val
35 40 45
Ser Pro Glu Leu Lys Asn Leu Asp Leu His Gly Ser Thr Asp Ser Gly
50 55 60
Phe Gly Ser Thr Lys Pro Ser Leu Gln Thr Glu Glu Pro Gln Phe Leu
65 70 75 80
Leu Pro Asp Pro His Pro Gln Ala Asp Arg Thr Leu Gly Asn Arg Glu
85 90 95
Pro Pro Val Leu Gly Asp Ser Cys Ser Ser Gly Ser Ser Asn Ser Thr
100 105 110
Asp Ser Gly Ile Cys Leu Gln Glu Pro Ser Leu Ser Pro Ser Thr Gly
115 120 125
Pro Thr Trp Glu Gln Gln Val Gly Ser Asn Ser Arg Gly Gln Asp Asp
130 135 140
Ser Gly Ile Asp Leu Val Gln Asn Ser Glu Gly Arg Ala Gly Asp Thr
145 150 155 160
Gln Gly Gly Ser Ala Leu Gly His His Ser Pro Pro Glu Pro Glu Val
165 170 175
Pro Gly Glu Glu Asp Pro Ala Ala Val Ala Phe Gln Gly Tyr Leu Arg
180 185 190
Gln Thr Arg Cys Ala Glu Glu Lys Ala Thr Lys Thr Gly Cys Leu Glu
195 200 205
Glu Glu Ser Pro Leu Thr Asp Gly Leu Gly Pro Lys Phe Gly Arg Cys
210 215 220
Leu Val Asp Glu Ala Gly Leu His Pro Pro Ala Leu Ala Lys Gly Tyr
225 230 235 240
Leu Lys Gln Asp Pro Leu Glu Met Thr Leu Ala Ser Ser Gly Ala Pro
245 250 255
Thr Gly Gln Trp Asn Gln Pro Thr Glu Glu Trp Ser Leu Leu Ala Leu
260 265 270
Ser Ser Cys Ser Asp Leu Gly Ile Ser Asp Trp Ser Phe Ala His Asp
275 280 285
Leu Ala Pro Leu Gly Cys Val Ala Ala Pro Gly Gly Leu Leu Gly Ser
290 295 300
Phe Asn Ser Asp Leu Val Thr Leu Pro Leu Ile Ser Ser Leu Gln Ser
305 310 315 320
Ser Glu
<210> 460
<211> 83
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S130
<400> 460
Ala Leu Leu Trp Cys Val Tyr Lys Lys Thr Lys Tyr Ala Phe Ser Pro
1 5 10 15
Arg Asn Ser Leu Pro Gln His Leu Lys Glu Phe Leu Gly His Pro His
20 25 30
His Asn Thr Leu Leu Phe Phe Ser Phe Pro Leu Ser Asp Glu Asn Asp
35 40 45
Val Phe Asp Lys Leu Ser Val Ile Ala Glu Asp Ser Glu Ser Gly Lys
50 55 60
Gln Asn Pro Gly Asp Ser Cys Ser Leu Gly Thr Pro Pro Gly Gln Gly
65 70 75 80
Pro Gln Ser
<210> 461
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S135
<400> 461
Arg Leu Arg Arg Gly Gly Lys Asp Gly Ser Pro Lys Pro Gly Phe Leu
1 5 10 15
Ala Ser Val Ile Pro Val Asp Arg Arg Pro Gly Ala Pro Asn Leu
20 25 30
<210> 462
<211> 92
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S136
<400> 462
Asn Arg Ala Ala Arg His Leu Cys Pro Pro Leu Pro Thr Pro Cys Ala
1 5 10 15
Ser Ser Ala Ile Glu Phe Pro Gly Gly Lys Glu Thr Trp Gln Trp Ile
20 25 30
Asn Pro Val Asp Phe Gln Glu Glu Ala Ser Leu Gln Glu Ala Leu Val
35 40 45
Val Glu Met Ser Trp Asp Lys Gly Glu Arg Thr Glu Pro Leu Glu Lys
50 55 60
Thr Glu Leu Pro Glu Gly Ala Pro Glu Leu Ala Leu Asp Thr Glu Leu
65 70 75 80
Ser Leu Glu Asp Gly Asp Arg Cys Lys Ala Lys Met
85 90
<210> 463
<211> 90
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S137
<400> 463
Asn Arg Ala Ala Arg His Leu Cys Pro Pro Leu Pro Thr Pro Cys Ala
1 5 10 15
Ser Ser Ala Ile Glu Phe Pro Gly Gly Lys Glu Thr Trp Gln Trp Ile
20 25 30
Asn Pro Val Asp Phe Gln Glu Glu Ala Ser Leu Gln Glu Ala Leu Val
35 40 45
Val Glu Met Ser Trp Asp Lys Gly Glu Arg Thr Glu Pro Leu Glu Lys
50 55 60
Thr Glu Leu Pro Glu Gly Ala Pro Glu Leu Ala Leu Asp Thr Glu Leu
65 70 75 80
Ser Leu Glu Asp Gly Asp Arg Cys Asp Arg
85 90
<210> 464
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S138
<400> 464
His Tyr Phe Gln Gln Lys Val Phe Val Leu Leu Ala Ala Leu Arg Pro
1 5 10 15
Gln Trp Cys Ser Arg Glu Ile Pro Asp Pro Ala Asn Ser Thr Cys Ala
20 25 30
Lys Lys Tyr Pro Ile Ala Glu Glu Lys Thr Gln Leu Pro Leu Asp Arg
35 40 45
Leu Leu Ile Asp Trp Pro Thr Pro Glu Asp Pro Glu Pro Leu Val Ile
50 55 60
Ser Glu Val Leu His Gln Val Thr Pro Val Phe Arg His Pro Pro Cys
65 70 75 80
Ser Asn Trp Pro Gln Arg Glu Lys Gly Ile Gln Gly His Gln Ala Ser
85 90 95
Glu Lys Asp Met Met His Ser Ala Ser Ser Pro Pro Pro Pro Arg Ala
100 105 110
Leu Gln Ala Glu Ser Arg Gln Leu Val Asp Leu Tyr Lys Val Leu Glu
115 120 125
Ser Arg Gly Ser Asp Pro Lys Pro Glu Asn Pro Ala Cys Pro Trp Thr
130 135 140
Val Leu Pro Ala Gly Asp Leu Pro Thr His Asp Gly Tyr Leu Pro Ser
145 150 155 160
Asn Ile Asp Asp Leu Pro Ser His Glu Ala Pro Leu Ala Asp Ser Leu
165 170 175
Glu Glu Leu Glu Pro Gln His Ile Ser Leu Ser Val Phe Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu His Pro Leu Thr Phe Ser Cys Gly Asp Lys Leu Thr Leu Asp
195 200 205
Gln Leu Lys Met Arg Cys Asp Ser Leu Met Leu
210 215
<210> 465
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S141
<400> 465
Lys Arg Leu Lys Ile Ile Ile Phe Pro Pro Ile Pro Asp Pro Gly Lys
1 5 10 15
Ile Phe Lys Glu Met Phe Gly Asp Gln Asn Asp Asp Thr Leu His Trp
20 25 30
Lys Lys Tyr Asp Ile Tyr Glu Lys Gln Thr Lys Glu Glu Thr Asp Ser
35 40 45
Val Val Leu Ile Glu Asn Leu Lys Lys Ala Ser Gln
50 55 60
<210> 466
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S142
<400> 466
Arg Lys Pro Asn Thr Tyr Pro Lys Met Ile Pro Glu Phe Phe Cys Asp
1 5 10 15
Thr
<210> 467
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S143
<400> 467
Lys Ser Arg Gln Thr Pro Pro Leu Ala Ser Val Glu Met Glu Ala Met
1 5 10 15
Glu Ala Leu Pro Val Thr Trp Gly Thr Ser Ser Arg Asp Glu Asp Leu
20 25 30
Glu Asn Cys Ser His His Leu
35
<210> 468
<211> 525
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S144
<400> 468
Cys Met Thr Trp Arg Leu Ala Gly Pro Gly Ser Glu Lys Tyr Ser Asp
1 5 10 15
Asp Thr Lys Tyr Thr Asp Gly Leu Pro Ala Ala Asp Leu Ile Pro Pro
20 25 30
Pro Leu Lys Pro Arg Lys Val Trp Ile Ile Tyr Ser Ala Asp His Pro
35 40 45
Leu Tyr Val Asp Val Val Leu Lys Phe Ala Gln Phe Leu Leu Thr Ala
50 55 60
Cys Gly Thr Glu Val Ala Leu Asp Leu Leu Glu Glu Gln Ala Ile Ser
65 70 75 80
Glu Ala Gly Val Met Thr Trp Val Gly Arg Gln Lys Gln Glu Met Val
85 90 95
Glu Ser Asn Ser Lys Ile Ile Val Leu Cys Ser Arg Gly Thr Arg Ala
100 105 110
Lys Trp Gln Ala Leu Leu Gly Arg Gly Ala Pro Val Arg Leu Arg Cys
115 120 125
Asp His Gly Lys Pro Val Gly Asp Leu Phe Thr Ala Ala Met Asn Met
130 135 140
Ile Leu Pro Asp Phe Lys Arg Pro Ala Cys Phe Gly Thr Tyr Val Val
145 150 155 160
Cys Tyr Phe Ser Glu Val Ser Cys Asp Gly Asp Val Pro Asp Leu Phe
165 170 175
Gly Ala Ala Pro Arg Tyr Pro Leu Met Asp Arg Phe Glu Glu Val Tyr
180 185 190
Phe Arg Ile Gln Asp Leu Glu Met Phe Gln Pro Gly Arg Met His Arg
195 200 205
Val Gly Glu Leu Ser Gly Asp Asn Tyr Leu Arg Ser Pro Gly Gly Arg
210 215 220
Gln Leu Arg Ala Ala Leu Asp Arg Phe Arg Asp Trp Gln Val Arg Cys
225 230 235 240
Pro Asp Trp Phe Glu Cys Glu Asn Leu Tyr Ser Ala Asp Asp Gln Asp
245 250 255
Ala Pro Ser Leu Asp Glu Glu Val Phe Glu Glu Pro Leu Leu Pro Pro
260 265 270
Gly Thr Gly Ile Val Lys Arg Ala Pro Leu Val Arg Glu Pro Gly Ser
275 280 285
Gln Ala Cys Leu Ala Ile Asp Pro Leu Val Gly Glu Glu Gly Gly Ala
290 295 300
Ala Val Ala Lys Leu Glu Pro His Leu Gln Pro Arg Gly Gln Pro Ala
305 310 315 320
Pro Gln Pro Leu His Thr Leu Val Leu Ala Ala Glu Glu Gly Ala Leu
325 330 335
Val Ala Ala Val Glu Pro Gly Pro Leu Ala Asp Gly Ala Ala Val Arg
340 345 350
Leu Ala Leu Ala Gly Glu Gly Glu Ala Cys Pro Leu Leu Gly Ser Pro
355 360 365
Gly Ala Gly Arg Asn Ser Val Leu Phe Leu Pro Val Asp Pro Glu Asp
370 375 380
Ser Pro Leu Gly Ser Ser Thr Pro Met Ala Ser Pro Asp Leu Leu Pro
385 390 395 400
Glu Asp Val Arg Glu His Leu Glu Gly Leu Met Leu Ser Leu Phe Glu
405 410 415
Gln Ser Leu Ser Cys Gln Ala Gln Gly Gly Cys Ser Arg Pro Ala Met
420 425 430
Val Leu Thr Asp Pro His Thr Pro Tyr Glu Glu Glu Gln Arg Gln Ser
435 440 445
Val Gln Ser Asp Gln Gly Tyr Ile Ser Arg Ser Ser Pro Gln Pro Pro
450 455 460
Glu Gly Leu Thr Glu Met Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Gln Asp Pro
465 470 475 480
Gly Lys Pro Ala Leu Pro Leu Ser Pro Glu Asp Leu Glu Ser Leu Arg
485 490 495
Ser Leu Gln Arg Gln Leu Leu Phe Arg Gln Leu Gln Lys Asn Ser Gly
500 505 510
Trp Asp Thr Met Gly Ser Glu Ser Glu Gly Pro Ser Ala
515 520 525
<210> 469
<211> 189
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S145
<400> 469
Arg His Glu Arg Ile Lys Lys Thr Ser Phe Ser Thr Thr Thr Leu Leu
1 5 10 15
Pro Pro Ile Lys Val Leu Val Val Tyr Pro Ser Glu Ile Cys Phe His
20 25 30
His Thr Ile Cys Tyr Phe Thr Glu Phe Leu Gln Asn His Cys Arg Ser
35 40 45
Glu Val Ile Leu Glu Lys Trp Gln Lys Lys Lys Ile Ala Glu Met Gly
50 55 60
Pro Val Gln Trp Leu Ala Thr Gln Lys Lys Ala Ala Asp Lys Val Val
65 70 75 80
Phe Leu Leu Ser Asn Asp Val Asn Ser Val Cys Asp Gly Thr Cys Gly
85 90 95
Lys Ser Glu Gly Ser Pro Ser Glu Asn Ser Gln Asp Leu Phe Pro Leu
100 105 110
Ala Phe Asn Leu Phe Cys Ser Asp Leu Arg Ser Gln Ile His Leu His
115 120 125
Lys Tyr Val Val Val Tyr Phe Arg Glu Ile Asp Thr Lys Asp Asp Tyr
130 135 140
Asn Ala Leu Ser Val Cys Pro Lys Tyr His Leu Met Lys Asp Ala Thr
145 150 155 160
Ala Phe Cys Ala Glu Leu Leu His Val Lys Gln Gln Val Ser Ala Gly
165 170 175
Lys Arg Ser Gln Ala Cys His Asp Gly Cys Cys Ser Leu
180 185
<210> 470
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S146
<400> 470
Lys Lys Asp His Ala Lys Gly Trp Leu Arg Leu Leu Lys Gln Asp Val
1 5 10 15
Arg Ser Gly Ala Ala Ala Arg Gly Arg Ala Ala Leu Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Ala Asp Asp Ser Gly Phe Glu Arg Leu Val Gly Ala Leu Ala Ser Ala
35 40 45
Leu Cys Gln Leu Pro Leu Arg Val Ala Val Asp Leu Trp Ser Arg Arg
50 55 60
Glu Leu Ser Ala Gln Gly Pro Val Ala Trp Phe His Ala Gln Arg Arg
65 70 75 80
Gln Thr Leu Gln Glu Gly Gly Val Val Val Leu Leu Phe Ser Pro Gly
85 90 95
Ala Val Ala Leu Cys Ser Glu Trp Leu Gln Asp Gly Val Ser Gly Pro
100 105 110
Gly Ala His Gly Pro His Asp Ala Phe Arg Ala Ser Leu Ser Cys Val
115 120 125
Leu Pro Asp Phe Leu Gln Gly Arg Ala Pro Gly Ser Tyr Val Gly Ala
130 135 140
Cys Phe Asp Arg Leu Leu His Pro Asp Ala Val Pro Ala Leu Phe Arg
145 150 155 160
Thr Val Pro Val Phe Thr Leu Pro Ser Gln Leu Pro Asp Phe Leu Gly
165 170 175
Ala Leu Gln Gln Pro Arg Ala Pro Arg Ser Gly Arg Leu Gln Glu Arg
180 185 190
Ala Glu Gln Val Ser Arg Ala Leu Gln Pro Ala Leu Asp Ser Tyr Phe
195 200 205
His Pro Pro Gly Thr Pro Ala Pro Gly Arg Gly Val Gly Pro Gly Ala
210 215 220
Gly Pro Gly Ala Gly Asp Gly Thr
225 230
<210> 471
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S147
<400> 471
Lys Lys Asp His Ala Lys Ala Ala Ala Arg Gly Arg Ala Ala Leu Leu
1 5 10 15
Leu Tyr Ser Ala Asp Asp Ser Gly Phe Glu Arg Leu Val Gly Ala Leu
20 25 30
Ala Ser Ala Leu Cys Gln Leu Pro Leu Arg Val Ala Val Asp Leu Trp
35 40 45
Ser Arg Arg Glu Leu Ser Ala Gln Gly Pro Val Ala Trp Phe His Ala
50 55 60
Gln Arg Arg Gln Thr Leu Gln Glu Gly Gly Val Val Val Leu Leu Phe
65 70 75 80
Ser Pro Gly Ala Val Ala Leu Cys Ser Glu Trp Leu Gln Asp Gly Val
85 90 95
Ser Gly Pro Gly Ala His Gly Pro His Asp Ala Phe Arg Ala Ser Leu
100 105 110
Ser Cys Val Leu Pro Asp Phe Leu Gln Gly Arg Ala Pro Gly Ser Tyr
115 120 125
Val Gly Ala Cys Phe Asp Arg Leu Leu His Pro Asp Ala Val Pro Ala
130 135 140
Leu Phe Arg Thr Val Pro Val Phe Thr Leu Pro Ser Gln Leu Pro Asp
145 150 155 160
Phe Leu Gly Ala Leu Gln Gln Pro Arg Ala Pro Arg Ser Gly Arg Leu
165 170 175
Gln Glu Arg Ala Glu Gln Val Ser Arg Ala Leu Gln Pro Ala Leu Asp
180 185 190
Ser Tyr Phe His Pro Pro Gly Thr Pro Ala Pro Gly Arg Gly Val Gly
195 200 205
Pro Gly Ala Gly Pro Gly Ala Gly Asp Gly Thr
210 215
<210> 472
<211> 419
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S148
<400> 472
Cys Arg Lys Lys Gln Gln Glu Asn Ile Tyr Ser His Leu Asp Glu Glu
1 5 10 15
Ser Ser Glu Ser Ser Thr Tyr Thr Ala Ala Leu Pro Arg Glu Arg Leu
20 25 30
Arg Pro Arg Pro Lys Val Phe Leu Cys Tyr Ser Ser Lys Asp Gly Gln
35 40 45
Asn His Met Asn Val Val Gln Cys Phe Ala Tyr Phe Leu Gln Asp Phe
50 55 60
Cys Gly Cys Glu Val Ala Leu Asp Leu Trp Glu Asp Phe Ser Leu Cys
65 70 75 80
Arg Glu Gly Gln Arg Glu Trp Val Ile Gln Lys Ile His Glu Ser Gln
85 90 95
Phe Ile Ile Val Val Cys Ser Lys Gly Met Lys Tyr Phe Val Asp Lys
100 105 110
Lys Asn Tyr Lys His Lys Gly Gly Gly Arg Gly Ser Gly Lys Gly Glu
115 120 125
Leu Phe Leu Val Ala Val Ser Ala Ile Ala Glu Lys Leu Arg Gln Ala
130 135 140
Lys Gln Ser Ser Ser Ala Ala Leu Ser Lys Phe Ile Ala Val Tyr Phe
145 150 155 160
Asp Tyr Ser Cys Glu Gly Asp Val Pro Gly Ile Leu Asp Leu Ser Thr
165 170 175
Lys Tyr Arg Leu Met Asp Asn Leu Pro Gln Leu Cys Ser His Leu His
180 185 190
Ser Arg Asp His Gly Leu Gln Glu Pro Gly Gln His Thr Arg Gln Gly
195 200 205
Ser Arg Arg Asn Tyr Phe Arg Ser Lys Ser Gly Arg Ser Leu Tyr Val
210 215 220
Ala Ile Cys Asn Met His Gln Phe Ile Asp Glu Glu Pro Asp Trp Phe
225 230 235 240
Glu Lys Gln Phe Val Pro Phe His Pro Pro Pro Leu Arg Tyr Arg Glu
245 250 255
Pro Val Leu Glu Lys Phe Asp Ser Gly Leu Val Leu Asn Asp Val Met
260 265 270
Cys Lys Pro Gly Pro Glu Ser Asp Phe Cys Leu Lys Val Glu Ala Ala
275 280 285
Val Leu Gly Ala Thr Gly Pro Ala Asp Ser Gln His Glu Ser Gln His
290 295 300
Gly Gly Leu Asp Gln Asp Gly Glu Ala Arg Pro Ala Leu Asp Gly Ser
305 310 315 320
Ala Ala Leu Gln Pro Leu Leu His Thr Val Lys Ala Gly Ser Pro Ser
325 330 335
Asp Met Pro Arg Asp Ser Gly Ile Tyr Asp Ser Ser Val Pro Ser Ser
340 345 350
Glu Leu Ser Leu Pro Leu Met Glu Gly Leu Ser Thr Asp Gln Thr Glu
355 360 365
Thr Ser Ser Leu Thr Glu Ser Val Ser Ser Ser Ser Gly Leu Gly Glu
370 375 380
Glu Glu Pro Pro Ala Leu Pro Ser Lys Leu Leu Ser Ser Gly Ser Cys
385 390 395 400
Lys Ala Asp Leu Gly Cys Arg Ser Tyr Thr Asp Glu Leu His Ala Val
405 410 415
Ala Pro Leu
<210> 473
<211> 192
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S149
<400> 473
Thr Cys Arg Arg Pro Gln Ser Gly Pro Gly Pro Ala Arg Pro Val Leu
1 5 10 15
Leu Leu His Ala Ala Asp Ser Glu Ala Gln Arg Arg Leu Val Gly Ala
20 25 30
Leu Ala Glu Leu Leu Arg Ala Ala Leu Gly Gly Gly Arg Asp Val Ile
35 40 45
Val Asp Leu Trp Glu Gly Arg His Val Ala Arg Val Gly Pro Leu Pro
50 55 60
Trp Leu Trp Ala Ala Arg Thr Arg Val Ala Arg Glu Gln Gly Thr Val
65 70 75 80
Leu Leu Leu Trp Ser Gly Ala Asp Leu Arg Pro Val Ser Gly Pro Asp
85 90 95
Pro Arg Ala Ala Pro Leu Leu Ala Leu Leu His Ala Ala Pro Arg Pro
100 105 110
Leu Leu Leu Leu Ala Tyr Phe Ser Arg Leu Cys Ala Lys Gly Asp Ile
115 120 125
Pro Pro Pro Leu Arg Ala Leu Pro Arg Tyr Arg Leu Leu Arg Asp Leu
130 135 140
Pro Arg Leu Leu Arg Ala Leu Asp Ala Arg Pro Phe Ala Glu Ala Thr
145 150 155 160
Ser Trp Gly Arg Leu Gly Ala Arg Gln Arg Arg Gln Ser Arg Leu Glu
165 170 175
Leu Cys Ser Arg Leu Glu Arg Glu Ala Ala Arg Leu Ala Asp Leu Gly
180 185 190
<210> 474
<211> 191
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S154
<400> 474
Tyr Arg Val Asp Leu Val Leu Phe Tyr Arg His Leu Thr Arg Arg Asp
1 5 10 15
Glu Thr Leu Thr Asp Gly Lys Thr Tyr Asp Ala Phe Val Ser Tyr Leu
20 25 30
Lys Glu Cys Arg Pro Glu Asn Gly Glu Glu His Thr Phe Ala Val Glu
35 40 45
Ile Leu Pro Arg Val Leu Glu Lys His Phe Gly Tyr Lys Leu Cys Ile
50 55 60
Phe Glu Arg Asp Val Val Pro Gly Gly Ala Val Val Asp Glu Ile His
65 70 75 80
Ser Leu Ile Glu Lys Ser Arg Arg Leu Ile Ile Val Leu Ser Lys Ser
85 90 95
Tyr Met Ser Asn Glu Val Arg Tyr Glu Leu Glu Ser Gly Leu His Glu
100 105 110
Ala Leu Val Glu Arg Lys Ile Lys Ile Ile Leu Ile Glu Phe Thr Pro
115 120 125
Val Thr Asp Phe Thr Phe Leu Pro Gln Ser Leu Lys Leu Leu Lys Ser
130 135 140
His Arg Val Leu Lys Trp Lys Ala Asp Lys Ser Leu Ser Tyr Asn Ser
145 150 155 160
Arg Phe Trp Lys Asn Leu Leu Tyr Leu Met Pro Ala Lys Thr Val Lys
165 170 175
Pro Gly Arg Asp Glu Pro Glu Val Leu Pro Val Leu Ser Glu Ser
180 185 190
<210> 475
<211> 222
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S155
<400> 475
Ser Ala Leu Leu Tyr Arg His Trp Ile Glu Ile Val Leu Leu Tyr Arg
1 5 10 15
Thr Tyr Gln Ser Lys Asp Gln Thr Leu Gly Asp Lys Lys Asp Phe Asp
20 25 30
Ala Phe Val Ser Tyr Ala Lys Trp Ser Ser Phe Pro Ser Glu Ala Thr
35 40 45
Ser Ser Leu Ser Glu Glu His Leu Ala Leu Ser Leu Phe Pro Asp Val
50 55 60
Leu Glu Asn Lys Tyr Gly Tyr Ser Leu Cys Leu Leu Glu Arg Asp Val
65 70 75 80
Ala Pro Gly Gly Val Tyr Ala Glu Asp Ile Val Ser Ile Ile Lys Arg
85 90 95
Ser Arg Arg Gly Ile Phe Ile Leu Ser Pro Asn Tyr Val Asn Gly Pro
100 105 110
Ser Ile Phe Glu Leu Gln Ala Ala Val Asn Leu Ala Leu Asp Asp Gln
115 120 125
Thr Leu Lys Leu Ile Leu Ile Lys Phe Cys Tyr Phe Gln Glu Pro Glu
130 135 140
Ser Leu Pro His Leu Val Lys Lys Ala Leu Arg Val Leu Pro Thr Val
145 150 155 160
Thr Trp Arg Gly Leu Lys Ser Val Pro Pro Asn Ser Arg Phe Trp Ala
165 170 175
Lys Met Arg Tyr His Met Pro Val Lys Asn Ser Gln Gly Phe Thr Trp
180 185 190
Asn Gln Leu Arg Ile Thr Ser Arg Ile Phe Gln Trp Lys Gly Leu Ser
195 200 205
Arg Thr Glu Thr Thr Gly Arg Ser Ser Gln Pro Lys Glu Trp
210 215 220
<210> 476
<211> 282
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S156
<400> 476
Ser Ile Tyr Arg Tyr Ile His Val Gly Lys Glu Lys His Pro Ala Asn
1 5 10 15
Leu Ile Leu Ile Tyr Gly Asn Glu Phe Asp Lys Arg Phe Phe Val Pro
20 25 30
Ala Glu Lys Ile Val Ile Asn Phe Ile Thr Leu Asn Ile Ser Asp Asp
35 40 45
Ser Lys Ile Ser His Gln Asp Met Ser Leu Leu Gly Lys Ser Ser Asp
50 55 60
Val Ser Ser Leu Asn Asp Pro Gln Pro Ser Gly Asn Leu Arg Pro Pro
65 70 75 80
Gln Glu Glu Glu Glu Val Lys His Leu Gly Tyr Ala Ser His Leu Met
85 90 95
Glu Ile Phe Cys Asp Ser Glu Glu Asn Thr Glu Gly Thr Ser Leu Thr
100 105 110
Gln Gln Glu Ser Leu Ser Arg Thr Ile Pro Pro Asp Lys Thr Val Ile
115 120 125
Glu Tyr Glu Tyr Asp Val Arg Thr Thr Asp Ile Cys Ala Gly Pro Glu
130 135 140
Glu Gln Glu Leu Ser Leu Gln Glu Glu Val Ser Thr Gln Gly Thr Leu
145 150 155 160
Leu Glu Ser Gln Ala Ala Leu Ala Val Leu Gly Pro Gln Thr Leu Gln
165 170 175
Tyr Ser Tyr Thr Pro Gln Leu Gln Asp Leu Asp Pro Leu Ala Gln Glu
180 185 190
His Thr Asp Ser Glu Glu Gly Pro Glu Glu Glu Pro Ser Thr Thr Leu
195 200 205
Val Asp Trp Asp Pro Gln Thr Gly Arg Leu Cys Ile Pro Ser Leu Ser
210 215 220
Ser Phe Asp Gln Asp Ser Glu Gly Cys Glu Pro Ser Glu Gly Asp Gly
225 230 235 240
Leu Gly Glu Glu Gly Leu Leu Ser Arg Leu Tyr Glu Glu Pro Ala Pro
245 250 255
Asp Arg Pro Pro Gly Glu Asn Glu Thr Tyr Leu Met Gln Phe Met Glu
260 265 270
Glu Trp Gly Leu Tyr Val Gln Met Glu Asn
275 280
<210> 477
<211> 57
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S157
<400> 477
Trp Lys Met Gly Arg Leu Leu Gln Tyr Ser Cys Cys Pro Val Val Val
1 5 10 15
Leu Pro Asp Thr Leu Lys Ile Thr Asn Ser Pro Gln Lys Leu Ile Ser
20 25 30
Cys Arg Arg Glu Glu Val Asp Ala Cys Ala Thr Ala Val Met Ser Pro
35 40 45
Glu Glu Leu Leu Arg Ala Trp Ile Ser
50 55
<210> 478
<211> 285
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S158
<400> 478
Ser Leu Lys Thr His Pro Leu Trp Arg Leu Trp Lys Lys Ile Trp Ala
1 5 10 15
Val Pro Ser Pro Glu Arg Phe Phe Met Pro Leu Tyr Lys Gly Cys Ser
20 25 30
Gly Asp Phe Lys Lys Trp Val Gly Ala Pro Phe Thr Gly Ser Ser Leu
35 40 45
Glu Leu Gly Pro Trp Ser Pro Glu Val Pro Ser Thr Leu Glu Val Tyr
50 55 60
Ser Cys His Pro Pro Arg Ser Pro Ala Lys Arg Leu Gln Leu Thr Glu
65 70 75 80
Leu Gln Glu Pro Ala Glu Leu Val Glu Ser Asp Gly Val Pro Lys Pro
85 90 95
Ser Phe Trp Pro Thr Ala Gln Asn Ser Gly Gly Ser Ala Tyr Ser Glu
100 105 110
Glu Arg Asp Arg Pro Tyr Gly Leu Val Ser Ile Asp Thr Val Thr Val
115 120 125
Leu Asp Ala Glu Gly Pro Cys Thr Trp Pro Cys Ser Cys Glu Asp Asp
130 135 140
Gly Tyr Pro Ala Leu Asp Leu Asp Ala Gly Leu Glu Pro Ser Pro Gly
145 150 155 160
Leu Glu Asp Pro Leu Leu Asp Ala Gly Thr Thr Val Leu Ser Cys Gly
165 170 175
Cys Val Ser Ala Gly Ser Pro Gly Leu Gly Gly Pro Leu Gly Ser Leu
180 185 190
Leu Asp Arg Leu Lys Pro Pro Leu Ala Asp Gly Glu Asp Trp Ala Gly
195 200 205
Gly Leu Pro Trp Gly Gly Arg Ser Pro Gly Gly Val Ser Glu Ser Glu
210 215 220
Ala Gly Ser Pro Leu Ala Gly Leu Asp Met Asp Thr Phe Asp Ser Gly
225 230 235 240
Phe Val Gly Ser Asp Cys Ser Ser Pro Val Glu Cys Asp Phe Thr Ser
245 250 255
Pro Gly Asp Glu Gly Pro Pro Arg Ser Tyr Leu Arg Gln Trp Val Val
260 265 270
Ile Pro Pro Pro Leu Ser Ser Pro Gly Pro Gln Ala Ser
275 280 285
<210> 479
<211> 325
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S161
<400> 479
Ser Tyr Arg Tyr Val Thr Lys Pro Pro Ala Pro Pro Asn Ser Leu Asn
1 5 10 15
Val Gln Arg Val Leu Thr Phe Gln Pro Leu Arg Phe Ile Gln Glu His
20 25 30
Val Leu Ile Pro Val Phe Asp Leu Ser Gly Pro Ser Ser Leu Ala Gln
35 40 45
Pro Val Gln Tyr Ser Gln Ile Arg Val Ser Gly Pro Arg Glu Pro Ala
50 55 60
Gly Ala Pro Gln Arg His Ser Leu Ser Glu Ile Thr Tyr Leu Gly Gln
65 70 75 80
Pro Asp Ile Ser Ile Leu Gln Pro Ser Asn Val Pro Pro Pro Gln Ile
85 90 95
Leu Ser Pro Leu Ser Tyr Ala Pro Asn Ala Ala Pro Glu Val Gly Pro
100 105 110
Pro Ser Tyr Ala Pro Gln Val Thr Pro Glu Ala Gln Phe Pro Phe Tyr
115 120 125
Ala Pro Gln Ala Ile Ser Lys Val Gln Pro Ser Ser Tyr Ala Pro Gln
130 135 140
Ala Thr Pro Asp Ser Trp Pro Pro Ser Tyr Gly Val Cys Met Glu Gly
145 150 155 160
Ser Gly Lys Asp Ser Pro Thr Gly Thr Leu Ser Ser Pro Lys His Leu
165 170 175
Arg Pro Lys Gly Gln Leu Gln Lys Glu Pro Pro Ala Gly Ser Cys Met
180 185 190
Leu Gly Gly Leu Ser Leu Gln Glu Val Thr Ser Leu Ala Met Glu Glu
195 200 205
Ser Gln Glu Ala Lys Ser Leu His Gln Pro Leu Gly Ile Cys Thr Asp
210 215 220
Arg Thr Ser Asp Pro Asn Val Leu His Ser Gly Glu Glu Gly Thr Pro
225 230 235 240
Gln Tyr Leu Lys Gly Gln Leu Pro Leu Leu Ser Ser Val Gln Ile Glu
245 250 255
Gly His Pro Met Ser Leu Pro Leu Gln Pro Pro Ser Arg Pro Cys Ser
260 265 270
Pro Ser Asp Gln Gly Pro Ser Pro Trp Gly Leu Leu Glu Ser Leu Val
275 280 285
Cys Pro Lys Asp Glu Ala Lys Ser Pro Ala Pro Glu Thr Ser Asp Leu
290 295 300
Glu Gln Pro Thr Glu Leu Asp Ser Leu Phe Arg Gly Leu Ala Leu Thr
305 310 315 320
Val Gln Trp Glu Ser
325
<210> 480
<211> 253
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S165
<400> 480
Asn Arg Ser Phe Arg Thr Gly Ile Lys Arg Arg Ile Leu Leu Leu Ile
1 5 10 15
Pro Lys Trp Leu Tyr Glu Asp Ile Pro Asn Met Lys Asn Ser Asn Val
20 25 30
Val Lys Met Leu Gln Glu Asn Ser Glu Leu Met Asn Asn Asn Ser Ser
35 40 45
Glu Gln Val Leu Tyr Val Asp Pro Met Ile Thr Glu Ile Lys Glu Ile
50 55 60
Phe Ile Pro Glu His Lys Pro Thr Asp Tyr Lys Lys Glu Asn Thr Gly
65 70 75 80
Pro Leu Glu Thr Arg Asp Tyr Pro Gln Asn Ser Leu Phe Asp Asn Thr
85 90 95
Thr Val Val Tyr Ile Pro Asp Leu Asn Thr Gly Tyr Lys Pro Gln Ile
100 105 110
Ser Asn Phe Leu Pro Glu Gly Ser His Leu Ser Asn Asn Asn Glu Ile
115 120 125
Thr Ser Leu Thr Leu Lys Pro Pro Val Asp Ser Leu Asp Ser Gly Asn
130 135 140
Asn Pro Arg Leu Gln Lys His Pro Asn Phe Ala Phe Ser Val Ser Ser
145 150 155 160
Val Asn Ser Leu Ser Asn Thr Ile Phe Leu Gly Glu Leu Ser Leu Ile
165 170 175
Leu Asn Gln Gly Glu Cys Ser Ser Pro Asp Ile Gln Asn Ser Val Glu
180 185 190
Glu Glu Thr Thr Met Leu Leu Glu Asn Asp Ser Pro Ser Glu Thr Ile
195 200 205
Pro Glu Gln Thr Leu Leu Pro Asp Glu Phe Val Ser Cys Leu Gly Ile
210 215 220
Val Asn Glu Glu Leu Pro Ser Ile Asn Thr Tyr Phe Pro Gln Asn Ile
225 230 235 240
Leu Glu Ser His Phe Asn Arg Ile Ser Leu Leu Glu Lys
245 250
<210> 481
<211> 99
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S168
<400> 481
Thr Ser Gly Arg Cys Tyr His Leu Arg His Lys Val Leu Pro Arg Trp
1 5 10 15
Val Trp Glu Lys Val Pro Asp Pro Ala Asn Ser Ser Ser Gly Gln Pro
20 25 30
His Met Glu Gln Val Pro Glu Ala Gln Pro Leu Gly Asp Leu Pro Ile
35 40 45
Leu Glu Val Glu Glu Met Glu Pro Pro Pro Val Met Glu Ser Ser Gln
50 55 60
Pro Ala Gln Ala Thr Ala Pro Leu Asp Ser Gly Tyr Glu Lys His Phe
65 70 75 80
Leu Pro Thr Pro Glu Glu Leu Gly Leu Leu Gly Pro Pro Arg Pro Gln
85 90 95
Val Leu Ala
<210> 482
<211> 86
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S169
<400> 482
Thr Ser Trp Val Trp Glu Lys Val Pro Asp Pro Ala Asn Ser Ser Ser
1 5 10 15
Gly Gln Pro His Met Glu Gln Val Pro Glu Ala Gln Pro Leu Gly Asp
20 25 30
Leu Pro Ile Leu Glu Val Glu Glu Met Glu Pro Pro Pro Val Met Glu
35 40 45
Ser Ser Gln Pro Ala Gln Ala Thr Ala Pro Leu Asp Ser Gly Tyr Glu
50 55 60
Lys His Phe Leu Pro Thr Pro Glu Glu Leu Gly Leu Leu Gly Pro Pro
65 70 75 80
Arg Pro Gln Val Leu Ala
85
<210> 483
<211> 189
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S170
<400> 483
Lys Lys Pro Asn Lys Leu Thr His Leu Cys Trp Pro Thr Val Pro Asn
1 5 10 15
Pro Ala Glu Ser Ser Ile Ala Thr Trp His Gly Asp Asp Phe Lys Asp
20 25 30
Lys Leu Asn Leu Lys Glu Ser Asp Asp Ser Val Asn Thr Glu Asp Arg
35 40 45
Ile Leu Lys Pro Cys Ser Thr Pro Ser Asp Lys Leu Val Ile Asp Lys
50 55 60
Leu Val Val Asn Phe Gly Asn Val Leu Gln Glu Ile Phe Thr Asp Glu
65 70 75 80
Ala Arg Thr Gly Gln Glu Asn Asn Leu Gly Gly Glu Lys Asn Gly Tyr
85 90 95
Val Thr Cys Pro Phe Arg Pro Asp Cys Pro Leu Gly Lys Ser Phe Glu
100 105 110
Glu Leu Pro Val Ser Pro Glu Ile Pro Pro Arg Lys Ser Gln Tyr Leu
115 120 125
Arg Ser Arg Met Pro Glu Gly Thr Arg Pro Glu Ala Lys Glu Gln Leu
130 135 140
Leu Phe Ser Gly Gln Ser Leu Val Pro Asp His Leu Cys Glu Glu Gly
145 150 155 160
Ala Pro Asn Pro Tyr Leu Lys Asn Ser Val Thr Ala Arg Glu Phe Leu
165 170 175
Val Ser Glu Lys Leu Pro Glu His Thr Lys Gly Glu Val
180 185
<210> 484
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S171
<400> 484
Lys Lys Pro Asn Lys Leu Thr His Leu Cys Trp Pro Thr Val Pro Asn
1 5 10 15
Pro Ala Glu Ser Ser Ile Ala Thr Trp His Gly Asp Asp Phe Lys Asp
20 25 30
Lys Leu Asn Leu Lys Glu Ser Asp Asp Ser Val Asn Thr Glu Asp Arg
35 40 45
Ile Leu Lys Pro Cys Ser Thr Pro Ser Asp Lys Leu Val Ile Asp Lys
50 55 60
Leu Val Val Asn Phe Gly Asn Val Leu Gln Glu Ile Phe Thr Asp Glu
65 70 75 80
Ala Arg Thr Gly Gln Glu Asn Asn Leu Gly Gly Glu Lys Asn Gly Thr
85 90 95
Arg Ile Leu Ser Ser Cys Pro Thr Ser Ile
100 105
<210> 485
<211> 303
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S174
<400> 485
Ser His Gln Arg Met Lys Lys Leu Phe Trp Glu Asp Val Pro Asn Pro
1 5 10 15
Lys Asn Cys Ser Trp Ala Gln Gly Leu Asn Phe Gln Lys Pro Glu Thr
20 25 30
Phe Glu His Leu Phe Ile Lys His Thr Ala Ser Val Thr Cys Gly Pro
35 40 45
Leu Leu Leu Glu Pro Glu Thr Ile Ser Glu Asp Ile Ser Val Asp Thr
50 55 60
Ser Trp Lys Asn Lys Asp Glu Met Met Pro Thr Thr Val Val Ser Leu
65 70 75 80
Leu Ser Thr Thr Asp Leu Glu Lys Gly Ser Val Cys Ile Ser Asp Gln
85 90 95
Phe Asn Ser Val Asn Phe Ser Glu Ala Glu Gly Thr Glu Val Thr Tyr
100 105 110
Glu Asp Glu Ser Gln Arg Gln Pro Phe Val Lys Tyr Ala Thr Leu Ile
115 120 125
Ser Asn Ser Lys Pro Ser Glu Thr Gly Glu Glu Gln Gly Leu Ile Asn
130 135 140
Ser Ser Val Thr Lys Cys Phe Ser Ser Lys Asn Ser Pro Leu Lys Asp
145 150 155 160
Ser Phe Ser Asn Ser Ser Trp Glu Ile Glu Ala Gln Ala Phe Phe Ile
165 170 175
Leu Ser Asp Gln His Pro Asn Ile Ile Ser Pro His Leu Thr Phe Ser
180 185 190
Glu Gly Leu Asp Glu Leu Leu Lys Leu Glu Gly Asn Phe Pro Glu Glu
195 200 205
Asn Asn Asp Lys Lys Ser Ile Tyr Tyr Leu Gly Val Thr Ser Ile Lys
210 215 220
Lys Arg Glu Ser Gly Val Leu Leu Thr Asp Lys Ser Arg Val Ser Cys
225 230 235 240
Pro Phe Pro Ala Pro Cys Leu Phe Thr Asp Ile Arg Val Leu Gln Asp
245 250 255
Ser Cys Ser His Phe Val Glu Asn Asn Ile Asn Leu Gly Thr Ser Ser
260 265 270
Lys Lys Thr Phe Ala Ser Tyr Met Pro Gln Phe Gln Thr Cys Ser Thr
275 280 285
Gln Thr His Lys Ile Met Glu Asn Lys Met Cys Asp Leu Thr Val
290 295 300
<210> 486
<211> 96
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S175
<400> 486
Ser His Gln Arg Met Lys Lys Leu Phe Trp Glu Asp Val Pro Asn Pro
1 5 10 15
Lys Asn Cys Ser Trp Ala Gln Gly Leu Asn Phe Gln Lys Met Leu Glu
20 25 30
Gly Ser Met Phe Val Lys Ser His His His Ser Leu Ile Ser Ser Thr
35 40 45
Gln Gly His Lys His Cys Gly Arg Pro Gln Gly Pro Leu His Arg Lys
50 55 60
Thr Arg Asp Leu Cys Ser Leu Val Tyr Leu Leu Thr Leu Pro Pro Leu
65 70 75 80
Leu Ser Tyr Asp Pro Ala Lys Ser Pro Ser Val Arg Asn Thr Gln Glu
85 90 95
<210> 487
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S176
<400> 487
Ser His Gln Arg Met Lys Lys Leu Phe Trp Glu Asp Val Pro Asn Pro
1 5 10 15
Lys Asn Cys Ser Trp Ala Gln Gly Leu Asn Phe Gln Lys Arg Thr Asp
20 25 30
Ile Leu
<210> 488
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S177
<400> 488
Ser His Gln Arg Met Lys Lys Leu Phe Trp Glu Asp Val Pro Asn Pro
1 5 10 15
Lys Asn Cys Ser Trp Ala Gln Gly Leu Asn Phe Gln Lys Lys Met Pro
20 25 30
Gly Thr Lys Glu Leu Leu Gly Gly Gly Trp Leu Thr
35 40
<210> 489
<211> 239
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S180
<400> 489
Tyr Arg Lys Arg Glu Trp Ile Lys Glu Thr Phe Tyr Pro Asp Ile Pro
1 5 10 15
Asn Pro Glu Asn Cys Lys Ala Leu Gln Phe Gln Lys Ser Val Cys Glu
20 25 30
Gly Ser Ser Ala Leu Lys Thr Leu Glu Met Asn Pro Cys Thr Pro Asn
35 40 45
Asn Val Glu Val Leu Glu Thr Arg Ser Ala Phe Pro Lys Ile Glu Asp
50 55 60
Thr Glu Ile Ile Ser Pro Val Ala Glu Arg Pro Glu Asp Arg Ser Asp
65 70 75 80
Ala Glu Pro Glu Asn His Val Val Val Ser Tyr Cys Pro Pro Ile Ile
85 90 95
Glu Glu Glu Ile Pro Asn Pro Ala Ala Asp Glu Ala Gly Gly Thr Ala
100 105 110
Gln Val Ile Tyr Ile Asp Val Gln Ser Met Tyr Gln Pro Gln Ala Lys
115 120 125
Pro Glu Glu Glu Gln Glu Asn Asp Pro Val Gly Gly Ala Gly Tyr Lys
130 135 140
Pro Gln Met His Leu Pro Ile Asn Ser Thr Val Glu Asp Ile Ala Ala
145 150 155 160
Glu Glu Asp Leu Asp Lys Thr Ala Gly Tyr Arg Pro Gln Ala Asn Val
165 170 175
Asn Thr Trp Asn Leu Val Ser Pro Asp Ser Pro Arg Ser Ile Asp Ser
180 185 190
Asn Ser Glu Ile Val Ser Phe Gly Ser Pro Cys Ser Ile Asn Ser Arg
195 200 205
Gln Phe Leu Ile Pro Pro Lys Asp Glu Asp Ser Pro Lys Ser Asn Gly
210 215 220
Gly Gly Trp Ser Phe Thr Asn Phe Phe Gln Asn Lys Pro Asn Asp
225 230 235
<210> 490
<211> 202
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S183
<400> 490
Tyr Tyr His Gly Gln Arg His Ser Asp Glu His His His Asp Asp Ser
1 5 10 15
Leu Pro His Pro Gln Gln Ala Thr Asp Asp Ser Gly His Glu Ser Asp
20 25 30
Ser Asn Ser Asn Glu Gly Arg His His Leu Leu Val Ser Gly Ala Gly
35 40 45
Asp Gly Pro Pro Leu Cys Ser Gln Asn Leu Gly Ala Pro Gly Gly Gly
50 55 60
Pro Asp Asn Gly Pro Gln Asp Pro Asp Asn Thr Asp Asp Asn Gly Pro
65 70 75 80
Gln Asp Pro Asp Asn Thr Asp Asp Asn Gly Pro His Asp Pro Leu Pro
85 90 95
Gln Asp Pro Asp Asn Thr Asp Asp Asn Gly Pro Gln Asp Pro Asp Asn
100 105 110
Thr Asp Asp Asn Gly Pro His Asp Pro Leu Pro His Ser Pro Ser Asp
115 120 125
Ser Ala Gly Asn Asp Gly Gly Pro Pro Gln Leu Thr Glu Glu Val Glu
130 135 140
Asn Lys Gly Gly Asp Gln Gly Pro Pro Leu Met Thr Asp Gly Gly Gly
145 150 155 160
Gly His Ser His Asp Ser Gly His Gly Gly Gly Asp Pro His Leu Pro
165 170 175
Thr Leu Leu Leu Gly Ser Ser Gly Ser Gly Gly Asp Asp Asp Asp Pro
180 185 190
His Gly Pro Val Gln Leu Ser Tyr Tyr Asp
195 200
<210> 491
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S186
<400> 491
Arg Trp Gln Phe Pro Ala His Tyr Arg Arg Leu Arg His Ala Leu Trp
1 5 10 15
Pro Ser Leu Pro Asp Leu His Arg Val Leu Gly Gln Tyr Leu Arg Asp
20 25 30
Thr Ala Ala Leu Ser Pro Pro Lys Ala Thr Val Ser Asp Thr Cys Glu
35 40 45
Glu Val Glu Pro Ser Leu Leu Glu Ile Leu Pro Lys Ser Ser Glu Arg
50 55 60
Thr Pro Leu Pro Leu Cys Ser Ser Gln Ala Gln Met Asp Tyr Arg Arg
65 70 75 80
Leu Gln Pro Ser Cys Leu Gly Thr Met Pro Leu Ser Val Cys Pro Pro
85 90 95
Met Ala Glu Ser Gly Ser Cys Cys Thr Thr His Ile Ala Asn His Ser
100 105 110
Tyr Leu Pro Leu Ser Tyr Trp Gln Gln Pro
115 120
<210> 492
<211> 304
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S189
<400> 492
Met Ala Ala Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Ala Ala Pro Val Ser Ser
1 5 10 15
Thr Ser Ser Leu Pro Leu Ala Ala Leu Asn Met Arg Val Arg Arg Arg
20 25 30
Leu Ser Leu Phe Leu Asn Val Arg Thr Gln Val Ala Ala Asp Trp Thr
35 40 45
Ala Leu Ala Glu Glu Met Asp Phe Glu Tyr Leu Glu Ile Arg Gln Leu
50 55 60
Glu Thr Gln Ala Asp Pro Thr Gly Arg Leu Leu Asp Ala Trp Gln Gly
65 70 75 80
Arg Pro Gly Ala Ser Val Gly Arg Leu Leu Glu Leu Leu Thr Lys Leu
85 90 95
Gly Arg Asp Asp Val Leu Leu Glu Leu Gly Pro Ser Ile Glu Glu Asp
100 105 110
Cys Gln Lys Tyr Ile Leu Lys Gln Gln Gln Glu Glu Ala Glu Lys Pro
115 120 125
Leu Gln Val Ala Ala Val Asp Ser Ser Val Pro Arg Thr Ala Glu Leu
130 135 140
Ala Gly Ile Thr Thr Leu Asp Asp Pro Leu Gly His Met Pro Glu Arg
145 150 155 160
Phe Asp Ala Phe Ile Cys Tyr Cys Pro Ser Asp Ile Gln Phe Val Gln
165 170 175
Glu Met Ile Arg Gln Leu Glu Gln Thr Asn Tyr Arg Leu Lys Leu Cys
180 185 190
Val Ser Asp Arg Asp Val Leu Pro Gly Thr Cys Val Trp Ser Ile Ala
195 200 205
Ser Glu Leu Ile Glu Lys Arg Leu Ala Arg Arg Pro Arg Gly Gly Cys
210 215 220
Arg Arg Met Val Val Val Val Ser Asp Asp Tyr Leu Gln Ser Lys Glu
225 230 235 240
Cys Asp Phe Gln Thr Lys Phe Ala Leu Ser Leu Ser Pro Gly Ala His
245 250 255
Gln Lys Arg Leu Ile Pro Ile Lys Tyr Lys Ala Met Lys Lys Glu Phe
260 265 270
Pro Ser Ile Leu Arg Phe Ile Thr Val Cys Asp Tyr Thr Asn Pro Cys
275 280 285
Thr Lys Ser Trp Phe Trp Thr Arg Leu Ala Lys Ala Leu Ser Leu Pro
290 295 300
<210> 493
<211> 296
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S190
<400> 493
Met Ala Ala Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Ala Ala Pro Val Ser Ser
1 5 10 15
Thr Ser Ser Leu Pro Leu Ala Ala Leu Asn Met Arg Val Arg Arg Arg
20 25 30
Leu Ser Leu Phe Leu Asn Val Arg Thr Gln Val Ala Ala Asp Trp Thr
35 40 45
Ala Leu Ala Glu Glu Met Asp Phe Glu Tyr Leu Glu Ile Arg Gln Leu
50 55 60
Glu Thr Gln Ala Asp Pro Thr Gly Arg Leu Leu Asp Ala Trp Gln Gly
65 70 75 80
Arg Pro Gly Ala Ser Val Gly Arg Leu Leu Glu Leu Leu Thr Lys Leu
85 90 95
Gly Arg Asp Asp Val Leu Leu Glu Leu Gly Pro Ser Ile Glu Glu Asp
100 105 110
Cys Gln Lys Tyr Ile Leu Lys Gln Gln Gln Glu Glu Ala Glu Lys Pro
115 120 125
Leu Gln Val Ala Ala Val Asp Ser Ser Val Pro Arg Thr Ala Glu Leu
130 135 140
Ala Gly Ile Thr Thr Leu Asp Asp Pro Leu Gly His Met Pro Glu Arg
145 150 155 160
Phe Asp Ala Phe Ile Cys Tyr Cys Pro Ser Asp Ile Gln Phe Val Gln
165 170 175
Glu Met Ile Arg Gln Leu Glu Gln Thr Asn Tyr Arg Leu Lys Leu Cys
180 185 190
Val Ser Asp Arg Asp Val Leu Pro Gly Thr Cys Val Trp Ser Ile Ala
195 200 205
Ser Glu Leu Ile Glu Lys Arg Cys Arg Arg Met Val Val Val Val Ser
210 215 220
Asp Asp Tyr Leu Gln Ser Lys Glu Cys Asp Phe Gln Thr Lys Phe Ala
225 230 235 240
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Ala His Gln Lys Arg Leu Ile Pro Ile Lys
245 250 255
Tyr Lys Ala Met Lys Lys Glu Phe Pro Ser Ile Leu Arg Phe Ile Thr
260 265 270
Val Cys Asp Tyr Thr Asn Pro Cys Thr Lys Ser Trp Phe Trp Thr Arg
275 280 285
Leu Ala Lys Ala Leu Ser Leu Pro
290 295
<210> 494
<211> 251
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S191
<400> 494
Met Ala Ala Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Ala Ala Pro Val Ser Ser
1 5 10 15
Thr Ser Ser Leu Pro Leu Ala Ala Leu Asn Met Arg Val Arg Arg Arg
20 25 30
Leu Ser Leu Phe Leu Asn Val Arg Thr Gln Val Ala Ala Asp Trp Thr
35 40 45
Ala Leu Ala Glu Glu Met Asp Phe Glu Tyr Leu Glu Ile Arg Gln Leu
50 55 60
Glu Thr Gln Ala Asp Pro Thr Gly Arg Leu Leu Asp Ala Trp Gln Gly
65 70 75 80
Arg Pro Gly Ala Ser Val Gly Arg Leu Leu Glu Leu Leu Thr Lys Leu
85 90 95
Gly Arg Asp Asp Val Leu Leu Glu Leu Gly Pro Ser Ile Gly His Met
100 105 110
Pro Glu Arg Phe Asp Ala Phe Ile Cys Tyr Cys Pro Ser Asp Ile Gln
115 120 125
Phe Val Gln Glu Met Ile Arg Gln Leu Glu Gln Thr Asn Tyr Arg Leu
130 135 140
Lys Leu Cys Val Ser Asp Arg Asp Val Leu Pro Gly Thr Cys Val Trp
145 150 155 160
Ser Ile Ala Ser Glu Leu Ile Glu Lys Arg Cys Arg Arg Met Val Val
165 170 175
Val Val Ser Asp Asp Tyr Leu Gln Ser Lys Glu Cys Asp Phe Gln Thr
180 185 190
Lys Phe Ala Leu Ser Leu Ser Pro Gly Ala His Gln Lys Arg Leu Ile
195 200 205
Pro Ile Lys Tyr Lys Ala Met Lys Lys Glu Phe Pro Ser Ile Leu Arg
210 215 220
Phe Ile Thr Val Cys Asp Tyr Thr Asn Pro Cys Thr Lys Ser Trp Phe
225 230 235 240
Trp Thr Arg Leu Ala Lys Ala Leu Ser Leu Pro
245 250
<210> 495
<211> 191
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S192
<400> 495
Met Ala Ala Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Ala Ala Pro Val Ser Ser
1 5 10 15
Thr Ser Ser Leu Pro Leu Ala Ala Leu Asn Met Arg Val Arg Arg Arg
20 25 30
Leu Ser Leu Phe Leu Asn Val Arg Thr Gln Val Ala Ala Asp Trp Thr
35 40 45
Ala Leu Ala Glu Glu Met Asp Phe Glu Tyr Leu Glu Ile Arg Gln Leu
50 55 60
Glu Thr Gln Ala Asp Pro Thr Gly Arg Leu Leu Asp Ala Trp Gln Gly
65 70 75 80
Arg Pro Gly Ala Ser Val Gly Arg Leu Leu Glu Leu Leu Thr Lys Leu
85 90 95
Gly Arg Asp Asp Val Leu Leu Glu Leu Gly Pro Ser Ile Glu Glu Asp
100 105 110
Cys Gln Lys Tyr Ile Leu Lys Gln Gln Gln Glu Glu Ala Glu Lys Pro
115 120 125
Leu Gln Val Ala Ala Val Asp Ser Ser Val Pro Arg Thr Ala Glu Leu
130 135 140
Ala Gly Ile Thr Thr Leu Asp Asp Pro Leu Gly Ala Ala Gly Trp Trp
145 150 155 160
Trp Leu Ser Leu Met Ile Thr Cys Arg Ala Arg Asn Val Thr Ser Arg
165 170 175
Pro Asn Leu His Ser Ala Ser Leu Gln Val Pro Ile Arg Ser Asp
180 185 190
<210> 496
<211> 146
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S193
<400> 496
Met Ala Ala Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Ala Ala Pro Val Ser Ser
1 5 10 15
Thr Ser Ser Leu Pro Leu Ala Ala Leu Asn Met Arg Val Arg Arg Arg
20 25 30
Leu Ser Leu Phe Leu Asn Val Arg Thr Gln Val Ala Ala Asp Trp Thr
35 40 45
Ala Leu Ala Glu Glu Met Asp Phe Glu Tyr Leu Glu Ile Arg Gln Leu
50 55 60
Glu Thr Gln Ala Asp Pro Thr Gly Arg Leu Leu Asp Ala Trp Gln Gly
65 70 75 80
Arg Pro Gly Ala Ser Val Gly Arg Leu Leu Glu Leu Leu Thr Lys Leu
85 90 95
Gly Arg Asp Asp Val Leu Leu Glu Leu Gly Pro Ser Ile Gly Ala Ala
100 105 110
Gly Trp Trp Trp Leu Ser Leu Met Ile Thr Cys Arg Ala Arg Asn Val
115 120 125
Thr Ser Arg Pro Asn Leu His Ser Ala Ser Leu Gln Val Pro Ile Arg
130 135 140
Ser Asp
145
<210> 497
<211> 172
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S194
<400> 497
Met Ala Ala Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Ala Ala Pro Val Ser Ser
1 5 10 15
Thr Ser Ser Leu Pro Leu Ala Ala Leu Asn Met Arg Val Arg Arg Arg
20 25 30
Leu Ser Leu Phe Leu Asn Val Arg Thr Gln Val Ala Ala Asp Trp Thr
35 40 45
Ala Leu Ala Glu Glu Met Asp Phe Glu Tyr Leu Glu Ile Arg Gln Leu
50 55 60
Glu Thr Gln Ala Asp Pro Thr Gly Arg Leu Leu Asp Ala Trp Gln Gly
65 70 75 80
Arg Pro Gly Ala Ser Val Gly Arg Leu Leu Glu Leu Leu Thr Lys Leu
85 90 95
Gly Arg Asp Asp Val Leu Leu Glu Leu Gly Pro Ser Ile Glu Glu Asp
100 105 110
Cys Gln Lys Tyr Ile Leu Lys Gln Gln Gln Glu Glu Ala Glu Lys Pro
115 120 125
Leu Gln Val Ala Ala Val Asp Ser Ser Val Pro Arg Thr Ala Glu Leu
130 135 140
Ala Gly Ile Thr Thr Leu Asp Asp Pro Leu Gly His Met Pro Glu Arg
145 150 155 160
Phe Asp Ala Phe Ile Cys Tyr Cys Pro Ser Asp Ile
165 170
<210> 498
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S195
<400> 498
Met Ala Ala Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Ala Ala Pro Val Ser Ser
1 5 10 15
Thr Ser Ser Leu Pro Leu Ala Ala Leu Asn Met Arg Val Arg Arg Arg
20 25 30
Leu Ser Leu Phe Leu Asn Val Arg Thr Gln Val Ala Ala Asp Trp Thr
35 40 45
Ala Leu Ala Glu Glu Met Asp Phe Glu Tyr Leu Glu Ile Arg Gln Leu
50 55 60
Glu Thr Gln Ala Asp Pro Thr Gly Arg Leu Leu Asp Ala Trp Gln Gly
65 70 75 80
Arg Pro Gly Ala Ser Val Gly Arg Leu Leu Glu Leu Leu Thr Lys Leu
85 90 95
Gly Arg Asp Asp Val Leu Leu Glu Leu Gly Pro Ser Ile Gly His Met
100 105 110
Pro Glu Arg Phe Asp Ala Phe Ile Cys Tyr Cys Pro Ser Asp Ile
115 120 125
<210> 499
<211> 304
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S196
<400> 499
Met Ala Ala Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Ala Ala Pro Val Ser Ser
1 5 10 15
Thr Ser Ser Leu Pro Leu Ala Ala Leu Asn Met Arg Val Arg Arg Arg
20 25 30
Leu Ser Leu Phe Leu Asn Val Arg Thr Gln Val Ala Ala Asp Trp Thr
35 40 45
Ala Leu Ala Glu Glu Met Asp Phe Glu Tyr Leu Glu Ile Arg Gln Leu
50 55 60
Glu Thr Gln Ala Asp Pro Thr Gly Arg Leu Leu Asp Ala Trp Gln Gly
65 70 75 80
Arg Pro Gly Ala Ser Val Gly Arg Leu Leu Glu Leu Leu Thr Lys Leu
85 90 95
Gly Arg Asp Asp Val Leu Leu Glu Leu Gly Pro Ser Ile Glu Glu Asp
100 105 110
Cys Gln Lys Tyr Ile Leu Lys Gln Gln Gln Glu Glu Ala Glu Lys Pro
115 120 125
Leu Gln Val Ala Ala Val Asp Ser Ser Val Pro Arg Thr Ala Glu Leu
130 135 140
Ala Gly Ile Thr Thr Leu Asp Asp Pro Leu Gly His Met Pro Glu Arg
145 150 155 160
Phe Asp Ala Phe Ile Cys Tyr Cys Pro Ser Asp Ile Gln Phe Val Gln
165 170 175
Glu Met Ile Arg Gln Leu Glu Gln Thr Asn Tyr Arg Leu Lys Leu Cys
180 185 190
Val Ser Asp Arg Asp Val Leu Pro Gly Thr Cys Val Trp Ser Ile Ala
195 200 205
Ser Glu Leu Ile Glu Lys Arg Leu Ala Arg Arg Pro Arg Gly Gly Cys
210 215 220
Arg Arg Met Val Val Val Val Ser Asp Asp Tyr Leu Gln Ser Lys Glu
225 230 235 240
Cys Asp Phe Gln Thr Lys Phe Ala Leu Ser Leu Ser Pro Gly Ala His
245 250 255
Gln Lys Arg Pro Ile Pro Ile Lys Tyr Lys Ala Met Lys Lys Glu Phe
260 265 270
Pro Ser Ile Leu Arg Phe Ile Thr Val Cys Asp Tyr Thr Asn Pro Cys
275 280 285
Thr Lys Ser Trp Phe Trp Thr Arg Leu Ala Lys Ala Leu Ser Leu Pro
290 295 300
<210> 500
<211> 296
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S197
<400> 500
Met Ala Ala Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Ala Ala Pro Val Ser Ser
1 5 10 15
Thr Ser Ser Leu Pro Leu Ala Ala Leu Asn Met Arg Val Arg Arg Arg
20 25 30
Leu Ser Leu Phe Leu Asn Val Arg Thr Gln Val Ala Ala Asp Trp Thr
35 40 45
Ala Leu Ala Glu Glu Met Asp Phe Glu Tyr Leu Glu Ile Arg Gln Leu
50 55 60
Glu Thr Gln Ala Asp Pro Thr Gly Arg Leu Leu Asp Ala Trp Gln Gly
65 70 75 80
Arg Pro Gly Ala Ser Val Gly Arg Leu Leu Glu Leu Leu Thr Lys Leu
85 90 95
Gly Arg Asp Asp Val Leu Leu Glu Leu Gly Pro Ser Ile Glu Glu Asp
100 105 110
Cys Gln Lys Tyr Ile Leu Lys Gln Gln Gln Glu Glu Ala Glu Lys Pro
115 120 125
Leu Gln Val Ala Ala Val Asp Ser Ser Val Pro Arg Thr Ala Glu Leu
130 135 140
Ala Gly Ile Thr Thr Leu Asp Asp Pro Leu Gly His Met Pro Glu Arg
145 150 155 160
Phe Asp Ala Phe Ile Cys Tyr Cys Pro Ser Asp Ile Gln Phe Val Gln
165 170 175
Glu Met Ile Arg Gln Leu Glu Gln Thr Asn Tyr Arg Leu Lys Leu Cys
180 185 190
Val Ser Asp Arg Asp Val Leu Pro Gly Thr Cys Val Trp Ser Ile Ala
195 200 205
Ser Glu Leu Ile Glu Lys Arg Cys Arg Arg Met Val Val Val Val Ser
210 215 220
Asp Asp Tyr Leu Gln Ser Lys Glu Cys Asp Phe Gln Thr Lys Phe Ala
225 230 235 240
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Ala His Gln Lys Arg Pro Ile Pro Ile Lys
245 250 255
Tyr Lys Ala Met Lys Lys Glu Phe Pro Ser Ile Leu Arg Phe Ile Thr
260 265 270
Val Cys Asp Tyr Thr Asn Pro Cys Thr Lys Ser Trp Phe Trp Thr Arg
275 280 285
Leu Ala Lys Ala Leu Ser Leu Pro
290 295
<210> 501
<211> 251
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S198
<400> 501
Met Ala Ala Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Ala Ala Pro Val Ser Ser
1 5 10 15
Thr Ser Ser Leu Pro Leu Ala Ala Leu Asn Met Arg Val Arg Arg Arg
20 25 30
Leu Ser Leu Phe Leu Asn Val Arg Thr Gln Val Ala Ala Asp Trp Thr
35 40 45
Ala Leu Ala Glu Glu Met Asp Phe Glu Tyr Leu Glu Ile Arg Gln Leu
50 55 60
Glu Thr Gln Ala Asp Pro Thr Gly Arg Leu Leu Asp Ala Trp Gln Gly
65 70 75 80
Arg Pro Gly Ala Ser Val Gly Arg Leu Leu Glu Leu Leu Thr Lys Leu
85 90 95
Gly Arg Asp Asp Val Leu Leu Glu Leu Gly Pro Ser Ile Gly His Met
100 105 110
Pro Glu Arg Phe Asp Ala Phe Ile Cys Tyr Cys Pro Ser Asp Ile Gln
115 120 125
Phe Val Gln Glu Met Ile Arg Gln Leu Glu Gln Thr Asn Tyr Arg Leu
130 135 140
Lys Leu Cys Val Ser Asp Arg Asp Val Leu Pro Gly Thr Cys Val Trp
145 150 155 160
Ser Ile Ala Ser Glu Leu Ile Glu Lys Arg Cys Arg Arg Met Val Val
165 170 175
Val Val Ser Asp Asp Tyr Leu Gln Ser Lys Glu Cys Asp Phe Gln Thr
180 185 190
Lys Phe Ala Leu Ser Leu Ser Pro Gly Ala His Gln Lys Arg Pro Ile
195 200 205
Pro Ile Lys Tyr Lys Ala Met Lys Lys Glu Phe Pro Ser Ile Leu Arg
210 215 220
Phe Ile Thr Val Cys Asp Tyr Thr Asn Pro Cys Thr Lys Ser Trp Phe
225 230 235 240
Trp Thr Arg Leu Ala Lys Ala Leu Ser Leu Pro
245 250
<210> 502
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S199
<400> 502
Lys Ser Gln Trp Ile Lys Glu Thr Cys Tyr Pro Asp Ile Pro Asp Pro
1 5 10 15
Tyr Lys Ser Ser Ile Leu Ser Leu Ile Lys Phe Lys Glu Asn Pro His
20 25 30
Leu Ile Ile Met Asn Val Ser Asp Cys Ile Pro Asp Ala Ile Glu Val
35 40 45
Val Ser Lys Pro Glu Gly Thr Lys Ile Gln Phe Leu Gly Thr Arg Lys
50 55 60
Ser Leu Thr Glu Thr Glu Leu Thr Lys Pro Asn Tyr Leu Tyr Leu Leu
65 70 75 80
Pro Thr Glu Lys Asn His Ser Gly Pro Gly Pro Cys Ile Cys Phe Glu
85 90 95
Asn Leu Thr Tyr Asn Gln Ala Ala Ser Asp Ser Gly Ser Cys Gly His
100 105 110
Val Pro Val Ser Pro Lys Ala Pro Ser Met Leu Gly Leu Met Thr Ser
115 120 125
Pro Glu Asn Val Leu Lys Ala Leu Glu Lys Asn Tyr Met Asn Ser Leu
130 135 140
Gly Glu Ile Pro Ala Gly Glu Thr Ser Leu Asn Tyr Val Ser Gln Leu
145 150 155 160
Ala Ser Pro Met Phe Gly Asp Lys Asp Ser Leu Pro Thr Asn Pro Val
165 170 175
Glu Ala Pro His Cys Ser Glu Tyr Lys Met Gln Met Ala Val Ser Leu
180 185 190
Arg Leu Ala Leu Pro Pro Pro Thr Glu Asn Ser Ser Leu Ser Ser Ile
195 200 205
Thr Leu Leu Asp Pro Gly Glu His Tyr Cys
210 215
<210> 503
<211> 364
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S202
<400> 503
Lys Gly Tyr Ser Met Val Thr Cys Ile Phe Pro Pro Val Pro Gly Pro
1 5 10 15
Lys Ile Lys Gly Phe Asp Ala His Leu Leu Glu Lys Gly Lys Ser Glu
20 25 30
Glu Leu Leu Ser Ala Leu Gly Cys Gln Asp Phe Pro Pro Thr Ser Asp
35 40 45
Tyr Glu Asp Leu Leu Val Glu Tyr Leu Glu Val Asp Asp Ser Glu Asp
50 55 60
Gln His Leu Met Ser Val His Ser Lys Glu His Pro Ser Gln Gly Met
65 70 75 80
Lys Pro Thr Tyr Leu Asp Pro Asp Thr Asp Ser Gly Arg Gly Ser Cys
85 90 95
Asp Ser Pro Ser Leu Leu Ser Glu Lys Cys Glu Glu Pro Gln Ala Asn
100 105 110
Pro Ser Thr Phe Tyr Asp Pro Glu Val Ile Glu Lys Pro Glu Asn Pro
115 120 125
Glu Thr Thr His Thr Trp Asp Pro Gln Cys Ile Ser Met Glu Gly Lys
130 135 140
Ile Pro Tyr Phe His Ala Gly Gly Ser Lys Cys Ser Thr Trp Pro Leu
145 150 155 160
Pro Gln Pro Ser Gln His Asn Pro Arg Ser Ser Tyr His Asn Ile Thr
165 170 175
Asp Val Cys Glu Leu Ala Val Gly Pro Ala Gly Ala Pro Ala Thr Leu
180 185 190
Leu Asn Glu Ala Gly Lys Asp Ala Leu Lys Ser Ser Gln Thr Ile Lys
195 200 205
Ser Arg Glu Glu Gly Lys Ala Thr Gln Gln Arg Glu Val Glu Ser Phe
210 215 220
His Ser Glu Thr Asp Gln Asp Thr Pro Trp Leu Leu Pro Gln Glu Lys
225 230 235 240
Thr Pro Phe Gly Ser Ala Lys Pro Leu Asp Tyr Val Glu Ile His Lys
245 250 255
Val Asn Lys Asp Gly Ala Leu Ser Leu Leu Pro Lys Gln Arg Glu Asn
260 265 270
Ser Gly Lys Pro Lys Lys Pro Gly Thr Pro Glu Asn Asn Lys Glu Tyr
275 280 285
Ala Lys Val Ser Gly Val Met Asp Asn Asn Ile Leu Val Leu Val Pro
290 295 300
Asp Pro His Ala Lys Asn Val Ala Cys Phe Glu Glu Ser Ala Lys Glu
305 310 315 320
Ala Pro Pro Ser Leu Glu Gln Asn Gln Ala Glu Lys Ala Leu Ala Asn
325 330 335
Phe Thr Ala Thr Ser Ser Lys Cys Arg Leu Gln Leu Gly Gly Leu Asp
340 345 350
Tyr Leu Asp Pro Ala Cys Phe Thr His Ser Phe His
355 360
<210> 504
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S211
<400> 504
Ala Leu Tyr Leu Leu Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His
1 5 10 15
Lys Pro Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln
20 25 30
Ala Asp Ala His Ser Thr Leu Ala Lys Ile
35 40
<210> 505
<211> 188
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S212
<400> 505
His Arg Arg Ala Cys Arg Lys Arg Ile Arg Gln Lys Leu His Leu Cys
1 5 10 15
Tyr Pro Val Gln Thr Ser Gln Pro Lys Leu Glu Leu Val Asp Ser Arg
20 25 30
Pro Arg Arg Ser Ser Thr Gln Leu Arg Ser Gly Ala Ser Val Thr Glu
35 40 45
Pro Val Ala Glu Glu Arg Gly Leu Met Ser Gln Pro Leu Met Glu Thr
50 55 60
Cys His Ser Val Gly Ala Ala Tyr Leu Glu Ser Leu Pro Leu Gln Asp
65 70 75 80
Ala Ser Pro Ala Gly Gly Pro Ser Ser Pro Arg Asp Leu Pro Glu Pro
85 90 95
Arg Val Ser Thr Glu His Thr Asn Asn Lys Ile Glu Lys Ile Tyr Ile
100 105 110
Met Lys Ala Asp Thr Val Ile Val Gly Thr Val Lys Ala Glu Leu Pro
115 120 125
Glu Gly Arg Gly Leu Ala Gly Pro Ala Glu Pro Glu Leu Glu Glu Glu
130 135 140
Leu Glu Ala Asp His Thr Pro His Tyr Pro Glu Gln Glu Thr Glu Pro
145 150 155 160
Pro Leu Gly Ser Cys Ser Asp Val Met Leu Ser Val Glu Glu Glu Gly
165 170 175
Lys Glu Asp Pro Leu Pro Thr Ala Ala Ser Gly Lys
180 185
<210> 506
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S213
<400> 506
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 507
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S214
<400> 507
Cys Val Lys Arg Arg Lys Pro Arg Gly Asp Val Val Lys Val Ile Val
1 5 10 15
Ser Val Gln Arg Lys Arg Gln Glu Ala Glu Gly Glu Ala Thr Val Ile
20 25 30
Glu Ala Leu Gln Ala Pro Pro Asp Val Thr Thr Val Ala Val Glu Glu
35 40 45
Thr Ile Pro Ser Phe Thr Gly Arg Ser Pro Asn His
50 55 60
<210> 508
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S215
<400> 508
Gln Leu Gly Leu His Ile Trp Gln Leu Arg Ser Gln Cys Met Trp Pro
1 5 10 15
Arg Glu Thr Gln Leu Leu Leu Glu Val Pro Pro Ser Thr Glu Asp Ala
20 25 30
Arg Ser Cys Gln Phe Pro Glu Glu Glu Arg Gly Glu Arg Ser Ala Glu
35 40 45
Glu Lys Gly Arg Leu Gly Asp Leu Trp Val
50 55
<210> 509
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽S216
<400> 509
Gln Leu Gly Leu His Ile Trp Gln Leu Arg Lys Thr Gln Leu Leu Leu
1 5 10 15
Glu Val Pro Pro Ser Thr Glu Asp Ala Arg Ser Cys Gln Phe Pro Glu
20 25 30
Glu Glu Arg Gly Glu Arg Ser Ala Glu Glu Lys Gly Arg Leu Gly Asp
35 40 45
Leu Trp Val
50
<210> 510
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽X001
<400> 510
Gly Ser Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Ala Ala Thr
1 5 10 15
Ala Gly Ser Gly Ser Gly Ser
20
<210> 511
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽IL7
<400> 511
Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu
1 5 10 15
Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser
20 25 30
Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp
35 40 45
Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg
50 55 60
Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu
65 70 75 80
Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val
85 90 95
Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser
100 105 110
Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu
115 120 125
Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys
130 135 140
Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His
145 150
<210> 512
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽Flexible接头
<400> 512
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 513
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽IL7RA ECD和TM
<400> 513
Glu Ser Gly Tyr Ala Gln Asn Gly Asp Leu Glu Asp Ala Glu Leu Asp
1 5 10 15
Asp Tyr Ser Phe Ser Cys Tyr Ser Gln Leu Glu Val Asn Gly Ser Gln
20 25 30
His Ser Leu Thr Cys Ala Phe Glu Asp Pro Asp Val Asn Ile Thr Asn
35 40 45
Leu Glu Phe Glu Ile Cys Gly Ala Leu Val Glu Val Lys Cys Leu Asn
50 55 60
Phe Arg Lys Leu Gln Glu Ile Tyr Phe Ile Glu Thr Lys Lys Phe Leu
65 70 75 80
Leu Ile Gly Lys Ser Asn Ile Cys Val Lys Val Gly Glu Lys Ser Leu
85 90 95
Thr Cys Lys Lys Ile Asp Leu Thr Thr Ile Val Lys Pro Glu Ala Pro
100 105 110
Phe Asp Leu Ser Val Val Tyr Arg Glu Gly Ala Asn Asp Phe Val Val
115 120 125
Thr Phe Asn Thr Ser His Leu Gln Lys Lys Tyr Val Lys Val Leu Met
130 135 140
His Asp Val Ala Tyr Arg Gln Glu Lys Asp Glu Asn Lys Trp Thr His
145 150 155 160
Val Asn Leu Ser Ser Thr Lys Leu Thr Leu Leu Gln Arg Lys Leu Gln
165 170 175
Pro Ala Ala Met Tyr Glu Ile Lys Val Arg Ser Ile Pro Asp His Tyr
180 185 190
Phe Lys Gly Phe Trp Ser Glu Trp Ser Pro Ser Tyr Tyr Phe Arg Thr
195 200 205
Pro Glu Ile Asn Asn Ser Ser Gly Glu Met Asp Pro Ile Leu Leu Thr
210 215 220
Ile Ser Ile Leu Ser Phe Phe Ser Val Ala Leu Leu Val Ile Leu Ala
225 230 235 240
Cys Val Leu Trp
<210> 514
<211> 286
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽IL2RB ICD
<400> 514
Asn Cys Arg Asn Thr Gly Pro Trp Leu Lys Lys Val Leu Lys Cys Asn
1 5 10 15
Thr Pro Asp Pro Ser Lys Phe Phe Ser Gln Leu Ser Ser Glu His Gly
20 25 30
Gly Asp Val Gln Lys Trp Leu Ser Ser Pro Phe Pro Ser Ser Ser Phe
35 40 45
Ser Pro Gly Gly Leu Ala Pro Glu Ile Ser Pro Leu Glu Val Leu Glu
50 55 60
Arg Asp Lys Val Thr Gln Leu Leu Leu Gln Gln Asp Lys Val Pro Glu
65 70 75 80
Pro Ala Ser Leu Ser Ser Asn His Ser Leu Thr Ser Cys Phe Thr Asn
85 90 95
Gln Gly Tyr Phe Phe Phe His Leu Pro Asp Ala Leu Glu Ile Glu Ala
100 105 110
Cys Gln Val Tyr Phe Thr Tyr Asp Pro Tyr Ser Glu Glu Asp Pro Asp
115 120 125
Glu Gly Val Ala Gly Ala Pro Thr Gly Ser Ser Pro Gln Pro Leu Gln
130 135 140
Pro Leu Ser Gly Glu Asp Asp Ala Tyr Cys Thr Phe Pro Ser Arg Asp
145 150 155 160
Asp Leu Leu Leu Phe Ser Pro Ser Leu Leu Gly Gly Pro Ser Pro Pro
165 170 175
Ser Thr Ala Pro Gly Gly Ser Gly Ala Gly Glu Glu Arg Met Pro Pro
180 185 190
Ser Leu Gln Glu Arg Val Pro Arg Asp Trp Asp Pro Gln Pro Leu Gly
195 200 205
Pro Pro Thr Pro Gly Val Pro Asp Leu Val Asp Phe Gln Pro Pro Pro
210 215 220
Glu Leu Val Leu Arg Glu Ala Gly Glu Glu Val Pro Asp Ala Gly Pro
225 230 235 240
Arg Glu Gly Val Ser Phe Pro Trp Ser Arg Pro Pro Gly Gln Gly Glu
245 250 255
Phe Arg Ala Leu Asn Ala Arg Leu Pro Leu Asn Thr Asp Ala Tyr Leu
260 265 270
Ser Leu Gln Glu Leu Gln Gly Gln Asp Pro Thr His Leu Val
275 280 285
<210> 515
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸Kozak型序列
<220>
<221> 未归类特征
<222> (7)..(7)
<223> n = T 或 U
<220>
<221> 未归类特征
<222> (9)..(9)
<223> n = G可以存在或可以不存在
<400> 515
ccaccangn 9
<210> 516
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸Kozak型序列2
<220>
<221> 未归类特征
<222> (7)..(7)
<223> n = T或U
<220>
<221> 未归类特征
<222> (9)..(9)
<223> n = G可以存在或可以不存在
<400> 516
ccgccangn 9
<210> 517
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸Kozak型序列3
<220>
<221> 未归类特征
<222> (11)..(11)
<223> n = T或U
<220>
<221> 未归类特征
<222> (13)..(13)
<223> n = G可以存在或可以不存在
<400> 517
gccgccgcca ngn 13
<210> 518
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸Kozak型序列4
<220>
<221> 未归类特征
<222> (11)..(11)
<223> n = T或U
<220>
<221> 未归类特征
<222> (12)..(12)
<223> n = G可以存在或可以不存在
<400> 518
gccgccacca nn 12
<210> 519
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸Kozak序列
<400> 519
gccgccacc 9
<210> 520
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸三重终止序列
<400> 520
taatagtga 9
<210> 521
<211> 191
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸WPRE
<400> 521
gtcctttcca tggctgctcg cctgtgttgc cacctggatt ctgcgcggga cgtccttctg 60
ctacgtccct tcggccctca atccagcgga ccttccttcc cgcggcctgc tgccggctct 120
gcggcctctt ccgcgtcttc gccttcgccc tcagacgagt cggatctccc tttgggccgc 180
ctccccgcct g 191

Claims (71)

1.一种复制缺陷型重组反转录病毒颗粒在制备用于以基因方式修饰受试者的静息T细胞或静息NK细胞的试剂盒中的用途，其中所述试剂盒的用途包含：使所述T细胞或NK细胞离体与所述复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触，其中所述复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包含表面上的假型组件及所述表面上的膜结合T细胞活化组件，其中所述接触有助于利用所述复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转导所述T细胞或NK细胞，由此产生经基因方式修饰的T细胞或NK细胞，且其中所述接触进行1小时至12小时之间。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述接触进行1小时至6小时之间。
3.根据权利要求1所述的用途，其中所述膜结合T细胞活化组件为抗CD3 scFvFc。
4.根据权利要求1所述的用途，其中所述复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包含多核苷酸，所述多核苷酸包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一个或多个转录单元，其中所述一个或多个转录单元编码包含嵌合抗原受体(CAR)的第一多肽和包含T细胞淋巴增生性组件的第二多肽，且其中所述经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞能够在不存在针对所述CAR的ASTR的靶标且不存在外源性细胞因子的情况下在离体培养物中存活至少7天。
5.根据权利要求4所述的用途，其中所述T细胞淋巴增生性组件包含嵌合细胞因子受体。
6.根据权利要求5所述的用途，其中所述嵌合细胞因子受体包含连接至IL-7受体α的IL-7，或其保留促进T细胞和/或NK细胞增生的能力的片段，且其中所述嵌合细胞因子受体是组成性活性的。
7.根据权利要求6所述的用途，其中所述嵌合细胞因子受体包含共价连接至能够结合IL-7的IL-7受体的功能性胞外片段、IL-7受体跨膜域及IL-7受体信号传导域的IL-7。
8.根据权利要求4所述的用途，其中所述CAR为MRB-CAR。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的用途，其中所述复制缺陷型重组反转录病毒颗粒为慢病毒颗粒，且其中所述经基因方式修饰的细胞为经基因方式修饰的T细胞。
10.一种经基因方式修饰的T细胞或NK细胞，其通过根据包含使静息T细胞和/或静息NK细胞离体与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触的方法转导静息T细胞和/或静息NK细胞来制得，其中所述复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包含在其表面上的假型组件及在其表面上的膜结合T细胞活化组件，其中所述接触有助于利用所述复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转导所述静息T细胞和/或NK细胞，由此产生经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞，且其中所述接触进行1小时至12小时之间。
11.根据权利要求10所述的经基因方式修饰的T细胞或NK细胞，其中所述接触进行1小时至6小时之间。
12.根据权利要求10所述的经基因方式修饰的T细胞或NK细胞，其中所述膜结合T细胞活化组件为抗CD3 scFvFc。
13.根据权利要求10所述的经基因方式修饰的T细胞或NK细胞，其中所述复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包含多核苷酸，所述多核苷酸包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一个或多个转录单元，其中所述一个或多个转录单元编码包含嵌合抗原受体(CAR)的第一多肽和包含T细胞淋巴增生性组件的第二多肽，且其中所述经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞能够在不存在针对所述CAR的ASTR的靶标且不存在外源性细胞因子的情况下在离体培养物中存活至少7天。
14.根据权利要求13所述的经基因方式修饰的T细胞或NK细胞，其中所述CAR为MRB-CAR。
15.根据权利要求13所述的经基因方式修饰的T细胞或NK细胞，其中所述多核苷酸进一步包含Kozak相关序列、WPRE组件及多重终止序列中的一者或多者。
16.根据权利要求13所述的经基因方式修饰的T细胞或NK细胞，其中所述T细胞淋巴增生性组件包含嵌合细胞因子受体。
17.根据权利要求10至16中任一项所述的经基因方式修饰的T细胞或NK细胞，其中所述复制缺陷型重组反转录病毒颗粒为慢病毒颗粒，且其中所述经基因方式修饰的细胞为T细胞。
18.一种使用复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转导淋巴细胞的方法，其包含：
A.将包装细胞悬浮培养在无血清培养基中，其中所述包装细胞包含编码所述复制缺陷型反转录病毒颗粒的可包装RNA基因组、REV蛋白质、gag多肽、pol多肽及假型组件的核酸序列；
B.从所述无血清培养基采集所述复制缺陷型重组反转录病毒颗粒；以及
C.使所述淋巴细胞与所述复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触，其中所述接触进行少于12小时，由此转导所述淋巴细胞。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述包装细胞进一步包含编码活化组件的核酸。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述活化组件为抗CD3抗体。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述抗CD3抗体为抗CD3 scFvFc。
22.根据权利要求18所述的方法，其中所述包装细胞为包含稳定整合于其中的编码所述可包装RNA基因组的核酸的永生化细胞。
23.根据权利要求18所述的方法，其中所述gag多肽及所述pol多肽由一种或多种可诱导启动子表达且其中所述方法进一步包含：在所述培养期间添加反式激活因子以诱导从所述一种或多种可诱导启动子表达所述gap多肽及所述pol多肽。
24.根据权利要求18所述的方法，其中所述复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包含多核苷酸，所述多核苷酸包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一个或多个转录单元，其中所述一个或多个转录单元编码包含嵌合抗原受体(CAR)的第一多肽。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述CAR为MRB-CAR。
26.根据权利要求18所述的方法，其中所述复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包含多核苷酸，所述多核苷酸包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一个或多个转录单元，其中所述一个或多个转录单元编码淋巴增生性组件。
27.根据权利要求18所述的方法，其中所述接触进行1小时至12小时之间。
28.根据权利要求18所述的方法，其中所述淋巴细胞能够在不存在任何外源性细胞因子的情况下在体外扩增。
29.根据权利要求18至28中任一项所述的方法，其中所述淋巴细胞为静息T细胞且其中所述复制缺陷型重组反转录病毒颗粒为慢病毒颗粒。
30.一种复制缺陷型重组反转录病毒颗粒，其包含：
A.多核苷酸，其包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一个或多个转录单元，其中所述一个或多个转录单元编码嵌合抗原受体(CAR)；及
B.在其表面上的假型组件及T细胞活化组件，其中所述T细胞活化组件不由所述复制缺陷型重组反转录病毒颗粒中的多核苷酸编码，且其中所述T细胞活化组件为抗CD3 scFvFc抗体。
31.根据权利要求30所述的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒，其中所述复制缺陷型反转录病毒颗粒进一步包含能够结合至CD28的膜结合多肽。
32.根据权利要求30所述的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒，其中所述抗CD3 scFvFc抗体与异源GPI锚定连接序列融合。
33.根据权利要求30所述的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒，其中所述一个或多个转录单元进一步编码淋巴增生性组件。
34.根据权利要求33所述的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒，其中所述CAR和所述淋巴增生性组件表达为分离的多肽。
35.根据权利要求34所述的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒，其中所述淋巴增生性组件为嵌合淋巴增生性组件。
36.根据权利要求35所述的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒，其中所述嵌合淋巴增生性组件为组成性活性嵌合细胞因子受体，且其中所述组成性活性嵌合细胞因子受体的表达处于控制组件的控制下。
37.根据权利要求36所述的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒，其中所述嵌合细胞因子受体包含IL-7受体的胞内信号传导域、IL-12受体的胞内信号传导域、IL-15受体的胞内信号传导域、IL-21受体的胞内信号传导域、IL-23受体的胞内信号传导域、IL-27受体的胞内信号传导域、转化生长因子β(TGFβ)诱饵受体的胞内信号传导域或CD28。
38.根据权利要求35所述的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒，其中所述嵌合淋巴增生性组件包含细胞因子受体且所述细胞因子受体包含连接至所述IL-7受体的IL-7，或其保留促进T细胞和/或NK细胞增生的能力的片段，且其中所述嵌合细胞因子受体是组成性活性的。
39.根据权利要求38所述的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒，其中所述嵌合细胞因子受体包含共价连接至能够结合IL-7的IL-7受体的功能性胞外片段、IL-7受体跨膜域及IL-7受体信号传导域的IL-7。
40.根据权利要求30所述的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒，其中所述多核苷酸进一步包含Kozak相关序列、WPRE组件及多重终止序列中的一者或多者。
41.根据权利要求30至39中任一项所述的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒，其中所述复制缺陷型重组反转录病毒颗粒为慢病毒颗粒且所述启动子在T细胞中为活性的。
42.一种复制缺陷型重组反转录病毒颗粒，其包含含有可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一个或多个转录单元的多核苷酸，其中所述一个或多个转录单元编码包含嵌合抗原受体(CAR)的第一多肽和包含组成性活性嵌合淋巴增生性组件的第二多肽，且其中所述嵌合淋巴增生性组件不包含连接至其同源受体或连接至其同源受体片段的细胞因子。
43.根据权利要求42所述的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒，其中所述嵌合淋巴增生性组件包含嵌合细胞因子受体。
44.根据权利要求42所述的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒，其中所述组成性活性嵌合淋巴增生性组件的表达处于控制组件的控制下。
45.根据权利要求42所述的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒，其中所述复制缺陷型重组反转录病毒颗粒进一步包含在其表面上的假型组件。
46.根据权利要求42所述的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒，其中所述复制缺陷型重组反转录病毒颗粒进一步包含在其表面上的T细胞活化组件，其中所述T细胞活化组件不由所述复制缺陷型重组反转录病毒颗粒中的多核苷酸编码。
47.根据权利要求46所述的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒，其中所述T细胞活化组件为抗CD3抗体。
48.根据权利要求47所述的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒，其中所述T细胞活化组件为抗CD3scFvFc。
49.根据权利要求42至47中任一项所述的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒，其中所述复制缺陷型重组反转录病毒颗粒为慢病毒颗粒，且其中所述启动子在T细胞中为活性的。
50.一种经基因方式修饰的T细胞或NK细胞，其中所述T细胞或NK细胞表达包含组成性活性嵌合淋巴增生性组件的第一工程化信号传导多肽及包含嵌合抗原受体(CAR)的第二工程化信号传导多肽，所述组成性活性嵌合淋巴增生性组件不包含连接至其同源受体或连接至其同源受体片段的细胞因子，所述嵌合抗原受体包括抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜域及胞内活化域。
51.根据权利要求50所述的经基因方式修饰的T细胞或NK细胞，其中所述第一工程化信号传导多肽的表达处于控制组件的控制下。
52.根据权利要求50所述的经基因方式修饰的T细胞或NK细胞，其中所述细胞为T细胞。
53.根据权利要求50所述的经基因方式修饰的T细胞或NK细胞，其中所述CAR为MRB-CAR。
54.一种用于转导静息T细胞和/或静息NK细胞的方法，其包含使所述静息T细胞和/或静息NK细胞离体与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触，其中所述复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包含在其表面上的假型组件及在其表面上的膜结合T细胞活化组件，其中所述接触有助于利用所述复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转导所述静息T细胞和/或NK细胞，由此产生经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞，且其中所述接触进行1小时至12小时之间。
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述接触进行1小时至6小时之间。
56.根据权利要求54所述的方法，其中所述膜结合T细胞活化组件为抗CD3 scFvFc。
57.根据权利要求54所述的方法，其中所述复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包含多核苷酸，所述多核苷酸包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一个或多个转录单元，其中所述一个或多个转录单元编码包含嵌合抗原受体(CAR)的第一多肽及包含T细胞淋巴增生性组件的第二多肽，且其中所述经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞能够在不存在针对所述CAR的ASTR的靶标且不存在外源性细胞因子的情况下在离体培养物中存活至少7天。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述T细胞淋巴增生性组件包含嵌合细胞因子受体。
59.根据权利要求58所述的方法，其中所述嵌合细胞因子受体包含连接至IL-7受体α的IL-7，或其保留促进T细胞和/或NK细胞增生的能力的片段，且其中所述嵌合细胞因子受体是组成性活性的。
60.根据权利要求59所述的方法，其中所述嵌合细胞因子受体包含共价连接至能够结合IL-7的IL-7受体的功能性胞外片段、IL-7受体跨膜域及IL-7受体信号传导域的IL-7。
61.根据权利要求57所述的方法，其中所述CAR为MRB-CAR。
62.根据权利要求54至61中任一项所述的方法，其中所述复制缺陷型重组反转录病毒颗粒为慢病毒颗粒，且其中所述经基因方式修饰的细胞为经基因方式修饰的T细胞。
63.根据权利要求57所述的方法，其中10％至50％之间的所述静息T细胞和/或静息NK细胞经转导。
64.一种用于转导静息T细胞和/或静息NK细胞的方法，其包含使所述静息T细胞和/或静息NK细胞离体与转导反应混合物中的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触，其中所述复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包含其表面上的假型组件及其表面上的膜结合抗CD3scFvFc抗体，其中所述接触有助于利用所述复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转导所述静息T细胞和/或NK细胞，由此产生经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞。
65.根据权利要求64所述的方法，其中所述转导进行1小时至20小时之间。
66.根据权利要求64所述的方法，其中所述复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包含多核苷酸，所述多核苷酸包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中具有活性的启动子的一个或多个转录单元，其中所述一个或多个转录单元编码包含嵌合抗原受体(CAR)的第一多肽及包含T细胞淋巴增生性组件的第二多肽，且其中所述经基因方式修饰的T细胞和/或NK细胞能够在不存在针对所述CAR的ASTR的靶标且不存在外源性细胞因子的情况下在离体培养物中存活至少7天。
67.根据权利要求66所述的方法，其中所述T细胞淋巴增生性组件包含嵌合细胞因子受体。
68.根据权利要求67所述的方法，其中所述嵌合细胞因子受体包含连接至IL-7受体α的IL-7，或其保留促进T细胞和/或NK细胞增生的能力的片段，且其中所述嵌合细胞因子受体是组成性活性的。
69.根据权利要求68所述的方法，其中所述嵌合细胞因子受体包含共价连接至能够结合IL-7的IL-7受体的功能性胞外片段、IL-7受体跨膜域及IL-7受体信号传导域的IL-7。
70.根据权利要求64至69中任一项所述的方法，其中所述复制缺陷型重组反转录病毒颗粒为慢病毒颗粒，且其中所述经基因方式修饰的细胞为经基因方式修饰的T细胞。
71.根据权利要求66所述的方法，其中10％至50％之间的所述静息T细胞和/或静息NK细胞经转导。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110244612A (zh) * 2019-06-06 2019-09-17 西安交通大学 一种基于化学扩散机理的二元数字通信系统
CN111549044A (zh) * 2020-07-13 2020-08-18 北京市肿瘤防治研究所 靶向trbc1 car-t细胞的制备方法与应用
CN111662900A (zh) * 2020-05-13 2020-09-15 重庆师范大学 一种磺胺二甲嘧啶核酸适配体筛选方法、试剂盒及应用
WO2024051831A1 (zh) * 2022-09-09 2024-03-14 信达细胞制药(苏州)有限公司 组成型嵌合细胞因子受体及表达其的免疫细胞及应用

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11111505B2 (en) 2016-03-19 2021-09-07 Exuma Biotech, Corp. Methods and compositions for transducing lymphocytes and regulating the activity thereof
WO2020047527A2 (en) 2018-09-02 2020-03-05 F1 Bioventures, Llc Methods and compositions for genetically modifying lymphocytes in blood or in enriched pbmcs
US11325948B2 (en) 2016-03-19 2022-05-10 Exuma Biotech Corp. Methods and compositions for genetically modifying lymphocytes to express polypeptides comprising the intracellular domain of MPL
IL278044B2 (en) * 2018-04-19 2024-04-01 Baylor College Medicine Reprogramming of CD4 T cells to CD8 T cells through forced expression of CD8AB and type 1-restricted T cell receptors
US20220133792A1 (en) * 2019-02-01 2022-05-05 The Trustees Of Dartmouth College Signaling platforms for chimeric antigen receptor t cells
JP2022519704A (ja) * 2019-02-08 2022-03-24 シアトル チルドレンズ ホスピタル （ディービーエイ シアトル チルドレンズ リサーチ インスティテュート） キメラサイトカイン受容体
MX2021010444A (es) 2019-03-01 2021-09-21 Allogene Therapeutics Inc Receptores de citocinas quimericos que tienen un ectodominio de pd-1.
EP3715368A1 (en) * 2019-03-28 2020-09-30 Albert-Ludwigs-Universität Freiburg Chimeric antigen receptors, vectors coding for such receptors and their use in the modification of t cells
CN112500492B (zh) * 2019-09-13 2023-08-04 中国科学院分子细胞科学卓越创新中心 一种嵌合抗原受体及其用途
WO2021073626A1 (zh) * 2019-10-17 2021-04-22 北京门罗生物科技有限公司 嵌合抗原受体和其中表达有嵌合抗原受体的t细胞
JP2023504081A (ja) * 2019-11-27 2023-02-01 ボード オブ リージェンツ，ザ ユニバーシティ オブ テキサス システム 神経膠芽細胞腫及び他の癌を処置するためのナチュラルキラー細胞免疫療法
US20230111159A1 (en) * 2020-03-05 2023-04-13 Exuma Biotech Corp Methods and compositions for the delivery of modified lymphocyte aggregates
CA3204357A1 (en) * 2021-01-28 2022-08-04 Todd LUMAN Methods for transducing immune cells
WO2022187289A1 (en) 2021-03-01 2022-09-09 Exuma Biotech Corp. Methods and compositions for the delivery of retroviral particles
WO2023168305A1 (en) 2022-03-01 2023-09-07 Exuma Biotech Corp. Viral particles with membrane-bound hyaluronidase

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1635988A (zh) * 2001-11-06 2005-07-06 考丽克萨有限公司 检测、诊断和治疗血液恶性肿瘤的组合物和方法
CN1897977A (zh) * 2003-10-20 2007-01-17 Ns基因公司 帕金森氏病的体内基因治疗
WO2014186469A2 (en) * 2013-05-14 2014-11-20 Board Of Regents, The University Of Texas System Human application of engineered chimeric antigen receptor (car) t-cells
WO2016139463A1 (en) * 2015-03-02 2016-09-09 Ucl Business Plc Retroviral and lentiviral vectors
CN108884460A (zh) * 2016-03-19 2018-11-23 F1肿瘤医学公司 淋巴细胞转导及其扩增调节的方法与组合物

Family Cites Families (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5677425A (en) 1987-09-04 1997-10-14 Celltech Therapeutics Limited Recombinant antibody
US5585362A (en) 1989-08-22 1996-12-17 The Regents Of The University Of Michigan Adenovirus vectors for gene therapy
DE69233013T2 (de) 1991-08-20 2004-03-04 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of National Institute Of Health, Office Of Technology Transfer Adenovirus vermittelter gentransfer in den gastrointestinaltrakt
US5252479A (en) 1991-11-08 1993-10-12 Research Corporation Technologies, Inc. Safe vector for gene therapy
FR2688514A1 (fr) 1992-03-16 1993-09-17 Centre Nat Rech Scient Adenovirus recombinants defectifs exprimant des cytokines et medicaments antitumoraux les contenant.
AU680459B2 (en) 1992-12-03 1997-07-31 Genzyme Corporation Gene therapy for cystic fibrosis
US5310903A (en) 1993-03-05 1994-05-10 Merck & Co., Inc. Imidazolidyl rapamycin derivatives
JP3532566B2 (ja) 1993-06-24 2004-05-31 エル． グラハム，フランク 遺伝子治療のためのアデノウイルスベクター
CN1263864C (zh) 1993-10-25 2006-07-12 坎吉公司 重组腺病毒载体及其使用方法
US5527907A (en) 1993-11-19 1996-06-18 Abbott Laboratories Macrolide immunomodulators
US5525610A (en) 1994-03-31 1996-06-11 American Home Products Corporation 42-Epi-rapamycin and pharmaceutical compositions thereof
US5362718A (en) 1994-04-18 1994-11-08 American Home Products Corporation Rapamycin hydroxyesters
US20030036654A1 (en) 1994-08-18 2003-02-20 Holt Dennis A. Synthetic multimerizing agents
ES2178101T3 (es) 1994-12-09 2002-12-16 Imp College Innovations Ltd Genes de virulencia en la region vgc2 de salmonella.
CA2219080A1 (en) 1995-06-07 1996-12-27 Ariad Gene Therapeutics, Inc. Rapamycin-based regulation of biological events
US6489458B2 (en) 1997-03-11 2002-12-03 Regents Of The University Of Minnesota DNA-based transposon system for the introduction of nucleic acid into DNA of a cell
JP2002508971A (ja) 1998-01-15 2002-03-26 アリアド・ジーン・セラピューティクス・インコーポレーテッド 多量体キメラ蛋白質を使用する生物学的イベントの調節
AU783158B2 (en) 1999-08-24 2005-09-29 Ariad Pharmaceuticals, Inc. 28-epirapalogs
US6916846B2 (en) 2000-05-12 2005-07-12 Merck & Co. Inc. Coumermycin analogs as chemical dimerizers of chimeric proteins
GB0105924D0 (en) 2001-03-09 2001-04-25 Microscience Ltd Promoter
US7387896B2 (en) 2003-03-26 2008-06-17 The Regents Of The University Of Michigan MicroRNA vectors
WO2006007539A1 (en) * 2004-07-01 2006-01-19 Virxsys Corporation Vector packaging cell line
SG160326A1 (en) 2004-11-08 2010-04-29 Univ Yale Structure-based compound design involving riboswitches
US8236925B1 (en) 2005-08-26 2012-08-07 University Of Minnesota Protein nanorings
NO2406399T3 (zh) 2009-03-09 2018-07-14
EP4049674A1 (en) 2009-11-03 2022-08-31 City of Hope Truncated epidermal growth factor receptor (egfrt) for transduced t cell selection
JP6066991B2 (ja) * 2011-04-08 2017-01-25 ベイラー カレッジ オブ メディスンＢａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ キメラサイトカイン受容体を用いて、腫瘍微小環境の影響を逆転する方法
EP4074735A1 (en) 2014-08-28 2022-10-19 BioAtla, Inc. Conditionally active chimeric antigen receptors for modified t-cells
EP3472318B1 (en) * 2016-07-08 2023-09-06 Exuma Biotech Corp. Methods and compositions for transducing lymphocytes and regulating the activity thereof
GB201614093D0 (en) * 2016-08-17 2016-09-28 Autolus Ltd Vector

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1635988A (zh) * 2001-11-06 2005-07-06 考丽克萨有限公司 检测、诊断和治疗血液恶性肿瘤的组合物和方法
CN1897977A (zh) * 2003-10-20 2007-01-17 Ns基因公司 帕金森氏病的体内基因治疗
WO2014186469A2 (en) * 2013-05-14 2014-11-20 Board Of Regents, The University Of Texas System Human application of engineered chimeric antigen receptor (car) t-cells
WO2016139463A1 (en) * 2015-03-02 2016-09-09 Ucl Business Plc Retroviral and lentiviral vectors
CN108884460A (zh) * 2016-03-19 2018-11-23 F1肿瘤医学公司 淋巴细胞转导及其扩增调节的方法与组合物

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HAIGUANG YANG ET AL.: "Cell type-specific targeting with surface-engineered lentiviral vectors co-displaying OKT3 antibody and fusogenic molecule", PHARM RES., vol. 26, no. 6, pages 1432 - 1445, XP019686189, DOI: 10.1007/s11095-009-9853-y *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110244612A (zh) * 2019-06-06 2019-09-17 西安交通大学 一种基于化学扩散机理的二元数字通信系统
CN110244612B (zh) * 2019-06-06 2020-05-26 西安交通大学 一种基于化学扩散机理的二元数字通信系统
CN111662900A (zh) * 2020-05-13 2020-09-15 重庆师范大学 一种磺胺二甲嘧啶核酸适配体筛选方法、试剂盒及应用
CN111662900B (zh) * 2020-05-13 2023-06-27 重庆师范大学 一种磺胺二甲嘧啶核酸适配体筛选方法、试剂盒及应用
CN111549044A (zh) * 2020-07-13 2020-08-18 北京市肿瘤防治研究所 靶向trbc1 car-t细胞的制备方法与应用
WO2024051831A1 (zh) * 2022-09-09 2024-03-14 信达细胞制药(苏州)有限公司 组成型嵌合细胞因子受体及表达其的免疫细胞及应用

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